aan de rijks-universiteit te utrecht
na machtiging van den rector magni-
ficus ü". W. H Julius, hoogleer,\\ar in

de faculteit der wis- en natuurkunde
volgens besluit van den senaat der
universiteit tegen de bedenkingen van
de faculteit der geneeskunde te ver-
dedigen op Dinsdag 22 October 1907
des namiddags te 4 uur door ==



	. V •		; V \' V

»Vv i ^		\'» \'"vC.
			■ ■ \'V ■ -f

-V.
			. rji

			■
			t ■■JrX

■ t 1* ■-\'->, ;







wm.


wmk

Bij liet voltooien van mijn proefschrift is het mij eene
diep gevoelde behoefte mijnen dank uit te spreken jegens
U, Hoogleeraren en Lectoren der Medische en Philoso-
phische faculteit voor het onderroijs, dat ik van U mocht
ontvangen.

Bovenal voel ik mij gedrongen, Hooggeleerde Pekel-
haring, Hooggeachte Promotor, U mijne erkentelijkheid
te betuigen voor de belangstelling, die Gij steeds in mijn
werk hebt betoond en voor den raad en steun, die ik
nooit te vergeefs bij U zocht. Zoo werd mij het werk
tot eene aangename taak.

Hooggeleerde Lameris, dat mij het voorrecht ie beurt
viel, onder uwe assistenten te worden opgenomen, zal
mij steeds met groote erkentelijkheid blijven vervullen.
De gelegenheid, mij geboilen, onder moe leiding mijne
practischc kennis te vermeerderen, zat mij later, als ik
zelfstandig zal hebben op te treden, zeker tot voordeel
zijn. Moge het hun ten goede komen, die zich dan aan
mijne zorgen zullen toevertroiLwen.

Kenige opmerkingen over Antistoffen ... 43
Ret neerslaan van proteolytisch en mulk-

OVKH de vermindering van proteolytisch en
mklkstkemmend Enzym door Digestie ... 73

Nca de onderzoekingen van Pelouze en Siraon in
1840 was men algemeen van meening, dat de kaas-
stremming het gevolg was van het zuur worden der
melk en dus als een secundaire werking van de
melkzuurgisting moest worden beschouwd. Ham-
marsten was de eerste, die aantoonde, dat men te
doen had met een specifieke werking van het leben-
zym op de caseine. Sedert dien tyd is er een vry
omvangryke literatuur over dit onderwerp eu zyne
.verschillende onderdooien verschenen. In een zeer groot
aantal punten bestaat nog verschil van meening: zelfs
ziet men hier on daar de vraag rijzen of de tijd voor
dorgelyke onderzoekingen wel geacht mag worden reeds
to zyn aangebroken, nu de kennis der enzymen in \'t
algemeen nog als zoo gebrekkig moet worden be-
schouwd. Zeker ware het bestudeeren der maagen-
zymen heel wat gemakkelyker, wanneer men, toegerust
met eeno volledige bekendheid met het wezen en de
werkingswyze der enzymen in het algemeen, den
arbeid kon beginnen, maar by gebreke daarvan is
men nog niet genoodzaakt allo onderzoek in dit speciale
onderdeel te laten varen.

In de laatste jaren is herhaaldelijk do vraag be-
handeld, of leb, chymosine, als een afzonderiyk, zelf-
standig enzym te beschouwen is.

Bammarsten heeft reeds in zyne eerste mededeeling
over dit onderwerp deze vraag in bevestigenden zin
beantwoord. Hij onderzocht extracten van het maag-
slymvlies van zoogdieren en kwam tot het besluit, dat
daaruit oplossingen konden worden verkregen, die
melk niet meer tot stolling konden brengen, maar
wel in staat waren, bij zure reactie, eiwit te verteren,
dat dus pepsine van chymosine kon worden gescheiden.

Intusschen werden allengs oude en nieuwe ervarin-
gen aan het licht gebracht, waaruit bleek dat, bij
neutrale reactie, melk gestremd kan worden, niet
alleen door een enzym van het maagslymvlies af-
komstig, maar ook door het pancreassap, ja door be-
standdeelen van allerlei organen van dieren en zelfs
van planten. Ook eencellige organismen, bacteriën,
bezitten, indien zij tot proteolyse in staat zyn, voor-
zoover het onderzoek reikt, allen het vermogen uit
melk kaas te doen ontstaan i).

Het samengaan van het vermogen tot proteolyse
en tot vorming van kaas uit melk, doet het vermoeden
ryzen, dat beide werkingen aan dezelfde stof ge-
bonden zijn.

Mijn onderzoek had ten doel de juistheid van dit
vermoeden te toetsen,* evenwel uitsluitend met be-
trekking tot de vraag, of de twee het meest bestu-
deerde werkingen van het maagsap der zoogdieren,
het verteren van eiwit en het doen stollen van melk,
aan twee verschillende enzymen, pepsine en chymosine,
dan wel aan een enkel moetèn worden toegeschreven.

Bij zyn onderzoekingen over pepsine kwam Pekelha-
ring tot de, in verband met do mededeelingen van Ham-
marsten verrassende, bevinding, dat pepsine, ook na
langdurige digestie met zoutzuur en na zorgvuldige

Nencki en Sfeber, die deze bevinding bevestigden,
spraken de onderstelling uit, dat pepsine te beschouwen
zou zijn als een reuzenmolecule, met onderscheidene
zyketens, waarvan de eene, by zure reactie, hydrolyse
van eiwit, de andere, by neutrale reactie, stolling van
melk zou kunnen veroorzaken — eene onderstelling,
waarby Pekelharing, in eene latere mededeeling, zich
aansloot.

Pawlow en Parastschuk gingen verder en vatten de
vertering van eiwit en do vorming van kaas niet op
als het gevolg van werking van, tweeërlei atoom-
groepen, maar zagen daarin de werking van een en
dezelfde stof, onder verschillende omstandigheden.

Sawjalow meende zelfs de vorming van paracaseine
uit caseine als een beginnende digestie van eiwit te
mogen beschouwen.

Do voorstanders der dualiteiteit waren daarmede
echter niet overtuigd. Vooral Schmidt Nielsen sprong
voor de oude opvatting in do bres en door Bang werd
zelfs een derde enzym in het strydperk gevoerd, dat
hy met den naam parachymoslne bestempelde. Dit
zou zich door enkele eigenschappen van do chymosine,
het gewone lebenzym, onderscheiden en als hot melk-
stremmend enzym van bepaalde diersoorten en ook
van den mensch zyn te beschouwen. Ik heb mij by myn
werk in hoofdzaak bepaald tot de laatste twee vragen;
of er inderdaad grond bestaat een afzonderiyk para-
chymosine aan te nemen on of men pepsine en
chymosine als een of als twee verschillende stoffen
moet opvatten. Dat er zich hierby moeilykheden voor-
doen, mogo reeds blykon uit de oneonigheid, die er
nog heerscht omtrent deze vragen. Vooral twee be-
zwaren treden op den voorgrond: de bereiding van

zuivere enzymoplossingen en de juiste bepaling van
haar melkstremmend en eiwit oplossend vermogen.
Daarom meen ik over deze punten afzonderiyk eenige
nadere mededeeling omtrent de door mij gevolgde
methoden te moeten doen voorafgaan, alvorens tot de
eigenlijke proeven over te gaan. Het enzym heb ik
op eenigszins andere wijze bereid, als de meeste
onderzoekers. Wat de bepaling der werkzaamheid be-
treft, heb ik mij gehouden aan de gebruikeiyke
methoden, terwyl ik door andere combinaties en ver-
schillende inrichting der proeven getracht heb tot
meer klaarheid te komen.

In 1872 publiceerde//amma?"sffn 1) zijn eerste onder-
zoek over lebwerking; hij toonde aan, dat het enzym
de caseine zelf aantast en dat dus het ontstaan van
melkzuur daarbij geen rol speelt. Reichel en Spiro\')
bewezen, dat er by de stremming geen leb verloren
gaat, zooals voor echte enzymwerking karakteristiek is.
Over dit punt bestaat dan ook geen twijfel. Leb ver-
toont volgens Hammarsten veel overeenkomst met
pepsine, doch bezit veel minder weerstandsvermogen
tegen verschillende schadelijke invloeden. Daarom is
het ook moeilyk pepsinevrije leb te bereiden. Hij
slaagde er niettemin in door gefractioneerde praeci-
pitatie met magnesiumcarbonaat of loodacetaat eene
oplossing te maken, die wel melk deed stremmen,
doch geen eiwit oploste. Door langdurig verhitten tot
40° bij zure reactie wordt leb vernield, terwijl do
pepsine grootendeels gespaard blyft. Volgens deze twee
methoden kan men volgens Hammarsten pepsinevrye
leb en lebvrye pepsine maken. Tevens meende hij
daarmee bewezen te hebben, dat leb en pepsine twee
verschillende stoffen zijn. Deze opvatting heeft onder
de verschillende onderzoekers hare voor- en tegenstan-
ders gevonden.

\') üober (Jio Milcligorhininip und dio daboi wirltondon Formonlo
dor MaKenschloimhaut. Rof. Mnly\'a Jnbrosborichto, 1872, S. 118.

Pekelharing i) beschreef in 1896 eene nieuwe methode
om uit maagsiymvliezen zuivere pepsine te bereiden,
waarbij werd gebruik gemaakt van de eigenschap van
het enzym in zure vloeistoffen op te lossen, terwijl
het weer neerslaat als de aciditeit tot zekeren graad
daalt. Daar dit ook de door mij gebezigde methode is,
zal ik in het volgende hoofdstuk eene meer uitvoerige
beschrijving geven. Hoewel de maagslymvliezen bij
de bereiding steeds 5 dagen met zoutzuur gedigereerd
werden, en dus volgens Hammarsten geen leb meer
konden bevatten, was het afgescheiden enzym toch
in staat melk te doen stremmen. Wel bleek bij de
analyses, dat deze pepsine niet als een zuivere stof
mocht beschouwd worden, doch toen het gelukt was
uit het maagsap van een flstelhond pepsine te berei-
den, die in verscheidene praeparaten een vry wel
standvastige samenstelling bleek te bezitten, vertoonde
deze dezelfde eigenaardigheid.Voor verschillende
pepsine-praeparaten uit den handel werd hetzelfde
gevonden. Pekelharing sluit zich daarom aan by de
kort te voren door Nencki en Sieber^} verkondigde
opvatting, dat Proteolyse en melkstremming werkingen
zijn van eenzelfde molecule. Ook 2y komen evenals
Pekelharing tot de conclusie, dat pepsine eene eiwit-
stof is met zeer labiel en complex samengesteld
molecule, dat waarschijnlijk bestaat uit verschillende
onderdeelen, waarvan elk de drager van bijzondere
eigenschappen is. Zy onderscheiden in zulk een reuzen-
molecule, behalve een hoofdmiddelpunt, centra van de

\') Uobor eine neue Boroitungawoise dos Pepsins. Zoitsciir. für
Physiol. Chomio Bd. XXII, S. 233.

V Beiträge zür Konntniss dos Magonsaftos Cind dor chemi-
schen Zusamonsetznng der Enzyme. Zeitschr. f. Physiol. Chom.
Bd. XXXII, S. 291.

2e, 3e en 4e orde voor de afzonderlijke atomen en
bestempelen deze onderdeelen met den naam Seiten-
molekel. Een dezer Seitenmolekel zou dan de hydroly-
tische splitsing van eiwit bewerken, terwijl een
andere de drager zou zyn van de lebwerking. Het
eiwit splitsende deel zou waarschynlijk met chloor
verbonden zijn; daarvoor pleit, dat de proteolytische
werking door verdund alkali reeds wordt vernield.

Pawlow en Parastschuk \') onderzochten maagsap, dat
zy verkregen uit eene geïsoleerde kleine maag van een
hond. Zij vergeleken de verhouding van stremmende
en digereerende werking onder verschillende omstan-
digheden. Voor de bepaling der coagulatie werd het
enzym niet geneutraliseerd. Maagsap, dat onder ver-
schillende physiologische omstandigheden, na voeden
met brood, met melk en met vleesch, werd afgeschei-
den, vertoonde verschillend proteolytisch vermogen.
In het broodsap werden buisjes van Mett het meest
aangetast. Door toevoegen van HCl en water werden
van alle drie soorten gelijke hoeveelheden gemaakt,
die bij gelyk HClgehalte, wat de digestie betreft,
aequivalente quantiteiten enzym bevatten. Van alle
drie werd de stollingstijd bepaald, die in alle drie ge-
vallen gelyk was. De stremmende werking was dus vol
komen evenredig met de Proteolyse.

In het maagsap, dat na toediening van verschillend
voedsel in elk der achtereenvolgende uren afzonderiyk
werd opgevangen, was het enzymgehalte niet gelyk;
wel ging sterker Proteolyse samen mot krachtiger
stremming. Werd maagsap by zure reactie gedigereerd
in de broedstoof, dan verminderde de werkzaamheid;

Uebor die oin und domzolbon Eiwoiszfermonto zukom-
mondo protoolytischo und Miicli koagnliorondo Wirkung vor-
schlodonor Vordnuungssafto. Zoitschr. f. Physiol. chom. Bd.
XLII, S. 415.

Dezelfde uitkomst werd verkregen, wanneer het sap
telkens voor de vermenging met melk werd geneu-
traliseerd met bariumcarbonaat.

By neutralisatie met soda verdween de stremmende
werking eerder dan de proteolyse. Werd zuur maagsap
5 minuten aan verschillende temperaturen van 15 tot
62° blootgesteld, dan namen beide werkingen weer
evenredig met elkaar af.

Door toevoeging van verschillende stoffen als chloor-
natrium, natriumacetaat, natriumsalicylaat, aceton,
alkohol, suiker, gal werd het parallelisme opgeheven
en wel in dien zin, dat de digestie geschaad werd,
de stremming niet; werd de verontreinigde oplossing
echter met zoutzuur verdund en vergeleken met eeno
even sterk verdunde zuivere oplossing, dan werden
de uitkomsten weer gelijk bevonden. Met de vermin-
derde concentratie van de toegevoegde stof verdween
haar storende invloed. Aan vernieling van pepsine
kon hier dus niet gedacht worden.

Alkalien en alkalische zouten deden ook de leb-
werking afnemen, een vermindering der proteolys«}
ging daarmee evenwel samen.

Voor pancreassap en het secreet der pars pylorica
van de maag en van de klieren van Brunner van het
duodenum constateerden zij hetzelfde parallelisme.

In alle onderzochte enzymen vonden Pawlow en
Parastschuk dus onder allerlei omstandigheden over-
eenkomst tusschen digereerende en stremmende
werking.

Om eene verklaring te vinden voor de meening van
andere schryvers, \'dat leb en pepsine twee verschil-
lende stoffen zyn, kritiseerden zij de door anderen
gevolgde methoden van onderzoek.

In de eerste plaats bleek hun, dat de tydwet zelfs
by neutralisatie met NaHCO, voor eenigszins ver-
dunde oplossingen niet geldt. Een tweede belangryke
factor is de vernielende invloed van alkaliën, waarmee
gewooniyk geneutraliseerd wordt; zelfs door zeer
voorzicbtig neutraliseeren met natriumcarbonaat wordt
enzym vernield. Hierin zoeken zij vooral de ver-
klaring van het door Hammarsten gevonden ver-
schynsel, dat leb door digestie met zoutzuur meer
vernield wordt dan pepsine.

Voor de bepaling van proteolytische en stremmende
werking werden niet even nauwkeurige methoden
gevolgd. Fibrine is toch voor pepsine een reagens van
bijna onbegrensde gevoèligheid, terwijl de neutrale
leboplossing by verdunning weldra de grens harer
werkzaamheid bereikt; zy konden krachtig werkend
broodsap verscheidene honderd malen on zelfs duizend
maal verdunnen en toch in 1 d, 2 uur vertering van
fibrine waarnemen. Hetzelfde sap met NaHCOg geneu-
traliseerd en 10 tot 20 maal verdund, deed de melk eerst
na vele uren stremmen en by nog verder verdunnen
in \'t geheel niet meer. Ook werd door vele onder-
zoekers niet gelet op don digestiestorenden invloed
van zouten, waardoor de stremming niet wordt ge-
hinderd. Dit treedt vooral op den voorgrond bij ver-
schillende lebpraeparaten uit den handel, en geeft,
althans grootendeels, volgens Paiolow en Parastschuk,
eone verklaring voor de bevindingen van Gldssner die
gemeend heeft de zymogenen van pepsine en van
chymosine van elkander te kunnen scheiden, door een
extract van het maagslymvlies, waarin beide zymogenen
zi,in opgelost, met uranylacetaat en natriumphosphaat
te behandelen. Dat dan de van het gevormde

uranylphosphaat afgefiltreerde vloeistof, nadat het
enzym door zoutzuur vrygemaakt was, wel de werking
van chymosine, maar niet of nauwelyks die van
pepsine vertoonde, kon immers toegeschreven worden
aan het gehalte van de vloeistof aan natriumacetaat,
waardoor de werking van pepsine wordt tegengegaan.

De juistheid van deze verklaring werd nader aan-
getoond door Pekelharing i), die de methode van
Glässner volgde, alleen met deze wijziging, dat het
filtraat van het uranylphosphaat eenigen tijd tegen
verdund zoutzuur gedialyseerd werd; dan kwam de
proteolytische werking even krachtig voor den dag
als de stremmende.

Ook vond Pekelharing, in tegenstelling met Glässner, dat
uit het pylorusgedeelte van het varkensmaagslijmvlies
een enzymoplossing bereid kan worden, waarvan het
stremmend vermogen parallel gaat met het proteo-
lytische.

De methode van iJammars^en waarmede hy meende,
door schudden met magnesiumcarbonaat, de pepsine
met het praecipitaat te kunnen verwyderen, terwijl
de leb in oplossing bleef, bleek ondoelmatig. Wel
vonden ook Pawlow en Parastschuk, dat het filtraat
sterke lebwerking bezat, en fibrine zelfs in 24 uur
niet aantastte, maar als het met zuur 5 ä 10 maal
verdund werd, dan loste het fibrine duidelyk op.
Proportionaliteit van beide werkingen was in het
filtraat aanvankelijk niet te vinden, de pepsinewerking
was veel zwakker dan de stremming. Werd echter
het filtraat dat door schudden met magnesiumcar-
bonaat alkalisch was geworden niet dadelyk aan-
gezuurd, maar eerst geneutraliseerd en na eenigen tyd
op de gewenschte aciditeit gebracht, dan vonden zy
dat de pepsine in minstens even sterke mate was

aau te toonen als de leb. Werd de alkalische vloei-
stof direct aangezuurd, dan werd ze troebel en ontstond
er een neerslag, dat uitbleef als in 2 stadia werd
aangezuurd, eerst tot neutrale reactie en daarna tot
de bepaalde aciditeit. De pepsine-werking was des
te sterker, hoe langer de neutrale reactie geduurd had.

Het door Hammarsten ingebrachte bezwaar, dat
proteolytische en stremmende werking bij verdunning
der oplossing niet dezelfde verhouding vertoonden tot
de enzymconcentratie, meenden Pawlow en Parast-
schuk te kunnen weerleggen door hetgeen zy vonden,
wanneer met de verdunning het zuur- resp. zout-ge-
halte verandering onderging. De werking van met
NaHCOg geneutraliseerd maagsap was evenredig
met de 1ste macht van de concentratie. Werd zuur
maagsap in verschillende quantiteit aan dezelfde hoe-
veelheid melk toegevoegd, zoodat behalve het enzym-
gehalte ook dat van het zuur veranderde, dan vonden
zü evenredigheid met het kwadraat van de enzym
quantiteit: hetzelfde werd waargenomen by neutrali-
satie met een zout dat do reactie bespoedigt,
als bariumcarbonaat. Voegden zy verschillende, doch
groote hoeveelheden eener sterk verdunde neutrale
oplossing aan de melk toe, dan zagen zij vaak een
derden rogel; de tijden waren evenredig met den wortel
der enzym-Goncentratio.

Op dezelfde wijze kan de regel voor do proteolyse
veranderd worden. By verdunning van een niet al te
sterk maagsap met water vonden zij dat heb eiwit
der buisjes van Mett evenredig met de eerste macht
der concentratie werd aangetast.

De werkingawet is dus te zeer van omstandigheden
afhankelijk om daaruit eenig bewys te putton voor
of tegen de eenheid van pepsine en leb.

enzym van dieren en planten, die nooit melk als
voedsel te verwerken hebben, laat zich volgens
Paiolow zoo verklaren, dat de stremming van melk
een bykomende reactie van het pepsine molecule is.
Hy beschouwt de stremming evenals de vorming
van plasteine, als eene omgekeerde, proteosynthetische
werking van de pepsine.

Saiojaloio kan in hoofdzaak met de opvatting van
Paidow meegaan. Hy meent echter, dat zyn eerste
bewys voor de eenheid der enzymen, de constante
verhouding der pepsine en leb in het maagsap onder
verschillende physiologische omstandigheden, ook ver-
klaard kan worden uit de constante samenstelling
van het protoplasmamolecule in de maagkliercel.
Stelt men zich voor, dat dit m pepsine vormende
groepen bevat en n chymosine vormende, dan zullen
beide enzymen by het uiteenvallen van het molecule
vrij komen in de verhouding m: n.

Terwijl Pa:clow bewees, dat de scheiding van leb en
pepsine slechts schynbaar gelukt, meent Saiojalow
dat het tweede bezwaar tegen de eenheid, de ver-
schillende regels, die de enzymen by toenemende ver-
dunning volgen, door Pawloto. niet voldoende is
weerlegd.

Hij onderzocht daarom de werkingswet van pepsine
en chymosine opnieuw en vond, dat het hiatste in
geconcentreerde oplossingen, zoodat de stollingstyd
niet meer bedroeg dan 10 minuten, eene werking bezat,
die evenredig was met de Ie macht van het enzym-
gehalte. Voor pepsine vond hij volgens de methode
van Grützner met karmynfibrine eveneens even-
redigheid van de werking met de Ie macht der

1) Zur Frago nach der IdontiUlt von Popsin und Cliyraosin.
Zoitscbr.\'f. Pliysiol. Chom. Bd. XLVI, S. 307.

Wordt het eiwitsplitsend vermogen met behulp van
eiwitbuisjes naar Mett bepaald, dan vindt men even-
redigheid van de pepsineconcentratie met het kwadraat
der afneming van het eiwitcylindertje. Dit feit werd
door alle onderzoekers geconstateerd. Saiojaloio ver-
klaart dit niet als eene eigenaardigheid van de pepsine,
maar als een gevolg van de inrichting der proeven.
De digestie vindt plaats binnen de eiwitgel, en men
mag aannemen, dat daar de concentratie van de
pepsine eene andere is, als in de vloeistof. Om dit te
onderzoeken nam hij in plaats van eiwit gelatine, die
zich juist zoo gedraagt als eiwit, wanneer zij op de-
zelfde wyze in buisjes van Mett gebruikt wordt. By
40° werd een neutraal extract van varkensmaagslym-
vliezen in verschillende verdunningen met gelatine
gemengd en in buisjes gebracht. Na het vast worden
der gelatine werden de buisjes in "/lo zoutzuur gewor-
pen en bleven daarin by kamertemperatuur 3—6 uur.
De afneming der gelatinecylindertjes verhield zich nu
als de ie macht der concentratie. Sawjaloiv besluit
daaruit, dat de zoogen. regel van Borissow niet de
werkingswet van pepsine weergeeft, maar een uit-
drukking is voor de verhouding van de pepsine-con-
centratie in de eiwitgel en in de oplossing, waarin
het buisje ligt.

Dat chymosine bij neutrale reactie werkt is volgens
Sawjalow slechts schynbaar, omdat melk geen neutrale
vloeistof is; er komen H-ionen in voor. Hij vond, dat
een neutraal extract van varkensmagen in overeen-
stemming hiermee bij toevoegen van O.ö^o monoka-
lium phosphaat fibrine oploste on eiwitbuisjes aan-
tastte, hoewel de vloeistof geen vry zuur bevatte. Hy
besluit tot het bestaan van één maagenzym dat

proteolytisch en stremmend werkt. Met Pawloics ver-
klaring der lebwerking als een proteosynthetische reactie
van de pepsine kan hjj niet instemmen; hü neemt aan, dat
deze opvatting voor de vorming van plasteine geldt, maar
daar caseine geen digestieproduct is, maar een natief
eiwit van hoog moleculair gewicht, meent hy dafzy hier-
voor niet van toepassing is. Hy beschouwt de lebwerking
als eene beginnende caseinedigestie, waarby splitsing
geschiedt in paracaseine een een albumoseachtig eiwit.
Dat de paracaseine met calcium wordt neergeslagen
heeft met de enzymwerking niets uit te staan. Deze
theorie wordt gesteund door het feit dat albumosen de
lebwerking storen, wat moeilijk te verstaan zou zyn,
als stremming het omgekeerde proces was van digestie,
maar daarentegen zeer verklaarbaar wordt als men
beide werkingen beschouwt als digestie.

Aan de methode van Schrumpft) om de pepsine
door neerslaan met in aether en alkohol opgeloste Chole-
sterine af te zonderen kan men na hetgeen door
Paioloio over de scheiding der enzymen werd medege-
deeld, niet veel waarde hechten. Dikwyls werd het
enzym door de behandeling geheel onwerkzaam en
steeds verloor het, ook al vertoonde het aanvanke-
lijk krachtige proteolyse, na 3- ä 4 uur zyne werking.
Men mag dus met groote zekerheid besluiten, dat de
ondergane behandeling ten zeerste nadeelig was voor
het enzym.

Van der Leekgaat uit van de onderstelling, dat
pepsine en chymosine, als zij identiek zyn in ver-
schillende oplossingen, altyd in dezelfde verhouding
moeten voorkomen. Hy neemt van twee handelsprae-

\') Darstellung dos Pepsinfonneiitos aus Magonprossaft.
Hofm. Boitr. Bd. VI S. 396.

•) Aromabildende Bactorien in Milch. Contralblatt für Bak-
teriologie und Parasitenkiindo, Bd. Vil. 2o Abt. S. 483.

paraten, leb en pepsine, gelijke hoeveelheden en vindt
dat de leb melk in 25 maal korter tijd doet stremmen,
dan de pepsine. Daarna bepaalt hij van beiden de
proteolytische werking; deze is by de pepsine onge-
veer 50 maal sterker dan by de leb. Na hetgeen door
Paicloto en anderen over digestie storende stofifen in
lebpraeparaten uit den handel is gezegd, behoeft het
nauwelyks vermelding, dat deze proef niets bewyst.
Dezelfde proef werd herhaald met hetzelfde resultaat,
waarbij een eigen gemaakt enzympraeparaat uit kalfs-
magen werd gebruikt.

Een kalfsmaag werd met 5% NaCl oplossing uitge-
trokken en het enzym met keukenzout gepraecipiteerd
en weer opgelost in water. Deze vloeistof werkte
zwak proteolytisch en sterk stremmend. Dezelfde
maag werd met 2®/o zoutzuur voor den tweeden keer
uitgetrokken. Dit extract werkte sterk proteolytisch
en zwak coaguleerend. Ook deze vloeistoffen zyn niet
vergelykbaar, daar de eerste ongetwijfeld voel keuken-
zout bevatte. Ik vond, dat 0.147o NaCl de digestie
van kippeneiwit tot op de helft verminderde.

Ernstiger bedenkingen tegen de eenheidstheorie
werden geopperd door Schmidt Nielsen. Hy legt
vooral nadruk op de ontdekking van Hammarsten,
dat men eene oplossing van maagenzym door dige-
reeren mot zoutzuur chymosinevry kan maken,
zonder dat zy hare digereerende werking verliest. Dit
geldt althans voor het enzym uit kalfsmagen. De
mogelijkheid acht hij niet uitgesloten, dat honden-
maagsap, waar Pawlow mee werkte, in dezen van het
kalfsmaagsap verschilt. Ook heeft hij het bezwaar
tegen Paiolow\'s werk, dat het niet zeker is, of de
door hem waargenomen stremming wel chymosine-

\') Uebor dio vorniointlicho Idontilt von Popsin nnd Cbymosin.
Zoitschr. f. Physiol. Chom. Bd. 48 S. 92.

werking is, daar hij zure enzymoplossingen gebruikt(},
terwyl Hammarsten reeds mededeelde, dat pepsine
by zure reactie onafhankelyk van de chymosine melk
kan doen stremmen. In hoofdzaak komt het principe
van Schmidt Nielsen\'s onderzoek hierop neer: hij
liet een zuur kalfsmaaginfuus zoolang digereeren,
totdat de melkstremming bij neutrale reactie een zeer
langen tijd noodig had (4—6 uur) en verdunde dan
eene geneutraliseerde hoeveelheid van hetzelfde niet
gedigereerde maaginfuus zooveel met gedistilleerd
water, dat ze by neutrale reactie de melk in den
zelfden tyd deed stremmen.

Beide oplossingen werden dan tot dezelfde aciditeit
aangezuurd en de Proteolyse met fibrinevlokken be-
paald. Ook onderzocht hy de stremmende werking van
beide vloeistoffen by zure reactie, waartoe hy het zuur
aan de melk toevoegde en daarna de aangezuurde
melk met eene afgemeten hoeveelheid neutrale enzym-
oplossing vermengde. De uitkomsten leerden, dat de
fibrinedigestie en de zure melkstremming by de ge-
digereerde oplossing veel minder tyd behoefden dan
bij de verdunde, terwijl de stremming by neutrale
reactie door beide in byna denzelfden tyd geschiedde.
Sqhmidt Nielsen besluit daaruit, dat leb en pepsine
onmogelijk dezelfde stof kunnen zyn. By mijn eigen
onderzoek heb ik deze kwestie nog eens nagegaan.
Ik kom daarop later terug.

E. Fuld 1) kon de waarneming van Hammarsten, dat
chymosine door 48 uur digereeren met zoutzuur ver-
nield wordt, niet bevestigen; hij bereikte dit zelfs na
dagen niet. Niettemin is hij een tegenstander van do
eenheidstheorie. „Sind die Zeiten noch nicht lange,
resp. nicht ganz vorüber, wo man in Lab und Pepsin

1) Uebor Milcligorinnung dürcb Lab. Ergobnisso dor Physio-
logie, ^e Jahrgang, le Abt. S. 479 und 472.

ein und dasselbe Molecule sehen wollte" zoo drukt hy
zich uit. In eene latere mededeeliug over „Molken
albumose\'\', nadat hy heeft kennis genomen van de
onderzoekingen van S2nro en Petry over de splitsende
werking van leb op caseine, schynt het, dat deze over-
tuiging niet zoo vast meer staat en meent hy, dat de
zelfstandigheid van leb tegenover pepsine opnieuw
bewezen dient te worden.

Terwijl men het er wel algemeen over eens is, dat
de werking van pepsine op eiwit bestaat in eene hydro-
lytische splitsing, is er langen tijd oneenigheid geweest
over het wezen der lebwerking.

Hammarsten meende, dat er by de stremming
splitsing van caseine plaats vond; het eene splitsings-
product, de paracaseine, zou door binding met
calcium het kaasneerslag, vormen het andere zou als pep-
tonachtige stof in oplossing blijven. Hij verklaart echter
niet, waarom niet van het oogenblik af, dat de leb wordt
toegevoegd, kaas begint neer te slaan. Do omzetting
der caseine begint wel dadelijk; dit kon Fuld^) be-
wyzen door aan een mengsel van melk en enzym-
oplossing na eenigen tijd digeroeron eene nieuwe hoe-
veelheid melk of enzym toe te voegen. Uit de verlenging
resp. verkorting der strommingstijden kon dan berekend
worden hoeveel caseine op het moment der tweede
enzymtoevoeging reeds in paracaseine veranderd was.
Het bleek dat de omzetting met constante snelheid
plaats heeft. Dat het enzym by de overdraging van
calcium aan de paracaseine geen werkzaam aandeel

3) Uobor dio Milcligorinnung durch Lab. llofui. Boitrilgo,
Bd. II. Ö. 178, 177.

heeft, zooals de Jager i) wil, kon Fuld aantoonen door
calciumvrije caseine oplossingen met leb te digereeren,
en daarna CaClj, toe te voegen. De praecipitatie ge-
schiedde dan zeer snel en in gelijken tijd, onafhankelijk
van de hoeveelheid leb. Hy schrijft het plotseling
neerslaan daaraan toe, dat caseine de kaas in oplos-
sing houdt; is het caseinegehalte tot een zekeren graad
gedaald, dan geschiedt de praecipitatie.

Beichel en Spiro namen eene specifieke digeree-
rende werking van leb op caseine waar. Door eene
calciumvrije caseineoplossing met leb te digereeren
konden zij aantoonen, dat daarby albumose ontstaat.

Fetry meent, dat de stremming van caseine niet
berust op eene splitsing in paracaseine en weieiwit.
Hy beschouwt het ontstaan van weieiwit als de
werking van een afzonderlijk in leb voorkomend
splitsend enzym, dat met de stremming niets heeft
uit te staan.

Werd een kalkvrije caseine-oplossing langen tijd
met leb gedigereerd, dan kon hij door toevoegen van
CaClj geen neerslag meer krygen; dit wyst op eene
verandering der caseine, die verder gaat dan paraca-
seinevorming. Door op verschillende tijden een proef
van de digereerende oplossing te nemen en daaruit
\'de gevormde paracaseine door verzadigen met mag-
nesiumsulfaat te verwyderen, kon hy aantoonen, dat
in het flltraat de hoeveelheid in oplossing blyvende
stikstof by langer digestie vermeerdeVde. De vorming
van weieiwit hield dus by het ontstaan van paraca-

\') Over do working van lebferuiont. VVoekblad v. h. Nederl.
Tüdachr v. Geneeskunde, 1897, pag. 262.

•) Hoeinflüssung und Natur des Labungsvorgangos. Hofni.
Beiträge, Bd. VIII, S. 367.

s) Ueber dio Einwirkung des Labformonts auf Kaseih. Hofm.
Beiträge, Bd VIII, S. 339.

seine niet op, maar schreed steeds verder. Ook met
azynzuur ontstond er in de gedigereerde oplossing een
neerslag, werd dit afgefiltreerd, dan kon hy door half
verzadigen met ammoniumsulfaat in het filtraat een
neerslag verkrijgen, dat Veel overeenkomst bezat met
de primaire albumosen der proteolytische enzymen;
werd dit afgefiltreerd, dan ontstond door geheel ver-
zadigen weer een neerslag, dat met secundaire
albumosen overeenkwam. Het lebenzym is dus in staat
eene diepgaande splitsing van het caseine-molecule te
weeg te brengen. De werking verschilt in zooverre
van die der bekende proteolytische fermenten, datzy
by neutrale reactie en lage temperatuur plaats vindt.
Werd van twee verschillend sterke leboplossingen
de splitsende werking nagegaan door bepaling van de
hoeveelheid stikstof, die na half verzadigen met
zinksulfaat in oplossing bleef, dan vond hij eene ver-
houding van concentratie en werking naar de regel
van Schütz—Borissow.

Er bestond dus een zekere overeenkomst met pep-
sinewerking, waarom Petry dacht aan de mogelijk-
heid, dat de leb met pepsine verontreinigd was. Hy
onderzocht dus of andere eiwitten er ook door werden
aangetast. Bij neutrale reactie werden noch kippeneiwit
noch serumalbumine gedigereerd; bij zure reactie word
serumalbumine wel aangetast, het andere niet. Do
digestie van het serumeiwit was echter zoo gering,
dat het pepsinegehalte in geen geval hoog kon zijn.

Hy nam nu eene zure pepsine-oplossing, die door 8
dagen digereeren niet meer in staat was een tien-
voudig volume melk in 12 uur te doen stremmen, en
verdunde deze zooveel met zoutzuur, dat de digestie
der serumalbumine buisjes twee maal zoo groot was als
van de leboplossiug. Word deze oplossing geneutrali-
seerd on met caseineoplossing gedigereerd, dan kon

hij geen splitsing van caseine constateeren. Daaruit
besluit hy dat ook in de leboplossing de splitsende
werking niet aan verontreiniging met pepsine kan
worden toegeschreven. Ook meent hy daarmee de
bewering weerlegd te hebben, dat caseine tegenover
proteolytische enzymen minder resistent is en daarom
door pepsine onder omstandigheden, waarin andere
eiwitten onaangetast blijven, wel wordt gedigereerd.
Petry onderstelt daarom in zijn leb een ander proteo-
lytisch enzym, dat alleen op caseine werkt, ook bij
lage temperatuur en neutrale reactie.

Dit besluit is naar myne meening niet te recht-
vaardigen. Petry gebruikte een lebpraeparaat van Merck,
Hij maakt nu nergens gewag van de mogelykheid,
dat dit praeparaat, evenals voor zoovele andere door
verschillende onderzoekers werd aangetoond, tevens
pepsine werking bezit, mits het slechts door geschikte
bewerking geactiveerd wordt. Dat hij dit over\'t hoofd
zag en daarom eerst dacht aan verontreiniging met
pepsine moet wel worden toegeschreven aan zyne
vaste overtuiging van de tweeheid van leb en pepsine.
Hij vond, dat zyn lebpraeparaat in staat was bij
neutrale reactie eene vergaande splitsing van caseine
te- weeg te brengen en bij zure reactie serum albumine
op te lossen. Op de andere onderzochte eiwitten was
geen proteolytische werking waar to nemen. Of deze
werking door digestie storende stoffen werd verhin-
derd en of de stoornis opgeheven kon worden, werd
niet beproefd. In merkwaardige overeenstemming
hiermee is het door ü. Schicarzgevonden onderscheid
tusschen kippeneiwit en serumalbumine. Voegde hy
aan eene popsineoplossing antipepsine toe, dan werd
de digestie van kippeneiwit gestoord, die van serum-

In verband hiermee schijnt het mij toe, dat men
by de verschillende splitsende werking van Petry\'s
lebpraeparaat tegenover caseine, serumeiwit en andere
eiwitten eerder heeft te denken aan een verschil der
eiwitten, dan aan een onderscheid in de enzymen.

Men kan zich. toch zeer goed voorstellen, dat de
leboplossing, waarin het proteolytisch agens door
bijmengselen verhinderd wordt andere eiwitten aan te
tasten, nog wel in staat is caseine by neutrale reactie
te splitsen en serumalbumine by zure reactie op te
lossen. De proef van Petry met gedigereerde pepsine
oplossing is hiermee evenmin in tegenspraak, als zy
voor zijn doel bewijzend is. Het feit, dat pepsine-op-
lossingen, die bij neutrale reactie melk doen stremmen,
dit vermogen door digestie met zoutzuur verliezen,
kan niet ontkend worden. Alleen over de verklaring
heerscht verschil van meening. Terwyl de oorspron-
kelijke meening was, dat het lebenzym vernield werd
{Hammarsten), meenen anderen, dat in het neutralisee-
ren do oorzaak der onwerkzaamheid moet gezocht
worden {Pawlow). Petry gebruikte eene-gedigereerde
oplossing van pepsine, die bij neutrale reactie melk
niet meer deed stremmen in 12 uur, maar bij zure
reactie nog wel serumalbumine oploste. De inactiviteit
tegenover caseine bi.i neutrale reactie kan dus ver-
klaard worden, doordat het enzym na de digestie door
neutraliseeren onwerkzaam wordt.

Petry heeft dus niet bewezen, dat niet gedigereerde
pepsine by neutrale reactie geen caseine splitst. Stelt
men zich op het standpunt van hen, die meenen, dat
pepsine on leb 6ën stof zijn, dan kan men do strem-
ming van caseine aldus verklaren. Het enzym (pep-
sineleb) brengt by neutrale reactie eene splitsing der

caseine tot stand. Zoodra het grootste deel der caseine
in paracaseine is overgegaan, is volgens Fuld de eerste
bij aanwezigheid van calcinmzonten niet in staat de
tweede in oplossing te houden; de calcium verbinding
der paracaseine slaat neer, waarop het enzym volgens
Petry by neutrale reactie niet verder werkt. By
afwezigheid van kalkzouten heeft de praecipitatie
niet plaats, maar zet het enzym zijne splitsende
werking op de paracaseine voort.

Volgens Petry berust de stremming niet op splitsing
der caseine in paracaseine en weieiwit; dan toch, meent
hy, zou men bij de stremming van gelykehoeveelheden
melk door verschillende quantiteiten leb evenveel weiei-
wit moeten vinden. Hy vergeleek de hoeveelheid weiei-
wit die ontstond by de stremming van twee even groote
proeven melk, waarvan de eene voorzien was van
eene sterke, de andere van eene 200 maal verdunde
leboplossing, en vond in de proef met verdunde leb
meer weieiwit dan in de andere. Dat laat zich wel
verklaren. Petry vond, dat de caseinesplitsing plaats
heeft volgens de regel van Schutz—Borissow. De 200
maal verdunde oplossing heeft dus voor de vorming
van evenveel weieiwit V 200 maal zooveel tijd noodig
als de sterke oplossing. De "proef met de verdunde
oplossing duurde ruim 200 maal zoo lang als de
andere en moest derhalve ook meer weieiwit bevat-
ten. Een deel van de paracaseine, dat in \'t begin der
proef uit de caseine was afgesplitst zal daarby eene
verdere ontleding hebben ondergaan en waarschynlyk
in \'t geheel niet meer zyn neergeslagen. Het is toch
□iet waarschynlyk, dat eerst alle caseine in paracaseine
moet zijn omgezet, voordat de laatste eene ver-
dere splitsing ondergaat, vooral omdat Fuld be-
wees, dat de omzetting met constante anelheid plaats
heeft.

Nog op andere wijze trachtte hy te bewyzen, dat
het caseinesplitsend enzym der leb een ander is,
als het stremmende.

Eene leboplossing werd deels door digereeren met
natriumcarbonaat verzwakt, en deels zoo veel verdund,
dat beide oplossingen in denzelfden tijd melk deden
stremmen. Dan werd uit melk een calciumvrye
caseine-oplossing bereid, en het caseine-splitsend ver-
mogen hierop onderzocht. De met NajCOj behandelde
leb splitste minder caseine, dan de verdunde, en na
lange digestie met NajCO, was in \'t geheel geen
splitsing waar te nemen. Dit pleit nu tegen de ver-
klaring der stremming als splitsingsproces, maar
bewijzend is het niet, daar niet werd beproefd, of de
calciumvrye caseineoplossing na de digestie met ver-
zwakte leb door toevoegen van calcium tot stolling
was te brengen. Het is toch mogelyk, dat de mis-
handelde leb nog wel in staat was in melk caseine
splitsing en daardoor stremming te weeg te brengen,
maar niet in eene vloeistof, waarin de kunstmatig af-
gescheiden caseine was opgelost. De bezwaren, door
Petry ingebracht tegen de opvatting, dat de strem-
mende werking van leb op caseine berust op splitsing,
wegen dus niet zwaar.

Ful(V) constateerde eveneens, dat leb in staat is
de caseine te splitsen en M. van Herwerden toonde
aan dat daarby splitsingsproducten ontstaan, die door
verschillende reacties zijn to onderscheiden.

Na al wat in den lateren tyd hierover bekend is
geworden mag men wel besluiten, dat stremming van
caseine eene reactie is, die niet zoo heel veel verschilt

•) Beitrnp znr KonntnissdorLabwirkiniKaiifCasoin. Zoitschr.
f. riiysioi. Chouiio, Ud. LII. S. 184.

van de oplossing van eiwit door pepsine. De opvatting
van Saiojalow, dat stremming een begin van digestie
is,¹ waarbij een der eerst ontstaande digestie producten
zich met calcium verbindt tot eene onoplosbare stof,
heeft dus zeer aan waarschijnlijkheid gewonnen. Men
heeft dan alleen aan te nemen, dat caseine zich in
zooverre van de andere eiwitstoffen onderscheidt, dat
het door leb, waarin de pepsine voor andere eiwitten
inactief is, wel wordt gesplitst en dat voor deze
werking zure reactie en hoogere temperatuur geen
vereischten zyn. Dat leb ook voor kippeneiwit by
neutrale reactie niet geheel inactief is, toonde M. van
Herwerden aan met een handelspraeparaat van Van
Hasselt en dat zy bij zure reactie wel serumeiwit
aantast werd door Petry waargenomen.

Het bezwaar, dat door Schmidt Nielsen tegen de
eenheid der enzymen werd ingebracht zal ik in een
later hoofdstuk uitvoeriger behandelen.

Voor de bepaling der hoeveelheid leb, die eene
oplossing bevat wordt gewoonlyk aangenomen, dat de
concentratie der oplossing omgekeerd evenredig is met
den tijd, die voor de stremming noodig is.

Voor het enzym der kalfsmagen werd deze wet
door de meeste onderzoekers jnist bevonden, althans
binnen zekere grenzen.

Fuld^) kon met de methode van Morgenroth zoowel
voor zeer zwakke als voor zeer. a\'erke concentratie
geldigheid der wet constateeren. Lörcher vond, dat
bij toenemende concentratie de snelheid der werking
steeds minder toenam. Pawlow kon voor hondenmaag-
sap, als het eenigszins verdund werd, geen even-
redigheid tusschen hoeveelheid leb en werking meer

waarnemen. Volgens Becker i) gaat de wet voor
menschelijk maagsap niet op. Bang meent, dat het
enzym van varkens en eenige andere dieren zich in
dezen anders gedraagt, dan dat van het kalf.

Daar hij ook in andere opzichten verschil tusschen
deze beide enzymsoorten vond, neemt hij aan, dat
het stremmend enzym van \'t varken evenals dat uit
pepsine praeparaten een andere stof is, als de kalfs-
leb en de leb uit den handel.

Op deze kwestie zal ik hier niet verder ingaan; by
de beschrijving myner proeven kom ik er nader op
terug.

Niet alle onderzoekers werkten met gelyke prae-
paraten. De een gebruikte bereidingen uit den handel,
de ander oplossingen, die door extractie of andere
bewerking uit magen van verschillende dieren ver-
kregen werden. Door Bang en anderen werd reeds
de opmerking gemaakt, dat men by de studie der
enzymen wel heeft te onderscheiden van welke diersoort
zy afkomstig zijn, maar van niet minder belang is de
bereidingswyze. Veel hangt af van den graad van rein-
heid on den aard van eventueel aanwezige veront-

reinigende stoffen. Daarom meen ik, dat een eenigszins
nauwkeurige beschryving van de gevolgde methode
van bereiding en de pogingen om onzuiverheden te
elimineeren hier niet achterwege mag blijven.

Zuiver enzym is zeker het best te verkrygen van
honden met een maagfistel, vooral, wanneer deze com-
municeert met een afzonderiyko bijmaag. Verontreini-
ging is dan vrijwel uitgesloten, behalve met wat slijm,
dat bovendien gemakkelyk verwyderd kan worden.
Daarby is men er zeker van, het maagenzym in zyn
meest natuurlijken vorm te verkrygen. Deze methode
brengt evenwel niet geringe bezwaren mee en voor
de keuze van het proefdier is men haast beperkt tot
den hond. Daarby doet zich dan weer demoeilykheid
voor, dat het maagsap van den hond in vergelyking
met dat van andere dieren volgens sommigen een
aparte plaats inneemt. Daar nu mijn onderzoek in
hoofdzaak gericht was op de chymosine-parachymosine
en de chymosine-pepsine kwestie, scheen het beter
gebruik te maken van kalfs- en varkensenzym. Ik
moest dus eene andere bereidingswijze kiezen. Daarom
maakte ik gebruik van de methode door Pekelharing
meegedeeld en beschreven in Hoppe Seyler\'s Zeit-
schrift Bd. 22 welke methode\'ik hier in \'t kort zal
herhalen.

Van 10 varkensmagen wordt de mucosa van het
funduagedeelte afgepraepareerd, goed fijngehakt en
gebracht in een fle.sch met ö L 0,5% HCl. De flesch
wordt in een bak met water gezet, dat op een con-
stante temperatuur van 37" wordt gehouden. In de
meeste gevallen werd de vloeistof zoo gedurende 2
dagen gedigereerd, soms ook langer. Na afloop der
digestie wordt de troebele vloeistof door zuigfllters,
waarin zich samengeperste pap van flltreerpapier be-
vindt,^ gefiltreerd. Er wordt een helder geel gekleurd

filtraat verkregen, dat in perkament dialysators in een
grooten bak met stroomend water gehangen wordt.
De dialyse werd gewoonlijk 24 uur voortgezet. Dan
is de vloeistof troebel geworden. Door centrifugeeren
kan er een neerslag uit afgescheiden worden, dat in
0,27o HCl bij eene temperatuur van 37" na eenigen
tijd voor het grootste deel oplost. De vloeistof wordt
dan door een verwarmd filter in de stoof bg 87° ge-
filtreerd. Men verkrijgt dan een helder, lichtgeel fltraat,
dat by afkoelen troebel wordt, als althans voor het
oplossen van het praecipitaat uit de centrifuge niet te
veel HCl werd gebruikt. Dit filtraat wordt weer in een
dialysator gebracht en 24 uur gedialyseerd tegen ge-
distilleerd water; er is dan weer een neerslag ont-
staan, dat afgefiltreerd wordt. Het filter wordt tusschen
filtreerpapier uitgeperst, het neerslag er afgenomen,
opgelost in 0,2% HCl van 37° en bij eene temperatuur
van 37° gefiltreerd. Men verkrijgt dan een filtraat, dat
zeer sterke enzymwerking bezit en als vrij zuiver
mag worden beschouwd. De reiniging kan dan nog
worden voortgezet door herhaald dialyseeren tegen
gedistilleerd water en weer oplossen in zoutzuur.
Wegens het belangrijk verlies, dat daarmee gepaard
gaat, heb ik dit gewoonlijk niet gedaan.

De vloeistof, die men by het centrifugeeren van
het gedialyseerde filtraat der mucosae overhoudt, bevat
nog veel enzym, dat door basisch loodacetaat en
ammoniak wordt neergeslagen. Er ontstaat een volu-
mineus vlokkig praecipitaat in eene heldere kleurlooze
vloeistof. Het neerslag wordt op eenige filters afge-
filtreerd, tusschen filtreerpapier zacht uitgeperst,
van de filters genomen en met zooveel oxaalzuur
in kristalvorm vermengd, als noodig is om nl
het aanwezige lood to binden. Na eonigen tijd staan
by een temperatuur van 80° ziet men het lood-

oxalaat als een wit poeder bezinken. Door middel
van een zuigfilter is het gemakkelyk te verwyderen
en men houdt een helderbruine vloeistof over, waarin
na 24 uren dialyseeren tegen stroomend water weer
een neerslag ontstaat, dat door centrifugeeren afge-
scheiden wordt, opgelost in 0,2% HCl by 37° en
verder behandeld als het eerste door dialyse uit het
Altraat der mucosae verkregen neerslag. In de vloei-
stof, die na het centrifugeeren van de met oxaalzuur
behandelde en gedialyseerde vloeistof afgegoten wordt
kan door verzadigen met ammoniumsulfaat het hierin
nog aanwezige enzym worden neergeslagen. Men
filtreert het neerslag af, drukt het filter weer zacht
uit tusschen filtreerpapier, neemt het praecipitaat
er af, en brengt het in een dialysator, die in stroomend
water wordt gehangen. In 24 uur is alles in het
naar binnen gedialyseerde water opgelost en een groot
deel van .het (NHjjSO^ verdwenen. De dialysator
wordt nu in een glas met 0,2% HCl gehangen, na 24
uur wordt de inhoud er uitgegoten, tot 37° verwarmd
en by dezelfde temperatuur gefiltreerd. Het filtraat
wordt weer gedialyseerd tegen gedistilleerd water;
er ontstaat een praecipitaat, dat afgeflltreerd wordt,
opgelost in 0,27o HCl en by 37® nogmaals gefiltreerd
en men heeft eene derde hoeveelheid sterk werkende
enzymoplossing.

Aangezien de bereide oplossingen gewoonlyk dadelyk
in bewerking genomen werden, heb ik het enzym niet
gedroogd en in poedervorm gebracht. Het is mij
overigens herhaaldelyk gebleken, dat eene dergelyke
oplossing in 0.2% HCl zoo noodig weken lang op eene
koele plaats bewaard kan worden, zonder aan strem-
mend en digereerend vermogen noemenswaardige
verliezen te lijden.

enzym geen moeilijkheden. Men verkrijgt bij de dialyse
een neerslag, dat in 0.2% HCl by 37° gemakkelijk
oplost en door filtreeren door een verwarmd filter
gereinigd kan worden van een klein blyvend neerslag
van onoplosbare bijmengselen. In het heldere filtraat
heeft men dan een oplossing van zeer weinig ver-
ontreinigd enzym, zooals na de analyses, door
Pekelharing verricht, wel mag worden aangenomen.

Anders is het by de bereiding van het enzym uit
kalfsmagen. Hier heeft men voortdurend te kampen
met een slymerige stof, die bij dialyse met het enzym
neerslaat en in zoutzuur by 37° gedeeltelijk weer
oplost. Zy bemoeilijkt het filtreeren in hooge mate en
maakt het soms geheel onmogelijk. Ook gaat zy voor
een deel over in het filtraat, dat dan ook byna nooit
dadelijk als een heldere vloeistof te verkrijgen is.
Door eenigszins van de gewone wijze van doen af ue
wijken, gelukte het meestal wel, ofschoon niet altijd,
een helder filtraat te krijgen. Ik bracht daartoe het
neerslag uit do dialysators in een niet al te groote
hoeveelheid 0,2% zoutzuur. Door flink omroeren ging
het over in een dunne slijmige vloeistof, die een uur
lang in de broedstoof op een temperatuur van 37°
werd gehouden en van tijd tot tijd nogmaals omgeroerd,
daar er zich telkens weer een bezinksel in afscheidde.
Daarna werd de vloeistof afgekoeld on bleef ongeveer
24 uur bij lage temperatuur atiuin. Ze was dan vrij-
wel helder geworden, terwijl op den bodem een neerslag
was afgezet, waarvan de bovenste laag veel lichter
gekleurd was, dan de onderste.

Werd nu opnieuw verwarmd tot 37° dan loste de
lichter gekleurde hwg op, en zoo niet geheel, dan was
ze door toevoegen van meer zoutzuur genuikkelijk
geheel in oplossing te brengen.
Do onderste laag loste zoo goed als niet op, en bleef

By dialyse van het filtraat sloeg het enzym dan
weer neer als een slijmige stof, die aan de dialysator
vastkleefde, zoodat deze meestal opengeknipt moest
worden om alles goed te kunnen verwijderen. Dit
praecipitaat loste dan in zoutzuur gemakkelyk op.

Men mag dus niet verwachten, dat het enzym hier
in even zuiveren toestand afgescheiden was als
uit de varkensmagen, waar het als een fyn korrelig
praecipitaat in den dialysator aanwezig is. De gelyke
aard van de stof, die uit het eerste neerslag als veront-
reiniging kan worden afgescheiden, maakt het waar-
schynlijk, dat ook het slijmige karakter van het
gezuiverde enzym niet is te beschouwen als een
eigenaardigheid van het kalfsenzym, maar is toe te
schryven aan een niet te verwyderen bijmengsel. Uit
de vloeistof, die door centrifugeeren van het met
oxaalzuur behandelde en doo- dialyse neergeslagen
enzym werd afgescheiden, kon ik met (N H^), S
geen bruikbare hoeveelheid enzym meer afzonderen.
Het praecipiteeren geschiedde veel minder gemakkelijk,
dan by het varkensenzym en het groote praecipitaat,
dat ten slotte ontstond, liet zich moeilijk afiiltreeren;
in den dialysator gebracht trok het zooveel water tot
zich, dat het byna nooit gelukte uit deze verdunde
oplossing na dialyse tegen zoutzuur en tegen ge-
distilleerd water een neerslag te verzamelen.

Het gevonden verschil tusschen kalfs- en varkens-
enzymbereiding scheen my niet zonder belang voor
de verdere vergelijking dezer beide stoffen.

Bang, die zich met dit onderwerp het meest bezig-
hield, gebruikte extracten uit maagslijmvliezen. De
overweging, dat de slijmachtige stof misschien niet
aanwezig\'ZOU zyn in enzymoplossingen, die door uit-

trekken met zoutzuur by kamertemperatuur bereid
waren, bracht mij er toe ook deze methode te be-
proeven.

Ik liet fijngehakte kalfsmaagmucosae uittrekken
met 0,4 7o HCl.; na eenige uren had ik een zeer werk-
zame oplossing verkregen, die door een zuigfilter ge-
filtreerd werd. Het heldere filtraat werd gedialyseerd
tegen stroomend water en vertoonde na 24 uur een
vry groot neerslag van dezelfde slymerige consistentie
als het andere praeparaat. Opgelost in 0,2 % HCl.
by 37° gefiltreerd en opnieuw gedialyseerd tegen ge-
distilleerd water sloeg het weer neer zonder van
aard te zyn veranderd. Er is dus geen reden om aan
te nemen, dat de koud bereide extracten in dit opzicht
van de andere oplossing verschillen.

Verder heb ik enzymoplossingen onderzocht, die
gemaakt waren door uitpersen van maagmucosae om
te zien of op deze wijzo misschien gemakkelyker een
bruikbaar praeparaat was te verkrygen.

320 Gram fijngehakte maagslymvliezen van het
kalf werd met Infusorien aarde en zand in een mor-
tier fijngewreven, met IGO cm®. 0,2 % HCl vermengd
en iu een hydraulische pera by een druk van 250
atm. uitgeperst. Het sap werd gefiltreerd; het hel-
dere filtraat bedroeg 240 cm®, met een aciditeit van
0,058 7o HCl.

Deze vloeistof bezat een krachtig stremmend ver-
mogen, maar eiwit werd er byna niet door aangetast.
Er kon hier dus gedacht worden aan de mogelykheid
dat alleen leb, geen pep.sine in het perasap was over-
gegaan ; het was dan te verwachten, dat deze in de
met zand gemengde tot een kook aaamgeperate mucosa-
resten was achtergebleven. Daarom werd deze koek
in 0,5 7o HCl fljngeroerd en 3 dagen gedigereerd.
Er werd een helder filtraat uit verkregen, dat echter

slechts zeer geringe proteolytische en stremmende
werking bezat. Er bleef dus niet anders over, dan
dat de pepsine wel degelijk in het perssap opgelost
was, maar door een of ander agens onwerkzaam ge-
maakt werd. Dat de pepsine als proenzym aanwezig
zou zijn was niet heel waarschijnlijk en werd door
een nieuwe proef, waarbij 0,5 7o HCl gebruikt werd,
weerlegd. "Waarschijnlijk bevatte het perssap dus
antipepsine. Uit een nader onderzoek zal blyken, dat
dit inderdaad de oorzaak was van de geringe digestie.
In het enzym dat op de gewone wijze door digestie
der slijmvliezen werd gewonnen, heb ik van anti-
peptische werking nooit iets waargenomen. Mis-
schien blyft deze stof, die door het kneuzen der weef-
sels met zand schynt vry te komen, by digestie in
de mucosaresten achter; nog aannemelijker is, dat
zij door de digestie wordt vernield.

Een voor het doel bruikbaar enzym was echter op
deze wyze niet te verkrijgen, waarom ik deze methode
ook niet verder heb toegepast.

De meeste lebpraeparaten digereeren by zure reactie
geen eiwit en toch is het niet moeilyk daaruit eene
werkzame pepsineoplossing te maken.

De onbekendheid met de stoffen, die ter conservee-
ring zyn toegevoegd en de onzekerheid ze volkomen
te kunnen verwijderen maken deze bereidingen voor
proefneming minder geschikt.

Daar zelfs sporen van enzym, die aan het vaatwerk
blijven kleven, de juistheid der uitkomsten zeer kunnen
benadeelen, is reinheid in alle opzichten een eerste ver-
eischte. Voor de bepaling der digestie werd gebruik
gemaakt van buisjes, met kippeneiwit gevuld, vol-
gens de methode van Mett. De buisjes werden
bewaard in een goed gesloten fleschje met 0,2 % zout-
zuur, waaraan een kristalletje thyraol was toegevoegd.
Voor het gebruik werden zü steeds met een pincet,
dat te voren even gegloeid was, uit het fleschje
genomen.

De glazen doosjes, waarin de digestie plaats had
werden met warm zeepwater uitgewasschen en daarna
in eene sterke oplossing van kaliloog gelegd; voor
het gebruik goed uitgespoeld met water en daarna
met 0,2% HCl en afgedroogd met een schoone doek.
De enzymoplossingen, waarvan het proteolytisch ver-
mogen bepaald moest worden, werden in de gewenschte
verdunning afgemeten met een pipet, waarop tiende
deelen van een cm\' nauwkeurig waren af to lezen.
Steeds werd voor een proef 10 cm® vloeistof gebruikt,
waarin 2 buisjes gelegd werden. Daarby werd zorg
gedragen, dat de buisjes midden in do vloeistof
lagen. De digestie had gewoonlyk plaats by een HCl
gehalte van 0,2% in een broedstoof by een tempera-
tuur van 37o.

De duur der proef waa gewoonlyk 5 uur; slechts
wanneer met zeer zwakke oplossingen gewerkt werd,
werd de digestie langer voortgezet. De verkorting van
het eiwitkolommotje werd onder het mikroskoop met

behulp van een oculairmikrometer, die in 50 deel-
strepen, die elk met Vso iii.M. van het te meten
voorwerp overeenkwamen, verdeeld was, gemeten.

Gewoonlyk kon de meting op deze wyze vrij nauw-
keurig geschieden; slechts enkele malen werd door
een schuin beloop of door onduidelykheid der eiwit-
grens de bepaling wat bemoeilijkt. Wanneer het glazen
buisje niet recht was afgebroken werden fouten zooveel
mogelyk vermeden door het buisje zoo te leggen, dat
de grens van onder- en bovenkant elkaar bedekten.

Volgens den regel van Schütz-Borissow verkrygt
men door van de gevonden getallen het kwadraat te
nemen eene uitdrukking voor de verhouding der enzym-
concentratie in de gebruikte oplossingen.

Deze regel gaat op, mits de enzymwerking niet te
zwak en niet te sterk is. Is zij te zwak, dan komen
kleine fouten, voortspruitend uit het niet volkomen
nauwkeurig afsnyden der eiwitkolommetjes te veel
in aanmerking, terwyl ook onnauwkeurigheden in
het meten zich meer doen gelden ; is de verkorting van
het eiwit-cylindertje zeer groot, dan is de toeganke-
lykheid tot het eiwit voor het enzym bemoeilykt en
inderdaad vindt men in die gevallen te lage uitkomsten.
Zooals ik hierboven reeds vermeldde zou de regel van
Schütz-Borissow volgens Saiojaloio niet zyn een
directe uitdrukking voor de intensiteit der pepsine-
werking op het eiwit, maar aangeven de verhouding
van de enzymconcentratie binnen het buisje ten
opzichte van de concentratie der vloeistof, waarin de
buisjes liggen. Als men byv. de enzymconcentratie
op 1 m.m. afstand van het uiteinde van een buisje,
dat in eene oplossing ligt, gelyk 1 stelt, dan zou de
enzymconcentratie op hetzelfde punt in een buisje,
dat in een 4 maal sterkere oplossing ligt, gelijk 2
moeten zijn. Daarby zou dan de intensiteit der directe

Hoe dit züi de hoofdzaak is of men dezen regel mag
aannemen als een maat voor de bepaling van het
pepsinegehalte of niet.

De meeste onderzoekers geven op deze vraag een
bevestigend antwoord en voor zoover ik heb nagegaan
mag men inderdaad aannemen, dat de concentratie
evenredig is met het kwadraat van de verkorting, even-
wel met de beperking, dat de werking niet al te sterk
en niet al te zwak moet zyn. Dit kwam o.a. duide-
lyk uit in eenige proeven, met hondemaagsap, waar
dus van storende bymengselen niet veel sprake kan
zijn. Een proef werd genomen met onverdund sap,
een met 2 maal en een met 4 maal met eene over-
eenkomstige HCl oplossing verdund sap.

Na 5 uur geven dus de voor oplossing 1 en 2 ge-
vonden getallen de concentratie weer. Na 22 uur is
het voor oplossing 1 gevonden getal te laag. \'

Na 5 uur heeft oplossing 3 nog te weinig verteerd
om een betrouwbaar getal te geven. Na 22 uur vindt
men juist hier de goede uitkomst.

Men mag dus aannemen, dat de getallen, zoover zo
liggen ongeveer tusschen 1 en 15, werkeiyk een
juiste uitdrukking voor de concentratie zijn. Zeer
sterke oplossingen zou men dus korten tyd moeten
laten werken, terwyl voor zwakke oplossingen de
digestie langer zou moeten worden voortgezet. Daar
het nu in myne proeven meestal niet aankwam

op zulke uitersten en het veelal te doen was om de
verandering der werking van enzymoplossingen, die
gedigereerd werden in verschillende phasen der digestie
na te gaan, zou men door telkens een anderen
duur voor de proef te kiezen moeilijk vergelijkbare
getallen krygen, tenzy de digestie zoo lang werd voort-
gezet, tot een voor alle proeven gelijk aantal m.m.
opgelost was. Men zou in dat geval in den tyd een
maat hebben voor de concentratie.

Wegens de groote bezwaren, die deze metbode zou
opleveren, heb ik den meer eenvoudigen weg gekozen.
Was de werking zeer zwak geworden, dan werd de
meting soms 2 maal op verscbillende tyden verricht.
Een bron van fouten zou nog kunnen gelegen zyn in
de aanwezigheid van antipepsine. Volgens Danilewsky
komt toch in de maagmucosa een antipeptische stof
voor, die door uittrekken met verdund zuur in de
oplossing overgaat; zij is bestand tegen een temperatuur
van 60 è, 70»; het zou dus niet onmogelijk zijn, dat
deze stof in myne praeparaten voorkwam. Danilewsky
vond evenwel, dat deze antipepsine door zure pepsine
vernield wordt; daar de digestie der mucosae altijd
minstens 36 uur werd voortgezet;, is het niet waar-
scbynlijk, dat er in het filtraat nog veel van over is.

Bovendien kan het by de reiniging van het enzym
met de andere bijmengselen verwijderd zyn.

Ik heb dan ook noch in het kalfs-, noch in hot var-
kensenzym ooit iets van antipepsine kunnen bespeuren,
en men mag toch verwachten, dat bij het groot aantal
op verschillende wijze verrichte proefnemingen een der-
gelyke stof niet in belangryke hoeveelheid aanwezig kon
zyn zonder hare tegenwoordigheid nu en dan te verraden.

\') Zie E. Honzel, Antipepsin als Ursacho der Nichtselbts-
verdauung des Magena. rof. Jahrosbericht über dio Fortscbr.
der Thiercbem. Bd. XXXIII, S. 656.

Evenmin lieb ik de aanwezigheid kunnen bespeuren
van eene stof, die de leb tegenwerkt.

Voor het vaststellen van het stremmend vermogen
heb ik gebruik gemaakt van ontroomde koemelk, af-
komstig van een zuivelfabriek, waar de melk van een
groot aantal koeien dooreen gemengd en machinaal
door centrifugeeren van de room ontdaan werd. Vol-
gens opgave van de fabriek heeft deze melk een vrij
wel constante samenstelling. Bovendien heb ik, wan-
neer het er op aankwam de verandering van het stollend
vermogen eener enzymoplossing op verschillende dagen
te vergelijken, steeds een controleproef genomen met
een constant blyvende leboplossing. Hiervoor werd
een praeparaat van van Hasselt gebruikt, tien maal
verdund met gedistilleerd water; de gevonden stol-
lingstyden bedroegen byna altyd 36 seconden; ze
waren nooit korter dan 80 seconden en nooit langer
dan 40 seconden. Wanneer met zwakke enzymoplos-
eingen gewerkt werd, werd veelal oen proefje melk
zonder toevoeging als controle gebezigd. Dit stolde
nooit voor afloop der proef, die somtyds 7 uur duurde,
wel als het den nacht over in het waterbad bleef.
Daar de proeven meestal minder dan oen uur en
byna nooit langer dan 5 ü, 6 uur duurden, meende
ik in deze molk een deugdelyk middel to hebben ter
bepaling der enzymsterkte.

De reageerbuisjes, waarin de proeven werden ge-
daan, werden met warm zeepwater gereinigd, afge-
spoeld met leidingwater en in een kom gelegd, die
gevuld werd met kokend water, waarin ze bleven
tot het water eenigszins afgekoeld was, daarna wer-
den ze boven de kachel of in een stoof gedroogd. Voor
elke bepaling word 8 c.m.\' melk gebruikt, die met
een pipet in het reageerbuisje werd afgemeten.
Do buisjes werden zoo lang in een waterbad

van 370 gezet, tot de melk dezelfde temperatuur had
aangenomen, dan werd ze overgegoten in een buisje,
dat de gewenschte quantiteit enzymoplossing bevatte,
nadat ook dit buisje eenigen tyd in het waterbad
had gestaan; het mengsel werd even omgeschud en
weer in het bad geplaatst; voor de tijdsbepaling werd
het buisje al naar gelang van den te verwachten stol-
lingstyd elke 5, 10, 15 seconden of met nog langer
tusschenpoozen er even uit genomen en er onmid-
dellijk weer in gezet. De enzymoplossingen werden
afgemeten met een pipet, die in Vio c-m.\' was ver-
deeld. Het volume werd steeds gebracht op 2 c.m.®
Op deze wijze meende ik beter vergelijkbare uitkomsten
te krijgen, dan door het toevoegen van verschillende
hoeveelheden der oplossingen, terwijl het goed ge-
mengd worden van het enzym met de melk er tevens
door bevorderd werd.

Ik heb gewerkt met geneutraliseerde en zure enzym-
oplossingen. Voor de neutralisatie met natronloog
werd de benoodigde hoeveelheid zure vloeistof afge-
meten in een bekerglaasje. De loog, waarvoor een
tiende normaal oplossing werd gebruikt, werd uit een
buret droppelsgewyze toegevoegd onder voortdurend
omschudden der vloeistof, ten einde plaatselyk op-
treden van alkalische reactie, die het enzym zou
kunnen schaden, zooveel mogelyk te voorkomen.

De reactie werd bepaald met lakmoes- of lakmold-
papier. De geneutraliseerde oplossing, werd dan na
al of niet verdunnen met water zoo spoedig mogelyk
met de melk gemengd. Werd geneutraliseerd met
CaCOj dan werd eerst de enzymoplossing in een buisje
afgemeten en zoo noodig tot 2 cm" aangevuld. Daarna
werd gepulveriseerd CaCO, in geringe overmaat toe-
gevoegd, omgeschud en het buisje 1 minuut in het
waterbad gezet, waarna de melk er by werd gegoten.

Deze methode gaf ik de voorkeur boven het eerst
verwijderen van het CaCOg door filtratie, omdat de
werking na het neutraliseeren somtyds afneemt, zoo-
als later zal blijken. Werd eerst gefiltreerd, dan vond
ik den stollingstijd inderdaad vaak langer, dan wanneer
op de gewone wyze werd gewerkt.

Voor de stremmingsproeven met zuur enzym werd
de vloeistof door verdunning met water gebracht op
eene aciditeit van 0,17o om zooveel mogelyk directen
invloed van het zuur te vermyden. Het melk-enzym
mengsel bevatte dan 0,02% HCl, en hiervan kan men
geen belangrijke werking op de caseine verwachten.

Om na te gaan in hoeverre de gevonden tyden voor
de stolling de enzymconcentratie inderdaad weergeven
werden met bekende verdunningen eenige proeven
genomen, die op de volgende wijze werden ingericht:
Een sterke oplossing van gezuiverd varkensenzym in
0,2% HCl werd voor een deel geneutraliseerd met
"/lo NaOH; by de neutrale oplossing werd zooveel
water gevoegd, dat het volume 2 maal zoo groot
werd als dat van de zure oplossing. De verkregen vloei-
stof werd telkens 2 maal verdund met een NaCl
oplossing die gemaakt was door 0,27o HCl te neu-
traliseeren met NaOH en met water aan te vullen
tot het dubbele volume, een vloeistof, die dus, wat het
NaCl gehalte betreft, overeen kwam met de enzym-
oplossing. Met elke verdunning werd een proef gedaan;
de gevonden cyfers vormen kolom 1. Deze methode
gaf ik de voorkeur boven het verdunnen met HCl en
elke proef afzonderiyk neutraliaeeren, omdat hieraan
het bezwaar verbonden is dat de neutralisatie niet
in alle proeven gelijk effect heeft. Het bezwaar der
gevolgde methode ia, dat hot enzym voor de latere

In kolom 2 vindt men de tyden, die gevonden
werden by neutralisatie met CaCOg. Hier werd met
HCl verdund en elke proef afzonderiyk geneutrali-
seerd. Voor de eerste proef werd de oorspronkelyke
oplossing 2 maal verdund met 0,2 % HCl om dezelfde
hoeveelheid enzym te hebben als in de met natron-
loog geneutraliseerde.

De derde kolom stelt voor de werking by zure
reactie. In de eerste proef , werd de oplossing 2 maal
verdund met water, teneinde de enzymconcentratie
weer gelijk te maken en tevens de aciditeit op 0,1 %
te brengen. De verdere verdunning geschiedde met
0,1 % HCl.

In horizontale richting heeft men dus gelyk enzym
gehalte, in vertikale richting gelyk zout-, resp. zuur-
gehalte. Voor elke proef werd 8 c.m\'. melk gebruikt
en 2 c.m®. enzymoplossing.

In alle drie gevallen bestaat dus evenredigheid
tusschen stollingstyd en verdunning. Het verschil
is alleen hierin gelegen, dat by neutralisatie met
NaOH reeds bij 4 maal verdunnen de uitkomst
onjuist is bij neutralisatie met CaCO\' eerst by 64 maal
en by zure reactie by 256 maal verdunnen. Men raag

dus besluiten, dat de tijden bij neutralisatie met NaOH
niet juist de concentratie weergeven, tenzü de op-
lossing zeer veel enzym bevat; by neutraliseeren met
CaCOs kan men ook bij verdunde oplossingen op de
cijfers rekenen, terwyl men by zure reactie zeer ge-
ringe hoeveelheden enzym kan meten. In proef 8 is

2 cm\' van de 128 maal verdunde oplossing, die dus
± 0,008 cm\' van de oorspronkelijke oplossing bevat,
nog in staat de melk op den juisten tyd te doen stollen.
De hoeveelheid enzym moet hier wel heel klein zyn.
Eigenaardig is, dat in alle 3 kolommen de onjuiste
uitkomst ten naasteubij voorkomt by gelyken duur
van de stolling.

3 van kolom 3 zijn hieraan toe te schryven, dat ik
korter tyden dan 5 seconden niet goed kon bepalen
zoodat 5 voor do eerste cijfers onjuist en to veel is.
Voor het kalfsenzym werd een zelfde reeks proeven
met verschillende verdunningen gedaan. Do bereiding
der oplossingen en de verdunning geschiedde op de-
zelfde manier als by het varkensenzym.

Na neutralisatie met natronloog zyn do uitkomsten
hier dus beter dan by het varkensenzym.

De tijden stemmen vrywel met de verdunning
overeen tot een 32 malige verdunning toe.

"Wel komen reeds by 8 maal verdunnen kleinere
onregelmatigheden voor, maar over \'t algemeen zijn de
tyden ongeveer in Overeenstemming met de concen-
tratie. By 64 maal verdunnen was de stollingstijd
zeer onbetrouwbaar. In myne verdere proeven had ik
meermalen gelegenheid bij met NaOH geneutraliseerde
oplossingen dergelyke niet geheel prompte uitkomsten
waar te nemen. Meestal deed ik dubbele proeven met
dezelfde vloeistof met de bedoeling de juistheid der
uitkomst zooveel mogelyk te controleeren. Daarby
kwam het nog al eens voor, dat twee gelyke proeven,
wanneer de tyd althans eenige minuten bedroeg,
een verschil opleverden.

Bij neutralisatie met CaCOj zijn de uitkomsten
byna geheel juist; de kleine afwykingen in de eerste
getallen laten zich gemakkelijk verklaren als men van\'
beneden naar boven gaande de grootte der fouten
berekent. Uitgaande van proef 5 zou men moeten
vinden 50, 25, 121/2, 6V4. Het is nu duidelijk, dat
verschillen als 12Vj en 15,6en 10 bij zoo korte tyden
wel vallen onder het bereik der .waarnemings-fouten.

Wat de zure reactie betreft, hier zijn alle tijden
iets korter, terwyl de juistheid der uitkomsten over-
eenkomt met die bij neutralisatie me CaCOj.

In bovenstaande gegevens heeft men ongeveer een
maatstaf in hoe verre men uit de gevonden tyden
het enzymgehalte mag beoordeelen.

By de beschrijving der enzym-bereiding merkte ik
reeds op, dat het waarschijnlyk is, dat het varkens-
en kalfsenzym, volgens Pekelharing\'s methode afge-
scheiden en gezuiverd, geen noemenswaardige hoe-
veelheid antistoffen bevat.

In het sap, dat ik verkreeg door kalfsmaagmucosae
fijn te wry ven en uit te persen kon ik wel antipepsine
aantoonen.

Het perssap werd aangezuurd tot0,27o HCl. Werd
dan een deel geneutraliseerd met NaOH en met water
verdund tot 2 maal het volume, dan deed het de
melk in de gewone verhouding van 2 op 8 stollen in
l\'/g minuut; bij 2 maal verdunnen met 0,2% HCl en
neutraliseeren met CaCOs was de tijd Va min. en by
2 maal verdunnen met water 10 seconden.

Werd nu van het onverdunde perasap de proteolyse
bepaald, dan vond ik in 5 uur een digeatie = O, in 24
uur waa er nog onmeetbaar weinig, en in 102 uur
1,9 m.m. gedigereerd. Een uiterst geringe digestie dus
in vergelyking met het zeer krachtig stremmend ver-
mogen. Ik heb er reeds op gewezen, dat de oorzaak
niet lag in scheiding der enzymen noch in de luin-
wezigheid van proenzym. Eerst heb ik nu getracht
de pepaine door digestie der vloeiatof werkzaam te
maken. Na 4 dagen digereeren was de stollingstijd na
neutralisatie met NaOH l^/j min., met CaCOg 7* miïi-
by zure reactie 7 min. De digeatie waa in 5 uur = O,
in 24 uur = 0,4 m.m. Van een duidelyke toeneming der
peptische werking blykt dus niets.

Dit is nu niet in directe tegenspraak met de mede-
deeling van Danilewsky dat de antipepsine door zure

pepsine wordt vernield, want in een vloeistof als deze,
waarin zooveel antipeptische stof aanwezig is, is te
verwachten, dat ook de invloed van de pepsine op de
antipepsine zelf zeer zal worden belemmerd.

Dat hier werkelijk een stof was, die de pepsine
tegenwerkte, blykt uit de volgende waarnemingen.
Een hoeveelheid van het sap werd gedialyseerd tegen
0,2 % HCl en na 24 uur werd de digestie opnieuw
bepaald. Deze bedroeg nu in 5 uur, 1,8 m.m, dus een
belangrijke toeneming.

Nog duidelyker was de volgende proef: Met een deel
van het perssap, dat 4 dagen gedigereerd was, werd een
proef genomen en een andere met hetzelfde sap 4 maal
verdund met 0,2% HCl. De uitkomst was in 24 uur:

Zeer bewyzend is ook het volgende. Van een zeer
werkzame kalfsenzymoplossing werd 1 c.m\'. verdund
met 9 c.m®. 0,2 % HCl en 1 c.m®. werd verdund met
9 c.m^. perssap, dat ook 0,2 % HCl bevatte.

Opmerkelijk is, dat de hier aanwezige antistof zich
alleen als antipepsine, niet als antileb voordeed, terwijl
Sawjalow tot staving zijner meening, dat chymosine-
werking berust op caseinedigestie, juist aanvoert,
dat antistoffen beide reacties tegengaan.

Hy voegde daartoe aan de stremmingsproef albu-
mose toe en bespeurde, dat deze de lebwerking tegen
ging. Afgezien van de vraag of de hier aanwezige

antistof een albumose is, moet ik er op attent maken,
dat uit bovenstaande proef met onverdund en 4 maal
verdund sap blykt, dat 4 maal verdunnen de anti-
werking zeer veel geringer maakt. Bij de strem-
mingsproeven wordt de enzymoplossing door toevoe-
ging der melk 5 maal verdund. Dit kan dus het
verschynsel heel wel verklaren.
De antistof wordt door neutraliseeren niet vernield.
Een hoeveelheid sap werd geneutraliseerd en bleef
daarna 1 uur staan, in welken tijd een neerslag ont-
stond, dat door centrifugeeren verwyderd werd. De
vloeistof vertoonde toen een stollingstyd van 1 min.
Na aanzuren tot 0,2 "/o was de digestie in 5 uur = 0.

In aansluiting aan de beschreven uitkomsten met
perssap kan ik eenige proeven vermelden met twee
verschillende lebpraeparaten uit den handel.

Onderzocht werden een leboplossing van van Has-
selt en een Deenscbe van Hansen. Beide praeparaten
vertoonen neutrale of byna neutrale reactie, hebben
een sterk stremmend vermogen, mtuvr aangezuurd,
laten zij eiwit zoo goed als onaangetast.

Eenige cm\', leb van Hansen worden 10 maal ver-
dund met water. Deze oplossing doet do melk in de
gewone verhouding stollen in 30 seconden. 2 cm®, leb
worden daarop verdund met 18 cm®. 0,2 % HCl. Deze
oplossing, die dus bijna 0,2 "/o HCl bevat werkt als volgt:
2 X verdund met water 5 ü, 10 sec.

Do zure oplossing, niet verder verdund, digereert
in 5 uur byna niets. Evenals het perssap heeft deze
oplossing naast een zeer sterk stremmend vermogen,
byna geen proteolytische werking.

Van hetzelfde lebpraeparaat wordt nu 40 c.m®. ge-
dialyseerd tegen stroomend water. Na 24 uur is het
volume toegenomen tot 70 c.m\'. De vloeistof wordt
uit den dialysator genomen en het enzym neergeslagen
met verdund azijnzuur.

Door centrifugeeren en afgieten der vloeistof wordt
het neerslag afgezonderd en opgelost in 0,2 % HCl.

Deze oplossing heeft nu ongeveer een gelyke wer-
king op melk als de vorige, terwijl de eiwitbuisjes
er veel meer door worden aangetast.

Gefiltreerd en verdund met 0,2 % SCI. De werking
dezer oplossing is de volgende:

Werd de oplossing van met azynzuur neerge-
slagen enzym nu nog 24 uur gedialyseerd tegen ge-
distilleerd water en het daarby ontstaande neerslag
opgelost in 0,2 7o HCl, dan vertoonde zy by onge-
veer gelijke melkstremming een digestie van 2,3 m.m.
Een belangrijke toeneming was. hier dus niet meer
bereikt.

Ook door dialyse alleen kan men deze praeparaten
hare peptische werkzaamheid althans ten deele weer-
geven. Na 2 dagen dialyseeren tegen stroomend water
en daarna 5 dagen tegen 0,2% HCl vond ik, nadat
de vloeistof met zoutzuur nog wat verdund was, het
volgende:

In aanmerking genomen de veel zwakkere strem-
mende werking van deze oplossing, ziet men dat de
digereerende ook hier belangryk was toegenomen.

Men is dus geenszins gerechtigd dergelijke lebop-
lossingen scherp te onderscheiden van pepsineprae-
paraten. Aan Pawloio, die over dit onderwerp meer
uitgebreide onderzoekingen deed, gelukte het in alle
hem ten dienste staande leb en pepsine praeparaten
beide werkingen aan te toonen en te bewijzen, dat, waar
een van beide scheen te ontbreken, zij slechts ge-
maskeerd was.

In de hier onderzochte handelspraeparaten zyn de
zouten, die gewoonlyk ter conserveering worden toe-
gevoegd mogelyk de oorzaak van do stoornis. Dat
zelfs een NaClgehalte van 0,147o de digestie zeer
merkbaar benadeelt, merkte ik reeds op.

By het perssap is het waarschijnlijk, dat het door
Danilewsky en Schioars in maagmucosae gevonden
antipepsine het storende agens is.

Onderscheidene methoden zijn door verschillende
onderzoekers beproefd om te trachten eene scheiding
teweeg te brengen tusschen pepsine en chymosine.
Dialyse werd voor zoover ik vond door geen van
allen voor dit doel aangewend.

enyzmoplossingen, die 0,2 % HCl bevatten, als zy
gedialyseerd worden tegen water, een deel van het
enzym tegen den dialysatorwand afzetten, wanneer de
aciditeit der vloeistof tot een zekeren graad gedaald is.

Volgens Pekelharing is bij een HCl gehalte van
0,02 7o de oplosbaarheid van pepsine het geringst,
terwyl zy door lage temperatuur nog sterk vermin-
derd wordt. De vloeistof in den dialysator is dan
evenwel nog niet van alle enzym bevrijd. Het zou
nu zeer denkbaar zyn, dat pepsine en chymosine in
deze omstandigheden verschil in oplosbaarheid ver-
toonden, zoodat een van beide by een bepaalde acidi-
teit meer neersloeg dan de andere. Een bezwaar bij
het vergelyken van het filtraat met het weer opge-
loste praecipitaat is, dat het eerste meer verontrei-
nigende stoffen bevat, zoodat geen volkomen verge-
lijkbaarheid bestaat, daar de bymengselen op een van
beide werkingen meer invloed kunnen hebben, dan
op de andere.

Men mag uit dergelijke proeven dan ook alleen een
besluit trekken, wanneer het gelukt eene oplossing te
verkrygen, waarin een der werkingen geheel of byna
geheßl ontbreekt, terwyl de andere goed vertegen-
woordigd is. Kleine verschillen hebben in dezen
geen bewyskracht. In een vry groot aantal verge-
lykingen van digestie en stremming van de vloeistof
en het opgeloste neerslag vond ik bijna steeds paral-
lelisme beider werkingen; de enkele keeren, dat het
parallelisme verbroken was, was het verschil te
klein om het als bewijs voor de scheiding te doen gelden.

Uitgaande van de gedachte, dat er mogelyk maar
een klein verschil in oplosbaarheid beider enzymen kon
bestaan, heb ik beproefd door herhaalde dialyse van
een zelfde hoeveelheid een duidelyk verschil te vinden.
Hiertoe werden na 24 uur dialyseeren tegen gedis-

tilleerd water beide werkingen van een deel van het
neerslag, opgelost in 0,2 % HCl en van de vloeistof
bepaald en vergeleken. Het dialysaat werd eerst aan-
gezuurd tot 0,2% HCl. De rest van het opgeloste
praecipitaat werd dan opnieuw 24 uur gedialyseerd
en hetzelfde herhaald. Dit geschiedde 6 keer achtereen.
Indien de onderstelling opging, zou ik ten slotte een
neerslag moeten krygen, waarin een der enzymen
in vergelyking met het andere geheel of voor een
groot deel op den achtergrond trad.

De volgende cijfers geven de verhouding van strem-
mende en digereerende werking na de verschillende
dialyses weer. De aciditeit van de vloeistof was na
de eerste dialyse 0,037o, i^a volgende was ze
minder. Het [is zeer moeilyk in dit opzicht overeen-
stemming te krijgen. De neutralisatie geschiedde met
CaCOj. Voor de digestie werd 10 c.m^. vloeistof gebruikt
van dezelfde concentratie ala voor de stremming.

Ook door G keer dialyseeren was de verhouding der
werkingen niet in die mate veranderd, dat men mag

besluiten, dat een der enzymen ten opzichte van het
andere sterk was verminderd.

De kleine afwijkingen na de 4e en 6e dialyse leggen
niet veel gewicht in de schaal, de korte stollings-
tyden in aanmerking genomen. De hoofdzaak is, dat
by herhaald dialyseeren een toenemende wijziging in
de verhouding niet is te constateeren. Het gelukt
dus niet door dialyse de enzymen van elkaar te scheiden.

Nog op andere wijze heb ik de onscheidbaarheid
der werkingen op de proef ge.steld. Ten einde in eene
oplossing van pepsine en anti-pepsine deze beide
stoffen van elkaar af te zonderen, maakte Schwarz
gebruik van de eigenschap der pepsine, in eiwit
in te dringen. Deze methode heb ik nu ook
aangewend voor eene enzymoplossiog uit var-
kensmagen.

Geneutrahseerd met CaCOj deed deze oplossing
de melk stremmen in 20 seconden, by zure reactie
2 maal verdund met water in 16 seconden.

In 5 uur digereerde zij 2.1 m.m. van een eiwit
buisje. 22 c.m^ dezer oplossing werd vermengd met
stukjes fyn gewreven gestold kippeneiwit en bleef
daarmee 21 uur op een koele plaats staan. Daarna
werd gefiltreerd ; het filtraat bedroeg 21 c.m\'. Dit
Altraat deed de melk stollen:
na neutralisatie met CaCOa niet in 6\'/j uur;

by zure reactie 2 X verd. met water „ „ 6 uur;
bij zure reactie onverdund (0,27o HCl) „ 5 uur.

De stukjes eiwit werden met 21 cm» 0,27o HCl
in de stoof gezet, na 24 uur waren ze geheel
opgelost.

Proteolytisch en stremmend vermogen waren dus
gelijkelyk" door de stukjes eiwit geabsorbeerd. Ook

deze methode is dus niet in staat pepsine en leb te
scheiden en, al moge zy de eenheid dezer enzymen
niet bewyzen, de waarschynlykheid wordt er zeker
door verhoogd.

In Pflügers Archiv Bd. 79 verscheen eene publicatie
van Bang over het melkstremmend enzym, dat voor-
komt in pepsine-praeparaten, vergeleken met gewone
leb. De aanleiding tot dit onderzoek was de bevinding
van Thunberg, een van Hammarsten\'a assistenten,
dat een pepsine-oplossing, die eenigen tijd gedigereerd
werd, na neutralisatie met alkali geen stremming van
melk meer kan te weeg brengen, wel daarentegen na
neutralisatie met CaCOs. Hy werkte deze proef na en
vont], uitgaande van eene sterke pepsine-oplossing,
waarvan 1 cm\', met \'Vio alkali geneutraliseerd, 10 cm\'
melk oogenblikkelyk deed stremmen, dat de oplossing
na eene digestie van 96 uur geen stremming meer kon
verwekken, als ze met alkali geneutraliseerd werd;
by neutralisatie met CaCOg stolde de melk nogonmid-
dellyk en eerst na 11 dagen digereeren was het strem-
mend vermogen ook na neutralisatie met CaCOj
vordwonen.

Dit was in strijd met de waarneming van /iam-
marsten, dat men iu eene leboplossing door 24 ü 48
uur digereeren allo leb kan vernietigen. Ter verge-
lyking herhaalde hy de proef met een leb-praeparaat
uit den handel en met extract uit kalfsmagen en vond
nu de lebwerking zoowel by neutralisatie met alkali

als met CaCOj in 24—48 uur verdwenen. Aan dit
verschil ontleent hij het recht de pepsineleb en de
gewone als twee verschillende stoffen van elkaar te
onderscheiden.

„Der Unterschied ist zweifach," zegt hij. „Erstens
musz man das Pepsinlah viel länger als das gewöhn-
liche digeriren, urn die Labwirkung zu vernichten,
wenn man, wie gewöhnlich, mit Alkali neutralisirt
und zweitens kommt dann für das Pepsinlab eine
Periode wo man zwar keine Labwirkung nach neutra-
lisiren mit Alkali findet, nach Neutralisation mit
kohlensaurem Kalk abersehrdeutliche, ja sogar starke
Labwirkung demonstriren kan, während das gewöhn-
liche Lab keine solche Periode gibt. Dieser Unterschied
ist so bedeutend, dasz man berechtigt ist, darüber
zu zweifeln ob nicht hier zwei verschiedene Fer-
mente vorliegen."

Door een viertal reacties tracht hü dan verder de
juistheid dezer onderstelling te bewijzen. Het komt
mij voor, dat hier grond bestaat voor enkele opmer-
kingen. Bang gebruikte twee verschillende pepsine-
praeparaten, pepsinum siccum, een Zweedsch en een
Deensch., die beide sterke lebwerking bezaten. Als leb
gebruikte hij eene Zweedsche bereiding, - Barnekow\'s
Lope en extracten uit kalfsmagen. Het is my nu
niet duidelyk, hoe hij dus kan spreken van pepsineleb
en gewone. Hot kalfsmaag extract heeft toch evengoed
digereerende als stremmende werking en handelsleb,
zooals ik in een vorig hoofdstuk voor twee praeparaten
aantoonde, ook, al moge de proteolyse door bymeng-
selen belemmerd zyn. Vermoedelijk" zal Barnekow\'s
Lope in dit opzicht wel niet anders zijn. Of men nu een
pepsine-oplossing heeft die tevens lebwerking vertoont,
of een leboplossing, die ook proteolytisch werkt, maakt\'
geen verschil en een onderscheiding van pepsineleb

en gewone is dus moeilyli te rechtvaardigen. In den
loop zyner verhandeling geeft hy aan, dat de ge-
wone leb (chymosine) het melkstremmend enzym der
kalfsmagen is, terwyl by het varken de pepsineleb
(parachymosine) voorkomt. Ik heb my daarom by mijn
onderzoek over chymosine en parachymosine aan dit
onderscheid gehouden en gebruik gemaakt van
enzymoplossing uit kalfs- en varkensmagen.

De bevinding van Bang dat chymosine door eene
digestie van 24—48 uur geheel wordt vernield, kan ik
niet bevestigen. Integendeel heb ik mij er dikwijls
van kunnen overtuigen, dat een oplossing van kalfs-
enzym gewooniyk veel langer gedigereerd moet worden,
voordat zy hare coaguleerende werking na neutralisatie
met alkali verliest, een resultaat, dat ook door Fuld
werd verkregen.

Wordt met CaCOj geneutraliseerd, dan kan men,
evenals Bang voor parachymosine vond, nog veel langer
stolling waarnemen. Ten bewyze mogen de volgende
getallen dienen. De gebruikte enzymoplossing was
gemaakt door lyngehakte kalfsmaagslymvliezen 37
uur met 0,57o HCl te digereeren en daarna te fil-
treeren : Het Altraat werd in een waterbad verder
gedigereerd.

By de met NaOH geneutraliseerde proeven werd zoo-
veel water gevoegd, dat het volume 2 maal zoo groot
werd ; de met CaCO, geneutraliseerde proef werd voor
het toevoegen van het CaCOg 2 maal verdund met water.

Na 210 uur digereeren dus nog een stollingstyd van
75 min. en eerst na 286 uur was de tyd niet goed
meer te bepalen ; met CaCOj geneutraliseerd deed het

enzym de melk nog stollen in S\'/g minuut. Dat ook
mijne gezuiverde praeparaten van kalfsenzym langer
moesten digereeren bljjkt uit de proeven in tabel
I waar de stollingstijd eerst in 9 dagen toenam
van 2®/i2 min. tot 45 min. terwyl de tijd bij neu-
tralisatie met CaCOj op den 9en dag 110 sec. bedroeg
en in tabel III, waar de tyd in 5 dagen toenam
van 1% min. tot meer dan 2 uur, terwyl dezelfde
hoeveelheid enzym, met CaCOj geneutraliseerd de melk
deed stollen in 5 min. Het is trouwens moeilyk te
begrypen, dat in alle mogelyke enzymoplossingen,
onafhankelijk van concentratie en bymengselen, de leb
steeds in denzelfden korten termyn zou vernield worden.
Het moet toch wel verschil geven of men eene op-
lossing heeft met veel of weinig leb, met zwak of
sterk digereerend vermogen.

Men moet echter den observatietyd niet al te kort
nemen — bij Bang\'s proeven was deze 1 uur — en
vooral daarom niet, omdat by zwakke werking de tijd
allicht wat langer uitvalt dan met de concentratie
overeenkomt. In mijne proeven zou men na eene digestie
van 114 uur by een observatietijd van 1 uur reeds
tot de afwezigheid van lebenzym besloten hebben.

Zoo\'als later blyken zal meen ik echter aanleiding
te hebben de afneming der stremmende werking van
gedigereerde enzymoplossingen by neutrale reactie
op andere \'wyze te verkaren.

De vier reacties die Bang aangeeft ter onderscheiding
beider enzymen zyn: le het verschillend gedrag by ver-
dunnen, 2e by toevoegen van chloorcalcium, 3e ver-
schillende resistentie tegen verhitten en 4e tegenover
alkali.

Ik heb by oplossingen van kalfs- en varkensenzym
deze reacties herhaaldelyk nagegaan; het resultaat
laat ik hier volgen. Het lykt mij doelmatig aan de

hand van Bang\'s mededeeling elk afzonderiyk in de-
zelfde volgorde te bespreken en met zijne uitkomsten
te vergelyken.

Be zoogenaamde tijdwet, door Soxhlet voor chymo-
sine vastgesteld, mag volgens de meeste onderzoekers
als juist aangenomen worden.

Herhaaldelyk heb ik mij er van overtuigd, dat
inderdaad de stollingstyd evenredig is aan de ver-
dunning, mits de verdunning niet al te ver gaat. Dan
vond ik in twee opzichten eene afwyking ; als met de-
zelfde verdunning twee of meer proeven gedaan werden,
waa er vaak verschil in tyd, zoodat men de werking
niet meer als zoo nauwkeurig te bepalen raag be-
schouwen, als in sterkere oplossingen ; in de tweede
plaats werden de tijden dan wat langer dan te ver-
wachten was.

Stollingstüdon : 1\'/» min. 3 min. B\'/j min. 11\'/i min. 26 min.
Verdunning: onverdund 2X 4X öx 16 X
Zyn de atollingstijden zeer lang geworden, dan vindt
men ook niet meer het scherp waarneembare moment,
waarin het vloeibare mengsel zich afscheidt in een
coagulura en het heldere weieiwit, maar langzamer-
hand komen er vlokken en het kan geruimen tyd duren,
eerdat het komt tot volkomen stolling, die somtyds ook
geheel uitblijft. Het bepalen van den tyd ia in dezo
gevallen niet nauwkeurig mogelyk.

Parachymosine volgt nu naar Bang\'s mededeeling bij
neutrale reactio de tijdwet niet. In sterke oplossingen
zyn de tyden iets korter, dan de verwachte en by verder
verdunnen komt spoedig een moment, waar de tyden
naar verhouding veel te lang zijn of stolling geheel
uitblyft. Dit onderscheid heb ik ook gevonden tusschen
het enzym van kalveren en van varkens, zooals een
blik op bladzijde 40 en 41 duidelyk maakt.

lÜk te begrijpen. Dat het enzym door verdunnen met
water vernield zou worden is niet waarschijnlijk; dit
is door Bang aangetoond ; als hy verschillende hoe
veelheden onverdund enzym aan de melk toevoegde,
vond hg het zelfde. Hij verdunde met water. Men
zou dus kunnen- onderstellen, dat het zoutgehalte in
de minder verdunde proeven meer het optimum voor
parachymosine nabij kwam. In myne proeven bleef
het zoutgehalte constant en toch was het verschijnsel
niet minder duidelyk. Het schynt wel, alsof er een
bepaald stollingsvermogen aanwezig moet zijn om de
voorhanden hoeveelheid caseïne in den juisten tijd om
te zetten, want in alle drie kolommen (bladz. 40) ligt de
grens der juiste uitkomsten ongeveer by dezelfde tijden.
Voor dat stollend vermogen is dan by neutralisatie
met NaOH meer enzym noodig dan by neutralisatie
met CaCOj en het minst by zure reactie.

De varkensenzymoplossing, beoordeeld naar de
stolling by zure reactie, is 2 maal zoo sterk als die\'
van het kalfsenzym. Wordt ze 2 maal verdund.

dan is het stollend vermogen bij zure reactie gelijk,
bij neutrale reactie ± 2 maal zoo zwak. Bjj 4
maal verdunnen komt de tyd by neutrale reactie niet
meer met de concentratie overeen en by 8 maal ver-
dunnen is de tijd reeds zeer lang. De overeenkomstige
kalfsenzymoplossing geeft dan nog een stollingstijd
van 160—170 seconden en stremt ook by verdere ver-
dunning nog overeenkomstig de concentratie. Vat men
nu de stremming by neutrale vloeistof op als eene ver-
traagde werking van het zure enzym, dan volgt daar-
uit, dat deze vertraging bij het varkensenzym grooter
is, dan by het kalfsenzym. Dit stemt overeen met
hetgeen Bang vond met betrekking tot het alkali.
Parachymoslne is toch veel gevoeliger tegen alkali,
dan chymosine. Neutrale reactie is nu evenmin onver-
schillig voor het enzym. Men kan er zich toch ge-
makkelijk van overtuigen, dat de neutrale reactie op
den langen duur de werkzaamheid van het enzym
doet afnemen. Met dezelfde geneutraliseerde varkens
enzymoplossing, waarmee bovenstaande proeven ge-
daan werden, herhaalde ik 25 minuten na de neutra-
lisatie de eerste twee proeven. Voor de eerste vond
ik toen in plaats van 40 seconden, 50-d GO sec. en
70 sec. Voor de tweede SYj minuut. Evenzoo ver-
mindert de werkzaamheid als het varkensenzym met
CaCOs geneutraliseerd is. Een door 4 maal dialyseeren
gereinigde oplossing, geneutraliseerd met CaCOs deed
de melk stollen in 25 seconden. Een deel der geneu-
traliseerde oplossing bleef 5 uur bij kamertemperatuur
staan. De melk stremde met dezelfde hoeveelheid en-
zym nu niet in ly» uur. Verder heb ik herhaaldelyk
gevonden, dat by neutrale reactie, wanneer de op-
lossingen niet te sterk zyn, de uitkomsten niet altyd
heel prompt zyn. Neemt men bijvoorbeeld twee proeven
met dezelfde neutrale oplossing, dan dekken de uit-

komsten elkaar niet altyd. Ook is het niet hetzelfde of
men eene kleine quantiteit neutraliseert of eene groote,
al wordt er voor gezorgd, dat het alkali even voor-
zichtig en in minstens even groote hoeveelheid wordt
toegevoegd. Ik vond bijvoorbeeld, wanneer ik 273 cm®,
van eene oplossing neutraliseerde met 1,3 cm®, \'^/iq
NaOH een tijd van 15 minuten. Neutraliseerde ik
10 cm®, van dezelfde oplossing met 5,3 cm®. NaOH,
dan vond ik minuut.

Dit alles is moeilyk te rymen met een specifiek
bij neutrale reactie werkend enzym en wijst veel eer
op eene vertraging door de neutralisatie te weeg ge-
bracht. Het eerste onderscheid tusschen chymosine
en parachymosine zou dus herleid kunnen worden
tot een verschil in gevoeligheid voor alkalische resp.
neutrale reactie.

Ook de tweede door Bang aangegeven reactie ter
onderscheiding van chymosine en parachymosine, de
verschillende versnelling door CaClg te weeg gebracht
schynt my toe door mijne opvatting geheel verklaard
te kunnen worden. Bang geeft aan, dat de versnelling
door CaCIg voor parachymosine veel grooter is dan
voor chymosine. Heeft men eene oplossing van para-
chymosine en een van chymosine, die bij neutrale
reactie in denzelfden tijd melk doen stollen, dan zal
een gelyke hoeveelheid CaCl, den .stollingstyd van de
parachymosine veel meer verkorten dan die van de
chymosine. Naar hetgeen ik hierboven betoogd heb,
zyn evenwel chymosine en parachymosine-oplossingen,
die bij neutrale reactie de melk in denzelfden tyd doen
stremmen geenzins geljjk van concentratie, als men het
enzym gehalte berekent naar de werking by zure reactie.
De parachymosine-oplossing bevat meer enzym.

Laat ik mijn eigen proeven buiten rekening, dan
volgt dit ook uit de proeven van Bang zelf. Hy ver-

gelykt eene pepsine-oplossing met eene oplossing van
Barnekow\'s Löpe in verschillende verdunningen.

In proef 1 is de pepsine-oplossing sterker dan de
chyraosine-oplossing, in de volgende 3 proeven dus ook
en toch is in proef 3 de tyd voor de pepsine-oplossing 40,
voor de chymosineoplossing 17 min. Waar dus een
parachymosine-oplossing bij gelijken en somtyds zelfs
bij langer stollingstyd meer enzym bevat dan een
chymosine-oplossing, daar kan het geen verwondering
baren, dat het toevoegen van eene gelyke hoeveelheid
CaClj in de meer geconcentreerde parachymosine-op-
lossing grooter versnelling geeft, dan in de chyraosine-
oplossing. Men heeft deze uitkomst dan evenwol niet
zoo te formuleeren, dat CaClj de parachymosine-reactie
meer versnelt dan de chymosine-werking, maar dat
de werking van parachymosine bij neutrale reactie
trager is, dan die van chymosine.

Bang deelt verder moe, dat een kleine hoeveelheid
CaClj, die op chymosine geen versnellende werking
meer heeft, de parachymosine-reactie nog wel bevordert
en als grons geeft hy aan dat 0,02% CaClj in het
melk-enzym-raengsel op chymosine niet meer werkt,
op parachymosine nog wel. Dit heb ik voor myno
chymosine-oplossingen niet gevonden ; 0,02% CaClj en
zolfs minder veroorzaakte nog wel versnelling,\'zooals
de volgende cyfers doen zien. Hiervoor werd gebruikt
een oplossing van gezuiverd kalfsenzym, geneutrali-
seerd met \'Vio NaOH.

Ter vergelyking met eene door Bang vermelde proef
met zwakker enzymoplossing, waarbij de stolling 13
min. duurde en na toevoegen van 0,02% CaClj 12
minuten, werd dezelfde oplossing zoo veel verdund,
dat de melk in 12 min. stremde.

Herhaaldelyk heb ik deze uitkomsten gecontroleerd
en steeds grooter invloed van CaClj gevonden, dan
door Bang wordt opgegeven.

Het tweede verschil tusschen chymosine en para-
chymoslne kan dus tot het eerste worden teruggebracht.

Ik kom nu tot de 3o en 4o reactie, den invloed van
verhitten en van alkali op parachymosine en chymo-
sine. Voor een gemakkelyker overzicht zal ik deze twee
reacties te gelyk behandelen.

Bang deelt mede, dat chymosine zeer gevoelig is
voor verhitten. Een temperatuur van 70° is voldoende

het in korten tijd te vernielen by neutrale reactie;
bij zure reactie is het nog gevoeliger. Parachymosine
daarentegen wordt zelfs gedurende 10 minuten niet
door een temperatuur van 70° vernield, wel vermindert
de werkzaamheid er door. Door een temperatuur van
75° wordt ook de parachymosine vernield; chymosine
wordt zelfs na 1 min. verhitten tot 70? vernietigd.
Men mag de parachymosine-oplossing evenwel niet
geheel neutraüseeren, als gewoon lakmoes als indicator
wordt gebruikt, wel als de reactie met lakmoïde be-
paald wordt. Gebruikt men lakmoes, dan moet de
reactie zwak zuur blijven, ongeveer 0,05% HCl. Ik
heb nu wel lakmoïde gebruikt, maar daar dit zeer
weinig van het lakmoes verschilde, heb ik hoofdzakelijk
tegen lakmoes getitreerd, waarbij dan met de neutrali-
satie zoover werd gegaan, totdat het lakmoespapier nog
een schyntje van roode kleur vertoonde. Door enkele
tiénden cm^ kon dan de neutrale reactie bereikt worden,
zoodat de oplossing de neutrale reactie zeer naby was.
Dan werden in 2 reageerbuisjes elk 2 cm® afgemeten
en de buisjes in een bekerglas met water, dat op een
temperatuur van 70* gehouden werd, gedompeld ; door
eenig heen en weer bewegen werd gezorgd, dat de
oplossing zoo spoedig mogelyk de temperatuur van
het water aannam. De verhitting werd steeds 10
minuten voortgezet, teneinde aan de uitkomst grooter
zekerheid te geven. Dan toch is volgens Bang van
chymosine geen spoor over, terwyl de parachymo-
sine alleen wat verzwakt wordt. Na afloop werden
de buisjes afgekoeld, weer tot 37® verwarmd en de
8 cm\' melk toegevoegd.

Het 4o onderscheid beider enzymen bestaat hierin,
dat de parachymosine veel minder resistent is tegen-
over alkali, dan chymosine. Een alkali-gehalte van
0,01% vernielt het eerste in V» uur, het tweede

ondervindt er slechts geringen invloed van. Bang ver-
meldt nu de volgende proef:

Een geneutraliseerde pepsineoplossing en een ge-
neutraliseerd extract uit kalfsmagen werden elk in
2 deelen verdeeld en van beide de eene helft gekookt.
By 5 cm\' ongekookte parachymosine-oplossing werd
gevoegd 5 cm® gekookte chymosine-oplossing, en bij
5 cm® ongekookte chymosineoplossing, 5 cm® gekookte
parachymosine-oplossing. De mengsels deden eene gelyke
quantiteit melk in 5 minuten en 6 minuten stollen. Aan
beide werd alkali toegevoegd tot 0,01 % en na Vs uur
werd geneutraliseerd. Het mengsel met ongekookte para-
chymosine had zyne werking geheel verloren, het andere
coaguleerde melk in 5 min. Hy besluit dus, dat de
parachymosine vernield was, de chymosine intact
gebleven, doch laat er op volgen, dat in andere proeven
de parachymosine soms geheel vernield werd, soms
eerst na werking van 1 uur, duidelyk geschaad.
Wel was de invloed van het alkali steeds grooter dan
op de chymosine.

De inrichting van de proef was gebaseerd op de be-
doeling, voor beide enzymen volkomen gelijke condities
te scheppen. Bang vond immers^ zelf, dat oplossingen,
die Veel albumosen bevatten resistenter waren tegen
alkali dan meer zuivere. De albumosen beschermen
het enzym, waarschi^jnlyk door binding van het alkali,
voor vernieling. Meer of minder albumose in een van
beide oplossingen, zou dus tot foutieve uitkomsten
aanleiding geven. Dit trachtte hy nu te ontgaan door
de vermelde wyze van proefneming.

Ik moet daartegen evenwel aanmerken, dat een
gekookte enzymoplossing niet hetzelfde is, als een en-
zymoplossing, waarin alleen het enzym vernield is.
De andere bestanddeelen ondergaan den invloed van
het koken evenzeer. Ik vond by verhitten van chy-

mosine-oplossingen tot 70° by neutrale reactie gedurende
10 minuten, dat de oplossing soms sterk, soms
licht troebel werd, somtijds ook geheel helder bleef;
dat men dus door koken eene oplossing zou krygen
van vernield enzym en onveranderde bymengselen is
niet waarschynlijk en dit ontneemt veel van de
waarde aan de door Bang gevolgde methode.

Onderstelt men by voorbeeld, dat chymosine-oplossin-
gen een tegen alkali beschermende stof bevatten, para-
chymosine-oplossingen niet, en dat deze stof door
koken dit vermogen verliest, dan is daarmee het ge-
heele verschil verklaard.

Het is moeilyk in eene oplossing het enzym te
vernielen, zonder tevens groot gevaar te loopen, dat
de bijmengselen verandering ondergaan. Door verhitten
tot 80® by zure reactie gedurende ongeveer een uur
is het mij evenwel gelukt eeno chymosine-oplossing
hare stremmende werking te ontnemen, terwyl ze
een duidelyken beschermenden invloed tegen alkali be-
hield. Hiervoor gebruikte ik een filtraat van in 0.5 %
HCl gedigereerde kalfsmaag-mucosae. Na het verhitten
word geneutraliseerd. De vloeistof bleef by hot ver-
hitten en neutraliseeren volkomen helder, doch deed
in de gewone verhouding melk niet stremmen in S\'/s
uur. 12,7 cm\' dezer vloeistof werd gevoegd by 5 cm\'
eener zure oplossing van varkensenzym, en daarna werd
het mengsel geneutraliseerd met 2,3 cm\' »/,o NaOH.

Ter vergelyking werd 5 cm\' van hetzelfde varkens-
enzym verdund met 12,7 cm\' gedistilleerd water on
geneutraliseerd met 2,3 cm\' "/jo NaOH. Van beide
mengsels word do stollingstyd bepaald en de invloed
van 10 min. verhitten op 70° en van alkali nagegaan.
De neutralisatie was niet tot volkomen neutrale reactie
voortgezet, daar men volgens Bang voor de verhittinga
proef eene zwak zure reactie moet kiezen.

Voor de alkali-proef werd daarom eerst nauwkeurig
geneutraliseerd, wat bij de eene vloeistof bereikt werd
door 0,2 cm» NaOH, bij de andere door 0,3 c.rn»
NaOH toe te voegen aan 9 cm». Door 0.25 cm». 7io
NaOH werd aan de beide mengsels eene gelyke alkali-
citeit gegeven van ten naasten bij 0,01 "/o en na \'/j
uur staan werd dan het eene door 0,45 cm» "/k, HCl,
het andere door 0,55 cm» HCl terug gebracht tot
dezelfde byna neutrale reactie als te voren. Daar beide
mengsels verschilden in NaCl gehalte, werd nog een
derde gemaakt door 5 cm» varkensenzym-oplossing te
verdunnen met 12,7 cm» van eene NaCl-oplossing, die
overeenkwam met het geneutraliseerde kalfsmucosa
Altraat en dit mengsel aan dezelfde bewerking te
onderwerpen. De uitkomsten waren de volgende:

By verhitten gedroeg het met. water verdunde var-
kensenzym zich dus als parachymosine, natcevoegen
van verhitte chymosine oplossing, als chymosine. Ver-
dund met NaCl-oplossing begon de melk na 13 min.
vlokkig te worden, er kwam en stolsels in, maar tot vol-
komen stremming kwam het niet. Er.blykt dus niet
duidelijk of de verhitte chymosine-oplossing de para-
chymosine minder bestand deed zijn tegen verhitten, of
dat dit aan het hooger NaCl gehalte to wyten is. Uit latere
proeven blykt,dat de bestanddeelen van eene chymosine-
oplossing ook hier hoogstwaartchynlyk van invloed zyn.

Wat de resistentie tegen alkali betreft, gedraagt
het varkpnsenzym zich als parachymosine zoowel na

verdunnen met water als met NaCl oplossing. Toe-
voeging van verhitte chymosineoplossing oefent daaren-
tegen een belangrijken beschermenden invloed uit. Dat
deze beschermende eigenschap door verhitten tot
80° zou zyn ontstaan, is minder waarschijnlyk dan
dat zy door koken in Baiig\'s proeven zou zijn ver-
loren gegaan.

Ik heb verder niet Bang\'s methode gevolgd met ge-
mengde enzymoplossingen, maar eenvoudig by ver-
schillende kalfs- en varkensenzymoplossingen den in-
vloed van alkali en verhitten onderzocht.

Voor varkensenzym vond ik, dat het zich inderdaad
tegenover alkali en verhitten voordeed als parachy-
mosine. De volgende cyfers, gevonden met eene
oplossing van gezuiverd varkensenzym in 0,2o/(, HCl
geven dit duidelijk weer. Naar aanleiding van Bong\'s
opmerking, aangaande de mogelykheid, dat parachy-
mosine en pepsine identiek zouden zijn, werd ook de
invloed op het digereerend vermogen bepaald. De op-
lossing werd geneutraliseerd tot zeer zwak zure re-
actie, de stollingstijd bepaald, waarna 8 cm\' der ge-
neutraliseerde vloeistof werd aangezuurd met 2 cm\'
2% HCl. Nadat de vloeistof op de boven beschreven
wijze deels 10 min. aan een temperatuur van 70°,
deels aan een alkaligehalte van 0,01 »/o gedurende Va
uur was blootgesteld geweest, werd eveneens van
beide 8 cm\' aangezuurd tot 0,4% HCl, en hiervan
de digestie bepaald:

De stollingsproeven geschiedden als by de eerste
proef en werden alle dubbel genomen als controle.
De uitkomsten waren gelyk.

De invloed van verhitten en alkali op het dige-
reerend vermogen\'was volkomen evenredig aan die
op het stremmend vermogen. Na verhitten was de
stollingstyd immers nia^l zoo lang, de digestie 76
maal zoo gering, door alkali waren beide werkingen
O geworden.

Een andere proef gaf in zooverre andere uitkomsten,
dat hier de invloed van\'"; alkali, hoewel grooter dan
die van verhitten, niet zoo sterk was, als in de vorige
proef. Het digestie vermogen was evenwel daarmee
evenredig ook minder afgenomen.

In tegenstelling met Bang vind ik dus, dat geens-
zins door verhitten en alkali-inwerking kan aangetoond
worden, dat parachymosine en pepsine twee verschil-
lende enzymen zyn ; integendeel pleit de gelijke invloed
van beide op stollend en peptoniseerend vermogen
sterk^voor^de eenheid beider stoffen.

Wat het enzym uit kalfsmagen bqtieft, hier heb
ik verschillende uitkomsten verkregen. Werd eon fil-
traat van gedigereerde kalfsmaagmucosae gebruikt,
of een bij kamertemperatuur bereid extract daarvan,
dan bleek dit niet bestand tegen verhitten, veel beter
tegenjde] werking van alkali. Ter illustratie vermeld
ik een proef met extract uit kalfsmaag-slymvliezen.
370 grarn mucosae werden fijngehakt en eenige uren

bü kamertemperatuur met 1 L 0,4% HCL uitgetrokkeii.
Daarna werd gefiltreerd en het filtraat 24 uur gedialy-
seerd tegen stroomend water; het neerslag dat daarbü
ontstaan was werd door centrifugeeren verwijderden
de vloeistof aangezuurd tot 0,2% HCl. Na neutrali-
seeren met natronloog werd de stremmingstijd bepaald
en de invloed van verhitten en alkali onderzocht.

Deze oplossing gedraagt zich dus als chymosine;
anders was het met het kalfsenzym, als het op de
gewone wijze was afgezonderd en gereinigd. Dan werd
de invloed van alkali veel grooter, maar die van ver-
hitten tegelijk kleiner. Ten bewijze laat ik hier de
getallen volgen, verkregen met een door dialyse ge-
zuiverd kalfsenzym. Evenals bij de proeven met
varkensenzym werd ook hier de digestie bepaald :

Behalvo, dat dezo oplossing minder sterk werkte,
was er geen onderscheid met de vroeger vermelde
parachymosineproef. De digestie vermindering was
bijna volkomen evenredig aan het verlies aan stollend
vermogen. Ik heb deze proeven nu meermalen her-
haald met gezuiverd kalfs-enzym en telkens het zelfde
gevonden, mits de reiniging nauwkeurig geschied was.
Ik vermeld nog eenige getallen, die werden gevonden
met eene andere hoeveelheid\'door dialyse afgezonderd
kalfs-enzym.

Het gelukt nu niet altijd het kalfs-enzym op de
door mij gevolgde wijze dadelijk zeer rein te ver-
krijgen. Een met loodacetaat en ammoniak neerge-
slagen en volgens de gewone methode behandeld enzym,
gaf na de laatste dialyse tegen gedistilleerd water
een vrij groot neerslag, dat door centrifugeeren werd
afgezonderd en opgelost in 40 cm® 0,2% HCl. De
groote hoeveelheid neerslag in verhouding tot de ge-
ringe hoeveelheid HCl deed eene geconcentreerde op-
lossing verwachten en des te meer, omdat de vloeistof
bü het neutraliseeren een weinig troebel werd. De
stollingstijd bedroeg SVs min. en beantwoordde dus
niet aan de quantiteit opgeloste stof. Het was dus
zeker, dat het enzym vry sterk verontreinigd moest
zijn. Deze oplossing gedroeg zich nu tegenover ver-
hitten en alkali geheel als chymosine; hot digestie
vermógen bleek evenredig met de stremmende werking.

Na de vermelde proeven begon ik sterk te twyfelen
aan de juistheid van het door Bang aangegeven ver-
schil tusschen chymosine en parachymosine. Het had

er allen schyn van dat chymosine niet anders was,
dan verontreinigde parachymosine. Vooral het steeds
gepaard gaan van resistentie tegen alkali en gevoelig-
heid voor verhitten bij de ongezuiverde en het om-
gekeerde by de zuivere oplossingen deed het ver-
moeden voor de hand liggen, dat in de bijmengselen
de oorzaak van het verschil was te zoeken. Dat er
door de behandeling van het enzym, die vroeger uit-
voerig beschreven is, iets anders zou plaats hebben,
dan het verwyderen van verontreinigende stoffeo, is
niet aannemelijk vooral voor de lo portie enzym, die
door dialyse in het filtraat der gedigereerde slijmvliezen
wordt gepraecipiteerd.

Daar myne enzymbereiding evenwel van die van
Hang verschilde, heb ik ook een extract uit kalfs-
magen onderzocht. 350 gram fyngehakte slymvliezen
werden eenige uren met 1 L 0,4% HCl uitgetrokken
by kamertemperatuur. Door filteeren werd een heldere
vloeistof verkregen, die duidelijk chymosine-reactie
vertoonde.

De rest van het extract werd 2 dagen gedialyseerd
tegen stroomend water; er ontstond een neerslag, dat
werd afgezonderd door de centrifuge en opgelost in
een weinig 0,2% HCl. Deze oplossing werd 24 uur
gedialyseerd tegen gedistilleerd water on het neerslag
dat nu ontstaan was, opgelost in 0,2% HCl, geneutra-
liseerd on op de gewone wyze onderzocht.

Na verhitten. Na alkali behandeling.
Stollingstyd: 10 sec. 12\'/. min. geen stolling in 30 min.

Al moge het verhitten dit enzym ook nog belangryk
beschadigen, zoo neemt de werking toch veel minder
af, dan by hetzelfde enzym vóór het reinigen.

nog veel meer tegenover alkali de parachymosine sterk
genaderd. Het is ook zeer waarschynlyk, dat het en-
zym niet van alle bymengselen geheel bevryd werd,
zoodat men mag onderstellen, dat het er geheel mee
zou overeenstemmen, als men er in slaagde het ge-
heel van verontreiniging te ontdoen.

Het leb-praeparaat van van Hasselt en dat van
Hansen heb ik aan een zelfde onderzoek onderworpen.

Een hoeveelheid leb-oplossing van van Hasselt werd
24 uur gedialyseerd tegen stroomend water om de
zouten te verwijderen, daarna werd het enzym neer-
geslagen met verdund azyn-zuur en door centrifugeeren
afgescheiden; na uitwasschen met water en opnieuw
centrifugeeren, werd het neerslag opgelost in 0,2%
HCl en na eenig verdunnen en neutraliseeren onder-
zocht. Ter vergelyking werd ongezuiverde leb gebruikt,
10 maal verdund met water.

De gewone leb gaf dus chymosine reactie, na zui-
vering naderde zy tot de parachymosine. Op dezelfde
wijze behandeld, doch na het neerslaan niet uitge-
wasschen met water, vertoonde leb van Hansen wel
minder resistentie tegen alkali doch \'de gevoeligheid
tegen verhitten was gelyk gebleven. Een deel van
het in HCl opgeloste enzym werd nu 24 uur gedialy-
seerd tegen gedistilleerd water en nu kwam het met
parachymosine overeen. Ter vergelyking werd weer
met water verdunde leb gebruikt.

Ook deze handelspraeparaten verliezen dus door
reiniging hun chymosine karakter .tegenover alkali en
verhitten.

Daar nu de 3e en 4e reactie van Bang blyken te
berusten op bymengselen, die in de chymosine-oplos-
singen aanwezig zyn en de 2e reactie, zooals ik boven
aantoonde, tot de 1® herleid kan worden, blyft geen
ander onderscheid tusschen chymosine en parachy-
mosine over, dan het verschil in vermindering der wer-
king by verdunning der geneutraliseerde oplossingen.

Ik heb er reeds op gewezen dat neutrale reactie
voor het enzym evenmin onverschillig is als alkalische,
dat het onder sommige omstandigheden door neutrali-
satie veel van zyne werkzaamheid verliest. In het vol-
gende hoofdstuk zal ik nog eenige feiten hebben aan te
halen, die dit bevestigen. Pawlow vond, dat neutrali-
satie met NajCO, vernieling van het enzym ten ge-
volge had ; hij werkto mot hondemaagsap, dat weinig
bymengselen bevat.

Ik heb ook eenige keeren maagsap van den hond
onderzocht en vond, dat dit by goede digestie en
krachtige stremmende werking bij zure reactie en na
neutralisatie met CaCO,, zeer geringe werking ver-
toonde, als het met NaOH werd geneutraliseerd. ..

Becker vond, dat zijn enzym minder werkte, als
hij het neutraliseerde en aan aangezuurde melk toe-
voesde, dan wanneer hy het zure enzym aan gewone
Hofm. Beitrilgo Bd. VII, 8. 115.

melk toevoegde; zelfs kon hij vermindering der werking
constateeren, als hy hfi»- sap eerst neutraliseerde en
daarna weer zuur maakte. Hij schrijft dat toe aan
gevoeligheid van het maagsap voor alkali. Petry kon
door digestie met NajCOg zijne leb-oplossingen minder
werkzaam maaken. Dit alles wijst er op, dat niet
alleen overmaat van alkali, maar zelts neutrale
reactie schadelyk is voor het enzym. Dat een alkali-
gehalte van 0,017o, dat dus de grens van zuur en
alkalisch maar even overschrijdt, onder sommige omstan-
digheden het enzym in Yg uur totaal onwerkzaam
maakt, heb ik hierboven aangetoond. Op den aard en het
verschil van de werking van het alkali zal ik niet
trachten nader in te gaan. Bij de gebrekkige kennis
van de bestanddeelen der enzym-oplossingen zou ik
my met gissingen moeten tevreden stellen. Dat
evenwel de bestanddeelen, die de vloeistof behalve
het enzym in oplossing houdt, van groot belang zijn
voor de uitwerking van bet alkali, dat meen ik te
hebben aangetoond, en daaruit meen ik met eenig
recht te mogen afleiden, dat ook bij de toevoeging
van alkali, die niet verder gaat, dan do neutrale reactie,
de bymengselen het verschil verklaren, dat door Bang
werd .gevonden tusschen chymosine en parachymosine
by neutrale reactie. Dat het mij niet gelukt is eene
oplossing van kalfsenzym zoo zuiver te bereiden, dat
zij ook in dit opzicht zich als parachymosine voordeed,
dat meen ik te mogen toeschryven aan de onvol-
komenheid der bereidingswijze, die niet toeliet hot
kalfsenzym geheel van zyne bymengselen te ontdoen.
Wel kan ik er op wyzen, dat mijne praeparaten zich
niet, zooals die van andere onderzoekers, tot zeer
vergaande verdunning aan de tydwet hielden. Maar
zoo groote gevoeligheid voor alkali als by het varkens-
enzym, heb ik niet bereikt.

De overeenkomst van het stremmend en digereerend
enzym tegenover verhitten en alkali en de verandering,
die het weerstandsvermogen onderging door het
zuiveren der oplossing leidden mü er toe nader te
onderzoeken, hoe het enzym zich gedraagt tegenover
neutraliseeren voor- en nadat het eenigen tijd
gedigereerd is.

Over (le Vermindering van proteolytisch en melk-
Htreminend Enzym door Digestie.

Hammarsten toonde aan, dat zure chymosine oplos-
singen, die bij 37—40\' gedigereerd werden, na eenigen
tyd het vermogen verloren, na neutralisatie met
alkali melk te doen stremmen, terwyl eiwit by zure-
reactie er nog door werd opgelost. Hy besloot daaruit
dat de leb vernield was, de pepsine niet. Later legde
Schmidt Nielsen met een kleine wijziging der proeven
er nogmtuils den nadruk op, dat hierin een bewys
is gelegen, dat pepsine en leb twee afzonderlyke
stoffen zyn.

Zooals ik in het vorige hoofdstuk heb meegedeeld
vond ik, dat onreine en gezuiverde enzym-oplossingen
uit kalfsmagen een verschillend weerstands vermogen
bezitten tegenover alkali, en dat do oorzaak hiervan
gelegen is in eene stof, die het enzym tegen de schade-
lyke werking beacliermt. Do minder sterke werk-
zaamheid van varkens-enzym dan van kalfs-enzym
bij neutrale reactie meende ik hieraan te mogen too-
schryven, dat het kalfs-enzym nooit geheel van deze
beschermende stof bevrijd werd. Do mogelijkheid lag
nu voor de hand, dat deze stof door digestie vernield

kon worden, zoodat het enzym in eene oplossing, die
aan digestie werd onderworpen, niet alleen afnam in
qnantiteit, maar ook gevoeliger werd voor neutrali-
seeren. Ik heb nu getracht deze ondersteüing aan de
waarneming te toetsen en onderzocht daartoe in
verschillende phasen der digestie het stollend ver-
mogen bij neutrale reactie en de digereerende werking
van de zure oplossing en van de geneutraliseerde op-
lossing, nadat zy weer was aangezuurd. Werd het
enzym door digestie inderdaad gevoeliger voor neutrali-
seeren, dan moest dit ook merkbaar zijn in de digestie-
proef met de oplossing die geneutraliseerd geweest
was. Ik maakte eene oplossing van gezuiverd kalfs-
enzym ; de eerste (dialyse-enzym) en tweede portie
(loodacetaat-enzym) werden samengevoegd en opgelost
in 0,27o zoutzuur. Deze vloeistof werd in twee deelen
verdeeld; het eene deel werd bij 37° in de broedstoof
gedigereerd, het andere by lage temperatuur bewaard.

Tabel I A geeft de cyfers voor de gedigereerde
oplossing. Hier, evenals in alle volgende proeven, werden
de stollingstyden telkels twee maal bepaald, ten einde
de uitkomsten zoo veel mogelyk te controleeren;
leverden zy verschil op, dan werden beide ingevuld,
steeds werd 8 cm» melk gebruikt en 2 cm® enzym
oplossing. De eerste bepalingen op 14 April geschiedden,
voordat do vloeistof in de stoof werd geplaatst. Op
de dagen, in kolom 1 aangegeven, werd telkens eene
hoeveelheid van de vloeistof geneutraliseerd en met
gedistilleerd water tot het dubbele volume aangevuld.
Kolom 6 geeft aan hoeveel telkens werd genomen.
Met de geneutraliseerde vloeistof werden dan de
stollingsproeven gedaan, die in kol. 2 zyn opgeteekend.
Van 9 cm® neutrale vloeistof, aangezuurd met 1 cm®
27o zoutzuur werd de digereerende werking onderzocht.
Deze vindt men in kol. 3.

Ter vergelyking werd de proteolytische werking
van het enzym bepaald in dezelfde phase der digestie,
doch niet geneutraliseerd (kol. 4). Hier werd gebruikt
\'IV2 cm\' zure enzym-oplossing, verdund met 5Yj cm®
0,2% zoutzuur, overeenkomstig kol. 3. Voor kol. 5
werd eveneens de zure enzym-oplossing gebruikt, doch
hier werd behalve het enzym- en HCl- ook het NaCl
gehalte gelyk gemaakt met dat van de proef in kol.
3. In kol. 7 vindt men de stremmingstyden met eene
10 maal verdunde leb-oplossing van van Hasselt, om
de melk op de verschillende dagen te controleeren.

Vergelykt men nu kol. 2 met kol. 4, dan ziet men in de
eerste dagen geen sterke vermindering der lebwerking
in verhouding tot de vermindering der digestie. Integen-
deel, neemt de proteolytische werking een weinig meer
af, dan de stremmende. Op 22 April was dit plotseling
veranderd; terwyl de pepsine-werking onbelangrijk
was verminderd na do vorige bepaling, vorderde
de stremming 4 maal zooveel tyd. Dit is moeilijk te
rijmen met de voorstelling van Hanunarsten. Als de
leb door digestie vernield werd, zou men toch ver-
wachten, dat dit geleidelijk van het begin af plaats
had en niet eerst ongeveer evenredig met de auto-
digestie der pepsine en na verloop van eenige dagen
veel meer. Het verschijnsel laat zich daarentegen zeer
goed verklaren, als men aanneemt, dat het enzym
tydens de digestie door vernieling eener beschermende
substantie gevoeliger wordt voor neutraliseeren. De
gebruikte oplossing bevatte dan veel van deze stof,
zoodat eerst na eene digestie van 8 dagen zooveel was
vernield, dat de rest niet meer. in staat was den
schadelijken invloed vaii het neutraliseeren tegen te
giuin. Des to meer wordt men van de juistheid dezer
verklaring overtuigd, als men kol. 3 vergelijkt met
kol. 4. Gedurende de eerste dagen had het neutrali-

seeren weinig invloed op de proteolytische werkzaam-
heid van het enzym, op 20 April was het verschil
der uitkomsten nog gering en 2 dagen later in over-
eenstemming met de sprongsgewijze vermindering van
het stremmend vermogen, vindt men voor het enzym dat
geneutraliseerd is geweest 8 maal geringer digestie,
dan bij het andere, dat deze bewerking niet heeft
ondergaan. Dat het bij de neutralisatie ontstaande
NaCl niet de oorzaak is van de geringe digestie
blijkt uit de getallen van 28 April kol. 3 en 5. Wel
werd de digestie door toevoeging van NaCl gestoord,
maar de werking van het geneutraliseerde enzym was
toch 9 maal kleiner, dan van de niet geneutraliseerde,
oplossing die evenveel NaCl bevatte. Tusschen 20 en
22 April was dus het gehalte aan beschermende stof
zoo gering geworden, dat het alkali het enzym, zoowel
het proteolytische, als het stremmende kon aantasten.
Als dit nu zoo is, dan moet men vinden, dat een niet
gedigereerde enzym-oplossing beter bestand is tegen
neutraliseeren met alkali, ook wanneer zy te voren
met zoutzuur verdund wordt. Het pepsine gehalte
der gedigereerde oplossing was op 23 April ongeveer
tot Vc afgenomen. Dienovereenkomstig werd dat deel
van -de enzym-oplossing, dat by lage temperatuur be-
waard was, G maal met 0,27o zoutzuur verdund en
op dezelfde wyze onderzocht als de gedigereerde op-
lossing; de uitkomsten vindt men in tab. I B. De
proteolytische werking van het zure enzym stemt
ongeveer overeen met die van de gedigereerde oplossing
op 23 April en in de proef, waar NaCl is toegevoegd
is zy geheel gelijk. De invloed van neutraliseeren op
het digestie vermogen is echter veel geringer, en in
overeenstemming daarmee is de stremmingstijd by
neutrale reactie veel korter. Het proteolytisch, zoowel
als het ^stremmend-enzym is iu deze oplossing dua

Een nieuvsre reeks proeven (Tabel II) gaf even
duidelüke uitkomsten. De bepalingen werden hier
vollediger gedaan en ook de verandering van de
melkstremmende werking by zure reactie onderzocht.
Op 1 Mei werd de oplossing in de broedstoof gezet, nadat
eerst een bepaling gedaan was. Op de dagen in kol.

I aangegeven, werd 10 cm\'van de vloeistof afgemeten,
geneutraliseerd met "/m NaOH-oplossing en met ge-
distilleerd water tot het dubbele volume verdund
(zio kol 13). De neutrale vloeistof werd dan in 4 porties
verdeeld ; twee van 2 cm\' waarmee de stremmingstijd
by neutrale reactie werd bepaald (kol 2), een van 9
cm\' die na aanzuren met 1 cm\' 2o/o HCl moest dienen
voor de digestie proef (kol. 5) en een van 6 cm\', die
door 0,3 cm\' 2% HCl oplossing gebracht werd op
eene aciditeit van O,!^- Met de laatste portie werd
dan de stremming by zure reactie bepaald, waarvoor
in 2 prooven 2 cm\' aangezuurde oplossing werd ge-
bruikt (kol. 3) in 2 andere 0,4 cm\', verdund met 1,6 cm\'
gedistilleerd water (kol. 4). Do getallen van kolom
6, 7 en 8 stollen voor de werking der zure enzym-
oplossing na toevoeging van zooveel NaCl als do
ovoreenkomatigo geneutraliseerde oplossing bevatte.
Do vloeistof word daartoe 2 maal verdund met eene
NaCl oplossing, die per cm\' 2 maal zooveel keukenzout
bevatte als do geneutraliseerde enzym-oplossing. Voor
de stolling werd dan gebruikt 2 cm\' en 0,4 cm\' ver-
dund met 1,6 cm\' water (kol 6 en 7); voor de digestie
9 cm\' waaraan was toegevoegd Va cm\' Ü,27o zoutzuur
on Va cm\' 27o zoutzuur, (kol. 8). In kolom 9, 10 en

II werd alleen het enzym- on zuurgehalte gelyk ge-
maakt door toevoeging van water, reap. zoutzuur. In
kol. 9 word gebruikt 1 cm\' oplossing 1 cm\' wator,

in kol. 10, 0,2 cm» oplossing -j- cm» water, en in
kol. 11, 4V3 cm» oplossing -f ^V^ cm» 0,20/0 zoutzuur.

Door deze inrichting der proeven kon ik nu beoor-
deelen in verschillende phasen der digestie, hoe het
gesteld was met de stremmende werking by neutrale
reactie, by zure reactie nadat de oplossing geneutrali-
seerd geweest was en bij zure reactie met en zonder
toevoeging van NaCl. Voor de proteolytische werking
kon ik dezelfde vergelijking maken. In kolom 2, 5, 8
en 11 ziet men weer hetzelfde als in tabel I; de
leb werking by neutrale reactie neemt gedurende de
eerste 3 dagen af evenredig met de pepsinewerking
by zure reactie, onverschillig of er al dan niet NaCl
is toegevoegd en of de oplossing eerst geneutraliseerd
is geweest. Na 5 dagen digereeren houdt de even-
redigheid van kolom 2 met kol. 8 en 11 op, met kol. 5
duurt ze nog voort.

Uit kolom 8 en 11 ziet men, dat het toegevoegde
keukenzout de proteolytische werking ongeveer tot
de helft vermindert, uit kolom 5 en 8, dat neutralisatie
gedurende de eerste drie dagen geen anderen invloed
op het digereerend enzym heeft, dan die welke af-
hankelijk is van het ontstaande keukenzout. Na 5 dagen
digéreeren, overeenkomstig de sterke vermindering
van de stremmende werking, doet de neutralisatie
zich ook op het digereerend enzym veel meer gevoelen.
De verklaring, die ik bij tabel I gaf, geldt ook hier.
Dat de termijn, gedurende welken het neutraliseeren
weinig invloed heeft in de eerste reeks 6 dagen be-
droeg en hier drie dagen, leidt tot de gevolgtrekking,
dat in de hier gebruikte oplossing minder beschermende
stof aanwezig was dan in de vorige.

Vergelykt men nu ook de stremmende werkiug by
zure reactie in de verschillende phasen der digestie,
dan ziet men zoowel by de sterke (kol. 3, 6 en 9;

als bij de zwakkere concentratie (kol. 4, 7 en 10), dat
de toevoeging van keukenzout den stollingstyd niet veel
verandert, dat neutralisatie daarentegen de werking
belangrijk vertraagt, wanneer het enzym eenigen tijd
gedigereerd is. Dit stemt dus overeen met hetgeen
voor de proteolytische werking werd gevonden.

Voor tabel III A zijn de proeven weer op dezelfde
wyze ingericht als voor tabel II; alleen werd in kol.
4, 7 en 10 een sterker concentratie gebruikt. De uit-
komsten zijn in overstemming met hetgeen te voren
besproken werd.

Overeenkomstig de wijze, waarop Schmidt Nielsen
zijne proeven inrichtte, werd een deel van dezelfde
oplossing in ijs bewaard; hiervan werd telkens 5 cm\'
geneutraliseerd met 2,6 cm» "/k, NaOH oplossing en
door toevoegen van 2,4 cm\' gedistilleerd water gebracht
op een volume van 10 cm\' (kol. 13 B). Deze neutrale
vloeistof werd dan met eene overeenkomstige keuken-
zoutoplossing 2, 3 en G maal verdund, (kol. 1) en
voor de proeven gedeeltelyk weer aangezuurd en
gebruikt in dezelfde verhoudingen als de geneutrali-
seerde gedigereerde oplossing, van tabel III A. Voor de
proeven in kolom 6 tot 11 werd de enzym-oplossing
in dezelfde verhouding verdund met 0,2% zoutzuur,
en behandeld als de overeenkomstige gedigereerde
enzym-oplossing. By vergelyking van tabel III A on
B ziet men evenals in tabel I dat de neutralisatie
weer veol grooter invloed heeft op het gedigereerde
enzym, dan op het enzym in de verdunde oplossing,
zoowel op de stremmende als op do proteolytische
werking.

Een verschynsel verdient nog nadere bespreking.
Als de digestie lang geduurd heeft, eu de tyden voor
de stremming by neutrale reactie zeer lang geworden
zyn, ziet men dat de digestie-proeven met geneutrali-

seerde en weer aangezuurde enzym-oplossing naar
verhouding te hooge cyfers geven (tabel II 8 Mei en
vooral tabel III 3 Juni.) Dit laat zich wel verklaren.

De proteolyse is zeer gering en de oplossing van eiwit
in de buisjes van Mett geeft dus hoogst waarschijnlyk
niet geheel nauwkeurig de enzym-concentratie weer;
eveneens zal de stremmingstijd bij zoo zwakke lebwer-
king allicht een te langen tijd vorderen. Door Faiolow
is er reeds op gewezen dat men bij verdunde oplossingen
in de stremming van melk en de oplossing van eiwit
geen even gevoelige reacties heeft voor het aantoonen
van de enzymconcentratie. Had ik fibrine gebruikt in
plaats van buisjes met gestold kippenei wit, dan zou
de onevenredigheid waarschynlijk nog meer in \'toog
zyn geloopen. Men mag nu niet uit het oog verliezen,
dat de geneutraliseerde oplossing voor de digestie-
proef weer werd aangezuurd ; er verliepen nooit meer
dan enkele minuten tusschen het bereiden der neutrale
oplossing en het aanzuren; het is dus zeer waar-
fecbynlijk, dat het aangezuurde enzym minder van den
scbadelyken invloed van het neutraliseeren ondervond-
dan het deel, dat voor de stremming bij neutrale
reactie werd bestemd. Volgens F,idd gaat immers aan
de vernieling door alkali een reparabele stoornis vooraf.

Zoo kan ook verklaard worden dat Schmidt Nielsen
uitkomsten verkreeg, die hem deden besluiten tot de
dualiteit van pepsine en chymosine. Hij verdeelde eene
geconcentreerde oplossing van kalfsmaag-enzym in twee
deelen, het eene deel werd gedigereerd, het andere
in ijs bewaard. Wanneer nu de gedigereerde-oplossing
genoeg van haar stremmend vermogen by neutrale
reactie had verloren, werden beide oplossingen ge-
neutraliseerd. De niet gedigereerde werd zooveel ver-

dund, dat zij in denzelfden tyd (4-6 uur) melk deed
stollen, als de gedigereerde oplossing. , ,

Van beide neutrale vloeistoffen werd dan een deel
aangezuurd tot dezelfde aciditeit en het stollend ver-
mogen met fibrinevlokken bepaald. Hy vond dan, dat
de gedigereerde oplossing in veel korter tyd de fibrine
oploste, dan de niet gedigereerde, en daaruit besluit
hy, dat door de digestie meer leb werd vernield, dan
pepsine.

Na hetgeen hierboven gezegd is, meen ik, dat dit
zoo verklaard kan worden; het gedigereerde enzym
wordt door neutraliseeren minder werkzaam, doch
door daarop volgend aanzuren wordt nog een deel
behouden, dat in staat is eene fibrinevlok in vrij
korten tyd op te lossen, terwijl in de niet gedigereerde
oplossing, waar het enzym door neutralisatie minder
wordt geschaad, zoowel de stremmende, als de
proteolytische werking door de verdunning in gelyke
mate afnemen.

De juistheid dezer verklaring kan ik uit myne cyfers
aantoonen. Tabel Hl A en B, waar de proeven werden
ingericht zooals die van Schmidt Nielsen, geeft ook
dezelfde uitkomsteo. Kiest mon de getallen van 31
Mei, dan vindt men, dat do lebworking by neutrale
reactie ongeveer tot V; is afgenomen, wordt de op-
lossing weer aangezuurd, dan digereert zy 1,1. Volgens
Schmidt Nielsen moet men dus de niet gedigereerde
oplossing 7 keer verdunnen. Daarvoor kan men uit
tab. Hl B de 6 malige verdunning nemen, hier was
de stollingstyd 10 minuten, de digestie 0,49.

Volgens Schmidt Nielsen zou men dus concludeoron,
dat de gedigereerde oplossing by byna gelijken stollings-
tyd ruim 2 maal meer pepsino bevatte dan do ver-
dunde. Vergelykt men nu ook de getallen van kolom
11 A, dan ziet men, dat de pepsine-werking eigenlijk

niet 1,1, maar 4,2 bedroeg. Het getal 1.1 wasslecbts
afhankelijk van het neutraliseeren. De verdenking
ryst dus, of\'het getal 13 van kol. 2 A ook niet voor
een groot deel is toe te schrijven aan de neutralisatie.
By de verdunde oplossing is de invloed van het neu-
traliseeren kleiner (1,21 en 0,49) en zooals uit kol.
8 B blijkt byna geheel te stellen op rekening van
het ontstaande keukenzout, wat bij de gedigereerde
oplossing niet het geval is. Ik besluit hier dus uit,
dat men uit de werking der geneutraliseerde gedige-
reerde en der geneutraliseerde verdunde oplossing in
het geheel geen conclusie mag trekken omtrent de
afneming van het stremmend en digereerend enzym
door digestie.

Gaat men omgekeerd te werk en maakt men de proteo-
lytische werking der niet gedigereerde oplossing door
verdunnen met zoutzuur gelyk aan die van de
gedigereerde oplossing, dan vindt men het vol-
gende: Op 31 Mei was het pepsine-gehalte tot de
helft verminderd (kol. 11 A). Werd de niet gedigereerde
onlossing 2 maal verdund met 0,2% zoutzuur, dan
vond ik ook een digestie van 4,41 (kol. 11 B). Inde
gedigereerde^ en de verdunde oplossing is dus het
pepsine-gehalte met zekerheid gelyk. In de overeen-
komstige geneutraliseerde oplossingen vindt men voor
de verdunde oplossing sterker digestie en stolling,
dan voor de gedigereerde. Dat er geen evenredigheid
is (voor de digestie is de verhouding Vai.voor de stolling
V4) schrijf ik, zooals ik reeds zeide, hieraan toe, dat de
oplossing voor de stremmingsproef niet meer wordt
aangezuurd, wat voor het gedigereerde enzym van
meer beteekenis is dan voor het niet gedigereerde.

Hiermede meen ik dus aangetoond te hebben, dat
Schmidt Nielsen niet heeft bewezen, dat pepsine én
chymosine twee verschillende stoffen zyn.

Ook voor het varkens-enzym heb ik onderzocht,
welke verandering het stremmend en digereerend ver-
mogen door digestie ondergaat. Daar ik uit het onder-
zoek over chymosine en parachymosine wist, dat
varkens-enzym zeer gevoelig is voor neutraliseeren,
ben ik hier op eenigszins andere wijze te werk gegaan.

Ik bereidde eene geconcentreerde oplossing van ge-
zuiverd varkensenzym in 0,2% zoutzuur, en plaatste

ze in de broedstoof. Op verschillende tijden zooals
tabel IV kolom 1 aangeeft, werd 10 cm\' van de op-
lossing genomen en hiervan de digestie in 5 uur
bepaald, (kol. 6). Voor de stremming bij zure reactie
werd 1 cm® oplossing verdund met 1 cm® water, en
als gewoonlyk na verwarming met 8 cm® melk gemengd,
(koh 5). In 3 andere buisjes werd elk 2 cm® af-
gemeten. Twee dezer buisjes werden met een kleine
overmaat gepulveriseerd calcium-carbonaat geneutrali-
seerd ; een er van werd 1 minuut in \'t waterbad gezet
en dan de melk er bij gegoten (kol. 2) ; het andere
bleef na de neutralisatie Vi2 uur bij kamertemperatuur
staan, waarna het eveneens 1 minuut verwarmd werd
en met melk voorzien, (kol. 3). Het derde buisje
diende als controle en bleef Va uur by kamertempera-
tuur staan, daarna werd het geneutraliseerd en na 1
minuut in \'t waterbad met melk gemengd (kol. 4). Er
werd altyd zorg voor gedragen, dat er juist 1 minuut
verliep tusschen het toevoegen van CaCOj en het
bij gieten der melk.

Evenals bij het kalfs-enzym werden alle proeven
dubbel genomen. De buisjes met geneutraliseerde op-
lossing bevatten tweemaal zooveel enzym, als die
waarmee de stolling by zure reactie plaats vond. Daar
het er alleen om gaat de relatieve vermindering van \'
het enzym-gehalte uit de verhouding der tyden by de
verschillende bepalingen na te gaan en te vergelijken
met de vermindering van het digereerend enzym, doet
dit overigens niets ter zake. Uit tabel IV kon ik dus
beoordeelen, het afnemen van het digereerend vermogen,
van het stremmend vermogen by zure en neutrale
reactie en de verandering, die het enzym in ver-
verschillende phasen der digestie onderging door Va
uur staan bij neutrale reactie.

geven, wanneer het digereerend enzym, ongeveer tot
Vj, Vs enz. was afgenomen. Vergelijkt men op deze
plaatsen de stollingstyden van kol. 5, dan ziet men,
dat deze toenemen in te naasten by omgekeerde
evenredigheid met de getallen voor de digestie. Uit
het geheele beloop van kol. 5 en 6 mag men dus
besluiten, dat digereerende en stremmende werking
bij zure reactie gelijkelyk afnemen. Van 1 Maart af
houdt de evenredigheid op ; men is hier weer gekomen
aan de grens, waar de enzym-oplossing te zwak wordt
om in de verhouding 2:8 met genoegzame nauw-
keurigheid melk te doen stremmen, om de uitkomst
te mogen vergelijken met hetgeen de digestieproef
oplevert. Tegelijkertijd gaan de uitkomsten der beide
stollingsproeven van elkaar verschillen.

De tyden, die werden gevonden voor het geneu-
traliseerde enzym vertoonden aanvankelijk eveneens
evenredigheid met het afnamen van het digereerend
enzym. Do evenredigheid houdt hier echter eerder op,
(kol. 2.) on op 5 Maart was het stremmend enzym
by neutrale reactie niet goed meer aan to toonen, bij
zure reactie nog wel, terwijl er tevens nog goed waar-
neembare digestie phuits vond. Uit kol 3, ziet men,
dat het enzym in den eersten tyd, als do oplossing
nog geconcentreerd is, weinig verandert door Vj
staan by neutrale reactio; hoo meer de concentratie
afneemt des te grooter wordt de invloed van de
neutraio reactie. Dat inderdaad in den invloed dor
neutrale reactie gedurende Va um" oorzaak der
verminderde werking is te zoeken, bewyzen de proeven,
waarin het enzym na Va uur staan by kamertempera-
tuur werd geneutraliseerd, (kol. 4). Neutraliaeeren
heeft in verdunde oplossingen eon schadelijken invloed
op de enzymwerking. Dit verklaart voldoende, waarom
do stremmondo werking by neutrale reactie eerder

onevenredig wordt met de proteolyse dan bij zure
reactie en eerder geheel verdwynt, dan de digereerende
werking. Bewyzend voor het bestaan van een afzon-
deriyk enzym, dat by neutrale reactie werkt, zooals
Hammarsten zich voorstelde, is dit verschynsel dus niet.

By het kalfsenzym vond ik, dat de nadeelige invloed
van neutraliseeren met alkali op de gedigereerde op-
lossing moest worden toegeschreven aan de vernieling
eene stof, die het enzym beschermt. Bij het varkens-
enzym is bij neutralisatie met calcium-carbonaat een
dergelyke stof niet in het spel.

Dit bewijst tabel V. Het eerste deel A is geheel
ingericht als tabel IV. Een deel van de oplossing werd
niet gedigereerd, maar in verschillende verhoudingen
met 0,2% zoutzuur verdund: B. Van elke verdunning
werd 2 cm\' direct na neutralisatie met melk gemengd,
en 2 cm\' na Va "ur staan by neutrale reactie. Men
ziet hier precies hetzelfde als bij de gedigereerde op-
lossing ; het enzym in do geconcentreerde oplossing
ondervindt geen of weinig invloed van de neutrale
reactie; hoe meer de oplossing verdund wordt, des te
meer wordt de werking er door benadeeld. Daar de
verdunde oplossing zich zoo geheel gelyk gedraagt
als de gedigereerde kan men moeilijk blijven aannemen,
dat door digestie eener enzym-oplossing moer leb dan
pepsine vernield zou worden.

Om my geheel te overtuigen heb ik de onderzoekings-
methode van Schmidt Nielsen eenigszins gewyzigd ook
op het varkensenzym toegepast. Een oplossing, die
na neutralisatie met CaCOj melk deed stremmen in
5 seconden, by zure reactie 2 miuil verdund met water,
in 5 seconden en in 5 uur een digestie vertoonde
van 11,5G werd gedeeltelyk in de stoof gedigereerd,
gedeeltelyk bü lage temperatuur bewaard. Na 11 dagen
digereeren was de stollingstyd van het met CaCO,

geneutraliseerde enzym 80 seconden. Een hoeveelheid
niet gedigereerde oplossing werd nu zooveel met 0,27o
zoutzuur verdund, dat zy, geneutraliseerd, melk in
denzelfden tijd deed stremmen. Van beide oplossingen
werd nu ook de stremming bij zure reactie en de
digestie bepaald:

De proef leert, dat er na 11 dagen digereeren niet
meer melkstremmend enzym is verloren gegaan, dan
pepsine.

Een tweede proef, geheel op dezelfde wyze ingericht,
gaf het volgende: de oplossing, waarvan werd uitge-
gaan, deed de melk stremmen in ongeveer 5 seconden
na neutralisatie met CaCOg, by zure reactie 2 maal
verdund met water in minder dan 5 seconden ; de
digestie was in 5 uur 4,6 m.m. Een deel van de
oplossing werd gedigereerd en na 11 dagen vergeleken
met het gedeelte, dat bij lage temperatuur was be-
waard en ongeveer 5 maal verdund met 0,2% zoutzuur:

De oplossing werd verder gedigereerd. Na 10 dagen
kon ik met geneutraliseerd enzym den stollingstijd niet
goed meer bepalen. In enkele proeven ontstond strem-
ming na eenige minuten, in andere nog niet in ,10
minuten. Bij zure reactie werkto ze nog goed. Do niet
gedigere9rde oplossing werd nu met zoutzuur zooveel

(11 maal) verdund, dat zij by zure reactie in den-
zelfden tyd melk deed stremmen als de gedigereerde.

Dat in deze proef by langer stollingstijd ongeveer
dezelfde digestie werd gevonden als by de bepaling
na 11 dagen digereeren, mag hieraan worden toege-
schreven, dat by de laatste andore, versch gemaakte
eiwitbuisjea werden gebruikt.

Pawlow had dus wel gelyk, toen hij beweerde, dat
de methode van Hammarsten, om door digestie met
zoutzuur lebvrye pepsine-oplossingen te bereiden, slechts
schynbaar haar doel bereikt en dat men iu het ueu-
traliseeren de oorzaak van de vermeende scheiding der
enzymen heeft te zoeken. Hoe het mogelijk was, dat
de neutralisatie tot deze verkeerde voorstelling aan-
leiding gaf, daar is hij niet nader op ingegaan. Dit is
naar ik meen uit boven vermeld onderzoek duidelijk
geworden.

De resultaten van mijn werk kunnen ten slotte
in de volgende besluiten worden samengevat:

P. Hot door Bang ontdekte onderscheid tusschen
chymosine en parachymosine berust niet op verschil-
lende eigenschappen dezer enzymen, maar op do ajui-
wezigheid van eene stof, die de chymosine verontreinigt
en in de parachymosine niet of in veel geringer mate
voorkomt. Door reiniging kan men uit chymosine een

eazyin bereiden, dat de eigenschappen van parachymo-
sine bezit of althans sterk daartoe nadert.

2®, De onderstelling van Bang, dat men door ver-
hitten der enzymoplossing tot 70° kan bewyzen, dat
parachymosine en pepsine twee verschillende stoffen
zijn, is niet juist. Integendeel pleit de gelyke invloed
van verhitten en van de werking van 0,01% alkali
gedurende Vs uur op het stremmend en digereerend
vermogen der oplossing voor de eenheid van proteo-
lytisch en stremmend enzym.

3°. Wanneer het enzym door dialyse uit eene zure
oplossing wordt gepraecipiteerd, is in het neerslag
geen verandering in de verhouding van digereerende
en stremmende werking waar te nemen.

4". Door kippeneiwit wordt zoowel het proteolytisch
als het melkstremmend enzym in gelijke mate ge-
absorbeerd.

5®. De door my onderzochte praeparaten, die wel
melk doen stremmen, doch geen eiwit oplossen, ont-
leenen deze eigenaardigheid aan bijmengselen, die de
proteolyse storen.

6°. Noch door Hammarsten, noch door Schmidt
Nielsen is bewezen, dat men door digestie met zoutzuur
lebvrye pepsine-oplossingen kari maken. Zoowel de
wyze waarop de beide werkingen afnemen, als de
gelyke invloed van neutraliseeren op beide functies
wyzen er veeleer op, dat pepsine en leb een en
dezelfde stof zyn.

Het door Hemmeter tegen Pawlow\'s onderzoek
geopperde bezwaar, dat het mogelyk is, dat twee

\') Aro the proteolytic and milkcoaRulatlng offoctsofRaatric
and pancroatic juice due to ono and tho samo onzyrao? Ber-
liner klin. Wochonschr. FoBtnunimor f. C. A. Ewald 19ü5,S. 14.

dooreengemengde stoffen zich tegenover allerlei ver-
schillende invloeden zoo volkomen gelyk gedragen,
dat de verhouding hunner werkzaamheid steeds de-
zelfde blyft, kan ook tegen myne proeven ingebracht
worden. Een bewys voor de eenheid, zooals Hemmeter
wenscht, kan echter feitelijk niet geeischt worden.
Men kan uit maagslijmvliezen eene stof bereiden, die
eiwit oplost en melk doet stremmen. A priori bestaat
er geen reden te denken, dat dit een mengsel is van
twee stoffen. Eerst toen Hammarsten meende, dat het
mogelijk was deze stof te scheiden in twee, die elk
afzonderlijk een der functien vertegenwoordigden, ont-
stond de meening, dat leb een andere stof was dan
pepsine. Paiolow heeft aangetoond, dat het niet gelukt
eene splitsing te weeg te brengen, noch door praecipi-
tatie met magnesium-carbonait volgens Hammarsten,
noch met de door andere onderzoekers gevolgde
methoden. Hij vermoedt, dat de schijnbare splitsing
door digestie met zoutzuur is toe te schrijven aan
het neutraliseeren. Dat dit zoo is, heb ik hier boven
aangetoond.

Zoolang er geen deugdelyk bewijs is geleverd, dat
de spitsing wel gelukt, zoolang is er geen reden om
te onderstellen, dat pepsine en leb twee verschillende
stoffen zijn.

Na het onderzoek van Spiro, Petry, Fuld en van
Henoerden omtrent de caseine-splitsende werking van
leb bij neutrale reactie, staan aan de onderstelling van
Sawjalotoy dat de maagklieren é6n enzym voortbrengen,
dat in staat is bij lichiuimstemperatuur en zure reactie
eene hydrolytische spitsing van eiwitstoffen te weeg
te brengen en bij neutrale reactie het caseine-molecule
te doen uiteenvallen in splitsingsproducten, waarvan
oen deel zich met calcium verbindt tot het onoplosbare
kaasstolsel, geen ernstige bezwaren meer in den weg.

5 ^ 10
sec.

5 a 10
sec.

20 „

30 „

50 „

3. By Peritonitis exsudativa tuberculosa verrichte
men laparotomie, doch niet voordat het exsu-
daat lang heeft bestaan.

4. Do constipeerende invloed van morphine is hoofd-
zakelyk toe te schryven aan den invloed van
het vergif op de maag.

6. Tijdens de zwangerschap wordt het onderste
uterussegment gevormd, grootendeels uit de cervix
uteri.

7. De überrumpelungs methode verdient bij de be-
handeling van vele hysterische toestanden aan-
beveling.

8. Het eten van rauwe eieren, afkomstig uit eeno
omgeving, waar typhus heerscht, is gevaarlyk

10. Anthracose der longen ontstaat niet door opne-
men van kooldeeltjes uit den darm.

11. Er bestaan intracranieele vasodilatatoren voor de
hersenvaten, die afhankelijk zijn van een deel
der hersenen, dat proximaal van de medulla
oblongata gelegen is.

13. De zenuwvezelen, die uitgaan van de verschil-
lende gebieden van de retina begeven zich niet
naar afzonderlyke gebieden in de cortex.

		■\'•.iS
	v " \' \'
r . K ,

-Jfc. ..... «r. -, W

	1 Verdunning	Qeneutr. m. NaOH.	Qeneutr. m. CaCO.	Zure reactie.
1 X	onvord.	40 sec.	5 sec	B sec.
2	2 X verd.	90	5 „	E> ..
3	.4X „	7-17 min.	B.Y10 „	B „
4	8X „	meer dan 1 uur	15 n	10 „
5	16X „		30 h 85 „	16 j\\ 20 sec.
0	82 X ,		80 a 90 „	80 „
7	64X ,		8—IIV2 min.	60 ..
8	128 X „			110 „
9	•256X „			6 min.

	Vordimning	Qonoutr. ni. NnOh.	Gonoutr. m. CaCoi	Zuro roactio.
1	onvord.	60 soc.	5 aec.	5 soc.
O	2 X vord.	95 „	10 „	f\' „
3	4X „	160-170 ,	15 „	10 „
4	8X «	330-376 „	20 „	15 „
6	16X „	8V«-I27.niln.	öO „	30 „
0	82X .	24 ,	100	55 „
7	64X «	37->60 „	37. min.	2 min.
8	128 X .		6\'/. „	47. .
9	250 X »	1	157. „	13 „
10	512 X „		>40 „	>60

Varken	Ka	If.
Zure R	NaOH.	Zure R \|	NaOH.
5 sec.	40 sec.		^
	90 „	5 sec.	50 sec.
5 „	7-17 min.	5 „	95 „
10 „	>60 „	10 „	160-170
IB a 20 „		IB „	330-876 „
30 „		80 .,	8V2-1272min.
60 ,.		B5 „	24 „
110 ..		120 „	37->CO .
360		2B5 ,. 780 „ >60 min.

	Ferment	Water.	Melk.	Tyd voor	Tüd voor
	opl.	Pepsine.	B Löpe.
1	1 cm3		10 cm3	2,30 min.	4 min.
2	72	7o cm«	10 „	7,30	8,30 „
3	•A	„	10 „	40	17 „
4	7.	V.	10 „	geen	38,30 „

		Stoll.tyd	Digestie
lo dial.	neerslag	0 sec.	7,7 m.m
	vloeistof	0 „	8	»
20 dial.	neerslag	0 „	7,1	n
	vloeiatof	5 „	0,4	n
3o dial	neerslag	5 „	6	n
	vloeistof	10 „	4,8	n
40 dial.	neerslag	10 „	6,3	>»
	vloeiatof	0 „	6.3	n
£o dinl.	neerslag	10 „	6,1	»
	vloeistof	15 .	5,2	»
60 dial.	neerslag	15 „	5,6	n
	vloeistof	10 „	4,6	n

Melk.	Neutr. en- zym opl.	Water	1 cm3 CaCl2 opl.	CaCl2 gehalte van het melk enz mengsel.	Stoll. tüd
10 cm3	1 cm3	1 cm3	_	_	4Vi min.
10 „	j»	—	V. %	0,0416 7o	40 sec.
10 „	\' ))	—	7« \'L	0,0208 7o	70 „
10 „	n	—	Vs Vo	0,0104 7o	110 ,.
10 „	\' r	—	\'/.. 7.	0,0052 7o	2 Va min.
10 •„	1 1»	—	\'/.\' Vo	0,0026 Vo	3
10 „	\' w	—	V.. "/„	0.0013 %	4 „

Molk.	Neutr. en- zym-opl.	Water.	1 cm3 CaCI, opl.	CaClt gehalte van het melk enz. mengsel.	Stoll.tyd.
10 cm3	1 cra3	1 cm3	_	_	12 min.
10 „	1	—	0.4 %	0,033 %	2 „
10 „	1	—	0,2 %	0,0165 %	4 „
10	1 „	—	0,1 %	•0,00825 %	8V, „

		Na ver- hitten.	Na alkali bohandoling.
StollingatUd:	25 soc	40 soc.	geen atoll. in 57i uur.
DlROstio iu fi uur:	0,70	4,41	0
2o macht van het
aantal ni. m.

		Na ver- hitten.	Na alkali bo- handeling.
Stollingstyd:	5 & 10 sec.	16 sec.	;J0 800.
Digestie in 5 uur:	11,56.	7,84	,4.81
2« macht v. h. aantal m.m

I hitten.	handeling.
Stollingstyd:	3\'/. min.	7\'/. min.	goen stolling
			in 7 uur.
Digestie in 20 uur:	15,21	4.84	0
2o macht v. h. aantal m. m.

	Na ver- bitten.	Na alkali be- handeling.
Stollingstyd:	T\'/t min.	11 min.	geen stolling
			in 5\'/. uur.
Digestie in 5 uur:	4.	1,96.	0
2e macht v. h aantal m. m.

			c U E		.£ -O		c rt
Datum.	TOM , slg (D O O O OJ	2 is .2 g § ë ^ c g - rt -Q	O is 03 rt r- H ü £ s £ ^ r3 l-> C O rt ® ïL " 03 tS CS	" c ® S-Hl £ > ^ \|X\| m	.2 ^ ^ n m s OJ .2? \'O Q	> ^ C OJ ^
				Jzi-Q-a
8	Febr.	10 soc.	5 sec.		6 sec.	9,6	35 ft 40 s.
12	»»	10	10 a 16 „	10 sec.	10 „	5,3	35 „
13	tf	15-20	15-20 ,,	16-20 „	10-16 „	6.	36{\\40„
14	**	16-20 „	15-20 ,	15-20 „	10 „1	I 5,3.S	40 „
16	II	10-16 „	16-20 „	16-20 „	10-16 „	3,6	35 „
18	n	25-30 „	20-30 „	30	15-20 .,	2,56	36 „
19	n	26 „	26-35 „	20 „	15 „	3.2	.30-36,,
20	>1	30-40	35-66 „	26-30 „	20 „	3,2X	36 „
21	>•	45-60 „	85-120 „	70 „	20-25 „	8,2	36 -40„
22	tl	45 „	70-76	40	26 „	2,7	40 „
23	It	50-75 „	80-160,,	60 „	25-30 „	2,1	40 „
25	II	100-130,,	3-6 min.	60 „	36 „	1,66	35 - 40 „
26	1\'	70-100„	47. 1.	2\'/, min.	30 „	l\|82>-i	40 „
27	II	66-106,,	8	1	35 „	2,r>o	36,,
28	tl	4Vo-9 m.	17-45 „	0	40 .,	1,1 H	35-10,,
1	Maart	8-22 „	44-48 „	13-20,,	65-80 „	0,81	35 - 40 „
2	II	22-26 „	>1 uur,,		70-86	0,49	35 „
4	II				165-270.,		40 „
5	!•	> 1 uur			150-160,.		40 „
7	II				4\'/2-&7.n>.	0,49	40
12	II				>6 uur.	0,49	40 „
20	II					0,04	85 „

1— 3 K)"-\' OSOD<f»tO—• pQ OlO^JCTif^lOH-oc-gOJÜiWU)— OtOOJtf\'»— XXX J • ......s............^ > = = -- = 1 ......s...........?	0 »3 1
^ i ioooooocnyoToioi ^ 1 ^ OJ \' 1 1 1 1 1 1 o—lJk --05 — •JOOiW.ösc;» o c >r>ytoocnoy<o 1 3. = - g -- c 1 ^ S	Geneutraliseerd met CaCOi.
VSïëo Oo _\'-\'C0Oü>OO 3 CO C 3 CO 5- g -- ^ 3- -- =	Na V2 ""r staan bU neutrale reactie.
-cnOOOCTCXOOOO 3 _ a. ? • - .........P	Na Vi uur staan bU zure reactie daarna neutraliseeren.
CgOOOO. CT „ ->3 ..........P	Zure reactie 2 X verd. met water.
O ec — cacowoi^CTjcoifc-H-\' "i- \'c5 00 \'es «Ji "to to "tc o: io \'i \'-j "V c» P Z ^ X ^ *	Digestie in fi uur.
CT^Su\'oi SooooCT^\'ccioa\'OO^CToa\'O«\' • \' \' \' \' 1 \' ■ \' \' OOOCO "O ° oO» O	Leb van van Hasselt.

	Godig. opl.	Verdunde opl.
Geneutrali.seord mot CaCO..	25 sec. 30-35 soc.	80 soc. 30-35 soc.
Zuro reactie 2 X verd. m. wat.,	15 „	20 , 15-20 , ,
Digostio in 6 uur.	2 m.m.	1.9 m.m.

14 April-	2Vi2 minuten	7,84	15,21
15 „	47«
16 ».	8V2
17 «	5V2	4	4,41
18 «
2 " 1	1
19 »	e\'A		3,61
20 «	6	2,25	3,61
	24—26 „		2,89
22 «		0,36
23 «	45 »	0,16	2,25
B.
	12V2	1	2,89


M

O	cib a

	"o ■LJ
	m
O

o\'

	Qedig. opl.	Verdunde opl.
Zure reactie 2 X verd, in. wat., Digestie in 5 uur.	35 sec. 35 sec. 1,9 ui m.	35ii40 sec 40 sec. 1,9 m.m.


" . . . ■ •


A"	• . ^ ■ ■
. ■ . . . \\ . î
■3,7«V.^. ■ .
\'\'y \' \',..\', .t