\'IS
\'il"

-.-■J\' • ■■■

<1

• r - *

. v ^ v \'

.-r

% ~

■ I

■ : >

. ;

i-\'S■ ■>

li-

i;, -

•f <

. njt;.- . ... ...

&

iïv.\':

rt- ,. t •. »

► -*.■» r

S\'A-,..

■" . -ff.\'

i^\'-v.

.■■ 3

Reinkulturen uit één onder het

mikroskoop geïsoleerde cel.

I

Tl
. \'V

Reinkulturen uit één onder het
C^ mikroskoop geïsoleerde cel.

PROEFSCHRIFT

TKR VERKRUOIXa VAS DES QBAAD VAS

1Ä

AAN DE ^IIJKS-|JNIVERSITEIT TE pTRECHT,
SA MACimOIXa van dk» rectok-maoxikicvs

Dr. W. KAPTEYN,

Hoogl«rAar In dc Faculttlt der Wli- «n NituurkiinJc,

VOLGKNS HKSLUIT VAN DKN SKNAAT DKll UNIVKKSITKIT,

TKCIEX UB IlKDENKtSÜE.V VAN

i)h raculticit dhr wis- kn natuuukundu

TE VKUUKDKIEN

op Maandag 10 Juni i90\\ des namiddags ten l ure,

uooil

SAMUEL LEONARDUS SCHOUTEN,

gcbortn t» ROTTERDAM.

UTIIKCIIT. — K. WKNTZEli Jc Co. — I\'JOl.

^ I

\'Is:

.iùim

aa mijae c^uders ea raijac

678

V\' , • -

S: \'

•\'S

n

\'•..\'.v\'F-

\'-m

i-\' ...

m

■ .

\'rM -i

;. . H f\' \'

i -

1 ^

■ft

^ ;

! .,

i]

f

^ Bij het einde van mijn studiejaren kan ik niet
nalaten Uy Hoogleeraren van de Facidleit der
IVis- en Natuurkunde, mijn hartelijken dank te
brengen voor het ondenuijs dat ik van U mocht
ontvangen.

De tijd, hooggeleerde Huurecht, dien ik op het
Zoölogisch Laboratorium doorbracht, zal bij mij
steeds in dankbare herinnering blijven.

U, hooggeachte Rauwenhoff, die sinds eenige
jaren- van Uiu rust geniet, mag ik hier niet ver-
geten ; ik ben U zeer erkentelijk voor de luelwillend-
heid die ik, ook als assistent, van U heb mogen
ondervinden.

Tn \'t bijzonder voel ik me echter gedrongen tot
U, Hooggeachte Promotor Went, een woord van
dank te richten. Zeer veel heb ik als assistent en
ook daarna, geleerd door Uw methode van ^luerken
gade te slaan, cn door Uiv oordeel over het werk

van anderen te vrageii. De eischen, die een ernstig
onderzoeker zich zeiven moet stellen, de voorwaarden,
waaraan degelijke wetenschappelijke arbeid moet
voldoen en het verkeerde van een oppervlakkige
werhnethode hebt Gij mij steeds voor oogen ge-
houden.

Daarvoor, alsook voor de raadgevingen die ik
bij de sa^nenstelling van dit proefschrift mocht
ondervinden, zal ik U steeds dankbaar blijvcii.

Den heer Pulle, assistent bij de Botanie, ben ik
erkentelijk voor de htdp, mij verleend bij het ver-
beteren der dnikproeven.

INHOUD.

Inleiding.......\'..... i

Eerste Afdeeling. Technisch gedeelte.

Hoofdstuk i. Beschrijving van het isoleer-
toestel ............10

Hoofdstuk ii. Het vervaardigen van de

isoleer-naalden.........15

Hoofdstuk iii. Het isoleeren.....37

Tweede Afdeeling. Toepassingen.

Hoofdstuk iv. Reinkultuur van Saproleg-

niaceeën...........55

Hoofdstuk v. Proeven over Pleomorphic . 95

Hoofdstuk vi. Conclusie......114

.v.f,

. - -t \' • i..v\'*\'\'

. ■■ ■■ .v-i,.

V V • !•

\' - - v -j . •

6S

■•,.

m-yr

1

I. . .

4.\'

INLEIDING.

Aan de plaatkiiltuur-metliocle van Kocii is
liet tc danken dat de studie der mikroörga-
nismen, en speciaal de bakteriologie, in den laatsten
tijd zulk een ontzettende vlucht heeft genomen.
Toch is van veel niikroörganisnien het maken
van een reinkultuur nog een onopgelost vraag-
stuk. Veel onderzoekers zullen meenen, dat dit
niet het gevolg kan zijn van een gebrek dat
deze methode in zich zelve heeft, maar van het
feit, dat de juiste samenstelling^ van den voedings-
bodem in zulke gevallen nog onbekend is; zij
meenen dat wanneer die gevonden is, het maken
van een reinkultuur door middel van de plaat-
kultuur-niethode ook per se gelukken zal.

Hoewel het verre van mij is, dat ik aan de
geniale vinding van Kocii ook maar het geringste
zou willen afdoen, en ik ten volle hare belang-
rijkheid besef, geloof ik toch, dat bovengenoemde
nieening verkeerd is, dat m. a. w. de methode

op zich zelf de oorzaak is, dat zij tot hiertoe voor
veel mikroörganismen zonder resultaat is beproefd.

Dit is b.v. het geval met verschillende grootere
organismen, die in media voorkomen waarin zich
tevens veel bakteriën bevinden, zooals Amoeben,
Infusorien, groote sporen van schimmels (b. v.
.van Saprolegniaceeën), sporen van Myxomyceten
enz. Ik geloof, dat het mislukken van de rein-
kultuur van zulke organismen dikwijls hierin ge-
legen is, dat het zeer moeielijk is ze door schiidden
(de belangrijkste factor van de plaatkultuur-methode)
te bevrijden van bakteriën, die er uitwendig op
vastzitten; het gevolg is, dat er wel eèn kolonie
ontstaat in de uitgegoten plaat, maar dat na
korteren of längeren tijd zich de verontreinigingen
door bakteriën vertoonen.

Ook kan het mogelijk zijn, dat de chemische
eigenschappen van de gelatine als zoodanig scha-
delijk werken op de ontwikkeling. Dit is b. v.
door WiNOGRADSKV bcwezcH voor de nitriet-
en nitraatvormende bakteriën in den bodem; deze
kunnen de gelatine niet verdragen, \'t Is volstrekt
niet gewaagd te veronderstellen, dat dit met meer
bakteriën, die men tot hiertoe niet rein heeft
kunnen kweeken, het geval is.

Eindelijk kan misschien de physische natuur van

de gelatine, dus het feit dat zij een vasten voe-
dingsbodem levert, de reden zijn van de nega-
tieve resultaten die men tot hiertoe met sommige
organismen heeft verkregen. Indien deze toch in
de natuur alleen in vloeibare media voorkomen,
en hun bouw (b.v. het bezit van cilien) en levens-
verrichtingen (b.v. snelle beweging) ook verraden
dat zij voor die vloeibare media speciaal geschikt
zijn, dan is het a priori niet te verwonderen dat
er sommige zullen gevonden worden, die op
een vasten voedingsbodem minder goed of in \'t
geheel niet kunnen groeien. Dit kan b.v., mèt
de hierboven genoemde reden, de oorzaak zijn
dat Amoeben en My.xomyceten, die in hun ont-
wikkeling een zwermstadium doorloopen, Infuso-
riën en vele bakteriën, die sterk bewegelijk zijn,
nog niet rein konden gekweekt worden.

Doch, welke de redenen ook mogen zijn, een
feit is het dat men van vele organismen op gee-
nerlei wijze, en óók niet door middel van de
plaatkultuur-methode, een reinkultuur heeft kun-
nen maken.

Met scheen mij daarom niet overbodig toe op
het gebied van de reinkultuur-techniek eens een
geheel nieuwen weg te beproeven, en tc zien welke
resultaten ik daardoor zou kunnen verkrijgen.

in \'t kort komen die resultaten» hierop neer dat
men met behulp van fijne glazen naalden, wel-
ker beweging door middel van een bepaalde mecha-
niek volkomen geregeld is, uit een mengsel van
verschillende mikroörganismen er één, welk men
wil, kan isoleeren en overvoeren in een voedings-
bodem. Daartoe brengt men van het materiaal,
waaruit men een cel wil isoleeren, een druppel
op een dekglas, en daarnaast, op eenigen afstand,
een druppel van den voedingsbodem waarin de
kuituur moet ontstaan. Dit dekglas wordt gelegd
op een vochtige kamer, die zich op de object-
tafel van het mikroskoop bevindt, en door wel-
ker zijwanden de genoemde naalden zóó gesto-
ken zijn, dat men ze met de punt het dekglas
kan doen aanraken. Door middel van die naalden
kan men nu, met de sterkste vergrooting, één
bakterie of een andere cel overvoeren uit den
eenen druppel in den anderen. Daarna wordt
het dekglas op een gewone vochtige kamer ge-
legd, die bij de vereischte temperatuur kan ge-
zet worden. De groei van de kolonie kan, vanaf
het eerste begin, dan ook met .sterke vergrooting
gevolgd worden.

Behalve voor het hierboven be.schreven doel,
het maken van reinkulturen in \'t algemeen\', kan

de nieuwe methode ook nog van nut zijn voor
de oplossing van een ander Vraagstuk. Ik be-
doel dat van de variabiliteit en de pleomorphie.
Ieder zal moeten toegeven dat op dit gebied nog
veel mcthodiscJi moet gewerkt worden. Menigeen
die een weinig dieper doordringt in de bakterio-
logie, en speciaal in de systematiek der bakteriën,
zal tot de wanhopige conclusie komen, dat door
het onmethodisch werken van vele onderzoekers
in de laatste jaren, het materiaal als in een Augias-
stal is opgestapeld, \'t Is wenschelijk dat er eens
een eind kome aan het dikwijls volkomen onge-
motiveerd beschrijven van nieuwe soorten. Veel
onderzoekers, die tegenwoordig op de een of
andere plaats een bakterie aantreffen, gieten een
plaatkuituur, kweeken de gevonden bakterie op
enkele van de meest gebruikelijke voedingsbo-
dems, en wachten af, of ze een gelijkenis kunnen
ontdekken met een reeds bestaande species.
Vinden ze die niet bij hun eerste jiogingen, dan
meenen ze der wetenschap ecn dienst te bewij-
zen door de «nieuwe soortc, begeleid van een
diagnose die in veel opzichten duister is of voor
\'t grootste deel uit algemeene termen bestaat, dc
wereld in te zenden. Zij bekommeren er zich
minder om, welken wijzigenden invloed de vroe-

2

gere levensomstandigheden op de gevonden
bakterie kunnen gehad hebben, of welken invloed
de voedingsbodems die ze zelf gebruiken, door
hun afwijkende samenstelling, nog kunnen uit-
oefenen. En dit zijn, naast vele andere, toch
factoren, die van groot belang zijn. Een gevolg
is, dat vele soorten, die men eerst ,voor ver-
schillende aanzag, naderhand dezelfde bleken te
zijn, m. a. w. dat men met pleomorphe vormen
had te doen gehad.

Aan den anderen kant weer tracht men som-
mige soorten, die men vroeger voor één geheel
aanzag, te splitsen.

Hoe het zij, er heerscht, deels door de groote
moeielijkheden, die het te bewerken materiaal zelfs
voor de kundigste onderzoekers oplevert, deels
door het slordig en vluchtig werken van anderen
een ontzettende verwarring op het gebied van
de bakteriologische systematiek, \'t Is noodzakelijk,
wil men aan die verwarring zooveel mogelijk paal
en perk gian stellen, dat er een grondige studie
gemaakt worde van de variabiliteit en het pleomor-
phisme. En voor die studie is noodig een vol-
komen zekerheid dat men, bij het maken van een
reinkultuur, van één cel is uitgegaan. Verder
moet het mogelijk zijn om, indien men een bak-

terie zich laat deelen onder veranderde uitwendige
omstandigheden, zicrt\'érri: volgende generatie afzonder-
lijk te kunnen onderzoeken, even goed als men
bij hoogere planten alle opeenvolgende generaties
op dit punt kan onderzoeken. Indien men b.v.
wil nagaan welken wijzigenden invloed een zure
voedingsvloeistof op een bepaalde bakterie a heeft,
dan moet men in staat zijn om a zich in die
zure vloeistof te laten deelen tot 2 cellen ai a,
en om de eene cel ai direkt te enten op een
gewone voedingsbodem, de andere zich nogmaals
te laten deelen tot a« 4- aj. Daarna moet men
weer de eene cel aa kunnen enten op denzelfden
gewonen voedingsbodem, en de andere zich weer
laten deelen tot a,^ aa, enz. Op die wijze
krijgt men kuituren uit de opeenvolgende gene-
raties ai, aa, as enz., en kan men bestudeeren
in hoeverre de gewijzigde vormen langzamerhand
in elkaar overgaan, dan wel sprongsgauijs uit
elkaar zijn ontstaan.

Natuurlijk moeten al deze proeven genomen
worden onder de noodige voorzorgen, opdat de
eens ontstane reinkultuur ook bij de opeenvolgende
overentingen werkelijk rein blijve.

Door mijn .spoedig vertrek naar Buitenzorg
heb ik, behalve andere toepassingen van mijn

methode, óók die betreffende variabiliteit en pleo-
morphie moeten afbreken. Ik hoop ze echter
later voort te zetten, vooral omdat ik meen dat
mijn methode in veel opzichten zeer geschikt is
voor een dergelijke bestudeering van die kwesties.

Dat die methode zelf geen verbeteringen meer
behoeft, stel ik mij niet voor; ongetwijfeld zal
het, vooral ook als andere onderzoekers haar
beproeven, noodig blijken hier en daar wijzigin-
gen in te voeren.

Nog minder stel ik mij voor, dat zij een middel
zal zijn, waarmede alle mogelijke reinkulturen
kunnen gemaakt worden, en dat zij de reeds be-
staande methode van reinkultuur, de in vele.op-
zichten voortreffelijke plaatkultuur-methode, geheel
zal verdringen, \'t Doel is, dat ze zal be-
proefd worden als langs een anderen, meier
eenvoudigen weg, geen uitkomsten kunnen worden
verkregen.

Laat mij ten slotte nog mededeelen, dat dc
grondleggers van de mykologie (dk Bary, Brefeld
e. a.) hun kuituren van schimmels nooit anders
gemaakt hebben dan door uit te gaan van één
cel in een hangenden druppel. Hun methode
was deze, dat ze een massa sporen of conidiën
in een gesteriliseerde vloeistof verdeelden, waarna

ze \'op verschillende dekglaasjes een menigte han-
gende druppels aanbrachten en zóó lang zochten
tot ze een druppel vonden waarin één spore of
conidie voorkwam. De kuituurvloeistoffen werden
een weinig zuur genomen, om bakteriën-ontwik-
keling tegen te gaan. Voor morphologische studiën
zijn dergelijke kuituren uitstekend geschikt; voor
uitgangspunt van physiologische onderzoekingen
echter niet, want de reinheid is volstrekt niet
gewaarborgd.

Hun methode, is echter niet bruikbaar voor
kleinere cellen, en natuurlijk in \'t geheel niet
voor bakteriën.

Eerste afdeeling. Technisch gedeelte.

HOOFDSTUK I.

Beschrijving van het isoleertoestel.

In fig. I is een schematische voorstelling ge-
geven van het instrument dat voor de isolatie
dient. De teekening stelt voor een vertikale
doorsnede midden door het toestel, op de helft
van de ware grootte.

A is een ijzeren plaat, die op vier pooten (in
de fig. niet weergegeven) rust. Het mikroskoop
is door middel van een ijzeren beugel bevestigd
op een vierkante koperen plaat B, die weer op
een toestel met schuifbeweging C rust. Door
aan den schroef D te draaien kan men het mi-
kroskoop met B naar links of rechts bewegen;
door middel van een andere schroef, die in de
fig. niet is geteekend, voor- of achterwaarts.

Van het mikroskoop is geteekend de voor-
werptafel F, het verlichtingstoestel van Abbe G,

11

het irisdiaphragma H, de spiegel I, de voet J,
en een objectief K. Op de voorwerptafel bevindt
zich een vochtige kamer, de,,isoleerkamer" L,
die van een bijzondere constructie is. De linker-
en rechterzijwand nl. zijn ieder voorzien van een
horizontale spleet, die met een dikke olie kan
worden afgesloten.

Door die spleten steken twee glazen naalden
M, waarvan de vorm en de vervaardiging in het
volgende hoofdstuk zullen worden beschreven.
De glazen stukken L\\ die zich aan de boven-
zijde van de spleten bevinden, kunnen worden
weggenomen, wanneer men de naalden wil ver-
wijderen of weer op hun plaats brengen. Wan-
neer men ze tot dat doel iedere keer door de
spleet moest steken, zou men veel gevaar loopen
de fijne punten, waarop alles aankomt, te breken.

Op de vochtige kamer, die met behulp van
een bewegelijke object-tafel (ik gebruik die van
Leitz) verschoven kan worden, brengt men het
dekglas, aan welks onderzijde geïsoleerd zal worden.

De naalden zijn ieder bevestigil in 2 houders
N, die zich bevinden op een koperen staaf O,
die draaibaar is om een punt P. Aan het uit-
einde van de staaf bevindt zich ecn rond koperen
plaatje Q, waarmee zij rust op een vertikale

12

Staaf R. R bevat van onderen een schroefdraad,
en kan door middel van het rondsel S in de kolom
T op en neer geschroefd worden. Een spiraal-
veertjeli,^ houdt O altijd tegen R aangedrukt.

\'t Is duidelijk dat wanneer R bovenwaarts ge-
schroefd wordt, de punt van M in de vochtige
kamer benedenwaarts zal gaan, en omgekeerd.
De schroefdraad in R is betrekkelijk fijn, en de
hefboomsarm P Q ongeveer 2 maal zoo lang als
de afstand van P tot de punt van de glazen
naald; men kan dus zeer geringe verplaatsingen
teweeg brengen. Het draaipunt P wordt gedragen
door een gebogen koperen stang V, die aan T is
bevestigd.

De as bij P is zóó gemaakt dat men, als het
glazen stukje L^ is verwijderd en dc spiraalveer
U is losgemaakt, dc staaf O met dc glazen naald
gemakkelijk van het toestel kan losmaken.

Het geheel is verder zóó ingericht dat de grootste
miki-oskopen (b.v. Zciss statief I a, Lcitz statief
I) èn ook dc meest gangbare kleinere statieven
er bij gebruikt kunnen worden. Daartoe kan
men C met dc tafel B hooger cn lager zetten
door middel van 2 schroeven E. De afstand
tusschen dc steunpunten P is zóó gemaakt dat
de objecttafcls van dc grootste statieven, cn dus

13

van zelf ook die der kleinere, er tusschen passen.

De glazen naalden worden tegen stoeten enz.
beveiligd, door zinken kappen, die er over heen ge-
plaatst en aan de dragers V bevestigd worden.
Met opzet is er aan beide kanten tusschen V en
het mikroskoop een groote ruimte open gelaten,
waardoor men de handen kan steken als dit voor
de verplaatsing van spiegel of irisdiaphragma
noodig is.\')

Met dit toestel is men dus in staat zeer fijne
bewegingen onder het mikroskoop te maken,
zoowel bij zwakke als bij de sterkste vergrooting.
Tot nog toe zijn de toepassingen beperkt alleen
tot het isolccrcn van niikroörganismen. Ik ben
er echter zeker van dat men er velerlei andere
werkzaamheden mee zal kunnen verrichten of ge-
makkelijker maken, b.v. het sorteeren van fijn
plankton-materiaal, het vervaardigen van duur-

\') Het hier beschreven instrument is op voortref-
felijke wijze vervaardigd door den heerJ.W. du Groot,
amanuensis aan het Laboratorium voor anorganische
scheikunde te Utrecht.

Mocht mijn methode ruimeren ingang vinden, dan
zullen de volgende toestellen een aanmerkelijke ver-
eenvoudiging ondergaan, vooral wat betreft de wijze
waarop het mikroskoop wordt verplaatst. Tevens
zal er dan een vaste prijs kunnen worden gesteld.

zame praeparaten van dergelijke mikroörganismen,
enz. Ik mag ten minste, waar de moeielijkste
experimenten (het isoleeren van bakterien) naar
wensch geslaagd zijn, verwachten dat ook ge-
makkelijker toepassingen niet zullen mislukken.

Toen ik mijn methode al geheel had uitgewerkt
en ik er reeds vele proeven mede had gedaan, be-
merkte ik uit de historische aanteekeningen die
Apathy geeft in zijn: „Die Mikrotechnik der thieri-
schen Morphologie" dl I (Braunschweig. Bruhn 1896),
dat er in vroeger jaren al reeds vele pogingen wa-
ren gedaan om een geschikte methode te vinden
waarmede men kleine organismen (Diatomeeën, kleine
Crustaceeën enz.) onder het mikroskoop zou kunnen
verplaatsen of isoleeren.

Geen van die methoden heeft echter aan de ver-
wachtingen beantwoord, omdat het gebruik groote
moeielijkheden opleverde, en alleen bij zeer zwakke
vergrooting kon plaats vinden. ^

Voor de curiositeit vermeld ik alleen dj\\t de beste
van die inrichtingen door Hanks in 1877 is gecon-
strueerd. Zij bestond uit een stuk van een borstel-
haar, waarvan de punt in het midden van het ge-
zichtsveld uitkwam. Door horizontale bewegingen
van de objecttafel werden de voorwerpen verplaatst
in horizontale richting, door een op en neer bewegen
van het veriichtingsapparaat in vertikale richting.
Men kon een organisme isoleeren door het aan de
natte punt van het haar te doen vastkleven en het,
wanneer het haar droog was geworden, oj) te vangen
op een glaasje.

HOOFDSTUK II.

Het vervaardigen van de isoleernaalden.

Het is mij niet spoedig gelukt den meest
bruikbaren vorm der glazen naalden vast te stel-
len, cn de methode voor de vervaardiging tc
vinden; cr waren verschillende technische moeielijk-
heden, die zich hierbij voordeden.

En nog zou ik niet durven beweren dat dc
vcrschillcndc vormen die ik thans gebruik, voor
geene verbetering vatbaar zijn. hitcgendeel, ik
ben er van overtuigd dat bij een uitgebreider
gebruik van de methode, sommige veranderingen
nog wcnschclijk zullen blijken.

Voor-het isoleeren van de vcr.schillendc organis-
men worden 3 soorten van naalden gebruikt. Voor
dc kleinste mikro-organismcn (b.v. staaf- cn kom-
mavormige cn ronde baktcrien) gebruikt men een-
voudig rechte, puntig-uitloopendc naalden (fig. 12)
die ± 10 fx. dik zijn; voor mikro-organismcn
van middelmatige grootte (b.v. zeer kleine spo-

i6

ren, conidien of gistcellen) een dun gesloten *
oog (fig. 13), dat uitwendig een doorsnede heeft
van ± 35 terwijl de dikte van den draad
± 4 ^ is; voor de grootste mikro-organismen (b.v.
Myxomyceten, eencellige Algen, zwermsporen
van Algen en Schimmels, gewone sporen en coni-
dien, Gistcellen, Amoeben, Infusorien) worden
omgebogen, dikke haken (fig. 14) gebruikt, die,
uitwendig gemeten, ± 160 wijd zijn, terwijl
de dikte van den draad ± (j.. is.

Ik zal er thans toe overgaan de methode van
de vervaardiging, die voor de 3 soorten verschil-
lend is, te beschrijven. Deze beschrijving zal
met eenige nauwkeurigheid moeten geschieden,
hoewel ik er van overtuigd ben dat ze, vooral
voor lezers die voor technische kwesties weinig
voorliefde gevoelen, weinig aantrekkelijks bevat.
Een vluchtige uiteenzetting zou het doel missen
dat ik mij voorstel: het mogelijk te maken dat
ieder, die het wil, dc naald zelf zal kunnen ver-
vaardigen of laten vervaardigen. ^

Men gebruikt nienwc glazen staven, ter dikte
van ± 3 mm. Oud glas, hetwelk .men o.a. hier-
aan kan herkennen dat het in dc gasvlam ccn
wit, gescheurd voorkomen verkrijgt, is onbruik-
baar. Het vervaardigen van dc rechte naalden

voor de kleinste mikro-organismen is het eenvou-
digst. Men neemt een stuk van ±20 cm. lengte,
houdt het op een afstand van ± 5 cm. van het
uiteinde in de vlam van een Bunsenschen brander
en trekt het daarna uit. Men mag hierbij niet
zóó sterk verhitten dat het glas te slap is, en
ook niet te snel uittrekken. In dat geval zou
het uitgetrokken gedeelte, dat op zijn dunste
plaats maar één niM dik mag zijn, te dun wor-
den. Men krijgt dus een staaf ongeveer van den
vorm van fig. 15. Men trekt nu boven de ± 2
mm. hooge vlam van een mikrobrUnder deze
staaf uit op de plaats die ongeveer 6 cm.
van het dikke gedeelte verwijderd is. Wanneer
men dit plekje ook al weer niet tc sterk verhit
en niet tc snel uittrekt, verkrijgt men een ge-
deelte dat nog geen halve mm. dik, en b.v. 5
mm. lang is (fig. 16). Nu draait men de vlam
van den mikrobrandcr zoo laag mogelijk, zóó
dat zc b.v. eene doorsnede heeft van i — i 3 mm.
(dc opening van den mikrobrandcr moet hiervoor
natuurlijk zeer klein zijn), en trekt men boven
dat vlammetje dc glasstaaf oj) dc plaats waar ze
\'la mm. dik is, in tweeën. Wanneer men hierbij
niet tc lang verhit en met ccnigc kracht trekt,
zal men niet een lang, draadvormig uiteinde krijgen.

i8

maar een plotseling fijn-toeloopende punt, zooals
in fig. 17 vergroot is voorgesteld.

Door eenige oefening is dit resultaat spoedig
te verkrijgen. Men controleert gedurig onder het
mikroskoop met zwakke vergrooting of de punt
den gewenschten vorm heeft (v.r.nl. of ze wel
scherp uidoopt), en ook of het uiteinde vlak bij
de punt de juiste dikte heeft, die ± 10 moet be-
dragen. Iedere keer dat dit niet het geval blijkt
te zijn, smelt men boven den mikrobrander de
uiteinden aan elkaar, en trekt dan weer uit.

De naald is echter, wanneer zij van het be-
gin tot het eind rechdijnig is, nog niet volkomen
bruikbaar. Het uiteinde ter lengte van ongeveer
3 mm., dat in de isoleerkamer steekt, moet iets
naar boven loopen (fig. i). Wanneer men dit
uiteinde boven een mikrobrander omboog, zou
het kunnen gebeuren, zelfs al was de vlam zoo
laag mogelijk, dat de scherpe punt wegsmolt.
Daarom wordt dit gedeelte omgebogen onder
het miskroskoop, door middel van een platina-
draad die men laat gloeien, op een wijze
die zoo aanstonds (pag. 33) zal behandeld
worden, als het daarvoor benoodigde toestel,
waarmede de andere naalden gemaakt worden,
beschreven is.

Is het vervaardigen van dit soort naalden uit
den aard der zaak gemakkelijk, de andere leve-
ren meer moeielijkheden op.

Terwijl gewone bakterien in een zeer klein
druppeltje ^ kunnen worden overgevoerd, en het
zelfs wenschelijk is dat dit druppeltje zoo klein
mogelijk zij, moeten draadvormige bakterien en
andere grootere mikro-organismen in grootere
druppels worden vervoerd. Beproeft men dit in
druppels die te klein zijn, dan gaat de cel
gedurig tegen het dekglas vastzitten en blijft ze
dus achter. Men kan de cel dan wel met de
naald weer losmaken, maar een eind verder her-
haalt zich het bezwaar en bovendien — een te
sterke directe aanraking met de naald is, vooral
bij dunwandige cellen, altijd nadeelig.

In \'t algemeen moet een mikro-organisme dat
men wil isoleeren, door het druppeltje, waarin
het vervoerd wordt, a. h. w. geheel omhuld zijn,
maar daarom heeft men voor grootere cellen ook
grootere druppels noodig.

Nu zou men meenen dat men met eenvoudige
rechte naalden van den vorm als in fig. 12, in-
dien men ze maar dikker maakte, zijn doel zou
kunnen bereiken. Dit is echter niet zoo. De
druppel die men met dikkere rechte naalden

2Ó

verkrijgt, is wel grooter, maar de dikte van de
naald zou, vooral bij het werken met de sterke
vergrootingen, hinderlijk worden, inzonderheid als
men druppels wilde verkrijgen die groot genoeg
zijn voor de grootste cellen.

Men moet daarom aan de naalden een vorm
geven zóó, dat de waarneming er niet door ge-
hinderd wordt, en ze toch in staat zijn om grootere
druppels te vervoeren. Zulk een vorm vinden
we afgebeeld in fig. 13 en 14.

Maar nog om een andere reden is deze vorm
noodig. Grootere cellen worden, omdat in een
grooten transportdruppel zoo licht bakterien mee-
gaan, altijd eerst gevoerd door een reinigings-
druppel, waar men zc bij voorkeur dwars doorheen
haalt. Dit zou haast niet mogelijk zijn met een
rechte naald; wèl kan dit met een haak- of oog-
vormige gebeuren, omdat men daarmede een
cel in een grooten druppel gemakkelijk kan
voortduwen of meetrekken. Hen directe aan-
raking van een cel is in zulke omstandigheden
niet gevaarlijk, indien deze maar niet tegen het
glas vast zit.

Het vervaardigen van haak- en oogvorniigc
naalden, zóó klein, dat zc bij sterke vergrooting
gebruikt kunnen worden, kan natuurlijk niet uit

2 I

de vrije hand en niet ongewapend oog geschie-
den. Daarvoor is een inrichting noodig, waarvan
hier de beschrijving volgt. (Zie fig. i8).

De figuur, die schematisch is, stelt het geheel
voor, van boven gezien.

Het microscoop rust op een tafel, en de tubus
A is 90 " achterwaarts gedraaid, zoodat ze dus
horizontaal staat. B is een zwak objectief (b.v.
Leitz 3). C zijn de schroeven voor de verplaatsing
van de tubus; de mikrometerschroef is in de
fig. niet te zien. D is de voorwerp tafel. Vóór
het mikrometer-oculair bevindt zich een blauw
glaasje E, dat door middel van een ronde veer
aan de tubus is bevestigd. De verlichtings-
lens van Abbe is verwijderd, en het irisdiaphragma
G is met den spiegel 11 zoover mogelijk van dc
voorwcrptafel verwijderd. Door het gat in dc
objccttafcl steken 2 stalen naalden I en K, die
beide knievonnig zijn gebogen cn resp. in dc hou-
ders L en M zijn geschroefd. Deze houders zijn door
nn\'ddel van vcercn om den rand van dc voor-
wcrptafel geklemd, cn kunnen langs dien rand
met dc vingers verplaatst worden. N is een ge-
bogen platina-draadjc, dat in een houder O is
bevestigd. P is dc glazen naald die bewerkt
moet worden, en die in een houdc.T O is vast-

3

22

gemaakt. De houders O en Q zijn beide aan
een voetstuk bevestigd, waarin ze door een schroef-
beweging vertikaal op en neer kunnen bewogen
worden. Die voetstukken zelf staan ieder met
drie puntige pooten op een glazen plaat, die ge-
woon op de^ tafel ligt, en kunnen dus gemakkelijk
in horizontale richting verschoven worden. Men
kan derhalve de stalen naalden I en K, de pla-
tina-draad N en de glazen /laald P in het ge-
zichtsveld van het mikroskoop brengen, en op
alle mogelijke manieren ten opzichte van elkaar
bewegen.

Bij den houder Q behoort bovendien een los,
knievormig gebogen stuk R, aan welks eene uit-
einde een klem S is bevestigd. Men kan dit
stuk met het ondereinde R^ klemmen in den hou-
der O zóó, dat de klem S zich bevindt boven
de uiteinden van de naalden I en K. Men kan
dan in de klem S de glazen naald, die in be-
werking is, bevestigen zoodat men die vcriikaal \\i\\
het gezichtsveld ziet. Als men de glazen naald
direct in den houder Q klemt, ziet men haar
horizontaal in het gezichtsveld.

De draad N staat door middel van een draad-
geleiding (waarvan een klein deel in de fig. door
stipijellijnen is aangegeven) in verbinding met

23

een accumulator. In de geleiding zijn geschakeld
een weerstandsbank (voor kleine weerstanden) en
een stroomverbreker (een koperen beugel, die
gemakkelijk draaibaar is en met beide uiteinden
in kwik kan gedompeld worden.) Het geheel
staat, zooals reeds gezegd is, op een tafel,
en wel dicht bij den rand. Men zit op een
laag bankje, en zorgt er voor, dat men den
stoomverbreker zeer gemakkelijk met de linker-
hand, die daarbij op de tafel rust, kan gebruiken.

Met deze inrichting is men in staat de oog-
en haakvormige naalden te maken.

Om een oogvormige te vervaardigen, gaat men
weer uit van een glasstaaf zooals men die voor
de rechte naald (zie boven) noodig had. Men
verwerkt die staaf op dezelfde wijze, totdat ze
den vorm van fig. i6 heeft. Nu trekt men het
gedeelte, dat ± V-j ni.m. dik is, echter zoo uit
dat er een ± lo m.m. lang zeer fijn, draadvormig
einde aan komt, zóó fijn, dat het in de lucht
heen en weer gaat (fig. 19). Dit uiteinde houdt
men ongeveer bij a boven de vlam van den
mikrobrander, die men zoo laag mogelijk heeft
gedraaid; het wordt, omdat het zoo dun is, naar
birjcn toe omgebogen. Deze ombuiging mag niet
te sterk zijn; de hoek dien het omgebogen deel

24

met de staaf maakt, mag niet minder dan — 150°
bedragen, (fig. 20). Nu wordt de staaf bij /?
weer omgebogen, zoodat men fig. 21 krijgt. Bij
dit ombuigen zorge men er voor, dat het rechte
deel van de glazen staaf met de omgebogen ge-
deelten in één vlak ligt. Daarna zet men de
glazen staaf in den houder O zóó dat het dunne
uiteinde in het gezichtsveld komt, en de ge-
heele .staaf, met de bochten die men er in ge-
maakt heeft, in één horizontaal vlak komt te
liggen. Het dunne uiteinde moet naar het objectief
toegekeerd zijn en niet naar de objecttafel (fig. 18).
Men\'brengt nu de naald I, de platina-draad N en
het uiteinde van de glazen staaf in het gezichts-
veld van het mikroskoop, zoodat men ziet het-
geen in fig. 22 is voorgesteld. P is de punt van
de stalen naald I, waartegen het uiteinde van de
glazen staaf is aangedrukt. In het gezichtsveld
bevindt P zich onder die glasdraad, in werke-
lijkheid natuurlijk er boven, \'t Is wenschelijk dat
men het mikroskooj) instelt op een deel van de
stalen naald dat zich zeer dicht bij de punt
bevindt, en dat dus niet zoo dik is; \'anders toch
heeft I\' te groote afmetingen, iets wat de duide-
lijkheid van het beeld onnoodig zou verminderen.
N\' is de platina-draad, van welks ronden vorm

25

I

men natuurlijk maar een klein g-edeelte ziet.
Men zorgt er voor dat de glasdraad precies
boven het midden van de bocht van de platina-
draad zich bevindt; van boven gezien dus zooals
in fig. i8. Het deel van de glasdraad, dat zich
in het midden tusschen P en N\' bevindt, moet
ongeveer vier ^ dik zijn. ^

Men heeft van te voren in de electrische
stroomgeleiding zóóveel weerstand ingevoegd dat
de platina-draad N\' die 0,25 mm. dik is, kan
gloeien zonder dat hij smelt.

Nu doet men N\' plotseling een zeer kort
moment gloeien. Het gevolg is dat de glasdraad
ombuigt ongeveer op de plaats waar hij vier ^
dik is, en wel met een vrij scherpe bocht (fig. 23)
Thans blijkt tegelijk het nut van de stalen naaltl I\'
Deze dient nl. om de warmte van den glasdraad
weg te voeren en dus om te verhinderen dat
die op een plek meer naar links in het gezichts-
veld zou ombuigen, een plaats .die dikker zou
zijn dan vier ^ Bovendien zou ile glasdraad,
zonder dat de stalen naald er tegen aan was ge-
drukt, niet in een sciierpe, maar in een groote
bocht ombuigen, zooals bijv. in fig. 24.

Men schroeft daarna den houder O voorzichtig
naar ijoven; het dikkere deel van den glasdraail

26

zal dus in het gezichtsveld naar beneden gaan.
Natuurlijk mag men dit niet te ver doen, daar
anders de elasticiteitsgrens wordt overschreden
N^ wordt verplaatst tot vlak boven de scherpe
bocht in den glasdraad. Men krijgt dus fig. 25.
Nu gloeit men weer even, waardoor men krijgt
fig. 26. Men schroeft den houder weer naar
beneden ; het dikkere gedeelte van den glasdraad
krijgt dus weer zijn rechten vorm, fig. 27.

Het gebeurt zelden dat het omgebogen deel
bc volkomen in hetzelfde vertikale vlak terecht
komt als ab; meestal buigt bc een weinig hetzij
naar den eenen, hetzij naar den anderen kant
van dat vlak. Als dit maar weinig scheelt, is
het geen reden om de glazen naald af te keuren
en een nieuwe te beginnen; wel moet men dit
doen als het veel verschilt.

Men draait nu de glazen staaf in den houder
O 180" om; men krijgt dus in het gezichtsveld
te ^/ien fig. 28. (N heeft men een weinig ver-
schoven.)

Nu beweegt men den houder Q voorzichtig
naar beneden; men ziet daardoor, in het gezichts-
veld het dikke deel van den glasdraad naar
boven gaan, en het dunne uiteinde naar beneden
buigen; er ontstaat dus een oog. Het omge-

• 27

bogen deel bc moet vlak langs het dikkere deel
ab gebogen worden en er een weinig tegenaan
drukken (fig. 29); ook moet het zich aan de
voorzijde van ab bevinden, zoodat men bij een
hoogere instelling van het mikroskoop bc, bij
een iets lagere instelling ab ziet. Nu doet men
aan naald K, dicht bij de punt aan de onderzijde
een weinig lijm. Men bepaalt van te voren de
plaats waar het druppeltje lijm moet zitten opdat
het, tegelijk met den glasdraad,- in \'t gezichtsveld
duidelijk zichtbaar is. Men beweegt met de
hand, terwijl men door het mikroskoop ziet, naald
K naar het omgebogen deel bc zóó, dat de glas-
draad met de lijm in aanraking komt en aan de
naald vastkleeft (fig. 30.)

Als de lijm hard is beweegt men eerst P in
het gezichtsveld naar boven, en dan ab een weinig
naar boven, en K\' een weinig naar beneden.
I let oog van den glasdraad wordt hierdoor kleiner;
\'t is echter door de bovenwaartsche beweging van
a b en de benedenwaartsche van K\' gespannen,
en \'t zou dus, als K\' bv. los liet, weer in zijn
vroegeren toestand van fig. 30 terugspringen.
Men brengt echter P aan tegen a b, en N\' op
eenigen afstand van het oog, (fig. 31,) en doet
N\' even gloeien. Daardoor zal de stand die kort

28

te voren door den glasdraad in gespannen toestand
werd ingenomen, gefixeerd worden; het oog is
kleiner geworden. Men brengt weer a b naar
boven, K^ naar beneden, P tegen a b aan en
gloeit daarna, en herhaalt deze handelwijze totdat
het oog van den glazen draad een diameter
heefi; gekregen van ±_ ZS f^- tegen ab ge-
plaatst, dient hier alweer om de warmte af te
leiden; wanneer men P wegliet zou de glasdraad
door gloeiing van N\' ook op een plaats meer
naar links ombuigen, en zou men dus b.v. fig.
32 krijgen.

Nu moet men den glasdraad van K\' losmaken.
Men voert daartoe T weg uit het gezichtsveld en
beweegt a b een weinig naar boven, zoodat er
eenige spanning in den glasdraad ontstaat. Men
brengt N\' vlak bij K\' en gloeit bij tusschcn[)oo-
zen eenige malen zeer kort. Daardoor verkoolt
de lijm en bc springt los. Vervolgens moet het
deel van bc, vanaf c tot d, verwijdertl worden.
Daartoe verwijdert men de naalden I en K, en
de platinadraad N, en zet men het niiscroscoop
weer in verticale houding; men brengt op de
voorwerptafel een objectglas, dat men vastzet
met behulj) van de bij ieder microscoop behoo-
renden stalen klemmen. In den iiouder O

29

vestigt men het losse stuk T (fig. i8) waaraan
met behulp van klemmen, een scheermes is be-
vestigd. Met stuk T zelf kan om een horizon-
tale as draaien; daardoor is het mogelijk het
vlak van het mes een grootere of" kleinere hoek
t. o. v. de objecttafel te laten maken. Met
scheermes moet een scherpen kant hebben die
zoo weinig mogelijk schaarden bevat. Men brengt
het vlak van het mes in een hoek van 45"
met de objecttafel.

Nu brengt men de scherpe kant van het scheer-
mes in het gezichtsveld. Op het objectglas heeft
men onder het objectief een weinig gewoon,
fijn kamerstof gestrooid, en men beweegt nu het
scheermes naar beneden totdat het \'t objectglas
raakt. Men verplaatst den houder O en het stuk T
met het scheermes zelf zoolang, tot dat gedeelte
van de scherpe kant het objectglas aanraakt, dat
zich in het gezichtsveld bevindt, lichter zullen
er, tenzij het mes ideaal geslepen is, altijd klei-
nere of grootere schaarden in de scherpe kant
voorkomen. Men beweegt daarom het objectglas,
terwijl het mes er op rust, heen en weer; alleen
01) die plaatsen waar het stof verschoven wordt,
raakt de scherpe kant het glas. Men beweegt
daarna het mes iets naar boven. Nu brengt men

30

het oog" van den glasdraad op het objectglas, en
zorgt men dat de plaats d, waar de draad moet
worden afgeknapt, zich bevindt op een plaats
waar de scherpe kant van het mes zooeven wer-
kelijk het dekglas aanraakte. Die plaats is ken-
baar, omdat men het micrometer-oculair gebruikt.
Men beweegt dan het mes weer naar beneden
en is daardoor in staat den glasdraad bij d door
te hakken, \'t Spreekt van zelf dat dit\'een werk is
dat zeer voorzichtig moet gebeuren, omdat er
altijd kans is dat de glasdraad eenigszins gefor-
ceerd wordt en dan bij b stuk springt. Is echter
het doorhakken bij d gelukt, dan neemt men
den glasdraad uit den houder O, eii buigt men
hem zeer voorzichtig bij /? (fig. 21) boven den
mikrobrander recht.

Groote mikroörganismen isoleert men bij zwakke
vergrooting. Daardoor is het mogelijk om een
cel, als dat moet, ook uit het midden van een
druppel te halen (bij sterke vergrooting kan men
alleen cellen, die dicht bij den rand liggen, iso-
leeren). Wanneer men dit echter doet met een
dikke öf?^vormige naald, vertoonen groote cellen,
wanneer het oog zich geheel in den drui)pel be-
vindt, dikwijls neiging om zich te jjlaatsen o[)
dat deel van het oog, waar de glasdraden elkan-

•

31

der kruisen, en ze blijven dan op die plaats vast-
zitten (fig. 34). Daarom gebruikt men voor het
isoleeren van groote mikroörganismen een dikke
//(/rrX-vormige naald. Het buigen van zulk een
naald gaat in sommige opzichten anders. De
glazen staaf, waarvan men uitgaat, wordt uitge-
trokken en omgebogen totdat men fig. 19 heeft,
op dezelfde wijze als dit met de oogvormige
naald gebeurde. Alleen moet het draadvormig
uiteinde niet zóó dun zijn dat het van zelf in
de lucht heen en weer gaat, maar iets dikker.
Daarna brengt men de naald ook op dezelfde
manier in het gezichtsveld, maar zorgt men dat
het gedeelte midden tusschen I\' en N\', dat bij
de vorige naald ± 4 ^a dik was, hier ± 28
dik IS. Het stuk vanaf dat gedeelte tot het
uiteinde mag niet korter zijn dan 5 mm. Nu
gloeit men N\'; de glasdraad buigt om, maar niet
zoo ver als in fig. 23. Omdat hij dikker is, buigt
hij tot een vorm als in fig. 35. Men zet daarna
de naald in den houder R (fig. 18,) zoodat men haar
volkomen vertikaal in het gezichtsveld ziet. Men
verplaatst N\' (fig 36) en gloeit bij tusschenpoo-
zen. I\' is liierbij niet noodig. Men krijgt dan
fig. 37; de naald is dan wel reeds haakvormig,
maar dc haak is tc wijd. Om hem smaller te

32

maken brengt men de naald weer in den hou-
der O, en plaatst men P zooals in fig. 28. Daar-
na beweegt men, onder dezelfde voorzorgen als
vroeger, de naald weer zóó dat men fig. 29
krijgt. Omdat hier de draad bij b dikker is als
bij de oog\\^ormige naald en het gevaar voor
stukspringen grooter is, moet dit ombuigen zeer
voorzichtig geschieden. Men bevestigt bc weer
aan K^ door middel van lijm (fig. 30), en be-
weegt K^ zeer voorzichtig Q.QXi weinig naar beneden.
Dan gloeit men N^ op dezelfde wijze als bij de
andere naald, totdat de breedte van het oog dat
men gekregen heeft (uitwendig gemeten) ± 160
bedraagt. Men maakt, door verkoling van de
lijm, K^ weer los van den glasdraad, en brengt
K\' los tegen de onderzijde van bc aan; daarna
beweegt men ab in het gezichtsveld een weinig
naar beneden (fig. 38). Men gloeit even, brengt
ab weer een weinig naar beneden, gloeit weer,
•enz. totdat de 2 beenen van de haak parallel
loopen (fig. 39).

De glasdraad moet nu bij d doorgehakt worden.
Dit kan niet met een scheermes gebeuren, om-
dat men altijd de draad ojj twee plaatsen zou
raken. Men bevestigt daarom aan den houder
O, in plaats van een scheermes, een [)raepareer-

33

naald niet houten handvat. De punt is van deze
naald afgebroken en daarna is zij van voren
scherp, wigvormig gevijld (fig. 40). Men drukt
nu met de punt van de wig op i^laats d, op de-
zelfde wijze als men dit met de oogvorniige naald
deed. Alleen behoeft hier niet door middel van
stof de plaats van aanraking met het objectglas
bepaald te worden.

Ten slotte wordt uit de naald, boven den mi-
krobrander, de bocht bij (fig. 2 i) weer verwijderd.

Op pag. 18 werd, bij de behandeling van het
vervaardigen van de rechte naald voor bakterien,
gezegd, dat de wijze waarop die naalden aan het
einde worden omgebogen, later zou beschreven
worden, \'t Is duidelijk dat dit ombuigen ook
geschiedt door middel van het toestel waarmede
de andere naalden gemaakt zijn. Men bevestigt
dc glasstaaf in den houder Q cn zorgt cr voor
dat de naald P drukt tegen een plaats die 4 mm.
van de punt is verwijderd. Dan gloeit men N\'
bij tusschenpoozen, totdat het omgebogen deel met
het overige gedeelte een hoek maakt van 150".
1 iet zal van dc dikte van dc ombuigingsplaats
aihangcn of het uiteinde naar boven dan wel
naar beneden zal ombuigen. Is dc draad op den
afstand van 3 him. tc dik, dan zal hij door

34

gloeiing van N^ in \'t geheel niet buigen, en zal
men, indien dit mogelijk is, dichter bij de punt
moeten buigen, waar de draad dunner is.

Het spreekt van zelf, dat het onmogelijk is
om de naalden altijd van volkomen denzelfden
vorm of dezelfde dikte te vervaardigen. Daarom
gaf ik ook altijd de gemiddelde afmetingen. De
dikte van de rechte naalden mag varieeren tus-
schen 9 en 12 ^; de dikte van de oogvormige
tusschen 31/2 en 5 f^^ terwijl de wijdte of door-
snede van het oog (buitenmaat) van 30—40 /x
mag bedragen. De dikte van de haakvormige
naald eindelijk kan 25—30 de wijdte van dc
haak (buitenmaat) 130—190 fi zijn.

Als het blijken mocht, dat het dikke gedeelte
van de naald, na de vervaardiging, tc lang is
voor het isoleer-toestel, mag men zc niet op dc
gewone manier invijlen en doorbreken; door dc
schok zou tegelijk de fijne punt er af kunnen
springen. Men verwijdert daarom het overtollige
gedeelte door uittrekken in dc vlam en daarop
volgcrid rondsmclten.

Het bevestigen van de isolcernaalden in het
toestel geschiedt op de volgende wijze.

Men. zet het mikroskoop in het isoleer-toestel
en wel in zijn gemiddelden stand, d. w. z. zóó,

35

dat het door middel van de schuifbeweging C •
ongeveer even ver naar rechts als naar links,
even ver naar voren als naar achteren kan ver-
plaatst worden. De isoleerkamer is ook midden
onder het objectief geplaatst; men heeft er dc
losse stukken, die de zijspleten bedekken afge-
nomen.

Nu doet men in de naaldhouders N (fig. i)
.stopverf, en legt daar de naalden op, zóó dat
de punten naar boven wijzen, elkander bijna
midden onder het objectief raken, en zich iets
lager dan de bovenrand van dc isolcerkamer
bevinden. Daarna legt men dc losse stukken
weer op de zij.splcten, en een dekglas op dc
isolcerkamer. Nu drukt men de naalden zóó diep
in de stopverf, dat de uiteinden bij een ongeveer
horizontalen stand, door beweging van dc rondsels
S (fig. i) de onderzijde van het dekglas kunnen
aanraken, en ook minstens 2 m.m. naar beneden
kunnen bewogen worden. Men moet deze be-
wegingen kunnen maken niet alleen als de iso-
lcerkamer zich bevindt midden onder de tubus
van het mikroskoop, maar ook als zij zóó ver
naar links of naar rechts is verschoven, als dit
voor het isoleeren noodig is. Verder mogen dc
punten, als ze het dekglas aanraken, niet veerdor

36

dan 150 fi. van elkander verwijderd zijn ; ze
moeten nl. bij gebruik van de sterke vergrooting
ook beide in één gezichtsveld vallen.

Hebben de naalden den gewenschten stand,
dan laat men daar, waar ze in de stopverf rusten,
eenige druppels zegellak of lutum vallen, waar-
door ze voor goed bevestigd zijn.

Omdat er 3 stellen naalden gebruikt worden,
behooren bij het isolatie-toestel ook 6 losse naald
houders O (fig. i).

HOOFDSTUK III.

Het Isoleeren.

De dekglaasjes die hierbij gebruikt worden
zijn i8 X i8 mm. groot. Ze moeten natuurlijk
goed .schoon zijn; daartoe worden ze eerst eeni-
gen tijd in het bekende mengsel van Kal.
bichrom. en zwavelzuur gelegd, of zoo noodig
in dat mengsel opgekookt, en na flinke afspoeling
in alkohol bewaard.

Als men wil isoleeren, begint men met eenige
dekglazen in te wrijven met een zacht linnen
lapje, waarop men zeer weinig vaseline heeft
gedaan. Met een ander schoon lapje wrijft men
dc vaseline er weer zóó ver uit, dat het dek-
glaasje cr blauwachtig beslagen uitziet. Ook zorgt
men voor een voldoend aantal vochtige kamers.
1 licrv\'oor wordt niet dc meest voorkomende vorm,
n.1. een ring op ccn voorwcrpglas, gebruikt, maar
ccn vierkant glazeii raam op ccn voorwcrpglas. De
zijwanden van dc kamer zijn 2—3 m.m. hoog,
5 m.m. breed; de inwendige ruimte is i.j x 14

4

38

• *

m.m. Men kan deze kamers, indien men het
glazen raam uit 4 losse stukken maakt, gemak-
kelijk zelf vervaardigen. Men wrijft ze, evenals
de isoleerkamer, van binnen in met een watje
met vaseline, die de stofdeeltjes, die er in moch-
ten vallen, zal vasthouden.

\' Ook worden zoowel de zijwanden van de
vochtige kamers als van de isoleerkamer van tc
voren aan de bovenzijde voorzien van de vase-
line, die voor de afsluiting met de dekglaasjes,
noodig is. Daarna wordt het eerste dekglaasje
waarop geïsoleerd zal worden, in gereedheid ge-
bracht. Van te voren heeft men het materiaal
waaruit een organisme zal worden afgezonderd,
zóó sterk verdund, dat er zich, wanneer men er
een druppel van op het dekglas brengt, niet al
tc veel cellen langs den rand bevinden, \'t Moet
n.1. mogelijk zijn om één cel uit den druppel
tc trekken, zonder dat er andere, die er te dicht
bij liggen, meegaan. Dit verdunnen geschiedt
op dc volgende manier. Men zorgt er voor dat
men steeds in voorraad heeft een menigte reagccr-
bui.sjes met 5 ccm. vocdingsbouillon, glucosc-
pepton, in \'t algemeen met vloeistoffen waarin
dc verschillende mikro-organismen kunnen ge-
kweekt worden. Deze buisjes moeten volkomen

39

gereinigd, en de vloeistoffen door hard filtreer-
papier gefiltreerd zijn, opdat er zich zoo weinig
mogelijk zwevende deeltjes in bevinden. Hierin
wordt zooveel van het materiaal, waaruit geïso-
leerd zal worden, gebracht, dat ongeveer de juiste
verdunning verkregen is. Bevindt dit materiaal
zich in een vloeibaren voedingsbodem, dan haalt
men dit daaruit met een uitgegloeid platina
lepeltje, omdat men daarmede sneller klaar is
dan met een gewoon entoog, dat te weinig ma-
teriaal kan bevatten. Vóór men gaat isoleeren,
controleert men op een met vaseline ingewreven
cn daarna geflambeerd dekglas (wij zullen dit
voortaan kortweg eennoemen)
of de juiste verdunning verkregen is.

Stel dat men uit een vloeistof, waarin venschil-
lende bakterien voorkomen, 2 bakterien van soort
a, 2 van soort b en 2 van soort c wil isoleeren,
dan gaat men op de volgende wijze te werk.
Men klemt een met vaseline ingewreven dek-
glaasje tusschen een dekglaspincet, en haalt het
3 maal door de vlam. Daarna legt men het
pincet zóó neer, dat de zijde van het dekglas
die bij het flambeeren naar beneden was gekeerd,
zich aan dc onderzijde bevindt. Nu flambeert
men een platina-entoog, en zet men onder elkan-

40

der, even naast het midden van het dekglas, en
wel aan de linkerzijde 2 druppels af van de
gesteriliseerde vloeistof, waarin de kuituur moet
ontstaan (deze druppels zullen voortaan vocdiugs-
druppels genoemt worden). Daarnaast, dus rechts
van het midden, zet men, op 2 m.m. afstand
van iederen druppel, óók onder elkander, van het
verdunde materiaal 2 druppels af, die voortaan
;;/rt/677^^7/druppels zullen heeten. (fig. 4.)

Men brengt altijd eerst de voedingsdruppels
op het glaasje, en daarna de materiaaldruppels,
omdat er dan de minste kans bestaat dat het
glaasje niet voldoende zou zijn afgekoeld. Men
legt daarna het dekglaa.sje op een vochtige kamer,
om infectie te voorkomen, en tegelijk ook om
het aan dc randen van vaseline te voorzien.

Nu legt men op den bodem van de isolcer-
kamer, tegen den voor- of tegen den achterwand
aan (niet in het midden, wat de waarneming
;cou kunnen hinderen) ecn druppel water, en gaat
nien over tot het sterilisccren van de naalden.
Daartoe neemt men de losse zijstukken, die dc sple-
ten bedekken (fig. i IJ) van dc kamer af, en smeert
men cr al vast dc vaseline op die later voor de
bevestiging zal moeten dienen. Door ecn schroef
los tc draaien bij het steunpimt P (fig. 1) en

41

het losmaken van de spiraalveren U haalt men nu de
staven O voorzichtig uit het toestel, en houdt men
de punten van de glazen naalden eerst in een
klein bakje met sterk zwavelzuur, en daarna iets
dieper (c.f. pag. 113 ) in een dito met ammonia, die
men beiden van te voren heeft klaargezet. Men
brengt daarna weer alles op zijn plaats, en legt
de losse zijstukken op de spleten. Vóór deze
worden dichtgemaakt, legt men het dekglaasje,
waarop geïsoleerd zal worden al op de isoleerka-
mer ; hoe eerder n.1. de naalden tegen luchtinfectie
zijn beschermd, des te beter. Het dichtmaken zelf
geschiedt met ricinus-olie of met olijf-olie, die
door diapalm ongeveer even dik-vloeibaar als
ricinus-olie is gemaakt. De • laatste wordt vóór
het gebruik geschud; men laat ze van een platten
metalen spatel in de spleet vloeien.

Nu gaat men over tot het eigenlijke isoleeren.
Men wacht eerst even tot het dekglas geheel
beslagen is met kleine afgeronde druppeltjes.
Is dit zoo, en is dus de isoleerkamer verzadigd
van waterdamp, dan plaatst men tloor. middel
van dc schuifbewcging van C (fig. i) het micros-
coop zoo, dat dc punt van de linkernaald ongeveer
in het midden van het gezichtsveld komt. Daar-
na plaatst men, door middel van de bewegelijke

42

objecttafel, de isoleerkamer zoo, dat die punt
bijna den rand van een materiaaldruppel (en wel
den rand die naar den er tegenover liggenden
voedingsdruppel is toegekeerd) aanraakt (fig. 5.)
Natuurlijk moet men er voor zorgen dat bij deze
verplaatsingen de linkernaald niet met een der
druppels in aanraking komt; de rechternaald kan
dit niet omdat die zoover mogelijk naar beneden
is gedraaid. In \'t algemeen moet men, wat den
stand van de twee naalden t. o. v. elkaar betreft
er voor zorgen, dat óf beide naalden tegelijk
het dekglas aanraken, óf één van de twee.
Nooit mogen beide naalden tegelijk omlaag zijn
gedraaid, of mag men bijv. gelijktijdig de eene
naar beneden, de andere naar boven draaien.
Tegen het dekglas aangedrukt, bevinden de pun-
ten zich nl. naast elkaar; als men ze beide naar
beneden beweegt kunnen de punten, omdat de
beweging die van een cirkelboog is, elkander
raken en breken (vooral is dit met de oog- en
haakvormige het geval.).

Nu gaat men de sterkste vergrooting gebruiken;
om alles op de juiste plaats (fig. 6) in het ge-
zichtsveld te krijgen, zal er meestal nog een kleine
verplaatsing noodig zijn van het microskoop of
de naald, die men maar fiauw ziet, omdat zij het

43

dekglas niet aanraakt. Men zoekt nu langs den
rand van den druppel tot men een bakterie van
soort a ziet. Heeft men die gevonden dan
brengt men de punt van de naald tegen het
dekglas, en raakt men er den druppelrand even
mede aan. De naald zal een weinig vloeistof uit
den druppel trekken (fig. 7.) Blijkt het dat de
bewuste bakterie meegegaan is, dan verschuift
men de isoleerkamer een weinig, waardoor een
klein druppeltje met die bakterie er in, loslaat
van den grooten druppel (fig. 8.) Hiervoor zijn
zeer kleine bewegingen noodig; men kan die,
nog beter dan door het verplaatsen van de isoleer-
kamer, óók verkrijgen door zijdelings tegen de
micrometerschroef van het mikroskoop of tegen
de naaldhouders te duwen.

Wanneer men nu, terwijl alleen de uiterste
punt van de naald het dekglas aanraakt, een zeer
dunne bakterie met het druppeltje wilde vervoe-
ren, zou men er last van hebben dat deze a. h. w.
langs de punt afgleed en achterbleef. (Bij dikkere
en bolvormige bakterien heeft men daar nooit
last van.) Dc meniscus is n.1. bij dc punt niet
bol genoeg, om zulk een bakterie binnen den
druppel te houden, l\'^ig. 9 stelt dezen toestand
op doorsnede voor; ab is het dekglas, c is dc

44

naald, het geharceerde is de druppel. Men drukt
daarom de naald iets meer tegen het dekglas
aan; dit kan gebeuren, doordat zij veerkrachtig
is. Fig. lo stelt voor hetgeen men dan krijgt,
n.1. een bolle meniscus, terwijl de punt van de
naald het dekglas in \'t geheel niet aanraakt. Als
men zoo een dunne bakterie overvoert, blijft hij
in den druppel.

Men vervoert het druppeltje met de bakterie
er in (den ,,transportdruppel") met de linker-
naald, totdat deze ongeveer de helft van den
afstand tusschen de twee druppels heeft afgelegd.
Bij dit vervoeren blijkt het tevens waartoe het
dekglaasje met vaseline moest worden ingewre-
ven. Was dit niet gebeurd, dan zou de water-
damp op het dekglaasje gecondenseerd, zijn in
den vorm van onregelmatig-begrensde, met elkaar
vervloeiende druppels. Als men door die druppels
den transportdruppel wilde vervoeren, zou deze
laatste er ook mede vervloeien, en de bakterie
zou niet meegaan.

Nu het glaasje met vaseline is ingewreven, is
er een beslag ontstaan van kleine, ronde, scherp-
begrensde druppeltjes, die niet met elkaar ver-
vloeien. en waarmede de transportdruppel ook niet
vervloeit.

45

De vochtige kamer moet natuiirhjk met water-
damp verzadigd zijn, om te voorkomen dat de
transportdruppel verdampt onder het overvoeren.

Is men nu op ongeveer de helft van den af-
stand gekomen, dan overtuigf men er zich van
dat men niét meer dan de ééne bakterie in kwes-
stie heeft geïsoleerd. Blijkt dit werkelijk, dan
beweegt men de linkernaald zoo ver mogelijk
naar rechts in het gezichtsveld. Nu beweegt men
de rechternaald naar omhoog; deze moet (zie
pag. 36) zóó geplaatst zijn, dat de punt bij sterke
vergrooting in alle geval in hetzelfde gezichts-
veld kan komen als de linkernaald. Natuurlijk
zal die punt niet preciós op de juiste plaats terecht-
komen ; een kleine verplaatsing zal meestal noodig
zijn. Eerst als beide naalden in het gezichts-
veld zijn, beweegt men de linkernaald naar om-
laag. Met dc rechternaald, die men nu nid^

1) Men bepaalt eens voor altijd voor iedere naald
hoeveel keeren men het rondsel van de naaldhou-
ders moet ronddraaien, opdat de naald zóó laag ge-
steld is dat de punt niet met de onderkant van de
hangende druppels in aanraking kan komen. Doet
men dit niet, dan zou men iedere keer bij het om-
laag-draaien de sterke vergrooting met de zwakke
moeten verwisselen, om te controleeren of dc naald
ver genoeg naar beneden is gedraaid.

\' 46

evenals de linker-, plat tegen het dekglas be-
hoeft aan te drukken, als men een dunne bakte-
rie isoleert, omdat de bewegingsrichting van het
dekglas t.o. van den stand van de naald een
andere is (zie fig. 11), voert men den transport-
druppel tot vlak bij den voedingsdruppel. De
rand van den voedingsdruppel komt bij het over-
voeren natuurlijk plotseling aan de rechterkant
van het gezichtsveld te voorschijn. Wanneer de
transportdruppel nu ook in de rechterhelft ver-
voerd werd, zou het bij ongeluk kunnen gebeu-
ren dat men niet bij tijds met de beweging op-
hield, en dat deze, vóór men die nog eenmaal
gecontroleerd had, in den voedingsdruppel terecht
kwam. Men voert daarom den transportdruppel
over zoo ver mogelijk /iuls in het gezichtsveld,
dan kan men altijd op den juisten tijd met de
beweging ophouden, als de voedingsdruppel rec/iis
in het gezichtsveld verschijnt. Men voert einde-
lijk den transportdruppel in den voedingsdruppel
over, doch niet dan na er zich nog voor het laatst
van overtuigd te hebben, dat de bewuste bakterie
er in voorkomt.

Een enkele keer (maar zeer zelden) zal het
kunnen gebeuren dat men, behalve de bakterie,
ook xiog een of ander zwevend deeltje in den trans-

47

portdruppel vindt. Dit kan echter nooit een le-
vende bakterie of een spore wezen, want men
heeft den druppel gecontroleerd nadat men de
linkernaald had omlaag gedraaid, en hem daarna
met de rcchtcrnaald, die steriel was, overgevoerd.
Wat er dus onderweg is bijgekomen, kan niet
anders zijn dan een onverbrandbaar stofdeeltje
dat door het flambeeren van het geprepareerd
dekglaasje, door de een of andere oorzaak, niet
op het glas gefixeerd was. Doch zooals we reeds
zeiden, het gebeurt hoogst zelden dat men, be-
halve de bakterie, nog iets anders in den trans-
portdruppel aantreft. Mocht het gebeuren, en
vertrouwt men de zaak toch niet, dan kan men
altijd den druppel weer een eind terugvoeren, en
een andere bakterie isoleeren.

Op dezelfde wijze isoleert men uit de andere
materiaaldruppel één bakterie van soort a, en
voert die over in den bijbehoorenden voedings-
druppel.

Mierbij draagt men er steeds zorg voor dat
de naald die gebruikt wordt, omlaag gedraaid is.

De naalden behoeven natuurlijk niet na het
isoleeren van iedere cel gesteriliseerd te worden.
Dit geschiedt alleen als ze gedurende eenigen
tijd niet gebruikt zijn geworden, en ook als men

48

bij het isoleeren een fout heeft begaan die het
waarschijnlijk maakt dat ze door bakterien zijn
verontreinigd (b.v. als de rechternaald, waarop
ten slotte alles aankomt, bij ongeluk in den ma-
teriaaldruppel is terecht gekomen).

Is deze tweede bakterie overgevoerd, dan laat
men het dekglas nog op de isoleerkamer liggen,
totdat een tweede dekglaasje, voor de isolatie
van de bakteriën van soort b, in gereedheid is
gebracht.

Het verwijderen van een dekglaasje van de
isoleerkamer moet met veel voorzichtigheid ge-
schieden. Licht men het te snel op, dan zal
door de zuiging de olie, die de zijspleten afsluit,
in de isoleerkamer gezogen worden en de onder-
zijde van het dekglas verontreinigen. Men steekt
daarom een plat, fijnpuntig pincet tusschen dek-
glas en kamerwand, en maakt eerst een opening
in de vaseline die voor de afsluiting dient. Eerst
daarna licht men het dekglas voorzichtig op.

Ieder dekglas, waarop geïsoleerd is, wordt op

een vochtige kamer gelegd. Men kan oj) den

bodem een klein waterdruppeltje aanbrengen,

doch dan altijd tegen den wand die zich bij de

materiaaldruppels bevindt. De waterdamp die zich

0

uit dat druppeltje, vooral in een broedstoof, ont-

49

wikkelt, wordt n.i. gecondenseerd op dat gedeelte
van het dekglas dat zich er boven bevindt, i. c.
tusschen de materiaaldruppels. Geschiedde dit
tusschen de kuituurdruppels, dan zouden deze
kunnen vervloeien, en de kuituur dus mislukken.
De vochtige kamers in kwestie worden bij de
vereischte temperatuur neergezet. Indien als kui-
tuurdruppel een vaste voedingsbodem is geno-
men, kan de ontwikkeling van dc kolonie, omdat
die aan den rand plaats grijpt, met sterke ver-
grooting worden gevolgd.

De reden waarom twee naalden gebruikt wor-\'
den, is de volgende.

Het geval zou zich kunnen voordoen, (hoewel
het zeer zelden, bijna nooit, voorkomt, als er
met schoone, goed gesteriliseerde naalden ge-
werkt wordt, cn als men er maar voor zorgt dat
men de linkernaald nooit te diep in den niatc-
riaaldruppcl steekt), dat aan dc het eerst gebruikte
linkernaald een bakterie bleef vastkleven. 13an
zou die bakterie wel eens kunnen loslaten juist
op het moment dat de transportdruppel in den
vocdingsdruppel gebracht werd, en zoodoende
zou deze niet met cén, maar met twee bactcrien
tegelijk gciint zijn. Daarpm heb ik er dc voor-
keur aangegeven, hoewel dat geval zich zelden

50

zou voordoen, om met twee naalden te werken.
Heeft men werkelijk gezien dat men, na den
halven afstand met de linkernaald te hebben
afgelegd, maar één cel heeft geïsoleerd, dan
wordt die verder overgebracht met de rcch-
tcmaald, waarvan het zeker is dat ze volkomen
rein is. Daarbij komt het bovengenoemde voor-
deel, dat eventueel bijkomende deeltjes dan ook
nooit bakterien kunnen zijn.

Gaan we nu na hoe men groote mikröorganis-
men, bv. zwermsporen, isoleert. We nemen aan
dat de vloeistof waarin deze voorkomen, sterk
verontreinigd is met bakterien. Men brengt nu
midden op het dekglas, onder elkander, 3 drup-
pels van dezelfde vloeistof als waarin men het
materiaal heeft verdund, en die voortaan rcini-
^zw^j-druppels zullen heeten. Links daarvan brengt
men 3 voedingsdruppels, rechts 3 druppels van
het verdunde materiaal.

Voor het isoleeren gebruikt men de grove
naalden. Bij zwakke vergrooting (bv. Leitz obj.
3, oc. i) haalt men met de linkernaald een zwerm-
spore uit den materiaaldruppel. Men zorgt er voor
dat het ^druppeltje waarin deze spore geïsoleerd
wordt, zoo klein mogelijk is. Daarna onderzoekt men
dat druppeltje en de zwermspoor met zeer sterke

51

vergrooting (ik gebruikte een apochromaat-oiie
immersie 2 ni. m. apert. 1.30 en compensatie-
oculair 4 of 6). Blijkt het al dadelijk dat op de
spore bakterien vastzitten (en om de spore aan
alle kanten hierop te onderzoeken, is het noodig,
het druppeltje met de naald gedurig wat te ver-
schuiven, waardoor zij om haar as draait), óf
blijkt het dat er in te sterke mate ook losse
bakterien in het druppeltje zitten, dan isoleert men
een andere zwermspore. Enkele weinige bakte
rien in het druppeltje kunnen niet schaden, want
die blijven toch in den reinigingsdruppel achter.

Heeft men nu een goede zwermspore geïso-
leerd, dan voert men die over met zwakke ver-
grooting naar den reinigingsdruppel, en daarna
dwars door dien heen, zóó dat zij dien aan de
andere zijde weer verlaat. In dien druppel blijven
dan de bakterien achter; mocht er ook een
enkele zijn meegegaan (wat bij de controle met
de sterkste vergrooting blijkt), dan voert men
de spore weer even terug in den reinigingsdruj)-
pel, en isoleert haar daar weer uit. Blijken nu
de zwermspore en het druppeltje volkomen rein
te zijn, dan voert men de si)orc met zwakke
vergrooting en met de rechternaald over tot dicht
bij den kuituurdruppel, controleert daar nogmaals

52

voor het laatst met sterke vergrooting, en brengt
haar eindelijk in den kuituurdruppel.

Sommige sporen, b.v. de zwermsporen van
Saprolegniaceeën, zijn betrekkelijk groot; indien
men ze langzaam met de naald overvoert, kan
men er gedurig last van hebben dat ze op het
dekglas blijven vastzitten, en dus niet met de
naald meegaan. Daarom doet men het beste
, zulke sporen in het druppeltje zoo snel mogelijk
te vervoeren, in welk geval ze niet gedurig ach-
terblijven. Ook moet men bij groote mikroörga-
nismen, die een zeer zachten membraan hebben,
opjDassen dat ze niet te sterk door de naald worden
aangeraakt, waardoor ze kunnen barsten.

In \'t algemeen vereischt het eenige oefening
om groote cellen, als ze teer zijn, over te voeren;
dc verschillende bijzonderheden die daarbij te
pas komen, moet ieder uit zich zelf leeren kennen.
Door eenige oefening zijn dc moeielijkheden
.spoedig overwonnen.

Eén soort van cellen is er, waarvan het isolee-
ren volgens mijn methode groote moeielijkheden
geeft, ja zelfs in sommige gevallen onmogelijk
is. Het zijn dezulke die lang, draadvormig, en
tegelijk zeer dun zijn. Deze blijven bij het over-
voeren zeer licht aan het dekglas vastzitten. Toch

53

bieden ze aan mijn methode geen bezwaar, als
men voor de isolatie maar jonge individuen uit-
kiest. Ook kan men in zulke\' Gfevallen de erove

O t>

naalden gebruiken, die een grootcren druppel voor
het overvoeren leveren. Pvlij is b.v. het isoleeren
van Beggiatoa, zelfs met\\ fijne naalden, steeds
zonder veel moeite gelukt, indien ik slechts jonge
cellen uitkoos.

Wanneer het na eenigen tijd blijkt, dat de
geïsoleerde cel zich in den voedingsdruppel heeft
vermenigvuldigd, moet er natuurlijk worden over-
geënt in een gewoon buisje. Indien men een
vasten voedingsdruppel heeft gebruikt wacht men
totdat de kolonie met het bloote oog zichtbaar
is. Voor dit overenten kan men gebruikmaken
van een eenvoudig toestelletje, dat schematisch
en op doorsnede is afgebeeld in fig. 2.

Op een voetstuk a, dat met lood verzwaard
is, staan twee kolommen b, die 10 cm. hoog
zijn. Op deze kolommen is met lak bevestigd
een voorwerpglas met vochtige kamer c, die in
het midden een ojjening d heeft, waarvan de
diameter 15 mm. bedraagt. Die opening kan
worden afgesloten door er een glazen plaatje e,
dat geheel met vaseline is bestreken, onder te
schuiven. Op de vochtige kamer, die van binnen

5

54

ook met vaseline is bestreken, om geen last te
hebben van infectie door stofdeeltjes, legt men
het dekglas f, waarop geïsoleerd is. Men kan
nu zeer gemakkelijk, als men e heeft wegge-
schoven, met een platina-naald. van onderen, door
de opening ,heen, uit den kultuurdruppel over-
\' enten in een buisje. Dit toestelletje biedt het
voordeel aan dat het dekglaasje volkomen. vast
ligt en infectie van buiten af gedurende deze
manipulatie wordt tegengegaan.

Mocht het soms voor sommige mikroörganismen
om de een of andere reden gewen.scht zijn dat ze,
na de isolatie, zich niet in een vochtige kamer, maar
direct in een buisje of een kolf verder ontwikkelen,
dan kan men als volgt doen. Men isoleert
in een vloeibaren kuituurdruppel, en brengt direct
daarna het glaasje op het zoo juist beschreven
tóestelletje. Om daarin de geringste verdam-
ping tegen te gaan heeft men in de hoeken van de
vochtige kamer waterdruppeltjes aangebracht. In
een gesteriliseerd capillair glazen buisje ( i cm.
lang, inwendige ruimte Va m.m.), waarvan men
er steeds in voorraad heeft, wordt dan, met een
geflambeerd pincet, de kultuurdruppel opgezogen
en terstond in het bui.sje of in de kolf gebracht.

Tweede afdeeling. Toepassingen.

HOOFDSTUK IV.

Reinkultuur van Saprolegniaceeën.

De Saprolegniaceeën komen, doordat het meeren-
deel een saprophytische levenswijze voert, meestal
voor in water dat van bakterien wemelt. Wil
men een reinkultuur van een Saprolegniacee
maken, dan kan men twee wegen volgen. Men
kan een stuk van het mycelium of een zwerm-
spore, met de bakteriën die er op vastzitten, op
een vasten voedingsbodem brengen. Dan zal
het mycelium zich straalsgewijs verspreiden, en
dit in sommige gevallen sneller doen dan de bak-
terien. Wanneer men dan na eenigen tijd van
den omtrek van het mycelium een gedeelte weg-
neemt, zal dit weinige, misschien zelfs geene
bakteriën, bevatten. Als men dit mycelium dan
op een nieuwen vasten voedingsbodem brengt,
kan men na eenigen tijd weer van den omtrek
een deel wegnemen, en deze handelwijze her-
halen, totdat men een reinkultuur heeft gekregen.

Op deze wijze heeft Klebs op bouillon-gelatine
reinkulturen gemaakt van Saprolegnia mixta
De Bary.

\'t Spreekt echter van zelf dat deze methode,
welke uitstekende resultaten ze ook al heeft ge-
geven, en nog kan geven, niet steeds kan worden
toegepast. ^

Als er aan het eerste stuk mycelium bakterien
zitten, die even snel of nog sneller zich over de
oppervlakte verspreiden als de schimmel, of steeds
met de jongste groeiende toppen van het mycelium
zich mee laten voeren; als de schimmel of de
bakteriën de gelatine doen vervloeien, of, gesteld
dat men agar gebruikt, als de bakteriën zich in
het condensatie-water kunnen verspreiden, dan
levert in al deze gevallen genoemde methode
geen resultaten. De tweede weg is deze, dat
men uitgaat van een zwermspore, waarop geen
bakterien zitten (stukken van het mycelium, hoe
klein ook, kan men hiervoor niet gebruiken,
want ze zijn altijd verontreinigd.) Ook hiervoor
zal men misschien de plaatkultutir-methode van
Kocii kunnen gebruiken. Daartoe moet men dan
een plaat met zwermsporen uitgieten, en zoeken

\') Ki.khs. Zur Physiologie der Fortpflanzung einiger
Pilze. Jahrb. für wiss. Botanik. XXXIIl png. 514\'.

57

onder de kolonies, totdat men er een heeft ge
vonden waarin geen bakterien voorkomen. Ik
heb hierbij echter mijn methode gebruikt, niet
omdat ik geloof dat ze in dit geval noodzakelijk \'
was, maar wèl omdat ze den gcmakkelijkstcn en
een zekeren weg aanbood. Men isoleert daartoe
een zwermspore die volkomen rein is; deze moet
men zoeken onder diegene, die niet lang ge-
leden uit het sporangium zijn getreden, daar ze
door een eenigszins lang verblijf in het water
door bakterien kunnen worden bezet.

\'t Uitgangsmateriaal verschaft men zich op dc
bekende wijze, door nl. insecten, liefst mcclwor-
men, op slootwater te laten drijven, \'t Is mij
gebleken dat men dc mooiste ontwikkeling met
meclvvormcn krijgt, als deze werkelijk op de
oppervlakte van het "water blijven liggen, cn niet
wanneer ze na verloop van eenigen tijd zinken,
hetgeen geschiedt als men zc levend op het
slootwater legt, door dc vele bewegingen die
den dood voorafgaan. Daarom nu)ct men dc
dieren eerst dooden, door zc eenvoudig eenigen
tijd in een reageerbuisje met water onder tc
dompelen, om zc daarna voorzichtig op dc opper-
vlakte van het slootwater- tc leggen. Ook is het
\'t beste om slootwater tc nemen zonder groote

58

vlokken van algen, daar die meestal in het water
stijgen en de vrije ontwikkeling van de hypben -
kunnen in den weg staan.

Men spoelt nu een meelworm, die dicht bezet
is met een mycelium, waaraan ook sporangien
voorkomen, uit in % NaCl of een andere
vloeistof, die isotonisch is met het celvocht, en
legt hem daarna, ook in een dergelijke vloeistof,
op een horlogeglas. Na een of meer uren zal
men op de oppervlakte een menigte zwermsporen
zien liggen, die in dien tijd uh; verschillende
sporangien zijn vrijgekomen. Met een platina-
oog neemt men van de oppervlakte wat vloeistof
met zwermsporen weg, en brengt men daarmede
2 materiaaldruppels op het isoleerdekglaasje, en
daarnaast de andere druppels, zooals dat in hoofd-
stuk III is beschreven. Voor kuituurdruppels nam
ik\' water, waarin een erwt was gekookt meel-
worm-bouillon, meelworm-bouillon-gelatine of dito
-agar, Meelworm-bouillon maakt men door een
zeker gewicht gedoode, fijngehakte meelwormen
aan te mengen met het dubbele gewicht aan
water, dit dan eenigen tijd in een broedstoof te
laten trekken en daarna, in reageerbuisjes, in

ï) Kiyiius. 1. c. pag. 516.

59

de autoclaaf te steriliseeren. Hierbij kan men
dan io7o gelatine of 2^/0 agar doen.

Een zwermspore van Achlya sp., die ik in
meelworm-bouillon had geïsoleerd, bleek na 24
uur ontkiemd te zijn tot een zóó sterk mycelium,
dat dit zich over den geheelen kultuurdruppel
uitstrekte. Die druppel werd, met het mycelium,
overgebracht in een buisje met meelworm-bouillon.
Van uit deze kuituur werd later overgeënt op
meelworm-bouillon-gelatine, dito-agar, erwtenwater,
glucose-pepton (glucose 5 o/oi pepton witte Vj
kal. fosfaat Vio%, magn. sulfaat V20 %), dito-ge-
latine, eiwit (5 gr. gedroogd kippeneiwit in 100
ccm. water) en rijst (i vol. rijst op 3 vol. water).
Al deze voedingsbodems bleken voor de schimmel
uitstekend te zijn. Minder geschikt waren Lofller\'s
bouillon-gelatine en dito-agar.

Over het algemeen is er zeer weinig bekend
over de voedingsphysiologie van schimmels, die
op dierlijke substraten leven. Ik besloot daarom
bij Achi.ya een en ander van die kwestie tc on-
derzoeken, tc meer daar ik de methode die Klkhs \')
voor dc bestudcering van ditzelfde vraagstuk bij
Saprolegnia mixta gebruikte, niet voor de beste
houd.

ï) Kleüs. 1. c. pag. 518 e.v.

6o

Op het eerste gezicht schijnt \'t een gemakkelijke
taak om na te gaan welke voedingswaarde een
bepaalde stof voor een of ander organisme heeft;
in werkelijkheid zal ieder, die zich met deze
kwestie bezig houdt, bemerken dat er zich zeer
veel moeielijkheden bij voordoen. Volgens Pfeffer
b.v. 1) kan een stof, die op zich zelf geen goed
voedsel is, dit wèl zijn, wanneer ze te zamen
met een andere stof wordt gebruikt. Al meent
men dus te hebben gevonden dat een bepaalde
stof goed wordt opgenomen, dan weet men nog
niet of dit óók het geval zou zijn als men naast
die stof eens ander voedsel gaf dan in het eerste
geval. Een andere moeielijkheid is b.v. nog
deze: ha hoeveel tijd moet men den groei con-
troleeren, om daaruit de voedingswaarde van een
bepaald medium te beoordeelen. Als men dit
na te korten tijd doet, weet men niet of men
het maximum van groei al voor zich ziet; als

9

men er te lang mee wacht kan dit maximum al
voorbij zijn, en de schimmel al ten deele zijn
afgestorven.

Pfeffer, Ueber Election organischer Nilhrstolfe.
Jahrb. für wiss. Bot. XXVill, pag. 205.

De eerste onderzoekingen hierover zijn van Raulin.
Ann. d. sc. nat. Botanicjue. V serie 1869, pag. 93\'.

6i

Ik zou thans nog niet durven beslissen, welke
de beste methode is om dit vraagstuk te onder-
zoeken ; met die van Kleijs kan ik me echter
niet vereenigen. In zijn uitvoerige\'^ en overigens
voortreffelijke studie, waarnaar ik reeds eenige
malen heb verwezen, gaat hij op pag. 518 e.v.
na, in welke stoffen Saprolegnia terstond of na
eenigen tijd sporangien vormt, en wanneer het
mycelium zich alleen vegetatief voortplant. Worden
er terstond sporangien gevormd, dan is dit een
bewijs voor een slechte voedings-vloeistof; naar-
mate ze later gevormd worden is dit een bewijs
voor een betere ; worden ze in het geheel niet
gevormd, dan is het voedsel het beste. Dit cri-
terium berust op voorafgaande onderzoekingen,
waarbij het hem o.a. was gebleken dat bij plot-,
selinge voedselonttrekking altijd sporangien ont-
stonden, terwijl bij overvloed van voedsel alleen
vegetatieve voortplanting i)laats greep.

Met \'materiaal was altijd van dezelfde kwaliteit,
n.1. afkomstig van een versche bouillon-gelatine-
kultuur, of van een kuituur in erwt-aftreksel. De
verschillende vloeistoffen, die met elkaar moesten
worden vergeleken, konden natuurlijk niet altijd
met volkomen dezelfde hoeveelheid mycelium wor-
den geent; fouten zijn (vooral bij schimmels,

62

wier mycelium ééne, meestal taaie massa vormt)
hierbij niet te vermijden. Ik meen daarom dat
een controle reeds na 24 uur, zooals Kleds dat
deed, juist omdat die fouten onvermijdelijk zijn,
wel wat te vroeg is. Als men iets langer wacht,
zullen de verschillen meer vereffend en het maxi-
mum van groei toch nog niet overschreden zijn.
Maar dit is een kleine bedenking in verhouding
tot een andere, n.1. dat Klebs om de voedings-
waarde van een stof te onderzoeken, de schimmel
laat groeien in die stof alleen, opgelost in water.
Hierdoor moet de schimmel gebrek lijden aan
k vele, voor de voeding noodige elementen ; zij
wordt dus in abnormale oinstandigheden geplaatst,
die ons niet veroorloven conclusie\'s aangaande
de voedingswaarde van de onderzochte stoffen
te maken.

Klebs beroept zich op de reeds hierboven ge-
noemde resultaten van Pfeffer, dat n.1. een or-
ganische stof, alléén genomen, een slecht voedsel
kan zijn, maar in verbinding met andere .stoffen,
verschillende levensfunctien zooals\'b.v. de adem-
haling en de stofwisseling zeer goed zou kunnen
helpen, en hij zegt dat hij zulke fouten dus niet
. kan maken. Dat is zeker waar; het komt mij
echter niet onwaarschijnlijk voor dat de andere

63

fouten, die met bovengenoemde methode gemaakt
worden, grooter zijn.

In één geval \'), waar hij Saprolegniaceeën in
koolhydraten kweekt, erkent hij zelf dat zijn proeven
niet geheel correct zijn, omdat de voedingsbodem
geen N-verbindingen bevat. Hij zegt echter dat
het mycelium in de eerste 24 uur op zijn N-
voorraad wel kan leven. Of dit waar is, zou ik
niet durven beslissen; zeker is het echter dat
Klkhs, wat dit teren op reservevoedsel aangaat,
het ook niet geheel met zich zeiven eens is,
want op pag. 537, waar hij de voedingswaarde van
N-houdende anorganische zouten bespreekt,\'moet
het mycelium weer op zijn C-voorraad teren.
Bovendien, hoe kan er ooit sprake zijn van j^c-
hcclc onttrekking van voedsel, wanneer een my-
celium altijd in de eerste 24 uur op zijn eigen
protoplasma kan teren ? En toch zegt Klkhs
dat, wanneer men een mycelium na afspoeling
in gewoon water brengt, er sporangien ontstaan
juist door de plotselinge onttrekking van al het
voedsel. Dat komt niet geheel uit.

Een feit is het dat geen enkele tot hiertoe
gebruikte methode om de voedingswaarde van
een stof na te gaan, volkomen correct is. Zoolang

>) Kleos. 1. e. pag. 529—531.

64

we echter geen volmaakte methode hebben, moeten
we die kiezen, welke de minste fouten heeft. In
alle geval moet aan deze voorwaarde worden
voldaan, dat de proefobjecten over alle elementen
die ze voor hun voeding noodig hebben, kunnen
beschikken. Eerst dan zijn de omstandigheden
normaal.

Laat ons een voorbeeld nemen. Men wil na-
gaan welk N-voedsel het best is voor een orga-
nisme. Het komt mij voor dat men dan een
vrij goede manier volgt, wanneer men verschil-
lende kolven gereed maakt die alle elementen
bevatten, behalve N. Nu-doet men bij kolf i
een soort N-voedsel, bij kolf 2 weer een andere
soort enz., en men vergelijkt den groei in de
verschillende kolven. Tot volkomen controle
kweekt men óók in één kolf waarin men geen
N-voedsel heeft gebracht. Op deze manier, die
door vele onderzoekers wordt toegepast, heb ik
eenige proeven genomen om na te gaan welk
N- en welk C-voedsel voor de schimmel het
beste was. Om het eerste na te gaan nam ik
7 kolven, die ik ieder voorzag van 100 ccm.
water, waarin 5 °/o glucose techn., Vio "/o kal.
fosfaat en V.jo "/() magn. sulfaat. Bij kolf i deed
ik verder niets, bij 2 nog Vj "/„ pepton witte, bij

Ó5

3 7o amm. sulfaat, bij 4 V2 % kal. nitraat,
bij 5 Vo % natr. nitriet, bij 6 Va 7o asparagine,
bij 7 7o ureum.

Al deze kolven werden discontinu gesteriliseerd,
terwijl alle stoffen er in zaten, behalve 7. Het
ureum nl. wordt bij vochtige sterilisatie ontleed, en
daarom werd het afzonderlijk in de droogstoof i uur
lang op 150" verhit. Doet men dit op een horloge-
glas of in een kroesje, dan heeft men er later, daar
het bij die hitte smelt, moeite mede om het
los te maken, en bovendien loopt men dan nog ge-
vaar voor verontreiniging. Daarom werd het in een
klein buisje gedaan. Dit buisje werd in een gewoon
reageerbuisje, dat met een watteprop was afgeslo-
ten, gesteriliseerd ; daarna werd het buisje met het
ureum in kolf 7 geworpen, waarin het ureum
spoedig oploste. In ieder der kolven werd een
nagenoeg even groote hoeveelheid mycelium ge-
bracht. Dit levert bij Phycomyceten, indien deze niet
fructificeeren, eenige nioeielijkheid, doordat het
mycelium één taaie samenhangende massa vormt,
waaruit men zelfs met een omgebogen platina-
haak niet altijd gemakkelijk stukken kan los-
trekken, in geen geval steeds even groote stuk-
ken. Ki.khs legde een vlok mycelium in een
" L. cT pag. 518.

66

bak met water, en trok die daarin in gelijke
stukken ; het overtollige water nam hij met filtre er-
papier weg. Als hij die stukken moest over-
brengen in vloeistoffen, die gemakkelijk door
bakterien worden aangetast, steriliseerde hij den
bak met water eerst, en liet hij het afdrogen
met filtreerpapier achterwege. Ik volgde een
andere methode. \'

Er werd een kuituur aangelegd in een buisje
met schuin-gestolde glucose-pepton-gelatine. Als
er aan weerszijden mycelium-draden tegen het
glas waren opgegroeid, werden met behulp van
een geflambeerd platina-mesje eenige van die
draden afgesneden, en deze werden dan in de
kolven overgebracht. Zoo\'n platina-me.sje kan
men zich gemakkelijk zelf vervaardigen door uit
te gaan van een dikke platina-naald, die men
ombuigt zooals in fig. 3. Het gedeelte bij a
wordt plat gehamerd en met een fijn vijltje van
een .scherpen kant voorzien. Daarmede kan men
dan zeer gemakkelijk nagenoeg even groote hoe-
veelheden mycelium, indien dit tegen een glazen
wand zit, afsnijden.

De kolven werden, na geënt te zijn, bij 24" C.
in de broedstoof gezet.

Van den aanvang af groeide het mycelium in

67

de kolf met glucose-pepton verreweg het sterkste,
Na 3 dagen was de verhouding :

2 »> 3 > 6 > I, 7 > 4 > 5 1).

Deze verhouding bleef dezelfde tot na i6 da-
gen, toen ik de serie voor het laatst controleerde.
Het resultaat is dus: natr. nitriet, kal. nitraat
en ureum vormen geen voedsel ; het eerste is
zelfs een vergift, want het mycelium-klompje in
de kolf met natr. nitriet was het eenige waarbij
niet de minste ontwikkeling, zelfs niet in het bcf-
gin, was waar te nemen, terwijl het, toen ik het
na 2O dagen overbracht in glucose-pepton, zich
niet meer ontwikkelde. Asparagine is slecht voed-
sel, amm. sulfaat is beter, maar pepton is het
ideale voedsel.

Tijdens de proef entte ik uit de kolf met glu-
cose-pepton in kolf 8 met Va % pepton witte -f
Vio "/o kal. fosfaat Voo "/o magn. sulfaat, hi het
begin was de ontwikkeling zeer sterk, later werd
ze iets minder, maar ten slotte bleef zc staan in
het midden tusschen die van glucose-pepton en
glucose-amm. sulfaat. Pepton alleen levert dus
zoowel N- als C-voedsel.

\'^ Indien de ontwikkeling in de eene kolf eenvou-
dig sterker is als in de andere, duid ik dit aan door
het teeken >. Indien het verschil echter groot is
of zeer groot, gebruik ik resp. de teekens » en »>.

68

Om na te gaan welk C-voedsel voor de
schimmel het beste is, wanneer als N. voedsel
een NHg-verbinding gegeven wordt deed ik in
13 kolven 100 ccm water, Va amm. sulfaat
(het pepton kon hier\\\'00r natuurlijk in geen ge-
val gebruikt worden), Vio % kal. fosfaat en V20 %
magn. sulfaat. Bij dit mengsel werden gevoegd
de tè onderzoeken C-bronnen, en wel:
bij kolf 9 5 gr. aardappelmeel.

10 » saccharose.

11 » laevulose-stroop.

12 » maltose.

13 » melksuiker.

14 » glucose.

15 » cellulose (zetmeelvrij filtreerpapier)

16 2 Va gr. natr. benzöaat.

17 » kal. tartraat.

18 » kal. acetaat.

19 » kal. citraat.

20 » natr. butyraat.

21 deed ik niets.

Na 7 dagen was het resultaat aldus :
9 » 12 > 13 > 14 > II, 10 > 21 > 19, 17,
15, 16, 20, 18.

Aardappelmeel is dus het beste C-voedsel, dan
volgt maltose, dan melksuiker, dan glucose\', en

69

ten slotte laevulose-stroop en saccharose, waarin
de groei gering was. In kolf 19 en 17 was in
in het begin nog een minimale groei zichtbaar
geweest; in de laatste vier kolven in het geheel
geen groei.

Een verblijf van 24 dagen in de kolven met
natr.-benzöaat, natr.-butyraat en kal. acetaat was
voor het mycelium doodelijk, terwijl het even
lange verblijf in de kolven met kal. citraat en
kal. tartraat niet doodelijk was. Althans, toen .
ik uit al die kolven het stukje mycelium entte
in glucose-i)epton, kwamen de kuituren afkomstig
uit de 3 eerstgenoemde kolven niet, uit de 2
laatstgenoemde wèl op.

Werd in plaats van aardappelmeel rijstemeel
genomen, dan was de groei even sterk ; ik heb
met opzet echter niet rijstemeel gebruikt voor
de vergelijkende proef over het C-voedsel, omdat
er zich dikwijls restanten van dc alcuron-laag die
om dc rijstckorrels zit, in bevinden.

Dc groote hoeveelheid vet, die ik steeds aan-
trof bij mcclwormcn, waarop men (zie pag. 57) de
schimmel zeer goed kan doen groeien, deed bij
mij de vraag ontstaan of vetten in \'t algemeen
als voedsel zouden kunnen gebruikt worden. Ik
nam een proef met Arachis-olic, waarvan door

6

70

andere onderzoekers reeds was aangetoond
dat ze tot voedsel kon dienen. Er werden 6
kolven klaar gemaakt:

la en ib bevatten V<j 7o amm. sulfaat, \'/jo "/o
kal. fosfaat en Vgo \'^/q

magn. sulfaat.
2a en 2b bevatten Vo % pepton witte, Vjo "/o
kal. fosfaat en Vgo % magn. sulfaat.

3a en 3b bevatten 2 % glycerine, Vio °/o kal.
fosfaat en VoQ "/q magn. sulfaat.

In alle 6 werd Arachis-olie gedaan.
In la greep een zeer geringe ontwikkeling
plaats, ongeveer een even sterke als in een op-
lossing van amm. sulfaat alleen; dus was die
ontwikkeling zeker ten koste van het amm. sul
faat. In 3a was geen ontwikkeling te bespeuren
in 2a wel, maar hier weer om dezelfde reden
ten koste van de pepton.

. Arachis-olie werd dus niet als voedsel gebruikt
De schimmel vormt onder sommige omstandig
heden zuren. In een buisje met glucose-pepton
dat sterk alkalisch reageerde, werd de schimmel
gebracht-, na 10 dagen was de reactie duidelijk

1) B.v. Went. Over den invloed van de voeding
op de afscheiding van enzymen door Monilia Sito-
phila (Mont.) Sacc. Kon. Alt. van Wetensch. 26 Jan.
1901 pag. 490.

zuur. Dit zuur wordt niet gevormd als pepton
alleen als voedsel gegeven wordt, want kolf 8
(zie boven), die alleen pepton bevatte, reageerde
bij het enten zeer zwak alkalisch, en na 2 7 dagen
nog neutraal. Die zeer geringe verandering in
reactie schrijf ik toe aan het feit dat alle voe-
dingsbodems, ook zonder dat ze geënt zijn, na ver-
loop van tijd minder alkalisch, dikwijls zelfs zuur
worden. Ook wordt er geen zuur gevormd als
glucose met amm. sulfaat als voedsel gegeven
wordt. De kwestie zelf heb ik niet verder onder-
zocht; evenmin welk zuur hier gevormd wordt.

De schimmel kan ook zonder O leven, en
vormt daarbij alkohol Met mycelium vormde,
met glucose-pepton als voedsel, in een O-vrije
ruimte (verkregen volgens de methode van Bucii-
ni:r, n. 1. door middel van pyrogallu.szuur en
KOM) een dikke, stijve massa. De vloeistof
werd gedistilleerd, en hetgeen het eerst overging
werd met KOM en J verwarmd; de zeer duide-
lijk waarneembare jodoform-lucht liet weinig
twijfel over aan de aanwezigheid van alkohol.

Ook heb ik een en ander onderzocht aangaande
de vorming van .suiker uit zetmeel. Dat er suiker

1) Althans zeer waarschijnlijk, want ^relied be-
trouwbaar is de hier volgende reactie op alkohol niet

,72

gevormd werd, was mij al gebleken toen ik de
rijst uit een kolf, waarin na 15 dagen een flinke
kuituur was ontstaan, met FeiiliNg\'s proefvocht on-
derzocht. Om te vinden welke suiker dit was,
nam ik een klompje van den voedingsbodem,
en maakte er het ozazon uit, dat bleek te bestaan
uit bundels van lange naalden, zooals die bij
aanwezigheid van d-glucose ontstaan. Ten over-
vloede werd nog eens met opzet een oplossing
van d-glucose op de hierboven beschreven wijze
behandeld; de ontstane naalden bleken identisch
te wezen.

Daar in het algemeen schimmels uit zetmeel
niet direct d-glucose, maar eerst dextrine als
tusschenproduct maken, kon ik hier verwachten,
dat er ook niet alleen d-glucose in den voedings-
bodem zou zitten, maar, omdat de kuituur nog
niet zeer oud was, ook een hoeveelheid dextrine.
Om dit na tc gaan, polariseerde ik de vloeistof,
waarin een gedeelte van dc rijst was uitgetrokken,
na filtratie; dc uitkomst was ccn rcchtsdraaiing
van 1.58". Bij titratie vond ik dat 9 ccm. 10 ccm.
FehlinCt reduceerden. Volgens dc koper-reductie
zou er dus 0.55 d-ghicosc geweest zijn; deze zou
echter een rcchtsdraaiing gegeven hebben van 0.5.

m

•Er kon dus niet alleen d-glucose aanwezig zijn.

73

Dat de andere stof, die zulk een sterke R-draai-
ing veroorzaakte, dextrine moest zijn, werd zeer
waarschijnlijk toen ik een deel van de vloeistof
met alkohol behandelde. Hierdoor slaat n.1. de
dextrine neer. Toen ik daarna polariseerde, vond
ik een rechtsdraaiing van 0,32 ; bij titratie vond
ik dat 17,5 ccm. van de vloeistof 10 ccm. Fehling
reduceerden, wat op een d-glucose-gehalte van
0,29 7o wijst. Zulk een oplossing geeft ook een
rechtsdraaiing van 0,3.

Volkomen duidelijk zijn deze uitkomsten echter
nog niet, want wc. vinden in het eene geval een
gehalte van 0,55 "/o, in het andere geval van
0,29 \'Vu d-glucose. Als het laatste juist is, moe-
ten we tot de conclusie komen, dat we bij de
andere titratie 0,55 7o vonden, doordat de nog
aanwezige dextrine dan óók koperproefvocht zou
reduceeren; als het eerste juist is, moeten we
aannemen dat we het geringe gehalte van 0,29 "/o
vonden, omdat door de alcohol, behalve dex-
trine, ook wat d-glucose is gepraecipiteerd. Voor
beide mogelijkheden bestaat kans; ik «lurfechter
niet beslissen, wat hier het geval is; \'t is mo-
gelijk dat beide factoren het hunne hebben bij-
gedragen tot de verschillende uitkomsten.

Zeer duidelijk is de omzetting van zetmeel na

74

te gaan met de auxanograpische methode van
Beyerixck-Wijsman.^) Men maakt een oplossing
van Vg 7o amm. sulfaat, Vg % oplosbaar zetmeel en
2 % agar. Daarvan giet men een dunne plaat
in een gewone kuituurdoos. Ment ent de plaat
in het midden met de schimmel. Na een of
2 dagen, als de schimmel tot op ongeveer een
cm. van den omtrek de plaat overwoekerd heeft,
overgiet men die met een verdunde J-oplossing,
die men even laat inwerken, waarna men haar
afgiet, en de plaat met water afspoelt.

Een groot gedeelte in het midden is dan kleur-
loos; daaromheen vindt men een roode zone
(dextrine) en geheel in de rondte, waar dc schimmel
nog niet is gegroeid, wordt de plaat blauw. Als
dc mycelium-draden niet te dicht op elkaar zit-
ten, kan men zien dat de draden, die juist in
de blauwe zone zijn doorgedrongen, met rood
omlijnd zijn.

Uit het feit dat de schimmel gelatine doet
vervloeien, vermoedde ik dat cr een proteolytisch
enzym werd afgescheiden. De\'snelheid waarmede

1) Beverink. Die Bacteriën der Papilionaceen-
knöllchen. Bot. Zeit. i888 pag. 762.

Wijsman, üe diastase, beschouwd als mengsel van
maltase en dextrinase. Akad. proefschr. Amst"". 1889.

•75

dit enzym werlct, en de omstandigheden waar-
onder het ontstaat, heb ik iets nauwkeuriger
onderzocht.

In het begin gebruikte ik hiervoor de methode
zooals die door FER^n is aangegeven. Hiertoe
giet men in gewone reageerbuisjes 5—10 ccm.
van een mengsel dat uit 100 ccm. water, 7 gr.
gelatine en i gr. carbolzuur bestaat, en daarop
giet men, na afkoeling, de vloeistof die men
op haar proteolytisch enzym wil onderzoeken,
voorzien van 2 "/q carbolzuur. In plaats van
carbolzuur worden ook andere antiseptica, b.v.
thymol voorgeschreven. Men gaat nu na of de
gelatine vloeibaar wordt, en hoe snel dit geschiedt.
Bij niet zeer snel werkende enzymen kan het
echter vele dagen, soms weken lang duren vóór
men eenige uitwerking ziet. Daarom heb ik de
methode van Fer.mi zóó gewijzigd, dat de resuh
taten zoo spoedig mogelijk zichtbaar zijn.

Men neemt water dat met thymol verzadigd
is, en doet daarbij 7V2 "/n gelatine en zóóveel
fijngewreven vermiljoen, dat de vloeistof Hink
rood ziet. Terwijl men door roeren zorgt dat
het vermiljoen niet bezinkt, giet men van dit
mengsel in reageerbuisjes, in ieder ± 5 ccm. Dit

ï) Arch. f. Hyg. XII, 240.

76

geschiedt het beste door middel van een trechter,
waaraan men een glazen buis heeft bevestigd die
tot op den bodem van de buisjes reikt. Als de
gelatine hard is geworden, zet men de buisjtïs
in een bekerglas met water dat op 40" C wordt
gehouden. Is de gelatine gesmolten, dan houdt
men de buisjes in een schuine houding gedurende
10 sec. onder de kraan vao de waterleiding, waaraan
men een of ander waaier-vormig apparaat heeft
bevestigd, zoodat de straal zeer breed en dun
wordt en tegelijkertijd al de gelatine omspoelt.
(Men kan hiervoor een vleermuis-gasbrander ge-
bruiken, zooals die boven op Bunsensche branders
geplaatst worden voor het verkrijgen van een
platte vlam,) Door die bespoeling van 10
sec. wordt de gelatine niet vast, maar wel dik-
vioeibaar. Als men dan daarna het buisje ver-
tikaal neerzet, zal er tegen de wand, boven de
óppervlakte van de gelatine, een dunne laag,
in den . vorm ongeveer van een halve ellips
achterblijven. Na bekoeling kan men in deze
buisjes verder op de gewone wijze de vloei-
stoffen gieten, die men wil onderzoeken, voorzien
van een stukje thymol.

Het doel van deze methode is dit, dat het
enzym in aanraking komt met een zoo ^root

77

mogelijke oppervlakte van de gelatine, die, omdat
ze ook in een zeer dunne laag is uitgespreid,
spoedig kan worden opgelost. Door de roode
kleur ziet men die oplossing des te sneller. Om
bij vergelijkend onderzoek er zeker van te zijn
dat de gelatine-Iaag even dik is in alle buisjes,
worden deze eerst alle op een even hooge tem-
peratuur verwarmd, en daarna even lang afge]
koeld. Bij een langere aikoeling toch zou er
meer gelatine tegen den wand blijven zitten, bij
een kortere minder.

Met deze buisjes kan men dus r\' aan de
laag die tegen den binnenwand zit in korten tijd
zien of er een enzym aanwezig is en hoe snel
dit werkt, en 2® aan de massa die onderin zit, de
werking over een Zr/z/^\'-cv-tijdsverloop controleeren.

Ik onderzocht met deze gewijzigde, èn tege-
lijkertijd ook met de oude methode ter verge-
lijking, of de schimmel in een voedingsbodem
van § 7o eiwit in water en in een van glucose-
pepton proteolytische enzymen afscheidt. In
beide gevallen gebruikte ik eenvoudig de vloei-
stof uit de kultuurkolf, na filtratie, maar ook
een gefiltreerd aftreksel in water van het fijnge-
wreven mycelium. Dit fijnwrijven geschiedde
met glaspoeder. Ik had dus:

78

A. de vloeistof uit de kuituur op eiwit.

B. het aftreksel van de fijngewreven schimmel
uit de kuituur op eiwit.

C. de vloeistof uit de kuituur op glucose-pepton.

D. het aftreksel van de fijngewreven schimmel
uit de kuituur op glucose-pepton.

\'s Avonds ten 9 ure deed ik bovengenoemde
vloeistoffen in buisjes, op de hierboven beschreven
wijze voorzien van vermiljoen-thymol-gelatine. Het
resultaat was den volgenden morgen, dus na
12 uren, reeds duidelijk te zien: de dunne laag
was - door het enzym in A en B bijna geheel
verdwenen en door C en D nog niet zeer merk-
baar aangetast. Na 2 dagen was de dunne
laag in C en D bijna verdwenen en pas na 3
dagen in D verdwenen, terwijl ze toen in C nog
niet geheel weg was. Het enzym was dus in
veel sterkere mate gevormd op den voedings-
bodem van eiwit als op dien van glucose-pepton.

Dit zou in overeenstemming zijn met de be-
kende theorie dat een cel een enzym zal afschei-
den naarmate zij dit noodig heeft, om de saam-
gestelde voedingsstoffen te splitsen in meer een-
voudige en assimileerbare. In dit geval zou men
ook volgens die theorie verwachten dat in een
voedingsbodem met eiwit meer enzym, althans

79

een dat krachtiger werkt, zal worden afgeschei-
den ais in een voedingsbodem met glucose-pep-
ton. Aan den anderen kant is er echter ge-
waarschuwd tegen het te snel trekken van alge-
meene conclusiën op dit gebied.

Ook vergeleek ik de bruikbaarheid van deze
gewijzigde methode met de oude, waarbij men
de gelatine gewoon in vertikaal-staande buisjes
laat stollen, dus zonder een dunne laag tegen
den wand. Daarbij was na 3 dagen nog geen
uitwerking van het enzym zichtbaar.

Eveneens ging ik nog door een enkele proef
na, wélken invloed de aanwezigheid van zuur of
alkali op de werking van het enzym heeft. Van
ieder der 4 bovengenoemde vloeistoffen werden
twee hoeveelheden genomen, en van deze de
eene zwak alkalisch, de andere zwak zuur ge-
maakt (met behulp van MCI en van Na OM).
Met bleek dat het enzym zoowel bij aanwezig-
heid van zuur als van alkali, werkt. Na 3 dagen
was in iedere buis de dunne laag verdwenen.
Volgens de thans heer.schonde nomenclatuur zou

Wknt. Over den invloed van de voeding op
de afscheiding van enzymen door Monilia sito-
phila (Mont.)-Sacc. Kon. Akad. van Wetensch.
26 Jan. 1901, pag. 499.

8o

men dit dus een tryptisch ënzym kunnen noemen.
Ook ging ik nog na of de schimmel een enzym
afscheidt dat in staat is vet te splitsen. In een-
kolQe deed ik loo ccm water, V3 gr. pepton
witte, Vio 7o kal. fosfaat en \'Ao % magn. sulfaat.
Daarbij deed ik Arachis-olie, en zooveel lakmoes-
oplossing dat het geheel de neutrale paar.se tint
had. Het kolfje werd met de schimmel geënt.
Als de olie gesplitst werd, zouden er vrije vet-
zuren en glycerine moeten ontstaan. Deze zuren
zouden niet geneutraliseerd kunnen worden, want
bij een voeding met pepton ontstaat (zie pag. 71 )
geen alkalische reactie. De lakmoes-oplossing
zou dus, als vetten gesplitst werden, rood moe-
ten -worden. Dit gebeurde echter niet ; de schim-
mel scheidt dus geen vetsplitsend enzym af. Na-
tuurlijk diende een soortgelijk ongeënt kolfje tot
controle.

Dit onderzoek naar de. werking van het enzym
is tevens voor mij een aanleiding geweest om na
te gaan of er in de methode voor de bestudee-
ring van deze kwestie niet eenige veranderingen
waren te brengen.

Er staan voor het enzym onderzoek twee we-
gen open : de antiseptische en de aseptische
methode.

8i

De eerste, waarvan we zoo juist een toepas
sing- hebben gezien, is gebaseerd op het feit dat
de enzymen over het algemeen betrekkelijk on-
gevoelig zijn voor veel stoffen, die voor levende
cellen doodelijk zijn, o.a. voor verschillende anti-
septica.

Deze dienen natuurlijk om de ontwikkeling van
bakterien, die al in dc kuituur mochten zitten,
of er naderhand door infectie bij zouden kunnen
komen, tegen tc houden.

Een bezwaar van deze methode is en blijft
echter dit, dat men er nooit zeker van is het
enzym in zijn zvan uitwerking voor zich tc zien.
Want al mag het over \'t algemeen waar zijn dat
dc enzymen, in verhouding tot dc levende cellen,
betrekkelijk ongevoelig zijn voor veel protoplasma-
vergiften, geheel ongevoelig zijn zc er bijna nooit
voor. In vele gevallen oefenen zij zelfs een vrij
sterken invloed uit. Dc antiseptica, die het meest
bij deze methode gebruikt worden, zijn: thymol,
chloroform, phenol, toluol, aether, actherische
oliën, sterke alkohol, salicylzuur, natriumfluoride,
calomel, sublimaat, natriuni-arseniet en natrium-
azoïmid Van verscheidene van deze stoffen

1) Van dit lijstje zou ik ten minste thymol en chlo-
roform willen schrappen, en wol omdat het geen

ilu is het bekend geworden dat ze zich tegen-
over de enzymwerking volstrekt niet neutraal
gedragen. Vooral is dit het geval met salicyl-
zuur, phenol, thymol, chloroform en natriumfluoride.
Verdunde alkohol werkt zwak in op pepsine,
vrij schadelijk op diastase en invertase, vernie-
tigend op maltase in tegenwoordigheid van water.
Phenol werkt storend in op pepsine en misschien
ook op diastase.

Van andere, nog niet genoemde protoplasma-
vergiften, is het bekend dat natriumarsenaat,
borax en kininesulfaat zeer schadelijk zijn voor
de werking van invertase, dat zilvernitraat in een
kleine dosis, wintergreen-olie en kaneel nogal,
en kaliumcyanide zeer sterk nadeelig is voor

vertrouwbare antiseptica zijn. Smith demonstreerde
op een congres van bakteriologen 12 verschillende
bakterien, die groeiden in een voeding.sbodem, waarbij
een gelijk vol. chloroform was gevoegd, en 2 soorten
die in bouillon met thymol groeiden. ^Zie Centralbl.
für Bakt. und. Par. Knd. I. XXIX pag. 445). Albert
vond in gistsap met 10 % rietsuiker en i % thymol
een rijke bakterien-ontwikkeling (zie Centralbl. f. B.
u. P. II. VII pag. 74). Ik zelf vond ook in een
buisje met 7v2 ccm. glucose-pepton en een stuk thymol
ter grootte van i ccm. een sterke bakterien-ontwik-
keling. Ik kweekte dezelfde bakterie in bouillon en
in bouillon 4- thymol, en vond in het laatste (waar-
schijnlijk toevallig) zelfs een iets sterkeren groei!

83

dezelfde stof. Ook veel alkaloïden en looistof
werken vertragend in op enzymen, terwijl for-
maldehyd ze geheel onwerkzaam maakt.

In andere gevallen kunnen sommige proto-
plasma-vergiften weer bevorderend werken voor
de enzymen; dit is b.v. met sommige alkaloïden
en met zilvernitraat, in een sterke dosis toege-
diend, het geval.

We zien dus dat enzymen in \'t algemeen
gevoeliger zijn gebleken voor antiseptica dan
men in \'t begin meende. En dit is geen wonder,
want zelfs voor neutrale zouten zijn zij gevoelig;
de meeste van deze werken in verdunden toe-
stand bevorderend. In enkele gevallen meenen
sommige onderzoekers (b.v. Duclaux) wel een
verklaring te hebben voor die verschillende uit-
werking. Van een zout b.v., dat de caseïne,
welke in dc melk gesuspendeerd is, oplost, zou
men wel van te voren kunnen venvachten dat
het schadelijk zal werken op het lebenzym. Daar
het verder vrij zeker is dat zeer verdunde zuren

1) Ik ontleen dc meeste van deze feiten aan: Die
Fermente amd ihre Wirkungen, von Carl Oppiïn-
heimer. Leijizig, Verlag von F. C. W. Vogel, 1900.
pag. 41 e.v., alwaar ook uitgebreide litteratuur-opgave,
en aan: Traité de Microbiologie, par E. Duclaux,
Paris. Masson et O\' 1899. Dl. II pag. 371, e.v.

84

over *t algemeen voordeelig werken, en zeer
verdunde alkaliën nadeelig, zou men ook kunnen
verwachten dat stoffen die een -zwak zure reactie
doen ontstaan bevorderend, en die, welke een
alkalische reactie zullen teweegbrengen, schadelijk
zullen werken.

Maar dit zijn slechts enkele gevallen, waarin
eene verklaring met eenige waarschijnlijkheid
kan gegeven worden; meestal weet men van te
voren in \'t geheel niet in hoeverre, en nog
minder waarom een antisepticum een voordeeligen
of een schadelijken invloed op het te onderzoe-
ken enzym zal hebben. Dit is zeker, bijna
altijd hebben ze een grooteren of kleineren in-
vloed, en dat alleen reeds maakt dat de antisep-
tische methode van enzym-onderzoek nooit te
vertrouwen is.

De tweede methode, de asepti.sche, kan men
op 2 manieren toepassen. Men kan in een
glazen doos een vasten voedingsbodem uitgieten
waarop het mikroörganisme in . kwestie moet
groeien, en daar bij voegen de stof waarop het
enzym moet inwerken; alles natuurlijk onder de
noodige voorzorgen van steriliteit. Daarna wordt
het mikroörganisme er op gebracht, en als het
zich ontwikkeld heeft wordt met verschillende

85

hulpmiddelen nagegaan hoever het enzym door
de gelatine of agar is gediffundeerd en welke
veranderingen het heeft teweeggebracht. Van deze
methode zagen we reeds een toepassing op pag. 74.

De andere manier is deze, dat men de kui-
tuur, ook ondtr de noodige voorzorgen tegen
infectie, filtreert door een bakterienfilter, en daar-
mede een scheiding tusschen het enzym en de
levende cellen teweegbrengt.

De eerste manier, die tot hiertoe reeds veel
resultaten heeft gegeven, is intusschen niet te ge-
bruiken als men het enzym afzonderlijk aan ver-
schillende proeven wil onderwerpen. Ook houden
de gelatine en de agar, als colloïde lichamen, de
enzymen, die er doorheen moeten diffundeeren, min
of meer legen. Hetzelfde is het geval met de bakte-"
rienfilters, die door moleculaire adhaesie sommige
bestanddeelen van de te filtreeren vloeistof in
meerdere of mindere mate tegenhouden. Son\\s ko-
men stoffen geheel veranderd, dan weer zoo, dat
enkele producten er uit vernietigd zijn, uit het
filter te voorschijn. Misschien speelt ook de zuur-
stof, die in de poriën zit, hierbij een rol.

Vooral ook schijnt de slijmachtige laag, die
zich na eenigen tijd op den filter afzet, verschil-
lende bestanddeelen tegen te houden.

7

86

In de antiseptische methode heb ik geen andere
wijzigingen pogen te brengen dan de hierboven
op pag. 75—77 beschrevene.

Wat de aseptische betreft, heb ik getracht een
filter te\' vinden dat gemakkelijker is aan te wen-
den dan de porceleinen, dat absolute zekerheid
geeft wat de steriliteit betreft, en dat de vloei-
stoffen, althans de enzymen meer onveranderd
doorlaat. Ik meen dat ik, althans voor het on-
derzoek van sommige schimmels, naar wensch
ben geslaagd, en wil het apparaatje dat daarbij
dien.st doet, hier nog mededeelen. Het is afge-
beeld in fig. 41, en zóó eenvoudig gebouwd dat
er niet een afzonderlijke. beschrijving behoeft
vooraf te gaan. Alleen zij hier medegedeeld
dat het apparaat van glas is vervaardigd, en dat
de gestippelde deelen in de figuur watteprop-
\' pen, en de geharceerde deelen caoutchouc-buisjes
voorstellen.

Men doet onder in de dikwandige buis A een
hoeveelheid glaspoeder of diatpmeeën-aarde. Daar-
boven giet men een voedingsvloeistof, waarin de
schimmel moet gekweekt worden. In de buizen
F, G, F^ en G\' doet men de stoffen, waarop
men het enzym wil laten inwerken. In het fleschje
C^ doet men water. Dan wordt het geheel ge-

87

sterilisecrd, waarna in A de schimmel wordt
geënt.

We willen eens een gecompliceerd geval nemen,
n.1. dat men van de schimmel de vloeistof wil
afgieten, om het enzym dat er in zit, te onder-
zoeken, en dat men óók de schimmel wil fijn-
wrijven om het enzym uit de cellen zelf te ver-
krijgen. In beide gevallen willen we de inwer-
king op 2 verschillende stoffen a en b nagaan.

Als de schimmel in A zich goed ontwikkeld
heeft, giet men uit C zooveel water op de watte-
prop E, dat die er mee verzadigd is. Daarna
giet men dc vloeistof uit dc kuituur in A op dc
watteprop E, waarbij men natuurlijk het glazen
T stuk, dat tusschen A en D is ingeschakeld,
zóó houdt dat die vloeistof niet in C kan loopen.
Dc natte watteprop E, die 5 c.m. hoog is, dient
als filter, en houdt als zoodanig cvcntucelc losse
stulcken van het mycelium terug. Men laat dc eene
helft van het fikraat loopen in ^^ waarin dc stof
a zit, de andere helft in G, waarin dc stof b zit.
1 Iet bui.sje ilat door dc watteprop E is gesto-
ken, dient om dc lucht die door het fikraat ver-
plaatst wordt, tc doen ontwijken. Na het filtreeren
sluit men de caoutchouc-buizen die en G met
D verbinden, door klcmkranen. af; men kan

\\

f *

daarna F en G van D losmaken en afzonderlijk
bewaren.

Nu gaat men over tot het uitpersen van het
mycelium. Van te voren moet dit echter flink
worden afgespoeld. Daartoe giet men uit C
water op het mycelium, en spoelt men dit door
schudden, waarbij men B op en neer beweegt, af.
Daarna giet men het water weg in de rechter
buis D, die nu toch niet meer noodig is. Men
herhaalt dit eenige malen, giet het laatste spoel-
water niet door D weg, maar gebruikt dit om
de Vv^atteprop E^ te bevochtigen, en wrijft ver-
volgens met behulp van B de schimmel met het
glas of de diatomeeënaarde fijn. Voor alle zeker-
heid wrijft men het deel van B dat boven de
watteprop uitsteekt, met vaseline in; dan kunnen
er nooit bak\'teriën bij de beweging van B naar
binnen komen.

Is het mycelium goed fijngewreven, dan giet men
er nog wat water uit C op, en filtreert men door
de watteprop E\' in de linkerbuis D\' op dezelfde
wijze als men dit in de rechterbuis D deed.

Door voorloopige proeven had ik geconsta-
teerd dat myceliumdraden en stukken daarvan
door een watteprop worden tegengehouden,
wanneer die ten nu\'nste vochtig is.

89

Met dit toestel ging- ik nog na, of Achlj^a
een enzym afscheidt dat zetmeel ontleedt. Ik
wilde alleen maar de afgegoten vloeistof van de
kuituur gebruiken, en bevestigde aan A dus
alleen de buis D met toebehooren. In de buisjes
F en G deed ik water waarin een weinig op-
losbaar zetmeel was opgelost, zóó dat het met
jodium zich nog even blauw kleurde. De schim-
mel zelf werd in A op 5 "/q rijstemeel gekweekt.

De eene helft van het filtraat werd in het
buisje F met de zetmeeloplossing even gekookt.
I Iet andere buisje G werd niet gekookt. Na 3
dagen kleurde het gekookte buisje zith met jo-
dium duidelijk blauw, en het ongekookte niet
meer.

Ook heb ik nog onderzocht of het filtreeren
door watten een be[)aalden invloed kon hebben,
dien b.v. het ^ filtreeren door hard of zacht fil-
treerpapier niet zou vertoonen. Met enzym was
in alle gevallen echter even werkzaam.

Voor bakterien en kleine gistcellen is een watte-
prop echter niet een voldoende filter; verschil-
lende proeven toonden aan, wat trouwens reeds
bekend was, dat dergelijke kleine cellen door
natte watten heengaan. Men kan dus alleen een
wattenfilter gebruiken, wanneer zooals in het zoo-

90

even beschreven toestelletje, geen bakterien in
het spel kunnen komen.

De hierboven beschreven methode, om bij het
onderzoek van proteolytische enzymen vermiljoen
te gebruiken, kan ook bij het aseptisch enzym-
onderzoek toegepast worden. Het bleek mij n.1.
dat vermiljoen, hoewel het een kwikverbinding
is, toch geen antiseptische waarde heeft. Op
eenige buisjes vermiljoen-gelatine (zonder thymol),
die ik open had laten staan, groeide n.1. na
eenigen tijd vrij welig Penicillium glaucum. Om
volkomen zekerheid te hebben heb ik, naast elkaar,
Aspergillus niger, Monilia javanica, Cladothrix dicho-
toma en Bacillus megatherium gekweekt op gewone
vleesch-gelatine en op idem vermiljoen. Dc
laatste had ik, om ze eenigszins tc zuiveren,
fijngcwrc\\ \'cn in lo "/() zoutzuur, cn c/^inrn.! flink
,uitgewasschcn. Deze organismen \'groeiden op
beide voedingsbodems even goed.

Wanneer men dc litteratuur over Saprolcgni-
aceeën opslaat, zal men bijna overal de niecning
vinden dat ze voor hun sapropliytischc levenswijze
bij voorkeur dierlijke stoffen verkiezen. Uit bo-
venstaande onderzoekingen betrerfendc dc voe-
dingsphysiologie, vooral b.v. uit het krachtig
versuikcren van zetmeel is het echter gebleken

\' 91

dat substraten van zuiver plantaardigen oorsprong
minstens even gunstig zijn als dierlijke. Het feit
dat Arachis-olie, en dus misschien ook andere
vetten, niet \'worden ópgenomen, pleit ook wel
eenigszins tegen een groote voorliefde voor dier-
lijke substraten. Ik vermoed dat de gewone
methode die altijd gevolgd wordt om materiaal
van Saprolegniaceeën te krijgen, n.1. het werpen
van insecten in een bak met slootwater^), de
oorzaak is van die meening. Dat men juist
dieren heeft gekozen om er deze schimmels zich
op te laten ontwikkelen vindt zijn grond waar-
schijnlijk hierin dat er maar betrekkelijk weinig
schimmels zijn die op dierlijke substraten sapro-
phytisch voorkomen, zoodat er weinig kans be-
staat dat er ook andere, niet gewenschte Fungi
op die dieren zullen ontstaan, die de Saproleg-
niaceeën min of meer zouden kunnen verdringen.

Vele malen had ik geprobeerd het vegetatieve
mycelium van de schimmel, waarmede al de
hierboven beschreven proeven zijn verricht, tot
sporangienvorming te dwingen volgens dc metho-
de van Ki.Kits. Deze bestaat hierin dat men

Zie b.v. Strasuurger. Das botanische Practicum
Dritte umgearbeitete Auflage, pag. 451.

-) Zur Ph^\'siologie der Fortpflanzung einiger Pilze.
Jahrb. für Wiss. Bot. XXXIIl pag. 518.

92

een kuituur aanlegt in een goede voedings-
vloeistof, b.v. envtenwater ; als het mycelium zich
flink ontwikkeld heeft, spoelt men het af in water
en laat het daarin gedurende een uur liggen om
er al de voedings-vloeistof goed uit te trekken.
Daarna wordt het in zuiver water overgebracht,
waarin het na ongeveer 24 uur, ten gevolge van de
plotselinge voedselonttrekking, sporangien vormt,
terwijl later oögonien en antheridiën ontstaan \').

Al mijn pogingen om goede sporangien te
krijgen, mislukten echter; ik kreeg er slechts
met rudimentaire sporen, van kleine gedaante,
enz. Klebs geeft alleen aan dat het mycelium in
zuiver water moet gebracht worden ; ik gebruikte
daartoe altijd leidingwater, en schreef het mis-
lukken van mijn proeven toe aan het feit dat
indertijd misschien de een of andere voedings-
. vloeistof een zóódanig nadeeligen invloed op het
mycelium zou hebben gehad, dat er een aspo-
rogeen ras zou zijn ontstaan. Ik staakte dus
deze proefnemingen, in de meening dat ze toch
nutteloos waren.

Tijdens het afdrukken van dit proefschrift
waagde ik echter nog een laatste kans, en nam
geen leiding-, maar regenwater. Met resultaat

>) I.e. pag. 554 e.v..

93

was, dat ik na ii/, dag de lang begeerde spo-
rangien, normaal gevormd en gevuld met sporen
te zien kreeg. Het leidingwater had dus een
nadeeligen invloed gehad; \'t is natuurlijk best
mogelijk, dat water van andere leidingen de
sporangien-vorming niet zou hebben tegengehou-
den! Een mooie antheridien- en oögonien-vorming
vertoonde het mycelium niet, waarschijnlijk door-
dat het grootste deel van de reservestoffen voor
de sporangien verbruikt waren; volgens Klehs \')
gebeurt dat in deze omstandigheden dikwijls.
De tijd om ze op andere manieren, die Klkhs
aangeeft, te doen ontstaan, ontbrak mij. Ik
moet het nauwkeurig determineeren, waarvoor
men de geslachtelijke organen noodig heeft, dus
tot later uitstellen. Naar hetgeen ik echter reeds
gezien heb, schijnt het mij \'t meest waarschijnlijk,
dat ik heb te doen gehad met Achlya oblongata
de Bary,\' waarbij gladde, peervormige oögonien
voorkomen, terwijl de antheridien niet uit dezelfde
myceliumdraden ontspringen als de oögonien.

Intusschen, al is de soort nog niet bekend,
dit doet niets af aan de waarde van de boven-
staande onderzoekingen. Van alle 9 Achlyasoorten

\') 1- c. pag. 555.

94

toch, die in Rabeniiorst\'s Kryptogamen-Flora
voorkomen, staat aangegeven, dat ze alleen of bij
voorkeur op dierlijke substraten saprophytisch
voorkomen. Biologisch komen ze alle met elkaar
overeen; daarom doet het er betrekkelijk weinig
toe, welke soort voor mijne proeven diende.

1) Hiervan\'Bnd. I, afd. IV: Phycomycetes, bewerkt
door A. Fischer 1892, pag. 346 e. v.

I-IOOFDSTUK V.

Proeven over pleomorphie.

Ecn uiteenzetting van hetgeen over deze be-
langrijke kwestie geschreven is, en een opsom-
ming van dc verschillende waarnemingen die er
mede in verband staan^ zouden zeker dc stof
kunnen leveren van eenige boekdeelen. Ik zal •
in dit korte bestek mij dan ook van ccn uitvoerige
bespreking van dit vraagstuk onthouden,
tc meer daar ik later mijn onderzoekingen op
dit gebied op bt-ecder schaal hoop voort tc zetten.

Men kan bij hoogere planten verschillende
soorten van veranderlijkheid onderscheiden. Er
treden variaties op waarbij dc veranderde vormen
t. o. v. dc ecn of andere eigenschap slechts ccn
ijmiutitaticf verschil toonen met den normalen,
en er komen ook variaties voor waarbij het ver-
.schil met den normalen vorm (jmxUtaticf is. De .
eerste worden in het meesterwerk van de Viues
»Die Mutationsthcorict Jïuctuccrcndcy dc laatste

96

)

sprongvariaties genoemd. De eerste zijn erfelijk
niet constant, de laatste meestal wèl.

En wat zou, nu dit boek algemeen een voor^
werp van studie is, meer voor de hand liggen
dan dat we de terminologie die daarin voorkomt,
ook overnemen, en op de bakterien toepassen!
Toch zou ik voor mij dit thans nog hiet willen
doen, en wel omdat er nog te weinig van die
verschijnselen bij de .bakterien is bestudeerd.
Eén kwestie b.v., of waargenomen veranderingen
langzamerhand dan wel sprongsgewijze ontstonden,
kon niet geheel worden uitgemaakt en wel omdat
men geen methode had om alle opeenvolgende
generatie\'s afzonderlijk te onderzoeken. Den
eersten stap in de richting van dat onderzoek
heeft Beijerinck al gedaan in zijn belangwekkende
studie »Over verschillende vormen van erfelijke
variatie bij mikroben« Maar de laatste en
beslissende stap zal pas gedaan zijn\'als de ver-
anderingen niet alleen aan subvariantcn -), die
toch nog altijd verscheidene generatie\'s van el-
kander verwijderd zijn, kunnen worden nagegaan,
maar aan alle opeenvolgende generaties. Zooals

Kon. Akad. van Wetenschappen. Verg. van 27
Oct. 1900.

^ Zie bovengenoemde verhandeling.

97

ik al in de inleiding zeide, meen ik dat mijn
methode van bakterien-isolatie daar waarschijnlijk
den weg toe zal kunnen banen.

Hoe het zij, ik geloof dat een bepaalde ter-
minologie voor de verschijnselen van verander-
lijkheid bij de bakterien, die in overeenstemming
is met die der hoogere planten, nog niet moet
worden vastgesteld vóór er wat dieper in deze
kwestie is doorgedrongen.

Ik heb mij daarom voorshands nog tevreden
gesteld met de klassieke benaming „pleomorphie"
als titel boven dit hoofdstuk te plaatsen. Men
moet het dus opvatten als een collectief begrip,
waaronder alle soorten van variaties der bakterien
vallen.

Als grondlegger van de leer der pleomorphie
moet Nac.KLi beschouwd worden. I lij vond bij de
meest verschillende ontledingsprocessen bakterien
van denzelfden vorm, en omgekeerd bij een en
hetzelfde rottingsproces baktcrien van de meest
uiteenloopende gedaante. I^it was voor hem een
van dc gewichtigste argumenten waarop hij zijn
leer grondvestte, dat alle baktcrien zouden zijn
opgebouwd uit één of meer kleine bolvormige cel-
len ; uit de verschillende rang.schikking zouden dan
gedurig staafvormige, gekromde, spiraalsgewijs-

98

gedraaide en draadvormige organismen ontstaan.
Na NäGELi waren het o.a. Billroth, Cienkowski,
Büchner, Zopf en Metschnikoff die de leer der
pleomorphie, zij het ook in verschillende vormen,
verkondigden. De meeste van hun onderzoe-
kingen zijn echter gedaan met onzuivere kuituren;
daaraan is het bv. toe te schrijven dat Zopf
meende bij Cladothrix dichotoma uit de lange
draadvormige bakterien Spirillen te zien ontstaan.
Ook andere onderzoekingen uit den lateren tijd
waarbij bakterien uit schimmels zouden ontstaan,
bleken naderhand geheel waardeloos te zijn, om-
dat het uitkwam dat ze niet met reinkulturen
waren gedaan. Op het oogenblik is er dan ook
geen enkele reden om dergelijke geweldige over-
gangen voor mogelijk te houden. Terecht zegt
daarom Migula als hij het over soorten heeft
die in reinkultuur zijn gekweekt, met het oog op
de proeven van Zopf: ,,Gerade bei diesen arten
ist aber eine so weitgehende Vielgestaltigkeit

niemals beobachtet worden----

Maar tusschen pleomorphie in dezen zin en
een absoluut constant zijn van den vorm bestaat
een groot verschil. Talloos zijn de onderzoe-
kingen, gedaan door ernstige en bekwame waar-

1) W. Migula System der Bakterien. Bnd 1 pag. 221.

99

nemers met behulp van reinkulturen, waarbij de
vormen van de bakterien in engeren zin wèl in
elkaar overgingen. Men heeft kokken zien ver-
anderen in staafjes, staafjes in vibrionen, deze
weer in kokken enz., en dat onder veranderde
omstandigheden die niet zóó abnormaal waren
of ze konden in de natuur óók wel voorkomen.
Wat moet men van die onderzoekingen denken}
Veel onderzoekers nemen ze voor waar aan, maar
schrikken terug voor een consekwente toepassing
van die resultaten, die hierin moet bestaan, dat
men de geheele indeeling van de bakteriën in
kokken, staafjes, enz. laat varen. Maar daarmede
zou een groot deel van het gebouw der bak-
teriologie staan of vallen.

lien gevolg is dat men in de meeste hand-
boeken een zekere onbeslistheid aangaande deze
kwesties aantreft. Men is bang ze aan tc grij-
pen, praat cr wat omheen en komt tot dc con-
clusie dat de waarheid wel zoowat in het midden
zal liggen. Maar met die machtspreuk komt men
niets verder.

Toch zijn cr enkele onderzoekers die be.slist
durven zeggen wat ze van dc zaak gelooven, cn
die in .scherp omlijnde trekken aangeven injioc-
verre zc de pleomorphie aannemen of verwerpen.

lOÓ

Tot hen behooren o.a. Migula en Duclaux.
De eerste, een tegenstander van pleomorphie,
erkent b.v. ten opzichte van Microspira Commai)
dat deze kan voorkomen als echte, typische komma-,
vormen, die ongeveer 3 maal zoo lang zijn als
breed, en een duidelijke kromming vertoonen;
verder in kortere afmetingen, waarbij de kromming
sterker of zwakker kan zijn, en eindelijk als zeer
lange vormen, 6—8 maal zoo lang als dik\', met
een zeer sterke of nauwelijks merkbare bocht.
Mij neemt dus aan, zooals ieder bakterioloog
dat tegenwoordig wel doet, dat de grootte van
de cellen kan veranderen, en ook dat de vorm
kan verschillen, maar het laatste toch binnen
zekere grenzen die door het karakter van de
soort bepaald zijn. Die grenzen trekt hij met
beslistheid als hij zegt: »In dessen so verschieden-
artig auch die einzelnen Formen einer Art sein
mögen, sie halten sich dennoch immer innerhalb
der Grenzen, welche ihnen durch den Charakter
der Gatting gezogen sind ; niemals wird aus einer
Microspira ein Spirillum oder ein Baiillus.^

Een tegenovergesteld standpunt wordt met
evenveel beslistheid door Duclaux ingenomen.
Na verschillende onderzoekingen te hebben aan-

_r__

>1) 1. c. pag. 234.

lOI

gehaald waarbij de vormen der bakterien op
allerlei wijze in elkander overgaan, zegt hij^);
>une classification est impossible à faire; il est
impossible de trouver pour chaque microbe 2in
petit nombre dc propriétés assez nettes et assez con-
stantes pour pouvoir assurer sa diagnose.« Onder
„soort" verstaat daarom Duclàu.x een bacil van
typischen vorm mèt al de afwijkende bacillen
die langs e.xperimenteelen weg uit die bacil kun-
nen verkregen worden. , •

Bij eene methodische bestudeering van het
vraagstuk van de pleomorphie zal er echter altijd
wel één moeilijkheid blijven die niet geheel voor
oplossing vatbaar is. \'t Is deze : welke van de
veranderde omstandigheden, waaronder men de
vorm der bakterien ziet varieeren, zijn abnormaal,
d.w.z. zóó dat ze in de natuur niet voorkomen,
en welke zijn normaal. Sommige schrijvers b.v.
\'willen volstrekt niet ontkennen dat één bakterie
in den vorm van staalje, vibrio en coccus kan
voorkomen, indien men de kuituur maar aan
abnormale omstandigheden blootstelt. Maci\'-) zegt,
sprekende over de Proteus van Haushk: »mais

O Duclaux. Traité de microbiologie 1898. Tome
I pag. 260.

-) Traité praticjue de Bacteriologie 3""® éd. 1897,
pag. 329.

8

102

pour obtenir des variations de formes, il» faut
placer la Bactérie dans des conditions défavorables,
en particulier la faire vivre dans un milieu acide. «
En later: >ces modifications ne se produisent que
dans des conditions déterminées«, waaronder hij
dan ook weer abnormale verstaat.

\'t Is waar dat veel gevallen van pleomorphie,
die bekend zijn geworden, juist het gevolg waren
van abnormale levensvoorwaarden. Guignard en
ciiarrin kregen uit Bac. pyocyaneus lange en
korte staafjes en Spirillen, door antiseptische
stoffen in de bouillon te doen. Sciioitelius
kweekte Bac. prodigiosus op bouillon met wijn-
steenzuur, en kreeg lange bacillen. Wasserzug
kreeg gelijke resultaten door de bouillon gedu-
rende 5 min. op 50° te houden. In al die ge-
vallen konden de onderzoekers de oorspronkelijke
•vormen weer terugkrijgen, als ze de bakterien ook
weer in hun oorspronkelijke omgeving brachten.
Wanneer zij daarmede te lang wachtten, bleken
de veranderingen blijvend tc zijn geworden.

Andere onderzoekingen echter, te veel om op

\') Sur les variations morphologiques des microbes.
Comptes rendus de l\'Académie des Sciences. 5 Dec.
1887.\'

2) Kölliker\'s Festschrift. Leipzig 1887.

•■\') Annales de l\'Institut Pasteur II en III.

103

» ^

te noemen, zijn er gedaan waarbij veranderin-
gen optraden onder gewijzigde omstandigheden,
die men niet anders dan door een blind voor-
oordeel abnormaal zou kunnen noemen. In zulke
gevallen nemen de vurige tegenstanders van
de veranderlijkheid hun toevlucht tot een ander
wapen. De onderzoekers zijn dan bij hun ver-
meende reinkultuur niet van één cel uitgegaan,
óf de kuituur is later door luchtinfectie veront-
reinigd.

Het is niet te loochenen dat beide gevallen,
waarover ik hier een enkel woord wil zeggen,
kunnen voorkomen. Ik zal bij de proeven van
Pasteur, Miquel en Hesse, die hebben aange-
toond dat de kans voor luchtinfectie uiterst ge-
ring is, niet uitweiden, daar ze algemeen bekend
zijn. Als men verder onder de noodige voor-
zorgen werkt, en de proeven waar het op aan-
komt, (zooals de hiervolgende betreffende pleo-
morphie) niet maar ééns doet, doch gelijktijdig
in vcrschillcndc scncn en als men ze daarna nog
eens herhaalt, dan is men er zeker van dat lucht-
infectie geen aanleiding tot vergissingen kan heb-
ben gegeven.

Het andere genoemde bezwaar, dat men bij
de reinkultuur, verkregen volgens de Kocii\'sciie

104

methode niet van één cel is uitgegaan, acht ik
van grooter beteekenis.

Van verschillende kanten is aangetoond, dat de
plaatkultuur-methode, wanneer men slechts ééns een
plaat uitgiet en uit de daarin ontstane kolonies kui-
turen aanlegt, niet te vertrouwen is. Holm heeft
haar voor gistcellen gecontroleerd. Hij deed 23
proeven ; slechts in één geval bleek het dat de 100
kolonie\'s uit 100 cellen ontstaan waren, terwijl bij
de andere gemiddeld 100 kolonies uit 108 cellen
waren gevormd. In het ongunstigste geval vond hij
zelfs dat 100 kolonies uit 135 cellen waren ontstaan.

Miquel -) heeft een dergelijk onderzoek voor
bakterien gedaan. Van een plaatkultuur werd
uit 100 kolonies in 100 kolven met bouillon
geënt. Het onderzoek van de kolven toonde
134 verschillende soorten mikro-organismen. De
f fout schuilt hierin, dat door schudden niet altijd
de cellen goed van elkaar gescheiden worden.

Nu is het een feit dat veel onderzoekers de
gewoonte hebben om slechts éénmaal een plaat

1) Uber die Methoden der Reinkultur und im
besonderen über die Plattenkultur von Koch und
über die Fehlergrenze dieser Methode. Zeitschr. f.
d. ges. Brauwesen. Pag. 458 e.v. München 1891.

2) Dixième memoire sur lès poussières organisées
de l\'air et des eaux. Ann. de Montsouris 1888.

IÓ5

uit te gieten en daaruit (natuurlijk als de kolonies
niet te dicht op elkaar zitten) terstond hun kui-
turen aan te leggen, \'t Is daarom in \'t algemeen
een volkomen gemotiveerde tegenwerping wanneer
de bestrijders van de leer der pleomorphie het
optreden van veranderde vormen toeschrijven
juist aan de onbetrouwbaarheid van de plaatkul-
tuurmethode. Maar ik betwijfel of alle onder-
zoekers Kocii\'s methode zoo toepassen, en of
daarom dit verwijt in alle gevallen mag gelden.
Velen zullen ongetwijfeld niet uit de eerst ont-
stane kolonies direct hun kuituren hebben aan-
gelegd, maar uit die kolonies eerst nogmaals een
plaat hebben gegoten, en dit eenige malen her-
haald hebben vóór zij hun eigenlijke proeven deden.
Iin veranderlijkheid, gevonden bij zulke proeven,
mag niet zoo maar geloochend worden. Ik voor mij
geloof nl. dat, onder die voorzorgen, de methode
van Kocii in vertrouwbaarheid veel heeft gewon-
nen. En ongetwijfeld is dit ook de bedoeling

1) Dit geldt natuurlijk alleen, als men te doen heeft
met kleine cellen, waarop niet licht andere gaan
vastzitten. Voor groote cellen, die uit een sterk
verontreinigd medium komen, en die dikwijls bezet
zijn met bakterien, blijft (zooals ik al in de inleiding
zeide) het bezwaar bestaan dat ze door schudden
niet geïsoleerd kunnen worden, zelfs als men de
plaatkultuur-methode meerdere malen toepast.

io6

geweest van den uitvinder, wiens methode niet
in waarde mag verliezen, omdat anderen haar
op verkeerde wijze toepassen.

Maar absohite betrouwbaarheid kan ze niet
geven. Jörgensen zegt daarom ook: „Wenn
man auch die Plattenkulturen mehreremale wieder-
holt, so weiss man doch in Wirklichkeit nie, ob
das Ziel erreicht ist oder nicht." Daarom heeft
Hansen -) de methode van Koch in dien zin ge-
wijzigd voor gistcellen, dat hij op een groot
dekglas een gelatineplaat uitgiet die zóó dun is,
dat men onder het mikroskoop kan controleeren
of de cellen gescheiden zijn, en waar ze liggen.
Die plaatsen worden aangeduid, en men kan de
ontwikkeling van de kolonies van het eerste
begin af nagaan. Voor bakterien is dit principe
ijatuurlijk niet door te voeren, daar men ze niet
in een gelatine-laag, hoe dun die ook is, kan zien
liggen en nog minder ze kan onderscheiden van
kleine vaste bestanddeelen die er altijd in ont-
zettende massa in voorkomen. \'

Ik meen daarom dat mijn isolatie-methode
noodig is voor een beslissend onderzoek over de

Die Mikro-organismen der GUrungsindustrie.
Berljn. Paul Parey. 1898 pag 37.
-) Ibid. pag 35 (zie aldaar ook litteratuur.)

io7

veranclcrlijkheidsverschijnselcn bij bakteriën, en
wel allereerst omdat nien er hierbij zeker van is
dat het uitgangspunt van de kuituur één cel is,
vervolgens omdat men de variatie al bij de eerste
cellen van de kolonie kan controleeren en niet
het minst omdat ze den weg kan banen tot een
vergelijkend onderzoek van alle opeenvolgende
generaties.

De proeven die ik heb genomen zijn minder
dan men na deze lange inleiding zou verwachten.
De reden hiervan is, dat ik gedwongen werd ze
af te breken. Wat ik echter heb gevonden, acht
ik niet te onbelangrijTc om hier mede te deelen.

Dr. Kohlrrl\'gc.e \'), privaatdocent in de klima-
tologie en tropische ziekten aan dc Universiteit
alhier, had voor een onderzoek van faeces gela-
tine-platen aangelegd, en uit de kolonies in bui.sjes
met vleesch-gelatine over^eënt. Na eenigen tijd
vond hij in 2 buisjes een mengsel van staafjes
en vibrionen, en omdat hij toch met een onder-
zoek over vibrionen bezig was, wilde hij deze
laatste isoleeren. Hij goot ten tweeden male een
plaat, ditmaal van vleesch-agar. Van de ontstane
kolonies vertoonde er echter geen enkele vibrionen.

\') Symbiose zweier pleomorpher Faeces-Bakleriën.
Arch, für path. Anat. 13d. 163. Hft. 3.

io8

maar alle bestonden uit korte staafjes. Hij entte
over in buisjes met glycerine-gelatine en \'t re-
sultaat was weer: alleen zeer korte staafjes. Na
eenigen tijd echter, toen deze buisjes vervloeid
waren, onderzocht hij ze nogmaals," cn — toen
kwamen er naast de staaQes weer vibrionen voor.
Hij goot toen uit die vervloeide buisjes nogmaals
een agarplaat, en \'t gevolg was dat hij weer niets
dan korte staaijes vond. Uit dezelfde buisjes goot
hij ook een gelatine-plaat en entte hij een steck-
kultuur in vleesch-gelatine. In \'t begin trof hij
niets dan korte staafjes aan, en later, als de gelatine
vervloeid was, naast dc staafjes ook vibrionen.

Op gcenerlei wijze kon hij echter een reinkul-
tuur van vibrionen krijgen; wèl van staafjes, als
hij n.1. een kuituur in bouillon, waarin beide
voorkwamen, bij 37" zette. Daarin schenen dc
vibrionen af te sterven, terwijl dc staafjes over-
bleven.

De heer Kohlurl\'ggk deelde mij eindelijk,
nadat alle >j30gingcn om dc zaak op tc lossen,
waren mislukt, het raadselachtige geval mede,
cn verzocht mij of ik niet eens ccn vibrio uit
een vervloeide kuituur voor hem zou willen
isoleeren. . *

Ik isoleerde er eenige; dc kultuurdruppels be-

109

stonden uit vleesch-gelatine. De dekglaasje3 waar-
op geïsoleerd was, werden gelegd op vochtige\'
kamers, waarin ik, op den bodem, nog een drup-
peltje water bracht. Den volgenden dag, \'s mor-
gens, waren de kolonies al opgekomen en konden
wij met de sterkste vergrooting het krioelen
van de vibrionen prachtig zien. Den daaropvol-
genden dag. waren de kolonies sterk in grootte
toegenomen; ze besloegen ongeveer Vi van de
grootte van den kultuurdruppel. In alle zagen
wij sterk bewegelijke vibrionen. Wij maakten er
ook gekleurde praeparaten van, en zagen er
niets dan vibrionen in. Daarna werd uit de ko-
lonies geënt in 3 verschillende voedingsbodems,
n.1. gewone vleesch-gelatine, id. die 10 x verdund,
en dus vloeibaar was en pepton-water (i o/g pepton).

Na twee dagen maakten wc gekleurde pracpa-
ten van deze kuituren. In dc kuituren op ge-
wone gelatine waren naast de vibrionen, ook
staafjes te zien, van beide ongeveer evenveel.
De kuituren in dc vloeibare vocdin^bodcms ver-
toonden bijna alleen vibrionen.

Ook isoleerde ik 2 vibrionen in vleeschgclatine
en legde ik het dekglaasje op een vochtige ka-
mer waarin ik geen waterdruppel op den bodem
bracht. De oppervlakte van dc kuituurdruppels

I lO

was hier dus droog. In verband daarmede was
er ook een verschil te zien in gedaante van de
bakterien uit de kolonies. Terwijl in de vorige
kolonies, die waren opgekomen in een met wa-
terdamp verzadigde ruimte, alle bakterien na
eenige dagen nog als sterk bewegelijke vibrionen
dooreen krioelden in het condensatie-water dat
op de kultuurdruppels was neergeslagen, ontston-
den hier uit de geïsoleerde vibrio reeds in het
begin dikke vibrionen, die onbeweeglijk waren
(waarschijnlijk omdat ze volkomen droog lagen)
terwijl een onderzoek van de kolonies, toen ze
3 dagen oud waren, naast de dikke vibrionen,
reeds staafjes te zjen gaf.

Alles resumeerende bleek dus in alle geval
met volkotnai zekerheid uit deze proeven, dat
\'cm vibrio staafjes kan voortbrengen. Wat de om-
standigheden, waaronder dit plaats grijpt, betreft,
was het zeer waarschijnlijk dat de physische na-
tuur van den voedingsbodem hierbij een groote
rol speelt, en wel in dien zin, dat op een vasten
voedingsbodem .staaljes, op een vloeibaren vibrionen
ontstaan. JVaaroni in vloeibare voedingsbodems
in het begin nog enkele staafjes naast de vibrionen
voorkomen, zou ik niet durven zeggen. Bij
cholera-kulturen is dit echter ook een gewoon

111

verschijnsel. Uit de kuituren met vibrionen kan
men weer de staafjes terugkrijgen, door op vaste
voedingsbodems te enten, en uit de kuituren met
staafjes de vibrionen, door ze in vloeibare media
over te brengen. We hebben hier dus een ver-
schijnsel van een niet-erfelijke variatie. Het ge-
val vormt een pendant van hetgeen Bonnier
bij hoogere planten naging. Deze onderzoeker
plaatste planten uit de vlakte op de bergen, zag
daar veranderingen optreden, bracht ze daarna
weer op de vlakte, en vond dat ze hun vorige
gedaante weer aannemen.

Ik besloot later, hoewel deze proeven wel aan-
spraak konden maken op nauwkeurigheid, daar
ze niet met één, maar met meerdere geïsoleerde
vibrionen gedaan waren, deze kwestie nog eens
na te gaan. Speciaal wilde ik nog eens zien
binnen hoeveel tijd men uit een vibrio een staafje,
cn uit ecn staafje weer een vibrio kon maken.

Ik isoleerde 4 vibrionen in kuituurdruppels van
vlcesch-gclatine. Twee cr van liet ik zich ont-
wikkelen in ccn vochtige kamer zonder water op
den bodem, dc andere mèt ccn waterdruppel.
Na 2 dagen controleerde ik dc kolonies. Dc

\') Recherches expérimentales sur Tan atomic des
végétaux. Impr. typogra])hiciue. Corbeil (S. et O.) 1S96.

112

eerste bestonden uit diklce, onbewegelijke, de
laatste uit dunnere, sterk bewegelijke vibrionen.
Ik entte van de kolonies over op vleesch-agar,
uit iedere kolonie in één buisje. Na 2 dagen bleek
het, zoowel uit onderzoek van de levende cellen
als uit gekleurde praeparaten, dat in alle buisjes
niets dan zeer kleine bewegelijke staafjes (hoogstens
I [z lang) voorkwamen, sommige zóó kort, dat
het bijna kokken waren. Van uit ieder dezer
agar-buisjes entte ik over in bouillon, bouillon-
gelatine en 10 X verdunde bouillon-gelatine. Na
twee dagen bleken alle vloeibare voedingsbodems
niets dan groote, sterk bewegelijke en sterk ge-
kromde vibrionen te bevatten, terwijl op de vleesch-
gelatine alleen kleine, bewegelijke staafjes voor-
kwamen. Binnen 6 dagen was dus de overgang
van vibrio tot, staafje en van staafje weer terug
tot vibrio afgeloopen.

Nog een enkel woord wil ik hieraan toevoe-
gen naar aanleiding van een opmerking die de
heer Koiiluruggk in de hierboven genoemde ver-
handeling maakt \'). Hij zegt daarin dat het
staafje uit het mengsel van de vibrionen en staaf-

1) l-.c. pag. 375.

113

jes, dat ik óók voor hem isoleerde, na de isolatie
de gelatine. niet meer deed vervloeien, en daar-
voor wèl. Dit was volkomen waar. De reden
van dit verschijnsel en ook nog van een ander,
dat n.1. geïsoleerde bakterien soms niet op kwa-
men, kon zooals mij later bleek, tweeërlei geweest
zijn. Ik gebruikte in het begin voor het isoleeren
dikwijls glaasjes die op het oog volkomen schoon
waren, maar toch (waarschijnlijk door een voor-
afgaand verblijf in chloroform, die onder inwer-
king van het licht ondeed werd) een schadelijken
invloed konden uitoefenen op de bakterien. Later
koos ik met zorg mijn dekglaasjes uit, en nam
ik bij voorkeur nieuwe. Een andere reden was
dat ik bij het steriliseeren der naalden deze soms
dieper in het zwavelzuur stak dan in de ammonia.
Daardoor diffundeerde het overtollige zuur naar de
punt van de naald, ten nadeele natuurlijk van de
geïsoleerde bakterien. Toen ik, onder vermijding
van deze fouten, het staafje nogmaals isoleerde,
bleek zijn vervloeiingsvermogen na de isolatie
even sterk te zijn. Van een niet-opkomen der
kolonies had ik toen ook geen last meer.

HOOFDSTUK VI.

Conclusies.

I. De methode en haar toepassingen.

I. De nieuwe methode voor liet maken van
reinkulturen komt in \'t kort hierop neer dat
onder het microscoop, zoo noodig met de sterkste
vergrooting, met behulp van fijne glazen naalden
één cel uit een druppel met verschillende mikro-
organismen wordt geïsoleerd, en overgebracht in
een steriele druppel, waarin .zij zich tot een rein-
kultuur vermenigvuldigt.

. 2. Het nadeel van de methode (indien ik dit een
nadeel mag noemen) bestaat hierin dat zij aan
hen die haar gebruiken hoogere eischen stelt
dan die van Kocii. Ik vermoed daarom dat zij
voor beslist onhandige personen altijd min of
meer een struikelblok zal blijven. Ook vordert
zij wel wat meer tijd.

3. Het algemeene voordeel bestaat hierin dat
men volkomen zekerheid heeft dat de reinkiiltuur
in kwestie uit niet meer dan één cel is ontstaan,

115

en verder dat men de cel die men wil isolee-
ren, kan uitkiezen en na de isolatie nauwkeurig
kan controleèren wat er met die cel gebeurt.
De ontwikkeling van de reinkultuur kan men
dan ook van het allereerste begin af met sterke
vergrooting nagaan, vooral als de voedingsbodem
vast is.

Dit zijn voordeden die de methode van Kocii
niet aanbiedt, daar zij nooit volkomen zekerheid
kan geven dat alle kolonies uit één cel zijn
ontstaan; daar het verder, als men een plaat
uitgiet, altijd onbekend voor ons blijft welke
cellen er sterven, welke zich verder ontwikkelen,
en wat er in het begin met deze laatste gebeurt\');
en eindelijk omdat men bij een plaatkuituur
nooit de geschiedenis van de kolonies met de
j/trrX\'j/t\' vergrooting kan controleeren.

4. Men kan met deze methode (behalve
natuurlijk alle reinkulturen die men door middel
van de plaatkultuur-methode óók kan maken)
reinkulturen maken uit cellen die meestal door
bakterien zijn verontreinigd.

1) Er kunnen zich dan ook bij het gieten van
plaatkulturen dikwijls zeer raadselachtige gevallen
voordoen, waarbij Kocii\'s methode, zelfs bij herhaalde
toepassing, ons in den steek laat (c.f. in hoofdstuk V
de vibrionen van Kohldrugge.)

ii6

5. De methode kan dienen voor een beslissend
onderzoek van alle mogelijke kwesties betreffende
pleomorphie. Men gaat hier n.1. van één cel uit,
en kan terstond zien welke de vorm is van de
cellen die er uit ontstaan. Ik betwijfel niet of
men zal ook alle opéénvolgende generaties kun-
nen onderzoeken.

Zijn bovengenoemde toepassingen speciaal voor
het maken van reinkulturen, er zijn echter nog
andere. Men zal met behulp van deze methode
allerlei mikröorganismen met elkander in aanra-
king kunnen brengen of aan verschillende om-
standigheden blootstellen. Men zal er dus b.v.

6. de kwestie van de copulatie mede kunnen
onderzoeken. Kr zijn bij dierlijke en plantaardige
organismen veel gevallen waarin men niet weet
of\' men met copulatie te doen heeft. Dit is
natuurlijk haast niet uit te maken wanneer zulke
cellen, die dikwijls bewegelijk zijn, zich in groote
druppels bevinden tegelijk met andere organis-
men. Thans is men in staat om, op één dekglas,
in verscheidene kleine druppeltjes twee cellen te
zamen te brengen, cn kan men dus veel gemak-
kelijker nagaan of er copulatie plaats grijpt. Kon
men dit vroeger alleen bij toeval zien, thans heeft
men een zekere methode.

117

7- Men zal onder het mikroskoop verschil-
lende experimenten over symbiose en parasitisme
van lagere organismen kunnen doen, en deze
van den aanvang af kunnen controleeren.

8. Ten slotte wil ik er nog op wijzen dat
voor zuiver technis.che doeleinden het isolatie-
toestel nuttig kan wezen. Het sorteeren van zeer
fijn plankton-materiaal en het maken van duur-
zame praeparaten daarvan, (vooral van afzonder-
lijke organen) zal er gemakkelijker en met meer
dere juistheid mede kunnen geschieden dan onder
de loupe of het praepareermikroskoop uit de
vrije hand. I let onderzoek of het teekenen van
levende mikroörganismen, die sterk bewegelijk
zijn (b.v. Infusorien, zwermsporen) is dikwijls niet
mogelijk, daar zij gedurig buiten het gezichtsveld
, van het mikroskoop verdwijnen. Met behulp van
het isolatie-toestel kan men ze echter in een
klein druppeltje isoleeren, desnoods zóó klein,
dat ze er juist in passen, en dus niet kunnen
ronddraaien.

II. De methode toegepast op de reinkultuur van
een saprophytischen schimmel.

I. Met behulp van deze methode is geïso-
leerd een zwermspore van Achlya .sp. I Iet

ï I.

mycelium werd gekweekt op meelworm-voedings-
bodems, glucose-pepton, eiwit en rijst. In al
deze bleef het vegetatief.

2. . Sporangien werden verkregen door plotse-
linge voedselonttrekking.

Omdat er weinig bekend ,was over de voedings-
physiologie van schimmels die op dieren sapro-
phytisch leven, is er over deze kwestie een en
ander onderzocht.

3. .Het beste N-voedsel was, wanneer glucose
als C-voedsel diende, pepton. Veel minder goed
was amm. sulfaat, en dan kwamen in afnemende
volgorde: asparagine, ureum, kal. nitraat en natr.
nitriet. Het laatste werkte als vergift.

4. Wanneer amm. sulfaat als N-voedsel werd
gegeven, was het beste C-voedsel aardappelmeel,
cn dan kwamen in afnemende volgorde: maltose,
melksuiker, glucose, laevulose-stroop en saccharose.
Cellulose, kal. citraat cn kal. tartraat werden niet
opgenomen. Natr. bcnzöaat, natr. butyraat en
kal. acetaat werkten als vergift!

5. Pepton is zoowel C- als N-voedsel.

6. Vetten worden als C-bron niet opgenomen.

7. Dc schimmel kan ook anaëroob gekweekt
worden. Daarbij wordt er alkohol gcvorm\'d.-

8\' Onder sommige omstandigheden ontstaan

119

er zuren (b.v. bij voeding met glucose-i^eptort,
en dan vermoedelijk uit de glucose).

9. De schimmel zet amylum om in dextrine,
en daarna in d-glucose. Dit geschiedt door een
amylolytisch enzym.

i o. Verder scheidt de schimmel nog een pro-
teolytisch enzym af, dat o.a. de gelatine vloeibaar
maakt. Dit werkt in alkalische en in zure op-
lossingen (is dus tryptisch).

11. Een vetsplitsend enzym wordt niet afge-
scheiden.

III. De methode toegepast voor het onderzoek
van het vraagstuk der pleomorphie.

i Met volkomen zekerheid is het bewezen
dat een vibrio in een staafje en een staafje in
een vibrio kan veranderen.

2. De bacil die voor deze proeven diende,
vertoonde den vorm van een groote vibrio op een
gewonen vloeibaren voedingsbodem en den vorm
van een kort staafje op denzelfden voedingsbo-
dem wanneer die met gelatine was vast gemaakt.

3. De overgang van vibrio tot staafje en van
staafje weer tot vibrio kan binnen 6 dagen af-
loopen.

Ï2Ó

ÏV. Aanhangsel, bevattende een gewijzigde en
een nieuwe methode voor enzym-onderzoek.

1. De bekende methode voor het onderzoek
van proteolytische enzymen werd zóó gewijzigd
dat het enzym niet alleen inwerkt op een dikke
laag gelatine op den bodem van een reageer-
buisje, maar óók op een zeer dunne laag tegen
den wand, waarvan men het oplossen (óók door-"
dat de laag met vermiljoen is roodgekleurd) zeer
spoedig kan zien.

2. Er werd geëxperimenteerd met een nieuw
toestel dat in staat stelt dc enzymen van schim-
mels te onderzoeken, zonder den nadecligen in-
vloed van antiseptica of van een bakteriënfilter.
In dit apparaat wordt dc schimmel rein gekweekt
en daarna wordt de kuituur, tcnuijl het toestel
gesloten blijft, gefiltreerd door een wattcprop,
waarna men de kultuurvloeistof en het mycelium
(het laatste na fijnwrijving) op hun enzym kan
onderzoeken.

121

PLAAT I.

Fig. i. Schematische voorstelling van het isolatie-
toestel, op doorsnede (pag. lo—13).
» 2. id. van het toestel waarmede uit den iiultuur-
druppel in voedingsbodems wordt geënt,
(pag. 53)-

3. Platina-draad, waaruit een dito-mesje wordt
vervaardigd, (pag. 66).
» 4. Isoleer-deliglaasje met materiaal- en kultuur-
druppels. (pag. 40).
» 5. Materiaal- en kultuurdruppel, bij zwakke
vergr. (pag. 42).

> 6—8. Het isoleeren van een bakterie uit den

materiaaldruppel, bij sterke vergr. (pag. 42/43).
» 9—ii. Het overvoeren van een bakterie, op

doorsnede, (pag. 43—46).
» 12—14. De 3 soorten van isoleernaalden,
(pag. 15/16).

» 15—17 en 19—21. Isoleernaalden, in bewerking,
(pag. 17-24X

PLAAT IL

Fig. 18. Schematische voorstelling van het toestel
waarmede de isoleernaaklen worden ver-
vaardigd. (pag. 21—23).

> 22—33 en 35—39. Isoleernaalden in bewerking

onder het mikroskoop van bovengenoemd
toestel, (pag. 24—32).

> 34. Onbruikbare dikke, oogvormige isoleer-

naald. (pag. 31).

> 40. Wig voor het afknappen der dikke naal-

den. (pag. 33).

> 41. Apparaat voor aseptisch enzym-onderzoek

van schimmels, (pag. 86—88).

STELLINGEN.

I.

Het is wetenschappelijlc onjuist twee geslachten
Bacillus en Vibrio te onderscheiden.

• II.

Er bestaat geen betrouwbare methode voor
het onderzoek van bakteriën-enzymen.

III.

Het is wenschelijk dat het woord »ferment«
vervalle.

IV.

I

Er bestaat geen enkele reden om met Beijekinck
aan te nemen dat heterogene celdeeling minder
waarschijnlijk is door »epigenesis" dan door
»evolutie". (Zie: Beijerinck. Over verschillende
vormen van erfelijke variatie bij mikroben. Kon.
Akad. van Wetensch. 27 Oct. 1900 pag. 320.)

V.

Het verdient geen aanbeveling een verschil te
maken tusschen rotatie en circulatie.

VI.

De imbibitie-theorie van Sachs msig niet gc/tcc/
worden verworpen.

VII.

De methode volgens welke tegenwoordig bij
bakteriën bijna algemeen de diagnose van een

123

sool-t gesteld wordt, is niet alleen in de meêsté
gevallen waardeloos, maar ook nadeelig voor den
vooruitgang der bakteriologie.

VIII.

Het moet nog bewezen worden dat de nitri-
fikatie-bakteriën niet in staat zijn organische N-
houdende verbindingen als voedsel tc gebruiken.

IX.

De gewone verklaring van het discontinu steri-
liseeren, als zouden de 2" en 3® verhitting dienen
om de bakteriën tc dooden welke zich ontwik-
keld hebben uit sporen die bij dc i® cn 2\' ver-
hitting blijven leven, is onjuist.

X.

De uitwerking van het gistsap van Buciinkr
berust op de aanwezigheid van ecn enzym, niet
van levende protoplasmadceltjes.

XI.

Het is wenschelijk dat dc naam „endothe-
lium" vcrvallc.

XII.

Dc waarde van den ductus pneumaticus als
systematisch kenmerk dient nog eens uitvoerig
onderzocht te worden.

XIII.

Ten onrechte zegt O. Hkrtwig (Die Zelle und
die\'Gewebe. Bnd. II pag. 64 1898): „Bei allen
einzelligen Lebewesen ist erbgleiche Theilung ihres

124

Zellenorganismus die einzige die vorkommt und
vorkommen kann." •

XIV.

Het verdient aanbeveling, om met Kleinenberg
(Zeitschr. für Wiss. Zoöl. 1886) geen middelste
kiemblad te onderscheiden.

XV.

Huwelijken tusschen bloedverwanten zijn slechts
zelden af te keuren.

XVI.

De verklaring die Holleman (Leerboek der
org. Chemie. 1896 pag. 412) geeft van de waar-
den der dissociatieconstanten van de 3 mono-
chloorbenzoëzuren, is onjuist.

XVII.

Het is (althans in de Philosophische faculteit)
wenschelijk, dat er vóór het eerste c.xamen ge-
regelde responsie-colleges worden gegeven.

XVIII.

Bij het candidaats-examen in de Plant- en
Dierkunde worde geen Wiskunde geëischt.

XIX.

% •

Voor a. s. natuurphilosophen cn medici moeten
op het eind-examen van het gymnasium Grieksch
cn Latijn als examen-vakken worden vervangen
door Natuurlijke Historie, Natuur- cn Scheikunde.

PUai I

Trut fi^. I-ITM. 19-11

/j".

CZI3 E

■ --

(-^ C

LQ.

CZ=3\' C

iSCAn

II.

H

{c^. 18 en 21- <-1

■ ■

»

M

■ît -■■ ■\'

7 U\'.

•.V

V : ■ \'v •: ;■

tfM\'-\'"

1-; v^

• ■v- -

■I ■ . ■.

\'fi

S\' ,V\'■\'..<••/•• -\'f. ■

• ■•t\'V\'rV

I

few

"73

ïv

Sjs^iy*\'- •