BIJDföVGE TOT DE KENNIS DER
BACTERIEELE GISTINGEN

■

"■Sï-

.V- V

■ ♦ \' «.

» ,
% »

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DEN
GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUUR-
KUNDE AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE
UTRECHT OP GEZAG VAN DEN RECTOR-MAG-
NIFICUS Dr. H. F. NIERSTRASZ, HOOGLEERAAR
IN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUN-
DE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER
UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN
DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE
TE VERDEDIGEN OP MAANDAG 1 DECEMBER
1924, DES NAMIDDAGS TE 4 UUR DOOR

\' -ri^, ■ \'

-1 ■ •

.v-i-

V - ■ .

Bij het voltooien van dit proefschrift is het mij een behoefte,
U, Hoogleeraren in de Faculteit der Wis- en Natuurkunde,
mijn dank te betuigen, voor het onderwijs, dat ik van U mocht
ontvangen,

U, Hooggeleerde Cohen, dank ik ten zeerste voor het van U,
op colleges en practica, genoten onderricht. In het bijzonder
waardeer ik het, dat Gij mij na mijn doctoraalexamen op zoo
welwillende wijze steun hebt verleend,

U Hooggeleerde van Romburgh^ hen ik zeer erkentelijk voor
al datgene, wat ik door Uw onderricht heb geleerd. De kritische
geest, die in Uw onderwijs op den voorgrond treedt, zal voor
mijn verder leven van groot nut zijn.

Met zeer veel genoegen. Hooggeleerde Kruyt, denk ik steeds
terug aan Uw heldere en boeiende colleges. Voor het van U
genoten onderwijs en Uw leerrijken, vriendschappelijken omgang,
blijf ik U in hooge mate dankbaar,

U, Hooggeleerde de Graaff, Hooggeachte Promotor, ben
ik zeer veel verschuldigd, voor de bereidwillige wijze, waarop
Gij mij steeds met raad en daad hebt bijgestaan hij de bewerking
van dit proefschrift.

De belangstelling, die Gij bij mij hebt opgewekt voor de
grondproblemen der biochemische wetenschappen, is mede
oorzaak geweest, dat ik mijn studie onder uw leiding heb willen
beëindigen.

Zeer waardeer ik Uw toewijding en hulpvaardigheid, die
Gij mij steeds onverflauwd getoond hebt.

De uitbreiding mijner gezichtkring onder Uw leiding is voor
mijne ontwikkeling van hooge waarde geweest.

Ook aan U, Hooggeleerde Schoorl, mijn dank voor de
welwillendheid, waarmede Gij mij steeds hebt willen ter zijde
staan.

■ r -li-\'r u^. ,

• , - -.fr.- ,

. ,. ■ /

De ervaring leert^ dat ?oowel suikerrijke, plantaardige^
als eiwitrijke, dierlijke producten gemakkelijk en spontaan
in ontleding overgaan, wanneer zij eenigen tijd aan «ich
zelf worden overgelaten, maar, terwijl de eerstgenoemde
zelfstandigheden doorgaans een gisting doen ontstaan, ver-
wekken de laatstgenoemde stoffen een meer of minder in-
tensieve rotting.

In het dagelijksch leven is men in staat deze beide pro-
cessen gemakkelijk te onderscheiden, maar beschouwt men
ze van uit een meer wetenschappelijk standpunt, dan
blijken beide omzettingen moeielijker te onderkennen, ja
zelfs een analogen aard te bezitten, omdat beide slechts door
den invloed van microörganismen tot stand kunnen komen.

Het is voornamelijk Pasteur geweest, die aantoonde, dat
de gisting, zoowel als de rotting veroorzaakt worden door
microben, waardoor hij het eerste licht deed opgaan, aan-
gaande den waren aard en de ware beteekenis dezer, reeds
sedert de oudheid, den mensch bekende processen. Een
schrede verder wordt afgelegd, wanneer Büchner in
1897 bewijst, dat de alcoholische gisting een, van de levende
gistcel af te scheiden, fermentatief proces is.

Met de ontdekking der zymase in het kiemvrije gist-
perssap, is dus het proefondervindelijk bewijs geleverd
voor het bestaan van een zoogenaamde celvrije gisting.

Toch moet men op grond hiervan niet zeggen, dat daar-
mede de uitspraak van Pasteur kwam te vervallen, die toch
in de gistmg een zuiver microbiologisch proces zag, want
zonder levende gistcel, geen zymase.

welke tracht door te dringen in het eigenlijke wezen van
het gistingsproces ^elf.

De suikerontledingen, die door micro organismen worden
veroorzaakt, worden doorgaans aangeduid door het product,
dat \'t meest op den voorgrond treedt. Zoo spreekt men van
de melkzure gisting, waarbij uit koolhydraten in hoofdzaak
melkzuur wordt gevormd, b.v.: Q H^g 0, = 2C, H, O3;
de methaangisting, waarbij nevens kooldioxyde groote
hoeveelheden methaan uit het suikermolecuul ontstaan,
b.v.: Ce Os = 3 ch, 3 CO^.

Een andere, zeer bekende gisting is de boterzme gisting.
Hier onstaat, naast CO^ en H^, belangrijke hoeveelheden
boterzuur.

De gisting, welke in het volgende aan een nader onderzoek
werd onderworpen, kan worden aangeduid met den naam
van de gemengd zure gisting. Zij wordt o.a. veroorzaakt door
een bepaalde groep van bacteriën n.1. de coli-typhus-
familie.

De stoffen, die hier als eindproducten optreden,zijn: melk-
kuur, azijnzuur, mierenzuur en barnsteenzuur, welke aldus
aanleiding werden te spreken van „gemengd zure gisting";
terwijl tevens gassen ontstaan, n.1. kooldioxyde en waterstof.
Hoewel de eindproducten van deze gisting bekend zijn,
wordt een juist inzicht, aangaande het chemisme, dat hier
onder den invloed der microscopisch kleine wezentjes tot
stand komt, nog steeds gemist. Het is hier hetzelfde geval
als het voor kort nog was met de alcoholische gisting, waar-
van begm- en eindproducten bekend waren, maar waarvan
de omzetting of de omzettingen, welke plaats grijpen, nog
geheel m \'t duister waren gehuld.

Het probleem, het wezen der gemengd zure gisting in
studie te nemen, leek, na de gelukkige wijze, waarop
Neuberg zich met het vraagstuk der alcoholische gisting
heeft bezig gehouden, zeer gewenscht, te meer nu Neuberg
van meening schijnt, dat, hetgeen hij voor de alcoholische

gisting tracht waar te maken, ook voor andere o.a, bacterieëie-
gisting zou gelden, ja, dat zijn opvatting een algemeene basis
vormt ter verklaring van alle gistingsverschijnselen.

Als we de onderzoekingen over de gemengd zure gisting,
veroorzaakt door de coli-typhus-groep, in de litteratuur
naslaan, dan kunnen we twee verschillende richtingen van
onderzoek vinden.

Eén groep van onderzoekers heeft zich daarbij voorname-
lijk bezig gehouden met het vinden van differentieel
diagnostische kenmerken.

Zoo heeft b.v. Ducamp i) de ontleding van verschillende
koolhydraten door paratyphus-hzctericn uitvoerig onder-
Zocht.

Ook de Graaff heeft de vergisting der koolhydraten
door de Paratyphioideeën bestudeerd, maar, terwijl Ducamp
zijn onderzoek niet uit structuurchemisch standpunt heeft
beschouwd, is dit door de Graaff wel gedaan. Tevens is
dit onderzoek meer systematisch en over de meer zeldzame
suikers uitgebreid, terwijl bovendien verschillende stammen
in onderzoek werden genomen.

De andere groep van onderzoekers heeft meer op het
chemisch gebeuren, tijdens de ontledingen, gelet.

Zoo o.a. is het Harden =»), die de vergisting van druiven-
suiker door Bact, coli {commune) heeft bestudeerd. Hij
meent deze ontleding als volgt in formule te mogen brengen:

Hoe fraai en verrassend kloppend op het eerste gezicht
ook, houdt deze formule in het geheel geen rekening met
mierenzuur, noch barnsteenzuur, twee producten, die bij
deze gisting zonder eenigen twijfel steeds en zelfs in be-
langrijke hoeveelheid gevormd worden,

Harden heeft bovendien de gassen, die ontstaan, ge-
analyseerd en zich de vraag gesteld, of deze steeds in een
onderhng constante verhouding ontstaan.

PoTTEviN 1) heeft een zelfde onderzoek gedaan als Harden,
m^r gebruikte, inplaats van coZi-, paratyphus-hacttrièn,
Hij vindt bij de ontleding van glucose de volgende eind-
producten: alcohol, azijnzuur, melkzuur, barnsteenzuur,

De laatste tien jaar heeft men zich in \'t bijzonder toe-
gelegd, om het chemisme van de gisting te bestudeeren.
Zooals gezegd, is het Neuberg, die zich dit onderwerp tot
Zijn levenswerk heeft gesteld.

Hoewel Neuberg en zijn leerhngen zich voornamelijk
met de alcoholische gisting hebben bezig gehouden, hebben
ZIJ toch ook onderzoekingen gedaan, ten opzichte van de
barteneële, boterzure en gemengd zure gisting.

De theorie, die hij heeft uitgewerkt voor de alcoholische
gisüng, biedt, naar hij meent, groote kans licht te versprei-
den over het wezen der gisting in \'t algemeen, althans geeft
Zi) voldoenden grond om te trachten erop voort te bouwen,
in de hoop aldus een verklaring te vinden voor het ont-
staan van de vele en uiteenloopende producten der
gisting.

Voordat Neuberg zich met het ontledingsprobleem bezig
hield, waren er al vele onderzoekers geweest, die verschil-
lende theorieën over het uiteenvallen van de koolhydraten
onder invloed van microben hadden opgesteld.

Waar een alcoholische en een gemengd zure gisting zoo
memgmaal gecombineerd optreden, bovendien de vorming
van melkzuur uit suikerachtige materie, zoowel in het
dierlijk organisme, als onder invloed van alkaliën, gemakke-
lijk tot stand komt, ligt het voor de hand te meenen, dat de

ontleding van het hexosemol. (Q H^^ 0«) ingeleid wordt
door een uiteenvallen in twee triosemoL (Cg Hg O3).

Daar melkzuur dezelfde empirische formule heeft, werd
de hexosesplitsing voorgesteld als het ontstaan van twee
mol. melkzuur. Deze hypothese is het eerst uitgesproken
door Nencki, maar werd voornamelijk door Büchner en
Meisenheimer verdedigd.

Ook heeft von Bayer dezelfde gedachte gehad. Hij
trachtte te verklaren, door het uittreden en weder intreden
van de bestanddeelen van water, hoe een hexose-mol. kan
overgaan in een lichaam van hypothetische structuur:
CH, - CHOH - C (OH), -C (OH)^ - CHOH - CH3,
dat vervolgens, door uittreden van water, in CH3 —
CHOH - CO - CO - CHOH - CH3 overgaat, welk
hchaam gemakkeliik in twee mol. melkzuur uiteenvalt,
waartoe slechts de medewerking van twee mol. water
noodig is.

Hoewel deze hypothese onhoudbaar bleek, doordat gist
noch melkzuur, noch de melkzure zouten ontleedt, werd
de triosehypothese niet afgezworen. Er zijn immers nog
andere stoffen, die dezelfde empirische formule hebben als
melkzuur en zoo waagden Büchner en Meisenheimer
thans de veronderstelling uit te spreken, dat dioxyaceton,
Loeb, dat glycerinealdehyde en Wohl, dat methylglyoxaal
het zoo lang gezochte tusschenproduct der alcoholische
gistmg was. Het experiment stelde deze onderzoekers
spoedig te leur, daar genoemde stoffen door de levende
gistcel slechts langzaam en moeiliik worden aangetast; zij
konden dus bezwaadijk als tusschenproducten bij het zoo
stormachtig verloopende proces worden opgevat.

Hoewel de triosehypothese dus volgens de feiten on-
houdbaar was, kreeg zij op onverwachte wijze steun door
geheel andere biochemische omzettingen.

Bij deze omzettingen was gebleken, dat de a-ketonzuren
als intermediaire stofwisselingsproducten in het dierlijk

organisme optreden. Een dezer ketonzuren bleek het pyro-
druivenzuur te zijn. Dit zuur, dat gemakkelijk door oxydatie
uit methylglyoxaal onstaat, werd zelfs door Fernbach en
Schoen i) bij de alcoholische gisting, in tegenwoordigheid
van CaCOg, aangetoond.

Het is de pathologie geweest, die ons het verband heeft
geleerd tusschen de a-ketonzuren en de triosehypothese.

Door Neubauer is n.1. gevonden, dat de a-aminozuren,
die in het eiwitmolecule voorkomen, door het dierlijk or-
gamsme over de a-ketonzuren als intermediaire producten
worden afgebroken.

Naast de belangrijke ontdekking van Neubauer, toonde
Felix Ehrlich 2) aan, dat de gistcel in staat is de a-amino-
zuren, in een suikerhoudend milieu, om te zetten tot pri-
maire aminen, welke één C atoom minder in het mol. be-
zitten.

Zoo vormt gist uit alanine aethylalcohol:
CH3 - CH NH2 - COOH —^ CH3 - CH, OH.
uit leucine amylalcohol:
CH

Ook hier sprak Neubauer de gedachte uit, dat, in aan-
slmting en in overeenstemming met de desamineering door
het dierlijk orgamsme, al weder de a-ketonzuren als pri-
maire tusschenproducten zouden kunnen fungeeren en ook

Evenals de a-aminozuren, worden\' de a-ketonzuren
door de gist tot primaire alcoholen met één C atoom minder
omgezet.

Ontstaat dus uit het phenylalanine
(Q H5 CHa CHNH2 COOH) phenylalcohol (Q H, CH^ CH^
OH), uithetphenylpyrodruivenzuur (Cg Hg CHg CO COOH)
wordt dezelfde verbinding gevormd.

Dat de ontleding der a-aminozuren over de a-keton-
zuren verloopt, en dat niet de a-oxyzuren tusschen pro-
ducten zijn, bewees men uit het feit, dat de a-oxyzuren
door de gistcel onaangetast bleven.

De ontdekking van Ehrlich is voor het probleem van
de gisting van groot belang geweest. Zij verspreidde licht
over het ontstaan der foezelolie, welke niet langer als een
product der suiker-, maar veeleer als een der eiwitontleding
moet worden beschouwd, terwijl zij tevens Neubauer tot
de uitspraak verleidde, dat ook bij de suikerontleding,
tijdens de alcoholische gisting, de ketonzuren, met name
het pyrodruivenzuur, een rol van groote beteekenis zouden
kunnen vervullen.

Hebben Neubauer en Ehrlich het licht ontstoken, de
man, die hierop voortbouwende een geheel nieuwe gistings-
theorie heeft opgesteld, die een beeld gaf van de verschil-
lende phasen der ontleding van de suikerachtige materie
van af het koolhydraat tot aan de eindproducten, is Neuberg.

De eerste stap in deze richting is zijn ontdekking van de
suikervrije gisting, n.1. de inwerking der gistcel uitsluitend
op ketonzuren. Hij vindt, dat de levende gistcel, zoowel als
het gistperssap, in staat blijken, die zuren te ondeden onder
vorming van kooldioxyde en een aldehyde met één C atoom
minder dan het zuur, dus:

Hij neemt ter verklaring aan, dat de gistcel een bijzonder
e^ym produceert, de carboxylase, dat aansprakelijk voor
die ontleding moet worden gesteld.

De suikervrije gisting brengt een nieuw inzicht, aangaande
het wezen der alcoholische gisting.

Neubeeg bewijst niet alleen het bestaan der carboxylase
m de levende gistcel, maar tevens in het gistperssap
en m de kiemvrije gistpraeparaten. Hij heeft aangetoond,
dat, waar een zyraatische werking is ook steeds een carboxy-
lase aanwezig is.

QH,,0e==2QH,03.
en zich daarbij denkt, dat de gevormde triose, het methyl-
glyoxaal is, dat gemakkelijk en snel tot pyrodruivenzuur
Zich omzet, welk jjuur onder invloed der carboxylase in
kooldioxyde en acetaldehyde wordt ontleed.

Het bezwaar tegen deze hypothese is, dat het methyl-
glyoxaal, waaruit de andere producten moeten ontstaan,
door gist absoluut niet wordt ontleed.

Neüberg heeft deze moeiUjkheid omzeild, door er op te
wijzen, dat er minstens 8 isomere vormen van het methyl-
glyoxaal kunnen bestaan en dat de vorm, die ontstaat bij
het uiteenvallen van het hexosemol. dus een andere zijn
moet dan dien, welken wij door onze synthese kennen.
Trouwens de formule CH3 CO CHO of C3 H, O, wijst er
reeds op, dat een hydraat hier met groote waarschijnlijkheid
een rol zal spelen, wil althans het eerste splitsingsproduct
der smker aan de formule van een triose C3 H. O3 voldoen.

Neüberg krijgt een flinken steun voor zijn gedachte door
het feit, dat het pyrodruivenzuur zoo gemakkelijk te ver-
aten IS en later nog doordat het hem gelukt acetaldehyde,
het ontledingsproduct van het pyrodruivenzuur, vast te
leggen. Door aan te nemen, dat pyrodruivenzuur als tus-
schenproduct optreedt, is de moeilijkheid, om het ontstaan
van kooldioxyde te verklaren, overwonnen.

Neuberg denkt zich, dat de aethylalcohol ontstaat uit
het acetaldehyde, cn wel, door aan te nemen, dat het methyl-
glyoxaal met het acetaldehyde de omzettingen van Cannizzaro
volbrengt, als volgt:

Hierbij treedt pyrodruivcnzuur op, dat uiteenvalt in CHj
CH0-fC02,0nderde katalytischewerkingvande carboxylase.

Neuberg heeft zich dus een beeld gevormd van de
ontleding van \'t suikermolecule door gist, en hoewel de
eindproducten der gemengd zure gisting geheel andere zijn
dan die der alcoholische gisting, heeft reeds hij getracht, in
aansluitingmetzijntheoretische en experimenteele bewijzen,
ook eenig licht te verspreiden over het wezen der kool-
hydraat-ontleding door de bacteriën.

Wil men doordringen in de ontieding van stoffen met
zes C atomen, dan lijkt het ons noodzakelijk de vraag,
welke van zeer samengestelden aard is, eenvoudiger te
formuleeren en eerst de vergisting van stoffen met twee en
drie C atomen te bestudeeren.

Dit werd dan ook gedaan en de stoffen, die hiervoor in
aanmerking kwamen, geënt in hoofdzaak met de coli-hac-
teriën, daar het onderzoek veel te uitgebreid zou worden, om
alle bacteriën van de coli-typhus-gtotp op al deze stoffen
te laten inwerken. Alleen daar, waar de gisting met de
andere bacteriën nieuwe inzichten kon geven, hetzij over
den invloed der chemische structuur, hetzij over eventueele
tusschenproducten, zijn ook die proeven ingezet.

Want een nauwkeurige studie van de omzettingen der
suikers en suikerachtige lichamen met een gering aantal kool-
stofatomen, kan met waarschijnlijkheid een beter en gemakke-
lijker inzicht geven van de eigenlijke suikerontleding, ofwel,
daarvoor een waardevolle werkhypothese doen opstellen.

De microörganismen, die het vermogen bezitten de kool-
hydraten te ontleden onder vorming van melkzuur, barn-
steenzuur, azijnzuur, mierenzuur, benevens COg en Hg, als
eindproducten, kunnen tot een bepaalde groep n.1. tot die
van de bacteriën der gemengd zure gisting worden samen-
gevat. Tot deze groep behooren de coli-typhusachtige
organismen, welke een zeer groot aantal verschillende
soorten omvatten, die zoowel saprophyten als parasieten zijn.

Tot deze laatsten rekent men de paratyphus-, de typhus-,
en de dysenterie-hacterièn, terwijl de meeste co/z-bacteriën
een saprophytisch karakter vertoonen.

Voor het volgend onderzoek zijn van al deze soorten
eenige stammen in studie genomen, echter, om het te be-
perken, werd in hoofdzaak het meest actieve organisme, het
B. coli gekozen.

De bacteriën werden, alvorens te worden gebruikt,
steeds op hunne kenmerkende eigenschappen gecontro-
leerd. Dit geschiedde, door van de culturen verdunningen
te maken in steriel water en hiervan platen te gieten. Na
tweemaal 24 uur werden de geïsoleerde kolonies overgeënt
op schuin gestolde agar en van deze culturen de eigen-
schappen nagegaan op de gebruikelijke en specifieke
voedingsbodems. Tijdens het onderzoek werd tevens de
zuiverheid der stammen gecontroleerd.

De proeven werden steeds genomen met 24 uur oude
agar-culturen. Bij de drie co/istammen, deed zich het eigen-
aardige verschijnsel voor, dat één der stammen een positieve

reactie van Voges-Proskauer gaf, terwijl de twee andere
deze reactie niet gaven.

Daar deze drie organismen eigenbeweging bezaten en
een volkomen coliachtigen groei te zien gaven, werden zij
alle drie als coZz-bacteriën beschouwd, en het laatst bedoelde
niet met B. lactis aërogenes (onbeweeglijk — slijmvorming)
vereenzelvigd, daar we meenen, dat dit ongeoorloofd is.
De reactie van Voges-Proskauer wordt in Amerika ge-
bruikt om faecale coli- te onderscheiden van andere coli-
bacteriën. Hier gebruikt men daarvoor meestal de proef
van Eijkman. De reactie van V.-P. berust op het feit, dat
de co/f-bacteriën uit een bijzonderen voedingsbodem, waarin
glucose is opgelost, diacetyl produceeren. Deze stof, die
waarschijnlijk uit methylacetylcarbinol CH3 CH OH COCH3
(aldolcondensatie van acetaldehyde) wordt gevormd, ver-
bindt zich onder invloed van 10 % kaliloog met arginine
of kreatine tot een eösineachtig gekleurd lichaam, terwijl
uit denzelfden voedingsbodem deze coZz-bacterie niet zooveel
Zuurproduceert,datraethylroodduidelijkroodwordtgekleurd.

Deze eene co/istam gaf dus een positieve Voges-Proskauer
reactie, een negatieve methylrood-reactie en een negatieve
vergisting bij 45\' C. Dit is in volkomen overeenstemming met
hetgeen van Dongen en de Graaff geconstateerd hebben,
die voor het eerst een verband hebben aangetoond tusschen
de gisting bij 45° C., de reactie op methylrood en die van
Voges-Proskauer.

Behalve de bacteriën der coli-typhus-gvotp werd bij dit
onderzoek nog een andere bacterie gebruikt en wel voor de
bereiding van dioxyaceton, n.1. de Acetobacter suboxydans.

Deze bacterie heeft het vermogen, om glycerine om te
zetten in dioxyaceton, zooals in \'t algemeen de meer-

waardige alcoholen tot ketosen, evenals de bekende sor-
bosebacterie van Beltrand.

Een uitvoerige beschrijving van het organisme vindt men
in het Tijdschrift voor Vergl. Geneeskunde, door Klüyver
en de Leeuw. ^

Het komt in \'t kort hierop neer, dat deze microbe geënt wordt op
verd. gistwater, waaraan 2% glycerine is toegevoegd. Dc kolf wordt
10 k 14 dagen bij 25° C. geplaatst; de glycerine is dan grootendeels
omgezet in dioxyaceton. De kolfinhoud wordt afgefiltreerd en in
vacuum beneden 30° C. ingedampt. Er blijft een h\'chtbruine stroop
in de kolf achter; deze wordt met een tienvoudige hoeveelheid abs.
alcohol geschud. Dioxyaceton lost op, terwijl de verontreinigingen
achterbh\'jven; deze worden geheel neergeslagen door daarna de helft
van het volume der oplossing aan aether toe te voegen. Na flink
schudden, laat men 24 uur staan cn filtreert dan dc heldere vloeistof
af. Deze h\'chtbruine vloeistof wordt weer beneden 30° C. in vacuum
ingedampt. Dc achterbh\'jvendc, bruine stroop wordt na eenige dagen
vast, en door fijnwrijven onder abs. alcohol cn affiltreeren, verkrijgt
men een zuiver wit dioxyaceton. Smpt. 79° i 80° C.

De bacterie, A, suboxydans, werd bewaard op moutagar-
platen, waaraan eenig krijt was toegevoegd. De microben
vormen op deze platen kristallen van Ca-oxygluconaat,
waardoor de oppervlakte zeer hard wordt, hetgeen het
overenten bijzonder bemoeilijkt. Daarom werden de bac-
teriën ook op verd. gistwater verder gekweekt, waarvan
met behulp van een pipet Pasteur werd afgeënt.

De bacterie A. Suboxydans was mij welwillend door Prof. KuryvER
voor dit onderzoek afgestaan.

§ 1. Al schijnt het niet gemakkelijk alle tusschen-
producten der gisting aan te toonen, toch zijn alle proeven
in deze richting belangrijk, omdat elk positief resultaat een
stap nader tot het einddoel beteekent. Het bestaan van een
intermediair product te constateeren, geschiedt door het
vast te leggen aan bepaalde stoffen, zóó, dat het product aan
een verdere ontleding geheel wordt onttrokken.

Een andere weg zou zijn, de samenstelling van het
milieu van de gisting en de omstandigheden, waaronder
deze tot stand komt, zóó te veranderen, dat bepaalde pro-
ducten tot hoofdproducten werden.

Het is aan Neuberg en zijn leerlingen gelukt door toe-
voeging van zwaveligzure zouten, acetaldehyde als tusschen-
product bij de alcoholische gisting vast te leggen.^) Deze
nopvangmethode," zooals Neuberg die noemt, is later in het
voorbijgaan door hem toegepast op enkele suiker-ontledingen
door bacteriën.

Zoo laat Nord B, coli, B, dysenteriae, B. lactis aërogenes,
dus co/i-f_j>/jÄi«-organismen, inwerken op glucose, manniet
en glycerine, in tegenwoordigheid van sulfiet en vindt daarbij
acetaldehyde in verschillende hoeveelheid.

e^ele suikers der pentosereeks laten vergisten, o.a. door
B. acetoaethylicum en Lactobacillus pentoaceticus.

Ook zij hebben sulfiet toegevoegd, om met grooter zeker-
heid het acetaldehyde te kunnen aantoonen. Het was dus
nog een open vraag, maar zeker eene van belang, of bij de
gemengd zure gisting de ontleding onder invloed van alle
typische vertegenwoordigers der coli-typhus groep steeds
acetaldehyde als tusschenproduct doet vinden.

Netoerg, die het ontstaan van acetaldehyde verklaart
door het uiteenvallen van pyrodruivenzuur in acetaldehyde
en kooldioxyde, heeft bij de alcoholische gisting ook ge-
tracht het pyrodruivenzuur zelf in handen te krijgen,
hetgeen hem echter tot dusver niet gelukt is.

Bij de alcoholische gisting gaat het acetaldehyde door
reductie over in aethylalcohol, terwijl bij de gemengd zure
gisting waterstof als zoodanig vrijkomt en hoogstens een
spoortje alcohol wordt gevormd. Toch wordt bij deze
gisting, zooals we uit de proeven zullen aantoonen, steeds
acetaldehyde als tusschenproduct gevonden. Hierbij moet
dadelijk worden gezegd, dat ook zonder sulfiet, sporen
aldehyde onder de gemengd zure gistingsproducten werden
opgemerkt, maar in oneindig veel kleinere hoeveelheden
dan wanneer sulfiet werd toegevoegd. \'

Deze sulfiet-methode, die door Neuberg en Reinfurth
met succes is toegepast bij de alcoholische gisting, berust
op het feit, dat acetaldehyde gebonden wordt aan secun-
daire, zwavehgzure zouten. Acetaldehyde is het eerste tus-
schenproduct, dat op deze wijze bij een gisting is vast-
gelegd.

Wel had Loeb^) getracht, door toevoeging van aniline,
ammoniak of phloroglucine bij gistende suikeroplossingen,
tusschenproducten vast te leggen, maar hij verkreeg slechts
negatieve resultaten.

Ook Fernbach en Schoen^) dachten pyrodruivenzuur
vastgelegd te hebben met koolzure kalk. Deze proeven
echter, door Neüberg herhaald, bleken onjuist te zijn. Dat
Fernbach en Schoen zeker zóó geen pyrodruivenzuur-
calcium konden afscheiden, blijkt nog ten overvloede hieruit,
dat het Ca-zout van dit zuur goed oplosbaar is in water en
dat het bovendien gemakkelijk door gist verder wordt ontleed.
Er was dus geen reden het op deze wijze vast te leggen, laat
staan aan het vergistende milieu te onttrekken.

Neüberg en färber^) zijn de eersten geweest, die, door
in alkalisch milieu de gisting te doen plaats grijpen, con-
stateerden, dat neutrale, zwaveligzure zouten in groote con-
centratie in \'t geheel niet schadelijk op de gist werken. Dit
was onverwacht, omdat het vrije zwaveligzuur, evenals de
zure zouten daarvan, giftig, dus antiseptisch werken en
in hun tegenwoordigheid geen behoorlijke vergisting
mogelijk is.

Toen nu gevonden was, dat de neutrale, zwaveligzure
zouten onschadelijk waren, hebben Neüberg en Rein-
fürth getracht met deze zouten het acetaldehyde vast te
leggen. Deze eigenschap der aldehyden in \'t algemeen was
reeds lang bekend. Tiemann^) heeft aangetoond, dat
dinatriumsulfiet met enkele aldehyden zich om kan zetten
volgens de vergelijking;

RCHO 4- Naa SO3 -f H2O = RCH (OH) (SOgNa)
NaOH en vele andere onderzoekers, als Lemme ¹),
Seyewetz en Gibello Kleber «), Sadtler \'),

Bürgess^), Auerbach en Barschall^), hebben hierop een
methode voor quantitaüeve bepaling van aldehyden
gebaseerd, waarbij de gevormde natronloog acidimetrisch
bepaald wordt.

Het is Neuberg en Reinfurth gelukt het acetaldehyde
vast te leggen. Een bedrag van 73,45 % van de toegevoegde
hoeveelheid suiker, werd als aldehyde teruggevonden.

Nord heeft bij zijn proeven met bacteriën dezelfde resul-
taten gekregen, terwijl ik zelf met glycol 80 % terugvind
als aan sulfïet gebonden acetaldehyde.

De aldehydesulfietverbinding, een maal tot stand ge-
komen, stoort de gisting in ^t geheel met; het is een zeer
resistente verbinding, hetgeen blijkt uit het feit, dat men in
de kolf geen spoor acetaldehyde kan ruiken. De overmaat
sulfiet in de oplossing werkt bovendien de ontleding van
de acetaldehyde-natriumbisulfietverbinding tegen, zoodat
zelfs bij verwarming de verbinding zeer moeilijk uiteenvalt.

Eerst wanneer de overmaat sulfiet wordt weggenomen,
door neer te slaan met bariumchloride, kan men door koken
een hydrolytische splitsing bewerken, waarbij acetaldehyde
m vrijheid wordt gesteld.Deze splitsing is volledig,
indien men kookt onder toevoeging van calciumcarbonaat.

Als we nu suikerhoudende vloeistoffen in tegenwoordig-
heid van sulfiet vergisten, mogen we verwachten, dat het
suikerrnolecule (aldose, zoowel als ketose) zich dadelijk zal
verbinden met een sulfietmolecule.

Farnsteiner hebben verbindingen van glucose met
Zwaveh\'gzuur gekregen; ook van zuur natriumsulfiet met
glucose zijn verbindingen bekend. Deze komen in twee optisch
actieve isomeren voor, zoodat er in de vloeistof een even-
wicht is tusschen het sterk linksdraaiende en het zwak
rechtsdraaiende additieproduct.

Nu reageeren de secundaire alkalisulfieten zelf alkalisch
en als zij met aldehyden reageeren, komt er bovendien
alkalihydroxyde vrij; beide omstandigheden werken het
ontstaan van complexe verbindingen der suikers tegen. Dit
gebeurt ook met de onbestendige bisulfietverbindingen van
de suikers, zoodat zeker in de dinatriumsulfiethoudende
oplossing slechts een uiterst gering bedrag der suikers (in
het meest ongunstige) geval zal gebonden zijn.

Dit blijkt ook wel, want bij aanwezigheid van veel sulfiet,
wordt toch alle suiker, die voorhanden is, vergist.
Tiemann heeft aangetoond, dat voor het tot stand komen
van aldehyde-bisulfietverbindingen, uit aldehyden en bi-
sulfieten, een weinig natriumcarbonaat een goede kataly-
sator is. Nu ontstaat bij de suikervergisting door bacteriën
steeds kooldioxyde, dat zich verbindt met het vrij geworden
natriumhydroxyde, zoodat hier van zelf eenig dubbel-
koolzurenatrium ontstaat, waardoor de aldehyde-bisulfiet-
verbinding gemakkelijker tot stand komt. De reacties, die
zich in de gistingsvloeistof afspelen, nadat het acetaldehyde
en het kooldioxyde zijn gevormd, kunnen dus als volgt
worden in beeld gebracht.

Hoewel het sulfiet niet schadelijk op de microörganis-
men werkt, zijn er toch grenzen, waarbinnen de concen-
tratie moet worden gehouden. Het gevolg hiervan is, dat
men nimmer de theoretische hoeveelheid aldehyde kan
binden. De groote overmaat sulfiet, die men dan noodig
zou hebben, om de dissociatie van de complexe aldehyde-
sulfietbinding tegen te gaan, zou schadelijk blijken voor den
groei en de ontwikkeling der bacteriën en daardoor dus de
gistmg storen. De aldehyde opbrengst is dus niet geheel
onafhankelijk van de hoeveelheid sulfiet, hoewel er geen
rechtstreeksche betrekkingen tusschen beide bestaan Daar
het oplosbare dinatriumsulfiet in groote concentratie voor
de bacteriën eenigszins giftig werkt, hebben we bij dc
quantitatieve aldehydebepalingen van het moeilijk oplos-
bare, neutrale calciumsulfiet CaSO, 2 H,0 gebruik ge-

Nord noemt dit een groote verbetering voor de „opvang-
me^ode omdat nu ook stoffen, als bijv. slycerinealdehyde
en dioxyaceton, welke zeer gevoelig zijn voor het alkalis^ch
reageerende secundair natriumsulfiet, toch onderzocht
kunnen worden.

Glycerinealdehyde en dioxyaceton vormen met natrium-
bisulfietgemakkehjkco^^^ verbindingen, terwijl zij 1
met het neutrale, moeihjk oplosbare calciumsulfietnietdoen.

methode uitgewerkt om acetaldehyde bij de alcoholische
gisting vast te leggen.aiconoiiscne

J) In ons geval, waar wij met bacteriën-materiaal bij 37° C werken
tevcndten calcumcarbonaat toevoegen, om de gevormde zlren té

genomen, n.1, het door VoRLaNDERi) bereidde dimethyl-
hydroresorcine (dimethyl-cyclohexaandion).

Deze stof, die kortheidshalve dimedon genoemd wordt,
bezit de eigenschap, om zich met aldehyden te verbinden
onder afsplitsing van een mol. water:

CH,

H,0

KyCiCH,),

CH2

Daar de koolhydraten en ketonen dit niet doen, is dit
dus een zeer geschikte stof, om het acetaldehyde, ook bij
tegenwoordigheid der suikers, vast te leggen. De stof, die
ontstaat door condensatie van twee mol. dimedon met één
mol. acetaldehyde heet aethylideen-bis-dimethylhydroresor-
cine of aldomedon. Het dimedon is moeilijk oplosbaar, maar
de hoeveelheid, die noodig is bij de gisting, lost, hoewel
langzaam, toch geheel op. Daarentegen is het aldomedon in
water nagenoeg absoluut onoplosbaar.

Door deze eigenschap is de stof dus gemakkelijk af te
scheiden. Nu is het dimedon een protoplasmagift, zoodat

het slechts in kleine concentratie gebruikt werd door
Neuberg en Reinfurth bij de ontleding met gist. Toen ik
deze methode op de bacteriegisting toepaste, bleek het, dat
deze stof een sterk vergift was voor deze organismen, zoodat
met een zeer verdunde oplossing van dimedon moest
worden gewerkt. Het gevolg hiervan was, dat er slechts
een gering neerslag ontstond, \'t welk als „aldomedon"
kon worden geidentificeerd, doordat het onoplosbaar was
in water en oplosbaar in alcohol.

Noch door wijziging van de hoeveelheid suiker, noch door
verandering van de samenstelling van het milieu, waarbij
zoowel van een organischen als van een anorganischen
voedingsbodem werd gebruik gemaakt, kon ik een voldoende
opbrengst aan aldomedon verkrijgen. Zoodat deze methode,
om acetaldehyde vast te leggen, voor de vergisting met
coli-typhiis-hzcttntn onbruikbaar is.

Het vastleggen van acetaldehyde, ook bij de koolhy-
draatgisting door deze bacteriën, mag het eerste experimen
teele bewijs zijn, dat dit lichaam een intermediair tusschen-
product daarbij is. Gevonden werd, dat bijna alle stoffen, die
worden aangetast, over het aldehyde worden afgebroken. Dit
is dus geheel in analogie met hetgeen over de ontleding van
die stoffen door gist is waargenomen. Ook hier weder blijkt
de uitspraak van Arinstein juist te zijn, wanneer hij zegt:

„Demnach beschreitet die Natur in den Grundzügen den
selben Weg bei den wichtigsten biochemischen Abbaureactionen
der Kohlenhydrate. Nur der Schlusszahl ist je nach der Lebens-
bedürfnissen der einzelnen Organismen verschieden**

§ 3. Zooals in de theoretische beschouwing is gezegd,
gelukt het ook bij de bacterieële gisting het ontstaan van
acetaldehyde door middel van de opvangmethode van
Neuberg en Reinfurth, aan te toonen.

Om zeker te zijn, dat acetaldehyde uitsluitend afkomstig
is van de stof, die men wil laten vergisten, moet gewerkt
worden, zoowel in anorganisch als in organisch milieu.
Hoewel ik vele anorganische voedingsbodems heb gemaakt,
met steeds verschillende stoffen in steeds wisselende con-
centraties, is het niet gelukt een anorganischen voedings-
bodem te vinden, waarin de bacteriën, ook in tegenwoordig-
heid van sulfiet, zoo goed groeien, dat zij energie genoeg
hebben, om de koolhydraten merkbaar te ontleden. De vol-
gende anorganische voedingsbodems werden gemaakt.

Deze voedingsbodems geënt met B, coli gaven nimmer
eenig resultaat bij het opsporen van acetaldehyde Daarna
werd lakmoes aan deze oplossingen toegevoegd, wat ook
geen verbetering gaf.

Vervolgens heb ik de hoeveelheden natriumsulfiet ver-
anderd, daar deze verbinding toch eenigszins schadelijk voor
de bacterie is, maar ook bij verschillende, kleinere concen-
traties van het sulfiet was er na 7 tot 12 dagen geen spoor
gjj^ehyde aan te toonen.\'\')

*) Ook met den voedingsbodem van Capaldi en proskaimr*
werden slechts sporen aldehyde aangetoond.

Het gevolg van deze voorproeven was, dat ik noodge-
dwongen tot een organisch milieu mijn toevlucht moest
zoeken; de conclusie, dat ook de stikstofvoeding van groote
beteekenis is voor het verloop der gisting! Op grond van
dit resultaat werd toen besloten den volgenden voedings-
bodem te bereiden.

1,0 gr. „Witte" pepton
2,0 „ Na^SOa
1,0 „ CaCOg
IOOC.C.H2O.
waaraan 2 gr. glucose werd toegevoegd.

Het bleek al dadelijk, dat de bacteriën in deze oplossing
goed groeien wilden en ik kon reeds na 5 dagen duidelijk
acetaldehyde aantoonen. Ik heb daarna steeds deze oplossing
gebruikt, waarbij de hoeveelheden sulfiet wel eens ver-
anderd werden, hetgeen echter geen belangrijke vermeerde-
ring van aldehydeopbrengst gaf^).

Eerst werd een heldere 1 % „Witte" peptonoplossing
gemaakt, door 10 gr. pepton op te lossen tot 1 L., deze op
117° C. in een autoclaaf gedurende 5 minuten te verwarmen
en daarna helder te filtreeren.

Van deze oplossing werd telkens 100 c.C. genomen en in
kolfjes van 200 c.C. inhoud gedaan; hierbij werd vervolgens
1 gr. CaCOg en 2gr NajSOg gevoegd en deze oplossing
gedurende een half uur in stroomenden waterdamp ge-
steriliseerd.

Den volgenden dag werden 2 gr. van de te onderzoeken
stof, zoo steriel mogelijk, bij de oplossing gevoegd; daarna
werd weer een half uur in de autoclaaf op 100° C. verhit.

Voor bepaalde suikers, die in de alkalische oplossing
gevaar loopen te verharsen, werd een afzonderlijke
sterilisatie bij 100° C. van een waterige oplossing in dubbele

concentratie toegepast, deze steriele oplossing werd vervol-
gens bij de sulfiet-oplossing gevoegd.

Dat enkele koolhydraten, bijv. gulose, door de sterilisatie
sterk verharsen, blijkt duidelijk, door de oplossing voor en
na de sterilisatie te polariseeren De draaiing vermindert
soms tot op de helft,hetgeen niet geschiedt, als we in waterige
oplossing steriliseeren en daarna de twee steriele oplossingen
samenbrengen.

Nadat de voedingsbodem 200 gesteriliseerd was, werd
deze tot den volgenden dag bij 37° C. weg gezet, om
de steriliteit te controleeren, eerst daarna werd de vloei-
stof met de bacterie geënt. De enting geschiedde met een
24 uur oude agarcultuur; deze werd met een steriel oogje
van 1,5 m.M, doorsnede in de vloeistof gebracht. Er werd
zooveel mogelijk getracht in elke 100 c,C, oplossing één
oogje met bacteriën te brengen. Indien na twee dagen
geen groei te zien was, werd opnieuw bijgeënt. De gisting
had plaats in een broedstoof bij 37° C,

Eenige proefjes werden ingezet, om den eenigszins
schadelijken invloed van de sulfiet-oplossing bij deze hooge
temperatuur te kunnen beoordeelen, .

Twee kolfjes met 100 c.C, alkalische bouillon werden
geënt met B. coli, terwijl in een der kolfjes 2 gr, NaaSO,
was gevoegd. Na verloop van 2 X 24 uur was er een dui-
delijk verschil in groei in de beide kolfjes te zien. Een
grooter verschil in groei was te zien, als beide kolfjes met
een paratyphusstam geënt waren. Uit de verkregen resul-
taten blijkt dus, dat de microben niet geheel ongevoelig
zijn voor de aanwezigheid van sulfiet-ionen. Het aan-
toonen van acetaldehyde had plaats na 1, soms na 12 dagen.

Eiken dag werd de kolf omgeschud, om het calcium-
carbonaat van den bodem door de vloeistof heen te mengen.

Men moet er voor zorgen, dat de zuurgraad der op-
lossmg met te hoog wordt, daar anders de bacteriën af-
sterven, ahhans zich niet verder ontwikkelen

per 100 c.C vloeistof 10 gr. CaC03 aanwezig was; deze
diende om de dissociatie van de complexe aldehydesulfiet-
verbinding te bevorderen.

-l^et neergeslagen met
^u eener 25 BaCl^ oplossing. Deze onverbruikte
sulfiet zou de dissociatie van de complexe verbinding im-
mers tegenwerken. ^

De kolf, die voorzien was van een Liebigsche- en een
spiraalkoeler, werd voorzichtig verhit i). De gecondenceerde
vloeistof werd in een zuigerlemeyer, die verbonden was
aan den spiraalkoeler en in een ijsbad stond, opgevangen.

In deze erlemeyer werden 5 c.C. 96 % alcohol 2) gedaan
zooc^at de mogelijk meekomende aldehydedampen hierin
worden opgelost en vastgehouden. 10 c.C. destillaat werden
opgevangen en hierin gereageerd op acetaldehyde,

3 c.C. van het destillaat worden met 0.5 c.C 4 y nitro
prussidnatrium geschud en hierbij 1 c.C. 3 % piperidinê
oplossing gevoegd; een karakteristieke blauwkleuring wijst
op acetaldehyde. Deze reactie kunnen we ook dadelijk
toepassen op de gistingsvloeistof, maar dan is zij lane niet
zoo dmdehjk en gevoelig, daarom destilleerde ik steeds de
oplossing en reageerde op \'t destillaat.

b) Met een andere hoeveelheid van het destillaat werd
met mtrophenylhydrazine het hydrazon gemaakt. Dit

hydrazon, dat uit prachtige gele, naaldjes bestaat, werd met
water gewasschen, vervolgens gedroogd, waarna het kon
worden geidentificeerd door het smeltpunt, 128° C.

Steeds werd een mengproef met eenig authentiek hy-
drazon gemaakt en geconstateerd, dat het smeltpunt con-
stant bleef.

Onder het microscoop is het duidelijk te onderscheiden
van het hydrazon van aceton, smpt. 148° C. en ook van het
p. nitrophenylhydrazine zelf, smpt. 157° C.

Daar voor deze proeven de organische voedingsbodems
aangewezen zijn, was het noodig, om zeker te zijn, dat de
acetaldehyde alleen afkomstig is van de te onderzoeken
stof, steeds een blanco proef tevens in te zetten.

Het is n.l. lang niet onmogelijk, dat de pepton „Witte",
een stof, waarvan de samenstelling niet bekend is en boven-
dien wisselt, ook door de bacteriën onder vorming van
acetaldehyde ontleed wordt.

Het was daarom zoo\'n voordeel geweest, als we een goeden
anorganischen voedingsbodem hadden kunnen vinden.

Gelukkig zijn echter alle blanco proeven zonder een spoor
acetaldehyde-ontwikkeling verloopen. Het aldehyde, dat
ik bij mijn proeven heb vastgelegd, is dus ongetwijfeld af-
komstig geweest van de ontlede, toegevoegde stof.

Een zeer groot aantal stoffen werden onderzocht, niet
alleen koolhydraten, doch ook meerwaardige alcoholen.
Daarnaast werden verschillende andere stoffen in studie
genomen, welke eventueel als tusschenproduct, of als eind-
product bij de suikerontleding zouden kunnen optreden.
Hiervoor kwamen ook eenige zuren in aanmerking, die in
den vorm hunner Ca- of Na-zouten gebruikt werden.

Het spreekt van zelf, dat de zuren als zoodanig niet
onderzocht konden worden, daar in de oplossing het on-
misbare calciumcarbonaat aanwezig diende te zijn, boven-
dien zou de H-ionenconcentratie te hoog worden voor
de bacterieontwikkeling. De door mij voor dit onder-

zoek gebruikte koolhydraten^ welke alle na onderzoek
bleken chemisch zuiver te zijn, waren:

Hexieten, d, manniet, d, sorbiet, i, dulciet.
Pentosen, L arabinose, L xylose, U rhamnose,
Pentieten, L arabiet, i. adoniet,
Tetrieten, i, erythriet,
Disacchariden, maltose, lactose, saccharose,
Trisacchariden, raffinose»
Zuren, L gluconzuur.

Verder werden nog de volgende stoffen gebruikt: glycol,
glycerine^), glycerinealdehyde, methylglyoxaal, dioxyaceton,
pyrodruivenzuur, glycerinezuur, melkzuur, harnsteenzuur,
glycolzuur, azijnzuur en mierenzuur.

Ook deze stoffen werden op zuiverheid gecontroleerd,
hierbij bleek, dat glycerinealdehyde een weinig dioxy-
aceton bevatte, terwijl het methylglyoxaal, dat slechts in een
3 % oplossing aanwezig was, een weinig zuur reageerde en
tevens een spoortie alcohol bevatte.

Het pyrodruivenzuur werd bereid, volgens voorschrift
van de Jong 2). Het gehalte aan pyrodruivenzuur werd be-
paald door dit als phenylhydrazon neer te slaan en te
wegen Het glycerinezuur werd volgens de methode van
zinno¹) bereid, als Ca-zout afgescheiden en uit verd. alcohol
omgekristalliseerd.
Over de bereiding van dioxyaceton zie blz. 12.

Het glycol werd gezuiverd door het tweemaal te destil-
leeren, en den laatsten keer dat gedeelte op te vangen, dat
bij 197° C. overging.

Zooals uit de proeven blijken zal, werden al deze stoffen
geënt met coZi-bacteriën en de meeste ook met de andere
bacteriën van de coli-typhm-gtoep.

De coZi-bacteriën zijn de geschikste vertegenwoordigers
van deze groep, daar zij het best groeien en de meeste
energie ontwikkelen om de stoffen, welke haar worden voor-
gezet, aan te tasten. Het gevolg hiervan is, dat de hoeveel-
heden acetaldehyde, die ontwikkeld worden uit eenzelfde
stof door de verschillende bacteriën, niet alle even groot
zijn. Steeds werd waargenomen, dat de co/istammen en de
paratyphus B- stammen, veel meer acetaldehyde uit een
zelfde hoeveelheid stof produceeren, dan de paratyphus
A-, typhus- en dysenterie-hzQXzviln. Ja, het war,en voor
deze drie laatste bacteriën dikwijls slechts sporen acetalde-
hyde, die konden worden aangetoond. Deze kleine hoeveel-
heden aldehyde werden dan ook alleen met de kleur-
reactie van Rimini geconstateerd, daar deze veel gevoeliger
is, dan het aantoonen door een hydrazon van het aldehyde
te maken.

Van enkele stoffen stonden mij maar kleine hoeveelheden
ter beschikking, waardoor dan ook alleen met co/i-bacteriën
werd geënt.

De verkregen uitkomsten na 12 dagen bij 37° C,, zijn in
de tabellen op bl, 28 en 29 verzameld.

Hierbij kan nog vermeld worden, dat de proeven genomen
zijn, met 3 coli, 9 paratyphus B, 2 paratyphus A, 2 typhus en
5 dysenteriestzmmen\'^), terwijl bij elke reeks van proeven
een blancoproef werd ingezet, die een controle was op vol-
komen steriliteit der gebruikte koolhydraat-peptonop-
lossingen.

koolhydraten acetaldehyde als tusschenproduct optreedt.
De vraag of de stoffen, die een negatieve acetaldehydereactie
gaven, door de bacteriën op een andere manier ontleed wor-
den, dan wel onaangetast blijven, zullen we in hoofdstuk
V beantwoorden.

Als we de resultaten der proeven bekijken, dan zien we,
dat de meeste koolhydraatachtige stoffen acetaldehyde als
tusschenproduct vormen, terwijl de vier zuren, die als eind-
producten der gemengd zure gisting optreden, geen acetal-
dehyde geven; slechts melkzuur gaf een spoortje blauw-
kleuringmetde reactie van Rimini bij coli en paratyphus B,

Echter alle stoffen, met uitzondering van methylglyoxaal,
die in de eerste plaats in aanmerking zouden kunnen komen
als tusschenproduct bij de suikerontleding, geven bijna
alle acetaldehyde,

§ 4. De proeven, die genomen werden met dimedon in-
plaats van sulfiet, zijn als volgt uitgevoerd.

Eenige voorproeven werden ingezet met een pepton-
acetaldehydeoplossing. Dit peptonwater bevatte 1 %
aldehyde en werd in kolfjes, waarin verschillende hoeveel-
heden dimedon waren ingewogen, verdeeld. Deze kolfjes
werden gedurende 24 uur in de stoof bij 37° C. geplaatst.
Op den bodem had zich een neerslag gevormd, dat afge-
filtreerd werd, uitgewasschen met water en opgelost in
weinig abs. alcohol. Deze oplossing werd vervolgens in een
Zie over het steriliseeren van deze stoffen blz. 43 en 44.

bekerglas met water uitgegoten, waarbij het aldomedon neer-
sloeg. Den volgenden dag werd dit neerslag afgefiltreerd en
uit verdunden alcohol omgekristalliseerd, smeltpunt 139° C.

Het dimedon, dat niet gebonden was, lostte in het water
op; door indampen werd in alle kolfjes, waaraan van 1 tot
5 gr. dimedon was toegevoegd, nog dimedon terug gevonden,
smeltpunt 142° C.

Nadat deze proefies goede resultaten hadden gegeven,
werd de volgende voedingsbodem gemaakt voor de bac-
teriëele gisting.
100 C.c HjO.

Deze werd na sterilisatie (3 achtereen volgende dagen op
100° C.), geënt met S. colu De kolf werd eiken dag omge-
schud, daar het dimedon aan de oppervlakte blijft driiven
en slechts langzaam oplost.

De oplossing werd na eenige dagen zwak troebel, maar
van een flink neerslag was geen sprake. Na verloop van 14
dagen werd de kolfinhoud gecentrifugeerd en het geringe
sediment als boven behandeld. Er ontstond na uitgieten
in water geen neerslag, slechts enkele witte vlokjes waren te
zien. Deze werden door centrifugeeren verzameld, maar de
hoeveelheid was te klein voor verdere behandelingen. Er
werd slechts geconstateerd, dat het neerslag oplosbaar was
in alcohol en door toevoeging van veel water weer neersloeg.

Ik heb deze proeven nog eenige malen herhaald, waarbij
de hoeveelheid dimedon steeds geringer werd genomen,
maar verkreeg geen voldoende neerslag, om het aldomedon
duidelijk aan te toonen.

Dat de bacteriën op den voedingsbodem zonder dimedon
goed wilden groeien, was van te voren geconstateerd, zoodat
de remmende werking bij de proeven aan den schadelijken
invloed van het dimedon op de bacteriën moet worden toe-

geschreven. Ook in een voedingsbodem met pepton en
dimedon wilden de bacteriën niet groeien.

§ 5. Nadat de methode om acetaldehyde te binden met
sulfiet zoo gunstige resultaten bij de bacterieële gisting had
gegeven, heb ik getracht nog een ander product vast tc
leggen. Het was n.1. aan von Grab gelukt, het pyrodruiven-
zuur door middel van de synthese van Döbner^) met
/3 naphthylamine te condenseeren en zoo kreeg hij het
Ci methyl- ^ naphtocinchoninezuur.

Deze reactie kon echter niet voor de gisting met coli-
typhus-hacttrièn worden gebruikt, daar het ß napthyl-
amine een zeer sterk bacteriegift is, zoodat er in de kolfjes
voor deze proeven geen groei plaats vond.

De producten, die door de bacteriën der coli-typhus^voe.p
uit suikers en suikerachtige stoffen worden gevormd, zijn
onder te brengen in de volgende groepen:

Hierbij is op te merken, dat allereerst een onderzoek
werd ingesteld naar de mogelijke aanwezigheid van aceton,
formaldehyde, methylalcohol; deze stoffen konden echter
nimmer worden aangetoond.

Het systematisch onderzoek naar de vertegenwoordigers
dezer vier groepen werd als volgt uitgevoerd:

A. Daar al deze onderzoekingen in een peptonoplossing
waaraan calciumcarbonaat is toegevoegd, uitgevoerd zijn,
zijn de eventueel aanwezige zuren in den vorm hunner
Ca-zouten aanwezig. Men kan dus de neutrale, vluchtige
producten dadelijk afdestilleeren. Van de 500 c.C. gistings-
vloeistof wordt 300 c.C. afgedestilleerd, en het destillaat
wordt nogmaals gedestilleerd, waardoor de vluchtige pro-
ducten meer geconcentreerd worden. Dit wordt nog een

derde maal herhaald tot men 100 c.C. destillaat heeft.
Hiermee reageert men op de betreffende stoffen als volgt:

Waar het zeer lastig is om deze stof naast acetaldehyde
aan te toonen, moet het aldehyde eerst verwijderd worden.
De vloeistof wordt met een flinke overmaat p. nitrophenyl-
hydrazineoplossing in 30 % azijnzuur een uur lang aan
een terugvloeikoeler gekookt. Daarna wordt een gedeelte
afgedestilleerd en op afwezigheid van aldehyde gereageerd
met de kleurreactie van Rimini. Is aldehyde afwezig, dan
wordt op alcohol gereageerd:

Deze reactie kan ook uitgevoerd worden, als het aldehyde
nog niet verwijderd is. Ik heb dit met eenige proefjes waar,
naast alcohol acetaldehyde aanwezig was, geconstateerd.

Daartoe voegt men aan 2 c.C. geconcentreerde oplossing
toe, 33mgr. metallisch natrium en 274 mgr. 1. 2. 4. chloor-
dinitrobenzol. Men verwarmt even, waarna op den bodem
kristallen van NaCl zich vormen, terwijl in de vloeistof de
naaldjes van 2.4 dinitrophenetol uitkristalliseeren. Deze
worden omgekristalliseerd uit benzine. Smpt. 85° C. (op-
gegeven 85.2° C.).

c. Op a c e t y 1-m ethyl-carbinol: met Feh-
lings reagens, dat door deze stof reeds in de koude wordt
gereduceerd (aldehyden reduceeren eerst bij verwarmen).
Terwijl ik deze stof geen enkele maal heb kunnen aantoonen
met deze reactie, noch zooals in de verhandeling staat van

Grimeert (1901), door er een hydrazon van te maken i),
verkreeg ik bij enkele stoffen wel een positieve reactie
Voges-Proskauer, die zeker ook wijst op de aanwezigheid
van het acetyl-methyl-carbinoP).

De bacteriën der coli-typhusgtotp hebben de eigenschap
ook de pepton van den voedingsbodem te ontleden. Op
enkele afbraakproducten van de pepton werd volledigheids-
halve gereageerd.

Aminen zijn volgens deze reactie van ammoniak te onder-
scheiden, doordat de kleur van het neerslag niet bruin is,
maar bij de prim. aminen lichtgeel bij de secund. en tert. wit.

10 c.C. cultuurvloeistof worden vermengd met 5 c.C.
sterk zoutzuur (s.g. 1,2) en op dit mengsel worden zeer
voorzichtig 2 c.C. para-dimethylaminobenzaldehydeop-
lossing geschonken, zóó, dat een duidelijke scheidings-
vlakte bewaard blijft.

B. In de 200 c.C. vloeistof, die na de eerste destillatie
in de kolf zijn achter gebleven, zijn de Ca.-zouten van de
zuren aanwezig.

Hiervan worden 100 c.C. gebruikt voor de bepaling der
vluchtige zuren. Door toevoeging van zwavelzuur worden
deze zuren in vrijheid gesteld en vervolgens 50 c.C. af-
gedestilleerd. Deze worden geneutraliseerd en tot een klein

Voges-Peoskauer. Zie Standard Methods of Water Analysis.
®) Ehrlich. D. Med. Wochenschr. 1901.

Mercurizouten worden door mierenzuur gereduceerd
via mercurozouten tot metallisch kwik, dat als een grijs
praecipitaat optreedt.

Deze reactie is gevoelig tot 1 : 1000, terwijl het ontstaan
van mercurozouten door het optreden eener witte troe-
beling van HgCl na toevoeging van NaCl nog veel gevoe-
liger is (1 : 100000).

Het mierenzuur wordt door magnesium- of iizerpoeder
gereduceerd tot formaldehyde. Dit aldehyde wordt aan-
getoond door een kleurreactie, o,a. door de oplossing laags-
pwij?e te brengen op een oplossing van zoutzure morphine
in sterk zwavelzuur, waardoor een paarsgekleurde zóne
ontstaat.

Voor deze beide reacties moet men zeker zijn, dat zwa-
veligzuur niet aanwezig is, daar dit storend werkt.

a. Door verhitting van de drooggedampte Ca-zouten
en de dampen van aceton, die hierdoor ontstaan, op te
vangen in water. In deze waterige oplossing wordt het aceton
aangetoond met salicylaldehyde en vast kaliumhydroxyde;
er ontstaat dan een roodgekleurde zóne.

Verhitting van de drooggedampte Na-zouten met water-
vrij NagCOg en een weinig AsgOg.

C. De andere 100 c.C. werden tot ongeveer 50 c.C. in-
gedampt en vervolgens geperforeerd, na toevoeging van
verdund zwavelzuur tot dit in overmaat aanwezig was en

filtratie van het na eenigen tijd neergeslagen gips. Hierbij
deed zich het bezwaar voor, dat de doorstrijkende vloei-
stof met de aetherdruppels een emulsie vormde; ik heb toen
een losse prop ontvette watten, onder de zijbuis van een
wijden perforator aangebracht^).

Op deze wijze kon de perforatie eenige etmalen achter-
een zonder stoornis worden voorgezet.

De zoo verkregen aetheroplossing wordt op een water-
bad verdampt, waardoor ook de aanwezige vluchtige zuren
verwijderd worden.

Het residu bestaat uit een scherp riekende stroop, waarin
soms kristalletjes te zien zijn. Deze stroop wordt opgelost
in ± 50 c.C. alcohol van 96 % en, na toevoeging van
phenolphtaleïne, wordt aan de kokende oplossing een ver-
zadigde, waterige barytoplossing toegevoegd tot blijvende
roodkleuring.

Hierdoor ontstaat een neerslag van Ba-succinaat, deze
stof is onoplosbaar in alkohol sterker dan 70 %. Aan elke
50 c.C. alcoholische oplossing mag dus maar 10 c.C. baryt-
oplossing worden toegevoegd, is de blijvende, roode kleur
nog niet opgetreden, dan moet eerst nog eens 50 c.C. sterke
alcohol worden toegevoegd. Het Ba-succinaat wordt af-
gefiltreerd en na met alcohol te zijn schoongewasschen,
opgelost in enkele c.C. verdund zoutzuur. De oplossing
wordt op een waterbad tot droog ingedampt op een hor-
logeglas. Uit het residu wordt het barnsteenzuur door
sublimatie verkregen, dit geschiedt door een ander hor-
logeglas er op te leggen en boven een microvlammetje te
verhitten.

Op barnsteenzuur wordt vervolgens gereageerd
met Pb-acetaat, waarbij de ruitvormige kristallen van Pb-
succinaat ontstaan.

Het alcoholische fikraat bevat het oplosbare Ba- 1 ac-
t a a t. Na verdrijving van de alcohol wordt 20 c.C. water

toegevoegd en van de oplossing de rotatie bepaald in een
buis van 10 c.M. Deze was voor het gevonden melkzuur
eenige minuten rechts. (De zouten draaien tegengesteld).
Een gedeelte van deze oplossing wordt vervolgens door een
alkalische permanganaatoplossing geoxydeerd, waardoor
het melkzuur omgezet wordt in pyrodruivenzuur.

Het pyrodruivenzuur wordt aangetoond door alkalisch
maken met loog en daarna een korreltje nitroprussid-
natrium toe te voegen (roodkleuring), waarna bij aanzuren
met azijnzuur een voorbijgaande blauwkleuring optreedt.

§2. D. De gasvormige producten, die zeer dikwijls bij
de vergistingen door bacteriën der coli-typhusgrozp worden
geproduceerd, zijn op eenvoudige wijze te analyseeren.

Hiervoor wordt een gistkolfje gebruikt, dat van boven
uitgetrokken is tot een tweemaal omgebogen buisje. Dit
buisje is voorzien van een kraan, (zie fig.). De kolf wordt

met de gistingsvloeistof gevuld en daarna twee dagen achter-
een gesteriliseerd op 100° C. De opening A is voorzien van

een wattenprop» Vervolgens wordt de vloeistof geënt en
eenige dagen in de broedstoof bij 37° C. geplaatst. Nadat
zich het gas bii B heeft verzameld, wordt de gistkolf uit
de stoof genomen en het gas, dat zich gevormd heeft, uit
de kolf geperst.

De wattenprop bij A wordt weggenomen en de opening
voorzien met een gummistop met lange, glazen buis E,
Zóó, dat de opening goed is afgesloten. Het omgebogen
buisie C wordt geheel met water gevuld; het is een tamelijk
wijd buisje, zoodat het, door de kolf een beetje schuin te
houden, gemakkelijk vol gespoten kan worden.

Dit buisje wordt vervolgens in een bekerglas met ver-
zadigde keukenzout-oplossing geplaatst, de opening D
blijft onder de pekel.

Een nauwe eudiometerbuis wordt boven deze opening
geplaatst, zoodat bij openen der kraan en door in de buis
E water te gieten, het gas uit B in de eudiometerbuis
wordt geperst. Deze buis met gas wordt in een diepen cy-
linder met water gebracht en het volume van het gas af-
gelezen. Nu brengt men een stukje kaliumhydroxyde onder
water in de eudiometerbuis en schudt deze eenige keeren
flink om^).

Nadat de buis weer in den cylinder is geplaatst en de
temperatuur van het water in den cylinder heeft aange-
nomen, wordt het volume weer afgelezen. Het verschil is
natuurlijk de hoeveelheid kooldioxyde, welke is geabsor-
beerd, terwijl het gas, dat overblijft, uit waterstof
bestaat. Dat hier geen andere gassen onder gemengd zijn,
werd geconstateerd door dit overblijvende gas te mengen
met lucht of zuivere zuurstof en daarna een vonk door het
mengsel te slaan. Het blijkt dan, dat al het gevormde gas

Dit kan gemakkelijk gebeuren door met den duim de buis van
onderen af te sluiten.

verdwenen is. Er is geen CO2 ontstaan, hetgeen gecontro-
leerd wordt door het gas, nadat de vonk doorgeslagen is,
weer met loog te schudden en het volume te controleeren.
Methaan is er dus niet gevormd. Uit de genomen proeven
blijkt ook, dat er geen stikstof ontstaan is.

Bij een bepaalde gisting ontstond 21.8 c.C. gas; hiervan
was 3,4 c.C. kooldioxyde, de gasrest, die onderzocht moest
worden, was dus 18,4 c.C.

De buis werd in den cylinder een eindje omhoog getrok-
ken, zoodat het gas onder een kleineren druk stond dan
één atmosfeer.

De vonk werd er door geslagen en nadat de vloeistof
weer in rust was gekomen, het volume afgelezen. 11,6 c.C.
De contractie was dus 39—11,6 = 27,4 c.C./ hiervan be-
stond f uit waterstof; 27,4 X I = 18,3 c.C.

Hier werd lucht gebruikt in plaats van zuivere zuurstof.
Hoeveelheid gas 15 c.C.
kooldioxyde 1,6 „

gistingen slechts twee gassen geproduceerd worden n.1.
kooldioxyde en waterstof.

Hierbij deed zich het eigenaardige verschijnsel voor, dat
de verhouding van deze twee gassen bij eenzelfde ver-
gisting niet constant was. Zoo ontstond in de eene kolf
in 24 uur b.v. 20 c.C. gas, terwijl in eenzelfde kolf met den-
Zelfden inhoud en geënt met dezelfde bacterie, slechts
12 c.C. was gevormd.

Waterstof ontstaat bij deze gistingen het meest, terwijl
het kooldioxyde-gehalte eerst gering is, later toeneemt, een
maximum bereikt en dan weer afneemt.

De verhoudingsgetallen van deze gassen zijn dus zeer
betrekkelijk en hangen van verschillende omstandigheden
af, o.a. zeer sterk van den duur van de gisting, maar het
spreekt, dat bijv. ook de oplosbaarheid van de gassen in den
voedingsbodem^) een rol speelt. Ook meen ik opgemerkt
te hebben, dat de zuurgraad van het milieu invloed uit-
oefent, waarschijnlijk, omdat deze merkbaar inwerkt op
den groei der geënte organismen, dus ook op de gasvorming.
Een kleine verandering in de waterstofionen-concentratie
van de gistingsvloeistof gaf dadelijk groote verschillen in
de hoeveelheid gevormd gas. Om dit te constateeren werd
een reeks gistbuisjes met 100 c.C. peptonwater gevuld,
terwijl in elk buisje 2 gram glucose werd opgelost.

Aan deze buisjes werd thans melkzuur toegevoegd in
verschillende hoeveelheid. De waterstofionen-concentraties
werden met behulp van indicatoren bepaald 2). Nadat de
buisjes met B, coli geënt waren en 24 uur in de broedstoof
hadden gestaan, was er reeds een duidelijk verschil in gas-
ontwikkeling te zien. In het gistkolfje met een Ph van 6.1

Kooldioxyde lost ongeveer 50 tnzsl zoo goed op in water als
waterstof bij een temp. van 20° C.

had de sterkste ontwikkeling plaats gehad, terwijl in het
buisje met een Ph van 4,2 geen gas gevormd was.

Een uitgebreid onderzoek, om het verband tusschen
waterstofionen-concentratie en bacterie-ontwikkeling te
bestudeeren, zou zeker van groot belang zijn.

Ook de zuren, die als eindproducten bij de verschillende
gistingen ontstaan, veranderen den zuurgraad van het
milieu zeer sterk. Meestal wordt dan ook calciumcarbonaat
aan den voedingsbodem toegevoegd om deze zuren te binden,
waardoor de gisting tot het einde toe verloopen kan. Dit
kunnen wij bij deze proeven, waar het ons om de gassen
te doen is, niet toevoegen; de ontstane zuren zouden
uit het carbonaat kooldioxyde vrijmaken, hetgeen storend
zou werken.

§ 3. Het doel was, inzicht te krijgen in de ontleding der
hexosen, daarom hebben wij \'t onderzoek systematisch op-
gezet en ons de vraag gesteld, hoe gedragen de microben
zich t.o.v. suikers of suikerachtige lichamen van zeer een-
voudige samenstelling.

Gekozen werden dus glycol (2 w. alcohol), glycerine (3 w.
alcohol), terwijl bovendien werden onderzocht de mogelijke
tusschenproducten, als glycerinealdehyde, dioxyaceton, me-
thylglyoxaaU Voor het onderzoek werden deze stoffen tot
een hoeveelheid van 5 gr. opgelost in 500 c.C. pepton-
water. (Dit peptonwater werd gemaakt door 10 gram pepton
„Witte" op te lossen in één liter water. Deze oplossing werd
gedurende 10 minuten op 117° C, gesteriliseerd, daarna
gefiltreerd en weer gesteriliseerd bii 100° C,).

Aan den voedingsbodem werd vervolgens 5 gr, calcium-
carbonaat toegevoegd en twee achtereenvolgende dagen
gesteriliseerd bij 100° C,

Deze proeven werden alleen met B. coli ingezet en slechts
voor een enkele stof ook met paratyphus B bacteriën.

Als controle diende een kolf met 500 c,C, peptonwater
met krijt, waarin geen groei optrad. Ook deze kolf werd aan
hetzelfde qualitatieve onderzoek onderworpen.
Hieronder volgen de resultaten,
a, glycol.

Het glycol was gezuiverd door destillatie, kookpunt
197° C, De kolf met glycol werd geënt met J5, coli en ge-
durende 26 dagen in de broedstoof bij 37° C, geplaatst.
De kolfinhoud werd op de aangegeven wijze onder-

zocht. De reactie was neutraal. In het destillaat werd
acetaldehyde, ammoniak en een spoor indol aangetoond. De
reactie op acetaldehyde was sterk positief, zoowel de proef
van Rimini als de hydrazonvorming. Alle andere reacties,
onder A genoemd vielen, negatief uit.

Van de vluchtige zuren werd alleen azijnzuur gevonden,
geen mierenzuur. Ook de reacties op harnsteenzuur en
melkzuur waren zonder eenig resultaat.

Glycol geeft bij de ontleding geen gasvormige producten,
noch met B, coli, noch met de andere bacteriën van deze
groep. Een kolf met glycoloplossing geënt met een para-
typhus B stam gaf dezelfde splitsingsproducten als met
de B. coli, maar in veel kleinere hoeveelheden.

Nadat de kolf geënt was en een maand in de stoof had
gestaan, begon de vloeistof te klaren en er trad geen kool-
dioxyde-ontwikkeling meer op.

Het destillaat volgens A reageerde alkalisch; hierin wer-
den aangetoond, groote hoeveelheden acetaldehyde, spottn
alcohol en, als splitsingsproductenvan den voedingsbodem,
ammoniak en indoL

De perforatie met aether geschiedde na aanzuren met
zwavelzuur en de stroop, die overbleef na verdamping der
aether, bevatte enkele kristalletjes. Deze stroop gaf een zeer
stekenden damp. Met barytwater ontstond in de alcoh. op-

lossing een troebeling. Op de beschreven wijze werden
barnsteenzuur en melkzuur aangetoond. De lactaat-
oplossing draaide eenige minuten links : er was dus rechts
melkzuur aanwezig^). Het melkzuur werd ook micro-
chemisch aangetoond met Yt.-nitraat. De Yt-lactaat kri-
stallen tusschen gekruiste niçois geplaatst, gaven een
assenkruis te zien. Het melkzuur was echter maar in zeer
geringe hoeveelheid aanwezig.

In de gistkolfjes hadden zich na één dag geweldige
hoeveelheden gas gevormd; het gas bestond wit kooldioxyde
en waterstof. De verhouding tusschen deze gassen was in
verschillende proeven als:

Na een dag of zes had het gasvolume zijn maximum bereikt
en daarna begon het volume te verminderen; de verhouding
liep terug tot 1 : 3,5; 1 : 4. Het kooldioxyde-gehalte begon
weer af te nemen. Onderstaande grafische voorstelling geeft
een beeld van de gasontwikkeling in een kolf van 250 c.C.
inhoud gevuld met een 2 % glycerine oplossing en een van
100 c.C. met denzelfden inhoud.

Dat het kooldioxydegehalte later afneemt, moet worden
toegeschreven aan \'t feit, dat de bacteriën uit de pepton
ammoniak produceeren, hetgeen zich verbindt met het
koolzuur tot carbonaat en bicarbonaat^).

Deze stof heb ik niet zuiver kunnen krijgen; ze was
steeds verontreinigd met eenig dioxyaceton Het was voor
deze proeven echter niet zoo bezwaarlijk, daar het dioxy-
aceton, zooals later zal blijken, niet zoo snel wordt ontleed
als het glycerinealdehyde, zoodat het op de gasontwikkeling

1) Mierenzuur werd zelfs na 20 dagen niet in de gistkolf gevonden.
Dioxyaceton wordt aangetoond met de reactie van Denigès.
C. R. 1909, I, 172.

na één dag geen invloed uitoefent. Bij de analyse werd
Zooals steeds alleen op de hoofdproducten gelet en niet op
sporen van bijproducten.

Van de stoffen onder B werd hier slechts azijnzuur ge-
vonden; beide reacties op deze stof waren zeer sterk positief.

Voor deze proef werd de glycerinealdehydeoplossing
door kaarsfiltratie i) gesteriliseerd. Het was mij n.1. ge-
bleken, dat bij verhitting op 100° C. verharsing optrad,
waardoor de vloeistof zich bruinkleurde. De gasanalyse
gaf ook voor een gefiltreerde oplossing veel meer gas, dan
eenzelfde oplossing, die bij 100° C. gesteriliseerd was.

De verhouding der gassen (CO2; Hg) liep nog al uit een,
na een dag b.v. 1 : 3,5; 1 : 4,3; 1 : 3,1.

Na meerdere dagen nam het kooldioxyde-gehalte in ver-
houding toe; zoo vond ik na 4 dagen 1 ; 2,4.

De analyse met paratyphus B bacteriën gaf dezelfde
producten als met S. coli; er werd voor deze bacteriën ook
gas gevonden, hetgeen bij glycerine niet het geval was.

Het dioxyaceton, dat door gisting van glycerine met de
A, suhoxydans ontstaan was, werd, door eenige malen fijn
wrijven onder absoluten alcohol en daarna snel afzuigen,
nogmaals gereinigd. Het was toen een zuiver wit praepa-
raat; smeltpunt tegen 80° C. Deze stof heeft de eigenschap

in waterige oplossing zeer sterk te verharsen, daarom werd
de vloeistof door een cnamberland-kaars gefiltreerd. Deze
kaars houdt de bacteriën tegen en de oplossing, die hij door-
laat, is steriel. Men moet hierbij erg oppassen en zeer goed
controleeren of de vloeistof werkelijk steriel is; het gebeurt
dikwijls, dat deze kaarsen kleine barstjes bevatten, waardoor
de bacteriën meefiltreeren.

De kaars en de kolf, waar de vloeistof in gefiltreerd
wordt, moeten droog gesteriliseerd worden in een droog-
stoof gedurende een half uur op 170° C.

Nadat de vloeistof gefiltreerd en steriel calciumcarbonaat
was toegevoegd, wachtte ik drie dagen, om te zien of er groei in
de kolf optrad. Was dit niet het geval, dan werd de kolf met
de bacteriën geënt en geplaatst in de broedstoof bij 37° C.

De vloeistof, die lichtgeel was, werd door het staan bij
deze broedtemperatuur steeds donkerder, doordat ook bij
deze temperatuur verharsing optreedt.

De analyse gaf veel azijnzuur met daarnaast sporen
aldehyde, alcohol, indol en ammoniak, terwijl de reactie van
Voges-Proskauer duidelijk positief was.

De gasontwikkeling had zeer langzaam plaats: eerst na
3^4 dagen waren er eenige c.C. gas gevormd. Het gas be-
stond voor ongeveer -f gedeelte uit kooldioxyde, terwijl de
rest waterstof was. Ook de paratyphus B stammen gaven
gas, terwijl de andere bacteriën geen gas ontwikkelden.

De mogelijkheid, dat de verharsingsproducten de ont-
leding zouden beïnfluenceeren, heb ik willen uitschakelen,
door deze zelfde proeven te herhalen bij kamertemperatuur.
De vloeistof behield toen de lichtgele kleur.

Bij deze proeven werden dezelfde resultaten verkregen:
ook hier had weer een zeer langzame ontleding van het
dioxyaceton plaats.

Dat werkelijk het dioxyaceton veel minder krachtig
wordt aangetast dan b.v. glycerine, bewijst het volgende
proefje:

In een gistkolfje van 200 c.C. ontstond bij kamertempera-
tuur, na 3 dagen, 6 c.C. gas uit een 1 % dioxyacetonoplossing,
terwijl uit een 1 % glycerineoplossing reeds na 1 dag 24
c.C. gas gevormd werden.

Dit zuur dat gemaakt was door oxydatie van glycerine,
werd in het calciumzout omgezet met behulp van CaCOg.
Na affiltratie van de overmaat krijt en indamping van de
vloeistof tot klein volume, werd het zout door alcohol ge-
praecipiteerd; het was een witte, kristallijne stof.

Daar het mol. gewicht van dit zout ongeveer tweemaal
zoo groot is als van het vrije zuur, werd 10 gr. zout opge-
lost in 500 c.C. peptonwater, terwijl slechts 2 gr. krijt werd
toegevoegd.

Ook deze stof werd langzaam ontleed; na drie dagen was
er slechts een zwakken bacteriegroei waar te nemen. Na vier
weken werd de kolfinhoud verwerkt.

A. De vluchtige, neutrale producten zijn: veel acetalde-
hyde, ammoniak en indoL Alcohol werd niet aangetoond.

B. Het zure destillaat bevatte alleen azijnzuur, terwijl
de reacties op melkzuur en barnsteenzuur in het perforaat
negatief uitvielen.

Het gas, dat eerst na eenige dagen zich vormde, bestond
alleen uit waterstof, daar het kooldioxyde werd gebonden
tot carbonaat en bicarbonaat.

De analyse van de producten, ontstaan door de gisting
met paratyphus B bacteriën gaf dezelfde resultaten als
met B, coli.

Het glycerinezuur was inactief en bereid, volgens voorschrift
van ZiNNO Pharm. C. H. 38. 1897, 780.

stoffen is, welke in aanmerking komen, om als tusschen-
product bij de alcoholische gisting op te treden, werd aan
een nauwkeurig onderzoek onderworpen. Het was bereid
uit kaliumbitartraat en kaliumbisulfaat,volgens de methode
uitgewerkt door de Jong^). In de geconcentreerde oplos-
sing werd de hoeveelheid zuiver pyrodruivenzuur bepaald
door het als hydrazon neer te slaan en dit te wegen; twee
bepalingen gaven 90.7 en 90.9 % zuiver zuur.

Iets meer dan 5 gr. van deze oplossing werd in 500 c.C.
peptonwater opgelost en daarna met loog op lakmoes ge-
neutraliseerd. Deze neutrale vloeistof werd door een kaars
gefiltreerd en vervolgens gecontroleerd of zij steriel was.
24 Januari werd de kolf geënt met de bacterie en 20 Fe-
bruari geanalyseerd. Door een proefje te nemen met
Phenylhydrazine bleek, dat al het pyrodruivenzuur ver-
dwenen was; er ontstond geen neerslag.

Positieve reactie Voges-Proskauer, dus ook hier heeft
zich eenig acetyl-methyl-carhinol gevormd.

Acetaldehyde werd niet gevonden, terwijl de reacties op
ammoniak en indol slechts zwak positief waren. Na aanzuren,
destilleerde azijnzuur over.

De gasanalyse gaf tot resultaat, dat na één dag groote
hoeveelheden gas waren gevormd, bestaande uit kooldioxyde
en waterstof. Meestal vond ik een verhouding van deze twee
gassen als 3 : 5 na één dag. Het kooldioxyde werd na meer-
dere dagen gebonden tot bicarbonaat: CHgCOCOONa
H2O —V CHaCg NaHCOg.

Hier vinden we dus een groot verschil met de ontieding
van het glycerinezure-zout; daar bestond het gas alleen uit
waterstof en werd het kooldioxyde dus dadelijk gebonden.

Bij het pyrodruivenzuur, dat zeer sterk vergist, komt het
kooldioxyde eerst in vrijheid en wordt dan gebonden.

De paratyphus B bacteriën ontleden pyrodruivenzuur
niet zoo sterk als de co/z-bacteriën, maar zij geven dezelfde
producten.

Ik heb bij alle ontledingen opgemerkt, dat de paratyphus
B bacteriën de stoffen niet zoo sterk aantasten als de
coli bacteriën; meestal waren het slechts sporen, cKe aange-
toond werden.

Ten slotte werd een kolf waarin alleen peptonwater en
calciumcarbonaat, geënt met co/z-bacteriën en na dertig dagen
geanalyseerd.

Gevonden: ammoniak, indol en een spoortje vluchtigzuur,
Barnsteenzuur en melkzuur werden niet gevonden.

De in § 3 verkregen resultaten^) laten zich tot de vol-
gende tabel vereenigen:

Allereerst treft hierbij de groote eenvormigheid in den
aard der producten, zoo geven al deze stoffen azijnzuur,
terwijl de meeste ook acetaldehyde vormen.

1) Deze tabel geldt uitsluitend voor dc ontleding door de coli-
bacteriën; de ontledingsproducten van het pepton zijn hierin niet
opgenomen.

Bevreemdend is zeker het feit, dat alleen glycerine, barn-
steenzuur en melkzuur vormt, terwijl noch glycerine-
aldehyde noch glycerinezuur een spoor van deze stoffen
produceeren.

Mierenzuur werd in \'t geheel niet aangetoond, daaren-
tegen is het bij de suikerontieding altijd aanwezig.

Kooldioxyde, zoowel als waterstof worden bij deze ont-
ledingen steeds gevonden, uitgezonderd bij die van glycol.
Deze laatste stof wijkt dus af van een van de hoofdken-
merken van de gemengd zure gisting door de coZi-bacteriën.

In het volgende hoofdstuk zullen, van de hier gevonden
producten, de methoden der quantitatieve bepaling be-
sproken en aan enkele stoffen getoetst worden.

Voor de quantitatieve bepaling van organische lichamen
staan ons helaas nog weinig beproefde methoden ten dienste,
zelfs waar het geldt de meest eenvoudige verbindingen.
Vooral indien deze stoffen in mengsels moeten worden be-
paald, laten bijna steeds de bestaande methoden ons min
of meer in den steek, zoodat men dan daarbij voortdurend
voor allerlei soms nog geheel onopgeloste problemen komt
te staan, wanneer men in de quantitatieve verhoudingen
van het mengsel wenscht door te dringen,

In oplossingen, zooals ze doorgaans bij het bacteriolo-
gisch onderzoek worden gebruikt, heeft men hoogst samen-
gestelde mengsels van zeer uiteenloopende, organische
stoffen te zien, als van de bestanddeelen der voedingsbodem,
zoowel als van de eventueele splitsingsproducten daarvan,
waardoor de bekende methoden menigmaal niet of uiterst
bezwaarlijk zijn toe te passen.

De resultaten, die tot dusver bij het onderzoek der bac-
terieële ontledingen verkregen werden, zijn dan ook in \'t
meerendeel der gevallen slechts benaderend.

Een volkomen sluitende koolstofbalans van een vergiste
stof is een ideaal toestand, die elke onderzoeker op dit
gebied, voorloopig nog maar als een illusie moet beschou-
wen, of de omstandigheden moeten hem al zeer gunstig
zijn. Daar nauwkeurige, quantitatieve bepalingen haast
onmogelijk zijn in de gebruikelijke gistingsoplossingen,
is het apriori dan ook overbodig om sporen van stoffen te
willen bepalen. De fouten zouden dan te groote afmetingen

Op grond van deze overwegingen werd bij dit onderzoek
steeds afgezien deze minimale hoeveelheden te bepalen.

Hiervoor komt in de eerste plaats in aanmerking het
acetaldehyde. Deze stof werd in hetzelfde destilleer-
toestel, als beschreven staat op blz. 23 afgedestilleerd, alleen
werd het acetaldehyde, dat als damp in de kolf achter bleef,
door een stoomstraal uitgedreven.

De vloeistof werd opgevangen in een maatkolf van 100
c.C., die geheel in ijs geplaatst was en waarin van te voren
eenige c.C. alcohol waren gebracht.

Meestal werd uitgegaan van 50 c.C. gistingsvloeistof
en nadat ongeveer 25 c.C. waren afgedestilleerd, werd be-
gonnen met de inleiding van stoom, totdat 100 c.C. in de
maatkolf waren opgevangen.

Een bisulfiet-oplossing van bekende sterkte wordt ver-
mengd met de aldehyde-oplossing; het aldehyde wordt door
het bisulfiet gebonden en door titratie met jodium wordt
bepaald hoeveel bisulfiet gebonden werd.

Ik heb eenige veranderingen aan deze methode aange-
bracht, daar mii dadelijk bleek, dat, als de jodium-oplossing
bij het mengsel van bisulfiet en acetaldehyde werd ge-
voegd er gasvormig SOg ontweek, hetgeen dus blijkbaar
niet snel genoeg tot sulfaat geoxydeerd was. Om dit te ver-
mijden werd de oplossing van bisulfiet en acetaldehyde
gepipeteerd onder de oppervlakte van een bepaalde hoeveel-

heid gestelde jodium. Door de vloeistof langzaam toe te
voegen ontweek er hoegenaamd geen SOg.

De bisulfiet-oplossing bevatte ongeveer 12 gr. K H SOg
per liter. Deze oplossing werd steeds versch gemaakt en
om haar zoo constant mogelijk te houden werd bovendien
10 % alcohol toegevoegd.

De deugdelijkheid der methode werd getoetst aan een
aldehydeoplossing, waarvan het gehalte met behulp van
het p. mtrophenylhydrazine nauwkeurig was bepaald. Door
verdunning van zuiver aldehyde, werd een oplossing van
300 c.C. gemaakt, die ongeveer een half procent aldehyde
bevatte. Hiervan werden 25 c.C. afgepipeteerd en in een
bekerglaasje gedaan, waarna een oplossing van p. mtro-
phenylhydrazine in 30 % azijnzuur werd toegevoegd, tot-
dat geen neerslag meer ontstond. Na 24 uur staan werd op
een gewogen filter afgefiltreerd en na drogen in een droog-
stoof op 100° C., het gewicht van het hydrazon bepaald.

Twee bepalingen gaven 499 en 496 mgr. hydrazon, het-
geen overeenkomt met 122 mgr. acetaldehyde in 25 c.C.
oplossing. Ook volgens de methode Ripper werd in deze
oplossing het acetaldehyde bepaald, gevonden in 25 c.C.
120 en 121 mgr. acetaldehyde, hetgeen dus zeer bevredigend
overeenkomt met de gewichtsanalytische bepaling.

Mierenzuur werd blijkens de qualitatieve analyse bij de
ontledingen van de onderzochte stoffen niet gevonden,
dus kwam als vluchtig zuur alleen azijnzuur in aan-
merking. De methode, die voor de quantitatieve bepaling
van dit zuur het eenvoudigst en doeltreffendst bleek, was
het zuur door stoomdestillatie uit de oplossing geheel te
verdrijven en daarna het overgedestilleerde zuur door titratie
te bepalen.

50 c.C. vloeistof werden met zwavelzuur (4 n). zuur
gemaakt, hetgeen gecontroleerd werd op een methyl-

violetpapiertje, vervolgens met stoom over gedestilleerd en
opgevangen in een maatkolf van 1 L. Hiervan werden 500
c.C. afgepipeteerd en getitreerd met 0,1 n. loog, de andere
500 c.C. dienden als controleproef. Deze methode bleek
twee fouten in te sluiten:

Ie. De laatste sporen zuur blijven hardnekkig in de
destillatiekolf achter, zij zijn eerst bij veel langere stoom-
destillatie daaruit te verwijderen.

2e. De titratie van 500 c.C. is bezwaarlijk daar in zoo\'n
groote hoeveelheid vloeistof een ruime overmaat loog moet
worden toegevoegd om een blijvende kleuromslag van den
indicator te bewerkstelligen. Deze twee bezwaren heffen
elkaar echter eenigszins op, hetgeen blijkt uit de afzonder-
lijk genomen proeven.

250 mgr. azijnzuur (als Ca-zout) werden in 250 c.C. pepton-
water opgelost; hiervan werden 50 c.C. afgepipeteerd en
na aanzuren, aan stoomdestillatie onderworpen.

Het destillaat werd getitreerd, 500 c.C. verbruikten 8,12
c.C. 0,0998 n. loog, dit komt overeen met 8,1 c.C. 0,1 n.
loog = azijnzuur of met 48,6 mgr. azijnzuur in 50 c.C.
vloeistof. De controleproef gaf in 50 c.C. 48,9 mgr. azijn-
zuur. Deze uitkomsten bleken dus vrij goed overeen te
stemmen, en op grond daarvan werd deze methode van
werken gevolgd

Melkzuur, dat ook een weinig vluchtig is, werd alleen
bij de ondeding van glycerine gevonden, en slechts in zeer
kleine hoeveelheid. Ik heb het deel, dat daarvan overging
verwaarloosd en als azijnzuur in rekening gebracht.

De destillatie methode van Duclaux (Traité de microb. III
blz. 384) gaf oneindig veel slechtere uitkomsten, deze methode is voor
quantitatieve bepalingen te onnauwkeurig, zooals trouwens ook reeds
anderen, o.a. Jan Smit (Diss. Amsterdam) opmerkten.

buisjes gevuld met natronkalk, die voor en na de proef ge-
wogen werden. Daar echter het vrij wordende zuur uit het
calciumcarbonaat ook kooldioxyde in vrijheid stelt, moet
dit dus in rekening worden gebracht.

Dit werd gedaan door voor en na de gisting het Ca-ge-
halte van de vloeistof te bepalen. Daartoe werd eerst de
oplossing zorgvuldig door een gehard filter gefiltreerd, om
ook de zeer fijne krijtdeeltjes te verwijderen; bepaald werd
dus de opgeloste hoeveelheid Ca-ion. Dit Ca werd, na toe-
voeging van een weinig NH4CI, bij kookhitte gepraecipi-
teerd met NH4-oxalaat. Na uitwasschen van het neerslag
(geen neerslag in het fikraat met CaCy werd het filter door-
gestoken, met kokend, verdund zwavelzuur en kokend water
schoongespoeld en het oxalaat, na toevoeging van over-
maat 50 % H2SO4, getitreerd met 0,1 n. KMnOi.

Hieruit kan men berekenen de hoeveelheid zuur, die ge-
vormd was en vervolgens ook de hoeveelheid kooldioxyde,
die door het gevormde zuur uit het aanwezige calcium-
carbonaat vrij gemaakt werd.

Deze hoeveelheid werd afgetrokken van de hoeveelheid
kooldioxyde, die in de natronkalkbuisjes opgenomen was,
om zoodoende de hoeveelheid koolzuur, welke door de
gisting was ontstaan, te bepalen.

25 c.C. gistingsvloeistof werden in een wijden perforator
gedurende twee dagen geperforeerd, nadat zij met verdund
zwavelzuur aangezuurd waren. De aetherische oplossing,
die een weinig geel gekleurd was, werd droog gedampt op

een waterbad en het residu in 100 c.C. 96 % alcohol op-
genomen. De heldere oplossing werd op een waterbad
verhit en nadat eem\'ge druppels phenolphtaleïne waren toe-
gevoegd, werd bij de kokende oplossing een koud verzadigde,
waterige oplossing van baryt gedruppeld, tot een blijvende
roodkleuring was ontstaan.

Vervolgens werd het kolfje met een gummistop, door-
boord met een natronkalkbuisje, gesloten.

Was de kolf totaal afgekoeld en de bovenstaande vloei-
stof helder, dan werd ze snel door een gewogen Gooch-
kroes afgefiltreerd en met 96 % alcohol nagewasschen.

Na ten slotte één keer met aether te zijn nagespoeld, werd
bij 100° C. gedroogd en daarna gewogen.

Het gevaar van deze methode is, dat zich gemakkelijk
BaCOg kan vormen^), daarom moet bij afkoeling van de
kolf de lucht slechts toetreden door een natronkalkbuisje,
terwijl men bovendien moet zorgen, dat slechts ten hoogste
één druppel overmaat barytwater aanwezig is.

Een blancoproef gaf het volgende resultaat: 200 mgr,
zuiver, gesublimeerd barnsteenzuur leverden 0,4329 gr,
Ba-succinaat, overeenkomende met 201,9 mgr, zuur.

Melkzuur werd bepaald, door het getal, gevonden
voor de totale zuurgraad, te verminderen met de getallen,
gevonden voor azijnzuur en barnsteenzuur. De totale
zuurgraad werd bepaald, door voor en na de gisting het Ca-
gehalte van de vloeistof te bepalen®).

e. Ten slotte moeten nog de methoden besproken wor-
den, op welke wijze de vergistende stoffen zelf quantitatief
bepaald werden,

De stoffen, waarvan ik de ontleding quantitatief onder-
zocht heb, zijn glycol, glycerine en pyro-
druivenzuur.

Dit laatste zuur werd weer als phenylhydrazon neerge-
slagen en bepaald als op blz. 50.

In de litteratuur zijn vele quantitatieve glycerine
bepalingen bekend, die op geheel verschillende eigen-
schappen van de glycerine berusten.

Zoo wordt volgens de methode van Zeisel de glycerine
met HJ omgezet in isopropyljodide. In deze oplossing
wordt vervolgens het jodide met zilvernitraat neergeslagen
en dit gewichtsanalytisch bepaald.

Een andere bepaling berust op het principe, om glycerine
om te zetten in triacetaat en hiervan het verzeepingsgetal
te bepalen.

In bier en wijn wordt glycerine bepaald door indam-
pen met kwartszand en vervolgens extractie van het residu
met alcohol, of beter met aceton. Deze methode leek het
meest geschikt om hier, in het peptonhoudende milieu,
gebruikt te worden. Pepton wordt door aceton en ook
door alcohol neergeslagen, terwijl ook het Ca-acetaat, dat
in de oplossing voorkomt, in aceton niet oplosbaar bleek.

Toch moest de methode een weinig worden veranderd en
wel zoo, dat niet geheel tot droog werd ingedampt, daar dan
het residu de glycerine zoo stevig vast houdt, dat deze er
niet meer quantitatief is uit te extraheeren.

50 c.C. der glycerinepeptonoplossing werden tot een
klein volume (± 3 c.C.) ingedampt, vervolgens onder om-
schudden eenige druppels 96 % alcohol toegevoegd en
daarna aceton. Indien de aceton dadelijk werd toegevoegd,
sloeg een klonterige massa neer, terwijl door de voor-
behandeling met alcohol een fraai wit vlokkig neerslag ont-
stond. Na 24 uur staan werd het neerslag afgefiltreerd en

eenige keeren eerst met aceton en daarna met alcohol nage-
wasschen. De vloeistof werd vervolgens verdampt op een
waterbad en de achter gebleven glycerine gewogen.

Zuivere glycerine werd twee dagen bewaard in een
exsiccator boven zwavelzuur, hiervan werd 812 mgr. op-
gelost in 100 c.C. peptonwater.

In deze oplossing werd de glycerine bepaald, als boven
beschreven en vervolgens, voordat ze gewogen werd, weer
twee dagen in denzelfden zwavelzuur exsiccator gedroogd.

Voor elke bepaling was 50 c.C. gebruikt, gevonden 407
en 409 mgr. glycerine. Hieruit blijkt, dat niet al de bestand-
deelen van de pepton neergeslagen zijn, of dat de laatste
sporen water niet verwijderd worden. Langer in een
exsiccator plaatsen gaf geen beter resultaat, toch is de be-
paling voor dit onderzoek als nauwkeurig genoeg, geaccep-
teerd. Om te controleeren of het aanwezige Ca-acetaat en
de fijne krijtdeeltjes nog invloed zouden kunnen hebben,
werd een peptonoplossing bereid, waaraan toegevoegd was
2 % Ca-acetaat en 2 % krijt, en bovendien aan 50 c.C.
351 mgr. glycerine.

Met een pipet van 50 c.C. werd de vloeistof na bezinken,
opgezogen en vervolgens door een hard filter gefiltreerd.
Na schoonwasschen met water, werd het glycerinegehalte
in de vloeistof bepaald; gevonden : 350 en 353 mgr. dus
ook hier bleek deze methode bruikbaar te zijn.

De methode, die voor glycerine gebruikt werd, is ook
toegepast om het glycol te bepalen. Glycol lost goed op in
alcohol\' en aceton, dus de behandeling, als bij glycerine
beschreven, werd hier op dezelfde wijze gevolgd. Nu heeft
watervrij glycol de eigenschap om zeer gemakkelijk water-
damp aan te trekken, wanneer het aan de lucht staat;

binnen twee weken neemt het 60 % in gewicht toe en vormt
een hydraat met twee mol. water i). Eerst na 4 è 5 dagen
in een zwavelzuur exsiccator te hebben gestaan bleef het
gewicht constant. De proeven gaven minder goede resul-
taten dan met glycerine, hoewel deze methode toch ook
voor glycol nog wel bruikbaar is.

50 c.C. peptonwater met 2 % Ca-acetaat en 2 % Ca-
carbonaat bevatten 775 mgr. glycol. In twee proefjes wer-
den 759 en 763 mgr. teruggevonden. Daar het verschil
nog al groot was, wilde ik controleeren of de glycol met het
afdestilleeren niet een weinig vluchtig was. De genomen
proeven toonden aan, dat in het destillaat met CuSO^ en
loog een spoortje glycol kon worden gevonden 2).

Ik heb toen getracht een andere methode te volgen.
Glycol werd daartoe in alkalisch milieu geoxydeerd met
permanganaat en na aanzuren werd het permanganaat
teruggetitreerd. Deze methode mislukte evenwel geheel,
daar de concentratie van het glycol in de oplossing zoo ge-
ring was, dat er bijna geen verschil tusschen een 1 % glycol
oplossing en een blanco peptonwateroplossing gevonden
werd. Ik was daarom genoodzaakt de extractie methode met
aceton te volgen.

De uitvoering van een volledige quantitatieve analyse
van een vergiste stof geschiedde nu als volgt:

In een erlemeyerkolf van 1 L. werden 500 c.C. 1 % pepton
oplossing afgemeten en deze bij 100° C. gesteriliseerd.
Den volgenden dag werd een bepaalde hoeveelheid zuivere,
te vergisten stof afgewogen en deze aan de peptonoplossing,
tegelijk met 5 gr. Ca-carbonaat, toegevoegd, daarna werd

de kolf opnieuw in stroomenden damp gesteriliseerd.
De kolf werd gesloten met een steriele, driemaal door-
boorde gummistop, voorzien van een opzet, bestaande uit
drie U-vormige buizen, (zie fig.) waarvan a met calcium-
chloride, de beide andere, h en c, met natronkalk gevuld
waren. De hen verbindende buisjes hangen aan twee

glazen staafjes, die op hun beurt aan een dikkere glazen
staaf vastgesmolten zijn, welke laatste met een omgebogen
einde in de gummistop van de kolf is bevestigd. Door deze
stop gaan bovendien het buisje d, dat naar de U-buizen
leidt, en het buisje e, dat onder de vloeistofspiegel uitmondt.
Aan het andere einde draagt dit laatste een wijdere buis
ƒ, gevuld met natronkalk en watten. Een dergelijke buis g
sluit, achter de laatste U-buis, het toestel met inhoud aan
de andere zijde van de buitenlucht af. Binnendringen van
koolzuur en infecties wordt door deze inrichting geheel
tegengegaan.

Voordat de vloeistof met de bacterie geënt werd, pipe-
teerde ik met een steriele pipet 100 c,C, vloeistof uit de
kolf. Hiervan werden 50 c.C. gebruikt voor twee Ca-
bepalingen, terwijl met de overgebleven 50 c.C. een con-

tróle proef werd ingesteld op de hoeveelheid in oplossing
gebrachte zuivere stof.

De 400 c.C. cultuurvloeistof werden vervolgens geënt
met een oogje van een 24 uur oude agarcultuur van het te
bestudeeren microörganisme. Vervolgens werd de kolf
gesloten met de gummistop, echter zonder verbonden te
zijn met de U-vormige buisjes. De stop en de buisjes,
zoover ze onder de stop uitkwamen, werden gesteriliseerd.

Toen werd, gedurende één uur, een koolzuurvrije lucht-
stroom door de kolf gezogen; dit had ten doel alle kool-
dioxyde te verwijderen, voordat de U-buisjes met de kolf
verbonden waren.

Vervolgens werden de twee natronkalkbuisjes gewogen
en met het chloorcalciumbuisje aan de kolf verbonden.
Het geheele toestel werd daarna in de stoof bij 37° C. ge-
plaatst. Van tijd tot tijd werd de kolf omgeschud om de
gevormde zuren zoo volledig mogelijk te neutraliseeren.
Na ongeveer 30 dagen werd met het onderzoek begonnen,
de gisting kon dan als geëindigd worden beschouwd.

Nu werd weer een koolzuurvrije luchtstroom door de
vloeistof gezogen, waarna de twee natronkalkbuisjes ge-
wogen werden.

Vervolgens werden 50 c.C. afgepipeteerd voor de be-
paling van de onvergiste stof en tweemaal 25 c.C. voor de
Ca bepaling.

Voor de bepaling van het vluchtig zuur dienden 50 c.C.,
deze werden met stoom gedestilleerd en het destillaat met
0.1 n. loog getitreerd. Voor de barnsteenzuur bepaling wer-
den telkens 25 c.C. geperforeerd. Melkzuur, werd, zooals
gezegd, niet rechtstreeks bepaald.

200 c.C. werden gebruikt voor de acetaldehyde-bepaling.
Daar bleek, dat het acetaldehyde in de broedstoof bij 37° C.
uit de kolf vervluchtigt, werd een afzonderlijke proef in-
gesteld, om de hoeveelheid acetaldehyde te bepalen, die
tijdens de proef bij 37° C. ontweek. Hiervoor werd een

kolf gebruikt van denzelfden inhoud en deze in een ther-
mostaat bij 37° C. geplaatst, terwijl de gassen condenseer-
den in een maatkolfje van 100 c.C. gevuld met water, dat
buiten de thermostaat onder stroomend water voort-
durend werd afgekoeld. Nadat deze kolf even lang had
staan gisten als de andere, werd de maatkolf tot 100 c.C.
aangevuld en hierin het aldehyde bepaald volgens de ge-
wijzigde methode van Ripper. Ook in deze kolf werd de
hoeveelheid vergiste stof (zie boven) bepaald. Zoo kon dan
bij de volledige proef een juiste correctiefactor worden aan-
gebracht voor het acetaldehyde.

De proeven voor de quantitatieve analyse werden steeds
geënt met coZz-bacteriën. Deze micro organismen doen de
verschillende stoffen zoo volledig mogelijk ontleden, waar-
door we dus een duidelijk beeld krijgen van de ver-
houding van de producten, die ontstaan bij de gemengd
zure gisting.

Bovendien moest een keuze worden gedaan, daar een
volledig onderzoek met alle vertegenwoordigers der coli-
typhusgtotp veel te uitgebreid zou worden en zeer veel tijd
zou vereischen.

Allereerst werden, volgens de beschreven methode, de
uit het glycol gevormde producten, bepaald. Uit de quali-
tatieve analyse was gebleken, dat bij deze ontleding alleen
acetaldehyde en azijnzuur ontstaan. Het absorptietoestelletje
voor gassen kon dus bij deze bepaling geheel vervallen;
de kolf werd dan ook slechts met een wattenprop gesloten.

Opgelost werden 4,915 gr. zuivere, boven zwavelzuur
gedroogde glycol in 500 c.C. peptonwater, waaraan onge-
veer 3 gr. Ca-carbonaat was toegevoegd. Na de sterilisatie
werden 100 c.C. steriel afgepipeteerd, waarvan 50 c.C.
gebruikt werden voor een glycolbepaling; gevonden werd
daarbij 485 mgr.

Dit getal werd voor de verdere berekening als de juiste hoe-
veelheid glycol aangenomen. De fout, die aan de bepaling
kleeft, werd door het glycolgehalte voor en na de vergisting
op dezelfde manier te bepalen, eenigszins geëlimineerd.

Voor de Ca-bepaling in 25 c.C. cultuurvloeistof, die hier
ingesteld werd als controle op de hoeveelheid totaal zuur,
waren noodig 2,08 en 2,12 dus gemiddeld 2,10 c.C. 0,0987 n.
permanganaat, dat is 2,07 c.C. 0,1 n.

De kolfinhoud werd met een 24 uur oude agarcultuur
geënt en 30 dagen in de broedstoof geplaatst. De analyse
gaf de volgende resultaten:

Voor de Ca-bepahngen in 25 c.C. vloeistof waren noodig
9,41 en 9,46 c.C. 0,0986 n. permanganaat = 9,34 c.C. 0,1 n.
Het verschil van voor en na de ontleding bedraagt dus 7,24
c.C. 0,1 n.

Dit calcium was aanwezig als Ca-acetaat, dus komen
die 7,24 c.C. 0,1 n. permanganaat overeen met 7,24 c.C.

0,1 n. azijnzuur = 43,44 mgr. per 25 c.C. of 87 mgr. per
50 c.C. gistingsvloeistof.

50 c.C. vloeistof werden voor de azijnzuurbepaling met
stoom gedestilleerd en opgevangen tot één liter.

De helft hiervan nam ter neutralisatie 7,18 c.C. 0,1 n.
NaOH; dit komt overeen met 14,36 c.C. 0,1 n. zuur per
50 c.C. gistingsvloeistof = 14,36 x 6 = 86 mgr. azijnzuur,
hetgeen met het reeds gevonden cijfer volkomenovereenstemt.

Vervolgens werd de hoeveelheid onvergiste glycol be-
paald. Dit geschiedde door 50 c.C. vloeistof te filtreeren,
daarna in te dampen en te extraheeren met aceton. Ge-
vonden werd, dat 229 mgr. vergist was, dus 485 — 229
= 256 mgr. glycol is onveranderd nog aanwezig.

Voor de bepaling van het acetaldehyde werden 200 c.C.
afgepipeteerd en gedestilleerd. Nadat ongeveer 50 c.C.
was opgevangen, werd stoom door de kolf gedreven, totdat
100 c.C. in de maatkolf was opgevangen.

50 c.C. van de NaHSOg oplossing werden getitreerd;
hiervoor waren noodig gemiddeld 54,03 c.C. 0,1 n. J^ op-
lossing. (54,05 en 54,02 c.C.).

50 c.C. bisulfietoplossing 25 c.C. aldehydeoplossing
verbruikten 49,52 en 49,48 c.C. 0,1 n. J^. Verschil is dus
4,53 c.C. 0,1 n. Jg; dit komt overeen met 4,53 x 0,17348 X
0,1 = 80 mgr. acetaldehyde in 25 c.C. destillaat en deze zijn
afkomstig van 50 c.C. gistingsvloeistof.

De proef, die ingesteld werd, om het aldehyde, dat tijdens
de ontleding in de stoof vervluchtigd was, te bepalen, gaf
het volgende resultaat:

300 c.C. peptonwater met 2,894 gr. glycol werden in een
thermostaat geplaatst en de dampen opgevangen in een maat-
kolf met 80 c.C. water. Deze kolf bleef ook 30 dagen staan,
en nadat de maatkolf tot 100 c.C. was aangevuld, werd
hierin het acetaldehyde bepaald.

50 c.C. bisulfiet verbruikten 53,22 en 53,19 c.C. 0,1 n. Ja,
gemiddeld 53,21 c.C.

50 c.C. bisulfiet 25 c.C. aldehyde verbruikten 52,61
en 52,63 c.C. gemiddeld 52,62 c.C. 0,1 n. Jg. Verschil is dus
0,59 c.C. 0,1 n. Ja.

Nu werd bij deze proef per 50 c.C. vloeistof 233 mgr.
glycol teruggevonden, er is dus ontleed 482 — 233 = 249
mgr. Deze 249 mgr. glycol ontwikkelden 0,59 c.C. 0,1 n.
acetaldehyde, dat is dus per 100 mgr. glycol 0,22 c.C. 0,1 n.
acetaldehyde. Deze correctie moeten we bij de volledige
analyse in rekening brengen. Daar waren 229 mgr. glycol
ontleed, waarvoor we dus een vermeerdering aan acetalde-

c.C. 0,1 n. aldehyde == 9 mgr. aldehyde; totaal was er dus
ontstaan 89 mgr. acetaldehyde.

We kunnen nu de gistingsbalans voor de koolstof per
50 c.C. vloeistof opmaken, deze wordt als volgt:

Opvallend hierbij is, dat in beide proeven een groote
hoeveelheid glycol onaangetast bleef.

Dit kan niet zijn oorzaak vinden in den zuurgraad van
het milieu, daar het calciumcarbonaat steeds in overmaat
aanwezig was.

Het moet dus gezocht worden in de concentratie van het
acetaldehyde. Zooals bekend, is dit een bacteriegift, indien
het in grootere concentratie aanwezig is. Om deze remmende
werking te demonstreeren werd een klein proefje genomen
met ongeveer een half procentige acetaldehydeoplossing
in peptonwater en geënt met B. coli. Het bleek, dat bij deze
concentratie van acetaldehyde de bacteriën niet wilden
groeien. Het is dus zeer wel mogelijk, dat de grensconcen-
tratie, waarbij de bacteriën nog kunnen vergisten, gelegen
is bij een concentratie, zooals die bij de genomen proeven,
na ongeveer drie weken, was. Ook dit werd nagegaan en
het bleek, dat de bacteriën bij een concentratie van 0,2 %
aan acetaldehyde niet afsterven, maar zich ook niet ont-
wikkelen in de peptonoplossing. De vergisting vindt dus door
de gevormde hoeveelheid acetaldehyde een natuurlijk einde.

Het te kort van 6% aan C. kan voor een gedeelte
worden toegeschreven aan het gewicht van de gevormde
bacteriën. Kruse i) geeft in zijn boek een lijst op voor het C.
gehalte van de meeste bacteriën en dit is gemiddeld 50 %
van het gewicht^) der micro organismen.

Met glycol werd nog een andere, quantitatieve proef
ingezet en wel, om te bepalen de hoeveelheid acetaldehyde,
die werd vastgelegd aan sulfiet; theoretisch toch zou al het
aldehyde vastgelegd moeten worden.

Voor deze proef werden 400 c.C. peptonwater met 4,042
gr, glycol, in een kolf gebracht, waarin 2 gr, krijt en 3 gr.

Dr. W. Kruse. Allgemeine Mikrobiologie blz. 54.
\') Zie hierover bij vergisting van glycerine.

versch neergeslagen CaSOa^) aanwezig waren. Na sterili-
satie werden 50 c.C. afgepipeteerd voor een glycolbepaling.
Gevonden werd 501 mgr.

De kolf werd geënt met B. coli en van 18 Maart tot 20
April in de stoof geplaatst. Voor de analyse werden 50 c.C.
gebruikt, om de hoeveelheid onontleed glycol te bepalen.

Dit geschiedde niet geheel volgens de beschreven methode,
daar hier het sulfiet en de dubbelverbinding van aldehyde en
sulfiet aanwezig waren. De overmaat van het sulfiet werd
ter verwijdering eerst neergeslagen met 20 c.C. 25 % BaClg
oplossing. Vervolgens werd de aldehydesulfietverbinding
door koken met Ba(0H)2 ontleed; het vrijkomende sulfiet
werd weder als BaSOg neergeslagen. De overmaat barium-
hydroxyde werd door CO2 omgezet in carbonaat.

Hierbij ontstaat ook bicarbonaat, dat door koken weder
omgezet wordt in carbonaat. Na affiltratie en eenige malen
schoonwasschen met water, werd de vloeistof ingedampt en
het glycol door extractie bepaald. Teruggevonden in 50 c.C.
352 mgr. glycol; er was dus ontleed 501 — 352 = 149 mgr.

De acetaldehydebepaling geschiedde met 200 c.C.
gistingsvloeistof; deze werden met stoom gedestilleerd en
het destillaat tot 100 c.C. aangevuld.

50 c.C. bisulfiet 25 c.C. aldehydeoplossing verbruikten
41,19 en 41,15 c.C. 0,1 n. Ja. Verschil is dus 2,43 c.C. 0,1
n. J2. Dit komt overeen met 84 mgr. acetaldehyde in 50 c.C.
gistingsvloeistof. Theoretisch zouden er uit 149 mgr. glycol

1) Nopd. (Biochem. Zeitschr. 96 blz. 164) geeft de voorkeur aan
CaSOg, boven Na2S03 voor quantitatieve bepalingen. Ie Omdat
CaSOg neutraal reageert, terwijl NasSOg sterk alkalisch reageert, cn
2c het NajSOg maakt bij de reactie met acetaldehyde natronloog vrij,
hetgeen de condensatiercactie van sulfiet en aldehyde zeer tegenwerkt.
Deze schadelijke invloed is bij het gebruik van CaSOg veel geringer.

Hierbij wordt verondersteld, dat er geen acetaldehyde
vervluchtigd was, maar bij het ontstaan dadelijk door het
bisulfiet gebonden werd, hetgeen ook het meest waar-
schijnlijk is.

Naast het aldehyde was een spoor azijnzuur aantoonbaar;
er was dus een weinig aldehyde geoxydeerd.

Dat er hier zoo weinig glycol vergist werd, moet toege-
schreven worden aan den eenigszins schadelijken invloed
van de sulfiet-ionen op de ontwikkeling der bacteriën.

Volgens de qual. analyse ontstaan hierbij, acetaldehyde,
azijnzuur,barnsteenzuur,melkzuur, kooldioxyde en waterstof.

10,880 gr. zuivere, gekristalliseerde glycerine werden
opgelost in 600 c.C. peptonwater, waaraan 4 gr. CaCOg
was toegevoegd. Na sterilisatie werden 100 c.C. afgepipe-
teerd. De contrólebepaling leverde 901 mgr. glycerine per
50 c.C. vloeistof (theoretisch 907 mgr.). De hoeveelheid
opgelost Ca bedroeg per 25 c.C.: 2,12 c.C. 0,1 normaal.
De kolf werd gesloten met het apparaat, om het gevormde
kooldioxyde op te vangen. De glazenbuisjes, die onder de
gummistop uitkwamen, werden nog eens extra geflambeerd.
De vloeistof was met een jonge cultuur der co/z-bacterie
geënt op 12 April. Gedurende één uur werd een koolzuur-
vrije luchtstroom door de kolf gezogen. De kolf werd daarna
in de broedstoof geplaatst.

De analyse geschiedde op 14 Mei, dus na 32 dagen. De
kolf werd in een bak met ijswater geplaatst, terwijl direkt
achter de kolf een waschfleschje met 100 c.C. gedest. water
ingeschakeld werd, waardoor het meegevoerde acetaldehyde
werd tegengehouden. Een koolzuurvrije luchtstroom werd
gedurende één uur door de vloeistof gezogen.

37,324 — 35,496 = 1,828 en 28,276 — 27,960 = 0,316.
totaal 2,144 gr. COg. Dit komt overeen met 214,4 mgr.
CO2 per 50 c.C. gistingsvloeistof

Vervolgens werd het Ca-gehalte bepaald in 25 c.C. Noodig
waren 13,4 c.C. 0,1 n. permanganaat. Dus totaal Ca-gehalte
per 50 c.C. 26,8 c.C. 0,1 n. Oorspronkelijk waren aanwezig in
50 c.C. onvergiste vloeistof 4,24 c.C. 0,1 n. Er was dus een
hoeveelheid, overeenkomende met 22,6 c.C. 0,1 n. KMnOi,
in oplossing gegaan, daarbij uit het krijt vrijmakende
22,6 X 2,2 = 49, 6 mgr. COg. Uit de glycerine werd dus
214,4 — 49,6 = 164,8 mgr. CO2 ontwikkeld.

Ter bepaling van de hoeveelheid glycerine, die niet
aangetast was, werden 50 c.C. gebruikt. Gevonden 393
mgr. Ontleed was er dus 901 — 393 = 508 mgr. glycerine.
Voor de acetaldehyde bepaling werden 200 c.C. vloeistof
gebruikt; hierbij werden 40 c.C. vloeistof gevoegd uit het
waschfleschje. Bij de destillatie met stoom werden 100 c.C.
opgevangen en getitreerd. Gevonden in 25 c.C. destillaat
2,56 0,1 n. J2. Dit komt overeen met 44 mgr. acetalde-
hyde in 50 c.C. gistingsvloeistof. De proef, die ingesteld
werd om het aldehyde te bepalen, dat tijdens de vergisting
verdampt was, leverde per 100 mgr. glycerine voor
50 c.C. vloeistof 0,21 c.C. 0,1 n. J2.

18,4 mgr. acetaldehyde. De totale hoeveelheid gevormde
acetaldehyde is dus 62,4 mgr. per 50 c.C. De bepaling van
azijnzuur leverde voor 50 c.C. vloeistof 17,79 c.C. 0,0902 n.
zuur, hetgeen overeenkomt met 96,36 mgr. azijnzuur^).

2) Om nog eens een contrôle op de qualitatieve analyse te kunnen
uitoefenen, werden de 1^/jL destillaat na neutralisatie ingedampt tot
een klein volume en vervolgens een reactie op mierenzuur ingesteld.
Met 10 c.C. eener oplossing van 10 % HgCU, 3 % NaCl en 3 gr. Na-
acetaat. Er ontstond geen neerslag van HgCl.

In 25 c.C. vloeistof werd het barnsteenzuur bepaald;
gewicht van het Ba-succinaat was 28 mgr., dit komt over-
een met 13 mgr. zuur of per 50 c.C. 26 mgr. (4,4 c.C. 0,1 n.
zuur) barnsteenzuur.

Samen

Voor het melkzuur blijft dus 2,14 c.C. 0,1 n. zuur, over-
eenkomende met 19,3 mgr. melkzuur in 50 c.C. vloeistof.
De gistingsbalans is dus:

Bij deze analyse bleef een gedeelte van het COg als bi-
carbonaat in oplossing, hetgeen met een luchtstroom bij
lage temperatuur niet ontleedt, met als gevolg, dat dus al
het koolzuur niet verwijderd werd.

Bij een andere analyse werd het COg verwijderd door de
kolf in een waterbad van 50° C. te plaatsen en daarna een
luchtstroom door de vloeistof te zuigen. Thans werden

echter twee waschfleschjes ingeschakeld, om het acetalde-
hyde vast te houden. De uitkomst hier verkregen was iets
gunstiger, het azijnzuur- en barnsteenzuurgehalte bleken
iets hooger, terwijl het melkzuurgehalte daardoor iets lager
was. Ook koolzuur was iets hooger. Gevonden werden de
volgende cijfers:

Zooals reeds gezegd werd op blz. 69, bestaat de helft van
het gewicht van de bacteriën uit koolstof. De glycerine-
peptonoplossing bleek een zeer goeden voedingsbodem voor
de co/z-bacteriën; de microörganismen ontwikkelden er zich
veel beter in, dan in een glycolpeptonoplossing. Om nu
eenigszins een beeld te krijgen van de hoeveelheid koolstof,
die noodig is om de bacteriën op te bouwen, heb ik het ge-
wicht van de microben bepaald in 50 c.C. glycerinepepton-
water. Het kolfje met deze vloeistof werd, nadat het met
B. coli geënt was, een maand in de stoof gezet. Vervolgens
werden de bacteriën van de vloeistof electrisch afgecen-
trifugeerd, met steriel water volkomen schoongewasschen
en daarna gedroogd.

Het gewicht van de bacteriën was 76 mgr., hiervan is
dus de helft koolstof. Deze 38 mgr. koolstof zijn niet alleen
van de glycerine afkomstig, maar ook voor een gedeelte

natuurlijk van de pepton. Stel, dat 50 % van de glycerine
afkomstig is, dan komen nu in de gistingsbalans in totaal
168,9 17 = 185,9 mgr. C. of 97,6 %.

Voor de bepaling van de ontledingsproducten (azijnzuur,
sporen acetyl-methyl-carbinol, kooldioxyde en waterstof)
van dit zuur, werd de analyse eenigszins gewijzigd. Hier
werd n.1. geen calciumcarbonaat bij de oplossing gevoegd,
maar het zuur werd geneutraliseerd met loog t.o.v. phenol-
phtaleïne

Ongeveer 6 gram van het praeparaat, dat beschreven
staat op blz. 50, werd opgelost in 500 c.C. peptonwater.
Vervolgens werd de oplossing geneutraliseerd en door een
CHAMBERLANükaars gefiltreerd. Nadat de vloeistof twee
dagen in de stoof had gestaan, werd de inhoud op steriliteit
gecontroleerd.

50 c.C. werden afgepipeteerd voor een pyrodruivenzuur-
bepaling. Met phenylhydrazine-zoutzuur werd het hydrazon
gemaakt, gevonden in 25 c.C. (voor twee bepalingen)
526 en 525 mgr. hydrazon, terwijl het fikraat met wasch-
water telkens 100 c.C. was. Hierin waren 13 mgr. hydrazon
opgelost, dus totaal hydrazon 538 mgr. Dit komt overeen
met 537 mgr. pyrodruivenzuur in 50 c.C. gistingsvloeistof.
De kolf werd met het absorptietoestelletje gesloten, nadat
met een jonge cultuur van B. coli geënt was. Het pyro-
druivenzure zout vergistte zeer krachtig. Het was dan ook
niet te verwonderen, dat na vier weken, toen de kolf-
inhoud geanalyseerd werd, bleek, dat al het pyrodruivenzuur
ontleed was.

Zoowel vóór, als na de ontleding werd het koolzuur weer
door een luchtstroom verdreven; hierbij werd de kolf op
gewone temperatuur gehouden. Het had n.1, geen zin om

Deze stof is zeer giftig voor bacteriën, dus werd slechts zeer
weinig indicator toegevoegd.

de kolf op 50° C. te brengen, daar het opgeloste en gebonden
koolzuur afzonderlijk werden bepaald. Voor de bepaling
van het gebonden koolzuur werd het toestelletje van
Rupp^) gebruikt, waarbij voor elke bepaling 25 c.C.
vloeistof in het erlemeyertje werden gepipeteerd.

Het principe van deze methode is, dat het toestel ge-
wogen wordt met vloeistof en een pipetje met zuur. Vervol-
gens wordt het zuur bij de vloeistof gevoegd en zoodoende
komt het koolzuur vrij, dat ontwijkt. Nadat het apparaat
op een microvlammetje is verhit en een langzame kool-
Zuurvrije luchtstroom wordt doorgezogen, weegt men het toe-
stel opnieuw; het verschil is de hoeveelheid kooldioxyde. De
waterdamp wordt vastgehouden in een chloorcalciumbuisje.

Er werd in 25 c.C. vloeistof, volgens deze methode, 81
mgr. CO2 gevonden; dat is in 50 c.C. 162 mgr. COg.

De twee natronkalkbuisjes gaven een vermeerdering
van 28,345 — 28,109 = 0,236 en 36,535 — 35,848 = 0,687
gr. CO2, dat is voor 50 c.C. vloeistof^) 105 mgr.; totaal was
er ontstaan 105 162 = 267 mgr. CO2.

Voor de bepaling van het azijnzuur werden 50 c.C. met
stoom gedestilleerd tot een liter. Voor de neutralisatie van
het destillaat waren noodig 58,54 c.C. 0,1 n. loog. Dit komt
overeen met 351,2 mgr. azijnzuur.

1) Rupp. Zeitschr. f. Anal. Chemie 51, 1912, 487.
») Er was slechts 440 c.C. vloeistof in de kolf; bij de kaarsfiltratie
waren 60 c.C. achtergebleven. De kolfinhoud werd dan ook pas na de
ontleding gemeten.

Als we uit het ontlede pyrodruivenzuur de theoretisch
ontwikkelde hoeveelheid kooldioxyde berekenen, komen
we op 268,5 mgr., hetgeen dus goed overeenkomt met de
gevonden waarde.

Het te kort kunnen we toeschrijven aan sporen acetyl-
methyl-carbinol, welke bij deze ontleding gevonden worden
en voor een gedeelte ook aan het gewicht van de gevormde
bacteriën.

Ook hier bleek weer, dat het percentage koolzuur vrij
goed klopte met de berekende hoeveelheid.

Het was misschien nauwkeuriger geweest, indien we bij de
analyse van glycerine ook het opgeloste en gebonden kool-
zuur bepaald hadden met behulp van het toestelletje van
Rupp. Dit bracht echter zijn bezwaren mee, daar bij glycerine
tevens krijt in de oplossing aanwezig was, waardoor dus een
filtratie noodig was. Het gevolg hiervan zou zijn, uit-
wasschen van het filter en daardoor zou het volume te groot
worden, om voor deze methode bruikbaar te zijn. Bij in-
damping zou CO2 verloren gaan, om deze reden werd de
andere methode gekozen^).

Titraticmethoden zijn in een peptonhoudend milieu niet uit
te voeren. Deze stof bleek een te sterke buffer te zijn, zoodat een om-
slag nooit scherp was te zien.

Het is thans wenschelijk, om op grond van de verkregen
resultaten, welke in het voorgaande hoofdstuk zijn mede-
gedeeld, een verklaring te zoeken voor het ontstaan van de
verschillende producten, welke als eindproducten bij de
verschillende gistingen werden gevonden.

Waar wij hier te doen hebben, met stoffen, die een
kleiner aantal C. atomen bezitten dan de koolhydraten, is
het probleem, een plausibele verklaring te geven van de
verschillende trappen, die doorloopen worden, voor het
eindproduct is ontstaan, oogenschijnlijk eenvoudiger. Maar
desniettegenstaande de opzet zoo eenvoudig mogelijk is
gehouden, hebben hier omzettingen plaats, welke wij met
onze gewone, chemische begrippen, ons niet goed kunnen
voorstellen. Hier hebben ons slechts uitsluitend de feiten
den weg te wijzen.

Vele biochemische reacties verloopen onder invloed van
katalysatoren. Willen wij dus in *t chemisch laboratorium
dergelijke reacties ten uitvoer brengen, dan moeten we dus
trachten een katalysator te vinden, die deze werking kan
uitvoeren.

Zoo heeft Wieland de biochemische oxydatie van
aldehyden tot zuren in zijn laboratorium kunnen bewerk-
stelligen met behulp van de fijn verdeelde metalen der
platinagroep. Hij stelt zich dit verschijnsel zoo voor, dat
de aldehyden zich eerst met water verbinden en dat deze

verbindingen, onder invloed van den katalysator, gedehy-
dreerd worden. De waterstof vindt dan meestal een acceptor
(b.v. de luchtzuurstof), maar soms ook wordt ze als gas in
vrijheid gesteld. De oxydatie, welke door middel van de
zuurstof van het watermolecule tot stand komt, duiden wij
in \'t vervolg aan als hydroxydatiei de overgang van aldehyde
in zuur derhalve aldus:

Een tweede moeilijkheid bij de oplossing van het pro-
bleem, is het feit, dat een stof voor kan komen in ver-
schillende isomere vormen. Terwijl de bacteriën den
eenen vorm kunnen aantasten, ontleden zij den anderen
vorm misschien in \'t geheel niet. Willen wij dus van een
dergelijke stof onderzoeken, of zij eventueel als tusschen-
product bij een vergisting een rol speelt en hebben wij juist
den anderen isomeren vorm van die stof in handen, omdat
deze het gewone, synthetische product is, dan blijkt dus
die stof niet te worden aangetast, zou dus als tusschen-
product niet in aanmerking komen. Men moet daarom altijd
zeer voorzichtig zijn met bepaalde stoffen geheel buiten te
sluiten als tusschenproducten bij de bacterieële vergistingen.

Wanneer wij er in geslaagd zijn voor de meest eenvoudige
stoffen een aannemelijke verklaring te geven, hoe zij door
bepaalde bacteriën worden afgebroken, dan kan deze
mogelijk tevens eenig licht verspreiden, aangaande de ont-
leding van meer ingewikkelde stoffen, als b.v. de kool-
hydraten, welke ons, uit den aard der zaak het meest inte-
resseeren.

Van niet te miskennen invloed, bij de ontleding van ver-
schillende stoffen, is de samenstelling van den kweek-
bodem. Zoowel de stikstofbron als de waterstofionen-con-
centratie hebben grooten invloed op de ontwikkeling der
organismen. De bacteriën hebben stikstof noodig voor den
opbouw van hun protoplasma. Het spreekt dus van zelf\'

dat de vorm, waarin de stikstof in den voedingsbodem voor-
komt, in nauwe betrekking staat tot de ontwikkeling en
vitaliteit van de bacterie. Meestal groeien de bacteriën beter
in kweekbodems met organische stikstof, dan in die, waarin
de stikstof voorkomt in anorganische verbinding.

De waterstofionen-concentratie van het milieu doet ook
gijn invloed gelden op de ontwikkeling van de bacterie.
Het gebied der Ph, waarbij deze micro organismen zich
goed kunnen ontwikkelen, is voor de verschillende stammen
zeer uiteenloopend. Hoewel het van de meeste bacteriën nog
niet bekend is, staat wel vast, dat dit gebied voor velen niet
zeer ruim is. Zooals we b.v. weten, ontwikkelen zich in de
melk eerst de Streptococcen, Zij produceeren zuur en door-
dat de zuurgraad voor hen te groot wordt, sterven zij af en
eerst thans komen de melkzuurbacteriën op den voorgrond,
die de zuurvorming voortzetten. Voor deze laatsten is het
gebied der Ph waarbij zij kunnen leven, dus veel grooter
dan voor de Streptococcus lacticus.

Beginnen we thans onze beschouwingen met de een-
voudigste stof het glycol, dan hebben we in hoofd-
stuk III gezien, dat deze stof ontleed wordt onder vorming
van acetaldehyde en azijnzuur.

Om deze omzetting te verklaren, nemen wij aan, dat het
glycol in staat is de bestanddeelen van één mol. water te
verliezen en over te gaan in aethyleenoxyde, welke ver-
binding door intermoleculaire atoomverschuiving kan over-
gaan in acetaldehyde.

De omzetting van glycol in het oxyde is een zeer belang-
rijke, daar deze in de verdere bespreking dikwijls ter sprake
komt, zoodra twee OH groepen naast elkaar voorkomen.

De intermoleculaire atoomverschuiving van het oxyde
kunnen we opvatten als een pinakolineomzetting:

De omzetting van glycol in acetaldehyde wordt in het
labojatoriiim uitgevoerd, door glycol te verhitten op
500°—550° C., terwijl ook het aethyleenoxyde bij deze
temperatuur overgaat in het acetaldehyde.

IPATiEwi) heeft aangetoond, dat, wanneer deze laatste
reactie in tegenwoordigheid van aluminiumoxyde verloopt,
het oxyde reeds bij 250° C. overgaat in acetaldehyde.

Het is dus zeer aannemelijk, dat de reactie, door de bac-
teriën bewerkstelligd, op dezelfde wijze verloopt; de om-
standigheden zullen in de gistingskolf zóó zijn, dat de mi-
croörganismen deze omzetting bij gewone temperatuur
kunnen tot standbrengen.

De tweede phase van deze reactie is de overgang van het
aldehyde in azijnzuur. Deze omzetting zouden we als een
gewone oxydatiereactie kunnen opvatten.

Dat dit werkelijk een oxydatie is, welke door de zuurstof
van de atmosfeer tot stand komt, wordt bewezen door de
gisüng in een waterstofatmosfeer, dus onder volkomen af-
sluiting der luchtzuurstof, te doen plaats hebben.

Hiertoe werd een kolf van Pasteur gevuld met 300 c.C,
peptonwater, waaraan 3 gr. glycol en 2 gr. calciumcarbonaat
was toegevoegd. Na sterilisatie werd geënt met B. co/z.
Vervolgens werd de kolf met zuivere waterstof gevuld en

De waterstof borrelde langzaam door; aan het afvoer-
buisje van de kolf bevond zich een ventiel van Bunsen,
zoodat er geen zuurstof van buiten kon toetreden.

De analyse gaf groote hoeveelheden acetaldehyde, maar
geen spoor van azijnzuur, zoodat de bovengenoemde ver-
onderstelling hiermee ten volle werd bevestigd.

Bij de ontieding van glycol door de co/z-bacteriën moet dus
de atoomverschuiving de energiebron zijn. Een tweede con-
clusie is, dat hier pyrodruivenzuur geen tusschenproduct
is, ondanks het feit, dat acetaldehyde ontstaat.

De ontieding van het pyrodruivenzuur kunnen we ons,
volgens Neüberg, aldus voorstellen: eerst wordt COg afge-
splitst en daarna het aldehyde geoxydeerd tot zuur, waarbij
waterstof vrijkomt.

Neüberg denkt zich voor het eerste gedeelte der reactie
een enzym, dat hij carboxylase noemt. Het zou alle a keton-
zuren kunnen splitsen in COg en een aldehyde, dat één C,
atoom minder bevat. Dit enzym, dat Neüberg bij de gist
heeft gevonden, kunnen we dus ook bij de ontleding der
bacteriën aannemen, hetgeen b.v. Arinstein ook voor de
boterzure gisting met B, hutylicus Fitz heeft aangenomen.

Bodnar^) heeft zich met de bestudeering van de car-
boxylase bezig gehouden en gevonden, dat het een bestand-

1) Het waterstofgas werd gewasschen door zwavelzuur, een per-
manganaat- en een alk. pyrogalloloplossing. Het gas was afkomstig
uit een cylinder en bevatte volgens analyse ± 1 % zuurstof.
=\') C. Neüberg en L. Karczag. Biochem. Zeitschr. 36, 1911, 68.
») B. Arinstein. Biochem. Zeitschr. 117, 1921, 269.
«) J. Bodnar. Biochem. Zeitschr. 72, 1916, 193.

de carboxylase ook in het dierlijk lichaam voorkomt
hebben Mayer en Tscherngrutzki aangetoond, ter-
wijl Zaleski en Marx^) gevonden hebben, dat ook de hoogere
Planten het vermogen bezitten pyrodruivenzuur te splitsen.

Men ziet, dat de carboxylase dus zeer verspreid in de
natuur voorkomt en niet alleen bij de ontleding van kool-
hydraten, maar ook bij de splitsing van eiwitten door mi-
croorganismen een van de belangrijkste enzymen kan zijn.

u T ^^^\'^^d^hyde, welke hier eveneens tot
stand komt, heeft echter een ander karakter; wij moeten
ftaar opvatten als een hydroxydatie. De waterstof, die bii de
reactie vrij komt, verbindt zich hier niet met de zuurstof

Neuberg en Arinstein, die de boterzure gisting bestu-
deerden, noemen dit verschijnsel een „waterstofgisting:\'
Hieruit volgt, dat, wanneer we het pyrodruivenzuur ver-
gisten in een waterstofatmosfeer, dus onder anaërobe om-
standigheden, de oxydatie van acetaldehyde tot zuur toch
even goed moet plaats vinden. De proef, als contrôle
hierop ingeste d, gaf bevestiging van deze veronderstelling.
Er werd n 1. hier geen acetaldehyde gevonden, maar wel

Met behulp van de ontleding van glycol en pyrodruiven-
zuur, kunnen we nu de ontleding der meer ingewikkelde
stoffen met 3 C. atomen trachten te verklaren.

Gezien de eindproducten, die ontstaan, acetaldehyde,
azijnzuur, COg en Hg, blijkt het, dat deze bijna dezelfde
zijn, als die, welke uit het pyrodruivenzuur worden ge-
vormd. Het is dus zeer waarschijnlijk, dat het glycerine-
aldehyde eerst overgaat in pyrodruivenzuur en dat dit op de
boven beschreven wijze, geheel aansluitende aan Neuberg\'s
opvatting, ontleed wordt. Om de overgang glycerinealde-
hyde pyrodruivenzuur plausibel te maken, nemen wij een
dehydratatie aan, welke in *t glycerinealdehydemolecule
tot stand wordt gebracht.

Op deze wijze hebben wij weder de glycolformule voor
ons en mogen in aansluiting daarmede de „glycolomzetting"
doen plaats grijpen n.1.:

Hierbij ontstaat dus methylglyoxaal, hetwelk door hy-
droxydatie overgaat in het overeenkomstige zuur, waarbij
waterstof vrij komt.

Het pyrodruivenzuur valt thans weder uiteen in kool-
dioxyde en acetaldehyde, waarna dit laatste voor een ge-

deelte, door hydroxydaüe, overgaat in azijnzuur, waarbij
nogmaals waterstof onstaat.

Bij deze ontleding zou dus tweemaal zooveel waterstof
moeten ontstaan als kooldioxyde; dat dit in werkelijkheid
varieert, mogen we aan verschillende omstandigheden
toeschrijven.

Het is n.1. zeer wel mogelijk, dat bij de aërobe gisting naast
de hydroxydatie, ook een gewone luchtoxydatie kan plaats
vinden voor de overgang van methylglyoxaal en acetaldehyde
in de overeenkomstige zuren. Deze oxydatie zal dan weer
afhankelijk zijn van den vorm der gistingskolf i), tempera-
tuur en reactie van het milieu. Hiermee zou dan ook ver-
klaard worden, waarom de verhouding der twee gassen
CO, en H2 bij de verschillende proeven zoo uit elkaar loopt;
zelden treft men twee proeven aan waar de mengverhouding
der gassen in beide hetzelfde is. De anaërobe ontleding
van glycerinealdehyde gaf dezelfde producten als de aërobe
vergisting, zoodat daardoor de hydroxydatie bewezen wordt.

Een andere voorstelling der ontleding van het glycerine-
aldehyde zou zijn haar te doen verloopen over het glycerine-
zuur, door hydroxydatie 2). Uit het feit echter, dat de
ontleding van glycerinezuur oneindig veel lanzamer ver-
loopt dan die van glycerinealdehyde, volgt, dat, hoewel
misschien niet geheel, toch grootendeels en voornamelijk
het glycerinealdehyde eerst omgezet wordt in het methyl-
glyoxaal

Hiermee staat in verband de hoeveelheid lucht, die in aanraking
komt met het vloeistofoppervlak.

Het methylglyoxaal, dat in het chemisch laboratorium gemaakt
wordt, kan door de co/i-bacteriën niet ondeed worden. Neuberg heeft
echter erop gewezen, dat 8 isomere vormen voor deze stof bestaan-
baar zijn; hij veronderstelt, dat het methylglyoxaal, dat tijdens de
alcoholische gisting ontstaat, een der isomere vormen is, die wel
ontleedbaar blijkt te zijn.

Bij de ondeding ontstaan COg, Hg, acetaldehyde en azijn-
zuur. De ontleding van dit zuur kunnen we ons op de vol-
gende wijze voorstellen:

Het pyrodruivenzuur valt vervolgens uiteen in acetalde-
hyde en COg. Een gedeelte van het acetaldehyde wordt verder
geoxydeerd tot azijnzuur, waarbij waterstof vrijkomt, ter-
wijl een andere gedeelte, als eindproduct blijkbaar, blijft
bestaan.

Deze ontleding verloopt slechts zéér langzaam. Na eenige
dagen komt er eerst gas ontwikkeling, er schijnen dus pro-
ducten aanwezig te zijn, die moeilijk worden aangegrepen.

Waarschijnlijk gaat de „glycolomzetting" in tegenwoor-
digheid van een carboxylgroep zeer lastig, dit leid ik af uit
het verschil in snelheid, waarmee glycerine, glycerinealde-
hyde en glycerinezuur worden ontleed. Hoe verder de
oxydatie aan het eindstandige koolstofatoom heeft plaats
gehad, hoe minder intensief en hoe minder snel heeft de
vergisting plaats. Ten bewijze hiervan en in analogie hiermee
werd geconstateerd, dat glycol ontleed wordt, terwijl
glycolzuur onaangetast blijft!

Glycerinezuur gaat bij längeren tijd staan over in het
anhydried, hetgeen een zeer bestendige verbinding is, welke
eerst bij lang koken met water overgaat in het zuur. Het is
misschien niet uitgesloten, dat ook deze vorm een rol speelt
bij de zoo opvallend vertraagde ontleding van het glycerine-
zuur.

Zooals we uit de qualitatieve analyse gezien hebben, ont-
staan bij de ontleding van deze stof azijnzuur, kooldioxyde
en waterstof.

Het spreekt dus van zelf, dat we ook hier weer inter-
mediair het pyrodruivenzuur moeten ontstaan denken, ge-
zien de eindproducten^).

We kunnen ons dit alleen zoo voorstellen, dat we een
uittreden van water aannemen, tusschen de twee buitenste
koolstofatomen.

Deze stof bezit een vierring; nu zijn er stoffen bekend met
een ring van 3 koolstof- en één zuurstofatoom. Hoewel
déze stof nog niet bekend is, kent men wel isomeren ervan.
Zoo geeft Meyer en Jacobson aan de monoöxyderivaten

dat het onbestendige verbindigen zijn, die tot de /S lactonen
behooren. Het is dus zeer wel mogelijk, dat bovengenoemde
stof als intermediair product optreedt en overgaat door
opening der ring en intermoleculaire atoomverschuiving in
het pyrodruivenzuuraldehyde:

Deze stof gaat dan over in het overeenkomstige zuur en
door de carboxylase-splitsing ontstaan acetaldehyde en
kooldioxyde.

») Bij deze ontleding ontstaat ook, evenals bij die van pyrodruiven-
zuur, acetyl-methyl-carbinol. Het ontstaan van deze stof wordt op blz.
91 behandeld.

Zooals we in hoofdstuk III gezien hebben ontstaan bij de
vergisting van glycerine: azijnzuur, barnsteenzuur, melk-
zuur, acetaldehyde, kooldioxyde en waterstof.

Deze ontleding geeft ons plotseling een geheel ander
beeld. Hier beginnen wij, feitelijk zonder eenige inleiding,
het proces voor ons te zien, dat zich bij de suikers voordoet,
waar immers eveneens de genoemde eindproducten worden
gevormd, benevens mierenzuur, dat echter merkwaardiger
wijze hier niet werd gevonden.

Hoe moeten we ons het ontstaan van al deze producten
voorstellen ? De stoffen acetaldehyde en kooldioxyde wijzen
zeer waarschijnlijk op het intermediair ontstaan van pyro-
druivenzuur uit glycerine. Dit kunnen we ons als volgt
denken:

Vervolgens wordt deze laatste verbinding geoxydeerd met
water tot pyrodruivenzuur, waarbij dan twee mol, waterstof
vrijkomen.

Het pyrodruivenzuur valt uiteen in acetaldehyde en
kooldioxyde, terwijl een gedeelte van het aldehyde door
hydroxydatie overgaat in azijnzuur.

De oxydatie van alcohol tot zuur, zooals we hier veronder-
stellen, is in de biochemie bekend. Zoowel onder invloed
van levende bacteriën als van „dauerpraeparaten" wordt
b.v. aethylalcohol omgezet in azijnzuur buiten toetreding
van de luchtzuurstof

Dat ook bij ontieding van glycerine de luchtzuurstof geen
rol speelt, werd geconstateerd door de vergisting te doen
plaatshebben in anaërobe omgeving, n.1. in een geëva-
cueerden exsiccator, waarin een alkalische pyrogallolop-
lossing was gebracht. Door gebruik te maken van een drie-
weg kraan werd de loog pas aan de pyrogallol toegevoegd,
nadat eerst de kolf luchtiedig was gezogen, zoodat zeker de
laatste sporen zuurstof, door de versch bereide pyrogallol-
oplossing, werden weggenomen.

Ook bij deze anaërobe vergisting ontstonden dezelfde
eindproducten als bij de aërobe ontieding, zoodat we de
oxydatie ook hier geheel als een hydroxydatie moeten op-
vatten.

Is dus door de omzetting van glycerine in pyrodruiven-
Zuur het ontstaan van enkele producten verklaard, hiermee
is nog geen oplossing gevonden voor het ontstaan van barn-
steenzuur en melkzuur.

In \'t algemeen verbindt men aan \'t begrip ,tgisting*\' de
voorstelling, dat hier een proces zich afspeelt, waarmee de
organismen groote moleculen kunnen afbreken waardoor
zij energie winnen. Met het verkleinen van de moleculen
staat echter in nauw verband het omgekeerde proces n.1.
het vergrooten.

Het was dus van groot belang, enzymen op te sporen, die
kernsynthetische eigenschappen bezitten.

Reeds lang waren er enzymatische synthesen bekend
zooals de opbouw van vetzure esters, disacchariden, eiwitten
met behulp van lipasen, glucosidasen en proteasen. Bij deze

molecule-koppeling vinden er alleen reacties plaats tus-
schen koolstof en zuurstof of tusschen koolstof en stikstof
atomen. Een geheel afzonderlijke groep vormen echter die
enzymen, die de koolstof-koolstofketen verbreken, zooals de
zymase en de carboxylase.

Een fermentatieve vereeniging van de splitsingsproducten
van korte koolstofketens door middel van hunne koolstof-
atomen tot langere ketens, was tot voor kort nog niet ge-
vonden. Dit gelukte eerst Neüberg en Hirsch toen zij het
enzym de carboligase vonden in de gist.

Als men aan een gistende suikeroplossing benzaldehyde
toevoegt, ontstaat een product, dat is samengesteld uit één
mol. bitteramandelolie en een mol. acetaldehyde.

Neüberg en Ohle^) hebben de formule van deze ver-
binding bepaald en gevonden, dat het phenyl-acetyl-
carbinol CgHg — CHOH — CO — CHg was.

Dit proces is een zuiver enzymatisch proces d.w.z. ook
bij celvrije gisting wordt dit product geproduceerd. Het bij-
zondere bii deze reactie is, dat wanneer men benzaldehyde
met acetaldehyde samenbrengt, het ferment niet werkzaam
is en er dus geen koppeling plaats heeft; wel als men in-
plaats van acetaldehyde pyrodruivenzuur gebruikt. Dit
hangt denkelijk samen met het feit, dat het acetaldehyde,
hetgeen door carboxylase splitsing van pyrodruivenzuur ont-
staat, den gewenschten „reactionfdhigen" vorm bezit voor een
koolstof-koolstof koppeling. Hieruit volgt dus, dat het pyro-
druivenzuur het uitgangspunt is voor kernsynthetische reacties.
Bij de vergisting van glycerine hebben we nu in het barn-
steenzuur ook een stof, die ontstaan is door koolstof kop-
peling, een andere mogelijkheid toch is niet denkbaar. Uit
de voorgaande beschouwing volgt, dat we ook hier het pyro-
druivenzuur als uitgangspunt voor het ontstaan van barn-

1) C. Neüberg en J. Hirsch. Biochem. Zeitschr. 115, 1921, 282.
») C. Neüberg en H. Ohle. Biochem. Zeitschr. 121, 1921, 312»

Het pyrodruivenzuur is aanwezig in zijn tautomeren vorm,
en nu ontstaat uit twee mol. van deze stof onder invloed van
de carboxylase twee onverzadigde brokstukken, die door
de werking van het enzym, de carboligase, gekoppeld wor-
den, terwijl er kooldioxyde en waterstof vrij komt, aldus:

Deze laatste verbinding gaat door intermoleculaire atoom-
verschuiving over in het aldehyde van barnsteenzuur, dat
door hydroxydatie omgezet wordt in het overeenkomstige
zuur.

CHa^ ^ Xo

Waarom nu bij de vergisting van glycerinealdehyde en
glycerinezuur, waar toch ook het pyrodruivenzuur als
tusschenproduct ontstaat, geen barnsteenzuur wordt ge-
vormd, is nog een onopgelost probleem gebleven; het houdt
misschien verband met de structuur van het pyrodruivenzuur
en het acetaldehyde, zooals het bij die ontledingen ontstaat.

Een andere stof, die ook door koolstofkoppeling moet
ontstaan, is het acetyl-methyl-carhinoL

Deze stof ontstaat bij kleine hoeveelheden bij de ver-
gisting van dioxyaceton en pyrodruivenzuur.

Zooals we gezien hebben ontstaat uit dioxyaceton ook
intermediair het pyrodruivenzuur, deze laatste stof nu zal
door het enzym, de carboxylase, gesplitst worden. Het
acetaldehyde, dat dan ontstaat, zal in een vorm aanwezig
moeten zijn, die gemakkelijk de aldolcondensatie volbrengt.
Hierbij zal mogelijk ook de carboligase zijn invloed doen
gelden.

Ook hier kunnen we weer dezelfde vraag stellen als bij
het barnsteenzuur, waarom ontstaat deze stof niet altijd
waar pyrodruivenzuur optreedt ? Het antwoord zal wellicht
op structuurchemisch gebied zijn gelegen!

Keeren we terug tot de vergisting van glycerine, dan
moeten we nog het ontstaan van melkzuur beschouwen.
Om het ontstaan te verklaren nemen wij aan, dat glycerine
eenzelfde omzetting ondergaat als dioxyaceton De stof,
die dan ontstaat, bezit weer een vierring, welke door openen
en atoomverschuiving overgaat in het melkzuuraldehyde,
aldus:

CHa OH CHa

CH OH —^ CHOH >0

Door hydroxydatie gaat deze laatste stof dan over in
melkzuur. Uit het feit, dat dioxyaceton zoo langzaam ver-
gist kan men de conclusie trekken, dat de waterafsplitsing

van de 1—3 koolstofatomen uiterst moeilijk door de bac-
teriën tot stand komt. Voor glycerine zal deze omzetting
ook verre ten achter staan bij de omzetting tot
pyrodruivcnzuur, en hierin zullen we dus de oorzaak
moeten vinden voor de geringe hoeveelheid melkzuur, die
ontstaat.

De groote hoeveelheden melkzuur, die bij de kool-
hydraatvergisting gevormd worden, moeten we waarschijn-
lijk op een geheel andere manier ontstaan denken. Hierbij
zal ook het mierenzuur wel een rol spelen.

Dit zuur werd nooit bij een van de beschreven ontledingen
door de co/i-bacteriën aangetoond, terwijl het bij de ont-
leding der suikers steeds ontstaat.

Nu bleek uit eenige proefjes, die werden ingezet, dat
het mierenzure-natrium door de co/i-bacteriën langzaam
in CO2 en Ha wordt gesplitst, hetgeen ook door verschil-
lende onderzoekers gevonden was^). De uitspraak van
sommigen, dat het mierenzuur ontstaat door reductie van
het kooldioxyde lijkt dan ook onwaarschijnlijk, maar niet
geheel onmogelijk, als omkeerbare reactie. Waar wij echter
de ontieding van glycerine en van pyrodruivcnzuur, wat
snelheid en gasontwikkeling betreft, zeker mogen vergelijken
met de vergisting van glucose door de co/i-bacteriën, waarbij
tevens COg en Hg ontstaan, echter geen mierenzuur, komt
het ons voor, dat men met de voorstelling „koolzmr-re-
ductie" zich wel wat al te gemakkelijk van de zaak af-
maakt.

Een merkwaardig verschijnsel deed zich nog voor bij de
anaërobe vergisting van glycerine. Zooals gezegd, ontston-
den bij de ontleding in het luchtiedige dezelfde producten
als bij de aërobe vergisting, daarentegen in een waterstof-
atmosfeer werd plotseling aethylalcohol aangetoond en
slechts sporen acetaldehyde. Doordat hier een van de ont-
ledingsproducten in overmaat wordt toegevoegd, kon het
Pakes en Jollyman. Journ. Chem. Soc. 79, I, 1901, 386.

een verschuiving van het evenwicht zijn, dat dit niet
zoo is, werd geconstateerd door de gisting te laten
verloopen in een koolzuuratmosfeer. Kooldioxyde toch
is ook een splitsingsproduct, maar nu werd geen spoor
aethylalcohol gevonden.

We moeten dus het ontstaan van aethylalcohol als een
gewone reductie van het acetaldehyde beschouwen. De andere
eindproducten waren hetzelfde gebleven als bij de aërobe
ontleding.

Aan het slot van deze beschouwingen gekomen, wensch ik
nog eens in het bijzonder erop te wijzen, dat de gistings-
schemata slechts opgesteld werden voor het B, coli, dus
zonder meer niet voor andere organismen zijn toe te passen.
Ik meen goed te doen daarop nadrukkelijk te wijzen, omdat
men vooral in den tegenwoordigen tijd de neiging ziet
ontstaan op grond van een zeer beperkt onderzoek te gene-
raliseeren en dit iets is, waarvoor men zich ter dege heeft
te wachten.

Daar lang niet alle onderzochte koolhydraten en meer-
waardige alcoholen acetaldehyde als tusschenprodcut gaven,
werd de vraag gesteld, of deze stoffen dan ook op een andere
wijze ontleed worden?

Van de beschikbare koolhydraten werden 0,5 % oplos-
singen gemaakt in peptonwater. Voor de sterilisatie werden
deze oplossingen nauwkeurig geneutraliseerd op lakmoes,
dat aan den voedingsbodem werd toegevoegd. Vervolgens
werden alle bacteriën der coli-typhus-grosp op deze ver-
schillende peptonoplossingen geënt en na 5 dagen werd
geconstateerd of er zuur, gas, of beide waren gevormd,
m.a.w. of de toegevoegde stoffen ontleed waren.

Voor de dysenterie-hactcricn, die verschillend op sommige
koolhydraten inwerken, werd een afzonderlijke tabel op-
opgesteld. Deze bacteriën geven nooit gasontwikkeling, dus
zijn deze kolommen in tabel II vervallen.

De proeven werden in de broedstoof bij 37° C. geplaatst.
Het volgend overzicht geeft een duidelijk beeld van de
resultaten.

Ontleding der koolhydraten door de verschillende stammen
der coli-typhüs groep,

Dys.
Shiga-
Kruse.

Dys.
Flexner,

Dys.
Hiss.

Dys.
Strong.

Stoffen.

Dys. Y.

z.
z.

2.
2.
2.
2.

2.
2.

sp.

Vergelijken we nu de resultaten van deze proeven met
de tabel op bi?. 28, dan zien we, dat de stoffen, die zuur
resp. gas of beide produceeren, ook een positieve reactie op
acetaldehyde geven.

Wij kunnen hieruit de conclusie trekken, dat alle stoffen,
die ontleed worden door de bacteriën der coli-typhus-groep,
acetaldehyde als tusschenproduct doen ontstaan.

Uit tabel II volgt, dat enkele van deze koolhydraat-
oplossingen voor de verschillende soorten van dysenterie-
bacteriën zeer geschikte differentiaaldiagnostica zijn.

Een van de vragen, welke zeer zeker is te stellen, is deze:
Is de gemengd zure gisting veroorzaakt door de coli-typhus-
bacteriën een enzymatisch proces of niet? Is het proces
enzymatisch, dan zal het mogelijk zijn ook hier, evenals bij
de gist, een zoogenaamd celvrije gisting te produceeren.

Ik heb langs verschillende wegen getracht de enzymen
in vrijheid te stellen en vervolgens gecontroleerd of deze
gisting teweeg brachten.

Wij hebben rekening te houden met het feit, dat het
zoowel ecto- als endo-enzymen kunnen zijn, die hier een rol
spelen. De eerste stap was dan ook de vloeibare bacterie-
culturen door een chamberland-kaars te filtreeren. De
ecio-enzymen gaan voor een groot gedeelte met de vloeistof
door de kaars heen, zoodat wij in het filtraat deze kunnen
aantoonen, door de vloeistof aan een suikeroplossing toe te
voegen en te zien of er gisting plaats heeft.

Dit onderzoek werd uitgevoerd met 300 c.C. alkalischen
bouillon. Deze oplossing werd geënt met twee oogjes coli-
bacteriën en 14 dagen in de stoof geplaatst. Vervolgens
werd de vloeistof door een porceleinen kaars gefiltreerd en
het filtraat gecontroleerd op afwezigheid van bacteriën, door
overenten op bouillon. 5 c.C. van het steriele filtraat werden
in gistkolfjes gevoegd bij 10 c.C. 3 % oplossing van glucose,
glycerine en pyrodruivenzuur en deze kolfjes bij 37° C.
geplaatst.

Indien de bacteriën ecto-enzymen geproduceerd hadden,
zou in deze kolfjes gisting moeten plaats hebben. Na drie

Er werd vervolgens, in analogie met de ontleding
door enzymen van de gist, een weinig verdund gist-
water bij de verschillende oplossingen gedaan. Er zit n.1.
in dit gistwater een co-enzym, dat noodig is, om de ont-
leding van de suikerhoudende vloeistof met gistperssap te
doen plaats grijpen. Doch ook na toevoeging van dit
verdunde gistwater trad in de kolfjes geen gisting op.
£cto-enzymen zijn dus afwezig.

r. De bacteriën werden geënt op alkalischen bouillon
en veertien dagen bij 37° C. geplaatst. Nadat er flinke groei
was opgetreden, werden de microörganismen afgecentrifu-
geerd en in een centrifugebuis verzameld. De bacteriën
werden in deze buis gedood door middel van aceton, waarbij
deze vloeistof gedurende een week op de organismen staan
bleef. Vervolgens werd de buis, die met een wattenprop
gesloten was, in de stoof geplaatst, waardoor na 2 dagen, de
aceton geheel verdampt was. De bacteriekoek, die overbleef,
werd, na verwrijven met een steriel spateltje, in de verschil-
lende gistkolfjes gebracht. Weer had geen gisting plaats.
De mogelijkheid bestond natuurlijk, dat de aceton ook de
enzymen had vernietigd. Daarom werd nog een ander
bacterie-doodend middel gebruikt n.1. tolml Nadat weer
een flinke dosis levend bacteriën-materiaal verzameld was,
werd dit over vijf verschillende gistbuisjes verdeeld. In elk
buisje, dat voor i gevuld was, werden drie druppels
toluol gedaan. Daarna werd het eerste buisje een kwartier
lang geschud en vervolgens een oogje van de bacterie-emul-
sie uitgestreken over een agarplaat, om te controleeren of
al de bacteriën gedood waren, terwijl het gistkolfje geheel
gevuld werd met een 3 % glucoseoplossing.

De andere gistkolfjes werden achtereenvolgens een kwar-
tier langer geschud en verder op dezelfde manier behandeld.

In het eerste kolfje trad gisting op. Na drie uur was dit
reeds duidelijk te zien, maar den volgenden dag bleek, dat
vele kolonies op de eerste agarplaat gegroeid waren. Na één
kwartier schudden waren dus niet alle bacteriën gedood.

In de andere kolfjes had geen gisting plaats en ook de
agarplaten waren steriel gebleven.

Volgens deze methode waren er dus geen enzymen gevon-
den, die gisting konden veroorzaken. Het is lang niet on-
mogelijk, dat door het dooden van het micro organisme met
aceton of toluol, de bacterie zoover intact blijft, dat toch
de endo-enzymen niet naar buiten komen. Er werden daar-
om nog eenige andere proeven ingesteld om te trachten de
endo-enzymen buiten de bacteriecel te brengen.

Vette oliën bezitten de eigenschap bacteriën op te lossen i).
Van deze eigenschap heb ik gebruik gemaakt om de bacteriën
te dooden en te trachten aldus de eventueel aanwezige
endo-enzymen in oplossing te krijgen.

Een flinke dosis bacteriën-materiaal werd gedurende een
maand in een wijde reageerbuis in aanraking gebracht met
20 c.C. zuivere Arachisolie. Met een steriele spatel werd
de vloeistof iederen dag flink omgeroerd en men zag duide-
lijk dat de hoeveelheid bacteriën-materiaal verminderde. Na
30 dagen waren nog slechts bruine vlies jes op den bodem van
de buis te zien. Er werden toen een paar oogjes van deze
olie overgeënt op alkalische bouillon, om de steriliteit te be-
oordeelen. Er had echter geen groei meer plaats, zoodat kon
worden aangenomen, dat alle bacteriën opgelost of gedood
waren.

De olie werd in een gistkolf gebracht en half gevuld met
steriel water. De kolf werd met een steriele gummistop
gesloten en in een schudmachine gedurende 12 uur geschud.

Dit had ten doel de enzymen uit de olie in het water te
verdeelen. Den volgenden dag werd een sterke glucose-op-
lossing aan de vloeistof toegevoegd, zoodat de eindconcen-
tratie ± 2 % was.

Vervolgens werd de kolf in de stoof bij 37° C. geplaatst.
Gisting had echter niet plaats. Dezelfde proeven werden
herhaald, maar in plaats van glucose werden glycerine en
pyrodruivenzuur gebruikt. Ook deze stoffen werden niet
ontleed.

Nadat al deze proeven negatieve resultaten hadden op-
geleverd, werd besloten, om zeker te zijn, dat werkelijk geen
enzymen aanwezig zijn, bacterieperssap te gaan bereiden.

Prof. SöHNGEN stelde mij in de gelegenheid, om in zijn
laboratorium, waar een bacteriepers aanwezig is, deze
proeven ten uitvoer te brengen^).

Dit perssap wordt gemaakt op dezelfde wijze als men gist-
perssap maakt. De bacteriën worden met infusorienaarde
en kwartszand vermengd en vervolgens door een zeef ge-
wreven, zoodat er een droog, fijnkorrelig poeder ontstaat.
Dit laatste wordt in een mortier fijngewreven.

Deze laatste bewerking moet zeer nauwkeurig en lang
gebeuren, daar anders de meeste bacteriën in leven blijven.
Wanneer men lang genoeg heeft gewreven, moet er een
plastische massa ontstaan, die geheel aan den stamper
blijft kleven. Deze massa wordt vervolgens in de pers ge-
bracht in een vochtig uitgeknepen persdoek. De bacteriepers
bestaat uit een kleinen, stalen cylinder, waarin van boven een
opening zit, die doorloopt tot een fijne zeef. Onder deze
zeef is een bakje, waarin het sap wordt opgevangen. In de
holte brengt men de persdoek met inhoud en sluit de ope-
ning af met een stalen schijf. Dit heele toestelletje brengt
men onder een glycerinepers. Deze pers zet men langzaam
aan, daar anders de persdoek barst. Men kan zoo een druk

op de bacteriën uitoefenen van 300 tot 350 atmosfeer;
hooger druk is niet noodig. Het sap verzamelt zich in het
bakje. Het spreekt vanzelf, dat deze heele bewerking moei-
lijk steriel uitgevoerd kan worden. Dit feit is echter van
niet zoo groot belang, als men bedenkt, dat de groote hoe-
veelheid bacteriën, waarvan men uitgaat, weinig veront-
reinigd zullen worden door een enkele bacterie, die tijdens
het persen in het sap komt. Daarbij komt, dat de enzymen
de gisting binnen drie uur moeten bewerken, terwijl die
enkele bacteriën, dat niet binnen 24 uur duidelijk te zien
geven. Men zou het perssap nog door een kaars kunnen
filtreeren. Dit is echter niet aan te bevelen, daar de kaars
misschien enkele enzymen tegenhoudt. Nadat ik eerst van
bovengist het perssap had gemaakt, om de methode van
werken te leeren kennen, heb ik ook van de co/i-bacteriën
een perssap gemaakt.

Daarvoor was natuurlijk een reusachtige hoeveelheid
bacteriën-materiaal noodig. Uit genomen proeven bleek,
dat de co7i-bacteriën het best op moutagar wilden groeien;
hierop vormen ze een dikke laag. Ook in moutextract
groeiden ze goed, zoodat ik 20 groote moutagar
platen en 10 kolven met moutextract heb ingezet. Deze liet
ik vier dagen groeien en verzamelde toen de bacteriën in een
mortier. Van de platen werden de bacteriën voorzichtig
afgeschraapt, terwijl de kolven werden gecentrifugeerd.
Zoodoende werd een flinke hoeveelheid bacteriën-materiaal
verzameld. Deze werd met zand en infusorienaarde ge-
wreven en vervolgens geperst. Voordat de massa geperst
werd, heb ik onder de microscoop gecontroleerd of de
bacteriën stuk waren. De meeste bacteriën waren fijn-
gewreven en slechts een enkele was intact gebleven. Na het
persen werd het sap ook onder de microscoop bekeken;
hier was een enkele bacterie in te vinden, doch zooals
reeds gezegd, zal deze geen invloed uitoefenen op de en-
zymen van de groote hoeveelheid, die geperst werd

(enzymen veroorzaken reeds na drie uur gisting). Het hel-
dere perssap werd in een gistkolfje met een geconc. glucose
oplossing gebracht en in de stoof bij 33° C. geplaatst; na
drie uur was er van gisting geen sprake. Ook een kolfje met
glycerine gaf geen gasontwikkeling. Dat er werkelijk bacte-
rieperssap in de vloeistof uit de pers aanwezig was, con-
stateerde ik door in het sap de aanwezigheid van het enzym
katalase aan te toonen met een druppel HgOg. Er ontstond
n.1, een duidelijke opbruising, hoewel niet zoo sterk als met
het gistperssap. In verband met het feit, dat ook in deze
laatste proef geen gunstig resultaat verkregen is, meen ik te
moeten concludeeren, dat de gisting door de coli-typhus-
bacteriën geen enzymatisch proces is.

1°. Bij de vergisting van verschillende suikers en suiker-
achtige stoffen door bacteriën der coli-typhusgroep bleek
steeds acetaldehyde als tusschenproduct op te treden.

2°. Een overzicht werd gegeven van de producten, door
deze bacteriën uit verschillende stoffen met 2 en 3 C atomen
gevormd.

3°. Een uitvoerige bespreking volgde, over de methoden
ter quantitatieve bepaling der producten. Vervolgens werd
de quantitatieve analyse van de ontledingsproducten van
glycol, glycerine en pyrodruivenzuur gegeven.

4°. De resultaten werden besproken in verband met
het chemisme der omzettingen.

5°. Ten slotte werd nagegaan of het vergistingsproces
door bacteriën een enzymatisch karakter heeft.

De opvatting, dat aminozuren, bij het iso-electrische
punt, hoofdzakelijk als „Zwitterionen:* optreden, is boven
de oude opvattingen te verkiezen.

De meening, dat toevoeging van menagewater een na-
deelige invloed zou uitoefenen op de biologische reiniging
van afvalwater, is onjuist.

De elmentairanalyse volgens Heslinga is voor vaste stoffen
te verkiezen boven de gebruikelijke methode van Dumas.

De conclusie van Jaeger en Germs, dat geel en rood
loodoxyde in verhouding van enantiotropie tot elkaar staan,
vereischt nadere bevestiging.

Brun heeft door zijn proeven niet bewezen, dat de vul-
kanische exhalatie op zich zelf, volkomen watervrij is.

De eind Ph van microbenculturen kan niet geacht worden
een eigenschap van deze microörganismen te zijn.

Toevoegen van arsenigzuur voor het omladen van een
chroomhydroxyde sol, volgens Sen en Dhar, is overbodig.

De biochemische eigenschappen der bacteriën zijn van
meer belang dan de morphologische.

v\'.

A .t\' -,

„ \' M .

^ t ,
h

iif

A4 .w --

	Bact. Coli (3)	Bact. Parat. B. (9)	Bact. Parat. A. (2)	Bact. Typhi (2)	Bact. Dys (5)
1 ........... 1 ycerme......... glycennealdehydei) ^.ethylglyoxaafi) Oioxyaceton 1)____ Pyrodruivenzuur i). gjycerinezuur glycolzuur ...	-f- sp.	sp. sp. -1-	sp. sp. sp. sp.	sp. sp. sp. sp.	sp. sp. sp. sp. sp.
melkzuur ........	sp.	_		_
barnsteenzuur..... ®^»jnzuur .....
				_
oiierenzuur ......	—	—	—	—	—

Stoffen.	Neutr. vl. prod.	vl. zuren.	Niet vl. zuren.	Gasvormige prod.
glycol.	acetaldehyde.	azijnzuur	geen.	geen.
glycerine	acetaldehyde sporen alcohol	azijnzuur	barnsteen- zuur. melkzuur.	COi en Hl
glycerinealdehyde.	sporen aldehyde sporen alcohol.	azijnzuur	geen.	COi en Hl
glycerinezuur	acetaldehyde	azijnzuur	geen.	H.
dioxyaceton.	sporen aldehyde sporen alcohol sporen acetyl- methyl-carbinol	azijnzuur	geen.	COi cn Hl
pyrodruivenzuur	sporen acetyl- methyl-carbinol.	azijnzuur	geen.	CO* cn H,
peptonwater.	geen.	sp. zuur.	geen.	geen.

verdwenen stof	gevormde producten in mgr.	berekénd als C.
229 mgr. glycol; berekend als C. 88,6 mgr.	acetaldehyde 89 mgr. azijnzuur 87 „	48,5 mgr. 34,8 „
	totaal 176 mgr.	83,3 mgr. of 94%
Bij een andere proef werden de volgende cijfers gevonden. De kolf had 28 dagen in de stoof gestaan.
verdwenen stof	gevormde producten in mgr.	berekend als C.
222 mgr. glycol; berekend als C. 86 mgr.	acetaldehyde 83 mgr. azijnzuur 89 „	45,2 mgr. 35,6 „
	totaal 162 mgr.	80,8 mgr. of 93,9%

verdwenen stof.	gevormde producten in mgr.	berekend als C.	proc. der glycerine als C.
487 mgr. glycerine; berekend als C. 190,5 mgr.	acetaldehyde 43,2 mgr. azijnzuur 98 „ barnsteenzuur 28,5 „ melkzuur 13,8 „ koolzuur 163,2 „	23,6 mgr. 39,2 „ 11.6 „ 5,5 „ 89, „	12,4 % 20,6 % 6,1 % 2,9 % 46,7 %
	totaal 346,7 mgr.	168,9 mgr.	88,7 %

verdwenen zuur.	gevormde producten in mgr.	berekend als C.	proc. v.h. zuui als C.
537 mgr.; berekend als C. 219,7 mgr.	azijnzuur 351,2 mgr. kooldioxyde 267 „	140,5 mgr. 72,8 „	64 % 33,1 %
	totaal 618,2 mgr.	213,3 mgr.	97,1 %

	BacU	BacU	Boet.	Bact.	Bact
	Coli (3)	Parat. B. (9)	Parat. A. (2)	Typhi (2)	Dys^). (5)
			4-


		-t-
	—	—	—	—	—
	—		—	—	—
	4-
		-t-		■
	-1-		4-	-t-	—
I. arabinose......					-1-
			sp.\')		sp.
L rhamnose .....				—	—
	—	—	—	—	_
i. adoniet .......	—	—	—	—	—
i. erythriet ......	—	—	—	—	—
maltose ..........	-1-
		—	—	—
lactose ...........		—	—	—	—
		—	—	—	—
1. gluconzuur ....

verdwenen zuur.	gevormde, producten in mgr.	berekend als C.	proc. v.h. zuur berekend als C.
496 mgr.;	azijnzuur 321 mgr.	128,4 mgr.	63,3 %
berekend als C.	kooldioxyde 246,4 „	67,2 „	33,1 %
202,9 mgr.
	totaal 567,4 mgr.	195,6 mgr.	96,4 %

Stoffen.	B. coli (3)	B. para- typhus B (9)	B. para- typhus A (2)	B. typhus (2)
d. glucose ....... d. mannose....... d. galactose ...... d. fructose ....... 1. gulose ........ 1. idose .........	z. z. z. z.	ë\' g. g. g.	z. 2. Z. z.	g. g. g\' g-	z. z. z. z.	g- g- g- g\'	z. z. z. 2.	—
d. manniet....... d. sorbiet........ i. dulciet........	z. z. z.	g^ g. g.	z. z. z.	g- g. g.	z. z. z.	g- g. g.	Z. 2. 2.	—
1. arabinose ..... 1. xylose ........ I. rhamnose......	z. z. z.	g. g. g.	z. z. z.	g. g- g.	z. sp. z.	sp.	z. z.	—
1. arabiet ........ i. adoniet .......	_	—	-	—	—	—	—	—
maltose .......... saccharose ....... lactose ..........	z. z. z.	g. g. g-	z.	g.	z.	g-	z.	—
raffinose.........	z.	g.	-	—	—	—	_	_
i. erythriet......	—	—	-	—	—	—	_	_
glycerine ........ dioxyaceton ......	z. z.	g. g-	sp. z.	g.	sp. z.	-	sp. z.	—
glycol ...........	z.	—	sp.	-	sp.	—	sp.	—

/i;



\'À:-- ■ ■■ ■