TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN
DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GE-
ZAG VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS DR. L.
S. ORNSTEIN, HOOGLEERAAR IN DE FACUL-
TEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE, VOLGENS
BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNIVERSI-
TEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE
FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE
TE VERDEDIGEN OP MAANDAG 4 JULI 1932,
DES NAMIDDAGS 4 UUR

Nu tenslotte mijn wensch om mijn studietijd te besluiten met
het schrijven van een proefschrift toch nog in vervulling is gegaan,
wil ik gaarne van deze gelegenheid gebruik maken, om aan allen,
die tot mijne academische opleiding bijdroegen, mijnen hartelijken dank
te betuigen.

Hooggeleerde van Romburgh, Kruyt, Ornstein, Moll, Zeer-
geleerde Strengers. Uit Uwe colleges en practica mocht ik de grond-
slagen der chemie en physica leeren, welke zoo noodzakelijk zijn voor
den bioloog. Hiervoor zeg ik U hartelijk dank.

Hooggeleerde Pulle. U dank ik zeer voor Uw onderricht in de
systematiek der planten.

Hooggeleerde Went. Met dankbaarheid zie ik terug op den tijd,
dat ik in Uw laboratorium werkzaam was en Uwe leerrijke colleges
volgde.

Hooggeleerde Nierstrasz. Uit Uwe heldere colleges en gedurende
het practisch werk onder Uwe leiding mocht ik veel van U leeren,
ook hoe onontbeerlijk eene kritische beschouwingswijze voor weten-
schappelijk onderzoek is. Hiervoor ben ik U veel dank verschuldigd.

Zeergeleerde de Lange. De tijd, dat ik in Uw laboratorium werk-
zaam was en de voortdurende belangstelling, die ik daarbij van U
mocht ondervinden, zullen steeds bij mij in aangename herinnering
blijven.

Sehr geehrter Herr Professor Wald sc hm idt-Lei tz. Ich brauche
Ihnen wohl kaum zu versichern, wie vielen Dank ich Ihnen schulde
fiir die Gelegenheit, welche Sie mir gegeben haben, in Ihrem Institut
die neueren Methoden der Enzymforschung kennenzulernen. Ohne
diese Gelegenheit wäre es mir unmöglich gewesen, dieses Thema zu
bearbeiten. Auch Ihnen, Herr Dr. Schaffner, bin ich sehr dankbar
für die viele Hilfe, die Sie mir zuteil werden ließen, ebenso wie allen,
welche während meines Aufenthaltes in Prag mir so freundlich ent-
gegengekommen sind.

Hooggeleerde Jordan, Hooggeachte Promotor. Van het oogen-
blik af, dat ik Uwe boeiende colleges begon te volgen, voelde ik mij
tot de vergelijkende physiologie aangetrokken. De wijze, waarop gij
op de nog onvoltooide problemen weet te wijzen, heeft steeds mijn
bewondering gewekt. Dat ik op Uw aanraden onder leiding van

Professor Waldschmidt-Leitz te Praag heb gewerkt, is voor mijn
onderzoek van onschatbare waarde geweest. Ook voor Uwe aanmoe-
diging gedurende het practische werk voor dit proefschrift en voor
Uwe welwillendheid bij de publicatie ervan, ben ik U zeer dankbaar.
Aan den tijd, dat ik assistente op Uw laboratorium was, heb ik de
prettigste herinneringen. Voor de vriendelijke gastvrijheid mij door
Mevrouw Jordan en U betoond, zeg ik U eveneens hartelijk dank.

Zeergeleerde Vonk. Uwe groote bereidwilligheid om mij bij elke
moeilijkheid in mijn werk te helpen, was mij een groote steun, die
er veel toe heeft bijgedragen, dat dit proefschrift beeindigd kon
worden. Hiervoor zeg ik U ook op deze plaats hartelijk dank.

De groote hulpvaardigheid van wijlen van Norden zal bij mij
steeds in goede herinnering blijven. Ook U, waarde van Mastbergen,
dank ik voor Uw hulp.

Ten slotte ook een woord van hartelijken dank aan hen, die door
hun daadwerkelijke belangstelling mij hebben geholpen dit proefschrift
te voltooien.

Die Enzyme der Wirbellosen wurden von ihrer ersten Entdeckung an
verglichen mit den besser bekannten Wirbeltierenzymen. Im allgemeinen
wurden bei den verschiedenen Gruppen von Invertebraten Enzyme be-
schrieben, wovon das eiweißspaltende dem Trypsin der Säugetiere ähn-
lich sein sollte; ferner fand man verschiedene der kohlehydrat- und fett-
spaltenden Enzyme wieder. Eine Aufzählung der verschiedenen älteren
Befunde hier wiederzugeben, ist überflüssig, zumal die Literatur sehr aus-
führlich zusammengestellt ist von Jordak (35), von Biedermann in
WiNTERSTEiNs Handbuch der vergleichenden Physiologie (9) und neuer-
dings wieder von Jordan in Bethes Handbuch der normalen und patho-
logischen Physiologie (38).

Die meisten älteren Untersuchungen über die eiweißspaltenden Fer-
mente bei Tieren aus den verschiedenen Klassen hatten gezeigt, daß ein
Enzym vorhanden ist, welches imstande ist, verschiedene native Eiweiß-
körper (Gelatine, Casein, Fibrin) zu spalten, und zwar (nach der Mehrzahl
der Autoren) vorwiegend bei neutraler oder schwach alkalischer Eeak
tion, wobei weiter eine „freie Säurequot; schädigend wirkt und bei welcher
Spaltung Peptone und oft Tryptophan und Tyrosin als Produkte auf-
treten. Die Frage nach der Ähnlichkeit mit einer der verdauenden Pro-
teasen der Vertebraten lag nahe; es wurden meistens die Enzyme als
„typsinähnliche Proteasenquot; oder „Urtrypsinquot; beschrieben (siehe dazu
JoBDAK [35]). Daneben war zuerst nur bei Cephalopoden von Cohnheim
(15) em Erepsin gefunden worden, welches mit dem im vorangehenden
Jahre von ihm in der Darmschleimhaut von Säugern entdeckten Erepsin
(14) verglichen wurde.

Die eiweißverdauende Wirkung des Magensaftes der Crustaceen
wurde im Jahre 1877 von Hoppe-Seylee (32) bei Astacus nachgewiesen-
er verghch das darin vorhandene Ferment seiner Wirkung nach mit dem
eiweißspaltenden Ferment aus dem Pankreas der Vertebraten und zeigte
daß es von der sogenannten Leber sezerniert wurde. Gegenüber seiner
Meinung wurde im folgenden Jahre von Krfkenberg (47) das Vorhan-
densein sowohl von Trypsin als von Pepsin im Magensaft angegeben.

Jordan (34) widerlegte Krukenbergs Angaben und zeigte daß
Hoppe-Seylers Auffassung des Enzyms als dem Trypsin ähnlich, richtig
war: bei der Einwirkung des Magensaftes auf Eiweißkörper konnten im
Verdauungsgemisch neben Albumosen und Peptonen Tyrosin und Leucin
nachgewiesen werden.

Für andere Decapoda (Cancer fagurus, Maja squinado) fand Sellier
(68) eine ähnliche Wirkung des Magensaftes, auch Roae (63) fand bei
Cancer eine Protease, welche Fibrin bei neutraler und alkalischer Re-
aktion spaltet.

Nachdem durch die Untersuchungen von Sörensen (75, 76, 77) die
große Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration für die Wirksam-
keit eines Enzyms klargelegt worden war, wurde versucht, die Enzyme
der Wirbellosen zu charakterisieren und, falls möglich, mit denen der
Pflanzen oder Tiere zu identifizieren durch die Bestimmung der p^-
Optima. Die proteolytischen Enzyme wurden unterschieden in eigent-
liche Proteasen, welche native Eiweißkörper angreifen, und Peptidasen,
welche Peptide spalten; zu den letzteren wurde das Erepsin gerechnet'
Die eigentlichen Proteasen umfaßten drei Typen:

1.nbsp;Pepsin, welches in stark saurem Gebiet wirkt. Opt. p„ = unge-
fähr 2. fH ö

In einer Untersuchung über das Papain, das proteolytische Enzym
aus dem Milchsaft von Carica papaya, verglichen Eingeeu. gruttbernk
(62) das proteolytische ^stocws-Enzym mit dem Papain, mit welchem es
die pa-0ptima der Enzymwirkung auf verschiedene Substrate gemein
hatte.

Keügbb (42) und Krüger u. Graetz (45) arbeiteten mit Astacus-
Magensaft; sie glaubten anfänglich gezeigt zu haben, daß eine Pepsin-
fraktion neben einer Trypsinfraktion mit einem Opt. bei pjj = 7_8 an-
wesend sei; in einer späteren Publikation (46), worauf ich weiter unten
zurückkomme, wird aber die Annahme einer Pepsinase bezweifelt. Auch
wurde die Anwesenheit eines Erepsins mit einem Pg-Opt. bei 7,3—8,9
nachgewiesen.

Hirsch (30, siehe auch Jordan u. Hirsch [38]) fand bei der Unter-
suchung des Sekretionsrhythmus bei Astacus, daß, wenn man den Magen-
saft zu verschiedenen Zeiten nach der Nahrungsaufnahme auf Enzym-
kraft prüft, der Höhepunkt der Kurve für die Kaseinspaltung nicht mit
dem für die Peptonspaltung zusammenfällt, vielmehr ist das Maximum
dér ersten Kurve gleichzeitig mit dem Minimum der zweiten; hieraus
wurde auf das wahrscheinliche Vorkommen von zwei Proteasen, einer
,,Kaseinasequot; und einer ,,Peptonasequot; geschlossen.

Shinoda (69) wiederholte mittels der Alkoholtitrierung und mit ver-
schiedenen Substraten die Versuche von Hirsch über den Sekretions-
rhythmus der beiden angegebenen Enzyme, konnte aber auf diese Weise
nicht die Existenz zweier Enzyme nachweisen; die Kurven für sämtliche
geprüfte Substrate waren gleich den Kurven von Hirsch für Pepton.
A\ich Krüger u. Graetz (46) bezweifeln die Angaben von Hirsch über
das Vorkomznen zweier Proteasen, sie nehmen die Anwesenheit von nur
einer Protease, dem .^stacws-Trypsin, neben einer Erepsinkomponente
an. Die von ihnen früher angegebene Pepsinase konnte nicht nachge-
wiesen werden, das früher beobachtete kleine Optimum der Fibrin- (und
auch Kasein-)spaltung in saurem Gebiet dürfte verursacht sein „durch
Adsorption von titrierbaren Gruppen an der Oberfläche der Fibrinkörn-
chen bei den verschiedenen pjjquot; (1. c. S. 488). Bei Benutzung einer Lö-
sung eines Eiweißkörpers, Pflanzenkasein, war das Optimum im sauren
Gebiet verschwunden, doch lag die Annahme einer „Pepsinasequot;, dem
Säugetierpepsin ähnlich, noch nahe, weil der .^stascws-Magensaft nach ih nen
weit in das saure Gebiet hinein noch Spaltungen hervorruft. Weil aber die
Spaltung von Clupein, welches von Pepsin sicher nicht angegriffen wird,
durch Astacus-Magensaft ebensogut wie die Spaltung von Pepton, Kasein
n. a. bis zu einem Pg = 2 stattfindet, schlössen die Verfasser, daß eine Pep-

sinase fehlt, und daß also nur eine einzige Protease^ vorhanden ist, deren
Wirksamkeit sich weit in das saure Gebiet erstreckt. (Für die Fibrin-
spaltung wurde der Wirkungsbereich von p3lt;2 bis p^ gt; 12 angegeben.)

Aus den gefundenen pj,-Optima (welche für Fibrin und Pepton bei
7—8 bzw. 7,5 bestimmt wurden), die zwar teilweise durch Erepsinwir-
kung abgeändert sind, und aus dem Verhältnis der gefundenen Spaltwerte
für die verschiedenen Substrate schlössen Kküger u. Graetz auf eine
Älmlichkeit mit dem Hefetrypsin, während sie auch zu den intracellulären
Enzymen der Vertebraten Beziehungen wahrscheinlich machen; so für die
^stacMs-Proteinase mit der Proteinase aus der Milz (94). Diese Ansicht war
von ihnen auch schon in früheren Publikationen geäußert worden (45)
und sollte nicht nur für die proteolytischen, sondern auch für die lipa-
tischen (44) und für die kohlehydratspaltenden Enzyme zutreffend sein.

VoNK (83) hatte 1927 auch schon die Auffassung geäußert, daß die
Proteinase von Astacus und Jlomarus zu den pflanzlichen Proteinasen, die
ihr Optimum bei dem isoelektrischen Punkt der Substrate haben, Be-
ziehungen aufweist, wobei er auch auf die Arbeit von Ringer u. Grtjtte-
rink (62), worin die ^stecws-Proteinase mit dem Papain verglichen wurde,
hinwies und nicht, wie Krüger meint, auf Ringers Arbeit über das p^-
Optimum für Trypsin.

Sh inoda (69) versuchte ebenfalls der Art der Proteasen von Astacus
näher zu kommen mit Hilfe der pg-Optimabestimmungen und der Be-
stimmung der spezifischen Substrate, die nur von bestimmten Enzymen
der Vertebraten gespalten werden. Er fand u.a. eine Spaltung von Binde-
gewebe (welches als ausschließlich von Pepsin spaltbar galt) durch Asta-
cws-Magensaft. Auch Dipeptide wurden gespalten. Nach ihm umfaßt
die Wirkung des Magensaftes alle diejenigen Wirkungen, welche die ver-
schiedenen Säfte der Wirbeltiere zusammen ausüben, die proteolytische
Wirkung erstreckt sich also auf die ganze Breite der Eiweißlösung.

Später wurde von Vonk (85) darauf hingewiesen, daß Thomas u. Sey-
mour-J ones (78) 1923 gezeigt hatten, daß Bindegewebe nicht nur von Pep-
sin, sondern auch von Trypsin angegriffen wird, nur liegt das Pn-Optimum
für die Spaltung durch Trypsin außerordentlich niedrig (bei pg = 5,9). Also
war der Widerspruch, daß hier ein Enzym vorhanden ist, welches Binde-
gewebe spaltet, aber sonst keinerlei Pepsineigenschaften zeigt, damit fort-
gefallen.

Die Bestimmung der pj,-Optima für die Spaltung von nativen Eiweiß-
körpern durch den ^stoctts-Magensaft ergab nach Shinoda das pn-
Optimum für Gelatine bei pg — 6,5 nach Messung der freiwerdenden

1 Krüger spricht hier von Protease. Im Anschluß an die neueren Befunde
von Waldschmidt-Leitz (100,105) (s. dazu S. 165 u. 166) mag hier darauf hin-
gewiesen werden, daß es richtiger wäre, hier von Proteinasewirkung zu sprechen,
was im folgenden dann auch getan worden ist.

Aminosäuren; bei pa = 5 und pa = 8, wenn man die freiwerdenden
Polypeptide titriert, und bei 5,5 und 7,7, wenn man die Verflüssigung
einer Gelatinesäule als Maß der Enzymwirkung nimmt. Für Kasein lag
das Wirkungsoptimum bei pg = 5,6 und für Fibrin bei 5,5 und 8. Über-
dies wurde das pg-Optimum für die Spaltung von Pepton bestimmt; für
Pepton Witte lag es bei 6,7 und für Pepton F bei 6,2.

Nach Shinoda ist die Bestimmung der pjj-Optima ungenügend zur
Feststellung der Anwesenheit von einzelnen Enzymen, wie sie nach
Waldsohmidt-Lbitz bei den Säugetieren vorkommen, und von welchen
jedes eine spezifische Aufgabe hat zur Lösung bestimmter Bindungen im
Eiweißmolekül. Es geht aus den pg-Optima nur hervor, daß „die Wir-
kung des ^«fectts-Magensaftes auf einige spezifische Substrate unter ganz
anderen Bedingungen vor sich geht als die entsprechende Wirkung durch
die jeweiligen Enzyme des Säugetieresquot; (1. c. S. 342). Die Pg-Optima
des J.5tocMS-Magensaftes stimmen größtenteils mit dem natürlichen p^
des Saftes, der bei 5—5,6 gefunden wurde, überein.

Überdies fand Shinoda ein Optimum der Autolyse bei p^ 3,5
und ein zweites bei Pn = 9. Bei dem natürlichen p^ des Saftes ist die
Autolyse fast null, so daß keine Verdauung des eigenen Eiweißes statt-
findet. Dagegen findet Keügee (46) fast keine Autolyse; auch in einer
späteren Mitteilung (43) verneint Krüger die Anwesenheit einer be-
deutenden Autolyse und bestreitet Shinodas Angaben darüber; nach ihm
ist eine sehr geringe Autolyse nur im sauren Gebiet wahrnehmbar.

Shinoda gibt an, daß die Dipeptidspaltung, die letzte Phase des pro-
teolytischen Abbaues, nur sehr gering ist; dieses läßt vermuten, daß die
Endverdauung in den Zellen der Mitteldarmdrüse stattfindet. Auch
kann es die Bedeutung haben, einer Überschwemmung des Organismus
mit Aminosäuren vorzubeugen (Vonk, 84). Als Optimum für die Di-
peptidspaltung fand Shinoda p^ = 9.

Aus den Versuchen von Shinoda und aus dem Fehlen irgendeiner
Aktivierung schloß Vonk (84), daß die ^.stoctfÄ-Proteinase mehr Überein-
stimmung zeigt mit pflanzlichen Proteasen, wie sie in der Hefe gefunden
worden waren, als mit den proteol3H;ischen Enzymen der Vertebraten.

Krüger (43) vergleicht in seiner letzten Publikation die Astacus-
Enzyme mit denen des Hefepreßsaftes; diese Vergleichung sollte auch für
die übrigen Wirbellosen gelten. Bei allen von ihm untersuchten Arten
fand er Proteinasewirkung (gemessen an Peptonspaltung) und Dipepti-
dasewirkung; auch konnte er für Astacus Polypeptidasewirkung i nach-
weisen, die derjenigen der Hefe ähnlich war.

^ Ich spreche hier von 'Pvoieina,mwirkung ustt., weil man ohne Trennung der
Enzyme nicht berechtigt ist von einer Proteinase, Polypeptidase usw. zu reden;
es könnte ein Enzym vorhanden sein, das allein alles leistet wozu die Teilenzyme
der Vertebraten imstande sind. Nur die Wirkung wurde wahrgenommen.

Für die Proteinasewirkung von Ästacus wurde das Optimum der
Caseinspaltung bei Pn = 7 gefunden.

Im ^stoCMs-Magensaft (und auch wohl bei den anderen Wirbellosen)
sind also nach Krüger drei Fermente zu unterscheiden: eine Proteinase,
eine Polypeptidase und eine Dipeptidase, wie sie auch in Hefepreßsaft
vorkommen (siehe aber Fußnoten 1 auf S. 156 u. 157).

Auch bei anderen Wirbellosen hat man in den letzten Jahren ver-
sucht, durch pH-Optimabestimmungen dem Charakter ihrer proteolyti-
schen Fermente näher zu kommen.

Für die Goelenterata schlössen Bodansky u. Rose (11) und Bodansky (10)
aus den von ihnen gefundenen pn-Optima 3,0 und 7,3 (für die Verflüssigung von
Gelatine durch den Extrakt der Mesenterialfilamente von Physalia, Stomolophus
und Metridium) auf die Anwesenheit von Pepsin und Trypsin; auch eine „Labquot;-
wirkung wurde nachgewiesen.

Yonge (143) schloß aus seinen pn-Optimabestimmungen für Leibesflüssig-
keit von Fungia und für Extrakte der Mesenterialfüamente von LohophylUa auf
die Anwesenheit einer extracellulären Protease in den beiden Arten, welche Pro-
teine bis zu Polypeptiden abbaut, und deren Optimum bei p,i ='7,1 liegt, neben
{hQiLohophyllia) einer intracellulären Protease, welche Proteine bis zu Aminosäuren
spaltet, und deren Optimum bei 9,2 liegt. Diese letzte konnte durch Adsorption in
eine trypsinähnliche Proteinase und eine Peptidase getrennt werden (siehe auch
S. 167 u. 168). Ein Optimum der Wirkung von Extrakten, bei pj, = 5,3 gelegen, würde
auf eine wahrscheinlich anwesende Protease der Zooxanthellen zurückgeführt.

Bei den Echinodermen wurde von OoMEN (59) gefunden, daß bei den Holo-
thurien eine Protease anwesend ist, deren Wirkung bei steigender Alkalinität zu-
nimmt; ein deutliches Optimum wurde nicht gefunden.

Krüger (43) fand für Holothuria schätzungsweise ein pji-Optimum für
Pepton bei p,j = 7,5; er fand höhere Spaltungswerte als von Oomen angegeben.

Für die Polychaeta ist eine Arbeit von Nicol (57) zu erwähnen, der bei Sabella
eine Protease fand, welche Gelatine bei einem Optimum p« = 8 spaltet; auch
andere native Eiweißkörper und Pepton werden gespalten und zwar unter Auf-
treten von freien Aminosäuren.

In der Gruppe der Mollusca wurde von Graetz (17, 18) bei verschiedenen
Pulmonata ein proteolytisches Enzym gefunden, welches seine Wirkung hat bei
Ph 2—11,5, mit einem Optimum bei pjj = 7,6, neben einem ereptischen Enzym,
dessen Optimum bei p^ = 7,3 liegt. Die Wirkung der beiden proteolytischen En-
zyme ließ sich mit der von J^tacws-Magensaft vergleichen.

Für einige Opisthobranchiata zeigte Krüger (43) die Anwesenheit ähnlicher
Enzyme.

Yonge (142) fand für den Lamellibranchier Ostrea edulis zwei Optima der
Gelatineverdauung, das eine bei p,i = 3,7, das zweite bei pjj = 9.

Sawano (67) fand für Extrakte der Mitteldarmdrüse von Ostrea circumpicta
das Optimum der Gelatinespaltung bei p„ = 8,0, für Casein bei pjj = 4,0.

In der Gruppe der Cephalopoda zeigte Krüger (43) bei Medone, Sepia und
Octopus die Anwesenheit einer Protease und Erepsin; der Magensaft von Eledone
hatte schätzungsweise ein Optimum bei pn = 7,5 für die Peptonspaltung.

In der Gruppe der Insecta (wofür eine sehr ausführliche Aufzählung der ver-
schiedenen Befunde durch Uvarov [81] gegeben ist) wurde von Abbott (1) die
Anwesenheit eines proteolytischen Enzyms, welches dem Trypsin ähnlich sein

sollte, für PenpZaweto angegeben, andere Autoren geben eine,, Pepsinquot;fraktion an
(Pavlovsky u. Zaein [61] bei der Honigbiene).

wigglesworth (110, III) untersuchte das proteolytische Enzym bei Peri-
planeta, und schloß auf Grund der Natur der Verdauungsprodukte, des Verhaltens
gegenüber Blausäure und der Ähnlichkeit der p^-Kurven für verschiedene Sub-
strate (Optimum bei Ph = 7—7,5) mit denen des Trypsins, auf den trypsinähn-
lichen Charakter der Protease; daneben konnte auch Erepsin, mit einem Optimum
bei p^i = 8,5, nachgewiesen werden. Auch das Adsorptionsverhalten des Enzyms
ist nach ihm das gleiche wie für Pankreastrypsin; es gelang ihm, die „Trypsin-
fraktionquot; erepsinfrei, und das „Erepsinquot; trvpsinfrei zu bekommen (siehe dazu
auch S. 167 u. 168).

Shinoda (70) fand für eine Larve von Bombyx mori (der Seidenraupe), daß
die Protease ihr Optimum bei p^j = 9,5 hat. Hobson (31) fand für die Larve
von Lucilia (der Fleischfliege), daß eine „Tryptasequot; mit einem Optimum für
Gelatine bei pj, = 8 im Mitteldarm anwesend sei, die Pn-Kurve für die Tryptase
von Lucilia geht beinahe mit einer Pankreas-Trypsin-p^-Kurve parallel; nur ist
die erstere im sauren Gebiet wirksamer, genau wie Wiggleswoeth es für Peri-
planeta fand. Eine „Peptasequot;, dem Pepsin ähnlich, ist nicht vorhanden; eine
Peptidase ist anwesend.

In der Gruppe der Tunicata fand Yonge (141) bei Ciona intestinalis eine
Protease, welche bei alkalischer und neutraler Reaktion wirkt.

Krüger (43) fand bei der nämlichen Art eine stärkere proteolytische Wirkung
als Yonge, er konnte die Wirkungen einer Protease, einer Poljrpeptidase und
einer Dipeptidase zeigen.

Für andere Tunicata, Tethyum, Boltenia, Molgula, Ascidia fand Berrill (8)
im „Leberquot;-Extrakt eine Protease, Avelche im Bereich von pjj 6—10 wirksam ist,
und deren Optimum bei pji 8,0—8,5 liegt.

Ans dieser Übersicht geht hervor, daß beim näheren Studium der
proteolytischen Enzyme der Wirbellosen diese einerseits mit den Pflan-
zenenzymen verglichen wurden (Vonk, Krüger u. Graetz), oder mit
den proteolytischen Enzymen der Organe der Säugetiere (Krüger),
andererseits mit den Verdauungsenzymen der Wirbeltiere, und speziell
mit den Pankreasenzymen ( Yonge, Wigglesworth, Hobson, Bo-
dansky und Rose, diese letzten auch mit Pepsin).

Was die Untersuchung nach der Art der Enzyme erschwert, ist die
Tatsache, daß bei den Invertebraten sämtliche Enzyme an einem Ort
wirken, so daß von einer räumlichen Trennung, wie sie beim Säugetier
(und nach Vonk [83] für die Proteasen auch bei Amphibien und Fischen,
nach WoLVEKAMP (140) auch bei Schildkröten) besteht, keine Rede ist.

Jordan (37, 38) wies auf die Bedeutung dieses Unterschiedes zwischen
Wirbellosen und Wirbeltieren hin. Durch die Tatsache, daß bei den Vertebraten
die Enzyme, welche die Verdauung beenden (Erepsin, Maltase), über die Länge
des Mitteldarmes verteilt sind und immer getrennt sind von den Enzymen, welche
die Verdauung anfangen (Pepsin im Magen, Trypsin vom Pankreas an den Darm
abgegeben, Amylase in Speichel und Pankreas), ist der Organismus vor einer
Überschwemmung mit den Endprodukten geschützt. Bei den Wirbellosen ist
die Verdauung langsam, überdies tritt die Nahrung nur in kleinen Portionen in
den Mitteldarm ein, wo erst die Resorption stattfindet.

Endonzyme zwar vielleicht vorkommen kann (kleine Dipeptidspaltung bei Asta-
cus), aber auch fehlen kann (für die Karbohydrasen siehe Wiebsma u. v. d Veen
[109]), ist doch durch die oben erwähnten Umstände eine Überschwemmung mit
Verdauungsprodukten ausgeschlossen.

In solchen Enzymgemischen, wo also die ganze Verdauung von einem
einzigen Saft geleistet wird, die einzelnen Wirkungen dieses Saftes auf
spezifische Substrate, auf bestimmte „Enzymindividuenquot; zurückzuführen
nach den jeweiligen p^-Optima, ist äußerst schwierig. Erstens weil im
Falle der proteolytischen Enzyme ein mit der Protease anwesendes Erep-
sin durch die weitere Spaltung der entstehenden Produkte eine Verschie-
bung der pg-Optima oder ein zweites Pü-Optimum verursachen kann
(siehe dazu Vonk [83] an den kohlehydratspaltenden Enzymen der
Fische, Waldsohmidt-Leitz [94] an den proteolytischen Enzymen der
Milz). Zweitens hat die Anwesenheit von Elektrolyten einen großen Ein-
fluß auf die Lage des pn-Optimums (siehe Einger [62] an Papain) ; auch
andere begleitende Stoffe können das Optimum wesentlich entstellen
(siehe willstätter [130], über MagenKpase). Drittens ist die Zeit der
Einwirkung zu beachten; die Beständigkeit der Enzyme ist verschieden
bei verschiedener Acidität, das Resistenzoptimum fällt nicht immer mit
dem Wirkungsoptimum zusammen (siehe Sjöberg [71] über Amylase von
Phiseolus). Eine Charakterisierung und Identifizierung der Enzyme in
Gemischen nach ihren Pu-Optima ist also keine sichere, um so mehr als
auch die verschiedenen Substrate mit dem nämlichen Enzym verschie-
dene pjj-Optima ergeben. Nach Northrop (58) sollten für Pepsin und
Trypsin die pu-Kurven mit den Dissoziationskurven der angewandten
Substrate übereinstimmen, wobei Pepsin nur mit den Eiweißkationen,
Trypsin nur mit den Eiweißanionen reagieren soll. Für Papain fällt nach
willstätter (123) das pn-0ptimum zusammen mit dem isoelektrischen
Punkt des Substrates; das Papain würde danach nur das undissoziierte
Eiweißmolekül angreifen. Auch für Kathepsin, die Proteinase aus tie-
rischen Organen, hat der elektrochemische Charakter des Substrates Ein-
fluß (Waldsohmidt-Leitz, 105); hier dürfte aber „in erster Linie der
elektrochemische Charakter der Kathepsin-Substratverbindung bestim-
mend sein für die Reaktionsgeschwindigkeitquot; (1. c. S. 35).

Ist also die Bestimmung der Pü-Optima nicht genügend zur défini-
tiven Charakterisierung der Enzyme, auch die spezifische Wirkung auf
verschiedene Substrate erlaubt nicht, wenn es sich um verschiedene Wir-
kungen eines einzigen Saftes handelt, die einzelnen Wirkungen auf ver-
schiedene Enzyme zurückzuführen (siehe dazu auch Jordan [37, S. 21]).
Nur nach erfolgter IsoHerung der einzelnen Enzyme der Wirbellosen aus
ihren Gemischen kann man versuchen, sie mit den, ebenfalls isolierten,
Enzymen der Wirbeltiere oder Pflanzen zu vergleichen (siehe dazu Jor-
dan, 1. c. S. 21, Shinoda [69] S. 343).

Die Isolierung von Enzymen aus ihren Gemischen mit fremden Be-
gleitstoffen und mit anderen Enzymen wurde von Willstätter vor-
genommen. In einer umfangreichen Reihe von Untersuchungen, die von
ihm und seinen Schülern in den Jahren 1920—1928 (113, siehe auch 89)
ausgeführt wurden, hat er eine Methode zur Reinigung und Isolierung
der Enzyme ausgearbeitet und angewandt; die Methode, die er benutzte,
war die der fraktionierten Adsorption und Elution aus den Adsorbaten!
Es hat sich nämlich gezeigt, daß sogenannte oberflächenaktive Stoffe,
wie Kaolin, Tonerde, Eisenhydroxyd u. a., imstande sind, die Enzyme
mittels kleinen Affinitätsbeträgen an sich zu binden. Diese kleinen
Mengen an Affinität lassen sich im allgemeinen mit sehr gelinden che-
mischen Mitteln wieder aufheben, z. B. durch verdünnte Alkalien.

Im vorigen Jahrhundert wurden schon vereinzelte Versuche gemacht und
einige Enzyme aus ihren Gemischen durch Adsorption abgetrennt; unter anderem
gelang es Brücke (12) 1861 das Pepsin durch Adsorption seiner Lösung zu ent-
ziehen und nachher aus diesem Adsorbat frei zu legen. Die so erhaltene Enzym-
lösung zeigte fast keine Eiweißreaktionen mehr. Auch die Trennung von Enzy-
men aus einem Gemisch, nämlich dem Pankreassaft, wurde mit Hilfe des Adsorp-
tionsverfahrens schon 1862 von Danilewsky (16) und später von Cohnheim (13)
versucht; das eiweißspaltende Enzym wurde dabei frei von Diastase erhalten,
und ebenso die Diastase frei von Trypsinwirkung.

Erst 1907 nahm Michaelis (54, 55, 56) die Adsorption von Enzymen wieder
auf, und zwar versuchte er der elektrochemischen Natur der Enzyme näher zu
kommen. Aus der Tatsache, daß Invertin bei jeder Reaktion durch das elektro-
positive Adsorbens Tonerde adsorbiert wurde, schloß er auf den sauren Charakter
dieses Enzyms, aus der Aufnahme von Trypsin bei jeder Reaktion durch Tonerde
und ebensogut durch das elektronegative Adsorbens Kaolin auf die amphotere
Natur des Trypsins. Indessen hat es sich später herausgestellt, daß dieses Ad-
sorptionsverhalten der Enzyme nicht diesen selbst zukommt, doch für ihre Aggre-
gate mit begleitenden Stoffen, wie sie sich in den Enzymlösungen finden, gilt.
So konnte Willstätter (132) für das Invertin zeigen, daß das Adsorptionsver-
halten vom Reinheitsgrad des Enzyms abhängig sei: während aus der Rohlösung
nur eine Adsorption mit Tonerde gelang, war es möglich aus reineren Lösungen
das Enzym an Kaolin zu adsorbieren; es besitzt also sowohl saure wie basische
Eigenschaften. Trypsin aus Pankreas wird nach einer vorläufigen Reinigung gar
nicht mehr von Tonerde, aber quantitativ von Kaolin aufgenommen, die basische
Natur überwiegt jetzt (Willstätter u. Waldschmidt-Leitz [135]).

„Das Adsorptionsverhalten von Enzymen aus unreinen Lösungen sagt also
nichts über die elektrochemische Natur eines Ferments aus, sondern es läßt nur
erkennen, ob in dem aus einem Ferment und seinen jeweiligen Begleitstoffen ge-
bildeten Additions- oder Adsorptionsprodukt die Säure- oder Basennatur über-
wiegtquot; (Willstätter [132, S. 57]). Die Begleitstoffe vermögen also das Adsorp-
tionsverhalten eines Enzyms abzuändern, auch können sie auf die Zerlegung der
Adsorbate mit chemischen Mitteln einen Einfluß haben: mit dem Enzym können
Stoffe adsorbiert sein, welche beim Eluieren mitwirken (von Willstätter als Ko-
eluentia bezeichnet), oder solche, welche das Enzym fester an das Adsorbens
binden (Ko-adsorbentia).

Eine quantitative Messung der Enzyme, die als Kontrolle zu ihrer
Reinigung notwendig ist, ist nur möglich nach ihrer katalytischen Wirk-
Z. f. vergl. Physiologie Bd. 17.nbsp;11

samkeit. Bis jetzt ist es auch Willstättee trotz weitgehender Rei-
nigung vieler Enzyme nicht gelungen, ein Enzym auf Grund anderer,
z. B. chemischer oder physikalischer Merkmale zu beschreiben. Wo be-
stimmte Stoffe als wesentliche Bestandteile eines Enzyms aufgefaßt wur-
den, konnte immer gezeigt werden, daß sie für die Enzymwirkung be-
langlos waren (so Proteine, Kohlehydrate oder Phosphorverbindungen
für die Saccharase aus Hefe, Proteine und Kohlehydrate für Lipase aus
Pankreas). Chemische Reaktionen für die Enzyme selbst sind also nicht
bekannt ; überdies werden fast alle Enzymeigenschaften durch Begleit-
stoffe beeinflußt (so z. B. die Abhängigkeit ihrer Wirkungen von der
H-Ionenkonzentration, ihre Haltbarkeit, ihr Temperaturoptimum, ihr
Adsorptionsverhalten). Die einzige Eigenschaft, die den Enzymen selbst
zukommt, ist ihre spezifische katalytische Wirkung.

Die quantitative Analyse der Enzyme wurde von Willstätter dm-ch-
geführt (114). Einerseits wurde durch quantitative Kontrolle die Aus-
beute, die sich bei der Herstellung von Enzymlösungen und bei der wei-
teren adsorptiven Reinigung ergab, im Verhältnis zum Ausgangsmaterial
bestimmt, andererseits die enzymatische Konzentration oder der Rein-
heitsgrad in den erhaltenen Lösungen festgestellt. Als allgemeines Maß
für die Enzymwirkung wurden von Willstätter u. Kuhn (129, auch
115) Einheiten aufgestellt, die auf Grund der Messung von Reaktions-
geschwindigkeiten festgestellt wurden. Die Einheiten sind durch be-
stimmte Leistungen unter gewissen Bedingungen der Zeitdauer, der Tem-
peratur, der Konzentration der Substrate, der Acidität usw. definiert.
Die Ausbeuten wurden in Enzymeinheiten angegeben ; die enzymatische
Konzentration oder der Reinheitsgrad, also die Verdünnung der un-
bekannten reinen Enzyme mit Fremdstoffen, wird gemessen, indem
man die Anzahl der Enzymeinheiten in 1 g Substanz ermittelt.

Obwohl es sich zeigte, daß der Reaktionsverlauf in vielen Fällen von
Begleitstoffen abhängig ist und daß also die Messung von einem Enzym
in verschiedenem Reinheitsgrad und bei verschiedenem Ursprung in un-
gleichem Maße von Begleitstoffen beeinflußt wird, berechtigt doch die
Messung der Spaltungen unter bestimmten Bedingungen zum Vergleich
von Enzymmengen, die in Präparaten aus dem nämlichen Ausgangs-
material gefunden werden (siehe dazu Willstätter, 116).

Die von Willstätter und seinen Schülern aufgestellten Maße haben
nur Bedeutung für den Vergleich der Mengen des nämlichen Enzyms, sie
erlauben keine Beurteilung des Mengenverhältnisses verschiedener
Enzyme.

Mit Hilfe dieser quantitativen Bestimmung konnte der Gang einer
Adsorption leicht festgestellt werden. Mittels der Adsorptionsmethoden
ist es Willstätter und seinen Schülern in vielen Fällen gelungen, manche
Enzyme von den mit ihnen vergesellschafteten fremden Begleitstoffen zu

trennen, und so deren Einfluß auf die Enzymwirkung zu beseitigen und
auch der chemischen Natur des Enzyms selbst näher zu kommen (siehe
auch willstätteb, 115). Im allgemeinen nimmt ein Adsorbens, wie Ton-
erde, ein Enzym zusammen mit einer bedeutenden Menge von Fremd-
körpern auf. Eine Aufgabe besteht darin, die Adsorption genügend aus-
wählend zu gestalten; je geringer die Menge eines Adsorbens, welches zur
Aufnahme eines Enzyms erforderlich ist, desto höher ist die zu erwartende
Steigerung der enzymatischen Konzentration. Der Adsorptionswert (139)
(d. h. die Anzahl der Enzymeinheiten, welche von 1 g des Adsorbens auf-
genommen werden), welcher als Maß für die Adsorption gilt, ist ver-
schieden bei verschiedener Acidität der Lösung und u. a. auch 'abhängig
von der Verdünnung der Enzymlösung. Durch Abänderung dieser Fak-
toren gelingt es, die Adsorption so auswählend wie möglich zu gestalten.
Es stellte sich bei den Untersuchungen von WillstIttee heraus, daß ein
Wechsel im Adsorptionsmittel die enzymatische Konzentration weiter zu
steigern vermag. Die Grenze der Methode wird hier durch den Umstand
gezogen, daß eine weitere Steigerung des Reinheitsgrades durch die zu-
nehmende Unbeständigkeit des Enzyms selbst kompensiert wird.

Es wurden mit Hilfe dieser Methode Enzympräparate erhalten, welche,
wie z. B. die Hefesaccharase, 3000mal konzentrierter waren als das Aus-
gangsmaterial; andere, wie die Pankreaslipase, sind auf 250maligen Rein-
heitsgrad gebracht.

Diese Methode ermöglichte es, die Wirkung des Enzyms selbst, un-
abhängig von seinen Begleitstoffen kennen zu lernen und es zeigte sich,
daß verschiedene Eigenschaften, wie sie für Enzyme beschrieben worden
waren, nicht länger für die gereinigten Enzyme galten. So war u. a. für
die Magenlipase verschiedener Säugetiere ein Pn-Optimum bei 4_5 ge-
funden; das gereinigte Enzym aber hat das nämliche Optimum wie Pan-
kreaslipase, und zwar bei p^ = 8,9 (130). Auch können begleitende
Stoffe eine hemmende Wirkung auf das Enzym ausüben, so daß erst nach
ihrer Beseitigung das Enzym seine volle Wirkung zu zeigen vermag, wie
bei der Pankreaslipase; diese ist in der Drüse mit Eiweißstoffen vergesell-
schaftet, die ihre Wirkung in saurem Milieu hemmen (138).

Eine zweite Aufgabe bestand darin, in einem Gemisch von Enzymen
die einzelnen Enzyme voneinander zu trennen, um danach deren Wir-
kungen scharf umgrenzen zu können. Die Trennung von Enzymen aus
einem Gemisch gründet sich auf die Tätsache, daß verschiedene Enzyme
in ihren sauren und basischen Eigenschaften feine Abstufungen zeigen.

Das erste Beispiel für die Trennung von Enzymen durch Adsorption war das
am pankreatischen Enzymgemiscli von Lipase, Trypsin und Amylase (Will-
stltter u. Waldsghmidt-Leitz [135, 137]). Die Lipase läiSt sich durch eine
Tonerdesorte, Cy genannt, dem Gemisch entziehen; bei der zweiten Tonerde-
adsorption ist die Lipase einheitlich im Adsorbat anwesend und läßt sich durch

schwach alkalisches Phosphat eluieren. In der Restlösung sind Amylase und
Trypsin vorhanden; aus ihr wird Trypsin mit Kaolin aufgenommen; in der
Elution des Adsorbates mit verdünntem Alkali findet sich das Trypsin einheitlich
wieder, die Amylase bleibt allein in der Restlösung zurück. In einer weiteren
Untersuchung gelang es Waldsciimidt-Lbitz (86, 87), das tryptische Enzym
mittels Adsorption von seinem Aktivator, der Enterokinase, zu trennen; dadurch,
wurde es möglich, die Wirkung des nichtaktivierten Trypsins von der des akti-
vierten Enzyms zu unterscheiden. Auch konnten Waldschmidt-Leitz u. Hae-
teneck (95, 96) von der Trypsinkomponente des Pankreas das Erepsin ab-
trennen durch mehrmalige Adsorption an Tonerde und Elution der Adsorbate.

In derselben Weise wurden von Willstätter verschiedene pflanzliche
Enzyme isoliert.

Mit den einheitlichen Enzymlösungen, so z. B. denjenigen der Pro-
teasen, wurden Versuche angestellt, um durch ihre spezifische Wirkung
der Struktur des Eiweißes näher zu kommen.

Die eiweißspaltenden Enzyme, von welchen man mittels der Adsorp-
tionsmethode jedes einheitlich erhielt, waren:

1.nbsp;Pe'psin, aus dem Magensaft, greift native Eiweißstoffe an; p„-Opti-
mum bei Pn = ungefähr 21.

2.nbsp;Trypsin, aus Pankreas, und zwar: a) inaktives, spaltet Peptone;
Pn-Optimum 8,2—8,7; b) aktiviertes, spaltet native Eiweißkörper und
Peptone; pij-Optimum 8,2—8,7.

3.nbsp;Erepsin, aus Pankreas, Darm, Hefe und Organen der Säugetiere,
spaltet Di- und Polypeptide; p^-Optimum bei ungefähr 8.

4.nbsp;Papain, aus dem Milchsaft von Carica papaya, und zwar: a) in-
aktives, spaltet native Eiweißkörper (und kein Pepton), pjj-Optimum der
Wirkung bei dem jeweiligen isoelektrischen Punkt des Substrates; b) ak-
tiviertes (durch Blausäure), spaltet native Eiweißkörper und Peptone,
Pjj-Optimum bei dem isoelektrischen Punkt des Substrates^.

5.nbsp;Hefeprotease oder Hefetrypsin, welches mit dem aktivierten Papain
nahezu übereinstimmt.

6.nbsp;Kathepsin aus tierischen Organen und Geweben, und zwar: a) in-
aktives, spaltet nur Pepton, Optimum p,^ — ungefähr 4; b) aktiviertes
(durch Blausäure) spaltet native Eiweißkörper und Pepton, Optimum
Pg = ungefähr 4.

In den letzten Jahren erkannte man, daß was man bisher als einheit-
liche Enzyme aufgefaßt hatte, doch noch Mischungen waren, die sich bei
weiterer Anwendung der Adsorptionstechnik von einander trennen ließen.
So ist die Einteilung der oben angeführten proteolytischen Enzyme aus
dem Verdauungstrakt der Säugetiere, die immer als Pepsin, Trypsin und
Erepsin gekennzeichnet wurden, abgeändert worden; das nämliche gilt
für die intracellulären Organenzyme, die von Waldschmidt-Leitz u.

1nbsp;Das Pepsin wurde nicht durch Adsorption gereinigt; trotzdem hat sich
seine Stellung zu den anderen Enzymen nicht geändert.

Deutsch (94) als „Proteasequot; und „Erepsinquot; bezeichnet worden waren,
sowie für die pflanzlichen Enzyme, die in einer Reihe von Arbeiten von
Willstätter und Grassmann untersucht wurden.

Waldschmidt-Leitz (100) konnte zeigen, daß das Pankreastrypsin
in zwei Komponenten zerlegt werden kann, wovon die eine, die Pro-
teinase, aktiviert dvu-ch Enterokinase, nur native Eiweißkörper angreift,
die andere, die Carboxypolypeptidase, auch durch Enterokinase aktivier-
bar, bestimmte Polypeptide angreift, und zwar solche, bei denen die
Carboxylgruppe frei ist. Und zwar ist, wie es scheint, eine gewisse stär-
kere Ionisation dieser Gruppe notwendig. Nach Abderhalden (3) ist
auch dieses letzte Enz3Tn wieder in zwei Teilenzyme zerlegt worden, wo-
von das eine acylierte Peptide, das andere Tyxosinpeptide spaltet.

Das Erepsin aus Pankreas und Darm besteht auch aus zwei Kompo-
nenten (6, 92), einer Aminopolypeptidase, welche nur Polypeptide spal-
tet, und einer Dipeptidase, die nur auf Dipeptide wirkt. Beide wirken
nur bei Gegenwart einer freien Aminogruppe im Substrat. Nach Linder-
ström-Lang (50, 51, 53) sollte die-Dipeptidase aus Malz und Darm-zwei
Komponenten aufweisen; die eine Komponente, Dipeptidase I, soll
Alanyl-Glycin viel schneller als Leucyl-Glycin angreifen, und das Opti-
mum bei pg — 7,3 haben; die andere, Dipeptidase II, soll Leucyl-Glycin
schneller spalten und ihr Optimum bei pg = 8,2 haben. Die erste Kom-
ponente ist unbeständig, die zweite beständig. Von Grassäiann (27)
wurde diese Auffassung von zwei Enzymen kritisiert, er führt den Unter-
schied in der Spaltung beider Dipeptide zurück auf ungleichen Einfluß
von hemmenden Begleitstoffen.

Von dem proteolytischen Gemisch aus Organen, z. B. aus der Milz,
zeigt die Protease eine Aktivierung durch einen natürlichen Aktivator,
die Zookinase. Diese kann mittels Alkoholextraktion von der Proteinase
abgetrennt werden. Sie kann in ihrer Wirkung durch Blausäure und
Schwefelwasserstoff ersetzt werden (93,105). Im ganzen ist nach Wald-
sohmidt-Leitz (90,105) dieses proteolytische Gemisch aus vier Enzymen
zusammengesetzt. Und zwar wurde die Protease zerlegt in eine Pro-
teinase (die nach Willstätter [117] als Kathepsin bezeichnet wurde und
ein pg-Optimum hat bei 4—51) und eine Carboxypolypeptidase, welche
ein Pg-Optimum bei 4,2 hat. Diese Carboxypolypeptidase greift wie die
tryptische Carboxypolypeptidase nur bestimmte Polypeptide an. Diese
beiden Enzyme sind durch Zookinase, HCN und H2S aktivier bar. Das
aktivierte Kathepsin spaltet native Eiweißkörpef; das nichtaktivierte
Kathepsin spaltet Peptone der peptischen und tryptischen Verdauung,
nicht aber die von Papain-Blausäure gebildeten.

1 Siehe dazu auch Hedin (29), der mit anderer Methodik auch neuerdings
wieder die Existenz zweier Proteasen in der Milz angibt, deren eine, die a-Protease,
bei einem p« = 8 als Optimum wirkt, die andere bei p« = 4 ihr Optimum hat.

Das Erepsin ist hier auch wieder zerlegt worden in eine Aminopoly-
peptidase und eine Dipeptidase; für die beiden ist HCN ein Gift, beide
haben ihr Optimum bei pj, = 8.

Auch in Organen von Wirbellosen, u. a. in der grünen Drüse von
Crustaceen, wurde eine, bei saurer Reaktion optimal mrkende Proteinase
gefunden (79, 80).

In den farblosen Blutkörperchen (117, 118, 120) und in der Magen-
schleimhaut (118), in den Speicheldrüsen (118,119) und im Blutserum (26)
wurde von Willstätter und Mitarbeitern die Anwesenheit eines Kathep-
sins, dem Milzenzym ähnlich, neben einer Trypsinkomponente, nach-
gewiesen; daneben kommen in Leukocyten auch eine Carboxypolypepti-
dase, eine Aminopolypeptidase und eine Dipeptidase vor.

Aus dem papainhaltenden Milchsaft von Carica pxpaya, welcher aus
VmES' Untersuchungen bekannt war, und aus welchem das Enzym in
reinerem Zustande von Willstätter u. Geassmann (121) erhalten wor-
den war, konnten drei Komponenten durch Adsorption voneinander ge-
trennt werden:

1.Einenbsp;Proteinase, das Papain, von welcher das Reaktionsoptimum
für verschiedene Substrate mit deren isoelektrischem Punkt überein-
stimmt (123) und welches (inaktiviert und aktiviert) native Eiweißkörper
und aktiviert Peptone spaltet i. Von Ambros u. Harteneck (4, 5) wurde
im Milchsaft auch ein natürlicher Aktivator des Papains gefunden, den
sie als ,, Phjdjokinasequot; bezeichneten.

2.nbsp;Eine Polypeptidase, welche durch HCN aktivierbar ist und also
wahrscheinlich mit der katheptischen Carboxypolypeptidase identisch
ist (5).

Grassmann (122, 24) die Anwesenheit eines „Trypsinsquot;, welches dem
aktivierten Papain gleichzustellen sei, neben einem (nur Dipeptide spal-
tenden) Erepsin nachgewiesen. Später konnte Grassmaott (19, 20, 21, 22)
die Gegenwart einer Proteinase, welche durch einen natürlichen Akti-
vator, sowie durch HCN und HsS aktivierbar ist, und welche wie Papain
das Wirkungsoptimum bei dem isoelektrischen Punkt des Substrates hat,
nachweisen neben einer Aminopolypeptidase, welche von HCN und HgS
gehemmt wird, und einer Dipeptidase. Die Verschiedenheit in Spezifität
zwischen der inaktiven Hefeproteinase und inaktivem Papain und

1 Die Lage des isoelektrischen Punktes des Fibrins wird aber sehr stark be-
einflußt von der Art der Ionen des benutzten Puffergemisches. Siehe dazu
VoNK (85 a). Wenn derartige große Unterschiede in der Lage des isoelektrischen
Punktes (für Fibrin von pn 7—3,7) auch für andere Substrate gefunden werden
sollten, ist es zweifelhaft, ob die Auffassung, daß es eine 'Gruppe von Enzymen
gibt, welche ihre Substrate optimal beim isoelektrischen Punkte spalten, auf die
Dauer aufrecht erhalten werden kann.

zwischen aktivierter Hefeproteinase und aktiviertem Papain führte er
zurück auf die Anwesenheit zweier natürlicher Aktivatoren, eines für
Pepton-, des anderen für Gelatinespaltung, welche beide durch HON er-
setzbar sind und in verschiedener Menge in den verschiedenen Enzym-
präparaten angetroffen werden.

Auch die chemische Natur der Aktivatoren ist nach ihrer Abtrennung
von den Enzymen untersucht worden, und zwar fand Geassmann (23,28),
daß die Aktivation des Papains, der Hefeproteinase und des Kathepsins
aus Nieren nicht nur von den natürlichen Aktivatoren und von HON
herbeigeführt wird, sondern auch von der reduzierten Form des Gluta-
thions und von Cystein. Dieser letztere Stoff hemmt die Wirkung von
(durch Enterokinase aktiviertem) Trypsin, während die oxydierte Form
des Cysteins, das Cystin, die Trypsinaktivierung, ebensogut wie Entero-
kinase, herbeiführen kanni. Waldschmidt-Leitz (91, 101, 102) konnte
die Zookinase aus Leber reinigen bis zu einem kristallinischen Präparat,
welches mit der reduzierten Form des Glutations identisch gefunden
wurde.

Die Frage, ob die katheptische Aktivierung auf einer Reaktion des
Aktivators mit dem Enzym selbst oder ob sie auf einer Ausschaltung der
hemmenden Wirkung von Schwermetallionen (Keebs, 41) durch Kom-
plexbindung des Aktivators mit diesen beruht, scheint noch nicht ent-
schieden zu sein.

Es hatte sich also in den letzten Jahren bei näherer Kenntnis der
eiweißspaltenden Enzyme der Vertebraten und der Pflanzen heraus-
gestellt, daß zur Spaltung des Eiweißmoleküls mehrere Enzyme not-
wendig sind, die sich in ihrer Wirkung nicht vertauschen lassen; jedes
einzelne von ihnen hat die Aufgabe, eine bestimmte Bindung zu zer-
sprengen. Es fragte sich, wie die Enzyme der Wirbellosen, wo ja ein
einziger Saft alles leistet, sich verhalten.

Das Problem war also das folgende: Mittels der Adsorptionsmethode
zu untersuchen, ob das verdauende Gemisch der Crustaceen mehrere
eiweißspaltende Enzyme enthält, ob es möglich ist, sie proteolytisch ein-
heitlich zu bekommen und weiterhin zu versuchen, sie mit den bekannten
anderen Enzymen zu vergleichen.

Die erste Anwendung der Adsorptionsmethode bei Invertebraten geschah
durch Karrer (39) bei seinen Untersuchungen über die Lichenase, das Reserve-
zellulose spaltende Enzym von Helix pomatia, welches durch Adsorption von
einem anderen cellobiosespaltenden Enzym befreit werden konnte.

Der erste Versuch, bei Invertebraten einzelne proteolytische Enzyme aus
ihrem Gemisch zu isolieren, wurde von Wigglesworth (110, III) an Glycerin-
extrakten von Periplaneta.gemacht; kurz darauf von Yonge (143) an Extrakten

1 Die Aktivierung von Trypsin durch Cystin scheint inzwischen von Grass-
mann widerrufen zu sein. Siehe dazu: Waldschmidt-Leitz u. Purr, Hoppe-
Seylers Z. 198, 260 (1931) und zwar S. 261, Fußnote 5.

der Mesenterialfilamcnte von LobophylUa. Weil schon das Adsorptionsverhalten
der pankreatischen Enzyme von ein und derselben Tierart verschieden sein kann,
und in hohem Maße von der Beschaffenheit des Drüsenmaterials und der An-
wesenheit von Begleitstoffen abhängig ist (siehe Waldschmidt-Leitz u. Har-
teneck [96, S. 215]), so erscheint es merkwürdig, daß sowohl Wiggleswoeth
wie Yonge mit genau dem nämlichen Verfahren wie es für die Trennung von
Pankreastrypsin und -erepsin benutzt wird, bei Periplaneta und bei Lobophyllia
eine Trennung in Trypsin und Erepsin herbeiführen konnten. Übrigens sind sie
bei dieser ersten Analyse geblieben.

Weil die Adsorptionsmethode bekanntlich viel Material beansprucht,
wurde für die Untersuchung nicht Astacus, sondern Maja squinado
gewählt.

Als Material wurde Maja squinado Late., die Meerspinne, benutzt,
die mir in reichlicher Anzahl in „The Marine Biological Laboratoryquot; in
Plymouth freundlichst zur Verfügung gestellt wurde^.

3nbsp;Tage aufbewahrt und daraus nach Bedarf entnommen. Im ganzen
kamen 100 Tiere zur Anwendung.

Im Anfang wurde versucht, den intakten Tieren den Magensaft mittels einer
gebogenen Glasröhre, in der Weise wie es für Astacus geschieht (36) zu ent-
nehmen. Leider stellte sich das bald als unmöglich heraus, weil die Tiere mit
ihren starken Mandibeln die Glasröhre, nachdem sie in den Magen eingeführt
worden war, hartnäckig festhielten und öfters zersplitterten. Ich mußte also
darauf verzichten, dem nämlichen Tiere einige Male nacheinander den Magen-
saft zu entnehmen.

Zunächst wurde bei jedem Tier das erste Paar Gehfüße mit den großen
Scheren abgeschnitten, danach so schnell wie möglich die anderen Beine. Da
es nicht möglich war, die Tiere mittels Chloroform oder Äther zu betäuben,
wOTdc darauf das Zerebralganglion vernichtet. Dann wurde der Magensaft
mittels einer gebogenen Glasröhre aus dem Magen ausgehebert, und sofort mit

4nbsp;Teüen Glyzerin (ungefähr 87%) vermischt. Nach einigen Tagen wurde das
Gemisch durch Glyzerinfilter filtriert; man erhielt eine klare, schwach orange-
braune Lösung. Im Ganzen bekam ich auf diese Weise von 54 Exemplaren von
Maja 670 ccm Enzymlösung mit einem Gehalt von ungefähr 70% Glyzerin,
Diese Glyzerinkonzentration genügt zur Stabilisierung mancher Vertebraten
Proteasen (Waldschmidt-Leitz [95], Vonk [83], auch Veenon [82]). Dement
sprechend war auch hier die Wirkung der Enzymlösung, gemessen an Casein
Verdauung, nach 5 Monate langem Stehen unvermindert erhalten, wie aus unten
stehenden Zahlen hervorgeht (für die Methodik siehe dieses Kapitel, Abschnitt 3)

Pro Titration (Alkoholtitration) 2 ccm, d. h. 40 mg Casein, 0,1 ccm Enzym
lösung, 1,2 ccm Pufferlösung 1/5 mol. Kaliumbiphtalat-Salzsäure, p^ = 6,0. Ver
dauungszeit 90 Min. Temperatur 30» C. Sofort nach Herstellung der Enzym
lösung Aciditätszuwachs 0,59 ccm 1/10 n NaOH. Nach 5 Monaten Stehen Acidi

1 Herrn Dr. E. J. Allen, Direktor dieser Station, sei an dieser Stelle noch-
mals mein herzlicher Dank ausgesprochen für sein freundliches Entgegenkommen.

tätszuwachs 0,55 ccm 1/10 n NaOH. Diese Enzymlösung wird im Folgenden mit
„Magensaft 1:4quot; bezeichnet.

Nachdem der Magensaft dem Tiere entnommen war, wurde vom frontalen
Ji.nde anfangend, wo ja ein Schnitt durch das Ganglion schon vorlag, der Rücken-
panzcr ringsum durchschnitten und vorsichtig abgehoben. Dann wurde festge-
stellt, ob der Magen bei der Ausheberung des Saftes intakt geblieben war. Wo
(lies in vereinzelten Fällen nicht der Fall war, wurde der betreffende Magensaft
nicht weiter benutzt. Die Mitteldarmdrüse wurde darauf sorgfältig herauspräpa-
rier^ mit Filtrierpapier ganz leicht getrocknet und gewogen. Es wurden zuerst
die Drusen von 40 Tieren verarbeitet. Sie wurden dann mit der Schere zerschnit-
ten und mit geglühtem Quarzsand zerrieben, danach mit 4 Teilen Glyzerin (87%)
auf der Schüttelmaschine für kurze Zeit geschüttelt. Nach 3 Wochen langem
Stehen wurde erst durch ein lockeres Tuch kolliert und darauf die noch sehr trübe
i^osung durch Glyzerinfilter filtriert und das Volumen gemessen. Ich erhielt

Qßo'^'^®®''!-^quot;®® ''''''nbsp;Mitteldarmdrüsen ein Frischgewicht von •

yw,5 g hatten, 4280 ccm klaren Extrakt, mit einem Gehalt von ungefähr 70%
Glyzerin. In dieser Glyzerinlösung war auch nach 6 Monate langem Stehen keine
oder nur eine geringe Verminderung der Enzymwirkung, gemessen an Casein und
^^ycylglycin, zu erkennen, wie aus untenstehenden Zahlen hervorgeht.

Pro Titration (Mikro-v. Slyke) 2 ccm, d.h. 40 mg Casein, 0,1 ccm-Roh-
extrakt, 1,2 ccm Pufferlösung 1/5 mol. Kaliumbiphtalat-Salzsäure, Pn = 6 0
Verdauungszeit 90 Minuten. Temperatur SO« C. Bald nach Anfertigung des
^xtraktes Aciditätszuwachs 0,42 ccm 1/10 nNHa- Nach 6 Monate langem Stehen
0,39 ccm 1/10 n NKg.

Pro Titration (alkohol. Titration) 10 ccm, d. h. 66 mg Glycylglycin, 0,5 ccm
Rohextrakt, 4 ccm. Pufferlösung 1/5 mol. Glycocoll-NaOH, pn = 8,4. Ver-
dauungszeit 6 Stunden. Temperatur 30° C. Bald nach Anfertigung des Ex-
traktes Aciditätszuwachs 1,84 ccm 1/10 n NaOH. Nach 5 Monate langem Stehen
1,70 ccm 1/10 nNaOH.

Von 60 anderen Exemplaren von Maja wurden die herauspräparierten Mittel-
darmdrüsen in der Weise wie es von Willstätter u. Waldschmidt-Leitz (135)
für Schweinepankreas gemacht wurde, mit Aceton und Äther getrocknet (siehe
dazu Rona [65, S. 234]). Das feingemahlene Pulver (247 g) wurde trocken
aufbewahrt.

Nach Bedarf wurden hiervon einige Gramm entnommen und mit 16 Volum-
teilen Glyzerin (87%) (135) 4 Stunden lang auf der Schüttelmaschine geschüt-
telt. ^ Darauf wurde filtriert und mit destilliertem Wasser einmal verdünnt.
In dieser Weise erhielt ich eine Enzymlösung, die pro Kubikzentimeter eine En-
zymmenge enthielt, stammend von ebensoviel Gramm Frischgewicht der Drüse
als der Rohextrakt frischer Drüsen (abgesehen von Verlust an Enzym bei der
Siebung des Pulvers). Bestimmungen der Casein- und Glycylglycinspaltung durch
diesen „Extrakt getrockneter Drüsenquot; ergaben bei ähnlichen Ansätzen, wie für
den Rohextrakt frischer Drüsen, niedrigere Werte als dieser; der Enzymgehalt ist
in dem letzteren höher, doch ist die enzymatische Konzentration niedriger, das
Enzym mehr verunreinigt mit Fremdstoffen, die bei der Trocknung der Drüsen
schon weggenommen wurden (95).

Rohextrakt frischer Drüsen . 0,42 ccm 1/10 n NH2 1,84 ccm 1 /lO n NaOH
Extrakt getrockneter Drüsen. 0,25 ccm 1/10 n NaOH 1,33 ccm 1 /lO n NaOH
Magensaft 1:4.......0,59 ccm 1/10 NaOH 1,78 ccm 1 /lO n NaOH

Ein Vergleich der Wirkung von Magensaft 1:4 und Mitteldarm-
drüsenextrakt zeigte für die beiden eine Stärke der Enzymwirkungen der
nämlichen Größenordnung, sowohl für Casein- als für Glycylglycinspal-
tung. Es scheint also die Erepsinwirkung nicht in besonderem Maße in
den Follikeln der Mitteldarmdrüse stattzufinden, wie man aus dem ge-
ringen Erepsingehalt von .45tocms-Magensaft (Shinoda, 69) geneigt sein
würde zu vermuten. Übrigens ist der Erepsingehalt hier nicht so niedrig,
wie Shinoda (69) es für Astacus angegeben hat.

Die Übereinstimmung der Enzymwirkungen in Magensaft und
Drüsenextrakt berechtigt zur Benutzung des letzteren für das Studium
der verdauenden Enzyme, was bei den großen Mengen von Drüsen-
substanz, verglichen mit dem spärlichen Magensaft, einen großen Vorteil
bedeutet. Auch ist die Beschaffenheit der Drüsenauszüge (siehe auch
108) nicht, wie die des Magensaftes, abhängig von dem wechselnden Zu-
stand des lebenden Tieres und ebensowenig abhängig vom Mageninhalt.

Für den allergrößten Teil der Versuche wurde der Eohextrakt frischer
Drüsen benutzt.

Der ph des Magensaftes wurde sofort nach Entnahme, leider nur
colorimetrisch, bestimmt und gefunden, daß er im Mittel 6,3 betrug (von
68 Tieren, wo keine Reste von Nahrung anwesend wareni). Von 10 Tieren,
die 1 Woche gehungert hatten, betrug der pn des Magensaftes im
Mittel 6,12.

Shinoda (69) fand für .^siacws-Magensaft p^ = 5,6, bei Hungertieren
pg = 5,01, KBtiGER bei Hungertieren p^ = 4,67, nach Fleischnahrung
Ph - 6,6 (46).

Es gibt zwei prinzipiell verschiedene Gruppen von Methoden, nach
welchen man den Verlauf einer enzymatischen Proteolyse messen kann;
die erste umfaßt diejenigen Verfahren, wobei man das unveränderte Sub-
strat mißt, die zweite beruht auf der Messung der entstandenen Spalt-
produkte. Beim Abbau der Proteine durch die verschiedenen Enzyme
werden die hochmolekularen Eiweißstoffe bis zu ihren einfachsten Bau-
steinen, den Aminosäuren, zerkleinert. Für die Peptidasen, die Di- und
Polypeptide angreifen, wußte man, daß sie die CO-NH-Bindung sprengen.
Für die Proteasen, die native Eiweißkörper und deren höhere Abbau-
produkte angreifen, wurde oft eine desaggregierende Wirkung, wobei
Molekülkomplexe gesprengt werden sollten, neben einer rein chemischen
Spaltung angenommen (2, 7, 60). Doch ist für die Beispiele des Pepsins
(106, 107), Trypsins (104), Papains (104, 124) und der Hefeproteinase
(22, 24) gezeigt worden, daß auch hier die Enzymwirkung in der Auf-

Spaltung von Peptidbindungen bestellt i, wobei also COOK und NHg in
gleichem Maße freikommen. Für die Untersuchung der Enzymwirkung
durch Messung der entstehenden Spaltprodukte kann man daher zwei
Wege einschlagen und entweder die freigewordene COOH- oder die NHa-
Oruppe bestimmen. Das letztere wird getan von Likderström-Lang
(49) bei der acidimetrischen Titration der Aminogruppen in Gegenwart
von Aceton und durch das gasanalytische Verfahren nach v. Slyke (72,
73, auch Rona, 65); dieses beruht auf der Tatsache, daß bei der Reaktion
der freiwerdenden Aminogruppen mit salpetriger Säure nach der Glei-
chung: R NHg -f H NOa = R 0 H H^O N^ Stickstoff freikommt,
der dann gasvolumetrisch gemessen wird.

Für die Bestimmung der freigewordenen COOH-Gruppen anderer-
seits kann man entweder die Formoltitration nach Sörensen (74) be-
nutzen, wobei NHa durch Formaldehyd neutralisiert, und dann die
COOH-Gruppe acidimetrisch titriert wird, oder die Alkoholtitration nach
willstätter (112, 134) ausführen, wobei durch den Alkohol die basi-
schen Eigenschaften der Aminogruppe zurückgedrängt werden und die
COOH-Gruppe acidimetrisch bestimmt werden kann.

Von diesen vier Verfahren wurden das zweite, nach v. Slyke, und
das vierte, nach Willstätter hier benutzt. Die alkoholische Titration
wurde von Willstätter und seinen Schülern verbessert (131, 136, 103
19, 88) und von Grassmakn (25) in einer Mikroausführung angegeben,
die hier zur Ersparnis von Material benutzt wurde und sich als sehr zu-
verlässig erwies. Neuerdings wurde von Linderström-Lang (52) eine
Mikromodifikation beschrieben, die es gestattet, bei Titration von sehr
geringen Mengen, und zwar 0,000056 mg Aminostickstoff (i/io der Menge
bei Grassmann angegeben) eindeutige Ergebnisse zu bekommen.

Die Verfolgung der Adsorptions- und Elutionsprozesse geschah mit
Hilfe der alkoholischen Mikrotitrationsmethode, die Bestimmung der
ph-Kurven hauptsächlich mit dem Mikro-v. Slyke, teilweise auch mit
der Alkoholtitrierung.

Aus einem Ansatz von 2 ccm, enthaltend 60 mg Casein, 0,8 ccm Pufferlösung
l/5mol.2 (für die späteren Adsorptionsversuche 0,5 ccm), und 0,2 ccm Roli-
extrakt, p,j = 6,2 (der das Optimum darstellt, siehe folgenden Abschnitt) wurden
0,5 ccm mittels einer Kapillarmeßpipette entnommen und titriert (Kontrolle), der

^ Siehe dagegen die Befunde von Rona u. Mislowitzer (66), durch welche
eine Molekülzerkleinerung ohne COOH-Zuwachs durch Trypsin gezeigt wurde.

^ Die Caseinlösung wurde in der Weise hergestellt, daß 6 g Casein gelöst
wurden in 6 ccm 1 n NaOH einige Kubikzentimeter destillierten Wassers (unter
kräftigem Schütteln und bei Zugabe von einigen Tropfen Octylalkohol zur
Verhinderung übermäßigen Schäumens) und auf ungefähr 20 ccm aufgefüllt
mit destilliertem Wasser. Darauf wurde mit 80 ccm (und. weil es sich, als ge-
nügend erwies, später mit 50 ccm) 1/5 mol. Pufferlösung, deren Zusammensetzung

Ansatz sofort in den Thermostaten von 30« C gestellt und 4 Stunden darin ge-
lassen, darauf zur Bestimmung wieder 0,5 com titriert. Zur Titration wurde zu
dieser Probe von 0,5 ccm 5 Tropfen einer 0,1%igen alkoholischen Thymolphtha-
leinlösung zugefügt, und darauf mit 1 /lOO n 90% alkoholische Lauge bis zur

deutlichen Blaufärbung titriert;
dann wurde das 9fache Volumen
(4,5 ccm) kochenden absoluten
Alkohols zugegeben, wodurch die
blaue Farbe verschwindet und
wieder bis zum Endpunkt titriert;
die hier auftretende Farbe läßt
sich mit einer 1/400 mol. CuCla-
Lösung in überschüssigem Am-
moniak vergleichen. Die Titration
findet am besten beim Licht einer
Tageslichtlampe (200 Kerzen)
statt, im Innern eines weißbeklei-
deten Kastens.

Der Titrationsfehler ist nach
Gbassmann (25) für eine Ti-
trationsprobe von 0,2 ccm auf
0,005 ccm 1/100 n NaOH zurück-
zubringen; nach einiger Übung
war hier, bei einer Titrationsprobe
von 0,5 der Fehler der Titration
0,02 ccm 1 /lOO n NaOH.

Bei Bestimmungen mit ver-
schiedenen Enzymmengen (1: 8) in einer bestimmten Zeit stellte es sich heraus,
daß keine direkte Proportionalität zwischen Enzymmenge und Umsatz besteht
(siehe Tabelle 1); auch eine einfache Beziehung zwischen Zeit und Umsatz ist
hier nicht aufgefunden worden, wie aus Tabelle 1 hervorgeht und wie es auch
für die Proteinspaltung durch andere Proteasen (Trypsin [136], Papain [121]
und Milzprotease [94]) gefunden worden war.

Tabelle 1. Zeitlicher Verlauf der Gaseinspaltung mit verschiedenen Enzymmengen.
Spaltung von 15 mg Casein in 0,5 ccm bei 30» C während 6 Stunden, Kalium-
biphtalatpuffer, p^ des Ansatzes = 6,2; Spaltung in ccm 1/100 n KOH.

Die Bestimmungsmethode beruht auf der Messung der Spaltungen,
welche in einer bestimmten Zeit, und zwar 4 Stunden, von verschiedenen

in einem Kontrollversuch bestimmt worden war, auf 100 ccm aufgefüllt. (Um
im Ansatz den Ph = 6,2 zu erzielen, wurde 80 ccm bzw. 50 ccm 1 /5 n Kahum-
biphtalat-Natronlauge vom pji = 5,8 zugegeben.) Jeder Ansatz von 2 ccm
enthielt 1 ccm dieser Mischung.

Enzymmengen hervorgerufen wurden; als vorläufiges Maß für die Menge
der Jfaya-Proteinase, die zur Kontrolle ihres Verhaltens bei der ad-
sorptiven Trennung von den anderen proteolytischen Enzymen dienen
soll, ist die {Maja-) Proteinase-Einheit eingeführt worden. Sie wurde an-
genommen als diejenige Enzymmenge, welche unter den Bestimmungs-
bedingungen (Vol. 0,5 ccm, 15 mg Casein, 30« C, p^ = 6,2) in 4 Stunden
eine Spaltung von 2,25 ccm 1/100 n KOH bewirkt; sie ist in 0,05 ccm
des Rohextraktes vorhanden. Die mit Enzymmengen 1: 8 in 4 Stunden
erzielten Spaltungen (siehe Tabelle 1) sind in der Abb. 1 zusammen-
gestellt, so daß man aus dem jeweils unter den Bestimmungsbedingungen
gefundenen Spaltungswert die Menge des vorhandenen Enzyms mittels
der Kurve ableiten kann.

Es sind aber noch künftige eingehendere kinetische Messungen not-
wendig, um diese vorläufige Einheit durch eine allgemeinere zu ersetzen.

Carboxypolypeptidase, das polypeptidspaltende Enzym, das nur die-
jenigen Polypeptide spaltet, in denen eine freie COOH-Gruppe anwesend
ist, ist bisher gefunden worden als tryptische Carboxypolypeptidase ver-
mischt mit tryptischer Proteinase, und davon getrennt worden (100) (das
Enzym ist durch Enterokinase aktivierbar) und als katheptische Car-
boxypolypeptidase in den Organen der Vertebraten, aktivierbar durch
Zookinase, HCN oder HgS (105) und in den farblosen Blutkörperchen (117).

Für die Bestimmung einer eventuellen Carboxypolypeptidase bei Maja wurde
hier als Substrat Chloracetyl-l-tyrosin^ benutzt, das nach Waldschmidt-Leitz
zu den Substraten der bekannten Carboxypolypeptidasen zählt (98, 99, 100, 105).
Es wurde eine geringe, doch deuthche Spaltung gefunden.

Zur Bestimmung (mit der alkoholischen Mikrotitration) kamen aus einem
Ansatz von 2 ccm, enthaltend 0,4 ccm Chloracetyltyrosinlösung (11,3 mg =
4/100 Millimol Substrat), 0,8 ccm Pufferlösung l/5mol.2 und 0,2 ccm Roh-
extrakt, Pjj = 6,2, jedesmal 0,5 ccm zur Titration zur Anwendung. (Derpj, = 6,2
war willkürlich; eine Bestimmung der pji-Optimumkurve fand nicht statt.)

Die 0,5 ccm Titrationsprobe wurde dem Gemisch mit einer Kapillarmeß-
pipette entnommen, nach Zugabe von 5 Tropfen einer 0,1% igen alkoholischen
Thymolphthaleinlösung bis zu deutlicher Blaufärbung titriert, darauf 4,5 ccm
absoluter Alkohol zugegeben, und wieder bis zum Endpunkt titriert. (Zweck-
mäßig soll die Größe der Spaltung so gewählt werden, daß das abgespaltene
Tyrosin in Lösung bleibt, weil es sonst die Titration unmöglich macht.)

Bei Bestimmungen mit verschiedenen Enzymmengen stellte es sich heraus,
daß eine Proportionalität zwischen Enzymmenge und Umsatz in einer bestimm-
ten Zeit besteht (Tabelle 2), wenigstens für Spaltungen bis ungefähr 60%
(^eOccm 1/100 n KOH).

^ Für die Überlassung von 4 g dieses Präparates bin ich Herrn Privatdozent
Dr. A. Schaffner zu Prag zu vielem Dank verpflichtet.

2 Um im Ansatz den pjj = 6,2 zu erzielen, wurde 0,8 ccm 1 /5 n Natrium-
borat-Salzsäure vom p„ = 6,54 zugegeben; diese Zusammensetzung war in
einem Vorversuch ermittelt worden.

]Messungen zur Verfolgung des Reaktionsverlaufes wurden nicht ge-
macht. Als {Maja)-CarboxypolypepUdase-Einheit, die daher nur als eine
vorläufige anzusehen ist, und nur zur Verfolgung der Adsorptionen dienen

Tabelle 2. Enzymmenge und Um-
satz. Spaltung von 2,58 mg = 1/100
Millimol Chloraeetyltyrosin in
0,5 ccm bei 30quot; C während 6 Stun-
den, Natriumboratpuffer, p,j des
Ansatzes = 6,2; Aciditätszuwachs
in ccm 1 /lOO n KOH.

gewählt, die unter den Bestim-
mungsbedingungen (Vol. 0,5 ccm, 2,575 mg. Chloraeetyltyrosin, 300 C,
Ph = 6,2, 6 Stunden) eine Spaltung von 0,58 ccm 1/100n KOH bewirkt-
sie ist in 0,05 ccm des Rohextraktes vorhanden.

Die Beziehung zwischen dem gemessenen Umsatz und der Enzym-
menge veranschaulicht die Kurve in der Abb. 2, die auf den Messungen
der Tabelle 2 beruht.

Aminopolypeptidase, das polypeptidspaltende Enzym, dessen An-
lagerung an die freie Aminogruppe der Peptide erfolgt (Waldschmidt-
Leitz, 105), ist in Pankreas- und Darmerepsin (92, 6), in der Magen-
schleimhaut (117), in den farblosen Blutkörperchen (118, 119), in tie-
rischen Organen (105) und Blutserum (25) sowie im Hefepreßsaft (19,
20,21, 22) nachgewiesen worden; auch konnte Keügee (43) im Magen-
.saft von Astacus und im Mitteldarmdrüsenextrakt von Ciona eine Wir-
kung auf Leucyldiglycin nachweisen.

Die Bestimmung einer eventuellen Aminopolypeptidase bei Maja fand mit
Leucyldiglycini bei dem optimalen pn = 8,2 (siehe nächsten Abschnitt) statt.

Zur Bestimmung (mit der alkoholischen Mikrotitration) kamen aus einem
Ansatz von 2 ccm, enthaltend 0,4 ccm. Leucyldiglycinlösung (19,6 mg = 8/100
MiUimoI Substrat), 0,8 ccm Pufferlösung l/5mol.2 und 0,2 ccm Rohextrakt,

1nbsp;Das mir freundlichst von Herrn Privatdozent Dr. A. Schaffner in Pra*^
überlassen wurde.nbsp;®

2nbsp;In einem Vorversuch wurde die Zusammensetzung des Puffers bestimmt,
der im Ansatz den p^ = 8,2 erzielt; der gefundene Puffer war Glycocoll-NaOH
von einem p^ = 12,39.

Ph = 8,4, jedesmal 0,5 ccm zur Titration zur Anwendung. Die Titration fand,
wie für die Chloracetyltyrosinspaltung beschrieben, statt.

Es ergab sich bei Bestimmungen mit verschiedenen Enzymmengen, daß eine
Proportionalität zwischen Enzymmenge und Umsatz in einer bestimmten Zeit
besteht (Tabelle 3), wenigstens für die Spaltungen bis ungefähr 60% (auf eine

Tabelle 3. Enzymmenge und Umsatz.
Spaltung von 4,9 mg = 2/100 Milli-
mol Leucyldiglycin, in 0,5 ccm bei
300 C, während 6 Stunden, Glyco-
coll-Puffer, Ph des Ansatzes = 8,2;
Spaltung in ccm 1/100 n KOH.

Bindung bezogen, d. h. 1,20 ccm
1 /lOO n KOH). Weitere kinetische
Älessungen wurden nicht gemacht,
die aufgestellte Einheit ist also nur
als vorläufige zu betrachten.

Als {Maja)-Aminofolyfe'ptidaseeinheit wurde diejenige Enzymmenge
gewählt, die unter den Bestimmungsbedingungen (Vol. 0,5 ccm, 4,9 mg
Leucylglycylglycin, 300C, pH= 8,2,6 Stunden) eine Spaltung von l,10ccm
1/lOOn KOH bewirkt; sie ist in 0,05 ccm des Eohextraktes vorhanden.

Die Beziehung zwischen dem gemessenen Umsatz und der Enzym-
menge veranschaulicht Abb. 3, die auf den Messungen der Tabelle 3 be-
ruht, und mit deren Hilfe die Menge des vorhandenen Enzyms aus dem
jeweils gefundenen Spaltungswert abgeleitet werden kann.

Die Dipeptidase, die im Pflanzen- und Tierreiche weit verbreitet ist,
ist nur imstande, Dipeptide zu zerlegen. Ihre Wirkung wurde meistens
bei früheren „Erepsinbestimmungenquot; gemessen und dann als Erepsin-
wirkung angesehen. Ihre Einheitlichkeit ist in letzter Zeit bestritten
worden (50, 53, 51, auch 27), siehe dazu Kapitel I.

Die Wirkung der Dipeptidase wurde hier nur gemessen an der Hydro-
lyse von Glycylglycin, bei dem optimalen p^ = 8,4 (siehe nächsten Ab-
schnitt).

Aus einem Ansatz von 2 ccm, enthaltend 0,4 ccm Glycylglycinlösung
(10,56 mg = 8/100 Millimol Substrat), 0,8 ccm Pufferlösung l/5mol.i und

^ Um im Ansatz den p„ = 8,4 zu erzielen, wurde 0,8 ccm 1 /5 n Glycocoll-
NaOH von einem pjj = 12,67 zugegeben; diese Zusammensetzung war in einem
Vorversuch ermittelt worden.

0,2 ccm Rohextrakt, pji = 8,4, kamen jedesmal 0,5 ccm zur alkoholischen Titra-
tion, die, wie für die Chloracetyltyrosinspaltung beschrieben, stattfand, zur
Anwendung.

Auch hier wurde, bei Bestimmungen mit verschiedenen Enzymmengen, ge-
funden, daß eine Proportionalität zwischen Enzymmenge und Umsatz in einer

Tabelle 4. Enzymmenge und Umsatz.
Spaltung von 2,64 mg = 2/100 Milli-
mol Glycylglycin in 0,5 ccm bei 30quot; C
während 6 Stunden, Glycocoll-Puffer,
Pu des Ansatzes = 8,4; Aciditäts-
zuwachs in ccm 1 /lOO n KOH.

bestimmten Zeit besteht (Tabelle 4).
(Weil bei der Spaltung durch 0,1 ccm
Rohextrakt, das gesamte Substrat ge-
spalten ist, ist dieser Punkt nicht
in die Kurve Abb. 4 eingetragen; die späteren Messungen [siehe Kap. III]
fallen aber alle in den linearen Verlauf der Kurve.)

Messungen zur Verfolgung des Reaktionsverlaufes wurden nicht ge-
macht. Als (Jlfo!/a)-Dipeptidaseeinheit, die daher nur als eine vorläufige
anzusehen ist, und nur zur Verfolgung der Adsorptionen dienen soll,
wurde diejenige Enzymmenge gewählt, die unter den Bestimmungs-
bedingungen (Vol. 0,5 ccm, 2,64 mg Glycylglycin, 30» 0, Pu = 8,4,
6Stunden) eine Spaltung von 1,67ccm 1/100n KOH bewirkt; sie ist in
0,05 ccm des Rohextraktes vorhanden.

Die Beziehung zwischen dem gemessenen Umsatz und der Enzym-
menge veranschaulicht Abb. 4, die auf den Messungen der Tabelle 4
beruht.

Die Bestimmung der Pü-Abhängigkeit der Caseinspaltung fand mittels
' zweier Methoden statt, erstens mit dem gasanal5i;ischen Verfahren nach
v. Slyke, und zwar in dem Mikroapparat (72, 73), zweitens mit der
Alkoholtitration nach Willstätter (136); die erste Methode hat den
großen Vorteil, die Schwierigkeit der Eigenfärbungen der Lösungen, die
bei Titrierungen oft störend wirken, ganz zu umgehen.

Zur Bestimmung im v. SLYKE-Apparat wurden 3,5 ccm einer 6%igen Ca-
seinlösungi (210 mg Casein) mit 6 ccm Pufferlösung 1 /5 mol. (meistens Phosphat-

1 Bereitet wie auf S. 171, Fußnote 2, nur mit dest. Wasser auf 100 ccm
aufgefüllt.

puffer) vermischt und auf 30o C vorgewärmt. Darauf wurde 0,5 ccm Rohextrakt
zugesetzt, sofort 2 ccm im v. Slyke - Apparat „titriertquot;, und der Ansatz nach
Entnahme einiger Kubikzentimeter zur elektrometrischen pH-Bestimmung in
den Thermostaten von SO» C gestellt. Nach 90 Min. wurden wieder 2 ccm dem
Ansatz entnommen, im v. Slyke -Apparat titriert und aus den beiden gefunde-
nen Werten für die freigewordenen Stickstoffmengen die Menge des bei der Ver-
dauung freigewordenen Aminostickstoffes berechnet mit Hilfe der in Rona (65)
gegebenen Tabellen für die Dichte des über Wasser aufgefangenen Stickstoffes
bei der jeweils abgelesenen Temperatur und dem abgelesenen Barometerstand.
Zum Vergleich mit der alkoholischen Titration wurde der Zuwachs an Amino-
stickstoff in Kubikzentimeter 1/10 n NHg ausgedrückt. Die Ablesung des
Stickstoffs ist in dem Mikroapparat bis auf 0,001 ccm möglich; der Fehler der
Titration ist nach Kttpelwieser u. Singel (48) 0,003 mg NHg-Stickstoff d h
also 0,002 com 1 / lO n NHg. Die Schütteldauer des Verdauungsgemisches mit der
salpetrigen Säure im Apparat war immer 20 Min.

Das Ergebnis der Bestimmung der Spaltungen bei verschiedenen p^ ist zü-
sam mengestellt in Tabelle 5 und in der Kurve Abb. 5.

Tabelle 5. Caseins-paltung durch Rohextrakt und Wasserstoffzahl. 2 ccm : 42 mg
Casein, 0,1 com Rohextrakt (2 Prot.-Einheiten), 1,2 com Pufferlösung 1/5 mol.,
30quot; 0, 90 Min. Titration im Mikro-v. SLYKE-Apparat.

Die Pn-Abhängigkeit der Caseinspaltung durch Magensaft wurde mit der
Alkoholtitration untersucht; hierbei wurden aus einem gleichen Ansatz wie oben
(nur wurde 0,1 com Magensaft statt 0,1 com Rohextrakt verwandt) 2 ccm in
ein Gemisch von 1 ccm abs.Alkohol und 3 ccm Aqua dest. unter Zufügung von
Z. f. vergl. Physiologie Bd.l7.nbsp;12

0,5 ccm 0,5% Thymolphthalein gebracht, und mit 1 /,10 n 90% alkoholischer Lauge
titriert; darauf nach Zugabe von 24 ccm siedenden abs. Alkohol die Titration zu
Ende geführt. Der Titrationsfehler ist nach einiger Übung ungefähr 0,05 ccm
1/10 n NaOH.

Tabelle 6. Caseinspaltung durch Magensaft und Wasserstoff zahl. 2 ccm : 42 mg
Casein, 0,1 ccm Magensaft 1 : 4 (ungefähr 3 Prot.-Einheiten), 1,2 ccm Puffer-
lösung 1 /5 moL, 30quot; C, 90 Min. Alkoholische Titration.

Das pjj-Optimum liegt für Rohextrakt und für Magensaft bei einem
Pg = ungefähr 6, wie es auch von Shinoda (69) für ^«tocws-Magensaft
gefunden worden war (zwischen 5,6 und 6,5), im Gegensatz zu Krquot;üg}ER
u. Graetz (45, 46), die das Optimum für vlstocMS-Magensaft bei 7—8
fanden, welch hohes Optimum sie auf die Anwesenheit von (bei alkali-
scher Reaktion wirkender) Peptidase neben der Proteinase zurückführten.
In einer späteren Publikation gibt Krüger (43) das Optimum bei un-
gefähr 7 (6,8 bis 7,3) an.

Für die ungereinigte IfaProteinase liegt das Optimum eher im
schwach sauren Gebiet, die Anwesenheit der Peptidase veranlaßte einen
leichten Anstieg im alkalischen Gebiet, wodurch ein zweites niedriges
Optimum entstand. (Für das Optimum der gereinigten Proteinase siehe
Kapitel IV, Abschnitt 3.)

Die Kurven fallen nach der sauren Seite ziemlich steil ab, bei einem
Ph lt; 4 war keine Enzymwirkung nachweisbar.

Die Bestimmung der Spaltungen wurde wieder für den Rohextrakt
im Mikro-v. Slyke (in ähnlicher Weise wie es für die Caseinspaltung be-

schrieben wurde) und für den Magensaft mit der alkoholischen Titration
ausgeführt. Bei der alkoholischen Titration wurde die Titrationsprobe
von 2 ccm in ein Gemisch von 2 ccm destilliertem Wasser und 4 ccm
absolutem Alkohol gebracht, so daß die alkoholische Konzentration 50%
betrug, nach Zugabe von 0,4 ccm 0,5% Thymolphtalein mit 1 /lO n 90%
alkoholischer Lauge titriert, darauf nach Zugabe von 35 ccm siedendem
absoluten Alkohol wieder bis zum Endpunkt titriert (136).

Das Ergebnis ist zusammengestellt in den Tabellen 7 und 8 und den
Kurven Abb. 7 und 8.

Tabelle 7. OdatinesTpaltung durch Mohextrakt und WasserstoffzaU. 2 ccm : 40 mg
Gelatine (0,4 ccm 10%iger Lösung, im Thermostaten 30« 0 flüssig gehalten),
0,1 ccm Rohextrakt, 1,2 ccm Pufferlösung 1/5 mol., 30quot; C, 90 Min. Titration im

Das Pjj-Optimum der Gelatinespaltung durch Rohextrakt und Magen-
saft liegt also bei einem pn = 6,1^—6,3, wie es auch von Shinoda für
4«tocw-Magensaft gefunden wurde (ungefähr 6,5).

Auch hier ist der leichte Anstieg auf der alkalischen Seite deutlich
zu erkennen.

Tabelle 8. Gelatinespaltung durch Magensaft und Wasserstoff zahl. 2 ccm : 40 mg
Gelatine (0,4 ccm 10%iger Lösung, im Thermostaten 30» C flüssig gehalten),
0,1 ccm Magensaft 1:4 (ungefähr 3 Prot.-Einheiten), 1,2 ccm Pufferlösung
1 /5 mol., 30quot; C, 90 Min., alkoholische Titration.

Clupein, das Protamin aus Heringssperma, ist für Pepsin unangreif-
bar (Kossel, 40), von Trypsin wird es angegriffen, und zwar sowohl von
der Carboxypolypeptidase als von der Proteinase; von dieser letzten nur
nach Aktivierung mit Enterokinase (101). Ebenso wird es von akti-
viertem Papain gespalten (105) und auch vom Kathepsin (117, 105), und
zwar im letzten Falle sowohl von der aktivierten Proteinasefraktion als
von der aktivierten Carboxypolypeptidase. Für die beiden ,,Erepsinquot;-
komponenten, Aminopolypeptidase und Dipeptidase, ist es unangreifbar.

Das Optimum der Clupeinspaltung durch Trypsin liegt nach Wald-
sohmidt-Leitz bei pg = 8,9 (104), für Papain bei schwach alkalischer
Reaktion (64), für gastrisches Kathepsin nach Willstätter u. Bamann
beipg = 5 (117), für Milzkathepsin bei pjj = 5,2 (105). Krüger u. Graetz
(46) fanden einen Anstieg der pg-Kurve für die Clupeinspaltung durch
^stoCMÄ-Magensaft nach der alkalischen Seite hin, bis zu 7,8; das Opti-
mum ist nicht näher bestimmt worden, und weil zwischen 3,6 und 7,8
keine Punkte vorliegen, mag das Optimum ebensowohl bei einem pg ge-
ringer als 7,8, als bei einem pg größer als 7,8 liegen.

Das Optimum wurde hier nicht bestimmt, die Spaltung wurde bei
Ph = 6,2 gemessen. Es war eine deutliche Spaltung zu erkennen:

,1 Für die Überlassung dieses Substrats bin ich Herrn Privatdozent Dr.
A. ScHÄEENEE ZU Prag zu Dank verpflichtet.

Nach Shinoda (69) ist das Optimum der Peptonspaltung durch ^sto-
CMs-Magensaft für Pepton F pjj = 6,2 und für Pepton Witte pjj = 6,7.
Krüger (46) fand das Optimum bei pn = 7,6 für Pepton (Kahlbaum).
Die Ph-Kurve wurde hier nicht bestimmt, nur wurde eine Spaltung
von Pepton (Exalb. Merck) durch Rohextrakt bei einem pg = 6,2 nach-
gewiesen.

Im Anschluß an Shinodas (69) Angaben über das Pu-Optimum der
Bindegewebsverdauung durch As-
tocMs-Magensaft (bei ungefähr (3—7
titrimetrisch gemessen, bei pg = 6,3
colorimetrisch gemessen) wurde
die pjj-Optimumkurve für die Spal-
tung von Ligamentum nuchae
nochmals mit iWa/a-Rohextrakt
titrimetrisch bestimmt; das Opti-
mum (siehe Tabelle 9 und die
Kurve Abb. 9) wurde gefunden
bei Pjj = 6,4, das für Trypsin liegt
nach Thomas u. Seymour-Jones
(78) bei Ph = 5,9.

Tabelle 9. Spaltung van Bindegewehe durch Magensaft und Wasser Stoff zahl.
3 ccm: 0,025 g Ligamentum nuchae, 0,25 ccm Magensaft 1 :4, 2,5 ccm Puffer-
lösung 1/5 mol., 30quot; C, Zeit 6 Stunden, alkoholische Titration.

Das Pjj-Optimum, das hier gefunden wurde (siehe Tabelle 10 iind
die Kurve Abb. 10) liegt bei pjj ungefähr 8,2, ebenso wie es von Wald-

schmidt-Leitz (105) für die Aminopolypeptidase aus Milz angegeben
wird; für die Aminopolypeptidase aus dem Darmerepsin liegt es bei
Ph = 8,0 (92), für die der Hefe bei 6,7—7,0 (21, 22), für die aus Blut-
serum bei 7,4—7,5 (26). Keüger
(43) fand für die Spaltung von Gly-
eocollesterehlorhydrat durch Mittel-
darmdrüsenextrakt von Aplysia
einen Anstieg der Kurve von der sau-
ren Seite nach dem Neutralpunkt zu
(leider ist die Kurve nicht nach der
alkalischen Seite verfolgt worden);
mit .^stocM5-Magensaft fand bei
Ph = 6,9 eine Spaltung dieses Sub-

Abb. 10. Spaltung von Leucylglycylglycin « ,rnf,p«
durch Magensaft und Wasserstoffzahl. StrateS Statt.

Tabelle 10. Spaltung von Leucylglycylglycin durch Magensaft und Wasserstoff zahl.
2 ccm : 19,6 mg Substrat (in 0,4 ccm Lösung), 0,2 ccm Magensaft 1:4, 1,2 ccm
Pufferlösung 1/5 moL, 30quot; C, 6 Stunden, alkoholische Titration.

Das Optimum für Rohextrakt (siehe Tabelle IIA und die Kurve
Abb. 11) und für Magensaft (siehe Tabelle 12 und die Kurve Abb. 12)
liegt bei einem pH = 8,4, also ein wenig mehr nach der alkalischen Seite
hin als für die meisten untersuchten Dipeptidasen; für Milz (94, 105),
Darm (103, 92), Pankreas (95) und Hefe (122) wird das Optimum bei
Ph = 8,0 angegeben; für das Enzym der Leukocyten gibt Huspeldt (33)
das Pn-Optimum bei 7,3 an; für die Dipeptidase, welche Papain begleitet,
bei Ph = 7,6 (5).

Für ^stoctts-Magensaft gibt Shinoda (69) das Optimum der Wirkung
auf Dipeptide bei Pn = 9 an, während Krüger (45) mit dem nämlichen
Material arbeitend, das Optimum bei 7,3—8,0 findet. Für verschiedene
Pulmonaten hat Graetz (17, 18) das Optimum bei 7,3 gefunden.

Weil nach Shinoda (69) die Autolyse von .^stocws-Magensaft sehr be-
deutend ist, und die Werte für die Dipeptidspaltung nur eine Fraktion

der bei der Autolyse gefundenen Werte darstellen (siehe dagegen Keüger
(43), der fast keine Autolyse und eine bedeutende Dipeptidspaltung
findet) wurde hier untersucht, inwieweit die Autolyse hier Einfluß hat.
Die Titration wurde ausgeführt, wie für Glycylglycinspaltung, nur ohne
Substrat; die für die Autolyse gefundenen Werte sind in der Tabelle IIB
zusammengestellt.

Tabelle IIA. Glycylglycinspaltung durch BohextraJct und WasserstoffzaU. 10 ccm:
66 mg Glycylglycin (in 0,5 ccm Lösung), 0,5 ccm Rohextrakt, 4 ccm Puffer-
lösung 1 /5 mol., 300 Cj 6 Stunden, alkoholische Titration.

Tabelle IIB. Autolyse von Rohextrakt und Wasserstoff zahl. Ansatz wie für
Tabelle 10, nur ohne Substrat.

Die gefundenen Autolysewerte, die also nur sehr gering sind, wurden
in der Tabelle 11 A in Rechnung gebracht; die in der letzten Spalte an-
gegebenen Werte sind als Differenz der gefundenen Spaltungen und der
gefundenen Autolysewerte berechnet; die Kiu-ve Abb. 11 beruht auf
diesen Zahlen. Auf die Lage des p^-Optimums oder auf die Form der
Kurve hat die Autolyse aber keinen Einfluß.

Auch mit dem v. SLYKE-Apparat wurde die Aciditätszunahme bei der
Autolyse gemessen; die stärkste, wenn auch sehr geringe, Autolyse zeigte
sich bei Pn = 8,1.

Die Spaltung von Glycylglycin durch Magensaft zeigte ein gleiches
Pß-Optimum bei p^ = 8,4 (siehe Tabelle 12 und Abb. 12).

Tabelle 12. Glycylglycinspaltung durch Magensaft und Wasserstoff zahl. 2 ccm zu
10,56 mg Glycylglycin (in 0,8 ccm Lösung), 0,2 ccm Magensaft 1:4, 0,8 ccm
Pufferlösung 1/5 mol., 30» C, 6 Stunden, alkoholische Titration.

Um der Frage, ob und mit welcher der jetzt bekannten Proteinasen
das proteolytische Maja-Enzym zu vergleichen ist, näher zu kommen,

wurde versucht, den Rohextrakt mit einem der jetzt bekannten Akti-
vatoren zu prüfen. Als Aktivatoren sind bekannt:

1.nbsp;Enterokinase, für die tryptische Proteinase (und auch die tryp-
tische Carboxypolypeptidase) (86, 87, 97, 100).

2.nbsp;Zookinase, für die katheptische Proteinase aus Geweben (und auch
für die katheptische Carboxypol3^eptidase) (93, 94, 105).

4.nbsp;HCN und HgS, welche für Kathepsin (93, 105), Papain (121, 4, 5)
und Hefeproteinase (22) die natürlichen Aktivatoren zu ersetzen vermögen.

Von diesen wurden die Zookinase (129, 130) und die Phjrtokinase (28)
mit der reduzierten Form des Glutathions identisch gefunden, auch kann
ihre Wirkung durch Cystein ersetzt werden, dagegen die Wirkung der
Enterokinase durch Cystin i.

Von diesen Aktivatoren wurde die Wirkung von Enterokinase, Zoo-
kinase, HCN und H2S auf die Protease von Maja geprüft.

Zur Aktivierung mit HCN wurde zu 5 ccm des Rohextraktes 2 ccm
5%ige HCN-Lösung zugegeben (5% KCN mit HQl auf Ph = 4 gebracht)
und das Gemisch 3 Stunden im Thermostaten bei 30® C belassen, dann
neutralisiert und zu 10 ccm aufgefüllt (also Rohextrakt 1:1). Für den
Rohextrakt ohne Zusatz, der als Kontrolle dienen soll, wurde 5 ccm mit
2 ccm angesäuertem destilliertem Wasser, die nämliche Zeit bei 30quot; C ge-
lassen, darauf auch auf 10 ccm verdünnt.

H2S wurde aus einem Kippapparat während 1/2 bzw. 1 bzw. 11/2 Stun-
den durch die Enzymlösung geführt, darauf neutralisiert und auch hier
auf die Verdünnung 1:1 gebracht.

Tabelle 13. Versuch zur Ahtivierung des Mohextraktes mit HCN und H^S. 2 ccm:
40 mg Gelatine (0,4 ccm 10% ige Lösung, im Thermostaten 30« C flüssig gehalten),
0,2 ccm Rohextrakt 1:1(2 Prot.-Einheiten), 1,2 ccm Phosphatpufferlösung 1 /5 mol.,

2nbsp;In der vorläufigen Mitteilung (53 a) wurde diese Zahl versehentlich als 0,51
angegeben.

Mit HaS findet eine beträchtliche Verminderung der Enzymwirkung
statt, die wohl auf Enzymzerstörung zurückzuführen ist. Die verminderte
Enzymwirkung nach Sstündiger Aktivation mit HCN scheint größten-
teils auf den Einfluß der sauren Reaktion zurückzuführen zu sein.

Ein Enterokinasepräparat wurde aus getrockneter Darmschleimhaut
bereitet nach Waldschmidt-Leitz (87) (und zwar S. 239, auch in Rona
[65], und zwar S. 263). Nach der Fällung mit Gerbsäure wurde die
Mutterlauge (mit 30 ccm Kaolin 2,64 g) adsorbiert und darauf mit 100 ccm
0,05 n Ammoniak eluiert.

Diese Elution ist erepsinfrei, eine Erepsinbestimmung nach Wald-
schmidt-Leitz (103) ausgeführt (10 ccm, 132 mg Glycylglycin, 5 ccm

1nbsp;/5 mol. Phosphatpuffer, 1 ccm der Enterokinaselösung, p^ = 7,8, 30'^ C,
Titration nach Zugabe von 130 ccm Methylalkohol mit 1/10 n 90%igem
alkoholischen NaOH), ergab in 6 Stunden einen Aciditätszuwachs
= 0,0 ccm 1/10 n NaOH.

Um den Enterokinasegehalt dieser Elution zu bestimmen, wurde 1 g
Pankreastrockenpulver mit 16 ccm Glyzerin, 87% ig, 5 Stunden lang im
Thermostaten bei 30^ C extrahiert, darauf zentrifugiert. 5 com dieser
Lösung wurden mit 25 ccm Wasser verdünnt und nochmals zentrifugiert.
An dieser Enzymlösung wurden Tr3^sinbestimmungen ausgeführt nach
Willstätter u. Waldschmidt-Leitz (136), und zwar eine ohne und
eine nach Aktivierung durch die Enterokinaselösung.

2nbsp;ccm In NH4CI — NH4OH-Puffer 1 : 1, 2,5 ccm Trypsinlösung, p^j = 8,9,
300 C) in 20 Min. eine Aciditätszunahme von 0,57 ccm 1/10 n NaOH.

Nach Aktivierung während 30 Min. bei 30quot; C mit 0,5 ccm der Enterokinase-
lösung ergab eine ähnliche Bestimmung in 20 Min. eine Aciditätszunahme von
3,01 ccm 1/10 n NaOH.

Die Zunahme der Spaltung durch 0,5 ccm Enterokinase war also:
2,44 ccm 1 /lO n NaOH.

Zur Aktivierung des Rohextraktes wurden 2 ccm Rohextrakt mit
4 bzw. 8 ccm der Enterokinase versehen und während 1 /g Stunde im
Thermostaten bei 30'' C belassen; zur Kontrolle wurden zu 2 ccm Roh-
extrakt 8 ccm destilliertes Wasser zugefügt und das Ganze die näm-
liche Zeit im Thermostaten gelassen. Dann wurden Casein- und Puffer-
lösung (auf 30° C vorgewärmt) zugegeben und nach Titration einer
Kontrollprobe das Gemisch 4 Stunden im Thermostaten bei 30quot; C be-
lassen.

Die gefundenen Werte sind in Tabelle 14 angegeben; es findet keine
Wirkungssteigerung des Rohextraktes mit Enter okinase statt.

Tabelle 14. Versuch zur Aktivierung des Rohextraktes mit Enterokinase. 10 ccm
zu 300 mg Casein (5 ccm 6%ige Lösung), 0,5 ccm Rohextrakt (10 Prot.-Einheiten)
mit 2 ccm Aqua dest., bzw. 1, bzw. 2 ccm Enterokinaselösung 1/2 Stunde bei 30« C
belassen, 2 ccm Ammonchlorid-Ammoniakpuffer, pn = 8,1, 30quot; C, 4 Stunden.

Eine Zookinaselösung wurde hergestellt nach den Angaben von Wald-
schmidt-Leitz (105) aus Schweineleber, und zwar wurden 300 g Schweine-
leber mit 500 ccm 96%igem Alkohol während 1/2 Stunde geschüttelt,
dann der alkoholische Extrakt abgesaugt und der Rückstand wieder mit
500 ccm 70%igem Alkohol behandelt, die beiden alkoholischen Extrakte
vereinigt und durch Eindampfen im Vakuum bei 30quot; C von Alkohol be-
freit, darauf mit Wasser auf 60 ccm aufgefüllt; diese trübe Lösung ent-
hält den Aktivator.

Um ihre Wirksamkeit zu prüfen, wurde eine inaktive Kathepsin-
lösung nach Waldschmidt-Leitz (105) hergestellt aus mit Alkohol und
Äther getrockneter Schweineleber; pro 1 g Trockengewicht wurde mit
10 ccm Glycerin, 87%, extrahiert.

Eine Kathepsinbestiminung nach Waldschmidt-Leitz (105) ausgeführt ergab
(1,2 com : 18 mg Gelatine, 0,225 ccm Leberextrakt, 0,4 ccm Aqua dest. bzw.
0,4 ccm Zookinaselösung, 0,25 ccm Acetatpuffer 1 n, 30quot; C, p^ = 4, Titration im
Mikro-v. slyke-Apparat) in 24 Stunden die folgenden Werte:

Hierauf wurde versucht, den Rohextrakt mit dieser Zookinaselösung zu
aktivieren:

10 ccm : 300 mg Casein, 0,5 ccm Rohextrakt (10 Prot.-Einheiten) mit 2 ccm
dest. Wasser bzw. 2 ccm Zookinaselösung versehen, 2 ccm Ammoniumchlorid-
Ammoniak Puffer 1 n, pn = 8,1, 30« C, 4 Stunden, alkoholische Titration.

Es galt hier, der Frage nach der Vielheit und der Natur der proteo-
lytischen Enzyme bei niederen Tieren näher zu kommen mittels der in
Kapitel I besprochenen Adsorptionsmethoden.

500 g Böhmisches Kaolin^ wurden mit 1,5 Liter reiner Salzsäure (spezifisches
Gewicht 1,18) gut vermischt und erwärmt, zunächst so langsam, daß es einen Tag
bis zum beginnenden Kochen dauerte, dann einen weiteren Tag zum lebhaften
Sieden. Durch Verdünnen und wiederholtes Dekantieren trennt man die eisen-
haltige Lösung vom Kaolin ab und wiederholte noch dreimal diese Behandlung
mit Salzsäure, so daß im ganzen 14 Tage dazu nötig waren. Schließlich wird das
Kaolin mit kaltem Wasser soweit ausgewaschen, daß das Wasser fast keine
Säurereaktion mehr zeigt, während eine kleine Probe des Kaolins auf Lackmus
noch stark saure Reaktion aufweist.

2.nbsp;Tonerde Cy. Eine Tonerdesuspension wurde bereitet nach der Vor-
schrift von Willstätter u. Kraut (125).

Die heiße Lösung von 500 g Alg (804)3 18 HgO in 1 Liter Wasser wurde
auf einmal in 6,5 Liter Ammoniumsulfat-Ammoniakwasser von 6O0 eingetragen.
Dieses Reagens enthält 300 g Ammoniumsulfat und 430 ccm ungefähr 20%igen
Ammoniak (d. h. 78,4 g statt berechnet 76,6 g Ammoniak). Dieser Überschuß ist
nötig, die Lösung muß schwach alkalisch bleiben. Während des Fällens und einer
weiteren Viertelstunde wird lebhaft gerührt, wobei man die Temperatur nicht
unter 60quot; sinken läßt.

Die Fällung ist anfangs ungemein voluminös, und wird erst während des
Rührens flockig.

Man verdünnt auf 40 Liter und dekantiert, wobei sich der Niederschlag zu-
nächst rasch absetzt, klar, aber in ziemlich hoher Schicht. Um noch vorhandenes
oder während des Auswaschens aus Ammoniumsulfat zurückgebildetes basisches
Aluminiumsulfat vollends zu zerlegen, wird zum Waschwasser beim 4. Dekan-
tieren 80 ccm 20% Ammoniak hinzugefügt. Nach häufigem Auswaschen (zwi-
schen dem 12. und 20. Mal) wird die Waschflüssigkeit nicht mehr klar; von da an
dekantiert man noch zweimal, wofür mindestens einige Tage erforderlich sind.

Dieses Präparat wurde einige Monate, bevor es zur Enzymadsorption
verwendet wurde, bereitet.

Die erhaltene Tonerdesuspension, die in der Cy-Modifikation an-
wesend war (Willstätter u. Kraut, 126, 127), bildete eine weiße,
flockige, etwas plastische Suspension.

100 g Ferriammoniumalaun, in 200 ccm Wasser gelöst, werden bei gewöhn-
licher Temperatur auf einmal unter lebhaftem Rühren in 800 ccm Ammoniak-
Ammoniumsalzgemisch eingetragen, das 10,8 g (statt 10,6 g) Ammoniak mit
27,5 g Ammoniumsulfat enthielt. So entstand eine gleichmäßige, rotbraune
Fällung, die noch eine halbe Stunde lang stark gerührt wurde. Dann wurde auf
4 Liter aufgefüllt und dekantiert, wobei sich das Gel anfangs langsam und in
hoher Schicht, später rasch und niedrig absetzte. Nach den ersten Dekantierun-
gen ist es zweckmäßig, zweimal einige Kubikzentimeter konzentriertes Ammoniak
hinzuzufügen. Dadurch gelingt es, das Gel von einem noch recht beträchtlichen

1 Das ich freundlichst von der Fabrik „de Porceleijne Fleschquot; in Delft erhielt.

SOi-Gehalt zu befreien. Bei den letzten Malen (vom 10. Mal an) war das Wasch-
wasser sehr trübe, es ließ sich beim 14. Mal vollständig von dem jetzt plastisch
gewordenen Gel abgießen. (Sulfat war nun nicht mehr nachweisbar.)

3.nbsp;Ungefähr 0,6% 22/3 Ammoniumphosphat (nach Willstätter, 135,
86), bestehend aus 57 Volumenteilen l%iges Diammoniumphosphat,
3 Teilen n NH3, 40 Teilen 87%iges Glyzerin. Glyzeringehalt also un-
gefähr 30%.

In einen graduierten Meßzylinder wird eine bestimmte Menge einer
Enzymlösung gebracht, mit ebensoviel destilliertem Wasser verdünnt
und aus einer Pipette eine bestimmte Menge des Adsorbens zugegeben,
darauf mit einigen Kubikzentimetern 1 n Essigsäure, deren Menge in
einem Kontrollversuch vorher bestimmt worden ist, auf den gewünschten
Ph gebracht. Darauf wird gut durchgeschüttelt und sofort das Gemisch
in zwei bis vier Zentrifugengläser übergebracht und ungefähr 3 Min.
zentrifugiert, wobei eine Schnelligkeit von mindestens 3000 Umdrehungen
pro Minute notwendig sein soll. Darauf wird die überstehende ,,Rest-
lösungquot; von dem Adsorbat abgegossen, in einen Meßzylinder gebracht
und, falls sie nicht nochmals zur Adsorption zur Verwendung kommt, mit
NaOH neutralisiert (gegenüber Lackmuspapier) und das Volumen ab-
gelesen.

Um aus dem Adsorbat das Enzym zu eluieren, wird erst ausgewaschen,
nach Adsorption bei saurer Reaktion zweckmäßig mit angesäuertem
destilliertem Wasser mit einem Gehalt von 30% Glyzerin. Mit einem
abgerundeten Glasstab wird das Adsorbat mit einigen Tropfen Wasch-
wasser zerrieben, darauf mehr Wasser zugegeben bis auf das ursprüng-
liche Volumen; darauf wieder abzentrifugiert. Hiernach wird mit der
jeweils benutzten Elutionsflüssigkeit (im Volumen wie die Ausgangs-
lösung) das Adsorbat in der oben beschriebenen Weise vermischt und
sofort zentrifugiert. Die Elution wird in einen Meßzylinder gebracht und
nach Neutralisieren das Volumen bestimmt.

Die Restlösungen und Elutionen wurden sobald wie möglich nach
ihrer Herstellung zu Verdauungsversuchen verwendet. Außerdem fand
in sämtlichen Versuchen die Adsorption und Elution unter Eiskühlung

statt, auch, wurden alle Enzymlösungen sofort nach ihrer Bereitung in
den Eisschrank gestellt bis sie zur Verwendung kamen.

Ein Beispiel, welches die Ausbeute an Proteinase und Dipeptidase nach ein-
maliger Kaolinadsorption und Elution des Adsorbates angibt, mag hier zum
besseren Verständnis angeführt werden:

20 ccmi Rohextrakt enthaltend 400 Proteinaseeinheiten (0,05 ccm Roh-
extrakt veranlassen unter den in Kap. II, Abschnitt 2, angeführten Bestimmungs-
bedingungen: Vol. 0,5 ccm, 15 mg Kasein, pjj = 6,2, Zeit 4 Stunden, einen Acidi-
tätszuwachs von 2,25 ccm 1/100 n NaOH, enthalten also 1 Proteinaseeinheit) und
400 Dipeptidaseeinheiten (0,05 Rohextrakt : 1,67 ccm 1/100 n NaOH oder 1 Di-
peptidaseeinheit) werden mit 20 ccm Aqua dest. verdünnt und mit 2,5 ccm Kaolin-
suspension (220 mg) bei einem pu = 4 (eingestellt durch n Essigsäure) adsor-
biert. Die Restlösung der Adsorption (56 ccm) enthielt noch 348 Proteinase-
einheiten (0,14 ccm Restlösung ergab unter den Bestimmungsbedingungen einen
Aciditätszuwachs von 2,10 ccm 1/100 n NaOH, enthielt also nach der Kurve
Abb. 1 0,87 Proteinaseeinheiten), d. h. 87%, neben 148 Dipeptidaseeinheiten
(0,14 ccm Restlösung ergab unter den Bestimmungsbedingungen einen Aciditäts-
zuwachs von 0,66 ccm 1/100 n NaOH, enthielt also nach der Kurve Abb. 4
0,37 Dipeptidaseeinheiten), d. h. 37%.

Das Adsorbat wurde ausgewaschen mit 40 ccm 30%igem Glyzerinwasser von
von einem pjj = 4, nach Abzentrifugieren des Waschwassers Avurde es mit 40 ccm
0,04 n NH4OH (30% Glyzerin enthaltend) eluiert; Elution 40 ccm, die Elutions-
ausbeute betrug 16 Proteinaseeinheiten (0,1 ccm Elution: 0,14 ccm 1/100 n NaOH,
also 0,04 Proteinaseeinheiten) oder 4% neben 0 Dipeptidaseeinheiten (0,1 ccm
Elution : 0,0 ccm 1/100 n NaOH).

Wenn man die Enzymbestimmungen an aliquoten Teilen der Enzym-
lösungen ausführt (wie im oben angeführten Beispiel 0,05 ccm Roh-
extrakt bzw. 0,14 ccm Restlösung bzw. 0,1 ccm Elution), kann man aus
dem jemals gefundenen Aciditätszuwachs mit Hilfe der Kurven Abb. 1,
2, 3 und 4 die Ausbeute in Enzymeinheiten sofort ablesen und in % des
Ausgangsmaterials berechnen. Dieses ist in den im folgenden angeführ-
ten Tabellen geschehen^.

Es zeigte sich, daß die Proteinase schwer adsorbierbar war, sowohl
Tonerde wie Kaolin vermochten, auch bei wiederholter Adsorption iind
bei verschiedenen Aciditäten nur einen Bruchteil des Enzyms an sich zu
binden, wie aus Tabelle 15 hervorgeht.

Dagegen wurden die anderen proteolj^tischen Enzyme besser adsor-
biert; in den Elutionen der Adsorbate findet sich die Proteinase in mäßi-
ger Ausbeute, neben den beiden Poljrpeptidasen vor (siehe Tabelle 17),

1nbsp;Der Übersichtlichkeit wegen wurde in den im Folgenden angeführten Ta-
bellen immer von 20 ccm Rohextrakt ausgegangen, wie es auch meistens in den
Versuchen geschah; hier und da wurde aber nur 10 ccm Rohlösung angewandt,
die übrigen Lösungen in entsprechenden Mengen.

2nbsp;In Gegensatz zu der in der vorläufigen Mitteilung (53 a) gebrachten Berech-
nung, wobei die Ausbeuten an Enzym in Prozenten angegeben waren, überein-
stimmend mit dem Prozent der beobachteten Spaltungen.

Tabelle 15. Adsorptionsverhalten der Maja-Proteinase mit Kaolin und Tonerde. Angewandt jeweils 20 ccm Rohextrakt, mit dem
gleichen Volumen Wasser verdünnt, p^ = 4, eingestellt durch n Essigsäure, Ph = 8 durch 0,1 nNH^OH, Angaben beziehen sich
auf ahquote Teile der Lösungen (siehe S. 190), Angaben für die Wirkung bedeuten Zuwachs an Kubikzentimeter 1/100 n NaOH

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so daß der Vorgang der Adsorption und Elution für die Gewinnung ein-
heitlicher Proteinase keine Aussicht bot.

Es war erwartet worden, daß die Proteinase und Carboxypolypepti-
dase auch hier, wie es für Trypsin (100) und Kathepsin (105) der Fall ist,
einigermaßen das nämliche Adsorptionsverhalten zeigen würden, und im
Anfange wurde dann auch nur versucht, die „Trypsinquot;fraktion vom
„Erepsinquot; zu trennen, gemessen an den Wirkungen auf Casein und
Glycylglycin. Nachdem aber die caseinspaltende Fraktion frei von
„Erepsinquot; erhalten worden war (durch viermalige Adsorption an Kaolin
bei Pji = 4 (siehe Tabelle IG), stellte es sich heraus, daß die Proteinase auch

Tabelle 16. Trennung von „Proteasequot;' und „Erepsinquot; durch Kaolinadsorption.
Kaolinadsorption: 20 ccm Rohextrakt 20 ccm dest. Wasser 25 ccm
(220 mg) Kaolin, pn = 4, 1 Kaolinrestlösung noch dreimal mit je 2,5 ccm Kaohn
adsorbiert; jedes Adsorbat nach einmaligem Waschen (mit 40 ccm 30%igem Gly-
zerinwasser vom Ph = 4) eluiert: in Versuch A mit 40 ccm 22/3 Ammonium-
phosphat, in Versuch B mit 40 ccm 0,04 n NH4OH. Angaben beziehen sich auf
aliquote Mengen der Lösungen (und zwar entsprechend 0,05 ccm Rohextrakt),
Angaben für die Wirkung bedeuten Zuwachs an Kubikzentimeter 1 /lOO n NaOH
unter den Bestimmungsbedingungen.

jetzt noch mit der Aminopolypeptidase vergesellschaftet war; die vierte
Restlösung der Kaolinadsorption enthielt neben 65% der Proteinase 49%
der Aminopolypeptidase (siehe dazu Tabelle 17, vierte Alinea von unten),
ein anderes Mal 60% der Proteinase, 32% der Aminopolypeptidase (Ta-
Z. f. vergl. Physiologie Bd. 17.nbsp;13

Tabelle 17. Adsorptionsverhalten der vier Enzyme hei Adsorption an Kaolin und Elution aus den Adsorbaten. Kaolinadsorption:
20 ccm Rohextrakt 20 ccm dest. Wasser 2,5 ccm (220 mg) Kaolin, p^ = 4,0, Kaolinrestlösung 1 noch dreimal mit je 2,5 ccm
Kaolin adsorbiert; jedes Adsorbat nach einmaligem Waschen (mit 40 ccm 30%igem Glyzerinwasser von p^ = 4) eluiert mit
40 ccm 22/3 Ammonphosphat. Angaben beziehen sich auf aliquote Mengen der Lösungen, und zwar entsprechend 0,05 ccm Roh-
extrakt, Angaben für die Wirkung bedeuten Zuwachs an Kubikzentimeter 1/100 n NaOH unter den Bestimmungsbedingungen.

belle 17, zweite Alinea von unten) und war frei von Dipeptidase und
Carboxypolypeptidase.

Es zeigte sich, daß die Proteinase und Aminopolypeptidase weit-
gehend das nämliche Adsorptionsverhalten zeigen. Weder mit Kaolin
bei saurer Reaktion, noch mit Tonerde bei saurer oder alkalischer Re-
aktion gelang es, die zwei Enzyme, die zusammen in der vierten Rest-
lösung der Kaolinadsorption anwesend sind, voneinander zu trennen
(Tabelle 18 a—c). Auch für Eisenhydroxyd bei saurer Reaktion war die
Adsorption eine gleichmäßige und die Trennung aussichtslos (Tabelle 18d).

Bei der Adsorption mit Eisenhydroxyd bei neutraler Reaktion wird
aber die Aminopolypeptidase vorwiegend adsorbiert. Durch wiederholte
Adsorption wurde schließlich die Proteinase frei von der Aminopoly-
peptidase erhalten (Tabelle 18 e—f). Nach viermaliger Adsorption ist
die Proteinase in 29% Ausbeute proteoljrtisch einheitlich in der Lösung
anwesend.

Tabelle 18. Versuche zur Trennung von Proteinase und Aminopolypeptidase. Je
45 ccm Restlösung der viermaligen Kaolinadsorption (aus 20 ccm Rohextrakt),

nach dem Beispiele der Tabelle 17 gewonnen (Ausgangslösung) werden
a) noch dreimal der Adsorption mit je 2,5 ccm (220 mg) Kaolin bei pj, = 4,

~ quot; ( 36 „ ) Tonerde bei p^ =, 4,
( 36 „ ) „ „ p^ =
(123,6 mg Fe^Og) Eisenhydroxyd

Angaben beziehen sich auf aliquote Teile der Lösungen, entsprechend 0,1 (für d
und e 0,05) ccm Rohextrakt, Angaben für die Wirkung bedeuten Zuwachs an
Kubikzentimeter 1/100 n NaOH unter den Bestimmungsbedingungen.

Die Carboxypolypeptidase wird, wie aus der Tabelle 17 hervorgeht,
vom Kaolin bei saurer Reaktion weitgehend adsorbiert. Es gelang, das
Enzym aus den vereinigten Kaolinadsorbaten zu eluieren (siehe dazu
auch Tabelle 17). Nur war es in dieser Elution mit der Proteinase und
Aminopolypeptidase vergesellschaftet (siehe Tabelle 19).

Weil Tonerde bei alkalischer Reaktion die Proteinase und Amino-
polypeptidase fast nicht adsorbiert, wurde diese Elution (der vereinigten

Kaolinadsorbate) mit Tonerde
adsorbiert, die Carboxypoly-
peptidase wird vom Adsorbens
gut aufgenommen, und bei
der Elution mit verdünnter
Essigsäure findet sich die
Carboxypolypeptidase in 60%
Ausbeute einheitlich vor (Ta-
belle 19).

Die Aminopolypeptidase
zeigte, wie schon erwähnt,
weitgehend das nämliche Ad-
sorptionsverhalten wie die
Proteinase und war schwer da-
von zu trennen (Tabelle 18).
(Auch bei den Hefeenz3mien
fand Gkassmann, daß das Ge-
misch der Proteinase mit der
Aminopolypeptidase bei der
Adsorption mit Tonerde nicht
aufgeteüt wird [24, 19].)

Es gelang, aus den verei-
nigten drei ersten Eisenhydro-
xydadsor baten die Aminopoly-
peptidase in 28% Ausbeute
fast ohne Proteinase freizu-
legen (Tabelle 20); eine weitere
Reinigung konnte durch die
geringe Menge des Enzyms
nicht durchgeführt werden.

Die Dipeptidase scheint so
unbeständig zu sein, daß eine
Elution aus irgendeinem Ad-
sorbat bis jetzt nicht möglich
gewesen ist, wie schonend und
schnell auch gearbeitet wurde.
Ob die starke Adsorption durch
Kaolin (siehe Tabelle 16) und
auch durch Tonerde wirklich
auf Adsorption oder auf eine
teilweise Vernichtung des En-
zyms während der Adsorption
beruht, ist zur Zeit nicht zu

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entscheiden. In den Elutionen der Adsorbate findet sich keine Dipep-
tidase vor (Tabelle 16).

Tabelle 20. Versuch zur Isolierung der Aminopolypeptidase. Je 45 ccm Restlösung
aus 20 ccm Rohextrakt der viermaligen Kaolinadsorption (Ausgangslösung) nach
dem Beispiel der Tabelle 17 gewonnen, wurden noch dreimal der Adsorption mit
je 6 ccm (185,4 mg) Eisenhydroxydaufschlämmung bei p,j = 7 unterworfen, die
Adsorbate vereinigt und nach einmaligem Waschen (mit 30%igem Glyzerin-
wasser Pjj = 7) eluiert mit 40 ccm 1/20 n Essigsäure.
Angaben beziehen sich auf aliquote Teile der Lösungen, entsprechend 0,05 ccm
Rohextrakt, Angaben für die Wirkung bedeuten den Zuwachs in Kubikzenti-
meter 1 /lOO n NaOH unter den Bestimmungsbedingungen.

Kapitel IV.
Die Proteinase.
1. Gewinnung der Protoinaselösungen und deren Beständigkeit.

Wie am Ende des vorigen Kapitels beschrieben wurde, ergab eine
viermalige Adsorption des Rohextraktes mit Kaolin bei pjj = 4 und

Tabelle 21. Gewinnung der Proteinaselösung. Proteinaselösung, proteolytisch ein-
heitlich, bereitet nach dem Beispiele der Tabelle 18 f, durch viermalige Adsorp-
tion an Kaolin bei Ph = 4 und darauffolgende viermalige Adsorption an je

6 ccm (185,4 mg) Eisenhydroxyd bei pji = 7.
Angaben beziehen sich auf aliquote Teile der Lösungen, und zwar 0,05 ccm Roh-
extrakt, Angaben für die Wirkung bedeuten Zuwachs an 1 /lOO n NaOH unter den
Bestimmungsbedingungen.

darauf folgende viermalige Adsorption der vierten Restlösung mit Eisen-
hydroxyd bei Ph = 7, eine Restlösung, die nur die Proteinase in ungefähr
30%iger Ausbeute und keines der drei anderen Enzyme enthielt.

Die Beständigkeit der Proteinase erlaiibt es, Versuche über Spezifität
usw. an dem Tage nach der Herstellung der Proteinaselösung aus-
zuführen.

Proteinaselösung, sofort nach Herstellung gemessen: 1,15 ccm 1 /lO n
NHg. Die nämliche Lösung, nach 24 Stunden Stehen im Eisschrank:
1,07 ccm 1/10 nNH^.

Eine gereinigte Proteinaselösung spaltet Pepton und Clupeinsulfat;
hier untenstehend sind die Zahlen der Spaltungen angeführt.

Peptonspaltung. Pro Titration (Mikro-v. Slyke) 2 ccm, enthaltend
0,4 ccm Restlösung (0,2 ccm enthalten 0,3 Proteinaseeinheiten): 100 mg
Pepton (Ex alb. Merck).

1,2 ccm Pufferlösung 1 /5 mol. (KH2PO4, NagHPOi). pn 6,4, Tem-
peratur 30® C, Aciditätszunahme in 4 Stunden 0,36 ccm 1/10 n NHg.

Clupeinspaltung. Pro Titration (Mikro-v. Slyke) 2 ccm, enthaltend
0,4 ccm Restlösung (0,2 ccm enthalten 0,3 Proteinaseeinheiten). 40 mg
Clupeinsulfat. 1,2 ccm Pufferlösung (KH2PO4, NagHPOi). pa =6,2,
Temperatur 30quot; C, Aciditätszunahme in 4 Stunden 0,24 ccm 1 /lO n NHg.

Es wurde mit der gereinigten Proteinaselösung die Abhängigkeit der
Wirkung auf Gelatine und Casein von der Wasserstoffzahl untersucht;
die Bestimmung der Spaltungen wurde im Mikro-v. Slyke ausgeführt,
wie es im Kapitel 2, Abschnitt 3, für den Rohextrakt beschrieben wurde.

Tabelle 22. Oelatinespaltung durch Proteinase und Wasserstoff zahl (siehe Kurve
Abb. 13). Pro Titration im Mikro-v. Slyke 2 ccm (aus einem Ansatz von 10 ccm)
enthaltend: 40 mg Gelatine (0,4 ccm 10%ige Lösung, im Thermostaten bei 30» C
flüssig gehalten), 1,2 ccm Pufferlösung 1/5 mol., 0,4 ccm Restlösung (0,2 ccm
enthalten ungefähr 0,3 Prot.-Einheiten). 90 Min. 300 0.

Das pH-Optimum der Gelatinespaltung (s. Tabelle 22 u. Abb. 13) ist
nach der Reinigung also nach der alkalischen Seite verschoben und liegt,

statt bei 6,1 jetzt bei 8,1; also in der Nähe des Optimums (8,2—8,7
nach Waldschmidt-Leitz, 86) der Wirkung von Trypsin auf Gelatine.

Tabelle 23. Caseinspaltung durch Proteinase und Wasserstoff zahl (siehe dazu Kurve
Abb. 14). Pro Titration (im Mikro-v. Slyke) 2 ccm (aus einem Ansatz von
10 ccm) enthaltend: 40 mg Casein. 1,2 ccm Pufferlösung 1/5 mol., 0,4 ccm Rest-
lösung (0,2 ccm enthalten ungefähr 0,3 Prot.-Einheiten). 3 Stunden. 30quot; C.

Das pg-Optimum für die Caseinspaltung (s. Tabelle 23 u. Abb. 14)
ist nach der Reinigung auch mehr im alkalischen Gebiet gelegen, und
zwar bei p^ ungefähr 7,4; für Trypsin liegt das Optimum nach North-
rop (58 a) bei p,i = 8,6.

Auch mit den gereinigten Proteinaselösungen wurde, wie es für den
Rohextrakt (allerdings mit negativen Resultaten) gemacht worden war,
untersucht, inwieweit Enterokinase, Zookinase, Blausäure oder HgS als
Aktivatoren in Betracht kommen.

Die Versuche wurden genau wie in Kapitel II, Abschnitt 4 a, für den
Rohextrakt beschrieben wurde, angesetzt. Die Ergebnisse sind in Ta-
belle 24 zusammengestellt.

Tabelle 24. Verswh zur Aktivation der Proteinaselösung durch HCN, 2 ccm: 40 mg
Gelatine (0,4 ccm 107oiger Lösung, im Thermostaten 30» C flüssig gehalten),
a) 0,2 ccm Proteinaselösung (ungefähr 0,3 Prot.-Einheiten) (mit 0,2 ccm Aqua
dest. bzw. 0,1, bzw. 0,2 ccm HCN 2 Stunden bei 30o C belassen), b) 0,4 ccm
Proteinaselösung (0,2 ccm = ungefähr 0,3 Prot.-Einheiten) (mit 0,2 ccm Aqua
dest. bzw. 0,1, bzw. 0gt;2 ccm HCN 3 Stunden bei 30quot; C belassen), 1 ccm Phosphat-
pufferlösung 1/5 mol., Ph = 8,1 (Opt. pn), 30quot; C, 90 Min., Titration im Mikro-

Die benutzten Enterokinaselösungen wurden in ähnlicher Weise be-
reitet wie es in Kapitel 2, Abschnitt 4 b, beschrieben wurde.

0,5 ccm Enterokinaselösung 1 erteilte 25 mg Trockenpankreas (für die Ausfüh-
rung der Bestimmung siehe Kap. II, Abschnitt 4 b) eine Steigerung der
Aciditätszunahme von 2,09 ccm 1/10 n NaOH; die Enterokinaselösung
war erepsinfrei.

0,5 ccm Enterokinaselösung 2 erteilte 25 mg Trockenpankreas eine Steigerung der

Ein Versuch, der mit der Enterokinaselösung 1 angestellt wurde, ergab für
die Spaltung von 2 ccm (40 mg Gelatine, 1,2 ccm Phosphatpufferlösung 1/5 mol.,
0,2 ccm Proteinaselösung (0,3 Proteinaseeinheiten), Ph = 8,1, 30» C, 3 Stunden,
Titration im Mikro-v. SLYKE-Apparat, die folgenden Werte:

Es wurde darauf, mit jeweils frisch hergestellten Enterokinaselösungen
dieser Versuch, nur jetzt mit Caseinspaltung, wiederholt; die Ergebnisse
sind in der Tabelle 25 zusammengestellt.

Tabelle 25. Versuche zur Äktivation der Proteinaselösung durch Enterokinase.
10 ccm : 300 mg Casein (5 ccm 6%ige Lösung), 2 ccm Ammoniumchlorid-Am-
moniakpuffer, 2 ccm Proteinaselösung (0,2 ccm = 0,3 Prot.-Einheiten) während
1/.2 Stunde mit Aqua dest. bzw. 1 ccm bzw. 2 ccm Enterokinaselösung im Thermo-
staten 30quot; C belassen, pjj = 8,1, 30° C, 4 Stunden, alkoholische Titration.

Es findet also eine Aktivierung durch Enterokinase statt; es muß also
ein natürlicher Aktivator der Proteinase im Rohextrakt anwesend sein
und dieser ist bei der adsorptiven Reinigung von ihr abgetrennt worden.
t)a Enterokinase den spezifischen Aktivator für Trypsin darstellt, scheint
die if a ƒ«-Proteinase also trjrpsinähnlichen Charakter aufzuweisen.

Die benutzte Zookinaselösung war die nämliche, die für die Versuche
über Aktivierung des Rohextraktes benutzt worden war; es wurde ver-
sucht, ob die Proteinaselösung durch sie aktiviert werden konnte. Eine
Titration von 11 ccm (300 mg Casein, 2 ccm Ammoniumchlorid-Ammo-
niakpuffer 1 n, 2 ccm Proteinaselösung (0,2 ccm = 0,3 Proteinaseein-
heiten), mit 2 ccm Aq. dest. bzw. 2 ccm Zookinaselösung vermischt, Ph =
8,1, 30quot; C, 4 Stunden, alkoholische Titration) ergab: für-Proteinaselösung
HgO eine Aciditätszunahme von 1,00 ccm 1/10 n NaOH, für Pro-
teinaselösung mit Zookinase eine Aciditätszunahme von 0,96 ccm 1 /lO n
NaOH.

Das Studium der Literatur über die proteol5rtischen Enzjmae der
Wirbellosen hat uns gezeigt, daß diese auf Grund der Pg-Optima ihrer
Wirkungen auf verschiedene Substrate und auf Grund der Spaltung spe-
zifischer Substrate, einerseits verglichen wurden mit den Pflanzenenzymen
(z. B. denen der Hefe) oder mit den intracellulären Enzymen der Organe

der Säugetiere (Vonk, Keügee, Gbaetz), die wahrscheinlich miteinander
sehr nahe verwandt sind. Andererseits dagegen waren sie mit den Ver-
dauungsenzymen der Wirbeltiere und speziell mit den Pankreasenzymen
(Yonge, Wigg-leswoeth, Hobson) verglichen worden. Aus allen diesen
Vergleichungen ergaben sich wichtige Probleme. Das Problem, welches
sich aus der Vergleichung mit den Wirbeltieren ergab, war unser Aus-
gangspunkt. Waldschmidt-Leitz hat seine Auffassung über die Natur
der Bindungen 1 im Eiweißmolekül aufgebaut auf die Erfahrungen an
Wirbeltierenzymen: die verschiedenen Enzyme entsprächen verschiede-
nen Arten der Bindungen innerhalb des Eiweißmoleküls. Wenn auch an
der Richtigkeit dieser Auffassung kaum zu zweifeln war, so ergab doch
gerade die Untersuchung bei einem Wirbellosen eine sehr bedeutende
Möglichkeit, um die allgemeine Gültigkeit der Auffassung von Wald-
schmidt-Leitz zu prüfen. Bei den Wirbeltieren entspricht der Verteilung
der Proteolyse auf verschiedene Teilenzyme eine wenigstens teilweise
Verteilung dieser Teilenzyme auf verschiedene Abschnitte des Darm-
traktus. Die Notwendigkeit der Verteilung des Wirkungsbereiches
könnte durch die topographische Anordnung gegeben sein, nicht durch
die Eigenart des Eiweißmoleküls. Es könnte sein, daß da, wo ein ein-
heitlicher Verdauungssaft vorkommt (den man sich in seiner Einheitlich-
keit verschaffen kann, ohne Extraktion), auch ein einziges proteolytisches
Enzym vorhanden ist. Obgleich diese Möglichkeit nach neueren Ergeb-
nissen auch nicht sehr wahrscheinlich war, so ist es doch von Bedeutung,
daß wir sie haben ausschließen können.

Eine Entscheidung der Frage nach der Art der bei Wirbellosen an-
wesenden Enzyme ist nur möglich nach ihrer Isolierung wie sie in man-
chen Fällen von Willstätter und seinen Schülern mittels der Adsorp-
tionsmethoden ausgeführt wurde.

Weil die Adsorptionsmethode viel Material beansprucht, war sie bis-
her in der vergleichenden Physiologie, mit Ausnahme der Arbeiten von
Yonge und Wiggleswoeth, die sich auf eine erste Trennung von,,Tryp-
sinquot; und ,,Erepsinquot; beschränkten, noch nicht angewandt worden. Durch
die Benützung von Maja squinado war es möglich, hinreichendes Material
zu bekommen.

Es ergab sich, daß vier Teilenzyme vorhanden sind, wovon drei, die
Proteinase, die Carboxjrpolypeptidase und die Aminopolypeptidase, ein-
heitlich erhalten wurden; die Dipeptidase erwies sich als sehr unbeständig.

1 Der Ausdruck „Bindungenquot; wird hier in ganz allgemeinem Sinne benutzt.
Bei der gleichen Anordnung der Atome an der Bindungsstelle können doch
•verschiedene Bindungen vorliegen, je nach dem Einfluß, welche die Konfiguration
der verbundenen oder benachbarten Moleküle, die Länge der Peptidkette usw. auf
die Beständigkeit der Bindung haben.

gehend, näher studiert. Es zeigte sich, daß ihre pn-Optimumkurven nach
der Reinigung sich ixnterscheiden von denen des ungereinigten Enzyms,
was wohl auf einen Einfluß von Begleitstoffen, auf deren Bedeutung
Willstätter in manchen Fällen hingewiesen hat, zurückzuführen ist.
Die pg-Optima für Gelatinespaltung und Caseinspaltung, die für Roh-
extrakt bei 6 bzw. 6,2 gefunden worden waren, liegen jetzt bei 8,1 bzw.
7,4, sie stimmen jetzt mehr mit den pn-Optima der Trypsinwirkung (für
Gelatine bei pg = 8,2—8,7 nach Waldschmidt-Leitz, für Casein bei
Pjj == 8,6 nach Northroi') überein. Zusammen mit den Begleitstoffen
dahingegen passen die Enzyme besser zu den, in den natürlichen Säften
verwirklichten Bedingungen.

Die Annahme einer Ähnlichkeit der Jfa/a-Proteinase mit Trypsin
wird wahrscheinlich durch die Tatsache, daß die Proteinase, die vor der
Reinigung keine Aktivierung mit Enterokinase erfuhr, nach ihrer Rei-
nigung von Enter okinase aktiviert wird. Es scheint also ein natürlicher
Aktivator bei der adsorptiven Treimung von den anderen Enzymen von
ihr abgetrennt zu werden, wodurch das Enzym an Aktivität einbüßt i,
und nun durch Enterokinase aktivier bar wird.

Künftige Untersuchungen werden die Art dieser Aktivation näher
untersuchen, sowie auch (durch Untersuchung der Spaltbarkeit von Pro-
dukten der Trypsinverdauung durch die ifa^a-Proteinase) die eventuelle
Identität der Proteinase mit dem Trypsin feststellen müssen.

1.nbsp;VondenMitteldarmdrüsenvonnbsp;wurdenExtrakte an-
gefertigt, sowohl von frischen Drüsen als von vorher mit Aceton und
Äther getrockneten; auch wurde der Magensaft mit Glyzerin vermischt;
die Enzyme erwiesen sich haltbar.

2.nbsp;Es wurden mit den Rohextrakten Bestimmungen ausgeführt, um
das Vorhandensein einer eventuellen Proteinase (gemessen an Casein-
spaltung), einer eventuellen Carboxypolypeptidase (gemessen an Chlor-
acetyltyrosinspaltung), einer eventuellen Aminopoljrpeptidase (gemessen
an Leucyldiglycinspaltung) und einer eventuellen Dipeptidase (gemessen
an Glycylglycinspaltung) zu untersuchen. Es wurden für diese Enzyme
{Maja)-Einheüen aufgestellt, die nur als vorläufige aufzufassen sind und
nur dazu dienen, die Vorgänge bei der Adsorption verfolgen zu können.

3.nbsp;Es wurden die pj,-Optima für den Rohextrakt und den Magensaft
bestimmt, und zwar wurde für die Caseinspaltung das Optimum bei
Pjj = 6,2 gefunden, für Gelatinespaltung bei Pjj = 6, für Spaltung von

1 Durch die Abtrennung des Aktivators, und durch die Veränderung der
Lage des pjj-Optimums siiid die Messungen der Proteinase nicht genau, die Aus-
beuten nach der Adsorption also alle zu niedrig.

Ligamentum nuchae bei Pu = 6,4, für Leucyldiglycinspaltung bei pjj =
8,2, für Glycylglycinspaltung bei pg = 8,4.

4.nbsp;Im Anschluß an die Erscheinungen der Aktivierung, wie sie für
Pflanzen- und Vertebratenenzyme bekannt sind, wurde versucht, mittels
einiger dieser Aktivatoren (und zwar HgS, HON, Zookinase und Entero-
kinase) eine Wirkungssteigerung des Extraktes herbeizuführen; dieses
gelang aber nicht.

5.nbsp;Es wurde versucht, die einzelnen Enzyme zu isolieren und gezeigt,
daß tatsächlich vier Enzyme vorhanden sind.

6.nbsp;Weil die Proteinase sich weder mit Tonerde bei alkalischer oder
saurer Reaktion, noch mit Kaolin bei saurer Reaktion adsorbieren ließ,
wurde sie nur proteolytisch einheitlich erhalten durch adsorptive Ab-
trennung der sie begleitenden Enzyme. Die Carboxypolypeptidase und
Dipeptidase konnten durch viermalige Adsorption an Kaolin von ihr ab-
getrennt werden; die Aminopolypeptidase schließlich durch daran an-
schließende viermalige Adsorption an Eisenhydroxyd. Die Proteinase
wvirde in einer (scheinbaren) Ausbeute von ungefähr 30% erhalten.

7.nbsp;Die Carboxypolypeptidase, welche durch Kaolin stark adsorbiert
wird, konnte gereinigt werden durch Adsorption der Kaolinelution mit
Tonerde und darauffolgende Elution mit verdünnter Essigsäure; sie war
in dieser Elution proteolytisch einheitlich anw^esend in einer 60% igen
Ausbeute.

8.nbsp;Die Aminopolypeptidase, die erst durch Eisenhydroxydadsorption
von der Proteinase getrennt werden konnten, wurde aus der Elution die-
ser vereinigten Adsorbate fast proteinasefrei erhalten; neben Aminopoly-
peptidase in 28%iger Ausbeute fanden sich noch 2% der Proteinase in
der Elution.

9.nbsp;Die Dipeptidase konnte nicht gereinigt werden; ihre Unbeständig-
keit scheint so groß zu sein, daß eine, Elution nicht gelang.

10.nbsp;Für die gereinigte Proteinase wurden nochmals die pn-0ptima
ihrer Wirkung auf Gelatine und Casein bestimmt, und diese jetzt gefun-
den bei Ph = 8,1 bzw. pg = 7,4, woraus auf eine Ähnlichkeit mit dem
Trypsin geschlossen wurde.

11.nbsp;Versuche zur Aktivierung mit HON und Zookinase ergaben bei
der gereinigten Proteinase wieder ein negatives Resultat, dagegen trat
mit Enterokinase eine Aktivitätssteigerung auf; dieses ist eine Stütze
für die Auffassung, daß das Enzym dem Trypsin ähnlich ist.

Zum Schlüsse möchte ich meinem hochverehrten Lehrer, Herrn Prof.
H. J. Jordan, herzlichen Dank sagen für die Anregung zu dieser Unter-
suchung und sein dauerndes Interesse an ihr, sowie Herrn Dr. H. J. Vonk
für die viele Hilfe bei der Ausführung der Arbeit, die er mir zuteil wer-
den ließ.

Audi Herrn Prof. E. Waldschmidt-Leitz in Prag bin ich für die Ge-
legenheit, die er mir wohlwollend bot, die Methoden der Adsorption in
seinem Laboratorium kennen zu lernen, zu vielem aufrichtigen Dank ver-
pflichtet; für die viele Hilfe, die Herr Privatdozent Dr. A. Schaffner
mir dabei verlieh, sei ihm auch an dieser Stelle herzlich gedankt.

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K., Kraut, H u. Erbacher, 0.: Ebenda 58, 2448 (1925). - 128. WillstS K
Kraut, H. u. Fremcry, W.: Ebenda 57, 1491 (1924). - 129 WillstX R „'
Kuhn, K : Ebenda 56, 509 (1923). - 130. Willstätter ß. u.

~ Willstätter, R. u. Racke, F.: Ann. Chem. 425,1 (1921); - 133 Will-
statter I u. Schneider, K.: Hoppe-Seylers Z. 133, 193 (1924). - 134. Willstätter
B. u Waldschmidt-Leitz, E.: Ber. dtsch. chem. Ges. 54,2988 (1921). -- m SoTe

turna, S. u. Kunstner, G.: Ebenda 161, 191 (1926). - 137. Willstätte^ ß Wnld
schmidt-Leitz, E. u. Hesse, A.B. F.: Ebenda 126, 143 (1923) - 137 Ätittirquot;
K., VValdschmidt-Leitz, E. u. Memmen, F.: Ebenda 125,93 (1922/23) —139 Will-'
r.nbsp;- 140. Wolvekamp, H.

De proteinase uit het maagsap en middendarmklierextract
van Maja squinado is identiek met de geactiveerde tryptische
proteinase der vertebraten.

De eiwitvertering bij Maja squinado geschiedt door ten-
minste vier enzymen (proteinase, carboxypolypeptidase,
aminopolypeptidase en dipeptidase), die achtereenvolgens
het eiwit aantasten,

Het is niet noodzakelijk, het verschijnsel der maximale
verkorting bij het midden van de hartpauze onder invloed
van kortdurende rekking bij het hart van Helix pomatia
te verklaren door een autokatalytisch proces.

Onder natuurlijke omstandigheden is het Og-verbruik van
Nereis virens onafhankelijk van de O2 - spanning.

Uit de proeven van Stekelenburg is gebleken, dat de
hypothese van Treub, dat blauwzuur het eerste assimilatie-
product van stikstof is, onjuist is.

0,94	1,17
1,56	1,83
2,25	2,56
3,25	3,70

Enzymmenge in com	Aciditätszuwachs
des Kohextraktes	in ccm l/lOOn KOH
0,0125	0,16
0,025	0,31
0,05	0,58
0,10	0,85

PufFcrgemisch	Pii des Ansatzes (elektro- metrisch gemessen)	Aclditätszuwachs in ccm l/io n NHj
Kaliumbiphtalat NaOH	5,2	0,25
KH2PO4, Na^HPOi	5,7	0,38
	6,0	0,42
„ ,,	6,9	0,31
	7,5	0,27
ïj 5»	7,9	0,31

Puffergemisch	P£[ des Ansatzes colori-	Aciditätszuwachs
Puffergemisch	raetrisch gemessen	in 1/10 n NaOH
K-Biphtalat-NaOH	6,5	0,33
» »	6,1	0,56
99 99	6,4	0,53
Na-Borat-HCl	6,4	0,55
Jgt; 99	6,9	0,45
Sgt; gt;gt;	7,0	0,41
gt;gt; gt;J	7,2	0,37
99 99	7,4	0,29
99	7,6	0,29
99 J»	7,7	0,31
99 99	8,1	0,37
99 99	8,6	0,35
Na-Borat-NaOH	8,8	0,33
99 99	9,0	0,29

Puffergemisch	Pii des Ansatzes elektro- metrisch gemessen	Aciditätszuwachs in ccm I/IO n NH2
K-Biphtalat-NaOH	4,9	0,25
KH^PO.-Na^HPO,	5,3	0,53
s» ,,	6,1	0,74
	6,2	0,72
	6,7	0,70
» ,»	7,5	0,60

Enzymraenge in ccm	Aciditätszuwachs
des Rohextraktes	in ccm 1/100 n KOH
. 0,0125	0,30
0,025	0,57
0,05	1,11
0,10	1,74

Puffergemisch		Pii des Ansatzes colori- metrisch gemessen	Aclditätszuwachs in ccm 1/10 n NaOH
K-Biphtalat-NaOH		1 5,1	0,22
gt;9	99	5,5	0,40 0,49
„	5,	5,8	0,40 0,49
gt;5	99	6,3	0,72
Na-Borat-HCl		6,8	0,63
99		7,1	0,51
99	99 1	7,4	0,41
99	99	7,7	0,36
99	99	7,9	0,37
„	99	8.4	0,47
99	„	8,6	0,44

Puffergemisch	pii des Ansatzes colori- metrisch gemessen	Aciditätszuwachs in ccm 1/10 n NaOH
K-Biphtalat-NaOH	4,9	0,18
Na-Borat-HCl	5,7	0,38
99 99	6,0	0,43
99 99	6,4	0,49
99 99	7,0	0,43
99 99	7,9	0,32

Puffergemisch	Pii des Ansatzes colori-	Aciditätszuwachs
Puffergemisch	metrlsch gemessen	in ccm 1/10 n NaOH
Glycocoll-HCl	6,3	0,05
NaOH	7,0	0,25
	7,2	0,29
ff ff	7,6	0,46
ff ff	8,2	0,54
ff ff	8,4	0,48
ff ff	8,8	0,24
ff ff	9,0	0,16

Puffergemisch	Pi'i des Ansatzes elektrometrlsch gemessen	Aciditätszuwachs in ccm 1/10 n NaOH gefunden
Puffergemisch	Pi'i des Ansatzes elektrometrlsch gemessen		nach Korrektion für Autolyse s. Tab. HB
Glycocoll-HCl	6,1	0,10	0,10
NaOH	U	0,26	0,21
,, ,,	7,5	0,46	0,41
gt;• '»	7,8	0,94	0,87
gt;gt; gt;gt;	7,9	1,17	1,09
	8,2	1,74	1,64
♦ J »gt;	8,4	1,84	1,76
»	8,7	1,67	1,61
99 99	8,9	1,63	1,56

Puffergemisch	Pii des Ansatzes elektro- metrlsch gemessen	Aciditätszunahme In ccm 1/10 n NaOH
Glycocoll-HCl	3,3	0,01
99 99	i 3,7	0
99 99	1 4,0	0,05
99 99	4,4	0,08
K-Biphtalat-NaOH	4,8	0,03
	5,1	0,02
	5,8	0,03
Glycocoll	6.1	0
K-Biphtalat-NaOH	j 6,2	0,02
Na-Borat-HCl	6,5	0,05
»» 5»	6,8	0,06
	7,3	0,04
Glycocoll-NaOH	7,5	0,05
„ »	7,8	0,07
Na-Borat-HCl	7,9	0,08
Glycocoll-NaOH	8,2	0,10
}t quot; !	8,4	0,08
1 quot; **	8,6	0,06
„ » 1	8,8	0,07

Puflergemisch	Pii des Ansatzes colori- metrisch gemessen	Aciditätszunahme in ccm 1/10 n NaOH
Glycocoll-HCl	6,2	0,08
„ NaOH	6,8	0,22
» »	7,4	0,40
j» gt;t	7,8	0,49
» »	8,1	0,58
99 »•	8,4	0,65
99 99	8,9	0,48
99 99	9,1	0,26

Enzymlösung	Zeit der Aktivierung	Aciditätszunahme
Enzymlösung	in Stunden	in ccm l/lO n NH2
Rohextrakt -f- H2O	—	0,71
gt;, HgS		0,54
» rr		0,50
'» »	1	0,212
	IV.	0,17
Rohextrakt -f- HgO	—	0,57
HCN^	3	0,51

Enzymlösung	Aciditätszuwachs in ccm l/lO n NaOH
Rohextrakt -J- HjO	3,54
Rohextrakt 1 ccm Enterokinase	3,51
Rohextrakt 2 ccm Enterokinase	3,51

		Angewandt		Reaktion		Proteinase
Ausgangslösung	Adsorbens	ccm	mg	der Lösung Pu	Enzymlösung	Beobachtete Spaltung	Proteinase- Einheiten	Ausbeute in % des Roh- extraktes
Rohextrakt „ 5,	Kaolin 3,	1,25 2,5 5 10	110 220 440 880	4 4 4 4	Rohextrakt Restlösung 1. Adsorption quot; y) quot; „ quot; »	2,25 2,18 2,09 2,00 1,95	1 0,94 0,86 0,78 0,75	100 94 86 78 75
Rohextrakt »	Tonerde 5?	1,25 5 1,25 2,5 5	18 72 18 36 72	4 4 8 8 8	Restlösung 1. Adsorption ,, „ gt;' ,J	2,21 1,99 2,18 2,10 2,04	0,96 0,77 0,94 0,87 0,81	96 77 94 87 81
Rohextrakt Restlösung 1. Adsorption	Kaolin	2,5 2,5	220 220	4 4	Restlösung 1. Adsorption 2. „	2,09 1,97	0,86 0,76	86 76
2. 3. „		2,5 2,5	220 220	4 4	quot; 3. „ quot; „	1,88 1,79	0,70 0,65	70 65
Rohextrakt Restlösung 1. Adsorption	Kaolin	1,25 1,25	110 110	4 4	Restlösung 1. Adsorption 2. „	2,18 2,13	0,94 0,89	94 89
quot; 2. „ 2. 2. „ ,, 2. „	»	1,25 1,25 2,5 5,0	110 110 220 440	4 8 8 8	„ 3 a. 3 b. „ 3 c. „ • 3d. „	2,08 1,95 1,93 1,90	0,85 0,75 0,74 0,72 1	85 75 64 72

Au3gangslösung	Angewandt			Reaktion der löaung Pn	Enzymlösung	Proteina.se
Au3gangslösung	Adsortens	ccm	mg	Reaktion der löaung Pn	Enzymlösung	Beobachtete Spaltung	Proteinase- Einheiten	Ausbeute in % des Roh- extraktes
Rohextrakt Restlösung 1. Adsorption 1.	Tonerde j) 5,	1,25 1,25 1,25	18 18 18	8 8 4	Restlösung 1. Adsorption „ 2 a. „ 2a.	2,18 2,11 2,06	0,94 0,88 0,83	94 88 83
Rohextrakt Restlösung 1. Adsorption 2. „ 3. „ 2. „ 3. „	Kaolin ff Tonerde 9y 9*	2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5	220 220 36 36 36 36	4 4 4 4 8 8	Restlösung 1. Adsorption 2. „ 3.nbsp;„ 99 4. ,, 99 3. „ 4.	2,09 1,97 1,91 1,88 1,91 1,89	0,86 0,76 0,73 0,70 0,73 0,71	86 76 73 70 73 71
Rohextrakt Restlösung 1. Adsorption 2. „ 3. 4.nbsp;„ 5.	Tonerde 99 Kaolin 99 Tonerde 99	1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25	18 18 110 110 18 18	8 8 4 4 8 8	Restlösung 1. Adsorption j, 2. ,, ,, 3. ,, 99 4. ,, 5. „ 99 6- 99	2,18 2,11 1,96 ^ 1,88 ni 1,82	0,94 0,88 0,76 0,70 cht bestim 0,67	94 88 76 70 mt 67
Rohextrakt 4 maliger Adsorption Restlösung 4. Adsorption 5. 4.	Kaolin Tonerde 99	2,5 2,5 2,5 2,5 2,5	220 36 36 36 36	4 8 8 4 4	Restlösung 4. Adsorption 5. 6- 5., „ 6.nbsp;„	3,25 2,67 2.47 2,45 2,50 2.48	2 1,36 1,18 1,16 1,20 1,18	100 68 59 58 60 59

Enzymlösung	Proteinase			Dipeptidase
	Wir-	Ein-			-------
	Wir-	Ein-	Aus-	Wir-	Ein-	Aus-
	kung	heiten	beute	kung	heiten	beute
Rohextrakt..........	2,25	1,0	100	1,67	1,0	100
Restlösung der 1. Adsorption. . .	2,10	0,87	87	0,66	0,37	37
Elution A des 1. Adsorbates . . .	0,14	0,03	3	0,0	0,0	0
Restlösung der 2. Adsorption. . .	1,96	0,76	76	0,48	0,26	26
Elution A des 2. Adsorbates . . .	0,09	0,02	2	0,0	0,0	0
Restlösung der 3. Adsorption. . .	1,88	0,70	70	0,28	0,15	15
Elution A des 3. Adsorbates . . .	0,09	0,02	2	0,0	_	___
Restlösung der 4. Adsorption. . .	1,79	0,65	65	0,01	0	0
Elution A des 4. Adsorbates . . .	0,09	0,02	2	0,0	—	—
Rohextrakt...........	2,25	1,0	100	1,67	1,0	100
Restlösung der 1. Adsorption. . .	2,06	0,83	83	0,65	0,36	36
Elution B des 1. Adsorbates . . .	0,14	0,03	3	0	0,0	0
Restlösung der 2. Adsorption. . .	1,97	0,76	76	0,52	0,29	29
Elution B des 2. Adsorbates . . .	0,08	0,02	2	0,0	0,0	0
Restlösung der 3. Ad.sorption. . .	1,91	0,73	73	0,29	0,16	16
Elution B des 3. Adsorbates . . .	0,08	0,02	. 2	0,0	0	0
Restlösung der 4. Adsorption. . .	1,79	0,65	65	0,0	0	0

	Proteinase			Carboxypolypeptidase			Aminopolypeptidase			Dipeptidase
Enzymlösung	Wir- kung	Ein- heiten	Aus- heute in %	Wirkung	Einheiten	Ausheute in %	Wirkung	Einheiten	Ausbeute in %	Wirkung	Einheiten	Ausheute in %
Rohextrakt.......	2,25	1	100	0,58	1	100	1,10	1	100	1,70	1	100
Restlösung d. 1. Adsorption Elution aus d. 1. Adsorbat	2,31	1	100	0,56	0,95	95	1,02	0,93	93	—	—	—
Restlösung d. 2. Adsorption Elution aus d. 2. Adsorbat	2,11 0,22	0,87 0,05	87 5	0,40 0,18	0,65 0,28	65 28	0,89 0,15	0,80 0,14	80 14	0,50	0,28	28
Restlösung d. 3. Adsorption Elution aus d. 3. Adsorbat	1,95 0,16	0,75. 0,03	75 3	0,25 0,15	0,40 0,23	40 23	0,70 0,05	0,63 0,05	63 5	0,34	0,18	18
Restlösung d. 4. Adsorption Elution aus d. 4. Adsorbat	1,79 0,17	0,65 0,03	65 3	0,15	0,23	23	0,55 0,07	0,49 0,06	49 6
Rohextrakt (0,1 ccm) ...	3,25	2	100	0,85	2	100	1,74	2	100	.—	—	—
Restlösung d. 4. Adsorption	2,49	1,19	60	0	0	0	0,72	0,64	32	—	—	—

Puflergemisch	Pii des Ansatzes (elek- trometrisch gemessen)	Ae. Zuwachs in 1/10 n NH2
K-Biphtalat-HCI	4,3	0,11
NaOH	5,2	0,20
KH^PO,, Na^HPOi	6,3	0,29
	6,8	0,31
	7,7	0,41
	8,1	0,45
	8,6	0,35

Puffergemisch	p,i des Ansatzes (elek- trometrlsch gemessen)	Ac.-Zuwachs in 1/10 n NH2
K-Biphtalat-HCl	4,3	0,21
KH2PO4, Na,HPO,	6,3	0,44
» ,,	6,8	0,50
» 5,	8,1	0,64
	8,6	0,55

Enzymlösung	Zeit der Aktivierung in stunden	Aciditätszunahme in ccm 1/10 n NH2
Proteinaselösung a HjO	—	0,17
a-fO,l ccm HCN	2	0,15
a-1-0,2 „ „	2	0,14
Proteinaselösung b HaO	3	0,35
b 0,1 ccm HCN	3	0,25 .
b 0.2 „ „	3	0,25