PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD
VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT
OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS
DR. H. BOLKESTEIN, HOOGLEERAAR IN DE
FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJSBEGEERTE.
VOLGENS BESLUIT VAN DE SENAAT DER
UNIVERSITEIT TE VERDEDIGEN TEGEN DE BE-
DENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS- EN
NATUURKUNDE OP DINSDAG 18 JUNI 1935, DES
NAMIDDAGS TE DRIE UUR
DOOR

Bij de voltooiing van dit proefschrift breng ik mijn harte-
lijke dank aan de Hoogleeraren en oud-Hoogleeraren van
de Faculteit der Wis- en Natuurkunde en aan Allen, die
tot mijn wetenschappelijke opleiding hebben bijgedragen.

Dit geldt natuurlijk in het bijzonder voor U, Hooggeleerde
KÖGL, Hooggeachte Promotor, voor de voortdurende be-
langstelling, die Gij voor mijn werk hebt gehad en voor het
assistentschap, dat Gij mij hebt verleend.

Deze dank strekt zich verder uit tot al mijn collega's, die
mij meermalen met raad en daad hebben terzijde gestaan
en tot het gezamenlijk personeel van het Organisch Chemisch
Laboratorium, waarvan ik steeds alle medewerking heb onder-
vonden.

Deze dissertatie werd in het Organisch Chemisch
Laboratorium der Rijksuniversiteit te Utrecht bewerkt en be-
handelt een deel van de onderzoekingen over auxinen, die
aldaar zijn verricht door F. Kögl en zijn medewerkers,
waartoe de schrijver zich gedurende enkele jaren heeft mogen
rekenen. Door een doelmatige verdeeling van het werk vulden
de resultaten van de verschillende medewerkers elkaar aan,
zoodat het gebied van de auxinen binnen betrekkelijk korte
tijd opgehelderd kon worden. Aan de schrijver dezer disser-
tatie viel ten deel de isoleering van het auxine uit gist en
het onderzoek naar de specifiteit van hetero-auxine. Deze
beide punten hangen ten nauwste samen met de door
F. Kögl, A. J. HaagenSmitenH. Erxleben onder-
zochte auxine-problemen, zoodat op deze onderzoekingen en
haar botanische grondslag nader ingegaan dient te worden.

Een bespreking van het oudere botanische werk over „de
groeistofquot; kan hier achterwege blijven i). Eerst de bekende
publicatie van F. W. W e n 12), waarin hij een methodiek

Voor een literatuuroverzicht van deze publicaties, zie: F. W. Went,
Ree. Trav. Bot. néerl. 25, 1 (1928); vgl. ook: Lehrbuch der Pflanzen-
physiologie van S. K O s t y t s c h e w en F. A. F. C. Went, 2de deel,
1931 (uitgave J. Springer, Berlijn).

beschreef, waarmede een nagenoeg quantitatieve bepahng
van het auxine mogelijk werd, gaf de beslissende stoot tot
het chemisch onderzoek. Evenals bij vroegere onderzoekingen
worden ook bij deze methodiek de kiemplantjes van haver
gebruikt.

Het auxine wordt in de top van de coleoptile gevormd en
gedurende de groei polair — van de top naar de basis —
getransporteerd. Snijdt men nu de top af, dan vindt gedurende
enkele uren geen groei meer plaats, tot langzamerhand de top
zich regenereert en dus opnieuw auxine gevormd en ge-
transporteerd kan worden. F. W. Went ontdekte nu, dat,
wanneer men dergelijke afgesneden coleoptile-toppen op een
dun plaatje agar plaatste, het auxine uit de toppen in de
agar diffundeerde. Een blokje agar, dat op deze wijze met
auxine was „geladenquot;, legde hij op een versch gedecapi-
teerde coleoptile en nam waar, dat het groeiproces verliep,
alsof er geen decapitatie had plaats gehad. De plantentop
kan dus vervangen worden — althans gedurende enkele uren
— door een auxinehoudend agarblokje. Went paste nu
de volgende kunstgreep toe: Het agarblokje werd niet cen-
trisch op de gedecapiteerde coleoptile geplaatst, maar excen-
trisch. Het naar beneden getransporteerde auxine komt nu
slechts in aanraking met die plantencellen, die zich onder
het agarblokje bevinden. Het gevolg zal zijn, dat deze cellen
zich gaan strekken, niet echter de diametraal daar tegenover
liggende cellen, met als resultaat een kromming van de co-
leoptile van het agarblokje af. Deze kromming is binnen be-
paalde grenzen en onder bepaalde omstandigheden evenredig
met de auxineconcentratie in het agarblokje i).

gangsstoffen voor de chemische isoleering van de auxinen
gezocht worden. Het was reeds geruime tijd bekend, dat
verschillende schimmels en bacteriën auxinen vormen en aan
hun voedingsbodems afstaan i). Het auxine-gehalte van deze
cultures was echter zeer gering vergeleken met dat van urine.
De aangewezen weg was dus om eerst de actieve stof uit
urine te isoleeren en eerst later te trachten een isoleering
uit plantaardig materiaal te bewerkstelligen. Daar het op-
werken van de urine van dieren, b.v. van merries, zeker geen
gunstiger resultaat opleverde, werd voor de isoleering uit-
sluitend menschelijke urine gebruikt. De eerste zuiverings-
trappen berusten op de oplosbaarheid van auxine in aether
en op het feit, dat auxine het karakter van een zuur heeft.
De verder gevolgde weg ter concentreering is in de volgende
tabel kort weergegeven.

2de neerslag
(in alkalisch milieu) 1ste neerslag, soms
f i 11 r a a t ook het 2de neerslag

loodzout

neerslag in
alkalisch milieu

De na omkristalliseeren verkregen zuivere stof kreeg de
naam auxine (van av^dvw ■-= doen groeien); later werd voor

in benzol
onoplosbare deel

lanolextract benzolrest

rest

deze verbinding, ter onderscheiding van een nauw verwante,
eveneens actieve stof, de naam auxine-a ingevoerd. De kris-
tallen waren optisch actief, smolten bij 190° C. en hadden de
brutosamenstelling CigHgaOg. Hun werkzaamheid bedroeg
50 milliard AE per gram.

Onder een AE f= avena'eenheid) wordt die hoeveelheid
auxine verstaan, die in een agarblokje van i/eoo cm^ aanwezig
moet zijn om bij de test van F. W. Went aan een gedecapi-
teerde coleoptile bij een vochtgehalte van 92 fo en een tempe-
ratuur van 22—23° C. binnen twee uren een kromming van
10° te voorschijn te roepen.

Naast het chemisch onderzoek van auxine-a liepen proeven,
die zich bezig hielden met de vraag naar de afkomst en de
beteekenis ervan. Het bleek, dat de auxine-uitscheiding het
grootst was enkele uren na de hoofdmaaltijd en wel ontstonden
er, indien men de per uur uitgescheiden hoeveelheid auxine —
uitgedrukt in AE — afzette tegen de tijd, duidelijke maxima
in de grafiek. Daar deze zgn. auxine-toppen op hongerdagen
niet optraden, konden verschillende dieeten erop onderzocht
worden, of zij de auxine-toppen al dan niet te voorschijn
riepen. Bij deze door A. J. Haagen Smiti) uitgevoerde
proeven bleek nu, dat glucose, zetmeel en kippeneiwit geen
maxima deden ontstaan, doch dat deze wel optraden, indien
slaolie of boter werd genuttigd. Dit resultaat gaf aanleiding
tot het onderzoek van oliën en vetten op hun gehalte aan
auxine. Inderdaad kon in verschillende oliën en vetten auxine,
hetzij in veresterde, hetzij in vrije toestand, aangetoond
worden.

Daarmede was een nieuw uitgangsmateriaal voor de berei-
ding van auxine gevonden. Natuurlijk had de isoleering uit

een plantaardige olie het meeste interesse; er werd daarom een
maïsolie opgewerkt, die reeds bij uitschudden met water of
bicarbonaatoplossing haar groeistof afstond. Uit deze maïsohe
hebben F. K ö g 1 en medewerkers i) — werkende volgens
het op urine beproefde schema — behalve het auxine-a nog een
ander actief bestanddeel geïsoleerd, het auxine-b. Ook dit
was optisch actief. De brutosamenstelling ervan bedroeg
C18H30O4, het smeltpunt was 183° C., terwijl de activiteit
even groot was als die van auxine-a, nl. 50 milliard AE per
gram.

F Kögl en H. ErxlebenS) kwamen op grond van hun
onderzoekingen tot de volgende formule voor auxine-a:

De volgende gegevens leidden tot deze formuleering:
1. Auxine-a is een zuur, dat een lacton vormt. Uit de snel-

heid, waarmede zich het evenwicht lacton zuur instelt, kon
men besluiten tot een ^-lacton.

2.nbsp;Bij inwerking van m-dinitro-benzoylchloride ontstaat een
tri-(m-dinitro-benzoyl)-auxine, zoodat, behalve het „lacton-
hydroxylquot;, nog twee verdere OH-groepen aanwezig moeten
zijn. Daar een y-lacton de voorkeur zou hebben boven een
ó-lacton, kon men tegelijkertijd besluiten, dat op de y-plaats
t.o.v. de carboxylgroep waarschijnlijk geen OH-groep aan-
wezig is. De functie van de vijf O-atomen was hiermede op-
gehelderd.

3.nbsp;Bij de katalytische hydreering neemt auxine-a twee
H-atomen op, waaruit men afleidde, dat het molecule een
dubbele binding bevat en dat er bovendien een ring in aan-
wezig moet zijn.

4.nbsp;Bij alkalische oxydatic met kaliumpermanganaat ontstaat
een dicarbonzuur van de samenstelhng C13H24O4. Door de
reactie van Blanc kon aangetoond worden, dat dit door
afbraak verkregen zuur een gesubstitueerd glutaarzuur is.

5.nbsp;Om uit te maken op welke wijze het Cis-glutaarzuur
gesubstitueerd is, werd het in een Q:,a'-dioxyzuur omgezet en
de ester daarvan met methylmagnesiumjodide behandeld.

Het hierbij gevormde diglycol (VI) gaf bij oxydatie met
loodtetraacetaat volgens Criegee een 1,3-diketon (VII). Door
alkalisplitsing van dit diketon ontstond een rechtsdraaiend
a-methylboterzuur (VIII) en 3-methylpentanon-2 (IX). Daar-
uit volgt voor het Cis-dicarbonzuur de constitutie (X) van een
a.a'-di-sec. -butyglutaarzuur.

6. Door oxydatie van dihydro-auxine-a met chroomzuur
ontstaat een ringketon C13H24O.

Dit leidt tot de volgende conclusie: Op dc plaats, waar deze
Cg-rest van de ring aftakt, bevat de ring een dubbele binding.
De carbonylgroep in het ringketon gaf de plaats aan, waar
oorspronkelijk de Cg-rest vastgehecht was. De vorming van
het Ci3-zuur is aldus te verklaren, dat de oxydatie aan de
dubbele binding plaats heeft; hierbij worden twee nieuwe
carboxylgroepen gevormd, terwijl de hydroxyl- en carboxyl-
dragende Cg-rest verwijderd wordt.

'C=0

■Ch2

7. Dihydro-auxine-a geeft bij oxydatie met loodtetraacetaat
een oxy-aldehyde met 16 koolstofatomen en daarnaast glyoxyl-
zuur. Daaruit is te concludeeren, dat twee hydroxylgroepen a-
en jS'Standig t.o.v. de carboxylgroep staan. De in 1. uitgespro-
ken veronderstelling, dat zich het lacton-hydroxyl niet in y-,
maar in ó-positie bevindt, wordt hierdoor eveneens bevestigd. Bij

de aanwezigheid van een hydroxylgroep op de y-plaats zou nl.
de glycolsplitsing ook tusschen /3 en y moeten plaats hebben.

Formule I voor auxine-a is dus in overeenstemming met alle
tot nog toe gevonden feiten.

De structuurbepaling van auxine-b geschiedde langs over-
eenkomstige lijnen en leidde tot formuleering XI.

2.nbsp;Auxine-b bevat een keto-groep (vorming van een semicar-
bazon), die, daar auxine-b gedurende het smelten stormachtig
CO2 afsplitst, waarschijnlijk op de /8-plaats t.o.v. de car-
boxylgroep staat. De functie van de vier O-atomen is dus
opgehelderd.

3.nbsp;Bij de katalytische hydreering worden vier atomen water-
stof geaddeerd, waarvan de twee laatste echter door de car-
bonylgroep opgenomen worden.

4.nbsp;Bij de alkahsche oxydatie met kaliumpermanganaat ont-
staat een dicarbonzuur C13H24O4, dat volkomen identiek is
met het dicarbonzuur verkregen uit auxine-a.

-C-CH2-CO ^CHz — COOH

'CH-'CH ^^

5. Bij oxydatie van het acetaliseeringsproduct van auxine-b
kon men. behalve het Cig-zuur, cis-glutaconzuur isoleeren,
dat uit de Cg-rest afkomstig moet zijn. Dit schijnt op het eerste
gezicht erop te wijzen, dat de Cg-rest niet volgens (XII),
maar volgens (XIII) te formuleeren zou zijn, terwijl de ge-
makkelijke vorming van een ó-lacton en de afsplitsing van COg
beter met formuleering (XII) in overeenstemming is.

Later werd gevonden, dat bij destillatie van auxine-a-lacton
(XIV) met kaliumbisulfaat een product ontstaat, dat met
auxine-b identiek is.

I I

OH H

Daar over de richting van de waterafsphtsing van het a- en
/?-hydroxyl nauv/ehjks een twijfel kan bestaan, vormt deze
omzetting van auxine-a in auxine-b een belangrijke steun voor
de formuleering van auxine-b volgens formule XI. De vor-
ming van het cis-glutaconzuur moet dan door intra-moleculaire
atoomverschuiving verklaard worden.

Een overzicht van de interessante gegevens op optisch actief
gebied en de conclusies, die men daaruit over de configuratie
van auxine trekken kan, is hier achterwege gelaten.

Ten einde grootere hoeveelheden urine tegelijkertijd te kun-
nen opwerken werden pogingen in het werk gesteld om een
nieuwe methodiek uit te werken. Men vond, dat een aanzien-
lijk deel van de actieve stof aan verschillende koolsoorten te
adsorbeeren was en hieruit door 60 %-ige aceton, waaraan
5 % geconcentreerde ammoniak was toegevoegd, weer geë-
lueerd kon worden.

Dit procédé i) werd voor het eerst toegepast op urine uit
khnieken, omdat deze dagelijks in groote quantiteit ter be-
schikking stond. Het bleek, dat het gewone schema voor
de concentreering van auxine hier niet zonder meer toe te
passen was. Daarom werd voor de bereiding van het loodzout
een extractie met xylol en met cyclohexaan ingeschakeld. De

nu volgende lactoniseering verliep echter zeer onbevredigend:
een groot gedeelte van de actieve stof werd gedurende het
lactoniseeren vernietigd. Men trachtte daarom door de be-
reiding van andere metaalzouten een verdere concentreering
door te voeren en inderdaad konden na bereiding van een
bariumzout actieve kristallen worden afgezonderd. Deze ver-
toonden een zwakke optische activiteit, smolten bij 164° C. en
bevatten tot groote verrassing stikstof. Hun bruto samenstelling
was C10H9O2N, hun werkzaamheid bedroeg ± 20 milliard AE
per gram.

Nu was bekend, dat tryptophaan-praeparaten uit de handel
een zwakke activiteit bezitten. In het vermoeden, dat men hier
te doen had met een molecuulverbinding tusschen auxine
eenerzijds en tryptophaan of een dergelijke stof anderzijds,
werden verschillende kleurreacties op indolderivaten uitge-
voerd, waarbij de voor |8-indolyl-azijnzuur beschreven reactie
met ferrichloride-zoutzuur 1) intens positief uitviel.

Door een gefractioneerde adsorbtie aan calciumcarbonaat
volgens Tswett kon uit het geïsoleerde product een on-
werkzame optisch actieve verontreiniging worden afgezonderd.
Het aldus gezuiverde materiaal bleek met ^-indolyl-azijnzuur
volkomen identiek te zijn. Het bezat — evenals het synthe-
tische product — een activiteit van ongeveer 25 milliard AE
per gram. Deze nieuwe groeistof kreeg de naam /letero-auxine,
om aan te geven, dat het hier om een chemisch geheel anJer
auxine gaat.

Het voorkomen van hetero-auxine in urine is gemakkelijk
te verklaren, indien men bedenkt, dat tryptophaan door rot-
tingsbacteriën tot ^-indolyl-azijnzuur wordt afgebroken.
C. Herteri) heeft zelfs reeds eenmaal ;8-indolyl-azijnzuur
uit urine geïsoleerd bij een geval van abnormale darmflora.
In normale urine heeft men slechts in 10 % van de gevallen
^-indolyl-azijnzuur door kleurreacties kunnen aantoonen. 2)

Om gevallen met een abnormaal hooge auxine-uitscheiding
te verklaren, moesten F. K ö g 1, A. J. H a a g e n S m i t en
H. ErxlebenS) aannemen, dat auxine-a en auxine-b uit
onbekende „Vorstufenquot; ontstaan. Dit schijnen nu de trypto-
phaanhoudende eiwitten te zijn, welke bij afbraak weliswaar
geen auxine-a, maar hetero-auxine leveren. Daarmede wordt
ook begrijpelijk, waarom de bereiding van auxine-a het best
gelukt, wanneer de urine van gezonde, met stevige kost ge-
voede individuen gebruikt wordt.

2)nbsp;H. Rosin, Virschows Arch. path. Anat. u. Physiol. 123, 519
(1891); Dtsch. med. Wschr. 19, 519 (1893).

Terwijl onder normale omstandigheden bij de ontlasting van
de darm ook een groot deel van de darmflora regelmatig ver-
wijderd wordt, kan in hongertoestand of bij zieken met een
vertraagde ontlasting, het rottingsproces vollediger verloopen.
Zoo is het te verklaren, dat de urine uit klinieken een minder
geschikt uitgangsmateriaal is dan de urine van normale indi-
viduen.

Uit het achterwege blijven van een auxine-top nu het
nuttigen van kippeneiwit is te concludeeren, dat de afbraak
van proteïnen niet spontaan de vorming van ;8-indolyl-azijn-
zuur ten gevolge heeft. Aan de andere kant werd nooit een
auxine-vrije urine aangetroffen en blijft ook op een honger-
dag een auxine-niveau bestaan, dat slechts zeer langzaam
daalt. Men moet daaruit besluiten, dat dit auxine-niveau door
de geleidelijke vorming van /8-indolyl-azijnzuur uit trypto-
phaan op peil gehouden wordt. In vitro is bij de inwerking
van rottingsbacteriën op tryptophaan eerst na 24 uur /8-indolyl-
azijnzuur aan te toonen.

Op grond van het resultaat van de kleurreactie met ferri-
chloride-zoutzuur mag men aannemen, dat de in normale urine
voorkomende actieve stoffen voornamelijk uit auxine-a en
slechts voor 20 % uit /8-indolyl-azijnzuur bestaan. Zooals ge-
zegd, is deze verhouding in urine uit klinieken ten gunste van
/8-indolyl-azijnzuur verschoven en in een geval met abnormaal
hooge auxine-uitscheiding heeft men kunnen aantoonen, dat de
actieve stof voor meer dan 75 % uit hetero-auxine bestond.

In het eerste hoofdstuk is er op gewezen, dat urine voor de
isoleering van het auxine het meest gunstige uitgangsmateriaal
was. Dit nam evenwel niet weg, dat daarna ook getracht
moest worden de auxinen uit plantaardig materiaal te be-
reiden. Door dieetproeven werd men gewezen op het hooge
auxinegehalte van maïsolie en mout, waaruit dan naast
auxine-a het nauw verwante auxine-b is geïsoleerd. Terwijl in
het beginstadium van het groeistofonderzoek de grastoppen de
eenige auxinebron vormden, vond N. Nie Isen i), dat een
bij de avenacoleoptilen werkzame stof door de schimmels
Rhizopus suinus Nielsen en Absidia ramosa aan hun voedings-
bodems afgestaan wordt. F. Kögl en A. J. Haagen
S m i t 2) vonden ook in andere Rhizopus-soonten, in cultures
van Bac. coli en vooral ook in gist — althans in AE gemeten
— betrekkelijk groote hoeveelheden auxine. Gelijktijdig heeft
ook N. N i e 1 s e n 3) op het auxine-gehalte van gist gewezen
en P. Boysen-Jensen4) beschreef de vorming van

ä) N. Nielsen, Biochem. Z. 237, 244 (1931).
lt;) P. Boysen-Jensen, Biochem. Z. 236, 205, 239, 243 (1931) en
250, 270 (1932).

„Wachstumsregulatorenquot; bij Aspergillus niger en talrijke
bacteriën. Nadat door de isoleering van auxine uit urine de
activiteit van de kristallijne stof bekend was geworden, kon het
gehalte aan auxine in de cultures van deze schimmels en bacte-
riën berekend worden, wanneer daarin tenminste door deze
organismen eveneens auxine-a wordt afgescheiden. Zoo ble-
ken 25000 1 cultuurvloeistof van Bac. coli, 4000 1 voedings-
bodem van Rhizopus nigricans of 5000 1 voedingsbodem van
Aspergillus niger elk ongeveer 1 g auxine te bevatten.

Gunstiger waren de verhoudingen bij gist; deze had
bovendien het voordeel, dat zij niet in het laboratorium
zelf gekweekt behoefde te worden. Toch moesten wij er reke-
ning mede houden, dat ook hier een twee millioen-voudige
concentreering noodig was, vóór wij de actieve stof kristallijn
in handen zouden hebben.

Wij onderzochten achtereenvolgens het waschwater, het
autolysesap, het kooksap en het plasmolysesap van twee
soorten bakkersgist — Koningsgist en Hollandiagist — op
hun werkzaamheid. Onderstaande tabel geeft een overzicht
van de gevonden activiteiten.

Bij een eerste poging bereidden wij het kooksap uit 150 kg
Koningsgist door deze hoeveelheid met ruim 150 1 water
meerdere uren te koken. Gedurende het indampen trad een
verlies aan actief materiaal op van ruim 80 % (een directe
extractie met aether zou zeer groote hoeveelheden aether ver-
eischt hebben). Gelukkig bleek, dat in het plasmolysesap even-
veel auxine aanwezig was als in het kooksap, terwijl boven-

Het plasmolysesap werd verkregen door aan gist ongeveer
een tiende van haar gewicht aan ammoniumchloride toe te
voegen en dit mengsel een nacht te laten staan. Het tamelijk
dikvloeibare plasmolysaat werd met geconcentreerd zoutzuur
aangezuurd en in scheitrechters meermalen met peroxyd-vrije
aether uitgeschud, waarbij sterke emulgeering optrad. De
aether bleek ongeveer twee derden van het in de gist aan-
wezige auxine te hebben opgenomen en wel had de door af-
dampen van de aether verkregen strooperige rest een activiteit
van ± 60 000 000 AE/g.

Voor de verdere opwerking pasten wij natuurlijk het op
urine beproefde schema toe. De aether werd met een bicar-
bonaatoplossing gefractioneerd, waarbij de actieve stof, zooals
te verwachten was, in de zuurfractie teruggevonden werd. Het
residu van de zuurfractie werd uitgekookt met petroleum-
aether en het in petroleumaether onoplosbare deel, dat nog alle
actieve stof bevatte, werd opgenomen in verdunde alcohol. De
zoo verkregen oplossing schudden wij herhaalde malen met
benzol uit. Dit benzolextract bevatte ongeveer 70 % van de
oorspronkelijk aanwezige actieve stof. Het werd op zijn beurt
uitgeschud met water en met verdunde methanol. Deze
laatste extracten voegden wij samen en extraheerden ze met
aether. Tot dusverre toe werd dus voor de concentreering
gebruik gemaakt van kleine oplosbaarheidsverschillen.

Uit het residu van de aetheroplossing bereidden wij een
lood- en een calciumzout; de door middel van de test ge-
vonden meest werkzame fractie, hetzij neerslag, hetzij filtraat,
werd na de gebruikelijke opwerking door koken met abs.
methanol-chloorwaterstof gelactoniseerd resp. veresterd. Ter-
wijl deze behandeling bij de opwerking van urine geen noe-
menswaardig verlies met zich mede bracht, hadden wij hier
altijd een deficit van ruim 60 % aan actieve stof, zoodat de uit
50 kg gist verkregen stroop nog slechts 1,5 mg auxine bevatte.

Daar deze hoeveelheid voor de fractioneering in hoogvacuum
te gering was, hebben wij nog 100 kg gist in 2 porties op
dezelfde wijze verwerkt om voor de hoogvacuumdestillatie
voldoende materiaal te hebben.

De bij deze destillatie verkregen meest actieve fractie was
een olie, die, ook na een tweede destillatie, door herhaaldelijk
afkoelen met een aether-koolzuurmengsel niet tot kristallisatie
te brengen was. De activiteit van deze olie bedroeg 5—6 mil-
liard AE per gram. Een herhaling van de opwerking met
100 kg gist had eveneens een negatief resultaat.

Onder deze omstandigheden bestond er weinig hoop langs
dezelfde weg tot isoleering van een gekristalleerd auxine uit
gist te komen. Er waren nu immers reeds 400 kg gist opge-
werkt zonder eenig resultaat. De verdere bewerking van het
probleem werd daarom uitgesteld.

Door de ontdekking van hetero-auxine, welke intusschen
plaats gevonden had, kwam ook het probleem van de isoleering
van het auxine uit gist in een nieuw stadium. Zooals in het
vorige hoofdstuk is uiteengezet, moet men aannemen, dat het
optreden van /8-indolyl-azijnzuur in urine te danken is aan de
inwerking van darmbacteriën op tryptophaanhoudende eiwit-
ten. In ieder geval is het een feit, dat rottingsbacteriën trypto-
phaan kunnen omzetten in /8-indolyl-azijnzuur, dus in een
auxine. Het lag daarom voor de hand om aan te nemen, dat het
vermogen deze omzetting tot stand te brengen niet tot deze
micro-organismen beperkt is. Onafhankelijk van deze argumen-
tatie pleitte een —- tevoren onverklaarbaar — experimenteel
gevonden feit ervoor, dat het auxine uit gist met /3-indolyl-
azijnzuur identiek kon zijn. De tot hetero-auxine leidende op-
werkingen van urine, evenals die van gist, toonden nl. bij de
behandeling met methanol-chloorwaterstof een verregaande
vernietiging van de actieve stof. De waarschijnlijkheid, dat het
gezochte auxine uit de gist met hetero-auxine identiek was,
werd daarmede steeds grooter.

Er werd nu 50 kg gist opgewerkt, waarbij wij gebruik
maakten van de ervaringen, opgedaan bij de isoleering van het
hetero-auxine uit urine. Wij werkten deze hoeveelheid op tot
aan het loodzout, maar schakelden vóór de bereiding hiervan
een extractie met warme xylol in. Wij verkregen zoo een olie,
waaruit na een dag staan in de koelkast actieve kristallen uit-
kristalliseerden, welke bij het koken met ferrichloride-zoutzuur
de voor jS-indolyl-azijnzuur beschreven kleurreactie gaven.
Deze kristallen waren echter nog zeer onzuiver: zij bezaten
slechts een werkzaamheid van ongeveer 2 milliard AE per g.
Zij werden driemaal uit chloroform omgekristalliseerd, dan
tweemaal met petroleumaether uitgekookt en het onoplosbare
gedeelte daarna nog tweemaal uit water omgekristaHiseerd. De
opbrengst bedroeg toen 9 mg, de werkzaamheid ongeveer
19 milliard AE per gram en ook dit product gaf een sterk
positieve kleurreactie. Helaas ging een deel van deze kostbare
stof verloren; de rest werd nog twee keer uit water omgekris-
talliseerd en had toen een smeltpunt van 164—165° C. Het
mengsmeltpunt met synthetisch ;8-indolyl-azijnzuur gaf geen
depressie en ook de physiologische activiteit kwam met die van
het synthetische product overeen. Daar de identiteit van de
beide verbindingen vaststond, kon van een herhaling van de
isoleering afgezien worden, temeer daar in het volgende sub-
kapittel onafhankelijke argumenten worden aangevoerd voor
deze identiteit van het auxine uit gist met hetero-auxine.

De volgende tabel geeft een overzicht van de bewerkingen,
die noodig waren om tot gekristalliseerd hetero-auxine te
komen:

Het blijft nu nog de vraag, of de activiteit van de ruwe
gistextracten uitsluitend te wijten is aan hetero-auxine, dan
wel of naast |8-indolyl-azijnzuur ook nog auxine-a en auxine-b
een rol spelen. Uit het feit, dat de activiteit van de moederloog

rest

neutrale fractie
petr.-aetherextract
ligroïne-extract

in benzol
onoplosbare deel

van de actieve kristallen nog slechts 25 % van de oorspron-
kelijke werkzaamheid bedroeg en dat gedurende de geheele
opwerking een paralleliteit bestond tusschen de werkzaamheid
en de intensiteit van de kleurreactie met ferrichloride-zoutzuur,
moet geconcludeerd worden, dat de activiteit van gistextract
uitsluitend of ten minste voor het allergrootste deel, aan de
aanwezigheid van hetero-auxine toe te schrijven is.

2. De idcntificecring van de auxincn uit Aspergillus niger
en Rhizopus nigricans.

Zooals reeds is beschreven, zijn de omstandigheden voor de
isoleering van het auxine bij gist veel gunstiger dan bij andere
lagere organismen, zooals Aspergillus- en Rhizopus-soorten.
Het was daarom zeer gewenscht de isoleering van de betref-
fende auxinen langs een weg te doen plaats vinden, welke
minder tijd en werk vereischte. Te dien einde moest men trach-
ten karakteristieke verschillen tusschen de drie auxinen te
vinden. Daar op physiologisch gebied geen principieel verschil
bekend was, moest dit identificeeren geschieden door gebruik
te maken van het onderscheid in chemisch opzicht. Gelukkiger-
wijze zijn de omstandigheden daarbij buitengewoon gunstig.

1. Hetero-auxine is — als indolderivaat — niet bestand
tegen koken met zuren, wel tegen verhitten met loog; auxine-a
gedraagt zich precies omgekeerd: het verliest zijn activiteit bij
verhitten met loog. is daarentegen ongevoelig voor 3 uur
koken met 5 %-ig zoutzuur; auxine-b verliest zijn activiteit
zoowel door koken met verdund zuur als door koken met loog,
wat bij een /S-ketozuur wel begrijpelijk is.

Door gebruik te maken van de biologische testmethode is
het verschillend gedrag van de drie auxinen nog met zeer
kleine hoeveelheden vast te stellen. Wanneer grootere hoeveel-
heden ter beschikking staan, kan natuurlijk ook nog de kleur-

2. De moleculairgewichten van auxine-a en auxine-b zijn
328 resp. 310, terwijl dat van hetero-auxine slechts 175
bedraagt. Dit verschil is zoo groot, dat met de biologische
moleculairgewichtsbepaling van F. W. Went uit te maken
is, met welk auxine men te doen heeft.

F. W. Went 2) ging de diffusiesnelheid van de groeistof
in op elkaar gestapelde agarblokjes met behulp van de plan-
tentest na. Hij slaagde erin de diffusie-coëfficiënt D te bepalen
door gebruik te maken van de door H. R. B r u i n s 3) aange-
geven formule D =

In deze formule stellen voor:
h = de hoogte der blokjes in cm,
t = de duur der diffusie in dagen,

X = een van de experimenteel bepaalde krommingshoeken
afhankelijke grootheid, die met behulp van de door H. R.
Bruins aangegeven formules en tabellen berekend kan
worden.

Deze methode gaf in groote verdunningen van sterk ver-
ontreinigde praeparaten verrassend goede resultaten: F. W.
Went stelde zoo voor auxine-a vast het moleculairgewicht
376.

Inmiddels is een nieuwe, en waarschijnlijk gevoeliger, kleurreactie op
|8-indolyl.azijnzuur beschreven door S. Winkler en S. Petersen,
H. S. 231, 210 (1935).

') H. R. Bruins, dissertatie Utrecht, 1922; verg. ook J. Stefan,
Sitzgsber. Kgl. Akad. Wien 79, 161 (1897) en W. Kawalki, Wied.
Ann. 42, 185 (1894).

Dat deze proeven voor identificeeringsdoeleinden inderdaad
te gebruiken zijn, werd aangetoond door het gevonden mole-
culairgewicht van het auxine uit gist (experimenteel 193 tegen-
over de theoretische waarde 175).

Alle hier aangegeven moculairgewichten zijn op deze wijze
bepaald door A. J. H a a g e n Smit, waarvoor wij hem ook
op deze plaats onze hartelijke dank betuigen.

Het moleculairgewicht van de auxinen van Aspergillus niger
en van Rhizopus nigricans werd bepaald, nadat wij de ruwe
actieve stroopen hadden gezuiverd door ze te fractioneeren
met bicarbonaatoplossing en de zuurfractie met petroleum-
aether uit te koken. De gevonden moleculairgewichten waren:
voor Aspergillus niger 169 en voor Rhizopus nigricans 176 en
190, overeenkomstig de waarde voor hetero-auxine.

Hiermede stemt het resultaat van de bestendigheidsproeven
volkomen overeen. Het auxine uit Aspergillus niger bleek niet
bestand te zijn tegen koken met zuur, wel tegen koken met
loog, wat eveneens het geval is met het auxine uit Rhizopus
nigricans. Wij moeten dus concludeeren dat de auxinen uit
deze schimmels met ^S-indolyl-azijnzuur identiek zijn. i)

Gelijktijdig met deze proeven werd door F. K ö g 1, A. J.
Haagen Smit en H. Erxleben^) met gelijke me-
thoden aangetoond, dat in de toppen van grassen, het klas-
sieke studieobject van het botanisch groeistofonderzoek, naar
alle waarschijnlijkheid auxine-a gevormd wordt.

') Na het afsluiten van deze dissertatie verscheen een mededeeling van
K. V. Thimann, J. of Biol. Chem. 109, 279 (1935), waarin hij de door
bovenstaande gegevens reeds vastgestelde identiteit van rhizopine met
y5-indolyl-azijnzuur door isoleering van actieve kristallen bevestigde. De
toegepaste werkwijze ter zuivering correspondeert in principe met de door
ons uitgewerkte methodiek.

P. Boyscn-Jenseni) heeft het resultaat van zijn on-
derzoekingen over het auxine uit Aspergillus aldus samen-
gevat, „dass der von Aspergillus gebildete Wachstumsregu-
lator, der eine so auffällige Wirkung auf das Wachstum der
Avena-Koleoptile hat, für Aspergillus selbst kein notwendiger
Wachstumsfaktor ist; es ist, soweit man beurteilen kann, ein
zufälliges Stoffwechselprodukt, das bisweilen gar nicht, unter
geeigneten Kulturbedingungen aber in relativ grossen Mengen
gebildet wird.quot;

Eenige jaren geleden hebben wij de proeven van B o y s e n -
Jensen herhaald en — afgezien van een kleine, niet essen-
tieele afwijking — volkomen kunnen bevestigen. Toentertijd
scheen het ook ons merkwaardig, dat Aspergillus onder be-
paalde omstandigheden een gecompliceerd hormoonmolecuul
opbouwt, zonder dat dit voor zijn groei principieel noodzakelijk
is. Deze omstandigheden verschijnen nu evenwel in een ander
hcht, daar het hier niet gaat om de synthese van auxine-a of -b,
maar om de vorming van /8-indolyl-azijnzuur, dat bij niet-
assimileerende organismen door afbraak van tryptophaan kan
ontstaan.

In het beginstadium van het chemische „groeistofquot;-onder-
zoek was N. Nielsens rhizopine, een 7000-voudig gecon-
centreerd product uit Rhizopus suinus, het eerste gemakkelijker
toegankelijke praeparaat voor verdere studies. Ook in de

laatste tijd gebruikt men voor „groeistofquot;proeven in verschil-
lende botanische laboratoria nog rhizopinepraeparaten, daar
hiermede de botanici schijnbaar minder aan het gevaar bloot
staan, dat zij met een aan de grascoleoptile vreemd auxine
experimenteeren. Zooals uit het bovenstaande evenwel blijkt, is
het in werkelijkheid zoo, dat juist de lagere plantaardige orga-
nismen een ander auxine vormen dan de grassen zelf.

Het is een gelukkig toeval, dat uit urine, welke immers de
beide auxinen bevat, eerst het „echtequot; auxine geïsoleerd is.
Wanneer de eerste isoleeringspogingen tot ;8-indolyl-azijnzuur
geleid hadden, zou men zich waarschijnlijk niet de moeite
hebben gegeven ook nog de in de moederloogen voorkomende
actieve stof af te zonderen. Met het gegeven, dat ook gist en
andere lagere plantaardige organismen een met jff-indolyl-
azijnzuur identiek auxine vormen, zou men zich waarschijn-
lijk hebben tevredengesteld en eventueele afwijkingen in het
gedrag van het auxine uit grassen zouden op begeleidende
stoffen zijn teruggevoerd; de auxinen -a en -b zouden dan nog
lange tijd verborgen gebleven zijn.

Het j8-indolyl-azijnzuur — of indol-3-azijnzuur — was in
de literatuur reeds bekend. Wij hebben het gesynthetiseerd
volgens de methode van R. Majima en M. Kotake^)
door op indolmagnesiumjodide chlooracetonitril te laten in-
werken en het condensatieproduct te verzeepen.
. In physiologisch opzicht is het hoogst merkwaardig, dat
constitutioneel zoo verschillende stoffen als auxine-a en -b
eenerzijds en hetero-auxine anderzijds, qualitatief zoowel als
quantitatief dezelfde werking uitoefenen. Weliswaar bedraagt
de gemiddelde werkzaamheid van hetero-auxine (25 milliard
AE/g) slechts de helft van auxine-a resp.-b (50 milliard
AE/g), maar het lijkt niet onjuist bij het vergelijken van deze
activiteiten met de moleculairgewichten rekening te houden
en de ..moleculaire activiteitenquot; kan men practisch aan elkaar
gelijk stellen.

en medewerkers alle reden de test van F. W. W e n t op te
vatten als streng specifiek, daar de werkzaamheid van de
auxinen -a en -b reeds door kleine veranderingen in het mole-
cuul volkomen verloren ging. Wel toont het bestaan van
auxine-a naast auxine-b aan, dat in de zuurstofhoudende
Cs-rest tenminste op de a- en ;8-plaats 2 groepeeringen moge-
lijk zijn, die voor het physiologisch effect van het molecuul
dezelfde beteekenis hebben, doch daarentegen bewijst de inac-
tiviteit van de auxine-a-methylester en die van dihydro-auxine-
a, dat de carboxylgroep en de dubbele binding voor de physio-
logische activiteit noodzakelijk zijn. Uit de werkzaamheid van
het auxine-a-lacton is geen verdere conclusie te trekken, daar
het evenwicht in oplossing naar de zijde van het vrije zuur
verschoven is. Ook de onwerkzaamheid van het auxine-b-
acetaal is in dit verband van interesse. Ten slotte moet nog op
de binnen enkele maanden optredende inactiveering van
auxine-a en auxine-b gewezen worden. Ofschoon dit verschijn-
sel tot nu toe wegens gebrek aan materiaal nog niet nauw-
keurig bestudeerd kon worden, staat toch al vast, dat men
hier met een isomerisatie te doen heeft, waarbij de carboxyl-
groep en de dubbele binding behouden blijven. Dit is wel het
merkwaardigste voorbeeld van de samenhang tusschen de
constitutie en de werkzaamheid van de auxinen -a en -b.

Het was nu van veel belang om te onderzoeken in hoeverre
de activiteit van hetero-auxine specifiek aan haar constitutie
gebonden is. Terwijl het bij de auxinen -a en -b nog geruime
tijd duren zal, voordat men synthetische varianten van deze
moleculen ter beschikking heeft, is dit bij hetero-auxine nu
reeds mogelijk, daar de groep van stoffen, waarmede men hier
te doen heeft, synthetisch gemakkelijk toegankelijk is.

Bij het vergelijken van de werkzaamheid van de verschil-
lende derivaten doen zich de bij de test van F. W. Went
steeds optredende schommelingen in de gevoeligheid van de
planten op verschillende dagen resp. uren op minder prettige

wijze gelden i). Om ons althans eenigermate daarvan onaf-
hankelijk te maken, hebben wij — zooals dat op ons labora-
torium gebruikelijk is — alle activiteiten gestandaardiseerd,
d.w.z. betrokken op een werkzaamheid van auxine-a van 50
milliard AE per gram. Bleek de werkzaamheid van auxine-a
op een dag, dat de metingen werden verricht slechts 25 mil-
liard AE per gram te bedragen, dan werd de gevonden activi-
teit van de onderzochte stof met twee vermenigvuldigd.

Bij synthetisch ^S-indolyl-azijnzuur vonden wij in de practijk
activiteiten tuschen 8 milliard en 50 mihard AE per gram. De
werkzaamheid van dit synthetische product werd over een
periode van enkele maanden bepaald en op de genoemde wijze
op auxine-a betrokken. De gemiddelde activiteit bedroeg 25
milliard AE per gram.

') Zooals uit het onderzoek van F. Kögl, A. J. Haagen Smit
en H. Erxleben, H.S. 220, 138 (1933), bekend is, schommelt de acti-
viteit van standaardoplossingen tusschen 10^® en AE per gram, onaf-
hankelijk van de zuiverheidsgraad van de auxine-oplossingen.

Zooals boven vermeld is, verliest auxine-a door verestering
met diazomethaan zijn werkzaamheid. De jS-indolyl-azijnzure
methylester, die eveneens door inwerking van diazomethaan
op het vrije zuur verkregen werd, bezit daarentegen een acti-
viteit van 10 milliard AE per gram. Daar deze ester niet
kristalliseert, werd nagegaan of de werkzaamheid aan een ver-
ontreiniging door het vrije zuur te wijten was. De over het
pikraat gezuiverde ester bezat evenwel dezelfde activiteit.

Wij hebben ;8-indolyl-azijnzuur ook met methanol-chloor-
waterstof veresterd, zooals dat bij de isoleering van het auxine
uit gist bij de „lactoniseeringquot; gebruikelijk was. Uit het
reactie-mengsel konden wij door middel van het pikraat de
methylester isoleeren, echter in zeer slechte opbrengst. Klaar-
blijkelijk wordt /8-indolyl-azijnzuur — evenals andere indol-
derivaten — in het zure milieu voor een groot gedeelte nog
anderszins aangetast. Dit feit en de t.o.v. het vrije zuur met
voor omstreeks 60 % verminderde werkzaamheid maken het
begrijpelijk, dat bij de eerste pogingen om het auxine uit gist
te isoleeren juist de „lactoniseeringquot; een groot verlies aan
activiteit met zich mede bracht.

De activiteit van de methylester van y8-indolyl-azijnzuur
was tegenover de onwerkzaamheid van auxine-a-methylester
des te verrassender, daar het carboxyl de eenige groep is,
welke beide moleculen gemeen hebben. De vraag was nu: is de
ester als zoodanig werkzaam of is de werkzaamheid toe te
schrijven aan een gedeeltelijke verzeeping gedurende de inwer-
king op de plant? In het laatste geval zou dan de verzeeping
van hetero-auxine-methylester veel sneller moeten plaats vin-
den dan die van de auxine-a-methylester i).

Het was daarom van belang ook nog homologe esters,
waarbij wij een kleinere verzeepingssnelheid konden verwach-
ten, te onderzoeken. De door middel van diazoaethaan ver-
kregen j8-indolyl-azijnzure aethylester, welke eveneens over
het pikraat werd gezuiverd, bezat een activiteit van 3 milliard
AE per gram. Nog interessanter was het onderzoek van de
n-propylester en de iso-propylester, daar bij deze goed met
elkaar te vergelijken stoffen zeker een verschil in verzeepings-
snelheid te verwachten was. De n-propylester welke met be-
hulp van n-diazopropaan verkregen was, bezat een activiteit
van 1 milliard AE per gram. De iso-propylester, verkregen
door omzetting van het zilverzout van ;8-indolyl-azijnzuur met
iso-propyljodide, was 10 maal minder actief.

Helaas geeft de literatuur over de verzeepingssnelheden van
verschillende esters door phytolipasen slechts weinig uit-
sluitsel 2). Toch lijkt het ons waarschijnlijk, gezien de dalende
activiteit van de beschreven homologe esters, dat hun werk-
zaamheid aan een gedeeltelijke verzeeping toe te schrijven is 3).

Natuurlijk hebben wij ons ervan overtuigd, dat de verzeeping van
|8-indolyl-azijnzure methylester niet reeds plaats heeft in de verdunnings-
vloeistof met welke wij de te onderzoeken oplossing ongeveer 12 uren
voor de eigenlijke test bereidden.

vgl. in dit verband de polariteitstheorie van F, W, Went, Jhrb. f,
wiss. Bot. 76, 528 (1932).

Het blijft dan evenwel een raadsel, waarom de auxine-a-
methylester niet eveneens een dergelijke partieele verzeeping
ondergaat.

In verband met deze in beide auxinen aanwezige carboxyl-
groep hebben wij getracht iets over de dissociatiecon-
stanten van auxine-a en hetero-auxine te weten te komen.
De gebruikelijke methode, het meten van het geleidings-
vermogen, was in ons geval om verschillende redenen niet
uitvoerbaar. Ten eerste waren de oplosbaarheden te gering,
ten tweede stonden ons van auxine-a slechts enkele milli-
grammen ter beschikking en eindelijk bleek de oplossing van
hetero-auxine gedurende de proef chemische veranderingen te
ondergaan. Wij moesten ons daarom er mede tevreden stellen
vergelijkende Pj^-metingen in 0,001-molair oplossingen uit te
voeren. Hierbij vonden wij voor auxine-a: K = 1 Xnbsp;en

voor hetero-auxine: K == 2 X 10quot;^ Uit de aard der zaak
kunnen deze getallen niet nauwkeurig zijn, maar het blijkt
toch, dat wij te doen hebben met dissociatieconstanten van
dezelfde orde van grootte.

K. Thimann en H. Dolk, Proc. Nat. Acad. Sciences 18, 30
(1932), vonden voor ruw „rhizopinequot; een K = 1,8 X 10quot;^ Ofschoon de
toegepaste methodiek aan bedenkingen onderhevig is, komt deze waarde
met ons eigen resultaat overeen.

Een tweede vraag, die zich nu voordeed, was: gaat bij hetero-
auxine evenals bij auxine-a de werkzaamheid door hydreeren
verloren? Natuurlijk was het vooral van belang te weten te
komen of het 2,3-dihydro-indol-3-azijnzuur al dan niet actief
was. Door directe hydreering kon deze stof niet verkregen
worden, omdat hierbij meer dan de berekende hoeveelheid
waterstof werd opgenomen. Daarentegen kon — met de me-
thode, welke door R. R o b i n s o n i) bij de hydreering van
/8-indolyl-boterzuur toegepast werd — uit de methylester van
/8-indolyl-azijnzuur de 2,3-dihydro-indol-azijnzure methylester
verkregen worden. Het pikraat hiervan werd viermaal uit
alcohol omgekristalliseerd, maar de uit dit pikraat teruggewon-
nen ester bezat nog een activiteit, en wel van 34 millioen AE
per gram. Het lag voor de hand bij deze geringe activiteit aan
de aanwezigheid van sporen |8-indolyl-azijnzure methylester te
denken. Voor de verdere zuivering werd daarom gebruik ge-
maakt van de grootere basiciteit van de dihydro-ester door de
oplossing van het zwak actieve product in aether met zwavel-
zuur te fractioneeren. Na een verdere zuivering over het
pikraat was de verkregen ester volkomen inactief.

Het uit deze ester door verzeeping met baryt bereide 2,3-
dihydro-indol-3-azijnzuur (XXI) was eveneens biologisch on-
werkzaam.

Onze volgende taak was nu na te gaan in hoeverre de
activiteit verandert door invoering van methyl- of aethyl-
groepen in de benzol- of pyrrolkern. Als eerste verbinding
kwam daarvoor in aanmerking het l-methylindol-3-azijnzuur
(XXII).

Wij hebben dit zuur bereid volgens een voorschrift van A.
P i c c i n i n i 1) door 1-methylindol te condenseeren met diazo-
azijnester en het condensatieproduct te verzeepen. Tot onze
verrassing bezat dit zuur nog een — zij het zwakke — acti-
viteit. Hoewel de gevolgde bereidingsmethode een verontrei-
niging door jS-indolyl-azijnzuur eigenlijk buiten sloot, hebben
wij ons hiervan toch trachten te overtuigen, door het zuur
nog langs een andere weg te bereiden. Daartoe maakten wij
gebruik van de door E. Fischer gegeven algemeene synthese
vaq indqlderivaten, welke hier aan het voorbeeld van 1-
methyl-indol-3-azijnzuur weergegeven zij.

Door aldus uit te gaan van as. methyl-phenylhydrazine en
de ester van aldehydo-propionzuur verkregen wij het ver-
langde zuur, dat eveneens actief was. Ook een praeparaat,
dat prof. R. Robinson zoo vriendelijk was ons toe te
zenden, bezat eenzelfde werkzaamheid. Het schijnt dus, dat
de invoering van een methylgroep aan het stikstofatoom de
werkzaamheid wel sterk drukt, maar niet volkomen vernietigt.

Er rest ons nog te vermelden, dat de l-methylindol-3-azijn-
zure aethylester, zooals die bij de bereiding van het zuur vol-
gens A. P i c c i n i n i als tusschenproduct verkregen werd.
volkomen inactief was. Eerst na de verzeeping ervan trad de
genoemde physiologische werking op. Dit verschijnsel, dat

analoog is aan de verminderde werkzaamheid van de methyl-
ester van /8-indolyl-azijnzuur, schijnt zeer algemeen te zijn.
Alle door ons gesynthetiseerde esters waren minder werk-
zaam dan de correspondeerende zuren.

CH2—COOH

Pl^nbsp;125 000 000 AE/g

Behalve het stikstofatoom schijnt ook de vrije 2-plaats (a-
plaats) een belangrijke rol te spelen. Wij hebben in navolging
van E. Fischeri) het 2-methylindol-3-azijnzuur (XXIII)
bereid door het phenylhydrazon van laevulinezuur met
ZnClg te smelten. Het zuur had een activiteit van 125 millioen
AE per gram; de methylester (XXIV) ervan, verkregen door

inwerking van diazomethaan op het vrije zuur, was inactief.
Vervangt men de methylgroep op de a-plaats door een aethyl-
groep (XXV), dan verdwijnt de activiteit volkomen. Dit
2-aethylindol-3-azijnzuur hebben wij bereid door het phenyl-
hydrazon van homo-laevulinezuur met zwavelzuur te behan-
delen.

Is het molecuul dus zeer gevoelig voor substituties in de
pyrrolkern, minder is dit het geval bij een substitueering in de
benzolkern.

(XXVI)nbsp;bereid door het p-tolylhydrazon van aldehydo-pro-
pionzure ester met zwavelzuur te behandelen, nog 1500 mil-
lioen AE per gram te bedragen. De methylester ervan

(XXVII),nbsp;die weer door inwerking van diazomethaan op het
vrije zuur werd verkregen, had een activiteit van 1200 mil-
lioen AE per gram en is dus, zoo al niet veel, toch weer minder
werkzaam dan het vrije zuur.

Het was nu te verwachten, dat de gelijktijdige invoering
van twee methylgroepen, één in de benzolkern, de andere in
de pyrrolkern, de activiteit volkomen zou opheffen. Een zuur,
dat aan deze eisch voldoet is het 2,5-dimethylindol-3-azijn-
zuur (XXVIII).

verkregen door inwerking van zwavelzuur op het p-tolylhy-
drazon van laevulinezuur. Inderdaad bleek deze verbinding
inactief te zijn.

Ten slotte hebben wij nog de invloed onderzocht, die de
zijketen uitoefent door in deze zijketen een methylgroep in te
voeren en door haar te verkorten of te verlengen met een
C-atoom.

Het a-(j8-indolyl)-propionzuur (XXIX), verkregen volgens
een voorschrift van A. Ellingeri) door inwerking van
zwavelzuur op het phenylhydrazon van aldehydo-isoboterzure
ester, bezit nog de tamelijk sterke activiteit van 5 milliard AE
per gram. De stof schijnt dus betrekkelijk ongevoelig te zijn
voor deze vervanging van een H-atoom uit de zijketen door
een methylgroep. Daarentegen is de lengte van de keten van
doorslaggevende invloed, want zoowel het ^-indolylcarbonzuur
(XXX) als het ;S-indolylpropionzuur (XXXI) zijn beide
onwerkzaam. Deze twee laatste zuren hebben wij bereid door
volgens R. Majima en M. Kotake2) chloormierenzure
ester resp. chloorpropionitril op indolmagnesiumjodide te laten
inwerken en het reactieproduct te verzeepen. Het ;8-indolyl-
propionzuur verkregen wij bovendien nog volgens A. El-
lingeri) door het phenylhydrazon van aldehydo-boter-
zure ester met zwavelzuur te behandelen.

gt;) R. Majima en M. Kotake, Ber. 55, 3870 (1922); 58. 2042
(1925); 63, 2240 (1930).

Ter vergelijking met het yS-indolyl-carbonzuur (XXX)
hebben wij ook nog het a-indolyl-carbonzuur (XXXII) be-
reid.

het phenylhydrazon van pyrodruivenzuur. Zooals te ver-
wachten was, is dit zuur onwerkzaam.

In het Eerste Hoofdstuk hebben wij vermelding gemaakt
van het feit, dat niet-assimileerende organismen uit trypto-
phaan-houdende eiwitten /S-indolyl-azijnzuur kunnen vormen.
Het lag dus voor de hand om ook enkele biologische afbraak-
producten van tryptophaan te synthetiseeren en op hun activi-
teit te onderzoeken. Hiervoor kwamen in aanmerking het l-ß-
indolyl-melkzuur (XXXIII) en het ^ß-indolyl-pyrodruiven-
zuur (XXXIV), die door een hydrolytische resp. oxydatieve
desamineering uit tryptophaan kunnen ontstaan.

/-/ff-indolyl-melkzuur

1) E. Fischer, A. 236, 142 (1885).

200 000 000 AE/g

Het Z-y8-indolyl-melkzuur bereidden wij volgens F. E h r-
lich en P. Jacobseni), door Oidium lactis een maand
lang te kweeken op een Z-tryptophaan-houdende voedings-
bodem. Het na enkele malen omkristalliseeren verkregen
zuivere Z-|8-indolyl-melkzuur was bij de test volkomen inactief,
evenals het rac.-;8-indolyl-melkzuur, dat uit de linksdraaiende
vorm verkregen werd door autoclaveeren met baryt volgens
een voorschrift van K. Ichihara en N. Iwakura2).
Daarentegen bezat het ;S-indolyl-pyrodruivenzuur een activi-
teit van 200 millioen AE per gram. Dit zuur werd verkregen
door opensplitsen van het az-lacton uit hippuurzuur en ^-in-
dolaldehyde volgens A. Ellinger en Z. Matsuoka^).
Een verontreiniging door |8-indolyl-azijnzuur mogen wij —
gezien de gevolgde bereidingsmethode — wel uitgesloten
achten. Bovendien bezaten drie door verschillende personen
bereide praeparaten van dit zuur dezelfde activiteit. Wij
mogen dus aannemen, dat de plant een oxydatief-decarboxy-
leerende werking uitoefent, waardoor uit ^-indolyl-pyrodrui-
venzuur ten deele hetero-auxine ontstaat. Deze werking is
echter slechts zeer zwak, want een minder ver geoxydeerd
product — |8-indolyl-melkzuur — wordt er niet door beïnvloed,
In dit verband is het interessant er op te wijzen, dat K. T h i-

1) F. Ehrlich en P. Jacobsen, Ber. 44, 888 (1911).
») K. Ichihara en N. Iwakura, H. S. 195, 202 (1931).
ä) A. Ellinger en Z. Matsuoka, H.S. 109, 259 (1920).

m a n n 1) een paralleliteit vond tusschen de hoeveelheid
hetero-auxine gevormd door Rhizopus suinus in tryptophaan-
houdende voedingsbodems en de mate van luchttoevoer aan
deze cultures.

Er moet hier uitdrukkelijk vastgesteld worden, dat de ge-
geven activiteiten — met uitzondering van die van j8-indolyl-
azijnzuur zelf — de gemiddelde waarden zijn uit slechts een
vijftal metingen. Het spreekt daarom wel vanzelf, dat bij
langer uitmeten de cijfers nog wel eenige verandering kunnen
ondergaan.

Als drempelwaarde hebben wij aangenomen een activiteit
van 10 milhoen AE per gram, d.w.z.: een stof wordt dan als
onwerkzaam beschouwd, wanneer zij in een concentratie van
1 mg in 20 cm^ water geen duidelijke kromming van de
coleoptile meer tengevolge heeft. Een activiteit van 10 milhoen
AE per gram zou overeenkomen met een verontreiniging aan
/S-indolyl-azijnzuur van ongeveer 0,03 %. Een dergelijke ver-
ontreiniging komt noch in het smeltpunt, noch in de analyse-
cijfers tot uiting en zal ook door omkristalliseeren moeilijk
te verwijderen zijn. Het spreekt aan de andere kant vanzelf,
dat wij door de gevolgde werkwijze gezorgd hebben een
„besmettingquot; met /S-indolyl-azijnzuur uit te sluiten.

1) K. Thimann, J. of Biol. Chem. 109, 279 (1935);
vgl. ook D. Woods, Biochem. J. 29, 640, 649 (1935).

Het is al hoogst eigenaardig, dat twee zoo verschillende
stoftypen als auxine-a (of -b) en hetero-auxine, welke in hun
bouw geenerlei overeenkomst bezitten, bij de celstrekking de-
zelfde werking uitoefenen. Nog merkwaardiger is het echter,
dat deze gelijksoortige werking niet hiertoe beperkt blijft, maar
zich ook uitstrekt over andere planten-physiologische ver-
schijnselen.

Zooals bekend is. regelt het auxine uit de toppen van
grassen niet alleen de gewone celstrekking, maar bemiddelt
het bovendien de photo- en geotropische krommingen, zooals
F. W. Wen tl) en H. Dolk 2) hebben aangetoond.
F. K ö g 1 en medewerkers ^) stelden vast, dat niet alleen ge-
kristalliseerd auxine-a deze functie van het auxine uit de
grastoppen kan overnemen, maar dat ook hetero-auxine in
staat is aan de gedecapiteerde coleoptile, die b.v. op zwaarte-
krachtprikkels niet meer reageert, deze verloren gevoehgheid
terug te geven.

De negatieve geotropie van de spruit komt tot stand, door-
dat de zwaartekracht de transportrichting van het auxine
beïnvloedt. De onderzijde van een horizontaal gelegde coleop-
tile ontvangt meer auxine, zoodat de spruit zich opricht.
N. Cholodny4) neemt aan. dat de positieve geotropie

1) F. W. Went. Ree. Trav. Bot. néerl. 25, 1 (1928).
') H. Dolk, dissertatie Utrecht, 1930.

*) N. Cholodny, Jahrb. f. wiss. Bot. 65, (1926); Planta 6, (1928);
(1928); Ber. dtsch. bot. Ges. 51, 85 (1933).

van de wortel op analoge wijze tot stand komt. Deze auteur
heeft nl. reeds eenige tijd geleden een remming van de wortel-
groei door het ruwe extract uit de grastoppen geconstateerd.
Als eenzelfde auxine de groei van de coleoptile versnelt en
de groei van de wortel remt, zou de geotropische prikkel even-
eens aan de onderzijde van een horizontale wortel een opeen-
hooping van auxine doen ontstaan. Daardoor zal de minder
geremde bovenzijde sterker gaan groeien, waarmede de posi-
tieve geotropie van de wortel verklaard is. In dit verband is het
van belang, dat F. K ö g 1 en medewerkers i) hebben gecon-
stateerd. dat een oplossing, die 0,1 y gekristalliseerd auxine-a
bevat, nog een duidelijke remming van de wortelgroei teweeg
brengt. Deze zelfde remmende werking wordt ook door hetero-
auxine, zij het in mindere mate, uitgeoefend. De concentratie,
die noodig is om een remming van de lengtegroei van de
wortel teweeg te brengen, bedraagt hier 10 y per liter.

Als pendant van de „wortel-remmendequot; werking der
auxinen vonden K. Thimann en F. S koog 2), dat ook
de ontwikkeling van de laterale knoppen van Vicia faba zoo-
wel door auxine-a als door hetero-auxine geremd wordt.

F. W. W e n t 3) bestudeerde wortelvormende stoffen en
vond, dat zij in hun chemisch gedrag een vrij groote over-
eenkomst met de auxinen vertoonen. Naderhand kon hij met
behulp van twee der in het laboratorium te Utrecht bereide
kristallijne auxinen — auxine-a en hetero-auxine — aan-
toonen, dat deze inderdaad wortelvorming teweeg brengen.
Terwijl F. W. Went bij deze proeven hoofdzakelijk met
Pisum experimenteerde vond F. L a i b a c h 4), dat ook in-

ternodiën van Tradescantia geschikt zijn om wortelvormende
stoffen aan te toonen. F. K ö g 1 en A. J. H a a g e n S m i t
onderzochten gekristalhseerd auxine-a en hetero-auxine met
behulp van deze door F. Laibach beschreven test en
vonden, dat beide in zeer kleine doses werkzaam zijn. Wij
hebben dus ook hier weer met een gelijksoortige werking van
de beide auxine-typen te doen.

F. Kögl heeft naar aanleiding van de ervaringen, die in
de laatste jaren op het gebied der geslachtshormonen zijn
opgedaan, het bekende beeld van Emil Fischer aldus
gevarieerd, dat bij deze hormonen „das .Schloss' nicht nur
durch den .klassischen Schlüssel', sondern auch durch weniger
gut funktionierende Nachschlüssel oder gar Dietriche geöffnet

hij op een lezing op dit beeld terug; hij concludeerde, dat men
hetero-auxine niet als „looperquot; mag beschouwen, daar dit het
„slotquot; te gemakkelijk opent, en beschrijft de situatie als volgt:

Schloss und denken nicht an die Tür und die Kammer, die wir
aufschliessen wollen. Eine Kammer kann aber auch einmal
eine zweite Tür — vielleicht sogar eine Hintertür — haben,
die durch einen eigenen Schlüssel geöffnet wird!quot;

Het zal de taak zijn van het toekomstig auxine-onderzoek
om na te gaan of dit beeld van de „Hintertürquot; in biologisch
opzicht een reëele beteekenis heeft.

150 kg Koningsgist (Delft) werden in 6 porties in zinken
teilen met een zelfde hoeveelheid water gekookt gedurende
6 tot 7 uren. Na afkoelen en bezinken werd de bovenstaande
heldere vloeistof zoo goed mogelijk afgeheveld. De resteerende
gistbrij was niet te filtreeren door filtreerpapier, zand of
linnen. Ook toevoegen van alcohol gaf geen betere afzetting
van het celmateriaal, zoodat wij de vaste bestanddeelen met
behulp van een Sharpless-centrifuge moesten afscheiden. De
op deze wijze verkregen heldere oplossing werd in een appa-
raat volgens Schmalfuss-Jansseni) in vacuo inge-
dampt tot op ongeveer 10 1. Het bleek, dat deze 10 1 nog
slechts 20 % van de oorspronkelijke aanwezige hoeveelheid
auxine bevatten. Deze opwerking werd daarom niet verder
voortgezet.

Het plasmolysesap werd opgewerkt volgens de methode,
die tot de isoleering van auxine-a uit urine had geleid. De
gist bevatte 17 000 000 AE/kg.

50 kg gist werden fijngebrokkeld en met ongeveer 5 kg
poedervormig secundair ammoniumphosphaat bestrooid. Na
een nacht staan bij kamertemperatuur werd aangezuurd met

ongeveer 20 cm^ geconc. HCl tot zure reactie op congopapier.
Bij het aanzuren trad een heftig bruisen op. Daarom zijn wij
naderhand overgegaan tot een plasmolyse met ammonium-
chloride, die bovendien het voordeel had, dat het verkregen
sap nog iets dunner was dan dat, verkregen met secundair
ammoniumphosphaat. Het dikvloeibare plasmolysaat liet zich
niet dan met groote activiteitsverliezen — door adsorptie van
het auxine aan de vaste bestanddeelen — centrifugeeren. Wij
hebben het daarom onmiddellijk geëxtraheerd met peroxyd-
vrije aether i).

De beste methode was, dat wij eerst de brij van 1 kg gist
met ongeveer 700 cm^ aether tot een emulsie schudden en
deze emulsie daarna drie malen met telkens 600 cm^ aether
extraheerden. Wij gebruikten dus 2,5 1 aether per kg gist of
125 1 per portie van 50 kg. Het verzamelde aetherextract
werd boven Na2S04 gedroogd en ingedampt. Het residu
woog ± 10 g en had een activiteit van 60 000 000 AE/g.
Ongeveer 70 % van de totaal aanwezige hoeveelheid auxine
was dus in het extract overgegaan, nl. 12 mg 2),

Het aether-residu werd weer in aether opgenomen, het vo-
lumen gebracht op ongeveer 5 1 en deze oplossing drie malen
uitgeschud met 5 %-ige bicarbonaatoplossing. Het bicarbo-
naatextract zuurden wij aan met ijsazijn en schudden het
daarna drie malen met aether uit. De aether werd gedroogd
boven Na2S04 en afgedampt. Het residu woog ± 4,6 g en

1) G. Garbarini, C. 1126 (1909); N. Milas, Am. Soc. 53, 221
(1931). Wij hebben steeds peroxydvrije aether gebruikt, ook daar, waar
eenvoudigheidshalve van aether sprake is.

') Wij rekenden indertijd met een activiteit van 50 milliard AE per
gram gekristalliseerd auxine. Om een beter denkbeeld te geven van het
probleem, zooals het zich toen aan ons voordeed, hebben wij deze cijfers
hier gehandhaafd. In werkelijkheid waren 24 mg auxine aanwezig.

had een activiteit van 120 000 000 AE/g. Er waren dus nog
11 mg auxine aanwezig.

Het aether-residu werd gedurende een half uur gekookt
met versch gedestilleerde petroleumaether (kpt. 40—60° C.).
Na afkoelen werd voorzichtig gedecanteerd en de extractie
nog twee malen herhaald. Daarna werd, geheel op dezelfde
wijze, drie malen uitgekookt met petroleumaether (kpt. 60—
80° C.). Het in petroleumaether onoplosbare deel woog 2,3 g
en bezat een activiteit van 130 000 000 AE/g. Er waren dus
nog 6 mg auxine aanwezig. De verdwenen milligrammen wer-
den teruggevonden bij het in petroleumaether oplosbare deel.
Het bleek, dat door de aanwezige vetzuren (boterzuur) het
auxine gedeeltelijk in de petroleumaether werd medegenomen.
Deze vetzuren konden wij verwijderen door voor het uitkoken
een vacuumdestillatie in te lasschen, waarbij op 100° C. werd
verhit, zoodat de vetzuren overdestilleerden.

Het stroopje werd opgelost in 100 cm^ 60 %-ige aethyl-
alcohol en 15 malen met telkens 15 cm^ versch gedestilleerde
benzol uitgeschud. Het verzamelde benzolextract schudden
wij daarop drie malen uit met telkens 75 cm^ water en ver-
volgens nog drie malen met telkens 75 cm^ 50 %-ige methanol.
Dit laatste extract werd, om de methanol te verwijderen, in
vacuo ingedampt tot ongeveer een vijfde van zijn oorspronke-
lijk volumen, dan gevoegd bij het waterextract en het geheel
vier malen uitgeschud met aether. Na drogen boven Na2S04
en afdampen kregen wij uit deze aether 800 mg stroop met
een activiteit van 250 000 000 AE/g, zoodat nog 4 mg auxine
voorhanden waren.

Wij namen de stroop op in 20 cm^ alcohol en voegden een
geconcentreerde oplossing van 5 g neutraal loodacetaat in
water toe. Het gevormde neerslag bevatte haast geen auxine

en werd weggeworpen. Bij het fikraat voegden wij druppels-
gewijze 30 %-ige natronloog tot zwak alkalische reactie op
broomthymolblauw. Het gevormde neerslag werd afgefiltreerd
en fikraat en neerslag gescheiden opgewerkt. Zij werden beide
opgenomen in ijsazijn en de verkregen oplossingen werden
uitgeschud met aether. De na afdampen van de aether en
het azijnzuur verkregen stroopjes bleken bij het testen geen
noemenswaardige zuivering te hebben ondergaan. Zij werden
daarom weer samengevoegd en opgelost in 10 cm3 alcohol.
Aan deze oplossing voegden wij 100 cm^ water toe, dan een
geconcentreerde oplossing van calciumacetaat in water en
tenslotte druppelden wij n-KOH toe, tot bij verder toevoegen
geen neerslag meer ontstond. Het neerslag werd afgecentrifu-
geerd en achtereenvolgens met water, alcohol en water ge-
wasschen. In het uitgewasschen neerslag was haast geen
auxine aanwezig. Het centrifugaat leverde na aanzuren, uit-
schudden met aether en afdampen van de aether 500 mg
stroop, met een werkzaamheid van 400 000 000 AE/g.

Het stroopje werd opgenomen in 5 cmS abs. methanol, welke
1,5 gewichtsprocent HCl bevatte en gedurende een half uur
op een waterbad gekookt. Na afdampen in vacuo werd het
residu opgenomen in aether en deze oplossing twee malen met
2 %-ige bicarbonaatoplossing en twee malen met water uitge-
schud. In de extracten was geen auxine aanwezig. Het residu
uit de aether woog 375 mg en had een activiteit van
200 000 000 AE/g. Aanwezig waren dus nog 1,5 mg auxine,

Op geheel dezelfde wijze hebben wij nu nog twee maal
50 kg gist opgewerkt. De gemiddelde activiteit van deze gist
bedroeg resp. 20 en 23 millioen AE/kg. De cijfers voor deze
tweede en derde opwerking waren:

De aldus verkregen producten werden vereenigd en tesamen
gelactoniseerd. Na opwerken resulteerde een stroopje met een
activiteit van 500 000 000 AE/g. De totale hoeveelheid stroop
bedroeg 600 mg, zoodat nog slechts 6 mg auxine aanwezig
waren. Deze 600 mg hebben wij in twee porties in hoogvacuum
gedestilleerd. De meest actieve fractie destilleerde bij 125—
140° C. en 0,01 mm druk over en had bij de test een activiteit
van 5 000 000 000 AE/g. Tot kristallisatie kon dit destillaat
niet gebracht worden. Daarom werd het product nog eens in
hoogvacuum gedestilleerd, doch ook het nieuwe destillaat
kristalliseerde niet na herhaaldelijk afkoelen met een mengsel
van vast koolzuur-aether.

Een tweede poging met nogmaals 100 kg gist verliep nog
slechter. Reeds gedurende de zuiveringsgang traden zulke
groote verliezen op, dat aan destilleeren niet te denken viel.

Na de ontdekking van hetero-auxine werd het probleem
belangrijk vereenvoudigd. Hetero-auxine bleek een activi-
teit te bezitten van 25 milliard AE/g, dus de helft van
de activiteit van auxine-a. Wij konden daarom nu volstaan
met een millioenvoudige concentreering, d.w.z. de hoeveelheid
uitgangsmateriaal kon tot op de helft worden verminderd. Wij
hebben dus nogmaals het plasmolysesap van 50 kg gist met
een gemiddelde activiteit van 20 millioen AE/kg opgewerkt.
De cijfers hiervoor luiden:

Alvorens nu over te gaan tot de bereiding van het Pb- en
het Ca-zout, hebben wij een behandeling met xylol inge-
schakeld; het stroopje werd met versch gedestilleerde xylol
gedurende een half uur in een waterbad op 85° C. verwarmd
(badtemperatuur), waarna wij lieten afkoelen en de xylol af-
schonken. Dit proces werd zoolang herhaald — 8 malen in
totaal — tot de afgeschonken xylol kleurloos was. De ver-
zamelde extracten werden in vacuo drooggedampt. Het residu
kristalliseerde na een nacht staan bij 1° C. gedeeltelijk uit.
De kristallen, die met FeCls en HCl een sterk positieve kleur-
reactie gaven, werden afgezogen, omgekristalhseerd uit chloro-
form, twee malen uitgekookt met ligroïne en nog twee malen
uit water omgekristalliseerd. Opbrengst 9 mg. Helaas ver-
ongelukte hiervan een groot gedeelte en kon de rest slechts
in verontreinigde toestand teruggewonnen worden. Zij werd
opgenomen in aether, met bicarbonaatoplossing gefractioneerd,
waarna de zuur-fractie nog twee malen uit water omge-
kristalliseerd werd. Smeltpunt 164—165° C. Activiteit
30,000 000 000 AE/g. Mengsmeltpunt met synthetisch /3-in-
dolyl-azijnzuur zonder depressie eveneens bij 164—165° C.

Wij hebben Aspergillus niger gedurende 5—7 dagen bij
30° C. op verschillende, door P. Boysen-Jensen(i)
aangegeven voedingsbodems gekweekt. Daarna werd gefil-
treerd en de filtraten op hun auxinegehalte onderzocht.

Het auxinegehalte van voedingsbodem VI kon eerst worden
aangetoond, nadat het fikraat door indampen in vacuo ge-
concentreerd was. In het fikraat van voedingsbodem II kon
zelfs na 40-voudige concentreering geen auxine worden
aangetoond. Ook de myceha, gegroeid op de voedingsbodems
I, 11, III, waren auxine-vrij,

65 Petrischalen van 20 cm doorsnede werden elk gevuld met
100—125 cm3 van een voedingsbodem verkregen door 20 g
ruwe glucose, 5 g citroenzuur, 0,4 g tyrosine en 0,25 g
KH2PO4 in een liter water op te lossen. De schalen werden
na steriliseeren en afkoelen geënt met Aspergillus niger van

^) Voor de berekening van het groeistofgehalte vgl. P. B o y s e n-
J en sen, Biochem. Z. 236, 206 (1931) en Biochem. Z. 250, 271 (1932).

') Aangezien de oplosbaarheid van tyrosine slechts 0,04 g per 100 cm®
water bedraagt, bevatte deze voedingsbodem de grootste hoeveelheid van
het tyrosine als „Bodenkörperquot;.

Tieghem. Na 6 dagen kweeken bij 31° C. werd het
mycelium verwijderd en de oplossing gefiltreerd. Het filtraat
had een activiteit van 10 000 AE per cm^; het werd aange-
zuurd met geconc. HCl en met aether geëxtraheerd. Het aether-
extract werd met een oplossing van bicarbonaat gefractioneerd
en de zuurfractie op de gebruikelijke wijze met petroleum-
aether uitgekookt. Het zoo verkregen product, met een activi-
teit van 27 000 000 AE per g, hebben wij voor de identificee-
ringsproeven gebruikt:

4,5 mg werden 3 uren gekookt met 2,5 cm^ 5 %-ige HCl,
daarna uitgeschud met aether en de na afdampen van de
aether verkregen rest getest. Deze rest was inactief.

1 mg werd gedurende 3 uren gekookt met 2,5 cm^ 5 %-ige
KOH. Na afkoelen werd aangezuurd met verd. H2SO4 en
uitgeschud met aether. De aether-rest had een activiteit van
19 000 AE, dus 70 % van de oorspronkelijke activiteit. Waar
zoowel auxine-a als auxine-b door koken met loog vernietigd
worden 1), is hun aanwezigheid hier dus uitgesloten en wordt
de waarschijnlijkheid, dat wij hier met hetero-auxine te doen
hebben zeer groot.

80 Petrischalen van 20 cm doorsnede werden elk gevuld
met 175 cm^ zand, dat van te voren door herhaaldelijk op-
slibben in water, gevolgd door verhitten op 300° C., gezuiverd
was. In elke schaal deden wij 75 cm^ gesteriliseerd 10 %-ig
moutextract, waarna wij de platen steriliseerden, na afkoelen
entten met Rhizopus nigricans en 6—7 dagen kweekten bij
25° C. Het zand werd dan uitgeperst en uitgewasschen, het
verzamelde filtraat — ongeveer 10 1 — met geconc. HCl aan-
gezuurd en met aether uitgeschud. Na fractioneeren met bicar-

bonaatoplossing en uitkoken van de zuurfractie met petro-
leumaether, had het product een activiteit van 40 000 000 AE
per gram.

3 mg hiervan werden gedurende 3 uren gekookt met 2,5 cm3
5 %-ig HCl. Na extractie met aether bleek de aetherrest alle
activiteit verloren te hebben.

2 mg werden gedurende 3 uren gekookt met 2 cm^ 5 %-ige
KOH. Na afkoelen, aanzuren en extraheeren met aether bleek
de aetherrest een activiteit te bezitten van 64 000 AE, dus
80 % van de oorspronkelijke activiteit.

De bepalingen geschiedden volgens de diffusiemethode van
F. W. Went en werden uitgevoerd door A. J. Haagen
Smit. Wij gebruikten bij de gist een gedeelte van het product
na de fractioneering met bicarbonaatoplossing, bij Aspergillus
en Rhizopus de boven beschreven extracten. Als moleculair-
gewicht werd gevonden: voor de groeistof uit gist 193, voor
de groeistof uit Aspergilluscuhmes 169 en voor de groeistof
uit RhizopuscukuTts 176 en 190. ^-indolyl-azijnzuur heeft een
moleculairgewicht 175, dat van auxine-a en auxine-b bedraagt
resp. 328 en 310.

Wij maten i) de van oplossingen van hetero-auxine en
auxine-a en vonden de volgende waarden:

hetero-auxine: 0,01 molair oplossing Ph = 3,44
0,005 molair oplossing P^, = 3,55
0,001 molair oplossing = 3,92

De metingen geschiedden met een micro-ionometer van Lauten-
schlager, aan chinhydron-verzadigde calomel electroden.

auxine-a: 0,001 molair oplossing Pj^ = 4,00
0,001 molair oplossing P^ = 3,99
[H-P

Met de formule K = ^-^^^ (massawerkingswet) bereken-
den wij hieruit de dissociatieconstanten en vonden voor

Het /ï-indolyl-azijnzuur werd bereid volgens de methode
van R. M a j i m a en M. K o t a k e i), door op indolmagne-
siumjodide chlooracetonitril te laten inwerken en het gevormde
product te verzeepen. Kleurlooze kristallen (uit benzol). Smp.
164—165° C. 2). Activiteit: 25 milliard AE/g.

100 mg /3-indolyl-azijnzuur werden opgelost in 5 cm^
absolute aether. Deze oplossing koelden wij met ijs en voegden
er een oplossing van diazomethaan in aether aan toe. Het
diazomethaan was op de gebruikelijke wijze uit nitroso-
methylurethaan en KOH bereid. Na drie uren staan bij
kamertemperatuur dampten wij de oplossing droog om het
diazomethaan kwijt te raken en namen de rest weer in aether
op. Deze oplossing werd gefiltreerd, twee malen met 3 %-ige

») R. lackson, J. of Biol. Chem. 88, 660 (1930), heeft zoowel de
methyl- als de aethylester bereid door inwerking van methanol-(aethanol-)
chloorwaterstof op ^-indolyl-azijnzuur. Hij stelt zich tevreden met de ver-
melding, dat beide esters bij ongeveer 180° C. bij 2 mm druk destilleeren
en geeft geen analyses.

bicarbonaatoplossing uitgeschud en eenmaal met water uit-
gewasschen. De aether werd daarna boven Na2S04 gedroogd
en afgedampt. Er resulteerde een ohe met een activiteit van
10 milliard AE/g. De ohe werd opgelost in weinig alcohol
en aan deze oplossing toegevoegd een warm verzadigde op-
lossing van 150 mg pikrinezuur in alcohol. Bij afkoelen kris-
talliseerde het pikraat uit, dat nog twee malen uit alcohol
werd omgekristalliseerd. Roode kristallen. Smp. 125° C.

5 mg van dit pikraat werden onder verwarming op een
waterbad in 25 cmS water opgelost en met wol ontleed 2).
De teruggewonnen vrije ester had eveneens een activiteit van
10 milhard AE/g.

Deze werd bereid door inwerking van diazoaethaan op
(8-indolyl-azijnzuur. Het is een hchtgele ohe met een activiteit
van 3 milliard AE/g. Ook hiervan werd in alcoholisch milieu
een pikraat bereid. Roode kristallen. Smp. 84° C., na drie
malen omkristalliseeren uit alcohol.

C-H-N-analyse der stof na drogen bij kamertemperatuur in hoog-
vacuum boven P2O5:

1) De analyses werden uitgevoerd door Dr. Ing. A. Schoeller, Berlijn-
Schmargendorf.

') H. Müller, H.S. 207, 209 (1932). Alle pikraten, die wij hebben
bereid, zijn op deze wijze getest.

Deze nog onbekende ester ontstond door inwerking van
diazopropaan 3) op ;8-indolyl-azijnzuur. Het is een gele olie
met een activiteit van 1 milliard AE/g. Het pikraat (uit alco-
hol) smelt bij 105° C. In totaal werd 3 malen omgekristalli-
seerd.

C-H-N-analyse van het pikraat na drogen bij kamertemperatuur in
hoogvacuum boven P2O5:

200 mg /8-indolyl-azijnzuur werden opgelost in alcohol en
met een oplossing van KOH in alcohol zorgvuldig geneutrali-
seerd onder toevoegen van wat water om het kaliumzout in
oplossing te houden. Daarna voegden wij een kleine overmaat
AgNOs in water opgelost toe en filtreerden het gevormde
Ag-zout af. Dit Ag-zout werd goed uitgewasschen met alcohol
en bij kamertemperatuur in het donker en in vacuo gedroogd
boven P2O5. Af en toe werd het drogen onderbroken en het
zout gepoederd. Het stofdroge Ag-zout slibden wij op in
absolute benzol, voegden er iets meer dan de berekende hoe-

^) Volgens S. Nirdlinger en S. Acree, Am. Chem. Joum. 43,
358 (1910) bereidden wij nitroso-propylurethaan door N2O3 op het con-
densatieproduct van propylamine en chloorkoolzure ester te laten inwerken.
Uit het nitroso-propylurethaan verkregen wij op de gebruikelijke wijze het
diazopropaan.

veelheid isopropyljodide aan toe en schudden het mengsel
gedurende 6 uren in het donker. Daarna werd afgefiltreerd
en de benzol in vacuo verjaagd. Het residu namen wij op in
aether en schudden deze aether drie malen met 5 ^-ige bicar-
bonaatoplossing uit. De aether werd toen gedroogd boven
Na2S04 en afgedampt. Het residu had een activiteit van 100
milfioen AE/g. Van dit residu werd een pikraat bereid. Roode
kristallen uit alcohol. Smp. 100—101° C., na drie malen om-
kristalhseeren.

100 mg ;8-indolyl-azijnzure methylester werden opgelost in
7,5 cm3 alcohol en aan deze oplossing toegevoegd 30 mg
PtOg en 0,1 cm3 geconc. HCl. In drie uren tijd werden —
onder schudden bij kamertemperatuur — opgenomen
16,12 cm3 H2 (berekend 11,85 cm3) 1). Het hydreeren werd
toen onderbroken en de katalysator afgefiltreerd. Het fikraat
werd tot op een klein volumen ingedampt, met een 10 %-ige
oplossing van kaliloog zwak alkalisch gemaakt en met aether
geëxtraheerd. Dit aetherextract schudden wij herhaalde malen
uit met y2 %-ig zwavelzuur. Uit het waterextract konden wij
na opwerken 27 mg van het uitgangsmateriaal als pikraat
terugwinnen. Het zure extract neutraliseerden wij met 0,2 n
KOH en extraheerden het met aether. Het aetherextract werd

boven Na2S04 gedroogd en afgedempt. Het residu losten
wij in weinig alcohol op en voegden er een warm verzadigde
oplossing van pikrinezuur in alcohol aan toe. In de koude
kristalliseerden roode naaldjes uit, die afgezogen en nog vier
malen uit alcohol omgekristalliseerd werden. Smp. 178° C.

4 mg van dit pikraat werden opgelost in water en met wol
ontleed. Het na extractie met aether verkregen residu had
nog een activiteit van 34 000 000 AE/g. Wij hebben daarop de
methylester als volgt gezuiverd: 100 mg pikraat werden op-
gelost in water en met wol ontleed. Daarna werd geëxtra-
heerd met aether en de aether herhaalde malen met Yi %-ig
zwavelzuur uitgeschud. Dit extract neutraliseerden wij met
0,2 n KOH en schudden het met aether uit. De aether werd
gedroogd boven Na2S04 en afgedampt. Van het residu be-
reidden wij weer een pikraat, dat vier malen uit alcohol om-
gekristalhseerd werd. Het aldus gezuiverde pikraat losten wij
weer op in water en ontleedden het met wol. De oplossing
werd gebracht op een volumen van 100 cm^. Deze oplossing
vertoonde bij de test geenerlei activiteit meer. Ook het na
extractie met aether en droogdampen van de aether verkregen
residu was onwerkzaam.

Vrij j8-indolyl-azijnzuur nam bij de katalytische hydreering
met Pt02 veel te veel waterstof op. Daarom bereidden wij
eerst de 2,3-dihydroindol-3-azijnzure methylester (zie hier-

boven) en zetten deze door verzeeping om in het vrije dihydro-
zuur, dat in de literatuur nog niet bekend was.

125 mg 2,3-dihydro-indol'-3-azijnzure methylester werden
gedurende 4 uren op een waterbad aan een terugvloeikoeler
verhit met 1 cm3 2 n H2SO4. Daarna voegden wij de be-
rekende hoeveelheid 0,05 n Ba (OH) 2 toe, centrifugeerden
het BaS04 af en dampten het centrifugaat in vacuo droog.
Er resulteerde een dikke gele ohe. Deze namen wij in weinig
water op en voegden er een warm verzadigde oplossing van
150 mg pikrinezuur in water aan toe. Bij afkoelen sloeg een
donkerbruine olie neer, die na 8 weken staan bij 1° C. kris-
talhseerde. De kristallen werden opgenomen in weinig warme
alcohol, uit welke oplossing na drie dagen staan bij kamer-
temperatuur andermaal een gedeelte uitkristalhseerde. Bij een
hernieuwd omkristalliseeren uit alcohol trad spontaan kristal-
lisatie in. Wij kristalliseerden nog twee malen uit alcohol om
en verkregen 50 mg roodbruine kristallen met een smeltpunt
van 168° C.

Een gedeelte van dit pikraat werd in water opgelost en
met wol ontleed. Wij schudden de vloeistof uit met aether
en dampten dit aetherextract vervolgens droog. Het residu ver-
toonde geenerlei activiteit.

Volgens E. Fischeri) werd bereid l-methylindol-2-
carbonzuur door het methylphenylhydrazon van pyrodruiven-

zuur in HCl op te lossen. Door decarboxyleeren ontstond
hieruit 1-methylindol, dat volgens A. Piccininii) met
diazo-azijnester gekoppeld werd. Door verzeeping van het
condensatieproduct ontstond l-methylindol-3-azijnzuur, dat
in totaal 8 malen uit benzol-petr.-aether werd omgekristalli-
seerd. Kleurlooze kristallen, Smp. 128° C. Activiteit: 30 mil-
hoen AE/g. Naderhand hebben wij dit zuur ook nog bereid
door het as.-methylphenylhydrazon van aldehydo-propion-
zure ester met H2SO4 te behandelen overeenkomstig de be-
reiding van 2-aethylindol-3-azijnzuur (XXV).

Dit zuur werd verkregen door volgens E. Fischer2)
het phenylhydrazon van laevulinezuur met ZnCl2 te smelten.
Kleurlooze kristallen na vier malen omkristalliseeren uit ace-
ton. Smp. 128° C. Activiteit: 125 miUioen AE/g.

Deze nog niet beschreven ester werd verkregen door
methyleeren van het vrije zuur met diazomethaan. Zij werd
drie malen omgekristaUiseerd uit verdunde alcohol. Kleurlooze
kristallen. Smp. 65° C. Inactief.

door 1 g homo-laevulinezuur met de berekende hoeveelheid
phenylhydrazine te overgieten en het condensatieproduct
met 20 cm3 absolute alcohol, waaraan 1,6 g geconc.
H2SO4 was toegevoegd, gedurende 4 uren op een water-
bad aan een terugvloeikoeler te koken. Na afkoelen werd
het reactieproduct in 500 cm^ water uitgegoten, waarop
zich een bruine olie afscheidde, die door uitschudden
met aether en afdampen van de aether kon worden afge-
zonderd. Deze olie werd met 50 cm^ van een 10 %-ige op-
lossing van KOH in alcohol gedurende % uur op een water-
bad gekookt. Het reactieproduct goten wij wederom uit in
water en extraheerden deze oplossing, nadat zij met verdund
H2SO4 aangezuurd was, met aether. De aether werd met
een bicarbonaatoplossing gefractioneerd. De zuurfractie
leverde na opwerken een kristallijn product, dat 6 malen uit
water werd omgekristalliseerd, waarbij groote verliezen op-
traden. Kleurlooze kristallen. Smp. 100—101 ° C. Inactief.

5 g ester van barnsteenzuurhalfaldehyde (= formylpro-
pionzuur) 1) werden op de berekende hoeveelheid p-tolylhy-
drazine2) gegoten en de verkregen bruine stroop behandeld,
zooals bij 2-aethyljndol-3-azijnzuur (XXV) is beschreven.
De kristallen van het tot dusverre onbekende zuur werden 3

malen uit water omgekristalliseerd. Zeer licht gele kristallen.
Smp. 151° C. Activiteit 1,5 milliard AE/g.

Ook deze nog niet beschreven ester werd verkregen door
inwerking van diozamethaan op het vrije zuur. Het was een
olie met een activiteit van 1 200 000 000 AE/g. Het pikraat
(uit alcohol) smok bij 122-123° C., na 4 malen omkristalli-
seeren.

7,5 g laevulinezuur werden opgelost in water en gevoegd
bij de zwak azijnzure oplossing van de berekende hoeveel-
heid p-tolylhydrazine. Het ontstane p-tolylhydrazon werd
afgefiltreerd, uitgewasschen met water, gedroogd bij kamer-
temperatuur in vacuo boven P2O5 en drie malen uit benzol om-
gekristalliseerd. Kleurlooze kristallen, die aan de lucht snel
verharsen. Smp. 97° C.

7,5 g van dit p-tolylhydrazon werden innig gemengd met
37,5 g ZnCl2 en in een open kolf in een ohebad verhit tot
120° C. (buitenbad), waarop het mengsel een half uur werd
gehouden. De groene smelt werd na afkoelen behandeld met
0,2 n HCl om het ZnCl2 op te lossen, waarna werd gefil-
treerd. Het donkere, kleverige residu droogden wij bij kamer-

temperatuur aan de lucht, poederden het en kookten het her-
haaldelijk met aether uit. De aether werd met een bicarbo-
naatoplossing gefractioneerd. De zuur-fractie leverde na op-
werken een grijswit poeder, dat in verdund azijnzuur werd
opgenomen. De oplossing werd opgekookt met noriet en
warm gefiltreerd. Het bij afkoelen uitkristaUiseerende gedeelte
werd nog drie malen uit verdund azijnzuur omgekristalliseerd.
Zeer licht gele kristallen. Smp. 172—173° C. Inactief. Het
zuur was in de literatuur nog niet bekend.

Door ringsluiting en afsphtsing van ammoniak aan het
phenylhydrazon van aldehydo-isoboterzuur volgens A. E 1-
1 i n g e r 1) kregen wij het verlangde zuur in handen. Kleur-
looze kristallen na 3 malen omkristalliseeren uit water.
Smp. 102° C. (A. E 11 i n g e r geeft 107° C. aan). Activiteit:

Daar dit omkristalliseeren met groote verliezen gepaard
ging, hebben wij het pikraat bereid en dit vier malen uit
alcohol omgekristalliseerd. Na ontleding van het pikraat met
wol vonden wij voor het residu eveneens een activiteit van
5 milliard AE/g.

C-H-N-analyse van het pikraat na drogen der stof bij 30° C. In
hoogvacuum boven P2O5:

Wij lieten volgens R. Majima en M. Kotake^)
chloormierenzure aethylester inwerken op indolmagnesium-
jodide en kregen door verzeeping van het reactieproduct het
gewenschte zuur. Kleurlooze kristallen. Smp. 213° C. Inactief.

a)nbsp;analoog aan indol-3-azijnzuur volgens R. Majima en
M. Kotake^) waarbij wij chloorpropionitril in plaats van
chlooracetonitril gebruikten.

b)nbsp;volgens A. Ellinger^) analoog aan de bereiding
van a-(jS-indolyl)-propionzuur, waarbij i.p.v. aldehydo-iso-
boterzuur het aldehydo-boterzuur gebruikt werd.

Dit zuur werd verkregen volgens E. Fischeri) door
verhitten van het phenylhydrazon van pyrodruivenzuur met
ZnCla op 195° C. Kleurlooze kristallen. Smp. 200—201° C.
Inactief.

1) R. M a j i m a en M. K o t a k e, Ber. 55, 3870 (1922); 63, 2240 (1930).
») R. Majima en M. Kotake, Ber. 58, 2042 (1925).
') A. E Hing er, Ber. 38, 2887 (1905).
*) E. Fischer, Ann. 236, 142 (1886).

Oidium lactis werd volgens F. E h r 1 i c h en P. J a c o b-
seni) gekweekt op een voedingsbodem, die /-tryptophaan
bevatte. Dit Z-tryptophaan werd zoodoende omgezet in l-P-
indolyl-melkzuur. Noch het Z-melkzuur, noch het racemaata)
waren werkzaam. Kleurlooze kristallen na drie malen omkris-
talliseeren uit aether-hgroïne. Smp. 99° C. voor het /-melkzuur
en 145—146° C. voor het racemaat.

Dit zuur hebben wij verkregen volgens A. E11 i n g e r
en Z. Matsuoka3) uit het acetyl-azlacton van hippuur-
zuur en indol-3-aldehyde. Wij hadden na 4 malen omkristal-
liseeren uit ijsazijn een bijna kleurloos praeparaat in handen
met een smp. 210° C. Activiteit: 200 millioen AE/g.

K. Ichihara en N. Iwakura, H.S. 195, 202 (1931).
3) A. Ellinger en Z. Matsuoka. H.S. 109, 261 (1920).

In verband met de in het Eerste Hoofdstuk besproken onder-
zoekingen hebben wij enkele urine- en faeces-soorten getest
en een aantal plantaardige oliën en vetten op hun auxine-ge-
halte onderzocht. De onderstaande tabellen geven een over-
zicht van de verkregen resultaten.

gewicht van het
alcoholextract:

3nbsp;9

4nbsp;9

4nbsp;g
44 g
2,5 g
20 g
44 g
2.5 g

5nbsp;0

22 g

De physiologische activiteit van de drie auxinen is ge-
bonden aan de aanwezigheid van een vrije carboxylgroep.

De methode om dissociatieconstanten te bepalen door
middel van uitschudreacties verdient geen aanbeveling.

De theorie van W. Lepeschkin is niet in staat de ver-
schijnselen, die bij het verstijfselen van zetmelen optreden,
afdoende te verklaren.

Het bewijs, dat Streptococcus lactis en Streptococcus fae-
calis als twee verschillende organismen opgevat moeten worden,
is door het onderzoek van J. Sherman en P. Stark niet
geleverd.

De esterase-modcllen van W. Langenbeck en J. Baltes
zijn aan bedenkingen onderhevig.

W. Langenbeck en ]. Baltes, Ber. 67, 387 (1934).
S. Olivier, Rec. 54, 322 (1935).

De aanwezigheid van een inosiet-oxydeerend systeem is
door het werk van N. Das en B. Guha niet bewezen.
N. Das en B. Guha, H.S. 235, 157 (1935).

»
■ •.■WS5 •

T *nbsp;Î » »

, - lt; ^ -
' * v

	Gewicht van de actieve fractie in mg:	Activiteit in AE/mg:	Totaal aan- wezig auxine in mg:
1. plasmolysesap......	_	20	20
2. aetherextract......	12 000	60 000	14
3. bicarbonaatextract ....	3 800	160 000	13
4. residu na uitkoken met pe-
troleumaether .....	3 000	210 000	12
5. benzolextract......	500	750 000	8
6. na Pb- en Ca-zout ....	300	1 300 000	8
	—	23	23
2. aetherextract......	20 000	40 000	16
3. bicarbonaatextract ....	4 400	170 000	15
4. residu na uitkoken met pe-
troleumaether .....	1900	400 000	15
5. benzolextract......	500	1 100 000	11
6. na Pb- en Ca-zout . . .	350	1 400 000	10

	Gewicht van de actieve fractie in mg:	Activiteit in AE/mg :	Totaal aan- wezig auxine in mg;
1. plasmolysesap......	_	20	40
2. aetherextract......	—	niet getest	'—
3. bicarbonaatextract ....	6 500	210 000	26
4. residu na uitkoken met pe-
troleumaether.....	3 000	250 000	25
	'—	niet getest

Voedingsbodem: (berekend op 100 cm' oplossing)	Gevonden hoeveelheid auxine:	Volgens Boysen- Jensen:
I. 5 g glucose; 0,25 g Ca(N03)2 • 4 H^O; 0,025 g KjHPO,; 0,025 g MgS04 • 7 H^O; 0,025 g KCl; 1 druppel 10«/o-ig FeCls; 100 cm' 0,2 %-ig HCl.
II. 0,2 g Ca(N03)2- 4 HjO; 2 g glucose; 0,5 g citroenzuur; 0,025 g KHjPOi.	___	___
III. 2 g glucose; 0,5 g pepten; 0,5 g citroen- zuur; 0,025 g KH,P04.	53 000 AE/1	d = 2,2 ')
IV. 2 g glucose; 0,5 g citroenzuur; 0,025 g KH2PO4; 0,04 g tyrosine.	1 250 000 AE/1	niet uitgevoerd
V. 2 g glucose; 0,5 g citroenzuur; 0,025 g KH.PO,; 0,5 g tyrosine»).	520 000 AE/1	d = 1,67
VI. 5 g glucose; 0,5 g citroenzuur; 0,025 g KH,P04; 0,5 g asparagine.	18 750 AE/1	d = 0
VII. 2 g glucose; 0,5 g citroenzuur; 0,025 g KHjPOi; 0,5 g leucine.	300 000 AE/1	niet uitgevoerd

Urine van:	s.g.	hoeveelheid uitgescheiden auxine per dag:
	1,0265	100 000 000 AE
merrie.........	1,030	30 000 000 „
merrie.........	1,038	250 000 000 „
	1,034	95 000 000 „
koe..........	1,043	14 000 000 „
teef..........	1,0225	4 000 000 „

Faeces van:	activiteit per gram:
mensch.........	5-10 AE
kip..........	10-15 AE

Auxine uit:	Zuurbe- stendig:	Alkalibe- stendig:	Moleculair- gewicht;	Aard van het auxine:
Aspergillus niger .	neen	ja	169	hetero-auxine
Rhizopus nigricans	neen	ja	176,190	hetero-auxine
Avena - coleoptilen	ja	neen	346	auxine-a
gist.....	—	—	193	hetero-auxine

	Gewicht van de actieve fractie in mg:	Activiteit in AE/mg:	Totaal aan- wezig auxine In mg:
1. plasmolysesap......	^_	17	17
2. aetherextract ......	10 000	60 000	12
3. bicarbonaatextract ....	4 600	120 000	11
4. residu na uitkoken met pe-
troleumaether .....	2 300	130 000	6
5. benzolextract......	800	250 000	4
6. na Pb- en Ca-zout ....	500	400 000	4
7. na lactoniseering.....	375	200 000	1,5

Oliesoort:	activiteit
Oliesoort:	per kilogram:
slaolie.........	400 000 000 AE
slaolie.........	0 „
	0 „
arachisolie.......	0 „
sesamolie........	0
ricinusolie.......	0 „
zonnebloempittenolie . . .	0 .,
olijfolie........	0 .,
	0 „