ÜBER DIE EIWEISSLÖSENDEN
ENZYME IM MAGENSAFTE VON

ASTACUS

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OSAMU SHINODA

bibliotheek der

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ÜBER DIE EIWEISSLÖSENDEN ENZyME
IM MAGENSAFTE VON ASTACUS

UNIVERSITEITSBIBLIOTHEEK UTRECHT

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OBER DIE EIWEISSLÖSENDEN ENZyME
IM MAGENSAFTE VON ASTACUS

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT,
OP GEZAG VAN DEN RECTOR MANIFICUS
DR. B. J. H. OVINK, HOOGLEERAAR IN DE
FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJSBE-
GEERTE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE BE-
DENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS -
EN NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN OP
MAANDAG 30 APRIL 1928, DES NAMIDDAGS
DRIE UUR, DOOR

OSAMU SHINODA

GEBOREN TE OSAKA

verlagsbuchhandlung julius springer

in berlin ■ 1928

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AAN MIJNE MOEDER

VOORWOORD

Bij het eindigen van mijn studietijd is het mij aangenaam mijn
dank te kunnen betuigen aan allen, die mij in mijn studietijd geleid
en voortgeholpen hebben.

Hooggeleerde JORDAN, hooggeachte Promotor. De tijd, dien ik
op Uw laboratorium onder Uwe leiding mocht doorbrengen, zal mij
altijd in gedachten blijven. Ik dank U voor het vele, dat ik van
U geleerd heb en voor de hulp, die ik bij mijn promotie van U
mocht ondervinden. De vriendelijkheid, waarmede zoowel Gij als ook
Mevrouw JORDAN mij op allerlei wijze zijt tegemoet gekomen, vormt
voor mij een der schoonste herinneringen aan mijn Europeesche reis.

Hooggeleerde NIERSTRASZ. Voor de gastvrijheid, waarmede Gij
mij, niet alleen in Uw laboratorium, maar ook in Uw huiselijken
kring hebt willen ontvangen, zeg ik U en Mevrouw NIERSTRASZ
mijn hartelijken dank.

Zeergeleerde HIRSCH, ook U dank ik voor Uwe goede raadgevingen
en voor do welwillendheid, waarmee Gij mij met de resultaten van
Uwe nog niet gepubliceerde onderzoekingen in kennis hebt gesteld.
De dagen in Uw gastvrij huis doorgebracht, zal ik nimmer vergoten.
Ontvang ook daarvoor, samen met Mevrouw HIRSCH bij dezen mijn
bewijs van groote erkentelijkheid.

Zeergeleerde SCHUURMANS STEKHOVEN. Ik dank U, dat Gij
mij bij het samenstellen van mijn proefschrift zeer behulpzaam zijt
geweest.

Zeergeleerde VONK. Ik ben er U zeer dankbaar voor, dat Gij
mij ten allen tijde met raad en daad hebt willen terzijde staan.

Tenslotte wil ik niet nalaten ook do ROCKEFELLER International
Education Board dank to zeggen voor haar finantiëelo hulp, dio hot
mij mogelijk maakte dit proefschrift to bewerken.

Die älteste Frage, welche die vergleichende Physiologie der Ver-
dauung beherrscht hat, ist diejenige, nach der Analogie zwischen den
Proteasen der Säugetiere und denjenigen der Wirbellosen. In der
älteren Literatur stellte man sich die Frage, ob die eiweißverdauenden
Enzyme, die man in den verschiedenen Säften der wirbellosen Tiere
findet, mit dem Pepsin oder dem Trypsin der Wirbeltiere vergleichbar
sei. Damals waren das die einzigen Proteasen, die man bei den Wirbel-
tieren kannte: das Erepsin war noch nicht entdeckt worden \\md der
Unterschied zwischen aktiviertem und nichtaktiviertem Trypsin un-
bekannt. Die beiden Begriffe Pepsin und Trypsin waren für die ver-
gleichende Physiologie beinahe ausschließlich durch die Reaktion defi-
niert, bei welcher sie arbeiten: Pepsin bei saurer, Trji^sin bei „alkali-
scherquot; Reaktion. Beide Enzyme waren außerdem dadurch charakteri-
siert, daß sie einander zerstören. Bei einer bestimmten Reaktion in
lt;ler Mischung beider Enzyme behauptet sich nur dasjenige, für welches
die betreffende Reaktion günstig ist. Später wurde die Definition etwas
genaiier. Ohne besondere technische Hilfsmittel gelang es, bei der
tryptischeu Verdauung bestimmte kristallinische Produkte zu er-
halten, die man als Leucin und Tyrosin erkannte; während durch eine
einfache Reaktion mit Bromwasser ein Körper in den Verdauungs-
produkten charakterisiert wurde, der später als die Aminosäure Tryp-
tophan identifiziert werden konnte. Mit anderen Worten, es fanden
sich bei der tryptischen Verdauung freie Aminosäuren, die bei der
peptischen Verdauung nicht auftraten, wenn man wenigstens das Pepsin
in reinem Zustande gebrauchte.

Die ersten Untersueher auf dem Gebiete der Enzyme wirbelloser
Tiere beschränkten sich völlig auf den Nachweis der Reaktion. Von
einzelnen Forschern wurde ausdrücklich die Behauptung aufgestellt,
daß, wenn der Magensaft eines Tieres auf Lakmus sauer reagiere, man

2. f. vergl. Physiologie Bd. 7.nbsp;22

von einem pepsinartigen Enzym reden müsse, während, sobald das
Lakmuspapier blau wird, ein tryptisches Enzym gegeben sei. Gegen
diese allzu oberflächliche Charakterisierung der Enzymarten hat Jor-
dan (8) Front gemacht.

Wenn man auch damals nicht über Mittel verfügte, um die Reaktion
auf genauere Weise festzustellen, so wußte man doch schon, daß Lak-
mus keineswegs seinen Umschlag nach rot auf freie Säuren beschränkt,
sondern schon etwa durch die Anwesenheit saurer Salze in geringen
Mengen gerötet wdrd. So weit man damals wußte, kam Pepsin nur in
Gegenwart größerer Menge freier Mineralsäure vor: Seine Wirkung, so
sagte man, beschränkt sich vollkommen auf die Zusammenarbeit mit
freier Säure, während von Trypsin bekannt war, daß es zwar schneller
bei alkalischer Reaktion arbeite, daß es aber auch bei neutraler Reaktion
(auf Lakmus) seine Wirkung nicht einstelle. Ja, eine schwachsaure
Reaktion auf Lakmus schloß Trjrpsinwirkung nicht völlig aus. Daher
erwies sich Lakmus als Indikator für die Wirkung der Proteasen in
einer der beiden Formen als unbrauchbar. Andere Indikatoren, wie
Kongorot, Lakmoid usw. wurden schon damals in die vergleichende
Untersuchung eingeführt.

Von diesem Standpunkte aus hatte Jordan (7) im Jahre 1904 die
Protease aus dem „Magensaftquot; des Flußkrebses untersucht. Er kam
damals zu den folgenden Ergebnissen: Im Kaumagen von Astacus be-
findet sich ein Saft, auch während des Hungers, den man sich leicht
dadurch verschaffen kann, daß man unter den Mandibeln eine dünn
ausgezogene Glasröhre in den Magen einführt. Der Saft steigt dann
sofort in das Rohr. Wir nennen ihn Magensaft, obwohl er nicht durch
die chitinisierten Wände des Magens abgesondert wird, sondern aus den
zahlreichen Blinddärmen stammt, zu denen der Mitteldarm dieser Tiero
umgestaltet ist. Diese Blinddärme sind es, die man früher „Leberquot;
oder ,,Hepatopankreasquot; nannte.

Der Magensaft hat die folgenden Eigenschaften: Er ist eiweißreich,
gelb bis braun, Zusatz ganz geringer Menge Säure verursachen einen
feinflockigen Niederschlag des Eiweißes, welches in dem Saft aufgelöst
ist. Das Eiweiß dürfte ein Globulin sein.

Die Reaktion des Magensaftes ist schwach sauer auf Lakmus, so
schwach, daß es sich nicht um freie Säure, wie sie im Magen der Säuge-
tiere vorkommt, handeln kann. Kongorot Avird nicht gebläut, Guenz-
BURGs Reagenz erwies sich dem Safte gegenüber als indifferent. Tinktura
Cochinellae wird vom Saft blaurot, rotes Lakomoidpapier blau gefärbt.

Damals schloß Jordan, daß der Magensaft vom Flußkrebs ein freies
Alkali enthält, neben welchem sich ein saures Salz befinde, Auffassungen,
denen heute keine Bedeutung mehr zukommt. Jedenfalls widerlegte
die Feststellung die Meinung, als müsse die Protease des Saftes ein

pepsinartiges Enzym sein. Weiterhin wurde die Meinung, daß Pepsin
nicht in Frage kommt, gestützt durch die Erscheinungen, welche man bei
der Eiweißverdauung beobachten konnte. Hoppe-Seyleb (6) sagte
auf Seite 397 seiner Arbeit: „Fibrinflocken werden in kurzer Zeit in der
Flüssigkeit bei gewöhnheher Temperatur, ohne Quellung bis auf geringen
Rückstand gelöst, bei 400 geschieht dieses in wenigen Minuten. Salzsäure
in geringen Spuren verlangsamt die Verdauung sofort. Ein Tropfen
Salzsäure von 2% sistiert sie. Das Filtrat ist stets wirkungslos. Löst
man den Niederschlag in Salzsäure von 0,1% wieder auf, so zeigt sich
diese Lösung auch unwirksam. Dagegen gibt der Niederschlag eine
vollkommen wirksame Lösung, wenn man ihn in verdünntem Alkali
auflöst.quot; Als Produkte der Eiweiß Verdauung durch den Saft vom
Flußkrebs hatte man die folgenden gefunden: Mehr als 1 ccm Krebssaft
wurde mit 50 ccm Chloroformwasser verdünnt und dieser Flüssigkeit
eine gewisse Menge Fibrin bei 30—400 zugesetzt. Nach 12 Stunden war
alles gelöst. Die klare, schwarzgelbe Flüssigkeit gab bei Zusatz ver-
dünnter Essigsäure einen ziemlich feinflockigen Niederschlag. Das
Filtrat trübte sich beim Kochen neuerdings, worauf abermals filtriert
wurde. Das klare Filtrat ergab deutlich Biuretreaktion mit roter Fär-
bung (Albumosen). Nach vollkommenem Aussalzen der Flüssigkeit
fällt die Biuretreaktion wieder positiv aus, so daß Peptone vorhanden
sein müssen. Läßt man den Saft längere Zeit einwirken, z. B. drei Tage,
dann tritt bei Zusatz von Essigsäure keine merkliche Trübung mehr ein
und auch beim Kochen war die Eiweißfällung sehr viel geringer, als
nach kurzer Verdauungszeit. Nunmehr gab eine Probe des klaren Fil-
trats sehr deutliche Tryptophanreaktionen. Beim Eindampfen der
neutralisierten Eiweißflüssigkeit scheiden sich aus dem braunen Sirup
massenhafte Leucinkugeln und Tyrosindrusen aus. Aus allen diesen
Ergebnissen hatte Jordan geschlossen, daß der Magensaft des Fluß-
krebses eine tryptische Protease enthielte. Die ältere Behauptung
KnuicENBERGs (10), (laß der Saft von Ästacna und Homarua gleichzeitig
Pepsin und Trypsin enthält, meinte Jordan widerlegen zu können.
Krukenberq hatte mit Extrakten aus der Mitteldarmdrüse gearbeitet
und hatte auch saure Extrakte der Drüse wirksam gefunden. Jordan
hatte dagegen gefunden, daß saure Extrakte aus der Drüse nicht wirk-
samer sind, als die gleiche Säure, ohne daß man damit zuer.st eine Drüse
extrahiert hat. Das galt für beide genannte Ivrustazeenarten.

Auch bei vielen anderen wirbellosen Tieren fördert dio genannte
Methodik analoge Erscheinungen zutage. Sehr überzeugend waren die
Resultate verschiedener Untersucher, wir nennen hauptsächlich Niren-
stein (13), bei Paramaecium. Wenn diese Tiere Nahrung hi ihre Vakuolen
aufgenommen haben, dann läßt sich durch Hinzufügung von Farbstoff-
indikatoren zur Nahrung ausgesprochen saure Reaktion in der Vakuole

22*

nachweisen. Allein, solange diese saure Reaktion herrscht, findet keine
Verdauung in der Vakuole statt. Erst, wenn sie verschwindet und alka-
lischer Reaktion Platz macht, setzt die Verdauung ein. Die saure Re-
aktion wird in Zusammenhang gebracht mit der Nahrung dieser Bak-
terienfresser und man meint, daß die Säure bei der Abtötung der Bak-
terien eine Rolle spielt; das Enzym aber, welches in der Vakuole wirkt,
ist nicht imstande bei saurer Reaktion zu arbeiten. Da man bei den
Wirbellosen nirgends mit den damals zur Verfügung stehenden Mitteln
ein pepsinartiges Ferment fand, so schien es, als sei Pepsin ein be-
sonderer Besitz der Wirbeltiere, als sei vielleicht das Pepsin ein ,,An-
passungsproduktquot; an die saure Reaktion im Magen der Wirbeltiere.
Diese kann man vergleichen mit der sauren Reaktion in der Vakuole
von Paramaecium, allein mit dem Unterschiede, daß die saure ,,anti-
septischequot; Periode, durch den Besitz dieses eigentümlichen Vorenzyms,
dem Verdauungsprozeß nicht verloren gehe. Denn Pepsin sei nur eine
Art Vorenzym, welches das Eiweiß zwar angreift, aber seine Spaltung
nicht vollendet.

Die Tatsache, daß Pepsin das Eiweißmolekül nicht bis zur vollstän-
digen Befreiung der Aminosäuren spaltet, wurde erst einwandfrei an-
erkannt, als man mit hinlänglich gesäuberten Pepsinpräparaten ar-
beitete. Unsaubere Magenextrakte können Erepsin enthalten. Am zu-
verlässigsten erwies sich bekannthch Magenfistelsaft. Es stand also
bei den Säugetieren eine Vielheit von Enzymen gegenüber jener ver-
muteten Einheit bei den Wirbellosen.

Mittlerweile war das Erepsin entdeckt worden, und gleichzeitig
ergab sich die merkwürdige Tatsache, daß bei den Säugetieren die
letzte Hand an die Spaltung der Eiweißkörper sowohl als der Kohlen-
hydrate durch Sekrete des eigentlichen Mitteldarmes gelegt wird. Weder
der Magen, noch das Pankreas bereiten praktisch diejenigen Enzyme,
welche die genannten Nahrungsmittel in resorbierbaren Zustand
spalten. Der Darm der Wirbeltiere läßt nur Monosaccharide hin-
durch. Und wenn auch die Resorption sich keineswegs auf Amino-
säuren zu beschränken braucht, praktisch werden durch den Darm tiur
Aminosäuren in das Blut hindurchgelassen. Diese Umstände schienen
ein Licht auf die Bedeutung der Enzymketten, wie sie bei den Wirbel-
tieren vorkommen, zu werfen, man mußte zwischen Vorverdauung und
definitiver Verdauung unterscheiden. Erstere geschieht in großen Mengen
zugleich, im Magen und im Darm (Pepsin, Trypsin, Amylase), während
letztere durch den Umstand, daß die kleinen Darmdrüsen über die ganze
Länge des Darmes verteilt sind, nur langsam und gleichmäßig über die
Darmlänge verteilt, vor sich geht. Es ist leicht einzusehen, daß auf
diese Weise der Organismus vor Überschwemmung mit den Verdau-
ungsprodukten beider genannter Nahrungskörpergruppen beschützt ist.

Die Auffassung, die wir einleitend kurz skizziert haben, wurde durch
die Untersuchungen der WiLLSTÄTTERschen Schule schwer erschüttert.

Während man bis dahin in dem Besitz einer Vielheit von Proteasen
bei den Wirbeltieren lediglich den Ausdruck einer Art Arbeitsteilung
gesehen hat, d. h. eine Arbeitsteilung unter den verschiedenen Teil-
strecken des Magendarmkanals, so ergab sich neuerdings auch eine
spezifisch chemische Bedeutung der Proteasen des Wirbeltieres.

Bekanntlich fußt die neue Enzymatologie zum großen Teil auf den
Arbeiten von R. Willstätter und seinen Schülern. Die Methode, die
unsere Auffassung über die Enzyme umzugestalten berufen ist, strebt
eine Trennung der einzelnen Enzyme voneinander an, durch fraktionierte
und selektive Adsorption. Durch diese Methoden gelang es, wenn auch
zunächst keine vollkommene IndividuaUsierung der einzelnen Enzyme
zu erlangen, so doch mit dermaßen gereinigten Enzymen zu arbeiten,
daß man den Wirkungsbereich des einzelnen Enzyms viel strenger
umschreiben kann, als das bis dahin möglich war. In Wirklichkeit
liefert der Organismus z. B. im Pankreas keineswegs einheitliches
Trypsin, sondern auch das Pankreas enthält Erepsin, daher die Not-
wendigkeit, das Tr3rpsin durch die genannte Methode zu isolieren.
Mit diesen gereinigten Enzymen gelang es E. Waldschmidt-Leitz, eine
genaue Klassifikation der Wirbeltierproteasen aufzustellen. Er unter-
scheidet vier Proteasen, nämlich Erepsin, Trypsin-Enterokinase (akti-
viertes Trypsin), nichtaktiviertes Trypsin, endlich Pepsin.

Erepsin wirkt in alkalischem Milieu vornehmlich auf niedere Poly-
peptide und spaltet sie zur Aminosäure. Allerdings vermag Erepsin auch
wirkliches Pepton (d. h. durch langdauernde Einwirkung von Pepsin aus
dem Eiweiß enstandes Pepton) zu spalten. Aber die eigentliche Wirkung
des Erepsins dürfte doch die Lösung von Dipeptidbindungen sein.

Trypsin im Zusammenwirken mit bestimmten Mengen von Entero-
kinase greift natives Eiweiß an, und spaltet es so, daß einzelne Amino-
säuren, wie Leucin, Tyrosin und Tryptophan frei werden. Viele Dipep-
tide vermag es aber nicht zu spalten.

Unaktiviertes Trypsin spaltet Pepton, aber kein natives Eiweiß,
während Pepsin natives Eiweiß spaltet, aber in seiner Wirkung nicht
weiter geht, als bis zur Bildung von Pepton.

Waldschmidt-Leitz ist der Meinung, daß diese vier Enzyme ver-
schiedene Funktion haben. Wenn man mit modernen Titriermethoden,
z. B. mit Alkoholtitration, die Menge der Aminosäuregruppen, die als
Produkte der verschiedenen Enzyme auftreten, feststellt, so zeigt es sich,
daß bei der Wirkung aller vier Enzyme Aminogruppen frei werden und
daß der den einzelnen Enzymen entsprechende Zuwachs im Verhältnis
ganzer Zahlen zueinander steht, gleichgültig in welcher Reihenfolge
man die Enzyme einwirken läßt. Daher schließt Waldscimidt-Leitz,

daß keines der Enzyme durch eines der drei anderen ersetzt werden
kann, jedes habe eine spezifische Aufgabe.

Endlich äußert Waldschmidt-Leitz die Meinung, daß die vier
Enzyme je einer Art der chemischen Bindung, durch welche die ver-
schiedenen Aminosäuren miteinander zum Eiweißmolekül verbunden
sind, entsprechen. Gegenüber der Auffassung verschiedener Forscher,
z.B. Abderhalden, behauptet er, daß wir es in keinem Falle mit einer
desaggregierenden Wirkung eines Enzyms zu tun haben; denn (ab-
gesehen von den oben wiedergegebenen Argumenten) schon bei der
Pepsinwirkung treten saure und basische Gruppen im Verhältnis von
1:1 auf. Dies hat zur Voraussetzung, daß einzelne Aminosäuren ab-
gespalten werden, was bei einer Desaggregierung nicht der Fall sein
würde. Der weitere Schluß aus diesem Verhalten ist der, daß das Ei-
weißmolekül vier verschiedenartige Bindungen enthält, von denen jede
so spezifisch ist, daß es eines besonderen Enzyms bedarf, um sie zu
lösen. Dabei ist es natürlich gleichgültig, ob derartige Enzyme topo-
graphisch voneinander getrennt sind (Pepsin und die übrigen) oder
miteinander gemischt wirken (Trypsin und Erepsin).

Aus diesen Tatsachen ergibt sich für die vergleichende Physiologie
eine vollkommen neue Problemstellung. Solange man sich noch voll-
kommen auf die Feststellung des Substrates, der Reaktion auf einige
wenige Indikatoren und das Auftreten einiger weniger Produkte be-
schränkte, konnte man noch von einer einheitlichen Protease im Safte
etwa des Krebses reden. Wie ist das nun mit der heutigen Methodik?
Wenn Waldschmidt-Leitz recht hat, so ist die spezifische Form der
Enzymwirkung durch spezifische Eigenschaften des Eiweiß gegeben
und nicht durch die Eigenart des Tieres. Daher muß auch der Magensaft
eines In vertebraten nicht ein einheitliches „Urtrypsinquot;, sondern ein
3—4faches Enzymgemisch enthalten.

Ich habe mir nun zur Aufgabe gestellt, diese Dinge beim Flußkrebs
zu untersuchen, mußte mir aber unmittelbar sagen, daß ich nur einen
Teil der neueren Methoden auf diese Analyse anzuwenden imstande
sei. Es hätte auf der Hand gelegen, mit fraktionierter oder selektiver
Adsorption eine Trennung der verschiedenen Proteasen im Magensafte
des Krebses zu versuchen. Allein es schien mir, daß ich auf diesen Weg
verzichten müßte. Die Erfahrungen über die Adsorptionsmethode sind
wohl noch nicht Allgemeingut; wenn man sie auf ein Objekt wie den
Magensaft des Flußkrebses übertragen wollte, so würde man über un-
gezählte Exemplare dieser Tierart verfügen müssen. Ich hoffe später,
wenn mir die Adsorptionsmethode genau bekannt ist, auf diese Technik
auch beim Flußkrebs zurück zu kommen. Zunächst standen mir zur
Verfügung zwei Mittel, um eine etwaige Vielheit von Enzymen zu cha-
rakterisieren. Gegenüber den alten primitiven Methoden der Reaktion

auf einige Farbenindikatoren steht heute die wohlausgebildete Technik
der pjj-Bestimmungen. Da man außerdem durch Söeensen und Will-
stätter und van Slyke Über vorzügliche Methoden verfügt, den Gang
einer Enzymwirkung quantitativ zu verfolgen (z. B. Formol- und Alko-
holtitrierung), so gelingt es heute leicht, das p^-Optimum einer be-
stimmten Enzymwirkung festzustellen. Ob ein solches Optimum aller-
dings dazu dienen kann, ein bestimmtes Enzym, vergUchen mit einem
anderen zu charakterisieren, das steht noch nicht fest. In der Literatur
über die vergleichende Physiologie der Enzyme, scheint man diese
,,Etikettierungquot; der Enzyme als zuverlässig zu betrachten. Es sei hier
schon bemerkt, daß ich mich diesem Optimismus nicht anschließen
kann und daß Untersuchimgen gezeigt haben, daß die Charakterisierung
einzelner Enzyme durch pj,-0ptima zunächst noch nicht möglich ist.
Immerhin wollen wir doch unsere diesbezüglichen Erfahrungen mit-
teilen, da sie für künftige Untersuchungen wertvolles Material enthalten.

Eine zweite Methode ist diejenige, uns nach bestimmten Substraten
umzusehen, die spezifisch nur durch ein bestimmtes Enzym gelöst
werden können, wenigstens bei den Wirbeltieren. Solange wir das
Eiweißmolekül noch nicht so kennen, daß die Bindungen, deren Lösung,
nach Waldschmidt-Leitz, Aufgabe bestimmter Enzyme ist, für alle
Enzyme direkt untersuchen können, müssen wir auf andere Weise ver-
suchen, den Enzymen spezifische Aufgaben zu stellen. Was das Erepsin
betrifft, so liegen die Dinge klar genug: Beim Wirbeltier vermag nur das
Erepsin gewisse Dipeptide zu lösen. Es war also die Frage, ob derartige
Dipeptide wie z. B. Glyzyl-glyzin, oder Leucyl-glyzin durch denMagensaft
des Flußkrebses gelöst werden können. Wesentlich schwieriger gestaltete
sich die Frage bezüglich einer etwaigen Pepsinfraktion im Safte des
Flußkrebses. Die enzymatologische Literatur gab hier keinen Auf-
schluß. Dagegen schien es mir, als könne man vielleicht reines Binde-
gewebe von Wirbeltieren als ein Sulbstrat verwenden, durch welches
Pepsin- und Trypsinwirkung voneinander unterschieden werden können.
Durch die klinischen Arbeiten von Saiili wußten wir, daß das Trypsin
und das Erepsin des Menschen Bindegewebe praktisch nicht angreifen,
während das Pepsin des Magens dieses sehr leicht tut. Darauf be-
gründet sich die Prüfung der Magenfunktion des Menschen durch Sauli.
Er verwendet Glasröhrchen mit Methylenblau, die durch eine Gummi-
membran verschlossen werden. Diese Gummimembrano wird durch
eine präparierte Darmsaite festgebunden. Im gesunden Magen löst sie
sich auf und der Farbstoff erscheint im Harn. Fehlt die Magenverdau-
ung, so bleibt die Saite auch im gesunden Darm ungelöst. ^ So verfügte

1 Siehe neuerdings Sahli, Hermann: The fallacy et Sahli „Desmoid Reac-
tionquot;. Journ. Americ. Med. Assoc. 82, 51. 1924. Daselbst auch die Literatur über
das Unvermögen des Trypsin-Erepsingemisches, rohes Bindegowebe zu verdauen.

ich wenigstens über zwei spezifische Substrate, von denen allerdings
das Letztgenannte nicht so weitgehend untersucht war, daß man von
einer allgemein gültigen Spezifität reden durfte. Für eine allgemeine
Physiologie ist das Argument, daß der Saft eines Tieres Bindegewebe
löst, natürlich nur ein Analogieschluß dafür, daß er eine Pepsinfraktion
enthält. Dagegen sind die Untersuchungen mit den genannten ver-
schiedenen Substraten biologisch hochinteressant; denn wenn es gelingt,
zu zeigen, daß der Saft eines Invertebraten imstande ist, nicht nur,
wie man das früher wußte, natives Eiweiß so zu verdauen, daß dabei
einzelne Aminosäuren auftreten, sondern, daß dieser Saft Dipeptide
und Bindegewebe zu lösen vermag, dann darf man hieraus das Folgende
schließen: Mag er eine oder mehrere Enzyme enthalten, jedenfalls be-
schränkt sich seine Wirkung nicht auf Trypsinwirkung, sondern sie um-
faßt alles, was die verschiedenen Säfte der Wirbeltiere zu lösen ver-
mögen.

Ich versprach mir zu Anfang meiner Untersuchung sehr viel aus
einer Kombination beider genannter Methoden, d. h. ich nahm mir
vor, nicht lediglich die Tatsache zu prüfen, ob der ^s/ctcMs-Saft die ge-
nannten Substrate zu lösen vermag, sondern auch die ii,j-Optima dabei
festzustellen. Es war möglich, daß z. B. die Verdauung von Darmsaiten
ein ähnlich niederes p^-Optimum zeigte, wie ein solches dem Pepsin
zukommt. Eine derartige Koinzidenz würde die Meinung vom Vor-
handensein einer Pepsinfraktion bei Astacus weitgehend gestützt haben.
Es sei hier schon erwähnt, daß diese Hoffnung getäuscht wurde, wie wir
aus den Versuchsergebnissen ersehen werden.

Bei Anwendung der Methoden der pjj-Optima sind wir gezwungen,
den Enzymen ein Milieu zu verschaffen, welches nicht übereinstimmt
mit ihrem natürlichen Milieu. Während das natürliche Milieu einen ganz
bestimmten pg- hat, müssen wir zur Feststellung der Optima bestimmte
Puffergemische zusetzen, wodurcß wir also zweierlei am natürlichen
Magensaft verändern: 1. seine Wasserstoffionenkonzentration, 2. sein
Gehalt an gelösten Stoffen.

Daß ein Enzym möglicherweise ein Optimum besitzt, welches anders
ist, als dasjenige des Saftes oder des Milieus, indem es normalerweise
wirkt, ist bekannt. Im Gegensatz zu den meisten anderen Enzymen
des Wirbeltieres, gilt dieses für das Trypsin. Nach Long und Fenger
(12) ist der Inhalt des Darmes mancher Säugetiere neutral (p„ = 7,2),
ja, sogar schwach sauer. Dagegen liegt das p^-Optimum des Trypsins
wesentlich höher. Es kann nicht genau festgestellt werden, da ein großer
Unterschied besteht zwischen dem Resistenzoptimum und Wirkungs-
optimum dieses Enzyms. Das Resistenzoptimum liegt bei pg =3,15.
Nun nimmt zwar die Wirkungsgeschwindigkeit des Trypsins mit zu-
nehmendem Pjj zu, allein, gleichzeitig wird das Enzym schneller und

schneller vernichtet. So bleibt die Bestimmung optimaler Wirkung
immer ein Kompromiß, bei dem die willkürliche Feststellung der Wir-
kungszeit von großer Bedeutung ist (Ringer [15]). Bei einer Wirkungs-
zeit von 11 Minuten liegt das p^-Optimum des Enzyms bei 11,3, da-
gegen bei einer Wirkungszeit von 4—5 Stunden, die mehr den physio-
logischen Verhältnissen entspricht, bei Pj, 8—9. Diese Optima liegen
also jedenfalls weit entfernt von den Bedingungen, wie sie im Darm
der Säugetiere herrschen.

Für Erepsin wird das Pu-Optimum durch Euler als 8,7 angegeben,
nach Waldschmidt-Leitz als 7,8. Für Pepsin fällt Optimum und
Milieubedingungen wieder zusammen, wenigstens bei den Säugetieren
(Reaktion und Optimum ungefähr gleich 2. Näheres siehe Euler (3).
VoNK (17) stellte im Mageninhalte von Esox luceus Pjj-Werte von 4,7
bis 5,8 fest, während die Optima des Pepsins bei Fischen sich nicht
wesentlich unterscheiden dürften von denjenigen der Säugetiere z. B.
für Acanthias gleich 2,2 bis 2,51.

Untersuchungen über verschiedene Pn-Optima bei der
proteolytisclien Wirkung der Säfte wirbelloser Tiere.

Während man früher, wie oben gezeigt wurde, durch die zufällige
Wahl der Objekte zu der Meinung gekommen war, daß die verdauen-
den Säfte der niederen Tiere eine einheitliche Protease enthalten, dio nur
bei einer einzigen Reaktion (pjj) arbeitet, zeigte sich neuerdings, daß
bei anderen Tieron die p„-Empfindlichkeit mindestens viel weniger
groß ist, als dieses nach jenen älteren Versuchen z. B. beim Flußkrebs
der Fall zu sein schien. Van der Heyde (17) fand bei Asterias forbesii
und Thyone briarius einen Darmsaft, der sowohl bei saurer, als bei alkali-
scher Reaktion Eiweiß zu lösen vermag. Allerdings ist die Menge des
Produktes bei alkalischer Reaktion größer, so daß der Verfasser schließt,
es handele sich um eine tryptische Verdauung mit verhältnismäßig
großer Unabhängigkeit vom py. Auch Oomen (14) fand im Verdauungs-
safte von Holothuria stellati eine nach seiner Meinung einheitliche Pro-
tease, dio bei Pjj-Werton von 2,8 bis 9,2 wirken soll, mit zunehmender
Stärke bei zunehmender Alkalinität. Maxima und Minima ergaben sich
bei Alkoholtitrierung nicht. Leider hat Oomen es versäumt, den p,j
in der Mischung von Puffergemisch, Substrat und Saft potenziometrisch
festzustellen. Er beschränkte sich auf Feststellungen des p,j in dem
Puffergemisch mit dem Substrat, so daß vermutlich durch Zutat des
Saftes eine Veränderung des p^ auftrat.

Bodansky (1) untersuchte Extrakte von Coelonteraten, und zwar
Physalia arethusa und Siomolophus meleagris. Er bestimmte die Menge

1 Die Karbohydrasen besitzen ein Optimum (zwischen 6—7), welches der
Reaktion innerhalb des Darmes der verschiedenen Tiere sehr nahe liegt.

Gelatine, die durch diese Extrakte verflüssigt wurde, und zwar bei ver-
schiedenen pg-Werten. Es gelang ihm, distinkte Optima festzustellen.
Das eine lag bei p^ 3,0—3,5, das zweite bei ungefähr 7,8.

Yonge (19) untersuchte auf die gleiche Weise Extrakte aus der Mittel-
darmdrüse von Ostrea edulis und fand als Optima 3,5 und ungefähr 9.

P. KbItger (10) steUte ebenso zwei Optima fest für die Proteolyse
durch den Magensaft von Astacus. Das eine soll bei 3,5, das andere bei
7—8 liegen. Es muß dabei aber unmittelbar erwähnt werden, daß
Krüger versäumt hat, sich vor der Wirkung der Autolyse auf das
eigene Eiweiß durch Kontrollversuche zu schützen. Wir werden auf
diesen Umstand weiter unten zurückkommen.

Offenbar nehmen die genannten Forscher ohne weiteres an, daß die
beiden Optima einer Pepsin- und einer Trjrpsinfraktion entsprechen.
Wir werden weiter unten auf diese Frage zurückkommen, wenn wir
unsere eigenen Resultate mitgeteilt haben.

Die Wasserstoffionenkonzentration des Magensaftes
von Astacus fluviatilis und A. inacrodactylus.

Mir standen zur Verfügung zwei Arten von Flußkrebsen, nämlich
Astacus fluviatilis und Astacus macrodactylus. Die erste Art erhielten
wir durch eine holländische Züchterei. Sie sind von normaler Größe,
dunkelbraun. Allein, sie sind schwach und man kann sie nur kurze
Zeit im Aquarium lebend erhalten. Der Magensaft ist rotbraun und

in der Regel etwas weniger viskös, als der
Saft der anderen Art. Astacus macrodactylus
danken wir der freundlichen Hilfe von
Herrn Dr. W. Wunder, der sie uns aus Bres-
lau schickte. Sie sind groß, mehr oder weni-
ger grünlich braun, aber etwas heller von
Farbe als fluviatilis. Sie sind wesentlich
stärker als diese und lassen sich längere
Zeit im Aquarium am Leben erhalten. Da-
Abb. 1. Die Veränderung von ph des her habe ich die meisten meiner Versuche
Magensaftes n^ach^der Fütterung (vgl. mi^ dieser Art ausgeführt. Der Magensaft

ist gelbhch bis grünhch-braun und oft sehr
viskös. Ich werde meine Daten ohne Rücksichtnahme auf die Art an-
geben, da sich keine wesentlichen Unterschiede ergeben haben.

Der Magensaft wurde auf bekannte Weise mit einer Glasröhre dem
lebenden Tiere entnommen. Der Pu wurde mit Hilfe der Wasserstoff-
elektroden gemessen. War die Menge die zur Verfügung stand zu klein,
so benutzte ich die Quinhydronelektroden, die ich nach der Anleitung
VoNKs (18) benutzt habe. Die Resultate zahlreicher Messungen waren
die folgenden:

Tiere, die 10 Tage lang gehungert hatten, hatten in ihrem Magensaft
einen pg von 5,01. Tiere, die mit 0,2 g Fleisch gefüttert worden waren,
hatten einen p^ von ungefähr 5,6.

Die Autolyse des Magensaftes.

Alle quantitativen Versuche über eine Verdauung in dem Magensafte
eines Krebses haben zur Voraussetzung, daß man unter den gewählten
Bedingungen die Autolyse des eigenen Eiweißes genau kennt. Es geht
nicht an z. B. dem Magensaft ein Substrat hinzuzusetzen, etwa Dipeptide,
und dann später festzustellen, daß bei einem bestimmten pjj die titrier-
baren Aminosäuren zugenommen haben, da auch ohne Zusatz von
Dipeptiden eine solche Zunahme stattfinden muß, wenn man in der
Nähe des Optimums der Autolyse arbeitet. Außer dieser technischen,
hat aber die Untersuchung der Autolyse eine biologische Bedeutung.
Offenbar ist der Eiweißgehalt des Magensaftes ein integrierender Be-
standteil dieses Sekrets, wenn wir auch zunächst nicht sagen können,
welche Rolle er spielt. Man könnte in erster Linie an Pufferung denken,
die ja sicherlich auch in dem Safte niederer Tiere vorhanden sein muß,
wenn die Wirkung der Enzyme nicht durch alle möglichen Nahrungs-
mittel durch abweichenden p^ geschädigt werden soll.

Schon Jordan (7) hatte gefunden, daß das Eiweiß des Saftes gegen-
über der eigenen Protease außerordentlich widerstandsfähig ist. Aller-
dings hat er sich, wenn auch nur durch den Augenschein, von einer
geringen Autolyse überzeugt. Meine Versuche wurden mit Willstät-
ters Alkoholtitrierung ausgeführt, und zwar wurde die Methode Ronas
,,Fermentmethodenquot; (16) entnommen.

Allgemeines über die Jlethodik meiner Untersuchungen.

Puffergemische. Ich benutzte Glykokoll, Borat und Biphtalatge-
mische. Letztere eignen sich am besten für die Alkoholtitrierung.
JrOrnbsp;i

durch andere Forscher benutzt, aber seine Puffungskapazität ist nicht
sehr groß bei Werten, die höher als Pn = 5 liegen.

Ich stellte verschiedene Versuchsreihen unter Benutzung der Alko-
holtitrierung an und fand ein Optimum der Autolyse hei ungefähr p 3 5
ein anderes bei ungefähr 9. Ein ausgesprochenes Minimum fand sich
bei Ph 6. Hieraus ergab sich, daß der normale pjj des Saftes ganz in
der Nähe dieses Minimums liegt, so daß also hierdurch die Autolyse
des Saftes unter normalen Bedingungen eine sehr geringe Rolle spielt,
wie, wenn auch ohne quantitative Methode, Joedan festgestellt hat.

Die Ergebnisse über die Autolyse nötigen uns zu einer Kritik einer
jüngst erschienenen Arbeit von P. Krüger (10). Krüger gebraucht
jeweils 0,5 ccm Saft mit lOccm Puffergemisch. Obwohl er drei Arten
von Kontrollversuchen macht, über Faktoren von untergeordneter Be-
deutung (wenn wir nach den Resultaten urteilen dürfen), ließ er die
wichtigste, die Kontrolle für Autolyse weg, was zumal bei der verhältnis-
mäßig hohen Konzentration des Saftes, die er benutzte, von großer
Bedeutung ist. Daher sind seine Kurven, wenigstens bei den genannten
pg-Werten, Resultanten der Autolyse und der Proteolyse.

Die Wirkung des^Magensaftes auf natives Eiweiß.

Ich habe gearbeitet mit Kasein, Gelatine, Fibrin und verschiedenen
Arten von Bindegeweben aus den oben angegebenen Gründen. Als
Methode diente innerster Linie die Alkoholtitration. Mit ihr wurden

die Pjj-Optima be-
stimmt. Die Werte,
die ich fand, sind
recht verschieden.

Um die Zunah-
me der Spaltungs-
produkte zu mes-
sen, bediente ich
mich auch der ko-
lorimetrischen Me-
thode, d. h. der Lö-
sung gefärbter Sub-
strate, die quantita-
tiv kolorimetrisch
festgestellt werden kann. Endlich machte ich Gebrauch von der Mett-
schen Methode, die darauf beruht, daß män in geeichten Glasröhren
gelatinierte Gelatine bringt, diese Röhre in das Enzym legt und nach
bestimmten Zeiten die Länge des gelösten Gelatinefadens mißt.

Mit Kasein ergab sich ein deutliches Optimum etwas unter einem

Pjj-Wert von 6. Die Kurve fällt steil auf der sauren Seite ab, während
sie nach der alkalischen Seite langsam absinkt.
Oitvnbsp;Bei Gelatine fand ich ein Opti-

mum bei ungefähr 6,5 mit symmetri-
schem Abfall der Kurve nach bei-
den Seiten. Bei Fibrin ergaben sich
zwei Optima, eins bei ungefähr 8
und ein zweites, wenn die Enzyme
stark waren, bei ungefähr 5,5 (siehe
Tabelle 4).

0,1

6

\'pH

Abb. 4. Die Wirkung des Magensaftes (oben) sowie
des Mitteldanndrüsenextraktes auf Gelatine (vgl.
Tabelle 3, B).

0,3

L

u

5 6 7 6 9
-^pH

Abb. 5.

Abb. 5. Die Wirkung des Magensaftes auf Fibrin (vgl. Tabelle 3, C). — Abb. 6. Die Wirkung des
Pepsins auf Catgut von Sähli ;—) sowie auf Ligamentum nuchae (----) (vgl. Tabelle 4).

Bindegewebe oder Kollageuverdauungen.

Mit Kollagen stellte ich die folgenden Versuche an. Erstens stellte
ich das Pn-Optimum fest, welches sich bei einer Verdauung durch Säuge-
tierpepsin ergibt. Zweitens untersuchte ich die Wirkung von Trypsin
auf Bindegewebe (bei p^ 8), endlich arbeitete ich mit dem Safte von
Astacus. Als Substrat verwandte ich Catgut, wie es in der Chirurgie
verwendet wird, Ligamentum nuchae vom Rind und andere Binde-
gewebspräparate. Am besten eignete sich für meine Versuche „Catgutquot;
für die Desmoidreaktion von Sadli^

Ungereinigte Bindegewebspräparate werden zum Teil gut von Trypsin
verdaut und ihre Verdauung mit Pepsin gibt kein deutliches Optimum.
Wenn man Sahlis Catgut in ein, wie üblich hergestelltes Pepsin- und
Trypsin-(Pankreatin-Rhenania-)Gemi^ch bringt, so löst es sich nur in

1 Wir erhielten dieses Präparat von der Firma Hausmann, St. Gallen, durch
freundliche Vermittlung von Herrn Professor Dr. H. Sauli.

Pepsin auf. In Trypsin bleibt es äußerlich unverändert i. Der Magen-
saft des Flußkrebses beträgt sich diesbezüglich wie Säugetierpepsin!
Allein das Lösungsvermögen ist nicht groß. Nun mußten wir das p^-
Optimum dieser Wirkung zunächst titrimetriseh bestimmen. Für Pepsin
ergab sich ein Optimum von 2—2,0. Für Magensaft von Astacus ergab
sich das Folgende: es war mir nicht mögUch, vollkommene Wirkungs-
kurven gegenüber diesem Substrat zu erhalten, da ich nicht über so
große Saftmengen verfügte. Allein, mit einer gewissen Sicherheit kann
ich schheßen, daß das Optimum der Bindegewebeverdauung nicht
niedriger als 4 und nicht höher als 7,5 liegt. Für Sahlis Präparat

liegt es ungefähr bei 6,7; da im Laufe des Versuches der pjj etwas ab-
nimmt, so liegt es ein wenig mehr nach der alkalischen Seite, also etwa
bei 6,8 (vgl. Tabelle 5—7).

Die Wirkung auf Dipeptide.

Die einfachste Methode, um die Spaltung von Dipeptiden zu zeigen,
war die Benutzung von sogenanntem Fermentdiagnostikum^, das ist
Glyzyl-tryptophan, bei dessen Spaltung Tryptophan frei wird und daher
die Trjrptophanreaktion auftritt, allein diese Methode war leider nicht
brauchbar, da durch die Autolyse des Saftes auch schon Tryptophan-

1nbsp;Es sei ausdrücklich bemerkt, daß, wenn man Trypsin auf Bindegewebe
wirken läßt, und .die Zunahme der freiwerdenden Aminosäuren titriert, eine
solche sich in der Tat feststellen läßt, zumal bei ungereinigtem Bindegewebe
(andere Eiweißkörper?). Auch in dieser Beziehung ist Sahlis Catgut am besten,
da es am wenigsten Titerzunahme bei Trypsineinwirkung ergibt.

2nbsp;Firma Kalle u. Co., A.-G. Biebrich a.Rh.

reaktion auftritt, wobei also nicht festgestellt werden kann, aus welcher
Bindung Tryptophan freigemacht wird. Ich arbeitete daher mit Glyzyl-
glyzin und Leucyl-glyzin. Die Lösung ist außerordentlich schwach,
findet aber statt, und zwar bei einem p^-Optimum von 9. Die Resultate
findet der Leser in Tabelle 8. Eine genaue Kurve der Wirkung könnt«
ich nicht zeichnen, Aveil das Optimum mit dem Autolyseoptimum
zusammenfällt und die Wirkung der „Erepsinfraktionquot; überhaupt nur
aus einer Substraktion des Autolysetiters im Kontrollversuche, vom
Titer des mit den Dipeptiden gemischten Saftes erhalten werden kann.
Es sei ausdrücklich bemerkt, daß nur auf diesem Wege die Verdauung

IS
1,1
1,3

1,1
1,0
0,3

^ 0,7
I QV

I 4J

0,1
0,1
0

10

-pH

Abb. 8. Die Wirkung des Mageusaftes auf Leucyl-glyzin (vgl. Tabelle 7, B, b) mit Autolysekontrollo

(-—).

der Dipeptide überhaupt bewiesen werden kann. Krügers diesbezüg-
liehe Versuche müssen als nichtbeweisend angesehen werden und auch
der von ihm gefundene niedere pg-Optimumwert konnte durch meine
Versuche nicht bestätigt werden. Er dürfte sich auf reine Autolyse
beziehen.

Zunächst stellen wir also fest, daß der Saft des Flußkrebses alles
leisten kann, was die Saftgemische der Wirbeltiere zu leisten imstande sind.
Soweit wir dieses beurteilen können, sind also alle Wirkungsfraktionen
im Safte des Krebses vertreten. Es fragt sich nun, ob diesen Wirkungs-
fraktionen auch bestimmte Enzymindividuen entsprechen. Um dieses
festzustellen, wurden nun noch eine Reihe p,j-Optimumbestimmungen
ausgeführt, in der Hoffnung, daß sich einzelne Fraktionen als Enzym-
individuen charakterisieren lassen würden. Wir haben schon oben
erwähnt, daß diese Untersuchungen nicht zu einem bestimmten Resultate
geführt haben. Wir lassen unsere Versuche folgen.

Die Wirkung des Magensaftes von Astacus auf Peptone.

Als Substrat diente Wittepepton und Pepton F der Firma Witte
in Rostock. Dieses letztere verschaffte mir Herr Dr. G. Ch. Hiesch.
Ich sage ihm auch an dieser Stelle für seine freundliche Hilfe meinen
besten Dank.

Für beide Stoffe fand ich nur ein einziges pn-0ptimum, nämlich

6,7 für Wittepepton und
6,2 für Pepton F. Beide
Kurven fallen symme-
trisch sowohl nach der
sauren, als nach der alka-
lischen Seite ab.

Diese Tatsache ist von
der größten Wichtigkeit.
^ p!^nbsp;An und für sich diente

Abb. 9. Die Wirkung des Magensaftes (□) und Mitteldarm- mir die Wirkung des Saf-
drüsenextraktes (O) auf Wittepepton, sowie des Extraktes auf ^nbsp;fnbsp;pUj,

Pepton F (A) (vgl. Tabelle 8).nbsp;iquot;eptone zur una-

rakterisierung tryptischer
Wirkung. Beim Säugetier würde man ein Enzym, welches auch weit-
gehend gespaltenes Pepton F zu verdauen vermag, als Trypsin bezeichnen.
Dabei würde man aber unter allen Umständen kein so niederes Optimum
für seine Wirkung finden, sondern, wie wir oben hörten, ein Optimum
von ungefähr pji 8—9.

Pn-Optiraumbestimmungen des Spaltungsbeginnes.

Deenby (2) untersuchte das Optimum der Autolyse von Hefezellen.
Er stellte es fest bei p^ 5,5, während nach seinen eigenen Untersuchungen
das „Pepsinquot; der Hefe ein solches bei p^ 3—3,5 und das „Trypsinquot; bei
7,5—8 hat. Er schloß daraus, daß das Optimum der Autolyse einer
kombinierten Wirkung beider Enzyme zuzuschreiben sei. Wir wollen
hier nicht die Frage diskutieren, inwiefern zwei derartige Enzyme zu-
sammen arbeiten können, und zwar dergestalt, daß die optimale Menge
des Produktes bei einem pjj entsteht, der zwischen den beiden indivi-
duellen Optima beider Enzyme liegt. Es will uns scheinen, als ob man
in der allgemeinen Physiologie mit den aus der Wirbeltierphysiologie
stammenden Begriffen wenig sorgfältig umgeht. Pepsin und Trypsin
des Säugetieres arbeiten niemals zusammen, auch überlagern sich ihre
Wirkungsbereiche nicht.

Wenn bei Pflanzen und niederen Tieren zwei Enzyme vorkommen
und wenn dies© bei ihrer Zusammenarbeit ein mittleres pjj-Optimum
haben, so handelt es sich hierbei schon um Eigenschaften, wie sie bei
Enzymen, denen man die Definition entnahm, nicht vorkommen.

Nun wäre es ja immerhin möglich, daß der Prozeß viel komplizierter

ist, daß z. B. in der ersten Pliase ausschließlich Pepsin wirkt, sodann
Trypsin. Wir messen die Produkte, deren Masse abhängig ist von der
individuellen Wirkung beider Enzyme. Am besten wäre dieses bei
Bmdegewebe zu verstehen, wenn dieses auch beim Flußkrebs aus-
schließUch durch die „Pepsinfraktionquot; angegriffen werden Avürde. Die
Masse des titrierbaren Produktes würde dann in erster Linie abhängen
von der Pepsmwirkung. Sie würde der Trypsim\\irkung das Material
zur Verfügung stellen; aber naturgemäß würde auch von der Ge-
schwindigkeit der Trypsinwirkung die Menge der Endprodukte ab-
hängen. Drittens würde auch die Geschmndigkeit der Trypsinwirkung
diejenige der Pepsinwirkung beeinflussen müssen, da ja durch die Auf-
spaltung der peptischen Produkte die Pepsinwirkung be -
schleunigt werden müßte (GleichgewichtsVerschiebung).
Diese Wechselwirkung ist so kompliziert, daß wir es uns
versagen müssen, uns in weitere Spekulationen über
ein mögliches Kompromißoptimum zu ergehen. Da-
gegen wollen wir eine Reihe von Versuchen besprechen,
deren Ziel es war, das Anfangsstadium der Verdauung
allein zu fassen. Auch dieses ist keine vollkommen ein-
deutige Methode, wenigstens nicht bei Anwendung voii
Gelatine oder Fibrin, da diese beiden Stoffe sowohl
von Pepsin, als von Trypsin angegriffen werden. So-
lange wir uns aber einigermaßen an die Definition die-
ser beiden Proteasen halten, muß das Bindegewebe ein
gutes Objekt für unsere Versuche sein; denn bei ihm
muß der Spaltungsbeginn eine Funktion lediglich des
Pepsins sein. Wenn auch diese Versuche keine Sicher-
heit geben können, da sie sich ja auf eine Analogie
begründen, so schien uns doch ihre Methode die beste Aussicht zu geben,
um zu zeigen, daß vermutlich auch das Einzelenzym, welches die Pro-
teolyse einleitet, bei jenem initiieren p,i-Optimum arbeitet.

In erster Linie bediente ich mich der METTschen Röhren, die mit
Gelatme im Gelzustande gefüllt, in das Verdauungsgemisch gelegt
werden. Die Abnahme der Gelatinesäule innerhalb einer bestimmten
Zeit wird gemessen (siehe Abb. 10).

Das Verdauungsgemisch wird in einer Zentrifugenröhre von ungefähr
G cm Länge und 1 cm Durchmesser gebracht. Der innere Durchmesser
der mit Gelatine gefüllten Kapillare betrug ungefähr 1,1 mm. Die Länge
der Gelatmesäule wird vor und nach der Verdauung (bei Zimmertempera-
tur) gemessen. Die Methode ist nicht sehr fein, so daß eine genaue
Eichung der Kapillare nicht vorgenommen wurde.

Übrigens steht das Prinzip der Methode demjenigen nahe,, welches
der durch Bodansky (1, bei Zölenteraten) und Yonoe (19, bei Mollus-

Z. f. vcrgl. Pliysiologie Bd. 7.nbsp;23

ken) angewandten Methode zugrunde liegt. Meine Resultate findet
der Leser in Tabelle 10. Im Mittel erhielt ich ein Optimum von 5,5 und
ein zweites von 8. Auch mit Willstättees Polypeptidtitrierung, die
sich ja im wesentlichen auf frühe Spaltungsprodukte beschränkt, er-
hielt ich fast gleiche Optima.

Mit Fibrin, mit unserem wichtig-
sten Substrate, Bindegewebe, nämlich

I

y

B

Abb. 11. Die Verflüssigung der
Gelatinesäule (vgl. Tab. 10).

Abb. 12. Der Spaltbeginn bei Gelatine bestimmt mit
Polypeptidtitratlon (vgl. Tab. 9).

Ligamentum nuchae des Rindes, benutzte ich die kolorimetrische
Methode. Die Stoffe wurden mit Ammoniakkarmin gefärbt und so gut
ausgewaschen, daß sie in schwacher Säure keine Farbe mehr abgeben.

Eine weitere Erklärung
der Methode erübrigt
sich, da sie durch die
Publikation der Grütz-
NERschen Schule allge-
mein bekannt ist. Für
Versuche bei alkalischer
Reaktion kam an Stelle
des alkalilöslichen Kar-
mins, Spritblau.

Bei Fibrin erhielt ich
nur die höhere Zahl, die
ich bei Titraiion ge-
funden hatte (pir 8). Mit
Bindegewebe fand ich,
daß die Kurve etwas asymmetrisch wurde: nach der sauren Seite fällt
die Kurve allmählicher ab, als nach der alkalischen. Aber die Optima
bleiben fast unverändert (p^ 6j. Der Leser findet die Daten in Tabelle 12.

Diskussion meiner Resultate.

Wir wollen unsere Resultate zusammenfassend in zwei Gruppen
zerlegen. 1. Ich ging aus von dem Gegensatze, der zwischen der alten
und neuen Auffassung über die Enzyme wirbelloser Tiere bestand.

Jordan hatte in seinem Buche und in seinen älteren Publikationen von
„Urtrypsinquot; gesprochen. Eine Auffassung, die naturgemäß im Wider-
spruch steht zu den Resultaten neuester Untersuchungen. Wir wissen
heute, daß das Trypsin der Säugetiere nicht alles zu leisten vermag,
was für die Verdauung der Eiweißkörper nötig ist, so daß es ausgeschlos-
sen erscheinen muß, daß ein einziges Enzym, welches die gesamte Ei-
weißverdauung eines Tieres zu leisten hat, mit dem Trypsin der Säuge-
tiere verglichen werden darf.

2. Wenn den Anschauungen von Waldschmidt-Lkitz diejenige all-
gemeine Gültigkeit zukommt, die der genaimte Verfasser zur Begrün-
dung seiner Schlüsse voraussetzen muß, so ist die ältere Meinung Jor-
dans, daß Avir bei den wirbellosen Tieren eine einzige „Urproteasequot;
finden, nicht mehr haltbar, auch wenn man dieser Protease einen größe-
ren Wirkungsbereich zuerkennt, als dem Trj-psin. Denn nach Wald-
schmidt-Leitz könnten den verschiedenen Arten von Peptidbindungen
im Eiweißmolekül jeweils besondere Enzyme auch bei Wirbellosen ent-
sprechen. Viele neuere Untersucher haben, wie wir das in der Ein-
leitung auseinandergesetzt haben, sich ohne weiteres der Meinung Wald-
schmidt-Leitz\' angeschlossen: sie meinen, daß den beiden Optima, die
sie finden, ein Pepsin und ein Trypsin entspricht.

1.nbsp;Ich habe in dieser Arbeit zeigen können, daß der eiweißverdauende
Saft des Flußkrebses sicherlich imstande ist, das Eeiweißmolekül in
seiner Gesamtheit abzubrechen. Die letzte Phase der Spaltung, die
beim Wirbeltier durch das Erepsin geleistet wird, erwies sich in meinen
Versuchen als äußerst schwach: Glyzyl-glyzin, sowie Leucyl-gly-
zin, wurde bei einem pH-Optimum von 9 sehr schwach gespalten. Als
Charakteristikum für die peptische Phase wählten wir die Spaltbarkeit
des Bindegewebes, in erster Linie die nach Sahli präparierte Darmsaite,
die gelöst Avurde.

2.nbsp;Wenden Avir uns jetzt der zAveiten Frage zu, nämlich nach dem
Vorkommen verschiedener Einzelenzyme im Safte des Flußkrebses.
Es Avill ims scheinen, als dürfe man diese Frage noch nicht beantAvorten.
Dagegen haben meine Untersuchungen viel neues Material, Avcnn auch
nicht zur BeantAvortung, dann doch zur Beurteilung dieser Frage ge-
liefert. Ausgehend von der Definition der Einzelenzyme, Avie wir sie
in der Wirbeltierphysiologie finden, müssen Avir zunächst feststellen,
daß die pg-Optima durchaus ungenügend sind, um in solchen Enzym-
gemischen die Anwesenheit von derartigen Einzelenzymen festzustellen.
Es fehlt den Enzymen, zumal bei niederen Tieren, eine Konstanz der
pn-0ptima. Verschiedene Substrate haben verschiedene Optima, die
sich bislang noch nicht durch Eigenschaften der Substrate (z. B. durch
den isoelektrischen Punkt) haben erklären lassen. Man vergesse auch
nicht, daß man alle diese Bestimmungen nur mit Hilfe grober Eingriffe

23*

ausführen kann, d. h. unter Hinzufügung von Puffergemischen, um die
pg-Werte zu erzielen. Es scheint aber (nach Ringer), daß bei manchen
Enzymen die Zutat, zumal von Elektrolyten einen direkten Einfluß
auf das p^-Optimum hat. Die Hauptsache aber ist, daß die Wirkung
des Krebssaftes auf einzelne spezifische Substrate, unter ganz anderen
Bedingungen vor sich geht, als die entsprechende Wirkung durch die je-
weiligen Enzyme des Säugetieres.

Ich habe gezeigt, daß wenig verdautes Wittepepton (hauptsächUch
Albumosen) durch ^stocti^-Saft bei p^ 6,7 optimal verdaut wird. Weit-
gehend verdautes Pepton (Pepton F) bei Ph6,2: wäre der Saft eine
Mischung von Trypsin und Pepsin im Sinne der Vertebratenphysio-
logie, so müßte der pjj-Wert beim Pepton F steigen, da eigenthches
Pepton ledigüch durch Trypsin angegriffen werden müßte, mit einem
alkalischen Optimum.

Auch Bindegewebe, das mutmaßliche Substrat der Pepsinfraktion,
wird mit einem p^-Optimum von 6,7 verdaut. Daß dieses Optimum
sich auf die erste Phase der Spaltung bezieht, ergab sich aus der An-
wendung der kolorimetrischen Methode auf Bindegewebe. In allen
diesen Fällen erhielten wir gleiche, nämlich für Pepsin viel zu hohe
Pjj.Optima. Damit konnten wir die Annahme ausschließen, daß jene
pjj-Mittelwerte, die wir als unterstes Optimum fanden, Mittelwerte
zwischen den Optima von Pepsin und Trypsin des Wirbeltieres, d. h. als
Kompromißoptimum zwischen beiden Enzymen aufzufassen seien. Ein
wesentlicher Punkt, der nicht übersehen werden darf und der gegen
das Vorhandensein eines Pepsines im Sinne der Wirbeltierphysiologio
spricht, ist das Fehlen jeglicher Labwirkung des Magensaftes von Asta-
cm fluviatilis, eine Labwirkung, die für Pepsin charakteristisch sein soll.

Wir haben noch einem Einwände zu begegnen. Es kommt nämlich
im Krebsmagensafte ein pj,-Optimum vor, welches dem des Pepsins
näher liegt, als alle anderen. Es ist das niedere Optimum der Autolyse,
welches bei 3,5 liegt. Autolyse spielt aus folgendem Grunde eine be-
sondere Rolle. Bei p^ 4 fängt das eigene Eiweiß des Saftes an sich zu
trüben, bei p,j 3 ist alles Eiweiß niedergeschlagen und alle Enzyme
werden durch den Niederschlag adsorbiert. (Das Filtrat ist wirkungs-
los, während der in Alkali gelöste Niederschlag die volle Enzymwirkung
hat.) Bei jenem pj,-Optimum von 3,5 messen wir die Wirkung des
Enzyms auf das eigene Eiweiß, welches durch Adsorption mit dem
Enzym verbunden ist. Man könnte nun daran denken, daß das eiweiß-
freigemachte Enzym eines Krebses ein niederes ,,Pepsin-Optimumquot;
haben würde, als der natürliche Saft. Man erinnere sich auch, daß ich
mit der METTschen Methode sowie mit der Polypeptidtitration bei Gelatine
die Spaltungsbeginnoptima bei pg 6, d. h. bei demselben p^ wie das
Autolyseminimum fand. Bei der Fibrinolyse läßt sich titrimetrisch

eines der Optima bei p^ etwa 6 feststellen; dieses Optimum ver-
schwindet bei der Spritblaufibrinmethode, und es bleibt nur das
andere, das bei p^ 8 liegt.

Wahrscheinhch jedoch ist das Verhalten bei der Autolyse spezifisch
für diese Erscheinung; denn wäre Autolyse und z. B. Fibrinolyse das
gleiche, und Autolyse bei niederem p^ durch die Adsorption nur bevor-
zugt, so müßte die Autolyse auch bei p^ 6—7 vor sich gehen, wo die
totale Proteolyse und Peptolyse maximal sind. Das ist nicht der Fall.
Das Optimum 6,7 der ersten Bindegewebsverflüssigung spricht gegen
die Möglichkeit eines Kompromisses zwischen niederem pjj-Optimum
und Beschädigung des Enzyms durch solchen niederen pjj, denn ein
solches Wirkungsoptimum müßte niederer hegen. Praktisch geht die
Verdaimng beim Flußkrebs optimal bei p„-Werten von 5,5 bis 6,5 vor
sich, ganz in der Nähe des p^ des Saftes. Ob innerhalb der Coeca die
Bedingungen für die schwache „Erepsinwirkungquot; (pjj 9) und zugleich
für das zweite Optimum anderer Substrate gegeben sind, wissen wir nicht.

Kurzum, beim Flußkrebs von „Pepsinquot; und „Trypsinquot; usw. zu
reden, ist beim gegenwärtigen Stande unseres Wissens nicht erlaubt.
Die Pg-Optima eignen sich, für sich genommen, nicht zur Charakteri-
sierung von proteolytischen Enzymen, da sie offenbar durch alle mög-
lichen Umstände verändert werden, und nicht ausschließlich als Funktion
der Enzymart zu betrachten sind. Künftige Versuche werden das Enzym-
gemisch in seine Faktoren zerlegen und deren spezifische Eigenschaften
feststellen müssen. Die einzelnen Teilenzyme, die den Bindungsarten des
Eiweißmoleküles entsprechen, werden erst dann allgemein gültige Defi-
nitionen erhalten (falls man, wie wohl zu vermuten ist, das Vorhanden-
sein solcher Teilenzyme überhaupt nachweisen kann). Die „allgemeine
Physiologiequot; hat auch hier eine ausgebaute vergleichende Physiologie
zur Voraussetzung. Vorläufig fußt auch die WillstätterscIio Schule
nur auf einigen Spezialfällen. Wir müssen uns in unserer Darstellung auf
Enzynuüiri-ttjigr beschränken und dürfen bei den Wirbellosen noch nicht
von „\'Enzyiwindividuenquot; reden.

Der Rhythmus der Sekretion der verdauenden Enzyme.

Daß bei den wirbellosen Tieren Sekretionsrhythmen nach Maßgabe
der Nahrungsaufnahme entstehen, hatHiRScii vor längerer Zeit gezeigt (4).
Im vorigen Jahr hat er diese Rhythmen auch bei Astacus gefunden (5,
siehe auch Betiies Handbuch für normale und pathologische Physio-
logie, 9). Bei diesen letztgenannten Untersuchungen, von denen er
im zitierten Handbuch eine kurze Übersicht gibt, fand er die bemerkens-
werte Tatsache, daß bei Astacus die Verdauung nativen Eiweißes und
von Pepton F verschiedene Sekretionsrhythmen habe. Als natives Ei-
weiß diente Kasein. Wird nun die Enzymkraft in bestimmter Weise zu

verschiedenen Zeiten nach der Nahrungsaufnahme geprüft, so ergibt
sich für die Menge der ,,Kaseinasequot; und der ,,Peptonasequot; je eine Kurve
mit zwei Höhepunkten binnen sechs Stunden, aber die Kurven sind
nach Hirsch nicht gleich. Sie folgten vielmehr in ihren Maxima und

Minima aufeinander. Daraus ergibt sieh, daß die Kraft der Protease
für hoch zusammengesetzte und diejenige für tief abgebaute Eiweiß-
körper rhythmisch in reziprokem Verhältnis steht. Diese eigentümlichen
Befunde werden vermutlich am besten durch die Annahme von zwei
verschiedenen Proteasen im Magensafte von Astacus erklärt. Diese An-

gäbe weckte in mir die Hoffnung, durch „systematische Stufenunter-
suchungenquot;, in verschiedenen Zeitabständen nach der Fütterung meiner
Krebse, doch noch imstande zu sein, verschiedene Enzymindividuen
voneinander zu unterscheiden. Leider ergab sich, daß die genannten
Unterschiede sich nicht feststellen lassen. Kasein wird durch den Magen-
saft des Flußkrebses nur schwer angegriffen. Hierdurch entstand ver-
mutlich eine Unregelmäßigkeit der „Kaseinasekurvequot;, wie sie in dem
6

mir freundlich zur Verfügung gestellten Manuskript von Hirsch vor-
kommt. Ich habe daher die Stufenuntersuchungen mit verschiedenen
Substraten und mit Alkoholtitrierung wiederholt. Ich ließ die Tiere
mindestens eine Woche lang hungern, sodann wurden sie mit 0,2 g
Fleisch gefüttert imd ihr Magensaft wurde nach bestimmten Zeitinter-
vallen entnommen und auf seine Wirkung untersucht. Als Substrat
diente hierbei Gelatine, Wittepepton, Pepton F^ Kasein und Sahlis
Darmsaite; außerdem benutzte ich noch gefärbtes Fibrin für kolori-

1 Ich hätte lieber an Stelle von dem immerhin Undefinierten Gemisch, wie es
im Pepton F vorliegt, Dipeptide verwandt, nämlich Glyzyl-glyzin, oder Leucyl-
glyzin, allein diese werden zu schwach angegriffen.

metrische Messungen. Die Resultate sind, wie sich aus den folgenden
Tabellen ergibt, immer gleich den Kurven von Hirsch für Pepton F:
Die „Sekretion von Protease und Peftonasequot; war synchron. Es ließen
sich auf diese Weise nicht zweierlei Enzyme voneinander unterscheiden.
Die erste Sekretion tritt eine und die zweite Sekretion 31/2 Stunden
nach der Fütterung auf. Der frisch abgesonderte Saft ist dunkler ge-
färbt und die Farbe des Saftes ist bis zu eili|p gewissen Grade der In-
dikator für die Enzymkraft, obwohl Schwankungen nicht unbedeutend
sind (siehe Tabelle 12).

Ich möchte hier einige weitere Erfahrungen hinzufügen über die
Hungersekretion, die man dadurch kontrolheren kann, daß man dem
Magen eines hungernden Krebses von Zeit zu Zeit Saft entnimmt. Die
Methode wurde angewandt, um die Prüfungen des Saftes nach Fütte-
rung zu kontrollieren. Die Resultate findet der Leser in Tabelle 13.
Es zeigte sich deutlich, daß bei Entleerung des Magens der verdauende
Saft kontinuierlich aus der Mitteldarmdrüse in den Magen fließt, ein
Abfluß, dem die sekretive Tätigkeit der Drüse auf dem Fuße folgt.

Zusammenfassung.

1.nbsp;Der Saft des Flußkrebses wirkt kräftig auf Eiweiß und Pepton,
sehr schwach auf Dipeptide (Glyzyl-glyzin und Leucyl-glyzin).

2.nbsp;Der Saft verdaut auch Bindegewebe, vor allen Dingen das Binde-
gewebe der präparierten Darmsaite, wie sie Sahli zur Unterscheidung
zwischen peptischer und tryptischer Verdauung beim Menschen ver-
wendet. Der Saft verhält sich hiernach wie Pepsin, verdaut das Binde-
gewebe aber im Gegensatz zu Pepsin der Wirbeltiere bei einem pj,
von 6,8. Auch andere Formen von nativem Eiweiß, sowie Pepton werquot;
den (wie bekannt) verdaut. Der Saft ist also imstande, alle Eiweiß-
fraktionen zu spalten, welche in den Verdauungsorganen der Wirbeltiere
durch die verschiedenen daselbst anwesenden proteolytischen Teil-
enzyme gespalten werden können.

3.nbsp;Es kommt im Safte des Flußkrebses eine Autolyse vor. Sie zeigt
zwei Pii-Optima. Das eine liegt bei 3,ö, das andere bei 9. Die niedere
Lage des erstgenannten Optimums bedingt es, daß innerhalb des natür-
lichen Magensaftes Autolyse nur in sehr bescheidenem Ausmaße statt-
findet. Das bedingt Schutz des eigenen Eiweißes, da der Saft im Hunger
ein pH von 5, nach Fütterung ein solches von 5,5 hat.

4.nbsp;Bei Ph 4 beginnt eine Trübung des Saftes. Bei pj, 3 ist alles Eiweiß
niedergeschlagen und es hat die Enzyme, adsorptiv gebunden, mit sich
zu Boden gerissen. Im Zustande adsorptiver Bindung findet die Autolyse
optimal statt.

5.nbsp;Bei der Verdauung verschiedener eiweißartiger Substrate haben
sich verschiedene Optima ergeben; in der Regel (und bei der Anwendung

bestimmter Formen der Titrierung) handelt es sich um 3 Optima. Das
eine für Pepto- und gesamte Proteolyse liegt bei pjj 6,2—6,7. Für den
Spaltungsbeginn der Eiweißkörper (mit Ausnahme der Bindegewebe) zeigt
sich bei dem gleichen p^-Wert ein Minimum, während Optima hierfür
bei pn 8—9 (Fibrin, Gelatine) bzw. 5,3 (Gelatine) liegen.

6.nbsp;Das Optimum bei p^ 5 ist bisher nicht eindeutig festgestellt,
da bei niedrigerem p^ als etwa 4 der Magensaft selbst fast unwirksam
geworden ist (siehe oben). Es ist sogar wahrscheinlicher, daß dieses
Optimum tatsächlich niedriger als bei 5 liegt, da bei anderen Inverte-
braten ein Säureoptimum bei pjj 3—3,5 gefunden ist, wenn man ver-
hältnismäßig eiweißarme Organextrakte verwandte (vgl. Yonge [19],
Bodansky [1]). Ich will mein Experiment zunächst für die Feststellung
dieses Wertes fortsetzen.

7.nbsp;Die gefundenen Optima liegen niemals genau beim isolektrischen
Punkt des Substrates.

8.nbsp;Aus den verschiedenen pjj-Optima lassen sich keine Schlüsse
ziehen auf das Vorhandensein verschiedener protoelytischer Teilenzyme.
Denn erstens liegen die gefundenen Optima des Flußkrebses (im Gegen-
satz zu manchen andern Invertebraten) zu nahe beieinander, um zu
einem Schlüsse zu berechtigen. Zweitens ergaben sich bei der Anwen-
dung spezifischer Substrate, die beim Wirbeltier nur durch eines der
Teilenzyme angegriffen werden, beim Flußkrebs Optima, die vollkommen
anders sind, als diejenigen der Teilenzyme bei den Vertebraten, welche
dieselben Substrate angreifen; z. B. hat Bindegewebe (auch bei Be-
stimmung des Spaltungsbeginnes) ein mittleres Pn-Optimum von un-
gefähr 6,7, Pepton F mit seinem größeren Gehalt an Pepton hat einen
etwas niederen pg (6,2), als das Albumosengemisch, welches unter dem
Namen „Wittepeptonquot; käuflich ist (6,7).

9.nbsp;Wenn man nach der Fütterung der Tiere die verschiedenen Se-
kretionsstufen (im Sinne Hieschs) auf ihre Wirkung auf verschiedene
Substrate hin untersucht, die beim Wirbeltier durch verschiedene Teil-
enzyme angegriffen werden, so zeigt sich, daß der abgeschiedene Saft
immer die gleichen Enzyme enthält, d. h. die Maxima und Minima
aller untersuchten Wirkungen fallen zusammen. Es gelingt also auch
nicht auf dem Wege der Stufenuntersuchung verschiedene Enzymindi-
viduen voneinander zu unterscheiden.

10.nbsp;Wir dürfen von einer alles umfassenden proteolytischen Wirkung
reden, aber noch nicht von verschiedenen proteolytischen Individuen.
Wenn es einmal gelingen sollte, diese letzteren durch moderne Isolie-
rungsmethode einzeln darzustellen, dann ergibt sich heute schon aus
unserem Resultate, daß diese Teilenzyme andere Eigenschaften haben

werden, als diejenigen des Wirbeltierkörpers, und daß man in der all-
gemeinen Physiologie daher diesen Teilenzymen neue Definitionen wird
geben müssen.

Die Untersuchung wurde mit Unterstützung des Rockefellers In-
ternational Education Board ausgeführt; ich danke dem Board bestens
für seine Hilfe; ebenso danke ich Herrn Prof. H. Jordan, der mir einen
Platz in seinem Institut zur Verfügung stellte, mir das Thema für diese
Arbeit gab und mich stets mit seinem Rat unterstützt hat. Dem Herrn
Dr. H. J. vonk danke ich für seine freundliche Hilfeleistung.

Bibliograplile.

1. Bodansky, M. und Rose, AV.: Americ. Journ. Physiol. 62, 473. 1922. —

2.nbsp;Dernby: Journ. of Biol. Chera. 35, 179. 1918. — 3. Eulcr, H.: Chemie der En-
zyme II. Teil, 2. Abs. 1927. — 4. Hirsch, G. C.: Biol. Zentralbl. 38, 41. 1918. —
5. Ders. und Jacobs, W.: Zeitschr. f. Zellforsch, u. mikroskop. Anat. 3,198.1926.
— 6. Hoppe-Seyler: Arch. f. d. ges. Physiol. 14, 395. 1877. — 7. Jordan, H. J.:
Ebenda 101, 263. 1904. — 8. Ders : Vergleichende Physiologie wirbelloser Tiere.
1. Ernährung. 1914. — 9. Ders. und Hirsch, G. C.: Handb. norm, pathol. Physiol.

3,nbsp;24 (besonders S. 89). 1927. — 10. Krüger, P. und Gractz, E.: Zeitschr. f. phy-
siol. Chem. 166, 128. 1927. — 11. Krukenberg: Heidelberger Untersuch. 1, 331;
2,1 u. 261. 1878. — 12. Long, J. H. und Fenger, F.: Journ. of the Americ. Chem.
Soc. 39, 1278. 1917. — 13. Nirensteln: Zeitschr. f. allg. Physiol. 6. 1905. —
14. Oomen, H. A. P. C.: Public. Staz. Zool. Napoli 7, 3. 1926. — 15. Ringer und
Gruttcrink, B. W.: Zeitschr. f. physiol. Chem. 1Ó6, 275. 1926. — 16. Bona, P.:
Praktikum der physiologischen Chemie. 1. Fermentmethoden. 1926. — 17. van der
Heyde, H. C.: On the physiology of digestion, respiration and excretion in Echino-
dermes. Diss. Amsterdam. 1922. — 18. Vonk, H. J.: Zeitschr. f. vergl. Physiol.
5, 445. 1927. — 19. Yonge, C. M.: Journ. of Mar. Biol. Assoc. 14, 295. 1920.

Protokolle.

Tabelle 1. Die Wassorstoffionenkonzentration des Magensaftes von
A. macrodactylus.

Tabelle 2. Die Autolyse des Magensaftes.

A: 10 ccm Pufferlösung und 2 ccm verdünnter Magensaft (1 x 20), 37» C, 19 Stun-
den; 3 ccm Reaktionsgemisch ist in 30 ccm absoluten Alkohol gebracht, mit n/10
NaOH titriert, Thymolphthalein als Indikator. Der pg der Gemische wurde nicht
gemessen, da in so verdünnten Lösungen die Unterschiede zwischen dem Pu der
Lösungen und dem des Pufferungsgemisches xmbedeutend sind.

B: Die Autolyse bei konzentrierteren Lösungen von Magensaft, a) 10 ccm Puffer,
3 ccm Wasser, und 2 ccm Magensaft (zentrifugiert), 9 Stunden, 37quot; C. 5 ccm
wurden in 50 ccm absolutem Alkohol mit 10/n NaOH titriert, Thymolphthalein
als Indikator. Pn 3,6—9,9 in 3 Reihen.

b) 6 ccm Puffer, 2 ccm Wasser und 1 ccm Magensaft, 19 Stunden, 370 C. 3 ccm
wurden in 30 ccm absoluten Alkohol mit n/10 NaOH titriert, Thymolphthalein

als Indikator.

1 In saurem Milieu findet Präzipitation der Eiweißkörper des Magensaftes
statt, aber dies stört die Autolysevcrsuche nicht (vgl. Kapitel über Autolyse).

Tabelle 3. Die Verdauung der nativen Eivveißkörper mit
Astacus-Magensaft.

A: Kasein: a) 13 ccm Puffer, 0,1g Kasein und 1,3 com Magensaft (1x10);
1 Stunde; 370 C. 5 ccm waren wie oben in Alkohol titriert.

b) 16 ccm Puffer, 0,1 g Kasein und 1,2 com Magensaft (1 x 10); 1 Stunde, 37quot; C.

Titration wie oben.

B: Gelatine: a) 6ccm Puffer, Iccm 6%ige Gelatine und 1 ccm Magensaft (1 x 30);

45 Minuten, 37» C.

b) 1 ccm Wasserextrakt der Mitteldarmdrüse statt des Magensaftes; l^/j Stun-
den, 37quot; C. Die beiden Tritationen mit 3 ccm Gemisch in absolutem Alkohol.

C. Fibrin: a) 10 ccm Puffer. 0,1 g Fibrin und 1 com Magensaft (1 X 10); 3 Stun-
den, 37quot; C.

b) 16 com Puffer, 0,05 g Fibrin und 1,3 ccm Magensaft (1 x 10); 37» C, 3 Stunden.
Titration in Alkohol mit 3 (a) bzw. 5 (b) ccm Reaktionsgemisch.

Tabelle 4. Die Wirkung von Pepsin auf Kollagen.

A. 10 ccm Puffer, 3 ccm 6%iges Pepsin und 0,05 g SahliscIics Catgut; 38quot; C,
18 Stunden. 5 com wurden in öOccm absolutem Alkohol mit n/10 NaOH titriert,
Thymolphthalein als Indikator.

B: 10 ccm Puffer, 5 com 10%igc^ Pepsin und 0,05 g SAULisches Catgut; SO» C,
18 Stunden. Titration wie oben.

C: Puffer und Pepsin wie oben, 0,05 g getrocknetes Ligamentum nuchae vom
Rind; 37» C, 18 Stunden. Titration wie oben.

Tabelle 5. Die AVirkung von Trypsin auf Kollagen.
10 ccm Puffer (Glykokoll NaOH, pg 8,17), 2 ccm 3%iges Pankreatin (Rhenania)
und 0,05 g Kollagen; 38«C, 17Stunden. 5 ccm wurden in Alkohol mit n/lONaOH
titriert, Thymolphthalein als Indikator.

Tabelle 6. Die Wirkung des Magensaftes auf Kollagen.

A: a) 7 ccm Pufferlösung wurden mit 2 ccm Magensaft gemischt, hiervon wurden
3ccm zusammen mit 0,05 ccm Catgut von Sahli bei 37quot; C 4 Stunden lang gehalten.
2 ccm Gemisch wurden in 20 ccm absolutem Alkohol titriert, Thymolphthalein
als Indikator. Die Autolyse wurde kontrolliert.

b) 10 ccm Puffer, 1 ccm Saft (1 x 10) und 0,05g Catgut von Sahu; 370C, 6 Stun-
den. Vor dem Experiment wurden 3 ccm für die pg-Bestimmung genommen.
3 ccm sind wie gewöhnlich in Alkohol titriert.

B: 10 ccm Puffer, 1 ccm Magensaft (1 x 10) und 0,1 g gewöhnliche Darmsaite,
hiervon wurden 3 ccm vor dem Experiment für die pg-Bestimmung genommen.
37° C, 4 Stunden. 3 ccm wurden in 30 ccm absolutem Alkohol mit n/10 NaOH
titriert, Thymolphthalein als Indikator.

C: 10 ccm Puffer, 1 ccm Magensatt (1 x 10) und 0,1 g getrocknetes Ligamentum
nuchae vom Rind, hiervon wurden 3 ccm vor dem Experiment für die p„-Bcstim.
mung genommen, 370 C, G Stunden. Titration wie oben.

1 3 ccm Gemisch wurden in 35 ccm Alkohol titriert, der jedoch 0,5 ccm n/10
HCl enthält.

Tabelle 7. Die Wirkung des Magensaftes auf Dipeptide.

A: 6 ccm Puffer, Iccm Magensaft und 3 com l,25%iges Leucylglyzin; 37quot; C,
19 Stunden. 3 ccm wurden in 30com absolutem Alkohol mit n/10 NaOH titriert.
Die Autolyse wurde kontrolliert (statt Dipeptidlösung das gleiche Volumeri

destilliertes Wasser).

B: a) Bedingungen wie oben; statt Leucylglyzin wurde 2%ige3 Glycylglyzin an-
gewandt. Auch die Kontrolle mit gekochtem Magensaft wurde gemacht, um zu -i

b) 10 ccm Puffer, 2 ccm Magensaft und 3 ccm 2%ige Glyzylglyzin S?» C,
19 Stunden. 5ccm wurden wie gewöhnlich in Alkohol titriert. Die Kontrolle mit
gekochtem Magensaft und Dipeptidlösung Avurde am sauren Ende gemacht. Die
ganze p^-Reihe wurde in 3 Serien untersucht.

Z. f. vergl. Pliysiologie Bd. 7.

Tabelle 8. Die Wirkung des :Magensaftes auf Peptone.

A: a) 6 ccm Puffer, 1 ccm Magensaft (1 x30 centrifugiert) und 1 ccm 6%iger
Wittepepton; 37quot; C, 45 Minuten. 3 ccm wurden wie gewöhnlich in Alkohol titriert.
Die Kontrolle mit gekochtem Magensaft wurde gemacht. Wenn die gleiche Puffer-
lösung gebraucht wird, so unterscheiden sich die p^ des Reaktionsgemisches und
der Kontrolle nur wenig (siehe 1. und 8. Kolumne), so daß nicht alle p,j gemessen

wurden.

Experiment

Kontrolle mit gekochtem Magensaft

b) 10 ccm Puffer, 2 ccm Wasserextrakt der getrockneten Mittcldarmdrüse und
2 ccm 5%iger Wittepepton; 37quot; C, 1!) Stunden. 5 ccm wurden wie gcwöhnlicli in

Alkohol titriert.

1 Vor der Titration wurden 5 ccm n/10 HCl hinzugefügt und die Titration
wurde mit 100 ccm Alkohol ausgeführt.

B: 10 ccm Puffer, 2 ccm Wasserextrakt der getrockneten Mitteldarmdrüse und
3 ccm 5%iger Pepton F (ex carne, Witte [Rostock]). Titration wie oben.

Tabelle !). Die pn-Optinia des 3Iagensaltes für KiM eilJspaltungsbcgiun
(bis zu den Polypeptiden).

0 ccm Puffer, 1 ccm Magensaft (1 x 30) und 1 ccm ß%igc Gelatine; 37quot; 0,45 Min.
3 ccm Avurden wie gewöhnlich a) in absolutem bzw. b) in 55%iger Alkohol titriert.

Tilbollo 11. Die AVii\'knng des 3Iagonsiiftcs iiulquot; iiufgcnirbto fosto
Eiwoiükörperquot;.

A: Mit Karmin gefärbtes Fibrin. 5 ccm l\'iiffer, 0,5 ccm Magensaft (1 x 7,5) und
0,05 g Fibrin. Zimmertemperatur, 21 Stunden. Kolorimeterstandard willkürlicli.

1 Ich danke hier bestens Herrn Prof. Dr. W. E. Ringer, der mir das gefärbte
Fibrin zur Verfügung stellte.

B: Mit Spritblau gefärbtes Fibrin, a) 5 ccm Puffer, 1 com Magensaft (1 x 10) und

0,05 g Fibrin. 37quot; C. 2 Stunden,
b) 5 ccm Puffer, 2 ccm Magensaft (1 x2) und 0,05 g Fibrin. 37° C, 2 Stunden.

Pufferlüsims

p„ l)ei Ende ; KolorimetiTzalil

In beiden Fällen wurden Substrat und Puffer gcinischt, bei 37quot; C 30 Minuten
lang im Thermostaten gehalten, erst dann wurde die Fermentlösung zugegossen.
Farbenstandard willkürlich.

C: Mit. Karmin gefärbtes Ligamentum nuchae (vom llind)i.

a)nbsp;G ccm Puffer, 1 ccm Magensaft (1 x 10) und 0,08 g Ligament. Zimmertempe-

ratur, 19 Stunden. Kolorimctcrstandard willkürlich.

b)nbsp;5 ccm Puffer, I ccm Magensaft (1 x 10) und 0,07 g Ligament. Zimnicrteinpo-

ratur, 19 Stunden. Kolorinieterstandard willkürlich.

1 Das Ligament (in Alkohol aufbewalirt) wurde möglichst klein gcscluiittcn
und mindestens 3 Tage in einer gesättigten ammouiakalischen Lösung von
Karmin gelassen.

I): Mit Spritblau geLärbtes Ligamentum nuchae (vom Rinde) i. 5 ccm Puffer,
1 ccm Magensaft (1 x 10) und 0,06 g Ligament. 37» C, 5 Stunden. Kolorimeter-
standard willkürlich. Das Experiment ist einmal wiederholt worden.

Tabelle 12. Sekretionsrhythnins des 3Iagcnsaftes nach der Fütterung.

A: 5 ccm Biphthalat Puffer (Pi, 6,59) und 0,08 g Spritblaufibrin, 37quot; C; nach
30 Minuten wurden 2 ccm Magensaft (1 x20) zugefügt, 45 Minuten Verdauung.
Farbenstandard willkürlicli.

^ Das Ligament war 2 Tage lang mit alkoliolischer Lösung von Spritblau
(0,05%) gefärbt.

C: Die Magensäfte wurden mit SOfach Volumen Waf?ser verdünnt. Alle Experi-
mente bei 37quot; C.

a)nbsp;5 ccm Puffer (6,5), 2 ccm Saft und 0,05 g Spritblaufibrin; 35 Minuten vorläu-

fige Quellung, 45 Minuten Verdauung.

b)nbsp;10 ccm Puffer (6,5), 2 ccm Saft und 2 ccm 5%ige Gelatine 3,5 Stunden. 5 ccm

wurden in Alkohol titriert.

c)nbsp;10 ccm Puffer (6,5), 2 ccm Saft und 2 ccm 3%iges Pepton F; 4,5 Stunden.

5 ccm wurden in Alkohol titriert.

d)nbsp;10 ccm Puffer (6,5), 2 ccm Saft und 2 ccm 5%iges Wittepepton; 3 Stunden

50 Minuten. 5 ccm wurden in Alkohol titriert.

1): Die Magensäfte wurden mit 3()fach Volumen Wasser verdünnt. Alle Experi-
mente bei 37quot; C.

a)nbsp;10 ccm Glykokoll-Puffer (p„ 6,7), 2 ccni Saft und 0,05 g Spritblaufibrin; 30 Mi-
nuten vorläufige Quellung, 1 Stunde Experiment. Kolorimetprstnndard willkürlich.

b)nbsp;lOecm Biphthalat-Puffcr (Pj, 5,8), 2 ccm Saft und 0,1 g Kasein; 4 Stunden.

5 ccm wurden in Alkohol titriert.

c)nbsp;10 ccm Hiphthalat-Puffcr (Pn 6,1), 2 ccm Saft und 2 ccm .^quot;/iigcs Pepton F;

3Stunlt;len -10 Minuten. 5 ccm wurden in Alkohol tritriert.

d)nbsp;10 ccm Puffer, 4 ccm Saft und 2 ccm l%iges Glyzylglyzin; 19 Stunden. 5 ccm

wurden in Alkohol titriert.

e)nbsp;lOecm Puffer, 2ccm Saft und 0.05g SAiiLisehes Catgut; 191/.^ Stunden, öecm

wurden in Alkohol titriert.

0. Shinoda:
Tabelle 12. D. (Fortsetzung).

Dauer nach der Fütterung in Stunden.....i 0,0

c (Pepton F)

1.nbsp;Titration . . .

2.nbsp;Titration . . .
Zunahme . . . .

d (Glyzylglyzin) . . .
e (SAHLisches Catgut).

E): Die Magensäfte wurden mit 20faohcn Volumen Wasser verdünnt. Alle Experi-
mente bei 37quot; C.

a)nbsp;10 ccm Biphthalat-Puffer (pa 5,6), 2 ccm Saft und 3 ccm 5%ige Gelatine;

1 Stunde. 5 ccm wurden in Alkohol titriert.

b)nbsp;10 ccm GlykokoU-Puffer (py 6,7), 2 ccm Saft und 3 ccm 5%iges Wittepepton

2 Stunden. 5 ccm wurden in Alkohol titriert.

c)nbsp;10 ccm Biphthalat-Puffer (6,1), 2 ccm Saft und 3 ccm 6%iges Pepton F;

2 Stunden 50 Minuten. 5 ccm wurden in Alkohol titriert.

d)nbsp;10 ccm Puffer (py 5,8), 2 ccm Saft und 0,1 g Kasein; 19 Stunden, 5 ccm wur-

den in Alkohol titriert.

e)nbsp;10 ccm Puffer (p^ 6,7), 2 ccm Saft und 0,05 g Catgut von Sahli; 19 Stunden.

5 ccm wurden in Alkohol titriert.

f)nbsp;5 ccm Puffer (p^ 6,7), 1 ccm Saft und 0,05 g Spritblaufibrin. 30 Minuten vor-

läufige Quellung, 45 Minuten Verdauung.

g)nbsp;Farbe der verdünnten Säfte. In beiden Fällen waren der Kolorimeterstan-

dard willkürlich.

a (Gelatine)

1.nbsp;Titration . . .

2.nbsp;Titration . . .
Zunahme ....

b (Wittepepton)

1.nbsp;Titration . . .

2.nbsp;Titration . . .
Zunahme ....

c (Pepton F)

1.nbsp;Titration . . .

2.nbsp;Titration . . .
Zunahme ....

d (Kasein)

1.nbsp;Titration . . .

2.nbsp;Titration . . .
Zunahme ... .

e (SAHLisches Catgut)

1.nbsp;Titration . . .

2.nbsp;Titration . . .
Zunahme ....

f (Fibrin)

Kolorimeterzahl .
g (Verdünnter Saft)
Kolorimeterzahl .

Tabelle 13. Die Sekretion dos Verdauungssaftes nach der künstlichen
Entleernng des Magens.

A: Die Magensäfte wurden mit lOfachem Volumen Wasser verdünnt; 37» C.
a) Die Farbe der verdünnten Säfte.

b)nbsp;5 ccm-Biphthalat-Puffer (pn 6,2), 2 ccm Saft und 0,05 g Spritblaufibrin.
30 Minuten vorläufige Quellung, - 45 Minuten Verdauung. In a und b war der

Kolorimeterstandard beide willkürlich.

c)nbsp;10 ccm Biphthalat-Puffer (pu 5,9), 2 ccm Saft und 2 cöm 6%ige Gelatine;

1 Stunde.

d)nbsp;10 ccm Glykokoll-Puffer (pji 8,0), 2 ccm Saft und 3 ccm 6%iges Wittepepton
45 Minuten. In c und d je 5 ccm wurden in Alkohol titriert.