•fc ■• .. V »
& \'

PROEVEN TER VERKRIJGING VAN EEN
ONSCHADELIJKE EN ZUIVERE ENTSTOF
TEGEN DIPHTHERIE

PROEVEN TER VERKRIJGING VAN
EEN ONSCHADELIJKE EN ZUIVERE
ENTSTOF TEGEN DIPHTHERIE

ter verkrijging van den graad van
doctor in de geneeskunde aan de
rijks-universiteit te utrecht op
gezag van den rector magnificus
Mr. J. Ph. suyling, hoogleeraar in de
faculteit der rechtsgeleerdheid,
volgens besluit van den senaat der
universiteit tegen de bedenkingen
van de faculteit der geneeskunde
te verdedigen op dinsdag 4 mei 1926,
des namiddags te 4 uur door

electrische drukkerij L. e. bosch & zoon - utrecht

Het is mij een mngeimme taak U, Hoogleeraren en Docen-
ten der Medische en Philosophische Faculteiten, aan de Kijka
Universiteit te Utrecht mijn dank te betiiigen voor \'de tot nu
toe van U genoten opleiding, die reeds in zooverre wtichten
heeft mogen dragen, dat zij mij in staat stelde de in dit proef-
schrift beschreven onderzoekingen te verrichten. Weest ervan
overtuigd, dat ik het een voorrecht acht, nog niet, zooals de
meeste promovendi, dit onderzoek als het slot der opleiding
te moeten beschomvem

U, Hooggeleerden Aldershoff, Hooggeachten Promotor,
dank ik niet alleen in het bijzonder voor de wehvillende ivijze
wmrop Gij mij in de gelegenheid hebt gesteld dit proefschrift
te bewerken, maar ook voor het feit, dut Gij mij hebt bekend
nemaakt met dezen nieuwen tak van wetenschap, waarvoor ik
in mijn verdere leven steeds de volle belangstellin^g zal
blijven behouden.

U, Zeergeleerden Pond/man, dank ik voor de tegemoetko-
mende ivijze, waarop Gij mij verschillende moeilijkheden hebt
helpen overwinnen.

Gaarde breng ik hier ook een woord van dank aan U,
Schuttrma^is Stekhoveii, voor de vele nuttige wenken, die Gij
mij bij de bestudeering der literatuur hebt gegeven.

Erkentelijk ben ik voor de wehuillende medewerking, die
ik van het personeel van het Rijks Serologisch Instituut mocht
ondervinden.

In het laatst van 1890 publiceerde Behring zijn pogingen
om caviae te immuniseeren tegen diphtherie met behulp van
diphtheriebacillen. Hij verzwakte daartoe de virulentie dezer
bacillen met behulp van chemicaliën, hoofdzakelijk door jood-
trichloride. Bij proeven op paarden bleek, dat de onvatbaar-
heid bij deze dieren beter tot stand was te brengen door diph-
therietoxine in te spuiten. Evenwel deden zich groote moei-
lijkhéden voor om doodelijke toxinewerking te voorkomen.
Daarom gebruikte Behring eveneens joodtrichloride om de
vergiftigheid van het toxine te verminderen, maar ook dit liet
hij tenslotte weg en immuniseerde zijn paarden met behulp
van diphtherietoxine, verdund met physiologische keukenzout-
oplossing. Tenslotte bleek de beste weg voor het leggen van
de grondimmuniteit: gelijktijdige toediening van toxine en
antitoxisch serum.

Bij onderzoek bleek n.1. dat serum van een met een derge-
lijk mengsel behandeld paard antitoxische eigenschappen
krijgt. Wordt dit serum bij een mensch ingespoten, dan wordt
ook deze. mensch onvatbaar en blijft dit, zoolang nog anti-
toxine in zijn bloed aanwezig is. Dit antitoxische serum is
dus te gebruiken om den mensch tijdelijk passief onvatbaar
te maken tegen diphtherie.

Aan gebruik van diphtherieserum als afdoend voorbe-
hoedmiddel staan echter verschillende nadeelen in den weg.
Het grootste nadeel is de te korte duur van de immuniteit.
De hoeveelheid antitoxine per c.c. bloed daalt direct na de
inspuiting zeer snel, als gevolg van het feit, dat het soort-
vreemde serum spoedig wordt uitgescheiden.

Wanneer men kon beschikken over homoloog antiserum,
d.w.z. anti-serum afkomstig van een mensch, zou na inspui-

ting hiervan de immuniteit veel langer blijven bestaan, omdat
dit homologe serum in het lichaam niet aan Proteolyse onder-
vi^orpen is. Dit wordt bevestigd door het feit, dat pasgebore-
nen gedurende het eerste halve jaar een negatieve reactie
van Schick vertoonen tengevolge van het van de moeder mee-
gekregen antitoxine-gehalte van hun bloed. Bovendien zyn
borstkinderen blijkbaar onvatbaar, zoolang zij gezoogd
worden.

Dat homoloog antitoxine veel langer in het bloed blijft
dan heteroloog, toonde Behring (1) aan door proeven
op twee kinderen. Het eerste kind werd ingespoten met
heteroloog antitoxisch serum, het tweede met homoloog.
In het bloed van het tweede kind was het antitoxine na lan-
gen tijd nog aan te toonen, terwijl het uit het bloed van het
eerste kind reeds verdwenen was.

Voor passieve onvatbaarmaking komt het gebruik van ho-
moloog antiserum echter om practische redenen niet in aan-
merking. Men kan alleen beschikken over serum van dieren
afkomstig, dus heteroloog serum. Wilde men dus längeren
tijd passieve onvatbaarheid tot stand brengen met soort-
vreemd serum, dan zou men telkens weer opnieuw moeten
inspuiten. Bovendien verdwijnt het bij de tweede injectie in-
gespoten antitoxine nog veel sneller uit het bloed dan het
antitoxine van een eerste injectie. Bij een eerste inspuiting
is het na twintig dagen verdwenen, bij een tweede na acht
dagen. Behalve dit bezwaar, staat ook het gevaar voor
anaphylaxie bij eventueel later noodige inspuiting van een
therapeutische dosis antiserum aan de prophylactische toedie-
ning in den weg. Nog een nadeel is, dat het serum al vergiftig
kan zijn voor vele patienten bü eerste inspuiting, zoowel bü
prophylactische als therapeutische injectie (serumziekte).

De voorbehoedende serumtoediening tegen diphtheric zal
beperkt moeten blijven tot omgevingen, waar onmiddellijk ge-
vaar voor infectie bestaat, b.v. kinderziekenhuizen, inter-

naten, en families waar een geval van diphtherie voorkomt,
enz.; waar dus voor actieve onvatbaarmaking geen voldoende
tüd is.

Op grond van deze bezwaren, klevend aan de passieve on-
vatbaarmaking, maar niet minder wegens het feit, dat, niet-
tegenstaande de therapeutische toepassing van diphtherie-
serum, nog jaarlijks in ons land ±: 250 kinderen aan diphthe-
rie sterven, voelen we de behoefte aan een actieve onvatbaar-
making ten zeerste. Ook hiervoor heeft Behring den weg ge-
wezen in zijn toxine-antitoxine mengsel.

By actieve immunisatie wordt in het lichaam zelf, dus
„autoloog", antitoxine gevormd. Weliswaar beschikt de actief
onvatbaar gemaakte persoon niet in lengte van dagen over
vry antitoxine in zijn bloed, maar het groote voordeel van
de actieve immuniseering is, dat het lichaam in een allergi-
schen toestand gaat verkeeren, zoodat het in staat is op een
hernieuwden specifieken prikkel door b^i besmetting met
diphtheriebacillen gevormd toxine, te reageeren met oen
nieuwe zeer snelle en ruime productie van antitoxine.

Het toxine-antitoxine mengsel (T.A.) door Behring voor
actieve onvatbaarmaking aangegeven, bevat een overschot
aan toxine, is dus zoogenaamd ondernetdraal. De zich na de
enting vormende homologe antitoxinen waarborgen een lang-
durige giftimmuniteit.

Behring bereidde verschillende toxine-antitoxinemengsels,
waarvan T.A. VI en T.A. VII het meest gebruikt worden.
Het T.A. VII is bestemd voor alle personen ouder dan V/2
jaar. Het wordt, evenals T.A. VI, in bepaalde verdunningen
met physiologische zoutoplossing intracutaan ingespoten. Het
T.A. VII is niet bruikbaar om kinderen beneden l\'/i jaar
onvatbaar te maken. Deze kinderen zyn slechte antitoxine-
vormers, hun gevoeligheid voor T.A. is gering, zoodat Behring
kinderen beneden V/2 jaar voor enting met het zwakkere
T.A. VII ongeschikt acht. Hy gebruikte daarom voor kinde-
ren tusschen 1/0 en l^y jaar een meer toxisch T.A., n.1. het
genoemde T.A. VI. De goede werkzaamheid der T.A. praepa-

raten is niet alleen aan een bepaalden tijdsduur gebonden,
maar ook de samenstelling van het mengsel moet aan zeer
bepaalde eisehen, in verband met het antitoxinebindend
vermogen van het gebruikte toxine, voldoen.

Behring meende, dat de immuniteit steeds gebonden zou
zijn aan de aanwezigheid van vry antitoxine in het bloed.
!Zoodra het antitoxinegehalte van het bloed beneden een ze-
kere grens zou dalen, zou de onvatbaarheid verdwenen zijn,
zoodat volgens hem de immuniteit voor diphtherie na T.A.
behandeling na IY2 tot 2 jaar weer voorbij zou zijn. Deze
opvatting blijkt echter niet juist, zooals ook hier te lande ten
Bokkel Huininck kon aantoonen. Hij kon met zekerheid uit-
maken, dat patienten, die met T.A. behandeld waren, en na
11/2 tot 2 jaar geen belangrijke hoeveelheid antitoxine in hun
serum meer hadden, in een allergischen toestand verkeei-den,
zoodat zü in staat waren om op een nieuwe T.A.-inspuiting
veel sneller met antitoxine-vorming te reageeren dan vroeger.
Hij heeft dit onderzocht bi.j 9 kinderen die ongeveer twee
jaar te voren waren geïmmuniseerd met T.A. en daarop had-
den gereageerd met de vorming van antitoxine in verschil-
lende hoeveelheden en die allen blijkens een antitoxinebepa-
ling van hun bloed een sterke daling van het vroegere anti-
toxine-gehalte vertoonden. Reeds twee dagen na de nieuwe
T.A. inspuiting bleek het bloed een hoog antitoxine-gehalte
te bezitten.

Ten Bokkel Huininck toonde hiei-mee dus aan, dat er
tengevolge van een immunisatie met T.A., een toestand
ontstaat, die het individu in staat stelt met groote snelheid
antistoffen te vormen als reactie op een hernieuwden
specifieken prikkel. Men kan vernachten, dat dergelijke,
met T.A. behandelde en in een allergischen toestand verkee-
rende personen, ook snel antitoxine zullen vormen, zoodra het
bij een natuurlijke infectie met diphtheriebacillen tot resorp-
tie van diphtherietoxine komt.

Ook Aldershoff (2) kon, in verband met de reactie van
Schick, aantoonen, dat het ontbreken van vry antitoxine in het

bloed nog niet gemis aan onvatbaarheid beteekent, dat er dus
een latente immuniteit bestaat. Van 24 kinderen, die diphthe-
rie hadden gehad, vertoonden 11 een positieve reactie van
Schick en 13 een negatieve i-eactie. Van 33 verpleegsters, die
diphtheriepatienten hadden verpleegd, vertoonden 15 een
positieve reactie. Wanneer men bij dergelijke, waarschijnlijk
onvatbare, personen 0,1 cc T.A. van Behring in verdunning
1/40 intracutaan inspuit, dan ziet men in veel gevallen hierop
een sterke reactie ontstaan. Dit is een bewijs, dat deze per-
sonen reeds gesensibiliseerd zijn. Personen, die een positieve
reactie van Schick vertoonen als uiting van vatbaarheid, rea-
geeren zeer zelden op deze gift T.A. intracutaan.

Verder vond Aldershoff, dat, wanneer men drie ä vier da-
gen na de positief uitgevallen reactie van Schick bij volwasse-
nen of kinderen, die diphtherie hebben gehad, de reactie
nogmaals uitvoert, deze in eenige gevallen negatief is ge-
worden. Door den prikkel, uitgeoefend door de kleine hoe-
veelheid toxine, by de eerste reactie van Schick ingebracht,
is er dus weer vrij antitoxine in voldoende hoeveelheid ge-
vormd.

De reactie van Schick bcwyst dus niet de aanwezigheid of
afwezigheid van vatbaarheid, maar is alleen een reactie
op de al of niet aanwezigheid van vrij antitoxine. Zij behoudt
echter voor jonge kindei-en haar waarde, omdat die kinderen
nog slechts zelden op natuurlijke wijze onvatbaar zyn ge-
worden.

Bü behandeling met T.A. van Behring is in den regel de
vorming van antitoxine eerst drie weken na het begin van
de behandeling aan tc toonen en ook dän herhaaldelijk nog
maar in geringe hoeveelheid, temijl die hoeveelheid in den
loop van de tweede maand stijgt. De T.A.-behandeling is dus
in verband met den betrekkelijk langen tijd, die voor de vor-
ming van antitoxine noodig is, ongeschikt voor toepassing
bü personen, die al met diphtheriebacillen besmet zyn. Deze
menschen zullen behandeld moeten worden met voorbehoe-

dende seruminspuitingen om direct tegen de toxinen van de
bacillen beschermd te worden. Deze bescherming duurt ech-
ter slechts twee tot drie weken. Men heeft daarom getracht
de passieve immunisatie te combineeren met de actieve. De
eerste drie weken zou dan het ingebrachte heterologe serum
de beschuttende werking kunnen uitoefenen, terwijl dan
na dien tijd het door de actieve immunisatie ontstane
antitoxine de beschermende rol zou kunnen overnemen. In
enkele gevallen gelukt dit inderdaad, maar in verreweg de
meeste gevallen blijkt, dat het ingebrachte antitoxine de ac-
tieve onvatbaarmaking verhindert, zooals Zingher ondervond.

Zingher was in twee weesinrichtingen bezig met de actieve
immunisatie tegen diphtherie. In de eerste inrichting was
alleen nog maar de reactie van Schick uitgevoerd, in de
andere was de eerste inspuiting met het Amerikaansche T.A.
reeds gegeven, toen in deze weeshuizen diphtherie uitbrak.
Men diende nu een voorbehoedende serumdosis toe, terwijl
men met de actieve immunisatie verder ging. Het resultaat
was, dat na drie maanden een groot deel der behandelde kin-
deren nog een positieve reactie van Schick vertoonde. De
combinatie van passieve en actieve immunisatie heeft men
daarna in Amerika geheel opgegeven. Is passieve immuni-
satie noodig, dan wacht men in die gevallen twee maanden,
vóórdat men een T.A. behandeling laat volgen.

In verband met de door Zingher opgedane ervaring, dat
een wegens het optreden eener epidemie noodzakelijk gewor-
den inspuiting met serum, den uitslag der reeds begonnen
actieve onvatbaarmaking te niet deed, stelde Aldershoff
zich, bij het onderzoek naar onvatbaarheid bij personen, die
diphtherie hadden gehad, de vraag, of en in hoeverre de toe-
diening van antidiphtherieserum tydens de ziekte invloed
uitoefent op het ontstaan van onvatbaarheid. Van 23 per-
sonen, die diphtherie hadden gehad en met antiserum waren
behandeld, vertoonden 15 toch nog een positieve reactie van
Schick. Hieruit volgt, dat het ontstaan van natuurlijke im-
muniteit door serumbehandeling belemmerd wordt.

De ervaringen opgedaan met het T.A. van Behring zijn
over het algemeen niet groot, in verhouding misschien nog
het grootst hier te lande. (Ten Bokkel Huininck, Hulshoff
Poll, Kramer, Aldershoff).

Schreiber (4) behandelde 40 patienten met T.A. van Beh-
ring. Uit zijn onderzoek blijkt, dat door middel van eenige
injecties met T.A. een antitoxinegehalte van het bloed te ver-
krijgen is, groot genoeg om een zekere beschutting tegen een
niet te sterke bacterieele infectie te geven.

Hahn (5) immuniseerde 40 patienten. Het gelukte hem in
de meeste gevallen in drie tot vijf weken, zonder schade voor
het organisme, een actieve onvatbaarheid tot stand te bren-
gen. Hü meent, dat men bij een epidemie de klinisch nog ge-
zonden met het T.A. van Behring dient in te spuiten, hetgeen
op grond van het voorafgaande minder juist moet worden
geacht.

Kleinschmidt en Viereck (5) spoten een dertienjarig
meisje in met T.A. van Behring. Het bloed van dit kind bleek
na 17 dagen een zeer hoog antitoxinegehalte te bezitten.

In 1914 deelde Behring (6) mede, dat ongeveer 7000 in-
jecties met zyn T.A. uitgevoerd waren. In verband met het
resultaat van deze injecties meende Behring te kunnen
zeggen, dat bij geregelde toepassing van zyn T.A., de diphthe-
rie als endemische ziekte tot verdwijnen zou zyn te brengen,
even goed als pokken door koepokenting.

Röhmer (7) ging de antitoxinevorming bü zuigelingen na.
Hij onderzocht 46 kinderen van 21/^ maand tot l^/y ji^ar oud
en vond, dat na de injectie in 17 gevallen geen antitoxine in
het bloed was aan te toonen. Bovendien was er een duidelijk
onderscheid te merken tusschen kinderen, jonger dan 4V1>
maand en oudere kinderen. Bij de jongste kinderen was het
resultaat zeer gering. Immers, kinderen jonger dan 6 maan-
den zijn als regel passief immuun.

Ten Bokkel Huininck (8) toonde door een onderzoek op
een groot aantal schoolkinderen aan, dat het T.A. mengsel
van Behring in staat is op ongevaarlijke wijze bij den mensch
de vorming van antitoxine op te wekken. Tevens kon hij be-

wijzen, dat ook na T.A.-injectie een allergische toestand ont-
staat, die het organisme in staat stelt als reactie op een
hernieuwde inspuiting, in zeer veel korter tijd dan voordien,
antitoxine te vormen; dat dus geënte personen ook in dit op-
zicht geheel gelijk te stellen zijn met hen, die op natuurlijke
wijze onvatbaar zijn geworden. Tijdens diphtherie-epide-
mieën in scholen, weeshuizen, enz., beveelt hij aan: actieve
immunisatie met behulp van T.A.-inspuitingen, waartegen
evenwel dezelfde bezwaren bestaan, als die naar aanleiding
van Hahn\'s opvattingen geuit.

Ook Kramer (9) komt op grond van zijn ervaringen tot
dezelfde inzichten. Hij zegt: „Wil men bij epidemieën of bij
dreigende epidemieën voorbehoedend ingrijpen, dan moet m.i.
de gedragslijn de volgende zijn:

lo. In het gezin, waar diphtherie is voorgekomen, aan de
medeverdachte kinderen een voorbehoedende serum-
gift geven; bij de overige gezinsleden de reactie van
Schick toepassen en bij een positieve uitkomst dezen
met T.A. behandelen.

2o. Bij schoolepidemieën, e.d., de op Schicktoxine positief
reageerende kinderen met T.A. inspuiten.

In weeshuizen, gestichten, kinderhuizen voor vacantieko-
lonies, en dergelijke meer, zal men zonder veel bezwaar, ook
zonder dat er diphtherie heerscht, zuiver uit voorzorg dus,
naar gelang van den uitslag van de reactie van Schick, een
T.A. behandeling kunnen instellen."

Kramer (10) onderzocht verder bij 114 verpleegsters, die
diphtherie-patienten moesten verzorgen, de immuniteit tegen
diphtherie met behulp van de reactie van Schick. In die ge-
vallen, waarin de reactie positief was, werd T.A. ingespoten.
Was de reactie negatief, dan werd geen behandeling toege-
past. De verpleegsters, die met T.A. behandeld waren, kregen
over het algemeen geen diphtherie, terwijl bij de onbehandel-
den, met een negatieve reactie van Schick, wel gevallen van
deze ziekte voorkwamen.

De reactie van Schick valt negatief uit, wanneer per cc
bloed 1/30 A.E. of meer, aanwezig is. Voor volwassenen
schynt, blijkens de uitkomsten die Kramer kreeg, deze grens
van 1/30 A.E. per cc te laag te zijn om voldoende te beschut-
ten. Kramer raadt daarom aan, alle volwassenen, die met
diphtheriepatienten in aanraking komen, regelmatig met
T.A. te behandelen, ook al vertoonen deze menschen een
negatieve reactie von Schick.

Bieber (11) vond het groot aantal entingen, noodig by de
T.A. behandeling volgens Behring, een bezwaar voor de al-
pmeene practische toepassing. Dikwijls zijn vijf inspuitingen
intracutaan noodig om onvatbaarheid te veroorzaken, d.w.z.
om een voldoende antitoxinegehalte van het bloed te verkrij-
gen. Bieber trachtte daarom een entstof te bereiden, die op
een eenvoudige manier te gebruiken was. Verder moest deze
stof de onvatbaarheid snel tot stand brengen, en bovendien
onschadelijk voor het organisme zyn. Hij probeerde eerst
zijn doel te bereiken met behulp van sterk verdund toxine.
Maar de antitoxinevorming was hierbij na één of twee entin-
gen gering. Om met dit verdund toxine een goede immuniteit
te verkrijgen, zouden zeer veel entingen noodig zyn, wat weer
practisch onuitvoerbaar is. Daarom keerde Bieber weer te-
i\'ug tot proeven met een T.A.-mengsel, waarin meer anti-
toxine aanwezig was dan in het T.A. van Behring. Hy onder-
zocht de werking van dat mengsel door by 80 menschen in-
spuitingen ermee te verrichten en vond, dat bü 70 % één
enting subcutaan voldoende was om onvatbaarheid te ver-
oorzaken. Bij 30 % van de personen waren twee entingen
noodig. Vier weken na de eerste enting werd een voldoend
antitoxinegehalte van het bloed gevonden.

Waar Bieber niet aangeeft of zyn mengsel nog toxisch is,
valt het resultaat, in verband met de vraag of neutrale en
overneutrale mengsels ook immuniseeren, niet voldoende te
beoordeelen.

onvatbaarheid is te verkrijgen, zijn aan deze methode ver-
schillende bezwaren verbonden. De enting in de huid is tech-
nisch moeilijk. De herhaalde entingen, twee tot vijf in aan-
tal, zijn lastig voor het kind, voor de ouders en ook voor den
arts. Verder is de juiste samenstelling van het toxine-anti-
toxinemengsel van Behring niet nauwkeurig bekend, en is de
giftigheid niet steeds dezelfde (Aldershoff). Behring liet zich
over de juiste samenstelling van zijn toxine-antitoxinemeng-
sel niet uit. Er is slechts van bekend, dat het onderneutraal
is, d.w.z. dat het aanwezige toxine slechts gedeeltelijk geneu-
traliseerd is door het antitoxine.

Bovenstaande bezwaren hebben ertoe geleid, dat de intra-
cutane methode van Behring vervangen werd door de subcu-
tane; een methode, die door Park en Zingher in New-York
is aangegeven. Deze methode heeft de volgende voordeelen
boven die van Behring. De toepassing is eenvoudig. Er zijn
maar drie subcutane inspuitingen noodig, telkens met één
week tusschenruimte. De samenstelling van het toxine-anti-
toxinemengsel is bekend, terwijl de methode reeds op groote
schaal is toegepast.

Oorspronkelijk gebruikten Park en Zingher een toxine-
antitoxinemengsel van de samenstelling 0.85 Lf gemengd
met 1 AE, d.w.z. dat een hoeveelheid antitoxine, die in staat
is 100 d.l.m. te binden, gemengd wordt met 85/100 deel van
Lf. Lf is de hoeveelheid toxine, die gemengd met 1 A.E. nog
juist in staat is een cavia van 250 gram in 4 dagen te doo-
den, dus nog 1 d.l.m. vrij toxine bevat. Berekent men dit voor
een toxine, waarvan Lf is 0.35 cc. en de d.l.m. is 0.007 cc. dan
blijkt, dat op 0.85 X 0.35 = 0.2975 cc. toxine, bevattend

^^ . = 42.5 d.l.m., komt 1 A.E., die in staat is 100 d.l.m.
toxine te neutraliseeren. Het T.A. mengsel is dus volgens
deze berekening ^ = 2.35 maal geneutraliseerd, d.w.z. sterk
overneutraal. Toch is het in proeven op dieren onderneutraal,
het is toxisch. Wanneer men uitgaat van de tusschen Lf en
d.l.m. bestaande verhoudingen,.is schijnbaar overmaat anti-

Bij de bereiding van een T.A.-mengsel moet men dus reke-
ning houden met de antitoxinebindende eigenschappen van
het gebruikte toxine en niet uitgaan van een schema, ont-
leend aan de theoretische verhoudingen tusschen Lf, d.l.m.,
en A.E. Controle door proeven op dieren blijft steeds nood-
zakelijk, waarbij door Banzhaf (12), die de mengsels van
^ark en Zingher standaardiseert, voor dit oude mengsel, 0.85
^ aangegeven, dat 1 cc. bij een cavia van

gram slechts een gering infiltraat mag geven en geen
verlamming, terwijl 5 cc. een duidelijke plaatselijke reactie
gevolgd door verlamming, dus geen acuten dood, mag ver-
oorzaken.

Dit mengsel, 0.85 Lf 1 A.E., bevat een groote hoeveel-
heid toxine, die echter voor een groot deel is geneutraliseerd.
Nu rijst de vraag: kan men dezelfde uitwerking bereiken door
een kleinere hoeveelheid toxine in te spuiten, die voor een
kleiner deel door antitoxine is geneutraliseerd? De voordee-
len hiervan zijn, dat men minder proteïnen, afkomstig van de
bacteriën en van den voedingsbodem, en minder eiwit,
afkomstig v?n het voor neutraliseering toegevoegde serum,
in het mengsel heeft. Vooral dit laatste is een voordeel,\'
daar toch herhaalde inspuitingen van zeer kleine hoe-
veelheden vreemd eiwit, het gevaar voor overgevoeligheid
voor dit eiwit doen ontstann. Dat dit bij de enting met T.A.
practische waarde heeft, blijkt uit de onderaoekingen van
Hooker (13) over de opwekking van overgevoeligheid door
zeer kleine hoeveelheden paardenserum; met T.A. behandelde
personen vertoonen een overgevoeligheid van de huid. Park
bevestigt dit, met de opmerking, dat deze overgevoeligheid
echter heel wat zwakker is dan bü personen, die vroeger be-
handeld zün met therapeutische seruminspuitingen. Hooker
acht deze ovei^evoeligheid echter geen reden om bü de be-

relding\' der T.A.-mengsels van serum, afkomstig van een
ander dier dan van het paard, gebruik te maken, zelfs niet,
als in de toekomst alle kinderen tegen diphtherie zouden
worden geïmmuniseerd. Waar men over schapendiphtherie-
serum beschikt, zooals in het Rijks Serologisch Instituut (R.
S. I.) te Utrecht, veixiient bereiding van T.A. met behulp van
dit serum toch aanbeveling. Zeker is het van groot be-
lang om de hoeveelheid vreemd eiwit in het toxine-antitoxine-
mengsel zoo gering mogelijk te doen zijn.

Volgens dit beginsel hebben Park en Zingher (14) hun
nieuw T.A. bereid. Dit bevat per cc. 0.1 Lf -f 0.075 A.E., dus
per cc. heel wat minder toxine, maar ook absoluut en in ver-
houding minder antitoxine. Ook hier bestaat controle door
proeven op dieren, n.1. 1 cc. moet steeds verlamming geven,
die meestal na 18 dagen doodelijk afloopt, terwijl 5 cc. in
10 dagen, maar ook niet eerder, den dood veroorzaakt. Het
mengsel is wat meer toxisch dan het vroeger gebruikte 0.85
Lt 1 A.E., maar de reactie bij den mensch is geringer,
doordat het minder proteïnen bevat. De onvatbaarmakende
werking is even goed gebleken als van het vroeger gebruikte
mengsel. Na inspuiting van 1 cc. per keer is de reactie ge-
ring. Tegenwoordig wordt het mengsel, bereid volgens het
beginsel (niet volgens het schema) van Park en Zingher, door
het R. S. I. afgeleverd.

Dat dit middel, T.A.U(trecht),goederesultatengeeft,blijkt
uit mededeelingen daaromtrent van den geneeskundigen in-
specteur Dr. Doyer. Bij de entingen te Uitgeest bleek, dat bü
319 kinderen, die vóór de enting een positieve reactie van
Schick vertoonden, deze na de enting nog positief was geble-
ven bij 9 kinderen, d.i. 2,8 %, terwijl 18 kinderen, d.i. 5.6 %,
nog zeer zwak reageerden. Bij 91.5 % kan dus de enting als
geslaagd worden beschouwd. Dr. Doyer zegt: „Dit resultaat,
wordt nog overtroffen door de practische gevolgen, want
sinds de vaccinatie werd ingesteld, hebben zich te Uitgeest
geen gevallen meer voorgedaan. Het practisch resultaat is
dus 100 %."

Opgemerkt dient te worden, dat er nog voorstanders zijn
voor de intracutane methode, zij het dan ook op andere gron-
den. Böhme en Riebold (15) meenen, dat de methode van
Behring voor Duitschland te duur is en dat zij daarvoor in
de plaats moeten stellen het gebruik van hun „diphtherie-
lymphe". Dit bestaat uit een emulsie van levende diphtherie-
bacillen. Deze diphtherielymphe wordt op dezelfde manier
toegepast als koepokstof. Böhme en Riebold hebben 62 per-
sonen met hun lymphe behandeld. Zij vonden, dat van het ge-
bruik van levende, toxine-afscheidende diphtheriebacillen
geen nadeelige gevolgen zijn te vreezen. Toch heeft deze me-
thode tegenover de onderhuidsche inspuiting zooveel nadee-
len, dat practische toepassing geen aanbeveling verdient.

Naast de genoemde voordeelen bezit T.A. echter ook
nadeelen. Het blijft toch altijd toxisch. En dat de toxiciteit
door allerlei invloeden kan toenemen, blijkt uit het feit, dat
in Amerika eenmaal door aflevering van een toxisch mengsel
door een „commercial laboratory", in een der zuidelijke ste-
den acht dooden onder de ingespoten kinderen te betreuren
waren. Dit T.A. bleek n.1. bevroren te zijn geweest, waardoor
blijkbaar toxine was vrijgekomen. Ook de doodelijke gevallen
die zich in Oostenrijk hebben voorgedaan, wijzen erop, dat
bij de bereiding en toediening van T.A. alle noodige voorzor-
gen moeten worden genomen.

Verder bestaat het gevaar, dat de geënte persoon gevoelig,
c.q. overgevoelig is voor het serumeiwit van het antitoxine uit
het T.A.-mengsel. Verder laat de standvastigheid van de T.A.
mengsels te wenschen over. Op den duur treden er verande-
ringen in op, waardoor de goede werking verloren gaat en
gevaren bij het gebruik kunnen ontstaan.

Bovenstaande bezwaren hebben ertoe geleid, pogingen in
het werk te stellen om een geheel ongiftig toxine, dat echter
zijn onvatbaarmakende antigeenwerking behouden heeft, in
handen te krijgen. Verschillende onderzoekingen in deze rich-
ting zijn dan ook gedaan.

deling van diphtherietoxine met formol ook de onvatbaar-
makende werking verloren ging. Toevoeging van formaline
en maandenlang verblijf bij broedtemperatuur ontnam naar
hun ervaring het toxine ook zijn onvatbaarmakende werking.
Hun ervaring is echter in strijd met die van tal van anderen.

Glenny en Sudmersen (17) vonden, dat caviae na inspuiten
van met formaline bewaard toxine, geen reactie gaven, maar
wel onvatbaar werden.

Glenny en Hopkins (18) voegden aan diphtherietoxine één
per duizend formaline toe en verwarmden dit vier weken lang
op 37° C. De giftigheid van het toxine was hierdoor sterk
verminderd maar niet geheel verdwenen. Met dit „modified
toxin" of „toxoid"(??) deden zij proeven op konijnen en
vonden, dat de onvatbaarmakende werking van diphtherie-
toxine stijgt, indien het toxine veranderd is in toxoid. In ieder
geval kan worden gezegd, dat formol aan het toxine zijn toxi-
sche werking ontneemt en de antigeen - d.i. antistofverwek-
kende - werking doet behouden. Ja, het schijnt zelfs, dat de
toxische factor de antigeen factor belemmert.

Practische \'beteekenis heeft echter dit ontgifte toxine pas
gekregen door den arbeid van Ramon (19) in het Instituut
Pasteur te Parijs. Hij vond, dat zich in een mengsel van diph-
therietoxine en -antitoxine een vlokkig neerslag vormt, het
duidelijkst bij 37° C. Het neerslag ontstaat het eerst in dat
mengsel, waar het toxine juist door het antitoxine geneutra-
liseerd wordt, (floculation initiale). Dit mengsel vertoont bü
een cavia geen toxische werking meer, terwül ook de be-
schuttende werking verdwenen is, d.w.2. er is noch vrü toxi-
ne, noch vrü antitoxine aanwezig.

Met behulp van deze uitvlokkingsreactie is de .sterkte van
een antitoxine of toxine te bepalen, indien men een toxine of
antitoxine van bekende sterkte in handen heeft. Deze methode
geeft veel snellere uitkomsten dan de proeven op dieren en
spaart vele dieren uit. De toepassing van de reactie is een-
voudig, hoewel ervaring voor betrouwbare aflezing vereischt
wordt, en het gebruik van een sterk toxine noodig is, daar

Het denkbeeld om antitoxische sera te titreeren door mid-
del van uitvlokking met toxine, is niet van Ramon afkomstig.
Reeds in 1909 gebruikten Calmette en Massol de uitvlokkings-
reactie bij het titreeren van antislangenbeetserum.

Nicolle, Césari, en Debains (20) brachten het beginsel in
toepassing bij het titreeren van diphtherie- en tetanus-serum
door middel van een ringreactie, die ontstaat, als met toxine
vermengde gestolde gelatine wordt overgoten met antitoxisch
serum.

Georgi (21) vond, onafhankelijk van de genoemde onder-
zoekers, dat antitoxische sera door uitvlokking kunnen wor-
den getitreerd. Hij merkte op, dat, wanneer hij bij een meng-
sel van toxine en antitoxine gecholesterineerd hartextract
voegde, uitvlokking optrad ongeveer bij het neutrale punt.
Evenwel is aan Georgi ontgaan, dat reeds ook door eenvou-
dige menging van toxine en antitoxine een neerslag ontstaat.

Ramon voegde aan zijn mengsels van toxine en antitoxine
0-2 per duizend formaline toe, teneinde omzettingen door be-
smetting met levende kiemen tegen te gaan. Hij merkte op,
dat deze formalinetoevoeging geen invloed had op het uitvlok-
Kend vermogen van het toxine. Toxine, waaraan foi-maline
was toegevoegd en dat geruimen tijd aan het licht was bloot-
gesteld geweest, behield zyn waarde om door middel van uit-
vlokking de sterkte van een serum te bepalen. De toxische
eigenschappen namen sterker af, naarmate het formaline
langer inwerkte, totdat ten slotte een toxine ontstond, dat
geheel onschadelijk werd voor een dier. De omzetting van het
toxine in dit ongiftige product kon volgens Ramon worden
bespoedigd door toevoeging van méér formaline en door hoo-
gere temperatuur. De onvatbaarmakende werking bleef be-
houden. Toxine, waaraan 3 a 4 per duizend formaline wordt
toegevoegd en dat een zekeren tijd aan een temperatuur van
370—42° C. wordt blootgesteld, blijft met dezelfde hoeveel-
heid antitoxisch serum de uitvlokkingsreactie geven. De
reactie verloopt iets langzamer als met het oorspronkelijke

toxine, maar dit ongiftige toxine, „anatoxine" volgens Ra-
mon, geeft bij een cavia noch plaatselijke noch algemeene
verschijnselen, zelfs niet in groote giften van b.v. 5 cc. Een
toxine, dat door invloed van formaline en een temperatuur
van 37°—42° C. zijn toxische eigenschappen heeft verloren,
maar zijn uitvlokkend vermogen nog bezit, heeft ook zijn
immuniseerende eigenschappen bewaard. Er blijkt dus een
rechtstreeksche verhouding te bestaan tuschen het uitvlok-
kend vermogen en de onvatbaarmakende werking. De anti-
geenwerking wordt dus bepaald door het uitvlokkend vermo-
gen, niet door de toxiciteit. Hoe meer antitoxine-eenheden een
bepaalde hoeveelheid anatoxine noodig heeft om uit te vlokken
en hoe sneller deze uitvlokking plaats heeft, des te sterker
is het onvatbaarmakend vermogen. Door middel van de uit-
vlokkingsreactie van Ramon is \'het dus mogelijk de immu-
niseerende werking van anatoxine te bepalen.

Ramon heeft met zijn anatoxine proeven gedaan op caviae.
Veertien dagen na een onderhuidsche inspuiting van 1 cc.
anatoxine, verdraagt een cavia reeds meerdere doodelijke gif-
ten toxine. Ramon vond verder, dat hij met zijn anatoxine
ook paarden kon immuniseeren.

Nadat Ramon bij dieren goede resultaten verkregen had, is
het anatoxine ook toegepast om kinderen tegen diphtherie te
immuniseeren. Het is gebleken, dat het anatoxine ook bij den
mensch onvatbaarheid veroorzaakt. Zoeller meent zelfs na G
weken 100 % goed gevolg te zien.

Uit mededeelingen van Darré, Loiseau, LafFaille, Roubino-
vitch en Zoeller (22) valt af te leiden: anatoxine werkt bij
den mensch als antigeen. De vóór de enting positieve reactie
van Schick wordt negatief en het serum van den patient bevat
antitoxine. Deze vorming van antitoxine gaat snel, sneller
dan met toxine-antitoxinemengsel. De onvatbaarheid ontstaat
bü 88.7 % der geënten na 5 a 6 weken en bij 98.8 % na 8
weken. Verder behoudt het serum van den patient langen tijd
zijn antitoxische werking. Volgens deze onderzoekers is de
plaatselijke en algemeene reactie zelden merkbaar en hoogst

zelden van eenige beteekenis, waarbij echter dient te worden
opgemerkt, dat z« jonge kinderen beneden 6 jaar immuni-
seerden. Indien bij deze een plaatselijke reactie ontstaat, ver-
dwijnt ze weer spoedig. De algemeene reactie uit zich door
lichte temperatuursverhooging, die niet parallel gaat met de
plaatselijke reactie.

Park en Zingher (23) hebben ook reeds proeven genomen
met „toxoid". Dit toxoid was niet geheel ongiftig, maar had
nog zwak toxische eigenschappen. Zij voegden nog antitoxine
toe, zoodat zij dus eigenlijk werkten met een toxine-antitoxi-
nemengsel, waarin verzwakt toxine aanwezig was. De wer-
king van dit mengsel bleek minder toxisch dan van hun
oude toxine-antitoxinemengsel, hetgeen niet te verwonderen
IS. De plaatselijke reactie, toegeschreven aan de aspecifieke
proteïnen, was bij kinderen echter zeer sterk, ook bij tien-
voudige verdunning. Ook hun bleek, dat het onvatbaarma-
kend vermogen niet afhangt van de toxiciteit, maar van het
vermogen om antitoxine te binden. Vandaar, dat zü er toe
overgingen onderzoekingen te doen met geheel atoxisch ana-
toxine, bereid volgens de methode van Ramon, door 4 tot 5
weken verwarmen op 38° C. na toevoeging van 2 a 3 per dui-
zend formaline. De onvatbaarmakende werking van het ana-
toxine bleek even goed te zijn als van T.A., maar de plaatse-
lijke reactie was zeer sterk door het groote proteinegehalte
van het anatoxine. Ook bü tien- tot twintigvoudige verdun-
ning bleef de plaatselijke reactie bestaan.

Ramon raadt daarom voor het immuniseeren met ana-
toxine den leeftijd van li/o—6 jaar aan, omdat die kinderen
meestal nog niet gesensibiliseerd zijn voor de bacteriënprote-
inen, daar zü als regel nog niet in aanraking geweest zijn met
diphtheriebacillen, zoodat de plaatselijke reactie by die kin-
deren gering is.

Aldershoff (3) vond, dat na toevoeging aan tliphtherietoxine
van 3 a 4 per duizend formaline, de tijd, die noodig is om een
geheel ongiftig anatoxine te verkrijgen, afhankelijk is van
de temperatuur, waaraan het toxine wordt blootgesteld en

■dat een langzame ontgifting gedurende vier tot vijf weken bij
37° C. de voorkeur verdient boven een snellere bij 40°—42°
C., zooals oorspronkelijk door Ramon werd aangegeven. Het
immuniseerend vermogen bleef in het eerste geval iets beter.
Hij stelt als eisch van onschadelijkheid, dat 5 cc. by een cavia
onderhuids ingespoten, geen plaatselijke of algemeene reactie
verwekt.

Wanneer toxine eenigen tijd op 75° C. verhit wordt, zooals
noodig is om het toxine zijn giftigheid te doen verliezen, ver-
liest het zijn uitvlokkend vermogen, terwijl ook de immuni-
seerende eigenschappen bijna geheel verloren zyn. Dit blijkt
o.a. ook uit onderzoekingen in het R. S. I. Vijf caviae werden
drie maal met 1/2 cc. van gedurende tien minuten op 75° C.
verhit toxine ingespoten. Na twee maanden vertoonden vier
van de vyf caviae nog een positieve reactie van Schick en
verdroegen een tienvoudige d.l.m. niet. Slechts het vyfde dier
vertoonde een negatieve reactie van Schick en verdroeg een
tienvoudige d.l.m. zonder bezwaren. Dit dier vertoonde vóór
de enting een positieve ware en een positieve pseudoreactie
van Schick en was dus waarschijnlijk al in aanraking ge-
weest met diphtheriebacillen, zoodat het dier reeds gesensibi-
liseerd, allergisch was. De geringe antigeen prikkel van het
verhitte toxine is hier misschien voldoende geweest om
bij dit allergische dier de beginnende onvatbaarheid volledig
te maken. Dat de immuniseerende werking van dit verhitte
toxine zeer zwak was, is in overeenstemming met het ver-
dwenen zijn van het uitvlokkend vermogen.

Wanneer toxine echter door langdurige verwarming en
toevoeging van formaline geheel omgezet is in anatoxine, ver-
andert door verwarming het uitvlokkend vermogen niet meer,
zooals Ramon door verwarming van anatoxine op 72° aan-
toonde, terwijl ook de onvatbaarmakende werking blijft be-
staan. Het onder invloed van formaline uit toxine ontstane
anatoxine is dus blijkbaar geheel iets anders dan door warmte
verzwakt toxine; het verschilt daarvan in wezen.

tracutane inspuiting met anatoxine nagaan, dat by den
mensch de onvatbaarheid sneller tot stand komt, naarmate
de allergie sterker is ontwikkeld. Hy onderscheidt vier ver-
schillende toestanden, waarin de mensch zich kan bevinden,
n.1.:

1°. toestand: reactie van Schick is positief, de pseudo-
reactie is negatief, d.w.z. de persoon is gevoelig voor
diphtherietoxine en nog nooit met diphtheriebacillen
in aanraking geweest, is „ongerept."

2°. toestand: reactie van Schick is positief, de pseudo-
reactie is positief, d.w.z. de persoon is gevoelig voor
diphtherietoxine en is vroeger al in aanraking ge-
weest met diphtheriebacillen, is dus gesensibiliseerd,
»» allergisch".

3°. toestand: reactie van Schick is negatief, de pseudo-
reactie is positief, d.w.z. de persoon is ongevoelig voor
diphtherietoxine, maar wel gevoelig voor bacteriënpro-
teïnen, hy is „allergisch onvatbaar".

4°. toestand: reactie van Schick is .negatief, de pseudo-
reactie is negatief, d.w.z. de persoon is ongevoelig voor
diphtherietoxine en ongevoelig voor bacteriënproteï-
nen, dus „anergisch onvatbaar".

Zoeller vond nu dat menschen met positieve pseudoreactie
Van Schick in 50 % van de gevallen onvatbaar gemaakt kon-
den worden door één inspuiting; in 100 % door twee inspui-
tingen. Menschen met een negatieve pseudoreactie van Schick
konden met één inspuiting niet geïmmuniseerd worden, ter-
wyl na twee inspuitingen 50 % onvatbaar werd.

Menschen, die in een allergischen toestand verkeeren, zyn
dus makkelijker te immuniseeren dan menschen met een ne-
gatieve pseudoreactie van Schick, of wel: Dc onvatbaarheid
komt des te nelier tot stand, naarmate dc allergie sterker is
ontivikkeld,

Aldershoff kon deze ervaringen van Zoeller proefondervin-
delijk bevestigen. Hij nam daartoe twee groepen van caviae.

De eerste groep bestond uit dieren met positieve ware en
negatieve pseudoreactie van Schick, d.w.z.: dieren die gevoe-
hg waren voor diphtherietoxine en nooit met diphtherieba-
cillen in aanraking waren geweest, dus ongerepte dieren. De
tweede groep bestond uit caviae met positieve ware en po-
sitieve pseudoreactie van Schick, d.w.z.: dieren die gevoelig
waren niet alleen voor diphtherietoxine, maar ook voor bac-
teriënproteïnen, omdat ze reeds vroeger met diphtheriebacil-
len in aanraking waren geweest. Deze caviae waren namelijk
gevoelig gemaakt voor de bacteriënproteïnen door ze van te
voren in te spuiten met doode diphtheriebacillen.

Hij stelde zich nu de vraag: worden de dieren uit de twee-
de groep, die reeds voor bacteriënproteïnen zijn gesensibili-
seerd, na behandeling met anatoxine eerder onvatbaar dan
die dieren, die nooit met bacteriënproteïnen in aanraking
waren geweest?

Na twee en drie inspuitingen met anatoxine, telkens V2 cc.
met één week tusschenruimte, waren de dieren onvatbaar
voor een tienvoudige d.l.m. By ongerepte caviae werd de
reactie van Schick na één maand negatief, terwijl de pseudo-
reactie, die onstaan was onder invloed van het anatoxine in
veel gevallen weer negatief werd, d.w.z.: dat een gedeelte der
dieren ten opzichte van de bacteriënproteïnen weer is ge-
desensibiliseerd.

Deze onderzoekingen omtrent de onvatbaarmaking met
anatoxine doen tevens zien, geheel in overeenstemming met
de resultaten die Ramon verkreeg, dat anatoxine sneller on-
vatbaar maakt dan toxine-antitoxinemengsel, hetgeen trou-
wens niet kan verwonderen, daar het ongiftige anatoxine
onverdund wordt ingespoten, terwijl in T.A. het anti geen in
sterke verdunning aanwezig is. De reactie van Schick
werd by de gesensibiliseerde caviae reeds na 14 dagen
zwak positief of negatief. By\' de ongerepte caviae duurde
dit een maand. De gesensibiliseerde dieren werden dus
sneller onvatbaar dan de ongerepte dieren. De onvatbaar-
heid komt ook hier des te sneller tot stand, naarmate de aller-

gie sterker is ontwikkeld, hetgeen, zooals wij boven zagen,
Zoeller ook reeds bij den mensch aantoonde.

Ook bij paaixlen is met anatoxine onvatbaarheid te ver-
wekken. Sterke hyperimmunisatie, die zich uit door een hoog
antitoxinegehalte van het bloedserum, is mogelijk, zooals uit
onderzoekingen van Ramon is gebleken. De tyd, waarin dit
hooge antitoxinegehalte van het bloedserum ontstaat, is vol-
gens Ramon bü behandeling met anatoxine ± 6 weken, ter-
wijl ,by behandeling met toxine-antitoxinemengsel het twee-
maal \'ZOO lang duurt, voordat hetzelfde antitoxinegehalte
wordt verkregen. Verder woi-dt het paard bij behandeling
met anatoxine niet telkens weer blootgesteld aan den toxine-
pi\'ikkel, zoodat de gezondheidstoestand van het dier veel be-
ter is en het paard ook veel langer te gebruiken zou zyn.

De ervaringen in het R. S. 1. met hyperimmunisatie van
paarden door anatoxine opgedaan, zijn echter niet zoo gunstig
als die van Ramon, vooral wat betreft den eindtiter van het
verkregen serum. Toch is het gelukt op deze wijze sera te ver-
kregen van 700 \'A.E. per cc.

De vraag is: moet by het onvatbaar maken tegen diphthe-
rie het T.A.U. vervangen worden door anatoxine? Aangezien
de onvatbaarmakende werking van het anatoxine wel vast-
staat, is men geneigd deze vraag bevestigend te beantwoor-
den en het door Loiseau, Park en Zingher, e.a. gegeven voor-
beeld te volgen. Maar onverdund anatoxine geeft vooral by
kinderen boven 6 jaar en by oudere menschen een sterke
plaatselijke proteïnereactie, doordat deze personen meestal
allergisch zyn voor bacteriënproteïnen. Deze plaatselijke
reactie is onschuldig, maar vormt toch voor de algemeene
toepassing van anatoxine een gi\'oote belemmering.

Men zou anatoxine kunnen verdunnen en wel in die mate,
dat ook by volwassenen de plaatselijke proteïnereactie niet
sterker is dan by gebruik van T.A.U. Maar dan is de vraag:
werkt in die mate verdund anatoxine zeker en betrouwbaar
immuniseerend? Is dit niet het geval, dan moet getracht wor-

den een anatoxine te krijgen, dat zooveel mogelijk is bevrijd
van proteïnen, zoodat, ook onverdund, een niet te sterke
plaatselijke reactie optreedt, zoodat de toepassing hierdoor
niet belemmerd wordt.

Een voordeel van anatoxine is, dat het geen soortvreemd
serum bevat, zoodat geen overgevoeligheid hiervoor kan ont-
staan. (Hooker).

Ter beantwoording der in deze inleiding gestelde vragen
werden de in de volgende hoofdstukken beschreven onderzoe-
kingen ingesteld.

Wordt bij de bereiding van anatoxine de toxische wer-
king weggenomen door formaline of door verwarmen?

Om deze vraag te beantwoorden werd aan vier fleschjes
toxine No. 48 respectievelijk toegevoegd 3, 4, 5 en 6 per dui-
zend formaline en werden deze fleschjes geplaatst in de
broedstoof bij een temperatuur van 37° C. (Tabel I).

Het toxine in het eerste fleschje, dat 3 per duizend forma-
line bevatte, bleek zijn toxische werking verloren te hebben
na 36 dagen; 6 cc. van het zoo verkregen anatoxine U8 I
bleek, ingespoten bij een cavia, noch plaatselijke noch alge-
meene reactie meer te geven.

Het toxine, waaraan 4 per duizend formaline was toege-
voegd, bleek volgens de dierproef na 29 dagen ongiftig te
zijn geworden. Het zoo verkregen anatoxine werd genoemd
anatoxine 48 II.

Het toxine, waaraan 5 per duizend formaline was toege-
voegd had zijn toxische werking verloren na 11 dagen en
werd genoemd anatoxine 48 III, terwijl het toxine, waaraan
6 per duizend formaline was toegevoegd, na 9 dagen ongiftig
was geworden. Dit is het anatoxine 48 IV.

Verder weitl aan vier fleschjes toxine No. 48 respectievelijk
toegevoegd O, 3, 5 en 6 per duizend formaline en werden deze
fleschjes geplaatst in een waterbad van 58° C. (Tabel II).
Het toxine, waaraan geen formaline was toegevoegd, bleek
atoxisch te zyn na een vcmaiming van 56 uur (anatoxine
Oa). HeT toxine, waaraan 3 per duizend formaline was
toegevoegd, was atoxisch na drie dagen (anatoxine 48 Ia),
evenals het toxine met 5 per duizend formaline (anatoxine
^8 Illa). (Deze beide laatste anatoxinen werden niet eerder
op ongiftigheid beproefd, zoodat het mogelijk is, dat zy ook

reeds, evenals de anatoxinen 48 Oa en 48 IVa na 56 uur hun
giftigheid hadden verloren). Het toxine met 6 per duizend
formaline had zijn giftige werking verloren na een verwar-
ming van 56 uur (arDatoxine i8 IVa).

Met de zoo verkregen anatoxinen werden caviae behandeld,
telkens in groepen van vier. Twee dieren van elke groep kre-
gen twee inspuitingen subcutaan van 1/2 cc. met een week
tusschenruimte, terwijl de twee overige dieren van elke groep
drie onderhuidsche inspuitingen kregen van V2 cc. telkens met
een week tusschenruimte. 27 dagen na het begin van de be-
handeling werd de reactie van Schick toegepast, terwijl de
dieren drie dagen later ingespoten werden met 20 of 40 d.l.m.
ter bepaling van den graad van hun onvatbaarehid. Uit tabel
1 blükt:

1°. Anatoxirüe UB I heeft een goede immuniseerende wer-
king. Op de eerste injectie van \\k cc. reageerden de dieren
niet. Na de tweede en derde injectie trad een kleine plaatse-
lijke reactie op, zich uitende in een lichte roodheid en schil-
féring der huid. Dit is een aanduiding, dat de dieren door de
eerste inspuiting van 1/2 cc. anatoxine reeds gesensibiliseerd,
„allergisch", zijn. De dieren zijn al op weg naar de onvat-
baarwording. Veertien dagen na de laatste injectie bleken
alle dieren een negatieve reactie van Schick te vertoonen
(uitgezonderd cavia No. 3, die zeer licht reageerde), terwijl
ook de pseudoreactie van Schick bij alle dieren negatief was;
dus ook bij die dieren, die op de tweede en derde inspuiting
van 1/2 cc. anatoxine wèl plaatselijk reageerden. Dit is een
teeken, dat die dieren ten opzichte van de bacterieproteïnen
en eiwitten uit den voedingsbodem weer zijn gedesensibili-
seerd, anergisch immuun zijn geworden (Zoeller). Bij alle
dieren was de reactie op een inspuiting van 40 d.l.m. slechts
plaatselijk. Er vormde zich om de plaats van inspuiting een
licht infiltraat, terwijl er geen algemeene ziekteverschijnselen
optraden. Deze lokale reactie treedt dus ook op bij dieren, die
een negatieve reactie van Schick vertoonen. Men moet echter

in het oog houden, dat de reactie van Schick negatief uitvalt,
wanneer het antitoxinegehalte van het bloed gelijk is aan
of grooter is dan 1/30 A.E. per cc. Dit antitoxinegehalte be-
hoeft dan niet voldoende te zün om de, in de weerstandsproef,
ingespoten hoeveelheid toxine geheel te neutraliseeren, zoodat
nog een plaatselijke toxinewerking optreedt. Dieren, die na
een gift van 20 of 40 d.l.m. alleen reageeren door het vormen
van een plaatselijk infiltraat, kunnen als voldoende immuun
worden beschouwd. Ontstaat later een plaatselijke huid-
necrose, dan is dit een bewijs, dat de specifieke toxinewerking
nog zeer sterk is. Dieren waarbij een necrose optreedt kun-
nen dus niet als voldoende immuun worden beschouwd.

2°. Atmtoxine Jt8 II blijkt eveneens een goede immunisee-
rende werking te bezitten. Geen enkele van de behandelde
dieren vertoonde een plaatselijke reactie na de verschillende
injecties van 1/2 cc. anatoxine. Caviae No. 3 en 4 hadden een
negatieve ware en een negatieve pseudoreactie van Schick.
Cavia No. 1 vertoonde een licht positieve ware en een nega-
tieve pseudoreactie, terwijl cavia No. 2 op beide intracutane
injecties licht positief reageerde. Een maand na de eerste
injectie verdroegen caviae No. 1 en 4 een gift van 40 d.l.m.
zonder eenige reactie, terwijl daarop cavia No. 3 licht en
cavia No. 2 iets sterker plaatselijk reageerden.

3°. Anatoxine It8 UI blijkt ongeschikt te zijn voor het on-
vatbaarmaken van de dieren. Cavia No. 1 werd negen dagen
na de eerste injectie paralytisch en stierf vier dagen later.
De overige dieren reageerden niet op de inspuitingen van 1/2
cc. Cavia No. 2 vertoonde een negatieve ware en een negatieve
pseudoreactie van Schick. Caviae No. 3 en 4 vertoonden een
positieve ware en een positieve pseudoreactie (gecombineerde
reactie), terwyl de ware reactie veel sterker was dan de
pseudoreactie. Op inspuiting van 40 d.l.m. reageerde cavia
No. 2 alleen plaatselijk; caviae No. 3 en 4 reageerden sterk
plaatselijk maar ook algemeen. Cavia No. 4 stierf zelfs al
twee dagen na het toedienen van 40 d.l.m.

baar werd, terwijl caviae No. 3 en 4 met drie injecties nog
vatbaar tolevenj Individueele verschillen spelen, zooals ook
blijkt uit het optreden van paralyse, by caviae dus blijkbaar
een groote rol.

4°. Anatoxine i8 IV blijkt evenmin goede onvatbaarma-
kende eigenschappen te bezitten. De dieren reageerden niet
op de eerste twee inspuitingen van het anatoxine. Op de derde
inspuiting was de reactie zwak. Alle vier de dieren vertoon-
den een negatieve ware en een negatieve pseudoreactie van
Schick. Toch was de graad van onvatbaarheid niet hoog, zoo-
als bleek uit de reactie op een gift van 20 of 40 d.l.m. Cavia
No. 2 stierf vier dagen na een gift van 40 d.l.m. Cavia No. 3
reageerde op 20 d.l.m, lokaal, later met necrose. Alleen cavia
No. 4 vertoonde na een gift van 40 d.l.m. geen enkele reactie;
alleen dit laatste dier was voldoende immuun.

1°. Anatoxine A8 Oa bezit in het geheel geen immunisee-
rende werking. Drie dieren vertoonden een positieve ware en
een negatieve pseudoreactie van Schick, terwijl deze dieren
na een gift van 20 of 40 d.l.m. na één dag stierven. Alleen
cavia No. 1 vertoonde een negatieve ware en een negatieve
pseudoreactie van Schick, terwijl het dier ook op een gift van
20 d.l.m. niet reageerde; dit dier was dus blijkbaar onvatbaar,
hoewel een verklaring hiervoor niet is te geven.

2°. Anatoxine 48 Ia blijkt eveneens een onvoldoende im-
muniseerende werking te hebben. De reacties op de verschil-
lende inspuitingen van 1/2 cc. anatoxine waren allen negatief.
Cavia No. 1 vertoonde een negatieve ware en een negatieve
pseudoreactie van Schick. Dit dier reageerde op een injectie
van 20 d.l.m. sterk plaatselijk, terwijl na twee dagen lichte
necrose optrad. Cavia No. 2 vertoonde een positieve ware en
een negatieve pseudoreactie van Schick. Het dier was dus
nog vatbaar, wat ook bleek na toediening van 40 d.l.m. Het
dier stierf na één dag. Cavia No. 3 vertoonde een positieve
ware en een positieve pseudoreactie van Schick. Op 20 d.l.m.
reageerde het dier plaatselijk met lichte necrose. \'Cavia No. 4

vertoonde een negatieve ware en een negatieve pseudoreactie
van Schick. Het dier was echter al eenigen tijd ziek, zoodat
de reactie op een gift van 40 d.l.m. niet was na te gaan. By de
sectie bleek het dier niet aan diphtherie gestorven te zijn.

3°. Anatoxine 48 lila bezat een zeer goede onvatbaarma-
kende werking, terwyl de dieren niet reageerden op de ver-
schillende injecties van V^ cc. van het anatoxine. De ware
zoowel als de pseudoreactie van Schick was bü drie dieren
negatief. Cavia No. 2 vertoonde een positieve ware en een po-
sitieve pseudoreactie. Op een gift van .20 en 40 d.Lm. reageer-
den de dieren in het geheel niet. Ook slechts twee injecties
van V2 cc. anatoxine bleken een zeer voldoende onvatbaarheid
te veroorzaken. Met het oog op de sterke tegenstelling tus-
schen de werking van anatoxine 48 Hla met die van de ana-
toxinen 48 Oa en 48 Ia zyn later de proeven met anatoxine
48 Illa herhaald (zie blz. 30).

4°. Anatoxiwe 48 IVa had geen onvatbaarmakende wer-
king. De dieren vertoonden na de injecties van 1/2 cc. geen
reactie. Alle dieren hadden een positieve ware en een nega-
tieve pseudoreactie van Schick. De caviae No. 1 en 4 stierven
na een gift van respectievelijk 20 en 40 d.l.m., terwijl de die-
ren No. 2 en 3 een sterke necrose vertoonden na injectie van
40 en 20 d.l.m.

5°. Verder wei-d een fleschje toxine No. 48 vei-warmd op
50° zonder dat formaline was toegevoegd. De giftige wer-
king bleek verdwenen te zün na verwarming gedurende
56 uur. Met dit zoo verkregen unatoxine 48b werden weer
vier caviae behandeld. De dieren vertoonden na inspuiting
van V2 cc. geen reactie. De ware reactie van Schick was bü
alle dieren positief en de pseudoreactie negatief. Ter bespa-
ring van dieren werd alleen cavia No. 4 ingespoten met 40
d.l.m. Het dier stierf na één dag.

Uit deze proeven valt af te leiden, dat anatoxine 48 I goede
onvatbaarmakende eigenschappen bezit. Alleen de plaatse-
lijke aspecifieke reacties, volgende oj) de tweede en derde

injectie, vormen een hezvmar voor de toepassing bij den
mensch, zooals enkele op den mensch toegepaste entingen
met anatoxine reeds hebben geleerd. Vu.ndaur dat werd ge-
tracht een ■anatoxine te bereiden, dat deze aspecifieke wer-
king niet bezat (zie hoofdstuk IV en IX).

Anatoxine 48 II heeft eveneens een goede immuniseerende
werking, terwijl na de verschillende injecties geen plaatse-
lijke reacties optraden, Hoe moet dit laatste verschijnsel wor-
den verklaard? De toegevoegde formaline schijnt op de
eiwitten, afkomstig van de bacteriën en van den voedings-
bodem, een destrueerende werking uit te oefenen, des te ster-
ker naarmate meer formaline wordt toegevoegd. Een forma-
linegehalte van 4 per duizend geeft in dit opzicht de meest
juiste uitkomsten, daar hierbij de eiwitten zoover worden
afgebroken, dat zij geen plaatselijke reactie meer veroorza-
ken, terwijl toch, zooals blijkt uit het behoud der onvatbaar-
makende werking, het toxine niet te ver wordt vernietigd,
maar in anatoxine wordt omgezet. Bij een formalinegehalte,
hooger dan 4 per duizend, wordt echter blijkbaar ook het
toxine te vèr gedestrueerd, zoodat ook de antigeeneigenschap-
pen verdwijnen.

Dit wordt bevestigd door het feit, dat anatoxine 48 III en
anatoxine 48 IV een onvoldoende onvatbaarmakende werking
bezitten.

Uit de werking van de anatoxinen 48 Oa en 48b blijkt, dat
een verhoogde temperatuur alléén geen aanleiding geeft tot
het vormen van anatoxine. De toxische werking wordt wel
weggenomen, maar ook de onvatbaarmakende antigeenwer-
king is verdwenen. Voor de omzetting van toxine in anatoxine
is dus een bepaald formalinegehalte noodig.

Merkwaardig is het verschil in werking tusschen anatoxine
48 III en anatoxine 48 Illa. De vraag doet zich voor:

Heeft bij anatoxine 48 Illa de formaline gelegenheid ge-
had eenigen tijd in te werken vóórdat de verwarming tot 58°
plaats vond? Is misschien een zekere fixatie van het anti-
geenlichaam van het toxine mogelijk geweest vóór de inwer-

king der hooge temperatuur, die, zooals bekend is, door een-
maal gevormd anatoxine wordt verdragen?

Om deze vraag te \'beantwoorden werd een nieuwe proef-
reeks opgesteld. (Tabel III). \'Aan toxine No. 50 werd ach-
tereenvolgens toegevoegd 3, 4, 5 en 6 per duizend foimaline.
I>eze monsters werden drie dagen verwarmd op 37° en daar-
na 56 uur op 58°. De giftigheid bleek daarna volgens de dier-
proef verdwenen te zijn; 6 cc. ingespoten bij een cavia, gaf
geen verschijnselen. Tevens werd een tweede proefreeks op-
gesteld. Aan toxine No. 50 werd weer achtereenvolgens toe-
gevoegd 3, 4, 5 en 6 per duizend formaline. Deze monsters
werden nu zeven dagen in de ijskast geplaatst en daarna ver-
warmd op 58°, weer gedurende 56 uur. Ook hier was na deze
behandeling de toxiciteit blijkens de dierproef verdwenen.
De zoo verkregen producten werden genoemd anatoxine 50
/—IV en anatoxine 50a I—IV.

Uit tabel III volgt, dat de onvatbaarmakende werking van
deze anatoxinen 50 en 50a onvoldoende is. Wel bezaten eeni-
ge dieren na de behandeling een zekere mate van onvatbaar-
heid, hetgeen blükt uit het resultaat van de reactie van
Schick, maar toch was in de meeste gevallen de immuniteit
niet voldoende om een gift van 20 tot 40 d.l.m. te overwinnen.
De meeste dieren stierven na het toedienen van deze gift.
Slechts twee dieren bezaten een voldoende immuniteit, name-
Uik caviae No. 8 en No. 12.

Hieruit blükt dat, wanneer de formaline gelegenheid heeft
eenigen tüd op het toxine in te werken bü een temperatuur
van ± 4° of bü een temperatuur van 37° vóórdat de verwar-
niing tot 58° plaats heeft, het antigeenlichaam niet gefixeerd
wordt.

Voor het vormen van anatoxine is het dus noodig, dat de
formaline langen tüd op het toxine kan inwerken bü een
temperatuur van 37°.

De bevreemdende immuniseerende werking van het anor-
toxine 48 Illa (tabel IV) werd nu opnieuw beproefd, terwül
een tweede hoeveelheid toxine No. 48 op dezelfde manier werd

behandeld als waarop het anatoxine 48 Illa was verkregen.
Dit werd genoemd anatoxine 48 Illa IL

Uit tabel IV blijkt, dat zoowel anatoxine 48 Illa als ana-
toxine 48 Illa II onvoldoende onvatbaarmakende eigenschap-
pen bezitten. Alle dieren vertoonen een sterk positieve ware
reactie van Schick. Geen enkel dier was dus door de behan-
deling met deze beide anatoxinen voldoende onvatbaar ge-
w^orden. Dit bleek ook uit de reactie volgende op een gift van
20 of 40 d.l.m. Slechts twee caviae overleefden deze dosis, ter-
wijl de zes overige dieren binnen drie dagen stierven.

Merkwaardig is de verschillende werking van anatoxine
48 Illa in de eerste en tweede proef. De in tabel II hiermee
behandelde dieren bezitten een sterke immuniteit, temijl de
dieren van tabel IV in het geheel geen onvatbaarheid vertoo-
nen. Een verklaring hiervoor te vinden is mij niet gelukt.
Waarom het anatoxine 48 Illa in het eerste geval een zeer
goede, en in het tweede geval géén onvatbaarmakende wer-
king bezat, blijft een open vraag.

Verder volgt uit deze proeven, dat een negatieve reactie
van Schick nog niet een voldoende onvatbaarheid waarborgt,
althans niet tegen de in de proeven gebruikte hoeveelheid
toxine. Daarentegen blijkt een positieve reactie van Schick
een zekere uiting te zijn van vatbaarheid, althans bij dieren
op deze wijze onvatbaar gemaakt. Alle dieren, die na de en-
tingen een positieve reactie van Schick vertoonden, werden
na een gift van 20 of 40 d.l.m. ziek en meestal stierven zij in
korten tijd.

Daar bij het gebruik van onverdund anatoxine dikwijls na
de onvatbaarmakende inspuitingen plaatselijke reacties, af-
hankelijk van het hooge gehalte aan aspecifieke eiwitten, op-
treden, werd onderzocht in welke verdunningen anatoxine
nog voldoende onvatbaarmakend werkt.

Van vijf verschillende anatoxinen, in tien- tot dertigvou-
dige verdunning, werd de onvatbaarmakende werking onder-
zocht. De uitkomsten van deze proefneming worden weerge-
geven in tabel V. De dieren kregen weer twee of drie onvat-
baarmakende inspuitingen van V^ cc. Een maand later wer-
den zij ingespoten met 20 of 40 d.l.m., nadat drie dagen te
voren, althans in een gedeelte der proeven, de reactie van
Schick was uitgevoerd.

Vier caviae werden behandeld met anatoxine No. 47, be-
reid van toxine /Vo. 47 waarvan de dJ.m. grooter dan 10 mgr.
w^as, in een tienvoudige verdunning. Reacties na de immu-
niseerende injecties traden niet op. Alle dieren vertoonden
een negatieve pseudoreactie van Schick en een sterk positieve
ware reactie. Alleen caviae No. 1 en 3 werden ingespoten
met 20 d.l.m. Beide dieren stierven na deze injectie, geheel
m overeenstemming met het resultaat van de reactie van
Schick.

Zeven caviae werden behandeld met anatoxine No. 43 1,
bereid van toxine No. 43, waarvan de d.l.m. kleiner dan 4
Wfn was, in een tienvoiulige verdunning. Na de eerste im-
muniseerende inspuiting volgde by\' geen enkel dier een
reactie. Na de tweede injectie trad bij vijf caviae een lichte
plaatselijke reactie op, terwijl op de derde injectie drie die-

ren reageerden. De reactie van Schick werd niet uitgevoerd.
Alle dieren bleken immuun voor een gift van 20 d.l.m.; ook
die dieren, die reeds drie weken na de eerste injectie inge-
spoten werden.

Vervolgens werd de onvatbaarmakende werking getoetst
van een \'anatoxine, afkomstig uit het instituut Pasteur te
Parijs, in een tienvoudige verdunning. Elf dieren werden
met dit anatoxine behandeld. Plaatselijke reacties traden na
de immuniseerende injecties niet op. Reeds ongeveer drie tot
vier weken na het begin der behandeling bleken de dieren
voor een gift van 20 of 40 d.l.m. een zekere, maar niet vol-
doende mate van onvatbaarheid te bezitten. Twee dieren over-
leefden deze dosis niet. Drie caviae, n.1. de Nos. 1, 3 en 11 ver-
toonden een negatieve reactie, terwijl de overige dieren alleen
plaatselijk reageerden. Cavia No. 11 werd later paralytisch.

Vervolgens werd de immuniseerende werking nagegaan
van anatoxine No. 43 II in een tienvoudige verdunning. Vier
dieren werden hiermee behandeld. Bij geen enkel dier trad na
de onvatbaarmakende inspuitingen een plaatselijke reactie
op. Ongeveer drie en vier weken na de eerste injectie werden
de dieren ingespoten met 40 d.l.m. Drie dieren vertoonden
hierop geen verschijnselen. Alleen cavia No. 1 verdroeg deze
dosis niet, het dier stierf in korten tijd.

Vier dieren werden geïmmuniseerd met anatoxine No, 43II
in een timnügvoudige verd-mming. Na de verschillende in-
spuitingen van Vè cc. volgden geen verschijnselen. De reactie
van Schick werd uitgevoerd. Drie dieren vertoonden een ne-
gatieve pseudo- en een positieve ware reactie van Schick.
Cavia No. 4 vertoonde een gecombineei-de reactie. Na een
gift van 20 d.l.m. stierf cavia No. 1. De drie overige dieren
reageerden alleen plaatselijk, terwijl bij caviae No. 2 en3 later
een lichte necrose optrad. De verkregen immuniteit was dus
wel zeer onvolkomen.

Daarna werd de onvatbaarmakende werking van anatoxine
No. 43 II in een dertigvoudige verdunning onderzocht, even-
eens op vier caviae. Plaatselijke reacties traden na de im-

muniseerende inspuitingen niet op. Alle dieren vertoonden
een negatieve pseudoreactie en een positieve ware reactie van
Schick. Alleen caviae Nos. 1 en 3 kregen een gift van 20
d.l.m. Cavia No. 1 stierf, cavia No. 3 i-eageerde sterk plaat-
selyk, later gevolgd door het optreden van necrose. Ook deze
verdunning gaf dus slechte resultaten.

Ten slotte werden vier caviae behandeld met anatoxine No.
48, bereid van toxine No. 48, uuarvan de d.l.m. 6 mgr. was,
w ee?i vijftienvo-udige verdunning. Na de verschillende injec-
ties van % cc. volgden geen verschijnselen. Drie dieren ver-
toonden een negatieve pseudo- en een zwak positieve ware
reactie van Schick. By cavia No. 4 waren beide reacties ne-
gatief. Alleen caviae Nos. 1 en 3 weidden ingespoten met 20
d.l.m. Cavia No. 1 stierf, cavia No. 2 reageerde plaatselijk.
Samenvatting.

Anatoxine No. 47 in een tienvoudige \'verdunning is onge-
schikt voor het immuniseeren van caviae.

Anatoxine No. 43 I in een tienvoudige verdunning heeft zeer
goede onvatbaarmakende eigenschappen. De plaatselijke re-
acties na de immuniseerende injecties, hoewel aanmerkelijk
nimder sterk dan na gebruik van onverdund anatoxine, blij-
ven echter een bezwaar vormen voor de toepassing (bü den
mensch.

Ook anatoxine Patnjs in een tienvoudige verdunning heeft
een vrü goede immuniseerende werking. Van elf dieren ble-
ken slechts twee dieren nog vatbaar voor een dosis van 40
d.l.m. De overige dieren verdroegen een dosis van 20 of 40
d.l.m., zü het dan ook door het vormen van een plaatselük
infiltraat.

Anatoxine No. 43 II in een tiemoudige verdunning heeft
goede onvatbaarmakende eigenschappen. Plaatselyke reacties
na de verschillende injecties traden niet op. Drie dieren rea-
geerden niet op een gift van 40 d.l.m., slechts één dier met
twee inspuitingen stierf.

Vergelükt men de werking van anatoxine Parys en ana-
toxine No. 43 II, beide in tienvoudige verdunning, dan blükt

dat de beide anatoxinen, wat betreft het geven van plaatse-
lijke reacties na de onvatbaarmakende inspuitingen, gelijk
staan, maar dat de immuniseerende werking van het ana-
toxine Parijs iets minder goed is dan van anatoxine No. 43II.

Anatoxine No. 43 II in een timntigvoudige en in een dertig-
voudige verdunning geeft een minder \'betrouwbare onvat-
baarheid. Na de behandeling verdroegen de meeste dieren wel
een gift van 20 d.l.m., maar de na die gift optredende plaat-
selijke reactie was zeer sterk. Ook de reactie van Schick was
bij alle dieren positief, uitgezonderd bij één cavia, die een
gecombineerde reactie vertoonde.

Anatoxine No. 48 in een vijf tienvoudige verdutvning bezit
eveneens minder goede onvatbaarmakende eigenschappen. De
reactie van Schick was bü drie dieren zwak positief, bü één
dier negatief. Het eerste dier verdroeg een gift van 20 d.l.m.
niet, terwül cavia No. 3 daarop sterk plaatselük reageerde.

Conclusie: anatoxine in een tienvoudige verdunning, mits
onverdund goed immuniseerend en stammend van een sterk
toxine, bezit een goede immuniseerende werking. Grootere
verdunningen hebben onvoldoende onvatbaarmukende eigen-
schappen.

Is het mogelijk, anatoxine te bereiden, arm aan eiwitten,
waardoor de aspecifieke reactie wordt verminderd, maar

de antigeenwerking behouden blijft? of wel:
Welke eiwitten kunnen uit anatoxine worden verwijderd
zonder dat de immuniseerende werking verloren gaat?

De aanwezigheid van een werkzaam antigeen is alleen vast
te stellen door de immuniseerende werking te beproeven op
dieren, of door middel van de uitvlokkingsreactie van Ra-
mon, zooals later zal blijken (zie hoofdstuk I en VIII).

Toxine bezit naast de antigeenwerking ook de giftige wer-
king, zoodat bij toxine gemakkelijk te controleeren is aan welk
eiwit deze giftigheid en tevens het antigeen gebonden is.
Daarom werd eerst nagegaan welke eiwitten uit toxine kon-
den worden verwijderd, zóó, dat de toxiciteit bleef bestaan.
Uitgegaan werd van toxine No. 26 met een d.l.m. van 3 mgr.
Aan 30 cc. toxine werd toegevoegd 15 cc. verzadigd am-
moniumsulfaat. Hierdoor ontstond een neerslag, hoofdzake-
lijk bestaande uit euglobulinen. Het filtraat werd behandeld
met een gelijk volume verzadigd ammoniumsulfaat, waar-
door hoofdzakelijk de pseudoglobulinen neerslaan. Het laat-
ste filtraat bevat dan albuminen. Dit filtraat werd nu geheel
verzadigd met ammoniumsulfaat, waardoor deze albuminen
neergeslagen woi-den.

Het neerslag van euglobulinen werd opgelost in 10 cc. wa-
ter. Hiervan werd 10 mgr. subcutaan ingespoten bij een
eavia. Het dier reageerde op deze injectie alleen plaatselijk
niet een licht infiltraat. Het toxinegehalte van deze euglo-
buline-oplossing is dus gering.

Het neerslag van pseudoglobulinen werd eveneens opge-
lost in 10 cc. water. Hiervan werd bij een cavia 10 mgr. on-
derhuids ingespoten. Deze injectie veroorzaakte een sterke

plaatselijke reactie, terwijl het dier na twee dagen stierf. Een
tweede marmot werd ingespoten met 5 mgr. Ook dit dier ging
na twee dagen dood. Daarna werd 21/0 mgi\'. bü een derde dier
ingespoten. Dit dier stierf na vier dagen. Deze 2yo mgr. van
de pseudoglobuline-oplossing bleek dus juist één d.l.m. te be-
vatten. In deze oplossing is dus een groot gedeelte van het
toxine aanwezig.

Van de albuminen, opgelost in 10 cc. water, gaf 10 mgr.,
bij een cavia ingespoten, geen enkele plaatselijke of alge-
meene reactie. Een injectie van 6 cc. veroorzaakte in 30 mi-
nuten den dood van een dier. Deze dood was echter niet het
gevolg van de giftigheid van de albuminen, maar van de gif-
tige werking van het ammoniumsulfaat, dat bij de bereiding
van de albuminen in het neerslag was achtergebleven. Dit
bleek uit een controleproef, waarbij een cavia werd ingespo-
ten met een oplossing van ammoniumsulfaat. Ook hier trad
de dood op in zeer korten tijd en met dezelfde verschijnselen
als bü de injectie met 6 cc. van de albumine-oplossing.

Uit deze p^\'oeven valt af te ledden, dat de toxische iverkiny
van toxine voor een groot deel is gebonden aan de pseudo-
globuKnen.

Verondersteld werd nu, dat de antigeenwerking van ana-
toxine eveneens gebonden zou zyn aan de in het anatoxine
aanwezige pseudoglobuline.

Nu werden 90 cc. anatoxine No. 45 II behandeld met 45 cc.
verzadigd artimoniumsulfaat. Aan het filtraat werd toege-
voegd een gelük volume verzadigd ammoniumsulfaat. Het zoo
verkregen neerslag werd verzameld en opgelost in 30 cc.
water. Zoo werd dus:

1°. een oplossing verkregen, waarin de concentratie van
de pseudoglobulinen drie maal sterker was dan in het
oorspronkelüke anatoxine.

2°. Door 10 cc. van deze oplossing weer te verdunnen met
20 cc. water, werd dezelfde pseudoglobulineconcentra-
tie verkregen als die van het oorspronkelüke ana-
toxine.

Met de^e pseudoglobuline-oplossingen werden nu immu-
niseeringsproeven op caviae genomen.

Zooals uit tabel VI blükt, heeft de driemaal geconcentreer-
de pseudoglobuline-oplossing een vrü goede onvatbaarmaken-
de werking. De dieren vertoonden na de eerste twee injecties
geen plaatselüke reactie, terwül na de derde injectie de
reactie bü twee dieren negatief was en bü drie dieren slechts
een zeer licht plaatselük infiltraat gevormd werd. Büna alle
dieren vertoonden na twee of drie injecties van i/o cc. van de
pseudoglobuline-oplossing een zwakke gecombineerde reactie
Van Schick. Cavia No. 7 vertoonde een negatieve pseudo-
i\'eactie en een positieve ware reactie, terwül bü caviae Nos.
8 en 9 beide reacties negatief uitvielen. Alle dieren verdroe-
gen een gift van 20 of 40 d.l.m., uitgezonderd cavia No. 7,
Welk dier in overeenstemming met het resultaat van de reactie
van Schick, twee dagen na de onderhuidsche injectie van 40
d.l.m. stierf. Bü de overige dieren trad alleen een plaatselüke
i\'eactie op, ibehalve bü caviae Nos. 8 en 9, die in het geheel
geen verschünselen vertoonden, eveneens in overeenstem-
ïning met de reactie van Schick.

De pseudoglobuline-oplossing in dezelfde concentratie bezit
een zwakke immuniseerende werking. De reactie na de
verschillende injecties van Yn cc. was in alle gevallen negatief.
Caviae Nos. 1 en 2 vertoonden een gecombineerde reactie van
Schick. Toch stierf cavia No. 2 twee dagen na een gift van
40 d.l.m,, terwül cavia No. 1 daarop alleen plaatselük rea-
geerde. Cavia No, 3 vertoonde een negatieve ware en een
negatieve pseudoreactie van Schick, terwül het dier 40 d.l.m.
verdroeg zonder verschünselen te geven. Cavia No, -1 was
yolgens de reactie van Schick vatbaai\', wat ook bleek na de
injectie van 40 d.l.m. Het dier stierf in twee dagen,

Conchisie: De (Memaal. geconcc^itreerde pseudoglobnli7}c-
^plossijig, verkregen vit anatoxine, heeft bevredigemle immu-
^^\'^seerende eigenschappen, terwijl de oplossing van dezelfde
(Concentratie als in het oorspronkelijke anatoxine, slechts
^UKLkke onvatbaarmakende werking heeft.

Heeft zwak toxisch anatoxine een betere immuniseerende
werking dan geheel atoxisch anatoxine?

Ter beantwoording van deze vraag werd de onvatbaarma-
kende werking van anatoxine No. 43 I onderzocht. Dit ana-
toxine bezat nog een geringe giftigheid; 6 cc. ingespoten bij
een cavia veroorzaakte de dood van het dier in drie dagen.
Met dit onverdunde anatoxine werden zeven caviae behan-
deld. Zooals tabel VII aangeeft was de plaatselijke reactie na
de verschillende injecties van 1/2 cc. bijna altijd positief. Daar
dit een groot bezwaar vormt voor de practische toepassing bij
den mensch, werd een tweede proefreeks opgesteld met ana-
toxine No. 43 I in een tienvoudige verdunning. De reacties, die
hierbij na de eerste injecties van 1/2 cc. optraden, waren ne-
gatief. Na de tweede en derde injectie vertoonden de meeste
dieren een zwakke reactie. De immuniseerende werking van
het tienvoudig vei-dunde anatoxine bleek goed te zyn. Alleen
cavia No. 1 reageerde plaatselijk op een gift van 20 d.l.m.,
terwijl de overige dieren geen verschijnselen vertoonden.

Verder werd het anatoxine No. 43 nog eenige dagen op
een temperatuur van 37° gebracht, waardoor de giftigheid
verdween zooals uit een dierproef bleek; 6 cc. was voor een
cavia niet toxisch.

Met dit ongiftige anatoxine No. 43 II werden opnieuw
zes caviae behandeld. Vier dieren kregen twee injecties van
1/2 cc., twee dieren kregen één injectie. Plaatselijke reacties
traden na deze inspuitingen niet op, terwijl de na de behan-
deling verkregen onvatbaarheid wel niet zeer sterk, maar
toch voldoende was, zooals blijkt uit de uitkomst na de giften
van 40 d.l.m.

toxinen Nos. 43 I 1/10, 43 II, 48 I en 48 II vergelijkt, ziet
men, dat anatoxine No. 43 I 1/10 de beste onvatbaarmakende
eigenschappen bezit, tenminste te oordeelen naar de plaat-
selijke reactie, optredende na een gift van 20 d.l.m. Bij de
anatoxinen No. 48 I en 48 II vormen zich na een gift van 40
d.l.m. vrij sterke plaatselijke reacties. Anatoxine No. 43 I
werd, wegens te sterke reactie na de inspuitingen, uitge-
schakeld.

Uit deze proeven blijkt, dat zwak toxisch anatoxine zeer
goed immuniseert, misschien zelfs beter dan geheel atoxisch
anatoxine. Toch moet voor het gebruik bij den mensch aan
het ongiftige anatoxine de voorkeur worden gegeven, daar
bij het gebruik van het zwak toxisch anatoxine de plaatselijke
reacties, optredende na de immuniseerende injecties, een be-
zwaar vormen, evenals de giftigheid, al is die dan ook gerin-
ger dan die van T.A.

Het is de vraag of de lokale reactie, optredende na een gift
van 40 d.l.m., veroorzaakt wordt door het toxine, dat zich in
de dosis van 40 d.l.m. bevindt, of dat de reactie niets anders
is dan een anaphylactisch verschijnsel, veroorzaakt door de
aspecifieke eiwitten, die zich zoowel in het anatoxine als in
het toxine bevinden. De dieren zijn door de verschillende in-
spuitingen voor deze eiwitten gesensibiliseerd. Het plaatselijk
gevormde infiltraat zou dan eigenlijk overeenkomen met een
positieve pseudoreactie van Schick, in een meer uitgebreide
vorm.

Indien dit juist is, heeft het ontstaan van een plaatselijk
infiltraat na het toedienen van een aantal d.l.m. geen betee-
kenis en zou de uitwerking van een dergelijke gift alleen
moeten worden beoordeeld naar het ziek worden of sterven
van het dier.

De volgende proef leert echter, dat de lokale reactie, op-
tredend na een gift van 40 d.l.m., wel degelijk op een speci-
fieke toxinewerking berust.

Acht caviae werden drie maal ingespoten met Vo cc. ana-
toxine, telkens met twee dagen tusschenruimte. De dieren

werden zoo dus voor de eiwitten uit het anatoxine gesensibi-
liseerd. Tv/ee weken na de laatste injectie werden de dieren
behandeld met een dosis verwarmd toxine, waarin dezelfde
hoeveelheid eiwit aanwezig was als in 40 d.l.m. Geen enkele
van de dieren reageerde op deze injectie. Hieruit volgt, dat
het plaatselijke infiltraat, dat dikwijls ontstaat na inspuiten
van 40 d.l.m. op specifieke toxinewerking berust.

Voor het beoordeelen van de mate van immuniteit moet
dus met het al of niet ontstaan van een plaatselijk infiltraat
na een injectie van 40 d.l.m., rekening worden gehouden.

Wordt de onvatbaarmakende werking van een anatoxine
bepaald door de oorspronkelijke giftigheid van het toxine;
staat zij dus in rechtstreeksch verband met dc d.l.m.?

In onderstaande tabel is een overzicht gegeven van de on-
vatbaarmakende werking van de in de proeven gebruikte
anatoxinen. ^

Uit deze tabel blykt, dat anatoxine No. 48 I en anatoxine
No. 48 II goede immuniseerende eigenschappen bezitten. Een
vyf tienvoudige verdunning van dit anatoxine bezit een on-
voldoende werking. De d.l.m. van het overeenkomstige toxine
was 6 mgr.

De anatoxinen Nos. 43 I en 43 II, in tienvoudige verdun-
ning, vertoonen een goede onvatbaarmakende werking. Ana-
toxine No. 43 II in twintig- en dertigvoudige verdunning
werken onvoldoende. De d.l.m. van het oorspronkelyke toxine
No. 43 was 3 mgr,

Anatoxine No. 47 in tienvoudige verdunning heeft een
slechte immuniseerende werking. Het oorspronkelyke toxine
had een d,l.m. grooter dan 10 mgr.

Woi-dt de werking van de verschillende verdunningen van
de anatoxinen met elkaar vergeleken, dan blijkt dat de ana-
toxinen Nos. 43 1:10 en 43 II 1:10 goede immuniseerende
eigenschappen bezitten. De anatoxinen Nos. 48 I 1:15 en 47
1:10 vertoonen een onvoldoende onvatbaarmakende werking.

Co7ielusie: Bij de bereiding van anatoxine moet men uit-
gaan van een toxine met een kleine d.l.m. en, zooals later zal
blijken, met een groot uitvlokkend vermogen.

We weten dat toxine per os onschadelijk is, dus geen toxine-
werking vertoont. Hiermee behoeft echter nog niet samen te
gaan een verdwijnen der antigeenwerking. Vandaar dat de
bovenstaande vraag gesteld werd.

Ter beantwoording van deze vraag werd aan een aantal
caviae toxine No. 26, in een vijfvoudige verdunning, per os
toegediend. Tevens werd aan een tweede groep dieren op
dezelfde wijze anatoxine No. 43 II in een tienvoudige ver-
dunning gegeven. Daarnaast werd nog de werking van T.A.
U., per os toegediend, nagegaan. .

In deze proeven kregen de dieren twee of drie giften van
2 cc. per keer, telkens met een week tusschenruimte. Onge-
veer 27 dagen na de eerste dosis werd de reactie van Schick
toegepast. Uit tabel VIII blijkt, dat de dieren na de verschil-
lende giften van 2 cc. toxine, T.A.U., of anatoxine geen en-
kele reactie vertoonden, uitgezonderd cavia No. 4. Dit dier
stierf één dag na het toedienen van de eerste gift van 2 cc.
toxine. Waarschijnlijk is een gedeelte van het toxine geko-
men in de trachea. Het slijmvlies daai-van heeft het vermo-
gen toxine direct op te nemen, waardoor de dood van het dier
verklaard is. Cavia No. 3 vertoonde een negatieve pseudo-
reactie en een negatieve ware reactie van Schick. Al de an-
dere dieren vertoonden een negatieve pseudoreactie en een
positieve ware reactie. Volgens de uitkomsten van deze reac-
ties was dus alleen cavia No. 3 immuun, terwijl de overige
dieren nog vatbaar waren. Caviae Nos. 1, 3, 6 en 10 werden
ingespoten met 40 d.Lm. Na deze injectie vertoonde cavia
No. 1 een plaatselijke reactie, do drie overige dieren stierven.

Conclusie: Toxine, T.A.U. of anatoxine, -per os toegediend,
heeft geen immuniseerende iverking.

Een andere bron ter verkrijging van een eiwitarm ana-
toxine zou misschien gelegen zijn in de binding toxine-anti-
toxine of anatoxine-antitoxine, zooals die bij de uitvlokkings-
reactie van Ramon ontstaat. Teneinde dit na te gaan, diende
eerst deze reactie nader te worden bestudeerd.

Van verschillende toxinen en anatoxinen werd het uitvlok-
kend vermogen bepaald (zie hoofdstuk I).

Aan een serie buizen, elk bevattende 10 cc. van de ver-
schillende toxinen of anatoxinen, werd achtereenvolgens
een stijgende hoeveelheid antitoxisch serum toegevoegd. Deze
buizen werden gebracht bü een temperatuur van 37° of 50°.
Na eenigen tüd trad in verscheidene van de buizen een
opalescentie op, gevolgd door het ontstaan van een fün neer-
slag, dat zich het eerst vormde in één van de buizen,
doch dikwüls ook in twee of drie-buizen tegelük. Hierdoor
is dus de uitkomst der reactie niet af te lezen. Pas wanneer
het füne precipitaat tot wattige vlokken samenklontert, en
dit gebeurt in één buis vóór alle andere (fiocidation initiale),
is het oogenblik van aflezen der reactie gekomen. Deze buis
bevat dan juist een neutraal mengsel van toxine en antitoxi-
ne. Tabel IX geeft een overzicht van het uitvlokkend vermo-
gen van verschillende toxinen en anatoxinen. In elke proef
werd 10 cc. toxine of anatoxine gebruikt. De laatste kolom
geeft de hoeveelheid antitoxisch serum aan, waarmee de uit-
vlokking het eerst optrad.

Vergelükt men het uitvlokkend vermogen van de toxinen
Nos. 26, 43, 49 en 45, dan blykt, dat het toxine met de
kleinste d.l.m. het grootste uitvlokkend vermogen bezit. Verder
bezitten een versch toxine en het daaruit bereide anatoxine
hetzelfde uitvlokkend vermogen, zooals aangetoond wordt

Toxine No. 45, waai-van de oorspronkelijke d.l.m. 5 mgr.
was, blijkt een kleiner uitvlokkend vermogen te bezitten dan
het daarvan bereide anatoxine No. 45. Het eenmaal in ana-
toxine omgezette toxine behoudt het uitvlokkend vermogen
van het oorspronkelijke toxine, zoodat hier moest worden
aangenomen, dat het toxine No. 45 zoowel in uitvlokkend ver-
mogen als in toxiciteit achteruit was gegaan. Dit bleek juist
te zijn. De oorspronkelijke d.l.m. van 5 mgr. \'bleek nu 8 mgr.
te zijn geworden, welke verzwakking, behalve door het be-
waren, volkomen werd verklaard door de te hooge zuurgraad
van het toxine. De Ph was 6,8, terwijl voor goede bewaring
een Ph van 7,5 gewenscht is.

De zuurgraad van de toxinen Nos. 43 en 49 was steeds
nagegaan en door toevoeging van phosphorzuur op de juiste
waarde gehouden, waardoor de oorspronkelijke d.l.m. veel
minder was veranderd. Het uitvlokkend vermogen van deze
toxinen is constant gebleven, zooals blijkt uit de werking van
de overeenkomstige anatoxinen. Uit het bovenstaande is de
conclusie te trekken:

Indien men een toxine längeren tijd. wil bewaren, zóó, dat
het uitvlokkend- vermogen en dus ook de antigeeneigenschap-
ven, b.v. voor bereiding vav T.A., constant blijven, is het
noodig dat de uxiterstofionen^concentratie van het toxine
op de juiste waarde (Ph = 7.5) wordt gehouden. Bij het
bewaren van toxine wordt het afnemen der giftigheid niet
veroorzaakt doordat het toxine overgaat in anatoxine, want
dan zou het uitvlokkend vermogen hetzelfde moeten blijven,
maar doordat het toxine overgaat in toxoïden. Toxoïde is dus
blikbaar geheel iets anders dan anatoxine, en is de door
Glenny e.a. gebruikte term „toxoïd" in dezen zin minder juist.

Verder werd de invloed nagegaan van de temperatuur op
het verloop van de reactie. Bü kamertemperatuur duurde het
langen tüd vóórdat de uitvlokking optrad. Bü een tempera-
tuur van 37° was deze tüd twee tot vier uur, terwül bü 50°

à 55° de reactie in de meeste gevallen, in ongeveer een half
uur tot stand kwam, teimiihste, wanneer toxine gebruikt
werd. Met behulp van anatoxine was het verloop van de
reactie veel langzamer. Meestal was dan een verwarming op
50° gedurende eenige uren noodig, terwijl by een tempera-
tuur van 37° de uitvlokking dikwijls pas optrad na vieren-
twintig uur.

Zoo moet de negatieve uitkomst worden verklaard, die
Nélis (25) verkreeg met een toxine, dat zes maanden lang in
de broedstoof was geweest. Hy zegt: „Ce produit ne flocule
plus du töut après 12 heures à 37°. D\'après Ramon, il con-
serverait cependant son pouvoir de floculation, à part un re-
tard dans son apparition. Il en résulte que le résultat que j\'ai
obtenu n\'est pas général."

Nélis meende dus, dat de uitvlokkingsreactie met behulp
van zes maanden lang verwarmd toxine niet meer optrad.
Deze meening is echter onjuist. Wordt toxine zes maanden
verwarmd op 37°, dan verliest het zijn giftigheid, maar niet
zijn uitvlokkend vermogen, zooals Ramon aantoonde. Het
toxine gaat namelijk over in anatoxine. Indien Nélis bij het
uitvoeren van de reactie de verwarming op 37° langer dan
12 uur had toegepast, zou de uitvlokking waarschijnlijk wel
tot stand zijn gekomen.

De hoeveelheid antitoxisch serum, noodig voor het ont-
staan der reactie, was by elke temperatuur, lager dan 55°,
dezelfde. De temperatuur heeft alleen invloed op de snelheid
van de reactie. Toch verdient het aanbeveling de reactie uit
te voeren by een temperatuur tusschen 40° en 50°. Tusschen
50° en 55° verloopt de reactie te snel. Meestal ontstaat dan
de uitvlokking in meerdere buizen zoo snel achtereen, dat een
juiste waarneming der tijdsverschillen bezwaarlijk wordt. By
een temperatuur hooger dan 55°, treden onregelmatigheden
in het verloop van de reactie op, zoodat de uitvlokking dan
geen waarde meer heeft.

De reactie is het scherpst by 37°. De tyd, noodig voor het
ontstaan der uitvlokking is dan echter dikwijls lang, wat

voor practische toepassing een groot bezwaar vormt. Tus-
schen 40° en 50° verloopt de reactie veel sneller en is een
juiste waarneming zeer goed mogelijk. Meestal ontstaat, bij
een temperatuur hooger dan 40°, het fijne precipitaat in
meerdere buizen tegelijk, maar de eigenlijke donzige uit-
vlokking vertoont zich altijd het eerst in één van die buizen,
zoodat na eenige ervaring, een juiste aflezing geen moeilijk-
heden geeft.

Toch dient men steeds zijn aandacht aan het verloop der
reactie te wijden, zoodat het goede tijdstip van uitvlokking
kan worden waargenomen.

Teneinde te trachten dit practische bezwaar te ondei-van-
gen, werd de vraag gesteld: bevat de middelste van de bui-
zen ivaarin de nitvlokking heeft pl<mts gehad, het juist neur
trale mengsel van toxine en antitoxine? Kan men dus de
reactie laten afloopen en dan het eindresultaat leeren kennen
door de verhoudingen tusschen toxine (anatoxine) en anti-
toxine, die de middelste der uitgevlokte buizen aangeeft? Dit
bleek volgens een proefneming niet het geval te zijn. Een rij
buizen, gevuld met 10 cc. toxine No. 26, waaraan stijgende
hoeveelheden antitoxisch serum waren toegevoegd, werd 24
uur bij 37° gebracht. In dertien buizen was een uitvlokking
ontstaan. De middelste van die buizen bevatte 0.7 cc. serum.
Tevens was nagegaan in welke buis de uitvlokking het eerst
optrad. Dit geschiedde in de buis die 0.6 cc. serum bevatte.
Bovenstaande vraag moet dus ontkennend worden beant-
woord.

Conclusie: bij het uitvoeren van de reactie van Ramon is
het noodig het verloop van de reactie voortdurend, te volgen,
zoodat een juiste waarneming van het mengsel, waarin het
eerst de uitvlokking ontstaat, kan geschieden.

In al deze proeven werd, in verband met de af te meten
hoeveelheden serum, steeds 10 cc. toxine of anatoxine ge-
bruikt. Indien het mogelijk was het serum te verdunnen, zou

Met behulp van tweemaal verdund antitoxisch serum bleek
de reactie op dezelfde wijze te verloopen als met onverdund
serum, Hierbij kon dus de hoeveelheid toxine tot op de helft
worden verminderd.

Een viervoudige verdunning gaf minder goede resultaten.
De uitvlokking ontstond in meerdere buizen tegelijk, zoodat
een scherpe aflezing onmogelijk werd. Tevens was de tijd,
waarin de reactie tot stand kwam veel langer dan bij ge-
bruik van onverdund of tweemaal verdund serum. Uit deze
proeven volgt: By de toepassing van de reactie van Ramon
kan het toegevoegde antitoxische serum tweemaal verdund
worden. Sterkere verdunning van het serum veroorzaakt
een minder scherpe uitvlokking, althans met het in de
proeven gebruikte toxine, zoodat dan de waarde van de reac-
tie verloren gaat.

Met behulp van deze uitvlokkingsreactie is de sterkte van
een willekeurig antitoxisch serum te bepalen, indien men
een toxine van bekend uitvlokkend vermogen in handen
heeft.

Serum van paard 1 bevatte, volgens een titratie op caviae
220 A.E. per c.c. Toxine No. 26 vertoonde de uitvlokkings-
reactie met 0.6 c.c. van dit serum. Deze 0.6 c.c. bevatte
0.6X220=132 A.E.Dus 10 c.c. toxine No. 26 heeft voor de
uitvlokking 132 A.E. noodig.

Het uitvlokkend vermogen van een toxine wordt weerge-
geven door de L.f. (limes flocculationis); dit is, volgens Glenny
en Okell, de hoeveelheid toxine, die de uitvlokkingsreactie
geeft met 1 A.E. Uit bovenstaande gegevens kan men de
L.f. van toxine No. 26 afleiden. 10 c.c. toxine No. 26 geeft
de reactie van Ramon met 132 A.E. of 1 A.E. is equivalent

De sterkte van een willekeurig antitoxisch serum is nu te
bepalen met behulp van dit toxine No. 26. Men gaat uit van

een bepaalde hoeveelheid serum en gaat na hoeveel cc toxine
toegevoegd moet worden om de uitvlokkingsreactie tot stand
te brengen. Daar de L. f. van het toxine ^ is, is dan het

aantal A.E. van de gebruikte hoeveelheid serum gelijk aan
de hoeveelheid toxine in c.c., vermenigvuldigd met 13,2.
Deelt men deze uitkomst door het aantal cc. van het serum,
dan vindt men de sterkte hiervan in A.E. per cc. B.v.: 0.5 cc.
serum geeft de reactie met 8 cc. toxine No. 26 en bevat
dus 8 X 13,2 == 105,6 A.E. of de sterkte van het serum is

Men kan ook uitgaan van een bepaalde hoeveelheid van
het toxine en nagaan hoeveel cc. serum moet toegevoegd
worden om de uitvlokkingsreactie tot stand te brengen: b.v.
men gaat uit van 10 cc. toxine. Deze 10 cc. toxine is equiva-
lent met 132 A.E. Is to.v. 0.5 cc. serum gebruikt, dan bevat
deze 0.5 cc. serum 132 A.E. Dus de sterkte van het serum
is 264 A.E.

Door middel van een toxine waarvan de L.f. bekend is, kan
men nu ook, met behulp van een willekeurig serum, het uit-
vlokkend vermogen van elk ander toxine bepalen. Men be-
paalt eerst, door middel van het toxine van bekend uit-
vlokkend vermogen, dc sterkte van het serum, en met behulp
hiervan het uitvlokkend vermogen van het tweede toxine.

Men moet goed in het oog houden, dat men met behulp van
deze uitvlokkingsreactie de toxiciteit van een toxine niet kan
bepalen; men bepaalt alléén het uitvlokkend vermogen. Prac-
tisch gaan echter toxiciteit en uitvlolckend vermogen groo-
tendeels parallel, zoodat ook wel als regel een toxine met een
groot uitvlokkend vermogen, dus met een kleine Lf, een kleine
d.l.m. bezit.

De beschreven uitvlokkingsproeven werden alle uitgevoerd
met behulp van versch serum. Oud en ook gezuiverd, eiwit-
arm serum bleek de reactie niet te geven, echter wel, wanneer
aan oud of gezuiverd serum een weinig versch serum werd
toegevoegd. De sterkten van deze oude of gezuiverde sera zijn

nu ook weer te bepalen, indien de sterkte van het toegevoegde
versche serum bekend is. Een hoeveelheid versch serum van
220 A.E. werd vermengd met een zelfde hoeveelheid oud
serum. 10 cc. Toxine No. 26 gaf de reactie met 0,4 cc. van dit
mengsel. Deze 0,4 cc. bevatte dus 132 A.E. Hierbij is 0.2 cc.
versch serum, bevattende 0.2 X 220 = 44 \'A.E, Dus 0.2 cc,
oud serum bevat 132 _ 44 = 88 A,E,, of 1 cc, bevat 440 A,E,

Proeven ter verkrijging van een eiwitarm anatoxine,
bereid uit het neerslag van Ramon.

Wordt het bij de reactie van Ramon verkregen neerslag,
bestaande uit een verbinding van toxine en antitoxine, op-
gelost met behulp van een weinig azijnzuur en wordt deze op-
lossing een uur lang verwarmd op 60°, dan blijkt, dat het
toxine vernietigd is, terwijl de oplossing antitoxische eigen-
schappen heeft gekregen. Dit werd bevestigd door de volgen-
de proefneming. Het neerslag, verkregen door aan 15.6 cc.
serum een overeenkomstige hoeveelheid toxine toe te voegen,
werd verzameld en opgelost in 11 cc. aangezuurd water en
daarna een uur lang op 60° C. verwarmd. Het serum bevatte
oorspronkelijk 300 A.E. per cc. In deze oplossing was dus
aanwezig 4680 A.E. of 425 A.E. per cc., eventueele verliezen
buiten beschouwing gelaten. De oplossing werd nu getitreerd
op 400 A.E. per cc. en ingespoten bij een cavia. Het dier stierf
in vier dagen. Opgemerkt dient te worden, dat de gebruikte
cavia 300 gram zwaar was. Deze titratie was dus niet zuiver
quantitatief, maar toont aan dat vrijwel al het antitoxine
behouden is gebleven.

Uit het neerslag, bestaande uit toxine en antitoxhi\'e, ver-
kregen volgens de reactie van Ramon, nxis dvsi het antitoxine
weer vrij te krijgen, op welk feit Ramon dan ook de bereiding
van een zeer zuiver eiwitarm antitoxine heeft gegrond.

N^oor ons doel, de bereiding van een eiwitarm anatoxine,
was echter de vraag: Is het mogelijk nit het neerslag het anti-
toxine te vertüijdcren, zoodat het armtoxine overblijft?, van
meer belang.

Het antwoord op deze vraag zou voor de bereiding van
een eiwitam anatoxine van groote beteekenis kunnen zijn.

C. Hallauer (26) beschreef de werking van zuren op bac-
terieele toxinen. Hij vond, dat waterige oplossingen van diph-
therietoxine door toevoeging van zuren hare giftigheid ver-
liezen. De toxiciteit is weer terug te krijgen door de zure
oplossing te neutraliseeren met alkaliën. Tegelijk met de
giftwerking verdwijnen bij het aanzuren ook de antigeen-
eigenschappen, terwijl bij het neutraliseeren van de zure
oplossing deze eigenschappen weer terug komen. Op deze
manier is dus een antigeen om te zetten in een niet-antigeen
en omgekeerd een niet-antigeen weer in een antigeen. Het
inactiveeren van toxine door zuren is een proces, waarvan
het verloop afhangt van den zuurgraad der toxineoplossing.
De omzetting geschiedt niet in eens, maar heeft plaats na
een lange inwerking van het zuur. De reactiveering van het
toxine door alkaliën verloopt veel sneller. Hiervoor is slechts
een korten tüd noodig.

In verband met deze vinding van Hallauer werd de werking
van zuur op een oplossing van het neerslag van toxine en
antitoxine, verkregen volgens de reactie van Ramon, nage-
gaan.

Aan 300 cc. toxine No. 26 werd 18.5 cc. serum toegevoegd,
bevattend diè hoeveelheid antitoxine, waardoor het toxine
juist geneutraliseerd werd, d.w.z. die de sterkste uitvlokking
gaf. Dit mengsel werd 24 uur bij 37° C. geplaatst. Het zoo
verkregen neerslag werd afgecentrifugeerd en de helft daar-
van werd opgelost in 9 cc. water, waaraan 1 cc. normaal
zoutzuur was toegevoegd. Deze ziire oplossing bleef 24 uur
staan bij kamertemperatuur. By een cavia werd daarna V-i
cc. van de zure oplossing ingespoten. Het dier vertoonde na
deze injectie geen enkele reactie; de zure oplossing was dus
óf neutraal gebleven óf antitoxisch geworden. Om dit na te
gaan werd een tweede cavia behandeld met »/j cc. van de
zure oplossing, waaraan een hoeveelheid toxine was toege-
voegd, overeenkomende met 5 d.l.m. Ook dit dier vertoonde na
de injectié geen verschijnselen, zoodat er blijkbaar antitoxine
vrij was gekomen en wel voldoende om deze 5 d.l.m. te binden.

Na 24 uur werd de zure oplossing nauwkeurig geneutraliseerd
met Icaliloog. Van deze neutrale oplossing werd 1/2 cc. bij een
cavia ingespoten. Het dier stierf na vier dagen; de scheikun-
dig neutrale oplossing was dus biologisch niet neutraal geble-
ven, maar toxisch geworden; by de wisseling der scheikun-
dige reactie is dus antitoxine vernietigd.

Het tweede gedeelte van het oorspronkelijke neerslag werd
opgelost in 9 cc. water, waaraan 1 cc. normaal zoutzuur was
toegevoegd. Na 24 uur werd V2 cc. van deze oplossing ver-
mengd met een hoeveelheid toxine, overeenkomende met 50
d.l.m., ingespoten bij een cavia. Het dier vertoonde geen
reactie. Dus is een groote hoeveelheid toxine tijdelijk buiten
werking en een groote hoeveelheid antitoxine vry. Na 2 X
24 uur werd deze proef herhaald bü een tweede cavia. Ook
dit dier vertoonde geen verschünselen, terwül bü een her-
haling van de proef na 3 X 24 uur hetzelfde resultaat werd
verkregen. Na 3 X 24 uur werd de zure oplossing geneutra-
liseerd. Een cavia, ingespoten met 1 cc. van deze neutrale op-
lossing, vertoonde geen verschünselen, in tegenstelling met
de werking van de na 1 X 24 uur geneutraliseerde oplossing.

Uit deze proeven volgt dus: in de zure oplossing van het
neerslag, bestaande uit toxine en antitoxine, is vrü antitoxine
aanwezig. De binding tusschen het toxine en het antitoxine
schünt opgeheven te zün, terwül het toxine door de werking
van het toegevoegde zuur zün giftigheid en tevens zyn anti-
toxinebindende eigenschappen heeft verloren. In de na 24 uur
geneutraliseerde oplossing is een overschot aan toxine. Hier-
uit volgt, dat het door het zuur geïnactiveerde toxine zün gif-
tigheid geheel of gedeeltelük heeft teruggekregen, terwül
tegelükertüd het antitoxine gedeeltelük door het zuur is ver-
nietigd. In de eerst aangezuurde en daarna geneutraliseerde
oplossing is dus naast elkaar aanwezig vrü toxine en toxine
gebonden aan antitoxine.

Wanneer het toxine 3 X 24 uur aan de werking van het
toegevoegde zuur is blootgesteld, wordt het toxine door neu-
traliseeren van de zure oplossing niet meer gereactiveerd.

Het antitoxine is nog in vrij groote lioeveelheid aanwezig,
zooals blijkt uit het feit, dat 50 d.l.m. totaal geneutraliseerd
worden.

Verondersteld werd nu, dat zuur op een oplossing van het
neerslag bestaande uit anatoxine en antitoxine, verkregen
volgens de reactie van Ramon, op overeenkomstige wijze in-
werkt als op een oplossing van het neerslag van toxine en
antitoxine. Indien dit juist was, zou door aanzuren en daarna
neutraliseeren van de oplossing van anatoxine en antitoxine,
een oplossing verkregen worden, waarin naast elkaar aan-
wezig zijn: vrü anatoxine en anatoxine gebonden aan anti-
toxine; d.w.z. in de oplossing is een overmaat aan vry on-
giftig antigeen. Zoo zou dan een oplossing worden verkregen
die veel overeenkomst heeft met T.A., wat betreft de verhou-
ding antigeen antitoxine. Immers, in T.A. is naast elkaar
aanwezig toxine en toxine gebonden aan antitoxine, T.A. be-
zit dus eveneens een overmaat van vrij, maar giftig, antigeen.
Het voordeel van het ongiftige anatoxine-antitoxine, A.A.,
voor immuniseeringsdoeleinden springt onmiddellijk in het
oog, vooral in verband met de in den laatsten tijd in het bui-
tenland door T.A. verwekte ongevallen.

Aan 300 cc. anatoxine No. 43 II werd 18 cc. serum toege-
voegd; dit is diè hoeveelheid — waarmee de sterkste uitvlok-
king optreedt. Dit mengsel werd zoolang in de broedstoof ge-
plaatst, totdat een duidelijk neerslag was gevormd. Dit neer-
slag werd afgecentrifugeerd en opgelost in 45 cc. water,
waaraan 5 cc. normaal zoutzuur was toegevoegd. Na 24 uur
werd deze oplossing geneutraliseerd. Daarna werd een ge-
deelte van de oplossing zesmaal verdund, een tweede gedeelte
werd drie maal verdund en een derde gedeelte werd tweemaal
verdund. Zoo werden dus drie oplossingen verkregen, waarbij
in de eerste oplossing het antigeen aanwezig was in dezelfde
concentratie als in het oorspronkelijke anatoxine. In de twee-
de oplossing was het antigeen tweemaal en in de derde op-
lossing driemaal geconcentreerd. De drie oplossingen werden
achtereenvolgens genoemd: A.A. I, II en III.

De onvatbaarmakende werking van dit A.A. werd nu on-
derzocht. Drie groepen van vier caviae werden achtereenvol-
gens behandeld met A.A. I, II en III. De dieren kregen twee
of drie immuniseerende injecties van Yo cc, telkens met een
week tusschenruimte. Ongeveer 27 dagen na de eerste injec-
tie werd de reactie van Schick uitgevoerd. Daar in dit A.A.
analoge verhoudingen tusschen anatoxine en antitoxine aan-
wezig zijn als in T.A. tusschen toxine en antitoxine, was te
verwachten, dat de dieren na 27 dagen nog niet een vol-
doende immuniteit zouden bezitten. Immers, caviae behan-
deld met T.A., zyn pas na zes weken immuun. Daarom werd
ongeveer zes weken na de eerste immuniseerende injectie een
tweede reactie van Schick uitgevoerd. Drie dagen daarna
werden de caviae ingespoten met 40 d.l.m. Tabel X geeft een
overzicht van de verkregen resultaten.

Bü geen enkele van de dieren trad na de immuniseerende
injecties een plaatselüke reactie op. De eerste reactie van
Schick, evenals bü immuniseeren met zuiver anatoxine ver-
richt na 4 weken, was bü alle dieren positief, in tegenstelling
met het resultaat van de twee weken later, dus als na immu-
niseeren met T.A., uitgevoerde reactie. Nu reageerden alle
dieren negatief. Een pseudoreactie van Schick trad in geen
enkel geval op, hetgeen de eiwitarmoede van het gebruikte
A.A. duidelük bevestigt. De dieren waren dus volgens de
reactie van Schick na zes weken onvatbaar geworden, het-
geen ook verwacht werd.

Over de uitkomsten na de gift van 40 d.l.m. valt niet te
oordeelen, daar het grootste gedeelte van de dieren eenige
dagen na het toedienen van die gift stierven aan leverbotziek-
te. Geen enkele van de gestorven dieren, uitgezonderd cavia
No. 4, vertoonde verschünselen van diphtherietoxinevergifti-
ging. Dit laatste dier vertoonde lichte diphtherische ver-
schünselen, hoewel niet met zekerheid was uit te maken, dat
dit dier aan diphtherie gestorven was.

Uit de resultaten van de toediening der UO d.l.m. valt he-
laas door de ongelukkige sterfte der -proefdieren aan leverbot,

geen goede gevolgtrekking te niaken. Daar evenwel de reactie
van Schick bij alle dieren negatief uitviel, kan op grond van
de ervaring, dat deze negatieve reactie parallel loopt met
onvatbaarheid, worden besloten, dat de imnmniseerende wer-
king van A.A. een goede is.

Onmiskenbaar is de groote beteekenis, die reeds thans bij
de diphtheriebestrijding, de immunisatie met het toxine-anti-
toxinemengsel (T.A.) van Park en Zingher heeft. Ondertus-
schen ziin de aan het gebruik ook van dit mengsel verbonden
bezwaren niet denkbeeldig gebleken (zie inleiding).

Tot op zekere hoogte voorziet reeds thans, in theorie, het
door Ramon aangegeven anatoxine — een door inwerking
van formaline op toxine bereide, als onschadelijk aanbevo-
len, entstof — in deze leemte. By de practische toepassing
is ondertusschen hier te lande en elders gebleken, dat aan de
enting onaangename, zij het onschadeliike, reactieverschijn-
selen verbonden zyn.

Een poging, om deze te ondervangen lag aan de proefne-
mingen, die in deze verhandeling neergelegd zyn, ten grond-
slag.

Allereerst werd een systematisch onderzoek ingesteld naar
de factoren, die by de omzetting van toxine in anatoxine een
rol spelen. Daarbij bleek, dat voor deze omzetting een bepaald
formalinegehalte noodig was. De beste uitkomsten werden
verkregen met een formalinegehalte van 0.1 %. By nadere
bestudeering van het wezen van het verkregen product bleek,
dat de antigeenwerking van het toxinedoor inwerking der for-
maline niet vernietigd werd tenzy het formalinegehalte hoo-
ger genomen werd dan 0.4 %. Dan verdwenen ook de anti-
geeneigenschappen.

Wat de temperatuur betreft, waarby de omzetting van
toxine in anatoxine plaats vindt, bleek by een formalinege-
halte van 0.4 %, 37° C. gedurende 29 dagen de voorkeur te
verdienen. By inwerking van hoogere temperatuur verdwynt
de giftigheid wel veel sneller, maar blyft niet de volle anti-
geenwerking behouden. Dit geschiedt het best by 37° C., ter-

wijl de giftigheid verloren gaat. Inwerking van een hooge
temperatuur alléén geeft geen aanleiding tot het vormen van
anatoxine. De toxische werking wordt dan wel weggenomen,
maar ook de onvatbaarmakende werking verdwijnt.

Vervolgens werd gezocht naar een antwoord op de vraag
of een zekere mate van overgebleven toxiciteit de onvatbaar-
makende werking van anatoxine ten goede kwam. Uit de
genomen proeven bleek, dat zwak toxisch anatoxine zeer goed
immuniseerde, misschien zelfs beter dan geheel atoxisch
anatoxine. Afgezien van het vraagstuk der plaatselijke reac-
tie, moest toch de giftigheid van dit mengsel als een bezwaar
voor de toepassing bij den mensch beschouwd worden.

Een nader onderzoek naar de immuniseerende werking van
verschillende anatoxineoplossingen leerde nog het volgende:
de onvatbaarmakende werking van een anatoxine wordt ge-
deeltelijk bepaald door de vergiftigheid van het oorspronke-
lijke toxine. Het sterkst immuniseerende anatoxine wordt
verkregen wanneer men uitgaat van een toxine met een kleine
dosis letalis minima

Uit de negatieve resultaten van proeven om caviae te im-
muniseeren door middel van toediening door den mond van
toxine, T.A.U., of anatoxine, werd de slotsom getrokken, dat
zoodanige toedieningswijze geen immuniseerende werking
heeft.

Vervolgens werd de invloed bestudeerd, die verdunnen
heeft op het optreden van plaatselijke reactie eenerzijds en
de immuniseerende werking anderzijds; een en ander in ver-
band met de hierboven genoemde onaangename reactie, ver-
bonden aan het inspuiten van onverdund anatoxine, in de
gebruikelijke dosis. Deze reacties zijn afhankelijk van het
hooge gehalte aan aspecifieke eiwitten. Uit de genomen proe-
ven valt af te leiden, dat de tienvoudige verdunning van een
werkzaam anatoxine (en deze weer afkomstig van een sterk
werkend toxine) een goede onvatbaarmakende werking bezit.
Grootere verdunningen hebben onvoldoende onvatbaarma-
kende eigenschappen. Plaatselijke reacties traden na de im-

Ondertusschen werd de mogelijkheid verondersteld, een
anatoxine te bereiden, dat arm was aan aspecifieke eiwitten
en dan ook onverdund een krachtige onvatbaarmakende wer-
king zou paren aan het voordeel geen ongewenschte reactie
te geven. Met behulp van ammoniumsulfaat werden de ver-
schillende eiwitten uit toxine van elkaar gescheiden en na-
gegaan aan welk eiwit de toxiciteit gebonden was. De pseudo-
globulinegroep bleek de meest toxische eigenschappen te bezit-
ten. Nu moest worden nagegaan of de antigeenwerking van
anatoxine eveneens gebonden was aan de, eventueel in het
anatoxine aanwezige, pseudoglobulinegroep. Met behulp van
ammoniumsulfaat werd deze groep uit anatoxine neergesla-
gen, af gefiltreerd en weer opgelost in water. Nu werd van
deze oplossing de onvatbaarmakende werking onderzocht. Uit
de desbetreffende proeven bleek, dat deze (op drievoudige
sterkte gebrachte) pseudoglobulineoplossing bevredigende
immuniseerende eigenschappen heeft. (De oplossing bleek bij
een gelijk pseudoglobulinegehalte als van het oorspronkelijke
anatoxine, slechts zwakke onvatbaarmakende werking te
bezitten).

In aansluiting hieraan werd nu nog langs geheel anderen
weg gestreefd naar het verkrijgen zoowel van een eiwitarm
toxine als van een eiwitarm anatoxine. Als uitgangspunt
hiertoe diende het feit, dat in mengsels van antitoxine en
toxine (resp. antitoxine en anatoxine) onder bepaalde om-
standigheden samengebracht, een vlokkig neerslag ontstaat,
bestaande uit een verbinding van antitoxine en toxine (resp.
antitoxine en anatoxine). Dezerzijds werd nu de mogelijkheid
verondersteld, dat deze verbinding omkeerbaar zou zijn. In
dat geval zou vernietiging op de een of andere wijze van de
antitoxine-component tengevolge hebben, dat een eitvitarm
toxine, resp. anatoxine, verkregen werd. Als voorbereidend
onderzoek werd de uitvlokkingsreactie van Ramon nader be-
studeerd en van verschillende toxinen en anatoxinen het uit-

vlokkend vermogen bepaald. Daarbij bleek, dat het uitvlok-
kend vermogen van een toxine als regel des te grooter is
naarmate de d.l.m. kleiner is. Van belang is verder, dat een
toxine en het daarvan bereide anatoxine hetzelfde uitvlok-
kend vermogen bezitten. De temperatuur, waarbij de uit-
vlokkingsreactie het scherpst optreedt, is 37° C. De reactie
verloopt sneller bij hoogere temperatuur en tot 50° is het
verloop nog goed te volgen. Boven 50° verliest zij echter
haar waarde, omdat dan onregelmatigheden in de uitvlok-
king optreden.

Om een juiste waarneming van het mengsel, waarin het
eerst de uitvlokking ontstaat, mogelijk te maken, bleek het
noodzakelijk het verloop der reactie voortdurend te volgen.

Bovendien werden nog de navolgende bijzonderheden over
de uitvlokkingsreactie gevonden. Z\\] verloopt met behulp
van twee maal verdund antitoxisch serum op dezelfde wijze
als met onverdund. In alle opzichten werd bevestigd de
vondst van Ramon, dat met behulp van deze reactie de
sterkte van een willekeurig antitoxisch serum te bepalen is,
indien men over een toxine van bekend uitvlokkend vermo-
gen beschikt. Zoo ook, dat men door middel van een toxine,
waarvan de limes floculationis (Lf.) bekend is, met behulp
van een willekeurig serum, de Lf. van elk ander toxine bepa-
len kan.

Wat nu de pogingen betreft om uit het vlokkig neerslag,
verkregen bij de uitvlokkingsreactie, weer toxine vrij te
maken, het navolgende. Dit neerslag werd met behulp van
zoutzuur opgelost en de aldus verkregen oplossing na 24 uur
geneutraliseerd (ten opzichte van phenolphthaleïne). Bij na-
dere proeven bleek, dat in de zure oplossing vrij antitoxine
aanwezig was. De binding tusschen het toxine en het anti-
toxine was dus opgeheven, terwijl het toxine, door de wer-
king van het toegevoegde zuur, zijn giftigheid en tevens zijn
antitoxinebindende eigenschappen verloren had. In de na 24
uur geneutraliseerde oplossing bleek een overmaat van toxine
aanwezig te zijn. Daaruit volgde dus, dat het door het zuur

geinactiveerde toxine zijn giftigheid geheel of gedeeltelijk
teruggekregen had, terwijl tegelijkertijd het antitoxine door
het zuur gedeeltelijk vernietigd was.

Verondersteld werd nu, dat zuur op een oplossing van het
neerslag, bestaande uit anatoxine en antitoxine, op overeen-
komstige wijze inwerken zou. Dan zou een oplossing worden
verkregen, die veel overeenkomst heeft met T.A., wat be-
treft de verhouding antigeen-antitoxine. In dit „A.A."
(„Ananti") zou dan naast elkaar aanwezig zijn: vrij anti-
geen en antigeen, gebonden aan antitoxine. Dat dit inderdaad
het geval is, bleek uit de goede immuniseerende werking van
dit ananti. Bij geen enkel dier trad na de immuniseerende in-
jecties een plaatselijke reactie op. Na zes weken vertoonden
alle dieren een negatieve reactie van Schick. ■

De gevolgtrekking is dus gewettigd, dat het mogelijk is,
ter voorbehoedende onvatbaarmaking tegen diphtherie, de
beschikking te knjgen over een entstof, die aan krachtige
immuniseerende werldng een volstrekte orischadelijkheid —
in den zin van toxiciteit — pmrt en bovendien door de afive-
zigheid van aspecifieke eiwitten tot geenerlei ongeioenschte
reactie bij de inspuiting aanleiding geeft.

22. Bull, et Mém. de la Soc. Med. des Hôpitaux de Paris
T XLVII No. 16, 17, 18.

H
f

Anatoxine
N°.

47
1 :10

cS
ü

I
"iö"

ÏT/ÏÖ

31/10

- 1 30/8

7/9
14/9
7/9
7/9
10/9
10/9
10/9

1
2
8

8
9

10
11

« 99

18/8

S
B

cS
«

es
rs

«3

II. Wordt bij de bereiding van anatoxine
de toxische werking weggenomen door
formaline of door verwarmen? . . .31

IV. Is het mogelijk, anatoxine te bereiden,
arm aan eiwitten, waardoor de aspeci-
fieke reactie wordt venninderd, maar de
antigeenwerking blijft behouden? . . 43

V. Heeft zwak toxisch anatoxine een be-
tere immuniseerende werking dan ge-
heel atoxische anatoxine? .... 46

VI. Wordt de onvatbaarmakende werking
van een anatoxine bepaald door de oor-
spronkelijke giftigheid van het toxine;
staat zij dus in rechtstreeksch verband
met de d.l.m.?.......49

VIL Is immuniseeren per os mogelijk? . . 51
VIII. Proeven omtrent de uitvlokkingsreactie

IX. Proeven ter verkrijging van een eiwit-
arm anatoxine, bereid uit het neerslag

Met behulp van de reactie van Ramon is de sterkte (d.l.m.)
van een toxine niet te bepalen.

De encephalitis, die ontstaat na enting tegen pokken, berust
niet op een neurotroop worden van het vaccmevirus.

De toediening door den mond van een waterige suspensie
van adsorbeerende kool (carbo adsorbens) ni voldoende hoe-
veelheden, verdient als eerste hulp by vele vergiftigmgen de
voorrang en de voorkeur.

Voor het stellen van de bacteriologische diagnose diphthe-
rie, is virulentieonderzoek onmisbaar.

Bij keuring van beroepschauffeurs is het noodig, dat hun
kleurenzin getoetst wordt.

Door sterilisatie van erfelijk belaste individuen neemt het
aantal minderwaardigen slechts langzaam af.

Bij de procedure met betrekking tot het onderzoek naar het
vaderschap, heeft serologisch bloedonderaoek weinig waarde.

^ O) ^	O W ft «S CU ® P O* l-H a p	bO O «O rf^ rt^ " ê- K* ® S P	00 O 05 ^ a (D H B P	> 0 ^ c 1 CD
>0. os (O I-\'	03 bO M	•f. co to i-*	rf». CO to	Cavia
- » - - . O	C3 - - \' "HÏ O	- - - ^ - - - ^ O	g - - - O	le injectie
1 1 1 1	1 1 1 1	1 1 1 1	1 1 1 1	reactie
1-1 co ï ï 3 -^ï O	Hi - . . W " \' " I-» O	- - - " " \' t-i	- - . Jï;	2e injectie
1 1 1 1	1 1 1 1	1 1 1 1	H-H-	reactie
to - " i-i O	O	t-» t—1 M (-»	Hi h-i - H» Hi	Se injectie
H-H-	1 1	1 1	-I-	reactie
- - - w " h-k	h-l . , W «I " l-k 1-1 Hi O	. . . ^	to . , - " * H» Hi	datum	CQ
1 1 1 1	1 ^	1 1 hfH-	1 H- 1 1	O
1 1 1 1	s 1 s-	1 1 H- 1	1 1 1 1	<
, , « «ï (-i	- - ■• - I-»	to .. , , -92 - - " i-k	. . , ^ • - .. h-i	datum	1 1
»(^ to N> O O O O	H.» rf.. to O O O TT O	ï 3 ï - - - O	. . ï è	aantal	I CL 3
1 2 « 5 g ^ § 3^3 tü m ® —Q	-1- ^ N O l-i	1 i	H-H- H-	3 n rt. 5\' !

Ol ® w . c S 1 ® e ° O-		w S O- C« 00 § p«	w P co rfi. O* 00 JP 00 o^ M 3 r	Ol O) tt^ Ol , 00	> 3 s i
W to >-«	CO to M	tf- os bo t—	rf»- co to M	tf». M to l-"	Cavia N".
. . - S - . .. O	. , . s \' "■ \' «O	to - - "ïo	■* • lo	to .. , ^ CO - - " lo	le injectie
1 1 1 1	1 1 1 1	MM	1 M 1	M 1 1	reactie
» » - i-i	. . , ^ - - • "S O	3 \' - " \' \' f—^ O	, c« - - HÏ O	os . - - Ti O	2e injectie
1 H- 1 1	MM	MM	1 M 1	MM	reactie
i-i i-i - i-i	O	- O	i-mi, -Ï5 O	i-i- co O	3e injectie
1 H-	1 1	1 1	1 1	1 1	reactie
= . - ^ " * M	- ^. « " * "* h-i O	to - - • O	- . . ® \' * H» O	to . , . * - " l-l O	datum	Cö O o\' PT-
		M 1	1 1	1 ^	O
1 1 1 i	MM	1 1 1	1 1 1	MM	<
§	to » - - O	bO «O - - - ^ O	, . , s " - 1—1 O	to . . , - - - ^ O	datum	CL
ê	to t«\' to O O O O	tK to to O O O O	to rfk. to O O O O	to tt^ to O O O O	aantal
to	£2 3 3 § s s ^ O 3 3 O OQ 03 ® ^	MM	se- S i i géi 1: ® QD ^^ CO hJ ^ £. ® S- s ® S- S 3 <5 ®		i O S\'

s	O* O SB a HH	g p HH HH	§ s> HH	§	§ HH HH HH	§ a	§ HH	Z rf 3" (D
HO t-l o> w	CO	H-l H-i to t-i	l-i O «O	00 -J	05 W	co	to Hk	Cavia N".
\' i-k t-i							HH	Ie injectie
1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	reactie
" Ml								2e injectie
1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	1 1 H^ to	reactie
^ to 1							3e injectie
1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	1 1	reactie
	ï ï			3 ï	ï :		HH HH to	datum	W O TT
to		<		H-H-	H-	tf H-	H- 1	O
^ 1	1 1	1 1	1 1	H-H-	1 1	1 1	1 1	<
s f-t- 2 fp 3 Jè: c ^ Ü)	- -			ï ï	ï ï	ï ï	HH HH to	datum	3 1 1
3	(O O O		ê §	^ to O O	è g	to O O	ê§	aantal
		1 -i-		1 s CB 3	s a	3 s 3 co n>	S ® O \'■i	3 99 O a\'

00 t—1 1—( (-H 85 HH (—(	00 1—( 1—I ►H 01	13 Z et- i O
CO U) t—	co lo	Cavia N°.
: : 3 ::■	to - - - (0	Ie injectie
l 1 1 1	1 1 1 1	reactie
ï ï : ï	. - . s to	2e injectie
1 1 1 1	1 1 1 1	reactie
Cl» H»	Ol	3e injectie
1 1	1 1	reactie
ï : : ï	1-1 3 3 3 4® t-i	datum	co O B: O
^		O
1 1 1 i	H- 1 1 H-	<
ï ï 3 ï	3 - - ^ 1—\'	datum
ê g ê §	ê § ê §	aantal
--J- ^	^	3 ts O ct- 5\'

> »-\' co » S" ® B\' (D	H CJ	h-i Z O O M K) i\' as ®	s O t»
O CO ®	05 cn	co to M	Cavia N°.
2 ï 3 5		ïS : 3 : O	le gift
1 1 1 1	1 1	1 1 1	reactie
ï ï ï :		co Hl	2e gift
1 1 1 1	1 1	1 \' \'	reactie
- ï	ï	O	3e gift
1 1	1	1 1	reactie
ï ï ï 3	^ sa	ï -	datum	CO O Ö*
		1	O
1 1 1 1	1 1	1 1 1	<
ï : : 5	s :	ï » i_i	datum	O. 3
è 1 1 1	1 O \'	è 1 ê	aantal
		g s	i O et-

Paeudo-	O*	.52		.2	a>	.2	£	Schick	dim
globulinen	es	•z»	O	O	O	s	S				fl	#—4
uit anatoxine	\'S		s	S	£	.s	S	1	0	V	c s	oS	reactie
45 II	c3 ü	(D		(S	« 03		■3			c8	§
			1					T3
3 X gecon	1	3/11		10/11				30/11		28/11		intercurrent
centreerd.	2		99	—			99		19/11		intei	■current
	3	f9	—	99	—	17/11	—	99	db	±	3/12	40
	4	tt	—	99	—	>>	—	99	±	±	99	99
	5	14/12	—	21/12	—			11/1	±	±	14/1	99
	6	ft	—	99	—			99		±	99	20
	7	»9	—	99	—	28/12	±	99		—	99	40	t
	8	99	1 —	99	—		±	99	—	—	99	20	—
	9		! _ 1	99	—	>>	±	99	—	—	99	40
zelfde	1	B/11		10/11	_			30/11	±	±	3/12	40
concentratie	2	ff	—	99	—		1	99	±	±	tt	>f	t
	3	tt	—	1 "	—	17/11	—	99	—	-	tt	1 1)	—
	4	ft	—	99	—		—	99	±		tr	1)	f

									dim
Anatoxine	Cavia	le		2e		3e
			reactie		reactie		reactie
	N°.	injectie		injectie		injectie		datum	aantal	reactie
43 I	1	11/8	—	18/8
Hcht	2		—	tt
toxisch	3	ff		tt		28/8
	4	ff		tt		tt
	5	18/8
	6	»1		25/8
	7	ff		ff
43 I	1	15/8	—	22/8	—	30/8	—	7/9	20
1 :10	2	»>	—	ff	—	ff	—	14/9	40	—
licht	3		—	ff	±			1/9	20	—
toxisch	4	>1	—	tf	±			7/9	99	—
	5	. 18/8	—	25/8	±	2/9	±	10/9	ff	—
	6	»>	—	ff	±	tt	±	10/9	ff	—
	7	ft	—	tf	±	tt	±	10/9	»	—
43 II	1	28/8	—	5/9	—			17/9	40	—
atoxisch	2	1?	-	tt	—		1	23/9	tt	f
	3	tt	—					12/9	tt
	4	tt	—					23/9	tt
	5	tt	—	tt	—			17/9	tt	f
	6	tt	—	tt	—		i	23/9	tt

N**. van het	dhn van het	Temperatuur waarbij de re- actie geschiedde	Sterkte van het serum in A.E.	Hoeveelheid van het serum
toxine of anatoxine	toxine in mgr.	in c.c.	in A.E.
45		± 8	37°	220	0.2	44
	45	—	if	tf	0.3	66
48		6	if	tt	—	—
	48	—	if	tt	0.3	66
43		< 4	50°	tt	0.6	132
	43	—	ff	Tt	0.6	132
49		—	ff	lt	0.3	66
	49	5	ff	tt	0.3	66
öl	•	—	,,	tt	0.25	55
Ö2		4	tf	tt	0.45	99
26		3	ff	tt	0.6	132
26		3	37°	tt	0.6	132
26		3	50°	tt	0.6	132
26		3	55°	tt	0.6	132

1/2	—	15/2	—	—	18/2	40
	—	tt	—	—	99	>>
9t	—	tl	—	—	99	tt
99		»			99	II



-, >\'vTv,


	>