\' . • \' ..\' • - y-.- ■ \' • y > ; * . • ••?.<-• •".•-\' . •■ ^ \\ ■ •

proefschrift ter verkrijging van
den graad van doctor in de wis- en
natuurkunde aan de rijks-universi-
teit te utrecht, op gezag van den
rector-magnificus dR. h. f. nierstrasz,
hoogleeraar in de faculteit der wis-
en natuurkunde. volgens besluit
van den senaat der rijks-universiteit
tegen de bedenkingen van de facul-
teit der wis- en natuurkunde te ver-
dedigen op dinsdag 7 october 1924.
des namiddags ten vier uur. door

h .rq euo-hluoam
-»fw Tia7 juoA-^ 3G i^»
Tîujea« ewiiojov \\3ay«u>iHuuTAt^ i^ i
\' V TAAH32 mn HAV

Bij het afsluiten van dit proefschrift en daarmee van een tijd-
perk. waarnaar ik graag zal blijven terugzien, wil ik hier allen
dank zeggen, die op eenigerlei wijze tot mijn vorming hebben
bijgedragen.

U Hoogleeraren in de Faculteit der Wis- en Natuurkunde ben
ik zeer erkentelijk voor het genoten onderwijs maar vooral voor
wat enkelen Uwer mij persoonlijk hebben willen geven.

In de allereerste plaats geldt mijn dank U. Hooggeleerde
JORDAN. Hooggeachte leermeester en promotor. Aangetrokken
tot Uw persoon en Uw vak. door het enthusiasme waarmee Gij
Uwe colleges weet te geven, heb ik later, als Uw assistent het
voorrecht gehad den rijkdom van Uwe denkbeelden te mogen
ervaren. In de vele uren van persoonlijk gesprek, hebt Gij mij
geleerd, hoe voor een bioloog het exacte denken onontbeerlijk is.

Steeds meer heb ik leeren waardeeren de wijze waarop Gij
Uwen leerlingen de noodzakelijkheid van zelfbewustwording toont.

Wat ik U persoonlijk te danken heb, vooral door het buiten-
gewone vertrouwen, dat U mij schonk, door Uw hulp en belang-
stelling en door de vrijheid, die U mij gaf voor mijn onderzoek,
zoover de drukbezette tijd. dat toeliet, zal ik niet verder om-
schrijven. Ook de vriendschap die Mevrouw JORDAN en U. mij
en mijn gezin in deze jaren bewezen hebben, zal ons onvergetelijk
blijven.

Hooggeleerde went. ik zal het steeds als een voorrecht blijven
beschouwen, dat ik. hoewel niet tot den kring van Uwe speciale
leerlingen behoorende, gedurende mijn studietijd menige keer bij
U heb mogen komen om Uw raad in te winnen.

Ik betreur het zeer. Hooggeleerde WesterdijK, dat ik niet in
de gelegenheid geweest ben. onder Uw leiding practisch werk-
zaam te zijn. De vriendelijke belangstelling van U ondervonden.
Zal bij mij in dankbare herinnering blijven.

Uw colleges Hooggeleerde KruyT. waren mij een toonbeeld
van helderheid en boeienden betoogtrant. Mijn belangstelling in
de Kolloidchemie eenmaal door U gewekt, zal in de toekomst steeds

levendig blijven. Het spijt mij zeer, dat ik om mijn haastig vertrek
geen gelegenheid heb gehad mijn werk met U te bespreken.

Hooggeleerde MAGNUS, ik acht het een groot voorrecht, dat
ik Uwe bezielende colleges heb kunnen volgen, maar bovenal acht
ik het een voorrecht dat Gij mij toegang hebt willen verleenen
tot Uw referaatavonden, waar door Uw helder oordeel en on-
uitputtelijke kennis de Physiologie leven voor mij heeft gekregen.

Bij de bewerking van mijn proefschrift, heb ik van zeer velen
een onmisbaren steun ontvangen.

Gij, Hooggeleerde RiNGER, hebt mijn eerste schreden geleid
op het gebied der Physiologische-Chemie. Het was in Uw labo-
ratorium, dat ik de eerste methoden leerde, noodig voor het
uitvoeren van dit onderzoek. De bizondere welwillendheid van
Dr. Cohen TERVAERT wil ik daarbij niet vergeten.

Buitengewone gastvrijheid, Hooggeleerde schoorl, heb ik ge-
durende meer dan 2 jaar in Uw persoonlijk laboratorium onder-
vonden. Zonder Uw kritiek, zonder Uw geduld en onverflauwde
aanmoediging, zou het mij zeer moeilijk geweest zijn mijn taak tot
een goed einde te brengen.

Voor alles, wat ik van U leerde, ben ik U zeer veel dank
verschuldigd. Evenzoo ben ik Mejuffrouw giltay erkentelijk
voor haar welwillend verleende hulp.

Zeergeleerde kolthoff, nooit tevergeefs heb ik U mijn moeilijk-
heden voorgelegd. Uw hartelijke hulpvaardigheid heb ik zeer op
prijs gesteld.

Hooggeleerde Ornstein, ook U ben ik dankbaar voor de
gastvrijheid, die Gij mij op Uw laboratorium hebt willen verleenen.

Zeergeleerde burger, dat Gij in Uwen drukbezetten tijd nog
gelegenheid vondt mij te helpen, waardeerde ik ten zeerste.

Vooral U waarde denier van der GON ben ik veel dank
verschuldigd voor de royale wijze, waarop Gij in vele kostbare
uren met Uw ingenieus toestel opnamen voor mij hebt willen
verrichten. Het spijt mij zeer, dat wij dit onderzoek hebben
moeten afbreken.

U waarde prys, betuig ik mijn dank voor de voortreffelijke
wijze, waarop Gij de teekeningen voor mijn proefschrift hebt
vervaardigd en ook voor de hartelijkheid, waarmee Gij mij steeds
geholpen hebt.

Een warm woord aan U, Zeergeleerde de mol, trouw stondt
Gij mij bij de samenstelling van dit proefschrift met Uw ervaring
ter zijde.

Tenslotte gedenk ik met dankbaarheid allen, die mij buiten mijn
studie tot steun waren en mij hun vriendschap hebben bewezen.
In het Utrechtsch-Studenten-Corps maar vooral in de V. C. S. B.
heb ik trouwe vrienden leeren kennen.

Onvergetelijk zullen mij dc vele uren zijn, Hooggeleerde HEERING,
waarin ik met U heb mogen samenwerken in de jongenskampen.
Voornamelijk in dien tijd is tot ontwikkeling gekomen, wat ik
hooger schat dan wetenschappelijke kennis.

Ook Gij, Hooggeleerde roessingh, waart steeds vol belang-
stelling voor mij en mijn gezin.

Het zuurstofgehalte van met lucht verzadigd bloed van
Helix pomatia...............11

Het zuurstofgehalte van met lucht verzadigd bloed van
Carcinus maenas................

Steeds is men er zich van bewust geweest, dat de rol, die het
bloed bi) de ademhaling van mensch en dier speelt, zeer belang-
rijk is.

Meende men aanvankelijk, door de voorstellingen van LavOISIER,
(1780) dat het bloed tot taak had de warmte, die door de verbranding
in de longen ontstond, op te nemen en in het lichaam te ver-
deden, later vooral door de onderzoekingen van gustav magnus,
(1837) is gebleken dat het bloed niet de warmte maar de zuurstof op-
neemt, die voor de verbranding noodig is. Het zou echter nog
een dertigtal jaren duren, eer PFLÜGER (1872) kon uitmaken, dat de
verbranding niet in het bloed zèlf, maar vooral in de weefsels
plaats vindt.

Dacht men eerst, dat haemoglobine slechts een transportmiddel
was, tendienste van de gaswisseling van de weefsels, in de laatste
jaren is gebleken, dat het probleem van de ademhalingsfunctie
van het bloed niet zoo eenvoudig is als men het zich wel voor-
stelde. Vooral Engelschen en Amerikanen hebben door intensief
en exact onderzoek aan het licht gebracht, dat van de meerdere
of mindere verzadiging van het haemoglobine met zuurstof, een
aantal evenwichtsprocessen in het bloed afhankelijk zijn. die voor
het leven van het organisme van fundamenteel belang zijn.

Anderzijds heeft ook de chemische kant van het vraagstuk van
de ademhalingsfunctie van het haemoglobine reeds vroeg de onder-
zoekers beziggehouden. Ter bestudeering van de vraag of bij
het opnemen van de zuurstof door haemoglobine, al dan niet van
een zuiver chemische binding sprake is, werd in de laatste 60 jaar
een enorme experimenteele arbeid verricht.

Thans mogen wij het bewezen achten, dat hier een chemische
reactie plaats heeft.

Het eigenaardige en interessante van deze reactie is echter, dat
de organische chemie geen voorbeeld kent, dat er mede gelijk te
stellen is.

Door de bizondere eigenschappen van haemoglobine wordt de
belangstelling der onderzoekers in toenemende mate aan het bloed
gewijd, zoodat weinig gebieden der Physiologie zich thans zoo
snel ontwikkelen, als juist dat der kennis van de functie van
het bloed.

2e. in bloedlichaampjes of opgelost in het plasma van zeer
vele, tot verschillende groepen behoorende, Invertebraten.

Naast deze roode bloedkleurstof echter, komt bij 2 groepen
der Invertebraten -- de Mollusken en de Arthropoden — een
blauw pigment voor, het haemocyanine, dat dezelfde functie
te vervullen heeft als het haemoglobine.

Heeft men thans na jarenlange arbeid, een — zij het ook nog
gebrekkig — inzicht gekregen in de ademhalingsfunctie van hae-
moglobine, van de beteekenis van haemocyanine in dit opzicht is
nog zeer weinig bekend.

„As yet we know comparatively little about haemocyanin,
„especially with regard to its relation to oxygen. It is a matter
„which would well repay investigation to determine whether it
„has the remarkable properties which haemoglobin has in this
„respect, properties which are at present unique".

In analogie met wat er van het haemoglobine bekend is, hebben
wij getracht onze kennis van het haemocyanine te vermeerderen.

Ook de exacte bestudeering van de eigenschappen van haemo-
cyanine is uit verschillend oogpunt interressant:

Ie, van chemisch standpunt gezien, zou het zeer belangrijk zijn
te weten of haemocyanine, in verband met zijn chemische consti-
tutie, zich ten opzichte van zuurstof op dezelfde bizondere wijze
gedraagt als haemoglobine.

2e. Het haemocyaninehoudende bloed — evenals het haemoglo-
binehoudende bloed van sommige Invertebraten — is een betrekkelijk

eenvoudig systeem, vergeleken bij het bloed der Vertebraten. Het
is te verwachten, dat de eigenschappen van haemocyanine, alhoewel
in beginsel op die van haemoglobine gelijkende, in andere opzichten
zoo zullen afwijken, dat eene studie van de ademhalingsfunctie
van het haemocyanine nieuwe en vergelijkbare inzichten in den
physisch-chemischen samenhang tusschen zuurstof en ademhalings-
pigmenten zal geven.

3e. Verschillende onderzoekers hebben zich afgevraagd,
..waarom" bij zoo verschillende soorten der Invertebraten haemo-
globine voorkomt, terwijl bij daarmee nauw verwante soorten
haemocyanine aanwezig is. Wij meenen dat deze vraag, zóó ge-
gesteld, in eene proefondervindelijke wetenschap niet thuis hoort.
In de grillige verdeeling van de ademhalingspigmenten meenen wij
geheel andere, uiterst belangrijke problemen te zien. Het is een
feit, dat de ademhalingskleurstoffen bij verschillende dieren zeer
verschillende eigenschappen bezitten: niet alleen komen er ver-
schillende soorten van pigmenten voor, maar ook één en dezelfde
bloedkleurstof, b. v. haemoglobine, heeft bij verschillende dieren
onderzocht, steeds weer andere eigenschappen. Deze eigenschappen
staan op zeer bepaalde wijze in verband met bijzonderheden van
het milieu (b.v. meer of minder gebrek aan zuurstof) of van de
organisatie van het dier (b.v. de noodzakelijkheid, om bij een
duikende leefwijze, korteren of längeren tijd van een zuurstof-
voorraad in de long te moeten leven).

Belooft de studie van den samenhang van milieu en organisatie
een beter inzicht in de talrijke factoren, die de functie van de
verschillende ademhalingspigmenten beheerschen, omgekeerd geeft
ons de kennis van de eigenschappen der bloedkleurstofFen een
kijk op den ingewikkelden samenhang tusschen het dier en zijn milieu.

Uit dit alles volgt, dat de bestudeering van de eigenschappen van
haemocyanine, aan de hand der moderne methoden, zooals die bij
het haemoglobineonderzoek gebezigd worden, een groot en inte-
ressant arbeidsveld openen, zoowel voor de algemeene- als ook
voor de vergelijkende-physiologie.

SWAMMERDAM was de eerste die vermeld heeft, dat de slak
geen rood gekleurd, maar blauw bloed heeft.

Eerst veel later deed harless (1847) de interessante waarneming,
dat het bloed van Loligo, Eledone en Helix pomatia aan de lucht
blootgesteld, donker blauw van kleur werd.

Hij toonde aan, dat deze kleurverandering, tenminste bij Helix
pomatia, door zuurstof werd veroorzaakt.

De chemische analyse van het bloed, uitgevoerd door VON
Bibra bracht aan het licht, dat er geen spoor ijzer, daarentegen
vrij veel koper in het bloed dezer dieren aanwezig is.

Ook Paul Bert (1867) zag bij zijn experimenten met Sepia.
dat het bloed, eerst zoo goed als ongekleurd, bij aanraking met
de buitenlucht intensief blauw werd.

Hij was de eerste, die deze kleurverandering in verband bracht
met de ademhalingsfunctie van het bloed.

De eigenlijke ontdekker van de beteekenis van het haemocyanine
voor het lagere dier is echter L. prédèricq (1878).

In 1878 ontdekte deze bekende Belgische physioloog, dat de
blauwe kleurstof, waaraan hij den naam „haemocyanine" (van
ûc^[^x bloed en kóxvot blauw) gaf, werkelijk een rol speelde bij de
ademhaling van Octopus vulgaris.

dans l\'eau; dèsqu\'on l\'en empêche, en le retirant de l\'eau ou sim-
plement en introduisant les doigts dans la cavité palléale, le sang
de l\'artère se décolore et prend la teinte pâle asphyxique".

In analogie met Hb noemde hij de ongekleurde vorm haemo-
cyanine en de blauwe, geoxydeerde, oxyhaemocyanine. *)
_«

Hij uitte tevens het vermoeden, dat het Gu in het Hcy een-
zelfde rol zou spelen, als hef Fe in het haemoglobine.

Behalve bij Cephalopoden toonde FrêDÉRICQ (1879) het voor-
komen van Hcy ook aan bij decapode-Crustaceae, en sindsdien zijn
er een zeer groot aantal dieren bekend geworden, die deze stof
bezitten.

Zij behooren echter alle tot 2 groepen der Invertebraten: de
Mollusken en de Arthropoden. Onder de Mollusken hebben
alle Cephalopoden, vele Gastropoden en vele Lamellibranchiaten
Hcy.; onder de Arthropoden, vooral de hoogere Crustaceae en
verder Limulus, enkele Scorpionidae en Araneidae.

Dat Hcy een eiwitstof is heeft FrêDÉRICQ reeds ondubbel-
zinnig aangetoond (1878) eveneens, dat het Cu een vast bestanddeel
is van het molecuul. Weliswaar heeft HEIM (1892) dit later
betwijfeld, maar zijn conclusie is onjuist gebleken.

Behalve Genth (1852), WlTTlNG (1858) en dubois (1900) hebben
vooral DhéRÉ (1900—1901) en burdel(1922) uitgebreide onder-
zoekingen gedaan en het Cu-gehalte bepaald van het bloed van ver-
schillende Mollusken en Crustaceae.

Het is gebleken, dat het Hcy-gehalte niet alleen bij verschillende
soorten verschillend is, maar ook dat één dier in verschillende
jaargetijden en bij verschillende omstandigheden belangrijke ver-
schillen in het kopergehalte van zijn bloed vertoonen kan.

Zoo vond ik bij Helix pomafia 0.064 en 0.051 "/o Cu; het laatste
vooral na een hongerperiode.

Dat het kopergehalte bij verschillende diersoorten, verschillend
is, vindt zijn oorzaak in het Hcy gehalte van het bloed dezer
dieren. Zoo heeft bloed van Cephalopoden vergeleken bij dat van
andere dieren het meeste Cu, maar ook het hoogste Hcy-gehalte.

Verschillende onderzoekers hebben het Cu-gehalte van gezui-
verde Hcy trachten te bepalen.

Ook ik heb van Hcy van Helix pomatia na 3 maal omkristalli-
satie volgens de methode van DHÉRÊ (1908), het Cu gehalte bepaald.

Daartoe werden 8.5730 gr. Hcy oplossing in vacuo gedroogd
naast Pa Os tot 0.200 gr. Naast een verzadigde oplossing van
NaBr werd dit gewicht 0.2260 gr. De op deze wijze verkregen

Hiervan werden 29.7, 29.7 en 29.6 mgr. gemineraliseerd en in
de asch werd. op de in Hoofdstuk III beschreven wijze, het Cu-
gehalte bepaald. Daarbij werd gevonden 0.076. 0.075 en 0.076
mgr. Cu d. i. van 29.7 mgr. Hcy 0.256 % en berekend op absoluut
droge stof 0.29

De sulfaatasch van 105 mgr. van dit Hcy woog 1. mgr. en
bevatte behalve koperoxyde tamelijk veel gips en een spoor phos-
phorzuur. *)

Over de wijze waarop het Cu in het Hcy molecuul aanwezig is.
zijn de meeningen van verschillende onderzoekers nog zeer verdeeld.

PhILIPPI(1918) heeft kunnen aantoonen, dat Hcy uit Helix po-
matia afkomstig, na splitsing met loog een sterke pyrrolreactie geeft.

In analogie met Hb zou men dan kunnen aannemen, dat het
Cu in het Hcy molecuul aan verschillende pyrrolringen gebonden is.

Andere onderzoekers hebben kunnen vaststellen, dat het Cu
zich gemakkelijker uit Hcy laat afsplitsen dan het Fe uit Hb.
Zij meenen daarom, dat Hcy als een koperalbuminaat beschouwd
mag worden.

Deze bepaling werd met groote welwillendheid door Prof. Dr. N. schoorl
voor mij uitgevoerd.

Wat de verbinding van Hcy met O2 betreft, is reeds vermeld
hoe FrÊDÉRICQ aantoonde, dat Hcy in \'t bloed van Octopus den
rol van ademhalingspigment vervult.

Heim (1892) heeft echter de ademhalingsfunctie van Hcy voor
Crustaceae ontkend, ofschoon de door -hem gepubliceerde cijfers
het tegendeel zouden doen vermoeden.

Dit was voor DhÉRÉ (1900) aanleiding om voor verschillende
dieren het O2 gehalte van met lucht geschud bloed vast te stellen.
Helaas bezigde hij daarvoor de niet steeds betrouwbare methode
van SCHÜTZENBERGER( 1873). Weliswaar komen enkele der door
hem verkregen cijfers overeen met die van andere onderzoekers,
die voor de O2 bepaling de kwikpomp hebben gebezigd.

Behalve de genoemde, hebben nog andere onderzoekers zich
met het zuurstofbindingsvermogen van Hcy bezig gehouden. De
door hen verkregen resultaten zijn zeer verschillend. Teneinde
een beter overzicht te geven, vat ik in onderstaande tabellen de
tot nu toe verkregen uitkomsten samen.

De cijfers, welke verkregen werden door het gebruik van de
kwikpomp zijn gescheiden van die, welke verkregen zijn met de
methode van SCHUTZENBERGER.

Niet in deze tabel opgenomen zijn de resultaten van griffith
(1892) daar deze klaarblijkelijk geheel verzonnen zijn. Ook heb
ik het onderzoek van richet (1879) over Palinurus weggelaten,
aangezien hij een veel te hoog cijfer heeft gevonden.

Uit deze tabel blijkt, dat op één uitzondering na alle onder-
zoekers tot het resultaat gekomen zijn, dat een meer of minder
groot gedeelte van de opgenomen zuurstof door het Hcy werd
gebonden, dus ook Heim, niettegenstaande hijzelf anders meent.

Door het bezit van deze kleurstof kan volgens bovenstaande
cijfers het bloed van;

Palinurus vulgaris 2
Homarus vulgaris 4 „ „ „ bevatten
dan het plasma zonder Hcy.

Alsberg 6 Clark (1914) als eenige uitzonderingen kunnen met
de kwikpomp niet meer zuurstof uit het bloed van Limulus poly-
phemus verkrijgen, dan de hoeveelheid die normaal daarin opge-
lost zou voorkomen zonder de aanwezigheid van Hcy. Zij con-
stateerden tevens, dat de blauwe kleur van het bloed in vacuo
niet verdween en meenden daaruit te mogen concludeeren dat
Hcy O een stabiele verbinding is, die op andere wijze dan Hb O2
haar zuurstof aan de weefsels afstaat.

Dergelijke waarnemingen zijn door botazzl(1919) vermeld. Deze
onderzoeker beweert nl. dat het bloed van Octopus vulgaris onder
de klok van een gewone luchtpomp, ook na zeer langen tijd, zich
niet ontkleurt, terwijl in een vacuum, verkregen door een rotatie-
pomp, de ontkleuring pas bij ongeveer O m.M. begon en het zeer
lang duurde, voordat het geheel ontkleurd was.

Uit de waarneming, dat het bloed van Octopus zich zoo moeilijk
ontkleurde, meende hij zelfs te mogen concludeeren dat henze(1901)
en Winterstein (1909) bij hun onderzoekingen omtrent het O2
gehalte bij Octopus — waarbij zij beiden een kwikpomp hadden
gebezigd — niet de totale hoeveelheid O2 uit het bloed hebben
kunnen verkrijgen. Daarom kwalificeert hij deze onderzoekingen
als

Het is klaarblijkelijk dat niet alleen Alsberg & Clark, maar
vooral botazzi onjuiste waarnemingen hebben gedaan.

Want bij de bestudeering van de zuurstofbinding van Hcy in
het bloed van Helix heb ik voortdurend kunnen constateeren, dat
de blauwe kleur van het HcyO in het vacuum van een kwik-

pomp bijna onmiddellijk verdwijnt ook zouden schudden of ver-
warmen en zonder dat de vloeistof kookt onder invloed van de
sterk verminderden druk.

Hcy oplossingen vertoonden tenslotte nog slechts een zeer
zwak blauwe tint veroorzaakt door het Tyndall-efFect. Slakken-
bloed werd na verlies van zijn O2 geelachtig, met een licht-
blauwe tint.

Het bloed van Catcinus is door de aanwezigheid van tethron
erythrine, donker blauwgroen.

In vacuo wordt deze kleur wel lichter, maar hierbij vindt
volkome ontkleuring niet plaats door de aanwezigheid van het
tethronerythrine.

Niet alleen in een kwikpomp, maar ook onder de stolp van
een gewone luchtpomp die met de hand gedreven wordt, ont-
kleuren HcyO-oplossingen en slakkenbloed zich volkomen. Zelfs
als de vloeistof in een lange en smalle reageerbuis of in een cuvet
van enkele m.M. wijdte onder de klok staat, treedt gedurende
den nacht ontkleuring op.

Ik heb dit meermalen kunnen constateeren bij het onderzoek
van het spectrum van Hcy en Hcy O (Hoofdstuk V).

Dat HcyO tegen de bewering van BOTAZZI (1919) in, door het
inleiden van gassen ontkleurt, hebben DhÈRÊ ö schneider (1919)
aangetoond met bloed van Helix en Homarus, waardoor zij H2
hadden laten borrelen.

Bij 15° was na V2 uur reeds het bloed geheel ontkleurd. Ook
is de bewering van BOTAZZI onjuist, dat (N H.i)2 S het Hcy
chemisch zou veranderen en dat het door toevoeging van (N H4)2 S
ontkleurde bloed niet meer blauw zou kunnen worden. Met deze
stof ontkleurde Hcy-oplossingen echter, en evenzoo slakkenbloed.
werd niet alleen door schudden met lucht weer blauw, doch ook
spontaan trad de kleur weer op. als de vloeistof eenigen tijd aan
de lucht werd blootgesteld.

De intensiteit van de blauwe kleur vau een Hcy-oplossing kan
niet als maat voor de meer of mindere verzadiging met O2 worden
gebezigd; roteert men slakkenbloed of Hcy oplossing met gas-
mengsels van verschillend O2 gehalte, dan kan men vaak geen
verschil in de intensiteit van de blauwe kleur constateeren.

als zou het HcyO de O2 eerst na langen tijd bij ongeveer O m.M.
spanning loslaten, onjuist is.

Bij de bestudeering van de zuurstofbinding van haemocyanine
heb ik steeds in ongeveer 1 minuut alle zuurstof uit het Hcy
kunnen vrijmaken.

Uit de bepalingen van het zuurstofbindingsvermogen van bloed
van Carcinus maenas en Helix pomatia, die in de volgende hoofd-
stukken verder besproken zullen worden, vat ik in onderstaande
tabel die resultaten samen, welke verkregen zijn bij verzadiging
met lucht, omdat zij een antwoord geven op de vraag hoeveel O2
bij normale O2 spanning in het bloed der bovengenoemde dieren
in het bloedplasma is opgelost en hoeveel aan het Hcy is gebonden.
De gebezigde methodiek wordt uitvoerig in het volgende hoofd-
stuk beschreven.

Uit deze tabellen blijkt, dat in het bloed van Helix pomatia
onder normale omstandigheden een weinig meer O2 aan het Hcy
gebonden is, dan in het plasma is opgelost. Dit vindt zijn oor-
zaak in het geringe Hcy-gehalte van het bloed dezer dieren.

Ongeveer dezelfde verhouding tusschen gebonden en opgeloste
hoeveelheid O2 vinden wij in het bloed van Carcinus maenas.

Nemen wij voor het oogenblik aan, dat gedurende de circulatie
van het bloed door het lichaam van Helix pomatia het O2 ge-
halte van het bloed alleen van het verschil in de partieele O2
spanningen, die in de „long" en in de weefsels heerscht, afhankelijk
is, dan kan onderstaande curve duidelijk maken, hoe bij verschil-
lende 02-spanningen van het bloed, de verhouding tusschen dc
hoeveelheden opgeloste en gebonden O2 is. Men ziet, dat bij lage
02-spanning de hoeveelheid opgeloste O2 (voorgesteld door den
afstand van de horizontale as tot de lijn O A) veel minder is dan
de hoeveelheid O2, die aan het Hcy gebonden is (voorgesteld
door den afstand van de horizontale as tot de kromme.)

Haemocyanine houdend bloed is dus — vooral bij lage zuur-
stofspanning — een veel beter hulpmiddel om O2 te verkrijgen
dan pigmentvrije bloedsoorten. In dit opzicht is Hcy met Hb te
vergelijken, al is de werking van Hb veel krachtiger dan die
van Hcy.

Bij hoogere O2 spanningen is dit verschil geringer dan bij
lagere. De afstand van de stippellijn O B tot de kromme geeft
voor de verschillende partieele O^-spanningen dit verschil aan.
De totale hoeveelheid O2 in het bloed aanwezig bij verschillende
O2 druk wordt door den afstand van de kromme tot O A uit-
gedrukt.

In dit verband zijn de volgende waarnemingen interessant:
Door een injectienaald te steken in de rechterrandvene (zie
Hoofdstuk III) en daaraan een capillaire buis te verbinden waarin
wat paraffine-olie gebracht was, kon ik ongeveer 5 c.M^. veneus
bloed opvangen, dat niet met de lucht in aanraking was geweest.

Uit de geijkte capillaire buis werd 2 maal 2 c.M^. van dit bloed
uitgepompt. Daarbij werden 17.6 en 17.4 m.M^. O2 verkregen.
Brengen wij deze getallen in bovenstaande curve, dan zou daaruit
blijken, dat in het bloed van de rechterrandvene een partieele O2
spanning heerschte van ongeveer 78 m.M. Hg. overeenkomende
met 10.5 "/0O2.

Aangezien de O2 in de weefsels van de slak in wisselwerking
staat met die van het bloed, kan men dus op deze wijze de O»
spanning, die in de weefsels heerscht indirect bepalen.

Het was mijn plan op deze wijze ook in het arterieele bloed
van de Vena pulmonalis het O2 gehalte en de O2 spanning te
bepalen, maar ik ben niet tot de uitvoering kunnen komen. In
elk geval is het duidelijk, dat op deze wijze door de studie van
het bloed een inzicht kan worden verkregen in vraagstukken van
de O2 spanning en van het O2 verbruik in de weefsels en organen.

Een van de belangrijkste problemen van de zuurstofbinding van
Hcy, die moeten worden opgelost, is het vraagstuk van de specifieke
zuurstofcapaciteit, omdat daarmee alle verdere onderzoekingen op
dit nieuwe gebied op een vaste basis worden gesteld.

Bij het onderzoek naar de zuurstofbinding van Hb hebben meer
dan een halve eeuw twee meeningen tegenover elkaar gestaan:

Op grond van zijn resultaten, verkregen bij de bestudeering
van de eigenschappen van Hb tenopzichte van CO, nam HÜFNER
(1894) aan:

2e dat bij het opnemen van bepaalde gassen, zooals CO en O2,
Hb daarmee een zuiver chemische binding aanging.

Door op deze reactie de wet der massawerking toe te passen,
was HÜFNER (1901) de eerste, die een mathematische voorstelling
verkreeg van het evenwicht, dat er moest bestaan tusschen Hb en
O2. Dit evenwicht kon volgens HÜFNER grafisch worden voor-
gesteld door een rechthoekig hyperbool. BOHR (1904) echter
bestreed deze voorstelling op grond van resultaten van eigen onder-
zoekingen en van die van vele anderen.

Indien de bloedkleurstof steeds dezelfde samenstelling had, zoo
zegt Bohr, dan moet noodzakelijk ook zijn ijzergehalte en de
maximale hoeveelheid zuurstof, die Hb onder gelijke omstandig-
heden kan binden, steeds dezelfde zijn. De verhouding dezer twee
grootheden werd door hem de specifieke zuurstofcapaciteit
(1909) genoemd en gedefinieerd als „das Verhältnis der maximalen

Sauerstoffbindung zur Eisenmenge des Blutes oder der Haemoglo-
binlösung". Deze Sp. O. C. zou dus moeten zijn volgens de
voorstelling van hüfner aannemende dat in de reactie:
1 Hb O2 1 Hb O2

De hoeveelheid zuurstof, die aan zóóveel Hb gebonden is, dat
daarin 1 gram Fe aanwezig is, zou dus steeds moeten zijn 401 c.M^,
Deze Sp. O. C. was in de proeven van BOHR en zijn medewerkers
niet alleen nooit constant, maar verschilde in enkele gevallen wel
eens 30 "/o. Hierdoor kwam BOHR tot de opvatting, dat Hb niet
alleen bij verschillende diersoorten verschillend was, maar dat zelfs in
een en hetzelfde individu minstens 4 soorten Hb aanwezig moesten zijn.

Hij zegt dan ook „Es wäre z. B. denkbar, dasz einer dieser
Farbstoffe Sp. O = 400, ein anderer Sp. O = 200 hätte".(1909 p. 100)

In dezen strijd is tenslotte de beslissing gevallen ten gunste
van hüfner, vooral door het onderzoek van peters (1912)
die, gebruik makende van verbeterde methoden, kon aantoonen,
dat de Sp. O. C. van het bloed van verschillende diersoorten
constant was en binnen de foutengrens overeenkwam met de
theoretisch berekende waarde.

Toen ik nu hetzelfde vraagstuk voor Hey aanvatte, rees onmid-
dellijk de vraag of het mogelijk was van tc voren de Sp. O. C.
te berekenen.¹) Door de volgende overwegingen bleek dit mogelijk.

Het is bekend, dat 1 gram Hb 1.34 c.M^ O2 binden kan. Uit
de onderzoekingen van winterstein (1909) was gebleken, dat in het
bloed van Octopus 1 gram Hey ongeveer 0.5 c.M^ O2 kon binden.

Nemen wij nu aan. dat 1 molecuul Hey 1 at. Cu bevat, evenals
1 Hb 1 Fe en stellen wij het Cu gehalte van Hey op\'/s \'\'/o(HenZE(1901)
vond 0,38 °/o) dan zou dus 1 gram Hey 3 mgr. Cu bevatten; 3 mgr.
Cu zouden dan overeenkomen met 0,5 c.M^ O2 en 1 gr. Cu met
167 C.M3. O2. De Sp. O. C. zou dus zijn 167. Berekenen wij
de Sp. O. C. uit theoretische getallen, dan hebben wij de keuze
die van uit verschillende verhoudingen nl. 1 Cu tot 2 O, 1 Cu tot

1 Deze berekening had ik reeds gemaakt en met anderen besproken, voordat
het artikel van QUAOLIARIELLO in WiNTERSTEIN s Handbuch d. verg. Physlol.
Bd. I. 1. Hälfte p. 597 verschenen was.

1 O enz. Nemen wij aan, dat de verhouding 1 Cu op 1 O is,
dan krijgen wij de volgende getallen:

1 O ^ V2 mol O2 ^ 11,197 _
iCu 1 gr. at. Cu 63,57
Dit getal komt dus zeer goed overeen met het bovenstaande,
verkregen uit experimenteele gegevens.

Het spreekt vanzelf, dat deze overwegingen een zekere aan-
trekkelijkheid gaven aan de experimenteele oplossing van het
vraagstuk.

Teneinde Hcy voor het onderzoek te verkrijgen, zou het bloed
van verschillende dieren gebezigd kunnen worden.

In de eerste plaats zouden daartoe Cephalopoden in aan-
merking komen, omdat het bloed dezer dieren ongeveer 9 °/o Hcy
bevat. Het is echter duidelijk, dat in een laboratorium, niet aan
de zee gelegen, Cephalopoden een zeer duur materiaal zouden
vormen; afgezien van de vraag, of men ze ten allen tijde in vol-
doend aantal levend ter beschikking zou kunnen hebben. Daarom
®oest het onderzoek verricht worden met Helix pomatia, een dier
dat ten allen tijde beschikbaar is, daar het als consumptieartikel
ter markt komt. Bovendien stelt het al zeer geringe elschen
aan zijn verzorging.

Het bloed van de wijngaardslak bevat 2-3 °/o Hcy, een zeer
geringe hoeveelheid vergeleken met het Hb gehalte van het bloed
Van Vertebraten. Berekenen wij de hoeveelheid zuurstof, die uit
^en paar c.M\'. van dit slakkenbloed verkregen kan worden,
blijkt, dat de uitvoering van het onderzoek eigenaardige moeilijk-
heden oplevert en speciale methoden vereischt, die ik eerst zal
vermelden, alvorens de verkregen uitkomsten mee te deelen.

Teneinde de specifieke zuurstofcapaciteit van haemocyanine te
^^unnen bepalen, is het dus noodig te beschikken over:

1 een methode die ons nauwkeurig leert vaststellen, hoe groot
de hoeveelheid koper is, die in haemocyanine wordt aangetroifen;

2°. een methode, die het mogelijk maakt te bepalen, hoeveel
Zuurstof er maximaal door het haemocyanine kan worden gebonden.

Hiervoor had ik een der gebruikelijke macromethoden kunnen
bezigen. Bij aanwezigheid van voldoende koper ware dit dan
daarmee nauwkeurig te bepalen geweest. Voor een meer uit-
gebreid onderzoek echter zou daartoe te veel materiaal noodig
geweest zijn. want: Ie uit één wijngaardslak kunnen slechts enkele
C.M3 bloed worden verkregen; 2e het gehalte aan haemocyanine
is maximaal en 3e deze kleurstof bevat slechts 0.29 °/o koper.

Daarom moest er een quantitatieve micromethode uitgewerkt
worden, waarmee hoeveelheden koper van 0.5-0.1 mgr. zoo mogelijk
tot 0.001 mgr. nauwkeurig vastgesteld kunnen worden. Dit is
oogenschijnlijk geen moeilijke opgave maar een quantitatieve be-
paling van koper kan door de aanwezigheid van andere metalen
worden gestoord; deze moeten dan vooraf verwijderd of onwerk-
zaam worden gemaakt. Dat dit laatste groote moeilijkheden kan
opleveren, zal uit het onderstaande blijken.

Het was dus noodzakelijk voor den verderen loop van het
onderzoek te weten, welke metalen in het hloed van Helix pomatia
aanwezig zijn. Daartoe werden eenige c.M^. in een platina-kroes
met zwavelzuur verascht. In deze sulfaatasch werden naast Cu
ook K, Na. Ca en Fe gevonden terwijl Mn en Zn microchemisch
niet konden worden aangetoond.

Hieruit bleek dus, dat op een storing van de koperbepaling
door ijzer gerekend moest worden.

titrimetrische methoden.
Alvorens een passende te vinden hebben wij verschillende dezer

redenen: Een quantitatieve electrolytische afscheiding van ver-
schillende metalen op een passende electrode is voor grootere
hoeveelheden gemakkelijk. Op een geschikte balans kan het metaal

an nauwkeurig worden gewogen. Voor zeer kleine hoeveelheden
echter is de quantitatieve afscheiding moeilijk. De weging vereischt
een speciale balans; riesenfeld & möller(1915)hebben een instru-
ment daarvoor beschreven, hetwelk echter zoo gevoelig is, dat de
weging van de kathode daarop vaak moeilijkheden oplevert. De door
r\'regl(1913) beschreven methode daarentegen gaat tot een nauw-
keurigheid van 0.005 mgr., wat voor mijn doel nog niet voldoende is.
tenslotte zou de mogelijkheid van een volledige afscheiding van
net koper bij aanwezigheid van ijzer nog moeten blijken.

2. Onder de oudere colorimetrische methoden hebben
DhéRÉ (1900) en, later, BURDEL (1922) bij hun onderzoekingen
betreffende haemocyanine die met kaliumferrocyanide gebezigd,
■^jj bepaalden hoeveelheden van 1-0.5 mgr. met een nauwkeurig
heid van 0.05 mgr. Deze methode moest dus voor mijn doel
ongeschikt geacht worden.

Ook van de nieuwere, zeer gevoelige kleurreacties nl. die met
phenolphtaline H2O2 volgens ThOMAS ö Carpentier (1921)
en die met hydrochinon volgens AlOY ö Valdiguié (1922) moest
Worden afgezien, omdat het gebruikte gedestilleerde water alleen
reeds deze kleurreacties vertoonde.

3. De precipitatie-reactie met cupferron was ongeschikt.
Omdat zij een gelijken zuurgraad van de standaarden met de te
oepalen oplossing bleek te vereischen; bovendien — en dit is wel
net voornaamste — omdat zij niet kon worden toegepast zonder
voorafgaande scheiding van het aanwezige ijzer. Dit laatste bleek
oij deze kleine hoeveelheden niet mogelijk.

Van de titrimetrische methoden, gaf die met titaanchloruur *)
volgens knecht ö Hibbert (1903) uitzicht op succes. Wegens de
omslachtigheid van de opstelling echter, werd voorloopig aan de
oekende jodometrische kopertitratie volgens de haen (1854) de voor-
keur gegeven. Zij is eenvoudig uit te voeren en zeer nauwkeurig,
deze methode is het tenslotte gelukt, ook bij aanwezigheid

*) De titratie met titaanchloruur Is o.a. door JAHN 1911. Zeitschr. f. physiol.
chem. 75 p, 308 en door PETERS 1912 Jl. of Physiol. 44 p. 131 toegepast op dc
microbepaling van ijzer.

van ijzer, zeer kleine hoeveelheden koper tot een nauwkeurigheid
van 0.001 mgr. vast te stellen.

Het principe der jodometrische kopertitratie is de reactie van
een cuprizout met een jodide onder vorming van cuprojodide en
vrij jodium, dat met thiosulfaat weer gebonden wordt.

Het is bekend, dat de aanwezigheid van zuren en van een groote
overmaat jodide de snelheid van de eerste reactie sterk bevordert.

Om deze reactie te kunnen bezigen voor de bepaling van kleine
hoeveelheden koper, moesten de zuurconcentratie en de hoeveelheid
jodide zoodanig gekozen worden, dat onmiddellijk de juiste hoe-
veelheid jodium wordt vrijgemaakt.

Door aanwezigheid van zuur en van een overmaat jodide ont-
staat joodwaterstof, dat door de lucht wordt geoxydeerd onder
vrijmaking van een extra hoeveelheid jodium, dat voor de be-
paling zeer storend kan zijn.

Deze luchtoxydatie wordt door het koper katalytisch versneld
en treedt in sterk zure oplossingen zeer licht op. Uit proeven,
die ten doel hadden den zuurgraad vast te stellen, bleek, dat in
10 c.c. maximaal slechts 2 druppels 4 N. H2 SO4 aanwezig mocht
zijn, dat azijnzuur daarentegen in veel grootere concentraties niet
storend werkte. Ook bleek een te groote overmaat jodide de
luchtoxydatie te bevorderen, terwijl toch een zekere overmaat noodig
is om de reactie van het Cu voldoende snel te doen verloopen.

Er moest dus bij een bepaalde zuurconcentratie, die hoeveelheid
toe te voegen jodide worden gezocht, die de reactie van het
cuprizout voldoende versnelt, maar nog geen storende luchtoxydatie
veroorzaakt.

Voor dit onderzoek werd uitgegaan van een standaard-koper-
oplossing, verkregen door een plaatje zuiver koper (Kahlbaum)
van nauwkeurig 1 gram, op te lossen in sterk salpeterzuur, af te
dampen op het waterbad en het residu met enkele druppels azijn-
zuur in water op te lossen tot 100 c.M^. Van deze standaard-
oplossing werd, door een gedeelte 100 maal te verdunnen, een

andere verkregen, die precies 0,1 mgr. per cM^. bevatte en voor
de onderstaande titraties gebezigd werd. Aan 0.1 mgr. Cu werden
telkens 6 druppels azijnzuur van 30 "/o toegevoegd en verschillende
noeveelheden eener normaaloplossing van kaliumjodide tot een
totaal volume van 10 c.M^.

De gebezigde thiosulfaatoplossing werd verkregen door een
oplossing van ongeveer 0.1 N. 100 maal te verdunnen.

De titraties werden uitgevoerd met een microburet, die een
totaalinhoud had van 10 c.M^. en voorzien was van een Schell-
oach\'sche streep. De inhoud was verdeeld in 0.05 c.M^. en daar
de streepjes van de schaalverdeeling een onderlingen afstand hadden
van 1.8 m.M., konden verschillen van 0.01 c.M^. gemakkelijk ge-
schat worden.

In de hier volgende tabel zijn vereenigd de resultaten van titraties
na toevoeging van verschillende hoeveelheden jodide.

Hieruit blijkt dus, dat de juiste hoeveelheid Cu wordt terug-
gevonden met ongeveer 2.5 c.M^. eener normaal KI oplossing
onder bovengenoemde omstandigheden.

De mogelijkheid bestaat, dat de juiste uitkomst wordt verkregen
door compensatie van twee fouten, nl. een tekort — veroorzaakt
door de onvoltooide reactie van het cuprizout — gecompenseerd
door jodiumafscheiding, afkomstig van beginnende luchtoxydatie.

Een moeilijkheid bij de uitvoering van de bepaling lag ook in
de waarneming van den kleuromslag van den stijfselindicator.

Deze wordt niet plotseling van blauw kleurloos, maar verandert
geleidelijk van paars in goudgeel en ontkleurt zich terwijl de laatste
0.5 c.M^. 0.001 N. thiosulfaat-oplossing wordt toegevoegd.

Bij daglicht is deze ontkleuring moeilijk te volgen. Daarom werd
in de donkere kamer de bepaling bij kunstlicht met bepaalde
voorzorgen uitgevoerd.

Teneinde het omslagpunt nauwkeurig te bepalen werd aan het
einde van de titratie, na toevoeging van eiken druppel thio. de
kleur van de vloeistof met water vergeleken. Het gemakkelijkst
geschiedt dit als men de kolfjes op een vel dof wit papier plaatst
en belicht met een electrische metaaldraadlamp, waarvan het licht
door een scherm van hetzelfde papier op de kolfjes wordt ge-
concentreerd. \') Geen directe stralen van de lamp kunnen dan
de oogen van den waarnemer treffen.

Bij eenige oefening is de kleuromslag onder deze omstandig-
heden tot op 0.02 C.M3. 0.001 N. thiosulfaat te zien, dus met
een nauwkeurigheid van ongeveer 0.001 mgr. koper.

Met de zoo verkregen opstelling moest nu worden onderzocht
of bij de titratie van verschillende hoeveelheden koper dc resul-
taten van duplobepalingcn voldoende met elkaar overeenstemden.

Een reeks van bepalingen werd gedaan, waarvan de resultaten
in onderstaande tabel zijn samengevat. -

Titratie van verschillende hoeveelheden koper in 10 c.M^. bij
toevoeging van 2.5 c.M^. N. KI en 10 druppels 30 «/o azijnzuur.

dat in den regelde absolute fout niet meer is dan 0.02 c.M^.
een half schaaldeel der buret;

2". dat bij gebruik van 0.002 N. thiosulfaat de relatieve fout
voor hoeveelheden van 1—0.1 mgr. ongeveer 1 "/o is.

Tenslotte werd nog een reeks van bepalingen uitgevoerd.
Hiervoor werd gebezigd een thiosulfaatoplossing van precies 0.001 N.
en een microburet volgens Bang. Deze buret heeft een totaal-
inhoud van 5 C.M3. Bij gebruik van een loupe is het volume
tot op 0.002 C.M3. te schatten. Daar aan het einde der titratie
de thio druppelsgewijs wordt toegevoegd, is het voor de nauw-
keurigheid van belang de punt der buret zoo fijn te maken, dat
I C.M3. in ongeveer 40 druppels uitvloeit.

Onderstaande tabel vereenigt de resultaten van de reeks van
bepalingen op deze wijze uitgevoerd.

1°. dat de duplo-bepalingen onderling minder dan 1 druppel
(0.02 c.M\'.) uit de buret van BaNG verschillen.

2°. dat bij gebruik van 0.001 N. thiosulfaatoplossing, het onder-
linge verschil in een duplo-bepaling minder is dan 0.001 mgr. Cu.
3°. dat hoeveelheden van 0.5—0.05 mgr. koper microjo-

Het is noodzakelijk hier te vermelden, dat bovenstaande resul-
taten alleen bereikt werden bij gebruik van zeer zuivere reagentia.
Alle pogingen, die aanvankelijk werden aangewend, om bij opeen-
volgende titraties van eenzelfde hoeveelheid koper overeenstem-
mende cijfers te verkrijgen, mislukten. Zij hebben zeer veel tijd
in beslag genomen. Tenslotte bleek, dat de gebezigde reagentia
(azijnzuur, zwavelzuur, loog) stoffen bevatten, die belangrijke
hoeveelheden jodium konden binden. Anderzijds bleek, dat KI
(Kahlbaum) door metaalverontreiniging (Cu ?) in azijnzuur-oplossing
jodium kon vrijmaken. Deze hoeveelheden zijn zoo klein, dat
zij bij de gewone jodometrische titratie geen merkbaren invloed
uitoefenen. Bij een microjodometrie echter, kunnen zij een be-
langrijke fout teweegbrengen. Daarom moeten hierbij alleen zuivere
reagentia gebezigd worden.

Alvorens over te gaan tot de bepaling van onbekende hoeveel-
heden koper — teneinde toevallige afwijkingen in de omstandigheden
uit te schakelen — werd bij alle latere bepalingen steeds de thio-
sulfaat-oplossing van ongeveer 0.001 N. gesteld op een standaard-
koper-oplossing. De latere titercijfers werden dan op het eerst-
verkregene omgerekend.

In het begin werd reeds medegedeeld, dat er gerekend moet
worden op een storing van de quantitatieve koperbepaling door
ijzer, daar dit in slakkenbloed voorkomt. Behalve bij de andere
methoden kan ook bij de jodometrische titratie ijzer storend werken
want ferrizouten reageeren met jodiden onder vrijmaking van jodium.
Er moest dus naar een middel worden gezocht om die reactie
te onderdrukken, teneinde haar invloed op de quantitatieve be-
paling van koper volgens bovenstaande methode? \'uit te schakelen.

Door toevoeging van natriumpyrophosphaat \') werd wel het
ferrizout complex gebonden, maar 1 druppel Na2 P2 O7 oplossing
van 5 °/o vertraagt dc reactie van de kleine hoeveelheid Cu reeds
zoodanig, dat van een nauwkeurige bepaling geen sprake meer

Was. Phosphorzuur daarentegen was niet in staat de reactie van
het ferrizout voldoende te onderdrukken. Pogingen om het koper
>n zure oplossing quantitatief op een Al. plaatje neer te slaan en
na wederoplossing in verdund salpeterzuur, jodometrisch te bepalen,
mislukten, omdat het gebezigde zeer zuivere aluminium nog sporen
Cu bevatte.

Een bevredigend resultaat werd tenslotte verkregen met toe-
voeging van natriumfluoride. \') Bij de bepaling van 0.1 mgr.
Cu — bij aanwezigheid van evenveel ijzer — in 10 c.M^., was
de passende hoeveelheid 0.6 ä 0.8 c.M^. fluoride-oplossing van
0-5 "/o. De titratie moet echter met eenige voorzorgen worden
uitgevoerd, want de reactie van het ferrizout wordt door het
fluoride niet blijvend onderdrukt maar slechts vertraagd.

Daarom mag de temperatuur niet hooger zijn dan 15° C. en
moet de titratie binnen 1 ä 1.5 min. uitgevoerd worden. Daarna
moet de oplossing minstens gedurende de daaropvolgende minuut
ongekleurd blijven. Treedt de blauwe kleur binnen dezen tijd weer
op, dan is er tc weinig thiosulfaat toegevoegd.

De titratie, na toevoeging van natriumfluoride, heeft weliswaar
de gewenschte nauwkeurigheid, maar zij vereischt veel oefening.
Eveneens werden goede resultaten verkregen met de toevoeging
van natriumphosphaat. (LEY 1918.)

De uitvoering van de bepaling is hier gemakkelijker dan met
toevoeging van natriumfluoride, daar er geen bijzondere voor-
zorgen genomen behoeven te worden en de nauwkeurigheid van
de titratie binnen ruime grenzen onafhankelijk is van de phosphaat-
concentratie.

Zoowel met toevoeging van fluoride als met die van phosphaat
konden dus ten slotte kleine hoeveelheden koper, ook naast een
ferrizout, met een nauwkeurigheid tot op 1 "/o worden bepaald.

In het voorgaande is alleen rekening gehouden met eeii mogelijke
storing van de koperbepaling door ferri. Bij de toepassing van
de methode op de analyse van bloed was het echter niet uitge-
sloten, dat ook andere elementen de nauwkeurigheid van de
uitkomsten konden beïnvloeden (WÖBER 1922). Daarom heb ik
getracht, het koper eerst electrolytisch quantitatief af te scheiden
en dit daarna microjodometrisch te bepalen.

Reeds dadelijk bleek, dat bij een klemspanning van 2 Volt
kleine hoeveelheden koper niet quantitatief worden afgescheiden.
De hoeveelheid, die in oplossing blijft, kan bij de bepaling van
grootere hoeveelheden koper verwaarloosd worden; in ons geval
echter is dit niet toelaatbaar (Tabel X N®. 1-5).

4". opvoering van de klemspanning aan het einde van de
electrolyse, werd bereikt, dat van 0.1 mgr. koper praktisch
alles werd afgescheiden (Tabel X N". 6-14).

Is de quantitatieve afscheiding van zeer kleine hoeveelheden
koper betrekkelijk gemakkelijk, moeilijker is deze te bereiken als in
de vloeistof ook ijzer aanwezig is. De moeilijkheid ligt nl. hierin,
dat bij een klemspanning beneden 3 Volt het koper riiet quanti-
tatief wordt afgezet — waarschijnlijk onder invloed van het aan-
wezige ijzer —, terwijl boven 3 Volt, behalve het koper, ook ijzer,
op de kathode wordt afgescheiden (Tabel XI en XII).

Teneinde een volledige afscheiding van het koper te bereiken,
kon niet worden afgezien van een opvoering der klemspanning
aan het einde der electrolyse. Daarom werd besloten de jodo-
metrische bepaling van het afgescheiden koper steeds na toevoeging
van fluoride of phosphaat uit te voeren, opdat eventueel mede?\'
afgescheiden ijzer de bepaling niet zou storen.

De hierboven beschreven methode werd tenslotte op de bepaling
van koper in slakkenbloed toegepast.

Een cyHndertjevan platinagaas, 3 c.M. lang en 1 c.M. in doorsnee,
wordt als kathode gebezigd. Teneinde contact m\'ït den wand van
het electrolysevat te vermijden, is de kathode aan den boven- en
onderrand voorzien van glaskraaltjes. Als anode dient een platina-
draad. die in het vaatje is vastgesmolten.

Het electrolysevat — gemaakt van een reageerbuisje — bevat
meestal 6 c.Melectrolyse vloeistof. Door een aangesmolten
zijbuisje wordt langzaam lucht in het vat geblazen om de vloei-

Stof te roeren. Dit is noodzakelijk voor een snelle en volledige
afscheiding van het koper.

Teneinde de temperatuur van de vloeistof te kunnen regelen, is
het electrolysevat gedompeld in een glazen waterbad, dat door een
hceteluchtbrander op 70°-90° C. wordt gehouden. De vloeistof mag

niet koken, daar anders licht verlies door overkoken wordt ver-
oorzaakt. Teneinde spatjes, die door de opstijgende gasbellen
meegenomen worden, op te vangen en weer in de vloeistof terug

te brengen, is een glazen trechtertje ongeveer 1 c.M. boven den
vloeistofspiegel vastgesmolten aan de platinadraad van de kathode,
die door het kurkje loopt, dat het electrolysevat van boven afsluit.

Het bovengedeelte van het electrolysevat, waarin de waterdamp
condenseert, wordt tegen de opstijgende warmte beschermd door
een, op het waterbad liggende, asbestplaat.

De electrische stroom wordt geleverd door een accumulatoren
batterij van 5 cellen, elk van 2 Volt. (Fig 3 Acc.)

De klemspanning wordt geregeld met den schakelaar en met
den schuifweerstand (Fig. 3 Wd.)

Het afgescheiden koper kan, gedurende het uitlichten van de
kathode uit het electrolysevat, gedeeltelijk weer in de zure rest-
vloeistof oplossen. Teneinde dit te voorkomen wordt na afloop
Van de electrolyse — bij gesloten stroom — de moederloog met
gedestilleerd water van het reservoir (R) uit weggespoeld. Hierbij
daalt de stroomsterkte en pas als zij haar minimum heeft bereilct,
®ag de kathode uit het electrolysevat worden weggenomen.

Na voorzichtig afspoelen in gedestilleerd water wordt de kathode
»n een reageerbuisje met warm salpeterzuur van 25 % gedompeld,
Waarin het afgescheiden koper oplost. Deze oplossing wordt
quantitatief in een porceleinen schaaltje gegoten, en op het water-
bad afgedampt. Het residu wordt met 10 druppels azijnzuur
en 2 c.Mwater .verwarmd en in een Erlemeyer-kolfje overgebracht.
Het schaaltje wordt daarna nog 2 maal met 1-2 c.Mwater
uitgewasschen.

Na toevoeging van phosphaat, KI en 1 c.M^. stijfseloplossing
Wordt de titratie in de donkere kamer uitgevoerd.

Op deze wijze werden in 13 bepalingen gemiddeld 98.5"/o van
het koper teruggevonden. (Tabel XII N®. 56-68). Bovendien kon
vastgesteld worden dat bi- en pyrosulfaat, welke ontstaan door
verbranding van bloed met H2 SO4, de resultaten van de electro-
lyse niet behoeven te beïnvloeden. (N». 69-73).

De exactheid van de methode voor de microbepaling van koper
bleek ten slotte uit de resultaten van een analyse van drie mengsels
van zouten, samengevat in onderstaande tabel.

Voor de mineralisatie van organische stoffen worden verschil-
lende methoden aanbevolen

Bij verbranding in een platinakroes met toevoeging van sterk
zwavelzuur is het zeer noodzakelijk, dat er voortdurend toezicht
gehouden wordt. Geschiedt dit niet, dan ontstaat zeer licht ver-
lies door spatten of door over den rand loopen van het zwavelzuur.

Bij drooge verassching moet de vlam zoodanig geregeld worden
dat de hitte niet te klein of niet te groot is, in beide gevallen
blijft de verbranding dan onvolkomen. Veel sneller en zekerder
verloopt de destructie. van organisch materiaal in een Kjeldahl-
kolf met toevoeging van een mengsel van gelijke deelen zwa-
velzuur en salpeterzuur.

Teneinde condensatie van de zure dampen in den hals van de
kolf — en daarmee den duur van de verbranding — tot een minimum
te beperken, wordt door een rechthoekig omgebogen glazen buis
een sterke luchtstroom in den bol van de kolf geblazen.

De verwarming van de kolf geschiedt het best met een heete-
lucht-brander. De vlam wordt in het begin zeer laag gehouden
Want de vloeistof kan zeer licht stooten. De destructie kan dan
zichzelf worden overgelaten. Na eenigen tijd, als de witte
dampen van zwavelzuur zich ontwikkelen, moet de vlam hoog
Worden opgedraaid, daar anders de verbranding onvolledig blijft.
Teneinde de laatste resten zwavelzuur te verdrijven, moet ook de
hals van de kolf worden verhit. Is na verdrijving van het zuur
het residu in de kolf nog niet geheel ontkleurd, dan moet opnieuw
zuur worden toegevoegd. Dit is echter zelden het geval.

Op deze wijze kunnen eenige c.M^. bloed, met een dubbele
hoeveelheid zwavelzuur en evenzooveel salpeterzuur in één keer
toegevoegd, bij een passende grootte van dc vlam, bijna geheel
zonder toezicht in uur volkomen worden verascht.

Door 3 maal uitwasschen met telkens 2 c.M\'. warm gedestilleerd
Water wordt de asch in het electrolysevat overgebracht en na
toevoeging van 1 druppel 4 N. zwavelzuur, 1 druppel 4 N.
salpeterzuur en 20 mgr. ureum geëlectrolyseerd.

Tenslotte werd de microjodometrische titratie toegepast bij de
l>epaling van de hoeveelheid koper in 2 c.M\'. slakkenbloed.
Daarbij werd in 3 bepalingen het koper electrolytisch afgescheiden,
daarnaast in 3 andere de electrolyse achterwege gelaten. In dit
laatste geval werden hoogere titercijfers verkregen. Naderhand
Werd hetzelfde nogeens gedaan met een andere hoeveelheid slakken-
bloed maar bij de bepaling zonder electrolyse werd de sulfaatasch
eerst geneutraliseerd met natronloog en daarna pas getitreerd.
Ook hier werden zonder electrolyse hoogere cijfers verkregen.

Dat de resultaten der directe titraties hooger zijn dan die ver-
kregen na electrolyse kon niet verklaard worden door aanwezig-
heid van ijzer. Bij de bepalingen werd fluoride toegevoegd. Wel
is mogelijk, dat de aanwezigheid van veel alkalizouten de directe
titraties heeft beinvloed. Slakkenbloed bevat zeer veel Ca en Na.
die door de electrolyse van de asch verwijderd worden. In elk
geval stemmen de resultaten van de triplobepalingen onderling
goed overeen. (Vgl. Tabel IX).

Microjodomometrische bepaling van koper in asch van 2 c.M^.
slakkenbloed. (Helix pomatia).

Voor de bepaling van de hoeveelheid zuurstof, die in het
bloed aanwezig is, bestaan twee methoden:

Deze methode, berustende op de sterk reduceerende eigenschappen
van natriumhydrosulfiet (Na2 82 O4), is oorspronkelijk bedoeld voor
de bepaling van vrije zuurstof in waterige oplossingen. Naderhand
is echter deze titratie door SCHÜTZENBERGER & RiSLER (1873 toe-
gepast bij de bepaling van het zuurstofgehalte van runder- en
hondenbloed.

Eveneens hebben cuénot (1892), heim (1892), DHÉRÉ(1900)e.a.
zich er van bediend bij hun onderzoekingen omtrent het zuurstofbin-
dingsvermogen van het bloed van Mollusca en Crustaceae.

Het is echter duidelijk, dat de methode niet alleen voor de
bepaling van het zuurstofgehalte van water \') onvoldoende is, maar
ook, dat bij de titratie van de zuurstof in bloed 2) onbetrouwbare
cijfers werden verkregen.

Terecht waarschuwt WiNTERSTEIN (1909) dan ook voor het
gebruik van de zuurstoftitratie volgens SCHÜTZENBERGER in een
chemisch niet verder bekende vloeistof.

Electrolytischc afscheiding van 0.1 mgr. in 6 c.M^. oplossing met 0.5 c.M^. 4 N. zwavelzuur bij verschillende tijdsduur cn klemspanning.

1	2
2	^^
3	ff
4	ff
5	ff
6	3.4
7	3.8
8	^^
9	4
10
11
12	5.8
13	„
14	7.75

Elcctrolytische afscheiding van 0.1 mgr. Cu in 6 c.M^. oplossing bij aanwezigheid van ijzer bij verschillende tijdsduur en klemspanning

Elcctrolytischc afscheiding van 0.1 mgr. Cu in 6 oplossing bij aanwezigheid van ijzer bij verschillende tijdsduur en klcmspanning

N».	Klemspanning in Volt.	Stroomst in Amp.
37a	1.8
38	2.0
39	3.0
40	3.0
41	3.0
42	3.0
43	3.0
44	3.0
45	3.0
46	5.0
47	6.0
48	7.0
49	7.0
50	7.0	2.8
51	7.5
52	8.0
53	8.0
54	8.0
55	8.0
56	20\'met 3 Volt en 10\'met 8 Volt
57
58
59
60	5\'-3V:20\'-4V.:35\'met8V.
61	,» 6 "
62	15\'-3.8V.: 30\'-7V.	0.8
63	20\'-3V.: 5\'-4V.: 30\'^8 V.
64	15\'-4Volt en 20^-8 Volt.	1
65	en 30\'	>.
66	1. >•
67	f* ff
68	ff ff
69	3.4	0.02
70	3.1
71	3.9
72	3.0
73	2.7

0.5C.M3.

Ware er een stof bekend, die bij toevoeging aan het bloed uit
het haemocyanine quantitatief de O2 verdreef, evenals ferricyanide
dit uit haemoglobine doet, dan zou een pressimetrische zuurstof-
bepaling in het bloedgas-apparaat volgens BaRCROFT (1914) groot
gemak hebben opgeleverd; thans was ik aangewezen op de
physische methode nl. de extractie van de zuurstof in het vacuum
van een kwikpomp.

Het spreekt vanzelf, dat voor het uitpompen van bloed en in
\'t algemeen van organische vloeistoffen niet elke kwikpomp ge-
schikt is.

Voor het onderzoek van bloedgassen der Vertebraten zijn door
zeer verschillende onderzoekers pompen geconstrueerd, maar ten-
slotte hebben slechts enkele vormen dezer apparaten zich weten
te handhaven.

Een volledig en kritisch overzicht der verschillende soorten van
pompen vindt men bij BOHR in Tiegerstedt\'s Handb. d. physiol.
Methodik. Bd. 2, Ie Hälfte.

Heeft men eenmaal een kwikpomp met goede kranen en glazen
verbindingen, die langen tijd een vacuum kan behouden, dan kan
daarmee practisch elke gewenschte hoeveelheid bloed worden
uitgepompt.

Met een reeks van verschillende pipetten, elk voor een bepaalde
hoeveelheid, kan men dan het bloed in de pomp brengen. Een
groote kwikpomp volgens ZUNTZ stond mij ter beschikking. Wat
de werking betreft zou deze hebben voldaan aan de daaraan te
stellen eischen. doch door de constructie heeft het gebruik van
deze groote kwikpomp verschillende nadeden:

Ie. Het is een ingewikkeld toestel, geheel van glas vervaardigd en
dus zeer breekbaar.

2e. Het gebruik is zeer omslachtig en tijdroovend. Er moet
eerst een volledig vacuum worden verkregen; daarna moet een
pipet gevuld met bloed aan de pomp bevestigd en gevacueerd
worden, terwijl het bloed onderwijl verwarmd en geschud moet
worden. Vooral dit laatste moet voorzichtig geschieden, teneinde
de pomp niet te beschadigen.

toestel worden overgebracht, teneinde het volume en de samen-
stelling daarvan te bepalen.

Daarom werd overgegaan tot het gebruik van de kwikpomp vol-
gens van Slyke (1917). die vooral in Amerika algemeen in gebruik

is gekomen bij onderzoekingen van bloedgassen. Dit toestel is
oorspronkelijk bedoeld voor de bepaling van CO^ in bloedplasma
van den mensch. Daarna is het ook gebezigd voor de bepaling
van het zuurstofgehalte en van het zuurstofbindingsvermogen van
het bloed. Het is er op ingericht om 1-3 c.M^. bloed uit te
pompen en het verkregen gas, 300-800 m.M3.. met een nauw-
keurigheid tot gemiddeld 1,5 «/o te meten.

De absolute nauwkeurigheid gaat dus tot 7 m.M3., doch dit is
voor mijn doel, het meten van ongeveer 50 m.M3., niet voldoende.

Ue nauwkeurigheid waarmee het gasvolume, dat bij de extractie
verkregen is, kan worden afgelezen, is afhankelijk van de nauw-
keurigheid, waarmee het kwikniveau buiten en binnen in het toestel
op gelijke hoogte kan worden gebracht.

Dit wordt nog bemoeilijkt, doordat binnen in het toestel steeds
een deel der uitgepompte vloeistof op het kwik blijft drijven;
ook a tracht men de vloeistof vóór de meting zoo nauwkeurig
mogelijk weg te vangen. Teneinde de aflezing van het volume
met grooter nauwkeurigheid mogelijk te maken, hebben Van
slijke ö stadie (1921) later het oorspronkelijke toestel gewijzigd
door de ruimte waarin \'t gas gemeten wordt langer en nauwer
te maken.

Niettegenstaande deze verbeteringen, zag ik er van af de
opgevangen gassen in de pomp zelf te meten, daar het in evenwicht
brengen der kwikniveau\'s binnen en buiten het apparaat niet
gemakkelijk was.

Na aan het oorspronkelijke toestel van VAN SLIJKE eenige ver-
anderingen te hebben aangebracht, gebruikte ik het alleen om
daarmee de vloeistoffen uit te pompen.

vangen, in een geschikte
capillaire buis opgenomen
en daarin gemeten en ge-
analyseerd.

De pomp heeft een in-
houd van 100 c.M\'.; op
de buret behoeft geen ver-
deeling te worden aan-
gebracht, de beide drie-
wegkranen e en f zijn elk
7 c.M. lang en zeer nauw-
keurig geslepen.

De oorspronkelijke kra-
nen waren te kort en
lekten, zoodra het kranen-
vet vochtig was geworden.
De kraanmantel loopt uit
in een bolletje, dat uitge-
pompt en dichtgesmolten
kan worden; hierdoor
wordt het lekken volko-
men uitgesloten.

Het buisje b heeft een
inhoud van 6 c.M\'. De
capillaire buis a, in het oor-
spronkelijke toestel naar
beneden omgebogen en
bestemd voor het verwij-
deren van de uitgepompte
vloeistoffen, is in ons toe-
stel gebezigd om de ver-
kregen gassen boven kwik
te kunnen opvangen. Zij
is daartoe voorzien van
een kelkje K, dat gemak-

kelijk kan worden afgenomen en door een afvoerbuis met kraan
kan worden geledigd.

Onder kraan f bevindt zich een „wissel" d voor het tijdelijk weg-
vangen van de uitgepompte vloeistof. Daarmee is verbonden een
„fuik" g van glas. aangebracht teneinde uit de slang opstijgende
gasbellen te kunnen verwijderen. Het toestel is gemonteerd op
een plank en heeft een horizontale as A loopende in een metalen
buis B, die door een klem verbonden is aan een statief Stg, dat
aan den muur is bevestigd.

De verbinding van de plank aan het statief is zoodanig, dat
bij voorzichtig schudden de inhoud van den bol in een draaiende
beweging kan worden gebracht.

Een kwikreservoir R kan hooger of lager aan een ketting
worden vastgehaakt. Daarmee kan het kwik in het toestel op
elke gewenschte hoogte gebracht worden. Een metalen bak met
water, onder het toestel, dient om kwikdruppels op te vangen,
als ze uit het apparaat vallen.

Het kwikreservoir R wordt in stand I gebracht en de geheele
pomp - ook de buis a en b - met kwik gevuld. Daarna wordt
kraan e gesloten en het reservoir R in de hand zóóver omlaag
gebracht, dat er een Torricellische ruimte ontstaat. Als nu het
reservoir weer opgeheven wordt, moet het kwik met een scherpen
metaalklank tegen de kraan slaan als bewijs dat de pomp vol-
komen luchtledig is. Bij aanwezigheid van lucht hoort men het
scherpe geluid niet of veel minder. Is de pomp volkomen lucht-
ledig bevonden, dan wordt bij gesloten kraan e eenige c M^
water in b gebracht en het reservoir R in stand II gehangen. Door
voorzichtig openen van kraan e wordt nu het water, zonder lucht
toe te laten, zoo volledig mogelijk in de pomp gezogen Ver-
volgens wordt R in stand III gebracht, dit is 80 c.M. beneden
kraan f. Door het dalen van het kwik in de pomp ontstaat een
Torricellische ruimte, waarin het water begint te koken.

Door voorzichtig schudden wordt de geheele inhoud gedurende
het zakken van het kwik in een draaiende beweging gehouden
Is het kwikniveau even boven kraan f gekomen, dan wordt deze
gesloten en het toestel met as A uit buis B genomen en 1 minuut

met beide handen zoodanig geschud, dat het water in den bol
een draaiende beweging krijgt. Hierdoor komen de in het water
opgeloste gassen vrij.

Nadat het toestel weer aan het statief bevestigd is, wordt R
weer in stand I gebracht en kraan f zóóver geopend, dat het
kwik langzaam in de pomp omhoog stroomt. Zoodra het water
even onder kraan c is gekomen, wordt deze geopend om het uit-
gepompte gas door b te verwijderen.

Op dezelfde wijze wordt het water nog eens uitgepompt.
Meestal komen dan nog eenige m.M^. gas vrij.

Door voorzichtig openen van kraan e laat men het water nu
langzaam in b opstijgen. Zoodra eenig kwik boven de kraan ge-
komen is, wordt deze gesloten en R in stand II geplaatst. Met
een pipet of saturator wordt vervolgens de te onderzoeken vloei-
stof in een laag onder het uitgepompte water gebracht en ver-
volgens daarmee in de pomp opgenomen.

Door contrölebepalingen is gebleken, dat het afsluitende water
onderwijl geen lucht opneemt.

Om lekken te voorkomen wordt nu de boring van kraan c
met kwik „verzegeld". De vloeistof wordt, zooals boven beschreven
is, door schudden in het toestel uitgepompt en vervolgens zoo vol-
ledig mogelijk in d overgebracht; om dit gemakkelijk te kunnen
doen loopt het buisvormig gedeelte van de pomp boven kraan f
zeer nauw toe. Vervolgens wordt R in stand IV gehangen en
het kwik door c langzaam in den bol toegelaten.

Onderwijl wordt k met kwik gevuld en daarin het kelkje van
de Jordanpipet J. P. gedompeld, echter zoodanig, dat geen lucht-
bel daarin achterblijft.

Door de schroef een weinig omhoog te draaien wordt in de
capillaire eenige c.M^. kwik opgenomen.

Als het kwik in de pomp tot e gestegen is, wordt de kraan
naar a geopend en het verkregen gas, door deze heen, in het
kelkje van de Jordanpipet gebracht en in de capillaire opgeschroefd.

De pipet wordt vervolgens uit het kwikbekertje gelicht en het
opgenomen gas gemeten en geanalyseerd.

Teneinde de werking van de pomp te controleeren en de nauw-
keurigheid van de methode te bepalen, werd het gasgehalte be-
paald van gedestilleerd water, dat met lucht verzadigd was.

Gasgehalte van 2 c.M\'. gedestilleerd water verzadigd met lucht bij verschillende

Ie dat er uit het gedestilleerde water meer gas werd verkregen,
dan de nauwkeurige tabellen van FOX (1907-1909) aangeven; of
het CO^-gehalte van de laboratoriumlucht daarvoor aansprakelijk
was, weet ik niet;

3c dat in deze gevallen weliswaar een mogelijke fout van
4- 2.8 m.M3, op 45 m.M^. kan optreden, maar dat bij het onder-
zoek van bloed deze verhouding veel gunstiger is, aangezien daarbij
grootere gasvolumina verkregen worden;

4c dat deze opstelling dus aan de gestelde eischen voldoet,
daar de bereikte nauwkeurigheid voldoende is.

Teneinde de uitgepompte gassen nauwkeurig te meten en te
analyseeren. werden bij de kwikpomp 4 verschillende gaspipetten
volgens JORDAN (1920) gebezigd. 40 c.M. lang verdeeld in m.M. met
capillairen van verschillende wijdten, varieerend van 0.8 tot
2 m.M. diameter. (Zie fig. 4, A en B).

Het kelkje is zoodanig aan de capillaire gesmolten, dat er geen
verwijding heeft plaats gehad; daardoor wordt voorkomen, dat
bij het dompelen van het kelkje in kwik, in de monding van de
capillaire een luchtbelletje achterblijft, dat niet te verwijderen i^.
Het kelkje is 1.2 c.M. in doorsnede en 3 c.M. lang en heeft een
zijbuisje, dat daar loodrecht op staat. Als de pipet voor het
opvangen van het uitgepompte gas verticaal staat, kan door dit
zijbuisje geen gas ontsnappen.

Voor het opzuigen van het te analyseeren gas is een stalen
schroef met kleinen spoed in een buis aan de capillaire bevestigd.
Hierdoor kan het opzuigen van een gasbel zeer regelmatig ge-
schieden. wat noodig is voor een zuivere meting. Voor het con-
stant houden van de temperatuur van de gasbel werd een bak
van aluminium gebezigd, zoover gevuld met water, dat het kelkje
daarin verticaal ondergedompeld kan worden. Er is dan zóóveel
water aanwezig, dat de temperatuur in dezen bak gedurende een
analyse practisch niet verandert.

Deze oplossingen moeten samengevoegd worden in de hierboven
gegeven volgorde, daar er anders een onoplosbaar neerslag ontstaat,
dat de vloeistof onbruikbaar maakt.

Deze zuurstof absorbeerende vloeistof verdient de voorkeur
boven het meer gebruikelijke alkalische pyrogalol. omdat ze helder
en doorzichtig is en men gedurende de absorptie de gasbel kan
blijven waarnemen.

Om het kelkje met absorptievloeistof te vullen wordt het afge-
sloten met een gummistop. waardoorheen een glazen buisje loopt
voorzien van een kraan. Dit buisje wordt in de vloeistof ge-
dompeld. Men verlengt het zijbuisje met een capillaire en zuigt
eraan, de absorbeerende vloeistof loopt dan in het kelkje.

Als dit geheel gevuld is en geen luchtbellen daarin zijn achter-
gebleven, sluit men het kraantje.

De gasbel wordt nu uit de capillaire in het gevulde kelkje
geschroefd en daarin flink geschud. Men zorge ervoor, dat daarbij
geen lucht door het zijbuisje van de kelk kan toetreden.

Het CO2 wordt bijna onmiddellijk, de O2 in ongeveer 1 minuut
volkomen weggenomen. Door eenige keeren de gasbel in en uit
te schroeven, overtuige men zich. dat de absorptie volledig is
geweest.

Teneinde de nauwkeurigheid der metingen in de capillaire niet
te beinvloeden, zorge men ervoor, dat daarin geen absorptievloei-
stof wordt opgenomen. Zeer belangrijk is ook, dat het op- en
neerschroeven langzaam en zeer regelmatig geschiedt en dat de
capillaire bij de aflezing op een spiegel wordt gelegd teneinde de
parallactische fout te vermijden.

Teneinde den graad van nauwkeurigheid van analysen met de
Jordanpipet te bepalen, werden verschillende hoeveelheden lucht
daarmee geanalyseerd. De resultaten zijn in onderstaande tabel
vereenigd.

Uit deze cijfers blijkt, dat een analyse van kleine luchtvolumina
met deze methode, voldoende nauwkeurig uitgevoerd kan worden,
indien de geschikte capillaire daarvoor wordt gebezigd, want boven-
staande resultaten zijn weliswaar verkregen met een buis van
ongeveer 1 m.M. diameter, doch gelijke resultaten zouden te be-
reiken zijn met capillairen van 0.5 of 2 m.M. diameter.

De Jordanpipet is dus een zeer nauwkeurig en gemakkelijk te
hanteeren apparaat, vooral geschikt voor de analyse van hoe-
veelheden gas, die te groot zijn voor de microtonometer van
KroGH (1908) en te klein voor het toestel van HALDANEn916).

Kan men bij een onderzoek het volume der uit te pompen
gassen vooraf reeds ongeveer schatten, dan kan men met een
passende capillaire de analyse uitvoeren met een relatieve nauw-
keurigheid van 0.1 "/o. Voor mijn onderzoek werden voornamelijk

zulke met een inwendige doorsnee van 0.8 en 1 m.M. gebezigd.
Ze waren op eudiometrie onderzocht en geijkt door ze uitte
wegen met vochtig kwik (Barcroft 1908, p. 790).

Teneinde het bloed gemakkelijk en zonder verontreiniging uit
Helix pomatia te verkrijgen, wordt de schelp zorgvuldig schoon-
gewasschen en vervolgens daarin een kleine opening getikt, op
de voorlaatste winding, zoo dicht mogelijk tegen den naad\'aan
(zie flg. 4)

Na verwijdering van de kleine kalkstukjes ziet men duidelijk
een bloedvat loopen — de rechter-Randvena — dat van den
apex af langs den geheelen rechterrand van den ingewandszak
loopt, tot dicht bij de ademopening toe.

Deze groote vene (daarom ook wel Vena magna genoemd),
welke dus geheel onder den naad van de schelp verloopt, voert
het bloed van lever en ingewanden naar de „long" en heeft
verschillende groote zijtakken.

1 Deze methode werd reeds lang in het laboratorium van Prof. JoRDAN toegepast
cn heeft dit boven andere voor, dat dc proefdieren zich meestal herstellen.

in \'t gebied van de long en de nier - welke laatste men meestal
door de schelp heen kan zien liggen - loopt de vene langs het
rectum en den secundairen ureter, zoodat dit gedeelte niet geschikt

Een zeer geschikte plaats bevindt zich even vóór den overgang
van de vene in de „long". Om het bloed snel te laten uitstroomen,
wordt in de opening van de schelp een watteprop geduwd en
daarmee een zoodanigen druk op het dier uitgeoefend, dat het
bloed meestal in een fijne straal uit de vene spuit. Men leert
spoedig de juiste plaats vinden voor de punctie en kan dan
4 a 5 C.M3. bloed per slak verkrijgen.

Het zoo verkregen bloed is een opalescente blauwe vloeistof,
waarin vele leucocyten voorkomen. Deze werden vóór het nemen
der proeven steeds verwijderd, door het bloed te centrifugeeren
of af te filtreren na adsorptie met carbo animale.

Worden de leucocyten niet verwijderd, dan versmelten ze na eenige
uren met elkaar. Er ontstaan kleine en grootere gelatineuze korrels.

Om deze korrels heen verdwijnt weldra de blauwe kleur van
het bloed door reductie van het haemocyanine en na 12 uur
gestaan te hebben - zelfs in de ijskast - is, alleen nog een
laag aan de oppervlakte van de vloeistof blauw.

Het bloed, verkregen na adsorptie en filtratie, was donker blauw.
Deze kleur verminderde niet indien het in een goed gesloten kolfje

Van Carcinus maenas werd bloed verkregen door het voor-
laatste lid van een extremiteit weg te knippen.

Onmiddellijk zoodra dit gebeurd is, treedt er een sterke tonus
van dc strekspieren op; dit leidt meestal tot autotomie. waarbij
de wond gesloten wordt en het dier weinig bloed verliest. Wordt
de poot niet afgeworpen, dan vloeit daaruit langzaam druppels-
gewijze het bloed, dat in een buisje wordt verzameld. Zoodra
het bloed met de lucht in aanraking komt, zet zich de fibrine in
draden en klompjes af. Er wordt geen „koek" gevormd zooals
dit in het bloed van Vertebraten plaats vindt maar de stukjes

Als men geduldig wacht en zorgt, dat de wond niet door het
stolsel verstopt raakt, kan men uit een volwassen krab ongeveer
5 c.M3. bloed verzamelen. Na adsorptie met carbo animale en

affiltratie werd er een donkere, blauwgroene vloeistof verkregen,
die vooral bij opvallend licht bekeken blauw schijnt Het is be
kend dat behalve haemocyanine in het bloed van Crustaceae een
lipochroom voorkomt, het tethronerythrine, dat in een zuurstofrijke
atmosfeer onder invloed van het licht zeer donker wordt. Van-
daar de donkere kleur van het bloed.

Behalve bloed waarin de eigenschappen van het haemocyanine
door de daarin aanwezige electrolyten beïnvloed worden, moest
er bi, het onderzoek ook de zuivere stof gebezigd worden Ten-
einde haemocyanine in zuiveren toestand te verkrijgen is het nood-
zakelijk dit te doen uitkristalliseeren.

Dit was reeds gelukt aan Henze (1907) kobert (1903) en
vooral aan DhêRÉ (1908) en DhéRÉ 6 burdel (1914)

Volgens DhéRÉ is het optreden van Hcy-kristallen een teeken
van zeer vergevorderde demineralisatie. Bij het begin van het
krista lisatieproces was het specifiek geleidingsvermogen dan ook
9-14 x lo-ö reciproke Ohm.

Voor het doen kristalliseeren van haemocyanine bestaan ver-
schillende methoden. Naar gelang van het dier waaruit het Hcy

verkregen is. dient men een andere methode te kiezen. DhéRÉ(1919)
Voor bloed van Helix pomatia is dialyse de aangewezen weg
Het IS bekend, dat men door dialyse practisch alle electrolyten
uit een eiwitoplossing verwijderen kan.

Uit het Hb-onderzoek is echter gebleken, dat alleen het Ca ¹)
moeilijkheden kan opleveren, daar het tegen gedestilleerd water
gedialyseerd slechts voor 50-75 «/o diffusibel is. Neuhausen (1923)
kationen zooveel mogelijk te verwijderen, hebben

1 Hcy verkregen door gewone dialyse bleek na 3 maal omkristallisatie «een
K of Na meer te bevatten maar wel Ca. (zie noot pg 6).

Adolf 6 Ferry (1921) hun haemoglobine-oplossingcn gedialyseerd,
intermitteerend om den anderen dag in gedestilleerd water. dat
met CO2 was verzadigd: of zij hebben om den anderen dag hunne
oplossingen zelf met CO2 verzadigd.

Zij nemen aan, dat door deze bewerking het haemoglobine in zijn
isoëlectrisch punt bevrijd werd van alle kationen volgens de reactiej:

Zij verkregen zoodoende zeer zuivere oplossingen met een
electrisch geleidingsvermogen van max. 3 X 10"\'\' mi"- 8 X lO"^
reciproke Ohm. Deze cijfers behooren tot de beste, die in de
literatuur dienaangaande vermeld zijn.

Gelijke resultaten verkreeg HEIDELBERGER (1922) door Hb na kris-
taltisatie op te lossen met Naz CO3 en te dialyseeren in gedestilleerd
water, verzadigd met een mengsel van 4 deelen CO2 en 1 deel Oo.

Voor het dialyseeren worden verschillende soorten van mem-
branen gebezigd. Een volledig overzicht over deze methode en
haar verschillende toepassingen is gegeven door H. Thoms,
Abderhalden Handb. biol. Arbeitsmeth. Abt. III, Teil B. p. 360-\'84.

De voordeelen van het gebruik dezer zakjes boven die van
perkamentpapier vervaardigd, zijn de volgende:

2e. Ze kunnen gemakkelijk zelf vervaardigd worden in elke
gewenschte afmeting, terwijl ook de meerdere of mindere door-
laatbaarheid geregeld kan worden door één of meer lagen collo-
dium te nemen.

De gebezigde collodiumoplossing bestond uit 10 gram watervrije
collodiumwol, opgelost in een mengsel van 50 c.M^. absoluten
alkohol en 150 c.M^. watervrijen aether. Met deze oplossing
werden als volgt zakjes vervaardigd. Een nauwkeurig droog en
schoongemaakt verzamelbuisje van ongeveer 15 c.M. lengte en
2—4 c.M. wijdte wordt met de oplossing tot den rand gevuld.
Daarna wordt het buisje boven de flesch met collodium omge-

keerd en gedurende een 1/2 minuut in dien stand gehouden, ten-
einde het te laten uitdruipen.

Vervolgens wordt het buisje met de beide handen zoo regel-
matig mogelijk in een horizontalen stand geroteerd, teneinde de
vloeistof goed te verdeelen. De bodem van het zakje moet dikker
zijn dan de wanden, daarom wordt het buisje gedurende de rotatie
met tusschenpoozen in een schuinen stand gehouden, hierdoor
vloeit een deel van het collodium naar den bodem en droogt daar
tenslotte op.

Wordt de rotatie niet regelmatig uitgevoerd, dan ontstaan er
zeer licht onregelmatige gedeelten in den wand van het zakje,
dat hierdoor niet gemakkelijk van het glas kan worden losgemaakt!

De rotatie wordt zoolang voortgezet totdat al de aether ver-
dampt is, wat gemakkelijk aan den reuk te constateeren valt.
Is het collodium zoo ver opgedroogd, dan wordt het buisje in
alcohol van 70 > gedompeld en eenige minuten daarna in een
bak met water gelegd.

Als de buizen niet te veel collodium bevatten, kunnen gemak-
kelijk 10 zakjes per uur vervaardigd worden.

Teneinde de vervaardigde zakjes zonder gevaar voor scheuren
uit de buizen te kunnen nemen, moeten zij eenigen tijd in het
water blijven liggen. Na ongeveer 24 uur hebben zij zich van
het glas losgemaakt en kunnen ze worden gebruikt.

Op deze wijze verkregen zakjes kunnen in verdunden alcohol
onbepaalden tijd worden bewaard. Ik gaf er echter de voorkeur
aan, ze vóór het gebruik steeds versch te vervaardigen.

Men overtuigt zich van het al of niet dicht zijn van de ge-
maakte zakjes, door deze met een oplossing van congorood te
vullen, te sluiten, en gedurende een nacht in water te laten drijven.

Is er den volgenden dag kleurstof in het water gekomen, dan
zijn de zakjes onbruikbaar.

Teneinde de gevulde zakjes in het water te laten drijven werden
ze slechts voor ongeveer 7-« gevuld en gesloten door den boven-
rand van het zakje dicht te drukken en eenige keeren om te
vouwen. De lucht, die in het zakje boven de vloeistof is op-
gesloten, kan niet ontsnappen en houdt niet alleen het zakje
drijvende maar verhindert door haar spanning het binnendringen
van water.

Mij aan de voorschriften van DhêRÊ houdende, dialyseerde ik
aanvankeUjk het slakkenbloed tegen gedestilleerd water, dat dage-

DHÉRÈ (1919 III) vermeldt dit niet, wel echter, dat de kristal-
len in de zakjes gedurende eenige jaren goed kunnen blijven, ook

Wij hebben kunnen constateeren, dat in een oplossing van
gezuiverde Hcy gedurende meer dan een jaar geen verandering
optrad. In een enkel geval zag ik evenals DHÊRÊ een bruin pig-
ment ontstaan, dat langzamerhand donkerder werd. en tenslotte

Terwijl DHÉRÊ aanneemt, dat haemocyanine. zelfs bij lang-
durige dialyse, niet verandert, heeft HEIDELBERGER (1922) aan-
getoond. dat bij dialyse gedurende langer dan een week het zuurstof-
bindingsvermogen van gekristalliseerde haemoglobine voortdurend

Daar dit bij haemocyanine ook het geval zou kunnen zijn. heb ik ge-
tracht het zuiveringsproces door dialyse, sterk te bekorten. De toe-
passing van de methode van HEIDELBERGER gaf daartoe gelegenheid.

was, werd hierdoor licht troebel. Vervolgens werd gedurende
5 minuten uit een cylinder zuurstof in het water geblazen, teneinde
het haemocyanine in geoxydeerden toestand te houden. ¹)

De flesch werd onmiddellijk daarop met een rubberstop gesloten
en in ijs geplaatst. Den volgenden dag was de troebeling in het
bloed verdwenen. Het water werd ververscht en evenals den
vorigen dag met CO2 en O2 behandeld.

Om de twee dagen werd echter geen CO2 door het water
geleid. Afhankelijk van de doorlaatbaarheid der collodiummem-
braan, ontstaat na 3 of 4 dagen in het bloed een bliivende troe-
beling, die echter verdwijnt zoodra CO2 in het buitenwater ge-
leid wordt. Laat men nu het verzadigen met CO2 achterwege, dan
ontstaat er een sediment op den bodem der zakjes. De moederloog,
nog zwak blauw gekleurd, wordt nu zoo volledig mogelijk met
een Pasteursche pipet weggezogen en vervangen door gedestilleerd
water. Vervolgens worden de zakjes weer gesloten, en eenige
malen omgekeerd, teneinde den inhoud te vermengen.

Nu worden de kristallen door het inleiden van CO2 in het buiten-
water opgelost en daarna worden de zakjes in versch gedestilleerd
water in ijs geplaatst.

Na 2 dagen is het Hey dan weer opnieuw uitgekristalliseerd.
Deze omkristallisatie kan desgewenscht nog eenige keeren worden
uitgevoerd.

Na éénmaal omkristalliseeren was het spec. geleidingsvermogen
van de moederloog bij 15° C. reeds tot 4 X 10" reciproke Ohm
gedaald. Het sediment aldus verkregen, is donkerblauw gekleurd.
Waarschijnlijk zijn oplossingen van Hey, op deze wijze van
electrolyten gezuiverd, beter geschikt voor het onderzoek van zijn
zuurstofbindingsvermogen, dan die verkregen na langdurige dialyse
zonder gebruik van CO2 en O2. Vergelijkende bepalingen heb
ik echter niet uitgevoerd,

Bij de bestudeering van het evenwicht tusschen zuurstof en
haemocyanine was het noodig bloed of haemocyanine oplossingen

1 Dialyseert men bloed, dat zijn blauwe kleur verloren heeft, dan kan het
in enkele dagen weer blauw worden; vaak echter gebeurt dit pas\'na längeren tijd.

met gassen van verschillende samenstelling in evenwicht te brengen.
Deze bewerking ..satureeren" genoemd, kan geschieden in ver-
schillende soorten van flesschen, die daartoe in een draaiende
beweging worden gehouden.

Bij ons onderzoek werden saturatoren gebezigd volgens achter-
staande schets, (zie fig. 6). Deze flesschen komen in vorm overeen
met die, welke door Barcroft (19H) beschreven zijn. alleen de
afmetingen zijn anders. De flesschen hadden een totaal inhoud van
ongeveer 400 cM\\ terwijl de „pipet" (zie fig. 7 p.) geijkt was
voor het overbrengen van precies 2 c.M». Drie zulke flesschen
waren door klemmen bevestigd om een horizontalen as, die in
een bak met water was gemonteerd.

Door een electromotor werden de saturatoren in dien bak rond-
gewenteld, De omwentelingssnelheid van de as kon door een
paar riemschijven en een schuifweerstand voor den motor, geva-
rieerd worden tusschen 15 en 150 omwentelingen per minuut.
Meestal werden de flesschen gedurende 1 uur met een maximum

van 50 omwentelingen p. m. geroteerd. De temperatuur van het
water bleef zonder regeling binnen 0.2° C. constant, aangezien
de proeven bij kamertemperatuur werden uitgevoerd.

Teneinde den saturator met een bepaald gasmengsel te vullen,
werd de volgende opstelling ¹) gebezigd (zie fig. 7).

Een maatglas M. geplaatst op een blok. is voorzien van een
goed sluitende gummistop. waardoor 2 buisjes loopen; de eene
gaat precies tot den bodem, de andere blijft in de rubberstop.

Door aan de gummislang A te zuigen wordt het maatglas uit
vat V geheel met water gevuld. Vervolgens wordt door kraan a
te openen, zooveel lucht in het maatglas toegelaten, als noodig
is om een bepaald gasmengsel te vormen. De rest van het water
wordt nu door stikstof uit een cylinder vervangen. Een saturator
S met eenige c.M\'. bloed wordt met de waterstraalluchtpomp zoo
volledig mogelijk geëvacueerd en gesloten. Nadat de pipet p
van den saturator in een bak met kwik is gedompeld, wordt

Door den verminderden druk in de flesch stijgt het kwik daarin
omhoog en kan bij goede evacuatie den saturator bijna geheel
vullen.

Door zuigen aan het buisje van kraan b wordt het bloed, dat
op het kwik drijft, tot aan de boring van de kraan gebracht en
deze daarna gesloten. Vervolgens wordt de gummislang van den
cylinder naar kraan b verplaatst. Het maatglas wordt van het
blok genomen, de kranen a en b geopend en vervolgens ook kraan c
van d naar p. Terwijl het kwik nu langzaam uit den saturator
loopt, vult deze zich met het gasmengsel. Zoodra het kwik uit
de flesch gevloeid is, worden de kranen b en c gesloten, de
saturator weggenomen en geroteerd. Eenige keeren gedurende
de rotatie moet door het openen van kraan b een eventueelen
overdruk in den saturator weggenomen worden. Na afloop wordt
de saturator uit het waterbad genomen. Door in verticalen stand
kraan c van d naar p te openen, vult de pipet zich met vloeistof
uit de flesch. De gevulde pipet kan dan in het buisje b van de
kwikpomp van VAN SlijKE (zie fig. 4) worden geledigd.

bepalingen gebruikt. Vooral als de flesch even in de handen
wordt verwarmd, vult zich de pipet met de vloeistof, die door
den lichten overdruk uit den saturator wordt gedreven.

Tenslotte wordt de saturator met de buret van een gasanalyse-
toestel volgens Haldane (1916) verbonden, en dooreen analyse
wordt de zuurstofspanning in den saturator gecontroleerd.

Met de hierboven beschreven methoden, heb ik vervolgens
getracht de Sp. O. C. van Hcy te bepalen.

Zooals reeds in het begin van dit hoofdstuk is vermeld, werd
daarvoor bloed van Helix pomatia gebezigd.

Ongeveer 50 c.M^. bloed verkregen uit 12-15 slakken werden
gefiltreerd en gecentrifugeerd of na adsorptie met carbo animale
afgefiltreerd.

Deze bewerking is niet alleen noodig om kleine kalkstukjes,
die door het bloed zijn meegenomen te verwijderen, maar vooral
om de leucocyten uit het bloed weg te nemen.

Vervolgens werden van bovengenoemde hoeveelheid 3 soms
4X2 C.M3. verascht en voor de koperbepaling gebezigd.

Van een ander gedeelte werd, na verzadiging met lucht, telkens
2 C.M3. in het apparaat van VaN SlijKE uitgepompt, en in de
opgevangen gassen werd het zuurstofgehalte bepaald.

Het is duidelijk, dat de zuurstof op deze wijze bepaald, uit
twee gedeelten bestaat nl. een deel, dat aan het Hcy was gebonden
en een ander, dat in de waterige vloeistof van het bloed was
opgelost.

De hoeveelheid gebonden zuurstof, die bekend moet zijn voor
de berekening van de Sp. O. C. is dus niet direct te bepalen en
alleen te berekenen als het verschil van de verkregen totale hoe-
veelheid en de opgeloste hoeveelheid zuurstof.

Het volume van de opgeloste O2 kan ook worden berekend,
als het zoutgehalte van het bloed bekend is.

Ik gaf er echter de voorkeur aan deze hoeveelheid experi-
menteel te bepalen in de overweging, dat de cijfers, die men
voor de hoeveelheden uitgepompt gas verkrijgt, een zekere fout
bevatten.

paalde totale hoeveelheid O2. niet een andere hoeveelheid wordt
afgetrokken, die door berekening is gevonden, maar een. die
met dezelfde methodiek verkregen is.

Teneinde de in het bloed opgeloste zuurstof te kunnen bepalen
moest dus eerst het Hcy verwijderd worden. Daartoe werden in
een kolfje ongeveer 20 c.M^. bloed gekookt, waardoor het Hcy
stolde en een waterige vloeistof zich afscheidde.

De inhoud van het kookkolfje werd zoo volledig mogelijk in
een mortier overgebracht, daarin tot een papje gewreven en ver-
volgens gefiltreerd. Na afkoeling en verzadiging met lucht werden
van dit fikraat, telkens 2 c.M^. uitgepompt. Het spreekt vanzelf,
dat de hier gebezigde methode een ruwe is. Om het eiwit te
verwijderen, had ik beter ultrafiltratie kunnen toepassen.

De verkregen resultaten echter, vertoonden een zoo gering ver-
schil met de theoretisch berekende waarde, dat ik het koopen
van een kostbaar ultrafiltratie-apparaat niet voldoende gerecht-
vaardigd achtte.

In Tabel XV zijn samengevat de resultaten der bepalingen van
het totale volume zuurstof in 2 c.M^. slakkenbloed aanwezig, van
de opgeloste hoeveelheid O2 en van het kopergehalte.

In een andere reeks (Tabel XVI) was de gevonden Sp. O. C.
gemiddeld 154 d. i. 87.5 % van het theoretische getal.

Alvorens verder te gaan, is het noodzakelijk hier even bij de
gevonden getallen stil te staan teneinde niet uit het oog te ver-
liezen, hoe wij bij dit onderzoek ons doel trachten te bereiken.

In het begin van dit hoofdstuk is uiteengezet, dat na lange
jaren van onderzoek aan het licht is gebracht, dat Hb de zuurstof
zoodanig opneemt, dat 1 molecuul Hb 1 molecuul zuurstof op-
neemt, niet meer en niet minder.

Ie. het gebleken was, dat haematine, een splitsingsproduct van
Hb, een constant ijzergehalte had;

2c. bij de zuurstof binding van Hb er een vaste verhouding
bleek te bestaan tusschen de hoeveelheid ijzer en de maximale
hoeveelheid zuurstof, die door het Hb kon worden gebonden.

Het doel van ons onderzoek nu is na te gaan, in analogie met
wat van Hb bekend is, of ook Hcy de zuurstof chemisch bindt.
Aannemende, dat het koper op dezelfde wijze en in dezelfde verhou-
ding in het Hcy aanwezig is. als het ijzer in Hb, moest onderzocht

was. Uit de vergelijking van experimenteele en theoretische ge-
gevens. hebben wij voor deze verhouding, de Sp. O. C. van
Hc^ het getal 176 gevonden, overeenkomende met de verhouding

De vraag rijst dus vanzelf: wat is de oorzaak, dat hier voor de
Sp. O. C. inplaats van 176, 158.5 werd gevonden?
Ter verklaring zou men nu kunnen aannemen;
Ie. óf het Hcy bindt de zuurstof niet in vaste verhouding tot
zijn kopergehalte, dus niet chemisch;

2e. óf, mocht de binding van zuurstof wel chemisch zijn. dat
in de gevonden verhouding tusschen zuurstof en koper de hoeveel-
heid gebonden O2 te klein was (wegens ontoereikende O^-druk
veroorzaakte onvolledige Oa-verzadiging van het Hcy) of. dat de
hoeveelheid Cu te groot was.

Of de eerste veronderstelling, dat het Hcy de O2 niet in vaste
verhouding tot zijn Cu gehalte bindt juist is of niet, kan pas later
blijken. De mogelijkheden in het 2e geval genoemd moesten in
elk geval onderzocht worden.

In de eerste plaats moest dus worden nagegaan of de hoeveel-
heid koper, die in het slakkenbloed aanwezig is. uitsluitend in het
Hcy voorkomt, dan wel of een gedeelte als een koperzout in
\'t bloed is opgelost. Het is immers een bekend feit dat Cu in
verschillende organen van zeer vele dieren voorkomt.

Daar Helix pomatia zich met planten voedt, die zonder twijfel
Cu kunnen bevatten, zou het dus niet te verwonderen zijn als in
het bloed dezer dieren ook. buiten het Hcy, nog koper aanwezig was.

In de vloeistof verkregen na verwijdering van het Hcy heb ik
echter meermalen te vergeefs getracht Cu aan te toonen¹).

Dit was tevens een bewijs dat Hcy van Helix pomatia bij het
coaguleeren door hitte geen Cu afsplitst, wat door COUVREUR
ö RoUGIER (1902) werd beweerd, maar door DhÉRÊ (1903) is
tegengesproken.

Er bleef dus voorloopig niets anders over, dan aan te nemen
dat bij de bepaling van de Sp. O. C. van slakkenbloed na schudden
met lucht, het Hcy niet volledig met zuurstof was verzadigd.

Teneinde een volledige verzadiging van het Hcy met zuurstof
te bereiken, was de aangewezen weg het bloed met zuivere O2
in evenwicht te brengen.

Hoe eenvoudig dit moge schijnen, de moeilijkheid was niet op
deze wijze te overwinnen.

In de 3e kolom van rechts, is voor de hoeveelheid opgeloste O2 in
2 c.M^. bloed gemiddeld : 12.8 m.M^ opgegeven. Onder deze kolom
ziet men, dat de gevonden totale hoeveelheid O2 gemiddeld 30.8 is.

De gebonden O2 is gemiddeld 17.9 m.Mvarieerend tusschen
16.2 en 18.8 m.M^. De nauwkeurigheid van de bepaüng gaat
dus tot 2 m.M^., een zeer geringe hoeveelheid gas. als men met
groote volumina te maken heeft, maar in dit geval echter 10 ®,o
van het gevonden cijfer.

Wordt nu het bloed met zuivere O2 inplaats van met lucht
verzadigd, dan is \'t duidelijk dat de opgeloste hoeveelheid O2
5 maal zoo groot wordt, terwijl de gebonden hoeveelheid O2
hoogstens 20 m.M^. worden kan. De foutengrens wordt in dit
geval, dus onbeduidend kleiner en daarmee wordt dus dc nauw-
keurigheid in de berekening van dc Sp. O. C. ook weinig grooter.
Uit deze overwegingen blijkt dus, dat de gevonden getallen voor
de Sp. O. C. van Hcy. het maximum zijn van wat met bloed van
Helix pomatia bereikbaar was, aangezien de chemische capaciteit
van dit bloed zoo gering is.

Het is dus niet mogelijk gebleken de theoretische waarde van
de Sp. O. C. van Hcy — met slakkenbloed — meer dan 90 "/o te
benaderen, aangezien de hoeveelheid gebonden zuurstof, daarin te
klein was. om nauwkeurige bepalingen mogelijk te maken.

Gevonden totale hoeveelheid O2 gemidd . . .
„ opgeloste „ .. •• • • ♦
gebonden >« »• " . • •
Cu gemiddeld.........

Daarom heb ik getracht deze moeilijkheid te overwinnen, door
inplaats van slakkenbloed een Hcy-oplossing te bezigen.

Door een grootere Hcy concentratie werd ook de hoeveelheid
gebonden O2 veel grooter. Door slakkenbloed te dialyseeren, op
de reeds beschreven wijze, werd Hcy in kristallijnen toestand
verkregen.

Van dit gezuiverde product werd door toevoeging van/eenige
kristallen Naa CO3 een oplossing gemaakt, die op dezelfde wijze
als bloed werd gebezigd voor de bepaling van de Sp. O. C.
Teneinde echter zeker te zijn van de volledige verzadiging \'van
het Hcy met O2 werd de oplossing niet met lucht, maar met een
zuurstofrijk gasmengsel geroteerd.

In de Ie groep van bepalingen bleek bij analyse het O2 gehalte
van het gasmengsel waarmee geroteerd werd 72 "/o en in de
2e groep 52 0/0 te bedragen.

Met opzet werd de saturatie niet met zuiver O2 uitgevoerd
aangezien dan de verhouding van de hoeveelheid opgeloste tot
de hoeveelheid gebonden O2 weer minder gunstig zou worden.

De hoeveelheid opgeloste O2 werd berekend aangezien de
experimenteele bepaling niet mogelijk was; de oplossing stolde

De, op deze wijze verkregen, getallen voor de Sp. O. C. 172
en 173 bereikten dus, binnen de foutengrens van de gebezigde
methoden het theoretische getal.

Al ontbrak mij de gelegenheid nog meer bepalingen uit te voeren,
toch meen ik te mogen concludeeren, dat hiermee waarschijnlijk
gemaakt is, dat de Sp. O. C. van Hcy werkelijk een verhouding
van 1 at. O. op 1 at. Cu aanwijst, tenminste bij de zuurstof-
binding van Hcy van Helix pomatia. Daarnaast echter werd
het physiologisch belangrijke feit, geconstateerd dat het Hcy in
het bloed van deze slak bij normale temperatuur en zuurstof
spanning niet volkomen verzadigd is.

Zooals reeds meermalen vermeld is, komt Hcy niet alleen bij
Mollusca, maar ook bij Arthropoda, voor. Het zou nu kunnen
zijn, dat bij de zuurstofbinding van het Hcy van Mollusca de

Sp. O. C. 176 is maar van het Hey van dieren beboerende
tot de andere groep een ander getal. Deze veronderstelling wordt
b.v. gesteund door de resultaten van DhÉRÉ, waarover straks
meer gezegd zal worden.

Teneinde bovengestelde vraag op te lossen, heb ik getracht de
Sp. O. C. te bepalen van het Hcy in het bloed van een Crus-
tacea. Het is mij helaas niet mogen gelukken bloed van Homarus.
dat veel Hcy bevat, voor dit onderzoek te verkrijgen. Van het
Zoölogisch Station te den Helder ontvingen wij echter Carcinus
maenas. Het bloed dezer dieren bevat minder Hcy. dan dat
van Helix pomatia. Bij voorbaat was het dus reeds duidelijk,
dat de moeilijkheden groot zouden zijn. Voor de verassching
werden telkens 4 c.M3. gebezigd en voor de bepaling van de
totale hoeveelheid O« na verzadiging met lucht 2 maal 3 c.M3.
en eenmaal 2 c.M3. De opgeloste zuurstof werd bepaald zooals
dat voor Helix is beschreven. Tabel XVIII geeft de verkregen
resultaten.

Helaas heeft ook hier gebrek aan tijd verdere bepalingen ver-
hinderd. In elk geval is hiermee aangetoond, dat de Sp. O. C.
van Hcy van Crustaceae waarschijnlijk eveneens 176 is. Mocht
door latere bepalingen aan het hcht worden gebracht, dat aan de
hier vermelde onderzoekingen met bloed van Helix en van
Carcinus geen methodische of andere fouten kleven, dan zou dus
hieruit blijken dat bij 15° C. en 160 m.M. O2 spanning het Hcy
in het bloed van Carcinus (en misschien van Crustaceae in het
algemeen) meer verzadigd is dan in het bloed van Helix po-
matia. Dit feit zou in verband kunnen staan met het grootere
zoutgehalte van het bloed van de krab. Ik ben er mij van be-
wust, dat bovenvermelde cijfers echter nog geen conclusie in dezen
zin wettigen.

Vragen wij ons af of de hier verkregen resultaten geheel nieuw
zijn, dan zien wij, dat de literatuur slechts de onderzoekingen van
DhÉRÊ 1900-\'03) vermeldt.

In 1892 verscheen het onderzoek van HEIM waarin mede-
gedeeld werd, dat bloed van verschillende, door hem onderzochte,
decapode Crustaceae geen Cu bevatte en daar in dit bloed wel
Hcy aanwezig was. zou het Cu dus geen bestanddeel van Hcy zijn.

verhouding van de hoeveelheid Cu. die in het bloed van ver-
sclullende Crustaceae en Mollusken aanwezig is en de hoeveel-
neid U2 bij verzadiging met lucht.

De 3 laatste kolommen zijn door mij toegevoegd. De hoeveel-
heden opgeloste zuurstof werden berekend uit het vermoedelijke
zoutgehalte van het bloed dezer dieren eueiijxe

Uit deze tabel blijkt dat het bloed der Crustaceae een grootere
Sp. O C. heeft dan t bloed der Mollusca. Het feit opzichzelf
komt dus overeen met de resultaten boven verkregen, maar het
verschil is echter, dat Dhéré slechts in één enkel geval de the
oretische waarde ongeveer heeft bereikt nl. bij Cancer pagurus
183. De cijfers voor de Mollusca zijn allen zeer laag. terwijl
die voor de Crustaceae allen zeer hoog zijn. Voor sommigen,
bijv. Carcinus maenas, zou de gevonden Sp. O. C. een ver
houding van 1 Cu tot 2 O doen vermoeden.

Teneinde deze verschillen te kunnen verklaren noemt DhÉRÉ
verschillende mogelijkheden op, die echter weinig waarschijnlijk zijn.

De meest plausible verklaring van de geringe overeenstemming
in de gevonden getallen, lijkt mij toe te liggen in zijn methode
voor de bepaling van het zuurstofgehalte.

DhÉRÉ toch bezigt voor de O2 bepaling, de titrimetrische
methode volgens schützenberger.

Dat deze methode onbetrouwbaar is, blijkt o.a. uit de cijfers
van schützenberger (1873) zelf, verkregen bij de bepaling van de
hoeveelheid O2 in leidingwater (0,97 vol %) en in bloed van
eenige zoogdieren (± 28 vol "/o).

Het is begrijpelijk, dat de cijfers van DHÉRÉ voor het O2 ge-
halte van het bloed, van Crustaceae in \'t algemeen zoo hoog zijn,
vergeleken met die voor het O2 gehalte van het bloed van Mol-
lusca. Crustaceae hebben behalve Hcy en tethronerythrine andere
eiwitten in hun bloed, stoffen die zonder twijfel door het Na2 Sg O4
gereduceerd kunnen worden.

Tenslotte zou ik nog o^ het volgende willen wijzen: QUAG-
liariello (1922) heeft in Wintersteins Handbuch der vergl. Physiol.
eveneens gebruik makende van de cijfers van DHÉRÉ, voor 5 van
de 7 onderzochte diersoorten de Sp. O. C. berekend en tenslotte
de verkregen getallen gemiddeld.

Het is op deze wijze, dat hij een waarde van 179 heeft ver-
kregen. Het is echter duidelijk, dat bij zoo sterk uiteenloopende
getallen (126 en 238) het nemen van een gemiddelde, geen waarde
heeft.

Het resultaat van de bepalingen in dit hoofdstuk vermeld is
dus: dat met groote waarschijnlijkheid is gebleken, dat Hcy de
zuurstof bindt in vaste verhouding tot zijn Cu gehalte en wel
als 1 at Cu tot 1 at O. Wij zouden dus ook hier op dezelfde
gronden als bij Hb van een chemische binding van de O2 mogen
spreken. Dit is niet alleen voor Hcy van Helix maar ook voor
dat van Carcinus waarschijnlijk gemaakt.

Hiermee wordt niet gezegd, dat het Hcy van de slak identiek
is met dat van de krab. integendeel dit is zeer onwaarschijnlijk,
maar de prosthetische groep van deze eiwitmoleculen bindt de
O2 op dezelfde wijze.

In het vorige hoofdstuk is vermeld, dat Hey uit bloed van
Helix pomatia verkregen 0.29 «/o Cu bevat. Hieruit is te bere-
kenen, dat (bij een Sp. O. C. van 176.) 1 gr. Hcy 2.9 X 0,176 =
0.51 cM\\ zuurstof binden kan. Daarentegen kan 1 gr. Hb.
max. 1.34 c.M^. zuurstof opnemen. Haemocyanine heeft dus
2/5 van de chemische capaciteit van haemoglobine.

Na het vraagstuk van de stoechiometrische binding van de
zuurstof moest ongetwijfeld dat van het evenwicht tusschen
zuurstof en Hcy worden aangevat.

Het is een algemeen bekend feit, dat bloed gemakkelijk zuur-
stof opneemt en ook gemakkelijk weer kan afstaan: dit komt door-
dat in het bloed twee vormen van Hb voorkomen, die alleen in
hun zuurstof gehalte van elkaar verschillen maar overigens voort-
durend in elkaar kunnen overgaan. Tusschen Hb en oxy Hb
bestaat dus steeds een zeker evenwicht, dat alleen van de om-
standigheden van het milieu - voornamelijk van het zuurstofge-
halte — afhankelijk is.

Teneinde de hoeveelheid oxy Hb, als maat voor het zuurstof-
bindingsvermogen van Hb, bij verschillende O2 spanningen te
bepalen, moet bloed, of een Hb oplossing, waarvan de concen-
tratie bekend is. met gasmengsels van verschillend O2 gehalte, in

Vervolgens wordt, door uitpompen of op andere wijze, van
een nauwkeurig afgemeten hoeveelheid het O2 gehalte bepaald
en daaruit berekend welk gedeelte van de totale hoeveelheid Hb
als oxy Hb aanwezig was. Neemt men nu de gebezigde O2 span-
ningen als abscis en het percentage oxy Hb als ordinaat en zet
men in dit systheem de cijfers, die uit de proeven verkregen zijn.
als punten uit. dan vormt de verbindingslijn van deze punten de
dissociatie-kromme, dus een graphische voorstelling van het
evenwicht tusschen Hb en O2 bij verschillende zuurstofspanningen.

De bestudeering van de vraag welk verband er bestaat tusschen
de hoeveelheid oxy Hb en de partieele O2 spanningen waarmee
het in evenwicht is, onder verschillende omstandigheden, heeft
een enorme literatuur doen ontstaan in ons o.a. een inzicht ge-

Zooals reeds in het begin van Hoofdstuk IH is vermeld was hüfner
(1901) de eerste die in de rechthoekige-hyperbool een graphische
voorstelling meende te mogen zien. van het overwicht tusschen
Hb en O2 bij verschillende zuurstofspanningen.

Hij was echter volkomen speculatief, op theoretischen grondslag,
tot deze voorstelling gekomen. Toen later bohr (1903) experi-
menteel het bovengenoemde evenwicht bestudeerde, verkreeg hij
een geheel andere voorstelling.

Later is door het onderzoek van roberts & Barcroft(1909)
aan het licht gekomen, dat zoowel hüfner als bohr gelijk hadden.

De door hen gegeven graphische voorstellingen konden uit een
gemeenschappelijk oogpunt worden verklaard.

Ofschoon een oplossing van Hb in water klaarblijkelijk geen
homogeen systheem vormt, heeft toch eerst hüfner en daarna
vooral Barcroft en zijn medewerkers, op de reactie van Hb en
O2 de wet van de massawerking toegepast, teneinde de experi-
menteel bepaalde curven te kunnen verklaren.

Aannemende dat de zuurstof binding van Hb kan worden voor-
gesteld door de volgende evenwichtsreactie

hebben Barcroft 6 roberts (1909) aangetoond, dat voor een
gedialyseerde Hb oplossing de langs experimenteelen weg ver-
kregen punten op de theoretisch berekende kromme vielen. In
dit geval was de kromme een rechthoekig hyperbool.

Teneinde de wisselende vorm van de dissociatie-kromme te
kunnen verklaren heeft HiLL (1913) de aggregatietheorie opgesteld.
Hij neemt aan. dat een Hb oplossing zonder electrolyten moleculair
dispers is maar dat onder invloed van zouten de moleculen poly-
meriseeren.

De daardoor ontstane molecuulaggregaten nu binden de O2
volgens onderstaande evenwichtsreactie.

Hbn n O2 (Hb O2) n waarin n het gemiddelde aantal mole-
culen aangeeft, dat in een complex aanwezig is. barcroft (1913)
kon aantoonen. dat deze vergelijking voldeed voor alle gevonden

dissociatickrommcn van bloed, binnen de foutengrens van de
gebezigde methodiek. Hierdoor werd het dus mogelijk de even-
wichtsreactie tusschen Hb en O-, onder zeer verschillende om-
standigheden uit een gemeenschappelijk oogpunt te beschouwen.

Inplaats van deze zuiver chemische reactie van Hb en O2 neemt
o.a. BaYLISS (1918) een andere wijze van binding aan. Zijn voor-
stelling. waarop ik hier niet nader wil ingaan, vindt m. i. minder
steun in de experimenteele data dan de opvatting van hill.

Ic. een physisch-chemisch oogmerk, teneinde de wisselwerking
tusschen Hb en O2 te leeren kennen onder zeer verschillende

2e. een biologisch oogmerk, teneinde een inzicht te verkrijgen
in de opname van zuurstof in longen en kieuwen en in de afgifte
in de weefsels. Reeds uit den vorm van de dissociatiekromme
van het bloed van een dier, kunnen belangrijke conclusies worden
getrokken (vgl. KROGH (1919) omtrent de biologisch belangrijke
eigenschappen van het bloed van dat dier.

In analogie met Hb, was het dus van groot belang de dissociatie-
kromme vast te stellen van Hcy onder verschillende omstandigheden.

Het sprak vanzelf dat wij zouden moeten beginnen met de
kromme van een zuivere, zoo mogelijk electrolytvrije, Hcy-op-
lossing omdat wij daarin met een eenvoudig systeem te maken
hebben. Later zou dan den invloed van verschillende factoren
op de eigenschappen van Hcy moeten worden nagegaan. Ten-
slotte kan door vergelijking een inzicht verkregen worden in de
ademhalingsfunctie van dit bloedpigment.

Voor de vaststelling van de dissociatiekromme van zuivere Hcy
werd gebezigd een oplossing van kristallen verkregen door dialyse
van slakkenbloed volgens de reeds eerder beschreven methode.

De oplossing had bij 15° C. een specifiek electrisch geleidings-
vermogen van 3 X 10-reciproke Ohm.

De kleur was bij opvallend licht, donker blauw bij doorvallend
licht echter diep paars. Aan het slot van dit hoofdstuk zal ik
op deze kleur nog nader terug komen.

Verschillende saturatoren werden elk gevuld met 8-10 c M3
vacuelrd ^\'^\'"\'^^""^^^^ens met de waterstraalluchtpomp geë-

Vervolgens werden ze na elkaar gevuld met gasmengsels, waarin
respectievelijk 2 6; 5.1; 8.5; 12.0; H.9 «/o O. aanwezig was. en
daarop geroteerd gedurende 3/4 uur met een snelheid van 50 om-
wentelingen per minuut.

Met den kwikpomp volgens van Slijke werden uit eiken satu-
rator minstens 2 maal 2 c.M3. oplossing uitgepompt. In de op-
gevangen gasbellen werd met de Jordanpipet het O^ gehalte bepaald

De maximale hoeveelheid O^ die in 2 c.M3. aan het Hcy qe-
bonden kon worden, werd berekend uit het Cu gehalte, aan-
nemende dat de Sp. O. C. 176 is. Deze hoeveelheid was dus
31.5 m.M3. De getallen, gevonden voor de gebonden hoeveelheid
U2. zijn in de laatste kolom opgegeven in % van deze 31.5 m M3

Zet men nu de zoo berekende getallen in een coördinaten systeem
uit dan krijgt men onderstaande dissociatie-kromme, (fig. 8 (III))

Zuurstofgehalte van bloed van Helix pomatia bij verschillende zuurstofspanningen.

Op dezelfde wijze werd met een hoeveelheid versch afgetapt
slakkenbloed gehandeld. De verkregen cijfers zijn vereenigd in

Deze hoeveelheid was gemiddeld 13.5 m.M^. Bij een partieele
O2 spanning van 156 m.M. was dus in 2 c.M3. bloed 13.5 m^.M3
opgelost. Bij een spanning van O m.M. zal deze hoeveelheid
ongetwijfeld O zijn. Door graphische interpolatie vindt men nu
de hoeveelheden voor partieele spanningen, die tusschen Oen 156

\'\'^dT" maximale hoeveelheid O2. die in 2 c.M3. van dit bloed
gebonden kon worden, werd evenals boven berekend uit het Cu

De hier verkregen cijfers voor de hoeveelheid O2 gebonden
worden graphisch voorgesteld in onderstaande curve de dissociatie-
kromme van slakkenbloed bij 15°. (fig. 9.)

Laat ik vooropstellen, dat de curve voor Hcy en voor bloed
van Helix pomatia verkregen is, door de bepaling van een gering
aantal punten. Dc kromme welke in fig. 8 en 9 getrokken is,
zal dus bij nader onderzoek nog belangrijke wijzigingen kunnen
ondergaan, maar niettegenstaande deze onzekerheid, meen ik toch
tot het volgende gerechtigd te zijn:

Ie. Vergelijken wij de dissociatiekromme van bloed van Helix
met die van Hcy verkregen na verwijdering van de electrolyten
(zie fig. 8 II en III) dan staat het vast dat de curve voor slakken-
bloed steiler verloopt, dan die voor een Hcy opening. Dit zou dus
beteekenen dat onder dezelfde omstandigheden slakkenbloed meer
Oz kan opnemen dan een Hcy oplossing zonder electrolyten. Bij
bloed van Vertebraten en een oplossing van electrolytvrije Hb is
iets dergelijks vastgesteld voor O2 spanningen boven 70 m.M.
terwijl bij O2 spanningen lager dan 70 m.M. het omgekeerde
plaats heeft, daar is dus bij gelijke zuurstofspanning een Hb op-
lossing meer verzadigd dan bloed.

2e. Vergelijken wij de dissociatie-kromme van Hcy bij 15° met
die van Hb bij 16° dan is het duidelijk (fig. 8 I en III) dat Hb een
veel grootere affiniteit tot O2 heeft dan Hcy. Met deze eigen-
schap alleen, zou echter een dier dat Hb bezit niet kunnen leven,
aangezien dan onder normale omstandigheden het Hb wel vol-
komen verzadigd zou zijn, maar aan de weefsels van het dier
geen O2 zou afstaan.

Daarentegen zou het Hcy minder verzadigd zijn, maar van zijn
zuurstof ook gemakkelijker aan de weefsels kunnen afstaan.

3e. Vergelijken wij de dissociatiekromme van Helix bij 15°
met die van den mensch bij 38° (de stippellijn in fig. 9), dan is
het duidelijk, dat bij een daling van de O2 spanning tot 60 m.M.
het bloed van den mensch practisch geen O2 afstaat. Het bloed
van de slak daarentegen 50 "/o van de O2 die aan het Hcy ge-
bonden is.

De beteekenis van die eigenschappen van Hcy ten opzichte
van zuurstof, voor de biologie van Invertebraten, die Hcy bezitten
vergeleken met die, welke Hb als bloedkleurstof hebben, moet nog
verder onderzocht worden, maar het is duidelijk dat door deze
vergelijking, veel zal kunnen verklaard worden, van wat thans nog
duister is in de biologie van deze dieren.

Ik ZOU dit hoofdstuk willen besluiten met een opmerking over
de kleur van slakkenbloed en Hcy oplossingen.

diep blauwe kleur, welke bij doorvallend hcht een paarse tmt
heeft. Slakkenbloed echter, heeft door zijn opalescentie een meer
licht blauwe kleur, die bij doorvallend licht een b-mpaarse tmt
heeft. Dit bovengenoemde verschil verdwijnt volkomen ^
men aan een Hcy oplossing b.v. enkele druppels 0.5 «/o CaCl.
oplossing toevoegt. Het Hcy vlokt dan niet uit maar verandert

verandering I de stabiliteit van de oplossing want goed gedia-
Tvseerde Hcy. oplossingen vlokken niet uit bij toevoeging van
aUol. wel echter in bovengenoemd geval, als men eerst electro-
lyten heeft toegevoegd. Bovendien stolt een ^»tar^
oplossing niet bij kookhitte. Ze coaguleert echter onmiddellijk zoodra
Zn vooraf zouten toevoegt. Deze laatste waarnemingen werden
reeds in 1903 door dhêré vermeld en ik heb ze volkomen

Zooals reeds in Hoofdstuk II is vermeld, verdwijnt bij een ex-
tractie in het toestel volgens van SlijKE. zoowel van slakken-
bloed als van een Hcy-oplossing. de blauwe kleur zoo goed als
geheel het bloed wordt dan geelachtig, de Hcy oplossing zwak
opalescent. Dit gebeurt dus zonder verwarming.

Met het bestudeeren van het absorptiespectrum van Hcy in
analogie met dat van Hb. kan men verschillende dingen trachten
te bereiken:

Ie. De karakteriseering van deze eiwitstof en van zijn ver-
bindingen met gassen. Door deze karakteriseering zou b.v. de vraag
opgelost kunnen worden of slechts één soort Hcy bestaat, dan
wel of bij de verschillende diersoorten specifieke verschillen in
het spectrum van Hcy te constateeren zijn.

2e. De quantitatieve bepaling van het Hcy en van zijn ver-
bmding met zuurstof en andere gassen door spectrophotometrie.

3e Een inzicht in den onderlingen samenhang der absortie-
banden zooals Baas BeckinG (1921) met behulp van de theorie
van perrin voor Hb en Hb02 heeft trachten te geven.

Vele onderzoekers hebben zich bezig gehouden met het absorptie-
spectrum van haemocyaninehoudend bloed.

De meesten echter hebben slechts kunnen constateeren. dat het
Hcy. vooral in dikkere lagen, het spectrum verduistert, zonder
bepaalde deelen geheel te absorbeeren.

De eerste, die bij het spectroscopisch onderzoek van bloed van
Hehx pomatia een absorptieband opmerkte, was KrukenberG
0882). Hij zag, dat bij toenemende dikte van de laag bloed, om
de D lijn (geel) een deel van het spectrum donkerder was dan
aan weerszijden daarvan.

Eerst veel later heeft Gautrelet (1903). eveneens met bloed
van Helix, dezelfde waarneming gedaan. Hij zag een zeer breede
absorptieband zonder scherpe grenzen, waarvan het maximum bij
D lag.

Ongeveer tegelijkertijd heeft KOBERT (1903) dezelfde vage band
opgemerkt in het absortiespectrum van het bloed van Eledone
moschata.

De eigenlijke ontdekkers van het absorptiespectrum van Hcy zijn
DhÊRÉ en BURDEL (1913). Door het bezigen van exacte methoden
hebben deze voortreffelijke onderzoekers met bloed van Helix
pomatia. Sepia officinalis, Palinurus vulgaris, en Homarus vulgaris
bij een passende dikte van de laag een scherp afgegrensden ab-
sorptieband in het gele deel van het spectrum gevonden.

Dezelfde resultaten verkregen zij met oplossingen van HcyU
van Helix pomatia en met het gedefibrineerde bloed van Asfacus.
De as van dezen absorptieband varieerde tusschen 571 en 581

Naar hun meening. vindt deze variatie zijn oorzaak niet zoozeer
in de meer of mindere aanwezigheid van zouten (het bloed van
zeedieren bevat natuurlijk meer zouten, dan dat van Helix), als wel
in de specifieke verschillen van het absorptiespectrum van het
Hcy dezer dieren. Bij reductie van het HcyO verdween de absorp-
tieband geheel.

Bepalingen van VLÊS (1913) met behulp van de spectrophoto-
meter bevestigden de waarnemingen van DHÉRÉ en BURDEL.
Daarentegen heeft ALSBERG (1915) vermeld, dat het spectrum van
HcyO van Limulus geen bepaalden absorptieband heeft. Behalve
in het zichtbare gebied heeft DhéRÊ (1913) (1920) ook het ab-
sorptiespectrum van HcyO in het ultraviolet onderzocht. Hij ont-
dekte daarbij twee banden, de eerste tusschen 293 en 263 ^ fx,

Deze absorptiebanden waren identiek zoowel in bloed, als in
gezuiverde HcyO-oplossingen. van Helix. Octopus. Astacus en
Palinurus.

Later heeft BURDEL (1922) hetzelfde geconstateerd voor ge-
zuiverde HcyO van Sepia. Eledone. Helix en Palinurus.

le. Het ultraviolette gebied. Het was mij opgevallen, dat DhÉRÉ
in zijn publicaties over het ultraviolet-absorptiespectrum van HcyO
niet vermeld heeft welk beeld men verkrijgt bij reductie van het HcyO.

Het vraagstuk hoe het ultraviolet-absorptiespectrum van HcyO
van dat van Hcy verschilt, heeft een zeer interessante zijde ge-
kregen door de voorsteHing van DHÊRÉ (1919).

Hij meent nl. dat de band tusschen 364 en 328 fj. fj, toege-
schreven moet worden aan de prosthetische groep van het Hcy-
molecuul.

Indien dit juist is, dan is de mogelijkheid niet uitgesloten, dat
door den overgang van HcyO in Hcy, iets in deze groep ver-
andert, en daarbij tevens de plaats of de intensiteit van den band,
die deze groep karakteriseert.

Teneinde dit na te gaan heb ik, geholpen door Dr. H. C.
Burger eenige opnamen gedaan van het ultraviolette-absorptie-
spectrum van Hcy en HcyO.

Een kleine booglamp met automatische regeling gaf een hori-
zontalen lichtbundel, die door een kwartslens viel in de as van
een cylindrische cuvet, welke door een schroef korter of langer
gemaakt kon worden. Uit de cuvet trad de lichtbundel in een kleine
kwartsspectrograaf. die op een photographische plaat een ultra-
violet spectrum wierp.

Met deze opstelling werden opnamen gedaan van het ultraviolet-
absortiespectrum van onverdund versch slakkenbloed, dat zorg-
vuldig was gefiltreerd. In nevenstaande figuur ziet men de verkregen
resultaten.

N». 2 en 3 geeft het spectrum van het geoxydeerde bloed in
2 verschillende laagdikten.

In de eerste groep (I) was de belichtingstijd bij alle opnamen
60 sec. en bij de tweede groep (II) respectievelijk 10. 30, 90 en
10. 30. 90 sec.

De 2e groep is slechts bij de Ie gevoegd, teneinde den absorptie-
band te kunnen locahseeren met behulp van de kwiklijnen. Op
N". 10 ziet men namelijk van rechts naar links achtereenvolgens
de lijnen 3132, 3655. 4047 Ä enz.

Vergelijken wij nu de nummers 2 en 5. dan zien wij duidelijk,
dat 2 een absorptieband vertoont, waarvan de as bij i 3600 A ligt,
dien 5 daarentegen in dit gebied mist. Bij deze twee opnamen
was de laagdikte van de vloeistof precies gelijk. De nummers

dan 2 en 5. De absorptieband van het oxy-Hcy is hierdoor niet
meer duidelijk waarneembaar. In elk geval ziet men door verge-
lijking van 2 en 3 eenerzijds. 5 en 6 anderzijds, dat bij reductie
van het HcyO. de band (welke door DHÊRÉ tusschen 3640 en
en 2380 A is gelocaliseerd). uit dit gebied verdwijnt. De band.
op bovenstaande figuur bij N^. 2 vastgelegd, is zonder twijfel
identiek met die. welke door DhÉRÊ is beschreven.

Bovenstaande opnamen. 2 en 5. heb ik vervolgens gephotome-
treerd. teneinde het al of niet aanwezig zijn van den absorptieband
in een curve te kunnen uitdrukken. De getallen, die de golflengten
aangeven, zijn in de curve aangebracht na vergelijking van het
spectrum van de gebezigde booglamp, zooals dat bij de nummers
1, 4 en 7 is vastgelegd, met de emissielijnen van het kwik.
Men ziet duidelijk enkele emissielijnen in het spectrum, van de
booglamp, afkomstig van de vulling der koolspitsen. Deze lijnen
zijn ook aanwezig bij de nummers 2, 3. 5 en 6. zoodat daarmee

Het negatief I. waarvan nevenstaande reproductie is gegeven,
werd in een statief geklemd, dat automatisch in een horizontale
richting werd verplaatst. Met behulp van eenige lenzen, werd
het licht van een klein electrisch lampje door de photographische
plaat geworpen en opgevangen op eene kleine thermozuil. ver-
bonden met een galvanometer volgens MOLL. waarvan de uitslagen
photographisch geregistreerd werden.

Bij de verplaating van het photographische plaatje, werd op deze
wijze de meer of mindere zwarting, in het beeld van het spectrum,
geregistreerd op een reep photographisch papier, waarvan achter-
staande figuur een reproductie is:

Men ziet hier dus, beter nog dan fig. 10 kan aantoonen, dat bij
reductie van het HcyO. de band tusschen 3700—3200 A uit dit
gebied verdwijnt.

Of de band geheel uit het spectrum weg gaat dan wel slechts
verschuift, heb ik niet kunnen aantoonen.

Bij de vele punten van overeenkomst in de eigenschappen van
Hcy en Hb, vinden wij hier een punt van verschil, want Hb
vertoont, evenals Hcy, een absorptieband in zijn ultraviolet-
spectrum, welke voor HbOa zijn middellijn heeft bij 414 /i^. (j.. en
voor Hb. bij 429 (x. (x. Bij de reductie van HbO« verplaatst
deze band zich dus een weinig naar het gebied met grootere
golflengte.

2e. Het zichtbare gebied. DhÉRÉ en burdel (1913) hebben
den absorptieband van HcyO in het zichtbare gebied, voor het
bloed van verschillende diersoorten gelocaliseerd en evenzoo voor
HcyO-oplossingen. Zooals reeds is vermeld heeft VlÈS (1913)
de quantitatieve verhoudingen in het aborptiespectrum bepaald,
maar slechts voor bloed van Octopus. Het leek mij echter gewenscht
eerst de eigenschappen van het gezuiverde Hcy in dit opzichtte
bestudeeren, teneinde later daarmee het quantitatieve\'spectrum
van het bloed van verschillende dieren te kunnen vergelijken.

deze richting een groot aantal bepalingen, met oplossingen van
zeer verschillende concentratie, gedaan moeten worden. Hiertoe
ontbrak mij helaas echter tijd en gelegenheid, zoodat tot nu toe
slechts enkele bepalingen zijn uitgevoerd.

Gebruik makende van de groote welwillendheid van den Heer
H A C denier van der GON. hebben wij met een geheel

automatische opstelling spectrophotometrische bepalingen van het
absorptie-spectrum van Hcy- en HcyO-oplossingen gedaan.

Het materiaal voor deze proeven werd verkregen door. op de
in Hoofdstuk III beschreven wijze, bloed van Helix pomatia te

Van de verkregen kristallen werden, door toevoeging van sporen
NaCl. oplossingen verkregen, die voor de metingen werden ge-
bezigd. Teneinde het HcyO te reduceeren. heb ik gebruik ge-
maakt van het relatieve vacuum van een gewone luchtpomp.
Onder een goed sluitende stolp werd het Hcy gedurende den nacht

In enkele bepalingen werd het HcyO met een druppel ver-
dunde {NH4)2S gereduceerd.

Wij gingen steeds zóó te werk. dat eerst het spectrum van
HcyO, daarna, in de zelfde cuvet, dat van de gereduceerde stof

De gebezigde opstelling is reeds door DENIER VAN DER GON
(1923) beschreven; ik kan volstaan met de volgende hoofdzaken

Van een kleine, constante lichtbron, wordt het licht in een
monochromator zoodanig verdeeld, dat telkens slechts een zeer
nauwe bundel uit een bepaald gedeelte van het spectrum kan uit-
treden; automatisch wordt na elke opname een volgende bundel
vrijgelaten, zoodat op deze wijze achtereenvolgens alle stralen van
het spectrum door de te onderzoeken oplossing kunnen worden
geworpen. Teneinde de absorptie quantitatief te kunnen meten
wordt gebruik gemaakt van cuvetten, die zoodanig zijn gecon-
strueerd. dat tusschen twee glasplaatjes, met glazen ringen, twee
afzonderlijke ruimten naast elkaar worden gevormd. De beide helften
van zoon cuvet hebben precies dezelfde wijdte. In de eene helft
wordt de te onderzoeken oplossing gebracht, in de andere water.
Afwisselend wordt nu één van de beide helften voor den stralen-

bundel gehouden, die uit den monochromator treedt. Na door de
vloeistof te zijn gegaan, wordt het licht opgevangen op een ther-
mozuil, verbonden met een galvanometer volgens MOLL, waarvan
de uitslagen op een photographische trommel worden geregistreerd.

Voor eiken uittredenden stralenbundel registreert de galvanometer
na elkaar 2 punten (eigenlijk lijntjes), en keert dan, door de afslui-
ting van het licht, weer naar zijn nulpunt terug. Wij krijgen op
deze wijze voor de totale opname, een reeks van telkens 3 punten
boven elkaar, waarvan één het nulpunt is terwijl de afstand van
dit nulpunt tot een der beide andere, telkens een maat\'geeft voor
de intensiteit van het licht, dat door het water, en van de inten-
siteit van het licht, dat door de oplossing treedt. Voor elke
stralenbundel (elke ..stap") wordt dus geregistreerd de verhouding

van de intensiteiten van het licht voor en na het doorloopen van
een laag van bepaalde dikte, van de te onderzoeken oplossing.

Zet men nu de verkregen verhoudingen in de absorptie van
de opeenvolgende stappen in een coördinatensystheem uit. met de
golflengte als abscis en de doorlating in "/o als ordinaat, dan
krijgt men nevenstaande curven (fig. 12):

III. is eveneens een curve voor HcyO van dezelfde concen-
tratie maar in een cuvet van 5.15 m.M. dikte.

Hieruit ziet men duidelijk, dat het HcyO een band heeft,
waarvan de as ligt bij 560 f^^. en dat de band verdwijnt bij

Merkwaardig is het. dat de zoo verkregen lijnen, voor een-
zelfde laagdikte en eenzelfde Hcy concentratie, niet op elkaar
vallen (natuurlijk met uitzondering van het gedeelte in het absorptie-
gebied). Dit beteekent dus. dat het HcyO. behalve in het ab-
sorptiegebied. in het geheele spectrum een deel van de binnen-
dringende stralen onderschept.

Dit feit is reeds door DhÉRÉ en eveneens door VLES vermeld.
Wij hebben hier naast een absorptie te maken met een dispersie
van een deel van het licht, vooral van de blauwe stralen, door de
deeltjes van de oplossing. De kleur van het blauwe HcyO wordt
dus veroorzaakt door 2 factoren: de absorptie van de gele en
geel-groene en de dispersie van de blauwe stralen.

Het zou zeer interessant zijn te weten of werkelijk, zooals uit
deze curven blijkt, de colloidale deeltjes van de oplossing bij de
oxydatie grooter worden, dit probleem, kan misschien worden
opgelost, aangezien KRUYT en TENDELOO (1924) een methode
hebben uitgewerkt voor de bepaling van de grootte der deeltjes
in colloidale oplossingen.

Tenslotte hebben wij met een dergelijke opstelling als voor het
zichtbare gebied, ook de absorptie in het ultra-rood bestudeerd.

met de bedoeling de vraag op te lossen of Hcy evenals Hb. ook
in het ultra-rood een absorptie-band vertoont. Wij hebben dit
echter niet kunnen constateeren voor de golflengten kleiner dan
\\5 [X. In het verdere deel van dit gebied worden de stralen zoo-
danig door het oplosmiddel (water) geabsorbeerd, dat het moeilijk
te constateeren is, of HcyO of Hcy hier een absorptieband heeft.

In analogie met haemoglobine werd van haemocyanine. de
koperhoudende ademhalingskleurstof van vele Invertebraten. het
zuurstofbindingsvermogen bestudeerd.

Dit geschiedde aan de hand van zeer exacte methoden nl.:
le. een koperbepalingsmethode waarmee hoeveelheden van
0.1 mgr. tot op 1 % nauwkeurig te bepalen is en

2e. een methode voor de bepaling van de totale hoeveelheid
zuurstof, die in 2 c.M^. bloed aanwezig is. met een nauwkeurig-
heid tot ongeveer 2 m.M^.

Carcinus maenas ongeveer evenveel zuurstof aan het Hcy ge-
bonden is. als in de vloeistof is opgelost.

Bij de zuurstofbinding bleek dat er. analoog met Hb. een vaste
verhouding bestaat tusschen de hoeveelheid koper en de maximale

Uit de experimenten met gezuiverde haemocyanine werden voor
de spec. zuurst, cap. de getallen 172 en 173 verkregen; met het
bloed van Carcinus maenas 169. en met het bloed van Helix
pomatia 154 en 158.5. Deze laatste te lage getallen vonden hun
oorzaak in de geringe chemische capaciteit van het bloed dezer
dieren, waardoor de foutengrens der gebezigde methode zeer

^"^vLT bloed van Helix en voor gezuiverde haemocyanine. werd
met enkele punten de dissociatie kromme bij 15° vastgesteld.
Ten slotte is ook het spectrum bestudeerd.

Het bleek dat de band van oxyhaemocyanine aanwezig in het
ultraviolet bij reductie verdwijnt; dat in het ultrarood beneden
1.5 [X, geen absorptieband te vinden is, en dat in het zichtbare
gebied, behalve absorptie van de gele- en geelgroene stralen door
het oxyhaemocyanine ook een dipersie van het licht plaats heeft.

n:>h-> ;\',v tJ!;:ni,Vvî>fn\'t/.ii ybi^uju^arv v.nr. f -,rnvf;nv-t,-) -.j, j.fj
: wy^hi,\'^ t \\\\ a-j f.^! mAU.v.n; o, n,-: .j-v....:

Adolf, E. F. & Ferry. R. M. 1921. The oxygen dissociation of He-
moglobin and the effect of electrolytes upon it.
Journ. of biol. Chem. 47, p. 540-
Aloy & Valdguié 1922.

Bull. Soc. Chem. 31, p. 1176-
Alsberg, C. L. 1915. Note on the reduction of Oxyhaemocyanme in

Journ. of biol. Chem. 8, p. i.
Alsberg, C. & Clark W. M. 1914- The solubility of oxygen in the
serum of Limulus polyphemus and in solutions of pure Limulus hae-

mocyanin.
Journ. of biol. Chem. 19, p. 503-
Barcroft, J. 1908. Zur Lehre vom Blutgaswechsel in den verschiedenen

Ergebnisse der Physiol. 7, p. 701.
Barcroft, J. & Roberts, F. 1909. The dissociation curve of haemo-
globin.

Journ. of Physiol. 39, P- M3-
Barcroft, J. 1913. The combination of Haemoglobin with oxygen and

with carbon monoxide H.
Biochem. Journ. 7, p. 481-
Barcroft, J. 1914. The respiratory function of the blood. Cambndge

Dissertatie Utrecht.
Bayliss, W. M. 1918. Principles of general Physiology. Edit.

Mem. Soc. des Sciences de Bordeaux 5, p. 120.
Bohr Chr. 1892. Ueber den specifischen Sauerstoffgehalt des Blutes.

Bohr, Chr. 1909. Blutgase und respiratorischer Gaswechsel
Nagels Handb. d. Physiol. Bd. I p. 54.

Burdel, Alb. 1922. Contribution à l\'étude des Hémocyanines.
Mem. Soc. Fribourg. d. Se. Nat. 1, p. 195.

Carpentek, t. IVÎ. 1921. Tables factors and formulas for computing
respiratory exchange and biological transformations of energy.
Carnegie Institution of Washington Publ. N«. 303.

CuÉNOT, L. 1891. Eludes sur le sang et les glandes lymphatiques dans
la serie animale II.
Arch. Zoôl. Exp. [2] 9, p. 13 en 365.

Dhéré, Ch. 1900. Le cuivre hématique et la capacité respiratoire de
l\'hémocyanine.

--- \'903- Quelques nouveaux documents concernant le cuivre héma-
tique des Invertébrés et la capacité respiratoire de l\'hémocyanine.
C. R. Soc. Biol. Paris 55, p. 1161.

Journ. de Physiol. et de Palhol. génér. 18, p. 685.
Dhéré, Ch. & Schneider, A. 19\'9- Sur la dissociation des oxyhémo-

C. R. Soc. Biol. 82, p. 1038.
Dhéré, Ch. & Schneider, A. 1920. Nouvelles recherches sur la réduc-
tion des oxyhémocyanines et sur la combinaison des hémocyanines
avec le bioxyde d\'azote.

C. R. Soc. Biol. 83, p. 1605.
Dubois, R. 1900. Du cuivre normal dans la serie animale (Animaux

Ann. Soc. Linn. Lyon 47, p. 93-
_ igoo. Sur la cuivre normal dans la serie animale.

C. R. Soc. Biol. Paris 52, p. 392.
Fox, Ch. J. J. 1907. On the coefficients of absorption of the atmos-
pheric gases in distilled water and sea water.

I. Nitrogen and oxygen.
Conseil permanent international pout l\'exploration de la mer.
Publications de circonstance N®. 41.

IL Carbonic acid.
Publications de circonstance N». 44.
Foulk, c. W. & Morris, S. 1922. The comparative values of different
specimens of jodine for use in chemical measurements.
Journ. Am. Chem. Soc. 44. P- 225.
FrédÉricQ, L. 1878. Sur l\'hémocyanine, substance nouvelle du sang

C. R. Acad. Se. Paris 87. p. ggà.
__1878. Recherches sur la physiologie du poulpe commun (Octopus

Bull. Acad. Se. Belgique [2] 46, p. 710-
Gautrelet, j. 1903. Les pigments respiratoires et leurs rapports avec
l\'alcalinité apparente du milieu intérieur. Thèse Faculté des Sciences
de Paris.

Genth, Fr. a. 1852. Ueber die Aschenbestandteile des Blutes von Limulus
cyclops.

Gon, h. a. c. Denier v. d. 1923. Détermination de coefficients d\'ab-
sorption.

Griffith, A. B. 1890. On the Blood of the Invertebrata I.
Proc. Roy. Soc. Edinburgh. 18, p. 288.

HEm K 1892. Etudes sur le sang des Crustacé\'s décapodes.
Theses Paris Sciences Ser. A. N®. 758.

C. R. Acad. Se. Paris 114, p. 771.
Henze, m. 1901. Zur Kenntniss des Haemocyanins L
Z. f. physiol. Chem. 33, p. 370.

Hill A. V. 1912. The combinations of haemoglobin with oxygen and
with carbon monoxide I.
Biochem. Journ. 7, p. 471,
Hüfner, g. 1894. Arch. f. Anat. u. Physiol. p. 130.

-- 1901. Neue Versuche über die Dissociation des Oxyhämoglobins
Arch. f. Physiol. Sup. Bd. p. 187. \' 0

Jolijet. F. & Regnard p. 1877. Recherches sur la respiration des
Animaux aquatiques.
Arch, de Physiol. [2] 4, p. 584.

Jolijet & Viallanes. 1895. Contributions à l\'étude du sang et de sa
circulation chez les Arthropodes.
Travaux des laboratoires d\'Arcachon p. 13.
Jordan, H. & Schwarz B. 1920. Einfache Apparate zur Gasanalyse
und Mikrorespirometrie in bestimmten Gasgemischen und über die
Bedeutung des Hämoglobins beim Regenwurm.
Pflüger\'s Arcli. 185, p. 311.

Ber. d. D. Chera. Ges. 36, p. 1549-
Robert. R. 1903. Ueber Haemocyanin nebst einigen Notizen über
Hämerythrin.

Skand. Arch. Physiol. 20, p. 279.
Kroch, A. and Leitch I. 1919. The respiratory Function of the Blood
in Fishes.
Journ. of. Physiol. 52, p. 288.
Krukenberc, C. F. W. 1882. Zur Kenntniss des Hämocyanins.

Vgl. Physiol. Studiën II. R. i. Abt. p. 182.
Kruyt, H. R. & Tendeloo, H. J. C. 1924. De bepaling van de grootte
van onzichtbare deeltjes in emulsoïde solen.
Versl. Kon. Acad. van Wetensch. W. en N. Afd. 33, p. 184.
Lavoisier. Oeuvres de Lavoisier publiés par les soins du ministre de
l\'instruction publique.
Paris 1862—93.

Chem. Ztg. 41 p. 763.
Lockemann, G. 192i. Aschenanalyse. Abderhalden Handb. biol. Arbeits-
meth. Abt. i Teil 3 p. 663—691.
Magnus, G. 1837. Ueber die im Blute enthaltenen Gase. Sauerstoff,

Annalen d. Physik 66, p. 177.
Moser, L. 1904. Untersuchungen über die Kupfertitration mit Jodkalium
und die Anwendbarkeit derselben bei Gegenwart von Eisen und-Arsen.
Zeitschr. f. anal. Chem. 43, p. 597-
Neuhausen, B. S. & Pinkus, J. B. 1923. A Study of the condition of
several inorganic constituents of serum bij means of ultrafiltration.

J. biol. chem. 57, p. 99-
Peters, R. A. 1912. Chemical nature of specific oxygen capacity in

Haemoglobin.
Journ. of Physiol. 44, P- i3i-
Pflügjcr, E. 1872. Uber die Diffusion des Sauerstoffs, den Ort und
die Gesetze der Oxydationsprocesse im tierischen Organismus.
Pflüger\'s Archiv. 6 p. 43.

Philippi, e. 1918. Zur Kenntniss der Haemocyanine.
Zeitschr. f. physiol. chem. 104, p. 88,

Richet. Ch. 1879. De l\'hémoglobine et de ses combinaisons avec les gaz
Progrès med. 7, p. 601.

Riesenfeld, H. & Möller, H. T. 1915. über Mikro-Eleclroanalyse.
Z. f. Elektrochem 21, p. 137,

schützenberger, P. & Risler. Ch. 1873. Dosage de l\'oxygène libre
ou dissous, au moyen d\'une solution titrée de l\'hydrosulfite de soude.
Bull. Soc. Chim. Paris 20, p. 152.

schützenberger, P. & Risler, Ch. 1873. Recherches sur le pouvoir
oxydant du sang.

1873. Sur l\'action de l\'oxygène dissous sur les réducteurs.
C. R. Acad. Se. Paris 76, p. 1214.

Van Slijke, D. D. Studies of acidosis II. A method for the deter-
mmation of carbon dioxide and carbonates in solution.
J. biol. Chem. 30, p. 347.

Van Slijke, D. D. & Stadie, W. C. 1921. The determination of the
gases of the blood.
j. biol. Chem. 49, p. 527.
Swammerdam. j. Bijbe! der Natuure I p. 119—120.

Thomas, P. & Carpentier, G. 192 i. Un réactif très sensible du cuivre:
le réactif de Kastle—Meyer.
C. R. Acad Se. Paris 173, p. 1082.
Vlès. 1913. Sur l\'absorption des rayons visibles par le sang de Poulpe.
C. R. Acad. Se. Paris 157, p. 802.

Winterstkin, h. 1909. Zur Kenntniss der Blutgase wirbelloser Seetiere.
Bioch. Zeitsch. ig, p. 384.

Witting, E. 1858. Ueber das Blut einiger Crustaceen und Mollusken.
Journ. f. prakt. Chem. 73, p. J2i.

De didactyle extremiteit der Vertebrata moet als primitiever
worden beschouwd dan de pentadactyle.

De Hexapoda kunnen samen met Cumacea. Amphi- en Iso-
poda van een gemeenschappelijken oervorm worden afgeleid.

Het is mogelijk bij Phanerogamen door bevruchting het aantal
chromosomen doelbewust te vermeerderen.

Zoogenaamde myrmekophile planten vertoonen geen aanpassing
aan een symbiose met mieren.

Niettegenstaande groote verschillen in bouw en grootte van
het rostrum, hebben alle Belemniten zich in horizontalen stand voort-
bewogen.

Het haemoglobine van den regenworm is voornamelijk een
transportmiddel voor koolzuur.

Bij de bestrijding van virusziekten moet meer aandacht worden
geschonken aan de bestrijding van bladluizen.

Physiologie der dieren is onontbeerlijk in de opleiding
biologen voor onderwijs en praktijk.



	! y ■ - ■
	iy\'

I



, ff\'.. • : \' .



	«

Cu gehalte	O2 gehalte	Opgei. Oi	Geb. O2
in mgr. p. c.M^.	in vol. "/o.	in vol. %.	in vol.
0.051	1.48	0.7	gemid.
	1.38	0.65	0.75
0.052	1.44	0.64	gemid.
	1.44		0.8
	1.43
0.057	1.54	0.63
	1.57	0.66	gemid.
	1.47	0.63	0.9
	1.50	0.65

Cu gehalte	O2 gehalte	Opgei. O2	Geb. O2
in mgr. p. c.M^.	in vol.	in vol. Vo-	in vol.
	1.14	0.59	gemid.
0.033	1.14	0.57	0.85
	1.16

Genomen Cu in mgr.	Titcrcijfer in c.M\'. 0.989X0.002 N. thio.	Gevonden Cu in mgr. gemiddeld uit triplo.
0.010	0.115; 0.105; 0.110	0.014
0.020	0.180; 0.180; 0.185	0.023
0.050	0.430; 0.415; 0.420	0.053
0.100	0.780; 0.795; 0.800	0.099
0.200	1.610; 1.638; 1.630	0,204
0.505	4.000; 4.010; 4.020	0.504
1.000	7.860; 7,850; 7.890	0.990

Titercijfer	Afwijking
0,001 N. thio.		---
in mgr.	in %
0.330:0.341	2	10
0.626 :0.625	1	2.5
0.910: 0.920	0	0
1.235: 1.225	- 1	— 1.2
1.511 : 1.520	- 1	- 1
4.600:4.613	-3	- 1
7.648:7.641	-6	- 1.2

N\'.	Toegevoegd.	Klemspanning en Tijd.	Temp.	Gevonden koper.	Samenstelling v/h. mengsel.
1	1 druppel 4 N. H, SO4 2 druppels 4 N HNO3 20 mgr. ureum.	3 Volt gedurende 15 min. 4 „ „ 10 „ 9.5 „ 10	75°	0.100 mgr. (titratie na toevoeging van Nap oplossing),	0.1 mgr. Cu 0.1 Fe 0.1 „ Pb 0.4 Zn 0.1 .. Mn 0.02.. As
2	als bij 1.	3.2 Volt gedurende 25 min.	750	0.099 mgr. (titratie zonder toevoeging van Na F oplossing).	0.1 mgr. Cu 0.1 Fe 0.2 „ Pb 0.3 Zn 0.2 Mn 0.01.. AS
3	als bij 1.	3.2 Volt gedurende 20 min.	75"	0.0995 mgr. zonder Na F	0.1 mgr. Cu 0.1 .. Fe

Datum.	Gevonden koper na electrolyse.	Gevonden koper zonder electrolyse.	Opmerkingen.
5-IV-\'23	0.127 mgr. 0.127 .. 0.127 „	0.134 mgr. 0.134 .. 0.134 „	Bij de directe titratie was de sulfaatasch niet geneutraliseerd.
7-V-\'23	0.129 mgr. 0.129 „ 0.129 ..	0.133 mgr. 0.140 „	Sulfaatasch vóór de titratie met loog geneutraliseerd.

Duur in minuten.	Temp. der oplossing.	Door titratie terug- gevonden hoeveel- heid Cu in "/o.
120	75" C.	99
	»» >»	87
tt	ff t*	88
„	ff tf	91
180	ff n	71
120	ff ff	100
ff	tf ff	100
„	„	100
60	95°	90.5
	ff ff	88.5
180	70° ..	95
17	95°	96
20	f» ft	95
25	70° ..	100

N\'.	Klemspanning in Volt.	Stroomsterkte in Ampère.	Toegevoegd.	Duur in minuten.	Temp. der oplossing.	Door titratie terug- gevonden hoeveel- heid Cu in "/„.	Datum.	Opmerkingen.
15	3		2 dr. sterk Hj SO.,	120	80° C.	82.5	29-I-\'23
16	1 f		0.5 C.M3. 4 N. Hj SOi		f»	86	30-I-\'23
17	f f			ft	ff	88.5
18	f f		„			89	II
19	3.2		2 dr. sterk H« SO,			104	29-I-\'23	Ijzer mede afgescheiden.
20	ff		0.5 c.M\\ 4 N. Ha SO4	90	95° ..	80	8-II-\'23
21	f t			105	1» ••	87		•
22	3.8			120	80° ..	110	24.I-\'23
23	ff		f»	ft	II	107.5		tf t» tl
24			geen zuur	^ j	fi	140	II	tt ft tl
25		■ 0.025	0.5 C.M3. 4 N. Hï SOi	60	95° ..	87.5	23-II.\'23
26				45	II »»	92.5	23 ..
27	11		>•	270	II »•	85	19 ..
28	5.8 -		0.3 C.M3. 4 N. Ha SOi	20	II	89.5	26 ..
29	11		0.5	30	11 ♦♦	89	27
30	7.3		ft	15	80° M	95	6-IlI-\'23
31	f •		* ,,	25	75° ..	103	II	II it it
32	t f		M	25	■>	103		tl it tt
33	7.5			20	95° ..	100	2-III-\'23
34	11		»*	150	80° ..	175	II	11 1» tl
35	7.75 t»			15	70° ..	97	9 ..	Door spatten iets verloren.
36			20	65° ..	105	8	Ijzer mede afgescheiden.
37	f f			20	1» "	104	8 ..	tl

Duur in min.	Temp. der oplossing.	Door titratie terug- gevonden Cu In %.	Datum.
240	75° C.	8.5	21-III-\'23
390	90° „	92	20-III
150	80° „	100	31-1
90	95° „	99.7	5-II
90	95° ..	90.5
210	tf	83		tt
180	80°	94.5	21-111
330		92	22
360	»»	91	23	fi	t»
20	75°	95	5-IV
20	>t	95		tf
20	»»	100	4		tt
20		100		ft
30		95	9	tt	tt
17		92.5	4	tf	ft
15	80° „	91	27-111	tt
20	ft	84.5	28		ft
20		97.5	28	tt	tt
20	75°	92.5	4-IV	„
30	65°	100	10	tt	tf
..		105
»»		97		tf
»1		96.5
60	70° ..	100	12		ff
60	ft	100		ft
45	65° ..	100
55	70° ..	950/0	13	tt	tf
35	70° ..	95 «/o
45		99
»♦	„	100
*t		100
»f		97 0/0
35	85° ..	104	4-V	tt
tt	75° ..	100	7	ft	ff
50	75° ..	100	9
15	75° ..	100
85		93	7	tt	tt

Datum.	Barom. (gecor- rigeerd).	Temp. gedest. water in gr. C.	Temp. badw. in gr. C.	Lengte gasbel in m.M.	Inhoud capill. per m.M,	Vol. gasbel gered, tot 0° en 760 m.M. droog in m.M®.	2 c.M\'. gedestilleerd water bevat volgens de tabellen van Fox	Afwij- king in m.M^
O,	N,	CO:	Totaal.
26-IV-23	750.7	14.7	14.5	86.5	0,550	47.6 X 0.923 = 43.9	14.3	27.2	0.6	42.1	1.8
	750.0	14.8	14.5	80.5	tf	48.7 X 0.922 = 44.9	14.3	27.2	0.6	42.1	2.8
	749.0	15.1	14.7	84.0		46.2 X0.919 = 42.4	14.3	27.0	0.6	41.9	0.5
	748.0 t	15.4	14.8	87.0	ft	47.8X0.918 = 43.9 1	14.1	26.8	0.6	41.5	2.4
28-IV-23	750.1	12.1	11.8	84.5		1 46.5 X 0.933 = 43.4	15.1	28,4	0.7	44.2	— 0.8
	750.0	13.0	12.2	88.5		48.7 X 0.931 = 45.3	14.8	27.8	0.6	43.2	2.1
	749.8	14.0	13.0	86		47.3 X 0.928 = 40.9	14.5	27.4	0.6	42.5	1.6
	749.2	15.1	13.9	86.5		47.6 X 0.923 = 44.0	14.3	27.0	0.6	41.9	2.1

Inhoud van de capillaire per m.M.	Oorspronke- lijke lengte der luchtbel in m.M.	Lengte na Oj abs. in m.M.	Geab- sorbeerde Oj in m M.	O^ gehalte in 7„.	Nj gehalte in %.
0.853 m.M\'.	256.0 227.5 243.0 211.0	202.5 179.0 192.5 167.0	53.5 47.5 50.5 44.0	20.9 20.9 20.8 20.9	79.1 79.1 79.2 79.1
ft	119.0 110.5 106.0 112.0	94.0 87.5 84.0 88.5	25.0 23.0 22.0 23.5	21.0 20.8 20.8 21.0	79.0 79.2 79.2 79.0
	60.0 63.0 71.5 58.5	48.0 50.0 57.0 47.0	12.0 13.0 14.5 11.5	20.0 20.6 20.3 19.7	80.0 79.4 79.7 80.3

12.3	176.5	74.5	50.0
13.0	150.0	77.0	51.5
13.6	103.0	52.0	36.0
14.0	90.0	54.5	38.0

Titercijfers ± 0.001 N. thio in c.M^.	Gevonden Cu. in mgr.
Bloed.	0.1 mgr. standaard oplossing.
1.655 1.640 1.630	1.445 1.455	0.113 gemiddeld.

^\'»houd capill. Per m.M. m.M\'\'.	Vol. O2 gereduc. 0° C. 760 m.M. droog, in m.M^	Red. fact.	Datum.
0.550 0.853 0.853	12.6 1 j ( gemidd. 12.85 13!O )	0.935 0.932 0.929 0.927	28-III-\'24.
\' ^ versch	bloed.
^^hoüd capill. per m.M. m.M3.	Vol. O2 gereduc. 0° C. 750 m.M. droog, in m.M\'.	Red. fact.	Datum.
0.550 0.550 0.853 0.853	30.8 j gemidd. 30.8 30.0 )	0.932 0.930 0.927 0.926	28-III-\'24

	■■ \'. I.\'
i	\' 1

Titercijfers ± 0.001 N thio in c.M\',	Gevonden Cu in mgr.
Bloed.	0.1 mgr. stand. opl.
1.675 1.685 1.670	1.610 1.620	0.104 gemiddeld.

Groep.	Barom. gecorr.	T. op- lossing in gr. C.	T. bad- water in gr. C.	Lengte gasbel in de capill. in JD-^
Oorspr.	Na Oj abs.	O., wegg^\'
I	756.8 756.8 756.8	15 ff	14.5 tf ff	135.5 133.4 134.0	12.0 11.0 12.0	123.5 121.5 122.0
II	756.8 ft	15.1 ft ff	14.5 ft	129.5 126.0 126.5	21.0 20.0 21.5	108.5 106 10.5

Vol. % 0,	Temp.
4.2	18°C
3.9	18°
2.2	19°
1.45	17°
2.4	22°
1.6	18°
1.6	18°
3.9	18°
3.9	18°
3.1	17°
3.0	18°5
1.6	18°
1.6	18°

capill. Per m.M. m.M^.	Vol. O2 gereduceerd 0\' C. 760 m.M. droog in m.M®.	Red. fact.	Datum.
0.853	28.9 )	9.41	17-V-\'24.
ft	28.7 [ 28.8	9.33
ff	28.7 )	tf

Gevonden totale hoeveelheid O2	gemiddeld. . . .	28.8 m.M3.
„ opgeloste		12.8 ..
gebonden	.......	16.0
„ hoeveelheid Cu „
	Sp. 0. C.	154 ..
"/o van de theoret. waarde (176)	.......	87.5 ..

Titercijfers ± 0.001 N thio in C.M3.	Gevonden Cu in mgr.
Hcy opl.	0.1 mgr. stand opl.
4.495 4.500 4.475	1.575 1.585 1.560	0.285 gemiddeld. .

Groep I.	Gevonden totale hoeveelheid O2 . . .	97.1
	Berekende opgeloste hoeveelheid O2 . .	48.0
	„ gebonden „ ....	49.1
		0.285
	Sp. 0. C.	172
	"/o van de theor. waarde (176) . . . .	97.7
Groep II.	Gevonden totale hoeveelheid O2 . . .	84.4
	Berekende opgeloste hoeveelheid O2 . .	35.0
	„ gebonden „ „ • •	49.4
	Gevonden Cu gemiddeld......	0.285
	Sp. 0. C.	173
	"/o van de theor. waarde (176) . . . .	98.2

Barom.	T. bloed	T. badw.	Lengte gasbel in de capill. in	m.M.
gecorr.	in gr. C.	in gr. C.	Oorspr.	NaCOaabs.	Na O2 abs.	O2 we00\'
752.0	15.3	14.5	60.5	48.0	33.0	15.0
tt	tt	14.4	62.0	46.5	32.0	14.5

Titercijfers ± 0.001 N. thio. in c.M^.	Gevonden Cu in mgr.
Bloed.	0.1 mgr. stand. opl.
2.050 2.060 2.075	1.545 1.550 1.540	0.133 gemidd. dus in 3 C.M3. 0.100

Gevonden totale hoeveelh. O2 gemiddeld . .	34.3 m.M3.
„ opgei. „ .... ...	17.4 ..
„ gebonden „ .. ...	16.9 ..
„ hoeveelheid Cu „ ...	0.100
Sp. 0. C.	169
0/0 van de theor. waarde (176)......	96

Cu in	Opge-	Gebon-
mgr.	lost.	den.
28.5	0.6	3.6
23.	0.6	3.3
11.5	0.65	1.55
6.5	0.7	0.75
8.	0.6	1.8
7.0	0.6	1.0
5.5	0.6	1.0
10.0	0.6	3.3
8.5	0.6	3.3
10.5	0.6	2.5
9.5	0.6	2.4
4.5	0.6	1.0
3.0	0.6	1.0

Temp. 15° C.	Gasmengsel.	Totale O2.	Opgel. O2.	Geb. O2.	Verzad. in	0/0.
Barom.	2.60/0 02=19.4m.M.	13.1; 12.3 m		1.8 m	i.M\'.	11.3; 10.5 m.M\'.	36.0; 33.5,
761.2
	5.1 „ =38.0 ..	16.4; 16.7	t»	3.6	»>	12.8; 13.1	40.6; 41.6.
Waterd.
Sp. 12.8	8.5 .. .. =63.5 ..	21.5; 21.5; 24.0	"	6.0	tt	15.5; 15.5; 18 ..	49.2; 57.2;	49.2.
	12.0.. .. =89.5 ..	25.0; 24.0; 26.5	ft	8.2	ff	16.8; 15.8; 18.3	53.5; 50.0;	58.0.
	\|l4.9„ „ =111.0 „	29.9; 32.0	ff	11.0	ff	18.9; 21.0	60.0; 66.5.
	20.9 „ „ =15.6 ..	39.0; 38.1	f9	14.4		24.6; 23.7	78; 75.
Gevonden Cu in 2 c.M\'. 0.179 mgr.	100 0/0 verzad. = 0.179 X 176 i	= 31.5