■u

Onderzoekingen over de
Vorming van Diastase door
Aspergillus Niger van Tiegh,

DOOR

G. L. FUNKE

\'s-GRAVENHAGE
MARTINUS NIJHOFF
1922

.. .. . . .. .......

■t.s "i. " - \'v-

ONDERZOEKINGEN OVER DE
VORMING VAN DIASTASE DOOR ASPER-
GILLUS NIGER VAN TIEGH.

v-V,

m

ONDERZOEKINGEN OVER DE
VORMING VAN DIASTASE DOOR
ASPERGILLUS NIGER VAN TIEGE

PROEFSCHRIFT TOT HET VERKRIJGEN VAN DEN GRAAD
VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE. AAN DE
RIJKSUNIVERSITEIT TE^TOECHT, OP GEZAG VAN DEN
RECTOR MAGNIFICUS DR. J. A. CrVAN LEEUWEN, HOOG-
LEERAAR IN DE FACULTEIT DER GODGELEERDHEID,
VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNIVERSITEIT,
TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS-
EN NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN OP DINSDAG,
DEN ELFDEN APRIL 19^, DES NAMIDDAGS TE 4 URE

DOOR

GEORGE LODEWIJK FUNKE

GEBOREN TE DEN HAAG

\'s-GRAVENHAGE

MARTINUS NIJHOFF
1922

r

. ri

■ , • • .\'J -

i ■ ■ .• :

Aan mijne Ouders

v^-m

m\':

\'ff \'. -

Het stemt tot dankbaarheid eenige jaren te hebben
mogen leven in een omgeving waar men dagelijks om-
gang heeft met menschen die wetenschap maken en
doceeren. Met vreugde grijp ik de gelegenheid aan
eenige woorden te richten tot hen, die mij de waarde
van deze omgeving hebben leeren kennen en appre-
ciëeren en mij naar hun beste krachten bij mijn studie
hielpen. "

Meer nog dan het college dat ik bij U liep, zullen uw
redevoeringen, Hooggeleerde Cohen, die ik bij ver-
schillende gelegenheden mocht hooren, mij bij blijven
als schoone uitingen van wetenschappelijk leven in
den meest verheven zin.

Het doet mij leed. Hooggeleerde Wichmann, U niet
meer in Utrecht te zien op den dag mijner promotie.
Ik beschouw het als een voorrecht uw hooggewaar-
deerde persoonlijkheid te hebben leeren kennen op uw
colleges en vooral ook van naderbij op de excursie, die
ik met U mocht maken.

De bijzonder welwillende wijze waarop Gij, Hoogge-
leerde Jordan, steeds klaar stond om mij te woord te
staan over verschillende kwesties die mij moeilijk-
heden brachten, is door mij altijd ten zeerste op prijs
gesteld.

Hooggeleerde Pulle, wanneer ik U noem, denk ik
natuurlijk in de eerste plaats aan de prachtige en

interessante plantengeographische excursie in het
Ober-Engadin, die ik aan uw initiatief te danken heb
Maar ook de systematiek der planten is mij, onder uw
leidmg duidelijk en daardoor sympathiek geworden

Hooggeleerde Westerdijk, ik zal er altijd dankbaar
voor blijven dat mijn studie mij met U in aanraking
heeft gebracht. Uw voorbeeld dat metterdaad toont
hoe men goed en serieus werken kan doen samengaan
met een alleszins blijde levensopvatting, is voor mij
van groote waarde geweest en zal dat nog lang zijn.

De echt wetenschappelijke wijze waarop Gij, Hoog-
geleerde Nierstrasz, in uw colleges den nadruk weet te
leggen op de groote lijnen, het essentiëele in moeilijke
en verwarde zaken met een enkel woord weet te karak-
teriseeren en daardoor bij uw hoorders voor altijd vast
te leggen, is even origineel als voortreffelijk. De indruk
daarvan zal voor mij blijvend zijn. De maanden ge-
durende welke ik op uw laboratorium onder uw per-
soonlijke leiding mocht werken, behooren daardoor tot
de mooiste die ik aan de academie doorbracht.

Hooggeleerde Went, Hooggeachte Promotor, het is
moeilijk in enkele woorden te zeggen wat gij in mijn
studiejaren voor mij zijt geweest. Uw voortdurende
belangstelling in mijn werk, uw zeer persoonlijke lei-
dmg daarbij, de groote welwillendheid waarmee gij
altijd klaar stond mij te helpen, voor dat alles betuig
ik U mijn hartelijke dankbaarheid. Met zeer veel ge-
noegen zal ik ook steeds blijven herdenken de vele
excursies, de groote gastvrijheid van uw huis en vooral
de vriendelijke belangstelling, die mevrouw Went mij
daarbij steeds betoonde.

INHOUD.

Blz.

I. INLEIDING..................................1

II. OVERZICHT VAN DE LITERATUUR..............2

III. METHODE VAN ONDERZOEK EN FOUTENBRONNEN 7

A. METHODE VAN ONDERZOEK......................7

B. FOUTENBRONNEN..............................12

IV. RESULTATEN EN CONCLUSIES, VOOR DE SERIES
GEKWEEKT OP GLUCOSE, ZETMEEL EN MALTOSE 22

A. RESULTATEN..................................22

B. CONCLUSIES....................................39

V. SERIES OP SACCHAROSE, GLYCERINE EN MELK-
SUIKER ..................51

VI. SAMENVATTING VAN DE RESULTATEN.....57

VII. LITERATUUR................59

VIII. TABELLEN.................63

L INLEIDING.

Het was mijn plan te promoveeren op een onderzoek
over enzymen. Toen ik aan het zoeken was naar een
geschikt onderwerp, stelde prof. dr. F. A. F. C. Went
mij voor, het werk dat hij begonnen was, voort te zet-
ten. Dit was een onderzoek over den loop van de vor-
ming van diastase door Aspergillus niger. Ik heb dit
aanbod dadelijk en met vreugde aangevat. Voor ik
begin met het beschrijven van mijn proeven en resul-
taten, wil ik aan prof. dr. F. A. F. C. Went mijn groote
dankbaarheid uitspreken voor de bijzondere welwil-
lendheid waarmee hij het voortzetten van eigen werk
aan mij heeft overgelaten. Tevens voor de vele en
waardevolle hulp, mij daarbij betoond en de groote
vrijheid waarmee ik gébruik mocht maken van alle
inrichtingen en materiaal, die het Botanisch Labora-
torium te Utrecht bezit.

11. OVERZICHT VAN DE LITERATUUR.

Reeds vele onderzoekers hebben zich bezig gehouden
met het vraagstuk of schimmels en bacteriën, onder in-
vloed van de voeding, de afscheiding van hun enzymen
qualitatief en (of) quantitatief reguleeren. De wijze ech-
ter waarop de meesten van hen hun proeven inrichtten,
is zeer primitief; er wordt niet genoeg aandacht besteed
aan storende invloeden; het probleem wordt door bijna
een ieder van verschillende kanten aangepakt. Het
verbaast ons dan ook niet te zien dat de verkregen
resultaten elkaar vrij algemeen tegenspreken.

De eersten reeds die op dit terrein onderzoek verrich-
ten, zijn het er niet over eens, of de organismen hun
enzymen slechts dan vormen wanneer ze noodig zijn,
qualitatief reguleeren dus. Zoo constateerde Wortmann
(55) in 1882 dat bacteriën slechts dan diastase vormen,
wanneer ze op zetmeel werden gekweekt. Hij werkte
met een mengsel van rottingsbacteriën, zou dus zelf
zijn materiaal niet kunnen noemen.

Büsgen (18) deelt echter in 1885 mede dat Aspergillus
Oryzae ook diastase produceert wanneer hij die op
glucose als eenige koolstofbron kweekte.

Fermi (27) 1890—1891, maakte culturen van bacte-
riën op resp. eiwitten en suikers; slechts in het eerste
geval werden proteolytische enzymen gevormd. In
1895 echter vindt hij met Montesano (28) dat Asper-

gillus niger invertase afscheidt, wanneer als organisch
voedsel uitsluitend glycerine wordt gegeven. Daaren-
tegen geeft Pfeffer (42) in hetzelfde jaar als zijn mee-
ning te kennen, dat als regel organismen hun enzym-
productie richten naar de aanwezige voeding. Asper-
gillus niger, gekweekt op een mengsel van glucose en
zetmeel, zal eerst dan diastase produceeren, wanneer
de glucose is opgebruikt, de schimmel dus aangewezen
is op het zetmeel.

In het laboratorium van Pfeffer en in denzelfden
geest deed in 1898 Katz (33) een meer uitvoerig onder-
zoek, waarbij hij schimmels kweekte (Aspergillus niger
en Penicilhum glaucum) op verschillende suikers,
steeds echter met toevoeging van zetmeel, meestal
0,25 %. Hij nam waar dat de suikers de productie
van diastase zeer verminderen en wel te meer naar-
mate hun concentratie hooger is; bij Penicilhum wordt
de diastasevorming zelfs bij lage suikerconcentratie
al geheel stopgezet. Toch vond hij ook diastaseproduc-
tie op glucose alleen. Hier werd dus voor het eerst een
quantitatieve regulatie onder invloed van de voeding
waargenomen. Jammer is het dat Katz zich vergenoegde
met van dag tot dag te onderzoeken of er van het zet-
meel in de cultuurvloeistof nog iets over was; viel de
jodiumreactie negatief uit, dan werd de proef niet
verder voortgezet. Bij de cultuur op glucose was hem
één waarneming ook voldoende om zijn conclusies uit
te trekken.

Duclaux (23) zegt in 1899 reeds, dat Penicilhum glau-
cum en Aspergillus niger vele enzymen produceeren, die
slechts binnen vrij wijde grenzen afhankelijk zijn van

de voeding. Tot een dergelijk resultaat kwam ook
Went (51) in 1901. Hij vond bij Monilia sitophila tien
verschillende enzymen, die hij in drie groepen ver-
deelde naar gelang hun afscheiding door de voeding
werd gereguleerd: een groote groep was steeds aan-
wezig, onverschillig welke voedingsbodem gegeven
werd; een tweede die niet altijd, maar dan toch bij
verschillende stoffen werd gevormd en een groep die
slechts optrad, wanneer die stoffen aan de schimmel
werden gegeven, die door de enzymen in kwestie wor-
den gesplitst.

Ook Butkewitsch (19) merkte in 1902 bij Aspergillus
niger en Penicillium glaucum op, dat de voeding invloed
heeft op de hoeveelheid enzym die geproduceerd wordt.
Waar hij maar met twee verschillende samenstellingen
van voedingsbodems experimenteerde, mogen uit zijn
resultaten niet te veel gevolgtrekkingen gemaakt
worden.

Pottevin (43) deed in 1902 een onderzoek naar de
lactase van Aspergillus niger; deze bleek slechts onder
bijzondere omstandigheden op te treden en dat nog
wel wanneer ze haar specifieke werkzaamheid uit kon
oefenen.

Dox (22) 1910 meent, na een onderzoek op Penicil-
lium camemberti, dat alle enzymen die een organisme
kan produceeren, ten allen tijde aanwezig zijn; dat de
voeding dus slechts een quantitatieven invloed heeft en
wel in dien zin, dat er meer enzym gevormd wordt
naarmate het meer noodig is. Ongeveer dezelfde mee-
ning verkondigen Colin (21) 1911 en Grézes (32) 1912.

In 1911 voerde Kylin (34) een onderzoek uit dat wel

breeder werd opgezet dan de vorige, maar dat in deze
zaak toch ook niet veel meer klaarheid brengt. Hij cul-
tiveerde schimmels op verschillende stoffen, steeds met
bijvoeging van zetmeel en ging van dag tot dag na of
er nog zetmeel in de voedingsbodem aanwezig is. Hoe
meer suiker is toegevoegd, hoe langer het duurt eer dit
verdwijnt. Wanneer dit echter het geval is, dan achtte
hij de proef geëindigd. Ook op voedingsbodems zonder
zetmeel constateerde hij diastaseproductie. Hij ging dit
na voor zeer vele verschillende stoffen. Bij alle kwam
diastase voor; wanneer echter zetmeel was toegevoegd,
was de diastaseproductie veel belangrijker en nog ster-
ker was dit het geval wanneer alleen zetmeel als voe-
ding gegeven werd. Kylin ziet hierin een mooi voor-
beeld van quantitatieve regulatie.

Al deze onderzoekingen hebben een groote fout ge-
meen : er werd nooit gelet op den leeftijd van de schim-
mels wanneer men de waarnemingen deed. Toch is het
moeilijk aan te nemen dat een schimmel ten allen tijde
van haar ontwikkeling een zelfde hoeveelheid enzym
afscheidt; het is integendeel zeer goed denkbaar, dat
een zekere hoeveelheid wordt gevormd, die later door
een of andere oorzaak weer verdwijnt. In geen geval
is men gerechtigd de resultaten die men verkrijgt bij
twee proeven, op verschillenden leeftijd van het orga-
nisme genomen, met elkaar te vergelijken. Deze over-
wegingen brachten Went (52) ertoe in 1914 na te gaan
hoe het verloop van de diastasevorming is bij een
schimmel i.c. Aspergillus niger, gedurende de heele
ontwikkeling. Als voedingsbodem werd gebruikt 5 %
glucose en eiken dag, later om de twee of drie dagen

werd onderzocht of en hoeveel diastase aanwezig was
in mycelium en cultuurvloeistof. Op deze wijze werd
een voorstelling verkregen van de enzymproductie en
van den leeftijd van de schimmel, waarop die productie
haar maximum bereikt.

Wanneer men nu hetzelfde doet met culturen op
voedingsbodems van andere samenstelling, krijgt men
een materiaal van feiten dat recht geeft tot het maken
van gevolgtrekkingen van eenige waarde. Dit nu is het
doel van het aanhangig onderzoek.

Ik heb hier slechts de literatuur genoemd die in
engeren zin op het onderwerp betrekking heeft. Bij
het bespreken van verschillende onderdeelen zal ik
steeds verwijzen naar de daarbij behoorende artikelen.

III. METHODE VAN ONDERZOEK EN FOU-
TENBRONNEN.

A. METHODE VAN ONDERZOEK.

De methode van dit onderzoek is door Went (52)
reeds uitvoerig beschreven. Waar ik daarvan slechts
weinig ben afgeweken, kan ik met een korte beschrij-
ving volstaan.

Als voedingsbodem werd gebruikt een oplossing van
de volgende zouten:

NH4NO3 0,5 %

K2HPO4 0,1 %

M^SO^ 0,05 %

Hieraan werd nooit iets veranderd. Als organische
voeding werden meest koolhydraten gegeven; hun
aard en concentratie zal bij de bespreking van de
proeven worden medegedeeld. Van deze cultuurvloei-
stof werd telkens 75 c.c.M. in elke kolf gedaan; 40 a 50
kolven vormden een serie die, na gesteriliseerd te zijn,
tegelijkertijd werden geënt. Dit enten geschiedde als
volgt: een flinke hoeveelheid conidiën werd gebracht
in een buisje met gesteriliseerd water. Zij verspreiden
zich daarin over het oppervlak. Met een entoog werd
nu van dat oppervlak telkens een druppel genomen en
in een kolf gebracht. Men mag aannemen dat zoodoende
ongeveer evenveel conidiën in elke kolf terecht komen.

De ontwikkeling was dan ook altijd zeer gelijkmatig
in alle kolven; hoogstens was in de eerste dagen eenig
verschil merkbaar.

De culturen werden gebracht in een kamer, waar de
temperatuur 22° bedroeg (Iater20°).Electrische kachels,
die automaties werden gereguleerd, zorgden ervoor, dat
deze temperatuur bewaard en tevens constant bleef.
SchommeHngen waren uiterst zeldzaam en nooit hoo-
ger dan 0.2°. Door ervoor te zorgen, dat er steeds water
stond in eenige platte zinken bakken, was de vochtig-
heidsgraad er eveneens constant. De kamer had geen
ramen, zoodat de culturen er in het donker stonden,
behalve gedurende den tijd waarin de waarnemingen
plaats hadden. Ik heb nooit eenigen invloed kunnen
bemerken van het electrisch licht dat dan moest
branden. Gasleiding was niet aanwezig.

Twee ä drie dagen na het enten was de ontwikkeling
meestal zoover gevorderd, dat ik kon beginnen met
waarnemen. Per dag werden daartoe twee of drie cul-
turen gebruikt en wel in de eerste week eiken dag, in de
tweede week om den anderen dag, in de weken daarop
om de drie of vier dagen. Met die culturen werd als
volgt te werk gegaan: van beide kolven werd de cul-
tuurvloeistof afgefiltreerd. Het mycelium van een
daarvan werd daarbij opgevangen op een tevoren in
den exsiccator gedroogd en dan gewogen filter. Wan-
neer dit filter met het mycelium wederom in den
exsiccator tot constant gewicht gebracht was, werd
het nogmaals gewogen. Zoodoende kan men de ont-
wikkeling van de schimmel nauwkeurig volgen. Het
andere mycelium werd eerst goed afgewasschen om

alle cultuurvloeistof, die diastase kon bevatten, eraf
te spoelen, dan fijngewreven met infusoriënaarde,
vervolgens uitgetrokken met de cultuurvloeistof, die
tevoren was opgekookt ter vernietiging van mogelijk
enzym; soms ook werd uitgetrokken met 75 c.c.M.
water. Na een uur werd het mengsel gefiltreerd en het
filtraat onderzocht op diastase, evenals de cultuur-
vloeistof uit de andere kolf; dikwijls werd één cultuur
meer gebruikt om uit eenige getallen een gemiddelde
te kunnen bepalen.

Het onderzoek naar het gehalte aan diastase nu had
op de volgende wijze plaats. Ik maakte een oplossing
van aardappelzetmeel, dat geprepareerd was volgens
de methode van Lintner. Hiervan werd telkens 1 Gr.
opgelost in 1250 c.c.M. water (een oplossing dus van
0,08 %) onder voortdurend roeren, terwijl ervoor ge-
zorgd werd dat het water niet tot koken kwam. Van
deze oplossing werd een hoeveelheid, meestal25 c.c.M.,
vermengd met een zelfde hoeveelheid van de te onder-
zoeken vloeistof; het tijdstip van het vermengen werd
genoteerd; van tijd tot tijd werd een weinig ervan afge-
nomen, telkens na even schudden. Met een verdunde
oplossing van J in JK werd dan gezien of nog zetmeel
of erythrodextrine aanwezig was. Zoodra er geen zelfs
zwakroode kleuring meer.optrad, doch de vloeistof geel
bleef, werd het zetmeel geacht te zijn omgezet. De tijd,
die hiervoor noodig was, is natuurlijk zelden heel pre-
cies te bepalen maar men benadert dien toch zeer goed
door te interpoleeren tusschen de twee laatste waar-
nemingstijden waarbij resp. een zwak geelroode en gele
kleur optrad. Natuurlijk werd ervoor gezorgd dat die

laatste waarnemingstijden zoo kort mogelijk na elkaar
komen. Bij de meeste omzettingen kon de tijd worden
uitgedrukt in minuten, bij de allerkortste in seconden.

Went verdeelde het mengsel van zetmeel en cultuur-
vloeistof of myceliumextract over vele reageerbuisjes.
Het is me echter gebleken dat de verdeeling van het
enzym in de vloeistof niet altijd geheel homogeen is.
Het gebeurt n.1. dat soms de omzetting in sommige
buisjes sneller verloopt dan in andere. Daarom is het
ook goed om het mengsel telkens even te schudden
voor men een proef er af neemt. Het afpipetteeren in
de vele buisjes neemt daarbij onnoodig veel tijd in
beslag.

Uit de omzettingstijden berekende ik een waarde
voor het enzymgehalte op dezelfde wijze als Went:
voor een omzettingstij d van 150 minuten nam ik aan
een hoeveelheid enzym = 100. Bedraagt de omzettings-
tijd dus b.v. 54 miriuten, dan wordt de hoeveelheid
enzym x 100 = 277,8.

Behalve het drooggewicht en het enzymgehalte
werd tevens eiken dag bepaald de zuurgraad van de
cultuurvloeistof zoowel als van het myceliumextract
en soms ook de hoeveelheid suiker, die nog over was
in de voedingsbodem.

Wat niet gebruikt werd van de verschillende vloei-
stoffen bleef bewaard en daarmee werd in de volgende
dagen op dezelfde wijze nagegaan hoelang het enzym
zijn kracht behield. Hierover zal nader worden bericht.

Volledigheidshalve vermeld ik dat bij alle omzettin-
gen de invloed van vreemde organismen werd geweerd
door toevoeging van eenige druppels toluol.

Als bezwaar tegen deze methode zou men m.i. in de
eerste plaats kunnen aanvoeren de weinige nauwkeu-
righeid die men bereikt door het nagaan van de zet-
meelomzetting met de jodiumreactie. Natuurlijk is het
bepalen van rotatie en reductievermogen veel nauw-
keuriger; de lage concentratie van het zetmeel maakt
deze bepalingen echter heel moeilijk; daarbij had ik
voor mijn proeven dien hoogen graad van nauwkeu-
righeid niet noodig. De getallen die ik verkreeg, dienen
slechts om vergeleken te worden met andere en staan
ieder op zichzelf in een lange reeks, die tezamen het
verloop aangeven van de enzymvorming. Zooals men
later zal zien, is het mij vrijwel gelukt een voorstelling
van dat verloop te krijgen, ook ondanks het feit dat
deze niet het resultaat isivan waarnemingen, gedaan aan
één Cultuur. Want dat is eveneens een groot bezwaar,
dat men met zeer vele schimmelculturen moet werken,
waarbij de individueele verschillen niet te vermijden
zijn. Intusschen geloof ik wel te mogen verklaren, dat
ook dit bezwaar niet groot genoeg is om ons te beletten
na te gaan, wat er tijdens de ontwikkeling plaats heeft.

Het groote voordeel van de methode is, dat ze weinig
tijd kost. Slechts daardoor is het mij mogelijk geweest
mijn waarnemingen uit te strekken over bijna duizend
culturen. Het behoeft geen nader betoog, dat het
groote feitenmateriaal, op deze wijze verkregen, op-
weegt tegen vele bezwaren. Het is meer waard van een
gebeurtenis bij herhaalde waarneming telkens het-
zelfde algemeene beeld te verkrijgen, dan slechts één-
maal, zij het in dat geval dan ook met iets meer nauw-
keurigheid.

B. FOUTENBRONNEN.

De foutenbronnen, die een onderzoek als dit bemoei-
lijken, zijn ongemeen talrijk. Geheel en al te ontgaan
zijn ze niet en ik geloof dat men nooit anders uit deze
zaak zal krijgen dan waarden, die slechts bij benade-
ring en relatief juist zijn. Men moet wel in het oog
houden dat ik het woord foutenbron hier zeer ruim op-
vat. Ik versta er tevens onder de moeilijkheden die uit
de variabiliteit van het proeforganisme zelve voort-
vloeien, een variabiliteit, zoo groot, in zoo sterke mate
onderhevig aan invloeden die men geneigd is te ver-
waarloozen, dat totnogtoe, voor zoover mij bekend,
nog niet twee onderzoekingen over Aspergillus zijn ge-
daan, die volkomen met elkaar zijn te vergelijken.

Sinds het werk van Hanna Lappalainen (35) weten
we dat niet alleen de chemische samenstelling van het
glaswerk van grooten invloed is op habitus, conidiën-
vorming en physiologische eigenschappen, maar dat
hetzelfde soort glas in deze opzichten nog belangrijke
verschillen kan vertoonen naarmate het nieuw is of
reeds gedurende eenigen tijd gebruikt. Ik werkte met
bolvormige kolven met rechten hals; toen daar eenige
malen schimmels in waren gekweekt, werden ze dus
vervangen door nieuwe van hetzelfde soort. Dit glas
splitste alkaliën af, wanneer daarin een vloeistof werd
gekookt, eveneens bij het steriliseeren van de cultuur-
vloeistof. Nadat 75 c.c.M. water een kwartier in zoo\'n
kolf had gekookt, gaf phenolphtaleïne een sterke rood-
kleuring. Een enkele druppel zuur van O.IN was vol-
doende om het water weer te neutrahseeren. Om na te

gaan of reeds eenige malen gebruikte kolven en nieuwe
ook hierin verschilden, titreerde ik het daarin gekookte
water met een zeer zwak zuur, ong. 0.005 N. Ik kreeg
hierbij de volgende uitkomsten: 50 c.c.M. water, in
nieuwe kolven gekookt, werden geneutraliseerd door
resp. 10.9, 34.1 en 12.7 c.c.M. zuur; dito in oude door
resp. 33.3 en 23.1 c.c.M. Men ziet dat de kolven in dit
opzicht groot verschil vertoonen hoewel men hieruit
nog niet mag afleiden, dat reeds gebruikte kolven altijd
meer alkahën afsplitsen.

Het stëriHseeren geschiedde door de kolven op drie
achtereenvolgende dagen gedurende een half uur op
100° te verhitten. De eerst witte oplossingen van redu-
ceerende suikers, maltose, glucose, melksuiker, werden
daarbij vrij sterk bruin gekleurd. M.i. moet men dit
toeschrijven aan de werking van de alkaliën; er heeft
hoogstwaarschijnlijk een enolisatie plaats, waarbij ook
ketosen ontstaan, volgens dit schema:
R.CH0H.CH0^R.C0H:CH0H^R.C0.CH20H

aldose enol ketose

{Boëseken (16)).

Er moet dus rekening mee gehouden worden dat in
de series op reduceerende suikers gekweekt, die suikers
steeds voor een klein deel in andere vormen waren
omgezet.

De hoeveelheid zuur, die Aspergillus niger vormt, is
echter vanaf den eersten dag van ontwikkeling reeds
aanzienlijk genoeg om de alkaliën te neutraliseeren; ik
heb er daarom geen verdere aandacht aan geschonken.
Natuurlijk was het beter geweest Jenaglas te gebrui-
ken, maar daarvan was niet voldoende voorraad be-

schikbaar. Immers, 200 ä 300 kolven waren bijna
steeds tegelijkertijd in gebruik.

Hanna Lappalainen deelt ook mede dat in het labo-
ratorium van professor Elfving te Helsmgfors, culturen
van Aspergillus niger aanwezig zijn, die men van ver-
schillende kanten had laten komen. Hieronder bleken
niet minder dan acht rassen te zijn die in physiologisch
opzicht van elkaar verschilden. Brenner (17) vond daar
nog drie nieuwe bij. Hij vergelijkt ze met de mutaties
die Schiemann (46) beschreef, doch is daartoe m.i. niet
gerechtigd. Schiemann verkreeg ze n.1. door toevoegen
van vergiftige zouten aan de voedingsbodem, Brenner
door te kweeken bij verschillende temperaturen en wel
steeds vele maanden achtereen. Dit heeft ongetwijfeld
grooten invloed, maar wanneer men maar lang genoeg
de oorspronkelijke omstandigheden laat inwerken, kee-
ren ook de oorspronkelijke eigenschappen weer terug.
Hemzelf is het tenslotte dan ook gelukt een ras weer
tot een ander terug te brengen. De proeven van Lappa-
lainen en Brenner gaan in geheel andere richting dan de
mijne, de physiologische afwijkingen die zij bestudeer-
den en beschreven zijn andere, zoodat het mij niet
mogelijk is geweest uit te maken met welk van hun
rassen ik heb gewerkt. Ik kan slechts mededeelen dat
ik een reincultuur kreeg uit de verzameling van het Phy-
topathologisch Laboratorium „Willie Commelin Schol-
ten" te Baarn, waarvan verder steeds werd overgeënt.

Een bijzondere oorzaak voor de vele rassen die Bren-
ner verkreeg, ligt daarbij voor een groot deel in de tem-
peratuur waarbij hij soms kweekte, nl. 35°. Daarbij
treden allerlei compHcaties op die ik bij 20° en 22° nooit

waarnam, zooals het voorkomen van zetmeel in de
hyphen. Boas (13) heeft trouwens ook al gewaarschuwd
tegen de vele bijzonderheden, die Aspergillus niger bij
hoogere temperaturen vertoont.

In dit verband zijn nog eenige feiten belangrijk. Het
is me gebleken, dat het er ten zeerste op aankomt met
welke conidiën men een serie ent: eenige series werden
nl. dubbel genomen, een daarvan geënt met conidiën
die afkomstig waren van een cultuur op dezelfde voe-
ding als de serie in kwestie, de andere met conidiën van
een daarvan verschillende voedingsbodem. Altijd tra-
den tusschen twee van dergelijke series groote ver-
schillen op: de diastaseproductie, drooggewicht, habi-
tus, conidiënvorming, in dat alles uitte zich de afkomst
van de conidiën. Vaste regels zijn in dezen voorloopig
nog niet te geven. Hoewel ik er later op hoop terug te
komen, wil ik nu reeds even wijzen op eenige treffende
voorbeelden. Tabel IA en IB geven een overzicht van
de diastasevorming bij twee series, ieder gekweekt op
5 % glucose. IA is geënt met conidiën afkomstig van
een cultuur, eveneens op 5 % glucose (GG), de andere
van een op 0,5 % zetmeel, (ZG). Verder zie men fig. 10
die een graphische voorstelhng geeft van de ontwikkel-
de hoeveelheden enzym van twee series op zetmeel
0.5 %, resp. geënt van culturen op 0.5 % zetmeel (ZZ)
en 5 % glucose (GZ).

In al deze gevallen kwamen de conidiën van flink
ontwikkelde culturen, die nooit ouder waren dan drie
ä vier weken; de oorzaken voor deze verschijnselen
kunnen dus niet liggen in het feit, dat de conidiën niet
volkomen kiemkrachtig waren.

Totnogtoe heeft men slechts zelden gedacht aan de
mogelijkheid van zulk een sterke nawerking van een
vorig milieu en er bij proeven dan ook geen rekening
mee gehouden. Het blijkt intusschen noodzakelijk te
zijn dat te doen en niet te snel over te gaan tot het
accepteeren van nieuwe rassen.

De eenige auteur die, voor zoover mij bekend, iets
dergelijks heeft waargenomen bij Aspergillus niger, is
Grezes (32). Hij vond zeer verschillende hoeveelheden
invertase wanneer de conidiën afkomstig waren van
culturen op saccharose of barnsteenzuur. De culturen
waren tevoren reeds minstens zestig maal achtereen-
volgens op voedingsbodems van diezelfde samenstel-
hng overgeënt; men ziet uit mijn proeven, dat een der-
gelijke langdurige inwerking van het milieu volstrekt
niet noodzakelijk is om markante verschillen te ver-
krijgen. Ik achtte twee maal achtereenvolgens enten
op dezelfde bodem in dezen reeds voldoende. Het is
zeer de moeite waard deze feiten te vergelijken met
eenige waarnemingen van mej. Joh. Westerdijk en van
Luyk (53) over een soortgelijk verschijnsel bij de sporen
van Gloeosporium.

Het werd ondertusschen moeilijk bij deze onzeker-
heden een gedragslijn vast te stellen. Ik besloot alle
series te enten met conidiën van culturen, die op voe-
dingsbodems van gelijke samensteUing gegroeid waren.
Bij de gevallen waarin daarvan werd afgeweken, zal dat
vermeld worden. Voor eventueele latere onderzoekers
op dit gebied is het dan de aangewezen weg om een-
zelfde gedragslijn te volgen. Slechts dan zal het moge-
lijk zijn hun resultaten te vergelijken met de mijne.

Het Opvallend groote verschil tusschen mijn eerste
uitkomsten en die van Went deed bij mij het vermoeden
rijzen of wellicht de oppervlakte der culturen eenigen
invloed op hun physiologisch gedrag kon uitoefenen.
Went werkte met een oppervlakte van 24 Dc.M., later
van 47 Dc.M., mijn culturen hadden altijd een opper-
vlakte van 48 Dc.M. Waarschijnlijk leek het dus wel
niet, dat hierin de oorzaak kon liggen. Toch nam ik een
proef, die weliswaar niet ophelderde wat de reden was
van het genoemde verschil, maar die desniettemin niet
zonder resultaat bleef. In Erlemeyerkolven van twee
verschillende grootten en wel in zes van ieder, werd 75
c.c.M. voedingsoplossing gebracht van 1 % glucose.
De oppervlakte van de vloeistof bedroeg in de kleine
26 Dc.M., in de groote 82 Dc.M. Op denzelfden dag
werd geënt, den 8sten, 14den en 21 sten dag waargeno-
men. De resultaten ziet men in de tabel:

26 c.m.

Men ziet hieruit, dat men tot na de eerste week reke-
ning dient te houden met de oppervlakte. De hoeveel-

2

heid enzym, het drooggewicht zoowel als de zuurgraad
blijven achter bij de culturen in de kleine kolven; later
herstelt zich deze achterstand en is weinig verschil
meer te merken.

De onderzoekingen in de laatste twaalf jaren gedaan
over den invloed van de waterstofionenconcentratie op
de werking van enzymen, noodzaakten mij na te gaan
hoe de diastase van Aspergillus niger reageerde op den
zuurgraad van het milieu. Dat die niet zonder invloed
kon zijn, stond al dadelijk bij mij vast, daar Aspergillus
niger veel zuur produceert, zoodat de diastase steeds
werkt bij een hooge waterstofionenconcentratie.

Ik richtte mijn onderzoek in naar de methode van
Sörensen (47). Deze berust hierop, dat men standaard-
oplossingen maakt, die een bekende waterstofionencon-
centratie hebben. Deze, en de stof waarvan men die
concentratie te weten wil komen, worden met een indi-
cator gekleurd; door vergelijken van de kleuren kan
men de waterstofionenconcentratie zeer nauwkeurig
bepalen. De standaardoplossingen werden in dit geval
gemaakt volgens de opgaven van Clark en Luhs (20).
De chemicaliën, die ik hiervoor noodig had, werden mij
in zuiveren toestand welwillend beschikbaar gesteld
door dr. I. M. Kolthoff, terwijl prof. dr. W. E. Ringer
zoo vriendelijk was de standaardoplossingen zelf voor
mij te controleeren met de waterstof electrode. Beiden
heeren breng ik hier mijn hartelijken dank voor hun
zeer gewaardeerde hulp, die het mij mogelijk maakte
dit onderdeel van mijn proeven zonder al te groote
moeite uit te voeren.

Het onderzoek zelf was vrij eenvoudig. Van een

enzymoplossing werd telkens een zekere hoeveelheid
(10, 15 of 20 c.c.M.) vermengd met evenveel zetmeelop-
lossing die in deze gevallen 0.16 of 0.32 % sterk was.
Om verschillende zuurgraden te verkrijgen, gebruikte
ik de standaardoplossingen zelf. Deze werden in meest
even groote hoeveelheden aan het enzym-zetmeel toe-
gevoegd. Zij hebben daarbij het voordeel, dat zij buffer-
oplossingen zijn, zoodat de waterstofionenconcentratie
tijdens de proeven constant bleef. De H" van het meng-
sel werd dan bepaald, evenals de omzettingstijden bij
de verschillende zuurgraden. Voor verdere bijzonder-
heden mag ik verwijzen naar de artekelen van Sörensen
en MichaUis (37—40).

De resultaten vindt men in fig. 1 op de gebruikelijke

wijze uitgedrukt. Deze kromme kwam uit alle proeven
te voorschijn, onverschillig de concentratie van de

diastase, zoowel voor die in de cultuurvloeistof als in
het mycelium.

Men ziet dat de diastase van Aspergillus niger vrij
ongevoelig is voor den zuurgraad; binnen wijde gren-
zen is de werking optimaal. Het is een gelukkige coïnci-
dentie, dat de schimmel deze optimale concentratie
altijd zelf tot stand brengt in haar cultuurvloeistof. Men
behoeft ze nu nooit kunstmatig daartoe te brengen
Soms is ze te hoog, doch men bedenke dat voor het
waarnemen de vloeistof altijd vermengd wordt met de
neutrale zetmeeloplossing. Daardoor zakt de altijd
tot binnen de grenzen van optimale werkzaamheid.

Dit werk vereischte natuurlijk groote nauwkeurig-
heid. Men kan aan de figuur wel zien dat die met de
jodiummethode te bereiken is. Ten overvloede verwijs
ik naar de goede overeenkomst tusschen mijn proeven
(31) en die van Adler (1) over den invloed van het

Het is volstrekt niet vanzelf sprekend, dat een schimmel zelf die
waterstofionenconcentratie doet ontstaan, waarbij haar enzymen hun
volle kracht kunnen ontplooien. Dit is mij gebleken, toen ik eenige cul-
turen van Monilia sitophila onderzocht op gehalte aan diastase. De cul-
turen waren ongeveer drie weken oud; gekweekt op 5 % melksuiker.
De cultuurvloéistof had hier een Pu = 8; de omzetting van zetmeel
geschiedde daarbij zeer langzaam. Werd de vloeistof echter kunstmatig
aangezuurd, dan ging het veel sneller. Ik verkreeg de volgende gegevens

bij Ph = 3-95.......... omzetting in 52 minuten

„ „ = 5.40............. „31

„ „ = 5.90......................„32

„ „ ±6.50......................„32

„ .. ± 7.50 (natuurlijke toestand) „ „ 500

Dit is nog slechts een voorloopig resultaat; het zegt echter genoeg om
tot groote voorzichtigheid aan te manen. Voordat men een onderzoek
gaat doen naar quantitatieve enzymproductie, dient men dus eerst te
weten bij welke waterstofionenconcentratie die enzymen moeten wor-
den waargenomen.

milieu op de werking van de diastase van mout.

Over het algemeen behoefde ik dus geen rekening
meer te houden met den zuurgraad, behalve in één ge-
val. Zooals men uit de kromme ziet, is de werking bij
Ph = 6 reeds minder dan optimaal, bij Ph = 7 bijna
nihil. Nu bevat het mycelium zelf ongeveer geen zuur.
Wanneer men het met water uittrekt heeft het extract
een Ph = i 6; het vermengen met zetmeeloplossing
doet dat nog dalen tot i 6.5, m.a.w. de diastase werkt
dan maar met een deel van haar kracht; de cijfers die
men zoo krijgt geven een te lage waarde aan. Om een
mogelijken invloed van bijmengsels in de cultuurvloei-
stof te ontgaan, had ik tot mijn spijt reeds een aantal
waarnemingen op deze wijze gedaan, voordat mij be-
kend was welk een fout ik hiermee beging. Daarbij kan
die invloed, zoo die al bestaat, van slechts zeer geringe
beteekenis zijn. Immers, de kromme van fig. 1 ver-
loopt zeer geleidelijk. Dit zou niet het geval geweest
zijn, wanneer de bijmengsels van de cultuurvloeistof
hun eigen invloed hadden uitgeoefend. Want dan had
mem mogen verwachten, schommelingen of andere af-
wijkingen in de lijn te zien optreden.

Zooals men ziet, zijn er bij een onderzoek als dit vele
moeilijkheden waar men rekening mee heeft te houden.
In hoeverre ik erin ben geslaagd resultaten te verkrij-
gen, die niet al te zeer den invloed daarvan hebben
ondervonden, moge uit de volgende hoofdstukken
blijken.

IV. RESULTATEN EN CONCLUSIES, VOOR DE
SERIES GEKWEEKT OP GLUCOSE, ZET-
MEEL EN MALTOSE.

A. RESULTATEN.

De resultaten die ik op de hierboven beschreven
wijze verkreeg, heb ik voor elke serie in een tabel sa-
mengebracht. Voordat ik de hoofdzaken van ieder
daarvan afzonderlijk bespreek, zou ik eerst eenige op-
merkingen willen maken die voor vrijwel alle gelden.
Als voorbeeld kies ik daarbij tabel N°. 3, waarin de
waarnemingen zijn neergelegd, gedaan aan een serie
die gekweekt werd op 2.5 % glucose. Men ziet aan het
hoofd boven de kolommen wat zij voorstellen.

Tusschen den 13den en lóden dag wordt het laatste
voedsel verteerd, zooals blijkt uit de draaiing die de
cultuurvloeistof geeft in den polarimeter (2de kolom).
Iets vroeger is het maximum aan drooggewicht be-
reikt (9de kolom). Voordat dus nog de assimilatie ge-
heel ten einde is, heeft de dissimilatie reeds de over-
hand verkregen. Dit gaat zoo bij de meeste series; soms
ook vallen deze twee verschijnselen samen. Na het be-
rèiken van dit maximum vermindert het gewicht van
het mycelium, eerst vrij snel, later zeer langzaam; soms
blijft zelfs een vrijwel constante hoeveelheid gedurende
een lange reeks van dagen bewaard.

De zuurgraad van de cultuurvloeistof (8ste kolom)
stijgt ook tot den 13den dag, neemt daarna iets af en
blijft dan verder even. hoog. Hetzelfde geldt, zooals
trouwens vrijwel vanzelf spreekt, voor het extract uit
het mycelium (6de kolom), wanneer dat met de opge-
kookte cultuur vloeistof is uitgetrokken. Zeer dikwijls
stijgt de waterstofionenconcentratie boven die, welke
optimaal is; ik heb reeds medegedeeld waarom dit geen
bezwaar is (pag. 20). Men kan nu echter zien dat dit
wel het geval is met het extract, verkregen door het
fijngewreven mycelium met water uit te trekken.
Hiervan is de Ph altijd te laag (4de kolom).

Dit blijkt dan ook zeer duidelijk uit de getallen voor
het gehalte aan diastase, die bij deze zuurgraad werden
verkregen (3de kolom), wanneer men ze vergelijkt met
die, gevonden bij de juiste waterstofionenconcentratie,
in het extract met de cultuurvloeistof dus (men zie ook
de tabellen 7—9, 2de en 3de kolom; hierbij is de
niet vermeld, doch die week niet af van de overeen-
komstige in tabel 3).

Het is van belang de hoeveelheden diastase in het
mycelium te vergelijken met die, welke in de cultuur-
vloeistof werden gevonden. Wij zien in beide gevallen
een sterke ontwikkeling van het enzym, die voortgaat
tot den 7den dag, dan in de cultuurvloeistof een kleine
daling vertoont om later te stijgen tot een veel grooter
productie dan eerst was bereikt. De diastase in het
mycelium echter vertoont in haar ontwikkeling geen
algemeene stijging of daling doch slechts groote schom-
melingen. Iets dergelijks ziet men in de tabellen Nos. 2,
4, 8 en 9, voor resp. glucose 4 %, glucose 1 %, zetmeel

0.25 % glucose 2.5 % en zetmeel 0.4 % glu-
cose 1 %.

Overal is daar de hoeveelheid diastase in het myce-
lium ten slotte zooveel minder dan in de vloeistof, dat
men de eerste bijna kan verwaarloozen tegenover de
laatste. De indruk, dien ik kreeg, is dat de schimmel
haar diastase uitscheidt in de omringende vloeistof,
zoodat de hoeveelheid die achterblijft in het myceHum,
altijd eenigszins toevallig is.

Dat deze hoeveelheid inderdaad zeer onbepaald is
en afhankelijk van toevallige omstandigheden, wordt
duidelijk geïllustreerd door de volgende tabel. Deze
stelt voor de hoeveelheid diastase van een kleine serie,
gekweekt op 0.5 % zetmeel, waarbij ik de cultuurvloei-
stof niet opkookte voordat het mycelium ermee werd
uitgetrokken. Men heeft dus naast elkaar de reeksen
getallen voor het enzym in mycelium -f cultuurvloei-
stof en in de cultuurvloeistof alleen. Wanneer de dias-
tase in het mycelium een grootheid van eenige beteeke-
nis of van zelfstandige waarde vertegenwooordigde, dan
mocht men verwachten dat de eerste reeks getallen

(deze cijfers zijn alle gemiddelden uit minstens twee waarnemingen.)

steeds belangrijk hooger zou zijn dan de laatste. Nu
ziet men dat die laatste waarden in het begin maar wei-
nig kleiner, later zelfs grooter zijn. Slechts op den 4den
en Sden dag schijnt er in het mycelium een grootere
hoeveelheid diastase aanwezig te zijn; daarna wordt
zeer blijkbaar bijna alles in de cultuurvloeistof uitge-
zonden.

Fig. 2 stelt beide reeksen getallen graphics voor; het

valt daarbij op hoe
veel regelmatiger
het verloop van de
productie aan dias-
tase in de vloeistof

alleen (-) is dan

van die in mycelium
en vloeistof samen

(.....)■

Beschouwt men

daarbij van de tabel-
len 7 en 9 kolommen
2 en 3, dan valt het
op, dat er bijna niet
de minste regelma-
tigheid bestaat in
_ de verhouding van
enzymhoeveelheid

Fig. 2. Diastase in myc. cuit.vi.st.-): in het mycelium,

diastase in de cult.vloeist. alleen (.....) „ .

wanneer dat met

water of met cultuurvloeistof is uitgetrokken. Men zou
verwachten dat zonder uitzondering het extract met
water een veel lager diastasegehalte zou vertoonen. Dit

is lang niet altijd het geval, ja soms is het zelfs hooger.
Daarentegen komen de hoeveelheden diastase in de
beide cultuurvloeistoffen vrij goed overeen; er zijn ver-
schillen, vrij belangrijke zelfs op een zelfden dag, maar
het algemeene verloop is voor beide hetzelfde. Dit ver-
sterkte mijn indruk dat de hoeveelheid enzym in het
mycelium slechts toevallig is.

De afscheiding van het enzym nu geschiedt reeds in
het eerste stadium van sterke ontwikkeling, zoodat ik
niet kan aannemen dat de diastase in de vloeistof alleen
afkomstig zou zijn uit afgestorven of toevallig open
gegane cellen; m.i. is het enzym door het levende pro-
toplasma naar buiten getreden.

Bij het bespreken van de series behoef ik niet veel
meer te zeggen over den zuurgraad. Alleen zou ik nog
even in willen gaan op de vraag welk zuur het is, dat de
hooge waterstofionenconcentratie veroorzaakt, ook
omdat mijn proeven in dezen iets anders leeren dan
eenige vroegere onderzoekingen. Benecke (4) vindt dat
Aspergillus niger oxaalzuur vormt wanneer een orga-
nische verbinding als stikstof bron wordt gegeven. Bij
ammoniumzouten echter wordt slechts het NH4 ion
verteerd, het NO3\' vormt salpeterzuur en dit belet.de
vorming van organische zuren. Wehmer (48—50) be-
vestigt dit; hij zegt dat het zuur de schimmel in haar
ontwikkeling niet schaadt, wel echter de conidiënvor-
ming tegenhoudt. Na eenigen tijd zou het zuur weer
verdwijnen, daar basische afbraakproducten van ei-
witten het neutraliseeren. Wij zullen zien dat deze twee
laatste beweringen hoogstens slechts ten deele waar
zijn. Boas en Leherle (14, 15) gingen de zuurgraad van

dag tot dag na; ook zij vonden bij voeding met
NH4NO3 de sterkste zuurvorming niet alleen, maar
ook een die slechts weinig terughep; in tegenstel-
ling met de zuurvorming bij organische stikstofbron,
welke snel weer afnam, daar h.i. de schimmel het
oxaalzuur zelf verteert. De resultaten van Elfving (25)
kloppen vrijwel met de andere; hij noemt naast
oxaalzuur ook citroenzuur. Daar de voedingswaarde
hiervan echter hooger is, wordt het ook het snelst
weer verteerd.

Het is echter heel jammer dat geen van deze onder-
zoekers hun proeven verder hebben uitgestrekt dan
over 10 ä 12 dagen. Bijna allen hebben een overdreven
voorstelling van den invloed van het zuur op de schim-
mel, meenen dat dit meer of minder snel weer ver-
dwijnt, een meening waartoe een zelfs kleine daling
van den zuurgraad in de laatste dagen van hun proe-
ven aanleiding geeft. Wanneer men de proeven slechts
langer voortzet blijkt dit alles dadelijk. Men kan het
zien in alle tabellen waarin de Ph is opgegeven.

Intusschen heb ook ik, bij voeding met NH4NO3,
nooit eenig spoor van organische zuren kunnen vinden.

Er schijnt wel een relatie te bestaan tusschen de hoe-
veelheid schimmelstof en de daaruit gevormde hoeveel-
heid zuur. Bij armelijke voeding n.1. 0.5 % 2.5 %
wordt de Ph niet zoo hoog (2.9) als bij voeding op

Evenmin zal ik in het vervolg nog veel aandacht De-
hoeven te vragen voor het drooggewicht. De ontwikke-
ling daarvan, zooals we die zien in tabel 3 is vrij-
wel die van alle series. De dagen waarin het maximum

werd bereikt verschilden meestal maar weinig. De
hoogte van dat maximum varieerde zeer, maar bleek
een functie te zijn van het aan de schimmel gegeven
voedsel. Bij de meest rijkelijke voeding, d.w.z. dus voor
zoover het zetmeel en glucose betrof, werd ongeveer
23 % in drooggewicht van de schimmel omgezet, bij
de armelijkste 0.5 %, ±31 %. Alle tusschenliggende
hoeveelheden (1—1,4—2—2,5—2,75—4-^.1%) ver-
toonen percentages die zich regelmatig rangschikken
tusschen deze beide uitersten. De graphische voorstel-
ling hiervan, fig. 3, toont dit zeer duidelijk.

300

) 100

373 1000

vocdingsconcen tralie

Fig. 3. Maximum drooggewicht bij verschillende concentratie van
voeding (de hoeveelheid hiervan uitgedrukt in m.Gr.)

Om den lezer hinderlijk veel zoeken in de tabellen te
besparen zal ik bij het noemen van een serie er steeds
tusschen haakjes aan toevoegen op welke dagen het
maximum gewicht was bereikt en hoeveel dit bedroeg
in milligrammen; b.v. glucose 4% (13—16; 912).
Want het is altijd noodig te weten op welke dagen de

maximum-ontwikkeling wordt bereikt. Pfeffer heeft
daar blijkbaar niet aan gedacht (42; 1. c. pag. 257 noot)
Hij bepaalde de drooggewichten pas op den 20sten—
26sten dag van de culturen, kreeg dus getallen die niet
met elkaar vergeleken mogen worden, die over het ge-
heel weinig meer waard zijn.

In het vervolg interesseeren ons vnl. de getallen die
de hoeveelheiden diastase aangeven. Daar een enkele
lijn beter en sneller overzicht geeft dan een reeks getal-
len, heb ik deze van de meeste series graphics opgetee-
kend. Daarbij golden voor mij de volgende overwegin-
gen : de hoeveelheid diastase in de cultuurvloeistof is
meestal zooveel grooter dan die in het mycelium, dat
eerstgenoemde, alleen opgegegeven, een voldoende uit-
drukking geeft van de diastaseproductie van de schim-
mel. Soms heb ik beide hoeveelheden opgeteld en in
een lijn weergegeven; meestal verandert dit niet veel
aan de hoofdzaken.

Öe getallen zijn echter weinig geschikt om zonder
meer te gebruiken voor graphische voorstellingen; de
schommelingen van den eenen op den anderen dag zijn
soms vrij groot, wel niet groot genoeg om het beeld van
den gang van het geheel te bederven, maar wel om het
zeer te vertroebelen. Want deze schommelingen zijn
het gevolg van verschillen tusschen de culturen en van
waarnemingsfouten. Vooral bij de zeer korte omzettin-
gen kunnen deze laatste hinderlijk zijn. Wanneer we
vinden dat de cultuurvloeistof van een schimmel op
eenige achtereenvolgende dagen het volgend aantal
minuten noodig heeft om het zetmeel om te zetten:
6^6.5—8—7—7.5—6—8,5 enz., dan geeft dat als

hoeveelheid enzym: 2500—2222—1875—2143—2000
—2500—1765, getallen die graphies voorgesteld, groote
schommelingen vertoonen, terwijl toch iedereen in zal
zien dat we hier met een zelfde orde van grootheden
te doen hebben. Ik achtte me dus gerechtigd om op alle
getallen een zekeren dempingsfactor te leggen, die hun
verschillen, welke essentieel zijn, duidelijk genoeg doet
uitkomen, doch toevaUige en nietsbeteekenende eenigs-
zins vereffent. Ik meen dien te hebben gevonden in den
zeer eenvoudigen maatregel om van alle getallen den
logarithmus te nemen; in plaats van de bovenstaande
reeks krijgen we dan: 3,38—3,35—3,27—3,33—3,30
—3,38—3,25, hetgeen den werkelijken gang van zaken
meer bevredigend weergeeft. Bij het beschouwen van
de lijnen houde men dus steeds in het oog, dat de
hoeveelheden diastase niet als zoodanig, doch door hun
logarithmen zijn weergegeven; dit om mogelijke ver-
warringen te voorkomen wanneer men uit de lijnen de
absolute hoeveelheden enzym wil opmaken.

Een nog eenvoudiger voorstellingswijze is de volgen-
de: in plaats van het omgekeerd evenredige van den
omzettingstijd, zet men dien tijd zelf af en wel op den
ordinaat naar beneden toe. (zie fig. 8). Dit heeft echter
een groot bezwaar: wanneer de omzettingstijden op
een reeks dagen ongeveer de volgende zijn: 2000—800
—110—35—12—4—3—3.5 min. enz. (iets dergelijks
komt in het begin van de ontwikkeling zeer veel voor),
dan moet men of den eersten of den laatsten getallen
geweld aandoen om ze in een graphische voorstelling
tot hun recht te laten komen, hetgeen dan toch nog
meestal niet lukt. Waar deze maatregel zich echter

eenigszins liet toepassen heb ik het gedaan. Men zal
zien dat dan in hoofdzaak het beeld gelijk blijft aan de
logarithmenlijn.

Serie gekweekt op glucose 5%
(11_19; 944.5) fig. 4, tabel IA.

GG: d.w.z. geënt met conidiën van een cultuur op
glucose 5 %.

Serieop glucose5% (9—16; 1217) tabelIB

ZG: d.w.z. geënt met conidiën van een cultuur op
zetmeel 0. 5%.

Het is ten zeerste de moeite waard om de tabellen
betreffende deze series te vergelijken. De nawerking
van het vorig milieu op de conidiën waarmee geënt
werd, blijkt hier wel zeer duidelijk. Het drooggewicht
wordt bij ZG opvallend veel hooger; conidiën worden
in deze serie weinig gevormd en wel vnl. aan de randen
van het mycelium. Het midden van de culturen bleef
vrijwel wit. Bij GG echter waren de mycelia geheel
zwart.

Stellen. Bij GG is deze wel van belang. Wij zien hier een
vrij sterke stijging in beide lijnen n.1. voor de diastase

in myceUum cultuurvloéistof (-), zoowel als voor

de cultuur vloeistof alleen (----); lang voordat het max-
imum gewicht bereikt is neemt die weer af. Op den
9den dag ongeveer is een minimum bereikt; voor de
cultuurvloeistof alleen gaat dit zelfs door tot op 0.
Later komt weer een stijging tot een hoeveelheid die
nog overtreft, hetgeen in den beginne gevormd was.

Glucose 4% (13—16; 912) fig. 5, tabel 2.

Ill

i t ^ S IW BW jv

dagen.

Fig. 5. Glucose 4%. Diastase in de cultuurvloeistof.

Ook hier traden reeds in het begin van de ontwikke-
ling rijkelijk conidiën op, zoodat het mycelium spoedig
geheel zwart was. Dit is trouwens het geval bij alle
series op glucose en zetmeel; de mycelia vormden in
deze series een plat, aaneengesloten vlies; alleen de
allerzwaarste vertoonden daarin golvingen.

Het verloop van de diastasevorming lijkt veel op dat
van glucose 5 %. Het eerste maximum is hier minder
hoog, doch de daling daarna gaat minder ver door;
deze bereikt haar laagste punt op den 9den dag. De

tweede stijging begint vroeger en bereikt een veel
hooger niveau.
Glucose 2.5 % (11—13; 615.5) fig. 6, tabel 3.

iiii

lil

2 4
dogen

Fig. 6. Glucose 2.5 %. Diastase in de cultuurvloiestof.

Men ziet hier alweer een dergelijk verloop als bij de
vorige series. De verschillen tusschen glucose 5 % en
glucose 4 % zijn hier nog sterker uitgesproken. De
daling, die nog veel minder diep gaat, bereikt haar
laagste punt op den 9den dag.

Glucose 1 % (9—16; 261) fig. 7, tabel 4.

ini

Si

dagen

Fig. 7. Glucose 1 %. Diastase in de cultuurvloeistof.

Er is hier van geen daling meer sprake, hoogstens is
er een flauwe aanduiding van over. Verder overtreft de
enzymproductie alles wat we tot nog toe zagen.

Fig. 8 stelt voor het verloop van de diastasevorming
van de laatste drie series, opgeteekend volgens de
tweede methode, op pag. 30 beschreven. Men ziet dat
hierbij commentaar overbodig is.

Fig. 8. Glucose 1 %-; glucose 2.5 %.....; glucose 4 %........

Bij de series op zetmeel vindt men in de tabellen met
een kruisje aangegeven de dagen waarop de voedings-
bodem voor het eerst geen reactie met jodium meer
vertoonde. Bij de series, die op verschillende mengsels
van zetmeel en glucose werden gekweekt, kan men zien
dat deze de opvattingen van Kylin niet steunen. Een
enkele blik maakt tevens duidelijk, dat als men zoover
is, dat geen zetmeel meer in de voedingsbodem voor-
komt, de proef eigenlijk nog pas goed beginnen moet.

Zoolang nog zetmeel in de cultuurvloeistof aanwezig
was, werd het gehalte aan diastase daarin als volgt be-
paald: twee hoeveelheden van de cultuurvloeistof wer-
den vermengd met resp. gelijke volumina water en zet-
meel 0.08 %; in beide mengsels was zoodoende de zuur-
graad gelijk. De tijd, dien het mengsel met zetmeelop-
lossing meer noodig had, voordat de reactie met j odium
uitbleef, werd gecenseerd aan te geven hoeveel diastase
aanwezig was. Het is de vraag of deze methode wel
geheel juist is; waar het hier echter slechts de aller-
eerste dagen van de ontwikkeling gold, die nog van
weinig belang zijn, heb ik gemeend dat het geen groot
bezwaar was aldus te werk te gaan.

Zetmeel 2% (11—22; 493) fig. 9 tabel 5.

Bij het steriliseeren van de kolven voor deze serie
trad een neerslag van zetmeel op; dit werd uit eenige
kolven gewogen en bleek in allen ± 8 % te bedragen
van het geheele gewicht. Veel invloed kan het dus met
gehad hebben.

sterk aan die bij de series op glucose 5, 4 en 2.5 %. De
ontwikkeling was in het begin zeer langzaam; het max-
imum drooggewicht wordt dan ook later bereikt. De
daling in de lijn heeft eerst op den 11 den dag haar
laagste punt bereikt.

Zetmeel 0.5 % (7—11; 155) fig. 10 (—) tabel 6A.
ZZ: d.w.z. geënt met conidiën van een cultuur op
zetmeel 0.5 %.

dito (9—13; 177.5) fig. 10 (.....), tabel 6B.

GZ: d.w.z. geënt met conidiën van een cultuur op
glucose 5 %.

Ook deze parallelseries zijn een merkwaardig voor-
beeld van de verschillen in de conidiën waarmee zij wer-
den geënt. Evenals bij de twee series op glucose 5 % zien
we meer drooggewicht bij de serie die met „vreemde"
conidiën werd geënt. Tevens is hier de diastasevorming
geringer en duurde het langer voordat het mycelium
zwart was van de conidiën. Analoge verschillen dus,
hoewel anders in verhouding.

Het verloop van de enzymvorming doet zeer denken
aan die van glucose 1 %. De daling is in beide lijnen
door een klein knikje aangeduid.
Bij een derde serie op zetmeel 0.5 % fig. 11, tabel

Fig- 11. Zetmeel 0.5%. Diastase in de cultuurvloeistof.

was een vrij groote hoeveelheid zetmeel tijdens het
steriliseeren uitgevlokt. Dit heeft blijkbaar niet als
voeding kunnen dienen, getuige ook het drooggewicht
van den 13den dag: 116 m.Gr. We kunnen deze serie
beschouwen als een, die minder dan 0.5 % voedsel
heeft gehad en het is merkwaardig, dat in het verloop
van de diastaseproductie hier zelfs elke kleinste aan-
duiding van een inzinking in de lijn zooals bij de andere
series, achterwege bleef.

Deze serie diende voor speciale doeleinden, die weinig
verband hielden met de proeven; daarom zijn ook niet
alle waarnemingen gedaan, zooals b.v. die van het
drooggewicht; ik kan daarom niet met zekerheid zeg-
gen of dat van den 13den dag, het eenige dat gewogen
werd (met dat van den 32sten dag, dat 95 m.Gr. be-
droeg), tevens het maximale ontwikkelde gewicht

voorstelt; heel ver kan het er onmogelijk af zijn. Hoe-
wel deze serie geënt werd met conidiën van een cultuur
op 0.5 % zetmeel, van dezelfde voedingsbodem dus,
blijft de diastaseontwikkeling toch belangrijk achter
bij die van de serie ZZ. Misschien ligt de reden in het
uiterst geringe mycelium dat zich vormde, maar ik
durf hierover niets met zekerheid zeggen.

Zetmeel 0.1% Glucose 4%
(9—13; 902) fig. 12 en 12A (—), tabel 7.

iiiih

911

De lijn voor de diastase in de vloeistof geeft weer een
zelfde beeld als bij glucose 4 %. Op den 9den en 19den
dag bereikt de daling haar laagste punt; de stijging
daarna is veel geringer dan we het totnogtoe zagen. De
lijn voor de enzymproductie in mycelium cultuur-
vloeistof (fig. 12A —) zegt niet veel; men kan er het nu
reeds bekende verloop misschien uit opmaken doch
uitgesproken is dit niet.

Zetmeel 0.25% -1- Glucose 2.5%
(7—13; 636.5) fig. 12 en 12A (......), tabel 8.

E)e diastase in de voedingsbodem biedt alweer niets
nieuws; het laagste punt bereikt de lijn weer op den
9dendag. Wat de totale productie betreft (fig. 12A--- ),
ook hier is, voorloopig althans, weinig uit op te maken.
Ik kom hierop terug.

Zetmeel 0.4 % -f- Glucose 1 %
(7—13; 357) fig. 12 en 12A (........), tabel 9.

Het verloop van deze serie herinnert sterk aan dat
van glucose 1 %. Beide lijnen geven hier vrijwel het-
zelfde beeld.

B. CONCLUSIES.

Al de lijnen die ik nu besproken heb, maken wel heel
duidelijk dat het er voor de vorming van diastase niets
toe doet of glucose dan wel zetmeel als voeding wordt
gegeven. De belangrijke verschillen schijnen een gevolg
te zijn van de hoeveelheid voedsel, niet van den aard
daarvan.

Ik meen nu mijn resultaten als volgt te mogen inter-
preteeren: het normale verloop van de vorming van
diastase is een productie, die stijgt tot een maximum

bereikt is. Dan wordt geen diastase meer geproduceerd,
doch hetgeen aanwezig is behoudt zijn kracht voor on-
bepaalden tijd. Dit verloop vertoont zich slechts bij
zeer geringe voeding, n.1. bij minder dan 0.5 %; is de
voeding rijkelijk, dan scheidt het mycelium in veel
sterker mate stoffen uit in de omringende vloeistof
waaronder er zijn (eiwitten ?), die de diastase adsorbee-
ren of op andere wijze onwerkzaam maken. Dit begint
reeds in de eerste dagen van de ontwikkeling, zoodat
niet alleen het normale maximum niet bereikt wordt,
doch in de dagen, waarin het mycelium zijn grootste
gewicht ontwikkelt, wordt de diastase zoo sterk aange-
tast dat er na een top weer een daling komt, die dieper
gaat naarmate er meer van die stoffen geproduceerd
worden, d.w.z. naarmate het gewicht van het mycelium
grooter is of wel naarmate de voeding rijkelijker is.
Het verbaast ons dan ook niet te zien, dat het laagste
punt van de lijn altijd bereikt wordt midden in de dagen
waarop het drooggewicht maximaal is. Langzamerhand
gaan echter die stoffen in ontbinding over of worden
door de schimmel geässimileerd, hoe het zij, ze laten de
diastase los zoodat deze weer werkzaam kan worden en
wel ten volle, zoodat nu pas de werkelijke hoeveelheid
enzym, die de schimmel geproduceerd heeft, te voor-
schijn komt. De lijn stijgt dan tot ver boven het eerst
bereikte maximum en blijft daar . Het is nu ook dui-

Misschien mogen we de plotselinge, vrij groote hoeveelheid dias-
tase, die optreedt op den laatsten dag van waarneming bij serie ZG,
tabel IB, als een begin van dit „vrijkomen" beschouwen. Het droogge-
wicht in deze serie was hoog: 1217 m.Gr., zoodat men zich kan voor-
stellen dat de diastase steeds vrijwel geheel gebonden was, nu echter,
zij het laat, toch nog vrij gaat komen. Intusschen is dit eene getal voor
een dergelijke conclusie natuurlijk nog niet voldoende.

delijk waarom de lijnen die de productie van mycelium
vloeistof weergeven, zooals die in fig. 12A, soms een
verloop vertoonen waaruit zoo weinig valt op te maken.
Immers, het enzym in het mycelium was blijkbaar niet
onder invloed van de belemmerende factoren in de
vloeistof; het heft dus de daling die de diastase in de
vloeistof vertoont, wanneer ze afzonderlijk graphies
wordt voorgesteld, gedeeltelijk op, waardoor het al-
gemeene verloop in die lijnen vertroebeld wordt.

Men zou ook kunnen denken dat het nog aanwezig
zijn van suikers in de vloeistof de omzetting van het
zetmeel vertraagt, doordat het evenwicht bij de reactie
verschoven wordt. Dit gebeurt inderdaad, wanneer men
een oplossing van maltose voegt bij het mengsel enzym-
zetmeel. Ik verkreeg hiervoor de volgende gegevens:
een oplossing van diastase, die het zetmeel in 185 sec.
omzette, deed dit in een milieu dat 1 % maltose be-
vatte in 440 sec., bij 2 % maltose in 1140 sec. Daar de
diastase van Aspergillus niger het zetmeel tot maltose
splitst (zie pag. 43 noot), komen de series op glucose
niet in aanmerking bij deze kwestie en wat betreft de
series waar ook zetmeel als voeding diende, hier kan
misschien in de eerste dagen de maltose een remmende
factor zijn. De hoofdoorzaak ligt echter niet hier; men
bedenke slechts, dat de daling altijd het sterkst is na de
geheele vertering van het voedsel.

De werkelijke hoeveelheid enzym, die tenslotte te
voorschijn komt, blijkt altijd even groot te zijn, onge-
acht de concentratie van de voeding. Tenminste, bij de
series op 0.5—2.5 % zien wij dat steeds ongeveer het-
zelfde hooge maximum bereikt wordt. Die van 4 %

komen daar niet geheel aan toe, doch het is aan te
nemen dat het langer duurt voordat alle belemmeringen
voor de diastase zijn weggenomen, daar ze in grooter
hoeveelheid aanwezig waren. Ditzelfde geldt natuurlijk
in nog sterker mate voor de series op 5 %.

We zien dus, dat noch de aard, noch de concentratie
van de voeding invloed uitoefenen op de diastasepro-
ductie, tenminste voorzoover betreft zetmeel en glu-
cose. De concentratie kan slechts tijdelijk den gang
van zaken verstoren. Fig. 11 van de derde serie op zet-
meel 0.5 % is daarom de eenige, die een juiste voorstel-
ling geeft van het verloop van de vorming van diastase.

Eenige belangrijke feiten staven m.i. de hier beschre-
ven opvatting. Men zie fig. 13 tabel 10 voor een serie
op maltose 5 % (11—13; 1040.5). Het eerste ma-

ximum wordt hier wel gevolgd door een daling, maar
deze is veel minder diep dan bij glucose 5 % en wordt
gevolgd door een stijging, die ook veel minder hoog
komt. Nu produceert Aspergillus niger blijkbaar zeer
weinig maltase. Het duurt tenminste lang, voordat de

maltose uit de cultuurvloeistof verdwijnt; waar glucose
en andere voedingsstoffen meestal reeds op den lOden
a 12den dag waren opgeteerd, is hier op den 24den en
zelfs op den 31 sten dag nog vrij veel suiker aanwezig ,
hetgeen ook wel blijkt uit de draaiing van de cultuur-
vloeistof. Deze is bij andere series op den lOden a 12den
dag = O, hetgeen ongeveer samenvalt met het berei-
ken van het maximum aan drooggewicht; hier is die op
den 24sten dag nog = 1 °23\'24", waarop ook het droog-
gewicht nog maar weinig is teruggeloopen, nl. tot 911
m.Gr. Wel heeft de dissimilatie dus de overhand gekre-
gen, maar er wordt toch blijkbaar altijd nog geassimi-
leerd tevens en tegelijkertijd worden dus hoogstwaar-
schijnlijk stoffen geproduceerd, die de diastase beletten
haar volle kracht te ontplooien. Hier treedt de maltose
zelf zeker ook als remmende factor op. Wanneer de
serie langer was voortgezet, zou ongetwijfeld ook de
groote hoeveelheid enzym, die we bij andere series
waarnemen, zijn opgetreden. Helaas ontbraken mij de
noodige culturen daartoe en de tijd om die te maken.

Uit de getallen voor de draaiing van de cultuurvloeistof kan men
opmaken dat, zooals ook te verwachten was, Aspergillus niger de
maltose splitst tot glucose. Waar daar echter zoo lange tijd voor noodig
blijkt te zijn. kan men niet anders aannemen dan dat bij de omzettingen
van zetmeel, die alle meest snel verloopen, als eindproduct maltose
ontstaat. Ik werd in deze meening nog versterkt door een ander feit:
bij de derde serie op 0.5 % zetmeel werd in den beginne eiken dag nage-
gaan hoe groot het reduceerende vermogen was van de cultuurvloeistof.
Toen het zetmeel daaruit geheel verdwenen was (op den 9den dag), bleek
het reduceerend vermogen even groot te zijn als van een oplossing van
0.4 % maltose; d.w.z. er waren toen bijna even groote hoeveelheden
van cultuurvloeistof als van een oplossing van 0.4 % maltose noodig,
om eenzelfde volumen van Fehling\'s proefvocht te reduceeren. Dit is
nog wel geen bewijs, maar maakt de veronderstelling toch wel zeer

waarschijnlijk.

Een groot aantal uitkomsten, die ik verkreeg bij een
heel ander soort waarnemingen, steunen m.i. eveneens
de conclusies, die ik hierboven heb uiteengezet. Ten-
minste, zij worden op zeer aannemelijke wijze door
mijn opvatting verklaard.

Zooals ik reeds mededeelde werden de cultuurvloei-
stoffen, voor zoover er na de proefnemingen nog wat
van over was, bewaard. Van dag tot dag of van week
tot week werd nagegaan of de kracht van de diastase al
of niet afnam. Het is niet goed mogelijk om de uit-
komsten. die ik hiermee verkreeg, hier alle neer te
schrijven: het zijn er eenige honderden. Noodig is dit
trouwens niet, want van een groot aantal ervan kan
ik met eenige woorden zeggen wat ze leeren.

De vloeistoffen van de drie series op zetmeel 0.5 %
behielden hun kracht voor onbepaalden tijd; zelfs die-
genen, die na ^b tien maanden onderzocht werden op
hun gehalte aan diastase, bleken ook toen nog een zet-
meeloplossing van 0.08 %\' in den zelfden tijd om te
zetten als op den dag, waarop ze van de schimmel wer-
den afgefiltreerd. Er zijn hierop eenige uitzonderingen
en wel in de serie GZ. Men herinnert zich, dat in deze de
hoeveelheid mycehum, die gevormd werd, het grootst
was van de drie; het bereikte zijn maximum op den
9den tot den 13den dag. De vloeistoffen van deze dagen
nu vertoonen een teruggang van het enzym en wel was
na 34 dagen van de oorspronkelijke kracht over:
in de vloeistof van den 7den dag 50%
» >> » » » 9den „ 60%

11 den „ 78%
>» )i >t )) „ 13den „ 82%

In deze vloeistoffen waren dus in voldoende mate
stoffen afgescheiden die de werking van het enzym
remden.

Van de serie ZZ was een cultuur overgebleven, die ik
op den 175sten dag na de enting op de bekende wijze be-
handelde. Ik verwachtte, dat de afbraakproducten van
het mycehum de diastase geheel onwerkzaam gemaakt
zouden hebben. Toch bleek er nog een hoeveelheid
diastase = 577 aanwezig te zijn, vrij belangrijk dus en
wat meer zegt, na ± 7 maanden was nog 72 % van de
kracht in deze vloeistof over. Nu bedroeg het droogge-
wicht van dien 175sten dag 110 m.Gr., nauwelijks min-
der dus dan op den 40sten tot 50sten dag van deze
serie. Van een vergaande afbraak kan dan ook nog geen
sprake zijn geweest en dit verklaart ook wel het betrek-
kelijk hooge enzymgehalte.

Van de serie op zetmeel 2 % (11—22; 493) konden
slechts de vloeistoffen van de laatste vier dagen van
Waarneming bewaard worden, t.w. van den 29, 32,
36 en 45sten dag. De groote stijging was op den 29sten
dag al lang begonnen, het enzym moest reeds grooten-
deels „vrij" zijn. Ik mocht dus verwachten dat ook in
deze vloeistoffen de diastase mettertijd niet of weinig
aan kracht zou verliezen. Dit bleek ook zoo te zijn:
in de vloeistof van den:
29sten dag was na 62 dagen nog over 82%
32sten „ „ 124 „ „ 100%

36sten „ 131 ...... 90%

36sten „ „ 223 „ „ 75%

45sten „ .. .. 131 . „ „ 78%
Het is duidelijk wat men nu kan verwachten van de

series op 1—2.5—4 en 5 % glucose; n.1. bij 1 % zullen
de vloeistoffen van de meeste dagen volmaakt con-
stant van kracht moeten zijn; hoogstens zullen enkele
in de dagen van maximaal drooggewicht na eenigen
tijd hun diastatische werkzaamheid langzamerhand
verhezen. Hoe hooger de concentratie van de voeding,
hoe meer vloeistoffen niet constant zullen blijken te
zijn, des te sneller zullen ze tevens hun kracht verliezen.

Deze verwachtingen komen ook vrijwel uit; bij glu-
cose 1 % (9—16; 261) waren niet constant de vloeistof-
fen van den 5den tot den 9en dag; hiervan was na
12 dagen nog over:

in de vloeistof van den 5den dag 69 %

6den „ 70 %
7den „ 50 %
9den „ 62.5 %
13; 615.5) gold hetzelfde
voor den 5den tot den 18den dag en wel was na 12
dagen over:

in de vloeistof van den 5den dag 70%

, 6den „ 86%
, 7den „ 61%
, 11 den „ 8%
, 13den „ 16%
, 16den „ 9%
. 18den „ 62%

Met ziet, dat het grootere drooggewicht zich reeds
sterk laat gelden; dit is ook het geval bij de serie op
glucose 4 % (13—16; 912). Hier was in de vloeistoffen
van den 5den dag tot den 18den dag nog over van de
diastatische werkzaamheid na 10 dagen:

GEKWEEKT OP GLUCOSE, ZETMEEL EN MALTOSE. 47
in de vloeistof van den 5den dag 56%

46%
33%
16%
7.8%
86%
50%

\'r / r fW

Tevens waren in deze serie de vloeistoffen der laat-
ste dagen ook niet meer geheel constant; na twee maan-
den had hier de diastase meestal 20 a 30 % van haar
kracht verloren.

Glucose 5% (11—19; 944.5); van deze serie zijn
slechts de vloeistoffen der laatste dagen bewaard ge-
bleven; uit fig. 4 is al te zien dat het enzym hier niet
geheel „vrij" komt. Het is dus begrijpelijk, dat zelfs op
deze dagen de diastase haar kracht vrij snel blijkt te
verliezen. Na 6 dagen was nog maar over:

in de vloeistof van den 33sten dag 8%
„ „ „ „ „ 37sten „ 9%
„ „ „ „ 40sten „ 50%

„ „ „ „ „ 46sten „ 10%

Wij kunnen hieruit m.i. veilig de conclusie trekken dat
in deze serie geen vloeistof haar kracht lang behou-
den heeft.

Ik kon niet altijd alle vloeistoffen zoo lang bewaren
als ik wilde, om de eenvoudige reden, dat ze na zekeren
tijd waren opgebruikt. Daarom is het mij niet mogelijk
geweest de getallen, die ik voor deze series gaf, te ont-
nemen aan waarnemingen, die alle na een gelijk aantal
dagen zijn gedaan. Ik zou dat aantal wel voor alle series
gelijk kunnen maken, maar moet dan de resultaten op-

geven voor het kleinst aantal dagen gedurende welke
bij één van die series de waarnemingen werden gedaan,
i.e. 6 bij glucose 5 %; in de meeste gevallen geven de
resultaten dan geen overzicht meer. Toch illustreeren
zij m.i. ook zoo duidelijk genoeg den invloed, dien de
meerdere of mindere schimmelstof uitoefende en wel
sterker, naarmate het mycehum meer drooggewicht had
ontwikkeld.

De serie op maltose gaf in dezen slechts weinige en
onsamenhangende resultaten.

Zetmeel 0.1 % glucose 4 % (9—13; 902): geen
terugggang in de vloeistoffen van den 3den en 4den
dag; verder zijn geen waarnemingen gedaan.

Zetmeel 0.25 % glucose 2.5 % (7—13; 636.5). Na
6 dagen was nog over:

in de vloeistof van den 4den dag 30%
„ „ » ,, ,, 18den „ 24%
» » » „ 19den „ 20%

n IJ I» »> II 21 sten ,, 21%
1» II i> I» 11 23sten „ 12%

Van de latere dagen verloren de vloeistoffen na länge-
ren tijd niet meer dan ongeveer 15 %.

Zetmeel 0.4 % glucose 1 % (7—13; 357), Na 12
dagen was nog over:

in de vloeistof van den 4den dag 54 %
„ „ 5den „ 7.5%
9den „ 2.5 %
„ 11 den ,. 11 %

„ 13den 13 %

De invloed van de schimmelmassa is hier veel sterker

GEKWEEKT OP GLULOSE, ZETMEEL EN MALTOSE. 49
dan ik had verwacht bij een zoo betrekkelijk gering

drooggewicht.

Fig. 14 Stelt voor het verloop van den achteruitgang
van de diastatische kracht in de vloeistoffen van
den llden (......) en 13den dag (-) van laatstge-
noemde serie. Deze lijnen toonen duidelijk aan, dat het
onwerkzaam maken van de diastase plaats heeft vol-
gens de wet van de massawerking. Het is daarom onge-

4

wenscht de resultaten van snelle en langzame afname
van kracht met elkaar te vergelijken na een gelijk,
klein aantal dagen.

Het is te begrijpen, dat de hoeveelheid stoffen,
die de diastase onwerkzaam maken, nog al eens zal
verschillen. We behoeven ons er dan ook niet over
te verwonderen, dat er in de resultaten, hierboven
beschreven, vrij veel onregelmatigheden voorkomen.
Men kan daarbij in de tabellen van de series op
mengsels van zetmeel en glucose zien, dat de ver-
schillen in de hoeveelheden diastase van twee kolven
het grootst plegen te zijn op de dagen, waarop de
remmingsfactoren hun invloed het meest uitoefenen.

Voorloopig is het mij niet mogelijk een quantitatieve
relatie aan te geven voor een hoeveelheid van de rem-
mende zelfstandigheid, die een bepaalde hoeveelheid
enzym onwerkzaam maakt. Ik heb daartoe wel pogin-
gen aangewend door uitzouten, neerslaan enz., doch
deze gaven geen resultaat. Dit kan ik alvast wel mede-
deelen: het gaat hier om zeer kleine hoeveelheden; de
vloeistoffen, die diastase bevatten, waren zonder uit-
zondering volmaakt helder, (NH4)2S04 gaf zelfs in
groote concentratie geen merkbaar neerslag.

V. SERIES OP SACCHAROSE GLYCERINE
EN MELKSUIKER.

De series, die mij nog ter bespreking overblijven,
hebben, wat productie aan diastase betreft, niet veel
resultaat opgeleverd. In andere opzichten leeren ze
echter wel eenige belangrijke dingen.

Op saccharose 5 % werden vier series gekweekt, en

wel één, geënt met conidiën van een cultuur op glucose

5%, één, geënt met conidiën van een cultuur opsaccha-
rose 5% en twee, die een dergelijke parallelserie vorm-
den, doch waaraan waren toegevoegd kleine hoeveel-
hedenZnSO^ en EeSO^ (0.0025%; Raulin (44)). Ik wilde
n.1. onderzoeken of de bekende uitwerking van die zou-
ten op het drooggewicht, ook zou gelden voor de pro-
ductie van diastase.

Alle vier deze series vormden een zwaar mycehum,
dat sterke golvingen vertoonde in zijn oppervlak. De
culturen, waaraan ijzer en zink waren toegevoegd,
waren vrij sterk citroengeel gekleurd onder invloed van
het ijzer; het mycehum was hier zeer bros, kon niet dan
in vele stukken uit de kolven gehaald worden. Conidiën
werden ongeveer niet gevormd, hoogstens aan de ran-
den, terwijl daarentegen de culturen zonder zink en
ijzer na eenigen tijd met een niet zeer dichte laag coni-
diën overdekt waren.

Saccharose 5% (28—37; 1058) tabel llA.

GS: d.w.z. geënt met conidiën van een cultuur op
glucose 5 %.

Saccharose 5% (18—220 ; 989) tabel IIB.

SS: d.w.z. geënt met conidiën van een cultuur op
saccharose 5 %.

De diastase in de cultuurvloeistof is in beide series
zeer onbeduidend; in het mycelium van GS treedt van-
af den 13den dag een kleine hoeveelheid op, die vrij
constant blijft, zoolang als de waarnemingen duurden.
In SS komt ook deze diastase niet voor, tenminste, de
hoeveelheden in deze serie zijn zoo gering, dat ik meen
ze te mogen verwaarloozen. Men ziet, dat de omzetting
van de saccharose en de vertering van de invertsuiker
in beide series ongeveer even langen tijd in beslag
namen; waarom het maximum aan drooggewicht in
GS later bereikt wordt dan in SS is mij niet duidelijk.

Saccharose 5% Fe---f-Zn"
(11—16; 1426) tabel 12A
GS\': d.w.z. geënt met conidiën van een cultuur op
glucose 5 %.

Saccharose 5% Fe" H-Zn"
(11—18; 1417) tabel 12B.

SS\': d.w.z. geënt met conidiën van een cultuur op
saccharose 5 %.

Men ziet, dat het drooggewicht hier werkelijk meer
bedraagt dan in de series, waarin geen zink- en ijzerio-
nen aanwezig waren; tevens werd het maximum veel
sneller bereikt.

Verder treedt hier in het mycelium van GS\' een
hoeveelheid diastase op vanaf den 11 den dag, die op
den 26sten weer verdwenen is. Deze hoeveelheid is on-

geveer het dubbele van de overeenkomstige bij GS,
hoogstwaarschijnlijk onder den invloed van de ijzer- en
zmkionen. Evenals in SS, is ook in SS\' deze geringe
productie weer verdwenen; dit is in dit geval het eenige
verschil, dat de herkomst van de conidiën verraadt.
Intusschen is zooiets genoeg om absolute tegenspraak
te veroorzaken in de resultaten van onderzoekers, die
zich alleen bekommeren om de enzymen, die een schim-
mel in haar mycelium bevat en er niet op letten, uit
welke conidiën zij hun culturen verkrijgen.

Het is opvallend, hoe weinig diastase op saccharose
gevormd wordt. Voor zoover ik dat kon nagaan, heb-
ben andere onderzoekers nooit een zoo groot verschil
tusschen de diastaseproducties op glucose, zetmeel of
saccharose gevonden. Katz (33) en Kylin (34) spreken
van „reichliche Mengen", zij het, dat bij hen de sac-
charose altijd vermengd was met 0.25 % zetmeel. Ook
de meeste andere geven van dergelijke vage aanduidin-
gen, waaruit intusschen toch wel valt op te maken, dat
ze op saccharose nooit zoo opvallend veel minder dias-
tase vonden dan op andere suikers. Misschien is het
groote gewicht van het mycelium hier van invloed ge-
weest. Dit kunnen we ons inderdaad voorstellen voor
de series op saccharose -f- Fe- • -f- Zn\'waar dit 1426
en 1417 m.Gr. bedroeg en waarbij dan misschien nog
een nadeelige invloed komt van het ijzer en zink. Bij de
series SS en GS is het minder waarschijnlijk (989 en
1059); het eerste scheelt maar weinig met het maxi-
mum gewicht van de serie op glucose 5 %—GG: 944
"^•Gr., terwijl bij deze toch een belangrijke hoeveelheid
diastase voor den dag kwam. In elk geval blijft het

denkbaar dat deze kleine hoeveelheid meer aan droog-
gewicht, juist den doorslag geeft.

Wanneer dit alles waar is, kunnen we verwachten
dat Aspergillus niger, gekweekt op een lagere concen-
tratie van saccharose, b.v. 1 %, groote hoeveelheden
diastase zal produceeren. Ik heb nagegaan of dit werke-
lijk het geval is, entte daartoe zes kolven op 1 %
saccharose (met conidiën van een cultuur op 4 % glu-
cose), waarvan ik telkens twee op den 7den, 14den en
21 sten dag onderzocht. Het resultaat ziet men in de

De ontwikkeling ging in het begin zeer langzaam,
zoodat de 7de dag over het algemeen een negatief
resultaat opleverde; op den 14den dag echter waren
drooggewicht en zuurgraad zoodanig, dat een flinke
hoeveelheid diastase verwacht mocht worden; desniet-
temin bleef die hier uit. Het is dus niet alleen de con-
centratie, maar ook de chemische aard van de saccha-
rose, die zich hier doet gelden. Dat er nog onbelang-
rijke hoeveelheden diastase optreden, meen ik te mogen
toeschrijven aan de nawerking van de 4 % glucose,
vanwaar de conidiën kwamen, waarmee de kolven wer-
den geënt.

1) Dit getal is het gemiddelde van de resultaten van waarnemingen,
gedaan aan twee culturen.

Op den 21 sten dag echter, is het resultaat werkelijk
zooals dat werd verwacht; de hoeveelheid diastase, die
toen in de cultuurvloeistof aanwezig bleek te zijn, is
nog wel niet zoo groot als bij de serie op 1 % glucose,
maar desniettemin is een groote stijging hier zoo on-
miskenbaar, dat ik niet aarzel aan te nemen, dat deze
mijn veronderstelling, hierboven uitgesproken, vol-
komen bevestigt.

Michaèlis en Menten (39) hebben onderzocht, welken
invloed bijmengsels uitoefenen, wanneer ze worden
gevoegd bij de combinatie enzym-substraat, i.e. mver-
tase-saccharose. Zij vonden, dat er stoffen zijn, wier
aanwezigheid de affiniteit van het enzym tot zijn sub-
straat ten zeerste vermindert. De splitsingsproducten
van de saccharose deden dat eenigermate, glycerine o.a
zeer sterk. Misschien moeten we saccharose en fructose
als dergelijke bijmengsels voor de combinatie diastase-
zetmeel beschouwen. Dat zou dan verklaren, waarom
we op 5 % saccharose nauwelijks eenige productie aan-
treffen. De proef is nog niet lang genoeg voortgezet om
de belemmeringen: eerst de saccharose en fructose,
later het groote schimmelgewicht, te laten verdwijnen.
Is dat eenmaal gebeurd, dan komt dus toch de diastase
te voorschijn, zooals bij de kleine proef op 1 % sac-
charose.

Glycerine 5% (28—33; 1021) tabel 13A
geënt met conidiën van een cultuur op glucose 5 %.

Glycerine 5% (29; 998) tabel 13B
geënt met conidiën van een cultuur op glycerine 5 %.

De ontwikkeling op glycerine ging zeer langzaam;
tenslotte echter werden eenige in elkaar gerolde, com-

pacte stukken mycelium gevormd, die los van elkaar
bleven drijven. Zij waren lichtgrijs van de conidiën, die
er dicht tegen aan zaten.

Zooals men in de tabel ziet, is in beide series de ont-
wikkeling van diastase niet noemenswaard. Hieruit
mogen we dus nog niet besluiten dat Aspergillus niger,
op glycerine gekweekt, geen diastase vormt. Eerst zou
onderzocht moeten worden of op een lagere concentra-
tie niet hetzelfde resultaat werd verkregen als bij 1 %
saccharose. Voorloopig mogen we slechts constateeren
dat, bij voeding op 5 % glycerine, de eventueele facto-
ren, die een diastaseproductie verhinderen te voor-
schijn te komen, na een tijdsverloop van 52 dagen nog
niet verdwenen zijn.

Op melksuiker 5 % werden eveneens twee parallel-
series gekweekt. De schimmel heeft zich hierop bijna
niet ontwikkeld. Bij Aspergillus niger schijnt geen lac-
tase voor te komen en dus, waar noodig, ook niet ge-
produceerd te worden. De draaiing van de cultuur-
vloeistof, die op den eersten dag 2°28\'3" bedroeg, was
op den 19den nog 2°24\'36". Er verschenen uiterst kleine
en dunne vliesjes mycelium, die slechts zichtbaar waren
door de conidiën, die zij droegen. De tabellen van deze
series geef ik niet, ze zijn volstrekt onbelangrijk. Dat
er geen productie van diastase plaats vond, is nauwe-
lijks de moeite van het vermelden waard.

VI. SAMENVATTING DER RESULTATEN.

Het is noodzakelijk gebleken, voor men proeven doet
met enzymen van schimmels, eerst te weten welke
waterstofionenconcentratie voor de werking van die
enzymen optimaal is. De zuurgraad voor de diastase
van Aspergillus niger is in haar cultuurvloeistof opti-
maal. Dit is niet het geval bij alle schimmels.

Het komt er ten zeerste op aan wat, de vonge voe-
dingsbodem geweest is, waarvan de conidiën stammen
waarmee men de culturen maakt voor het experiment.
Men zorge ervoor, dat Hefst conidiën worden genomen
van culturen op een bodem van dezelfde samenstelhng
als die, waarop de proeven worden gedaan.

Aspergillus niger produceert groote hoeveelheden
diastase en wel vanaf het begin van haar ontwikkeling
in stijgende mate, tot een zeker maximum bereikt is.
Ban wordt de productie stopgezet, doch de reeds aan-
wezige hoeveelheid blijft gedurende het verdere leven
van de schimmel bestaan. Dit had plaats bij voeding
met glucose, maltose en zetmeel. Noch de aard nocii
de concentratie van een van deze stoffen was daarbij
van invloed.

De concentratie van de voeding kan, wanneer die
grooter is dan 1 %, tijdelijk de diastasevorming ver-
storen, doordat daarbij stoffen worden gevormd, die
het enzym onwerkzaam maken. Wanneer die stollen

mettertijd op een of andere wijze weer verdwijnen,
komt de normale hoeveelheid diastase echter toch te
voorschijn.

De diastase wordt direct na haar vorming in de
cultuurvloeistof uitgescheiden.

De diastase verhest, zelfs na langen tijd, niets van
haar kracht.

Saccharose oefent een nadeeligen invloed uit op het
in werking treden van de diastase; zijn echter de sac-
charose en haar omzettingsproducten uit de cultuur-
vloeistof verdwenen, dan komt ook hier de diastase
te voorschijn.

Bij voeding met 5 % glycerine werd geen productie
van diastase waargenomen.

Bij Aspergillus niger komt geen lactase voor, ook
niet wanneer de schimmel wordt gekweekt op melk-
suiker, zoodat daarop geen of een zeer geringe ontwik-
kehng plaats heeft.

vu. LITERATUUR.

1 Abler, L. Biochem. Zeitschr. Bd. 77 1916. Ueber den Einfluss der
Wasserstoffionen auf die Wirksamkeit der Malzdiastaje^

2 Barnett. G. D. and Barnett, C. W. Proc. see of Exp. BioL and
Med. Vol. 18 1920. Colorimetric determination of H concentration
by means of a doublewedge comparator.

3 Bayliss, W. M. Principles of general Physiology. London-iNew

4 SLke, W. Bot. Zeitung Bd. 65 1907. Kleine Mitteilungen ueber

5 lir^™ Bd. I 1916. Fermentstudien

I. Die Autolyse der Stärke. .

6 id. ibid. Fermentstudien 2. Die Autolyse der Starke.

7 id. ibid. Bd. 1917 Fermentstudien 3. Pepsin und peptische

8 ttS. Bd. 1919. Fermentstudien 4. Zur Autolyse der Stär^^

9 id. ibid. Bd. 3 1920. Fermenstudien 5. Fermentbildung durch

10 m!^!\' 1920. Bemerkung zu Wohlgemuths und Sallingers

Einwände etc. . .„ Knmoo-

11 id. ibid. Bd. 4 1921. Fermentstudien 7. Die orgamsche" ^
nente der Diasta^en und das wahre Wesen der Autolyse der Starke.

12 id. Pflügers Archiv für die gesammte Physiologie Bd. 183
Stärke. Stärkekörner und Stärkelösungen.

13 Boas, F. Beih. zum Bot. Centralbl. Abt. 1 ^d- 36 1919 Unt^J-
ueber Sänrewirkung und Bildung löslicher Stärke bei Schimmel

Pilzen (Asp. niger) 1. .. t, rh 90 1918 Unters.

14 Boas. F. und Leberle. H. Bioch. Zeitschr. Bd. 90 19lö. u

ueber Säurebildung bei Pilzen und Hefen I.

15 id. ibid. Bd. 92 1918. id. II. ,g

16 Boëseken J. Beknopte scheikunde der suikers Délit ^^ •

17 Brenner W. Centralbl. für Bakt. Parasitenkunde und Infektions
krankh. Bd. 40 1914. Die Stickstoffnahrung f j

18 Büsgen M. Ber der Deutschen Bot. Ges. Bd. 3 1885. Asperg

19 Wewitsch, W. Jahrb. für wiss. Bot. Bd. 38 1902. Umwandlung

der Eiweissstoffe durch die niederen Pilze im Zusammenhang mit
einigen Bedingungen ihrer Entwicklung.

20 Clark, W. M. and Lubs, A. H. Journ. of Bact. Vol. 2 1917. The
colorimetric determination of hydrogen ion concentration and its
application in bacteriology.

21 Colin, H. Hydrolyse de quelques polysaccharides par le Botrytis
cinerea. Thèse de doctorat Paris 1911.

22 Dox, A. W., U. S. Department of Agric. Bureau of animal Industry
Bull. 120 Wash. 1910. The intracellular enzyms of Pénicillium
and Aspergillus.

23 Duclaux, E. Traité de Microbiologie. T. II Paris 1899.

24 Eichwald.E. und Fodor, A. Die physikalisch-chemischen Grund-
lagen der Biologie. Berlin 1919.

25 Elfving, F. Öfersigt af Finska Vetenskaps-Societetens Förhand-
lingar Bd. 6 Afd. A N°. 15 191&—1919. Ueber die Bildung organi-
scher Säuren durch Aspergillus niger.

26 Euler, H. Chemie der Enzyme München-Wiesbaden 1920.

27 Fermi, C. Centralbl. für Bakt. und Paras.kunde. Bd. 10 1891.
Weitere Untersuchungen ueber die tryptischen Enzyme der Mi-
kroorganismen.

28 Fermi, C. und Montesano, G. Centralbl. für Bakt. und Paras,
kunde. Abt. 2 Bd. 1 1895. Die von den Mikroben bedingte Inver-
sion des Rohrzuckers.

29 Fernbach, A. Comptes rendus de l\'Ac. des sc. T. 142 1906. In-
fluence de la réaction du milieu sur l\'activité des diastases.

30 Fischer, E. Ber. der Deutschen Chem. Ges. Bd. 27 III 1894.
Einflusz der Configuration auf die Wirkung der Enzyme.

31 Funke, G. L. Zittingsverslag der Kon. Acad. van Wetensch. te
Amsterdam. Deel 31 1922. De invloed van de waterstofionencon-
centratie op de werking van de diastase van Aspergillus niger.

32 Grezes, G. Ann. de l\'Inst. Pasteur. T. 26 1912. Recherches sur la
su erase de 1\'Aspergillus niger.

33 Katz j. Jahrb. für wiss. Bot. Bd. 31 1898. Die regulatorische Bil-
dung von Diastase durch Pilze.

34 Kvlin H. Jahrb. für wiss. Bot. Bd. 53 1911. Ueber Enzymbildung
und Enzymregulation bei einigen Schimmelpilzen.

35 Lappalainen H. öfversigt af Finska Vetenskaps-Societetens
Förhandlingar. Bd. LXII 1919—1920 Afd. A N°. 1. Biochemische
Studien an Aspergillus niger. Akad. Abhandlung.

36 Lippmann, O. v. Chemie der Zuckerarten. Braunschweig 1895.

37 Michaëlis, L. Bioch. Zeitschr. Bd. 33 1911. Ueber die Dissozia-
tion der amphoteren Electrolyte.

38 Michaëlis. L. und Davidsohn. H. Bioch. Zeitschr. Bd. 35 1911.
Die Wirkung der H\'Ionen auf das Invertin.

39 Michaëlis, L. und Menten. Miss M. L. Bioch. Zeitschr. Bd. 49

1913. Die Kinetik der Invertinwirkung. co toiA

Michaelis, L. und Pechstein, H. Bioch. Zeitschr.\' Bd. 59. 1914.
Die Wirkungsbedingungen der Speicheldiastase.
Pekelharing. C. A. Ree. des trav. bot. néerl. Vol. 16 1919. Some

remarks on enzymes.

42 Pfeffer, W. Jahrb. für wiss. Bot. Bd. 28 1895. Ueber Election

organischer Nährstoffe. , ,

43 PoTTEViN. H. Ann. de 1\'Inst. Pasteur. T. 27 1913. Influence de Ia
configuration stéréo-chimique des glucosides sur l\'actmte des
diastases hydrolytiques. ^ , . .

44 Raulin, J. Etudes chimiques sur la végétation. Thèse de doctorat

Paris 1870. e,

45 Ringer, W. E. en Trigt, H. van. Onderz. physiol. lab. Utr. öae
reeks. Vol. 14 1913. Over den invloed van de reactie op de werkmg
van ptyaline. , „, o

46 Schiemann. E. Zeitschr. für ind. Abst.- und Vererb, lehre. Bd. ö
1912. Mutationen bei Aspergillus niger van Tieghem.

47 Sörensen. S. P. L. Bioch. Zeitschr. Bd. 21 1909. Enzymstudien Ii.

48 Wehmer, C. Bot. Zeitung. Bd. 49 1891. Entstehung und physio-
logische Bedeutung der Oxalsäure im Stoffwechsel einiger Püze.

49 id. Ber. der Deutschen bot. Ges. Bd. 24 1906. Die Bildung freier
Oxalsäure durch Aspergillus niger. .

50 id. Bioch. Zeitschr. Bd. 59 1914. Der Gang der Acidität m Kultu-
ren von Aspergillus niger bei wechselnder Stickstoffquelle.

51 Went. F. a F. C. Jahrb. für wiss. Bot. Bd. 3Ó 1901. Ueber den
Einfluss der Nahrung auf die Enzymbildung durch Moniha sito-

Phila (Mont.) Sacc. ,0,0

52 id. Zittingsverslag der Kon. Acad. van Wet. te Amst. Dl. 27 19lö.
De loop van de vorming van diastase van Aspergillus mger.

53 Westerdijk. Joh" en Luvk. A. van. Meded. uit het phytopath.
lab. .,W. C. Scholetn". Amst. Dl. 4 1920. Die Gloeosporien der

Eiche und der Platane.

54 Wohlgemuth, J. Bioch. Zeitschr. Bd. 9 1908. Methode zur quan-
titativen Bestimmung der diastatischen Fermente.

55 Wortmann, J. Zeitschr. für physiol. Chemie. Bd. 6 1882. Unter-
suchungen ueber das diastatische Ferment der Bakterien.

f. ■ .

VIII. TABELLEN

> .

^ \'S

tabel ia.

GG Glucose 5%.

TABEL IB.
ZG Glucose 5%.

diastase in
het myc. \')
diastase in
de cultuur-
vloeistof

droogge-
wicht
in m.Gr.

diastase in
het myc.\')
diastase in
de cultuur-
vloeistof \')

drooggew.

in m.Gr.

67
112
264
399
571

885
1330
1125
1213
1200

956

886
851
889
841

779
807

de resul-

de getallen in deze kolommen zijn alle gemiddelden van
taten van waarnemingen aan minstens twee culturen.

Glucose 4%

tabel 3.

Glucose 2.5%.

draaing
van de
cult. vi. St.
10 c.m.

5\' 24"
O\' O

0° 43^12\'

0° 4\' 12
0° O\' 14\'
Q° O\' O

Ph. vh.
myc.
extract
met
cult,
vi. St.
uitgetr.

5.4
5.2
3.6
3.4

4.2

3.2

3.25

3.4

3.2

3.3

Glucose 1%.

TABELLEN.

Zetmeel 2%.

diastase in

het
mycelium

Ph van het
mycelium-
extract

diastase in de
cultuur-
vloeistof

Ph van de
cultuur-
vloeistof
droogge-
wicht in
m.Gr.

de getallen in deze kolommen zijn alle gemiddelden van de resul-
taten van waarnemingen aan minstens twee culturen.

Zetmeel 0.1% glucose 4%

a> O

E

UI .S

3 -s

s ^

=5 S

gemiddelde

van kolf
1 ea 2
droog-
gewicht
in m.Gr.

TABEL 8.

Zetmeel 0.25 % glucose 2.5 %.

Zetmeel 0.4 % glucose 1 %•

diastase in
de

cult. vi. St.
in kolf 2.

gemiddelde

van kolf
I en 2.

Maltose 5 %.

tabel IIA.

Saccharose 5%.
_ GS

TABEL IIB.

Saccharose 5 %.

SS

Ä in
c ^

.3 4)

O e

W CJ

aj o

Is

•a

^ 3° 6\'20"
3 3065\' 3\'
r32\'14\'
5 0° 6\' 5

1°43\'12
1°29\'36°
1°21\'52\'
1°19\'41\'

■1°12\'24\'

-1°43\'12\'
1°10\'28\'

0\'19

0° 0\' 0

_1<\'38\'42\'

TABEL 12A.

Saccharose 5 % Fe" Z"
GS\'

TABEL 12B.
Sacch.5% Fe- Z-
SS\'