aan de rijks-universiteit te utrecht,
op gezag van den rector magnificus DR.
B.J.H. OVINK, hoogleeraar in de faculteit
der letteren en wijsbegeerte. volgens
besluit van den senaat der universiteit
tegen de bedenkingen van de faculteit der
geneeskunde te verdedigen op DINSDAG
26 JUNI 1928, \'s namiddags 4 uur. door

Daar mijn academische scholing in dezen arbeid haar einde vindt, grijp
ik de gelegenheid aan om U, mijn Leermeesters der Utrechtsche Universiteit,
mijn diepgevoelden dank uit te spreken voor de veelzijdige opleiding,
die ik door Uw toedoen heb verkregen.

Hooggeleerde EYKMAN, nu dit proefschrift, dat de samenvatting is
van in Uw laboratorium gedurende verscheidene jaren voortgezette onder\'
zoekingen, is voltooid, gevoel ik hoezeer Ge mij aan U hebt verplicht met
Uw voortreffelijke wetenschappelijke leiding.

Door Uw onafgebroken belangstelling en vriendschappelijke deelname,
zijn Uw uitgebreide kennis en kritische zin mij een hoog gewaardeerde
steun geweest voor de bewerking van deze dissertatie. De jaren, in Uw
laboratorium doorgebracht, beteekenen voor mij een blijvende bron ven
wetenschappelijke en persoonlijke herinneringen.

Het is hier ook de plaats om den invloed te gedenken dien Gij, Hoog\'
geleerde RINGER, op mijn vorming hebt gehad. De tijd. in het physiolo-
gisch-chemisch laboratorium doorgebracht, deed zich in mijn later werk
gelden. U. evenals mijn betreurden Leermeester PEKELHARING, behoort
daarvoor mijn dank.

Zeer Geleerde van RIJSSEL, het was in Uw laboratorium, dat ik voor
het eerst met de practijk der Serologie en Bacteriologie kennis maakte. Ik
vergeet niet, hoe gij mijn belangstelling voor verscheidene harer problemen
hebt weten te wekken.

Ofschoon, Zeer Geleerde BIJL. de drukke werkzaamheden aan de Bacte-
riologische Afdeeling van het Centraal Laboratorium zulks niet gemakkelijk
maakten, hebt gij mij in de gelegenheid gesteld om dii proefschrift te vol-
tooien. waarvoor ik U veel dank verschuldigd ben. Uw aangename omgang
en die mijner Collegae aan het Laboratorium, stel ik op hoogen prijs.

In het bijzonder wensch ik nog de overwegende beteekenis. die het weten-
schappelijk vuur en het voorbeeld mijns Vaders steeds voor mij hebben ge-
had, in dankbaarheid te gedenken.

Reeds spoedig na het ontstaan der serologische wetenschap,
is men erin geslaagd een groote verscheidenheid van anti-
stoffen in het bloedserum van lijders aan infectieziekten cn
van met bacteriën behandelde proefdieren te onderkennen;
ook vond men dergelijke antistoffen, die ontstonden na paren-
terale toevoering van allerlei cellen en opgeloste stoffen aan
het menschelijke of dierlijke organisme, welke hieraan vreemd
waren. Als de voornaamste groepen dezer antistoffen gelden:

Hierbij komen nog de opsoninen, die de phagocytose ver-
gemakkelijken Al deze antistoffen gelden als specifiek, d.w.z.
ze reageeren uitsluitend of vooral met het antigeen, de sub-
stantie, die ze heeft doen ontstaan; daar zij het product zijn
van een verworven immuniteit, noemt men ze ook immuun-
stoffen.

Aanvankelijk was men de meening toegedaan, dat men door
middel van de verschillende toegepaste methoden (onschadelijk
maken van vergiften bij proefdieren, uitvlokkingsreacties in
reageerbuizen enz.) ook werkelijk geheel verschillende anti-
stoffen kon aantoonen. Wanneer men met een enkelvoudig
antigeen — zooals een gezuiverde eiwitstof — een proefdier

Dc niet geheel in dit kader passende anaphylaxinen laat ik hier buiten
beschouwing.

inspuit, dan ontstaat behalve predpitine ook complementbindende
antistof. Werkt men evenwel met gecompliceerde antigenen,
zooals b.v. het geval is, wanneer men bacteriën of roode bloed-
lichaampjes inspuit, die opgebouwd zijn uit een aantal ver-
schillende eiwitstoffen, dan is het resultaat nog moeilijker te
overzien volgens de oudere opvattingen, daar tegen al deze
antigenen alweer verschillende antistoffen zouden worden ge-
vormd. In den nieuweren tijd helt men over naar de opvatting,
dat in waarheid het immuniseeringsproces niet zoo ingewik-
keld is; voor elk antigeen, dat niet uit een aantal reageerende
stoffen is samengesteld, zou men eerder de vorming van één
enkele antistof mogen verwachten. De tegenstanders van deze
unitarische hypothese ^ waarvan enkele aanhangers zich reeds
in het begin van de ontwikkeling der serologie lieten gelden —
grondden hun oppositie vooral op het feit, dat in vele ge-
vallen deze antistoffen niet samengaan in hun werking; het
komt voor, dat zij niet alle tegelijkertijd ia het immuunserum
aantoonbaar zijn, ook wanneer hun ontstaan voor een gegeven
geval op goede gronden aangenomen mocht worden.

Een studie te leveren, die dit vraagstuk geheel omvat, is
nauwelijks mogelijk. Van het oogenblik af, dat ik mijn onder-
zoekingen over dit onderwerp aanving, heb ik mij beperkt
tot de groep der uitvlokkende antistoffen. Ook hier heeft
men tusschen dc hoofdtypen der specifieke uitvlokkingen:
precipitatie cn agglutinatie, verschillen opgemerkt, die men
als bewijzen tegen de identiteit dezer antistoffen meende te
mogen opvatten. Dit proefschrift is het resultaat van een poging,
om in deze zaak eenige klaarheid tc brengen. Ter verduide-
lijking zij nog even in herinnering gebracht, dat precipitinen
antistoffen zijn, die uitvlokking teweeg brengen van een anti-
geen in opgelosten toestand, terwijl agglutininen hetzelfde doen
met een gesuspendeerd (corpusculair) antigeen, b.v. bacteriën
of lichaamscellen.

In 1897 ontdekte Kraus (1). dat, door aan Altraten van bac-
tcrieculturen in bouillon een weinig serum van tegen deze
bacteriën geïmmuniseerde dieren toe te voegen, in het mengsel
neerslagen ontstonden, die van even specifieken aard bleken
te zijn als de reeds gevonden agglutinatie-reacties. Deze neer-
slagen ontstonden n.l. alleen bij toevoeging van zulk een
homoloog immuunserum; niet indien een serum van een niet
behandeld dier (normaal scrum) of van een met andere bac-
teriën geïmmuniseerd dier werd gebruikt. Paltauf (2), in wiens
laboratorium deze proeven gedaan waren, heeft aanstonds
getracht verband te leggen tusschen deze specifieke uitvlokkingen
in cultuurflltraten (precipitaties) en die welke bij de culturen
zelf, door samenklontering der in de vloeistof zwevende bacteriën,
konden worden opgewekt (agglutinaties). Kraus had n.l. ge-
vonden, dat behalve bouilloncultuurflltraten, ook extracten van
dc bacteriën zelf dergelijke precipitaties met homologe im-
muunsera vertoonden. Paltauf meende nu te moeten aannemen,
dat het eigenlijk alleen op de precipitatie aankwam, en de
agglutinatie der bacteriën geheel te verklaren was, doordat
deze door het in de vloeistof ontstane precipitaat werden
meegesleept naar den bodem van het proefbuisje. In deze
theorie van Paltauf werd dus aan de bacteriën een geheel

passieve rol toebedeeld, en de ontwerper ervan heeft hiermee
den geheelen strijd over het verband tusschen precipitatie en
agglutinatie ontketend.

Proeven van Ch. Nicolle. Ch. Nicolle (3) heeft voor deze
theorie experimenteele bewijzen zoeken te vinden. Hij herhaalde
de proeven van Kraus, en voegde aan de cultuurflltraten
suspensies van geheel andersoortige bacteriën of ook wel
anorganisch materiaal toe, en zag dan de suspensiedeeltjes
geheel als bij een agglutinatie samenklonteren. Tevens werd
een sterk versnelde reactie waargenomen. Zag hij b.v. met
een Altraat van colibacillen-cultuur eerst na 15 a 20 uur preci-
pitatie door het immuunserum optreden, bij toevoeging van
typhus-, proteus- of psittacosisbacillen was er reeds na Vs uur
agglutinatie. Evenzoo: Altraten van den „vibrion de Massaouahquot;
gaven na 24 uur precipitatie met het homologe serum, bij
toevoeging van talkpoeder agglutineerden de suspensiedeeltjes
reeds na 1 uur.

Kraus heeft zich in een onderzoek samen met Seng (4) voor
deze proeven van Nicolle verklaard. Wat Nicolle vond voor
de speciAeke precipitatie, werd door Kraus en Seng ook aan-
getoond voor precipitatie van bacterieAltraat-eiwitten door
chemicaliën, zooals alcohol. Werd hierbij aan het Altraat de
een of andere suspensie van anorganisch materiaal toegevoegd,
dan agglutineerde de suspensie; in een contrölebuis, waar de
suspensie was toegevoegd aan physiologische zoutsolutie (dus
zonder bacterie-eiwit), trad met alcohol geen agglutinatie op.
Het feit, dat meestal in geagglutineerde bacteriemassa\'s om
de bacteriën geen laagje van geprecipiteerd eiwit kon worden
aangetoond, wordt niet aanvaard als tegenargument, daar in
de bovengemelde proeven dit laagje (dat toch wel bestaan
moet) evenmin door het met een microscoop gewapend oog
kan worden ontdekt: zelfs door kleuring wordt het niet
zichtbaar.

Niettemin is tegen de „mechanischequot; theorie van Paltauf
en Nicolle een sterke oppositie ontstaan. Indien werkelijk, zoo
redeneerde men, de agglutinatie afhankelijk is van een in de
vloeistof gevormd precipitaat, dan moet men ook altijd in ge-
vallen, waar agglutinatie wordt aangetoond, met het fikraat
der culturen precipitatie kunnen opwekken. Tchistovitch (5),
die overigens de proeven van Nicolle bevestigde, wees erop
dat dit in \'t geheel niet het geval is: vaak blijft de precipi-
tatie uit, terwijl de bacteriën goed worden geagglutineerd
door het specifieke serum. Radzievsky (6) heeft bevestigd, dat
inderdaad agglutinatie en precipitatie niet parallel gaan. Om
goed precipitabele fikraten te verkrijgen, moet men oude cul-
turen, waarvan vele bacteriën zijn afgestorven en door de
vloeistof uitgeloogd, filtreeren; hiermee krijgt men een over-
vloedig precipitaat, terwijl zulk een oude cultuur in vele ge-
vallen slecht agglutineert. Omgekeerd worden jonge culturen
zeer gemakkelijk geagglutineerd, terwijl de fikraten zeer slechte
of geen precipitaties geven. Deze resultaten zijn wel algemeen
aanvaard, zoodat de theorie van Paltauf-Nicolle geen lang
leven heeft gehad.

Veeleer neemt men met Gruber en Bordet aan, dat het
proces der agglutinatie zich afspeelt aan de oppervlakte der
bacterie zelf, buiten invloed der precipitatie, die eventueel in
de vloeistof plaats vindt. Het is evenwel duidelijk, dat deze
opvatting op zichzelf geen conclusies toelaat aangaande de
vraag, of men bij deze twee reacties met éénzelfde antistof,
of groep van antistoffen, te doen heeft, daar men bovenge-
noemde punten van verschil geheel kan terugbrengen tot het
al of niet aanwezig zijn van precipitabele of agglutinabele
substantie.

Het vraagstuk: is bacterieagglutinine hetzelfde als bacterie\'
predpitine, is, geheel onafhankelijk van de bovenbeschreven
opvattingen, het onderwerp van een meeningsverschil geweest,
dat aanleiding was tot het schrijven van dit proefschrift, zoodat

de argumenten pro en contra dienen te worden uiteengezet.
In hoofdzaak kunnen de argumenten, die tegen het z.g. uni-
tarisch standpunt worden aangevoerd, in 3 groepen worden
samengevat, waarvan de eerste twee, in tegenstelling met de
derde, algemeen zijn erkend en aanvaard.

le. Bij de precipitatie-reactie kan men het antigeen sterk
verdunnen, terwijl dit met het antiserum niet mogelijk is. Hoe
ver de verdunning van het antigeen (hier = precipitable sub-
stantie) kan gaan, is vooral gebleken, sinds men precipitinen
tegen menschelijke en dierlijke eiwithoudende vloeistoffen
(serum, melk enz.) is gaan bereiden. Verdunningen van het
antigeen van 1 : 10.000 en meer zijn niets bijzonders, indien
men over een sterk antiserum beschikt.

Daartegenover kan men zelfs sterke antisera slechts weinig
verdunnen, zonder dat zij hun werking verliezen. In het hand-
boek van Kolle en Wassermann vindt men aangegeven dat
de grens ongeveer de 1 :40 bedraagt. In de litteratuur vond
ik evenwel meer dan eens titers van ± 1 : 100, terwijl ikzelf
éénmaal (met paardeserum als antigeen) den titer 1 :200 heb
behaald.

Ik meen goed te doen erop te wijzen, dat volgens algemeen
verbreide opgaven \' die ik ook tijdens mijn onderzoek be-
vestigd vond — een serum ongeveer bij de verdunning 1:1000
de grens bereikt, waarbij nog door chemische middelen een
eiwitneerslag kan worden verkregen. De specifieke neerslagen,
met sterke antigeenverdunningen verkregen, bestaan dan ook
bijna geheel uit precipitine van het antiserum afkomstig; het
antigeen is dan zoo sterk verdimd, dat het op zichzelf geen
waarneembaar neerslag meer kan geven. Dit wetende, mag
men de juistheid eener bewering als van Cromwell (7), die
met een (haemoglobine-) antigeenverdunning van 1 :200.000
en een antiserumverdunning van 1 :4.000 nog precipitaten
zag, met reden betwijfelen.

2e. Bij de agglutinatie-reactie kan men het antiserum sterk
verdunnen, terwijl dit met het antigeen niet mogelijk is. Bij
de agglutinatie is het dus geheel omgekeerd: antiserum-ver-
dunningen van 1 : 10.000 zijn gemakkelijk te bereiken, en
herhaaldelijk zijn veel hoogere titers waargenomen. Daartegen-
over staat, dat men een bacteriesuspensie reeds na betrekke-
lijk geringe verdunning al niet meer voor de agglutinatieproef
gebruiken kan. Een verhouding, waarbij het conglomeraat in
hoofdzaak uit antistof bestaat (verg. boven precipitinen). komt
hier dan ook niet voor.

3c. Precipitinen en agglutininen zijn niet altijd beide tegelijk
in een antiserum aantoonbaar. Bestaat bij de beoordeeling der
twee vorige groepen van gegevens een communis opinio, hier is
het geheel anders gesteld: er heerscht in dit opzicht de grootste
verwarring en tegenspraak. Na hetgeen zooeven is gezegd
over de critiek op Paltauf en Nicolle, heeft men weinig moeite
om in te zien, van welk een belang het is, te letten op quan-
titatieve verhoudingen. Het is Kraus, dc belangrijkste verdediger
van het unitarische standpunt, die hierop sterk den nadruk
heeft gelegd. Radzievsky in zijn meergemeld onderzoek, en
na hem Bail (8), vonden dat de vloeistof boven het precipi-
taat, verkregen door toevoegen van een bacteriefiltraat aan
het antiserum, nog bijna even sterk de homologe bacteriën
agglutineerde als het serum vóór de toevoeging van het Altraat.
Kraus en v. Pirquet (9) wezen er terecht op, dat de toevoeging
van een willekeurige hoeveelheid Altraat niet den minsten waar-
borg geeft, dat men inderdaad al het predpitine verwijderd
heeft. Zij herhaalden deze proeven, en wisten de verhouding
antiserum-Altraat zoodanig te kiezen, dat met het precipitaat
vrijwel alle agglutininen werden verwijderd.

Ingewikkelder is de polemiek, te voorschijn geroepen door
de onderzoekingen van Gaethgens (10). Deze verrichtte een
onderzoek bij konijnen, die hij met typhusbadllen inspoot cn

die hij 24 uur later bloed aftapte ter bepaling van het gehalte
aan precipitinen en agglutininen tegenover typhus. De meeste
dezer dieren gaven een serum, dat met bacillen en hun Al-
traat geen specifieke reactie vertoonde; enkele gaven echter
een positieve precipitatiereactie, terwijl de agglutinatie nega-
tief was. Weliswaar moet men in aanmerking nemen, dat de
precipitineproef ■— verricht volgens de ringmethode — gedaan
kan worden met onverdund serum, terwijl men, om onspeci-
fieke (d.i. niet door de specifieke antistof gegeven) agglutinaties
te ontgaan, het serum moet verdunnen {Gaethgens, die met
jonge konijnen experimenteerde, paste de verdunning 1 : 5 toe).
Toch blijft dit resultaat merkwaardig, als men zich herinnert
dat men de agglutinatieproef met zoo verbazend geringe hoe-
veelheden antistof kan uitvoeren, in tegenstelling met de pre-
cipitatieproef. Ook de precipitinogenen zouden zich anders ge-
dragen dan de agglutinogenen; zij zouden n.1. sneller uit het
bloed verdwenen zijn (aangetoond door het serum bij andere
dieren in te spuiten).

Tegenspraak is evenwel niet uitgebleven. Fukuhara{\\ 1)sprak
het onderzoek van Gaethgens op alle punten tegen, na her-
haling van zijn proeven. Hij meende diens waarnemingen te
moeten toeschrijven aan onspecifieke precipitaties. Gaethgens
nam onmiddellijk dit argument over, en sprak in een ver-
weer (12) op zijn beurt twijfel uit over de precipitatietechniek
van Fukuhara. Door Amiradzibi en Kaczijnski (13), die zich
op aandringen van Kraus in de polemiek hebben gemengd,
en eveneens Gaethgens op alle punten bestrijden, wordt deze
vraag alweer naar voren gebracht: is de ringproef bruikbaar
voor het aantoonen van zwakke specifieke reacties? Deze
zuiver technische kwestie heeft veel aandacht getrokken, en
zal later in dit proefschrift nader worden besproken; het is
evenwel zeker, dat deze critiek het standpunt van Gaethgens
heeft verzwakt. Anderen zijn hem echter bijgevallen; zoo vond
Mü//er (14), dat bij inspuiting van caviae met malleus-culturen

eerst precipitinen, en dan agglutininen aantoonbaar zijn, ter-
wijl bij konijnen het omgekeerde werd waargenomen: eerst
agglutinatie, en later precipitatie.

Een en ander rechtvaardigt de opvatting, dat inderdaad in
een immuunserum, ook met een betrouwbare en zorgvuldig
uitgevoerde techniek, niet altijd tegelijk precipitinen en agglu-
tininen tegenover de gebruikte bacteriestam zijn aan te toonen.
Wij zijn dus verantwoord door deze waarnemingen, om de
onder de 3e groep samengevatte steUing voorloopig als werk-
hypothese te aanvaarden.

De theorie van Bordet betreffende het verschijnsel der agglu-
tinatie heeft de physisch-chemische beschouwingswijze der
immuniteitsreacties in eere gebracht. Bordet heeft het eerst
gewezen op de overeenkomst, die er bestaat tusschen het samen-
klonteren van bacteriën onder den invloed van een immuun-
serum, en de uitvlokking van gesuspendeerd anorganisch mate-
riaal (15, 16). Hij toonde aan, dat voor het een, zoowel als
voor het ander, de aanwezigheid van zouten een groote be-
teekenis heeft. Sinds zijn onderzoekingen zijn we gewoon het
agglutinatieproces te verdeelen in 2 phasen: le de binding
van het agglutinine aan de bacteriën, waarbij geen invloed
van zouten is vast te stellen, en 2e de uitvlokking der met
agglutinine beladen bacteriën, die onder den invloed van zouten
plaatsvindt, en bij afwezigheid van zouten uitblijft.

Hier worden met agglutinine beladen bacteriën vergeleken
met suspensies, als die van kaoline, die reeds uit zichzelf de
eigenschap hebben van door geringe hoeveelheden chloor-
natrium of andere zouten uit te vlokken. In deze beschouwings-
wijze van Bordet is geen plaats voor de precipitinereactie,
waarbij het antiserum inwerkt op het colloidaal opgeloste
antigeen in plaats van op een suspensie van organisch
materiaal. Ik heb mij afgevraagd, of wellicht uit dit verschil
van physisch-chemischen aard de tegenspraak, die op dit ge-

bied heerscht, kan worden afgeleid, en of de hierboven be-
schreven tegenstellingen tusschen precipitatie en agglutinatie
kunnen worden verklaard door de afwijkingen in verdeeling
van het antigeen (fijne, colloidale of grove, microscopische)
in aanmerking te nemen.

Dc opzet der proeven, van dit gezichtspunt uit genomen,
zal in het volgende hoofdstuk worden medegedeeld. Het be-
ginsel, waarvan ik uitging, was als volgt: indien wij als werkhy-
pothese aannemen, dat agglutinatie en precipitatie, bij een
typhusbacillencultuur b.v., worden veroorzaakt door precies
dezelfde antistof of antistoffen, dan moet het gelukken door
een willekeurig colloidaal opgelost antigeen te veranderen in
een gesuspendeerd antigeen, het karakter der immuniteits-
reactie zoodanig te wijzigen, dat men in plaats van een pre-
cipitatie, een agglutinatie met haar typische kenmerken ziet
optreden. Ik meende het best zulk een colloidaal opgelost
antigeen in een gesuspendeerd te kunnen veranderen, door
het te adsorbeeren aan fijn verdeeld suspensiemateriaal.

Voor mijn proeven werden een aantal konijnen geïmmuni-
seerd met Paardeserum (P.S.) en andere met Caseine, uit koemelk
bereid (Cas.), waarbij van de ontstane antistofiFen in studie wer-
den genomen de precipitinen. Het optreden van agglutininen
is iets, dat bij deze methodiek kan worden uitgesloten. Agglu-
tininen zijn immers antistolFen, die ontstaan na het toevoeren
van cel-elementen van vreemde herkomst (bacteriën, roode
bloedlichaampjes) aan het proefdier en het vermogen bezitten
om deze cellen uit te vlokken. Weliswaar kunnen aggluti-
ninen ontstaan na injectie van celvrije vloeistoffen; in dit
geval kan men er b.v. op rekenen, dat door de injectie van
paardeserum agglutininen tegenover de erythrocyten van
het paard ontstaan. Men kan dit niet opvatten als een be-
wijs, dat precipitinen en agglutininen hier gelijk zijn, daar er
voorbeelden te over zijn van het optreden van antistoffen
voor antigenen van zeer verschillende herkomst, bij het in-
jiceeren van één dezer (heterologe antigenen). Maar wèl is
het een feit, dat agglutinine ontstaat na de injectie van het
bacterie-extract; dit kan ook het geval zijn bij het inspuiten
van serum, daar dit bestanddeelen van erythrocyten kan be-
vatten, en geringe hoeveelheden antigeen antistoffen kunnen
doen ontstaan.

Ik ben daarom een stap verder gegaan en heb op een later
uitvoerig te beschrijven manier mijn colloidaal opgeloste anti-
genen gebracht in den vorm van suspensies, met bacteriën
vergelijkbaar, door ze n.l. aan organisch of anorganisch sus-
pensiemateriaal te adsorbeeren.

Nu reeds kan ik mededeelen, dat zoodoende met aggluti-
naties nauw verwante reacties door middel van immuunsera
konden te voorschijn geroepen worden. Voor het paardeserum
geldt nog de tegenwerping, dat dit verontreinigd kon zijn
met bestanddeelen van bloedcellen (agglutinogenen); voor het
caseïne is dit moeilijk te aanvaarden, daar dit met veel zorg
werd gezuiverd.

Bereiding van zuivere caseïne uit koemelk. Een afgemeten
hoeveelheid taptemelk, die eerst nog eenige malen door een dik
papierpapfilter was heengezogen, werd met het viervoudige
volume leidingwater verdund, en daarna met 5 % azijnzuur ge-
mengd, totdat een maximale uitvlokking werd bereikt. Dan werd
de vloeistof afgefiltreerd, en het neerslag met gedestilleerd water
gewasschen, totdat het waschwater met lakmoespapier geen
verkleuring meer gaf. Vervolgens werd het neerslag uitgeperst
tusschen filtreerpapier, en met 0.6% NaOH en physiologi-
sche zoutsolutie (phys. NaCl) opgelost, waarbij zorg werd
gedragen, dat de vloeistof niet alkalisch werd. Met deze neu-
trale oplossing werd nog 3 maal de bewerking herhaald; de
laatste maal geschiedde de wassching grondiger, met het doel
een zorgvuldiger reiniging te verkrijgen: het waschwater werd
met zilvernitraat en salpeterzuur onderzocht op chloorionen,
en de bewerking voortgezet totdat deze niet meer aan te
toonen waren.

Aan de laatste wassching ging nog vooraf de steriliseering,
die noodig werd geoordeeld om te verhinderen, dat de proef-
dieren werden geïnfecteerd met levende, pathogene kiemen.
Daar Wright (17) heeft aangetoond, dat eerst bij zeer lang-

durige verhitting van een neutrale caseine-oplossing racemi-
seering optreedt van het caseine-molecuul, mag men aannemen
dat de veranderingen, die men vóór dien tijd waarneemt
(moeilijke oplosbaarheid o.a.), berusten op physische veran-
deringen. Het bleek, dat wij genoeg hadden, voor ons doel,
aan een éénmahge verhitting bij 100° C. in den stoom-
cylinder gedurende V2 uur.

De gezuiverde en gesteriUseerde caseine werd op een glazen
plaat dun uitgespreid en in de broedstoof bij 37° gedroogd.
Het bleek, dat na 48 uur in de stoof gebleven te zijn, de
eiwitmassa een constant gewicht had bereikt, maar na 24 uiu:
is toch de droging al zeer dicht hiertoe genaderd, zoodat ik
op den duur met 24 uur drogen kon volstaan.

Bereiding van casétnè-oplossingen. Hiertoe werd een be-
paalde hoeveelheid caseine afgewogen, en in een kolfje, met
phys. NaCl in een waterbad van 46—50° C. geplaatst.
Hierbij zwelt de caseïne door wateropneming, hetgeen noodig
is om een volledige oplossing te bereiken. Dit weeken kan
men ook bij lagere temperatuur doen, maar dan moet men
het kolfje gedurende längeren tijd in de ijskast zetten (om
bacteriegroei te voorkomen). De geweckte caseïne wordt in
een mortiertje gewreven, onder toevoeging van het weekwater
en NaOH 0.6 %, waarbij ze grootendeels, maar niet geheel
oplost. Daarna brengt men de massa quantitatief over in een
buis, waar met een glaspotlood-streep het verlangde volume
is aangegeven op den buitenkant, vult met phys. NaCl aan
tot de streep, en nu wordt meestal alles opgelost door de
buis in een waterbad van 60—62° C. te plaatsen gedurende
10—15 minuten. De reactie moet nu tegenover lakmoes am-
photeer of zwak alkalisch zijn.

Zulke caseine-oplossingen werden herhaaldelijk gecontro-
leerd op steriliteit door aërobe en anaërobe cultuur; nooit
werden levende bacteriën aangetoond, ook niet als de op-

lossing eenige weken was bewaard. Microscopisch, in den
hangenden druppel, zag ik evenmin bacteriën; wèl ziet men
nog vrij veel fijne droppeltjes zweven, die naar alle waar-
schijnlijkheid uit vet, afkomstig van de melk, bestaan. Het
zou voor de hand liggen, ter wille van een zuiver caseine-
preparaat, dit vet uit de gedroogde caseïne te extraheeren;
evenwel zag ik daarvan af, daar in de eerste plaats het niet
gemakkelijk is eiwit zoodoende geheel van vet te ontdoen,
cn verder de inwerking van extractie-middelen als aether,
alcohol en aceton, het eiwitmolecuul chemisch kan aangrijpen
en zoodoende de caseïne althans gedeeltelijk zou veranderen.
Daar het nu bewezen is, dat chemische veranderingen samen-
gaan met wijziging van de serologische eigenschappen van
een eiwit, zou hierdoor het groote voordeel van het enkel-
voudige antigeen, dat wij in caseine bezitten, verloren gaan.
Vet daarentegen bezit, zooals bekend, geen antigene eigen-
schappen en kan dus in dit opzicht niet storend werken.

Techniek der precipitatie-reactie. Met de aldus bereide steriele
caseineoplossingen en met steriel gewonnen paardeserum werden
konijnen intraveneus ingespoten, waarbij in den regel tusschen-
ruimten van 7 dagen tusschen twee opeenvolgende injecties
werden in acht genomen: alleen om bijzondere redenen werd
van dezen regel afgeweken. De hoeveelheid geïnjiciëerd anti-
geen bedroeg — met uitzondering van de allereerste injectie,
die vaak kleiner werd genomen — voor het paardeserum
2 è 3 cc. en voor caseine een overeenkomstige hoeveelheid,
berekend naar het eiwitgehalte van paardeserum. Ter wille
van de overzichtelijkheid der gegevens werd deze verhouding
uitgedrukt in de eenheid 5. Deze drukt uit een eiwitgehalte,
ongeveer gelijk aan dat van paardeserum, dat ± 8 % eiwit
bevat. De meestal voor injectie gebruikte caseïne-oplossingen
bevatten 4 % caseine, dus de sterkte was Va S.

Dezelfde methode werd gebruikt voor het noteeren der
antigeenverdunningen, die bij de eigenlijke precipitatieproef
werden gebruikt. Ik merk nog op, dat met betrekking tot de
antigenen steeds van verdunning wordt gesproken in dit proef-
schrift : met het woord titer wordt steeds de titer der serumquot;
verdunning bedoeld, zulks om verwarring tusschen precipitatie-
en agglutinatietiter (welke laatste steeds door de serumverdunning
wordt aangegeven) te voorkomen.

De sera werden gewonnen door het bloed uit de oorvena
of uit het hart (door punctie) af te tappen, en 24 uur te laten
staan. De bloedkoek werd zooveel mogelijk afgecentrifugeerd,
en het vervolgens afgegoten serum door centrifugeeren van
bloedlichaampjes bevrijd. De bloedafneming geschiedde steeds,
vóórdat een nieuwe injectie werd gegeven. Door de dieren, vol-
gens het voorschrift, tevoren minstens 18 uur te laten hongeren,
slaagde ik er in vele gevallen in, een volkomen helder serum
te verkrijgen. Evenwel lukte dit toch zelfs met genoemde
voorzorg niet altijd, zoodat een aantal sera toch eenigszins
opalescent waren. Bovendien ontstaat bij het afnemen van
grootere hoeveelheden bloed licht haemolyse, vooral wanneer
de bloedwinning op bezwaren stuit (kleine vaten, slechte
punctie). Inactiveering der sera (bij 55° C.) had niet plaats.

Ringmethode of mengmethode ? Deze twee factoren, opales-
centie en haemolyse, die soms niet te vermijden zijn, gaven
ernstige moeilijkheden, toen ik de ringmethode, die het meest
gebruikelijk is, toepaste. Hetzij men het verdunde antigeen
op het serum laat vloeien (Ueberschichtung volgens Ascoli), of
het serum onder het verdunde antigeen brengt (Unterschichtung
volgens Uhlenhuth), in beide gevallen ondervindt men het
bezwaar, dat bij onvolkomen heldere of haemolytische sera
eenerzijds ringvormige nevels (pseudoringen) ontstaan, ander-
zijds werkelijk specifieke precipitatieringen moeilijk waar te
nemen zijn. Het eerste feit, dat ik zelfs bij heldere sera waar-

nam na toevoeging van phys. NaCl, is o.a. uitvoerig besproken
in de reeds vermelde discussie naar aanleiding van Gaethgens\'
precipitatieproeven, en is aanleiding geweest, dat men Gaethgens
en zijn dualistische medestanders heeft verdacht van het af-
lezen van onspedfieke reacties. Hiertegen hebben zij aange-
voerd, dat men geen gevaar loopt van zich te vergissen, indien
men het let op de kwaliteit van den ring: dichte, „dekkleurigequot;
ring tegenover lichte, „lakkleurigequot; ring, welke laatste onspe-
dfiek is. Bovendien moet bij een positieve ringproef den
Volgenden dag een neerslag op den bodem van het buisje te
zien zijn.

Wat het eerste betreft: dicht en licht zijn in de practijk
niet altijd gemakkelijk te onderscheiden. Bovendien, als men
aan den ring zeer strenge eischen stelt, om met zekerheid dit
gevaar te ontgaan, dan lijdt de gevoeligheid van de methode.
Hetzelfde geldt voor den eisch, dat men een neerslag moet
kunnen waarnemen. Men vraagt zich af: als het toch om een
neerslag te doen is, zou het dan niet eenvoudiger zijn om de
vloeistoffen te mengen?

Een nieuwere methode, door Friedberger en zijn school
(18, 19) in zwang gebracht en die berust op een verschijnsel,
reeds door anderen {Fornet, Muller) waargenomen, schijnt
meer zekerheid te brengen, maar mist alweer groote gevoelig-
heid. Zoo zou volgens Ikeda (19) een serum, dat nog een
positieve ringproef geeft met antigeen, verdund tot 1 : 20.000,
den dubbelen ring van Friedberger nog slechts met antigeen
1 : 1000 geven.

Ik heb mij voor dit onderzoek, uit onvoldaanheid met de
ringproef, gewend tot de mengmethode, waarbij ik, na de
noodige ervaringen, vergissingen kon uitsluiten, terwijl de
methode toeliet om met zeer sterke verdunningen, zoowel van
antigeen als antiserum, te werken. De gevoeligheid der methode
bleek zelfs voor mijn doel, waar het erop aankwam om ook
zwak precipiteerende sera te titreeren, geheel voldoende. Door

te werken onder controle met phys. NaCl, zoowel als hete-
roloog antigeen, kwam ik een factor te onderkennen, die voor
deze methode een gevaarlijke bron van fouten genoemd mag
worden, en toch als zoodanig niet in de door mij bestudeerde
htteratuur wordt vermeld.

Het natroebelen der sera is deze factor, die niet bij alle
sera in gelijke mate optreedt, en naar het schijnt niet door
de mij bekende critici der mengmethode als bron van fouten
is onderkend. Wanneer b.v. Gaethgens en Müller 24 uur
na menging van normale sera met bacterie-filtraten of -extracten
fijne nevels waarnemen, dan meen ik, dat zij waarschijnlijk
dezelfde nevels hebben gezien, die bij sommige konijnensera
reeds 24 uur na de gewinning optreden, en bedrieglijk veel
lijken op specifieke precipitaten. De controle met phys. NaCl
of heteroloog antigeen wijst deze natroebelingen onfeilbaar
aan, en men hoeft deze controles niet eens tegelijk met de
specifieke proef te nemen, daar zij in het ongemengde serum
even snel ontstaan.

Het bedriegelijke van deze troebellngen is, dat zij in het
onverdunde serum niet altijd makkelijk waar te nemen zijn.

Het kan b.v. gebeuren, dat men meent een vrijwel helder
serum te gebruiken, en door eenvoudige verdunning met phys.
NaCl eensklaps de fijne vlokjes ziet. Nauwkeurige controle
met de loupe toont deze dan ook zonder uitzondering in het
onverdunde serum aan, waarvan het hooge gehalte aan col-
loïden wellicht aansprakelijk is voor het gezichtsbedrog.

Wanneer men tracht, ter wille van de nauwkeurigheid der
proef, deze natroebelingen door het voor de hand liggende
middel, centrifugeeren, te verwijderen, dan komt men bedrogen
uit. Urenlang centrifugceren vermag zulk een serum niet geheel
te verhelderen. Waar ik het noodig vond dit te bereiken,
heb ik de sera van troebelheid bevrijd door ze 8—12 maal
door een klein papierfilter te halen. Ik moet erbij zeggen,
dat de troebellng meestal niet zoo sterk is, dat zij voor den

geoefende, die erop verdacht is, de waarneming der toch
anders gevormde, specifieke precipitaten stoort. Is dit wèl
het geval, dan doet men het best, zulk een serum eenige
dagen te laten staan, alvorens het te filtreeren, daar de troebe-
ling zich dan niet zoo spoedig herhaalt. Slechts in één geval
heb ik een voortgezette neiging tot uitvlokken bij een konijne-
serum gezien, waarbij in enkele weken steeds grootere pre-
cipitaten zich op den bodem van de serumbuis ophoopten,
ofschoon het serum steriel bleek te zijn. Dit geval betrof
een konijn, dat te gronde ging onder verschijnselen, die op
chronische anaphylaxie wezen, en stervende was toen de
punctie verricht werd.

Ik heb wel eens gemeend, dat deze natroebelingen door
herhaald injiceeren en bloedaftappen ontstonden, maar ik heb
het verschijnsel sedert zoo vaak gezien bij sera van normale,
niet tevoren behandelde of afgetapte dieren, dat deze op-
vatting niet houdbaar bleek te zijn.

Toepassing der mengmethode. Meestal worden precipi-
teerende sera niet getriteerd naar de serumverdunning, maar
men bepaalt hun sterkte door de verdunning van het antigeen,
waarmee de precipitatie nog is waar te nemen. Daar het in
mijn bedoeling lag de precipitatie met de agglutinatie te ver-
gelijken, heb ik daarentegen steeds de sterkte van een pre-
cipiteerend serum bepaald door den serumtiter ten opzichte
van een bepaalde antigeenverdunning; hierdoor kreeg ik met
de agglutinatie beter vergelijkbare waarden.

Ik ging steeds als volgt te werk: scrum en opeenvolgende
verdunningen daarvan worden gemengd met gelijke deelen
antigeenverdunning. Dc laagste serumtiter was dus steeds Va-

Voor het antigeen vindt men in de proeven en tabellen
steeds opgegeven de verdunning van het antigeen, die aan
het serum en deszelfs verdunningen wordt toegevoegd. Om

dc antigeenverdunning in het mengsel tc weten, moet men
den opgegeven verdunningsgraad dus verdubbelen.

Ten slotte nog een woord over de noteering der precipi-
taten, waarbij in den regel de 3 volgende graden werden
onderscheiden, met de bijgegeven teekens:
= met het bloote oog zijn vlokken waarneembaar, met een
duidelijk precipitaat op den bodem van het buisje.

4- = met het bloote oog zijn in de vloeistof vlokken waar-
neembaar, zonder een gemakkelijk waarneembaar preci-
pitaat.

± = opalescentie der vloeistof; met een zwakke loupe ziet
men duidelijk vlokjes (bij lamplicht tc bekijken).

Evenwel is deze noteering niet altijd gebruikt; men zal
tabellen aantreffen waar alleen het teeken gebruikt is.

Naast de eigenlijke precipitatie-reactie werd, zooals gezegd,
een methode toegepast, waarbij het antigeen (caseïne of paarde-
serum) werd geadsorbeerd aan een suspensie (zie pag. 18 en 20).
Teneinde verwarring te voorkomen, zal in het vervolg de
methode, waarbij immuumsera inwerken op deze suspensies,
waaraan antigeen was geadsorbeerd, die der suspensie-preci-
pitatie worden genoemd; hiervan wordt de predpitatie met
colloïdaal opgelost antigeen als sol-precipitatie onderscheiden.

Het geluk diende mij, dat deze proeven eerst verricht
werden met caseïne, daar dit voor dit doel meer geschikt
bleek te zijn dan paardeserum. Mijn uitgangspunt was het
onderzoek van Landsteiner en Uhïirz (20), die serumeiwitten
aan silicaten en andere fijnkorrelige materialen adsorbeerden,
en vonden dat daarbij een groot gedeelte der eiwitten werd
geadsorbeerd, en wel te meer naar mate het eiwit gemak-
kelijker is uit te zouten met ammoniumsulfaat. Van het euglo-
buline (gemakkelijkst uitzoutbare fractie) werd zoo gevonden,
dat uit de verdunde oplossing 71 % van het eiwit wordt

verwijderd; bij sterker oplossingen daalt dit percentage, terwijl
toch de totale hoeveelheid geadsorbeerd eiwit stijgt. Verder
vonden zij, dat zure en basische silicaten beter eiwit adsor-
beerden dan neutrale.

Deze onderzoekingen zijn geheel in overeenstemming met
hetgeen ons bekend is omtrent adsorptie van eiwitten aan
suspensies.

Eiwitten hebben in het algemeen in physisch-chemisch op-
zicht de eigenschappen van hydrophile colloïden, die hun
naam ontleenen aan het feit, dat zij uit den vasten toestand
(gedroogd of uitgezouten) gemakkelijk door oplossing in vloei-
baren (hier: in water) overgaan. Zulke hydrophile colloïden
kunnen eerst door grootere hoeveelheden neutraal zout wor-
den uitgevlokt.

Hiertegenover staan de hydrophobe (moeilijk in water op-
losbare) of suspensiecolloïden, die met kleine hoeveelheden
zout reeds uitvlokken. Deze eigenschap hebben de suspensie-
colloïden gemeen met de eigenlijke suspensies, die in tegen-
stelling met alle colloïden uit microscopisch waarneembare
deeltjes bestaan.

Wanneer men opgelost eiwit samenbrengt met suspensies
van kool, kaoline enz., dan wordt het aan de oppervlakte
sterk geadsorbeerd; een merkwaardigheid hierbij is, dat de
adsorptie min of meer irreversibel is.

Verder is het opmerkelijk, dat als adsorbens zoowel zure
als basische suspensies kunnen dienst doen. Men is gewend
bij colloïden waar te nemen, dat zij geadsorbeerd worden aan
suspensies van tegengestelde electrische lading. Eiwitten uit
physiologische vloeistoffen plegen electronegatief geladen te

\') Voor de volgende uiteenzetting ontleen ik aan R. Höher, Physikalische
Chemie der Zelle und der Gewebe. 1924. Weliswaar worden in dit werk
voorbeelden genoemd van suspensies met fijner korrel dan de bij deze onder-
zoekingen gebruikte (b.v. onoplosbare kalkzouten. p. 288). doch dit bleek
in beginsel geen verschil uit te maken.

zijn, daar zij zwak zuur reageeren, cn in het lichaam door
middel van alkali zijn opgelost, zoodat men de verbinding,
b.v. Na —eiwit— krijgt. Nu zou men verwachten, dat zulk
eiwit enkel door electropositief geladen (basische) suspensies
wordt geadsorbeerd. Dat dit niet het geval is, maar ook
electronegatief geladen (zure) suspensies eiwitten goed adsor-
beeren, wordt toegeschreven aan het amphotere karakter
dezer stoffen, waardoor zij in licht alkalische oplossing toch
ook kationen (positieve ionen) kunnen vormen. Toch pleegt
de adsorptie aan alkalische suspensies gemakkelijker en volle-
diger plaats te vinden.

Wanneer eiwit in voldoende quantiteit wordt geadsorbeerd,
neemt men het verschijnsel waar, dat de suspensiedeeltjes de
eigenschappen van het geadsorbeerde eiwit eenigermate gaan
overnemen, d.w.z. zij gedragen zich nu in sommige opzichten
als hydrophile colloïden. Men kan dit opmerken, doordat de
suspensie bestendig is geworden tegenover verdunde zout-
oplossingen. Het ongevoelig worden voor een zwakke zout-
oplossing kan men dus gebruiken als symptoom van een
adsorptieproces.

Adsorptie van caseïne. Hiervoor werden als adsorbens
achtereenvolgens beproefd: anorganische, en wel zure, n.1.
kaoline, talk, acidum silicicum, terra silicia — zoowel als
basische, n.1. magnesiumoxyd, magnesiumhydraat: vervolgens
organische: colophonium en zink-stearaat waren hiervan de
voornaamste.

Van de anorganische voldeden het best kaoline cn mag-
nesiumoxyd. Een afgewogen hoeveelheid adsorbens werd
gemengd met een weinig phys. NaCl en verschillende hoe-
veelheden caseïneoplossing; deze werden samen in buisjes
geschud, en 2 uur in de langzaam bewegende schudmachine
of in de mengmachine gehouden. Nu liet ik de grovere deeltjes
bezinken, en pipetteerde de bovenstaande vloeistof weg;

daarna werd de suspensie tot een geschikte dichtheid verdund.
Meestal was voor het verkrijgen van een goede suspensie
een gewichtsverhouding caseïne-adsorbens van ongeveer 1:10
noodig; om dit te bereiken werd aan 0.4 gr. kaoline 1 cc.
caseïne Vs S. toegevoegd. Voor het basische materiaal werd
meer eiwit vereischt; dit materiaal was evenwel ook meer
volumineus.

De aldus verkregen suspensies vlokten onder den invloed
van phys. NaCl niet meer uit.

Met de organische materialen stond de zaak eenigszins anders.
Colophonium werd van de onderzochte, meest bekende hars-
soorten het beste bevonden. Hier werd niet uitgegaan van
het vaste materiaal, maar van een alcoholische oplossing, die
werd verdund volgens het volgende schema:

In een maatglas van 100 cc. wordt 2 cc. van een alcoho-
lische colophoniumoplossing gebracht, en hier gelijkmatig, onder
langzaam schudden, aq. dest. bijgevoegd; de snelheid van toe-
voeging heeft weinig beteekenis. Aan deze suspensie wordt
het eiwit geadsorbeerd, met inachtneming van de physiolo-
gische NaCl-concentratie (het gedestilleerd water werd met
een gelijk volume van een dubbel-geconcentreerde, dus 1,7%,
oplossing op physiologisch peil gebracht). Het bleek, dat zulk
een colophonium-suspensic lang niet zoo gemakkelijk uitvlokt
als een suspensie van anorganisch materiaal, b.v. kaoline;
over deze en andere technische bijzonderheden zal uitvoeriger
in het volgende hoofdstuk worden bericht. Ik deel alleen nog
mede» dat toevoeging van kleine hoeveelheden caseïne een
neerslag in de suspensie geeft, en eerst bij vermeerdering van
de hoeveelheid de suspensie stabiel wordt. De verhouding
caseïne—suspensie was hier ongeveer 1 :6.

Zinkstearaat is het eigenaardigste van de gebruikte mate-
rialen. Het is niet te suspendeeren in vloeistoffen als phys.
NaCl of gedestilleerd water, daar het hardnekkig samenklontert.
Eerst na toevoeging van eiwit gelukt het de massa tot een

stabiele suspensie te verwrijven. Dit is een bezwaar voor de
toepassing, maar er zijn voordeelen aan verbonden, die het ver-
kieslijk maken boven de andere suspensies. De onverdunde
suspensie blijft een nacht over staan; de grovere korrels zakken
deels uit, voor een ander gedeelte stijgen ze naar de oppervlakte.

Adsorptie van paardeserumeiwit. Hierbij was dezelfde tech-
niek van toepassing, als beschreven voor caseine. Wèl zijn
er afwijkingen in de verhoudingen geconstateerd. Zoo bleek
dat het alkalische magnesiumoxyd hier minder noodig had dan
het zure kaoline; de gewichtsverhoudingen waren 1 : 12 en
1:6. En terwijl het zinkstearaat ten opzichte van caseïne
de verhouding 3:1 vertoonde, was dit voor paardeserum 3 : 2.

Er zij nog op gewezen, dat men niet mag verwachten, dat
de eiwitten van het paardeserum worden geadsorbeerd in
dezelfde verhouding als ze in het serum voorkomen in opge-
losten toestand, op grond van de afwijkingen, die door Land-
steiner en Uhlirz bij hun, op pag. 27 reeds aangehaald, onder-
zoek werden vastgesteld. Hier kan ik nog aan toevoegen,
dat het zeer verschillend gedrag van eiwitten tegenover ad-
sorbentia een bekend feit is.

Duur van het adsorptieproces. Deze is in het algemeen
vrij kort; 20 minuten geldt als een tijd, waarin het evenwicht
tusschen oppervlak en grenslaag zich in alle gevallen heeft
ingesteld. Aanvankelijk heb ik een längeren tijd gebruikt voor
mijn adsorptieproeven: het bleek mij spoedig, zooals in het
volgende hoofdstuk wordt beschreven, dat een veel kortere
tijd voldoende is.

Chemische kenmerken der precipitatie-reactie. Indien men
de verhouding antigeen-antiserum op een geschikte wijze kiest,
vindt men een bepaalde optimale verhouding, waarbij zoowel
het precipitine als het antigeen totaal worden uitgevlokt
{Von Dungern (21)). Evenwel is het moeilijk om deze ver-
houding te treffen, vooral bij een zwak precipiteerend serum.
Vaker vindt men in de vloeistof boven het precipitaat óf
nog precipitine, óf nog antigeen over; soms ook treft men
beide tegelijk in de heldere vloeistof aan, hoewel in kleine
quantiteit. Dit laatste feit doet sterk denken aan een chemische
evenwichtsreactie, waarbij de componenten gedeeltelijk worden
gebonden, maar ook ten deele vrij blijven. {Eisenberg (22)).
Von Dungern heeft dit ook aangetroffen in het serum van
konijnen, die hij met andersoortig bloedplasma had ingespoten,
wanneer hij betrekkelijk kort na de injectie het bloed van
zijn proefdieren aftapte. Hij meende dit te moeten toeschrijven
aan het naast elkander gevormd worden van afzonderlijke
precipitinen (Partialimmunkörper) tegenover de verschillende
eiwitten van het ingespoten plasma. Hierbij worden tegenover
lt;de verschillende antigenen, niet even snel en niet even rijkelijk,

precipitinen gevormd — een feit, sedert bekend geraakt onder
den term: antigenen-concurrentie van Michaelis ■— zoodat
het kan gebeuren, dat van het één nog geen precipitine aan-
wezig is, en het antigeen nog niet is verwijderd, terwijl een
ander antigeen tot sterke antistof-productie aanleiding gaf,
waardoor het werd gebonden en verwijderd.

Hetzelfde, wat volgens Von Dungern in vivo gebeurt, ziet
men wanneer men de precipitatie in vitro doet. Ook hier een
complex antigeen, waarvan de afzonderlijke eenheden ver-
schillend kunnen reageeren, zoodat in de bovenstaande vloeistof
eenerzijds antigeen, anderzijds antistof aantoonbaar is. Daarom
leek het mij nuttig, om de caseïne-precipitatie in dit verband
te onderzoeken.

De proef werd als volgt gedaan: van een konijn, dat 4
injecties met caseïne had ontvangen, werd 8 dagen na de
laatste injectie uit het hart bloed genomen en serum gewonnen.
Gelijke hoeveelheden van dit serum werden in buisjes gedaan
en gemengd met even groot volume antigeenverdunningen, in
de concentraties Veo S—Viooo S De zes buisjes bleven 6 uren
bij 37° C. staan, waarna de ontstane neerslagen werden af-
gecentrifugeerd (het grootst was het neerslag met Gas. Veo S).
Dan werden de heldere vloeistoffen afgezogen, en elk in

Zooals gezegd (pag. 22) geeft het teeken S een eiwitoplossing aan ter
sterkte van ± 8 O/o.

drieën verdeeld: één portie ontving een gelijk volume anti-
serum, één een gelijk volume antigeen (Cas. V400 S) en één
phys. NaCl. M.a.w. er werd achtereenvolgens gereageerd op
in de vloeistof achtergebleven antigeen en antiserum, met een
controle ; deze reacties werden afgelezen na 24 uur staan bij
kamertemperatuur.

Het blijkt, dat in deze reeks de beide reactie-componenten
niet naast elkander in de vloeistof boven het precipitaat konden
worden aangetoond. Om zekerheid te hebben, werd de proef
herhaald. Zooals men hierboven kan aflezen, zou men in de
buurt van het buisje II de optimale antigeen-concentratie
voor de binding mogen vermoeden, daar hier geen antigeen
meer werd teruggevonden, terwijl bij I het precipitine ver-
bruikt was.

Bij de nieuwe proef werd op achtergebleven precipitine
onderzocht met Cas. V200 S. ; de aflezing werd nu gedaan met
een agglutinoscoop.

Het blijkt dat hier in verscheidene buisjes antigeen en pre-
cipitine naast elkaar in aantoonbare hoeveelheid opgelost voor-
kwamen. Ter verklaring van dit verschil met de vorige proef
is het volgende aan te voeren:

le. Er was ditmaal gewerkt met een zwakker serum (van
hetzelfde konijn, maar 6 dagen later afgetapt); zwakke sera
hebben behalve een lageren titer gewoonlijk ook minder
snelheid van uitvlokken (geringer aviditeit).

2e. Er was afgelezen met den agglutinoscoop, die sterker
vergrootte dan de loupe.

3e. Kan van invloed zijn geweest het feit, dat nu de neer-
slagen waren afgecentrifugeerd na 4 uur staan bij 37° C.

De antigeen concentratie van buisje II bleek ook hier zeer
geschikt: de neerslagen van antigeen en precipitine beide
waren in buisje II zeer klein. Nu was ook deze concentratie
voor de titratie op de vloeistof gebruikt.

Naar aanleiding van deze ervaringen werd in het vervolg
voor dc precipitatie met caseine de antigeenverdunning Yjoq S,
en later VssoS gebruikt. Het blijkt verder, dat, als men de
reactie met een sterke precipitineconcentratie uitvoert, deze
snel afloopt. Voor reacties met kleine hoeveelheden is het
evenwel noodig, dat men de buisjes langer laat staan.

De temperatuur schijnt geen anderen invloed te hebben,
dan dat bij 37° de vlokvorming iets sneller optreedt: in den
regel heb ik echter de buisjes bij kamertemperatuur laten
staan tot den volgenden dag.

Het is nog van belang op tc merken, dat een precipitatie-
reactie door zeer sterke anti geenoplossingen in hooge mate
wordt geremd; men ziet in zulke buisjes een opalescentie,
maar geen of weinig precipitaat. De precipitatie heeft plaats
in een zöne, die zich bevindt tusschen zeer sterke en zeer
zwakke antigeenverdunningen; dit verschijnsel heeft men het
zónephenomeen gedoopt.

Antigene eigenschappen van caseineen paardeserum. Caseïne
staat, wat betreft precipitine-vormend vermogen, ten achter bij
paardeserum. Terwijl ik met caseine bij konijnen geen hoogere
serumtiters wist te behalen dan Yso» kreeg ik met paardeserum
vaak Vioo\' éénmaal Vsoo\' Ook had ik herhaaldelijk gelegenheid
op te merken, dat met caseïne de precipitinevorming pas later
zichtbaar werd.

in de bewering van P. Müller (23). dat Calciumzouten voor
de precipitatie van caseine noodig zouden zijn. Deze bewering
van Müller is reeds door anderen weersproken ; ook ik vond,
dat de principitatie door toevoeging van chloorcalcium aan
een, uit zuiver NaCl en gedestilleerd water bereide, physio-
logische zoutsolutie volstrekt niet werd bevorderd.

Caseïne neemt, met enkele andere lichaamseiwitten (o.a. lens-
eiwit en fibrinogeen), een eenigszins afzonderlijke positie in
onder de precipitinogenen. Terwijl b.v. serumeiwit voor de
diersoort specifieke precipitinen opwekt, verkrijgt men door
injectie van caseïne eener willekeurige diersoort een precipi-
tine, dat met caseïne van andere diersoorten zelfs beter reageert
dan met het weieiwit of serumeiwit van de eigen diersoort.
Het was dan ook niet te verwachten, dat in mijn proeven
het paardeserum en het rundercaseïne met eikaars sera zouden
reageeren. Inderdaad bleek bij controle met een sterk anti-
paardeserum, dat het caseïne hiermee totaal niet reageerde,
en omgekeerd.

Evenmin vond ik ooit reacties van mijn antigenen met
normaal konijnenserum. Er bestond dus bij deze precipitatie-
proeven, naar men mag aannemen, volstrekte specificiteit.
Voor misleiding door bedriegelijke reacties zij verwezen naar
hoofdstuk II.

Het is nog van belang te weten, dat normaalserum geen
invloed heeft op de precipitatie met serumverdunningen-
titratie, zooals door mij gedaan werd. Dit feit wordt wel in
toepassing gebracht, indien men met de ringproef reageert
op verwante antigenen — zooals bij het onderzoek op bloed-
soorten voor gerechtelijke doeleinden geschiedt — waarbij
men door serumverdunning de specificiteit der proef verhoogt.
Door nu als verdunningsvloeistof te gebruiken normaalserum,
behoudt men het voordeel, dat onverdund serum geeft, van
een scherp scheidingsvlak te leveren bij de ringproef (zie
Hektoen (24)).

Vooral bij de dubbele ringproef, waar men liefst met ge-
concentreerde antigenen werkt, is deze methode van belang,
en wordt dan ook door Ikeda in zijn reeds vermeld onder-
zoek aanbevolen. M. Nicolle, Césari en Debains (25) hebben
de origineele gedachte gehad, als verdunningsvloeistof vloei-
bare, zuurvrije 10 % gelatine te gebruiken; na stolling van
het mengsel gieten zij het antigeen op de vaste oppervlakte
uit. Al deze voorzorgen zijn evenwel bij de mengmethode
overbodig. Ik heb nog getracht, door toevoeging van een
heteroloog precipiteerend serum aan een precipiteerend mengsel
uit te maken, of zulk een immuumserum wellicht een onspeci-
fieke, precipitatie-bevorderende stof bevatte. Daarvoor werd
caseïne Vsbo S toegevoegd aan met phys. NaCl verdund
precipiteerend serum, en aan met anti-typhusserum verdund
precipiteerend serum. Ik zag daarbij geen waarneembaar ver-
schil, en werd zoodoende eveneens tot de algemeen geldende
opvatting gebracht, dat het precipitaat bij een specifieke
precipitatiereactie vrijwel geheel uit de antigeen-antistofver-
binding bestaat.

Bepaling optimale antigeenconcentratie. Bij de boven aan-
gehaalde proeven met caseïne was het reeds gebleken, dat
er een antigeenconcentratie bestond, waarbij de reactie opti-
maal was, geheel in overeenstemming met wat daarover in
de litteratuur gemeld wordt. Bij de verdere proeven zou het
van groot belang zijn een antigeenconcentratie te gebruiken,
waarbij nu niet dc componenten der reactie zoo volledig
mogelijk werden verbruikt, maar een, waarmee zeer kleine
hoeveelheden precipitine nog zouden reageeren. Daarom werd
een proef ingericht als volgt:

Een konijn, dat is ingespoten geworden met paardeserum,
levert een serum met een middelmatig hoogen titer. Hiervan
worden nu verschillende verdunningen gemaakt. Van elke
verdunning wordt een serie gebruikt, waarbij gelijke hoeveel-

heden elk worden voorzien met antigeen, varieerende in de
verdunningen 1 : 10 tot 1 : 5000. Zoodoende krijgt men een
goed overzicht over de verhoudingen bij verschillende preci-
pitinehoeveelheden. De noteering geschiedt alweer op de ge-
bruikelijke wijze: immuumserumtiter wordt aangegeven naar
de totale verdunning in het buisje; antigeenverdunning naar
dc concentratie van het toegevoegde antigeen. Aflezing, als
voortaan steeds, na staan bij kamertemperatuur den volgen-
den dag.

In deze tabel i) ziet men heel goed het „zónephenomeenquot;,
cn ook dat deze precipiteerende zóne naar beide kanten zich
uitbreidt, naarmate er meer precipitine aanwezig is. Men
ziet nog iets anders: waar dit noodig was, is dc sterkste
precipitatie van een serie aangegeven door een accolade: ^—-—\'.
Nu blijkt, dat bij toenemende hoeveelheden precipitine deze
zóne van optimale neerslagen zich naar links verplaatst.
Verder valt nog iets merkwaardigs op: zoodra men een weinig
meer antigeen toevoegt dan bij de optimale neerslagen het
geval was, houdt het verschijnsel spoedig op en men ziet
alleen nog wat opalescentie (= oplossing van het precipitaat
in overmaat antigeen); verdunning van het antigecn wordt
veel beter verdragen dan concentreering ervan.

Wat nu betreft het eerste doel van de proef: antigeen
1 :250 en 1 :500 gaven de beste neerslagen, en daar bij
grootere hoeveelheden precipitine de optimale neerslagzöne
zich naar links verplaatst, werd voor de verdere precipitatie-
proeven als regel het gebruik van P. 5. 1:250 aangenomen.

Nadat aldus de precipitatietechniek methodisch was uitge-
werkt, ben ik op de reeds aangegeven manier (hoofdstuk II)
suspensfes gaan bereiden, die vervolgens werden getitreerd
met precipiteerend serum, ter vergelijking met de eigenlijke
precipitatieproef.

Proeven met caseïne geadsorbeerd aan kaoline kwamen het
eerst aan de beurt. Kaoline is een materiaal, dat zoowel in ge-
concentreerde als verdunde suspensie gemakkelijk door zouten
uitvlokbaar is; door schudden is het dan weer gemakkelijk
fijn te verdeelen. Mijn kaolinemateriaal vlokte zelfs met ge-
distilleerd water uit, als de suspensie dicht was. In dit verband
is de volgende proef leerzaam:

In 2 maatglazen van 100 cc. worden elk 0.4 gr. kaoline
gedaan. Het eene wordt tot 100 cc. gevuld met gedestilleerd
water, het andere met phys. NaCl, en dan beide geschud.
Als de suspensies vervolgens eenige oogenblikken hebben
gestaan, ontstaat vlokking, waarna beide snel uitvlokken.

Nu schudt men beide maatglazen krachtig, waardoor de
deeltjes weer fijn verdeeld geraken, cn verdunt ze elk 10 maal
met hun eigen suspensievloeistofFen (gedest. water en phys.
NaCl). Nu waarnemende, ziet men dat de 10 maal verdunde
suspensie in phys. NaCl snel uitvlokt, die in gedestilleerd
water stabiel blijft.

Door caseine toe te voegen in de gewichtsverhouding 1 : 10
wordt, zooals gezegd, deze neiging tot uitvlokken opgeheven.

Conclusie: door adsorptie van caseïne aan kaoline wordt
de titer van anticaseineserum verhoogd.

Een positieve reactie werd bij het reageeren volgens de
nieuwe methode afgelezen na 24 uur staan, waarbij het buisje
op den bodem een vlokkig, in plaats van gelijkmatig bezinksel
vertoont.

Proef met normaalserum: de caseine-kaoline suspensie wordt
tot den titer Vbo biermee uitgevlokt.

De lading van het adsorbens is van geen invloed op de
uitvlokking; met het alkalische (electropositieve) magnesium-
oxyd kon ik de reactie even mooi krijgen als met het zure
kaoline; ook hier wordt de titer van het serum aanmerkelijk
verhoogd door adsorptie van het antigeen.

Ik heb nog geëxperimenteerd met de andere in hoofdstuk II
genoemde suspensiemiddelen, die ten deele wel voldeden o.a.
terra silida (infusoriënaarde) — maar toch stonden zij bij
kaoline en magnesiumoxyd, vooral wat betreft de afleesbaar-
heid der reactie, ten achter.

Er valt nog iets op tc merken met betrekking tot de in
de suspensies van kaoline en magnesiumoxyd aanwezige hoeveel-
heid antigeen. Met verwaarloozing van de kleine hoeveelheid,
die met het grofkorreUge suspensiemateriaal bij de bereiding
van de suspensie teloor mocht gegaan zijn, werd deze be-
rekend op een antigeenconcentratie van slechts Vieoo S. M.a.w.
daar de antigeenconcentratie gebruikt bij de solprecipitatie
Vsoo S was. en de titerverhooging bij toepassing der suspensie-
precipitatie ongeveer 6 maal de normale titer bedroeg (zie
hierboven), kunnen wij concludeeren dat er in dezen eenige
proportionaliteit tusschen de antigeenverdunning en de titer-

verhooging bestaat. Maar terwijl bij de solprecipitatie anti-
geenverdunning verlaging van den titer ten gevolge zou hebben
(zie pag. 35 en 38), heeft verdunning ervan door suspensiedeeltjes
ermee te bekleeden, waarbij dus de eigenlijke reageerende
eiwitmassa slechts een klein gedeelte uitmaakt van de geheele
agglutinabele massa, juist het omgekeerde gevolg.

Vergelijking met de agglutinatie. Hierin lijkt mij een be-
langrijke aanwijzing te liggen voor de agglutinatie van bac-
teriën of andere cellen. Ook hier wordt de antistof gebonden
aan suspensiedeeltjes, waarbij de veranderingen aan deze opper-
vlakte verantwoordelijk moeten worden gesteld voor de uit-
vlokbaarheid. Ook hier gedraagt zich de geheele suspensiemassa
waarschijnlijk min of meer passief tegenover de oppervlaktelaag,
die in engeren zin het reageerende antigeen vertegenwoordigt,
(zie de samenvatting pag. 86).

Bi) dit alles moet men in aanmerking nemen ik loop
hier op een later te geven uiteenzetting vooruit — dat de uit-
vlokkingsvatbaarheid van bacteriën, zoowel als van suspensies,
in vrij sterke mate gebonden is aan de concentratie van dc
suspensie; te sterk verdunde suspensies reageeren niet meer.

Samenvattende, kom ik tot de conclusie, dat een antigeen
in suspensie, van zoodanige dichtheid, dat het gemakkelijk
uitvlokbaar is, boven een colloïdaal opgelost antigeen even-
eens in optimale concentratie — het voordeel heeft van een
geringe hoeveelheid antigeen tc bevatten, waardoor slechts
weinig antistof vereischt wordt voor een specifieke reactie.
Hierdoor zou de hoogere titer van het scrum tegenover het
gesuspendeerde antigeen kunnen worden verklaard. Of deze
verklaring de eenig aanvaardbare is, zal nog later worden
besproken.

Verbetering der caseine-kaoline suspensies. Dc tot dusverre
gebruikte suspensies gaven wel eens moeilijkheden bij het

aflezen. Ook zonder uitvlokking bezonken zij vrij snel, veel
sneller dan een bacteriesuspensie. Ik trachtte hieraan tegemoet
te komen, door het soortelijk gewicht en de viscositeit der
vloeistoffen te verhoogen, zonder de toevoeging van electrolyten
(deze remmen bij overmaat zoowel agglutinatie als precipi-
tatie). Sterke rietsuikeroplossingen waren het middel hiertoe.

Bereiding van suspensies met saccharose: in phys. NaCl
werd een 50% oplossing van saccharose gemaakt: hiermee
werd een geconcentreerde caseïne-kaoline suspensie tot de
gewenschte dichtheid verdund. Met dit materiaal werden op
de gebruikelijke wijze gelijke hoeveelheden van serumverdun-
ningen gemengd, zoodat bij de proef de concentratie van riet-
suiker 25 % werd.

Het resultaat was. dat de reactie veel fraaier afleesbaar
werd. Een positieve reactie uit zich op twee wijzen:

le. De groote massa van de kaoline slaat niet in een dun
laagje neer, als in de contrölebuisjes, maar komt in één klompje
te liggen.

2e. In de bovenstaande vloeistof ziet men fijne vlokjes in
een volkomen heldere vloeistof zweven.

De twee verschijnselen zetten zich niet voort in dezelfde
serumverdunningen; het eerste (klompvorming) zet zich voort
in een verdunning 10—20 X hooger dan de solprecipitatie;
het tweede (zwevende vlokjes) in een 8—10-voudige ver-
dunning.

Er werd dus op deze wijze een zeer bevredigende titer-
verhooging verkregen. Wat betreft de onspecifieke uitvlok-
baarheid volgens deze methode: heterologe sera vlokken de
suspensies in saccharose uit tot ongeveer denzelfden titer als
zonder saccharose.

Met deze verbeterde methodiek trachtte ik de vraag te
beslissen: Heeft de binding van het precipitine plaats aan
de oppervlakte der suspensiedeeltjes ? De suspensie werd hiervoor
in dichtere concentratie genomen, en op 2 verschillende wijzen

toegevoegd n.1. le. met caseïne, vooraf geadsorbeerd, en 2c.
caseïne, niet vooraf geadsorbeerd.

Verder werden van een immuunserum, dat oorspronkelijk
een goeden titer had, n.1. Vbo» maar eenige weken in de ijs-
kast had gestaan, twee serieën buisjes met verdunningen ge-
vuld, zoodanig dat de titers Vbo-^Viooo zouden bedragen.

In de eene serie werd aan elke cc. serumverdunning toe-
gevoegd 1 cc. van een mengsel, dat uit gelijke deelen van
de suspensie B en de caseïne-oplossing A bestond, cn eerst
2 uren na menging had gestaan bij kamertemperatuur: serie I.

In de tweede serie werd aan elke cc. serumverdunning
eerst Vs cc. caseïne A toegevoegd; na menging met het serum
werd dan direct Va ec. kaolinesuspensie B toegevoegd, en
opnieuw gemengd: serie II.

Zoodoende ontvangt serie I een suspensie, waaraan eerst
caseïne is geadsorbeerd, en serie II een mengsel, waar dit
niet is geschied. Kaoline en caseïne komen in alle buisjes van
beide serieën in gelijke hoeveelheden voor.

Het blijkt dus, dat de suspensie-precipitatie reactie alléén
plaats heeft na voorafgaande adsorptie van het antigeen

de suspensie; de binding van het precipitine heeft dus plaats
aan de oppervlakte hiervan. De positieve reactie in serie B
bij Vso hebben wij het recht als onspecifiek te beschouwen
(zie pag. 40).

Men zou tegen deze proeven met saccharose kunnen aan-
voeren, dat door verscheidene onderzoekers een storende in-
vloed van rietsuiker bij agglutinatie (Landsteiner tn Welecki) (26)
en precipitatie (Downs en Goodner) (27) is vastgesteld. Daar-
tegenover staat, dat Victor Henri en Girard-Mangin (28)
vonden, dat saccharose een bevorderenden invloed had op
het uitvlokken van roode bloedlichaampjes door colloïden;
in navolging hiervan werd de rietsuikermethode uitgewerkt.
Ook ik vond bij mijn kaolinesuspensies veeleer een bevor-
derende dan remmende werking.

Proeven met harsen. Ook de rietsuikermethode voldeed
ten slotte niet. Het werken met de strooperige vloeistoffen
was omslachtig en ik voelde er meer voor om met bacteriën
meer vergelijkbare suspensies te maken, daar de kaoline toch
nog vrij sterk korrelig was. Daarom werden proeven genomen
met harsen, waarvan het soortelijk gewicht dat van phys.
NaCl weinig ondoopt. Fijngewreven leveren verschillende
harssoorten een materiaal, dat volstrekt geen verbetering be-
teekent in vergelijking met kaoline. Ik nam daarop mijn
toevlucht tot alcoholische oplossingen, waarvan door verdun-
ning met gedestilleerd water suspensies werden bereid.

Nu moet worden opgemerkt, dat men na lezing van publi-
caties over physisch-chemische onderwerpen niet zoo gauw
begrijpt, wat men eigenlijk met zoo\'n in gedestilleerd water
verdunde harsoplossing, in handen heeft. Vaak wordt zoo
iets als een suspensiecolloïd betiteld, o.a. in Höber\'s bekende
boek. In de litteratuur vindt men daarentegen vaak de be-
naming suspensie. Om dit punt voor mijzelf duidelijk te maken,
heb ik mijn toevlucht genomen tot eigen onderzoek.

Het bleek spoedig, dat verschillende factoren op de vor-
ming der suspensies, zooals ik ze zal blijven noemen, invloed
hebben. Zij werden onderling vergeleken macroscopisch, met
opvallend en doorvallend licht, en microscopisch in den hangen-
den druppel.

Suspensies van de volgende harsen werden bestudeerd:
mastix, colophonium, benzoë, guajak en gummi gutti. Het
bleek, dat de laatste 3 minder geschikt waren, daar het niet
lukte hiermee voor de suspensie voldoend sterke (10% alco-
holische) oplossingen te maken. Dit nu is niet zonder beteekenis,
zooals vooral uit de proeven met mastix en colophonium zal
blijken. Daarom heb ik mij ten slotte tot deze laatste twee
beperkt.

Het bleek, dat het een groot verschil maakt, of men van
sterke of zwakke alcoholische oplossingen uitgaat. Mastix en
colophonium, uit 10% oplossingen verdund, gaven een melk-
witte, geheel ondoorzichtige suspensie, waarin men met de
loupe gemakkelijk korrels ziet. Microscopisch ziet men een
groote verscheidenheid van bollen; er zijn er, eenige malen
grooter dan een leucocyt, cn met sterke vergrooting nauwe-
lijks zichtbare.

Uitgaande van een 4 % alcoholische oplossing, merkt men
met het bloote oog niet veel onderscheid met de vorige sus-
pensies. Microscopisch heeft men echter een geheel ander
beeld voor zich; men kan spreken van een verschuiving naar
Weinere afmetingen. Er zijn meer bollen van middelmatige
grootte, en vooral ook meer kleine bolletjes. Mastix en
colophonium geven hetzelfde beeld.

Ten slotte werden de resultaten van nog zwakker alcoho-
lische oplossingen, n.1. 1 %, vergeleken. Hierbij geschiedde
iets verrassends. Terwijl colophonium nu weder een ver-
schuiving gaf naar kleinere bolgroottc, veranderde het mastix
totaal van karakter. In plaats van een melkwitte, ontstond
een licht troebele vloeistof, die met opvallend licht nu sterk

opaliseerde. Microscopisch was het gezichtsveld bijna leeg;
hier en daar een enkel zeer fijn bolletje. M.a.w. het mastix
was in colloïdalen toestand verkregen; het was dus nu voor
het doel ongeschikt.

Men heeft het dus, door uit te gaan van alcoholische op-
lossingen, geheel in de hand om zich een suspensie te be-
reiden van een verdeeling, welke men wenscht. Colophonium
bleek minder neiging te hebben om in colloïdalen toestand
over te gaan dan mastix. Om deze reden heb ik op den duur
het colophonium voor mijn proeven verkozen. Meestal ging
ik uit van een 3,2 % of 4 % alcohohsche oplossing. Een
sterkere oplossing heeft het voordeel, dat men er minder kans
mee heeft om colloïdaal opgeloste deeltjes te verkrijgen. Een
groot nadeel is, dat er veel te grove korrels in voorkomen,
terwijl een niet onaanzienlijk gedeelte van het hars uit de
sterke oplossing bij de verdunning als een beslag zich tegen
het glas afzet.

Behalve de besproken methode van concentratie der alco-
holische oplossing, heb ik in de litteratuur nog 2 andere
methoden gevonden, dienende om dc korrel van dc suspensie
te vergroven. In de eerste plaats kan men dit doel bereiken
door te verdunnen met heet water. Zoo verkreeg ik uit een
4 % colophoniumoplossing met kokend heet water een sus-
pensie, die het beeld gaf van een volgens de koude methode
uit 10 % oplossing bereide. Eenig voordeel bood de methode
echter niet.

Verder heeft Sachs (29) aangegeven, dat men, van één-
zelfde mastixoplossing (1 % alcoholisch) uitgaande, twee zeer
verschillende verdeelingen in gedest. water kan bereiden:
indien men de oplossing vlug in het water blaast, ontstaat
een zwak doorschijnende emulsie; druppelt men de oplossing
in het water onder aanhoudend schudden, dan ontstaat een
melkwitte vloeistof. Deze laatste methode werd niet toege-
past, daar zij mij onzeker leek. Ter voorkoming van misverstand

zij nog medegedeeld, dat ik er zorg voor droeg, dat in de
bereide suspensies, die werden vergeleken, steeds gelijke
hoeveelheden hars zich bevonden.

Een aardige proef om ad oculos het verschil in dispersie-
graad tusschen verschillend bereide suspensies te demonstreeren,
is de volgende.

Maatglas I ontvangt colophonium 10% in alcohol 2 cc.
aq. dest. tot volledig neerslaan.

Aan beide maatglazen waren dus colophonium, alcohol en
water in gelijke hoeveelheden toegevoegd.

Door papierfilter gefiltreerd, loopt de vloeistof uit maat-
glas I (grove korrel) eerst licht troebel door en dan, tenge-
volge verstopping der filterporiën, helder; die uit maatglas II
loopt even melkwit door als de oorspronkelijke suspensie.

Ten slotte nog iets over de alcoholverdunningen. Ik heb
gebruikt oplossingen in 96 % alcohol. In de litteratuur wordt
aangegeven, dat men gewoonlijk 10 maal met water verdunt:
de practijk leerde mij, dat men minstens 8 maal met water moet
verdunnen, om het hars volledig in suspensie over te brengen.

Weg ens het alcoholgehalte der vloeistoffen was het noodig,
aan suspensies te adsorbceren, die aanmerkelijk meer verdund
Waren dan die voor adsorptie werden gebruikt met anorga-
nisch materiaal. Hier overkwam mij de verrassing, dat een
dergelijke meer verdunde suspensie (zonder adsorbaat) niet
®et physiologische keukenzoutopiossing uitvlokt. Inderdaad
blijkt, dat deze suspensies alleen in geconcentreerden vorm
door zouten werden uitgevlokt, en dan nog in het bijzonder
door NaCl-concentraties, die boven de physiologische liggen.

Zoowel voor colloïdaal gedisperseerd als voor grover ver-
deeld hars geldt dit. Mastix en colophonicum gedragen zich
in dit opzicht (binnen eenigszins ruime grenzen) ongeveer gelijk.

Van de proeven, in dit verband genomen, geef ik er één,
die uitgekozen werd, omdat zij de aanleiding was tot de
proevenreeks, die in hoofdstuk V beschreven wordt.

Colloïdaal mastix werd bereid uit 1 % alcoholische op-
lossing. Drie verschillende verdunningen werden gebruikt, n.1.
0.4%, 0.04% en 0.004%; deze worden elk met verschil-
lende concentraties NaCl in gelijke hoeveelheden gemengd,
zoodanig dat de zoutconcentraties der mengsels bedragen
resp. 15%, 5% en 2%.

Het blijkt uit dit staatje, dat de colloïd-concentratie in de
eerste plaats grooten invloed heeft op de uitvlokbaarheid.
Alleen een geconcentreerde harsdispersie kan door al de ge-
bruikte NaCl-oplossingen worden uitgevlokt. Van deze keuken-

zoutoplossingen is alleen de 5 % oplossing in staat het sterk
verdunde mastix uit te vlokken, resp. te veranderen. De
physiologische zoutsolutie is dus voor dit doel ongeschikt en
evenzeer voor colophonium, zooals mij gebleken is.

Al mist men nu de opheffing der electrolytvlokking als
symptoom van eiwitadsorptie, men kan daarvoor een ander
verschijnsel gebruiken, waarvan ik hier een voorbeeld geef.

Er ontstaat dus in de buisjes met zeer weinig eiwit een
neerslag, dat niet te zien is bij toevoeging van meer caseine.
Dit eerste neerslag mogen wij wel opvatten als symptoom
van beginnende adsorptie: voor mijn proeven werd gewoonlijk
de verhouding van Vio gekozen; later ook Ve met colophonium.

Van mastix heb ik voor de volgende proeven afgezien,
maar de bereiding van de caseine-colophoniumsuspensie ge-
schiedde volgens een gelijksoortig schema.

Proeven met caseïne-colophonium. Colophonium is een hars,
dat men door verhitting van zijn vluchtige bestanddeelen
heeft bevrijd, hetgeen mij voor deze proeven ook een voor-
deel leek te zijn. Daar het soortelijk gewicht laag is, blijft
het fraai in suspensie.

Met dit materiaal werden de titers der anticaseine-sera
niet onbelangrijk verhoogd, n.1. gemiddeld 5 maal, terwijl de
caseineconcentratie in de suspensies 6—8 maal gering^p was
dan in de voor de precipitatie-proef gebruikte oplossingen.
Het lijkt ook hier, of er een zekere verhouding tusschen
titerverhooging en antigeenverdunning bestaat.

Uitvoeriger zal over de proeven met caseïne-colophonium
worden bericht in het volgende hoofdstuk. Hier wil ik nog
erop wijzen, dat normale sera eveneens met deze suspensie
reageeren, tot den serumtiter Vbo- Dit geschiedt op een eigen-
aardige wijze, die ik het „opheldering s-e ff eetquot; heb genoemd.
Voegt men bij een lage serumverdunning (normaal- of immuun-
serum) een gelijke hoeveelheid suspensie, dan ziet men in
eenige minuten de buisjes geheel opklaren, alsof er een nevel
optrekt. Spoedig is, ook met de loupe, van de supensie vrij-
wel niets meer te zien; het is alsof de deeltjes zijn opgelost.
Onder het microscoop ziet men evenwel dat in zulk een
menging al de bolletjes nog te zien zijn, maar in kleine
klompjes gegroepeerd. Hoe het komt, dat deze klaarblijkelijk
uitgevlokte deeltjes niet meer te zien zijn, kan ik niet ver-
klaren; het lijkt me toe, dat we hier met een zuiver optisch
effect te doen hebben, veroorzaakt door de hooge aanwezige
concentratie van eiwitten, of misschien speelt adsorptie dezer
eiwitten een rol.

Proeven met typhus-colophonium. Het leek nuttig, deze
gemakkelijk hanteerbare methode eens te vergelijken met de
agglutinatie bij typhus. Extracten van typhusbacillen werden
bereid door agarcultuurmassa\'s met droog NaCl in een mortier
te wrijven, daarna te suspendeeren en, nadat ze eenige uren
bij 37° C. hadden gestaan, door een kaars te filtreeren. Deze
bacillen-extracten werden aan colophonium geadsorbeerd, en

met deze suspensies vervolgens antityphus-sera (van typhus-
lijders en konijnen) getitreerd. Dit liep evenwel uit op een
grooten tegenvaller: geen enkele positieve reactie werd ver-
kregen, nergens was in de proefbuisjes specifieke uitvlokking
waar te nemen.

Proeven met paardeserumsuspensies. Ook hier kwam een
teleurstelling: met geen der beproefde materialen gelukte het
ook maar een schijn van een specifieke uitvlokking te krijgen!

Deze tegenslagen hadden het gevolg, dat ik opnieuw naar
suspensie-materiaal ging zoeken, en dit ten slotte vond in
zinkstearaat, een in water onoplosbare verbinding van stearine-
zuur met zink.

Proeven met zinkstearaat. Dit materiaal wordt weer anders
verwerkt, als in hoofdstuk II beschreven. De verkregen sus-
pensies lijken bedriegelijk veel op die van b.v. typhusbacillen.
Na 24 uur staan ziet men in de controlebuisjes op den
bodem alleen een zeer klein koepeltje van witte stof, die
door schudden gemakkelijk weer in de vloeistof verdeeld wordt.
Er is één verschil: de suspensie is iets grover van korrel,
waarom het niet aan te raden is om af te lezen met een
loupe, maar met het bloote oog bij kunstlicht.

Er zijn aan deze suspensie twee groote voordeelen ver-
bonden, vergeleken met de vorige:

le. Men heeft zeer weinig last van onspecifieke reacties;
de suspensies konden gemakkelijk zóó worden ingesteld, dat
normaal serum in den titer Ygo geen reactie meer gaf.

Een positieve reactie ziet er eenigszins anders uit, dan b.v.
een positieve Widal; de ontstane conglomeraten zijn nooit
meer dan korrels, die bovendien niet bezinken, daar het
materiaal ongeveer hetzelfde soortelijk gewicht schijnt te

hebben als phys. NaCl. Als positief gold alleen een buisje,
waar in een volkomen heldere vloeistof met het bloote oog
scherp te onderscheiden korrels zweven.

Regelmatig werd met deze suspensies, zoowel voor caseïne
als paardeserum, een titer bereikt, 10 maal hooger dan die
van de precipitatie. Dit is merkwaardig, omdat de suspensies
hier werden ingesteld op een hoog antigeen-gehalte; ze be-
vatten n.1. resp. P.S. V300 en Cas. Veeo S. M.a.w.: verge-
leken met wat gevonden werd bij kaohne- en colophonium-
suspensies, had de hoogere titer een verder verwijderd verband
met de mindere hoeveelheid antigeen in de suspensie. Het is
verder opmerkelijk, dat terwijl voor de sol-precipitatie met
paardeserum en caseïne beide dezelfde antigeenverdunning
werd gebruikt (Vsbo S.), toch de zeer verschillende hoeveel-
heden antigeen bevattende suspensies allebei den titer 10 maal
verhoogden. Uitvoerige tabellen zijn in het volgende hoofd-
stuk te zien.

Ik heb mij nog de vraag voorgelegd, of het aanbeveling
zou verdienen, proeven te doen met antigenen geadsorbeerd
aan organisch materiaal b.v. bacteriën. Daarvan werd even-
wel afgezien, om de volgende redenen:

1.nbsp;onderzoekingen hebben geleerd, dat lichaamseiwitten niet
gemakkelijk worden geadsorbeerd aan organisch materiaal;
de hoeveelheden geadsorbeerd eiwit waren nauwelijks aan-
toonbaar (30 en 31);

2.nbsp;autoagglutinabele bacteriën, die in de bacteriewereld het
standpunt innemen van anorganisch suspensiemateriaal als
kaoline, wat betreft gemakkelijke uitvlokbaarheid met geringe
zoutconcentraties, kan men door middel van eiwit-toevoeging
(Schutzkolloid) niet in suspensie houden. Mij althans is dit met
2 autoagglutinabele Proteus-stammen en 1 autoagglutinabele
Shiga-Kruse stam niet gelukt.

vergelijkbare uitkomsten niet zouden worden verkregen, om
welke reden ik ervan afzag.

Kort samengevat, werd met deze proeven aangetoond, dat
het gebruik van een antigeen in den vorm van een suspensie,
den onderzoeker in staat stelt, aanmerkelijk hoogere serumver-
dunningen met positieven uitslag te bereiken, dan wanneer het
antigeen colloidaal is opgelost in physiologische zoutsolutie.

Dit voor drie jaren aangevangen onderzoek was reeds af-
gesloten, toen ik een recent onderzoek van Jones (32) in
handen kreeg, waarin deze de resultaten van een met gelijke
bedoelingen ondernomen proefreeks mededeelt, die de in dit
hoofdstuk tot dusverre gegeven onderzoekingen in hoofdzaak
bevestigen.

Wat het gebruik van harsen betreft, valt op te merken, dat
deze reeds toepassing vonden bij immuniteitsreacties. O.a. pas-
ten Dujarric de la Rivière en Roux (33) benzoëhars toe bij
precipitatie met extracten van meningococcen en gonococcen.

Hoe verhoudt zich nu de precipitatie met verdunde suspensies
tegenover die met sterk verdund colloïdaal antigeen?

Zooals reeds werd medegedeeld, geldt als een kenmerkend
verschil tusschen precipitatie en agglutinatie het feit, dat men
bij de eerste het antigeen buitengewoon sterk kan verdunnen,
terwijl men met een sterk verdunde bacteriesuspensie geen
agglutinatie meer kan verkrijgen (zie hoofdstuk I). Nu is dit
een feit, dat men niet zonder meer moet aanvaarden. Welis-
waar kan men b.v. een paardeserum, dat als antigeen gebruikt
wordt, zeer sterk verdunnen, maar men moet bedenken dat
zulk een serum zeer veel precipitabele stof (± 8 % eiwit) bevat.
Als men dit vergelijkt met een bacteriesuspensie, zooals men
die verkrijgt door een agarbuis of plaat met bacteriecultuur
af te spoelen door middel van phys. NaCl, dan vergelijkt
men geheel ongelijkwaardige hoeveelheden. Zelfs een zeer

dichte bacteriesuspensie bevat betrekkehjk weinig vaste stof,
zooals men gemakkelijk aan kan toonen door haar uit te an-
trifugeeren, waarbij men slechts een vrij dunne laag op den
bodem van het buisje verkrijgt.

Het leek daarom bij de hier te beschrijven proefneming
juister, om die antigeenverdunningen te vergelijken, welke
een optimale reactie met het immuunserum gaven.

Bij deze proeven werd als antigeen paardeserum, en paarde-
serum geadsorbeerd aan zinkstearaat, gebruikt. Voor precipi-
tatie met paardeserumverdunningen was reeds gevonden, dat
de verdunning 1 : 250 een optimale reactie gaf (pag. 38).

Bepaling van de optimale reactie met zinkstearaat. Hiertoe
bediende ik mij van den nephelometer van Mc. Farland
Deze bestaat uit een serie van buizen van gelijke wijdte, die
gevuld zijn met stijgende hoeveelheden bariumsulfaat in sus-
pensie, waarvan dc achtereenvolgende suspensies telkens met
een gelijke hoeveelheid toenemen. Zoodoende krijgt men ver-
schillende graden van dichtheid: 1, 2, 3 enz. — resp. corres-
pondeerende met suspensies van bariumsulfaat van 0.0112%,
2 X 0.0112 %, 3 X 0.0112 % enz. —, waarmee men nu de ge-
bruikte antigeensuspensies kan instellen door de dichtheid met
die van de nephelometerbuizen te vergelijken. Ik droeg er
steeds zorg voor. dat de gebruikte buizen van gelijke wijdte
waren, en vergeleek ze steeds op dezelfde wijze n.1. bij op-
vallend licht tegen wit-zwarten achtergrond, na de nephelo-
meterbuizen eerst behoorlijk tc hebben geschud.

Het bleek dat de hoogste titers met P.S.-zinkstearaat werden
verkregen met suspensies, die een dichtheidsgraad van 1 tot
en met 5 bezaten. Ik gaf er de voorkeur aan, tc werken met
een dichtheid 5, daar deze het gemakkelijkst afleesbare
reacties gaf.

\') Overgenomen uit Kolmec: Infection, Immunity and Biologie Therapy,
1924, pag. 195.

le Proef. Serum konijn D, titer ^/go met P.S. ^/ggo» wordt
getitreerd met 4-voudig en 20-voudig verdund antigeen (dus
P.S. Viooo en P.S. Vsooo)- Resultaat:

Antigeen P.S. \'/«o, onverdund .
Antigeen P. 8. Viso- ^ ^ verdund
Antigeen P. S. V„,. 20 X verdund
C (phys. NaCl).......

Hetzelfde werd nu gedaan met een suspensie P.S.-zink-
stearaat van een dichtheid 5, eveneens onverdund en 4Xen
20X verdund. Resultaat:

Als men deze resultaten met elkaar vergelijkt, dan ziet men,
dat verdunning van het opgeloste antigeen alleen tot gevolg
heeft, dat de precipitaten geringer in omvang worden, terwijl
de titer van het serum (Vbo) quot;\'et daalt. Evenwel is het met
de suspensie anders gesteld: geringe verdunning heeft geen
invloed, terwijl bij 20-voudige verdunning de titer zakt tot
den sol-precipitatietiter.

Hetzelfde werd gedaan met het serum van konijn E, titer
met P.S. V26O was Vio- Dit zwakkere serum bleek iets sterker
den invloed der P.S.-verdunning te ondergaan.

Met het P.S. Vzbo 20 maal verdund waren de positieve
reacties zwak; er was zeer duidelijke opalescentie, terwijl met
de zwakke loupe zeer fijne vlokjes waarneembaar waren. De
20 maal verdunde stearaat-suspensie gaf geen vlokking; wèl
was er een opheldering te bespeuren, evenals bij de eerste
proef. Het bleek evenwel, dat precies hetzelfde te zien was
met normaal konijneserum:

Dergelijke ophelderingen, die bij zeer verdunde suspensies
den indruk van een positieve reactie mochten geven, kon ik
dus niet laten gelden; zooals gezegd, was van een vlokking
bij deze verdunde suspensie geen sprake bij de laatste proef
en slechts in zeer geringe mate bij de eerste proef.

Conclusie: gesuspendeerd antigeen verdraagt verdunning
veel minder goed dan antigeen in oplossing, ook als men de
voorzorg neemt bij de verdunning uit te gaan van antigenen
in optimale concentratie.

Met de proeven, in dit hoofdstuk beschreven, meen ik te
hebben aangetoond, dat wanneer men een antiserum laat in-
werken op het homologe antigeen, geadsorbeerd aan een
suspensie (suspensie-precipitatie), er karakteristieke verschillen
optreden, vergeleken met de reacties, die men verkrijgt door
het antiserum te laten inwerken op het homologe antigeen
in colloïdale oplossing (sol-precipitatie). Deze verschillen uiten
zich eenerzijds, doordat de titer van het serum door toepas-
sing van de suspensie-precipitatie wordt verhoogd; anderzijds
hierin, dat men het antigeen door het in den vorm eener
suspensie aan te wenden, niet meer sterk kan verdunnen.
M.a.w. de antigeen-suspensies gedragen zich tegenover preci-
pitinen eenigszins als bacterie-suspensies tegenover agglutininen.

Het standpunt, bereikt door de proeven, in het vorige
hoofdstuk vermeld, heb ik getracht te bevestigen, door na te
gaan of in andere gevallen de resultaten verkregen met colloï-
daal opgelost en met gesuspendeerd antigeen, evenmin parallel
gaan. Zooals reeds werd uiteengezet, hebben sommigen op
grond van het niet gelijktijdig aantoonbaar zijn van precipi-
tinen en agglutininen, ten opzichte van deze immuunstoffen
het dualistische standpunt verdedigd (zie hoofdstuk I).

De in dit hoofdstuk te beschrijven proeven werden gedaan
met de antigenen caseïne en paardenserum, en de adsorbentia
colophonium en zinkstearaat.

Twee konijnen, I en II, ontvangen 150—200 mgr. caseïne
intraveneus, telkens met een week tusschenruimte; alleen na
de eerste injectie was het interval 6 dagen. Vóór elke nieuwe
injectie werd bloed afgetapt en het serum van beide dieren
getitreerd met caseïne en caseïne-colophonium. Zoodoende
verkreeg ik een goed overzicht van de onderlinge verhouding
der twee reacties tijdens de immuniseering. Voor de bereiding

der antigenen werden steeds dezelfde colophonium- en caseine-
oplossingen bereid en steeds volgens dezelfde methode.

1 September: eerste injecties aan I en II.
7 September: bloed afgetapt en met sera gereageerd.
Resultaat na 24 uur:

Dit resultaat was zeer verrassend. Zooals uit de hier ge-
geven tabel blijkt, waren de sol-precipitaties bij de beide
konijnen I en II volkomen negatief, terwijl de suspensie-
precipitaties als positief moesten gelden. De reacties met
caseïne-colophonium immers waren sterker positief dan men
met een normaal serum pleegt te zien, dat hoogstens tot den
titer Vso uoQ eenige inwerking vertoont. Om evenwel zeker
tc zijn, dat er geen vergissing was begaan, titreerde ik nu
een normaal serum met het gebruikte colophonium antigeen;
dit was dus geheel hetzelfde als dat van de vorige proef,
alleen had het 24 uur lang gestaan, hetgeen echter volgens
mijn ervaring — door speciale proeven gestaafd — geen
verschil maakt.

Op verschillende wijzen bereide suspensies van gelijke dichtheid geven
overigens, mits met dezelfde verhouding antigeen en adsorbens, dezelfde
resultaten.

Het is dus bewezen, dat aan een fout in de suspensie deze
positieve reacties niet mogen worden geweten.

In het vervolg werden de titraties alle gedaan met iets
meer verdunde materialen, n.1. caseïne Vsso ^ en caseïne
(Vl«BO S)-Col.

De mogelijkheid is niet ontkennen, dat het gebruik van
een iets meer verdund precipitatie-antigeen wel invloed zou
kunnen hebben. Evenwel kan dit de stijging van den precipi-
tatietiter van O op V20 en Vbo niet verklaren. Ook in een
later in dit hoofdstuk te beschrijven proefreeks vond ik, dat
na injectie van caseïne een week later nog geen precipitinen
aantoonbaar zijn (met caseïne Vsbo S), en na nóg een injectie
er gewoonlijk een vrij goede precipitinevorming optreedt

(zie pag. 67). De hier gegeven resultaten lijken me dus geheel
betrouwbaar te zijn.

In deze serie zien we nu voor het eerst de verhouding
tusschen caseïne-proef en suspensieproef optreden {± 1 : 5),
die de meest voorkomende is.

Bijzonder opmerkelijk is het feit, dat II nu een behoorlijken
precipitatietiter heeft gekregen, terwijl met de suspensie de
titer dezelfde bleef!

21 September. Weer bloed afgenomen en getitreerd. Bij
het bloedaftappen door hartpunctie bezweek helaas konijn I,
zoodat het voor het laatst in deze tabel verschijnt.

Dus geen verschil met den vorigen keer.
28 September. Konijn II bloed afgenomen en getitreerd.

Hier is nu de titer met de suspensiemethode 10 maal ver-
hoogd. Evenwel is het niet raadzaam, aan dergelijke kleine

wisselingen waarde te hechten, daar op den predpitinetiter
Vso eerst Veo volgt (^/^q is misschien wel positief). Maar als
voorspel tot de volgende titratie is het niet zonder belang.
5 October. Konijn II bloed afgenomen en getitreerd.

Bij constant blijvenden precipitatietiter, wordt de suspensie
tot een titer van Viooo uitgevlokt! Vergeefs heb ik gebracht
in de gevolgde bereidingsmethode van de suspensie een fout
te vinden. Voor een hernieuwde titratie was geen serum
meer over.

Wonderlijk genoeg, neemt nu de titratie der twee methoden
een tegenovergesteld verloop: de titer met caseïne stijgt, die
met caseïne-colophonium daalt en gemeenschappelijk wordt
de normale onderlinge verhouding hersteld.

Wanneer men deze gegevens in het kort samenvat, krijgt
men het volgende verloop: I en II krijgen al spoedig na de
eerste injectie een titer met de suspensie, terwijl er van pre-

cipitatie in het geheel niets te bespeuren is (dit laatste kwam
regelmatig na één caseïne-injectie voor); spoedig stelt zich een
verhouding in tusschen de twee methoden, die gelijk blijft;
als met II de proef wordt vervolgd, zet zich een tweede af-
zonderlijke stijging in van den suspensie-titer, die wederom
wordt gevolgd door een stijging van den precipitatietiter, en
herstel van de normale verhouding tusschen de twee anti-
genen.

Er bestond dus in deze proeven geen volkomen paralIeUsme
tusschen de twee methoden.

Nog op een andere manier werd op parallehsme getoetst,
door nl. de in de vorige proefreeks verkregen antisera op
verschillende temperaturen, en gedurende verschillende tijden,
te verhitten. Piek (34) is de eerste geweest, die een ver-
schillende gevoeligheid van precipitinen en agglutininen tegen-
over verhitting meende vast te stellen. Hij verhitte anti-typhus
en anti-cholera sera (van paarden) gedurende Vs—V4 uur op
58—60° C., en zag nu met dc homologe cultuurflltraten en
-extracten geen precipitaties meer, terwijl de agglutinatie on-
verzwakt bleef; in enkele gevallen werd de agglutinatietiter
door de verhitting zelfs verhoogd. Hierin zag Piek alweer
een bewijs, dat precipitinen en agglutininen in de onderzochte
sera niet identiek konden zijn.

Ik geef deze proeven precies in dezelfde volgorde waarin
ze werden genomen, op gevaar af, dat men de indeeling
willekeurig zal vinden.

De sera I en II van 14 September worden gedurende
50 minuten op 59—60° C. verhit. Vervolgens werd ge-
titreerd met de gewone caseïneoplossing en -suspensie. Resul-
taat na 24 uur:

Hier werd dus bij serum I — dat vrij sterk haemolytisch
was — een negatieve reactie met beide methoden bereikt;
bij II was de reactie met de suspensie positief, met de op-
geloste caseïne negatief. Ik merkte evenwel op, dat wel is
waar nergens vlokking zichtbaar was, maar wèl opalescentie.
Daar ik voor een positieve precipitatie (evenals met een sus-
pensie) steeds duidelijk zichtbare vlokking eischte, konden deze
opalescenties niet als positieve precipitaties worden genoteerd.
Daarom werd na nogmaals 24 uur wederom afgelezen.
Resultaat na 2X24 uur:

Het is nu wel duidelijk geworden, dat de waargenomen
opalescenties eenvoudig vertraagde precipitatie-reacties waren.
Bij I was de reactie met de suspensie dus eveneens sterk
vertraagd, bij II slechts weinig.

Ten overvloede werden nog de verhitte sera met phys.
NaCl getitreerd; hierbij zag ik geen opalescenties.

Het serum II van 21 September wordt gedurende 2 uur
op 49° C. verhit. Resultaat der reacties na 24 uur:

M.a.w. deze lage verhitting had geen invloed.
Het serum II van 21 September (2de portie, licht haemo»
lytisch) wordt gedurende 2 uur op 58° C. verhit. Resultaat
der reacties na 24 uur:

Voor het eerst werd hier dc noteering ± ingevoerd. Ik
kreeg n.1. weer dezelfde opalescenties zonder vlokvorming.
Toen ik evenwel de buisjes met de loupe bekeek bij lamp-
licht, werd het duidelijk, dat de opalescentie door vlokjes
werd gevormd. Dergelijke fijne reacties werden later ook met
on verhitte sera gevonden en als specifieke precipitaties onderkend.

De suspensie reageert weliswaar met iets fijner vlokking op
de verhitting van het serum, maar de titer is gestegen 1 (verg.
pag. 63). Dit feit, dat volgens de serologische terminologie
dus neerkomt op vermindering van de aviditeit der binding,
gepaard gaande met verhooging van den titer, wordt wel
meer vermeld in de litteratuur.

Het semm II van 28 September wordt gedurende 22 uur
op ongeveer 49° C. verhit. In dezen tijd heeft de temperatuur
van het waterbad eenigszins gewisseld, van 48° C. in het
begin tot 50° C. op het einde der verhitting. Daarna wordt
op de gewone manier getitreerd. Resultaat na 24 uur:

Met caseïne werd dus alleen in de verdunning Yg,, zwakke
vlokvorming gezien; bij V2—\'Vio was er alleen opalescentie
(met lamplicht afgelezen). Met de suspensie was de titer een
weinig gedaald, terwijl de vlokvorming in de positieve buisjes
iets flauwer was, maar in den loop van den dag van aflezing
nam de grootte der vlokken toe.

Deze proeven gaven den indruk, dat de titratie door middel
der suspensiemethode, door de verhitting der sera wel nadeel
ondervond, maar toch minder achteruitging dan de eigen-
lijke precipitatieproef. Hier was al spoedig van een typische
precipitatie niet veel meer te zien. Er was wel samengang
(al de reacties werden vertraagd), maar geen werkelijk paral-
lelisme bij deze proeven, zoodat men tot de conclusie zou
kunnen komen, dat men met twee verschillende antistoffen
te doen had. Waar nu de sol-precipitatie werd gedaan met
optimale concentratie van het antigeen, is er te meer reden
om aan de proeven van Piek verricht met cultuurfiltraten en
extracten (pag. 63), geen groote beteekenis te hechten.

Dit materiaal stelde mij in staat om onder aanwending van
uitvoeriger controle de proeven voort te zetten, daar zoowel

caseïne als paardeserum uitstekende suspensies hiermee gaven,
die goed reageerden op de werking van antiserum. Bij de
vorige proeven moest ik mij noodgedwongen beperken tot
caseïne, daar het toen gebruikte suspensiemateriaal geen goede
uitkomsten gaf met paardeserum en typhusbacillen-extract en
kon ik daardoor de mogehjkheid niet uitsluiten, dat sommige
behandelde dieren een verhoogd onspecifiek uitvlokkingsver-
mogen ten opzichte van suspensies hadden gekregen. Door
het nieuwe materiaal was eindelijk de gelegenheid open tot
het nemen van kruisproeven.

Alvorens deze proeven nader tc beschrijven, valt eerst het
verschil te demonstreeren tusschen caseïne en paardeserum,
wat betreft de antigene eigenschappen, welk verschil hier op
zeer opmerkelijke wijze aan den dag trad.

Konijnen no. 10, 11 en 12 ontvingen elk 5 cc. caseïne Vs S
intraveneus. Ruim een week later werd bloed afgetapt en
getitreerd met de homologe antigenen. Resultaat:

Ik veronderstelde, dat wellicht (mede in verband met de
iets grootere caseïne-dosis) de caseïne-dieren iets later zouden
reageeren. Daarom kregen deze dieren een nieuwe injectie —
de paardeserum konijnen niet — en werd gewacht totdat in
het geheel 24 dagen na de eerste injectie waren verloopen,
en toen nogmaals de caseïne-dieren getitreerd. Resultaat:

Bij deze dieren was het resultaat dus wel heel mager!
Geen van hen kreeg nog een injectie; maar de sera werden
3 maanden later alle opnieuw getitreerd met de homologe
antigenen. Resultaat:

Conclusie: de caseïne-konijnen reageeren toch niet 200 heel
slecht, mits men 2 injecties geeft en desnoods langer wacht
met het bloed afnemen. In elk geval was de reactie bij deze
3 caseïne-dieren veel slechter dan bij de proeven met caseïne-
colophonium.

Ik richtte nu een nieuwe proef in, waarbij het de bedoeling
was weer het oogenblik te treffen, waarop de precipitinen
juist zouden zijn aan te toonen.

De twee groepen wordt bloed afgenomen, resp. 4 en 3
dagen na de injectie, en alle sera werden getitreerd met de
beide precipitatie-antigenen en met de beide suspensie-anti-
genen (kruisproef). Het resultaat was nihil.

Dadelijk krijgen de dieren een nieuwe, nu grootere injectie
(1 cc. elk). Na 3 dagen wordt weer bloed afgenomen en ge-
titreerd als tevoren met nog 2 normale sera erbij.

P.S. antigeen: oplossing \'/«o S, suspensie Vsoo S.
Cas. antigeen: oplossing \'/»o S, suspensie V««o S.

Het resultaat was een volkomen verrassing. Weliswaar
ging de proef in één opzicht normaal, dat de positieve sera
alle reageeren met het homologe antigeen: de sera D en E
reageeren alleen met paardeserum, het serum B alleen met
caseïne. Maar de verhouding tusschen suspensie- en solpreci-
pitatieproef is totaal zoek 1 Zooals reeds in het vorige hoofd-
stuk werd medegedeeld, zag ik regelmatig bij de sera van
hooger geïmmuniseerde dieren, dat de suspensie met 10 maal
hooger serumverdunningen reageerde. Zoo had serum D
met de suspensie van P.S. den titer Vioo moeten geven; serum
E den titer Vbo 5 serum B met de caseïne-suspensie Vuc -A/Ze

drie blijven ver onder den verwachten titer, en bij twee preci-
piteerende sera is er zelfs in het geheel geen reactie met de
suspensie.

Bij deze bevindingen heb ik mij niet onvoorwaardelijk neer-
gelegd. Konijn B gaf ik nog 2 injecties met 2V2 cc. caseïne S;
konijnen D en E kregen nog 2 injecties van 2V2 cc. paarde-
serum. Een week na de laatste injecties werd opnieuw kruis-
gewijs getitreerd, behalve serum D.

Merkwaardigerwijze heeft de verhouding tusschen precipi-
tatie- en suspensiemethode zich hier nu hersteld, terwijl serum
B hierbij niet eens in precipitatietiter gestegen is. Dit laatste —
herstel der verhouding, terwijl één der titers constant bleef —
zag ik ook in de proeven met caseïne en colophonium; maar
overigens is het verloop hier precies andersom: eerst komt
de precipitatie, en later de suspensiereactie 1

Ik breng in herinnering, dat een serumverdunning Vio nog onspecifieke
uitvlokking geeft met zinkstearaat-suspensies.

Het spreekt vanzelf, dat bij deze proeven de antigenen geheel
op dezelfde wijze en met dezelfde materialen, met de meeste
zorg werden bereid.

Paralleliteit is dus, ook bij het gebruik van zinkstearaat als
suspensiemateriaal, niet onder alle omstandigheden aanwezig.

In de voorgaande hoofdstukken werd een proevenreeks
verricht, waarbij de veranderingen in de precipitatie zijn be-
studeerd, die werden teweeg gebracht door het antigeen aan
suspensies te adsorbeeren. Daarbij werden afwijkingen gecon-
stateerd, zooals verscheidene onderzoekers die bij agglutinatie
hebben gevonden, ter onderscheiding van de precipitatie.

Physische chemie der agglutinatie. Het leek mij wensche-
lijk, deze gegevens aan te vullen met een onderzoek naar den
invloed van zouten op de precipitatie. Voor de agglutinatie
is deze 2de phase van het uitvlokkingsproces {Bordet zie pag. 17)
reeds zeer uitvoerig bestudeerd door Bechhold (35), Neisser
en Friedemann (36), Buxton, Shaffer en Teague (37) en anderen.
Deze onderzoekers hebben gevonden, dat met agglutinine
beladen bacteriën zich ten opzichte van zouten gedragen als
electronegatief geladen (d.i. zure) suspensies. Agglutinine-
bacteriën zijn dan ook zwak electronegatief geladen, d.w.z.
zij hebben de lading aangenomen van het eiwit van het anti-
serum, dat op ze heeft ingewerkt (Shibley) (38). Over de eigen-
lijke werking van de zouten bij agglutinatie, waarover we
vooral door Northrop en de Kruif zijn ingelicht, zal ik niet
uitweiden; de bedoeling is hier alleen den invloed der zouten
bij precipitatie te vergelijken met die bij agglutinatie.

electropositieve — kationen. In de eerste plaats overweegt
de invloed van de valentie der kationen: éénwaardige kationen
als Na vlokken veel minder sterk uit dan 2-waardige als
b.v. Ca; deze op hun beurt werken zwakker dan 3-waardige.
Onder de éénwaardige kationen hebben nog een sprekende
werking de organische en het waterstof (H-)ion, zoomede ionen
van zware metalen (Ag.). Bij het werken met kationen van
zware metalen is nog gebleken, dat zij op eiwitten en or-
ganische suspensies een bijzonder sterke werking uitoefenen,
daar zij met deze irreversibele verbindingen aangaan.

Tegenover de werking der kationen staat die der anionen
geheel op den achtergrond. Regel is, dat bij de besproken
suspensies de anionen juist een verminderde werking vertoonen,
naarmate de valentie toeneemt.

De werking der ionen wordt bepaald met toevoeging van
verschillende zouten, die men kiest naar de ionen, welke men
wil bestudeeren, en uitgedrukt door de minimale hoeveelheid
zout, die uitvlokking veroorzaakt. Indien men b.v. het anion
Cl in de gebruikte zouten heeft, kan men de kationen naar
hun werking rangschikken; evenzoo kan men bij constant
kation een aantal anionen onderzoeken en rangschikken.

Bij de agglutinatie van bacteriën zijn deze zoutinvloeden
door de hierboven genoemde onderzoekers reeds lang nage-
gaan. Bij de precipitatie vindt men over zoutinvloeden daaren-
tegen uiterst weinig. Het meeste wordt nog medegedeeld door
Eisenberg in zijn reeds aangehaald autoreferaat (22), die vond
dat NaCl-oplossingen — zelfs geconcentreerde — geen invloed
hebben op de precipitatie; daarentegen remden MgClj en
MgSO^ deze in sterke mate.

in studie te nemen. Colloidaal opgeloste antigenen (precipitino-
genen) en serumeiwitten, waartoe waarschijnlijk ook de im-
muunprecipitinen te rekenen zijn, zijn hydrophile colloiden,
d.w.z. zij vlokken door neutrale zouten in hooge concentratie
uit, en zijn daarna weer gemakkelijk oplosbaar. Bij de preci-
pitinereactie heeft men evenwel met iets anders te doen : het
precipitaat vlokt bij lage — physiologische — zoutconcentratie
uit, en is dan eerst met bijzondere kunstgrepen (verwarmen,
alkaliën of zuren) weer op te lossen. Mijn vraagstelling was
deze: Gedraagt zich de eiwit-precipitine verbinding als een
suspensie-colloïd, evenals de bacterie-agglutinine verbinding
de eigenschappen van een echte suspensie heeft?

De eenvoudigste vraag, die men zich kan stellen, is de
volgende : heeft de precipitatie, zooals men die gewoon is te
doen, n.1. met gebruik van physiologische zoutsolutie, plaats
met de voor dit doel meest geschikte NaCl-concentratie ?
Deze vraag is niet zonder belang, daar het uitvlokken van
suspensiecolloïden in verdunden vorm, zeer sterk afhankelijk
is van de concentratie van het zout, zooals werd aangetoond
voor mastix (zie pag. 48). In de serologie is het niet zonder
beteekenis om te weten, op welke wijze men het gemakke-
lijkst een gevoelige precipitatie kan krijgen. Hiervoor diende
de volgende, orienteerende proef. Paardeserum werd 200 maal
verdund met oplossingen van zuiver NaCl, en wel in sterkten
van 5 X, 2 X, 1 X, Va X en Vß X de normaaloplossing. Door
deze oplossingen te mengen met gelijke hoeveelheden preci-
piteerend serum, dat 10 maal met gedestilleerd water verdund
was, en met gedest. water en deze antigeen bevattende op-
lossingen verder werd getitreerd, kreeg ik dus een aantal
titraties met verschillende NaCl-hoeveelheden in de menging.
Ter controle werd nog een serie getitreerd met gedestilleerd
water en één met physiologisch NaCl (èn serum èn antigeen).

Correctie spreekt vanzelf dat de proef in dezen vorm
niet zuiver is. Zoowel het antiserum als het paardeserum
bevatten .immers zouten. Ze zijn echter zoo sterk verdund,
dat, zooals blijken zal, deze kleine hoeveelheden zout geen
invloed konden hebben. Het voor de hand liggende middel
dialyse waagde ik niet toe te passen bij deze proeven, daar
hierbij eiwitneerslagen ontstaan, die de aflezing onbetrouw-
baar zouden maken. Dit heeft de agglutinatiemethode voor,
dat men zich van een troebeling van het antiserum niet veel
hoeft aan te trekken.

Conclusies: de sporen zout, die nog in de vloeistoffen aan-
wezig waren, daar de sera niet gedialyseerd werden, zijn niet
voldoende om de precipitatie van het bij Vbo quot;og zwak
positieve serum te bewerkstelligen. Het blijkt dat de physio-
logische NaCl-concentratie vrijwel ligt in de zóne van wat
ik de optimale zoutconcentratie mag noemen. Door het ge-
bruik van meer of minder NaCl neemt de titer niet toe; wèl
krijgt men bij het gebruik van een weinig minder zout iets
grooter neerslagen bij den titer Vso*

De physiologische zoutsolutie, die werd gebruikt, bevatte
0.85% NaCl, hetgeen ongeveer neerkomt op een V7 nor-

Het is opmerkelijk, dat verhooging van het NaCl-gehalte
tot iets meer dan het physiologische, reeds een nadeeligen
invloed heeft.

De volgende proef werd eenigszins anders ingericht. Ik
heb een serum genomen, dat den titer Vioo bad, en dit 25
maal met gedest. water verdund. Van een aantal zouten
werden normale en ^/^q normale oplossingen gemaakt, zoo-
danig dat deze tevens paardeserum in de verdunning 1 :200
bevatten. Met deze stamoplossingen werden serieën buisjes
gevuld en verdunningen gemaakt met paardeserum 1 : 200
in gedestilleerd water. Zoo werden telkens 10 buisjes gevuld
met oplossingen, die varieerden van Vs N. tot V2000 N.,
telkens één serie van één zout, terwijl overal paardeserum
was in de verdunning 1 : 200. Van het Vss verdunde serum
werden telkens gelijke hoeveelheden (1 cc. bij 1 cc.) in de
buisjes gedaan en gemengd; na 24 uur werden de precipi-
taties afgelezen als volgt.

Van de onderste 3 seriën (tabel XXVIII) vallen de sterkere
concentraties weg, wegens gebrekkige oplosbaarheid; daar de
serieën hier ten deele ontbraken, werden bij deze dan ook
niet, als bij de andere zoutseriën, accoladen geplaatst.
Deze accoladen geven voor elk zout weer de buisjes, waarin
de uitvlokkingen het grootst waren {optimale zoutconcentraties).

nemen, dat de vloeistoffen bij deze proef eveneens een weinig
zout, afkomstig van de gebruikte sera, bevatten (minder dan
in de vorige proef!).

Men krijgt hier wel den indruk, dat zeer weinig NaCl
voldoende is voor een positieve proef; de optimale zóne be-
vindt zich bij Vio—V« N., m.a.w. de physiologische zout-
concentratie is juist aan de bovenkant ervan.

Zeer sprekende invloed van de valentie der kationen valt
uit deze tabel af te lezen. Zonder uitzondering reageeren de
zouten met 2-waardige kationen sterker, wat betreft de mini-
male zoutconcentratie die nog werkzaam is; bovendien lossen
ze bij hoogere doses het precipitaat weer spoediger op, al
is dit niet zoo buitengewoon opmerkelijk. Men zal in dit ver-

band de 3-waardige kationen missen: de verklaring is deze,
dat de gebruikte aluminiumzouten in de concentraties V^oo—
VlOOO oogenblikkelijk na menging neerslagen gaven, die niet
werden genoteerd, daar het bleek dat dit onspecifieke reacties
waren.

Controle: dezelfde proef werd geheel overgedaan, maar
zonder toevoeging van P.S. Resultaat; nergens troebeling,
behalve bij zwakke concentraties van aluminiumzouten; deze
werden daarom van de lijst geschrapt.

De onderzochte éénwaardige ionen gedragen zich onderling
geheel zooals het te verwachten is bij electronegatieve sus-
pensiecolloïden : Na en K werken even sterk in (verg. NaCl
en KCl); daarentegen werkt (NHJ Cl iets sterker (NH4-ion).
Het morphinechloride werkt weer iets sterker dan de vorige
drie (organisch ion).

M.a.w. de paardeserum-precipitineverbinding gedraagt zich
tegenover kationen geheel als een electronegatief geladen sus-
pensiecolloïd.

Iets moeilijker zijn de gedragingen der anionen te waar-
deeren. Ter vergelijking geef ik hier een verkorte tabel van
Freundlich, die de minimale concentraties van verschillende
zouten bepaalde, welke het electronegatief geladen suspensie
colloïd arseensulfide deden uitvlokken (in millimolen per liter) :

Het 2-waardige SOi-ion gedroeg zich in mijn proeven als
in de tabel van Freundlich, d.w.z. het werkte minder sterk
dan het 1-waardige Cl-ion. Het 1-waardige NOj-ion gedroeg

zich niet volgens den regel. In plaats van ongeveer gelijk
als het Cl-ion te werken, was er meer van noodig om uit-
vlokking te verkrijgen, en loste het precipitaat in overmaat
weer snel opl Ik merk nog op, dat Bechhold voor typhus-
bacillen met agglutinine gelijke werking van NOg en Cl vond,
evenwel zagen Eisenberg en Volk (39), dat nitraten bij over-
maat sterker remming gaven dan chloriden (eveneens bij
typhusagglutinatie); hetzelfde vonden zij met sulfaten! •

Nog vreemder is het gedrag van kaliumcitraat; het citraat-
ion deed geheel het tegenovergestelde in mijn proeven, daar
het de precipitatie vrij sterk bevorderde!

Met de anionen werden dus afwijkingen gevonden van wat
de regel voor suspensiecolloïden voorschrijft.

Om deze gegevens te completeeren, heb ik nog een aantal
zouten met meerwaardige kationen willen toepassen, waarvan
echter al dadelijk de zware metaal-zouten CuClo en HgClg
benevens CdCL en ZnSO^ afvielen, daar zij al in zeer ver-
dunde oplossingen neerslagen gaven met P.S. Vsoo- Ook het
3-waardige ferri-ion (FeClg) kon om die reden geen toepassing
vinden, de overige zouten werden precies op dezelfde manier
met P.S. Vsoo gelijke hoeveelheden Y25 verdund precipi-
teerend serum toegevoegd. Dit serum was echter een ander
dan het vorige; het werkte sterker (dc titer was n.1. Vsoo)»
zoodat wellicht hieraan moet toegeschreven worden, dat het

Vio

V»

V«

VlOO

Vaoo

V«o

^/lOOO

Viooo

nor-
maal

Zoutcon-
centratie

Ca Cl,. .	±		-1-	-f					±	—
Mn Cl,. .	±	±				-f	-1-
Co Cl,. .	—	±			-1-		4-			±
NlCl, . .	—	—	±		4-	4-	-h	-t-	-f-	-1-

ter contrôle erbij was gevoegd, nu in hoogere concentraties
nog neerslagen gaf.

In deze serieën schijnt Mn iets sterker te werken dan Ca,
Co weer sterker dan Mn en Ni sterker dan Co. Evenwel
bleek, dat de stamoplossing V50 N (met P.S. V200) bij Co Clg
opalescent was geworden, en bij Ni Clg zelfs den volgenden
dag een klein neerslag had gegeven. Daarom werd aan deze
twee zouten verder geen aandacht meer gegeven. Mn Clg
geeft met een normaalserum ^/go geen neerslagen.

Hoe gedragen zich nu kationen van verschillende valentie
naast elkaar hi] de precipitatie-reactie? Het is van belang dit
te weten, daar in de lichaamsvloeistoffen één- en tweewaar-
dige kationen in gemakkelijk aantoonbare hoeveelheid aanwezig
zijn. Eisenberg en Volk, in hun reeds geciteerd onderzoek,
vonden dat verschillende kationen elkaar addeeren, wat be-
treft hun remmende werking, bij overmaat, op de typhus-
agglutinatie. Ik heb de werking van Ca en Mn tegenover
Na nagegaan.

Proef: over een serie van 13 buisjes worden eerst zout-
mengsels (1 cc. per buisje) verdeeld op de volgende wijze:

Afdalende hoeveelheden NaCl-oplossing worden gemengd
met klimmende hoeveelheden CaClj-oplossing. Beide oplos-
singen hebben een sterkte van 0.290 N. en bevatten V200 P-S.
Als nu elk buisje gemengd wordt met 1 cc. door middel
van gedestilleerd water Vbo verdund antiserum, dan is de
zoutconcentratie in ieder buisje geworden 0.H5 N. Dit is
juist ook de moleculaire concentratie van het gebruikte phys.
NaCl ( de gebruikelijke correctie).

In de tabel XXX is voor elk buisje de verhouding der zout-
mengsels opgegeven. Het gebruikte serum was dat van de
eerste proef met verschillende zouten (tabel pag. 77), in
dezelfde concentratie.

Interessant is het, te letten op het buisje IX, waar juist
geen precipitatie meer te zien is. De CaClg-concentratie is
daar 0.7x0.145 = 0.1015 N. of vrijwel Vjo normaal. Dit is de
concentratie, waarbij ons bleek, dat CaClg nog juist precipitatie
gaf; bij een sterkere dosis n.1. V4 N. was er niets meer te
zien (tabel pag. 77). De toevoeging van een weinig NaCl,
n.1. 0.3 X de physiologische concentratie, was reeds voldoende,
in deze serie, om de werking van CaClj Vio N. zoodanig te
versterken, dat er geen precipitatie meer optrad.

Men krijgt hier sterk den indruk, dat NaCl en CaClg elkaar
addeeren in hun werking. Deze proef vertoont dus iets geheel
anders, dan wat in de physiologie bekend staat onder den
naam van balanceerende werking van ionen, waarbij Natrium-
en Calium-ionen eikaars werking schijnen op te heffen. Dit
gegeven is volkomen bevestigd door de verdere proeven
met CaClg cn MnClg.

Proeven met verdunde zoutoplossingen. Ik had opgemerkt,
dat de neerslagen met zouten van 2-waardige kationen, in
de optimale concentraties, zooveel grooter neerslagen gaven
dan de buisjes met phys. NaCl. Ter vergelijking werden sera
getitreerd, waarbij serieën waren genomen, deels met phys.
NaCl, deels met Vioo of V200 N. CaCls resp. MnClg. Ik geef
verkort zulk een titratie weer:

M.a.w. door te titreeren in sterk verdund CaClg (resp.
MnClg) kan men aanmerkelijk veel hoogere titers verkrijgen.

Verder werd een titratie uitgevoerd, waarbij ik NaCl en
MnClg mengde, elk in de concentratie, die juist zich aan de
bovengrens van de optimale bevindt, n.1. phys. NaCl en
Vbo N. MnClg. Het serum werd verdund met phys. NaCl,
het antigeen met MnClg Vbo N., en de twee in gelijke hoe-
veelheden gemengd. In de menging waren dus naast elkaar
MnClg Vioo N. (dat evenals CaClg de titers in de concen-
tratie Vioo N. ongeveer 10-voudig verhoogt) en NaCl in de
halve physiologische concentratie, (dus nu geheel in de opti-
male zóne).

M.a.w. het sterke precipiteerende vermogen van Mn Clj
Vioo N is door de aanwezigheid van NaCl in de halve phy-
siologische concentratie bijna geheel genivelleerd. Ook dit
wijst op een zuiver addeerende werking.

Uit het reeds gezegde zou men kunnen afleiden, dat het
nu een kleinigheid geworden is om de precipitatiemethode
te verbeteren, door n.1. te titreeren met oplossingen van zouten
van 2-waardige kationen. Inderdaad wordt de titer hiermee

sterk verhoogd, maar het doel om in zwak precipiteerende sera
kleine hoeveelheden precipitine aan te toonen, die met phys.
NaCl aan de waarneming ontsnappen, heb ik niet kunnen
bereiken. Dit tengevolge van:

Onspecifieke reacties met CaCl^ en MnCl^, Als men wille-
keurige konijnesera verdunt met deze zouten in de concentraties,
voor optimale precipitatie geschikt (nu dus zonder P.S.), dan ont-
staan precipitaten gewoonlijk tot den titer Vio—\'Vso\' Als nu
de titer van het antiserum heel laag is, dan maakt deze on-
specifieke precipitatie een zuivere waarneming onmogelijk.
Herhaaldelijk werd getracht, door wijziging der concentraties
hierin verbetering te brengen, zonder dat het mij lukte. Boven-
dien kreeg ik den indruk, dat bij een lageren titer de preci-
pitaten met CaClg of MnClg volstrekt niet zooveel meer
overvloedig zijn dan met NaCl; het lijkt alsof het serum
steeds beter met NaCl reageert, des te zwakker het is.

Met verdunde NaCl-oplossingen krijgt men deze onspeci-
fieke precipitaten niet; ook kan men, althans met zwakkere
sera, hiermee geen verhooging van den specifieken precipitatie-
titer bereiken.

Ik heb mij nog afgevraagd, of onspecifieke precipitaten ook
precipitine bevatten. Bij onderzoek van een serum, dat een
titer van Vso («»et phys. NaCl) had, bleek dat er na weg-
centrifiugeeren van zulk een precipitaat met CaClj Yiio N.,
nauwelijks verzwakking van de specifieke precipitatie in het
serum te zien was.

Bij het overzien der in dit proefschrift vereenigde gegevens,
meen ik dat men gerechtigd is de opvatting te verdedigen,
dat tot dusverre door duahstisch gezinde schrijvers te weinig
waarde werd gehecht aan den invloed van physisch-chemische
factoren bij de beoordeeling der mogelijke identiteit van
specifieke precipitinen en agglutininen.

Door colloïdaal opgeloste antigenen, n.l. caseïne en paarde-
serum, te adsorbeeren aan verschillende suspensies, werden
met bacteriesuspensies vergelijkbare antigenen verkregen, die
onder de inwerking van precipiteerende, homologe immuun-
sera uitvlokten. De aldus verkregen reacties gaven niet alleen
voor het oog den indruk van bacterie-agglutinaties, maar
bleken ook eenige typeerende eigenschappen van deze te
vertoonen.

Het toevoegen van suspensies aan colloïdaal opgeloste anti-
genen, om met agglutinaties vergelijkbare reacties te verkrijgen,
werd reeds in 1898 door Ch. Nicolle (3) toegepast. Deze
onderzoeker schijnt hierbij aan de suspensiedeeltjes een geheel
passieve rol te hebben toebedeeld, in de meening dat zij werden
meegesleept door het in de hen omgevende vloeistof ontstane
precipitaat, zulks in navolging van de opvattingen van PaU
tauf over de agglutinatie (pag. 11): hij heeft de methode dan
ook alleen toegepast met antiserum-verdunningen, waarbij
met cultuurfiltraten zonder meer nog precipitatie te zien was.

De noodzaak, dat voorafgaande adsorptie moet plaats vinden
om de typeerende serumtiterverhooging met suspensiemateriaal

te verkrijgen, werd in dit proefschrift bewezen (pag. 43), en
in de onlangs verschenen pubhcatie van Jones (32) eveneens
betoogd.

Het was opmerkeUjk. dat nu de precipiteerende sera met
dergelijke suspensies in hooge verdunningen specifieke uit-
vlokking gaven, terwijl omgekeerd verdunning der suspensies
slechts in beperkte mate kon geschieden, zonder de reactie
te storen. Door deze resultaten hebben de in hoofdstuk I,
sub le en 2e (pag. 14, 15) genoemde argumenten der dualisten
veel van hun waarde verloren.

Bij deze proeven werd aandacht geschonken aan de wensche-
lijkheid, om voor specifieke reacties optimale concentraties der
antigenen te bepalen en aan te wenden.

Verder bleek, dat niet onder alle omstandigheden de be-
schreven sol- en suspensie-precipitaties parallel gingen, nóch
in het verloop van een immuniseeringsproces, noch onder
invloed van verhitting der antisera (hoofdstuk IV). Hiermee
verloren wederom argumenten der dualisten (hoofdstuk I,
sub 3e, pag. 15) goeddeels hun overtuigende kracht, daar
ook bij deze proeven slechts van precipitinen sprake kon zijn.

Deze onderzoekingen werden aangevuld met proeven over
den invloed van zouten op de precipitatie van paardeserum-
antigeen. Het bleek, dat hier de invloed der kationen over-
wegend was, evenals reeds lang was vastgesteld voor het
agglutinatie-proces. Tevens was er gelegenheid te wijzen op
de beteekenis van onspecifieke precipitaties, zoowel in phy-
siologische zoutsolutie (pag. 25), als in verdunde oplossingen
van zouten met 2-waardige kationen (pag. 83).

Ofschoon deze proeven, naar mijn meening, het unitarische
standpunt versterken, is het noodig erop te wijzen, dat vaak
de omstandigheden ingewikkelder zijn. dan bij de hier be-
schreven proeven. Het uitgangspunt hierbij was, dat precipi-
tinen en agglutininen zouden inwerken op hetzelfde antigeen.

maar resp. in colloïdaal opgclosten — cultuurflltraat of bacterie-
extract en gesuspendeerden — bacteriesuspensie — vorm.
Nu zijn gegevens bekend, die ervoor pleiten, dat antisera niet
altijd met hetzelfde antigeen — maar in verschillenden vorm —
reageeren.

Zoo vond Demees (40), dat gezuiverde haemoglobine, bij
konijnen ingespoten, wèl aanleiding geeft tot het vormen van
een precipitine hiertegen, maar niet van haemolysine, dat
zooals bekend ontstaat na injectie van erythrocyten of stromata.
Verschillen vond ook Klein (41) tusschen erythrocyten-extract
en stromata als antigenen, o.a. ten opzichte van de vorming
van erythroprecipitine en -agglutinine. De afwijkingen waren
hier evenwel slechts relatief. In dezelfde richting zouden de
proeven van Harrison (42) wellicht kunnen wijzen, waarbij de
buitenste laag van bacteriën werd opgelost met pyocyanase,
tengevolge waarvan zij met immuunserum niet meer agglu-
tineerden.

Deze proeven bewijzen evenwel niet anders, dan dat de
buitenste laag van cellen in sommige gevallen zooveel van
den celinhoud kan afwijken in chemische samenstelling, dat
deze bestanddeelen als verschillende antigenen ook verschil-
lende antistoffen geven. Heel sprekend is het voorbeeld, door
Demees geconstateerd, van zuivere haemoglobine en stromata
Doch in gevallen waar dergelijke verschillen niet op den
voorgrond treden, is er ten aanzien van precipitinen en agglu-
tininen alle reden voor de paradox „er zijn juist zooveel
antistoffen als er methoden zijn om ze aan te toonenquot;.

Overgenomen uit: H. G. Wells. Die Chemischen Anschauungen über
Immunitätsvorgänge.

6.nbsp;A. Radzievsky. Zeitschr. f. Hygiene u. Infektionskrankheiten Bd. 34, p. 369.

9.nbsp;R. Kraus en C. v. Pirquet. Centralblatt f. Bakteriologie O. Bd. 32, p. 60.

13.nbsp;iS. Amiradzibien Kaczynski. Zeitschrift f. Immunitätsforschung, Bd.6, p.694.

20.nbsp;Landsteiner en Uhlirz. Centralblatt f. Bakteriologie, O. Bd. 40, p. 265.

22.nbsp;Ph. Eisenberg. Centralblatt f. Bakteriologie. Bd. 31, p. 773 (autoreferaat).

24.nbsp;Hektoen. The Journal of the American Medical Association 1918,70, p. 1273

26.nbsp;K. Landsteiner en St Welecki, Zeitschrift f. Immunitätsforschung, Bd. 1,

30.nbsp;K. Landsteiner en Sfankovic. Centralblatt f. Bakteriologie, O. Bd. 41, p. 108.

34.nbsp;Pick. Hofmeisters Beiträge z. Chemie. Physik u. Pathologie. Bd. 1. p. 351.

39.nbsp;P. Eisenberg en R. Volk. Zeitschrift f. Hygiene u. Infektionskrankheiten

Historisch overzicht en stand van het vraagstuk ... 11
Theorie van Paltauf-Nicolle. Verschillen tusschen precipitatie cn
agglutinatie. Theorie van Bordet.

Eerste gedeelte: precipitatietechnlek. Bereiding van caseïne.
Techniek der precipitatie-reactie. Natroebelen der sera. Toepassing
mengmethode.

Tweede gedeelte: adsorptietechniek. Suspensie- en sol-
precipitatie. Adsorptie van eiwitten aan suspensies. Adsorptie van
caseïne. Adsorptie van paardeserumeiwit.

Eerste gedeelte: precipitatie van colloïdaal opgelost
antigecn. Chemische kenmerken der preclpltatle-reactie. Antigene
eigenschappen van caseïne en paardeserum. BepaUng optimale anti-
geen-concentratie.

Tweede gedeelte: precipitatie van gesuspendeerd an-
t ig een. Caseïne gebonden aan kaoline, proeven. Proeven met
harsen. Caseïne-mastlx en caseïne-colophonium. Typhus-colophonium.
Proeven met paardeserum. Zlnkstearaat.

Ongelijktijdig optreden en verdwijnen van sol- en sus-
pensie-precipitatie..................

Vergelijking caseïne en caseïne-colophonium. Verhitting van anti-
caseïnesera. Proeven met zinkstearaat.

Enkele physisch-chemische gegevens over precipitatie . 72
Physische chemie der agglutinatie. Invloed van zouten op de preci-
pitatie. Gelijktijdige werking van verschillende kationen. Proeven
met verdunde zoutoplossingen. Onspecifieke reacties.

Tegenover een enkelvoudig antigeen wordt in elk afzon-
derlijk geval slechts één enkele antistof gevormd.

Het gebruik van haemolytische of opalescente patiënten-
sera voor de reactie van Wassermann is af te keuren.

Besmetverklaring van havens wegens pest moet geschieden
dadelijk, nadat aldaar rattenpest is geconstateerd.

De difFerentieel-diagnose tusschen pokken en waterpokken
zal in de practijk in Nederland moeten worden gesteld op
de verspreiding der eruptie.

Het ontstaan van encephalitis na vaccinatie met koepok-
stof, wordt door den leeftijd van het geënte kind beinvloed.

Niet alle deficientieziekten kunnen worden verklaard, alléén
door gebrek aan vitaminen.

Bij het gonorrhoisch prostata-absces grijpe men chirurgisch
in, langs perinealen weg.

Het zelden voorkomen van dementia paralytica bij Inlanders
kan een oorzaak vinden in het feit, dat malaria in sterke
mate endemisch heerscht in Indië.

Influenza en verkoudheid zijn aandoeningen, uit wier epi-
demiologische verschillen geen afwijkingen ter zake van haar
aetiologie kunnen worden afgeleid.

T.: .\'-Ç,\'	A\';	A\'-;; • -•• •
\' - ■ quot;l

	quot;... \'	..-y**•«\' gt; - - •
	■ il\':

Serumtiter	V.o	V.OO	V.00	v.o.	VïOOO	c.
Serie I.........		4-
Serie 11.........		—	—	-	—	—

Mastix, toegevoegde concentraUe	0.4 0/0	0.04 0/0	0.004 0/0
In NaCl 150/0. na V.u. In NaCl 150/0. na 4 u. In NaCl 150/0. na24u.	troebel, vlokking troebel, vlokking troebel, vlokking	sterk opalescent sterk opalescent sterk opalescent	-
In NaCl 50/0. na V: u. In NaCl 50/0. na 4 u. In Naa 50/0. na 24 u.	uitgevl. helder uitgevl. helder uitgevl. helder	opalescent uitgevl. helder uitgevl. helder	licht opalescent
In NaCl 20/0. na Vi u. In NaCl 20/0. na 4 u. In NaCl 20/0, na 24 u.	uitgevl. helder uitgevl. helder uitgevl. helder

	I	II	III	IV	V	VI	Contr.
Caseïne Viio S.......	0.1	0.2	0.5	1	2	3	0 cc.
Mastix 0.32 O/o fin aq. dest.) .	1	1	1	1	1	1	1 cc.
2 X phys. NaCl (= 1.70/0). .	1	1	1	1	1	1	1 cc.
Phys. NaCl.......	7.9	7.8	7.5	7	6	5	8 cc.
Verhouding .... mastix	V.00	V.0	V.0	Vio	V.

Serum D titers	V,o	V50	VlOO	v.00	Vsoo	VlO.0	C
P. S. stearaat onverdund . .						_
P. 8. stearaat A X verdund .						—
P. S. stearaat 20 X verdund .

Precipitaat verkregen met Cas.	I	II	Ill	IV	V	VI
V.oS	V»ooS	Vm S	V«oo S	VsooS	\'AoooS
Vloeistof reageert met antiserum					__
Cas. V400 S	—
phys. NaCl	—	—	—	—	—	—

Precipitaat verkregen met Cas.	I	II	III	IV	V	VI
V.o S	V.00 s	V«o s	v.00 S	Vsoo S	Vi 000 S
Vloeistof reageert met antiserum					___
Cas. V.00 S
phys. NaCl	—	—	—		—	—

Antigcen P.S.	O 1	m rJ	O m	8	O UI CS	8 in		8 in ri .—1	iK lt;
Antiserum titer Vw						—	—	_
.. v»	—	—	—	—	±	±	—		—
.. Vio	—	—	—		±	±	±	±	—
.. V.	±	±					±	±	±

Serum konijn E titers	V.	V.	Vio
P.S. Vj5ogt; onverdund.........				-H-
P.S. Vjso. 4X verdund . . ......		-H-
F. S. Vito. 20 X verdund.......		±	±	—
TABEL IX.
Serumtiters	V.o	%0	VlOO	c
P. S.-zinkstearaat, onverdund......
P. S.-zinkstearaat, 4 X verdund.....
P. S.-zinkstearaat, 20 X verdund.....	—	■—	—

Serum titers normaal serum	V.o	V.o	Vi.o	V.00	c.
P.S.-zinkstearaat 20 X ver- dund .........	ophel- dering	ophel- dering	-	—	—

Titers van de sera	V:	\'A	vlo	V.o	Vso	vloo	C. phys. NaCl
I met caseïne (Vjoo S.) .		___	___	-
I met cas. (Visoo S.) — col.							—
II met caseïne (Vjoo S.) .	—	—	—	—	—	—	—
II mctcas.(vijoos.) —col.							—

Titers	V.	v5	Vlo	V«o	V.0	Vioo	V.00	V500	vlooo	c
I met caseïne .						___				_
I met cas .-col. .								—	—	—
II met caseïne .					—	--
II met cas.-col. .								—	•—

Serumtiters	V.	v»	Vlo	V20	V«0	v.00	V,CO	V«00	VlOÜO	c.
I met caseïne. .						__
I met cas.\'col. .								—	—
II met caseïne. .					—
II met cas.-col. .									--

Serumtiter	V.	Va	Vio	v.0	V.0	V10«	v.00	Vtoo	Viooo	c.
II met caseine. .	-f-			-h	.
II met cas.-col. .								—	—	—

Serumtiter	V2	V.	Vlo	V20	Vbo	Vioo	V200	V.00	VlOOO	c.
II met caseïne . . II met cas.-col. .										—

Serumtiters	V.	Vs	Vlo	V:o	c.
	f Konijn 7.....		±	±
P.S.	quot; 8.....		±	±
	l 9.....	±	±	±
	f quot; 10.....	-H-		-H-		_
Caseïne	quot; H.....
	l .. 12.....				±

Buisje	I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII	IX	X	XI	XII	XIII
NaCl 0.290 N.	1	0.95	0.9	0.8	0.7	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	0.05	0
CaCl, 0.290 N.	0	0.05	0.1	0.2	0.3	0.4	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	0.95	1
Met ser. Vjq in aq.dest.

Titer verhit serum	V»	Va	Vi.	v.0	Vso	Vioo	Vsoo	Vsoo	Viooo	c.
I met caseïne. . . .	...					___
I met cas.-col. . . .
II met caseïne. . . .			.—		—	—
II met cas.-col. . . .									—

Titer verhit serum	V.	V.	vlo	V«	Veo	Vioo	v:«o	V»o	vlooo	c.
I met caseïne. . . .
I met cas.-col. . . .								—	—
II met caseïne. . . .				—		—
II met cas.-col. . . .								■—	—

Titers der sera	Precipitatie	Suspensie
V:	V,	Vio	C.	VïO	v40	Vioo	C.
Caseme-konijn A met P.S.
B id.	—	—	—		—	—	—
C id.	—		—		—	—	—
Serum-Konijn D id.						--
E id.			—		—	—	—
F id.	—	—	—		—	—	—
Norm. ser. 1 id.	—	—	—		—	—	—
Norm. ser. A. 54 id.	--	—			—	—	—
Caseine-konijn A met Cas.
B id.		—	—		—	—
C id.	—	—	—		—	—	—
Serum-konljn D id. E id. .. F id.	—	—	—		—	—	—
__		—			__
Norm. ser. 1 id.	--	—	—		—	—	—
Norm. ser. A 54 id.		—	—		—\'	—	—

Serumtiters	V.0	Vbo	Vl.0	v.00	v.00	vloco	c.
D met P.S.
D met P.S. suspensie						—	—

Serumtiters		Vao	Vioo	v,„„	Vsoo	Viooo
Met P.S. V„o. CaCh Viio N.				±	±	—

Serumtiters	V.	Vio	V,„
I Serum met phys. NaCI getitreerd.......			±
II Serum met NaCl—MnClj getitreerd......			±