PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DEN
GRAAD VAN DOCTOR IN DE GENEESKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECÏIT
OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS
JHR. MR. B. C. DE SAVORNIN LOHMAN HOOG-
LEERAAR IN DE FACULTEIT DER RECHTS-
GELEERDHEID VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE
BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER
GENEESKUNDE TE VERDEDIGEN OP DINSDAG
19 MEI 1931 DES NAMIDDAGS TE 5 UUR DOOR

Bij het verschijnen van dit proefschrift is het mij een
welkome taak U, Hoogleeraren, oud-Hoogleeraren en Docen-
ten der Medische en Philosophische Faculteiten te loeiden en
voorts U allen, die tot mijne medische vorming hebt bijge-
dragen, te bedanken voor het van U genoten onderwijs.

Hooggeleerde Ai^dershoff, hooggeachte Promotor, veel
dank ben ik U verschuldigd voor alle moeite en tijd, die gij
U gegeven hebt bij de totstandkoming van dit proefschrift.
Uw uitgebreide kennis, de prettige wijze in Uwe belangstelling
hebben den tijd, op Uw Instituut doorgebracht, tot één der
aangenaamste van mijn leven gemaakt.

Hoogedelgestrenge van Reekum, niet alleen waart gij
één der eersten, die den stoot gaf tot de wording van een
proefschrift, maar tevens is Uwe naam door Uwe onbe-
krompen opmerkingen en raadgevingen onverbreekbaar aan
dit werk gebonden. Moge ik ook in de toekomst steeds op
Uw zeer gewaardeerden steun blijven rekenen.

Zeergeleerde Pondman, Tasman en Brandwijk, de bereid-
willigheid waarmede gij mij over moeilijkheden heenhielpt,
Uwe vriendschappelijke omgang stemt mij tot dankbaarheid.

De inspectie van den Militair Geneeskundigen Dienst,
voor de bereidwilhgheid, waarmede gij mij in de gelegenheid
steldet dit proefschrift te voltooien, ben ik U dank verschul-
digd.

Het personeel van het Rijks Serologisch Instituut in \'t
bijzonder U, Theo van de Vathorst en verder allen,
die Uwe medewerking hebt betoond, dank ik voor den mij
bewezen dienst.

Uit de literatuur der afgeloopen wereldoorlog (F. Stricker^
en W. Hoefman^) blijkt het aantal tetanusgevallen vooral
in het begin veel grooter dan in één der oorlogen voordien.
Ue oorzaak moet gezocht worden in de groote verandering,
die het gevechtswapen ondergaan had. Het in den grond
dringend en daar detoneerend projectiel maakte als treffer
scheurwonden, die in eerste instantie al verontreinigd waren
met aarde etc., beide voorwaarden ter begunstiging van de
vegetatie van den tetanusbacil.

Daar we op goeden grond mogen aannemen, dat dergelijke
verontreinigde wonden ook in een toekomstigen oorlog zullen
overheerschen, doet ons dit ä priori al besluiten, dat iedere
wond op besmetting met tetanus verdacht zal zijn en dus
als zoodanig behandeld zal dienen te worden. Het is algemeen
bekend, dat wanneer het tetanusgif eenmaal gebonden is
aan de daarvoor gevoelige elementen in casu het zenuwweef-
sel, het slechts met groote moeite en op voor de vitaliteit van
^t weefsel ingrijpende wijze weer vrij kan worden gemaakt.
Een zeker afdoende genezing van eenmaal manifeste tetanus
^hoort aldus tot de groote uitzonderingen en open vragen.
Het verhinderen van tetanus en alle gevolgen van dien
^^^^ inen dus in een prophylactisch optreden te zoeken.

Tot vóór eenige jaren bepaalde men zich overal tot de
zoogenaamde propliylactische seruminjectie; door deze
inspuiting werden in het Hchaam onmiddellijk de immuun-
stoffen gebracht. Echter kleven aan deze injectie vele be-
zwaren. De aanwezigheid van dit soortvreemde, zoogenaamde
passieve eiwithchaam (men late in het midden in hoeverre
dit zelf het antilichaam of de drager ervan is) is zooals van
alle vreemde eiwitten niet duurzaam. Na eenigen tijd,
tien tot twintig dagen, afhankelijk van de dosis, en van de
üiersoort waarvan het afkomstig is, wordt het, met het eraan
gebonden antitoxine, weer uitgescheiden. Dit is oorzaak,
aat er in weerwil van de, met het oog op de bovengenoemde

frequentie der tetanusgevallen aanbevolen seruminjectie,
nog zoovele gevallen van zoogenaamde tétanos post sérique
voorkwamen. Op aanraden van Vaii^i^ard^ is men toen over-
gegaan tot een herhaling der inspuiting, desgewenscht
inspuitingen om de 6 a 7 dagen (Aschoff en RobERTSOn).
De werkzaamheid van deze herhaalde injecties wordt echter
verminderd, doordat het lichaam door de voorgaande in-
spuitingen zoogenaamd gesensibiHseerd, in staat is, dit vreem-
de eiwit met deze antistoffen in steeds sneller tempo te
elimineeren.

Bij de herhaalde serimiinjectie dreigen daarnaast, hoewel
zeer zeldzaam, nog overgevoeligheidsverschijnselen van veel
ernstiger aard; zelfs doodelijk: anaphylatische shock, terwijl
ook de enkelvoudige inspuiting niet geheel als onschadelijk
is aan te zien in verband met het optreden van de primaire
serumziekte.

Al deze momenten drongen dus in de richting van een an-
dere meer afdoende bestrijding van den tetanus: een actieve
onvatbaarmaking. Daarbij maakt het lichaam zijn eigen
immuunstoffen; er ontstaat een humorale immuniteit (aan-
wezigheid van antistoffen in de lichaamsvochten) en een
cellulaire (de réactivité acquise: op de specifieke prikkel of
misschien ook op de niet specifieke - krijgt men een sterke
vorming van antilichamen: zoogenaamde „bond antitoxiquequot;).
Echter kan deze de seruminjectie niet geheel verdringen,
daar voor het tot stand komen van de actieve onvatbaarheid
een zekere tijd noodzakelijk is. Waar onmiddellijk in het zich
actief immuniseerende o/ geïmmuniseerde lichaam de aanwezig-
heid van het tetanus antilichaam gewenscht is, heejt men naar
de seruminjectie te grijpenl

Als vaccin kan het gif als zoodanig niet gebruikt worden;
de ziekmakende resp. doodelijke dosis ligt te dicht bij de im-
muniseerende,

Reeds Ehreich heeft bij het diphtherietoxine er op gewezen,
dat toxiciteit en antitoxine-binding niet parallel gaan en
daarmede den weg aangeduid langs welken een actieve
onvatbaarheid zich ontwikkelen kan, zonder dat dit eenig
gevaar mede brengt voor het individu.

Zooals bekend onderscheidde men volgens Ehri^ich in elk
bacterieel gif de zoogenaamde toxoïden, d.w.z. stoffen, die
wel in staat zijn om antitoxinen te binden (zouden wel een

Haptophore groep bezitten) maar hun giftigheid (toxophore
groep) ingeboet hebben. quot;Op grond van het feit, dat bij het
bewaren van een toxine-oplossing de toxische eigenschappen
in veel sterkere mate afnemen dan het antitoxine-bindend-
vermogen moet men aannemen, dat bij dit proces de toxoïd-
lichamen zich vermeerderen ten koste van de toxine-stoffen.
peze overgang is bij de verschillende bacterieele gifstoffen
in wisselende mate aanwezig, zoo weten we dat b.v. het teta-
nustoxine zeer sterk neigt tot toxoïden vorming.

Is het dan verwonderlijk, dat het tetanusgif een der eerste
was, dat gebruikt werd om daarmee de omzetting van gifstof
in toxoïde stoffen te bevorderen, daarbij het toxoïd beschou-
wend als een prachtig middel ter immunisatie?

Na zijn uitgebreide proeven over het diphtherietoxine heeft
BEHiprG^ het tetanusgif bewerkt met goudzouten en joodtri-
chloride. Daarna heeft hij in samenwerking met Kitashima
en Ransom zuren, alkaliën, desinfectiemiddelen, kleurstoffen,
edelmetalen, kool, dierlijk weefsel en orgaandeelen er mede
in contact gebracht. Hij zag bij zijne „abgeschwächtequot;
ginen, dat de ziekmakende dosis meer neiging had constant
te blijven, terwijl de doodelijke steeds toenam: z.g. grooter
worden der „D-Werthquot;. De omzetting duurde echter lang,
de giftigheid (directe gifwaarde) ging sterk achteruit, maar
niet geheel verloren, het antitoxine-bindendvermogen (indi-
recte gifwaarde) ging eveneens sterk achteruit.

In de literatuur is een geval bekend van volkomen ongiftig-
neid van tetanustoxine door behandeling met zwavel-
koolstof door Ehrlich, terwijl het antigeenvermogen is
blijven bestaan. Daarna is dit altijd een mislukking gebleken.
IvöwENSTEiN kon langs dezen weg bij proefdieren een late
en een descendeerende tetanus verkrijgen.

In 1902 heeft löwenstein^ het werk van von Behring
nagedaan en verder voortgezet. Door toevoeging van water-
stof- of calcimnsuperoxyd was het mogelijk zoowel diphtherie
^s tetanusbouillon en -filtraat volkomen ongiftig te maken,
j^et aldus behandelde tetanustoxine kon echter geen anti-
toxinen meer binden (in het neutrale mengsel kwam het anti-
oxine vrij) terwijl er mede ingespoten muizen geen spoor
van immuniteit vertoonden. Hij kwam dan ook tot het resul-
^at, dat het toxine in al zijn drie bekende eigenschappen
vernietigd werd: toxiciteit, antitoxinebindendvermogen en

antigeenvermogen. In 1899 had Behring al opgemerkt, dat
het diffuse dagHcht een geheel andere werking op het tetanus-
toxine uitoefent dan het verwarmen op b.v. 65®. De giftigheid
van het toxine verminderde, de bindende eigenschap bleef
bestaan. In zijn eigen onderzoekingen over den invloed van
het diffuse daglicht op het tetanustoxine citeert lyöwENSTEiN®
de hierop betrekking hebbende passage, terwijl hij daar tevens
neerschrijft: „In den sehr umfangreichen Arbeiten von
Behring über den Tetanus finden wir eine Beobachtung ganz
scharf gefaszt, die für den weiteren Gang meiner Unter-
suchung vom ausschlaggebender Bedeutung hätte sein
müssen, wenn ich sie nicht übersehen hätte.quot;

De grondgedachte van het geheele werk van I^öwenstein
is geweest een „Schonendequot; methode te vinden, waarbij dus
de directe gifwaarde vermindert en de indirecte behouden
blijft. Aldus kwam hij er toe in Januari 1904 tetanustoxine
met verschillende desinfectantia aan het daglicht bloot te
stellen. De flesch alleen, die met 2%o formaline voorzien was,
bleek na ± 8 maanden een volkomen giftvrij „toxinequot; te
bevatten. Bij verder onderzoek bleek er een zekere inductie-
periode aanwezig; is deze eenmaal overschreden, dan gaat de
ontgifting veel sneller. Daar men met het veel heftiger werken-
de zonlicht afhankelijk was van meteorologische factoren,
werd Nernstlicht aangewend. Echter kon men niet op deze
wijze een volkomen verdwijnen van de toxiciteit verkrijgen.
Omdat ten duidelijkste gebleken was, dat formaline de werkng
van het zonlicht ondersteunde, werden i7oo formaline-gif-
oplossingen onder de Nernstlamp gehouden. Allereerst krijgt
men een verlenging van den incubatietijd, als men de doode-
lijke dosis bij een proefdier inspuit. Deze is echter voor een
groot gedeelte voor rekening van de formaline te stellen.
Bij nader onderzoek bleek het witte licht minder uitwerking
te hebben dan de daarin aanwezige roode stralen, zoodat de
laatste als de effectieve dienden aangemerkt en een renmiende
werking aan de stralen van kleinere golflengte moest worden
toegeschreven. Bij grooter worden van de lichtbron zagen ze
althans in het begin de omzetting van het toxine lang-
zamer gaan, wat ze verklaren doordat de remmende
invloed van de niet-roode stralen toegenomen is.

Met al deze proeven kwam I^öwenstein tot het inzicht,
dat zoowel formaline als licht beide noodig waren voor de

ontgifting; over de chemische processen, die het licht te
voorschijn roept kan hij echter niets mededeelen.

Terwijl eigenlijk Behring de vraag van een actieve tetanus-
vaccinatie nergens aanroert, omdat hij met geen zijner
stoffen een volkomen ongiftigheid van het toxine, zonder dat
het bindingsvermogen sterk geleden had, had kunnen ver-
krijgen, kon I^öwENSTEiN integendeel met zijne aan het
zonhcht blootgestelde formoltoxinen muizen en nog gemakke-
lijker caviae immuniseeren. Hier wordt dus de grondslag ge-
legd voor de latere meer uitgewerkte vaccinaties met formol-
toxoïden. I^ówenstein merkte tevens al op, dat de beste
entstoffen zich laten bereiden uit de sterkste toxinen.

In igio zette IvÖwenstein zijn werk met Eisler^ voort.
Uit de drie kleurenproef was gebleken, dat de warmte
(roode) stralen verantwoordelijk waren voor de ontgifting,
nu toonden beiden aan, dat bij toxine-oplossingen in 14 dagen
oij 37® een volkomen ongiftigheid te verkrijgen was. Als
optimum werkende formolconcentratie werd 2 a 37oo
aanbevolen. Het eenmaal ongiftige formóltoxine werd nooit
^eer giftig, het was in staat antitoxinen te verwekken,
antitoxinen te binden.

Ramon heeft feitelijk deze formoltoxoïden nader bestu-
deerd. Hij wees er op, dat er door het in contact brengen van
tetanustoxine met formahne niet ontstaat maar één of andere
toxoïde, maar een zeer bijzonder toxoïd, dat hij daarom
onatoxine genoemd heeft. Hij stelt dan ook aan deze anatoxine
eenige eischen. i® volkomen ongiftigheid, 2® vermogen om als
antigeen op te treden, 30 stabiliteit tegen invloeden, die het
oorspronkelijke toxine zouden vernietigen. Tevens heeft
■Kamon aangetoond, dat evenals het toxine met zijn over-
eenkomstig antitoxine uitvlokkingen geeft bij het zooge-
naamde neutrale punt, het anatoxine dit eveneens deed.
j^ij bekend toxine kan men aldus het antitoxine in vitro
titreeren en omgekeerd. Het anatoxine is daarnaar in de
grootheid van zijn binding ten opzichte van zijn overeenkom-
stig antitoxine af te lezen en zoodoende in zijn antigeeii-
vemiogen te waardeeren. Hoe grooter namelijk de mogelijk-
heid van antitoxine-binding, des te beter antigeen en dus
aes te beter vaccin.

Op aanraden van Ramon heeft Descombey® naar analogie
Van het diphterie-anatoxine het tetanus-anatoxine nader

onder de oogen gezien. Het tetanustoxine, waarvan hij uit-
ging had een d.l.m. cavia i : lo.ooo in 4 dagen. Dit heeft
hij blootgesteld aan warmte en formaline. Het daaruit
ontstane anatoxine vlokte in de zelfde verhoudingen als
het oorspronkelijke toxine, echter was de uitvlokkingstijd
er van verlengd. Tevens vond hij dat het antigeenvermogen
in de dierproef van twee anatoxinen met dezelfde A.W.
(antigeenwaarde) omgekeerd evenredig was met den duur
van de uitvlokking. Resultaat van deze onderzoekingen was,
dat hij reeds de mogelijkheid voorzag het tetanusanatoxine
te gebruiken om huisdieren te vaccineeren.

Scherper gesteld vinden we deze gedachte van de hand van
Ramon in de Annales de l\'Institut Pasteur 1925 blz. 20.

„Nous sommes donc en possession d\'une méthode générale
pennettant de transformer à volonté les antigènes les plus
toxiques en antigènes inoffensifs, ou, comme nous les avons
appelés en „anatoxinesquot; dont le pouvoir immunisant peut
être facilement évalué en vitro par la réaction de floculation
et qui peuvent être utihsés soit dans le domaine expérimental,
soit encore et surtout dans la thérapeutique préventive et
même curative de certaines maladies-de l\'homme et des

Bij verder onderzoek over de ontwikkeling van het 2 0/00
formoltoxine tot anatoxine bleek Descombey», dat de eigen-
schap van het formoltoxine om late en algemeene tetanus
te geven slechts op den duur verdwijnt. Hij stelt dan ook
de eisch, die verder steeds in de Fransche literatuur wordt
vooropgezet: dat men dan pas van anatoxine mag spreken
als 5 tot 10 c.c. er van onderhuids bij een cavia van ± 300 gr.
ingebracht, noch lokale, noch algemeene, noch vroege of
late tetanus geeft. Dit was bij het toxine bovenvermeld, dat
Descombëy gebruikte na 20 dagen verblijf in de broedstoof
bij 370 het geval. Dat ten opzichte van de tijdsduur, noodig
om een toxine om te vormen tot anatoxine geen scherpe
uitspraak te doen is, springt duidelijk in het oog. Afgezien
van de quantiteit formaline en de temperatuur waarbij
men het toxine bewerkt, zal de oorspronkelijke giftigheid
van het uitgangstoxine in de eerste plaats wel van invloed
zijn. Bij mijn eigen overeenkomstige onderzoekingen, die
echter met veel sterker toxinen plaats vonden, is het mij
dan ook nooit gelukt om in 20 dagen bij 20/00 en 37° een

volkomen ongiftigheid te verkrijgen, zoodat ik ten slotte bij
40 graden en 3 a 4 o/qq formaline een vrij snel (20 dagen)
zich vormend anatoxine kon verkrijgendatgoedimmuniseerde.
Exacte waarden kan ik hieromtrent niet mededeelen, daar ik
in het algemeen slechts met een anatoxine no. 80 experimen-
teerde (zie hoofdstuk II).

Ook I^emos Monterio^® kon met zijn toxinen waar-
over hij zich verder niet uitlaat, zelfs na vele maanden
bij 370 en 1.50/00 formaline geen volkomen ongiftigheid
verkrijgen. Met meer formaline, 50/00, kon hij in minder dan
15 dagen goede antigenen krijgen, deze gaven ingespoten bij
paarden immuniteit en hyperimmuniteit.

Bescombey vond verder, dat hoe langer het verblijf in
de broedstoof was, des te langer werd de uitvlokkingstijd en
dus volgens reeds vroeger opgedane ervaringen des te kleiner
antigeenvermogen; vandaar niet te weinig formaline of
genoeg formaline om de giftigheid in niet te langen tijd te
Verminderen en toch de antigeeneigenschappen zoo weinig
mogelijk te schaden (Ramon). Na één injectie van i c.c. van
zijn anatoxine zag Descombey al na twee è drie weken bij
caviae weerstand tegen verscheidene d.l.m. Hier ziet men
duidelijk de enorme verschillen met de Joodtoxinen, zooals
Okudaquot; gebruikte. Deze laatste kon met 3 maal een injectie
Van I è, 5 cc. een immuniteit tegen één d.l.m. verkrijgen
bij caviae.

Het gelukte Descombey om paarden in 2 ^ 3 weken met
dit anatoxine door 2 injecties van 15 h. 20 c.c. een hyper-
immuniteit te verschaffen, zoowel tegen experimenteele
Vergiftigingen als tegen de natuurlijke infectie. Het bleek
bem^ dat een paard ingespoten met 20 cc. anatoxine als één
injectie, niet in staat was om 2^3 weken daarna, het in-
brengen van een houtsplinter die in een 3 maanden oude
tetanuscultuur gedoopt was, zonder doodelijke tetanus te
Verdragen. Een ander paard daarentegen, dat slechts één
mjectie van 10 c.c. anatoxine had gekregen, weerstond deze
mfectie, zoodat Descombey zeer terecht wijst op de groote
mdividueele verschillen, die te voorschijn treden als men dieren
tegen tetanus immuniseert.

Ramon heeft met Descombey^^ zijn onderzoekingen uit-
gebreid. Naar analogie van het feit, dat tapioca met tetanus-
toxine gemengd meer immuniteit geeft dan het toxine alleen,

vonden ze, dat tapioca ook het antigeen-vermogen van het
anatoxine vermeerdert. Ze berichten zelfs, dat de humorale
immuniteit lo a 20 maal zich vergroot, zelfs tot 50 maal,
waardoor aldus een weg wordt gewezen om snel en econo-
misch paarden te hyperimmuniseeren.

Het was Raj^ion^^ opgevallen, dat wanneer hij een absces
zag ontstaan op de plaats, waar het tetanusanatoxine was
ingebracht, het gehalte aan antistoffen plotseling zeer toenam
in het bloed. Hij heeft toen kunstmatig getracht om huid-
reacties en abscessen te krijgen met verschillende stoffen,
o.a. broodkruimels met het te verwachten resultaat.

Al deze factoren maken het verblijf van het anatoxine op
de inentingsplaats langer en hierin moet waarschijnhjk de
oorzaak gezocht worden, dat ook de wijze van toedienen van
het anatoxine de waarde der humorale immuniteit beïnvloedt.
Zoo vonden Ramon en DescombeyI^ dan ook, dat het sub-
cutaan inbrengen van het anatoxine veel meer antistoffen
te voorschijn kon roepen dan wanneer dezelfde hoeveelheid
intramusculair werd ingespoten. I^ater zijn deze uitkomsten
door Grasset^^ bevestigd en uitgebreid. Bij subcutaan en
intracutaan inbrengen zag deze onderzoeker verder geen ver-
schil in de waarde der immuniteit bij caviae. In verband met
de grootere hoeveelheid moet echter de onderhuidsche in-
spuiting aangeprezen worden. Bij caviae, waarbij hij ge-
durende vier dagen om de tien uur vernieuwd een compres
met tetanusanatoxine op de huid aangebracht had, zag hij
geen spoor van antitoxine in het serum, noch een plaatselijke
immuniteit bij het inbrengen van de d.l.m. daar.

Over het verloop van de immuniteit kon Descgmbey^®
mededeelen, dat bij paarden, die 2 maal 5 cc. van zijn ana-
toxine hadden gekregen, er een stijging in het antitoxine-
gehalte optrad en gedurende 6 maanden aanliield. Na een jaar
zou de titer van het bloed gedaald zijn totdievaneenpaarweken
na de tweede injectie (neutralisatie mogelijkheid van 2 d.l.m.
cavia cc. serumweerstand tegen de doodelijke tetanusinfectie).
Met een nieuwe injectie (injection de rappel) zag hijquot; een groote
plotselinge stijging. Na eerst samen met ZoEivi^ER het diph-
therieanatoxine gemengd te hebben met een ander vaccin
hebben Ramon en Zoeller^® caviae ingespoten met mengsels
van tetanusanatoxine en vaccin T.A.B. (typhus, paratyphus
A. en B.) en andere anatoxinen (vaccins associés). Zij zouden

een enorme vermeerdering gezien hebben van het antitoxine-
gehalte en trachtten dit verschijnsel te verklaren door het
toegevoegde vaccin te beschouwen als een aspecifieke prikkel.
Van een immuniteit tegen typhus, paratyphus A en B wordt
niet gesproken. Daarna heeft Ramon^® samen met ly. Nattan-
lyarrier en Grasset het vraagstuk van de niet-specifieke
prikkel toegevoegd aan de specifieke van het tetanus-ana-
toxine, nader uitgewerkt met verschillende stoffen, waarvan
o.a. van belang zijn om te vermelden het trypoxyl, respect,
tryparsamide.

Boor een mengsel van tetanusanatoxine en trypoxyl in
te spuiten bij met slaapziektekiemen geïnfecteerde ratten,
zagen ze dat er niet alleen een sterke vermeerdering was van
het antigeenvermogen van het anatoxine, maar tevens de
werking van het chemotherapeuticum behouden bleef.

Het beschermen van paarden en andere huisdieren tegen
de tetanusinfectie als practisch gevolg van alle boven be-
schreven onderzoekingen, is uitvoerig uitgewerkt door Ramon
en Descombey^quot;. Ten eerste konden deze onderzoekers vóór
de behandeling nooit een spoor antitoxine bij hunne proef-
dieren vinden en vervolgens bleek hun, dat niet alleen tapioca
de eigenschap had het antigeenvermogen van het anatoxine
te vergrooten, maar dat de nu gevormde immuniteit veel
standvastiger bleek, namelijk zeer langzaam vermindert,
zoodat bij deze wijze van vaccineeren pas na 2 3 jaar een
hernieuwing van een anatoxineïnjectie noodig was om het
dier niet het oog op zijn immuniteit op een bepaald niveau
te houden (grond immuniteit).

Na deze belangrijke successen met het tetanusanatoxine
hij huisdieren publiceerden de Franschen al spoedig hunne
poging tot onvatbaarniaking van menschen. Als bijzonderheid
ZIJ hier vermeld, dat tijdens den wereldoorlog in 1917 door
v en Bazy met mengsels van tetanustoxine en gram-
oplossing (2 deelen toxine en i deel jodiumoplossing, be-
staande uit i deel jodium en 2 deelen joodkali en 200 deelen wa.-
ter) getracht is menschen te vaccineeren tegen tetanus, echter
zonder resultaten. I^ater is door Okuda de samenstelling
van deze joodtoxinen gewijzigd (i deel toxine en i deel jodium-
oplossing) omdat hij met de voorgenoemde een enttetanus zag
ontstaan. Het groote bezwaar van deze gemodificeerde tetanus-
gnfen is echter hun groote labiliteit, zoodat ze eigenlijk

onmiddellijk na hunne bereiding gebruikt moeten worden, en
hun gering antigeen-vermogen. Ook Roux en Martin konden
na hunne experimenten geen algemeen gebruik aanraden van
joodtoxinen. Ramon en Zoeller^i hebben het eerst met for-
moltoxoïden in casu tetanusanatoxine menschen gevaccineerd.
De grootemoeielijkheid blijft altijddebeoordeehngderimmuni-

teit, daar er niet zooals bij diphtherie een huidreactie (Schick)
is, die ons kan inhchten over de aanwezigheid van tetanus-
antitoxine respect, mogelijkheid van deze snel te kunnen
vormen (réactivité acquise). Nadat Ramon en Zoeller
de ongiftigheid van hun tetanusanatoxine hadden nagegaan
(zie Descombey\'s eisch hier omtrent blz. 14) hebben ze aller-
eerst verdunningen van het anatoxine ingespoten en zagen
hiervan nooit eenig bezwaar. Daarna is het hun gelukt, nadat
ze steeds vóór de vaccinatie het serum van hun proefpersonen
hadden nagegaan op de aanwezigheid van tetanusantitoxinen
en daarin nooit een spoor hadden gevonden, jongelingen met
drie injecties van i a 2 cc. onverdund tetanusanatoxine in
vijf a zes weken een humorale immuniteit te bezorgen,
dusdanig, dat het serum in staat was per cc. verscheidene
d.l.m. cavia te neutrahseeren. Deze feiten zeggen echter
in zooverre betrekkelijk weinig, omdat men niets kan zeggen
van de hoeveelheid antitoxine die noodig is ter neutrali-
satie van een d.l.m. cavia van een willekeurig toxine.

Verwonderd staat men echter over de uitgebreidheid van
het menschen materiaal, dat gevaccineerd is door het Insti-
tuut Pasteur tegen tetanus hetgeen men moet afleiden uit
het feit dat Ramon en Zoeller geen verschillen bij tetanus-
enting bij verschillende rassen opmerkten. Is deze conclusie
gerechtigd, dan moeten hier niet eenige, maar vele personen
volgens eenzelfde schema met het tetanusanatoxine zijn
geënt (zie mijne sterk varieerende uitkomsten met eenige
menschen). Ook zagen ze^a een sterke vermeerdering van de
antitoxische titer van het bloed, als ze het tetanusanatoxine
mengden met een microben vaccin( het verhitte T.A.B. of
het lipo-vaccin), met een ander anatoxine, met toxinen!!!
(b.v. streptococcen).

Maar nog een gewaagde factor blijkt zeer zeker bij hunne
vaccinaties wanneer we lezen, dat zelfs bij zieke menschen
geen verandering in het verloop en waarde van de immuniteit
ontstond. Ten slotte komen ze tot de gevolgtrekking, dat

bi] een van tetanusinfectie verdacht persoon vóór de tweede
jtnatoxineinjectie, een seruminjectie als „méthode d\'urgencequot;
IS aangewezen. Eigenaardig is, dat waar de Fransche onder-

toeschrijven aan het simultaan immuni-
seeren (zie hoofdstuk III), hier juist geen melding gemaakt

Uit verdere onderzoekingen bleek Ramon en Zoei,i.er23
dt na een jaar nog een onvatbaarheid bestond, dusdanig,
udt een cc. serum in staat was 20 a 100 d.l.m. cavia te neu-
auseeren. Een hernieuwing der injectie en serum onderzoek
^d eenja^j^g^f ^^ neutralisatiemogelijkheid van ± 1000 d.l.m.
dvia per cc. Het serum van de jonge menschen, die vóór
jaar de laatste anatoxine injectie gehad hadden, bleek nog
M ^^^^ ^^^nbsp;^^^^^ neutraliseeren.

dstgesteld was, dat na inspuiting met anatoxine, onmiddellijk
na üe conceptie en tijdens de zwangerschap van konijnen en
^aviae, het serum van moeder en pasgeborene na het werpen
ongeveer gelijke hoeveelheden antitoxine bevatte, zagen ze
oij pasgeboren kinderen een veel kleinere immuniteit aan-
^zig dan bij de oorspronkelijk gevaccineerde moeder. Deze
^umteit is voor de jongen een passieve en verdwijnt dus,

^^ ^^ ^^ verschillende stadia
uer graviditeit(!) aanwendden, zagen ze niet de minste plaatse-
nji^e ot algemeene reactie, noch onregelmatigheden in het
verloop bij de zwangere vrouw.

^nd te beschermen tegen tetanus, die uitgaat van de navel-
streng wonden en is volgens bovengenoemde onderzoekers
oe vaccinatie tegen tetanus met het anatoxine bij de toekom-
stig moeder aangewezen in streken waar de tetanus umbili-
AfSsanbsp;IS, zooals in sommige streken van Azië en

Het gedrag van antigenen en antilichamen in het zwangere
aier is nader onder de oogen gezien door Nattan—i^arrier
^amon en Grasset^^. Nadat ze bij het zwangere dier 48 uur
voor het werpen 30 cc. van hun tetanusanatoxine hadden
mgespoten, zagen ze nooit een spoor van immunisatie bij

de daarna geborene. Het tetanustoxine bleek bij injectie
bij konijnen in het geheel niet, bij caviae ten deele de placenta
te kunnen passeeren. Het inspuiten van antitoxine bij het
zwangere dier even vóór de partus gaf bij de jongen de aan-
wezigheid van antitoxine. Blijkens bovenvermelde erva-
ringen gaan dus zoowel de homologe als de heterologe passieve
antilichamen door de placenta heen (selectie van de placenta).
Het was verder van belang de doorgankelijkheid voor antigeen
■en antistof van andere organen na te gaan, of misschien
langs anderen weg dan de onderhuidsche inbrenging ook
quot;voldoende onvatbaarheid tegen tetanus was te verkrijgen.

Het bleek Ramon en Grasskt^s, dat de onbedekte darmwand
van den pasgeborene doorgankelijk was voor toxinen en
antitoxinen en dat er in aansluiting aan toediening per os
van tetanustoxine en -anatoxine een immuniteit ontstond,
hoewel veel minder in waarde dan bij onderhuidsche injectie.
Al spoedig na de geboorte worden de slijmvliezen met een
slijmlaag bedekt, waardoor de spijsverteringssappen gelegen-
heid krijgen toxinen en anatoxinen te vernietigen; laatst ge-
noemde onderzoekers zagen deze stoffen,in vitrosamengebracht
met spijsverteeringssappen hare toxiciteit en antigeenvermogen
(pouvoir floculant) verliezen. I^aat men jonge dieren echter
van te voren rundergal, ricinusolie of aloë sHkken, dan krijgt
men gelijkwaardige uitkomsten als bij den pasgeborene:
de gal zou de slijmlaag oplossen, de aloë zal waarschijnlijk
de darmwand beschadigen; in beide gevallen zal dus de op-
name meer mogelijk zijn door het darmslijmvlies. Merkwaardig
zijn hunne uitkomsten in zooverre dat reeds 12 dagen na de
inbrenging de weerstand tegen een doodelijke dosis tetanusgif
aanwezig is. Deze gaf tot 8 a 9 dagen nog sterfte van het proef-
dier. Uit mijn eigen onderzoekingen kan ik mededeelen, dat
bij onderhuidsche inbrenging van anatoxine bij caviae, welke
wijze van enten wel meer werkzaam is dan de toediening
per os, eerst na 2,5 a 3 weken een weerstand ontstond tegen
een dan ingespoten d.l.m. Deze weerstand komt namelijk
eerst langzaam en pas later veel sneller (zie hoofdstuk II).
Dat door Ramon en Grasset langs deze wijze per os een der-
gelijke immuniteit bereikt is, moet men eendeels toeschrijven
aan het meerdere antigeenvermogen (maar het tetanus-
toxine, dat ze gebruikten voor de anatoxine vorming is veel
zwakker dan waarover ik de beschikking had) anderdeels aan

het meerdere vermogen van hunne proefdieren om op ana-
toxine te reageeren met antitoxinevorming. Zoo is wel bekend,
dat konijnen, en hiermede experimenteerden laatstgenoemde
onderzoekers, zich beter laten immuniseeren dan caviae.

Op gelijke wijze hebben Ramon en Z0E1.1.er getracht
menschen te vaccineeren. Zoowel oplossing in physiologische
zoutoplossing, als toevoeging van bicarbonas natricus of gal gaf
geen resultaat. Al deze feiten hebben echter slechts wetenschap-
pelijke waarde, voor de praktijk gelden de veel betere uitkom-
sten, die verkregen zijn met de onderhuidsche toediening.
Waarbij nog komt dat bij bovengenoemde methoden zoo\'n
groote moeilijkheid schuilt in het aangeven van een juiste
doseering.

Volledigheidshalve zij hier nog een onderzoek van Des-
combey27 vermeld, die bij caviae intracerebraal tetanus-
anatoxine inbracht. Hem bleek, dat men gebonden is aan
zeer kleine hoeveelheden, 0,1 cc., waarbij men toch al sterke,
zij het voorbijgaande nerveuse verschijnselen krijgt (stupor,
excitatie). De uitkomsten waren ten opzichte van de immuni-
^it niet verschillend van de onderhuidsche inspuiting.
Tevens vond hij geen locale immuniteit, in casu van het ence-
phalon tegen het tetanusgif, zoodat hij aan het eind van zijn
publicatie zegt: „II n\'y a pas d\'immunité acquise contre
Ie tétanos sans antitoxine humorale aisément décelable.quot;

Ter inleiding dienen eenige algemeene opmerkingen over
de werkwijze gemaakt te worden. Alle vaccinaties werden
verricht met het anatoxine N«. 80, afkomstig van het toxine
80 (d.l.m. muis i : 300.000), dat bereid was door dit gedurende
een maand met 40/00 formaline bij 37» te houden. Dat ik
bij mijn entingen slechts één anatoxine gebruikte vergrootte
de zekerheid der beoordeeling van met deze entstof verkregen
immuniteit; hetgeen temeer van waarde is, daar het verschil
in individueele gevoeligheid der proefdieren toch al, ook al
gebruikt men een groot aantal, een factor van onzekerheid
blijft.

De immuniteit, die verkregen werd, werd nagegaan als
humorale immuniteit door het serum van het gevaccineerde
dier te titreeren op antitoxine aldus: | cc. van het te onder-
zoeken serum werd gemengd met 1 cc. physiologische zout-
oplossing, waarin tetanustoxine in verschillende hoeveelheid
werd opgelost. Dit mengsel werd na 3/4 uur gestaan te hebben
bij kamertemperatuur bij witte muizen in een der achter-
pooten ingespoten. In het begin van mijne entingen gebruikte
ik voor de titratie van het serum mijner proefdieren een
toxineoplossing, die onder toluol bewaard werd en daar alle
nadeelen van had: sterke modificatie. Het gevolg hiervan was,
dat een groot aantal controleproeven bij elke titratie moest
genomen worden, omdat de d.l.m. van het toxine zeer in-
constant was; aan het gemodificeerde toxine met zijn wisse-
lende hoeveelheid toxoïden kwam de binding derzelfde hoe-
veelheid antitoxine op zeer verschillende wijze tot uiting
in de resteerende toxiciteit, zoodat de resultaten wel onderling
in dezelfde proef maar niet ten opzichte van andere entingen
konden vergeleken worden. Het was zoodoende slechts bij
benadering mogelijk de immuniteit van verschillende groepen

te vergelijken, Ken belangrijke vooruitgang was dan ook
de beschikking over een gedroogd tetanustoxine, dat door
•Dr. Pondman bereid was en een d.l.m. muis had van 0.0005
mgr. Het aantal controleproeven was één, hoogstens 2 per
proef. De doodelijke dosis bleek mij n.1. steeds voldoende
constant en ik kreeg aldus vergelijkbare waarden en een
goed overzicht.

Naast deze serumtitraties werd zooals verderop zal blijken,
de immuniteit van het geheele geimmuniseerde dier nagegaan
(combinatie van cellulaire en humorale immuniteit) door het
een of meerdere malen zijn doodelijke dosis tetanusgif te
geven. Ook hier kwam het voordeel van dit gedroogde toxine
weer sterk naar voren: nauwkeurigheid, mogelijkheid van
Vergelijken en zuinigheid ten opzichte van proefdieren.

Waardeering door middel van het bepalen van het anti-
toxinegehalte in het serum.

Bij drie groepen van 12 caviae werd rechts van de mediaan-
lijn de buikhuid geschoren. Een groep van 12 kreeg op deze
plaats onderhuids cc. tetanusanatoxine, een tweede groep
kreeg op deze plaats i cc., het derde I2tal 2 cc. anatoxine.
Den volgenden dag was er geen spoor van iritatie op de in-
spuitingsplaatsen waar te nemen, de algemeene toestand was
goed. Gedurende een week werden deze dieren alle zonder
eenige verdere behandeling gelaten, daarna werd hartpunctie
verricht bij enkele dieren van elke groep. Het sermn werd nu
van elke groep afzonderlijk nagegaan op de aanwezigheid
van tetanusantitoxine op de volgende wijze: zie tabel i.

Gemengd werd |cc. serum met een | cc. phys. zoutopl..
Waarin resp. i, 2 en 3 d.l.m. muis gedroogd toxine waren
opgelost. Deze mengsels werden bij witte muizen van 15 gr.
mgespoten in de rechter achterpoot. Een andere muis kreeg
als controle i d.l.m. opgelost in i cc. phys. zoutopl. AUe
muizen hadden den volgenden dag tetanus in verhouding tot
het aantal d.1 .m., dat was toegediend en gingen hieraan min
of meer snel te gronde.

Na twee weken werd wederom hartpunctie verricht. Als
bovenwerdhetseruminhoeveelheid van | cc. gemengd met | cc.
phys. zoutopl. met resp. i, 2 en 3 d.l.m. muis (gedroogd toxine).
Den volgendendaghadhetcontróledier (ingespotenmet i d.l.m.)
sterke tetanus, eveneens de muizen, dien 2 en 3 d.l.m. met | cc.
serum gemengd (steeds van elk der 3 groepen) ingespoten was.
„De mengselsquot; muizen met i d.l.m. waren nog vrij, kregen

Opmerkingen: Van elke hartpunctie werden 2 ä 3 dieren genomen, eenmaal gepunc-
teerde caviae werden niet meer voor een ze punctie gebruikt.

Gelijk met de punctie: serumtitratie. In de tabel is de neutralisatiemogelijkheid per J cc.
uitgedrukt in dim. muis gezet.

evenwel in den loop van eenige dagen tetanus, gingen er echter
niet aan dood. Een duidelijk verschil tusschen de sera der met
verschillende hoeveelheden anatoxine ingespoten caviae was
niet aantoonbaar.

Na drie weken werden er van elke groep weer caviae ge-
puncteerd. Er bleek nu een immuniteit te zijn ontstaan,
die door titraties duidelijk aantoonbaar was. Terwijl de dieren,
die gevaccineerd waren met -|cc. anatoxine nauwelijks i d.l.m.
muis konden neutraliseeren per \\ cc. serum, waren de dieren
ingespoten met i resp. 2 cc. anatoxine in staat 2 a 3 d.l.m.
per I cc. serum te neutraliseeren.

Na vier weken wederom serumonderzoek. De titratie op
muizen gaf een stijging van het antitoxinegehalte ten op-
zichte van de toestand na 3 weken: de dieren gevaccineerd

niet 1 cc. anatoxine konden nu 4 d.l.m. per cc. serum
nauwelijks neutraliseeren, de dieren die met i cc. en
2 cc. anatoxine ingespoten waren 8 a 10 d.l.m. per | cc.
serum.

Na zes weken konden de caviae die met een | cc. anatoxine
geënt waren, nog niet geheel 10 d.l.m. muis neutraliseeren
per 1 cc, serum; 1 cc. serum van de dieren, die met één
resp. 2 cc. anatoxine ingespoten waren, gemengd met | cc.
phys. zoutopl., waarin 20 d.l.m. muis, gaf bij muizen inge-
spoten geen spoor van tetanus.

Men ziet dus, dat langzamerhand, tot zekere hoogte, af-
hankelijk van de hoeveelheid ingespoten anatoxine, de immu-
niteit zich ontwikkelt; in den beginne zeer langzaam, na de
derde week snel stijgend.

Hier zij tevens opgemerkt, dat men zich bij de titratie-
uitkomsten ten zeerste rekenschap dient te geven, dat er
groote individueele verschillen bestaan en dat om niet tot
verkeerde gevolgtrekkingen te komen voor een serumtitratie
het mengen van meerdere sera aangewezen is. Tevens is
noodig bij elke titratie steeds weer een contróledier te
nemen.

Hoe groot deze individueele verschillen der dieren kunnen
zijn moge blijken uit het volgende. Drie caviae hadden elk
vóór 7| week een injectie van i cc. tetanusanatoxine onder
de buikhuid gekregen. Het serum van deze dieren bleek af-
zonderlijk getitreerd in één geval 100 tot 200 d.l.m. muis,
in een tweede geval nog geen 20, in het derde geval van 20—50
d.l.m. muis per cc. te kunnen neutraliseeren. Neemt men
het gemiddelde van deze uitkomsten, dan ziet men
dat hier ten opzichte van de toestand van 6 weken weer
een duidelijke stijging van het antitoxinegehalte is waar te
nemen.

Men heeft goede gronden, aan te nemen, dat deze stijging
gedurende eenige maanden plaats vindt en daarna in een
daling overgaat. Het serum van eenige dieren, die voor
8 maanden een injectie van 2 cc. anatoxine gekregen hadden
bleek mij bij titratie per | cc. 5 a 10 d.l.m. muis te kunnen
neutraliseeren, terwijl 6 weken na de enting, zooals boven
vermeld, deze waarde 20 d.l.m. was;

De wording en het verloop van de immuniteit tegen tetanus
bereikt met het anatoxine is met de methode, die ik toepaste

(het mengen van het te titreeren serum met phys. zoutopl.,
waarin het gedroogde toxine in bepaalde hoeveelheid wordt
opgelost) slechts zeer grof te benaderen, maar met het oog
op de bedoeling van mijn onderzoekingen ruim voldoende.
Buitengewoon interessant is een titratiemethode, die onlangs
uitgewerkt en gepubliceerd is door Feieeabend^®. Hiermede
is het zelfs mogelijk om 1/500 A.E. (Internationaal) te meten.
Als indicator dient de locale tetanus, die men in zijn ver-
schillende vormen zou kunnen aflezen en daarnaar waardeeren
bij caviae, door bij deze dieren mengsels van serum (waarvan
de waarde te bepalen is) en grenswaarden van bekend
toxine (de zg. I^.l.r. dosis) in één der achterpooten in te
spuiten. Afgezien van de moeiUjkheid van het aflezen van
de verschillende vormen van locale tetanus, is de hoeveel-
heid en de aard (men moet caviae gebruiken) der proefdieren,
die men noodig heeft voor een titratie een bezwaar en Hjkt
mij tenslotte deze waardebepaling voor direct practisch ge-
bruik ongeschikt. Evenwel bericht FbiErabend die deze
methode toepaste bij zijne serumtitraties zeer gunstige
resultaten.

dat ingebracht bij caviae het tetanusanatoxine instaat is
om het specifieke antilichaam te voorschijn te roepen;
dat de antitoxische titer in de eerste plaats afhankelijk is
van den tijd sedert de inspuiting verloopen, in de tweede plaats
van de dosis anatoxine en ten derde vooral van het individueel
wisselend vermogen van het proefdier om het specifieke
antilichaam te vormen: de zg. réactivité naturelle
(ZOELLER^O) .

Om uit te maken, wanneer caviae na een anatoxineïnjectie
een dusdanige immuniteit hadden gekregen, dat ze in staat
waren een onmiddellijk ingebrachte d.l.m. cavia of meer te
weerstaan werd een groep van caviae elk onderhuids \\ cc.
tetanusanatoxine ingespoten: zie tabel 2.

Na II dagen werden enkele dezer dieren een doodelijke
dosis tetanustoxine (gedroogd) in i cc. phys. zoutopl. opgelost
in de rechter achterpoot gespoten. Als doodelijke dosis werd

genomen i d.l.m. cavia = 5 d.l.m. muis. De contróledieren,
Qie dezelfde hoeveelheid gekregen hadden, gingen in 3 ä 4
aagen te gronde, de met anatoxine behandelde gingen een
later dood aan tetanus.

Na 18 dagen werd aan de gevaccineerde caviae als boven
bereid resp. i en 2 d.l.m. cavia gegeven. Terwijl het contróle-
^er met i d.l.m. cavia al na 24 uur uitgesproken tetanus
J^ad (rechter achterpoot was geheel gestrekt en stijf) had het
geente dier, dat i d.l.m. cavia had gekregen, een hoewel naar
achteren gerichte nog gebogen rechter achterpoot (voetzool
werd opgelicht): dus veel minder tetanus. Het gevaccineerde

dier, dat met 2 d.l.m. cavia was ingespoten, had ongeveer
gelijke afwijkingen van de rechter achterpoot als het contróle-
^er, en ging als dit laatste in 3 dagen aan tetanus te gronde.
Het geënte dier, dat i d.l.m. had gekregen, behield langen
tijd uitgesproken tetanus, bleef echter leven. Hiermede
bleek dus, dat caviae geënt met l cc. anatoxine, die blijkens
serumtitraties een hoewel slechts even aantoonbare humorale
lïnmuniteit hadden, in staat waren een dosis tetanusgif,
die den dood in 3 a 4 dagen bij een niet gevaccineerde cavia
Veroorzaakte, te weerstaan. Dit was dus na 2 a 3 weken het
geval.

Een herhaling van deze proef (tabel 3), waarbij nu met drie
hoeveelheden anatoxine i en 2 cc. werd gewerkt, leerde,
dat caviae, die voor twee weken een injectie van | cc. tetanus-
anatoxine gekregen hadden, ongeveer in denzelfden tijd
aan tetanus stierven bij toediening van i d.l.m. cavia als
de contróledieren. Caviae, die met i cc. anatoxine onderhuids

waren ingespoten kregen zware tetanus en stierven veel
later, na 8 a 9 dagen; dieren die met 2 cc. anatoxine geimmu-
niseerd waren kregen geen verschijnselen met i dim.,
met 2 d.l.m. cavia een lichte tetanus die al spoedig verergerde
en tenslotte den dood veroorzaakte.

Na _2i week bleek de met J cc. anatoxine behandelde
cavia in 8 dagen aan tetanus te sterven, terwijl het controle-
dier met dezelfde hoeveelheid toxine in 3 dagen stierf (i d 1 m )
Immumsatie met i cc. anatoxine en natuurlijk ook 2 cc.

gaf bij caviae in denzelfden tijd volkomen weerstand tegen
I d.l.m. (in \'t geheel geen verschijnselen van tetanus bij
de met 2 cc. geënten.).

Een maand na één injectie van i cc. anatoxine werd bij
caviae tevens de weerstand tegen tetanustoxine nagegaan.
Deze caviae waren echter voor een groot gedeelte week
tevoren gepuncteerd omdat ze voor een andere proef gediend
hadden. Ze waren nog in het geheel niet van deze ingreep
hersteld (verHes van ± 5 cc. bloed), en voelden vermagerd
en slap aan. De gevolgen bleken ook ten duidelijkste bij hunne
weerstand tegen het tetanustoxine. Terwijl de voor ii week
gepuncteerde dieren bij inspuiten van i cc. tetanus toxine-
oplossing in de rechter achterpoot, waarin 100 d.l.m. cavia
uitgesproken tetanus kregen, met 200, 400 en 800 d.l.m.
cavia hieraan in korten tijd te gronde gingen, bleek één van

de niet gepuncteerde dieren zelfs looo d.l.m. cavia te kunnen
Weerstaan. Het dier kreeg wel uitgesproken tetanus (stijfheid
en rechtuitgestoken achterpoot) ging er echter niet aan dood.
contrôle caviae, dien I d.l.m. resp. 5 d.l.m. cavia was ingespo-
ten, stierven in 3 resp. 2 dagen aan zeer zware tetanus.

Dit laatste onderzoek werd herhaald, waarbij ik mij tevens
^e vraag stelde: hoe bij het nog niet geheel geimmuniseerde

dier of bij het dier, dat reeds een bepaalde immuniteit had,
ingespoten met i d.l.m. (doodelijk voor het niet geheel ge-
immuniseerde dier) resp. een hoeveelheid tetanusgif (doode-
lijke dosis voor het geimmuniseerde dier) het ziekteproces
door het gelijktijdig inspuiten van tetanusanatoxine in nega-
tieven of positieven zin kon beinvloed worden; of dus in
het laatste geval aan het tetanusanatoxine een therapeutische
functie kon toegeschreven worden.

Van een groep van caviae werd 1/3 deel geënt met ^ cc.,
een tweede 1/3 deel met i cc. en een laatste met 2 cc. ana-
toxine. (zie tabel 4).

Vijftien dagen na de injectie werd den dieren, die met
è cc. resp. I cc. anatoxine gevaccineerd waren één d.l.m.

cavia toegediend. Terwijl het controle dier met i d.l.m. in
3 dagen aan uitgesproken tetanus stierf, gingen de met | cc.
geënten in 4 dagen, met i cc. in 6 dagen dood aan tetanus.
Dieren, die met i resp. 2 cc. anatoxine waren ingespoten,
gingen met 2 d.l.m. in 3 resp. 6 dagen te gronde aan tetanus.

Na 19 dagen gingen de caviae, die met 1 cc. gevaccineerd
waren, met i d.l.m. cavia te gronde in gemiddeld 6 dagen;
de met i cc. gevaccineerde konden i d.l.m. weerstaan,
zonder ziekteverschijnselen.

Na 28 dagen bracht i d.l.m. die bij contrôledieren den
dood veroorzaakte aan tetanus in 3 dagen, bij met | cc.
anatoxine ingespoten caviae nog zeer zware tetanus, de met
I cc. gevaccineerde kregen met 100 d.l.m. cavia tetanus,
die bij enkele nog na 3 weken den dood veroorzaakte, 500
d.l.m. gaf in dit geval zeer snel optredende doodelijke tetanus
na 2 dagen.

Na 30 dagen veroorzaakte 2 d.l.m. cavia bij de dieren,
die met l cc. anatoxine ingespoten waren den dood aan teta-
nus na gemiddeld 3 dagen. Caviae die met i cc. anatoxine
waren ingespoten werden in ± 2 dagen door snel optredende
tetanus gedood met 500 d.l.m. cavia.

Men ziet aldus, dat deze uitkomsten vrijwel overeenkomen
met die van de voorgaande onvatbaarmakingen; opvallend
is hier evenwel het groote verschil in effect tusschen 1 en
I cc. anatoxineinjectie.

Hiernaast werd nu in het verloop dezer entingen op ver-
schillende tijdstippen de werking van het gelijktijdig met het
toxine (echter op een andere plaats) inspuiten van anatoxine
nagegaan.

Het bleek, dat caviae, die met | cc. anatoxine geënt waren
en met i d.l.m. caviae na 4 dagen aan tetanus stierven, met
dezelfde gif dosis en gelijktijdig inspuiten als boven beschreven
van I cc. anatoxine in 5 dagen aan tetanus stierven, terwijl
dezelfde dieren met 10 cc. anatoxine zeer zware tetanus
kregen en veel later te gronde gingen: na ± 12 dagen.

Caviae, die met ^ cc. anatoxine geïmmuniseerd waren,
stierven met 2 d.l.m. cavia in 3 dagen aan uitgesproken
tetanus, met gehjktijdige inspuiting van 2 d.l.m. en daarnaast
I cc. anatoxine na 6 dagen, terwijl ze na inspuiting van 2
d.l.m. en 10 cc. anatoxine zeer zware tetanus kregen en na
I maand nog leefden: de béide achterpooten door de tetanus

geheel gestrekt. Caviae, die met i cc. geënt waren gingen
500 d.l.m. cavia in 2 dagen dood aan tetanus; met
plijktijdige toediening van 10 cc. anatoxine onder de buik-
huid trad de dood vele uren later op.

Hieruit blijkt dus ten duidelijkste, dat het tetanusanatoxine
Zoowel bij het nog niet geheel geïmmuniseerde als bij het
geïmmuniseerde dier de werking van de doodelijke dosis
tetanusgif kan vertragen c.q. tegenhouden.

Voor de volledigheid werd tevens de werking van het
tetanusanatoxine nagegaan bij het niet geënte dier. Hiervoor
Werden eenige even groote caviae in de rechter achterpoot
met i d.l.m. cavia ingespoten. Het grootste gedeelte kreeg nu
^vens nog 10 cc. tetanusanatoxine onder de buikhuid.
Den volgenden dag bleken de dieren, die slechts i d.l.m.
gekregen hadden, meer tetanus te toonen dan de dieren,
die gelijktijdig met 10 cc. anatoxine waren ingespoten.

3 dagen gingen de eerste dieren aan tetanus dood, terwijl
de laatste groep nog sterke tetanus had en i ä 2 dagen later
stierf. Ook hier dus de mogelijkheid van het anatoxine om
de werking van de doodelijke hoeveelheid tetanusgif te
Vertragen. Men heeft hier waarschijnlijk aan te nemen,
dat door het groote overschot aan bindende stoffen (aan-
wezigheid van het anatoxine), het toxine afgehouden wordt
Van plaatsen waar dit laatste anders zijn giftige werking
kan ontvouwen.

Wanneer men inplaats van één injectie, twee aanwendt,
krijgt men veel krachtiger immuniteit. (Zie tabel 5).

14 dagen na de 2e injectie bleek het serum der proefdieren
nog geen 100 d.l.m. muis per cc. te kunnen neutraliseeren:
t aan tetanus 2e dag.

35 dagen na de 2e injectie was de waarde iets grooter dan
de neutralisatie mogelijkheid van 100 d.l.m. per | cc. serum.

60 dagen na de 2e injectie kon het serum per ^ cc. nog geen
200 d.l.m, muis neutraliseeren (dood aan tetanus na 3 a, 4
dagen).

20 dagen na de 2e injectie nog niet 100 d.l.m. muis per \\ cc.
serum te neutraliseeren.

32 dagen na de 2e. injectie kon | cc. serum nog niet 200
d.l.m. muis neutraliseeren. ( aan tetanus 2e dag).

70 dagen na de 2e injectie was de neutralisatiemogelijkheid
voor I cc. serum minder dan 200 d.l.m. muis ( aan tetanus
na 5 dagen).

Opmerkingen: de aangegeven tijden bij de hartpunetie hebben betrekking op de 2o
injectie. Verder ala bij tabel 1.

40 dagen na de 2e injectie bleek het serum der proefdieren
per I cc. bijna 16000 d.l.m. muis (muis kreeg iets tetanus)
te kunnen neutraliseeren.

Vat men al deze uitkomsten samen, dan blijkt bij een tijds-
termijn van 14 70 dagen (zie boven uitkomst van de immu-
nisatie met interval van 14 dagen) en 2 injecties, de immuni-
teit nog de waarde van neutralisatiemogelijkheid per ^ cc,
serum van 200 d.l.m. muis niet te hebben.

In een kortere tijd, 35 40 dagen (zie immunisatie met
interval van 5 weken) ontstond zelfs een neutralisatiemoge-
lijkheid per \\ cc. van iets minder dan 16000 d.l.m. muis.

Het ejject van de vaccinatie tegen tetanus met dezelfde
hoeveelheid anatoxine wordt grooter, naarmate de injecties
verder uit elkaar liggen.

na de le, het antitoxinegehalte weer kan doen stijgen, blijkt
wel uit het volgende: het serum neutraliseerde per\' ^ cc. na
O maanden nog niet 5 d.l.m. muis gedroogd toxine. Ken
meuwe injectie van i cc. anatoxine en onderzoek van het
serum na i week leerde, dat dit nu per ^ cc. meer dan 1000 d.l.m.
muis kon neutraliseeren. Wel was dus de humorale immuni-
teit aanvankelijk zeer laag, maar de latente cellulaire immu-
mteit was aanwezig en kwam plotseling in al zijn kracht te

voorschijn bij het wederom aanwenden van de specifieke
pnkkel: injection de rappel.

Op grond van de boven verkregen resultaten met het teta-
nusanatoxine stelde ik mij nu de volgende practische vraag:
op welke wijze moet men enten om in een bepaalde tijd
een zoo krachtig mogelijke immuniteit te verkrijgen? Hierbij
heeft men onmiddellijk te kiezen in aantal, grootte der in-
jecties en de intervallen tusschen de injecties. Aantal en
intervallen zullen in het algemeen wederkeerig elkander
beinvloeden, omdat met het toenemen van het aantal injec-
ties in een gegeven tijd, het interval er tusschen kleiner zal
dienen te worden. De grootte van de injectie is echter onaf-
hankehjk van de bovengenoemde twee. Daarom werd de
grootte van de injectie allereerst als eenige ongelijke (i a cc.
anatoxine) als volgt onder de oogen gezien. (Zie tabel 6).

Een groep II caviae kreeg als le injectie | cc. anatoxine,
de 2 andere inspuitingen waren ieder i cc. op dezelfde tijden.

Een groep III caviae kreeg als le injectie i cc. anatoxine,
de 2e en 3e injectie waren ieder | cc.; intervallen als boven.

Een week na de 3e injectie werd bij de 3 groepen hart-
punctie verricht en het serum ervan nagegaan op antitoxine-

gehalte. Terwijl groep I en III in staat waren per f cc. sertun
1000 tot 2000 d.l.m. muis te neutrahseeren, kon groep II
van 50 tot 250 d.l.m. muis neutrahseeren. Duidehjk bleek dit
verschil tevens 5 maanden na deze titratie. Dieren van groep
II, ingespoten met 20.000 d.l.m. cavia waren den volgenden dag
reeds dood aan zeer sterke tetanus, terwijl caviae van groep
III zware tetanus vertoonden en na 4 dagen stierven.

De verschillen tusschen de groepen I en II zijn weinig in
het oog springend; duidelijk minder is het antitoxinegehalte
van het serum bij groep II zoodat: een kleine aanvangsdosis
bij tetanusanatoxine-entingen onjuist is en men beter de
volgende injecties kleiner kan Mezen.

Daarna werd met een constante injectie van i cc. anatoxine
met wisselende intervallen en aantal injecties in een tijd van
4 weken als volgt gevaccineerd: zie tabel 7.

Een groep C kreeg om de drie weken een zelfde injectie.
Zoodat: groep A in totaal kreeg 3 cc. anatoxine, groep B en
groep C 2 cc. echter met andere intervallen.

4 weken na de le injectie voor de drie groepen hartpunctie
Voor enkele dieren uit elke groep. Het serum van de dieren
van groep A bleek nu nog niet geheel 2000 d.l.m. muis
(gedroogd toxine) per ^ cc. te kunnen neutraliseeren, groep B
had een iets hoogere antitoxinewaarde 2000 d.l.m.), ter-
wijl groep C in staat was per | cc, serum bijna 4000 d.l.m.
mms te neutraHseeren. (titratiemuis kreeg den 3en dag iets
tetanus).

Men ziet aldus, dat hoewel groep A meer anatoxine heeft
gekregen dan groep C, de laatste meer immuniteit heeft dan
Qe eerste. Degevoeligmakende injectie heeft langer ingewerkt?

Merkwaardig waren de uitkomsten der drie groepen
A, B en C één maand na de eerste punctie. Terwijl het serum
Van groep A nu in staat was om meer dan 8000 d.l.m. muis
per ^ cc. te neutraliseeren, kon dat van groep B niet 8000
^•l-m. muis (f aan tetanus na i dag) en dat van groep
^ eveneens geen 8000 d.l.m. (f aan tetanus na 4 dagen)
neutraliseeren.

Hier zijn dus de rollen omgedraaid: de dieren, die 3 maal icc.
anatoxine gekregen hebben, vertoonen hoogere antitoxine-
Waarden dan de caviae, dien 2 maal i cc. anatoxine is inge-
spoten.

Men kan dus de gevolgtrekking maken, dat het inspuiten
om de week kort na de laatste injectie, een lager antitoxine-
gehalte van het serum geeft; maar dat daarna het voordeel
^mt aan de dieren, die het meeste anatoxine gekregen hebben.
Het ligt voor de hand dit verschijnsel als een soort depót-
werking te verklaren: het tetanusanatoxine is gebonden aan
de hierdoor te voorschijn geroepen (homologe) antitoxinen,
IS dus bij titratie op muizen niet aantoonbaar, maar ontvouwt
ondertusschen toch een antigeenwerking in het dierlijk
organisme

Groep B krijgt 2 maal i cc. anatoxine, interval 2 weken.
Groep C krijgt 2 maal i cc. anatoxine, interval 3 weken.
Het serumonderzoek vond voor de 3 groepen plaats 5 weken
na de le injectie.

Groep A kon per i cc. serum bijna 2000 d.l.m. muis
(droog toxine) neutraliseeren: titratiemuis ging dood aan
tetanus na 7 dagen.

Groep C kon per | cc. serum ± 4000 d.l.m. (f aan
tetanus 6e dag) neutraliseeren.

Van deze dieren werd na 3 maanden wederom het anti-
toxinegehalte van het serum bepaald, met het resultaat, dat
de antitoxische titer van de groep A hooger was dan die van de
andere groepen B en C. Tusschen de groepen B en C kwamen
geen duidelijke verschillen voor den dag.

Resumeerende de resultaten van deze onderzoekingen,
waarbij in een gegeven tijd een zoo krachtig mogelijke immu-
niteit werd getracht te bereiken, kan ik besluiten:

2e. dat voor het zoo snel mogelijk bereiken van een
bepaalde immuniteit er een behoorlijke afstand tusschen de
gevoehgmakende en de 2e injectie moet zijn.

3e. dat, als men snel achter elkaar inspuit, b.v. om de week
er een z.g. depotwerking in het organisme optreedt, die op
den duur pas effectief blijkt.

4e. dat, wanneer men den tijd heeft, het aanbeveling
verdient om het interval tusschen de le en de 2e injectie
groot te kiezen.

Tenslotte werd nu nog de invloed van de niet specifieke
prikkel op het effect van de tetanusanatoxine-inspuiting na-
gegaan.

Het bleek, dat, als men caviae, die met tetanusanatoxine
No. 80 een zekere immuniteit hadden verkregen, een nieuwe
injectie gaf met tetanusanatoxine voorzien van 2% yatreen,
het effect grooter was dan met tetanusanatoxine in dezelfde
hoeveelheid zonder yatreen.

Een groep caviae werd met een tusschenruimte van 2
Weken ingespoten met 2 injecties van i cc. tetanusanatoxine.

Een groep II kreeg met hetzelfde interval 2 maal i cc. van
een oplossing, die bereid was met yatreen als boven.

Voor beide groepen werd steeds den dag na de injectie de
plaatselijke reactie op de inspuiting nagegaan en er bleek
steeds bij de met 2 % yatreenanatoxine ingespoten dieren een
vrij sterk infiltraat te bestaan, dat echter binnen korten tijd
steeds weer verdween.

Twee weken na de 2é injectie werd het serum der beide
groepen getitreerd op muizen en bleek de le groep per | cc.

nog in het geheel met 250 d.l.m. mins te kunnen neutrali-
seeren, terwijl het serum der 2e groep iets meer antitoxine
bevatte: titratiemuis ging veel later dood.

Vier weken na de 2e injectie bleek het serum der eerste
groep minder dan 250 d.l.m. per 1 cc. te kunnen neutrali-
seeren, terwijl de 2e groep als overeenkomstige waarde
250—500 d.l.m. had.

Samenvattend kan men dus besluiten, dat het toevoegen
van yatreen in staat is de antigeenwerking van het tetanus-
anatoxine te verhoogen, waarbij echter de infiltratie op de
plaats der enting het gebruik van deze combinatie voor
entingen van menschen niet zal bevorderen.

Hieronder heeft men te verstaan het gelijktijdig inspuiten
van zoowel anatoxine (antigeen, vormer van het actieve
antilichaam) als van serum (het passieve antilichaam).

Deze wijze van enten is natuurlijk daar aangewezen, waar
onmiddellijk in het menschelijk organisme de aanwezigheid
van de tetanusantistof gewenscht is. Van Fransche zijde
werd, vooral met het oog op het voorkomen van de zoogenaam-
de tétanos post sérique, dit vraagstuk onder de oogen gezien.
I^oor de zoogenaamde prophylactische seruminjectie te
combineeren met tetanusanatoxine-inspuiting, beoogde
men een duurzame immuniteit te verkrijgen. Men dacht
namelijk dat de zoogenaamde actieve antilichamen, dus af-
komstig van de werking van het anatoxine, langzamerhand
in de plaats zouden treden van de met de seruminjectie
ingebrachte zoogenaamde passieve antistoffen, die zooals
bekend, na bepaalden tijd (zie inleiding) hunne werking
hebben ingeboet. Men spoot in Frankrijk dus bij menschen
gelijktijdig op verschillende plaatsen antitetanusserum en
tetanusanatoxine in. Men kan theoretisch dan verschillende
toestandsbeelden krijgen:

le. Het antitoxine in het bloed vermindert langzamerhand:
de passieve antilichamen worden uitgescheiden, eventueel

2e. Het antitoxinegehalte blijft op dezelfde hoogte: de
verdwijnende passieve antilichamen worden in gelijke mate
Vervangen door de actieve, ontstaan door de anatoxine-
Werking.

3e. De antitoxische titer van het bloed neemt toe: er is meer
nieuw-vorming door het anatoxine, dan verwijdering van het
passieve antilichaam. Om een hiaat tusschen de passieve
en actieve immunisatie te voorkomen (de actieve immu-
niteit ontstaat immers slechts langzamerhand) werd na tien
dagen weer een serum-injectie gegeven. Weer tien dagen
later werd opnieuw tetanus-anatoxine geinjiceerd, die

Is echter het simultaan immuniseeren mogelijk? On-
middellijk komt men dan tot de volgende vragen:

Voor de beantwoording van de eerste vraag werd de
volgende proef genomen: bij twaalf caviae werd de buik
geschoren. Bij zes werd ter weerszijde van de mediaanlijn
respectievelijk 2 cc. antitetanusserum en 2 cc. tetanus-
anatoxine no. 80 ingespoten. De andere zes kregen alleen
serum onderhuids.

Den volgenden dag bleek bij de dieren de buikhuid op de
plaats, waar het serum ingespoten was min of meer verdikt,
terwijl de anatoxineïnjectie geen locale reactie van eenige
beteekenis had veroorzaakt.

Door bij deze dieren na i dag, na 3 dagen, na 6 dagen, na
10 dagen en na 15 dagen hartpunctie te verrichten en het
serum te titreeren op het A.E. gehalte ziet men al dadelijk,
dat in het bloed van de simultaan ingespoten dieren 1/30
A.E. na i dag aanwezig is, terwijl bij de „serumquot;dieren dit
1/15 A.E. bedraagt (zie graphische voorstelling).

De geheele lijn van de „serumquot;dieren loopt op een veel
hooger niveau dan bij de „simultanequot; dieren: ten slotte is
er dan in het geheel geen antitoxine meer aan te toonen,
doordat na 15 dagen zelfs een halve cc. serum van beide
reeksen gemengd met een halve cc. physiologische zoutop-
lossing waarin i d.l.m. muis is opgelost, dit dier niet meer
beschut tegen een doodelijk verloopende tetanus.

Men mag hieruit dus zeer zeker besluiten, wat eigenlijk
al a priori te verwachten was (binding antitoxine-anatoxine),
dat men bij het simultaan inspuiten, door het inbrengen van
het tetanusanatoxine, afhankelijk van de dosis van het
anatoxine, een groot gedeelte van het „passievequot; antitoxine,
buiten werking stelt. Hiermede heeft men dus bij simultaan-
inspuitingen ten zeerste rekening te houden.

2e. Hiervoor werd een serie dieren ingespoten met anti-
tetanusserum en tetanusanatoxine als bij vorige proef, een

andere groep alleen met anatoxine. Terwijl de dieren, die
alleen met tetanusanatoxine ingespoten waren na eenigen tijd

Voor de serom-dieren waren de waarden van het bloed
na I, 3 en 6 dagen respectievelijk Vu. ± Vüd .± \'Ao A.E.

Voor de simultane dieren waren deze waarden
respectievelijk \'/ao. ± V«o. \'ets grooter dan Vso A. E.

De gebroken lijn geldt voor de „simultaanquot;-dieren
(2 cc. serum en 2 cc. tetanus anatoxine).

Den tienden dag was de titer bij beide minder dan
\'/,,,„ A. E.. br bleek echter nog eenige immuniteit
(titratie op muizen). Voor dezen dag is dan ook een
willekeurige waarde tusschen \'/uo (4^) en o genomen.
Daar tijdens de serumtitraties op d.l.m. muis gebleken
was, dat het serum der „senimquot;-dieren in antitoxine-
gehalte hooger was dan dat der „simultaanquot; dieren,
is de waarde van de laatste in de graphische voorstelling
onder die der „seruraquot;-dieren geplaatst.

Beide lijnen vallen daarna af naar o.: geen anti\'
toxine meer aantoonbaar na 15 dagen.

,,105

»Ï^AOAE

^ysoAÏE

=KooAE

een aantoonbare immuniteit gekregen hadden, was bij de
simultaan ingespotenen geen spoor antitoxine aantoonbaar.

Het gelijktijdig inspuiten van antitetanusserum en tetanus-
anatoxine drukt dus zeer zeker de werking van het anatoxine
in het dierlijk organisme.

Maar al was dan ook niet een humorale immuniteit aan-
wezig (is slechts grof met mijne methode te benaderen) er
diende uitgemaakt te worden of het anatoxine bij het simul-
taan enten een werking in het dierhjk lichaam had ontvouwd:
het vermogen om op de specifieke prikkel te reageeren door
de vorimng van antistoffen, had verhoogd. Daarom werd aan
al de simultaan geïmmuniseerde caviae een tweede injectie
met tetanusanatoxine gegeven. De caviae gedroegen zich
ten opzichte van deze anatoxineïnjectie overeenkomstig als
dieren, dien slechts één injectie was gegeven, waaruit volgt,
dat dus blijkbaar de eerste met serum gecombineerde in-
spuiting van tetanusanatoxine geen voor het laatste specifieke
werking had verricht.

Volledigheidshalve werd nogmaals een reeks caviae ge-
vaccineerd in andere verhoudingen:

een groep dieren kreeg aan één zijde van de mediaanlijn
5 cc. antitetanusserum, aan de andere zijde i cc. tetanus-
anatoxine no. 80, een tweede groep diende ter controle en
kreeg geen inspuiting. Na 2 maanden (er werd vrij lang ge-
wacht om de werking van het anatoxine bij de simultaan
ingespoten dieren tot zijn recht te laten komen) werd aan elk
dezer dieren één injectie van i cc. tetanusanatoxine gegeven en
na drie weken het serum getitreerd op muizen. Van beide groe-
pen bleken de sera in staat per 1 cc. ongeveer 2 tot 5 d.l.m.
mms (gedroogd toxine) te neutraliseeren. Men krijgt dus
duidelijk den indruk, (hetgeen bij de boven beschreven
proeven reeds gebleken was), dat de antitoxische titer van het
bloed ook bij de simultaan-ingespoten dieren te danken is
aan de onderhuidsche inbrenging van tetanusanatoxine vóór
drie weken. (Vergelijk hiermede mijne uitkomsten van het
onderzoek over de totstandkoming van de immuniteit tegen
tetanus: Hoofdstuk I).

De zoogenaamde „réactivité acquisequot;, die ik met de tweede
anatoxineïnspuiting hoopte te kunnen aantoonen en niet
bleek te bestaan, trachtte ik nog op andere wijze aan te
toonen.

Van een reeks van twaalf caviae werden zes simultaan
ingespoten (2 cc. antitetanusserum en 2 cc. tetanusanatoxine)
en zes kregen alleen antitetanusserum subcutaan.

Na ruim drie maanden werd aan deze dieren respectievelijk
I, 2, 3, en 4 d.l.m. gegeven, opgelost in i cc. physiologische

De volgende dagen vertoonden alle dieren zoowel „simul-
taanquot; als „serumquot;, afhankelijk van het tetanustoxine-dosis,
tetanus en gingen ongeveer gelijktijdig (ten opzichte van de
dosis) te gronde aan klemziekte.

^ij het simultaan injiceeren schijnt het tetanusanatoxine geen
9/ althans zeer weinig werking in het dierlijk organisme te

Had het anatoxine immers het vermogen om antitoxine te
vormen latent doen ontstaan, dan moest toch zeker bij deze
proef het verschil in het verloop van de tetanus te voorschijn
^ijn gekomen. Waar dit niet het geval is kan men slechts
de gevolgtrekking maken, dat het gelijktijdig met groote
overmaat antitetanusserum ingespoten anatoxine geen anti-
geen-werking heeft kunnen verrichten en kan men dus niet
alleen zeggen, dat het simultaan inspuiten ongunstig is voor
de serumwerldng, maar tevens het ontstaan van de actieve
quot;nmuniteit verhindert.

Onder gemengde enting verstaat men de praeventieve be-
handeling met een mengsel van twee of meer entstoffen. De
bedoehng van deze wijze van immuniseeren is met één
injectie tegenover meerdere ziektekiemen tegelijkertijd
weerstand te verkrijgen (b.v. Diro, een gemengde entstof
tegen diphtherie en roodvonk), waarbij tevens de mogelijkheid
bestaat, dat de eene entstof als aspecifieke hulp de antigeen-
werking van de andere vermeerdert.

Ik heb uitsluitend proeven genomen met gemengde vaccins
bestaande uit twee entstoffen, tetanusanatoxine gemengd
met typhusvaccin resp. diphtherie-anatoxine.

Het meest gunstige is natuurlijk, wanneer de werking van
beide vermeerdert, dus dat het eene vaccin het andere stimu-
leert. Het kan ook zijn nut hebben als één der vaccins in
werking vermeerdert en het andere gelijk blijft. Vermindert
echter één van beide, dan kan ons standpunt betrekkelijk
zijn; verminderen beide, dan moet men deze geassocieerde
vaccinatie als ondeugdelijk verwerpen.

Om de vragen, hierboven gesteld, te beantwoorden werd
als gemengd vaccin gekozen een mengsel, dat bereid was door
het neerslag, uit doode typhusbacillen bestaande, dat ver-
kregen werd door lo cc. T.A.B. vaccin (Typhus-paratyphus
A-paratyphus B) te centrifugeeren en daarna te suspen-
deeren in lo cc. tetanusanatoxine No. 80.

Als eerste proef (zie tabel 10) werd bij zes caviae i cc. van
dit gemengde vaccin onder de buikhuid ingespoten, bij een
tweede groep van zes werd alleen i cc. tetanusanatoxine
No. 80 onderhuids ingebracht. Er traden geen noemens-
waardige huidreacties op. Na 14 dagen (eerste titratie) werd

serum, van enkele dieren uit elke groep door hartpunctie
Verkregen, onderling vergeleken. In | cc. sertmi bleek een
dusdanige hoeveelheid tetanusantitoxine aanwezig, dat een
hoeveelheid toxine overeenkomend met i d.l.m. muis bijna

TABEL 10 (Proef 1).

14 dagen
na le inj.

hart-
punctie te-
vensserum-
titratie

lt; 1 dim.

Werd geneutraliseerd, want de muis, die voor deze titratie
diende, kreeg slechts in zeer lichten graad tetanus. Van een
duidelijk verschil tusschen de beide groepen was geen sprake.

Onmiddelhjk na de hartpunctie werden alle dieren weer
geënt resp. met het gemengde vaccin of alleen met tetanus-
anatoxine.

Na i8 dagen werd hartpunctie gedaan bij de nog niet ge-
puncteerde caviae. Bij serumonderzoek op muizen bleek
het serum der met gemengd vaccin ingespoten dieren meer
antito3dne te bevatten dan dat der dieren, die met tetanus-
anatoxine alleen geënt waren; de verhoudingen tusschen de
beide immuniteitstoestanden was ± 2:1.

Het serum der met gemengde entstof ingespoten dieren
bleek geen typhus-agglutininen te bevatten.

Als tweede proef werd hetzelfde onderzoek herhaald (zie
tabel II). De gemengde entstof werd als vroeger bereid. Het
tetanusanatoxine was ook hetzelfde. Met een interval van
5 weken werd aan 6 caviae (groep i) het gemengde vaccin,
aan 6 andere (groep 2) alleen het tetanusanatoxine telkens
I cc. onderhuids ingespoten. Een derde 6 tal (groep 3) kreeg
met hetzelfde interval, als eerste injectie i cc. T.A.B, vaccin,
als tweede injectie i cc. gemengde entstof als boven.

Was nu het immuniseeren met gemengd vaccin beter dan
met het enkelvoudige tetanusanatoxine, dan moest dit ver-
schil, gezien den langen tijd tusschen de 2 inspuitingen, zeer
naar voren komen. Daarbij werd tevens extra lang gewacht,
voordat de dieren gepuncteerd werden, nl, 6 weken.

Het serum der met gemengd vaccin ingespoten dieren bleek
aldus 6 weken na de 2e injectie nog geen 8000 d.l.m. muis
(gedroogd toxine) per 1 cc. te kunnen neutraliseeren (f aan
tetanus 6e dag), terwijl het serum der dieren, dien het enkel-
voudige tetanusanatoxine was ingespoten meer dan 16000
d.l.m. per | cc. kon neutraliseeren. Hoeveel meer is helaas
niet te zeggen, daar deze uitkomsten zeer onverwacht waren
en de 16000 d.l.m. muis als uiterste grens bij deze titraties
was beschouwd. In ieder geval kan men zeggen, dat de met
gemengd vaccin ingespoten dieren ver ten achter waren
gebleven in immuniteit bij de caviae, die slechts tetanus-
anatoxine in dezelfde hoeveelheid gekregen hadden.

Daarna werd het serum (van dezelfde hartpunctie af-
kornstig) der groepen i en 3 onderzocht op typhusaggluti-
natie. Het resultaat was, dat voor de eerste groep van dieren
de agglutinatie voor twee typhusstammen een titer had van
20 resp. 40 ä 80 (twijfelachtig). Paratyphus A agglutineerde
spontaan. Paratyphus B agglutineerde met een serum-
verdunning 20, 40 ä 80 twijfelachtig.

1nbsp;cc.

tetanus
anatoxine

2nbsp;cc.
typhus-
tetanus

anatoxine

1 cc.
T.A.B.

vaccin

1nbsp;cc.

tetanus
anatoxine

2nbsp;cc.
typhus-
tetanus

anatoxine

1 cc.
T.A.B.

vaccin

de twee bovengenoemde typhusstammen een titer van onge-
veer 400 resp. 800. Paratyphus B agglutineerde nog in serum-
verdunning 600,

Hieruit mag men besluiten, dat voor de eerste groep de
agglutinatie in het algemeen veel minder sterk is dan die voor
de derde groep en dat dus bij het gebruik van gemengd
vaccin T.A.B. het typhusvaccin in zijn werking sterk wordt
benadeeld.

Als derde proef (zie tabel 12) werd als een tweede typhus-
tetanusanatoxine-vaccin een mengsel gekozen, dat bestond
uit gelijke deelen typhusvaccin T.A.B. en tetanusanatoxine
No. 80.

Een groep A groot 8 caviae, kreeg 2 maal i cc. tetanusana-
toxine met een interval van 11 dagen.

Een evengroote groep B kreeg 2 imal 2 cc. gemengd
vaccin (typhusvaccin-tetanusanatoxine ää) met een interval
als boven.

Na 14 dagen hartpunetie. Het serum van de dieren van de
groepen A en B werd onderzocht op zijn gehalte aan tetanus-
antitoxine, van groep B en C op typhusagglutinatie.

Het resultaat van het serum onderzoek van groep A en B
was, dat (le titratie) de muizen, die met serum van groep A
waren ingespoten ongeveer in gelijke mate tetanus kregen en
hieraan stierven, als de muizen, die met serum van groep B
waren ingespoten: | cc. serum der beide groepen kon nog geen
100 d.l.m. muis neutraliseeren.

Het agglutinatieonderzoek van de groepen B en C gaf voor
B de mogehjkheid tot agglutinatie van twee tj^husstammen
tot een titer van nauwelijks 40: voor paratyphus A en B viel
deze negatief uit.

Voor groep C was de agglutinatie voor de beide typhus-
stammen duidelijk 80. Paratyphus A en B eveneens negatief.

Na twee weken werden de groepen A en B wederom verge-
leken, dus 4 weken na de 2e injectie. Een typhusagglutinatie
werd niet verricht.

Het serumonderzoek (2e titratie) op tetanusantitoxine
gaf voor groep A een neutralisatiewaarde van 50—100
d.l.m. muis (gedroogd toxine); dat van groep B kon nog geen
50 d.l.m. muis neutrahseeren (f aan tetanus 2e dag), telkens

per I cc. serum. Hier ziet men dus, dat de caviae, die 2 maal
J cc. van het enkelvoudige tetanusanatoxine gekregen
hadden, ruim 2 maal grootere inmiuniteit hadden dan de
met gemengd vaccin ingespoten dieren.

Weer na vier weken, dus 8 weken na de tweede injectie,
Werd hartpunctie bij de overgebleven dieren verricht (3e
titratie).

Bij de titratie op muizen, om de antitoxische titer van het
serum tegen tetanus te leeren kennen bleek, dat terwijl het
serum van de dieren, die met tetanusanatoxine waren in-
gespoten nog geen 200 d.l.m. per cc. kon neutraliseeren
(t aan tetanus na 3 dagen) van de met gemengd vaccin
mgespoten dieren cc. serum 200 d.l.m. muis (gedroogd
toxine) zoover kon neutraliseeren, dat pas op den 8sten dag
tetanus optrad. De typhusagglutinatie voor 2 stammen voor
groep B zoowel als voor groep C was zeer onduidelijk; een
verschil tusschen de groepen B en C werd niet gevonden.

Uit de titraties van deze derde proef, waarbij het gemengde
Vaccin op een andere wijze bereid was, valt weer zeer weinig
te leeren, wat betreft de werking van het tetanusanatoxine;
Van het vaccin T.A.B. kan gezegd worden, dat het in het
gemengde vaccin minder antigeenvermogen heeft dan het
typhusvaccin alleen.

Vat men al deze uitkomsten met bovengenoemde twee
Verschillend bereide typhus-tetanusanatoxine vaccins samen,
dan blijkt, wat betreft het optreden van tetanusantitoxine
m het serum bij de genomen proeven, dat:

Bij de eerste titratie (14 dagen na de le injectie) geen ver-
schillen te bestaan tusschen de dieren, die met het enkel-
voudig tetanusanatoxine en die met het gemengde vaccin
zijn ingespoten.

Bij de tweede titratie (18 dagen na de 2e injectie) het
Voordeel sterk te liggen aan de zijde van de dieren, die met
het gemengde typhus-tetanusanatoxine waren ingespoten 2:1.

gekregen hadden, meer dan 2 maal zooveel antitoxine in het
serum bezaten dan de dieren, die met de gemengde entstof
waren ingespoten.

Bij de eerste titratie er geen verschil in antitoxinegehalte
van het serum tusschen de met het enkelvoudig tetanusana-
toxine en de met gemengde entstoffen ingespotene was.

Bij de tweede titratie het voordeel aan de zijde van de
dieren, die met het enkelvoudige tetanusanatoxine waren
ingespoten.

Bij de derde titratie bevatte het serum der met de gemengde
entstof ingespoten dieren meer antitoxine.

Overziet men nu al deze titraties dan blijkt ten opzichte
van het optreden van tetanusantitoxine het voordeel
evenzoo vele malen aan de zijde te liggen van de dieren,
die met de gemengde als van de dieren die met de enkel-
voudige entstof zijn ingespoten, zoodat noch aan het met
gemengde entstoffen, noch aan het met enkelvoudig ana-
toxine inspuiten den voorrang verleend kan worden.

Alles te zamen genomen mag men dan ook niet meer be-
sluiten dan dat bij het mengen van tetanusanatoxine met
typhusvaccin, de werking van het eerste niet steeds verhoogd
wordt, zooals in de Fransche literatuur wordt beweerd (zie
inleiding).

Evenwel behoeft hiermede de verdienste van het mengen
van tetanusanatoxine met T.A.B. wat de werking betreft
van het anatoxine, nu nog niet ontkend te worden; (zie begin
van dit hoofdstuk).

Een overzicht van typhusimmuniteit c.q. agglutinatie
bij deze 3 dierproeven geeft betere resultaten met het enkel-
voudige typhusvaccin, zoodat het effect van het T.A.B. vaccin
verminderd wordt door het gelijktijdig inspuiten met anatoxine.

Zoodat tenslotte van het gecombineerde vaccin kan worden
gezegd, dat het ter verkrijging van antitoxische tetanus-
immuniteit niet duidelijk bij het enkelvoudige anatoxine
achterstaat, maar dat de immuniteitswaarde voor typhus
aanmerkelijk geringer is dan voor het typhusvaccin af-
zonderlijk.

Naast de combinatie van tetanusanatoxine met typhus-
vaccin werd het tetanusanatoxine gemengd met gelijke
hoeveelheden diphtherie-anatoxine.

I.nbsp;Een eerste groep kreeg onder de buikhuid tweemaal met
een interval van twee weken telkens i cc. tetanusanatoxine.

II.nbsp;Een tweede groep met hetzelfde interval tweemaal een
injectie van 2 cc. tetanus-diphtherie-anatoxine aa.

III.nbsp;Een derde groep kreeg tweemaal met twee weken
tusschenruimte telkens i cc. diphtherie-anatoxine.

Na elke injectie werd den volgenden dag de inentings-
plaats nagegaan en bleek bij de met enkelvoudig tetanus-
anatoxine ingespoten dieren practisch geen huidreactie aan-
wezig, terwijl de dieren, die met het gemengde vaccin be-
handeld waren vrij sterke infiltraties hadden, evenals de
caviae, die met diphtherie-anatoxine waren ingespoten. De
infiltraten gingen echter steeds vrij snel terug (zie tabel 13).

In de eerste plaats werd vergeleken de eerste met de tweede
groep met het oog op de aanwezigheid van tetanusantitoxine.

Het serum van de dieren, die alleen met tetanusanatoxine
waren ingespoten, was in een hoeveelheid van | cc. niet in
staat om 100 d.l.m. muis te neutraliseeren; f aan tetanus
na drie dagen, zonder zware tetanusverschijnselen den eersten
dag.

Het serum van de dieren, die met gemengd tetanus-diphthe-
rie-anatoxine waren ingespoten, kon eveneens geen 100
d.l.m. muis per | cc. neutraliseeren; echter den eersten dag
al sterk tetanus, den tweeden dag f.

Daar te hoog getitreerd was, kan men geen juiste gevolg-
trekking maken; echter mag men toch met eenige zekerheid
aannemen, lettend op het verloop bij de titraties op muizen,
dat het serum der caviae, die met het enkelvoudig tetanus-
anatoxine waren ingespoten meer tetanusantitoxine bevatte
dan dat der dieren, die het gemengde vaccin tetanus-diph-
therie-anatoxine gekregen hadden.

Om de groepen II en III te vergelijken op diphtherie-
immuniteit werd de intracutane methode op caviae gevolgd
zooals die door Römer is aangegeven. Aangezien ik evenwel
zooveel intracutane injecties op hetzelfde dier moest geven,
bleek het beschikbare huidoppervlak te klein en ging ik tot
het konijn over. Eerst diende bepaald te worden in welke
verdunning het gebruikelijke „Schickquot; toxine nog reactie
gaf in de konijnenhuid. Aldus werden van het toxine, zooals
bij den mensch voor de reactie van „Schickquot; wordt aangewend
de volgende zes verdunningen gemaakt: i : 25; i : 20;
i : 15; i : 10; 1:5; 1:1 en onverdund.

Hiervan werd nu 0.2 cc. intracutaan ingespoten in de ge-
schoren konijnenrug. Na 24 uur kwam er al een duidelijke
reactie bij verdunningen, die het meeste toxine bevatten.

In den loop van eenige dagen werden deze reacties veel
sterker; in de verdunningen i : 5, i : i en onverdund trad
zelfs uitgesproken nécrosé op. De verdunning i : 25 gaf
nog een duidelijke plaatselijke reactie (roodheid).

Nu werd het serum der groepen II en III verdund: i : 10
I : 25; I : 75; I : 250; i : 1000.

Het „Schickquot;toxine werd verdund dusdanig, dat er nog
een zeer duidelijke reactie te verwachten was op het konijn
n.1. I : 20. Daar het mengsel (serum en verdunde „Schickquot;-
toxine), dat ingespoten wordt 0.2 cc. moet zijn, waarvan
o.i cc. „Schickquot;-toxine-verdunning, moet dus nu het „Schick\',
toxine verdund worden i : 10.

Vervolgens werd nu i cc. van elke serum-verdunning van
iedere groep gemengd met i cc. i : 10 „Schickquot;-toxine
oplossing.

In de geschoren huid van den konijnenrug werden nu
rechts de vijf titratiemengsels der „diphtheriequot;-caviae, links
die der „tetanus-diphtherie-anatoxinequot;-caviae, telkens in
een hoeveelheid van 0.2 cc. intracutaan ingespoten.

Na een dag was er al een Hchte roodkleuring bij de sterkste
serumverdunning links (de z.g. „geassocieerdequot; plaats),
terwijl tevens de controle positief was. In den loop van de
volgende drie dagen breidden aan de zijde, waar de mengsels
met het serum van groep II waren ingespoten, de positieve
reacties zich uit tot en met het mengsel, dat het meeste
serum .bevatte. Aan de „diphtheriequot; kant (serum der dieren
van groep III) werden alleen reacties gezien bij de serum-
verdunningen I : 1000 en i : 250; de controle was sterk
rood.

In het verdere verloop helderden in eenige dagen de roode
verkleuringen weer op, de reactie der controle bleef nog langer
bestaan.

Men ziet dus, dat de verdunde „SGhickquot;-toxine oplossing
I : 10 in de hoeveelheid van o.i cc., die bekend is als duidelijk
reactie te geven in de konijnenhuid, voor het grootste gedeelte
door het serum der „diphtheriequot;-dieren n.1. tot i : 75 ge-
neutrahseerd was, terwijl bij de „gemengd ingespotenquot;-kant
zelfs de verdunning i : 10 niet in staat was de reactie er van
tegen te houden.

Daar natuurlijk een toevallige samenloop van omstandig-
heden bij deze uitslag niet was uit te sluiten, werd na 8 weken
wederom hartpunetie gedaan bij de nog lüet gepuncteerde
dieren en het serum van de groepen als hierboven aan een
herhaald onderzoek onderworpen.

De groep I, die met tweemaal i cc. tetanusanatoxine
ingespoten was, neutraliseerde nog geen 200 d.l.m. per i cc.
serum, evenmin de groep, die met tweemaal 2 cc. tetanus-
diphtherie-anatoxine ingespoten was: Groep II.

Voor beide groepen bleek tetanus f 2e dag, zoodat hier
geen verschillen in tetanusimmuniteit konden worden aan-
getoond. Het onderzoek op diphtherie-immuniteit werd weder-
om als boven beschreven verricht.

Den volgenden dag was de controlereactie zeer duidelijk
rood. In den loop van de volgende drie dagen werden de vier
sterkste serumverdunningen aan de „geassocieerdequot; kant
(de verdunning i : 10 bleef nog vrij) min of meer rood, echter
niet zoo sterk als de controles.

Aan de „diphtheriequot;kant was alleen de meest sterke serum-
verdunning: i : 1000 iets rood. In den loop van twee volgende
dagen verbleekten de reacties, de controles bleven nog iets
rood en warm. Deze laatste verdwenen na enkele dagen even-
eens.

le: dat de diphtherie-immuniteit zoowel voor de enkel-
voudig als gemengd ingespoten dieren gestegen was ten op-
zichte van den toestand van 20 dagen na de tweede injectie.

2e: dat nu een serumverdunning van i op 250 van de
„diphtheriequot;-dieren; daarentegen slechts in verdunning i : 10
van de met gemengd vaccin ingespoten caviae in staat was
de reactie op te heffen, die een bepaalde hoeveelheid diph-
therie-toxine moest geven, of: De gemengd ingespoten dieren
hadden een minder sterke diphtherieimmuniteit dan de dieren,
die met enkelvoudig diphtherie-anatoxine waren ingespoten.

Overziet men de uitkomsten van dit gemengd tetanus-
diphtherievaccin allereerst ten opzichte van de tetanus-
immuniteit, dan blijkt dat bij het eerste onderzoek het voor-
deel was aan de zijde van diè dieren, die met het enkelvoudige
tetanusanatoxine waren ingespoten; bij het tweede onder-
zoek daarentegen was geen verschil merkbaar.

Aangaande de diphtherie-immuniteit (antitoxische titer)
ohjkt in de beide onderzoekingen het voordeel geheel te liggen
aan de zijde van het inspuiten van het enkelvoudige diphtherie-
anatoxine. Waarom bij het mengen van tetanusanatoxine
met diphtherie-anatoxine proefondervindelijk de werking van
het tetanusanatoxine min of meer gelijk blijft, terwijl die
van het diphtherie-anatoxine vermindert, kan ik niet ver-
klaren.

Resumeerende de resultaten van de immunisatie met deze
beide gemengde vaccins (T.A.B.-tetanusanatoxine en
diphtherie-anatoxine-tetanusanatoxine) kan men besluiten:
le. dat in gemengde vaccins de werking van tetanus-
anatoxine min of meer onveranderd blijft, maar wel eenige
neiging vertoont in zijn werking te verminderen.

2e. dat de specifielce werking van het bijgevoegde tweede
vaccin, het T.A.B, respectievelijk diphtherie-anatoxine,
geringer is dan de toepassing van het afzonderlijke vaccin
a.A.B. respectievelijk diphtherie-anatoxine.
3e. dat het mengen van vaccins als regel niet is aangewezen.

Nadat bij een groot aantal caviae lo cc. van het anatoxine
No. 80 onderhuids was ingespoten en nooit een plaatselijke
reactie, noch tetanus, hetzij lokaal of algemeen, vroeg of
laat was opgetreden, werd na voorafgaand onderzoek op
steriliteit, overgegaan tot het inspuiten bij menschen.

Alvorens tetanusanatoxine in te spuiten werd bij elk
der proefpersonen een venepunctie gedaan. Het verkregen
serum bleek bij muizen ingespoten nooit eenige toxiciteit
te bezitten, tevens viel een onderzoek op tetanus-antitoxine
negatief uit, daar muizen ingespoten met een mengsel van
I cc. phys. zoutopl., waarin i d.l.m. muis en cc. van het te
onderzoeken serum, in denzelfden tijd aan tetanus te gronde
gingen als een contróledier, hetwelk in i cc. physiologische
zoutoplossing i d.l.m. muis was ingespoten.

Aangezien het niet mogelijk is door een eenvoudige huid-
reactie de antitoxische immuniteit bij tetanus te bepalen,
moest naar een andere methode van vergelijking worden om-
gezien. Het kwam mij het meest praktisch voor de verkregen
immuniteit der geënte personen te vergelijken- met de pas-
sieve immuniteit, die verkregen wordt door inspuiting van
de gebruikelijke prophylactische dosis tetanusserum.

Om deze grootte te kennen werd bij een persoon, die 24
uur te voren met 20 A.E. (tetanusantitoxine) was ingespoten,
venepunctie gedaan en het serum op antitoxinegehalte
onderzocht. Deze 20 A.E. neutraliseeren de hoeveelheid
toxine, die 20 X 40.000.000 gram muis dooden, zoodat,
wanneer we de hoeveelheid bloed op 5 1^. stellen en aannemen
dat alle antitoxine vrij in het bloed aanwezig is, i cc. bloed
een hoeveelheid antitoxine bevat, die 800.000.000 : 5000 gram
d.l.m. muis neutrahseert, dit is 160.000 gram d.l.m. muis of
16,000 d.l.m. muis van 10 gram. Mijne uitkomsten op muizen
leerden echter, dat na een tetanusseruminjectie van 20 A.E.,

Wanneer het mij nu mogelijk was met het anatoxine een
dusdanige immuniteit te verkrijgen, dat ^ cc. serum van den
gevaccineerde 250 d.l.m. muis (gedroogd toxine) neutrali-
seerde, meende ik te mogen aannemen, dat er dan een vol-
doende weerstand tegen de tetanusinfectie bestond.

Immers deze te meten antitoxische titer is slechts een onder-
deel, zelfs een klein onderdeel van den weerstand van het
actief geïmmuniseerde lichaam, omdat hier de cellulaire
immuniteit nog naast de humorale staat en gene als oorzaak
yan de laatste een belangrijke functie in afweer van infecties
m casu tetanus moet toegezegd worden. Deze ,,réactivité
acquisequot; is helaas niet te meten, maar in zijn sluimerende
kracht zeer zeker te waardeeren, daar we uit serumtitraties
na een z.g. „injection de rappelquot; kunnen nagaan, hoe er uit een
zeer lage antitoxische titer in het bloed in zeer korten tijd
een zeer hooge humorale immuniteit kan ontstaan. Uit
dierproeven kon ik bevestigen, dat deze reactie op een her-
meuwde inspuiting des te krachtiger is, naarmate het tijds-
verloop tusschen de iste injectie (gevoelig makende) en de
2de inspuiting grooter is. (zie hoofdstuk I). Met het oog
op den incubatietijd van tetanus is het dan ook niet gewaagd
te zeggen, dat de humorale immuniteit door de vaccinatie
opgewekt zeer veel lager kan zijn dan die na de prophylac-
tische serum injectie en des te lager, naarmate de vaccinatie
langer in het verleden ligt, omdat men immers de tetanus
mfectie als specifieke prikkel een werking toe mag schrijven
als een „injection de rappelquot;. Hoe hoog deze humorale
immuniteit minstens moet zijn is natuurlijk niet te zeggen,
eendeels onmiddellijk al hierom niet, omdat we dan zouden
moeten experimenteeren op menschen met de zoo verrade-
Ijjke tetanusziektekiemen, anderdeels omdat er zulke persoon-
lijke verschillen zijn in gevoeligheid, die de mogelijkheid
tot anti toxine vorming beheersclien. \'

Proefpersoon T. kreeg als eerste injectie i cc. anatoxine;
5 weken later wordt venepunctie gedaan. Het serum wordt
getitreerd op de aanwezigheid van antitoxine. Br bleek in

zooverre antitoxine in het bloed aanwezig, dat ^ cc. serum
gemengd met i d.l.m. ingespoten bij een muis deze langer dan
6 dagen in leven liet. Daarna kreeg T. als 2e injectie i cc.
anatoxine. Twee weken hierna werd alvorens de 3e injectie
te geven, nogmaals venepunctie gedaan. Terwijl het contróle-
dier in 4 dagen aan tetanus stierf, kon een | cc. serum een
muis tegen 2 a 4 d.l.m. beschermen. Twee weken na de 3e
injectie bleek het serum 1000 d.l.m. muis per ^ cc., te
kunnen neutraliseeren, d.w.z. de actieve humorale immuniteit
was dus ruim 4 x grooter dan die na de seruminjectie van
20 A.E. Dit was dus 9 weken na de le injectie het geval.

Proefpersoon B. werden met een interval van i maand
2 injecties van i cc. anatoxine gegeven. Het serum bevatte
na de le injectie geen aantoonbare hoeveelheid antitoxine.
Twee weken na de 2e injectie kon door | cc. serum 3 a 5
d.l.m. muis geneutraliseerd worden. Eén week na de 3e
inspuiting (7^ week na de le injectie) neutraliseerde het serum
meer dan 250 d.l.m. per cc. Er werd helaas niet hooger ge-
titreerd, zoodat niet te zeggen is hoeveel grooter het anti-
toxinegehalte in werkelijkheid was.

Proefpersonen P. en L. kregen ieder met i maand interval
I cc. anatoxine. Eén maand na de le injectie bleek ^ cc.
serum van L. nog niet één d.l.m. muis te neutraliseeren: Het
dier kreeg zware tetanus, ging echter niet dood. Van P. is de
waarde na de le inspuiting niet bekend. Een week na de 2e
injectie werd een vene-punctie verricht en hierna de 3e
injectie van i cc. anatoxine gegeven. Terwijl na de 2e injectie
het serum van P. niet in staat was per | cc. i a 2 d.l.m. te
neutraliseeren, neutraliseerde dat van L. 2—5 d.l.m.

Een week na de 3e injectie (dus 6|- week na de le injectie)
waren de resultaten van P. zoodanig, dat het serum per cc.
nog geen 250 d.l.m. neutraliseerde (muis tetanus f tweede
dag), terwijlL. instaat was nagenoeg 1000 d.l.m. muis per cc.
serum te neutraliseeren (titratie muis kreeg matige tetanus).

Merkwaardig was, dat terwijl de gevaccineerden T., B. en P.
geen reactie hadden vertoond, bij L. daarentegen na de ana-
toxine-injectie een lichte roodheid was waar te nemen.
In het geheele verloop van de immunisatie blijkt L. beter
onvatbaar te worden; vooral na de 3e injectie blijkt er tus-
schen P. en L. een duidelijk verschil te bestaan.

^roejpersonen W., Th. en S werden eveneens gelijktijdig
gevaccineerd. De eerste 2 injecties met een interval van 3
Weken, de derde één week na de tweede.

De venepnnctie had plaats bij W. en Th. 12 dagen na de
3e injectie (dus a 6 weken na de le injectie). Er kwamen
groote verschillen voor den dag.

kon per 1 serum meer dan 2000 d.l.m. muis neutrali-
seeren. Hooger was door mij niet getitreerd.

T\'/i.konper \\ cc. serum nog geen 250 d.l.m. neutraliseeren,
lager was niet getitreerd.

•S*., die drie weken later, dus 33 dagen na de 3e injectie
gepuncteerd werd, was in staat nog geen 250 d.l.m. per | cc.
serum te neutraliseeren (f muis na 6e dag).

Ie. dat het met anatoxine No. 80 mogelijk is bij menschen
m het serum tetanusantitoxine te voorschijn te roepen.

2e. dat met de gebruikte injecties van i cc. dit eerst
na de 3e in ruime mate optreedt.

3e. dat er groote persoonlijke verschillen bestaan, die
de uitkomsten beheerschen.

^ 4e. dat met deze hoeveelheden anatoxine in het algemeen
niet eerder dan na 6 weken een voldoend antitoxinegehalte
Van het bloed aanwezig is.

BETEEKENIS VAN DE UITVI.OKKING VAN
RAMON AI,S WAARDEBEPALING VOOR HET
TOXINE RESP. ANATOXINE EN ANTITOXINE.

Dit hoofdstuk heeft geenszins de pretentie het verschijnsel
van de uitvlokking in wezen te verklaren. Zooals bekend
is, wijst Ramon en met hem vele andere Fransche onder-
zoekers nog steeds op het feit, dat men in de uitvlokkings-
reactie, zoowel bij titratie van tetanus- als bij de titratie van
diphtherietoxine, -anatoxine en -antitoxine een buiten-
gewoon eenvoudig middel bezit om in vitro eenerzijds de
antigeenwaarde (antitoxineverwekkende en -bindende) van
toxine of anatoxine en anderzijds de neutraliseerende (toxine-
bindende) waarde van het serum te bepalen.

Het feit, dat vele sera neerslagen geven als men ze mengt
met hun overeenkomstige toxinen, is reeds lang bekend.
In 1909 deden Cai,me™ en Massol hierover al mede-
deelingen ten opzichte van het titreeren van het cobra-
antitoxine. In 1919 en 1920 pubHceerden Nicolle, CésARi
en JouAN^i- 32 hun titraties van diphtherie- en tetanustoxine,
waarbij ze het toxine of het serum, dat ze wilden titreeren,\'
mengden met 10% gelatine en hierop het homologe serum of
toxine in opklimmende hoeveelheid goten. Ze zouden goede
overeenkomst gekregen hebben tusschen de waarden in
vitro en vivo, en schrijven hun succes toe aan het met ammo-
niumsulfaat geconcentreerde toxine, dat ze gebruikten.

Ramon bracht dus eigenlijk in principe niets nieuws,
toen hij er op wees, dat wanneer men bij elkaar voegt toxine
en specifiek antitoxine er na bewaren bij kamertemperatuur
een z.g. uitvlokking kan optreden. De groote verdienste van
Ramon ligt echter in zijn uitspraak, dat deze uitvlokking
het allereerst optreedt daar (floculation initiale), waar toxine
en specifiek antitoxine in elkaar neutraliseerende hoeveel-
heden bij elkaar zijn gebracht. Voor versche toxinen geldt, dat
wanneer men ze titreert met hetzelfde serum en bij dezelfde

temperatuur, de uitvlokkingstijd recht evenredig toeneemt
met de grootte van de d.l.m. Van het anatoxine kon Ramon ^^
mededeelen: „lyC pouvoir antigène est d\'autant plus consi-
dérable que le temps de floculation est plus réduitquot;. Zoo
fag dan ook Descombey het formoltoxine bij langer verblijf
in de broedstoof zijn antigeenvermogen inboeten, terwijl de
uitvlokkingstijd langer werd. Samen met Ramon ^^ zegt
I^Escombey, dat vooral bij tetanustoxinetitratie deze uit-
vlokking van zoo groote waarde moet zijn, omdat bij dit
toxine het giftigheidsvermogen zoo labiel is en dus daarom
niet goed is te titreeren in vivo. Noodig is in de eerste plaats
een „sérum convenablement choisiquot;, z.g. goed uitvlokkend
serum. Verder zagen zij de initiale uitvlokking ook steeds
m het neutrale mengsel optreden.

Al spoedig echter gaf Schoi^z ^^ een zeer scherpe critiek
hierop. Hij meent, dat er voor de titratie in vitro voor één
gifteenheid tweemaal zooveel antitoxine (Ramon) noodig is
als in vivo, omdat die ééne gebonden antitoxine-eenheid
identiek is met de antitoxische energie van loo caviae. Of
evenwel een dergelijke voorstelling van den gang van zaken bij
de neutralisatie van toxine en antitoxine recht van bestaan
heeft, mag, in aanmerking genomen de moderne beschou-
wingen van het wezen dezer reactie, ten zeerste betwijfeld
Worden (Bordet c.s.). Met de methode in vitro, zegt Scholz,
zijn de verschillen 3 a 400 maal grooter dan bij titratie in
vivo, zoodat hij dan ook meent, dat deze methode voor
practisch gebruik niet in aanmerking kan komen. Dit alles
geldt voor het tetanustoxine resp. antitoxine.

Maar ook Abt en Erber ^^ kwamen bij hunne onderzoe-
kingen over het titreeren van tetanustoxine—antitoxine tot
de uitspraak, dat tetanustoxine resp. antitoxine bij hunne
nitvlokkingen lang niet die regelmatige uitkomsten gaven
als bij diphtherieuitvlokking. De tetanustoxinen, die ze
gebruikten, waren ongeveer van dezelfde sterkte en vlokten
met hun serum vrijwel op dezelfde hoogte in de serie uit na
2 a 3 uur in een waterbad bij 45 graden C. gestaan te hebben.
Bij hoogere temperatuur zouden de uitkomsten onregel-
matiger worden. Met hun sera kregen deze onderzoekers veel
minder juiste waarden. De snelheid van uitvlokking was zeer
verschillend en daarom zou volgens hen in de tetanus- meer
dan in de diphtheriesera een colloïdebeschermer voorkomen.

Zij komen tenslotte tot het resultaat, dat ± 60 % van de sera
overeenkomst geeft tusschen vivo en vitrotitraties en schrijven
bij de verschillen der rest nog een grooten invloed toe aan de
individueele gevoeligheid der proefdieren, zoodat bij toename
van dit aantal de overeenkomst tusschen vivo- en vitro-
proeven nog meer aan den dag zal treden. Deze laatste op-
merking maakt echter den indruk van het verlangen de uit-
komsten in vitro sluitend te maken met die in vivo. Abt en
Erber willen tenslotte de uitvlokking stellen boven de
methode in vivo uit het oogpunt van tijd en geld.

Naar aanleiding van zijn proeven over de uitvlokking kon
schmidt 37 mededeelen, dat de titraties van een groot aantal
tetanussera met bijna zekerheid kan plaats hebben in vitro
(overeenkomst met Abt en Erber). Daar hij echter met
Fransch serum, alleen met Fransch toxine meer regelmatige
uitvlokkingen kreeg in de buurt van het neutrale punt, schijnt
volkomen homologe herkomst een rol te spelen en kan dus de
uitvlokking alleen niet gebruikt worden als waardebepaling
en dient dus iedere uitvlokking telkens gecontroleerd te
worden door titratie op dieren. Bij zijn experimenten zag
hij soms een in meerdere buizen tegelijkertijd optredende
gelijkwaardige uitvlokking; soms niet een uitvlokking op het
neutrale punt, zoodat hij controle aanraadt door het uit-
vlokkende mengsel bij dieren in te spuiten.

Al deze onregelmatigheden bij de uitvlokking van tetanus-
(ana) toxine-antitoxine werden door Kaxic ^s samenge-
bracht onder den naam „floculations non spécifiquesquot;.
Hij drukt zich buitengewoon voorzichtig uit door te zeggen,
dat als men de z.g. „floculation faussequot; zou kunnen onder-
scheiden van de ware uitvlokking, deze methode mogelijk in
aanmerking zou kunnen komen om de proeven in vivo in
vitro te contrôleeren. De eigenschappen van de valsche
uitvlokking zijn volgens hem: het snel optreden, troebel zijn
en blijven en hoog liggen in de serie der uit te vlokken buizen.
De ware uitvlokking ligt lager in de serie, verschijnt later
en vertoont behalve de volgende kenmerken, namelijk
i. troebel worden, vlokken en ophelderen of 2. helder blijven
gedurende het geheele uitvlokkingsproces onafhankelijk van
den tijd van verblijf in het waterbad, ook soms nog de ken-
merken van de valsche uitvlokking. Kawc zag verder in de
serie soms drie zones van uitvlokking, soms geen uitvlokking

in de buis, die overeenkomen moest met de titratie in vivo.
Hij komt dan ook tot het lage cijfer van 39 % overeenkomst.

In een zeer uitgebreid artikel over toxoïden zegt BÄCHER
dat de uitvlokking een speciale eigenschap moet zijn van vele
toxinen, hetzij ten gevolge van de eigenaardigheid van de
gebruikte stam, hetzij als gevolg van bepaalde inwerkingen
oij de toxinevorming.

Hiervoor zou ook het zoo buitengewoon goed vlokken der
^n of meer avirulente toxinen, die Ramon, Berthëlot,
Grasset en Amoureux in bouillon met galtoevoeging
konden verkrijgen, pleiten. Laatste onderzoekers beweren wel,
dat ze immuniseeren, maar een juiste antigeenwaarde is niet
bewezen. Bächer zegt dan ook terecht en scherp verder,
dat een behouden vlokkingsvermogen er op wijst: „dasz jene
Schädlichkeiten nicht oder nur wenig eingewirkt haben, die im
Stande sind in gleicher Weise das antigene Vermögen und
die Flockungsfähigkeit zu beeinträchtigenquot;.

Ook lyöwENSTEiN die bij zijn eerste onderzoekingen met
Versehe sera in beginsel de bevindingen van Ramon kon
bevestigen, laat zich naderhand minder optimistisch uit.
Zoowel bij de uitvlokking van de sera als van de anatoxinen
kreeg hij eclatante verschillen met hare waarden in vivo,
Zoodat hij meent dat de eigenschappen van het antigeen
jiüster te bepalen zijn met de „Bindungswertquot; zooals deze
bij diphtherie werd vastgesteld volgens Bächer, Kraus en
IvöWENSTEiN Hetzelfde konden Isabownski en gito-
Witsch mededeelen. Ze konden goed vlokkende anatoxinen
krijgen met slecht antigeenvermogen.

Deze bindingswaarde wordt berekend door bij 2 A.E.
(Ehri^ich) een bepaalde hoeveelheid (ana)toxine (waarvan
de bindingswaarde te bepalen is) te voegen, dusdanig, dat
nien na dit mengsel 3/4 uur bij kamertemperatuur te hebben
laten staan hieraan een L, -f dosis voor een cavia (bekend
toxine) toevoegt en wederom na een verblijf van 3/4 uur bij
kamertemperatuur dit geheele mengsel bij een cavia inspuit.
Sterft het dier in 3 ä 4 dagen aan tetanus, dan is juist die
hoeveelheid (ana)toxine toegevoegd, die in staat is i A.E. te
neutraliseeren. Hoe meer (ana)toxine men in den beginne
nioet toevoegen om deze A.E. te binden, d.w.z. hoe grooter
de „Bindungswertquot; van dit (ana)toxine is, des te geringer
bindend- c.q. antigeenvermogen.

Terwijl Ramon, Abt en Erber en met hen vele anderen
in de uitvlokking zien een zichtbaar worden van de specifieke
binding tusschen toxine en antitoxine, zijn anderen van
meening, dat beide processen naast elkaar verloopen. Bron-
FEnbrenner en Reichert ^^ konden bij hun proeven over
botulismus aantoonen, dat door zuurtoevoeging uit een
toxisch filtraat het praecipitinogeen was neer te slaan. De
bovenstaande vloeistof had iets aan toxiciteit verloren. Het
neerslag was na neutralisatie en oplossing in staat met het
specifieke serum uitvlokkingen te geven. De groote overeen-
komst tusschen de titraties in vivo en vitro die zij bij diph-
therie erkennen, berust volgens hen op de gelijkheid van de
voedingsbodem en de eenheid van de bacil. (Park en
WiiVeiams No. 8).

Ook Darzine ^^ meent, dat, wanneer het tetanustoxine
zich steeds aan één of meer goed bepaaldfe fracties bond,
de uitvlokking evengoede resultaten zou geven als bij diph-
therie, Hij deelt verder de sera in naar de uitvlokkingstijd.
Hoe sneUer een serum uitvlokt, des te minder overeenkomst
tusschen de waarden in vivo en vitro.

Hij vlokte verschillend oude ongefiltreerde tetanuscultures
uit en zag dat het floculaat, dat hij met de jonge cultures
verkreeg, hoofdzakelijk uit bacteriehchamen bestond en
langzamerhand met de ouderdom van de cultuur toenam in
homogeniteit. Bij het centrifugeeren van ongefiltreerde
cultures zag hij de uitvlokkingstijdtoene men met den duur
van het verblijf in de centrifuge. Hij meent uit dit alles te
mogen besluiten, dat de bacteriën en sporen een rol spelen bij
de uitvlokking,tevens „précipitationquot;,,,agglutinationquot;en,,flo-
culationquot;onder te mogenbrengenonderéénnaam,,floculationquot;.

Echter is de uitvlokking die Darzine verkreeg beter
te rangschikken onder de „niet-specifiekequot; uitvlokkingen, zoo-
als er toch door vele stoffen tot stand gebracht kan worden.

Darzine krijgt bij zijn titratieproeven 47% overeenkomst.
De uitvlokking zelf is volgens hem een „processus ininter-
rompuquot;. Het eind ervan is niet scherp aan te geven; centri-
fugeert men en zet men de bovenstaande vloeistof weer
met versch serum in het waterbad, dan krijgt men opnieuw
een uitvlokking.

beschouwt tegenover de Duitsche, dan komt men tot de
gevolgtrekking, dat vooral ten opzichte van het tetanustoxine
respectievelijk-anatoxine, de laatste de nadruk legt op de
gt;.Bindungswertquot; (zie vroeger) als waardebepaling, terwijl de
eerste slechts aan de uitvlokldng vasthoudt en van de B.W.
zelfs geen melding maakt.

Met het oog op deze sterke verdeeldheid in waardeering
van het phenomeen van de uitvlokking bij tetanus in de
eerste plaats, verder in aanmerking nemende de aan bijna
zekerheid grenzende regelmaat, die steeds door anderen en
mij ook bij diphtherietitraties in vitro gezien werd, werd
door mij een poging gewaagd te trachten aanknoopings-
punten te vinden, om deze uitvlokking als waardebepaling
hij mijn toxinen en naderhand anatoxinen aan te nemen en
aan te bevelen.

Allereerst werd getracht met een gegeven toxine en een
gegeven serum een uitvlokking te verkrijgen. Als toxine
Werd gebruikt een gedurende bijna twee jaar onder toluol
bewaard tetanusgif, dat oorspronkelijk een d.l.m. muis
I : 100.000 had. Het serum stamde van een aderlating bij
een hoog geimmuniseerd paard, die voor eenige dagen had
plaats gevonden, was zonder conserveermiddel en had een
Waarde van ± 5 A.B. (Ehri^ich) = 330 Amerikaansch.

De methode, die gevolgd werd, was die, zooals indertijd
aangegeven door Abt en Erber (zie begin van dit hoofdstuk).
I^aar de laatsten werkten met een gedroogd serum, dat ze
zoodanig oplosten dat i cc. 200 Amerikaansche eenheden
bevatte, werd het mij ter beschikking staande serum op deze
Waarde verdund; aldus in een verhouding dat 2 cc. serum
Werden aangevuld met 1.3 cc. physiologische zoutoplossing.
In elk buisje van een serie van twaalf werd nu 4 cc. van het
toxine afgepipetteerd, waarna er in de eerste o.io cc. verdund
serum als boven, in de tweede 0.02 cc. serumverdunning
meer, etc. In elke buis opvolgend in de serie kwam dus steeds
een hoeveelheid verdund serum meer ter waarde van
Vioo X 200 A.E. == 4 A.E. (Amerikaansche eenheden).
De inhoud werd gemengd en het geheel gezet in een waterbad
Van 450—50®. Gedurende de twee uur, die volgden, werd

er een zeer Hellte opalescentie waargenomen, daarna trad
er in de btiis, die 0,24 cc. serum bevatte, een zeer fijne vlokken-
regen op, die steeds grover werd. De antitoxine bindende
waarde (antigeenwaarde) kon hieruit berekend worden als
volgt ^^ X 373 X 330 = 12 A.K. (Amerikaansch). In hoeverre
er in de optimum buis een neutraal mengsel aanwezig was,
werd niet nagegaan.

Door deze proef werd men dus ongeveer ingelicht welke
verhouding men moest kiezen bij de titreering van andere
toxinen tegenover ditzelfde serum.

De waarde van bovengenoemd toxine gevonden, werd
omgerekend in Internationale eenheden. ~ X 12 — 22.7.
Gezorgd werd nu, dat deze waarde ongeveer in het midden
van de reeks buizen kwam te liggen. Kr werd nu uitgegaan
van 3 cc. toxine in elke buis. Het serum werd verdund
1: 6.25, bevatte dus nu 100 A.K. (Internationaal) per i cc.
In de minimum buis kwam zooveel verdund serum dat dit
per cc. toxine 20 A.K. vertegenwoordigde. Klke volgende
buis bevatte per cc. toxine i A.K. meer.

Het toxine 102 B. werd aldus ingezet en vlokte na twee
uur ongeveer als toxine 102A.: fijne vlokkenregen. De A.W.
hieruit berekend bedroeg 25. Toxine 103 als boven ingezet
gaf een uitvlokkingstijd: K.f. gt; 3 lt; 3i uur en een A.W. 24.

Toxine 104 gaf in alle buizen troebeling. In buis 3 trad na
5 uur een zeer fijne uitvlokking op (geen fijne vlokkenregen).
In de naburige buizen eveneens. Tenslotte kan men deze
uitvlokking(?) door de geheele serie waarnemen. Nergens ziet
men een volledig worden, in alle buizen blijft het floculaat
zweven.

Ook met hoogere en lagere serumdosen was geen duidelijk
resultaat te bereiken, ook niet met het eerst te laten staan
bij 0° en daarna in het waterbad, bij i 50° C. te plaatsen.

Toxine 107 gedroeg zich het meest eigenaardig. In de eerste
plaats was de uitvlokkingstijd (K.f.) ongeveer 12 uur, dus
zeer lang, de buizen werden al spoedig zeer onregelmatig
troebel; er ontstonden op een gegeven oogenblik vlokken,
die groot en donzig werden, geen fijne vlokkenregen. Bij her-
haling bleek de uitvlokking met hetzelfde serum in dezelfde
concentraties en zelfde hoeveelheiden een langere tijd noodig

^ hebben. De buizen waren weer zeer onregelmatig troebel.
^^ buis, die bet eerst uitvlokte¹), bleef ook bij herhaalde
proeven vrijwel dezelfde plaats behouden in de serie. Daar de
roebelheid toegeschreven werd aan bacterieele verontreini-
gingen, werd, waarop steeds door Schoi^z in 1924 is gewezen,
aan de toxinen 0.5 carbol toegevoegd en bij de uitvlokking,
die nu verkregen werd, waren de buizen veel minder troebel.

Om uit te maken of de eerste uitvlokking optrad in de buis
daarin toxine en antitoxine in neutrale verbinding aanwezig
Waren, werd deze buis, benevens een buis waar minder en
^n buis waar meer serum in aanwezig was, gecentrifugeerd.
■De bovenstaande vloeistof werd nu bij elk van deze mengsels
aigegoten. Bij witte muizen werden nu mengsels ingespoten
Van I cc., telkens bestaande uit | cc. van de inhoud van één
der drie bovengenoemde buizen en | cc. physiologische
zoutoplossing, waarin 20 d.l.m. muis (toxine-oplossing) was
opgelost. Deze muizen bleven volkomen gezond, terwijl
het contróledier met 20 d.l.m. den volgenden dag aan uitge-
sproken tetanus stierf, zoodat zelfs een buis met minder serum
dan de eerst vlokkende, nog een groote hoeveelheid vrij anti-
toxine bleek te bevatten. Dit is des te merkwaardiger, omdat
^CHMiDT kon aantoonen, dat het neutrale mengsel in het
Waterbad aan giftigheid toeneemt; wel is waar weinig, maar
Volgens hem aantoonbaar, m.a.w. had één der bovengenoemde
en onderzochte buizen het neutrale mengsel bevat, dan moest
zeker met 20 d.l.m. muis een dusdanige toxiciteit van het
ingespoten mengsel zijn ontstaan, dat de hiermede ingespoten
niuis aan tetanus moest gestorven zijn.

Bij deze inleidende proeven was dus bewezen, dat het
niogelijk was een uitvlokking te verkrijgen; dat enkele
toxinen in korten tijd regelmatig vlokten; dat andere onregel-
matige uitvlokkingen gaven (No. 107), zoowel wat betreft
het verloop der uitvlokking: geen _ fijne vlokkenregen,
troebelheid der buizen in het begin; als aan het eind: geen
neerslag.

1nbsp; Ik spreek hier en in het vervolg steeds van eerste uitvlokking en niet
^an „initialequot; omdat dit laatste een goed omschreven begrip dient te zijn, in
uer tijd door Ramon bij zijne titraties in vit-o bij diphtherie ingevoerd: eerst
vlokkende buis met neutraal mengsel.

Al deze onregelmatigheden in mijne uitvlokkingsproeven
wezen er op, dat er nog onbekende factoren zijn, die de
regelmaat hierin verstoren. Door de welwillendheid van Dr.
Tasman werd mijne aandacht gevestigd op de niet volkomen
reinheid, waarin het glaswerk verkeerde, dat ik gebruikte.
Daar zoo goed als niets bekend was van het colloïd-chemisch
.gebeuren bij het uitvlokkingsproces, kon men aan elke
verontreiniging een rol toeschrijven en diende deze dus te
^worden uitgeschakeld.

De beteekenis van het chemisch zuiver glaswerk werd nu
■aan uitvoerige uitvlokkingsproeven getoetst (Proef I, II, en
III). Eendeels werden buizen gereinigd met borstels en
daarna in gewoon leidingwater uitgespoeld: z.g. vuilequot;
buizen; anderdeels werden buizen gedurende een nacht in
een chroomzuuroplossing gezet, die bereid was door samen-
voeging van gelijke deelen io% Kalium bichromaat en ge-
concentreerd zwavelzuur. Hierna werden ze gedurende 2 uur
uitgestoomd en gedroogd: z.g. „schoonequot; buizen.

Het serum, een oud serum (± 4 A.E. volgens Ehrlich),
werd verdund 1:5. Het toxine was No. 118. Nu werd 5 maal
een gelijke serie ingezet van 11 buizen met „vuilequot; en 5 maal
een gelijke serie met „schoonequot; buizen. In iedere buis werd

3nbsp;cc. toxine met \\ % carbol afgepipetteerd. Het verdunde serum
werd in een dusdanige hoeveelheid toegevoegd, dat de eerst
vlokkende buis in het midden kwam te hggen (uit een vóór-
proef bekend). Het geheel kwam in een groot waterbad bij
49 a 50®-

le serie: na ± 12 uur een troebelheid optreden, die zich
onregelmatig over de serie uitbreidt en sterker wordt. I^ang-
zamerhand ontstaan de vlokken. Na ± 19 uur is er in buis

4nbsp;de sterkste troebehng met de grootste vlokken; van een
fijne vlokkenregen is geen sprake. Men kan niet zeggen
dat in één der buizen eerder een uitvlokking optreedt dan in
de andere,

2e serie. Ongeveer als boven, troebelheid sterk. In geen
enkele buis treedt er vlokking op.

3e serie. De troebelheid is hierin minder uitgesproken.
Na ig uur zijn regelmatige fijne nitvlokkingen in de buizen
3, 4, 5, en 6. Geen der genoemde vlokt eerder dan de ander.

4e serie. Ook hier treedt door de geheele serie langzamerhand
een troebeling op; ten slotte zijn alle buizen, de eerste uitge-
zonderd, zeer sterk troebel. Na 19 uur vlokt zeer sterk buis i :
de inhoud is helder. Verder is er een minder sterke uitvlokking
m buis 6. Geen eerste uitvlokking.

5e serie. lyangzamerhand wordt de reeks in zijn geheel
sterk troebel. Na 19 uur uitvlokking in buis 3.

Ie serie. Na 13 uur wordt het maximale gedeelte van de
serie iets troebel en breidt zich naar minimum uit. Na 14
^ur 50 min. vlokt heel duidelijk buis 6 met fijne vlokkenregen,
Waarin de vlokken steeds grooter worden. Tenslotte is na

uur de geheele serie buizen helder van inhoud, alleen buis
quot; is krachtig uitgevlokt met groote vlokken.

2e serie. Na i 13 uur is hier troebelheid, vooral sterk aan
het einde van de reeks. Na ± 14 uur 30 min. begint er een
uitvlokking in buis 6. Toestand na 19 uur is dan: in buis i
en 2 zijn groote vlokken, krachtige uitvlokking, inhoud
Van de buis is helder. Buis 6 vlokt eveneens: inhoud iets
troebeler.

3e. serie. In den loop van 13 uur wordt ook hier de inhoud
der buizen aan het einde van de serie meer troebel. Na i
15 nur vlokt in vrij troebel milieu buis 6. Deze uitvlokking
breidt zich naar rechts zoowel als naar links uit, zoodat ten-
slotte de toestand na 19 uur is: eerste drie buizen helder,
de rest troebel, sterkste uitvlokking in buis 6.

4e serie. Na 13 uur is er een dubieuze uitvlokking in buis 5
in licht troebele omgeving. Een uur later is de uitvlokking
duidelijk en breidt zich over de naaste omgeving uit. Eerste
uitvlokking aldus in 5.

5e serie. Na zeer dubieuze uitvlokkingen in min of meer
troebele omgeving komt er na 15 uur een uitgesproken uit-
vlokking in buis 6, terwijl de inhoud in het verloop tot
19 uur na de inzetting der proef opheldert. De uitvlokking
breidt zich in de naburige buizen alleen naar links uit („mini-
malequot; buizen).

Overziet men deze feiten, dan dient allereerst opgemerkt
te worden, dat het serum zeer oud was, zonder conserveer-
middel was bewaard geworden en dat carbol is toegevoegd
aan het toxine hetgeen zooals later zal blijken van groote
invloed is op de gang der uitvlokking. Daar deze omstandig-
heden voor „schoonequot; zoowel als voor „vuilequot; buizen gelijk
bleven, mogen de resultaten van dit onderzoek vergeleken
en de afwijkingen tusschen de „schoonequot; en de ,,vuilequot; series
toegeschreven worden aan de meerdere of mindere zuiverheid
van het glaswerk.

Hierin werden van de vijf series in drie zeer krachtige
uitvlokkingen waargenomen n.1. in de le, de 2e, en de 5e serie.
De eerste uitvlokkingen waren in de respectievelijke series
te zien in buis 6; buis 6 (i en 2); buis 6; buis 6.

Hierin werd slechts in serie 4 een krachtige uitvlokking
waargenomen. Eerste uitvlokkingen voor de vijf series in de
buizen 4?; geen eerste uitvlokking; 3.4.5.; i; 3. De eerste
uitvlokking is daarom zoo moeilijk af te lezen omdat de
inhoud der buizen zoo sterk troebel wordt.

Voor de „schoonequot; buizen krijgt men dus meer regelmaat
in de uitvlokkingen, de uitvlokkingstijd is vrij constant en
kleiner, de inhoud blijft helderder, de waarden liggen hooger.

1.nbsp;De uitvlokking trad in het algemeen sneller op. De resul-
taten waren hier voor de „schoonequot; buizen veel regelmatiger
dan voor de „vuilequot;. In de eerste traden krachtige uitvlokkin-
gen op, terwijl de buizen daarbij helder bleven. De eerste uit-
vlokking ligt bij de „schoonequot; serie regelmatig in buis i en 2
van de serie en komt na ^ 16 uur. Bij de „vuilequot; is er soms
na 30 uur nog geen uitvlokking te constateeren. Eerste

uitvlokkingen bij de „vuilequot; series soms hier en daar in heldere
of troebele omgeving, min of meer sterk vlokkend.

Hier werd geëxperimenteerd met een ander serum. Dit was
vrij versch, van een ander paard afkomstig. Toxine met
0.5% carbol als boven.

Terwijl bij de „schoonequot; buizen al snel, na 3 a 4 uur een
eerste uitvlokking in de opvolgende series optreedt aldus: in
serie i, buis 4 en 5; in serie 2 buis 4 en 5; in serie 3 buis 4; in
serie 4 buis 5 en 6; in serie 6 buis 4 en 5, blijft de inhoud helder.

In de „vuilequot; series treden deze uitvlokkingen veel onregel-
piatiger en later op n.1. in serie i geen eerste uitvlokking;
111 serie 2 geen duidelijke eerste uitvlokking; in serie 3 buis 6;
serie 4 buis i, 3 en 5; in serie 5 buis 2.

le. In goed gereinigde buizen is het proces van de uitvlok-
king meer te overzien en vindt men meer regelmaat in deze

2e. De uitvlokkingstijd, de K.f., is van groot belang met
het oog op de factoren die de regelmaat in de uitvlokkingen
verstoren.

3e. De uitvlokkingstijd wordt grooter in minder goed ge-
reinigd glaswerk, terwijl de troebelheid der mengsels toeneemt.

4e. De duur van den uitvlokkingstijd is afhankelijk van
de aard van het serum (zie de uitkomsten van de proeven
II en III met verschillende sera) en van deszelfs ouderdom.

5e. Hoe kleiner de K.f., des te minder kans op onregel-
matigheden bij het minder goed gereinigde glaswerk. Bij uit-
vlokkingsproeven van diphtherietoxine-antitoxine ziet men
dan ook geen verschil tusschen de uitvlokkingen in „schoonequot;
en „vuilequot; buizen, in overeenstemming met het sneller
nitvlokken dezer mengsels.

6e. Tenslotte is met het oog op de langere uitvlokkings-
tijden het gebruik van niet goed gereinigd glaswerk te ont-
raden bij titraties van tetanustoxine-antitoxine.

Eindelijk werd nog nagegaan in hoeverre er een reproduceer-
bare regelmaat was in een serie ten opzichte van het eerst
vlokkende mengsel in goed gereinigd glaswerk. Als toxine
werd genomen toxine No. 120, met een 0.5% carbol; het serum
(± 5 A.E.) bevatte i^o superol. Nadat door een voorproef
uitgemaakt was, waar in de serie het eerst uitvlokkend
mengsel lag, werden 10 series elk van 11 buizen in een water-
bad gezet van ± 49 a 50quot;. Ongeveer verscheen er gelijktijdig
in dezelfde buis van iedere serie een zeer fijne uitvlokking,
die in de loop van meerdere minuten toenam en zich over de
naburige buizen uitbreidde.

Uitgaande van deze feiten werd nu een aantal toxinen,
in volgorde als hieronder aangegeven, aan uitvlokking
onderworpen, steeds met hetzelfde serum 4 A.E. Ehrwch)
dat niet te oud was en superol bevatte. Van dit serum
was uit oriënteerende uitvlokkingsproeven bekend, dat het
goede uitvlokkingen gaf in niet te langen tijd. Het voordeel
van dit oude serum was de min of meer constante anti-
toxische waarde, hetgeen ook daaruit bleek, dat het serum
ook na eenige maanden met een gegeven toxine in dezelfde
verhoudingen uitvlokte als tijdens deze experimenten; het
eenige verschil betrof den uitvlokkingstijd, deze was iets langer
geworden.

De buizen, die voor deze uitvlokkingen gebruikt werden,
waren als boven aangegeven gereinigd. Het aantal buizen
bedroeg nu steeds 22 per serie. In iedere buis werd 3 cc. van
het te onderzoeken toxine gebracht, dat 0.5 % carbol bevatte,
nadat het door een E.K. (Entkeimungsfilter) gezogen was.
Het toxine was steeds helder. Het serum werd verdund 1:5,
en toegevoegd in opklimmende hoeveelheid van 0.03 cc., te
beginnen met 0.48 cc. Dan werd elke buis bedekt met stanniol,
inhoud gemengd en geplaatst in waterbad van 49 a 50®.
De buizen werden zooveel mogelijk geobserveerd en het
oogenbhk, dat één der buizen begon te vlokken opgeteekend
als einde van den uitvlokkingstijd. Deze buis werd als de
„eerstquot;vlokkende genomen, de optimum buis.

Toxine 102. Terwijl alle buizen min of meer helder blijven,
wordt na 3| uur in buis 12 een uitvlokking zichtbaar; J uur

later eveneens in buis g. Dus eerste uitvlokking, die als
fijne vlokkenregen begint, in buis 12.

Toxine 107. Uit voorgaande proeven was bekend, dat dit
toxine een zeer lange uitvlokkingstijd had. De buizen werden
alle in het verloop van 6 uur min of meer troebel. Na
nur ontstond er in buis 7 een uitvlokking, die zich zoowel
rechts als links uitbreidde, zoodat na 17 uur buis 6, 7, en 8
ylokten met een min of meer fijne vlokkenregen. De inhoud
IS opalesceerend; er komt geen neerslag. Gedurende de vol-
gende 8 uur breidt zich de uitvlokking naar rechts en naar
^nnks ongeveer even snel uit.

Toxine ttoA. In de opvolgende buizen van de serie ziet
nien langzamerhand minder troebel, troebel, helder en minder
troebel elkaar afwisselen. Na ± 3 uur ontstaat in een heldere
omgeving in buis 12 een uitvlokking. In buis 21 ontstaat een
ï uur later eveneens een uitvlokking; deze buis was helder
en werd troebel in het verloop van deze uitvlokking en bleef
Verder troebel. Al de uitvlokkingen begonnen als een fijne
vlokkenregen.

Toxine 112-4. Terwijl in het verloop van de proef de buizen
alle min of meer opalesceerend worden, ontstaat er na 10 uur
40 minuten in buis 10 fijne vlokkenregen, die steeds toeneemt
en zich zoowel rechts als links over de serie uitbreidt: eerste
uitvlokking.

Toxine ii2ß. Alle buizen blijven gedurende het geheele
proces helder. Na i 7 uur ontstaan er enkele fijne vlokken
in buis i en 2. Ze vergrooten zich plotseling, er is dus geen
fijne vlokkenregen. Na i 18 uur is de uitvlokking voort-
geschreden naar rechts. In de buizen 14, 15, 16 en 17 is een
krachtige uitvlokking (nieuwe uitvlokkingszóne). Opvallend
is nu de groote hoeveelheid neerslag in de buizen 6, 7, 8, 9,
lo en ii.

Nadat het toxine weer opnieuw is ingezet, waarbij buis i
als midden in de nieuwe serie is genomen, verschijnt na ± 7 uur
een uitvlokking als boven in de buizen die 0.48 en 0.51 van
het verdunde serium bevatten (vroegere buis i en 2), zoodat
nien als eerste uitvlokking buis i en 2 van de voorgaande
proef mag aannemen.

Toxine 113.4. In buis 15 en 16 wordt na 2\\ uur in licht
troebele omgeving een uitvlokking zichtbaar, die zich uit-
breidt naar rechts en Hnks. Na ± 30 min. begint in buis 12

een nieuwe uitvlokking, ofschoon de eerste uitvlokkingszóne
reeds genaderd is tot en met buis 14. Men zou zich nu kunnen
voorstellen, dat er een fout gemaakt was in de doseering van
het verdunde serum, zoodat er in buis 12 meer verdund
serum is dan in buis 13. Opvallend echter is, dat bij een her-
haling van deze uitvlokking hetzelfde feit opnieuw waarge-
nomen werd, zoodat men in bovengenoemde buis 12, een
nieuwe uitvlokkingszóne heeft te zien.

buizen min of meer troebel, waaronder enkele zelfs zeer
troebel. Na ^ 2 uur en 45 min. ontstaat er in buis 16, die
minder troebel is, een eerste uitvlokking, die niet mooi is
om als vlokkenregen bestempeld te worden. In het verloop
van het uitvlokken wordt de buis troebeler, de uitvlokking
breidt zich over de aanliggende buizen uit in vrij troebele
omgeving. In büis 19, die helder is en blijft, begint onder-
tusschen een zeer fijne vlokkenregen, die de indruk maakt een
tweede zóne van uitvlokking te zijn.

Toxine 114. Tijdens het verblijf in het waterbad worden
alle buizen min of meer troebel. Na ^ 4 uur en 50 min. ont-
staat er een eerste uitvlokking in buis 11 met vrij heldere
inhoud, die zich vrij regelmatig alleen naar rechts (hoogere
serumdosis) uitbreidt.

Toxine 115. Na 3^ uur zijn met enkele uitzonderingen alle
buizen min of meer opalesceerend. Na 5 uur ontstaat er
een duidelijke eerste uitvlokking (fijne vlokkenregen) in
buis 14, die zich naar rechts en links, maar vooral in de laatste
richting uitbreidt. Een uur na het zichtbaar worden der
eerste uitvlokking, komt er een tweede uitvlokkingszóne in
buis 2 en 3, die zich gelijk naar rechts en links uitbreidt.
Het aanzien van deze zóne van uitvlokking is niet verschillend
van de eerste.

Toxine 116. Alle buizen worden min of meer troebel,
vooral rechts in de serie. Na 4 uur, nadat hier en daar alleen
aan het eind van de serie een enkele vlok is gezien, komt er
een uitvlokking in buis 10 en 13. Het is geen fijne vlokkenre-
gen, maar terwijl de vlokken in grootte toenemen, komen
er kleinere bij en wordt de uitvlokking als zoodanig gemakke-
lijker waarneembaar; buis 11 volgt al gauw volgens hetzelfde
schema als 10 en 13. Als de uitvlokkingen in deze buizen al
zeer duidelijk zijn, worden er in de buizen aan het begin van

de serie enkele vlokken in de inhoud waargenomen. Van een
eerste uitvlokking is hier geen sprake, de uitvlokking zelf
volgt hier een zeer eigenaardig beeld.

Toxine 117. Alle buizen worden min of meer troebel.
In heldere omgeving komt na 4 uur een duidehjk waarneem-
bare eerste uivlokking als fijne regen in buis 9. Deze neemt
jn krachtigheid toe, terwijl er uitbreiding plaats vindt over
de omgeving, vooral naar rechts. Merkwaardig is het ont-
staan van een tweede uitvlokkingszóne in buis 19 in zeer
troebel miheu, heeft de eigenschap, dat hier en daar een
vlok, die steeds grooter wordt, te zien is en tenslotte als
nitvlokking moet aangemerkt worden.

Toxine 118. Alle buizen blijven helder tot na uur in
buis 16 een fijne uitvlokking begint. Buis 17 volgt al gauw
dusdanig, dat men den indruk krijgt, dat tusschen buis 16 en

de eerste uitvlokking zal gelegen hebben. De uitvlokking
oreidt zich in de richting der minimum buizen uit; i uur
later begint in buis 5 en 6 een uitvloklcing. Merkwaardig is een
plotsehng in buis 9 en 10 optredende zeer fijne uitvlokking
(min of meer fijne vlokkenregen). Bij herhaling van deze
nitvlokking in zijn geheel verloopt de fijne uitvlokking
Weer in dezelfde buis als boven beschreven. Hier heeft men
Waarschijnlijk te maken met drie uitvlokkingszónes.

Toxine 120. Terwijl alle buizen langzamerhand min of
nieer opalesceerend worden, ontstaat na 4 uur in buis 5
een uitvlokking, die er als een fijne vlokkenregen uitziet.
I^eze uitvlokking breidt zich over de aangrenzende buizen uit.

Toxine 121. Een mooie fijne vlokkenregen treedt in geen
enkele buis op. In het begin ziet men sporadisch vlokken
zweven. Deze worden grooter, waardoor de uitvlokking als
zoodanig duidelijk wordt in het begin van de serie in buis
3, 4, 5 en 6. Een eerste uitvlokking is aldus niet te herkennen;
de buizen, die langzamerhand troebel worden helderen niet
meer op; 8 uur later vlokt de serie in jle eerste 12 buizen,
terwijl in 13 slechts een zeer fijne uitvlokking te zien is,
m.a.w. de uitvlokking breidt zich gelijkmatig over de serie
uit, zoowel naar rechts als naar links.

Toxine 122. Alle buizen worden troebel. In buis 4 wordt
in vrij heldere omgeving na ± loj uur een uitvlokking
zichtbaar. In buis 9 begint al gauw een nieuwe uitvlokkings-

Toxine 123. Alle buizen min of meer troebel; na 3I uur
wordt er in buis 14 een uitvlokking zichtbaar, die niet als
een zeer fijne vlokkenregen begint, maar hier en daar als een
sporadische vlok, die grooter wordt en daarom als uitvlokking
dient aangemerkt te worden.

Overziet men alle beschreven uitvlokkingen, dan blijkt,
dat er met twee uitzonderingen (toxine 116 en 121) van de
17 onderzochte toxinen, dus in het algemeen een eerste
uitvlokking was waar te nemen. De toxinen, die in de volg-
orde waarin ze hierboven beschreven zijn, in ouderdom
toenemen, maaktén den indruk van beter uit te vlokken en
daarom juister af te lezen te zijn in hunne uitvlokkingen,
naarmate ze ouder waren. De fijnste vlokkenregens werden
door mij waargenomen bij de oudere toxinen. De eerste
uitvlokking verliep volgens de schema\'s zooals door Kawc
beschreven zijn (zie in het begin van dit hoofdstuk); echter zag
ik dikwijls een andere vorm, waarbij in het mengsel slechts
enkele vlokken te zien waren, die grooter werden, samen-
klonterden en een neerslag vormden. Naast de toxinen, die
één uitvlokkingszóne hadden, waren er andere met twee en
meer dergelijke zones. Merkwaardig was het altijd vroeg of
laat troebel worden der mengsels in het waterbad, in tegen-
stelling met de diphtherieuitvlokkingen. Het maakte den
indruk van bacteriëele verontreiniging te zijn. Kleuren en
uitstrijken op voedingsbodems gaf negatieve resultaten,
zoodat hier nogmaals blijkt, dat het bij de titraties van tetanus-
(ana) toxine en antitoxine in vitro minder aankomt op
steriel, maar meer en vooral op goed gereinigd glaswerk.

Van groot belang was de vraag of de eerst vlokkende buis
het neutrale mengsel bevatte.

Er bleek, dat i cc. bij een muis ingespoten geen verschijn-
selen c.q. tetanus gaf, zoodat het neutraal of overneutraal
moest zijn.

Daarop werd na de uitvlokking, de inhoud van deze buis
gecentrifugeerd en van de bovenstaande vloeistof cc.
gemengd met ^ cc. phys. zoutopl., waarin eenige malen de
d.l.m. muis was opgelost. Het bleek mij bij herhaling, dat
het mengsel sterk overneutraal was en meer dan 100 d.l.m

muis (gedroogd toxine) per | cc. buisinhoud kon neutrali-
seeren. Men zou zich kunnen voorstellen, dat door het staan
gedurende vele uren in het waterbad bij 50^ het „eerst uit-
vlokkendequot; mengsel dusdanig was beïnvloed, dat het over-
ueutraal was geworden, b.v. er zouden toxoïden zijn ontstaan,
die wanneer men aan het mengsel weer opnieuw toxine toe-
voegde, dit zouden verdringen. Daarom werd een mengsel,
Zooals in de eerst uitvlokkende buis aanwezig was, gedurende
J uur bij kamertemperatuur gehouden en dan als boven-
beschreven nagegaan op neutraliteit. Ook hierbij was de uit-
slag:

Tenslotte werd van meerdere toxinen een reeks van
33 buizen ingezet, waarin in de le buis nu inplaats van 0.48
ec. verdund serum (dosis bij de le buis van de serie van 22
buizen) 0.18 cc. bevatte, met de bedoeling na te gaan of ook
uog eerder een uitvlokking zou optreden, die bij een serie van
22 buizen aldus over het hoofd zou zijn gezien. Er bleek,
dat de eerste vlokking ook nu weer in dezelfde buis verscheen,
Waarvan de inhoud dus overneutraal bleek te zijn.

Kn eindelijk werden om zoowel een verandering van het
toxine als serum in zijn vlokkende eigenschappen uit te
sluiten, deze proeven later nogmaals meerdere malen her-
haald met dezelfde resultaten. De uitvlokkingstijd was echter
toegenomen. Hiermede is dus uitvoerig bewezen, dat bij deze
uitvlokkingen van absolute waarden moest worden afgezien.

Maar al was de uitvlokkende buis dan niet neutraal, had
deze dan niet een relatieve waarde? M.a.w. kon men uitgaande
Van de plaats van de eerst uitvlokkende buis in de serie
Vergelijkenderwijze conclusie strekken over de eigenschappen
\'^an het toxine?

Daartoe werden vergeleken de plaats van de eerst uit-
vlokkende buis ten opzichte van de oorspronkelijke toxiciteit
van het toxine. Dat de op het oogenblik aanwezige toxiciteit
Van geen groote waarde was, is te begrijpen, daar alle toxinen
gemodificeerd waren door de bewaring onder toluol, en
zeer zeker des te meer, naarmate ze langer er onder verbleven
hadden. Dat hierbij hunne bindingswaarde en dus hunne
uitvlokkingswaarde er onder geleden had, was begrijpelijk
en daarom zijn zeer zeker in onderstaand schema niet alle
Waarden, die met de uitvlokking verkregen werden, volkomen
vergelijkbaar. Het meest vergelijkbaar zijn die toxinen, die

in het schema bij elkaar zijn geplaatst; het allermeest is
dit het geval met die toxinen, die hetzelfde nummer en tevens
de letter A of B dragen, daar ze van culturen stammen,
die op denzelfden tijd zijn bereid en daarna onder toluol
zijn geplaatst. Maar als ook de afstand tusschen twee toxinen
die men vergelijkt, grooter is in het schema, dan kan men toch
deze min of meer vergelijken, daar aan het eind van deze
serie van uitvlokkingen bleek, dat serum en toxine in hunne
bindingsneiging, berekend met de uitvlokking, ook door
langer staan niet veel geleden hadden.

ter vergelijking van de eerst vi^okkende buis met de
oorspronkei.ijke toxiciteit, die Onmiddellijk na de be-
reiding van het toxine werd vastgesteld op muizen.

TOXINEN.

1.nbsp;toxine

2.nbsp;toxine

3.nbsp;toxine

4.nbsp;toxine

5.nbsp;toxine

6.nbsp;toxine

7.nbsp;toxine

8.nbsp;toxine

9.nbsp;toxine

10.nbsp;toxine

11.nbsp;toxine

12.nbsp;toxine

13.nbsp;toxine

14.nbsp;toxine

15.nbsp;toxine

16.nbsp;toxine

17.nbsp;toxine

Onmiddellijk valt in dit schema de volstrekte onregelmatig-
heid op, opmerkelijk is b.v. de verhouding van de toxinen
iioA en iioB. Beide toxinen vlokken uit in buis 12 resp. 13,
de toxiciteit verhoudt zich echter als i : 6. De beide toxinen

zijn van even oude culturen en daarna even lang onder toluol
bewaard en daar ze ongeveer op dezelfde hoogte vlokken,
komt dit overeen met een uitspraak van BaChER (zie
Vroeger): dat de uitvlokking een eigenschap is van een be-
paalde stam en voedingsbodem.

Zonder twijfel is uit al deze uitkomsten de conclusie te
trekken, dat met mijne uitvlokking, waarvan ik immers mag
aannemen, dat deze te vergelijken is met de uitvlokkingen,
die anderen verkregen, noch absoluut, noch betrekkelijk een
indruk is te krijgen van de eigenschappen van het tetanus-
toxine. Volledigheidshalve werden door mij naast elkaar
eenige toxinen en de daaruit bereide anatoxinen uitgevlokt.
Zoowel toxine als anatoxine vlokten in dezelfde verhoudingen,
het schema volgens hetwelk ze vlokten bleef gelijk. De buizen
Werden b.v. min of meer troebel. Een toxine, dat niet als
tijne vlokkenregen vlokte geeft een analoog verschijnsel
bij zijn anatoxine, b.v. toxine 120.

I^aar de toxinen niet in hun uitvlokkend vermogen te
Waardeeren zijn, volgt dus onmiddellijk dat:

zoowel toxinen als anatoxinen in hunne bindende neiging
^og niet te beoordeelen zijn naar de uitvlokking, die men ver-
als men ze mengt met antitetanusserum in bepaalde
^^rhoudingen.

Onderzoekingen met een ander serum op meerdere toxinen
gaven resultaten die de bovenstaande uitspraak niet wijzigden,
niaar integendeel bevestigden.

Het serum, dat waarschijnlijk een waarde had van ±
y A.E. (Ehri^ich), werd wederom als bovenvermeld verdund,
^aast elkander werden vergeleken toxine 114, 115, 116, het
toxine 114 werd ter vergelijking uitgevlokt met het vroegere
serum. Terwijl het toxine 114 met dit laatste serum in i 4
a 5 uur uitvlokte, was de uitvlokkingstijd met het nieuwe
serum lt; 2 uur, voor toxine 115 lt; 2 uur, voor toxine 116 lt; 3
nur. De eerste uitvlokking lag in de minimum buis, terwijl de
uitvlokking zich vrij snel naar rechts uitbreidde; de buizen
bleven vrij helder. Bij toxine 115 ontstond alleen een duidelijk
op den bodem liggend neerslag. Bij geen der toxinen zag men
een vloklcenregen. Deze uitkomsten sluiten in principe met
de waarde van dit serum n.1. grooter dan het vorige.

mum buis het allereerst uit te vlokken, de uitvlokkingstijden
werden zeer kort tot zelfs ± 50 min. voor toxine 115 en 116;
voor toxine 114 veel langer. Op een gegeven oogenblik
bevatte de minimum buis slechts 0.9 cc. verdund serum i : 5.

Tot plotseling zonder mij bekende oorzaak bij een serie,
die weer iets lager was ingezet, de uitvlokking begon in de
maximum buis. De uitvlokkingstijd was eveneens zeer onbe-
rekenbaar, nu eens zeer kort, dan weer veel langer, b.v. het
toxine 116, dat bij een serie, waarbij de buis, die 0.45 cc.
serum had gekregen in i uur 30 min. uitvlokte, den volgenden
dag in een zelfde serie in ± 40 min. Ook de uitbreiding van
de uitvlokking in de naburige buizen verschilde in tijd.
Andere toxinen gedroegen zich wel is waar regelmatiger,
maar in het algemeen kan men besluiten dat dit serum niet
geschikt is voor uitvlokkingsproeven, „non convenablement
choisi.quot;

Door een toevallige samenloop van omstandigheden be-
merkte ik, dat het toxine 118 met 0.5% carbol gemengd in
± i uur 30 min. een uitvlokking gaf, die niet te onderscheiden
was van de uitvlokking van Ramon. Het neerslag was iets
minder sterk uitgesproken.

2e. Welke is de invloed van de carbol op de uitvlokkingen
van tetanustoxine en -antitoxine.

le. Mijn onderzoek leerde dat deze vraag ontkennend be-
antwoord kan worden: met de concentratie van de carbol
werd de uitvlokkingstijd kleiner. Bij een serie buizen waarin
steeds dezelfde hoeveelheid toxine was gedaan, werd in
opklimmende hoeveelheden carbol toegevoegd tot 2% en
bleek er in het waterbad bij 50® in het toxine 118 met 2%
carbol het allereerst een uitvlokking op te treden. Deze was

zeer krachtig, breidde zich naar de lagere waarden uit en nam
daarbij af in sterkte. De uitvlokkingstijd wordt tenslotte
oneindig groot o.a. bij 0.3% ontstond na langen tijd nog een
neerslag in de buis, dat sterk deed denken aan het neerslag
dat verkregen werd met de uitvlokking van Ramon in de
hnis, die min of meer van het optimum, in het algemeen van
het middelpunt van een uitvlokkingszóne aflag. De minimum
earbolconcentratie waarbij nog een neerslag werd gevormd
Was verschillend voor de diverse toxinen.

2e. a. Deze invloed bleek bij meerdere malen uitgevoerde
nitvlokkingen een remmende te zijn. In het algemeen werden
met het toenemen der carbolconcentraties de buizen veel
troebeler; bij 1% sterke troebeling, zelfs bij 2% niet meer
af te lezen. Met 0.5% kreeg men practisch alleen verschil
ur de uitvlokkingstijd. Tevens bleek, dat wanneer van een
toxine A. de uitvlokkingstijd grooter was dan van een toxine
Ê., dit verschil nog grooter werd wanneer men aan deze beide
toxinen een gelijke hoeveelheid carbol toevoegde.

6. De uitvlokking veranderde niet van aanzien: b.v. een
toxine, dat zonder carbol niet als fijne vlokkenregen uit-
blokte met zijn correspondeerend serum, vertoonde hetzelfde
vlokkingsbeeld als een toxine met 0.5% a 1% carbol.

c. Ten opzichte van de plaats van de eerste uitvlokking
Inrijgt men den indruk, dat het optimum van uitvlokking
een geringe neiging heeft naar links in de serie te verschuiven.

.Het toxine 113B, zonder carbol, b.v. vlokte met een serie
mt in buis 16 na 4 uur.

Het toxine 117 gaf daarentegen, iets na elkaar ongeveer
op dezelfde plaats liggende uitvlokkingen resp.: geen, met
en 1% carbol.

3e. In een waterbad van 50® werd van het toxine 118, dat
door een E.K. (Seitz Entkeimungs Filter) was gefiltreerd,

ingezet een hoeveelheid zonder carbol, met i % carbol en nog
eens met i % carbol; daarnaast bij kamertemperatuur zonder
carbol. Nadat het toxine door de carboltoevoeging was uit-
gevlokt werd de inhoud van één der buizen, die i% carbol
bevatte, gecentrifugeerd, de andere werd geschud, dusdanig,
dat neerslag en vlokken weer in een fijn verdeelde toestand
kwamen.

Op witte muizen werd nu de d.l.m. van deze behandelde
toxinen nagegaan n.1.: i. het toxine dat i uur bij 50® had
gestaan, 2. het 1% carboltoxine na centrifugeeren, 3. het
1% carboltoxine met neerslag, 4. het toxine dat i uur bij
kamertemperatuur had gestaan.

1.nbsp;I cc. ingespoten bij muizen in verdunning i : 10,000
t aan tetanus 4e dag,

3.nbsp;I cc. ingespoten bij muizen in verdunning i : 50
iets tetanus, i : 10 f aan tetanus 4e dag.

4.nbsp;I cc. ingespoten bij muizen in verdunning i : 10.000
t aan tetanus 4e dag.

Waaruit dus ten duidelijkste blijkt, dat het toevoegen
van carbol het toxine sterk modificeert en tevens, omdat
het 1% carboltoxine met neerslag giftiger is dan het 1%
carboltoxine zonder dit, een gedeelte van het toxine gebonden
is aan het neerslag.

Daarnaast blijkt tevens dat de temperatuur van 50®
dezelfde modificeerende invloed heeft op de toxiciteit van
het toxine als de temp. van 18®.

Interessant is, dat een toxine No. 70, ongeveer 3 jaar oud,
dat geen uitvlokkingen meer gaf, zelfs niet na dagen, met
carbol tot hooge concentratie geen uitvlokking meer kon geven,
m.a.w. de praecipitabele stoffen zijn er uit verdwenen.
Opmerkelijk is, dat tetanustoxinen, die onder toluol bewaard
worden regelmatig troebel worden en dat welhcht het langere
verblijf onder de toluol een verklaring kan geven voor boven-
staande gebeurtenis.

le. dat het in het algemeen mogelijk is een uitvlokking,
die verschillende verloopsvormen heeft, te verkrijgen als

2e. dat vele onbekende factoren de uitvlolddng beheerschen,
Waarvan o.a. zeer zeker een groote invloed moet toegezegd
Worden aan de e.v. onreinheid van het gebruikte glaswerk.

3e. dat de buis, die het allereerst uitvlokt, sterk overneu-
traal is, dus geen initiale uitvlokking.

4e. dat met het oog op de plaats van deze buis in de serie
geen aanknoopingspunten zijn te vinden om de toxinen in
hunne antigeeneigenschap onderling te waardeeren.

6e. dat er met andere stoffen, o.a. carbol, ook uitvlokkingen
zijn te verkrijgen, waarbij de concentratie dezer stoffen de
Uitvlokkingstijd beheerscht. Deze uitvlokking is niet te onder-
scheiden van die, welke men verkrijgt als men tetanustoxine
en specifiek antitoxine bijeenvoegt. Het neerslag is iets
toxisch. Het carbol werkt sterk modificeerend op het toxine.

7e. dat, waar er meerdere niet specifieke uitvlokkingen
schijnen te bestaan en men deze niet kan onderkennen van
de ware, waardebepaling in vitro door middel van uitvlokking
alsnog uitgesloten is.

OVER DE TITRATIE VAN
TETANUS(ANA)TOXINE EN ANTITOXINE
DOOR MIDDEI.VAN „RINGPRaCIPITATIONquot;.

Het streven om door het doen optreden van de uitvlokking
in één bepaald gebied deze duidelijker te doen zijn, zooals
oorspronkelijk (zie blz. 60) ook door Nicoi,i,e, CésARi en
Jouan door middel van een vaste bodem (10 % gelatine)
werd verricht, is weder opgevat door Hoen, TschErtkow
en ZiPP Deze kiezen daarvoor echter geen vast milieu, maar
een gelatineoplossing van 2%, waarin deze uitvlokking op-
treedt op en in de omgeving van het aanrakingsvlak van toxine
en antitoxine in den vorm van een ring: „R i n g p r â c i -
pitationsréaktionquot;. De laatste onderzoekers hebben
oorspronkelijk deze reactie bij diphtherietoxine en -anti-
toxine toegepast en kwamen tot de slotsom, dat de praeci-
pitinogene eigenschappen niet te scheiden zijn van de anti-
gene. Onder de antigene eigenschappen verstaan ze dan
de bindende eigenschappen van het toxine in den zin van
Bâcher, Kraus en IvÖWEnstein (de „Bindungswertquot;.
Zie blz. 63). Bij het anatoxine vindt Ramon de lyf. (antigeen-
waarde) even groot als bij het oorspronkelijke toxine, hetgeen
in het algemeen is bevestigd en ook mijn meening is in die
richting. De uitvlokkingstijd is echter grooter geworden.
Nu vinden Bâcher, Kraus en I^owenstein met hunne
bindingswaarde een grootere waarde bij het anatoxine,
zoodat ze meenen, dat de antigene eigenschappen zijn ver-
minderd. Hoen, Tschertkow en Zipp konden bij hunne
titratieproeven met toxinen en anatoxinen bij diphtherie een
analoge verhouding verkrijgen als bovengenoemde onder-
zoekers met hunne „Bindungswertquot;. Tevens vonden zij bij
verwarming van het anatoxine op 65 en 70 graden met hunne
ringmethode vermindering der antigeenwaarden, die niet
met de uitvlokking was aan te toonen. Om deze verminderde
waarden die toevallig(?) sluiten met de bindingsmethode, te

interpreteeren als een vermindering der antigeenwaarde is
een min of meer apodictische uitspraak zonder eenigen grond.
Aangetoond moet worden, dat, als met een anatoxine een
vermindering gevonden wordt bij de ringmethode, terwijl
de uitvlokking dezelfde waarde heeft behouden, dit antigeen-
vermogen geleden heeft bij zeer vele dierproeven. Daarbij
meen ik, dat ook Bächkr, Kraus en I^öwenstein niet het
recht hebben het grooter worden van de „Bindungwertquot;
te verklaren als een vermindering van het antigeenvermogen
van het anatoxine: m.i. verontachtzamen ze hier de vraag in
hoeverre of toxine en anatoxine in staat zijn elkaar in hun
binding met antitoxine te verdringen.

De ringmethode is daarna als waardebepaling door HoEN
en Tschertkow toegepast bij titraties van tetanus(ana)-
toxinen en antitoxinen en wordt door hen geprezen boven
iedere andere methode.

De door hen gepubliceerde optimistische uitkomsten waren
aanleiding voor mij deze ringreactie onder de oogen te zien.

Ken gelatineoplossing werd bereid als door hen aangegeven:
2 % gelatine lo % NaCl. De eerste vraag, die ik mij stelde,
Was, of het inderdaad mogelijk was een ring te verkrijgen,
als men tetanustoxine en tetanusantiserum in een bepaalde
verhouding bijeen brengt en of deze specifiek was. Het schema
dat gevolgd werd, was hetzelfde als door de onderzoekers
aangegeven voor het titreeren van antitetanussera.

Het serum waarmede ik mijn onderzoekingen verrichtte,
Werd dus verdund i : 25 met phys. zoutopl. voorzien van
0-3% carbol. In een serie van 10 buisjes werd nu afgepipet-
teerd in ieder i cc. van deze uitgangsverdunning en hierbij
Werd nu phys. zoutopl. met 0.3% carbol gedaan aldus, dat
de eerste buis bevatte: i : 25 verdund serum, de tweede i : 50,
de derde i : 75, enz., de tiende i : 250. Uit elk dezer buizen
werd nu i cc. genomen en gebracht in de serie van 10 buizen,
waarin de ringreactie moest plaats vinden. Hierbij werd ver-
volgens i cc. van de boven bereide gelatineoplossing: 2 % gela-
tine 10 % NaCl. gedaan, zoodat de serumverdunningen nu

5% NaCl. Met een voor i cc. geijkte Pasteursche pipet
werd zeer voorzichtig i cc. van een door een E.K. gefiltreerde
tetanustoxineoplossing op de serumverdunningen gebracht,
dusdanig, dat er een scherp scheidingsvlak ontstond. Elk

buisje werd aan de bovenzijde bedekt met een blaadje
staniol en daarna in een broedstof van 37® gezet. Bén water-
bad bleek onbruikbaar, daar er dan te veel stroomingen ont-
staan, die het aanrakingsoppervlak tusschen serum en toxine
verstoren. De bedoehng hiervan is om te bepalen met welke
verdunning van een bekend serum er nog een ring optreedt
met i cc, van een bekend toxine. Deelt men deze verdunning
nu op de antitoxische waarde, bekend uit de dierproef, dan
bepaalt men de Lp. grootte van het toxine. Dit is dus eigenlijk
die hoeveelheid antitoxine, die juist in staat is i cc. van het
gebruikte toxine te neutraliseeren (Ramon). Door nu met een
onbekend serum te experimenteeren en de verdunning,
waarbij men nog juist een ring waarneemt, te vermenigvul-
digen met deze Lp. grootte, heeft men aldus onmiddellijk de
antitoxische waarde (Hoen en Tschertkow). Na zes uur
(later bleek mij dat het juister is om de drie uur waar te nemen,
omdat een ring die op deze wijze ontstaat soms weer snel
verdwijnt) bleken de scheidingsvlakken vervaagd, van een
ring was niets te zien, en werd ook in de volgende dagen niets
gezien, wel werd de buisinhoud troebel.

Ook bij herhaling is het mij niet gelukt met dit toxine en
dit serum een ring te verkrijgen. Met een ander toxine ont-
stond een ring bij een serumverdunning i : 50, deze was zeer
kortstondig. Werden de serumverdunningen minder sterk
genomen i : 20, dan was het wel mogelijk ringen te krijgen.
De ringen die bij de minder sterke verdunning vrij sterk
zijn, zijn verderop zeer moeilijk zoo niet onmogelijk te
herkennen. Daarom werd zoowel het gelatinegehalte als de
temperatuur verhoogd om een scherper grensvlak en aldus
een scherpere ring te houden. Inderdaad waren de ringen nu
veel duidelijker te zien, maar de moeilijkheden om ten
slotte de buis te herkennen, waar nog juist een ring aanwezig
was, werden niet minder. Zoo was er een duidelijk verschil in
ringen tusschen 2, 3 en 4% gelatine-oplossingen, die gebruikt
werden voor de eindverdunningen van het serum. Tot slot
bleven er altijd nog de refractaire sera, die noch met het eene,
noch met het andere toxine en in verdunningen waarbij dit
zeer zeker moest, een ring gaven.

Na deze negatieve resultaten werd nog de wijze toegepast
zooals aangegeven voor de titratie van de toxinen^\'.

1nbsp;/o gelatine en 5% NaCl. bevatte. Het toxine werd verdund
aldus: I cc. toxine, i cc. toxine en i cc. phys. zoutopl.,
^ cc. toxine en 2 cc. phys. zoutopl., etc.

In iedere buis werd nu 2 cc. van de serumverdunning als
bovengenoemd afgepipetteerd en daarop werd nu zeer
Voorzichtig i cc. van het verdunde toxine gebracht. Na 2 uur
Was er al in het begin van de serie (minst sterke verdun-
nmgen) een vrij scherpe ring te zien. Deze ring werd lang-
zamerhand zichtbaar tot in het einde van de serie.

Het toxine werd nu in een volgende proef in grootere
verdunning, te beginnen met 1:5, op de serum verdunning
gevloeid en nu ontstonden al spoedig zeer fijne ringen.
Waarvan de laatste zeer moeilijk zoo niet onmogelijk is af
te lezen. Het best ziet men deze door de buizen te houden te-
gen een donkere achtergrond en het licht van boven-voor te
laten opvallen. Het was dan zelfs mogelijk zeer fijne ringen
waar te nemen, maar des te fijner men de ringen kon zien,
des te moeilijker was het een einde in de ringvormen vast
te stellen.

I^eze uitkomsten waren de inleiding voor een reeks van
onderzoekingen van zeer algemeenen aard.

2nbsp;% gelatine en 10% NaCl. en van 4% gelatine en 10%
NaCl. De temperaturen waren 37 en 50 graden. Getitreerd
Werden twee maal twee toxinen.

E)e eerste twee toxinen No. 117 en No. 118 werden verdund
als boven vermeld, te beginnen met verdunning 1:5. Het
serum werd verdund i : 15 dusdanig, dat ontstond een 1%
en 2% gelatineoplossing -f 5% NaCl. De serie bestond uit
lo buisjes i, 2, tot en met 10,

bij 37® Ring in i en 2.
bij 50O „ „ I, 2 en 3.
2 % gelatine, 5 % NaCl. bij 37« „ „ i, 2, 3, 4-

Men kan hieruit onmiddellijk zien, dat zoowel de tempera-
tuur als het gelatinegehalte quantitatief en qualitatief de ring-
reactie beinvloeden. Om hier één van deze de voorrang te
geven is moeilijk.

Den volgenden dag waren de ringen veel minder scherp
en daardoor het aflezen ondoenlijk.

De resultaten met het tweede paar toxinen 115 en 116 onder
gelijke omstandigheden waren.

bij 370 ring in i, 2, 3, 4.
bij 50O ring in i, 3, 2, 4, 5,
2% gelatine, 5 % NaCl. bij 37° ring in i, 2, 3, 4, 5, 6, 7.

bij 37® ring in i, 2.
bij 50O ring in i, 2, 3, 4,
2 % gelatine, 5 % NaCl. bij 37» ring in i, 2, 3, 4-

voor toxine 115 met 1% gelatine bij 37« ook ring in 5.
voor toxine 116 met 1% gelatine bij 37« ook ring in 3.

de ringen zijn veel breeder, veel minder scherp te onder-
scheiden van de troebele omgeving, zoodat nu in het geheel
geen duidelijke gevolgtrekkingen te maken zijn.

Uit deze proef kan men concludeeren, dat hier de invloed
van de gelatineconcentratie grooter is, dan die van de
temperatuur.

Overziet men de resultaten van al deze algemeene proeven,
dan kan de ringreactie als waardebepaling niet in aanmerking
komen.Wel zijn er geen bijzondere titraties verricht, maar met
bet oog op den grooten invloed van concentratie van de
gelatine en van de temperatuur is er alle reden om deze een
succes te ontzeggen.

Men heeft zelfs alle recht aan te nemen, dat er nog vele
andere factoren zijn, die deze ringreactie zullen beïnvloeden
en zullen o.a. veranderingen in den aard en concentratie
der electrolyten, herkomst en bereiding der gelatineoplossing,
etc. een invloed toegeschreven moeten worden, immers men
heeft hier in tegenstelling met de uitvlokkingsreactie, niet
met een homogeen mengsel te maken. De resultaten, die
men verkrijgt zijn afhankelijk van de diffusie der werkzame
stoffen naar het aanrakingsoppervlak en dus zullen vorm en
grootte van dit laatste (wijdte der reageerbuizen) benevens
de concentratie van de reageerende bestanddeelen (verdun-
ningen), de uitkomsten sterk beïnvloeden.

Daarbij heeft men (zie boven) bij de ringreactie, zooals
deze door Hoen en TschERTKow wordt aanbevolen, slechts
vergelijkenderwijze conclusies te trekken. Namelijk moet men
beschikken over een standaard-toxine en standaard-serum
en kan daarnaast pas titreeren op een willekeurig toxine c.q.
serum.

Ten slotte rest nog de buitengewone moeilijkheid in het
constateeren der ringen, zoodat, alles te zamen genomen,
we aan deze reactie slechts een teleurstelling in het practische
gebruik kunnen toezeggen.

Het is mogelijk bij caviae met het tetanusanatoxine een
specifieke immuniteit te bereiken. Deze immuniteit kan men
vergrooten door meer van het vaccin in te spuiten, maar
tevens meerdere malen, en de injecties ten opzichte van elkaar
een bepaalde plaats in tijdorde te geven. De antigeenwerking
IS te vergrooten door bijvoeging van een niet specifieke
prikkel. De immuniteit ontstaat langzamerhand, is te bepalen
door het aantoonen van een humorale-(muistitraties) en
een cellulairé immuniteit (réactivité acquise), het vermogen
om op een hernieuwde inspuiting te reageeren met de vorming
van specifieke antitoxinen. Zoowel cellulaire- als humorale
immuniteit zijn afhankelijk van een bepaalde gevoeligheid van
het organisme (de réactivité naturelle), die de individueele
verschillen bij de gevolgen der entingen veroorzaakt. Deze
réactivité is een blijvende eigenschap, geen tijdelijke toestand,
blijft dus steeds aanwezig en maakt het zoo gevaarlijk uit
slechts enkele vaccinaties gevolgtrekkingen te maken. Naar
analogie van dierimmunisatie is het ook mogelijk menschen
te wapenen tegen tetanustoxine c.q. tetanuskiemen.

Evenwel zal het gebruik van het tetanusanatoxine altijd
op groote moeilijkheden blijven stuiten. Men bedenke, dat
men te maken heeft met een stof, die, voor zij door een be-
werking tot z.g. anatoxine werd, in toch zoo minimale dosis
reeds ziekmakend respect, doodelijk was.

Ik herinner hier aan toxinen, die ik op het Rijks Serologisch
Instituut zag bereiden. Een d.l.m. muis i : 500.000 en kleiner
was geen uitzondering.

Men kan nu als volgt de d.l.m. voor een mensch theoretisch
berekenen. Het is namelijk bekend, dat de mensch waarschijn-
lijk gevoeliger is dan het paard, terwijl dit laatste 12 maal
gevoeliger is dan de muis m.a.w., de toxinehoeveelheid om
één muis van 15 gram te dooden is vernietigend voor 12 maal

15 gram — i8o gram mensch. Stelt men een mensch op een
gewicht van 72 K.G. dan kan dus de giftdosis voor 400 muizen
voor dezen mensch doodelijk worden, waarbij men nu eenigs-
zins een idee van de kleinheid der doodelijke hoeveelheid
krijgt. Daarnaast weten we, dat de eenmaal uitgebroken
tetanus zulke slechte kansen voor genezing biedt. Wil men
absoluut overtuigd zijn van de volkomen onschadelijkheid,
dan heeft men eenige malen bij caviae 10 cc. onderhuids
in te spuiten en deze dieren nauwkeurig te observeeren,
omdat anderen en ook mij bleek, dat na twee weken het uit-
breken van een late algemeene tetanus nog mogelijk is.

En dan blijft er nog een verraderlijk moment bij de tetanus-
anatoxinebereiding over, de mogelijkheid van de tetanusbacil
om zijn resistente sporen te vormen. Zoo bleek bij één van
de nieuw bereide anatoxinen, dat van een toxine met een
d.l.m. muis i : 100.000 stamde, door dit gedurende 3 weken
met 0,4% formaline bij 40® C. te zetten, dat na enting van 50
gram in de Tarozzi-bouillon er gasvorming optrad en na
nauwkeurig onderzoek de tetanusbacil in reinkultuur was
te kweeken. Dit anatoxine had verder bij caviae onderhuids
ingebracht in hoeveelheid van 10 cc. geen verschijnselen,
van welke vorm van tetanus dan ook, gegeven.

Dat bij een onderzoek op een voor tetanus zeer gunstige
voedingsbodem van een voldoende hoeveelheid 50 c.c.)
anatoxine blijkt, dat de mogelijkheid tot vorming van tetanus-
bacillen uitgesloten is, opdat men niet onaangenaam verrast
worde, doordat op een gegeven oogenblik, door omstandig-
heden, die dit mogelijk maken, bij één zijner vaccinaties ent-
tetanus optreedt.

Om verder overtuigd te zijn van zijn immuniseerende kracht,
heeft men een juiste en afdoende waardebepaling noodig.
Wel weten we, dat anatoxinen afgeleid van toxinen met een
zeer kleine d.l.m. zeer sterk als antigeen werken, maar abso-
luut is hier niets te bepalen. Waardebepalingen in vitro zijn
de juiste, waardebepalingen in vivo hebben het bezwaar,
dat ze duur zijn en bovendien binnen vrij ruime grenzen
afhankelijk van de gevoeligheid der proefdieren.

Heeft men eenmaal een anatoxine en weet men, dat het
goed immuniseert, dan rijst de vraag: waar is het aangewezen?

Reeds Ramon heeft opgemerkt, dat het gebruikt moet
worden voor soldaten, die naar een veldslag gaan. Ik zou
dit eerst nog wat algemeener willen zeggen. Daar we zelfs
niet kunnen benaderen hoe groot de waarde van de humorale
immuniteit moet zijn om een mensch te beschermen tegen de
doodelijke tetanusinfectie, te meer daar bij de actieve immuni-
satie de cellulaire immuniteit de hoofdrol speelt, en we niet,
zooals bij de diphtherie, een eenvoudige huidreactie hebben
om de immuniteit vast te stellen, is er bij elke tetanusvacci-
natie een zeker risico aanwezig, tenzij men als eisch stelt, dat
na de vaccinatie de antitoxische titer van het bloed gelijk moet
zijn aan die na de prophylactische seruminjectie van 20 A.E.
Hiervoor zijn echter venepuncties en vergelijkende serum-
titraties op dieren noodzakelijk, zoodat deze wijze van con-
troleeren van het resultaat der entingen slechts voor den
enkehng kan plaats vinden.

Het bovengenoemde risico moet nu opwegen tegen de
tetanusgevallen die optreden als er niet gevaccineerd wordt
en men kan bovengenoemde gedachte aldus formuleeren:

le. Voordat hij naar het front vertrekt dient iedere militair,
met inachtneming van de bovengenoemde voorzorgs-
maatregelen, gevaccineerd te worden tegen tetanus. Omdat
er voor het tot stand komen van een afdoende immuniteit
een zekere tijd noodig is, moet het zwaartepunt van deze
enting gelegd worden in de depóts, waar de jonge menschen
afgericht worden tot soldaat etc. Het bereiden van groote
hoeveelheden tetanusanatoxine in vredestijd is hiervan de
logische consequentie. Wij behoeven immers niet bevreesd
te zijn, dat er door den tijd tetanusanatoxine verloren zal
gaan, daar het juist zoo stabiel is in zijn eigenschappen. Het
combineeren van verschillende vaccins kan eventueel over-
wogen worden, (zie „geassocieerdequot; vaccinaties) indien men
er echter bij bedenkt, dat de waarde der typhusenting er
onder lijdt.

2e. In omgevingen, waar door weinig hygiënische omstan-
digheden en slechte wondverzorging percentsgewijze veel
klemziekte (tetanus umbiHcaHs) voorkomt is vaccinatie der
toekomstige moeder op ruime schaal aangewezen, indien men
niet de voorkeur geeft aan een seruminspuiting bij den pas-
geborene.

3e. Wat meer voor den enkeHng geldt: Wanneer bij oorlogs-
gemutileerden naderhand een plastiek gedaan en dus ge-
manipuleerd wordt in een omgeving waar nog tetanus
ziektekiemen, sporen van de vroegere verontreinigde wond
afkomstig, een vita minima kunnen leiden, dienen deze
gewapend te worden tegen de postoperatieve tetanus door
een afdoende vaccinatie en moet men hier het bloed nauw-
keurig nagaan op de aanwezigheid van de tetanusanti-
ncliamen (zie vaccinatie van menschen).

Zoo ziet men dus, dat het tetanusanatoxine in vredestijd
weinig in aanmerking zal komen, omdat de tetanus zoo zelden
voorkomt en we in onze seruminjectie een onmiddellijk goed
werkend prophylactisch middel hebben, in tegenstelling met
den langen duur der behandeling met anatoxine.

Zeer effectief zou het geweest zijn, als men tijdens de
werking der passieve immuunlichamen een actieve immuni-
satie tot stand had kunnen brengen. Ik kan hierin de Fransche
onderzoekers met volgen, omdat ik uit hoofde van een groote
reeks van onderzoekingen niet alleen meen, dat de passieve
mmunisatie benadeeld wordt (het simultaan immuniseeren
is dus met onschuldig!) maar tevens het anatoxine in zijn
werking wordt opgeheven: De ,,tétanos post sériquequot; is niet
te beheerschen met vaccinaties.

Naar analogie van dierproeven meen ik bij den actief
geimmumseerden mensch, bij op tetanusinfectie verdachte
wond op een meuwe injectie van tetanusanatoxine aan te

rappel. Ook al is bij de geïmmuniseerde persoon het antitoxine-
gehalte aanmerkelijk gedaald, dan overweegt de antitoxine-
verwekkende prikkel van het anatoxine verre het verUes
dat ontstaat door binding van eventueel nog aanwezig

Stricker, F., Deutsche med. Wochenschrift 1909. pag. 1069.
Erfahrungen über Tetanus während des Weltkrieges.

Katalasen in Bakterienfiltraten.
I.öwenstein, E., Zeitschr. f. Hyg. und Inf. Krankheiten,
1909. pag. 491. Über aktive Schutzimpfung bei Tetanus
durch Toxoïde.

7\' I.öwenstein, E., Handbuch der biol. Arbeitsmethoden, 1928.
pag. 1046. Toxinen und Toxoïden.
Descombey p.. Comptes rendus des séances de la Soc. de
Biologie 1924. T 91, pag. 239. 1,\'anatoxine tétanique.
9- Descombey, P., Annales de l\'Inst. Pasteur 1925, pag. 485.
Vaccination du cheval par l\'anatoxine tétanique.

de Biol. 1925. T 92, pag, 309. ly\'immunisation antitétanique
par la méthode des toxoïdes.

On the prophylactic value of iodized tetanus toxin.
Centralblatt für Bact. etc. Referate, Bd. 76, pag. 507.

Biol. 1925, T 93, pag. 508. Sur l\'immunisation antitétanique
et sur la production de l\'antitoxine tétanique.

de Biol., 1925, T. 93, pag. 898. Sur l\'immunisation anti-
tétanique et sur la production d\'antifoxine tétanique.

pag. 783. Essais de vaccination intracutanée et cutonée
chez le cobaye par l\'anatoxine tétanique.

T. 94, pag. 253. Sur la vaccination antitétanique du cheval!
Durée de l\'immunité.

17- Descombey, p., C. r. des Séanc. de la Soc. de Biol. 1926,
T. 94, pag. 315. ly\'immunisation antitétanique du cheval.
Effects des injections d\'anatoxine sur des sujets antéri-
eurement vaccinés.

Biol. 1926, T. 94, pag. 106. I,es „vaccins associésquot; par
union d\'une anatoxine et d\'un vaccin microbien (T.A.B.)
ou par mélange d\'anatoxines.

Séanc. de la Soc. de Biol. 1927, T. 97, pag. 501.
Essais d\'immunisation de l\'animal par l\'anatoxine tétanique
associés à des agents chimiothérapiques.

II, pag. 834. Iv\'anatoxine tétanique et la prophylaxie du
tétanos chez le cheval et les animaux domestiques.

pag. 803. Iv\' anatoxine tétanique et l\'immunisation active
de l\'homme vis-à-vis du tétanos.

Sciences 1926, No. 182, pag. 182. De la valeur antigène
de l\'anatoxine tétanique chez l\'homme.

Biol. 1929, T. 100, pag. 92. Nouveaux résultats concernant
la vaccination de l\'homme contre le tétanos.

rinst. Past. 1927, II, pag. 848. ly\'Anatoxine tétanique
et l\'immunité antitétanique chez la mère et le nouveau-né.

l\'Inst. Past., 1927, II, pag. 862. Contribution à l\'étude du
passage des antigènes et des anticorps à travers le placenta.

pag. 868. Recherches sur le passage des toxines, des
anatoxines et des antitoxines à travers les parois du tube
digestif.

Sur la vaccination du cobaye contre le tétanos par injection
intracérébrale d\'anatoxine tétanique.

29- Feierabend, B., Les travaux de llnst. d\'Hygiène publique
de l\'Etat Tchécoslovaque. Oct. 1930, pag. 136.
L\'immunisation active chez le cobaye, le cheval et l\'homme
au moyen de l\'anatoxine tétanique.

Sciences 1919, pag. 1433. Précipitation mutuelle des toxines
et de leur antitoxines. AppHcation au titrage des sérums
antidiphtériques et antitétaniques.

1920, pag. 596. Etudes sur la précipitation mutuelle des
anticorps et des antigènes.

34- Ramon, G., Descombey, P., C. r. des Séanc. de la Soc. de
Biol. 1926, T. 95, pag. 434. Sur l\'appréciation de la valeur
antigène de la toxine et de l\'anatoxine tétanique par la
méthode de floculation.

Heft 5-6, pag. 434. Nachweis und Austitrierung anti-
toxischer Sera (insbesondere des Tenanus-antitoxins) im
Reagenzglas.

Le phénomène de floculation des toxines diphtérique et
tétanique vis-à-vis de leur antitoxines.

reux, G., C. r. des séanc. de la Soc. de Biol. 1927 T. 96,
pag. 30. Production d\'anatoxine tétanique par culture du
Bacille tétanique en bouillon bihé.

Imm. forschung 1925, No. 42, pag. 350. Zur Frage der
aktiven Schutzimpfung gegen Diphterie.

forschung 1927. No. 52. pag. 334. Über die antigenen
Eigenschaften der Anatoxine.

Exp. Medicine 1925, 44, pag. 533- The nature of the
toxm-antitoxin floculationphenomenen

Etudes sur la floculation des mélanges de toxine et d\'anti-
toxine tétaniques.

Inf. Krankheiten, 1928, Bd. 108, Heft. i. pag. 61.
Uber die Einheit der präcipitinogenen und der antitoxin-
bmdenden Substanz im Diphterietoxin

pankheiten 1929. Band iio, Heft 2, pag. 272.
Wertbestimmung des Tetanusheilserums mittels Ring-
präcipitation.

KranHieiten, 1929, Band iio, Heft 4. pag. 732.
Wertbestimmung des Tetanustoxin und -toxoids in vitro
mittels der Ringpräcipitationsmethode.

V: Beteekenis van de uitvlokking van
Ramon als waardebepaling voor het
toxine resp. anatoxine en antitoxine. 60

„ VII: Slotbeschouwingen, practische aanwen-
ding van het tetanusanatoxine ... 91

Het grooter worden van de „Bindungswertquot; te inter-
preteeren als een vermindering van het antigeenvermogen
van het anatoxine ten opzichte van het oorspronkelijke
toxine berust op onvoldoenden grond,

In omgevingen, waar de tetanus neonatorum frequent is,
behandele men den pasgeborene met seruminjectie eventueel
make men de a,s, moeder vroegtijdig onvatbaar tegen tetanus
met anatoxine,

In geval van mobilisatie dienen de officieren met de leiding
te velde belast aan een streng geneeskundig onderzoek onder-
worpen te worden, zoowel wat hun lichamelijken als hun
psychischen toestand betreft.

Vooral in militairen dienst is slechts in het uiterste geval
het voorschrijven van steunzolen, en dan voor elke persoon
passend gemaakt, aangewezen.

De waarde van den officier van gezondheid in voorste
linie wordt niet beheerscht door z\'n medische kennis,

Bij septische angina is tonsillectomie en blootleggen van
het spatium parapharyngeum met al of niet onderbinding
van de halsvenen ernstig te overwegen.

Bij een advies betreffende zwangerschap aan een patiente
met mitraalstenose houde men zich aan de uitspraak van
Mackenzie, zie: Heart disease and pregnancy,

Indien anisokorie gepaard gaat met verminderde gevoelig-
heid van het hoornvlies, is de diagnose tabes waarschijnlijk.

Groepen	Injectie	Reactie	Na I week	Na 2 weken	PUNCTIE Na 3 weken	Na 4 weken	-- Na 6 weken
I	i cc. tetanus anatox.	geene	—	gt;olt; I dim.	iets lt;1 dim.	lt;4 d.l.m.	lt;10 dim.
2	I cc. tetanus anat.	geene	—	gt;olt; I dim.	2 ä 3 dim.	gt; 8 dim. lt;10 dim.	gt;20 dim.
3	2 cc. tetanus anat.	geene	—	gt;olt; I dim.	2 d 3 dim.	gt; 8 dim. lt;10 dim.	gt;20 dim.

RESULTAAT VAN ÉÉN INJECTIE.
Groep	Na 11 dgn.	Na 18 dgn.
i cc. tetanus anat.	1 dim. cavia tetanus f 4 amp; 5 dgn.	1nbsp;dim. zware tot. 2nbsp;dim. t 3 dgn.
Contrólo	1 dim. tetanus t 3 ^^ 4 dgn.	1 dim. tetanus t 3 dgn.

	tabel 3.
resultaat van één	injectie.
Groepen	Na 2 weken.	Na 2J week.
} cc. tetanus anatoxine	1 dim. tetanus t 4dgn.	I dim. tetanus t 8dgn.
1 cc. tetanus anatoxine	1 dim. tetanus t 8dgn.	1 dim. lichte tetanus
2 cc. tetanus anatoxine	1 dim. tetanus f op den duur	1 dim. geen ver- schijnselen.
contrôle	1 dim. tetanus t 3amp;4dgn.	1 dim. tetanus t 3dgn.

			- HARTPUNCTIE
Ie	inj.	2e inj. na	Na	Na	Na
	10 dgn.	14 dgn.	35 dgn.	60 dgn.
1	cc.	1 cc.	lt; 100	iets gt; 100	lt; 200
tet.	anat.	tet. anat.	dim.	dim.	dim.
		Na	20 dgn.
		14 dgn.	na 2e.	32 dgn.	70 dgn.
1	cc.	1 cc.	lt; 100	lt; 200	lt; 200
tet.	anat.	tet. anat.	dim.	dim.	dim.
		Na	40 dgn.
		35 dgn.	na 2e
1	cc.	1 co.	iets
tet.	anat.	tet. anat.	gt; 16000
			dim.

Groepen le injectie	Na 1 week „ 2 weken	Na 3 weken	Na 4 weken	Na 5 mJid.
I	1 cc. tetan. anat.	1 co. tetanus anat.	1 co. tetanus anat.	1000.-2000 d.l.m.
II	i cc. tetanua anatoxine	1 cc. tetanus anatoxine	1 cc. tetanus anatoxine	50—260 d.l.m.	met 20.000 d.l.m. cavia t 1 dag
III	1 cc. tetanus anatoxine	J cc. tetanus anatoxine	i cc. tetanus anatoxine	1000-2000 d.l.m.	met 20.000 d.l.m. cavia t 4 dgn.
	Opmerkingen:	de aangegeven tijden hebben betrekking op do le injectie

Grosp	Na	Na	Na	Na	Na
	15 dgn.	15 dgn.	19 dgn.	28 dagen	30 dagen
J cc.	1 dim.		1 d.l.m.	1 dim.	2 dim.
tetanus	tetanus		tetanus	zeer zwaren	tetanus
anatoxine	t 4 dgn.		t 6 dagen	tetanus.	t 3 dgn.
1 cc.	1 dim.	2 dim.	1 dim.	100 dim.	600 dim.
tetanus	tetanus	tetanus	geen ver-	tetanus f	tetanus
anatoxine	t 6 dgn.	t 3 dgn.	schijnselen	? 3 weken	t 2 dgn.
		600 dim.
				t 2 dgn.
2 co.		2 dim.
tetanus		tetanus
anatoxine		t 6 dgn.
controle	1 dim.		1 dim.	1 dim.	1 dim.

	Ie inj.	Na 1 week	Na 2 weken	Na 3 weken	Na 5 weken
A.	1 cc. tetanus anatoxine	I co. tetanus anatoxine	I cc. tetanus anatoxine		lt; 2000 d.Lm.
B.	1 cc. tetanu s anatoxine		1 cc. tetanus anatoxine		lt; 2000 d.l.m.
C.	1 co. tetatnua anatoxine			1 cc. tetanus anatoxine	bijna 4000 d.l.m.

		18 dgn. na
		2e inj. hart-
2e injectie	reactie	punctie te-
2 weken na		vens serum-
le inj.		titratie.
1 co.	geene	iets
typhus.	lt;100dlm.
tetanus
anatoxine
1 co.	geene	± 60 dim.
tetanus
anatoxine