TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOC-
TOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE
RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG
VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS JHR. DR. B. C.
DE SAVORNIN LOHMAN, HOOGLEERAAR IN DE
FACULTEIT DER RECHTSGELEERDHEID, VOL-
GENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNI-
VERSITEIT TE VERDEDIGEN TEGEN DE BE-
DENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS- EN
NATUURKUNDE OP MAANDAG 10 NOVEMBER
1930 DES NAMIDDAGS TE VIER UUR DOOR

Bij de voltooiing van dit proefschrift wii iilt; gaarne van
de gelegenheid gebruik maken, een woord van dank te rich-
ten tot allen, die invloed op mijn wetenschappelijke oplei-
ding uitoefenden.

In de eerste plaats tot U, Hooggeleerden Went, hoog-
geachten promotor. Nooit genoeg zal ik het kunnen waar-
deeren, dat ik mijn proefschrift onder Uw leiding heb mogen
bewerken. Uw warme belangstelling in mijn werk is voor
mij van groote beteekenis geweest. Niet minder ben ik Me-
vrouw Went en U erkentelijk voor de groote hartelijkheid
en gastvrijheid, die gij mij bewezen hebt.

Hooggeleerde Westerdijk, Uw colleges en practica zijn
voor mij van groote waarde geweest. Tevens heb ik het zeer
op prijs gesteld, dat ik assistente bij U heb mogen zijn. Ik
dank U voor alles, wat gij gedurende deze jaren voor mij
geweest zijt.

U, Hooggeleerden PuIIe en Nierstrasz, dank ik voor wat
gij hebt bijgedragen tot mijn wetenschappelijke vorming.

Zeer erkentelijk ben ik U, Hooggeleerden Jordan, van
Romburgh, Kruyt en Moll voor het onderwijs in mijn eerste
studiejaren.

Zeer gewaardeerd heb ik het, Hooggeleerde Baas Becking,
dat ik bij den aanvang van mijn onderzoek vele goede
raadgevingen van U heb mogen ontvangen.

Bij de bewerking van mijn dissertatie heb ik veel hulp
mogen ondervinden in het Physisch Laboratorium te Utrecht
en in het Laboratorium voor Technische Botanie te Delft,
waarvoor ik U, Hooggeleerden Ornstein en van Iterson,
veel dank zeg. Ook de assistenten in bovengenoemde labo-

ratoria zijn mij zeer behulpzaam geweest. Geachte Vermeu-
len, zonder Uw hulp zou het mij niet mogelijk zijn geweest
het physische deel van dit proefschrift te bewerken. De
groote bereidwilligheid, waarmee gij mij steeds behulpzaam
zijt geweest, heb ik zeer op prijs gesteld. Ook U, geachten
Eilers, ben ik voor Uw nuttige wenken en hulp zeer erken-
telijk.

U, Zeergeleerden Nuernbergk, ben ik zeer verplicht door
Uw hulp en het gebruik van Uw toestel.

Verder wil ik woorden van dank richten tot het geheele
personeel van het Botanisch Laboratorium; in het bijzonder
dank ik U, waarden A. de Bouter, voor de zorg door U aan
de teekeningen besteed.

§ 1. Microchemisch aantoonen van de kleurstof.
§ 2. Oplosbaarheidseigenschappen van de kleurstof

5.nbsp;De chromatografische analyse van Tsw^ett .
§ 6. Methodiek van de chromatografische analyse

lyse op de schimmelkleurstoffen ....
§ 8. Is er nog een derde kleurstof aanwezig . .

§ 10. Het uitkristalliseeren van carotinoïden . .
§11. Intensiteitsbepaling van de kleurstoffen met de
colorimeter...........

13
13

20
23
26
28

HOOFDSTUK V. Dc invloed van lucht op de vor-
ming van de kleurstoffen en van dc conidiën . . 54

electrische lichtbron op de kleurstofvorming . 70
§ 4. De invloed van intermitteerende belichting met
een electrische lichtbron op de kleurstofvor-
ming ..............72

Het oorspronkelijke doel van dit onderzoek was het ver-
band na te gaan tusschen de hoeveelheid licht en de hoe-
veelheid gevormde kleurstof in Monilia sitophila (M o n t.)
S a c c.

In de publicaties van Went (1901 b, 1904) wordt ver-
meld, dat Monilia sitophila in het donker gekweekt kleur-
loos is, terwijl de schimmel in het licht een oranje kleurstof
vormt. Het bleek, dat een cultuur van de schimmel, die in
het donker gegroeid was, zich in diffuus daglicht na 3 of 4
uur rose kleurde, langzamerhand donkerder werd en ten-
slotte in intensief oranje overging. Voor de vorming van de
kleurstof is de inwerking van het licht op de schimmel
absoluut noodzakelijk en wel alleen dat deel van het licht,
dat de stralen met kleine golflengten bevat; rood, geel en
oranje licht hebben geen invloed. Dit laatste werd waarge-
nomen met klokken van Sachs, waarin zich vloeistoffen
bevonden, die verschillende deelen van het spectrum absor-
beerden.

De kleurstofvorming geschiedt langzamerhand, eenigen
tijd na het ophouden van de belichting wordt ze eerst zicht-
baar. Een korte belichting, 15 min. inwerking van diffuus
daglicht, is reeds voldoende om zichtbare kleurstofvorming
te verkrijgen; bij een langere belichting hoopt zich de wer-
king op en wordt er meer en meer kleurstof gevormd. Ver-
dere photometrische onderzoekingen werden niet gedaan,
daar een nauwkeurige bepaling van de kleurstof niet moge-
lijk was.

Het pigment, waardoor de schimmel oranje gekleurd
wordt, zou Carotine zijn, wat met de kalimethode van
Molisch (1896) aangetoond werd. De met deze me-
thode verkregen kristallen gaven de microchemische Caro-
tine reacties. Ook wat zijn oplosbaarheid betrof, gedroeg
het pigment zich als Carotine. Daar uit de schimmel geen
zuivere carotine-oplossing verkregen werd, kon spectro-
scopisch slechts vastgesteld worden, dat de kleurstof-
oplossing een absorptieband bezit, die het geheele blauwe
en violette deel van het spectrum omvat, ongeveer van
A 0.5 af.

Moeilijk kon vastgesteld worden, hoe de Carotine in het
cytoplasma verdeeld voorkomt. Het maakte den indruk als
zou de kleurstof in zeer fijne druppeltjes (misschien in een
vet opgelost) aanwezig zijn.

Deze veronderstelling is door latere onderzoekingen over
het voorkomen van Carotine in de cel zeer aannemelijk ge-
worden. Men heeft n.1. gevonden, dat Carotine en daarmee
verwante pigmenten heel vaak in cellen voorkomen, waarin
lipoïden aanwezig zijn. Men heeft daarom aan die pig-
menten den gezamenlijken naam van vetkleurstoffen of,
zooals Czapek (1913) heeft voorgesteld, van chromoli-
poïden gegeven. Tswett (1911) noemde die chromoli-
poïden, die chemisch nauw verwant zijn met Carotine, caro-
tinoïden. Czapek (1922) wijst er op, dat de groote
meerderheid van de oranje-geel en rood gekleurde schim-
mels kleurstoffen schijnt te bevatten uit de groep van de
chromolipoïden, maar dat deze nog nooit precies bepaald
zijn. Zelfs moet nog vastgesteld worden of Daucuscarotine
wel bij schimmels voorkomt.

Door deze opmerking van Czapek leek het mij niet
overbodig, voordat ik mij met het eigenlijke onderzoek zou
gaan bezig houden, eerst nauwkeurig de chemische en
physische eigenschappen van de schimmelkleurstof vast te

stellen en te vergelijken met Daucuscarotine, wat beschre-
ven is in hoofdstuk III en IV.

Bij het herhaaldelijk kweeken van de schimmel merkte
ik op, dat luchttoevoer van belang is voor de vorming van
de kleurstof en de conidiën. Dit heeft geleid tot de proeven
vermeld in hoofdstuk V.

In hoofdstuk VI heb ik, behalve het verband van de
hoeveelheid licht en de hoeveelheid gevormde kleurstof, ook
nog besproken hoe met een nauwkeurige methode nage-
gaan is, bij welke golflengten van het licht kleurstofvor-
ming mogelijk is.

Voor het onderzoek werd een stam van Monilia sitophila,
afkomstig van het „Centraal Bureau voor Schimmelcultu-
resquot; te Baarn, Holland, gebruikt.

Monilia is een zeer gemakkelijk groeiende schimmel, die,
in cultuurbuizen met een gunstigen voedingsbodem, rijkelijk
oranje conidiën vormt. In oudere cultures vormen zich ste-
riele peritheciën, in hun aanvangsstadium beschreven door
Went (1901a), maar daar ze niet tot verdere ontwikke-
ling kwamen, was het niet mogelijk de schimmel de wer-
kelijke plaats in het systeem te geven. Shear en Dodge
(1927) gelukte het rijpe peritheciën te verkrijgen. Het as-
cosporenstadium van Monilia sitophila behoort tot de Pyre-
nomyceten en de schimmel wordt nu tot een nieuw geslacht
Neuwspora gerekend. Uit het onderzoek van Shear en
Dodge is gebleken, dat N. sitophila heterothallisch is,
éénsporecultures geven steeds alleen het conidiënstadium.

Van nu af zal ik in den tekst de schimmel niet meer
Monilia, maar Neurospora noemen.

Als men den invloed van verschillende uitwendige om-
standigheden op de kleurstofvorming na wil gaan, moet men
de schimmel kweeken onder zoo gunstig mogelijke voe-
dingsvoorwaarden. Over het algemeen voldoen de natuur-

lijke voedingsbodems beter dan de syntlietische, maar deze
laatste hebben het groote voordeel, dat men precies de
samenstelling hiervan kent. Verder is het de vraag wat beter
geschikt is, vaste of vloeibare voedingsbodems. Synthetische
agarbodems werden het eerst geprobeerd.

Went (1901a) vond, dat maltose, zetmeel of technische
glucose goede koolhydraten voor Neurospora sitophila zijn.
Bij alle drie waren als voedingszouten toegevoegd 0,5 %
KNO3, 0,1 % KH2PO4, en 0,05 %nbsp;Inderdaad

bleek, dat de groei op deze drie agarbodems in glazen cul-
tuurdoozen, beschreven in § 4, vrij goed was. De schim-
mel vormde op den vasten bodem een vrij dikke mycelium-
laag, luchtmyceliuni was slechts weinig aanwezig. Om het
myceliumdek geheel vrij van den voedingsbodem te krijgen,
bleek het noodig dezen laatste te koken. Hierdoor is het
gebruik van vaste voedingsbodems onmogelijk, daar de
schimmelkleurstoffen, die tot de carotinoïden behooren, niet
aan hooge temperatuur blootgesteld mogen worden, waar-
op door E s c h e r (1909) gewezen werd. E s c h e r kreeg
n.1. de beste en zuiverste carotine-opbrengst uit Daucus
carota, als de wortelen niet van te voren gekookt waren,
wat vroegere onderzoekers wel steeds gedaan hadden.

Ook natuurlijke voedingsbodems, als gestoomde rijst,
wortelen en brood, zijn ongeschikt; het mycelium groeide
hier geheel om- en doorheen en was er niet vrij van te krij-
gen.

De drie bovengenoemde koolhydraatbodems werden nu
zonder toevoeging van agar, dus als vloeibare voedings-
bodem geprobeerd. De schimmel groeide over de oplossing
naar de opstaande kanten van de doozen en vormde daar
wat luchtmycelium. Het schimmeldek vormde veel minder
kleurstof dan het luchtmycelium, wat aan zuurstofgebrek
te wijten is (zie hoofdstuk V). Voor mijn verdere proeven
was het dus noodzakelijk, dat ik uitsluitend luchtmycelium
gebruikte. In bovengenoemde cultures was het gevormde

luchtmycelium te gering om mee verder te werken. Daar
Went (1901 b) vermeldt, dat de oogst van N. sitophila
met de concentratie van de koolhydraten stijgt, leek het mij
heel goed mogelijk, dat ook de hoeveelheid luchtmycelium
zou toenemen met de koolhydraatconcentratie.

Bovendien vond ik in de literatuur eenige opgaven, die er
op wijzen, dat ook de kleurstofvorming hierdoor beinvloed
wordt. Nader onderzocht moest dus ook worden, of bij een
bepaalde koolhydraatconcentratie een optimale pigment-
vorming plaats heeft.

§ 3. De invloed van de koolhydraatconccntratics op de vorming
van het luchtmycelium cn de kleurstof.

L i p p m a a (1925) ging de rhodoxanthinevorming na in
geïsoleerde bladfragmenten van Reseda odorata op saccha-
rose-oplossingen en vond, dat bij grootere suikerconcen-
traties dit Carotinoide sneller gevormd wordt; een optimale
concentratie werd niet gevonden. Te hooge concentraties
veroorzaakten het afsterven van de bladfragmenten, zonder
dat zich rhodoxanthine gevormd had. C h o d a t en
Mayer (1927) werkten over de carotinevorming bij
eenige algen. Deze onderzoekers constateerden verhoogde
kleurstofvorming bij toenemende suikerconcentratie.

Ook voor niet-carotinoïden werd waargenomen, dat de
kleurstofvorming soms beinvloed wordt door concentratie-
verschillen van de koolhydraatvoeding, o.a. vond Nau-
mann (1912), dat voor Epicoccum purpurascens het op-
timum van de pigmentvorming bij een 5—10% glucose-
oplossing ligt. Bij een concentratie van 50—60 % glucose
groeide de schimmel nog wel, maar de kleurstofvorming
bleef geheel uit. Dat bij dit hooge glucosegehalte geen
kleurstof gevormd werd, wordt aan den hoogen osmotischen
druk toegeschreven. In het onderzoek door Hibino
(1925) over Monascus purpureas wordt vermeld, dat be-

halve voor saccharose, de kleurstofvorming ongeveer even-
redig is met de koolhydraatconcentraties.

Om na te kunnen gaan, of ook bij Neurospora de vor-
ming van de pigmenten en het luchtmycelium door de kool-
hydraatconcentraties beinvloed wordt, werden eenige reek-
sen van cultures gemaakt. Voor deze cultures werd een
voedingsbodem gebruikt, die als zouten 0,3 % KNO3,
0,05 % KH2PO4 en 0,01 % MgS04 bevatte. N a u m a n n
(1912) kreeg in deze verhouding de beste pigmentvorming
bij E p i c 0 c c u m. Van deze vloeistof werd in ieder van
de glazen cultuurdoozen 20 c.c. gebracht en hieraan de
verschillende hoeveelheden glucose of maltose toegevoegd.
De volgende percentages werden gebruikt:
% glucose 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50.
% maltose 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70.
In de oplossing met maltose groeit de schimmel sneller
dan in die met glucose. Het meeste luchtmycelium wordt
gevormd in de oplossing met 5—10 % glucose of 20—30 %
maltose. Bij hoogere concentraties neemt de hoeveelheid
luchtmycelium af, de groei wordt minder, om in een op-
lossing met 40 % glucose of met 70 % maltose geheel op
te houden. Dit ophouden van den groei is naar alle waar-
schijnlijkheid terug te brengen op den hoogen osmotischen
druk. Voegt men n.1. bij een 5 % glucoseoplossing zooveel
NaCl toe, dat deze oplossing isotonisch is met de 40 %
glucoseoplossing dan treedt geen groei op.

Na gelijke belichting vertoonden de schimmelcultures
in de voedingsbodems met de verschillende glucose- of mal-
toseconcentraties geen uiteenloopende verschillen in kleur-
stofvorming. Van een optimale kleurstofvorming was in
ieder geval geen sprake. Zooals mij uit latere proeven bleek,
wordt de eenigszins ongelijke kleurstofvorming hoogst-
waarschijnlijk niet veroorzaakt door de concentratieverschil-
len van de koolhydraten. In hoofdstukVI zal ik er op wijzen,
dat schimmelcultures, die onder dezelfde omstandigheden

gegroeid zijn, na gelijke belichting dikwijls verschil in
kleurstofvorming vertoonen.

Het zou dus alleen mogelijk zijn uit te maken, of de
kleurstofvorming beïnvloed wordt door concentratiever-
schillen van de koolhydraten als bij hoogere concentraties
de kleurstofvorming geheel of nagenoeg geheel ophoudt.
Een uitblijven van de pigmentvorming werd echter niet
waargenomen. Bij de hoogere suikerconcentraties was de
schimmelgroei zeer gering, slechts een gedeelte van de voe-
dingsoplossing werd overgroeid; geen luchtmycelium werd
gevormd, direct op het schimmeldek bevonden zich coni-
diën.

Ondanks de voordeelen, die het gebruik van synthetische
voedingsbodems biedt, ben ik tenslotte voor mijn verdere
proeven toch overgegaan tot het gebruik van een natuur-
lijken bodem. Het bleek mij, dat N. sitophila in vloeibare
mout veel meer luchtmycelium vormt dan in suikeroplossin-
gen met de meest gunstige koolhydraatconcentraties. Daar
het voor mijn onderzoek van veel belang was zooveel moge-
lijk luchtmycelium le verkrijgen, werd de schimmel steeds
in vloeibare mout gekweekt. Om zeker te zijn steeds met
denzelfden bodem te werken, kreeg ik de beschikking over
een groote hoeveelheid mout, afkomstig van de bierbrou-
werij „d\'Oranjeboomquot; te Rotterdam, voldoende voor mijn
geheele onderzoek. De verkregen mout werd steeds met
dezelfde hoeveelheid water verdund. Zooals uit de vorige
§ gebleken is, oefenen concentratieverschillen van de kool-
hydraten geen invloed uit op de kleurstofvorming. Bij het
gebruik van de vloeibare mout heeft men dus alleen zorg
te dragen niet met een te geconcentreerde oplossing te wer-
ken, daar anders conidiënvorming optreedt. Het beste is

enkele verdunningen te maken en dan te bepalen bij welke
verdunning de meeste luchtmyceliumgroei optreedt.

Voor mijn proeven werden steeds glazen cultuurdoozen
met een diameter van 10 c.M. en een hoogte van 6 c.M.
gebruikt. Het deksel was van spiegelglas en paste goed
sluitend met ingeslepen rand op de doos. Neemt men doo-
zen met deksels met overhangenden rand, die slecht slui-
ten, dan heeft er door den te vrijen luchttoevoer conidiën-
vorming plaats, wat voor de belichtingsproeven vermeden
moet worden. Hierop zal ik in hoofdstuk V nog terug
komen.

Na afzonderlijk steriliseeren van de doozen en de voe-
dingsoplossing, moet eenzelfde hoeveelheid van deze laat-
ste in de doozen gebracht worden. Op een eenvoudige
manier kan dit geschieden met een scheitrechter, waaruit
men een bepaald vol. mout af kan laten loopen. Den schei-
trechter maakt men steriel door dezen goed met een alcohol-
sublimaatoplossing te schudden en daarna flink met geste-
riliseerd water na te spoelen. In elke doos werd op deze
wijze 20 c.c. voedingsoplossing gebracht.

Voor de latere belichtingsproeven is het van belang, dat
de schimmel zoo gelijkmatig mogelijk tegen de opstaande
kanten groeit. Daarvoor is het noodig, dat de doozen na het
enten niet meer verplaatst worden, daar anders allicht het
entstukje verschuift en men daardoor een onregelmatigen
groei van het luchtmycelium krijgt. Daarom plaatste ik de
glazen doozen voor het enten in een kist, die ik geheel van
het licht kon afsluiten. Uit eenzelfde doos, waarin in het
donker kleurloos mycelium gegroeid was, entte ik in het
midden van elke doos ongeveer even groote stukjes myce-
lium. Het hangt nu van de temperatuur af hoelang men de
cultures moet laten groeien. Om ze voor de verdere proe-
ven te kunnen gebruiken, moesten ze zoolang groeien, tot
het luchtmycelium het deksel bereikt had. Ik beschikte niet
over zulk een groote thermostaat, dat deze alle doozen be-

Afhankelijk van een gemiddelde hoogere of lagere tem-
peratuur had de schimmel vroeger of later het deksel van
de doos bereikt. Bevonden zich de cultures in een kweek-
kasje met dagtemperatuur van 26—28° C., een nachttem-
peratuur van 22° C., dan was na 5 dagen het deksel be-
reikt. Later bevonden de schimmels zich echter op een tafel
van de laboratoriumzaal voor de centrale verwarming ge-
plaatst, waar de dagtemperatuur 22° C., de nachttempe-
ratuur 19° C. was; dan\'waren ze eerst na dag geschikt
voor het gebruik.

Het mycelium, dat in de doozen gegroeid is en dat aan
verschillende uitwendige omstandigheden blootgesteld is
geweest, moet nu geoogst worden, om dan de kleurstoffen,
die zich in de schimmel gevormd hebben, nader te kunnen
onderzoeken.

Daar de schimmel gevoelig voor licht is, is het dus
noodzakelijk als men over lichtinvloeden werkt, de schim-
mel bij rood licht te oogsten, daar ik gevonden heb, dat in
dat deel van het spectrum geen kleurstofvorming plaats
heeft (zie hoofdstuk VI).

Met een spatel kan men heel gemakkelijk het mycelium-
dek, dat over de vloeibare mout gegroeid is, losstooten
van het luchtmycelium en dan dit laatste van den opstaan-
den kant van de doos afschuiven. Het myceliumdek is na
afspoelen met water heel goed vrij van mout te krijgen.
Voor vergelijkingsproeven over de kleurstofvorming is het
echter niet te gebruiken, daar alleen de allerbovenste laag
kleurstof vormt, wat ik reeds in § 2 vermeldde.

Door Willstatter en Stoll (1913) wordt aange-
geven, dat het luchtmycelium zoo snel mogelijk gedroogd
moet worden, daar bij langzaam drogen kleurstof verloren

gaat. Eerst wordt het mycelium goed uitgeperst tusschen
filtreerpapier en daarna gebracht in een droogstoofje on-
der afsluiting van licht, bij een temperatuur niet hooger dan
40° C. Door Goerrig (1918) wordt er nadrukkelijk op
gewezen, dat hooge temperatuur en direct licht bij het
drogen vermeden moeten worden. De Carotinoiden worden
omgezet onder invloed van warmte en licht.

Na 8 uur is het mycelium voldoende gedroogd om ge-
poederd te kunnen worden in een mortier, die vooral van
binnen niet geglazuurd mag zijn, daar anders het myce-
lium niet goed fijngewreven kan worden. Na deze bewer-
king wordt het mycelium om verder geheel te drogen, in een
exsiccator gebracht. Vooral mag het stukgemaakte myce-
lium om verder te kunnen drogen niet meer in het droog-
stoofje gebracht worden, daar anders het schimmelpoeder
in zeer korten tijd ontkleurt. Waarschijnlijk heeft bij deze
hooge temperatuur door oxydatie een veel snellere omzet-
ting van de kleurstoffen plaats in de stukgemaakte cellen.
Groote voordeelen zou een vacuum droogoventje bieden,
waarover ik echter niet beschikte.

Het schimnielpoeder, dat nu verder gedroogd is in de
exsiccator, kan, nadat het eerst nog eens fijngemaakt is in
een mortier, door een zeef met een zeefwijdte van 1/3 m.M.
gewreven worden. Het is van belang het poeder zoo fijn
mogelijk te maken, omdat dan alleen de kleurstoffen door
het oplosmiddel snel en volkomen uitgetrokken worden.
Verder is het ook noodig voor het vergelijken van de kleur
van de poeders. Voor het bepalen van de kleur, zoowel
van de poeders als van de kleurstofextracten, werd de Code
des couleurs van K I i n c k s i e c k en Valette (1908)
gebruikt. De cijfers achter de kleuren in den verderen tekst
verwijzen naar de staaltjes in genoemde code.

Wanneer men het gepoederde schimmelmycelium droog
en goed van de lucht afgesloten houdt, kan men het wel
eenige weken bewaren, maar na verloop van eenige maan-

den ziet men duidelijk, dat de kleur aanmerkelijk afgeno-
men is. Howard (1925) bewaarde het gedroogde gema-
len tomatenpoeder, dat het carotinoïde lycopersicine bevat,
gedurende 5 maanden in het donker en vond dan nog
slechts heel weinig vermindering van kleur.

Wil men het mycelium langer dan een paar weken bewa-
ren, dan is het aan te raden het niet fijn te wrijven, maar
het mycelium als zoodanig te bewaren; in stukgemaakte
cellen toch heeft men eerder kans op omzettingen van de
kleurstof. Nog beter zou waarschijnlijk zijn het mycelium
in buizen te brengen, waarin men koolzuurgas leidt en deze
daarna dicht te smelten, op dezelfde wijze waarop men
carotinekristallen bewaart.

Went (1904) paste de kalimethode van Mol i sch
(1896) toe op het mycelium van Neurospora sitophila en
verkreeg Carotine kristallen. Ik werkte de aangegeven
methode na, bracht het mycelium gedurende eenige dagen
in een goed van de lucht afgesloten glazen doos, waarin
zich alcoholische kaliloog (40 % alcohol, 20 % KOH) be-
vond. De kaliloog wascht men met gedistilleerd water ge-
durende eenige uren uit. Ik verkreeg kleine roode kristal-
len, die met geconcentreerd zwavelzuur met een geringe
hoeveelheid water blauwkleuring gaven, wat ook door
van Wisselingh (1915) gevonden is. Tswett
(1911) wees er op, dat de kalimethode geen specifieke
reactie voor de Carotine is. Hiermee kan slechts zeer alge-
meen het aanwezig zijn van kleurstoffen van de carotinoï-
den-groep vastgesteld worden. Hij meent dan ook, dat de
resultaten van Ta ni m e s (1900) en Kohl (1902), die
gebaseerd zijn op de microchemische methode herzien moe-
ten worden en men hiervoor de macrochemische methoden
moet gebruiken.

Hierna onderzocht ik de oplosbaarheidseigenschappen
van de kleurstof uit gedroogd schimmelpoeder, verkregen
op de wijze, zooals dit in het vorige hoofdstuk beschreven

is. De kleurstof is onoplosbaar in water, verdund azijn-
zuur en verdund zoutzuur. Oplosbaar is de kleurstof in ab-
soluten alcohol, methylalcohol, aether en petroleumaether,
die alle oranje-geel gekleurd worden; oranje wordt de
kleurstof opgelost in chloroform, benzol, toluol, xylol en
terpentijnolie; zwavelkoolstof, waarin de kleurstof zeer
goed oplosbaar is, wordt rood-oranje gekleurd.

Van belang was nu na te gaan, welk oplosmiddel het
best en het vlugst al de kleurstof uit het schimmelpoeder
kan extraheeren. Volgens de opgave van T s w e 11 (190öb)
geven groene bladen, met petroleumaether behandeld, meer
of minder gele extracten. Het hoofdpigment is carotine,
maar sporen van andere pigmenten worden ook uitgetrok-
ken. Voor het extraheeren van al het chlorophyl en de caro-
tinoïdenpigmenten beveelt Tswett aan petroleumaether,
bevattend 10 % absoluten alcohol voor versche bladeren, en
1 % absoluten alcohol voor gedroogde bladeren. Daar ik
vermoedde, dat in de schimmel alleen carotine aanwezig
was, leek het mij voldoende petroleumaether bij het droge
poeder te voegen. Hiertoe bracht ik een bepaalde hoeveel-
heid van het gedroogde schimmelpoeder, b.v. 200 m.G., in
een scheitrechtertje van 100 c.c. inhoud. Van te voren had
ik onder in het trechtertje een watten propje aangebracht.
Goot ik nu op het poeder 3 c.c. petroleumaether, dan kleur-
de deze zich direct oranje-geel. Dit herhaalde ik eenige
malen, totdat tenslotte het oplosmiddel kleurloos bleef; toch
was het schimmelpoeder nog niet geheel ontkleurd. Bij het
afloopen van het extract merkte ik op, dat het watje steeds
rose gekleurd werd en zich niet ontkleurde, wanneer ik het
in versche petroleumaether legde.

Uit het bovenstaande, n.1. het niet geheel ontkleuren van
het poeder, meende ik te mogen opmaken, dat er nog een

tweede kleurstof aanwezig is, die in het geheel niet of on-
voldoende door de petroleumaether uitgetrokken wordt. Ik
voegde daarom aan het oplosmiddel 1 % absoluten alcohol
toe, omdat dan volgens Tswett (1906b) de carotinoïden
uit de bladeren geëxtraheerd worden. Inderdaad werd het
poeder nu veel meer, maar nog niet geheel ontkleurd.

Daar in het plantenrijk naast carotine heel dikwijls
xanthophyl voorkomt, leek het mij heel goed mogelijk, dat
de schimmel deze laatste kleurstof ook bevatte. Nu is xan-
thophyl heel gemakkelijk oplosbaar in methylalcohol. Voeg-
de ik nu bij het poeder, dat reeds met petroleumaether was
uitgetrokken, absoluten methylalcohol dan kleurde deze
vloeistof zich dadelijk oranje-geel. Na herhaaldelijk verver-
schen werd het poeder kleurloos en ook ontkleurde zich het
rose watje.

Om het proces te bespoedigen voegde ik bij de petro-
leumaether direct eenige druppels methylalcohol. Wanneer
men voortdurend versch oplosmiddel toevoegt bij 200 c.c.
schimmelpoeder is dit na een dag geheel kleurloos uitge-
trokken.

Het kleuren van het watje en het feit dat er twee oplos-
middelen noodig zijn voor het ontkleuren van het poeder,
wijst er wel op, dat er meer dan één kleurstof aanwezig is.

Door Coward (1924) wordt vermeld, dat verzeeping
met 20 % potasch de eenige methode is voor het quantita-
tief uittrekken van de chromolipoïden. Voor het extrahee-
ren van de kleurstoffen van Neiirospora was deze methode
echter niet bruikbaar, daar het schimmelpoeder zeer lang-
zaam ontkleurd werd en het extract niet in aether over te
voeren was.

Om meer zekerheid te verkrijgen, dat er inderdaad meer
dan één kleurstof in de schimmel aanwezig was, paste ik de

capillairanalyse van Goppelsroeder (1901) toe, die
o.a. ook door Kylin (1927) gebruikt is voor het bepa-
len van carotinoïde kleurstoffen in alle mogelijke vruchten.

Deze analyse berust op de eigenschap, dat de componen-
ten van een kleurstofoplossing een ongelijk opstijgings-
vermogen bezitten in eenzelfde capillairmedium b.v. in een
strook filtreerpapier. Ik behandelde het schimmelpoeder al-
leen met petroleumaether en bracht dit extract in een rea-
geerbuisje, waarin een strook filtreerpapier gehangen werd,
zoodanig, dat slechts een klein deel van het papier in de
vloeistof stak. Dit liet ik gedurende eenigen tijd staan en nu
zag ik, dat langzamerhand de kleurstof naar boven steeg.
Wanneer de stijging opgehouden is, wordt het filtreerpapier
uit de vloeistof genomen en gedroogd. Het deel, hetwelk in
de vloeistof gestaan heeft en een groot deel er boven is rose
gekleurd, terwijl er een smalle geel-oranje band hieraan
grenst. Ook dit wijst er dus op dat er minstens twee kleur-
stoffen aanwezig moeten zijn, en dat deze beide, ook al is
het dan niet volkomen, door petroleumaether uitgetrokken
worden.

Wanneer ik het pigment volkomen uit het schimmelpoeder
met petroleumaether en een weinig methylalcohol uittrok
en de kleurstoffen uit dezen laatste in de eerste overvoerde,
volgens de methode nog te noemen op pag. 21, en vervolgens
den methylalcohol verwijderde, dan kreeg ik toch hetzelfde
beeld met de capillairanalyse, als wanneer ik zonder me-
thylalcohol gewerkt had, waardoor ik wel den indruk kreeg,
dat er niet meer dan twee kleurstoffen aanwezig zijn.

Om nu de carotinoïden te scheiden, paste ik de chroma-
tografische analyse van T s w e 11 toe, waarvan ik eerst
het principe en de methodiek in de volgende paragrafen be-
spreken zal.

Tswett (1906 b en c) vermeldt, dat de verschillende
gekleurde bestanddeelen van de chloroplasten in bepaalde
oplosmiddelen zeer karakteristieke adsorptiecoëfficienten
vertoonen ten opzichte van fijn verdeeld materiaal als
CaCOs, inuline, saccharose en vele andere stoffen, mits
deze laatste onoplosbaar zijn in het gebruikte oplosmiddel
en indien ze in fijn verdeelden toestand verkregen kunnen
worden.

Volgens P a 1 m e r (1922) is het bovengenoemde toe te
schrijven aan het feit, dat verschillende gele chromolipoïden
van de chloroplasten in organische oplosmiddelen als col-
loiden aanwezig zijn, en dat naarmate de colloidale deel-
tjes grooter zijn, deze meer geadsorbeerd worden. Enkele
stoffen als Carotine, die niet geadsorbeerd wordt, zijn in
ware oplossing aanwezig.

Tswett vond petroleumaether, het oplosmiddel van
Carotine, het best geschikt om de adsorptie eigenschappen
na te gaan. Ook zwavelkoolstof is goed te gebruiken, om-
dat alle pigmenten van de chloroplasten hierin zeer sterk ge-
kleurd zijn. Hij heeft aangetoond, dat zorgvuldig gedroogde
CaCOs, inuline, saccharose, die onoplosbaar zijn in pe-
troleumaether, het xanthophyl geheel zullen adsorbeeren,
wanneer de petroleumaetheroplossing geschud wordt met
een overmaat van het adsorbens. Opdat de adsorptie vol-
ledig zal zijn, mag geen spoor van alcohol aanwezig zijn.
Tswett heeft gevonden, dat petroleumaether, die slechts
1 % alcohol bevat, het grootste deel van het xanthophyl van
het adsorbens bevrijdt.

Deze methode kan dienen om de carotinoïden, welke
zuurstof bevatten, zooals b.v. xanthophyl, te scheiden van
die, welke zuurstofvrije moleculen bezitten, zooals b.v. Caro-
tine.

houdende carotinoïden van elkaar scheiden. Het algemeene
principe berust hierop, dat, wanneer verschillende stoffen
aanwezig zijn in eenzelfde oplosmiddel, die alle geadsor-
beerd worden door eenzelfde adsorbens er meer of minder
verplaatsing is van een geadsorbeerde stof door de andere.
Dit is afhankelijk van de betrekkelijke affiniteiten van de
verschillende stoffen voor dit adsorbens.

Op dit principe berust Tswett\'s chromatografische
analyse. Indien er in Neurospora sitophila meer dan twee
carotinoïden aanwezig mochten zijn, die niet met de capil-
lairanalyse voor den dag zijn gekomen, dan zouden ze nu
met T s w e 11 \'s methode te voorschijn moeten komen.

S c h e r t z (1929) bestrijdt de opvatting van T s w e 11,
dat alleen carotine niet geadsorbeerd wordt en xanthophyl
wel. Hij wijst er op, dat T s w e 11 nooit met kristallen van
de chromolipoïden-pigmenten heeft gewerkt. De beide op-
lossingen van carotine en xanthophyl, waarmee Tswett
werkte, moeten dus beide belangrijke sporen van eikaars
pigment bevat hebben, alsook een belangrijke hoeveelheid
van de oxydatieproducten van de twee pigmenten. Dit moet
duidelijk zijn voor ieder, die kristallen isoleerde van caro-
tine en xanthophyl en die dan bovendien de groote hoe-
veelheid niet kristalliseerbaar materiaal opgemerkt moet
hebben. Werkt men met geheel zuivere carotine en xan-
thophyl uit kristallen verkregen, dan ziet men, dat caro-
tine niet geadsorbeerd wordt door CaCOg en xanthophyl
slechts betrekkelijk, d.w.z. dat deze veel langzamer door
een CaC03kolom gaat dan carotine.

De methode, die gebruikt wordt voor de analyse van een
mengsel van carotinoïden is de volgende:

Een zeer fijn verdeeld adsorbens, dat de te onderzoe-
ken stoffen niet oxydeert of reduceert, wordt aanbevolen,

b.v. CaCOs. Eerst wordt de CaCO^ gedurende eenige uren
gedroogd bij 150° C. en daarna bewaard in goed sluitende
flesschen. Een glazen adsorptiebuis, met een diameter van
1—2 cM. en een lengte van 10—15 cM. en aan één zijde
uitgetrokken in een smal buisje, dat een kleine opening
heeft met een diameter van 1—2 mM., wordt hiervoor ge-
bruikt. Op den overgang van de breedere in de smallere buis
bevindt zich een wattenprop en hierop wordt CaCOg aan-
gebracht, welke goed vast aangedrukt moet worden. De
homogeniteit van de zuil is zeer belangrijk voor de regel-
maat van de adsorptiezones. De buis wordt tot op 2 a 3 cM.
van den rand gevuld en de CaCOg door een wattenprop af-
gesloten. De buis wordt geplaatst op een kolf, die verbon-
den is met de waterstraalluchtpomp. Het zuivere oplosmid-
del (hetzij petroleumaether, hetzij zwavelkoolstof, afhan-
kelijk van het gekozen oplosmiddel voor het pigment) wordt
nu op de kolom gegoten en door middel van lichte zuiging
wordt het adsorbens bevochtigd. De zuiging wordt stopge-
zet en de bovenste wattenprop verwijderd.

Deze voorafgaande bewerking is noodzakelijk voor den
regelmatigen gang van de chromatografie. Geschiedt deze
niet, dan kan het gebeuren, dat bij het opgieten van de te
onderzoeken vloeistof de bovenste lagen van het adsorptie-
poeder door de zich daaronder vormende luchtbellen om-
geworpen worden.

Een oplossing van de kleurstof wordt in de buis gego-
ten en door middel van lichte zuiging door de kolom ge-
voerd. Regelmatig wordt zuiver oplosmiddel toegevoegd,
zoodat er voortdurend een stroom door de kolom heenge-
zogen wordt. De laag pigment zakt langzaam naar beneden
en zal zich in zones van relatieve adsorptie differentieeren,
die van de grootste adsorptieaffiniteit bij den top, die van
de minste bij den bodem, Hoe gelijkmatiger de kolom aan-
gedrukt is, des te meer zullen de zones ware ringen wor-

Palmer (1922) merkt op, dat de pigmenten in de ver-
schillende zones, door deze methode verkregen, niet zuiver
zijn, zooals T s w e 11 beweert; ze kunnen echter gezuiverd
worden door herhaling van de analyse van het pigment in
een bepaalde zone verkregen.

§ 7. Toepassing van de chromatografische analyse op de schimmel\'
kleurstoffen.

Voordat ik de chromatografische analyse kon toepassen
was het noodig, dat de kleurstoffen zich in hetzelfde op-
losmiddel, n.1. petroleumaether, bevonden en dat geen spoor
van methylalcohol aanwezig was. Tswett (1906 b)
kreeg een alcoholhoudende petroleumaetheroplossing van
chlorophyl vrij van alcohol door de groene oplossing een
aantal malen met het dubbele volume water in een schei-
trechter goed uit te wasschen. Daar alcohol grootere op-
lossende affiniteit voor water dan voor petroleumaether be-
zit, kon hij den alcohol op deze wijze practisch geheel uit
de chlorophyl-oplossing verwijderen.

Toen ik nu bij het twee phasen-systeem, petroleum-
aether en methylalcohol, waarin zich de kleurstoffen bevon-
den, water voegde, vormde zich op de scheidingslaag een
emulsie, die niet verdween, terwijl de waterige methyl-
alcohol nog tamelijk sterk gekleurd bleef.

Goerrig (1917) heeft waarschijnlijk dezelfde moei-
lijkheid gehad. In tegenstelling met Willstätter en
Stoll (1913) was het haar vaak onmogelijk al het xan-
thophyl uit den methylalcohol in aether over te voeren na
langzaam toevoegen van water.

Schertz (1925 b) geeft aan, dat het extract van
xanthophyl in methylalcohol in aether overgevoerd kan
worden door het hiermee te schudden en evenveel van een

verzadigde keukenzoutoplossing toe te voegen, als er me-
thylalcohol aanwezig is.

Door het toevoegen van de electroliet NaCl voorkomt
men de vorming van een emulsie op de scheidingslaag
van de petroleumaether en den methylalcohol. Aanvanke-
lijk vormde zich wel een troebeling, maar deze trok na
eenige uren rustig staan weer op. De waterige methyl-
alcoholoplossing is nu ook nagenoeg kleurloos, maar nog
niet geheel helder. Dit is te wijten aan het feit, dat
zich om enkele kleurstofdeeltjes een NaCl mantel vormt,
die het daardoor onmogelijk maakt, dat deze deeltjes in
de petroleumaether kunnen overgaan. Hoe minder gecon-
centreerd de NaCl oplossing is, zoo, dat er nog juist ge-
noeg is om te voorkomen, dat zich een emulsie vormt, des
te helderder wordt de methylalcohol en des te minder
kleurstofdeeltjes blijven in die vloeistof achter. Het bleek
mij, dat een 6 % NaCl oplossing voor het doel geschikt
was.

Als nu alle kleurstof overgevoerd is in de petroleum-
aether moet deze volgens Tswett (1906 a) driemaal
geschud worden met het dubbele volume water om de
laatste sporen methylalcohol te verwijderen. Ik liet daarna
de petroleumaether eenigen tijd in den scheitrechter staan,
om het water te laten zakken en dan af te laten loopen.
Daar de afvoerbuis van den scheitrechter langs de zijkan-
ten hierdoor vol waterdruppels is gekomen en deze bij het
laten afloopen van de petroleumaether heel gemakkelijk
meegevoerd zouden worden, goot ik het extract liever door
den hals van den trechter op de calciumcarbonaat kolom,
die van te voren bevochtigd was met petroleumaether. Voor
quantitatief werk heeft deze wijze van óverschenken zijn
bezwaren, daar het bijna niet te voorkomen is, dat er wat
van het extract verloren gaat. Toch leek mij dit beter, dan,
zooals b.v. Goerrig (1918) aangeeft, het petroleum-
aetherextract te drogen, door het door een trechter met

een weinig Na2S04 te laten gaan. Door Coward (1924)
is n.1. gevonden, dat Na2S04 de chromolipoïden adsor-
beert, waardoor door deze manier van drogen wat kleur-
stof verloren gaat.

Ik gebruikte calciumcarbonaat pro analyse van Merck,
dat voldoende gezuiverd is om te voorkomen, dat er ver-
ontreinigingen aanwezig zouden kunnen zijn, die dan mis-
schien niet geheel zonder chemischen invloed op de kleur-
stofextracten waren. De buis werd op een reageerbuis ge-
plaatst en ik paste in het begin geen zuiging toe, zoodat
de vloeistof rustig naar beneden kon zakken. Ik nam waar,
dat het bovenste deel van de CaCOs geheel rose werd ge-
kleurd, terwijl een gele ring steeds meer naar beneden
zakte om ten slotte als gele (221—206) druppels in de
reageerbuis terecht te komen. Als al het extract in het
CaCOs gezakt was, voerde ik voortdurend versche petro-
leunmaether toe en om het doorloopen wat te versnellen
paste ik soms wat lichte zuiging toe. Het watje onder in
de buis werd langzamerhand geheel rose gekleurd en de
vloeistof, die nu afliep, was niet geel meer, maar oranje-
geel (156—161). Ik meende daarom, dat de CaCOa kolom
niet in staat was de geheele hoeveelheid tweede kleurstof
te adsorbeeren. Wel vond ik het merkwaardig, dat alleen
het allerbovenste stuk van de kolom rose gekleurd was,
terwijl de rest nagenoeg kleurloos leek. Toch voerde ik
het doorgeloopen extract nog eens door een nieuwe ko-
lom, maar deze kleurde zich niet rose, wel echter het wat-
tenpropje onderaan. Dit bracht mij op het denkbeeld, dat
er misschien nog een derde kleurstof aanwezig was, die
niet, of slechts in het begin, door CaC03 geadsorbeerd

Zooals ik reeds op pag. 11 vermeldde, verwijzen de nummers
achter de kleuren naar de Code des Couleurs. Zijn er twee cijfers
opgegeven, dan wil dit zeggen, dat een geconcentreerde en minder
geconcentreerde oplossing vergeleken zijn.

wordt en wel door watten. Om dus de adsorptie van de
watten uit te schakelen, bracht ik onder in de buis een
prop glaswol en voerde nieuw extract door. Het eerste
extract, dat doorliep, was toch weer geel, maar werd na
eenigen tijd oranje-geel. Dit wees er dus op, dat, mocht
er nog een derde kleurstof aanwezig zijn, deze langzamer
door de CaCOg ging dan de eerste. Ik voerde nu zooveel
versche petroleumaether door tot deze tenslotte kleurloos
afliep. In de kolom bevond zich dus slechts één kleur-
stof en deze moest vrijgemaakt worden van de CaCOg.
Tswett (1906 a) maakte de pigmenten vrij met alco-
holische petroleumaether, dit lukte mij niet zoo goed, ook
niet, wanneer ik veel absoluten alcohol toevoegde. Daar de
kleurstoffen het best uitgetrokken worden uit het schim-
melpoeder met methylalcoholische petroleumaether, goot
ik op de buis, die nog geheel vochtig was van de petro-
leumaether, absoluten methylalcohol en zag dat de rose
ring direct vrijgemaakt werd en als een gele ring naar
beneden schoof. In de reageerbuis druppelde eerst de laat-
ste rest van de petroleumaether en daarna de oranje-gele
(156—166) methylalcohol, die door de petroleumaether
heenzakte en geen kleurstof aan deze afstond. Schudde ik
echter later de twee vloeistoffen in een scheitrechter, dan
ging wel eenige kleurstof in de petroleumaether over. In
deze laatste vloeistof is het pigment oranje (141) ge-
kleurd. Wil men al het pigment uit het CaCOs vrijmaken,
dan moet men er voor zorgen, dat de kolom nog niet ge-
heel uitgedroogd is.

De vloeistof, die afgeloopen is uit de CaCOa buis, waarin
zich onderin glaswol bevond, voerde ik door een buis,
waarin zich een groote hoeveelheid watten bevond, die ik
goed vast aandrukte. De watten kleurden zich onmiddel-

lijk rose. Ik overgoot ze met versehe petroleumaether, en
zag, dat een geel (221—206) extract afliep. Ik goot net
zoo lang petroleumaether over de watten, totdat de vloei-
stof kleurloos afliep en zag dat de watten rose gekleurd
bleven. Overgoot ik nu de watten, die nog vochtig waren
van de petroleumaether, met absoluten methylalcohol, dan
werd onmiddellijk de kleurstof vrij gemaakt en zakte deze
als een rose ring naar beneden. In de reageerbuis, waarin
eerst de laatste resten ongekleurde petroleumaether aflie-
pen, druppelde nu de licht oranje-rose (121) gekleurde
methylalcohol af. Zoodra dit extract in aanraking kwam
met de petroleumaether, ging de kleurstof hierin over, en
zakte de kleurlooze methylalcohol naar beneden. Mocht
deze laatste nog eenige kleurstof bevatten, dan ging na
schudden onmiddellijk alle kleurstof in de petroleumaether
over, en kon in een scheitrechter de ongekleurde methyl-
alcohol van de licht oranje-rose (121) petroleumaether ge-
scheiden worden. Inderdaad is er dus een derde kleurstof
aanwezig. De drie gevonden kleurstoffen zal ik, zoolang
ik hun absorptiespectra nog niet met reeds bekende caro-
tinoïden vergeleken heb, voorloopig carotinoïde A, B en
C noemen.

De oplossing van carotinoïde A is in petroleumaether
geel (221—206) gekleurd. In het systeem CaCOs-petro-
leumaether wordt carotinoïde A niet geadsorbeerd, dus ge-
draagt het zich als Carotine.

De oplossing van carotinoïde B is in methylalcohol
oranje-geel (156—166), in petroleumaether oranje (141)
gekleurd. In het systeem CaCOs-petroleumaether wordt het
carotinoïde B geadsorbeerd, dus gedraagt het zich als
xanthophyl en rhodoxanthine. Carotinoïde B geeft echter
een rose adsorptiering, xanthophyl zooals Tswett
(1906 c) aangeeft een gele, rhodoxanthine volgens L i p p-
maa (1925) een intensief violet-bruinachtig roode, dus is
carotinoïde B niet identiek met een van deze pigmenten.

De oplossing van Carotinoide C is in petroleumaether
licht oranje-rose (121) gekleurd. In het systeem CaCOg-
petroleumaether wordt het pigment niet geadsorbeerd, maar
gaat langzamer door de CaCOgkolom dan het carotinoïde
A. Het gedraagt zich dus evenals lycopine, dat, zooals
Co ward (1924) opgeeft, de CaCOs kolom rose kleurt,
langzamer door de CaCOg kolom gaat dan Carotine en
M^aarvan de oplossing in petroleumaether rose gekleurd is.
In het systeem watten-petroleumaether wordt carotinoïde C
geadsorbeerd. Carotinoïde A en B zijn volgens colorime-
trische bepaling in ongeveer gelijke hoeveelheid aanwezig,
carotinoïde C komt echter in zeer geringe hoeveelheid voor.
Hierdoor is het verklaarbaar, dat deze laatste niet waar te
nemen is met de capillairanalyse van Goppelsroeder
(1901).

Volgens de hierboven genoemde bewerking is het dus
mogelijk de drie schimmelkleurstoffen te scheiden. Men
moet echter bedenken, dat men de volgorde van de bewer-
king niet verwisselen kan en b.v. eerst carotinoïde C schei-
den van A en B door het petroleumaetherextract direct door
watten te voeren. Het is mij n.1. gebleken, dat carotinoïde B
ook geadsorbeerd wordt door de watten, wat heel gemakke-
lijk na te gaan is als men het doorgeloopen extract door een
CaCOg kolom voert; deze blijft dan kleurloos, wat er dus
op wijst, dat men alleen met carotinoïde A te doen heeft.

Bij toevoeging van methylalcohol op de wattenkolom zakt
deze eerstgenoemde als een gele ring naar beneden; was al-
leen carotinoïde C aanwezig dan zou de ring rose gekleurd
zijn. Carotinoïde C is in zoo geringe mate aanwezig, dat
de gele kleur overheerscht.

Toch is deze heele methode, als men met kleine hoeveel-
heden werkt, eigenlijk niet voor quantitatief onderzoek te
gebruiken. Ik wilde daarom probeeren of het niet mogelijk
was de kleurstoffen met de uitschudmethode te scheiden.

De uitschudmethode biedt in zooverre voordeelen boven
de vorige, dat niet alle kleurstoffen in petroleumaether be-
hoeven te worden overgevoerd en de aanwezigheid van
methylalcohol geen bezwaar is.

Wil Ist älter en Stoll (1913) gebruikten de uit-
schudmethode om de carotinoïden uit de bladeren te schei-
den. Ze voegden bij 80 c.c. petroleumaether, waarin zich
de carotinoïden bevonden, achtereenvolgens 100 c.c. 80 %
methylalcohol, 100 c.c. 90 % methylalcohol en 2 maal
50 c.c. 92 % methylalcohol toe. Het laatste extract was
meestal kleurloos; was dit niet het geval dan schudden ze
nog eens met 92 % methylalcohol uit.

Ik wilde nu probeeren of het mogelijk was carotinoïde B
van A en C te scheiden door de methylalcoholische petro-
leumaether herhaaldelijk met waterige methylalcohol van
de bovengenoemde percentages in een scheitrechter uit te
schudden. Hoewel ik herhaaldelijk zelfs met 92 % methyl-
alcohol uitschudde, bleef deze voortdurend een weinig ge-
kleurd. Ten slotte wilde ik onderzoeken of de petroleum-
aether vrij was van carotinoïde B en voerde daartoe de
vloeistof, na deze eerst goed uitgewasschen te hebben met
water, door een CaCOs kolom, waarin zich onderin glas-
wol bevond. Ik nam waar, dat zich direct boven in de
CaCOg een rose ring vormde, die niet verdween na toevoe-
ging van versche petroleumaether. Carotinoïde B is dus
door de uitschudmethode met methylalcohol niet geheel uit
de petroleumaether te krijgen. Het extract, dat door de
CaCOskolom gedruppeld is en nu met methylalcohol 92 %
uitgeschud wordt, geeft aan dezen laatste geen kleurstof af.

Carotinoïde A en C blijven dus na uitschudden met me-
thylalcohol in de petroleumaether; carotinoïde B daaren-
tegen gaat uit de petroleumaether in den methylalcohol over,

maar omgekeerd gaat ook weer wat kleurstof uit den methyl-
alcohol in de petroleumaether.

Palmer en Eckles (1914) hebben iets dergelijks
gevonden voor een carotinoïde maïskleurstof; deze schijnt
even gemakkelijk uit 80 % alcohol door petroleumaether als
uit deze laatste door nieuwen 80 % alcohol geextraheerd te
worden. Dit pigment is door Karre r, Salomon en
Wehr li (1929) zeaxanthine genoemd. Toch kan Caro-
tinoide B niet identiek zijn met deze zeaxanthine, daar dit
laatste pigment noch uit petroleumaether, noch uit zwavel-
koolstof door CaCOs geadsorbeerd wordt.

Door Lubimenko (1927) is een carotinoïde gevon-
den in bladeren, dat evengoed oplosbaar is in petroleum-
aether als in alcohol en dat door hem xanthocarotine is
genoemd. Scheidt men carotine en xanthophyl op de ge-
wone wijze, dan vindt men de xanthocarotine vermengd met
de carotine in de petroleumaetherlaag en ook vermengd met
het xanthophyl in de alcohollaag. Over de adsorptie-
eigenschappen van xanthocarotine wordt niet gesproken,
dus moet het absorptiespectrum van carotinoïde B verge-
leken worden met dat van de xanthocarotine (zie hoofdstuk
IV).

Carotinoïde A gedraagt zich ten opzichte van het systeem
petroleumaether-methylalcohol (80%—92%) evenals ca-
rotine, het is epiphasisch.

Carotinoïde B gedraagt zich ten opzichte van het systeem
petroleumaether-methylalcohol (80 %—92 %) niet uitge-
sproken hypophasisch, zooals wel voor xanthophyl en fuco-
xanthine door W i 11 s t ä 11 e r en Stoll (1913) en voor
rhodoxanthine door L ip p m a a (1925) aangegeven wordt,
waardoor het dus met geen van deze pigmenten identiek
kan zijn.nbsp;\'

Carotinoïde C gedraagt zich ten opzichte van het systeem
petroleumaether-methylalcohol (80 %—92 %) evenals ca-
rotine en lycopine; het is epiphasisch.

Om nu de carotinoïden A, B, en C nader te bepalen is
het verkrijgen van kristallen van groot belang. In de vol-
gende § wil ik mijn pogingen om deze te verkrijgen bespre-
ken.

Het was mijn bedoeling om de carotinoïden A, B en C
te doen uitkristalliseeren en te trachten na te gaan of caro-
tinoïde A identiek was met de carotine uit de wortelen van
Daucus carota. Hiervoor had ik ook kristallen van deze
laatste noodig en daar ik wel begreep, dat het uitkristalli-
seeren groote moeilijkheden met zich mee zou brengen, leek
het mij goed eerst te trachten zuivere kristallen van Daucus-
carotine te verkrijgen. Het materiaal, dat ik hiervoor noodig
had, kon ik in elke hoeveelheid verkrijgen, terwijl het schim-
melmateriaal beperkt was. Voor het verkrijgen van enkele
grammen kristallen moesten reusachtige hoeveelheden wor-
telen verwerkt worden. E sch er (1909) verkreeg 125
gram kristallen van 472 kilogram gedroogde (5000 kilo-
gram versche) wortelen. Daar het onmogelijk was deze
groote hoeveelheden op het botanisch laboratorium te
Utrecht te verwerken, werd mij vergund op het laborato-
rium voor Technische Botanie te Delft te werken. Ik ging
uit van 71/2 kilogram gedroogde (100 kilogram versche)
wortelen en verwerkte deze volgens de methode aangegeven
door Schertz (1925 a). Ik verkreeg plus minus 2 gram
kristallen, waarvan het smeltpunt 169° C. was. Na deze ge-
heele bewerking werd het me wel duidelijk over hoeveel
materiaal men beschikken moet om uitkristallisatie te ver-
krijgen, daar er steeds een zeer groote hoeveelheid niet-
kristalliseerbaar materiaal aanwezig is. Ook Schertz
(1929) wijst hierop.

Lost men eenige kristallen op in petroleumaether en eeni-
ge in zwavelkoolstof, dan wordt de eerste geel (231—236),

de tweede oranje (106—121) gekleurd. Deze kleuren wijken
af van carotinoïde A opgelost in petroleumaether (206—
221) en in zwavelkoolstof (56—71). De oplossing van ca-
rotinoïde A is in zwavelkoolstof zelfs rood-oranje gekleurd.

Ik kweekte een zeer groote hoeveelheid schimmels en be-
schikte tenslotte over 20 gram droge stof (de opbrengst
van de cultuur uit één doos is plus minus 70 milligram).
Ik trok het poeder uit met methylalcoholische petroleum-
aether en scheidde de kleurstoffen hieruit volgens de me-
thode beschreven in § 8. Het eerst verwerkte ik caro-
tinoïde A. dat zich in petroleumaether (kookpunt 28—
40° C.) bevond en dampte de vloeistof onder verminderden
druk in.

Om het stooten van de petroleumaether door de kook-
puntsvertraging, die dikwijls optreedt, te voorkomen, voer-
de ik koolzuurgas door een fijn uitgetrokken glazen buis,
die eerst over CaClo geleid was. Het koolzuurgas voorkomt
tevens oxydatie van het carotinoïde. Toen het oplosmid-
del voor een groot deel ingedampt was, vormden zich kleine
witte kristalletjes. Het waren geen carotinoïde-kristallen,
want deze zijn zoo specifiek, dat ze onmiddellijk te herken-
nen zijn.

Ik filtreerde de witte kristallen af en dampte de rest van
het extract verder in. Er vormden zich geen carotinoïde-
kristallen, alleen een oranje-roode korst. Ik heb geen ver-
dere pogingen aangewend met carotinoïde B en C, daar ik
tot de overtuiging was gekomen, dat ik van een ontzaglijk
veel grootere schimmelmassa uit zou moeten gaan, om uit-
kristallisatie te verkrijgen.

Van de afgefiltreerde lange witte naaldvormige kristallen,
bepaalde ik het smeltpunt en vond 148i/^° C.

Zellner (1907) geeft op, dat een hoog moleculaire
alcohol, dicht bij cholesterine staand, zeer verbreid is in
schimmels. Deze stof kristalliseert gemakkelijk uit in pe-
troleumaether en aether.

Chodat en Schopfer (1927) geven op, dat in
een versche chloroformoplossing van het carotinoïde van
Mucor hiemalis een vrij groote hoeveelheid van Choleste-
rine aanwezig is, dat ze aantoonen met de Liebermannsche
reactie. Ik paste deze reactie toe op de witte kristallen. Ze
bestaat daarin, dat men zwavelzuur met azijnzuuranhydride
toevoegt en daardoor een kleurverandering krijgt, die loopt
van bloedrood over blauw, paarsblauw naar groen. Deze
reactie geldt voor alle lichamen van de cholesterine-groep,
en aangezien de reactie positief verliep, is dus hiermee be-
wezen, dat de kristallen tot deze groep behooren. Door
Willstätter en Stoll (1913) wordt over Choleste-
rine nog het volgende gezegd: „Beziehungen des Carotins
zum Cholesterin, die sich in der Literatur oft erwähnt fin-
den, existieren in Wirklichkeit nicht.quot;

Voor de vergelijking van de betrekkelijke kleurintensiteit
van de carotinoïde-pigmenten werd de Doppelkeil-Kolori-
meter volgens Bjerrum-Arrhenius gebruikt. De
colorimeter is eigenlijk geconstrueerd voor de Ph bepaling,
maar was voor niet al te kleine hoeveelheden schimmel-
kleurstoffen ook wel voor mijn doel geschikt.

De gebruikte colorimeter bestaat, zooals de naam reeds
aangeeft, uit een dubbele wig, die verkregen wordt door
een lang rechthoekig glazen bakje door een glazen plaat,
volgens de diagonaal geplaatst, in twee helften te verdeelen
en een prismacomparator, die verschuifbaar op het bakje
aangebracht is. In den prismacomparator bevindt zich in een
reageerbuisje het carotinoïde, waarvan de kleurintensiteit
vergeleken moet worden. In het glazen bakje bevindt zich in
de eene helft de vergelijkingsoplossing, in de andere ge-
distilleerd water; door het schuiven van den comparator
langs het rechthoekig glazen bakje verkrijgt men door de

plaatsing van de dubbele wig alle overgangen van de ver-
gelijkingsvloeistof van geconcentreerd tot verdund.

^ Een groote moeilijkheid voor het vergelijken van de caro-
tinoïden is het verkrijgen van een geschikte vergelijkings-
oplossing. Het allerbeste zou zijn een carotinoïde-oplossing
van bepaalde kleurintensiteit te gebruiken, maar dan zou
deze dikwijls opnieuw gemaakt moeten worden, wat na-
tuurlijk te groote bezwaren oplevert. De carotinoïde-oplos-
singen zijn n.1. onbestendig en worden door het licht en de
zuurstof uit de lucht verzwakt.

In § 8 heb ik er reeds op gewezen, dat het met de kleine
hoeveelheden schimmelmateriaal eigenlijk niet mogelijk is
de pigmenten zoodanig te scheiden, dat ze voor quantitatief
onderzoek gebruikt kunnen worden. Voor het colorimetrisch
onderzoek leek het mij dus beter de drie kleurstoffen niet te
scheiden. Het was nu noodig een vergelijkingsoplossing te
vinden, die overeenkomt met het petroleumaetherextract,
dat het mengsel van de drie carotinoïden bevat. Door
Willstatter en Stoll (1913) werd een 0,2% ka-
liumbichromaatoplossing gebruikt voor het vergelijken van
carotine- en xanthophyloplossingen. Het bleek echter, dat
deze vergelijkingsoplossing niet geschikt is voor het meng-
sel van de drie schimmelkleurstoffen. De kaliumbichro-
maatoplossing komt wel overeen met een vrij geconcen-
treerde oplossmg van de drie schimmelpigmenten, niet ech-
ter met een verdunde, daar een minder geconcentreerde
kaliumbichromaatoplossing een groene tint heeft, die de
carotinoïden niet bezitten.

Een methyloranje-oplossing voldoet echter zeer goed,zoo-
wel voor verdunde als voor geconcentreerde oplossingen,
die de drie carotinoïden bevatten.

Bij het gebruik van methyloranje als vergelijkingsvloei-
stof moet men bedenken, dat men hier te doen heeft met een
mdicator, zoodat men de oplossing in een kolf van Jena- of
Pyrexglas moet bewaren om te voorkomen, dat er alkali

afgegeven wordt. Maakt men een flinke hoeveelheid van een
geconcentreerde oplossing van methyloranje, dan kan men
gedeelten hiervan meer of minder verdunnen al naarmate
men meer of minder geconcentreerde kleurstofoplossingen
colorimetrisch vergelijken moet. Bovendien is een geconcen-
treerde methyloranjeoplossing te vergelijken met een 0,2 %
kaliumbichromaatoplossing, die steeds houdbaar is, zoodat
gecontroleerd kan worden of de eerstgenoemde oplossing
niet in kleur verzwakt en tevens is dan hierdoor de con-
centratie vastgelegd.

Om de kleurstoffen colorimetrisch te kunnen vergelijken,
moeten ze steeds, nadat ze uit het schimmelpoeder geextra-
heerd en in de petroleumaether overgevoerd zijn, in het
reageerbuisje van de colorimeter tot een bepaald volumen
ingedampt worden. Er moet minstens 3 c.c. van de vloeistof
in het reageerbuisje aanwezig zijn, wil men deze in den
prismacomparator duidelijk kunnen waarnemen. Het rea-
geerbuisje werd geijkt op 3 c.c. en de vloeistof tot dit volu-
men ingedampt.

Daar de carotinoïden aan geen hooger temperatuur dan
40^ C. blootgesteld mogen worden, moet het extract onder
verminderden druk ingedampt worden. Hiertoe bracht ik het
reageerbuisje in een wijdere glazen buis, die gesloten was
met een dubbeldoorboorde gummistop. In de eene opening
bevindt zich een korte omgebogen glazen buis, die niet in de
vloeistof reikt en in verbinding staat met de waterstraal-
luchtpomp; in de andere opening past een lange capillair
uitgetrokken glazen buis, die diep in de vloeistof gestoken
wordt en aan het boveneinde met een kurkje gesloten is.
Daar dit kurkje nooit volkomen afsluit, wordt, wanneer zui-
ging toegepast wordt, een heel zwakke luchtstroom door de
vloeistof gezogen, waardoor stooten voorkomen wordt. Om
het indampen van de petroleumaether nog te versnellen
woidt om de groote glazen buis een waterbad geplaatst,
waarin het water een temperatuur van ± 40° C. heeft.

A4oeten grootere hoeveelheden kleurstofextracten inge-
dampt worden, zoodat de geheele bewerking vrij langdurig
is, dan verdient het aanbeveling niet lucht, maar koolzuur-
gas door de capillaire buis te leiden, om oxydatie van de
carotinoïden te voorkomen.

Tenslotte heeft het verdere onderzoek er niet toe geleid,
deze colorimeter voor quantitatieve bepalingen te gebrui-
ken. Toch leek het mij niet overbodig te vermelden, hoe
eventueel de intensiteit van de kleurstoffen colorimetrisch
vergeleken kan worden.

In § 10 van het vorige hoofdstuk heb ik reeds meege-
deeld, dat het mij niet gelukt is kristallen van de schimmel-
carotinoïden te verkrijgen. Door middel van de absorptie-
spectra van de schimmelpigmenten is het mogelijk ze met
reeds bekende carotinoïden te vergelijken. Carotine heeft in
zijn verschillende oplosmiddelen een zeer karakteristiek
spectrum; door de meeste onderzoekers worden twee, soms
drie absorptiebanden in het groene en blauwe deel van het
spectrum opgegeven. De ligging van de banden varieert
eenigszins met den brekingsindex van de oplosmiddelen.
Door P a 1 m e r (1922) wordt echter vermeld, dat de ban-
den identiek zijn in aether, alcohol en petroleumaether, om-
dat de brekingsindices van deze oplosmiddelen dicht bij el-
kaar liggen, in zwavelkoolstof daarentegen, die een hoo-
geren brekingsindex heeft, worden de banden verschoven
naar het roode deel van het spectrum. Voorts meent hij, dat
de breedte en de intensiteit van de absorptiebanden afhangt
van de concentratie van de kleurstofoplossing en van de
dikte van de laag, die het licht moet passeeren en dan bo-
vendien nog van het oog van den waarnemer. Hierdoor
wordt het duidelijk, dat de opgaven van verschillende on-
derzoekers wel eens wat uiteenloopen, vooral ook omdat de
absorptiebanden niet scherp begrensd zijn.

sorptiebanden (in ßji) van Carotine in oplosmiddelen met
verschillenden brekingsindex.

brekings-
oplosmiddel index band Inbsp;band IInbsp;band 111
aether 1,357 490-475nbsp;455-445nbsp;430-418
alcohol 1,358 490-475nbsp;455-445nbsp;430-418
zwavelkoolstof 1,628 510-485nbsp;470-458nbsp;437-425

Willstätter en Stoll (1913) geven de volgende
metingen van de absorptiebanden (in ju jx) van carotine in
oplossingen bevattend 0,005 gram in 1 liter alcohol of zwa-
velkoolstof.

oplosmiddel laagdikte band I band II absorptie
alcoholnbsp;5 m.M. 492-478 459-446 415-

10 m.M. 492-476 459-445 419-
zwavelkoolstof 5 m.M. 524-510 489-475
10 m.M. 525-508 490-474

Voor het qualitatief bepalen van de absorptiebanden van
Dauciiscarotine en de schimmelcarotinoïden werd een
Fiiess-spectograaf gebruikt. 0,005 gram Daucuscarotine-
kristallen werden opgelost in 1 liter petroleumaether, een
andere 0,005 gram in l liter zwavelkoolstof

Veel moeite kostte het van beide oplossingen een vrij
duidelijk spectrogram te verkrijgen. In beide oplosmidde-
len vertoont carotine drie absorptiebanden, in zwavelkool-
stof gaan de twee eerste banden bijna in elkaar over. De
plaats van de banden (in /uß) is als volgt:

petroleumaether 491-475 457-445 427-418
zwavelkoolstofnbsp;521-500 488-471 455-442

Zooals men op plaat 1 no. 2 en 3 kan zien is het heel
moeilijk, door het diffuse karakter van de grenzen van de
banden, nauwkeurig de plaats op te geven. De metingen
voor de Carotine komen nagenoeg overeen met de opgaven
van Willstätter en Stoll (1913).

Voor de schimmelcarotinoïden was het bij gebrek aan
kristallen niet mogelijk van een oplossing van bepaalde con-
centratie uit te gaan. In de volgende paragraaf zal ik be-
spreken, hoe ik voor Daucuscarotine-oplossingen van ver-
schillende concentraties uitmaakte, dat de plaats van de
absorptiebanden steeds dezelfde blijft.

Uit het gedroogde schimmelpoeder is het carotinoïde A
het gemakkelijkst met petroleumaether te extraheeren. Van
deze oplossing trachtte ik een spectrogram te verkrijgen,
wat mij tenslotte ook gelukte. Op plaat 1 no. 1 zijn heel
duidelijk 5 absorptiebanden waar te nemen. De plaats van
de banden (in [i ß) is als volgt:

Zooals men ziet, zijn de absorptiebanden van carotinoïde
A, als men ze vergelijkt met die van Daucuscarotine, naar
hét rood verschoven. Bovendien heeft carotinoïde A vijf
absorptiebanden, wat mij eerst heel vreemd leek, omdat er
bij de tot nog toe bekende cartinoïden hoogstens vier waar-
genomen zijn. Na de metingen met den monochromator, be-
schreven in de volgende paragraaf, geloof ik, dat de meeste
carotinoïden wel meer dan drie absorptiebanden bezitten,
maar dat deze meestal niet met het oog of op de fotografie
waar te nemen zijn. Het verschijnen van absorptiebanden
op een spectrogram is n.1. van verschillende omstandighe-
den, als goede concentratie, juiste belichtingstijd en plaat-

gevoeligheid, afhankelijk. Door een toevallig goede com-
binatie van deze factoren zijn voor carotinoïde A vijf ban-
den op de fotografie te voorschijn gekomen.

Van het carotinoïde B werden de absorptiebanden be-
paald in methylalcohol, daar het pigment in dit oplosmid-
del het gemakkelijkst te verkrijgen is. Op plaat 1 no. 4 ziet
men duidelijk drie absorptiebanden, waarvan de plaats (in
mm) als volgt is:

De plaats van de banden van carotinoïde B in methyl-
alcohol is bijna dezelfde als van de eerste drie van caroti-
noïde A in petroleumaether. Daar de beide pigmenten zich
echter in verschillende oplosmiddelen bevinden, is de plaats
van de banden niet precies te vergelijken. Bovendien is ook
uit een spectrogram de plaats van de absorptiebanden, door
de grenzen hiervan te meten, niet juist te bepalen; deze gren-
zen moeten eerst gecorrigeerd worden voor plaatgevoelig-
heid en dispersie. Met behulp van intensiteitsmetingen is
de plaats van de absorptiebanden langs fotografischen weg
wel juist te bepalen, maar, daar mij een snellere appara-
tuur ter beschikking stond, heb ik dit niet gedaan.

Voor de bepaling van absorptiespectra van de caroti-
noïden is de opstelling (fig. 1) als volgt:

Het licht van de lamp P, die op constante spanning
brandt, wordt evenwijdig gemaakt door de lens Li en pas-
seert de cuvet F, waarin zich de kleurstofoplossing bevindt.
Een beeld van de lamp wordt dan door de lens Lo gepro-
lecteerd op de spleet S], van een dubbelmonochromator van

van Cittert (1923), die geen valsch licht doorlaat. Dit
apparaat is samengesteld uit twee precies gelijke monochro-

mators, de eerste Si Lg P L4 en de tweede S\\ L\'3 P\' L\'4.
De gang van de stralen is duidelijk te zien in fig. 1, waarin

de lenzen aangegeven zijn door Lg, L4, L\'4 en L\'3 en de
prisma\'s door P en P\'. In het vlak van spleet 83 w^ordt door
den eersten monochromator een spectrum gevormd. Door den
stand te varieeren van spleet S2, die verplaatsbaar is met
behulp van een schroef, kan in den tweeden monochromator
licht van een bepaalde golflengte intreden. De spleetstan-
den zijn met een noniusaflezing nauw^keurig reproduceer-
baar. Wordt So zoodanig ingesteld, dat rood licht in den
tweeden monochromator kan intreden, dan zal door S2, be-
halve het roode, ook nog valsch licht (van andere golf-
lengte) doorgelaten worden. Het valsche licht zal echter
onder een anderen hoek in het prisma P\' gebroken worden
en zal niet op de spleet S\'i geprojecteerd worden. Op deze
wijze wordt het valsche licht in een dubbelmonochromator
geëlimineerd.

Het beeld van spleet S\\ wordt op zijn beurt geprojec-
teerd op een vacuumthermoelement Vj, door lens L5. De
ontstane thermostroom wordt gemeten met de versterkings-
opstelling (galvanometer G^, thermo-relais Vo en galvano-
meter Go) volgens M o 11 en Burger (1925).

De monochromator moet vooraf nauwkeurig geijkt zijn,
b.v. met heliumlijnen, zoodat het verband tusschen de door-
gelaten golflengten en den noniusstand bekend is. Men meet
nu den uitslag van de cuvet met de kleurstofoplossing en die
van de cuvet alleen met het oplosmiddel. De doorlating
wordt verkregen door den eersten uitslag door den tweeden
te deelen om de absorptie van de cuvet en het oplosmiddel
te elinu\'neeren.

Bepaalt men nu de doorlating van het aantal golflengten
in het zichtbare deel van het spectrum voor een kleurstof-
oplossing, dan kan men een absorptiekromme verkrijgen,
door op de abscis de golflengten en op de ordinaat de ge-
vonden procentueele doorlating aiquot; te zetten. Men verkrijgt
dan een kromme met verschillende maxima, welke met ab-
sorptiebanden van de kleurstof overeenkomen.

Voordat echter de absorptiekrommen van de verschillen-
de carotinoïden bepaald werden, moest eerst uitgemaakt
worden, of concentratieverschil van de kleurstofoplossin-
gen invloed uitoefent op de plaats van de absorptiebanden.
Dit was noodzakelijk, omdat ik, zooals reeds in de vorige
paragraaf vermeld is, bij de schimmelcarotinoïden niet van
dezelfde concentratie uit kon gaan.

Van de kristallen van Daucuscarotine werden 10 m.G.
in 1 liter aether opgelost en van een gedeelte hiervan werden
drie verschillende verdunningen gemaakt. Van deze oplos-
singen, die in een goed afgesloten cuvet werden gebracht
om verdamping te voorkomen, werden de eerste twee ab-
sorptiebanden bepaald.

De absorptiekrommen van de vier oplossingen, waarvan
zich de concentraties verhouden als 1 : 1/2 : 1/4 : Viogt; wor-
den in fig. 2 respectievelijk aangeduid met de nummers
1, 2, 3 en 4. Zooals men ziet, is de plaats van de maxima
I en II van de vier krommen dezelfde en heeft dus geen
bandverschuiving plaats, wat ook heel duidelijk uitkomt als
men de punten a onderling en de punten b onderling ver-
gelijkt. Wel merkt men op, dat de vorm van de kromme
verandert met de concentratie. Hoe minder geconcentreerd
de kleurstofoplossing is, hoe meer de maxima uitgerekt
worden in de richting van de ordinaat. Bij de meest gecon-
centreerde oplossing wordt a\\ het licht van 4875—4400 Ä
geabsorbeerd.

Daar dus concentratieverschillen van de carotine-oplos-
sing geen invloed uitoefenen op de plaats van de absorptie-
banden, kunnen nu de absorptiespectra van Daucuscarotine
en de schimmelcarotinoïden bepaald en onderling vergele-
ken worden.

Eenige kristallen van Daucuscarotine werden opgelost in
zwavelkoolstof, aether en petroleumaether en van deze drie
oplossingen werden de absorptiekrommen bepaald, die aan-

gegeven zijn in fig. 3. Zooals men ziet, is de vorm van de
drie krommen nagenoeg gelijk; ter verduidelijking zijn de

telkens in de drie oplosmiddelen terugkeerende minima aan-
gegeven met de letters a-f en de maxima met de cijfers
1-V. Heel duidelijk is een sterke bandverschuiving naar het

roode deel van het spectrum waar te nemen van carotine op-
gelost in zwavelkoolstof, daar dit oplosmiddel een hoogeren

brekingsindex heeft dan aether en petroleumaether.
In fig. 4 zijn de drie absorptiekrommen aangegeven van

carotinoïde A in de drie oplosmiddelen zwavelkoolstof,
aether en petroleumaether. Het gemakkelijkst krijgt men dit

pigment in zwavelkoolstof of aether opgelost door het
petroleumaetherextract tot een droge korst in te dampen

en dan in zwavelkoolstof of aether op te lossen. In de drie
krommen zijn ook hier de telkens terugkeerende minima
met a-f en de maxima met I-V aangegeven.

Carotinoïde B is opgelost in zwavelkoolstof, methylalco-
hol en aether. Het pigment wordt door toevoegen van een
6 % NaCl oplossing overgevoerd uit den methylalcohol in
aether. Een gedeelte hiervan wordt tot een droge korst in-
gedampt en opnieuw opgelost in zwavelkoolstof.

In fig. 5 zijn de drie absorptiekrommen geteekend. De
minima zijn weer met de letters a-f, de maxima met de
cijfers I-V aangegeven.

Van carotinoïde C zijn alleen de absorptiekrommen be-
paald in petroleumaether en aether. Dit pigment is steeds
in zoo geringe hoeveelheid in de schimmel aanwezig, dat
het niet mogelijk was het carotinoïde in drie oplosmiddelen
te onderzoeken. De onderzochte oplossing van petroleum-
aether was zeer verdund, wat duidelijk uit den vorm van de
kromme (fig. 6) waarneembaar is. De maxima zijn sterk in
de richting van de ordinaat uitgerekt. Hierdoor treden ook
de minima, die steeds in meer of mindere mate in de andere
absorptiekrommen aanwezig zijn, zeer sterk naar voren en
maken daardoor de plaats van de absorptiebanden minder
duidelijk. Vergelijkt men echter deze uitgerekte kromme met
de kromme van het carotinoïde C in aether, dan is het
toch wel mogelijk de punten a-f en de nummers 1-1V aan
te geven.

Nu moeten de absorptiekrommen van de vier kleurstoffen
in hetzelfde oplosmiddel nog onderling vergeleken worden.
Teekent men de krommen van de vier kleurstoffen b.v. in
aether opgelost, op transparant papier en legt men deze op
elkaar, zoodat de maxima elkaar ongeveer bedekken, dan
merkt men op, dat de vorm van de krommen zeer veel ge-
lijkenis vertoont, dat steeds dezelfde maxima en minima
terugkeeren, wat er op wijst, dat de stoffen zeer nauw ver-
want zijn.

Teekent men de absorptiekrommen van de verschillende
carotinoïden in hetzelfde oplosmiddel onder elkaar, dan is

een bandverschuiving waar te nemen, en wel het duidelijkst
als de pigmenten in zwavelkoolstof opgelost zijn.

zwavelkoolstof het beste oplosmiddel is voor het bepalen
van de absorptiebanden van de carotinoïden. In oplosmid-
delen met lageren brekingsindex verschuiven de banden
sterk naar het violet en wordt het verschil in ligging veel
minder duidelijk.

van Daucuscarotine en de schimmelpigmenten respectievelijk
opgelost in: zwavelkoolstof, aether en petroleumaether.

drie schimmelcarotinoïden ten opzichte van die van Dau-
cuscarotine naar het roode deel van het spectrum. Het mmst
verschuiven de banden van carotinoïde A, dan die van caro-
tinoïde B en het meest die van carotinoïde C.

Om duidelijk de verschuiving te doen uitkomen volgen
hieronder drie tabellen, waarop de plaats van de punten a-f
in de drie oplosmiddelen aangegeven is.

Carotinoïde A komt in zijn chemische eigenschappen
overeen met Daucuscarotine (zie hoofdstuk III), maar daar
zijn absorptiespectrum een weinig afwijkend is, zal ik het
schimmelpigment toch carotinoïde A blijven noemen.

Carotinoïde B is meer naar het roode deel van het spec-
trum verschoven dan carotinoïde A. In zijn gedrag ten op-
zichte van het twee phasen-systeem petroleumaether-alcohol
komt carotinoïde B vrijwel overeen met het door Lub i-
m e n k o (1927) gevonden xanthocarotine. Lubimenko
vindt voor dit pigment twee absorptiebanden in zwavel-
koolstof, band 1 komt overeen met die van xanthophyl,
band 11 met die van carotine. Hij geeft de volgende metin-
gen voor de absorptiebanden:

Daar van carotinoïde B alle banden ten opzichte van die
van carotine naar het roode deel verschoven zijn, is het
schimmelpigment dus niet identiek met xanthocarotine en
zal ik het carotinoïde B blijven noemen.

Carotinoïde C is het meest naar het roode deel van het
spectrum verschoven. Wat zijn chemische eigenschappen
betreft, komt carotinoïde C overeen met lycopine (zie hoofd-
stuk 111).nbsp;, ^ ,

bepaald in alcohol en geeft twee metingen op (in mm), cle
eerste voor een minder en de tweede voor een meer gecon-
centreerde oplossing.

Coward (1924) heeft de absorptiebanden gemeten
van lycopine, opgelost in petroleumaether.

Vergelijkt men de opgaven van E s c h e r en C o w a r d
met elkaar dan ziet men, dat de banden volgens E s c h e r
een weinig meer naar het roode deel van het spectrum lig-
gen.

De maxima 1 en 111 van carotinoïde C, opgelost in petro-
leumaether, komen goed overeen met de absorptiebanden 1
en 111 van lycopine volgens de opgave van Coward.
Het maximum 11 van carotinoïde C ligt een weinig meer
naar het roode deel van het spectrum dan band 11 van lyco-
pine. Men moet echter bedenken, dat de metingen van
Coward verkregen zijn met een spectroscoop en dat hier-
mee niet zonder meer de juiste plaats van de banden aan
te geven is. Zeer waarschijnlijk is carotinoïde C dus iden-
tiek met lycopine, maar daar ik hiervoor geen absolute
zekerheid heb, zal ik het .schimmelpigment toch carotinoïde
C blijven noemen.

Het in dit hoofdstuk beschreven onderzoek werd verricht
in het Physisch Laboratorium der Rijksuniversiteit te
Utrecht Prof. Dr. L. S. Ornstein dank ik op deze
plaats ten zeerste voor zijn hulp en tevens voor de bereid-
willigheid, waarmede hij mij toestond van de apparaten ge-
bruik te maken.

Neurospora sitophila werd hoofdzakelijk in glazen cul-
tuurdoozen met deksels met ingeslepen rand (zie pag. 9)
gekweekt. Soms moest ik, wanneer ik veel schimmehnate-
riaal tegelijk noodig had, ook nog gebruik maken van doo-
zen met deksels met overhangenden rand. In de eerstge-
noemde doozen vormde de schimmel prachtig hoog wit
luchtmycelium als de cultures in het donker gestaan had-
den. In de doozen met deksels met overhangenden rand
groeide de schimmel ook heel goed, vormde wit luchtmyce-
lium, maar wanneer dit een eind tegen den opstaanden kant
van de doos gegroeid was, vertoonden zich hiertusschen
kleine groepjes conidiën. Deze laatste zijn in het allereerste
ontwikkelingsstadium wit, maar al heel spoedig worden ze
rose, dan oranje-rose en tenslotte fel oranje. Hierin heeft
dus, zonder aanwezigheid van licht, kleurstofvorming plaats.

De doozen met de deksels met overhangenden rand zijn
veel minder goed gesloten dan die met deksels met inge-
slepen rand, waardoor dus een verschil ontstaat in de toe-
treding van de lucht. Indien inderdaad deze vrijere toetre-
ding van belang is voor de kleurstofvorming, dan zal de
schimmel, als men het deksel van de doos er gedurende
eenige uren afneemt, wat betreft den luchttoevoer, onder nog
betere voorwaarden zijn dan in de slecht sluitende doo-
zen.

Opent men de goed gesloten doos en laat men deze steeds
onder afsluiting van licht staan, dan is er als de doos na 5
uur gesloten wordt, geen kleurstofvorming in het lucht-
mycelium waar te nemen. De kans, dat de schimmel door
het langdurig geopend zijn van de doos geïnfecteerd wordt,
is voor Neurospora niet groot.

Na een dag is er tusschen het mycelium een begin van
vorming van conidiën waar te nemen, die zich snel rose kleu-
ren. Het mycelium is echter nog steeds kleurloos gebleven.
De vrije toetreding van de lucht heeft dus niet ten gevolge
gehad, dat zich zonder licht kleurstof vormde in het lucht-
mycelium. Hiervoor moet dus steeds de factor licht aanwe-
zig zijn.

Nu is het de vraag of er pigmentvorming mogelijk is bij
aanwezigheid van licht als de cultuurdoos van de lucht af-
gesloten wordt. Om dit te onderzoeken werd de rand van
de goedsluitende doos met vaseline ingesmeerd en na het
enten op de doos geplaatst, zoodat toetreding van de lucht
niet meer mogelijk was. Gedurende zes dagen werd de doos
in het duister bewaard. In dezen tijd was de schinmiel vrij
goed gegroeid, wel minder dan in een niet zoo goed geslo-
ten doos, maar er had zich nog tamelijk veel wit lucht-
mycelium gevormd. De cultuur werd nu in diffuus daglicht
gebracht, maar na eenige dagen had zich in het geheel
geen kleurstof gevormd.

Het licht alleen is dus niet voldoende om de kleurstof te
vormen; er moet ook voldoende luchttoevoer plaats heb-
ben.

Ook in de literatuur vond ik eenige opgaven, die er op
Wijzen, dat er voor de vorming van enkele roode schimmel-
kleurstoffen voldoende luchttoevoer moet zijn. Laborde
(1896) vermeldt, dat de kleurstofvorming in Euroiiopsis
Gayoni bij zwakke luchttoetreding en op vloeibare media ge-
ring was. Na rijkelijken toevoer van lucht werd er snel kleur-
stof gevormd. B e s s e y (1904) vond, dat voor de vorming

van de roode kleurstof van eenige soorten van Fusarium en
Neocosmospora zuurstof onmisbaar is. Op vloeibare media
vormt de kleurstof zich slechts in het oppervlakkig gelegen
deel van het mycelium. Door Hibino (1925) is bij Mo-
nascus purpureus waargenomen, dat in anaerobiontische
cultures de kleurstofvorming zeer verminderd was. Het ge-
lukte hem echter niet een volkomen kleurlooze cultuur te
verkrijgen. Zeker is het echter, dat zuurstof belangrijk is
voor de pigmentvorming.

Evenals B e s s e y (1904) vond ik ook, dat op de vloei-
bare mout alleen de bovenste laag van het mycelium kleur-
stof bevatte; lagen, die zich in de mout bevonden bleven
ongekleurd. Nam ik het myceliumdek, wat meestal vrij dik
was, uit de voedingsoplossing en legde ik het met de onge-
kleurde zijde naar boven, dan vormde zich hierin heel spoe-
dig kleurstof.

Van belang was het nu na te gaan of de zuurstof bij de
aanwezigheid van licht noodzakelijk is voor de kleurstof-
vorming van Neurospora. Went (1901 a) vermeldt, dat
deze schimmel anaerobiontisch leven kan. Werd de schim-
mel geënt in cultuurbuisjes en deze gebracht in wijdere
Buchnersche buizen, waarin zich pyrogallol en kaliloog be-
vonden en het geheel goed afgesloten van de lucht, dan
had er normale ontwikkeling plaats. Dit was ook het geval,
wanneer de culturen zich in doozen onder een glazen klok
bevonden, waarin de lucht door waterstof verdrongen en dit
gas van tijd tot tijd vernieuwd werd. Het uitstroomende
waterstofgas bevatte koolzuur. Wel maakte het den indruk,
dat de ontwikkeling van de schimmel geringer is, naarmate
de zuurstof beter verdreven is. Niet vermeld wordt of de
kleurstofvorming vermindert of ophoudt. B e s s e y (1904)
onderzocht bij eenige soorten van Fusarium en Ncocosmo-

Spora den invloed van zuurstof en andere gassen op de vor-
ming van de oranje kleurstof. Van deze kleurstof kon slechts
vastgesteld worden, dat het geen chromolipoïde was. Geen
kleurstof werd gevormd in een atmosfeer van waterstof of
koolzuur; zuurstof is dus voor de vorming van het oranje
pigment noodzakelijk. Naumann (1912) werkte met
Epicocciim purpurascens, een schimmel met een rood pig-
ment van een onbekende chemische samenstelling. Voor de
vorming van dit pigment is zuurstof absoluut noodzakelijk.
Dit leidde hij af uit de volgende feiten: 1. de schimmel
vormt bij submersen groei nooit pigment; 2. door quantita-
tief uitschakelen van de zuurstof gelukte het de kleurstof-
vorming zoowel als den groei te onderdrukken, zonder
daardoor de schimmel te dooden, b.v. in een atmosfeer van
koolzuur; 3. door de aanwezigheid van sporen zuurstof
treedt zoowel groei als pigmentvorming op, n.1. in een at-
mosfeer van waterstof en stikstof, waaruit de zuurstof zoo-
veel mogelijk door pyrogallol verwijderd is.

Om den invloed van verschillende gassen na te gaan,
werd Neurospora in Erlenmeyer kolven van 300 c.c., waarin
zich vloeibare mout bevond, geënt. De kolven waren geslo-
ten door een dubbel doorboorde gummistop, waarin zich
een glazen in- en afvoerbuisje bevonden. Bij het inleiden
van koolzuur werd de toevoerbuis lang, de afvoerbuis daar-
entegen kort genomen. Juist het omgekeerde geschiedde bij
de doorvoering van lichtere gassen. Onderzocht werden:
koolzuur, waterstof en stikstof.

In een Kipptoestel werd uit marmer en zoutzuur koolzuur
ontwikkeld en dit gas werd door een wasclifleschje met ge-
tlistilleerd water in de kolf geleid, waarin de schimmel ge-
ent was. Nadat het koolzuur gedurende een paar uur door-
geleid was, werden de toe- en afvoerbuizen, die capillair
uitgetrokken waren, toegesmolten. Na 6 dagen was geen
groei waar te nemen. Om te controleeren of de schimmel

nog leefde, werd de gummistop er afgenomen en de kolf
me\'t een wattenprop gesloten. Na een paar dagen trad groei
en in het licht kleurstofvorming op.

Om nu vast te kunnen stellen of in een atmosfeer van
koolzuur kleurstofvorniing mogelijk is, werd het gas in een
kolf geleid, waarin zich reeds hoog wit luchtmycelium ge-
vormd had. Gedurende eenige uren werd onder afsluiting
van licht koolzuur doorgevoerd. Nadat de toe- en afvoerbuis
afgesmolten waren, werd de kolf in diffuus daglicht ge-
plaatst. Na een paar dagen was absoluut geen kleurstofvor-
ming opgetreden. In een atmosfeer van koolzuur is dus geen
pigmentvorming mogelijk.

Werd de gummistop nu vervangen door een wattenprop,
dan was na eenige uren in diffuus daglicht nog geen rose
kleuring waar te nemen. Dit is wel steeds het geval bij een
schimmel, die onder normale omstandigheden in het donker
gekweekt is en dan in het licht geplaatst wordt. Na 24 uur
trad in de kolf, waarin zich koolzuur had bevonden, begin
van kleurstofvorming op en na eenigen tijd was de kleuring
heel normaal. Het duurt dus tamelijk lang, voordat de
schimmel zich hersteld heeft en weer in staat is pigment

De waterstof werd in een Kipptoestel ontwikkeld uit zink
en zwavelzuur. Het gas werd geleid door waschfleschjes
met sublimaat, kaliumpermanganaat, alkalische pyrogallol-
oplossing en gedistilleerd water. Nadat alle lucht uit de kolf,
waarin zich de geënte schimmel bevond, verdreven was,
werden de toe- en afvoerbuisjes dichtgesmolten. Na 6 da-
gen was het geënte stukje mycelium een weinig uitgegroeid.
Dit uitgroeien wijst op minimale aanwezigheid van zuurstof.

Of kleurstofvorming in een atmosfeer van waterstof mo-
gelijk is, kan vastgesteld worden, door het gas te leiden
door een kolf, waarin zich reeds hoog wit luchtmycelium
bevindt, dat van het licht afgesloten is. In een atmosfeer

van waterstof blijft de schimmel, na plaatsing in diffuus
daglicht, kleurloos. Na opening van de kolf is na een dag
begin van kleurstofvorming waar te nemen.

Om een koolzuurvrije en zooveel mogelijk zuurstofvrije
atmosfeer te verkrijgen, werd een stikstof bom gebruikt.
Deze bevat volgens d e B o e r (1928) een gas, bestaande
uit bijna 98 % stikstof en ruim 2 % zuurstof. De stikstof
werd geleid door waschfleschjes met alkalische pyrogallol-
oplossing en gedistilleerd water. Gedurende eenige. uren
werd de stikstof door de kolf geleid, waarin het mycelium
geënt was, en daarna werden de toe- en afvoerbuisjes dicht-
gesmolten. Na eenige dagen was duidelijk groei waar te
nemen, en zelfs vormde zich wat luchtmycelium, dat zich bij
aanwezigheid van licht heel zwak kleurde, maar na eenige
dagen niet in kleurintensiteit was toegenomen. Deze kleur-
stofvorming was zoo gering, dat deze slechts duidelijk
waarneembaar was, als het luchtmycelium uit de kolf werd
gehaald en eenige lagen op elkaar gelegd werden. Ver-
gelijkt men dit met absoluut kleurloos mycelium, dan is wel
eenig verschil te bespeuren. Den nog betrekkelijk goeden
groei bracht ik op rekening van de bij de stikstof nog aan-
wezige zuurstof.

Werd nu, onder afsluiting van licht, door een kolf, waar-
in reeds wit luchtmycelium gevormd was, gedurende eenige
uren stikstof geleid en werd na afsmelting van de toe- en
afvoerbuisjes deze kolf in diffuus daglicht geplaatst, dan
vormde zich ook een zeer geringe hoeveelheid kleurstof, die
niet in sterkte toenam. Ook deze kleuring was eerst na ver-
gelijking met geheel kleurloos mycelium waar te nemen.
De geringe hoeveelheid zuurstof bij de stikstof was dus
blijkbaar in staat een heel zwakke kleurstofvorming teweeg
te brengen.

Onverklaarbaar leek me aanvankelijk nog, waarom geen
kleurstofvorming plaats had in de schimmel, die zich ont-

wikkeld had in een glazen cultuurdoos, die geheel van de
lucht afgesloten was, en wel in de schimmel, die gegroeid
was in een atmosfeer van stikstof, die ± 2 % zuurstof be-
vatte. De schimmel heeft voor zijn groei zuurstof noodig,
wat blijkt uit het uitblijven van groei in een atmosfeer van
koolzuur en uit den zeer geringen groei in een atmosfeer van
waterstof, waar slechts sporen zuurstof aanwezig zijn.
In de kolf, waarin stikstof met een klein percentage zuur-
stof geleid was, had eenige ontwikkeling plaats, die op-
hield, nadat blijkbaar alle zuurstof opgebruikt was. De
schimmel, die in de afgesloten doos geënt was, kon aan-
vankelijk groeien in een atmosfeer, waarin ± 20 % zuur-
stof aanwezig was, welk percentage tijdens den groei daal-
de. De ontwikkeling was vrij goed en hield eerst op, na-
dat alle zuurstof verbruikt was. Het leek me nu eerst niet
goed verklaarbaar, waarom zich, bij aanwezigheid van
licht, wel een geringe hoeveelheid kleurstof vormde in de
schimmel, die in de kolf met een atmosfeer van stikstof ge-
groeid was en niet in de afgesloten doos, daar in beide de
zuurstof wel geheel, of nagenoeg geheel, opgebruikt zal zijn.
Dit zou alleen te verklaren zijn, als ook de kleurstofvor-
ming bij afwezigheid van zuurstof onder invloed stond van
het aanwezige koolzuur. In de kolf groeit de schimmel van
het begin af in een atmosfeer met weinig zuurstof, hoog-
stens 2 D e B o e r (1928) vond voor Pliycomyccs, ge-
kweekt op zetmeelmedia, dat bij aanwezigheid van 2 %
zuurstof de koolzuurafgifte tot 50 % van de normale werd
gereduceerd, terwijl bij 1 % zuurstof de afgifte slechts
40 % was. Ook in een veel oudere publicatie van D i a k o-
n o w (1886) wordt vermeld, dat de COo-afgifte door Peni-
cillium en Aspergilliis, gekweekt op suikermedia, bij afwe-
zigheid van zuurstof, tot een vierde verminderd is.

Er mag dus wel verondersteld worden, dat ook de kool-
zuurafgifte van Neurospora, in de kolf met zeer kleine zuur-
stofspanning belangrijk afgenomen zal zijn en door het

weinige mycelium zal de hoeveelheid gevormd koolzuur niet
groot zijn. In de doos daarentegen heeft in het begin nor-
male ademhaling plaats; langzamerhand zal bij daling van
het zuurstofgehalte de koolzuurafgifte verminderen. Er
wordt tamelijk veel mycelium gevormd, dus de hoeveelheid
aanwezig koolzuur zal tenslotte vrij groot zijn. Wanneer in-
derdaad het koolzuur bij afwezigheid van zuurstof de kleur-
stofvorming tegengaat, moet deze wel in geringe mate
optreden, als het koolzuur geabsorbeerd wordt door kali-
loog. Daarom plaatste ik in een doos een bakje met sterke
kaliloog en sloot de doos van de lucht af. Nadat de schim-
mel zich ontwikkeld had en geen verdere groei meer optrad,
werd de cultuur in diffuus daglicht geplaatst. Na eenigen
tijd had er werkelijk een zeer geringe kleurstofvorming
plaats, die niet in sterkte toenam.

Inderdaad schijnt dus bij afwezigheid van zuurstof de
aanwezigheid van een bepaalde hoeveelheid koolzuur rem-
mend op de kleurstofvorming te werken. Wordt deze wer-
king opgeheven, dan is zonder zuurstof een zeer geringe
kleurstofvorming mogelijk.

Ook de andere proeven, waarbij de verschillende gassen
over goed gegroeide cultures geleid werden, stennnen hier
goed mee overeen. In een atmosfeer van koolzuur is geen
pigmentvorming mogelijk. In een atmosfeer van waterstof
met sporen van zuurstof zal de koolzuurafgifte gering zijn.
Daar er echter in de kolf een groote hoeveelheid luchtmyce-
lium aanwezig is, is de hoeveelheid gevormd koolzuur blijk-
baar toch nog te groot, en de eerst nog aanwezige zuurstof
te klein, om kleurstofvorming mogelijk te maken. De schim-
mel in de kolf met een atmosfeer van stikstof, vermengd
met ±2 % zuurstof, heeft een belangrijke vermindering in
zijn koolzuurafgifte. Door de eerst nog aanwezige zuurstof
schijnt de schimmel in staat te zijn toch nog eenige kleur-
stof te vormen.

veelheid koolzuur bij afwezigheid van zuurstof nog juist
eenige kleurstofvorming mogelijk is, zou eerst nauwkeurig
de ademhaling van Neurospora bekend moeten zijn.

In § 1 wees ik er reeds op, dat conidiën zonder aanwe-
zigheidvan licht oranje kleurstoffen kunnen vormen, waartoe
het mycelium nooit in staat is. In het volgend hoofdstuk zal
ik bespreken, hoe ik getracht heb na te gaan of er verband
bestaat tusschen de hoeveelheid licht en de hoeveelheid ge-
vormde kleurstof. Hiervoor was het echter noodig, dat ik
steeds met cultures werkte, die geen conidiën vormden, daar
deze onafhankelijk van licht hun intensief oranje kleur aan-
nemen. Het was dus noodzakelijk vast te stellen door welke
factoren de conidiënvorming beinvloed wordt.

Went (1901 a) vermeldt, dat de conidiënvorming van
Neurospora sitophila sterk onder invloed staat van de voch-
tigheid en toont dat voor een drietal gevallen aan. In het
wanne en vochtigeklimaatvan Java groeide de schimmel zoo
welig, dat de conidiën zich buiten de wattenprop of de gla-
zen schalen vertoonden. Voorts vormden zich in verdunde
voedingsoplossingen veel conidiën, terwijl ze in geconcen-
treerde oplossingen bijna niet aanwezig waren, wat waar-
schijnlijk te wijten is aan de geringe dampspanning boven
deze laatste. In een kolf, waarover laboratoriumlucht streek,
vormden zich tamelijk veel conidiën, de conidiënvorming
was echter veel grooter als de lucht eerst door water gevoerd
werd. Werd de lucht echter eerst over chloorcalcium geleid,
dan vormde zich krachtig ondergedoken mycelium, maar
er was geen spoor van conidiën waar te nemen. Het ont-
breken van de conidiën aan het ondergedoken mycelium zou
niet geweten moeten worden aan de zuurstofonttrekking,
daar in anaerobe schimmelculturen in een atmosfeer van
stikstof wel conidiën gevormd werden.

Indien ik de cultuurkolven en doozen met deksels met in-
geslepen rand, zoowel als die met deksels met overhangen-
den rand, waarin zich gelijke hoeveelheden vloeibare mout
bevonden. na het enten in een zeer vochtige ruimte plaatste
bij een temperatuur van ± 30°, dan was inderdaad na en-
kele dagen de schimmel uit de wattenprop en de doozen
gegroeid en hadden zich hier buiten rijkelijk conidiën ont-
wikkeld. Dit trad op zoowel in doozen met deksel met inge-
slepen rand, als in die met deksel met overhangenden rand.
Liet ik de doozen en kolven na het enten staan in de labora-
toriumlucht, die veel minder vochtig was, dan groeide het
mycelium niet naar buiten en vormden zich conidiën in de
kolven en in de slecht sluitende doozen. In de goed slui-
tende doozen had zich alleen hoog luchtmycelium gevormd,
terwijl men door het beter sluiten, en dus grootere vochtig-
heid, hier eerder conidiën in zou verwachten. Bracht ik nu
in eenige goed sluitende doozen bakjes met calciumchloride,
in andere bakjes met water, dan traden in de eerste conidiën
op, vooral rondom de chloorcalcium, terwijl in de tweede
slechts luchtmycelium gevormd werd. Dit nam ik waar zoo-
wel bij vloeibare mout, als bij moutagar als voedingsbo-
dem. Voorts verkreeg ik bij verhoogde concentratie van de
voedingsoplossing (zie pag. 8) steeds conidiënvorming.
Hieruit ziet men dus, dat conidiënvorming plaats heeft bij
afname van de luchtvochtigheid. Ditzelfde werd voor een
soort van Botyiris gevonden door Link, R a m s e y en
B a i 1 e y (1924). Ook het tegenovergestelde komt voor bij
soorten van Sclcroünia, door M o I z (1907), Schellen-
l^erg (1907) en Barss (1923) waargenomen. Hier
treedt conidiënvorming vooral in vochtige lucht op.

In de cultures, die zich in een atmosfeer van koolzuur,
waterstof of stikstof bevonden, of in doozen, die door het
bestrijken van de deksel met vaseline geheel van de lucht
afgesloten waren, zag ik nooit conidiënvorming optreden.
Voor die vorming is zuurstof noodzakelijk. Door extra toe-

voer van lucht b.v. door het wegnemen van het deksel gedu-
rende eenige uren, vormden zich zeer veel conidiën. Het op-
treden van de conidiën buiten de cultuurdoozen en buizen in
een vochtige warme atmosfeer is dus een gevolg van den groo-
ten luchttoevoer. Luchtvochtigheid schijnt dus bij dien groo-
teren luchttoevoer de conidiënvorming niet tegen te werken.
Ik controleerde het nog eens door een doos zonder deksel
na enting op een bak met water te plaatsen en hierover een
klok te zetten. Er vormde zich hoog luchtmycelium, dat snel
over den rand van de doos groeide naar den bak met wa-
ter. Vochtige lucht bevordert zeer de groeisnelheid van het
mycelium; dit is ook door Kunkel (1914) waargenomen.
Onderaan het mycelium vormden zich talrijke conidiën; de
vorming hiervan wordt dus niet in vochtige lucht tegenge-
werkt.

Ook in zeer droge atmosfeer heeft bij rijkelijke aanwe-
zigheid van zuurstof conidiënvorming plaats. Dit is gemak-
kelijk waar te nemen, als men de doos, waarin het myce-
lium geënt is, zonder deksel in een exsiccator plaatst. Het
mycelium blijft laag, maar er vormen zich talrijke conidiën.
Zelfs kan men in deze zeer droge atmosfeer het mycelium,
dat in vloeibare mout gegroeid is, zonder voedingsbodem
tot conidiënvorming brengen. Wordt het myceliumdek na
afspoelen met water en drogen tusschen filtreerpapier in
den exsiccator gelegd, dan vormen zich na korten tijd zeer
veel conidiën.

Bij rijkelijken zuurstoftoevoer heeft dus zoowel in droge
als in vochtige atmosfeer conidiënvorming plaats.

Reeds verschillende malen heb ik er op gewezen, dat
Neurospora sitophila in het donker gekweekt kleurloos is
en in het licht oranje gekleurd wordt. Dit is opgemerkt door
Went (1901 b, 1904) en reeds in de inleiding besproken.
In de literatuur zijn verschillende gevallen bekend, waar
Carotine en enkele onbekende schimmelpigmenten onder in-
vloed van het licht gevormd worden.

Reeds E 1 f v i n g (1882) deelde mee, dat bij geëtioleer-
de planten de Carotine (spreekt nog van etioline) zich in het
licht vermeerderde, wanneer de chlorophylvorming door
verlaging van temperatuur onderdrukt werd. Kohl (1902)
bevestigde deze mededeeling, maar vond, dat ook zonder
medewerking van licht Carotine gevormd kon worden. B e s-
s ey (1904) vindt, dat de oranje kleurstof van eenige soor-
ten van Fusarium en Neocosmospora, die niet tot de chro-
molipoïden behoort, slechts onder invloed van het licht ge-
vormd kan worden. Willstätter en Stoll (1913)
vermelden groote schommelingen in carotinevorming in
licht- en schaduwbladen. Uit een bijgevoegde tabel volgt,
dat er meer Carotine gevormd wordt in lichtbladen. L i p p-
maa (1924) verkreeg de omzetting van chloroplasten in
chroinoplasten in geïsoleerde bladfragmenten van Reseda
odorata op saccharose-oplossingen. De roode kleurstof van
de chromoplasten is een carotinoïde; licht schijnt voor de

vorming onontbeerlijk te zijn. In 1925 heeft L i p p m a a dit
onderzoek verder voortgezet en vond, dat de roode kleuring
van de bladen veroorzaakt wordt door het zich vormende
rhodoxanthine, een carotinoïde. Bij cultures in het donker
verliep het proces van de chromoplastenvorming,wat chloro-
phyl, xanthophyl en carotine betreft, bijna evenals bij cultu-
res in het licht. Daarentegen waren de gevormde hoeveel-
heden rhodoxanthine minimaal en bedroegen gemiddeld ca.
1/5 van de gelijktijdig in het licht gevormde hoeveelheden.
D a n i i O V (1925) vermeldt, dat cultures van Isaria vires-
cens in het donker kleurloos waren, terwijl in daglicht de
chromolipoïden optraden, waardoor de schimmel van rose
tot oranjerood gekleurd werd. Chodat en Mayer
(1927) merkten op, dat de carotine in eenige algen in het
licht toenam.

Het mycelium van Neurospora maakt, als het zich in het
donker ontwikkeld heeft, een absoluut kleurloozen indruk.
Toch vond ik na extraheeren met methylalcoholische petro-
leumaether, dat deze lichtgeel gekleurd werd, wat er dus
op wijst, dat er zonder licht toch nog een weinig kleurstof-
fen gevormd worden.

Reeds een zeer korte belichting door diffuus daglicht
deed de hoeveelheid kleurstoffen toenemen. Werkte het licht
langer op de schimmel in, dan nam de vorming van de
pigmenten toe. Dit deed vermoeden, dat er een verband be-
staat tusschen de toename van de hoeveelheid licht en de
toename van de hoeveelheid kleurstoffen. Om hier echter
nader op in te kunnen gaan, was het noodig, dat met een
electrische lichtbron gewerkt werd.

Als lichtbron werd genomen een electrische daglichtlamp,
die in een cylindervormig glazen vat gehangen werd, waarin
voortdurend water stroomde om de lamp te koelen, daar

anders een te groote temperatuursverhooging op zou tre-
den. De schimmel werd gekweekt in de glazen doozen met
deksels met ingeslepen rand in 20 c.c. vloeibare mout, zoo-
als aangegeven is op pag. 9. Hierin vormde zich in het don-
ker hoog wit luchtmycelium zonder conidiën.

Om de intensiteit van het licht, waarmee de schimmels
bestraald werden, te meten, werden eerst met een photo-
electnsche cel, die op de plaats van de cultuurdoozen gezet
was, de relatieve lichteenheden gemeten. Om nu deze laatste
uit te drukken in absolute waarden (erg/cM^ sec) is later
de uitslag van de photocel vergeleken met den galvanome-
teruitslag van een absoluut geijkte thermozuil bij gebruik
van dezelfde lichtbron. Bij deze meting was tusschen de
lichtbron en de thermozuil, respectievelijk de photocel, ko-
persulfaat en 2 c.M. water tusschengeschakeld. Het bleek
uit deze vergelijkingsmeting, dat de schimmels in het zicht-
bare deel van het spectrum (CUSO4) door ongeveer 88 6
erg/c.M^ sec. belicht werden.

Twaalf doozen werden voor de belichting rondom het
cyhndervormige vat geplaatst, zoodat het licht onder een
loek van 60° in de doozen viel. Eerst werden gelijke be-
lichtingstijden genomen om uit te kunnen maken of de ge-
vormde hoeveelheid kleurstof in het luchtmycelium van alle
doozen even groot was. Daar de kleurstof zich eerst lang-
zamerhand vormt, werden bij alle proeven de cultures na de
belichting gedurende 24 uur in het donker gezet en daarna
werd het luchtmycelium pas geoogst en behandeld op de
op pag. 10 beschreven wijze. De kleur van het gedroogde
poeder, afkomstig uit de verschillende doozen, werd verge-
leken. De poeders varieerden aanzienlijk in kleurintensiteit.
Om te controleeren, of inderdaad de hoeveelheden ge-
vormde kleurstoffen aanmerkelijk verschilden, extraheerde
\'k de verschillende poeders volgens de gegeven methode en
vergeleek de verkregen extracten colorimetrisch (zie pag.
30). Inderdaad was er een belangrijk verschil waar te ne-

men; het bleek, dat dit aan de gedroogde poeders heel goed
te constateeren was. Deze proeven werden verschillende
malen herhaald, ook met andere belichtingstijden, maar
steeds werden betrekkelijk groote afwijkingen waargeno-
men Deze afwijkingen meende ik voor een groot deel te
moeten toeschrijven aan het feit, dat het licht niet loodrecht
inviel, waardoor het mycelium niet geheel gelijkmatig be-
licht werd. Het beste zou zijn, als de doozen op hun kant
gezet en dan op gelijke hoogte rondom de lamp geplaatst
konden worden, zoodat het licht loodrecht inviel. Door den
vloeibaren voedingsbodem is dit echter niet mogelijk.

Een andere oplossing werd verkregen door in een grooten
ronden aquariumbak met een diameter van 50c.M. 3 lampen
te hangen en deze ook weer voortdurend met stroomend
water te koelen. De bak werd op een ijzeren-ring geplaatst,
die bevestigd was aan een ijzeren driepoot. Hierdoor was
het dus mogelijk onder den bak de doozen op 12 c.M. af-
stand te zetten. De drie lampen waren zoodanig geplaatst,
dat ze de hoekpunten van een gelijkzijdigen driehoek vorm-
den. De bodem van den bak was van vrij goed glas, zoo-
dat het den indruk maakte, dat de belichting heel gelijk-
matig was.

Op dezelfde wijze als genoemd op pag. 67 werd de in-
tensiteit bepaald. Per lamp werden de schimmels door 130,6
erg/c.M.^ sec. belicht. Tusschen twee lampen in was de
lichtintensiteit 20 % minder, zoodat slechts drie doozen
tegelijk belicht konden worden, wat een bezwaar is van
deze manier van belichting. Iedere doos vormde een hoe-
veelheid luchtmycelium, dat gemiddeld slechts 70 m.G. aan
droge stof opleverde, terwijl voor het colorimetrisch be-
palen van de kleurstoffen van minstens 200 m.G. droge
stof uitgegaan moet worden, daar voor zeer kleine hoe-
veelheden de methode niet nauwkeurig genoeg is.

Nu de belichting van de doozen dus heel gelijkmatig was,
bepaalde ik eerst, of op deze wijze de hoeveelheid ge-

vormde kleurstof bij gelijken belichtingstijd even groot was.
Verschillende groepen van drie doozen werden belicht en
ook nu werden weer verschillen waargenomen. Wat kon de
oorzaak van deze ongelijkheid zijn? Zou het te wijten zijn
aan den ongelijkmatigen groei van het mycelium, zoodat de
dichter op elkaar gegroeide myceliumdraden minder licht
ontvingen dan de los van elkaar liggende draden? Op pag.
9 heb ik er reeds op gewezen, dat ik een zoo gelijkmatig
mogelijken groei trachtte te verkrijgen, door het entstukje
van ongeveer gelijke grootte in het midden te enten. Toch
kan men niet voorkomen, dat er dichte en minder dichte
plekken luchtmycelium gevormd worden. Bovendien krijgt
het mycelium, dat zich dicht bij het deksel bevindt, ook meer
licht, dan hetgeen vlak bij den bodem is, daar de lichtinten-
siteit omgekeerd evenredig is met het quadraat van den af-
stand. Om deze fouten uit te kunnen schakelen en een dunne
laag mycelium te kunnen belichten »trachtte ik het mycelium
^egen een glazen plaat op te laten groeien, wat echter niet
gelukte. Moest de conidiënvorming bij de belichtingsproe-
ven niet uitgeschakeld worden, dan zou misschien moge-
lijk zijn het ongekleurde luchtmycelium tusschen twee gla-
zen plaatjes te leggen en dan te belichten. Haalt men het
luchtmycelium echter uit de cultuurdoozen, dan krijgt het
zulk een vermeerderden luchttoevoer, dat zich conidiën be-
ginnen te vormen.

Mogelijk ligt de ongelijkheid van kleurstofvorming ook
aan den niet overal even grooten luchttoevoer in de doozen.
In hoofdstuk V besprak ik den grooten invloed, dien de
zuurstof heeft op de kleurstofvorming. Daar niet alle doozen
precies even goed zullen sluiten, trachtte ik deze ongelijk-
heid uit te schakelen, door het deksel met vaseline in te
smeren en dus geheel van de lucht af te sluiten. Voor den
luchttoevoer werd midden in het deksel een opening ge-
maakt van 1 m.M. diameter. Na het enten groeide het myce-
lium nu niet langs den opstaanden kant van de doos; pre-

cies onder de opening vormde zich een weinig luchtmyce-
lium, wat echter veel te gering was om mee verder te wer-
ken. Ten slotte probeerde ik nog gelijken luchttoevoer te
verkrijgen, door in den rand van den opstaanden kant van
de glazen doos op gelijke afstanden zeer ondiepe inham-
men te maken. Het resultaat was, dat zich precies onder de
openingen kleine groepjes conidiën vormden; deze manier
van kweeken was dus niet bruikbaar.

Het gelukte mij dus niet, de ongelijkheid in groei en
luchttoevoer uit te schakelen, maar toch wilde ik trachten
eenig inzicht te krijgen over den invloed van verschillende
hoeveelheden licht op de kleurstofvorming. De kleurstoffen
werden niet colorimetrisch bepaald, daar de uitkomsten te
ongelijk waren om ze in getallen vast te kunnen leggen.
Aan de kleur van het poeder was de meer of mindere hoe-
veelheid gevormde kleurstof heel goed te schatten en voorts
konden de poeders vergeleken worden met de „Code des
couleursquot;.

§ 3. De invloed van continue belichting met een electrische lichtbron
op de klcurstofvorming.

De verschillende belichtingstijden werden tamelijk uit-
eenloopend genomen om duidelijke verschillen waar te
kunnen nemen. Ik begon met korte belichtingstijden en nam
telkens drie doozen, die ik 5, 10, 15, of 30 min. belichtte.
Daar de kleurstof zich eerst langzamerhand vormt, werden,
zooals ik reeds opmerkte, bij alle proeven de cultures na
de belichting gedurende 24 uur in het donker gezet, terwijl
daarna pas het luchtmycelium geoogst werd.

Vervolgens verlengde ik de belichtingstijden tot 1, 2, 3,
4, 6, of 8 uur, om ten slotte zelfs 20 of 24 uur te belichten.
Na al deze belichtingen was heel duidelijk waar te nemen,
dat er geen regelmatige vermeerdering van de kleurstoffen
had plaats gehad. De meeste toename werd waargenomen,
als de schimmel, die in het donker gegroeid was, aan een

Behalve de onregelmatige toename trad ook wel na
langere belichting een afname op. Heel goed denkbaar is,
dat het licht, dat verschillende stoffen om kan zetten in de
carotmoïden, ook tot het omgekeerde in staat is en dat bij
bepaalde belichtingstijden deze laatste splitsing tiideliik

Het golfvormige verloop van de vermeerdering van de
\'eurstoffen hoort nu\'sschien thuis onder de verschijnselen,
\'e Plotnikow (1928) periodische lichtverschijnselen
noemt. De verschijnselen ontstaan door de gelijktijdige in-
werking van licht van verschillende golflengten. Ze zijn
echter nog zeer weinig onderzocht, slechts enkele gevallen

^ chemie zijn beschreven en Koningsberger
y 22) heeft ze waargenomen bij den plantengroei. Een
arakteristiek verschijnsel voor de lichtgroeireactie is het
go fvormige verloop, wat bij monochromatisch licht niet op-
reedt. Koningsberger meent, dat de oorzaak van dit
golfvormig verloop niet, of tenminste niet uitsluitend, in de
P ant, maar in de samengestelde natuur van het witte licht
gezocht moet worden. Plotnikow zegt hierover: „Es
pussen in der Pflanze ein oder mehrere Faktoren vorhan-
en sein, die bei Strahleneinwirkung entweder periodisch
auftreten und verschwinden oder unter der Einwirkung ver-
seiiedener Wellenlängen zu verschiedenen Zeiten auftre-

ten und auf diese Weise das periodische Wachstum d.h.das
intermittierend verlaufende Anhäufen der chemischen Stof-
fe verursachenquot;.

Om uit te kunnen maken of het golfvormige verloop van
de kleurstofvermeerdering werkelijk geheel of gedeeltelijk
ontstaat door de inwerking van het samengestelde licht, zou
de schimmel aan verschillende hoeveelheden monochroma-
tisch licht blootgesteld moeten worden. Zoolang echter de
groei in de doozen zoo onregelmatig is en niet elke myce-
liumdraad evenveel licht en zuurstof krijgt, heeft het voor-
loopig geen nut hier verder op in te gaan.

§ 4. Dc invloed van intermitteerende belichting ract ccn clectrische
lichtbron op de kleurstofvorming.

Terwijl ik bezig was met de in de vorige § genoemde be-
lichtingsproeven, is het één maal gebeurd, dat tijdens het
belichten door een defect aan het stopcontact de belichting
onderbroken moest worden. De cultures waren slechts 10
min. belicht en het duurde eenigen tijd, voordat de overige
50 minuten licht gegeven konden worden. Na het drogen
bleek, dat deze groep schimmehnycelium, die in twee ge-
deelten belicht was, aanmerkelijk meer kleurstof gevormd
had, dan de overige groepen, die een uur continu belicht
waren. Dit bracht mij op het denkbeeld, dat intermittee-
rende belichting misschien heel gunstig op de kleurstofvor-
ming zou werken. Heel goed mogelijk is, dat tijdens het
duisternisinterval, dat op het lichtinterval volgt, omzettingen
plaats vinden, die de volgende lichtwerkingen bevorderen.
Door P 1 o t n i k o w (1928) wordt er ook zeer nadrukke-
lijk op gewezen, dat bij intermitteerende belichting bij vele
processen niet de eenvoudige „Lichtsummenregelquot; geldt.
Hij zegt o.a.: „Bei physiologischen Prozessen verstärkt sich
die Dunkelwirking dadurch, dasz bei ihnen noch das Hinzu-
diffundieren oder Hinzuströmen der Reaktionskomponenten
hinzukommt, die während der Dunkelpause an die Beiich-

Bij de continue belichtingsproeven vond ik, dat na zeer
korten belichtingstijd reeds tamelijk veel kleurstof gevormd
werd. Als belichtingsinterval werd 5 minuten genomen, het
duisternisinterval nam ik veel grooter, 1 uur, en ik be-
lichtte driemaal. Na deze intermitteerende belichting was
de hoeveelheid gevormde kleurstof aanzienlijk grooter dan
na 15 minuten continue belichting. Werden langere belich-
Jingsintervallen van 10 of 15 minuten en de duisternis-
intervallen weer van een uur genomen, dan was de hoeveel-
heid gevormde kleurstof na drie maal 10 of drie maal 15
minuten belichting even groot als na drie maal 5 minuten,
Er schijnt dus slechts een betrekkelijk kleine hoeveelheid
licht noodig te zijn om het kleurstofvormingsproces in gang
^e zetten. De grootere hoeveelheid licht oefent dan geen
verderen invloed hierop uit.

Nu is het nog van belang om na te gaan, of de duur van
^e duisternisintervallen van beteekenis is. Verschillende
duisternisintervallen werden beproefd en wel 1/4» V2. 1
2 uur. Het belichtingsinterval was steeds 5 minuten. Was
cr nu driemaal 5 minuten belicht en als duisternisinterval
tweemaal i/^ uur genomen, dan bleek bij het oogsten na
24 uur, dat er minder kleurstof gevormd was, dan in het
mycelium, dat 2 duisternisintervallen van 1 uur had gehad
Aussehen de belichtingsintervallen van 5 minuten. Ook bij
2 tluisternisintervallen van i/i» uur was de hoeveelheid kleur-
stof nog iets minder dan met 2 van 1 uur. Werden de duis-
ternisintervallen langer dan 1 uur, n.1. 2 uur, genomen, dan
was er evenveel kleurstof gevormd als met die van 1 uur.
Men ziet hier dus uit, dat de grootste hoeveelheid kleur-
stof gevormd wordt, als na iedere belichting den stoffen,
Waaruit de kleurstoffen gevormd worden, een bepaalde tijd
Wordt gegeven om zich om te zetten. Één uur duisternis-
\'quot;terval is reeds voldoende, en toch blijkt, dat, als het myce-

lium direct na het eerste duisternisinterval van 1 uur ge-
oogst wordt, er nog absoluut geen kleurstof gevormd is.
Wordt direct na het eerste duisternisinterval van 2 uur
geoogst, dan is pigmentvorming waar te nemen. Om het
licht weer verdere eenvoudige stoffen te doen omzetten,
schijnt het dus niet noodzakelijk te zijn, dat het geheele
omzettingsproces tot de vorming van de kleurstoffen afge-
loopen is. Waarschijnlijk worden uit eenvoudige stoffen in
de schimmel eerst tusschenstoffen gevormd, voordat de
kleurstoffen ontstaan. Nu is het heel goed denkbaar, dat na
een duisternisinterval de tusschenstoffen gevormd zijn en
dat er opnieuw genoeg eenvoudige stoffen aanwezig zijn
om het omzettingsproces bij de belichting weer in gang
te zetten.

Alen krijgt wel den indruk, dat het licht met intermit-
teerende belichting veel meer benut wordt dan met continue
belichting. Dit zou dan nog een andere verklaring kun-
nen geven voor het golfvormig verloop van de kleurstof-
toename bij continue belichting. Als er inderdaad slechts
een kleine hoeveelheid licht noodig is, die het omzettings-
proces in gang zet, en tijdens dit proces het meerdere aan-
gevoerde licht van weinig of geen beteekenis is, dan zal
men bij continue belichting een periodisch verloop van de
kleurstoftoename verkrijgen,

Zooals ik reeds in de inleiding vermeldde, is door Went
(1901 b, 1904) waargenomen, dat de schimmelkleurstof
van Neurospora niet door alle deelen van het samengestelde
licht gevormd wordt. Dit werd gevonden door de cultures
onder klokken van Sachs te plaatsen; één ervan bevatte
een oplossing van dubbelchroomzurekalium, een tweede een
oplossing van koperoxydammoniak en een derde een oplos-
sing van zwavelzure chinine. De cultuur onder de eerste

klok, die roode, oranje en gele stralen doorlaat, werd niet ge-
kleurd. Onder de tweede klok, die blauw licht doorlaat, werd
de cultuur wel gekleurd, evenals onder de derde, die het ultra-
violette licht absorbeert. Deze laatste proef bewijst dus, dat
de kleurstofvorming niet alleen onder invloed van het ultra-
violette licht gevormd wordt, maar dat ook, of uitsluitend,
aan de zichtbare stralen met kleine golflengten deze wer-
king toekomt.

Een twintigtal jaren voor W e n t\' s onderzoek was door
E 1 f V i n g (1882) juist gevonden, dat slechts de zwakker
breekbare stralen in staat zouden zijn carotine (etioline)
in kiemplanten te vormen. Zelf wees iiij er echter op, dat
zijn methode te grof was, om met zekeriieid uit te kunnen
maken, of er in het blauwe en violette licht absoluut geen
vorming van gele kleurstof plaats heeft.

B e s s e y (1904) vermeldt, dat de werkzame stralen voor
de vorming van het oranje pigment van de soorten van
Piisariuni en Ncocosnwspora, die van de blauwe spectrum-
helft zijn. Danilov (1925) nam waar, dat het oranje-
roode pigment van Isaria viresccns door het blauwe licht
snel gevormd wordt; in het gele en het groene licht is de
vorming veel langzamer en in het roode licht is er in het
geheel geen, of hoogstens een zwakke rose kleuring.

C h O d a t en Mayer (1927) vermelden, dat Clilorella
ruhcscens in totaal licht (d.w.z. achter een venster) vlug-
ger carotine vormt dan achter klokken van S e n e b i e r ;
de minste kleurstof wordt gevormd achter een oplossing van
llt;opersulfaat. Men krijgt hierdoor den indruk, dat het uiter-
ste roode deel van het spectrum en misschien ook het infra-
rood de carotinevorming bevordert. Belichtingsproeven met
genoemde klokken zijn echter te grof, dan dat men hieruit
een conclusie kan trekken.

Voor het onderzoek, bij welke golflengten van het licht
kleurstofvorming in Neurospora sitophila plaats heeft, werd
dezelfde proefopstelling gebruikt als N u e r n b e r g k en

L Cl

-G-G

-O

Als lichtbron werd de kwiklamp K (fig. 10) gebruikt, het
licht hiervan gaat door de collectorlens L en de cuvet Ci, ge-
vuld met een oplossing van kopersulfaat (6 %, 1 c.M.), waar-
door de infraroode en uiterste zichtbare roode stralen geab-
sorbeerd worden. Is de sluiter A geopend, dan passeert het
licht een glazen Schottfilter F en de cuvet C2, gevuld met
een oplossing van zoutzure chinine (2 gram in 100 c.c.
N.HCl, 1 c.M.), waardoor het ultraviolette licht en A 405
geabsorbeerd worden, en valt dan op den spiegel S, die een
hoek van 45° maakt met het horizontale vlak, waarop de
cultuurdoozen geplaatst zijn,waardoor het licht hierop lood-
recht invalt. De intensiteit van het licht wordt in erg/c.M2.
met behulp van een geijkte thermozuil en een galvanometer
gemeten. Deze waarde moet verminderd worden met 10 %,
daar door reflectie van de glazen deksels van de cultuur-
doozen 10 % van het licht verloren gaat. Deze 10 % is niet
afgetrokken van de waarde na de intensiteitsmeting bij
A 366. Bij deze belichting waren de deksels van de doozen
genomen, daar het ultraviolette licht anders te veel geab-
sorbeerd zou worden.

Voor het verkrijgen van zuiver monochromatisch licht zijn
Schottfilters gebruikt, in combinatie met de cuvetten met de
oplossing van kopersulfaat en zoutzure chinine.Deze laatste
oplossing werd verwijderd bij het gebruik van de filters

3,77
45,3
116

4,87
19,47

29.25

150
900
3600

150
900

3600

509
3668Ö
376020

583
15770

94770

5,64
22,56
17,00

1.91

150
900
5400

12600

761
16866
82620

24000

UGs en UG2 GGia, daar hierdoor de golflengte 366 pas-
seert, die in het ultraviolette deel van het spectrum ligt. In
tabel IV wordt aangegeven, bij welke golflengten en licht-
hoeveelheid kleurstofvorming plaats heeft.

Uit tabel IV ziet men, dat bij a 578 en A 546 geen
kleurstofvorming plaats heeft. Bij A 436, A 405 A 366
en A 366 heeft wel pigmentvorming plaats, als de energie
niet te klein is, zooals het geval was bij de beide eerste me-
tingen bij A 436 en A 405 A 366.

Bij 366 was het niet mogelijk een groote intensiteit te
verkrijgen, vandaar dat de belichtingstijd heel lang geno-
men is. De kleurstofvorming was nog wel gering, maar toch
voldoende om te constateeren, dat ze ook in het ultraviolet
plaats heeft.

Voor het roode deel van het spectrum werd niet de kwik-
lamp als lichtbron gebruikt, daar hiervoor de intensiteit te
klein is, maar een Philips bioscoopgloeilamp, die in tegen-
stelling met het lijnenspectrum van de kwiklamp een con-
tinu spectrum geeft. Door de Schottfilter wordt nu ook niet
één enkele golflengte, maar een deel van het roode spectrum
doorgelaten van 700—600 (grootste doorlating van 620—
610).

Met de bioscooplamp werd bovendien nagegaan, of ook
bij andere golflengten in het blauwe deel, meer naar het
groene deel van het spectrum, kleurstof gevormd wordt;
doorgelaten worden 510—405 (grootste doorlating
450—440).

Uit tabel V ziet men, dat in het roode deel van het spec-
trum (700—600) geen kleurstof gevormd wordt. Boven-
dien blijkt, dat in het blauw ook bij A 510—A 405 rijke-
lijke pigmentvorming optreedt.

De oranje kleur, die de cultures van Neurospora sitophila,
in het licht geplaatst, aannemen, wordt gevormd door drie
carotinoïden, die carotinoïde A, B en C genoemd zijn.

Tijdens het zoeken naar een geschikten voedingsbodem
voor de schimmel werd tevens nagegaan, welken invloed
concentratieverschillen van maltose- en glucosevoedings-
oplossingen op de kleurstofvorming hebben. Deze verschil-
len zijn van geen invloed op de kleurstofvorming; te hooge
concentraties werken door den hoogen osmotischen druk
remmend op den groei.

Een methode wordt aangegeven om de drie carotinoïden
zoo vlug mogelijk uit het schimmelmycelium te extraheeren.

De scheiding van de drie pigmenten geschiedt als volgt:
het carotinoïde B is van de carotinoïden A en C door de
chromatografische methode van Tswett te scheiden. In
het systeem CaCOs-petroleumaether wordt het carotinoïde
B door het calciumcarbonaat geadsorbeerd en kan, daar
carotinoïde A en C niet geadsorbeerd worden, van deze ge-
makkelijk gescheiden worden. In het systeem watten-petro-
leumaether wordt uit het mengsel carotinoïde A en C slechts
het laatste geadsorbeerd, waardoor het gemakkelijk van ca-
rotinoïde A te scheiden is. Door methylalcohol wordt caro-
tinoïde B uit CaCOg en carotinoïde C uit de watten vrij-
gemaakt.

Voor het scheiden van de carotinoïden A en C is de uit-
schudmethode niet bruikbaar. De carotinoïden A en C ge-
dragen zich ten opzichte van het systeem petroleumaether-
alcohol^ steeds epiphasisch; het carotinoïde B daarentegen
is niet uitgesproken hypophasisch, bij het uitschudden gaat
steeds een deel in de petroleumaether over.

Met een spectrograaf is een fotografie gemaakt van de
absorptiespectra van Daucuscarotine opgelost in petroleum-
aether en zwavelkoolstof, van carotinoïde A in petroleum-
aether en van carotinoïde B in methylalcohol. Op de foto-
grafie is verschuiving van de absorptiebanden naar het
roode deel van het spectrum van carotinoïde A en B ten
opzichte van die van Daucuscarotine duidelijk zichtbaar.

Quantitatief zijn de absorptiespectra bepaald met een
monochromator. Eerst werd met dezen laatste vastgesteld,
dat concentratieverschillen van Daucuscarotine opgelost in
aether geen bandverschuiving teweegbrengen. Absorptie-
krommen zijn gegeven van Daucuscarotine, carotinoïde A,
B en C opgelost in zwavelkoolstof, aether, petroleumaether
en methylalcohol. Hieruit blijkt, dat de absorptiebanden van
de drie carotinoïden ten opzichte van die van Daucuscaro-
tine naar het roode deel van het spectrum verschoven zijn,
het minst die van carotinoïde A, het meest die van caroti-
noïde C. De ligging van de absorptiebanden van caroti-
noïde A en B komt niet overeen met die van reeds bekende
carotinoïden. Zeer waarschijnlijk is carotinoïde C identiek
met lycopine.

Voor de normale kleurstofvorming is zuurstof noodza-
kelijk. Bij afwezigheid van zuurstof is bij een zeer laag
koolzuurgehalte een zeer geringe pigmentvorming mogelijk.

Conidiënvorming wordt bevorderd door rijkelijken zuur-
stoftoevoer, zoowel in droge als in vochtige atmosfeer; in
niet goed doorgeluchte cultures treedt alleen in zeer droge
atmosfeer conidiënvorming op.

Conidiën vormen steeds pigment ook zonder aanwezig-
heid van licht. Hiermee dient dus rekening gehouden te
worden, als men den invloed van het licht op de kleurstof-
vorming in de schinunel onderzoekt.

hebben voor het oog kleurloos mj\'celium. Na extractie blijkt
dit mycelium toch nog een geringe hoeveelheid kleurstoffen
te bevatten.

Bij continue belichting met licht van een electrische licht-
bron heeft de toename van de hoeveelheden kleurstoffen een
golfvormig verloop. Gedurende langere continue belichting
komt het voor, dat er kleurstofafname plaats heeft.

Intermitteerende belichting werkt gunstig op de kleur-
stofvorming, vooral wanneer de duisternisintervallen niet te
kort genomen zijn.

Met monochromatisch licht is onderzocht, bij welke golf-
lengten kleurstofvorming plaats heeft. Geen kleurstoffen
worden gevormd in het roode, gele en groene deel van het
spectrum; kleurstofvorming treedt op in het blauwe, vio-
lette en ultraviolette deel.

1923, Oregon Agr. Coll. Exp. Stat. Circ. 53.
B e s s ey, E. A., Ueber die Bedingungen der Farbbildung
bei Fusarium.
1904, Flora 93.
Boer, S. R. de, Respiration of Phycomyces.

1928, Ree. des trav. bot. néerl. vol. XXV.
Cittert, P. H. V a n. Un monocliromateur de grande lu-
minosité et avec peu de lumière diffuse.

C h o d a t, R. et Mayer, F. L., Sur les conditions de
la fonnation de la Carotine chez les algues en cul-
ture pure.

C h o d a t, R. et S c h 0 p f e r, W. H., Carotine et sexualité.
1927, Compte rendu Soc. Phys. et Hist, nat., Genève
44, 3.

Coward, K. H., Some observations on the extraction
and estimation of lipochromes from animal and
plant tissues.

1913, 2. Auflage. Jena.
1922, 3. Auflage. Jena.
D a n i I o V, A. N., Zur Frage nach der Pigmentbildung
bei den Pilzen.

D i a k o n o w, N. W., Intramolekulare Athmung und
Gährthätigkeit der Schimmelpilze.
1886, Ber. der deutsch. Bot. Ges. Bd. IV.
E 1 f V1 n g, Fr., lieber eine Beziehung zwischen Licht
und Etiolin.

1882, Arb. des Bot. Inst, in Würzburg, II.
E s c h e r, H. H., Zur Kenntnis des Carotins und des Ly-
copins.

1909, Zürich. Polytechnikum, Diss.
Goerrig, E., Vergleichende Untersuchungen über den
Carotin- und Xanthophyllgehalt grüner und herbst-
lich gelber Blätter.
1918, Beih. bot. Centralbl. XXXV, 1.
Goppelsroeder, Fr., Capillaranalyse, beruhend auf
Capillaritäts- und Adsorptionserscheinungen.

H i b i n o, S. L, Conditions influencing the production of
colouring matter of Monascus purpureus Went.
1925, Proc. Kon. Ac., Amsterdam, vol. XXVIII,
No. 2.

1925, Ann. of Missouri Bot. Garden 12, April.
K a r r e r. P., Salomon, H. und W e h r 1 i, H., über
einen Carotinoidfarbstoff aus Mais: Zeaxanthin.
1929, Helvetica chim. acta. vol. Xll.
K1 i n c k s i e c k, P. et V a 1 e 11 e, T., Code des Couleurs.
1908, Paris.

Kohl, F. G., Untersuchungen über das Carotin und seine
physiologische Bedeutung in der Pflanze.

1922, Ree. des trav. bot. neerl. vol. XIX.
K u n k e 1, L. O., Physical and chemical factors influencing

1914, Bull. Torrey Bot. Club. XLl.
K y 1 i n, H., die karotinoiden Farbstoffe der höheren
Pflanzen.

1927, Zeitschr. phys. Chem. 163.
Laborde, M. J., Recherches physiologiques sur une
moisissure nouvelle l\'Eurotiopsis Gayoni.
1896, thèse Paris. Bordeaux.
Link, G. K. K., R a m s e y, G. B., and B a i 1 e y, A. A.,
Botrytis rot of the globe artichoke.
1924, Journ. of Agric. Research, vol. 29.
L i p p m a a, Th., Über den Parallelismus im Auftreten der
Karotine und Anthocyanine in vegetativen Pflan-
zenorganen.

-, Das Rhodoxanthin, seine Eigenschaften, Bildungs-
bedingungen und seine Funktion in der Pflanze.

L u b i m e n k 0, V., Les pigments des plantes et leur
transformation dans les tissus vivants de la plante.
1927, Rev. Gén. Bot. 39.
M O I i s c h, H., Die Krystallisation und der Nachweis des
Xanthophylls (Carotins) im Blatte.
1896, Ber. der deutsch. Bot. Ges. Bd. XIV.
Moll, W. J. H. and B u r g e r, H. C., The sensitivity of
a galvanometer and its amplification.
1925, Philosophical Mag. Vol. 1 Sept.
M 0 1 z, E. J., Über die Bedingungen der Entstehung der
durch Sclerotinia fructigena erzeugten „Schwarz-
fäulequot; der Äpfel.

Naumann, C. W., Epicoccum purpurascens und die
Bedingungen für seine Pigmentbildung.
1912, Hedwigia, Bd. 51.
N u e rn b e r g k, E., en du Buy, H. G., Methode zur
Analyse von Wachstumserscheinungen.
1930, Ree. des Trav. Bot. Néerl.
P a 1 m e r, L. S., Carotinoids and related pigments.
1922, New-York, U. S. A.

natural yellow pigment of milkfat. Part. 11 Chemical
and physiological relations of pigment of milkfat to
the carotin and xanthophylls of green plants.
1914, Missouri, Agr. Exp. Sta. Res. Bull., 10.
P 1 0 t n i k 0 w, J., Kurzer Leitfaden der Photochemie.

1907, Centr.Bl. für BakL Abt. II, Bd. 17.
S c h e r t z, F. M., Some physical and chemical properties
of carotin and the preparation of the pure pigment.
1925 (a), Journ. of Agric. Res. Vol. XXX.

phyll and the preparation of the pure pigment.
1925 (b), Journ. of Agric. Res. Vol. XXX.
—^—, The pure pigments, carotin and xanthophyll and
the Tswett adsorption method.

Shear, C. L. and Dodge, D. 0., Life histories and
heterothallism of the red bread-mold fungi of the
Monilia sitophila group.
1927, Journ, of Agr. Res. Vol. 34, No. 11.
T a m m e s, T., Ueber die Verbreitung des Carotins im
Pflanzenreiche.
1900, Flora 87, Heft 2.

1906 (a), Ber. d. deutsch. Bot. Ges. XXIV.
-, Physikalisch-chemische Studien über das Chloro-
phyll. Die Adsorptionen.
1906 (b), Ber. d. deutsch. Bot. Ges. XXIV.
-, Adsorptionsanalyse und chromatographische Me-
thode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls.
1906 (c). Ber. d. deutsch. Bot. Ges. XXIV.

1911, Ber. d. deutsch. Bot. Ges. XXIX.
Went, F. A. F. C., Monilia sitophila (Mont.) Sacc., ein
technischer Pilz Javas.

van Enzymen door Monilia sitophila (Mont.) Sacc.
1901 (b), 26 Januari, Zittingsversl. d. Kon. Ak. van
Wetensch. afd. Wis- en Natuurk. Amsterdam.

des Carotins und auf die Zersetzung der Enzyme.
1904, Ree. des trav. bot neerl. 1.
Willstätter, R. M., und Stoll, A., Untersuchungen
über Chlorophyll; Methoden und Ergebnisse.
1913, Berlin.

W i s s e I i n g h, C. v a n, Ueber die Nachweisung und das
Vorkommen von Carotinoiden in der Pflanze.
1915, Flora 107.
Z e 11 n e r, J., Chemie der höheren Pilze, Eine Mono-
graphie.
1907, Leipzig.

Rijkelijke zuiirstoftoevoer bevordert de conidiënvorming
van Neurospora sitophila.

De theorie van Dixon, dat de neerdalende stroom van de
organische stoffen zich beweegt door de houtvaten, die aan
de periferie gelegen zijn, is onjuist.

Door de onderzoekingen van Jatis Sen-Gupta is het aan-
nemelijk geworden, dat rheotropie niet bestaat.

Het is onwaarschijnlijk, dat de conidiën van Cadophora
fastigiata Lagerberg et Melin endogeen ontstaan.

De fungicide werking van Bordeausche pap berust voor-
namelijk op het oplossen van koper door excretiestoffen van
kiemende sporen.

Daucuscarotine	Carotinoïde A	Carotinoïde B	Carotinoïde C
l		l
a	5035 Ä	O 5120 A	5250 Ä	—
b	4650 „	4660 „	4980 „
c	4555 „	4585 „	4800 „
d	4440 „	4485 „	4520 „
e	4330 „	4425 „	4400 „
f	4200 „	4285 „	4325 „	1 quot;quot;

Daucuscarotine	Carotinoïde A	Carotinoïde B	Carotinoïde C
	l
a	4650 Ä	4775 Ä	4820 Ä	4960 Ä
b	4365 „	1 4420 „	4520 „	4620 „
c	4300 „	\' 4285 „	4450 „	4550 „
d	! 4225 „	: 4200 „	4335 „	4420 „
e	i quot; ; 4170 „	4120 „	4205 „	! 4225 „
f	4065 „	1 4075 „	4120	4135 „

Daucuscarotine	Carotinoïde A	Carotinoïde B	Carotinoïde C
	l		).
a 4660 Ä	4820 Ä	_	4910 Ä
b j 4365 „	4485 „	—	4620 „
c i 4285 „	4365 „	—	4455 „
d 4230 „	4255 „	—	4325 „
f j 4155 „	4205 „	—	4205 „
f 1 4030 „	4075 „	—	4140 „

No. en dikte v/h filter	Doorgelaten	Deel v/h spectrum waarin de doorgelaten ligt	Intensi- teit in erg/c.M°	Belich- tingstijd in sec.	Licht- hoeveel- heid in erg (c.M^sec.)	Kleur v/h gedroogde mycelium en nummers volgens Code d. couleurs
RGl (2 m.M.) »	700-600	rood	12,56 4,85	7200 10800	81540 47115	kleurloos 1»
BG4 (2 m.M.)	510 405	blauw	17,04	7200	110430	rood-oranje 86