	- ■

ului

Biß het eindigen van mijn academischen studietijd is
het mij een zeer aangename plicht, U, Hooggeleerde
Heeren Professoren en Zeergeleerde Heeren Lectoren der
Medische en Philosophische Facidteiten, mijn dank te
betuigen voor al hetgeen Gij tot mijne vorming hebt bij-
gedragen.

Vooral aan ü. Hooggeleerde Spronok , Hooggeachte
Promotor, gevoel ik mij ten zeerste verplicht voor de
groote hereiclioilligheid, waarmede Gij de leiding mijner
proeven op U naamt, voor den zeer geioaardeerden raad en
steun, dien Gij mij zoo ruimschoots ve?ieendet, voor het
vele en nuttige, loat ik nog in den laatsten tijd op TJio
laborcdorium van U mocht leeren.

Reactie-verandering van glycerinehoudende bouillons . . 43
Reactie-verandering in cultures onder afsluiting der zuurstof 47
Proeven met bouillon tiit versch en oud vleesch . .• . . 52
Proeven over het alkalisch houden vau cultures in wille-
keurige bouillons..............55

Nadat door Klebs in 1883 het eerst op den diphtherie
bacillus was gewezen en Loefplee dezen bacil nader
had . bestudeerd en zuiver gekweekt, namen, vooral
aangespoord door de klassieke onderzoekingen van Eoux
en Yeesin , talrijke bacteriologen dit onderwerp ter hand.
Men zocht in talrijke gevaUen van diphtherie naar den
nieuwen bacillus, kweekte hem op verschillende bodems,
het hem daarin zijn gif produceeren, experimenteerde
daarm.ede en onderzocht den bacil microscopisch. Zoo
kwam men dan ook weldra in het bezit van eene
menigte feiten omtrent de biologische en morphologische
eigenschappen van den diphtheriebacil en is hij aldus
geworden tot een der best bekenden onder de pathogene
microben.

Edoch, toen het er op aankwam in betrekkelijk korten
tijd cliphtheriegif van constante sterkte in groote hoeveel-
heid te verkrijgen, zooals men dit noodig heeft voor het
immuniseeren bij de bereiding van het antidiphtherisch
serum, toen ondervonden ook de grondleggers dier
therapie, BEHEmcr en Roux, dat men het verkrijgen

van het gewenschte vergif lang niet in de hand heeft.
Zoo zeide Behring \') nog verleden jaar: „Das Diphthe-
riegift wird, wie das Tetanusgift, aus Bouillonculturen
gewonnen. Die Culturen müssen jedoch, um eine nennens
werthe Ausbeute an Gift zu gewähren, lange Zeit
wachsen. Während das Maximum der Tetaiiusgiftan-
sammlung schon in 8 Tagen erreicht ist, dauert es 2 bis
4 Monate, bis man die Diphtherieculturen zum Zweck
der Giftgewinnung verarbeitet." Iets verder nog: „Ich
selbst bin auf einen bloss noch kleinen Rest einer
anfänghch grossen Quantität vom ISTormalgift angewiesen,
welchen ich vor 1 Jahre durch die verdienstvolle
Mitwirkung des Sanitätsrath 0. Boee erhalten habe.
Derselbe fand unter Hunderten von Litern anscheinend
gleich behandelter Diphtherieculturen nur 5 Liter heraus,
welche dem ISTormaldiphtheriegiftwerth entsprachen. Seit
dem haben wir uns sehr grosse Mühe gegeben, gleich
wirksame Culturen wieder zu bekoimiien, aber erst in
neuerer Zeit, nachdem wir die Temperatur, bei welcher
die Diphtherieculturen gezüchtet werden, auf 85° herun-
tersetzten, glauben wir Aussicht zu haben dieses Ziel
regelmässig erreichen zu können."

Roux heeft, om constant en in betrekkelijk korten
tijd (ongeveer 1 maand) vrij sterk diphtheriegif te krygen,
aanbevolen bouiUoncultures van den diphtheriebacil aan
te leggen in Fernbachsche ballons en arbeidt, sinds hij
antidiphtherisch genees-serum op groote schaal fabriceert,
met een tweetal groote broodkamers, van kostbare

Behring. BeTîâmpfung der Infectionskrankkeiten. Infection und
Desinfection, Leipzig, G. Thieme 1894, p. 172 en p. 174.

inrichtingen voorzien, om voortdurend vochtige, steriele
lucht over de cultures te doen strijken.

Bij een vergelijkende proef, in het pathologisch insti-
tuut alhier genomen, bleek eenzelfde diphtheriebacil,
gekweekt in denzelfden bouillon en in dezelfde broed-
stoof, bij aanvoer van lucht merkwaardiger wijze een
zwakker vergif te produceeren dan zonder dien toevoer.
Dat feit trok zeer de aandacht, en daar nergens eenige
fout viel te ontdekken, moest wel worden aangenomen,
dat de omstandigheden, waaronder de bacil zijn vergif
produceert, nog op verre na niet voldoende zijn bekend.
Bovendien was prof. Spbonok gebleken, dat volstrekt
niet altijd maanden noodig waren, om diphtheriegif te
verkrijgen; zoo bleken bv. bouilloncultures in gewone
kolven gekweekt, die slechts 17 dagen oud waren, een
Altraat te leveren, waarvan de giftigheid 5 malen grooter
was dan die van het normaalgif van Behriïtg- (1894).

Eindelijk was het prof. Spronok opgevallen, dat de
aanvankelijk zwak alkahsch reageerende bouiUoncultures
geenszins constant na zekeren tijd een zure reactie
aannamen, terwijl alle andere onderzoekers het er over
eens zijn, dat die wijziging van de reactie een karak-
teristiek verschijnsel is, dat de diphtheriebacil bij zijn
groei in bouillon teweegbrengt en sommigen zelfs zoover
zijn gegaan, om het uitblijven van die reactie-wisseling
te beschouwen als een eigenaardigheid, die den pseudo-
diphtheriebacil kenmerkt. ■

Naar aanleiding van die goed geconstateerde feiten,
geheel in strijd met de ervaringen van zoo betrouwbare
onderzoekers als behrma en Roux, stelde prof. Spronck
mij voor een onderzoek in te stellen naar de oorzaken

dier tegenstrijdigheden, en de wisselvalhgheid, die
bij de productie van diphtheriegif op groote schaal
zoo ontzettend storend is, zoo mogelijk aan banden
te leggen.

Dat wij tot zekere hoogte daarin zijn geslaagd, moge
uit de volgende hoofdstukken blijken.

In het jaar 1884 verscheen van de hand van Loepfler
een uitvoerige verhandeling: „Ueber die Bedeutung der
Mikroorganismen für die Entstehung der Diphtherie beim
Menschen, bei der Taube und beim Kalbe." Hij vond
in vele gevallen de door Klebs in 1883 het eerst
-aangegeven bacillen en het gekikte hem die zuiver te
kweeken. Met de reincultures deed hij talrijke entingen
en infectie-proeven bij verschillende dieren, die er alle
op wezen, dat de staafjes dezelfde werking uitoefenden
als het diphtherie-contagium bij den mensch. Het afdoende
bewijs daarvan kon hij echter nog niet leveren. Hij
kweekte de zuivere cultures op vleeschinfuus-pepton-
gelatine en ontdekte de voortreffelijkheid van het ook
nu nog algemeen gebruikte vleeschinfuus-pepton-giucose-
serum, welke cultuurbodem naar hem wordt genoemd.

1) Loeffler. Mittheilungen ans dem Kaiser!. Gesundheitsambte.
Bd. n 1884, S. 421.

Klebs. Verhandlangen des Congresses für inn. Medicin. IL
Abtheil. Wiesbaden 1883, S. 1-39.

In zijn tweede mededeeling, ^ in het jaar 1887, en
in de mededeelingen der onderzoekers in de eerste jaren
na 1884, nl. Emmbrioh, Babes, Soee^tsen, d\'Espinb,
Pbnzoldt, vindt men voornamelijk de aetiologische be-
teekenis van den bacil en zijn morphologische eigen-
schappen bestudeerd, terwijl von Hofmann-Wellenhop -)
een, geheel met den diphtheriebacil overeenkomende
microbe leerde kennen, die echter avirulent was.

Een zeer belangrijke bijdrage tot de kennis van de
diphtherie en de beteekenis van den Klebs-Loepfleeschen
bacil als oorzaak dier ziekte, leverden Roux en Yeesin
in 1888 door de ontdekking van het diphtheriegif.
Achtereenvolgens in 1888, \'89 en \'90 verschenen in de
„Annales de l\'Institut Pasteur" de resultaten hunner
uitgebreide, nauwkeurige onderzoekingen. Wegens de
groote beteekenis, welke die voor mijn onderwerp
hebben, zal ik enkele gedeelten daaruit citeeren. Zoo
zeggen zij in hun eerste meededeehng van 1888 van
den diphtheriebacil: „II pousse abondamment dans les
milieux hquides; le bouillon de veau légèrement alcahn
préparé avec une partie de viande pour deux parties
d\'eau nous a surtout servi dans ces recherches. Après
quelques jours de culture, le bouillon primitivement

LoefpXjER. Ergebnisse weiterer Uutersucliiingen über die Diph-
theriebacillen. Centralblatt f. Bacteriologie u. Parasitenkunde. Bd. II.
1887 , m 4.

t. Hopmann-Wellenhoe. Untersuchungen über den Klebs-
Loeffler\'sehen Bacillus der Diphtherie tiad seine pathogene Bedeutung.
Wien, medic. Wochenschr. 3 u. 4. 1888.

3) Eoux et Tersin. Contribution à l\'étude de la diphtérie. Ann. de
l\'inst. Pa,steur T. II 1888, m 12.

alcalin est devenu acide; cette acidité persiste assez
longtemps, puis elle est remplaçée par une reaction
alcaline si l\'air à libre accès dans la culture. Le
développement dans le bouillon se fait sous forme de
petits grumeaux qui se fixent sur la paroi des vases.
A l\'abri de l\'air, dans la vide, le bacille se cultive
facilement, mains moins énergiguement cependant qu\'à
l\'air; dans ce cas le bouillon devient également acide et
conserve cette réaction. L\'acidité est plus prononçée
dans les cultures faites dans le bouillon glycériné que
dans le bouillon simple; dans ce milieu, qui devient
bientôt d\'une acidité exagerée, le bacille perd sa vitalité.
Il en est de même quand il croît sur le sérum glycé-
riné , qui prend alors une réaction acide, ce qui ne
s\'observe pas avec le sérum ordinaire."

Wanneer zij de bouilloncultures door een Chamberland
filter persten en aldus geheel van microorganismen be-
roofden, verkregen zij een Altraat, dat bij injectie in
staat bleek dieren te dooden onder dezelfde verschijn-
selen\', als bij enting met de reincultuur der bacillen
werd waargenomen. Bleven de dieren verscheidene
dagen in leven, dan vertoonden ze typische verlam-
mingsverschijnselen , welke Loepplbr tevergeefs had ge-
tracht te voorschijn te roepen door injectie of enting
van reincultures.

Zij toonden aan, dat het Altraat van oudere cultures \'
een veel sterkere toxische werking had, dan dat van
jongere, verder, dat het gif zich vormt, zoowel in cultures
gekweekt zonder toetreding van lucht, als in cultures
aan de lucht, en dat het gif sneller werkt bij intra-
veneuze injectie, dan bij subcutane.

Kolisko en Paitaup ^ in Weenen, die, ongeveer
gelijktijdig met Roux en Yersin , proeven namen met
gefiltreerde reincultures van den diphtheriebacil, zagen
geen enkele hunner cavia\'s bezwijken na injectie van
1 cm® filtraat eener 14 dagen oude bouilloncultuur. Wel
vertoonden de dieren oedeem met opvolgende necrose
en ulceratie op de plaats van injectie. Intusschen
gelukte het ook dien onderzoekers later zich een zeer
werkzaam gif te verschaffen.

In de tweede mededeeling van Roux en Yersin,
welke in Juni 1889 verscheen, beschrijven zij deresub
taten hunner verdere proefnemingen met gefiltreerde
bouilloncultures en deelen zij nadere bijzonderheden
mede omtrent den aard van het diphtheriegif. Met
betrekking tot mijn onderwerp is bijzonder belangrijk:
„Les cultures du bacille de la diphthérie n\'ont des
propriétés toxiques énergiques que lorsqu\'elles .sont
devenues alcalines. Tant que la réaction est acide, il
faut des doses notables de liquide filtré pour produire
un effet sur les animaux. La réaction alcahne du
hquide est due sans doute à l\'oxydation de la matière
azotée du bouillon, car elle ne se produit pas dans les
cultures faites à l\'abri de l\'air; de plus dans les cultures
anciennes, il se forme au bout de plusieurs mois des
cristaux de phosphate ammoniaco-magnésien. Nous ne
\'saurions dire encore si l\'ammoniaque est la seule base
qui prenne naissance dans les cultures à l\'air."

Kolisko und Paltauf. Zum Wesen des Croups und der Dipli-
tlierie. Wien. Klin. Wochensch. 1889, n». 8.
2) Ann. de l\'lnst. Past. n". 6, 1889.

Zij vonden, dat het gif in het flltraat vernietigd wordt
door verhitting boven 60°, dat het niet oplosbaar is in
alcohol, dat het meegesleept wordt door verschiUende
praecipitaten, die zich in de vloeistof vormen, zoo van
phosphas calcis, van kleiaarde. Deze eigenschappen in
verband met de sterke werking van het gif in zeer
kleine doses, maakten het waarschijnlijk, dat het
diphtheriegif nadert tot de fermenten. Onder deze vindt
men er ook, zooals het pancreasferment, die onwerk-
zaam zijn in een zure vloeistof. Roux en Yeesin
gingen verder na, of de toevoeging van zuren aan een
sterk giftig, alkalisch filtraat, de schadelijke werking
daarvan ook verminderde. Dit bleek inderdaad het
geval te zijn. Was de reactie door toevoeging van
acid um lacticum of aciclum tartaricum duidelijk zuur
gemaakt, dan was 1 cm-"\' van die vloeistof niet meer
in staat cavia\'s bij subcutane injectie te dooden, die nu
slechts een licht oedeem vertoonden en weldra geheel
hersteld waren, terwijl een contrölecavia, na injectie
van \'0,5 cm^ van het alkalische filtraat, snel succom-
beerde. Neutraliseert men de zuur gemaakte vloeistof,
dan herkrijgt ze weder een groot gedeelte harer vroegere
werkzaamheid. Hoe langer het contact met het zuur
geduurd heeft, des te meer blijkt ze echter van haar
giftigheid verloren te hebben. Zelfs zeer geringe hoeveeb
heden zuur hebben een merkbaren invloed op de werk-
zaamheid van het gif.

Acidum phenicum, acidum boricum, biboras sodae bij
het toxisch filtraat gevoegd, vertragen de werking
daarvan, zonder evenwel den dood der proefdieren te
verhinderen.

Volgens de onderzoekingen van Roux en Tersin zou
derhalve de alkahsche bouillon, waarin diphtheriebacillen
gekweekt worden, regelmatig een zure reactie aannemen,
om na eenigen tijd weer alkahsch te worden, terwijl deze
reactieverandering in hooge mate van invloed is op de
toxiciteit van het Altraat.

Uit de door hen ontdekte feiten, dat hot Altraat
van een diphtheriebouillon haast onwerkzaam is zoolang
de bouillon nog zuur reageert, terwijl de giftigheid pas
voor den dag komt na verloop van eenigen tijd, wanneer
de bacteriën hebben opgehouden zich te vermenigvuldigen
en de alkalische reactie is ingetreden, en dat de giftigheid
stijgt evenredig aan den duur van die reactie, leidt
Gamaleia \') eene hypothese af, volgens welke het gif
zou besloten zijn in de lichamen der bacteriën en daaruit
slechts langzaam door het alkalische vocht zoude uitge-
loogd worden.

Zarotko vermeldt, dat zijn zwak alkalisch gemaakte
bouillon, (die hij aldus samenstelde: op 100 vleeschin-
fuus, 1,0 pepton, 1,0 dextrose, 0,5 keukenzout) meestal
reeds in den loop van den tweeden dag zuur werd.

Bovendien bemerkte hij, dat na koken van een zoo-
danigen zuren bouillon de reactie onveranderd blijft; ze
wordt dus niet door koolzuur veroorzaakt, ten minste
niet aUeen daardoor.

\') Gamaleta. Les poisons bactériens. Paris. Ruefp et C\'^ L892.
Bibliothèque médicale publiée sous la direction de Charcot et Debove.

2) Zahniko. Beitrag zur Kenntnis des Diphtheriebacillus. hiaug.-
dissert. Kiel 1889 en Centralblatt für Bacteriol. u. Parasiten kunde.
Bd. VL 1889. N". 6^8.

Omtrent den groei in zijn bouillon zegt hij: na 18 uren
bemerkt men reeds witte klompjes, die gedeeltelijk op
den bodem liggen, gedeeltelijk aan den wand van het
glas kleven. Met den microscoop ziet men, dat deze
klompjes koloniën zijn, in welke de bacteriën door een
zich intensief kleurende massa, worden samengehouden.
De verbinding is vrij vast, alleen door voortgezet, sterk
schudden is een voorbijgaande troebelheid van den bouillon
door verbrokkeling der klompjes te verkrijgen. Spontaan
zou de bouillon gewoonlijk nooit troebel worden. AUeen
bij zeer wehgen groei zou een kortdurende, spontane
troebelheid kunnen ontstaan, maar altijd zinken de cellen
toch weldra weder op den bodem en laten een volkomen
heldere vloeistof boven zich. Evenals \'Roux en Yersin
vond hij den groei bij zuurstofafsluiting iets verminderd.

Ook heeft hij den grooten invloed van de reactie van
den voedingsbodem op den groei waargenomen. Op
alkalische aardappelen groeit de bacil veel beter dan op
zure; evenzoo is dit onderscheid zeer sterk bij gelatine.

Die bevindingen omtrent den groei vermeld ik, omdat
ik meen door mijne proefnemingen ze nader te kunnen
verklaren.

D\'Espine en de Maeionao b deelen mede, dat de bacil
welig groeit in bouihon, samengesteld volgens de formule
van Loepeler (500 grm. versch rundvleesch gedurende-
24 uur gemacereerd in 1 L. water, daarna er aan
toegevoegd 10 grm. droge pepton, 5 grm. keukenzout en

\') D\'Espine et de Mahignac. Reclierches expérimentales sur le
bacille diplithérique. Révue médicale de la Suisse Eomande 1890.
NO. 1 et 2.

7 a 8 grill, glucose, vervolgens alkalisch gemaakt).
24 uren na de uitzaaiing is de bouillon\' reeds licht
zuur, wanneer de hoeveelheid niet grooter is dan 5 tot
6 cm^, na 2 dagen echter is de aciditeit altijd duidelijk.
Den groei in bouillon beschrijven ze juist als Zarniko.

Het eerst toonden ook die schrijvers de mogelijkheid
aan, om den bacil te kweeken in urine van den mensch.
Dat gelukte hun zoowel in urine, die de gewone normale
zure reactie had, als in urine, die vooraf was geneutra-
liseerd. Of deze laatste urine onder invloed van den
bacil ook zuur werd, geven zij echter niet aan.

■ Bij zuurstofafsluiting vonden zij voldoenden groei,
maar alleen in cultures in vloeibare media. Op een
vasten cultuurbodeni kwam niets op; maar lieten ze na
3, 6 of zelfs 28 dagen de lucht in de serumbuisjes toe-
treden, dan begon de cultuur zich nog te ontwikkelen.
Zij nemen aan, dat onder deze omstandigheden het virus
niet afsterft, maar latent blijft, omdat zij meestal zagen,
dat de kolonies bij toetreding der lucht weer opschoten.

Wanneer zij reeds flink opgekomen cultures op
Lobfpleesoh serum, gedurende 8 — 10 dagen onder de
klok van Buohner plaatsten, constateerden zij een sterke
verzwakking der virulentie, waarschijnlijk het gevolg
van het afsterven van een groot gedeelte der bacillen.
Deze virulentieafname was echter niet duurzaam, na
enkele dagen aan de .lucht gestaan te hebben, waren
de cultures weer even virulent als vroeger.

\') J. A. van den l^rink. liijclrage tot de kennis van de werking-
var het diphtherieferment. Proefschrift. Utrecht 1890.

pathologisch Iah oratorium alhier verricht, in 1890 ver-
schenen, kon de resultaten van Roux en Yersix
omtrent löactieverandering der diphtherie-houilloncultures
en omtrent den invloed der reactie op de giftigheid
geheel bevestigen.

Een hoogst gewichtige studie, vooral voor de, kennis
van het diphtheriegif, levérde in 1892 Guinochet
Zooals reeds door d\'Espine en de Maeionag was gedaan,
kweekte hij den bacil in urine, maar hij nam daarvoor
volkomen eiwitvrije urine, ten minste een zoodanige,
waarin alle gewone eiwitreacties negatief uitvielen.
Hij toonde aan, dat ook in dergelijke urine diphtheriegif
geproduceerd werd. En wat vooral van gewicht is, hij
vond dat, evenals bij bouillon, de urine, die eerst alka-
lisch was, zuur werd en later weer alkahsch, en dat ze
alleen dan toxisch was, wanneer ze voor de tweede
maal alkalisch reageerde. Hij gebruikte voor deze
proeven de urines van vier normale personen.

In het uitgebreide werk van Escheeich over aetio-
logie\' en Pathogenese der diphtherie zegt deze, door zijn
studies over diphtherie algemeen bekende onderzoeker,
dat hij de zure reactie in zijn bouilloncultures dikwijls
reeds na 30 uur zag ontstaan, maar meestal was ze den
derden dag duidelijk aan te toonen en nam in de
volgende dagen nog in intensiteit toe. De omslag in de
alkahsche reactie trad bij hem op zijn vroegst op:

\') Guinochet. Contribution à l\'étude de la toxine du bacille de la
diphtérie. Archiv, de médécine éxperim. et d\'anat. patholog. T. .IV.
1892. p. 487.

EscHERicir. AetioloËjie nnd Pathogenese der epidemischen Diph-
therie. I. Der Diphtheriebacillns A. Höluek. Wien. 1891.

7 weken na de enting; in liet grootste getal der in die
richting onderzochte cultures echter pas in de S\'i® of
maand. De alkalische reactie bleef dus bij hem veel
langer uit dan bij Roux en Yeesin , want, hoewel deze
laatsten niet direct aangeven, wanneer bij hen de
omkeer der .reactie plaats greep, valt toch uit hunne
opgaven af te leiden, zooals Escheeich o-pmerkt, dat hun
bouiUon na 23—42 dagen weer alkalisch was geworden.

De omkeer bleef ook bij Escheeich uit, wanneer de
bouilloncultuur van de lucht was afgesloten. Ze trad
veel sneUer in (reeds op den dag), wanneer lucht
werd doorgeleid, zooals dit door, middel van de door
Fbenbaoh aangegeven- ballons mogelijk is. Was er
glycerine in den bouillon, dan bleef de omslag in de
alkaüsche reactie ook uit.

Hij gebruikte bouiUon bestaande uit: vleeschinfuus
met pepton l^/o, keukenzout 0,5 "/„ en met of zonder
druivensuiker, want, zegt hij, druivensuiker wordt door
den bacil niet in merkbare mate omgezet en heeft, aan
den voedingsbodem toegevoegd, geen invloed op den groei.

Den groei in bouiUon beschrijft hij als Zaeniko , maar
merkt op, dat niet alleen de soort van bouillon, maar
ook de hoedanigheid en de reactie van den voedings-
bodem en het vegetatievermogen van de cultuur daarop
wel van invloed zijn.

Tsiklinsky \') uit zich over groei en reactieverandering
van diphtherie-bouilloncultures aldus: „La ^culture sur

\') M"® P. Tsikltnsky. La diphthérie. Etat actuel de nos connais-
sances bactériologiques. R,fivue générale des sciences pures et appliquées.
N». 23. 1894.

bouillon offre un aspect spécifique : le liquide reste
clair, tandis qu\'à la surface apparaît un voile qui se
colle aux parois: ce voile est formé de bacilles diphté-
riques enchevêtrés. Si l\'on abandonne la culture à
elle-même, le mifieu devient acide au bout de 15 jours
à peu près; après quoi il redevient alcalin."

IvuPEiANOw, die in het vorige jaar in het laborato-
rium. van Loeppler een onderzoek verrichtte over immu-
niteit bij diphtherie, ondervond ook de moeielijkheid
verbonden aan het bereiden van een diphtheriegif van
constante sterkte, dat hij noodig had, om de immuni-
seerende kracht van bloedserum te bepalen.

Hij onderzocht de giftigheid van cultures in pepton-
bouillon (aldus samengesteld: bouillon 100, pepton 1.0,
keukenzout 0,5, met carbon, natric. zwak alkalisch
gemaakt) 2, 4- en 6 maanden na de enting. Het filtraat
van de 2 maanden oude cultuur doodde, in een hoeveel-
heid van 1 cm® bij een cavia van 180 grm. ingespoten,
dit dier niet. Er ontstond alleen licht oedeem op de
plaats\' van injectie en later nécrosé.

Het filtraat van de 4 maanden oude cultuur was nog
zwakker en dat van 6 maanden zelfs zóó zwak, dat het
in de hoeveelheid van 5 cm® niet in staat was een cavia
te döoden. Hij kon dus op deze manier geen gif
verkrijgen, dat sterk genoeg was voor zijn doel.

Ongeveer even ontmoedigende resultaten, wat gifpro-
ductie aangaat, verkreeg hij door filtratie van 6 en 8

1) J. Kupeianow. Experimentelle Beitrage zur Frage der Immunität
bei Diphtherie. Centraiblatt f. Bacteriol. u. Parasiteiik. 1894. Bd. XVI.
No. 10/11.

Op voorstel van Loeffler nam hij daarom de volgende
proeven. Hij maakte pepton-bouillon vrij sterk alkalisch
met kaliloog, voegde nu aan gelijke gedeelten van dezen
bouillon normaal zoutzuur toe in de hoeveelheden van
10, 20, 30, en 40 cm-\' pro liter, terwijl hij bij één ge-
deelte niets deed. Op deze wijze verkreeg hij dus 5
verschillende bouiUons. De bouihon, waaraan geen zout-
zuur was toegevoegd, reageerde vrij sterk alkahsch. die
waaraan 10 "/oo was toegevoegd, neutraal, de overige meer
of minder zuur voor lakmoespapier. Al deze proeven
werden met dezelfde diphtheriebaciUen geënt. Ze tierden
het best in die met 10 zoutzuur, voldoende in die
met 20 "/oo zoutzuur en in die zonder zoutzuur, terwijl
die met 80 7oo ^0 7oo slechts zeer zwakken groei
vertoonden. Het filtraat van de cultuur m bouiUon met
10 7üo zoutzuur had na 2 weken zoo sterke toxiciteit,
dat 0,16 de dosis letalis minima pro kilo cavia vormde.
Het Altraat der 3 weken oude bouilloncultuur met 20
zoutzuur had slechts een zeer geringe toxiciteit. Daar-
entegen was het Altraat der 8 weken oude cultuur,
waaraan geen zoutzuur was toegevoegd, zoo sterk giftig
dat 0,01 cm-"® een cavia van 500 grm. in 2-3 dagen
doodde, dus minstens 8 malen sterker dan het Altraat
van den bouillon met 10%o zoutzuur; het was bijna
even sterk als een 2 dagen oude levende cultuur.

Merkwaardig is het feit, dat de sterkste gifprocluctie
niet had plaats gegrepen in den bouillon, waarin ■ de

sterkste groei was. De schrijver zegt dan ook: „Nach
den vorstehenden Versuchen hat es den Anschein, als
oh, abgesehen von der Virulenz der Kultur, der Grad
der Alkalescenz der Bouillon das ausschlaggebende
Moment bei der Giftbildung sei."

Toen hij voor een latere proef weer een sterkwerkend
gif noodig had, nam hij dus een, nauwkeurig als de
bovenbeschreven vervaardigden, peptonbouillon, dien hij
evenzoo met kaliloog alkalisch maakte, maar tegen alle
verwachting verkreeg hij toen een veel zwakker gif.
Hij had het dus nog lang niet in de hand. Intusschen
leverde hem een, met carbonas natricus zwak gealkali-
seeide, peptonbouillon, weer een zeer werkzaam gif.

Verdere stucbes over gifproductie in bouillon, schijnt
Kuprianow , daar het met zijn onderzoek niet in direct
verband stond, niet gemaakt te hebben.

Als een doorslaand bewijs van de onbekendheid,
waarin men verkeert omtrent de voorwaarden, onder
welke de bacil zijn gif produceert en men het kan yer-
krijgén, en het, uit die onbekendheid voortspuitende, sterk
uiteenloopen van de meeningen der onderzoekers, wü ik
hier de opvatting van Scheijrlen weergeven, zooals hij die
onlangs heeft bekend gemaakt in een referaat van zijne
hand in het Centralblatt für die medicinischen Wissen-
schaften \')• Hij zegt daar: „Die Darstellung des Diph-
theriegiftes, das zur möghchst starken Schutzimpfung

ScHEüULEN. Centralblatt f. die med. "Wissenschaften. 1895. N". 5.
blz. 78. Eef.: Sur la sérnmthérapie au nom d\'une Commission Com-
posée de M. M. Bbbgekon, Cadet de Gassicouet , Feodst et Steauss
ra23porteur. Bullet, de l\'acad. de med. Paris. 1894. N». 42 en Le
Progrès medio. 1894. N». 42.\'

gebraucht wü-d, geschieht auf die Weise, dass man
eine 24 stündige Diphtherie-kolonie in einen Kolben mit
alkalischer Peptonbouillon bringt, und dann die Kolben
in den Brutofen stellt; dieselben sind seithch mit einem
Glasrohr versehen, das eine dauernde Luftcirculation
ermöglicht. {Biese seitliche Röhre ist nicht nöthig; die
Luftcirculation hat auf die Gifthildung keinen Einfluss;
es ist nur nöthig, die Kolben so lange im Brutofen zu
lassen, his die Beaction deutlich und dauernd sauer
geworden ist, was in 3 — 6 Wochen geschehen ist. Bef)

Q g. dieses Giftes tötet ein -500 g. schweres Meer-
schweinchen in 24 Stunden."

Volgens SoHEURLBN is dus juist een zure reactie van
de vloeistof noodig, om een hoogen graad van giftigheid
te verkrijgen.

Eindelijk rest mij nog te vermelden, wat in de
verschiUende hand- en leerboeken der bacteriologie, die
ik heb kunnen raadplegen, over die questie gezegd
wordt. Men vindt ze in het geheel niet aangeroerd,
zooals bij Günther, b Feaenkel en Peeiepee,^) of wel,
men spreekt alleen met enkele woorden van de door
Roux en Yersin ontdekte reactieverandering als van
een constant optredend verschijnsel bij diphtherie-
houilloncultures, zoo: Heim, Cornil et Babes, *)

C. Günthek. Einführung in das Studium der Bakteriologie.
Leipzig. G. Thieme, 189L

C. FnäNKEL und E. Ppeifpeb. Mikrophotographisclier Atlas der
Bakterienkunde. Berlin. A. Hirschwald, 1892.

L. Heim.. Lehrbuch der bakteriologischen Untersuchung und
Diagnostik. Stuttgart. F. Enke, 1894.

Macé , b wurtz. De groei in bouillon wordt ook beschre-
ven als een troebelheid, die echter weldra overgaat in de
vorming van een kruimelig praecipitaat op den bodem,
terwijl de bovenstaande vloeistof helder wordt en blijft.
Heim schrijft dit laatste toe aan het ontbreken der
eigen beweging van den diphtheriebacil.

Ziedaar alles wat ik, met betrekking tot de gifpro-
ductie in diphtherie-bouiUoncultures, uit de uitgebreide
ütteratuur over de bacteriologie der diphtherie heb
kunnen verzamelen.

Alle onderzoekers zijn dus overtuigd van de reactie-
verandering van diphtherie-bouilloncultures en van den
grooten invloed van de reactie van het filtraat op zijn
giftige werking.

Bij de fabricatie van antidiphtherisch genees-serum,
gelijk die te Höchst, Berlijn en andere plaatsen op
groote schaal geschiedt, schijnen verschillende methoden
gebruikt te worden. Nadere bijzonderheden daaromtrent
zijn mij evenwel niet bekend. Te oordeelen naar de
maximale sterkte van het antidiphtherisch serum, dat
de fabrieken van Meister Lucius en Schering in den
handel brengen, ondervindt men daar bij de gifproductie
blijkbaar nog moeielijkheden.

Indien althans daar constant sterk vergif werd ver-
kregen zou de maximumsterkte steUig reeds meer dan
200 eenheden Behring-Ehrlich bedragen.

1) Macé. Traité pratique de bactériologie. Paris. Baillièkb et
Fils. 1893. Ed. 2e.

Zooals reeds in de inleiding is vermeld, had prof.
Speonok in strijd met aUe, in het vorige hoofdstuk
genoemde onderzoekers, waargenomen, dat zijne aanvan-
kelijk zwak alkahsche bouiUoncultures lang niet constant
na eenigen tijd een zure reactie hadden aangenomen.
Het was dus voor mij in de eerste plaats aangewezen
de reactie van eenige bouiUons, waarin diphtheriebaciUen
werden gekweekt, nauwkeurig na te gaan. Ik nam
daartoe een drietal in het laboratorium aanwezige bouil-
lons, aUen uit kalfvleesch vervaardigd volgens hetzelfde
hier gebruikelijke procédé, maar op verschillende tijden.

Ze bestonden uit kalfsvleeschinfuus van 1 deel vleesch
op 2 deelen water, waaraan was toegevoegd 1
pepton Witte en 0,6°/^ keukenzout, terwijl de reactie
zwak alkalisch was gemaakt met carbonas natricus.

De reactiebepaUng geschiedde in aUe volgende proeven
door met een vooraf gegloeide platinanaald een drupje
vloeistof uit het buisje te nemen en dat te brengen op
een lakmoespapiertje. Zoodoende kon men hetzelfde
buisje herhaalde malen onderzoeken zonder dat daardoor

ooit yerontreiniging der ciütuur is voorgekomen. Was
de wattenprop reeds meerdere malen afgenomen, om de
reactie te bepalen, en constateerde men daarna plotseling
een verandering van de reactie, dan werd regelmatig
uitgezaaid, om de reinheid van de cultuur met zekerheid
vast te stellen.

In alle volgende proeven werden de cultures gekweekt
bij 35° —36° C. Ik bezigde drie exemplaren van diph-
theriebacillen, die in het laboratorium aanwezig waren
en waarmede men bij cavia\'s proeven had verricht, om
na te gaan, of zij geschikt waren voor gifproductie.
Daarbij was gebleken, dat 0,1 cm-\'\' van een 24-uren
oude bouilloncultuur, onder de huid gespoten, cavia\'s
van 200 — 300 grni. binnen circa 24 uren doodde.

Het zij hier nog vermeld, dat het Altraat van de 17
dagen oude cultuur, waarover in de inleiding is
gesproken, en dat een giftigheid bezat 5 malen sterker
dan het normaalgif van Behring (1894), duidelijk alka-
lisch reageerde. Indien er dus een zure reactie had
bestaan, was deze relatief van korten duur geweest,
want de onderzoekers, die een bepaalden tijd aangeven
na verloop van welken bij hen de zure reactie weder
verdween, met name Roux en Yeesin en Escherioh,
konden geen van allen na een zoo korten tijd den
omslag in de alkalische reactie constateeren. Bij later
onderzoek echter van denzelfden bouillon bleek, dat er
feitelijk in het geheel geen zure reactie volgde, wanneer
diphtheriebacillen, uit pseudo-membranen van verschil-
lende diphtherielijders geïsoleerd, daarin waren uitgezaaid.

Ik zal nu in de volgende proeven de resultaten ver-
melden, die ik verkreeg bij nauwkeurige bepaling dei

reactie in het drietal kalfsvleesch-bouillons, die in het
laboratorium aanwezig waren.

Eene serie buisjes, die elk 10 cm-\'\' van een dier
bouihons bevatten, werden na zorgvuldige sterilisatie en
controle op hun steriliteit, geënt met denzellden bacil,
waarmede de bovengenoemde hooge giftproductie ver-
kregen was (in het laboratorium geclassificeerd als
diphtheriebacil n°. 101). Om de 2 à 3 uur werd de
reactie bepaald. Na 7 uur was deze amphoteer, na
20 uur duidelijk zuur, dit bleef zoo gedurende bijna
3 dagen, toen werd ze weer zwak zuur, amphoteer;
om den dag na de enting weer duidelijk alkahsch
te worden. G-edurende de volgende 21 dagen bleef de
reactie, dagelijks opgenomen, dezelfde, werd eer nog
sterker alkahsch.

10 uren na de enting was de bouiUon reeds hebt
troebel en werd dit gaandeweg al meer ; toen echter de
zure reactie optrad, scheen de groei niet voort te gaan,
langzamerhand zonken de bacteriën op den bodem,
vormden daar een korrehg praecipitaat en de boven-
staande vloeistof werd weer helder. Dit duurde totdat
de reactie alkahsch werd, waarbij in korten tijd de
geheele vloeistof intensief troebel werd, zij bleef dit nu
gedurende verscheidene dagen; langzamerhand klaarde
ze van boven af aan weer op, terwijl zich een volu-
mineus , vlokkig praecipitaat op den bodem verzamelde.

Op deze wijze van groei, die ik, in overeenkomstige
bouillons, bij al mijne proeven heb waargenomen, wensch
ik later nog terug te komen.

Een cultuur van diphtheriebacil 101, in een andere
voorhanden kalfsvleeschbouihon, die, evenals de vorige,
gemaakt was volgens het hier gebruikelijke procédé,
dat ik heb beschreven, werd gedurende 21 dagen evenals
de vorige op hare reactie onderzocht. Tot mijne ver-
rassing werd deze echter heelemaal niet zuur, de alka-
hsche reactie hleef steeds duidelijk, nam zelfs in de
laatste dagen eenigszins in intensiteit toe. De groei in
dezen bouillon was een voldoende. Reeds na 9 uur was
de bouillon licht troebel en den volgenden dag intensief;
dit bleef aldus gedurende ongeveer 12 dagen, toen
klaarde hij langzamerhand op en na 3 weken was er
een sterk, vlokkig praecipitaat op den bodem, dat door
licht schudden van het buisje opdwarrelde en de vloei-
stof troebel maakte.

Het alkalisch blijven van dien bouillon was geenszins
een gevolg van verontreiniging met andere bacteriën.
Controle-uitzaaiingen heten omtrent de zuiverheid der
cultuur geen twijfel over.

Daar aUe onderzoekers als een kenmerkende eigen-
schap van den bacil beschrijven, dat hij de bouillon-
cultures na eenigen tijd zuur doet worden, had ik hier
dus een geheel afwijkend resultaat verkregen, dat tot
verder onderzoek aanspoorde. \'

Ik bepaalde weder de reactie van een cultuur van
denzelfden bacü 101 in een derden kalfsvleeschbouihon.
Deze cultuur was den volgenden dag duidelijk zuur,
bleef dit gedurende 11 dagen en werd toen weer alka-

lisch. De groei kwam geheel overeen met den in den
eersten bouillon beschrevenen: zoolang de reactie zuur
bleef, was er een korrehg praecipitaat op den bodem
met een heldere, bovenstaande vloeistof; zoodra de alka-
lische reactie intrad, werd deze weer troebel.

Daar nu de nadeelige invloed van het zuur op de
giftigheid van het Altraat bekend is en een sterke gift-
productie was geconstateerd in een cultuur, die steeds
alkalisch bleef, lag het voor de hand de sterke giftige
werking met het ontbreken der zure reactie in verband
te brengen. Het was dus aangewezen te trachten de
oorzaak te vinden van die gewoonlijk voorkomende
reactieverandering; aldus zou men de afwijkende resul-
taten bij mijn proeven verkregen kunnen verklaren
en zou men in staat zijn wiUekeurig bouiUons te ver-
vaardigen, die steeds alkahsch bleven of zuur werden,
In dergelijke verschiUende bouiUonsoorten zou men dan
de gifproductie kunnen bestudeeren.

AUe in de vorige proeven onderzochte cultures waren
met denzelfden bacü geënt, ze hadden onder zooveel
mogelijk identische omstandigheden verkeerd, wat tem-
peratuur, vorm en vulling der buisjes aangaat. Men
moest dus wel in de eerste plaats in de samenstelUng
van den bouiUon de oorzaak zoeken van het al of niet
optreden der zure reactie. Hoewel nu altijd nauwkeurig
dezelfde methode gevolgd werd bij de vervaardiging van
dien voedingsbodem, is toch de samenstelUng der daarbij
gebruikte ingrediënten, speciaal van het vleesch, te
wisselend, om bouiUons met een constant gehalte aan
verschiUende stoffen te doen verkrijgen.

dan ook inderdaad reeds meermalen gewezen, echter
juist niet direct met het oog op diphtheriecultures.

Door de onderzoekingen van Petrusghky ^ vooral had
men verschiUende bacteriën leeren kennen, die door hem
in lakmoesmelk, gekweekt, duidelijk zuur produceerden
en andere, die daarentegen alkah vormden. Onder de
zuurvormers behoorden o. a. bacülus typhi abdom, bacillus
pneumonicus Friedländer, bacillus coü communis, bacUlus
prodigiosus.

Von Sommaruga verrichtte in 1892 een dergelijk
onderzoek; hij verkreeg echter bij dezelfde microben
resultaten, die soms lijnrecht stonden tegenover die
van Petrusghky.

Zoo waren bac. typhi abdom, bac. pneumonicus Fried-
länder, bac. coü communis, bij hem alkalivormers.

Von Sommaruga gebruikte voor deze proeven bouiUon
gêmaakt uit 1 kUo vleesch pro liter met 1 pepton en
0,5 keukenzout. Juist aan dit verschil in samensteUing
van zijn voedingsbodem met dien van Petrusghky
schrijft hij de sterk afwijkende resultaten toe. Hij wijst
er vooral op, dat in den voedingsbodem van dezen laatsten
melksuiker voorkomt en zegt: „So gut es nun bekannt
ist, dass manche Bacterien eine Zuckerart oder minde-
stens das bis zu einem gewissen Grade sich ähnhch ver-
haltende Glycerin zu ihrer Ernährung geradezu bedürfen,

\') Petrusghky. Bakterio-clieinisclie Untersucbungen. Centralblatt. f.
Bakteriol. ii. Parasitenk. 1889. Bd. VI. S. 625 ii. 657. 1890. Bd. VII.
S. 1 u. 49.

2) Von Sommaruga. Ueber Stoftvvecliselproducte von Mikroorga-
nismen. I MittheiJ. Zeitschrift f. Hygiene ii. Infectionskrankheiten. 1892.
Bd. Xn. S. 273.

so ist es nicht zu bezweifeln, dass andere Arten den
Zucker, ohne ihn gerade zu bedürfen, doch zu zersetzen im
Stande sind". Schabdingee, Nenoki, Bisghlek, Blachstein,
Bouteoux en vele andere onderzoekers hebben dan ook
die omzetting van glucose en andere suikers.in zuur,
speciaal melkzuur, zien plaats grijpen onder invloed
van verschillende bacteriën.

Een interessant onderzoek over deze questie, met
betrekldng op bac. typhi abdom. en bac. coh commun.
deelde Péeé mede. Hij vermeldt vooreerst de zeer
uiteenloopende meeningen over het al of niet zuur wor-
den van typhuscultures in geneutrahseerden bouillon
en de onderscheiding, die sommigen hebben willen maken
door middel van deze eigenschap tusschen den typhus-
bacil en den bac. coli communis.

De elkander tegensprekende resultaten, die hij daarbij
aanhaalt, zijn volgens hem: ook vooral te verklaren uit de
verschillende samenstelling der gebruikte voedingsmedia.

De bouillons bevatten, behalve gecomphceerde N-hou-
dende verbindingen, ook stoffen tot de groep der kool-
hydraten behoorende, die niet altijd dezelfde kunnen
zijn, maar veranderen met den toestand van verschheid
van het vleesch of met de wijze van bereiding. IVlen kan
er namelijk in aantreffen: glycogeen, glucose en melkzuur.
Afhankelijk van het oorspronkelijk gehalte aan glycogeen
in de spieren van het dier bij den dood en van omstan-
digheden , die in het vleesch na den dood een omzetting
in glucose en verder in andere producten, voornamelijk

\') PÉEÉ. Contribution à la biologie du bacterium coli commune et
du bacille typhique. Ann. de l\'Inst. Past. n®. 7 1893.

melkzuur, hebben kunnen veroorzaken, is het gehalte
aan glycogeen, glucose of melkzuur in het vleesch zeer
wisselend.

Péré nu maakte oplossingen van eiwitachtige lichamen,
voegde daaraan verschillende zouten toe en kreeg aldus
voedingsmedia, die geen koolhydraten bevatten en waarin
beide bacteriën, bac. typhi abdom. en bact. coh comm.,
goed groeiden. Beide vormden, als ahe bacteriën, die de
eiwitachtige stoffen ontbinden, ammoniak en maakten
zoo het cultuurmedium alkalisch, eerst echter was er
altijd voor beiden een korte periode van aciditeit. Maar
in bouihon (gemaakt uit gelijke deelen vleesch en water)
was deze aciditeit veel sterker. Men mag dus aannemen,
dat in bouihon het zuur niet geheel afkomstig is van de
eiwitachtige stoffen, maar voor een groot deel van kool-
hydraten. Is dit juist, zoo redeneerde Péré , dan moet
men ook uit vleesch, naar gelang het korter of langer
bewaard is, en er dus meer of minder glucose in aan-
wezig is, bouihons kunnen verkrijgen, die verschillende
aciditeit of zelfs in het geheel geen aciditeit vertoonen.
Die conclusie bleek juist te zijn. Hij nam een versch
stuk rundvleesch, bewaarde het bij 10°—13° en maakte
op verschillende tijden door hetzelfde procédé daarvan
bouihons. In den van versch vleesch bereiden bouillon
produceerde zoowel de bac. typhi als de bac. coh comm.
zuur. Was het vleesch daarentegen 40 tot 48 uren bij
genoemde temperatuur bewaard, dan brachten in de
daaruit bereide bouihons de genoemde bacteriën bij hun
groei geen zuur voort.

De bovengemelde elkander tegensprekende resultaten
werden aldus door Péré voldoende verklaard. Alles

hangt af van de voorwaarden, waaronder de proef ge-
schiedt en die voorwaarden zijn niet voldoende aange-
duid, wanneer men aUeen zegt, dat men in bouiUon
cultiveert. Dat zooveel gebruikte voedingsmeclium heeft
een te sterk variëerende samenstelling, om zonder meer
voor de studie van de functies der microben te kunnen
dienen.

Ook F Am, O die opmerkte dat bact. coü commune ook
gas ontwikkelt in gewonen bouiUon, zonder toevoeging
van glucose, wijst er op, dat dergelijke bouiUon toch
reeds een zekere hoeveelheid glucose bevat, afkomstig
uit het vleesch; hij bepaalde die hoeveelheid uit de
gasontwikkeling in de cultures en vond dat ze variëerde
van 0,06 — 0,1 op 100 deelen bouiUon.

Het lag derhalve voor de hand te ondersteUen, dat
ook bij het zuur worden van met den diphth\'eriebacil
bezaaiden bouiUon, koolhydraten een rol spelen. Te meer,
waar zóó in het oog springende verschillen werden
waargenomen, gelijk die boven bij bouiUons, schijnbaar
van gelijke samenstelleng, door mij zijn beschreven.

Daar nu evenwel Escheeich heeft beweerd, dat
druivensuiker niet in merkbare mate door den bacü wordt
omgezet, scheen het wenschelijk eenige proeven te ver-
richten om Eschbeioh\'s onderzoekingen te controleeren.
Ik deed dat door aan een bouiUon, die gebleken was
alkahsch te blijven., druivensuiker toe te voegen.

Pane. Sulla diversa quantita di glucosio clie si trova nel brodo
in rapporto al diverso grado di fermentazione di alcuni batteri. Eivista
clinica ■ e terapeutica 1892, p. 577. Keferaat in Baumgarten\'s Jahres-
bericht 1892, p. 462.

Een vrij groote lioeveellieid van den bouillon in proef II
onderzocht, die dus door den diphtheriebacil niet zuur
gemaakt werd, was nog in het laboratorium aanwezig.

Met dien bouillon werden 5 kolven, van denzelfden
vorm en gelijke grooiite, gevuld. Iedere kolf bevatte
200 cm®; in elke van deze werd nu een verschillende
hoeveelheid glucose opgelost, zoodat men verkreeg:
Kolf A. met 0,2 mgrm. glucose = 0,0001
Kolf B. met 1 mgrm. glucose = 0,0005
Kolf C. met 2 mgrm. glucose = 0,001 7^.
Kolf D. met 20 mgrm. glucose = 0,01
Kolf E. met 200 mgrm. glucose = 0,1
Uit iedere kolf werden 3 buisjes gevuld, elk met
ongeveer 10 cm^

De kolven zouden dienen, om. later gefiltreerd te
worden tot onderzoek van de toxiciteit, terwijl de
buisjes gebruikt werden om de reactie na te gaan.

iSTadat de bouillons in de kolven en buisjes zorgvuldig
gesterihseerd en gecontroleerd waren, werden ze geënt
met diphtheriebacil 101 uit een B-dagen oude, alkalische
bouilloncultuur.

Alle cultures waren den volgenden dag reeds duidelijk
troebel. Die troebelheid nam in de eerste dagen nog
toe en bleef toen stationnair. Verschil in groei tusschen
de verschillende bouillonsoorten was niet op te merken.

De reactie in de buisjes werd bepaald eenige uren na
de enting, den volgenden dag 2 malen en verder dage-
lijks éénmaal. De waarneming duurde 19 dagen.
Alle bouillonsoorten nu bleven alkahsch; ook de kolven

werden onderzocht en eveneens alkahsch gevonden.
Toch was er een opmerkelijk verschil in de intensiteit
der reactie. Den dag bleek reeds duidelijk, dat de
alkahciteit van den bouillon met 0,1 glucose zwakker
was geworden. Den volgenden dag was dat verschil
nog duidelijker en men kon toen, door snel achter
elkaar met de platinanaald een weinig van de verschik
lende bouihons op hetzelfde lakmoespapiertje te brengen,
een in intensiteit van kleur afdalende reeks vlekjes ver-
krijgen, waarbij bleek, dat de bouillons met 0,0001
0,0005 % en 0,001 het sterkst alkahsch, die met 0,01
zwakker en die met 0,1% verreweg het zwakst alkalisch
waren.

Gedurende 5 dagen ongeveer bleef de alcaliciteit in den
bouiUon met 0,1 % duidelijk zwakker dan in de overige.
Na dien tijd werd ze in aUe buisjes gelijk en nam in
het algemeen een weinig toe.

Uit dit resultaat kon men dus afleiden, dat de bacü
n°. 101 in bouiUons met hoeveelheden glucose van 0,1 7,
en minder, niet in staat was een zure reactie te
voorschijn te\' roepen, maar er werd blijkbaar toch
zuur geproduceerd, kenbaar aan de afname in intensiteit
der oorspronkelijke, alkahsche reactie; de hoeveelheid
zuur was echter niet voldoende om die te neutrahseeren.

Het scheen dus wenschelijk de proef te herhalen met
denzelfden bouUlon, waaraan grootere hoeveelheden
suiker waren toegevoegd.

Met denzelfden bouiUon, waarin, zooals gezegd, bacü
n". 101 geen zuur vormde, werden weer 5 kolven gevuld,

4 er van elk met 200 cm® en 1 met 100 cm®, wijl
de voorraad bouiUon was uitgeput. De volgende hoeveel-
heden suiker werden aan elke kolf toegevoegd:
Kolf A. 400 mgrm. glucose = 0,2
Kolf B. 800 mgrm. glucose = 0,4
Kolf C. 1200 mgrm. glucose = 0,6 7^.
Kolf D. 1600 mgrm. glucose = 0,8
Kolf E. 1000 mgrm. glucose 1
üit elke kolf werden weer drie busjes gevuld met
ongev. 10 cm®. Twee van elke serie dienden voor de
reactiebepaling der diphtheriecultures; in één werd een
pseudo-diphtheriebacü geënt, waarop ik later zal terug-
komen.

De enting der kolven en buisjes geschiedde 14 Februari,
10,30 V.m. met bacü n". 101, uit een 8-dagen oude,
alkaüsche bouihoncultuur. 4,30 n. m. waren ahe buisjes
nog alkahsch. Den volgende dag, 10,30 v. m., dus na
24 uur, waren alle duidelijk zuur. Deze zure reactie
bleef nu bestaan, werd zelfs in de eerste dagen nog
wat -sterker. De proef met de buisjes werd voortgezet
gedurende 74 dagen, van 14 Februari tot 29 April. Op
23 Maart kwamen bij enting uit den bouihon met 0,2
glucose op glycerineagar nog enkele diphtheriekolonies op.
Hoewel de bouillon in de buisjes door uitdroging tot
ongeveer Vs van zijn oorspronkelijk volumen was ge-
slonken en de bacillen 36 dagen in een vrij intensief zure
vloeistof hadden verkeerd, bleken ze dus nog niet afge-
storven te zijn. Op 18 April echter kwam bij herha-
ling van de uitzaaiing op glycerineagar en op serum
niets meer op. Ook in de andere bouihons waren de
bacihen toen afgestorven.

De kolven werden na 19 dagen geliltreerd. Al die
bouillons reageerden ook zuur, behalve die met 0,2
glucose; deze was alkalisch geworden, maar bij uitzaaiing
op glycerineagar bleek deze cultuur niet zuiver gebleven
te zijn. Het microscopisch onderzoek der opgekomen,
in het geheel niet op diphtherie gelijkende kolonies
toonde namelijk enkel coccen aan. De overige cultures
waren zuiver.

Wat den groei in de buisjes en kolven betreft, deze
kwam vrijwel overeen met de beschrijving, die Zarniko \')
geeft van den typischen groei in bouillon. Slechts een
kortdurende, spontane troebelheid was er ontstaan, toen,
ongeveer samenvallend met het tijdstip, waarop de zure
reactie intrad, de vloeistof ophelderde en de bacteriën
op den bodem zonken. Deze helderheid nu bleef steeds
bestaan, hoewel het korrehge praecipitaat op den duur
toch ook eenigszins was toegenomen.

Wanneer de buisjes eenigen tijd rustig hadden gestaan,
moest men vrij sterk schudden, om de vloeistof troebel
te maken. Deze troebelheid verdween dan weer lang-
zamerhand.

Ik kan het derhalve niet eens zijn met Escherich
wanneer hij zegt, dat druivensuiker niet in merkbare
mate door den diphtheriebacil wordt omgezet.

Daar in de vorige proeven geen omslag van de zure
reactie werd geconstateerd, de cultuur öf alkalisch bleef,
öf zuur werd en bleef, kwam het mij waarschijnlijk
voor, dat ik in de tweede serie (proef V) te veel suiker
had toegevoegd, zoodat de omslag wel zou te voorschijn

komen als ik een quantiteit suiker koos, die inlag
tusschen de hoeveelheid bij proef lY en die bij proef V
gebezigd.

Een buisje, gevuld met denzelfden bouiUon, maar
waaraan nu 0,15 7o glucose was toegevoegd, werd geënt
met bacil n°. 101 uit de stamcultuur. Den volgenden
dag was de bouillon zuur, dit bleef aldus gedurende
3 dagen; daarna nam hij langzamerhand weer een
duidelijk alkaüsche reactie aan. Gedurende 40 dagen
werd de cultuur nog geobserveerd; maar zij bleef die
reactie behouden. Wel nam de intensiteit der alkahsche
reactie toe.

Een tweede buisje met denzelfden bouillon met 0,15 7o
glucose werd geënt met een anderen diphtheriebacil,
bekend als n°. 102. Deze cultuur was den volgenden
dag\' amphoteer, den derden dag duidelijk zuur, bleef
dit 4 dagen lang en werd toen weer alkalisch.

0,15 7o glucose was dus ongeveer de juiste hoeveel-
heid, welke een bouillon moest bevatten, wilde men
door den groei van beide gebezigde bacillen daarin
nog een omslag van de zure in de alkahsche reactie te
voorschijn zien komen, namelijk onder de omstan-
digheden, waarin de cultuur van beiden had plaats
gegrepen.

G-elijk reeds vermeld, hebben Roux en Ybrsin het
eerst aangetoond, dat het ontstaan der alkalische
reactie in diphtlierie-bouiUoncultures te wijten is aan

oxydatie der N-houdende stoffen in den bouillon,
voornamelijk gekenmerkt door het gevormd worden
van ammonium-magnesiumphosphaat in de cultures.
Die oxydatie grijpt niet plaats, wanneer de lucht is afge-
sloten. In de eerste plaats is dus het intreden der alka-
hsche reactie afhankelijk van de meerdere of mindere
gemakkelijkheid, waarmede de lucht kan toetreden: van
het losser of vaster zitten van den wattenprop, van de
dunnere of dikkere laag, waarin de cultuur staat in de
kolven en buisjes. Verder zijn wellicht van invloed: de
vitaliteit van den bacil en de omstandigheden, die een
meerdere of mindere indamping der cultuur kunnen ver-
oorzaken en aldus het zuurgehalte meer of minder kun-
nen doen stijgen. Al die omstandigheden, welke zich
echter onmogelijk geheel laten regelen, dient men voor
oogen te houden. Het is aldus duidelijk, dat 0,15
glucose niet de absolute hoeveelheid vertegenwoordigt,
welke een bouillon moet bevatten, opdat men daarin
door cultuur van een willekeurigen diphtheriebacil den
omslag in de alkalische reactie kunne zien ontstaan.

De groei in de bouiUons van proef VI kwam overeen
met de reeds meermalen beschrevene. Naar gelang de
alkahsche reactie afnam, kwam de helderheid voor den
dag, terwijl de vloeistof met het afnemen van de zure
reactie hoe langer hoe meer troebel werd. Deze veran-
dering had geleidelijk plaats. Toch kon men steeds, naar-
gelang men een üink troebele of heldere vloeistof voor
zich had, reeds dadelijk uit dit aspect een besluit
trekken omtrent de reactie, zonder zich ooit te vergissen;
wanneer men namelijk ook den leeftijd der cultuur in
aanmerking nam, daar steeds alkahsch blijvende cultures

op den langen duur eveneens bezinken en helder worden.
Echter vindt men in de alkalische cultuur steeds een
praecipitaat, dat meer vlokkig en kleverig is, dan het
fijnkorrehge in een zure.

Den door Zabotko e. a. als typisch beschreven groei
heb ik dus ook wel waargenomen, maar alleen in cultu-
res, die zuur werden en bleven.

De meening van Escheeich, dat ook de reactie van
invloed is op het uiterlijk der bouilloncultures, heb ik dus
bewaarheid gevonden.

De membraanvorming aan de oppervlakte, zooals
Tsiklinsky die beschryft, is mij ook dikwijls voorge-
komen , meestal in alkalische cultures, maar zonder
eenige regelmaat; zoo waren in cultures van denzelfden
bacil, in denzelfden bouihon, de membranen nu eens aan-
wezig , dan weer niet. In het algemeen heb ik den indruk
gekregen, dat men ze wel het meest vindt bij zeer
wehgen groei.

Uit de voorgaande proeven blijkt nu ten duidelijkste,
dat\' men in een bouillon, waarin de bacil geen zuur
produceert, de zure reactie der cultures kan te voorschijn
roepen door er glucose aan toe te voegen, terwijl de
geproduceerde hoeveelheid zuur stijgt evenredig aan het
gehalte aan glucose. De zure reactie ontstaat dus door
omzetting van glucose in zuur, en dit vermogen heeft de
diphtheriebacil gemeen met vele andere bacteriën.

Zooals men zich herinnert, wezen Eoux en Yeesin en
Escheeich er op, dat de zure reactie ook intreedt in
bouillon, die glycerine bevat, terwyl ze alsdan zoo sterk
wordt, dat de omslag in de alkahsche uitblijft. De
proeven, die ik hieromtrent genomen heb, zullen later

vermeld worden; alleen wil ik er hier aan herinneren,
dat VON SoMMAEUGA ook reeds zegt, dat glycerine zich
verhoudt als glucose, in zooverre het ook door de
bacteriën in zuur wordt omgezet.

Ik trachtte nu eerst gemakkelijk te bereiden, vloei-
bare voedingsbodems te vinden, die door den bacil
niet zuur gemaakt zouden worden, om aldus de ver-
moedelijk gunstige werking van het alkahsch blijven
der reactie op de giftproductie te kunnen bestudeeren
en de wisselvalligheid, die voornamelijk hij de productie
op groote schaal zoo storend is, zoo mogelijk aan
banden te leggen. Een dergelijke, niet zuur wordende
voedingsbodem zou mij dän ook kunnen dienen voor
verdere proeven omtrent den invloed van glucose en
dien van glycerine.

Op de eerste plaats was het dus noodig, dat een
zoodanige voedingsbodem geen glucose of glycerine be-
vatte, en ten tweede, moesten de bacillen er sterk
genoeg in groeien, om een voldoende toxiciteit van het
filtraat te kunnen verwachten.

Het eerst werd beproefd te kweeken in een 1 %
oplossing van pepton Witte in gedestiheerd water,
waaraan 1 keukenzout was toegevoegd, en die zwak
alkahsch was gemaakt met carb. natricus. Edoch, het
was niet mogelijk eenigen merkbaren groei der bacillen in
die vloeistof te verkrijgen, zelfs na herhaalde enting.

De samenstelling werd nu gevariëerd tot 2 7o pepton
Witte met V2 °/o keukenzout, eveneens met carb.
natricus zwak gealkahseerd. Deze vloeistof vertoonde

\'den dag na de enting reeds een lichte troebelheid;
daarin gelukte dus de groei.

Verder werd gebruik gemaakt van verschillende
vleeschextractsoorten, die in den handel voorkomen,
vooral om de gemakkelijkheid, waarmede men met die
stoffen bouillons kan vervaardigen. Het nadeel, dat
door zeer vele onderzoekers aan die vleeschextracten
wordt toegeschreven, namelijk dat ze resistente sporen
bevatten, die slechts door een zeer nauwkeurige sterili-
satie op 2 achtereenvolgende dagen te dooden zijn, heb
ik nooit ondervonden. De vloeistoffen werden gedurende
1 à ly^ uur in hoeveelheden van hoogstens 200 cm®
aan stoom van 100° C. blootgesteld, en bleken dan bij
■controle steeds steriel te zijn.

Het gelukte mij voldoenden groei te verkrijgen in
voedingsbodems van de volgende samenstelling: ■

Allen zwak gealkaliseerd met carbon, natricus.
]\\Iet elk van die vloeistoffen, alsmede met bovenge-
noemde oplossing van pepton "Witte 2 en keukenzout
0,5 werd nu een kolfje gevuld. Alle kolfjes waren
van dezelfde grootte en gelijken vorm, en bevatten

Na sterilisatie en controle werden 2 buisjes geënt
met diphtherie if. 101 uit een 3 dagen oude, reeds
gedurende 2 dagen zuur reageerende, bouilloncultuur
(bouillon van proef I). Eén buisje van elk drietal diende
voor cultuur van een pseudo-diphtheriebacil. Den eersten
dag werd nu meermalen, de volgende 20 dagen dagelijks
éénmaal de reactie van de cultuur bepaald. Deze werd
steeds alkahsch gevonden. Er was ook geen vermin-
dering van de intensiteit dier reactie te bespeuren; wel
trad er later een lichte vermeerdering op.

De groei vertoonde het in proef II en proef IV be-
schreven uiterlijk. De troebelheid werd in de eerste
dagen nog wat sterker en bleef toen stationnair; alleen
in de laatste dagen werd de vloeistof wat helderer,
terwijl het vlokkig praecipitaat op den bodem toenam.

De vergelijking van den groei in de verschillende
voedingsbodems leverde den dag na de enting het
volgende resultaat: het sterkst troebel was de bouiUon
uit Liebig, iets minder die uit Kemmerioh, nog iets
minder die uit Cibils. De oplossing van pepton
keukenzout was slechts zeer zwak troebel. Later werd
de groei in Kemmeeich iets sterker dan in Liebig en
Cibils, maar in aUe drie was een vrij sterke troebelheid
aanwezig en ontstond een vrij volumineus praecipitaat-
De oplossing van pepton -f keukenzout werd niet meer
dan Ucht troebel, helderde vrij spoedig op en vertoonde
slechts een gering praecipitaat.

Toen na een paar dagen gebleken was, dat de cultures
in de buisjes alkalisch bleven, werden ook de verschik

lende kolven geënt met denzelfden bacil, uit een der
buisjes met cultuur in bouillon Kemmerich. De groei
was ook in de kolven vrij krachtig; den volgenden dag
waren aUe troebel. Hetzelfde verschil als bij de buisjes
was ook hier op te merken: in de oplossing pepton -[-
keukenzout groeiden de bacillen niet goed, daarentegen
werden de bouiUons Liebig, Kemmerich en Cibils aUe
flink troebel; later scheen de groei in den bouiUon Cibils
iets sterker dan in de andere.

Toen de cultures 19 dagen oud waren, werden ze
gefiltreerd en de reactie van aUe alkahsch bevonden.

Het was mij aldus gelukt in bovengenoemde vloei-
stoffen , met uitzondering van de pepton-keukenzout
oplossing, voedingsbodems te vinden, die geschikt bleken
voor de cultuur van diphtheriebaciUen, terwijl ze door
deze niet zuur gemaakt werden. Evenwel zij opgemerkt,
dat de groei in die verschiUende vleeschextractvloei-
stoffeii toch altijd iets minder sterk bleek, dan die in
den bouiUon uit proef I, welke eenige dagen zuur werd,
dus glucose scheen te bevatten; enkele buisjes met
dien bouiUon gevuld waren op denzelfden tijd met
denzelfden bacü geënt en ter vergelijking naast de
extractbouiUons geplaatst. Dit was ook geschied met
eenige buisjes, gevuld met den bouiUon bij proef II
gebezigd, welke alkalisch bleef; de groei in dezen laatste
was evenwel altijd iets minder intensief dan in de
vleeschextractvloeistoifen.

Door vele onderzoekers is er dan ook reeds voor
verschiUende bacteriën op gewezen, dat ze weUger
groeien in suikerhoudenden bouiUon, dan in bouiUon
zonder toevoeging van glucose vervaardigd. Hoewel

Esoherioh b dit ontkent, schijnt het dus ook voor den
diphtheriehacillus te gelden.

Zooals men zich herinnert, had GmisrooHET ook in
cultures van den diphtheriebacU in eiwitvrije urine
productie van zuur waargenomen. Het was na de ver-
kregen resultaten geoorloofd te denken, dat de 4 per-
sonen, waarvan Guinochet de urines gebruikte, allen
diabetici waren of een z. g. glycosurie alimentaire ver-
toonden. De herhaüng zijner proeven scheen dus
wenschelijk.

De urine van een normaal persoon werd met de
meest bekende reacties nauwkeurig onderzocht op eiwit
(kookproef, proef van Heller,- van Heinsius, proef
met salpeterzuur en ferrocyaankah) en op glucose (proe-
ven van Moore , Trommer , Worm- Müller en Nylakder) ,
maar gaf met geen enkel reagens een positief resultaat.
Deze urine werd hebt alkahsch gemaakt met een ver-
zadigde oplossing van carbon, natricus; de daardoor
gepraecipiteerde phosphaten werden door filtratie door
gewoon filtreerpapier verwijderd. Daarna werden reageer-
buisjes , met de urine gevuld, gedurende 1 uur in
stoom van 100° C.\' gesterihseerd en toen ze, na 24 uur
ter controle in de broedstoof gestaan te hebben, steriel
gebleken waren, geënt met diphtheriebacil n°. 102 uit

stamcultuur. Den volgenden dag was het nog quaestieus of
de cultuur was opgekomen, den dag echter was de
urine hcht troebel en had zich een gering praecipitaat
op den l3odem verzameld ; de troebelheid nam in den loop
van de volgende dagen niet toe, wel het praecipitaat.

Gredurende 55 dagen voortgezet, werd bij die proef
de reactie steeds alkalisch gevonden. In de eerste
dagen was ook geen vermindering van hare oorspron-
kelijke intensiteit te bespeuren; na eenige weken was
ze integendeel duidelijk sterker geworden.

De proef werd nu herhaald met de mines van 3
verschillende, normale personen, welke urines even-
eens, volgens de aangegeven reacties, vrij van eiwit en
suiker bleken te zijn. Yan elke urine werden 2 buisjes
gevuld, die na sterilisatie en controle geënt werden met
3 verschillende bacillen, namelijk n°. 100, 101 en 102.
Allen kwamen op, behalve één van de met bacil n°. 100
geënte buisjes. In allen bleef de reactie weer alkahsch
gedurende de 40 dagen, die de proef duurde.

Dit resultaat bevestigde dus onze meening omtrent
den invloed der glucose. Het moest dan ook mogelijk
zijn de zure reactie te voorschijn te roepen door bij
een van de bovenstaande urines glucose te voegen,
of wel door de bacillen te cultiveeren in de urine van
een diabetesdijder. Dat werd gedaan in:

In een der bovengenoemde urines werd na alkaüsatie
en filtratie 0,15 7o glucose opgelost; 4 buisjes werden
er mede gevuld. Na sterihsatie en controle werden

2 buisjes geënt met diphtheriebacil n®. 100, de 2 andere
met diphtheriebacil n\'\'. 101.

Voorts waren 3 buisjes gevuld met de urine van een
diabetes-lijder, welke aUe reacties op suiker zeer duidelijk
vertoonde, terwijl alle reacties op eiwit negatief uitvielen.
Na alkalisatie, sterihsatie en controle werden deze
buisjes geënt met diphtheriebacil n°. 102.

Gedurende de eerste dagen was het quaestieus of de
bacil n". 100 opgekomen was, en ook later bleef zijn
groei altijd slechts zeer zwak. De andere bacillen
jf. 101 en n^ 102 kwamen beiden flink op, zelfs scheen
hun groei in suikerhoudende urine krachtiger dan in
suikervrije.

In de urine met 0,15% glucose, geënt met bacil
n°. 100, bleef de reactie steeds alkalisch, werd echter
van den lO«^®" tot ongeveer den 20®^®" dag iets minder
sterk.

In de urine met 0,15 glucose, geënt met bacil
n°. 101, werd de reactie den volgenden dag minder
sterk alkalisch, den dag amphoteer, den dag
hebt zuur, den 5\'^®" dag weer amphoteer en bleef nu de
volgende 7 dagen amphoteer, nu eens meer naar den
alkahschen, dan weer meer naar den zuren kant over-
heUende. Na dien, tijd werd ze constant weer hebt
alkahsch.

In de diabetesurine, geënt met bacil n". 102, was de
reactie den S«^®" en 4^®" dag hchter alkalisch, werd verder
zeer hebt alkahsch, toen amphoteer, en was na 9 dagen
licht zuur. Gedurende 4 dagen bleef ze duidelijk licht

zuur, werd toen 8 dagen lang amphoteer, en vervolgens
zeer licht en toen licht alkahsch, welke laatste reactie
ze bleef behouden.

Door den slechten groei van bacil n°. 100 werd er
blijkbaar niet genoeg zuur gevormd, om de oorspronke-
lijke, alkalische reactie te neutraliseeren. Deze was-
echter wel gedurende eenige dagen verminderd, zooals
men gezien heeft.

Het laat intreden der zure reactie, haar lange duur
en geringe intensiteit worden verklaard door den altijd
zwakken groei der baciUen in urine, in vergelijking met
dien in bouiUon.

Dit laatste resultaat leverde dus de proef op de som
en is een duidelijk beAvijs voor de meening, dat de zure
reactie door de omzetting van glucose wordt veroor-
zaakt; tevens dwingt, het ons, om aan te nemen, dat
de urines van G-mNOCHET een dergelijke stof, zeer
waarschijnlijk glucose, bevatten.

Boven is er reeds op gewezen dat volgens Roux en
Yersin" en volgens Escheeich, de intensiteit der zure
reactie in dergelijke voedingsbodems eene zoo sterke
wordt, dat de baciUen afsterven en de omslag in de
alkalische reactie uitblijft.

Eveneens heb ik reeds vermeld, dat von Sommaeuoa
als zijne meening mededeelde, dat glycerine, evenals.

glucose, door verschillende bacteriën in zuur wordt
omgezet. In eene later van zijne hand verschenen,
speciaal daarop gerichte onderzoeking, b nam hij proeven
omtrent de omzetting van glycerine door verschihende
bacteriën (echter niet door bacülus diphtheriae) in eenige
voedingsbodems , namel. bouihon, gelatine, agar, allen
met 5 7o glycerine. Van de 19 species, die hij onder-
zocht, produceerden er 16 uit de glycerine zooveel
zuur, dat de cultures een duidelijke, soms een sterk
zure reactie vertoonden. Omtrent den tijd, waarop de
zure reactie intrad, geeft hij niets aan. Hij bepaalde
aheen quantitatief het zuurgehalte der cultures, toen
ze 35 dagen oud waren en vond dit laatste bij dezelfde
bacteriën veel sterker dan Petrushky in zijn lakmoes-
melk. Hij gebruikte voor zijn onderzoek gewone
zuivere glycerine uit den handel, en ook chemisch
zuiver giycerinum cristahisatum, dóch verkreeg daar-
bij geen verschh in resultaat.

Ik bezat nu in de bouihons, vervaardigd uit vleesch-
extract, geschikte voedingsmedia, om de omzetting van\'
glycerine door den diphtheriebacü na te gaan. Daar
die vloeistoffen niet zuur werden, dus geen suiker of
andere dergelijke stoffen bevatten, kon men, wanneer
daarin de reactieverandering intrad, deze geheel aan de
aanwezigheid van glycerine toeschrijven.

\') Von Sommaküga. Ueber Stoffwechselproducte von Mikroorga-
nismen. II Mittheil. Zeitschr. f. Hygiene u. Infectionskrankh. Bd. XV.
1893, p. 291.

Twee buisjes werden gevuld met een bouillon, bereid
uit Liebig\'s vleescbextract volgens het in proef VII
gegeven voorschrift, waaraan 4 % glycerine was toe-
gevoegd.

Na gewone sterisatie en controle werden ze geënt
met bacil n\'\'. 102 uit stamcultuur. De groei was in de
eerste 3 dagen een zeer geringe, den dag echter
werd de cultuur flink troebel en vormde zich een
membraan aan de oppervlakte ; de troebelheid nam later
nog iets toe en er verzamelde zich een sterk praecipitaat
op den bodem. Na eenigen tijd echter verdween de
membraan en helderde de vloeistof op.

De reactie werd den dag hchter, en de volgende
dagen zeer hcht alkahsch; den ll\'!®\'^ dag na de enting
was ze op eens licht zuur (de cultuur iDleek zuiver). De
intensiteit nam in de eerste dagen nog iets toe en later
weer iets af, maar bleef in het vervolg steeds zwak
zuur, hoewel de proef 59 dagen duurde.

Na verloop van dien tijd kwam bij uitzaaiing niets
meer op, zoodat de proef gestaakt werd.

Verder werden een paar buisjes gevuld met bouillon
uit Cibils-vleescbextract, eveneens met 4 glycerine ^
en geënt met bacil n". 100 uit stamcultuur. Deze
cultures vertoonden na 7 dagen een zure reactie en
behielden die ook gedurende de 46 dagen, welke de
proef duurde. De groei kwam overeen met dien in
Liebig-houillon.

Daar ik bij deze proeven glycerine gebruikt had^
welke bij nader onderzoek niet aan de eischen der

Pharinacopoe Ed. III bleek te voldoen, in zooverre zij
bij verbranding een duidelijk résidu achterliet, en het
dus mogelijk was, dat deze verontreiniging van invloed
geweest zoudo zijn, verschafte ik my glycerine, die
wel aan che eischen voldeed.

Aan een paar buisjes en een fleschje, gevuld met
Cibils-bouiUon, voegde ik 4 der onzuivere, aan een
ander paar buisjes en een fleschje, gevuld met denzelfden
bouillon, 4 "/o der zuivere glycerine toe. Allen werden
nu geënt met bacil n". 101. Den B*^®" dag reageerden
allen amphoteer, den dag duidelijk zuur en bleven
dit gedurende de 30 dagen, dat ze geobserveerd werden.
Evenals von Somiiarug-a vond ik dus ook, dat een lichte
verontreiniging der glycerine niet van invloed is.

Uit het resultaat dezer proeven blijkt ten duidelijkste,
dat ook de diphtheriebacil in staat is uit glycerine zuur
te produceeren. Het laat intreden der zure reactie in
de glycerine-bouiUons is waarschijnlijk gedeeltelijk te
wijten aan den geringen groei in de eerste dagen,
hetgeen ik constant bij deze cultures heb opgemerkt.
Ik heb echter niet den indruk gekregen, dat dit de
eenige oorzaak zoude zijn. Na een dag of vier was er
toch reeds een flinke groei, terwijl de reactieverandering
nog maar steeds niet te voorschijn kwam.

Veeleer scheen het, alsof de glycerine niet als zoodanig
door den bacil direct in zuur kon worden omgezet, maar
dat er eerst onder invloed der bacteriën een andere stof,
misschien een suiker, uit gevormd moest worden, uit
welke stof dan het zuur ontstond. Deze hypothese vindt
eenigen, zij het ook zwakken, steun in het door de
beroemde onderzoekingen van den chemicus Fischer

"bekend geworden feit, dat het mogehjk is alle suikers
synthetisch te vervaardigen uitgaande van glycerine.
Het vermogen nu der bacterien, om synthetisch werkzaam
te zijn staat buiten kijf. Von sommaeuoi» waagt het ook
niet zich direct uit te spreken over de natuur van het
gevormde zuur, hij wijst er aheen op, dat vele der door
hem onderzochte bacteriën in rosolzuurhoudende voedings-
bodems een duidelijk vermogen om te reduceeren ver-
toonen, en men dus zou kunnen denken, dat het zuur
ontstond door reductie van de glycerine.

Het niet meer optreden der alkahsche reactie is hier,
evenals in proef V, wel te wijten aan de groote hoeveeb
heid geproduceerd zuur. Door het gehalte aan glycerine
te verminderen is het waarschijnlijk ook mogelijk slechts
een voorbygaande zure reactie te verkrijgen. Intusschen
hebben de proeven, die ik daaromtrent nam met 1 "/o en
0,5 % glycerine, een negatief resultaat opgeleverd.

Roux en Yeesin en ook Escheeich deelen mede, dat
de aciditeit eveneens intreedt in cultures onder afsluiting
van de lucht en dat ze dan niet meer plaats maakt
voor een alkahsche reactie.

Dat deze reactieverandering nu ook door de omzetting
van glucose veroorzaakt wordt en in hoeverre de vrije
toevoer van lucht op het weder intreden der alcalici-
teit van invloed is, trachtte ik op de volgende wijze
uit te maken:

vorm werden hoog gevuld met. een gelijke hoeveelheid
van de volgende bouiüonsoorten: 1°. kalfsvleeschbouihon
van proef 1, waarin de zure reactie bij groei aan de
lucht slechts liorten tijd bleef bestaan; 2°. bouiUon uit
Liebig\'s vleeschextract, volgens het gegeven voorschrift
vervaardigd; 3°. dezelfde bouihon uit Liebig, waaraan
toegevoegd 0,2 "/o glucose.

Deze drie fleschjes werden geënt met bacü n°. 101
uit een twee dagen oude, zuur reageerende bouihon-
cultuur en geplaatst onder een klok van Büchner, die
met paraffine en vaseline hermetisch afgesloten was en
waarin de zuurstof geabsorbeerd werd door acidum
pyrogalhcum.

Drie geheel overeenkomstige fleschjes, met dezelfde
vloeistoffen hoog gevuld, werden evenzoo geënt en in
dezelfde broedstoof geplaatst, maar buiten de klok,
zoodat de lucht vrijen toegang had tot de cultuur.

Om nu verder nog na te gaan, of een ruime toe-
treding van zuurstof van invloed kon zijn tegenover
de betrekkelijk geringe .in de hoog gevulde fleschjes,
werden nog drie cultures aangelegd in groote kolven,
wier bodem slechts even bedekt was met een der
bovengenoemde vloeistoffen. Ook deze werden vrij in
dezelfde broedstoof geplaatst. De wattenproppen waren
op alle fleschjes en kolven zoo los mogelijk gezet.

Eindelijk werden nog in een tweede klok van Buohner
geplaatst een paar buisjes met een kalfsvleeschbouihon,
die bij groei aan de lucht geen zure reactie aannam
(uit proef II) en verder buisjes met denzelfden bouillon,
waaraan resp. 0,2 7o ? 7o ? 0,8 7o- en 1 7o glucose
was toegevoegd. Ze werden geënt als de vorige.

Deze buisjes konden nu dienen, om de omzetting van
suiker bij anaërobiose nader te bestudeeren en tevens
ter contrôle van het in de eerste klok te verkrijgen
resultaat.

De fleschjes en kolven, zoowel in als buiten de klok,
moesten bijna aUen eenige malen op nieuw geënt worden.
Zij begonnen eerst troebel te worden, nadat men met
een pipet uit de vermelde bouilloncultuur, waarmede
alle werden geënt, een vrij groote hoeveelheid cultuur
in elk tleschje en kolfje had gebracht. De proef duurde
20 dagen en leverde het volgende resultaat:

In de klok : De kalfsvleeschbouillon uit proef I reageerde
den dag na de gelukte enting zuur en bleef die

De bouiUon uit Liebig met 0,2 glucose reageerde
den dag na de enting zuur en bleef aldus.

Yan de buisjes in de klok bleven die met kalfsvleesch-
bouillon uit proef II steeds alkahsch. Die met denzelfden
bouillon, plus 0,2 7o en 1 7o glucose, waren

Buiten de klok: Men kon geen duidelijk onderscheid
constateeren in tijd van optreden of intensiteit der
reactie in tleschjes en kolven. De bouillon uit proef I
reageerde den volgenden dag zuur, bleef dit 3 dagen
en werd toen weer alkalisch. De bouillon uit Liebig
bleef steeds alkalisch. De bouillon uit Liebig met 0,2 \'Vq
glucose was den volgenden dag zuur en bleef aldus.

De groei van alle cultures in de klokken was veel
minder sterk, dan in de daarbuiten staande. Zoowel
in als buiten de klokken, vertoonde hij echter het

Deze proeven bevestigen dus het door Roux en Yeesin
en Escheeich medegedeelde, dat de zure reactie ook
bij anaërobiose voorkomt en dat voor het weder intreden
der alcahciteit de vrije toetreding van zuurstof nood-
zakelijk is; terwijl zij tevens aantoonen, dat ook bij
anaërobiose het zuur gevormd wordt door omzetting
van glucose.

De bepahng der reactie onder de klokken geschiedde
slechts enkele malen en zoo snel mogelijk, terwijl telken-
male een nieuwe hoeveelheid versch acidum pyrogalhcum
toegevoegd werd en de klok nauwkeurig met vaseline
en paraffine werd afgesloten.

Daar het voor het onderzoek der toxiciteit van cultures
bij zuurstofafsluiting niet wenschelijk was, ze te openen
vóór de filtratie, volgde ik hierbij een andere methode,
die meer waarborgen gaf dat de anaërobiose een abso-
lute was, namelijk de cultuur onder waterstof:

Drie fleschjes van denzelfden vorm en gelijke grootte
werden gevuld met een gelijke hoeveelheid bouillon uit
Liebig (als vroeger) bereid. Twee er van waren voorzien
van een dubbel doorboorde caoutchouc-stop, waardoor
een glazen aan- en afvoerbuis staken, om waterstofgas
door de vloeistof te leiden. Het derde fleschje was
met een gew^onen wattenprop gesloten en diende ter
controle.

Wanneer men de cultum"vloeistof direct na de enting
onder waterstof bracht, was te voorzien , dat er geen
voldoende groei zou plaats hebben, om een merkbare
toxiciteit te verkrijgen. Daarom werd het eene fleschje
onder H gezet,. nadat de cultuur 24 uren oud en flink
troebel was geworden, terwijl met het andere gewacht
werd, tot 8 x 24 uren na de enting waren verstreken
Minstens een half uur lang werd waterstofgas doorge-
voerd en de af- en toevoerbuis niet eerder dichtgesmolten,
dan nadat men aan de fijn uitgetrokken afvoerbuis het
gas zonder knal kon ontsteken en dit laatste dan rustig
voortbrandde. Aldus was men zeker dat alle zuurstof
verdreven was.

Het gas werd bereid uit zuiver zink en zuiver zoutzuur,
en bovendien nog geleid door oplossingen van acidum
pyrogalhcum, permanganas kahcus en nitras argenticus.

De groei onder H bleef sterk achter bij dien in het
fieschje aan de lucht; de cultures werden slechts weinig
troebel en klaarden weldra geheel op. Toen ze na
19 dagen werden gefiltreerd, reageerden beide cultures
onder H amphoteer. Bij uitzaaiing bleken de bacteriën
afgestorven te zijn. De cultuur aan de lucht reageerde
alkalisch en gaf bij uitzaaiing op glycerineagar nog vrij
veel diphtheriecolonies.

Die amphotere reactie in bouülon uit Liebig kan men
verklaren door aan te nemen, dat er in dezen bouillon
toch ook nog zuur gevormd wordt, maar zoo weinig,
dat het in cultures aan de lucht geheel wordt gecom-
penseerd door .de alkalivorming, terwijl het zuur voor
den dag komt, wanneer die alkahvorming wegvalt,
zooals bij anaërobiose. In dit geval was dus de zuur-

vorming juist sterk genoeg, om de oorspronkelijke,
alkalische reactie ongeveer te neutraliseeren.

Zooals men zich uit de aangehaalde onderzoekingen
van PÉRÉ herinnert, gelukte het dezen uit oud rund-
vleesch bouihons te maken, die door cultuur van bacülus
typhi abdom. en bact. coh comm. niet zuur werden,
terwijl bouihons volgens hetzelfde procédé gemaakt uit
hetzelfde vleesch, maar in verschen toestand, wel degelijk
een zure reactie gingen vertoonen. Hij schreef dit onder-
scheid toe aan het voorhanden zijn van glucose in versch
vleesch, welke stof in het oude vleesch was omgezet.

In verband met de verkregen resultaten was het dus
zeer interressant ook het gedrag van bacillus diphtheriae
onder dergelijke omstandigheden na te gaan.

Men nam 250 grm. rundAÜeesch (fijn gehakte biefstuk)
van een daags te voren geslachte koe. Dit vleesch was
bij lage temperatuur bewaard en dus nog zeer versch

125 grm. er van werd direct bij gewone kamertempe-
ratuur gedurende één nacht te trekken gezet op 250 grm.
water. Den volgenden morgen werd het vleesch door een
doek gecoleerd, uitgeperst en bij de aldus verkregen vloei-
stof gevoegd: 2 pepton Witte en 0,5 keukenzout.
Daarna werd opgekookt, gefiltreerd en zwak alkahsch
gemaakt met carbon, natric., vervolgens weer opgekookt,
gefiltreerd en toen de vloeistof daarna bij vernieuwde
verhitting niet meer troebel werd, in stoom gesterili-
seerd. Aldus verkreeg men: houillo7i uit versch vleesch.

De andere 125 grm. bleef\'s nachts bij gewone kamertem-
peratuur staan. Den volgenden morgen werd het vleesch
met een weinig water bevochtigd om uitdrogen tegen
te gaan en geplaatst bij ongeveer 20°. Aldus bleef het
staan tot den volgenden dag 4 uur n. m. Toen werd
het één nacht bij gewone kamertemperatuur op 250 grm.
water gezet en den volgenden morgen, op dezelfde wijze
als voren, daaruit bereid de houillon uit oud vleesch.
Dit laatste was dus 48 uren ouder dan het andere.

Met elke bouiUonsoort werden gevuld 3 buisjes en
1 kolfie, en aUen geënt met bacil n". 102 uit stam-
cultuur. De buisjes dienden voor de bepaling der reactie.

De groei in den bouillon uit versch vleesch was in de
eerste 2 dagen slecbts zwak, maar werd toen spoedig
vrij krachtig.

De reactie van den bouillon uit versch vleesch was den
dag hchter alkalisch, den 4\'^®" dag zeer zwak alka-
hsch , den dag licht zuur, den (j^g zeer duidelijk
zuur en bleef dit gedurende 10 dagen. De 4 volgende
dagen werd de reactie aldus opgeteekend: hcht zuur,
zeer hcht zuur, zeer licht alkahsch, hcht alkalisch. Een
14 dagen ongeveer duurde die zwakke alkahciteit. Toen
werd de cultuur flink alkahsch en als zoodanig nog een
paar weken geobserveerd. De proef duurde 50 dagen.

De intensiteit der alkahsche reactie in den bouillon uit
oud vleesch werd in de eerste dagen niet minder,
integendeel na verloop van 12 dagen ongeveer was ze
reeds duidelijk toegenomen en bleef nu vrij sterk alka-
hsch gedurende de geheele proef, namelijk 43 dagen.

Het door Péeé, bij cultuur van bac. typhi abdom. en
bac. coli comm., verkregen resultaat bleek dus ook te
gelden voor den diphtheriebacil en we konden hierin
een bewijs te meer zien voor den invloed van de glucose
op het ontstaan der aciditeit.

Uit de resultaten der voorgaande proeven was dus
met zekerheid vastgesteld, dat de zure reactie van
diphtherie-bouilloncultures afhankelijk is van de aan-
wezigheid van glucose of glycerine of beide.

Door een eigenschap, die de diphtheriebacil met vele
andere bacteriën gemeen heeft, is hij in staat genoemde
stoffen in zuur om te zetten. Naar analogie met vele
van die andere bacteriën, die door Schaedinoee , Nenoki ,
Rekowski , Bisohlee , Blachstein , Peedeix , Bouteoux ,
PÉEÉ e. a. onderzocht zijn, is het nu hoogst waarschijnlijk,
dat hij, behalve uit glucose, ook uit de verdere suikers
zuur kan vormen. Ik achtte het echter niet noodzakelijk
het onderzoek van den bacil in die richting voort te
zetten, daar men toch bij de bereiding van voedings-
bodems gewoonlijk aUeen met glucose en met glycerine
te doen heeft.

De door Péeé aangegeven methode om het vleesch
oud te laten worden bleek, volgens de laatste proef,
geschikt om een bouillon te verkrijgen, die niet zuur
wordt en waarin de bacil uitstekend groeit. De uitkom-
sten van proef VII hadden ons wel reeds geleerd steeds
alkalisch blijvende bouillons te vervaardigen uit ver-
schillende vleeschextracten, maar de groei van de meeste
exemplaren van diphtheriebaciUen in laatstgenoemde,
hoewel vrij krachtig, was toch altijd minder intensi-
tief, dan in bouiUons uit rundvleesch of kalfsvleesch,

In het algemeen heb ik bemerkt, dat de beste groei te
verkrijgen is in kalfs- of rundvleeschbouiUons met zooveel
glucose, dat de reactie slechts enkele dagen zuur bleef;
na weder intreden der alkahciteit werd dan de groei
weldra zoo sterk, dat hij dien in even oude cultures, die
geen reactieverandering vertoond hadden, overtrof. Het
glucose is dus op zichzelf voordeehg voor den groei,
maar nadeelig door het daaruit gevormde zuur, hetwelk
tevens volgens Roux en Ybrsin een slechten invloed
heeft op de gifproductie. Men moest dus trachten het
gevormde zuur weg te nemen niet door eliminatie der
oorzaak: het glucose, maar op een andere manier.

In den loop der beschreven proeven was. reeds
meermalen de vraag gerezen, of het mogelijk zoude zijn
de zure reactie te voorkomen door te zorgen voor een
voldoende hoeveelheid alkah in de cultuur, om het zuur
te neutrahseeren. Men zoude daartoe den bouiUon een
sterkere, oorspronkelijke alkahsche reactie kunnen geven,
voor dat men de bacteriën er in entte. Nu is het
echter een bekend feit, dat een hoog alkaUgehalte, even-
goed als een hoog zuurgehalte, voor de bacteriën scha-
delijk is. De grenzen, binnen welke verschiUende
parthogene microben zich nog ontwikkelen, heeft Boer \')

\') Boeb. Ueber die Leistungsfälligkeit mehrerer chemischer Des-
infectionsmittel bei einigen für den Menschen pathogenen Bacteriën.
Zeitschr. f. Hygiene u. Infectionskrankh. Bd. IX. 1890.

vastgesteld volgens een door Behring gegeven methode.
Zoo vond hij, dat de diphtheriebacü gedood werd hij een
gehalte van 0,06 "/o normaalzoutzuur indien versche , en
van 0,15% als 24 uur oude bloedserumcultures werden
gebezigd, bij een inwerking gedurende 2 uren. Dat
gehalte komt overeen met 17 resp. 42 cm\' normaalzuur
pro liter bouihon. Yan zwavelzuur heeft men iets
grootere hoeveelheden noodig. De uiterste grens naar
de alkahsche zijde bedroeg: 0,37o resp. 0,35% normaab
natronloog of 75 resp. 88 cm® pro liter.

De diphtheriebacü verhield zich in dit opzicht ongeveer
als de miltvuurbacü, terwijl h. v. de typhusbacü veel
grootere hoeveelheden zuur, de choleraspirü zeer veel
grootere hoeveelheden alkah kon verdragen.

Men is dus aan zekere grenzen gebonden. Naarmate
het oorspronkelijke alkaligehalte meer stijgt boven het
juist voordeelige voor de ontwikkeling, zal deze laatste
ook minder worden en aldus een voor de gifproductie
nadeeligen factor doen ontstaan.

Om nu na te gaan, in hoeverre het mogelijk was in
een bepaalden bouillon de zure reactie te doen uitblijven
zonder te veel schade aan den groei toe te brengen,
nam ik volgende proef:

11 gelijke buisjes werden gevuld met 10 cm® van
den bouihon uit proef I, die dus even zuur werd.

Uit een buret droppelde men nu een verzadigde
oplossing van carbon, natric. in die buisjes, zoodat
aan buisje n°. O niets, n®. 1 één droppel, n°. 2 twee

droppels, enz. tot aan buisje n°. 10 tien droppels alkali
"werden toegevoegd. 10 droppels vormden juist cm®.

3 dagen oude Liebig-bouilloncultuur. Al de cultures
waren den volgenden dag opgekomen, maar in verschil-
lende mate: buisje n°. O het sterkst en zoo afnemend
tot buisje n°. 10. De groei in n°. 8 tot en met n°. 10
was al heel zwak. Na 8 dagen ongeveer waren de
buisjes n°. O tot en met n°. 7 aden bijna even troebel,
tusschen de twee uitersten was alleen een gering ver-
schil merkbaar. N°. 8 tot en met n®. 10 vertoonden
nog slechts zeer weinig groei.

Het buisje n°. O was den dag na de enting zuur, bleef
dit 3 dagen lang en werd toen weer alkalisch. Buisje
n°. 1 vertoonde den volgenden dag amphotere reactie,
en bleef deze 3 dagen behouden. Vervolgens werd het
licht alkahsch en eindelijk alkahsch. In buisje n®. 2
was, gedurende dezelfde drie dagen, de intensiteit
der alkalische reactie verminderd. Alle volgende ver-
toonden geen afname der alcaliciteit.

Had men dus bij dien bouiUon uit proef I, per 10 cm®
slechts 1 droppel carbon, natric.-oplossing meer toege-
voegd , dan ware de reactie slechts amphoteer geworden,
2 droppels of Va5 cm® meer op de 10 cm® bouiUon =

4 cm® pro hter, hadden veroorzaakt, dat de zure reactie
heelemaal niet te voorschijn ware gekomen. De groei in
den bouiUon zou dan toch nog een voldoende geweest zijn;
immers, die in buisje n°. 2 vertoonde na enkele dagen
geen merkbaar onderscheid meer met dien in buisje n". 0.

Het is evenwel duidelijk, dat deze methode aUeen toe-
passelijk zoude zijn op bouiUons, die zoo kort zuur

werden (dus zoo weinig suiker bevatten), als de onder-
zochte ; bij bouiUons met een hoog gehalte aan glucose,
zou men de vloeistof zoo sterk alkahsch moeten maken,
dat de groei er min of meer onmogelijk in werd.
Echter ook in het eerste geval zou men altijd een
dergelijk onderzoek, als het beschrevene, aan de alkah-
seering van den bouiUon moeten laten voorafgaan, om de
juiste hoeveelheid vereischt alkah te leeren kennen. Dit
is een groot practisch bezwaar en bovendien kan men
zich voorstellen b, dat, al is de groei ook voldoende,
de giftigheid toch benadeeld wordt door het verhoogde
alkahgehalte.

Prof. Spronck vestigde daarom mijn aandacht op een
andere methode. Bij zijn technische onderzoekingen
over gisting bediende Bbijerinck zich van suikerhou-
dende , dus voor gisting vatbare voedingsbodems, waar-
aan hij een neutraal, onoplosbaar en voor de bacterien
dus onschadelijk koolzuur zout toevoegde; hij nam
daarvoor o. a. carbonas calcicus. Werd nu zuur gepro-
duceerd, dan werd dit door het zout als het ware in statu
nascenti vastgelegd en moest het op. deze manier gelukken
den voedingsbodem alkalisch te houden.

Bribger wijst in een onlangs verschenen onderzoek
op de schadelijke werking, die de, in eiwithoudende
voedingsbodems altijd plaats grijpende, vorming van
basische producten heeft op het gif, daar het bekend is,

2) Beijerink. Verfahren zum Nachweise der Säureabsonderung bei
Mikrobien. Centralblatt. f. Bacteriol. u. Parasitenk. Bd. IX. N". 24.

3) Beieger. Weitere Erfahrungen über Bakteriëngifte. Zeitschr. f.
Hygiene u. Infectionskrankh. Bd. XIX. 1895. H. I.

dat met toename der alkalische reactie de zoo labiele toxal-
buminen der bacteriën meer en meer vernietigd worden.
Hij bepaalde de hoeveelheid van deze geproduceerde
bases in tetanusbouillon, waarmede hij zich speciëel
bezig hield, en vond dat 1 L. tetanusbouihon in 7
dagen zooveel bases gevormd had, dat 17 — 38 cm^
normaahoog noodig waren om ze te neutrahseeren.

Dezen schadelijken invloed der basische producten,
onder welke het koolzure ammoniak wel een eerste
plaats bekleedt, trachtte hij nu op te heffen door aan
1 L. van den voedingsbodem ongeveer 20 grm. gips toe
te voegen; aldus grijpt er, volgens hem, van het eerste
oogenblik af aan een constante omzetting plaats van
het versch ontstane, schadelijke ammoniumcarbonaat
in het onschuldige ammoniumsulfaat. Het gelukte hem
zoo werkelijk zeer giftige tetanuscultures te verkrijgen.
Ammoniumsulfaat praecipiteert het tetanusgif, maar
aUeen door meeslepen met de gepraecipiteerde albumosen
uit de cultuur en zooals Beieger en Cohn i) aangetoond
hebben wordt het tetanusgift gevormd ten koste der
albumosen, zoodat, wanneer men een zeer giftige cultuur
heeft, de albumosen daaruit grootendeels of geheel ver-
dwenen zijn en dus ook het ammoniumsulfaat in een
dergelijke cultuur het gif niet meer neerslaat.

Volgens Brieobr is de diphtheriebacil niet in staat de
albumosen in zijn cultuur geheel om. te zetten en het
diphtheriegif wordt ook door middel van deze stoffen
door het ammoniumsulfaat gepraecipiteerd, zoodat men

1) Bkiegbe und Cohn. Untersucliungen ueber das Tetanusgift
Zeitschr. f. Hygiene u. Infectionskrankh. Bd. XV. 1893. S. 1.

door neerslaan met dit zout uit diphtheriecultures een
veel grootere hoeveelheid gif kan verkrijgen, dan uit
tetanuscultures.

Wilde men nu ook in diphtheriecultures, op de manier
van Beieger, de volgens hem zoo schadelijke bases in
het onschuldige ammoniumsulfaat omzetten, dan had
men misschien te vreezen, dat er veel gif neergeslagen
werd en men dus een zwak toxisch filtraat zou ver-
krijgen. In hoeverre deze vrees bewaarheid werd zal
later blijken.

Ik beproefde nu een bouillon, waarin de bacillen goed
groeiden, alkahsch te houden door bijvoeging van carbonas
calcicus en tevens den schadelijken invloed der gevormde
bases te neutraliseeren door gips. Daartoe werd de
volgende proef ingericht:

4 medicijnfleschjes van 200 grm. inhoud werden gevuld
met een bouillon, op de gewone manier bereid, uit versch
kalfsvleesch.

Carbonas calcicus en sulfas calcicus, beide chemisch
zuiver, werden op de volgende wijze aan enkele fleschjes

Een flesch n". 5 van eenigszins anderen vorm was
ingericlit als in proef XII om onder H. gezet te worden.
Ze werd gevuld met 200 grm. van denzelfden kalfvleesch-
bouillon, waaraan toegevoegd: 4 grm. carb. calc.

Door deze inrichting der proef kon men verwachten
een antwoord te krijgen op de vraag, welke invloed
het voordeeligste is voor de gifproductie, die van het
carb. calc., als houdende het medium alkahsch, die van
het sulf calc., als vernietigende de schadelijke bases, of
die van beiden te samen. Eindelijk zou men ook nog de
gifproductie onder anaërobiose in een alkalische cultuur
kunnen nagaan. Daar bij afsluiting der lucht geen
alkah in de cultuur werd gevormd (volgens proef XI en
XII) was het ook niet noodig er sulf calc. bij te voegen.

De vóór dit doel bereide kalfsvleeschbouillon werd,
zooals gezegd is, uit versch vleesch vervaardigd en zou
dus wel, volgens proef XIII, een zure reactie gaan
vertoonen. Om dit te onderzoeken werd eerst een
buisje er mede gevuld en geënt met bacil n°. 101. De
cultuur kwam goed op en was den volgenden dag
reeds zuur. Bijna dagelijks werd nu een maand lang
de reactie opgenomen, maar ze bleef steeds zuur. Na
verloop van dien tijd kwam bij uitzaaiing niets meer op,
zoodat men de proef afbrak. Er scheen dus veel glucose
in dit versche vleesch aanwezig te zijn en de bouillon
was wel geschikt, om den invloed van het carb. calc. te
vertoonen.

Ter controle werd verder een bouillon genomen, die
alkalisch bleef, bereid uit Cibils-vieeschextract volgens
het vroeger gegeven voorschrift. Op geheel overeen-
komstige manier werden nu met dezen bouillon weer

gevuld: 4, medicijnfleschjes van 200 grm. en 1 flesch
geschikt voor de cultuur onder H. Ze bevatten dus:

De hoeveelheden carb. calc. en sulf. calc. waren zoo
genomen, dat de bodem der fleschjes met een flinke laag
van die stoffen bedekt was en er dus zeker niet te
kort kwam. Overmaat kon hier niet schaden.

Behalve deze fleschjes, waren nog 3 buisjes gevuld
resp. met: kalfsvleeschbouillon met carb. calc.,kalfsvleesch-
bouihon met sulf. calc. en kalfsvleeschbouihon met carb.
calc. en sulf. calc , en 3 andere buisjes resp. met: Cibils-
bouiUon met carb. calc. Cibüs-bouiUon met sulf. calc.
en Cibüs-bouiUon met carb. calc. en sulf. calc.

Alle fleschjes en buisjes werden geënt met bacün". 101
uit de stamcultuur. In allen kwam de cultuur op.

Reeds spoedig nu zag men onderling een duidelijk ver-
schil ontstaan in het uiterlijk der cultures in kalfsvleesch-
bouülon in de buisjes en ook in de fleschjes. Die in kalfs-
vleeschbouUlon met carb. calc. en in denzelfden bouiUon
met carb. calc. en sulf calc. werden sterk troebel en
bleven dit, terwijl die in kalfsvleeschbouillon aUeen en
in denzelfden bouiUon met sulf calc. niet zoo troebel
werden en spoedig ophelderden. Ook hier vertoonde

dus de groei de meermalen beschreven kenmerken, daar
zooals men zal zien de reactie er mee in overeenstemming
was. De groei in de Cibils-bouillons was in allen onge-
veer even sterk. De beide flesschen onder H vertoonden
slechts een zeer zwakken groei; het meest troebel werd
nog wel de cultuur in kalfsvleeschbouihon met carb. calc.

De reactie in het buisje met kalfsvleeschbouiU. carb.
calc. bleef alkahsch; die in het buisje met kalfsvleesch-
bouiU. -f- sulf. calc. bleet zuur; die in het buisje met kalfs-
vleeschbouiU. carb. calc. sulf. calc. bleef alkahsch.

Gedurende 14 dagen werden ze geobserveerd. Toen
was dus reeds duidelijk, dat men door toevoeging van
carb. calc. in staat is een anders zuur wordende bouiUon
steeds alkahsch te houden, terwijl de groei er beter op
wordt.

De intensiteit der reactie in kalfsvleeschbouihon met
carb. calc. en in denzelfden bouiUon met carb. calc. en
sulf. calc. was dezelfde, evenzoo was er geen merkbaar
verschü in intensiteit der reactie tusschen de verschiUende
CibUs-bouiUons.

De cultures in kalfsvleeschbouillon werden gefiltreerd
toen ze 20 dagen oud waren; de reactie bleek toen
geheel overeen te komen met die in de buisjes, namelijk:
cultuur in kalfsvleeschbouiU.: zuur.

„ in kalfsvl. bouiU. carb. calc. : alkal.
„ in kalfsvl. boulU. -j- sulf. calc. : zuur.
„ in kalfsvl. bouiU. -f- carb. calc. sulf. calc.: alkal.

Cultuur onder H: alkahsch; dus hier ook was het
carb. calc. geschikt gebleken, om de vloeistof alkalisch
te houden.

De cultures in Cibils-bouillon waren 21 dagen oud,
toen men ze filtreerde. In allen bleek de reactie
alkalisch.

Nadat we aldus de oorzaak van het zuur worden
van diphtheriebouillons hadden leeren kennen en het ons
gelukt was, hetzij door eliminatie dier oorzaak, hetzij
door vernietiging van het geproduceerde zuur, diphtherie-
bouihons naar wihekeur alkahsch te houden, konden we
ons wenden tot het onderzoek van de gifproductie in
dergelijke alkalische of zure voedingsbodems.

Vooreerst echter wU ik in het volgende hoofdstuk
nog enkele proeven heschryven, die ik genomen heb
over de reactieverandering van voedingsbouillon, wan-
neer daarin pseudo-diphtheriebacülen worden gekweekt.

Naar aanleiding van de l)eroenide onderzoekingen van
Lobpplee in 1884, trachtte ook von Hofmann-Wellenhof \')
den Klebs-Loefflerschen bacil uit de pseudomembranen
van diphtherielijders te isoleeren. Hij Verkreeg daarbij
in reincultuur een bacillus, die geheel beantwoordde
aan de beschrijving, welke Loepelek van zijn bacil had
gegeven, maar niet virulent was.

Het gelukte von Hopmann-Wellenhop dikwijls (in
45 onderzochte gevaUen 26 maal) dienzelfden bacil te
isoleeren bij contröleonderzoekingen, die hij verrichtte
in gevallen van diphtherieachtige ontsteldng van den
pharynx bij scarlatina en morbilh, in gevallen van
eenvoudige pharynx-katarrh en eindelijk ook bij onder-
zoek van geheel normale slijmvliezen. Aldus kwam hy
er toe om aan te nemen, dat de door hem gevonden

bacil een regelmatige bewoner van de keelholte is, die
met diphtherie niets te maken heeft.

Bij gelegenheid\' van een samenkomst met Loefflee
te Berlijn werden de cultures van von Hofmann-
Wellenhop vergeleken met de oorspronkelijke van
Loefflee. Men kon daarbij geen morphologisch onder-
scheid tusschen beiden constateeren. Daarom werden
met beider cultures cavia\'s geënt. Het resultaat beant-
woordde evenwel in het geheel niet aan de verwachting,
daar ahe cavia\'s gezond bleven. Later bleek het, dat
het negatieve\' resultaat, met de cultuur van L\'oeffler
verkregen, moest worden geweten aan de omstandig-
heid, dat met een zeer oude cultuur was geëxperimen-
teerd, in welke de virulentie der bacihen sterk was
afgenomen.

Von Hofmann-Wellenhop verrichtte vele infectie-
proeven met ■ zijn bacillen, doch kon nooit cavia\'s er
mede dooden. Later gelukte het hem echter ook viru-
lente diphtheriebacillen te isoleeren, en Loefflee had
intusschen ook, evenals von Hofman-Wellenhop, uit
pseudo-membranen, naast virulente, morphologisch geheel
daarmede overeenkomende, avirulente bacihen kunnen
verkrijgen. Hij noemde deze laatste: pseudo-diphtherie-
bacillen.

Von Hopmann-Wellenhof kon door nauwkeurige verge-
lijking van cultures van beide bacillen op bloedserum,
gelatine en agar, enkele punten van verschil opmerken,
maar deze waren zoo gering en zoo inconstant, dat ze
niet praktisch bruikbaar waren voor de onderscheiding
van beide bacteriën.

.zwischen virulenten und nicht-virulenten Kulturen ver-
werthbare morphologische Unterschiede auf zu finden,
waren bisher erfolglos; mehrmals glaubte ich, solche
schon gefunden zu haben, aber dieselben erwiesen sich
als nicht constant oder noch innerhalb der Yarations-
breite fahend, welche den Kulturen eines jeden einzelnen
FaUes zukommt, oder doch als keine anderen, als sie
die virulenten Fähe unter einander oder die nicht-
virulenten Fälle unter einander auch zeigen."

Lobppler \') vond in hoofdzaak ook dezefde punten van
verschil tusschen beide bacillen als von Hopmann-
Wbllenhop, maar wijst er eveneens op, dat verreweg
het voornaamste onderscheid is gelegen in de algeheele
onschadelijkheid van den pseudo-, in tegenstelling tot
den echten diphtheriebacil.

Zaeniko vindt geen bruikbaar onderscheid in den groei
van beide bacillen op Loepplee\'s serum, op agar en op
gelatine, ook niet in de temperatuurgrenzen van den
groei van beiden, of in den vorm der. staafjes. Daaren-
tegen, zegt hij, vertoont de groei in bouillon een zeer
groot onderscheid. De pseudo-diphtheriebacil maakt den
bouillon van den dag af aan duidelijk troebel. Het
praecipitaat op den bodem is compacter en witter.
En terwyl de diphtheriebacil na korten tijd den bouiUon
zuur maakt, zou de bouiUoncultuur van den pseudo-
diphtheriebacU steeds bare alkalische reactie behouden.

Eoux et Yerstn. Contribvition à l\'étude de la diphtérie. Ann.
■de rinst. Pasteur n°. 7. 1890. p, 385. 3e mémoire.

tusschen beide baciUen: De pseudo-diphtheriebacil is in
de kolonies op serum dikwijls korter, dan de echte bacil.
De cultures in bouillon zijn weliger en gaan nog voort te
groeien bij 20° —22°, bij welke temperatuur de echte
bacü maar zeer zwak groeit. Zaait men tei vergelijking
beide bacterien in bouiUon, dan ziet men, dat beiden
den bouiUon eerst zuur en later weer alkahsch doen
worden, maar de reactie veranderingen ontstaan veel sneb
Ier in de cultures van den pseudo-diphtheriebacil. Evenals
de echte groeit ook de pseudo-diphtheriebacil onder
afsluiting der lucht, maar minder krachtig dan de eerste.

Escherioh i) constateerde op bloedserum in het algemeen
een minder sterke ontwikkeling van den pseudo-diph-
theriebacil , dan van den echten diphtheriebacU. Op giyce-
rineagar en op gelatine vond hij daarentegen den groei
van den eersten krachtiger.

De cultuur van den pseudo-diphtheriebacillus in bouiUon
is volgens Escherioh na 24 uur sterk troebel, veel
sterker dan die • van den diphtheriebacU, en ze wordt
later helder. Op den bodem vindt men meestal een
slijmerig, wit neerslag, in veel grooter hoeveelheid dan
bij den echten bacU. Maar een wezenlijk, constant
onderscheid is volgens hem, evenals volgens Zarniko,
gelegen in de verschillende verhouding der reactie van
den bouiUon, welke bij den pseudo-diphtheriebacil nooit
bepaald zuur wordt en reeds, na weinig dagen een
duidelijke toename der alkahciteit vertoont. Bovendien
zegt Escherioh nog: de toevoeging van druivensuiker
aan den bouiUon verandert niets aan die verhouding.

Ziedaar nu in hoofdzaak, hetgeen tot heden gepubh-
ceerd is over de morphologische en biologische eigen-
schappen van den pseudo-diphtheriebacil in tegenstelling
tot den echten Klebs-Loefflerschen bacil. Speciaal met
het oog op de verhouding der bouilloncultures heb ik
het vorige weergegeven, omdat ik alleen daarover
enkele proeven heb verricht. VerschiUende onderzoekers
geven nog minutieuze en uitgebreide beschryvingen van
den groei van beide bacillen op andere voedingsbodems,
maar geen enkel onderscheid, uitgezonderd het gemis
aan virulentie, was zoo constant en zoo sterk als dat,
hetwelk in de verhouding der bouillon-cultures door
bovengenoemde onderzoekers werd opgemerkt; hoewel,
zooals we gezien hebben, hunne meeningen over dat
laatste onderscheid zeer uiteenloopen.

Ik wü hier ook niet nader op de interessante quaestie
ingaan, of de pseudo-diphtheriebacü, zooals o.a. Escheeich
meent, een afzonderlijke soort van bacil vertegenwoor-
digt , dan of hij, volgens Roux en Yeesin en Baumgaeten,
slechts een geattenuëerde diphtheriebacü is,

Voor mijn proeven gebruikte ik een in het laborato-
rium aanwezigen pseudo-diphtheriebacü, bekend als
ps.-diphtheriebacil n". 115. Deze was 30 Jan. \'95
geïsoleerd uit het exsudaat van een kind lijdende aan
verdachte angina in het ziekenhuis alhier.

Die pseudo-diphtheriebacü ontwikkelde zich op glyce-
rineagar zeer veel krachtiger, dan de door mij gebruikte
diphtheriebaciUen. Op Loepfler\'s serum was de groei
ook nog iets sterker dan die der echte diphtheriebaciUen,

terwijl de kolonies zich meer in de vlakte uitbreidden..
Een duidelijk verschil in kleur was echter niet op te
merken. Schoon de bacil morphologisch de grootste
overeenkomst bezat met den echten diphtheriebacü, en
nog wel met de lange variëteit, was hij voor de cavia
a virulent.

Met bovengenoemden pseudo-diphtheriebacillus werd
geënt een huisje met denzelfden kalfsvleeschbouillon als
in proef I was gebezigd. Een ander buisje met denzelfden
bouillon, geënt met diphtheriebacü n°. 101, werd ter
vergelijking daarnaast geplaatst. Terwijl nu de diph-
theriecultuur gedurende ongeveer 4 dagen zuur reageerde,
bleef de reactie van de pseudo-diphtheriecultuur steeds
alkahsch gedurende de 21 dagen, dat ze geobserveerd
werd. Alleen den dag na de enting was de intensiteit
der alkalische reactie iets afgenomen, later echter nam
ze sterk toe. De groei van den pseudo-diphtherie-
bacillus was van den beginne af aan veel krachtiger,
dan die van den diphtheriebacü, en de bouihon, waarin
de eerste groeide, bleef steeds fhnk troebel, klaarde aheen
in de laatste dagen der proef een weinig op, terwijl zich
een volumineus praecipitaat op den bodem verzamelde.

Dat resultaat komt dus geheel overeen met de bevin-
dingen van Zarmko en Escherich.

Van twee buisjes met kalfsvleeschbouillon uit proef II,
die door den diphtheriebacU niet zuur werd gemaakt,
entte men het eene met den pseudo-, het andere met

een echten diphtheriebacil, n°. 101. Beide cultures bleven
gedurende 21 dagen de alkahsche reactie behouden,
welke in de eerste dagen niet afnam, maar later wel
toenam in intensiteit, het meest in de cultuur van
den pseudo-diphtheriebacil. 7 uur na de enting was de
cultuur van den laatsten reeds hebt troebel. De troebel-
heid en het praecipitaat, dat werd gevormd, bleven
steeds die in de diptheriecultuur overtreffen.

Met de bouihons uit vleeschextractsoorten en de pepton-
keukenzoutoplossing werden, zooals in proef VII is
vermeld, eveneens buisjes gevuld, die geënt werden met
den pseudo-diphtheriebacil.

Al deze cultures bleven ook alkalisch reageeren en
de groei was in allen duidelijk sterker, dan die der
diphtheriebaciUen in de overeenkomstige voedingsbodems.
Het sterkst groeiden de pseudo-diphtheriebaciUen in
Liebig, iets minder in Kemmerich en Cibils en verreweg
het minst sterk in de pepton-keukenzoutoplossing.

Zooals reeds in proef V werd medegedeeld, plaatste
men naast de buisjes gevuld met alkahsch blijvenden
bouiUon (uit proef II), waaraan was toegevoegd: resp.
0,2%, 0,4%, 0,67o, 0,87o, en 1 7o glucose, en geënt
met diphtheriebacü n". 101, ook 5 buisjes ieder met een
dier verschiUende bouiUons gevuld, doch geënt met
den pseudo-diphtheriebacU.

De cultures van beide bacillen werden gedurende
denzelfden tyd geobserveerd. Terwijl nu de reactie in

alle diphtheriecultures zuur werd en bleef, merkte men
bij de cultures van den pseudo-diphtheriebacil het
volgende op:

de bouihon met 0,2 % glucose bleef steeds alkalisch;
hij vertoonde geen vermindering der intensiteit van die
reactie in de eerste dagen;

de bouillon met 0,4 % glucose reageerde den eersten
dag na de enting licht alkahsch, den dag hcht zuur,
den S"!®" dag weer duidelijk alkalisch en bleef nu in het
vervolg deze laatste reactie behouden;

de bouillon met 0,6 7 glucose reageerde den dag na
de enting hcht zuur, den volgenden dag duidelijk zuur
en bleef dit gedurende 5 dagen. Later werd hij eerst
licht en vervolgens duidelijk alkahsch;

de bouillon met 0,8 7o glucose reageerde den dag na
de enting hcht zuur, den volgenden dag duidelijk zuur
en bleef nu gedurende 25 dagen aldus. Vervolgens
werd hij opeens hcht (cultuur bleek zuiver) en verder
duidelijk alkalisch;

de bouillon met 1 % glucose reageerde den dag na de
enting licht, den volgenden dag duidelijk zuur en bleef
26 dagen zuur, voordat hij weer alkahsch werd.

7 uur na de enting waren alle pseudo-diphtheriecul-
tures reeds hcht troebel. De bouihon met 0,2 V„ glucose
bleef troebel, helderde slechts op het laatst op. De
bouillon met 0,47o glucose bleef oveneens troebel, was
misschien iets, maar niet duidelijk helderer gedurende
den dag, dat hij zuur reageerde. Toen echter de zure
reactie ■ in den bouillon met 0,6 7o glucose was ingetreden,
begon deze gaandeweg geheel op te helderen en werd
eerst opnieuw troebel, toen de alkalische reactie te voor-

De bouilloncultures van onzen pseudo-diphtheriebacil
vertoonden dus een uiterlijk, dat evenzoo van de reactie
afhankelijk was, als we dat reeds bij de diphtheriebouib
loncultures opmerkten.

De groei in de pseudo-diphtheriecultures was weer
duidelijk krachtiger clan die in de diphtheriecultures.
G-edurende het bestaan der zure reactie was het praeci-
pitaat, gedurende dat der alkalische reactie waren de
troebelheid en het praecipitaat sterker.

Uit het verkregen resultaat blijkt dus, in strijd met
de bevindingen a^an Zarniko en Escherioh, dat onze
pseudo-diphtheriebacillus in staat was om in bouillon-
cultures een zure reactie te doen verschijnen en dat
die zure reactie hier, evenals in cultures van den
diphtheriebacil, door omzetting van glucose ontstaat;
alleen schijnt het voor den pseudo-diphtheriebacil noodig
te zijn, dat de bouillon een hooger gehalte aan glucose
bezitte, om een zure reactie daarin door zijn groei te
voorschijn te kunnen roepen. Dit onderscheid staat
waarschijnlijk in verband met den krachtigeren groei
van den pseudo-diphtheriebacil.

Wanneer men aanneemt, dat Zarniko en Escherioh
bij hun cultuur van den pseudo-diphtheriebacillus, bouib
lons bezigden met betrekkelijk weinig glucose, zooals
wij er b.v. een gebruikt hebben bij onze proef A.,
waarin de zure reactie niet te voorschijn komt bij cultuur
van den pseudo-diphtheriebacil, daarentegen wel bij cub
tuur van den diphtheriebacil, dan kan men hun resub
taten zeer goed verklaren.

Onderstelt men eveneens, dat de bouillons van Roux
en Yersin meer glucose bevatten dan die van Zarniko
en Escherich, altijd onder geheel dezelfde omstandig-
heden van cultuur, dan kan men zich, volgens onze
bevindingen, zeer goed voorstellen, dat eerstgenoemde
onderzoekers, zoowel hij cultuur van den pseudo- als van
den echten diphtheriebacü, de zure reactie zagen intreden
en dat de reactieveranderingen in de cultures van den
pseudo-diphtheriebacü veel sneller ontstonden.

Zoo gelukte het dus de uiteenloopende resultaten, die
verschihende onderzoekers bij hun bouihoncultures ver-
kregen , geheel bevredigend te verklaren.

De diphtheriecultures, gekweekt in kolfjes en fleschjes
en in de vorige hoofdstukken beschreven, werden, gelijk
boven vermeld, mede op haar vergiftigheid onderzocht.

Ahe cultures werden daartoe op gelijke wijze behan-
deld. Wijl gebleken was, dat de diphtheriebacil,.onder
voor gifproductie gunstige voorwaarden gekweekt, reeds
binnen circa 20 dagen een vrij groote hoeveelheid vergif
in bouillon kon vormen, bezigde ik, waar het belangrijk
scheen den voor gifvorming meest gunstige voeclings-
bouillon te leeren kennen, bijna uitsluitend cultures, die
slechts 19 — 22 dagen oud waren. Zoodoeïide zouden meer
evidente verschillen van vergiftigheid voor den dag komen,
dan bij oudere cultures.

AVanneer de tijd voor de filtratie was gekomen werd
de cultuur, na voorafgegane contröle-uitzaaüng op
giycerineagar en op Loefpler\'s serum, gemeten in een
zuiver en droog maatglas, om na te gaan hoeveel van
het oorspronkelijk volumen was verdampt. Die indam-
ping bedroeg voor ahe cultures van een serie ongeveer

evenveel, daar altijd kolfjes of fleschjes van denzelfden
vorm en gelijke grootte waren genomen, die een gelijke
hoeveelheid bevatten en in dezelfde broedstoof ston-
den. Overigens was ook het verschil in de kolfjes
en fleschjes, die voor toxiciteitsonderzoek werden
gebruikt, van geen beteekenis. De vermindering door
indamping van een cultuur met een oorspronkelijk
volumen van 200 cm\'- bedroeg in 19—22 dagen hoogstens
10 cm®. Men kon dus dezen factor bij vergelijking van
de cultures onder elkaar wel verwaarloozen.

Na meting en reactiebepaling werd nu aan de cultuur
0,5 ®/o carbol toegevoegd, om bederf van het Altraat te
voorkomen, wanneer nog microörganismen mochten
binnendringen door fouten in de asepsis na het filtreeren.
Alle verkregen Altraten bleven dan ook helder. Volgens
de onderzoekingen van Roux en Ybrsin heeft carbol
wel een vertragenden invloed op de werking van het
gif, maar deze is, volgens de ervaring in het laboratorium
alhier verkregen, bij een hoeveelheid van 0,5"/^ van
weinig beteekenis.

Nadat het carbol door hcht schudden geheel in
de vloeistof was opgelost, werd deze geAltreerd door
een dubbel Altrum van gewoon Altreerpapier. Het aldus
verkregen Altraat, dat altijd al bijna volkomen helder
was , werd dan opzettelijk door een en dezelfde bougie van
CiiAMBBRLAND geporst, omdat, gelijk men weet, de verschil-
lende bougies niet altijd hetzelfde Altraat leveren. De
bougie werd eerst bevochtigd door er een kleine hoeveel-
heid physiologische keukenzoutsolutie door te persen.
Het spreekt echter van zelf, dat men het Altraat eerst
•opving, wanneer het reeds eenigen tijd even intensief

was gekleurd als de vloeistof, die door de bougie heen-
gedreven werd, zoodat men zeker kon zijn, dat al de
keukenzoutsolutie er uit was. Om nu in staat te zijn
dezelfde bougie meermalen te kunnen gebruiken, werd
er tusschen de filtratie van twee cultures 1—2 hter
physiologische keukenzoutsolutie door heen geperst; aldus
kwamen wel geen bestanddeelen der vorige cultuur in
het filtraat der tweede, terwijl de permeabihteit van de
bougie ook niet merkbaar verminderde, omdat de over-
groote meerderheid der bacteriën door de voorafgaande
filtratie door filtreerpapier was teruggehouden. Het filtraat
uit de bougie werd opgevangen in zuivere, droge en
gesterihseerde fleschjes, die daarna behoorlijk gelakt op
een koele plaats in het duister werden bewaard. Al die
manipulaties geschiedden zoo snel mogelijk en het
filtraat werd daarbij zoo weinig mogelijk aan het licht
blootgesteld.

Elk fieschje diende slechts voor éëne injectie. Als
proefdier werd uitsluitend gebruik gemaakt van de cavia
cobaya en men injicieerde afieen subcutaan aan den
buik. Vooraf werd zorgvuldig geknipt en gereinigd
met alcohol en sublimaat. De verdunningen van het
filtraat, noodig voor de injectie van kleine onderdeelen
van 1 cM^, maakte men met gesterüiseerde, physiologische
keukenzoutsolutie. De steekopening werd afgesloten met
cohoclium.

Om de toxiciteit direct te kunnen vergelijken met die,
welke in de cultuur, in de inleiding vermeld, was ver-
kregen, ontvingen mijn proefdieren steeds 0,3 cM® pro
kilo subcutaan. Van de bedoelde cultuur toch bezat het
filtraat de eigenschap om cavia\'s, hoogstens 600 grm.

wegende, na subcutane injectie van 0,3 cm® pro Idlo
binnen 48 uren te dooden. Die graad van giftigheid
zou oolc in mijn proeven binnen circa 20 dagen moeten
worden bereikt, ja zoo mogelijk overschreden.

De bijzonderheden omtrent de dierproeven vindt men
in de verschihende protocols hierachter medegedeeld;
een kort overzicht er van laat ik hier volgen.

Proeven met de fütraten van cultures in denzelfden
kalfsvleeschbouillon, waaraan toegevoegd, 0,01 "/o; 0.1 %,
resp. 0,6 7o glucose.

Deze cultures waren geënt met bacü n». 101. De dieren,
welke men had ingespoten met het alkalisch filtraat der
bouihons met 0,01 7„ en met 0,1 % glucose, (cavian^ 1,
2, 3,) vertoonden een sterke zwelling met opvolgende
necrose op de plaats van injectie, maar succombeerden
niet. Het necrotisch gedeelte werd langzamerhand afge-
stooten. Oolc namen die , dieren niet in gewicht af en
waren overigens niet merkbaar ziek.

De cavia n^ 4 , welke het zure filtraat der bouillon met
0,6 7o glucose had gekregen, vertoonde aheen op den
dag na de injectie een zeer lichte zwehing, welke den
volgenden dag reeds was verdwenen.

Duidelijk blijkt uit die proef, dat toevoeging van glucose
aan denzehden bouihon in zóó groote hoeveelheid (0,6 "/J,
dat de reactie zuur bleef, de vergifproductie aanmerke-
lijk vermindert. Schoon de bouihons, waaraan slechts
0,01 7o en 0,1 % glucose was toegevoegd, alkahsch waren
gebleven, was hun filtraat toch op verre na niet zóó

giftig, dat 0,3 cm^ pro kilo subcutaan cavia\'s binnen
48 uren doodde. Welkclit was die kleine hoeveelheid
suiker reeds nadeelig voor de gifproductie, of erw^aren
andere omstandigheden in het spel, gelijk daar zijn:
vermindering van de virulentie van den bacil, trager
vermenigvuldiging in den gebezigden bouihon, moeielijker
toetreden van de lucht, enz. In elk geval bevestigen
die proeven het door Roux en Tebsin e. a meermalen
geconstateerde feit, dat de gifproductie niet van betee-
kenis is, zoolang de cultuur zuur reageert.

De toename in gewicht van alle cavia\'s, den eersten
dag na de injectie gelijk men in dit protocol opmerkt
is te wijten aan minder goede voeding daags vóór de
proef, terwijl de dieren in de kleine hokjes, waarin zij
daarna ter observatie overgingen, flink werden gevoed.

Proeven met de filtraten van cultures in bouiUons bereid
uit: Liebig-, Kemmerich- en GiUls-vleeschextract en in
pepto7i-keukenzoutoplossing.

Al deze cultures waren geënt met bacil n". 101. De
dieren met de Altraten der bouihons uit vleeschextract-
soorten ingespoten, gingen ahen een flinke zwehing met
opvolgende necrose. vertoonen. Die, welke de filtraten
van Kemmerich- en Cibils-bouihon hadden gekregen
(cavia n®. 6 en 7), namen bovendien langzamerhand
in gewicht af en stierven na 8 dagen. In deze had
dus de sterkste gifproductie plaats gegrepen.

Overeenkomstig met den zeer zwakken groei in de
pepton-keukenzoutoplossing werd de werking van het
filtraat daarvan ook uiterst zwak bevonden (cavia n°. 8),

De dood der beide cavia\'s n". 6 en n°. 7 was zonder
twijfel toe te schrijven aan het ingespoten vergif Andere
oorzalsen van den dood werden niet gevonden.

De aanvaniielijii toename in gewicht van alle dieren
op den eersten dag na de injectie is ook hier weer te
wijten aan minder overvloedige voeding vóór dien tijd.

Om na te gaan, of de gifproductie in Kemmerich- en
Cihils-bouiUon mettertijd, dat wil zeggen na meer dan
20 dagen, nog aanmerkelijk toenam, werden de volgende
twee proeven genomen.

Proeven met het filtraat van 45 dagen oude cultures in
denzelfden bouillon bereid uit Kemmerich-vleeschextraat.

Volgens het vroeger gegeven voorschrift werd bouillon
uit Kemmerich-vleeschextract vervaardigd en daarmede
literflesschen hoog gevuld. Ka sterilisatie en controle
bezaaide men allen met bacü n°. 100 uit de stamcultuur.
De bacil groeide niet heel sterk, een aantal flesschen
moesten een tweede maal geënt worden. De cultures
bleven staan van 10 Maart tot 24 April, waren dus 45
dagen oud toen ze gefiltreerd werden. Voor de filtratie
werden de cultures uit alle flesschen bij elkaar gegoten,
gemengd, daarin 0,5 "/o carbol opgelost en op de gewone
manier gefiltreerd.

Van het Altraat ontvingen twee cavia\'s (n°. 9 en 10)
weer 0,3 cm® pro kilo subcutaan met het volgende
resultaat: Beiden gingen een flinke zwelling vertoonen
op de plaats van injectie, namen progressief in gewicht
af, werden al zieker en zieker en succombeerden op

den dag na de injectie. De obductie toonde duidelijk
aan, dat de dood door het diphtheriegif was veroorzaakt.

Hoewel men de cultures van bacil n°. 100 vry oud
had laten worden, bleek dus de gifproductie daarin bij
deze tweede proef nog niet zoo sterk, dat 0,3 cm® pro
kilo subcutaan binnen 48 uren doodde. Door cultuur
in dezen bouillon konden we het gewenschte resultaat
nog niet bereiken.

Troeven met filtraten van cultures in denselfclen bouiUon
uit Gibils-vleeschextract, maar op verschillende tijden
gefiltreerd.

Een hoeveelheid bouiUon werd op de gewone manier
uit Cibils-vleeschextract bereid en daarmede gevuld
medicijnfleschjes van 500 grm. inhoud, zoodat elk fleschje
450 cm® bevatte. Na sterilisatie en controle werden
ze bezaaid op 14 Maart-met bacü n®. 102 uit stamcultuur.
De bacü groeide zeer intensief. Op 30 Maart, dus na
16 dagen, werd één fleschje gefiltreerd op de gewone
manier en van het verkregen filtraat direct bij een
cavia 0,3 cm® pro küo subcutaan ingespoten (cavia n°. 11).
Dit dier vertoonde den volgenden dag een weinig zwel-
ling, welke weldra verdween zonder necrose, en bleef
gezond.

Op 9 Aprü, dus na 26 dagen, werd een tweede fiesch
gefiltreerd en dezelfde dosis van het filtraat bij een
andere cavia subcutaan ingespoten (cavia n". 12). Dit
dier vertoonde in de eerste dagen een vrij flinke zwelling
op de plaats van injectie, gevolgd door necrose. Het

nam ook in de eerste dagen een weinig in gewicht af,
maar werd overigens niet ziek. Het necrotische gedeelte
werd dan ook later afgestooten en het dier genas.

Op 4 Mei werd een derde flesch gefiltreerd. De
cultuur was dus toen 51 dagen oud.

De gewone dosis van het filtraat werd hij cavia
n^. 13 subcutaan ingespoten. Dit dier nam in de eerste
dagen een weinig in gewicht af, vertoonde een flinke
zwelling gevolgd door necrose; maar het necrotisch
gedeelte werd later afgestooten en de cavia genas.

Zelfs na 51 dagen was er dus in de cultures van dien
bacü in Cibhs-bouihon niet genoeg gif geproduceerd, om
in een hoeveelheid van 0,3 cm® pro küo subcutaan
toegediend, een cavia te dooden.

Proeven met cle filtraten van cultures in LieUg-houillon
aan cle lucht en onder waterstof.

Het filtraat der Liebig-bouiUoncultuur aan de lucht
doodde het dier (cavia n°. 14) in 3 dagen. Hier had
men dus, volgens deze proef, een gif van vrij groote
sterkte. Of men nu met een bijzonder gevoehge cavia
te doen had, moet ik in het midden laten; de bouillon
was geheel op dezelfde manier als vroeger uit Liebig-
vleeschextract bereid, de cultuur had onder dezelfde
voorwaarden verkeerd en de groei daarin was niet
opvallend sterk geweest.

Uit het resultaat van deze proeven zou men dus
geneigd kunnen zijn aan te nemen, dat de anaërobiose
een nadeehgen invloed heeft op de toxiciteit; echter
dient men in het oog te houden, dat de onwerkzaam-
heid van het filtraat hier ook kan worden verklaard
uit den zeer geringen groei en het ontbreken der alkah-
sche reactie.

Proeven met de filtraten van cultures in bouillon bereid
uit versch, en in bouillon uit oud rundvleesch.

Ahe cultures waren geënt met bacil n°. 102 uit stam-
cultuur. De cultuur in bouiUon uit oud vleesch was
21 dagen, die in bouiUon uit versch vleesch 22 dagen
oud, toen ze gefiltreerd werd. Door het filtraat van
den bouiUon uit versch vleesch, die gedurende 12 dagen
ongeveer zuur was geweest, werd de cavia n°. 17 niet
gedood. Het dier vertoonde slechts een geringe zwelling,
gevolgd door een hebte, oppervlakkige necrose. Het
scheen niet ziek en nam niet in gewicht af.

De cavia n°. 18, die met het filtraat van den bouiUon uit
oud vleesch, welke steeds alkahsch had gereageerd, was
ingespoten, vertoonde daarentegen den volgenden dag
een sterke gewichtsafname, terwijl er een geringe
zweUing op de plaats van injectie aanwezig was. Het
dier was toen reeds zeer ziek, at niet meer en zat
ineengedoken in een hoek van zijn kooi. Den tweeden
dag na de injectie vond men het \'s morgens dood. De

sectie braclit de typisclie afwUkingen voor den dag\\
Die sterke gifproductie was dus verkregen in een bouillon-
cultuur, die steeds alkalisch had gereageerd en zelfs
gedurende verscheidene dagen een sterke intensiteit
dier reactie had vertooud, zooals in proef XIII is-
gemeld. Dit resultaat pleet dus sterk voor den gunstigen
invloed der alkahsche reactie en aan den anderen kant
tegen de schadelijke werking van de gevormde basische
producten, zooals die door Brieger wordt aangenomen.

Intusschen zou men kunnen meenen, dat hier,
behalve de werking van het diphtherietoxine, ook die
van ptomaïnen in het spel was geweest, daar het
vleesch eenigen tijd bij 20° was bewaard en dus in een
hchten graad van bederf had verkeerd. Het vleesch
was wel verkleurd, maar het slechts een geringe rottings-
lucht waarnemen, toen het voor de bouillonbereiding
werd gebruikt. Daarom trachtte ik na te gaan of die
ptomainen eenigszins tot den dood van het dier hadden
kunnen bijdragen. Zooals reeds door de beroemde onder-
zoekingen van Panum bekend is geworden, vernietigt
men de ptomaïnen niet door koken, zelfs niet wanneer
dit uren lang wordt voortgezet. Daarentegen wordt,,
zooals Roux en Ybrsin hebben gevonden, het diphtheriegif
reeds onwerkzaam door een kortdurende verhitting
boven 60°. Een gedeelte van het Altraat van den bouülon
uit oud vleesch werd nu gedurende een half uur in
kokend water gedompeld en daarvan 8 cM® subcutaan
geïnjiciëerd bij cavia n°. 19. Zooals uit het protocol

1) Panum. Das putride Gift der Bacterien, die putride Infection
oder Intoxication und die Septicämie. Virchow\'s Arcliiv. t. LX. 1874.

blijkt, ondervond het dier hiervan niet het minste letsel;
het werd niet ziek en kreeg slechts in de eerste dagen
een zeer geringe zwelling op de plaats van injectie.

Proeven met de filtraten van cultures in kalfsvleesch-
bouillon en in clenzelfden kalfsvleescMouillon met earh.
calc., — met sulf. calc., — met carb. en sidf. calc. en —
met carb. calc. onder waterstof.

Yan de cavias met de filtraten van deze bouiUons
ingespoten succombeerde aUeen die, welke het filtraat
van kalfsvleeschbouiUon met carb. calc. had ontvangen
(cavia n". 22) en wel binnen 48 uren na de injectie, en
zonder twijfel aan intoxicatie met diptheriegif, zooals
de sectie leerde.

De dieren, welke de beide andere alkahsche Altraten
hadden gekregen, namelijk dat van bouiUon met carb.
en sulf. calc. en dat van bouiUon met carb. calc.
onder H. (cavia n°. 23 en n®. 24), gingen beiden een Uchte
zwelliug met opvolgende necrose vertoonen, maar bleven
in leven. .

De zure Altraten, namelijk dat van bouülon met sulf.
calc. en dat van kalfsvleeschbouiUon alleen, veroorzaak-
ten slechts in de eerste twee dagen een zeer Uchte zwel-
ling (cavia n\'\'. 20 en n°. 21).

Uit dit resultaat blijkt dus duidelijk de voordeehge
invloed van het alkahsch blijven der reactie en tevens

de nadeelige werking van het sulf. calc. Bij cavia
n°, 21 kan men de geringe toxiciteit nog toeschrijven
aan de zure reactie, maar bij cavia n°. 23 had de cultuur
steeds alkahsch gereageerd en lag het dus voor de hand
om aan te nemen, dat het, door de aanw^ezigheid van
sulf calc. volgens BßiEaER gevormde, ammoniumsulfaat
een nadeehgen invloed op de gifproductie uitoefende.
Door den gunstigen invloed der alcahciteit vertoonde het
Altraat, bij cavia n°. 23 ingespoten, toch nog meerdere
werkzaamheid dan dat bij cavia n . 21 ingespoten.

Proeven met cle filtraten van cultures in Gibils-houillon
■ en in clenzelfden Cibils-bouillon met carb. calc., — met
sulf. ccdc., — met carb. en sulf. calc. en — met carb.
calc. onder, waterstof.

Al deze bouihons waren geënt met diphtheriebacü n". 101
uit stamcultuur. De cultures waren 21 dagen oud, toen
ze gefiltreerd werden. Zooals wij reeds in proef XV
vermelden, reageerden ahen alkahsch en wel zonder
duidelijk verschü in intensiteit. Volgens de resultaten
der vorige proeven konden we nu verwachten, dat het
filtraat van Cibüs-bouiUon aheen, en dat van Cibils-bouü-
lon met carb. calc. niet belangrijk in werkzaamheid zou-
den verschillen.

De giftigheid van de filtraten van den bouihon met
sulf. calc. zou echter volgens de aangenomen werking
van dit zout minder groot zi]n.

De cavia no. 25, met het filtraat der cultuur in
Cibils-bouihon alleen ingespoten, stierf binnen 48 uren.

De cavia n". 27, welke het filtraat van Cibils-bouihon met
carb. calc. gekregen had, vertoonde een progressieve ge-
wichtsvermindering met sterke zweUing, gevolgd door
necrose op de plaats van injectie, en stierf op den
dag na de inspuiting. Volgens de obductie moest men
den dood aan intoxicatie met diphtheriegif toeschrijven.

Het is mij niet geheel duidelijk geworden, waaraan
dat belangrijk verschil in giftigheid te wijten is. Uit
het resultaat, dat de sectie van cavia n". 25 leverde,
valt echter niet met voldoende zekerheid den dood door
diphtheriegif op te maken. Het dier vertoonde geen
hyperaemie der bijnieren en had een zeer sterk door gas
uitgezette maag. Den dag na de injectie was het niet
merkbaar ziek, terwijl het slechts zeer w^einig in ge-
wicht was afgenomen. Den dag na de injectie
echter, werd het plotseling \'smorgens dood gevonden.
Het is dus niet onmogelijk, dat de dood van het dier
door een andere oorzaak, waarschijnlijk met de sterk
uitgezette maag in verband staande, was verhaast.

Tegen mijn verwachting ging nu ook de cavia
n". 26, welke met het filtraat van Cibils-bouillon met sulf.
calc. was ingespoten, een progressieve gewichtsvermin-
dering vertoonen en werd al zieker en zieker, zonder
plaatselijke zwelling. Op den dag na de injectie werd
het dier dood gevonden.

inspuiting de canule te diep was ingestooten en in de
buil^liolte was tereditgekomen. Het dier had dus, in plaats
van een subcutane, een intraperitoneale injectie ontvangen.
Men vond subcutaan volstrekt geen oedeem, maar aan het
Peritoneum parietale, overeenkomende met de plaats
van injectie, afzetting van fibrine. De geheele peri-
toneaalholte en ook de pleuraholten waren met een sterk
haemorrhagische vloeistof gevuld. De bijnieren waren
hcht hyperaemisch.

De cavia n°. 28, welke het filtraat van Cibils-bouillon
met carb. en sulf. calc. ontvangen had, reageerde daarop
totaal niet. 29, welke het filtraat van de cultuur
onder H. gekregen had, vertoonde slechts enkele dagen
een lichte zwelling.

Bij nadere beschouwing waren dus de resultaten van
deze proeven met Cibils-bouillons, wat betreft den gunsti-
gen invloed der alkalische reactie , niet in tegenspraak met
onze bevindingen in de vorige proeven.

De resultaten bij cavia n°. 24 en n®. 29 verkregen
pleiten zeer voor den gunstigen invloed der anaërobiose
op de giftigheid eener cultuur, wanneer deze slechts
alkahsch blijft reageeren. Immers den zeer geringen
groei in aanmerking genomen, welke in de cultures onder
H had plaats gegrepen, was de werkzaamheid van de
filtraten dier cultures bepaald een sterke te noemen.

Nadat uit de voorafgegane proeven was gebleken, dat
de sterkste giftproductie had plaats gegrepen in den
alkahschen bouiUon bereid uit oud rundvleesch en
in den door toevoeging van carbonas calcicus, alkahsch
gehouden bouiUon, bereid uit versch kalfsvleesch, nam
ik een bouiUon bereid uit oud rundvleesch, waaraan ik

ten overvloede nog carbonas calcicus toevoegde, om, indien
er nog eenig zuur werd gevormd, ook die kleine quan-
titeit dadelijk te binden. Zoodoende, meende ik, zouden
de omstandigheden zoo gunstig mogelijk moeten zijn.

Proeven met de ßtraten van cultures in houillon bereid
uit oud rundvleesch, waaraan carb. calc. was toegevoegd.

Greheel op dezelfde wijze, als in proef XIII is
beschreven, het men een stuk versch rundvleesch
eenigen tijd bij ongeveer 20° staan en bereidde toen
daaruit bouiUon. Deze bouiUon werd verdeeld in medi-
cyntleschjes van 500 cM® inhoud zoo, dat elke flesch
450 cM® bevatte, dus hoog was gevuld. In elke flesch
werd een voldoende hoeveelheid carb. calc. gedaan.

De bouülon werd bezaaid op 3 Mei met diphtherie-
bacU n"". 102. De bacteriën groeiden uitstekend.

Op 27 Mei, dus na 24 dagen, werd de cultuur uit
één der flesschen gefiltreerd. Op 28 Mei, te 11 ure v.m.,
werd van het filtraat 0,3 cM® pro kilo bij een cavia
van 660 grm., dus bijzonder zwaar, subcutaan inge-
spoten (cavia n°. 30). Dat dier was den volgenden dag
ziek, vertoonde een weinig zwelling op de plaats van
injectie en was sterk in gewicht afgenomen; het stierf
dan ook nog op denzelfden dag \'s avonds te 6 ure,
dus binnen 36 uren na de injectie.

De obductie bracht de typische pleuritis serosa en
sterke hyperaemie der bijnieren aan het licht.

Op 3 Juni werden de cultures uit de overige flesschen
bij eengegoten en daarna gefiltreerd. Om den graad van

giftigheid van\' dit filtraat te leeren kennen, werd nu bij
een cavia 0,2 cM^ pro kilo (cavia no. 31) en bij een
andere 0,1 cM-\'\' pro kilo ingespoten (cavia n°. 32).

De eerste, welke 0,2 cM^\' pro kilo had ontvangen,
was den volgenden dag ziek, vertoonde een duidelijke
zwelling en stierf op den tweeden dag na de injectie,
dus binnen 48 uren. De sectie toonde weer pleuritis
serosa en hyperaemie der bijnieren aan.

De tweede, welke 0,1 cM^\' pro kilo had ontvangen,
vertoonde op den dag na de injectie eveneens een duide-
lijke zwelhng en was ziek. Den volgende dagen bleef
het dier die zwelling behouden, werd al zieker en zieker,
nam in gewicht af en stierf op den dag na de
injectie,

0,2 cM^ van het filtraat dier 31 dagen oude cultuur
doodde dus nog 1 kilo cavia binnen 48 uren.

In korte trekken samengevat, luiden derlialve de uit-
komsten van mijn proeven, als volgt:

In licht alkahschen voedingsbouillon produceert de
diphtheriebacil aheen dan een zoo groote hoeveelheid
zuur, dat de voedingsvloeistof een zure reactie aanneemt,.
als zich in dien bouihon zekere hoeveelheid glucose of
glycerine bevindt.

In bouihons bereid uit versch rund- of kalfsvleesch
is, naar de ervaring leert, bijna altijd een zoo groote
hoeveelheid glucose aanwezig, dat de reactie, onder
invloed van de ontwikkeling van den bacü, zeer duide-
lijk zuur wordt.

Daarentegen is volstrekt geen omslag der reactie te
constateeren, als men den bacü kweekt in bouihons uit
vleeschextracten (Liebig, Kemmerich, Cibils) bereid.
Yoegt men nu aan dergelijke bouillons, die dus blijkbaar
zeer weinig of geen glucose bevatten, een zekere hoe-
veelheid druivensuiker toe, dan treedt de zure reactie

na zekeren tijd in, terwijl de intensiteit dier reactie
afhankelijk is van de toegevoegde hoeveelheid suiker.

De zure reactie, die in bouillons uit versch vleesch
bereid is ingetreden, maakt in zeer vele gevallen weder
plaats voor een alkalische; voor dien tweeden omslag
der reactie is des te meer tijd noodig, naarmate het
vleesch een grootere hoeveelheid glucose bevat. Door
toevoeging van verschillende hoeveelheden druivensuiker
aan een bouillon, die zonder die toevoeging bleek alka-
lisch te blijven, kan men in dien bouiUon een tijdelijke
of een blijvende zure reactie doen ontstaan.

In suiker- en eiwitvrije urine produceert de diphtherie-
bacü geen zuur. In urine van een diabeticus of in
oorspronkelijk suikervrije urine, waaraan een weinig
glucose is toegevoegd, wordt zuur gevormd.

Het feit, dat af en toe in bouiUons bereid uit rund-
of kalfsvleesch de zure reactie niet kan worden gecon-
stateerd, is zonder twijfel in de eerste plaats hieraan
toe \'te schrijven, dat het gebezigde vleesch reeds eenige
dagen oud was.

In bouiUons, bereid uit een en hetzelfde stuk vleesch,
doch zoo, dat men een deel daarvan in verschen toe-
stand , een ander deel nadat het eenige dagen is bewaard
geworden, voor die bereiding bezigt, kan men den in-
vloed van het oud zijn van het vleesch gemakkelijk
constateeren.

De pseudo-diphtheriebacü verhoudt zich, met betrek-
king tot de zuurproductie in genoemde bouiUons, geheel
als de echte diphtheriebacü. AUeen valt op te merken,
dat, in tegenstelling tot den echten diphtheriebacü, de
pseudo-diphtberiebacil een ietwat grootere hoeveelheid

suiker behoeft, om een omslag van de oorspronkelijke,
alkalische reactie teweeg te brengen. Daarom blijft dien
omslag uit (Zaeniko en Escheeich), als toevaUigerwijze
de gebezigde bouillon een relatief kleine quantiteit glucose
bevat.

Het toetreden der dampkringslucht oefent op de reactie
der diphtheriecultuur een manifesten invloed uit: de
eenmaal zuur geworden diphtheriecultuur blijft die zure
reactie behouden, als het toetreden der lucht is verhinderd.
Door rijkelijken toevoer van lucht aan de zuur geworden
cultuur slaat de reactie in betrekkelijk korten tijd weder
in een alkaüsche om en wel door sneUere oxydatie der
N-houdende stoffen (Roux).

Wat de gifproductie van den diphtheriebacil betreft,
zoo lijdt het geen twijfel, dat de zure reactie der
voedingsvloeistof daarvoor nadeeüg is. Zoo lang de zure
reactie bestaat, bezit het filtraat der cultuur nagenoeg
geen vergiftige eigenschappen. Om snel en zeker een
sterk diphtheriegif te verkrijgen, moet dus, in de aUer-
eerste plaats, op de reactie worden gelet en het zuur
worden van den bouiUon tegengegaan. Daar om andere,
niet nader bekende oorzaken, doch waarschijnlijk in
verband staande met de inconstante samensteUing der
vleeschextracten, in bouiUons daaruit bereid, de gifpro-
ductie meestal veel geringer is, dan in bouiUons uit
rund- en kalfsvleesch vervaardigd, zal men van eerstge-
noemde, schoon zij alkahsch blijven, niet met succes
gebruik kunnen maken.

Men is dus genoodzaakt met vleeschbouiUon te arbeiden
en kan nu den schadelijken invloed der zure reactie
elimineeren, vooreerst door het vleesch oud te laten

worden en ten tweede door aan bouillon, hetzij uit versch
vleesch, hetzij uit oud vleesch bereid, carbonas calcicus
toe te voegen. Om zeker te gaan verdient het aanbe-
veling het vleesch oud te laten worden en aan den
daaruit bereiden bouillon desniettemin carbonas calcicus
toe te voegen. Deze methode verdient de voorkeur
boven die, welke de ingetreden zure reactie snel neu-
traliseert door toevoer van lucht en wel om deze reden,
dat de lucht de werkzaamheid van het diphtheriegif
vermindert.

Om die reden ook is het waarschijnlijk, dat een
diphtheriecultuur onder waterstof gekweekt een sterk
giftig filtraat zoude leveren, indien men slechts den
diphtheriebacil onder die omstandigheden krachtig konde
laten groeien.

Het bovenstaande geeft een plausiebele verklaring
van de vroeger besproken tegenstrijdige resultaten,
welke verschillende betrouwbare onderzoekers bij de
gifbereiding hadden verkregen.

Vooreerst is de sterke gifproductie, welke in de inlei-
ding is vermeld, zeer zeker te wijten aan het feit, dat
de gebezigde bouillon door cultuur van den diphtherie-
bacil niet zuur werd gemaakt.

Evenzoo zijn de schijnbaar zoo onverklaarbare resul-
taten , welke Kupeianow verkreeg, ons duidelijk. Immers
hij constateerde de sterkste gifproductie in den bouiUon,
die oorspronkelijk een vrij sterk alkalische reactie
bezat, terwyl in zijn andere bouiUons, die aanvan-
kelijk neutraal of zuur reageerden, resp. een veel
zwakker of in het geheel geen gif werd gevormd.
Kuprianow gebruikte bouiUons, die zonder toevoeging

van glucose werden vervaardigd; hij had dus bij die
proeven den bouiUon toevallig bereid uit vleesch, waarin
zeer weinig of geen glucose voorkwam. Het vermoeden,
dat hij opperde naar aanleiding van bovengenoemd
resultaat, namelijk, dat afgezien van de virulentie der
cultuur, de graad van alcahciteit van den bouiUon het
voornaamste moment bij de gifproductie zoude zijn, heb
ik dus in zooverre bewaarheid gevonden.

]3at Kupeianow in een bouihon, welke schijnbaar
geheel op dezelfde wijze was bereid als die, waarin
hij vroeger zoo sterke gifproductie kon constateeren,
bij een tweede proef slechts een veel zwakker gif kon
verkrijgen, is ook weer te verklaren door aan te nemen,
dat hij, in dit laatste geval, toevalligerwijze vleesch
met een betrekkelijk hoog glucosegehalte voor zijn
bouiUonbereiding bezigde.

Blijkbaar zijn ook de ongunstige resultaten, die Behring
bij zijn gifbereiding in het groot verkreeg, hieraan te
wijten, dat hij niet heeft gelet op de reactie zijner cul-
tures. Volgens onze bevindingen is de zure reactie van de
overgroote meerderheid dier cultures, wel waarschijnlijk
de oorzaak, dat daarin geen gif werd gevormd, dat
de sterkte van zijn normaalgif bereikte.

Wat betreft de resultaten, die in het laboratorium
alhier waren verkregen bij toepassing van de door
Roux aanbevolen methode om een sterke gifproductie te
verkrijgen, welke resultaten, zooals ik in de inleiding
heb vermeld, geheel in strijd waren met die van Roux,
zoo wU ik in de eerste plaats herinneren aan den ver-
zwakkenden invloed van den ruimen luchttoevoer op de
werkzaamheid van het diphtheriegif. Immers het is

bekend, dat het diphtheriegif veel van zijn kracht verhest,
wanneer het geruimen tijd in contact blijft met de
lucht. In de tweede plaats dient men ook te letten
op den voordeeligen invloed, die de methode kan hebben,
omdat, door de meerdere oxydatie van N-houdende
stoffen in de cultuur, een sterkere alkahproductie en
aldus een sneller omslag van een eventuëel ontstane
zure reactie plaats grijpt. In hoofdzaak moet dan ook
door den korten duur der zure reactie, de sterke gif-
productie, welke Roux met zijn methode verkrijgt,
worden verklaard. Het is echter duidelijk, dat in
cultures, waarin de diphtheriebacil geen zuur vormt,
ook de bovengenoemde voordeehge invloed van den
ruimen luchttoevoer zich niet kan doen gelden. Integen-
deel , in zulke cultures moet men den nadeehgen
invloed; namelijk het vernietigen van het gif door het
ruime contact met de lucht, in zijn volle kracht
waarnemen. Wanneer men nu onderstelt, dat in de
cultures, die voor de proef in de inleiding vermeld
dienden, de diphtheriebacil geen zuur produceerde, dan
kan men begrypen, waarom in dit geval de volgens
Roux\'s methode behandelde cultures een zwakkere
giftigheid vertoonden, dan die, waarover geen lucht
werd gevoerd. Het was inderdaad geconstateerd, dat
beide soorten van cultures na korten tijd alkahsch
reageerden.

Zoo ben ik dus door mijne uitkomsten in staat
de soms zoo tegenstrijdige resultaten te verklaren van
alle vroeger genoemde onderzoekers, behalve die van
schbuelen.

met de opvatting van Soheurlen, zoowel wanneer hij
meent, dat de toevoer van lucht in het geheel geen
invloed heeft op de gifproductie, als wanneer hij zegt,
dat de cultures juist zuur moeten reageeren om een
hoogen graad van giftigheid te bezitten.

filtraat der cultuur in bouillon,
waaraan toegevoegd:
0,01 glucose.
19 das-en. oud.

filtraat der cultuur in bouillon,
waaraan toegevoegd:
0,6 "/(, glucoss.
19 dagen oud.

bouillon, waaraan toegevoegd: 0,01 % , 0,1 , resp. 0,6 "/g glucose,
proef IV en V.

Proeven met de iiltraten van cultures in bouillons bereid uit:
zoutoplossing. Vergelijk

Sectie: diepgaande necrose op de plaats van injectie. Geen peritonitis, geen.
exsudaat in de borstholte, alle organen normaal.

Sectie: diepgaande necrose, geen peritonitis, geen exsudaat ia de borstholte,
alle organen normaal.

26 April, duidelijke zwelling op de plaats van injectie, gew. 370 grm.
37 » tlinke zwelling, gew. 340 grm. Dier is stil.

29 » » » Het dier is zeer ziek. gew. 320 grm.
Sterft \'s namiddags ten 3 ure.

Sectie: pleuritis serosa. Hyperaemia gland. supraren. Vrij sterk oedeem op
de plaats van injectie, overigens alle organen normaal.

29 » wordt \'s morgens dood in tet hok gevonden, gew. 310 grm.
Sectie: als van cavia n°. 9.

9 April \'95
12 m.

4 Mei \'95
10,30 V. m.

filtraat der cultuur in Liebig- : 0,157
bouillon, welke gedur. 16
dagen onder H had gestaan.

filtraat der cultuur in Liebig- i 0,141
bouillon, welke gedur. 18 ;
dagen onder H had gestaan.
19 dagen oud.

31 ï )) » Het dier is zeer ziek, gew. 365 grm.
Sterft \'s namiddags ten 4 ure.

Sectie-, pleuritis serosa. Hyperaemia gland. supraren. Vrij sterk oedeem op
de plaats van injectie, overigens alle organen normaal.

31 Maart, geen zwelling, gew. 465 grm.
1 April, » » gew. 465 grm.
De cavia blijft gezond.

filtraat der cultuur in bouillon | 0,120
bereid uit versch rundvleesch. i
22 da^en oud. !

hetzelfdo filtraat als cavia n°.
18, nadat het gedurende één
half uur in kokend water was
gedompeld.

24 » Het dier wordt \'s morgens dood gevonden, gew. 300 grm.
Sectie-, licht oedeem op de plaats van ilijectie.

filtraat der cultuur in kalfs- : 0,156
vleesclibouillon met carb. calc.,
welke gedur. 19 dagen onder
H liad gestaan.

•leiizelfden kalfsvleeschbouillon, met carb. calc.; — met sulf. calc.,
dergelijk proef XV.

30 April, geringe zwelling. Het dier is ziek, gew. 470 grm.
1 Mei. Het dier wordt \'s morgens vroeg dood gevonden, gew. 410 gram.
Sectie-, gering oedeem op de plaats van injectie.

In beide pleuraholten veel heldere vloeistof. Sterk hyperaemische bijnieren,
Overigens alle organen normaal.

Proeven met de Altraten van cultures in Cibels-bouillon en in : ^
met carb. en sulf. calc , — met carb calc. onder waterstof. ; i

Dosis
0,3 pro kilo
cavia.

0,147

filtraat der cultuur in Cibils-
bouillon, welke gedur. 20
dagen onder ïl had gestaan.

ienzelfden Cibels-bouillon met carb. calc., — met sulf. calc., —
Vergelijk proef XV.

Sectie ■. Zeer weinig oedeem op de plaats van injectie. Yeel heldere vloei-
stof in de pleuraholten. Geen hyperaemie der bijnieren. Zeer sterk door
gas uitgezette maag.

Sectie-. Geen oedeem op de plaats van injectie. De peritoneaalholte en de
beide pleuraholten bevatten zeer veel, sterk haemorrhagische vloeistof. Op de
plaats van injectie aan het peritoneum parietale vindt men een afzetting van
fibrine. De bijnieren zijn licht hyperaemisch, de nieren bleek. Het filtraat
schijnt direct in de peritoneaalholte gespoten te zijn.

Sectie-. Diep gaande necrose op de plaats van injectie. Geen vloeistof in
pleura- en peritoneaalholten. Geen hyperaemische bijnieren.

» lichte zwelling, gew. 545 grm.

» » » gew. 545 grm.

» »

filtraat der cultuur in bouillon
uit oud rundvleesch. met carb.
calc.

24 dagen oud.

filtraat der onder elkaar ge-
mengde cultures in bouillon
uit oud rundvleesch met carb.
calc.

31 dagen oud.
hetzelfde filtraat als cavia n°, 31.

Het dier, dat den gelieelen dag al ziek was, sterft \'s avonds tegen 6 ure.
Seotie-. Pleuritis serosa. Hyperaemia haemorrhagia gland. supraren. Licht
oedeem.

1,15 n. m. wordt het stervende gevonden.
2,30 n. ra. Het dier ligt dood in het hok.
Sectie-. Pleuritis serosa. Hyperaemia -f- haemorrhagia gl. supraren. Oedeem.

Het onderscheiden van diphtherische en diphtheroïde
slijmvhesaandoeningen op grond van het bacteriologisch
onderzoek is voorhands gevaarlijk en dus te verwerpen.

Koorts en leucocytose bij infectieziekten zijn als ver-
dedigingsmiddelen van het organisme tegen de infectie
op te vatten.

De meening van Chatbnay, volgens welke bij inspui-
ting van diphtheriegif bij konijnen en cavia\'s het aantal
leucocyten constant progressief zou dalen tot aan den
dood van het dier, is, wat konijnen betreft, niet juist.

Aderlating is een machtig, soms levensreddend thera-
\'peuticum, in het byzonder in zekere gevaUen van
pneumonie. Dat het meerendeel van de medici onzer
dagen hare waarde niet kent of minacht is te betreuren.

In vele opzichten wordt men omtrent de functie van
het hart voortreffelijk ingelicht door de studie van den
venapols, vaak beter dan dcfor die van den arteriepols.
Daarbij verdient aanbevehng de onderscheiding vsm een
auriculairen en een ventriculairen venapols.

„J\'inclinerais à penser que le bromure de potassium
doit rester pour ainsi dire un ahment pour l\'épileptique
qu\'il a guéri, ou dont il a suspendu la maladie."
(Voisin. De l\'emploi du bromure de potassium dans les X

Het afvloeien van meconium mag ook bij hoofd- en
dwarsligging niet zonder meer als een teeken van
dreigende of bestaande asphyxie van het kind opgevat
worden.

Het onderzoek per vaginam bij parturientes beperke
men tot die gevallen, waar door uitwendig onderzoek of
door onderzoek per rectum het doel niet wordt bereikt.

Bij de behandeling van perforeerende wonden der
borstholte immobiliseere men allereerst absoluut.

De operatie methoden bij strictura urethrae, genaamd :
„Cathétérisme forçé" en „gewaltsame Dilatation" zijn
geheel te verwerpen.

Dat de z. g. vermoeidheid van de retina zou zijn te
beschouwen niet als een gevolg van een alteratie dezer
laatste, maar van den lobus occipitalis der hersenen,
zooals SoHiELE beweert, is door hem niet bewezen.

Uraemie ontstaat door retentie van toxische stoffen
en door suppressie of vermindering van de „Sécrétion
interne" der nieren.

Dat de extirpatie der bijnieren zou dooden door
intoxicatie is onwaarschijnlijk.

De bij iritis, als ook de bij diabetes somwijlen voor-
komende myopie is zeer goed te verklaren uit een toename
van den brekingsindex van het waterachtig vocht.

Indien eenigszins mogelijk, verrichte men een optische
iridectomie aan de temporale zijde.

Het aannemen van een ontstaan van cehen uit
tusschenstof is een schrede achterwaarts.

De macroscopisch zichtbare karteling, de z. g. ora
serrata vormende, ontstaat gedurende het extrauterine
leven.

De door Dubois beschreven „Pitheca.nthropus erectus"
beeft uit een vergelijlsend anatomisch oogpunt niet die
beteelcenis, welige de schrijver hem toelsent.

Dat het hcht de hoofdoorzaali zoude zijn van de
spontane reiniging der rivieren, zooals Büchner beweert,
is zeer onwaarschijnlijk.

Bij de uitbreiding van infectieziekten zijn niet alleen
van invloed: plaatselijke en tijdelijke geschiktheid in den
zin der locahsten, maar ook vele andere factoren, als
daar zijn: verkeer, levenswijze en graad van immuniteit.

.Poklijders behandele men in een ziekenkamer, waarin
slechts roode lichtstralen worden toegelaten.

De retromediastinale ecchymosen hebben voor de
diagnose van den dood door stikking geen beteekenis.
Zij zijn kunstproducten door de obductie ontstaan.

„Es kann von moralisehem Irrsinn nur dann ge-
sprochen werden, wenn die durch verbrecherische
Handlungen sich documentirende morahsche Geluhhosig-
keit sich auf eine pathologische Ursache, respective auf
eine fehlerhafte psychische Organisation zurückführen
lässt" (v. Hofmann. Gerichthche Medicin).

extract, carnis	Liebig	0,5.
pepton Witte		2,0.
aq. destill.		100,0.
extract carnis	Kemmerich	0,5.
pepton Witte		2,0.
aq. destill.		100,0.
extract, carnis	ClBlLS	2,0.
pepton Witte		2,0.
aq. destill.		100,0.

Cavia n".	Gewicht.	! Datum van. injectie.	TOXINE. -	Dosis 0,3 pro kilo cavia.
5.	270 grm.	26 Febr. \'95	filtraat der cultuur iu Liehig-	0,081
		1 n. m.	bouiliou.
			19 dagen oud.
6.	210 grm.	26 Febr. \'95	filtraat der cultuur in Kemmerich-	I 0,063
		4 u. m.	bouillon.
			19 dagen oud.
7.	215 grm.	26 Pebr. \'95	filtraat der cultuur in Cibils-	0,064
	4 n. m.	bouillon.
			19 dagen oud.
8.	215 grm.	26 Febr. \'95	filtraat der cultuur in pepton-	0,064
		4 n. m.	keuk euzoutoplossiu g.
			19 dagen oud.

Cavia nO. 1	Gewicht.	Datum van injectie.	ï 0 X I N E. i 1 i i 1	Dosis 0,3 pro kilo cavia.
9.	400 grm.	25 April \'95	i Altraat der onder elkaar ge-	0,120
		12 m.	mengde cultures in bouillon-
			Kemmerich.
	i 1		45 dagen oud.
30.	1 415 grm.	25 April \'95	! filtraat der onder elkaar ge-	0,124 .
	i	12 m.	mengde cultures iu bouülon-
			Kemmericli.
			45 dagen oud.

Cavia n".	Gewicht.	Datum van injectie.	TOXINE.	Dosis 0,3 pro kilo cavia.
20.	480	grm.	29 April \'95	filtraat der cultuur in kalfs-	0,144
	1 i	5 u. m.	vleeschbouillon. 20 dagen oud.	j ; 1
31.	480	grm.	29 April \'95 5 n. m.	Altraat der cultuur in kalfs- vleeschbouilloa met sulf. calc. 20 dagen oud.	0,144 \' 1 1
22.	i 1 505 1	grm.	29 April \'95 5 n. m.	filtraat der cultuur in kalfs- vleeschbouillon met carb. calc. 20 dagen oud.	0,151
23.	I 520	grm.	29 April \'95 5 n. m.	filtraat der cultuur in Jialfs- vleeschbouillon met carb. en sulf. oalc.	0,156 1

Cavia		Datum van
Gewicht.	TOXINE.	Dosis.
n".		injectie.