PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DEN
GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUUR-
KUNDE AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE
UTRECHT, OP GEZAG VAN DEN RECTOR-MAGNI-
FICUS, Dr. L. S. ORNSTEIN, HOOGLEERAAR IN
DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE,
VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNI-
VERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE
FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE TE
VERDEDIGEN OP MAANDAG 30 NOVEMBER 1931.
DES NAMIDDAGS TE 4 UUR

De voltooiing van dit proefschrift biedt mij de welkome gelegen-
heid, U, Oud-Hoogleeraren en Hoogleeraren aan de Rijksuniversi-
teit te Utrecht, van wie ik onderricht heb mogen ontvangen, daar-
voor mijn welgemeenden dank te betuigen.

Hooggeleerde \'^nt, Hooggeachte Promotor, ik beschouw het
als een groote eer, door U in de gelegenheid te zijn gesteld om dit
onderzoek, waartoe Gij de aanleiding gaaft, in Uw Laboratorium
te verrichten. Daarvoor en niet minder voor debizondere belang-
stelling, welke Gij steeds in mijn werk getoond hebt, ben ik U zeer
dankbaar. De prettige sfeer in het Botanisch Laboratorium, de
gezellige uren ook, die ik in Uw gastvrij huis heb mogen door-
brengen, hebben deze jaren tot de aangenaamste van mijn studie-
tijd gemaakt.

Hooggeleerde Kruyt, een groot voorrecht acht ik het. Uwe met
zooveel geest voorgedragen colleges in de phasenleer en de kolloid-
chemie te hebben kunnen volgen. Bovendien hebt Gij eenige uren
van Uw druk bezetten tijd willen afstaan voor enkele besprekingen
betreffende mijn werk en voor het doorlezen van een deel van het
manuscript van dit proefschrift, waarbij ik menige waardevolle
raadgeving van U mocht ontvangen. Voor dit alles ben ik zeer
erkentelijk.

Hooggeleerde Cohen, de eisch van exactheid in denken en han-
delen, welke Gij steeds aan Uwe leerlingen stelt op Uw colleges en
practica in de physische chemie, is op mijn vorming van grooten
invloed geweest; ik dank U daarvoor zeer.

Hooggeleerde Ruzicka, aan U heb ik een groot deel van m\'jn
practische zoowel als theoretische vorming op hc. gebied van de
organische chemie te danken.

Doch ook aan Uw colleges en practica, die ik in de eerste ^aren
van mijn studietijd gevolgd heb, Hooggeleerde Van Romburgh,
behoud ik steeds de aangenaamste herinnering.

Tenslotte zou ik een woord van dank willen richten tot het per-
soneel van het Botanisch Laboratorium, dat mij in menig opzicht
van dienst is geweest; in het bizonder dank ik U, waarde A. de
Bouter, voor de fraaie uitvoering der teekeningen.

1 — In het jaar 1889 promoveerde te Amsterdam H. P. Wijs-
man op een dissertatie, getiteld: „De diastase, beschouwd als meng-
sel van maltase en dextrinasequot;. Hierin werd op een geheel bizondere
wijze aangetoond, dat moutextract twee, onafhankelijk van elkaar
bestaande amylasen bevat. De methode van Wijsman berust op
het verschillend gedrag van de beide enzymen in zetmeelhoudende
gelatine. Wanneer men in een Petrischaal een gelatineplaat giet,
die behalve 8 % gelatine ongeveer l % oplosbaar zetmeel bevat en
men brengt daarop een druppeltje moutextract, dan diffundeert
van daar uit de amylase in de omringende gelatine en tast daarbij
het zetmeel aan. Het fraaiste krijgt men dit verschijnsel te zien,
wanneer men na een diffusie van eenige dagen de plaat met een
verdunde oplossing van jodium in joodkalium overgiet. Er vertoont
zich dan op een diepblauwe ondergrond een rond diffusieveld, dat
uit twee deelen bestaat: een kleurloos centrum, omgeven door een
paarsen ring (fig. la). De begrenzing van de beide gebieden is
scherp, wanneer men de proef op de juiste wijze uitvoert i).

Dit verschijnsel nu is volgens Wijsman als volgt te verklaren:
moutextract bevat twee amylasen, die met verschillende snelheid
in de gelatine diffundeeren. Het enzym, dat het snelst diffundeert,
krijgt een voorsprong op het andere en de paarse ring geeft het
gebied aan, waar alleen dit enzym op het zetmeel heeft ingewerkt
Het laat daarbij een stof achter, die met jodium een paarse reactie
vertoont. Door het andere, langzamer diffundeerende enzym, wordt
deze stof vervolgens afgebroken tot een product, dat zich met
jodium niet meer kleurt.

Dat zich in den ring slechts één der beide enzymen bevindt
wordt aangetoond, door met een steriel mesje uit een ring dié
met met jodium behandeld is, een stukje uit te snijden en dit nu
weer op een zetmeel-gelatineplaat te leggen. Er vertoont zich dan
na eemge dagen en behandeling met jodium om het stukje een
zuiver paars diffusieveld, zonder kleurloos centrum.

De diffusiemethode kan, onder zekere voorzorgen, gebruikt wor-
den om aan te toonen hoe de verhouding der beide amylasen ver-
andert onder den invloed van verschillende omstandigheden. Im-
mers zal een vermeerdering of vermindering van het eiizym dat
den paarsen ring vormt, de „maltasequot;, een verbreeding resp ver-
smalling van dien ring tengevolge hebben.

Door Wijsman werden nu, met behulp van zijn methode de
volgende feiten vastgesteld.

a.nbsp;Verwarming van moutextract op 70° C. leidt tot het steeds
smaller worden van den ring. Na een verhitting van ongeveer
10.min. vertoont het extract nog slechts een kleurloos diffusieveld
(fig. \\c). Het is dus mogelijk, door verwarming op 70° de „maltasequot;
grootendeels of misschien zelfs geheel uit het mengsel te verwijde-
ren. Het ontbreken van den ring is echter geen zeker bewijs voor
de enkelvoudigheid i) van het praeparaat. Een relatief geringe
hoeveelheid „maltasequot; immers is welhcht niet in staat de grens
van het kleurlooze diffusieveld te bereiken.

b.nbsp;Onder den invloed van zwakke zuren, b.v. van melkzuur,
wordt de paarse ring naar verhouding breeder; daaruit blijkt, dat
in zwak zuur milieu de „dextrinasequot; sneller geïnactiveerd wordt
dan de „maltasequot;.

Wanneer men de amylase met alcohol van verschillende con-
centratie neerslaat, dan vertoont de met verdunden alcohol neer-
geslagen fractie smallere ringen dan het deel, dat pas doorgecon-
centreerden alcohol wordt uitgevlokt; het is dus mogelijk, door
gefractioneerde praecipitatie met alcohol een gedeeltelijke scheiding
der beide enzymen te bewerksteUigen.

£. De belangrijkste ontdekking wellicht, die Wijsman met be-
hulp van zijn methode heeft kunnen doen is de locahsatie der

1) Onder de .^enkelvoudigheidquot; van een amylasepraeparaat wordt hier
en in den vervolge verstaan, dat het slechts een der heide enzvmen bevat.

beide amylasen in de moutkorrel. „Maltasequot; en „dextrinasequot; wor-
aen in verschillende weefsels aangetroffen. De „maltasequot; ontstaat
uitsluitend in het melige endosperm, de „dextrinasequot; in de aleuron-
laag en m het cylinder-epitheel van het scutellum. De „dextrinasequot;
treedt het eerst in de aleuronlaag op, later in de kiem; gedurende
de kieming diffundeert zij naar het inwendige van de korrel en de
oplossing van het zetmeel geschiedt onder den invloed der beide
enzymen. Het rustende zaad bevat uitsluitend, of tenminste in
iioofdzaak „maltasequot;. Dit feit stelde Wijsman in de gelegenheid
om een enkelvoudig praeparaat van dit enzym te bereiden. Hij ging
«iaarbij uit van geparelde gerst, d.w.z. van ongekiemde gerst, waar-
van door een bepaalde wijze van malen de kiem en de aleuronlaag
verwijderd zijn. Een dergelijk praeparaat vertoont enkel een paars
aitfusieveld (fig. 15).

Gm na.te gaan, bij welke onderdeelen van het omzettingsproces
de maltose gevormd wordt, heeft Wijsman gebruik gemaakt van
de door Bevehinck ontdekte eigenschap van een lichtgevende
bacterie {Photobaaerium phosphorescens, Beyerinck). om maltos!
te verg-isten onder het vertoonen van een lichtverschijnsel, zetmeel
en dextrine daarentegen niet. Cultiveert men nu deze bacterie op
een zetmeelhoudende vischgelatine-plaat en laat men hierin mout-
amylase diffundeeren, dan ziet men een lichtverschijnsel op de
plaats waar maltose ontstaat. Het bleek, dat dit het geval was

aan den buitenrand van den paarsen ring, niet echter aan den rand
van het kleurlooze diffusieveld.

Op grond van zijn proeven kwam Wijsman tot het onderstaande
schema voor de werking der beide enzymen.

Tusschen haakjes staat aangegeven, of de producten al dan niet
een reduceerend vermogen bezitten en een reactie geven met
jodium. Volgens Wijsman kunnen dus heide enzymen het zetmeel
rechtstreeks aantasten onder vorming van reduceerende producten
(maltose en maltodextrine). Daarbij doet echter alleen de „dextri-
nasequot; de jodiumreactie verdwijnen, terwijl aan de andere kant
alleen de „maltasequot; tot de vorming van maltose aanleiding zou
kunnen geven.

Van de tusschenproducten verdient de erythrogranulose vermel-
ding. Dit product ontstaat door zetmeeloplossing zoo lang met
maltasequot; te bewerken tot geen verdere omzetting plaats heeft
Met alcohol kan het uit het reactiemengsel worden neergeslagen al
of met na verwijdering van de maltose door vergisting. In beide
gevallen kan het geheel vrij van maltose verkregen worden. Door
„maltasequot; wordt het niet omgezet. Terecht noemt Wijsman het
een „granulösequot; en niet een dextrine, daar het alle kenmerken van
het oorspronkelijke zetmeel bevat, terwijl men onder dextrinen
ajhraakproducten verstaat, welke altijd een reduceerend vermögen
bezitten.nbsp;®

In den loop van onze beschouwingen zal blijken, dat dit product
in meer of minder zuiveren toestand onder verschillende namen
een belangrijke rol heeft gespeeld bij het zetmeelonderzoek en dat
ook wij er een bizondere aandacht aan hebben moeten besteden.

Het onderzoek van Wijsman draagt er de sporen van, dat het
uit het werk van Beyerinck is voortgekomen; de voor de bac-

tenologie zoo vruchtbaar gebleken „auxanografische methodequot; is
er duidelijk m te herkennen. Het is trouwens ook Beyerinck i)
( geweest, die ontdekt heeft, dat men een mengsel van twee stoffen
sciieiden kan door diffusie in gelatine-gel. Op een cultuurplaat van
iU /O gelatine bracht hij een druppeltje ferrichloride. Er ontstond
een brum diffusieveld van ferrihydroxyde, omgeven door een ring
^^elke zoutzuur bevatte, waarvan de aanwezigheid bleek uit een
verdieping in het oppervlak der gelatineplaat aan den buitensten
rand van den ring. Een nog merkwaardiger experiment was dat,
waarbij hij een mengsel van zoutzuur- en zwavelzuuroplossing liet
diffundeeren. Ook hier was aan een verdieping in de gelatine te
zien, hoe ver het zuur zich in de plaat had uitgebreid. Behandelde
y nu zulk een plaat met een oplossing van bariumchloride, dan
on^tond alleen in het centrum een neerslag van sulfaat.

De door Wijsman uit het diffusiebeeld van de moutamylase ge-
bokken conclusie wordt door deze proeven wel gerechtvaardigd
De vraag, wat er nu in de gelatineplaat precies gebeurt, is niet
gemakkelijk te beantwoorden. Het verschijnsel laat zich op grond
van onze tegenwoordige kennis van de structuur der gelen nog het
beste beschouwen als een soort „capillair-analysequot;, zooals die door
Goppelskoeder xnet behulp van filtreerpapier is toegepast op

Het werk van Wijsman, waarvan hier in het kort een overzicht
gegeven werd, is door de meeste onderzoekers, die zich na 1890
met de moutamylase hebben bezig gehouden, vrijwel niet opge-

^^^ ^^^ te bespreken pubhcatie
van Beyerinck vindt men nergens iets vermeld omtrent een her-
haling van de diffusie-proeven of een poging, daartoe gedaan Toch
moet aan deze proeven een bizondere beteekenis worden toegekend
Het 18 herhaalde malen geconstateerd, dat moutamylase na ver\'
hitting, of na het brengen op een betrekkelijk hoogen zuurgraad,

1)nbsp;M. W. Beyerikck. Zts. ƒ. Physikal. Chem 3 110 nsso^nbsp;\'
Verzamelde Geschriften, Delft (1921], Deel II pag SS^

van eigenschappen verandert; deze feiten vormen echter nog geen
bewijs voor de aanwezigheid van twee enzymen. Terecht merkt
Kuhn i) hieromtrent het volgende op:

„Für katalytische Hydrierungen mit Platinmohr geht z.B. aus
„einer Untersuchung von R. Willstaetter und D. Hatt hervor,
„dass ein Katalysator, der zunächst auf zwei Stoffe A und B Was-
.,serstoff zu übertragen vermag, nach gewissen Veränderungen nur
„noch A hydrieren kann, während er gegenüber B vollkommen
„wirkungslos geworden ist. Diese Erscheinung, dass eine Ferment-
„lösung, die ursprünghch den Umsatz von zwei Stoffen katalysiert,
„nach dem Erhitzen oder anderen Veränderungen nur noch eine der
„beiden Wirkungen aufweist, kann somit ohne nähere Prüfung
„nicht als sicherer Beweis für das Vorhandensein von zwei Fer-
„menten mit verschiedener Stabilität, z.B. Amylase und Dextri-
„nase, geltenquot;.

De diffusieproef nu is tot dusver het eenige experiment, dat ons
in staat stelt om zonder dergelijke ingrijpende behandehngen, een
scheiding tusschen de beide bestanddeelen der moutamylase te
weeg te brengen.

In de tweede plaats hebben de snelheid en het gemak, waarmee
de proef, gegeven een zekere routine, is uit te voeren en de uiterst
geringe hoeveelheid enzym, welke er slechts voor noodig is, het aan
Wijsman mogelijk gemaakt om een zoo groot gebied te bestrijken,
als in geen ander onderzoek het geval is geweest.. Toen de door
hem in één verband waargenomen verschijnselen later afzonderlijk
door verschillende onderzoekers teruggevonden werden, is deze
samenhang weer verloren gegaan. De veronachtzaming van het
werk van Wijsman, waarover Beyerinck reeds in 1895 klaagde,
heeft de ontwikkehng der enzymchemie op dit punt dus wezenlijk
vertraagd.

Van minder belang moeten de proeven met lichtende bacteriën
geacht worden. Zij geven ons slechts qualitatievé resultaten, terwijl
gebleken is, dat het juist de hoeveelheid gevormde maltose is, die
ons een dieper inzicht in de werking der enzymen kan verschaffen.
Daar komt dan nog bij, dat die qualitatieve resultaten van Wijs-
man, voor zoover zij de „dextrinasequot; betreffen, aan twijfel onder-
_lt;

evig zijn. Volgens Wijsman zou de „dextrinasequot; uit zetmeel enkel
maltodextrine vormen, geen maltose. Toch heeft hij bij de werking
van dit enzym een lichtverschijnsel waargenomen, dat hij echter
toeschreef aan een geringe hoeveelheid „maltasequot;, die zich nog in
zijn praeparaat zou hebben bevonden. Reeds Beyerinck kwam,
zooals wij dadelijk zullen zien, tot een andere conclusie, terwijl uit
onze ervaringen volgt, dat een volgens Wijsman bereid praeparaat
van „dextrinasequot; in het geheel geen „maltasequot; meer bevat. Het
door Wijsman opgestelde reactieschema is dus op dit punt niet
juist gebleken. Het was trouwens al onwaarschijnlijk, dat het eind-
resultaat van de inwerking verschillend zou zijn, al naar de volg-
orde, waarin de beide amylasen werken.
Aan de andere kant echter dient er op gewezen te worden, dat
ijsman de eerste en tot 1925 de eenige is geweest, die de meening
heeft uitgesproken, dat heide amylasen in staat zijn rechtstreeks op
het zetmeel in te werken. Het is gebleken, dat deze voorstelling
als juist moet worden beschouwd in tegenstelling tot de lang ge-
huldigde opvatting, volgens welke het eene enzym het zetmeel zou
„oplossenquot; tot de vorming van een dextrine, terwijl pas daarna
het andere enzym uit dit dextrine maltose zou kunnen vormen.

omvangrijke literatuur over de moutamylase
zal hier alleen dat deel besproken worden, dat zich bezig houdtquot; met
de kwestie der beide enzymen of dat daarmee in nauw verband is
gebleken te staan.

Reeds in 1890 verkrijgt het onderzoek van Wijsman op een
enkel punt een bevestiging door het werk van Brown en Morris i)
die, onbekend met Wijsman en onafhankelijk dus van de diffusie-
methode, tot de ontdekking komen, dat het endosperm van onge-
kiemde gerst een weinig werkzaam enzym bevat, dat niet zetmeel-
oplossend werkt, terwijl bij de kieming door het epithelium van
het scutellum een ander enzym wordt afgescheiden, dat het zet-
meel gemakkehjk oplost. Het eerste enzym noemen zij „translo-
catie-diastasequot;, het tweede „secretie-diastasequot;.

In 1895 heeft Beyerinck i) een onderzoek gepubhceerd over het
voorkomen van ,,glucasequot; (het enzym, dat wij tegenwoordig maltase
noemen) in verschillende organismen; daarbij wordt echter ook
veel aandacht aan de zetmeelsplitsende enzymen besteed. Het
onderzoek van Wijsman wordt uitvoerig beschreven en een groot
deel der proeven herhaald. Beyerinck vindt, dat het enzym, dat
uit het scutellum diffundeert, naast maltodextrine ook maltose
vormt. Hij noemt dit enzym ,,granulasequot; en meent, dat de ,.dextri-
nasequot; van Wijsman als een daaruit door verhitting ontstaan kunst-
product moet worden beschouwd. Door de verhitting zou het
suikervormend vermogen verdwenen zijn en alleen het dextrine-
vormende overgebleven. Het gelukte Beyerinck echter niet de
,,granulasequot; van andere graansoorten door verhitting in ,,dextri-
nasequot; om te zetten. Wij hebben reeds uiteengezet, dat ook uit
de proeven van Wijsman tot de maltose vorming van ,,dextrinasequot;
moet worden besloten. Wat echter aan allen twijfel, op dit punt,
een einde maakt, is het door mij geconstateerde verschijnsel, dat
verhitting van de ,,dextrinasequot; het suikervormend vermogen aan-
zienlijk bevordert. ,,Granulasequot; en ,.dextrinasequot; zijn dus wel een en
hetzelfde enzym.

Een geheel andere twee-enzymen-theorie ontmoeten wij in een
artikel van Pottevin welke door alcohol neergeslagen amylase
laat inwerken op zetmeel en verschillende, door gefractioneerde
praecipitatie met alcohol van elkaar gescheiden, dextrinen. Hij
komt tot de conclusie, dat de reacties zetmeel-dextrine en dextrine-\'
maltose door verschillende enzymen worden gekatalyseerd. Het
verschil met de opvatting van Wijsman bestaat voornamelijk
hierin, dat volgens Pottevin slechts een der beide enzymen het
zetmeel rechtstreeks zou kunnen aantasten. Deze meening heeft
langen tijd voor de twee-enzymen-theorie van de moutamylase ge-
golden, latere onderzoekingen hebben de onjuistheid ervan echter
duidelijk aangetoond.

In 1902 ontdekt Baker 3), onbekend met Wijsman, een verschil
tusschen de enzymen uit gekiemde en ongekiemde gerst. Hij laat

1)nbsp;M. W. Beyerinck, Centr. f. Bact. Abt. 2, Bd. 1, 221, 265, 329 (1895).
Zie ook: Verzamelde Geschriften, Delft (1921), Deel III, pag. 128.

gerstamylase werken op oplosbaar zetmeel bij 50° en vindt dan na
^ uur 60 0/ van de theoretisch mogelijke hoeveelheid maltose en
als rest een „dextrinequot;, dat een blauwe kleur geeft met jodium en
zwak reduceert. Na lange inwerking werd de jodiumreactie violet
Hij noemt dit restproduct. dat met alcohol uit het reactiemengsel
kan worden neergeslagen a-amylodextrine. Het is een wit poeder
moeihjk oplosbaar in koud, beter in kokend water, dat een soeci\'
fieke rotatie vertoont van 190-195°. Door moutamylase wordt
het omgezet onder verdwijning van de J-reactie. Klaarblijkelijk
hebben wij hier dus met hetzelfde product te doen als de .erythro
granulösequot; van Wijsman. De zwakke eigenreductie zar wÏÏ het
gevolg geweest zijn van een geringe omzetting door de „dextrinas^\'

Bij dit werk van Baker sluiten zich nu, behalve latere onder-
zoekingen van Baker zelf, die van Ling en Sjoeberg aan Ter-
wille van de overzichtelijkheid zullen deze pubhcaties hier bij elkaar
behandeld worden, al moet de chronologische volgorde daardoor
worden onderbroken.

Baker en Hulton i) onderzoeken de amylase uit ongekiemde
rogge en haver. In beide gevallen vinden zij een verdergaande
suikervorming dan bij ongekiemde gerst. Met rogge ging de reactie
tot 72 %, echter trad bij 60 een sterke remming op. Met onge-
kiemde haver werd zelfs een suikervorming tot 96 o/^ bereikt hier
was een remming bij 60 % niet meer te onderscheiden. Als substraat
gebruikten zij oplosbaar zetmeel volgens Lintner.

Het onderzoek van Ling en Nanji 2) is vooral van beteekenis
voor de chemie van het zetmeel. Zij zijn van meening, dat zetmeel
uit twee chemisch verschillende componenten bestaat amylosequot;
en .amylopektinequot; 3) en dat men deze componenten kan scheiden
met behulp van amylase uit ongekiemde gerst. Gerstamylase, ge-
droogd met geconcentr. alcohol doet de „amylosequot; quantitatief in
maltose overgaan, terwijl de „amylopektinequot; nauwelijks wordt

„amylopektinequot; wel aan en vormt er een product uit, dat zij ge-
polymeriseerdquot; a-^-hexa-amylosequot; noemen. Deze stof vertoont
nagenoeg dezelfde eigenschappen als de a-amylodextrine van Baker
en de erythrogranulose van Wijsman, Ling en Nanji komen tot
de conclusie, dat „amylosequot; en „amylopektinequot; zich in het aard-
appelmeel bevinden in de verhouding 2 : I of in procenten 66,6 %—
33,3 %. Baker en Hulton (1929) oefenen kritiek uit op deze mee-
ning naar aanleiding van hun proeven met ongekiemde haver,
welke 96 % maltose vormde. Niet een van deze onderzoekers echter
is bekend met Wijsman en heeft geweten, dat het gebruik van onge-
kiemde granen volstrekt geen waarborg is voor het werken met een
enkelvoudig enzym. Niet zonder reden is Wijsman van geparelde
gerst uitgegaan!

Een derde onderzoeker, die van de tegensteUing gerstamylase:
moutamylase uitgaat, is Sjoeberg i). Ook hij vindt, dat oplosbaar
zetmeel door amylase uit ongèkiemde gerst voor 59—61 % in
maltose wordt omgezet Dat dit werkelijk een afbraak-grens is en
geen evenwicht, toont hij aan, door tijdens de omzetting te dialy-
seeren. Daardoor wordt de maltose verwijderd, de vloeistof binnen
de membraan geeft na afloop van de omzetting echter nog een
zuiver blauwe jodiumreactie. „Die Enzymlösung verhält sich also
„nicht wie diejenige, welche man gewöhnlich durch Extraktion von
„Malz bekommt, sondern sie scheint einen Teil der enzymatischen
„Tätigkeit nicht zu habenquot;. Sjoeberg en Eriksson vinden dan,
dat er twee enzymen moeten worden onderscheiden, waarvan het
eene maltose vormt, terwijl het andere de jodiumreactie doet ver-
dwijnen. Er is echter niet alleen verschil in ,,zetmeelsplitsendequot; en
,,suikervormendequot; werking, maar ook de afkomst der praeparaten
doet er toe. Zij hebben ook gewerkt met ,,amylosequot; en ,,amylopek-
tinequot;, dat zij bereiden volgens Gatin-Gruszewska en vinden,
in tegenstelling met Ling en Nanji, dat „amylosequot; niet volledig
wordt omgezet door gerstamylase. Eenig wezenlijk verschil tusschen
de beide ,,componentenquot; van het zetmeel vinden zij ook niet.

1)nbsp;K. SjöBERG, H. 131, IIC (1923); K. Sjöberg und E. Eriksson,
H. 139,118 (1924). (H = Hoppe-Seyler\'s Zeitschr. f. Physiol. Chemie).

onderzoekingen terug en zullen daar zien, dat door verschillende
onderzoekers onder „amylopektinequot; zeer verschillende stoffen ziin
verstaan.

Keeren wij nu weer tot de oudere publicaties terug, dan vinden
wij allereerst een mededeeling van Fraenkel en Hamburg i) welke
vermeldmg verdient. Het schijnt hen namelijk gelukt te zijn bii
dialyseeren van een oplossing van moutamylase tegen steriel water
een scheidmg te krijgen tusschen de beide enzymen In het water
gaat m hoofdzaak de „versuikerendequot; werking, terwijl de „zetmeel-
oplossende bhmen de membraan blijft. Het suikervormend enzym
(de „mal ase ) vertoont dus ook blijkens deze proeven de grootste
beweeglijkheid of de geringste neiging om geadsorbeerd te worden

Chrzaszcz 2) heeft de beide werkingen gescheiden door gefrac-
tioneerde praepicitatie van moutextract met ammoniumsulfaat
In de eerste fractie gaat meer de „zetmeeloplossendequot; werking, in
de middelste en hoogste meer de „suikervormendequot;. Dit komt dus
volkomen overeen met wat door Wijsman gevonden is bij de ge-
fractioneerde praecipitatie met alcohol,

Sherman en Schlesinger die zeer actieve praeparaten heb-
ben gemaakt door praecipitatie van gedialyseerd moutextract met
alcohol of aceton, onderscheiden twee werkingen of „krachtenquot; in
de amylase, de „zetmeeloplossendequot; (amyloclastic power) en de
„suikervormendequot; (saccharogenic power) en schrijven die toe aan de
aanwezigheid van twee enzymen, waarvan het eene het zetmeel
afbreken zou tot dextrine, het andere de dextrine tot maltose. Een
opvatting dus, welke met die der Fransche onderzoekers (Potte-
vin), niet met Wijsman, in overeenstemming is. De werking van
het „zetmeeloplossendquot; enzym wordt gemeten met de jodium-
methode, waarbij wordt nagegaan, hoeveel enzym in 30 min. bij
40° C. de jodiumreactie geheel doet verdwijnen; die van het „suiker-
vormendquot; enzym door bepaling van het reduceerend vermogen van
het reactiemengsel, 30 min. na het begin van de reactie. Zij komen
tot de conclusie, dat er geen quantitatief verband is tusschen de

1)nbsp;S. Fraenkel und M. Hamburg, Beitr. Chem. Physiol u Path 8
389 (1906).nbsp;^ • ^ •

zetmeelsplitsing en de suikervorming; het verdwijnen van de
jodiumreactie is geen maat voor de hydrolyse van het zetmeel
(amylum solubile volgens Lintner).

Hierbij kan worden opgemerkt, dat het resultaat van dit onder-
zoek schijnbaar in overeenstemming is met de theorie. Het is later
gebleken, dat beide enzymen suiker vormen (zooals Wijsman
trouwens al vermeldt), terwijl echter slechts bij de werking van het
ééne de jodiumreactie verdwijnt. Het spreekt wel vanzelf, dat men
deze verschijnselen niet kan onderscheiden, zoolang men met een
mengsel der beide enzymen werkt. Eenige latere onderzoekingen
van Sherman zullen elders besproken worden.

De opleving der enzymchemie na 1920 onder invloed van de
door Willstaetter i) ingevoerde methode der selectieve ad-
sorptie, doet zich ook gelden op het gebied der moutamylase. Dit
enzym schijnt zich echter voor de genoemde methode slecht te
leenen, de meeste onderzoekers werken met, al dan niet door dialyse
gezuiverd, moutextract.

Hizume 2) doet vergelijkende proeven tusschen de „oplossendequot;
werking op zetmeelstijfselpap en de „suikervormingquot; van mout-
extract (zonder verdere zuivering). Hij acht het resultaat van
Fraenkel en Hamburg niet juist, omdat zij slechts een gedeel-
telijke scheiding tusschen de beide werkingen konden verkrijgen.
Bij activeerings-proeven met verschillende zouten vindt hij een
volledig parallehsme tusschen de „suikervormendequot; en de „zet-
meeloplossendequot; kracht.

Wij komen dan tot een publicatie van Syniewski de eenige,
die meer dan een oppervlakkige beschouwing wijdt aan het werk
van Wijsman. De meeste onderzoekers nemen aan, dat er naast
een zetmeeloplossend-dextrinevormend enzym een dextrineafbre-
kend-suikervormend bestaat. Dit is geen ware twee-amylasen-
theorie, want alleen het eerstgenoemde enzym zou met recht een
amylase mogen heeten. Een ware twee-amylasen-theorie vinden we
bij Wijsman. Wijsman had echter weinig succes door zwakke be-

1)nbsp;R. willstätter, Ber. Chem. Ges. 55, 3G01 (1922), zie ook M. Grass-
mann, Neue Methoden und Ergebnisse der Enzymforschung, München
(1928). ,

wysvoenng en door de onwaarschijnlijkheid van zijn reactieschema.
Syn ewski neemt met Wijsman aan. dat er twee enzymen zijn,
die allebei maltose vormen. Het enzym uit de ongekiemde gers

Wij hebben reeds vermeld, dat het onjuist is, een niet reducee-
rend product een dextrine te noemen. Verder is het wel IT
waardig, dat Synikwski niets meedeelt omtrent een herhal n^van
de ^eproeven, die toch de kern van Wijsman\'s onderzoek uÏt
maken en dat hij zonder nadere contrôle aanneemt, dat onge-
kiemde (met geparelde) gerst een volkomen enkelvoudig enzvm-
praeparaat oplevert. Bovendien vermeldt hij bij zijn activiteits-
bepahngen niets omtrent den zuurgraad, waarbij zij geschiedden
Heel veel wijzer worden we dus niet door Syniewski

Hetzelfde kan niet gezegd\' worden van het werk van Ohlsson i)
dat als een der belangrijkste onderzoekingen van den laatsten tijd

guELOT (1887), heeft hij het gedrag van moutextract bij verschil-
ende temperaturen en zuurgraden aan een zeer nauwkeurironde .
zoek onderworpen. De activiteit van het dextrinevormende enzym
door hem dextrmogeen-amylasequot; genoemd, werd bepaald met d^
jodmmmethode van Wohlgemuth 2), die van het suiLrvormende
enzym, de , saccharogeen-amylasequot;, met de methode der quantita-
tieve suikerbepahng volgens Bang 3). De enzymen vertogen een
oodanig verschillende gevoeligheid voor verhooging van te \' e

Cl pnospnaat toe tot pH 6,0, dan is nog 70—80 0/ van
lt;ie oorspronkelijke „suikervormingquot; over, tegen slelts I-sT
van de „dextrmevormingquot;. Verhit men daarentegen het extract

gedurende 15 min. op 70° C. dan is van de „dextrineerendequot; werking
nog 75 % over, terwijl de „suikervormingquot; zeer gering geworden is.
Geheel verdwijnen doet zij echter niet, ook niet bij voortgezette
verhitting. Van deze beide praeparaten heeft Ohlsson vervolgens
de pH-kromme bepaald. De werking van de „saccharogeenamylasequot;
is optimaal bij ca. pH 4,9 met een langzame daling naar de alka-
lische zijde, de „dextrinogeen-amylasequot; vertoont haar hoogste
werking bij pH 5,75 met een veel steiler verloop van de kromme.
. Hier hebben wij dus een nieuw en zeer belangrijk argument voor de
twee-enzymen-theorie. Bovendien blijkt uit dit onderzoek, dat
beide enzymen rechtstreeks op het zetmeel vermogen te werken en
dat ook de „dextrinogeen-amylasequot; in staat is suiker te vormen, zij
het in geringere hoeveelheid dan de „saccharogeen-amylasequot;. Toch
zijn er nog wel eenige bezwaren tegen het werk in te brengen. Om
te beginnen wijkt de „saccharogeen-amylasequot; hierin af van de
„maltasequot; van \\vijsman, dat zij op den duur de jodiumreactie doet
verdwijnen; welHcht is zij dus niet geheel enkelvoudig. Verder kan ,
het feit, dat gewerkt werd met ongedialyseerd moutextract, dat
altijd een meer of minder groote hoeveelheid suikers bevat, op het
gedrag der enzymen van invloed zijn geweest. Wel heeft Ohlsson
telkens blanco-bepalingen gedaan, maar de reeds bij voorbaat aan-
wezige maltose in het reactiemengsel zal stellig remmend gewerkt
hebben op de suiker vorming, wat vooral bij de „dextrinogeen-
amylasequot; van beteekenis kan zijn geweest

Een tegenstander van de twee-enzymen-theorie vinden we in
Nishimura 2). Terwijl,Ohlsson met oplosbaar zetmeel werkte, doet
Nishimura zijn proeven met gewoon aardappelmeel en bepaalt het
,.oplossendquot; vermogen van zijn amylase-praeparaat (moutextract)
door meting van de viscositeit. Bij verwarming van het enzym
neemt de „versuikeringquot; sneller af dan de „oplossingquot;, de beide
werkingen zijn echter niet te splitsen. Verschuift men den zuur-
graad, waarbij de reactie verloopt, van pH 6,0 naar pH 3,0 dan
wordt daarentegen de „oplossendequot; kracht sterk geremd, de „sui-
kervormendequot; weinig. Zooals men ziet dezelfde feiten, die Ohlsson
geconstateerd heeft. Dat de beide „werkingenquot; niet te splitsen zijn,

werkt. Nishimura komt tot de slotsom, dat er niet twee enzymen
zi^ maar één, met een „activatorquot;. De „activatorquot; wordt bij
pH 3 geïnactiveerd, bij pH 7,4 is hij weer actief. Bij 70° wordt het
eigenlijke enzym sterk beschadigd, de.„activatorquot; blijft intact

stof op ztchze f geen enzymatische werking uitoefent. Nemen wii dit
in acht, dan komt de voorstelling van Nishimura op hetzelfde neer
als die van Ohlsson.

Een andere en zeer heftige tegenstander van de twee-enzymen-
theor IS SABAUTSCHKA^). Ook hij werkt met moutextrJcT en
drukt zoowel de „dextrineerendequot; werking als de „versuikerendequot;
. mt in den vorm van reactiesnelheidskonstanten k. en kd, waartoe
nij met alleen let op het verdwijnen-van de jodiumreactie maar
ook op een aantal tusschentinten, die hij reproduceert met behulp
van orgamsche kleurstoffen. Het quotient kz: kd vindt hij nagenoeg
gehjk aan 1. Na adsorptie van de amylase aan kaoline bij pH 4 4
en elutie bij pH 7,6 is de werkzaamheid 15-17 maal zoo groot als
die van het oorspronkelijke moutextract, zonder dat het quotient
k^ : kd veranderd is. Dit pleit dus volgens Sabalitschka voor de
eenheid der beide werkingen. Een voorbehandehng van het extract
fnbsp;\' ^^^ quotient evenmin veranderen. Alleen in

„geheel bizondere gevallenquot; is de k van de monomoleculaire reactie
met konstant en krijgt ook het quotient een hoogere waarde (tot
1180 toe). Dit gebeurt bij moutextracten, die aan een zuurgraad
hooger dan pH 4,0 blootgesteld waren, bij door ouderdom ver-
^urde praeparaten en bij versehe extracten van ongekiemde gerst
Hier wordt slechts 60 van de theoretische mogelijke hoeVeelheid
maltose gevormd, terwijl de jodiumreactie pas tegen\' het eind der
suikervormmg een kleuromslag vertoont. Het „dextrineeringsver-
mogen is hier volgens S. echter slechts schijnbaar sterker vermin-
derd, dan de suikervorming. „Solange die Verzuckerungskinetik den
von uns a s „normalquot; angenommenen Typ zeigt, liegt auch der
„Quotient kz: kd stets nahe am 1quot;.

Het zal duidelijk zijn, dat de redeneering van Sabalitschka
berust op een willekeurig gebruik van het begrip „normaalquot;. Voor

het overige zijn ook hier de meeste feiten weer dezelfde als die
door andere onderzoekers geconstateerd werden. Wat de adsorptie-
proeven betreft, deze zouden onder veel meer gevarieerde omstan-
digheden uiJ;gevoerd moeten zijn, om iets te kunnen bewijzen.

Wij komen nu tot de bespreking van enkele publicaties, die wel
niet rechtstreeks betrekking hebben op het twee-enzj^men-pro-
bleem, maar die daarmee toch in nauw verband zijn gebleken te
staan. De oudste betreft een onderzoek van Mlle. Philoche i)
waaruit wij alleen dat deel zullen lichten, dat voor ons van belang
, is. Mlle. Philoche vergelijkt de hydrolyse van oplosbaar zetmeel
en glycogeen door moutamylase en pankreas-amylase. Een be-
paalde hoeveelheid moutamylase geeft met glycogeen een veel ge-
ringer maltose-vorming, dan met een zelfde hoeveelheid zetmeel
onder gelijke omstandigheden. Om gelijke hoeveelheden maltose te
krijgen, was met glycogeen 20—100 maal zooveel amylase noodig,
als met zetmeel. Bij pankreas-amylase doet zich dit verschil niet
voor. Beide enzymen werken in nagenoeg dezelfde mate op zet-
meel, met glycogeen daarentegen vertoont pankreas-sap een veel
sterkere werking dan moutextract. De schrijfster geeft in de vol-
gende bewoordingen een mogelijke verklaring van dit verschijnsel:
„Ce résultat est intéressant puisqu\'il démontre l\'existance d\'une
„adaptation de l\'amylase animale vis-à-vis du glycogène, produit
„qu\'elle hydrolyse habituellement, tandis que l\'amylase végétale
„du malt, ne rencontrant jamais de glycogène au cours de la vie
„de la plante, n\'est pas adaptée à l\'hydrolyserquot;.

,,Nous semblons donc retrouver dans les amylases elles-mêmes une
„sorte de spécificitéquot; (curs. van mij).

Deze veronderstelling van een verschillende specificiteit van
moutamylase en pankreas-amylase op grond van de verschillende
stoffen, welke zij hydrolyseeren, vindt nu een merkwaardige beves-
tiging in een onderzoek van Richard Kuhn 2) betreffende de ver-
schillende producten, die door de genoemde enzymen gevormd wor^
den bij de hydrolyse van oplosbaar zetmeel. Uitgaande van een
ontdekking van Brown en Morris bestudeert I^uhn de rotatie

van de bij de reactie gevo^nde maltose. Maltose bestaat, evenals
de monosacchariden in tw^^rmen, die een verschillend draaiings-
vermogen bezitten, a-ma%gt;^ en ^-maltose, die in oplossing in
elkaar overgaan tot een evenwichtstoestand bereikt is. Kuhn laat
nu verschillende amylasen bij matige temperatuur (20° C) snel
reageeren met een zeer heldere, door electro-dialyse gezuiverde
zetmeeloplossing en bepaalt dan de verandering van het draaiings
vermogen van het reactieproduct, voor en na de toevoeging van
een weinig Na-carbonaat. Door alkah wordt de omzetting der beide
maltose-vormen in elkaar n.1. zeer versneld.

ffij vindt dan, dat pankreas-amylase en „Takadiastasequot; (Asper-
gillus-amylase) een maltose vormen, waarvan het draaiingsver-
mogen daalt na toevoeging van alkali, terwijl het product van de
moutamylase (gedialyseerd moutextract) een stijging vertoont. Deze
verschijnselen kunnen verklaard worden, door aan te nemen, dat
bij de werking van pankreas-amylase en Aspergillus-amylase in
eerste instantie a-maltose ontstaat, welke dan onder den invloed
van alkaH overgaat in a-^-maltose, terwijl moutamylase tot het
ontstaan van ^-maltose aanleiding geeft, dat dan eveneens in
ö-^-maltose overgaat. Op grond hiervan onderscheidt Kuhn a-amy-
lasen en ^-amylasen. Het blijkt dus, dat pankreas-amylase en
moutamylase ook wat hun reactie-producten betreft, een verschil-
lende specificiteit bezitten. Bovendien gedragen zij zich nog in een
ander opzicht verschillend. Bij de werking van moutamylase op
oplosbaar zetmeel is de jodiumreactie nog blauw, wanneer reeds
60 % maltose gevormd is, bij 80 % is zij onder omstandigheden nog
bruin. Daarentegen verdwijnt met pankreasamylase de jodium-
reactie al bij 30—35 % maltose. Dit verschil kan volgens Kuhn
met verklaard worden door een depolymeriseerend (amyloclastisch)
enzym naast een versuikerend aan te nemen; het onderscheid ligt
in een verschillend verloop der beide hydrolysen. Wij zullen nog wel in
de gelegenheid zijn op het werk van Kuhn en Philoche terug te
komen. Hier zij tenslotte nog iets vermeld omtrent het jongste
onderzoek van Ohlsson i), dat bij Kuhn aansluit.

Nadat Ohlsson heeft opgemerkt, dat het gedrag van de dex-
trinogeen-amylasequot; zeer veel gelijkt op dat van pankreas- en Asper-

gillus-amylase, gaat hij de mutarotatie van de reactieproducten der
beide moutamylasen aan een nauwkeurig onderzoek onderwerpen.
Het bhjkt, dat de „dextrinogeen-amylasequot; een neerwaarts rotee-
rende maltose vormt, dus tot de a-amylasen behoort; terwijl de
,,saccharogeen-amylasequot;, blijkens de opwaartsche mutarotatie van
de door haar gevormde maltose, tot de /S-amylasen gerekend worden
moet. Daarmee is dus de verschillende specificiteit der heide moutamy-
lasen aangetoond.

Het is mij gelukt langs een anderen weg een bevestiging van dit
resultaat te verkrijgen en ook het verband te vinden tusschen de
uitkomsten van KuHN en Ohlsson eenerzijds en die van Philoche
anderzijds.

Beschouwen wij nu de hier besproken publicaties in het licht
van het werk van Wijsman, dan zien wij dat dit, juist door zijn
veelomvattendheid, in staat is een verband te leggen, dat aan alle
onderzoekers ontgaan is, n.1. dat tusschen de amylase uit onge-
kiemde gerst en het zgn. ,,suikervormendequot; bestanddeel der moutamy-
lase. Het zal duidelijk zijn, dat de „translocatie-diastasequot; van
Brown en Morris, de „gerstamylasequot; van Baker, Ling en Sjoe-
berg en de ,,saccharogeen-amylasequot; van Ohlsson in hoofdzaak
identiek zijn met de „maltasequot; van Wijsman. Hetzelfde geldt voor
de „secretie-diastasequot;, de „dextrinogeen-amylasequot;, het ,.zetmeel-
oplossend enzymquot; en de „dextrinasequot;.

Het probleem der moutamylase verliest daarmee reeds een goed
deel van zijn gecompliceerdheid.

3 — Ons onderzoek nu had in de eerste plaats tot doel, de be-
langrijkste diffusie-proeven van Wijsman te herhalen en op grond
van zijn voorschriften droge praeparaten van de beide amylasen
te vervaardigen. Met deze praeparaten konden dan de resultaten
van Ohlsson aan een controle worden onderworpen. Bovendien
was het noodzakelijk, de enkelvoudigheid der praeparaten op een
meer overtuigende wijze, dan door Ohlsson gedaan was, aan te
toonen, wat vooral bereikt zou kunnen worden door beide enzymen
volgens de zelfde methode, die der quantitatieve maltosebepaling,
te bestudeeren.

Een bizondere moeilijkheid bij het onderzoek der amylasen wordt
opgeleverd door de substraten, zetmeel en glycogeen. Deels omdat

deze stoffen in water slechts een kolloide oplossing geven, een
oplossing dus, waarvan de eigenschappen niet alleen door de con-
centratie worden bepaald en deels ook door onze onvolkomen
kennis van hun chemische structuur.

Door de meeste zetmeelchemici wordt aangenomen, dat het zet-
meel uit twee componenten bestaat, ,,amylosequot; en ,,amylopektinequot;.
Omtrent de vraag of wij hier te maken hebben met verschillende
kolloide toestanden — sol en gel —, dan wel met stoffen van ver-
schillende chemische structuur, loopen de meeningen uiteen. Naast
deze componenten of vermeende componenten wordt veel gebruik
gemaakt van zgn. „oplosbaar zetmeelquot;, meestal bereid volgens
Lintner i). Op grond van overwegingen, die in het laatste hoofd-
stuk gegeven zullen worden, besloot ik enkel ,,oplosbaar zetmeelquot;

Het is gebleken, dat zoowel van de diffusieproeven van Wijsman,
als van de resultaten van Ohlsson een goede bevestiging verkregen
kon worden en dat de volgens Wijsman bereide praeparaten als
volkomen enkelvoudig mochten worden beschouwd. Het verloop
van de werking der beide amylasen bracht mij verder tot de over-
tuiging, dat zich in de zetmeeloplossing twee componenten van ver-
schillende chemische structuur moesten bevinden, een conclusie die,
in verband gebracht met de onderzoekingen van Kuhn en Phi-
loche tot enkele proeven met glycogeen als substraat leidden,
waaruit volgde, dat een van de beide zetmeelcomponenten waar-
schijnlijk identiek is met glycogeen. Een en ander maakte het ge-
wenscht om aan de beschrijving van de proeven, zooals die gegeven
zal worden in de hoofdstukken II t/m VI, een korte beschouwing
over den huidigen stand van het zetmeelonderzoek toe te voegen.

De willekeur die er een tijd geheerscht heeft bij de naamgeving
der enzymen, heeft tengevolge gehad, dat voor verscheidene en-
zymen meer dan een naam in omloop is of geweest is. Tegenwoordig •
huldigt men den regel, dat men het enzym noemt naar zijn sub- \'
straat, dwz. naar de stof, wier omzetting hij katalyseert, gevolgd
door den uitgang \'ase. De enzymen, die de hydrolyse van het zet-
meel katalyseeren, of meer precies van het amylum, dat zich in de
zetmeelpraeparaten bevindt heeten dus amylasen. Een oudere
benaming is diastase. In het fransch verstaat men onder „diastasesquot;
ook andere dan zetmeelsplitsende enzymen. Wij zullen ons aan de
moderne terminologie houden.

De door Wijsman voor de beide componenten der moutamylase
gebruikte namen „maltasequot; en „dextrinasequot; hebben betrekking op
de bij de reactie gevormde producten. Het enzym, dat de hydrolyse
van maltose tot glucose katalyseert, heette toen ,,glucasequot;, later
werd dit echter eveneens ,,maltasequot; genoemd, wat tot misverstand
aanleiding geven kon, te meer, daar moutextract ook „maltasequot; in
den hedendaagschen zin des woords bevat. Een voorstel van
Went 2), om dit enzym ,,malto-glucasequot; te noemen heeft geen
ingang gevonden. Ohlsson tracht aan de moeilijkheden tegemoet

1)nbsp;Dit voorbehoud is noodzakelijk, daar verscheidene zetmeelsoorten
nog een ander polysaccharide schijnen te bevatten, hemicellulose, dat alleen
door een bizonder enzym, de hemicellulase wordt aangetast. Aardappelmeel
bevat geen hemicellulose.

te komen door te spreken van „saccharogeen-amylasequot; en „dextri-
nogeen-amylasequot;. Deze namen hebben, buiten hun lengte, het be-
zwaar dat zij het gedrag der beide enzymen niet juist weergeven.\'
De dextnnogeen-amylasequot; dankt haar naam daaraan, dat zij
.aanleidmg geeft tot een snelle verdwijning van de jodiumreactie
gepaard gaande met een geringe suikervorming. Het is echter ge-
bleken m den loop van ons onderzoek, dat dit enzym, wanneer Lt
maar m voldoende hoeveelheid aanwezig is,aanleiLg tot een ze
snelle en aanzienlijke suikervorming geven kan, wafrbij een Ter
centage aan rnaltose kan worden verkregen, dat met de , siccharo
geen-amylasequot; met te bereiken is. Het zou dus. evengoed deTnaam
„suikervormend-enzymquot; verdienen.

stelt een eenvoudige en doeltreffende benaming voor de beide com-
ponenten m te voeren. Wanneer, zooals uit het jongste werk van
uhlsson^en ook uit ons onderzoek blijkt, de eene component tot
de a-amylasen, de andere tot de /5-amylasen gerekend moet worden
dan hgt het voor de hand van a-moutamylase en ß-moutamylase té
spreken, waarbij dan de a-moutamylase overeenkomt met de
„dextrinase de i^-moutamylase met de „maltasequot; van Wijsman
In het vervolg zullen deze namen steeds worden gebruikt.

Wijsman heeft de beide enzymen in den vorm van droge prae-
paraten m handen gehad. Door nagenoeg alle onderzoekers na Lm
met uitzondering van Sherman, is met extracten gewerkt Ex-
tracten bieden het voordeel van snel en gemakkelijk te bereiden te

en reduceerende suikers gedialyseerd te worden, waarbij dikwijls
een deel van het enzym verloren gchijnt te gaan. Droge praeparaten
zijn langer houdbaar,gt;at een groot voordeel is, daar verschillende
extracten, ook wanneer zij oogenschijnlijk op dezelfde wijze bereid
worden, nooit in alle opzichten met elkaar overeenkomen Een
droog praeparaat vergemakkelijkt ook de doseering van het enzym
daar een extract wel verdund, maar niet op een eenvoudige wijze
geconcentreerd kan worden.

In het geheel werden drie praeparaten gemaakt en wel een van
a-moutamylase, een van ^-moutamylase en een van a-ß-mont-
amylase, het natuurlijke mengsel der beide enzymen.

Voor de bereiding van a-moutamylase en a-^-moutamylase werd
uitgegaan van zgn. „helles Malzquot;, afkomstig van de N.V. Export-
mouterij „Nederlandquot; te Wageningen. Door Wijsman was het
moutextract met alcohol in vijf fracties neergeslagen, waarvan
echter alleen de eerste en de laatste voor de proeven werden ge-
bruikt. Ik besloot daarom, de amylase in twee fracties neer te slaan,
een tot 60 % alcohol en een van 60—80 %. De extractie van het
moutmeel en de droging der praeparaten geschiedden volgens
Sherman en Schlesinger i).

Het mout werd in een handmolen zoo fijn mogelijk gemalen en
bij porties van 500 gram verwerkt. Deze werden gedurende 2—3
uur bij 10—15° C. en onder voortdurend krachtig roeren geëxtra-
heerd met L. water, dat per L. J gr. KH^PO^ bevatte. Na afloop
werd de massa door een kaasdoek geperst en de zeer troebele vloei-
stof aan de waterstraal-luchtpomp gefiltreerd door gehard filtreer-
papier (Schleicher en Schüll Nr. 575, dat bij alle hier beschreven
filtraties gebruikt werd). Om een volkomen heldere vloeistof te
krijgen was het noodig, tweemaal te filtreeren, de tweede maal
door een filter, dat met een zeer dun laagje talcum bedekt was.

Bij de verkregen vloeistof werd nu gekoelde aethylalcohol van
96 % gevoegd, tot de concentratie van het mengsel 60 % bedroeg,
Dit geschiedde in hooge cylindrische maatglazen van 1 L. Na ver-
loop van eenige uren had het ontstane neerslag zich onder in het
maatglas opgehoopt, waarna de bovenstaande vloeistof voorzichtig
afgeheveld werd. De rest werd aan de waterstraalluchtpomp ge-
filtreerd en wel door een groote Büchner-trechter, aangezien kleine
filters spoedig geheel verstopt raakten. Bovendien bleek het ge-
wenscht om niet de volle zuigkracht van de pomp te gebruiken.
Zoodra de vloeistof door het filter heengezogen was, werd dit met
het daarop klevende neerslag uit den trechter verwijderd, het neer-
slag met een spateltje van het filtreerpapier afgelicht, op een glazen
schaaltje gebracht en dadelijk gedroogd in een vacuum-exsiccator
boven geconcentreerd zwavelzuur. Laat men het op het filter

drogen, dan hecht het zich daarop zoo vast, dat het er niet meer
van te verwijderen is zonder meenemen van papiervezels. Den
volgenden dag konden de hoornachtig uitziende stukjes in een
mortier gepoederd worden. De opbrengsten der verschillende por-
les werden tenslotte samengevoegd en goed gemengd. Deze Lte
fracüe, waarvan ca. 12 gr. verkregen werd uit 4 KG mo^t^^
vertoonde bij diffusie in zetmeelhoudende gelatine slechts een zeer
smalle ring Zij diende daarom voor de bereiding van aZ^t

met water aangewreven om het te bevochtigen vervol Jn. \'n
kolf ^et 300 ccm. gedest. water van ca. 60° g^bïlb ^
g ng daar^j niet meer in oplossing. Zonder dat gefiltreerd was^weTd
nu de kolf m een op 70° gehouden waterbad geplaatst en nadat

was, wat ongeveer 8 min. duurde, nog 15 min. daarin gelaten ver-
volgens snel afgekoeld, gefiltreerd en uit het filtraat de a-mout-
amylase op de beschreven wijze met alcohol tot 60 % neergeslagen
gefiltreerd en gedroogd. Opbrengst: 2 gr. van een licht bruin ge-
kleurd poeder, dat een volkomen kleurloos diffusieveld geeft en bii
oplossing in water slechts een geringe rest achterlaat

Bij het filtraat van de eerste fractie werd opnieuw alcohol ge-
voegd tot een concentratie van 80 o/^. Het daarbij gevormde neer-
slag zette zich spoediger af en was ook gemakkelijker te filtreeren
dan dat van de eerste fractie. De behandeling geschiedde overigens
op geheel dezelfde wijze. De opbrengst bedroeg ca. 20 gr Ter
verdere zuivering werd deze tweede fractie nog eens opgelost in
gedest. water en met alcohol neergeslagen. Een deel der begeleidende
eiwitten ging niet meer in oplossing, nadat hiervan was afgefil-
treerd, werd gekoelde alcohol van 96 % toegevoegd, eerst tot 60 %,
waarbij geen noemenswaardige uitvlokking optrad en vervolgens
tot 80 %. Daarbij deed zich het verschijnsel voor, dat de amylase
aanvankelijk in het geheel niet wilde uitvlokken, wel ontstond een
sterke opalescentie. Na toevoegen van een weinig KHoPO^ trad
spoedig uitvlokking op. Klaarblijkelijk werd de oplossing door het
phosphaat bij het iso-electrisch punt van het aanwezige eiwit ge-
bracht, waardoor ontlading optrad van het reeds door den alcohol
gedehydrateerde sol. i). Het neerslag werd op de beschreven wijze
1) Zie H. R. Kruyt, Colloids, New-York (1927), pag. 197-\'8.

gefiltreerd en gedroogd. Bij de diffusie in zetmeelhondende gelatine
vertoont de tweede fractie een breeden paarsen ring, zooals in
fig. la afgebeeld is. Het oorspronkelijke moutextract geeft onder
dezelfde omstandigheden een veel smalleren ring, zoodat, in over-
eenstemming met Wijsman, een gedeeltelijke scheiding der beide
enzymen heeft plaatsgevonden. De tweede fractie diende als
praeparaat van a-^-moutamylase. Het stelt een roomkleurig poeder
voor, dat in water restloos oplost. De opbrengst, na.de tweede
praecipitatie, bedroeg 5,5 gr.

Voor de bereiding van een droog praeparaat van /S-moutamylase
werd uitgegaan van parelgort uit den kleinhandel. Een drietal
monsters werd gemalen, met water geëxtraheerd en een druppel
van elk der extracten op een zetmeel-gelatineplaat gebracht.Twee
monsters vertoonden nog een duidelijk kleurloos veld met een zeer
breeden ring, bij het derde monster was het kleurlooze veld slechts
uiterst klein. Van het laatste werden daarom 3 KG. aangeschaft
en gesorteerd, dwz. alle vreemde bestanddeelen en slecht gepelde
korrels werden eruit verwijderd. De rest werd gemalen en met
tweemaal zijn gewicht aan alcohol van 50 % gedurende 2 uur onder
voortdurend roeren geëxtraheerd. Uit het gefiltreerde extract werd
de amylase neergeslagen met alcohol tot 80 %, het neerslag gefil-
treerd en gedroogd. Vervolgens werd het opnieuw opgelost in alco-
hol van 50 %,• van het niet in oplossing gegane deel afgefiltreerd en
uit het filtraat op de beschreven wijze het droge praeparaat ver-
vaardigd. Ook hier bleek bij de tweede praecipitatie toevoeging
van een weinig zuur K-phosphaat noodzakelijk voor de uitvlok-
king. Het was daardoor niet te vermijden dat dit praeparaat
evenals trouwens dat van a-^S-moutamylase een weinig van dit
zout bevatte.

De /3-moutamylase vertoont bij diffusie geen spoor meer van een
kleurloos veld. Opbrengst: 5,2 gr. van een nagenoeg wit poeder,
dat bij oplossing in water slechts een geringe rest achterlaat.

Alle praeparaten werden in een vacuum-exsiccator tot constant
gewicht gedroogd, daarna in kleine fleschjes van bruin glas in een
gewonen exsiccator boven geconc. HgSO^ gezet en daarin bewaard.

Hun eigenschappen (kleur, reuk, activiteit) zijn in den loop van
een jaar met merkbaar veranderd. Zij zijn vrij van maltase, wat
geconstateerd werd, door ze bij een oplossing van maltose te voegen
De^draaung van het mengsel veranderde niet in verloop van 48 Lr

Een enzymoplossing werd op de volgende wijze bereid. Daar de
poeders eenigszins vettig zijn, zijn zij moeilijk te bevochtigen en
moeten daarom met water worden aangewreven. De afgewogen
hoeveelheid, m een bepaald geval b.v. 100 mgr., werd dus in Sn
mortier geschud, met weinig gedest. water aangewreven, vervolgd
meer water toegevoegd en gewreven totdat alles, wkt aan den
bodem van het mortier en aan den stamper kleefde, was opgelost
De oplossing werd dan gespoeld in een Erlenmey er-kolf je vL be
kend gewicht en nog zooveel water toegevoegd tot het gewicht van
den inhoud 100 gr. bedroeg, daarna gefiltreerd. Een dergelijke op-
lossing zal in het vervolg als een „enzymoplossing Vioooquot; worden
aangeduid. Voor iedere proef, of bij elkaar behoorende serie van
proeven, werd een versche oplossing gemaakt. De oplossingen wer-
den, gedurende den tijd, dat zij niet in gebruik waren, in een koel-
kast (5—8° C.) bewaard, nadat er een weinig thymol aan was toe-
gevoegd.

Bij de meeste proeven werd als substraat oplosbaar zetmeel
gebruikt, en wel een praeparaat, dat volgens een eenigszins gemodi-
ficeerde methode van Lintner i) uit aardappelmeel van de „Phar-
maceutische Groothandelquot; te Utrecht bereid werd. Wijsman heeft
reeds opgemerkt, dat men een beter oplosbaar product verkrijgt,
wanneer men het zetmeel i.p.v. 7 dagen, zooals Lintner voor-
schrijft, 10 dagen bij kamertemperatuur met zoutzuur van 7-i-
behandelt. Daarbij is het van belang, dat men het zuur om den
anderen dag ververscht.

Door mij werd ook op deze wijze te werk gegaan; 400 gr. aard-
appelmeel werden in een bekerglas met zooveel zuiver zoutzuur
van 7J % overgoten, dat de vloeistof eenige centimeters boven het
bezonken meel kwam te staan. De kamertemperatuur bedroeg ge-
middeld 20° C. Om den anderen dag werd nu dit zuur afgeschonken

en door versch vervangen, waarbij de massa flink werd doorgeroerd.
Het zuur nam de eerste malen een eenigszins gele tint aan, later
bleef het volkomen kleurloos. Na 10 dagen (5x ververschen) werd
het meel, dat nu veel minder „paktequot; dan vóór de behandeling,
herhaalde malen met water, daarna eenige malen met aethylalcohol
van 96 % gewasschen, afgefiltreerd, met aether gedroogd en ten-
slotte ter definitieve droging gebracht in een vacuum-exsiccator
boven geconc. HgSO^. In het volgende hoofdstuk zal worden be-
schreven, hoe het gehalte van dit praeparaat aan zuiver amylum
werd bepaald en op welke wijze de gebruikte oplossingen werden
bereid.

Waarop de werking van het zoutzuur berust is niet met zeker-
heid bekend. Op grond van later te vermelden ervaringen i) kwam
ik er toe, nog eenige andere praeparaten te maken, die van het
eerste alleen hierin verschilden, dat zij langer met zuur behandeld
werden, n.1. resp. 12 en 14 dagen, met telkens eenmaal meer ver-
verschen. Deze praeparaten, welke zeer heldere oplossingen gaven,
vertoonden met /5-moutamylase een grootere reactiesnelheid dan
het eerste en werden door dit enzym ook iets verder afgebroken.
Toch bezaten alle praeparaten dezelfde, géringe, eigenreductie,
zoodat de oplosbaar-makende werking van het zoutzuur niet het
gevolg kan zijn van een steeds verder gaande hydrolyse. Op een
en ander zal in het laatste hoofdstuk worden teruggekomen.

De benoodigde hoeveelheid gelatine werd met een weinig water
opgesmolten in een warmwaterbad en het zetmeel afzonderlijk in
kokend water opgelost. De oplossingen werden dan bij elkaar ge-
goten, zooveel water toegevoegd als noodig was en het mengsel
even opgekookt. Vervolgens werd het uitgegoten in gesteriliseerde
Petri-schalen, zoo, dat de bodem even bedekt was. Op de opper-
vlakte van de gestolde plaat werd dan een weinig van het amylase-
poeder gebracht, b.v. met behulp van een vochtig glazen staafje.

Aanvankelijk gelukte het mij niet het ring verschijnsel scherp te
zien te krijgen. De proeven werden in den zomer uitgevoerd en de

Ik. dat bij lage temperatuur de randen der diffusie-velden en ringen
zeer scherp begrensd verschenen. Denbsp;fractie, vóór de ver-

boven 20 geen nng te constateeren was geweest. Hoe Ljver de
gelatme, hoe nauwer de capillairen van het trpinbsp;u ^ ^

met zetmed-gelatineplaten, welke slechts 2 % gelatine W,»
De verschiUende amylase-praeparaten gaven ti^^Z^^Itt,\'
dezelfde vage diffusiebeelden te zien als in platen van 8 o/ bif««
n het vervolg liet ik de diffnsie daarom steeds in de koeikasJ ver

Aangezien de kromme, die men verkrijgt door de beginsnelheid
van de reactie af te zetten tegen de H-ionen-concentratie in het
reactiemengsel en die hier kortweg de pH-kromme zal worden ge-
noemd, tot de meest belangrijke karakteristika van een enzym
gerekend moet worden, besloot ik mijn praeparaten in de eeirste
plaats op dit punt te onderzoeken.

Een verklaring van het verband, dat er bestaat tusschen reactie-
snelheid en pH, heeft Michaelis i) trachten te geven. De theorie
van Michaelis, welke in de eerste plaats is opgesteld voor de
saccharase (invertine), vindt men in alle handboeken en monogra-
fieën over enzymen uitvoerig behandeld 2); hier moge met het vol-
gende worden volstaan.

Wanr^er men een ampholyt, dus een electrolyt, die zoowel H
als OH vermag af te splitsen, b.v. een aminozuur, in oplossingen
van verschillenden zuurgraad brengt, dan treedt in de meeste ge-
vallen dissociatie op, dwz. men heeft in de oplossing naast onge-
sphtste (ongeladen) moleculen negatief geladen moleculen en
H-ionen, of wel positief geladen moleculen en OH-ionen. Zet men
nu het percentage ongesplitste moleculen af tegen de pH, dan krijgt
men een kromme, die een maximum vertoont bij het iso-electrisch
punt van het gebruikte ampholyt. Verschillende ampholyten geven
een verschillend verloop van de kromme, in sommige gevallen is

2)nbsp;Zie o.m..H. v. Euler, Chemie der Enzyme (1925), Teil I, pag. 62 en
J. B. S. Haldane, Enzymes (1930), pag. 12.

Bij vele enzymen neemt men nu iets dergelijks waar wanneer
men de ^reactiesnelheid tegen de pH afzet. MLAEL^\'kwaT
zoodoende toe, een enzym te vergeliiken met P.r, t ,
veronderstellen, dat allL de onUdquot;
werkzaam kunnen zijn. Dit houdt natuurlijk in dat Lt on ^
der enzymatische werking overeen moet kLen m t h tTsoTe^
tnsch punt van de enzymoplossing, dat door kataroretV
^en bepaald. Voor de gezuiverde Sst-sacchara
van Michaeus vrijwel op te gaan, tenminste wat d h^ingTan
het optimum en het verloop van de pH-kromme aan de aSsche
zijde van het optimum betreft. Aan de zure zijde treden dS
complicaties op. In de meeste gevallen echter komt het iso-ellc-
trisch punt met overeen met het punt van optimale activiteit Dit
zou dan zoo verklaard moeten worden, dat het hier de negatief of
po^tief geladen enzymmoleculen zijn, welke katalytisch werken

De theorie heeft later een zekere wijziging ondergaan 2), doordat
aangenomen wordt dat, zooals reeds door vroegere onderzoekers

Tdir; fzich tusschen enzym en substraat een ver!
binding vormt en dat het de dissociatie .an verbinding is die
het verloop van de pH-kromme bepaalt.nbsp;s - ^le

Van moutamylase is het verloop van de pH-kromme door ver-
scheidene onderzoekers uitvoerig bestudeerd. Adler gebruikte
daarbij verschillende bufferstoffen en vond een optimum tusschen
pH 4,7 en 5,15, eenigszins afhankelijk van den aard der buffer

gelegd op de rol, die de anionen der toegevoegde zouten spelen
kunnen bij de bepahng der pH-krommen.

1)nbsp;Daar de enzymen kolloide oplossingen vormen, komen hier natuurlijk
alleen de moleculen in aanmerking, die zich aan de oppervlakte der deeltjes
bevmden. Door de meeste physiologen wordt dit over het hoofd .ezïen

3)nbsp;A. J. Brown, Trans. Chem. Soc. London, 81, 373 (1902) en V Henri
Thèse. Paris (1903).nbsp;\\ 1 . ni^iNKj,

Sherman, Thomas en Baldwin i) vinden een optimum bij pH
4,4—4,5 en een zeer langzame daling van de kromme naar de alka-
ische zijde. Later hebben Sherman, Caldwell en Adams 2) aan
getoond, dat het optimum hij verhooging van temperatuur, vfa.a.rhii
men de reactie laat verloopen^ waar de alkalische zijde verschuift.
Bij 40° C. vinden zij het optimum tusschen pH 4,5 en 5,0; bij 70°
ligt dit tusschen pH 5,3 en 5,8 (phosphaatbuffer). DitresuHaat is
van belang, aangezien immers bij 70° de /5-moutamylase snel ver-
nietigd wordt, terwijl in het oorspronkelijke mengsel de werking
van deze component op den voorgrond treedt, zoodat de door
Sherman waargenomen verandering dus neerkomt op een ver-
schuiving van het optimum van de /?-moutamylase naar dat van de
a-moutamylase. Wij zullen zien, dat de door mij verkregen resul-
taten zich bij die van Sherman goed aansluiten.

Ook Euler en Svanberg hebben de pH-kromme van mout-
amylase bepaald®). Zij vinden een optimum bij pH 5,0 en aan de
alkalische zijde daarvan een verloop van de kromme, dat goed in
overeenstemming te brengen was met de theorie van Michaelis.

Erik Ohlsson is de eerste en tot nog toe de eenige geweest,
die de pH-krommen der heide moutamylasen afzonderlijk heeft be-
paald. De wijze, waarop hij de enzymen scheidt, is reeds in het
eerste hoofdstuk besproken. Door hem is gewerkt met phosphaat-
mengsel als bufferstof en de pH werd gemeten met de qWhydron-
electrode. De activiteit van de „saccharogeen-amylasequot; (^-mout-
amylase) werd bepaald volgens de methode der quantitatieve sui-
kerbepaling. Dit enzym vertoont een groot gebied van hooge werk-
zaamheid, met een optimum bij pH 4,9 ongeveer. De „dextrinogeen-
amylasequot; (a-moutamylase), waarvan de activiteit bepaald werd met
de jodiummethode volgens Wohlgemuth, waarbij wordt nagegaan
in hoeveel tijd de jodiumreactie omslaat van blauw in paars of wel
geheel verdwijnt, bezit daarentegen slechts een smal gebied van
optimale werkzaamheid bij pH 5,75. Bovendien is het verloop der

Ohlsson heeft ook nog getracht de pH-kromme vaquot;1 dexTrtaö
geen-amylase gt; te bepalen uit het reduceerend vermoge;; ™nTt
reacfemengsek De zoo verkregen kromme viel nietrm» Tet dt
welke volgens de jodmmmethode bepaald was zii
min identiek met die van de ..saccharogeen^amlquot;? Hef^
duidelijk, waaraan dit gebrek aan overiZemmt^ „ff T
toegeschreven. Tenslotte zij nog vermeld, d ie ™ Tttt
een eenigszms ander verloop van de dHnbsp;™™tte extract

lemLTnf Tquot;\'/^\' zoutoplossing een stof bevat dt bquot;:
lemmerend op de „dextrinogeen-amylasequot; werkt. Deze stof wordt
bij verwarmmg vernietigd.

De voornaams^zwaren. die men tegen het werk van Ohlsson
inbrengen kan ^en reeds in het eerste hoofdstuk naar voren
gebracht. Zij zijn hierin samen te vatten: ten eerste heeft Ohlsson
en ten tr. \'nbsp;praeparaten niet overtuigend bewezen

df vTZr.T P^Pr\'^^ beïnvloed zouden kunnen zijn Lr
de voorbehandehng (verhitten of aanzuren)

Alle reacties vonden plaats bij een temperatuur van 40° C Daar-
toe werd gebruik gemaakt van een, van een roerder voorzienen
waterbad-thermostaat, welke door een tetrachlooraethaan-kwik-
regulateur op de genoemde temperatuur werd gehouden met afwij-
kingen van ten hoogste 0,02° naar boven of naar beneden.

In den thermostaat bevond zich een koperen ring met klemmen,
waarin de reactiekolven (Erlenmeyerkolven van 100 of 200 ccm.)

zoo met den hals konden worden vastgeklemd, dat zij zich geheel
onder water bevonden; verder een in 0,1° verdeelden thermometer,
welke bij 40° met den normaal thermometer vergeleken en zonder
noemenswaardige afwijkingen bevonden was. \'

De maltose-bepalingen geschiedden volgens Schoorl i). Daar-
voor worden in een Erlenmeyerkolf van Jenaglas van 300 ccm.
10 ccm. CuS04-oplossing, welke 69,278 gr. CUSO4.5H2O ,,pro Ana-
lysequot; per L. bevat, gepipeteerd en vervolgens 10 ccm. Seignette-
natron (346 gr. Seignettezout en 100 gr. NaOH in 1 L.). Hierbij
wordt dan 10 of 25 ccm. van het te onderzoeken reactiemengsel
gepipeteerd en zooveel water toegevoegd, dat het totale volumen
50 ccm. bedraagt. De vloeistof wordt in 3 min. tot koken verhit
en gedurende precies 2 min. aan de kook gehouden, waarbij de
kolf op een gaasje staat, bedekt met asbest, waarin een voor de
kolf passende opening is uitgesneden. Dan wordt snel in koud water
gekoeld tot ca. 25°, 10 ccm. KJ-oplossing van 30 % toegevoegden
daarna 10 ccm. H2SO4 van 25 %. Het vrij gekomen jodium wordt
met 0,1 N. Na-thiosulfaat getitreerd, waarbij een zetmeeloplossing
van 2 % als indicator dienst doet. Men bepaalt op deze wijze het
restant cupri. Dit wordt van een bepaling in blanco afgetrokken en
uit het verschil in ccm. 0,1 N. thio met behulp van een tabeP)
de hoeveelheid maltose berekend.

Als bufferstof werd citraatmengsel gekozen. Uit 0,1 N. sec.
Na-citraat, dat een pH vertoont van 5,0 is door toevoeging van
0,1 N. HCl resp. 0,1 N. NaOH gemakkelijk een serie buffermengsels
samen te stellen, welke het te onderzoeken traject bestrijken. De
bepaling van de aciditeit geschiedde colorimetrisch en wel met den
„Doppelkeil-Kolorimeterquot; volgens Bjerrum-Arrhenius. Dit appa-
raat bestaat uit een lang rechthoekig glazen bakje, dat door een
diagonaalsgewijs geplaatste glazen plaat in twee wigvormige helften
verdeeld is. In beide helften bevindt zich een gelijke hoeveelheid
indicator-oplossing. Dóór toevoeging van 10 druppels 0,1 N. NaOH
in de eene helft, wordt hierin de extreem-alkalische kleur van den
indicator opgewekt; in de andere helft wordt de extreem-zure kleur

te voorschijn gebracht met 10 druppels 0,1 N. HCl. Bij doorzicht
m horizontale richting krijgt men dus alle overgangen tusschen
deze twee kleuren te zien. Langs het bakje kan een prisma-com-
parator geschoven worden, waarin zich een reageerbuisje bevindt
met 5 ccm. van de te onderzoeken vloeistof, voorzien van den-
zelfden indicator. De verhouding van de hoeveelheid indicator in
het bakje tot die in het buisje staat vast en moet zorgvuldig in
acht genomen worden om vergelijking mogelijk te maken Heeft de
vloeistof een eigen kleur of is zij troebel, dan kan zij zonder indi-
cator, m een reageerbuisje van dezelfde wijdte, zoo in den compa
rator geplaatst worden, dat de verschillen in kleur of intensiteit
worden gecompenseerd. Achter het bakje staat een belichtings-
apparaat, bestaande uit een metalen kastje met matglazen ruit
waarbinnen zich twee Philips daglichtlampen bevinden. Op den
comparator bevindt zich een pijltje, dat langs een schaalverdeeling
schuift, waarvan het nulpunt correspondeert met het midden van
de wig; op dit punt ziet men dus, in de onderste beeldhelft, de
neutrale kleur van den indicator; de pH van dit punt is voor elk
der gebruikte indicatoren bekend, zij bedraagt b.v. voor methyl-
rood 5,1. De comparator wordt nu zoo lang verschoven tot quot;de
kleuren van de beide beeldhelften met elkaar overeen komen en de
stand van het pijltje afgelezen; staat dit nu bij gebruik van methyl-
rood op het cijfer 2 aan de rechterzijde van het nulpunt, dan is de
pH van de onderzochte vloeistof 5,1 0,2 = 5,3; staat het op
2,5 aan de linkerzijde, dan is de pH 5,1 —0,25 = 4.85. De wig
wordt steeds zoo geplaatst, dat de alkalische kleur zich aan de
rechterzijde bevindt. Verschillen van 0.05 zijn direkt af te lezen,
0,01 kunnen worden geschat; daar de nauwkeurigheid echter niet
zoo ver gaat, heb ik de gevonden waarden steeds afgerond op 0,05.

Een serie citraat-mengsels werd nu gemaakt, waarvan de pH bij
benadering bekend was. De nauwkeurige bepalingen geschiedden
met de met driemaal hun volumen gedest. water verdunde oplos-
singen, aangezien de oplossing in het reactiemengsel ook in deze
verdunning aanwezig was. Bovendien werd, na afloop der suiker-
bepalingen, de pH van het reactiemengsel zelf onderzocht. Steeds
werd een goede overeenstemming gevonden, met uitzondering van
eenige reactiemengsels, alkalischer dan pH 6,9; hier was blijkbaar
de buffercapaciteit van het mengsel zoo gering, dat de eigen zuur-

graad van zetmeel en enzym (dat immers een weinig KH.PO
bevat) een rol ging spelen. In deze gevallen is natuurlijk alleen met
den zuurgraad van het reactiemengsel rekening gehouden.
^ Daar de temperatuur een niet geheel te verwaarloozen invloed
^ heeft, werden de buisjes met vloeistof en indicator in den ther-
mostaat op 40° gebracht, daarna vlug in den comparator geplaatst
en de bepaling zoo snel mogelijk uitgevoerd.

3 — Vervolgens zullen eenige voorbereidende werkzaamheden wor-
den beschreven.

Een voorraadsoplossing van 6 L. Na-thiosulfaat, welke per L.
100 mgr. kwikcyanide bevatte ter conserveering, bevond zich in
een flesch, voorzien van een hevel met klemkraan en een buisje
met natronkalk. De titer van de thio werd bepaald met 0,1 N.
KJOg „pro Analysequot; en bedroeg 0,098, zij werd van tijd tot tijd
gecontroleerd doch vertoonde geen merkbare verandering. Voor
alle bepahngen werd dezelfde geijkte buret gebruikt, eveneens
voorzien van een natronkalkbuisje; verder werd gebruik gemaakt
van geijkte pipetten van 1,5, 10 en 25 ccm.

Van de CuSO^-oplossing werd 1 L. gemaakt, bij vernieuwing
daarvan moest natuurlijk telkens een blanco-bepaling worden ver-
richt.

Van het zetmeelpraeparaat werden 5 gr. in een morfier met water
aangewreven en gespoeld in een kolf van bekend gewicht met
150 ccm. gedest. water, dat even van de kook was. Vervolgens werd
de oplossing weer tot koken verhit en gedurende i uur zachtjes aan
den kook gehouden, daarna afgekoeld én ingewogen tot 250 gr.

Van deze oplossing werden 20 ccm. gevoegd bij 20 ccm. zuiver
zoutzuur van 5 % in een Erlenmeyerkolfje van 100 ccm. en het
mengsel 3 uur aan een terugvloeikoeler in een kokend waterbad
verhit, na afkoeling geneutrahseerd met vast Na-carbonaat, in een
maatkolfje van 100 ccm. gespoeld en tot de streep aangevuld met
gedest. water. Hiervan werden 10 ccm. gevoegd bij de versch-
bereide /,Fehlingquot; en op de beschreven wijze het restant cupri
bepaald.

Verschil: 12 24 ccm. 0,098 N. thio = 12,00 ccm^O,l N wat over
een Wt met 35,5 mgr. amylum. Opgelost was in het zelfde volumen
40 mgr. van het praeparaat, zoodat het gehalte dus bedroeg 88 8 o^

zetmeeloplossing (2 gr zefmeS
m 100 gr. opl.) te maken, moesten dus 22 52 ct wordi 1
dit geschiedde op de zoo juist beschreven
b:j kamertemperatuur bewaard, nadat er eL weinig thyllT^
was toegevoegd. Haar zuurgraad bedroeg pH 4,2.

Van de 2 o/, zetmeeloplossing gaven 10 ccm. een titratieverschil
van 0,76 ccm. 0,98 K. thio. Bij de maltosebepalingen werd hier-
mede rekening gehouden door dit bedrag, of een deel ervan, van de
blanco-bepaling af te trekken.

Van elk der gebruikte enzympraeparaten gaven 20 mgr een
titratieverschil van ca. 0,1 ccm. thio; gezien de geringe hoeveelheid
enzym, welke zich in de reactiemengsels bevond beh\'oefde dTt n t
m rekening te worden gebracht.

Aangezien de gang van zaken bij alle reactiesnelheidsbepahngen
dezelfde was, zal deze slechts eenmaal uitvoerig worden beschreven
Het reactiemengsel zonder enzym en de enzymoplossing werden
afzonderlijk in den thermostaat gehangen totdat zij de temperatuur
van het water aangenomen hadden, wat na 20—30 min. het geval
was. Vervolgens werd op een nauwkeurig bekend tijdstip de be-
noodigde hoeveelheid enzymoplossing in het reactiemengsel gepipe-
teerd, waarbij als beginpunt van de reactie werd beschouwd het
oogenblik, dat de pipet voor de helft was leeggevloeid. De goed ge-
sloten kolf werd daarna even flink omgeschud. Na een bepaalden
tijd werd met een droge pipet een hoeveelheid (10 ccm. of 25 ccm )
uit de kolf genomen en dit gevoegd bij de, eenige minuten van te

voren bereide „Fehlingquot;, waardoor de reactie onmiddelijk tot stil-
stand kwam. Dit geschiedde zoo, dat het eindpunt van de reactie
ook weer viel op het oogenblik, dat de pipet voor de helft was leeg-
geloopen. Vervolgens werd onmiddelijk op de beschreven wijze de
maltose bepaald.

De reactiesnelheid van de /^-moutamylase werd bij 14 verschil-
lende zuurgraden bepaald. Het reactiemengsel had daarbij de vol-
gende samenstelling.

Aan de hand van eenige oriënteerende proeven was vastgesteld,
hoeveel enzym moest worden toegevoegd, om de reactie in een ge-
schikt tempo te doen verloopen.

Bij iederen zuurgraad werden 3—6 suikerbepalingen verricht
met tusschenpoozen van 1—2 uur. De resultaten vindt men in de
tabellen I t/m XIV (zie pag. 37 en 38). Vermeld zij nog, dat bij alle
bepalingen dezelfde enzymoplossing en dezelfde zetmeeloplossing
gebruikt werden.

In de eerste kolom van iedere tabel is de tijd aangegeven in uren,
in de tweede de hoeveelheden maltose in mgr. per 10 ccm. van het
reactiemengsel. In de derde vindt men de reactiesnelheid V vermeld,
uitgedrukt in mgr. maltose per uur. De gemiddelde reactiesnelheid
over de eerste 2 of 2 J uur diende voor het opstellen der pH-kromme,
afgebeeld in fig. 2. Men ziet daaruit, dat de /S-moutamylase haar
grootste werkzaamheid vertoont tusschen pH 4,55 en 5,15. Naar de
zure zijde vindt een veel snellere vermindering plaats, dan naar de
alkalische. Klaarblijkelijk wordt bij een H-ionen-concentratie, hoo-
ger dan pH 4,5, het enzym langzamerhand vernietigd. Dit komt
ook in de tabellen tot uiting. Binnen het gebied van optimale werk-
zaamheid vertoont de V een langzame daling, naar de zure zijde
gaat deze daling steeds sneller, naar de alkalische zijde wordt zij
daarentegen geringer, dwz. de reactie krijgt hier steeds meer de
neiging om rechtlijnig te verloopen. Vergelijkt men b.v. tabel III
met tabel X dan ziet men duidelijk het verschil. Bij pH 4,20 is de
beginsnelheid van de reactie tamelijk hoog, om dan vrij .snel te

geringer, zij blijft hier echter gedurende eenige uren nagenoeg
constant.nbsp;amp; 5

Een meer volledig beeld van de reactie krijgt men in tabel XV
te zien^In dit geval bedroeg het reactiemengsel 200 ccm terwiil
voor iedere bepahng 25 ccm. gebruikt werd. De eerste drie kolon^-
men komen overeen met die van de andere tabellen. Er is uit te

(I.e.) gevonden afbraakgrens bij gebruik van amylase uit onTe
Kiemde gerst.nbsp;quot;nbsp;^quot;gc-

Toevoegen van versch enzym had geen verhooging van de op
brengst tengevolge, zooals uit de volgende proef blijkt.

Drie kolfjes van 100 ccm. werden elk voorzien van:
10 ccm. 2 % zetmeelopl.
5 ccm. O,IN. citraatmengsel. pH 5,40
3 ccm. aq.dest.
2 ccm. enzymopl. i/iooo

Alle kolfjes werden in den thermostaat gezet, na 20, resp. 26 uur
de inhoud van twee er van gespoeld in de kolf met „Fehlingquot; en
het maltose-gehalte bepaald.

Bij het derde kolfje werd opnieuw 2 ccm. enzymoplossing gevoegd
en 24 uur later het maltose-gehalte bepaald.
c) 130,8 mgr. malt. 62 %.

In de vierde en vijfde kolom van tabel XV vindt men de reactie-
snelheids-constante van de monomoleculaire reactie op twee manieren
berekend.

vSherman en Walker i) vinden n.1. voor met alcohol neergeslagen
moutamylase (a-;3-moutamylase) een nagenoeg constante k, bij
gebruik van een geringe enzymconcentratie (hoogere concentraties
gaven een dalende k), wanneer zij in de formule

voor a de tn totaal aanwezige hoeveelheid zetmeel nemen aan het
begin van de reactie; is de in den tijd t omgezette hoeveelheid
berekend uit de gevormde hoeveelheid maltose. Daarnaast vinden
Euler en Svanberg bij een dergelijk praeparaat een bij benade-
rmg constante k, wanneer zij a gelijk stellen aan de in maximo
omgezette hoeveelheid zetmeel, dat was in hun geval 75 %.

In de vierde kolom nu vindt men de k, vermenigvuldigd met 10^
berekend voor « = 100 %; in de vijfde kolom k\' voor a = 62 y\'
waarbij dus verondersteld is, dat slechts 62 o/^ van het in den be-
ginne aanwezige zetmeel als substraat mag worden beschouwd
Zooals men ziet is k nagenoeg constant, terwijl k\' een stijging
vertoont. Wij moeten echter wel bedenken, dat wij hier met een
heterogene reactie te doen hebben, zoodat het constant zijn van
de k ons niets zegt omtrent het werkelijke verloop van de hydrolyse
Bovendien is gebleken, dat k alleen maar constant is bij een be-
paalde enzymconcentratie, welke hier toevallig gekozen werd voor
de bepaling van de pH-kromme. Bij verlaging van de enzym-con-
centratie vertoont k een stijging, bij verhooging een dahng, zooals
m hoofdstuk V blijken zal. Daar zal ook op deze kwesties nader
worden teruggekomen.

Het reactiemengsel vertoont na afloop der maltose-vorming nog
steeds een intensieve jodiumreactie. De kleur hiervan wordt door
Wijsman als paars opgegeven, door Baker en Sjoeberg (1 c) als
blauw. Het is mij gebleken, dat de Meur afhankelijk is van de rela-
tieve hoeveelheid jodium, die men toevoegt. Vult men een reageerbuis
met het uitgereageerde mengsel en voegt men hieraan een druppel
0,02 N. jodiumopl. in KJ toe, dan ontstaat een zeer donkere kleur
die bij verdunning blauw blijkt te zijn. Voegt men nu bij dit zeer
verdunde mengsel opnieuw een druppel van de genoemde jodium-
oplossmg, dan wordt de kleur paars. Het zelfde verschijnsel kan
men ook reeds in zekere mate te zien krijgen bij het oorspronkelijke
oplosbare zetmeel, dat in groote verdunning niet meer een zuiver
blauwe, maar een violette kleur met jodium geeft

Het restproduct, dat de blauwe of paarse jodiumreactie geeft
is natuurlyk niets anders dan de „erythrogranulosequot; van Wijsman\'
Volgens diens ervaring wordt het door ^^-moutamylase („maltasequot;)

met aangetast, wel door a-moutamylase („dextrinasequot;). Het leek
Znbsp;r ®nbsp;«^\'\'\'quot;ken bij de bepaling

Van het oplosbare zetmeel werden 100 gr. opgelost in ^ T v i ^
water en na afkoeling een oplossing van\'sOoCT^u^^
toegevoegd bovendien een weinig thymol, terwij fdepH m t behZ
van atraatmengsel op 4,8 werd ingesteld. Nadat het mengsem
uur m den thermostaat bij 40° gestaan had, werd opnieuw 500 rngr
^-moutamylase toegevoegd en weer 24 uur later de vloeistof Tven
opgekookt en gefiltreerd. Vervolgens werd onder verminderden druk
by 45 C. mgedampt tot ca. \\ van het oorspronkelijke volume en
daarna alcohol toegevoegd tot een concentratie van 60 % Het
restproduct sloeg in groote vlokken neer. Het neerslag werd afge-
filtreerd, uitgeperst en opgelost in 300 ccm. kokend water, Na
afkoeling werd weer met alcohol tot 60 neergeslagen en vervol-
gens de bewerking nog eens herhaald. Tenslotte werd de massa
SfeC.nbsp;^fnbsp;fijnkorrdig werd, daarna

Van het zoo verkregen poeder werd 1 gr. opgelost in 100 ccm
kokend water en van deze oplossing de eigenreductie en de werking
met ^-moutamylase onderzocht. Een reduceerend vermogen kon
niet geconstateerd worden.

10 ccm. erythrogranulose -f 5 ccm. citraatmengsel pH 5,10
5 ccm. enzymopl. Viooo gaven na 6 uur een titratieverschil van O 62
cmm. thio; na 24 uur 1,22 ccm. thio.

Om te zien of deze werking nog te verminderen was, werd de
erythrogranulose opnieuw opgelost in 1 L. water en 250 gr ^-mout-
amylase toegevoegd. Na 24 uur werd opgekookt en de zoo juist
beschreven bewerkingen herhaald. Het nu verkregen product ver-
toonde nog steeds een geringe werking met ^-moutamylase (titratie-
verschil 0,42 ccm. thio in 24 uur).

Reeds door schudden met koud water vormt het een troebele
oplossing, gemakkelijker lost het op in kokend water, hoewel ook

daarin de opalescentie blijft bestaan, wat bij het oorspronkelijke
oplosbare zetmeel niet het geval was.

Het gehalte aan zuiver amylum werd op dezelfde wijze als bij
oplosbaar zetmeel bepaald en bedroeg 91 %. Een oplossing van
1 % diende als voorraadsoplossing voor de bepaling der pH-kromme
van de a-moutamylase.

Oriënteerende proeven leerden al spoedig, dat de reactie van de
a-moutamylase geheel anders verliep, dan die van de p. Na een
snel begin vond spoedig een sterke remming plaats, zoodat het uit-
voeren van een lange serie bepalingen bij iederen gebruikten zuur-
graad weinig zin zou hebben. Besloten werd twee bepalingen te
doen, de eene 15, de andere 45 min. na het begin van de reactie.

5 ccm. enzymopl. Vsooo-
Voor iedere bepahng werd 25 ccm. gebruikt In tahpl Vvt •
men in de eerste kolom de pH, in de twee^d^ti ^fn
de derde het in den aangegeven tiid leZZ^^ fnbsp;quot;

mengsel Het voorbehoud dient « te t den^^
hjkheid bestaat, dat het geconstateerde reduceerende verm^^^^^^^^

Tabel XVII

pH	t min.	X mgr. malt.
4,80	45	15,5
5,00	45	18,2
5,75	45	26,6
5,95	45	25,4

Tabel XVI

pH	t	X
	min.	mgr. malt.
4,50	15	6,8
	45	7,1
5,00	15	10,0
	45	12,3
5,45	15	11,1
	45	17,2
5,65	15	11,2
	45	17,8
5,85	15	10,5
	45	17,8
6.05	15	9,9
	45	16,4
6,40	15	7,1
	45	12,5
6,75	15	4,3
	45	4,7

maltose gelijk aan 100 gesteld en de overige waarden van dezelfde
proef in procenten van dit verhoudingsgetal uitgedrukt.

Men ziet, dat de a-moutamylase tusschen pH 5,65 en 5,85 de
grootste werkzaamheid vertoont. Het gebied van optimale activi-
teit is smaller, dan dat van de /5-moutamylase, bovendien heeft de
kromme een veel steiler verloop, wat vooral aan de alkalische zijde
duidelijk tot uitdrukking komt. Beide krommen komen vrij nauw-
keurig met die van Ohlsson overeen, alleen schijnt de „saccharo-
geen-amylasequot; een grootere weerstand tegen zuur gehad te hebben,-
dan de /S-moutamylase. De overeenstemming bewijst, dat het zeer
wel mogelijk is om met de methode der suikerbepaling tot hetzelfde
resultaat te komen als met de jodiummethode, bij het onderzoek
van de a-moutamylase. Bovendien blijkt uit het feit, dat Ohlsson
phosphaatmengsels als bufferstof gebruikte, dat het anion der toe-
gevoegde zouten geen noemenswaardigen invloed heeft op het ver-
loop der pH-krommen, tenminste wat citraat en phosphaat betreft.

Uit de figuur is verder te zien, dat in het gebied van grootste
werkzaamheid der j8-moutamylase, de a-moutamylase slechts een
betrekkelijk geringe activiteit heeft. Wanneer dus het praeparaat
van a-moutamylase nog een zekere hoeveelheid /S-moutamylase
bevat, dan moet dit, bij gebruik van oplosbaar zetmeel als substraat
tot uiting komen door een afwijking van de met erythrogranulose
bepaalde kromme in het gebied van optimale activiteit der ^S-mout-
amylase. Om dit na te gaan, werden een viertal bepahngen gedaan met
een reactiemengsel, dat in plaats van erythrogranulose 50 ccm. I %
oplosbaar zetmeel bevatte. Voor het overige was de samenstelling
als die bij de vorige proef. De bij pH 5,75 gevormde hoeveelheid
maltose (zie tabel XVH) werd gelijk aan 100 gesteld en de andere
hoeveelheden in verhouding daartoe berekend. De gevonden waar-
den zijn in de pH-kromme van de a-moutamylase\'met kruisjes aan-
gegeven. Zooals men ziet vallen deze kruisjes precies op de met
erythrogranulose bepaalde kromme.

a)nbsp;dat het praeparaat van a-moutamylase geen op deze wijze aan-
toonbare hoeveelheid ^-moutamylase bevat en

b)nbsp;dat de keuze van het substraat {erythr.gr. of opl.zetmeel) geen in-
vloed heeft op het verloop van de pH-kromme.

Uit de ervaring van de meeste, in de inleiding genoemde, onder-
zoekers blijkt, dat bij de werking van „moutamylasequot; (a-^-mout-
amylase) op oplosbaar zetmeel, de werking van de /5-moutamylase
domineert, dwz. de pH-kromme, die zij vinden, lijkt nog het meest
op die van de /5-moutamylase. Laat men nu echter a-^-moutamylase
werken op erythrogranulose, dan kan men verwachten, dat in dit
geval de pH-kromme van de a-moutamylase te voorschijn komt.

De beteekenis van een dergelijke proef ligt hierin, dat de
moutamylase niet verhit is geweest, zoodat dus op deze wijze kan
worden nagegaan, in hoeverre de eigenschappen van de a-mout-
amylase door de verhitting bepaald werden.

Om een en ander te onderzoeken werd een gedeeltelijke pH-
kromme bepaald van a-;5-moutamylase met oplosbaar zetmeel,
resp. erythrogranulose als substraat. Bij iederen zuurgraad werd
slechts^én suikerbepaling verricht en wel 30 min. na het begin van
de reactie. De samenstelling der reactiemengsels was als volgt:
20 ccm. 2 % opl. zetmeel.nbsp;20 ccm. 2 % erythr. gr.

10 ccm. 0,1 N. citraatmengsel. 10 ccm. 0,1 N. citraatmengsel.
5 ccm. aq. dest.nbsp;10 ccm. enzymopl. Visoo-

Voor iedere bepaling werden 25 ccm. van het reactiemengsel ge-
analyseerd. De resultaten ziet men uit de tabellen XVIII en .XIX
en uit fig. 3.

De als Zap aangeduide kromme is die, welke met opl. zetmeel
werd verkregen, elke bepaling is hier door een cirkeltje aangegeven.
Ea/5 is de kromme met erythrogranulose, hier wordt iedere bepaling
door een kruisje voorgesteld. De dunne lijn a is de pH-kromme
van de enkelvoudige a-moutamylase. Men ziet, dat de kromme Zap
een optimum vertoont bij pH 5,3 en van daar naar de alkalische
zijde zeer langzaam afloopt. De kromme EayS heeft een optimum bij

pH 5,75, dus overeenkomend met dat van de a-moutamylase, en
daalt van daar zeer steil, imarbij zij grootendeels met de a-kromme
samenvalt. Alleen aan de zure zijde komt de Eo/S niet met de
a-kromme overeen.

Verder blijkt uit de tabellen en uit de samenstelling van de
reactiemengsels, dat met erythrogranulose als substraat een naar ver-
houding zeer groote hoeveelheid enzym moet worden toegevoegd, om een
eenigszins aanzienlijke suikervorming te krijgen.

Er vertoonen zich bij gebruik van de twee substraten dus aan-
zienlijke verschillen. Deze mogen niet aan den invloed der substraten
worden toegeschreven (zie de vorige proef!) en kunnen alleen daar-
door verklaard worden, dat zich in de niet verhitte a-ß-moutamylase
de a-component reeds met haar specifieke afhankelijkheid van den
zuurgraad bevindt.

De afwijking aan de zure zijde, bij tiet optimum der /S-mout-
amylase, moet worden toegeschreven aan het optreden van een
\'Samenwerking tusschen de beide enzymen, dwz. de erythrogranu-
lose wordt, na voorafgaande behandeling met a-moutamylase, ook
voor de /^-component aantastbaar, wat uit de volgende proeven
blijkt.

40 ccm. reactiemengsel, bevattende:
20 ccm. 2 % erj^throgranulose
10 ccm. 0,1 N. citraatmengsel pH 5,75
10 ccm. a-moutamylase-opl. ^/moo
werden gedurende 2|- uur in den thermostaat geplaatst. Vervolgens
werd opgekookt en nagegaan hoeveel maltose zich in 10 ccm. van
het mengsel bevond:

Daarna werden in een kolfje van 100 ccm. bij 10 ccm. van dit
mengsel 5 ccm. /5-moutamylase-opl. 7iooo gevoegd en 48 uur later
de inhoud geanalyseerd:

48,0 mgr. maltose.
dus 16,0 mgr. erbij gevormd, terwijl 5 ccm. /?-moutamylase-opl. uit
100 mgr. erythrogranulose, zonder voorbehandeling met a-mout-
amylase in denzelfden tijd slechts 2,8 mgr. maltose deden ontstaan.

met a-moutamylase na 2|- uur 32,8 mgr. malt.
na opkoken en toevoegen vannbsp;50,4 „

Samenvattend kunnen wij dus wel zeggen, dat bij de in dit hoofd-
stuk beschreven proeven de aanwezigheid van twee verschillende
amylasen in de mout definitief is komen vast te staan.

In het algemeen wordt de reactie van een enzym belemmerd door
producten, die verwant zijn met het substraat van dit enzym; in
de eerste plaats dus door de producten, welke bij de reactie ontstaan.
Voor de moutamylase is hieromtrent een uitvoerig onderzoek inge-
steld door WoHL en Glimm Zij voegden o.m. verschillende hoe-
veelheden maltose toe bij een mengsel van zetmeeloplossing en
enzymoplossing en bepaalden dan de toeneming van de suiker. Zoo
vonden zij, dat bij aanwezigheid van 15 % maltose in het reactie-
mengsel, geen toeneming meer te constateeren viel, dwz. de reactie
werd voor 100 % geremd. Een concentratie van 10 % maltose gaf
een remming van 67 %; 10 % fructose en 15 % saccharose hadden
echter in het geheel geen invloed. Sjoeberg vond, dat de reactie
van amylase uit ongekiemde gerst reeds door 0,5 % maltose ver-
langzaamd werd. Richard Kuhn heeft de invloed van a-maltose
en /5-maltose op de reactiesnelheid van a-amylasen en jS-amylasen
onderzocht. Dit is mogelijk, doordat een versche oplossing van
maltose nagenoeg uitsluitend /3-maltose bevat. Laat men de op-
lossing staan, dan gaat een deel van de /5-maltose over in a-maltose,
totdat een evenwicht bereikt is. De snelheid, waarmee de omzetting
plaats vindt, is vooral afhankelijk van den zuurgraad. Door alkali
wordt zij zeer versneld, terwijl zij in een oplo,ssing, zuurder dan
pH 6, slechts langzaam \\^erloopt. Men noemt deze wederzij dsche
omzetting, die geconstateerd wordt uit de daarbij optredende ver-

^ andering van het draaiings-vermogen, mutarotatie. Kuhn vond nu,
dat de reactie van „Takadiastasequot;, een a-amylase, door a-|3-maltose
(het evenwichtsmengsel) 2 X zoo sterk geremd werd dan door een-
zelfde hoeveelheid /?-maltose. Bij moutamylase, volgens Kuhn een
)S-amylase, waren de bepalingen met verschillende enzympraepa-
raten (extracten) niet allen met elkaar in overeenstemmingquot;. Over
het algemeen remde de (3-modificatie sterker dan a-yS-maltose; zoo
werd een extract van groenmout door /?-maltose l|-x zoo sterk
geremd dan door het evenwichtsmengsel. Bij één extract waren de
effecten nagenoeg gelijk.

De verschillende amylasen worden dus het sterkst geremd door
die vorm van maltose, die zij zelf doen ontstaan. Wanneer dus,
zooals uit de polarimetrische proeven van Ohlsson i) volgt, het
eene moutenzym een a-amylase, het andere een /^-amylase is, dan
moet dit ook tot uitdrukking komen in een verschillenden invloed
van en a-/?-maltose op de reactiesnelheid. Daarom werd besloten
deze invloed te bepalen.

Voor alle proeven werd ,,Maltose Kahlbaumquot; gebruikt. Hiervan
werden oplossingen gemaakt van 2 %, 4 % en 6 % in gedest. water.
Van te voren was nagegaan, hoeveel daarvoor moest worden afge-
wogen, daar de maltose water bevatte.Bovendien werd bij iedere
proef de concentratie nauwkeurig bepaald, zoodat precies bekend
was, hoeveel maltose aan het reactiemengsel werd toegevoegd. De
toevoeging geschiedde voor de bepaling van den invloed van /5-mal-
tose onmiddelijk na het oplossen, voor de bepaling met a-/3-maltose
werd de oplossing in den thermostaat bij 40° geplaatst en minstens
24 uur daarin gelaten. Ter vergelijking werd natuurlijk ook een
bepaling zonder toevoeging van maltose verricht en alle bepalingen,
die tot dezelfde proef behoorden, vonden plaats onder dezelfde
omstandigheden van temperatuur en zuurgraad. De gang van zaken
was overigens dezelfde als bij de in de vorige hoofdstukken beschre-
ven bepalingen van de reactiesnelheid.

In de tabellen vindt men het verschil tusschen de bepaalde hoe-
veelheid maltose en de van te voren toegevoegde hoeveelheid, uit-
gedrukt in mgr. per analyseproefje (10 ccm., behalve bij de proef,
vermeld in tabel XX, waarbij 25 ccm genomen werd).De samen-
stelling van het reactiemengsel was bij alle bepahngen als volgt:
50 ccm. 2 % opl. zetmeel
25 ccm. 0,1 N. citraatmengsel

De tabellen XX, XXI en XXII geven de proeven met j8-mout-
amylase; XXIII en XXIV die met a-moutamylase.

Men ziet, dat over het algemeen de reactie van de ^^-moutamylase
sterker geremd wordt door ;S-maltose, dan door a-^-maltose; in
enkele gevallen komt het effect overeen met het door Kuhn ge-
vonden verschil bij een extract van groenmout. Het is echter niet
bij alle bepahngen hetzelfde.

Bij de a-moutamylase daarentegen oefent de a-/?-maltose een
duidelijk sterkere remming uit dan de ;S-maltose en wel zijn de
beide bepalingen niet alleen onderling in goede overeenstemming,
maar bovendien komen zij vrij nauwkeurig overeen met het door
Kuhn gevonden verschil bij ,,Takadiastasequot;, hetgeen er dus wel
op wijst, dat wij hier met een a-amylase te doen hebben.

Het is nog niet gelukt a-maltose in zuiveren toestand in handen
te krijgen. Hudson en Yanowsky echter hebben vastgesteld,
dat het evenwichtsmengsel van maltose is samengesteld uit 64 %
^-maltose tegen 36 % a-maltose. Dit stelt ons in staat te berekenen,
hoe groot het aandeel geweest is, dat de a-maltose in het evenwichts-
mengsel aan de remming gehad heeft en welke remming wij ge-
kregen zouden hebben, indien wij met enkel a-maltose hadden kun-
nen werken.

De resultaten van deze berekeningen vindt men in de tabellen
XXV en XXVI; de verschillen komen hier, zooals men ziet, duide-
lijker te voorschijn.

a)nbsp;een nieuw argument vormen voor de ongelijksoortigheid der beide
amylasen en

INVLOED VAN DE ENZYMCONCENTRATIE OP DE
REACTIESNELHEID EN DE GRENS VAN DE
AFBRAAK DER BEIDE MOUTAMYLASEN

Het feit, dat mijn praeparaten van a- en ;8-moutamylase als
enkelvoudig mochten worden beschouwd, stelde mij in staat de
werking van de beide enzymen op hetzelfde substraat — oplosbaar
zetmeel — en met behulp van dezelfde methode voor de bepaling van
de activiteit te bestudeeren. Daartoe werd de reactiesnelheid en de
grens van de afbraak bepaald bij verschillende enzymconcentraties,
terwijl de concentratie van het zetmeel steeds dezelfde bleef, n.1.
1 %. Op deze manier konden de eigenschappen der beide amylasen
het duidelijkst tot uitdrukking komen.

Reeds in hoofdstuk IH zijn proeven vermeld, die bewijzen, dat
de grens van de zetmeelafbraak, veroorzaakt door /3-moutamylase,
niet verschuift bij langdurige inwerking of bij toevoegen van versch
enzym, terwijl het restproduct, bevrijd van maltose, nagenoeg geen
werking meer met dit enzym vertoont. Hieruit blijkt, dat wij dus
niet met een evenwichtstoestand, maar met een werkelijke grens van de
afbraak te doen hebben. Bij een van de proeven nu, die enkel dien-
den om de grens van de afbraak nauwkeurig te bepalen, werd gebruik
gemaakt van een zetmeeloplossing van 2%, die gedurende eenigen
tijd in de koude gestaan had en een melkwit uiterlijk vertoonde,
terwijl ook de viskositeit merkbaar grooter geworden was. Klaar-
blijkelijk was gelatineering ingetreden, zonder dat zich echter een
vaste massa had gevormd, aangezien daarvoor de concentratie te
gering was.\' Deze zetmeel-oplossing nu gaf met (J-moutamylase in
een etmaal slechts 52,2 % maltose. In drie etmalen werd 53,5 %

gevormd, terwijl 6 etmalen na toevoeging van het enzym 55,6 %
maltose ontstaan was. De reactie werd dus tegen het eind aanzienlijk
verlangzaamd. Bij verwarming van de zetmeeloplossing aan een
opstijgenden koeler om verandering van de concentratie te voor-
komen, begon de troebelheid bij 60° te verdwijnen. Bij 70° was de
vloeistof weer geheel helder geworden. Na afkoeling werd opnieuw
de grens van de afbraak bepaald en 60,9 % gevonden in 24 uur,
dus weer nagenoeg het oorspronkelijke percentage van 62 %. Het
was nu de vraag, in hoeverre dit percentage beïnvloed zou kunnen
zijn door onvolkomen peptisatie van het zetmeel, dwz. of niet een
beter „oplosbaarquot; zetmeel verder, wellicht voorquot; 100 %, door
(5-moutamylase zou kunnen worden gehydrolyseerd. Immers het
was wel gebleken uit het gedrag van de gegelatineerde zetmeelop-
lossing, dat om aan een gevonden afbraakgrens eenige beteekenis
te mogen toekennen, men er zeker van moet zijn, dat de kolloide
toestand van het substraat geen rol heeft gespeeld.

Om nu het gemakkelijkst-oplosbare deel van het zetmeel in
handen te krijgen schudde ik ca. 20 gr. van het praeparaat met
300 ccm. water van 60° C. gedurende ca. 20 min. Daarna werd van
het niet in oplossing gegane deel (verreweg het grootste deel) afge-
filtreerd en het filtraat uur langzaam gekookt. Het stelde een
glasheldere oplossing voor, welke ook na dagen bij kamertem-
peratuur te hebben gestaan nauwelijks eenige opalescentie ver-
toonde. Toch bevatte zij, blijkens analyse (hydrolyse met 2|- %
HCl op de beschreven wijze) ruim 0,8 % amylum. Hiermee werd
nu de afbraakgrens bepaald.
Reactiemengsel:

10 ccm. enzymopl. ^/looo
25 ccm. van het reactiemengsel bevatten vóór de hydrolyse:

101,6 mgr. amylum, wat overeenkomt met 107,5 mgr. maltose.^
na 20 uur werd gevonden: 68,7 mgr. maltose 64 % v. d. theorie.

oplosbaar zetmeel te maken uit denzelfden voorraad aardappel-
meel, vi^aaruit het eerste praeparaat bereid was. Het verschil met
het eerste praeparaat bestond hierin, dat het aardappelmeel i.p.v.
10 dagen, 12, resp. 14 dagen met 7i % zoutzuur bij kamertempera-
tuur behandeld werd i). Beide praeparaten bezaten een gehalte aan
zuiver amylum van 89 % en vertoonden dezelfde eigenreductie als
het eerste. Hun oplossingen waren, tenminste kort na de bereiding,
zeer helder. Een volledige oplossing van heide praeparaten werd door
^-moutamylase voor 64 7o gehydrolyseerd.

Ik meen daarom te mogen zeggen, dat dit percentage de werkelijke
grensafbraak van de ^-moutamylase voorstelt.

Bij de in het vervolg te beschrijven proeven is steeds het tweede,
12 dagen behandelde, zetmeelpraeparaat gebruikt.

De tabellen XXVII t/m XXX (zie pag. 55) en fig. 4 geven een over-
zicht van de proeven met verschillende concentraties (^-moutamylase,
die alle bij pH 5,00 en 40° C. werden uitgevoerd, terwijl de concen-
tratie van het zetmeel in het reactiemengsel 1 % bedroeg. De ge-
tallen bij de krommen en rechts boven de tabellen geven de rela-
tieve hoeveelheden /3-moutamylase aan, „1quot; beteekent daarbij,
dat 100 ccm. reactiemengsel 5 ccm. enzymoplos.sing V^ooo bevatten.
In de eerste kolom vindt men weer de tijd in uren, in de tweede
de hoeveelheid maltose in mgr. per 10 ccm., in de derde kolom
de hoeveelheid maltose in % van de theorie. V, k\' en k in de vierde,
vijfde en zesde kolom stellen resp. voor de reactiesnelheid in mgr.
maltose per uur, de reactiesnelheidsconstante van de monomoleculaire
reactie met a = 64 % en dezelfde constante voor a = 100 %2).

In de eerste plaats blijkt dat, onafhankelijk van de enzymconcen-
tratie, de reactie na korteren of längeren tijd bij de vorming van
ca. 64 % van de theoretisch mogelijke hoeveelheid maltose stopt.

Vérder, dat de beginsnelheid van de reactie nagenoeg evenredig is
met de enzymconcentratie en

ten derde, dat hij een geringe enzymconcentratie, de reactie een nage-
noeg rechtlijnig verloop heeft.

De enzymconcentratie „2quot; komt overeen met die, welke bij de
bepaling van de pH-kromme gebruikt was. Vergelijkt men tabel

De /5-moutamylase vertoont, in tegenstelling tot wat algemeen
voor de „moutamylasequot; gevonden is i), een zoodanige regelmatig-

1) Zie J. B. S. Haldane, Enzymes, London 1930, pag. 140, die als
,,abnormale verschijnselenquot; opgeeft: „the dependence of the endpoint on
the amount of amylase, and the lack of proportionahty between quantity
of amylase and reaction velocityquot;.

heid in haar gedrag, dat het, naar mijn meening, zin heeft om de
vraag te stellen hoe wij ons de werking van dit enzym moeten
denken.

Aangenonnen wordt, dat zich bij alle enzymwerkingen tusschen
enzym en substraat een verbinding vormt en dat, onder overigens
gelijkblijvende omstandigheden, de per tijdseenheid gevormde hoe-
veelheid reactieproduct, dus de reactiesnelheid, evenredig is met de
concentratie van deze verbinding. Er kunnen zich dan in hoofdzaak
twee gevallen voordoen

a)nbsp;Wanneer weinig enzym in staat is veel substraat te binden en
de substraat-concentratie is gering, dan zal de hoeveelheid enzym-
substraat-verbinding evenredig zijn met de concentratie van het sub-
straat. Daar deze gedurende de reactie vermindert, krijgen we in
dit geval dus een logarithmisch verloop.

b)nbsp;Het enzym bindt zoo weinig substraat of de substraat-con-
centratie is zoo hoog, dat er tot kort voor het einde van de reactie
steeds overmaat substraat aanwezig is. In dit geval is de hoeveel-
heid enzym-substraat-verbinding evenredig met de enzymconcen-
tratie-, wanneer deze niet verandert heeft de reactie dus een recht-
lijnig verloop.

De zaak wordt echter gecompliceerder wanneer de reactiepro-
ducten een remmende werking uitoefenen, wat meestal het geval is.
Dan zal zoowel de reactiesnelheid V als de k van de monomole-
culaire reactie een daling vertoonen. Een stijging van de reactie-
snelheidskonstante is onder geen omstandigheden te verwachten.

Beschouwen we nu de werking van de ^-moutamylase, dan zal
duidelijk zijn, dat we hier te doen hebben met het onder b ver-
melde geval. De reactiesnelheid daalt door de remmende werking
van de maltose. Hoe verder wij ons van de grens van afbraak be-
vinden en hoe langzamer de reactie plaats vindt, des te meer be-
nadert haar verioop de rechtlijnigheid. Wij hebben dit reeds gezien
in de tabellen I—XV, waar de rechtlijnigheid steeds duidelijker te
voorschijn komt, naarmate wij in meer alkalisch milieu werken,
dwz. naarmate de reactie langzamer gaat.

In fig. 5 en in de tabellen XXXI t/m XXXVII is de werking van
verschillende hoeveelheden a-moutamylase op een 1 % zetmeel-
oplossing bij pH 5,75 en 40° C. weergegegeven. Ook hier worden
door de cijfers boven de tabellen en bij de krommen de relatieve
enzymconcentraties aangeduid, „1quot; beteekent in dit geval, dat

zich in 200 ccm. reactiemengsel 5 ccm. enzymoplossing 1 /3000 be-
vonden. Bij iedere bepaling werden 25 ccm. geanalyseerd.

[ Van de regelmatigheden, die de i?-moutamylase vertoont, vinden
wij hier niet veel terug. Alleen bij geringe hoeveelheden enzym is
de beginsnelheid- van de reactie evenredig met de enzymconcen-

tratie. Bij de concentratie „5quot; echter is de gevormde hoeveelheid
maltose naar verhouding reeds te gering (nl 4). Wanneer \'^

maltosevorming klaarblijkelijk slechts met moeite de 36 over
schrijdt.nbsp;^^ uver-

Aanvankelijk veronderstelde ik, dat een zeer gering gehalte van
het praeparaat aan /9-moutamylase, niet aantoonbaar op de in
hoofdstuk III beschreven wijze, de overschrijding van de ver-
wachte grens veroorzaakte. Een oplossing van (reeds door ver-
hi^tting verkregen) a-moutamylase Vaoo werd daarom gedurende
15 mm. op 70° C. verhit, vervolgens snel afgekoeld en gefiltreerd
Met deze pas verhitte oplossing werden nu eenige bepalingen
gedaan, waarbij zich 10 ccm. resp. 25 ccm. bevonden in 100 ccm
reactiemengsel i). De zoo gevonden krommen, in fig. 4 gestippeld
sluiten zich goed bij de andere aan, tenminste geduLd! de eerst
uren van de reactie. Van het optreden van een scherpe grens is geen
sprake zoodat de veronderstelling van een verontreiniging met
^-moutamylase dus niet juist blijkt te zijn. Uit de ligging van de
kromme, bepaald met 10 ccm. enzymoplossing werd de relatieve
concentratie op ,16quot; geschat, de „vquot; geeft aan, dat hier met de
verhitte enzymoplossmg gewerkt is. Voor de andere bepaling volgt
daaruit een relatieve concentratie van „40vquot;nbsp;e ë

hitte enzymoplossing een merkwaardig verschil met dat van de
niet verhitte. Terwijl met de laatstgenoemde na 2—3 uur vrijwel
geen verdere maltosevorming meer optreedt, gaat met de verhitte
oplossing de reactie verder en wel, zooals uit de tabellen XXXVI
en XXXVII blijkt, met de enzymconcentratie ,,16vquot; in 60 uur tot
57,5 %, met de concentratie „40vquot; in 36 uur zelfs tot 75,2 o/.
Bovendien werd bij de bepaling „16vquot; na 2|- uur, dus nadat 41 \'%
maltose gevormd waren, bij 10 ccm. van het reactiemengsel 5 ccm.
van de verhitte enzymoplossing gevoegd en na 40 uur de gevormde
suiker bepaald: 82,9 mgr. maltose = 78,5 % van de theorie.

Hieruit blijkt dus, dat de a-moutamylase, dus die component,
welke in de literatuur ,,dextrinevormendquot; of ,,zetmeeloplossendquot;
genoemd wordt, wanneer zij maar in groote hoeveelheid aanwezig
is en door verhitting geactiveerd, in staat is meer maltose te vormen,
dan de ^-moutamylase, die altijd als het ,,suikervormendequot; enzym
beschreven wordt. Toch blijkt ook bij gebruik van de concentratie.
,,40vquot; een aanzienlijke remming van de reactie in de nabijheid van
36 % op te treden. In het volgende hoofdstuk zal getracht worden
van deze verschijnselen een verklaring te geven. ■

Het ligt voor de hand, de gevonden activeering van de a-mout-
amylase door verhitting, in verband te brengen met Ohlsson\'s
ontdekking van een in de mout, die de werking van dit enzym
belemmert en die door verhitting vernietigd wordt Dit verklaart
ook, waarom bij gebruik van moutextract zonder meer, de werking
van de i?-moutamylase zoo sterk op den yoorgrond treedt.

Het is mij niet gelukt, door gelijktijdige of achtereenvolgende
werking der beide amylasen, het zetmeel voor 100 % in maltose
om te zetten. In alle gevallen kwam de reactie tot stilstand bij de
vorming van 78—80 % maltose. Dit was ook, zooals wij zoo juist
gezien hebben, de grootste opbrengst, welke door de geactiveerde
a-moutamylase alléén verkregen kon worden. Door de meeste
onderzoekers is deze gedeeltelijke versuikering geconstateerd. Kuhn
(l.c.) vermeldt echter, dat sommige moutsoorten, na langdurige
extractie, een enzym leveren, dat een volkomen versuikering tot

stand brengt. Pringsheim i) heeft gevonden, dat de maltose-
vormmg eveneens verder gaat dan 78 o/„ wanneer men aan het
reactiernengsel bepaalde afbraakprodukten van eiwitstoffen toe-
voegt, die men krijgen kan door autolyse van gist of door kippen-
eiwit met pepsine te behandelen. Hij noemt deze stof, of verzame-
ling van stoffen, „komplementquot;. Door Kühn en door Sjoeberg
IS het bestaan van dit „komplementquot; bevestigd; echter schijnen
niet alle gistsoorten het te bevatten. Daar ik vermoedde, dat alleen
de a-moutamylase door het „komplementquot; zou worden beïnvloed
heb Ik getracht het te bereiden, wat mij echter niet is mogen ge-
lukken. Noch versche bakkersgist, noch versche biergist fafkomstijj
van de Brouwerij d\'Oranjeboom te Rotterdam) bleken het te be-
vatten. Wel vond een verhooging van het reduceerend vermogen
plaats; die moest echter toegeschreven worden aan de aanwezigheid
van maltase in het gistautolysaat, daar na verhitting op 75° ge
durende eenige minuten het effect verdwenen was, terwijl Lt
„komplementquot; thermostabiel heet te zijn. Ook kippeneiwit met
pepsme behandeld bij pH 2,0 en 30° C. gedurende 24 uur gaf een
verhooging van het reduceerend vermogen, dit bleek hier te moeten
worden geweten aan een eigenreductie van het toegevoegde prae-
paraat. Bracht ik deze in rekening, dan bleef voor de werking van
de a-^-moutamylase niet meer dan 78 % over.

2)nbsp;sjöberg, H. 159, 468 (1925), zie ook L. de Hoop u. J. A van
Laer, Biochem. Zts. 155, 235 (1925).

3)nbsp;H. Pringsheim, H. Borghard und H. Hupfer, Biochem. Zts. 238
iib, (1931) vermelden, dat glutathion dezelfde activeerende werking uit-
^•efent als het „komplementquot; (noot bij de corr.).

Wij hebben dus gezien, dat de beide moutamylasen, in den vorm
van enkelvoudige praeparaten, een zeer verschillende gevoeligheid
voor den zuurgraad van het milieu bezitten; dat de werking der
^-moutamylase het sterkst door /3-maltose, die der a-moutamylase
het sterkst door a-maltose geremd wordt en dat een volkomen op-
losbaar (peptiseerbaar) zetmeel door de ^ff-moutamylase voor 64 %
wordt gehydrolyseerd, waarbij een scherpe grens van afbraak op-
treedt, terwijl bij de werking van de a-moutamylase .36 % van het
zetmeel met groote snelheid wordt omgezet, de rest veel langzamer.
Daarnaast mogen de volgende feiten naar voren worden gebracht.
Door Hudson en Yanowsky is aangetoond, dat zich in de even-
wichtsoplossing van maltose 64 % ;5-maltose naast 36 % a-maltose
bevinden. Verder is uit het specifieke draaiingsvermogen van
a-glucose ([a]p = 109,6°) en i9-glucose ([aj^ =-f 20,5°) en
uit dat van het evenwichtsmengsel ([a]n = -f 52,3°) te bereke-
nen 2), dat in een oplossing van glucose na afloop der mutarotatie
^4 % iS-glucose naast 36 % a-glucose voorkomen.

De merkwaardige overeenstemming tusschen de afbraakgrenzen
der beide moutamylasen en de samenstelhng van het evenwichts-
mengsel van maltose en glucose, beiden typische afbraakproducten
van het zetmeel, heeft mij nu tot de overtuiging gebracht, dat het
zetmeel, tenminste in de door mij gebruikte oplossing, uit een even-

2)nbsp;Deze getallen zijn overgenomen uit P. Karrer, Lehrbuch der orga-
nischen Chemie, Leipzig (1928) pag. 320.

,^-.etmeel, 36 a-zetmeel voor. Het ^-zetmeel wordt alleen (of
tenmmste m de eerste plaats) door de ^-moutamylase gehydroly-
seerd, daarbij ontstaat de maltose in eerste instantie als ^-maltose
Het rest-product van de werking van /^-moutamylase, de stof, die
Wijsman erythrogranulose heeft genoemd, is dus a-zetmeeh dit
wordt alleen door de a-moutamylase aangetast, waarbij de maltose
in eerste mstantie als a-maltose ontstaat. Uit het feit dat een
scherpe grens van afbraak optreedt en dat het a-zetmeel op zichzelf
door ^-moutamyla.se .slechts weinig wordt aangetast, volgt, dat deze
component onder de omstandigheden waarbij gewerkt werd quot;slechts
voor een zeer gering deel in ^-zetmeel overgaat. Deze moeilijke om-
zetting, m tegenstelling tot wat wij bij a-maltose en a-glucose
vinden, wordt wel begrijpelijk wanneer wij bedenken, dat wij hier
met met betrekkelijk kleine moleculen in ware oplossing, maar met
groot-moleculaire verbindingen in kolloide oplossing te maken
hebben. Het schijnt overigens, dat een gedeeltelijke omzetting
plaats vindt tijdens de inwerking van a-moutamylase, gezien het
feit, dat daarna ook de ^-moutamylase een zekere werking ver-
toont i). Hoe moeten wij nu de werking van a-moutamylase op
oplosbaar zetmeel verklaren? Een mogelijke verklaring is deze
dat de nawerking, die dit enzym vertoont, wanneer 36% zijn om-
gezet, het gevolg is van een nalevering van substraat, dwz van een
omzetting van het ^-zetmeel in a-zetmeel, wanneer het evenwicht
verbroken is. Een andere mogelijkheid is, dat de a-amylase in staat
is ook ^-zetmeel langzaam te hydrolyseeren.

Wij komen dus tot de voorstelling, dat met de twee moutamy-
las^en, of meer in het algemeen, met de twee typen van amylasen \'
twee vormen van het zetmeel correspondeeren en dat de verschil-
lende specificiteit van deze beide typen van amylasen dus niet
alleen daarm bestaat, dat zij verschillende stoffen vormen (a-maltose
■en ^-maltose), maar ook hierin, dat zij verschillende stoffen afbreken
(a-zetmeel en ^-zetmeel). Deze voorstelling nu, is op de volgende
wijze uit te breiden.

Kuhn vindt, dat pankreas-amylase (als vertegenwoordiger van
de dierlijke amylasen) en Aspergillus-amylase (als vertegenwoor-
diger van de amylasen uit schimmels) tot de a-amylasen behooren.
Moutamylase (als vertegenwoordiger van de amylasen uit de groene
plant) bestaat uit een mengsel van a- en /^-amylase. Daar nu de
amylasen niet alleen hydrolyseeren, maar natuurlijk ook bij de
synthese der polysacchariden werkzaam zijn, ligt het voor de hand
om aan te nemen, dat in het dierlijk lichaam en in de schimmels alleen
a-zetmeel kan worden gevormd. Daar deze component moeilijk in
de andere overgaat, kunnen wij verwachten, dat wij haar als zoo-
danig zullen aantreffen. Inderdaad komt nu in het dierlijk lichaam
en in vele Fungi een polysaccharide voor, het ,,dierlijk zetmeelquot; of
glycog:een, waarvan bekend is, dat het in zeer nauwe verwantschap
tot het zetmeel staat, zonder daarmee in alle opzichten identiek
te zijn.

Daardoor is de mogelijkheid gegeven om onze voorstelling te
contróleeren. Immers is zij juist, dan moet het a-zetmeel {de erythro-
granulose) identiek zijn met glycogeen. Om dit na te gaan heb ik eenige
vergelijkende proeven gedaan met oplosbaar zetmeel, erythrogra-
nulose en glycogeen, waarbij het gedrag van deze drie stoffen ten-
opzichte van de beide moutamylasen werd vergeleken.

Tabel XXXIX

^-moutamylase
substraat	t uren	Xmgr. malt.
opl. zetmeel	1 2 3	24,1 43,5 57,5
er. granulöse	1 2 3	1,6 1,8 2,1
glycogeen	1 2 3	2,9 5,1 7,1

Tabel XXXVIII

a-moutamylase

substraat	t uren	Xmgr. malt.
glycogeen	i	22,0
	1	27,3
	H	29,3
er. granulöse	l	30,3
	1	32,5
	H	33,8
opl. zetmeel	i	46,6
	1	49,0
	li	50,0

Men ziet, dat i3-moutamylase met glycogeen slechts een zeer geringe
werking vertoont, evenals met erythrogranulose. In beide gevallen
blijft de jodiumreactie bestaan, evenals bij de werking op oplosbaar
zetmeel. De a-moutamylase doet met glycogeen niet alleen de
jodiumreactie verdwijnen, maar vormt daarbij ook een vrij aanzien-
lijke hoeveelheid maltose, welke meer overeenkomt met de hoeveel-
heid, die onder dezelfde omstandigheden uit erythrogranulose ge-
vormd wordt, dan met die, welke uit oplosbaar zetmeel ontstaat.
In de figuur is verder aangegeven, welke hoeveelheid maltose over-
eenkomt met 36 % v. d. theorie; men ziet, dat ook bij deze proef
de werking van de a-moutamylase met oplosbaar zetmeel in de
nabijheid van dit percentage tot stilstand komt.

Bij de werking van i0-moutamylase op glycogeen had zich na
24 uur 19,6 mgr. maltose gevormd. Ook bij langdurige inwerking
vindt dus niet een aanzienlijke suikervorming plaats.

Om te zien, of bij gebruik van glycogeen als substraat soms een
verschuiving van het optimum der a-moutamylase zou plaatsvinden,
werden de bepalingen, vermeld in tabel XXXX verricht. De samen-
stelling van het reactiemengsel was als bij de vergelijkende proeven,
alleen was de enzymoplossing verdund tot ^/gooo-

Het optimum ligt, zooals men ziet, ook hier bij pH 5,75. Aan de
alkalische zijde valt de kromme volkomen samen met die, welke
bepaald was met erythrogranulose als substraat, aan de zure zijde
is er een afwijking (fig. 7). Het is niet duidelijk, waaraan deze moet
worden toegeschreven, wellicht speelt hier de verschillende afkomst
der praeparaten een rol.

in aanmerking nemen, dan blijkt er dus wel een merkwaardige over-
eenkomst té zijn tusschen glycogeen en erythrogranulose of a-zet-
meel, wat hun gedrag ten opzichte van de beide moutamylasen
betreft. Doch ook in andere opzichten vertoonen zij gelijkenis. Beide

stoffen gaan reeds bij schudden met koud water eenigszins in „op-
lossingquot;, bij verhitten tot koken lossen zij gemakkelijk op tot een
betrekkelijk sterk opalesceerende vloeistof, echter zonder de voor
gewoon aardappelmeel zoo typische stijfselpap te vormen.

Ook het specifiek draaiïngsvermogen [aj^ van erythrogranulose
ligt zeer nabij dat van glycogeen. In het geheel heb ik van drie
stoffen de draaiing onderzocht: van oplosbaar zetmeel, van erythro-

granulöse en van glycogeen. De bepalingen geschiedden met een zgn.
„Halbschatten-apparatquot; volgens Laurent; als lichtbron werd een
natriumlamp gebruikt (D-lijn).

Een oplossing van 2 % vertoonde in een buis van 2 dM. bij 20°
een draaiing van 8,62°; 8,62° (twee bepahngen).

hoek voorstelt, l de lengte van de buis in dM., p de concentratie
van de stof in gr. per 100 gr. oplossing en d de dichtheid (die hier = 1
zal worden genomen), valt dan te berekenen:

Een zorgvuldig gefiltreerde oplossing werd eerst zoo ver verdund,
dat de draaiing ervan in een buis van 2 dM. nauwkeurig kon worden
afgelezen. Vervolgens werd deze oplossing op gehalte onderzocht
door hydrolyse met HCl op de beschreven wijze.

Een werkelijke 1 %-oplossing werd met zijn volume water ver-
dund en gaf in een buis van 2 dM.:

Huppert!) yond voor leverglycogeen [ajn = 4- 196,6°, een
waarde die, naar hij opmerkt, zeer dicht nabij komt aan die van
„erythrodextrinequot;, een stof, die Lintner en Duell kregen door
zetmeeloplossing met moutamylase {a-ß) te behandelen tot de
jodiumreactie roodbruin was en het restproduct met alcohol neer
te slaan; zij geven hiervoor [a]„ = 196°. Deze stof vertoonde
slechts een zeer gering reduceerend vermogen en kan als nagenoeg
identiek\'met erythrogranulose beschouwd worden. Het zelfde geldt

voor de „a-amylodextrinequot; van Baker i) met [aj^ = 190—195°
en de „a-;8-hexa-amylosequot; van Ling en Nanji 2) met [aj^ = 193°.

Gaan wij nu verder na in hoeverre de resultaten van andere
onderzoekers in dezelfde richting wijzen als de onze, dan kunnen
wij, wat het gedrag van de ^S-moutamylase betreft, opmerken, dat
over het algemeen bij de hydrolyse met „moutamylasequot;, waarvan
de werking grootendeels bepaald wordt door de |3-component, een
meer of minder sterke remming geconstateerd is, wanneer 60—65 %
van de theorie maltose gevormd was. Heel sterk trad de remming
op bij gebruik van amylase uit ongekiemde gerst (Baker; Ling;
Sjoeberg; Sabalitschka); de door de verschillende auteurs op-
gegeven grens van de afbraak varieert van 60—67 %. In alle ge-
vallen bleef de jodiumreactie bestaan. Uit onze ervaringen blijkt,
dat 64 % als de werkelijke grens moet worden beschouwd. Wat de
grensafbraak van de a-moutamylase betreft, hieromtrent heb ik
slechts één mededeeling kunnen vinden en wel bij Polak en Ty-
chowsky 3), die vermelden, dat moutextract, dat gedurende 15 min.
op 70° C. verhit was, uit „amylosequot; volgens Sherman en Baker,
zeer snel 35 % maltose vormt, waarbij de jodiumreactie verdwijnt,
terwijl verdere versuikering veel langzamer volgt.

Volgens onze voorstelling moet natuurlijk iedere a-amylase in de
nabijheid van 36 % een remming vertoonen. Aanwijzingen daarom-
trent vinden wij in eenige tabellen van Kuhn Bij de werking van
gezuiverde pankreas-amylase op „amylosequot; (volgens Sherman en
Baker ), vertoont de reactie een sterke remming nadat 40 %
suiker is gevormd; bij de ,,Takadiastasequot;, werkende op door elec-
trodialyse gezuiverd oplosbaar zetmeel (volgens Lintner), treedt
deze remming op bij 35—36 %. In fig. 8 zijn deze tabellen in den
vorm van de krommen a en b weergegeven. De kromme c heeft
betrekking op onze a-moutamylase en is ontleend aan tabel XXXVII

(deze diss. pag. 59). De figuur toont wel aan, dat de a-moutamylase
zich in haar gedrag zeer goed bij de andere a-amylasen aansluit.

Uit onze proeven, beschreven op pag. 45, blijkt, dat erythro-
granulose veel moeilijker dan oplosbaar zetmeel versuikerd wordt
door a-;3-moutamylase. Hetzelfde verschijnsel is voor glycogeen ge-
constateerd, zoowel door Mlle. Philoche i) als door Eadie 2). Wij

hebben gezien, dat dit aan de ;S-component van de moutamylase
moet worden toegeschreven. Mlle. Philoche vond bovendien,
dat glycogeen gemakkelijk wordt aangetast door pankreas-
amylase (a-amylase). Het verband tusschen deze verschijnselen

wordt duidelijk, wanneer wij aannemen, dat zoowel glycogeen als
erythrogranulose uit a-zetmeel bestaat.

Verder eischt onze voorstelling, dat het voorkomen van glycogeen
steeds zal samengaan met de aanwezigheid van enkel a-amylase,
terwijl overal waar zetmeel voorkomt, a-|8-amylase moet worden
aangetroffen. Van pankreas-amylase en Aspergillus-amylase staat
de natuur als a-amylase vast. Speeksel-amylase vertoont evenals
a-moutamylase alleen een kleurloos diffusieveld in zetmeel-gelatine
en gedraagt zich ook in andere opzichten als een a-amylase. Beye-
rinck vond, dat de amylase van een bacterie Granulohacter even-
eens slechts een kleurloos diffusieveld gaf. Beyerinck heeft ook
zeer veel plantaardige amylasen onderzocht met de diffusie-methode
van Wijsman. Genoemd worden de amylasen uit kiemende zaden
van tarwe, rogge, mats en vele andere Gramineen) Vicia faba, Pisum
sativum en vele andere Papillionaceën] verder de amylase uit de
wanden der vruchtbeginsels van Phaseolus en Cytisus; de bladstelen
van Robinia, knollen van Sagittaria sagittaefolia, etc. Met uitzon-
dering van de amylase uit mais vond hij, dat alle plantaardige amy-
lasen een meer of minder breeden paarsen ring gaven.

Van deze proeven heb ik die met kiemende zaden van tarwe,
haver, rogge, mais, Pisum sativum, Vicia faba en Phaseolus multi-
florus herhaald. De gekiemde zaden werden stukgesneden of geplet
en met weinig water geëxtraheerd. Zoowel druppels van het extract,
als deelen van het weefsel werden op gelatine-zetmeelplaten ge-
bracht. De diffusie vond plaats in de koelkast gedurende 6 dagen.
Alle praeparaten, ook die van mais, vertoonden een meer of minder
breeden paarsen ring. De ß-amylase is dus klaarblijkelijk een typisch
enzym van de groene plant, zooals ook het zetmeel een typisch plant-
aardig product is.

Vervolgens komen wij er toe, eenige feiten te beschouwen, die als
bezwaren tegen de voorstelling van een a- en een iï-zetmeel kunnen
worden opgevat.

Wanneer de a-moutamylase uit oplosbaar zetmeel 36 % mal-
tose vormt, dan mogen wij verwachten, dat een praeparaat van

a-zetmeel door dit enzym volledig zal worden omgezet. Dat is
echter niet het geval, de a-moutamylase ondervindt bij de werking
op erythrogranulose blijkbaar een aanzienlijke belemmering. Uit
fig. 6 is zelfs te zien, dat een bepaalde hoeveelheid a-moutamylase
uit oplosbaar zetmeel meer maltose vormt, dan uit eenzelfde hoe-
veelheid erythrogranulose, hoewel het eerstgenoemde substraat
slechts voor 36 %, het laatstgenoemde voor ca. 100 % uit a-zetmeel
bestaat. Wanneer alleen de concentratie van het substraat het ver-
loop van de reactie bepaalde, dan zou onze voorstelling moeilijk
juist kunnen zijn. Wij moeten echter bedenken, dat niet alleen het
substraat, maar ook het enzym in kolloide oplossing aanwezig is,
terwijl bovendien het enzympraeparaat niet vrij is van begeleidende
stoffen, voornamelijk van eiwit-achtigen aard, die onder omstandig-
heden een rol kunnen spelen. Merkwaardig is, dat met glycogeen
dezelfde belemmering optreedt als met erythrogranulose. Kuhn
vindt, dat glycogeen door gezuiverde pankreasamylase gemakkelijk
voor 100% in maltose kan worden omgezet, zoodat de belemmering
dus niet karakteristiek is voor de a-amylasen in het algemeen. Een
onderzoek naar de oorzaak van het verschijnsel is door mij niet
ingesteld, aangezien dit een werk op zichzelf zou zijn geworden.
Waarschijnlijk zullen, nadat een oppervlakkige hydrolyse heeft
plaatsgehad, de onzuijyerheden, die zich in de a-moutamylase be-
vinden, aan de deeltjes (micellen) van het a-zetmeel, die blijkbaar
een groote neiging hebben stoffen te adsorbeeren (jodiumreactie!),
worden geadsorbeerd, waardoor de omzetting tot stilstand komt.
Daarop wijst ook het verschijnsel, dat bij de werking van de a-
moutamylase na korten tijd een uitvlokking optreedt, die des te
sneller ontstaat, naarmate de reactie sneller verloopt. Dat de 36 %
a-zetmeel, die zich in het oplosbare zetmeel bevinden, zooveel ge-
makkelijker in hun geheel worden gehydrolyseerd, zou dan zoo
verklaard kunnen worden: de moleculen a-zetmeel vormen hier niet
één compakte massa, maar liggen verspreid tusschen een bijna 2 X
zoo groot aantal /3-zetmeelmolekulen, waardoor het enzym een
grootere werkzame oppervlakte aangeboden wordt.

Een ander feit, dat niet in overeenstemming is met wat wij
zouden mogen verwachten is, dat het specifieke draaiingsvermogen
van glycogeen en erythrogranulose (a-zetmeel) lager ligt, dan dat
van het oplosbare zetmeel (a-^-zetmeel) en dus ook lager dan dat

van zetmeel, terwijl zoowel a-nialtose, a-glucose en de a-gluco-
siden een hooger specifiek draaiingsvermogen hebben, dan de ;3-com-
ponenten van deze stoffen. Het is de vraag, in hoeverre de eigen-
schappen van de zetmeelen en die van de eenvoudige glucosiden
met elkaar vergeleken kunnen worden, m.a.w. of het draaiingsver-
mogen der zetmeelen alléén bepaald wordt door den aard der
glucosidische bindingen, die er in voorkomen, of dat ook andere
structuureigenaardigheden deze grootheid beïnvloeden. Wij komen
op deze kwestie in het volgende hoofdstuk nog even terug.

Wat de kleuring met jodium betreft, die bij glycogeen roodbruin,
bij erythrogranulose blauw of paars is, daaraan kan naar mijn mee-
ning niet een groote beteekenis worden toegekend. Vrij zeker speelt
hier de voorgeschiedenis der praeparaten een rol. Wanneer men
n.1. erythrogranulose of ook oplosbaar zetmeel behandelt met
a-moutamylase, dan ziet men de paarse kleur zeer snel in roodbruin
overgaan.

De hier geformuleerde bezwaren maken natuurlijk, dat de twee-
componenten-theorie van het zetmeel, in den door mij gegeven
vorm, een zeker speculatief karakter behoudt. Het komt mij echter
voor, dat niet een van deze bezwaren als een positief bewijs tegen
de theorie beschouwd mag worden en dat de argumenten pro zeker
tegen de contra-argumenten opwegen.

In het volgende, laatste hoofdstuk ,zal worden nagegaan, in hoe-
verre a-zetmeel en i9-zetmeel in verband kunnen staan met „amy-
losequot; en ,,amylopektinequot; en of uit de hiervoor beschreven proeven
met de moutamylasen ook iets omtrent de structuur der beide zet-
meelen kan worden afgeleid.

De literatuur van het zetmeel is zoo omvangrijk, gecompliceerd
en vol van tegenstrijdigheden, dat het niet mogelijk is om in een
kort bestek een ook maar bij benadering volledig overzicht te geven.
Ik moet mij daarom beperken tot eenige kwesties, die in nauw ver-
band staan met het hiervoor beschreven onderzoek. Voor een meer
volledig overzicht kan ik b.v. verwijzen naar H. Pringsheim, Die
Polysaccharide i), waarin de huidige stand van onze kennis vrij
nauwkeurig, hoewel weinig critisch, wordt samengevat.

Reeds Naegeli heeft twee zetmeelcomponenten onderscheiden.
\\^olgens hem ontstaan de zetmeelkorrels door intussusceptie, de
buitenste laag is de oudste en droogste en bestaat uit „zetmeel-
cellulosequot;, de inhoud noemt hij „zetmeel-granulosequot;. Deze opvat-
ting werd bestreden door Schimper s) en later door Arthur
Meyer die aantoonden, dat de zetmeelkorrels door appo.sitie
groeien tót laagsgewijs gebouwde sphaerokrystallen. Toch onder-
scheidt ook Arthur Meyer twee componenten, een die de bui-
tenste laag van de korrel vormt, ^-amylose,gt;en een, die de inhoud
uitmaakt, a-amylose. Het verschil hgt volgens hem niet in de che-
mische structuur, maar in den graad van hydratatie. Volgens Hugo
de Vries s) zou het zetmeel niet uit twee verschillende koolhydra-
ten, maar uit één stof in verschillende graden van dichtheid bestaan.

Uitvoerig is de kwestie daarna onderzocht door Maquenne met
verschillende medewerkers en Roux i), die de namen „amylosequot; en
„amylopektinequot; hebben ingevoerd voor resp. de inhoud en het om-
hulsel. De „amylosequot; geeft een heldere, niet viskeuze oplossing, zij
kleurt zich met jodium blauw en wordt door moutamylase geheel
in maltose omgezet. De ,,amylopektinequot; vormt bij verwarming de
,,stijfselquot;; de zeer viskeuze pap, die men krijgt, wanneer men aard-
appelmeel in kokend water tracht op te lossen, bestaat dus uit ver-
stijfselde ,,amylopektinequot;, vermengd met ,,amylosequot;-oplossing. De
,,amylopektinequot; geeft geen kleuring met jodium en wordt door het
,,suikervormendquot; enzym van de moutamylase niet aangetast, wel
door het ,,zetmeeloplossendequot; enzym, dat men dan ook feitelijk
,,amylopektinasequot; zou moeten noemen. In aardappelmeel komen
80—85 % „amylosequot; voor, naast 15—20 % „amylopektinequot;. Met
behulp van moutamylase kunnen ze gescheiden worden.

Een andere scheidingsmethode geeft Gatin-Gruszewska aan.
Zij behandelt aardappelmeel met 1 % NaOH-oplossing, waardoor
het „omhulselquot; springt; de inhoud, „amylosequot;, gaat in oplossing,
terwijl de „amylopektinequot; in den vorm van leege zakjes neerslaat.
Volgens haar zou het aardappelmeel 55—60 % „amylosequot; naast
40—45 % ,,amylopektinequot; bevatten.

Sherman en Baker s) trachten een scheiding tot stand te bren-
gen door aardappelmeel bij 80° C. te verstijfselen onder toevoeging
van een weinig NaCl, vervolgens worden de componenten door
centrifugeeren gescheiden. Er ontstaan dan twee lagen, waarvan
de bovenste de ,,amylosequot; bevat, deze wordt afgeheveld, de rest
met water vermengd en vervolgens opnieuw gecentrifugeerd. Op
deze wijze wordt de ,,amylosequot; uit de „amylopektinequot; geëxtra-
heerd. Beide vloeistoffen worden tenslotte in een autoclaaf verhit.
De opbrengst aan ,,amylopektinequot; blijkt eenigszins af te hangen
van den duur der verstijfseling, na 2—4 uur werden 66 % ver-
kregen.

in, n.1. door electrodialyse van zetmeelstijfsel. Daarbij gaat de
„amylopektinequot; naar de positieve pool, waarbij het in den vorm
van een gel bezinkt, de „amylosequot; blijft in oplossing. Verschillende
zetmeelsoorten bevatten de beide componenten in verschillende
verhoudingen, in aardappelmeel is volgens Samec de verhouding:
83 % „amylopektinequot; tegen 17 % „amylosequot;.

I.ing en Nanji bevriezen een zetmeel stijf selpap van 5% en
houden die dan gedurende 12 uur bij — 10° C. Bij het opwarmen
slaat de „amylopektinequot; als een wolhge massa neer, terwijl de
„amylosequot; in oplossing blijft. Men krijgt op deze manier 14 %
quot;amylosequot;, dit is echter veel minder dan in werkelijkheid aanwezig
is, aangezien de „amylosequot; moeilijk uit de gelatineuze „amylopek-
tinequot; is te extraheeren (Na-carbonaat bevordert de extractie). Een
goede scheiding krijgt men door zetmeelstijfselpap bij 50° C. te
behandelen met door alcohol neergeslagen en gedroogde amylase
uit ongekiemde gerst, die de „amylosequot; geheel in maltose omzet,
terwijl de „amylopektinequot; achterblijft. Volgens deze methode vm-
den zij 66,6 % „amylosequot; tegen 33,3 % „amylopektinequot;. Bij ge-
bruik van gerstextract zonder droging met alcohol krijgen zij niet
„amylopektinequot; maar „a-i3-hexa-amylosequot;, «en stof, die alle eigen-
schappen vertoont van ons a-zetmeel. Waar het verschil tusschen
„amylopektinequot; en „a-^-hexa-amylosequot; precies op neerkomt is niet
duidelijk, van een suikervorming bij de overgang van de eene stof
in de andere wordt niet gesproken, evenmin verdwijnt de jodium-
reactie. Waarschijnlijk beschouwen Ling en Nanji de laatstge-
noemde stof als depolymerisatieproduct van „amylopektinequot;.

Men ziet dus, dat het door verschillende onderzoekers opgegeven
gehalte van aardappelmeel aan „amylopektinequot; uiteenloopt van
15—20 % bij Maquenne tot 83 % bij Samec. Pringsheim be-
schouwt de door Samec opgegeven verhouding als juist: „Wenn
,,gelegentlich ganz andere Zahlen für den Gehalt der Stärke an
„Hüll- und Inhaltssubstanz angegeben werden, dann handelt es
quot;sich entweder nicht um Kartoffelstärke oder es wurden Trennungs-
quot;methoden herangezogen, die zu falschen Ergebnissen führtenquot;
Door een dergelijke willekeurige besUssing wordt echter het feit
der uiteenloopende resultaten volstrekt niet verklaard. Merkwaardig

is bovendien, dat Pringsheim vasthoudt aan de voorstelhng van
een „inhoudquot; en een „omhulselquot; van de zetmeelkorrel, hoewel 83 quot;/
voor een „omhulselquot; toch rijkelijk veel genoemd mag worden. Het
kan zijn, dat de buitenste lagen van de zetmeelkorrel door indroging
een grootere resistentie verkrijgen tegenover sommige Chemikalien
dan het inwendige, maar met chemisch verschillende componenten
kunnen wij hier onmogelijk te maken hebben, daar de zetmeel-
korrels in de plant steeds verder „groeienquot; en dus steeds nieuwe
buitenste lagen krijgen i).

Wat de kwestie omtrent de chemische natuur der beide zetmeel-
componenten betreft, daarbij moeten wij in de eerste plaats be-
denken, dat de scheiding volgens twee, principieel verschillende
methoden is uitgevoerd: door Maquenne en door Ling en
Nanji met behulp van amylase, al dan niet uit ongekiemde gerst
waarbij, zooals wij met het oog op onze eigen proeven kunnen
zeggen, inderdaad een chemische scheiding zal hebben plaats gehad
— en door Gatin-Gruszewska, Sherman en Samec langs zuiver
kolloidchemischen weg Beschouwen wij eerst de laatstgenoemde
methode, dan kunnen wij zeggen, dat deze in alle gevallen neer-
komt op de scheiding van een sol en een gel, dus van twee verschil-
lende toestanden, waarbij de verdunde loog en het keukenzout als
peptisator hebben gefunctioneerd. Daarom wisselt de door Sher-
man gevonden verhouding met de wijze van behandeling en vindt
Gatin-Gruszewska een volgens Pringsheim te groote hoeveelheid
„amylosequot;.

Toch stelt Samec zich op het standpunt, dat zijn „amylopektinequot;
zich onderscheidt van zijn „amylosequot; ook wat de chemische samen-
stelhng betreft 3). De „amylopektinequot; bevat n.1. een geringe hoe-
veelheid phosphaat (gem. 0,175 %, uitgedrukt als P^O^), die daarin
met aanwezig zou zijn als een verontreiniging, maar in den vorm
van een phosphorzure ester, welke de hooge viskositeit van zetmeel-
stijfselpap zou veroorzaken. Tegen deze voorstelling bestaan echter
ernstige bezwaren. Zoo geeft glycogeen, dat meer dan 4x zooveel
phosphaat bevat, dan „amylopektinequot;, in het geheel niet die zeer

1) Zie ook Benecke-Jost, Pflanzenphysiologie, 4. Aufl. Jena (1924)
Bd. I pag. 256.nbsp;■gt; ^ h

Zie ook J. J. Lijnst-Zwikker, Ree. Trav. Bot. Néerl. 18, 1 (1921)
3) M. Samec und F. v. Hoefft, Koll. Beih. 5, 141 (1913).

viskeuze pap, welke karakteristiek is voor aardappelzetmeel en
andere zetmeelsoorten. Andere bezwaren zijn naar voren gebracht
door v. d. Hoeve op grond van viskositeitsmetingen aan ver-
stijfseld aardappelmeel. De zetmeelkorrel moeten wij ons denken
als te zijn opgebouwd uit micellen, dwz. complexen van een meer
of minder groot aantal moleculen, waartusschen zich capillairen
bevinden, die met water gevuld zijn; in dat water komt het phos-
phaat als verontreiniging voor. In het zetmeelsol, de ,,amylosequot;,
zijn de micellen vrij in de oplossing aanwezig, in de verstijfselde
korreldeelen, de „amylopektinequot;, zijn zij aan elkaar gekit. Oplos-
baar zetmeel volgens Lintner geeft bij oplossing eveneens vrije
micellen en wordt door v. d. Hoeve dan ook eveneens »,amylosequot;
genoemd.

Het zal duidelijk zijn, dat het bij een dergelijke stand van zaken
geen zin had „amylosequot; en „amylopektinequot; volgens Samec, Sher-
man of Gatin-Gruszewska te bereiden. Zoo bleef dan de bewerking
volgens Lintner over als de eenvoudigste manier om over een
groote hoeveelheid zetmeeloplossing (sol) van gelijke qualiteit te
kunnen beschikken. Wat er nu precies gebeurt bij deze bewerking
van het aardappelzetmeel is, zooals reeds in het tweede hoofdstuk
werd opgemerkt, niet met zekerheid bekend. Het waarschijnlijkst
is, dat zich in het aardappelmeel een of meer stoffen bevinden, die
de stijfsel-(gel-)vorming bevorderen of wellicht meer precies: de
peptisatie belemmeren, en dat deze stoffen door het verdunde zout-
zuur worden weggenomen.

Keeren wij nu terug tot de eerstgenoemde categorie van schei-
dingsmethoden. Het spreekt vanzelf, dat de „amylopektinequot; van
Ling en Nanji (om het verouderde onderzoek van Maquenne ver-
der onbesproken te laten) een geheel ander product is, dan de „amy-
lopektinequot; van de drie zooeven genoemde onderzoekers. Uit de
bereidingswijze en uit de eigenschappen volgt wel, dat het in hoofd-
zaak dezelfde stof moet zijn als de erythrogranulose van Wijsman,
door mij a-zetmeel genoemd. Het behoeft dan ook niet te verwon-
deren, dat zij tot een verhouding van de beide componenten komen,
die zeer nabij de mijne ligt, n.1. 67—33 ongeveer, waarin zij de
„mooiequot;, maar nietszeggende verhouding 2 : 1 bespeuren.

I) J. A. v. d. Hoeve, Verstijfseling van aardappelzetmeel. Diss. Utrecht
(1930).

Dit alles nu is van belang met het oog op de door Pringsheim
uitgesproken meening, dat „amylopektinequot; in „oplosbarenquot; toe-
stand, dwz. (altijd volgens Pringsheim!) bevrijd van phosphaat,
identiek zou zijn met glycogeen i). Pringsheim is de eenige, die deze
identiteit aangeeft en hij grondt zijn opvatting ten deele op de
gelijkheid van de jodiumreactie, de gemiddelde deeltjesgrootte en
van het specifieke draaiingsvermogen, maar vooral op de resul-
taten van de chemische afbraak. Bij de verhitting van glycogeen
in glycerine ontstond „trihexosaanquot;, dat met een uit „amylopek-
tinequot; verkregen „trihexosaanquot; overeenkwam. „Amylosequot; leverde
bij deze bewerking „dihexosaanquot;. Door koud geconc. zoutzuur
werd uit glycogeen evenals uit „amylopektinequot; een trisaccharide
„amylotriosequot; verkregen, terwijl „amylosequot; een disaccharide,
\'.amylobiosequot;, gaf. Hoewel de meeningen uiteen loopen over de
betrouwbaarheid van de door Pringsheim gebruikte methode bij
de bepaling van de constitutie van zijn afbraakproducten (bepahng
van het moleculairgewicht uit de vriespuntsdaling), mogen wij toch
wel aannemen, dat het dezelfde producten geweest zijn, die hij uit
„amylopektinequot; en glycogeen kreeg.

Uit de ervaringen van Sherman en Baker daarentegen blijkt,
dat het door hen vervaardigde „amylopektinequot; in ieder geval niet
identiek geweest kan zijn met glycogeen. Het werd n.1. door mout-
amylase met vrijwel dezelfde snelheid gehydrolyseerd als „amylosequot;
en oplosbaar zetmeel; het eenige verschil was, dat het wat minder
ver dan deze praeparaten werd afgebroken. Daarentegen staat
glycogeen bekend als een slecht substraat voor moutamylase, zooals
reeds in het vorige hoofdstuk werd vermeld.

Tot dezelfde conclusie komt men naar aanleiding van het onder-
zoek van Sjoeberg en Eriksson 2), die amylase uit ongekiemde
gerst en uit mout lieten werken op „amylosequot; en „amylopektinequot;
volgens Gatin-Gruszewska, juist met de bedoeling om na te gaan;
of de beide zetmeelcomponenten ook in eenig verband zouden staan
tot de beide soorten van amylase. Niets van dien aard kon worden
aangetoond; zoowel gerstamylase als moutamylase maakte uit
„amylopektinequot; minder maltose vrij, dan uit „amylosequot;, wat vol-
quot; 1) H. PrinÓsheim, Ber. Chem.Ges. 57. 1581 (1924). Zie ook Die Poly-
saccharide, pag. 214.

Ziehier dus een tegenstrijdigheid, die echter begrijpelijk wordt,
wanneer we nagaan op welke wijze Pringsheim zijn ,,amylopek-
tinequot; bereidde. Hoewel hij zich met Samec op het standpunt stelt,
dat aardappelzetmeel 83 % „amylopektinequot; bevat, heeft hij toch
voor de bereiding daarvan in navolging van Ling en Nanji gebruik
gemaakt van amylase uit ongekiemde gerst: ,,Um das Amylopektin
„frei von Amylose zu erhalten, behandle ich es im Verfolge eines
„Vorschlages von Ling bei Zimmertemperatur mit einer mit Alko-
„hol gefällten Amylase aus ungekeimter Gerste, durch welche die
„Amylose schneller als das Amylopektin gespalten wird Unter
„Verzicht auf einen Teil des Amylopektins kommt man so in ver-
„hältnissmäszig kurzem Arbeitsgange zu einem amylosefreien
„Praeparat, etc.quot; 2). Het resultaat van zijn experiment is echter
moeilijk te vereenigen met deze redeneering; als opbrengst krijgt
hij n.1. slechts 28 % „amylopektinequot; 3), dwz. tegelijk met de 17 %
„amylosequot; zouden 55 % „amylopektinequot; verdwenen zijn ,wat niet
op een snellere omzetting van de „amylosequot; wijst! Terecht maken
Ling en Nanji in een latere publicatie Pringsheim op deze
tegenspraak opmerkzaam.

Het blijkt dus wel, dat men de beide beteekenissen van het begrip
„amylopektinequot; zorgvuldig onderscheiden moet. Doen wij dit en
bedenken wij dus, dat de „amylopektinequot; van Pringsheim ook
weer niets anders is geweest dan ons a-zetmeel, dan zien wij, dat
onze resultaten met die van Pringsheim volkomen overeenstem-
men. Wat echter aan hem zoowel als aan Ling ontgaan is, dat is
het verband tusschen de beide typen van amylasen en de beide
componenten van het zetmeel. En dit zou wellicht niet het geval
zijn geweest, indien zij bekend geweest waren met het reeds door
Wijsman ontdekte feit, dat de amylase uit ongekiemde gerst iden-
tiek is met één van de beide moutamylasen. Zoo komen wij dan
weer terug tot de reeds op pag. 18 gemaakte opmerking, dat de
kennis van het werk van Wijsman vandaag nog in staat is, ons

inzicht in den samenhang der verschijnselen op dit zoo gecompli-
ceerde gebied te verhelderen.

Een tiental jaren geleden huldigde men de opvatting, dat zet-
meel, cellulose, caoutchouc en andere niet- of alleen kolloidaal op-
losbare stoffen slechts een betrekkelijk klein molecule in den eigen-
lijken zin des woords zouden bezitten en dat de bizondere eigen-
schappen van deze stoffen hun oorzaak vonden in het feit, dat deze
moleculen in hooge mate zouden zijn gepolymeriseerd, dwz. dat de
,,deeltjesquot;, waar wij in de praktijk mee te maken hebben, zouden
bestaan uit een groot aantal van zulke eenvoudige moleculen, welke
door moleculaire krachten (cohaesie) tot een stevig complex zouden
worden samengebonden. Voor het zetmeel is deze voorstelling o.m.
door Karrer verdedigd. Door afbraak van zetmeel met Bacillus
macerans ontstaan gekrystalliseerde dextrinen, zgn. polyamylosen,
en de studie van deze stoffen leidde Karrer tot de overtuiging, dat
het eigenlijke zetmeelmolecule uit niet meer dan 6 glucoseresten
zou kunnen bestaan, dwz. dat in de bruto-formule van het zetmeel
(CeHjoOg)!! de n hoogstens 6 zou zijn. Voor „oplosbaar zetmeelquot;
komt hij tot een nog eenvoudiger structuur, dit praeparaat be-
schouwt hij als een polymeer van diamylose, dat een anhydride van
maltose is; hier zou de n dus niet grooter zijn dan 2. De werking
der amylase is dan volgens Karrer een dubbele : eerst wordt het
zetmeel gedepolymeriseerd tot diamylose, vervolgens vindt hydro-
lyse plaats van dit product, welke tot maltose voert. Deze omzet-
tingen zouden door twee enzymen kunnen worden gekatalyseerd.

Het zal duidelijk zijn, dat wij hier terecht komen bij de twee-
enzymen-theorie, zooals die door Pottevin naar voren is gebracht
en ook door andere fransche onderzoekers, b.v. door Maquenne,
wordt aangehangen.

Om te beginnen is het reeds zeer onwaarschijnlijk, dat een depo-
lymerisatie, dus niet een eigenlijke chemische reactie, door een
enzym zou worden gekatalyseerd; maar bovendien heeft het onder-
zoek der amylasen, met name het reeds door Wijsman, later door
Ohlsson en nu ook door mij verkregen resultaat aangetoond, dat

een depolymerisatie, welke dan tot uiting zou komen door het ver-
dwijnen van de jodiumreactie zonder suikervorming, niet optreedt.
Wèl verdwijnt, onder invloed van de a-amylasen de jodiumreactie,
echter alleen, nadat een zekere hoeveelheid maltose is gevormd, dus
nadat het eigenlijke molecule is aangetast.

Ook van andere zijden hebben zich in den loop der laatste jaren
de bezwaren tegen de polymerisatie-theorie opgestapeld. Het zou
mij te ver voeren, daarover in bizonderheden te treden, hier moge
slechts worden vermeld, dat Röntgenografische onderzoekingen
daarbij een belangrijke rol hebben gespeeld. Tegenwoordig is men
er vrij algemeen van overtuigd, dat zetmeel en dergelijke stoffen
een groot molecule hebben dat, bij het zetmeel, bestaat uit een
keten van glucosidisch gebonden glucose-resten, dwz. de glucose-
resten zijn hier niet door moleculaire krachten, maar door hoofd-
valenties aan elkaar gekoppeld Hoe lang deze ketens zijn en
welken vorm zij hebben, recht, of gesloten, of ook vertakt, dit zijn
vragen, die op het oogenblik nog niet kunnen worden beantwoord;
zeker schijnt het echter wel te zijn, dat bij een en dezelfde stof de
ketens niet allen dezelfde lengte hebben. Het .begrip „moleculequot;
komt daardoor eenigszins in het gedrang, daar wij onder een
molecule steeds een atoomcomplex van bepaalde, constante samen-
stelling verstaan; Kurt H. Meyer slaat daarom voor van „hoofd-
valentieketensquot; te spreken.

Wat nu de fijnere bouw van de hoofdvalentieketens van het zet-
meel betreft, daarvan is nog vrijwel niets met volkomen zekerheid
bekend. Met verdund zuur worden alle glucosidische bindingen ge-
splitst en er ontstaat glucose; met de amylasen worden zij om den
ander aangegrepen, waardoor men maltose als eindproduct ver-,
krijgt. De structuur van deze suiker is door Haworth en mede-
werkers met volkomen zekerheid bepaald Maltose (zie de for-
mule) bestaat uit twee, glucosidisch gebonden glucose-resten. In

1)nbsp;Zie echter: P. Karrer, Ueber Strukturfragen bei Polysacchariden;
Union Internationale de Chimie: Rapports sur les hydrates de carbone
(glucides), 1930, pag. 139.

2)nbsp;Kurt H. Meyer und H. Mark, Der Aufbau der hochpolymeren orga-
nischen Naturstoffe, Leipzig (1930), waarin men nadere bizonderheden over
deze kwesties vindt.

beide glucose-resten komt een O-atoom voor, dat deel uitmaakt
van een zesring (pyraanring). De glucosidische binding verbindt het
eerste C-atoom van de eene glucose-rest met het vierde C-atoom
van de andere, zij is van a-glucosidischen aard, onverschillig, of
men met a- of met ^-maltose te maken heeft. Men drukt dit uit

Het C-atoom, dat de reduceerende groep (aldehydgroep) draagt,
is met een sterretje aangeduid. Van de plaats die de OH-groep aan
dit C-atoom inneemt ten opzichte van het vlak van den zesring met
O van deze glucose-rest, hangt het af, of wij met a- of ^-maltose
te maken hebben. Het verschil is natuurlijk alleen in een ruimte-
lijk model weer te geven.

De aard van de glucosidische binding blijkt eenerzijds uit het
specifiek draaiingsvermogen, anderzijds uit het gedrag tegenover
bepaalde enzymen, glucosidasen genaamd. Maltase (in den heden-
daagschen zin des woords!) een a-glucosidase, is een katalysator
voor de hydrolyse van maltose tot glucose; een ^-glucosidase be-
zitten wij in de emulsine uit bittere amandelen.

Bij het zetmeel nu, doet zich o.m. het probleem voor van welken
aard de glucosidische bindingen in de hoofdvalentieketens zijn en
de vraag, die hier tenslotte behandeld zal worden is deze, in hoe-
verre de door mij verkregen resultaten bij de enzymatische analysé
tot de oplossing van dit probleem kunnen bijdragen. Ik moet reeds
direkt beginnen met te zéggen, dat een definitieve oplossing, bij
den huidigen stand van onze kennis, niet mogelijk is. Van ver-

schillende kanten komt men tot verschillende waarschijnlijkheden
en de moeilijkheid ligt steeds bij de vraag, welk experiment nu
eigenlijk als beslissendquot;tnag worden beschouwd.

Het ligt natuurlijk voor de hand om aan te nemen, dat ons
a-zetmeel a-glucosidische bindingen bevat, ons ;8-zetmeel daaren-
tegen /9-glucosidische. Gaan wij nu na welke bezwaren tegen een
dergelijke voorstelling bestaan, dan komen wij terug op het reeds
in het vorige hoofdstuk besproken specifieke draaiingsvermogen
van q-zetmeel, of glycogeen ([aj^ = 194—197°) en a-^-zetmeel
(oplosbaar zetmeel): [a]n = 215°. Daaruit zou volgen dat
^-zetmeel een hooger draaiingsvermogen heeft dan a-zetmeel, terwijl
alle j3-glucosiden, voor zoover bekend, een lagere [a] hebben, dan
de correspondeerende a-glucosiden. Kurt H. Meyer i) heeft vol-
gens den regel van Hudson 2) uit het verschil van het moleculaire
draaiingsvermogen (d.i. het spec. draaiingsvermogen vermenigvul-
digd met het moleculairgewicht) van /?\'-maltose en 3-glucose, het
mol. draaiingsvermogen en daaruit weer het spec. dr.-vermogen
berekend van een keten, die enkel a-1, 4-glucosidische bindingen
bevat. Hij komt daarbij tot [a]j, = 226—222°, een waarde, die
slechts weinig hooger ligt, dan die welke men meestal voor oplos-
baar zetmeel vindt.

Dit\'is de eene kant van de zaak. Daartegenover staat Kuhn\'s
ontdekking van het bestaan van a-amylasen en ^-amylasen. Kuhn
legt er den nadruk op, dat deze amylasen hun naam ontleenen aan
den vorm van maltose, die zij doen ontstaan, en niet aan den aard
der bindingen, die zij hydrolyseeren; dit in tegenstelling tot de a- pn
^-glucosidasen. Wanneer wij echter zien, dat de a-glucosidasen uit
a-glucosiden a-glucose doen ontstaan, de ^-glucosidasen uit /?-glu-
cosiden /?-glucose, dan is de verleiding toch wel zeer groot om aan
te nemen, dat ook met de amylasen op verschillende glucosidische
bindingen wordt gereageerd. Kuhn doet dit in zooverre, dat hij in
het zetmeel afwisselend een^a- en een ;8-binding aanneemt. Bij de
werking van de amylasen zouden dan niet alleen glucosidische bin-
dingen worden gesplitst, maar tevens omkeeringen en versprin-
gingen van den zuurstofring in de glucoseresten plaatsvinden op

2)nbsp;C. S. Hudson, J. Am. Chem. Soc. 32, 338 (1910); zie voor critiek
hierop Haworth, Const. of Sugars, pag. 10.

zoodanige wijze, dat tenslotte uit hetzelfde substraat met a-amy-
lase, a-maltose en met ^ff-amylase, ;f/-maltose ontstaat.

Ons onderzoek nu, waaruit blijkt, dat de beide amylasen niet
alleen verschillende maltosen vormen, maar ook verschillende zet-
meelen aantasten, doet hun gelijkenis met de beide glucosidasen nog
sprekender worden en maakt dus ook de waarschijnlijkheid grooter,
dat in een der beide zetmeelcomponenten ß-glucosidische bindingen
aanwezig zijn.

De voorstelhng, die op de eenvoudigste wijze het gedrag der
amylasen verklaren kan, is m.i. deze, dat het a-zetmeel enkel
a-glucosidische bindingen bevat, het ^-zetmeel afwisselend een
a- en een ^-binding. In de onderstaande formules is dit schematisch
aangegeven.

De horizontale strepen stellen de glucose-resten voor, de pijlen
geven de bindingen aan, welke worden gehydrolyseerd. Zooals men
ziet kan uit a-zetmeel direct a-maltose ontstaan, terwijl de ;9-amy-
lase op deze component niet kan inwerken.

In de formule voor /?-zetmeel geven de getrokken pijltjes de wer-
king van ^-moutamylase aan, daarbij ontstaat direct ;8-maltose.
Het ^-zetmeel is echter wellicht ook aantastbaar voor a-mout-
amylase; deze veronderstelling hebben wij reeds als een mogelijke
verklaring voor het overschrijden der afbraakgrens naar voren
gebracht. Door de gestippelde pijltjes is deze werking aangeduid;
zooals men ziet zou daarbij de a-vorm van een j3-disaccharide ont-
staan. Een dergelijke suiker, bekend als „isomaltosequot; of „dextri-
nosequot; schijnt door verschillende onderzoekers verkregen te zijn i).

de structuur der zetmeelcomponenten betreft, tot een andere voor-
stelling komen, dan die, welke hier is aangegeven. „Amylosequot;, ons
i8-zetmeel, zou volgens hen enkel a-bindingen bevatten, „a-jff-hexa-
amylosequot;, ons a-zetmeel, afwisselend een a- en een ^-binding, zooals
de naam reeds aanduidt. Onze ervaring, dat a-zetmeel door /3-mout-
amylase niet wordt gehydrolyseerd, pleit niet voor een dergelijke
structuur; bovendien blijkt uit hun eigen onderzoekingen, dat
,,a-i3-hexa-amylosequot; wèl door maltase (a-glucosidase), maar niet
door emulsine (iS-glucosidase) wordt aangetast.

Zoo zien wij dus dat, terwijl bij maltose en andere eenvoudige
glucosiden de resultaten van het polarimetrisch onderzoek en van
de enzymatische analyse in dezelfde richting wijzen, bij het zgtmeel
een tegenstrijdigheid blijft bestaan. Het wil mij echter voorkomen
dat wij, bij een zoo gecompliceerd gebouwde stof als het zetmeel,
waarvan de structuur nog niet tot in bizonderheden bekend is
(b.v. wat den aard der zuurstofringen betreft), aan de resultaten
van de enzymatische analyse de grootste beteekenis mogen toekennen.

Uitgangspunt van hét onderzoek vormde de dissertatie van H. P.
Wijsman: „De diastase, beschouwd als mengsel van maltase en
dextrinasequot;. In overeenstemming met Wijsman werd gevonden,
dat de aanwezigheid van twee amylasen in gerstemout door middel
van diffusie in zetmeelhoudende gelatine kan worden aangetoond
(fig. 1). Om het verschijnsel duidelijk te zien te krijgen bleek het
gewenscht, de diffusie bij lage temperatuur (5—10° C.) te laten ver-
loopen.

De beide amylasen, in de literatuur bekend als ,,zetmeeloplos-
dendquot;- of „dextrinevormendquot; enzym en ,,suikervormendquot; enzym
werden op grond van hun gedrag a-moutamylase en ^-moutamylase
genoemd.

Uit een waterig moutextract werd de amylase met alcohol in
twee fracties neergeslagen; een eerste fractie, welke uitvlokte met
alcohol tot 60 % en een tweede, die uitvlokte tusschen 60 en 80 %.
Uit de eerste fractie werd door verwarming op 70° C. gedurende
15 min. en neerslaan met alcohol tot 60 % een droog praeparaat
van a-moutamylase gemaakt. De tweede fractie diende als praeparaat
van a-^-moutamylase, het mengsel der beide enzymen. Een droog
praeparaat van i3-moutamylase werd bereid door geparelde gerst
(parelgort) met 50 % alcohol te extraheeren en vervolgens met
alcohol tot 80 % neer te slaan.

Als substraat diende „oplosbaar zetmeelquot;, uit aardappelmeel be-
reid volgens een eenigszins gemodificeerde methode van Lintner.
Van beide amylasen werd het verloop van de werking bestudeerd

1) Een beknopte beschrijving der belangrijkste proeven is reeds, gepu-
bhceerd in Proc. Kon. Acad. v. Wetensch. Amst. 34, 893 (1931).

met de methode der quantitatieve suikerbepahng volgens Schoorl.
De pH-bepahngen geschiedden colorimetrisch, als bufferstof.werden
mengsels van sec. Na-citraat met NaOH of HCl gebruikt. Alle
reacties vonden plaats bij een temperatuur van 40° C.

Bij de bestudeering van de eigenschappen der enzympraeparaten
werd het volgende vastgesteld.

1.nbsp;De /3-moutamylase vertoont haar grootste activiteit tusschen
pH 4,55 en 5,15 (fig. 2). Haar werking wordt door j5-maltose sterker
geremd dan door a-maltose. Bij geringe enzymconcentratie heeft de
reactie aanvankelijk een rechtlijnig verloop, de afwijking daarvan
bij gebruik van hoogere concentraties kan aan de remmende wer-
king van de gevormde maltose worden toegeschreven. De begin-
snelheid van de reactie is nagenoeg evenredig met de enzymconcen-
tratie. Onafhankelijk van de enzymconcentratie komt de reactie
bij de vorming van ca. 64 % van de theoretisch mogelijke hoeveel-
heid maltose uit een zetmeeloplossing van 1 % tot stilstand (fig. 4).
De jodiumreactie blijft daarbij steeds bestaan.

Het restproduct, de erythrogranulose van Wijsman, wordt met
alcohol uit het reactiemengsel neergeslagen. Het blijkt geen redu-
ceerend vermogen te bezitten en kleurt zich met jodium blauw of
paars al naar de relatieve hoeveelheid jodium, die toegevoegd
wordt.

2.nbsp;De a-moutamylase vertoont met erythrogranulose als sub-
straat een gebied van optimale activiteit tusschen pH 5,65 en 5,85.
De kromme heeft aan de alkalische zijde daarvan een veel steiler
verloop dan bij jff-nioutamylase (fig. 2). Met oplosbaar zetmeel als
substraat ontstaat dezelfde kromme, waaruit blijkt, dat het enzym-
praeparaat geen i3-moutamylase meer bevat. De werking van
a-moutamylase wordt door a-maltose sterker geremd dan door
i?-maltose. De beginsnelheid van de reactie is evenredig met de
enzymconcentratie wanneer deze laatste gering is. Bij verhooging
van de enzymconcentratie verschuift de grens van de afbraak,
echter treedt in de nabijheid van 36 % een sterke remming op.
Gebruikt men een enzymoplossing, die gedurende 15 minuten op
70° C. verwarmd was, dan worden ca. 36 % maltose met groote
snelheid gevormd, waarna de reactie langzaam verder gaat, onder
omstandigheden tot 78 % toe (fig. 5). De jodiumreactie verdwijnt
bij de werking van dit enzym snel.

3 De a-iï-moutamylase geeft met oplosbaar zetmeel als sub-
str^t een pH-kromme met een optimum bij 5,30 en een zeer lang-
zame daling naar de alkalisqhe zijde. Met erythrogranulose ligt het
optimum bij pH 5.75, terwijl de kromme in dit geval een even steile
dahng vertoont als die van de a-moutamylase (fig. 3), waaruit volgt,
dat dit enzym reeds als zoodanig in het mengsel voorkomt. Een
: quantitatieve versuikering kan met dit mengsel niet worden ver-
kregen in totaal wordt 78-80 % van de theorie maltose gevormd.

Uit de literatuur bleek, dat het evenwichtsmengsel van a- en
^-maltose en van a- en ^-glucose 36 % van de a-vorm bevat naast
64 % van de iJ. De afbraakgrenzen van de beide moutamylasen
werden hiermee in verband gebracht en de meening werd uitge-
sproken dat de zetmeeloplossing een evenwichtsmengsel voorstelt
van 36 % a-zetmeel naast 64 % ^-zetmeel. De erythrogranulose is
dus a-zetmeel en wordt alleen door a-amylasen aangetast. Aan-
gezien in het dierlijk lichaam en in schimmels alleen a-amylasen
voorkomen, kunnen wij in die organismen enkel a-zetmeel ver-
wachten, daar deze component zeer moeilijk in de ^-vorm overgaat.
Inderdaad blijkt het „dierlijk zetmeelquot;, glycogeen, m vele opzichten
overeen te komen met erythrogranulose; beide stoffen gedragen

(fig 6) en zij bezitten nagenoeg hetzelfde specifieke draaiings-
Urmogen. In de groene plant, waarin de beide zetmeelcompo-
nenten naast elkaar voorkomen, vindt men ook steeds een mengsel
van a- en ^-amylase. Verder blijkt uit een onderzoek van R. Kuhn,
dat ook bij de werking van andere a-amylasen, dan a-moutamylase,
een remming in de nabijheid van 36 % optreedt (fig. 8).

Tenslotte werden beide zetmeelcomponenten voorgesteld als
ketens van glucosidisch gebonden glucose-resten, waarbi] in het
a-zetmeel slechts a-glucosidische bindingen voorkomen, terwijl het
^-zetmeel afwisselend een a- en een ^-glucosidische bmding bevat.

Het is in het algemeen niet geoorloofd de grootte der deeltjes
bij lyophiele solen te berekenen met behulp van de formule van

Tegen de bepalingen van de dichtheid van anorganische zouten,
uitgevoerd door Wulff en Heigl, zijn ernstige bezwaren te be-
denken.

K Winterfeld en F. W. Holschneider, Ber. 64, 137, 692 (1931).
p. Karrer, Ber. 64, 942 (1931).

De gedragingen der vrije radicalen van het type triphenyl-
methyl kunnen het volledigst verklaard worden met behulp van
het principe der geïnduceerde, afwisselende polariteit van Robin-
son, Kermack en Lapworth.

Aan de bepaling van het moleculairgewicht van vitamine-A door
Bruins, Overhoff en Wolff kan niet een groote waarde worden

De beteekenis van de experimenteele wetenschappen voor de
ontwikkeling van den menschelijken geest wordt door de meeste
cultuurhistorici onderschat.

Tabel II pH 3,85
t	X	V
uren	mgr. malt.	x/t
1	7,7	7,7
2	12,7	6,4
4	19,6	4,9
5	22,2	4,4
6	23,8	4,0
Tabel	^^ pH 4,55
t	X	V
uren	mgr. malt.	x/t
H	14,5	9,7
	22,3	8,9
4	32,0	8,0
^	41,2	7,5
8	50,7	6,3

t	X	V
uren	mgr. malt.	x/t
1	8,9	8,9
2	15,3	7,7
4	29,1	7,3
5	35,3	7,1
6	39,5	6,6 .

t	X	V
uren	mgr. malt.	x/t
1	8,3	8,3
2	15,4	7,7
3	22,6	7,5
4	29,2	7,3
5	34,9	7,0
6	39,8	6,6
Tabel XI pH 6,90
t	X	V
uren	mgr. malt.	x/t
1	7,4	7,4
2	14,4	7.2
4	£6.6	6,7
5	31,4	6,3
6	37,2	6,2
Tabel XIII pH 7,35
t	X	V
uren	mgr. malt.	x/t
1	6,1	6,1
3	19,0	6,3
4	24,5	6,1
5	28.6	5,7

t	X	V	k. 10«	k\'. lOV
uren	mgr. malt.	x/t	a = 100	a = 62
1	23,5	23,5	40,5	67,0
2	45,3	22,7	41,0	70,0
3	65.5	21,8	41,0	74,0
4 lt; _.	82.7	20,7	40,7	76,5
H	103,8	18,9	39,4	79,4
22	164,4
70	163,7 = 62%

	t	X	V	pH	t	X	V
pH	min. j	1 mgr. malt.	rel.	min.	mgr. malt.	rel.
3,70	30	62,8	61,9	4,60	30	64,1	93,5
4,GO	30	99,6	98,1	5,00	30	67,9	99,0
5,00\'	30	100,3	99,0	5,30	30	67,8	99,0
5,30	30	101,5	100,0	5,75	30	68,6	100,0
5,75	30	99,5	98,0	6,00	30	64,3	94,0
0,00	30	98,6	97,0	6,45	30	47,8	69,6
G,45	30	96,8	95,4	6,85	30	39,5	57,5
6,85	30	91,8	90,5

Tabel XX			pH 5,15	Tabel XXIII	pH 5,75
t in uren	i	1	remming	t in min.	15	r.
zonder maltose 0,2 % a-i3-malt. 0,2 % ^-malt.	12,8 12,5 12,4	25.0 24,5 24.1	0,3 0,4	0,5 0,9	zonder maltose 0,4 % a-iS-malt. 0,4 % /?-malt.	25,6 23,5 24,4	2,1 1,2
Tabel XXI			pH 4,90	Tabel XXIV	Pïi	[ 5,75
t in uren	1	2	remming	t in min.	15	r.
zonder maltose 0,4 % a-i5-malt. 0,4 % i9-malt.	11,1 10,1 10,2	20,2 19,2 18,7	1,0 0,9	1,0 1,5	zonder maltose 0,4 % a-/3-malt. 0,4 % ^-malt.	29,7 26,4 28,0	3,3 1,7
Tabel XXII			pH 5,00
t in uren	li	H	remming
zonder maltose 0,6 % o-^-malt. 0,6 % j3-malt.	32,2 29,7 29,1	46,9 44,1 43,4	2,5 3,1	2,8 3,5

a-maltose	0	0,1	1.4	1,6	a-maltose	6,1	3,7
^-maltose	0,9	1,5	3,1	3,5	jS-maltose	1,7	1,2

t	x	% V. d.	v	k\'. 10*	k. 10*
uren	mgr. malt.	theorie	x/t	a = 64	a = 100
1	5,3	5,0	5,3	35	22,0
3	16,4	15,5	5,5	40	24,3
4	21,3	20,2	5,3	41	24,5
5	25,2	24,9	5,0	43	24,9
8	37,3	35,4	4,7
24	62,6	59,4
48	67,2	63,7
Tabel x:	k:viii		2
t	x	% V. d.	v	k\'. 10*	k. 10*
uren	mgr. malt.	theorie	x/t	a = 64	a = 100
1	12,0	11,4	12,0	85	52,5
2	22,2	21,0	11,1	86	51,3
4	40,4	38,3	10,1	99	52,5
5	46,9	44,5	9,4	103	51,1
6	51,5	48,8	8,1		48,5
7	55,9	53,0
24	67,1	63,5
Tabel x]	icix		5
t	x	% V. d.	v	k\'. 10*	k. 10*
uren	mgr. malt.	theorie	x/t	a = 64	a = 100
1	28,6	27,1	28,6	239	137,0
2	48,7	46,2	24,3	278	134,5
3	60,5	57,3	20,2	327	123,4
5	66,0	62,6	13,2
6	66,8	63,3
8	66,8	63,3			N
24	68,5	64,8
Tabel x?	cx		10
t	x	% v. d.	v
uren	mgr. malt.	theorie	x/t
1	51,0	48,3	51,0
2	64,1	60,7	32,0
3	66,4	63,0	22,1
5	66,8	63,3
24	68,3	64,7		*

t	X	%	t	X	0/ /o
uren	mgr. malt.	v. d. th.	uren	mgr. malt.	v. d. th.
k	15,0	5,7	i	30,5	11,5
1	23,8	9,0	1	44,6	17,0
H	28,3	10,7	H	52,1	19,7
2	32,2	12,2	2	56,3	21,3
15	37,2	14,1	2i-	58,0	22,0
40	37,4	14,2	21	62,3	23,6
Tabe	;L XXXIII	5	Tabi	iL XXXIV	12-1
t	X	0/ /o	t	X	%
uren	mgr. malt.	v. d. th.	uren	mgr. malt.	v. d. th.
i	60,7	23,0	1 ¥	73,2	27,7
1	77,0	29,2	i	89,4	33,8
H	81,9	31,0	1	93,2	35,3
2i	84,7	32,1	H	99,5	37,7
18	87,0	33,0	2	101,0	38,2
			2i	102,4	38,8
			20	10.5,2	39,9

t uren	X mgr. mait.	0/ /o v. d. th.	t uren	X mgr. malt.	0/ /O V. d. th.
1 T	86,9	33,0	i	79,6	,30,2
■k	98,9	37,4	i	93,4	35,4
li	109,3	41,3	H	104,6	39,6
2i	113,7	43,0	2i	108,1	• 41,0
60	114,2	43,3	60	151,5 ¹)	57,5

pH	t min.	X mgr. malt.
4,20	45	7,1
4,60	45	16,1
5,10	45	17,8
5,40	45	18,3
5,75	45	18,9
6,15	45	15,8
6,55	45	10,4

t	X	%
uren	mgr. malt.	v. d. th.
1 T	94,4	35,8
i	106,2	40,2
H	124,1	47,0
H	133,2 *)	50,5
36	198,3 *)	75,2