\' I ^

EN ZIJN QUANTITATIEVE BEPALING IN
PLANTAARDIGE VOEDINGSMIDDELEN TER
BEOORDEELING HUNNER WAARDE
ALS VITAMINE^A BRON

m_ i

■ - Ärquot;

-\'km \' »

quot;\'S.\'quot;. ■■•

■ sC-V

OVER CAROTINE
EN ZIJN QUANTITATIEVE BEPALING IN PLANTAARDIGE
VOEDINGSMIDDELEN TER BEOORDEELING HUNNER
WAARDE ALS VITAMINE-A BRON

EN ZIJN QUANTITATIVE BEPALING IN PLANTAARDIGE
VOEDINGSMIDDELEN TER BEOORDEELING HUNNER
WAARDE ALS VITAMINE ^A BRON

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN
DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE GENEES-
KUNDE AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE
UTRECHT, OP GEZAG VAN DEN RECTOR
MAGNIFICUS Dr. L. S. ORNSTEIN, HOOG-
LEERAAR IN DE FACULTEIT DER WIS- EN
NATUURKUNDE, VOLGENS BESLUIT VAN
DEN SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN
DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT
DER GENEESKUNDE TE VERDEDIGEN,
OP DINSDAG 27 OCTOBER 1931,
DES NAMIDDAGS TE 4 UUR,

]
1

Het verschijnen van mijn proefschrift tal van jaren na het beëindigen
van mijn academische heroefsstudie geeft mij thans een wel is waar late
maar inmiddels gaarne aangegrepen gelegenheid mij te kunnen kwijten
van den plicht der dankbaarheid jegens U Hoogleeraren der Natuur-
philosophische en Medische Faculteiten der Amsterdamsche Universiteit
voor Uw aandeel in mijn wetenschappelijke vorming. Dat helaas aan de
meesten Uwer slechts posthume mijn woorden van dank kunnen gewijd
worden stemt tot weemoed en onder hen, die reeds lange jaren niet meer
zijn, rijst hier voor mij in de eerste plaats de herinnering op aan U Hoog-
geleerde Bakhuis Ro o z eb o om en aan U Hooggeleerde Lobr y
V an Troostenburg de Br uyn. Door Uwe schitterende en demon-
stratieve colleges in de Chemische Wetenschappen te zijn ingeleid voel ik
niet alleen als een groot voorrecht, maar de indruk daarvan uitgegaan is
mij de lange jaren door als een kostbare herinnering bijgebleven. Dat
chemische studiën zoo mijn groote voorliefde kregen en bleven behouden
is stellig voor geen gering deel te danken aan de wijze, waarop Uw onder-
wijs in mij die neiging heeft weten aan te wakkeren.

Ook Uwe nagedachtenis Hooggeleerde S alt et onder wiens leiding
ik een aantal jaren mocht werken, herdenk ik met een warm gevoel van
oprechte erkentelijkheid voor de meer dan gewone wijze, waarop Gij het
mij mogelijk maakte den vrijen tijd, die mijn werkkring mij destijds liet,
te benutten om mijn biochemische kennis uit te breiden. Dank zij Uw
vriendelijken omgang en de zonnige levenswijsheid, die Uwe vaderlijke
raadgevingen doorstraalde, dank ook aan de zeer gewaardeerde dagelijksche
leiding Uwer medewerkers, heeft de tijd in Uw Instituut doorgebracht
een onuitwischbaar stempel op mijn wetenschappelijke ontwikkeling
gedrukt en kon mijn verblijf bij U uitgroeien tot jaren, wier herinnering
voor mij in de wervelingen des levens nimmer zal ondergaan.

U Hooggeleerde Ringer, Hooggeachte Leermeester, aan wiens
Instituut voor Physiologische Chemie ik het waarlijk niet geringe voor-
recht had geruimen tijd als Conservator verbonden te zijn, ben ik wel zeer
veel verplicht. Niet alleen, dat mijn verblijf ten Uwent 7nij zoo ruimschoots
in de gelegenheid heeft gesteld in het licht Uwer ervaring mijn blik te
verruimen en voor wetenschappelijke problemen te ontsluiten, maar de
dagelijksche omgang met U heeft bovendien aan mijn denk- en werkwijze
een leiding en richting gegeven, die voor mij van groote en blijvende waarde
ïs. Het besluit deze studierichting te verlaten, heb ik niet dan zeer noode
kunnen nemen.

U Hooggeleerde M end es da Costa zeg ik dank voor de
gelegenheid mij geschonken gedurende ruim 2 jaren als Uw assistetit
mijn practische kennis der Huid- en Geslachtsziekten uit te breiden en het
inzicht te verwerven, dat aan de physiologisch-chemische onderzoekings-
methoden als voortzetting der micropathologische in ruimer mate aandacht

dient geschonken te worden, omdat in hunne toepassing mogelijkheden
liggen voor de ontsluiting vun wellicht niet weinige der overtalrijke pro-
blemen in de Dermato-Venereologie.

Hooggeleerde W ol ff. Hooggeachte Promotor! Reeds jaren geleden
waart Gij het, die mijn eerste schreden leidde toen mijn wetenschappelijk
werk mij op chemisch terrein bracht. Steeds heb ik in later tijd den krach-
tigen steun, dien ik destijds van U met raad en daad mocht ontvangen,
in dankbare herinnering gehouden. Ook thans bij dit onderzoek, op Uwe
aansporing ondernomen, stemt het mij wederom tot groote erkentelijkheid,
dat Gij mij Uwe voorlichting en Uwe rijke ervaring op dit terrein, niet
hebt onthouden en mij in de gelegenheid hebt gesteld in Uw voortreffelijk
toegeruste Laboratorium het op mij genomen werk te volbrengen.

U Hoogleer ar en en Leeraren, eertijds verbonden aan het Geneeskundig
Laboratorium te Batavia, betuig ik mede de gevoelens mijner dankbaarheid
voor de wijze, waarop Gij mij daar in de leer der Tropengeneeskunde
en Tropenhygiëne hebt ingewijd. Het van U ontvangen onderwijs is mij
zoowel in Oost- als in West-Indiê van groot nut geweest.

Ten slotte dank ik allen, die mij bij de bewerking van dit proefschrift
op een of andere wijze behulpzaam zijn geweest.

De beteekenis van Carotine voor het dierlijk organisme.
Physiologisch verband tusschen Carotine en Vitamine-A . . 48

§ 5. De onderlinge scheiding van Carotine en Xanthophyll .nbsp;128^
§ 6. De meting van het Carotine- en Xanthophyll-gehalte der

Overzicht der quantitatieve Carotine-bepalingen in groenten
en vruchten verricht...................144

153

Gele, roode en oranje pigmenten komen zeer verspreid zoowel in
planten- als dierenrijk voor. Een eigenlijk indeelingssysteem ontbreekt
nog voor hen. In het algemeen kan men hen onderscheiden in:

De eerste groep valt voor ons hier buiten beschouwing, de ver-
tegenwoordigers der laatste groep vatte Tswett (2), in zooverre als
zij chemisch en genetisch met Carotine verwant zijn, samen onder
den naam „Carotinoidenquot;; de hydrocarbonen onder hen noemt hij
„Carotinenquot;, de oxyhydrocarbonen „Xanthophyllsquot;. Wel is waar is
de naam „Carotinoidenquot; voor deze kleurstoffen thans algemeen gang-
baar geworden, maar de indeehng van Tswett voldoet niet meer aan
de in de laatste jaren sterk uitgebreide kennis dezer pigmenten. Het
bleek n.1. dat sommige zuurstofhoudende Carotinoiden meer OH-
groepen bevatten dan de oudst bekende eenvoudige xanthophylls,
anderen bezaten carbonzuur-bouw en waren dus in het geheel niet in
de xanthophyll-groep onder te brengen. Sedert Kuhn en zijn mede-
werkers wezen op den poly-een-bouw der Carotinoiden, kan men wel-
licht hierin een basis vinden voor een indeehngssysteem op chemischen
grondslag. Men zou b.v. de tot dusver bekende Carotinoiden kunnen
verdeden in:

De namen lipochromen of chromolipoiden zijn volkomen ver-
ouderd en misleidend, men doet beter hen voor dit soort planten-
kleurstoffen geheel te laten vervallen.

Het eerst zijn de Carotinoiden bij planten ontdekt, daarna ook bij die-
ren aangetroffen, vervolgens heeft men de identiteit der Carotinoiden van
plantaardige- en van dierlijke herkomst kunnen aantoonen en ten slotte
vastgesteld, dat de dieren hun Carotinoide pigmenten aan hun plant-
aardig voedsel ontleenen. Hun eigenaardige verdeeling in het dierlijk
organisme deed vermoeden, dat hun voorkomen bij het dier niet als
een zuiver passief verschijnsel mocht worden opgevat en men nam ver-
schillende mogelijkheden voor een physiologische functie in overweging.
De aanwijzingen, die men eindelijk verkreeg, dat Carotine in verband
zou staan met de in het dierlijke lichaam aan vitamine-A toegekende
physiologische activiteit, gaf aan dit vermoeden een verrassende
richting.

Staat is Carotine om te zetten in een kleurloos of ten naastenbij kleur-
loos derivaat, waaraan men zich de vitamine-A werking gebonden
denkt.

Het actieve agens heeft men nog niet kunnen afzonderen, omtrent
het wezen der vitamine-A werking bestaan nog slechts vage ver-
moedens en omtrent het aangrijpingspunt in vivo d.w.z. de reactie
in de cel, waaraan de biokatalytische werking van genoemd vitamine
plaats vindt, tast men nog volkomen in het duister.

De ervaring heeft geleerd, dat het substraat, waaraan de vitamine-
werking is gebonden, kan voorkomen:

In hun vitamine-A behoefte voorzien mensch en dier voor een deel
door directe opname van het kleurlooze vitamine-A uit voedsel van
dierlijken oorsprong en voor een ander deel door ingestie van het sterk
gekleurde carotine, voornamelijk uit planten. Voor den zuigehng
neemt de melk, voor het oudere groeiende individu de plant de voor-
naamste plaats in als vitamine-A bron. Van de behoefte aan dezen
accessorischen voedingsfactor voor den volwassene is niet veel meer
bekend dan dat deficiency kan leiden tot klachten over hemeralopie
en dat er teekenen zijn, die wijzen op eenige relatie tusschen vitamine-
A en -D, welke laatste factor invloed heeft op de mineraal stofwisse-
hng, evenals tusschen A- en C-vitamine. Daarnaast heeft men gemeend,
dat een verhoogde vatbaarheid voor infectieziekten bij A-gebrek zich
ook tot den volwassen mensch zou uitstrekken. Men vermoedt dus,
dat ook voor het oudere individu vitamine-A niet zonder beteekenis is.

De wijze, waarop het provitamine carotine in vitamine-A wordt
omgezet hgt nog in het duister. Een recent onderzoek van Bruins,
OvERHOFF en WOLFF heeft eenig licht ontstoken in de quantitatieve
verhouding bij die omzetting. Uit de bepaling van de diffusiecon-
stanten van carotine en vitamine-A in xylol konden zij de verhouding
hunner moleculairgewichten berekenen en vonden aldus voor vita-
mine-A een moleculairgewicht van ongeveer 330, hetgeen op een
eenvoudige chemische betrekking tusschen beide stoffen zou wijzen.
Biologisch heeft men met zekerheid kunnen uitmaken, dat de vitamine-
A werking evenredig is met de hoeveelheid carotine, die bij de proef-
dieren tot ingestie komt. Voor voedsel, dat zijn vitamine-A waarde
uitsluitend ontleent aan zijn carotinegehalte, zooals dit bij planten het
geval is, kan dus naast het biologisch onderzoek van het materiaal
ook de bepahng van dat carotinegehalte een maat zijn voor het
vitamine-A vermogen.

Deze beschouwing sluit in zich de mogelijkheid om voor een belang-
rijk deel van ons dagelijks voedsel, n.1. de groenten, tot een een-
voudigere vitamine-A waarde bepaling te komen dan tot nu toe
bestond.

De thans gebruikelijke waardebepaling van het voedsel als vita-
mine-A bron is moeilijk, tijdroovend, kostbaar en ten slotte nog slechts
zeer grof, daar zij afgezien van alleen in zeer beperkte gevallen bruik-
bare, bovendien niet als geheel specifiek bewezen kleurreacties, berust

op biologische proeven, wier beoordeeling niet alleen groote ervaring
vereischt.maar ten deele afhangt van factoren,die men niet beheerscht.
Het dierexperiment geeft daarenboven niet zelden beduidende tech-
nische moeilijkheden, vooral bij het onderzoek van niet vloeibare
ingesta. Een eenvoudige, snellere, minder kostbare en meer exacte
methode voor de waardebepaling van een plantaardige vitamine-A
bron zou dus stellig als een aanwinst te beschouwen zijn.

Wij meenden nu, dat een carotinebepaling uitgevoerd met moderne
hulpmiddelen aan dit verlangen zou tegemoet kunnen komen en in
het voorliggende werk zijn nu de resultaten neergelegd van een in die
richting ondernomen onderzoek.

Quantitatieve bepahngen van Carotine in planten zijn meermalen
beschreven. De oudere methoden zijn voor ons onbruikbaar, omdat
zij geen onderscheid maakten tusschen de biologische antipoden Caro-
tine en xanthophyll. De door Willstätter en zijn medewerkers
gegeven methode en de daarin door enkele latere onderzoekers aange-
brachte wijzigingen kleven alle het bezwaar aan van omslachtigheid,
die somtijds bedenkelijk is voor de te verwachten betrouwbaarheid
der resultaten. Bovendien hebben deze methoden ook alle gemeen,
dat zij meer aangepast zijn aan het onderzoek van materiaal, dat van
nature zeer rijk is aan Carotine, in het tegenovergestelde geval leidt
de methodiek veelal tot het verwerken van onhandelbare groote
hoeveelheden en volumina. Vergelijkende bepalingen, waarbij de ver-
schillende bewerkingen, die het te onderzoeken materiaal moet onder-
gaan om tot de kennis der carotinewaarde te komen, werden ge-
wijzigd om mogelijke foutbronnen te herkennen en verbeteringen aan
te brengen, vindt men in de literatuur zoo goed als niet vermeld.
Toch zijn dergelijke onderzoekingen juist hier aangewezen, omdat de
ingewikkelde techniek, waaraan niet valt te ontkomen, uit den aard
der zaak een bron moet zijn voor verschillende grootere en kleinere
fouten. Wijzigingen in de techniek zullen ons niet alleen de beste
onderzoekmethode leeren kennen, zij zullen ook in staat zijn bij
overeenstemming der langs verschillende wegen verkregen uitkomsten,
tot grooter vertrouwen te voeren in deze ingewikkelde bepalingen.

Wetenschappelijk is het van belang de hoeveelheid Carotine
(vitamine-A) te kennen, die de mensch per dag noodig heeft. Tot
dusver is hier echter evenmin iets van bekend als men weet hoeveel
Carotine bij den mensch met zijn voedsel gemiddeld per dag tot
ingestie komt. Daar met dit onderzoek een eerste begin wordt gemaakt
om later tot die kennis te kunnen komen, leek het ons wenschelijk
de plantaardige voedingsmiddelen op hun carotinegehalte te onder-
zoeken in den vorm, zooals zij bij den mensch tot gebruik komen.
Alle groenten werden, voor zooverre zij aldus worden genuttigd, voor
het onderzoek eerst gekookt op een wijze, zooals men dit voor iedere
groente huishoudelijk pleegt te doen.

In het voorliggende werk is nu in hoofdzaak de methodiek bestu-
deerd om ook met kleine hoeveelheden carotinearm materiaal op zoo
eenvoudig mogelijke wijze het gehalte aan dit pigment te leeren kennen.

gebruikelijken groentenkost nog uiterst gebrekkig is, wordt hier tevens
een aanvang gemaakt met een systematisch onderzoek door de des-
betreffende bepaling bij een aantal tijdens dit onderzoek ter beschik-
king staande groenten te verrichten, daarnaast werden ook eenige
vruchten, meest conserven, onderzocht.

De verkregen carotinewaarden werden eindelijk vergeleken met
bestaande, langs biologischen weg verkregen gegevens over de vita-
mine-A waarde van dezelfde voedings- of genotmiddelen.

Het ligt voor de hand, dat naast de sprekende kleurenrijkdom der
bloemen zijner onmiddellijke omgeving ook het groen tapijt der hem
wijds omringende planten reeds vroeg in den natuurwetenschappelijk
ontwakenden mensch de belangstelling moest oproepen naar den aard
en het wezen der stoffen, die deze kleurschakeeringen te voorschijn
riepen. De bemoeiingen van den mensch om over de dragers van die
hem treffende plantenkleuren de vrije beschikking te krijgen en hen
naar verkiezing tot zijn nut of zijn genoegen te kunnen gebruiken,
gaan dan ook reeds verder terug dan menschenheugenis reikt. Ook de
wetenschappelijke onderzoekingen, ondernomen met het doel meerdere
kennis en diepere inzichten te vergaren omtrent plantenkleurstoffen,
zijn reeds vroeg in de literatuur vastgelegd. In het jaar 1682 deed
Nehemiah Grew een werk verschijnen, waarin hij aangaf met alcohol
of olie uit plantenbladeren een groen gekleurde oplossing te kunnen
bereiden; slechts weinige jaren later, in 1693, sloot zich hierbij de ont-
dekking van Joannes Rajus aan, dat planten, die in het donker
opgroeien niet groen, maar geel worden en dat zij in het licht terug-
gebracht zich spoedig groen gaan kleuren. Nog tal van meer of minder
belangrijke onderzoekingen volgden, doch eerst met Senebier, die in
1800 waarnam, dat een alcoholische oplossing van de groene blad-
kleurstof door de lucht en het licht wordt ontkleurd, kan men zeggen,
dat het tijdperk aanbreekt van meer regelmatige en systematische
doch geleidelijk ook van meer exacte onderzoekingen naar aantal,
aard en verspreiding, herkenning, beteekenis en samenstelling der
plantenpigmenten.

Voor het meerendeel vinden deze onderzoekingen in de le helft
der 19e eeuw hun uitgangspunt bij het bladgroen, het meest in het oog
loopende, het meest verspreide plantenpigment en daardoor van nature
als het ware voorbestemd om het eerst in onderzoek genomen te worden.
Uit hen sproot de eerste kennis, maar kwam ook de eerste strijd voort
over de uniteit of pluraliteit der verschillende plantenkleurstoffen en
de praeëxistentie der in vitro verkregen producten.

Niet zoo heel veel later begon men ook de gekleurde pigmenten
der bloemen en de niet-groene plantenkleurstoffen regelmatig in het
onderzoek te betrekken. Het was Bouillon—Lagrange, die voor
het eerst een onderzoek instelde naar het kleurend be^nsel van de
Wortelen van Daucus Carota (gele of roode wortel), hij noemde de
kleurstof, die hij hierin aantrof „gele olieachtige materiequot;. Vauquelin
(1829) noemde na hem dit kleurend principe „matière grasse résineusequot;.

Wackenroder verhitte het perssap van genoemde wortelen en extra-
heerde het gevormde coagulum met aether. Na verdamping hield hij
een goudgeel gekleurde vettige rest over, door deze met ammoniak
te verzeepen kon hij het grootste deel der voor de kleurstofafscheiding
hinderlijke extractiefstoffen verwijderen. Het aether-extract van dit
product gaf bij langzame, vrije verdamping robijnroode kristallen
van de gezochte kleurstof, zij lagen evenwel nog in een vettige massa
ingebed. Aan deze kristallen, die Wackenroder niet verder heeft
gereinigd, gaf hij den naam Carotine (1826). Van hun eigenschappen
vermeldt hij behalve de kleur, dat zij zonder reuk en smaak zijn, bij
verwarming week worden en ten slotte ontleden zonder te vervluch-
tigen. Zij waren onoplosbaar in alcohol.

Het gelukte eerst in 1846 aan Zeise (1,2) de kristallen van carotine
in meer zuiveren toestand te kunnen afscheiden en in zoodanige
hoeveelheid, dat hij een elementair-analyse kon uitvoeren, die als
moleculaire samenstelling CgHg aangaf, waarmede hij dit planten-
pigment tot een koolwaterstof bestempelde. Zeise zegt haar te be-
schouwen als „polymerisch mit Terpentinölquot;. De stof vormde kleine
donkerroode, sterk glinsterende kristallen, die zoowel in kleur als in
glans veel op gereduceerd metallisch koper geleken. Zij bezaten een
zwakken aangenamen geur en waren onoplosbaar in water, bijna
onoplosbaar in alcohol en moeilijk oplosbaar in aether en aceton. Bij
168° C. smolten zij tot een roode doorzichtige vloeistof, die verder bij
287° C. ontleedde onder ontwikkeling van geringe hoeveelheden gas
en de vorming van een olieachtig condensatieproduct naast een vrij
^oote hoeveelheid koolstof. Vochtig chloorgas verandert het carotine
in een sneeuwwit, in water en zwavelkoolstof onoplosbaar
derivaat.

Husemann, die in 1860 het onderzoek naar de elementaire samen-
stelling van het carotine-molecule hervatte, bestreed de meening van
Zeise, dat men in carotine een koolwaterstof had te zien, daar hij op
grond van zijn analysen aan de kleurstof de formule CggHaoOg
meende te moeten toekennen. Hij wijst voorts op zijn bevinding, dat
het molecule niet wordt aangetast door alkaliën, HgS en (NHJaS,
terwijl van de geconcentreerde minerale zuren H2SO4 en hno3 er
typisch op inwerken. Met geconcentreerd zwavelzuur zag hij, dat
carotine in de koude langzamerhand met fraaie purperblauwe kleur
oploste, in tegenstelling met het door licht veranderde carotine, dat
evenals het geruimen tijd op 150° C. verwarmde of gesmolten pigment
in zwavelzuur met bruine kleur oploste. Husemann gewaagde verder
van de groote lichtgevoehgheid der kleurstof en nam waar, dat hand
in hand met het verbleeken een verandering der oplosbaarheid gepaard
ging, die sterk verminderde in zwavelkoolstof en benzine, maar
toenam in alcohol en aether. Voorts vestigde hij de aandacht op den
vooral bij verwarming waar te nemen reuk naar Florentijnsche
viooltjes. Zoowel Wackenroder als Zeisé vermeldden, dat de kris-
tallen van carotine den vorm van rhombische plaatjes vertoonen,
Husemann verkreeg bij langzame verdamping uit benzine micros-
copisch kleine cubische kristallen, wier smeltpunt bij 167,5° C. lag.

Na Husemann volgt een lange periode, waarin geen nieuwe gezichts-
punten op de chemische samenstelling en eigenschappen van het
carotine-molecule naar voren gebracht worden.

Intusschen had men anderzijds chemisch aangetoond, dat het
chlorophyll van Pelletier en Caventou (1817) geen enkelvoudige,
maar een samengestelde kleurstof was en dat de meening van Ma-
caire—Princep, die in 1828 in zijn „Chromulequot; de moederstof had
meenen te mogen zien, waartoe al de verschillende kleurstoffen,
waaraan het loof der planten zijn kleur dankt als modificaties waren
terug te brengen, niet steekhoudend was. Voor zoover het de planten-
bladeren betrof had men leeren inzien, dat er minstens 2 verschillende
soorten van bladpigmenten bestonden n.1. g^oen en geel pigment. Van de
vele onderzoekers wier namen aan dezen pioniersarbeid zijn verbonden,
moge hier Berzelius vermeld worden, die in 1837 in de herfst-
bladeren van Pyrus communis een gele kleurstof aantrof, die hij
„Blattgelbquot; of „Xanthophyllquot; noemde en aanzag voor een progressief
ontledingsproduct van chlorophyll. Men houde hier wel bij in het oog,
dat zijn xanthophyll niet een meer omschreven chemisch begrip is,
zooals wij dit nu kennen, maar als een verzamelnaam moet opgevat
Worden. Fremy (i) kon in i860 door adsorptie met AI2O3 en op-
volgende elutie met alcohol, aether of zwavelkoolstof uit het alcoho-
lische bladextract een gele kleurstof afscheiden naast een niet gead-
sorbeerd blauw-groen pigment, een scheiding, die hij overigens
ook kon aanbrengen door zijn extract uit te schudden met een twee-
phasig mengsel van aether en zoutzuur, waardoor hij een geel gekleurde
epiphasische kleurstof oplossing verkreeg. Bij zijn voortgezet onder-
zoek (1865) (2) gelukte het hem voor het eerst uit een bladextract een
in water onoplosbare, doch in aether en alcohol oplosbare, nu eens in
gele lamellen, dan weer in roode prisma\'s kristalliseerende kleurstof
te verkrijgen, die uiterlijk herinnerde aan de kleur van kalium bichro-
maat kristallen.

Bougarel kon in 1877 uit de bladeren van den perzik eveneens
roode prismatische kristalblaadjes afscheiden, die evenals fuchsine
groenen glans bezaten, weinig oplosbaar waren in alcohol, maar met
geel-roode kleur gemakkelijk in chloroform en benzine oplosten en
met „une jolie coloration rosequot; in zwavelkoolstof.

Tot dusver had het chemisch onderzoek wel de pluraliteit der
bladkleurstoffen kunnen aantoonen en daarenboven in de meest
verschillende chlorophyll en niet-chlorophyll houdende planten het
voorkomen kunnen bewijzen van gele in water onoplosbare pigmenten,
zelfs had men gemeend meerdere van deze gele pigmenten naast elkaar
m de bladeren aan te treffen (Filhol 1868), maar tot een duidelijke
scheiding eenerzijds of tot een afdoende identificatie anderzijds der
door de verschillende onderzoekers gevonden gele pigmenten had het
chernisch onderzoek nog niet kunnen leiden. Voor een deel was dit
stellig het gevolg van het vooral in den beginne zeer verspreide
euvel om bij het kleurstofonderzoek gebruik te maken van sterk wer-
kende — en dus mogelijk diep ingrijpende — chemische agentia,
Waardoor het oordeel of men te doen had met gepraeformeerde planten-
2

pigmenten of kunstmatige derivaten zeer vertroebeld werd. Voor een
ander deel werkte ook een uitgesproken polypragmasie bij de metho-
diek van het chemisch onderzoek belemmerend op een zuiver oordeel
en was mede verantwoordelijk te stellen voor de neiging, die men bij
de oudere auteurs aantreft om iedere door hen onderzochte kleurstof
voor een andere te houden als die hunner voorgangers. Als den dieperen
grond voor al deze moeilijkheden moet men ten slotte wel de voor-
loopige onmacht aanzien, waarin men verkeerde om op een der
gebruikelijke methoden de pigmenten ter chemische identificatie in
voldoende hoeveelheden in rein kristallijnen toestand af te zonderen.
De geringe concentratie, waarin zij in de planten voorkwamen naast
de gemakkelijke ontleding, die plantenkleurstoffen in het algemeen
ondergaan, vormden daartoe wel het meest ernstige beletsel. Ge-
durende tal van jaren was het juist deze moeilijkheid, die een geduchte
rem heeft gelegd op den voortgang van het plantenpigment-onder-
zoek, klare inzichten heeft tegengehouden en het ontstaan van tallooze
nieuwe namen heeft in de hand gewerkt voor pigmenten van wie zich
thans laat beoordeelen, dat zij ongetwijfeld identiek moeten geweest
zijn. Omgekeerd had de vertroebeling der inzichten ook tot gevolg,
dat dezelfde namen aan geheel verschillende kleurstoffen werden ge-
gegeven, Bougarel noemde b.v. zijn roode in water onoplosbare
kristalblaadjes Erythrophyll, een naam reeds eerder door Berzelius
(2) gegeven aan zijn roode in water oplosbare kleurstof uit „Beerenquot;
en herfstbladeren. Hartsen noemde de roode kristallen uit groene
bladeren, die in water onoplosbaar waren Chrysophyll, een naam eerder
door SoRBY gebruikt voor een groep in water oplosbare celsapkleur-
stoffen.

Eenige opheldering kon bijgebracht worden door die groep van
onderzoekers, die naast de chemische ook aan de physische onderzoek-
methode een plaats inruimden. De Engelsche physicus Brewster
was de eerste, die in 1834 het spectraalanalytisch onderzoek der blad-
extracten invoerde en van een alcoholisch bladextract een spectrum
ontwierp, dat hij in een teekening, waarin men 5 absorptiebanden
kan waarnemen, vastlegde. Stokes berichtte in 1864, dat een chloro-
phylloplossing, d.w.z. een alcohoUsch bladextract, volgens zijn optisch-
chemische onderzoekingen bestond uit een mengsel van 2 groene en
2 gele kleurstoffen, die allen „highly distinctivequot; optische eigen-
schappen bezitten, hij verzuimde echter mede te deelen, waarin die
optische specificiteit bestond.

Een uitgebreid photochemisch onderzoek werd in Engeland in de
jaren 1865—1873 door Sorbynbsp;uitgevoerd met een door hem

zelf geconstrueerd apparaat voor microscopische spectraalanalyse,
voorzien van een vaste schaalverdeeling, waarmede hij dus in staat
was reproduceerbare getallen aan te geven voor de verschillende
absorptiemaxima zijner plantenkleurstoffen. Op deze wijze kon hij in
de bladextracten de enkelvoudige kleurstofcomponenten naast elkaar
aantoonen en kwam hij o.a. tot de onderscheiding van een 5-tal gele
in water onoplosbare pigmenten, die hij in één groep onderbrengt n.1.
zijn Xanthophyllgroep. Hoewel Sorby (2) in het algemeen bij het

door hem gegeven indeelingssysteem geneigd is een te groote waarde
toe te kennen aan geringe verschillen in de plaats der spectraalbanden,
was het hem toch ook mogelijk in de groene plantendeelen van Ficus
elastica 2 spectroscopisch vrij ver uiteen liggende „Xanthophyllsquot;
te onderscheiden. Deze beide xanthophyll-vertegenwoordigers werden
door hem tevens zoo regelmatig in andere bladeren aangetroffen, dat
hij er toe overhelt al de andere soorten als „variable mixturesquot; van deze
beide te beschouwen.

G. Kraus kwam tot een tegenovergesteld resultaat, hij erkende
voorloopig slechts één gele kleurstof. Zijn meening is echter gegrond
op een niet geheel juiste interpretatie van zijn eigen gegevens, naar het
ons voorkomt. Voor de kleurstof uit Daucus Carota geeft hij als ligging
der absorptiebanden volgens zijn schaalverdeeling op:

Band II 670 — 730 — 790.
Vergelijkt men hiermede de plaats der banden, die Kraus opgeeft
voor een oplossing van geel pigment verkregen uit een 9-tal verschil-
lende planten, dan valt het op, dat wel is waar de plaats der banden
verschillen vertoont, maar toch schommelt om een zeker gemiddelde.
Rekent men dit gemiddelde uit dan vindt men voor de plaats der
banden:

Eindabsorptie 925
Van bedoelde tabel, waaruit deze gemiddelde zijn berekend, zegt
Kraus, dat, als men alleen op de extreme waarden let, men best tot de
meening zou kunnen komen, dat er verschillende gele kleurstoffen
m de groene planten voorkomen en hij laat volgen: „man wird aber
beim Vergleich der Tabelle gewahren, dass diese Extreme reichlich
durch ZwischengHeder verbunden sind und dass es, bei Beachtung
dieser, nicht möglich ist, Anfang oder Ende für die Trennung zu finden.
Dies und das gleiche chemische Verhalten bewogen mich, diese Farb-
stoffe vorläufig als einen einzigen zu betrachten, dessen Bandlage
etwas variirtquot;. En in een noot verder: „Uebrigens sieht man dass
der gelbe Farbstoff von Daucus von dem gewöhnlichen gelben Farb-
stoff grüner Blätter etwas abweicht........quot;. Ongetwijfeld is Kraus

in zijn opvatting, in tegenstelling met Sorby, te schematisch geweest,
Want de afwijking in de plaats der banden bij Daucus-carotine vallen
met alleen ver buiten de hierboven berekende gemiddelden, maar
ook buiten de extreme waarden verkregen bij zijn groene planten.
De extracten van zijn groene planten bevatten vermoedelijk, naast
carotine, overwegend xanthophyll. Kraus heeft niet herkend wat
öorby wel heeft gedaan, dat in de planten 2 afzonderiijke gele pig-
menten voorkomen. Sorby (2) moet dan ook ongetwijfeld beschouwd
Worden als de ontdekker van de beide gele pigmenten naast elkaar
m de bladeren, die wij thans kennen onder de namen Carotine en
Xanthophyll; bovendien heeft hij ook herkend, dat de kleurstof uit
de wortelen van Daucus Carota spectraalanalytisch dezelfde was als
een der beide plantenbladerenpigmenten. De naam carotine heeft hij

evenwel niet gebruikt, vermoedelijk alleen als gevolg van het feit,
dat zijn onderzoekingen geheel op zichzelf staande werden uitgevoerd
zonder rekening te houden met de continentale ervaringen. Hij heeft
carotine als een modificatie in physischen zin van xanthophyll op-
gevat. De chemische verschillen liet hij buiten beschouwing.

Ondanks den geschetst\'en vooruitgang bleven de inzichten, die
men omtrent de gele in water onoplosbare plastiden pigmenten in het
algemeen had en de plaats, die het carotine meer in het bijzonder onder
hen innam, ook nu nog verre van klaar, de nomenclatuur verwarrend.

Borodin vermocht hierin eenige verdere opheldering bij te brengen,
hij was n.1. in staat kristallijne nevenpigmenten van het chlorophyll
aan te toonen, die in hun gedrag tegenover bepaalde organische oplos-
middelen verschilden. Uit Spirogyra verkreeg hij door alcoholextractie
roode kristallen; door hierop in passende verdunningen zwavelzuur te
laten inwerken, nam hij verschillen waar in de snelheid, waarmede
blauwkleuring intrad bij gelijke zuurconcentratie en herkende aldus,
dat deze kristallen een mengsel waren van verschillende stoffen.
Sterker nog kwamen deze verschillen uit bij behandelen van zijn oor-
spronkelijk kristalmengsel met alcohol en benzine. Een deel bleek
in alcohol moeilijk, daarentegen in benzine gemakkelijk oplosbaar te
zijn. Tot eerstgenoemde fractie behoorden kristallen van oranje-roode
kleur, zij hadden verschillende vormen, doch deden zich het meest
voor als rhombische plaatjes. Uit hun overig chemisch gedrag sprak
voor Borodin de identiteit dezer roode blaadjes met het erythrophyll
van Bougarel (carotine). Het in alcohol gemakkelijk oplosbare
deel van het mengsel vormde stroogele blaadjes of goudgele „Navi-
kelnquot;, hij rekende deze tot het xanthophyll of wel het phylloxanthine
van Fremy maar beschouwde ook dit nog als een mengsel van 2
verschillende kristallijne stoffen. In het geheel wil Borodin in de
bladeren 4 verschillende geel-roode pigmenten onderscheiden en wel
2 in benzine goed en in alcohol slecht, 2 omgekeerd goed in alcohol
en slecht in benzine oplosbare vormen. Beide kristalgroepen trof hij
in al de door hem onderzochte chlorophyll houdende planten aan.

Arnaud (^ 4) die in de jaren 1885—1889 uitgebreide onder-
zoekingen instelde naar het voorkomen en het wezen van de gele
kleurstof, die het chlorophyll in de bladeren begeleidt, verkreeg eerst-
genoemde kleurstof door petroleum-aether extractie van in vacuo
gedroogde bladeren van spinazie en reinigde de kristallen door her-
kristallisatie uit benzine. Eigenaardig is het stellig, dat Arnaud
slechts gewaagt van één gele kleurstof in de bladeren, die hij Carotine
noemt. Door een nieuwe elementair-analyse stelde hij vast, dat
carotine een onverzadigde koolwaterstof was aan welke de formule
C26H38 toekwam en stelde dus Zeise in het gelijk tegenover Huse-
mann, die ontkend had, dat dit pigment een koolwaterstof was. Hij
verklaarde de afwijkende meening van Husemann hierdoor, dat deze
een reeds gedeeltelijk geoxydeerd product, dat 6% (i mol.) zuurstof
had opgenomen, onderzocht had. Door hun gelijke oplosbaarheid in
verschillende oplosmiddelen, gehjken kristalvorm, zelfde smeltpunt
(168° C.), zelfde uiterlijk en zelfde chemische reacties besloot Arnaud

tot de waarschijnlijke identiteit van het Daucus-carotine met het blad-
carotine. Houdt men rekening met het feit, dat Arnaud geen onder-
scheid maakt tusschen Carotine en xanthophyll, dan kan men niet
zeggen, dat het bewijs voor de identiteit der beide kleurstoffen was
geleverd.

Monteverde (1) (1893) heeft er in navolging van Stokes, den ont-
dekker der ontmengingsmethode, opnieuw op gewezen, dat de gele
pigmenten, die het Chlorophyll vergezellen naar hun relatieve oplos-
baarheid in alcohol en petroleum-aether in 2 groepen verdeeld kunnen
worden en van deze eigenschap gebruik kan gemaakt worden als een
gemakkelijk middel om de beide pigmenten van elkaar te scheiden,
zooals ook Borodin (1883) en Guignet (1885) reeds hadden aange-
geven. Hij toonde aan, dat het pigment in de epiphasische petroleum-
aetherlaag, zoowel spectroscopisch als in andere opzichten identiek
was met Carotine en noemde het bladpigment, dat zich zoo gedroeg,
dan ook Carotine en de zich hypophasisch gedragende alcohol-oplos-
bare kleurstof, in navolging van G. Kraus, xanthophyll. Voor dit
laatste pigment sprak hij reeds het vermoeden uit, dat het geen enkel-
voudige kleurstof zou zijn, maar een kleurstofcomplex.

De reeks onderzoekingen van C. E. Schunck uit de jaren 1899—
1903, die het aanzijn gaven aan een aantal schitterende spectro-
photogrammen der gele plantenpigmenten, hebben voornamelijk door
een verwarring stichtende nomenclatuur weinig de aandacht tot zich
getrokken en daardoor niet tot verdere uitbreiding van de kennis
der Carotinoiden aanleiding gegeven.

Willstätter en Mieg hernamen in 1907 het onderzoek naar de
moleculaire samenstelling van Carotine. Uit brandnetelbladeren iso-
leerden zij 2 gele pigmenten, waarvan zij de elementair-analyse
konden uitvoeren, die voor het eene pigment, het Carotine, de mole-
culair formule C40H5Q gaf. Het Daucus-carotine bleek niet alleen de-
zelfde formule te bezitten, maar ook in alle overige eigenschappen,
in kristalvorm, kleur en oplosbaarheid vonden zij de identiteit tusschen
blad- en Daucuspigment volkomen. Sedert dien wordt de formule van
Willstätter en Mieg en de door hen bewezen identiteit algemeen
erkend. Voor het andere pigment, het xanthophyll stelden zij de for-
mule C4(,H6502 vast, eveneens naderhand algemeen als juist erkende
moleculair-formule voor deze plantenkleurstof.

Met deze onderzoekingen van Willstätter en Mieg kan het his-
torisch overzicht over de oudere onderzoekingen betreffende Carotine
besloten worden. Zoowel Carotine als ook xanthophyll zijn niet langer
groepsnamen voor een onbekend aantal plantenpigmenten, maar
stellen gedefinieerde organisch-chemische lichamen voor, getreden
uit een chaos van naams- en begripsverwarring en van nu af toe-
gankelijk voor dieper onderzoek ter opheldering hunner structuur,
physisch-chemische eigenschappen, physiologische beteekenis en ver-
spreiding in de natuur.

De analysen van Willstätter en Mieg hadden voor de gemiddelde
gewichtsverhouding van koolstof tot waterstof in het carotine-molecule
gegeven: CHi,406, zoodat de eenvoudigst op te stellen moleculair-
formule voor deze koolwaterstof zou zijn: CgH,; ebullioscopische
moleculairgewichts-bepalingen in chloroform en zwavelkoolstof, zoo-
mede analysen van de meest joodarme verbinding, wezen echter uit,
dat aan het molecule de formule: (C5H7)8 of €40115« moest toegekend
worden. De fraaie kristallen, waardoor Husemann reeds was getroffen,
kunnen naar omstandigheden eenigszins in vorm wisselen. Gekristal-
liseerd uit petroleum-aether vertoonen zij rhombische, bijna quadra-
tische plaatjes, uit aether vindt men dikwijls ingekerfde vierzijdige
blaadjes. Zij hebben een koperkleurig uiterlijk met fluweelachtigen
glans en blauwen weerschijn, zelfs de microscopische blaadjes zijn bij
doorzicht nog rood gekleurd, in poedervorm is de kleur steenrood.
Het smeltpunt wordt zeer verschillend opgegeven, volgens Will-
stätter en Mieg ligt het bij 167,5—168° C. (gecorr.), Zechmeister
c.s. geven aan 168° C., Scherz daarentegen 174° C., Eulerc.s.
169,5° C.; voor een zorgvuldig gereinigd praeparaat kwamen Euler,
Karrer en Rydbom bij hun latere onderzoekingen tot 183—184° C.,
Javillier en Emerique tot 184—185° C. en Dulière, Morton en
Drummond 184,5—185° C. Ten deele hangen de waargenomen ver-
schillen af van de wijze van verhitten tijdens de smeltpuntbepaling
(Willstätter und Escher; Euler), deels waarschijnlijk ook van
de mindere reinheid der onderzochte praeparaten, of gedeeltelijke
oxydatie, die volgens Scherz eigenaardige smeltpuntsverlaging
geeft, doch volgens recente onderzoekingen van Karrer en Helpen-
stein c.s. en van Kuhn en Lederer wellicht ook van het bestaan
van carotine-isomeren met verschillend smeltpunt. De groote mate
van oxydabiliteit, die het Carotine vooral in onzuiyeren toestand
kenmerkt, maakt het reinigen der praeparaten moeilijk, steeds gaat
dit proces gepaard met een aanzienlijk verlies aan stof. Bij de bereiding
moet het filtreeren, afdestilleeren en herkristalliseeren liefst in een
stikstofatmospheer bij verminderden druk geschieden.

In tal van organische oplosmiddelen is Carotine met een zeer
intensieve kleur oplosbaar b.v. in aether, chloroform, benzol, toluol,
xylol, terpentijn, petroleum-aether, tetrachloorkoolstof, zwavel-
koolstof, cyclohexaan, aetherische- en vette oliën en in oleinezuur.
In alcohol schijnt de oplosbaarheid zeer afhankelijk van de mate van
zuiverheid van het praeparaat, meestal vindt men aangegeven, dat
dit Carotinoid in kouden aethylalcohol nagenoeg onoplosbaar is en

nóg iets moeilijker in methylalcohol. Scherz (3) geeft aan, dat de
oplosbaarheid van carotine bij 25° C. in absoluten aethylalcohol:
15,5 mgr./L., in absoluten methylalcohol: nagenoeg onoplosbaar,
in petroleum-aether (Kpt. 30—50° C.): 626 mgr./L. en in aether:
1005 mgr./L. bedraagt. Voor xanthophyll met een smeltpunt 173—
174° C. vond Scherz in aether: 952 mgr./L., in petroleum-aether
(Kpt. 50—55° C.) : 9,51 mgr./L., in absoluten aethylalcohol: 201,5
mgr./L. en in absoluten methylalcohol: 134,9 mgr./L. Volgens Scherz

is xanthophyll in aether (vrij van peroxyden) onbestendig, zeer
bestendig daarentegen in absoluten aethylalcohol, lichtelijk onbe-
stendig in petroleum-aether; ook carotine is in aether onbestendig,
vooral in het hcht, maar volkomen bestendig in petroleum-aether en
in alcohol, al deze bepalingen werden bij ijskast-temperatuur
verricht.

Terwijl verdunde oplossingen van carotine meer of minder sterk
geel gekleurd zijn, geven meer geconcentreerde een oranje kleur, in
zwavelkoolstof lost het pigment zelfs bij groote verdunning met een
diep roode kleur op.

Vermelding verdient, dat Hymans van den Bergh, Muller en
Broekmeyer door langzaam verdampen van geconcentreerde alco-
holische oplossingen onder toevoegen van water colloidale waterige
oplossingen van het carotine konden verkrijgen, onlangs hebben
Fodor en Schoenfeld eveneens de bereiding van colloidale waterige
carotine-oplossingen beschreven.

Palmer en Eckles (1914) (®) wezen op de waarschijnlijkheid van
een carotine-eiwit verbinding in het serum, waarop wij in Hoofdstuk
III nog even nader moeten terug komen.

Vrijwel alle onderzoekers, die zich met de bereiding van carotine
hebben bezig gehouden, wijzen op de gemakkelijke ontleding van deze
stof aan de lucht, waarneembaar aan een geleidelijk volkomen ver-
bleeken. Reeds aan zijn ontdekker Wackenroder was dit gedrag
opgevallen. Willstätter en Mieg vonden, dat deze koolwaterstof niet
minder dan 34,3% van zijn gewicht aan gasvormige zuurstof kan
opnemen en dat de oxydatie evengoed in het donker, als in volkomen
droge atmospheer verloopt. Het was Escher, die er op wees, dat ook
de mate van auto-oxydatie van carotine afhangt van den graad van
zuiverheid der kristallen. Naarmate deze zuiverheid toeneemt, wordt
ook de latentieperiode, vóór het molecule door de zuurstof waarneem-
baar wordt aangetast langer, is de oxydatie echter eenmaal begonnen
dan schrijdt zij steeds sneller voort. Bij een zeer zuiver praeparaat met
een smeltpunt van 183° C. (gecorr.) konden H. v. Euler, Karrer
en Rydbom de ingetreden oxydatie pas vaststellen na 7—10 dagen,
sporen van een ijzerzout aan de oplossing toegevoegd bleken het proces
aanzienlijk te versnellen, zoodat in dat geval de oxydatie reeds na 4
dagen was aan te toonen. Duidelijker nog werden deze verschillen
na langer tijd. Na 33 resp. 39 dagen vonden gemelde onderzoekers
slechts 6,3 resp. 11,2% van de oorspronkelijke hoeveelheid geoxydeerd,
tenvijl met 0,03% FeClg dit bedrag reeds 18,2% was na 35 dagen.
Zij neigden dientengevolge tot de opvatting, dat de oxydatie van

Carotine steeds plaats vindt langs katal5rtischen weg door geringe
nog aanhechtende onzuiverheden, maar dat een chemisch zuiver
product aan de lucht waarschijnlijk volkomen bestendig zou zijn.
Behalve aan een chemische oxydatie door de luchtzuurstof moet o.i.
voor de snelheid van de ontleding van het onzuivere product een rol
worden toegekend aan de meerdere of mindere gelegenheid, die de
stof verkrijgt om photolytisch omgezet te worden. In hoofdstuk III
komen wij hierop nog uitvoerig terug.

Naast katalysatoren voor de oxydatie bestaan er omgekeerd ook
stoffen, die dit proces kunnen vertragen; in zeer belangrijke mate
kan men dit waarnemen, indien aan een carotineoplossing i—2%
van een phenol (Hydrochinon, Guajacol e.a.) wordt toegevoegd.
Huston, Lightbody and Ball vonden, dat 0,002—0,005% Hydro-
chinon het vitamine-A in melk en levertraan kon stabiliseeren. Mis-
schien zou deze eigenschap wel practisch te benutten zijn bij de be-
reiding der Carotinoiden.

Wij zagen vroeger reeds, dat carotine tegenover minerale zuren een
bijzonder gedrag vertoont. Indien men de indigo-blauwe oplossing
der kristallen in geconcentreerd H2SO4 met water verdund, s aat het
piment in groene vlokken neer. Of het hierbij geheel onveranderd
blijft is nog niet volkomen opgehelderd. Een zelfde kleurreactie ziet
men bij behandeling met geconcentreerd HNO 3 en met thymol of phenol
dat geconc. HCl bevat, evenzoo geven broomwater en broomdampen
een, zij het misschien meer voorbijgaande, blauwe kleur. In het bij-
zonder van de kleurreactie met H2SO4 meende men geruimen tijd ten
onrechte, dat zij voor carotine kenmerkend zou zijn. Sporen ferri-
chloride toegevoegd aan een carotineoplossing in olie deelen daaraan
een fraaie groene kleur mede, waarbij carotine volgens Palmer en
Thrun wordt geoxydeerd en het ferri-zout tot groen ferro-zout
wordt gereduceerd.

Alle drie de halogenen vormen met carotine gemakkelijk additie-
producten. Opgelost in chloroform kan carotine 8 mol. Brg addeeren,
het gevormde product ondergaat volgens Zechmeister en Tuzson (2)
metter tijd een secundaire omzetting, waarbij HBr vrijkomt, zoodat
ten slotte, zooals Willstätter en Escher al hadden aangegeven,
een lichaam ontstaat met de samenstelling: C4(,H36Br22. Het dijodide
door Willstätter en Mieg voor de elementair-analyse gebruikt,
kristalliseert in zeer fraaie rosetten van donkerviolette koper-glanzende
prisma\'s, die geen smeltpunt bezitten.

Zoowel carotine als xanthophyll vertoonen bij de spectraalanalyse
een zeer sterke selectieve absorptie. Afgescheiden van het feit, dat de
ligging der absorptiebanden bij beide Carotinoiden verschilt naar den
aard van het gebruikte oplosmiddel, vindt men de plaats der banden
bij verschillende waarnemers ook in oplosmiddelen, die op zichzelf
geen aanleiding tot merkbare bandverschuivingen geven, met geringe
verschillen opgegeven. In millimikronen vindt men b.v. voor carotine
bij:

Band II

455—445
460—445

Band III
430—418

Duliêre, Morton en Drummond vonden (1929) voor een zeer
zuiver carotine-praeparaat met smeltpunt 185° C. absorptiebanden
met max. bij: I 492—494 m.jx.; II 461—463 m.|jL.; III 434—437 m.fx.;
IV 348—350 m.jji. en V 277—280 m.jx. in hexaan.

Voor xanthophyll in alcoholische oplossing liggen de 3 banden
volgens Willstätter en Stoll:

Door middel van zijn chromatographische adsorptïeanalyse kwam
Tswett (i) zooals bekend is, tot de onderscheiding van 4 verschillende
soorten van xanthophyll n.1. a, en aquot; en xanthophyll p. De ligging
van de absorptiebanden, zooals boven aangegeven is, gelden voor het
«-product van Tswett, voor a en «quot; vermeldt hij alleen, dat hun
banden iets verschoven zijn naar de korte golfzijde van het spectrum.
Coward (2) geeft voor de verschillende xanthophylls, die volgens de
adsorptieanalyse van Tswett zijn te onderscheiden, de volgende lig-
ging der banden aan in aether:

Xanthophyll«
Xanthophyll «
Xanthophyll a\'
Xanthophyll ß

De verschillen tusschen de 3 eerstgenoemde xanthophyll-modifi-
caties zijn dus slechts zeer gering. Willstätter en Stoll hebben de
mogelijlAeid aangeroerd, dat de adsorptieverschillen afhankelijk
zouden zijn van gedeeltelijke oxydatie van het normale xanthophyll.
Scherz (®) deelde deze meening, maar drukt zich sterker uit, immers
hij zegt, dat de xanthophyll ß-zone van Tswett ongetwijfeld bestaat
uit geoxydeerd xanthophyll, daar zuiver xanthophyll uitgewasschen
zou kunnen worden uit de CaCOg-kolom, die voor de adsorptie dienst
doet. Deze opvatting van Scherz kan o.i. slechts gedeeltehjk worden
aanvaard, wij kunnen daartoe verwijzen naar Hoofdstuk III, waar
eigen ervaringen met betrekking tot het gedrag van het genoemde
Carotinoid in de Tswett-proef worden vermeld.

Bij het onderzoek van vruchten op hun carotine-gehalte kwamen
wij eenmaal in aanraking met xanthophyll ß, de ligging der absorptie-
banden werd in alcohoHsche oplossing aldus gevonden:
Band I: 475—462 m.[j..
Band II: 445—435 in.|x.
Band III: 425—eindabsorptie.

Vergeleken bij het gewone xanthophyll zijn dus beide banden naar
het ultraviolette einde van het spectrum verschoven. De onderlinge
verschillen in plaats van de banden der 3 genoemde Carotinoiden n.1.
Carotine, xanthophyll en xanthophyll ß mogen nu wel niet zeer groot
zijn, ook met de meest eenvoudige spectroscopische uitrusting zijn zij
toch duidelijk waar te nemen.

Quantitatieve metingen in het absorptiespectrum der planten-
pigmenten zijn het eerst verricht door Scheibe en Rosenberg ¹); zij
brachten voor beide Carotinoiden een buitengewoon sterke extinctie
aan den dag, die graphisch geprojecteerd met de bijbehoorende golf-
lengten een breeden hoofdband laat onderscheiden, die 2 kleinere
maxima bevat en daarnaast nog een nevenband.

Voor Carotine in cyclohexaan vonden zij bij de volgende golflengten
voor den molairen extinctiecoefficient K:
Log. K = 5.— bij 482 m.{ji.
Log. K = 5.— bij 451 m.(x.
Log. K = 4,3 bij 273 m.(x.

en voor xanthophyll:
Log. K = 5,2 bij 477 m.[i.
Log. K = 5,1 bij 446 m.[jL.
Log. K = 4,3 bij 268 m.(x.

Voor den hoofdband (liever absorptiezóne) blijkt xanthophyll
dus sterkere extinctie te vertoonen dan Carotine.

Zeer nauwkeurige quantitatieve metingen werden onlangs door
Wilhelmina van Deventer verricht met behulp van een voor den
spectrophotometer geplaatsten dubbelmonochromator, waardoor elk
spoor van valsch licht werd uitgeschakeld. Haar metingen geven aan,
dat het Daucus-carotine in petroleum-aether oplossing in het zichtbare
deel van het spectrum een sterke absorptiezóne vertoont tusschen

400—500 m.fji,., waaraan niet 2, maar 3 distincte absorptiemaxima
kunnen herkend worden, wier hgging reeds eerder in de tabel voor de
golflengten der banden werd opgegeven. Vermoedelijk heeft zij haar
metingen niet met een kwartsspectrograaf uitgevoerd, waardoor zich
laat verklaren, dat zij den door Scheibe en Rosenberg vermelden
nevenband in het ultraviolet bij 273 m.[x. niet opgeeft.

Onderzoekt men met een eenvoudigen handspectroscoop oplos-
singen van carotine en xanthophyll dan neemt men bij beide Caro-
tinoiden meestal slechts 2 absorptiebanden waar, beide maxima zijn
weinig scherp- en naar beide zijden ook ongelijk scherp begrensd,
het 3e maximum is hoogstens als een eindabsorptie te zien.

Waarnemingen over absorptie in het infrarood werden alleen bij
xanthophyll gedaan door Stair en Coblentz. Van belang is de aan-
wezigheid van den 3 ß. band, wijl deze werd aangetroffen in samen-
gestelde stoffen, die o.m. OH-groepen bevatten.

Voor alle door hen onderzochte xanthophyll-praeparaten vonden
Zechmeister en Tuzson (2) in monochromatisch hcht een sterk,
doch van stof tot stof wisselend rotatievermogen van het polarisatie-
vlak. Wel waren alle praeparaten dextrogyr, maar de specifieke
draaiing bleek afhankelijk van het bij de extractie gebruikte oplos-
middel, niet echter van het oplosmiddel sui generis. Xanthophyll,
verkregen volgens de aceton-extractie methode van Willstätter
en Stoll, bezat een specifieke draaiing [a]c = -f- 137°, praepa-
raten verkregen door alcohol-extractie bezaten een veel sterker
rotatievermogen: [a]c = 192°, deze verhouding bleek voor de
vermelde extractiemiddelen niet constant, soms was zij zelfs juist
omgekeerd. Bij een door hen bereid kleurloos reductieproduct
het Hexadekahydro-Xanthophyll (8 Hg) vonden zij overeen-
komstige verschillen in het rotatievermogen. Deze onderzoekingen
bevestigen dan ook in zekeren zin de meening van Tswett, dat
xanthophyll uit de groene bladeren zou bestaan uit elkaar zeer na
Verwante, maar het polarisatievlak ongelijk draaiende componenten.

Langen tijd heeft men gemeend, dat carotine in tegenstelling met
xanthophyll, optisch inactief was. Twee recente ongeveer gelijktijdige
mededeelingen hebben deze opvatting weerlegd. De eene, neergelegd
in een meer uitvoerig onderzoek van Karrer en Helfenstein c.s.,
zullen wij straks vermelden; de andere, een voorloopige mededeeling
van Kuhn en Lederer hield in, dat het gewone Daucus-carotine een
mengsel zou zijn van 2 modificaties, die naast smeltpunts- en kleine
oplosbaarheidsverschillen ook afwijkingen vertoonen in hun optisch
gedrag bij polarimetrisch onderzoek. Door gefractioneerde adsorptie
of gefractioneerde praecipitatie met Jodium wisten zij beide isomeren
te scheiden in een optisch sterk actieven component: «-Carotine en in
een inactieven: ß-carotine. Daarenboven konden zij uit de tetrajood-
verbinding nog een isomeer verkrijgen van het ß-carotine, die waar-
schijnlijk geen natuurlijk voorkomend Carotinoid voorstelt en waaraan
ZIJ den naam Iso-carotine gaven. Ook de ligging der absorptiebanden
is voor de 3 modificaties verschillend, de maxima geven zij voor zwavel-
koolstofoplossingen aldus aan:

De fractie: « zou ongeveer 5—15% van de totale hoeveelheid
carotine bedragen. Deze onderzoekingen laten weer een geheel nieuw
geluid in het carotine-vraagstuk hooren en kunnen van verstrekkenden
invloed zijn op onze kennis van de structuur van het carotinemolecule.

De inzichten in de structuur van het carotinemolecule dateeren
eerst van de laatste jaren. De interactie van de halogenen, noch de
oxydatieve afbraak der pigmentmoleculen waren tot dusver in staat
gebleken in belangrijke mate de kennis omtrent hun inwendige samen-
stelling te verruimen, de laatste methode leverde in het algemeen te
kleine en daardoor te weinig kenmerkende afbraakproducten.

Aan de eigenlijke opheldering van de inwendige structuur der caro-
tinoidenmoleculen liggen enkele gelijktijdige, volkomen onafhankelijke
en verschillende richting uitgaande onderzoekingen ten grond. Kuhn
en Winterstein (i,nbsp;die een aantal uiterst belangrijke

onderzoekingen over geconjugeerde dubbelbindingen hebben verricht,
bereidden langs synthetischen weg een serie poly-enen, waarvan het
eenvoudigste lid het reeds bekende Diphenylaethyleen (Stilbeen):
CgHg—CH = CH—CßHj en het hoogste lid een 16 CH-groepen
bevattend homoloog lichaam was. Het waren allen diphenylpoly-enen
opgebouwd uit systemen van geconjugeerde dubbelbindingen. Zij
vertoonden van lid tot lid een merkwaardige progressieve kleur-
variatie loopende van kleurloos bij Stilbeen over zwak geel bij 2
dubbelbindingen, geel bij 31=, oranje bij 51=, koperbrons bij 71=,
tot blauwachtig koperrood bij het hoogste lid met 8|=. Regelmatig
verdiepte zich dus hun kleur bij het toenemen in aantal der geconju-
geerde dubbelbindingen, wat zich ook manifesteert als de leden dezer
homologe reeks opgelost worden in geconc. H2SO4. Kuhn wees nu
in 1927 op de gelijkenis in eigen kleur en in het gedrag tegenover
geconc. zwavelzuur tusschen carotine en deze synthetische diphenyl-
poly-enen en meer in het bijzonder op de groote overeenkomst van het
plantenpigment met het Diphenyl-tetradeca-heptaeen: CgHg— (CH=
CH)7C6H5. (Kuhn und Winterstein (s).

Ongeveer ter zelf der tijd pasten Zechmeister, von Cholnoky
en Vrabély het katalytische hydreeringsprincipe, zooals dit het eerst
door Liebermann en Mühle was aangegeven, toe op carotine opgelost
in cyclohexaan. Zij vonden, dat het pigmentmolecule 22 waterstof-
atomen kon addeeren, waarbij als eindpunt der reductie het kleurlooze
Perhydrocarotine werd gevormd. Deze paraffineachtige koolwaterstof
gedraagt zich tegenover Br 2 als verzadigd en bevat slechts 4 atomen
waterstof minder dan een overeenkomstig paraffine met 40 koolstof-
atomen en heeft dus tot formule: C4oH,8. Dit onderzoek bracht het
zeer verrassende feit aan den dag, dat carotine in hoofdzaak een ali-
phatische structuur moet bezitten. Bij het quantitatief vervolgen
der reactie bleek, dat de kleur der oorspronkelijke carotine-oplossing

verdwenen was als 8 Hg waren ingevoerd. Het spectroscopisch onder-
zoek tijdens het verloop der reactie gaf tevens aan, dat zoolang de
reductie nog slechts partieel was, op elk oogenblik een mengsel voor-
handen was van onveranderd pigment en ontkleurde stof, bij volkomen
afwezigheid van gekleurde tusschenproducten, juist zooals Kuhn
en Winterstein (3) dit ook gevonden hadden bij de katalytische
hydreering van hun s5mthetisch Dibenzyl-butadieen. Uit deze gegevens
putten zij de overtuiging, dat het reactieverloop dus werkelijk het
afreageeren van een geconjugeerd systeem voorstelt, waarbij, zoolang
de reductie alleen de dubbelbindingen aantast, de kleur der oplossing
(het carotine-gehalte) omgekeerd evenredig is aan de hoeveelheid
opgenomen waterstof. Echter met het kleurloos worden der oplossing
bleek de waterstofopname niet op te houden en uit de graphische
projectie der hydreeringslijn bleek, dat naast 8 olefinisch geconju-
geerde dubbelbindingen nog 3 andere dergelijke bindingen in het mole-
cule moesten bestaan. Het door Kuhn en Winterstein (®) geuite
vermoeden omtrent het bouwtype der plantenpigmenten: R—(CH =
CH)—R had dus voor Carotine zijn bevestiging gevonden en daarmede
was een uiterst belangrijke stap gedaan in de richting van de kennis
der inwendige structuur van dit merkwaardige pigment. De sterke
extinctie voor een carotine-oplossing gevonden was hiermede in
overeenstemming, zooals ook de onderzoekingen van Pummerer en
Rebmann een bevestiging gaven. Zij konden door middel van Ben-
zoperzuur 8 atomen zuurstof in het Carotine molecule invoeren en
met Chloorjood 11 dubbelbindingen aantoonen. (Pummerer, Reb-
mann und Reindel).

Op grond van vergelijkingen met het verloop der hydreeringslijn
bij katalytische reductie van het constitutioneel bekende Bixine,
hebben Zechmeister en Vrabély later hun interpretatie van die lijn
bij Carotine gevonden in zooverre gewijzigd, dat zij ook hier in plaats
van 8, de aanwezigheid van g dubbelbindingen aannamen. Hun
argumentatie — een analogie afgelezen op een graphische kaart — is
stellig niet zoo heel sterk en wint er niet bij als men beide lijnen van
Zechmeister zelf met elkaar vergelijkt, men kan niet aan den indruk
ontkomen, dat de indeeling der dubbelbindingen in twee groepen n.1.
9 kleurgevende in conjugatiestelling en 2 moeilijk reduceerbare, een
eenigszins willekeurige groepeering der verkregen resultaten is.

Voor xanthophyll vonden Zechmeister en Tuzson (i) gelijke verhou-
dingen bij de hydreering als bij Carotine, zij verkregen hier als perhydro-
product een stof, die tot formule bleek te hebben: C40 H^g Ojquot;,
uit het feit, dat geen koolwaterstof als hydreeringsproduct werd
Verkregen blijkt dus, dat bij xanthophyll de zuurstof noch complex,
noch aan een der dubbelbindingen is gebonden. In elk geval kan tot
de identiteit der onverzadigde systemen bij beide Carotinoiden worden
besloten, beide zijn typische polyeen-kleurstoffen.

De oxydatieve afbraak van Carotine, die aanvankelijk zoo weinig
succes had opgeleverd, bleek ten slotte toch in handen van Karrer
en Helfenstein een machtig wapen te zijn om dieper in het wezen
van het kleurstof-molecule door te dringen. Een benzoloplossing van

Carotine schudden zij op een waterbad met een oplossing van Kalium
permanganaat in water en konden nu een aantal typische afbraakpro-
ducten aantoonen, die gewichtige conclusies toeUeten betreffende den
bouw van het molecule. Bij hun eerste onderzoek troffen zij onder de
afbraakproducten aan: oxaalzuur, minstens 4 moleculen azijnzuur en
hoogstwaarschijnlijk lonon, kenbaar aan den reuk naar cederhout
in sterke concentratie en naar de bekende viooltjes lucht van carotine
bij grootere verdunning van het lonon. Zij toonden tevens de uit ver-
dere lonon-afbraak gevormde dicarbonzuren: a,a\' -dimethylbamsteen-
zuuren a,a\'dimethyl-glutaarzuur. Een volgend onderzoek van Karrer,
Helfenstein, Wehrli en Wettstein leverde bovendien een weinig
dimethylmalonzuur, de ozonolyse een weinig geronzuur, de ontleding
met chroomzuur 6 mol. azijnzuur.

Door de verschillende onderzoekingen had men nu de volgende
gegevens verkregen voor het carotinemolecule:
1°. elementaire samenstelling: C40H66.

conjugatiestelling voorkomen.
30. het molecule bevat waarschijnlijk 2 koolstofringen, waarvan er

I bewezen en de andere aannemelijk gemaakt kan worden.
40. de koolwaterstof is optisch inactief.

50. de mogelijkheid van ontstaan van vermelde reeks oxydatieproduc-
ten moet uit de op te stellen structuurformule verklaard kunnen worden.

Deze gegevens in een formule ondergebracht, waarin de isopreen-
resten in regelmatige conjugatie voorkomen, brachten genoemde
onderzoekers tot de opstelling van de volgende structuurformule
voor carotine:

6||C_CH,CH.C.CH.CH.CH.C.CH.CH-CH.CH.C-CH.CH.CH.C.CH

\'i

CHi

De 2e koolstofring in het molecule is, als niet bewezen, onzeker.
Karrer, Helfenstein en Wehrli alsook Karrer, Wehrli en
Helfenstein meenden, dat xanthophyll de zuurstof als 2 —OH
groepen zou bevatten, daar de Zerewitinoff-bepaling 2 actieve H-
atomen aantoonde; hieruit trokken zij, in verband met het door
Zechmeister gevonden zelfde hydreeringsgetal als bij carotine, de
conclusie, dat xanthophyll evenals carotine 2 koolstofringen bevat.
Aan deze opvatting scheen de Kaliumpermanganaat-afbraak mede
steun te verleenen, immers de CHg groep no. 3 in den eersten ring laat
zich bij carotine in den vorm van a, a\'-dimethylglutaarzuur aantoonen,
doch bij xanthophyll gelukte het niet laatstgenoemd derivaat aan te
treffen, zoodat het schijnt, dat vermelde CHg groep op die plaats
ontbreekt of door CHOH vervangen is, waardoor de oxydatie bij
xanthophyll direct tot dimethylbamsteenzuur verloopt. Het niet

ontstaan van lonon bij de oxydatieve afbraak van xanthophyll maakt
het bovendien zeer waarschijnlijk, dat in den eersten ring een hydroxyl-
groep voorkomt.

Het verschil tusschen Carotine en het isomere, physiologisch-in-
actieve lycopine ligt, gelijk bekend, hierin, dat bij dit laatste Caro-
tinoid aan de einden van den aliphatischen keten geen ringsluiting
heeft plaats gevonden. Karrer en Bachmann wezen nu op een merk-
waardig verschil tusschen beide na-verwante plantenkleurstoffen
wat betreft het alkali-additievermogen. Bij geruimen tijd schudden
van een lycopine-oplossing in een mengsel van benzol en aether met
metallisch-natrium, vertoont de oplossing een kleurverandering van
olijfgroen, blauw tot violetblauw, daarop slaat de natrium-additie-
verbinding als een bruin-zwarte massa neer. Ook met lithium en
kalium konden dergelijke additieproducten van lycopine verkregen
worden, met Carotine of met xanthophyll worden echter dergelijke
verbindingen met alkalimetalen niet gevormd.

De onderzoekingen van Kuhn en Lederer (i), straks reeds ver-
meld, en het meer uitgebreide werk van Karrer, Helfenstein,
Wehrli, Pieper en Morf, in het bijzonder de daarbij vastgestelde
sterke optische activiteit van een der gevonden carotine-isomeren,
hebben de waarschijnlijke existentie van den 2en ring in den vorm,
zooals Karrer c.s. eerst hadden aangenomen, weer op losse schroeven
gesteld, omdat er in dat geval een asymetrisch C-atoom in het molecule
moet voorkomen, waarvoor in Karrer\'s eerste voorstelling geen plaats
is.

Karrer, Helfenstein, Wehrli, Pieper en Morf onderwierpen
niet minder dan 140 gr. Daucus-carotine aan gefractioneerde kris-
tallisatie uit petroleum-aether. De moeilijkst oplosbare kristallen
smolten bij 181—182° C. (ongecorr.), de gemakkelijkst oplosbare bij
ongeveer 170° C., deze laatste fractie nu bleek in chloroform en zwavel-
koolstof bij rood licht sterk optisch actief en wel rechtsdraaiend:

amalgaam verkregen mengsel van verschillende hydroderivaten bleef
nog sterk rechtsdraaiend: [a]D = -f- 60°. Naarmate de fracties
moeilijker oplosbaar werden nam hun optische activiteit af, zoodat
Verwacht mag worden, dat een geheel zuiver, zeer moeilijk oplosbaar
product met hoog smeltpunt, optisch inactief zal zijn. De rotatie was
niet afhankelijk van een verontreiniging, maar wel degelijk aan den
bij zonderen aard van het carotine-molecule gebonden.

Karrer c.s. wijzen er nu ook zelf op, dat de waargenomen optische
activiteit uitsluit om zonder meer de eerst opgestelde symmetrische
carotine-structuurformule te handhaven. Daar echter alle gegevens,
verkregen uit de oxydatieve afbraak, pleiten voor het bestaan van
2 ringen, zoeken zij de verklaring voor de asymmetrische structuur
bij de optisch actieve isomeren in een veranderde ligging der dubbel-
bindingen. Onder behoud van den door Karrer c.s. gegeven vorm
voor de structuur van het inactieve Carotine geven zij nu een 3-tal
structuur mogelijkheden voor de isomeren, die rekening houden met

den eisch van asymmetrie. In twee van die formules stellen zij de
conjugatie der dubbelbindingen onderbroken voor.

Het inactieve lichaam noemen zij carotine ß, de optisch actieve
isomeren, die zij onderling nog niet vermochten te scheiden, noemen zij
te zamen carotine a. Wegens de ^oote verwantschap van carotine en
xanthophyll o.m. ook hieruit bhjkend, dat Brandenberger in het
Röntgenspectrum bij beide geen verschillen vond, achten bovenge-
noemde onderzoekers het mogelijk, dat het hiervoor vermelde verschil-
lend gedrag van dit Carotinoide pigment uit het bestaan van isomeren
ook bij deze kleurstof kan verklaard worden. Misschien ontstaan hier
deze veranderingen in het molecule pas in vitro tijdens de extractie van
het materiaal.

Ter verdere opheldering van de structuur van het carotine-molecule
aan de hand van de nieuw verkregen gegevens, heeft Karrer met
Morf dit onderzoek voortgezet. Zij lieten aluminium-amalgaam op
een oplossing van carotine inwerken tot de kleur even ophelderde.
Door verdere katalytische hydreering van het verkregen product
bleek, dat dit m staat was lo mol. Hg op te nemen en daaruit besloten
zij, dat het gevormde reductieproduct inderdaad dihydrocarotine
was, een conclusie, die o.i. wel aan eenige bedenking onderhevig is.
Bij reductie met aluminium-amalgaam worden eenvoudige dubbel-
bindingen niet aangegrepen, maar wel inwerking verkregen op ge-
conjugeerde systemen. Gewoonlijk legt de H zich dan aan de einden
van het geheele systeem van geconjugeerde dubbelbindingen aan.
Neemt men dit ook voor carotine aan, dan moet een verschuiving
der dubbelbindingen in de koolstofringen van het carotine-molecule
optreden. Aan het carotine a geven genoemde onderzoekers dan de
formule:

CH,

H,C

Door oxydatieve afbraak van dihydro- a carotine metk alium
permanganaat konden zij aantoonen, dat de kerndubbelbinding van
dit molecule een andere ligging heeft dan in a-carotine zelf. De ge-
vormde dicarbonzuren n.1. a, a\' dimethyl-glutaarzuur bij het dihydro-
carotine en a, a\' dimethyl-glutaarzuur met a, a\'-dimethyl-barnsteen-
zuur bij het optisch actieve carotine konden zij alleen verklaren als

het eerste molecule zijn ringdubbelbinding bezat tusschen de ring-
atomen 5 en 6 en het Carotine a molecule tusschen de ringatomen
4 en 5. De afbraak met ozon van dihydrocarotine voerde ook tot geron-
zuur. Al deze gegevens te zamen maakten de gegeven structuur voor
den eersten koolstofring van Carotine a voor Karrer en Morf waar-
schijnlijk.

Kuhn en Lederer (2) hebben gevonden, dat de verhouding
a Carotine . , ,nbsp;. , ,

ß Carotine aan (inactief), nimmer echter alléén a Carotine (actief).
Bij toenemend rotatievermogen van het Carotine verplaatsen zich de
absorptiebanden naar het ultraviolet. Kuhn en Brockmann troffen
in palmolie een Carotine aan, dat van alle in de natuur voorkomende
carotine-mengsels de sterkste optische activiteit vertoont. Door
adsorptie aan Voller\'s aarde, waaraan het inactieve ß-carotine veel
gemakkelijker adsorbeert dan de actieve a-vorm, kunnen beide iso-
meren gescheiden worden.

In het feit, dat Karrer c.s. voor hunne isomeren bij spectros-
copisch onderzoek vaststelden, dat de absorptiebanden bij de groep
Carotine « meer naar het roode einde van het spectrum verschoven
waren, zou men een bevestiging kunnen zien van de waarneming
van Wilhelmina van Deventer, die onlangs op grond van,hare
quantitatieve bepalingen van het absorptiespectrum meende bij een
schimmel, Neurospora sitophila, een tweetal nieuwe Carotinoiden
aan te treffen, die min of meer verwant schenen aan het Daucus-
carotine en wier banden ook naar links verschoven bleken. Wij meenen
echter, dat aan dit onderzoek, hoe nauwkeurig ook voor het overige
uitgevoerd, ten deze geen volle bewijskracht mag worden toegekend
voor het bestaan van nieuwe tot de carotine-groep behoorende planten-
pigmenten, omdat zij bij de afscheiding dezer pigmenten verzuimd
heeft haar schimmelpoederextracten te verzeepen. Karrer en Ishi-
kawa namen bij de bereiding van hunne kunstmatige xanthophyll-
esters waar, dat deze producten, in tegenstelling met het niet ver-
ankerde Carotinoid zelf, zich in de 2-phasenproef (petr.-aether/85%
alcohol) juist gedragen als Carotine en met dit pigment in de epi-
phasische petroleum-aetherlaag oplossen. Ook natuurlijk voorkomende
plantenkleurstoffen gedragen zich aldus, immers het reeds aan Kraus
bekende Carotinoid uit Physalis alkekengi, door Kuhn en Wiegand
physalieen genoemd, werd door Kuhn, Winterstein en Kaufmann
herkend als de verzeepbare dipalmitinezure ester van xanthophyll,
hetgeen door Zechmeister en von Cholnoky en ook door Zech-
meister en Szillard werd bevestigd. Ook Karrer en Wehrli
troffen in Hippophaes rhamnoides een ester van Zeaxanthine aan en
Kuhn en Winterstein herkenden het Helenieen als de dipalmitine-
zure ester van luteine. Al deze natuurlijke xanthophyllesters gedragen
zich in oplosbaarheid als Carotine. Onder de Carotinoiden uit de schil
en het vruchtvleesch van Citrus aurantium werd door ons eveneens een
xanthophyllester aangetoond (Vermast). Na een kort durende ver-
zeeping van een petroleum-aether extract van genoemde schillen ging
3

bij uitschudden met 85% alcohol slechts weinig Carotinoid in deze laag
over en de weinige kleurstof, die nog door den alcohol was opgenomen,
kon daaraan weder door verschen petroleum-aether worden onttrokken
zonder den alcohol te verdunnen, zooals men moet doen om het gewone
xanthophyll uit alcohol weder in petroleum-aether over te voeren.
Deze Citrus-kleurstof vertoonde dus een zelfde tweeslachtig gedrag
als de kunstmatige xanthophyllesters van Karrer en Ishikawa en
als Palmer en Eckles reeds vroeger (1914) gevonden hadden voor
de natuurlijke kleurstof uit mais, het zeaxanthine, dat eveneens een
ester is gebleken te zijn. Uit voorafgaande onderzoekingen was ons ge-
bleken, dat sinaasappelen vrij groote hoeveelheden vaneen xantho-
phyll bevatten, zoodat het vermoeden zeer voor de hand lag, dat on-
voldoende hydrolyse van een als ester in de schillen aanwezig xantho-
phyll de oorzaak van het onverwachte verschijnsel was. Toen dan ook
de verzeeping op krachtige wijze herhaald werd, ging op een kleine
rest na alle kleurstof uit de petroleum-aetherlaag over in den alcohol.
Bij spectroscopisch onderzoek bleek deze kleine rest carotine te zijn,
het in den alcohol opgeloste pigment werd spectroscopisch geïdenti-
ficeerd met xanthophyll ß. Deze waarneming toonde op afdoende
wijze de absolute noodzakelijkheid aan om bij een carotinebepaling
het verzeepingsproces uit te voeren. Alleen afgaande op de 2-phasen-
proef zou hier immers, naast de geringe hoeveelheid in den alcohol
overgaand xanthophyll ß, zijn gevonden een groote hoeveelheid van
een in petroleum-aether oplosbaar Carotinoid. Bij spectroscopisch
onderzoek zou dit Carotinoid 4 tot 5 banden vertoond hebben, hetgeen
tot het besluit gevoerd zou hebben, dat in de sinaasappelschil een
nieuw Carotinoid was gevonden, verwant aan carotine. De verzeeping
echter doet zien, dat deze 4 tot 5 absorptiebanden behooren bij een
mengsel van 2 aanwezige Carotinoiden n.1. carotine met 2 tot 3 bij-
behoorende banden en een zich eveneens epiphasisch gedragenden
xanthophyllester met 2 daarbij behoorende banden. Wat hier voor-
kwam toont nu een sprekende overeenkomst met hetgeen Wilhelmina
van Deventer waamani. Haar nieuwe, op carotine gelijkende kleur-
stof, het carotinoide-A, verkrijgt zij zonder te verzeepen en ook hier
neemt zij in de petroleum-aetheroplossing 5 absorptiebanden waar.
Wij zijn dan ook, van oordeel, dat deze overeenkomst alleszins reden
geeft tot een herhaling van haar onderzoek onder de voorzorg van een
behoorlijke verzeeping, zonder dit laatste kan men het bestaan van
haar nieuwe Carotinoiden vooralsnog niet als bewezen aannemen.

Tegenover fijn verdeelde kool gedraagt carotine zicli capillair
actief, uit petrolenm-aether wordt het pigment geadsorbeerd door
Norit. (Quinn and Hartley). Zoowel Stephenson als Willimott
konden boter geheel ontkleuren door het aanwezige carotine aan
plantaardige kool te laten adsorbeeren. Laatstgenoemde onder-
zoeker meldt, dat het pigment ook door anorganische zouten wordt
geadsorbeerd; voor CaClgkonden wij dit herhaaldelijk bij het drogen van
een petroleum-aetheroplossing van carotine bevestigen, niet echter
voor NajS04 zooals Coward (2) mededeelt. Wanneer men een carotine-
oplossing filtreert over watervrij natriumsulfaat wordt het oppervlak

van dit zout hier en daar, vooral aan uitstekende deeltjes, sterk
gekleurd, neemt men echter voorzorgen tegen snel verdampen, dan
blijft die sterke kleuring ter plaatse achterwege. Laat men op sterk
gekleurde plaatsen een druppel petroleum-aether vallen, dan ziet
men onmiddellijke ontkleuring optreden. Het wil ons dan ook
voorkomen, dat men bij Na2S04 alleen met een verhoogde kleurstof-
afzetting te doen heeft tengevolge van plaatselijk iets gunstigere
verhouding voor de verdamping van het zeer vluchtige oplosmiddel,
daarentegen bij CaClg met een werkelijke, zij het ook niet sterke,
adsorptie.

Wat ten slotte de bereiding van chemisch zuiver carotine uit
planten betreft kunnen wij hier verwijzen naar de uitvoerige mede-
deeling van Euler, Karrer, Rydbom; Scherz (s); Javillier
en Emerique (2), en naar het hiervoor vermelde over de scheiding der
carotine-isomeren.

verspreiding en physiologische beteekenis
van carotine in het plantenrijk; voorkomen
en oorsprong van het pigment bij het dier.

Reeds de oudere onderzoekingen uit den tijd toen men nog niet tot
herkenning en strenge scheiding van Carotine en xanthophyll was
gekomen, geven ons inzicht in de groote verspreiding van de groep der
gele plastiden pigmenten in het plantenrijk; zoowel de uitgebreide
studiën van Sorby als die van Kraus leggen daarvoor getuigenis af.
Borodin trof zijn roode kristallen in alle door hem onderzochte
Chlorophyll houdende planten aan. Arnaud (3) vond in de sterkst
groen gekleurde bladeren de grootste hoeveelheden van zijn rood,
kristalliseerend pigment en kwam tot de uitspraak: „la Carotine est
un produit constant et normal de la vie végétale, on la rencontre
toujours et sans exception dans les feuilles des plantes en plein végé-
tationquot;, het gehalte in de plant vond hij wisselend met den leeftijd
van het gewas. Tegelijk met de inzichten over hun groote verspreiding,
kwamen de onderzoekers langzamerhand terug van de groote ver-
scheidenheid, die men aanvankelijk voor de roode en gele plastiden-
pigmenten had gemeend te moeten aannemen. Arnaud en Tine
Tammes, die alleen Carotine onderscheiden gaan daarentegen in die ver-
eenvoudiging weer te ver. Haar „Carotinequot; kon Tine Tammes langs
microchemischen weg in een groot aantal groene, gevlekte, gele en
ook geëtioleerde bladeren aantoonen, daarnaast ook in bloeiwijzen,
vruchten, zaden en in algen. Zij trachtte deze algemeen verspreide
kleurstof door een 3-tal microchemische reacties met het Daucus-
carotine te identificeeren:

1°. door kleurreacties b.v. met H2SO4, HNO3, Broomwater etc.
2°. door de reactie van Molisch, waarbij de bladeren eenige dagen
verblijven in een oplossing van 20% KOH in alcohol van 40 vol. %;
de gele pigmenten komen dan in de bladeren zelf tot kristallisatie.
30. door de bladcellen met verdunde zuren te behandelen volgens
Frank, waarbij Carotine zou uitkristalliseeren.

Tswett heeft er op gewezen, dat de door Tammes onderzochte
kleurreacties geen van alle specifiek zijn voor Carotine, maar ook door
andere Carotinoiden worden gegeven.

De reactie van Molisch is evenmin specifiek voor Carotine. De in
de cellen gevormde kleurstofkristallen onderzocht hij volgens zijn
chromatographische adsorptieanalyse en kon zoodoende bewijzen,
dat zij een mengsel vormden van Carotine en xanthophyll.

Over de specificiteit van de reacte van Frank spreekt Tswett
zich slechts in zooverre uit, dat naar zijn opvatting nog moet blijken

Ook Tammes heeft door haar onderzoek dus alleen de groote ver-
spreiding bewezen van de groep in water onoplosbare gele plastiden-
pigmenten, waartoe ook carotine behoort, niet echter van carotine
zelf, noch de identiteit van het bladcarotine met het Daucus-carotine
en wij zouden dan ook niet op dit onderzoek zijn ingegaan als niet de
critiek van Tswett op dit werk geleverd voor ons van belang was,
omdat hij daarin de criteria naar voren brengt, waarop men tot de
aanwezigheid van carotine mag besluiten. Aan het slot van zijn be-
schouwingen komt Tswett tot de uitspraak: „Jedenfalls bedürfen
die auf den erwähnten mikrochemischen Methoden basierenden
Resultate Tammes und Kohl\'s betreffende die „Verbreitung des
Carotinsquot; im Pflanzenreiche einer vollständigen Revision, wobei
man hauptsächlich die makrochemischen Methoden benutzen wirdquot;.

Over deze macrochemische methoden zegt hij nu het volgende.
De kristallijne afscheiding van carotine vordert zeer veel materiaal
en is bovendien door het gemakkelijk oxydeeren van het pigment
moeilijk; men zal er zich dus mede te vreden moeten stellen, de kleur-
stof aan de hand van eenige karakteristieke eigenschappen te identifi-
ceeren. Hiertoe zijn nu voornamelijk 3 eigenschappen bruikbaar n.1.:

phasenproef).
2°. het typische absorptiespectrum.
3°- een bijzonder gedrag bij adsorptie.

Naar een bekenden regel, volgens welken organische verbindingen
het best oplosbaar zijn in oplosmiddelen van ongeveer gelijke samen-
stelling, is carotine in de koolwaterstoffen der aliphatische of cyclische
reeksen veel beter oplosbaar dan in de alcoholen. Schudt men dus een
carotineoplossing in 80—90% alcohol met petroleum-aether uit dan
gaat de kleurstof volkomen in de koolwaterstof over. Een kleurstof,
die in dit tweephasig systeem in de onderste laag blijft of daarin over-
gaat is GEEN carotine.

Hierover spraken wij reeds uitvoerig in het 2e Hoofdstuk en dus
kan daarheen verwezen worden.

Volgens de onderzoekingen van Tswett is van de kleurstoffen
der groene en vergeelde bladeren carotine de eenige, die uit een alcohol-
vrije petroleum-aether oplossing door Saccharose, Inuline of Calcium
carbonaat niet wordt geadsorbeerd. Met zijn chromatographische
adsorptie vindt hij, dat xanthophyll wel door Calcium carbonaat wordt
geadsorbeerd, de daarbij blijkende ongelijkmatige verdeeling van dit
Carotinoid over de krijtkolom geeft hem aanleiding verschillende
modificaties van xanthophyll te onderscheiden.

De critiek van Scherz (®) op deze adsorptiemethode van Tswett,
waarin hij zegt, dat het onjuist is, dat xanthophyll selectief wordt
geadsorbeerd en carotine wordt doorgelaten, maar dat beide Caroti-
noiden slechts met verschillende snelheden door de Calcium carbonaat
kolom trekken, heb ik gemeend te kunnen bevestigen. In een des-
betreffende proef vormde aanvankelijk zoowel carotine als een mede
aanwezige ester van xanthophyll ß een ring, eerstgenoemde Carotinoid
beneden in de kolom, het laatste meer bovenin; naarmate echter
meer van hun petroleum-aetheroplossing door de kolom sijpelde,
verplaatsten de ringen zich steeds verder naar beneden, waardoor
spoedig het carotine doorliep, doch vervolgens ook de xanthophyll-
ester. Verzeeping van den ester maakte hierin geen verschil. Het eerst
doorgeloopen carotine was echter xanthophyllvrij. Op ^ond hiervan
ben ik het geheel eens met Scherz, die meent, dat bij het carotine
onderzoek een adsorptieproef volgens Tswett gemist kan worden
en dat zijn beide eerstgenoemde methoden toereikend zijn ter afschei-
ding en identificatie van het pigment. Bij onze later te beschrijven
experimenten is ten deze dan ook alleen van de ontmengingsproef,
na verzeeping, en van het spectroscopisch onderzoek gebruik
gemaakt.

Op de oudere onderzoekingen, die de groote verspreiding van caro-
tine in het plantenrijk hebben bewezen, nadat men dit pigment had
leeren afscheiden van zijn verwanten, behoef ik hier niet verder in
te gaan, daarvoor kan verwezen worden naar Palmer die in zijn
boek: „Carotinoids and related pigmentsquot; over deze materie een tot
1922 volledig overzicht geeft. Nadien zijn er nog een aantal publicaties
verschenen, die de wijde verspreiding van dit pigment verder in het
licht stellen. Coward (i, toonde in geëtioleerde pas ontkiemde gerst
naast carotine ook xanthophyll aan. Petrie vond beide plantenkleur-
stoffen in de bladeren van Australische Acacia\'s. Vera Reader vond
in Sarcina aurantiaca carotine en lycopine en in gist carotine. Scherz
(«) trof carotine aan o.a. in Buxus sempervirens, Prunus cerasifera
en Acer palmatum. Euler, Demole, Karrer en Walker vonden
carotine in spinazie, beukenbladeren, gras, mais, goudsbloemen en
kropsalade en namen tevens sterke schommelingen waar in de ver-
houding carotine/xanthophyll. Willstätter en Page troffen in ver-
schillende algen meerdere Carotinoide kleurstoffen, waaronder ook
carotine aan. Elisabeth Goerrig vond carotine in verschillende
plantenbladeren, Scherz nam waar, dat het carotine- en xanthophyll-
gehalte van ^oene bladeren in de verschillende maanden van het jaar
aan belangrijke schommelingen onderhevig is; hetzelfde hadden Will-
stätter en Stoll voor Chlorophyll aangetoond, zooals men ook van
andere zijden herhaaldelijk gewag vindt gemaakt van een zekere
relatie tusschen de plantenpigmenten onderling. Of deze correlatie
tusschen groene en gele plantenpigmenten zich verder uitstrekt dan
hun physiologische functie en meer in het bijzonder ook hun chemischen
aard betreft, wordt wel vermoed, maar is tot dusver nog onbewezen.
Willstätter kon aantoonen, dat de alcohol phytol eenderverzeepings-
producten van het Chlorophyll is; Karrer en Helfenstein (^j

hebben er op gewezen, dat de Carotinoiden niet alleen kunnen ontstaan
door conjugatie van isopreenresten, maar ook door vereeniging van
gelijke helften b.v. 2 phytol of phytolaldehyde moleculen onder
dehydreering.

Scherz (\') bevestigde de reeds lang geleden door Ville {1889)
vastgestelden invloed der bemesting op de pigmentformatie; voor
carotine, in het bijzonder, vermelden zij beide en ook andere onder-
zoekers den invloed van het stikstofgehalte van den bodem, waarin
men mede een aanwijzing kan zien voor een genetischen samenhang
van het stikstofhoudende chlorophyll en het stikstofvrije carotine
en waarin men in zekeren zin een steun kan vinden voor de hooger-
vermelde opvatting van Karrer c.s.

Aangaande de physiologische beteekenis der Carotinoiden voor de
plant en in het bijzonder over de rol van carotine, is tot dusver niet
zoo heel veel met zekerheid bekend. Bezwaarlijk kon men zich voor-
stellen, dat een zoo algemeen verspreide groep van plantenpigmenten
en een zoo trouwe begeleider van het chlorophyll als carotine is ge-
bleken te zijn, niet ook zelf een beteekenende functie in het planten-
leven zou toekomen. Aan hypothesen omtrent de beteekenis die het
carotine heeft voor de plant heeft het niet ontbroken; verschillende
opvattingen kunnen daarvoor getuigenis afleggen. Sorby (lt;) heeft
zich het eerst in deze richting uitgesproken (1873); hij meende, dat de
vorming van plantenkleurstoffen een directe functie van het licht was.
Hij merkte op, dat in zijn oplossingen de pigmenten door het licht
snel, maar in verschillende mate werden ontleed en wees op de merk-
waardige tegenstelling met den weerstand tegen ontleding, die zij in
vivo vertoonden. Hij stelde zich nu voor, dat deze weerstand slechts
schijnbaar was doordat elke kleurstof in de plant in een dynamisch
evenwicht verkeerde, dat beheerscht werd door vorming eenerzijds,
en gelijktijdige, aan de lichtintensiteit evenredige, afbraak anderzijds,
het maximum zou voor de verschillende kleurstof-componenten af-
hankelijk van de intensiteit van het licht, waardoor zij getroffen
werden, op verschillend niveau liggen. Volgens Sorby verkeert het
..endochroomquot;, waaronder hij de gezamenlijke kleurstoffen in de
plant verstaat, dus in een beweeglijk evenwicht, waardoor zij steeds
versch en krachtig blijven; een directe functioneele beteekenis schijnt
hij hieraan niet te hebben vastgeknoopt. Iets verder gaat Arnaud (*),
die ook getroffen door die tegenstelling in bestendigheid der planten-
pigmenten in en buiten de plant, daarvan in de volgende woorden een
verklaring geeft: „qu\'il est fort probable qu\'elle (la carotène) y (n.1.
m de plant) subit des alternations d\' oxidation et de rédnction de telle
Sorte que sa proportion demeure a peu prés invariable pour in espèce
de temps limitéquot;. Legde Arnaud wat de functioneele beteekenis
van carotine betreft den nadruk op zijn oxydatief vermogen, een
opvatting later ook door Willstätter en Mieg gesteund, Engel-
mann daarentegen zag in het absorptievermogen voor lichtenergie
uit het blauwe spectraalgebied een aanwijzing voor een assimilatorische
functie van carotine naast chlorophyll, sedert hij een 2e assimilatie
maximum bij licht uit het F-lijn gebied van hét spectrum voor groeité

planten had ontdekt. Ook Kohl (i) bracht dien 2en top der assimilatie-
curve in verband met de selectieve absorptie van Carotine en wees
op de door hem waargenomen afhankelijkheid der lichtabsorptie door
gele geëtioleerde bladeren van hun carotine-gehalte. Onder bepaalde
omstandigheden van zijn proefopstelling, zag hij zich genoodzaakt
aan dergelijke bladeren assimilatievermogen toe te kennen en dus aan
Carotine een assimilatorische functie. Kohl (2) wijst er ook op, dat
Timiriazeff (1889) de plantenpigmenten als overdragers der ont-
vangen lichtenergie, als sensibilisatoren dus, wil doen fungeeren en
stelt zich nu in aansluiting daarmede voor, dat evenals een hchtge-
voelige photographische plaat door verschillende kleurstoffen voor
afzonderlijke spectraalgebieden gevoelig gemaakt kan worden, ook de
verschillend gekleurde chloroplastenpigmenten licht van verschillende
golflengten kunnen absorbeeren en de opgenomen energie weer over-
dragen. Hij ontwikkelt nu de theorie, dat de plant niet aangepast
is aan de energierijke, maar zeer in intensiteit wisselende gele en groene
stralen van het directe zonlicht, maar wel aan de bij toenemende
laagdikte der atmospheer domineerende geelroode stralen, die door
chlorophyll kunnen worden geabsorbeerd en aan de blauwe door het
hemelgewelf gereflecteerde stralen, die door Carotine kunnen worden
opgenomen. Functioneel zou Carotine dus de photosynthetische assi-
milatie door chlorophyll aanvullen en beider vorming in de plant zijn
op te vatten als verschijnselen eener complementaire chromatische
adaptatie. Ook voor Kohl (2) is dit echter niet de eenige functie van
Carotine in de plant, hij erkent daarnaast ook de door Pringsheim
gestelde „Lichtschirm hypothesequot;, die aan Carotine de nevenfunctie
van enzymebescherming voor schadelijke lichtstralen (vooral X =
420 m.(x.) toekent. Inderdaad kon Went aantoonen, dat Carotine
in de plant gevormd wordt onder invloed van die stralen, die het zelf
vermag te absorbeeren.

De uitgebreide onderzoekingen van Noack over de beteekenis der
photochemische activiteit van chlorophyll voor het assimilatieproces,
verschaften tevens belangrijke gegevens over de functioneele betrek-
king tusschen genoemd pigment en Carotine. Beide pigmenten bleken
in photochemische wisselwerking te kunnen treden, in het licht doet
chlorophyll zeer snel het medeopgeloste Carotine en iets minder snel
het xanthophyll oxydatief verbleeken, omgekeerd oefenen beide pig-
menten daarbij op de groene bladkleurstof een beschermende werking
uit. Bewezen werd, dat deze protectieve invloed op het chlorophyll
niet in de eerste plaats aan een physische bescherming door filter-
werking der Carotinoiden was te danken, maar inderdaad aan photo-
chemische activiteit moest worden toegeschreven.

Biologisch spelen naast de photosynthesen ook de afbraakprocessen,
die onder invloed van lichtstralen van verschillende golflengten tot
stand komen een groote rol. Baur gaf in 1918 en 1929 zijn electro-
lytische theorie van de photolyse. De overeenkomst in de gevormde
producten bij photolyse en electrolyse is inderdaad wel zeer groot.
De Eder\'sche oplossing (i vol. 5% subhmaat met 2 vol. 4% ammonium
oxalaat) geeft b.v. bij electrolyse aan de kathode calomel en aan de

anode koolzuur juist als bij de photolyse onder invloed van een licht-
gevoelige stof b.v. eosine of chlorophyll.

De door Planck gegeven quantatheorie zegt, dat een stralend
lichaam de strahngsenergie niet continu, maar discontinu uitzendt;
ook de lichtabsorptie heeft discontinu plaats in bepaalde hoeveel-
heden, de zoog. Plancksche elementairquanta. Volgens Planck is
het energiequantum van het hcht evenredig met het trillingsgetal,
de grootte van dit quantum vindt men in ergs uitgedrukt als men
het trillingsgetal vermenigvuldigt met de Plancksche constante:

(6,57 x 10-27 erg/secunde.) De door Einstein afgeleide photo-
chemische aequivalentbetrekking wil, dat de opname van een licht-
quantum juist voldoende is om een lichtgevoelig molecule te dis-
socieeren en daaraan een éénmaal éénwaardige lading mede te deelen;
in het algemeen is het molecule niet in staat een 2e quantum te absor-
beeren alvorens het de gewonnen energie weer kwijt geraakt is. Het
licht brengt dus in het molecule een spanning te weeg, waarvan de
grootte afhangt van de grootte van het opgenomen lichtquantum
en dus evenredig is met het trillingsgetal van het ingestraalde licht.
De energie van het elementairquantum is dus: h x v. De door een
mol van een lichtgevoelige stof geabsorbeerde lichtenergie wordt
derhalve: N.h.v., in ergs, waarin N het Loschmidt\'sche getal,
h de constante van Planck en v het trillingsgetal van het ingestraalde
licht voorstelt. Deze hoeveelheid gewonnen energie is nu gelijk aan de
valentie lading F (= 96540 coulombs) maal het bij de dissociatie
opgetreden potentiaalverschil E. Nu is: F = N.e, waarin e de elec-
trische elementairlading in coulombs voorstelt. In Joules uitgedrukt
krijgt men dus:

Dergelijke moleculaire potentiaalverschillen kunnen nu een electro-
motorische kracht ontvouwen, die zelfs voor absorptie uit het zicht-
bare licht die van een loodaccumulator overtreft. Voor licht van de
hieronder volgende golflengte vindt men:

Hierdoor laat zich dus de krachtigere photoactinische werking
van het licht van kortere golflengte verklaren.

Volgens Baur heeft men in den lichttoestand van een photo-
trope stof dus niets anders te zien dan een electrische polarisatie van
het molecule. Het gedissocieerde electron werkt als kathode, terwijl
het overblijvende positief geladen rompmolecule als anode werkt.

Deze toestand van photochemische polarisatie van de lichtgevoelige
stof E drukt Baur uit door het volgende symbool:

Baur (i) zegt nu, dat de intredende chemische werking bestaat
in de vernietiging van de opgetreden lading en herkende daardoor de
photolysen als moleculaire electrolysen. Hij vermoedt, dat slechts een
deel van de E.M.K. bij den moleculairen photo-polarisator electro-
lytisch tot gebruik komt. Een deel van den lichtinhoud van het ge-
sensibiliseerde molecule gaat mogelijk in vs^armtebéweging over of
in straling (fluorescentie). Wil nu de beschikbare energie aanleiding
geven tot een photolytisch proces, dan moet een reeks van gunstige
voorwaarden samentreffen, die deels afhangen van de individueele
structuur van den ontvanger van de energie (acceptor), deels liggen in
bijzondere reactie-kinetische gedragingen der uit te electrolyseeren
stoffen. De door lichtabsorptie gewonnen energie behoudt de sensibi-
lator slechts kort om onder afgifte van stralende energie weer spoedig
tot zijn oorspronkelijken donkertoestand terug te keeren. In dezen
korten tijd, waarin het molecule verhoogde energie bezit, zal het met
den acceptor energie kunnen uitwisselen. Dit overdragen van energie
door den lichtontvanger op andere stoffen, die daarbij ontleed worden
noemde Baur nu: gesensibileerde (niet gesensibiliseerde) photolyse,
de sensibilator komt daarbij in tegenstelling met den acceptor, on-
veranderd uit het proces te voorschijn. Door deze afgifte en het weer
opnemen van negatieve ladingen is de gesensibileerde photolyse als
een oxydatie-reductie proces gekenmerkt. Volgens Neuweiler zouden
die systemen het gevoeligst zijn, waarbij de acceptor zijn absorptieband
op de linker zijde (naar het roode spectrumeinde) van den sensibilator
(ook wel actor genoemd) heeft. Voor iedere combinatie bestaat een
bepaalde lichtsterkte, waaronder een omzetting uitblijft; Baur (2)
noemt dit de drempelwaarde der lichtgevoeligheid van het systeem;
bovendien leert de ervaring, dat bij gesensibileerde photolysen vaak
kleine hoeveelheden van een depolarisator (acceptor) beter werken dan
groote, zóó zelfs, dat een concentratiewaarde bestaat, waarboven
de depolarisatie constant blijft.

Uit het door BXur gegeven symbool, dat de lichttoestand van een
sensibilator voorstelt blijkt aanschouwelijk, dat het gedissocieerde
(negatieve) electron door een reduceerbare stof gebonden kauworden
(kathodische depolarisatie) en door een oxydabele stof (anodische de-
polarisator) een ander (negatief) electron aan het positief geladen
rompmolecule kan afgegeven worden, waardoor de sensibilator dan
weer in zijn donker toestand is teruggekeerd.

Als voorbeeld voor een gesensibileerde photolyse kunnen wij nemen
de ontleding der hiervoor genoemde Eder\'sche oplossing door Eosine
in het licht, waarbij door kathodische depolarisatie sublimaat tot
calomel wordt gereduceerd en door anodische depolarisatie oxaalzuur
tot CO2 wordt geoxydeerd:

Böhl kon nu experimenteel bewijzen, dat het chlorophyll een sterk
photodynamisch werkzame plantenkleurstof is. Ook chlorophyll
wordt dus door absorptie van een lichtquantum electrisch gepolari-
seerd en kan krachtens het daardoor ontvangen arbeidsvermogen als
een moleculair Redoxsysteem worden opgevat. Hij was in staat ver-
schillende organische kleurstoffen als kathodische depolarisatoren
\' door het chlorophyll te doen ontleden. De kleurstoffen, die door het
chlorophyll gereduceerd worden onderscheidt hij in twee soorten n.1.
in die, wier photolytische reductieproducten zich met zuurstof niet
meer tot de oorspronkelijke kleurstof laten terug oxydeeren en in
degene, wier reductieproducten leucolichamen zijn, die met zuurstof
weer gemakkelijk de oorspronkelijke kleurstof terugvormen. Ook
Allisson toonde aan, dat chlorophyll gemakkelijk tot oxydatie-
reductie processen aanleiding kan geven. Bezien wij de waarneming
Van Noack in het licht van de hier vermelde theorie, dan wordt het
chlorophyll in de plant dus voor oxydatieve omzetting beschut door
carotine, dat daarbij de rol vervult van anodischen depolarisator en
dus zelf geoxydeerd wordt, of deze photolytische oxydatie hier rever-
sibel of irreversibel is blijft voorhands een open vraag. Maar niet alleen
als anodische — ook als kathodische polarisator kan het carotine fun-
geeren, zelfs, indien het licht primair er op inwerkt, als sensibilisator.
Neemt men hierbij in aanmerking, dat CO, zoowel als O2 als depolarisa-
toren (kathodische) dienst kunnen doen, dan zou men zich na al het
voorgaande kunnen voorstellen, dat de onder photodynamischen in-
vloed zich afspelende oxydatie-reductieprocessen der plantenkleurstof-
fen den sleutel vormen voor hunne physiologische functies. Op welke
wijze echter carotine aan het samenstel van mogelijke energieuit-
wisseling deelneemt kan nog niet worden overzien; de juiste functie
van dit pigment in de plant is nog onbekend. Een waarneming in deze
richting werd door Fodor en Schoenfeld gedaan. Zij vonden, dat
geoxydeerd carotine als Hj-acceptor dienst kan doen. Werd deze stof
in poedervorm samengewreven met een phosphaat buffermengsel,
dan kregen zij een suspensie, die na verder samenwrijven met een
erwtendehydrase-praeparaat spectraalbanden ging vertoonen, die er
op wezen, dat de dehydrase het geoxydeerde carotine in carotine had
veranderd. Zij meenen, dat vooral in coloidale oplossing zulke reacties
tot stand komen. Voegden zij aan dit mengsel bij een Ph6, formiaat
toe, dan werd meer CO2 vrij gemaakt dan zonder oxycarotine, bij
verminderde zuurstofabsorptie.

Geruimen tijd na de ontdekking der Carotinoide pigmenten bij de
planten en nadat men reeds belangrijke gegevens had verzameld
omtrent hun groote verspreiding in het plantenrijk en men zich zelfs
omtrent hun chemische samenstelling al had georiënteerd, werden ook
in de dierlijke weefsels pigmenten aangetroffen, die in velerlei opzichten
met de plantenkleurstoffen overeenkwamen.

Uit aan de lucht gedroogde corpora lutea van koeien verkregen
Piccolo en Lieben in 1865 door aether-extractie een pigment, dat zij
door langdurige verzeeping (8 uren) met kaliloog van de ongekleurde
begeleidstoffen konden bevrijden en daarop tot uitkristaUisatie

brengen. De glinsterende, roode, dichroitische kristalblaadjes waren
onoplosbaar in water, maar losten met een gele kleur op in benzine
en met een intensieve roode kleur in zwavelkoolstof. Zij namen het
verbleeken dezer kristallen aan de lucht waar en wel sneller in het licht
dan in het donker en beschreven hun blauwe kleurreactie met gecon-
centreerd H2SO4. Zij noemden deze kleurstof, die door hen als een
derivaat der bloedkleurstof werd beschouwd, „Luteo-Hämatoidinequot;
of „Hämoluteinequot;. Nagenoeg ter zelfder tijd kreeg ook Holm deze
kristallen in handen door extractie van versehe ovaria van koeien met
chloroform. Hij beschrijft hun kleur bij opvallend licht als „cantha-
riden grünquot; met een metaalreflex en bij doorvallend licht als rood.
Ook Holm bracht hen met de bloedkleurstof in verband en noemde
het pigment „Hämatoidinquot;.

Thudichum (1869) -stelde in het serum, vetweefsel, boter en ei-
dooier de aanwezigheid vast van een kleurstof, die geheel geleek op een
pigment, dat hij had aangetroffen bij planten in de zaden (mais),
vruchten, wortelen, bladeren en in een groot aantal bloemen. Dit
pigment, door hem „Luteinequot; genoemd, beschouwde hij wegens zijn
groote verspreiding als een normale, zoowel in het planten- als dieren-
rijk voorkomende kleurstof. Zij loste met een intensieve gele kleur
gemakkelijk op in alcohol, aether en chloroform, maar niet in water,
daarentegen wel in eiwithoudende media als bloedserum en den inhoud
van ovariaalcysten. Uit beide laatste media kon zij moeilijk weer ge-
extraheerd worden. De kristallen vormden rhombische plaatjes en
hun oplossing vertoonde 3 distincte absorptiebanden, wier plaats in
de verschillende oplosmiddelen een weinig afweek. De overige door
Thudichum vermelde eigenschappen komen overeen met die door de
vorige onderzoekers beschreven, hetgeen hem de overtuiging schonk,
dat Holm geen Hematoidine, maar Luteine in handen had gehad.
Tal van andere onderzoekers hebben na deze eerste waarnemingen
de aanwezigheid van Carotinoide pigmenten in de meest uiteenloopende
species van gewervelde en ongewervelde dieren kunnen aantoonen,
zoodat men wel zeggen mag, dat vertegenwoordigers dezer pigment-
groep welhaast in geen diersoort schijnen te ontbreken. Ofschoon
onder deze Carotinoiden het Carotine stellig een voorname plaats in-
neemt, geldt voor deze oudere onderzoekingen ook hier weer het be-
zwaar, dat dit pigment niet scherp van de overige was afgescheiden;
wel kan men dus als bewezen aannemen de algemeene verspreiding der
Carotinoiden als groep in het dierenrijk, maar het aandeel, dat de
afzonderlijke componenten, o.a. Carotine, daarin hadden stond niet
geheel vast. De nieuwere onderzoekmethoden konden ook thans
de ubiquiteit van het Carotine bewijzen. Vooral het werk van Palmer
en Ecklesnbsp;heeft hiertoe belangrijke bijdragen geleverd;

Palmer (1916) trof Carotine äan in het runderserum, voorts bij
geiten, paarden en ten slotte ook bij den mensch. Hymans van den
Bergh, Muller en Broekmeyer toonden Carotine aan in konijnen-
serum en in de lever, bijnieren en milt van honden, zoomede in groote
hoeveelheid in de bijnieren van cavia\'s. Evenals andere onderzoekers
vonden ook zij, in tegenstelling met Palmer c.s., Carotine in de levers

van varkens. Verne (1926) trof carotine aan in het integument van
crustaceeën, Schuette en Bott (1928) in den honing der bijen. Bij een
aardappelkever (Leptinotarsa decemlineata) vonden Palmer en
Knight in de lymphe niet minder dan 0,0136% carotine. Lwoff
stelde de aanwezigheid vast van een op carotine gelijkende stof bij
Copepoden. Van Eekelen, Wolff en Overhoff (1931) extraheerden
een aantal menschensera en verrichten vervolgens zeer nauwkeurige
spectrocolorimetrische carotine-bepalingen, per 10.— cc. serum
vonden zij gemiddeld ± 8 y van dit Carotinoid aanwezig.

Escher vergeleek in 1913 de door hem uit corpora lutea van koeien
geïsoleerde kristallen met Daucus-carotine en vond, behalve geringe
afwijkingen in het smeltpunt, volledige physische en chemische
overeenkomst tusschen beide stoffen. Volgens zijn ervaring was het
smeltpimt echter vrij gevoelig voor de wijze van verwarmen tijdens
de bepalingen, zoodat hij toch tot de identiteit van het planten- en
dierlijke carotine besloot, zooals thans algemeen is aangenomen.

Eigenaardig is het, dat Escher niet tevens op de plantaardige
afkomst van het dierlijke carotine heeft gewezen, ofschoon deze
samenhang door Thudichum in 1869 was aangeroerd en ook Poul-
ton (1) al in 1885 sterke aanwijzing had verkregen, dat de dieren hun
Carotinoide pigmenten aan hun plantaardig voedsel ontkenen, vooral
doordat hij in het versehe bloed van de op bladeren levende Sphinx
Ligustri twee duidelijke absorptiebanden waarnam, wier ligging
volgens zijn teekening, zeer spreekt voor de aanwezigheid van carotine.
Later in (1893) kon hij nader aantoonen, dat de kleur van zekere
Lepidoptera grootendeels afhangt van hun plantenvoedsel.

Een uitgebreid onderzoek naar den aard en de herkomst der pig-
menten bij runderen werd in 1914 door Palmer en Eckles
en in 1916 door Palmer (i) ingesteld. Allereerst stelden zij vast, dat
de natuurlijke boterkleurstoffen inderdaad Carotinoide pigmenten
Waren en wel grootendeels carotine, daarnaast echter ook xantho-
phyll. Zoo lang reeds de boter den mensch tot voedsel dient is bekend,
dat groen-voeder de kleurintensiteit der boter doet toenemen. Het
groen-voeder onderzochten zij nu op zijn kleurstof en vonden in
luzerne, klaver en gras, benevens in mais, zemelen, katoenzaad en
lijnzaad zoowel carotine als xanthophyll. Zij toonden verder experi-
menteel aan, dat het carotinoid-g:ehalte der melk daalde en rees
met het pigment-gehalte der voeding en ten slotte, dat het dierlijk
organisme bedoelde pigmenten niet kan opbouwen. Beide kleurstoffen
ontleent het dier dus aan zijn voeding. Hun waarneming beperkte zich
niet alleen tot de kleur van het botervet, maar ook voor het pigment
van het lichaamsvet, corpus luteum, huidsecretie-producten en serum
konden zij een zelfden oorsprong van het aanwezige carotine en xan-
tophyll vaststellen. Bij gelijke voeding vertoonde de opgenomen
hoeveelheid pigment (aantoonbare hoeveelheid?) verschillen, die van
het ras hunner proefdieren afhing. Eigenaardig was het zeker, dat alle
rassen zonder onderscheid onder normale omstandigheden gedurende
een korten tijd na het kalven zeer sterke pigmentatie van het melkvet
vertoonden, die,naar zij konden vaststellen,alleen op quantitatieve- niet

op qualitatieve verschillen berustte. Zij waren van oordeel, dat
aan dit opmerkelijke verschijnsel zeker een of andere physiologische
beteekenis ten grond lag. Ook in het melkvet van den mensch konden
zij een zelfde pigment-verhouding vaststellen als bij de dieren.

Het spreekt van zelf, dat toen eenmaal de plantaardige herkomst
der dierlijke Carotinoide pigmenten was uitgemaakt de vraag rees,
wat met deze pigmenten in het Hchaam geschiedde, of hun daar een
bijzondere functie moest worden toegeschreven en zoo ja, welke die
functie dan was.

Reeds spoedig was de tegenstelling opgevallen, dat onder de pig-
menten in de planten in het algemeen het xanthophyll overwoog
boven het carotine, maar dat deze verhouding in het dierlijke lichaam
juist andersom scheen te zijn. De gevoehgheid voor zuren, waarop
Willstätter en Mieg wezen, zou een aanduiding kunnen zijn, dat
dit pigment na ingestie door het maagsap werd vernietigd. Palmer
en Eckles vonden eenig verschil in het gedrag van xanthophyll
tegenover natuurlijk maagsap van de koe en tegenover pepsine-HCl.
Wel was de vernietiging in het laatste geval sterker, maar ook in het
eerste geval bleek een deel van dit pigment ontleed te worden.

Karrer en Helfenstein vonden bij schapen en koeien, dat
een deel van het met de voeding opgenomen xanthophyll met de
faeces wordt afgescheiden. Het smeltpunt van dit xanthophyll
bedroeg 190—191° C. en week dus beduidend af van dat van blad-
xanthophyll (174° C.), maar Karrer, Salomon en Wehrli wezen
er op, dat het smeltpunt van dit laatste Carotinoid eveneens belangrijk
verhoogd kan zijn. Naast xanthophyll kwam in de faeces ook een weinig
carotine voor, zoodat althans bij schapen en koeien een deel der Caro-
tinoiden den tractus intestinalis onveranderd passeert.

Palmer en Eckles (2) onderzochten het bloedserum van een pas
geboren kalf en vonden daarin geen Carotinoide pigmenten, terwijl
zij slechts geringe hoeveelheden daarvan aantroffen in het lichaams-
vet, niettegenstaande het serum van het moederdier rijk aan caro-
tinoid-pigment is. Zij vermoedden, dat het pigment slechts in zeer
geringe mate de placenta passeert en wijzen daarvoor op de analogie,
dat vetoplosbare kleurstoffen als Sudan III bij kleine dieren (ratten en
katten) evenmin de placenta schijnen te passeeren (Mendel en
Daniels).

Voor het xanthophyll, dat minder weerstand biedt aan de inwerking
van het digestieproces dan het carotine, bestaat volgens Palmer en
Eckles de mogelijkheid, dat het aan de ontleding ontsnapte deel,
dat in het runderlichaam wordt aangetroffen, daarin wordt opgenomen
door de gal of door vet, waarin dit piment oplost. Aldus zou xantho-
phyll dan via het poortadersysteem in de circulatie kunnen komen.
Voor carotine is dezen weg echter onwaarschijnlijk in de eerste plaats,
omdat dit pigment veel slechter in gal oplost en in de tweede plaats,
omdat bij de geringe hoeveelheden vet, die in het bloed voorkomen de
groote hoeveelheden van dit pigment, die in een zelfde volume bloed
worden gevonden, zich niet laten verbaren. Voor carotine willen
Palmer en Eckles dan ook een eenvoudige oplossing in het

serum aannemen. Versch bloedserum bleek evenwel niet in staat uit
een carotinehoudend residu van planten of bloedserum het carotine
op te nemen. Van den anderen kant kan men op de gewone wijze met
aether, petroleum-aether of zwavelkoolstof dit pigment niet uit het
seruni extraheeren en met aethyl- of methylalcohol kan dit slechts
geschieden als men na het neerslaan van het eiwit den alcohol verwarmt.
Evenmin kan uit gedroogd serum het pigment met genoemde oplos-
middelen geëxtraheerd worden vóórdat men het met alcohol heeft
behandeld. Men kan het serum zoo veel als men wil verdunnen met
water, maar daardoor het carotine niet zoodanig vrij maken, dat het
met aether, petroleum-aether enz. kan geëxtraheerd worden. Het
carotine bleek niet uit het serum verwijderd te worden door de glo-
buline neer te slaan, maar wel bij praecipitatie van de albumine.
Wordt de globuline uit het serum verwijderd en de overblijvende
albumine door verwarmen op 79° C. tot coagulatie gebracht, dan vindt
men in dit coagulum wel eenig carotine, maar het grootste gedeelte
blijft in het filtraat. Bij een serum, dat zeer rijk is aan carotine heeft
dit filtraat een goudgele kleur. Wordt het nu met ammonium sulfaat
verzadigd dan kan men nog een „caroto-albuminequot; fractie uitzouten,
het gevormde neerslag heeft een diep gele kleur en bevat slechts weinig
albumen. Dit chromoproteid is oplosbaar in water en geeft zijn caro-
tine niet af aan aether, petroleum-aether enz., alvorens met alcohol
te zijn ontleed.

Tot de vorming van deze caroto-albumine verbinding schijnen ook
cholesterine en een phosphorus bevattende stof (lecithine?) bij te
dragen.

Ook Chatton, Lwoff en Parat meenen, dat de albuminoide stof
uit de lichaamsvacuole van de infusorie Spirophrya zich vereenigt
met het bij de voeding opgenomen carotinoide pigment. Deze „caro-
tmalbuminesquot; kunnen bij decapoden verschillende kleuren aannemen,

In de vorming van een caroto-albumine complex ligt dus de trans-
port mogelijkheid voor dit pigment in een medium, waarin het zelf
met oplosbaar is.

BETEEKENIS VAN CAROTINE VOOR HET
DIERLIJK ORGANISME. PHYSIOLOGISCH VER-
BAND TUSSCHEN CAROTINE EN VITAMINE-A.

De grondleggende onderzoekingen van Eykman in 1896, die tot
het inzicht leidden, dat een zekere quaUtatieve insufficiëntie in de
voeding van mensch en dier tot diep grijpende stoornissen in hun
metabolische processen aanleiding kan geven, waren den stoot tot de
ontdekking van een veelzijdige functioneele beteekenis der voeding
voor het ongerept in standhouden van het organisme. De verschillende
physiologische functies, die men leerde onderscheiden, dacht men elk
gebonden aan een afzonderlijk chemisch substraat, dat de rol van een
accessorische voedingsstof vervulde. Het aantal dezer stoffen, dat men
genoodzaakt werd aan te nemen ter verklaring van nieuw ontdekte
eigenschappen der voeding, breidde zich steeds uit en vormde de
bouwsteenen voor de veelomvattende, maar in wezen nog weinig
opgehelderde leer der Vitaminen en Avitaminosen, zooals wij die
nu kennen.

Hopkins wees er in 1906 op, dat de dieren niet kunnen leven op
een dieet, bestaande uit een mengsel van eiwit, vet, koolhydraten en
de noodzakelijke anorganische componenten, het hchaam houdt ook
rekening met zekere „minor factorsquot; in het dieet.

Door Stepp (1909) werd opgemerkt, dat als uit het normale
voedsel met aether of icohol vetten of daarin oplosbare stoffen werden
geëxtraheerd, dit voedsel op den duur door muizen niet meer werd
verdragen en de dieren te gronde gingen. Hij kon niet uitmaken of
hierbij een der bekende lipoiden een rol speelde, lecithine was het
evenwel niet en Stepp dacht dan ook aan een andere onbekende stof,
daarbij de mogelijkheid open latend, dat kleine hoeveelheden vet voor
het normaal verloop der stofwissehng noodzakelijk zouden blijken te
zijn.

Hopkins (1912) nam waar, dat bij voedering van zijn ratten met
een dieet bestaande uit caseinogeen, zetmeel, rietsuiker, spek en an-
organische zouten de dieren in het leven bleven en nog een weinig
groeiden als hij de dieetbestanddeelen ongezuiverd te eten gaf, maar
dat de groei ophield en de dieren stierven zoodra hij alle componenten
nauwkeurig reinigde. Hij toonde tevens aan, dat de caloriewaarde van
dit voedsel voor de dieren voldoende was en dat dus niet in die richting
de oorzaak te vinden was voor het ontoereikende van dezen kost voor
de ratten. Voegde hij aan het basaaldieet melk toe tot een bedrag,
dat niet boven 4% van de totale voeding ging dan volgde goeden
groei. Door deze proeven vestigde Hopkins de aandacht op wat hij
noemde de accessorische factoren in het dieet.

Bij het bestudeeren van de voedingswaarde van verschillende
vetten vonden McCollum en Davis (i), dat een aether-extract van
boter of eidooier toegevoegd aan een synthetisch samengesteld dieet
stimuleerende werking op den groei van proefdieren bezat, in tegen-
stelling met andere vetten, zooals spek en olijfolie, die deze eigenschap
misten. Dit schonk hun de overtuiging, dat er in die vetten een essen-
tieele stof aanwezig moest zijn, die tot nu toe niet herkend was. Kort
daarop konden Osborne en Mendel (i) deze waarneming bevestigen
en vervolgens (la) aantoonen, dat ook in levertraan deze groeibevorde-
rende stof niet ontbrak. Zij gaven aan, dat deze nieuwe factor geen
lipoid was, oplosbaar was in alcohol en in staat een oogziekte te ge-
nezen, die McCollum en Simmonds later (1917} (2,3) als overeen-
komend met de ziekte door Bloch beschreven bij ondervoede Deensche
kinderen, als een op A-deficiency berustenden vorm van Xeroph-
thalmie herkenden.

Aan deze nieuw ontdekte physiologisch-actieve stof gaven Mc-
Collum en Kennedy den naam „fat-soluble Aquot;; Drummond (2)
stelde voor al de verschillende onbekende essentieele componenten
uit de voeding met een geringe afwijking van den door Funk in 1912
bedachten naam, aan te duiden met: „Vitaminquot; en hen ter nadere
onderlinge onderscheiding aan te geven met de letters: A, B etc. In
ons land houden wij ons aan den ouden naam van Funk, wij spreken
van Vitamine A, B, C etc.

Uit een groot aantal onderzoekingen der eerstvolgende jaren bleek,
dat de meest verschillende dierlijke weefsels Vitamine-A bevatten,
(OsBORNE en Mendel (^a, maar ook planten bleken de aan deze
hypothetische stof toegekende physiologische functie niet te missen.
McCollum en Davis McCollum en Simmonds (i), benevens
McCollum, Simmonds en Pitz (i, *) herkenden deze werking
bij eenige cerealia, boonen, plantenbladeren en in mindere mate in
zaden; Osborne en Mendel (s, 8) bij soyaboonen, spinazie,
klaver, luzerne en gras, McCollum, Simmonds en Parsons «) bij
spliterwten en aardappelen; Sugiura en Benedict (i, 2) bij bananen.

Hoe belangrijk deze eerste gegevens ook waren, zij hadden de
Waarde van de nieuwe ontdekking nog niet in het juiste licht kunnen
stellen, omdat geen voldoende onderscheid was gemaakt tusschen de
werking van vet- en wateroplosbaar vitamine. Aan dit bezwaar
kwamen Osborne en Mendel («) tegemoet door beide factoren te
scheiden. Zij extraheerden de in een luchtstroom van 60° C. gedroogde
plantendeelen van luzerne, klaver en eenige grassoorten met aether
en verkregen hieruit een groen olieachtig residu, dat voor spinazie
3—4%. voor jonge luzerne 3%, groen gras 4,1% en tomaten 2,8%
bedroeg van de oorspronkelijke hoeveelheid. Dit residu gevoederd
m hoeveelheden per dag, die overeenkwamen met i—2 gr. droge
plant, gaf bij ratten, die op een A-deficient dieet tot gewichtsafname
waren gebracht, hernieuwing van den groei. De beteekenende rol,
die aan de planten voor de vitamine-A voorziening moest worden
toegekend, bleek hun uit het feit, dat reeds 42 mgr. van een aether-

terwijl de ratten volgens hun berekening per dag 150—200 mgr.
boter als Vitamine-A bron noodig hebben. (Osborne, Mendel en
Wakeman (®)).

Behalve enkele eigenschappen, die men had leeren kennen b.v.
de oplosbaarheid in aether, benzine en alcohol en een zekere mate van
thermostabiliteit, waar men het overigens aanvankelijk niet geheel
eens over was, wist men van den vetoplosbaren factor niet veel; van
het wezen der actieve stof was niets bekend. Een onderzoek in deze
richting door Drummond (i) ondernomen had hem geleerd, dat „fat-
soluble Aquot; niet met eenigen component der vetten hetzij glycerine,
verzadigde- of onverzadigde vetzuren, cholesterine of phosphatiden
was te identificeeren. Drummond betrok echter ook nog andere
stoffen in dit onderzoek en van belang is zijn mededeeling: „unsuccess-
ful attempts were made to replace the fat-soluble accessory factor

Ongetwijfeld is Drummond de eerste geweest, die het planten-
pigment carotine, na isolatie, in het vitamine onderzoek heeft betrok-
ken uitgaande van de meening, dat het dier den accessorischen factor
misschien aan een plantaardige bron zou kunnen ontleenen. Het
onzuivere carotineproduct tot een hoeveelheid van 0,003% van de
geheele hoeveelheid voedsel als eenige vitamine-A bron aan het dieet
van zijn ratten toegevoegd vertoonde sporen van physiologische
werking in tegenstelling met een gezuiverd praeparaat, dat tot een
zelfde concentratie aan de voeding toegevoegd niet de minste werking
verried.

Eenige maanden later berichtte Steenbock, in 1917 moeilijkheden
te hebben ondervonden bij het grootbrengen van zijn ratten, wier
hoofdvoedsel destijds bestond uit maismeel; de dieren gingen lijden aan
xerophthalmie, voedden hun jongen niet op en stierven ten slotte.
Uit een onderzoek ingesteld naar het voorkomen van vitamine-A
in wortelen was hem gebleken, dat de sterk gekleurde exemplaren
rijk aan dit essentieele voedselbestanddeel waren, de ongekleurde
soorten, zooals suikerbieten en mangels daarentegen weinig of niets
van dezen factor bezaten. Steenbock herinnerde zich nu, dat tijdens
de periode, waarin de moeilijkheden met zijn ratten waren voorge-
komen, ter plaatse geen gezond geel maismeel te verkrijgen was en
dat hij genoodzaakt was geweest wit maismeel te voederen. Experi-
menten met een 8-tal verschillende soorten maismeel uitgevoerd
leerden hem nu, dat in de witte mais geen vitamine-A werking was
aan te toonen, maar dat gele mais normalen groei en voortplanting
bij de rat toeliet. In het eerste geval stierven de jonge ratten ge-
middeld in 3 maanden onder voor vitamine-A t5^ische deficiency
verschijnselen. Deze gegevens bracht hij nu in verband met het onder-
zoek van Osborne en Mendel (2), die in 1915 door gefractioneerde
kristallisatie bij lage temperatuur uit boter een actieve geel gekleurde
fractie konden afscheiden en een inactieve kleurlooze en verder met
zijn eigen met Boutwell en Kent (i) in 1918 ondernomen onderzoek,
waarbij gebleken was, dat de sterkst gekleurde vette oliën ook de

krachtigste vitamine-A werking vertoonden. Op de 13e jaarvergadering
der American Soc. of Biol. Chemists in April 1919 hadden zij
(2) zich naar aanleiding van dit onderzoek al uitgesproken voor het
bestaan eener relatie tusschen geel plantenpigment en vitamine-A,
doch tevens dat beide stoffen niet identiek waren.

Steenbock stelde nu de werkhypothese op, dat het vetoplosbare
groeibevorderende vitamine een GEEL PLANTENPIGMENT IS
OF EEN NAUW VERWANTE STOF, voor welke opvatting hij mede
steun vond in het werk van Palmer en Eckles, dat leerde, dat de
dieren niet in staat zijn de gele pigmenten carotine en xanthophyll
zelf op te bouwen. Uit het feit, dat boter, bladeren en wortelen, die
goede vitamine-A werking vertoonen rijk zijn aan carotine neigt hij
tot het besluit, dat de actieve stof het pigment carotine wel zal zijn,
maar sluit toch niet geheel en al de oogen voor de afwijkingen, die hij
en zijn medewerkers reeds bij hun eerste proeven waarnamen tusschen
de kleurintensiteit van het onderzochte materiaal en de vitamine
Waarde. Een verklaring hiervoor meent hij aanvankelijk te vinden in
een door hem onder sommige omstandigheden bij carotine herkende
labiliteit, maar hij denkt toch ook aan de mogelijkheid van een
LEUCOVERBINDING als directe oorzaak der physiologische vita-
mine-werking.

Na zijn grondleggende gedachte aldus geformuleerd te hebben,
laat hij met zijn medewerkers een aantal onderzoekingen volgen, die
alle aan zijn hypothese steun verleenen. Met Boutwell vond hij
het samengaan van groeibevorderende werking met het pigment-
gehalte bevestigd bij gele en witte mais, terwijl zij bij roode mais
de zeer beteekenisvolle ervaring opdeden, dat de varieteit met geel
endosperm wel vitamine-A werking bezat, degene met wit endosperm
haar echter ontbeerde. Met Gross vond hij, dat salade en spinazie
benevens koolsoorten een vitamine-A werking vertoonden, die in
overeenstemming met zijn theorie, quantitatief parallel liep met het
gehalte aan geel pigment d.w.z. voor salade geringer was dan voor
spinazie en het minst was voor kool. Met Boutwell, Sell en Gross
nam hij waar, dat bij extractie van gele mais met warmen alcohol
m een Soxhlet apparaat, evenals bij extractie van gedroogd poeder
Van luzerne, de vitamine werking overging op het ingedampte extract.
Het alcohol residu van het extract dezer laatste planten bevrijdden zij
door verzeeping van het aanwezige chlorophyll en extraheerden daarop
ten tweeden male met aether. Het nu verkregen geel-roode residu gaf
gedurende 22 weken een uitstekenden groei bij de biologische ratten-
Proef, klaarblijkelijk kon vitamine-A deze ingrijpende bewerking
Weerstaan. Zij onderwierpen nu dit residu op de wijze, waarop men
carotine van xanthophyll placht te scheiden (met alcohol/petroleum-
aether mengsel) aan fractioneering in de hoop door deze scheiding
tot een actieven en een inactieven component te komen. Inderdaad
bleek het residu uit de carotine-houdende petroleum-aether fractie
buitengewoon goede vitamine werking te bezitten, de xanthophyll
fractie daarentegen weinig of geen. In overeenstemming met de
Waarneming van Osborne en Mendel (®),maar in tegenstelling met

McCollum, Simmonds and Pitz (i) hadden zij dus gevonden, dat de
stof, die voor de vitamine werking verantwoordehjk was, gemctkkehjk
uit de planten was te extraheeren en in het bijzonder door alcohol
en benzine slechts met een gering verlies der physiologische waarde
kon verkregen worden.

Niettegenstaande al deze bemoedigende ervaringen, bleef Steen-
bock voor het feit staan, dat de vitamine-A werking niet onvoor-
waardelijk parallel hep met het kleurstofgehalte der onderzochte
stof. In een nader onderzoek met Mariana Sell en Mary Buell
stelden zij vast (1921), dat een zeer vitaminerijke levertraan slechts
een geringe hoeveelheid pigment bevatte en bleek, dat in het algemeen
wel de hooggekleurde boter het rijkst was aan vitamine-A, maar dat
dit gehalte toch geenszins evenredig was aan de hoeveelheid geel
pigment daarin aanwezig. Ondanks zijn reeds vroeger geuit vermoeden,
maakte toch het feit, dat de chemie der Carotinoiden hiervoor geen
aanknoopingspunt gaf hem, evenals Drummond en Coward (i),
huiverig om zonder meer tot het bestaan van een werkzame leuco-
verbinding dezer kleurstoffen te besluiten. Anderzijds noodzaakten
de sprekende resultaten zijner verdere onderzoekingen hem als het ware
zijn twijfel omtrent de chemische en physiologische verwantschap
tusschen plantenpigment en vitamine-A te laten varen. Met Sell
en Boutwell stelde hij nog vast, dat verschillende soorten rijpe
groene erwten, die tevens veel geel pigment bevatten, rijkere vitamine-
werking vertoonden, dan minder pigment houdende soorten. Met
Mariana Sell vond hij, dat witte bataten en wortelen, wat hun
vitamine-werking betreft, een schril contrast gaven te zien met de
gekleurde varieteiten en dat de toppen van witte wortelen, die een
weinig door chlorophyll gekleurd waren en ook wat geel pigment
bevatten, grootere physiologische werking bezaten dan de ongekleurde
ondereinden, met slechts half zoo veel gele kleurstof. Ook groene
koolbladeren uit het „hartquot; der plant waren werkzamer dan de witte
bladeren daarnaast met slechts i/io deel aan kleurstof. Geen van al
deze onderzoekingen had evenwel opheldering kunnen brengen in
de waargenomen onevenredigheid tusschen pigmentgehalte en physio-
logische activiteit en men kan er zich slechts over verwonderen, dat
Steenbock in geen enkel ander onderzoek ooit op deze zeer belangrijke,
onopgehelderde divergentie is ingegaan; zijn schitterend aangevangen
werk heeft Steenbock aan anderen ter voltooiing over gelaten.

De critiek op de door Steenbock naar voren gebrachte hypothese
deed niet lang op zich wachten. Reeds een paar weken later bracht
Palmer (2) een aantal voorbeelden bijeen om te bewijzen, dat van
eenige verwantschap tusschen vitamine-A en het plantenpigment
Carotine geen sprake kon zijn. Hoewel deze critiek in vrijwel alle op-
zichten onjuist was, meenen wij haar toch te moeten vermelden, omdat
het gezag van Palmer aan die critiek geruimen tijd de hand boven
het hoofd heeft kunnen houden, tegenstanders heeft gesterkt en aldus
de opvattingen heeft beheerscht. Palmer verwijst allereerst naar het
reeds vermelde onderzoek van Drummond onder de vrij onbegrijpe-
lijke opmerking, dat Carotine in het rattenhchaam niet werd gevonden.

Voor zoover kon worden nagegaan heeft Drummond daar ook niet naar
gezocht, wat voor de hand ligt, want daar ging het toch niet om.
Drummond wilde onderzoeken of een dieet, waarbij als éénige mogelijke
vitamine-A bron aan zijn proefdieren carotine werd gegeven al dan niet
voor dezen factor kenmerkende deficiency symptomen bij de ratten
deed optreden en daar dit inderdaad het geval was, besloot Drummond
van zijn standpunt te recht uit deze proef, dat carotine geen vitamine-
A werking kon ontvouwen en deze accessorische factor dus ook geen
carotine kon zijn. Pas later is gebleken, wat evenwel aan Palmer
nog niet bekend kon zijn, dat het onderzoek van Drummond in
meerdere opzichten niet bewijzend was. Een drietal jaren later n.1.
wezen Steenbock en Nelson er op, dat de gebruikelijke biologische
rattenproeven ter onderzoek van de vitamine-A waarde van een stof
vóórdien op onjuiste wijze waren uitgevoerd. Deze overtuiging was
hen bijgebracht door een onderzoek ondernomen eenerzijds in aan-
sluiting met de nieuwe opvatting van McCollum, Simmonds, Shipley
en Park, dat de anti-xerophthalmische en anti-rachitische eigen-
schappen van levertraan inhaerent zouden zijn aan 2 verschillende
factoren, anderzijds met de waarneming van Hume en van Gold-
Blatt en Soames, dat bestraling met ultraviolet Hcht bij A-deficiente
dieren leidde tot groeivermeerdering. Zij konden de mededeeling van
laatstgenoemde onderzoekers bevestigen, maar zagen tevens, dat een
opgetreden xerophthalmie door bestraling niet werd genezen en
het laetale einde slechts werd verschoven. Gelijke waarneming deden
zij, als zij in plaats van de dieren zelf te bestralen aan hun basaal-
dieet levertraan toevoegden, waarin het vitamine-A door langdurig
doorleiden van heete lucht (Hopkins, 1920) was vernietigd. Het
bleek hun, dat de reserve aan vitamine-A in de rat langer duurt dan
die van den nieuwen factor (later vitamine-D) en dat in de eerste 5—6
Weken op een dieet, waarin beide factoren ontbreken de groei beperkt
Wordt door het D-gebrek; wordt hierin weer voorzien dan herstelt
zich de groei om voor goed op te houden als alle A-voorraad is uitgeput.
Hun onderzoek had dus steun gegeven aan de opvatting, dat lever-
traan 2 vitaminen bevat, waarvan het eene infectie van luchtwegen
en oogen voorkómt (Vit. A) en het andere anti-rachitische eigenschap-
pen bezit (Vit. D), terwijl beide voor den normalen groei noodig zijn.
Derhalve kan de groeiremming bij deficiencyproeven niet alleen door
A-gebrek, maar ook door D-gebrek optreden. Volgens Steenbock,
Nelson en Black kan men nu eigenlijk niet meer spreken van een
groeibevorderend vitamine en mag men van dit symptoom als index
van de werking van vitamine-A alleen dan gebruik maken, als vol-
doende zorg is gedragen om bij de proefdieren de behoefte aan anti-
rachitisch vitamine te dekken. Hieruit volgt, dat de wijze, waarop tot
dusver de vitamine-A werking was bepaald, de waarde van vele aldus
verkregen gegevens in twijfel deed trekken en vele proeven met in
acht neming van het vermelde herzien dienden te worden, waaronder
ook die van Drummond, omdat de door hem waargenomen groei-
remming bij toediening van carotine niet op A-, maar op D-deficiency
kon berusten. Hieraan kan nog worden toegevoegd, dat later is

gebleken, dat de wijze van dispergeeren van het pigment met het oog op
zijn groote oxydabiliteit, invloed heeft op de resultaten; wij zijn in dit
opzicht in het geheel niet ingelicht omtrent de door Drummond
gevolgde techniek. Bovendien blijkt uit zijn proeven zelfs niet eens
de juiste doseering van het pigment per dag en per rat. Bij dit onder-
zoek kunnen vele onnauwkeurigheden schuil gaan, zoodat de waarde
ervan vrijwel buiten het beoordeelingsvermogen valt.

Terugkomend op de critiek van Palmer zij vermeld, dat hij wijst op
zijn onderzoekingen met Kempster, waarbij bleek, dat het mogelijk is
een broedsel kuikens tot vollen wasdom en voortplanting te brengen
op een dieet vrij of ten naastenbij vrij van carotinoiden. Zij hadden
dit onderzoek ondernomen, omdat het ook hun was opgevallen, dat
het tegelijk voorkomen van vetoplosbaar vitamine en carotinoiden
in boter en in de bladeren van groene planten toch wel meer dan een
toevallige relatie kon zijn, hoewel zij eigenlijk toch niet geloofden,
dat de plantencarotinoiden eenige physiologische beteekenis als
A-factor voor het dierlijke hchaam zouden bezitten. Zij onderwierpen
hoenderen aan een dieet, dat „zoo veel mogelijkquot; vrij was van caro-
tinoiden, geheel vrij van carotine was het echter geenszins, maar
Palmer vindt dit geen bezwaar, want de kuikens maken van dit
carotinoid toch geen gebruik. Een laag carotine-gehalte zal dan ook
geen invloed hebben op de interpretatie der resultaten in geval zij
slagen om de kuikens op dit „carotinoidvrijquot; dieet op te voeden. Het
is later overtuigend gebleken en door Rydbom bewezen, dat vogels
wel degelijk, juist als andere dieren, carotine als vitamine-A bron
gebruiken en dat xanthophyll bij hen zonder physiologisch effect is,
terwijl Capper, Mc Kibbin en Prentice voor kuikens aantoonden,
dat deze dieren carotine als vitamine-A bron benutten. Karrer,
H. v. Euler en Rydbom zagen bij kuikens goede physiologische
werking van carotine; xanthophyll was volkomen onwerkzaam.

Op dit hoogst twijfelachtige dieet zijn zij nu hun onderzoek be-
gonnen bij een groep kuikens, die snel stierven. De proef werd toen her-
haald met een groep van 75 dieren. De eerste weken volgde goede
groei, allengs zagen zij echter de gele kleur van bek en pooten afnemen
totdat alleen de zwak rose kleur van het onderliggende bloedrijke
weefsel overbleef, binnen weinige weken stierf nu de helft. Om het vol-
komen verwarde en nietszeggende van dit onderzoek duidelijk te doen
uitkomen, komt mij een woordelijke aanhaling het meest geschikt
voor, zij sluit onmiddellijk op het voorgaande aan. „It was feit, ho-
wever, that the nutritional disturbances encountered in the previous
experiment were probably due largely to the failure of the rations
to supply the quantity of vitamine essential for normal growth and
well beingquot;. En even verder: „Whit regard to an adequate supply of
fat-soluble vitamines the ration used was juged to be somewhat defi-
cient, but not dangerously soquot;. Zij besloten nu daaraan tegemoet te
komen en laten volgen: „A careful examination of pork liver showed
no pigments to be present which were distinctly characteristic of
carotin or xanthophyll\'. Zij gingen nu varkenslever toevoegen aan het
dieet, omdat Osborne en Mendel (3) («) gedroogde lever een goede

bron hadden bevonden zoowel voor water- als vetoplosbare vitaminen.
Volgens den titel van dit onderzoek wilden zij nagaan: „Relation of
plant carotinoids to growth, fecundity and reproduction of fowlsquot;,
nauwelijks bemerken zij op een niet eens carotinoidvrij dieet de eerste
deficiency symptomen of zij gaan die weer opheffen door aan de
proefdieren vetoplosbaar vitamine te geven. Den stand van het vraag-
stuk op dat oogenblik in aanmerking genomen is mij den gang van dit
onderzoek verre van duidelijk. Zij komen tot besluit: „that fowls can
be raised from birth to maturity on rations devoid or containing
mere traces of carotinoids provided the ration contains an adequate
supply of growth-promoting vitaminesquot;. Het meest onbegrijpelijk
is wel, dat zij ten slotte nog meenen bewezen te hebben, dat men om
iets van het wezen van vitamine-A te leeren kennen, geen houvast
heeft aan een relatie met plantenpigment en zij zeggen: „that the asso-
ciation of carotinoids and fat-soluble vitamine in certain plant and
animal materials such as green leaves and butter-fat, is probably
fortuitousquot;. Dit onderzoek kan men zich moeilijk anders verklaren
dan door aan te nemen, dat Palmer en Kempster van de veronder-
stelling uitgingen, dat de groeibevorderende werking van vitamine-A
niet alléén zou afhangen, maar van vitamine-A -f carotinoid, nergens
drukken zij evenwel dezen gedachtengang uit en zelfs wanneer men
dit aanneemt is hun onderzoek niet bewijzend; het eenige wat zij
misschien met dit verwarde onderzoek hebben kunnen aantoonen is,
dat kippen bij merkbaar verminderde carotinoiden ingestie, maar bij
voldoende vitamine-A toevoer, kunnen blijven leven en zich voort-
planten. Dit onderzoek nu doet bij Palmer dienst bij zijn critiek op de
hypothese van Steenbock en hij voegt er dan nog aan toe, dat dus
gebleken is, dat of de vet-oplosbare factor en de gele plantenpigmenten
zijn physiologisch niet verwant of de behoeften aan vetoplosbaar
vitamine van vogels verschilt van die van zoogdieren. Dat ook dit
laatste niet juist is vermeldden wij reeds. Het onderzoek van Palmer
en Kempster raakt de hypothese van Steenbock zelfs niet en kan
haar dus zeker niet ontzenuwen.

Een ander bewijs voor de negatieve verwantschap tusschen caro-
tinoiden en vitamine-A ziet Palmer in het feit, dat verschillende
dieren als schapen, varkens, honden, katten, konijnen en cavia\'s vrij
van carotine in hun bloed zijn (Palmer) alsmede in hun vetweefsel
en zenuwen (Dolley en Guthrie). Ook het melkvet van deze zoog-
dieren is kleurloos. Hoe kunnen nu, vraagt Palmer, met succes
jongen groot gebracht worden op carotinevrije melk als men aanneemt,
dat vitamine-A een der gele plantenpigmenten is?

Op zich zelf was dit geen ongerechte vraag, die ten minste recht op
de kern van het vraagstuk afging, het moet echter zeer sterk betwijfeld
Worden, of Palmer zich dit laatste wel bewust was. Maar zelfs al laat
men toe, dat dit wel het geval is geweest, dan zou zijn vraag nog geen
juiste critiek op Steenbock inhouden, immers deze zegt ten slotte
duidelijk, dat het bedoelde vitamine of ZELF EEN GEEL PLANTEN-
PIGMENT IS OF EEN NAUW VERWANTE STOF, misschien ook
Wel een LEUCO-VERBINDING. Naar aanleiding van eigen ervaring

De laatste bedenking van Palmer was gericht tegen de gebleken
onevenredigheid in kleur en in physiologisch vermogen van zekere
plantenohën. Palmer en Eckles hadden gevonden, dat katoenzaad-
olie een diep goudgele kleur kan bezitten en dan rijk is aan carotinoide
pigmenten, volgens Steenbock\'s theorie, zegt Palmer, zou dus deze
olie een uitstekende vitamine-A bron moeten zijn, doch McCollum,
Simmonds en Pitz (i) vonden, dat zoowel gebleekte als ongebleekte
katoenzaadolie vrij van vitamine-A is. Ook dit laatste argument
bleek niet steekhoudend, want een nader en uitgebreid onderzoek van
Drummond en Coward (i) (1920) gaf aan, dat vele plantenohën in
tegenstelling met de gangbare meening wel degelijk vitamine werking
bezaten en dat inzonderheid katoenzaadohe daar niet van verstoken
was, maar men vond bovendien dat tijdens de bewerking der oliën
een ^oot deel van hun carotinoiden kan verdwijnen, dat ook niet-
carotinoide pigmenten als kleurgevende componenten aanwezig
kunnen zijn, maar dat ook de mogelijkheid bestaat, dat er andere
carotinoiden in voorkomen dan carotine, aan welk pigment Steenbock
in de eerste plaats in verband met vitamine-A werking dacht. Hieruit
blijkt dat de voorgeschiedenis van de plantenohën een groote rol
speelt bij het onderzoek op hun vitamine-A vermogen.

Van de bestrijding van de hypothese van Steenbock door Palmer
bhjft dus zoo goed als niets over. Nu wordt Steenbock ook wel door
andere onderzoekers bestreden, maar telkens weer wordt men door den
zelfden indruk getroffen, dat de gegevens, die zij vermelden meestal
eerder een bevestiging dan een verwerping van zijn opvatting inhouden.
De oorzaak voor deze schijnbare tegenstrijdigheid is hierin te zien, dat
men zich naar Palmer\'s voorbeeld en misschien onder diens invloed,
over het algemeen eenzijdig oriënteerde betreffende Steenbock\'s
theorie door alleen het oog te richten op dat deel, waarin hij zegt,
dat carotine en vitamine identiek zouden zijn, zonder op het wel
bewust door hem gemaakte voorbehoud, dat weUicht ook een leuco-
derivaat in het spel zou kunnen zijn, verder acht te slaan. Wellicht
ook door het feit, dat Steenbock c.s. er niet verder op zijn ingegaan,
is dit belangrijk deel van zijn hypothese geheel op den achtergrond
geraakt en pas jaren later door andere onderzoekers op nieuw naar
voren gebracht en in het centrum van een onverdeelde belangstelling
geplaatst.

Wanneer Rosenheim en Drummond b.v., verklaren, dat fat-
soluble A niet identiek is met carotine, noch met xanthophyll als
zoodanig, maar toch wel op de een of andere wijze met deze klasse
van pigmenten zal samenhangen, is dit geen bestrijding, maar eerder
een bevestiging. Zeer duidelijk komt dit ook uit bij het onderzoek van
Drummond en Coward (i). Zij bemerkten, dat de boter, die een op
stal staande koe leverde hchter was dan toen het dier buiten was en
gras at en konden nu een geringe, maar toch duidelijke verminderde
vitamine werking voor die lichtere boter vaststellen. Weer buiten
op gras-voedsel gebracht nam de kleur der böter ook weer toe en steeg
de vitamine waarde. Van den anderen kant vonden zij bij 2 monsters

boter afkomstig van dieren uit denzelfden stal, dat het lichtst gekleurde
3roduct minstens even groote zoo niet iets grootere vitamine-waarde
)ezat dan de donkere. Zij onderzochten ook een aantal dierlijke-
en plantaardige oliën en vetten met verschillend sterke pigmentatie
en vonden geen scherpe scheiding tusschen beide groepen. Vele
plantenoliën vertoonden merkbare vitamine werking al stond hun
werking in het geheel achter bij die der dierlijke producten; een samen-
gaan van vitamine werking met de pigmentatie namen zij niet waar.
Zij trokken hieruit de conclusie, dat de aanwezigheid van gele pig-
menten in animale vetten en vegetabile oliën noch een maat, noch zelfs
een betrouwbare aanwijzing is voor hun physiologische werking,
tenzij men het bestaan van een leucoverbinding van het planten-
pigment aanneemt en dit voor de waargenomen afwijking verantwoor-
delijk stelt. De chemie der carotinoiden geeft hiervoor echter geen
steun, vandaar dat het dikwijls samengaan van den groeifactor met
carotinoide plantenpigmenten als TOEVALLIG moet beschouwd
worden. In dit oordeel nu zijn zij op een dwaalspoor gebracht doordat
zij de dierlijke en plantaardige oliën dooreen in hun beschouwing
betrokken. Hadden zij tusschen beide groepen een scheiding aange-
bracht en ook niet verzuimd bij de dierlijke producten alleen op hun
kleur af te gaan, maar het werkelijke carotinegehalte bepaald, dan zou
hen zonder twijfel gebleken zijn, dat de onevenredigheid in kleur en
physiologische werking alleen voorkwam bij de dierlijke, niet bij de
plantaardige producten. WelUcht hadden dan ook de vrij negatieve
gegevens omtrent de chemie der carotinoiden niet een dergelijke over-
wegende invloed op hun oordeel gehad. In latere onderzoekingen
Waren zij toch weer gedwongen meer waarde aan het plantenpigment
toe te kennen; zij vonden (Coward en Drummond, 1921) voor droge
z^en, geëtioleerde plantenkiemen en chlorophyll vrije bladeren geen
vitamine-A werking, daarentegen bij groene bladeren en ook bij lagere
chlorophyll-houdende planten (algen) groote physiologische activiteit;
weer niet bij pigmentlooze zwammen. Het actieve principe in groene
bladeren vonden zij gebonden aan het onverzeepbare deel van het blad-
extract; zij moesten voorts de gegevens van Steenbock betreffende
het verschil in vitamine activiteit tusschen witte en gele mais toegeven.

In Marjory Stephenson vond Steenbock een bestrijdster, die
zooals later weer bleek grooten steun heeft gegeven aan het tweede
deel van zijn hypothese. Haar onderzoek gaat twee verschillende
richtingen uit, die beide, volgens haar opvatting, leidden tot een af-
wijzende houding in zake het verband carotine-vitamine-A. Beide
d^Ien van haar onderzoek zijn wetenschappelijk zeker niet gelijkwaar-
dig te stellen, zooals aangetoond zal worden. Een ruw wortelen extract
door haar onderzocht, bleek uitstekende vitamine werking te bezitten,
zij vergeleek dit extract met een gezuiverd, 4 maal uit chloroform
hergekristaUiseerd carotine-praeparaat met een smeltpunt van 172—
^73° C. (ongecorr.). Door een berekening maakt zij uit hoeveel van het
gezuiverde carotine aan het basaal-dieet harer proefdieren moet toe-
gevoegd worden om in beide proeven per dag een hoeveelheid pigment
te voederen, die overeenkwam met gelijke hoeveelheden versche

wortelen. Bij het kristallijne pigment bleek niets van eenige vitamine-
A werking, het verschil tusschen beide praeparaten was dus wel
opvallend. Wanneer men echter haar berekening nader beschouwt
dan is op de gelijkheid der carotine ingestie in beide proeven, waarin
het zwaartepunt der geheele proef is gelegen, gegronde aanmerking
te maken. In de eerste proef was het ruwe extract uit 250 gr. versehe
wortelen opgelost in 250 gr. palmolie. Om nu bij de tweede proef een
oplossing van ongeveer gelijk carotine gehalte te krijgen lost zij 4 mgr.
carotine op in 100 gr. van dezelfde olie. Zij komt tot dit bedrag van
4 mgr., omdat naast haar eigen onderzoek ook andere onderzoekers
ongeveer 4 mgr. carotine als opbrengst uit 100 gr. versehe wortelen
hadden gekregen. In deze berekening schuilt nu de enorme vergissing,
dat de hoeveelheid gezuiverd carotine, die men uit een plant verkrijgt
eenvoudig gelijk wordt gesteld aan de totale hoeveelheid carotine, die
in de plant aanwezig is zonder het buitengewoon groote verlies bij het
reinigingsproces in aanmerking te nemen. Bovendien gaat deze bereke-
ning gedeeltelijk nog van de geheel onjuiste premisse uit, dat wortelen
steeds een zelfde carotine-gehalte bezitten. Marjory Stephenson
deelt niet mede hoeveel van elk der door haar onderzochte praeparaten
zij per dag en per rat geeft, in ieder geval moet dit bij de 2e proef een
veel geringere dosis carotine geweest zijn dan bij het onderzoek van het
ruwe extract. Haar conclusie, dat carotine niet de stof is, die voor de
groeibevorderende eigenschappen van het ruwe petroleum-aether
extract der wortelen verantwoordelijk is, heeft zij noch bewezen, noch
waarschijnlijk gemaakt. Zij had een carotine bepaling in het ruwe
extract behooren te doen en naar die uitkomst haar experiment
moeten inrichten.

Haar 2e proef daarentegen ontmoet minder bedenking, maar be-
strijdt Steenbock niet. Zij stelt zich voor na verwijdering van het
pigment uit de boter, dit vet op zijn resteerende groeibevorderende
eigenschappen te onderzoeken. De boter wordt in petroleum-aether
opgelost en ontkleurd met plantaardige kool. Het volmaakt kleurloos
gemaakte vetresidu bleek nog uitstekende vitamine-A werking te
bezitten. De verwijdering of destructie van het aanwezige pigment
leidde dus niet tot verlies van de typische vitamine werking bij de
boter en deze waarneming beteekende steUig een vooruitgang in het
vitamine onderzoek. De ongecoordineerde opvattingen omtrent het
vitamine-A vraagstuk, gevolg van verwarrende experimenten en
heerschend vooroordeel, beletten deze gewichtige vondst toen ter tijd
op zijn juiste waarde te schatten.

In 1921 schenken Palmer en Cornelia Kennedy aandacht aan
het meergemelde 2e deel van Steenbock\'s hypothese, waarin hij
doelt op de bestaansmogelijkheid eener voor de vitamine werking
verantwoordelijke leucoverbinding van carotine. Zij noemen dit deel
van zijn theorie: „rather fanciful in the light of what is known of the
chemistry of the Carotinoidsquot;, immers, zeggen zij, de eenige leuco-
vormen, die van deze stoffen bekend zijn tot nu toe, zijn oxydatie-
producten, maar oxydatie doet niet alleen de carotinoiden verbleeken,
maar daarbij wordt ook de werkzaamheid van vetoplosbaar vitamine

vernietigd (Hopkins). Het bestaan van kleurlooze derivaten van
carotine, waaraan de vitamine-werking zou gebonden zijn, schakelen
zij dus uit. Wij zullen er maar van af zien de rest van hun onderzoek
aan te halen, het is vernietigend voor...... henzelf.

In de eerstvolgende jaren maakt het carotine-vitamine vraagstuk
weinig vorderingen, het blijft bij eenige verdere bevestigingen, dat
de dieren hun vitamine behoefte aanvullen uit het plantenrijk. Volgens
Drummond, Zilva en Coward (1922) is het vitamine-A in de levertraan
van visschen in eerste instantie ongetwijfeld afkomstig van de uni-
cellulaire marine planten, van wie Jameson, Drummond en Coward
bewezen hadden, dat zij een goede vitamine-bron waren. Coward
nam waar, dat de vitamine-A werking van bladextracten toeman
in den tijd, dat het bladgroen gaat verdwijnen en de bladeren geel
Worden, maar de werking verdwijnt weder bij het verdorren der bla-
deren. Euler, Demole, Weinhagen en Karrer vonden echter in
vergeelde kastanjebladeren wel xanthophyll, maar slechts sporen
carotine en dienovereenkomstig voor hun verzeepte aether-extract,
slechts zwakke vitamine-A werking. Javillier, Baude en Levy—
Lajeunesse (1924) vonden in het parallelhsme tusschen vitamine-A
Werking en het chlorophyll gehalte der planten aanleiding om te onder-
zoeken of wellicht een chlorophyll component n.1. het bij verzeeping
van dit pigment vrijkomende phytol eenige physiologische activiteit
toekwam. Zij vonden, dat dit niet het geval was voor gezuiverd phytol,
maar wel als dit product nog carotine bevatte.

De stand van het vitamine-A vraagstuk was nu in 1925 zóó,
dat men wel eenige relatie tusschen dezen accessorischen voedings-
factor en het plantenpigment carotine aannam, maar de aard van
deze verhouding was nog geheel buiten den gezichtskring blijven
liggen. Carotine was echter niet identiek met vitamine-A.

In het laatstgenoemde jaar brengen nu Drummond, Channon en
Coward een nieuwe theorie naar voren, die zoowel de werking van
carotine beloofde te verklaren als tevens de klove te overbruggen
tusschen kleurverschil en physiologische werkzaamheid van beide
actieve stoffen. Zij meenen op grond hunner experimenten aan het
carotine zelf een groeibevorderende werking als vitamine-A geheel
te moeten ontzeggen en verklaren de schijnbare physiologische
activiteit van de plantenkleurstof door aan te nemen, dat zelfs het
meest zorgvuldig gereinigde kristallijne pigment-praeparaat geconta-
mineerd blijft met sporen vitamine. In deze theorie vallen Dulière,
Horton en Drummond hen bij, daar zij na vele herkristallisaties
nit hexaan ten slotte een praeparaat verkregen met een smeltpunt
van 185° C., dat zelfs in de hooge dosis van 0.5 mgr. per rat en per dag
slechts zwakke groeibevorderende werking vertoonde. Zij namen
bovendien waar, dat naarmate de zuiverheid van hun carotine-
praeparaat toenam de physiologische werking enorm verminderde,
zoodat zij voor een geheel rein praeparaat volkomen inactiviteit
moesten aannemen.

Deze onderzoekingen konden voor een wijle de meening geheel
doen omslaan, vitamine-A en carotine moesten volkomen van elkaar

gescheiden worden; het pigment kon alleen als adsorbens dienen voor
het werkzame agens.

Intusschen had Takahashi in 1922, naar hij meende, uit lever-
traan het vitamine-A als een semi-kristaUijne stof geïsoleerd. Dit
praeparaat „Biosterinquot; of „Biosterolquot; genoemd, meenden Takahashi,
Nakamiya, Kawakami en Kitasato in 1925 te kunnen identificeeren
met een onverzadigden alcohol: C27H46O2; ofschoon men dit product
nog als een tamelijk onzuiver mengsel moet beschouwen, is het toch
een der krachtigst werkzame levertraan-concentraten, waarin ge-
noemde Japansche onderzoekers bij spectroscopisch onderzoek een
absorptieband in het ultraviolet bij 320—328 m.[z. vonden, die in een
carotineoplossing werd gemist. Morton en Heilbron (^j bevestigden
hun waarneming en toonden bovendien aan, dat bij vernietiging
van het vitamine-A in de levertraan, hetzij door volgens Hopkins
heete lucht door te leiden, hetzij door bestraling met ultraviolet
licht, dezen band verdwijnt. Ook Rydbom nam later in een levertraan
extract dezen absorptieband bij 320 m[j!.. waar, dien men als specifiek
voor vitamine-A hield, totdat Rosenheim en Webster (2) (1929) aan-
gaven, dat men dit spectraal verschijnsel toch niet onvoorwaardelijk
als kenmerkend voor vitamine-A mocht houden. Het dihydroderivaat
van ergosterine bleek een intensieven absorptieband te vertoonen op
dezelfde plaats als de vitamineband van Takahashi c.s., de selectieve
absorptie in het ultraviolet bij het vermelde maximum vormt op zich-
zelf dus nog geen bewijs voor de aanwezigheid van vitamine-A. Het
vrije Sterine, noch zijn acetaat bezaten in doses van o.ooi - i mgr.
per dag en per rat eenige groeibevorderende werking en ook de kleur-
reactie volgens Carr en Price was voor deze stoffen negatief. Dit
onderzoek bracht tevens een oplevende speculatie, dat een Sterine
eerder dan een Carotinoid aan vitamine-A zou verwant zijn, buiten de
aandachtsspheer. (Drummond, Rosenheim en Coward (1925);
Rosenheim(^) (1927); Euler, Euler en Rydbom (1928).

Nieuwe inzichten in de onderlinge relatie tusschen carotine en
vitamine-A brachten B. v. Euler, H. v. Euler en Hellström (1928).
Onder adaequate toegiften vitamine-D aan het ratten dieet, behoorlijke
zorgen voor een goede depletieperiode en een voldoende waarnemings-
duur vonden zij voor gezuiverd carotine in dagdoses van 0,010—0.005
mgr. goede groeibevorderende werking. Dit was van groot belang,
omdat bij dit onderzoek de nieuwere inzichten waren gevolgd omtrent
de noodige voorzorgen, die bij deze biologische proeven in acht geno-
men moesten worden. Zij losten hun carotine op in de niet ontledend
werkende arachisolie en houden bij de beoordeeling hunner proeven
niet meer vast aan de Ophthalmie, maar uitsluitend aan de gewichts-
vermeerdering der proefdieren. Zij wezen verder op een zeer belangrijk
chemisch verschil tusschen de plantenkleurstof en het dierlijke lever-
traan vitamine-A, de blauwe kleur, die beider oplossing met het
SbClg-reagens gaf bleek niet geheel gelijk te zijn. Het spectroscopisch
onderzoek wees uit, dat de absorptieband in de oplossing van carotine
met SbCls lag bij 590 mfi., terwijl deze band bij levertraan naar het
roode einde van het spectrum was verschoven. Deze bandverschuiving

was niet afhankelijk van den aard van het oplosmiddel van carotine,
wel namen zij waar, dat de blauwe kleur intensiever en bestendiger
werd als zij olie aan de carotineoplossing toevoegden en daarna de
SbClj-reactie uitvoerden. Vooral de intensiteits verschillen in het blauw
brachten hen tot de meening, dat niet carotine, maar een daarmede
verwante stof in de levertraan de voor vitamine-A als specifiek
geldende SbClg-reactie gaf. Deze stof zou per mgr. een hoogere blauw-
waarde geven. Als zij een oplossing van carotine in chloroform ge-
durende i minuut aan de werking van ultraviolette stralen blootstelden
waarbij volkomen verbleeking volgde, bleef de reactie van Carr en
price uit.

De vitamine-A werking van carotine kon met toepassing der nieuwe
biologische techniek van verschillende zijden bevestiging vinden.
Moore zag goede physiologische werking met o,oio mgr. later (s)
niet 0,004—0,002 mgr. kristallijn carotine per dag. Collison, Hume,
Smedley—maclean en Smith vonden met een gewijzigde minimum
methode in het biologisch onderzoek met giften van 0,002—0,005 mgr.
carotine uit kool, spinazie en wortelen bij ratten goede werking, die
niet afnam naarmate hun kristallen zuiverder waren. Javillier en
Emerique onderzochten een 40 jaar oud „carotinequot; praeparaat
al dien tijd bewaard in een waterstofatmospheer in een dichtgesmolten
buis; zij vonden een physiologische werking van dezelfde orde als de
vorige onderzoekers. H. v. Euler, Demole, Karrer en Walker over-
wogen, dat als de vitamine-A werking van planten uitsluitend op hun
carotinegehalte berust, men voor deze kleurstof uit de meest verschil-
lende planten geïsoleerd, een constante verhouding tusschen beide
stoffen moet kunnen aantoonen. Zij onderzochten nu het carotine in het
onverzeepbare deel der aetherextracten van een groot aantal planten
op zijn vitamine werking. Het carotine-gehalte stelden zij colori-
metrisch, de vitaminewerking biologisch op ratten vast. Inderdaad
Vonden zij nu, zelfs bij zeer uiteenloopend carotine-gehalte der onder-
zochte planten, dat de vitaminewerking hunner extracten volkomen
evenredig was met de daarin gevonden hoeveelheid carotine. Boven-
dien zagen zij, dat hier de therapeutische dosis voor de deficiente
ratten quantitatief geheel gelijk was aan die voor het zuiverste
carotine-praeparaat gevonden. Niets wees dus op het bestaan van een
2en voor de vitamine-werking verantwoordelijk te stellen factor.
Dit kwam geheel overeen met de waarneming, dat het carotine door
alle herkristallisaties heen onverzwakt zijn werking behield. De
moeilijkst oplosbare kristallen van carotine uit wortelen waren boven-
dien in juist dezelfde dosis actief als de later uit de moederloog als een
2e fractie gewonnen kristallen. Op deze wijze werd door hen onderzocht
Carotine uit: spinazie, beukenbladeren, grassoorten, brandnetels,
bloemen van de goudsbloem en mais. Het aan de lucht geoxydeerde
carotine en het reductieproduct: perhydro-carotine bleken beide
volkomen inactief. Op grond van dit onderzoek komen zij tot de uit-
spraak, dat EEN CAROTINE-BEPALING IN PLANTENMATERIAAL
OVER DE GROOTTE DER VITAMINEWERKING UITSLUITSEL
KAN GEVEN.

Ten slotte moest ook Drummond c.s. tot de erkenning komen,
dat het vitamine-A uit plantaardig voedsel waarschijnlijk carotine is
en dat vroegere mislukking van zijn proeven te wijten was aan het ge-
bruik van aethyl-oleaat als vehiculum, waardoor het carotine ge-
oxydeerd werd (Ahmad en Drummond; Drummond en Morton).
Ook hij vond thans, dat carotine in een dosis van 0,005 mgr. per dag
physiologisch werkzaam was (Drummond, Ahmad en Morton, 1930).

Zoo had men dus langzamerhand belangrijk feitenmateriaal kunnen
bijeenbrengen, dat in het kort samengevat tot het inzicht leidde,
dat vitamine-A en carotine wel is waar niet identiek, maar vermoedelijk
toch nauw verwante stoffen waren. Daarnaast waren echter ook eenige
typische onopgelost gebleven verschillen blijven bestaan.

Een kort overzicht van de gevonden overeenkomst en de bestaande
verschillen tusschen beide stoffen moge hier volgen:

[ Drummond(i) (1919).
] Drummond en Baker (1923).
( Steenbock, Jones en Hart (1923).
( McCollum en Davis(2) (1914).
I Steenbock, Sell en Buell (1921).
( Morton en Heilbron(2) (1930).
Steenbock, Boutwell, Sell en

Willimott, Moore en Wokes (1926).
Morton en Heilbron(i) (1928).
Zilva(I,2) (1919).

2®. hun vernietiging bij oxydatie:

levertraan vitamine-A: ^nbsp;Willimott (1927).

boter vitamine-A:
carotine:

levertraan vitamine-A:

boter vitamine-A:
carotine:

hun thermostabihteit:
levertraan vitamine-A:

boter vitamine-A:

planten vitamine-A:
(carotine)

Zilva(3) (1924). Southgate (1925).
Hopkins (1920).
Osborne en Mendel (2) (1915).
Steenbock en Boutwell (2) (1920).

Willimott en Wokes deelen mede (1927), dat de bestraling van
levertraan lang een nadeelige nawerking vertoont op het vitamine-A
gehalte. Het eenmaal in gang gezette proces der photoactinische
vernietiging kan in de levertraan in het donker nog maanden lang
doorgaan.

De physiologisch werkzame carotine-dosis hgt volgens de oudere
onderzoekers voor de rat tusschen 5—10 y per dag, de nieuwere
onderzoekingen, met beter gereinigde praeparaten ingesteld, geven
± 2—5 y aan (Wolff, Gapper); volgens mondehnge mededeeling
van Prof. Jansen zou carotine zelfs in een dosis van 0.5 y physiologisch
actief zijn.

Het verschil tusschen carotine en vitamine-A bestaat in:
1°. de selectieve absorptie:

(»)
{*)

Carotine in hexaan. (Dulière, Morton en Drummond.)
volgens Scheibe en Rosenberg.

(SOg (Cady en Luck.)
2®. een verschil in stabihteit tegenover: l verhitten in Na-atm. (Sher-

Carotine opgebouwd in de planten, ook in het
dierlijk organisme voorkomend: sterk geel
30. het voorkomen: I gekleurd.

40. de adsorptie: Carotine wordt door fijn verdeelde kool gemakke-
lijker geadsorbeerd dan Vitamine-A.

Vitamine-A oplosbaar in methylalcohol en in
90% aethylalcohol. (Wolff, Overhoff en van
50. de oplosbaarheid: lt;( Eekelen.)

Omtrent de correllatie tusschen vitamine-A en carotine waren
nu aan de hand van de verkregen gegevens de volgende hypothesen
mogelijk:

1°. de physiologische werking kan bij beide stoffen gebonden zijn aan
een buitengewoon actieve „verontreinigingquot;, die beide stoffen
in zulk een geringe concentratie hardnekkig aanhangt, dat
hun physische eigenschappen daardoor niet merkbaar worden
beïnvloed.

2°. Vitamine-A is geen gedefinieerd chemisch lichaam, maar vormt
een physiologisch begrip. Men zou dus niet kunnen spreken van
vitamine-A als ,,stofquot;, maar alleen van vitamine,,werkingquot;, die in-
haerent is aan een bepaalde configuratie, die in verschillende
moleculen kan voorkomen.
30. Carotine en vitamine-A zijn 2 verschillende stoffen, die zonder
samenhang toevallig dezelfde physiologische werking bezitten.
40. Carotine kan door het dierlijke organisme in vitamine-A worden
omgezet. Deze factor stelt dus een physiologisch-actieve vorm
van het carotine voor.

De reeds vermelde onderzoekingen van Drummond, Channon en
Coward en van Dulière, Morton en Drummond (1929) hebben de
contaminatie-theorie in het leven geroepen. Dulière, Morton en
Drummond hadden de waarneming van Euler, Euler en Hell-
ström kunnen bevestigen, dat de blauwe kleurreactie van carotine
met SbClg en van vitamine-A met dit reagens niet gelijk was. De Carotine-
kleurreactie was gekenmerkt door een absorptieband bij 590 m(jL.,
de vitamine-A reactie daarentegen door een band bij 608—612 m(x.,
terwijl levertraan vitamine-A zelf een band in het ultraviolet bij 320—
330 m(x. vertoonde, die carotine miste. Beide stoffen verschillen dus
zeker en zij achtten het nu mogelijk, dat ondanks de reiniging in het

Carotine werkzame hoeveelheden vitamine-A aanwezig konden blijven,
die door de zeer sterke absorptie van het pigment tusschen 230-^00
ni(x. aan spectroscopische bepaling zouden kunnen ontsnappen.

De contaminatie-theorie scheen gesteund te worden door de be-
vinding van v. Euler, Karrer en Rydbom {1929), dat verschillende
monsters carotine variaties vertoonden in hun physiologische werking.
Ook bij hen had dit de vraag doen rijzen of de werkzaamheid van de
plantenkleurstof niet gebonden zou kunnen zijn aan onzuiverheden
in een dergelijke geringe concentratie aanwezig als men dit ook kende
voor het vitamine-D. Er werd echter door Moore(®) (1930) op gewezen,
dat Euler c.s. hun opvatting slechts grondden op geringe groei vari-
aties bij hun proefdieren waargenomen en op kleine verschillen in de
sterkte van de blauwe kleur met het SbClg-reagens gevonden bij
meting met den Rosenheim-Schuster Tintometer. Bij de biologische
ratten-proef weet men nu echter voldoende, dat de weg voor experi-
menteerfouten zoo breed open ligt, dat aan geringe verschillen in
groei geen groote waarde gehecht mag worden en bij de bepalingen
door middel van de kleurreacties bestaat er een groote mate van subjec-
tiviteit en onzekerheid om de gevonden waarden in een absolute
maat uit te drukken. Op grond van deze bedenkingen acht Moore de
gegevens van dit laatste onderzoek van twijfelachtige beteekenis.
Toch mag hier niet geheel en al de leering verwaarloosd worden, die
uit de geschiedenis van het vitamine-D onderzoek is te trekken.
Immers dddr bleek, dat deze factor in de buitengewoon geringe dosis
van o.ooooi mgr. werkt en hardnekkig aan Cholesterine gebonden kan
voorkomen. Zou men b.v. voor vitamine-A een even sterke werking
aannemen, dan zou slechts een onzuiverheid van ongeveer 1% der
carotinekristallen voldoende zijn om een schijnbare physiologische
activiteit van de plantenkleurstof te verklaren. Op zichzelf is een der-
gelijke geringe onzuiverheid van het bij uitstek moeilijk te reinigen
Carotinoid zeer goed mogelijk, maar niet te verklaren is dan de af-
wezigheid van den absorptieband bij 328 mjx. in een oplossing van
zeer actief werkend carotine (Moore(3), welke band immers volgens
Morton en Heilbron(^) (1928) specifiek moet geacht worden voor
levertraan-vitamine. Wel is waar was hier, zooals wij zagen, door
Dulière, Morton en Drummond tegen aangevoerd, dat deze band
door de zeer sterke absorptie van carotine tusschen 230—600 mji.
overschaduwd zou kunnen worden, waardoor de contaminatie met
vitamine-A spectroscopisch verborgen bleef, maar zoowel Moore als
Capper konden deze bedenking door een tegenbewijs ontzenuwen.
Van een zoo krachtig mogelijk werkend levertraan-concentraat
loste Capper(^) in aether 0.005% en van carotine 0.006% op en bepaal-
de in beide oplossingen met een kwartsspectrograaf langs photo-
metrischen weg quantitatief de absorptie. Op de meest ondubbel-
zinnige wijze laten zijn curven nu het groote verschil zien tusschen de
zeer sterke absorptie bij 328 m^z voor de levertraan en de slechts
geringe verheffing der curve op die plaats voor carotine. Het door
Capper gebruikte carotinepraeparaat was door Moore verkregen
door 12 maal herkristalliseeren uit cyclohexaan en vertoonde een smelt-

punt van 178° C. (ongecorr.), het werkte actief in een dosis van ± 2 y
per dag, het levertraanpraeparaat werkte regelmatig in een dosis
van 0,01 mgr. = 10 y per dag en in één enkel geval bij een dosis van
0,0033 rngr. — 3,3 y per dag. Bij gelijke gewichtsdosis werkte van
beide praeparaten het carotine dus sterker dan de levertraan, derhalve
kan de biologische werking van de plantenkleurstof niet uit de mede
aanwezigheid van vitamine-A, zooals dit door den 328 mfi. band
wordt gekarakteriseerd, verklaard worden. Wel is waar hadden
Dulière, Morton en Drummond uit schapenlever door verzeeping
een praeparaat verkregen, dat in veel geringere dosis (0,001—0,0005
mgr.) actief was maar Moore (®) vond tevens, dat de kleur bij de Carr
en Price reactie gegeven door de minimum werkzame carotinedosis
lichter was dan die van de minimum werkzame dosis van een zeer
actief levertraan concentraat. Het verbergen van een werkzame
dosis levertraan-vitamine zou echter vooropstellen, dat de kleur-
waarde van de minimum carotine dosis veel grooter zou moeten zijn,
immers zij zou door summatie tot stand komen van de kleur, gegeven
door 2 chromogenen. Houdt men met deze laatste gegevens rekening
en tevens met de door Capper aangetoonde afwezigheid van den ab-
sorptieband bij 328 m[jL voor carotine, dan is een pigment activiteit
door contaminatie met levertraan-vitamine uit te sluiten. Toch heeft
Rosenheim op eenigzins andere gronden de contaminatietheorie
in den allerlaatsten tijd weer doen herleven, zooals wij straks nog zullen
vermelden.

Karrer, B. v. Euler en H. v. Euler (1928) dachten zich de vita-
mine-A werking eerder gebonden aan een bijzondere configuratie in
het molecule dan aan het geheele molecule en hadden daarbij het oog
gericht op de poly-een groepen der carotinoiden (zie Hoofdstuk II),
die zij in vivo een katalytisch vermogen toeschreven. Steun aan deze
theorie scheen het aantoonen van vitamine-A werking te geven bij een
kunstmatig reductieproduct van een polyeenverbinding, het a-dihy-
drocrocetine (B. v. Euler, H. V. Euler en Karrer) en de mededeeling
van Euler en Hellström, dat luteine een groeibevorderende werking
van zeer specifieken aard zou bezitten, verder de door H. v. Euler,
Karrer en Rydbom aangetoonde vitamine-A werking van dijod-
carotine en de mogelijk geachte vitamine werking van xanthophyll
(Euler, Demole, Karrer en Walker). Deze opvattingen bleken niet
zonder meer juist. Bij een aantal carotinoiden met poly-eenbouw
b.v. lycopine, capsanthine, bixine en a-crocetine werd ieder spoor van
vitamine werking gemist (v. Euler, v. Euler en Karrer), ook
luteine- en xanthophyll-distearaat waren inactief (Rydbom), terwijl
de onwerkzaamheid van xanthophyll door tal van onderzoekers werd
vermeld, van wie wij alleen willen noemen Willimott en Moore
(1927), die zelfs in een hoeveelheid van 3 mgr. per dag bij ratten geen
vitamine-A werking zagen en B. v. Euler, H. v. Euler en Karrer
(1929), die ten slotte ook aan het xanthophyll een physiologische
werking moesten ontzeggen, ook in het Laboratorium van Wolff

werd xanthophyll volkomen inactief gevonden. De werkzaamheid
van a-dihydrocrocetine kon door Drummond, Ahmad en Morton
(1930) niet worden bevestigd en naar beide Euler\'s zelf berichtten
naderhand niet meer worden gereproduceerd, evenmin als het aan
H. v. Euler, Karrer en Rydbom mogelijk was met zekerheid
activiteit voor genoemd carotinoid aan te toonen. Ook over eenige
groeibevorderende werking van luteine vindt men geen bevestiging
meer, Euler, Karrer en Rydbom vonden bij dagdoses van 0,03 gr.
slechts uitermate wisselende, niets zeggende groeiwerking. Wat de
werking van dijodcarotine betreft, is het niet moeilijk zich voor te
stellen, dat het geaddeerde jodium in het lichaam weer wordt afge-
splitst en dus een gift van dit carotinederivaat neerkomt op de ingestie
van een geringere dosis carotine (Moore, 1929) Dienovereenkomstig
bleek dit praeparaat dan ook pas in een grootere dagdosis (0,02 mgr.)
te werken dan carotine (Euler, Karrer en Rydbom, 1929). Ten slotte
heeft Euler onlangs (1931) in een vergadering van de Royal Society
te Londen medegedeeld, dat van alle carotinoiden alléén het carotine
groeibevorderende werking blijkt te bezitten.

Sedert 1928 vindt men bij verschillende schrijvers inderdaad de
neiging aanwezig om meer dan één physiologisch werkend agens aan
te nemen. Enkele op zichzelf niet zeer sterke aanwijzingen konden tot
die opvatting leiden. In de allereerste plaats het bekende kleurverschil
tusschen het zoo intensief gele plantenpigment en de veel minder
sterk gekleurde hoogactieve levertraanpraeparaten of het kleurloos
gemaakte boterpraeparaat van Stephenson. Verder de door Sher-
man, Quinn, Day en Miller waargenomen verschillen in stabiliteit
bij verhoogde temperatuur tusschen olijfolie-extracten van spinazie
en een oplossing van boter in olijfolie. Bij de spinazie-extracten werd
de werking door 4 uren verhitten op 97° C. in een stikstofatmospheer
voor 20% vernietigd, bij de boter onder dezelfde condities voor 33%.
Cady en Luck vonden, dat het levertraan-vitamine door blootstellen
aan SOg snel wordt vernietigd, maar het werkzame agens uit luzerne
en spinazie niet door SOg werd aangetast.

Tegen een volkomen onafhankelijkheid van carotine en levertraan-
vitamine pleitten de onderzoekingen van Drummond c.s. Gebleken
Was, dat marine diatomeën als b.v. Nitzschia closterium, die groote
hoeveelheden carotine bevatten, voor ratten een goede vitamine-A
bron waren, dit gold volgens Coward en Drummond evenzeer voor
hoogere vormen van marine algen, die een vitamine werking bezaten
van dezelfde orde als te land verschillende koolsoorten. Drummond,
zilva en Coward wezen er nu in dit verband op, dat de buitengewone
Vermeerdering van algen en wieren begint, zoodra in het voorjaar de
intensiteit en duur van het zonlicht toeneemt en op den voet wordt
gevolgd door een snelle toename van plankton, die dus tegelijk ver-
schijnt met de groote scholen jonge visschen. Deze jonge dieren be-
ginnen hun eerste levensstadium met een vitamine-voorraad ontleend
aan den eidooier en vullen dien voorraad verder aan door het eten

van allerlei copepoden, decapodenlarven en moUuscen, wier dieet
uit diatomeën bestaat. Roofvisschen als schelvisch en kabeljauw
leven weer van die kleine visschen, wier vitamine voorraad dus ont-
leend is aan de marine flora. Op deze wijze is het vitamine-gehalte
van de levertraan terug te brengen tot het carotine-gehalte der uni-
cellulaire marineplanten. Niet alleen voor landdieren, zooals wij vroeger
bespraken, maar ook voor de traan leverende zeedieren is dus een
verwantschap van carotine en vitamine-A aan te nemen.

Ten slotte werd van zelf de aandacht terug geleid tot het tweede
deel van de hypothese van Steenbock, waarin hij van een leuco-
derivaat van carotine gewaagt. Een dergelijke mogelijkheid stuitte
nu langzamerhand op minder tegenstand, omdat inmiddels Zech-
meister, von Cholnoky en Vrabély de vorming van minder gekleur-
de tot ongekleurde reductieproducten van carotine hadden leeren
kennen. Nadat v. Euler, v. Euler en Karrer (1929) er op hadden
gezinspeeld, dat voor de vitamine-A werking wellicht in het dierlijke
lichaam gevormde carotinederivaten verantwoordelijk waren te
stellen en Euler en Rydbom er op hadden kunnen wijzen, dat bij de
voedering van wortelextracten aan konijnen in hun lever een bleek
geel pigment verschijnt, dat geen carotine is, formuleerde Moore
dit aldus, dat men in carotine vermoedelijk een „precursorquot; had te
zien, in staat in vivo omgevormd te worden tot vitamine-A. Tot
staving van zijn opvatting verrichtte Moore nu eenige treffende
onderzoekingen. Allereerst ontzenuwt hij de meening van de beide
Euler\'s en Karrer, dat een surplus aan carotine in het ratten voedsel
als onveranderd carotine in hun levers wordt vastgelegd; hij bewijst,
dat in tegendeel bij excessieve carotine voedering dezer dieren het
gehalte aan dit pigment in de lever nauwelijks en in de lichaamsvetten
zelfs in het geheel niet toeneemt. Vervolgens stelt hij het hoogst
gewichtige feit vast, dat naarmate de carotine ingestie grooter wordt
ook de sterkte der SbClg-reactie der levervetten toeneemt bij geltjk-
blijvend carotine-gehalte. Het blauwe reactieproduct vertoonde een
sterke absorptieband bij 610—630 m[jL (levertraan-vitamine) en geen
waarneembaren band bij 590 m[x (carotine). Trapsgewijze kon hij ver-
volgen hoe bij even toereikende carotine voedering geen vitamine-A
voorraad in de rattenlevers werd gevormd en hun levervetten dus
met SbClj evenzeer een negatieve reactie vertoonden als bij de contróle-
dieren, die nog in het volkomen depletiestadium verkeerden, terwijl
bij grooten carotine toevoer, blijkens de optredende ongewoon sterke
kleurreactie, een aanzienlijk vitamine-A depot in de levers werd opge-
legd.

Nu was dus gebleken, dat niet alleen bij ingestie van kleurloos
levertraan-vitamine, maar ook van het sterk gekleurde carotine in
de lever een vitamine-depot wordt aangelegd, Moore had hiermede
een sterke aanwijzing bijgebracht, dat het verdwijnen van carotine
te verbinden is met de vorming van vitamine-A in het dierlijke lichaam.

uit tomaten en een ruw physalieen-praeparaat in groote dosis aan-
vankelijk duidelijke vitamine-A werking vertoonden, na herhaald
herkristalliseeren verloren deze stoffen echter hun groeibevorderend
vermogen. Carotine kan men echter hoe vaak het ook wordt her-
gekristalliseerd zijn werking niet ontnemen en zij waren dus van
meening, dat in het eerste geval de physiologische werking afhankelijk
was geweest van carotine bijmengingen. Ook zij denken zich vitamine-
A in het lichaam ontstaan uit carotine, maar wijzen daarnaast toch
op de mogelijkheid van een minder eng verband tusschen beide stoffen
b.v. dat het carotine de vitamine-A vorming in het lichaam slechts
in gang zou zetten.

Capper (2) en Capper, McKibbin en Prentice konden de gegevens
van Moore (2) bevestigen. Eerstgenoemde zag, dat de absorptieband
bij 325 m[i., die algemeen als specifiek voor vitamine-A wordt erkend,
afwezig was in het absorptiespectrum van de leverolie van A-defi-
ciente ratten, daarentegen wel aanwezig was bij contróle-dieren, die
door toediening van flinke giften carotine genezen waren. Daar de
325 m(jL band niet aanwezig is in het carotine-absorptiespectrum, moet
de stof, die voor het verschijnen van dezen band verantwoordelijk is
in de leverolie der met carotine behandelde ratten, in vivo synthetisch
gevormd zijn uit het carotine. Laatstgenoemde onderzoekers vonden
bij kuikens, dat zelfs bij toediening van groote giften carotine in de
lever het pigment-gehalte nauwelijks toenam. Het carotine werd dus
in de levers niet als zoodanig opgelegd, maar veranderd in vitamine-A,
blijkens het verschijnen van de blauwe kleurreactie met SbClg met
absorptieband bij 610—630 m;;. en de aanwezigheid van een absorptie-
band bij 325 m(jL, terwijl de contróle-dieren in het levervet een negatieve
SbClg reactie vertoonden en geen absorptieband bij 325 m[x.

Bij doorstroomen van de levers van katten in vivo met een colloi-
dale oplossing van carotine konden Ahmad en Drummond echter
géén vorming van vitamine-A aantoonen en slechts onbeduidende
hoeveelheden carotine in de lever en in het bloed. Het toegevoerde
carotine scheen op groote schaal vernietigd te worden. Ook bij orale
toediening van carotine bij gemelde dieren konden slechts sporen van
het pigment in de lever worden teruggevonden en vitamine-A vorming
in dit orgaan niet met zekerheid worden aangetoond. (Heilbron en
Morton met Ahmad en Drummond, 1931).

Het verschijnen van een actief ongekleurd of ten naastenbij on-
gekleurd agens in de levers van konijnen bij injectie of voedering ge-
durende 3 dagen van een zekere hoeveelheid carotine kon daarentegen
Wel door Wolff, Overhoff en van Eekelen worden aangetoond.
Zij beschrijven eerst hun methode om in de weefsels carotine naast
vitamine-A aan te toonen en bepalen nu daarmede bij geëxstirpeerde
stukjes uit de levers hunner proefdieren naast elkaar het carotine
en vitamine-A gehalte vóór en na het toedienen van het carotine.
Hun gegevens laten zich aldus samenvatten:

Blijkbaar is het vermogen om het plantenpigment in vitamine-A
om te zetten bij de proefdieren zeer wisselend, niettemin blijkt duidelijk
de sterke stijging der vitamine-A Eenheden na de carotinegiften.

Geruimen tijd heeft men in het onzekere verkeerd of in de planten
naast carotine ook nog vitamine-A voorkwam. Willimott en Wokes
ontkleurden de extracten van sinaasappelen, spinazie en wortelen
met norit en dampten daarna in tot op een kleine rest. Deze ontkleurde
geconcentreerde extracten bleken nog vitamine-A werking te bezitten
(1927), waaruit men tot het voorkomen van vitamine-A in planten
zou moeten besluiten. Wij zijn echter niet ingelicht of deze extracten
ook na het concentreeren volmaakt kleurloos waren gebleven en in
welke doses zij werden toegediend. Wolff, Overhoff en van Eekelen
kwamen in hun hierboven aangehaalde onderzoek tot het resultaat,
dat in planten géén (in ieder geval niet in aantoonbare hoeveelheden)
vitamine-A voorkomt.

Geheel in overeenstemming met de opvatting van de omzetting
van carotine in vitamine-A in het dierlijke hchaam is ook het waar-
nemingsfeit, dat alle ongekleurde of weinig gekleurde praeparaten
met sterke vitamine-A werking tot dusver steeds van dierlijke herkomst
zijn gebleken.

Voor het oogenblik moet als meest waarschijnlijke hypothese
wel worden aangenomen, dat de vitamine-A werking is gebonden
aan een in het dierlijke organisme gevormd weinig gekleurd carotine-
derivaat. In verband hiermede doen zich nu onmiddelijk 2 vragen
voor, die de Wetenschap nog te beantwoorden heeft:

lo. Welk carotine-derivaat is als vitamine-A te beschouwen?
20. Volgens welk chemisme verloopt de activiteit van dat derivaat

Reeds in hun eerste onderzoek geven v. Euler, v. Euler en
Hellström als hun inzicht te kennen, dat de vitamine-A werking
voor het bloedserum aangetoond, welhcht zou berusten op een oxy-
datie-reductie katalyse, ook Karrer dacht aan deze mogelijkheid.

Vermoed werd, dat het werkzame derivaat een partieel gereduceerd
carotineproduct was n.1. het dihydrocarotine. Aanvankelijk konden
geen bewijzen voor die opvatting worden bijgebracht. Van carotine
kende men alleen met zekerheid het verzadigde reductieproduct n.1.
het perhydrocarotine (C4oH7g), maar deze stof was physiologisch
volkomen inactief. J. H. C. Smith meende door reductie van carotine
met aluminium-amalgaam lagere reductieproducten verkregen te
hebben o.a. dihydrocarotine. Hij beriep zich daarvoor op de analyse
van het reactieproduct, maar de verhouding van C : H bij carotine
(C40H56) en dihydrocarotine (C^oHgg) verschilt zoo weinig, dat betwij-
feld kan worden of de fout bij de uitvoering der elementair-analyse
van zijn ingedampt reactieproduct niet grooter zal zijn dan
het te vinden verschil in H-waarde. Ook Karrer, Helfenstein,
Wehrli, Pieper en Morf (1931) meenen, dat Smith geen zuiver
dihydrocarotine in handen had. Dat overigens poly-eenbouw en re-
ductie op zichzelf reeds voldoende zouden zijn om van een inactief
carotinoid tot een actieven vorm te komen bleek aan B. v. Euler, H.
v. Euler en Karrer (1929) bij riader onderzoek niet juist. Lycopine
uit de als bijzonder goede vitamine-A bron bekende tomaten is vol-
komen onwerkzaam, ook het synthetische lycopinecarbonzuur had in
giften van 0,02 mgr. geen effect bij ratten, een gedeeltelijk gereduceerd
lycopinepraeparaat evenmin. Ook Wolff heeft de inactiviteit van
lycopine kunnen bevestigen. Op grond van het feit, dat lycopine en
carotine als isomeren dezelfde elementaire samenstelling bezitten
moet men dus wel aannemen, dat de vitamine-A werking aan consti-
tutioneele of configuratieve verschillen is gebonden.

De opvatting, dat de vitamine-A werking in wezen aan een oxy-
datie-reductieproces zou gebonden zijn, is een voorstelling, die zeer
zeker volle aandacht verdient, te meer waar carotine eenerzijds in
het bloedserum als een caroto-albumine verbinding zou voorkomen
(Palmer en Eckles) (®), anderzijds ook in het kleurlooze serum de
aanwezigheid van vitamine-A werd aangetoond (van Eekelen).
Noch Euler c.s., noch Karrer hebben echter nader aangegeven hoe
zij zich die oxydatie-reductie voorstellen of tusschen welke systemen
zij zich de plaats vindende energieuitwisseling denken.

Reeds vroeger vermeldden wij, dat carotine een phototrope stof
IS en in den gesensibiliseerden toestand tot photolytische processen
aanleiding moet kunnen geven, die wellicht een rol spelen in de levende
plant. Of het gesensibiliseerde carotine-molecule in het lichaam een
rol speelt als actor is niet te zeggen, dat echter de eigenlijke vitamine-A
Werking met een dergelijke energieoverdracht van het carotine-mole-
cule is te verbinden, lijkt ons niet waarschijnlijk. In de eerste plaats
verkeert carotine in het lichaam in het donker, maar zelfs al zou men
toelaten, dat in de huid lichtenergie werd opgenomen en hier het
carotine-molecule werd gesensibiliseerd, dan zou toch de vitamine
Werking hiervan niet afhankelijk kunnen zijn, omdat bij de gesen-
sibiliseerde photolysen het substraat, dat de lichtenergie heeft opge-
nomen, na de electronenuitwissehng in zijn chemische samenstelling
onveranderd blijft. Het verschil tusschen den photoactieven en den

donkertoestand bestaat alleen in een verandering van het energie-
niveau in het molecule door de plaats vindende depolarisatie, Carotine
blijft echter in het lichaam niet onveranderd, maar wordt verbruikt,
omgezet in het kleurlooze vitamine-A. Ook dit leucoderivaat wordt
nu op zijn beurt in het hchaam verbruikt, de physiologische werking
is dus evenmin gebonden aan een reversibel proces: Carotine/Leuco-
derivaat.

Het is o.i. niet zeer waarschijnlijk te achten, dat men in het dihy-
drocarotine het physiologische agens heeft te zien. Door het groot
aantal dubbelbindingen in conjugatiestelling, die in dit molecule zijn
overgebleven, zal zijn kleur niet zoo heel sterk afwijken van het on-
veranderde carotine. Anderzijds weet men, dat noch het volkomen
geoxydeerde, noch het perhydrocarotine physiologisch actief is,
ofschoon beide praeparaten kleurloos zijn. Sedert kort weet men ook,
dat bij gedeeltelijke reductie van het carotine-molecule aanvankelijk
de activiteit van het verkregen praeparaat toeneemt (Euler, 1931),
zoodat men zich gaat afvragen of de vitamine-A werking wel een eng
begrensd begrip is, dat men zich gebonden aan één bepaald substraat
moet voorstellen of dat men niet eerder heeft te denken aan een veel-
zijdig systeem van oxydatie-reductieprocessen. De bouw van het
carotine-molecule laat de mogelijkheid open voor het bestaan van
verschillende oxydatie- en reductietrappen, wier kleur met het ver-
dwijnen der geconjugeerde dubbelbindingen in intensiteit afneemt.
Van beide groepen van derivaten moeten verschillende nagenoeg
kleurlooze componenten bestaan. Zoowel de oxydatie- als de reductie-
producten kunnen elk dus moleculaire Redoxsystemen vormen met
zeer verschillend energieniveau. De werkzame factor is nu wel niet
onder de oxydatieproducten te zoeken, daar Euler, K ARRERen Rydbom
aantoonden, dat bij oxydatie van carotine de blauwe kleurreactie
met het SbClg-reagens sterk afneemt. In de verschillende bestaanbare
reductieproducten van elk der carotine-isomeren ligt echter de mogelijk-
heid besloten voor een uitgebreide energie-overdracht met vermoedelijk
zeer verschillend potentiaalbereik. Zal men nu kunnen zeggen, dat
alleen één dier carotine-hydroderivaten met een zeer bepaalde
intramoleculaire potentiaalspanning functioneele beteekenis heeft voor
het dierlijke organisme? Is de blauwe kleurreactie met SbClg bij de
nagenoeg kleurlooze vitamine-A praeparaten slechts aan één werk-
zaam reductieproduct van het carotine gebonden?

Van verschillende zijden werd in den laatsten tijd gewezen op het
bestaan van carotine-isomeren, die onderling zouden verschillen in
de ligging der dubbelbindingen. Euler, Karrer, Hellström en
Rydbom hebben nu deze isomeren alsmede hun eenvoudigste hy-
dreeringsproducten op groeibevorderende werking onderzocht. Zoo-
wel carotine a als ß bleek zeer sterke werking te bezitten. Volgens
nauwkeurige spectrophotometrische bepalingen waren de gevormde
dihydrocarotinen volkomen vrij van a en ß-carotine, ook zij vertoonden
vitamine-A werking, hoewel slechts, in een dosis van 0,03 mgr. per
dag, Beide producten gaven met SbClg een zeer onbestendige blauwe
kleur, terwijl het absorptiespectrum een spoedig verdwijnenden band

bij 552 m[x en twee meer bestendige banden bij 488 en 455 mpi, te zien
gaf. De verdere hydreering der Carotinen voerde tot mengsels van
verschillend sterk gereduceerde derivaten. Een praeparaat, dat
volgens het hydreeringsgetal gemiddeld nog 8 dubbelbindingen bezat,
gaf in het ultraviolet de volgende absorptiebanden: Band I: 315 m[i;
Band II: 330—328 mjx; Band III: 370 mfx. Het valt op, dat dit reductie-
product van carotine evenals de levertraan een band bij 328 mfx bezit.
Gevolgtrekkingen meenen Euler c.s. hieruit nog niet te kunnen
niaken.

Ahmad en Drummond voederden hun proefdieren een samenge-
steld mengsel van carotine-reductieproducten tot een hoeveelheid
van 0,001—0,010 mgr. per dag. Zij zagen hiervan géén vitamine
Werking, die echter prompt volgde als zij aan deze dieren daarop
0,005 nigr. carotine per dag gaven. Zij meenen, dat in het hchaam
Wellicht andere carotine-derivaten dan reductieproducten gevormd
Worden, die voor de vitamine-A werking verantwoordelijk zijn. Waar
echter de reductie van carotine tot het dihydro-derivaat een subtiel
proces schijnt te zijn en genoemde onderzoekers geen enkel bewijs
geven, dat onder de door hen toegediende reductieproducten ook
Werkelijk dihydro-carotine aanwezig was, wat Euler, Karrer,
Hellström en Rydbom door verdere katalytische hydreering van hun
biologisch onderzocht reductieproduct wèl gepoogd hebben, kan aan
het hoogergenoemde onderzoek o.i. voorloopig geen volle bewijskracht
Worden toegekend. (Heilbron en Morton met Ahmad en Drum-
Mond).

In de vergadering van de Royal Society te Londen van 18
Juni 1931 heeft Euler nog eenige nadere mededeelingen om-
trent de biologische werking der hydrocarotinederivaten gedaan.
Door volkomen reductie werd ook hun carotine geïnactiveerd,
uiaar bij gedeeltelijk reductie nam aanvankelijk de physiologische
Werking toe, zoodat een hydrocarotine, waarin nog 8 dubbelbindingen
aanwezig waren veel sterker biologisch actief was dan het carotine zelf.
In dagdosis van 0,0005 mgr. (i y!) werkte dit product nog groeibevor-
derend, ook de blauwkleuring met SbClg was sterker dan bij carotine.
Het absorptiespectrum lijkt veel op datgene, wat aan levertraan-
vitamine wordt toegeschreven.

Het bleek aan Euler gelukt te zijn in kippenserum het carotine
om te zetten in een stof, die na-verwant was aan vitamine-A, spectros-
copisch waren beide stoffen evenwel niet geheel identiek. Euler
ineent, dat de omzetting in het bloed plaats vindt en dat vitamine-A
Werkt als katalysator bij de oxydatie. In verband met de vermeende
anti-infectieve werking van vitamine-A, is de waarneming van Euler
Van belang, dat excessieve giften van carotine bij koriijnen de ambo-
ceptor vorming in het bloed deden stijgen.

Op dezelfde vergadering van de Royal Society wijst Rosenheim
cr op, dat carotine een mengsel is van isomeren, wier optische activi-
teit echter bij de verschillende onderzoekers aanzienlijk verschilt. Hij
acht het dus voorloopig nog gevaarlijk de biologische werkzaamheid
aan een bepaalden isomeer te willen toekennen en vindt het toch niet

onmogelijk, dat de transformatie van carotine in vitamine-A in het
lichaam niets anders is dan een accumulatie van vitamine-A als uiterst
geringe verontreiniging in het carotine aanwezig. De band bij 328 mjx
in levertraan is misschien niet van vitamine-A afkomstig, maar van
een stof die dit agens begeleid.

Morton (1931) wilde daarentegen vasthouden aan den 328 mjz band
voor levertraanvitamine en wees er op, dat dihydrocarotine niet iden-
tiek was met vitamine-A, daar het carotinederivaat een band bij
317 m[jL vertoont en ook de blauwe kleur met SbClg van beide stoffen
niet gelijk is.

Het behoeft geen nader betoog, dat een s5mthetische bereiding
van carotine in staat zou zijn voor goed de contaminatietheorie te
onderdrukken. Chemisch kon het weinig waarschijnlijke van deze
theorie nog aangetoond worden door Euler, Karrer, Hellström
en Rydbom. Zij vonden, dat carotinetrijodide na met thiosulfaat
geregenereerd te zijn weer hetzelfde smeltpunt (176° C.) en dezelfde
absorptie vertoonde als het natuurlijke carotine en ook in alle andere
eigenschappen daarmede geheel overeenkwam. Het geregenereerde
carotine bleek geheel dezelfde groeibevorderende werking te bezitten
als het natuurlijke Daucus-carotine. Daar nu carotinetrijodide wordt
verkregen door neerslaan in zwavelkoolstof, waarin het moeilijk
oplosbaar is, terwijl dit medium een uitstekend oplosmiddel vormt voor
carotine, bezit men hierin aUe waarborgen, dat het trijodide geen on-
veranderd carotine als bijmenging bevat. Zou nu de groeibevorderende
werking niet aan carotine zelf, maar aan een onbekende begeleidend
stof zijn gebonden dan zou dus deze stof, evenals het carotine, door
jodium in een moeilijk oplosbaar jodide zijn omgezet en hieruit weer,
evenals carotine, door thiosulfaat geregenereerd zijn. Deze toevallig-
heid nu lijkt weinig waarschijnlijk.

De stand van het carotine/vitamine-A vraagstuk op het oogenblik
leidt er dus toe, dat men in een kristallijn carotine het meest werk-
zame vitamine-A praeparaat heeft te zien, dat uit dien hoofde dan ook
als een provitamine-A wordt opgevat en wel het eenig bekende. In
het dierlijke lichaam wordt deze stof omgezet in één of meer leuco-
derivaten van onbekende samenstelling, waaraan men de typische
vitamine-A werking meent te kunnen toeschrijven. De carotine-
leucovorm werkt in geringere gewichtsdosis physiologisch actief dan
het carotine zelf. Het is mogelijk, maar lang niet zeker, dat vitamine-A
een carotine-reductieproduct is.

Bruins, Overhoff en Wolff bepaalden voor carotine en vita-
mine-A de diffusieconstanten in xylol bij 20° C. Zij vonden voor caro-
tine: 0,455 c.m^. per 24 uren en voor vitamine-A: 0,578 c.m^. per 24
uren. Uit de verhouding van de moleculairgewichten, die hieruit
berekend kon worden vonden zij voor vitamine-A een moleculair-
ge wicht van omstreeks 330, derhalve aanzienlijk veel minder dan van
carotine (536,5) of een zijner, mogelijk werkzame, reductie-producten.

Uit het medegedeelde volgt welke groote beteekenis moet worden
toegekend aan de groenten, als voornaamste carotine-bron, in de

voedseleconomie van den mensch en vooral van den jongen groeien den
mensch. Naast en wellicht boven hun calorische waarde staat hun
essentieele voedingswaarde. Omtrent hun calorische waarde zijn wij
behoorlijk ingehcht, omtrent de waarde, die zij aan hun carotine-gehalte
ontleenen weten wij, wat onze dagelijksche voedingskost betreft,
nagenoeg niets. De carotinebepaling zal ons dus in staat stellen ook
hun physiologische waarde beter te leeren kennen en vergelijking en
beoordeeling der groenten in dit opzicht mogelijk maken. Wij moeten
natuurlijk voorloopig nog buiten beschouwing laten in hoeverre het
tot ingestie komend carotine in het dierlijke lichaam in den actieven
factor wordt omgezet. Het verschijnen van carotine in de faeces door
Karrer en Helfenstein ook Palmer en Eckles benevens
Heilbron en Morton met Ahmad en Drummond aangetoond, kan
er op wijzen, dat die omzetting niet quantitatief is. Mogelijk spelen
daarbij ras- en individueele eigenschappen van het dier een rol, daarop
Wijst ook het onderzoek van Wolff, Overhoff en van Eekelen.

De afwezigheid van vitamine-A in de voeding van jonge groeiende
dieren geeft bij hen tot stofwissehngsstoornissen aanleiding, die aan
een reeks van typische uitvalssymptomen kenbaar zijn en bij blijvende
onthouding van den A-factor eindigen met den dood van het individu.
Als initiale macroscopisch waarneembare verschijnselen gelden de
vermindering of het ophouden van den groei der dieren en het optreden
van een oogaandoening, die men met den naam xerophthalmie aan-
geeft. In de voortgeschreden gevallen komen daar meestal een of
meer der volgende afwijkingen bij: darmstoomissen, haematurie,
priapisme, motorische stoornissen in de voorpooten en de alleen bij
menschen waar te nemen hemeralopie. Het primair verzwakte, in zijn
afweeryermogen getroffen dier valt ten slotte ten offer aan tal van
ontstekings- en septische processen, die welhcht slechts ten deele
als een secundair gevolg van het vitamine-A gebrek mogen beschouwd
worden. Naast deze in vivo waarneembare deficiency verschijnselen,
bracht de autopsie nog een aantal interne afwijkingen aan het licht,
die niet zoo gemakkelijk voor een directe waarneming toegankelijk
zijn en daardoor langer aan de aandacht zijn ontsnapt. De kalk-
afzetting in de nierepitheliën geeft aanleiding tot de vorming van
nierbekkengruis en phosphaatsteenen in de blaas, de bindweefsel-
degeneratie van het haemopoietisch apparaat moet als de oorzaak
worden aangezien van de in vivo peripheer waar te nemen leucopoenie
(Roegholt). Als partiaal verschijnsel van een algemeene degeneratie
van het secerneerend epitheel, stelt men in den laatsten tijd als een
der vroegst aantoonbare symptomen van vitamine-A gebrek de op-
tredende kolpokeratose bij de vrouwelijke proefdieren op den voor-
grond (Hohlweg en Dohrn). Laatstgenoemde schrijvers vermelden,
dat de kolpokeratose, die bij A-deficiency optreedt wel door vitamine-A
toediening kan genezen worden, maar niet door carotine. Van Eeke-
len, Wolff en Overhoff toonden evenwel overtuigend aan, dat
doses van 5—6 y carotine per dag bij de rat in ongeveer 3 dagen de
verhoorning der vaginaal-epithehën doet ophouden en dat dan het
weder optreden van dit verschijnsel door dagelijksche giften van
2—3 T carotine wordt voorkomen. De invloed van het vitamine-A
gebrek op het dierlijk metabohsme kan dus wel veelzijdig tot uiting
komen.

Op verschillende wijzen kan de waarde van een voedingsmiddel
als vitamine-A bron worden onderzocht. Men kan dat vermogen in
vivo bij het dier waarneembaar maken, maar men kan in beperkte
gevallen ook in het te onderzoeken materiaal quantitatief de aanwezig-
heid aantoonen van een chromogeen, dat, naar men meent, samen-
hangt met de specifieke physiologische werking van het vitamine-A,

daarenboven is het soms nog mogelijk het vitamine-A rechtstreeks
door zijn specifieke absorptie aan te toonen en te meten. Men beschikt
daartoe over:

De biologische methode is de oudste en de meest algemeen bruik-
bare, de beide andere reacties zijn slechts in beperkte mate te ge-
bruiken en dankten hun ontstaan grootendeels aan de groeiende
ontevredenheid over de uitkomsten der biologische waardebepaling.

De keuze van diersoort voor de biologische proeven wordt door
Verschillende factoren beheerscht. In de eerste plaats is men met de
toelaatbare grootte der dieren aan zekere grenzen gebonden, de grootere v
gewone laboratoriumdieren kunnen om zeer uiteenloopende redenen
niet gebruikt worden. De ongewisheid der resultaten, waardoor elk
biologisch onderzoek welhaast is gekenmerkt, brengt mede, dat men
het vitamine-onderzoek niet met individuen, maar slechts met groepen
van dieren kan uitvoeren. De meeningen omtrent de noodzakelijke
grootte van die groepen loopen wel is waar zeer sterk uiteen, maar in
elk geval moet het aantal dieren, waaruit die groepen, naar de ver-
schillende inzichten, behooren te bestaan toch zóó groot zijn (4—14
stuks), dat bij eenige uitbreiding van het materiaal-onderzoek zelfs in
de grootste laboratoria de beschikbare plaatsruimte te beperkte grenzen
zou stellen aan het noodige aantal in voorraad te houden proefdieren,
daargelaten nog de sterk stijgende onderhoudskosten bij toenemende
grootte der dieren. Ook technische bezwaren bij de proeven zelf beletten
het gebruik van grootere dieren, want de afloop der proeven dient
binnen een practisch bruikbaren tijdsduur gehouden te worden en dat
kan alleen verkregen worden bij dieren, wier verschillende levens-
perioden niet te lang duren. Ook de voedselvoorziening spreekt bij de
keuze mede, niet alleen uit economische overwegingen wat hun quanti-
teit aangaat, maar vooral met het oog op den meestal beperkten voor-
raad op zijn physiologische werking te onderzoeken materiaal, dat ter
beschikking staat. Daarenboven bieden grootere hoeveelheden
voedingsmiddel, die over langen tijd bewaard moeten blijven, veel
niinder zekerheid tegen achteruitgang hunner vitamine-waarde, dan
kleine spoedig verbruikte quantiteiten. Van den anderen kant mogen
de dieren ook weer niet te klein zijn, omdat dan hun levensperioden te
kort worden voor behoorlijke waarneming en dergelijke dieren te ge-
voelig zijn voor allerlei neveninvloeden, die het karakteristieke ziekte-
beeld, waarop men voor zijn oordeel is aangewezen, vertroebelen.

Overwegingen van dezen aard hebben McCollum er toe gebracht
de rat als proefdier voor de biologische vitamine-proeven in te voeren
(1907)- Deze omnivoor, van nature sterk en niet veeleischend in zijn
Voedselvoorziening met niet te langen levensduur en groote fertiliteit,
bleek een uitstekend proefobject. Zoowel de grijze huisrat als de

albinorat (Mus norvegicus albus) worden gebruikt, de eerste niet zelden
in Amerika, de laatste meestal bij ons.

Aanvankelijk richtte men de proeven eenvoudig zoo in, dat een
aantal dezer dieren op vitamine-A vrij dieet gebracht werden tot zij
de eerste verschijnselen toonden, die men als typisch voor het ont-
breken van dezen voedingsfactor had leeren kennen. In groepen
ingedeeld kregen deze dieren dan verschillende, doch afgemeten
dagdoses van de te onderzoeken stof te eten bij een overigens vitamine-
A vrij basaaldieet en dan wachtte men het resultaat af. Men zag de
dieren genezen of na korter of langer tijd onder typische verschijnselen
sterven en richtte naar den afloop zijn oordeel over de physiologische
waarde van het onderzochte materiaal.

Spoedig bewees de ervaring ook hier op ondubbelzinnige wijze het
ingewikkelde verloop van biologische processen en stuitte men op
moeilijkheden om tot bruikbare gevolgtrekkingen te komen. Geleidelijk
werden tal van tekortkomingen in de oorspronkelijke methode her-
kend en hun invloed op de juistheid van het eindoordeel vastgesteld.
Men zag, dat de proefdieren onderling vrij groote physiologische
groeischornmelingen vertoonden (Leigh—Clare en Soames) en dat
ras en individueele gevoeligheid voor een synthetische voeding en voor
de grootte van vitamine giften in die mate hun invloed deden gelden,
dat men om bruikbare gegevens te verkrijgen, genoodzaakt was
maatregelen te treffen om aan de meest grove schommelingen paal
en perk te stellen. Zoo kwam men er toe te zorgen voor meer ideale
hygienische verhoudingen, voor uniforme voeding en gelijkmatige
voedseltoediening bij de proefdieren, men ging den gemiddelden
groei der verschillende rassen na onder die verbeterde omstandigheden
en stelde hun invloed vast op de fertiliteit, frequentie der conceptie,
lactatie, aantal en gewicht der jonge dieren. Rekening werd gehouden
met het groeiverschil bij beide geslachten en men leerde het verband
inzien tusschen leeftijd en hchaamsgewicht der jonge dieren en het
gunstigste tijdstip, waarop men bij hen de proeven kon inzetten. De
ervaring leerde, dat men zelfs genoodzaakt was te letten op het
voedingsregime der moederdieren om bruikbare uitkomsten te ver-
krijgen bij hun jongen.

Van belang was de waarneming van Steenbock, Sell en Nelson
(1923), dat de rat in zijn lichaamsweefsels groote hoeveelheden vita-
mine-A kan vast leggen voor toekomstig gebruik. De grootte dezer
depots is geheel afhankelijk van den vitaminerijkdom van het voedsel,
dat de rat in het laboratorium tot zich kan nemen. Zoowel het vitamine
A gehalte van het voedsel, als dat der depots in het moederdier zijn
van invloed op de hoeveelheid vitamine, die tijdens de lactatie met
de melk aan het jonge individu worden toegevoerd daar tot dekking
zijner behoeften dienen en bij surplus tot vorming van depots aan-
leiding geven. Ongelijke toevoer kan dus aanleiding geven tot ongelijke
grootte der vitamine depots bij de jonge proefdieren. Bij vitamine
onthouding zullen de jonge dieren dus op die ongelijke voorraden ge-
durende verschillende tijden ongestoord kunnen voortleven. Alleen
dan kan men een meer regelmatige en gelijkdurende depletieperiode

bij de jonge dieren verwachten als de voeding der moederdieren wat het
vitamine-A gehalte betreft, gestandaardiseerd is. Schommelingen in
den duur der depletieperiode zijn zooveel mogelijk te vermijden,
omdat zij noodzakelijkerwijze tot gevolg moeten hebben, dat bij de
proefdieren op ongelijken leeftijd en dus bij ongelijk lichaamsgewicht
en ongelijke vitamine-A behoefte, de proeven voor de waardebepaling
Worden ingezet. Bovendien bleek, dat de grootte van den vitamine-A
Voorraad, die de dieren van hun moeders medekregen van invloed was
op him weerstandsvermogen tegen infectie d.w.z. tegen mogelijke
secundaire doodsoorzaken. Sherman en Burtis namen proeven met
2 verschillende soorten dieet voor de moederdieren:

Niet alleen was nu bij het vitamine-A rijkere dieet ß. de depletie-
periode der jonge dieren inderdaad langer, maar de na exitus verrichte
autopsie gaf bij afstammelingen der A-dieet dieren teekenen van in-
fectie aan in 75% der gevallen, tegen bij de jongen der B-dieren slechts
in 25% der gevallen.

De herkenning van den invloed van het antirachitische vitamine-D
op het groeiproces der jonge dieren gaf Steenbock, Nelson en Black
aanleiding de gebruikelijke voedingstechniek bij de vitamine-A
proeven te wijzigen, zóó dat voldoende D-suppletie verzekerd was.
Ook de aanwezigheid der meeste andere bekende accessorische voe-
dingsfactoren is in het dieet der proefdieren noodzakelijk en dient
men dus te verzekeren. Wel liepen de meeningen over de behoefte der
ratten aan vitamine-C uiteen, doch in den laatsten tijd acht men dezen
factor toch wel noodig. Het komt ons echter ontoelaatbaar voor den
toevoer te regelen door toediening van citroensap, zooals een aantal
onderzoekers doen (Hume en Smitii; Collison c.s.; Euler, Euler
en Rydbom) of sinaasappelsap, zooals Drummond aangeeft, immers
in deze laatste vrucht konden wij niet onaanzienlijke hoeveelheden
carotine aantoonen, zoodat ook wellicht de verwante citroenen niet vrij
zijn van dit provitamine-A. Het B-complex vult men meestal aan met
giften gist of met het handelsproduct marmite. Hume en Smith zagen
bij giften van 0,5 gr. marmite per dag bij hun ratten een huidziekte
optreden, zooals beschreven is bij gebrek aan den factor Bg. Zij
meenen dus, dat marmite deficient is aan dezen factor en vervangen
marmite door 10—12% van het gewicht der totale voeding aan ge-
droogde gist bij te geven. Ook dit komt ons niet geheel zonder be-
lt;lenken voor, daar door Reader is aangetoond, dat in gist, in het
algemeen, carotine voorkomt en zulke hooge giften als 10—12% dus
\'Wel een lang niet te verwaarloozen hoeveelheid provitamine-A kunnen
bevatten.

Het basaaldieet dient aan den eisch te beantwoorden, dat het
vitamine-A vrij is, niet altijd scheen de caseine, die men meest als

eiwit component gebruikt, aan die voorwaarde te voldoen; aan de
reiniging van dit voedselbestanddeel moet dus extra zorg besteed
worden. Aan het toevoegen van vet achtte men aanvankelijk geen
voordeelen verbonden boven het gebruik van een vetvrij basaal-
dieet (Drummond en Coward Drummond, Coward en Handy;
Macy, Outhouse, Long en Graham). In den allerjongsten tijd is
echter gebleken, dat het vetgehalte van het dieet van invloed is op
de resorptie van het aan de proefdieren toegediende carotine. Bij een
vetvrij basaaldieet werd het pigment in het algemeen slecht opge-
nomen, zoodat het grootste deel met de excrementen werd uitge-
scheiden. Werd carotine opgelost in aethyllauraat in dagdoses van
0,05—0,01 mgr. aan ratten, die op vetvrij basaaldieet stonden, ge-
geven dan werd 84,9—93,7% van het pigment uitgescheiden, terwijl
de dieren op een dieet met 10% vet slechts 11,7% ingegeven carotine
uitscheidden. (Heilbron en Morton met Ahmad en Drummond).
Bij biologische proeven op vitamine-A schijnt dus het toevoegen van
vet aan het dieet noodzakehjk te zijn.

Als proefdieren gebruikt men liefst exemplaren uit één nest, van
een rattenstam, die reeds geruimen tijd in het laboratorium zelf wordt
voortgeteeld en dus beschouwd kan worden volkomen geadapteerd
te zijn aan de voor elk laboratorium weer bijzondere levensvoorwaar-
den. De vrouwelijke dieren, die ongeveer na 42 dagen geslachtsrijp
zijn, worden eerst op een leeftijd van 4 maanden tot de conceptie
toegelaten. Tijdens de graviditeit, die 23 dagen duurt zijn geen bij-
zondere zorgen voor de voeding noodig, tijdens de lactatieperiode
schijnen de moederdieren echter een 3—5 maal grootere behoefte te
hebben aan de in het B-complex voorkomende vitaminen om de jongen
tot normaal gewicht groot te brengen (Surenbsp;Sure en Walker;

Hartwell; Macy c.s.). Het bleek n.1., dat bij een te kort aan ge-
noemd complex de zoogende moeders 50% minder voedsel gebruik-
ten dan normaal. De invloed op den groei der jonge dieren hangt
echter niet alleen van de daling van het voedselniveau der moeder-
dieren af, maar is bovendien aan een specifieke werking van het
B-complex toe te schrijven. In tegenstelhng met wat men verwacht,
blijft de voedselopname tijdens de graviditeit op het normale niveau
van ongeveer 10 gr. per dag, maar stijgt tegen het einde der lactatie
tot het dubbele.

Sommige onderzoekers achten het voor regelmatige voeding en
groei noodig het aantal ratten bij de geboorte tot 6 stuks bij één
moeder te reduceeren, anderen vinden het beter de natuur den vrijen
loop te laten. De voor de proeven bestemde jonge ratten worden op
den 21—26en dag van de moeders afgenomen, men gebruikt echter
alleen die exemplaren, die op dat tijdstip minstens 38—40 gr. wegen.
Op het vitamine-A vrije dieet gekomen groeien deze dieren normaal
nog enkele weken door op hun bij de geboorte mede gekregen vitamine-
voorraad. Bij voorkeur gebruikt men voor de proeven vrouwelijke
dieren, omdat zij in het algemeen iets grootere uniformiteit in den groei
vertoonen, maar bovendien, omdat bij hen de blijvende verhoorning
der vaginaalepitheliën tengevolge van A-deficiency een grootere

gelegenheid tot waarneming biedt. Evans en Katharina Bishop wezen
er n.1. op (1922) dat de stoornis van den oestrus door gebrek aan
vitamine-A zeer karakteristiek is. Zij bestaat in verlenging van de
periode der desquamatieve verandering van het vaginaalepitheel
gedurende den oestrus. Bij gezonde dieren vindt men de verhoomde
epithelien alleen gedurende oestrus en ovulatie, maar bij vitamine-A
gebrek blijft dit verhoorningsproces bestaan gedurende de geheele
periode van acute deficiency. Maakt men echter van dit typische
verschijnsel in de proeven voor de beoordeeling gebruik, dan moet men
zorgen voor adaequate giften vitamine-B in de voeding. Evans en
Bishop vonden, dat bij B-gebrek het folliculair apparaat van het
ovarium tot volkomen rust komt; bij een te kort aan vitamine-B
worden de dieren pas veel later geslachtsrijp. Wanneer er geen oestrus-
cycli optreden, zal er dus ook geen sprake zijn van een verlenging van
de verhoorningsperiode, zoodat niettegenstaande A-deficiency geen
kolpokeratose optreedt.

Macy, Outhouse, Long en Graham gaven een verhoudingsschema
voor de gemiddelde tijden, waarop men bij het vitamine-A onderzoek
de voornaamste uiterlijk waarneembare karakteristieke verschijnselen
ziet optreden:

Het spreekt van zelf, dat bij wijziging van stal- en basaaldieet deze
getallen zullen veranderen, men vergeete niet, dat dergelijke cijfers
slechts gelden voor het laboratorium, waar zij zijn vastgesteld onder de
daar bestaande levensomstandigheden voor de proefdieren. Ook Hume
en Smith wezen er op, dat alle laboratoria in hun voedselvoorziening
of basaaldieet voor de ratten verschillen en bijgevolg ook den groei
en het gedrag der ratten aan schommelingen van zeer wisselenden
oorsprong en grootte onderhevig zijn. Op den invloed van de indivi-
dueele eigenschappen van de rat komen wij nog terug. Bovenstaande
gegevens hebben dus slechts relatieve waarde; zij werden aldus ge-
vonden voor ratten, wier moeders op een gestandaardiseerde stal-
voeding gehouden waren, tot een lang in het betrokken laborato-
rium voortgekweekten stam behoorden en in de meest gunstige
hygiënische levensomstandigheden geplaatst waren. Uit de tabel blijkt,
dat verreweg het vroegst optredende waarneembare symptoom van

A-gebrek de kolpokeratose is; xerophthalmiesymptomen en groei-
stilstand traden daar vrijwel gelijktijdig op; weinig ratten vertoonden
op dat oogenblik reeds macroscopisch waarneembare longlaesies,
maar een week later nam de frequentie van allerlei ontstekingspro-
cessen al sterk toe n.1. longinfecties, middenoorontstekingen en aan-
doeningen der mastoidcellen, abscessen van de speeksel- en tongbasis-
klieren, sinus- en retropharyngeaal-abscessen, somtijds haemorrha-
gieën. Met het oog hierop mag men de curatieve proef niet te laat
inzetten, want ook al kunnen de dieren het vitamine-A gebrek en de
daaruit voortkomende stofwisselingsstoomissen nog te boven komen,
de ontstekingsprocessen worden niet door vitamine-giften genezen
en kunnen nog wekenlang voortduren, op zichzelf den groei bij het
zieke dier belemmeren en steeds dreigen een secundaire doodsoorzaak
te worden. Om de waarneming dus niet te vertroebelen moet men
de curatieve proef aanvangen vóór er uitgesproken oogsymptomen
zijn, maar bovendien ook, omdat na ingetreden groeistilstand niet
zelden een snel verloopend laetaal einde volgt. Het zal derhalve
niet altijd gemakkelijk vallen het juiste tijdstip voor het begin der
proeven uit te kiezen. De echte xerophthalmie-symptomen worden
echter meestal vooraf gegaan door een kort durend stadium van
roodheid en zwelling der oogleden, benevens een depilatie der lid-
randen, die evenwel bij de veel gebruikte albinoratten niet altijd
gemakkelijk is waar te nemen (Nelson en Jones). Op een bijkomstige
moeilijkheid wees van Leersum, het komt n.1. voor, dat een paar
dagen na het intreden van gewichtsstilstand weer een gewichts-
vermeerdering valt waar te nemen, waardoor men anderzijds de kans
loopt de proeven te vroeg te beginnen op een tijdstip dus, waarop de
vitamine-A voorraad bij de jonge dieren nog niet voldoende was uit-
geput. Bovendien nam van Leersum een oogziekte waar, die gelijkt
op xerophthalmie, maar niet van avitaminotischen aard is. Op quali-
tatieve- en quantitatieve ongelijkmatigheden in den groei der proef-
dieren bij de curatieve methode hebben Coward en Key nog gewezen.
Zij namen bij vitamine-A toediening na een behoorlijke depletieperiode
— die volgens Hume en Smith 6—8 weken kan duren — de volgende
reactieverschülen bij hun dieren waar:
1«. onmiddellijke en sneUe groei.
20. onmiddellijke subnormaal blijvende groei.
30. lange latentie-periode, gevolgd door normaal groeiherstel.

Vooral in verband met laatstvermelde waarneming vestigen zij
de aandacht op de noodzakelijkheid van een voldoende lange voort-
zetting der proef. Zij achten een tijdvak van 8 weken noodig.

Vroeger gaven wij reeds aan, dat een van de vormen, waaronder
de door vitamine-A gebrek gestoorde stofwisseling tot uiting komt
de degeneratie van het secerneerende epitheel is, hieronder valt ook
het epitheel der digestieklieren b.v. het pancreas en de speeksel-
klieren. Waar het epitheel blijkbaar al vroegtijdig wordt aangetast —
immers het vaginaalepitheel degenereert al lang vóór de volkomen
depletie van het jonge dier — kan ook reeds een vroegtijdige functie-
stoornis dezer organen verwacht worden. Deze valt echter niet onder

onze directe waarneming, maar het is zeer goed mogehjk, dat hierin
de oorzaak ligt voor het feit, dat de deficiente dieren niet steeds
onmiddellijk na het instellen der therapie met groeiherstel reageeren
en nu eens een latentieperiode, dan weer gewichtsschommelingen
of verminderde groeisnelheid vertoonen. In die latentieperiode,
die verscheidene dagen kan duren, schuilt weer het gevaar, dat de
toestand der zieke dieren verergert en exitus ondanks toediening
eener toereikende vitamine-A dosis volgt.

De biologische bepaling der vitamine-A waarde volgens de cura-
tieve of therapeutische methode biedt dus beduidende moeilijkheden
en houdt tal van gevaren in, die haar tot mislukking of tot een onjuiste
appreciatie kunnen voeren. Ondanks de beste voorzorgen blijft zij
bij de waardebepaling een bron voor allerlei onnauwkeurigheden,
wier grootte en maat niet is te schatten. Begrijpelijk is het dus, dat men
naar technische verbeteringen in de methodiek streefde; niet alle
wijzigingen zijn evenwel verbeteringen gebleken. Nog minder juist
schijnt ons de minimum-methode te zijn (Sherman en Munsell), die
een variant is van de curatieve waardebepaling. De laatste methode
had tot doel de grootte der vitamine-A dosis te leeren kennen, die in
staat is het proefdier in al zijn functies in optimale conditie te brengen
en te houden. Bij de minimum-methode tracht men de hoeveelheid
van het te onderzoeken praeparaat te vinden, die in staat is het dier
juist te doen voortleven of het in een bepaalden welstand te doen
voortleven b.v. het dier te doen groeien met een vastgestelde gewichts-
vermeerdering in grammen per week. Men stelde zich voor aldus
scherper het effect van verschillen in de doseering te kunnen waar-
nemen. In het algemeen kan tegen deze methode de bedenking aange-
voerd worden, dat het tijdens de depletieperiode door vitamine-A
verarming tot groeistilstand gebrachte dier een ziek individu is, dat
tegen de verschillende noxen, waaraan de dieren in het gewone leven
zijn blootgesteld, een verminderd weerstandsvermogen zal bezitten.
Zoo zal het mogelijk zijn, dat reeds geringe schadelijke invloeden,
Waaraan elk levend wezen uiteraard blootstaat, maar die jonge
krachtige individuen niet hinderen dank zij het normaal functioneeren
Van al hun beschikbare afweermechanismen, op het beschadigde dier
vat kunnen krijgen, zijn toestand kunnen doen verergeren of zelfs
het dier ontijdig ten gronde richten. Het bezwaar van de minimum-
niethode is dus, dat het dier ziek blijft of ten minste niet in optimale
conditie verkeert en dus in een voortdurenden toestand van verhoogde
Vatbaarheid voor schadelijke agentia uit zijn omgeving voortleeft.
Op de individuen werken de met het leven verbonden schadelijke in-
vloeden niet gelijk in, waaruit voor de verschillende proefdieren een
ongelijke sterftekans moet resulteeren. Bij die ongelijke sterftekans
nioet men nu het oordeel over de waarde van het vitaminepraeparaat
Vestigen op groeiverschillen of op de verhouding van hun levensduur
als men gelijke ge wichtshoe veelheden der te onderzoeken praeparaten
toedient of op den gelijken levensduur als men verschillende hoeveel-
heden dier praeparaten geeft, al naar men de methode volgt, waarbij
de gewichtsvermeerdering in grammen of de levensduur of de

gewichtsverhouding der praeparaten, die de dieren even lang laat leven,
de basis is voor hun waardebepaling. Er is echter meer, dat de minimum
methode zwak fundeert. De zieke dieren hebben om te herstellen
aanvankelijk grootere giften vitamine noodig dan later om voort te
kunnen blijven leven; geeft men hen in den beginne te weinig dan zal
men vele dieren verliezen; geeft men meer, dan komt men al zeer
gemakkehjk tot onzuivere conclusies.

Tegenover de curatieve staat de preventieve of prophylactische
methode (Hume en Smith, 1928). De meest eenvoudige toepassing
hiervan is, dat men de dieren na de lactatieperiode op een vitamine-A
vrij basaaldieet brengt en daaraan de te onderzoeken stof toevoegt,
terwijl men dan den groei der dieren vervolgt. Voor de zekerheid
eener goede ingestie geeft men het te onderzoeken praeparaat meestal
\'s morgens vóór het andere eten als de dieren hongerig zijn; gaarne
gebruikt men, zoo mogelijk, als oplosmiddel carotinevrije olijf- of
arachisolie. Ook van vloeibare paraffine heeft men wel als dispergeer-
middel gebruik gemaakt, doch uit deze koolwaterstof schijnt de re-
sorptie minder goed te zijn. Vooral bij kleinere doses werden hiermede
slechte uitkomsten verkregen (Collison c.s.; Drummond en Morton,
1929). Andere onderzoekers mengen het te onderzoeken voedings-
materiaal door het gewone basaaldieet, maar daar de dieren morsen,
zullen zich moeilijkheden voordoen bij het vaststellen van de werkelijk
opgenomen hoeveelheden.

Macy, Outhouse, Long en Graham voerden de preventieve me-
thode eenigszins anders uit. Zij maakten gebruik van het ervaringsfeit,
dat de duur der depletieperiode bij de dieren afhangt van den hun
met de moedermelk toebedeelden vitaminevoorraad, m.a.w. afhanke-
lijk is van den vitaminerijkdom van het voedsel der moederdieren.
Zij geven nu aan deze dieren tijdens de graviditeit en de lactatie niet
het gewone gestandaardiseerde stalvoedsel, maar het vitamine-A vrije
basaaldieet met de noodige andere accessorische factoren en voegen
dan daarbij de te onderzoeken stof. Van den meerderen of minderen
vitaminerijkdom van deze toegift hangt nu de duur der depletie-
periode bij de jonge dieren af, immers de bijgegeven stof bepaalt als
eenige vitamine-A bron het gehalte aan dezen factor in de melk. Hier
is dus de duur van die periode een maat voor de vitamine-A waarde
van het te onderzoeken materiaal. Veel navolging heeft deze methode
niet kunnen vinden. Afgescheiden van vele andere bedenkingen, die
men kan aanvoeren, lijkt het al zeer ongewenscht om de indivi-
dueele vitamine-behoeften van twee verschillende dieren in één proef
te superponeeren en daarop de waardebepaling te doen berusten.

De grootste moeilijkheid bij de biologische ijking van vitamine-
praeparaten is wel gelegen in de individueele groeiverschillen der
proefdieren. Om den invloed van dezen factor op het resultaat der proef
zoo gering mogelijk te maken moet het aantal dieren, wier gedrag
tegenover een zeker praeparaat wordt onderzocht, zóó groot zijn,
dat de gemiddelde waarde van het praeparaat, die daaruit kan berekend
worden voor verschillende op gelijke wijze onderzochte groepen van
dieren niet alleen uit denzelfden stal, maar liefst ook voor verschillende

laboratoria, zoo veel mogelijk gelijk is. Het behoeft geen lang betoog
om in te zien, dat de gegevens nauwkeuriger worden naarmate het
aantal proefdieren stijgt, maar dat anderzijds de practijk grenzen
stelt aan het aantal voor één proef te gebruiken dieren, m.a.w. men is
wel gedwongen bij de biologische proef een schommeling in de waarde
der praeparaten te aanvaarden als een noodzakelijke kwaad. Het
aantal dieren, dat voor een onderzoek in de verschillende laboratoria
noodig wordt geacht wisselt vrij sterk, het wordt beheerscht door
plaatselijke omstandigheden en persoonlijke inzichten. Sherman en
Batcheldes vonden de biologische methode over het algemeen zeer
weinig nauwkeurig en meenden dat voor een bepaling 9 proefdieren
noodig waren. Irwin, Brandt en Nelson (i, 2) stelden een statistisch
onderzoek aan groot materiaal in. Bij nagenoeg 1000 voedingsexperi-
menten gingen zij de oorzaken na voor de verschillen in gewichts-
toename der proefdieren en stelden vast, dat de verschillen in hoeveel-
heid eten, die de dieren tot zich namen, de eetlust dus, de maatgevende
factor was voor de waargenomen groeiafwijkingen. Door een tweede
reeks van proeven vonden zij door wiskundige behandeling van het
statistisch materiaal betreffende de gemiddelde verschillen in gewichts-
toename, dat, wanneer voor elke proef 14 dieren werden gebruikt, onder
de in hun laboratorium bestaande levensomstandigheden, gegevens
verkregen werden, die den invloed van de verschillen in eetlust der
dieren voldoende ophieven om bruikbare inzichten in de vitamine-
Waarde van het onderzochte praeparaat te krijgen. Hoe ingewikkeld
echter onder deze omstandigheden de proeven zouden worden, volgt
uit een voorbeeld. Stel men heeft een voedingsmiddel van volkomen
onbekende vitamine waarde te onderzoeken, dan kan men b.v. be-
ginnen met een tweetal reeksen van proeven. In de eerste reeks geeft
men dan aan de dieren b.v. 5 gr. — 0,5 gr. en 0.05 gr. van de te onder-
zoeken stof. Vindt men nu bij 5 gr. wel, maar bij 0,5 gr. geen vitamine-
werking meer, dan zal men in de tweede reeks de dalende hoeveelheden:
4. 3, 2 en i gr. moeten onderzoeken. In het geheel zijn dus 7 afzonder-
lijke proeven ieder met 14 ratten te verrichten, m.a.w. voor de waarde-
bepaling heeft men in dat geval niet minder dan 98 ratten noodig.
Wetenschappelijk moge dit nu in een groot en goed toegerust labora-
torium mogelijk zijn, voor de waardebepaling van het voedsel in de
practijk is op deze wijze de biologische methode volkomen onbruikbaar.
In de practijk wijkt men daar dan ook op een vrijwel willekeurige
wijze van af. Men kan dus nagaan wat voor beteekenis aan een bio-
logische vitaminewaardebepaling in de practijk is te hechten; met
schommelingen in de vitaminewaarde van 50% naar boven en naar
beneden kan men al heel tevreden zijn. Dat ten slotte bij dergelijke
grove afwijkingen het geen zin heeft lang te twisten over de onderlinge
bezwaren van curatieve of preventieve methode van onderzoek,
lijkt ons voor de hand hggend.

Over de chemische kleurreacties en de spectrophotometrische
methode ter bepaling van het vitamine-A gehalte, kunnen wij kort
zijn. Beide methoden leenen zich alléén voor de bepaling van het

vitamine-A (in levertraan, boter). Wel is waar geeft ook Carotine»
evenals trouwens alle andere Carotinoide pigmenten, een blauwe kleur-
reactie met het reagens van Carr en Price (SbClg) (H. v. Euler,
Karrer en Rydbom), maar de kleurreactie van carotine met SbClg
staat in intensiteit ver achter bij de levertraan-vitamine kleurreactie
en is in ieder geval zóó zwak, dat men carotine veel beter aan zijn
eigen kleur kan meten, zooals wij in dit onderzoek doen.

De spectrophotometrische methode ter bepaling van het vitamine-A
gehalte in levertraan werd tot dusver alleen door Drummond en Mor-
ton verricht. Levertraan vitamine-A zelf vertoont een absorptieband
in het ultra-violet met een max. bij ± 328 m[jL; het blauwe reactie-
Droduct van dit vitamine in de Carr en price-reactie geeft absorptie-
janden, wier maxima liggen bij ± 608 mjx en 572 m^i. Genoemde
onderzoekers maten nu quantitatief de absorptie bij deze goflengten
en vergeleken de uitkomsten voor verschillende tranen met hun
Lovibond-waarden. Voor de metingen verricht bij 608 ma kregen
zij bevredigende overeenkomst met de colorimetrische Lovibond
waarden; de absorptiecurve met max. bij 328 mtx scheen echter ge-
comphceerd te zijn en bleek te bestaan uit een summatie van absorp-
ties gegeven door het levertraan vitamine-A en andere normale
levertraanbestanddeelen.

De voor het oogenblik algemeen gangbare opvatting is, dat de
absorptieband in het ultraviolet met een max. bij 328 mjji, in de
levertraan kenmerkend is voor de aanwezigheid van vitam\'ine-A.
Het blauwe reactieproduct bij de Carr en PRicE-reactie met SbClj,
vertoont verschillende absorptiebanden. Deze banden zijn voor lever-
traan en voor zijn onverzeepbare fractie (zoog. levertraan-concen-
traten) niet gelijk. Heilbron en Morton met Ahmad en Drummond
wezen er kortelings geleden op, dat ieder der beide producten 2 dis-
tincte absorptiebanden vertoont, de max, voor levertraan liggen bij
606 mfjL en bij 572 m[j, en voor de concentraten bij 620 m(jL en bij 583 m[i,.
Beide banden zouden niet van hetzelfde chromogeen afhankelijk zijn,
het chromogeen echter, dat verantwoordelijk is voor het optreden
van den band bij 572 m(i. is niet te differentieeren van de stof, die men
verantwoordelijk houdt voor de absorptie van de levertraan in het
ultraviolet bij 328 mjx. Daarmede nemen zij dus een nauwer verband
van het vitamine-A met den band bij 572 mji aan dan met den band
bij 606 m(x.

Over de juiste waarde van de kleurreactie voor de bepaling van het
vitamine-A gehalte in levertraan, is men het nog niet geheel eens, en
de desbetreffende onderzoekingen zijn dan ook nog in vollen gang.

Het vaststellen van het gehalte aan carotinoide kleurstoffen is
noch voor plantaardig-, noch voor dierlijk materiaal op technisch
eenvoudige wijze uit te voeren. Aan een quantitatieve gewichts-
analyse valt zelfs niet te denken, niet alleen wegens de geringe con-
centratie, waarin deze kleurstoffen in de natuur plegen voor te komen,
maar ook de moeilijkheid hen, uit welke weefsels ook, rein af te scheiden,
vormt hiertoe nog steeds een onoverkomelijk bezwaar; slechts ten
koste van veel arbeid en aanzienlijk pigmentverlies kan men de
carotinoiden chemisch zuiver bereiden. De groote kleurintensiteit,
die de oplossingen van alle carotinoiden kenmerkt, is echter een ge-
lukkige omstandigheid, die de mogelijkheid schept, met gebruik-
making van moderne hulpmiddelen, ook in zeer groote verdunning,
met voldoende nauwkeurigheid hun concentratie langs spectro-
colorimetrischen weg te bepalen. Deze methode geeft het voordeel,
dat vrijwel geheel afgezien kan worden van het zoo moeilijke, en met
het oog op ontleding der kleurstoffen zoo gevaarlijke reinigingsproces,
en volstaan kan worden alleen de meting storende gekleurde bij-
producten uit de oplossing van het Carotinoid, dat bepaald moet
worden, te verwijderen. Maar ook dit is niet zoo heel eenvoudig; slechts
door een reeks van opeenvolgende bewerkingen is men in staat
zoowel carotine als xanthophyll van elkaar gescheiden in oplossing
te verkrijgen, bij volkomen afwezigheid van andere gekleurde bestand-
deelen uit de plant. De in groote hoeveelheid in de oplossing mede
aanwezige ongekleurde bijmengsels behoeft men niet te verwijderen,
zij vormen geen practisch bezwaar voor de meting ¹.

De eerste quantitatieve bepalingen van plantenpigmenten werden
in 1873 door Sorby verricht, nadat hij ontdekt had, dat de in water-
onoplosbare plantenkleurstoffen, die oplosbaar zijn in zwavelkoolstof,
onderling gescheiden kunnen worden door hun zwavelkoolstofoplossing
in geëigende verhouding te mengen met alcohol en water. Allereerst
maakte hij de plantendeelen goed fijn, droogde hen een weinig en
extraheerde daarop onder verwarming met verdunden alcohol. Na
bekoeling van dit extract schudt hij met een flinke hoeveelheid
zwavelkoolstof, waarbij alle pigmenten met uitzondering van een deel
van het chlorophyll en het fucoxanthine in genoemd oplosmiddel
overgaan. De overblijvende alcoholische kleurstofoplossing wordt

1nbsp; Dat dit juist is werd vastgesteld door een sterk carotinehoudend petroleum-
aether extract uit een onzer groenten te meten in verschillende verdunningen
met zuiveren petroleum-aether gemaakt. Het carotine-gehalte gevonden bij de
spectrocolorimetrische bepaling kwam steeds overeen met de berekende waarde.

dan van de zwavelkoolstof afgepipetteerd en daarop nog herhaalde
malen opnieuw met dit oplosmiddel uitgeschud, ten slotte ingedampt
en dan nogmaals met CSg behandeld. Nu worden de vereenigde
zwavelkoolstoffracties op hun beurt weer met alcohol uitgeschud,
waardoor Sorby ten slotte alle chlorophyll kon verwijderen en alleen
zijn „oranje Xanthophyllquot; (d.i. carotine met xanthophyll) in zwavel-
koolstofoplossing overhield. Sorby waarschuwt er uitdrukkelijk voor
al deze bewerkingen uit te voeren met buitensluiting van sterk dag-
hcht, daar anders een deel der kleurstoffen kan ontleden. Daar het
hem niet mogelijk was voor alle kleurstoffen een chemische scheiding
aan te brengen, bepaalde hij hun gehalte volgens een door hem zelf
bedachte en uitgewerkte photochemische analyse. Door een reeks
van voorafgaande onderzoekingen had hij eerst de absorptiespectra
van verschillende plantenpigmenten afzonderlijk leeren kennen en
vastgelegd door middel van een zelf geconstrueerd apparaat voor
micro-spectraalanalyse (Sorby (i, 2) ). Voor een bepaalde planten-
kleurstof kende hij dus de hgging der bijbehoorende absorptiebanden.
In verschillende oplossingen van een zelfde pigment bepaalde hij nu
de relatieve sterkte der kleurstof door zoodanig te verdunnen, dat de
intensiteit hunner microspectroscopisch waargenomen absorptie-
spectra, gelijk was. Door nu de sterkte van een dier oplossingen wille-
keurig op 100 te stellen, kon hij uit de volumina, die benoodigd waren
om in andere oplossingen een gelijke bandintensiteit te bereiken, tot
een relatieve waardebepaling komen, hij voerde wat hij zelf noemt een
„Comparative quantitative analysisquot; uit. Zijn methode stelde hem
nu ook in staat daar, waar hij chemisch geen scheiding der pigmenten
kon aanbrengen, toch in hun mengsel de relatieve quantiteit der com-
ponenten te bepalen, door achtereenvolgens de intensiteit der bij-
behoorende bandenspectra in de te vergelijken oplossingen gelijk te
maken. De beperkte bruikbaarheid van dergelijke relatieve bepalingen
zag Sorby zelf wel in en hij heeft dan ook niet nagelaten te zoeken
naar houdbare standaardkleurstofoplossingen.

Arnaud (®), die zooals wij reeds eerder vermeldden het gele in water
onoplosbare pigment uit de bladeren samenvatte onder den naam
„Carotinequot;, voerde, om dit pigment te bepalen, in 1887 de colorime-
trische methode in. Hij droogde de bladeren in vacuo, omdat hij bij
temp.verhooging aan de lucht voor ontleding der kleurstof vreesde
en extraheerde nu 20 gr. van deze gedroogde bladeren met i liter
petroleumaether gedurende 10 dagen bij kamertemp, nu en dan
schuddend. Voor de bepaling neemt hij 100 cc. van het aldus verkregen
extract laat dit verdampen bij gewone temp. en neemt het residu
op in een kleine hoeveelheid zwavelkoolstof. In een Duboscq colori-
meter vergelijkt hij nu de kleur met die van een carotineoplossing van
bekende sterkte nl. 10 mgr. op i liter CSg. De bepalingen van Arnaud
zijn niet juist, niet alleen, omdat hij geen verschil tusschen carotine
en xanthophyll maakt, maar ook omdat men, gelet op het feit, dat pas
in de laatste jaren is gebleken welke pijnlijke voorzorgen men moet
nemen om een werkelijk zuiver carotinepraeparaat te verkrijgen,
gevoeglijk mag aannemen, dat zijn standaard-carotine verre van rein

Ville, die in 1889 den invloed van de bemesting op het kleurstof-
gehalte der planten naging, verrichtte daartoe eveneens quantitatieve
bepalingen van carotine (carotine xanthophyll) en van chloro-
phyll. Het drogen der plantendeelen en de extractie voert hij uit zooals
Arnaud deed, de colorimetrische bepaling wijzigde hij echter door
een empirische kleurenschaal te vervaardigen. Hij stelde de kleur
van een carotineoplossing, verkregen uit een bepaalde hoeveelheid
bladeren van de te onderzoeken planten, die gegroeid waren op een
veld, dat volgens hem een soort eenheidsbemesting had ondergaan,
willekeurig op 100 en verkreeg, door een aantal verdunningen van deze
zwavelkoolstof-carotinoidoplossing te maken, een kleurenschaal, die hij
vastlegde door papierstrookjes in dezelfde tinten te kleuren. Deze
empirische schaal gebruikte hij nu verder voor zijn metingen.

Monteverde en Lubimenko verrichtten evenals Sorby spectro-
metrische bepalingen der plantenkleurstoffen. Zij gebruikten hiervoor
buitengewoon kleine hoeveelheden, niet meer dan 100 mgr., versche
bladeren. Daar hun oorspronkelijk werk alleen in het Russisch schijnt
verschenen te zijn, ontleen ik hun techniek aan de beschrijving, die
Palmer (ƒ) hier van geeft. Zij macereerden deze kleine hoeveelheid
bladeren in een mortier met alcohol. Afgemeten hoeveelheden van dit
extract werden dan behandeld met een sterke barytoplossing, waar-
door alle kleurstoffen zouden worden neergeslagen. Na eenigen tijd
Wordt het neerslag afgefiltreerd en daarna geëxtraheerd met absoluten
alcohol, waardoor nu alleen de carotinoiden in oplossing zouden gaan,
die zij dan verder op de gebruikelijke wijze volgens de tweephasen-
niethode scheiden. De meting geschiedt nu zoo, dat zij een 0,001%
standaard-carotine oplossing maken, die zij in een cuvet in een zoo-
danige laagdikte voor hun spectrophotometer brengen, dat de absorp-
tiebanden van het pigment juist even zichtbaar worden. Voor de te
rneten carotineoplossing bepalen zij nu de laagdikte, waarbij een ge-
lijke intensiteit der absorptiebanden in den spectrometer wordt ver-
kregen. Uit de verhouding der laagdikten van standaard- en onbekende
oplossing berekenen zij dan het carotinegehalte. Palmer zegt van
deze methode, dat hij niet overtuigd is, dat door den absoluten alcohol
een quantitatieve extractie van het carotine uit het barytneerslag
Wordt bereikt, en wijst in dit verband op de veel lagere waarden, die
Monteverde en Lubimenko bij een aantal planten voor het carotine-
gehalte vonden, vergeleken met de waarden, die Arnaud opgeeft.
Ofschoon de opmerking van Palmer, wat betreft de vermoedelijke on-
volledige extractie wel juist zal zijn, is zijn verwijzing naar de ongelijke
resultaten met Arnaud volkomen onjuist, daar laatstgenoemde
carotine niet afzonderlijk, maar te zamen met xanthophyll bepaalde.
Op grond van eigen ervaringen met de verzeeping van chlorophyll
opgedaan, meenen wij, dat bij de methode der beide Russische onder-
zoekers groote kans bestaat, dat door den absoluten alcohol een deel van
het niet volledig verzeepte chlorophyll wordt opgenomen, hetgeen
tot groote fouten bij de spectrophotometrische bepaling aanleiding

geeft, die wel is waar in tegengestelden zin liggen als de door Palmer
aangegeven mogelijke fout, maar de geheele bepaling nog meer onzeker
maken.

willtätter, die door zijn vele en diepgaande studies, met tal van
zijn leerlingen ondernomen, als het ware een nieuwe aera in het
plantenpigmentonderzoek heeft ingeluid, legde in dit veelomvattende
werk ook voor het carotineonderzoek de basis, waarop onze huidige
kennis van dit pigment is opgebouwd. De quantitatieve bepaling der
gele plastiden-pigmenten was de vrucht van een breed opgezet onder-
zoek, dat hij in zijn bekende boek heeft neergelegd (Willstätter
en Stoll). Zij voeren bij de bepaling een strenge scheiding door
tusschen carotine en xanthophyll. Versehe bladeren worden in hoeveel-
heden van 40 gr. ongedroogd aan een voorextractie met verdund
aceton onderworpen. Daartoe worden zij in een schaal met 50 gr.
40% aceton overgoten en met 100 gr. kwartszand zoolang gemace-
reerd tot een tamelijk droge brij is ontstaan. Nadat deze brij met
nogmaals 100 cc. nu 30% aceton is omgeroerd wordt het aceton
in een Buchner-filter door een dunne talklaag afgezogen en de brij in
het filter nagewasschen met 100—200 cc. 30% aceton, totdat dit
kleurloos afloopt. Nu wordt de bladmoesbrij verder met onverdund
aceton gemacereerd en aan het einde daarvan wordt aan het extractie-
middel 5—10% water toegevoegd. Ten slotte krijgen zij een totaal
volume van 400—600 cc. acetonextract. De bedoeling van de voor-
extractie is om in water oplosbare kleurstoffen te verwijderen en moge-
lijke enzymewerking te voorkomen; Carotinoide bladpigmenten zouden
daarbij niet worden verwijderd. Het geheele acetonextract wordt dan
bij hoeveelheden van 100-^200 cc. uitgegoten in 200—250 cc. aether en
na iedere toevoeging het aceton met gedestilleerd water wegge wasschen.
Eindelijk wordt de rest van het nog aanwezige aceton uit de aether-
oplossing verwijderd door zeer voorzichtig toevoegen van water langs
den wand van den scheitrechter om mogelijke emulsie vorming te
voorkomen. Tenslotte wordt de aetheroplossing met watervrij natrium-
sulfaat gedroogd en gefiltreerd in een maatkolf van 200 cc. inhoud,
die verder met aether tot zijn merk wordt aangevuld. De eene helft
van deze aetheroplossing der gezamentlijke pigmenten, bestemmen
zij voor de bepaling van het chlorophyll, de andere helft voor het vast-
stellen van het gehalte aan gele plantenkleurstoffen. In dit laatste
deel verwijderen zij het chlorophyll door het te verzeepen met 2 cc.
van een geconcentreerde methylalcoholische oplossing van kaliloog. De
scheitrechter, waarin deze bewerking plaats vindt, wordt aanvankelijk
met de hand, vervolgens gedurende | uur met de schudmachine be-
wogen. Meestal zien zij dan, na een oogenbhk rustig staan, ontmenging
plaats vinden in een bovenste helder gele aetheroplossing en een
groen gekleurde benedenste alcohollaag, die de chlorophyllzeepen
bevat. Is de aetheroplossing nog groenachtig gebleven, dan is dit een
bewijs, dat nog niet alle aanwezige chlorophyll verzeept was en wordt
dit proces nogmaals herhaald. Ten slotte worden alcohol- en aether-
phasen gescheiden en daar de alcohol met de verzeepte chlorophyll-
resten nog wat Carotinoide kleurstof kan bevatten, wordt deze

oplossing wederom één of meermalen met een weinig aether uitgeschud.
De samengevoegde aetherfracties worden eindelijk ter verwijdering van
de laatste, mogelijk nagebleven, sporen chlorophyll weer met wat
looghoudend water gewasschen en daarop deze resten met de loog
verwijderd door 2 maal nawasschen met zuiver water. In vacuo wordt
vervolgens bij gewone temp. de aetheroplossing tot op eenige cc.
ingedampt en de rest, ter fractioneering van het aanwezige carotine
en xanthophyll, met 80 cc. petroleum-aether in een scheitrechter
overgebracht. Deze petroleum-aetheroplossing wordt nu ter scheiding
van de beide carotinoiden uitgeschud, eerst met 100 cc. 85%, dan
met 100 cc. 90% en ten slotte 2 maal met 50 cc. 92% methylalcohol.
De zoo verkregen methylalcoholische xanthophyll-oplossing wordt
vermengd met 130 cc. aether en daarop wordt door langzaam toevoegen
van water het xanthophyll uit den alcohol overgevoerd in den aether.
Zoowel deze xanthophylloplossing als de petroleum-aetheroplossing
van het carotine, worden door 2 maal wasschen met water van nog
aanwezigen methylalcohol bevrijd en dan ieder gefiltreerd in een maat-
kolf van 100 cc. inhoud. Somtijds zijn de oplossingen doordat zij water
in fijn verdeelden toestand bevatten, troebel; met een weinig absoluten
alcohol kunnen zij gemakkelijk opgehelderd worden. Na aanvulling
der kolven met aether in het eene, met petroleum-aether in het andere
geval, zijn beide oplossingen gereed voor de bepaling van hun gehalte
aan carotine en xanthophyll.

De wijze, waarop Willstätter c.s. de bepaling van carotine en
xanthophyll verrichtten, zal later in § 6 van dit Hoofdstuk worden
behandeld.

Scherz (®) heeft de methode van Willstätter eenigszins gewijzigd.
Ook hij onderzoekt de bladeren in verschen toestand, omdat hij meent,
dat bij drogen de pigmenten ontleed worden. Hij hakt 10 gr. versche
bladeren fijn en wijst er met nadruk op, dat het volkomen vernielen
van de weefsels een zeer voorname factor is voor een goede quantita-
tieve extractie. Daarna wrijft hij onder toevoeging van wat soda
ter neutralisatie der plantenzuren het gehakte bladmoes verder fijn
met kwartszand. Meestal laat hij een voorextractie met verdund
aceton achterwege; aan de vernietiging van enzymen schijnt hij niet
zoo veel waarde te hechten en de water-oplosbare pigmenten schijnen
hem geen last te geven, wat zeer begrijpelijk is, omdat zij tijdens de
bewerking van zelf verdwijnen. Als nu de bladeren droog zijn fijn
gewreven, voegt Scherz zuiver aceton toe en herhaalt hiermede de
maceratie om vervolgens in een Büchner filter over filtreerpapier te
filtreeren en dan over het filter zoolang met aceton na te wasschen tot
deze kleurloos afloopt. Tot zoover wijkt zijn werkwijze niet zoo veel
van die van Willstätter af, maar nu zet Scherz de extractie voort
met 100 cc. aether. Voor de volledige extractie heeft hij 100—250 cc.
aceton en 75—150 cc. aether noodig, maar hij voegt ten slotte nog 50 cc.
aether toe, omdat bij een grooter aethervolume het uitwasschen van
het aceton gemakkelijker gaat. Dit wegwasschen van het aceton
doet hij in een scheitrechter van i liter inhoud; het dient voor-
zichtig te geschieden om zoo min mogelijk aanleiding te geven tot

emulsievorming. Daartoe laat Scherz eerst door een trechter een
kleine hoeveelheid water toevloeien totdat zich een kleurlooze of
slechts zwak gekleurde waterlaag onder in den scheitrechter vormt,
die hij laat wegloopen. Na dit eenige malen herhaald te hebben wascht
hij de aetheroplossing met het water door beide vloeistoffen in den
scheitrechter om te keeren maar niet te schudden. Vormen zich
toch emulsies dan breekt hij die door bij het wasschen NaCl bevattend
water te gebruiken. Om de rest der flavonen en anthocyaninen te
verwijderen meent Scherz nu nog na te moeten wasschen met een
1% sodaoplossing; hij is n.1. bang, dat vooral bij niet verwijderen
der flavonen, die met alkali, zooals later bij de verzeeping gebruikt
wordt, diep gele oplossingen geven, fouten bij de meting zuUen ont-
staan. Deze phase in de bewerking is ons niet geheel duidelijk, immers
de flavonen en anthocyaankleurstoffen zijn wateroplosbaar en ver-
dwijnen vanzelf door het herhaalde uitwasschen, wat reeds geschied
is en bij de verdere bewerking nog zal gebeuren. Dergelijke kleurstoffen
troffen wij bijzonder sterk aan bij de carotinebepaling in vruchten, hun
verwijdering ging steeds gemakkelijk en volledig zonder bijzondere
maatregelen daarvoor te treffen.

De aetheroplossing der 4 plastiden pigmenten brengt hij nu in een
flesch van 250 cc. inhoud en voegt 10—25 cc. verzadigde methyl-
alcoholische kaliloog-oplossing toe, schudt flink door en zet nu ter
volledige verzeeping de flesch tot den volgenden dag in de ijskast.
Daags daarop is dan alle chlorophyll verzeept en als een laag op den
bodem van de flesch afgescheiden; de bovenste helder gele aetherlaag
bevat dan de carotinoide pigmenten. Scherz deelt mede, dat men zoo
noodig met flink schudden gedurende 15 minuten voor de verzeeping
kan volstaan, hoewel er dan kans bestaat, dat sporen chlorophyll
onverzeept blijven, die later in de xanthophyllfractie overgaan en dan
onbetrouwbare uitkomsten geven bij de colorimetrische of spectro-
colorimetrische bepaling. Hij brengt nu den inhoud van de flesch
over in een scheitrechter en spoelt de flesch eenige malen om met 10—
25 cc. water, dat daarna eveneens in den scheitrechter wordt gegoten.
Na toevoegen van 100 cc. aether schudt men flink om en laat nu 15—
30 minuten staan, dan zal de gele aetherlaag, die carotine en xantho-
phyll bevat, zich afscheiden boven een groene laag van chlorophyl-
linen-zouten, die men laat afloopen. De aether-oplossing wascht men
nu een paar malen met water uit om achtergebleven chlorophyll-
resten te verwijderen. Aan de verdunde alcoholische oplossing met de
chlorophylhnenzouten voegt men zóóveel water toe, dat het volume
ongeveer 75 cc. wordt en schudt nu met 100 cc. aether de daarin nog
achtergebleven resten der gele pigmenten uit, men herhale dit zóó
vaak tot de aether nagenoeg kleurloos is. De verzamelde aether-
fracties worden nu nogmaals met 10—25 cc. verdunde KOH-oplossing
gewasschen om de laatste sporen chlorophyll te verzeepen en daarna
wordt de aether 2 maal met gedestilleerd water gewasschen om de
gevormde chlorophylhnenzouten en het alkah te verwijderen.

De aetheroplossing der beide carotinoiden wordt nu bij 50° C.,
of bij nog lager temp., tot eenige weinige cc. ingedampt en verder onder

verminderden druk de laatste sporen aether verwijderd. Het residu
wordt door middel van iio cc. petroleum-aether en ongeveer 50 cc.
85% methylalcohol in een scheitrechter gebracht. Na flink schudden
laat men den trechter rustig staan tot volkomen ontmenging der lagen,
waarop men de onderste methylalcohohsche laag, die het xanthophyll
bevat, laat afloopen. Het overgebleven xanthophyll wordt uit den
petroleum-aether verwijderd door herhaald schudden met methyl-
alcohol, n.1. 2 maal met 25 cc. 85%,! maal met 25 cc. 90% en nog 2
maal met 25 cc. 92% methylalcohol. Is de alcoholoplossing na de
laatste maal uitschudden nog niet kleurloos, dan zette men deze be-
werking met 92% alcohol voort totdat zij kleurloos blijft. Telkens
na het schudden geve men de oplossingen 5 minuten tijd om te ont-
mengen. De petroleum-aether bevat nu alle carotine, de methylalcohol
alle xanthophyll. Aan deze laatste oplossing wordt nu 150—200 cc.
aether toegevoegd, waarop men alles overbrengt in een grooteren
scheitrechter en dan een volume water toevoegt gelijk aan het volume
methylalcohol, schudt flink door en laat 15 minuten staan. Nu is al
het xanthophyll in de bovenste aetherlaag overgegaan, de onderste
methylalcohollaag is kleurloos geworden. Ook hier gebruikt Scherz,
indien hij last heeft van emulsievorming, 10 cc. van een verzadigde
oplossing van NagSOi of NaCl. Den verdunden methylalcohol schudt
hij nu nogmaals met aether uit en laat hem dan wegloopen. De
vereenigde aetherfracties worden 2 maal met gedestilleerd water ge-
Wasschen ter verwijdering van den achtergebleven methylalcohol
en dan onder verminderden druk tot ongeveer 50 cc. ingedampt. Dit
residu brengt Scherz nu weer over in een scheitrechter, voegt aether
toe en daarop een weinig water om mogelijke sporen methylalcohol,
van den aether te scheiden. Deze laatste bewerking is ons niet duide-
lijk, het indampen van een aetheroplossing van xanthophyll is met het
oog op ontleding van dit carotinoid buitengemeen gevaarlijk, terwijl
de aanwezigheid van methylalcohol in geen enkel opzicht, bij welke
colorimetrische bepaling ook, hindert. De oplossing wordt nu in een
maatkolf gebracht en tot 100 cc. met aether aangevuld. Is ook deze op-
lossing door de aanwezigheid van sporen water niet helder, dan kan
men de troebehng opheffen met enkele druppels absoluten alcohol.

De petroleum-aether oplossing van het carotine wordt 2 tot 3 maal
met gedestilleerd water gewasschen om den bij het verwijderen van het
Xanthophyll opgenomen methylalcohol te verwijderen. Om het water
zich volledig uit de oplossing te laten afscheiden laat men haar ge-
durende eenigen tijd rustig staan of wel men droogt haar door over
Watervrij NagSOi te filtreeren in een maatkolf, die daarna tot zijn
merk (100 cc.) wordt aangevuld. Ook de carotineoplossing is thans
gereed voor de meting.

Steche bracht in de beschreven methodiek enkele kleine wijzi-
gingen. Terecht zag hij in, dat de flavonen van zelf tijdens het
uitwasschen der oplossingen worden verwijderd, hij laat dus de door
Willstätter aangeraden voorextractie met verdund aceton steeds
Weg. Hij voegt aan het waschwater evenwel soda toe in de meening
hierdoor de in water oplosbare pigmenten beter te kunnen verwijderen.

Het chlorophyll verzeept hij door driemaal achtereen de oplossing der
plantenpigmenten te schudden met 5 cc. verzadigde oplossing van
kaliloog in methylalcohol. Om het aceton te verwijderen en daarbij
emulsie vorming te voorkomen, gebruikt hij een 1% KCl oplossing,
waarmede hij 5 maal met 100 cc. wascht en daarna nog eenmaal
met 100 cc. 3% KCl.

Peterson volgt een eigen techniek om het carotine en xanthophyll
te scheiden. Evenals de vorige onderzoekers dampt hij de aether-
oplossing van de beide carotinoiden in en brengt dit residu nu met
zoo weinig mogelijk petroleum-aether en 75 cc. 85% methylalcohol
over in een scheitrecher. Deze scheitrechter plaatst hij nu in een
waterbad van 45° C. en verdampt den petroleumaether door een
zwakken luchtstroom er overeen te leiden. Als aUe petroleum-aether
tot op een kleine rest na verdampt is neemt hij den trechter uit het
waterbad en laat deze rest nu ook verdampen door den scheitrechter
met de hand rond te draaien. Het carotine verzamelt zich dan langs
den glaswand of drijft in dunne vlokken op den methylalcohol, hij
lost dan het neergeslagen (zeer onzuivere) carotine weer op in 5-7 c.c.
petroleum-aether en verdampt dit nogmaals op de laatst vermelde
wijze. Hij laat nu de methylalcoholische oplossing van het xanthophyll
afloopen op een hard filter en zegt dat de carotinevlokken daarbij voor
het grootste deel aan den glaswand van den scheitrechter blijven
hangen, als het afloopen ten minste voldoende langzaam geschiedt.
Kleinere medegevoerde vlokjes worden door het filter tegengehouden.
Om de laatste sporen xanthophyll te verwijderen wordt het in denschei-
trechter achtergebleven carotine nu opgelost in 5 c.c. petroleumaether
en 50 c.c. 85% methylalcohol toegevoegd, daarna wordt de petroleum-
aether verdampt en de methylalcohol toegevoegd aan de vorige
hoeveelheid. Dit proces wordt herhaald totdat de methylalcohol
kleurloos afloopt. De vereenigde methylalcohol-fracties worden in
een maatkolf van 200 c.c. inhoud verzameld en de kolf met 85%
methylalcohol tot het merk aangevuld. Hij brengt het xanthophyll
niet over in een ander oplosmiddel, maar meet direct in den verdunden
methylalcohol.

De carotinevlokken, die in den scheitrechter waren achtergebleven,
lost hij op in petroleum-aether en filtreert door het zelfde filter dat
de door den methylalcohol medegevoerde kleinere carotinedeeltjes
had opgevangen, die dus op deze wijze nog mede opgelost worden.
Het filtraat wordt opgevangen in een maatkolf van 100 c.c. inhoud,
ook de carotineoplossing is thans gereed voor de meting. Hoe Peterson
de meeting uitvoert deelt hij niet mede.

De voordeelen, die hij meent met deze eigenaardige methodiek te
zullen bereiken, zijn volgens hem vooral hierin gelegen, dat hij de vor-
ming van emulsies ontgaat en dus verlies aan pigment hierdoor voor-
komt. Zijn methode zou uitkomsten geven, die zich goed laten verge-
lijken met die, verkregen volgens Willstätter of Scherz. Wij meenen
te mogen betwijfelen of zijn methode wel het voordeel geeft, dat Peter-
son zich ervan voorstelt. Vooral ook in het meten van het xanthophyll
direct in de alcohohsche oplossing, schuilt, naar onze ervaring, een

groot gevaar. Is n.1. de verzeeping van het chlorophyll niet volkomen
geweest, hetgeen nog al eens wil voorkomen, dan gaat dit onverzeepte
chlorophyll bij de scheiding van de beide carotinoiden geheel mede
over in den alcohol en geeft dan bij de xanthophyllbepahng door zijn
groene kleur groote fouten, die, zooals wij in verschillende gevallen
konden nagaan, wel tot 30% te groote waarden voor dit pigment
kunnen geven. Onder § 5 van dit Hoofdstuk zullen wij hierop terug
komen.

Wij meenen met dit korte overzicht voldoende te hebben weerge-
geven, dat de bepaling van het carotine-gehalte in plantenmateriaal
inderdaad niet eenvoudig is. Voor een goed overzicht kan men het
samenstel van bewerkingen, dat hiertoe noodig is, het best in eenige
afzonderlijke, opvolgende phasen indeelen, die elk voor zich een
eenigszins afgegrensd geheel voorstellen. Bij ons onderzoek hebben wij
m elk dier onderdeelen wijzigingen aangebracht en onderzocht of
daarmede verbetering of vereenvoudiging in de methodiek was te ver-
krijgen.

De in verschillende onderdeelen ingedeelde bewerking zullen wij
thans achtereenvolgens in de volgende paragraphen gaan bespreken:

§ 4. de scheiding van het verzeepte chlorophyll van de oplossing
der carotinoiden.

Het is een algemeen bekend en in den zomer overal om ons heen
pmakkelijk waar te nemen feit, dat de kleurstoffen in de niet meer
levende plant spoedig vernietigd worden. De photoactinische werking
van het licht en het oxydatieve proces der luchtzuurstof, die beide de
pigmenten ontleden, spelen daarbij een belangrijkere rol dan de extrac-
tieve werking van regen en dauw op de in water oplosbare kleurstoffen
Van planten en bloemen. Zooals reeds werd vermeld heeft Noack
er op gewezen, dat de invloed van het licht op de in water onoplosbare
carotinoide pigmenten vooral tot uiting komt bij aanwezigheid van
chlorophyll. Voor ons pigment-onderzoek is dit in zooverre van be-
teekenis, dat het een waarschuwing inhoudt, de carotine-bepaling zoo
spoedig mogelijk, nadat de planten van het veld zijn gehaald, uit te
voeren, immers des te geringer is dan de kans, dat de deletair werkende
hchtfactor zich op de uitkomst der bepaling merkbaar kan doen gelden.
Het komt ons het veiligst voor, de groenten na den pluk zoo veel moge-
hjk tegen verdere lichtinwerking te beschutten, zoowel vóór als tijdens
de bewerking.

Het is dus van belang het eerste gedeelte van de bepaling zoo snel
mogelijk uit te voeren. Een vrij groote tijdwinst wordt verkregen door
het materiaal, zooals verschillende onderzoekers dit hebben gedaan,
versch te extraheeren en niet eerst te drogen. Zeer zeker zou dit dan ook
de aangewezen richting voor het onderzoek zijn, als zich daarbij geen
bezwaren van practischen aard deden kennen, die een algemeene bruik-
baarheid dezer methode in beduidende mate in den weg staan. Bij de
groote variatie in carotine-gehalte der verschillende groenten, zou men
bij het minder carotinerijke materiaal om meetbare hoeveelheden van
dit pigment te extraheeren met zeer volumineuse massa\'s der versehe
planten moeten werken, die enorme hoeveelheden oplosmiddel en
glaswerk van onhandelbare afmetingen zouden vereischen.

Practisch is de extractie van versch materiaal alleen mogelijk als
de plant zeer veel carotine bevat, zooals b.v. gele wortelen, boerenkool
etc., maar een algemeen bruikbare methode kan op de extractie van
versehe plantendeelen niet wel gefundeerd worden. Ook de bepahngen
van Monteverde en Lubimenko, die, zooals reeds werd vermeld,
met hoeveelheden van niet meer dan loo mgr. konden werken, zijn
slechts bij zeer carotinerijke bladeren uitgevoerd en bovendien naar
alle waarschijnlijkheid niet geheel betrouwbaar. Men kan ook gemakke-
lijk nagaan, dat met loo mgr. versch materiaal geen behoorlijk nauw-
keurige carotinebepaling verricht kan worden. Stel b.v. dat men
groentenmonsters heeft te onderzoeken, die per Kgr. in verschen
toestand 80, 50 en 30 mgr. carotine bevatten, per 100 mgr. dus over-
eenkomend met 8, 5 en 3 Y van dit pigment. Indien de extractie vol-
komen quantitatief zou verloopen, zou men ten slotte na alle nood-
zakelijke bewerkingen, waarbij evenmin verlies zou mogen voorkomen,
ieder dezer hoeveelheden pigment in een zeker eindvolume petroleum-
aether opgelost verkrijgen. In dit volume moet dan de carotine-con-
centratie gemeten worden. Voor den meest modernen spectrocolori-
meter, d.i. de Pulfrich Stufenphotometer, ligt de grens van toelaatbare
onnauwkeurigheid bij de aflezingen bij ongeveer 0,2—0,5 y carotine
per cc. oplosmiddel, waaruit volgt, dat de eindvolumina der petroleum-
aetheroplossingen bij de 3 vermelde groenten niet grooter zouden
mogen zijn dan ongeveer 40—16; 25—10 en 15—6 cc. Bij behoorlijk
quantitatief werken is het echter practisch onmogelijk de volumina zoo
gering te houden; bovendien zouden de onvermijdelijke verliezen bij de
voor dit soort van bepalingen noodige bewerkingen hier procentsge-
wijze een zoo grooten invloed verkrijgen op de eindwaarden, dat aan de
geheele uitkomst niet de minste waarde meer was te hechten. Zelfs al
laat men als regel een onnauwkeurigheid bij de meting toe als nood-
zakelijkerwijze verkregen wordt bij zoo zwak gekleurde oplossing met
een carotine-gehalte van 0,2—0,5 y per cc., dan nog schijnt ons een
betrouwbare bepahng in middelmatig en laag carotinehoudende
groenten in hoeveelheden van 100 mgr. versch plantenmoes een
onmogelijkheid.

Behalve versch kan men het plantenmateriaal ook gedroogd in
onderzoek nemen. Men heeft dan het groote voordeel, dat de volumina
veel geringer worden en bij laag carotinehoudende groenten kan

men grootere hoeveelheden onderzoeken zonder tot onhandelbare
quanta en volumina te komen.

Het drogen heeft echter ten allen tijde bij de onderzoekers, die zich
met de quantitatieve bepaling der pigmenten hebben bezig gehouden,
weinig waardeering kunnen vinden. Reeds Arnaud wees op de ont-
leding, die het carotine zou ondergaan, als men de plantendeelen zelfs
bij geringe temperatuursverhooging aan de lucht droogde. Door de
zuurstof buiten te sluiten en het drogen in vacuo te doen plaats vinden,
trachtte hij dit bezwaar te ondervangen. Een steun voor zijn opvatting
schijnt het onderzoek van Kohl te geven. Deze verrichtte zijn onder-
zoek juist als Arnaud met het eenige verschil echter, dat hij zijn
materiaal bij ioo° C. droogde. Zijn waarden voor de carotinoidfractie
lagen dan ook 30—50% beneden die van Arnaud.

Willstätter en Utzinger vonden bij door hen zelf gedroogde
brandnetelbladeren een verlies van 4—5% chlorophyll door het
drogingsproces veroorzaakt. Het chlorophyll bleef echter goed intact,
zelfs bij bladeren, wier chlorophyll zich overigens slecht bleek te be-
waren, als zij evenals Arnaud in een vacuum-exsiccator boven
zwavelzuur droogden. Elisabeth Goerrig droogde bij niet hooger
temperatuur dan 40° C., gebruikte geen vacuum-exsiccator, maar
beschutte de bladeren tijdens het drogen tegen de inwerking van het
licht. Zij ging den invloed van de temperatuur en het licht tijdens het
drogen na. Fagusbladeren droogde zij onder normale en extreme
verhoudingen van temperatuur en licht. Zij verkreeg de volgende ge-
gevens, waarbij de carotine en xanthophyllwaarden in willekeurige
eenheden zijn uitgedrukt:

Carotine schijnt dus minder gevoelig te zijn tegen temperatuurs-
verhooging dan xanthophill, maar in de bladeren is het gevoeliger voor
licht. Scherz vond, dat bij lage temperatuur in het donker xantho-
phyll sneller oxydeert dan carotine en evenals Goerrig, dat carotine
daarentegen bij kamertemperatuur in het zonlicht sneller oxydeert
in zijn oplossing dan xanthophyll.

Zeer waarschijnlijk kunnen dus ook photolytische processen tijdens
het drogen der groenten invloed hebben op het te vinden carotine-
gehalte. Noack vond later dan ook, dat in de doode chloroplasten zich
photochemische oxydatie-processen blijven afspelen en in het bijzonder
kon hij waarnemen, dat ook carotine aan die photoreacties deelnam.
Hij vond, dat fluoresceerend chlorophyll ook buiten het blad, in het
hcht in korten tijd carotine ontleedt en iets minder snel het xantho-
phyll. Zelf hebben wij in een proef kunnen bevestigen, dat een carotine-
oplossing, waaraan een weinig chlorophyll was toegevoegd in het licht

Uit de gegevens zou dus kunnen blijken, dat in de plant xanthophyll
gevoeliger is voor gewone chemische oxydatie door de zuurstof dan
het carotine, welk proces bij verhooging van temperatuur de gewone
toeneming van reactiesnelheid ondergaat, maar dat carotine daaren-
tegen gevoeliger is voor photochemische oxydatie. Het is o.i. mogelijk
te achten, dat in dit bijzonder gedrag der beide carotinoiden niet on-
belangrijke consequenties voor hun plantenphysiologische functies
liggen opgesloten, waarop wij hier echter niet verder kunnen ingaan.

Bij ons onderzoek nu werd het plantenmateriaal op verschillende
wijzen gedroogd, echter steeds onder voorzorg, dat het drogen in het
donker plaats vond. Onder deze voorwaarde kon noch van het drogen
zelf, noch van de aangewende temperatuur (kamertemp. en 45° C.),
noch van de toetreding van de lucht een belangrijke invloed op het
carotine-gehalte worden vastgesteld, wel echter op het xanthophyll-
gehalte. In zooverre komen dus onze gegevens met die van Goerrig
overeen.

Gekookte en daarna fijngehakte Boerenkool werd in een warmen
luchtstroom van 45° C. in het donker gedurende 24 uren gedroogd,
daarnaast werd een gedeelte van dezelfde gekookte groente gedurende
een even langen tijd in een vacuum-exsiccator boven PgOg gedroogd,
eveneens in het donker. De volgende tabel geeft de resultaten weer:

Uit de tabel blijkt, dat het drogen met phosphorpentoxyde wel
vollediger geschiedde dan met warme lucht, maar dat het carotine-
gehalte der versehe groente in beide gevallen gelijk werd gevonden;
niet daarentegen het xanthophyllgehalte. Voor carotine bedraagt
de afwijking tusschen hoogste en laagste waarde 5,6%, voor xantho-
phyll echter 25,4%. Daar de fout van de bepahng op omstreeks 13%

is te schatten blijkt, dat het drogen in een warmen luchtstroom
gedurende 24 uren practisch niet van invloed is op het carotine-gehalte,
maar zich wel in zeer beduidende mate op het aanwezige xanthophyU
doet gelden. Nu moet er hier wel op gewezen worden, dat petroleum-
aether geen goed extractiemiddel is gebleken voor de quantitatieve
verwijdering van het xanthophyll uit de planten, maar onze ervaring
leerde tevens, dat bij gelijke techniek de relatieve hoeveelheden
xanthophyll, die uit hetzelfde materiaal met petroleum-aether worden
geëxtraheerd geen grootere verschillen vertoonen dan die, welke uit
de fout van de bepaling kunnen verklaard worden. De gevonden
xanthophyll-waarden blijven dus wel onderling vergelijkbaar, hoewel
zij geen beeld geven van de quantitatieve verhoudingen van dit pig-
ment in de groenten.

Daar het onderzoek hier een groente gold, die vooraf gekookt
was, meenden wij ook een onderzoek te moeten instellen bij een on-
gekookte groente. Ongekookte spinazie werd versch onderzocht en
vergeleken met deze zelfde groente, nadat zij gedroogd was bij 45° C.
Versche groente kan echter niet met petroleum-aether geëxtraheerd
worden, derhalve werd de extractie in beide gevallen uitgevoerd met
85% aceton. Hierdoor werd tevens het voordeel verkregen, dat nu ook
een goed oplosmiddel voor xanthophyll werd gebruikt. De resultaten
zijn in de volgende tabel samengevat:

Het gevonden verschil in carotine-waarden bedraagt hier wel is
Waar 11,7%, doch is nog te verklaren uit de vermoedelijke fout, die
de methode aankleeft, bij xanthophyll is dit verschil niet minder dan
34.2 % en overtreft zeker de fout van de bepaling. In de vorige proef
het veriies aan xanthophyll 19,8% grooter dan aan carotine,

*) Deze schatting is natuurlijk vrij willekeurig en aan den hoogen kant.
Ue fout van de spectrocolorimetrische bepaling bedraagt 3%. Volgens de ver-
kregen ervaring uit duplobepalingen kan de grootste fout, afliankelijk van de
Dewerking van het materiaal, op ongeveer 10% geschat worden, hoewel zij bij
eenige routine in de techniek meestal wel minder zal zijn. Zij is het grootst bij
sterk emulsievormende extracten, zooals vooral bij erwten en bloemkool werd
ondervonden.

in laatstvermelde proef 22,5%. Deze cijfers wijzen er in de eerste plaats
op, dat de deletaire werlang van de luchtzuurstof sterker invloed
heeft op xanthophyll, dan op carotine, maar ook, dat deze invloed
op carotine bij het drogen bij 45° C. practisch van geen beteekenis is.
Dit laatste wordt nog duidelijker in het licht gesteld door een volgende
proef, waarbij dezelfde spinazie als boven vermeld volgens Soxhlet
met petroleum-aether geëxtraheerd, zoowel na koken en drogen bij
45° C., als ongekookt bij deze temp. gedroogd, de volgende carotine-
waarden gaf:

Hieruit volgt, dat het verschil in carotine-gehalte tusschen versch
onderzochte spinazie (tabel: 2) en dezelfde Spinazie na koken en
drogen (tabel: 3) slechts 3% bedraagt.

Op zeer snelle wijze kan de groente gedroogd worden door haar in
afgewogen hoeveelheid versch samen te wrijven met watervrij Na2S04.
In het algemeen heeft men hiervoor 5 tot 6 maal de gewichtshoeveel-
heid der te drogen groente aan zout noodig. De met deze methode
door ons met plantenmateriaal verkregen uitkomsten waren niet zeer
bemoedigend. Was het materiaal voor de vermenging met het zout
gemakkelijk zeer fijn te malen, dan waren de uitkomsten beter dan
waar dit b.v. met harde vruchtenschillen niet goed mogelijk was.
Zooals aan het einde van Hoofdstuk II reeds werd medegedeeld kan
men de waargenomen verschillen niet op rekening stellen van een meer
of mindere adsorptie der carotinoiden door het zout. De proeven hierop
betrekking hebbende werden met groenten en met geconserveerde
vruchten uitgevoerd:

Bij Raapstelen bedraagt het carotineverschil ongeveer 12%, bij
Kropsalade 6,5%. Bij de onderzochte vruchten waren de uitkonisten
echter geheel onbruikbaar:

Xanthophyll-
gehalte, in mgr.
per 100 gr.
Conserven:

Carotine-gehalte
in mgr. per loo gr.
Conserven:

afwezig,
afwezig.

0,23

0.39

0,48
1,64

0,11
0,44

Vooral bij de vruchten ziet men dus inderdaad groote verschillen
in de gevonden carotine-waarden, die zeer ten ongunste uitvallen van
het drogen met natrium sulfaat. Voor de quantitatieve bepaling van
carotine lijkt deze methode dan ook minder geschikt; wij hebben er
bij ons onderzoek verder geen gebruik van gemaakt.

Het drogen kan het best geschieden in het donker in een warmen
luchtstroom. Om dit proces te bespoedigen en tot den gewenschten
graad te doen voortschrijden, is het aangewezen de gekookte massa

eerst fijn te hakken. In een dunne laag spreidt men dan de groente in
een geëmailleerden bak uit,die nu in een lichtdicht gesloten droog-
apparaat werd gebracht. Dit apparaat in het Hygiënisch Laboratorium
te Utrecht in gebruik is geconstrueerd volgens de aanwijzingen van
SoRDELLi. Het bestaat uit een lichtdichte metalen kast, waarin van
boven door een electrischen waaier lucht wordt gevoerd over een groot
electrisch verwarmd gloeilichaam. Voor het doorlaten van de ver-
warmde lucht en het plaatsen der bakken met het te drogen materiaal
zijn eenige platen aangebracht, die op bijzondere wijze zijn ingericht.
De openingen in de platen om de lucht door te laten zijn niet van gaat-
jes, maar van korte metalen pijpjes voorzien, die maken, dat de warme
lucht, die van boven wordt aangevoerd zich niet onmiddelliik naar
alle richtingen verspreid, maar als zuiltjes van warme lucht op het te
drogen materiaal wordt geblazen. De bakken worden geplaatst op
geperforeerd metalen verhoogingen, die zóó op de platen zijn aange-
bracht, dat de lucht weer gedwongen wordt onder de droogbakken
door metalen pijpjes naar een lager gelegen compartiment te ontwijken,
waarin de volgende bak is geplaatst. De temperatuur van de warme
lucht kan geregeld worden. Op deze wijze verkrijgt men een zeer snel
drogen, vooral van vloeistoffen. Meestal was de groente in 18—24
uren zóó droog, dat zij tot een fijn poeder kon gemalen worden, daarna
werd dan nog door een uiterst fijne zeef gezeefd. Voor latere bereke-
ningen moet het gewicht van de droogrest nauwkeurig bepaald worden.

Het verkregen stoffijne groentepoeder werd steeds onmiddellijk
aan extractie onderworpen en tegen hcht beschut.

In enkele gevallen bleef de te drogen massa taai en wilde, ondanks
dagen lang overleiden van warme lucht,niet geheel droog worden.
Dan was het natuurlijk ook onmogelijk het materiaal tot poeder te
malen en zagen wij ons genoodzaakt de extractiemethode te wijzigen,
waarop wij in de volgende paragraaf zullen terug komen. Dit ongemak
deed zich voor bij alle sterker suikerhoudend materiaal, in de eerste
plaats bij vruchten en zooals van zelf spreekt, vooral bij de vruchten-
conserven. Bij groenten werd alleen last ondervonden met gekookte
gele wortelen. Ook Scherz (3) vermeldt, dat de aanwezigheid van
suiker hem moeite veroorzaakte bij het pulveriseeren van wortelen.

In de inleiding werd reeds medegedeeld, dat de opzet van dit onder-
zoek was de groenten te onderzoeken, zooals zij bij den mensch tot
gebruik komen. In de meeste gevallen werd dientengevolge het onder-
zochte materiaal vóór het drogen, gedurende een vastgestelden tijd
met een bepaalde hoeveelheid water, gekookt. De opgaven omtrent
kookduur en hoeveelheid water vindt men in de protocollen vermeld.

Gebleken is, dat het koken op het carotine als zoodanig geen in-
vloed heeft, ook op de extraheerbaarheid van het carotinoid uit de
plant was geen duidelijke invloed aantoonbaar. Willstätter en
Stoll hebben n.1. gewezen op de verandering van den physischen toe-
stand, waarin de pigmenten in de planten voorkomen, tengevolge

van het koken en op een daarmede in verband staande wijziging hunner
extraheerbaarheid door verschillende oplosmiddelen; wij zullen daarop
bij de bespreking van de „Extractie der plantenkleurstoffenquot; in § 2
nog even terug komen.

De volgende gegevens uit onze protocollen kunnen aantoonen,
dat het koken der groente inderdaad niet van invloed is op het carotine-
gehalte:

De cijfers uit de laatste kolom laten zien, dat zoowel bij Spinazie
als bij Raapstelen de gevonden carotine-waarden bij de ongekookte
en gekookte groenten slechts geringe verschillen vertoonen. Bij Spi-
nazie werd, berekend per 100 gr. versche groente, 4,1% minder caro-
tine gevonden in de ongekookte dan in de gekookte groente. Bij de
Raapstelen werd eveneens in de ongekookte groente 4^% minder
van dit pigment gevonden. Waar de fout van de methode zeker grooter
is te schatten, zeggen de gevonden verschillen dus al heel weinig,al
zou misschien in het feit, dat in beide gevallen bij de gekookte groente
iets meer carotine gevonden werd, een kleine aanwijzing te zien zijn
ten gunste van de opvatting van Willstätter en Stoll betreffende
de betere extraheerbaarheid van het pigment na koken van het
plantenmateriaal; zooals gezegd werd, komen wij hierop in § 2 nog
terug.

Ter verdere controle werden dezelfde Raapstelen eveneens met
aceton geëxtraheerd. Het volgende protocolextract toont aan, dat
ook thans het verschil in carotine-waarde tusschen de ongekookte
en gekookte groente onbeduidend was:

Allereerst zij opgemerkt, dat het aanzienlijke verschil in carotine-
gehalte bij de gekookte en ongekookte gedroogde groente hier van geen
beteekenis is, zooals in § 7 nog uitvoerig zal worden aangetoond; het
hangt samen met het verschil in drooggewicht van de groenten vóór
en na koken. De grootte van dit verschil is natuurlijk afhankelijk van
de hoeveelheid in water oplosbare extractiefstoffen, die met het afkook-
water verwijderd worden. Wordt de groente met het afkookwater
ingekookt, zooals dit a.o. het geval was bij de Spinazie, dan wordt
dit verschil van zelf sprekend kleiner dan wanneer de groenten worden
afgekookt in een ruime hoeveelheid water, die bij het afgieten meer
zouten en andere extractiefstoffen meeneemt. In ettelijke gevallen be-
droeg het gewichtsverschil der droogrest van gekookte en ongekookte
groente 20—40%. Tot welke moeilijkheden dit aanleiding kan geven
zal in § 7 van dit Hoofdstuk besproken worden.

Het is van groot belang voor het verkrijgen van zuivere uitkomsten,
dat niet alleen de groenten zoo versch mogelijk onderzocht worden om
ontleding van het carotine te ontgaan, maar men dient er ook tegen te
waken, dat de groente vóór het afwegen van de hoeveelheid, die onder
zocht zal worden, niet eerst met water wordt gewasschen, zooals bij
de meeste groentehandelaren, voor zij de groente gaan verkoopen,
gebruikelijk is. Men krijgt daardoor een zeer aanzienlijke kunstmatige
gewichtsvermeerdering van zeer wisselende grootte, die tot onjuiste
berekeningen aanleiding geeft. Ook hierop komen wij in § 7 uitvoerig
terug.

Ofschoon wel maandschommelingen in het carotine-gehalte der
planten bekend zijn (Scherz) (®) en ook wel verschillen bij door de zon
beschenen- en schaduw-bladeren zijn waargenomen, werd tot dusver
nog geen systematisch onderzoek naar mogelijke dagschommelingen
in het carotinoid-gehalte ingesteld. Men zal o.i. echter veihg doen
rekening te houden met de mogelijkheid, dat het carotine-gehalte
van groenten afkomstig van een veld, dat geruimen tijd aan recht-
streeksche felle zonnestralen was blootgesteld, anders kan zijn dan
wanneer dit gehalte onderzocht wordt als hetzelfde veld een tijdlang
in de schaduw, of zooals \'s nachts geheel in het donker gelegen heeft.
Waar mogelijk doet men het best, de te onderzoeken groente zelf
op een drogen dag te verzamelen van een niet aan de zonnestralen
blootgesteld deel van het veld.

Bij dit onderzoek werd nu een zekere hoeveelheid van de niet
natte en zoo versch mogelijke groente, b.v. 200—500 gr., afgewogen
en op de gebruikelijke wijze d.w.z. volgens de voorschriften van het
kookboek der Amsterdamsche Huishoudschool, gekookt en na van het
overtollige water te zijn ontdaan gedroogd. Groenten die niet gekookt
gegeten worden (Kropsalade), werden voor de carotinebepaling onge-
kookt onderzocht, evenmin werden de onderzochte vruchten gekookt.

Ofschoon, zooals reeds werd vermeld, tal van organische oplos-
middelen met meer of minder gemak de Carotinoide plantenkleur-
stoffen opnemen, beperkt zich de keuze der verschillende onderzoekers
Voor de quantitatieve extractie tot enkele dier oplosmiddelen. Men
vindt het gebruik vermeld van zwavelkoolstof (Sorby) petroleum-
aether (G. Kraus, Arnaud Coward (2)), alcohol (Monteverde
en Lubimenko), al of niet verdund aceton (Willstätter en Stoll,
Scherz) (6), benzol (Willstätter en Mieg), aether (Scherz (®),
Peterson). Alle onderzoekers met uitzondering van Coward verricht-
ten de extractie bij kamertemperatuur.

Bij den aanvang van dit onderzoek stonden wij nu voor de keuze
van extractiemiddel, extractiemethode en extractietemperatuur. Wij
lieten de keuze vallen op de continue extractiemethode volgens
Soxhlet, omdat hierbij het bewerkelijke macereeren van het te onder-
zoeken materiaal vervalt, men de extractie geheel aan zich zelf kan
overlaten en zij bovendien bij iets verhoogde temperatuur verloopt,
wat mogelijk aan het oplossen der gele plantenpigmenten ten goede zou
kunnen komen. Tot nu toe schijnt alleen Katharine Coward (2)
deze methode voor de bepaling der plantencarotinoiden te hebben
toegepast. Voor het onderzoek snijdt zij het plantenmateriaal in
kleine stukjes, voegt dan wat aether toe om mogelijke enzymatische
Processen tot staan te brengen en daarna ongeveer ^ gram Kalium car-
bonaat om het Chlorophyll te ontleden. Vervolgens worden de planten-
deelen met zand en watervrij Na2S04 samengewreven om hen te
Verbrijzelen en tevens te drogen, ten slotte wordt de droge massa in een
Soxhlet apparaat niet minder dan i—5 dagen met petroleum-aether
(Kpt. beneden 40° C.) geëxtraheerd. Zij vermeldt echter op deze wijze
Weinig bevredigende resultaten verkregen te hebben. Ten deele
meende zij dit te moeten toeschrijven aan haar manier van verzeepen
Van het Chlorophyll. Door hierin verandering aan te brengen en tevens
aan den petroleum-aether 20% alcohol toe te voegen werden haar resul-
taten beter, maar, naar het schijnt, toch niet geheel bevredigend,
want zij blijft aanraden het geheele procédé zoo veel mogelijk in een
Ng atmospheer te laten verloopen. Haar zeer afwijkende getallen bij
bepalingen met hetzelfde materiaal verricht mogen nu voor een deel
inderdaad op rekening zijn te schrijven van haar wijze van verzeepen
(vóór de extractie), voor een belangrijk deel moeten zij o.i. ook ge-
Weten worden aan de wijze, waarop zij het carotinoid-gehalte meet. Zij
maakt daartoe gebruik van de door Willstätter aangeraden colori-
metrische methode met Kalium bichromaat, maar vervaardigde een

nieuw geijkte kaart door de kleurdiepte van verschillende verdunningen
van carotine op de kleur eener bichromaatoplossing over te zetten.
In § 6 van dit Hoofdstuk zullen wij nog nader op dergelijke metingen,
die tot groote onnauwkeurigheid kunnen leiden, terugkomen. Waar-
schijnlijk zijn haar onbevredigende resultaten ten deele ook afhanke-
lijk van de onvoldoend fijne verdeeling van het te extraheeren planten-
materiaal, alsmede van den buitengewoon langen extractieduur.

Waar wij in dit onderzoek van het Soxhlet apparaat gebruik
maakten, werd als extractiemiddel petroleum-aether gebruikt met een
kookpunt van 60—80° C. Voor experimenteele doeleinden werd soms
aan genoemd extractiemiddel 20—25% aceton toegevoegd; als dit
geschiedde werd niet de gewone petroleum-aether gebruikt, maar een
destillaat, dat tusschen 56 en 63° C. was opgevangen ten einde in het
mengsel tecomponenten een meer overeenstemmend kookpunt te geven.

Tot de keuze van petroleum-aether werden wij geleid, omdat
andere extractiemiddelen om verschillende redenen ons minder ge-
wenscht toeschenen. Het scheen ons daarbij van weinig belang,
dat petroleum-aether als een minder geschikt extractiemiddel voor
xanthophyll wordt vermeld; ook onze ervaring kwam hiermede over-
een, zooals later uit de proeven zal blijken. Aether werd minder
geschikt gevonden wegens zijn gehalte aan peroxyden, waardoor
vooral bij de continue extractie groote kans moest geacht worden te
bestaan op oxydatie van de aanwezige carotinoiden. Men kan deze
oxydantia wel verwijderen, maar dit compliceert de methode, boven-
dien geeft aether bij de verdere bewerking door zijn laag kookpunt
aanleiding tot technische bezwaren en ten slotte was de hooge prijs
van aether ook een factor, waarmede wij rekening wilden houden
bij onze keuze. Chloroform was onbruikbaar, omdat het steeds de ont-
ledingsproducten HOCI2 en HCl bevat, die beide sterk ontledend op
carotine inwerken. Zwavelkoolstof is ongewenscht door zijn groote
giftigheid en het groote brandgevaar en bovendien, omdat hier in
het Laboratorium bij het reinigen van carotine aanwijzingen waren
verkregen, dat genoemd oplosmiddel misschien niet geheel indifferent
is voor dit pigment en ten slotte, omdat gevreesd werd, dat bij de
verzeeping xanthogenaat zou kunnen gevormd worden, dat door zijn
gele kleur wellicht aanleiding zou geven tot fouten bij de latere me-
tingen van het carotine-gehalte.

Willstätter en Stoll gewagen in hun boek van hun ervaring,
dat een organische stof, die een goed oplosmiddel is voor zekere
plantenkleurstoffen zich voor diezelfde pigmenten een volkomen on-
bruikbaar extractiemiddel kan betoonen, zoolang deze laatsten met
nog zekere andere bijproducten gemengd voorkomen. Zoo zou volgens
hen het droge poeder van bladeren zijn chlorophyll slechts langzaam
afstaan aan alcohol, uiterst langzaam aan aether, chloroform en
aceton, in het geheel niet aan benzol, petroleum-aether en zwavel-
koolstof,gemakkelijk daarentegen aan methylalcohol, hoewel zuiver
chlorophyll in benzol en watervrij aceton gemakkelijk oplost en
onzuiver chlorophyll ook in petroleum-aether. Wanneer een chlorophyll-
houdend blad slechts kort in kokend water wordt gedompeld verandert

reeds zijn kleur, het wordt donkerder groen. Willstätter en Stoll
wezen er nu op, dat spectroscopische metingen aan de absorptiebanden
van het chlorophyll verricht en het gedrag der bladkleurstof tegenover
de verschillende oplosmiddelen het waarschijnlijik maken, dat het
chlorophyll in de chloroplasten der bladeren als een adsorptieverbinding
van een colloid voorkomt. Immers bij vergelijk van de spectra van
chlorophyll in normale en in door kokend water verkleurde bladeren
(in situ) zagen zij in het laatste geval de banden verschoven naar het
ultra-violet, waardoor hun ligging was genaderd tot die, welke wordt
aangetroffen bij echte chlorophylloplossingen in vitro. Willstätter
eri Stoll meenen, dat de verhoogde temperatuur de wasachtige bege-
leidstoffen in de bladeren doet smelten en dat vervolgens het colloidale
chlorophyll in die gesmolten massa moleculair oplost. De physische
toestandverandering van de kleurstof zou dus de oorzaak zijn voor
het veranderde gedrag tegenover bovenvermelde oplosmiddelen;
bij extractie wordt nu het oplosmiddel van het chlorophyll, d.w.z.
de wasachtige producten, geëxtraheerd en daarmede het chlorophyll.
Tot staving hunner opvatting wijzen genoemde onderzoekers onder
meer nog op een analogon, dat zij hierin meenen te zien, dat colloidale
Waterige oplossingen van chlorophyll, hetzij bereid uit bladextracten,
hetzij uitgaande van zuiver chlorophyll, bij schudden met aether of
benzol hun kleurstof niet afgeven, doch na toevoegen van een weinig
zout b.v. chloorcalcium onmiddellijk de geheele hoeveelheid chloro-
phyll aan het oplosmiddel afstaan.

Bij de keuze van een extractiemiddel voor onze gekookte groenten
moesten wij dus ook wel degelijk rekening houden met de mogelijkheid,
dat de extraheerbaarheid der carotinoiden zou blijken veranderd te
zijn en zou het onderzoek zich ook in die richting moeten uitstrekken.
Met het oog op de zoo hinderlijke emulsievorming zou het bovendien
voordeelig zijn als het extractiemiddel zoo min mogelijk ongewenschte
bijproducten mede in oplossing deed gaan. In de eerste plaats was
Wat dit betreft aan het chlorophyll te denken, daardoor werden
benzol en vooral alcohol, dat een uitstekend oplosmiddel voor chloro-
phyll is, als extractiemiddelen uitgeschakeld. Zooals reeds gezegd
Werd, meenden wij in petroleum-aether met een kookpunt van 60—
80° C. een goed extractiemiddel voor het gekookte plantenpoeder
te mogen verwachten. Willstätter en Stoll deelen wel mede,
dat het in de gekookte bladeren veranderde chlorophyll gemakkelijk
in petroleum-aether oplost, in de practijk bleek echter, dat bij sterk
chlorophyll-houdend materiaal toch een belangrijk deel van het groene
pigment in het groentepoeder achterbleef. Overigens kregen wij bij
onze talrijke extracties den indruk, dat de extraheerbaarheid van
dit pigment uit het gekookte plantenpoeder niet altijd gelijk was.

De Soxhletapparaten, die gebruikt werden hadden meestal een
kolfinhoud van loocc.; slechts enkele malen, wanneer het een onderzoek
betrof van materiaal met een zeer laag carotine-gehalte (aardappelen)
en dus een grootere hoeveelheid poeder moest geëxtraheerd worden
om een meetbare carotine-oplossing te verkrijgen, benevens in die
gevallen, waar met watervrij natrium sulfaat was gedroogd, moest

een grooter Soxhlet-apparaat met een kolfinhoud van 250 cc. worden
gebruikt. Het heeft welHcht zijn nut er op te wijzen, dat men niet ver-
geten moet een paar kooksteentjes in de extractiekolven te brengen;
de petroleum-aether vertoont niet zelden kookpuntsvertraging, wat
onaangenaam opkoken tot gevolg heeft bij hervatting van de extractie,
als men deze om de een of andere reden had onderbroken. Wat dit
laatste betreft moge vermeld worden, dat men zonder bezwaar het
Soxhletapparaat gedurende den nacht buiten werking in het donker
kan laten staan om den volgenden dag de afgebroken extractie voort
te zetten. Alleen is het gewenscht de destillatie op een geschikt oogen-
bHk af te breken zóódanig, dat het zich in de extractiehuls bevindende
groentepoeder gedurende den rusttijd geheel onder den petroleum-
aether blijft. Men voorkomt zoodoende aanraking met de lucht en
dus mogelijke oxydatie, terwijl bovendien gedurende den nacht nog
eenige extractie van het plantenpoeder kan plaats vinden. Wij
hebben de extractie steeds bij zwak kunsthcht of gedempt daglicht
uitgevoerd; verschil in uitkomst geeft dit echter niet, zooals het
volgende protocol-extract laat zien:

Extractie bij:

Versch:

21,52
21,20

2,70
2,66

De in het Soxhletapparaat gebruikte hulzen van filtreerpapier
van de firma Schleicher en Schüll kunnen zonder bezwaar verschillende
keeren gebruikt worden. Zij bezitten een diameter van c.m. bij een
lengte van 8 c.m. voor het korte en 11^ c.m. voor het lange model.

Als het toestel werkt is de temperatuur van den petroleum-aether,
die uit den koeler in de extractiehuls druppelt afhankelijk van de
snelheid, waarmede de verdamping en de condensatie plaats heeft,
maar bovendien ook van de plaatselijke verhouding in de opstelling
van het apparaat ten opzichte van de warmtebron. Bij onze extracties
bedroeg de temperatuur in de huls, waarbij dus de extractie plaats
vond, ongeveer 30° C. Wij meenden nu ook te moeten nagaan of het
opvoeren van de extractietemperatuur eenigen invloed had op de
hoeveelheid carotine, die geëxtraheerd kon worden. Het extractie-
apparaat werd daartoe als volgt gewijzigd. Op een Erlenmeyerkolf

van I liter inhoud werd op een met collodium bestreken kurk een koeler
geplaatst; door middel van een koperdraad werd van onderen aan de
kurk een Soxhlet-extractiehuls gehangen en wel zoodanig, dat de
bodem van de huls ongeveer een vingerbreed hing boven het niveau
van de 150 cc. kokende petroleum-aether in de kolf. Wanneer nu de
destillatie op de stoomverwarming was in gang gezet, was de huls
met inhoud van alle zijden omgeven door damp van kokenden
petroleum-aether. De koudere van boven opdruppelende geconden-
seerde petroleum-aether koelde den inhoud van de huls weer af, maar
men zag de vloeistof van boven sneller in de huls druppelen dan van
onder er doorheen loopen, zoodat reeds een deel van den petroleum-
aether weer in de huls verdampte, ten bewijze dat de temp. in de huls
toch vrij hoog was. De extractietemperatuur bedroeg op deze wijze
ongeveer 55° C. Zooals nog blijken zal, heeft het onderzoek echter uit-
gewezen, dat met deze methode geen betere extractie van het carotine
te verkrijgen is dan met het gewone Soxhlet-apparaat.

De hoeveelheden plantenpoeder, die in de hulzen tot extractie
werden gebracht schommelden bij ons onderzoek van i—40 gr. In
het algemeen kan het aan de meer of minder groene kleur van het
poeder te schatten chlorophyllgehalte als een ruwe maat voor het te
verwachten carotinegehalte gebruikt worden (Arnaud) (») en men
kan hierin aldus een aanwijzing vinden voor de hoeveelheid planten-
poeder, die men in de huls zal brengen. Van aardappelen gebruikten
wij voor de extractie 40 gr. van de donkergroene boerenkool o.a. i gr.
Dergelijke kleine hoeveelheden zijn echter niet aan te raden, omdat
de fout van de bepaling dan te zwaar op de uitkomst gaat drukken.
Goede hoeveelheden zijn 3 ä 5—ä 12,5 gr. plantenpoeder.

Ten slotte werd de extractie met petroleum-aether ook bij kamer-
temperatuur verricht.

Het kwam er nu in de eerste plaats op aan, vast testellen, hoelang
men de extractie moet voortzetten om zoo volledig mogelijk het caro-
tine aan de groenten te onttrekken en voorts was het van belang, te
Weten, of tijdens de extractie niet een deel van het carotine ontleed
Werd. Ten slotte moest voor de extractie met petr.-aether volgens
Soxhlet worden nagegaan of de onder optimale extractievoorwaarden
Verkregen uitkomsten overeenkwamen met die welke met de tot dusver
gebruikelijke extractie met verdund aceton bij kamertemperatuur
Werden verkregen.

Plantenpoeders werden gedurende verschillende tijden geëxtra-
heerd, daarna werd de extractie voortgezet met verschen petroleum-
aether en nu na verzeepen van het Chlorophyll en verwijdering der
verzeepingsresten de gele kleur van beide extracten vergeleken. Het
hleek, dat het extraheerbare carotine bij goede pulverisatie van het
groentepoeder meestal na een extractietijd van ongeveer 6 uren
practisch er reeds geheel uit is, wat er dan nog aan extraheerbaar geel
pigment overbleef was gering en bestond overwegend of geheel uit

xanthophyll. Dit laatste pigment wordt dus met petroleum-aether
langzamer geëxtraheerd dan carotine.

Nadat tevens vastgesteld was, dat verlenging van den extractietijd
met spoedig tot ontleding van het carotine aanleiding geeft, besloten
wij dezen tijd veiligheidshalve op 8 uren te stellen.

D^ volgende proef laat zien, dat bij een extractieduur van 8 uren
practisch alle extraheerbare carotine uit de groente is verwijderd,
maar dat dit niet het geval is voor xanthophyll.

Na 8-urige extractie was dus al het carotine tot op na verwijderd
maar van het xanthophyll was nog ongeveer 12% in extraheerbaren
vorm achtergebleven. Het is dus niet juist, zooals Elisabeth Goerrig
meent, dat xanthophyll in het geheel niet door petroleum-aether
zou worden geëxtraheerd.

In de volgende proef werd onderzocht of langere extractie misschien
tot ontleding zou leiden der carotinoide kleurstoffen. Ongekookt-
gedroogde Spinazie werd volgens Soxhlet met petroleum-aether in
duplo geëxtraheerd. Na uur werd in het eene apparaat de extractie
beëindigd, maar in het andere apparaat nog gedurende een zelfden
tijd voortgezet. In beide proeven werd zoowel het carotine- als het
xanthophyll-gehalte bepaald: (zie Tabel 10).

Het verschil in carotine-gehalte bedraagt bij verdubbeling van den
extractietijd slechts 3% ten nadeele van den wel zeer langen extractie-
duur; dit bedrag valt overigens volkomen binnen de fout van de be-
paling. Het nadeelig verschil is voor xanthophyll daarentegen niet
minder dan 29% en overtreft zeker de fout van de bepahng. Beide
laatste tabellen laten zien, dat 8-urige extractie voor de carotine-
bepaling voldoende is, maar dat men zonder vrees voor carotine-
verlies dezen tijd zou kunnen verlengen. Er is dus ook niets tegen om
den hiervoor aangegeven minimum extractietijd van 6 op 8 uren te
brengen, zooals wij in onze proeven dan ook gedaan hebben. De

proeven laten bovendien zien, dat Soxhlet-extractie met petroleum-
aether niet alleen geen goede methode is voor de bepaling van het
xanthophyll in de planten, omdat het langzamer wordt geëxtraheerd,
maar dat het pigment daarnaast ook ontleed kan worden.

De bruikbaarheid van de Soxhlet-methode wordt echter pas be-
wezen door het verkrijgen van minstens even goede cijfers voor het
carotine-gehalte als met de gebruikelijke aceton-extractie. Wij gingen
dit in eenige proeven dan ook na.

B. De petroleum-aether-Soxhlet extractie vergeleken bij de extractie
met 85% aceton.

De zelfde Spinazie als in de vorige proef werd gebruikt, werd op
2 verschillende manieren met 85% aceton geëxtraheerd n.1. 1°. evenals
in gindsche proef, ongekookt-gedroogd en 2°. ook geheel versch, dus
niet gedroogd. De uitkomsten van deze beide bepalingen werden ver-
geleken met het carotine-gehalte verkregen met Soxhlet-petroleum-
aether extractie en reeds in de vorige proef vermeld.

De extractie met het verdund aceton geschiedde in een Büchner
filtreertrechter, waarin het filter bestond uit een laag talk tusschen
2 lagen fijn gemaakt asbest, van onder en van boven afgesloten door
een juist in het filter passend blaadje filtreerpapier. Geëxtraheerd
Werd op het filter bij vrije filtratie, het aceton werd dus niet door het
filter heen gezogen. De extractie werd hier evenals bij de Soxhlet
methode gedurende uur voortgezet, terwijl gedurende het laatste
nur de groentemassa uit het filter in een mortier werd overgebracht
ter maceratie met de acetonoplossing tot nagenoeg geen kleur meer
Werd afgegeven. De totaal benoodigde hoeveelheid verdund aceton
bedroeg 750 cc. De talklaag van het filter bleek in staat een deel van
net xanthophyll terug te houden, door nawasschen met een weinig
onverdund aceton kon het Carotinoid echter gemakkelijk geëlueerd
Worden.

aether uitgegoten en daarna met gewoon leidingwater — wij ge-
bruikten nooit gedestilleerd water bij onze bepalingen — het aceton
weggewasschen. Hierbij ziet men nog al eens vrij sterke emulsie-
vorming optreden; wij lieten dan telkens na het uitwasschen, na eenige
oogenblikken, alleen het benedenste heldere aceton-houdende water
wegloopen, waarbij de emulsie dus in den scheitrechter werd terug-
gehouden. Na het uitwasschen werd dan de geheele geëmulsioneerde
laag in een anderen scheitrechter overgebracht en daar met verschen
petroleum-aether geëxtraheerd door gedurende eenige oogenbhkken
met de hand te schudden, daarna te laten ontmengen. Dit werd zoo
noodig eenige keeren herhaald, totdat de petroleum-aether geen gele
kleur meer opnam. De petroleum-aether fracties werden telkens aan
de donkergroene hoofdmassa toegevoegd. De techniek van de ver-
zeeping en de verdere bewerking vindt men beschreven in de hierachter
volgende paragraphen, wij kunnen dus daarheen verwijzen.

Allereerst valt in deze proef weer op het groote verschil in de
hoeveelheid xanthophyll, die met aceton- of met petroleum-aether
extractie wordt gevonden, vooral bij niet-drogen van de groente.
Het blijkt, dat in de gedroogde groente bij aceton-extractie ongeveer
34% minder xanthophyll werd gevonden dan bij de versch tot extractie
gekomen groente. Reeds eerder vermeldden wij, dat naar alle waar-
schijnlijkheid het grootste deel van dit verlies op rekening komt van
de ontleding van dit pigment bij het droogproces; daarnaast rijst
echter ook het vermoeden, dat voor een deel de gevonden kleinere
waarden afhangen van een hchtelijk verminderde extraheerbaarheid
der carotinoiden uit het ongekookt-gedroogde materiaal. Men ziet

immers (Protocol: Proef XIII, C. i), dat bij het gekookte materiaal de
hoeveelheid van het gevonden carotine, welk pigment niet door het
lt;iroogproces wordt aangetast, weer iets is toegenomen (4,15 mgr. per
100 gr. versche groente), vergeleken bij de extractie van het onge-
kookte en gedroogde materiaal. Intusschen zijn de gevonden verschillen
niet groot en laten niet meer dan een vermoeden toe; anders is dit bij
xanthophyll, waar met petroleum-aether 27% minder geëxtraheerd
werd dan met aceton; dit is stellig de uitdrukking van quaUtatieve
verschillen in de extractie.

Toch vonden wij in de 5% grootere carotine-waarde bij petroleum-
aether-extractie vergeleken met de onder gelijke omstandigheden
verrichte aceton-extractie, aanleiding beide extractiemethoden verder
na te gaan.

Bij 45° C. op de gewone wijze, na koken, gedroogde Andijvie werd
op 3 verschillende manieren geëxtraheerd:
lo. met petroleum-aether volgens Soxhlet.

Thans gaf dus, in tegenstelling met de vorige proef, de extractie
met verdund aceton de hoogste carotine-waarde. Bij Soxhlet-extractie
met petroleum-aether werd in dit geval ongeveer 19% minder carotine
gevonden dan bij de extractie met 85% aceton, voor xanthophyll
bedroeg dit niet minder dan 67%. Daar bij deze proef de afwijking
in het gevonden carotine-gehalte bij petroleum-aether- en aceton-
extractie onwaarschijnlijk hoog was, maar van den anderen kant het
toevoegen van aceton aan den petroleum-aether tot verhooging van
het gehalte aan carotine in het extract had geleid vergeleken bij de
extractie met enkel petroleum-aether, herhaalden wij deze proef met
een andere groente. Daartoe werden Spruitjes gekozen. Het bleek
echter, dat dit monster spruitjes zeer slecht wilde drogen; na 60 uren

blootgesteld te zijn aan een luchtstroom van 45° C., werd het droogpro-
ces afgebroken, omdat bij nog langere voortzetting ook voor ontleding
van het carotine werd gevreesd. Na afkoehng bleven de groenteresten
taai en konden daardoor ook niet fijn gepulveriseerd worden. De oor-
zaak van dit ongemak was gelegen in het verzuim de groenten voor het
drogen fijn te maken; werd dit wel gedaan, dan leverden ook spruitjes
voor deze wijze van drogen en opvolgend pulveriseeren geen bezwaar.

Niettegenstaande de onvoldoend fijne verdeeling van het materiaal,
werden de bepahngen toch uitgevoerd en de groente op de 3 ver-
schillende manieren evenals in de vorige proef geëxtraheerd:

Deze proef was niettegenstaande de gemaakte fout toch zeer leer-
rijk. Allereerst bleek, dat de toevoeging van aceton aan den petroleum-
aether wel van geen invloed was op de extractie van het carotinoid,
maar verder bleek bij de aceton-extractie, dat na een extractietijd van
8 uren nog steeds vrij veel geel pigment door de grootere groente-
stukjes werd afgegeven. Zij waren nog vrij sterk gekleurd gebleven
en gaven bij maceratie tijdens een 2e extractie, gedurende 5 uren,
slechts langzaam hun pigment af. Ongetwijfeld moet men dan ook hier
in de minder fijne verdeehng van het materiaal de oorzaak zien voor
de uiteenloopende uitkomsten bij Soxhlet-extractie en de aceton-
extractie met maceratie. Daardoor is het dan ook duidelijk dat het
toevoegen van aceton aan den petroleum-aether op de extractie van
carotine geen invloed heeft, de extractie verschillen worden alleen
door mechanische verhoudingen beïnvloed.

De proef van Tabel 14 toont dan ook aan, dat bij goed fijn verdeeld
groentepoeder het toevoegen van aceton aan den petroleum-aether
geen zin heeft.

Alleen voor xanthophyll blijkt het extractiemiddel door aceton toe
te voegen een andere qualiteit gekregen te hebben.

Ook voor een groente met laag carotine-gehalte werd vastgesteld,
dat het geen voordeelen oplevert voor de carotine-extractie om aceton
aan den petroleum-aether toe te voegen bij de Soxhlet-extractie:

Bij de bewerking van de Bloemkool werd sterke emulsievorming
bij het uitwasschen ondervonden. De reeds bij andere bepalingen ver-
kregen indruk, dat na extractie met aceton in het algemeen meer
emulsievorming optrad dan na Soxhlet-extractie met petroleum-
aether werd ook hier weer versterkt. Emulsievorming brengt steeds,
hoe goed men ook poogt het daarin aanwezige pigment terug te
winnen, eenig verlies, dat bij groenten met laag carotine-gehalte
meestal zwaarder op de uitkomsten drukt dan bij het carotine-rijke
materiaal. Dat bij deze kleurlooze groente met laag carotine-gehalte
bij enkele aceton-extractie ongeveer 16% minder carotine werd
gevonden berekend op het drooggewicht, zal ook wel aan de sterkere
emulsievorming zijn toe te schrijven. De absolute waarde van het
verschil is intusschen zeer gering en bedraagt slechts 0,03 mgr. Men

kan dus van het toevoegen van aceton niet verwachten, dat het leidt
tot een betere extractie van het carotine, maar wel dat het aanleiding
geeft tot een sterkere emulsievorming. Omdat er dus meer nadeel dan
voordeel van is te verwachten, hebben wij deze wijziging dan ook verder
niet meer toegepast.

Wanneer inderdaad de meer of mindere fijne pulverisatie van het
te onderzoeken groentepoeder van doorslaggevende beteekenis is
voor de extraheerbaarheid van het aanwezige carotine met petroleum-
aether dan zou dit in de eerste plaats moeten blijken bij de extractie
van gele worteltjes, die, zooals vroeger reeds werd medegedeeld, na
het koken moeihjk te drogen zijn en dus bij niet fijne verdeeling ook
moeilijk quantitatief te extraheeren. De volgende proef gaf hierover
opheldering:

Na koken en gedurende 36 uren drogen vormden de wortelen een
eenigszins kleverige taaie massa, die niet fijn was te pulveriseeren,
maar na het malen kleverige stukjes gaf.

Na verwijdering van alle met petroleum-aether extraheerbaar
carotine (totaal 60,50 mgr. per 100 gr. gedroogde wortelen) kon door
opvolgende extractie met verdund aceton op het filter nog 10,20 mgr.
en door nog langere extractie onder maceratie ineen mortier nog 1,47
mgr. carotine aan de massa onttrokken worden, te zamen dus nog
11,67 nigT-^it geval kon met petroleum-aether alléén ongeveer 84%
van het aanwezige carotine verwijderd worden. In een ander gevid,
waarbij gepoogd was de worteltjes in hun geheel te drogen en dit
proces buitengewoon langzaam verliep, werd een zeer kleverige
massa verkregen. Hieruit kon met petroleum-aether niet meer dan
ongeveer 30% van het aanwezige carotine verwijderd worden. In beide
gevallen waren de wortelresten na de Soxhlet-extractie in de papier-

hulzen samengeklonterd en waren talrijke nog sterk rood gespikkelde
en dus onvolledig geëxtraheerde deeltjes in die massa te herkennen;
bij de opvolgende extractie met verdund aceton nam deze klontering af.
Vermoedelijk was het suikergehalte de oorzaak voor dit kleverige
samenbakken en was de waterhoudende acetonoplossing in staat de
suiker op te lossen, waardoor de klontering verminderde en het nog
aanwezige carotine beter toegankelijk werd voor het extractiemiddel.
Naar alle waarschijnlijkheid zijn het in hoofdzaak dus wel mechanische
belemmeringen, die verhinderen, dat het extractiemiddel het te extra-
heeren carotine bereikt. Zij zijn verantwoordelijk te stellen voor de
quantitatieve verschillen bij de carotinebepaling met beide genoemde
extractiemiddelen.

Bij het onderzoek van een monster gezouten snijboonen kon de
pulverisatie ook niet zoo goed als dit in de andere gevallen mogelijk
was, worden uitgevoerd, waarschijnlijk tengevolge van het niet goed
uitspreiden van de gekookte massa in den droogbak. Ook thans had
de Soxhlet-extractie niet de laatste resten carotine kunnen ver-
wijderen:

De extractieduur bedroeg voor beide Soxhlet-extracties yl uur;
daarna werden de resten van de le extractie nogmaals, thans met
85% aceton, geëxtraheerd door hen 2 maal telkens gedurende i uur
in een flesch in de schudmachine te schudden en tenslotte nog in
een mortier met het aceton te macereeren.

De bepalingen laten zien, dat de Soxlet-extractie in een duplo-
bepaling zeer goed overeenstemmende waarden geeft, doch dat in het
niet zeer fijn verdeelde plantenpoeder niet alle carotine voor den
petroleum-aether bereikbaar was en dientengevolge bij kneuzing van
het materiaal nog ongeveer 10% carotine meer was te extraheeren.
Tevens blijkt echter uit de proef, dat als de pulverisatie van het groen-
tenmateriaal geen grove te kortkoming vertoont, zooals dit bij de gele
wortelen het geval was, de Soxhlet-extractie met petroleum-aether
toch geen onbruikbare waarden geeft.

Ook bij het onderzoek van ongekookte bij 45° C. gedroogde en
daarna fijn gepulveriseerde groenten werden de Soxhlet- en de aceton-
methoden met elkaar vergeleken. De onderstaande tabel betreft het
onderzoek van Kropsalade:

De getallen voor carotine gevonden en berekend voor de versche
Raapstelen komen, zooals men ziet, bijna volmaakt overeen; de af-
wijking in de waarden berekend op het drooggewicht verschillen alleen
als men ^ongekookt- met gekookt-onderzochte groenten vergelijkt,
in § 7 van dit Hoofdstuk wordt dit verschil nader besproken, het vindt-
weer zijn grond in het verschil in droogrest. De xanthophyllwaarden
laten het gewone quahteitsverschil tusschen de beide extractiemiddelen
zien.

Ook voor winterspinazie was de overeenkomst in de gevonden
carotinewaarde met beide extractiemiddelen en -methoden uitstekend,
zoowel voor gekookte als ongekookte, gedroogde en ongedroogde
groente van één zelfde monster:

(Protocol: Proef XIII. A, i en 2; Ba, i en 2; Bh, i en 2; C, i en 2).
WINTER-SPINAZIE II.

De Soxhlet-extractie met petroleum-aether blijkt dus een goede
en tevens gemakkelijke methode te zijn ter bepahng van het carotine-
gehalte in groenten. De deugdelijkheid der methode staat of valt echter
met de mogelijkheid om het te onderzoeken materiaal als een stoffijn
-poeder te verkrijgen. Is dit mogelijk dan stemmen de uitkomsten
voortreffelijk overeen met de aceton-extractie.

Volgens de reeds hiervoor aangegeven techniek (gewijzigde Soxhlet-
extractie in Erlenmeyerkolf) werd nu nagegaan of het opvoeren van
de temperatuur, waarbij de extractie verloopt eenig voordeel oplevert
voor het extraheeren van het carotine uit de groente. Onderzocht
werden gekookte en gedroogde Spruitjes en Andijvie:

De verschillen, die bij een ongeveer 25° C. hoogere temperatuur
van het extractiemiddel aan den dag treden zijn o.i. niet van dien
aard om daarvoor van de gewone Soxhlet-methode af te wijken.

Vervolgens werd de proef genomen met een extractie bij kamer-
temperatuur met petroleum-aether. Wegens de snelle verdamping
van den petroleumaether leek ons de maceratiemethode minder ge-
schikt, wij pasten daarom de koude extractie van het materiaal toe.
Een hoeveelheid van 20 gr. gekookt en gedroogd loof van gele wortelen
(Daucus carota) werd na fijn gepulveriseerd te zijn in een bruine
flesch gedurende i uur met 70 cc. petroleum-aether in de schudma-
chine geschud. Na i uur werd de petr.-aether afgepipetteerd en door
een gelijke hoeveelheid versche vloeistof vervangen. In het geheel
werd aldus 9 x i uur telkens met 70 cc. petr.-aether geschud, daar
de plantendeelen echter nog vrij veel gele kleurstof bleven afgeven werd
besloten de extractie nog voort te zetten. Gedurende 6 uren werd nog
verder geschud, waarbij 5 X 80 cc. petr.-aether werd gebruikt. Beide
extracten werden samen gevoegd, verzeept en daarna op de gewone
wijze behandeld ter bepaling van carotine- en xanthophyll-gehalte.

Tegelijkertijd werd eveneens 20 gr. van het zelfde plantenpoeder
volgens Soxhlet met petroleum-aether geëxtraheerd ter vergelijking.
Ook dit poeder werd gedurende 15 uren aan extractie onderworpen.

Deze methode bleek zich niet voor practisch gebruik te eigenen.
Niet alleen, dat het carotine minder goed wordt geëxtraheerd dan
bij de Soxhlet-extractie, maar het uitschudden is omslachtiger en
duurt veel langer. Ook hier toont de proef weer duidelijk aan, dat het
xanthophyll veel minder gemakkelijker wordt geëxtraheerd door den
petroleum-aether dan het carotine.

De ongewijzigde Soxhlet-extractie methode is dus gebleken het
best aan het door ons gestelde doel te beantwoorden.

Aan het einde van onze bespreking van de extractie der carotinoide
pigmenten uit plantenmateriaal gekomen, kunnen wij, terugblikkend
op de resultaten met de verschillende wijzigingen in de techniek ver-
kregen, zeggen, dat wel is waar in de onderzochte gevallen niet steeds
een evengoede overeenstemming in de uitkomsten werd verkregen,
maar dat men van den anderen kant niet mag vergeten, dat het bij deze
pigmentbepalingen om zeer kleine waarden gaat, die door een inge-
wikkelde techniek verkregen worden. Onder deze omstandigheden
kan men redelijker wijze ook geen uiterste nauwkeurigheid verwachten
en moet een ruime speling in de gevonden waarden toegelaten worden.
Het is niet mogelijk aan de toelaatbare afwijking een experimenteel
gefundeerde getallenwaarde toe te kennen, omdat de verschillende
foutbronnen niet allen afhangen van regelmatig terugkeerende oor-
zaken. Een voorname oorzaak is b.v. de vorming van emulsies bij het
uitwasschen der pigmenthoudende oplossingen. De neiging tot emulsie-
vorming komt bij de verschillende groenten en ook bij verschillende
monsters van een zelfde groentesoort zeer ongelijk sterk tot uiting. Zij
is onberekenbaar, onze indruk is echter dat in het algemeen na aceton-
extractie sterkere emulsievorming optreedt dan na petr.-aether-
extractie. Hoe wij deze emulsievorming hebben trachten te verminde-
ren en de nadeelige gevolgen zoo veel mogelijk hebben ter zijde gesteld,
zullen wij later nog vermelden; te voorkomen, dat hierdoor een zeker
verlies aan pigment optreedt is niet mogelijk. In het algemeen zal dit
verlies de uitkomsten bij het onderzoek van weinig carotinehoudende
groenten zwaarder drukken dan bij de pigmentrijkesoorten. De
nauwkeurigheid der methode kan dan ook alleen aan de hand van bij
dit onderzoek verkregen ervaring zeer ruw geschat worden. Volgens
een dergelijke schatting meenden wij, dat men in het algemeen bij de
quantitatieve bepaling van carotine in planten een verschil in uitkomst,
bij afwijkende extractiemethoden, van ongeveer 13% toelaatbaar moet
achten. Het bleek, dat duplobepalingen met een zelfde extractie-
methode bij een zorgvuldige uitvoering wel gelijke uitkomsten geven,
het aan dit onderzoek hierachter toegevoegde tabellarisch overzicht
der verkregen resultaten geeft hiervan voorbeelden.

Houdt men dit alles in het oog, dan maakt het voor de uitkomst
geen groot verschil uit of het carotine gehalte in de groenten wordt
bepaald door extractie met verdund aceton onder maceratie of door
Soxhlet extractie met petroleum-aether, mits — en om het groote
gewicht er van moge dit hier nogmaals herhaald worden — het te
onderzoeken materiaal stoffijn gepulveriseerd is alvorens in het Soxhlet

apparaat tot extractie gebracht te worden. Is dit niet geschied of kan
dit om de een of andere reden niet geschieden, waarvoor wij reeds
het voorbeeld van de wortelen en vruchten aanhaalden, dan geeft
de Soxhlet extractie geen goede uitkomsten. De voorkeur verdient
laatstgenoemde extractiemethode zeer zeker bij het onderzoek van
groenten met een zeer gering carotinegehalte. Wanneer men dergelijk
materiaal met verdund aceton extraheert, heeft men een groot volume
van dit oplosmiddel noodig, dat een aanzienlijke hoeveelheid bij-
producten mede verwijdert, zoowel bij het overvoeren van het ge-
extraheerde carotine uit de aceton oplossing in petr.-aether, als bij het
uitwasschen later na de verzeeping, heeft men dan meestal door de
emulsievorming een in verhouding tot de totale hoeveelheid carotine,
groot verlies van dit pigment. Bij petroleum-aether extractie vervalt
in de eerste plaats het overvoeren met de daarbij optredende emulsie-
vorming en verhes, bovendien worden naar onze ervaring minder
emulsievormende bijproducten geëxtraheerd, zoodat ook na de ver-
zeeping het carotineverhes geringer is. Waar zij dus gebruikt kan
worden verdient de Soxhlet-methode om haar grooteren eenvoud,
voor de quantitatieve bepahng van carotine de meeste aanbevehng.\'

De verwijdering van het chlorophyll uit de bladextracten met het
doel alleen de geel gekleurde pigmenten in oplossing te verkrijgen,
werd door de oudere onderzoekers, die nog geen strenge scheiding
tusschen carotine en xanthophyll maakten, op verschillende wijzen
uitgevoerd. Meestal maakten zij aanvankelijk gebruik van de allengs
verkregen ervaring, dat chlorophyll zich uit verdunde alcoholische
oplossing laat uitschudden door petroleum-aether. Blijkbaar vormt
de alcohol, die daarbij door den petroleum-aether wordt opgenomen,
m.a.w. een verdunde oplossing van alcohol in petroleumaether, een
beter oplosmiddel voor chlorophyll dan een verdunde oplossing van
alcohol in water. Weer andere onderzoekers konden uit de alcoholische
oplossing het chlorophyll met verschillende plantaardige vette- en
aetherische oliën verwijderen. Het behoeft geen lang betoog, dat geen
dezer methoden zich aanpast aan een quantitatieve bepaling der
carotinoiden.

De waarneming van Wiesner in 1874, dat na inwerking van ver-
dunde ammonia of kaliloog op het residu van een alcoholisch blad-
extract het grootste deel van de gele kleurstof oplost, maar het chloro-
phyll achterblijft, legde den grondslag voor een meer doeltreffende
scheiding der groene en gele plantenkleurstoffen in hun vereenigd
extract. Zoowel Hansen als C. Kraus hebben dit proces verder
uitgewerkt; laatstgenoemde onderzoeker vond in 1875, dat na het
alkahseeren der alcoholische bladextracten met KOH, met benzol
geel pigment aan de oplossingen kon worden onttrokken. Guiqnet
(1885) verzeepte het groene petroleum-aether extract met een op-
lossing van NaOH in 95% alcohol. Later vond men, dat KOH in
methyl-alcohol beter verzeepte.

ester van een tweetal verwante tricarbonzuren, de chlorophyllinen.
Met alkali laten deze esters zich verzeepen, waarbij de onverzadigde
primaire, hoogere alcohol phytol: CgqHggOH met methylalcohol en
de zouten der beide carbonzuren vrijkomen. Hierin schuilt nu de
beteekenis van het verzeepingsproces voor de scheiding der groene
en gele plantenpigmenten, want de beide chlorophyllinen-zouten zijn
in tegenstelling met de esters in water oplosbaar en kunnen dus door
schudden van het verzeepte petroleum-aether extract met water
worden wegge wasschen. Willstätter en Stol;, geven aan, dat per
Kgr. geëxtraheerd plantenmeel voor de verzeeping 20 cc. geconcen-
treerde (28%) alcoh. kaliloog noodig is. Onder krachtig schudden van
het extract vindt dan de hydrolyse der esters plaats, die bij niet al te
groote hoeveelheden en met een overmaat van alkaU volgens hen bijna
oogenbHkkelijk verloopt. Onze ervaring ten deze is echter, dat men op
dit snelle verloop der reactie niet al te zeer moet vertrouwen, het vol-
ledig verzeepen kost tijd evenals ook de afscheiding der gevormde
zouten uit de oplossing tijd kost. Tracht men hen al te spoedig door
uitschudden met water te verwijderen, dan ondervindt men meestal
zeer veel last van emulsievorming, die tijdroovend ingrijpen noodig
maakt en waardoor het verlies aan Carotinoid verhoogd wordt.

Bij dit onderzoek verzeepten wij aanvankelijk met 5% natrium
methylaat in ± 99è% methylalcohol, omdat men hiermede met den
petroleum-aether een homogene oplossing verkrijgt waardoor gehoopt
werd een meer regelmatige en volledige verzeeping van het aanwezige
chlorophyll te verkrijgen. Deze methylaat-oplossing werd verkregen
door eerst methylalcohol over ongebluschte kalk te rectificeeren en
in den verkregen nagenoeg absoluten methylalcohol, in een kolf
voorzien van een terugvloeikoeler, 5% metallisch natrium op te lossen.
Verliep de reactie te heftig dan werd de kolf afgekoeld. Van deze
methylaatoplossing werd per 100 cc. petroleum-aether-extract, na
afkoeling van dit laatste tot kamertemperatuur, 5—10 cc. toegevoegd.
Na doorschudden werden de kolfjes in het donker, ten einde mogelijke
photochemische omzettingen te verhinderen, gedurende 18 — 2 x 24
uren aan verzeeping overgelaten. Men kan ook natrium aethylaat
gebruiken, maar deze oplossing bezit het nadeel bij bewaren te ver-
harsen en zich daarbij geelbruin te kleuren, weUicht kan deze kleurstof
later de metingen storen. Dit euvel vermindert echter sterk als men
de stukjes natrium zeer zorgvuldig schoonmaakt, zoodat niets anders
dan het blank metaal te zien is, hen daarna afspoelt met petroleum-
aether en de aethylaat-oplossing verder in de ijskast bewaart. Meer
dan 200 cc. werd nooit tegelijk gemaakt.

Het was natuurlijk van belang te weten of het alkali in het petro-
leum-aether-extract zich tegenover de carotinoiden en in het bijzonder
tegenover carotine wel geheel indifferent gedraagt. Dit werd o.a.
onderzocht in een proef, waarbij in een duplo-extractie aan het eene

extract 3 maal zoo veel methylaat werd toegevoegd als aan het andere
petroleum-aether extract.

Tabel 24.
(Protocol: Proef V. A en B.)
BOERENKOOL.
Groente gekookt en gedroogd bij 45° C.

Hieruit blijkt, dat het gehalte aan alkali voor de verzeeping in
zeer wijde grenzen gevarieerd kan worden zonder tot ontleding der
aanwezige Carotinoide pigmenten aanleiding te geven.

Nadat aldus vastgesteld was, dat noch carotine, noch xanthophyll
een groote gevoeligheid voor alkah bezitten, werd een poging gedaan
om het verzeepingsproces te vereenvoudigen en vooral ook te bekorten.
Daartoe werd bij een duplo-extractie in het eene extractiekolfje
2 uren vóór het einde der extractie aan den petroleum-aether toege-
voegd 15 cc. van de gebruikelijke natrium methylaatoplossing en daar-
na de extractie weer voortgezet, zoodat in beide proeven de extractie-
duur gelijk was. Het toevoegen van alkah aan den petroleum-aether
gaf in het Soxhlet apparaat bij de verdere extractie geen moeilijkheden.
Aan het andere kolfje werd op de gewone wijze na afloop der extractie
en bekoeling van den petroleum-aether eveneens 15 cc. natrium
methylaat toegevoegd. Beide kolfjes werden nu gedurende 2 X 24
uren in het donker geplaatst en daarna de pigmentbepalingen ver-
richt.

De verzeeping bij kooktemperatuur van petroleum-aether gaf dus
aanleiding tot een aanzienlijk geringere opbrengst zoowel aan carotine
als xanthophyll, van dit laatste pigment werd 55,5% teruggevonden,
van het eerste 59%. Ook bij een paar andere groenten werd deze
wijze van verzeepen onderzocht en wel met aethylalcoholaat. Dit
onderzoek leverde het volgende resultaat:

Het verschil in het gevonden carotinegehalte bedroeg thans met
aethylaat wel is waar slechts 12% en bij xanthophyll nog minder,
maar bij een herhaling van de proef met Savoyekool werd voor caro-
tine toch weer een verschil van ruim 23% gevonden:

Over het algemeen geeft dus de verzeeping bij hoogere temperatuur
aanzienlijk lagere carotinewaarden. Het geringere verschil in het tweede
geval bij de bepaling van het carotinegehalte van snijboonen doet
denken aan een nivelleerenden invloed van de fout der bepaling.
Verdere proeven in deze richting werden gestaakt, omdat ten slotte
ook bleek, dat het verzeepingsproces beter op andere wijze kon uit-
gevoerd worden, zij het dan ook, dat deze wijziging geen tijdsbesparing
bijbracht.

Behalve door een methylaat oplossing in homogene phase, kan men
de verzeeping ook verrichten door een oplossing van io% kaliloog in
methylalcohol. Men krijgt dan met petr.-aether wel een tweephasig
systeem, maar bij eenig schudden en verder rustig laten staan der beide
oplossingen gedurende een zelfden tijd als bij gebruik van methylaat,
verloopt de verzeeping van het Chlorophyll niet minder volledig als in
homogene phase. Men heeft echter het voordeel, dat de verwijdering
van het verzeepte Chlorophyll uit de oplossing der carotinoiden
gemakkehjker gaat en er bovendien minder kans is op carotine verhes
bij de verdere bewerking. Zooals in de volgende paragraaf nog zal
blijken heeft deze wijze van verzeepen het best voldaan. Steeds werd
echter zorg gedragen de alcoholische loog pas na volkomen bekoeling
tot kamertemperatuur aan de Soxhlet-extracten toe te voegen en de
verzeeping geheel in het donker te laten verloopen.

§ 4. De scheiding van het verzeepte Chlorophyll
van de oplossing der carotinoiden.

Dit gedeelte van het onderzoek is het meest bewerkelijke en ver-
eischt groote zorg, omdat de nauwkeurigheid van de carotine-bepaling
grootendeels afhangt van de maatregelen, die men tegen het hier
dreigende pigmentsverlies weet te nemen. Voorde verwijdering van het
aanwezige alkali of de gekleurde en ongekleurde zeepen is het noodig
aan de extracten een zekere hoeveelheid water toe te voegen en daarop
te schudden, waardoor meer of minder sterke emulsievorming op-
treedt. In deze emulsies wordt nu steeds een grootere of kleinere
hoeveelheid petroleum-aether met daarin opgelost carotinoid opge-
sloten gehouden en moet dus daaruit weder teruggewonnen worden.
Ten deele kan dit geschieden door de emulsies met geëigende middelen
te breken, voor een ander deel door hen voor zoover zij blijven bestaan
in hun geheel te vermjderen en daarna afzonderlijk met petroleum-
aether uit te schudden.

Wanneer men met methylaat in homogene phase verzeept en daar-
na een zekere hoeveelheid water toevoegt om de in water oplosbare
Chlorophyll- en andere zeepen op te nemen, ontstaat bij het schudden
steeds een sterke emulsievorming, waarin vrij groote hoeveelheden
carotine zijn opgesloten. Verzeept men daarentegen met alcoholische
kaliloog-oplossing, dan vindt men nagenoeg alle verzeepingsresten
in de alcoholphase of op het grensvlak van beide phasen als een groen-
zwarte massa, daarboven bevindt zich dan de heldere gele of geel-
roode petroleum-aether oplossing der carotinoiden. In den schei-
trechter kan men nu al dadelijk, door den alcohol te laten afloopen,
nagenoeg alle chlorophyllinenzouten verwijderen. Wel is waar bevat
de alcohol ook een aanzienlijk deel van het gemakkelijk daarin oplos-
bare xanthophyll en als hij van een hoog percentage is wellicht ook een
weinig carotine, maar xanthophyllverlies is als het geen zuiver experi-
menteele doel betreft, niet van belang en het weinigje carotine kan men
gemakkelijk terugwinnen. Het groote voordeel is, dat de hoofdmassa
van het petroleum-aether-extract nu ter verwijdering van de zeepen
niet zelf met water geschud behoeft te worden en dus niet aan het

emulsioneeren kan deelnemen. De bewerking wordt bij gebruik van
alcoholische loog in plaats van de methylaat- of aethylaatoplossing
wezenlijk vereenvoudigd en het carotineverlies verminderd. De in een
anderen scheitrechter overgebrachte alkalische alcohol met de oplos-
bare en onoplosbare verzeepingsresten wordt nu eenige malen nä
verdunning met een ruime hoeveelheid water met petroleum-aether
uitgeschud. Het water dient om het in alcohol opgeloste Carotinoid
daaruit te verdrijven en dus de opname door den petroleum-aether
te vergemakkelijken. Het spreekt van zelf, dat hier vrij sterke emulsies
op kunnen treden, maar het is tevens duidelijk, dat waar het carotine-
gehalte van de alcoholische oplpssing niet groot kan zijn, het carotine-
veriies, nadat bovendien nog eenige malen met petroleum-aether is
uitgeschud, tot een minimum kan beperkt worden. Hier heeft men dus
in een kleiner volume emulsievorming met een gering carotinegehalte
der oplossingen, terwijl bij uitschudden van het petroleum-aether-ex-
tract bij verzeeping in homogene phase emulsievorming plaats heeft
in groot volume met sterk carotine-houdende oplossingen.

De petroleum-aether-fracties, waarin het uit den alkalischen alcohol
geschudde Carotinoid werd opgenomen, nemen meestal ook weer een
weinig chlorophyll op en moeten dus op hun beurt met een weinig
alcoholische loog verzeept worden, hetgeen echter gemakkelijk kan
geschieden door den scheitrechter met de hand eenige minuten lang
te schudden, daarna voegt men een ruime hoeveelheid water toe,
zoodat het alcohol-percentage van de onderste laag niet meer dan
ongeveer 25% bedraagt en laat dan den scheitrechter eenigen tijd
rustig staan ter ontmenging, daarna laat men den verdunden alcohol
afloopen en schudt deze oplossing zoo noodig nogmaals met een weinig
petroleum-aether uit, den petroleum-aether bevrijdt men met water
van alkali. Alle verzamelde petroleum-aether-fracties voegt men nu
aan de hoofdmassa, die de te bepalen carotinoiden bevat, toe.

Naast alkali bevat deze hoofdmassa nog wat achtergebleven
verzeepingsresten. Beide verwijdert men door uitschudden met water,
waarin het alkali oplost en de zeepingsresten als groene draden uit den
petroleum-aether overgaan in de meer of minder dichte waterige-
emulsie van kleurlooze zeepen en wellicht nog andere uit de plant ge-
extraheerde bestanddeelen (phytosterinen). De wijze, waarop Scherz
en Steche emulsies pogen te breken (met NaCl of KCl) vermeldden
wij reeds, Wilhelmina van Deventer meent, dat hiervoor een
6% NaCl oplossing het meest geschikt is. Ons voldeden zoutoplossingen
(NaCl en (NH4)2S04) minder goed dan het telkens toevoegen van een
kleine hoeveelheid alcohol, waardoor de grove emulsies verdwijnen
en plaats maken voor fijne witte zeepemulsies die geen carotine in-
gesloten houden. Men drage hierbij alleen zorg, dat de alcoholcon-
centratie van de waterphase niet hooger wordt dan ongeveer 40%
om zeker te zijn, dat geen xanthophyll wordt opgelost, als men dit
Carotinoid, zooals wij in dit onderzoek om bijzondere redenen deden,
ook wil bepalen. Ten slotte vingen wij al het waschwater met de vaste
verzeepingsresten op in een grooten scheitrechter met een weinig
petroleum-aether en lieten het wit-troebele waschwater zooveel

mogelijk wegloopen, maar hielden de verzeepingsresten terug en
waschten hen nog enkele malen met petroleum-aether uit. Men
beëindigt het uitwasschen van de hoofdmassa als geen gekleurde
verzeepingsresten in draden meer na het schudden in de waterphase
te voorschijn komen. Men heeft dan een oplossing der carotinoiden,
die vrij is van andere kleurstoffen, maar nog veel andere ongekleurde
producten bevat als zeepen, phytosterine etc., voor de latere meting
hinderen deze producten echter practisch niet. Vermoedelijk zijn zij
echter wel de oorzaak, dat zeer vaak de petroleum-aether oplossing
der carotinoiden troebel is doordat zij fijn gëmulsioneerd water bevat.
Ofschoon deze troebeling gemakkelijk verwijderd kan worden, behoeft
men daar geen verdere aandacht aan te schenken, zij geeft bij de
verdere bewerking geen bezwaren, blijft zij ten slotte in de carotine-
petroleum-aether-oplossing na het uitschudden van het xanthophyll
bestaan, dan kan zij vóór de meting nog verwijderd worden, hoe dit
kan geschieden zullen wij nog vermelden.

Het gebruik van een tweephasen-systeem ter scheiding van planten-
pigmenten werd het eerst toegepast door Fremy (i), zooals reeds in het
le Hoofdstuk werd vermeld, door verschillende latere onderzoekers
(Sorby, G. Kraus e.a.) werden, met behoud van het beginsel van
het biphasisch systeem, wijzigingen in den aard der gebruikte oplos-
middelen aangebracht. Wiesner voerde in 1874 het gebruik van 85%
a cchol in bij de scheiding der gele plastiden pigmenten, Sachsse in
1877 dat van petroleum-aether. Ook in ons onderzoek werd voor die
scheiding gebruik gemaakt van de onoplosbaarheid van carotine in
verdunden alcohol samengaand met een sterkere oplosbaarheid van
xanthophyll in dezen alcohol dan in petroleum-aether. In het algemeen
vindt men vermeld, dat de juiste concentratie van den alcohol om
quantitatief xanthophyll van carotine uit hun gemeenschappelijke
oplossing in petroleum-aether te scheiden bedraagt 85—92 vol.%.
Veelal wordt methyl alcohol gebruikt, men kan evenhoed aethyl alcohol
gebruiken. Alvorens deze uitschudmethode te gaan toepassen stelden wij
voor aethyl-alcohol eerst de concentratiegrenzen vast, waarbij eener-
zijds nog geen xanthophyll aan het mengsel door uitschudden met
dezen alcohol werd onttrokken, anderzijds ook carotine in oplossing
begon te gaan. Het bleek, dat het oplossen van carotine zichtbaar
begon te worden bij een aethyl-alcoholconcentratie van 90 vol.%
en dat beneden 60% geen xanthophyll meer oploste. Scherp zijn
deze grenzen niet te trekken, omdat aard en hoeveelheid der bij-
producten hierop invloed uitoefenen. Het spreekt van zelf, dat het
voordeelig is de alcoholconcentratie zoo hoog mogelijk te kiezen, bij
85% is men naar beide richtingen veihg, zoodat bij al onze proeven
aethyl-alcohol met een concentratie van 85 vol.% werd gebruikt.

De petroleum-aether oplossing van de beide carotinoiden be-
handelt men een aantal malen met gelijke hoeveelheden van dezen
verdunden alcohol, tot deze zich niet meer kleurt. In het algemeen
kan men dit na ongeveer 8 maal uitschudden bereiken, waarvoor dan

in het geheel een hoeveelheid verdunde alcohol noodig is, die het
dubbele bedraagt van het volume petroleum-aether. Na het uitschud-
den behoeft men telkens slechts enkele minuten op de ontmenging
van de beide phasen te wachten, daarna kan men de alcoholische
xanthophylloplossing in een anderen scheitrechter laten afloopen.
Men kan de alcoholische xanthophylloplossing op haar beurt nog weer
met een kleine hoeveelheid petroleum-aether-oplossing uitschudden
om sporen carotine, die mede overgegaan mochten zijn, terug te
winnen. Men heeft nu de beide carotinoiden gescheiden, het carotine
in den petroleum-aether, het xanthophyll in den verdunden alcohol.
Is de carotine-oplossing troebel doordat zij sporen water bevat dan
kan men haar óf eenigen tijd rustig laten staan, waarbij zij van zelf
opheldert als ten minste niet al te veel zeepen aanwezig gebleven zijn,
óf men kan, na het volume te hebben bepaald, een klein gedeelte
filtreeren en dit voor de meting, die nu dadelijk kan plaats hebben,
gebruiken. Het is wel zelden noodig een correctie op het volume aan
te brengen voor het afgescheiden water, daar deze hoeveelheid zeer
gering is.

Wil men ook het xanthophyll-gehalte bepalen dan moet men met
deze oplossing voor de meting meestal anders te werk gaan, Is men
zeker, dat de verzeeping van het chlorophyll volkomen was en dat dus
de gecombineerde petroleum-aether oplossing der beide carotinoiden
geen spoor chlorophyll meer bevatte, dan zou men zonder bezwaar
de xanthophyllmeting dadelijk in de alcoholische oplossing kunnen
uitvoeren. Meestal kan men echter van de volkomen afwezigheid
van chlorophyll in gemelde oplossing niet zoo zeker zijn. Bij het uit-
schudden van den petroleum-aether met verdunden alcohol gaat al
het chlorophyll, dat aan de verzeeping ontsnapte mede in den alcohol
over. Deze oplossing is dus behalve geel door het opgeloste xanthophyll,
ook eenigermate groen gekleurd door de resten van het chlorophyll.
De kleurafwijking is meestal niet zoo sterk, dat zij voor het bloote oog
waarneembaar is, maar zij geeft bij de spectrocolorimetrie niettemin
tot ernstige fouten aanleiding. Het direct meten in de alcohohsche
oplossing blijft steeds gevaarlijk en is daarom te verwerpen. De in
Tabel 28 (p. 130) vermelde metingen mogen dit verduidelijken. Na de
meting in alcoholische oplossing, werd een deel van het hierin aan-
wezige xanthophyll, in afgemeten volume, in petroleum-aether over-
gevoerd en daarop in dit medium gemeten.

In deze gevallen werd dus van 4,6—30% xanthophyll te veel ge-
meten in de alcoholische oplossing. Dat werkelijk resten van chloro-
phyll hiervoor verantwoordelijk zijn te stellen ziet men bij het over-
voeren in petroleum-aether. Dit voert men als volgt uit. Aan de alco-
holische oplossing van het carotinoid voegt men in een grooten schei-
trechter een zekere hoeveelheid petroleum-aether toe. Daar echter
deze koolwaterstof geen bijster goed oplosmiddel voor xanthophyll
is, doet men verstandig zooveel toe te voegen, dat de concentratie-
van het xanthophyll vermoedelijk niet boven ongeveer 5 y per cc.
komt. Daarna voegt men zooveel water toe, dat de alcohol-concen-
tratie daalt tot beneden 50% m.a.w. ruim een gelijk volume water.

De alcohol bevat wel een geringe hoeveelheid petroleum-aether, bij
de vorige bewerking opgenomen, die nu ook vrij komt, maar deze
hoeveelheid kan ontoereikend zijn om al het xanthophyll op te lossen,
zoodat men, zooals reeds werd gezegd, veiliger doet, petroleum-aether
toe te voegen. Na de vloeistoffen eenigen tijd gelegenheid tot ont-
mengen gegeven te hebben, laat men den verdunden alcohol uit den
scheitrechter afloopen om hem dan nogmaals 2 tot 3 maal met een
geringe hoeveelheid petroleum-aether uit te schudden. De petroleum,
aether-fracties worden verzameld en daarna met water uitgewasschen
waarbij men meestal de laatste resten chlorophyll als groene draden
op de grens van beide vloeistoflagen zich ziet verzamelen. Men kan
hen dan gemakkelijk uit den scheitrechter verwijderen.

Dat bij het overvoeren van het xanthophyll na goede verzeeping uit
de alcoholische oplossing in petroleum-aether, het aanwezige xantho-
phyll quantitatief wordt teruggevonden werd als volgt bewezen. De
alcoholische xanthophyll-oplossing verkregen uit een onzer goed ver-
zeepte groenten-extracten bevatte 11 y van dit carotinoid per cc. Na
5-voudige verdunning met 85% alcohol werd van deze verdunde op-
lossing 10.— cc. in een glazen stopcylinder gebracht, daarna 10.— cc.
petroleum-aether en 10.— cc. water toegevoegd, vervolgens flink

geschud en ter ontmenging eenigen tijd ter zijde gezet. Het petroleum-
aether-volume bedroeg door opname van wat alcohol 10,5 cc. en bij
meting werd 72.—% blauw hcht doorgelaten, hetgeen overeenkomt
met 2,08 Y xanthophyll per cc. Dus per 10,5 cc. werd gevonden 21,84 T
xanthophyll, terwijl oorspronkelijk in de 10 cc. verdunde-alcoholische
oplossing 22 Y xanthophyll aanwezig was.

Nogmaals moet er hier met nadruk op gewezen worden, dat de
petroleum-aether-extractie niet geschikt is om betrouwbare quanti-
tatieve xanthophyll-bepalingen uit te voeren. Onze xanthophyll
bepalingen zijn dan ook minder geschied om de juiste waarde van dit
carotinoid in de groenten te leeren kennen, dan wel om enkele inzichten
te verkrijgen in het bijzonder gedrag van dit pigment, waartoe onze
bepaling zich wel leende.

Ter bepahng van het carotine- en xanthophyll-gehalte in
hun oplossingen hebben Willstätter en Stoll een colorimetrische
methode uitgewerkt. Zij berust op het ijken van een gemakkelijk te
bereiden oplossing van een zekere kleurstof, op carotine- en xantho-
phyll-oplossingen van overeenkomstige kleur. Een 0,2% Kalium
bichromaatoplossing bleek in kleur overeen te komen met een 5 x 10-®
molaire of 0,00268% carotine- en een evensterke molaire of 0,00284%
xanthophylloplossing. Uit de zeer spaarzame gegevens van Willstät-
ter heeft Palmer voor elk der beide carotinoiden een kromme ge-
construeerd, die den samenhang aangeeft tusschen de kleur van de
standaard bichromaatoplossing bij verschillende kolomhoogten in den
colorimeter en het carotinoid-gehalte van een oplossing van gelijke
kleur. Zie de bijgevoegde Kaart I, waarop de xanthophyll-curve echter
afwijkt van die van Palmer en hier meer in overeenstemming met de
door Willstätter opgegeven waarden is geteekend. Toen men later
betere methoden had leeren kennen om de carotinoiden bij hun be-
reiding te reinigen, bleek dat in de curve gebaseerd op de gegevens van
Willstätter verandering diende aangebracht te worden. Euler,
Demole, Karrer en Walker hebben (1930) nieuwe empirische
curven gegeven, die niet alleen quantitatief, maar ook qualitatief
afwijken van die van Willstätter. Zie kaart I. Vergelijkt men hen
n.1. dan blijkt uit hun verloop, dat volgens Willstätter äe absorptie
bij carotine sterker is dan bij xanthophyll, terwijl dit volgens Euler c.s.
omgekeerd is. In Hoofdstuk II vermeldden wij reeds, dat Scheibe
en Rosenberg spectrophotometrisch hebben aangetoond, dat de
extinctie bij xanthophyll grooter is dan bij carotine, waaruit dus
volgt dat bij Willstätter de verhouding van de kleuren der beide
carotinoiden tot de kleur der bichromaatoplossing onjuist is weer-
gegeven. Het blijkt, dat vooral het verloop van zijn xanthophyll-
curve zeer sterk afwijkt van die van Euler c.s. Hieruit volgt, dat
alle door Willstätter verrichte xanthophyll-bepalingen — en dat
zijn wel de meeste op het oogenblik gangbare waarden voor dit pig-
ment — onjuist zijn. Het is niet van belang ontbloot dit vast te stellen,
aangezien het juist Willstätter was, die de aandacht vestigde op

een zekere vastheid in de verhouding tusschen het in de planten voor-
komende carotine en xanthophyll. Ook de meeste op het oogenbhk
voor de planten aangenomen carotine-waarden berusten nog op de
colorimetrische bepalingsmethode van Willstätter, zoodat o.i.
behoefte bestaat om alle tot dusver verrichte carotine- en xanthophyll-
bepalingen te herzien en daarbij dan ook geen gebruik meer te maken
van de bichromaatmethode en de door Euler verbeterde omzet-
tingsgetallen, omdat afgescheiden van het bovenvermelde aan de
bichromaatmethode als zoodanig ook belangrijke bezwaren kleven.
Deze spruiten in de eerste plaats voort uit het feit, dat de kleur-
overeenkomst tusschen carotine-, xanthophyll- en kahum bichromaat-
oplossingen voor een bepaald concentratiegebied voor ons oog wel
gelijk schijnt, maar dat hun lichtabsorptie geenszins hetzelfde spec-
traalgebied omvat. Het is dus, dank zij de onvolkomenheid van ons
oog, wel mogelijk voor een bepaalde bichromaatconcentratie in de
kleur een bruikbare maat te verkrijgen voor een beperkt concentratie-
gebied der carotinoiden, maar evenredigheid in de kleur bij verdunnen
der oplossingen bestaat er in het geheel niet. Voor het meten van meer
verdunde carotine- en xanthophyUconcentraties zou men opnieuw
empirisch een kromme moeten bepalen, waarin over een zeker meet-
gebied de bij behoorende bichromaat-waarde werd vastgelegd. Hiertoe
zijn wel pogingen ondernomen (Coward) (2), maar volgens onze per-
soonlijke ervaring ten deze is het niet mogelijk carotine- en xantho-
phyll-concentraties, zooals die bij ons onderzoek ter meting kwamen
te bepalen met een voor dat meetbereik geijkte bichromaatoplossing.
Bij de betrekkelijk zwakke kleuren dier verdunde carotinoid-oplos-
singen was geen bruikbare kleurgelijkheid met een bichromaatoplossing
te verkrijgen. De invloed van de absorptie van ongelijke golflengten
uitte zich in een groene bijtint der bichromaatoplossing, die de op-
lossing der carotinoiden mist. Bovendien neemt het oog in het daghcht
bij deze zwakke kleuren eerst bij betrekkelijk groote wijziging der
kolomhoogte kleurverandering waar; de aflezingen zijn dus ook on-
scherp. Nu zou men wel door indampen in vele gevallen de carotinoid-
oplossingen in het meetbereik van de 0,2% bichromaat-oplossing
kunnen brengen, maar vooral voor de zwakke, niet zuivere oplossingen
der beide pigmenten houdt dit proces een groot gevaar in voor ont-
leding. Daar ons onderzoek er op gericht was gevaarlijke bewerkingen
te ontgaan, vereenvoudiging te betrachten en de betrouwbaarheid
der metingen te verhoogen, meenden wij afstand te moeten doen
van metingen uitgevoerd met behulp van een standaard bichromaat-
oplossing. Wilhelmina van Deventer raadt het gebruik aan van een
methyl-oranjeoplossing als standaard bij deze colorimetrie, zij vermeldt
echter noch methodiek, noch resultaten.

Wij hebben eenige metingen verricht, die de afwijkingen laten
zien als onze carotinoidoplossingen gemeten werden met een
standaard bichromaatoplossing met gebruikmaking van de ge-
tallen van Willstätter en met- die van Euler c.s. eenerzijds
en met den straks te beschrijven Spectrocolorimeter van Zeiss
anderzijds.

Kleurgelijkstelling in m.m.
bij kolomhoogte van:

Bij deze duplometing werd gemiddeld gevonden volgens Will-
stätter: 4,03 Y carotine per cc. en volgens Euler: 4,28 y per cc.
petroleum-aetheroplossing. Rekent men met deze waarde het gehalte
van 100 gr. gedroogde Andijvie uit, dan vindt men volgens:

Uit de gegeven getallen ziet men, dat vooral de xanthophyll-
waarden bij Willstätter en Euler ver uiteenloopen en dat in ieder
geval de EuLER\'sche waarden dichter bij de met den spectrocolori-
meter gevonden waarden liggen. De carotine-waarden liggen bij Will-
stätter en Euler dichter bijeen, maar zij wijken sterk af van die,
welke met den spectrocolorimeter gevonden worden en die als de juiste
beschouwd moeten worden. Men ziet echter tevens dat de kolom-
hoogten van bichromaat en carotinoid in de vermelde metingen aan-
zienlijk verschillen, dergelijke metingen zijn bij daglicht colorimetrie
niet geoorloofd, verdunning van de bichromaat oplossing mag echter
ook niet, zoodat als men niet wil indampen hieruit volgt, dat lagere
carotinewaarden als vermeld alleen spectrocolorimetrisch en niet
volgens de bichromaatmethode kunnen gemeten worden.

Scherz (i, 2) werkte een methode uit om het gehalte der caroti-
noiden in oplossingen spectrophotometrisch te bepalen. Hij stelde
daartoe eerst hun uitdoovingsvermogen vast bij monochromatisch
hcht van verschiUende golflengte (Helium-, Kwikdamplicht) en vond,
dat de absorptie van het kwikdamplicht uitgezonden door de lijn bij
^ = 435,8 m[x, het best als maat voor het gehalte aan carotine en
xanthophyll was te gebruiken. Scherz vervaardigde nu graphische
projecties, waarin hij op de X-as de carotine- en xanthophyll-concen-
traties in mgr. per liter aangaf en op een logarithmisch verdeelde
Y-as in procenten de hoeveelheid doorgelaten hcht. Voor oplossingen
van carotine in petroleum-aether, alcohol en aether bleek, dat de
absorptie in aether iets sterker was dan in de beide andere oplosmidde-
len. Voor zuiver xanthophyll werd de lijn alleen in aetheroplossing
bepaald. Met gebruik van deze kaarten kan nu het gehalte van elke
willekeurige carotine- en xanthophylloplossing gemeten worden door
met den spectrophotometer bij gelijke laagdikte als voor de standaard-
metingen werd gebruikt, de hoeveelheid doorgelaten licht te meten en
uit te drukken m procenten van de hoeveelheid invallend licht. Op
de kaart leest men dan de bij dit percentage behoorende carotine- of
xanthophyllconcentratie van de te meten oplossing af.

Bij onze bepalingen hebben wij gebruik kunnen maken van een
nieuwen spectrophotometer van Zeiss, den zoog. Stufenphotometer
of kortweg Stuphometer van Pulfrich, een toestel, waarbij de me-
tingen eenigszins het midden houden tusschen een gewone colori-
metrische- en een spectrophotometrische bepaling. Het groote voordeel
in het gebruik van dezen spectrocolorimeter is hierin gelegen, dat
dit toestel aan uitersten eenvoud in het gebruik een groote mate
van nauwkeurigheid der metingen paart.

Heilmeyer kan men vinden in het handboek van Abderhalden:
Die biologischen Arbeitsmethoden, 1929. Abt. II. Teil 2/II p. 2337—
2366. Wij meenen hier dus met een korte beschrijving te kunnen vol-
staan.

In wezen staat het toestel dicht bij een spectrophotometer, het ver-
schil bestaat in hoofdzaak daarin, dat men hier niet met eng begrensd
monochromatisch licht werkt, doch de monochromator vervangen is
door een drietal filters, die het meten van de lichtabsorptie in 3 groote
spectraalgebieden toelaten. Deze gebieden zijn zoo gekozen, dat het
licht voor ons oog nog monochromatisch schijnt en zij te zamen
ongeveer het geheele zichtbare spectrum omvatten. De spectraal-
gebieden door elk der filters bestreken zijn niet even groot, maar wel
scherp begrensd. Het doorlaatgebied van het blauwe filter is kleiner
dan van het groene en dit weer kleiner dan van het roode. Behalve
deze zoog. L-filters behooren bij het toestel nog een 7-tal spectraal-
filters, die een enger gebied van het spectrum omsluiten. Het filter
L.3 is echter gelijk aan het spectraalfilter S.47.

Als hchtbron dient een bijzonder apparaat, dat voor den Stupho-
meter wordt geplaatst en waarin een Nitralamp van 8 volt 50 kaarsen
is gemonteerd, die evenwijdige hchtstralen uitzendt door 2 met plan
parallel verloopende wanden begrensde glazen cuvetten. In de eene cu-
vette wordt een oplosmiddel gebracht, dat de lichtstralen zonder optisch
effect laat passeeren (optisch leeg water, alcohol, petroleum-aether
enz.), in de andere cuvette brengt men de te meten kleurstofoplossing.
De Stuphometer bevat een paar objectieven, die voorzien zijn van dia-
phragma\'s met verstelbare vierkante opening, zij bevinden zich achter
de cuvetten. Het licht, dat links en rechts met gelijke intensiteit in
deze beide objectieven invalt en eerst door de beide cuvetten is gegaan,
wordt door een stelsel van prisma\'s zoodanig in een oculair samenge-
bracht, dat het oog beide lichtbundels tegelijk en slechts door een zeer
smalle deellijn gescheiden in twee halfronden waarneemt, zooals men
dit kent bij een polarimeter. Vlak voor het oculiar bevindt zich een
draaibare schijf, die de filters kan bevatten. Zijn beide cuvetten gevuld
met water dan zal men bij gelijke verlichting der beide objectieven en
geheel geopende diaphragma\'s een volkomen homogeen verlicht veld
door het oculair waarnemen. Wordt het water in een der cuvetten
vervangen door de te meten gekleurde vloeistof dan zal deze een zekere
hoeveelheid van het invallende licht absobeeren en de eene helft van
het gezichtsveld zal donkerder schijnen. Door draaien van een trommel
kan de opening van het diaphragma voor de andere cuvette, die de
volkomen transparente vloeistof bevat nu zoo verkleind worden, dat
beide helften van het gezichtsveld weer even donker schijnen. Op de
trommel verdeeling leest men nu onmiddellijk af hoeveel men het licht
heeft moeten verzwakken om een gelijke intensiteit der uittredende
lichtstralen te verkrijgen met die, welke in de cuvette, die de te onder-
zoeken kleurstof bevat, werden doorgelaten voor een golflengte, die
door de keuze van het voorgeplaatste filter wordt bepaald. Het
afgelezen cijfer geeft de intensiteit van het doorgelaten licht aan in
procenten van de intensiteit van het invallende licht. De absorptie in

Voor de meting kiest men nu een der filters, die het golflengte-
gebied bestrijkt, waarin de maximale absorptie van de te onderzoeken
Ideurstof ligt. Het bij dit toestel behoorende blauwe filter S. 47 ( =
L. 3) bestrijkt ongeveer het spectraalgebied tusschen X = 447,5 —
492,5 m.fi., het is dus voor de meting van carotine buitengewoon
geschikt, omdat het geheele gebied, waarin de beide absorptiebanden
van carotine in het blauw liggen, omvat wordt. Daar de absorptie-
banden van xanthophyll slechts weinig naar rechts liggen, wordt voor
dit carotinoid nagenoeg geheel het blauwe absorptiegebied bestreken.

Wij moeten nog even terugkomen op de inrichting van de verstel-
bare diaphragma\'s en de trommel verdeeling, omdat een juist inzicht
hiervan noodig is om de later te geven graphische projectie goed te
kunnen begrijpen. De diagonaal van de vierkante diaphragma-opening
is bij voUe opening iets kleiner dan de doorsneden der objectieven;
in de uittreepupil gemeten is zij niet grooter dan 2,5 m.M. en daar bij
het zien door het oculair de oogpupil veel wijder dan 2,5 mM. is, wordt
hierdoor verkregen, dat het beeld der vierkante opening in zijn geheel
het oog treft, als het hoofd wordt stil gehouden. De vierkante opening
wordt gevormd door 2 rechthoekige ingesneden zwarte platen, die door
een micrometerschroef (den trommel) in de richting van den diagonaal
lichtdicht langs elkaar kunnen bewogen worden. Zoodoende kunnen
de vierkanten kleiner en grooter gemaakt worden, terwijl hun middel-
punt op dezelfde plaats blijft. De inrichting is nu zoo, dat juist bij één
omdraaiing van 360° van de micrometerschroef (den trommel) het
vierkant van volle opening tot volkomen sluiting verandert.

De diagonaal van het diaphragma verandert dus van 0 tot zijn
maximum waarde. Zij nu de lengte van den diagonaal in een gegeven
geval gelijk : L en de waarde van den tusschen 0 en 360° liggenden
hoek, waarover de trommel gedraaid is, die hierbij behoort : a, dan is
het verband tusschen de van o—i varieerende lichtintensiteit I en
de waarden L en a gegeven door de vergelijking:

(360)

Als men nu in een graphische projectie het verloop der I-waarden
in hun afhankelijkheid van hoek a aangeeft, waarbij men op de ordinaat
de I-waarden in % afzet, dan verkrijgt men een kromme, waarvan de
projectie op de X-as de trommelverdeeling aangeeft. Zij toont, dat de
verdeehngen voor geringe waarden van I veel verder uiteen liggen, dan
bij de hoogere lichtintensiteiten; de trommel is logarithmisch verdeeld
in 100 deelen, zij geven de procentuaire getallen van het doorgelaten
licht aan.

Voor de meting van willekeurige carotine- en xanthophyll oplos-
singen met behulp van den Stuphometer moet men eerst beschikken
over gegevens, die voor een bepaalde laagdikte (doorsnede van de
cuvette) der zuivere kleurstofoplossing van bekende sterkte, de ver-
houding aangeven tusschen de hoeveelheid doorgelaten licht en de
concentratie. Op bijgaande kaart II vindt men nu de graphische

voorstelling van een dergelijke bepaling met oplossingen van zuiver
carotine en xanthophyll. Op de X-as is de conc. der carotinoiden aange-
geven in Y per cc. en op de Y-as de hoeveelheid doorgelaten licht
in procenten, de getallen dus, die men direct op den trommel van den
Stuphometer afleest. De bepalingen voor het vervaardigen van de
kaart zijn verricht bij een laagdikte der kleurstofoplossingen van
5 mm.. Wanneer de op den trommel afgelezen waarden voor de
doorgelaten hchtintensiteit bij de meting der verschillende carotinoid-
verdunningen op de Y-as van gewoon miUimeterpapier waren afgezet,
zou een kromme zijn ontstaan, door deze getallen te logarithmiseeren
krijgt men een rechte lijn. Gebruikt men hiervoor miUimeterpapier,
waarvan de Y-as logarithmisch verdeeld is, dan geeft dit het groote
gemak, dat men nu de procentuaire getallen blijft aflezen en niet
hunne log.-waarden, die men eerst weer zou moeten omzetten in
procent-waarden. Bovendien geeft de lineaire functie ons een goed
controlemiddel voor de juistheid der metingen bij het vervaardigen
van de kaart.

Met behulp van de kaart zijn nu carotine- en xanthophyUbepa-
lingen van onbekende oplossingen gemakkelijk uit te voeren. Alvorens
echter tot een meting over te gaan moet men voor de onbekende
oplossing vaststellen, dat zij werkelijk een der beide carotinoiden
bevat en geen mengsel is van beide of een andere plantenkleurstof
bevat b.v. een xanthophyll-ester. Men onderzoekt de te meten oplos-
sing dus eerst spectroscopisch op de aanwezigheid van de karakteristie-
ke absorptiebanden en de afwezigheid van banden, die er niet bij
behooren. Dan tot de meting komend controleert men eerst den
o-stand van den Stuphometer d.w.z. men vult beide cuvetten met
een optische leege vloeistof, waarvoor wij wegens het snelle ver-
dampen liever geen petroleum-aether, maar alcohol gebruikten,
en kijkt nu door het oculair of de helderheid van beide gezichthelften
juist gelijk is als beide trommels op maximale opening der diaphrag-
ma\'s staan. Is dit niet het geval dan regelt men dit door kleine verplaat-
singen van de Stupholamp of door een der bijgegeven matglasschijfjes
voor het te sterk verlichte objectief te plaatsen. Zijn beide helften
nauwkeurig gelijk helder gemaakt, dan vervangt men in een der cu-
vetten den alcohol door de petroleum-aether-oplossing van het te meten
carotinoid. De nu tengevolge der absorptie ongelijk heldere gezichts-
veldhelften maakt men door draaien van den trommel gelijk en leest
dan het procentgetal van het doorgelaten licht af ten opzichte van het
invallende licht. Voor iedere meting verricht men aldus een zeker
aantal bepalingen, waaruit men de gemiddelde waarde berekent en
dan op de kaart de hierbij behoorende concentratie in y per cc. van het
betrokken carotinoid opzoekt. In het algemeen kunnen met den Stupho-
meter verschillen tusschen de beide gezichtshelften worden waarge-
nomen als hun helderheid i — 2% afwijkt. Onze kaart is geconstrueerd
voor een meetbereik van carotine en xanthophyll van o—9 y per cc.;
het is echter niet aan te raden de Stuphometer-waarden in de uiterste
gebieden af te lezen, omdat daar de foutbreedte te groot wordt. Het
is beter aflezingen beneden ongeveer 20% en boven ongeveer 90%

te vermijden; in het eerste geval wordt het gezichtsveld te donker,
in het laatste geval te licht om een voldoende nauwkeurige gelijkstel-
ling van de helderheid der beide helften te kunenn verkrijgen. Het kan
dus voorkomen, dan een carotinoidoplossing te geconcentreerd of te
verdund is om een tusschen 20 en 90% liggende aflezing te geven.
In het eerste geval kan men de oplossing verdunnen, in het laatste
geval kan men echter de, somtijds zéér verdunde, carotinoid-op-
lossingen niet zonder gevaar voor gedeeltelijk pigment-verlies in-
dampen. In beide gevallen kan men evenwel de oplossingen meten in
cuvetten van andere dikteafmeting dan de standaard-cuvette, waar-
mede de kaart is vervaardigd. Om de kaart dan toch voor de aflezingen
te kunnen gebruiken moet men de bij een andere cuvette-afmeting af-
gelezen waarden herleiden tot die voor de standaard-cuvette. Dit is niet
moeilijk. Immers bij een laagdikte: i wordt van het invallende licht

I een deel ^ doorgelaten, door 2 dergelijke lagen wordt dan doorge-
laten : ) en door n-lagen Heeft men nu b.v. bij de meting van

een carotineoplossing gebruik gemaakt van een cuvette van 20 mm.
dikte en op den trommel afgelezen, dat nu 41% van het invallende
licht wordt doorgelaten, dan zou bij halve dikte van deze laag worden
doorgelaten: (0,41)0,5 dus bij J dikte of mm. d.i. dus de afmeting
van onze standaard-cuvette: (o,4i)0\'25 of [/ 0,41 d.i. 0,80 of 80 %.

Aan de bepaling der pigment-concentratie met den Stuphometer
kleeft een fout van ongeveer 3% in de gevonden waarde.

Het mag wellicht verwondering wekken, dat hier een afzonderlijke
bespreking noodig wordt geacht voor een schijnbaar zoo hoogst een-
voudige zaak als het berekenen van het carotine- of xanthophyll-
gehalte, nadat de metingen in de betreffende extracten zijn verricht.
Immers men heeft nu in het gereinigde extract van een afgewogen
hoeveelheid der groente de carotinoid-concentratie bepaald en er rest
dus, zou men zeggen, niets anders dan een kleine omrekening. In
wezen is dit nu wel zoo, maar men moet niet vergeten, dat bij het ver-
melden van de carotine-waarde van een groente de bedoeling voorzit
de groenten onderling vergehjkbaar te maken wat hun Pro vitamine-A
waarde betreft als menschelijk voedsel. Dit moet in de opgegeven
getallen tot uiting komen en dit is niet zoo eenvoudig, maar houdt
moeilijkheden in, die zeker de moeite waard zijn onder de aandacht
gebracht te worden en die wij nog nergens vonden aangeroerd.

. Wij zullen nu eerst een aan de protocollen ontleend voorbeeld
geven van een carotine-meting en aan de verkregen uitkomst onze
beschouwingen wat de herleiding van dit getal tot de carotine-waarde
van de plant betreft, vastknoopen.

Protocol: Proef XVII, B i. Van gekookte en gedroogde Raapstelen
werd 4 gram poeder volgens Soxhlet geëxtraheerd en werd na aUe
noodige bewerkingen ten slotte het in die 4 gr. groentenpoeder aan-

wezige carotine in een petroleum-aether-oplossing met een volume van
325 cc. verkregen, geschikt voor de meting. De oplossing bleek te
geconcentreerd om direct in een laagdikte van 5 mm. in de standaard
cuvette gemeten te worden met den Stuphometer. In een maatkolfje
van 10 cc. werd zij nu 5 maal verdund met petroleum-aether. Na
voorzetten van het blauwe filter L 3 (S. 47) en o-puntsinstelling,
werden eenige metingen met den Spectrophotometer verricht, waarbij
achtereenvolgens werd gevonden, dat van het invallende licht werd
doorgelaten: 65.—%; 65.—%; 66,5%; 65.—%; 65,5%; 65,5%; 65.—%;
en 66,5%, gemiddeld dus: 65,5%. Op de kaart leest men af, dat dit
percentage doorgelaten hcht wijst op een carotine-gehalte van 1,67 y
per cc.; derhalve bevatte de oorspronkelijke oplossing: 5 x 1,67 y =
8,35 ï carotine per cc. De geheele hoeveelheid petroleum-aether be-
vatte dus: 325 X 8,35 y = 2713,75 y carotine. Deze hoeveelheid was
verkregen uit 4 gr. droog poeder van gekookte Raapstelen, zoodat
men nu eenvoudig kan uitdrukken hoeveel carotine 100 gr. gekookte
en gedroogde Raapstelen bevatten, in dit geval dus: 25 x 2713,75 y =
67,84 mgr. Uit Protocol-, Proef XVII, B. 1 en A. 2 blijkt, dat na koken
en drogen van deze Raapstelen de droogrest veel kleiner is dan bij
drogen zonder voorafgaand koken. In het eerste geval bedroeg de
droogrest 3,240%, in het laatste geval 5.593%. bijgevolg zijn 100 gr.
droog poeder in het eerste geval aequivalent aan 3086,4 gr. versche
groente, in het tweede geval aan 1780 gr. Het verschil in droogrest
tusschen gekookte en ongekookte groente is echter niet aUeen voor
iedere groente anders, maar is zelfs voor dezelfde groente een slecht
reproduceerbaar getal, omdat het afhangt van de wijze van koken,
zooals wij reeds vroeger aangaven. Door het carotine-gehalte van
groente, op te geven in mgr. per 100 gr. na koken gedroogd materiaal,
verkrijgt men dus een vrij willekeurig getal dat geen zuiver inzicht
in de carotine-waarde van de betrokken groente geeft. Men heeft
verder te kiezen tusschen opgave van het carotine-gehalte in mgr.
per 100 gr. ongekookt-gedroogde groente of tusschen opgave van het
gehalte per 100 gr. versche groenten. Beide wijzen van berekenen
kunnen echter leiden tot uitkomsten, die gebruikt ter beoordeeling
van de Vitamine-A waarde van een zekere groente tot principieel
verschillende opvattingen aanleiding geven. Een voorbeeld aan onze
protocollen ontnomen moge dit verduidelijken:

Deze tabel laat zien, dat beoordeeling in de verhouding hunner
waarde als Vitamine-A bron voor deze beide groenten moeilijk is.
Gaat men af op het droog gewicht der ongekookte groenten dan zou de
bepaling tot het oordeel voeren: beide groenten zijn een evengoede
Vitamine-A bron (38,50 mgr. en 37.44 nigr. per 100 gr.). Neemt men
als basis voor de beoordeeling het carotine-gehalte van het droog
gewicht der gekookte groenten dan luidt het oordeel: Raapstelen zijn
een veel betere Vitamine-A bron dan Spinazie (67,84 mgr. en 41,40
mgr. per 100 gr.). Baseert men daarentegen zijn oordeel op het carotine-
gehalte in de versche groenten dan luidt dit: Spinazie is een veel betere
Vitamine-A bron dan Raapstelen (gemid. 4,06 mgr. en gemid. 2,15
mgr. per 100 gr.).

Men zal wellicht geneigd zijn te zeggen, dat het gehalte aan carotine
in de versche plant de maatstaf moet zijn bij de beoordeeling van haar
vitamine-A waarde, maar men zou kunnen tegenwerpen, dat het
lichaam alleen de vaste stof van de groente benut en dat die ook alleen
voor een bepaalde groente, mits ongekookt, in een gegeven geval een
vaste waarde heeft, niet de aan meer of mindere uitdroging etc.
onderworpen versche groente. De keuze is moeilijk en wij zouden hier
ynüen voorstellen de moeilijkheid te ontgaan, door de carotine-waarde
voor groenten op te geven met 2 getallen. Met het eerste getal zouden
wij willen aangeven de hoeveelheid carotine, berekend per 100 gr.
versche groente, met het 2e getal de hoeveelheid carotine in 100 gr.
drooggewicht. Voor de groenten, die gekookt gegeten worden zouden
wij dan voorstellen het drooggewicht van de gekookte groente op te
geven, wordt de groente versch gegeten dan het drooggewicht van de
versche groente. Voor Spinazie zouden wij dus volgens tabel 32 wiüen
opgeven voor het carotine-gehalte: 4,15 mgr. en 41,40 G. mgr. en voor
Raapstelen: 2,20 mgr. en 67,84 G. mgr. Men ziet dalT onmiddellijk,
dat wel is waar in verschen toestand de Raapstelen een minder goede
Vitamine-A bron zijn dan Spinazie, maar dat zij veel meer water be-
vatten en dat dus 100 gr. versche groente in beide gevallen als voedsel
niet aequivalent is. Voor ongekookte groenten b.v. Kropsalade (zie
tabel 35) zouden wij dan de opgave aldus willen doen: 1,43 mgr. en
17.— O. mgr.

Reeds eerder hebben wij er tegen gewaarschuwd de te onderzoeken
groenten vóór het afwegen van de hoeveelheid, die in onderzoek zal
worden genomen, niet te wasschen, omdat zelfs na goed uitlekken
een groote hoeveelheid water in de groente achter blijft. Hoe aanzien-
lijk de gewichtsvermeerdering dientengevolge kan zijn leert de volgende
proef:

Van 2 porties zomer-spinazie A en B, ieder wegend 300 gr. werd
A ongewasschen gekookt en B na gewasschen te zijn en gelegenheid
gekregen te hebben gedurende geruimen tijd uit te lekken, weer ge-
wogen én daarna eveneens gekookt. Zie Tabel 33.

Hieruit blijkt, dat 100 gr. van deze groente na gewasschen te zijn
niet minder dan 30% water terughoudt; men zou dus voor deze groente,
als zij na het wasschen ter onderzoek werd afgewogen, ook 30% te-

weinig carotine gevonden hebben. Verder blijkt uit de gegevens, dat
gewasschen Spinazie bij het koken 50% van zijn gewicht inboet, on-
gewasschen daarentegen slechts 30%.

Kort geleden werd een onderzoek gepubliceerd door Hoff, waarbij
de invloed van het huishoudelijk koken der groenten op hun vitamine-
A gehalte werd nagegaan. Hoff komt daarbij tot een geheel andere
conclusie dan onze proeven uitwijzen, daar hij met de biologische
rattenproef vond, dat zoowel bij huishoudelijk koken als bij conser-
veeren in blik ongeveer de helft van de in de oorspronkelijke rauwe spinazie
aanwezige vitamine-A verloren gaat. (Dissertatie, Leiden. 1931. p. 31.).
Afgescheiden van het feit, dat in groenten geen aantoonbare hoeveel-
heden vitamine-A voorkomen (Wolff, Overhoff en van Eekelen)
en men dus ook niet meer van het „vitamine-A-gehaltequot; van groenten
behoort te spreken, maar alleen van hun Provitamine-A-gehalte
(Carotine) of van hun vitdctnine-A-waarde, vonden wij, dat door het
koken van de groente geen verandering in hun carotine-gehalte optrad,
derhalve hun vitamine-A-waarde gelijk bleef. De conclusie van Hoff
steunt op gegevens door hem verkregen: i«. door de biologische ratten-
proef en 2°. op een berekening. Wanneer men de uitkomsten van zijn
rattenproeven onderling vergelijkt dan ziet men, dat zij voor de ver-
schillende proefdieren, die in een zelfde proef ingezet zijn verder uit-
eenliggen dan men dit in het algemeen bij deze biologische proeven
mag verwachten. De nauwkeurigheid der beide vermelde biologische
proeven lijkt niet zeer groot. Wat de berekening van Hoff betreft
is het jammer, dat zijn opgaven niet voldoende aanwijzing geven voor
een juist inzicht. Hoff deelt mede, dat de spinazie door koken een
gewichtsverlies van 50% ondergaat, hetgeen met onze waarnemingen
overeenkomt voor zoover de Spinazie vóór het koken gewasschen
werd en nä het wasschen gewogen; Hoff verzuimt echter mede te
deelen of hij zijn gewichtsbepahng deed vóór of nä het wasschen.
Daar wij bij ongewasschen zomer-spinazie een gewichtsverlies van
slechts 30% na het koken vonden, kan niet aan den indruk ontkomen
worden, dat zijn gekookte Spinazie versch gewogen werd nä het

wasschen. Zijn rauwe Spinazie werd vermoedehjk vóór het wegen
en het insluiten in blik niet gewasschen, omdat anders bij het fijnmalen
een zeer groot gewichtsverlies zou zijn opgetreden door het wegloopen
van een groot deel van het aanhangende water, en ook door het later
in het blik vrijkomen van water, waardoor de gewichtsverhouding
tot de oorspronkelijke hoeveelheid versche Spinazie vrijwel geheel
te loor zou zijn gegaan. Zoowel de resultaten zijner biologische proeven
als de onzekerheid in de gewichtsverhoudingen der aan de proefdieren
toegediende groente, maken het voor ons buitengewoon moeilijk de
uitkomsten van Hoff te beoordeelen. Dat echter door het koken
of in blik sterüiseeren het carotine in zijn spinazie voor de helft
zou vernietigd worden achten wij ten eenen male uitgesloten en komt
ook niet overeen met de waarnemingen van Scheunert en met de
opgaven van het United States Department of Agriculture, die
steunen op waarnemingen door zeer verschillende onderzoekers
verricht. Bij het bewaren van de groente gaat het carotine-gehalte
achteruit. Ten einde hierin eenig inzicht te verkrijgen onderzochten
wij het carotine-gehalte van gekookte Boerenkool en bewaarden nu
de gedroogde en gepulveriseerde groente eenigen tijd bij toetreding
van de lucht in diffuus kamerlicht Van tijd tot tijd werd de bepaling
van het carotine-gehalte bij dit poeder herhaald. De resultaten waren
als volgt:

Onder de gemelde voorwaarden gaat het carotinoid-gehalte in
het groentenpoeder dus aanvankelijk sneller dan later achteruit,
waaruit volgt, dat het onderzoek op het carotine-gehalte der groenten
onmiddellijk moet aansluiten aan het verzamelen en drogen. Hieruit
laat zich natuurlijk niet beoordeelen óf en zoo ja in hoevèrre ook bij
in bhk ingesoldeerde versche groente, die verder bij —15° C. wordt

bewaard, zooals Hoff deed, het carotine-gehalte achter uitloopt.
Gelet echter op het feit, dat een dergelijk bhk toch ook een zekere
hoeveelheid lucht bevat en den zeer langen tijd, die de groente aldus
bewaard werd alvorens zij onderzocht werd, kan ook hier achteruit-
gang van het carotine-gehalte o.i. niet zonder meer buitengesloten
worden.

OVERZICHT DER QUANTITATIEVE CAROTINE-BEPALINGEN
IN GROENTEN EN VRUCHTEN VERRICHT.

Alvorens een overzicht te geven van de carotine-waarden in dit
onderzoek voor verschillende groenten en vruchten gevonden en
deze waarden te vergelijken met de reeds voor deze voedings- en genot-
middelen bekende vitamine-A waarden langs biologische weg ver-
kregen, willen wij hier een kort resumé laten volgen van den gang
van een dergelijk onderzoek, zooals onze ervaring nu heeft uitgewezen,
dat dit het best kan geschieden. Voor de bijzonderheden moge dan
verwezen worden naar de betreffende paragraphen van het vorige
Hoofdstuk.

De groenten worden verzameld van een droog, niet bedauwd
en niet in de zon liggend veld. Een zekere hoeveelheid wordt uitgezocht,
maar zonder de groenten te wasschen, afgewogen en gekookt. Het
koken geschiedde volgens de voorschriften van het kookboek der
Amsterdamsche Huishoudschool voor elke groente gegeven. Daar
echter bij het onderzoek bleek, dat het carotine-gehalte door het koken
niet verandert, is het overbodig deze voorschriften geheel te volgen.
Het koken wordt thans meer aangeraden wegens de theoretische
en practische aanwijzingen, dat het carotine beter extraheerbaar zou
worden. De gekookte massa maakt men fijn en droogt haar bij 45° C.
in een warmen luchtstroom in het donker. Na drogen bepaalt men de
droogrest en gaat dan over tot het stoffijn pulveriseeren van het ma-
teriaal. Aan deze laatste bewerking moet bijzondere aandacht besteed
worden. Een afgewogen hoeveelheid van dit poeder (in het algemeen
3a5—yi è. 12,5 gr.) wordt nu met petroleum-aether (Kpt. 60—80° C.)
in een Soxhletapparaat geëxtraheerd (in duplo) gedurende 8 uren bij
zwak kunstlicht of zeer gedempt daghcht. Niet vergeten kooksteentjes
in de kookkolven te brengen. Na afloop der extractie het extract
laten bekoelen en daarna quantitatief overbrengen in een scheitrechter
ter verzeeping. Hiertoe voegt men ongeveer 10—15 vol.% van de
hoeveelheid extract toe van een 10% oplossing van KOH in methyl-
of aethylalcohol van 96%. Het mengsel van extract en loog wordt dan
herhaaldelijk gedurende eenige minuten met de hand geschud en ver-
volgens in het donker weg gezet; nu en dan kan men nog eens omschud-
den, maar ten slotte Iaat men den scheitrechter minstens 6 uren rustig
staan. Het geheele verzeepingsproces moet ongeveer 18—24 uren
worden voortgezet. Na afloop laat men de hypophasische groene
alcoholische laag met de groenzwarte onoplosbare verzeepingsresten
in een anderen scheitrechter afloopen. Men voegt nu daaraan een 3-
voudig volume petroleum-aether toe en daarna zooveel water, dat de
alcoholconcentratie daalt tot 30—40%. Een of meer malen dezen ver-

dunden alkalischen alcohol met petroleum-aether uitschudden. De
hiervoor gebruikte petroleum-aether fracties verzamelen en met wat
alcoholische loog schudden, daarna water toevoegen en dan den ver-
dunden alcohol laten afloopen, ten slotte dezen petroleum-aether aan
de hoofdmassa toevoegen. De hoofdmassa nu door uitwasschen met
water van het overtollige alkah en nog aanwezige verzeepingsresten
bevrijden. De hierbij optredende emulsies breken door telkens na het
uitschudden met water wat alcohol toe te voegen, daarop de vloeistof-
fen voorzichtig mengen. Men moet bij het toevoegen van alcohol
zorgen, dat daardoor in de waterphase geen grootere alcohol-concen-
tratie dan ongeveer 40% ontstaat, als men ook xanthophyll wil iso-
leeren; wil men dit niet dan kan men de concentratie zonder bezwaar
desnoods tot 80% laten oploopen. Door den alcohol worden mede
groote hoeveelheden ongekleurde zeepen verwijderd. Deze alcoholische
wasch vloeistof bevat naast een groote hoeveelheid fijn geëmulsio-
neerde witte zeepen ook groene chlorophyllresten en andere onoplos-
bare geelbruin gekleurde bestanddeelen. Het uitwasschen moet meestal
zeer dikwijls herhaald worden totdat geen groene draden meer aan het
waschwater worden afgegeven. Het waschwater wordt verzameld in
een grooten scheitrechter, waarin men van te voren al een zekere
hoeveelheid (50—100 cc.) petroleum-aether gebracht heeft. De witte
emulsie laat men nu wegloopen, de vaste resten worden met den petro-
leum-aether geschud, daarna gescheiden, de petroleum-aether met
waterige loog geschud, het alkdi weggewasschen en daarna weer aan
de hoofdmassa toegevoegd. Voor de scheiding van carotine en xantho-
phyll is een dubbele hoeveelheid van het volume petroleum-aether
noodig aan aethylalcohol van 85%. De petroleum-aetheroplossing
der beide carotinoiden wordt nu ongeveer 8 maal met den in gelijke
hoeveelheden verdeelden 85% alcohol uitgeschud; na iederen keer
uitschudden geeft men de vloeistoffen eenige minuten gelegenheid
tot ontmengen, daarna laat men den alcohol, die nu een deel van het
aanwezige xanthophyll heeft opgenomen, afloopen in een grooten schei-
trechter. In het algemeen bereikt men na 8 maal uitschudden, dat de
alcohol kleurloos blijft. Men heeft nu het carotine in petroleum-aether-
oplossing en het xanthophyll in verdund-alcoholische oplossing. Niet
zelden is de petroleum-aether-oplossing troebel, men meet het volume
en laat dan de oplossing eenigen tijd staan, waarbij zij van zelf op-
heldert of zoo men de bepaling van het carotinegehalte dadelijk wil
verrichten kan men een deel over gewoon filtreerpapier filtreeren,
waarbij de petroleum-aether helder doorloopt.

De alcoholische xanthophylloplossing kan men met een gelijk
volume water verdunnen, waarbij de petroleum-aether door den
alcohol bij het uitschudden opgenomen, vrij wordt en al het aanwezige
xanthophyll opneemt. Daar echter petroleum-aether voor xanthophyll
een slecht oplosmiddel is, voegen wij steeds voor de ontmen^ng nog
een hoeveelheid petroleum-aether toe om het volume van dit oplos-
middel te vergrooten en daardoor het overgaan van het xanthophyll
uit den alcohol in den petroleum-aether te vergemakkelijken. Nu
scheidt men den verdunden alcohol van de petroleum-aether-xantho-

phylloplossing en wascht eerstgenoemde vloeistof nog uit met een
weinig petroleum-aether, die daarna aan de hoofdmassa wordt toe-
gevoegd. Na het volume bepaald te hebben, maakt men zoo noodig ook
deze oplossing op de aangegeven wijze helder.

De Aceton-extractie verrichte men met een 85% sterke oplossing.
Zoowel de fijngehakte versche plantendeelen, als het gedroogde
plantenpoeder wordt in een mortier bij gedempt daghcht of kunsthcht
met kwartspoeder gemacereerd tot de plantendeelen geen kleurstof
meer afgeven. Men gebruike telkens kleine hoeveelheden verdund-
aceton, dat men na de maceratie in een grooten scheitrechter filtreert.
Is de extractie beëindigd dan moet het geheele acetonextract over-
gevoerd worden in petroleum-aether; daartoe voegt men dan aan
genoemd extract een gelijk volume petroleum-aether toe en schudt
beide vloeistoffen, daarna zooveel water toevoegen tot het aceton-
gehalte tot beneden 30% daalt (d.w.z. ongeveer 3 volumina water
toevoegen), weer omschudden, laten ontmengen en het waterig aceton
met de emulsies op het scheidingsvlak af laten loopen in een anderen
scheitrechter en daar nog eenige malen met petroleum-aether uit-
schudden tot deze kleurloos blijft. Alle petroleum-aether fracties
verzamelen en dan met 10—15% van de alcohohsche KOH-oplossing
verzeepen en verder bewerken, zooals bij de petroleum-aether extractie
werd beschreven.

In onze proeven vindt men de aceton-extractie eenigszins anders
uitgevoerd; dit geschiedde echter alleen uit experimenteele over-
wegingen.

Bij dit onderzoek nu werd het carotine-gehalte van een 17-tal
verschillende versche groenten, één groentenconserve (gezouten
snijboonen), benevens 6 vruchtenconserven en 2 versche vruchten
vastgesteld. De bepaling van het carotine-gehalte in wortelloof in
text en protocol vermeld, geschiedde alleen ten einde experimenteele
gegevens te verkrijgen omtrent de mogelijkheid om carotine bij kamer-
temperatuur met petroleum-aether te kunnen uitschudden uit gedroogd
plantenmateriaal. Het wortelloof met zijn hoog carotine-gehalte, dat
toevallig ter beschikking stond, leek ons voor dit onderzoek bij uitstek
geschikt. Zooals reeds meermalen werd vermeld kon de ervaring van
andere onderzoekers, dat petroleum-aether voor xanthophyll geen goed
extractiemiddel is worden bevestigd. Dat toch de xanthophyll-waarden
werden bepaald en in de protocollen opgenomen geschiedde, omdat
bleek, dat moge hun absolute waarden niet juist zijn, hun relatieve
waarden vergelijkbaar waren en conclusies toelieten. Men houde dus
in het oog, dat onze xanthophyll-getallen voor zoover zij door petro-
leum-aether-extractie zijn gevonden niet het werkelijke xanthophyll-
gehalte der onderzochte groenten waarborgen.

Bij koolrapen werd in de plaats van carotine het daarmede isomere
pigment lycopine aangetroffen. Of daarnaast wellicht ook nog geringe
hoeveelheden carotine aanwezig waren konden wij niet uitmaken.
De absorptiebanden van carotine liggen tusschen die van lycopine in,
waardoor een geringe absorptie van carotine naast een veel sterkere

lycopineabsorptie niet was waar te nemen, tenzij misschien bij spectro-
photographische metingen. Wel heeft Coward (2) een methode aan-
gegeven om carotine en lycopine in oplossing van elkaar te scheiden,
die berust op de adsorptiemethode van Tswett, maar voor quantita-
tief werk lijkt ons deze methode minder nauwkeurig en quahtatief
verwachtten wij bij het zeer lage carotine-gehalte, dat in onze lycopine-
oplossing zou zijn aan te treffen, niet veel van een poging tot scheiding
volgens Tswett. Grootere hoeveelheden carotine en lycopine naast
elkaar in oplossing kunnen wellicht gescheiden worden door het lyco-
pine als het onoplosbare natrium-additieproduct neer te slaan (Karrer
en Bachmann), voor quantitatieve bepalingen is deze methode niet
geschikt. Het lycopine in de gele koolraapvarieteit werd spectros-
copisch geïdentificeerd door de ligging der absorptiebanden, waarvoor
wij vonden:

Eigen waarneming: Willstätter en Escher:
Band I.nbsp;494—512 in[znbsp;499—510 mjji

De aanwezigheid van lycopine in Rapen met gelen wortel werd het
eerst vermeld door Lubimenko (1914).

Bij sinaasappelen vonden wij zoowel in het vruchtvleesch als in
de schil in plaats van het gewone xanthophyll, het xanthophyll ß. De
ligging der banden werd reeds in het 2e Hoofdstuk aangegeven. (Zie
ook: Zechmeister en Tuzson (3). Andere carotinoide pigmenten
(carotinoide carbonzuur-esters, Fucoxanthine, etc.) werden in de
onderzochte groenten niet aangetroffen. Zij zouden in de alcohol-
fractie met het xanthophyll moeten verschijnen.

Geen xanthophyll kon aangetoond worden bij groenten in: Roode-
kool en de genoemde gele varieteit van koolraapwortelen, bij vruchten
niet in kersen, abrikozen en aardbeien.

Onderstaande tabel vermeldt de resultaten van alle verrichte
bepalingen. In de als aanhangsel toegevoegde protocollen vindt men
alle gegevens noodig voor de berekening van de in de tabel onderge-
brachte waarden. In de protocollen zijn kortheidshalve de bereke-
ningen weggelaten, zij werden uitgevoerd volgens het in Hoofdstuk VI
§ 7 gegeven voorbeeld.

Verklaring der in de tabel gebruikte afkortingen:
G. Groente vóór het onderzoek eerst gekookt.
O, Groente ongekookt onderzocht.

P. Groente gedroogd boven PgOg in den vacuum-exsiccator.
Z.nbsp;Groente gedroogd door samenwrijven met watervrij NagSO^.

S.P.K. Extractie volgens Soxhlet met petroleum-aether bij ± 30° C.
S.P.W. Extractie met petroleum-aether bij ± 55° C.
S.P.A. Extractie volgens Soxhlet met een mengsel van petr.-aether
en aceton.

E.P. Extractie door uitschudden met petr.-aether bij kamertemp.
A. Extractie met 85% aceton.

dubbele extractietijd
Duploproef.

verzeeping tijdens de extractie, dus bij kooktemp. van petroleum-aether
Duploproef.

B. VRUCHTEN.
Verklaring der hier gebruikte afkortingen:
C. Vruchtenconserve in blik.
V. Vrucht versch onderzocht.

Xantho-
phyll
mgr. p.
loo gr.
Onge-
droogd:

Gek.

of
Ong.

Carotine
mgr.p.ioogr.
Ongedroogd:

Vrucht:

Drogen:

Extractie:

C.
C.
C.
C.
C.
C.
V.
C.
C.

N.G.
Z.

N.G.
N.G.
N.G.
N.G.
N.G.
N.G.

S.P.K.

A.
S.P.K.
A.
A.
A.
A.
A.
A.

0,23
0,39
0,48
1,64
0,47
0,06
0,25
0,69
0,32

N.G.

0,36

Het „United States Department of Agriculturequot; heeft in circulaire
n°. 84 van November 1929 een lijst samengesteld, waarin o.m. de
vitamine-A waarde voor een groot aantal vruchten en groenten quali-
tatief wordt opgegeven. De voor het opgeven der waarde gebruikte
symbolen: ; 4- en , geven dus geen onderlinge quantitatieve
betrekking aan. Van Duitsche zijde werd voor vruchten en groenten
een dergelijke lijst samengesteld door Scheunert. Hij qualificeert
de waarde als vitamine-A bron van het door hem onderzochte materi-
aal als: Zeer goed; goed; gering; zeer gering en sporen. Voor hem was
de maatstaf voor vergelijking de vitamine-A waarde van een monster
goede handelsboter, die in een hoeveelheid van 0,5 gram bij A-deficiente
ratten blijvend goeden groei te voorschijn riep. Als nu 0,5—2 gr. van
het onderzochte materiaal een evengoede vitaminewerking vertoonde
als de boter, dan gaf hij de werking aan met: „zeer goedquot;; geringere
werking werd dan geschat en uitgedrukt in een der voormelde graden.

Voor verschillende der door ons onderzochte groenten vonden wij
geen Amerikaansche of Duitsche opgaven vermeld, hetzij omdat de
betreffende bepalingen niet verricht waren in een vorm die hen met
onze gegevens vergelijkbaar maakte, hetzij dat de door ons onderzochte
groentesoort in genoemde landen als voedsel niet- of minder in ge-
bruik was en daardoor niet op haar vitamine-A-waarde onderzocht.

1) Scheunert vermeldt schommelingen in de vitamine-A waarde bij ver-
schillende soorten gele wortelen.

-) Scheunert vermeldt vrij groote verschillen in de Vitamine-A waarde
bij verschillende monsters spinazie.

Volgens scheunert bestaan bij kersen groote verschillen wat hun Vita-
mine-A waarde betreft. Voor sommige soorten vond hij die waarde „zeer geringquot;,
voor andere daarentegen „goedquot;.

Bij vergelijking van onze carotinewaarden met de bekende
vitamine-A waarde van de overeenkomstige groenten en vruchten
ziet men, dat deze in het algemeen goed parallel loopen. Enkele ver-
schillen, zooals b.v. bij Abrikozen zijn o.i. op normale schommelingen
in het carotine-gehalte terug te brengen.

1.nbsp;De quantitatieve bepaling van het carotine-gehalte van groenten
en vruchten volgens de beschreven methodiek geeft op de meest
exacte, snelst uit te voeren en minst kostbare wijze inzicht in de
vitamine-A-waarde van dit belangrijk deel onzer voeding.

De biologische vitamine-A-waarde bepahng dient voor genoemde
voedingsmiddelen vervangen te worden door de carotine-bepahng.

2.nbsp;De extractie met petroleum-aether (Kpt. 60—80° C.) volgens
Soxhlet is een goede en tevens zeer gemakkelijke methode voor
de bepahng van het carotine-gehalte in groenten, mits men het
voor onderzoek bestemde gedroogde materiaal zorgvuldig uiterst
fijn pulveriseert. Bestaat er voor die allerfijnste pulverisatie een
beletsel, dan verdient de maceratie-methode met 85% aceton
voor de carotine-bepaling de voorkeur. De bepalingen verricht
volgens de Soxhlet-extractie methode en de beschreven vereen-
voudigde aceton-extractie methode geven onderling goed overeen-
stemmende carotine-waarden.

3.nbsp;Het koken van de groenten leidt niet tot ontleding van het aan-
wezige carotine, misschien wordt het pigment zelfs iets beter
extraheerbaar. De vitamine-A waarde van groenten gaat dus
door koken niet achteruit.

4.nbsp;Het drogen van groenten door middel van verwarmde lucht van
45° C. in het volkomen donker heeft in 24 uren geen merkbare
ontleding van carotine tot gevolg. Het xanthophyll wordt door dit
proces echter wel aangetast.

5.nbsp;De Soxhlet-extractie methode met petroleum-aether is ongeschikt
voor de bepaling van xanthophyll in de groenten.

6.nbsp;Bij de quantitatieve bepaling van carotine in groenten en vruch-
ten mag de verzeeping van het groentenextract nimmer worden
nagelaten. Xanthophyll-esters volgen bij de scheiding van xantho-
phyll en carotine laatstgenoemd pigment in den petroleum-aether;
na de verzeeping gaat het vrijkomende xanthophyll echter geheel
in den alcohol over. Het niet hydrolyseeren der carotinoiden-esters
leidt tot zeer onjuiste (te hooge) bepalingen van het carotine-
gehalte.

7.nbsp;Bij kamertemperatuur toont het carotine in de extracten zich zeer
resistent tegenover kaliloog; bij verhoogde temperatuur wordt het
pigment in de looghoudende extracten ontleed.

8.nbsp;Colorimetrische bepalingen van het carotine- (en xanthophyll-)
gehalte in oplossingen, door middel van een kalium bichromaat
standaardoplossing, zijn weinig nauwkeurig en slechts voor een
beperkt meetbereik bruikbaar. Spectrocolorimetrische bepalingen

stellen in staat in elke carotine-oplossing het gehalte te bepalen
met een fout van ongeveer 3%.

9. Het carotine-gehalte van een bepaalde groentesoort, dus ook de
vitamine-A-waarde is aan groote schommehngen onderhevig.
Met betrekking tot de vitamine-A-waarde is een strenge indeeling
der groenten naar de soorten onmogelijk. In het algemeen zijn
sterk chlorophyll-houdende groenten ook een goede vitamine-A-
bron, chlorophyll-arme groenten daarentegen een slechte vitamine-
A-bron.

10. Om de waarde van groenten en vruchten als vitamineA-bron aan
te geven uitgedrukt in hun carotine-gehalte geve men voor deze
laatste waarde 2 cijfers op. Het eene cijfer geeft aan de hoeveelheid
carotine per 100 gr. versch materiaal, het 2e getal geeft die waarde
per 100 gr. gedroogde groente, hetzij gekookt of ongekookt d.w.z.
zooals de betrokken groente tot gebruik komt. Dit laatste geve
men aan door de letters ^(ekookt) of 0(ngekookt) achter het
opgegeven getal te plaatsen.

Vóór de groenten in onderzoek werden genomen werd er op gelet,
dat zij niet nat waren ten gevolge van regen of dauw. Vóór het wegen
werden zij niet gewasschen, maar wel uitgezocht ter verwijdering van
aanhangend vuil en dorre of verlepte bladeren.

Voor zoover de groenten voor het onderzoek gekookt werden, werd
hierin het voorschrift gevolgd van het kookboek der Amsterdamsche
Huishoudschool.

Indien niet het tegendeel is vermeld, geschiedde de extractie door
middel van het Soxhlet apparaat steeds met petroleum-aether met
een kookpunt van 60—80° C.

Alle extracties, zoowel met het Soxhletapparaat als die met 85%
aceton verricht, vonden plaats bij zwak kunsthcht, tenzij anders ver-
meld. De verzeeping geschiedde bij kamertemperatuur en in het donker.
Ter bekorting is een en ander niet telkens opnieuw in de protocollen
vermeld.

Voor de meting werden de carotinoid-oplossingen steeds eerst
spectroscopisch onderzocht op de aanwezigheid van de vereischte
absorptiebanden. Deze bepalingen worden in de protocollen ter ver-
mijding van onnoodige herhalingen niet vermeld. Als gemiddelde
waarden werd voor de hgging der banden gevonden:

De metingen geschiedden met denStuphometer (Stufenphotometer)
van Pulfrich met gebruikmaking van het blauwe filter: L. 3 (S. 47).

De volledige berekening wordt alleen bij Proef I gegeven als voor-
beeld; overigens is zij in de protocollen weggelaten; men kan hen aan de
hand van de vermelde gegevens gemakkelijk uitvoeren.

De carotine- en xanthophyllwaarden werden na de meting van het
percentage doorgelaten blauw hcht afgelezen van de kaart, die men in
Hoofdstuk VII § 6 vindt; men vindt daar tevens de kaart voor de
colorimetrische bepaling met kahum bichromaat. Zij geeft de curven
aan volgens Willstätter en Stoll en volgens Euler, Demole,
Karrer en Walker.

Extractie-. 7,5 gr. poeder volgens Soxhlet met 100 cc. petroleum-aether
bij kunsthcht, eerst gedurende 5I uur (A), daarna nog uur
(B). Vervolgens de extractie voortgezet met 85% aceton gedu-
rende 5i uur (C), ten slotte nog 3 uren met 85% aceton (D).
Verzeeping-, met 5 cc. natrium methylaat gedurende 24 uren in het
donker (A). In B gedurende 2 uren onder schudden verzeept met
5 cc. 5% natrium methylaat, evenzoo in C en D.

Volume der carotine-petroleum-aether oplossing-. 172 cc.
Meting met^ Pulfrich Stufenphotometer, blauw filter: L. 3 (= S. 47).
Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 27,3% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 27,66% 27,2%

Komt volgens de kaart overeen met 5,16 y Carotine per cc., dus
in I cc. onverdunde oplossing: 5 x 5,16 y = 25,8 y Carotine.
Zelfde oplossing gemeten bij lo-voudige verdunning het 52,2%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 52,3 % 52,6 %

Volume der xanthophyll-petroleum-aether oplossing: 53 cc.
Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 47,8% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 47,2 % 48,4% 47,2 % 48.—%

48.— 47.5 48.— 48.—
Komt volgens de kaart overeen met: 4,66 y Xanth. per cc.
Per 100 gr. gek, en gedr. wortelen: 3,29 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche wortelen: 0,27 mgr. Xanthophyll.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 71,6% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 72,5% 71,2 % 72.—%
71,2 71.— 72.—
71,2 71.— 72.—

Komt volgens de kaart overeen met: 1,31 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. wortelen bij 2e extractie: 1,40 mgr. Car.
Per 100 gr. versche wortelen bij 2e extractie: 0,11 mgr. Car.
Xanthophyll werd niet meer gevonden.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 41,1% blauw hcht door, als
gemiddelde van: 41,5 % 40,8 % 41,3% 40,8%

41.— 41-— 41,2 41,1
Komt volgens de kaart overeen met: 3,51 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. wortelen bij 3e extractie: 10,2 mgr. Car.
Per 100 gr. versche wortelen bij 3e extractie: 0,82 mgr. Car.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 95,4% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 96.—% 96.—%
96.— 94.—
95-—

Komt volgens de kaart overeen met: 0,3 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. wortelen bij 3e extractie: 0,09 mgr.
Xanthophyll.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 32,8% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 33,2% 32,9% 33-—% 32,6%

Komt volgens de kaart overeen met: 4,42 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. wortelen bij 4e extractie: 1,47 mgr. Car.
Per 100 gr. versche wortelen bij 4e extractie: 0,12 mgr. Car.
Xanthophyll werd niet meer gevonden.

petroleum-aether bij kunsthcht.
Verzeeping: gedurende 2 X 24 uren met 10 cc. 5% natrium aethylaat.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 42,8% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 43,5% 43.—% 42.—% 42-—%

42.5 43-— 43.— 43-—
Komt volgens de kaart overeen met: 3,35 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 84,6%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 84,5% 85.—%

Komt volgens de kaart overeen met: 0,65 y Carotine per cc.
Gemiddeld dus per i cc. onverdunde oplossing 3,3 y Carotine.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool: 56,76 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool:nbsp;6,93 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 80,3% blauw
licht door, als gemiddelde van: 79,5 % 81.—% 81.—%

Komt volgens de kaart overeen met: 1,38 y Xanthophyll p. cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 2-voudige verdunning liet 58,6%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 59,5 % 58,5 %

Komt volgens de kaart overeen met: 3,37 y Xanthophyll p. cc.
Gemiddeld in i cc. onverdunde oplossing: 6,80 y Xanthophyll.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool: 20,4 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Boerenkool:nbsp;2,49 mgr. Xanthophyll.

( na koken en drogen 2,36 gr.
Extractie: i gr. droog poeder volgens Soxhlet gedurende 7 uren met

petroleum-aether bij kunsthcht.
Verzeeping: gedurende 2 x 24 uren met 10 cc. 5% natrium aethylaat.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 44.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 44,5% 44-—% 43.5 % 44.5%
43.5 44-— 44-— 43.5

Komt volgens de kaart overeen met: 3,24 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 85,1%
blauw licht door, als gemiddelde van: 86.—% 86,5 %

Komt volgens de kaart overeen met: 0,63 y Carotine per cc.
Dus in I cc. onverdunde oplossing gemiddeld aanwezig: 3,2 y
Carotine.

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 69,28 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 6,54 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 70,5% blauw
licht door, als gemiddelde van: 71,5% 71,5% 71,50/0 yo.—%

Komt volgens de kaart overeen met: 2,20 y Xanthophyll per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 2-voudige verdunning liet 41,6%
blauw hcht door als gemiddelde van: 41.—% 42.—%

Komt volgens de kaart overeen met: 5,55 y Xanthophyll per cc.
Dus per i cc. onverdunde oplossing gemiddeld aanwezig: 11,05 y
Xanthophyll.

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 35,35 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 3,34 mgr. Xanthophyll.

I na koken en drogen 62,776 gr.
Extractie: 10 gr. poeder volgens Soxhlet gedurende 10 uren met petr.-
aether.

Meting: Oplossing bij 2-voudige verdunning gemeten liet 39.—%
blauw licht door, als gemiddelde van: 38,5 % 39.—%

Komt volgens de kaart overeen met: 3,73 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 67,6%
blauw licht door, als gemiddelde van: 68.—% 67,5 %

Komt volgens de kaart overeen met: 1,53 y Carotine per cc.
In I cc. onverdunde oplossing dus gemiddeld aanwezig: 7,55 y
Carotine.

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 54,74 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 6,87 mgr. Carotine.
De Xanthophyllbepaling werd niet uitgevoerd.

Gekookt l als bij Proef III, doch thans werd het poeder onderzocht
Gedroogd lt; nadat het 5 dagen aan de lucht en diffuus kamerhcht was
Gewicht (blootgesteld.

B. Gedurende 2 X 24 uren met 15 cc. 5% natrium methylaat,
waarvan 2 uren bij kooktemperatuur van petroleum-aether.

Meting: Oplossing gemeten bij 2-voudige verdunning liet 58,7% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 58.—% 58,5 % 58,5 %

Komt volgens de kaart overeen met: 2,09 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning het 79,9%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 80.—% 79,5 %

Komt volgens de kaart overeen met; 0,87 y Carotine per cc.
In I cc. onverdunde oplossing dus gemiddeld aanwezig: 4,26 y
Carotine.

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 38,77 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 4,87 mgr. Carotine.
Na 5 dagen is dus van het Carotine nog 70,8% overgebleven.

Meting: Oplossing gemeten onverdund het 50,9% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 51,5 % 51,5 %
50.— 51.—
50.— 52.—
5I-—

Komt volgens de kaart overeen met: 4,26 y Xanthophyll per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 2-voudige verdunning liet 72,3%
blauw licht door, als gemiddelde van: 71,5 % 72,5 %

Komt overeen met: 2,05 y Xanthophyll per cc.
Gemiddeld in i cc. onverdunde oplossing: 4,18 y Xanthophyll.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 63,95 mgr. Xanthoph.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 8,03 mgr. Xanthoph.

Meting: Oplossing gemeten bij 2-voudige verdunning liet 65,7% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 66.—% 66.—% 65,5% 65,5%

Komt volgens de kaart overeen met: 1,65 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 85% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 85.—% 85.—%

Komt volgens de kaart overeen met: 0,63 y Carotine per cc.
Gemiddeld in i cc. onverdunde oplossing aanwezig: 3,22 y Caro-
tine.

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 22,86 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig:nbsp;2,87 mgr. Carotine.

Bij warme verzeeping vergeleken bij verzeeping bij kamertempe-
ratuur is dus het Carotine-gehalte 59% achteruitgegaan.

72.— 72,5 72.—
Komt overeen met: 2,08 y Xanthophyll per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 2-voudige verdunning het 84,5%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 83,5 % 84.—% 85.—%

Komt overeen met: 1,06 y Xanthophyll per cc. Dus gemiddeld
in I cc. onverdunde oplossing aanwezig: 2,10 y Xanthophyll.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 35,49 mgr. Xanthoph.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 4,45 mgr. Xanthoph.

Gekookt l als bij Proef III en IV, doch thans werd het poeder onder-
Gedroogd lt; zocht nadat het 11 dagen aan de lucht en diffuus kamer-
Gewicht { hcht was blootgesteld.

Verzeeping: A. met 5 cc. 5% natrium methylaat gedurende 2 x 24 uren.
B. met 15 cc. 5% natrium methylaat gedurende 2 x 24 uren.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 54,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 55,5% 54-—% 55-—% 54-—%

55.5 54-— 54-— 55-—
Komt overeen met: 2,39 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 88,75%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 88.—% 90,5 % 88.—%

89.5 88,5 88,5
88.— 88.—
Komt overeen met: 0,46 y Carotine per cc.
Gemiddeld in i cc. onverdunde oplossing aanwezig: 2,35 y Caro-
tine.

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 25,5 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig:nbsp;3,20 mgr. Carotine.

Het carotine-gehalte in de onverdunde oplossing werd ook colori-
metrisch gemeten met een 0,2% kalium bichromaat oplossing als
standaard. Bij 2 metingen werd gevonden, dat een kolomhoogte van

13,5 m.m. der bichromaatoplossing kleurgelijkheid gaf met een kolom-
hoogte van 109,5 m.m. der te meten carotineoplossing. Volgens de
door Willstätter gegeven tabel komt een kolomhoogte van 13,5 m.m.
van deze bichromaatoplossing overeen met een kolomhoogte van
17,5 m.m. van een 0,00268% carotineoplossing. Zoodat:

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 46,5 mgr. Carot.
Volgens de door Euler, Demole, Karrer en Walker gegeven
verbeterde tabel komt een kolomhoogte van 13,5 m.m. bichromaat
overeen met een kolomhoogte van 18,75 m.m. 0,00268% carotine-
oplossing, zoodat:

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 60,6% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 61.—% 60.—% 61.—% 60.—%
61.— 60.— 60.— 61.—

Komt overeen met: 3,16 y Xanthophyll per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 90,2%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 90.—% 89.—% 90.—%

Komt overeen met: 0,65 y Xanthophyll per cc.
Gemiddeld in i cc. onverdunde oplossing aanwezig 3,15 y Xantho-
phyll.

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 41,6 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 5,22 mgr. Xanthophyll.

Kleurgelijkstelling werd verkregen bij:
Kolomhoogte Bichromaat = Kolomhoo^e te meten Xanthoph.opl.

Gemiddeld dus bij: g.— m.m. bichromaat — gi.— m.m. xantho-
phylloplossing.

Volgens Willstätter geeft een kolomhoogte van g m.m. bichro-
maat een zelfde kleur als een kolomhoogte van 15,5 m.m. van een
0,00284% xanthophylloplossing.
Zoodat: 0,00284 : X = 91 : 15,5 waaruit:
X = 0,000483%
Volgens deze meting en berekening bevatte dus de xanthophyU-
oplossing per i cc. 4,83 y XanthophyU.

Volgens Euler, Demole, Karrer en Walker komt een kolom-
hoogte van g m.m. bichromaat overeen met een kolomhoogte van
13 m.m. van een 0,00284% xanthophylloplossing, zoodat:
0,00284 : X = 91 : 13 waaruit:
X = 0,000406%
Volgens deze berekening bevatte de xanthophylloplossing: 4,06 y
Xanthophyll per i cc.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 6i,g% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 62,5% 62.—% 62.—% 61,5 % 62.—%

62,5 62.— 61.— 62.— 61.—
Komt overeen met: i,8g y Carotine per cc.
Zelfde oplossing bij 5-voudige verdunning gemeten het go,8%
blauw hcht door, als gemiddelde van: g2,5 % gi,—% gi.—%

go.— gi,5 go.— \'
go.— go.—
Komt overeen met 0,37 y Carotine per cc.
Gemiddeld ui i cc. onverdunde oplossing aanwezig: 1,85 y Carot.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 27,6 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 3,47 mgr. Carotine.

Kleurgelijkstelling werd verkregen bij 2 metingen, waarbij de
kolomhoogte der bichromaatoplossing 10,5 m.m. bedroeg en van de
te meten carotineoplossing: g6,5 m.m.

Volgens Willstätter geeft een kolomhoogte van 10,5 m.m.
bichromaat een zelfde kleur als een kolomhoogte van 14,5 m.m. van
een 0,00268% carotineoplossing
Zoodat: 0,00268 : X = g6,5 : 14,5 waaruit:
X = 0,000402%
Volgens deze meting en berekening bevatte dus de carotineoplossing
per I cc. 4,02 y Carotine.

Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 59,3 mgr. Carotine.
Volgens Euler, Demole, Karrer en Walker komt een kolom-
hoogte van 10,5 m.m. bichromaat overeen met een kolomhoogte van
15,5 m.m. 0,00268% carotineoplossing,
zoodat: 0,00268 : X = 96,5 : 15,5 waaruit:

X = 0,000432%
Volgens deze berekening bevatte dus de carotineoplossing 4,32 y
Carotine per i cc.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 54,6% blauw licht door, als
gemiddelde van: 55-—% 54-—% 55,5 % 54.—% 54-—%

55.— 54,5 54-- 55--
Komt overeen met 3,82 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 43,7 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 5,49 mgr. Xanthophyll.

KleurgelijksteUing werd verkregen bij 2 metingen, waarbij de
kolomhoogte der bichromaatoplossing 12 m.m. bedroeg en van de
te meten xanthophylloplossing: 116 m.m.

Volgens Willstätter geeft een kolomhoogte van 12 m.m. bichro-
maat een zelfde kleur als een kolomhoogte van 21.— m.m. van een
0,00284% xanthophylloplossing,
Zoodat: 0,00284 : X = 116 : 21, waaruit:
X = 0,000514%
Volgens deze meting en berekening bevatte dus de xanthophyll-
oplossing I cc. 5,14 y Xanthophyll.

Volgens Euler, Demole, Karrer en Walker komt een kolom-
hoogte van 12 m.m. bichromaat overeen met een kolomhoogte van
16 m.m. 0,00284% xanthophyhoplossing,
Zoodat: 0,00284 : X = 116 : 16 waaruit:
X =. 0,000392%
Volgens deze berekening bevatte dus de xanthophylloplossing:
3,92 y XanthophyU per i cc.

Gekookt \\ als bij Proef III, IV en V doch thans werd het poeder
Gedroogd gt; onderzocht nadat het 17 dagen aan de lucht en diffuus
Gewicht ) kamerhcht was blootgesteld.

Extractie: i gr. droog poeder in duplo volgens Soxhlet gedurende 8è
uren met petroleum-aether.

Verzeeping: in beide extracten met 5 cc. 5% natrium methylaat, ge-
durende 2 X 24 uren.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 58,9% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 58,5 % 58,5% 59,5% 58.—%

60.— 58,5 59,5 59,_
Komt overeen met 2,11 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 21,52 mgr Carotine..
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 2,70 mgr. Carotine.
Na 17 dagen was dus van het Carotine overgebleven: 39,3%.
Xanthophyllbepahng niet verricht.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 61,6% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 62.—% 61,5% 61,5% 62.—%

60.— 62,5 61,5 62.—
Komt overeen met: 1,91 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 21,2 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig:nbsp;2,66 mgr. Carotine.

( na koken en drogen 47,050 gr.
Extractie: 3 gr. droog poeder gedurende 7è uur volgens Soxhlet.
Verzeeping: gedurende 18 uren met 10 cc. 5% natrium alcoholaat.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 34,9% blauw licht door,
als gemiddelde van: 35-—% 35.4% 34.6% 35.—%
35.— 34.5 35.2 34,7

Komt overeen met: 4,17 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-vovidige verdunning liet 81.—%
blauw licht door, als gemiddelde van: 81,5 % 81.—%

80,5 81.—
81.— 81.—
Komt overeen met: 0,82 y Carotine per cc.
Gemiddeld in i cc. onverdunde oplossing aanwezig: 4,14 y Carot.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 35,47 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 3,63 mgr. Carotine.

Meting in alcohol: Oplossing onverdund gemeten liet 57% blauw licht
door, als gemiddelde van: 57,5 o/^ 56,5 % 56,5 % 57,5 %

Komt overeen met: 3,55 y Xanthlophyl per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 59,17 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 6,19 mgr. Xanthophyll,
Van de alcoholische xanthophylloplossing werd nu 250 cc. over-
gebracht in een volume van 204 cc. petroleum-aether, waarbij de
aan de verzeeping ontsnapte chlorophyllresten, die tot onjuiste
metingen in alcoholische oplossing aanleiding geven, terugblijven.
Meting in -petroleum-aether: Oplossing onverdund gemeten liet 51,7%
blauw licht door, als gemiddelde van: 52,5 % 50.—% 52.—%

52.— 52.— \' 52.—
Komt overeen met: 4,16 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 56,58 mgr. Xanthoph.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 5,82 mgr. Xanthophyll,

Gekookt \\ als in Proef VII. Het poeder werd nu onderzocht na
Gedroogd J 3 x 24 uren in het donker te zijn bewaard, doch niet bij
Gewicht ) uitsluiting van de lucht.

Extractie: 3 gr. droog poeder volgens Soxhlet, gedurende 8 uren in
duplo met de beide volgende extractiemiddelen.

B.nbsp;met petroleum-aether Kpt. 56—63° C. (100 cc.).
Verzeeping: gedurende 2 X 24 uren met 10 cc. 5% natrium aethylaat.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 67,2°/o blauw hcht door,
als gemiddelde van: 67.—% 67,5 % 68.—% 66.—%
68.— 67.— 67.— 67.—

Meting in alcohol: Oplossing onverdund gemeten het 70.—% blauw
licht door, als gemiddelde van: 71.—% 70.—% 70.—% 70.—%

Van de alcohohsche xanthophylloplossing werden 100 cc., door
toevoegen van petroleum-aether en water en nogmaals uitschudden
van den nu zeer verdunden alcohol met versche petroleum
aether, in laatstgenoemde oplosmiddel overgebracht. Het volume
der petroleum-aether xanthophylloplossing bedroeg: loi cc.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 74,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 74,5% 73,5% 73,5% 75-—%

gemiddelde van: 62.—% 63.—% 61,5% \'62.—%
62.— 61.— 61.5 61.5
Komt overeen met: i,90y Carotine per cc.

Meting in alcohol: Oplossing onverdund gemeten het 70,5% blauw hcht
door, als gemiddelde van: 69,5% 70,—% 70,5% 69.—%

Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig.: 7,04 mgr. Xanthophyll.
Ook van deze alcoholische xanthophylloplossing werden 100 cc.
overgevoerd in petroleum-aether. Het volume van deze oplossing
bedroeg: 85 cc.

Meting in fetroleum-aether: Oplossing onverdund gemeten liet 70,3%
blauw licht door, als gemiddelde van:

70,5% 70.-% 7i--% 7i--%
70.— 70.— 70.— 70,5
Komt overeen met: 2,22 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Boerenkool aanwezig: 57,74 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Boerenkool aanwezig: 6,03 mgr. Xanthophyll.

PORSELEIN 1.
(le monster).
Gekookt: 35 minuten met aanhangend water.
Gedroogd: gedurende 18 uren in warmen lichtstroom van 45° C.
^ • t/. ( versch 500 gr.
Kaewxcnt. j koken en drogen 24,720 gr.

Extractie: volgens Soxhlet met petroleum aether (Kpt. 60—80° C.).
le extractie gedurende 8 uren]

2e extractie gedurende 6 uren [ geextrah. werd 20 gr. poeder.
3e extractie gedurende 6 uren)
Verzeeping: gedurende 2 X 24 uren met 5 cc. 5% natrium aethylaat.

Meting: Oplossing gemeten bij 50-voudige verdunning liet 71.—%
blauw licht door, als gemiddelde van: 71.—% 71.—%

71.— 71.—
Komt overeen met: 1,34 y carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein aanwezig: 50,35 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Porselein aanwezig: 2,49 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing gemeten bij 20-voudige verdunning het 66.—%
blauw licht door, als gemiddelde van: 66.—% 66.—% 66.—%
Komt overeen met: 2,62 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein aanwezig: 37,75 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Porselein aanwezig: 1,87 mgr. XanthophyU.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 85.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 85.—% 84.—% 86.—% 86.—% 85.5%.
Komt overeen met: 0,63 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein nog aanwezig: 0,2 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Porselein nog aanwezig: spoor Carotine.

Meting: Oplossing gemeten bij 2-voudige verdunning liet 55.—% blauw
licht door. als gemiddelde van: 55.—% 54-—% 55-—% 55-—%

Komt overeen met 3,75 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein nog aanwezig: 2,95 mgr. Xanth.
Per 100 gr. versche Porselein nog aanwezig: 0,15 mgr. Xanth.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 95.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 95.—% 95-—% 96.—% 94-—% 95-—%
Komt overeen met: 0.19 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein nog aanwezig: o.io mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Porselein nog aanwezig: spoortje Carotine.

Meting: Oplossing gemeten bij 2-voudige verdunning liet 76,5% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 76.—% 76.—% 77.—%

78.— 76.—
Komt overeen met: 1,66 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein nog aanwezig: 1,65 mgr. Xanth.
Per 100 gr. versche Porselein nog aanwezig:, 0.08 mgr. Xanth.

PROEF X.
PORSELEIN II.
(2e monster).
Gekookt: 35 minuten met aanhangend water.
Gedroogd: gedurende 18 uren in warmen luchtstroom van 45° C.

A.nbsp;volgens Soxhlet werd 12,5 gr. poeder met 100 cc. petroleum-
aether gedurende 6 uren geëxtraheerd bij kunstlicht.

B.nbsp;volgens de gewijzigde Soxhlet-methode werd 12,5 gr. droog
poeder geextraheerd in een filtreerpapieren huls, haiigende
in een Erlenmeyer kolf van i liter inhoud met 150 cc. petroleum-
aether. De extractie verliep hier bij ongeveer 55° C. (Bij de
ongewijzigde Soxhlet -methode bedroeg de temp. ongeveer 30° C.
Extr. 6 uren bij kunstlicht.

Tenslotte werd in beide gevallen het poeder nogmaals 3 uren met
verschen petroleum-aether geëxtraheerd.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 47,5% blauw
licht door, als gemiddelde van: 47,5% 47,5% 47,5%.
Komt overeen met: 2,94 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij lo-voudige verdunning het 68.—%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 69.—% 67.—% 67.—%

68.— 68.—
Komt overeen met 1,52 y carotine per cc.
Gemiddeld in i cc. onverdunde oplossing aanwezig: 15,01 y Carot.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein aanwezig: 18,5 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Porselein aanwezig: 0,54 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 35.—% blauw licht, door
als gemiddelde van: 35.—% 36.—% 35.—34,50/;^ 35-—%.
Komt overeen met: 6,63 y XanthophyU per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning het 81.—%

Komt overeen met: 1,33 y Xanthophyll per cc.
Gemiddeld in i cc. onverdunde oplossing aanwezig: 6,64 y Xanth.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein aanwezig: 3,36 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Porselein aanwezig: 0,1 mgr. Xanthophyll.

Verzeeping: evenals in vorige bepaling gedurende 24 uren met 5 cc.
5% natrium methylaat.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 51.—%
blauw licht door, als gemiddelde van: 50.—% 51,5% 50,5^/0

Komt overeen met: 1,34 y Carotine per cc. Dus in i cc. onverdunde
oplossing aanwezig gemiddeld: 13,35 y Carotine.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein aanwezig: 19,5 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Porselein aanwezig: 0^57 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 40,4% blauw licht door,
als gemiddelde van: 40.—% 40.—% 41.—% 40.—%

40.— 41,5 40 —
Komt overeen met: 5.71 y XanthophyU per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 82,8%
blauw licht door, als gemiddelde van: 83,5% 81,5% 83.—%

Komt overeen met 1,18 y XanthophyU per cc. Dus in i cc. on-
verdunde oplossing aanwezig gemiddeld: 5,85 y XanthophyU.
Per 100 gr. gek. en gedr. Porselein aanwezig: 3,04 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. versche Porselein aanwezig: 0,10 mgr. XanthophyU.
Daar hier bij beide extracties slechts gedurende 6 uren was geëx-
traheerd, werd de extractie nog gedurende 3 uren met petroleum-
aether voortgezet. Dit extract was bij beide extracties zóó zwak
gekleurd, dat een bepaling niet meer mogehjk was.

Gedroogd: gedurende 18 uren in warmen luchtstroom bij 45° C.
Gewicht: niet bepaald.

Extractie: 20 gr. droog, fijn gepulveriseerd poeder werd op 2 manieren
met petroleum-aether geëxtraheerd:

A.nbsp;Volgens Soxhlet aanvankelijk gedurende 9 uren, vervolgens
werd de extractie nog gedurende 6 uren verder voortgezet.

B.nbsp;In een bruine flesch werd de 20 gr. poeder gedurende i uur
in de schudmachine geschud met 70 cc. petroleum-aether,
daarna werd de petroleum-aether nog 8 maal telkens om het
uur ververscht. Vervolgens werd de extractie, omdat nog
steeds gele kleurstof werd afgegeven, nog gedurende 6 uren
voortgezet, waarbij 5 maal 80 cc. versche petroleum-aether
werd gebruikt. Totaal was dus 1030 cc. petroleum-aether
noodig. Deze extractie verhep dus bij kamertemperatuur.

Verzeeping: A. gedurende 2 x 24 uren met 5 cc. 5% natrium alcoholaat
B. gedurende 2 x 24 uren met 30 cc. 5% natrium alcoholaat.

Meting: Oplossing gemeten bij 20-voudige verdunnmg het 62,5%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 62.—% 62,5% 63.—%

Zelfde oplossing gemeten bij lo-voudige verdunning liet 40.—%
blauw licht door, als gemiddelde van: 39.—% 40.—% 40.—%

Komt overeen met: 3,62 y Carotine per cc. Gemiddeld dus in i cc.
onverdunde oplossing: 36,6 y Carotine.
Per 100 gr. gedroogd en gekookt wortelloof aanwezig: 39,4 mgr. Carot.

Meting\'. Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning het 30,5% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 30.—% 31.—% 30,5%

Komt overeen met: 3,95 y Xanthophyh per cc. Dus gemiddeld in
I cc. onverdunde oplossing: 38,53 y XanthophyU.
Per 100 gr. gekookt en gedroogd worteUoof aanwezig: 45,75 mgr. Xanth.

Meting: Oplossing gemeten bij lo-voudige verdunning het 74,5%
blauw licht door, als gemiddelde van: 74.—% 75.—% 74.—%

^ . 76.5 73.5
Komt overeen met: 1,15 y Carotme per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 54,6%
blauw licht door, als gemiddelde van: 53,5% 54,5 % 54.—%

, ^ . 53.5 54— 54.5
Komt overeen met: 2,39 y Carotme per cc. Dus gemiddeld in i cc.
onverdunde oplossing: 11,73 y Carotine.
Per 100 gr. gekookt en gedroogd wortelloof aanwezig: 33,9 mgr.
Carotine.

Meting: Oplossing gemeten bij lo-voudige verdunning liet 60,5%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 60,5% 60,5% 60,5%.
Komt overeen met: 3,17 y Xanthophyll per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning het 36,5%
blauw licht door, als gemiddelde van: 36,5% 37.—% 36,5%

Komt overeen met: 6,37 y XanthophyU per cc. Gemiddeld dus in
I cc. onverdunde oplossing: 31,78 y XanthophyU.
Per 100 gr. gekookt en gedroogd worteUoof aanwezig: 25,60 mgr.
XanthophyU.

B. Volgens Soxhlet gedurende 8 uren met petroleum-aether.
A. Volgens de gewijzigde Soxhlet-methode in Erlenmeyerkolf
met 150 cc. petroleum-aether bij ongeveer 55° C., zooals bij
Proef X werd beschreven.
Verzeeping: in beide extracten gedurende 2 x 24 uren met 10 cc.
5% natrium aethylaat.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 55,2% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 55,5% 55-—% 55-—%

55.5 55-—
Komt overeen met: 2,35 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gek. en gedroogde Spinazie aanwezig: 48,56 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Spinazie aanwezig:nbsp;4,87 mgr. Carotine.

Meting in alcohol: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet
71.—% blauw hcht door als gemiddelde van:
70,5% 71.-% 70.5% 70.5%
71,5 71.— 71,5
Komt overeen met: 2,16 y Xanthophyll per cc.
Meting in petroleum-aether: Van bovenstaande alcoholische xantho-
phylloplossing werd 500 cc. overgevoerd in petroleum-aether,
waarbij een volume van 511 cc. petroleum-aetheroplossing van
xanthophyll werd verkregen. Daarna werd de rest van de ver-
dund-alcohohsche xanthophylloplossing nogmaals met petroleum-
aether uitgeschud, waarbij nog xanthophyU bleek te worden
opgenomen. Dit 2e volume petroleum-aether bedroeg 310 cc.
Bij meting van het le volume petroleum-aether in de onverdunde
oplossing werd 32,8% blauw licht doorgelaten, als gemiddelde van:
33.5 % 33.—% 33-—% 32.5%
33— 33.— 32.— 32,5
komt overeen met: 7,04 y Xanthophyll per cc.
Bij meting van het 2e volume petroleum-aether werd in de onver-

68.-% 68.-% 68,5 % 69,5%
70.— 70.— 68.— 68,5%
Komt overeen met: 2,36 y XanthophyU per cc.
Uit 500 cc. alcoholische xanthophyUoplossing werd dus met
petroleum-aether geëxtraheerd: 4329,04 y XanthophyU. Uit
iioo c.m. dus: 9523,89 y XanthophyU.

Per 100 gr. gek. en gedr. Spinazie aanwezig: 76,19 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. versche Spmazie was aanwezig: 7,64 mgr. XanthophyU

Volgens de metmg in alcohol zou verkregen zijn:
Per 100 gr. gek. en gedr. Spinazie: 95,04 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. versche Spinazie:nbsp;9.50 mgr, XanthophyU.

De metmg in alcohol zou hier dus een vrij groote fout gegeven
hebben ten gevolge van de niet geheel voUedige verzeeping van
het m het oorspronkelijke extract aanwezige chlorophyU.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 61,1% blauw
licht door, als gemiddelde van: 61.—% 61,5% 61.—%

60,5 61,5
Komt overeen met: 1,94 y Carotine per cc.
Per 100 gr, gek. en gedr. Spinazie aanwezig: 51,44 mgr. Carotine
Per 100 gr. versche Spinazie aanwezig:nbsp;5,1 mgr. Carotine.

Werd aUeen in alcohol gemeten:
Per 100 gr, gek. en gedr. Spinazie aanwezig: 95,47 mgr. Xanthophyll
Per 100 gr. versche Spmazie aanwezig: g.55 mgr. XanthophyU.

Dit monster winterspinazie werd op verschiUende wijzen op zijn
carotine- en xanthophyllgehalte onderzocht:

versche Spinazie gedurende uur met totaal 750 cc. 85% aceton
geëxtraheerd. Na de extractie werd het aceton-extract over-
gevoerd in ongeveer een gehjk volume petroleum-aether en werd
verzeept gedurende 18 uren met 50 cc. 10% methyl-alcohohsche
kaliloog onder herhaald schudden.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 60,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 61.—% 59,5 % 61.—% 61.—%

61,5 60.— 60.— 60,5
Komt overeen met: 1,97 y Carotine per cc.
Per 100 gr. versche Spinazie was aanwezig: 4,28 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 24,8% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 25.—% 25.—% 25.—% 24,50%

25.— 24,5 24,75 24,30
Komt overeen met: 8,82 y Xanthophyll per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning het 73,8%
blauw licht door, als gemiddelde van: 74.—% 75-—% 73—%

Komt overeen met: 1,92 y Xanthophyll per cc. Gemiddeld m i cc.
onverdunde oplossing aanwezig: 9,21 y Xanthophyll.

Extractie: 5 gr. droog poeder op een Jena-glas Zeiss Tiegel I.G 3
gedurende 9i uur met 85% aceton geëxtraheerd onder telkens
omroeren en macereeren met een glasstaaf.

Verzeeping: gedurende 18 uren met 50 cc. 10% methylalcoholische
kahloog na overvoeren der acetonoplossing in petroleum-aether.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 50,6% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 50.—% 51-—% 5o.—% 50-—%

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 72,4% blauw
licht door, als gemiddelde van: 73.—% 72,5 % 72.—%

Komt overeen met: 2,04 y Xanthophyll per cc.
Uit de met het waschwater verwijderde emulsies kon nog xantho-
phyll geëxtraheerd worden, maar geen carotine. Daardoor werd
nog een volume van 80,5 cc. petroleum-aether-xanthophyU-
oplossing verkregen, die 44—% blauw hcht doorliet en bijgevolg
5,18 y Xanthophyll per cc. bevatte. Uit de 5 gr. poeder werd dus
totaal geëxtraheerd:

1754.4 ï 417 Y = 2171,4 y XanthophyU.
Per 100 gr. ongekookte gedroogde Spinazie aanwezig: 43,4 mgr. Xanth.
Per 100 gr. versche Spinazie aanwezig:nbsp;4,49 mgr. Xanth.

Gedroogd gewicht als in vorige bepahng B. a.
Extractie: 5 gr. poeder gedurende 9^ uur volgens Soxhlet.
Verzeeping: gedurende 18 uren met 20 cc. 10% aethylalcoholische
kaliloog.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 28,2% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 28,5% 28,5% 28,5% 28.—%

28,5 28,5 27,5 28.—
Komt overeen met: 4,99 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning het 77,7%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 78.—% 77.—% 78._%

Komt overeen met i.— y Carotine per cc. Gemiddeld in i cc.
onverdunde oplossing aanwezig: 5.— y Carotine.
Per 100 gr. ongekookte gedroogde Spinazie aanwezig: 38,5 mgr. Carot.
Per 100 gr. versche Spinazie aanwezig:nbsp;3,98 mgr. Carot.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 49,2% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 48,5 % 49,5% 49,50/^ 49.—o/^,

50.— 49,5 48,5 48,5
Komt overeen met: 4,49 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. ongekookte gedroogde Spinazie: 31,7 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Spinazie:nbsp;3,28 mgr. XanthophyU.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 63.—%
blauw licht door, als gemiddelde van:

63,5 % 63.—% 63.—% 62,5%
63.— 63.— 62,5 63,5
Komt overeen met: 1.82 y Carotine per cc.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 73,8%
blauw hcht door, als gemiddelde van:

74--% 73.5% 74.—% 74.—%
74-— 74.5 73-— 73\'—
Komt overeen met: 1,92 y Xanthophyll per cc.

Gekookt: 100 gr. versche Spinazie gedurende \\ uur in een bekerglas
met weinig water.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 20,5% blauw licht door,
als gemiddelde van: 8 gelijke metingen.
Komt overeen met 6,3 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 73,1%
blauw licht door, als gemiddelde van: 72,5% 73.—% 73.—%

Komt overeen met: 1,23 y Carotine per cc. Gemiddeld in i cc.
onverdunde oplossing aanwezig: 6,23 y Carotine.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Spinazie: 41,4 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Spinazie:nbsp;4,15 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 39,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 40,5 % 40.—% 39-—% 39.5%
40.— 39.— 39,5 39.5

Komt overeen met 5,87 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Spinazie: 40,9 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Spinazie:nbsp;4,10 mgr. Xanthophyll.

B.nbsp;Volgens gewijzigde Soxhlet-methode in Erlenmeyerkolf ge-
durende 6 uren met 150 cc. petroleum-aether bij ± 55° C.

Verzeeping: gedurende 2 X 24 uren met 10 cc. 5% natrium aethy-
laat bij beide extracties.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 37,4%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 38.—0/0 37.—% 37.—%

37.5 37.5
Komt overeen met: 3,89 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij lo-voudige verdimning liet 60,2%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 60,5% 60.—% 60.—%

Komt overeen met: 1,98 y Carotine per cc. Gemiddeld in i cc.
onverdunde oplossing aanwezig: 19,63 y Carotine.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie aanwezig: 19,98 mgr. Car.
Per 100 gr. versche Andijvie aanwezig:nbsp;0,92 mgr. Car.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 58,1% blauw licht door,
als gemiddelde van: 59-—% 58.—% 58.—% 57.5%

Komt overeen met: 3,42 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie: 9,20 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Andijvie:nbsp;0,43 mgr. Xanthophyll.

Komt overeen met 2,58 y Carotine per cc.
Zelfde oplossing gemeten bij lo-voudige verdunning het 70,7%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 71.—% 70.—% 71.—%

Komt overeen met: 1,36 y Carotine per cc. Gemiddeld in i cc.
onverdunde oplossing aanwezig: 13,25 y Carotine.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie: 21,68 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Andijvie:nbsp;1,03 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 39,4% blauw hcht door,
als gemiddeld evan: 39,5 % 40.—% 38,5%
40.— 39.—
Komt overeen met: 5,88 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie: 9,20 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Andijvie:nbsp;0,43 mgr. Xanthophyll.

B.nbsp;Met een mengsel van 75% petroleum-aether en 25% aceton,
volgens Soxhlet. Deze petroleum-aether was hergedestilleerd
en de fractie, die tusschen 56—63° C. overging werd opgevangen
en voor deze extractie gebruikt.

C.nbsp;Met 85% aceton op Buchner-filter, met maceratie aan het einde
der extractie.

Extractie: 5 gr. droog groentenpoeder met 100 cc. petroleum-aether,
gedurende 8 uren.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 44.—% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 44.—% 44-—% 44-—% 44-—%

Meting in alcohol: Oplossing onverdund gemeten liet 80,1% blauw hcht
door, als gemiddelde van: 80.—% 80.—% 80.—% 80.—%

Hiervan werd 200 cc. overgevoerd in petroleum-aether onder
toevoeging van water. De verdunde alcohol werd daarna nogmaals
met een hoeveelheid petroleum-aether uitgeschud. De samen-
gevoegde petroleum-aether fracties hadden een volume van:
98 cc.nbsp;•

Meting in petroleum-aether: Oplossing onverdund gemeten het 70,4%
blauw hcht door, als gemiddelde van:

Extractie: 5 gr. plantenpoeder met 75 cc. petroleum-aether (Kpt. 56—
63° C.) -f 25 cc. aceton, gedurende 8 uren.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 50,5% blauw licht door,
als gemiddelde van: 49,6% 51.5 50.5 % 50.—%

Komt overeen met: 2,7 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie: 38,3 mgr. Carotine
Per 100 gr. versche Andijvie:nbsp;1,77 mgr. Carotine.

Meting in alcohol: Oplossing onverdund gemeten liet 73,5% blauw hcht
door, als gemiddelde van: 74.—% 74.—% 73.--% 74.—%

Meting in petr.-aether: Van de alcoholische xanthophyUoplossing werd
een volume van 200 cc. overgebracht in petroleum-aether Het
petroleum-aether-volume bedroeg 95 cc. Deze oplossing onver-
dund gemeten het 58,3% blauw licht door, als gemiddelde van:

Komt overeen met: 3,41 y XanthophyU per cc. In 200 cc. alco-
hohsche xanthophyUoplossing dus aanwezig:

Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie: 28,90 mgr. XanthophyU
Per 100 gr. versche Andijvie:nbsp;1.34 mgr. XanthophyU.

De petroleum-aether-oplossing van het carotine in deze laatste
proef werd ook colorimetrisch gemeten met een 0.2% kalium bichro-
maat standaardoplossing. De kleurgelijkstelling in deze verdunde
oplossingen was moeilijk, afgelezen werd:

Carotineoplossing = kalium bichromaat oplossing
kolomhoogte in m.m.nbsp;kolomhoogte in m m

Volgens Willstätter komt een kolomhoogte van 12 m m stand-
aardbichromaatoplossing overeen met een kolomhoogte van 16 m m
0,00268% carotineoplossing en een hoogte van 12,5 m.m. met 16 5
m.m. carotineoplossing.

(I) X = 0,000415%.
(ip X = 0.000391%.
Volgens (I) is dus per cc. der onderzochte carotineoplossing aan-
wezig 4,15 Y en volgens (II): 3.91 y Carotine.

Volgens de door Euler, Demole, Karrer en Walker gegeven
getallen komt een kolomhoogte van 12 m.m. standaard bichromaat-
oplossing overeen met een kolomhoogte van 17 m.m. 0,00268%
carotineoplossing en 12,5 m.m. bichromaatoplossing met 17,5 m.m.
van dezelfde carotineoplossing. Daar de sterkte der oplossing om-
gekeerd evenredig is aan de kolomhoogte vindt men voor de carotine-
concentratie in de 710 cc. petroleum-aether:

waarin X het carotine percentage der te meten petroleum-aether-
oplossing voorstelt. Uit (I) volgt: X = 0,000442% en uit:

gemiddeld dus: 0,000428% carotine aanwezig in 710 cc. petroleum-
aether of: 0,000428 x 7,10 = 0,003039 gr. = 3039 y Carotine.

Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie: 60,78 mgr. Carotine.
De colorimetrische gevonden waarde lijkt dus naar niets bij de meting
van deze verdunde oplossingen.

Extractie: 3 gr. gedroogd poeder met 300 cc. 85% aceton gedurende
8 uren op een Jena-glas Zeiss Tiegel, I.G 3 onder omroeren en
macereeren met een glasstaaf.
Verzeepen: na overvoeren van het acetonextract in ongeveer | liter
^ petroleum-aether werd gedurende 18 uren met 50 cc. verzadigde
methylalcoholische kaliloog verzeept.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 75,6% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 74.—% 75,5 0/^ 75^5 0/^ 76,5%

75.5 76.- 75.- 76.5
Komt overeen met: 1,09 y Carotme per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie: 44,22 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Andijvie:nbsp;2,04 mgr. Carotine.

Meting in alcohol: Oplossing onverdund gemeten liet 73,5% blauw
hcht door, als gemiddelde van:

75-—% 73,5 % 73,5% 73,5 %
74-— 73-— 74,5 73-—
Komt overeen met: 1,94 y xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Anüijvie: 66,61 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Andijvie:nbsp;3,06 mgr. XanthophyU.

Meting in petrol.-aether. Van de alcoholische oplossing werd 200 cc.
overgevoerd in petroleum-aether. Dit volume bedroeg 132 cc.
deze oplossing onverdund gemeten het 68,8% blauw licht door,
als gemiddelde van: 69.—% 68.—% 69.—% 68.—% 69.—%

Komt overeen met: 2,36 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Andijvie: 53,50 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. versche Andijvie:nbsp;2,47 mgr. XanthophyU.

Deze groente werd aUeen versch onderzocht na drogen, zij werd
dus niet gekookt. Het drogen geschiedde op 2 verschiUende manieren:

Gedroogd: 17 gr. zeer fijn gemalen versche salade werden in een mortier
droog gewreven met ongeveer 90 watervrij natrium sulfaat.
Extractie: de geheele hoeveelheid werd in een groot Soxhlet-apparaat
met 250 cc. petroleum-aether gedurende 8 uren geëxtraheerd.
Verzeeping: gedurende 18 uren met 6 cc. 5% natrium methylaat.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 67,1% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 65,5% 68.—% 66,5 % 67.—%

66,5 68.— 68.— 67.—
Komt overeen met: 1,56 y Carotine per cc.
Per 100 gr. versche Salade aanwezig: 1,52 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 62,6% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 62,5% 63,5% 62.—% 62.—%

61,5 62,5 63,5 63.—
Komt overeen met: 2,96 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. versche Salade aanwezig: 1,46 mgr. XanthophyU.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 35,9% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 35,5% 36.—% 36.—% 36.—%

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 53,5% blauw licht door,
als gemiddelde van: 53,50/^ 53,50/^ 53-—% 54-—%

Extractie: 5 gr. groentepoeder werd op Jena-glas Zeiss Tiegel I.G 3
gedurende 8 uren met 300 cc. 85% aceton geëxtraheerd onder
omroeren en maceratie met een glasstaaf.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 65,5% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 65.—% 65.—% 65,5% 66.—%

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 47,7% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 47,5 % 47.5 % 48.—% 47.5 %

Per 100 gr. ongekookte gedroogde Salade: 25,97 mgr. Xanthophyll.
Daar echter het Saladepoeder na 8-urige extractie met 85%
aceton nog gele kleur afgaf werd, de extractie nogmaals gedu-
rende 5 uren voortgezet met 300 cc. 85% aceton, eerst toen bleek
alle kleurstof te zijn afgegeven. Op de gewone wijze in petroleum-
aether overgevoerd en verzeept, bleek dit extract geen carotine
meer te bevatten, doch uitsluitend xanthophyll. Het volume
der petroleum-aether xanthophylloplossing bedroeg 59 cc. Onver-
dund gemeten liet deze oplossing 75,4% blauw hcht door, als
gemiddelde van:

76.—% 75.-% 75--% 76.—% 74-—% 76.—%
Komt overeen met: 1,78 y XanthophyU per cc. Bij deze 2e ex-
tractie werd dus nog gevonden per 100 gr. gedroogde Salade:
2,10 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. ongekookte gedroogde Salade dus totaal: 25,97 2,10 mgr.

Het carotine- en xanthophyllgehalte werd bij deze groente op ver-
schiUende wijzen bepaald, zoowel voor de ongekookte als de gekookte
groente.

Gedroogd: 16 gr. versche ongekookte Raapstelen werden zeer fijn
gehakt en daarna met watervrij natrium sulfaat in een mortier
afgewreven tot een droog poeder was verkregen. Hiervoor was
ongeveer 100 gr. van genoemd zout noodig.
Extractie: gedurende 8 uren in een groot Soxhlet-apparaat met 250 cc.

petroleum-aether.
Verzeeping: gedurende 18 uren met 10 cc. 10% methylalcoholische
kaliloog.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 84,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 84.—% 85.—% 85.—% 84,5 %

84.— 85.— 85.— 84.—
Komt overeen met: 0,66 y Carotine per cc.
Per 100 gr. versche Raapstelen aanwezig: 1,71 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 38,6% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 38.—% 38.5 % 39-—% 38.5%

Komt overeen met 6,02 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. versche Raapstelen aanwezig: 2,48 mgr. XanthophyU.

Bij het extraheeren met petroleum-aether klonterde de zoutmassa
tot vrij harde stukken samen. Er was daardoor reden om aan voUedige
extractie te twijfelen, daarom werd de extractie nog gedurende 6 uren
met verschen petroleum-aether voortgezet. Het extract werd verzeept
met 6 cc. 5% natrium alcoholaat gedurende 2 x 24 uren.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 93,3% blauw licht door,
als gemiddelde van: 94.—% 93.5% 93-—% 93-—% 93-—%
Komt overeen met: 0,26 y Carotine per cc.
Per 100 gr. versche Raapstelen werd bij deze 2e extractie nog ge-

extraheerd: 0,14 mgr. Carotine. Dus totaal:
Per 100 gr. versche Raapstelen: 1,71 mgr. 0,14 mgr. = 1,85 mgr.
Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 78,1% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 78,5% 77,5% 78.—% 79.—% 77.5%
Komt overeen met: 1,56 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. versche Raapstelen werd bij deze 2e extractie nog ge-

extraheerd: 0,67 mgr. XanthophyU. Dus totaal:
Per 100 gr. versche Raapstelen: 2,48 mgr. -f 0,67 mgr. == 3,15 mgr.
XanthophyU.

Gedroogd: gedurende 18 uren in warmen luchtstroom van 45° C.
Gewicht: versch 156 gr.

na drogen 8,725 gr.
Extractie: 4 gr. droog poeder gedurende 8 uren volgens Soxhlet.
Verzeeping: gedurende 2 x 24 uren met 20 cc. 10% methylalcoho-
hsche kaliloog.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 78,3% blauw
licht door, als gemiddelde van: 78,5 % 78.—% 78,5 %

78.— 79.5 78.—
78— 78.—
Komt overeen met: 0,96 y Carotine per cc.
Per 100 gr. ongekookt-gedroogde Raapstelen: 37,44 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Raapstelen:nbsp;2,10 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 30,1% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 30,50/0 30.4% 29,90/^ 29,9%

Zelfde oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning het 79.—%
blauw hcht door, als gemiddelde van: 79.—% 78.—% 79,5 %

Komt overeen met: 1,49 y XanthophyU per cc. Gemiddeld in i cc.
onverdunde oplossing: 7,52 y XanthophyU.
Per 100 gr. ongekookt-gedroogde Raapstelen: 45,5 mgr. Xanthoph.
Per 100 gr. versche Raapstelen:nbsp;2,55 mgr. Xanthoph.

Extractie: 4 gr. groentenpoeder gedurende 8 uren met 300 cc. 85%
aceton geëxtraheerd op een Jena-glas Zeiss Tiegel I.G 3, onder
omroeren en macereeren met een glasstaaf.
Ter controle werd daarna hetzelfde poeder nogmaals geëxtraheerd
met 85% aceton gedurende 6 uren. Slechts een minimale en te
verwaarloozen hoeveelheid xanthophyU werd nog gevonden.
Verzeeping: gedurende 18 uren met 50 cc. 10% methylalcoholische
kahloog.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 53,2% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 53,50/0 53,5 % 52.—% 53-—%

Per 100 gr. ongekookt-gedroogde Raapstelen: 37,16 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Raapstelen:nbsp;2,08 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 27,2 %blauw licht door,
als gemiddelde van: 27.—% 27.—% 27,3% 27,2 %

27-— 27,5 27,4 27.—
Komt overeen met: 8,24 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. ongekookt-gedroogde Raapstelen: 59,74 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. versche Raapstelen:nbsp;3,36 mgr. XanthophyU.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 65,5% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 65.—% 65.—% 65.—%

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning liet 70,1% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 70.—% 70.—% 70.—%

Extractie: 4 gr. groentenpoeder gedurende 8 uren met 500 cc. 85%
aceton op een Jena-glas Zeiss Tiegel I.G 3, onder telkens om-
roeren en macereeren met een glasstaaf.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 51,6% blauw Jicht door,
als gemiddelde van: 52.—% 51.—% 5i-—% 52.—%
52.— 51.5 52.— 5I-—

Komt overeen met: 2,61 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Raapstelen: 65,25 mgr. Carotine.
Per 100 gr. Versche Raapstelen:nbsp;2,11 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdunning het 69,6% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 70.—% 70.—% 69._%

Komt overeen met: 2,3 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Raapstelen: 101,2 mgr. Xanthoph.
Per 100 gr. versche Raapstelen:nbsp;3,28 mgr. Xanthoph.

A.nbsp;10 gr. werd gedurende 8 uren volgens Soxhlet bij ± 30° C.
met iio cc. petroleum-aether geëxtraheerd.

B.nbsp;10 gr. werd gedurende 8 uren volgens de gewijzigde Soxhlet-
methode geëxtraheerd in een Erlenmeyer kolf van i Uter
inhoud bij ± 55° C. met 150 cc. petroleum-aether.

Verzeeping: beide extracten werden gedurende 2 x 24 uren verzeept
met 10 cc. 5% natrium aethylaat.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 72,2% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 72.—% 72.—% 73.—%

Komt overeen met: 1,28 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Spruitjes: 6,07 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Spruitjes:nbsp;0,60 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 71,5% blauw licht door,
als gemiddelde van: 72,5 % 72.—% 71,5 %

71.— 71.— 71.—
Komt overeen met: 2,12 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Spruitjes: 10,2 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. versche Spruitjes:nbsp;1,01 mgr. XanthophyU.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 67,9% blauw licht door,
als gemiddelde van: 67,5 % 68,5% 67.—% 68,5%

68.— 68,5 67.—
Komt overeen met: 1,52 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Spruitjes: 6,2 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Spruitjes:nbsp;0,62 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 67,9% blauw licht door,
als gemiddelde van:nbsp;67,5% 68,2% 68,2%

67.— 68,2 68,2
Komt overeen met: 2,44 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Spruitjes: 10,8 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. versche Spruitjes:nbsp;1,07 mgr. XanthophyU.

Deze groente werd na gekookt en gedroogd te zijn op 3 verschiUende
wijzen geëxtraheerd:

A. Extractie volgens SoxJüet met petroleum-aether.
Gekookt: ij uur met veel water.

Gedroogd: gedurende 60 uren in warmen luchtstroom. Het drogen
ging uiterst langzaam en was ten slotte nog onvolkomen, waardoor
het pulviseeren minder fijn was dan bij andere groenten.
Verzuimd was de kooltjes voor het drogen fijn te maken.

na koken en drogen 31,010 gr.
Extractie: 7,5 gr. gemalen groenten werden gedurende 8 uren volgens
Soxhlet geëxtraheerd met petroleum-aether (Kpt. 56-63® C.)
Verzeeping: gedurende 24 uren met 6 cc. 5% natrium aethylaat.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 72,8% blauw licht door,
als gemiddelde van: 72,5% 72.—% 72.—% 73.—%

Meting in alcohol: Oplossing onverdund gemeten het 83,1% blauw licht
door, als gemiddelde van: 83.—% 84.—% 82.—% 84.—%

Per 100 gr. versche Spruitjes aanwezig: 0,75 mgr. XanthophyU.
Van deze alcohohsche xanthophyhoplossing werden 200 cc. op
de gewone wijze in petroleum-aether overgevoerd. Het petroleum-
aether volume bedroeg: 73,5 cc.

Meting in petr.-aether: Oplossing onverdund gemeten het 67,9% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 68.—% 69.—% 68.—%

67.5 67,5 68.—
Komt overeen met: 2,44 y XanthophyU per cc.
De - 200 cc. alcohohsche xanthophylloplossing bevatten dus:

73,5 X 2,44 = 179,34 y XanthophyU.
Uit 7,5 gr. gek. en gedr. Spruitjes werd dus geëxtraheerd:

Extractie: 7,5 gr. gemalen groente, gedurende 8 uren met een mengsel
van 80 cc. petroleum-aether -{- 20 cc. aceton volgens Soxhlet.
Kpt. petroleum-aether 56-63° C.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 68,8% blauw hcht door,
ak frpmiHHplHp van\' f\\R—o/_ _0/ fin_o/ fin eO/

M^^ZMg:Oplossing onverdund gemeten het 82,3% blauw licht door,
als gemiddelde van: 82,5% 82.—% 81.—% 83.5%
82,5 82.— 82.5 82.—
Komt overeen met: 1,23 y Xanthophyll per cc.

Extractie: 7,5 gr. gemalen groentepoeder op Büchner filter gedurende
8 uren. Het filter werd nagewasschen met onverdund aceton om
het aan talk geadsorbeerde xanthophyU vrij te maken. Omdat
bij deze extractie niet alle pigment bleek verwijderd te zijn, werd
nogmaals gedurende 5 uren geëxtraheerd met 90% aceton.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 86,4% blauw licht door,
als gemiddelde van: 85,5% 86,5% 86.—% 85,5%

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 78.—% blauw hcht door,
als gemiddelde van 78.—% 77.5% 78,—%

Per 100 gr. gekookte en gedroogde Spruitjes nog geextraheerd: 2,38
mgr. Carotine. Totaal dus:

oplossing 200 cc. overgevoerd in petroleum-aether, hetgeen een
volume gaf van 76 cc. petroleum-aether. Deze oplossing onver-
dund gemeten liet 75,3% blauw hcht door, als gemiddelde van:
76,5% 75.5% 74—% 75.5%
75.5 75.5 75.— 75-—.
Komt overeen met: 1,79 y Xanthophyll per cc.
Uit 7,5 gr. gedroogde en gekookte Spruitjes werd bij le extractie
verkregen: 504,71 y Xanthophyll.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 61,4% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 60,5% 62.—% 61.—%
61,5 62.—

Komt overeen met: 3,08 y XanthophyU per cc. Uit 7,5 gr. Spruitjes
werd dus verkregen: 504,71 y 40,35 y = 545,06 y Xanthophyll.

Gekookt: na 24 uren uittrekken in water gedurende i uur gekookt in
versch water.

Extractie: Deze groenten waren niet zeer fijn gepulveriseerd. 5 gr.
groentepoeder gedurende 7i uur in duplo geëxtraheerd met 100
cc. petroleum-aether volgens Soxhlet. Daarna werd voor de plan-
tenpoederresten der le bepahng nagegaan of alle carotine en Xan-
thophyU was geëxtraheerd door dit poeder nogmaals te extrahee-
ren, nu met 85 % aceton. Daartoe werd het poeder 2 maal telkens
gedurende i uur in de schudmachine met 50 cc. 85% aceton
geschud en daarna in een mortier nog gemacereerd.

Verzeeping: de beide Soxhlet-extracten werden verzeept met 5 cc.
5% natrium aethylaat gedurende 24 uren.
Het aceton-extract werd geschud met 4 cc. 5% natrium aethylaat
gedurende i uur.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 67,3% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 67,5% 68.—% 67.—% 67,5%

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 76.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 76.—% 76,5% 75.—% 75.5% 76.—%
Komt overeen met: 1,07 y Carotine per cc.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 59,2% blauw licht door,
als gemiddelde van: 59-—% 60.—% 58.5 % 58.5%

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 80,9% blauw licht door,
als gemiddelde van: 82.—% 81,5% 80,5%

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 66,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 67,5 % 66,5% 66.—% 67.—%

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 60,2% blauw licht door,
als gemiddelde van: 60.—% 60,5 % 59,5% 60,5 %

Extractie: 10 gr. poeder volgens Soxhlet in duplo gedurende 8 uren.
Verzeeping: A. le Proef. Gedurende 2 X 24 uren met 5 cc. 5% na-
trium aethylaat. Verzeeping bij kamertemperatuur.
B. 2e Proef. Aan den petroleum-aether werd 2 uren voor het einde
der extractie toegevoegd 5 cc. 5% natrium aethylaat, daarna
werd de extractie gewoon voortgezet. De verzeeping geschiedde
dus tijdens de extractie bij kooktemperatuur van petroleum-
aether.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 77,7% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 78.—% 77,5 % 78.—%

77-— 78.— 77.5
Komt overeen met: 0,98 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Snijboonen: 2,33 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Snijboonen:nbsp;0,17 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 83,1% blauw licht door,
als gemiddelde van: 83.5% 84.—% 82,5%

82,5 83.—
Komt overeen met: 1,16 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Snijboonen: 3,45 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Snijboonen:nbsp;0,25 mgr. Xanthophyll.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 81,2% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 81.—% 80.—% 82.—% 81.—%

8i._ 82.— 81,5
Komt overeen met: 0,81 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Snijboonen: 2,04 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Snijboonen:nbsp;0,15 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 88,5% blauw licht door,
als gemiddelde van: 88.—% 89.—% 89.—%

88.— 89.— 88.—
Komt overeen met: 0,77 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Snijboonen: 3,25 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Snijboonen:nbsp;0,23 mgr. Xanthophyll.

A.nbsp;le proef. Gedurende 24 uren met 5 cc. 5% natrium aethylaat
bij kamertemperatuur.

B.nbsp;2e proef. Tijdens laatste li uur van de extractie werd aan het
extractiekolfje toegevoegd 5 cc. 5% natrium aethylaat en
daarop de extractie voortgezet tot ook hier 7 uren was ge-
extraheerd. De verzeeping verliep hier dus bij kooktempe-
ratuur van petroleum-aether. Na afloop der extractie werd
het extract dadelijk verder verwerkt.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 87.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 87.—% 86.—% 86,5 %

87.— 88.— 87.—
Komt overeen met: 0,54 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Savoye kool: 0,51 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Savoye kool:nbsp;0,03 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 95.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 95-—% 95.5% 95-—%

Komt overeen met: 0,32 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Savoye kool: 0,2 mgr. XanthophyU.
Per 100 gr. versche Savoye kool:nbsp;0,01 mgr. XanthophyU.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 92,8% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 92,5 % 93.—% 93-—% 92,5%

93-— 93-— 92,5
Komt overeen met: 0,28 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Savoye kool: 0,39 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Savoye kool:nbsp;0,02 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 95.—% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 5 metingen van 95.—%.
Komt overeen met: 0,32 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Savoye kool: 0,25 mgr. Xanthophyll.
Per 100 gr. versche Savoye kool:nbsp;0,01 mgr. Xanthophyll.

Verzeeping: gedurende 18 uren met 5 cc. 5% natrium aethylaat.
I. CAROTINEBEPALING.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 86,2% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 86,5% 86.—% 86.—%

86,5 86.—
Komt overeen met: 0,57 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde SelderijImoUen: 0,29 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche Selderij knollen:nbsp;0,01 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 87.—% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 87,5 % 87,5 % 86.—%

87.— 87.—
Komt overeen met: 0,88 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde SelderijknoUen: 0,08 mgr. Xanth.
Per 100 gr. versche Selderij knoUen:nbsp;spoor XanthophyU.

petroleum-aether.
Verzeeping: gedurende 24 uren met 15 cc. 5% natrium aethylaat.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 95,4% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 95,5 % 95.—% 95,5% 96.—%

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 76,1% blauw licht door,
als gemiddelde van: 76,3 % 76,5 % 75,6%

76.— 76.—
Komt overeen met: 1,72 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde Groene Erwten: 0,25 mgr. Xanthoph.
Per 100 gr. gedroogde Groene Erwten:nbsp;0,20 mgr. Xanthoph.

A.nbsp;gedurende 8 uren volgens Soxhlet 12,5 bloemkoolpoeder met
een mengsel van 80 cc. petroleum-aether (Kpt. 56—63° C.)
en 20 cc. aceton.

Verzeeping: gedurende 2 x 24 uren met 10 cc. 10% methylalcohohsche
kdUoog, in beide gevaUen.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 94,5% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 94,5 % 95-—% 93.5%

Xanthophyll was vermoedelijk in een spoor aanwezig, kon even-
wel niet gemeten worden.

Extractie: gedurende 8 uren werd 10 gr. groentenpoeder geëxtraheerd
met 300 cc. 85% aceton op een Buchner-filter.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 96,4% blauw licht door,
als gemiddelde van: 96.—% 96,5 % 97,5% 96.—%

Extractie: 10 gr. Roodekoolpoeder in duplo met 100 cc. petroleum-
aether volgens Soxhlet.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 94,7% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 95.—% 96.—% 93.5% 95.5 %

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 92,2% blauw licth door,
als gemiddelde van: 92.5 % 95-—% 93.5% 95.5 %

Extractie: gedurende 4 uren volgens Soxhlet. Later nogmaals gedurende
2 uren met verschen petroleum-aether; deze bleef echter volmaakt
kleurloos. 10 gr. groentenpoeder geëxtraheerd.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 91,1 %blauw licht door,
als gemiddelde van: 91.—% 92,5% 91.—%

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 93,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 94,5 % 92,5 % 93.5 % 93.5 %

Verzeeping: gedurende 2 X 24 uren met 5 cc. 5% natrium methylaat.
I. CAROTINEBEPALING.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 92.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 92,5% 92,5% 92.—% 91,5 %

92,5 92,5 92,5 92.—
Komt overeen met: 0,32 y Carotine per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde aardappelen: 0,03 mgr. Carotine.
Per 100 gr. versche aardappelen:nbsp;spoor Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 93.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 93—% 92.5% 92,5 %

93.5 93.5 93-—
Komt overeen met: 0,46 y Xanthophyll per cc.
Per 100 gr. gekookte en gedroogde aardappelen: 0,21 mgr. Xanthophyll
Per 100 gr. versche aardappelen:nbsp;0,03 mgr. Xanthophyll

PROEF XXIX.
KOOLRAPEN.
(Wortel, gele varieteit).
Gekookt: | uur met weinig water.

Na 2è uur bleek de hoofdmassa van het pigment reeds verwijderd
te zijn; daarna werd nogmaals, nu gedurende 6 uren geëxtraheerd
met verschen petroleum-aether.
Verzeeping: beide extracten gedurende 2 x 24 uren met 5 cc. 5%
natrium methylaat.

Het spectroscopisch onderzoek voor de meting wees uit, dat hier
geen Carotine, maar Lycopine aanwezig was. Gevonden werd voor de
hgging der banden:

Lycopine werd gemeten als Carotine; dit is onjuist, maar daar geen
zuiver lycopine ten dienst stond, kon voor dit Carotinoid geen gra-
phische projectie vervaardigd worden als voor carotine en xanthophyll
was geschied.

Volume der hruinroode lycopine-petr.-aether-oplossing: 47,5 cc.
Meting: Oplossing gemeten bij 5-voudige verdurming het 57,3% blauw
hcht door, als gemiddelde van: 58.—% 58.—% 57.—% 57.—%

57.— \' 57.— 58.— 57-—
57-— 57-— 57.5
Komt overeen met: 2,2 y Lycopme per cc. (dus volgens de kaart
voor Carotine).

Per 100 gr. gekookte en gedroogde Koolraapwortel (gele varieteit)
aanwezig: 2,61 mgr. Lycopine.
Xanthophyll was afwezig.

Volume der lycopine-petr.-aether-opiossing: 42 cc.
Meting: Oplossing onverdund gemeten het 66.—% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 66.—% 66.—% 66.—%

66.— 66.—
Komt overeen met: 1,63 y Lycopine per cc (volgens de kaart voor
Carotine.

0,29 mgr. Lycopine.
Totaal dus per 100 gr. gek. en gedr. Koolraapwortel aanwezig:

2,61 mgr. -I- 0,29 mgr. = 2,90 mgr. Lycopme,
Per 100 gr. versche Koolraapwortel: 0,25 mgr. Lycopine.

Extractie: De vruchten werden niet gedroogd, maar na verwijdering
van de pitten werd het vruchtvleesch zoo fijn mogelijk gehakt.
Een hoeveelheid van 50 gr. werd op een Buclmer-filter gedurende
8i uur met 750 cc. 85°/o aceton geëxtraheerd. Het laatste uur werd
de massa in een mortier gemacereerd.

Het aceton-extract werd overgevoerd in ongeveer 400 cc. petro-
leum-aether, die daarna 4 maal met leiding-water werd uitge-
wasschen ter verwijdering van het aceton. Er was veel in water
oplosbare kleurstof aanwezig.
Verzeeping: gedurende 18 uren met 50 cc. 10% methylalcohohsche
kaliloog.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 83,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 84.—°/o 84.—% 83.5 % 83.—%

83,5 84.— 84.— 83.—
Komt overeen met: 0,7 y Carotine per cc.
Per 100 gr. Kersenconserve dus aanwezig: 0,39 mgr. Carotine.
XanthophyU kon niet worden aangetoond.

Extractie: 30 gr. vruchtvleesch werd met ongeveer 150 gr. watervrij
natrium sulfaat gedroogd. Deze massa werd daarop geëxtraheerd
gedurende 8^ uur met 250 cc. petroleum-aether volgens Soxhlet.
Verzeeping: gedurende 24 uren met 10 cc. 10% methylalcoholische
kahloog.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 76,6% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 76.—% 77.—% 75.5 % 77.—%

77-—^ 77-— 76.— 77.—
Komt overeen met: 1,04 y Carotme per cc.
Per 100 gr. Kersenconserve aanwezig: 0,23 mgr. Carotine.
XanthophyU kon niet worden aangetoond.

A.nbsp;50 gr., fijngehakte Kwetsenconserve gedurende 8j uur geëxtra-
heerd met 750 cc. 85% aceton opeen Buchner-füter, Gedurende
het laatste uur werd de massa in een mortier gemacereerd.

B.nbsp;30 gr. fijngehakte Kwetsen werden gedroogd door samen-
wrijven met ongeveer 150 gr. watervrij natrium sulfaat en
daarna volgens Soxhlet geëxtraheerd gedurende 8j uur met
petroleum-aether.

A.nbsp;werd na overvoeren van het aceton in ongeveer 400 cc.
petroleum-aether verzeept met 50 cc. 10 % methylalcoholische
kahloog gedurende 24 uren.

B.nbsp;werd gedurende 24 uren met 10 cc. 10 % methylalcohohsche
kaliloog verzeept.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 58,1% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 58,5 % 58,5 % 58,5 % 57-—%
^^ ^nbsp;58.- 58.- 59-- 57.-

Komt overeen met: 2,14 y Carotme per cc.
Per 100 gr. Kwetsenconserve aanwezig: 1,64 mgr. Carotine.

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 69,2% blauw licht door
als gemiddelde van: 68,5 % 69.—% 70.—% 68,50/0

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 63,6% blauw licht door,
als gemiddelde van: 64.—% 63,5 % 64.—% 64.—%

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 68.2% blauw licht door
als gemiddelde van: 68,5% 68.—% 68.—% 69.—%

Extractie: 50 gr. fijngehakte abrikozen gedurende 8è uren met 600 cc
85% aceton op een Buchner-filter. Gedurende het laatste uur
werd het vruchtenmoes in een mortier met de aceton-oplossing
gemacereerd.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 77,2% blauw hcht door
als gemiddelde van: 76.—% 78.—% 77.5 % 77-—%

Per 100 gr. Abrikozenconserve aanwezig: 0,47 mgr, Carotine.
Xanthophyll kon niet worden aangetoond.

Extractie: 50 gr. fijngehakte aardbeienconserve met 600 cc. 85%
aceton gedurende 8i uren op een Buchner-filter. Gedurende het
laatste uur werd het vruchtenmoes gemacereerd met aceton in
een mortier.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 83.—% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 84.—% 83.—% 83.—% 82.—% 83.—%
Komt overeen met 0,72 y Carotine per cc.

Per 100 gr. Aardbeienconserve aanwezig: 0,06 mgr. Carotine.
Xanthophyll kon niet worden aangetoond.

Extractie: 50 gr. fijngemaakt vruchtvleesch van een rijpe banaan werd
op een Buchner-filter gedurende 8j uur met 700 cc. 85% aceton
geëxtraheerd. Gedurende het laatste uur werd het vruchtmoes
in een mortier met het extractiemiddel gemacereerd.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 78,4% blauw licht door,
als gemiddelde van: 76.—% 76,5% 76.—% 77.—%

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 83,4% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 84.—% 82,5 % 82,5 % 84.—%

Extractie: 50 gr. fijn gewreven vruchtvleesch met 700 cc. 85% aceton
op Buchner-filter gedurende 8i uur. Laatste uur maceratie in
een mortier.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 73.—% blauw licht door,
als gemiddelde van: 73,5% 73.—% 72.—% 72,5%

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 80,1% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 80.—% 80.—% 80,5% 80.—%

Extractie: 50 gr. op een metaalgaasje laten uitlekken om het overtollige
vocht te laten afloopen, daarna de rest op een Buchner-filter
gedurende 8è uur met 700 cc. 85% aceton geëxtraheerd, het laatste
uur onder maceratie in een mortier.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 79,4% blauw hcht door,
als gemiddelde van: 80.—% 79,5 % 80.—% 80.—%

Meting: Oplossing onverdund gemeten liet 80,7% blauw licht door,
als gemiddelde van: 79.—% 80.—% 81.—% 81.—%

Extractie: 50 gr. fijngehakt vruchtvleesch werd gedurende 8è uur met
700 cc. 85% aceton op een Buchner-filter geëxtraheerd, het
laatste uur onder maceratie in een mortier.

Meting: Oplossing onverdund gemeten het 88,8% blauw licht door,
als gemiddelde van: 88.—% 89.—% 90.—% 88,5 %

87,5 89.— 88.— 90.—
Komt overeen met: 0,46 y Carotine per cc.
Per 100 gr. versche Sinaasappel aanwezig: 0,36 mgr. Carotine.

Ter controle werd deze petroleum-aether-carotine-oplossing
nogmaals gedurende 24 uren verzeept en na wegwasschen van het al-
kali weder met 85% alcohol uitgeschud. Deze alcohol bleef echter
volmaakt kleurloos. Na indampen van de oplossing (na de meting)
waren de voor carotine kenmerkende absorptiebanden aanwezig.

Mding: Oplossing onverdund gemeten liet 81,2% blauw licht door,
als gemiddelde van: 80.—% 80.—% 82,5% 82.—%

81,5 81.— 81,5 81.—
Komt overeen met; 1,32 y XanthophyU per cc.
Per 100 gr. versche Sinaasappel aanwezig: 1,08 mgr. XanthophyU.

Bij spectroscopisch onderzoek van deze oplossing bleken de ab-
sorptiebanden in alcohol te liggen als volgt:
Band I 462—475 n:\\[x.
Band li 435—445 ni(x.
Band III 425—eindabsorptie.

Eenige cc. van de petroleum-aether oplossing van dit carotinoid
werden met een weinig methylalcohol verdund en daarna eenige drup-
pels sterk zoutzuur toegevoegd, waarop een helder blauwe kleur
ontstond. Het gewone xanthophyU verandert onder deze omstandig-
heden in hcht geel-groen, dat na verloop van tijd, b.v. i8 uren, ook
blauw kan worden. Werd na het optreden der blauwe kleur 25%
ammoniak in overmaat toegevoegd, dan herstelde zich weer de oor-
spronkelijke kleur, doch zij bleef iets lichter.

Op grond van deze gegevens werd dit carotinoid geïdentificeerd
met xanthophyU p. Het sinaasappel-carotine bleek bij biologisch
onderzoek op ratten goede Vitamine-A eigenschappen te bezitten,
het XanthophyU p bezat daarentegen geen physiologische activiteit:
Vermast, Naturwissenschaften 1931 p. 442—443.

Ahmad and Drummond, Bioch. Joum, 1930. XXIV. p. 27—36. The
relative vitamin-A value of the body and liver oils of certain fish.

Allisson. 1930. Helv. chim. acta XIII p. 788—805. Oxydo-Reduk-
tionen mit Chlorophyll und anderen Sensibilatoren.

Arnaud (i) 1885. Compt.rend. Acad. d. Sei. C. p. 751—753. Recherches
sur les matières colorantes des feuilles; identité de la matière
rouge orange avec la Carotine, C18H24O.

Arnaud 1886. Compt. rend. Acad. d. Sei. CIL p. 1119—1122.
Recherches sur la composition de la Carotine sa fonction chimique
et sa formule.

Arnaud 1887. Compt. rend. Acad. d. Sei. CIV. p. 1293—1296.
Dosage de la Carotine contenue dans les feuiUes des végétaux.

Arnaud 1889. Compt. rend, Acad. d. Sei. CIX. p. 911—914.
Recherches sur la Carotine; son rôle physiologique probable dans
la feuille.

Baur (2) 1929. Helv. chim. acta. XII. p. 793—806. Formeln für die
sensibilierte Photolyse.

Berzelius (1) 1837. Ann. d. Pharm. XXL p. 227—262. Ueber die gelbe
Farbe der Blätter im Herbste.

Berzelius (2) 1837. Ann. d. Pharm. XXL p. 262—267. Ueber der
rothen Farbstoff der Beeren und Blätter im Herbst.

Bloch. 1917. Ugeskrift f. Laeger. LXXIX. p. 349. Gecit. bij Mc.-
CoLLUM and Simmonds. The newer knowledge of nutrition,
p. 282. New-York. 1927.

Böhl 1929. Helv. chim. acta XII. p. 121—153. Zinkoxyd und Chloro-
phyll als optische Sensibilisatoren.

Borodin. 1883. Botan. Zeitung. XLI. kol. 577—579. Mélanges biolo-
giques tirés du Bulletin de l\'Académie Impériale des Sciences
de St. Pétersbourg. XL Janv. 1883.

Bougarel. 1877. BuU. Soc. chim. 27. p. 442—444. Sur une nouvelle
matière rouge accompagnant la chlorophylle.

Brewster. 1834. Transact. Roy. Soc. Edinburgh. XII. p. 538—545.
On the colours of natural bodies.

Bruins, Overhoff and Wolff. 1931. Bioch. Joum. XXV. p. 430—
438. The molecular weight of vitamin-A.

Capper (i) 1930. Bioch. Joum. XXIV. p. 453—455- The aUeged con-
tamination of carotene by vitamin A.

Capper (2) 1930. Bioch. Journ. XXIV. p. 980—982. Carotene and
vitamin A. The transformation of carotene into vitamin A as
shown by a study of the absorption spectra of rat-liver oils.

Capper, McKibbin and Prentice. 1931. Bioch. Journ. XXV. p. 265—
274. Carotene and vitamin A. The conversion of carotene mto
vitamin A by fowl.

Cady and Luck. 1930. Journ. biol. chem. LXXXVI. p. 743—753
Studies in the chemistry of vitamin A.

Carr and Price. 1926. Bioch. Journ. XX. p. 497—501. Colour re-
actions attributed to vitamin A.

Chatton, Lwoff et Parat. 1926. Compt. rend. Soc. d. Biol. 94.
P- 567—570- L\'Origine, la nature et revolution du pigment des
Spirophrya, des Polyspira et des Gymnodinoides. Présence de
Carotmalbumines dans la mue desquot; crustacés décapodes.

Collison, Hume, Smedley—Maclean and Smith. 1929. Bioch
Journ. XXIII. p. 634—647. The nature of the Vitamin A con-
stituent of green leaves.

Coward, Katharina Hope (i). 1923. Bioch. Journ. XVII. p. 145—
156. The association of Vitamin A with the lipochromes of plant
tissues.

Coward, Katharine Hope (2). 1924. Bioch. Journ. XVIII. p. 1114—
1122. Some observations on the extraction and estimation of
lipochromes from animal and plant tissues.

Coward, Katharine Hope (3). 1924. Bioch. Journ. XVIII. p 1123—
1126. The lipochromes of etiolated wheat seedlings.

Coward, Katharine Hope («). 1925. Bioch. Journ. XIX. p 500—
506. The persistence of Vitamin A in plant tissues.

Coward and Drummond. 1921. Bioch. Journ. XV. p. 530—539
The formation of Vitamin A in living plant tissues.

Van Deventer, Wilhelmina. 1930. Dissertatie. Utrecht. De kleur-
stoffen van Neurospora (Monilia) sitophila Shear et Dodge

Dolley and Guthrie. 1919. Science. L. p. 190. The origin of the nerve
cell pigments.

Drummond {\'). 1919. Bioch. Journ. XIII. p. 81—93. Researches on
the fat-soluble accessory substance. I Observations upon its
nature and properties.

Drummond (2). 1920. Bioch. Journ. XIV. p. 660. The nomenclature
of the so-called accessory food factors (Vitamins).

Drummond, Ahmad and Morton. 1930. Journ. Soc. Chem. Ind.
XLIX. p. 291—296T. Further observations on the relation of
carotene to vitamin A.

Drummond and Baker. 1929. Bioch. Journ. XXIII. p. 274—291.
Further studies of the chemical nature of vitamin A.

Drummond, Channon and Coward. 1925. Bioch. Journ. XIX,
p. 1047—1067. Studies on the chemical nature of vitamin A.

Drummond and Coward (i). 1920. Bioch. Journ. XIV. p. 668-^77.
Researches on the fat-soluble accessory substance V. The nutri-
tive value of animal and vegetable oils and fats considered in
relation to their colour.

Drummond and Coward (2). 1920. Bioch. Joum. XIV. p. 725—733-
Researches on the fat-soluble accessory factor (vitamin A). VI.
Effect of heat and oxygen on the nutritive value of butter.

Drummond and Coward 1921. Lancet II. p. 698—700. Nutrition
and growth on diets devoid of true fats.

Drummond, Coward and Handy. 1925. Bioch. Joum. XIX. p. 1068—
1074. On the technique of testing the presence of vitamin A.

Drummond and Morton. 1929. Bioch. Joum. XXIII. p. 785—802.
Observations on the assay of vitamin A.

Drummond, Rosenheim and Coward. 1925. Joum. Soc. chem. Ind.
XLIV. p. 123—124 T. The relation of sterols to vitamin A.

Drummond, Zilva and Coward. 1922. Bioch. Joum. XVI. p. 518—
522. The origin of the vitamin A in fish and fish hver oils.

Dulière, Morton and Drummond. 1929. Joum. Soc. chem. Ind.
XLVIII. p. 316 T.—321 T. The aheged relation of carotin to
vitamin A.

Van Eekelen. 1931. Act. Brev. Neerland. I. nquot;. 3. Demonstration
of Vitamin-A in Blood-Serum.

Van Eekelen, Wolff en Overhoff. 1931. De werking van Carotine
en Vitamme-A praeparaten, bepaald met de colpokeratosetest.
Nederl. Tijds. v. Geneesk. Jaarg. 75. p. 1662—1664.

Engelmann. 1887. Botan. Zeitung. XLV. kol. 393—398. Die Farben
bunter Laubblätter und ihre Bedeutung für die Zerlegung der
Kohlensäure in Lichte.

Escher. 1913. Zeitschr. physiol. Chem. 83. p. 198—211. Ueber den
Farbstoff des Corpus luteum.

Euler. 1931. Nature. 128. p. 40. (Verslag zitting Royal Soc. London,
18 Juni 1931.)

H. v. Euler, Demole, Karrer und Walker. 1930. Helv. chim.
acta. XIII. p. 1078—1083. Uber die Beziehung des Carotin-
gehaltes zur Vitamin-A Wirkung in verschiedenen pflanzlichen
Materiahen.

H. v. Euler, Demole, Weinhagen und Karrer. 1931. Helv. chim.
acta. XIV. p. 831—833. Weitere Beobachtungen über die Bezie-
hung des Wachstumsfaktors zum Carotin.

B. v. Euler und H. v. Euler. 1930. Khn. Woch. sehr. p. 916—918.
Neue Ergebnisse über A-Vitamine (Fettlösliche Wachstums-
faktoren).

B. v. Euler, H. v. Euler und Hellström. 1928. Bioch. Zeitschr.
203. p. 370—384. A-Vitaminwirkungen der Lipochrome.

B, v. Euler, H. v. Euler und Karrer. 1929. Helv. chim. acta. XII.
p. 278—285. Zur Biochemie der Carotinoide.

H. v. Euler, B. v. Euler und Rydbom. 1928. Bioch. Zeitschr. 199.
p. 276—293. Vitamin Wirkungen durch Sterylphosphate und
durch Sterine der Erythrocyten.

H. v. Euler und Hellström. 1929. Bioch. Zeitschr. 211. p. 252—258.
Uber die Veränderung der Menge der Carotinoide bei der Ent-
wicklung des Hühnereies.

H. v. Euler, Karrer, Hellström und Rydbom. 1931. Helv. chim.
acta. XIV. p. 839—842. Die Zuwachswirkung der isomeren
Carotinen und ihrer ersten Hydrierungsprodukte.

H. v. Euler, Karrer und Rydbom. 1929. Ber. Deutsch, chem. Ges.
62. p. 2445—2451. Über die Beziehungen zwischen A-Vitaminen
und Carotinoiden.

Euler en Rydbom. 1929. Svensk. Kemisk. Tidskrift. 41. p. 223.
Gecit. bij: Moore, Bioch. Journ. XXIV. p. 692—702. 1929.

Evans and Bishop. 1922. Journ. metabol. Res. I. p. 335—356. On
the relation between fertility and nutrition. II. The ovulation
rhythm in the rat on inadequate nutritional regimes.

Eykman. 1896. Geneesk. Tijdschr. v. Nederl.-Indië. XXXI. p. 214—
269. Polyneuritis bij hoenders. Nieuwe bijdrage tot de aetiologie
der ziekte.

Filhol. 1868. Ann. d. Chim. et de Physique. 4ème Sér. XIV. p. 332—
348. Recherches sur la matière colorante verte des plantes.

Fremy (i). i860. Compt. rend. Acad. d. Sei. L. p. 405—412. Recherches
sur la matière colorante verte des feuilles.

Fremy (2). 1865. Compt. rend. Acad. d. Sei. LXI. p. 188—192. Re-
cherches chimiques sur la matière verte des feuilles (deuxième
Communication).

Fodor und ScHOENFELD. 1931. Bioch. Zeitschr. 233. p. 243—244.
Darstellung und Eigenschaften wässeriger Carotinlosungen. (Vor-
läufige Mitteilung).

Funk. 1912/13. Journ. Physiol. XLV. p. 75—81. The preparation
from Yeast and certain foodstuffs of the substance the deficiency
of which in diet occasions polyneuritis in birds.

Grew, Nehemiah. 1682. Anatomy of plants p. 273. Gecit. bij Czapek,
Biochemie der Pflanzen. Jena 1913. p. 555.

Goerrig, Elisabeth. 1918. Beihefte z. Botan. Zentrbl. XXXV.
le Abt. p. 342—394. Vergleichende Untersuchungen über den
Carotin- und Xanthophyllgehalt grüner und herbstlich gelber
Blätter.

Goldblatt and Soames. 1922. Lancet IL p. 1321—1324. The effect
of radiation with the mercury-vapour quartz lamp on the growth
of rats fed on a diet deficient in the fat-soluble growth-promoting
factor.

Guignet. 1885. Compt. rend. Acad. d. Sei. C. p. 434—437. Extraction
de la matière verte des feuilles. Combinations définies formées
par la chlorophylle.

Hartwell. 1925. Bioch. Journ. XIX. p. 1075—1081. Mammary
secretion. VI. Vitamin B and the lactating rat\'s diet. 2 Vitamin B
requirement of the lactating and non-lactating rat. (Preliminary
note).

Heilbron and Morton, Ahmad and Drummond. 1931. Journ. Soc.
chem. Ind. L. p. 183 T—186 T. Characterisation of Vitamin-A.

Hoff. 1931. Dissertatie. Leiden. Vergelijkend onderzoek omtrent den
invloed van het huishoudelijk koken en van het conserveeren in
blik op het vitamine-gehalte van groenten.

Hohlweg und Dohrn. 1930. Zeitschr. ges. exp. Med. 77. p. 762—767.
Kolpokeratose, ein Test für Vitamin-A.

Holm. 1867. Joum. f. prakt. Chem. 100. p. 142—148. Untersuchungen
über das Hämatoidin.

Hopkins. 1906. Analyst. 31. p. 385—397. Gecit. in: Medical research
Council. Report on the Present State of Knowledge of Accessory
Food Factors (Vitamins). Second edition. London 1924.
p. 8.

Hopkins. 1912. Journ. physiol. XLIV. p. 425—460. Feeding experi-
ments illustrating the importance of accessory factors in normal
dietaries.

Hopkins. 1920. Bioch. Journ. XIV. p. 725—733. The effect of heat
and aeration upon the fat-soluble vitamine.

Hume. 1922. Lancet IL p. 1318—1321. The effect of radiation with
the mercury-vapour quartz lamp in the growth of rats fed on a
diet deficient in vitamin A.

Hume and Smith. 1928. Bioch. Journ. XXII. p. 504—521. A critical
examination of methods of evaluating vitamin A by means of
the growth of rats.

Husemann. 1861. Ann. d. Chem. u. Pharm. (Liebig\'s Ann.) CXVII.
p. 200—229. Ueber Carotin und Hydrocarotin.

Huston, Lightbody and Ball. 1928. Journ. biol. chem. LXXIX.
p. 507—518. Some biochemical relations of phenols. IL The
effect of hydroquinone on the vitamin A content of sored oils.

Hymans van den Bergh, Muller und Broekmeyer. 1920. Bioch.
Zeitschr. 108. p. 279—303. Das lipochrome Pigment in Blutserum
und Organen, Xanthosis, Hyperhpochromämie.

Irwin, Brandt and Nelson (i). 1930. Journ. biol. chem. LXXXVII.
p. 449—459. Apphcations of statistical method to the data of
vitamin feeding. 1. The percent effect of measured variables.

Irwin, Brandt and Nelson (2). 1930. Journ. biol. chem. LXXXVIII.
p. 461—^470. Applications of statistical method to the data of
vitamin feeding. IL How many animals per experimental lot.

Jameson, Drummond and Coward. 1922. Bioch. Journ. XVL p.
482—485. Synthesis of vitamin A by a marine diatom (Nitzschia
closterium W. Sm.) growing in pure culture.

Javillier, Baude et Mile Levy-Lajeunesse. 1924. Compt. rend.
Acad. d. Sei. lyg. p. 998—1000. Essais d\'identification du facteur
A. Le facteur A et le phytol.

Javillier et Emerique 1930. Compt. rend. Acad. d. Sei. igo.
p. 655—657. Sur l\'activité vitaminique du Carotène.

Javillier et Emerique (2). 1930. Compt. rend. Acad. d. Sei. igi,
p. 226—229. Sur une methode de purification de carotène et sur
l\'activité vitaminique d\'im carotène purifié.

Karrer und Bachmann. 1929. Helv. chim. acta. XII. p. 285—291.
XI. Mitteilung über Pflanzenfarbstoffe. Zur Kenntnis des Lyco-
pins.

Karrer, B. v. Euler und H. v. Euler. 1928. Arkiv Kemi, Min.
och Geol. 10 nquot;. 2. Gecit. bij: Moore, Bioch. Journ. XIII. p. 803—
811. 1929.

Karrer, H. v. Euler und Rydbom. 1930. Helv. chim. acta. XIII.
p. 1059—1062. Neue Versuche über die physiologische Wirkung
des Xanthophylls.

Karrer und Helfenstein (i). 1929. Helv. chim. acta. XII. p. 1142—
1144. Pflanzenfarbstoffe. XVI. Uber Carotin.

Karrer und Helfenstein (2). 1930. Helv. chim. acta. XIII. p. 86—
87. Über die Natur der Carotinoide im Schaf- und Kuhkot.

Karrer und Helfenstein (3). 1931. Helv. chim. acta. XIV. p. 78—
85. Synthese des Squalens.

Karrer, Helfenstein und Wehrli. 1930. Helv. chim. acta. XIII.
p. 87—88. Pflanzenfarbstoffe XVIII. Weiterer Beitrag zur
Konstitution der Carotinoide.

Karrer, Helfenstein, Wehrli, Pieper und Morf. 1931. Helv.
chim. acta. XIV. p. 614—632. Pflanzenfarbstoffe XXX. Beiträge
zur Kenntnis des Carotins, der Xanthophylle des Fucoxanthins
und Capsanthins.

Karrer, Helfenstein, Wehrli und Wettstein. 1930. Helv. chim.
acta. XIII. p. 1084—1099. Pflanzenfarbstoffe XXV. Über die
Konstitution des Lycopins und Carotins.

Karrer und Ishikawa. 1930. Helv. chim. acat. XIII. p. 709—713.
Pflanzenfarbstoffe XXII. Ester des Xanthophylls.

Karrer und Morf. 1931. Helv. chim. acta. XIV. p. 833—838.
Pflanzenfarbstoffe XXXI. Zur Konstitution des zweiten Carotin-
form (a—Carotin).

Karrer, Salomon und Wehrli. 1929. Helv. chim. acta. XII. p. 790—
792. Über einen Carotinoidfarbstoff aus Mais: Zeaxanthin.

Karrer und Wehrli, 1930. Helv. chim. acta. XIII.op. 1104—1105.
Pflanzenfarbstoffe XXVIII. Über den Farbstoff des Sanddorn-
beere. (Hippophaes rhamnoides).

Karrer, Wehrli und Helfenstein. 1930. Helv. chim. acta. XIII.
p. 268—273. Über Zeaxanthin und XanthophyU. Pflanzen-
farbstoffe XIX.

Kohl. 1906. Ber. Deutsch. Botan. Ges. XXIV. p. 222—229. Die
assimilatorische Funktion des Karotins.

Kohl. (2) 1906. Ber. Deutsch. Botan. Ges. XXIV. p. (39)—(54)
(Aanhangsel). Kohlensäure-assimilation und ChlorophyUfunk-
tion.

Kohl. (3) Geciteerd bij Palmer. Carotinoids and related pigments,
p. 250. Amer. chem. Soc. monogr. Series. New York. 1922.

C. Kraus. 1875. Flora. 8. p. 155—159. Ueber die Natur des Chloro-
phyllfarbstoffes.

G. Kraus. 1872. Zur Kenntnis der ChlorophyUfarbstoffe und ihrer
Verwandte. Stuttgart. 1872.

a-Carotin aus Palmöl.
Kuhn und Lederer (i). 1931. Naturwissenschaften. 19e Jahrg. p. 306.

Fraktionierung und Isomerisierung des Carotins.
Kuhn und Lederer (2). 1931. Z. physiol. Chem. 200. p. 246—254.

Ueber a-und ß-Carotin.
Kuhn und Wiegand. 1929. Helv. chim. acta. XII. p. 499—506.
Über konjugierte Doppelbindungen. IX. Der Farbstoff der Juden-
kirschen (Physalis alkekengi und Physalis Franchetti).
Kuhn un Winterstein, (i). 1928. Helv. chim. acta. XL p. 87—116.
Über konjugierte Doppelbindungen I. Synthese von Diphenyl-
poly-enen.

Kuhn un Winterstein. (2). 1928. Helv. chim. acta. XI. p. 116—122.
Über konjugierte Doppelbindungen II. Synthese von Biphenylen-
poly-enen.

Kuhn und Winterstein. (3). 1928. Helv. chim. acta. XI. p. 123—144.
Über konjugierte Doppelbindungen. III. Wasserstoff- und
Brom-anlagerung an Poly-ene.
Kuhn und Winterstein. (4). 1928. Helv. chim. acta. XI. p. 144—151.
Über konjugierte Doppelbindungen. IV. Molekülverbindungen
und Farbreaktionen der Poly-ene.
Kuhn und Winterstein. (5). 1928. Helv. chim. acta. XL p. 427—431.
Über konjugierte Doppelbindungen. V. Bemerkungen zur Kon-
stitution des Carotins und des Bixins.
Kuhn, Winterstein und Kaufmann. 1930. Ber. Deutsch, chem. Ges.
LXIII p. 1489—1497. Zur Kenntnis des Physalis-Farbstoffes.
(Über konjugierte Doppelbindungen XII.)
van Leersum. 1929. Tijdschr. v. Geneesk. p. 3997—4009. Over het
aantoonen van vitamines, in het bijzonder de vitamines A en D.
Leigh—Clare and Soames. 1928. Lancet I. p. 150—152. The relative
content of the fat-soluble vitamin A and D in a series of cod-liver
oils.

p. 1653—1660. Über Azafrin (III).
Lwoff. 1925. Compt. rend. Soc. d. Biol. gj. p. 1602—1604. Un Caro-
tinoide pigment oculaire de copépodes, son origine et son evo-
lution pendant l\'ontogénèse.
Macaire—Princep. 1828. Ann. d. Chim. et d. Physique. XXXVIII.

p. 415. Mémoire sur la coloration automnale des feuilles.
Mc.Collum. 1907. Gecit. door Mc.Collum and Simmonds. The newer

knowledge of nutrition, p. 17. New York. 1927.
McCollum and Davis (i). 1913. Journ. biol. chem. XV. p. 167—175.

The necessity of certain hpins in the diet during growth.
McCollum and Davis (2). 1914. Journ. biol. chem. XIX. p. 245—250.
Observations on the isolation of the substance in butter fat which
exerts a stimulating influence on growth,
McCollum and Davis 1915. Journ. biol. chem. XXL p. 179—182.

The influence of certain vegetable fats on growth.
McCollum and Kennedy. 1916. Joum. biol. chem. XXIV. p. 491—

McCollum and Simmonds 1917. Joum. biol. chem. XXXII.
p. 29—61. A biological analysis of peUagra-producing diets. I.
The dietary properties of mixtures of maize kernel and bean.
McCollum and Simmonds (2). 1917. Journ. biol. chem. XXXII.
p. 181—194. A biological analysis of pellagra-producing diets. II.
The minimum requirements of the two unidentified dietary factors
for maintenance as contrasted with growth.
McCollum and Simmonds 1917. Joum. biol. chem. XXXII.
p. 347—368. A biological analysis of pellagra-producing diets.
III. The values of some seed proteins for maintenance.
McCollum and Simmonds {*). The newer knowlegde of nutrition.

XXXVI.nbsp;p. 197—210. The dietary properties of the potato.
McCollum, Simmonds and Parsons 1919. Journ. biol. chem.

XXXVII.nbsp;p. 287—301. The dietary properties of the pea.
McCollum, Simmonds and Pitz (i). 1916. Amer. Journ. Physiol. XLI.

p. 361—375. The distribution in plants of the fat-soluble A, the
dietary essential of butter fat.
McCollum, Simmonds and Pitz (2). 1917. Joum. biol. chem. XXIX.
p. 341—354. The nature of the dietary deficiences of the oat
kernel.

McCollum, Simond and Pitz (3). 1917. Joum. biol. chem. XXIX.
p. 521—536. The dietary deficiences of the white bean, phaseolus
vulgaris.

McCollum, Simmonds and Pitz {«). 1917. Journ.biol. chem. XXX.
p. 13—32. The supplementary dietary relationship between leaf
and seed as contrasted with combinations of seed with seed.
McCollum, Simmonds, Shipley and Park. 1922. Journ. biol. chem. L.
p. 5—30. Studies on experimental rickets. XII. Is there a sub-
stance other than fat-soluble A, associated with certain fats
which plays an important role in bone development?
Macy, Outhouse, Long and Graham. 1927. Journ. biol. chem.
LXXIII. p. 153—174- Human milk studies. I. Technique employ-
ed in vitamin studies.
Mendel and Daniels. 1912. Journ. biol. chem. XIII. p. 71—95.
The behavior of fat-soluble dyes and stained fat in the animal
organism.

Monteverde (1). 1893. Acta Horti Petropolitani 13. p. 201—217.
Gecit. door Palmer. Carotinoids and related pigments, p. 41.
New York. 1922.
Monteverde (2). 1911. Gecit. door Tswett, Uber den makro-und
mikrochemischen Nachweis des Carotins. Ber. Deutsch, botan.
Ges. XXIX. p. 630—636.
Monteverde en Lubimenko. 1913. Bull. Acad. Imp. Sei. St. Péters-
bourg. Sér. 6; 7; p. 1007—1028. Recherches sur la formation de
la chlorophylle chez les plantes. III. Application de la méthode

spectrocolorimétrique de l\'analyse quantitative à l\'étude de la
question concernant l\'accumulation de la chlorophylle, de la
xanthophyUe et de la carotine dans la plante. Gecit. door Palmer.
Carotinoids and related pigments, p. 250. New York. 1922.

Moore 1929. Bioch. Joum. XXIII. p. 803—811. Vitamin A and
Carotene. I. The association of Vitamin A activity with Carotene
in the carrot root.

Moore 1930. Bioch. Joum. XXIV. p. 692—702. Vitamin A and
Carotene. V. The absence of the hver oil Vitamin A from Carotene.
VI. The conversion of Carotene to Vitamin A in vivo.

Morton. 1931. Nature. 128. p. 40. (Verslag zitting Royal Soc. London.
18 Juni 1931.

Morton and Heilbron (i). 1928. Biochem. Joum. XXII. p. 987—996.
The absorption spectrum of Vitamin A.

Morton and Heilbron (2). 1930. Biochem. Joum. XXIV. p. 870—873.
Vitamin A of butter.

Morton, Heilbron and Thompson. 1931. Biochem. Journ. XXV.
p. 20—29. Spectrographic data concerning vitamin A and hver
oils.

Nelson and Jones. 1928. Joum. biol. chem. LXXX. p. 215—226.
Observations bearing on the determination of Vitamin A.

Noack. 1925. Zeitschr. f. Botanik. 17e Jahrg. p. 481—558. Photo-
chemische Wirkungen des ChlorophyUs und ihre Bedeutung für
die Kohlensäureassimilation.

Osborne and Mendel (i). 1913. Journ. biol. chem. XVL p. 423—437.
The influence of butter-fat on growth.

Osborne and Mendel (la). 1914. Joum. biol. chem. XVII. p. 401—
408. The influence of cod liver oil and some other fats on growth.

Osborne and Mendel 1915. Journ. biol. chem. XX. p. 379—390.
Further observations of the influence of natural fats upon
growth.

Osborne and Mendel (»). 1917. Journ. biol. chem, XXXII. p. 309—
323. Nutritive factors in animal tissues. 1.

Osborne and Mendel 1918. Journ. biol. chem. XXXIV. p. 17—27.
Nutritive factors in animal tissues. II.

Osborne and Mendel 1917. Journ. biol. chem. XXXII. p. 369—
388. The use of soy bean as food.

Osborne and Mendel (®). 1918. Proc. Soc. Exp. Biol, and Med. XVI.
p. 98—99, The extraction of „fat-soluble Vitaminequot; from green
foods.

Osborne and Mendel (\'). 1919. Joum. biol. chem. XXXVII. p. 187—
200. The vitamins in green food.

XLL p. 549—565. Nutritive factors in plant tissues. IV. Fat-
soluble vitamine.

Palmer (i). 1916. Journ. biol. chem. XXVII. p. 27—32. The physio-
logical relation of plant Carotinoids to the Carotinoids of the cow,
horse, sheep, goat, pig and hen.
Palmer 1919. Science. New Ser. L. p. 501—502. Carotinoids as

fat-soluble vitamine.
Palmer 1922. Carotinoids and related pigments. The chromoli-

poids. Amer. Chem. Soc. monograph Series. New York. 1922.
Palmer and Eckles 1914. Journ. biol. chem. XVII. p. 191—210.
Carotin. — The principal natural yellow pigment of milk fat. Its
relations to plant carotin and the carotin of the body fat, corpus
luteum and blood serum.

I.nbsp;The chemical and physiological relation of the pigments of
milk fat to the carotin and xanthophyhs of green plants.

Palmer and Eckles (2). 1914. Journ. biol. chem. XVII. p. 211—221.
Carotin. — The principal natural yellow pigment etc.

II.nbsp;The pigments of the body fat, corpus luteum and skin secre-
tions of the cow.

Palmer and Eckles (3). 1914. Journ. biol. chem. XVII. p. 223—236.
Carotin. — The principal natural yellow pigments etc.

Palmer and Eckles 1914. Journ. biol. chem. XVII. p. 237—243.
Carotin. — The principal natural yellow pigment etc.

IV.nbsp;The fate of carotine and xanthophylls during digestion.
Palmer and Kempster. 1919. Journ. biol. chem. XXXIX. p. 299—

312. Relations of plant Carotinoids to growth, fecundity, and
reproduction of fowls.
Palmer and Kennedy. 1921. Journ. biol. chem. XLVI. p. 559—577,
The relation of plant Carotinoids to growth and reproduction of
albino rats.

Palmer and Knight. 1924. Journ. biol. chem. LIX. p. 443—449.
Carotin. — The principal cause of the red and yehow colors in
Perillus bioculatus (Fab.), and its biological origin from the
lymph of Leptinotarsa decemlineata (Say).
Palmer and Thrun. 1916. Journ. Ind. Eng. Chem. 5. p. 614—616.
The detection of natural and artificial pigments in oleomargarine
and butter. Gecit. door Palmer. Carotinoids and related pigments,
p. 219. New York. 1922.
Peacock. 1926. Lancet. IL p. 328—330. The action of light on cod
liver oil.

p. 486—491. Sur la matière verte des feuilles.
Peterson. 1930. Plant Physiology. 5. p. 257—261. Methods for the
quantitative extraction and separation of the plastid pigments
of tobacco.

Petrie. 1924. Bioch. Journ. XVIII. p. 957—964. The yellow pigments
of australian acacias.

Piccolo en Lieben. 1866. Giomale di scienze naturali ed economiche.
IL Palermo, p. 258. Verkort in: Zeitschr. f. Chem. II. Neue Folge
IV. p. 645—647 (1868).

POULTON (1). 1885. Proc. Roy. Soc. London. XXXVIII. p. 269—315.
The essential Nature of the Colouring of Phytophagous Larvae
(and their Pupae); with an Account of some Experiments upon
the Relations between the Colour of such Larvae and that of
their Food-plants.

PouLTON (2). 1893. Proc. Roy. Soc. London. LIV. p. 253—256. Results
of Researches on Luteine and the Spectra of yehow organic Sub-
stances contained in Animals and Plants.

pummerer und Rebmann. 1928. Ber. Deutsch, chem. Ges. LXI.
p. 1099—1102. Über Carotin.

PuMMERER, Rebmann und Reindel. 1929. Ber. Deutsch, chem. Ges.
LXII. p. 1411—1418. Über die Bestimmung des Sättigungs-
zustandes von Polyenen mittels Chlorjods und Benzopersäure.

Quinn and Hartley. 1931. Joum. biol. chem. XCI. p. 633—639.
A study of certain properties of the provitamin A.

Rajus, Joannes. 1693. Historia plantarum (I) i, p. 15, London.
Gecit. door Palmer. Carotinoids and related Pigments, p. 48.
New York. 1922.

Reader, Vera. 1925. Bioch. Joum. XIX. p. 1039—^046. A note on
the lipochromes present in certain bacteria.

Roegholt. 1929. Nederl. Tijdschr. v. Geneesk. p. 3744. A-vitamino-
tisch dieet. (Voordracht Nederl. Vereenig. v. Heelkunde.)

Rosenheim (i). 1927. Bioch. Joum. XXI. p. 386—388. Note on some
sterol colour reactions in their relation to vitamin A.

Rosenheim (2). 1931. Nature. 128. p. 40. (Verslag zitting Royal Soc.
London van 18 Juni 1931.)

Rosenheim and Drummond 1920. Lancet I. p. 862—864. On the
relation of the hpochrome pigments to the fat-soluble accessory
food factor.

Rosenheim and Schuster. 1927. Bioch. Journ. XXI. p. 1329—1334.
A new colorimeter based on the Lovibond colour system, and
its application to the testing of cod-liver oil, and other purposes.

Rosenheim and Webster. 1929. Bioch. Journ. XXIII. p. 633. Note
on the absorption spectrum of vitamin A.

Rydbom, 1930. Bioch. Zeitschr. 227. p. 482—487. Versuche über die
Wachstumswirkung von Carotinoiden.

Sachsse. 1877. Die Chemie und Physiologie der Farbstoffe, Kohlen-
hydrate und Proteinsubstanzen, p. 23. Leipzig. Gecit, door
Palmer. Carotinoids and related Pigments, p. 35 en 290. New
York. 1922.

Scheibe und Rosenberg. 1928. Loc. gecit. bij Pummerer und Reb-
mann. 1928. Ber. Deutsch, chem. Ges. LXI. p. 1099—1102. Über
Carotin.

Scherz (i). 1923. Joum. agricult. Res, XXVI. p. 383—400. The
quantitative determination of carotin by means of the spectro-
photometer and the colorimeter.

Scherz (2). 1925. Journ. agricult. Res. XXX. p. 253—261. The
quantitative determination of xanthophyll by means of the
spectrophotometer and the colorimeter.

Scherz 1925. Joum. agricult. Res. XXX. p. 469—474. Some
physical and chemical properties of carotin and the preparation
of the pure pigment.

Scherz 1925. Joum. agricult. Res. XXX. p. 575—585. Some
physical and chemical properties of xanthophyll and the prepa-
ration of the pure pigment.

Scherz 1928. Plant Physiology, j. p. 211—216. The extraction
and separation of chlorophyll (a -f- ß) carotin and xanthophyll
in fresh green leaves prehminary tot their quantitative deter-
mination.

Scherz 1929. Plant Physiology. 4. p. 135—139. Seasonal variation
of the chloroplast pigments in several plants on the Mall at
Washington.

Scherz (\'). 1929. Plant Physiology. 4. p. 269—279. The effect of po-
tassium, nitrogen and phosphorus fertilizing upon the chloroplast
pigments, upon the mineral content of the leaves, and upon
production in crop plants.

Scherz (®). 1929. Plant Physiology. 4. p. 337—347. The pure pigments
carotin and xanthophyll, and the Tswett adsorption method.

Schuette and Bott. 1928. Journ. amer. chem. Soc. 50. p. 1998—
2000. Carotin a pigment of honey.

Senebier. 1800. Physiol. Végét. II. p. 444. Gecit. door Czapek,
Biochemie der Pflanzen. Jena 1913. p. 556.

Sherman and Batcheldes. 1931. Joum. biol. chem. XCI. p. 505—511.
Further investigations of quantitative measurement of vitamin A
values.

Sherman and Burtis. 1928. Joum. biol. chem. LXXVIII. p. 671—
680. Factors affecting the accuracy of the quantitative deter-
mination of vitamin A.

Sherman and Munsell. 1925. Journ. amer. chem. Soc. XLVII.
p. 1639—1646. The quantitative Determination of Vitamin A.

Sherman, Quinn, Day and Miller. 1928. Joum. biol. chem. LXXVIII
p. 293—298. The relative stability of vitamin A from plant
sources.

Smith, J. H. C. 1931. Journ. biol. chem. XC. p. 597—605. Carotene. —
III. Hydrogénation and optical properties of carotene and its
hydrogenated derivates.

Sorby (i). 1865. Quarterl. Joum. of Science. II. p. 198—215. On the
application of spectrum-analysis to microscopical investigations
and especially to the detection of blood-stains.

Sorby 1867. Proc. Roy Soc. London. XV. p. 433—455. On a
Definite Method of qualitative Analysis of Animal and Vegetable
colouring Matters by Means of the Spectmm Microscope.

Sorby (s). 1871. Quartl. Journ. of Science. I. (New Ser.) p. 64—77.
On the various Tints of autumnal Foliage.

Sorby 1873. Proc. Roy. Soc. London. XXI. p. 442—483. On
comparative vegetable Chromatology.

SouTHGATE. 1925. Bioch. Joum. XIX. p. 733—736. Note on the
effect of high temperatures on the accessory food factor content
of cod-liver oil.

Stair and Coblentz. 1929. Physic. Rev. XXXIII. p. 1092. The
infra-red absorption spectrum of chlorophyll and xanthophyU.

Steche. 1927. Journ. Landw. 75. p. 211—214. Die Bestimmung des
ChlorophyUs nach WiUstätter in Landwirtschafts chemischen
Massenuntersuchungen.

Steenbock. 1919. Science. New Series. L. p. 352—353. White corn
vs. yeUow com and a probable relation between the fat-soluble
vitamine and yeUow plant pigments.

Steenbock and Boutwell (i), 1920. Joum. biol. chem. XLI. p. 81—
96. Fat-soluble Vitamine. III. The comparative nutritive value
of white and yellow maizes.

Steenbock and Boutwell. (2). 1920. Joum. biol. chem. XLI. p. 163—
171. Fat-soluble Vitamine. V. Thermostability of the fat-soluble
vitamine in plant materials.

Steenbock, Boutwell and Kent (i). 1918. Joum. biol. chem. XXXV.
p. 517—526. Fat-soluble Vitamine I.

Steenbock, Boutwell and Kent (2). 1920. Journ. biol. chem. XLI.
p. XII. Proc. amer. Soc. biol. Chem. 24—26 April 1919.

Steenbock and Boutwell with Sell and Gross. 1920. Joum. biol.
chem. XLII. p. 131—152. Fat-soluble Vitamine. VI. The extracta-
bihty of the fat-soluble vitamine from carrots, alfalfa, and yellow
corn by fat solvents.

Steenbock and Gross. 1920. Journ. biol. chem. XLI. p. 149—162.
Fat-soluble Vitamine. IV. The fat-soluble vitamine content of
green plant tissues together with some observation on their
water-soluble vitamine content.

Steenbock, Jones and Hart. 1923. Proc. amer. Soc. biol. Chem.;
Journ. biol. chem. LV. p. XXVI. Stabihty of vitamin in cod liver
oil.

Steenbock and E. M. Nelson. 1923. Journ. biol. chem. LVI. p. 355—
373. Light in its relation to ophthalmia and growth.

Steenbock, M. T. Nelson and Black. 1924. Joum. biol. chem.
LXII. p. 275—286. Fat-soluble Vitamine. XX. A modified
technique for the determination of Vitamin A.

Steenbock and Sell. 1922. Journ. biol. chem. LI. p. 63—76. Fat-
soluble Vitamine. X. Further observations on the occurrence of
the fat-soluble vitamine with yellow plant pigments.

Steenbock, Sell and Boutwell. 1921. Joum. biol. chem. XLVII.
p-. 303—308. Fat-soluble Vitamine. VIII. The fat-soluble vita-
mine content of peas in relation to their pigmentation.

Steenbock, Sell and Buell. 1921. Joum. biol. chem. XLVII.
p. 89—101. Fat-soluble Vitamine. VIL The fat-soluble vitamine

and yellow- pigmentation in animal fats with some observations
on its stability to saponification.

Steenbock, Sell and E. M. Nelson. 1923. Journ. biol. chem. LVI.
P; 327—343- Fat-soluble Vitamine. XI. Storage of the fat-soluble
vitamine.

Steenbock, Sell, E. M. Nelson and Buell. 1921. Tourn. biol. chem
XLVI. p. XXXII-XXXIII. Proc. amer. Soc. biol. Chem.
The fat-soluble Vitamine.

Stephenson, Marjory. 1920. Bioch. Journ. XIV. p. 715—720. A
note on the differentiation of the yellow plant pigments from the
fat-soluble vitamine.

Stepp. 1909. Bioch. Zeitschr. 22. p. 452—460. Versuche über Futte-
rung mit lipoidfreier Nahrung.

Stokes. 1864. Proc. Roy. Soc. London. XIII. p. 144—145. On the
supposed Identity of Biliverdin with Chlorophyll, with remarks
on the Constitution of ChlorophyU.

sugiura and Benedict (i). 1918. Journ. biol. chem. XXXVI. p. 171—
189. The nutritive value of the banana. I.

sugiura and Benedict (2). 1919. Journ. biol. chem. XL. p. 449—468.
The nutritive value of the banana. II.

Sure (i). 1924. Journ. biol. chem. LXIl. p. 371—396. Dietary requi-
rements for reproduction. III. The existence of the reproductive
dietary complex (Vitamin E) in the ethereal extracts of yellow
corn, wheat embryo and hemp-seed.

Sure (2). 1928. Journ. biol. chem. LXXVI. p. 673—683. Dietary
requirements for fertility and lactation. XIV. A quantitative
biological method for the study of Vitamin B requirement sfor
lactation.

Sure 1928. Journ. biol. chem. LXXVI. p. 685—700. Dietary
requirements for fertihty and lactation. XV. The inefficiency
of the lactating mother (mus norvegicus albinus) in secreting
Vitamin B in the milk, and the relation of this phenomenon to
infant mortality. (Detailed report).

Sure and Walker. 1931. Journ. biol. chem. XCI. p. 69—75. Dietary
requirements for fertihty and lactation. XXIII. The specific
effect of Vitamin B on lactation.

Takahashi. 1922. Journ. chem. Soc. Japan. XLIII. p. 828—830.
Nutritive value of lipoids. IV. Separation and identification of
active principle (Vitamin A) of cod-liver oil.

Takahashi, Nakamiya, Kawakami and Kitasato. 1925. Scient. Pap.
Inst phys chem. Res. III. p. 81—145. On the Physical and
Chemical Properties of „Biosterinquot; (A Name Given to Fat-
Soluble A) and on its Physiological Significance.

Tammes, Tine. 1900. Flora. 87. p. 205—247. Ueber die Verbreitung des
Carotins im Pflanzenreiche.

Thudichum. 1869. Proc. Roy. Soc. London. XVII. p. 253—256.
Results of Researches on Luteine and the Spectra of yellow
organic Substances contained in Animals and Plants.

Tswett (i). igo6. Ber. Deutsch, bot. Ges. XXIV. p. 384—393. Ad-
sorptions—analyse und chromatographische Methode. Anwen-
dung auf die Chemie des Chlorophylls.

Tswett (2). 1911. Ber. Deutsch, bot. Ges. XXIX. p. 630—636. Über
den makro- und mikrochemischen Nachweis des Carotins.

Vauquelin. 1829. Ann. d. Chim. et d. Physique. 41. p. 46—61. Mé-
moire sur l\'acide pectique et la racine de la carotte (Daucus
carota Linn, ombellif.)

Vermast. 1931. Naturwissenschaften. 19e Jahrg. p. 442—^443. Die
Carotinoide von Citrus aurantium.

Verne. 1926. Compt. rend. Soc. d. Biol. g4, p. 1349—1350- Cristal-
lisation du Carotène dans les téguments des crustacés décapodes.

Ville. 1889. Compt. rend. Acad. d. Sci. CIX. p. 397—400. Recherches
sur les relations qui existent entre la couleur des plantes et la
richesse des terres en agents de fertihté.

Wackenroder. 1826. Ueber das Oleum radicis Dauci aetherum, das
Carotin, den Carottenzucker und den officineUen succus Dauci.
Dissertatio de Anthelminticis regni vegetabilis etc. praemio
omata. Göttingen. 1826. Zie ook: 1833, Zonder titel. Jahres
Ber. ü. d. Fortschr. d. phys. Wissensch. (Berzelius\' Ber.) 12e
Jahrg. p. 277—278.

Went. 1904. Ree. d. Travaux botaniq. Neerland. N®. i—4. p. 106—
119. Ueber den Einfluss des Lichtes auf die Entstehung des
Carotins und auf die Zerzetzung der Enzyme.

Wiesner. Gecit. door Palmer. Carotinoids and related Pigments,
p, 32. New York. 1922.

Willimott. 1927. Joum. biol. chem. LXXIII. p. 587—592. The ad-
sorption of carotin by different charcoals and inorganic salts.

Willimott and Moore. 1927. Bioch. Joum. XXI. p. 86—88. The
feeding of xanthophyll to rats on a diet deficient in vitamin A.

Willimott, Moore and Wokes. 1926. Bioch. Journ. XX. p. 1292—
1298. Effects of various agents on colour tests for vitamin A.

Willimott and Wokes. 1927. Lancet II. p. 8—11. Colour tests for
vitamin A their application to natur^y occurring products.

Willstätter und Escher. 1910. Zeitschr. physiol. Chem. 64. p. 47—
61. Über den Farbstoff der Tomate (Zur Kenntnis des Carotins).

Willstätter und Mieg. 1907. Ann. d. Chem. (Liebig\'s Ann.). 355.
p. I—28. Untersuchungen über Chlorophyll. IV. Ueber die gelben
Begleiter des Chlorophylls.

Willstätter und Stoll. 1913. Untersuchungen über Chlorophyll;
Methoden und Ergebnisse. Berhn. 1913.

Willstätter und Page. 1914. Ann. d. Chem. (Liebig\'s Ann.). 404.
p. 237—271. Über die Pigmente der Braunalgen,

Wokes and Willimott. 1927. Bioch. Joum. XXL p. 419—^425. A
study of the effect of heat and oxidation on cod-liver oil as
measured by colour tests.

Wolff, Overhoff und van Eekelen. 1930. Deutsch. Med. Wochschr.
No. 34. Ueber Carotin und Vitamin A.

Zechmeister und von Cholnoky. 1930. Zeitschr. physiol. Chem.
180. p. 159—161. Über den Zustand der sauerstoffhaltigen
Carotinoide in der Pflanze.

Zechmeister, von Cholnoky und Vrabély. 1928. Ber. Deutsch,
chem. Ges. LXI. p. 566—568. Über katalytische Hydrierung
von Carotin.

Zechmeister und Szillard. 1930. Zeitschr. physiol. Chem. igo.
X 67—71. Über ein Carotinoid aus den Samenhüllen des Spindel-
baumes. (Evonymus europaeus.)

Zechmeister und Tuzson (i). 1928. Ber. Deutsch, chem. Ges. LXI.
p. 1003—1009. Zur Kenntnis des Xanthophylls. 1. Katalytische
Hydrierung.

Zechmeister und Tuzson (2). 1929. Ber. Deutsch, chem. Ges. LXII.
p. 2226—2232. Zur Kenntnis des Xanthophylls. II.

Zechmeister und Tuzson (3). 1931. Naturwissenschaften. 19e Jahrg.
p. 307. Über das Pigment der Orangenschale.

Zechmeister und Vrabély. 192g. Ber. Deutsch, chem. Ges. LXII.
p. 2232—2235. Zur Deutung der colorimetrischen Hydrierungs-
curve von Carotinoiden.

Zeise. 1847. Aus d. Oversigt over det K. d. Vidensk. Sesk. Forh.
1846. no. 7. u. 8. Voorkomend in: Journ. f. prakt. Chem. 40.
p. 297—299. Einige Bemerkungen über das Carotine.

Zeise. 1847. Ann. d. Chem. u. Pharm. (Liebig\'s Ann.) LXII. p. 380—
382. Ueber das Carotin.

ZiLVA (1). 1919. Bioch. Journ. XIII. p. 164—171. The action of ultra-
violet rays on the accessory food factors.

ZiLVA (2). 1920. Bioch. Journ. XIV. p. 740—741. The action of ozone
on the fat-soluble factor in fats.

ZiLVA (3). 1924. Bioch. Journ. XVIII. p. 881—882. The stabihty
of the vitamin A of cod liver oil towards the hardening process.

• 1-.

Drabkin en Waggoner hebben niet bewezen, dat koper geen
specifieke beteekenis heeft voor de haemoglobine-vorming in de rat.

Bij de Röntgenbehandeling van de chronisch verloopende leu-
kaemie moet ook aandacht geschonken worden aan de bestrahng
der nieren volgens Nemenow.

De van Fransche zijde onder den naam „Ectodermose érosive
pluri-orificiellequot; en van Duitsche zijde als „Dermatostomatitisquot;
beschreven dermatosen, zijn als bijzondere vormen van het Erythema
multiforme van Hebra op te vatten.

De epidemiologische beteekenis van den Bacteriophaag kan twee-
ledig zijn, hij kan zoowel factor voor de immuniteit als voor de infectie
zijn.

Résumés des Communications. Ille Congrès international de
Radiologie. Rapport n^. 3. Paris. 1931.

Het door Johanna Kooy bij trachoom aangetroffen polymorph
microorganisme is niet identiek met het Bacterium granulosis van
Noguchi.

Bij de Carotine-bepaling in plantenmateriaal kan het verzeepings-
proces niet gemist worden.

^ ..dl

quot;41

■ft\'.,

■ r\'

(i^iiii

: . ■

.^i-if..

	van het natuurlijk product opgelost in olie:	van het reactieproduct met SbCig:
	in het ultraviolet bij:	in het zichtbare spectrum bij:	in het zichtbare spectrum bij:
Lever- traan.	320-330 m^i. (328 mfi. max.)	(kleurloos)	(604-608 mpl.. (1) Bd. I (620-624 m[i. (gt;) l (572 ni[i.. max.) (») Bd.ii; ((583 m[x. max.) («)
Carotine.	Bd. IV 348-350 mti. (max.) 0 Bd. V 277-280 m.(A. (max.) (273 m.u-. max.) (*)	Bd. I. 492-476 mfA. Bd. II. 459-445 mf^- Bd. III. 427- mp.. (geel)	590 m[A. (max.)

Wijze van drogen:	Droog gew. in %:	Carotine mgr. per 100 gr. versehe groente:	Xanthophyll mgr. per 100 gr. versehe groenten:
Bij 45° C.	12,201	6,93	2.49
Met P2O5	9.440	6,54	3.34
in vacuo

Groenten onderzocht:	Carotine mgr. per 100 gr. versche groenten:	Xanthophyll mgr. per 100 gr. versche groenten:
Versch	4,28	6,82
Gedroogd bij 45° C.	3,78	4.49

Groenten onderzocht:	Carotine, mgr. per 100 gr. versch:
Ongekookt en gedroogd bij 45° C. Gekookt en gedroogd bij 45° C.	3,98 4.15

Versche groente, ongekookt gedroogd in het donker: (Soxhlet-extractie)	Carotine-gehalte per 100 gr. versche groente.	Xanthophyll-gehalte per 100 gr. versche groente:
Met watervrij NajSO^	1,85	3.15
Met warme lucht, 45° C.	2,10	2,55

Proef- dier.	Injectie mgr. carotine per dag.	Voedering mgr. carotine per dag..	Carotine-gehalte in de geexstirp. levers.	Vitamine-A gehalte in de geexst. levers.
vóór de proef.	na de proef.	vóór de proef.	na de proef.
I.	1,8	—	0,00	0,80	0.—	1000 E
2.	1.8	—	0,40	0,11	64 E	400 E
3-	2,6	—	0,12	1,40	30 E	370 E
4-	—	10	sporen	—	0.—	450 E

Gedroogd:	Extractie met:	Droog gew.	Gekookt of ongek.	mgr. Carotine per 100 gr.
in %:	Droge groente:	Versche groente:
Bij 45° C.	Petr.-aether	10,342%	Ongek.	38,50	3.98
Idem	Idem	10,018%	Gekookt	41,40	4.15

		Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
		Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
le Extractie, 8	uren.	2.49	50,35	1.87	3775
2e Extractie, 6	uren.	0,00	0,20	0,15	2,95
3e Extractie, 6	uren.	0,00	0,10	0,08	1,65

Extractie-duur:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch-	Droog.	Versch.	Droog.
9I uren	3.98	38,50	3.28	31.70
19 uren	3.86	37.30	2.34	22,60

Geëxtraheerd:	Extractie methode:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Droog:	Versch:	Versch.	Droog.
Versch.	85% Aceton	4,28	—	6,82	—
Ongekookt- gedroogd.	85% Aceton	3.78	36.60	4.49	43.40
Ongekookt- gedroogd.	Petr.-aether	3.98	38,50	3.28	31.70

Extractie-methode :	Caroline, mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch.	Droog.	Versch	Droog.
Petroleum-aether, (Soxhlet)	1,65	35.80	0,81	17.50
Petr.-aether 25% Aceton. (Soxhlet)	1.77	38,30	1.34	28,90
85% Aceton.	2,04	44.22	2,47	53.50

Extractiemethode:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
Petroleum-aether (Soxhlet)	0.59	5.59	0,58	5.46
Petr.-aether -f 25% Aceton (Soxhlet)	0.59	5.59	0.49	4.63
85% Aceton	0,85	7.99	0,77	7.27

E.\\;tractiemethode:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
Petroleum-aether -f 20% aceton	3.88	37.96	8,01	76,61
Petroleum-aether	3.82	37.37	6,03	57.74

Extractiem ethode:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
Petroleum-aether -f 20% aceton	0,01 1	0,19	Spoor	Spoor
85% Aceton	0,01	0,16	Spoor	Spoor

Extractiemethode:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per loó gr.
		Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
Soxhlet-Petr. -aether. 85% Aceton.		1.43 1.39	I7-— 16,60	I.3I 2.35	15.70 28,07
De overeenstemming in het gevonden carotine-gehalte is hier dus voortreffelijk. Ten slotte bewijst nog de extractie van zoowel gekookt- als onge- kookt bij 45° C. gedroogde raapstelen van één monster met petroleum- aether en met aceton, de gelijkwaardigheid van beide extractiemiddelen voor de carotine- en hun ongelijkwaardigheid voor de xanthophyll- extractie: Tabel ig. (Protocol: Proef XVII. A20, i en 2; Az^a, 1 en 2; B i®, i en 2; B 2°, I en 2). RAAPSTELEN.
Extractiemethode:	Gek. of ongek.	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch:	Droog:	Versch:	. Droog:
Soxhlet-Petr.-aether 85% Aceton. Soxhlet-Petr.-aether. 85% Aceton.	Ongekookt Ongekookt Gekookt Gekookt	2,10 2.08 2,20 2,11	37.44 37.16 67.84 65.25	2,55 3.36 2,95 3.28	45.50 59.74 91.43 101,20

Extractie- methode:	Gekookt of ongekookt.	Gedroogd of ongedroogd.	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
85% Aceton.	Ongekookt	Ongedroogd	4.28	—	6,82	—
85 % Aceton.	Ongekookt	Gedroogd	3.78	36,60	4.49	43.40
Soxhlet-
Petr.-aether	Ongekookt	Gedroogd	3.98	38.50	3.28	31.70
Soxhlet-
Petr.-aether.	Gekookt	Gedroogd	4.15	41.40	4,10	40,90

Extractiemethode:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per loo gr.
	Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
Petroleum-aether bij ± 30° C.	0,60	6,07	1,01	10,20
Petroleum-aether bij ± 55° C.	0,62	6,20	1,07	10,80

Extract verzeept bij kamertemp. met:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch:	Droog:	Vercrh:	Droog:
5 cc. 5% Natrium methylaat. 2 X 24 uren.	3,20	25,50	5,22	41,60
15 cc. 5% Natrium methylaat. 2 X 24 uren.	3,47	27,60	5,49	43,70

Verzeepimg bij:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
Kamertemperatuur	4,87	38,77	8,03	63,95
Ongeveer 65—75° C.	2,87	22,86	4,45	35,49

Verzeeping bij:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
	Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
Kamertemp. 2 X 24 uren	0,17	2.33	0,25	3.45
Ongeveer 65—75° C.	0.15	2,04	0,23	3.25

	Xanthophyll gemeten	in:	In alcohol teveel
	Alcohol	Petroleum-Aether
	mgr. per 100 gr.	mgr. per 100 grr.	vonden %
	Versch:	Droog:	Versch:	Droog:
BOERENKOOL III
Proef: VII, 2	6,19	59,17	5,82	56.58	4.6
BOERENKOOL III
Proef: VUL A, 2	9.60	91,84	8,01	76,61	20.—
BOERENKOOL III
Proef: VIII. B, 2	7.04	67,32	6,03	57.74	16,6
SPINAZIE I
Proef: XII. A, 2	9.50	95,04	7,64	76.19	24.7
ANDIJVIE II Proef: XV. A, 2	1,04	22,55	0,81	17,50	28.9
ANDIJVIE II Proef: XV. B, 2	1,60	34,67	1,34	28,90	20.—
ANDIJVIE II Proef: XV. C, 2	3,06	66,61	2,47	53.50	24,5
SPRUITJES II Proef: XIX. A, 2	0,75	7,10	0,58	5.46	30.—

Kleurgelijkstelling in m.m. bij kolomhoogste van:	Xanthophyll in y per c.c.
0.2% Ka Bichrom. oplossing:	Te meten xanthophyll- oplossing:	Volgens tabel:	Spectro- colorimeter:
Will- stätter:	Euler c.s.:
9-— 12.—	gi.— 116.—	4.83 5.14	4,06 3.92	3.16 3.82

0,2% Ka. Bichrom. oplossing:	Te meten Carotine- oplossing:	Volgens tabel:	Spectro- colorimeter:
Will- stätter:	Euler c.s.:
13.5 10,5 Nog een dupli Andijvie verkreg*	109,5 96,5 3-meting werd 2n: T (Protoi ANI	4.29 4,02 verricht m* abel 31. col XV. B ] )IJVIE II.	4.58 4.32 2t een carotine 0	2,35 1.87 ï-extract uit
Kleurgelijkstelling in m.m. bij kolomhoogte van:	Carotine in per c.c.
0,2% Ka. Bichrom. oplossing:	Te meten carotine- oplossing:	Volgens tabel:	Spectro- colorimeter:
Will- stätter:	Euler:
12.— 12,5	103,— 113 —	4.15 3,91	4,42 4.15	2,70

	Gewicht A.	Gewicht B.
Versche zomer-spinazie	300.— gr.	300.— gr.
Na wasschen en uitlekken	—	428.— „
Na koken en uitlekken	209.— „	210.— „
Na drogen bij 45° C.	14.18 .,	12,89 ..
	{4.727%)	(3.012%)

Groente:	Gek. of Ong.	Dro- gen:	Ex- tractie:	Droog- gew. in %:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. p. 100 gr.
			Droog:	Versch:	Droog:	Versch
Gele Wortelen Idem, 2 e extr.	G.	W.L.	S.P.K. A.	8,068	60,5 11,67	4.88 0,94	3.29 0,09	0,27 0,00
totaal					72,17	5.82	3,38	0,27
Boerenkool I. Idem	G. G.	W.L. P.	S.P.K. S.P.K.	12,201 9,440	56,76 69,28	6,93 6.54	20,40 35,36	2,49 3.34
Boerenkool II. Idem na 5 dagen Idem na 5 dagen	G. G. G.	W.L. W.L. W.L.	S.P.K. S.P.K. S.P.K.	12,555 12,555 12,555	54.74 38.77 22,86	6,87 4.87 2,87	niet be 63.95 35.49	paald 8,03 4.46
Idem na ii dagen Idem *) na ii dagen Idem ») na 17 dagen Idem «) na 17 dagen	G. G.	W.L. W.L.	S.P.K. S.P.K.	12,555 12,555	25.50 27,6	3.20 3.47	41,60 43,70	5.22 5.49
G. G.	W.L. W.L.	S.P.K. S.P.K.	12,555 12,555	21,52 21,20	2,70 2,66	niet be	paald
Boerenkool III Idem ■gt;) Idem 8)	G. G. G.	W.L. W.L. W.L. 1	S.P.K. S.P.A. S.P.K.	10,456 ïo,456 10,456	35.47 37.96 37.37	3.71 3.97 3.91	56,85 76,61 57.74	5.95 8,01 6,03

Groente:	Gek. of Ong.	Dro- gen:	Ex- tractie:	Droog gew. in %:	Carotine mgr. per 100 gr.	Xanthophyll mgr. per 100 gr.
			Droog:	Versch:	Droog:	Versch
Snijboonen (versch) Idem 1)	G.	W.L.	S.P.K.	7.094	2,33	0,17	3.45	0,25
G.	W.L.	S.P.K.	7.094	2,04	0,15	3,25	0,23
savoye Kool Idem \')	G. G.	W.L. W.L.	S.P.K. S.P.K.	5.413 5.413	0.51 0,39	0,03 0,02	0,20 0,25	0,01 0.01
Selderij knollen	G.	W.L.	S.P.K.	4.234	0,29	0,01	0,08	sp.
Groene Erwten (gedroogd)	G.	W.L.	S.P.K.	77.511	0,27	0,21	0,25	0,20
Bloemkool Idem	G. G.	W.L. W.L.	S.P.A. A.	7,15 7.15	0,19 0,16	0,01 0,01	sp. sp.
Roode Kool Idem (D)»)	G. G.	W.L. W.L.	S.P.K. S.P.K.	7.246 7.246	0,13 0,14	0,01 0,01	afw. afw.
Brusselsch Lof	G.	W.L.	S.P.K.	4.900	0,13	0,01	0,72	0,04
Aardappelen (oude) Koolrapen	G. G.	W.L. W.L.	S.P.K. S.P.K.	12,487 8,477	0,03 Lycc 2.90	sp. )pine 0,25	0,21 afw.	0.03

Groentesoort of	Carotine-waarde in dit onderzoek gevonden	Vitamine-A waarde volgens:
Vrucht:	m mgr. per	100 gr.	Scheunert:	U.S.A.Dep.Agr.
	Droog: \|	Versch:
Gele Wortelen	72,17 _G.	5.82	Goed
Boerenkool / Gekookt j	56.76 G. 37.37 G.		Zeer goed
Gedroogd		6,93 3.91		-f tot -1- -f
Versch \|		Zeer goed
Spinazie Gekookt 2)	48.56 G. 38.50 G.		Zeer goed tot goed
Versch 2) {		4.80 3.98	Idem.
Gedroogd

Groentensoort of	Carotine-waarde in dit onderzoek gevonden	Vitamine-A waarde volgens:
Vrucht	in mgr. per 100 gr.	Scheunert:	U.S.A. Dep. Agr.
•	Droog.	Versch
Andijvie I ( II i	19,98 G. 35,80 G.	0,92 1,65
Kropsalade	17.— 0.	1,43	Goed	tot
Spruitjes	6,07 G.	0,60	Goed
Snijboonen	2,33 G.	0,17	Gering
Savoye Kool	0,51 G.	0,03	Nihil
Selderij Knollen	0,29 G.	0,01	Gering
Gedroogde Groene Erwten	0,27 G.	0,21	Goed tot gering
Bloemkool versch	0,19 G.	0,01	Gering
Roode Kool	0,13 G.	0,01	2^er gering
Aardappelen	0,03 G.	Sp.	Sporen
Kersen Conserve versch^)	0,23		Goed
Abrikozen versch	0.47		Gering
AardbeienConserve		0,06	Zeer gering
Bananen		0,25		tot
Perzik Conserve Boschbessen Cons.		0,69 0,32	Gering Goed	tot
Sinaasappelen 4		0,36		4-