EEN SYSTEMATISCH ONDERZOEK NAAR DE
WAARDE DER KLEINE-PLAATCULTUREN
VOLGENS FROST VOOR DE BEPALING VAN
HET AANTAL LEVENDE BACTERIËN IN MELK

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN
DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE VEE-
ARTSENIJKUNDE AAN DE N^EEARTSENIJ-
KUNDIGE HOOGESCHOOL TE UTRECHT, OP
GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS
Dr J. H. HARTOG, VOLGENS BESLUIT VAN
DEN SENAAT DER VEEARTSENIJ KUNDIGE
HOOGESCHOOL, TE VERDEDIGEN TEGEN
DE BEDENKINGEN VAN DEN SENAAT OP
DONDERDAG 19 MAART 1925, DES NAMIDDAGS
VIER UUR, DOOR ADOLF CLAREHBURG,
GEBOREN TK UTRECHT

Bij de voltooiing van mijn \'proefschrift is het mij een aan-
gemme plicht, U, Hoogleeraren onzer Hoogeschool, hartelijk
dnnk te zeggen voor het genoten onderwijs.

Inzonderheid. U, Hooggeleerde Van Oyen, hooggeschatte
Promotor, ben ik groote dankbaarheid verschuldigd, niet al-
leen voor Uw initiatief, het in dit proefschrift behandelde
onderwerp ter hand te nemen, maar bovenal voor de welwil-
lende wijze, loaarop Gij mij bij mijn werk met raad en steun
hebt bijgestaan.

Gedurende de jaren, hij IJ als assisteiü doorgebracht, hebt
Gij mij steeds tot het bestudeeren van wetenschappelijke
vraagstukken opgemkt, waarhij mij Uw scherp en helder
oordeel zoo zeer ten goede is gekomen.

Hooggeleerde Schorna(}el, U ben ik in hooge mate dank-
Ixtm voor Uw aansporing tot wetenschappelijk onderzoek,
geduremk den tijd, dat ik onder Uw leiding werkzaam was.
Steeds hebt Gij mij met Uw groots ervaring welwillend ter
zijde gestaan en het is dnn ook voor een groot gedeelte., dal ik
U mijn welenschappelijke rorming verschuldigd. Ixm.

Waarde Frenkkl, dc tijd, welketi ik te zamen mei U heb
diHtrgelnraeht, is wor mij een zeer aangename en tevens zeer
leerrijke, geweest. Weest er van verzekerd, dat deze mij steeds
in dankbare, herinnering zal blijven.

Ten slotte dank ik U mijn zeer gewaardeerde collegae
Hoogland en \'I\'en Thije voor den aangenamcn atnbtelijken
(mgang, welken ik met U gehad heb en voor den steun, welken
ik in z(K) ruime mate mn U mocht ontvangen.

onderzoek van kiemrijke melk met behulp
van de kleine-plaatculturen bij 28\' c... 111

De waarde van het quantitatief bacteriologisch melk-
onderzoek is voor een groot deel gelegen in zijn scherp
controleerend vermogen op zindelijke winning en doelmatige
behandeling der mdk. Vooral bij controle op een bedrijf,
waar men zich toelegt op het winnen van melk,
welke aan hooge eischen voldoet, blijkt, welk een uit-
stekend hulpmiddel dit onderzoek is voor het opsporen
van binnengeslopen fouten. Zindelijk gewonnen en goed
behandelde melk bevat een laag aantal bacteriën, dat
niet meer dan enkele duizenden per c.M^. behoeft te
bedragen. 2ioodra dan ook blijkt, dat dit aantal aanzien-
lijk overschreden is, mag men aannemen, dat er iets in
het bedrijf niet in orde is, en een nader onderzoek kan
dan uitmaken, waar de fout schuilt.

1°. De oorspronkelijke infectie, d.w.z. de infectie, welke
tijdens het melken optreedt. Slechte stalinrichting, onvol-
doende reinheid der melkers, van de melkgevende dieren
en van den stal zijn eenige der vele oorzaken, welke een
hoog kiemgehalte der melk kunnen teweegbrengen. Maar
bovenal is een slechte reiniging van het vaatwerk een
groote bron voor infectie. Met nadruk dient er dan
ook op te worden gewezen, dat hieraan de noodige aan-

dacht moet worden besteeden dat men er vooral zorg voot
dient te dragen, dat, indien sterilisatie niet mogelijk
is, de melkemmers, welke liefst ook een nauwe opening
moeten bezitten, na grondige reiniging goed worden ge-
droogd, want juist de achtergebleven vloeistofresten
vormen zoo\'n uitstekenden voedingsbodem voor de micro-
organismen .

2°. De temperatuur, waarbij de melk wordt bewaard.
Het is zonder meer duidelijk, dat een warme omgeving
zeer bevorderlijk is voor een toename van het aantal
bacteriën. Daarom moet de melk, zoo spoedig mogelijk
na het winnen, koel worden bewaard en wel in een zinde-
lijk, stofvrij lokaal.

3°. De ouderdom der melk, d. i. de tijd, welke is ver-
loopen sinds de melk werd gewonnen. Het is vanzelf
sprekend, dat, hoe ouder de melk is, hoe grooter ook de
mogelijkheid zal zijn, dat de zich in de melk bevindende
bacteriën tot vermeerdering zijn gekomen.

Zoodra een der hier genoemde factoren ongunstig
inwerkt, komt dit tot uiting in een hoog kiemcijfer en
bezit men dus in het quantitatief bacteriologisch onder-
zoek een uitstekend middel om zulks aan te toonen. Een
nader onderzoek zal dan moeten uitmaken, waar de
infectiebron schuilt.

Het aantal kiemen, in de melk aanwezig, is tevens een
maatstaf voor de deugdelijkheid en de houdbaarheid der
melk. Wanneer niet de noodige zindelijkheid bij de melk-
winning betracht wordt, of wanneer de melk in een warme
omgeving wordt bewaard en vervoerd, zal deze binnen

korten tijd een groot aantal bacteriën bevatten, welke
daarin verschillende ongewenschte omzettingen kunnen
teweegbrengen. Het product kan dan schadelijke eigen-
schappen verkrijgen, als gevolg waarvan digestiestoor-
nissen bij zuigelingen en zwakke personen kunnen
optreden. Deze kiemrijke melk zal ook zeer spoedig zuur
worden en verschillende bewerkingen, welke in de zuivel-
industrie noodig zijn, niet kunnen doorstaan. Terwijl over
het algemeen kiemarme melk langen tijd goed blijft, zal
deze melk snel bederven en zeer zeker het koken niet
kunnen verdragen. Hoe grooter het kiemgehalte der
melk is, des te kleiner is in den regel de houdbaar-
heid ; het groote voordeel, aan een zindelijke winning
en goede behandeling, dus aan een laag bacteriecijfer der
melk verbonden, is dan ook de grootere houdbaarheid,
welke dit voedingsmiddel daardoor verkrijgt. Van zeer
groot belang is dit laatste voor de melkvoorziening der
groote steden, aangezien de melk vaak van ver verwijder-
de boerderijen moot worden betrokken en er zoodoende
dikwijls langen tijd verloopt, alvorens de melk den consu-
ment bereikt. Vooral gedurende het ondoelmatige trans-
port hebben de micro-organismen goede gelegenheid zich
te vermeerderen, ten gevolge waarvan groote hoeveel-
heden melk door bacterieele omzettingen voor de con-
sumptie verloren gaan. Het is zonder meer duidelijk, dat
een controle op den toestand dezer rauwe melk ten zeerste
noodzakelijk is, en juist het quantitatief bacteriologisch
onderzoek kan ons hierbij zoo goede diensten bewijzen.
Ook wanneer men tot pasteurisatie wil overgaan, zal men
dit onderzoek niet kunnen missen. In de eerste plaats

dient men hierbij immers steeds uit te gaan van deugde-
lijke melk, dus melk waarin, daargelaten andere eischen,
welke men daaraan stelt, de bacteriën zich niet zoo
rijkelijk hebben vermeerderd. In de tweede plaats moet
ook de gepasteuriseerde melk voortdurend worden ge-
controleerd, aangezien door pasteuriseeren geen steriel
product verkregen wordt en dus bij ondoelmatige be-
handeling bederf kan optreden. Het is algemeen bekend,
dat de sporen der rottingsbacteriën niet worden gedood,
en juist doordat de melkzuurvormende micro-organismen
wel vernietigd zijn, kunnen deze hun nadeelige werking
ten volle ontplooien, waarbij vooral de eiwitten worden
ontleed in stoffen, welke schadelijk voor de gezondheid
kunnen zijn. Door het afgestorven zijn der melkzuur-
vormers stolt deze melk niet en wordt het euvel niet
zoo gemakkelijk in den aanvang onderkend.

Op een groot belang van een laag kiemgehalte der melk
wil ik nog wijzen. In den laatsten tijd worden vele pogin-
gen in het werk gesteld melk te verkrijgen, welke zonder
nadeel rauw kan worden gedronken. Dat hierbij naast een
gering bacteriecijfer nog vele andere eischen moeten wor-
den gesteld, waardoor geen pathogene kiemen in de melk
kunnen geraken, spreekt vanzelf. Men komt dan op het
terrein der hygiënische melkwinning, welke vooral niet
met een zindelijke winning gelijkgesteld moet worden.
Wanneer men de garantie voor een volkomen onschade-
lijkheid van rauwe melk wil geven, komt men voor groote
moeilijkheden te staan. Ik noem hier slechts den eisch
van het niet aanwezig mogen zijn van tuberkelbacillen.
Dit is op zichzelf reeds een zeer moeilijk probleem, vooral

waar men behalve met de hygiënische, ook met de
oeconomische zijde van dit vraagstuk heeft rekening te
houden en geen maatregelen kan toepassen, welke de
melk zóó duur maken, dat ze voor de breede lagen der
bevolking niet te betalen is. Men zou daarom reeds een
zeer groote schrede\'op den goeden weg zijn, indien melk
kon worden verkregen met een gering aantal bacteriën,
dus met groote houdbaarheid, welke korten tijd vóór het
gebruik even zou kunnen worden gekookt. Vooral voor de
kinderen zou men hierdoor een voedingsmiddel verkrij-
gen, dat vrij is van gevaarlijke ziektekiemen en waarin
ook de vitaminen zeer weinig zouden hebben geleden.

In Amerika, waar de laatste jaren zeer veel over bacte-
riologisch melkonderzoek gewerkt is, heeft men de groote
invloed, welke het aantal kiemen op de qualiteit der melk
heeft, reeds lang ingezien. Men heeft daar de melk in ver-
schillende soorten ingedeeld en voor elke soort o.m.het
maximum toelaatbare aantal micro-organismen vastge-
steld. Voor „Grade" A, „Certified milk" (d.i. rauwe nielk),
geldt de limiet lO.üüO bacteriën per c.M».; voor „Grade"
A, gepasteuriseerde melk, vóór het pasteuriseeren 200.000
en daarna bij het bereiken van den consument 10.000;
voor „Grade" B deze melk moet worden gepasteuriseerd)
vóór het pasteuriseeren 1.000.000 en daarna 50.000;
voor „Grade" C vóór het pasteuriseeren meer dan
1.000.000 en daarna hoogstens 50.000 kiemen per c.M».")

Het ware te wenschen, dat men ook hier te lande tot
een dergelijke officieele indeeling der qualiteiten kon
komen. Hierdoor zou tevens mogelijk worden gemaakt,
dat voor een betere qualiteit een ietwat hoogere prijs

zou kunnen worden bedongen, waardoor de meerdere
zorg, door den veehouder aan de melkwinning besteed,
ook beloond werd. Dit zou er zeer zeker krachtig toe bij-
dragen, dat vele wantoestanden werden opgeheven en de
melkwinning en behandeling in betere banen werden
geleid.

Hiermede is wel voldoende het groote belang van het
onderzoek naar het aantal, in de melk aanwezige,
micro-organismen aangetoond.

In de verschillende laboratoria worden zeer uiteen-
loopende methoden toegepast voor de bepaling van het
aantal bacteriën in melk.

Als voornaamste en meest toegepaste methode mag ik
wel noemen de Kocn\'sche plaatmethode. Een bepaalde
hoeveelheid melk wordt in verschillende verdunningen,
met een hoeveelheid vloeibare agar — met of zonder toe-
voegsels — of gelatine vermengd, tot een plaat uit-
gegoten, welke bij een zekere temperatuur gedurende
meerdere dagen wordt bebroed. Daarna wordt het aantal
opgekomen koloniën geteld. Dit aantal, vermenigvuldigd
met den verdunningsfactor, geeft dan het aantal kiemen,
per c.M-^. in de melk aanwezig. Op deze methode kom ik
in een ander hoofdstuk uitvoerig terug. Reeds vele publi-
caties zijn over deze z.g. plaatmethode verschenen,
waarbij zeer uiteenloopende opgaven worden gedaan
omtrent het voedingsmedium, de temperatuur en den
duur der incubatie. Wat den voedingsbodem betreft,
beveelt dc één aan agar, een ander agar, waaraan een
bepaald percentage melksuiker is toegevoegd, een derde

wei-agar. Dan zijn er enkele onderzoekers, die gelatine
als het beste voedingsmediuni prefereeren. Ook over de
temperatuur, waarbij de platen moeten worden weg-
gezet, leest men zeer verschillende opgaven, n.1. van
temperaturen, die varieeren van kamer- tot lichaams-
temperatuur. Ten slotte loopt de duur der incubatie,
welke wordt aangegeven, uiteen van één dag tot 12 dagen.

Dit alles behoeft geen verwondering te wekken, aan-
gezien er zoovele soorten micro-organismen, meestal sa-
prophyten, in de melk kunnen voorkomen, waarvan de
optimum groe ivoor waarden zoozeer verschillend zijn.

In Amerika wordt algemeen voor het quantitatief
bacteriologisch melkonderzoek de „Standard plate me-
thod" toegepast, waarbij als voedingsmedium bouillon-
of vleesch-agar wordt gebruikt en de platen gedurende
48 uur bij 37° C. worden bebroed, waarna het aantal
koloniën wordt afgelezen. Hier te lande wordt daaren-
t-egen de bouillon-gelatine-plaatmethode aanbevolen,
waarbij gedurende 5 dagen bij 22° C. wordt bebroed.
Deze voorbeelden illustreeren ten duidelijkst«, hoe ver-
schillend dit onderzoek wordt uitgevoerd. Het ware te
wenschen, dat in alle landen een uniforme wijze van
werken werd opgesteld, waardoor men in de gelegen-
heid zou zijn eikaars uitkomsten goed te interpreteeren.

De meest op den voorgrond tredende nadeelen, aan
elke „groote-plaatmethode" verbonden, zijn :

1°. De lange tijdsduur, welke verloopt tusschen het
instellen van de proef en het aflezen van het resultaat.
Voor de praktijk der melkcontróle is dit een zeer groot
bezwaar, aangezien bij het aantreffen van een te hoog

kiemcijfer de melkleverancier moeilijk of niet kan na-
gaan, waar de bron der infectie schuilt en dus zoodoende
weinig prophylactische waarde aan deze controle is toe
te kennen.

2°. De groote hoeveelheden glaswerk en voedings-
bodem, welke per onderzoek noodig zijn, alsmede de
groote ruimte, welke per onderzoek in de broedstoof
wordt ingenomen. Voor elk onderzoek, dat volgens de
regels, door den Codex Alimentärius voor melk aan-
gegeven, wordt uitgevoerd, zijn meerdere steriele pi-
petten en dito glasdoozen, benevens een evenredig aan-
tal buizen steriele bouillon-gelatine noodig. Vooral wan-
neer het onderzoek over een groot aantal monsters
wordt uitgebreid, eischt het schoonmaken en sterili-
seeren van het glaswerk, als ook het bereiden van den
voedingsbodem veel werk en brengt evenredige kosten
met zich.

3°. De onzekerheid, dat men, indien bouillon-gelatine
als voedingsmedium wordt gebruikt, het resultaat na
verloop van den vereischten tijd kan aflezen, aangezien
dikwijls vervloeiing der gelatine optreedt, waardoor men
het aantal koloniën niet kan bepalen.

De tweede methode, welke in Amerika veel wordt toe-
gepast, is die van R. S. Breed " " "). Hierbij wordt
0,01 c.M». melk door middel van een capillairpipet over
1 op een voorwerpglas uitgestreken. Na droging

onder zachte verwarming wordt met behulp van xylol
of een ander oplosmiddel het vet verwijderd en het pre-
paraat opnieuw gedroogd. Daarna wordt dit ter fixeering
enkele minuten in alcohol gelegd en weer gedroogd, waar-

na het gekleurd wordt met waterig methyleenblauw of een
andere niet-alcalische kleurstof, welke ook niet de caseïne
mag aantasten. Onder het microscoop, met gebruikma-
king van een olie-immersie, worden dan de bacteriën ge-
teld. Voor een nauwkeurige waarneming moet in honderd
gezichtsvelden het aantal kiemen worden bepaald. Elke
bacterie, waargenomen per gezichtsveld, komt dan over-
een met ongeveer 500.000 micro-organismen per c.iVP.
melk. Ter vergemakkelijking van het onderzoek wordt
hierbij een bepaald teloculair gebezigd.

De aan deze werkwijze verbonden voordeelen zijn :
1°. Alle bacteriën, ook die, welke tot groepjes zijn
vereenigd, kunnen worden geteld.

3°. Men krijgt een inzicht omtrent het karakter der
bacterie-flora.
Als groote nadeelen staan hiertegenover:
1°. Wanneer het aantal kiemen minder dan 500.000
per c.M®. bedraagt, zijn de resultaten twijfelachtig.
Hierdoor is deze methode ongeschikt voor het mxderzoek
van indk met laag kienigehalte, h.v. modelmelk.

2°. Ook de doode micro-organismen worden meegeteld.
Voor het onderzoek van gepasteuriseerde melk is ze
daarom niet te gebruiken, terwijl ze ons voor de rauwe
melk geen juiste aanwijzing geeft omtrent het aantal
levende kiemen.

Een derde methode is die van Olav Skar " " "),
welke veel overeenkomst met de voorgaande vertoont.
Van een 2 % carbol-methyleenblauwoplossing wordt 0,2

c.M». in een reageerbuis gegoten, en aangevuld tot 5
c.M». met de te onderzoeken melk. Na flink schudden
wordt dit mengsel in een waterbad gedurende 5 à 10
minuten op 70° C. verwarmd, waarna c.M». der ge-
kleurde vloeistof met behulp van een fijne platinanaald
over een bepaald vierkant (24 x 20 m.M.), hetwelk zich
op een voorwerpglas bevindt, wordt uitgestreken. Het
preparaat wordt aan de lucht gedroogd en is nu voor het
onderzoek gereed. Met behulp van een olie-immersie
wordt het aantal bacteriën bepaald, waarbij van een
oculairmicrometer gebruik wordt gemaakt.

Om het aantal kiemen per c.M». te berekenen, moet het
gemiddelde aantal, dat per gezichtsveld aanwezig is, met
een zeer hoog cijfer worden vermenigvuldigd, varieerend
van 500.000 tot 40.000.000 al naar de grootte van het ge-
zichtsveld, dat wordt bekeken. De voor- en nadeelen van
deze methode komen overeen met die, welke hierboven van
de methode van Breed zijn opgegeven. Ook deze methode
is dm niet geschikt voor de controle van kiemarme melk.

Een vierde methode, door verschillende onderzoekers
toegepast, is de reduclaseproef, welke berust op het ver-
mogen der bacteriën bepaalde kleurstoffen te reduceeren
en om te zetten in kleurlooze verbindingen. Dit ontkleu-
ren zou des te sneller gaan, naarmate de melk meer bacte-
riën bevat, m. a. w. men zou uit den tijd, welke voor do
reductie noodig is, tot den bacteriënrijkdom der melk
kunnen besluiten. Methyleenblauw wordt algemeen uIh de
beste, te bezigen, kleurstof aanbevolen. De proef wordt
als volgt ingesteld. Bij oen bepaald quantum melk voegt
men een zekere hoeveelheid methyleenblauwoplossing,

waarna dit mengsel bij ± 38° C. wordt weggezet en de
tijd bepaald, waarbinnen zich de melk ontkleurt.

Ducleaux is waarschijnlijk de eerste geweest, die op
het verband van bacteriën met het reductie vermogen der
melk gewezen heeft. Verschillende onderzoekers hebben
zich na hem met dit onderzoek beziggehouden en hoewel
deze methode ook voorstanders telt, zijn toch de meesten
van meening, dat ze voor de bepaling van het aantal
kiemen in de melk ongeschikt is. Men is het er over het
algemeen nog niet over eens, hoe de reactie eigenlijk ver-
loopt, en of het alleen de bacteriën zijn, die de reductie
bewerkstelligen. Ook betwijfelt men, of de duur der reduc-
tie parallel gaat met het bacteriegehalte. Barthel
schrijft: „Diese Zahl, 10 Millionen, scheint folglich die
Grenzziffer zu sein, die sich mit Hilfe der Reduktjvse-
probe sicher feststellen liiszt. Bei einem Bakteriengelmlt
unterhalb dieser Zahl steht die Entfärbungszeit nicht in
einem direkten Veriiiiltnis zum Bakteriengelmlt".

Op grond van 252 onderzoekingen zegt Stafenséa :
„Indien men het grenscijfer van het aantnl bacteriën op
1 millioen stelt, gelijk de Code.x Alimenturius doet, dan
kun men geen gebruik van de i\\l.-reducUiaeproef maken,
daar een ontkleuringstijd van meer dan 6 uren zelfs geen
waarborg geeft, dat het bacteriëncijfer beneden één
millioen ligt".

Höyhkro is van meening, dat de reductascprocf geen
iijne reactie is voor de beoordeeling vun don bacteriën-
njkdom der melk, terwijl Dons") aan het slot van zijn
Hrtikel concludeert: „Die Redukt^iseprobe ist als Keim-
Juihlungamethode sehr ungenau und aus diesem Grunde

Er zijn ook onderzoekers, die zich in meer optimisti-
schen geest uitlaten. Een onderzoek op groote schaal zal
moeten uitmaken, welke waarde de reductaseproef voor
het quantitatief bacteriologisch melkonderzoek heeft.
M. i. staat het echter nu al wel vast, dat zij alleen beteeke-
nis zal kunnen krijgen voor het onderzoek van zeer kiem-
rijke melk.

De methode, hier te lande toegepast, welke is aange-
geven in den Codex Alimentarius kost veel materiaal
en is zeer tijdroovend. Dat aan het quantitatief bacterio-
logisch melkonderzoek een stiefmoederlijke rol is toebe-
deeld, vindt zijn oorzaak niet zoo zeer in dc geringe
waarde, welke men eraan toekent, dan wel in dc moeilijk-
heid, welke het onderzoek van een groot aantal monsters
meebrengt. Het is daarom dc giootc verdienste van
Frost een methode te hebben uitgedacht, welke aan
deze bezwaren te gemoet komt, omdat zij snelle uitkom-
sten geeft en naast de geringe ruimte, welke zij vcrciwht,
goedkoop in haar uitvoering is.

Ken aantal melkmonsters is aan een vergelijkend onder-
zoek onderworpen, ten einde na te gaan,of deze meth(xle
betrouwbare uitkomsten geeft en of zij bruikbaar is voor
de praktijk, waarbij bijzondere aandacht is geschonken
aan het onderzoek van z.g. modelmelk. Enkele onder-
deden zijn nader uitgewerkt, terwijl op grond van deze
studie eenige veranderingen in de te volgen werkwijze
idjn aangebraclit.

In Augustus 1916 publiceerde W. D. Frost „Pro-
fessor of Agricultural Bacteriology" aan de Universiteit
tü Wisconsin U. S. A., een voorloopige mededeeling over
een methode, ter snelle bepaling van het luintjil bacteriën
in melk. Bij deze methode, welke een combinatie was van
de directe telling en dc cultureele methoden, werden
inilturen op voorwerpglazcn luingelegd. Deze voorwer])-
glazen werden 3—6 uur in de broedstoof geplaatst, daarna
gedroogd en gekleiu-d, waarna de koloniën met het mi-
crascoop werden bekeken.

In deze eerste mededeeling werden geen bijzonderheden
vermeld; alleen werd in grove trekken mmgegeven, hoe
het onderzoek moe^jt gc-sc-hieden. De luvngegcven werk-
wijze was als volgt. Een tiende u.M\'. melk, vermengd
»net „Standard agar", word over een bepjuilde ópper-
vlakt« van een steriel voorwerpglas uitgeatroken. Na
stolling der agar werd het prepanvat ongeveer (J uur in
de broedstoof geplaatst, onder zoodanige omstandig-
heden, dat uittlrogen voorkomen werd. Hierna werd het
preparaat gedroogd en na een inleidende behandeling,
wjuirdoor kleurstofopname door dc agar zooveel mogelijk
verhinderd werd, gekleurd. Vervolgens werd het prepu-

raat iets ontkleurd, daarna afgespoeld en gedroogd. Deze
gedroogde en gekleurde plaatcultuur werd met het
microscoop bekeken. De kleine koloniën waren goed ge-
kleurd en kwamen donker uit tegen de kleurlooze of
lichtgekleurde omgeving. Met de zwakke vergrooting kon-
den deze koloniën heel goed worden waargenomen. Soms
waren ze, nadat de preparaten 4 uur in de broedstoof
hadden gelegen, met het bloote oog duidelijk zichtbaar.
Met behulp van een olie-immersie was het mogelijk de
morphologie der verschillende, tot koloniën uitgegroeide
bacteriën te bestudeeren.

Dc kiemcijfers, met deze door Frost uitgedachte
methode verkregen, kwamen overeen met die der gewone
plaatmethode. De verschillen waren weinig grooter dan
die, welke optraden tusschen 2 platen van dezelfde ver-
dunning of van verschillende verdunningen, bij toepas-
sing van de „Standard method".

Bij onderzoek van gepasteuriseerde of zeer kiemarme
melk moesten de kleine platen gedurende 8 uur in de
broedstoof gehouden worden.

Frost eindigt deze voorloopigc mededeeling met dc
conclusie, dat met zijn methode in V« tot V« van den tijd,
voor het onderzoek volgens de standaardmethode noodig,
een met deze laatste methode overeenstemmende aan-
wijzing van het aantal bacteriën in de melk wordt ver-
kregen, en verder, dat, hoe hooger het bactcriogehalte
is, hoe korter ook de tijd wordt, welke voor het onder-
zoek noodig is.

In een volgende publicatie \') gaf Frost een nauw-
keurige be.sclirijving van zijn methode.

De kleine-plaatculturen werden aangelegd op gewone
voorwerpglazen van 7,5 c.M. lengte en 2,5 c.M. breedte.
Vooraf waren deze zorgvuldig schoongemaakt, waarna
met een waspotlood langs een houten of kartonnen raam
op het middengedeelte een vierkant was getrokken, van
2 bij 2 c.M. Het door de waslijnen ingesloten oppervlak
bedroeg dus 400 m.M\'. De voorwerpglazen werden daarna
met een gasvlam gesteriliseerd en op een warme doos
geplaatst, welke voorzien was van een overhangend dak,
wa4irdoov ze tegen stof waren beschut.

In enkele buizen, welke 1 c.M\'. agar bevatten, werd
dexe voedingsbodem door verwarming gesmolten, waarna
deze buizen ter afkoeling in een waterbad van 45° C.
werden geplaatst. Tevens werd voor elk te onderzoeken
melkmonstcr een steriele, door oen watt<\'nprop afgesloten
Iniis in hetzelfde wato.rbad gebraclit.

Na flink schudden werd 1 c.M\'. melk in een dezer
steriele buizen gebracht en daarna dezelfde hoeveelheid
Van dc gesmolten op 45° C. afgekoelde agar toegevoegd.
Melk on agar werden goed gemengd, waarbij zorg werd
geclragen, dat dc agar niet tot onder 40° C. afkoelde. Te
dien einde werd het mengsel af en toe in het waterbad
van 45°C. gehouden. Met een steriele pipet werd \'/lo e.M\'.
vjin dit nielk-agarmengsel op een warm voorwerpglas
•)innen het beschreven vierkant gebracht en met dezelfde
pjpet zoo vlug en gelijkmatig mogelijk over dit vierkant
»»tgestreken. Om dc agar te. doen .stollen werd het prepa-
raat enkele oogcnblikken op een horizonUle plaat onder
een 8tolp gepljuitst. Op deze wijze was oen kleine plaat
verkregen, welke V» c.M\'. melk bevatte. Indien ver-

wacht werd, dat de te onderzoeken melk meer dan
1.000.000 bacteriën per c.M^ bevatte, werd deze vóór hefc
mengen met de agar 1 : 2 of 1 : 10 met steriel water of
steriele melk verdund, waardoor het preparaat ten slotte

De preparaten werden daarna in een speciaal daarvoor
vervaardigd kastje gedurende 5—6 uur in een broedstoof
bij 37° C. geplaatst. Op den bodem van dit kastje bevond
zich een laagje water, ten einde een met waterdamp ver-
zadigde atmosfeer te onderhouden. Wanneer slechts
enkele preparaten waren vervaardigd, werd dit kastje
door een petri-schaal vervangen.

Bij onderzoek van handelsmelk of melk, welke vóór het
onderzoek eenigen tijd in een warme omgeving was ge-
weest, was een broedtijd van 3—4 uur voldoende, terwijl
voor kortelings gepasteuriseerde of zeer goede melk deze
tijd waarschijnlijk tot 8 of misschien wel 12 uur moest
worden verlengd.

Nadat de koloniën voldoende ontwikkeld waren, weiden
de preparaten gedurende 10 minuten onder zachte ver-
warming gedroogd. Dit drogen moest zorgvuldig geschie-
den, daar anders scheuren in dc agar optraden.

De gedroogde plaatjes werden nu in dc vlam gefixeerd,
daania gedurende l minuut in een 10 % oplossing van
azijnzuur in 95 % alcohol gebracht en vervolgens 3 minu-
ten gekleurd in een 1 : 4 verdunning van Loeffler\'s
methyleenblauw. Hierna werden de preparaten enkele
seconden ontkleurd in 95 % alcohol en verder zonder
afspoelen gedroogd.

keken, kon dit geschieden, zonder van een dekglas ge-
bruik te maken. Bij sterke vergrooting echter werd een
dekglas op het preparaat gelegd, nadat de agaropper-
vlakte met cederolie of Canada-balsem bedekt was.

Was de melk in de juiste mate verdund, dan zag men
bij zwakke vergrooting 3—50 koloniën in elk microscopisch
gezichtsveld. Indien sterke vergrootingen werden ge-
bruikt, was het bij sommige melkmonsters moeilijk kolo-
niën van niet-gegroeide bacteriegroepen te onderkennen.
In den regel werd bij deze sterke vergrootingen een
hooger bacteriecijfer verkregen.

Het geheele preparaat werd bekeken, waarbij syste-
matisch in minstens 20 velden het aantal koloniën werd
geteld, n.1. langs elke diagonaal 10 velden. Van de kolo-
niën, die op de grens van het gezichtsveld lagen, werd
slechts het halve aantal meegeteld.

Om het aantal bacteriën per c.M». melk te berekenen,
werd vooraf de oppervlakte van het gezichtsveld bij elke
te gebruiken vergrooting bepaald, ten einde de z.g. mi-
croscopische factor, d.w.z. het aantal malen, dat het ge-
zichtsveld-oppervlak in hel totale cultuuroppervlak be-
grepen is, vast ie stellen. Aangezien deze voor een be-
paalde lenzencombinatie bij een zekere tubuslengtc con-
stant was, behoefde ze slechts eenmaal tc worden be-
pjuild. Met behulp van oen object-micrometer werd de
diameter van het gezichtsveld gemeten en dc oppervlakte
volgens de formule t: R* berekend. Was b.v. het opper-
vlak van het microscopisch veld 2 m.M\'., dan bedroeg

Daarna deelde Frost®) in 1916 de resultaten\'mede,
welke hij gedurende het voorafgaande jaar met zijn me-
thode verkregen had. Zeven en dertig fnonsters melk,
varieerende in bacteriënrijkdom van 675—20.000.000,
werden onderzocht, waarbij de „Standard plate method"
als controle werd toegepast. Er werd een bevredigende
overeenstemming tusschen beide methoden waargenomen.

Voor het aanleggen der kleine-plaatculturen werd
1 c.M^ der vooraf krachtig geschudde melk vermengd
met een gelijke hoeveelheid agar. Kiemrijke monsters
werden, alvorens deze bewerking te ondergaan, met ste-
riel leidingwater 1 :20 of 1 :200 verdund, welke ver-
dunningen zelfs voor de zeer kiemrijke monsters vol-
doende waren. Overigens geschiedde de vervaardiging
der preparaten op dezelfde wijze, als in de vorige publi-
catie door Frost werd aangegeven, alleen met dit ver-
schil, dat slechts C, minuten gekleurd werd.

Van elk melkmonster werden meerdere kleine-plaat-
culturen aangelegd, terwijl de koloniën in elk preparaat
werden geteld met behulp van 3 versciiillende objec-
tieven, welke respectievelijk vergrootingen gaven van
82, 200 en 840.

De „Standard plate method" werd op de gebruikelijke
wijze uitgevoerd, waarbij de agarplatcn gedurende 48
uur in een broedstoof van 37° C. werden geplaatst. De

koloniën werden met het bloote oog en tevens met 2
verschillende vergrootingen geteld. Verschillende ver-
dunningen werden aangelegd en alle koloniën op de ver-
schillende platen geteld, waarna uit het gemiddelde der
gevonden getallen het kiemcijfer der onderzochte melk
werd vastgesteld.

Naar het bacteriënaantal werden de onderzochte melk-
monsters in 4 klassen verdeeld :

De vergelijking der uitkomsten, met de twee beschre-
ven methoden verkregen, geschiedde zooveel mogelijk
door de telling van dc kleine-plaatculturen met behulp
van de zwakste vergrooting te verrichten, terwijl dio
van de „Standard method" met de sterkste vergrooting
werd gedaan.

Resultaten klasse A. Do tellingen volgens beide me-
thoden kwamen goed overeen. Het bacterie-aantal per
c.M\'. melk, vastgesteld volgens do methode van Frost,
wjus in alle gevallen grooter, gemiddeld 60% hooger,
«lan v()lgens do standaard-methode, terwijl de verhou-
ding varieerde van 1,10: 1 tot 2,86:1. De verschillen
tusschen de resultat<;n van de verschillende kleine-plaat-
culture.n van hetzelfde n\\elkmonster waren geringer, dan
die van do stand aard-platen.

grooter. De verhouding der beide tellingen varieerde van
0,17: 1 tot 3,12 : 1. Het aantal bacteriën, bepaald met
de kleine-plaatculturen, bedroeg slechts weinig minder,
dan met de standaard-platen, terwijl de variatie ten op-
zichte van het gemiddelde bij de laatste methode groo-
ter was.

Resultaten klasse C. De resultaten kwamen goed over-
een. De verhouding der tellingen volgens beide metho-
den wisselde van 0,25: 1 tot 4,14: 1, terwijl de kleine-
plaatculturen over het algemeen hoogere uitkomsten
gaven dan de standaard-platen. De variatie t.o.v. het
gemiddelde was bij de standaard-methode ongeveer drie-
maal zoo groot als bij de methode van Frost.

Resultaten klasse D. Alle tellingen in deze klasse vielen
bij de kleine-plaatculturen lager uit. De verhouding der
beide tellingen schommelde van 0,20 : 1 tot 0,93 : 1.
De afwijkingen t. o. v. het gemiddelde waren bij de
standaard-platen gemiddeld 2-raaal zoo groot als bij de
kleine-plaatculturen.

Op grond van deze waarnemingen herhaalde Frost
zijn reeds vroeger uitgesproken conclusie: „The results
obtained indicate that the difference between the counts
secured by the rapid method and the ordinary or standard
method usually amounts to little more than the varia-
tion, which occurs between duplicate plates, or between
different dilutions in the same analysis by the ordinary
plate method."

Wanneer bij de aflezing der kleine-plaatculturen
sterkere vergrootingen werden gebruikt vielen de tellingen
in den regel hooger uit. De melkmonsters van klasse

B en C werden met verschillende vergrootingen onder-
zocht, welke respectievelijk 82, 200 en 840 bedroegen. De
laatste vergrooting werd verkregen door gebruik te maken
van een olie-immersie. De verhouding van de hierdoor
verkregen resultaten was bij klasse B gemiddeld als
1 : 2,25 : 6,13 en bij klasse C als 1:1,93 : 3,21. Voor beide
klassen te zamen bedroeg dus het verkregen kiemcijfer bij
een vergrooting van 200-maal en 840-maal, respectievelijk
ruim 2-maal en 4|-maal zooveel, dan wanneer een ver-
grooting van 82-maal werd toegepast. Twee redenen
werden hiervoor opgegeven. In de eerste plaats konden
zeer kleine koloniën met de zwakke vergrooting niet wor-
den gezien, in de tweede plaats werden bij het gebruik
maken der sterkere vergrootingen groepen van doode
bacteriën meegeteld.

De resultaten, verkregen met de zwakke vergrooting,
kwamen in het algemeen overeen met die van de stan-
daard-platen. Door Fugst werd een lenzencombinatie
met een vergrooting van 200-maal als de beste aanbe-
volen.

Omtrent den tijdsduur der incubatie werd vastgesteld,
<lat, hoe langer deze genomen werd, hoe grooter ook de
koloniën waren, waardoor minder verwarring met groepen
doode bacteriën plaats vond. De voornaamste beteekenis,
welke Frost aan zijn methode hechtte, was de korte
incubatietijd. Terwijl deze voor de standaard-methode
48 uur bedroeg, kon bij de kleine-plaatculturen met 8—12
uur worden volstaan. In de meeste gevallen was slechts
6 uur noodig, terwijl bij sommige onderzoekingen 3 uur
voldoende was. In het algemeen werd aangeraden de

preparaten niet korter dan 6 uur in de broedstoof te laten.
Melk, versch van de koe of kort geleden gepasteuriseerd,
bevatte weinig bacteriën, welke zich slechts langzaam tot
zichtbare koloniën ontwikkelden. Voor deze melk werd
een incubatietijd van 12 uur noodig geacht, terwijl m
handelsmelk of andere melk met hoog kiemcijfer de bacte-
riën veel sneller koloniën vormden, zoodat na 3 uur het
grootste gedeelte kon worden geteld. Zonder nadeel kon
^e incubatietijd 18 uur en langer worden genomen. Er
vormden zich dan weieens „spreaders", d.w.z. koloniën,
die, aan de oppervlakte komend, de agaroppervlakte
overgroeiden; deze werkten echter niet storend op het
gebruik der kleine-plaatculturen.

Een jaar later gaf Frost een uiteenzetting van do
resultaten, welke hij met zijn methode in de praktijk ver-
kregen had, waarbij zoowel rauwe als gepasteuriseerde
melk, te zamen 111 monsters, aan een vergelijkend onder-
zoek werden onderworpen.

Ter controleering van de kleine-plaatculturen, welke
op de reeds bekende wijze werden aangelegd, werd door
een anderen onderzoeker van elk melkmonster van een
verdunning 1 : lO.OOÜ twee platen gegoten en deze ge-
durende 48 uur in een broedstoof bij 37,5° C. geplaatst.
Voor beide methoden werd hetzelfde voedingsmediuin
^jebruikt, hetwelk slechts 1 % agar bevatte, alhoewel
volgens Frost een hoogere concentratie beter ware ge-
weest.

Van ongeveer de helft der onderzochte monsters werden
ook door Frost agarplaten aangelegd. In 16 gevallen kon
het aantal koloniën op beide groote platen door het voor-

komen van „spreaders" niet worden geteld, terwijl in vele
gevallen een dezer platen om deze reden niet kon worden
afgelezen. Ook bij de kleine-plaatculturen kwamen
„spreaders" voor, die echter, in tegenstelling met de
standaard-methode geen beletsel vormden voor het be-
palen van het aantal koloniën. Tevens viel op te merken,
dat de groote platen, van hetzelfde melkmonster aange-
legd, dikwijls aanzienlijke verschillen te zien gaven. In
10 gevallen bedroeg het verschil 50 %, terwijl bij 11 mon-
sters dit meer dan 100 % bedroeg. Ook de kiemcijfers,
door den anderen onderzoeker en Frost met de groote
platen verkregen, liepen dikwijls sterk uiteen ; de ver-
houding wisselde van, 1 : 0,09 tot 1 : 8, terwijl de ge-
middelde verhouding 1 : 1,42 was.

In alle kleine-plaatculturen kon de telling worden uit-
gevoerd, ofschoon bij enkele de koloniën dicht gezaaid
waren en andere ,,spreaders" vertoonden.

Dc resultaten kwamen over het algemeen met die van
de standaard-platen overeen. Wanneer 3 monsters,waarbij
de kleine-plaatmethode aanzienlijk hoogere uitkomsten
gaf, werden uitgeschakeld, varieerde de verhouding dor
verkregen bacteriecijfers van 1 : 0,05 tot 1 : 7,43, terwijl
de gemiddelde verhouding I : 0,96 was. in 48 gevallen
gaf dc klcine-plaatcultuur een lagere, in 26 gevallen een
lioogere uitkomst dan do „Standard plate method",
ßnkele monsters gaven in de kleine-plaatculturen aan-
zienlijk lagere cijfers. Men zocht de verklaring aanvanke-
lijk in den korten incubatietijd ; wanneer deze echter in
sommige gevallen verlengd werd, verkreeg men weinig
hoogere cijfers. Aannemelijker was de veronderstelling,

dat de groepjes bacteriën in onverdunde melk niet ge-
makkelijk werden uiteengeschud, terwijl dit wel het geval
was, indien verdunningen werden aangelegd. Nu en dan
gaven de kleine-plaatculturen veel hoogere cijfers dan de
standaard-methode. Frost zocht de verklaring hiervoor
in het feit, dat bij zijn methode door de vermenging van
de agar met een relatief groote hoeveelheid melk een
auikerrijk voedingsmedium werd gevormd, waarin de
bacteriën zich beter ontwikkelden. Hij werd hierbij ge-
steund door de onderzoekingen van Sherman (1916,
Journ. Bact., 1,481—488), die in suikeragarplaten in den
regel meer koloniën tot ontwikkeling zag komen dan in
gewone agar. Tevens haalde Frost een publicatie aan
van CoNN (Public Health Reports, August 13, 1915),
waarin de uitkomsten waren neergelegd, welke verschil-
lende onderzoekers bij onderzoek van dezelfde melk-
monsters volgens de standaard-methode hadden verkre-
gen, om aan te toonen, dat de verschillen tusschen de
kleine-plaatculturen en de standaard-methode overeen-
kwamen met die, welke twee of meer personen bij onder-
zoek van hetzelfde melkmonster volgens de laatstgenoem-
de methode verkregen.

Bij eenige ervaring met het aanleggen der kleine-plaat-
culturen waren de koloniën hierin gelijkmatig verdeeld.
In een tabel werd van 10 preparaten het aantal koloniën,
dat in 20 velden afzonderlijk werd waargenomen, weer-
gegeven, om aan te toonen, dat deze cijfers niet ver uiteen-
liepen.

Bij onderzoek van een aantal melkmonsters in de
praktijk, zou men, na eerst het preparaat vlug te zijn

doorgegaan, waarschijnlijk dan ook kunnen volstaan met
in 4 a 5 velden de koloniën te tellen.

In een vorig artikel was meegedeeld, dat de resul-
taten bij sterkere vergrooting hooger uitvielen. Dit was
het geval, wanneer de incubatie 4 a 5 uur duurde. Werd
deze echter tot 7 a 8 uur verlengd, dan bleek er weinig
verschil te zijn, en kon die vergrooting worden toegepast,
waarbij de telling het gemakkelijkst kon geschieden.

Aan het einde van het artikel werden de volgende
voordeden der kleine-plaatculturen genoemd:

Stmmons ®) onderzocht 136 melkmonsters met bacterie-
cijfers, varieerende van 50—160.000.000 per c.M»., volgens
5 verschillende methoden, n.1. de directe microscopische
telling, de „Standard plate method", de lactose-agar-
plaatmethode, de kleine-plaatculturen van Frost en de
reductaseproef. De uitkomsten werden vergeleken met
die van de „Standard plate method", zooals deze door
de „American Public Health Association" was voor-
geschreven .

Voor de kleine-plaatculturen werd 1 c.M». melk goed
gemengd met 1 c.M». agar, welke vooraf gesmolten en
daarna tot 45° C. afgekoeld was. Melk met een hoog

bacteriegehalte werd vóór deze menging met steriel water
1 : 10 verdund. Daarna werd Vio van het melk (resp.
verdunde melk)-agarmengsel over een oppervlak van
4 c.M". op een, door flambeeren gesteriliseerd, voorwerp-
glas gelijkmatig verdeeld. Na stolling werden de prepa-
raten gedurende 5 a 6 uur bij 37° C. geplaatst en bij ±
100° C. op een heete plaat gedroogd. De plaatjes werden
1 minuut in een 10 % oplossing van azijnzuur in 95 %
alcohol gebracht, dan zonder spoelen gedurende 3—5
minuten in de kleurstof (1 deel Loepfler\'s methyleen-
blauw op 4 deelen gedestilleerd water), daarna goed ge-
spoeld en weer op de heete plaat gedroogd. De preparaten
werden met verschillende vergrootingen bekeken, waar-
voor de microscopische factoren resp. 227, 4650 en 21.050
bedroegen. In de meeste gevallen werd van de zwakke
vergrooting gebruik gemaakt. De uitkomsten kwamen
goed met die van de standaard-platen overeen; gemid-
deld wezen de kleine-plaatculturen 25 % meer bacteriën
aan. Simmons zocht hiervoor de verklaring in den beteren
voedingsbodem door de melktoevoeging. Melkmonsters
met hoog kiemcijfer gaven daarentegen met de standaard-
methode hoogere uitkomsten, waarschijnlijk door het
uiteenvallen van de bacterieklompjes bij het aanleggen
der verdunningen. De kleine-plaatculturen gaven betere
overeenstemming met de lactose-agarplaten dan met de
gewone agarplaten.

Indien de melk minder dan 1 millioen bacteriën bevatte,
gaven alle methoden, met uitzondering van die van de
directe microscopische telling, bevredigende resultaten.

met de methode van Frost in Vs—Vs van den tijd het
aantal kiemen in melk worden bepaald, terwijl tevens een
inzicht werd verkregen omtrent den aard der bacterieflora.

In 1921 publiceerde Frost de verbeterde techniek
voor het aanleggen der kleine-plaatculturen. In den aan-
vang van dit artikel legde hij er nogmaals den nadruk op,
dat het niet noodzakelijk was, de preparaten slechts
enkele uren in de broedstoof te laten, waardoor men ver-
plicht zou zijn op ongelegen tijden naar het laboratorium
te gaan, ten einde de culturen eruit te nemen en te dro-
gen. Men kon ze er evengoed 16, zelfs 24 uur in laten,
zonder nadeel hiervan te ondervinden. Het was dus moge-
lijk den éénen dag de culturen aan te leggen en deze den
volgenden dag verder te onderzoeken.

Alvorens tot het instellen der proef over te gaan, werden
ter gelijkmatige verdeel ing de melkmonsters minstens
25-maal om en om gedraaid. Ten einde schuimvorming,
welke het nauwkeurig pipetteeren zou kunnen bemoei-
lijken, te voorkomen, moest deze beweging voorzichtig
worden uitgevoerd.

De voornaamste verandering, welke werd aangebracht,
was, dat \'/lo melk direct op het voorwerpglas werd
gebracht, waarna ongeveer een gelijke hoeveelheid ge-
smolten, afgekoelde agar werd toegevoegd. Dit laatste
geschiedde met bepaalde pipetten, waarvan 1 of 2 drup-
pels ongeveer met deze hoeveelheid overeenstemden.
Ten einde de melk zoo nauwkeurig mogelijk af te meten,
werden hiervoor speciaal geconstrueerde pipetten ge-
bruikt met een nauw kanaal en een spits einde. Door
middel van een uitgegloeide platina lis werden melk en

agar goed gemengd en over het bekende oppervlak van
4 C.M-. uitgestreken. Deze bewerking geschiedde op de
„warm table», d. i. een metalen doos, aan alle zijden, met
uitzondermg van den boven- en onderkant, met asbest
bekleed, welke met water was gevuld en op ongeveer
45 C. werd verwarmd. In horizontale ligging liet men de
agar stoUen, waarna de preparaten in de „moist chamber
cabmet" werden geplaatst, d. i. een koperen kastje, waarin
zich een uitneembaar rek bevond, dat 48 voorwerpglazen
kon bevatten. Op den bodem kon water worden gebracht
terwijl tusschen het kastje en het rek ruimte werd gelaten,\'
ten einde den waterdamp te laten circuleeren. De „moist
chamber cabinet", met de preparaten erin, werd\'in een
broedstoof van 37,5° C. geplaatst. De duur der incubatie
was zeer verschillend. Voor melkmonsters, waarin de
bacteriën op het oogenblik van de bemonstering zich
reeds vermeerderden, was 4 uur voldoende, terwijl, als
de melk van een koelinrichting kwam, of indien ze ge-
pasteuriseerd of versch was en weinig bacteriën bevatte
7 of 8 uur noodzakelijk bleek. Bij niet spoedeischend
onderzoek kon men de preparaten tot den volgenden dag
in de broedstoof laten liggen.

De kleine-plaatculturen konden ook bij kamertempe-
ratuur (20° C.) bebroed worden; echter moest de inai-
batietijd in dit geval op minstens 24 uur gesteld worden,
terwijl dan nog de telling lager was dan bij 37° C. Dit was\'
echter nog niet met zekerheid vastgesteld.

Nadat de preparaten uit den incubator waren genomen
werden deze op een heete plaat of in een electrischen
oven gedurende ± 5 minuten bij een temperatuur die

even onder 100° C. lag, gedroogd, daarna 1 minuut be-
handeld met een 10 % oplossing van ijsazijn in 95 %
alcohol en vervolgens ongeveer 2 minuten gekleurd met
methyleenblauw of carbolthionine. Werd aan deze kleur-
stof 5 % ijsazijn toegevoegd, dan kon de behandeling met
den azijnzuren alcohol achterwege blijven. Zelfs was uit de
laatste onderzoekingen gebleken, dat vooraf drogen niet
noodzakelijk was. De azijnzure carbolthionine werd als de

helderder was dan bij aanwending van methyleenblauw.
Na het kleuren werden de preparaten bij een temperatuur
van even onder 100° C. op een heete plaat gedroogd.

Indien de melk meer dan 1 millioen kiemen bevatte,
werd 1 c.M». hiervan met 9 c.M». steriele melk verdund
en na krachtig schudden van deze verdunning een kleine-
plaatcultuur aangelegd. Met opzet word voor deze ver-
dunning geen water gebruikt, zooals dit bij de Kocn\'sche
plaatmethode het geval was, aangezien de groeivoor-
waarden dan geheel anders zouden zijn en niet te verge-
lijken met die voor de culturen, welke uit onverdunde
melk waren aangelegd.

Wilde men het omslachtige werk, hetwelk dit verdun-
nen meebrengt, omzeilen, dan kon men in plaats van
/20 slechts Vioo of \'/m c.M». melk op het voorwerpglas
brengen en hierbij een druppel steriele melk en een drup-
pel agar voegen, waarna het geheel werd uitgestreken.

Het tellen der koloniën en het berekenen van het aan-
tal bacteriën per c.M». melk geschiedde op de reeds vroe-
ger beschreven wijze.

der koloniën in 5 daartoe geschikte velden, nadat vooraf
een indruk was gekregen van de verspreiding der kolo-
niën. Bij het gebruik der sterke vergrooting werden in
preparaten, die 7 à 8 uur in de broedstoof waren geweest,
de kleine bacteriegroepjes niet meegeteld, aangezien in
dezen tijd de oorspronkelijk in de melk voorkomende
levende bacteriën tot flinke koloniën waren uitgegroeid.

Voor het onderzoek te velde had Frost een Vijzonder
soort koffer vervaardigd, waarin al het materiaal, voor
het onderzoek benoodigd, kon worden meegenomen,
terwijl, door in de „warm table" water van ± 43° C. te
brengen, het geheel als broedstoof dienst kon doen.

Hatfield en Park \') stelden een onderzoek in naar de
waarde van de kleine-plaatculturen voor het bacteriolo-
gisch melkonderzoek, waarbij zij enkele veranderingen in
de te volgen werkwijze aanbrachten. In plaats van, zooals
Frost voorschreef, de melk vóór het onderzoek 25-maal
voorzichtig te schudden, om schuimvorming tegen te
gaan, werd door hen krachtig geschud en daarna de
flesch schuin gehouden, om het gevormde schuim naar
één kant te laten drijven, ten einde met de pipet melk
zonder luchtbellen te kunnen opzuigen. Een tweede ver-
andering bestond hierin, dat na het kleuren der prepara-
ten deze enkele seconden in alcohol werden ontkleurd.

Een groot aantal melkmonsters werden onderzocht,
wajirbij als controle van dc kleine-plaatculturen in alle
gevallen de standaard-methode werd toegepjist. De kleine-
plaatculturen werden alle gedurende 15 à 1« uur in de
broedstoof geplaatst. Van elk preparaat werden bij het
begin van het onderzoek in 10 velden de koloniën geteld,

terwijl later door de grootere ervaring deze zoo gelijk-
matig verdeeld lagen, dat met 2 a 3 velden kon worden
volstaan. Als regel was de keuze van het te gebruiken
objectief van weinig invloed op de telling. Het effect
van een ongewone flora in de melk werd gedemonstreerd
door het onderzoek van 39 monsters gepasteuriseerde
melk, welke alle van één inrichting afkomstig waren.
Terwijl de resultaten der standaard-methode varieerden
van 62.000 tot 710.000 bacteriën per c.M^, gaven de
kleine-plaatculturen bij kleine vergrooting tellingen,
welke alle onder de 10.000 bleven. Bij gebruik van ster-
kere vergrootingen waren de uitkomsten hooger, terwijl
met de olie-immersie massa\'s bacteriën werden gezien,
welke niet tot duidelijke koloniën waren uitgegroeid.
Opmerkelijk was, dat in de standaard-platen slechts zeer
kleine koloniën ontwikkeld waren.

Na aanvankelijk voor de kiemrijke monsters verschil-
lende verdunningen met steriele melk te hebben ge-
maakt, werden deze ter vereenv(ni(liging der methodo
ten slotte achterwege gelaUm. Van deze monsters werd
op (Ie linkerzijde van het voorwerpglas 0,0ß c..M\\
«\'n op de rechterzijde 0,01 c.M\\ melk gebracht, waarna
door toevoeging van 2 druppels agar 2 culturen op de
jjewonc wijze werden aaingelegd.

In afwijking van de voorschriften van Frost werd dus
K^en sti»rielemelk aan de afgemeten 0,01 c.iN!\'. toegevoegd.

Te zamen werden 241 monsters melk onderzocht. De
goede soorten melk gaven het geringste verschil met de
st^uidaard-platen t<». zien. De gepasteuriseerde en de te
pasteu risee ren melk vertoonden grootere variaties.

De uitkomsten waren nu eens hooger, dan weer lager
dan de standaard-methode. Indien de melk meer dan
één millioen kiemen per c.M». bevatte, was het verschil in
den regel grooter. De schrijvers achtten een nadere studie
van de verdunning der melk en het onderzoek van melk
met ongewone bacteriesoorten noodzakelijk. Hun con-
clusie luidde : „Our present opinion is that both methods
are to be depended upon and that, according to the
local conditions, one or the other can be utilized".

Bovendien zijn nog twee artikelen over de kleme-
plaatculturen verschenen, welke in Nederland echter
niet te verkrijgen waren. In de literatuurlijst zijn deze
publicaties onder Nos. 4 en 8 aangegeven.

Het is opvallend, dat, waar de eerste mededeeling
over de kleine-plaatculturen reeds in 1915 gedaan is,
alleen van Amerikaansche zijde onderzoekingen hierover
zijn verricht.

Een ernstig bezwaar tegen de onderzoekingen naar
de betrouwbaarheid der nieuwe methode is, dat de con-
troleplaten bij 37° C. werden bewaard. In zijn voor-
loopige mededeeling erkent Frost, dat bij 22° 0. meer
koloniën tot ontwikkeling komen. In Amerika heeft men
echter de temperatuur van 37° C. gekozen, omdat hierbij
het resultaat reeds na 2 dagen bekend zou zijn. Deze
overweging moge misschien geldig zijn voor het onder-
zoek van melk in de praktijk, waar men bezwaarlijk
5 a 7 dagen op de uitkomst kan wachten, voor het con-
troleeren van een nieuwe methode is ze principieel fou-

tief. Zoolang men bij het quantitatief bacteriologisch
melkonderzoek niet op een bepaalde bacteriesoort onder-
zoekt, waarvan de optimum groeitemperatuur bekend
is, dient die methode te worden gevolgd, welke de
hoogste resultaten geeft. De controle-methode, door de
Amerikaansche onderzoekers toegepast, zou nog te ver-
dedigen zijn, indien er een constante verhouding bestond
tusschen de resultaten, welke de agarplaten bij 37° C.
en 22° C. opleveren. Deze verhouding is echter zeer
wisselend.

Een tweede bezwaar tegen bovengenoemde onder-
zoekingen is, dat, behoudens een onvolledig onderzoek
van Frost over de resultaten bij kamertemperatuur
(20° C.), alle experimenten met de kleine-plaatculturen
bij ± 37° C. werden verricht. Ook hierbij is de tempe-
ratuur zeer willekeurig gekozen. In melk komen vele
soorten micro-organismen met uiteenloopende optimum
groeitemperaturen voor en het is de vraag, of bij 37° C.
over het algemeen de beste groeivoorwaarden worden
gegeven. De saprophyten zijn meestal numeriek sterk
in de meerderheid en het is bekend, dat deze bij lagere
temperaturen veel beter tot ontwikkeling komen. Om
deze reden is het gewenscht na te gaan, bij welke tempe-
ratuur de beste resultaten mot de kleine-plaatculturen
worden verkregen.

De eerste vraag, welke zich bij het onderzoek naar de
waarde van de methode der kleine-plaatculturen voor-
deed, was, welke controle-methode moest worden toe-
gepast. Het lag voor de hand, om, waar het hier betrof
de bepaling van het aantal levende micro-organismen
in melkmonsters met uiteenloopend kiemgehalte, daar-
voor te kiezen de Kocn\'sche plaatmethode. Immers de
methode volgens Breed, zoowel als die van Skar, als
de reductaseproef zijn voor de kiemarme monsters onge-
schikt, afgezien nog van de andere bezwaren, waarop
in de inleiding reeds gewezen is.

Na kennisneming van hetgeen in de literatuur over
de KoCH\'sche plaat-methode gepubliceerd was, waarbij
viel op te merken, dat zeer uiteenloopende opgaven
werden gedaan omtrent samenstelling van den voedings-
bodem, duur en temperatuur der incubatie, werd aan-
vankelijk de methode aangewend, welke hier te lande
algemeen gebruikelijk was en aangegeven stond in den
Codex Alimentarius voor melk. Duidelijkheidshalve volgt
hier in zijn geheel, hetgeen daaromtrent is vermeld.

„Melk, bestemd voor quantitatief bacteriologisch onder-
zoek, wordt na deskundige bemonstering zoo spoedig en

zoo koel mogelijk, bij voorkeur in ijs-verpakking, ver-
voerd naar het laboratorium, om daar zoo spoedig moge-
lijk onderzocht te worden.
Hier worden de volgende verdunningen gemaakt:
a. 1 c.M\\ melk met 99 c.M^. steriele, physiologische
keukenzoutoplossing (0,9 %); verdunningsfactor : 100 ;

h. Van a 1 c.M®. met 99 c.M®. steriele, physiologische
keukenzoutoplossing (0,9 %); verdunningsfactor : 10.000.

Van elk dezer verdunningen wordt 0,5 c.M®. gelijk-
matig verdeeld in bouillongelatine tot platen gegoten.

Na 5 dagen broeden bij 22° C. worden op de platen,
waar dit mogelijk is, geteld:

Dit laatste onderzoek wordt ondersteund door micro-
scopische waarneming en, zoo noodig, door het aanleggen
van culturen in of op verschillende voedingsbodems,.
Het aantal koloniën wordt opgegeven per c.M®. melk.
Wanneer in bijzondere gevallen do telling vroeger ge-
schiedt, wordt hiervan, onder vermelding van de reden
van afwijking, aanteekening gehouden bij de opgave van
het aantal koloniën."

Do bouillongelatine werd bereid volgens het recept,
daarvoor in den Codex aangegeven.

Al heel spoedig bleek, hetgeen reeds bij vorige onder-
zoekingen was opgemerkt, dat in een groot aantal
gevallen aan deze methode een groot bezwaar, n.l.
het vervloeien der gelatine, verbonden was, waardoor
het aantal koloniën niet of zeer onnauwkeurig kon
worden bepaald.

Om deze reden werd nagegaan, of de gelatine door
agar zou kunnen worden vervangen, ten einde meer
zekerheid te hebben het eindresultaat van het controle-
onderzoek te kunnen aflezen. Allereerst diende nu te
worden nagegaan, of bij deze nieuwe methode, welke in
het vervolg agarplaat- of agargietmethode zal worden
genoemd, quantitatief even hooge uitkomsten werden
verkregen. Te dien einde werden 100 melkmonsters aan
een vergelijkend onderzoek onderworpen, waarbij zoo-
wel de gelatine- als agarplaatmethode bij dezelfde melk
werd toegepast. Van deze monsters waren 87 afkomstig
van verschillende z.g. modelbedrijven, terwijl de overige
13 zonder bijzondere voorzorgsmaatregelen gewonnen
waren. Met opzet werd voor het overgrootste gedeelte
melk genomen, waarvan verwacht mocht worden, dat
ze niet al te veel bacteriën zou bevatten, ten einde on-
nauwkeurigheden, welke sterke verdunningen veroor-
zaken, zoo gering mogelijk te doen zijn.

Bij deze en de hiernavolgende methoden werd gebruik
gemaakt van steriel glaswerk.

Nadat het melkmonster goed geschud was ter gelijk-
matige verdeeling van de verschillende bestanddeelen
werd met een pipet 10 c.M\'. der te onderzoeken vloei
stof in een buis gebracht, welke met een kurk was afge
sloten. Eenige minuten achtereen werd nu flink geschud
waarna 1 c.M^ gebracht werd in een kolfje met 49 c.M\'
steriele, physiologische keukenzoutoplossing. Op den bo

dem van het kolfje bevonden zich glaskogeltjes, om de
vermenging te vergemakkelijken. Na schudden werden
van deze verdunning 2 Petri-schalen bedeeld, ieder met
0,5 c.M»., terwijl tevens 1 c.M». werd gebracht in een
met een kurk afgesloten buis, waarin 9 c.M^ steriele,
physiologische keukenzoutoplossing. Weer werd enkele
minuten krachtig geschud en met behulp van een andere
pipet van deze tweede verdunning 0,5 c.M\'. in 2 Petri-
schalen gevoegd. Bovendien werd 1 c.M». in een tweede
buis met 9 c.M\'. physiologische keukenzoutoplossing ge-
bracht, weer flink geschud en van deze derde verdunning
2 Petri-schalen met 0,5 c.M\\ bedeeld.

In elk der 6 genoemde Petri-schalen werd een buis
met 15 c.M\'. vloeibare gelatine leeggegoten. De gelatine
was van te voren in een waterbad bij 45° C. opgesmolten
en daarna tot 25° C. afgekoeld. Het uitgieten geschiedde
op een koude, horizontaal gestelde glasplaat. Na stoU
ling der gelatine werden de glasdoozen in een broedstoof
bij 22° C. geplaatst.

Deze kwam geheel overeen met de hierboven beschre-
vene, met dit verschil, dat dc bouillongclatine vervangen
werd door bouillonngar, welke bij 100° C. was opge-
smolten en daarna tot 45° C. afgekoeld. Dc agarplaten
werden eveneens bij 22° C. weggezet.

I)e bouillonagar werd als volgt bereid : 1 K.G. vetvrij
rundvleesch, in kleine stukjes gesneden, werd overgoten
met 2 L. water en daarna langzaam aan den kook ge-

bracht. Na 2 uur koken werd de bouillon afgegoten,
het vleesch hierin uitgeperst en tot 2 Liter met leiding-
water bijgevuld. Daarna werd tot 1 % pepton „Witte"
en keukenzout toegevoegd. De vloeistof werd met
10 % carbonas natricus-oplossing tot zwak alkalisch tegen-
over vochtig lakmoespapier geneutraliseerd, waarna 40
gram fijn geknipte agar-agar werd toegevoegd. Dit meng-
sel werd 2 uur in den Koch\'schen stoomer bij 100° C.
geplaatst om de agar-agar te smelten. Daarna werd de
reactie weer nagegaan, welke soms iets zuur was gewor-
den, waarna een geringe hoeveelheid alcali werd toege-
voegd, totdat de oorspronkelijke alkalische reactie was
hersteld. De agarmassa werd nu tot 50° C. afgekoeld,
waarbij troebelingen ontstonden en zich tevens een neer-
slag vormde, en daarna direct weer 1—li uur in het
Kocn\'sche toestel geplaatst. Deze laatste bewerking
werd ter betere klaring van den voedmgsbodem in den
regel nog eens herhaald. Na filtreeren door een dubbele
laag watten werd 15 c.M®. in steriele cultuurbuizen afge-
meten. Deze werden door middel van een wattenprop
afgesloten en gedurende \\ uur in het Kocn\'sche apparaat
gesteriliseerd. Na afkoeling en stolling werden deze ge-
vulde buizen 2 dagen bij 37° C. bewaard, ter onderzoek
op steriliteit.

Eiken dag werden de platen nagezien, waarbij al
spoedig bleek, dat, alvorens het maximum aantal kolo-
niën zichtbaar was, het broeden, zoowel voor de agar-

als gelatineplaten, gedurende minstens 5 dagen moest
worden voortgezet, en dan nog konden vele koloniën
slechts met een loupe worden geteld. Ook als langer,
ja zelfs 10 dagen werd gewacht, kon het vergrootglas
niet worden gemist. De oorzaak hiervan was waarschijn-
lijk wel hierin te zoeken, dat voor verschillende bac-
teriën de ontwikkelingsvoorwaarden onvoldoende waren.
De samenstelling van het voedingsmedium en de broed-
temperatuur zoodanig te kiezen, dat alle bacteriën, welke
in melk kunnen voorkomen, tot flinke koloniën uitgroeien,
zal echter vermoedelijk wel tot de onmogelijkheden be-
hooren. Tevens viel op te merken, dat, wanneer vele
koloniën zich op één plaat ontwikkelden, deze kleiner van
afmetingen bleven, dan wanneer dit aantal gering was.

Ter vermijding van vergissingen werden de getel-
de koloniën met een stip O.I. inkt aangegeven. Het
aflezen der agarplaten leverde weinig moeilijkheden
op, behoudens enkele gevallen, waarbij overgroeiing
was opgetreden, zoodat do agaroppervlakte geheel of
gedeeltelijk met een bacteriënlaag overtrokken was of
waarbij weelderige schimmelgroei was ontstaan. Van
do gelatineplaten echter waren reeds na enkele dagen
vele min of meer vervloeid, hetwelk na längeren in-
cubatietijd toenam. Van de 100 ingestelde onderzoe-
kingen, waarbij hefc resultaat der agarplaten kon worden
afgelezen, moesten 30 wegens gedeeltelijke of algeheele
vervloeiing der gelatineplaten buiten beschouwing blij-
ven. Het bepalen van het aantal koloniën geschiedde
volgens de regels, welke in het rapport van de „Labo-
ratory Section of the American Public Health Associa-

tion", Oct. 24, 1916, waren vastgesteld Zooveel moge-
lijk werden die platen afgelezen, welke 30—300 kolo-
niën bevatten, terwijl van de voor telling in aanmerking
komende platen steeds het gemiddelde werd pnomen.
Platen met minder dan 30 koloniën werden, indien moge-
lijk, buiten beschouwing gelaten. Elke kolonie, welke
in de met verschiUende verdunnmg bedeelde ^lasdoozen
gegroeid was, kwam overeen met respectievelijk 100,
1000 en 10.000 bacteriën per c.M\'. melk. De uitkomsten
der platen, die van dezelfde verdunning in den overeen-
komstigen voedingsbodem waren aangelegd, liepen dik-
wijls sterk uiteen en verschiUen van 50 en meer procent
konden geen zeldzaamheid genoemd worden. De sterkste
verdunningen gaven over het algemeen het hoogste eind-
resultaat, waarschijnlijk door het niet gelijkmatig ver-
mengen en door het meerdere schudden, waardoor bac-
teriëngroepjes betere gelegenheid kregen uiteen te vallen
en tot meerdere koloniën uit te groeien.

Een overzicht der 70 onderzoekingen, waarbij zoowel de
gelatine- als agarplaten konden worden afgelezen, werd in
tabel 1 (zie blz. 44—46) weergegeven. De eerste kolom
vermeldt de nummers der gevallen, welke gerangschikt
werden volgens het opklimmend aantal der op de gelatine-
platen ontwikkelde koloniën. De tweede en derde kolom
vermelden het bacteriënaantal per c.M\'. melk, dat res-
pectievelijk volgens de gelatine- en agarplaatmethode
bij 22° C. verkregen werd. In de laatste kolom werd de
verhouding dezer beide tellingen berekend. Frappant was,
dat slechts in drie gevallen, t.w. nos. 20, 23 en 39, de
gelatineplaten hoogere uitkomsten gaven, waarvan de ge-

vallen 23 en 39 eigenlijk uitvielen, aangezien hierbij de
verschillen zoo gering waren, dat zij binnen de waar-
nemingsfouten bleven. De verhoudingen der beide tel-
lingen varieerden van 1 : 0,30 tot 1 : 31,67, terwijl het
gemiddelde aantal bacteriën, verkregen volgens de agar-
plaatmethode 2,25-maal zoo groot bleek als dat, met de
gelatineplaten verkregen. De nos. 5, 8, 45, 54, 58 en
59 gaven zeer groote verschillen in het voordeel van
de agar te zien, voor welk verschijnsel geen verklaring
gevonden werd. Wanneer deze waarnemingen buiten be-
schouwing werden gelaten, bleek de verhouding 1 :1,64
te worden, zoodat dan nog op de agar ruim IJ-maal
zooveel koloniën waren gegroeid als op de gelatine.

Op grond van dit experiment mag worden geconcludeerd,
dat hij liet quantitatief hacteriologisch melkonderzoek, in-
gesteld volgens de bepalingen van den Codex Alimentarius,
dehouillmigelatinedoor bouillonagar mag worden vervangen.

Aangezien de koloniën in de agarplaten bij 22° C.
pas na 5 dagen konden worden geteld, terwijl dan nog
in vele gevallen deze zeer klein, ja nauwelijks zicht-
baar waren, werd nu nagegaan, of 1°. door toepassing
van een hoogere broedtemperatuur, 2°. door de ver-
dunde melk over een gereed zijnde agarplaat uit te
strijken, de vermeerdering der bacteriën kon worden
bespoedigd.

Te dien einde werden 17 melkmonsters van diverse
herkomst en waarvan verwacht mocht worden, dat ze
een laag kiemcijfer zouden bezitten, elk volgens drie
methoden onderzocht:

2°. Volgens dezelfde methode, waarbij echter de platen
bij 37° C. werden weggezet.

Bij de 2 eerste methoden werden dezelfde verdunnin-
gen, als bij het vorige experiment beschreven, gebruikt,
terwijl weer elke verdunning in duplo werd onderzocht.
Voor de derde methode werden verdunningen^van 1 : 10,

2 agarplaten met 0,1 c.M\'. werden bedeeld, waarna deze
vloeistof met een rechthoekig omgebogen platina-naald of
met een glasspatel volgens Drigalski zooveel mogelijk
over de agaroppervlakte verdeeld werd.

lederen dag werden alle glasdoozen gecontroleerd,
waarbij bleek, dat bij de agarplaatmethode van 37° C.
de koloniën na 3 dagen konden worden geteld, dat dan
echter ook nog vele koloniën zeer klein waren gebleven.

Ook na veel langer, zelfs 10 dagen, broeden, was dit
nog het geval. Bij de agarstrijkmethode waren de kolo-
niën doorgaans veel grooter, terwijl reeds na 2 dagen
het aantal kon worden bepaald. Tevens werd een grootere
variatie in het kolonietype waargenomen, waardoor, dit
zij terloops opgemerkt, een beter inzicht in den aard
der bacterieflora werd verkregen. Daartegenover stond,
dat in vele gevallen de koloniën geconflueerd waren,
waardoor het aantal moeilijk kon worden opgegeven.

De bepaling van het aantal kiemen geschiedde vol-
gens de bij de vorige proef beschreven regels. De uit-
komsten werden weergegeven in tabel 2 (zie blz. 47).

De eerste kolom gaf de nummers weer der onder-
zoekingen, die gerangschikt werden volgens het opklim-

mend aantal bacteriën, verkregen volgens de agarplaat-
methode bij 22° C., welke in tegenstelling met de strijk-
methode, agargietmethode werd genoemd. De drie daarop
volgende kolommen vermeldden het aantal kiemen per
c.M\'. melk, respectievelijk bepaald met de daarboven ver-
melde werkwijze. In de laatste kolom werden de verhou-
dingen der tellingen volgens de drie methoden weerge-
geven. Slechts bij nummer 1 gaf de agarplaatmethode bij
37° C. de hoogste uitkomsten, terwijl in alle andere ge-
vallen de agargietmethode bij 22° C. de hoogste cijfers te
zien gaf. De verhouding der bacteriecijfers volgens beide
eerste methoden varieerde van 1 : 0,25 tot 1 :1,08, ter-
wijl gemiddeld de agarplaten bij 22° C. bijna tweemaal
zoo hooge uitkomsten gaven als die bij 37° C. De ver-
houding der kiem-aantallen, volgens de eerste en derde
methode, varieerde van 1 : 0,1 tot 0,71, terwijl gemiddeld
het bacteriecijfer bij de gietmethode bij 22° C. driemaal zoo
hoog was, als de strijkmethode bij 37° C. daarvoor aangaf.

De betere groeivoorwaarden voor de in de melk voor-
komende bacteriën bij lagere temperaturen gaf een ver-
klaring voor het hoogere kiemcijfer bij 22° C., terwijl
het nog geringere aantal bij de „strijkmethode" op grond
van confluentie moest worden verklaard.

Op grond van deze proefnemingen mag wel worden ge-
concludeerd, dat van de onderzochte werkwijzen de agar-
plaatmethode hij 22° C. verreweg de heste is. Daarom werd
besloten, als controle voor de kleine plaatcuituren, deze
methode toe te passen.

TABEL 1.
Aantal bacteriën per c.M^. rridh vólgens
gelatine- en agarplaatmethode bij 22° C.

Alvorens een bespreking te houden overMe resultaten,
verkregen met de „little plate method" volgens Frost
- voortaan Ueme-vlaatmetlwde genoemd — volgt hier
eerst een overzicht van de benoodigde apparatuur en het
materiaal, benevens van de techniek, welke voor deze
bacterietelling werd toegepast.

Voorwerpglazen. Hiervoor worden de gewoonlijk ge-
bruikte modellen genomen, welke 76 m.M. lang en

Marking Guide". Dit is een apparaat om gemakkelijk
en\'nauwkeurig vierkanten van 4 c.m\'. oppervlak op de
voorwerpglazen te teekenen langs 2 metalen modellen.
Op elk glas worden twee vierkanten aangebracht, aan-
gezien elk onderzoek in duplo geschiedde. Zie photo 1.

WaspoÜooden. Hiermede werden bovengenoemde vier-
kanten geteekend. Het groote voordeel boven andere
glaspotlooden was, dat ze zeer gemakkelijk op glas hun
kleurstof afgaven, terwijl bij de volgende bewerkingen

Pincet van bijzondere constructie n.1. met een lang,
recht en een iets korter omgebogen been. Het lange been

was voorzien van een verbreeding met een opstaanden
rand, waartegen het voorwerpglas onbeweeglijk in het
pincet gefixeerd kon worden. Zie photo 1, Met dit pincet
konden de verschillende manipulaties zeer gemakkelijk
uitgevoerd worden.

„Warm TaUe\'\\ Zie photo 2. Dit toestel dient om de
voorwerpglazen, welke erop gelegd worden, op een be-
paalde temperatuur te houden, n.1. bij het aanleggen der
kleine-plaatculturen op ± 45° C. en bij het drogen der
preparaten op 80° a 90° C. Het bestaat uit een recht-
hoekige, metalen doos, aan alle zijden, behalve aan boven
en onderzijde, door asbest omgeven. Deze doos rust op
3 metalen pooten, welke losgeschroefd kunnen worden,
waardoor de bovenzijde altijd in horizontalen stand kan
worden gebracht. Aan de rechterzijde van het bovenvlak
bevinden zich 2 schuin geplaatste buizen, welke in het
lumen van de metalen doos uitmonden en waarin bij het
instellen der proef buizen met gesmolten agar worden ge-
bracht. Aan de linkerzijde is een opening aangebracht,
waardoor men water in de doos kan laten vloeien en waar-
in tevens door middel van een doorboorde kurk een
thermometer bevestigd wordt, ten einde do temporatuur
van het waterbad te kunnen aflezen. Do verwarming
vindt plaats door een brander, welke met klemmetjes
aan de metalen pooten is bevestigd en door middel van
oen gummislang mot do gasleiding verbonden is.

Steride pipetten van 10, 1 en 0,1 c.M». De pipetten van
10 c.M». dienen om van het oorspronkelijke melkmonster
een gedeelte in een steriele buis over te brengen, die van
1 c.M». om druppels agar van de vereischto grootte te

laten uitvloeien en die van 0,1 cM\\ om zoo nauwkeurig
mogelijk V20 c.M^. melk te kunnen afmeten. Deze laatste
pipetten zijn in 10 gelijke deelen verdeeld en bezitten een
puntig eind, terwijl de deelstrepen op voldoenden afstand

Glazen plaat, met verstelbaren drievoet, waterpasje en
glazen stolp. Door middel van bet waterpasje wordt nage-
gaan, of de glazen plaat horizontaal ligt. Deze glazen plaat
dient om de aangelegde kleine-plaatculturen op te leg-
gen, ten einde de agar te laten stollen, terwijl de glazen
stolp over de preparaten heen wordt geplaatst, om ver-
ontreiniging uit de lucht te voorkomen.

Incubator met preparatenreh. Zie photo 3. Deze incuba-
tor bestaat uit een metalen kastje, waarin een uitneem-
baar rek, dat 48 voorwerpglazen kan bevatten, geplaatst
is. Op den bodem is ruimte gelaten, om water in te bren-
gen, ten einde een vochtige atmosfeer in den incubator
te onderhouden, terwijl voor goede circulatie van den water-
damp ruimte tusschen de wanden van het kastje en het
preparatenrek wordt gelaten. Hierdoor wordt het uit-
drogen der preparaten voorkomen.

Voedingsbodem. Hiervoor werd in den aanvang 2 %
bouillonagar gebruikt, terwijl later de 1J% concentratie
genomen werd, aangezien hiermede door het minder vlug
stollen op het warmwaterbad bij het vermengen met de

melk mooiere preparaten werden verkregen. Overigens
geschiedde de bereiding op de wijze, zooals in het vorige
hoofdstuk is aangegeven.

10 % Oplossing van ijsazijn in 95 % alcohol. Met deze
vloeistof werden de preparaten na het broeden behandeld,
ten einde de agar minder geschikt te maken voor het op-
nemen van kleurstof. Bij nader onderzoek bleek echter,
dat deze voorbehandeling gemist kon worden, indien
ijsazijn bij de kleurstof werd gevoegd.

Kleurstof. Door Frost werden 2 kleurstoffen aanbe-
volen, welke beide goede resultaten gaven: 1°. Een op-
lossing van 1 deel Loeffler\'s methyleenblauw in 3 deelen
gedestilleerd water of 1 deel verzadigde, alcoholische
methyleenblauwoplossing in 40 deelen gedestilleerd water.
2°. Carbolthionine met ijsazijn. Deze kleurstof werd vol-
gens onderstaand recept bereid: 1 gram thionineblauw
en 2,5 gram carbolzuur werden gevoegd bij 400 c.M®.
gedestilleerd water. Dit mengsel liet ik gedurende een
nacht bij kamertemperatuur staan, daarna werd het
gefiltreerd en bij het filtraat 20 gram ijsazijn gevoegd.

Het te onderzoeken monster werd ongeveer 20-maal
het onderst boven gedraaid ter gelijkmatige verdeel ing
der verschillende bestanddeelen. De melk bevond zich
in den regel in afgesloten flesschen en vertoonde bij aan-
komst op het laboratorium dikwijls een min of meer dikke
roomlaag, welke door schudden zoo gelijkmatig mogelijk
werd verdeeld. Nadat de flesch voorzichtig geopend was,
waarbij zorg werd gedragen den inhoud niet te ver-

ontreinigen, werd met een steriele pipet 10 c.M». in een
steriele reageerbuis, voorzien van een steriele gummistop,
overgebracbt. Deze buis werd eenige minuten geschud,
om zooveel mogelijk uiteenvallen van bacterieklompjes,
welke zich altijd in melk bevinden, te bewerkstelligen.
Volgens de onderzoekingen van Walter Meier dient
men de waarde van dit schudden niet te onderschatten.
Hij zegt n.1.: „Versuche hinsichtlich des Einfluszes
kräftigen Schütteins auf die mittels Gelatine- und Agar-
platten feststellbare Keimzahl in frischer Kuhmilch haben
ergeben, dasz 5 Minuten langes, kräftiges Schütteln der
Müch 9—137,7 Proz. mehr Keime in der Milch mittels
Plattenaussaat nachweisen liesz, als wenn die betreffende
Probe nur gut durchmischt wurde". Een bezwaar, dat
bij het schudden van deze onverdunde melk werd onder-
vonden, was, dat er boterbolletjes en schuim gevormd
werden. Daarom werd niet al te heftig geschud en de buis
in verticalen stand een oogenblik weggezet om de lucht-
belletjes zooveel mogelijk te laten ontsnappen. Daarna
werd met een steriele pipet van 0,1 cM\\, welker inhoud
in 10 gelijke deelen was verdeeld, tot aan de bovenste
deelstreep melk uit de buis opgezogen. De buis werd
hierbij schuin gehouden, om gemakkelijker schuimopname
te verhinderen. Het is gewenscht de pipet hierbij niet
verder in de melk te dompelen, dan noodig is om lucht-
opzuiging te voorkomen, daar bij diep onderdompelen
veel melk aan den buitenkant blijft kleven, welke daarna
naar beneden vloeit en de afmeting onnauwkeurig maakt.
In elk geval werd na vulling de punt van de pipet in aan-
raking gebracht met den binnenkant van de steriele buis

om de aanklevende vloeistof te verwijderen. Men kan ook
met steriel filtreerpapier of een steriel doekje den buiten-
kant afvegen, dit is echter niet zoo eenvoudig en geeft
bovendien kans op verontreiniging. Van te voren waren
op een schoon voorwerpglas met het beschreven toe-
stelletje 2 vierkanten van 4 c.M\'. oppervlak met was-
potlood aangebracht. Met het bekende pincet werd dit
voorwerpglas daarna opgenomen en gesteriliseerd door
het driemaal door de vlam van een BuNSEN\'schen bran-
der te halen met den gemerkten kant naar beneden en
éénmaal met denzelfden kant naar boven gekeerd. De
ervaring moet de snelheid van het door de vlam halen
aangeven, aangezien bij een te langzaam tempo de was
smelt en zich over de vierkanten verdeelt, terwijl, wanneer
dit te vlug geschiedt, onvoldoende sterilisatie verkregen
wordt. In dit verband dient er reeds op te worden gewe-
zen, dat voorwerpglazen, waarop de omtrekken der vier-
kanten zijn ingekrast, groote voordcelen bieden, in de
eerste plaats door de besparing van den tijd, welke voor
het aanbrengen der vierkanten noodig is, in de tweede
plaats doordat het bezwaar van het smelten der was bij
het steriliseeren geheel vervalt. Bovendien heeft men bij
de behandeling in de verschillende vloeistoffen geen last
van het loslaten der gekleurde wasdeeltjes, die zich dan
later weer op de preparaten kunnen afzetten en het af-
lezen bemoeilijken. Direct na het steriliseeren werd het
voorwerpglas met de teekening naar boven op de „warme
tafel" gelegd. Deze was van te voren met water gevuld
en op 45° C. verwarmd. Indien tijdens dc bewerking de
temperatuur onder 40° C. daalde, werd de gaskraan

wijder opengezet, terwijl men bij stijging boven 45° C.
minder gas liet toestroomen. Een paar agarbuizen waren
in een waterbad bij 100° C. geplaatst ter smelting van
den voedingsbodem en daarna ter afkoeling op 45° C.
in een waterbad van die temperatuur gebracht. In een
der schuin geplaatste openingen van de „warm table"
werd een buis met gesmolten en tot 45° C. afgekoelde
agar geplaatst, nadat de wattenprop was^afgenomen en
de monding was geflambeerd. Nu werd een lange, steriele
pipet van 1 c.W. na zachte verwarming in deze buis met
agar gebracht. De bedoeling van deze zachte verwarming
was om te voorkomen, dat de agar rondom de pipet zou
stollen. Al deze bewerkingen waren reeds geschied, als
de melk in de pipet van 0,1 c.M». werd opgezogen. Nu
werd op elk der vierkanten van het voorwerpglas 0,05
c.W. melk gebracht, waarbij moest worden zorg gedragen,
dat dit voldoende was afgekoeld, daar anders verschillen-
de kiemen zouden worden gedood. Van elk melkmonster
werd dus 0,1 c.M\'., verdeeld over 2 preparaten, onder-
zocht. Daarna werd zoo spoedig mogelijk uit de in de
„warm table" geplaatste agarbuis door middel van de
erin geplaatste pipet ongeveer een gelijke hoeveelheid ge-
smolten agar op elk vierkantje gebracht en de pipet
in de agarbuis gezet, om eventueel voor het maken
van andere preparaten weer dienst te dunnen doen. In
den regel was één druppel agar voldoende, terwijl anders
2 druppels werden toegevoegd. Het maakte zeer weinig
verschil uit, of de agardruppel naast of op den melkdruppel
werd gebracht, alleen bij koude melkmonsters verdiende
het de voorkeur de druppels naast elkaar te plaatsen om

te verhinderen, dat door toevoeging van den kouden
druppel de agar zou stollen. Met een uitgegloeid en daarna
behoorlijk afgekoeld platina-oogje werden nu beide drup-
pels innig gemengd, zoodat een homogene massa ontstond,
welke tijdens het mengen zoodanig werd uitgespreid, dat
het geheele vierkant gelijkmatig werd bedekt. Zonder
vooraf uit te gloeien werd met dezelfde naald op het
andere vierkant dezelfde bewerking herhaald. Door de
aanwezigheid der waslijnen werd dit uitspreiden verge-
makkelijkt daar deze de agar-melkmassa deden terug-
vloeien, zoodat tijdens de bewerking het vierkant niet
overschreden werd. In dit opzicht staan de voorwerp-
glazen, waarbij de vierkanten zijn ingekrast, in het nadeel,
echter ondervindt men hiervan bij eenige ervaring zeer
weinig stoornis. In het begin traden door gedeeltelijke
stolling der agar dikwijls korrels in het preparaat op.
Nadat meerdere handigheid was verkregen en bovendien
1J % agar in plaats van 2 % aan den voedingsbodem
was toegevoegd, werd hiervan, behoudens bij sterk afge-
koelde monsters, geen nadeel meer ondervonden. Deze
laatste monsters dient men dan ook vooraf even in een
waterbad van 45° C. eenige minuten te verwarmen. Zoo
spoedig mogelijk werd na het uitspreiden der melk-agar-
massa het preparaat op een koude, horizontaal gestelde
glasplaat onder een stolp gebracht ten einde het mengsel
te laten stollen. Men kan do preparaten ook direct in het
rek van den incubator plaatsen, waarbij zich echter het
bezwaar kan voordoen, dat door een niet horizontalen
stand van dit rek de massa vóór het stollen naar één kant
loopt, zoodat minder mooie resultaten worden verkregen.

De ervaring moest hierbij den jnisten tijd aangeven,
waarbinnen het melk-agarmengsel voldoende hard was
geworden. Deze tijd was ten zeerste afhankelijk van de
omgevende kamertemperatuur, \'s Winters kon met 10
minuten worden volstaan, terwijl \'s zomers 15 ä 20
minuten hiervoor noodig waren. Indien onvoldoende
stolling was verkregen, groeiden de bacteriën niet tot
mooie, scherp omschreven koloniën uit, \'doch trad dik-
wijls infiltratieve groei op, terwijl bij te lang laten liggen,
uitdroging der preparaten werd waargenomen.

Nadat voldoende stolling was opgetreden, werd het
voorwerpglas in den incubator in de broedstoof geplaatst.
De broedstooftemperatuur bleek van grooten invloed te
zijn op het aantal zich ontwikkelende koloniën. Volgens
de laatste publicatie van Frost moest deze 37,5° C. zijn,
terwijl geen voldoende experimenten waren genomen
om uit te maken, of ook bij 20° C. dezelfde resultaten
werden verkregen. Wel moest bij deze lage temperatuur
de incubatie minstens 24 uur worden voortgezet. Overi-
gens werden in de literatuur geen proeven vermeld,
waarbij een andere temperatuur dan 37° C. oi 37,5° C.
was toegepast. Op grond van verschillende onderzoekin-
gen bij diverse temperaturen, welke nader zullen worden
vermeld, werd nu vastgesteld, dat de beste broedtempe-
ratuur ongeveer bij 28° C. lag. De duur der incubatie
liep volgens Frost uiteen van 4 tot 8 uur, terwijl deze
zonder bezwaar tot 24 uur kon worden verlengd. Ook
hierover heb ik nader te beschrijven proeven genomen,
waarvan nu reeds wordt meegedeeld, dat bij een broed-
stooftemperatuur van 28° C. 15 uur voldoende is om

betrouwbare resultaten te verkrijgen, terwijl door een
längeren incubatieduur geen nadeel wordt ondervonden.

Het voorwerpglas, met de 2 gestolde agarplaatjes,
werd in den loop van den dag in de broedstoof bij 28° C.
geplaatst en daarna den volgenden dag verder behandeld.
Over den incubator dient nog het een en ander te worden
medegedeeld. Bijna voortdurend werden van één melk-
monster meerdere preparaten gemaakt, welke bij verschil-
lende temperaturen werden gebroed. Aangezien bij den
aanvang van het onderzoek slechts een en later twee incu-
batoren van het beschreven model aanwezig waren, werd
hiervoor met hetzelfde resultaat van een geïmproviseerd
apparaat gebruik gemaakt. Dit bestond uit een glasdoos,
op den bodem waarvan een PETRi-schaal werd geplaatst.
Op deze schaal werd het voorwerpglas gelegd, terwijl op
den bodem der glasdoos een laagje water werd gebracht
om een vochtige atmosfeer rondom de kleine platen te
onderhouden. Om dezelfde reden werd het deksel der
glasdoos na het inbrengen der preparaten met een laagje
vaseline vast aangesloten. Ook werd met veel succes ge-
bruik gemaakt van een glasdoos, waarin op halverhoogte
in horizontale ligging een geperforeerde, geglazuurd stee-
nen plaat rustte, waarop de kleine-plaatculturen werden
gelegd. Op den bodem der doos bevond zich een laagje
water, terwijl, door den rand van hot deksel in te vetten,
het geheel goed werd afgesloten. Heel goed voldeed ook
oen glazen doos, waarin zich een voor meerdere prepa-
raten gebouwd rekje bevond. Ook hier was, om uitdrogen
dor proparaten te voorkomen, water op den bodem ge-
bracht en het deksel der doos met vaseline ingesmeerd

ter betere afsluiting. Om bet vallen van waterdruppels door
de condensatie van den waterdamp van den binnenkant
van bet deksel op de agarplaatjes te voorkomen, werd
boven in het rekje een gewoon voorwerpglas gebracht om
deze druppels op te vangen.

Van tijd tot tijd werden de incubatoren in stoom ge-
steriliseerd of met kokend water omgespoeld. Ook werd
wel ter steril weering in den incubator volgens Frost
water aan de kook gebracht en op deze wijze dit toestel

Nadat het preparaat voldoende lang in de broedstoof
was geweest, werd het uit den incubator genomen. Met
het bloote oog waren dan meestal reeds vele koloniën
zichtbaar, die door hun witte kleur tegen de meer grijze
agar afstaken. Werd dit preparaat onder het microscoop
bij getemperd licht bekeken, dan konden alle koloniën
duidelijk worden waargenomen en de telling kwam ge-
heel overeen met die van de gekleurde kleine-plaat-
cultuur. Aangezien deze preparaten niet houdbaar zijn,
terwijl bovendien door kleuring de koloniën veel duide-
lijker voor den dag treden, is de verdere behandeling

Het preparaat werd vóór de kleuring eerst gedroogd
bij een temperatuur van ± 90° C., gedurende 2 a 3 minu-
ten, waarbij de vochtige glans verloren ging en het prepa-
raat dof werd. Dit drogen geschiedde door het voorwerp-
glas op de „warm table" te leggen, waarvan de tempera-
tuur door verwarming van het water tot 90° C. was
opgevoerd. Volgens de aanwijzing van Frost moest dit
drogen even onder het kookpunt van water plaats vinden.

Hierbij ontstonden echter dikwijls scheuren in de agar-
plaatjes, welke bij lagere temperaturen lang niet zoo ge-
makkelijk optraden. Bij ongeveer 90° C. droogden de
preparaten vlug, terwijl scheuren weinig voorkwamen.

Na het drogen werd het preparaat gedurende 2 minuten
gekleurd in de ijsazijnhoudende carbolthionine en ver-
volgens in water afgespoeld, om de overtollige kleurstof
te verwijderen. Daarna werd het definitief gedroogd,
door met een doekje den onderkant en de randen af te
vegen en het daarna gedurende 1 minuut bij 90° C. op de
„warme tafel" te leggen.

De agar was nu heel zwak of niet gekleurd, terwijl de
koloniën een mooie, donkerblauwe kleur vertoonden en
scherp afstaken tegen den lichten ondergrond.

Het drogen en kleuren der preparaten vond op de be-
schreven wijze plaats, nadat verschillende andere metho-
den op hun bruikbaarheid waren nagegaan. Indien de
preparaten, nadat ze uit de broedstoof waren genomen,
zonder voorafgaande droging, direct in de kleurstof wer-
den gebracht, bleek de ondergrond tamelijk sterk mee-
gekleurd to worden, waardoor het tellen der koloniën
bemoeilijkt werd. Met methyleenblauw werden, evenals
met carbolthionine, goede resultaten verkregen; do
koloniën namen hierbij over het algemeen een zeer
donkere kleur aan, terwijl do ondergrond niet zoo
mooi ontkleurd werd, als bij hot gebruik van carbol-
thionine. Do behandeling der preparaten vóór het
kleuren met een 10% oplossing van ijsazijn in 95%
alcohol bleek overbodig, aangezien zonder deze voor-
behandeling even mooie preparaten werden verkregen,

Het tellen¹) der koloniën geschiedde met behulp van
een microscoop van Zeiss, waarbij steeds het compensatie-
oculair 4 en de objectieven A en D werden gebruikt,
terwijl bij het bestudeeren der bacterievormen de olie-
immersie V12" goede diensten bewees.

Hierbij behoefde het preparaat niet met een dekglas te
worden afgesloten; de druppel cederolie werd direct op
de kleine plaat gebracht. In den regel kon met de zwakke
vergrooting worden volstaan, aangezien na 15 uur de
meeste bacteriën tot flinke koloniën waren uitgegroeid.
Alleen wanneer bij deze vergrooting het aantal koloniën
per gezichtsveld meer dan 30 ä 40 bedroeg, werd het
objectief D genomen, aangezien met objectief A dan niet
nauwkeurig kon worden geteld. Indien door het groote
aantal koloniën ook deze vergrooting onvoldoende was,
kon de opgave van het aantal slechts bij grove benade-
ring geschieden. In deze gevallen kon ook de olie-immer-
sie geen dienst doen, daar hierbij altijd in meerdere of
mindere mate confluentie der koloniën was waar te
nemen.

Indien verwacht werd, dat de melk een zoo groot aantal
kiemen bevatte, werd deze vóór het aanleggen der kleine-
plaatculturen verdund. Op deze kwestie van verdunning
kom ik in het hoofdstuk over het onderzoek van kiem-
rijke melk terug. Het is zeer moeilijk vaste kiemcijfers
aan te geven voor melk, waarbij objectief A, en die, waarbij
objectief D gebruikt moet worden, aangezien de grootte

1 Gemakflhalvo maakte ik by hot tellen dor koloniën gebruik van oen
automatisch tolapparaat.

der koloniën van zoovele factoren afhankelijk is. Ook het
aangeven van een bepaald kiemcijfer, waarbij de melk
moet worden verdund, is zeer lastig. De ervaring, maar
bovenal de experimenten moeten hierbij den weg aan-
wijzen. In de literatuur wordt hierover zeer weinig ge-
sproken. Alleen wordt aangegeven, dat bij het aanwezig
zijn van meer dan één millioen kiemen de melk moet
worden verdund. Mijn ervaring is, dat over het algemeen
tot een kiemcijfer van 100.000 met objectief A kan worden
volstaan, terwijl daarboven objectief D moet worden
gebruikt. Hiermede kan men tot 200.000 het aantal vrij
nauwkeurig opgeven, terwijl daarboven de melk vóór het
aanleggen der kleine-plaatculturen moet worden verdund.

Ook de vraag, in hoeveel velden de koloniën moeten
worden geteld om het aantal bacteriën in de melk te
bepalen, moet door de ervaring worden beantwoord.
Indien slechts weinig koloniën per gezichtsveld voor-
komen, moeten meer velden worden nagekeken, dan wan-
neer dit aantal grooter is. Ook de kwestie van het gelijk-
matig verdeeld zijn der koloniën is in dit opzicht van
groot belang. Daarom moet eerst worden nagegaan, hoe
het met deze verdeeling gesteld is, terwijl daarna bij
monsters, waarbij het aantal bacteriën niet hooger is dan
50.000 per c.M\'., in 5 a 10 velden het aantal koloniën
moot worden geteld. Is daarentegen hot aantal hooger,
dan kan mot het tellen van 2 a 5 velden worden volstaan.

De randzones der preparaten moeten niet worden mee-
geteld, aangezien hierin relatief weinig koloniën voor-
komen, en wel in do eerste plaats, omdat de agarlaag hier
het dunst is, en in de tweede plaats, omdat deze gedeel-

ten het meest aan uitdroging zijn blootgesteld. Ook
moeten van de koloniën, die op den rand van het micro-
scopisch gezichtsveld liggen, slechts het halve aantal in
de telling worden opgenomen. De conclusies over het
aantal te onderzoeken velden werden verkregen, door
meerdere tellingen van een verschillend aantal velden te
verrichten.

Indien het gemiddeld aantal kolohiën per gezichtsveld
bepaald was, kon heel gemakkelijk het aantal bacteriën
per gM\\ melk worden berekend. Hierbij werd uitgegaan
van de veronderstelling, dat elke kolonie afkomstig was
van één micro-organisme. Men moet zich er hierbij wel
van bewust zijn, dat heel dikwijls een kolonie uit meer dan
één bacterie gevormd werd. Dit bezwaar kleeft echter
aan elke cultiveeringsmethode en kan door schudden
van het monster tot een minimum beperkt worden, of-
schoon het, ook door zeer krachtig schudden, niet geluk-
ken zal, alle bacteriegroepjes in hun afzonderlijke exem-
plaren te doen uiteenvallen. Hiervan kon ik mij herhaalde-
lijk door het maken van een uitstrijkpreparaat of een
kleine-plaatcultuur, waarbij deze zonder voorafgaand
bebroeden direct gekleurd werd, overtuigen. Bijna altijd
waren in deze preparaten groepjes van 2 of meer bacte-
riën waar te nemen. Bij de kiemarme melkmonsters had
het schudden in dit opzicht veel minder effect dan bij dc
kiemrijke, waarbij de melk voor het aanleggen der cultu-
ren werd verdund en waarbij zonder bezwaar krachtiger
kon worden geschud.

De volgende formule werd voor de berekening van hot
aantal bacteriën per c.M^ melk gebruikt.

De eerste factor van dit product stelt bet gemiddeld
aantal koloniën per microscopisch gezichtsveld voor en
wordt op de bovenbeschreven manier bepaald. Van den
tweeden factor is het oppervlak van de kleine plaat be-
kend, namelijk 400 m.M^., terwijl het oppervlak van het
microscopisch gezichtsveld voor elke te gebruiken lenzen-
combinatie moet worden bepaald. Hiervoor wordt met
behulp van een object-micrometer de diameter van het
bedoelde veld gemeten en de formule ir R" toegepast.
Indien men er voor zorgt de tubuslengte constant te
houden, behoeft men voor elke lenzencombinatie dezen
diameter slechts éénmaal te bepalen. Bij een tubuslengte
van 155 m.M. is do diameter van het microscopisch ge-
zichtsveld bij compensatie-oculair 4 en objectief A
1,92 m.M., bij hetzelfde oculair en objectief D 0,45 m.M.
Het oppervlak van het microscopisch gezichtsveld be-
draagt nu respectievelijk 2,9 m.M^ en 0,16 m.M^ De
tweede factor, welke dc microscopische factor genoemd
wordt, bedraagt dus voor dc eerste lenzencombinatie

De derde factor bedraagt 20, aangezien Vso c.M®. molk
onderzocht werd. Indien de melk vóór het aanleggen der
kleine-plaatculturen, b.v. 1:10, was verdund, moest voor
dezen factor dan ook 200 worden genomen, aangezien dan
slechts Vjoo c.M®. in dc kleine plaat verwerkt was.

Werden, om eens een voorbeeld te noemen, van een
melkmonster, dat zonder voorafgaande verdunning werd
onderzocht, in 10 microscopische gezichtsvelden van de
lenzencombinatie compensatie-oculair 4 en objectief A 54
koloniën geteld, dan bedroeg het aantal bacteriën per c.M».

Het zal nu duidelijk zijn, dat elke kolonie, per micro-
scopisch gezichtsveld waargenomen, overeenkomt met 20
maal de microscopische factor, vooropgesteld, dat de
melk vóór het onderzoek niet verdund is.

Om het aantal bacteriën per c.M». melk te bepalen,
werd, indien met zwakke vergrooting werd gekeken, d. i.
de vergrooting, verkregen met compensatie-oculair 4 en
objectief A, het gemiddeld aantal koloniën per micro-
scopisch gezichtsveld vermenigvuldigd met 20 X 138 =
2760, afgerond 2800, en bij gebruik maken van de sterke
vergrooting, d. i. de vergrooting, verkregen met com-
pensatie-oculair 4 en objectief D met 20 x 2500 = 50.000.

Het tellen der koloniën en het berekenen van het
bacterie-aantal kan ook geschieden met behulp van een
telrooster, d. i. een dekglas, dat door fijne lijnen in vier-
kantjes van 1 mM\\ is verdeeld. Dit dekglas wordt dan
met de verdeeling naar onderen droog op het preparaat
gelegd en de preparaten met de reeds beschreven lenzen-
combinaties bekeken. Het zal zonder meer duidelijk zijn,
dat het gemiddeld aantal koloniën per ruitje, dus per

vermenigvuldigd wordt, is het aantal bacteriën, dat per
e.M». melk aanwezig is, bekend.

Met behulp van dit dekglas werden in meerdere prepa-
raten alle koloniën geteld, om te kunnen nagaan, hoeveel
velden moesten worden nagezien, indien van dit tel-
rooster geen gebruik werd gemaakt.

Door een inleidend onderzoek was nagegaan, of de
resultaten van de verschillende kleine-plaatculturen,
welke van één melkmonster waren aangelegd, sterk uit-
eenliepen, ten einde vast te stellen, hoe groot dit aantal
voor een nauwkeurige bepaling van het kiemcijfer der
melk moest zijn. Van een aantal melkmonsters waren
meerdere kleine-plaatculturen op verschillende voorwerp-
glazen aangelegd. Dit experiment, waarvan de resultaten
met die van Frost overeenstemden, leidde tot de con-
clusie, dat door het onderzoek in duplo, waarvoor dus
slechts één voorwerpglas noodig was, betrouwbare cijfers
werden verkregen.

RESULTATEN MET DE KLEINE-PLAATMETHODE
BIJ VERSCHILLENDE BROEDSTOOF-
TEMPERATUREN VERKREGEN.

Nadat was nagegaan, welke controle-methode voor de
beoordeeling van de uitkomsten der kleine-plaatcul-
turen moest worden toegepast, werd een aantal melk-
monsters vergelijkend onderzocht. De kleine-plaatme-
thode werd hierbij uitgevoerd op de wijze, als in het
vorige hoofdstuk is uiteengezet, waarbij echter de aan-
gelegde plaatjes in een broedstoof van 37° C. werden
geplaatst, terwijl ter controle tegelijkertijd van 3 ver-
dunningen van dezelfde melk, t.w. l : 100, 1 :1000 en
1 : 10.000, twee agarplaten werden gegoten, welke ge-
durende minstens 5 dagen bij 22° C. werden bewaard.
Het instellen dezer controle-proef geschiedde volgens de
beschrijving, in hoofdstuk III aangegeven.

Aangezien mij ter beoordeeling der methode het onder-
zoek van kiemarme monsters het meest gewenscht voor-
kwam, werd de te onderzoeken melk betrokken van
inrichtingen, waar meerdere zorg aan dc winning en
behandeling werd besteed. Tevens bracht mij het groote

belang, dat het quantitatief bacteriologisch onderzoek
van deze soort mélk heeft, en omdat daarvoor door den
Codex Alimentarius een maximum toelaatbaar aantal
kiemen van 50.000 per c.M®. is opgegeven, op deze keuze.
Het bleek reeds spoedig bij onderzoek van gewone han-
delsmelk, dat hierbij de bacteriënrijkdom in den regel
zóó groot was, dat, alvorens de kleine-plaatculturen
aan te leggen, verdunningen moesten worden gemaakt.
Aan het onderzoek van deze kiemrijke melk is een apart
hoofdstuk gewijd.

Ten einde melk van verschillende herkomst te ver-
krijgen, werd deze van vier verschilllende plaatsen geno-
men, waarvan drie buiten Utrecht gelegen waren. Zooveel
mogelijk werd de melk direct na aankomst op het labo-
ratorium onderzocht, waarbij dient te worden opge-
merkt, dat deze een zeer verschillenden ouderdom bezat,
varieerende van enkele tot 36 uren. De monsters werden
genomen van November 1923 tot November 1024, waar-
door ook de temperatuur dezer melk wisselend was.
Meerdere malen werden eigenhandig genomen melk-
monsters en tevens gesteriliseerde melk onderzocht.

Van elk melkmonster werden 4 kleine-plaatculturen
op 2 voorwerpglazcn aangelegd, waarvan het eene gedu-
rende 15 en het andere 24 uur in de broedstoof werd
geplaatst. Werd een kortere incubatietijd genomen, b.v.
8 a 10 uur, dan waren in vele gevallen de koloniën zeer
onvoldoende ontwikkeld, terwijl na 24 uur dikwijls over-
groeiing van een der preparaten werd waargenomen.

Van elke kleine-plaatcultuur werden in 15 microsco-
pische gezichtsvelden de koloniën geteld, en zoodoende

het kiemcijfer bepaald, terwijl van de 2 preparaten op
één voorwerpglas het gemiddelde werd genomen. Op
deze wijze werden van elk melkmonster 2 gemiddelde
kiemcijfers verkregen, waarvan het hoogste in de hier-
onder te vermelden tabellen werd verwerkt.

Van den aanvang af heb ik mij op het standpunt
gesteld, dat voor de practijk van het melkonderzoek
de preparaten duidelijk en gem^ikkelijk afleesbaar moes-
ten zijn. Daarom werden de resultaten zooveel mogelijk
bij zwakke vergrooting afgelezen, terwijl alleen de duide-
lijk zichtbare, dus flink ontwikkelde koloniën werden
geteld. In vele preparaten waren, zelfs nadat ze 24 uur
en langer in de broedstoof waren geweest, meerdere zeer
kleine koloniën zichtbaar, welke alleen bij sterke ver-
grooting of met een olie-immersie als zoodanig te onder-
kennen waren en slechts uit enkele tientallen bacteriën
gevormd werden. Dergelijke koloniën werden om ge-
noemde reden niet in de telling opgenomen.

De gemiddelde kiemcijfers werden onder 10.000 in
100-tallen, daarboven tot 100.000 in 1000-tallen en boven
100.000 in 10.000-tallen afgerond, waarbij resp. 50, öOO
en 5000 of meer voor 100, 1000 en 10.(K)0 werden in
rekening gebracht, terwijl daar beneden deze cijfers wer-
den verwaarloosd.

In het geheel werden 189 monsters onderzocht. In tabel
.3a (zie blz. 80—82) zijn de gevallen verzameld, waarbij het
met behulp van de kleine-plaatmethode bepaalde kiem-
cijfer minstens 75 % bedroeg van het met de controle-
methode gevonden cijfer. Dit zijn dus de melkmonsters,
waarbij de uitkomsten betrouwbaar kunnen worden ge-

acht. Als laagste limiet werd 75 % gekozen en niet 100 %,
aangezien bij elke cidtureele methode van quantitatief
bacteriologisch melkonderzoek, wanneer dit in duplo ge-
schiedt, verschillen tusschen de diverse uitkomsten waar
te nemen zijn. Bij de agarplaatmethode komen dikwijls
zeer groote variaties tusschen de resultaten der ver-
schillende verdunningen voor, echter loopen de uitkom-
sten van 2 platen, welke van dezelfde verdunning zijn
aangelegd, in den regel niet zoover uiteen en blijft, het
verschil meestal beneden 25 %.

Van de 189 onderzochte melkmonsters bevatten er 12
volgens de controle-methode meer dan een millioen bac-
teriën per c.M». Hiervan kon in de kleine-plaatculturen het
kiemcijfer niet worden bepaald ten gevolge van de sterke
confluentie der koloniën. Bovendien was van 6 monsters
niet dan bij zeer grove benadering het bacterie-aantal
te bepalen, eensdeels door de sterke overgroeiing met
bacteriën, anderdeels door het optreden van infiltra-
tieven groei, waardoor geen duidelijke koh>niën waren
ontstaan. Van meerdere voorwerpglazen was een der
kleine-plaatculturen door overgroeiing moeilijk of niet
af te lezen. In deze gevallen werd alleen het resultaat
der niet overgroeide cultuur opgenomen. De oorzaak
van het overgroeien met bacteriën was enkele malen
gelegen in het niet tijdig steriliseeren van den incubator,
hetwelk om de 5 a 7 dagen dient te geschieden.

De resultaten van liet onderzoek der resteerende 171
monsters zijn in tabel 3a en 36 opgeteekend. Hiervan
vielen 67 onder tabel 3a, terwijl de overige 104 monsters
onder tabel 36 (zie blz. 83—86) moesten worden gerang-

schikt, waarin die melkmonsters zijn opgenomen, waarvan
het kiemcijfer, verkregen met de kleine-plaatmethode,
minder bedroeg dan 75 % van dat, verkregen met de
controle-methode.

Van de in tabel 3o gerangschikte melkmonsters varieert
de verhouding van de verkregen kiemcijfers volgens con-
trôle- en kleine-plaatmethode van 1: 6 tot 1:0,75, terwijl
de gemiddelde verhouding 1:1,11 is. Worden de nummers
4 en 63 buiten beschouwing gelaten, dan zijn deze ver-
houdingen respectievelijk 1 : 1,93. 1 : 0,75 en 1 : 1,04.

Van de 67 monsters geven 31 hoogere en 32 lagere
uitkomsten dan de controle-methode, terwijl van 4 de
resultaten gelijk zijn. De nummers 1 en 2 zijn gesterili-
seerde melkmonsters. (Het steriel blijven der kleine-plaat-
culturen is wel een bewijs, dat, indien vlug gewerkt
wordt, infectie tijdens het vervaardigen en broeden niet
behoeft op te treden).

In tabel 36 zijn de volgens beide methoden bepaalde
kiemcijfers veel meer uiteenloopend. We zien hier, dat
de verhoudingen varieeren van 1 :0,63 tot 1 :0,03, ter-
wijl de gemiddelde verhouding 1 : 0,26 is. Opvallend is,
dat 81 monsters, dus bijna 4/5 van het aantal in deze
tabel gerangschikte melkmonsters, overeenkomende met
47% van het totaal getabellcerde aantal, volgens de
kleine-plaatmethode onderzocht, minder dan de helft
van het kiemcijfer geven, dat bij de controle wordt ge-
vonden. De oorzaak van dit verschijnsel is te vinden in
de temperatuur van 37° C., welke voor verschillende
bacterie-soorten ongunstig genoemd moet worden. Do
bacteriën, welke hun optimum groeivoorwaarden bij deze

temperatuur hebben, groeien tot zeer groote koloniën
uit, terwijl de overige zich niet of onvoldoende ontwik-
kelen. Bovendien worden door de snel groeiende bac-
teriën de andere in hun ontwikkeling tegengehouden.
In vele preparaten bevinden zich naast meerdere groote
koloniën talrijke, die, met de olie-immersie bezien, slechts
nit enkele tientallen bacteriën bestaan. In andere prepa-
raten, waarin deze groote koloniën niet voorkomen, zijn
alle koloniën zeer slecht ontwikkeld. Ook een langer ver-
blijf in do broedstoof verandert hier weinig of niet aan dc
grootte. Zonder twijlel speelt de hooge temperatuur een
ongunstige rol, vooral als men bedenkt, dat in objectglas-
culturen, welke van hetzelfde melkmonster zijn aangelegd,
doch bij lagere temperatuur worden geplaatst, de bacteriën
aich tot flinke koloniën ontwikkelen.

De broedstooftemperatuur van 37° C. veroorzaakt nog
een ander nadeel. Door de snelle vorming van meerdere
groote koloniën ziet n>en veel z.g. „sproaders" optreden.
Nu maken enkele „spreaders" het aflezen niet (mmoge-
lijk; wanneer er echter vele gevormd zijn, wordt het
tellen der koloniën ten zeerste bemoeilijkt en moet met
een benadering van het aantal worden volstaan. Dit
bezwaar wordt geheel of gedeeltelijk ondervangen, indien
een kortere incnbatieduur, b.v. 8 a 10 uur, wordt geno-
men, doch dan is in vele gevallen het aantal goed ont-
wflckelde koloniën veel kleiner dan na ± uur, terwijl
meermalen de koloniën dan zóó klein zijn, dat bij zwakke
vergrooting niet kan worden geteld en bij sterke ver-
griH)ting de aflezing zeer moeilijk, zoo niet onmogelijk is.
Niettemin was in vele gevallen het resultaat reeds na

10 a 12 uur af te lezen, hetwelk dus een voordeel van
de gebruikte temperatuur genoemd mag worden.

Deresulmen,bij 37° C. hereikt, zijn dus onbevredigend,
omdat bij een groot aantal gevallen minder dan 75 % van
hel aantal kdonièn, dat hij de controle-methode optreedt,
wordt waargenotïien.

Van 195 melkmonsters werden 4 kleine-plaatculturen
aangelegd, waarvan 2 gedurende 15 uur en de overige
2 gedurende 24 uur in een broedstoof bij 22 °C. werden
gezet, terwijl het kiemcijfer werd bepaald op de onder A

Meestal werden dezelfde melkmonsters gebruikt, als
voor het onderzoek onder A aangegeven, waarbij van
hetzelfde melkmonster meerdere kleine-plaatcultureu
werden aangelegd, welke dan in diverse broedstoven met
verschillende temperaturen werden gebracht.

Van de 195 monsters bevatten 16 volgens de controle-
methode meer dan één millioen bacteriën per c.M».,
terwijl de betreffende kleine-plaatculturen zeer vele,
over het algemeen, kleine koloniën vertoonden. Boven-
dien was er sterke confluentie opgetreden, zoodat het
kiemcijfer slechts bij grove benadering kon worden vast-
gesteld, reden waarom deze monsters niet in de tabellen
werden opgenomen. In de kleine-plaatculturen, welke
van dezelfde melk werden aangelegd, echter bij 37° C.
in de broedstoof werden geplaatst, waren in meerdere
gevallen slechts enkele koloniën gevormd, terwijl het
overgroote deel der bacteriën niet tot koloniën was uit-

gegroeid. Dit verschijnsel iverd bij 22° C. niet waargenomen-,
in alle gevaUen was een ontelba<jir aantal koloniën gevormd.

Slechts van één melkmonster kon wegens sterke over-
groeiing en uitgebreiden infiltratieven groei der kleine-
plaatculturen het bacteriecijfer niet worden opgegeven,
ofschoon dit volgens de controle-methode slechts 23.000
bedroeg.

De resultaten der overige 178 monsters zijn in de tabellen
4a en 4& weergegeven. In tabel 4a (zie blz. 87—90) zijn de
melkmonsters verzameld, welke volgens de kleine-plaat-
methode een kiemcijfer aanwezen, dat minstens 75 % be-
droeg van het volgens de controle-methode aangegeven ge-
tal. Zooals men ziet, vallen iiieronder99 monsters, dus 56 %
van het totaal getabelleerde aantal. In de laatste kolom
dezer tabel zijn de verhoudingen aangegeven tusschen het
bacterie-aantal van dezelfde melk, volgens de controle- en
kleine-plaatmethode verkregen. Deze verhoudingen vari-
eeren van 1 : 5,50 tot 1 : 0,75 en de gemiddelde verhcni-
ding is 1 : 1,21. Indien de nummers 4,83 en 85, waarbij do
kleine-plaatmethode een overwegend grooter getal aanwijst
dan de controle-methode, buiten beschouwing blijven, dan
worden deze verhoudingen resp. 1 :2,54,1 :0^75 en 1 :1,08.

In tabel Ah (zio blz. 91—93) zijn de monsters onder-
gebracht, waarbij het aantal bacteriën, verkregen met
de kleine-plaatmethode, minder dan 75% van dat der
contrôle-mothode bedroeg. Hieronder vallen 79 monsters,
dus 44 % van het totale aantal. De verhoudingen der
volgens beide genoemde methoden verkregen kiemcijfers
varieeren hier van 1 :0,74 tot l : 0,09, terwijl de ge-
middelde verhouding is 1 :0,51.

Van 32 der onder de tabellen 4a en 4fe vallende mon-
sters is het bacterie-aantal, met de kleine-plaat vastge-
steld, minder dan de helft van het resultaat der controle-
methode. Dit komt overeen met 18 % van het totale aan-
tal. De uitkomsten, bij 22° C. met de objectglas-culturen
verkregen, komen dus meer met die der controle-methode
overeen, dan het geval is bij 37° C.

Over het algemeen waren de preparaten mooier dan
bq 37° C., aangezien minder overgroeiing en ook minder
infiltratieve groei werd waargenomen. De koloniën wa-
ren nu eens grooter, dan weer kleiner dan die, verkregen
bij een temperatuur van 37° C.

Een groot bezwaar, aan de temperatuur van 22° C.
verbonden, was, dat na 15 uur in vele gevallen de kolo-
niën nog zeer gering ontwikkeld waren, meerdere malen
zelfs nog na 24 uur. Hieruit moest het lage bacterie-
cijfer in deze gevallen verklaard worden, aangezien, zoo-
als reeds werd meegedeeld, alleen goed uitgegroeide kolo-
niën werden geteld.

Op grond van de vrij goede resultaten, bij 22° C. be-
reikt, werd in verband met den tragen groei, welke
hierbij dikwijls optrad, nagegaan, of door het gebruik
maken van een hoogere temperatuur dit bezwaar kon
worden opgeheven, terwijl de genoemde voordeelen bleven
bestaan. Te dien einde werden van een aantal van do-
zelfde monsters, als voor de beide vorige experimenten
gebruikt, kleine-plaatculturen aangelegd, welke bij 26° C.
en 30° C. werden gezet. De resultaten, bij deze tempera-
turen verkregen, worden onder C en D besproken.

vermelden, waarbij werd nagegaan, of bij een temperatuur
van 22° C. de kleine-plaatjes in plaats van met bouillon-
agar, met bouillon-gelatine konden worden gemaakt. De
reden, waarom dit werd onderzocht, was, dat gelatine
gemakkelijker en bij lagere temperatuur smelt, waardoor
de preparaten bij 20° a 25° C. zouden zijn te vervaardigen,
terwijl bovendien tijdens de menging met de melk op
de „warme tafel" geen last van stolling werd onder-
vonden. Aan den anderen kant duurde het echter zeer
lang, vóór het melkgelatine-mengsel goed gestold was.
Het grootste bezwaar echter, waardoor de gelatine prac-
tisch voor dit doel onbruikbaar werd, was, dat zeer
sterke infiltratieve groei optrad en geen duidelijke kolonie-
vorming. Van de 20 onderzochte melkmonsters werden
slechts in 8 gevallen goede preparaten verkregen, waar-
van het kolonie-aantal overeenkwam met dat van de
kleine-plaiitculturen, welke met agar waren gemaakt,
echter was in de overige 12 gevallen het resultaat on-
mogelijk af te lezen. Om deze reden werd van verdere
proefnemingen met gelatine afgezien.

Bij deze temperatuur werden 115 onderzoekingen ver-
richt, waarbij dezelfde melkmonsters werden gebruikt,
als onder A en B aangegeven. Van 12 dezer was het
kiemcijfer, blijkens de controle-methode, hooger dan een
millioen, zoodat om de reden, onder B genoemd, de resul-
taten niet in de desbetreffende tabellen werden onder-
gebracht. Met nadruk dient er op te worden gewezen,
dat in tegenstelling met de preparaten, welke bij 37° C.

werden geplaatst, in al deze gevallen overvloedige kolo-
nievorming was opgetreden. Voor de practijk van de
melkkeuring is deze quaestie van groot belang, aange-
zien met één blik in het microscoop kon worden vast-
gesteld, dat het kiemcijfer zeer hoog was. Wanneer het
betreffende monster z.g. modelmelk was, zou het niet
aan de hiervoor gestelde eischen voldoen.

In één monster, waarbij de controle-platen een bac-
terie-aantal van 25.000 aanwezen, waren in de kleine-
plaatculturen slechts enkele koloniën waarneembaar.
Deze slechte uitkomst werd veroorzaakt door het ont-
breken van water in den incubator, waardoor een onvol-
doende vochtigheidsgraad was ontstaan en de kleine
plaatjes waren uitgedroogd.

De resultaten der overige 102 melkmonsters zijn weer in
de bekende twee groepen verdeeld en in de tabellen 5a (zio
blz. 94—96) en 56 (zie blz. 97) vereenigd. Zooals men hieruit
kan aflezen, gaven 77 monsters, dus 75 % van het totaio
aantal, zeer goede uitkomsten. De verhoudingen van do
kiemcijfers, welke van dezelfde monsters, respectievelijk
<loor middel van de controle- en kleine-plaatmethode, wer-
den verkregen, varieerden van 1:14,17 tot 1 :0,75, terwijl
gemiddeld de verhouding 1:1,16 was. Indien de nummers
3 en 68, waarbij de kleine-plaatmethode zeer hooge uit-
komsten gaf, buiten beschouwing werden gelaten, waren
deze verhoudingen resp. 1 :3,21, 1 : 0,75 en 1 : 1,02.

In tabel 56 moesten 25 gevallen, overeenkomende nuit
25 % van het totaal getabelleerde aantal, worden onder-
gebracht. De bovengenoemde verhoudingen varieerdeu
van 1 : 0,70 tot 1 :0,10 en de gemiddelde verhouding

was 1 : 0,51. Slechts in 9 gevaUen, dus 9 % van het ge-
zamenlijke aantal, waren de bacteriecijfers, met de kleine-
plaatmethode verkregen, minder dan de helft van die,
welke met de controle-platen werden bereikt. De oorzaak
hiervan was zeer moeilijk, zoo niet onmogelijk, met zeker-
heid op te geven. Mogelijk was, dat in enkele gevallen
de voorwerpglazen na het steriliseeren onvoldoende wa-
ren afgekoeld, ofschoon hieraan voortdurend de noodige
aandacht was geschonken. Het leek me echter zeer
waarschijnlijk, dat met de agarplaten, bij de contrôler
methode gebruikt, hoogere uitkomsten werden verkregen,
doordat bij het aanleggen der verdunningen de melk
krachtig kon worden geschud, waardoor aan de samen-
geklonterde bacteriën betere gelegenheid werd gegeven\'
uiteen te vallen, dan dit bij het aanleggen der kleine-
plaatjes uit de onverdunde melk het geval kon zijn.
Dit nadeel werd vooral bij het onderzoek van ,,model-
melk" waargenomen.

Over het algemeen werden mooie preparaten verkre-
gen, waarbij zeer weinig overgroeiing en „spreaders"
werden waargenomen. De koloniën waren in den regel
grooter dan in de preparaten, welke bij 22° C. waren
bewaard, ofschoon in enkele gevallen juist het tegen-
overgestelde werd waargenomen. Toch waren in meerdere
preparaten, echter minder dan bij 22° C., nog vele kolo-
niën na 15 uur onvoldoende ontwikkeld.

Ofschoon bij 26° C. goede resultaten waren verkregen,
werd nagegaan, of door het opvoeren der temperatuur

tot 30° C. het bezwaar van de geringe ontwikkeling
der koloniën in enkele gevallen kon worden ondervan-
gen. Te dien einde werden van 28 melkmonsters kleine-
plaatculturen aangelegd, welke bij 30° C. in de broed-
stoof werden geplaatst. Gelijktijdig werden van dezelfde
monsters preparaten bij een of meer der reeds genoemde
temperaturen bewaard. Enkele monsters bezaten blijkens
de controle-methode meer dan een millioen bacteriën
en werden om reeds bekende redenen buiten beschou-
wing gelaten. Van de overige 24 werden de resultaten op
de bekende manier in tabelvorm gebracht, waarbij bleek,
dat 19 monsters (tabel 6a, zie blz. 98), dus 79 % van het
totale aantal, volgens de kleine-plaatmethode, een kiem-
cijfer hadden, hetwelk minstens 75 % bedroeg van het
door de controle-methode aangewezen getal. De verhou-
dingen varieerden hier van 1 : 1,71 tot 1 :0,75, terwijl
de gemiddelde verhouding 1 :1,07 was. Van 5 monsters
(tabel 66, zie blz. 99) was het kiemcijfer minder dan 75 %
van hetgeen door de controle-methode werd aangegeven,
terwijl dit in geen enkel geval onder 50 % bedroeg.

We zien hieruit, dat, evenals bij 22° C., een goede
overeenstemming met de contróle-platen bestond.

Er werden mooie preparaten verkregen, waarin de
koloniën over het algemeen flink ontwikkeld waren, of-
schoon in enkele, naast groote, ook zeer kleine koloniën
voorkwamen. Hoewel in voel geringere mate, trad dus
hetzelfde nadeel op, als bij 37° C. Ook werd, sterker
dan dit bij 26° C. het geval was, vorming van „spreaders"
waargenomen. Daartegenover stond, dat de koloniën over
het algemeen zich bij 30° C. beter ontwikkelden,zoodat in

Het blijkt dus, dat, voor Jiet verkrijgen van een zoo groot
mogelijk aantal kohnièn, dat hovendien duidelijk afleesbaar is,
een temperatuur wenschdijk is, gelegen tusschen, 26° en 30° (7.

De verdere onderzoekingen zijn dan ook steeds bij
28° C. verricht. De resultaten, hierbij verkregen, kwamen
met die der beide vorige onderzoekingsreeksen overeen.

Zooals reeds in hoofdstuk IV werd meegedeeld, werden
door het onderzoek in duplo betrouwbare kiemcijfers ver-
kregen. De uitkomsten van kleine-plaatculturen, welke
van dezelfde melk waren aangelegd, liepen nogal eens
uiteen. Dc oorzaak hiervan was, dat niet steeds op elk
vierkant precies een even groot quantum melk gebracht
werd, terwijl bovendien de bacteriën niet altijd gelijk-
matig in de melk verdeeld waren. De gemiddelde bac-
teriecijfers, van meerdere onderzoekingen in duplo ver-
kregen, liepen in den regel niet ver uiteen. De onderlinge
variaties waren geringer dan die, welke tusschen verschil-
lende contróle-platen optraden. Zelden was het verschil
tusschen bovengenoemde gemiddelden grooter dan 25 %.

Van elk melkmonster werd dus 0,1 c.M®. in de kleine-
plaatjes verwerkt, terwijl bij de contróle-methode deze
hoeveelheid veel geringer was. Dit moet een groot voor-
«leel van de kleine-plaatmethode genoemd worden, aan-
gezien hierdoor de kans, dat het gevonden kiemcijfer
overeenkomt met het werkelijke aantal bacteriën in do
melk, veel grooter is, dan bij de agarplaatmethode.
Men moet hierbij echter wel rekening houden met het
feit, dat elke cultureele bepaling van den bacteriën-
rijkdom der melk een approximatieve is.

24.000
25.000
25.000
25.000
28.000
28.000
29.000
29.000
32.000
33.000
35.000
38.000
39.000
46.000
48.000
51.000
64.000
80.000
170.0(M)
350.000
380.000
390.000
450.00()
530.000
670.000
13.000
16.000
7.000
15.000
11.000
9.800
21.000
5.800
19.000
23.000
23.000
20.000
25.000
27.0(M)
29.000
11.000
30.000
51.000
ö(».000
190.000
110.(H)0
210.000
320.000
330.000
260.000

154.

155.

156.

157.

158.

159.

160.
161.
162.

163.

164.

165.

166.

167.

168.

169.

170.

171.

172.

173.

174.

175.

176.

177.

178.

6.500
7.600
7.600
7.900
8.600
8.700
10.000
10.000
10.000
11.000
11.000
12.(){)0
12.000
13.000
14.000
15.000
16.(M)0
17.000
17.000
18.000
18.(M)0
19,000
10.(M)0
2ü.0(M)
20.(MM)
21.0(M)
21.000
24.(KH)
6.200
7.500
6.300
9.800
9.000
12.000
17.000
13.000
8.700
9.300
11.000
20.000
15.000
13.000
15.000
12.000
12.000
15.000
19.(MH)
20.iM)0
17.000
2l.0(K)
17.(HM)
26.000
15.000
• 29.1M)0
16.000
34.000

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.
30.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.
4K.
4».

50.

51.

52.

Nadat was nagegaan, bij welke broedstooftemperatuur
met de kleine-plaatmethode de beste resultaten werden
bereikt, was het van groot belang vast te stellen, ge-
durende welken tijd de kleine-plaatjes in de broedstoof
moesten blijven, ten einde het maximum aantal bacte-
riën tot koloniën te doen uitgroeien, die met de zwakke
vergrooting van het microscoop zichtbaar waren.

Ten einde een indruk te verkrijgen omtrent den tijd,
waarbinnen de bacteriën in de kleine-plaatculturen zich
tot koloniën ontwikkelden, werden van verschillende
melkmonsters meerdere preparaten vervaardigd, welke
gelijktijdig in een broedstoof bij 28° C. werden geplaatst.
Tot een incubatieduur van 24 uur werd om de 2 uur één
voorwerpglas, waarop dus 2 kleine-plaatculturen aan-
wezig waren, uit de broedstoof genomen en werden ver-
volgens deze preparaten gedroogd en gekleurd. Van elk
op deze wijze behandeld melkmonster bleven daarna
nog 2 kleine-plaatculturen in duplo over, welke respec-
tievelijk 30 en 48 uur bij 28° C. werden gelaten.»)

♦) Collega W. Treffers was zoo vriendelyk gedurende den nacht om de
twee uur een voorwerpglas uit den incubator te nemen en daarna to drogen.

hierboven beschreven wijze onderzocht. De ouderdom
van de onder A en C genoemde melk was bekend en
varieerde bij den aanvang van het onderzoek van ^ tot
3 uur, gedurende welken tijd de monsters bij ± 15° C.
werden bewaard. Van de „modelmelk", waaronder dient
te worden verstaan melk, welke in gesloten flesschen
van z.g. modelinrichtingen werd verkregen, was de ouder-
dom niet bekend, maar bedroeg tijdens het onderzoek
naar schatting minstens 16 uur. Bovendien was niet
bekend, of deze melk in steriel vaatwerk gewonnen was.

De resultaten, welke met de onder A genoemde melk
monsters werden bereikt, kwamen, wat de ontwikkelings-
snelheid der bacteriën betrof, met elkaar overeen. De
bacteriënrijkdom varieerde, volgens de controle-methode,
van 1000 tot 8000 per c.M\'. In de eerste 3 preparaten,
welke dus resp. 2, 4 en 6 uren in de broedstoof waren
geweest, was geen spoor van kolonie-ontwikkeling waar
te nemen. Na 8 en 10 uur waren enkele koloniën, be-
staande uit meerdere 10- tot 100-tallen bacteriën, ge-
vormd. Na 12 en 14 uur waren meerdere kleine en groote
koloniën zichtbaar, terwijl de tijd, waarna de preparaten
met de kleine vergrooting konden worden afgelezen,
varieerde van 16 tot 20 uur. De bacteriecijfers, welke
na deze incubatietijden werden verkregen, kwamen over-
een met die, welke na längeren broedtijd werden bepaald,
en met die, welke door de controle-platen werden aan-

gegeven. De grootte der koloniën nam echter na langere
broedtijden geregeld toe.

In de kleine-plaatjes, welke van de „modelmelk" waren
aangelegd, hadden zich na een verblijf van 2 uur in de
broedstoof geen koloniën gevormd. Na 4 uur waren
slechts enkele koloniën zichtbaar, welke uit enkele 10-
tot lOO-taÜen bacteriën bestonden. Na 6 en 8 uur hadden
zich meerdere, iets grootere koloniën ontwikkeld, terwijl
na längeren incubatietijd het aantal, met de kleine ver-
grooting waarneembare, koloniën allengs toenam. Na 14
ä 16 uur was geen vermeerdering van dit aantal meer
waar te nemen. Wel nam de grootte der koloniën tot
een broedtijd van 24 a 30 uur geregeld toe. Nog zij
opgemerkt, dat de bacteriënrijkdom van deze monsters
„modelmelk" varieerde van 15.000 tot 70.000 en dat de
ontwikkelingssnelheid grooter was, naarmate zich meer
bacteriën in de melk bevonden.

De melkmonsters, onder C genoemd, kwamen, wat de
winning betrof, het meest met de gewone handelsmelk
overeen en bezaten een bacteriënrijkdom, varieerende van
90.000—^200.000 per c.M®. De bereikte resultaten weken
sterk af van die, welke met de onder A en B aangegeven
soorten werden verkregen. Reeds nadat de preparaten
2 uur in de broedstoof waren geweest, hadden zich meer-
dere kleine koloniën gevormd, welke uit meerdere 10- tot
100-tallen bacteriën bestonden. Na een broedtijd van 4
uur was het aantal — alsmede de grootte — der gevormde
koloniën aanzienlijk toegenomen, ter\\vijl na 6 a 8 uur
reeds een indruk van den bacteriënrijkdom der melk kon
worden verkregen, ofschoon de meeste koloniën nog zeer

klein waren. De omvang der koloniën werd na längeren
broedtijd grooter, zoodat na ± 12 uur de telling gemakke-
lijk kon geschieden. In de preparaten, welke langer dan
12 uur in de broedstoof gehouden werden, nam de
grootte der koloniën slechts weinig toe, terwijl geen ver-
meerdering van het aantal werd waargenomen.

Zooals reeds medegedeeld, werd deze proef genomen,
ten einde een idee te verkrijgen omtrent de snelheid,
waarmede de bacteriën tot koloniën uitgroeiden. Ik ben
er mij ten volle van bewust, dat op grond van dit experi-
ment geen conclusies te trekken zijn voor den minumum
incubatietijd van de verschillende melkmonsters, aange-
zien meerdere factoren hierop van invloed zijn. Ter be-
antwoording van de vele vragen, welke in verband met de
ontwikkeling van bacteriën in melk kunnen worden ge-
steld, zal een uitgebreid onderzoek noodzakelijk zijn.

Voor de practijk van het quantitatief bacteriologisch
melkonderzoek was het echter van zeer groote beteekenis
na te gaan, of binnen 24 uur na het onderzoek alle bacte-
riën zich tot, met de kleine vergrooting van hot micro-
scoop waarneembare, koloniën hadden ontwikkeld, m.a.w.
of na een längeren incubatietijd een hooger bacteriecijfer
werd verkregen.

To dien einde worden van ö6 melkmonsters 3 prepara-
ten in duplo vervaardigd, welke respectievelijk gedurende
15, 20 d 24 en 45 a 48 uur in een broedstoof bij 28° C.
werden gehouden. De melkmonsters waren van zeer ver-
schillende herkomst. Een gedeelte van deze monsters was
in een steriele glaskolf gewonnen, terwijl een ander ge-

deelte in niet-steriel vaatwerk was opgevangen. Ook wer-
den verschillende monsters „modelmelk" voor dit onder-
zoek gebruikt. In 45 der onderzochte gevallen werden
controleplaten gegoten. De resultaten van dit onderzoek
zijn in tabel 7a (zie blz. 108—109) weergegeven. Zooals
men hierop ziet, kwamen de bacteriecijfers, welke na de
verschillende incubatietijden werden verkregen, met elkaar
overeen, terwijl een bevredigende overeenstemming met de
uitkomsten der controleplaten werd waargenomen. De ver-
schillen tusschen de resultaten na de diverse broedtijden
bleven binnen de grenzen der nauwkeurigheid van de
methode. De omvang der koloniën nam bij toepassing
van een längeren incubatietijd dan 15 uur aanzienlijk
toe. In mindere mate was dit het geval bij de preparaten,
welke van de op niet-steriele wijze gewonnen melk waren
aangelegd. Over het algemeen vond bij een längeren
incubatietijd dan 24 uur de toename in grootte der kolo-
niën langzamer plaats. De lagere uitkomsten in de ge-
vallen 14,20, 24 en 29, na een broedtijd van 15 uur ver-
kregen, moeten waarschijnlijk hierdoor verklaard worden,
dat verschillende koloniën nog zóó klein waren, dat ze
met de zwakke vergrooting van het microscoop niet wer-
den opgemerkt.

Behalve bovengenoemde melkmonsters werden nog 29
monsters handelsmelk van diverse herkomst mot het-
zelfde doel onderzocht. In hoofdstuk VII wordt omtrent
het onderzoek van dezo melk uitvoerig mededeeling
gedaan. Alvorens de klcine-plaatculturen aan te leggen,
moesten verdunningen van de melk worden aangelegd.
Van elk melkmonster werden 2 preparaten in duplo ver-

vaardigd, welke respectievelijk gedurende 15 en 45 uur
in een broedstoof bij 28° C. werden geplaatst. De incubatie-
tijd van 20—^24 uur werd achterwege gelaten, aangezien
door verschiUende onderzoekingen was gebleken, dat de
op deze wijze verkregen bacteriecijfers overeenstemden
met die, welke na een broedtijd van 15 uur werden
verkregen. Voor de verdunning der melk werden zoowel
ontroomde melk als pepton-keukenzoutoplossing gebruikt.
De resultaten, welke met deze verdunningsvloeistoffen
werden verkregen, stemden goed met elkaar overeen.

In tabel 76 (zie blz. 110) zijn de uitkomsten onder-
gebracht, welke na de verschillende incubatietijden
werden afgelezen. De cijfers zijn overgenomen uit
tabel 8c (zie blz. 126), waarbij dient te worden opge-
merkt, dat van de monsters, welke in tabel 76 met de
nos. 1 t/m 16 zijn aangegeven, de resultaten der 1 op
10 verdunningen en van de overige, die der 1 op 100
verdunningen, werden overgenomen. Uit tabel 76 blijkt
duidelijk, dat er een goede overeenstemming bestond
tusschen de bacteriecijfers, welke na een broedtijd van
15 en 45 uur werden verkregen. Opvallend was, dat
"«I 15 uur in allo gevallen de koloniën flink ontwikkeld
waren, terwijl na een incubatietijd van 45 uur een geringe
toename in grootte viel waar to nemen.

Na een broedtijd van 45—48 uur waren dc preparaten
över het algemeen minder gemakkelijk afleesbaar, dan
Wanneer een broedtijd van 15, resp. 20—24 uur word toe-
Repast. Dit gold zoowol voor dc melkmonsters in tabel 7a
^ds voor die in tabel 86. Na een verblijf der kleine-plaatjes
\'15—(8 uur in dc broedstoof, waren vele koloniën

geconilueerd, terwijl meerdere malen overgroeiing met
bacteriën werd waargenomen. Om deze redenen konden
de koloniën in vele gevallen niet nauwkeurig worden ge-
teld en moest met een benadering van het bacteriecijfer
worden volstaan, terwijl in enkele gevallen de preparaten
onbruikbaar waren (tabel la nos. 48,51 en 56).

Opvallend was, dat in meerdere kleine-plaatculturen,
ook na een incubatietijd van 45—48 uur, kleine koloniën
werden waargenomen. Ter verklaring van dit verschijnsel
kwamen m. i. 3 mogelijkheden in aanmerking. 1°. De
broedstooftemperatuur van 28° C. was voor de bacteriën,
waaruit deze koloniën gevormd werden, niet gunstig.
2°. De samenstelling van het voedingsmedium was voor
deze bacteriën niet de gewenschte. 3°. Het aantal kolo-
niën in één kleine plaat was zeer groot, zoodat een geringe
afstand tusschen de koloniën onderling bestond. Deze
laatste mogelijkheid geldt natuurlijk alleen voor de kiem-
rijke monsters. Ook bij de Kocn\'sche plaatmethode is bij
het voorkomen van een groot aantal koloniën op één
plaat de omvang der koloniën kleiner, dan wanneer een
klein aantal zich hierop ontwikkelt.

Een merkwaardig verschijnsel, dat vooral na langere
broedtijden werd waargenomen, was, dat zich aan de
peripherie van enkele koloniën een krans van kleine
koloniën ontwikkeld had.

Deze froeinemingen, zoowd als die, in de JioofdstuJcJcen
V en Vn vermeld, leeren, dat over het algemeen na een
incubatietijd van 15 uur betrouwbare resultaten worden
verkregen, terwijl na 20—24 uur in alle gevallen de pre-

faratm gemalckdijk kunnen worden afgelezen. Voor het
onderzoek van kiemrijke, in niet-sterid vaatwerk gewonnen
mdk kan misschien met een broedtijd van 10 d 12 uur
worden volstaan.

In de practijk zal dus é&n dag na inlevering van de
melkmonsters het kiemgetal hekend zijn, terwijl hij de
methode, wdke in den Codex Alimentarius voor het quan-
titatief hacteriologisch mdkondjerzoek is opgegeven, hiervoor
5 dagen noodig zijn.

De oorspronkelijke opgave van Frost, waarhij 8 uur
broeden hij 37° C. voldoende wordt geacht, zal voor prac-
tische toepassing in de hand van laboranten tot mis-
wijzingen leiden.

12.000
13.000
15.000
15.000
16.000
17.000
18.000
21.000
26.000
26.000
33.000
38.000
40.000
40.000
46.000
53.000
56.000
56.000
64.000
71.000
75.000
92.000
100.000
100.000
120.000
130.000
160.000
190.000
550.000
10.000
7.800
13.000
18.000
14.000
11.000
12.000
17.000
16.000
27.000
35.000
28.000
32.000
32.000
28.000
40.000
41.000
31.000
61.000
65.000
66.000
96.000
76.000
86.000
160.000
110.000
210.000
150.000
230.000
12.000
11.000
12.000
21.000
14.000
15.000
11.000
17.000
16.000
29.000
34.000
33.000
30.000
33.000
30.000
44.000
43.000
33.000
66.000
79.000
79.000
90.000
70.000
90.000
140.000
100.000
180.000
150.000
240.000

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

8.700
14.000
12.000
16.000
14.000
18.000
14.000
15.000
18.000
28.000
30.000
30.000
32.000
32.000
33.000
46.000
45.000
34.000
60.000
84.000
onbruikbaar
80.000
60.000
onbruikbaar
100.000
100.000
170.000
150.000
onbruikbaar

ONDERZOEK VAN KIEMRIJKE MELK
MET BEHULP VAN DE KLEINE-
PLAATCULTUREN BIJ 28° C.

Bij onderzoek van kiemrijke melk is het noodig deze te
verdunnen, alvorens de kleine-plaatculturen aan te leg-
gen. In preparaten, van deze melk in onverdunden toe-
stand vervaardigd, wordt een ontelbaar aantal meestal
zeer kleine koloniën gevormd, welke bovendien meer of
minder sterk cpnflueeren. Om deze redenen is het aantal
koloniën in deze culturen niet nauwkeurig te bepalen.

Een aantal kiemrijke melkmonsters werd onderzocht,
bij welk onderzoek verdunningen met verschillende vloei-
stoffen werden aangelegd. Ten einde voor dit onderzoek
melk van zeer uiteenloopende herkomst te verkrijgen,
werden deze bij verschillende melkverkoopers aan huis
gehaald, terwijl tevens van meerdere slijters op straat
melk gekocht werd. Steeds werd er voor gezorgd, dat het
vaatwerk, waarin de melk werd ontvangen, van te voren

Deze melk werd goed dooreengemengd, waarna 1 c.M®.
hiervan gebracht werd in een met een steriele kurk afge-
sloten, steriele buis, waarin zich 9 c.M®. steriele verdun-
ningsvloeistof bevond. Na krachtig schudden werden van
deze verdunning op de gebruikelijke manier kleine-plaat-
culturen aangelegd. Van de meeste onderzochte melk-

monsters werden tevens verdunningen 1 :100 gemaakt,
door 1 C.M3. van de 1:10 verdunde melk in een nieuwe
hoeveelheid van 9 c.M?. steriele verdunningsvloeistof te
brengen.

Verschillende vloeistoffen werden op hun bruikbaar-
heid voor het verdunnen van melk onderzocht, t. w.
mißlk, bouillon, 1 % druivensuikerbouülon, 1 % melk-
suikerbouillon, pepton-keukenzoutoplossing en physio-
logische keukenzoutoplossing. Het bleek bij onderzoek
van een 4-tal melkmonsters, waarbij verdunningen met
al deze vloeistoffen werden gemaakt, dat in alle ge-
vallen goede ontwikkeling der koloniën in de kleine-plaat-
culturen was waar te nemen. Physiologische keukenzout-
oplossing voldeed niet zoo goed als pepton-keukenzout-
oplossing, aangezien de koloniën in de onderzochte ge-
vallen niet zoo groot waren, als wanneer laatstgenoemde

Aangezien van de hierboven aangegeven vloeistoffen
de pepton-keukenzoutoplossing het gemakkelijkst te be-
reiden en bovendien het goedkoopst was, werd bij de
volgende onderzoekingen in alle gevallen naast steriele
melk ook deze vloeistof voor het aanleggen der verdun-
ningen gebruikt, ten einde na te gaan, of overeenstem-
mende resultaten werden bereikt en dus de melk als ver-
dunningsvloeistof door pepton-keukenzoutoplossing kon
worden vervangen. De reden, waarom dit werd onder-
zocht, was, dat verschillende bezwaren aan het gebruik
van melk voor dit doel verbonden zijn. 1°. Ter verkrijging
van een steriele vloeistof moet de melk 3 achtereen-
volgende dagen gedurende een kwartier op 100° C. worden

verhit. 2°. Bij het schudden, na het vermengen van de te
onderzoeken melk met de gesteriliseerde melk, worden
schuim en boterbolletjes gevormd. 3°. Bij het bewaren
van de gesteriliseerde melk vormt zich aan de opper-
vlakte een roomlaag. Dit laatste bezwaar werd grooten-
deels ondervangen door ontroomde melk te gebruiken.
De pepton-keukenzoutoplossing, welke 1 % pepton (Witte)
en 1 % keukenzout bevatte, werd door eenmalige ver-
warming gedurende een half uur op 100° C. gesteriliseerd.
Na vermenging met melk kon zonder bezwaar krachtig
worden geschud, terwijl de oplossing zeer lang kon worden
bewaard, zonder veranderingen te vertoonen. Bovendien
was deze vloeistof goedkooper te verkrijgen dan melk.

Van elk melkmonster werden dus verdunnmgen van
1 op 10, en meestal ook van 1 op 100, in steriele ont-
roomde melk en in steriele pepton-keukenzoutoplossmg
gemaakt. Van elke verdunning werden 2 kleine-plaat-
culturen in duplo aangelegd, waarvan de eene gedurende
15 uur en de andere 45 uur in een broedstoof van 28 C.
werd geplaatst. Om het aantal bacteriën per c.M®. melk
te bepalen moest, indien het preparaat met de zwakke
vergrooting werd bezien (d.i. de vergrooting, verkregen
met comp. oc. 4 en obj. A), het gemiddeld aantal koloniën
per microscopisch gezichtsveld vermenigvuldigd worden
met 10 X 2800 = 28.000 of 100 X 2800 = 280.000, al
naar het preparaat vervaardigd was van een verdunnmg
1 op 10 of 1 op 100. Bij gebruik der sterke vergrootmg
(d.i. de vergrooting, verkregen met comp. oc. 4 en obj. D)
moest dit worden vermenigvuldigd met respectievelijk
10 X 50.000 = 500.000 en 100 X 50.000 = 5.000.000.

Zooveel mogelijk werden de koloniën met behulp van de
zwakke vergrooting geteld.

Bovendien werden van de onverdunde melk 2 kleine-
plaatculturen in duplo aangelegd. Een hiervan werd zon-
der verblijf in de broedstoof, na stolling van het melk-
agarmengsel, direct gedroogd en gekleurd, ten einde een
denkbeeld te krijgen omtrent de groepjesvorming der
bacteriën in de melk. De andere werd gedurende 15 uur
bij 28° weggezet.

Van elk melkmonster werden, ter controle van de uit-
komsten der kleine-plaatculturen, agarplaten in duplo
gegoten van verschillende verdunningen, t.w. 1 : 1000,
1 : 10.000 en 1 : 100.000.

De resultaten van het onderzoek der kiemrijke melk-
monsters werden voor een duidelijk overzicht in verschil-
lende tabellen weergegeven.

In tabel 8a (zie blz. 124) zijn de resultaten neergelegd
van het onderzoek naar de groepjesvorming der bacteriën
in de melk, benevens van de uitkomsten der kleine-
plaatculturen, welke van deze melk in onverdunden toe-
stand waren aangelegd.

Met behulp van een olie-immersie Via" werd van 34
preparaten in duplo de verspreiding der bacteriën nage-
gaan. Onder een bacterie-groepje werd een opeenhooping
van meerdere tientallen of meer bacteriën verstaan.
Samenvoegingen van enkele bacteriën werden niet in de
tabel opgenomen. Deze kwamen in nagenoeg alle melk-

monsters voor, hoewel bij nos. 1 en 2 slechts zeer weinige.
Werden in een kleine-plaat slechts enkele groepjes waar-
genomen, dan werd van weinig bacterie-groepjes gespro-
ken. Indien om de 2 a 3 microscopische gezichtsvelden
een groepje werd gezien, dan werd dit in de tabel met
meerdere groepjes aangegeven, terwijl bij het voorkomen
van deze groepjes in bijna elk gezichtsveld van vde
groepjes gesproken werd. Het aantal micro-organismen,
waaruit deze groepjes waren samengesteld, liep zeer uit-
een en varieerde van enkele 10- tot meerdere 100-tallen,
terwijl geen verband viel op te merken tusschen dit
aantal en de bacteriënrijkdom der melk. Bedroeg het
aantal bacteriën per c.M». melk minder dan 300.000, dan
werden geen of weinig groepjes waargenomen, terwijl bij
een kiemcijfer van 2.700.000 en hooger altijd vele werden
gezien. Bij melkmonsters met een kiemaantal, vaneerende
van 650.000 tot 2.700.000, was de groepjesvorming der
bacteriën zeer verschiUend. Terwijl bij nos. 9 en 11 met
een bacterie-aantal van resp. 890.000 en 1.140.000 geen
groepjes werden gezien, waren er bij nos. 8 en 10, waarbij
dit aantal resp. 880.000 en 950.000 bedroeg, vele waar-
genomen. Terloops zij nog opgemerkt, dat in de prepara-
ten van nos. 34 zeer vele lange, losliggende Streptococcen
aanwezig waren.

Over het algemeen was in de preparaten, welke van de
onverdunde melk waren vervaardigd, meer of minder

sterke confluentie der koloniën opgetreden, waardoor
het bacteriegehalte slechts bij grove benadering was aan
te geven.

De melkmonsters, in tabel 8a onder nos. 1, 2 en 3
aangegeven, waarbij het kiemcijfer volgens de controle-
methode resp. 46.000, 120.000 en 130.000 bedroeg, ver-
toonden geen confluentie der koloniën in de kleine-plaat-
culturen, terwijl de resultaten der kleine-plaatmethode
overeenstemden met die der controle-methode. In 6
gevallen was het aantal koloniën in de kleine-plaatjes
wegens de uitgebreide confluentie niet te schatten.

Opmerkelijk was het varieerende aspect der koloniën
in de verschillende preparaten. In de meeste gevallen
waren deze zeer gering ontwikkeld en was hierdoor, als-
mede door de confluentie, het aantal niet nauwkeurig te
bepalen. Daartegenover stond, dat in meerdere kleine-
plaatjes de koloniën zich flink ontwikkeld hadden. Dat
hierbij het bacteriecijfer niet nauwkeurig was op te geven,
werd of veroorzaakt door de confluentie alleen, of doordat
bovendien naast de groote koloniën zich vele zeer kleine
gevormd hadden.

Uit de tabel ziet men, dat in de gevallen, waarbij het
aantal bacteriën volgens de controle-methode 200.000 of
meer bedroeg, door de kleine-plaatculturen der onver-
dunde melk geen betrouwbare resultaten werden ver-
kregen.

Het is zeer moeilijk een minimum bacteriegchalte aan
te geven, waarbij in aUe gevallen de melk moet worden
verdund. Volgens Frost dient dit minimum op 1.000.000
te worden gesteld. Het hierboven vermeld onderzoek

leert echter, dat het gewenscht is reeds bij een bacterie-
cijfer van 200.000 verdunningen aan te leggen, hoewel
moet worden toegegeven, dat in verschillende gevallen,
waarbij het kiemcijfer hooger is dan 200.000, door
middel van de kleine-plaatculturen en met de contróle-
methode overeenstemmende cijfers worden verkregen.

In tabel 86 (zie blz. 125) zijn de resultaten weergegeven,
welke met de kleine-plaatculturen van de met ontroomde
meZA verdunde melkmonsters werden bereikt. Zooals men
ziet, werden zoowel verdunningen van 1:10 als van 1:100 ^
aangelegd. Ten einde na te gaan, of na een verblijf der
preparaten van 15 uur in de broedstoof het maximum
aantal koloniën tot ontwikkeling was gekomen, werden
van de meeste melkmonsters kleine-plaatculturen aan-
gelegd, welke 15 en 45 uur in de broedstoof werden ge-
plaatst.

Wanneer men tabel 86 aandachtig beschouwt, dan is
het opvallend, dat in de preparaten, welke van de sterkste
verdunning (1 : 100) zijn aangelegd, de hoogste bacterie-
cijfers worden afgelezen. Voor de melkmonsters, waarvan
in de kleine-plaatculturen van de verdunning 1:10 een
zeer groot aantal, deels geconflueerde koloniën ontwik-
keld waren, was dit begrijpelijk, aangezien voor een
nauwkeurige waarneming sterkere verdunningen behoor-
den te worden gebruikt. Voor de melkmonsters echter,
waarbij een relatief laag kiemcijfer werd waargenomen,

moest de oorzaak worden gezocht in de verdunning.
Hetzelfde verschijnsel werd waargenomen bij de controle-
platen, welke van verschillende verdunningen waren
aangelegd. Ook hierbij gaven de sterkste verdunningen
over het algemeen de hoogste uitkomsten. Deze omstan-
digheid mag bij het vergelijken van kleine- en groote-
plaatmethode dus niet ten nadeele van de eerste in de
schaal worden geworpen.

De resultaten der kleine-plaatjes, welke 45 uur in de
broedstoof waren geweest, stemden overeen met die,
welke na een incubatietijd van 15 uur werden verkregen.
In deze laatste preparaten waren de koloniën goed ont-
wikkeld en hoewel na een broedtijd van 45 uur over het
algemeen de grootte weinig was toegenomen, kon toch in
vele gevallen worden waargenomen, dat enkele koloniën
aanzienlijk grooter waren geworden, waardoor confluen-
tie was opgetreden en het aantal niet nauwkeurig kon
worden bepaald. Tevens werd opgemerkt, dat in enkele
preparaten ook na 45 uur kleine koloniën voorkwamen.
In enkele gevallen waren de kleine-plaatjes na 45 uur
met bacteriën overgroeid, waardoor de aflezing bemoei-
lijkt werd.

Van de 34 onderzochte melkmonsters werden in alle
gevallen verdunningen 1 :10 aangelegd. In de eerste 21
gevallen, waarbij het bacteriecijfer volgens de controle-
methode minder dan 2.900.000 bedroeg, werden door de
kleine-plaatculturen vrij wel hiermede overeenstemmende
getallen aangegeven, alleen de nos. 12 en 16 gaven nogal
belangrijke verschillen te zien. De oorzaak van de hoogere
uitkomsten in de controle-platen is m. i. gelegen in de

In de melkmonsters, onder nos. 22 tot en met 34 aan-
gegeven, varieerde het kiemcijfer volgens de controle-
methode van 2.900.000 tot ± 140.000.000. In deze 13 ge-
vallen werden met de kleine-plaatculturen van de 1 op
10 verdunde melk aanzienlijk lagere uitkomsten verkre-
gen om dezelfde redenen, als dit bij de preparaten der
onverdunde melk het geval was. Een uitzondering werd
door no. 23 gevormd, waarbij de resultaten overeen-
stemden met die van de contróle-platen. De kleine-plaat-
culturen, van de verdunning, 1:100 aangelegd, waren veel
beter afleesbaar, terwijl de hiermede verkregen kiem-
cijfers overeenstemden met die, welke door do controle-
methode werden opgeleverd. Alleen in dc gevallen, onder
nos. 24, 26 en 27 vermeld, waren dc uitkomsten aanzien-
lijk lager, hetgeen geen verwondering behoeft te wekken,
als men nagaat, dat de contróle-platen van een ver-
dunning 1 : 100.000 waren aangelegd.

Restdtaleii der Jdciyw-plaalcuUuren van de verdunningen
met pepton-keukenzoutoplossing.

De tabel 8c (zie blz. 126), waarin bovengenoemde resul-
taten zijn verzameld, is op dezelfde wijze opgesteld als do
voorgaande tabel. Mon ziet. dat de uitkomsten na een
incubaticduur van 15 uur overeenstemmen met die, wclko
na een broedtijd van 45 uur werden verkregen, terwijl na
15 uur do koloniën voldoende ontwikkeld waren. Ook hier
werd na 45 uur meerdere malen confluentie der kolomen

waargenomen, waardoor een lager kiemcijfer dan na
15 uur werd bereikt, terwijl in sommige gevallen slechts
een benaderende opgave kon worden gedaan.

Tevens valt weer op te merken, dat over het algemeen
door de sterkere verdunningen hoogere resultaten worden
verkregen.

De bacteriecijfers, welke van de 34 onderzochte mon-
sters in een verdunning 1 :10 werden verkregen, kwamen
in de gevallen, waarbij het bacterie-aantal volgens de
controle-methode minder dan 2.130.000 bedroeg, over
het algemeen overeen met die, welke met de laatst-
genoemde methode waren bepaald. De gevallen, waarbij
de controle-platen belangrijk hoogere uitkomsten gaven,
moesten weer uit de sterke verdunning (1 : 10.000) worden
verklaard.

Van 17 melkmonsters was het bacteriecijfer volgens de
controle-methode meer dan 2.100.000. De kleine-plaat-
culturen van de verdunningen 1 : 10 gaven in deze ge-
vallen over het algemeen onduidelijke beelden, terwijl
een te laag kiemgehalte werd aangewezen. Ook hier waren
de resultaten van de verdunningen 1 : 100 belangrijk
beter en de verkregen kiemcijfers in overeenstemming
met die der contróle-platen. De belangrijk hoogere uit-
komsten van deze platen in de gevallen, onder nos. 24,
26 en 27 aangegeven, vonden waarschijnlijk weer hun
oorzaak in de sterke verdunning (1 :100.000).

Ten einde een overzicht te geven van de resultaten, met
de beide verdunningsvloeistoffen bereikt, werd tabel
(zie blz. 127—128) opgesteld, waarin van elk melk-

monster de bacteriecijfers werden opgenomen, welke met
de contróle-methode en de twee verdunningsvloeistoffen
werden verkregen.

Van 17 melkmonsters, welke volgens de contróle-
methode een bacteriecijfer van minder dan 2.130.000
bezaten, werden in de betreffende kolommen de resul-
taten opgeteekend, welke met de 1 op 10 verdunningen
waren bereikt, terwijl van de overige 16 monsters de uit-
komsten der 1 op 100 verdunningen werden ingevuld.
Van deze laatste monsters varieerde het aantal bacteriën
per c.M®. volgens de contróle-platen van 2.130.000 tot
35.600.000. No. 34 der vorige tabellen werd in tabel 8d
niet opgenomen, aangezien hierbij het bacterie-aantal
slechts bij grove benadering kon worden bepaald. In de
laatste kolom zijn de verhoudingen van de verkregen
kiemcijfers, t. o. v. het resultaat der contróle-methode,
vermeld.

Indien No. 26 buiten beschouwing werd gelaten, vari-
eerden de verhoudingen van de bacteriecijfers, welke met
de contróle-platen en de kleine-plaatculturen van de met
ontroomde melk verdunde melkmonsters werden verkre-
gen, van 1 : 1,96 tot 1 : 0,40. Slechts in 4 gevallen over-
eenkomende met 12 % van het totaal getabelleerde aan-
tal, bedroeg het bacterie-aantal volgens de kleine-plaat-
methode minder dan de helft van hetgeen door de con-
tróle-platen werd verkregen, waarbij dient te worden
opgemerkt, dat in de gevallen 10 en 12 de uitkomsten
zeer weinig onder 50 % lagen. Gemiddeld was de verhou-
ding 1: 1,02, zoodat over het algemeen de resultaten zeer
goed overeenstemden.

Wat over de uitkomsten der kleine-plaatculturen van
de met ontroomde melk verdunde monsters gezegd is,
geldt ook voor de verdunningen met pepton-keukenzout-
oplossing. Bij uitschakeling van No. 26 varieerden de
bovengenoemde verhoudingen van 1: 1,80 tot 1: 0,40,
terwijl gemiddeld de verhouding 1: 1,05 was. Ook hier
bedroeg in dezelfde 4 gevallen het bacterie-aantal volgens
de kleine-plaatmethode minder dan de helft van dat der
controle-methode, terwijl bij de nos. 10 en 12 het verschil
met deze helft weer zeer gering was.

Bij vergelijking der tabellen 8a en 8d ziet men, dat in
de gevallen, waarbij met de kleine-plaatculturen uit de
onverdunde melk onvoldoende resultaten werden bereikt,
zeer goede uitkomsten werden verkregen, nadat verdun-
ningen waren aangelegd.

Reeds vroeger werd meegedeeld, dat melkmonsters met
een hooger kiemcijfer dan 200.000 moesten worden ver-
dund. Op grond van de hierboven besproken experimen-
ten kunnen over den graad der verdunningen, alsmede
over den aard der verdunningsvloeistof nadere aanwij-
zingen worden gegeven. Voor melkmonsters met een bac-
teriecijfer, varieerende van ± 200.000 tot ± 2.000.000,
kan met een verdunning 1 op 10 worden volstaan, terwijl
daarboven sterkere verdunningen moeten worden gebruikt.
Voorop dient te worden gesteld, dat men zich niet behoeft
te binden aan de door mij gebezigde verdunningen. Dc
graad der verdunningen zal moeten afhangen van het ma-
ximum aantal bacteriën, hetwelk men in bepaalde melk-
soorten toelaatbaar acht.

keuJcenzoutoplossing als verdunningsvloeistoffen werden
bereikt, kwamen zeer goed overeen. Op grond van de
reeds besproken voordeelen der pepton-keukenzoutop-
lossing boven ontroomde melk moet dus eerstgenoemde
vloeistof voor de verdunningen der melkmonsters worden
aanbevolen.

VERGELIJKING DER RESULTATEN, MET ONTROOMDE
MELK EN PEPTON-KEUKENZOUTOPLOSSING
ALS VERDUNNINGSVLOEISTOF
VERKREGEN.

Allereerst werd nagegaan, welke contróle-metliode voor
de beoordeeling der resultaten van de kleine-plaatcul-
turen moest worden toegepast. Aangezien de methode,
welke in den Codex Alimentarius voor het quantitatief
bacteriologisch melkonderzoek is aangegeven, v.n. door
de vervloeiing der bouillongelatine, geen bevredigende
uitkomsten gaf, werd door een vergelijkend onderzoek
van 100 melkmonsters, waarbij naast genoemde methode,
ook de „agarplaatmethode" werd gebruikt, nagegaan, of
de bouillongelatine door bouillonagar mocht worden ver-
vangen. Hot bleek, dat op de agarplaten gemiddeld li-
maal zooveel koloniën tot ontwikkeling kwamen als op de
gelatineplaten, terwijl bovendien een grootere zekerheid
bestond, dat dc resultaten konden worden afgelezen. In
36 % der gevallen, waarbij zoowel volgens do gelatine-
plaat- als volgens do agarplaatmethode het bacteriecijfer
kon worden bepaald, waren op de gelatineplaten minder
dan 60 % der koloniën ontwikkeld als op de agar-
platen. In de agarplaten bij 22° C. konden de koloniën
pas na 5 dagen worden geteld, terwijl deze in vele
gevallen dan nog zeer klein waren. Daarom werd
onderzocht, of 1°. door een hoogere brocdtemperatuur,

2°. door de verdunde melk over een agarplaat uit te
strijken de vermeerdering der bacteriën kon worden
bespoedigd. Te dien einde werden 17 melkmonsters
volgens onderstaande 3 methoden onderzocht: 1°. de
agarplaatmethode bij 22° C.; 2°. de agarplaatmethode bij
37° C.; 3°. de „agarstrijkmethode" bij 37° C. Het aantal
koloniën kon met de beide laatste methoden snel-
ler worden bepaald, echter was het verkregen kiemcijfer
volgens de eerste methode gemiddeld bijna 2-maal zoo
groot als dat volgens de tweede, en 3-maal zoo hoog als dat
volgens de derde methode. Op grond van deze proef-
nemingen werd de agarplaatmethode bij 22° C. als de
controle-methode voor de kleine-plaatculturen bij de
verdere experimenten gebruikt.

Door het onderzoek van een aantal melkmonsters,
zoowel volgens de kleine-plaat-, als volgens de controle-
methode, werd nagegaan, bij welke broedstooftempera-
tuur de beste resultaten werden verkregen. De kleine-
plaatculturen werden resp. bij 37°, 22°, 26° en 30° C. ge-
plaatst, terwijl van elk melkmonster het resultaat na een
incubatietijd van 15 en 24 uur werd bepaald. Voor eiken
incubatietijd werd het onderzoek in duplo verricht. De
resultaten bij 37° C. waren niet bevredigend. Van de 171
melkmonsters, waarbij het aantal koloniën in de kleine-
plaatjes kon worden vastgesteld, was in 104 gevallen het
verkregen kiemcijfer minder dan 75 % van dat, hetwelk
door de contróle-platen werd aangegeven, terwijl in 47 %
der gevallen de uitkomsten minder dan 50 % bedroegen.
In vele gevallen was het zelfs minder dan 20 %. Boven-
dien waren in vele preparaten naast zeer groote-, talrijke

zeer kleine-koloniën aanwezig, terwijl veel last van over-
groeiing en vorming van „spreaders" werd ondervonden.
Daarbij kwam, dat in meerdere gevallen, waarbij in de
melk meer dan 1.000.000 kiemen aanwezig waren, in de
kleine-plaatculturen slechts enkele koloniën gevormd
waren en het overgroote deel der bacteriën niet tot kolo-
niën was uitgegroeid. Bij een broedstooftemperatuur van
22° C. werden veel betere resultaten bereikt. Van 178
melkmonsters bedroeg in 79 gevallen het aantal bacteriën
volgens de kleine-plaatmethode minder dan 75 % van dat
der contróle-platen, en slechts in 18 % der onderzochte
gevallen minder dan 60%. In alle gevallen, waarbij
volgens de contróle-platen zich meer dan 1.000.000 kie-
men per c.M\'. in de melk bevonden, was een ontelbaar
aantal kleine koloniën gevormd. Door deze omstandigheid,
hetwelk men ook bij de temperaturen van 26° C. en 30° C.
kon waarnemen, werden in de practijk van het quantitatief
bacteriologisch melkonderzoek miswijzingen voorkomen.
Een groot bezwaar voor de kleine-plaatmethode aan de
temperatuur van 22° C. verbonden, was, dat na 15 uur
in vele gevallen do koloniën nog zeer gering ontwikkeld
waren, meerdere malen zelfs nog na 24 uur. Do kleine-
plaatculturen, welke in een broedstoof bij 26° C. werden
geplaatst, vertoonden dit euvel in veel mindere mate,
hoewol in meerdere preparaten nog vele koloniën na 16
uur onvoldoende ontwikkeld waren. Van 102 melk-
monsters, welke bij dezo temporatuur werden onder-
eocht, was het verkregen bacteriecijfer volgens de kleine-
plaatmethode in 26 gevallen minder dan 76 % van dat
der contróle-methode en slechts in 9 % der gevallen

minder dan 50%. Van 24 melkmonsters, waarbij de
kleine-plaatjes bij 30° C. werden bewaard, kon in alle
gevallen het resultaat na 15 uur worden afgelezen. In
5 gevallen was het kiemcijfer minder dan 75% van hetgeen
door de contróle-platen werd aangegeven, terwijl dit in
geen enkel geval minder dan 50 % bedroeg. Hoewel bij
30° C. de koloniën zich over het algemeen flink ontwikkel-
den, kwamen toch naast de groote koloniën vele zeer
kleine voor, terwijl ook meer last van de vorming van
„spreaders" werd ondervonden. De nadeelen, aan de tem-
peratuur van 37° C. verbonden, kwamen, ofschoon in veel
geringere mate, weer te voorschijn, zoodat geen proeven
bij temperaturen tusschen 30 en 37° C. werden genomen.

Het blijkt dus, dat voor het verkrijgen van een zoo
groot mogelijk aantal koloniën, dat bovendien duidelijk
afleesbaar is, een temperatuur wenschelijk is, gelegen
tuschen 26° en 30° C.

Kleine-plaatjes, welke met bouillongelatine in plaats van
met bouillonagar werden vervaardigd en waarbij een broed-
Btooftemperatuur van22°C. gebruikt werd, leverden, over
het geheel genomen, geen gunstige resultaten op.

De verdere proefnemingen met de kleine-plaatculturen
werden alle bij 28° C. genomen. Omtrent den minimum
incubatietijd kon door een inleidend onderzoek worden
vastgesteld, dat deze voor melkmonsters van verschillende
herkomst zeer uiteenloopend is. Bij kiemrijke, in niet
steriel vaatwerk gewonnen melk werd een snellere ver-
meerdering der bacteriën waargenomen, dan wanneer
deze in een steriele glaskolf was opgevangen. In elk geval
werden na een incubatietijd van 8—10 uur geen, voor dc

practijk betrouwbare, resultaten verkregen, zoodat op
den dag van inlevering der melkmonsters geen uitspraak
omtrent het kiemcijfer kon worden gedaan. Ten einde
na te gaan, of zulks één dag na de inlevering kon geschie-
den, werden van 85 melkmonsters van zeer verschillende
herkomst meerdere preparaten vervaardigd, welke ge-
durende verschillende tijden in de broedstoof werden ge-
houden. Het bleek, dat over het algemeen na 15 uur be-
trouwbare resultaten werden verkregen, hoewel in ver-
schillende gevallen de koloniën nog niet flink ontwikkeld
waren. Na 20—24 uur was in alle gevallen in de kleine-
plaatculturen het aantal koloniën gemakkelijk te bepalen,
terwijl na een broedtijd van 45-^8 uur geen vermeerde-
ring van dit aantal viel waar te nemen.

Ingeval de te onderzoeken melk meer dan 200.000
bacteriën per c.M®. bevatte, bleek het noodig, alvorens de
kleine-plaatculturen aan te leggen, verdunningen van
deze melk te maken. Door het onderzoek van 34 monsters
handelsmelk, waarbij preparaten van de onverdunde
melk werden vervaardigd, bleek, dat hiermede geen be-
trouwbare indruk van het aantal bacteriën werd ver-
kregen. Dit was wel het geval, indien de kleine-plaat-
culturen werden aangelegd van de 1 op 10 of 1 op 100
verdunde melk. In alle gevallen kwamen do bacterie-
cijfers, welke na een incubatietijd van 15 uur en 45 uur
werden verkregen, met elkaar overeen. Voor melk-
monsters, waarvan het bacteriecijfer varieerde van ±
200.000 tot ± 2.000.000, kon mot een verdunning van l
op 10 worden volstaan, terwijl daarboven een sterkere
verdunning moest worden gebruikt.

Verschillende verdunningsvloeistoffen werden op hun
bruikbaarheid onderzocht^ waarbij werd opgemerkt, dat
met pepton-keukenzoutoplossing even goede resultaten
werden bereikt als met ontroomde melk.

De kleine-plaatmethode volgens W. D. Frost is een
uitstekende, betrouwbare en snel tot het doel voerende
methode voor het quantitatief bacteriologisch melk-
onderzoek.

Ter verkrijging van de meest betrouwbare resultaten
dient de incubatietemperatuur op ±28° C. gesteld te
worden, waarbij in alle gevallen 20—24 uur na de inleve-
ring der melkmonsters het kiemcijfer kan worden afge-
lezen.

Indien verwacht kan worden, dat de melk meer dan
200.000 bacteriën per c.M». bevat, dient men, alvorens
tot het vervaardigen der kleine-plaatjes over te gaan,
verdunningen aan te leggen.

Voor het aanleggen der genoemde verdunningen is
pepton-keukenzoutoplossing boven ontroomde melk aan
te bevelen.

De kleine-plaatmethode voldoet beter aan de eischen,
die de practijk aan het quantitatief bacteriologisch
melkonderzoek stelt, dan dc tot heden gebruikelijke
methode der gelatine-plaatculturen.

and other richly seeded materials. Journ. Am. Med. Assoc.
Vol. LXVI, Nr. 12, pp. 889—890.

in milk with the standard plate method. Journ. Inf. Dis. Vol.
19, pp. 273—287.

Report International Milk Dealers Association, Spring-
field, Mass, Meeting, pp. 63—78.

of some rapid methods for bacteriologic analysis of milk.
Journ. Inf. Dis., Vol. 24, No. 4, pp. 322-336.

method of counting bacteria in milk. Journ. Inf. Diss., Vol.
28, No. 2, pp. 176—184.

value of Frost\'s littlo plate method for determining the
colony counts of milks. Proceedings of the Am. Assoc. Med.
Milk Commissions, Vol. 14.

value of the Frost\'s littlo plate method in the routine colony
count of milk samples. Am. Journ. Publ. Health, Vol. XII,
No. 6.

in milk bij direct microscopical examination, Centralbl. f.
Uakt. II. Bd. 30, p. 337.

milchhygienischen Untersuchungsmethoden. Ztschr. f. Un-
tersuchung der Nahrungs- und Genusimittel. Bd. 21, Heft 9,
S. 613—534.

Zählen von Bakterien von 0. Skab. Zeitschr. f. Fleisch u.
Milchhygiene. Jg. XXIII, Heft 13. (Origineel in „Skand.
Veter. Tidsskr.\'\' Aarg. II, 1912, Heft 8).

bij het onderzoek naar de qualiteit der melk de voorkeur.
Tijdschrift voor Veearisenijkunde, Deel 39, blz. 231—260.

im Dienste der Milchkontrolle? Zeitschr. f. Fleisch- u. Milch-
hygiene. Jg. XXIV, S. 107.

im Handel befindlichen Milchsorten. MilchwirLschaftl.
Contralbl, Jg. 43. 1914, S. 0.

milch verschiedener Herkunft in der Stadt Zürich nach Zahl
und Art der darin vorkommenden Spaltpilte. Zontralbl. f.
Bakt. II, Bd. 45. S. 433.

rungsmethoden für dio Bakterien der frischermolkcnen
Kuhmilch. Centralbl. f. Bakt. II. Bd. 48, S. 433.

count from milk samples. New York (Geneva) Agricult.
Exper. Stat., Tech. Bull. 75, pp. 1—97.

Interesse der menschlichen Gesundheit. Zeitschr. f. Flcisch-
und Milchhygiene. Bd. 30. H. 1.

and cnambees, W. H., Iii how far is the bacterial count of
milk influenced bij the dirt content? Jour. Dairy Science
Vol. 4, pp. 430-447.

milk as obtained bij microscopic and plate methods. New
York SUte. Agricult. Exper. Stat. Geneva, Tech. Bull. 86.

samtkubikinhaltes der Mikroorganismen in festen und
flüssigen SubsUnzen. Centrabl. f. Bakt. II, Bd. 57, S. 327.

30. 1922. Wilson, 0. S., The proportion of viable baclcria in young cultu-
res with especial reference to the technique employed in
counting. Jour, of bacteriology. Vol. VII.
87 1923 GÔZ0NY, Ludwig, und Kiiam&r, Eugen, Reduktionsversuche
mit Bakterien. Centralbl. f. Bakt. 0. Bd. LXXXIX, S. 193.
38. 1923. Rapport van do commissie van onderioek in zako hot inatcllcn
van een gomcontelijk mclkbcdrijf to Amsterdam.

„Marking guide\'-\' en pincet volgens W. D. Frost. Ongeveer
1/3 der ware grootte.

„Moist chamber cabinet\'\' volgens W. D. Feost. Ongeveer
1/4 der ware grootte.

b. 28 uur bij 28" C. Vorming van „spreaders^\'. Ware grootte.
Kleine-plaatcultuur van molk met 11.000 bacteriën per
c.M3. Vergrooting 40 maal.

Kleine-plaatcultuur van melk met 92.000 bacteriën per
C.M3. Vergrooting 40 ra aal.

Kleinc-plaatcultuur van melk met 190.000 bacteriën per
C.M3. Vergrooting 40 maal.

Kleine-plaatcultuur van melk met ± 3.000.000 bacteriën
per c.M». Vorgrooting 40 maal.

Photo	No.	1.
Photo	No.	2.
Photo	No.	3.
Photo	No.	4.
Photo	No,	6.
Photo	No.	6.
Photo	No.	7.
Photo	No.	8.
Photo	No.	9.
Photo	No. 10.
Photo	No.	11.
Photo	No.	12.
Photo	No. 18.
Photo	No.	14.

Kleine-plaatcultuur na een incubatietijd van 46 uur bij
28° C. Aan do peripherio van enkele groote koloniën een
krans van kleine koloniën gevormd. Vergrooting 40 maal.
Kleinc-plaatcultuur van melk met 20.000 kiemen per c.MS,
na een incubatietijd van 15 uur bij 28° C.
Kleine-plaatcultuur van dezelfde melk na een incubatietijd
van 24 uur bij 28° C. Vergrooting 40 maal.
Rand van een kolonie van staafjesvormige niicro-orgnnis-
men in een klcine-plaatcultuur. Vergrooting 600 maal.
Rand van oen kolonie van coccen in een kloine-piaatcultuur.
Vergrooting 600 maal.

♦) üe photo\'s werden vervaardigd in het Instituut van Prof. l)r. H.
SaioRNAQET. met medewerking van den heer C. J. Witmanb.

De methode, welke in den Codex Alimentarius (No. 1.
Melk. 1920) voor het quantitatief bacteriologisch melk-
onderzoek is aangegeven, dient door de kleine-plaat-
methode volgens W. D. Frost te worden vervangen.
«

De diagnose „Carcinosarcoom" door Jobst en Bieder-
mann gesteld bij twee gevallen van vulva carcinoom bij
het rund (Zeitschrift für Krebsforschung 1921, Band 18,
blz. 51) is onjuist.

Het verdient geen aanbeveling op onze lichtere gronden,
zooals het noordelijk gedeelte van Limburg, de fokkerij
van het zware trekpaard aan te moedigen.

Het afwezig zijn van Streptococcen in uitstrijkprepa-
raten van het melksediment bij koeien, die aan een
Streptococcen mastitis lijdende waren, is geen bewijs,
dat de aandoening genezen is.

Het voorschrift, vervat in art. 30, sub f, 2® alinea van
het Koninklijk Besluit van 5 Juni 1920 S. 285, waarbij
de z.g. vleeschlymphklieren steeds moeten worden onder-
zocht bij die vormen van tuberculose, waarin de ziekte
niet tot één orgaan en de daarbij behoorende lymph-
klieren beperkt is, moet in een aantal gevallen te streng
worden geacht.

Bij de winning van ziektekiemvrije melk moet met
de tuberculose der kleine huisdieren rekening worden
gehouden.

Waar in het z.g. Kcuringsregulatief van bacteriologisch
onderzoek van vleesch sprake is en hiermede khiarblijkelijk
uitsluitend musculatuur bedoeld wordt, moet men ter
voorkoming van misvattingen dit nader aangeven.

Er bestaan geen voldoende redenen, om in alle gevallen
van gegeneraliseerde straalschimmelziekte tot afkeuring
van het geslachte dier over te gaan.

Nos.	Gelatineplaat-	Agarplaat-	Verhouding
methode 22°C.	methode 22°C.	der tellingen T
1.	1.500	5.900	1	3.93
2.	2.000	4.500	1	2.25
3.	2.300	3.400	1	1.48
4.	2.400	5.700	1	2.38
5.	2.400	29.100	1	12.13
6.	2.500	2.900	1	1.16
7.	2.800	11.500	1	4.11
8.	2.800	39.500	1	14.11
9.	2.800	7.200	1	2.57
10.	2.800	8.800	1	3.14
11.	3.200	10.500	1	3.28
12.	3.300	4.800	1	1.45
13.	3.300	10.300	1	3.12
14.	3.400	4.100	1	1.21
15.	3.400	5.500	1	1.62
16.	3.400	4.500	1	1.32
17.	3.700	24.500	1	6.62
18.	3.900	5.400 .	1	1.38
19.	3.900	5.200	1	1.33
20.	4.000	1.200	1	0.30
21.	4.000	4.900	1	1.23
22.	4.300	4.500	1	1.05
23.	4.400	4.300	1	0.98
24.	4.600	7.000	1	1.52
25.	5.000	20.000	1	4.00

Nos.	Gelatineplaat-	Agarplaat-	Verhouding
methode 22°C.	methode 22°C.	der tellingen
26.	5.100	8.700	1	1.71
27.	5.200	12.300	1	2.37
28.	5.500	7.200	1	1.31
29.	5.600	6.700	1	1.20
30.	5.900	7.000	1	1.19
31.	6.100	10.400	1	1.70
32.	6.300	18.200	1	2.89
33.	6.400	12.700	1	1.98
34.	6.600	7.600	1	1.15
35.	7.100	8.100	1	1.14
36.	7.400	15.900	1	2.15
37.	7.600	22.000	1	2.89
38.	8.400	12.000	1	1.43
39.	8.700	8.600	1	0.99
40.	9.100	30.600	1	3.36
41.	9.500	15.400	1	1.62
42.	11.000	16.200	1	1.47
43.	11.700	50.800	1	4.34
44.	11.800	18.500	1	1.57
45.	12.000	103.000	1	8.58
46.	12.000	12.400	1	1.03
47.	14.500	19.000	1	1.31
48.	14.500	17.500	1	1.21
49.	15.000	28.300	1	1.89
50.	15.300	20.700	1	1.35
51.	16.600	16.700	1	1.01
52.	17.200	12.000	1	0.70
53.	18.600	32.400	1	1.74

Nos.	Gelatineplaat-	Agarplaat-	Verhouding
methode 22	methode 2 2°C.	der tellingen
54.	21.000	665.000	1	31.67
55.	22.000	78.500	> J[	3.57
56.	23.000	28.000	1	1.22
57.	23.600	25.100	1	1.06
58.	23.800	590.000	1	24.79
59.	26.000	450.000	1	17.31
60.	30.800	44.200	1	1.44
61.	30.900	34.500	1	1.12
62.	40.000	80.000	1	2.00
63.	40.900	45.900	1	1.12
64.	56.000	64.000	1	1.14
65.	102.000	272.000	1	2.67
66.	200.000	390.000	1	1.95
67.	350.000	415.000	1	1.19
68.	385.000	1.160.000	1	3.01
69.	395.000	525.000	1	1.33
70.	700.000	725.000	1	1.04
gemidd.	40.469	91.119	1	: 2.25

Nos.	Agar- giet- methode 22° C.	Agar- giet- methode 37° C.	Agar- strijk- methode 37° C.	Verhouding der tellingen t
1.	6.900	6.400	3.100	1	1.08 : 0.53
2.	8.000	7.000	5.700	1	0.88 : 0.71
3.	11.500	7.300	7.400	1	0.63 : 0.64
4.	13.200	6.800	6.400	1	0.52 : 0.48
5.	16.900	6.500	5.900	1	0.38 : 0.35
6.	17.400	9.800	7.300	1	0.56 : 0.42
7.	17.500	9.300	8.600	1	0.53 : 0.49
8.	17.600	10.600	4.900	1	0.60 : 0.28
9.	21.000	12.300	9.500	1	0.59 : 0.45
10.	22.500	16.900	11.900	1	0.75 : 0.53
11.	25.100	11.000	8.600	1	0.44 : 0.34
12.	25.400	12.500	11.800	1	0.49 : 0.46
13.	33.000	8.200	7.300	1	0.25 : 0.22
14.	37.000	36.000	19.600	1	0.97 : 0.53
15.	45.000	32.200	15.000	1	0.72 : 0.33
16.	51.000	38.000	5.100	1	0.75 : 0.10
17.	53.500	13.500	11.200	1	0.25 : 0.21
18.	78.000	29.000	14.200	1	0.37:0.18
gemidd.	27.750	15.183	9.083	1 :	0.55 : 0.33

Nos.	Controle- methode >	Kleine-plaat- methode 37°C.	Verhouding\'
1.	0	0	1	1.00
2.	0	0	l	1.00
3.	1.100	1.000	1	0.91
•t. \'	1.200	7.200	1	6.00
5.	1.300	2.300	1	1.77
6.	2.700	2.300	1	0.85
7.	2.800	3.900	1	1.39
8.	2.900	5.600	1	1.93
9.	2.900	5.500	1	1.90
10.	3.100	3..500	1	1.13
11.	3.100	3.400	1	1.10
12.	3.900	3.100	l	0.79
13.	4.100	4.200	1	1.02
14.	4.100	ü.600	1	1.61
15.	4.300	3.500	l	0.81
16.	4.500	7.100	1	1.58
17.	4.500	5.100	l	1.13
18.	4.500	3.400	l	0.76
19.	4.800	4.900	l	1.02
20.	4.800	5.800	1	1.21
21.	4.900	6.200	1	1.27
22.	5.000	6.300	1	1.26
23.	5.400	4.100	1	0.76
24.	5.500	5.500	1	1.(M)

Nos.	Controle- methode	Kleine-plaat- methode 37°C.	Verhouding
25.	! 5.900	11.000	1	1.86
26.	5.900	7.000	1	1.20
27.	6.300	4.800	1	0.76
28.	66.00	9.800	1	1.48
29.	6.600	5.100	1	0.77
30.	6.700	5.200	1	0.78
31.	7.000	8.000	1	1.14
32.	7.200	6.100	1	0.85
33.	7.200	8.600	1	1.19
34.	7.800	7.800	1	1.00
35.	8.000	6.500	1	0.81
36.	8.100	7.300	1	0.90
37.	8.300	12.000	1	1.45
.38.	8.400	8.700	1	1.04
39.	8.600	10.500	1	1.22
40.	8.800	6.6(M)	1	0.75
41.	10.000	8.800	1	0.88
42.	10.000	7.700	1	0.77 •
43.	10.000	9.100	1	0.91
44.	10.000	8.000	1	0.80
45.	10.0(K>	9.500	1	0.95
46.	10.000	7.700	I	0.77
47.	11.000	9.500	1	0.86
48.	11.000	8.100	1	0.74
49.	12.000	13.000	1	1.08
50.	12.000	23.000	l	1.92
51.	13.000	10.000	I	0.77
52.	14.000	18.000	1	1.29

Nos.	Controle- methode	Kle ine-plaat- methode 37°C.	Verhouding
53.	15.000	14.000	1	0.93
54.	15.000	16.000	1	1.07
55.	17.000	13.000	1	0.76
56.	17.000	16.000	1	0.94
57.	18.000	20.000	1	l.ll
58.	19.000	17.000	1	0.89
59.	20.000	15.000	1	0.75
60.	21.000	19.000	1	0.90
61.	22.000	19.000	1	0.86
62.	29.000	26.000	1	0.89
63.	75.000	:föo.ooo	1	4.27
64.	100.000	87.(K)()	1	().87
65.	170.000	230.000	1	1.35
66.	270.0(K)	240.000	1	0.89
67.	730.000	j 780.000	1	1.07
Gemidd.	27.907	32.685	1	: 1.17

	Contróle-	Kleine-plaat-
Nos.	methode i	methode 37°C.	Verhouding
68.	2.300	1.500	1	0.65
69.	3.4(M)	2.300	1	0.68
70.	4.800	3.300	1	0.69
71.	5.300	500	1	0.09
T2.	5.4(M)	3.100	1	0.57
73.	5.500	3.500	1	0.Ö4
74.	5.600	3.800	1	0.68
75.	5.7(H)	I.OIM)	1	0.33
76.	5.700	3.7(K)	l	0.65
77.	6.3(K)	4.1(^0	1	0.65
78.	7.(MM)	1.4(H)	1	0.20
70.	7.(KM)	3.700	l	0.53
8<).	7.(MM)	4.500	1	0.59
Hl.	7.B(M)	2.400	1	o.:)2
82.	7.0(M)	4.JMM)	1	0.62
83.	7.0(M)	3.4(M)	1	0.43
84.	8.7(M)	4.3(K)	1	0.4»
R5.	0.2(M)	5.4(K)	1	0.59
86.	0.{KM)	6.700	1	0.«8
H7.	lO.(HH)	6.000	1	0.60
88.	lU.(KK)	4.500	l	0.45
HO.	U).(HH)	4.6(H)	1	0.4C
90.	ll.iKKJ	5.400	1	0.49
01.	11.(HK)	3.900	1	0.35

	Controle-	Kleine-plaat-	TT 1 1 *
Nos.	Verhoudmg
methode	methode 37°C.
92.	11.000	5.300	1	n 0.48
93.	11.000	3.800	1	0.35
94.	11.000	5.400	1	0.49
95.	12.000	1.900	1	0.16
96.	12.000	300	1	0.03
97.	12.000	4.700	1	0.39
98.	12.000	2.300	1	0.19
99.	12.000	7.100	l	0.59
100.	12.000	5.400	1	0.45
101.	12.000	6.900	l	0.58
102.	12.000	2.900	1	0.24
103.	13.000	3.600	l	0.28
104.	15.000	6.200	1	0.41
105.	16.000	7.400	1	0.46
106.	16.000	9.800	l	0.61
107.	17.000	6.000	l	0.35
108.	17.000	9.000	1	0.53
109.	17.000	4.200	l	0.25
110.	18.000	6.400	l	0.36
111.	18.000	9.500	l	0.53
112.	18.0(K)	7.000	l	0.3»
113.	18.000	2.600	1	0.14
114.	18.000	7.000	l	0.39
115.	19.000	4.900	1	0.26
116.	19.000	11.000	l	0.58
117.	20.000	9.200	l	0.46
118.	20.000	13.000	l	0.65
119.	21.000	6.600	1	0.31

Nos.	Contróle- methode	Kleine-plaat- methode 22°C.	Verhouding
1.	0	0	1	1.00
2.	0	0	1	1.00
3.	1.050	1.100	1	1.05
4.	1.200	4.500	1	3.75
5.	1.300	2.200	1	1.69
6.	2.300	2.300	1	1.(M)
7.	2.8(K)	3.100	1	1.11
8.	2.900	5.700	1	1.97
9.	2.900	4.000	1	1.38
10.	3.100	4.400	1	1.42
11.	3.900	3.200	1	0.82
12.	4.500	4.400	1	0.98
13.	4.8(K)	6.200	1	1.29
14.	4.900	7.000	1	1.43
15.	5.200	l.liH)	1	1.48
1(J.	5.400	4.300	1	0.79
17.	5.500	6.300	1	1.15
18.	5.500	6.500	1	1.18
19.	5.600	4.300	1	0.77
20.	5.900	15.000	1	2.54
21.	6.300	8.600	1	1.37
22.	6.500	6.500	1	1.00
23.	6.600	9.900	1	1.50
24.	7.(M)0	6.700	1	0.96

Nos.	CJontróle-	Kleine-plaat-	Verhouding
methode	methode 22°C.
81.	59.000	55.000	1	0.93
82.	67^.000	65.000	1	0.97
83.	75.000	400.000	1	5.33
84.	78.000	71.000	1	0.91
85.	80.000	440.000	1	5.50
86.	100.000	100.000	1	1.00
87.	100.000	120.000	1	1.20
88.	110.000	110.000	1	1.00
89.	150.000	170.000	1	1.13
90.	160.000	180.000	1	1.13
91.	170.000	360.000	1	2.12
92.	180.000	160.000	1	0.89
93.	190.000	190.000	1	1.00
94.	200.000	260.000	1	1.30
95.	240.000	240.000	1	1.00
96.	270.000	380.000	1	1.41
97.	400.000	360.000	1	0.90
98.	420.000	320.000	1	0.76
99.	730.(M)0	810.000	1	l.Il
Gemidd.	50.288	60.917	1	: 1.21

Nos.	Controle- methode	B^eine-plaat- methode 22°C.	Verhouding
125.	10.000	6.100	1	0.61
126.	11.000	2.200	1	0.20
127.	11.000	4.900	1	0.45
128.	11.000	5.400	1	0.49
129.	11.000	6.500	1	0.59
130.	11.000	2.200	1	0.20
131.	12.000	3.200	1	0.27
132.	12.000	7.100	1	0.59
133.	12.000	3.300	1	0.28
134.	12.000	7.600	1	0.63
135.	12.000	6.000	1	0.50
136.	12.000	5.800	1	0.48
137.	13.000	4.800	1	0.37
138.	13.000	8.300	1	0.64
139.	15.000	9.100	1	0.61
140.	16.000	11.000	1	0.69
141.	16.000	9.100	1	0.57
142.	16.000	11.000	1	0.69
143.	17.000	9.000	1	0.53
144.	17.000	11.000	1	0.65
145.	18.000	12.000	1	0.67
146.	18.000	5.900	1	0.33
147.	18.000	13.000	1	0.72
148.	18.000	9.400	1	0.52
149.	19.0(K)	9.000	1	0.47
150.	19.000	12.000	1	0.63
161.	21.000	15.000	1	0.71
152.	22.000	1.900	1	0.09
153.	22.000	14.000	1	0.64

Nos.	Controle- methode	Kleine-plaat- methode 26°C.	Verhouding
1.	0	0	1	1.00
2.	0	0	1	1.00
3.	1.200	17.000	1	14.17
4.	2.300	3.600	1	1.57
5.	2.700 i	1 3.100 1	1	1.15
6.	2.800	1 6.100	1	2.18
7.	2.900	j 9.300	1	3.21
8.	2.900	i 8.500	1	2.93
9.	3.100	4.300	1	1.39
10.	3.400	4.500	1	1.32
11.	4.100	6.100	1	1.49
12.	4.500	8.100	1	1.80
13.	4.500	5.700	1	1.27
14.	4.500	5.300	1	1.18
15.	4.800	4.r)(M)	1	0.94
16.	4.800	5.200	1	1.08
17. :	5.000	5.ÖÜ0	1	1.12
18. ;	5.400	5.9(M)	1	1.0»
19. i	5.500	6.300	1	1.15
20.	5.500	9.600	1	1.75
21.	5.700	7.500	1	1.32
22.	5.700	5.600	1 1	0.98
23.	5.900	5.700	1	0.97
24.	6.300	lO.OOOj 1	1.5»

Nos.	Controle- methode	Kleine-plaat methode 26°C.	Verhouding
78.	4.100	1.900	1	0.46
79.	5.300	2.700	1	0.51
80.	5.400	3.700	1	0.69
81.	6.600	4.600	1	0.70
82.	7.200	2.900	1	0.40
83.	7.900	5.000	1	0.63
84.	8.800	4.300	1	0.49
85.	11.000	5.600		0.51
86.	11.000	5.200	1	0.47
87.	12.000	6.000	1	0.50
88.	12.000	7.900	1	0.66
89.	13.000	5.300	1	0.41
90.	16.000	9.100	1	0.57
91.	18.000	12.000	1	0.67
92.	19.000	9.500	1	0.50
93.	22.000	2.300	1	0.10
94.	26.000	17.000	1	0.65
95.	28.000	11.000	1	0.39
96.	29.000	6.400	1	0.22
97.	44.000	28.000	1	0.64
98.	46.000	27.000	1	0.59
99.	48.000	28.000	1	0.59
100.	51.000	11.000	1	0.22
101.	64.000	33.000	1	0.52
102.	670.000	360.000	1	0.54
Gemidd.	47.412	24.376	1 :	: 0.51

Nos.	< Contróle- methode	Kleine-plaat- methode 30°C.	Verhouding
1.	3.100	4.100	1	1.32
2.	5.500	9.400	1	1.71
3.	5.700	5.900	1	1.04
4.	63.00	10.000	1	1.59
5.	6.500	6.800	1	1.05
6.	7.600	6.700	1	0.88
7.	7.900	7.700	1	0.97
8.	10.000	8.600	1	0.86
9.	16.000	13.000	1	0.81
10.	20.000	15.000	1	0.75
11.	24.000	35.000	1	1.46
12.	32.000	24.000	1	0.75
13.	53.000	40.000	1	0.75
14.	100.000	95.000	1	0.95
15.	150.000	170.000	1	1.13
16.	160.000	220.000	1	1.38
17.	180.000	140.000	1	0.76
18.	190.000	190.000	1	1.00
19.	200.000	260.000	1	1.30
Gemidd.	61.979	66.379	1	: 1.07

Nos. <	Contróle- methode	15 uur	45 uur
1.	46.000	74.000	70.000
2.	120.000	130.000	150.000
3.	130.000	170.000	170.000
4.	200.000	260.000	280.000
5.	250.000	320.000	320.000
6.	290.000	330.000	310.000
7.	650.000	450.000	400.000
8.	890.000	630.000	550.000
9.	950.000	450.000	460.000
10.	1.140.000	1.040.000	1.010.000
11.	1.160.000	520.000	510.000
12.	1.170.000	1.350.000	1.250.000
13.	1.310.000	1.100.000	1.300.000
14.	1.390.000	930.000	870.000
15.	1.450.000	1.780.000	1.470.000
16.	2.100.000	2.970.000	2.170.000
17.	2.130.000	1.340.000	1.420.000
18.	2.320.000	3.030.000	2.620.000
19.	2.630.000	3.590.000	3.780.000
20.	2.700.000	4.860.000	4.350.000
21.	3.230.000	3.050.000	2.480.000
22.	4.300.000	1.710.000	1.820.000
23.	5.900.000	7.670.000	7.640.000
24.	5.900.000	1.330.000	1.530.000
25.	8.200.000	5.230.000	4.840.000
26.	10.300.000	11.400.000	10.000.000
27.	13.500.000	22.630.000	22.400.000
28.	27.400.000	36.500.000	32.500.000
29. \'	27.500.000	32.500.000	29.830.000

Nos.	Groepjesvorming der bacteriën	Contróle- methode	Kleine-plaatculturen by 28° C. van de onverdunde melk
1.	Geen groepjes bacteriën	46.000	39.000
2.	5> >> J>	120.000	140.000
3.	Weinig	130.000	115.000
4.	)} )) >j	200.000	± 90.000
5.	}} »> ))	250.000	± 150.000
6.	}) >> >>	290.000	± 240.000
7.	Meerdere „ „	650.000	± 280.000
8.	Veel „ „	880.000	± 500.000
9.	Geen „ „	890.000	± 360.000
10.	Veel „ „	950.000	± 340.000
11.	Geen „ ,,	1.140.000	± 500.000
12.	Weinig „ „	1.160.000	± 230.000
13.	Meerdere „ „	1.170.000	niet telbaar
14.	Weinig	1.310.000	± 210.000
15.	}) >> ff	1.390.000	± 750.000
16.	Meerdere „ „	1.450.000	± 770.000
17.	Veel „ „	2.100.000	± 1.500.000
18.	Meerdere „ „	2.130.000	± 510.000
19.	Veel „ „	2.320.000	± 1.560.000
20.	Meerdere „ ,,	2.630.000	± 1.250.000
21.	Veel „ „	2.700.000	± 1.500.000
22.	ff ff ff	2.900.000	± 610.000
23.	ff >t ff	3.230.000	± 1.250.000
24.	ff ff ff	4.300.000	± 685.000
25.	ff ff ff	5.90Ö.000	± 1.250.000
26.	)) M ff	5.900.000	± 1.100.000
27.	ff ff ff	8.200.000	± 1.880.000
28.	ff ff ff	10.300.000	niet telbaar
29.	ff ff ff	13.500.000	± 2.500.000
30.	ff ff >1	27.400.000	niet telbaar
31.	>> ff ff	27.500.000	± 2.500.000
32.	f> ff ft	27.900.000	niet telbaar
33.	f ff ff	35.600.000	niet telbaar
34.	f> ff ff	± 140.000.000	niet telbaar

Nos.	Contróle-	1 : 10	1 : 10	1 : 100	1 : 100
methode	15 uur 28° C.	45 uur 28° C.	15 uur 28° C.	45 uur 28° C.
1.	46.000	56.000	58.000	63.000	58.000
2.	120.000	130.000	130.000
3.	130.000	150.000	160.000
4.	200.000	200.000	190.000	430.000	400.000
5.	250.000	330.000	310.000
6.	290.000	310.000	290.000
7.	650.000	430.000	380.000	610.000	580.000
8.	880.000	810.000		1600.000
9.	890.000	610.000	640.000	930.000	930.000
10.	950.000	470.000	510.000	680.000	670.000
11.	1.140.000	1.050.000	1.040.000	1.300.000	±1.300.000
12.	1.160.000	520.000	520.000	900.000	890.000
13.	1.170.000	1.360.000	±1.250.000
14.	1.310.000	1.640.000	1.680.000	2.430.000	2.470.000
15.	1.390.000	860.000	930.000	870.000	760.000
16.	1.450.000	1.170.000	1.080.000
17.	2.100.000	1.970.000	2.170.000
18.	2.130.000	1.900.000	2.130.000	3.180.000	2.860.000
19.	2.320.000	1.930.000	1.850.000	3.420.000	3.420.000
20.	2.630.000	3.400.000	3.000.000	5.160.000	4.430.000
21.	2.700.000	2.530.000	1.980.000	3.780.000	3.290.000
22.	2.900.000	1.880.000		4.650.000
23.	3.230.000	3.250.000	±2.480.000
24.	4.300.000	1.250.000	±1.000.000	1.700.000	1.630.000
25.	5.900.000	4.000.000	±4.000.000	7.630.000	7.830.000
26.	5.900.000	1.250.000	±1.000.000	1.350.000	1.550.000
27.	8.200.000	2.470.000	2.350.000	4.980.000	4.450.000
28.	10.300.000	±7.000.000	±6.000.000	12.100.000	±10.000.000
29.	13.500.000	±9.550.000	±7.500.000	14.110.000	±14.000.000
30.	27.400.000	±1.500.000	±1.500.000	31.500.000	30.000.000
31.	27.500.000	±15.000.000	±15.000.000	32.830.000	30.330.000
32.	27.900.000	±12.500.000		20.500.000
33.	35.600.000	±20.000.000		38.330.000
34.	±140.000.000	niet telbaar	niet telbaar	±200.000.000	±200.000.000

Nos.	Contróle-	1 : 10	1 : 10	1 : 100	1 : 100
methode	15 uur 28° 0.	45 uur 28° C.	15 uur 28° 0.	45 uur 28° C.
1.	46.000	74.000	70.000	71.000	79.000
2.	120.000	130.000	150.000
3.	130.000	170.000	170.000
4.	200.000	260.000	280.000	480.000	410.000
5.	250.000	320.000	320.000
6.	290.000	330.000	310.000
7.	650.000	450.000	400.000	580.000	590.000
8.	880.000	800.000		1.550.000
9.	890.000	630.000	550.000	940.000	880.000
10.	950.000	450.000	460.000	1.310.000	950.000
11.	1.140.000	1.040.000	1.010.000	1.240.000	±1.200.000
12.	1.160.000	520.000	510.000	990.000	990.000
13.	1.170.000	1.350.000	±1.250.000
14.	1.310.000	1.100.000	1.300.000	3.360.000	2.660.000
15.	1.390.000	930.000	870.000	670.000	770.000
16.	1.450.000	1.780.000	1.470.000
17.	2.100.000	2,970.000	2.170.000
18.	2.130.000	1.380.000	1.620.000	1.340.000	1.420.000
19.	2.320.000	1.780.000	1.750.000	3.030.000	2.620.000
20.	2.630.000	3.500.000	2.920.000	3.590.000	3.780.000
21.	2.700.000	3.180.000	2.630.000	4.860.000	4.350.000
22.	2.900.000	3.180.000		4.600.000
23.	3.230.000	3.050.000	±2.480.000
24.	4.300.000	1.230.000	±1.000.000	1.710.000	1.820.000
25.	5.900.000	4.530.000	±4.000.000	7.670.000	7.640.000
26.	5.900.000	1.330.000	±1.000.000	1.330.000	1.530.000
27.	8.200.000	2.680.000	2.480.000	5.230.000	4.840.000
28.	10.300.000	±8.000.000	±6.000.000	11.400.000	±10.000.000
29.	13.500.000	±11.250.000	±7.500.000	22.630.000	±22.400.000
30.	27.400.000	±1.500.000	±1.500.000	36.500.000	32.500.000
31.	27.500.000	18.330.000	±20.000.000	32.500.000	29.830.000
32.	27.900.000	±12.500.000	22.400.000
33.	35.600.000	±20.000.000		31.170.000	±200.000.000
34.	±140.000.000	niet telbaar	niet telbaar	±200.000.000

Nos.	Controle- methode	Ontroomde melk	Pepton- keukenzout oplossing	Verhoudingen
1.	46.000	56.000	74.000	1	1.22 : 1.61
2.	120.000	130.000	130.000	1	1.08: 1.08
3.	130.000	150.000	170.000	1	1.15: 1.31
4.	200.000	200.000	260.000	1	1.00 : 1.30
6.	250.000	330.000	320.000	1	1.32 : 1.28
6.	290.000	310.000	330.000	1	1.07: 1.14
7.	050.000	430.000	450.000	1	0.66: 0.69
8.	880.000	810.000	800.000	1	0.92 : 0.91
0.	890.000	610.000	630.000	1	0.69 : 0.71
10.	950.000	470.000	450.000	1	0.49 : 0.47
11.	1.140.000	1.050.000	1.040.000	1	0.92 : 0.91
12.	1.160.000	520.000	520.000	1	0.45 : 0.45
13.	1.170.000	1.360.000	1.350.000	1	I.I6: 1.15
14.	1.310.000	1.640.000	1.100.000	1	1.25 : 0.84
15.	1.390.000	860.000	930.000	1	0.62 : 0.67
16.	1.450.000	1.170.000	1.780.000	1	0.81 : 1.23
17.	2.100.000	1.970.000	2.970.000	1	0.94 : 1.41
18.	2.130.000	3.180.000	1.340.000	1	1.49 : 0.63
10.	2.320.000	3.420.000	3.030.000	1	1.47 : 1.31
20.	2.630.000	5.160.000	3.590.000	1	1.96: 1.37
21.	2.700.000	3.780.000	4.860.000	1	1.40: 1.80
22.	2.900.000	4.650.000	4.600.000	1	1.60 : 1.59