19Z1

BIJDRAGE TOT DE KENNIS
DER CHEMIE VAN DE MELK-
ZUURGISTING

■ .fr

. . r-

/ \'.

s

\\ -

• A

V^^^Vn^S • \' \'S.\' - . • -

ar-^ ■

mSëQt. ■ - • ■

.^rM.: Sil

r: i

BIJDRAGE TOT DE KENNIS DER
CHEMIE VAN DE MELKZUURGISTING

TTTMnffl^mt Tfj-i\'- l rillffl:ntW»iWflrl»iTTfaYTrr rT n

Pi r .1 \' r" m. Jtfc- ■ > j-. \'tl. \' ■ ■^\'Va.. 3

BIJDRAGE TOT DE KENNIS
DER CHEMIE VAN DE
MELKZUURGISTING

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE ARTSENIJBEREIDKUNDE AAN DE RIJKS-
UNIVERSITEIT TE UTRECmTOP GEZAG VAN DEN RECTOR-
MAGNIFICUS Dr W. VOGELSANG, HOOGLEERAAR IN
DE FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJSBEGEERTE, VOL-
GENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNIVERSITEIT
TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS-
EN NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN OP MAANDAG
IJ^PRIL 1921, DES NAMIDDAGS TE 3 UUR DOOR

BERTHA JOHANNA HOLWERDA
GEBOREN TE ROTTERDAM

...........

■ ^

•

* (
■ v-^
■.\'1

AAN MIJN OUDERS

I\'«:"\'-.-

Bij het voltooien van dit proefschrift is het mij een aan-
gename taak, mijn erkentelijkheid uit te spreken jegens allen,
wier kennis en leiding mij tot voorlichting strekten bij mijn studiën.

Dat is in de eerste plaats jegens U, Hoogleeraren der Utrechtsche
Universiteit, wier colleges ik het voorrecht had te mogen volgen.

I

Een afzonderlijk woord van dank wensch ik tot U te richten.
Hooggeleerde Schoorl, waar Gij mij als promotor zoo in alle
opzichten welwillendheid en hulpvaardigheid hebt betoond.

Zeergeleerde Van Dam, voor de wijze, waarop Gij mij bij de
bewerking van dit proefschrift steeds met raad en daad hebt
terzijde gestaan, betuig ik U mijn bijzonderen dank.

Den Directeur-Generaal van den Landbouw betuig ik hier
mijn erkentelijkheid voor de gelegenheid, mij gegeven, aan het
Rijkslandbouwproefstation te Hoorn een proefschrift te bewerken.

De belangstelling en vriendschap van U, Zeergeleerde Grut-
terink, gedurende mijn studietijd ondervonden, zal mij steeds
in aangename herinnering blijven.

■ u

si

INHOUD.

Blz.

INLEIDING.......................1

HOOFDSTUK I.

DE DISSOCIATIECONSTANTE VAN MELKZUUR........5

a. Bepalingen van het geleidingsvermogen........7

b. Potentiometrische bepalingen van zuur-zout mengsels ... 10

c. Methode Bredig..................16

Colorlmetrlsche bepalingen.............23

Opsporing van de oorzaak der afwijking in de dissociatie-
constante, bepaald volgens Bredig van die, gevonden langs
anderen weg...................28

HOOFDSTUK II.

QUANTITATIEVE BEPALINGEN BIJ DE MELKZUURGISTING ... 37

Onderzoek in wei.

/. Onderzoek naar het optreden van een constante bij wille-
keurige stammen van het geslacht Streptococcus lactis . . 39

2. Eventneele invloed van den ouderdom der culturen op de
grootte der constante...............\'14

3. Invloed van de samenstelling der wei op de grootte der
constante....................

4. Mogelijkheid of de constante als biologisch kenmerk der
bacteriën han worden beschouwd...........51

6. Invloed van het ontstaan van optisch actief melkzuur op de
grootte der constante...............52

Bereiding van en onderzoek der eigenschappen der melkzuur-
bacteriën in een KUNSTMATIGEN voedingsbodem.

Bereiding van een kunsimatlgen voedingsbodem......56

Onderzoek van verschillende melkzmirbacteriün in dezen voe-
dingsbodem ....................60

Beoordeeling van den graad van zuiverheid der gisting, door

de bacteriën veroorzaakt, in deze cultuurvloeistof door:

1. Aantooning van het niet ontstaan van vluchtig zuur ... 07

2. Bepaling van de neutralisatiecurve van den voedingsbodem
in vergelijking met de zuurgraden veroorzaakt door de
bacteriën....................67

3. Extractie en onderzoek van het door gisting ontstane zuur 68

CONCLUSIES......................71

? \' ■

.... _ \'...j\'
■ ; . _ ■ ■ ■ --i" ■

■ ■ .\'■ \'

INLEIDING.

De groei en de ontwikkeling van de meeste micro-organismen
is in hooge mate afhankelijk van de waterstofionenconcentratie
van het milieu, waarin ze leven. Hieraan is vooral sinds de
onderzoekingen van SörensenI) veel aandacht geschonken. Het
verband, door hem aangetoond, tusschen de H-ionenconcentratie
van een vloeistof en de optimale werking van verschillende
enzymen, doet vooral de niet specifieke werking van verschil-
lende zuren uitkomen. Dat de H-ionenconcentratie een dikwijls
verwaarloosde factor is geweest bij vroegere biochemische onder-
zoekingen, waar men gewoonlijk met media gewerkt had, die
bufferende eigenschappen hebben, blijkt duidelijk uit zijn onder-
zoek. Toch is het noodig bij de biochemische studie van
micro-organismen niet uitsluitend rekening te houden met de
H-ionenconcentratie. Aan de werking, die de ongedissocieerde
moleculen kunnen uitoefenen dient ook waarde toegekend te
worden.

De volgende, gedeeltelijk tegenstrijdige, opgaven uit de literatuur
doen uitkomen, dat beide factoren invloed uitoefenen bij biologi-
sche processen.

Michaëlis-) vindt, dat Bacterium coli de H-ionenconcentratie
van een vloeistof altijd tot dezelfde waarde opvoert, onafhanke-
lijk van de begin-aciditeit ervan. Deze H-ionenconcentratie, 1 X10-®,
wordt als een biologisch kenmerk van Bacterium coli beschouwd.

Door een meer uitgebreid onderzoek toont Clark 3) aan, dat
de bufferwerking van den voedingsbodem invloed heeft op de,

1) sörensen, Biochem. Zeitschr., 21, 131. (1909).

Michaëlis, Zeitschr. f. Immunitatsforscli., 14, 170. (1912).

3) Clark, Journ. of biolog. ehem., 22, 87. (1915).

door deze bacteriën bereikte reëele aciditeit. Hij acht een toxische
werking van de ongedissocieerde moleculen niet uitgesloten en
waarschuwt tegen het aannemen van een onder bepaalde om-
standigheden constant gevonden grootheid als biologisch ken-
merk; het is noodig de eventueele invloed van verschillende
factoren op deze grootheid eerst na te gaan.

Johannessohn 1) meent de toxische werking, die organische
zuren uitoefenen bij het doen eindigen van de alcoholische gis-
ting te mogen toeschrijven aan de ongedissocieerde moleculen.

Bial2) vindt in tegenstelling daarmee dat de giftige werking
door organische zuren op gist uitgeoefend, alleen afhankelijk is
van de waterstofionenconcentratie.

Paul, Birstein en Reusz s) schrijven de antiseptische werking
van organische zuren toe zoowel aan de anionen als aan de
ongedissocieerde moleculen.

De zuur produceerende melkzuurbacteriën veranderen door hun
ontwikkeling de reactie van het milieu. Het einde van de ont-
wikkeling van micro-organismen wordt veroorzaakt doordat de
door hen gevormde stoffen een bepaalde concentratie hebben
bereikt. Bij de melkzuur gisting kan dit einde dus veroorzaakt
worden door de H-ionenconcentratie of door de hoeveelheid
ongedissocieerd melkzuur. De lactaationen komen, wat toxische
werking betreft, niet in aanmerking. Dat blijkt uit het bekende
feit, dat het mogelijk is door neutraliseering van het ontstane
zuur met CaCOs ongeveer alle lactose van een voedingsbodem
te vergisten.

Uit de onderzoekingen van van Dam 4) en van Svanberg \'"\')
blijkt, dat bij kweeken van melkzuurbacteriën in melkwei of
melkserumhet einde van de gisting veroorzaakt kan worden

1) Johannessohn, Biochem. Zeitsch., 47, 97. (1912).

2) Bial, Zeitschr. physik. Chem., 40, 513. (1902).

3) Paul, Birstein u. Reusz, Biochem. Zeitschr., 29, 202. (1910).
-") Van Dam, Biochem. Zeitschr., 87, 107, (1918).

6) svanberq, Inaugural Dissertation. (1918).

c) Onder melkwei wordt verstaan de vloeistof verkregen door afscheiding

van de caseine met leb; onder melkserum die, verkregen met een zuur.

zoowel door de hoeveelheid ongedissocieerd melkzuur, als door
een hooge H-ionenconcentratie.

Van Dam^) heeft aangetoond, dat gisting van gewone lacto-
coccen, die bij de kaasbereiding worden gebruikt, in melkwei
eindigt, wanneer de concentratie van het ongedissocieerde melk-
zuur ± 0,01 N is. Deze waarde wordt bereikt in melkwei als zoo-
danig en ook in die waaraan verschillende hoeveelheden Na lactaat
zijn toegevoegd. De H-ionenconcentratie bleef in deze gevallen
ver beneden die, welke schadelijk is voor de ontwikkeling van
de bacteriën en waarvoor 10 è 20 X lO-^ was gevonden.

SvANBERG^) vindt eveneens dat, bij het einde van de gisting
in melkserum, veroorzaakt door lactococcen, de concentratie van
het ongedissocieerde melkzuur ± 0,01 N is. De zuurproductie van
lactobacillen eindigt wanneer deze concentratie ± 0,1 N is. Wan-
neer de bufferwerking van dit melkserum door toevoeging van
Na lactaat wordt verhoogd, wordt deze concentratie bij het einde
van de gisting toch niet hooger gevonden. Ook in dit geval werd
niet de H-ionenconcentratie bereikt, die schadelijk was voor de
ontwikkeling van de bacteriën. In met HCl, HoSOj en H3 PO4
aangezuurde melk kon Svanberg geen gisting van de door hem
gebruikte stammen meer aantoonen, wanneer de H ionenconcen-
tratie grooter dan 25 X 10-\'\' werd.

De H-ionenconcentratie bij het einde van de gisting in melk-
wei of serum kan dus evenmin als de totale hoeveelheid ge-
vormd zuur als biologisch kenmerk der melkzuurbacteriën dienen.
Aangewezen hiervoor schijnt, zooals uit de genoemde onder-
zoekingen volgt, de hoeveelheid ongedissocieerd melkzuur.

De verschillende factoren, die invloed zouden kunnen hebben
op deze grootheid, zijn door mij aan een meer uitgebreid onder-
zoek onderworpen. Er diende te worden nagegaan of de grens-
waarde der concentratie van ongesplitste zuurmoleculen een altijd
optredende eigenschap van willekeurige melkzuurbacteriën was.
Evenals de resultaten verkregen door van Dam en door Svan-
berg, laten ook die, welke bij dit onderzoek zijn verkregen, duidelijk

1) Van Dam loc. cit.

2) Svanberg loc. cit.

uitkomen van hoeveel belang het is bij bacteriologische proeven
geheel gedefinieerde voedingsbodems te gebruiken; in dit geval
speciaal wat betreft de bufferwerking. Er is bij dit onderzoek
een poging aangewend om voor melkzuurbacteriën een voedings-
bodem te bereiden, die aan dezen eisch voldoet en overigens
in eigenschappen overeenkomt met de veel gebruikte melkwei,
waarvan de wisselende samenstelling een nadeel is. De uit-
komsten door van Dam i) verkregen bij een onderzoek over de
vertering van caseine door verschillende pepsinen wijzen op de
mogelijkheid een caseinepepton te kunnen verkrijgen, waarvan
de eigenschappen constant zijn. Tevens heeft de in de literatuur
verbreide meening, dat pepton voor melkzuurbacteriën een goede
stikstofvoeding is, de richting bij het zoeken naar een dergelijken
kunstmatigen voedingsbodem bepaald.

Voorde berekening van de concentratie van het ongedissocieerde
melkzuur, aanwezig in een vloeistof, waarvan de reëele zuurgraad
en de totale hoeveelheid daarin gevormd zuur bekend is, is de juiste
kennis van de dissociatieconstante van melkzuur noodig. De op-
gaven hiervoor zijn nog al uiteenloopend. Daar ook nog in 1918
van Amerikaansche zijde hiervoor weer een waarde is gepubli-
ceerd, die zeer belangrijk afwijkt van de door Ostwald gegevene,
is van eenige preparaten melkzuur de dissociatieconstante nog
eens bepaald (25°) door gebruik te maken van verschillende
methoden.

1) Van Dam, Zeitschr. physiol. chem., 79, 247. (1912).

HOOFDSTUK 1.

De dissociatieconstante van Melkzuur.

De in lateren tijd gebruikte waarde voor de dissociatieconstante
van melkzuur verschilt dikwijls zeer veel van de oorspronkelijk
door OstwaldI) bepaalde. Door meting van het geleidings-
vermogen vindt Ostwald K= 1.38 X 10-^25°).

Goldschmidt en Bürkle^) onderzochten den katalytischen invloed
van het waterstofion op de vorming der azokleurstoffen. Indien
voor melkzuur de door Ostwald bepaalde dissociatieconstante
K = 1.38X10-4 werd genomen, bleek de berekende snelheids-
constante niet overeen te komen met de gevondene. Daarom
werd door Bernoys de dissociatieconstante van melkzuur op-
nieuw bepaald door metingen van het geleidingsvermogen. Hoewel
uit de resultaten de gevolgtrekking wordt gemaakt, dat het
onderzochte zuur niet geheel zuiver was, meenen ze toch een
waarde K = 3,1 X 10-^ (25°) te mogen aannemen. In het handboek
van V. Meijer en Jacobson wordt ook deze waarde aangegeven.

Van Slijke en Van Slijke •») vinden voor het moleculaire ge-
leidingsvermogen van melkzuur een hoogere waarde dan Ostwald.
Ze geven hierbij echter geen cijfers op, waaruit K te berekenen is.

Van Dam s) bepaalt de dissociatieconstante van volgens Krafft
gedestilleerd melkzuur. Uit metingen van het geleidingsvermogen
wordt gevonden K= 1,47X-«(18°)- Uit de ontledingssnelheid

1) Ostwald, Zeitschr. physik. Chem., 2, 840. (1888).

■i) Goldschmidt u. Bürkle, Ber. d.d. Chem. Ges.. 32, 64. (1899).

3) Bernoys, Ber. d.d. Chem. Ges., 32, 64. (1899).

*) Van Slijke and Van Slijke, Am. Chem. Journ., 38, 400. (1907).

6) Van Dam, Vers!, d. Rijks Landb. Proefst. 10, 5. (1911).

van diazoazijnzure aethylester, volgens Bredig, met melkzuur
als katalysator, wordt K= 1,47 X lO-^ (18°) gevonden.

Van Slijke en Baker i) meten de H-ionenconcentratie van
zuiver melkzuur en die van mengsels, bestaande uit calcium-
lactaat en melkzuur. Op beide wijzen wordt K = 2,5 X 10-^ (25°)
gevonden. Ze houden echter geen rekening met de waarschijnlijk
geringe of complexe ionisatie van calciumlactaat, waardoor de
waarde, gevonden uit de metingen der H-ionenconcentratie der
mengsels, wel te hoog kan zijn.

Daar, zoowel bij gebruik maken van eenzelfde bepalingswijze,
als bij gebruik maken van verschillende methoden van onder-
zoek de opgaven van de dissociatieconstante van melkzuur niet
dezelfde zijn, heb ik van verschillende preparaten melkzuur op
verschillende wijze de dissociatieconstante opnieuw bepaald.

De preparaten waren:

I. melkzuur van Merck. De stroperige vloeistof bevatte ± 89 %
totaal zuur.

II. een laboratoriumpreparaat uit Utrecht (± 87,5 7o totaal zuur).
Het bleek later ongeveer 0,1%H2S04 te bevatten.

III. een laboratoriumpreparaatuitWageningen(±90%totaalzuur).

IV. melkzuur van Kahlbaum (± 90 % totaal zuur).

V. hetzelfde melkzuur van Kahlbaum door Prof. Schoorl volgens
Krafft en Dyes 2) in vacuo gedestilleerd. (± 96 % totaal zuur).

De methoden van onderzoek van deze vijf zuren zijn hoofd-
zakelijk de volgende drie geweest:

a. de meting van het moleculaire geleidingsvermogen in
verschillende verdunningen.

b. de electrometrische bepaling der waterstofionenconcentratie
van zuiver melkzuur en die van mengsels bestaande uit melk-
zuur en Na lactaat, melkzuur en Ca lactaat, melkzuur en Zn lactaat.

c. de bepalingen der H-ionenconcentraties volgens Bredig.

Alle vijf preparaten waren na hydratatie optisch inactief.

Voor volledige hydratatie werd een ongeveer 0,5 N oplossing in

een platinaschaal op het waterbad ± 16 uur verwarmd. Verdamping

1) Van Slyke and Baker, Joum. of Biel. Chem., 35, 147. (1918).

2) Krafft,en Dyes, Ber. d.d. Chem. Ges., 28, 2589. (1895).

van het zuur werd zooveel mogelijk tegengegaan door de platina-
schaal met een kwartsplaat af te sluiten. Bovendien was de inrichting
zoo gemaakt, dat het zuur slechts met waterdamp afkomstig van
gedestilleerd water in aanraking kon komen. Volledige hydratatie
werd geconstateerd door 5 cm^ ongeveer 0,5 N zuur met 0,1 N
loog te titreeren. De, door phenolphtaleine, zwak rose vloeistof
werd daarna vijf minuten of langer gekookt, de rose kleur moest
dan of blijven bestaan of V2 druppel 0,1 N loog moest de reactie
weer alkalisch maken. Voor duplo-bepalingen van het geleidings-
vermogen werd steeds een nieuwe hoeveelheid gehydrateerd.

Methode a.

Bij de meting van het geleidingsvermogen van melkzuur in
een vat met gewoon geplatineerde electroden deed zich de
moeilijkheid voor dat, dit niet constant bleek te zijn, maar bij
staan toenam door ontleding van het zuur. Bij gebruik van
blanke electroden was het geleidingsvermogen na drie kwartier nog
onveranderd; er was ook een scherp minimum waar te nemen.
De bepalingen van het geleidingsvermogen der zuren zijn daarom
in een vat met blanke electroden uitgevoerd. Het geleidings-
vermogen van het gebruikte water was hoogstens 1,2X10-^,
gewoolijk0,9X lO-^enis van het gevonden geleidingsvermogen
in zijn geheel afgetrokken. Daar het water namelijk steeds
alkalisch op methylrood reageerde, en het geleidingsvermogen
dus niet alleen van koolzuur afkomstig kon zijn, leek er me geen
reden te zijn om het gevonden geleidingsvermogen niet of met
de helft van dat van het water te verminderen i).

Het aequivalent geleidingsvermogen van het waterstofion bij on-
eindige verdunning is 349 (25°) aangenomen, dat van het lactaation
is berekend uit de opgaven van het geleidingsvermogen van
Na lactaat van Ostwald -) en 36,7 gevonden. Het aequivalent
geleidingsvermogen van melkzuur bij oneindige verdunning is
dus 385,7. In de volgende tabellen stelt Xor, het specifiek geleidings-
vermogen, verminderd met dat van het gebruikte water, voor;
a de dissociatiegraad.

1) Zie Kohlrausqh u. Holborn, Das Leitvermögen der Elektrolyte. 2c
druk, bi. 92.

2) Ibid. bi. 178.

TABEL L

Een bespreking der uitkomsten volgt in verband met die, ver-
kregen volgens de andere methoden.
Methode b.

Van Slijke en Baker i) meten de H-ionenconcentratie van
zuiver melkzuur met een waterstofelectrode. Deze meting is
bij vloeistoffen, die geen bufferende werking hebben gewoon-
lijk slecht uitvoerbaar; bij gebruik maken van een schud-
electrode zijn nog wel eens goede uitkomsten te krijgen. Om
het gebruik van een schud-electrode te omgaan heb ik voor
de bepaling van de H-ionenconcentratie van melkzuur gebruik
gemaakt van een klein electrodevat. Daar werd onderin een
langzame stroom waterstof geleid, zoodat de vloeistof geheel
in voortdurende beweging was. Er stelde zich een potentiaal-
verschil met de afleidingselectrode in, dat vooral bij de meer
verdunde oplossingen niet constant was. Zoo veranderde de
potentiaal van ± 0,005 N melkzuur in 3 kwartier ongeveer 4
millivolt, waardoor de dissociatieconstante schijnbaar van
1,34 XIO-\'^ tot 1,85X10-4 steeg. Bij ongeveer 0,1 N oplossingen
stelde zich een meer constant potentiaalverschil in. Echter werd
nooit bij herhaling van de proef met hetzelfde zuur eenzelfde
waarde gevonden. K= 1,69 X lO-^ en K= 1,86 X 10-\'< waren de
uitkomsten van een duplo-bepaling. Daar ook bij het meest zuivere
melkzuur (preparaat V) dergelijke uitkomsten\'zijn verkregen is
deze electrometrische methode niet verder toegepast.

Wel is langs electrometrischen weg de waterstofionenconcen-
tratie bepaald van mengsels bestaande uit ;

10 melkzuur en Ca lactaat.
20 „ „ Zn „
30 „ „ Na „
Het meten van deze mengsels met de waterstofelectrode gaf
1) Van Suyke and Baker, loc. cit.

geen aanleiding tot moeilijkheden. Als afleidingselectrode is
steeds de verzadigde calomelelectrode gebruikt. Deze en de
gaselectrode waren in een waterthermostaat van 25® geplaatst.
De gebruikte apparaten werden herhaaldelijk met een azijnzuur-
natronloog mengsel gecontroleerd.

Voor de berekening van de dissociatieconstante uit de
H\'ionenconcentratie van één der bovengenoemde mengsels is het
noodig de dissociatiegraad, a, van het toegevoegde lactaat te
kennen. Van den dissociatiegraad van oplossingen van Ca- en
Zn lactaat is niet veel bekend. Deze is bepaald uit het gelei-
dingsvermogen van de zouten in verschillend sterke oplossingen.

Als calciumlactaat zijn 2 verschillende preparaten gebruikt,
beide bereid door herhaald omkristalliseeren van Ca-lactaat. De
sterkte van de oplossingen moet bepaald worden door het CaO-
gehalte van het zout. Dit is van één preparaat gevonden door
directe gloeiing als 22,65 o/o, door neerslaan als Ca oxalaat 22,55%;
het andere preparaat bevatte 19,18% CaO (directe gloeiing).

Het aequivalent geleidingsvermogen bij oneindige verdunning
van Ca-lactaat is 96,6 genomen, dat van het lactaation 36,7;
van i Ca 59,9 (25°).

Daar de dissociatiegraden van de beide verschillende prepa-
raten, zoowel als die van de duplo-bepalingen bevredigend over-
eenstemden, zal ik alleen de gemiddelden hiervan opgeven, die
ook voor de verdere berekeningen zijn gebruikt.

TABEL VL

Dissociatie van Ca lactaat 25°.

Concentratie. Dissocintiegraad «.

0,1000 N 0,446

0,0500 N 0,545

0,0250 N 0.&40

0,0125 N 0,720

0,00C2 N 0,788

0,0031 N 0,843

0,0016 N 0,895

Zinklactaat werd bereid door melkzuur met de berekende
hoeveelheid ZnCOs te verwarmen. Daarna werd gefiltreerd en

het kristallisaat, dat in het filtraat ontstond werd herhaaldelijk
omgekristalliseerd (3 maal). Het luchtdroge preparaat werd ge-
analyseerd.

Door drogen bij 120°—130° werd het watergehalte = 18,50%
gevonden. Het ZnO gehalte van het anhydrische preparaat was
bij directe gloeiing 33,39 «/q; bij wegen als ZnS 33,30%. Daar
het ZnO gehalte van anhydrisch Zn lactaat 33,43% is, was het
preparaat waarschijnlijk dus wel zuiver. Toch is dit nog éénmaal
omgekristalliseerd en daarvan ook weer de dissociatie bepaald.
Het aequivalent geleidingsvermogen van ^ Zn 54,2 bij oneindige
verdunning geeft voor Zn lactaat 54,2 36,7 = 90,9. Ook hier
stemden duplo-bepalingen en die van de 2 verschillende prepa-
raten voldoende overeen.

TABEL VIL
Dissociatie van Zn lactaat 25°.
Concentratie. Dissociatiegraad a.

0,1000 N 0,238

0,0500 N 0,324

0,0250 N 0,420

. 0,0125 N 0,532

0,0062 N 0,644

0,0031 N 0,750

0,0015 N 0,846

De dissociatiegraad van Na-lactaat is door Ostwald i) bepaald.
Toch is de dissociatiegraad van dit zout nog eenige malen
bepaald. Daartoe werd melkzuur van bekende sterkte met natron-
loog precies geneutraliseerd en van deze oplossing het gelei-
dingsvermogen in verschillende verdunningen gemeten. Het plan
was om bij de bacteriologische proeven den invloed ook van
sterke lactaatoplossingen op de melkzuur gisting na te gaan. De
grootste concentratie, waarvoor Ostwald de dissociatie bepaalde
is ± 0,03 N. Om bovengenoemde reden is de sterkste oplossing
waarvan de dissociatie gemeten is ± 0,25 N geweest. Hoewel
bij een zoo sterke oplossing de ionenbeweeglijkheid niet meer
onafhankelijk is van de concentratie der oplossing en de disso-

1) Ostwald, loc. cit.

ciatiegraad dan niet meer gelijk genomen mag worden aan de
verhouding van het aequivalent geleidingsvermogen van de op-
lossing tot dat bij oneindige verdunning, was toch voor het te
gebruiken doel de dissociatie van de sterkere oplossingen op
deze wijze voldoende te benaderen. Het aequivalent geleidings-
vermogen van Na bij oneindige verdunning 50,9, geeft voor
Na-lactaat 50,9 36,7 == 87,6.

TABEL VIII.

Dissociatie van Na lactaat 25°.

De uitkomsten verkregen met methode b van de verschillende
preparaten zijn:

TABEL IX.

Potentiaalmetingcn van zuur-zoutniengsels van preparaat I.

Concentratie

melkzuur
10,81 X 10-3
10,45 X 10-3
5,83 X 10-3
5,46 X 10-3

Concentratie
Na lactaat
39,89 X 10-3
19,95 X 10-3
44,87 X 10-3
24,94 X 10-3

0,831
0,863
0,823
0,855

TABEL X.

4,90 X 10-5
8,71 X 10-5
2,40 X 10-5
3,98 X 10-5

K

1,51 X 10-4
1,45 X 10-4
1,53 X 10-1
1,56 X 10^

Pjotentiaalmetingen van zuur-zoutmengsels van preparaat III.

Concentratie

melkzuur
6,17 X 10-3
12,16 X 10-^
6,28 X 10-3
11,28X10-3

Concentratie
Na lactaat

44.88 X 10-3

39.89 X 10-3
24,95 X 10-3
19,95 X 10-3

TABEL XII.

Potentiaalmetingen van zuur-zoutmengsels van preparaat IV.

Concentratie

melkzuur
10,18 X 10-3
10,18X10-3
10,18X10-3
10,18X10^

Concentratie
melkzuur

20,36 X 10-3
10,18X10-3
10,18X10-3
10,18 X 10-3

Ca lactaat
100 X 10-3
75 X 10-3
50 X 10-3
25 X 10-3

Concentratie
Zn lactaat
99X10-3
75 X 10-3
45X10-3
15X10-3

C„

2,95 X 10-5
3,98 X 10-5
5,25 X 10-5
8,91 X 10-5

1,20X10-1
6,46 X 10-5
8,32 X 10-5
1,78X10-«

K

1,32X10-4
1,47X10-»
1,43X10-4
1,43X10-«

K

1,39 X 10-«
1,35 X 10-«
1,23X10-4
1,32 X 10-4

Concentratie Concentratie
melkzuur Na lactaat « Ujj K

11,36X10-3 40,09X10-3 0,826 5,37X10-5 1,57X10-4

6,35X10-3 45,10X10-3 0,818 2,69X10-5 1,57X10-^

10,82X10-3 20,05X10-3 0,864 9,12X10-5 1,45X10-^

5,81 X10-3 25,06X10-3 0,851 4,17X10-5 1.55X10-^

Methode c.

Bredig^) maakt gebruik van de katalytische werking, die
waterstofionen uitoefenen op de ontledingssneltieid van diazo-
azijnzure aetfiylester, om de H-ionenconcentratie van een vloei-
stof te bepalen. De ontleding van dezen ester onder N ontwik-
keling volgens de vergelijking

HC N2 COO C2 H5 H2O = N2 CH2 OH COO C2 Hg
is, indien overmaat water ten opzichte van ester aanwezig is,
een monomoleculaire reactie, zooals Bredig aantoonde. De hoe-
veelheid gevormde stikstof is dan op ieder tijdstip evenredig
met de hoeveelheid dan aanwezige ester of

a is de aanvangsconcentratie van den ester, gemeten door de
hoeveelheid totaal gevormde stikstof, X is de hoeveelheid ontlede
ester op het tijdstip t, ook gemeten door de hoeveelheid ge-
vormde stikstof.

Geintegreerd geeft deze vergelijking de snelheidsconstante K
van de reactie.

1 a

Bredig vindt K evenredig met de H-ionenconcentratie van de
vloeistof, waaraan de ester wordt toegevoegd. Voor 0,001 N
H NO3, dat als geheel gedissocieerd is beschouwd, waar de H-
ionenconcentratie dus ook gelijk 10-3 genomen kan worden,
vindt hij K = 385XlO-4, als gemiddelde van een groot aantal
bepalingen. Betrokken op een vloeistof met H-ionenconcentratie
= 1 N is K dus 38,5 en voor een willekeurige vloeistof, met

een snelheidsconstante K, is C„ = -ii-
__" 38,5

1) Bredig, Verhandlungen des naturhist. medizin. Vereins zu Heldelberff,
NF, IX Band 1 Heft.

Zie ook Fraenkel, Zeitsch. physik. Chem., 60, 202. (1907).

De bepalingen van de H-ionenconcentraties van melkzuur zijn
uitgevoerd op de manier, zooals door Bredig is aangegeven. Een
beschrijving van een toestel, geschikt voor het schudden van
het reactiemengsel en tevens voor het meten van het ontwikkelde
gas, wordt gegeven door Walton i). De ester werd bewaard
op barythydraat en vóór het gebruik eenige cm^ in vacuo afge-
destilleerd. Afgedestilleerde ester werd nooit langer dan 2 dagen
bewaard. De met baryt bewaarde ester bleef eenige maanden
goed, wat gecontroleerd werd door een bepaling met 0,001 N
HNO3 en door te constateeren, dat de ester door water ge-
durende den tijd, dat een bepaling duurde, niet merkbaar werd
ontleed. Drie verschillende esterpreparaten zijn gebruikt, waarvan
herhaaldelijk geconstateerd werd, dat de ontleding met HNO3
de juiste snelheidsconstante gaf. De tijd t is gemeten in minuten;
de hoeveelheid gevormde stikstof in cm^.

De uitkomsten, volgens methode c verkregen, zijn:

Preparaat I. TABEL XIV.

Katalysator 0,00877 N melkzuur
a = 35,1.

C„ = 1,05X10-3
K molkz. = 1,43 X 10-4

\'1) Walton, Zeitschr. Pliyslk. Chem., 47, 188. (1904).

Preparaat II.

Preparaat III. TABEL XVI.

Katalysator 0,01030 N melkzuur
a = 28,80.

Cu =1,09X10-3
K melkz. = 1,29X10-4

C„= 1.04X10-3
K melkz. = 1,27 X 10-4

gcm. 402 X 10-4

Katalysator 0,00193 N melkzuur
a = 36,89

Ch = 0,431 X 10-3
Kmelkz. = l,23 X 10-4

Preparaat IV; duplo-bepalingen van ongeveer eenzelfde con-
centratie worden verder niet vermeld, omdat de dissociatiecon-
stanten van melkzuur, uit deze bepalingen berekend, niet meer
dan drie eenheden in de 2e decimaal verschillen.

TABEL XVII.
Katalysator 0,01016 N melkzuur
a =: 32,00

Ch= 1,085X10-3
Kmelkz. = l,30 X 10-4

Katalysator 0,00506 N melkzuur
a = 30,00

gem. 199 X 10-4

Preparaat V. TABEL XVIIL

Katalysator 0,009614 N melkzuur

1,060X10-3
Kmelkz.= l,32 y 10-^

Ch = 0,717X10-8
Kmelkz. = l,33 XlO-4

Ch = 0,475X10-3
Kmelkz. = l,26 X 10-4

Van preparaat V is de H-ionenconcentratie van het zuivere
zuur ook colorimetrisch bepaald. De gebruikte indicatoren waren
tropaeoline-00 en methanylgeel. De bepalingen werden uit-
gevoerd in reageerbuizen van gelijken diameter en als verge-
lijkingsvloeistoffen werden versch gemaakte HCl oplossing ge-
bruikt. Daar bij deze wijze van werken een stoornis zou kunnen
optreden door de aanwezigheid van de ongedissocieerde zuur-
moleculen, die eenigzins vergelijkbaar is met de zoutfout van
den indicator, is getracht hierin eenig inzicht te krijgen. Daartoe
werd van 0,1 mol. phosphaatoplossing (phosphaat HCl) en 0,4
mol. acetaatoplossing (Na acetaat HCl) de H-ionenconcentratie
electrometrisch bepaald. Daarna werd deze colorimetrisch bepaald
met HCl als vergelijkingsvloeistof.

De uitkomst hiervan was het volgende, de H-ionenconcentratie
uitgedrukt als de negatieve machtslogarithme Ph:

(H electrode) p» (colorimetrisch)

0,1 mol. phosphaat 2,25 2,25 met tropaeoline 00

0,4 mol. acetaat 2,03 2,09 „

0,1 mol. phosphaat 2,27 2,27 „ methanylgeel

0,4 mol. acetaat 2,46 2,50 „

In een 0,1 mol. melkzuur oplossing behoeft naar alle waar-
schijnlijkheid geen rekening gehouden te worden met een mogelijk
foutieve aanwijzing van deze indicatoren.

Met den indicator tetrabroomphenolsulfonphtaleine zijn geen
goede uitkomsten verkregen. Het preparaat, dat ik tot mijn be-
schikking had, vertoonde in zoutoplossingen een kleur, die zeer
afwijkend was van die in zuiver HCl van dezelfde waterstof-
ionenconcentratie.

De uitkomst van de colorimetrische bepalingen was in 0,0924

N. melkzuur:

Ch K

met tropaeoline-00 3,69 X 10-3 1,54 x lO-i

met methanylgeel 3,63 X lO-» 1,48 X IO-^

De verschillen, die optreden bij de bepaling van de dissociatie-
constante volgens verschillende methoden, en die zich bij alle

vijf preparaten vrij regelmatig herhalen, hebben nog tot de over-
weging geleid om de H-ionenconcentratie van melkzuur te be-
palen door de snelheid der rietsuikerinversie. Hoewel deze
methode onafhankelijk is van de voorgaanden is hiervan toch
afgezien. De invloed van de niet gedissocieerde zuurmoleculen
op de snelheid van rietsuikerinversie is namelijk zeer slecht
mathematisch uit te drukken, zoodat voor een nauwkeurige be-
paling de methode toch eigenlijk niet in aanmerking komt, af-
gezien van den langen duur (± drie weken), die een bepaling met
0,1 N melkzuur bij 25° zou eischen.

Zoo vindt Ostwald i) geen constante verhouding tusschen
inversiesnelheid en H-ionenconcentratie; 0,5 NHCl. inverteert
6,07 X zoo snel als 0,1 N. Arrhenius2) heeft den invloed na-
gegaan van de ongedissocieerde moleculen van een zwak zuur
op de inversiesnelheid. Deze verhoogen de inversieconstante, hoe
sterker het zuur, hoe grooter de relatieve invloed. Cohen 3) vindt,
dat rietsuiker bij 80° door water duidelijk wordt geïnverteerd
en schrijft dit toe aan de zure eigenschappen van rietsuiker,
glucose en fructose, door hem aangetoond.

Bij de beoordeeling der uitkomsten, verkregen met de ver-
schillende preparaten volgens de drie methoden, kan preparaat II
buiten beschouwing blijven wegens het H2SO4 gehalte.

De verkregen uitkomsten zijn dus:

Preparaat I.

Methode a. Methode b.

1,54X10~4 1,55X10-4 mengsels mengsels mengsels

1,56 X 10-4 1,54 X 10-4 Na lact.-melkz. Ca lact.-melkz. Zn lact.-melkz.

1,52X10-4 1,50X10-4 1,51 X10-4 1,40X 10-4 1,17X10-4

1,51 X10-4 1,51 X 10-4 1,45X10-4 1,27X 10-4 1,24X10-4

1,37X10-4 1,46X 10-4 1,53X 10-4 1,41 X10-4 1,30X 10-4

1,37X10-4 1,41 X10-4 1,56X 10-4 1,47X 10-4 1,32X 10-4

Methode c.

1,43X10-4

____1,50X10-4

1) OSTWALD, Journ. f. prakt, chem., 31, 307. (1885).

2) Arrhenius, Zeitschr. physik. chem., 4, 237. (1889).

3) COHEN, Zeitschr. physik. chem., 37, 69. (1901).

N

i2 "03 I T I I

% S 2 2 2 S

I^XXXX

c l—I »-T T-< T-T

N

CO I T T 1 T

I1^2222

I^^XXXX

ta »-1 r-î\' r-T I-T

o

.s \'l\' f

"S I I I I
S e c o o o

w ft .-H ,-( ^ ^

g^xxxx

SC3 CO ITÎ o^

—\' in iq ifî in

(S t-H\' l-T .-H ,-H

f .«f »» Tt ,

I t I I I I I
o o o o o o o

« xxxxxxx

QJ
T3
O

O)

s

C8

i2
a

a,.

Oh ^ rH T-H 1—4 T-H 1-H

islî IT 1

a> e c» o o o

M c »-l l-H l-H

cxxxx

c ^ ^ ^ ^
N

N

Si .m T

T3 ço S ,-1 ^ ,-1

Ig^xxxx

(D iï ca o o CO 00

Ä S — ^ ^ TT ^
Kl r-T ^

o

N

IX

g Ó ô ô o

I^XXXX

ce T—< r-l ^ T-i
2

lllllll
d XXXXXXX
Ü

o It—\'

o

> 5

^sîXlîJlî

XXXXXXX

C3

a, ^ ^

. . .
eu e O O O O

M H \'-<\'—\' »-I

c^ xxxx

s -2 g {q s

c T-l

N

<u
•c

o

£ ë 13

o e ra
§

11 i î i X

w j; ^ T-I 1-1

o

g^XXXX

S i2 în In q 18

re 1-î" 1—1
2

o Ô X Î o o X

XXXXXXX

■>1< .«S\' TT

cL ô ô (i i O i

I T-l 1—I I 1 ,-H 1—c

XXXXXXX

»-H CO »-> »1 o t^
if5 in »n >n in -rf Tt
Ô^

Zonder op het oogenblik nog op een bespreking van de
afwijkingen, die de uitkomsten der verschillende methoden ver-
toonen, nader in te gaan, meen ik er toch reeds de conclusie
uit te mogen trekken, dat waarden als 3.1 X 10-^ (Goldschmidt
en Bürkle) en die van den meest recenten datum 2,5 X lO-^
(Van Slyke en Baker 1918) niet juist kunnen zijn en de waarde
voor K bij 25° het dichtst ligt bij de door Ostwald gegevene.
De laagste waarde, die gevonden is, is 1,17 X 10-^, de hoogste
1,62X10-4. Dat de meting der H-ionenconcentratie van een
oplossing van een zuiver zuur zonder eenige bufferwerking zooals
van Slyke en Baker doen, niet altijd de juiste uitkomst kan
geven, is ook voor melkzuur aangetoond. Worden echter boven-
dien hun waarden, verkregen langs electrometrischen weg met
mengsels van Ca lactaat en melkzuur, omgerekend met den
gevonden dissociatiegraad van Ca lactaat (ziebl.11), dan wordt
voor de dissociatieconstante van melkzuur gevonden:

1,41 X 10-4
1,34 X 10-4

1.34 X 10-4

1.35 X 10-4
1,30 X 10-4

enz.

Deze waarden wijken niet noemenswaard af van die, op dezelfde
wijze gevonden, bij de vier boven besproken preparaten. Dat van
Slyke en Baker door directe meting der H-ionenconcentratie van
zuiver melkzuur waarden vinden, die overeenkomen met de, op
foutieve wijze berekende uitkomsten, verkregen door metingen
aan mengsels, moet dus aan compensatie van fouten worden
toegeschreven. Het is ook niet onmogelijk, dat ze een minder
zuiver preparaat gebruikt hebben, een verontreiniging komt bij
meting van de H-ionenconcentratie van het zuur eerder tot uiting

dan bij de meting van mengsels.

Preparaat V kan\' op grond van de zuivering, die er op toe-
gepast is, als een zuiver preparaat beschouwd worden. Bij ver-
gelijking van de cijfers, die de verschillende methoden ook voor
dit zuur opleveren, is het niet mogelijk zonder meer tot een
waarde van K te besluiten.

Methode b is niet de meest nauwkeurige om tot de waarde
voor K te komen. Uit de metingen van de mengsels van Na-
lactaat en melkzuur blijkt, dat wel eens een waarde wordt ge-
vonden, die buiten de andere valt. Een afwijking van ^ milli-
volt in de potentiaalmeting geeft dan ook een verandering van on-
geveer vier eenheden in de 2e decimaal der dissociatieconstante. Bij
de metingen, verricht met mengels van Ca lactaat en melkzuur en
bij die met mengsels van Zn lactaat en melkzuur, ondergaat de uit-
komst waarschijnlijk den invloed van het niet juist kennen der
lactaationenconcentratie in oplossingen van Ca lactaat en in die
van Zn lactaat. De lage dissociatiegraad, bij deze zouten ge-
vonden, naast de bekende neiging van Ca en Zn cm complexe ionen
te vormen, deed al dadelijk vermoeden, dat in een oplossing
van Ca lactaat en in een van Zn lactaat andere ionen dan Ca-
en lactaat-, resp. Zn- en lactaationen bestaan. Dat de metingen
van deze mengsels toch zijn uitgevoerd naast die van Na lactaat
en melkzuur, was om te zien of de in de literatuur voorko-
mende afwijking van K hierdoor misschien verklaard zou worden.
Dit is gebleken niet het geval te zijn. De electrometrische
bepalingen, verricht met mengels van melkzuur en Na lactaat,
doen zien, dat deze methode bruikbare uitkomsten geeft, aan-
gezien hier van complexe ionisatie geen sprake kan zijn; die,
verricht met mengels van Ca lactaat en melkzuur, resp. met
Zn lactaat en melkzuur, wijken, hoewel niet veel, toch duidelijk
van de eerstgenoemde af. De verklaring hiervan is naar alle
waarschijnlijkheid de bovengenoemde onzekerheid in de lactaat-
ionenconcentratie.

Viscositeitsmetingen, verricht aan oplossingen van 0,1 N Zn-,
0,1 N Ca- en 0,1 N Na lactaat {25% hebben doen zien, dat de
uitkomst der berekening van de lactaationenconcentratie uit het
geleidingsvermogen, in oplossingen van Zn lactaat en Ca lactaat
niet den invloed ondergaat van een abnormaal hooge viscositeit
van deze oplossingen in vergelijking met die van Na lactaat.
Dit maakt het nog meer waarschijnlijk, dat bij oplossingen van
Zn lactaat en Ca lactaat aan complexiteit gedacht moet worden.

Te dien einde heb ik de uitkomsten, verkregen met de potentio-
metrische bepalingen der mengsels van Ca- resp. Zn lactaat en melk-

zuur niet gebruikt om de lactaationenconcentratie van de op-
lossingen van Ca- en Zn lactaat te berekenen. De metmg der
H-ionenconcentratie had, indien ze voor dit doel,gebruikt moest
worden, een grootere maat van nauwkeurigheid vereischt. Eris
namelijk altijd met een capillair electrometer gewerkt als nul-
instrument; een galvanometer had dan toch tenminste gebruikt

moeten worden.

Methode a en c lijken beide zeer nauwkeurige bepalmgswijzen om
de dissociatieconstante van een zuur te leeren kennen De methode
volgens Bredig geeft uitkomsten, waarvan de duplo-bepalmgen
altijd onderling zeer weinig afwijken; de reactieconstante is m
alle onderzochte gevallen goed constant gevonden. De methode
volgens Bredig heeft niettemin bij nagenoeg alle zuren een lagere
waarde opgeleverd voor K, dan die verkregen door metmg van
het geleidingsvermogen. 1) Ik heb bij de berekeningen van de
bacteriologische proeven voor K de waarde genomen, gevonden
uit de metingen van het geleidingsvermogen van preparaat V
in verschillende verdunningen. Een poging namelijk, om het
verschil in de uitkomsten, verkregen met methode a en die met
cop te helderen, is in zoo verre geslaagd, dat ik daar de con-
clusie uit meen te mogen trekken, dat de methode volgens Bredig

voor een nauwkeurige bepaling der dissociatieconstante van melk-
zuur niet in aanmerking kan komen en een weinig te lage waar-
den voor K moet geven.

K melkzüur =1,5X10-4(25°) is de waarde, die naar alle

waarschijnlijkheid het dichtst bij de juiste is.

Daar de methode Bredig altijd lagere waarden voor K opleverde,
dan die gevonden langs anderen weg, is allereerst gedacht aan
het optreden van een nevenreactie bij de esterontleding, analoog
aan die, welke optreedt wanneer zoutzuur aanwezig is.
Ns CH COO C2 Hs H- Cl\' = CH2 Cl COO C2H5 No

~i) Door van Dam (loc. cit.) is bij 18° geen afwijking gevonden bij gcbmik
maken van het geleidingsvermogen en de methode Bred.g ter bepahng
van K. Of de verklaring van deze overeenstemming te zoeken is m de
temperatuurcoefficient. door van Dam gebruikt, wordt ook door het hier
volgende onderzoek niet opgehelderd.

Deze bijreactie verraadt zich, daar het werkzame katalytische
agens dan verbruikt wordt, door een afneming van de snelheids-
constante tijdens de reactie. De snelheidsconstante is echter met
melkzuur, ook als de proef zeer lang werd voortgezet, altijd
constant gevonden ; er is nooit een neiging tot afneming gecon-
stateerd kunnen worden. Dit maakt het niet waarschijnlijk, dat
het melkzuur anders dan kataly tisch bij de reactie in werking treedt.

Wanneer het melkzuur tijdens de reactie op de één of andere
wijze werd verbruikt, zou het geleidingsvermogen na afloop
der reactie, vergeleken met dat van zuur van dezelfde concen-
tratie waaraan evenveel water als in het andere geval ester
was toegevoegd, nl. 1 %, zeer duidelijk afgenomen moeten zijn.
Proeven hierover genomen, waarbij melkzuur vergeleken werd
met azijnzuur (een zuur waarmee Bredig goede resultaten heeft
verkregen) gaven zulke onregelmatige uitkomsten, dat er geen
conclusie uit te trekken was. Bij een systematisch onderzoek,
later verricht met propionzuur, bleek dit te moeten worden toe-
geschreven aan de verzeeping van de gevormde glycolzure
aethylester. Een mengsel van propionzuur en ontlede diazo-
glycolzure aethylester had geen constant geleidingsvermogen.
Dit werd iedere 24 uur gemeten en het nam regelmatig toe. Op
deze manier was dus niet tot een bruikbare verklaring van
het verschijnsel te komen.

Om een algemeene verklaring voor de afwijking te vinden
was het noodig om eerst met andere zwakke organische zuren
bepalingen te verrichten. Het eenige éénbasische zwakke orga-
nische zuur, dat Bredig heeft gebruikt bij de contrôle van zijn
methode, is azijnzuur geweest. Zooals bekend, is mierenzuur,
dat een veel sterker zuur is dan azijnzuur, hiervan een veel
voorkomende verontreiniging.

De uitkomsten, verkregen met de methode Bredig, zijn door
mij vergeleken met die, verkregen uit de meting van het ge-
leidingsvermogen in verschillende verdunningen, bij de volgende
drie organische zuren:
Ie azijnzuur
2e propionzuur
3e boterzuur.

Het azijnzuur was een preparaat alkom.tig, van P™f-Schoorl
bereid door herhaald uitvriezen van zuiver azunzuur. Het bevatte

het zuufals zoodanig het geleidingsvermogen in verschillende ve -
tontagen bepaald De waarde voor de dissocaheconstante ge-
vönrn byverschillende verdunningen, was een vn, goed constante
irvrliwe overeenkomend met de in de literatuur opgegevene. Het
ororruur werd daarna gefracüonneerd gedestilleerd.Van twee op
E volgende fracties werd weer het geleidingsvermogen m vier

verdunllen bepaald. De uitkomsten "
overeenstemmend en weken zoo wemig ai van die van net oor
ronkëSrzuur, dat dit als een zuiver preparaatisbeschouwd.
^oTdf be^atogén volgens Bredig is één van de twee onderzochte

— boterzuur was ook een preparaat van Kahlbaum;

is gleTop dezelfde wijze als propionzuur onderzocht en ge-
des^lerd. De uitkomsten waren hier ook zoo bevredigend, dat
tot pen zuiver preparaat besloten kon worden.

Deuyomsen^v«kregenvolgensdetweeverschillendemetho

met de iMe zuren, zijn de volgende. Opgave van duplo-bepalmgen
Tb j befde methode; aohter^vege gelaten omdat die bevredigend
kloDten Die van het geleidingsvermogen, gemeten met onge-
w ».irrtP electroden hadden de vereischte overeenstemming;
Tvl "volgens Bredig, alle "epaaid bij 25», wijken
hoogstens twee eenheden in de 2e decimaal in de waarde der
dissodaüeconstante van het betreffende zuur onderhng af.

\'^Methode a. Het aequivalent geleidingsvermogen van azijnzuur
bij oneindige verdunning is 349 42,6 = 391,6 genomen.

tabel xix.

Geleiclingsvermogen azijnzuur.

concentratie X25 nnn^

0,1016 n 5,320X10-4 ^^

0,0508 n 3,703X10-4 0.0186

0,0254 n 2,598X10-^ 0,02®

0,0127 n 1,816X10-4 0.0369 ^

0,0064 N 1,282X10- 0,05^

0,0032 n 0,887X10-4 0,0713 1,74 Xl^-

Methode c. TABEL XX.

Katalysator 0,1031 N azijnzuur
- a = 33,10.

C„= 1,30X10-3
Kazijnz. = 1,66X10-5

Cn = 0,574X10-3
K azijnz. = 1,67 XlO-5

gem. 221X10-4

De literatuur geeft voor de waarde vanK azijnzuur 1,8 X10-^ (25)\').
Propionzuur.

Metfiode a. Het aequivalent geleidingsvermogen bij oneindige
verdunning voor propionzuur is 349 37,9 = 386,9 genomen.

TABEL XXI.
Geleldingsvermogen propionzuur.
concentratie xja « K

0,1038 N 4,664X10-4 0,0116 1,41X10-5

0,0542 N 3,352X10-4 0,0160 1,42X10-5

0,0259 N 2,330X10-4 0,0233 1,44X10-5

0,0065 N 1,144X10-^ 0,0455 1,41X10-5

0,0033 N 8,012 X 10-5 0,0637 1,41 X10-5

1) Zie voor de opgave van de dissociatieconstanten van organische zuren
(250) bv. de tabellen in Kohlrausch u. Holborn, Das Leitvermögen der
Elektrolyte 2e Auflage.

Methode c. TABEL XXIL

Katalysator 0,1137 N propionzuur
a = 32,62.

t a—X K

2 29,77 457X10-4

4 27,16 458X10-\'\'

6 24,78 458X10-4

9 21,55 461X10-4

12 18,78 460X10-4

16 15,65 459X10-4

20 12,95 462X10-4

25 10,23 464X10-4

40 5,05 466X10-4

50 3,13 469X10-4

85 0,62 466X10-4

gem. 462X10-4

De literatuur geeft voor K propionzuur de waarde 1,3 X lO-^ aan.

^m^eTho"de a. Het aequivalent geleidingsvermogen van boterzuur

bij oneindige verdunning is 349 34,1=383,1 genomen.

TABEL XXllI.
Geleidingsvermogen boterzuur.

X25

3,254 X 10-4 0,0171

2,330 X 10-4 0,0244

1,627 X 10-4 0,0341

1,143 X 10-4 0,0479

7,950 X 10-5 0,0667

5,462X10-5 0,0917

TABEL XXIV.
Katalysator 0,09328 N boterzuur.

: 35,98
a —X K

33,05 427 X 10-^

30,30 431 X lO-\'\'

27,85 428 X 10-4

24,50 429X10-4

21,48 431 X 10-4

18,10 430X10-4

14,60 430 X 10-4

11,82 429 X 10-4

8,38 430 X 10-4

5,00 430 X 10-4

2,78 435 X 10-*
gem. 430 X 10-4

De literatuur geeft voor K boterzuur 1,5 X lO-®.

Uit de cijfers blijkt, dat bij de drie onderzochte zuren dezelfde
soort afwijking als bij melkzuur wordt gevonden. Het zou mogelijk
kunnen zijn, dat er door de toevoeging van den ester invloed
wordt uitgeoefend op de dissociatie van het zuur.

Arrhenius!) heeft een uitvoerige studie gemaakt over den
invloed, die toevoeging van kleine hoeveelheden niet-electrolyten
op het geleidingsvermogen van electrolyten uitoefent. De invloed
van verschillende suikers, alcoholen en esters is hierbij nagegaan.
Hij komt tot de conclusie, dat bij zwakke electrolyten de ver-
mindering van het geleidingsvermogen niet alleen veroorzaakt
wordt door de ontstane verhoogde viscositeit van de vloeistof.
Bij zwakke zuren wordt door toevoeging van niet-geleiders de
dissociatie verminderd.

Kolthoff2) gebruikt den grooten invloed, die kleine hoeveel-
heden alcohol op het geleidingsvermogen van organische zuren
hebben, om het alcoholgehalte van een vloeistof te bepalen.
Hij acht het waarschijnlijk, dat het evenwicht:

niet ionogeen % ionogeen,

dat in een waterige oplossing van organische zuren bestaat,
door alcohol naar links wordt verplaatst. Dit is een andere ver-
klaring van de door Arrhenius onderzochte gevallen, maar komt
toch ook hierop neer, dat een zwak organisch zuur in een milieu,
waarvan een zeer klein gedeelte van het water is vervangen
door een niet-electrolyt, een kleinere dissociatieconstante heeft
dan in een waterig milieu.

Ik heb het waarschijnlijk geacht, dat de regelmatig terug-
keerende afwijking in de dissociatieconstanten van zwakke or-
ganische zuren, gevonden met de methode Bredig, was toe
te schrijven aan den invloed van het milieu. Er is daarom
gemeten of de vermindering van het geleidingsvermogen van
HNO3 bij vervanging van 1% water door glycolzure aethyl-
ester relatief kleiner was dan die van het geleidingsvermogen

1) Arrhenius Zeitschr. Physik. Chem., 9, 487. (1892).

2) Kolthoff, Ree. trav. chim., 39, 126. (1920).

der organische zuren. Er is bij het begin van de reactie vol-
gens Bredig diazo-ester aanwezig, die tijdens de reactie ver-
andert in glycolzure ester. Het was niet mogelijk om den invloed
van den diazo-ester op het geleidingsvermogen van de zuren te
meten, omdat deze onder gasontwikkeling ontleedt. Er kan echter
wel wórden aangenomen, dat de invloed van deze twee esters niet
veel zal verschillen. De glycolzure aethylester is bereid volgens
FiscHER. 1) Het verkregen product werd eenige malen gefraction-
neerd. Ten slotte is een fractie, die tusschen 159° en 160° over-
ging, gebruikt. Het geleidingsvermogen van een 1% waterige
oplossing van dezen ester was 3 X 10-6 (25°) en nam iets toe door
verzeeping. De invloed van den ester op het geleidingsver-
mogen van zuren is nagegaan. In het ééne geval werd aan de
oplossing van het zuur 1% (volume) water toegevoegd, m het

andere l^/o ester. ..r , ,

De uitkomsten waren de volgende, in de eerste cijferkolom

is het geleidingsvermogen van de oplossing van het zuur ver-
meld, in de 2de dat van het zuur, wanneer 1% van het
oplosmiddel door ester is vervangen, in de 3de de relatieve
vermindering, in 0/0, die het geleidingsvermogen hierdoor ondergaat.

X25 X25 ^

zuur in H2O zuur ester

H NO-^ 0,001 N 4,162X10-^ 4,094 Xl»"\'

azijnzuur ± 0,1 N 5,296X10- 5,101X10-^ 3,68 0/0

mSnzÏoi N 4,575X10-^ 4,388X10- 4,090/«

Kzuu±01 N 4,563X10- 4,373X10"^ 4,16 0/0

melkzuur 0,01 N 4,385X10- 4,142X10"^ 5,52 o/«

mekzuurï 0,005 N 2,948X10- 2,802X10"^ 4,920/«

melkzuur ± 0,0025 N 2,007 X10- 1.902 X10- 5,23 o/«

Duplo-bepalingen gaven vrijwel overeenstemmende waarden,
hoewel de metingen aan eenige onzekerheid onderhevig zijn
door het betrekkelijk groote, en niet geheel constante, geleidings-
vermogen van den glycolzuren ester zelf. Er kan echter toch wel
de conclusie uit getrokken worden, dat in een milieu waarin
1 0/0 ester aanwezig is, zooals bij de uitvoering van de methode
Bredig het geval is, deze zuren een iets lagere dissociatie-

1) Fischer, Ben d. d. chem. Ges., 28, 3256. (1895).

constante dan in water moeten vertoonen. De bepaling der
H ionenconcentratie volgens Bredig is, in den vorm waarin ze
door Bredig is gegeven, niet geschikt voor nauwkeurige bepa-
ling der dissociatieconstante van zwakke organische zuren.

Men kan aannemen, dat de invloed, die de toevoeging van
een niet-electrolyt op het geleidingsvermogen heeft van een zwak
zuur, uit twee factoren is samengesteld. De ééne factor bestaat
in de verhooging der viscositeit. Bij sterke en zwakke zuren
kan men aannemen dat, de invloed der viscositeit dezelfde is.
Het grootste gedeelte van het geleidingsvermogen van een zuur
wordt veroorzaakt door het H-ion, dat bij allen hetzelfde is.
Daarbij komt dan bij zwakke electrolyten de invloed, die de
niet-electrolyt heeft op de dissociatie, of op het evenwicht iono-
geen ^ niet ionogeen, wat praktisch op hetzelfde neerkomt.

Bij kleine hoeveelheden toegevoegde niet-electrolyt zijn deze
twee factoren als additief te beschouwen, zooals Arrhenius i) dat
aangeeft.

Uit de afwijking van de dissociatieconstante van een zwak
zuur, gevonden met de methode Bredig, is de invloed te berekenen
die 1 % ester op den dissociatiegraad van het zuur heeft. Bij de
metingen van het geleidingsvermogen ondergaat de uitkomst
zoowel den invloed van de verandering der viscositeit als die
van den dissociatiegraad. Het verschil van de twee afwijkingen bij
deze zwakke zuren zou, indien de bepalingen voldoende nauw-
keurig geweest waren, (wat, zooals boven bij meting van het
geleidingsvermogen is aangegeven, nog wel eens wat te wenschen
overlaat) ongeveer de invloed van de verandering der viscositeit
moeten zijn: d.i. de invloed, die toevoeging van 1 % ester op
het geleidingsvermogen van HNO3 heeft, n.1. ± 1,6%.

Het is gebleken, dat de bepalingen op deze wijze niet vol-
doende nauwkeurig zijn uit te voeren om den invloed, die toe-
voeging van 1 % ester heeft op het geleidingsvermogen van
zwakke zuren, te splitsen in de twee factoren, waaruit hij is
samengesteld. Dit blijkt uit de volgende tabel; K is de disso-

1) Arrhenius, loc. cit.

ciatieconstante van het betreffende zuur, gevonden uit meting
van het geleidingsvermogen, a ber. is de daaruit berekende
dissociatiegraad, a gev. de dissociatiegraad, gevonden uit een
bepaling volgens Bredig; factor II is de afwijking, op deze wijze
in den dissociatiegraad gevonden in % uitgedrukt, factor I II
de procentische invloed van 1 % ester op het geleidingsvermogen.
Het verschil tusschen factor I II en factor II zou de invloed
moeten zijn, die de verandering der viscositeit op het geleidings-
vermogen heeft en dus ± 1,6. Het blijkt wel, dat dit niet het

geval is.

TABEL XXV.

a ber. « gev. factor II factor I II

0,0096 N melkz. 1,50X10-^
0,0046 N melkz. 1,50 XIO"\'\'
0,0026 N melkz. 1,50 X 10-^
0,0995 N azijnz. 1,80 X 10-5
0,1137 N propionz. 1,41X10-5
0,0933 N boterz. 1,48 X10-5

Hoewel de meting van het geleidingsvermogen van de zuren,
waaraan ester is toegevoegd, evenals deze meting van den
ester, opgelost in water, onnauwkeurig is door de verzeeping,
is het toch opmerkelijk, dat het verschil tusschen factor II en
factor I II nergens in de nabijheid ligt van de waarde van
den invloed, die de ester heeft op het geleidingsvermogen.van
HNO3 d.i. 1,6. Een verklaring hiervan heb ik niet kunnen vinden.

HOOFDSTUK II.

Quantitatieve bepalingen bij de melkzuurgisting.

Het oorspronkelijke doel van dit bacteriologische onderzoek,
verricht met melkzuurbacteriën, was de samenstelling van een
kunstmatigen voedingsbodem daarvoor, die in eigenschappen ver-
gelijkbaar zou zijn met melkwei. Een dergelijke voedingsbodem
zou, om waarde te hebben, gemakkelijk reproduceerbaar moeten
zijn en dus nauwkeurig omschreven; de voedingsstoffen zouden
zooveel mogelijk gelijkwaardig moeten zijn aan die, welke in
de wei voorkomen, de bufferwerking en de zuurgraad ervan
zouden constant moeten zijn.

Zooals in de inleiding werd gezegd, maken de onderzoekingen
van van Dam^) en van Svanberg 2) het zeer waarschijnlijk, dat
bij het einde van de melkzuur gisting de hoeveelheid ongedis-
socieerde melkzuurmoleculen een constante waarde heeft. Uit
de genoemde onderzoekingen blijkt immers, dat, ook wan-
neer de H-ionenconcentratie van de melkwei of het melkserum
verkleind wordt door toevoeging van Na-lactaat, toch de gisting
eindigt bij een bepaalde concentratie van de ongedissocieerde
melkzuurmoleculen. Het lijkt dus de aangewezen weg om bij be-
oordeeling van melkzuur gisting in verschillende voedingsbodems
de concentraties ongedissocieerd melkzuur met elkaar te ver-
gelijken. Het is immers gebleken, dat de hoeveelheid totaal ge-
vormd zuur evenmin als de bereikte H-ionenconcentratie voor
een bepaalde stam een constante waarde heeft. Deze beide fac-
toren veranderen met de bufferwerking van het voedingsmedium,
ook al wordt dit overigens onveranderd gelaten.

1) van Dam, Blochem. Zeitschr., 87, 107. (1918).

2) Svanberg, Inaugural Dissertation. (1918).

Het onderzoek naar de hoeveelheid ongedissocieerde melkzuur-

moleculen. waarbij de gisting eindigt diende voor willekeurige
stammen bevestigd, en op sommige punten eenigzms uitgebreid
te worden, wanneer de waarde van de constante als beoordeehngs-
factor van de melkzuur gisting moet dienen ook in andere voedings-
bodem dan wei. Ik zal deze hoeveelheid, uitgedrukt m gram-
moleculen per L. in het vervolg kortheidshalve de constante van
de bacterie noemen en met de schrijfwijze Chm aanduiden.

Deze punten zijn: , ux o^ ^

1 Aan eenige willekeurige stammen van het geslacht Strepto-

\' coccus lactis na te gaan of bij groei in wei een constante

voor de bacterie wordt gevonden.

2. Eventueele invloed van den ouderdom der culturen op de

grootte der constante.

3. Invloed van de samenstelling der wei op de grootte der

constante. ,, ,,

4 Indien de constante voor een bepaalde reincultuur onafhan-
kelijk mocht blijken te zijn van den ouderdom der cultuur en
van verandering in samenstelling der wei, bestaat de moge-
lijkheid, dat de grootte van de constante een kenmerk ter
differentiatie van de stammen onderling kan zijn.

5 De mogelijkheid, dat het vinden van een constante al of met
\' afhankelijk is van de vorming van optisch actief melkzuur.

De isol\'atie der bacteriën, voor het onderzoek in wei en in
den kunstmatigen voedingsbodem gebruikt, geschiedde op de
gewone wijze via een plaatcultuur. Er werd in alle gevallen
een plaatcultuur op weigelatine aangelegd van melk, die bij
25° was gecoaguleerd na 24 uur staan. . ^ „

In Januari 1920 is geïsoleerd stam A en stam O uit melk,
afkomstig van de proefzuivelboerderij te Hoorn; A uit volle

melk, O uit centrifugemelk.

In Maart 1920 is stam R geïsoleerd uit handelsmelk.
Uit melk, afkomstig van 3 verschillende boerderijen in den omtrek
van Hoorn, zijn in Mei 1920 geïsoleerd de stammen K en B en D.

De stammen A, R, K en D zijn gedurende het jaar, dat er mee
geëxperimenteerd is geworden, altijd in staat gebleven melk

binnen 24 uur te doen coaguleeren bij 25°. De stammen O en B
hebben daarvoor bij 25° steeds 2 X 24 uur noodig gehad. Om de
reinculturen te behouden werden ze om den anderen dag overgeënt
in gesteriliseerde centrifugemelk. Microscopisch vertoonden ze
allemaal het gewone beeld van lactoccen (diplo-streptococcen).

In Februari 1920 bleek, dat stam A en stam O niet meer
groeiden in gewone mengmelk.

Daar hierbij te denken was aan het bekende feit, dat melk
afkomstig van nieuwmelksche koeien dikwijls een slechte voedings-
bodem is voor melkzuurbacteriën, zijn vanaf dien tijd de rein-
culturen altijd overgeënt in melk afkomstig van oudmelksche
koeien. Het verschijnsel heeft zich toen niet meer voorgedaan.
Bovendien konden de stammen A en O in deze melk weer tot
normalen groei gebracht worden.

Punt I. Bepaling van de constante van de geïsoleerde stammen
bij groei in wei.

De melkwei werd bereid door melk bij ± 37° met stremsel
te doen stremmen. Bij het kweeken van de melkzuurbacteriën
in melkwei hebben zich onverwachte moeilijkheden vertoond.
Het is met geen enkelen stam gelukt om in gesteriliseerde wei,
waaraan niets was toegevoegd, een dergelijke zuurvorming te
verkrijgen, dat deze als normale melkzuur gisting was te be-
schouwen.

In wei van gewone mengmelk, gemaakt met vloeibaar stremsel,
bleek geen enkele stam de potentieele zuurgraad hooger op te
voeren dan 10 ü 15 cm^ 0,1 N zuur per 100 cm^.

Zes verschillende soorten, ook door middel van vloeibaar stremsel
verkregen wei, afkomstig van 6 verschillende koeien, bleken alle
6 een even slechte voedingsbodem voor de bacteriën te zijn. Be-
halve met de reinculuur der bacteriën zijn deze 6 soorten wei ook
geënt met zg. zuursel voor de boterbereiding, aanwezig op het
Rijkslandbouwproefstation te Hoorn. Dit is namelijk te beschouwen
als een mengsel van zeer krachtige melkzuurbacteriën. Daar in
geen enkel geval normale zuurvorming werd verkregen met dit
zuursel, en ook de reincultuurstammen slechte zuurvorming ver-
toonden, werd het waarschijnlijk, dat de oorzaak der afwijking

in den voedingsbodem en niet in de geisoleerde stammen was
te zoeken.

De mogelijkheid, dat het vloeibare stremsel een conserveer-
middel kon bevatten, dat groei van melkzuurbacteriën tegenging,
is overwogen. De proeven zijn daarom herhaald met veel ver-
schillende soorten wei, verkregen door middel van droog stremsel-
poeder „Hansen", dat geen ander conserveermiddel dan natrium-
chloride bevat. Echter met hetzelfde resultaat. Svanberg i) gebruikt
voor het kweeken van melkzuurbacteriën melkserum, verkregen
door melk te coaguleeren met zoutzuur. Terwijl Svanberg in
een dergelijken stikstofarmen voedingsbodem een normale melk-
zure gisting verkreeg, was bij mij de groei daarin zoo gering, dat
ook van een poging om dezen te gebruiken, moest worden afgezien.
Daar in wei, waaraan 0,5% of 0.75% pepton was toegevoegd
met alle stammen een goede zuurvorming was te verkrijgen,
heb ik de proeven over melkzuur gisting in wei moeten ver-
richten met wei, waaraan pepton was toegevoegd. Ik heb het
noodig geacht de mislukte pogingen, om in gesteriliseerde melk-
wei, waaraan niets was toegevoegd, normale melkzuur gisting
te verkrijgen, hier mede te deelen, omdat dit Van Dam en
Svanberg wel gelukt is en ik geen verklaring kan geven
waarom het nu niet verkregen kon worden. Ik heb gedurende
het jaar 1920 nog dikwijls een poging aangewend om in ge-
steriliseerde wei zonder toevoeging normale gisting door de
melkzuurbacteriën te veroorzaken. Echter altijd met negatief
resultaat.

De proeven, genomen voor de bepaling van de constante van
een bepaalde reincultuur, zijn op dezelfde wijze verricht als door
Van Dam 2). Bij 45 cm^ wei werd een bekende hoeveelheid
Na lactaat gepipetteerd of gewogen, daarna opgevuld tot 50 cm^.
Na nog eens gesteriliseerd te zijn, werd deze voedingsbodem
met een druppel van de reincultuur geënt. Er is met deze be-
trekkelijk groote hoeveelheid geënt om zoodoende eenigszins
onafhankelijk te zijn van de individueele verschillen van een

1) Svanberg loc. cit. Zie bovendien Zeitschr. f. physiol. Chem., 108,
120. (1919) ,

2) Van Dam loc. cit.

reincultuur. Na afloop der gisting (dat was minstens 7 dagen
na enting) bij 25° werd de totaal gevormde lioeveelheid melk-
zuur uit de titercijfers gevonden; de H-ionenconcentratie van
de uitgegiste cultuur werd electrometrisch bepaald. Uit deze
gegevens is de constante van de bacterie, te berekenen.

Immers: K = (1)

K is de dissociatieconstante van melkzuur, C^ en C^: de
H-ionenconcentratie en de lactaationenconcentratie.

K= 1.5X 10-4

Ch wordt gemeten.

Cm is te berekenen uit de hoeveelheid gevormd melkzuur en
de hoeveelheid toegevoegd Na lactaat. Daar de reëele zuur-
graad van de culturen nooit hooger wordt opgevoerd dan
± 10-4 benadert men de lactaationenconcentratie van het ge-
vormde melkzuur het beste, door dit als Na lactaat aanwezig
te rekenen. De geheele hoeveelheid aanwezig lactaat wordt
dan gevonden: C^ = « (L — Ch^,).

L is dan de som van het toegevoegde lactaat en de hoeveel-
heid gevormd melkzuur.

Deze waarde voor C^^ ingevoerd in vergelijking (1) geeft:

= ^ _ ^K (2)

1

Ch Xa

In de culturen, waarin de gisting plaats vindt zonder toe-
voeging van Na lactaat, is deze wijze van berekening der lac-
taationen concentratie iets onzeker. Wanneer men in dit geval
het gevormde melkzuur aanwezig denkt te zijn als Na lactaat,
is het mogelijk dat een merkbaar deel aanwezig is als K- of
Ca lactaat, waarvoor dan niet de dissociatiegraad van Na lactaat
in rekening gebracht zou mogen worden. Ik meen een geringe
afwijking der C^^^ waarde, gevonden in culturen, waaraan geen
Na lactaat is toegevoegd, van die, gevonden in culturen met
toegevoegd Na lactaat, op grond van deze onzekerheid te mogen
verwachten.

De uitkomsten der proeven, verricht in Mei 1920 met de zes

genoemde bacteriestammen in wei (Wei I) ^^^^ OJ5 0/o
pepton was toegevoegd, waardoor het N gehalte O 14% ge-
worden was, zijn de volgende. De dissociatie^aad van Na-
lactaatis door graphische interpolatie gevonden mt de waarden
van Tabel VIII.

TABEL XXVI.

Stam A in Wei I (Mei 1920).

Concentratie Concentratie
toegev. Na lactaat gevormd melkz.

O 0,0334 N

0,020 N 0,0319 N

0,040 N 0,0308 N

0,060 N 0,0301 N

0,080 N 0,0296 N

0,100 N 0,0296 N

Stam O.

Concentratie
toegev. Na lactaat

O

0,020 N
0,040 N
0,060 N
0,080 N
0,100 N

Concentratie
gevormd melkz.

0,0304 N
0,0295 N
0,0286 N
0,0267 N
0,0261 N
0,0256 N

5,50X10-5
4,07X10-5
3,09X10-5
2,45X10-5
1,95X10-5
1,74X10-5

TABEL XXVllI.

Concentratie Concentratie

toegev. Na lactaat gevormd melkz.

O

0,020 N
0,060 N
0,080 N
0,100 N
0,236 N ^

Stam D.

TABEL XXIX.