TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT
OP GEZAG VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS
Dr. L. S. ORNSTEIN, HOOGLEERAAR IN DE
FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE
VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER
UNIVERSITEIT TE VERDEDIGEN TEGEN DE
BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS-
EN NATUURKUNDE OP MAANDAG 23 MEI 1932
DES NAMIDDAGS TE VIER UUR

Nu ik mijn studietijd afsluit met dit proefsclirift, dat nood-
zakelijkerwijs een weerspiegeling is van mijn wetenschappelijke
vorming, is het mij een behoefte dank te brengen aan allen, die
hieraan hebben medegewerkt.

Hooggeleerde Went, Hooggeachte Promotor, ik beschouw het als
een groot voorrecht, dat ik zal behooren tot degenen, die bij U hun
dissertatie hebben bewerkt. Voor de vrijheid, die Gij mij gelaten
hebt bij de keuze van het onderwerp van mijn dissertatie, ben ik
U zeer dankbaar. Dat Gij bij Uw veelomvattende arbeid voor ieder
onzer zulk een groote belangstelling toont, heeft mij steeds getroffen.
Uw leerrijke kritiek is voor mijn wetenschappelijke ontwikkeling
van groot belang geweest. Voor de mij betoonde gastvrijheid ten
Uwen huize, ben ik Mevrouw Went en U zeer dankbaar.

Hooggeleerde Westerdijk, Jordan, Pulle, Nierstras:^ en Kruyt,
al heb ik mij ook niet in de door U gedoceerde vakken verder ont-
wikkeld, toch zijn Uw colleges en practica voor mij van groote
waarde geweest. Ik heb het dikwijls betreurd, dat ik mij in Uw
vakken niet verder heb kunnen verdiepen. U, Hooggeleerde Jordan,
dank ik in het bijzonder voor hetgeen Gij aan mijn algemeene geeste-
lijke ontwikkeling hebt bijgedragen.

Hooggeleerde Baas-Becking, het feit, dat Gij de aanleiding gaaft
tot dit onderzoek, bewijst voldoende, welk een invloed Gij op mijn
wetenschappelijke vorming hebt gehad. Uw enthousiaste belang-
stelling en inzicht in de biologische problemen hebben mij over
vele moeilijkheden heen geholpen.

Hooggeleerde Kluyver, de korte tijd, dat ik onder Uw leiding
in Uw laboratorium heb mogen werken, is voor mij van zeer groote
beteekenis geweest. Zonder Uw hulp had ik dit onderzoek niet
kunnen verrichten. Ook Uw assistenten, in het bijzonder, U zeer-
geleerde Elema ben ik zeer verplicht.

Een gedeelte van het h.er beschreven onderjoek heb ik uitgevoerd
m het Phys.sch Laboratorium te Utrecht. Voor de raad en hu p
aldaar ontvangen zeg ik U, Hooggeleerde Ohnstein e„ de asLtën
2 van dtt laboratorium, in het biizonder U, Zeergeleerde ^

De Jong, zeer veel heb ik gehad aan Uw ralLvintn 00
microbiologisch of chemisch gebiednbsp;augevmgen op

Geachte Heer Lieert, ik dank U zeer voor de inlichtingen, die
Gl, mi, verstekt hebt omtrent het onderwerp van mijn disLati

HOOFDSTUK II. Literatuuroverzicht, betreffende de
micro-organismen, die het rood worden van gezouten

HOOFDSTUK III. Eigen isolaties en wijze van kweeken 19
HOOFDSTUK IV. Beschrijving van de gekweekte roode

en oranje BACTERIEN en vergelijking van deze met bac-
terien door vroegere onderzoekers beschreven .... 22
§ i. De staafvormige roode bacterie van klipvisch, haring

B.nbsp;Enkele morphologische en physiologische ge-
gevens .............. .... 25

HOOFDSTUK V. Gasvacuolen, als oorzaak van het ver-
schil in doorzichtigheid tusschen de culturen van de
verschillende stammen van bacterium halobium
§ I. Inleiding ....
§ 2. Literatuuroverzicht. ....
§ 3. Eigen proeven en bespreking der resultaten in verband

9.nbsp;Berust het verschil in kleur tusschen de ver-
schillende stammen op een verschil in kleur-
stof? ........

43
43
49

56
56

66
66
66
66

68
69

Het feit, dat er nog levende wezens worden aangetroffen in pekels
van zeer hooge concentratie, .is reeds lang bekend. Het zout is im-
mers een zeer gebruikelijk conserveeringsmiddel. Dat er dan toch
in gezouten levensmiddelen bederf kan optreden, heeft aanleiding
gegeven tot een reeks onderzoekingen ter bestrijding hiervan. Deze
onderzoekingen gelden dus pekels, waarvan keukenzout het hoofd-
bestanddeel uitmaakt, calcium, magnesium en sulfaat nooit geheel
afwezig zijn en de reactie ongeveer neutraal of iets zuur is. Soort-
gelijke pekels komen tot stand in de zouttuinen, waar zout gewonnen
wordt uit zeewater. Maar ook in de natuur, in woestijn- en berg-
streken komen pekels voor; de zoutmeren in het Westen van Noord-
Amerika, in Egypte en in Hongarije zijn hier voorbeelden van. In
deze natuurlijke pekels en in de zouttuinen komen eveneens orga-
nismen voor. Waar de natuurlijke pekels het gevolg zijn van indam-
ping van rivierwater, kan het voorkomen, dat, zooals in het Groote
Zoutmeer van Utah, de samenstelling van de pekel niet veel verschilt
van die der pekels, die ontstaan bij indamping van zeewater. In de
natuur komen echter ook pekels voor van geheel andere samenstel-
ling, zoo kan b.v. een groot percentage van het zout uit carbonaten
bestaan, waardoor ook de pH hooger is, dan van de eerstgenoemde
pekels. Zoo heeft het Searles-meer, behoorende tot het Haiwee-
bassin (in het Westen van N.-Amerika) een pH van 9,5. Ook komen
in dit meer sulfiden voor.

Nu is het een opvallend feit, dat een deel van de flora van alle
genoemde pekels bestaat uit roode bacteriën: Baas-Becking (1931)
schrijft in „Historical notes on salt and saltmanufacturequot;, dat ver-

schillende pekelmeren een roode kleur hebben, tengevolge van het
voorkomen van bacteriën. Ook haalt deze auteur zeer oude literatuur
aan, waaruit blijkt, dat reeds lang de roode kleur van natuurlijke
zouten bekend was (Plinius zegt, dat een van de kenmerken van
het echt zijn van „nitrumquot; uit Lydia, de roode kleur is). Verder
heeten verschillende woestijnmeren „roode merenquot;. Wat de pekels,
die ontstaan bij het indampen van zeewater in zouttuinen betreft,
hierover zegt Tressler (1923), dat, als de pekel bijna verzadigd is,
de oplossing steeds roze wordt, zoodat deze kleur gebruikt wordt
als indicator, dat de pekel geschikt is om overgebracht te worden
naar de pannen, waar, na indamping van deze pekel en afvoeren
van de moederloog, het ruwe zout gewonnen kan worden. Ook deze
kleur is het gevolg van roode bacteriën (Peirce (1914)) en dat ook
deze roode verkleuring reeds lang bekend is, blijkt uit hetgeen Baas-
Becking (1931(6)) vindt in zeer oude Chineesche manuscripten,
waar vermeld staat, dat het zeewater ingedampt wordt, totdat de
kleur rood wordt.

De derde pekel, waarvan sprake was, is de pekel, die ontstaat bij
het zouten van levensmiddelen. Dat ook hier een deel van de flora
uit roode bacteriën bestaat, blijkt uit het feit, dat het rood worden
van gezouten visch een veel voorkomende „bacteriënziektequot; is. De
vraag rijst nu, of dit rood worden van pekels het gevolg is van het
optreden van dezelfde bacteriën of tenminste van dezelfde groep van
bacteriën. Van Niel (1931) gelukte het uit de pekel van het Searles-
meer een zwavel-purperbacterie te isoleeren. Baas-Becking (1928)
had deze bacterie reeds als oorzaak van de roode kleur van het zout
en de pekel uit dit meer beschreven en er de naam van Rhodospirillum
halophilum aan gegeven. Uit de onderzoekingen van van Niel (1931)
blijkt, dat de volgende condities noodig zijn voor de ontwikkeling
van zwavel-purperbacteriën: volledig anaërobe omstandigheden, licht
en oxydeerbare zwavel of zwavelverbindingen, als HgS (welke stof
reeds de aanwezigheid van zuurstof uitsluit) sulfiet of thiosulfaat,
terwijl zij zich bij afwezigheid van dergelijke oxydeerbare anorgani-
sche verbindingen, anaëroob in het licht, ook met organische stoffen
kunnen ontwikkelen. Waar nu niet te verwachten is, dat deze con-
dities vervuld zijn in de pekels, die ontstaan, wanneer visch gezouten

wordt of in zouttuinen, 'is het niet waarschijnlijlc, dat zwavel-purper-
bacteriën hierin voorkomen. Toch blijft het zeer goed mogelijk, dat
men in deze pekels met de heterotrophe Athiorhodaceae, dus toch
met purperbacteriën te maken heeft, die zuurstof kunnen verdragen,
deze zelfs noodig hebben in het donker. Klebahn (1919) onderzocht
het pigment van een roode bacterie van klipvisch d.i. gezouten en
gedroogde kabeljauw. Het absorptie-spectrum, dat hij ontwierp van
een alcoholische oplossing van deze kleurstof komt nu echter niet
overeen met dat van de kleurstof van de purperbacteriën, de bacterio-
purpurine. Hieruit zou dus volgen, dat er een fundamenteel verschil
bestaat tusschen de purperbacteriën en de roode bacteriën, die voor-
komen in pekelvisch. Dit nader na te gaan is het doel van dit onder-
zoek. Hieraan knoopt zich een onderzoek vast, ten einde iets meer te
weten te komen van de morphologie en van het potentieele milieu
van de bacteriën uit de pekel. Onder potentieel milieu wordt hier
verstaan het complex van omstandigheden, waarbij deze organismen
kunnen voorkomen (Baas-Becking (1931 (c)).

literatuuroverzicht, betreffende de MICRO-ORGANISMEN, die het
rood worden VAN gezouten visch VEROORZAKEN

Er heerscht een groote verwarring aangaande het aantal en de
nomenclatuur van de bacterien en andere organismen, die het rood
worden van gezouten visch veroorzaken. Voor een uitvoerige be-
spreking van de literatuur vóór 1919, verwijs ik naar het literatuur-
overzicht van Klebahn (1919). Klebahn zelf onderscheidde drie
verschillende soorten aëroob te kweeken bacteriën, door hem van
klipvisch geïsoleerd, die hij de volgende namen gaf: Sarcina mor-
rhuae Farlow (cellen: 1,5—2,2 f^ in diameter, gram-negatief, kleur-
stof blijft in de cel). Micrococcus (Dipïococcus) morrhuae n. sp.
(cellen: i—1,5^ in diameter, gram-negatief, kleurstof in de cel).
Bacillus halobius ruber n. sp. (geen sporen, gram-negatief, kleurstof
in de cel). Hij laat in het midden of Sarcina rosacea J.-Olsen, waar-
van de cellen slechts 0,3—0,5^ groot zijn (Johan-Olsen (1887)),
Micrococcus littoralis (Poulsen) Kellerm., die gram-positief is (Kel-
lerman (1914)), Dipïococcus gadidarum Beckw., die gram-positief
is en 0,5 jw per cel groot is (Beckwith (1911)), Bacillus Danteci
Krause, die sporen vormt (Le Dantec (1891)), de Bacillus van
Peirce (1914), waarvan de kleurstof in de agar diffundeert en de
„Coccus du rouge de moruequot; van Le Dantec (1891), waarvan de
cellen 3—5 fi, groot zijn, tot deze bacterien behooren of andere
soorten vertegenwoordigen.

Wat Clathrocystis roseo-persicina betreft, welke verschillende
onderzoekers (o.a. Farlow (1880) en Patouillard (1885)) van
klipvisch isoleerden, Klebahn (1919) meent, dat deze niet als eigen-
lijke veroorzaker van het rood worden mag worden opgevat.

Na Klebahn (191g) hebben eerst Martel en Germain in 1921,
als veroorzaker van het rood worden van gezouten visch een bacterie
geïsoleerd, die zij Micrococcus ruhro-viscosus noemden, Harrison
en Kennedy in 1922 een bacterie, die zij Pseudomonas salinaria
noemden, daarna Cloake in 1923 een Sarcina, een Coccus, een
Staphylococcus en een staafvormige bacterie, Liebert en Deerns
in 1930 een Sarcina, een Micrococcus en een Bacillus met sporen,
terwijl Hanzawa en Takeda in 1930 behalve kleurlooze bacteriën
slechts een roode spruitende schimmel van rood gekleurde klipvisch
konden isoleeren, die zij Torula Wehmeri noemden, daar Wehmer
(1897) reeds een roode gist van gezouten haring isoleerde. In 1927
geeft Tattevin een samenvatting, hoewel blijkt, dat hij de onder-
zoekmgen van Klebahn (1919), Cloake (1923) en Peirce (1914)
niet kent, waarin hij de organismen, door de verschiUende onder-
zoekers geïsoleerd, met elkaar vergelijkt. Hij concludeert, dat de
roode kleur veroorzaakt wordt door de volgende organismen:

1.nbsp;Micrococcus littoralis Poulsen (Volgens Tattevin = Micro-
coccus rubro-viscosus Martel et Germain (1921) = Coccus
„du rouge de morue*' Le Dantec (1891)).

3.nbsp;Sarcina littoralis Poulsen (1879/80) (Volgens Tattevin =
Sarcina morrhuae Farlow (1880)).

4.nbsp;Bacillus ruhescens Edington (1887). (Volgens Tattevin =
la bactérie chromogène Gayon et Carles (1885) = le bacille éry-
throgène of „du rouge de moruequot; Le Dantec (1906)).

5.nbsp;Bacille rouge de Terre-Neuve Le Dantec (1891) = Bacillus
Danteci Krause (1896).

Daar Klebahn (1919) van meening is, dat le bacille érythrogène
van Le Dantec dezelfde is als Bacillus halobius ruber Klebahn,
wordt bij dit lijstje door Klebahn alleen Micrococcus (Diplococcus)
morrhuae toegevoegd, of deze moet dezelfde zijn als Micrococcus
littoralis Poulsen, die echter volgens Kellerman (1914) gram-
positief is. Daar Tattevin niet het onderzoek van Mauriac (1886/89)
vermeldt, die een Bacillus en een Micrococcus isoleerde van klip-

visch, die volgens hem alleen, als zij te zamen voorkomen, de roode
kleurstof produceeren, is het mogelijk, dat ook deze twee organismen
aan het lijstje moeten worden toegevoegd. Van meer belang is
Pseudomonas sälinaria Harrison et Kennedy. Deze bacterie werd
van klipvisch geïsoleerd en komt geheel overeen met Bacillus halo-
hius ruber Kl, Daar Harrison en Kennedy (1922) het onderzoek
van Klebahn (1919) niet kenden, kwamen zij ertoe, deze bacterie
een nieuwe naam te geven. Nog verwarrender maakt Bergey (1930)
het, als hij de bacterie omdoopt in Serratia salinaria, dus een ver-
wantschap met Serratia ,marcescens Bizio (Kever gezegd Bacillus
prodigiosus) aanneemt. Wat de bacteriën van Cloake (1923) en
Liebert en Deerns (1930) betreft, het blijkt, dat deze zeer goed over-
komen met reeds beschreven -en in het lijstje van Tattevin (1927)
vermelde bacteriën. Cloake (1923) vermeldt n.1., dat de door hem
geïsoleerde Sarcina, Coccus en Staphylococcus waarschijnlijk één en
dezelfde soort zijn, deze kan dus dezelfde zijn, als Sarcina morrhuae
Farlow, hoewel volgens Cloake de bacterie gram-positief is. De be-
schrijving van Cloake (1923) van de staafvormige bacterie, door
hem van gezouten visch geïsoleerd, komt volkomen overeen met die
van Klebahn's Bacillus halobius ruber. Liebert en Deerns (1930)
die haring, gezouten Cardium edule en zeezout onderzochten, iso-
leerden drie verschillende bacteriën, waarvan de Sarcina en de Coc-
cus zeer sterk geleken op Klebahn's Sarcina en Micrococcus. Wat
hun sporenvormende bacterie betreft, deze kan gelijk zijn aan
Bacillus Danteci Krause. Er blijft dus nog over de „Bacillusquot; van
Peirce (1914). Deze bacterie, die Peirce niet van gezouten visch,
maar uit zeezout van de zouttuinen bij Redwood City (California)
isoleerde, waarmee hij echter ook klipvisch kon infecteeren, doet in
afmetingen (3,2 bij 3,5 /i) meer aan een Coccus denken. Daar de
afmetingen te groot zijn voor een van de Cocci van het lijstje en Peirce
vermeldt, dat de kleurstof in de agar diffundeert, wil ik voor-
loopig deze bacterie aan het lijstje toevoegen.

Het lijstje micro-organismen, die als de oorzaak beschreven zijn
van „roodequot; gezouten visch, wordt dus:

3» Micrococcus {Dipïococcus) morrhuae Klebahn.
4. Sarcina morrhuae Farlow.
Zl- 5. Bacillus halobius ruber Klebahn.

Het blijft echter hoogstwaarschijnlijk, dat vele van deze bacteriën
identiek zijn. Later zal hierop nader worden ingegaan.

Van een reederij ontving ik eenige z.g. roode haringen in een ton-
netje met pekel. Van buiten was aan deze haringen weinig waar te
nemen, maar het bleek dat hom en kuit geheel rood waren gekleurd, ^
Stukken van deze organen werden in steriele petrischalen gelegd
op een laag van vochtig keukenzout, dat eveneens van te voren ge-
steriliseerd was. Ook werden gedeelten van hom en kuit in schalen
op een vaste voedingsbodem uitgelegd, die uit 30 % NaCl i), i %
pepton „Poulencquot; en 2V2 % agar bestond en een neutrale of eenigs-
Zins alkalische reactie vertoonde. Deze reactie is noodzakelijk voor^
het verkrijgen van de noodige vastheid van de voedingsbodem. J

Verder werd in twee petrischalen over een vaste bodem van de-
zelfde samenstelling, een entnaald uitgestreken, die bij de eerste
schaal gedoopt was in een verzadigde oplossing van NaCl, die met
stukjes hom of kuit geschud was en bij de tweede in de pekel, waarin
de haringen zich bevonden. Daar in de literatuur over de roode visch-
bacteriën meermalen vermeld wordt, dat deze „ziektequot; slechts op-
treedt, als de visch aan tamelijk hooge temperatuur wordt bloot-
gesteld, in de zomer of bij verzenden naar Zuidelijke landen (Beck-
with (1911), Cloake (1923), Hanzawa en Takeda (1930) e.a.) en
ook de optimum temperatuur zoowel voor Sarcina's als bacillen
bij ± 37° gevonden wordt (Cloake (1923). Klebahn (1919)), werden
alle petrischalen met entmateriaal in een thermostaat bij een tem-
peratuur van 37° geplaatst. Zoowel op het steriele zout als op de voe-
dingsbodem was na ongeveer eenjve^k een cultuur van roode bac-

Hieronder wordt in dit onderzoek steeds verstaan 30 gram Na Cl
opgelost in 100 cc water.

teriën ontstaan. De platen, waarop entmateriaal was uitgestreken,
bevatten na ongeveer dezelfde tijd vele roode ronde kolonies. Ver-
volgens werden stukken klipvisch, die mij door tusschenkomst van
Professor H. Klebahn als geïnfecteerd zijnde met roode bacteriën
-uit Bergen (Noorwegen) waren toegezonden, op dezelfde manier be-
handeld. In tegenstelling met de haring was aan deze stukken met
het bloote oog weinig of niets waar te nemen.

Evenzoo verkreeg ik op dezelfde gemakkelijke wijze een cultuur
quot;van roode bacteriën uit Trapani-zout, dat geheel rood gekleurd was
•en dat eveneens van vischzouterijen in Bergen afkomstig was. Het
bleek, dat al deze bacteriën staafvormig waren en dat degene van de
haring en de klipvisch in grootte en kleur zeer veel op elkaar geleken,
terwijl de bacteriën uit Trapani-zout geïsoleerd meer oranjerood
van kleur waren en kleiner van afmeting. Het gelukte dus de bacteriën
op een bodem, waarin als organischs stof slechts pepton aanwezig
was, te kweeken. De vroegere onderzoekers hebben allen visch-
bouillon of vischbouillonagar gebruikt, waaraan zij keukenzout
toevoegden, terwijl Klebahn (1919) de bacteriën ook zeer goed op
paardenserum met i % pepton of met i % pepton en i % druiven-
suiker kon kweeken. Hij had geen resultaat met albumine. Waar-
schijnlijk geven de bacteriën de voorkeur aan pepton boven eiwit.
Ook Liebert en Deerns (1930) merken op, dat als men bij de ge-
bruikelijke vischbouillon trypsine voegt, de roode bacteriën er zich
beter in ontwikkelen.

Liebert (1924) wijst er op, dat ook het eiwit van de pekelharing
■gedeeltelijk is omgezet door het enzym uit de Appendices pylorici,
die bij het kaken niet worden verwijderd. Hij neemt waar, dat de
werking van het enzym door het zout niet wordt beïnvloed.

Het gelukte niet een roode Sarcina uit het zout of van de visch
te isoleeren. Culturen van Sarcina morrhuae Farlow ontving ik
echter van Professor A. J. Kluyver en Ir. F. Liebert. Deze waren
•door den laatsten geïsoleerd. Eveneens verkreeg ik een cultuur van
een staafvormige roode bacterie van Professor A. J. Kluyver, die
:Zeer veel overeenstemming vertoonde met de roode staafvormige

bacterie van haring en klipvisch. Deze was door Dr. L, E. den
Dooren de Jong van gezouten kabeljauw geïsoleerd. Wel ont-
wikkelden zich nog op de agarbodem (30 % NaCl, i % pepton) uit
de haring een kleurlooze Sarcina (welke in het laatste hoofdstuk
behandeld zal worden) en een schimmel, die tot Torula epizoa Corda.
bleek te behooren. Ook werd in de pekel, waarin de haringen zich
bevonden, bij microscopisch onderzoek een gistachtig spruitende
schimmel waargenomen.

Prof. Dr. H. Klebahn, Prof. Dr. A. J. Kluyver, Ir. F. Liebert
en Dr. L. E. den Dooren de Jong dank ik op deze plaats ten zeerste
voor het mij doen toekomen van geïnfecteerd materiaal of culturen.

beschrijving van de gekweekte roode en oranje bacteriën en
vergelijking van deze met de bacteriën door vroegere onder-
zoekers beschreven

§ i. De staafvormige roode bacterie van klipvisch, haring en ge-
zouten kabeljauw,
A. Onderscheiding in verschillende stammen.

De laag bacteriën, die op de voedingsbodem, waarop stukjes hom
en kuit van haring gebracht waren, was ontstaan, was aanvankelijk
geheel doorzichtig rood gekleurd. Na eenige weken trad hierin
echter verandering op: een gedeelte van de cultuur werd troebel en
rose van kleur. Een soortgelijke verandering was in de kolonies, die
door uitstrijken van entmateriaal uit roode haring verkregen waren,
opgetreden. Twee groepen van kolonies kwamen voor: de iste groep
bestond uit doorzichtige, de 2e groep uit ondoorzichtige kolonies.
Deze ondoorzichtigheid is het gevolg van het optreden van een of
meer lichaampjes in de bacterie-cel. Deze lichaampjes zullen in het
volgende hoofdstuk behandeld worden. De doorzichtige kolonies kan
men onderverdeelen in oranjeroode, roode en paarsroode; de ondoor-
zichtige in kolonies, die roze, lila (in een meer roode en een meer
blauwe tint) en bijna wit van kleur zijn (men moet hierbij wel onder-
scheid maken tusschen wit en kleurloos). Het bleek, dat men hier
van verschillende stammen kan spreken, die in alle eigenschappen
overeenkomen, behalve in de kleur en in het al of niet voorkomen
van de genoemde lichaampjes in de cel. De eigenschappen van de
stammen bleken bij verder kweeken constant te zijn, ook wanneer een
suspensie van de bacteriën van een der stammen opnieuw werd

uitgestreken over een vaste voedingsbodem: er ontstonden dan slechts
kolonies van de kleur der moederkolonie. Wel was weer hetzelfde
verschijnsel op te merken als bij de oorspronkelijke isolaties: de
ondoorzichtigheid bij de stammen uit groep II trad pas op, als de
cultuur zich reeds geheel of bijna geheel ontwikkeld had. Een uitzon-
dering maakte hierop de bijna witte stam, waarbij de totale ondoor-
zichtigheid n.1. het „wittequot; uiterlijk reeds zeer vroeg in de ontwik-
keling optrad. Volgens de uitstrijkmethode werden van alle stam-
men reinculturen verkregen. Er werden zeven verschillende stammen
uit haring geïsoleerd. Ik wil deze met een nummer aanduiden, ont-
leend aan de Code des couleurs van Klincksieck en Valette (1908).
Op vaste bodem:

Stam 4) Oorspronkelijk doorzichtig roodoranje, later ondoor-
zichtig rose (56,61 of 66 al naar mate van ondoorzichtigheid).

Stam 6) Oorspronkelijk doorzichtig kleurloos, daarna door-
zichtig bruin (28), later ondoorzichtig lila (541 of 546 naar mate van
ondoorzichtigheid).

Stam 7) Oorspronkelijk eenigszins doorzichtig kleurloos, daarna
ondoorzichtig wit, later ondoorzichtig rose of lila (578 A of B,
553 A of B, 528 A of B, 503 A of B, 478 A of B naar meer of mindere
mate van witheid).

In vloeibare voedingsoplossing, waarin de bacterie zich goed ont-
wikkelde, is de verschillende kleur van de stammen binnen een
groep even goed, het verschil in doorzichtigheid tusschen de twee
groepen echter moeilijker dan op vaste bodem waar te nemen.

Dit is het gevolg van het feit, dat elke bacterie-cultuur in een vloei-
stof deze een zekere troebelheid verleent. Alleen stam 7) valt op
door het melkachtig witte uiterlijk van de cultuur.

Nu moet men niet denken, dat binnen een stam nooit verschillen
in kleurnuance optreden,' bij overenten waren deze echter nooit
constant. Zoo kwam het voor, dat oude culturen bijna geheel de

kleur verloren, ook kwamen meer paars en meer rood getinte cul-
turen van één stam voor. Ook bleek (toen de bacteriën in groote
hoeveelheid in petrischalen werden gekweekt), dat onder gelijke
omstandigheden en dezelfde ouderdom de bacteriën van één op de
20 platen de kleurstof geheel konden verliezen of dat de kleur geheel
afweek (b.v. bijna blauw was). Ook deze afwijkingen waren niet
constant bij overenting. Bij het vergelijken van de kleur van de
culturen van 2 petrischalen moet men er wel op letten met een
zelfde dikte van de laag bacteriën te doen te hebben. Het ver-
schijnsel, dat Eykman (1904) waarnam, n.1. dat de groei van bacte-
riën sterk afhankelijk is van de dikte van de laag voedingsbodem,
kwam bij deze wijze van kweeken, waarbij de plaat geheel bedekt is
met de cultuur, sterk tot uiting. Waarschijnlijk wordt dus ook door
deze bacterie een stof afgescheiden, die in de agar diffundeert en
die de ontwikkeling van de eigen soort remt, zooals Eykman (1904)
bij verschillende bacteriën, b.v. Bacterium co/z aantoonde. Bij stam 4)
trad nu echter een verandering van kleur op, die constant scheen:
in een cultuurbuis met vaste bodem waren gedeelten van de cultuur,
die rechtlijnig afgegrensd waren, bruin van tint en bleven helder!
doorzichtig.

Het bleek, dat de lichaampjes bij de bacteriën in deze helder
bruine gedeelten niet aanwezig waren. Bij overenten uit deze ge-
deelten, bleef de kleur van de cultuur eenige tijd constant, totdat
een cultuur regelmatig langs de geheele rand weer ondoorzichtig
begon te worden, tengevolge van opnieuw vorming van de genoemde
lichaampjes.

Uit klipvisch gelukte het mij slechts één stam te isoleeren en ook
de bacterie-cultuur van gezouten kabeljauw bleek een reincultuur
te zijn van één stam. De eerstgenoemde was dezelfde als stam 5)
uit haring, de laatste had een kleur, die tusschen stam 4) en 5) uit
harmg in staat. Deze stam 8) is oorspronkelijk doorzichtig roodoranje
later ondoorzichtig rood (staaltje 41 of 46 van de Code, naar mate van
ondoorzichtigheid).

Het feit, dat de kleur van de bacterie in de loop van de ontwikke-
hng kan veranderen, geeft misschien de mogelijkheid na te gaan hoe
de kleurstof in de bacterie gevormd wordt. Ik spreek hier alleen

van de overgang van kleurloos over bruin naar lila bij stam 6), daar
bij deze stam, in tegenstelling tot de andere uit groep II, de kleur-
verandering niet alleen het gevolg is van het troebel worden, ten-
gevolge van het optreden van de bepaalde lichaampjes in de cel.

De bacteriën werden waargenomen in een verzadigde Na Cl op-
lossing. Zij zijn staafvormig en vormen geen sporen. De afmetingen
van bacteriën uit jonge culturen bedragen: 0,6—0,9 n bij 2—öyw op
vaste voedingsbodem, terwijl in vloeibaar milieu ook langere voor-
komen (0,6—0,9 jii bij 2—27 fi), Klebahn (1919) vond voor Bacillus
halohius ruber 0,5—0,8 ft (op vaste) en 0,5—0,8 bij 2—45 /x (in
vloeibare voedingsbodem). De bacterie voert een voorwaartsche
schommelende beweging uit. Ook Klebahn (1919) dacht eigenbe-
weging bij Bacillus halobius ruber waar te nemen. Daar het hem
echter niet gelukte trilharen te kleuren, nam hij aan, dat de beweging
toch slechts op moleculaire beweging berustte.

Harrison en Kennedy (1922) gelukte het daarentegen trilharen bij
„Pseudomonas salinariaquot; door kleuring aan te toonen. Het bleek,
dat deze bacterie lophotrich was. Evenals Klebahn (1919) bij
Bacillus halobius ruber en Harrison en Kennedy (1922) bij ,,Pseu-
domonas salinariaquot; waarnamen, gedragen de bacteriën zich tegen-
over gram-kleuring negatief. Deze werd volgens het voorschrift uit
de „Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria (Society
of American Bacteriologists)quot; uitgevoerd. Op hetzelfde preparaat
werden gram-positieve staphylococcen zeer goed gekleurd. De fixatie
geschiedde in de vlam, terwijl de bacteriën van te voren in een ver-
zadigde oplossing van NaCl over het dekglas waren uitgestreken.
Tegenkleuring met saffranine verleende de bacterie een roode kleur.
Ook werden gekleurde preparaten verkregen met ijzeraluin en
Heidenhain's haematoxyline.

geïsoleerd op een voedingsbodem, die zeer veel NaCl bevatte.
Evenmin als het Klebahn (1919) en Harrison en Kennedy (1922)
gelukte met de door hen geïsoleerde bacteriën, gelukte het mij de
bacterie op gewone voedingsbodems te kweeken.

Klebahn (1919) trachtte Bacillus halobius ruber aan bodems, die
een geringer percentage NaCl bevatten, te gewennen, door traps-
gewijze de concentratie van het zout in de bodem te verlagen. Het
gelukte hem niet de bacterie op een bodem met minder NaCl dan
ongeveer 12 % te kweeken. Ook ik kon op dezelfde wijze geen ont-
wikkeling van de staafvormige roode bacterie verkrijgen op een
bodem met minder NaCl. In beide gevallen werd echter uitgegaan
van bacteriën, die reeds eenige tijd in cultuur waren. Door de onder-
zoekingen van Baars (1930) is echter gebleven, dat dezelfde bac-
terie een grooter aanpassingsvermogen kan vertoonen, wanneer
deze in de natuur voorkomt, dan wanneer zij geruime tijd in een
kunstmatig milieu is gekweekt. Het gelukte deze auteur n.1. aan te
toonen, dat Vibrio aestuarii en Vibrio thermodesulfuricans slechts
aanpassingsvormen zijn van Vibrio desulfuricans. Jonge culturen
van de halophiele aestuarii en de thermophiele thermodesulfuricans
konden trapsgewijze gewend worden respectievelijk aan een zoutvrij
milieu en een temperatuur van 30°, zoodat zij niet meer onder de
voor hen oorspronkelijk noodzakelijke omstandigheden konden groeien
(respectievelijk bij 3 % NaCl en bij 55°) en dus in eigenschappen
overeenkwamen met Vibrio desulfuricans. Omgekeerd kon Vibrio
desulfuricans langzamerhand overgevoerd worden in Vibrio aestuarii
of thermodesulfuricans. Waarom het hier gaat, is echter het feit, dat
met bacteriën, die reeds eenige tijd in cultuur waren, deze proeven
veel moeilijker waren uit te voeren. Met pas geïsoleerde vischbac-
teriën moet dus de proef van Klebahn (1919) herhaald worden.

In een vloeibaar milieu (30 % NaCl, i % pepton) ontwikkelt de
bacterie zich eveneens zeer goed: de oplossing wordt troebel, terwijl
zich aan de oppervlakte een huidje vormt. De temperatuur, waar-
bij optimale ontwikkeHng van de bacterie plaats heeft, is 37° C.
Gisting heeft niet plaats, als aan de 30 % NaCl en i % pepton
2 % saccharose, maltose of glucose wordt toegevoegd, hoewel de
groei zeer goed is (in een oplossing met glucose wordt geen zuur

gevormd). De bacteriën vormen geen indol, wanneer tryptophaan
aanwezig is. Daar een gelatineoplossing niet stijf wordt, wanneer
een groot percentage NaCl aanwezig is, kon niet worden nagegaan
of de bacterie gelatine doet vervloeien. Nitraten worden gereduceerd
tot nitrieten. Wat het gedrag ten opzichte van zuurstof betreft: de
bacterie groeit niet onder de oppervlakte van agar (zoomin in het
licht, als in het donker) of in de gesloten arm van een gistingskolfje.
Ook Harrison en Kennedy (1922) namen dit waar bij de „Pseudomo-
nasquot;, Katalase is aanwezig.

Als eerste factor, welke vormverandering bij bacteriën te weeg
brengt, moet verandering van de osmotische druk van het milieu
genoemd worden. Fischer (1900, 1903) ging de invloed van zout-
oplossingen van verschillende concentratie na. Hij vond, dat bij
verschillende bacteriën o.a. Spirillum undula, Vibrio cholerae, die in
een zoutvrij milieu zijn gekweekt, plasmolyse optreedt bij over-
brenging in een zoutoplossing: het protoplasma laat van de wand
los en trekt zich samen. Omgekeerd nam hij bij overbrenging van
een zouthoudend in een zoutvrij milieu een verschijnsel waar, dat
hij plasmoptyse noemt: de bacteriën zijn geheel vervormd, bollen
en knotsvormige bacteriën komen in de vloeistof voor. Deze zijn
volgens Fischer (1900, 1903) ontstaan, doordat een deel van het
protoplasma, dat door osmose water heeft opgenomen, door barsten,
die in de wand ontstaan zijn of op de plaatsen, waar de trilharen
ontspringen, naar buiten komt. Wanneer dit protoplasma met de
bacterie in verbinding blijft, treden knotsvormige bacteriën op; de
bollen zijn volgens h:m uitgetreden protoplasma-massa's, die zich
van een wand hebben voorzien. Deze verklaring van de vervormde
bacteriën is gebleken onjuist te zijn. Nooit zijn door latere onder-
Zoekers meer dergelijke „Plasmoptyse-Kugelnquot; waargenomen (zie
Meyer (1905), Raichel (1928)). Wel gelukte het Raichel (1928)

door overbrenging van Spirillum undula in gedistilleerd water of
glycerine de membraan van deze bacterie te doen barsten, de grillige
vormen van Fischer (1900, 1903) ontstonden echter door opzwelling
bij minder groote verhooging van de turgordruk van de spirillen.
Ook Baars (1930) nam waar, dat Vihrio aestmrii, die aangepast is
aan een medium met 3 % NaCl, bij overbrenging in een milieu met
i % NaCl sterk opzwelt.

Iets anders verkreeg Matzuschita (1900), die bij vele zoetwater-
bacteriën onderzocht, of ze op zoutbevattende media kunnen groeien.
Hij vond, dat vele bacillen rond, knotsvormig of spirilvormig kunnen
worden in milieu's met eenige percenten NaCl. De dikte is in het
algemeen het grootst bij 4—6 %; bij 8—10 % neemt deze weer af.
Cocci veranderen over het algemeen weinig van vorm onder invloed
van zout in de voedingsbodem.

Enkele Micrococci (b.v. ruhefaciens) vertoonen echter een opval-
lend verschijnsel: bij o—i % NaCl is de bacterie rond, terwijl op
een bodem met 1,5—8,5 % NaCl naast enkele ronde bacteriën,
rechte of gekromde staafjes voorkomen. Ook Baranik-Pikowsky
(1927) vond moeilijk te verklaren vormveranderingen bij bacteriën,
die bij verschillende concentraties van zout kunnen groeien. Een
van de door hem geïsoleerde soorten is in water en in een oplossing
van Limanzout (tot 25 %) staafvormig. In 26 en 28 % echter ge-
zwollen en ovaal. Ook andere geïsoleerde soorten nemen in dikte
toe bij verhooging van de concentratie.

Van belang is, dat Klebahn (1919) een opzwelling tengevolge
van verlaging van de osmotische druk van het milieu waarnam bij
Bacillus halobius ruber. Klebahn (1919) vervolgde de veranderingen,
die Bacillus halobius ruber ondergaat, wanneer hij bij een druppel
geconcentreerde NaCl-oplossing met bacteriën onder het dekglas,
voorzichtig water laat toetreden. In de grenslaag tusschen het water
en de zoutbevattende oplossing kon hij aan een en dezelfde cel de
op elkaar volgende stadia van opzwelling waarnemen. In de grenslaag
kwamen voor: geheel vernietigde bacteriën, overgangsvormen en
onveranderde bacteriën. Deze overgangsvormen vertoonen het beeld,
zooals figuur i het weergeeft. Klebahn (1919) beschrijft het ont-
staan van dergelijke ten deele of geheel opgezwollen staafvormige

bacteriën als volgt: „Beim Übergang in die Lösung von geringerem
Salzgehalt beginnt an irgendeiner Stelle der Membran, die als ein
Ort geringster Widerstandsfähigkeit angesprochen werden musz,

ein Aufquellen der Zellequot; en verder: „Je nach dem von der Konzen-
tration der umgebenden Flüssigkeit abhängigen Grade der Einwir-
kung, bleibt es bei diesen Veränderungen oder es werden die ganzen
Zellen in Mitleidenschaft gezogen und zu mehr oder weniger rund-
lichen Kügelchen umgestaltet. Der letzte Schritt ist das völlige Ver-
quellen und Auflösen der Kügelchenquot;. Klebahn (1919) kon nooit
uittreden van protoplasma waarnemen. Wanneer bollen in de prepa-
raten voorkwamen, waren dit geheel opgezwollen staafjes. Ik moet
hier vermelden, dat Cloake (1923) bij de staafvormige bacteriën,
die hij van gezouten visch isoleerde, spreekt van groot polymor-
phisme. Di afbeeldingen van Cloake (1923) komen zeer goed met
de figuur van Klebahn overeen (zie figuur i). Waarschijnlijk zullen
ook hier deze vormen door het overbrengen in pekel van geringere
concentratie dan waarbij ze zich ontwikkeld hebben, zijn opgetre-
den. Er werd dan ook in hoofdstuk II reeds aangenomen, dat Cloake
hier met Bacillus halobius ruber te doen had. Klebahn (1919)
schrijft het opzwellen bij verlaging van de concentratie aan osmotische
werking toe. Waar deze opzwellingen op bepaalde plaatsen sterker
-zijn dan op andere plaatsen, neemt hij aan, dat op deze plaatsen de

wand minder weerstand biedt. Het is echter de vraag of men de
verschijnselen, die Fischer (1900, 1903) en Raichel (1928) verkre-
gen, mag vergelijken met de resultaten met deze bacterie. Het is
een groot verschil of men te doen heeft met bacteriën, die achter-
eenvolgens de invloed ondervinden van oplossingen, die slechts in
enkele percenten NaCl van elkaar verschillen, zooals dit met de
bacteriën van Fischer en Raichel het geval was, of dat bacteriën
van een nagenoeg verzadigde NaCl oplossing overgebracht worden
in oplossingen van een concentratie, de helft zoo groot.

Baas-Becking (1930) oppert de mogelijkheid bij Dunaliella (even-
eens een organisme, dat in pekels wordt aangetroffen), dat het proto-
plasma een zoo groote imbibitiekracht heeft, dat het organisme hier-
door bestand is tegen de osmotische wateronttrekking van het milieu.
Onder imbititiekracht moet worden verstaan, de kracht, waarmee
het protoplasma imbibitiewater tracht op te nemen, Baas-Becking
(1930) neemt dus aan, dat een vacuole niet voorkomt of tenminste
niet verantwoordelijk is voor de turgor van de cel. Dus niet: de
zuigkracht van de cel (zuigkracht van het celvocht—wanddruk) = de
osmotische druk van het milieu, maar de imbibitiekracht—wand-
druk = de osmotische druk van het milieu.

Baas-Becking (1930) haalt verschillende voorbeelden aan, ten be-
wijze, dat het zeer goed mogelijk is, dat een dergelijke hooge imbibitie-
kracht aanwezig is. Het is slechts noodig, dat het protoplasma sterk
gedehydrateerd is. Zoo toonde Ludwig reeds in 1849 aan, dat een
grondig gedroogde dierlijke membraan in staat is, water te ont-
trekken aan een verzadigde NaCl-oplossing. Verklaart men het be-
stand zijn van Bacillus halobius ruber tegen de hooge osmotische
druk van het miheu, op dezelfde wijze als Baas-Becking (1930) dit
deed voor Dunaliella, dan moet men dus aannemen, dat ook dit
organisme slechts uit semi-permeabel protoplasma met een zeer
hooge imbibitie-kracht zonder vacuole bestaat. Dat het bij bacteriën
niet nieuw is, slechts protoplasma zonder vacuole aan te nemen,
volgt uit het onderzoek van Hylkema (1916), die aanneemt, dat dit
bij alle niet plasmolyseerbare bacteriën het geval is. Deze auteur
onderzocht of de meening van Fischer (1903), dat bacteriën, die
niet plasmolyseerbaar zijn, meer permeabel voor de osmotica zijn,

dan bacteriën, die wel plasmolyse kunnen vertoonen, juist is. Hij
kwam tot het resultaat dat dit niet het geval is: plasmolyseerbare
bacteriën kunnen evenveel of meer van een zout in de cel opnemen
dan niet plasmolyseerbare bacteriën. Hij is er van overtuigd, dat
het al of niet plasmolyseeren teruggevoerd moet worden op het
al of niet aanwezig zijn van een vacuole.

Bacillus halobius ruber moet dus tot de niet plasmolyseerbare bac-
teriën behooren. Dit is zeer goed in overeenstemming met wat
Fischer (1903) vond, n.1. dat vele bacteriën, die in staat zijn op
agar met 8—10 % NaCl te groeien, zooals Bacillus subtilis, Bacillus
mesentericus e.a. tot de niet plasmolyseerbare bacteriën behooren,
terwijl bacteriën als Vibrio cholerae en vele andere, die niet groeien
op een bodem met meer zout dan 5 % NaCl, tot de plasmolyseerbare
bacteriën behooren. Hoewel Klebahn (1919) van osmose spreekt,
stelt hij zich voor, dat bij Bacillus halobius ruber het protoplasma
de geheele cel vult en dat het celvocht, als drager van de osmotische
druk, zich in kleine druppeltjes in dit protoplasma bevindt of hierin
slechts geïmbibeerd is. In het laatste geval mag hij zeker niet van
zuivere osmose spreken. Kan Bacillus halobius ruber nu toch een
opzwelling bij verlaging van de concentratie van het milieu verkrij-
gen, als deze niet plasmolyseerbaar is? Men moet hierbij echter
weer niet vergeten, dat het al of niet plasmolyseeren van bacteriën
werd nagegaan aan zoetwaterbacteriën, die in oplossingen van enkele
percenten zout werden gebracht.

Wanneer buiten het nagenoeg semi-permeabele protoplasma van
de niet plasmolyseerbare bacteriën van Fischer (1903) een veel
sterker geconcentreerde oplossing was gebracht, dan zouden ook
deze bacteriën water hebben moeten afstaan. De osmotische water-
onttrekking van de omgeving zou zoo groot zijn, dat het protoplasma
als lyophiel kolloid een gedeehe van het gebonden water niet meer
20U hebben kunnen vasthouden. Omgekeerd zal het protoplasma
meer imbibitiewater op kunnen nemen (waardoor de imbibitiekracht
verlaagd wordt) en opzwellen, als het in een oplossing wordt ge-
bracht, die een geringere osmotische druk heeft dan waarmee het
protoplasma aanvankelijk in evenwicht was. Deze opzwelling nu is
veel geringer (tengevolge van het lyophiele gedrag van het proto-

plasma!) dan degene, die door zuivere osmose zou moeten plaats
hebben. Dit komt zeer goed overeen met de ervaringen aan Bacillus
halobius ruber gedaan.

Bij deze redeneering was dus aangenomen, dat het protoplasma,
tenminste de buitenste laag hiervan, semi-permeabel is. Is het
echter doorlaatbaar voor NaCl, ook dan zal bij overbrenging uit een
milieu met 30 % NaCl in een met 15% een volume-toename van
het protoplasma kunnen optreden, daar electrolyten (in de volgorde
van de lyotrope reeks) invloed hebben op het watergehalte van
lyophiele kolloiden. Deze invloed is verschillend voor verschillende
kolloiden. Zoo is een verzadigde oplossing van NaCl niet in staat
albuminen, maar wel globulinen uit het bloedserum uit te
zouten. Nu is echter de in laatste tijd door Plowe (1931) e.a. zeer
waarschijnlijk gemaakt, dat er, tenminste bij hoogere planten, een
membraan aan de buitenkant van het protoplasma voorkomt, Is
dit bij deze bacteriën het geval, dan moet men bij doorlaatbaarheid
van deze membraan voor NaCl, rekening houden met het evenwicht
van Donnan, wanneer n.1. NaCl aan de kolloidale deeltjes van het
protoplasma wordt geadsorbeerd. Bestaat een dergelijk evenwicht,
dan kan de concentratie van NaCl binnen en buiten verschillen,
ondanks de doorlaatbaarheid voor NaCl.

Toch blijft het moeilijk uit te maken, wat bij Bacillus halobius
ruber het geval zal zijn (vacuole of geen vacuole). Zuivere osmose
d.w.z. een vacuole met een zuiver semi-permeabele wand, blijft
uitgesloten: iste zou de osmotische druk van het celvocht, wil de
bacterie in een verzadigde NaCl-oplossing zijn turgor behouden nog
hooger moeten zijn dan die van een verzadigde NaCl-oplossing,
2de zou de cel een zoo groote hoeveelheid water moeten opnemen bij
overbrenging van een oplossing van 30 % NaCl in een met 15 %,
dat deze zou moeten barsten. Het is echter mogelijk, dat het proto-
plasma om de vacuole voor NaCl permeabel is, echter in mindere
mate dan voor water, zoodat de eerste tijd toch een opzwelling
in oplossingen met een geringere concentratie dan de oorspronkelijke
plaats heeft.

Behalve verandering van de osmotische druk van het milieu kun-
nen ook andere wisselende uitwendige omstandigheden vormver-

andering bij bacteriën teweegbrengen. Baars (1930) zag zeer af-
wijlcende vormen optreden, wanneer hij Vibrio desulfuricans uit het
gebruikelijke medium (pH = 7,8) overentte in media, waarin geen
krijt aanwezig was. De omzetting door deze sulfaatreduceerende
bacterie uitgevoerd, maakte nu het milieu steeds zuurder. De bacte-
riën in deze zure voedingsmedia konden aan één eind tot een bol op-
gezwollen zijn, terwijl aan het andere einde de gewone afmeting
behouden was gebleven. Eveneens kwamen bacteriën, die aan beide
uiteinden tot een bol zijn opgezwollen, voor. Ook algeheele opzwel-
ling werd waargenomen, welke sterk geleek op de veranderingen
door hem aan de zelfde bacteriën in hypotonische oplossingen waar-
genomen. Men ziet dus, dat opzwellingen niet altijd tengevolge van
osmotische werkingen optreden.

Oesterle en Stahl (1929) gingen de invloed na van verschillende
uitwendige omstandigheden op de vorm van Bacillus mycoides. Deze
bodembacterie, waarvan de exemplaren in kettingen geordend voor-
komen, vormt rhizoid vertakte kolonies op agar, is gram-positief en
vormt sporen. In bodemextract of vloeistof, waarin rotting had plaats
gehad (beide zeer nauwkeurig kiemvrij gemaakt door filtratie) ont-
stond een vorm, die gladde kolonies op agar vormt en waarvan de
staafjes vrij liggen en bewegen. Op de gebruikelijke voedingsagar
kon weer uit deze vorm de oorspronkelijke langzamerhand terug
ontstaan. Onder invloed van zonlicht kon een gram-negatieve vorm
optreden. Uit een sporenlooze vorm, die spontaan in segmenten
op agar ontstond, kon in zonlicht een oranje-roode vorm optreden,
waarvan de enkele bacteriën de vorm van coccen hebben en die
2;elfs op aardappel Sarcina's kan vormen.

De eerstgenoemde vorm, die gladde kolonies op agar vormt,
werd o.a. ook onder invloed van meer of minder geconcentreerde
oplossingen van NaCl of soda verkregen. Stahl (1929) ging als volgt
te werk: de bacterie werd in bouillon met verschillende concentratie
van NaCl of soda (i—32 %) geënt. Hierin ontwikkelde zij zich op
de bodem. Na eenige tijd werd uit de bouillon weer op gewone agar
geënt, waarop zich dan een nieuwe vorm ontwikkelde, waaruit lang-
zamerhand weer de oorspronkelijke typische mycoides ontstond. Na
zes maanden in zoutbevattende bouillon verbleven te zijn, werd een

deel gefiltreerd door een bacteriefilter. Het fikraat werd op gewone
agar geënt, wat ten gevolge had, dat de „gladdequot; vorm ontstond,
waaruit zich na eenige tijd weer de typische mycoides terugvormde.
De nieuwe vormen komen geheel overeen met Bacillus effusus,
olfactorius en nanus.

Van Niel (1931) ging de invloed na van verschillende concentratie
van NagS en van verschillende pH al of niet gecombineerd, op zeer
zorgvuldig verkregen reinculturen van verschillende Zwavel-purper-
bacteriën en vond, dat deze omstandigheden een zeer groote invloed
hebben op de vorm, zoodat een stam, oorspronkelijk van het type
van Chromatium sprekend kan gaan gelijken op Thiospirillum,
Rhahdochromatium, Lamprocystis e.a. beschreven soorten bij ver-
andering van milieu. Van Niel (1931) legt zeer sterk de nadruk op
het feit, dat men hier steeds te maken heeft met een invloed van wis-
selende uitwendige omstandigheden op de vorm, niet met levens-
cycli, die Löhnis e.a. meenen te hebben aangetoond bij bacteriën.

Van Niel (1931) gaat zoover, dat hij veronderstelt, dat de roode
soorten, die van geconcentreerde pekel zijn geïsoleerd, groei-vormen
zijn van gewone bodembacteriën, dit grondende op de onderzoe-
kingen van Oesterle en Stahl (1929) die ten iste bij Bacillus
mycoides een roode vorm verkregen onder invloed van veranderde
omstandigheden (zonlicht) ten 2e vonden, dat deze bodembacterie
onmiddellijk overgeënt kan worden van o op 32 % NaCl en weer
terug. Bacillus halobius ruber Kl. en Sarcina morrhuae Farlow
zouden dus dergelijke groei-vormen van gewone bodembacteriën
moeten zijn. Het zou dus mogelijk moeten zijn, deze bacteriën
onmiddellijk of in ieder geval gemakkelijk weer in een zoetwater-
milieu over te brengen. Dat dit met Bacillus halobius ruber niet ge-
makkelijk gebeurt is op bladzijde 26 reeds besproken.

Voor de Sarcina is de mogelijkheid met een dergelijke groei-vorm
te doen te hebben, veel grooter, hierover zal in de volgende § ge-
sproken worden. Ook voor de bacteriën, waarmee Golikowa (1930)
werkte, is het niet onwaarschijnlijk. Deze sporenvormende, staafvor-
mige, kleurlooze bacteriën, die hij van gezouten visch isoleerde,
kon hij n.1. kweeken op een bodem, die op z'n minst 1,5 % NaCl
bevatte, maar ook op een bodem, die met NaCl verzadigd was.

Evenals Klebahn (1919) bij Bacillus halobius ruber waarnam,
werd de staafvormige roode bacterie, waarvan in deze § sprake is,
geheel vernietigd bij overbrenging uit de pekel in water; slechts
korreltjes met een diameter van 0,6—1,5 ^ bleven over. Werden de
bacteriën echter overgebracht in een zoutoplossing, waarvan de
concentratie geringer was dan van de pekel, waarin zij zich hadden
ontwikkeld, dan konden dezelfde vervormde exemplaren waarge-
nomen worden, als Klebahn (1919) bij Bacillus halobius ruber zag,
(zie figuur i) hoewel enkele staafjes geheel de normale vorm behiel-
den. Deze laatste vielen op door de snelheid, waarmee zij zich voort-
bewogen. Er moet hier op gewezen worden, dat de bolvormige en
ovale exemplaren, die in deze hypotonische oplossingen voor-
kwamen een veel grootere diameter vertoonden, dan de korreltjes in
het water, n.1. gemiddeld 2,5/^.

Dat de vervormde staafjes niet dood behoeven te zijn, blijkt
hieruit, dat bij overenten van een bodem met 30 % NaCl groei
plaats heeft, terwijl bijna niet anders dan sterk gezwollen vormen
optreden. Bij terugenten op een bodem met 30 % ontstaan weer de
normale vormen. Ook bij langer verblijf op een bodem met 18 %
NaCl, worden de bacteriën weer normaal. In het literatuuroverzicht
in deze § is besproken op welke wijzen de opzwelling van Bacillus
halobius ruber, wanneer deze van oplossingen van hoogere in die
van lagereosmotische druk wordt overgebracht, kan verklaard worden.
Om de invloed van andere osmotisch werkzame oplossingen
dan die van NaCl na te gaan, werden de bacteriën overgebracht in
een oplossing van 4,5 mol saccharose. Zooals besproken is, is het in
geen geval mogelijk, dat het protoplasma om de vacuole (indien
er een vacuole voorkomt) geheel impermeabel is voor NaCl. Het is
echter wel te verwachten, dat dit voor saccharose practisch het geval
is, daar dit bij vele planten o.a. een bacterie n.1. Beggiatoa mirabilis
(Ruhland en Hoffmann (1925)) gevonden is. Een oplossing van 4,5

mol saccharose zou in dat geval osmotisch water aan de bacteriën
moeten onttrekken, ook al bestaat het celvocht uit een oplossing van
geconcentreerd keukenzout (5,25 mol), dat nog in ionen kan zijn
gesplitst. Of deze wateronttrekking werkelijk plaats had, is moeilijk
uit te maken, er ontstonden evenals in water korreltjes van 0,5—1,8 fi.
De bacteriën sterven waarschijnlijk onmiddellijk af. Er kon ook in een
voedingsoplossing, waaraan in plaats van NaCl 4,5 mol saccharose
was toegevoegd, geen bacterie-cultuur worden verkregen. In 2 mol
saccharose ontstonden eveneens bolletjes, deze waren iets grooter
n.1. tot 2,2 fi in diameter, terwijl de bolletjes, die ontstonden in een
oplossing van i mol saccharose hiervan niet verschilden. Deze bol-
letjes stel ik mij voor, als te zijn ontstaan door afronding gepaard
met een geringe opzwelling van de bacteriën, de korreltjes als ge-
deelten van vernietigde bacteriën. Het was onverschillig, of ik met
bacteriën werkte, die zich op een bodem, die 4,7—5,2 mol NaCl be-
vatte, of op een bodem met 3,2—3,6 mol NaCl hadden ontwikkeld.
De bacteriën van de bodem met 3,2—3,6 mol NaCl waren reeds
geruime tijd op deze bodem gekweekt en vertoonden het zelfde beeld,
als die van de bodem met 4,7—5,2 mol NaCl.

Ten laatste moet worden vermeld, dat enkele waarnemingen een
aanwijzing gaven, dat verandering van de chemische samenstelling
van de cultuurvloeistof ook het vermogen bezit vormverandering
van de levende bacteriën te weeg te brengen. Er zullen hierover
nadere proeven moeten worden verricht.

De vormveranderingen, die de bacteriën van de stammen uit
groep II vertoonen, zullen hier niet besproken worden, daar deze door
een inwendige oorzaak n.1. het ontstaan van bepaalde lichaampjes
in de cel worden teweeggebracht. Om vergissingen te voorkomen
werd er bij het onderzoek naar de vormverandering ten gevolge van
wisselende uitwendige omstandigheden steeds gewerkt met een
stam, die deze lichaampjes niet bevat.

D. Vergelijking met verschillende bacteriën, door vroegere onder-
zoekers geïsoleerd.

pen van de staafvormige roode bacterie zeer goed overeen met die
van Bacillus halobius ruber Kl.. Zoowel Klebahn (1919) als Harrison
en Kennedy (1922) hebben waarschijnlijk een stam van deze bac-
terie, die in cultuur helder, doorzichtig van uiterlijk is, in handen
gehad. Daar de bacterie geen sporen vormt, stelde ik in 1931 voor
de naam Bacillus te doen vervallen en de bacterie Bacterium halobium
te noemen. Daar in hoofdstuk VI zal blijken, dat de roode kleurstof
een geheel andere is dan prodigiosine, de kleurstof van Bacillus pro-
digiosus, is het niet aanbevelenswaardig de naam Serratia te gebrui-
ken, zooals Bergey (1930) doet.

Verder is het zeer waarschijnlijk, dat de Bacillus van Peirce (1914)
ook tot Bacterium halobium behoort. De afmetingen, die hij opgeeft,
komen zeer goed overeen met die van opgezwollen exemplaren van
Bacterium halobium in hypotonische oplossingen. Daar hij niet
vermeldt, dat hij de bacteriën bekeek in een even sterk geconcen-
treerde pekel, als waarin zij leven, is het zeer goed mogelijk, dat
hij inderdaad opgezwollen exemplaren waarnam ten gevolge van
verlaging van de zoutconcentratie. Ook het volgende maakt het waar-
schijnlijk, dat hij met Bacterium halobium te doen had: van de kolonies
zegt hij, dat zij ,,ranging in shade from pink through clear red to
crimson, according to the size of the colonyquot; zijn. Het is mogelijk,
dat hij hier dezelfde kleurverandering waarnam, als waarvan onder
A in deze § sprake was bij de stammen met een uiteindelijk ondoor-
zichtig uiterlijk b.v. stam 4). Dat de kleurstof van de bacterie van
Peirce (1914) in de agar diffundeert, blijft een verschilp unt.Hij ge-
bruikte echter i % agar, geïmpregneerd met pekel. Het is zeer goed
mogelijk, dat deze agar van een zeer zachte consistentie was en dat
de bacteriën zich daardoor ook eenigszins in de agar ontwikkelden,
wat de „shade of pinkquot; in de agar tengevolge had. Het gelukte mij
n.1. niet met minder dan 21/2 % agar een pekel van 30 % NaCl een

Ook Beckwith (191 i) neemt een kleurverandering waar bij de
door hem geïsoleerde en als Diplococcus beschreven bacterie. Hij
schrijft: „The colony after 20—25 repeated transfer showed some
loss of color, changing its degree of chromogenesis from a salmon
pink to a pinkish whitequot;. De mogelijkheid bestaat, dat deze Diplo-

coccus dezelfde is als Bacterium halobium, gezien de groote vorm-
veranderingen, die bacteriën kunnen ondergaan, ook omdat Beck-
with (1911) zegt, dat de coccen eenigszins ovaal kunnen zijn.
Voor de Bacillus en de Micrococcus van Mauriac (1886—'89) die vol-
gens hem, slechts te zamen het „roodquot; veroorzaken, bestaat groote
kans, dat beide tot een en dezelfde soort behooren en wel tot Bac-
terium halobium. Bij verlaging van de concentratie blijven immers
bij deze bacterie ook intacte staafjes zeer lang bewaard. Het komt
zeer veel voor, dat zoowel staafvormige als bolvormige {Micrococcus-
achtige) bacteriën, bij verlaging van de concentratie naast elkaar op-
treden.

Wat Bacillus Danteci Krause betreft, het is mogelijk, dat dit een
sporenvormende stam is van Bacterium halobium, zooals ook Liebert
en Deerns (1930) veronderstelden. Het is dus mogelijk, dat vijf
of zes van de elf op bladz. 17 en 18 beschreven bacteriën tot één en
dezelfde bacterie behooren n.1. Bacterium halobium.

Een reincultuur werd volgens de uitstrijkmethode verkregen. De
kleur van de cultuur komt overeen met het staaltje no. 81 van de
Code des Couleurs van Klincksieck en Valette (1908). In een
enkele cultuur kan de kleur eenigszins verbleekt zijn, dan komt deze
overeen met no. 66. In tegenstelling met de twee andere gekleurde
bacteriën is de groei van de Sarcina in vloeibaar milieu veel slechter
dan op vaste bodem, terwijl de bacterie ook aan de vaste bodem
de eisch stelt, dat deze een zekere stijfheid heeft. Men moet er dus
voor zorgen, dat de voedingsoplossingen, waaraan agar wordt toege-
voegd, een neutrale reactie hebben. (Vroeger werd reeds gesproken
over het feit, dat agar een sterk geconcentreerde NaCl oplossing bij
een eenigszins zure reactie niet de noodige stijfheid kan verleenen).
In vloeibaar milieu had een zeer geringe ontwikkeling op de bodem
van het vat plaats, terwijl de oplossing helder bleef. Werd bij 40°
een suspensie geschud met een agarbodem en deze daarna snel
afgekoeld, zoodat de agar stijf werd, dan ontwikkelde de bacterie
zich slechts aan de oppervlakte van de agar (zoowel in het licht als
in het donker). Deze proef en de slechte ontwikkeling in vloeibare

De afzonderlijke cellen zijn 0,9—2,7 in diameter groot. De
bacterie is gram-negatief (nagegaan naast positieve staphylococcen)
en katalase-positief. Indol wordt niet gevormd. Gelatine (± 15 %
NaCl) wordt vervloeid. De kolonies op agar zijn rond, ondoorzichtig.
De optimum temperatuur is 37° C. Geen gisting heeft plaats met
suikers. Nitraten worden gereduceerd tot nitrieten. Het bleek, dat in
tegenstelling met Bacterium halobium het microscopische beeld van de
Sarcina niet veranderde, als deze van een bodem, die een hoog percen-
tage NaCl bevatte, overgebracht werd in water. Ook had deze be-
langrijke verlaging van de osmotische druk van het milieu blijkbaar
niet de dood tengevolge. Bacteriën, die zich op een vaste bodem
(20 % NaCl) hadden ontwikkeld, werden in water gebracht. Na een
uur hierin te zijn verbleven, konden zij zich weer op een bodem
met 20 % NaCl ontwikkelen. Voor de Sarcina is dus de mogelijkheid
dat deze moet worden beschouwd als een groeivorm van een gewone
bodembacterie, veel grooter dan voor Bacterium halobium (zie
bladz. 34).

De bacterie vertoont een groote variabiliteit. In vloeibaar milieu
zijn de cellen 1,5—2,7groot, terwijl op vaste bodem ook afmetin-
gen van 0,9—1,5 fi voorkomen. Ook zijn op vaste bodem de pakjes
meest slecht ontwikkeld, terwijl coccen, diplococcen, streptococcen
en staphylococcen voorkomen. In vloeibaar milieu treedt de kleur
pas laat in de ontwikkeling op. Na ongeveer twee weken is de groei
macroscopisch zichtbaar in een vloeibaar milieu, terwijl de roode
kleur hierin pas na ongeveer zes weken optreedt; deze tijden zijn
natuurlijk afhankelijk van de hoeveelheid entstof. Ent men uit de
kleurlooze cultuur op vaste bodem, dan treedt de roode kleur weer
op, hoewel ik eens een plaat verkreeg met kleurlooze kolonies, die
pas na eenige dagen rood werden. Opvallend is, dat Sarcina morrhuae
Farlow volgens Klebahn (1919) dezelfde afmeting (1,5—2,2/i)
heeft als de groeivorm van deze Sarcina in vloeibaar milieu, terwijl
Micrococcus (Diplococcus) morrhuae Kl. dezelfde afmeting (1—1,5 -quot;)
heeft als de groeivorm van de Sarcina, die op vaste bodem kan
voorkomen. Het eenige verschil tusschen Sarcina en Micrococcus
(Diplococcus) morrhuae is dit verschil in grootte van de cellen en het

feit, dat de Micrococcus de eigenschap mist, Sarcina's te vormen
(Klebahn (1919)). Wel hangen de cellen van de Micrococcus met
tweeën of vieren aan elkaar (Klebahn (1919)). Ook de groeivorm
met kleine cellen van de Sarcina op vaste bodem vormde, zooals
gezegd, weinig pakjes. Uit dit alles volgt dus met groote waarschijn-
lijkheid, dat Sarcina morrhuae Farlow en Micrococcus (Dipïococcus)
morrhuae Kl. één en de zelfde soort is, die het best Sarcina morrhuae
Klebahn genoemd kan worden (Petter (1931)).

Ook Cloake isoleerde uit klipvisch een Sarcina, een Coccus en.
een Staphylococcus, die volgens hem waarschijnlijk tot een en de-
zelfde soort behooren. In hoofdstuk II werd aangenomen, dat hij hier
met Sarcina morrhuae Kl. te doen had. Wat de andere Micrococci
van het lijstje opbladz lyen 18 betreft, het is zeer goed mogelijk, dat
ook deze tot Sarcina morrhuae behooren, hoewel het ook mogelijk is,
dat men hier vervormde exemplaren van Bacterium halobium voor
Cocci heeft aangezien. Dit laatste is tenminste voor de Micrococcus
van Mauriac (1886—89) ^eer waarschijnlijk en misschien ook voor
de Dipïococcus van Beckwith (1911) (zie vorige §). Dat het meer
voorkomt, dat de Sarcina-vovm en de Coccü5-vorm met elkaar afwis-
selen naar gelang de uitwendige omstandigheden wisselen, vermeldt
reeds Falkenheim (1885). Deze auteur kweekte uit de maaginhoud
van den mensch een bacterie, die in hooiextract Sarcina's vormde,
op andere bodems echter slechts in de vorm van Coccen, Diplococcen
en tetraden van Coccen voorkwam.

Zooals in hoofdstuk III beschreven is, gelukte het uit Trapani-zout
op een bodem met 30 % NaCl, een oranje bacterie te isoleeren. Het
feit deed zich echter voor, dat, als een oplossing van het zout over een
vaste bodem werd gestreken, de opgetreden kolonies kleurloos waren;
slechts de plaatsen, waar de bacteriën in een grootere laag de voe-
dingsbodem bedekten, waren oranje van kleur. Afgezien van de
kleur, waren deze verschillende bacterie-culturen echter precies
gelijk van uiterlijk en ook microscopisch bestond er geen verschil
tusschen de bacteriën van de geheele plaat. Suspendeert men van
de oranje cultuur in een verzadigde NaCl-oplossing en strijkt men

opnieuw hiervan op een vaste bodem uit, dan treedt weer hetzelfde
beeld op, d.w.z. een oranje cultuur, waar veel is afgestreken, naast
kleurlooze kolonies. Men kan dit vele malen met hetzelfde resultaat
herhalen. Het is dus uitgesloten, dat de kolonies een andere bacterie
bevatten dan de culturen, ontstaan op de plaatsen, waar veel ent-
materiaal is uitgestreken. Ook in het licht waren de kolonies steeds
kleurloos en bij verder kweeken van de bacteriën uit deze kolonies,
trad de kleur niet weer op. Ook niet wanneer aan de voedingsbodem
0,2 % saccharose werd toegevoegd. De oranje kleur der bacterie is
n.1. het gevolg van het voorkomen van een carotinoïde kleurstof
(zie hoofdstuk VI) en verschillende onderzoekers o.a. Lippmaa
(1925) merkten op, dat de vorming van enkele carotinoïden be-
vorderd wordt door suikervoeding. Ik heb aangenomen, dat de oranje
cultuur op de eerste plaat, waarop Trapanizout werd uitgestreken,
reeds een reincultuur was. Hiervan werd verder gekweekt.

De bacteriën zijn staafvormig en vormen geen sporen. Zij zijn
0,6 bij 1,5—3,5 iquot; groot. Zij zijn gram-negatief en katalase-positief.
De kolonies op agar (30 % NaCl) zijn klein, rond, doorzichtig. Ook in
vloeibaar milieu heeft ontwikkeling plaats, dit wordt hierdoor troebel.
De groei van de bacterie is op deze vaste en in deze vloeibare media
slecht. Indol wordt niet gevormd. De optimum temperatuur is
37° C. Nitraten worden gereduceerd tot nitrieten. De bacterie groeit
niet onder de oppervlakte van agar (zoomin in het licht, als in het
donker). In de voorloopige mededeeling van dit onderzoek werd voor-
gesteld de bacterie Bacterium trapanicum te noemen (Petter (1931)).
Zij verschilt in kleur, in grootte, in wijze van ontwikkeling in vloei-
baar milieu en zooals later zal blijken, in kleurstof en in voedingsvoor-
waarden van Bacterium halobium.

Hoewel Bacterium trapanicum oranje van kleur is en niet van ge-
zouten visch werd geïsoleerd, is het toch mogelijk, dat ook deze
bacterie als een van de veroorzakers van het rood worden van ge-
zouten visch is te beschouwen. Het is n.1. door verschillende auteurs
aangetoond, dat het zout, waarmee de visch wordt gezouten, als de
infectie-bron van het „roodquot; moet worden aangezien (Farlow (1880),
Klebahn (1919), Cloake (1923)/ Liebert en Deerns (1930) e.a.).

ratuur beschreven micro-organismen, die het rood worden van ge-
zouten visch veroorzaken, hoogstwaarschijnlijk terug te brengen
zijn tot Sarcina morrhuae Kl., Bacterium halobium en Torula
Wehmeri Hanz. et Takeda, terwijl het mogelijk is, dat Bacillus Dan-
teci Krause als een afzonderlijke soort met Bacterium trapanicum
hieraan nog moeten worden toegevoegd.

gasvacuolen als oorzaak van het verschil in doorzichtigheid
tusschen de culturen van de verschillende stammen van bac-
terium halobium

Zooals in het vorige hoofdstuk beschreven is, zijn de stammen van
Bacterium halobium in twee groepen te verdeelen. De stammen
uit de eerste groep vormen een heldere, doorzichtige, de stammen uit
de tweede groep een ondoorzichtige, troebele bacteriënlaag op een
vaste voedingsbodem. Het ondoorzichtige uiterlijk van de tweede
groep treedt bij de meeste stammen uit deze groep pas op, wanneer
de bacteriën zich op de voedingsbodem reeds tamelijk goed ont-
wikkeld hebben. Dit troebel worden van de bacteriëncultuur is een
proces, dat langzamerhand in intensiteit toeneemt.

Toen nu microscopisch de bacteriën van de stammen uit deze
twee groepen werden vergeleken, viel een eigenaardig verschijnsel
in het oog. Terwijl de bacteriën uit jonge culturen van alle stammen
geheel gelijk van uiterlijk zijn, zijn bij de stammen uit de tweede
groep, dus bij stam no. 4, 5, 6, 7 en 8 (zie bladz. 23 en 24), wanneer
deze reeds eenige tijd het troebele uiterlijk vertoonen, in de bacterie-
cellen een of meer zeer kleine bolvormige, ovale of onregelmaïig ge-
vormde, scherp omlijnde lichaampjes waar te nemen. Deze lichaamp-
jes nemen langzamerhand in grootte toe. Bij stam no. 7 vullen zij
al spoedig de cel in zulk een mate, dat slechts een smal randje proto-
plasma overblijft.

De bacteriën, die deze lichaampjes bevatten, blijven zeer goed
overentbaar en verliezen ook hun beweeglijkheid niet. De stammen

uit de eerste groep bevatten deze lichaampjes nooit. Er blijkt dus
een zeer nauw verband te bestaan tusschen het uiterlijk van de cul-
tuur en het voorkomen van bepaalde lichaampjes in de cel. Het troe-
bele uiterlijk blijkt het gevolg van deze lichaampjes te zijn. Eén
ding is nog niet duidelijk, n.1. dat deze ondoorzichtigheid eerder is
waar te nemen dan de lichaampjes. Het is echter zeer goed mogelijk,
dat de lichaampjes wel reeds aanwezig zijn bij het eerste optreden
van ondoorzichtigheid, maar te klein om waar te nemen. Ook in vloei-
baar milieu zijn, zooals in hoofdstuk IV is meegedeeld, de twee
groepen hoewel moeilijker, te onderscheiden; ook hier treden bij
de stammen uit de tweede groep de lichaampjes op. Figuur 2 geeft
een beeld van de lichaampjes uit de stammen no. 4, 5, 6 en 8, zij
zijn steeds bolvormig of elliptisch, terwijl de
figuren 3 (a, b, c en d) het ontstaan en de ontwikke-
Hng van de lichaampjes bij stam no. 7 uitbeelden.
Dit is de eenige stam van groep II, waarvan de cul-
turen op vaste bodem reeds zeer jong geheel on-
Fig. 2. Bacterium doorzichtig zijn. In een zeer jonge cultuur in een

halobium. Bac- bloeibaar milieu, waaraan macroscopisch nog geen
tenen met kleinenbsp;1nbsp;n

in deze figuren weergegeven, voor, die in figuur 3e geteekend in de
minderheid, terwijl in geheel ontwikkelde culturen slechts de vormen
van figuur ^d en vooral van figuur ^e voorkomen. Ik stel mij het
ontstaan en de ontwikkeling als volgt voor: terwijl een zeer jonge
bacterie nog in het geheel geen structuur vertoont (figuur 3a), treedt
spoedig op bepaalde plaatsen (figuur 3b) een vage aanduiding van
lichaampjes op; deze ontwikkelen zich spoedig tot de scherp om-
lijnde Hchaampjes, zoodat een bacterie optreedt, zooals in figuur 3c
is weergegeven; hieruit ontstaan bacteriën van het type, zooals in
figuur ^d geteekend is, terwijl de vele lichaampjes, die bij deze
bacterie voorkomen ten slotte kunnen samenvloeien om bacteriën te
vormen, zooals in volwassen culturen het meest optreden (figuur 3e).
Zie ook de foto's a, b en c.

Het was nu de vraag van welke aard deze lichaampjes zijn. Aller-
eerst werd gedacht aan zwavelkorrels. Winogradsky (1887) merkte
op, dat, als hij Beggiatoa doodde, de zwavel, die deze bacterie kan

bevatten, na eenige tijd uitkristalliseert. Bacterium halobium kan
gemakkelijk gedood worden in water, de lichaampjes komen vrij en
vloeien samen tot grootere onregelmatige complexen; uitkristallisatie
van de inhoud heeft echter niet plaats. Toch is uit dit samenvloeien

Foto a en b. Bacterium halobium (stam 7) levend in pekel. Lineaire
vergrooting 1000 x. Foto c. idem (stam 5).

van de afzonderlijke lichaampjes, dat ten gevolge van het tegen elkaar
botsen door een lichte strooming in de vloeistof of door Brownsche
beweging veroorzaakt wordt en dat onder de microscoop zeer goed
is waar te nemen, reeds iets te concludeeren, n.1. dat men niet met
een vaste stof te doen heeft. Om zeker te zijn, dat de inhoud niet
uit zwavel bestaat, werd nagegaan of deze oplosbaar was in zwavel-
koolstof. Om het echter de zwavelkoolstof mogelijk te maken tot

de lichaampjes door te dringen, werd allereerst alcohol (g6 %), die
zich zoowel met water als met zwavelkoolstof mengt, bij het prepa-
raat van de bacteriën gevoegd. De bacteriën bevonden zich in dit
preparaat in geconcentreerde pekel. De alcohol had een onverwachte
uitwerking: de bacteriën veranderden onmiddellijk in een onduide-
lijke netachtige massa, van de lichaampjes met de scherpe omlijning
was niets meer waar te nemen. Zij bevatten dus in geen geval zwavel,
deze lóst niet op in alcohol. Ook is het niet waarschijnlijk, dat de in-
houdstof van de lichaampjes vette olie is, daar deze niet gemakkelijk in
koude alcohol oplost. Het viel op, dat, als de bacteriën, alvorens de

alcohol toegevoegd werd, door toevoeging van water gedood waren,
de invloed van de alcohol geringer was: pas als een suspensie van
de bacteriën in water eenige tijd met een ongeveer gelijk volume
alcohol (96%) geschud werd, verdwenen de samengevloeide
Hchaampjes. Het protoplasma om de lichaampjes moet dus een dus-
danige verandering hebben ondergaan, dat het minder doorlaat-
baar wordt voor alcohol.

Nu is echter een opvallend kenmerk van de lichaampjes, dat zij in
het microscopische beeld bij een bepaalde instelling een roode kleur
vertoonen, terwijl zij scherp omlijnd zijn. Schroeft men de tubus
naar boven, dan verdwijnt deze kleur en worden zij donker bij zwart
af, terwijl bij een lage instelling de roode kleur eveneens verdwijnt en
de lichaampjes zeer helder en licht worden, terwijl de donkere
rand ten koste van de lichaampjes breeder wordt. Zie hiervoor de
foto's a, b en c, waar de lichaampjes zoowel donkerder als lichter

dan het protoplasma en de omgevende vloeistof verschijnen, al
naar de instelling van het beeld. Het lichter worden bij lage en donker
worden bij hooge instelling is, hoewel minder uitgesproken, ook aan
luchtbellen in water waar te nemen. Dit verschijnsel, dat het gevolg,
is van het feit, dat lucht een lagere brekingsindex heeft dan water,
volgt uit fig. 4: men ziet, dat de
stralen, die evenwijdig invallen,de
stof met de geringere breking di-
vergeerend verlaten, zoodat bij in-
stelling van de microscoop op de
bovenkant van de luchtbel het oog
per eenheid van oppervlakte van
de luchtbel veel minder stralen
bereiken dan bij instelling op de
onderkant van de luchtbel per
eenheid van oppervlakte van de
luchtbel. Verder volgt uit deze
figuur de breeder wordende don-
kere ring om de stof met de zwakke
lichtbreking bij omlaag schroeven
van de tubus. Hoewel om de lichaampjes (ook de ronde) de donkere
rand bij lage instelling smaller is dan bij luchtbellen, was het dus te
vermoeden, dat de lichaampjes een stof bevatten, die een geringere
brekingsindex dan water en pekel heeft. Het bleek, dat dit vermoeden
juist was, daar bij zooveel mogelijk evenwijdig invallend licht (dus
met platte spiegel en zonder condensor) de lijn van Beck om de lang-
werpige lichaampjes is waar te nemen, die bij omhoog schroeven van
de tubus zich naar het water of de pekel toe verplaatst. De lijn van
Beck, die het gevolg is van algeheele terugkaatsing van een deel van het
invallende licht op de rechdijnige grens van twee stoffen met verschil-
lende brekingsindices, verplaatst zich n.1. bij langzamerhand hooger
wordende instelling naar de stof met de grootste brekingsindex (zie
Metzner (1928)). Daar de eenige bekende stoffen, die een geringere
optische dichtheid dan water bezitten, gassen en dampen zijn of
tenminste lichamen, waarin gassen of dampen in groote hoeveelheid
voorkomen, moeten de lichaampjes dus een gas of een gasmengsel

bevatten. Dat zij bij hooge instelling donkerder zijn dan luchtbellen
in hetzelfde milieu, kan het gevolg zijn van het feit, dat zij omsloten
worden door protoplasma, een optisch dichtere stof dan water (bre-
kingsindex = 1,33) ol p2kel(brekingsindex = 1,37). Metzner
(1928) vermeldt n.1., dat de brekingsindex van protoplasma i 1,5

is. Uit figuur 5, waar drie even-
wijdig invallende lichtstralen zijn
geteekend,blijkt, dat, wanneer deze
een object treffen, dat een ge-
ringere brekingsindex heeft dan
de omgeving, zij minder diver-
geerend dit object verlaten dan
wanneer dit object bovendien door
een laag van een stof wordt omge-
ven, die een nog grootere brekings-
index heeft dan de omgeving. Wat
de roode kleur bij een bepaalde
instelling betreft, deze kan niet het
gevolg, zijn van onvoldoende op
kleur gecorrigeerde lenzen, daar,
wanneer de volgende lenzen wer-
den gebruikt: compensatie-ocu-
lair 4 (Zeiss) 45 mm. met een
apochromaat objectief 2 mm, apert.
1,4, 90 (Zeiss) of met een olie-
1,3, 2,0 mm. (Zeiss), de roode

immersie, homogeen, ^/jg, apert,
kleur eveneens optrad. Deze kleur is misschien te begrijpen, wanneer
men bedenkt, dat van de stralen uit het zichtbare deel van het
spectrum de roode op de grens van twee stoffen met verschillende
brekingsindicïs het minst sterk worden gebroken. De in de figuur
4 geteekende stralen moet men zich voorstellen, als te zijn van
monochromatisch licht. De roode stralen zullen het minst diver-
geeren, zoodat het mogelijk is, dat, als men op de rand van het lichaam
scherp instelt, slechts de roode stralen in voldoende hoeveelheid
per oppervlakte-eenheid van het lichaam het oog treffen, tenminste
in het middengedeelte; de rand moet donker zijn (bij het naar om-

hoog schroeven van de tubus zullen ook de roode stralen te zeer
verspreid over het lichaam verdeeld zijn om een mdruk te geven
en is het lichaam donker, bij lage instelling daarentegen moeten ook
andere stralen dan de roode een lichtindruk te weeg brengen en
is het lichaam wit en Hcht met een breede donkere rand). Dat een
lichaam een roode kleur kan vertoonen bij een bepaalde mstelhng
van de microscoop, als gevolg van een Hchtbrekmg, die zwakker
is dan die van de omgeving, blijkt ook uit het volgende: wanneer
bacteriën van een stam uit groep i in een oplossing van 4,5 mol
saccharose worden gebracht, waarvan de brekingsindex grooter is
dan van het protoplasma van de bacteriën, dan zijn de geheele bac-
teriën bij een bepaalde instelling rood gekleurd. Klebahn (1895)
nam verder waar, dat kleine gasbellen in preparaten van gedroogde
Diatomeeënschalzn in canadabalsem eveneens een roode kleur ver-
toonen. Ik kan hier aan toevoegen, dat ook spleten tusschen zout-
kristallen, die met lucht Zijn gevuld, onder de microscoop dezel de
roode kleur vertoonen als de lichaampjes in de bacterien. Ook grillig
gevormde luchtbellen in water (Klebahn (1895 ) of m ee„ stof met
Ln grootere brekingsindex dan water b.v. olijfolie (brekingsindex

Nu zW hoofdzakelijk in de cellen van Cyanophyceae lichaampjes
beschreven, waarvan de laatste tijd aangenomen wordt dat zij gas
bevatten. Het is dus te vermoeden, dat de lichaampjes in de bacterien
van de stammen uit groep II van Bacterium halobium tot deze z.g.
gasvacuolen behooren. Om ze echter hiermee te kunnen vergelijken,
moeten eerst de eigenschappen van deze vacuolen worden behandeld.
Dit zal in de volgende § geschieden.

In 1894 merkte Richter op, dat bij verschillende
met z.g waterbloei, roode korrels in de cellen voorkomen, die hij
aanzag voor zwavelkorrels. In 1895 bestreed Strodtmann (a en 6
deze meening. Deze auteur komt n.1. tot de overtuiging dat de
„roodequot; korrels gas bevatten en de oorzaak zijn van het d ijfver-
mogen van het wiL. Dat dit laatste het geval is, blijkt uit de volgende

proef. De wieren werden in een flesch met water gebraclit, waar zij
spoedig aan de oppervlakte kwamen te drijven. De flesch werd ge-
heel gevuld met water, waarna een kurk zeer krachtig op de water-
kolom werd gedrukt. Het gevolg was, dat de wieren op de bodem
zonken, terwijl bij microscopisch onderzoek bleek, dat de lichaampjes
uit de cellen waren verdwenen. Strodtmann onderzocht ver-
schillende Cyanophyceae en vond, dat de lichaampjes bij alle vrij
drijvende soorten voorkomen, nooit bij vastzittende.

In hetzelfde jaar publiceerde Klebahn (1895) een onderzoek,
dat hij in vele opzichten tezamen met Strodtmann heeft uitgevoerd.
Klebahn bevestigt hierin de resultaten van Strodtmann en merkt
verder op, dat, terwijl de wieren normaal ondoorzichtig van uiterlijk
zijn en slechts in opvallend licht groengeel, zij, door de druk in de
genoemde proef, groen en doorschijnend worden. De roode kleur
beschouwt Klebahn als het gevolg van een lichtbreking, die geringer
is dan die van het omgevende protoplasma. Hij neemt waar, dat ge-
droogde wieren bij verhitting in olie of hars op meer dan 100°, de
lichaampjes behouden. Zij kunnen dus niet uit water of een andere
vluchtige vloeistof bestaan. Een gas kan, volgens hem, slechts al deze
eigenschappen toekomen. Hij noemt de lichaampjes gasvacuolen.
Het volgende staaft nog deze opvatting: door de wieren te behande-
len met vloeistoffen als alcohol, phenol of sterke zuren kan men
de gasvacuolen doen verdwijnen, terwijl kleine luchtbellen op de-
zelfde wijze b.v. uit de schalen van een diatomee zijn te verwijderen.
Klebahn verklaart dit uit de groote capillaire kracht, die deze.vloei-
stoffen ten opzichte van organische stoffen vertoonen. Het gas wordt
door deze kracht samengedrukt en daardoor gemakkelijk geabsor-
b;erd. Ook het verdwijnen door druk verklaart Klebahn door absorp-
tie van het gas door deze druk. Dat de gasvacuolen niet rond zijn
bshoeft volgens Klebahn niet te bevreemden: zeer kleine luchtbel-
letjes tusschen voorwerp- en dekglas kunnen eveneens grillige vormen
vertoonen; ook is het zeer goed mogelijk, dat de gasvacuolen een
protoplasmatische wand bezitten.

In 1896 beschreef Klebahn een proef, tezamen met Strodtmann
uitgevoerd, die als resultaat opleverde, dat de gasvacuolen, als de
wieren onder vacuum worden gebracht, niet verdwijnen.

Brand (1901) is de eerste, die op grond van de laatste proef
meent, dat de vacuolen geen gas kunnen bevatten.

In 1922 beschreef Wille lichaampjes in Thiotrix tenuis Winogr.,
die door Winogradski als zwavelkorrels zijn beschreven, maar
die het karakter van de „gasvacuolenquot; bleken te hebben wat optische
eigenschappen en gedrag ten opzichte van reagentia betreft. Hier
worden dus voor het eerst deze lichaampjes bij een bacterie beschre-
ven.

Daarna verschijnt van Molisch (1903) een publicatie, waarin deze
de gastheorie van Klebahn heftig bestrijdt, hoofdzakelijk op grond
van de feiten, dat de vacuolen in vacuum niet verdwijnen (wat
Molisch bevestigt) en dat zij niet rond zijn. Niet alleen de „gas-
vacuolenquot; in de cel, maar ook geïsoleerde „gasvacuolenquot; hebben
een onregelmatige vorm. Dit isoleeren gelukt Molisch door de
wieren eenige dagen in 10 % KNO3 te brengen. De cellen gaan
hierin te gronde, terwijl de vacuolen bewaard blijven en samen-
vloeien tot onregelmatig gevormde lichaampjes.

Ook pleit volgens Molisch tegen de gastheorie, dat in een voch-
tige kamer met de damp van chloroform, alcohol of aether de „gas-
vacuolenquot; vernietigd worden, terwijl gas door de geringe hoeveel-
heden van deze stoffen, die tot de „gasvacuolenquot; doordringen, niet
geabsorbeerd kan worden. Molisch onderscheidt twee soorten
„gasvacuolenquot; en noemt ze Schwebekörper; de eerste soort bevat
volgens hem een aantal zeer kleine deeltjes in Brownsche beweging,
deze kan dus geen gas bevatten, maar moet uit een licht beweeglijke
vloeistof bestaan. De tweede soort, die het meeste voorkomt, bevat
deze deeltjes niet en bestaat volgens Molisch uit een zeer viskeuse
vloeistof. Fischer (1905), die een bepaalde reservestof, het ana-
baenine (verwant met glycogeen) bij Cyanophyceeën beschrijft, houdt
de „gasvacuolenquot; voor een optisch effect, veroorzaakt door inter-
ferentie van het licht in het anisotrope anabaenine. In 1906 heeft
Molisch bijgedragen tot uitbreiding van de kennis, wat betreft het
voorkomen van de „gasvacuolenquot;. Hij trof deze n.1. bij twee zwavel-
purperbacteriën aan, die door hem als nieuwe soorten worden be-
schreven. Zij veroorzaken, dat deze bacteriën in vloeibaar milieu
aan de oppervlakte komen te drijven. Zij zijn volgens hem sterk

lichtbrekend. Hij blijft bij zijn meening, dat de Schwebekörperchen of
aerosomen geen gas bevatten. Het voorkomen van „gasvacuolenquot;
bij zwavel-purperbacteriën, die hierdoor aan de oppervlakte komen
te drijven, is opmerkelijk, daar uit de onderzoekingen van van Niel
(1931) is gebleken, dat deze bacteriën obligaat anaëroob zijn. Er
blijkt uit, dat bij de zwavelbacteriën het vermogen tot drijven, dat
de „gasvacuolenquot; aan de bacteriën verleenen, geen levensfunctie
kan zijn, maar den dood tengevolge moet hebben. Hiermee in verband
is opmerkelijk, dat de Cyanophyceae, die in geweldige massa in de
zomer waterbloei kunnen vertoonen, niet zelden alle zeer spoedig
afsterven (Klebahn (1896)).

Lauterborn (1915), die de naam pseudovacuolen voor de „gas-
vacuolenquot; gebruikt, beschrijft een nieuwe Oscillatoria met groote
pseudovacuolen, die echter geen waterbloei vertoont, maar op de
bodem van meren voorkomt. Hij is van meening, dat de pseudo-
vacuolen geen gas bevatten en dat „die Erhöhung der Schwebe-
fahigkeit kaum die Hauptfunktion der Pseudovakuolen sein kannquot;.
Hij veronderstelt, dat de inhoud een labiel stofwisselingsproduct is,
■dat bij Oa-gebrek als energiebron kan dienen, zonder hiervoor
eenige aanwijzing te hebben. Hij treft ook draadvormige bacteriën
met pseudovacuolen in het slijk op de bodem van een meer aan.

Wat de lichtbreking van de pseudovacuolen betreft, is hij niet
(duidelijk. Bij één van de bacteriën, Pelonema tenue, Lauterb.,
spreekt hij van zwak lichtbrekende, bij Pelonema pseudovacuolatum
Lauterb., echter van sterk lichtbrekende pseudovacuolen; bij beide
bacteriën hebben de vacuolen een roodachtige glans.

In 1922 verscheen van Klebahn een uitvoerige publicatie, die
vele nieuwe argumenten brengt ten gunste van de gastheorie. Aller-
eerst werd echter Molisch (1903) bestreden: Hoe is het mogelijk,
■dat Molisch in lichaampjes met een breedte van 2 honderden
korreltjes in Brownsche beweging ziet? Een inhoud, bestaande uit
•een stof van een „festweichequot; consistentie kan noch het optische
gedrag van de vacuolen verklaren, noch de oorzaak zijn van het
groote drijfvermogen van de organismen, die de vacuolen bevatten,
allerminst kan het het spoorlooze verdwijnen van de vacuolen door
druk verklaren, terwijl de gastheorie dit alles geheel verklaart. Dat

de vacuolen in vacuum bewaard blijven, hoeft volgens Klebahnquot;
niet tegen de gastheorie te pleiten, als de vacuolen een wand hebben,
die ondoorlaatbaar is voor gas. Dat ze een wand hebben, maakt
Klebahn zeer waarschijnlijk, ten eerste is het mogelijk de vacuolen
te isoleeren, wat ook Molisch (1903) deed, ten tweede gelukt het
Klebahn de gasvacuolen eerst te verwijderen, om ze dan opnieuw
in dezelfde cellen te doen ontstaan. Hij gaat als volgt te werk: de
wieren worden met formaldehyde gefixeerd, daarna over alcohol^
cederolie en ligroïne, met paraffine doordrenkten met de microtoom
gesneden. Daarna met toluol de paraffine weer opgelost en de door-
sneden bekeken. De vacuolen blijken, zooals te verwachten was,
verdwenen te zijn. Als echter de toluol verdampt is en de door-
sneden in geconcentreerde suikeroplossing bekeken worden, blijkt
het beeld precies gelijk aan dat van onbehandelde wieren met gas-
vacuolen. Klebahn verklaart dit als volgt: de wanden van de vacuolen
zijn bewaard gebleven; door de chemicaliën is het gas verdrongen;
na het verdampen van de toluol treedt echter lucht in de vacuolen
binnen.

Dat stoffen als chloroform en aether in zeer kleine hoeveelheden
de vacuolen vernietigen is volgens Klebahn, die aan deze stoffen
zeer veel nieuwe toevoegt (vluchtige koolwaterstoffen, chloorderi-
vaten van koolwaterstoffen e.a.) evenmin een argument tegen de
gastheorie. Hij verklaart het verschijnsel als volgt: daar al deze stoffen
tot de vetoplossende middelen behooren en het zeer goed mogelijk
is, dat de wand van de gasvacuolen geheel of gedeeltelijk uit een
vetachtige stof bestaat, zullen deze stoffen, al zijn de hoeveelheden,
die in het water en de wieren binnendringen, zeer klein, deze wand
kunnen oplossen of tenminste voor gas doorlaatbaar maken.

Molisch (1906) heeft verder volgens Klebahn veel te weinig
aandacht aan het optische gedrag van de vacuolen geschonken. In
de purperbacteriën kon hij zeer gemakkelijk de zwavelkorrels en de
„Schwebekörperchenquot; onderscheiden. De eerste zijn sterk Hcht-
brekend. Hoe kunnen nu de laatste het ook zijn? Ook Lauterborn
(1915) e.a., die de vacuolen geen inhoudstof toeschrijven, die het
S.G. van de wieren verlaagt, weet Klebahn te weerleggen. Gefixeer-
de Gloiotrichia echinulata, die kort na de fixatie nog een zeer groot

drijfvermogen aan den dag legt, verliest deze na eenige tijd en zinkt
op de bodem. Het blijkt, dat slechts in de uiteinden van de draden
de gasvacuolen duidelijk zijn afgenomen, de dikkere deelen bevatten
ze nog onveranderd. Het kan dus zeer goed, dat er wieren voor-
komen, die op de bodem van een meer leven en toch gasvacuolen
bevatten.

Behalve deze kritiek levert het onderzoek verschillende positieve
gegevens op, die pleiten voor de gastheorie. i°. Het gelukt hem, door
een plotselinge druk uit te oefenen op het dekglas van een preparaat,
waarin in uitgekookt water een draad van Anahaena, die van te voren
met kaliloog is behandeld (wat geen zichtbare invloed op de gas-
vacuolen heeft) langs de geheele draad gasbelletjes te voorschijn te
brengen, terwijl de gasvacuolen verdwijnen. De figuur 4 op blz. 559
is zeer overtuigend. 2°. Luchtbellen in gelatine-schuim zijn met
phenol zeer snel te verwijderen, evenals door druk. 3°. Er kan in een
daarvoor geconstrueerd apparaat een blijvende volumevermindering
van een brij van de wieren in water door druk geconstateerd worden.
Deze druk moet echter groot genoeg zijn om de vacuolen te ver-
nietigen. De volumevermindering is bijna volkomen evenredig met
de gebruikte hoeveelheid algen. Hij berekent uit de verschillende
waarnemingen een volume aan gasvacuolen van ± i % van het
geheele volume van de wieren. 4°. Getracht wordt het gas te analy-
seeren: titratie volgens Winkler van de zuurstof in water levert geen
grootere opbrengst, wanneer in dit water Gloiotrichia door druk van
de vacuolen is bevrijd. Met verschillende toestellen wordt gas uit
de wieren verdreven, nadat met zeer veel moeite de geabsorbeerde
lucht uit het water en de wieren zooveel mogelijk is verwijderd. Dit
gas wordt daarna in een toestel van Krogh gemeten en geanalyseerd.
Weinig zuurstof en koolzuur, geen waterstof, koolwaterstoffen en
koolmonoxyde kwamen in het opgevangen gas voor; dus bevatten
de vacuolen waarschijnlijk in hoofdzaak stikstof. Ten laatste moet
nog vermeld worden, dat Klebahn een drukkamer construeerde,
om microscopisch de wieren onder druk of vacuum te observeeren.
Het blijkt, dat een plotselinge drukvermeerdering van 2—3 atmos-
feren reeds voldoende is om de gasvacuolen bij gefixeerde Gloiotrichia
te doen verdwijnen; tegenover langzaam aanzwellende druk zijn de

vacuolen zeer resistent: een druk van 9 atmosferen doet nog enkele
vacuolen bewaard blijven,

In 1925 zette Klebahn zijn proeven voort. Op drie verschillende
wijzen met verschillende toestellen vindt hij, dat Gloiotrichia echinu-
lata, waaruit de gasvacuolen verwijderd zijn, minder gas bevat dan
materiaal, waarin deze nog aanwezig zijn. Zijn verschillende be-
palingen kloppen onderling goed en leveren een gasgehalte van ± 0.9
volume-percenten op. Ten laatste bepaalde hij nog eens de volume-
vermindering, die een hoeveelheid water met wieren ondergaat bij
verwijdering van de „gasvacuolenquot; door toevoeging van xylolen
vond 1.55 %. Dat Klebahn steeds een verschil in gasgehalte vindt
tusschen wieren met en zonder „gasvacuolenquot; en een hiermee over-
eenstemmende volume-vermindering bepaalt bij verwijdering van

gevonden percentage lijkt echter te oordeelen naar de beschrijving
en teekeningen van de gebruikte wieren te klein of de „gasvacuolenquot;
moeten, hoewel zij een zeer gering volume hebben, zich door de
geheele cel vertakken. Het gevonden percentage komt in ieder geval
goed overeen met de, uit het S.G. van de wieren (dat Klebahn (1922)
bepaalt) berekende hoeveelheid lucht, die noodig is om de algen te
doen drijven.

Eveneens in 1925 besprak Van Goor de verschillende opvattingen
en kwam tot de overtuiging, zonder de publicaties van Klebahn
(1922 en 1925) te kennen, dat Molisch (1903) gelijk heeft. Evenals
Brand (1901) neemt hij aan, dat de roode kleur de kleur van de
lichaampjes is.

Daarna beschrijft Kolkwitz (1928) weer een bacterie n.1. Sarcina
ventriculi, die „gasvacuolenquot; kan bevatten. Hij oppert de mogelijk-
heid, dat de inhoud van deze vacuolen een gas is, dat door gisting
is ontstaan en dat dit bij de andere bacteriën met gasvacuolen even-
eens het geval is, daar deze alle modderbewoners zijn.

Deze hypothese wordt in 1929 door Canabaeus verder uitgewerkt
voor de Cyanophyceae. Het gelukt haar invloed uit te oefenen op de
vorming van gasvacuolen. Bij verschillende wieren, die gewoonlijk
geen gasvacuolen vormen, kan zij door toevoegen van NaCl of
andere zouten in de cultuurvloeistof, maar vooral door de wieren

onder anaërobe omstandigheden te brengen, gasvacuolen doen op-
treden. Door het laatste komt zij tot de overtuiging, dat bij de
blauwe wieren de gasvacuolen eveneens gistingsgassen bevatten.
Het verband, dat zij meent op te merken tusschen de z.g. heterocysten
en gasvacuolen kan hier buiten beschouwing blijven.

Ik wil uit de genoemde onderzoekingen de volgende conclusie
trekken: hoewel over de wijze van ontstaan van de „gasvacuolenquot;
nog- niets bekend is en omtrent de omstandigheden, die invloed
hebben op dit ontstaan nog vragen open blijven, evenzoo wat betreft
de chemische samenstelling van de inhoud, staat sinds de onder-
zoekingen van Klebahn met zeer groote waarschijnlijkheid vast,
dat de inhoud een gas is.

§ 3. Eicen proeven en besprekinJ der resultaten in verband met de
gegevens uit de literatuur.

Uit het optische gedrag van de lichaampjes in de cellen van
Bacterium halobium concludeer ik, dat deze lichaampjes dezelfde
zijn als die, waarvan in de vorige § sprake was. Uit de volgende
proeven zal blijken, dat deze gevolgtrekking juist is, terwijl eveneens
verschillende argumenten ten gunste van de theorie van Klebahn
naar voren zullen komen. Ik wil dan ook evenals Kolkwitz (1928)
en Canabaeus (1929) de naam gasvacuolen van Klebahn (1895)
overnemen.

Wanneer op de pekel, waarin de bacteriën van een der stammen
uit groep II gesuspendeerd zijn, een druk wordt uitgeoefend door
op het vat, dat geheel gevuld is, de kurk met kracht te drukken, dan
blijkt bij microscopisch onderzoek, dat de lichaampjes uit de cel zijn
verdwenen: het uiterlijk van de bacteriën is geheel gelijk geworden
aan dat van de bacteriën, behoorende tot de stammen uit groep I.
Had men te doen met stam 7), waarvan een suspensie een zeer troebel,
melkachtig uiterlijk heeft, dan was na afloop van de druk de vloeistof,
indien dit pekel was, zeer veel helderder, indien water was gebruikt,
geheel helder geworden. Dit verschil is te wijten aan het feit, dat
in water het protoplasma van de bacteriën verslijmt, terwijl in pekel

na afloop van de druk de bacteriën, hoewel van de lichaampjes
bevrijd, bewaard blijven. Bij de andere stammen was eveneens een
dergelijk helder worden waar te nemen; daar een suspensie van deze
stammen echter minder troebel is dan één van stam 7), was dit
verschijnsel minder opvallend. Zoo ook was een vlok bacteriën van
een van de stammen uit groep II, als deze in de suspensie aanwezig
was, na afloop van de druk helder rood van kleur geworden, zelfs
was dit het geval met een vlok van stam 7), die normaal bijna wit van
kleur is. De proef komt dus geheel overeen met die van Strodtmann
(1895) en Klebahn (1895) bij Gloiotrichia, welk wier eveneens na
het verdwijnen van de „gasvacuolenquot; doorzichtig was geworden.
Het troebele uiterlijk van de cultuur van Bacterium halobium
(groep II), met als uiterste de „wittequot; kleur bij aanwezigheid van de
lichaampjes, die ik voortaan dus gasvacuolen zal noemen, is een
nieuw argument voor de theorie van Klebahn.

Een nog sterker argument levert het volgende: wordt de druk
plotseling opgeheven, dan treden uit een vlok bacteriën van stam 7),
als deze in de suspensie aanwezig is, vele met het bloote oog waar-
neembare gasbellen naar buiten, terwijl dit niet het geval is met een
vlok bacteriën, behoorende tot een stam, die geen gasvacuolen bevat.
Er werd bij deze proef uitgekookt water of uitgekookte zoutoplossing
gebruikt. Naar analogie van de verklaring van Klebahn (1895) van
de proef met Anabaena en Gloiotrichia onder het dekglas, zou men
dit als volgt kunnen verklaren: door de druk wordt het gas tot
absorptie in het protoplasma of de omgevende vloeistof gebracht,
daar volgens de wet van Henry de oplosbaarheid van een gas even-
redig is met zijn druk. De korte duur van de proef veroorzaakt
echter, dat het gas geen tijd wordt gelaten in de verdere
vloeistof te diffundeeren. Bij opheffen van de druk zal dus
het protoplasma en het water of de pekel, die de vlok bacteriën
doordrenkt, zeer sterk oververzadigd zijn met gas en dit gas dus
weer afgeven.

Het is echter zeer goed mogelijk, dat de druk niet groot genoeg is
om het gas geheel te absorbeeren. Ook moet men niet vergeten, dat
wanneer de vacuole een voor gas ondoorlaatbare wand bezit, deze
eerst moet barsten, alvorens het gas geabsorbeerd kan worden. Het

is misschien juister het proces zich bij de bacterie als volgt voor te
stellen. Door de druk zal allereerst de voor gas ondoorlaatbare
vacuolewand (als deze tenminste aanwezig is) op de plaats, waar hij
de minste weerstand biedt, barsten. (Hcewel de druk buiten de bac-
terie aan alle zijden even groot is, zal dit binnen de bacterie zeker
niet het geval zijn.) Daarna zal het gas voor een deel geabsorbeerd
worden door het protoplasma, de rest komt door een barst naar
buiten en zal door de vloeistof geheel of gedeeltelijk worden ge-
absorbeerd, afhankelijk van de duur van de druk. Na afloop van de
druk komt het gas weer geheel vrij.

Ook kon een invloed op het S.G. van een vlok bacteriën waar-
genomen worden, hoewel niet in zulk een mate als bij Gloio-
trichia, daar een vlok bacteriën in sommige gevallen in water
reeds vóór de gasvacuolen waren verwijderd, zich op de bodem
bevond. Waar echter een bacteriënmassa dreef, had het verwijderen
van de gasvacuolen steeds zinken tengevolge, terwijl een vlok bac-
teriën van een stam zonder gasvacuolen steeds, zoowel in water als
in verzadigde NaCl oplossing, een grooter S.G. had dan de vloeistof.
Ik wil er hier op wijzen, dat ook aan een suspensie van bacteriën van
stam 7 het geringe S.G. van de bacteriën is waar te nemen, na enkele
dagen rustig staan is n.1. aan de oppervlakte van de suspensie
een dikke laag bacteriën te vinden. Molisch (1906) nam hetzelfde
waar aan de door hem beschreven purperbacteriën met gasvacuolen.
Hij wijst er op, dat het aanwezige slijm de oorzaak zal zijn, dat de
bacteriën zich minder vlug dan Gloiotrichia en andere blauwe wieren
kunnen verplaatsen. Daar bij Bacterium halobium eveneens slijm
wordt aangetroffen, kan dit ook hier de oorzaak zijn van het feit,
dat de bacteriën niet eerder dan na enkele dagen aan de oppervlakte
komen te drijven.

Evenals Klebahn (1922) waarnam bij Gloiotrichia verdwijnen de
gasvacuolen bij Bacterium halobium tengevolge van een stoot ge-
makkelijker dan door een langzaam sterker wordende druk. Voordat
ik hierop nader kan ingaan, moet ik eerst vermelden, dat de Bac-
terium onder vacuum, evenals de Cyanophyceeën de gasvacuolen
behoudt. Verschillende bacteriënsuspensies, zoowel in een ver-
zadigde oplossing van NaCl, als in water bevonden zich meer dan

een week in een vacuum-exsiccator bij een druk van i cc. kwik: er
had geen verandering van kleur plaats en de gasvacuolen bleken
onveranderd aanwezig te zijn gebleven. Men moet echter, wil men
dit microscopisch constateeren, voorzichtig te werk gaan, daar bleek,
dat bij een plotseling terugbrengen van de druk van i cc. kwik op
i atmosfeer de vacuolen verdwijnen uit een bacteriënsuspensie in
water, niet uit de bacteriën, die in een oplossing van keukenzout zijn
gesuspendeerd. Zooals vermeld worden de bacteriën door water
gedood en versmelten de vrij gekomen gasvacuolen tot grillig ge-
vormde lichaampjes. Ik wil er hier op wijzen, dat een gelijk beeld
optreedt, als Molisch (1903) verkreeg, wanneer hij Aphanizomenon
flos aquae Ralfs. eenige dagen in 10% KNO3 bracht, waardoor de
draden vernietigd werden en de gasvacuolen vrij kwamen en samen-
smolten (figuur 4, bladz. 55). De samengevloeide gasvacuolen van
Bacterium halobium in water blijken dus door een druk van i atmos-
feer reeds te worden vernietigd, deze druk moet echter plotseling
worden toegediend, bij langzaam terugbrengen van vacuum op
I atmosfeer bleven de samengevloeide gasvacuolen onveranderd in
de suspensie aanwezig. Door een plotselinge stoot zal de proto-
plasmarest, die de lichaampjes, gevormd door het samenvloeien van
de vacuolen, omgeeft, gemakkelijker kunnen scheuren dan door een
langzamer aanzwellende druk.

Het gelukte niet de bacteriën van de gasvacuolen te berooven door
op het dekglas te drukken van een preparaat in water of pekel.
Klebahn (1922) vermeldt, dat hoewel het ook met levend materiaal
van Gloiotrichia mogelijk is, de gasvacuolen door druk op het dekglas
van het preparaat te verwijderen, hij toch beter resultaat verkrijgt,
wanneer hij gefixeerde of met KOH behandelde blauwe wieren ge-
bruikt. Er werd nu een preparaat gemaakt van de bacteriën van stam 7
in 20% KOH; het bleek, dat men reeds, nadat de bacteriën ongeveer
I minuut zich hierin bevonden, door op het dekglas met een naald
een druk uit te oefenen de vacuolen verwijderen kon, wat zeer goed
macroscopisch aan het helder worden van het preparaat op de plaats,
waar de naald gerust had, te zien was. Na afloop waren microsco-
pisch tusschen de resten van de bacteriën vele kleine gasbelletjes
waar te nemen. Werd het zelfde gedaan met bacteriën van een stam

zonder gasvacuolen, dan ook waren na afloop enkele gasbelletjes
waar te nemen, echter zeer veel minder dan wanneer stam 7 gebruikt
was. Klebahn (1895, 1922) wijst er op, dat, als men op water een
druk uitoefent en deze plotseling opheft, er luchtbellen gevormd
worden. Dat gasbelletjes bij de proef met een stam zonder gas-
vacuolen ontstaan, kan dus zeer goed hierin zijn verklaring vinden.

Het volgende maakt het zeer waarschijnlijk, dat de bacteriën, die
dóór druk van de gasvacuolen ontdaan zijn, nog levensvatbaar zijn.
Wanneer de klassieke proef met de druk op de kurk op een suspensie
van de bacteriën in een verzadigde oplossing van NaCl, steriel
wordt uitgevoerd en na afloop (als in een microscopisch preparaat
van de suspensie geen bacteriën met gasvacuolen meer waar te
nemen zijn), van deze suspensie een hoeveelheid op agar wordt uit-
gestreken, dan ontwikkelen zich hierop vele kolonies. Voor het groot-
ste deel bestaan deze uit bacteriën van hetzelfde type als de stam,
waarvan is uitgegaan, enkele kolonies blijven echter geheel helder
van uiterlijk. Bij microscopisch onderzoek blijken de bacteriën van
deze kolonies dan ook geen gasvacuolen te bezitten. Dit resultaat
werd zoowel met stam 7, als met een van de andere stammen met
gasvacuolen verkregen. De kleur van de heldere kolonies was rood-
bruin. Ook kwam het voor, dat een segment van een kolonie bestond
uit bacteriën zonder gasvacuolen, de rest uit bacterien met gas-
vacuolen. Bij verder kweeken van de doorzichtige kolonies bleven de
culturen de eerste tijd uit bacteriën zonder gasvacuolen bestaan. De
culturen, ontstaan uit bacteriën van stam 8, werden na eenige weken
echter weer troebel, als gevolg van het weder optreden van gas-
vacuolen. De culturen, ontstaan uit bacteriën van stam 7, bleven lan-
ger het vermogen gasvacuolen te vormen missen. Na ongeveer twee
maanden vertoonden echter ook sommige bacterien van enkele van
deze culturen weer het karakteristieke beeld, eigen aan de bacteriën
van stam 7, als gevolg van het weer optreden van gasvacuolen, ter-
wijl de cultuur eenigszins troebel was geworden.

Ik sprak, wat betreft de levensvatbaarheid van de bacteriën, die
van de gasvacuolen zijn ontdaan, van groote waarschijnlijkheid en
niet van zekerheid, omdat het nog mogelijk is, dat enkele bacteriën,
hoewel deze niet opgemerkt waren, door de druk niet van de gas-

vacuolen zijn beroofd en dat de opgetreden kolonies de nakomelingen
2;ijn van deze bacteriën. Er zijn dus de volgende mogelijkheden:
1°. De heldere kolonies zijn uit bacteriën, waarvan de gasvacuolen
zijn verwijderd, de troebele kolonies uit normaal gebleven bacteriën
voortgekomen. De nakomelingen van de bacteriën, waarvan de gas-
vacuolen zijn verwijderd, missen dus, als we met dit geval te maken
hebben, eenige tijd het vermogen gasvacuolen te vormen. Toch geloof
ik niet, dat het ontbreken van de gasvacuolen direct het gevolg
hoeft te zijn van dit mechanisch ingrijpen. Mechanische invloeden
kunnen van zeer ingrijpende aard zijn op het physisch-chemische
karakter van het protoplasma, in ieder geval moet de bacterie, ten-
gevolge van de wond, die door het uittreden van het gas moet zijn
ontstaan in minder gunstige condities verkeeren. Nu is het opvallend,
dat ook door ander soort ingrijpen n.1. bij plotseling overbrengen van
de bacterie van een bodem met 30 % NaCl op een met 20 %, lange
tijd geen gasvacuolen worden gevormd. Het is mogelijk, dat slechte
condities, waarin de bacteriën zich bevinden, in het algemeen de vor-
ming van gasvacuolen remmen. Opmerkelijk is, dat ook de culturen
op bodems met 20 % NaCl eenigszins bruin van tint zijn en dat de
plotseling opgetreden doorzichtige plaatsen in de cultuur van stam 4,
waarvan de nakomelingen eenige tijd het vermogen gasvacuolen te
vormen hadden verloren, eveneens bruin-rood van kleur waren (zie
bladz. 24). De verwijdering van de gasvacuolen zou dus, als geval I
juist is, slechts indirect de oorzaak zijn van het ontbreken van deze
bij de nakomelingen. 2°. Zoowel de heldere als de troebele kolonies
Zijn uit bacteriën, waarvan de gasvacuolen zijn verwijderd, voort-
gekomen. 3°. Beide typen van kolonies zijn uit bacteriën, die de
gasvacuolen hebben behouden, voortgekomen. Dat de nakomelingen
van deze bacteriën in een groot percentage het vermogen gasvacuolen
te vormen hebben verloren, moet in dit geval het gevolg zijn van de
nadeelige invloed van de druk op de bacteriën.

Zooals in de inleiding van dit hoofdstuk vermeld is, verdwijnen
de gasvacuolen onmiddellijk, wanneer bij de levende bacteriën in
«en verzadigde oplossing van NaCl alcohol 96 % wordt gevoegd.

Hetzelfde had plaats met geconcentreerd zoutzuur, met aceton en
met een 6 % oplossing van phenol. In de inleiding werd eveneens
vermeld, dat als de bacteriën van te voren in water waren gebracht,
de alcohol minder snel inwerkt. Dit was ook het geval met phenol
en aceton, niet met zoutzuur. Het door water gedoode protoplasma
wordt waarschijnlijk door het sterke zuur spoedig vernietigd. Men
kan onder het microscoop het plotseling verdwijnen van de vacuolen
door toevoeging van dit zuur achtereenvolgens bij de verschillende
bacterie-individuen vervolgen. Belangrijk is, dat ook in de prepa-
raten, waarin met reagentia de gasvacuolen zijn verwijderd, vele
gasbelletjes ontstaan. Zeer gemakkelijk zijn deze zelfs met het bloote
oog waar te nemen, wanneer een hoeveelheid bacteriën van stam 7
in aceton of geconcentreerd zoutzuur wordt gebracht. (Als men het
gemakkelijk verdampende aceton gebruikt, doet men het best een
preparaat te vervaardigen en dit met vaseline af te sluiten.) Brengt
men bacteriën van een stam zonder gasvacuolen in aceton of zoutzuur,
dan zijn (ook microscopisch) geen gasbellen waar te nemen. Er werd
bij gebruik van beide stammen voor gezorgd, dat geen voedings-
bodem mee in de aceton of het zuur werd overgebracht. De stammen
waren onder dezelfde omstandigheden gekweekt. Vooral de proef
met aceton is van belang voor de gastheorie, daar aceton een zeer
indifferente stof is, zoodat het gas niet ontstaan kan zijn door een
chemische reactie met een specifieke inhoudstof van de bacteriën
van stam 7.

Het blijkt dus, dat de gasvacuolen van Bacterium halobium bij
toediening van dezelfde stoffen en even snel verdwijnen als dit het
geval is met de gasvacuolen van de blauwe wieren. De meening van
Klebahn (1895), dat deze stoffen het gas verdringen, doordat er
een grootere adhaesie bestaat tusschen deze vloeistoffen en het proto-
plasma om de vacuole dan tusschen het gas en dit protoplasma, geeft
een zeer goede verklaring van dit verschijnsel.

Zooals in het literatuuroverzicht beschreven is, was het mogelijk
bij de blauwe wieren de gasvacuolen ook met vloeistoffen, die in zeer
geringe hoeveelheid in water oplossen, te verwijderen. Dit waren
alles organische stoffen, die gemakkelijk vet oplossen. Om na te gaan
of de gasvacuolen van Bacterium halobium ook door deze stoffen

kunnen worden vernietigd, werd een suspensie van stam 7 in water
en een in pekel met xylol geschud. Deze suspensies waren zeer ge-
concentreerd, zoodat zij geheel wit van uiterlijk waren. Vijf minuten
na het schudden was echter de waterige suspensie geheel helder,
terwijl de suspensie in de pekel veel minder troebel was geworden.
Het bleek, dat in de eerste van de bacteriën zoo goed als niets meer
te vinden was, terwijl in de laatste de bacteriën nog onveranderd
voorkwamen, behalve dat de gasvacuolen verdwenen waren. Dus ook
bij Bacterium halobium is het zeer goed mogelijk, dat de meening
van Klebahn (1922), dat de gasvacuolen een wand bezitten, die uit
een vetachtige stof bestaat, dus door vetoplosmiddelen als xylol
wordt vernietigd, juist is.

Wordt een suspensie van de bacteriën in water eenige tijd gekookt,
dan verdwijnen de gasvacuolen. Ook Wille (1902) kon door koken
de gasvacuolen uit r/izof/zrzx verwijderen. Dat Gloiotrichia, na te zijn
gedroogd, bij sterk verhitten in olie, hars of paraffine tot 228° C,
^oodat het wier bruin wordt, de gasvacuolen behoudt (Klebahn
(1922)), is hiermee niet in tegenspraak. De celwanden van de ge-
droogde wieren zullen de gasvacuolen blijven omsluiten, terwijl het
koken van de niet gedroogde bacteriën de structuur hiervan zal ver-
nietigen, zoodat het gas kan vrijkomen. Klebahn (1922) vermeldt
trouwens op bladz. 559, dat lang koken van Clathrocystis aeruginosa
Henfr. de gasvacuolen vernietigt.

Ter eerste oriënteering naar de chemische samenstelling van de
inhoud van de gasvacuolen, werd de volgende proef gedaan. Een sus-
pensie van de bacteriën van stam 7 werd bereid in een waterige
indigo-karmijnoplossing. De door de indigo-karmijn blauw gekleurde
suspensie werd door toevoeging van eenige druppels van een oplos-
sing van het reductiemiddel NaHSOs juist ontkleurd. Vervolgens
^erd een druk op de vloeistof uitgeoefend, zoodat de gasvacuolen
uit de bacteriën werden verwijderd. Indien de vacuolen zuurstof

bevatten, zou dus te verwachten zijn, dat de blauwe kleur weer
optrad. Dit was echter in het geheel niet het geval, ook met wanneer
vele vlokken, bacteriën in de suspensie aanwezig waren, terwijl de
oplossing, waar deze met de lucht in aanraking kwam, onmiddellijk
blauw van kleur werd. De vacuolen bevatten dus zeer weinig of geen
zuurstof. Bacterium halobium gedraagt zich in dit opzicht waar-
schijnlijk evenals de blauwe wieren (Klebahn (1922)). Welk gas of
gasmengsel dan wel de inhoud van de gasvacuolen uitmaakt, werd

In het literatuuroverzicht is de meening van Kolkwitz (1928) en
Canabaeus (1929) besproken. De laatste concludeert uit haar proeven
met verschillende blauwe wieren, dat in het algemeen de vorming
van gasvacuolen het gevolg is van intramoleculaire ademhaling ten-
gevolge van zuurstofgebrek. Het is mogelijk, dat dit bi) de Cyano-
phyceae met gasvacuolen het geval is, bij de aërobe Bactenum
halobium zeer zeker niet. Het feit, dat Sarcina ventriculi een enkele
maal gasvacuolen kan bevatten, terwijl zij bij geen andere bekende
gistende bacteriën tot nu toe zijn aangetroffen, maar wel bij een
aërobe bacterie en bij purperbacteriën, die volgens de onderzoekin-
gen van van Niel (1931) evenmin zich anaëroob m het donker
kunnen ontwikkelen, maakt deze theorie niet zeer waarschijnlijk.

Het voorkomen van gasvacuolen bij Bacterium halobium is een
nieuw bewijs voor de nauwe verwantschap tusschen de Schizophy-

Bacterium halobium blijkt een zeer gunstig object ter nadere onder-
zoeking van de gasvacuolen te zijn, daar men hier met vergelijkbare
stammen met en zonder deze inhoudsbestanddeelen te doen heeft.

mogelijk, dat bij Bacterium halobium het drijfvermogen,
dat de gasvacuolen de bacteriën verkenen, als een levensfunctie is
te beschouwen, daar zij aëroob zijn en in pekel zeer weimg zuurstof
is opgelost (zie hierover bladz. 52)-

Slechts in weinig onderzoekingen naar de oorzaak van het rood
worden van gezouten visch is aandacht geschonken aan de eigen-
schappen van de kleurstof van de geïsoleerde micro-organismen.
Peirce (1914) vermeldt, dat de kleurstof van de door hem geïsoleerde
bacterie in de agar van de voedingsbodem diffundeert. In hoofdstuk
IV is de mogelijkheid geopperd, dat dit een onjuiste waarneming
is geweest. Harrison en Kennedy (1922) vermelden, dat de kleur-
stofvan de „Pseudomonasquot; in een zoutoplossing, in absolute methyl-
alcohol, in aethylalcohol en in aceton oplost, niet in aether, xylol,
chloroform of zwak zuur. Klebahn (1919) ging de invloed van
geconcentreerd zwavelzuur na: hij bracht een kleine hoeveelheid
levende bacterien, zoowel tot de Sarcina als de Bacterium behooren-
de, in een druppel geconcentreerd zwavelzuur; het gevolg was, dat
op de plaatsen waar het zuur inwerkte, een blauwe verkleuring
optrad. Terwijl in deze eigenschap de twee bacteriën dus overeen-
komen, loopen zij in extraheerbaarheid van de kleurstof sterk uiteen:
terwijl de kleurstof van Bacterium halobium zeer gemakkelijk te
extraheeren is met aethyl- en methylalcohol en na indampen van de
verkregen oplossing gemakkelijk op te lossen in aether, aceton,
chloroform en vele andere organische vloeistoffen, schijnt de kleur-
stof van de Sarcina in deze gebruikelijke oplosmiddelen niet oplos-
baar te zijn. Wat het absorptie-spectrum betreft: m alcohol opgelost
vertoont de kleurstof uit Bacterium halobium drie banden (maxima
bij 528/t/i, 493//^^ en 462 H'')- Van de kleurstof van de Sarcina kon
uit de aard der zaak geen absorptie-spectrum van een oplossmg

ontworpen worden. Klebahn (1919) onderzocht deze echter in
opvallend zonlicht met een microspectraalapparaat van Seibert en
vond een band tusschen 555 en 535 fx^i en algeheele absorptie vanaf
515 [xfA.. Hij besluit uit de oplosbaarheid en het gedrag ten opzichte
van zwavelzuur tot nauwe verwantschap van de kleurstof uit Bacte-
rium halobium met de lipochromen, dus met de carotinoïden.

Wat de oplosbaarheid van de kleurstof betreft, kan ik het onder-
zoek van Klebahn (1919) geheel bevestigen; niet in water, maar in
vele organische oplosmiddelen lost de kleurstof zeer goed op. De
kleur van de oplossingen is als volgt: paars-rood in CSgJ rood in
benzol, xylol, toluol, chloroform, olijfolie; oranje-rood in petroleum-
aether, aceton, aethyl- en methylalcohol. Geen diffusie van de kleur-
stof had plaats in de agar van de voedingsbodem.

De kleurstof van de purperbacteriën, de bacterio-purpurine be-
staat uit twee componenten. Deze kan men afzonderlijk winnen door
de bacteriën achtereenvolgens met alcohol en met chloroform of CS2
te behandelen (Molisch (1907)). Hierdoor wordt de groene com-
ponent, de bacterio-chlorine door de alcohol geëxtraheerd, terwijl
de rood gekleurde bacterio-erythrine, die slecht in alcohol oplost,
pas door de chloroform of CSg uit de bacteriën wordt opgelost. Om
na te gaan of Bacterium halobium tot de purperbacteriën behoort,
werd dus een hoeveelheid bacteriën met aethylalcohol (96 %) be-
handeld; dit geschiedde met versche bacteriën van stam 5 bij kamer-
temperatuur. Het extract was echter, zooals onder i) van deze ^
reeds meegedeeld is, oranje-rood van kleur. Nu vermeldt Buder
(1919) echter, dat een klein gedeelte van de bacterio-erythrine bij
de behandeling met alcohol reeds oplost en dat dit gedeelte grooter
wordt, naarmate het percentage van de alcohol hooger is. Men kan

met absolute alcohol en gedroogde purperbacteriën een rood of bruin
extract verkrijgen. Voegt men nu chloroform bij dit extract en
daarna water, dan gaat de erythrine over in de chloroform, de chlorine
blijft in de verdunde alcohol. Dit voorschrift werd toegepast op de
alcoholische oplossing van de kleurstof uit Bacterium halobium, ech-
ter zonder resultaat: bij toevoeging van chloroform en daarna van
water, ging bij toenemende hoeveelheid water (begonnen was met
eenige druppels op lo c.c. alcohol) steeds meer van de roode kleurstof
in de chloroform over, totdat de alcohol niet groen, maar geheel kleur-
loos was. Bacterio-chlorine is dus niet azrmezig) Bacterium halobium
behoort dus niet tot de purperbacteriën.

Versehe culturen van verschillende stammen van de Bacterium
werden in een afgesloten reageerbuis met alcoholische kali (40 %
alcohol, 20 % KOH) gebracht. Na eenige dagen waren onder de
microscoop in de vlok bacteriën kleine kristallen waar te nemen.
Deze bestonden uit twee soorten, de eene soort was rood en ster-
vormig met onregelmatig vertakte stralen, de andere soort dun,
naaldvormig en geel. Beide kleurden zich met geconcentreerd H^SO^
blauw. Men heeft dus hierin een aanwijzing met twee verschillende
soorten Carotinoiden te doen te hebben. (Molisch (1896), Tswett
(1911), van Wisseling (1915)-)

geheel met methylalcohol uitgetrokken. In het extract werd een
strook filtreerpapier zoodanig gehangen, dat slechts een klem deel
van het papier met de vloeistof in aanraking was. Nadat de capillaire
opstijging in het papier opgehouden was, werd de strook uit de
vloeistof genomen en gedroogd. De strook bleek tot vlak onder de
hoogte, waartoe het extract was opgestegen, licht rose van kleur te
Zijn, daarboven volgde eerst een roode, daarna een oranje-gele zóne.
Dit wijst dus ook op twee kleurstoffen.

pan, was het noodzakelijk deze in kristalvorm te winnen; hiervoor
is noodig, een groote hoeveelheid kleurstof te isoleeren.

De bacteriën werden op agarbodem in petrischalen gekweekt,
zoodat de agar geheel met de cultuur overdekt was. Met een spatel
konden de bacteriën gemakkelijk van de voedingsbodem afgeschrapt
worden. Zij werden versch geëxtraheerd volgens de methode, die
willstatter en Stoll (1913) toepasten om de carotinoïden uit
groene bladeren te winnen. De bacteriën werden in een mortier
met fijn kwartszand en een weinig 70 % aceton gewreven en daarna
met 100 % aceton geëxtraheerd. De slijmerige witte rest werd af-
gefiltreerd en het fikraat in een scheitrechter gebracht. Vervolgens
werd een ongeveer even groot volume aether toegevoegd, daarna
water, met het gevolg dat de kleurstof geheel in de aether overging.
Hierna werd de aether vele malen met water gewasschen om de
aceton uit de aether te verwijderen. Wil men de vorming van een
emulsie op de scheidingslaag van de waterige aceton en de aether
zooveel mogelijk voorkomen, dan kan men, in navolging van van
Deventer (1930) in plaats van water een ± 6 % NaCl oplossing ge-
bruiken. Hierna werd de aether gedroogd met watervrij NagSOi.
Op deze wijze was dus de kleurstof uit de bacterien in een aetherische
oplossing verkregen. Daar aether zeer gemakkelijk door verdamping
is te verwijderen, kon de kleurstof dus nu na indamping van de op-
lossing in vele andere oplosmiddelen overgevoerd worden. Het in-
dampen geschiedde bij lage druk, in het donker, in een waterbad,
waarvan de temperatuur nooit hooger was dan 50°. De wijze van
isolatie komt dus geheel met die van Willstatter en Stoll (1913)
overeen, behalve dat deze de bladeren met 30 % aceton wreven.
Het bleek echter, dat bij deze concentratie van de aceton de kleurstof
van de bacteriën kolloïdaal in oplossing gaat en niet meer over te
voeren is in aether, behalve dan door toevoegen van (NHJa SO4 of
veel NaCl. Een concentratie van 70 % aceton bleek het best aan het
doel te beantwoorden, een nog meer geconcentreerde aceton was ook
minder geschikt, daar het bij deze concentratie moeilijk was, de
bacteriën voldoende te doen zwellen en fijn te wrijven.

Het residu, verkregen na indamping van het aether-extract, is
olieachtig. Dit is een- heel gewoon verschijnsel. De carotinoïden
lossen in het algemeen zeer goed in vetachtige stoffen op en komen
in de plant ook veel in dergelijke stoffen opgelost voor (Van Wisse-
lingh (1915), zopf (1891))- Vandaar ook, dat de methodes ter win-
ningvan carotinoïden in kristalvorm, zoowel de microchemische van
Molisch (1896), als de macrochemische, aanvangen met een be-
handeling van de ruwe kleurstof, waarbij het tegelijkertijd geëxtra-
heerde vet wordt verzeept of op een andere wijze verwijderd. Het
verzeepen is echter ook van belang voor andere eventueel aanwezige
esters. Vermast (1931) wijst er n.1. op, dat esters van xanthophyl,
welke door verschillende onderzoekers in verschillende planten zijn
aangetroffen, zich in oplosbaarheid b.v. in de twee-phasen-proef
(petr.-aether/85 % alcohol), als carotine gedragen, dus m tegen-
stelling tot het niet verankerde xanthophyl zelf, in de petr.-aetherlaag
oplossen. Het physaliëen uit Physalis alkekengi en het heleniëen
uit Tagetes zijn dergelijke esters. Men is er dus nooit zeker van
dat een kleurstof uit een extract, dat men met aan verzeeping heeft
onderworpen, carotine is en niet een xanthophyl-ester, als deze

Het was dus in verschillende opzichten van belang, het verkregen
kleurstofextract uit Bacterium halobium met alcoholische kali in
aanraking te brengen. Om uit de op deze wijze behandelde kleurstof-
oplossing de kleurstof te doen neerslaan, werd gebruik gemaakt van
het feit, dat de kleurstof zeer slecht in petr.-aether oplost. Deze
eigenschap heeft de kleurstof gemeen met capsanthine.

Ter winning van de zuivere kleurstof werd daarom de methode van
Zechmeister en Cholnoky (1927) gevolgd, die uit het ruwe kleur-
stofextract uit de vruchten van Capsicum annuum deze capsanthine
in kristalvorm wonnen (gebruik makende van de slechte oplosbaar-
heid in petr.-aether).nbsp;• , , .

De kleurstof uit de bacteriëncultuur (stam 5) van ruim honderd
petrischalen (diameter: 11 cM.) werd geëxtraheerd en in peroxyd-
vrije aether overgevoerd. Vóórdat de aether werd gewasschen, werd
een even groot volume petr.-aether toegevoegd, zoodat 1,5—2 L

oplossing verkregen was. Deze oplossing werd gedeeltelijk in een
breede scheitrechter, gedeeltelijk in een flesch, boven loo c.c. methyl-
alcoholische-kali (30 % KOH op absolute methylalcohol) als onder-
laag gebracht. Eenige keeren werden de vaten met de vloeistoffen
op en neer bewogen (schudden van de oplossing met de alcoholische
kah doet te veel kleurstof hierin overgaan). Na een nacht staan, werd
het mengsel van aether en petr.-aether van de onderlaag verwijderd
en zeer grondig gewasschen met water (15 maal met ongeveer i L)
tot het water neutraal en kleurloos was, niet meer schuimde, wanneer
het geschud werd en de kleurstofoplossing helder was. Nu werd de
kleurstof langzamerhand in petr.-aether overgevoerd door de op-
lossing tot 250 cc in te dampen, daarna 700 cc petr.-aether toe te
voegen, weer tot 250 cc in te dampen en daarna 850 cc petr.-aether
toe te voegen. Vervolgens werd de oplossing in een koudmakend
mengsel (ijs en keukenzout) in de ijskast een nacht bewaard. Het
gevolg was, dat de bodem van het vat de volgende dag geheel bedekt
was met ruw kristallijn kleurstofmateriaal. De moederlaag was echter
nog zeer intensief gekleurd. Deze werd op één vierde van het volume
ingedampt. In een koudmakend mengsel sloegen ook hieruit roode
kristallen neer. Tot zoover werd geheel de verbeterde methode van
Zechmeister en Cholnoky (1927) gevolgd en hetzelfde resultaat
verkregen. Zechmeister en Cholnoky (1927) kristalliseerden de

ter verdere zuive-
ring in CS2 om.
Deze bewerking had
echter, waar het de
kleurstof van Bac-
terium halobium be-
trof, weinig resul-
taat. Een zeer goede
methode ter verdere
zuivering, werd

echter gevonden in het toevoegen van petr.-aether na het op-
lossen van het ruwe kristallijne materiaal in CS2 (gedestilleerd).
Onmiddellijk sloeg een fijne regen van kristallen neer of bleef ge-

deeltelijk in de oplossing zweven. De afgefiltreerde kristallen werden
nogmaals met petr.-aether gewasschen, daarna gedroogd en onder
N. bij lage temperatuur bewaard. De kleur van de kristallen (zie
foto e) is zeer donker rood. Nog moet worden vermeld, dat zorg
werd gedragen, dat bij de behandeling de kleurstof zoo min mogelijk
werd blootgesteld aan belichting en hooge temperatuur of met zuur-
stof in aanraking kwam. De oplossing werd daarom van het licht
afgesloten, er boven werd steeds stikstof of koolzuur gebracht en
bij indamping gezorgd, dat de temperatuur van het waterbad nooit
hooger was dan 50° C. Het is n.1. een bekend feit, dat carotinoïden
gemakkelijk geoxydeerd worden en dat het licht hierbi; een groote
rol speelt. Een oplossing van de ongezuiverde kleurstof van de
bacterie was, na ongeveer een week aan licht en lucht te zijn bloot-
gesteld, na steeds geler van kleur te zijn geworden, geheel ontkleurd,
terwijl een dergelijke oplossing (N.B. ook in aether) aan de lucht in
het donker bewaard, meer dan een maand goed bleef.

Het principe van deze analyse berust op het feit, dat de caroti-
noïden in bepaalde oplosmiddelen in zeer verschillende mate of in
het geheel niet worden geadsorbeerd aan fijn verdeeld materiaal
als CaCOg, inuline, saccharose en andere stoffen. Hieruit volgt, dat
als zich verschillende carotinoïden in eenzelfde oplosmiddel bevinden
en men deze oplossing door een dikke laag van één van de genoemde
adsorbentia voert, de stof, die het sterkst geadsorbeerd wordt, de
carotinoïden, waarvan dit in mindere mate het geval is, zal verdrin-
gen. Deze zullen dus in de onderste gedeelten van de laag, waar ze
geen concurrentie meer ondervinden van de eerstgenoemde, vast-
gehouden worden. Degene, die niet geadsorbeerd worden, zullen
natuurlijk in het oplosmiddel blijven en dit kan worden opgevangen.
Het moet dus mogelijk zijn met deze methode een mengsel van
carotinoïden in zijn componenten te splitsen. Wat een uitvoeriger
beschrijving van de analyse betreft, verwijs ik naar Tswett (1906a
en b) en van Deventer (1930). Ik gebruikte CaCOa (Merck), welke
aan de zuiverheidseischen van de Nederlandsche pharmacopee bleek

te voldoen. Na een paar uur bij 150° C gedroogd te zijn, werd zij iti
een adsorptiebuis (21/2 cM of 11/2 cM bij 7 cM, voor de vorm zie
figuur 6) aangestampt. In de overgang van het wijde tot het nauwe
gedeelte van de buis bevond zich een prop glaswol. Glas verdient de
voorkeur boven watten, daar er carotinoïden zijn, die zeer sterk door
cellulose worden geadsorbeerd (b.v. carotinoïde C (van Deventer
(1930)). Eenige kristallen van de kleurstof uit Bacterium halobium
werden in gedestilleerde zwavelkoolstof opgelost en op de van te
voren met dit oplosmiddel bevochtigde zuil van CaCOg gegoten.
De oplossing werd met behulp van een waterstraalluchtpomp lang-
zaam door de zuil gezogen. Spoedig traden twee duidelijk van elkaar
gescheiden gekleurde zones in de CaCOg op, de onderste in veel
geringere intensiteit dan de bovenste. De Zwavelkoolstof verliet ge-
heel ontkleurd de CaCOg. Nadat de oplossing geheel was doorgeleid,
werd eenige tijd het zuivere oplosmiddel door de zuil gezogen. Ten-
gevolge hiervan verwijderden de twee ringen zich steeds verder van
elkaar en werd de bovenste ring steeds breeder, terwijl hierin drie
zones waren te onderscheiden, waar de kleurstof het sterkst was
geadsorbeerd. Ik wil deze zones A^, A^ en A3 noemen, terwijl ik de
onderste ring B noem. Nog later splitste ook A, zich, zoodat de
bovenste ring uit vier eenigszins in elkaar overvloeiende zones be-
stond (A/, Alquot;, Ag en A3). De kleur van de verschillende adsorptie-
zónes was eenigszins verschillend, B, A/ en A/' waren steenrood,
Ag wijnrood, A3 paarsrood van kleur. Met aether konden de ringen
weer van de CaCOg worden vrijgemaakt, nog beter gelukte dit,
wanneer bij de aether eenige cc methylalcohol was gevoegd. Ik
had dus een aanwijzing, dat ook de gewonnen kristallen uit een
mengsel van twee of meer nauw verwante kleurstoffen bestaan, die
aan CaCOs worden geadsorbeerd. Er zijn echter nog verschillende
moeilijkheden aan de chromatographische analyse verbonden, b.v.
kan men niet een scherpe lijn trekken tusschen stoffen, die niet en
die wel geadsorbeerd worden. De adsorptie is n.1. zeer sterk afhanke-
lijk van de vastheid, waarmee de CaCOa is aangestampt, de concen-
tratie, die de kleurstofoplossing heeft en de sterkte van de zuiging,
waarmee de kleurstofoplossing en het zuivere oplosmiddel door de
CaCOa wordt gevoerd. Zoo werd ring B, die, als de zuil niet zeer

vast was aangestampt, een gering geconcentreerde kleurstofoplossing
gebruikt was en een sterke zuiging was toegepast, aanvankelijk nog
geadsorbeerd, maar zoodra het zuivere oplosmiddel werd doorgeleid
weer vrijgemaakt. Verder is steeds door de verschillende botanische
onderzoekers, die met deze methode hebben gewerkt, aangenomen,
dat alle opgetreden ringen ook verschillende kleurstoffen bevatten.
Wel merkte Tswett (19066) op, dat men de analyse moet herhalen
om de kleurstoffen geheel vrij van elkaar te verkrijgen. Er is echter
kort geleden van chemische zijde een publicatie verschenen van
Kuhn, Winterstein en Lederer (1931). waaruit blijkt, dat men zeer
voorzichtig moet zijn met conclusies uit deze analyse getrokken.
Deze auteurs verkregen, nadat zij 0,5 mgr kristallen van xanthophyl
uit bladeren, met 0,5 mgr kristallen zeaxanthine tezamen hadden
opgelost in zwavelkoolstof, vier adsorptie ringen aan CaCOg. Het
bleek, dat als zij de kleurstof uit de tweede en de derde ring tezamen
opnieuw door CaCOj leidden, er weer vier ringen optraden. Dit kon
zoo lang herhaald worden, totdat men het kleurstofmengsel geheel
tot twee ringen (de eerste en de vierde) had teruggebracht. De ge-
zamelijke ringen I bleken na afloop voor 90 % zuiver xanthophyl,
de gezamelijke ringen IV voor 70 % zuivere zeaxanthine te zijn. De
twee middelste ringen vertegenwoordigden dus niet twee afzonder-
lijke kleurstoffen. Het kan zijn, dat iets dergelijks het geval is met de
vier adsorptieringen, die Tswett (19066) verkreeg met xanthophyl
uit bladeren. De kleurstof in de vier ringen aanwezig, noemde hij
respectievelijk a, a', aquot; en ß xanthophyl. Kuhn en Winterstein
(1931) vermelden n.1., dat de /J-xanthophyl van Tswett (19066)
hoogstwaarschijnlijk violaxanthine is (de carotinoïde kleurstof uit
Viola tricolor). Het zou dus mogelijk zijn, dat de twee middelste
ringen van Tswett bestaan uit mengsels van xanthophyl en viola-
xanthine.

Het was dus de vraag in hoeverre de adsorptieringen, verkregen
met de bacteriekleurstof, afzonderlijke kleurstoffen bevatten.

Er is echter nog een tweede mogelijkheid, n.1. dat er nog meer
componenten aanwezig zijn, dan dat er ringen optreden. Kuhn en
Lederer (1931) spreken n.1. niet van optreden van adsorptieringen,
als zij een mengsel van a- en /5-carotine aan kaolien laten adsorbeeren.

(Deze a en vorm werden onderscheiden op grond van spectrosco-
pische en polarimetrische bepalingen).

Dus werd nagegaan, wat gebeurde bij een herhaling van de
analyse. Daar ik voorzag, dat bij deze bewerking veel kleurstof ver-
loren zou gaan, wilde ik liever niet met de kristallen werken. Er werd
dus nagegaan of met een oplossing van de ongezuiverde kleurstof
hetzelfde adsorptie-beeld kon worden verkregen. Dit bleek het ge-
val te zijn. Nadat de kleurstofoplossing door de CaCOg zuil geleid
was, werd lange tijd het zuivere oplosmiddel doorgezogen. Daarna
werd ring A van B gescheiden, door, nadat de zuil eenigszins gedroogd
was, het gedeelte van de CaCOg, waarin ring A zich bevond, af te-
scheppen. Deze werd in een nieuwe adsorptie-buis gebracht en droog-
gezogen. Nu werd gedroogde aether door de CaCOg gezogen, zoodat
de kleurstof van het adsorbens werd vrijgemaakt. Uit de aetherische
oplossing werd de aether door verdamping verwijderd, de kleurstof
opnieuw in zwavelkoolstof opgelost en door een zuil CaCOj geleid.
Het bleek, dat de scheiding volkomen plaats had gehad, ring B trad
niet opnieuw op. Ook wanneer omgekeerd ring B uit de CaCOg werd
vrijgemaakt en opnieuw door CaCOg geleid werd, trad slechts ring
B op. A en B zijn dus twee afzonderlijke kleurstoffen. Dit was trou-
wens te verwachten, gezien het optreden van twee soorten kristallen
bij toepassing van de microchemische kristallisatiemethode van
Molisch (1896). De chromatographische analyse behoeft dus slechts
één maal toegepast om A en B te scheiden, mits men lang genoeg
met het zuivere oplosmiddel naspoelt. Het bleek n.1. dat, deed men
dit niet en scheidde men de twee kleurstoffen direct nadat de kleur-
stofoplossing doorgeleid was, kleurstof A tot een hoog percentage
met B verontreinigd was. Bij deze proef moet nog vermeld worden,
dat bij het lange doorleiden van CSg opviel, dat sommige ringen zich
nog verder deelden. Zoo splitste ring B zich onduidelijk in drie
deelen, terwijl behalve A^ ook A3 zich in tweeën deelde, zoodat het
beeld optrad, zooals in figuur 6 is weergegeven. De vraag was nu,
of al deze zones eveneens zelfstandige componenten van de kleurstof
van Bacterium halobium bevatten. Het werd alleen nagegaan voor de
zones van ring A, terwijl geen rekening werd gehouden met de
splitsing van A^ en A3.

I.nbsp;Al werd van k^ en A3 gescheiden en opnieuw geanalyseerd:
drie zones traden op, waarvan de onderste paarsrood was. De geheele
ring A is dus weer te voorschijn gekomen. De laag CaCOg, waarin
zich de bovenste van de drie zones bevond, werd
afgeschept en de hieraan geadsorbeerde kleurstof
opnieuw geanalyseerd. Nu trad slechts één ring
op, die zich na eenige tijd in tweeën deelde, wat
toe te schrijven is aan de splitsing van Ai in A/en
A/'. Wel vloeide de ring naar beneden eenigszins
uit. De vierde analyse deed ook dit uitvloeien
verdwijnen. Ai is dus een zelfstandig deel van
kleurstof A.

II.nbsp;Met A3 werd het zelfde resultaat bereikt.
Reeds bij de derde analyse trad slechts één ring
op, die zich na eenige tijd in twee deelen split-
ste, wat het gevolg is van de splitsing van deze

III.nbsp;Voor de zóne, waarin zich kleurstof Ag
bevond, bestond nu echter de mogelijkheid, dat
deze slechts een mengsel van Ai en A3 bevatte,
evenals de twee middelste ringen in de CaCOa zuil,
waardoor Kuhn, Winterstein en Lederer (1931)
een oplossing van een mengsel van xanthophyl
en zeaxanthine leidden, slechts een mengsel bevatten van deze twee
kleurstoffen. Bij de tweede analyse trad echter reeds de middelste
van de drie opgetreden ringen duidelijk op de voorgrond. Bij de
vierde analyse ontstond één ring, die naar boven en naar beneden
eenigszins- uitvloeide. Ook Ag is dus een zelfstandige component van
kleurstof A.

Het blijkt dus, dat de roode kleur van Bacterium halobium het ge-
volg is van het voorkomen van twee nauw verwante kleurstoffen,
waarvan degene (A), die in de grootste hoeveelheid aanwezig is, op
zijn minst bestaat uit drie componenten (isomeren?), terwijl de andere
kleurstof (B) waarschijnlijk eveneens uit enkele componenten be-
staat. De twee kleurstoffen werden door mij (1931) bacterio-ruberine
a en ^ genoemd. Bacterio-ruberine a en kunnen dus op dezelfde

wijze kristallijn gewonnen worden. Zij kunnen in het kristallijnen
neerslag óf als mengsel voorkomen, óf zij vormen mengkristallen.
Het voorkomen van mengkristallen werd o.a. door Kuhn, Winter-
stein en Lederer (193i) waarschijnlijk gemaäkt voor het mengsel
van carotinoïden, dat uit de eidooier kan worden geëxtraheerd.
Deze onderzoekers toonden n.1. aan, dat het xanthophyl uit de ei-
dooier uit een mengsel bestaat van xanthophyl uit bladeren en
zeaxanthine (afhankelijk van het voedsel van de kip). Deze twee
kleurstoffen zijn echter niet door kristallisatie te scheiden. Zij ver-
klaren dit, door aan te nemen, dat mengkristallen worden gevormd.

Daar het voor de vergelijking van bacterio-ruberine met de andere
bekende carotinoïden van belang was te weten of deze ook in petr.-
aether opgelost aan CaCOg geadsorbeerd wordt, werd een dergelijke
oplossing eveneens door een zuil fijn verdeeld CaCOg geleid. Het
bleek, dat alle aanwezige kleurstofcomponenten geadsorbeerd wer-
den: het extract, dat vrij kwam was geheel ontkleurd. Twee ringen
ware:n in de zuil aanwezig, de bovenste was rood, de onderste oranje
van kleur. Geen van de ringen was in zones verdeeld. Het bleek ech-
ter, dat wanneer aether werd toegevoegd, drie zones in de bovenste
ring (die verreweg de meeste kleurstof bevatte, dus uit bacterio-
ruberine a bestond) optraden, terwijl de kleurstof in dit oplosmiddel
opgelost, langzaam door de CaCOg naar beneden zakte en vrij kwam.

Om de kleurstoffen uit Bacterium halobium met andere reeds be-
schreven carotinoïden te kunnen vergelijken, moesten verschillende
eigenschappen van deze kleurstoffen worden nagegaan. Ik onder-
zocht allereerst of verschillende reacties, die kenmerkend voor de
carotinoïden zijn, een positief verloop hadden. Daarna werden het
absorptie-spectrum en de oplosbaarheid nagegaan. Ik ben mij hierbij
bewust zeer onvolledig te zijn, want zonder verder chemisch onder-
zoek is het natuurlijk uitgesloten nauwkeurig bacterio-ruberine a en
ß met de reeds bekende carotinoïden te vergelijken.

Van Wisselingh (1915) beschreef een reeks reacties, die min of
meer karakteristiek zijn voor de carotinoïden uit de plant. Het bleek,
dat degene, hiervan door mij op de kristallen van bacterio-ruberme
a en ^ toegepast, een positief resultaat opleverden. Kristallen van
bacterio-ruberine « worden in geconcentreerd zwavelzuur blauw; in
geconcentreerd salpeterzuur eerst blauwgroen, later groen; in een
oplossing van jodium in joodkalium langzamerhand groen; m een
verzadigde oplossing van ZnCl^ in 26 % HCl onmiddellijk blauw;
in verdund broomwater blauwgroen. Kristallen van bacterio-ruberme
P worden in geconcentreerd zwavelzuur blauw; in geconcentreerd
salpeterzuur blauwgroen; in een oplossing van jodium in joodkalium
groen; in een verzadigde oplossing van ZnCl^ in 26 % HCl onmid-
dellijk blauw; in verdund broomwater blauw.

Ter vergelijking met de banden, die Klebahn (1919) waarnam
in het absorptie-spectrum van een oplossing van de kleurstof van
Bacterium halobium, werd allereerst het spectrum van het mengsel
van bacterio-ruberine a en ^ zooals het in de bacteriën voorkomt,
onderzocht. Foto ƒ geeft een spectogram gemaakt met een kleine
Fuess-spectrograaf van de ongezuiverde kleurstof, opgelost m CS^.
Men ziet, dat het spectrum twee banden vertoont, waarvan degene,
die zich het dichtst bij
het violette deel van
het spectrum bevindt,
onduidelijk in twee
deelen is gedeeld. Met
behulp van een dub-

titatief het absorptiespectrum bepaald. De opstelling was dezelfde
als Janssen (1931) bij zijn onderzoek gebruikte en die hij als volgt
beschreef: „Met behulp van een lens werd het licht, afkomstig

van een 6 Volts automobiel-lampje, dat met constante stroom
gevoed werd, evenwijdig gemaakt. De hierachter geplaatste lens

vormde een beeld van de spiraal der lamp op de eerste spleet van
een dubbelmonochromator volgens van Gittert (1923). Een
achter de monochromator geplaatst achromatisch lenzenstelsel

beeldde de laatste spleet van de monochromator af op een vacuum-
thermo-element. De opvallende energie werd gemeten met een

thermo-relais-opstelling volgens Moll en Burger (1935). Tusschen
de beide eerste lenzen werden twee naast elkaar opgestelde kuvetten
geplaatst. Deze kuvetten, waarvan het eene met het oplosmiddel.

het andere met de oplossing gevuld was, konden om de beurt in de
lichtbundel gebracht wordenquot;.

Voor een uitvoeriger beschrijving zie van Deventer (1930). Men
bepaalt de intensiteit van het licht, dat door de te onderzoeken op-
lossing wordt doorgelaten in de verschillende spectraalgebieden. De
doorlating in procenten verkrijgt men door de verkregen uitslag,
wanneer de kuvet met de kleurstofoplossing zich in de lichtbundel
bevindt, te deelen door de uitslag verkregen, wanneer dit met de
kuvet met het oplosmiddel het geval is. Een doorlatingskromme
wordt verkregen, wanneer men de doorlating in procenten uitzet
tegen de golflengten. De plaatsen in de kromme, waar deze door-
lating gering is, komen overeen met de absorptiebanden van de kleur-
stofoplossing. Om deze banden van het volledig aantal kleurstoffen
uit de bacteriën te bepalen, werd een ongeveer 0,001 % oplossing
van de verkregen kristallen in gedestilleerde CSg bereid en hiervan
de absorptie-kromme bepaald; deze is weergegeven in figuur 7 (de
onderste kromme). Daar het bij deze concentratie van de oplossing
slechts mogelijk was, de doorlating in een gedeelte van het spectrum
te bepalen, werd een 0,0005 % oplossing bereid. Een volledige krom-
me kon hiervan verkregen worden (de bovenste kromme in figuur 7).
Eveneens werd voor enkele golflengten de doorlating van oplossingen
bepaald van een concentratie van 0,00025 en 0,000125 %. De ge-
bruikte kuvetten hadden een dikte van ^ cM. Het meten van de
doorlating van oplossingen van verschillende concentratie was nood-
zakelijk om na te gaan of deze kleurstofoplossingen de wet van Beer
volgden d.w.z. of voor verschillende concentraties de extinctie-
co ëfficient gelijk blijft. Is dit niet het geval, dan mogen geen conclu-
sies uit de krommen getrokken worden, daar dan bij verschillende
concentraties de banden niet op dezelfde plaats in het spectrum
liggen. In formule uitgedrukt luidt de wet van Beer:

waarin E = extinctie, K — extinctie-coëfficient, c = concentratie
van de absorbeerende deeltjes, d = dikte van laag in cM, Iq = inten-
siteit van het licht vóór de absorptie, I = intensiteit van het licht

na de absorptie. De log. van de percentueele doorlating moet dus
recht evenredig zijn met de concentratie, bij gelijke dikte van de
kuvet. Bij uitzetting van deze twee grootheden moet men dus een
rechte lijn verkrijgen. Voor de golflengten : 5655. 5280, 5000 en
4770 A werd de wet van Beer getoetst. De oplossingen bleken de wet

''rWur 8(B) is weergegeven de doorlatingskromme van de
bacteriekleurstoffen in methylalcohol. Vergelijkt men deze met de
kromme, verkregen met de oplossing in zwavelkoolstof (figuur 7),
dan valt de groote bandverschuiving naar het violette deel van het
spectrum op, als gevolg van het verschil in eigenschappen tusschen de
oplosmiddelen. Daar de invloed van het oplosmiddel op de absorptie
vL de opgeloste stof, als alcoholen gebruikt worden, weinig zal ver-
schillen, kunnen dus nu de minima uit de doorlatingskromme voor
methylalcohol met de banden, die Klebahn (1919) waarnam, ver-
geleken worden (zie tabel I).

Nu moeten echter de doorlatingskrommen van de kleurstofcom-
ponenten nog afzonderlijk worden onderzocht. In figuur 8 (A) en 9
Zijn de doorlatingskrommen van bacterio-ruberme a en ^ afzonderlijk
(opgelost in methylalcohol) weergegeven. De componeren waren
weer verkregen door gefractioneerde adsorptie aan CaCO« van een
oplossing van de kristallen. De volgende banden mtgedrukt in^./.
zijn uit de krommen af te leiden:

Het blijkt, dat a en yS beide twee zeer krachtige absorptie-banden
vertoonen en dat die van a ten opzichte van die van ^ naar het blauw
verschoven liggen. Uit de vergelijking met het mengsel van beide is
verder af te leiden, dat a de toonaangevende component is, daar de
minima van a samenvallen met die van het mengsel der twee kleur-
stoffen. Dus ook in zwavelkoolstof opgelost zullen de minima van a
moeten samenvallen met de minima in de doorlatingskromme van
het mengsel. Hieruit volgt, dat de maxima van de absorptie-banden
van bacterio-ruberine a (opgelost in zwavelkoolstof) ongeveer bij
560/i/x, 530 ;u/ien 500 ^^timoeten liggen. Van de verschillende compo-

Het in dit gedeelte van de § beschreven onderzoek werd m het
Physisch Laboratorium der Rijksuniversiteit te Utrecht verricht.
Professor Dr. L. S. Ornstein dank ik ten zeerste ervoor dat hi,
mij toestond van de toestellen gebruik te maken Ook wil ik Dr. C.
Janssen Czn. op deze plaats danken voor de door hem verleende

De proeven wetden genomen met» en ^ verkregen door chromato-
graphische analyse van een oplossing van de kristallen m zwavel-
Ustof. De oplosbaarheid bleek in grove trekken -or b^de kleur
stoffen gelijk te zijn. Het best lossen be^e op m me hy alcoho dan

aethylalcohol en terpentijnolie lossen z., vn) goed, m aethylalcohol
96 % vrij slecht, in olijfolie slecht en in petr.-aether en benzme zeer
slecht op, in V rdund zoutzuur of zwavelzuur en m water n,et.,
Bacterio ruberine ? is in oplossing geler van Meur dan bacteno-
ruberine«. Vervolgens werd nagegaan, hoe de kleurstof en z.ch m

Het bkek, dat zij geheel in de methylalcohol oplossen dus hypopha-
sisch zijn evenafs xanthophyl (Willstatter en Stoll (1913)).
Toch is deze voorkeur voor de alcohol niet zoo groot als van ucoxan
thine en c^psanthme - 'n-

rterfh^e^eTeiirr^rsf^^^^^^ Dat het l, deze proef
Lodzakeliik is van de van vet bevrijde kleurstof uit te gaan, blijkt mt
Tertr ng die acHMBtSTBR en Chol.okv (tg.,) opdeden met
capsanthine Deze kleurstof gaf n.1. vóór de verzeeping van het
eXact de TOorkeur aan het mengsel van aether en petr.-aether, na
dr^rzeepii aan de 75 % methylalcohol. Ook bacterio-ruberine
lost'óór de verzeeping van het tegelijkertijd geëxtraheerde vet beter

op in petr.-aetiier dan na deze zuivering, maar van een omkeering
van de ontmengingsproef is toch geen sprake. Vervolgens werd
nagegaan, hoe de twee kleurstoffen zich gedroegen ten opzichte van
het systeem zwavelkoolstof/methylalcohol loo %. Bacterio-rube-
rine a bleek in de methylalcohol op te lossen, bacterio-ruberine ß
zich over beide phasen te verdeelen. Werd echter de methylalcohol
eenigszins verdund, dan gingen beide kleurstoffen onmiddellijk ge-
heel in de zwavelkoolstof over,

Hoewel het reeds onder A 2) van deze § is besproken, wil ik er
hier nogmaals op wijzen, dat de veronderstelling in de inleiding
onjuist is gebleken te zijn, In geen geval behooren alle roode pekel-
bacteriën tot de purperbacteriën. Bacterium halobium tenminste be-
vat twee of meer Carotinoide kleurstoffen, terwijl bacterio-purpurine
uit een of twee (of meer?) Carotinoide kleurstoffen en een groene
kleurstof van geheel andere samenstelling bestaat. Uit tabel III
blijkt, dat bacterio-ruberine a en ß in eigenschappen verschillen van
bacterio-erythrine ß, de Carotinoide, die door de meeste onderzoekers
in de purperbacterien is aangetroffen.

Bacterio-erythrine a komt echter, wat spectrum betreft overeen met
bacterio-ruberine a. Bacterio-erythrine a is door Molisch (1907) in
de purperbacterie Rhodobacillus palustris aangetroffen en ook
Arcichovsky verkreeg volgens Buder (1919) van de Carotinoide
kleurstof uit een purperbacterie het absorptie-spectrum van bacterio-
erythrine a. Onderzoekingen over de chemie van de kleurstoffen
moeten besUssen of werkelijk bacterio-ruberine a en bacterio-ery-
thrine a dezelfde pigmenten zijn. De slechte oplosbaarheid van bac-
terio-erythrine in alcohol doet het niet verwachten. In de tweede
plaats wil ik er op wijzen, dat ook Bacillus prodigiosus een geheel
andere kleurstof produceert dan Bacterium halobium. Het prodigiosi-
ne behoort niet tot de Carotinoiden, hetgeen door Wrede (1930)
is aangetoond.

Wanneer men bacterio-ruberine aen ß met andere bekende Caro-
tinoiden vergelijkt (zie tabel III), dan blijkt, dat bacterio-ruberine a
eenige overeenstemming vertoont met rhodoxanthine, de caroti-

noïde kleurstof, die Lippmaa (1925) o.a. uit rood gekleurde bladeren
van Reseda odorata isoleerde. Ook de kleur van de kristallen komt bij
beide kleurstoffen overeen, eveneens het volgende.

In zeer geconcentreerde methylalcoholische kali ontstaat volgens
Lippmaa (1925) een kalium-verbinding van rhodoxanthine, die met
verdund zoutzuur onmiddellijk ontkleurt en die niet of in zeer ge-
ringe mate oplosbaar is in aether en andere oplosmiddelen. Wanneer
men bacterio-ruberine (opgelost in een mengsel van aether en petr.-
aether) met geconcentreerde methylalcoholische kah behandelt (zie
onder A 6) van deze §), dan gaat een deel van de kleurstof in de
alcoholische kali over, die hierdoor rood gekleurd wordt. Het blijkt
echter, dat bacterio-ruberine in de alcoholische kali een verandermg
ondergaat, daar bij toevoeging van aether en daarna water geen kleur-
stof uit deze oplossing in de aether over kan worden gevoerd, terwijl
bij toevoeging van verdund zoutzuur onmiddellijk ontkleurmg plaats
heeft. Het is dus waarschijnlijk, dat ook hier een kalium-verbinding

Een verschil tusschen bacterio-ruberine aen rhodoxanthine komt
in de oplosbaarheid en de adsorptie tot uiting, daar volgens Lippmaa
(1925) de kristallen van rhodoxanthine in methylalcohol veel slechter
oplossen dan in zwavelkoolstof, aceton en andere oplosmiddelen en
rhodoxanthine in zwavelkoolstof opgelost met aan CaCO^ wordt
geadsorbeerd. Van een overeenkomst van bacterio-ruberine ß met
een andere bekende Carotinoide (zie tabel III) is weinig te bespeuren.

9) Berust het verschil in kleur tusschen de verschillende stammen op
een verschil in kleurstof?

Daar tot nu toe slechts met stam 5) was gewerkt, werd vervolgens
de kleurstof uit de overige stammen chromatographisch volgens
Tswett (1906a en b) geanalyseerd. Hiertoe werd de ongezuiverde
kleurstof in zwavelkoolstof opgelost en door CaCO« geleid. Het
bleek, dat alle stammen het zelfde adsorptie-beeld opleverden (zie
figuur 6). Daar het echter mogelijk was, dat de kleurstof van de ver-
schillende stammen, hoewel nauw verwant en uit evenveel com-
ponenten bestaande, toch in hoedanigheid van deze componenten
verschilt, werd een mengsel van de kleurstof uit twee stammen

Kuhn en Winterstein (1931)
510—499, 480—468, 440— ,
WiLLSTÄTTER en ESCHER (19'quot;'

meer naar rood verschoven ten
opzichte van carotinoïde A en B
(v. Deventer (1930))

521—500, 488—471, 455—442
v. Deventer (1930)
492—478, 459—446, 415—
Willstätter en Stoll

554—540, 514—499, 479—472
Willstatter en Escher (1910)
510—499, 480—468, 440— 1
Willstätter en Escher

meer naar rood verschoven ten
opzichte van Carotinoide A en B
(v. Deventer (1930))

geanalyseerd. Is b.v. A^ van stam i) een isomeer van Aj van stam 2),
dan is het zeer waarschijnlijk, dat deze twee stoffen niet even sterk
worden geadsorbeerd. Een mengsel van de kleurstoffen uit twee
stammen moet in dit geval een grooter aantal adsorptie-ringen op-
leveren dan de kleurstoffen van één stam afzonderlijk. Het bleek
echter, dat vermenging van de kleurstoffen geen vermeerdering van
ringen teweeg bracht, zelfs al werd de kleurstof gewonnen uit een
mengsel van alle geïsoleerde stammen tezamen.

Een tweede argument, dat er voor pleit, dat het kleurstofmengsel
uit de verschillende stammen niet belangrijk in samenstelling ver-
schilt, levert de vergelijking van het absorptie-spectrum van een
oplossing van bacterio-ruberine uit de verschillende stammen. Het
spectrum werd bepaald van een oplossing in zwavelkoolstof van de
ongezuiverde kleurstof uit de stammen 6) en 8) met behulp van een
monochromator van Winkel-Zeiss. Voor het gebruik van dit toestel
dank ik Dr. E. Nuernbergk zeer.

De plaats van de banden werd met het bloote oog afgelezen. Voor
stam 8) werden de volgende banden bepaald: van 572—557en
van 540—519^/i, voor stam 6): van 572—553 en van 535—522
In de belangrijkste banden komen dus de kleurstoffen uit deze stam-
men overeen. Daar stam 6) en 8) tot de twee stammen behooren, die
het meest in kleur verschillen, neem ik aan, dat ook bij de overige
stammen deze overeenkomst bestaat.

Zooals te verwachten was, daar de kleurstof tot de carotinoïden
behoort, is bacterio-ruberine in zuur en alkalisch milieu niet ver-
schillend van kleur. Dus het verschil in kleur tusschen de verschil-
lende stammen kan niet het gevolg zijn van verschillende zuurgraad.
Daar een dergelijk kleurverschil wel voorkomt bij de kleurstof van
Bacillus prodigiosus (Kraft (1902), Wrede (1930)), volgt ook hieruit,
dat bacterio-ruberine en prodigiosine niet verwant zijn.

Het verschil in kleur tusschen de verschillende stammen zal dus
een gevolg kunnen zijn: 1°. van de verschillende wijzen, waarop een
gelijke kleurstof in de cel aanwezig is. (De kleurstofmoleculen kunnen
in de verschillende stammen in verschillend groote complexen aan-
wezig zijn), 2°. van een verschillende verhouding, waarin de gelijke
componenten voorkomen. (Het is mogelijk, dat een paars gekleurde

stam bacterio-ruberine ain relatief grootere hoeveelheid bevat dan
een roode stam), 3°. van een combinatie van het en gevaL Dat
het 2^ geval voorkomt, is niet zeer waarschijnlijk. Dit grond ik met
op het feit, dat het spectrum van de kleurstof uit de verschillende
stammen in groote trekken overeenkomt, daar bleek dat bacterio-
ruberine a in een zoo overheerschende mate voorkomt dat de
maxima van absorptie van een oplossing van een mengsel der beide
kleurstoffen overeenkomt met de maxima van een oplossing van a
afzonderlijk, zie figuur 8. Het is echter moeilijk te begrijpen hoe een
mengsel van de twee kleurstoffen een paarse kleur aan de bacterien
kan verkenen, daar zelfs in zwavelkoolstof opgelost de kleur van
bacterio-ruberine aen^ respectievelijk paars-rood en oranje-rood is.
Ook is het opvallend, dat zoodra de kleurstof bij de extractie uit de
bacteriën in de aceton overgaat, de kleur verandert van paars in
oranje-rood, als stam 6) gebruikt is en oranje-rood blijft, als stam 8)
gebruikt is. Ook de intensiteit van de kleur van de ringen in het
chromatogram zijn voor het bloote oog^m hun onderhnge ver-
houding gelijk voor de verschillende stammen.

Aangaande de kleurstof van Sarcina morrhuae cn Bacterium trapa-
nicum werden slechts zeer weinig onderzoekmgen gedaan. Bij geen
van beide bacteriën diffundeert de kleurstof in de agar van de voe-
dingsbodem. De kleurstof van beide bacteriën heeft de eigenschappen
van de carotinoïden, daar met de microchemische kristallisatie-
methode van Molisch (1896) kristalletjes werden verkregen, die met
geconcentreerd zwavelzuur blauw kleurden. Bij beide bacterien zijn

De kleurstof uit Bacterium trapanicum bleek zeer gemakkelijk
met methylalcohol geëxtraheerd te kunnen worden Het extract
had een oranje kleur. Evenmin als aan Klebahn (1919) gelukte het
mij de kleurstof uit de Sarcina in oplossing te verkrijgen.

Om iets meer te weten te komen omtrent het potentieele milieu
van deze organismen, werden de volgende vragen gesteld:

1)nbsp;Is het mogelijk de bacteriën in een synthetisch milieu te kweeken
d.w.z. de pepton door een organische stof van bekende samen-
stelling te vervangen?

3)nbsp;Is het mogelijk veranderingen in de osmotische druk van het
milieu aan te brengen?

4)nbsp;Heeft de NaCl slechts osmotische beteekenis? In hoeverre is
deze door andere zouten te vervangen, die een gelijke osmotische
druk aan de pekel verleenen?

Dat de oplossing van deze vragen een zeer omvangrijk onderzoek
vereischt, is te begrijpen. De genomen proeven dragen dan ook ten-
deele nog een oriënteerend karakter. Over vraag 3) zal niet meer
gesproken worden, deze vraag werd reeds in hoofdstuk IV be-
handeld.

Ik wil mij hier beperken tot de micro-organismen, die in een ge-
concentreerde pekel leven.

natriumbisulfiet, natriumhyposulfiet, borax, KNO3, Na^C^, bij het
zout gevoegd, waarmee de visch wordt gezouten, het rood worden
voorkomen. Het best bleek borax te voldoen. Volgens Hanzawa en
Takeda (1930) wordt in Atnerika „preservaline gebruikt, d.i. een
poeder van borax met NaCl om het „roodquot; van gezouten kabeljauw
te bestrijden. Hanzawa en Takeda (1930) namen zelf waar, dat a^s
2 % natriumbisulfiet of KNO3 bij de vischbouil on wordt gevoegd,
hierin geen ontwikkeling van Torala Wehmeri kan plaats hebben.
Deze onderzoekingen zijn dus geheel op de practijk gencht. De vol-
gende onderzoekers gaan op een meer wetenschappelijke wijze de
invloed na van verschillende zouten op de ontwikkeling van micro-
organismen uit verschillende pekels. Le Dantec 1906) nam waar
dat Je microbe dn rouge de morue^ zich met ontwikkelt, als het NaCl
door andere chloriden als KCl, MgCl, of CaCl^ is vervangen.
Klebahn (1919) vond, dat Bacterium halobmm NaN^ tot ongeveer
x,6 mol, KCl tot ongeveer 2,6 mol, 5arcma morrhuae NaN03 tot
ongeveer 2,3 mol, KNO3 tot ongeveer 2,4 mol en KCl tot ongeveer
1,6 mol verdraagt. Hij zorgde er voor, door met NaCl aan te vullen
dat de zoutconcentratie van deze voedingsbodems nooit lager werd
dan ongeveer 25 %• Hoewel de proeven volgens Klebahn nog on-
volledig Zijn, kon hij toch de volgende conclusie trekken: de ont-
wikkeling van deze halophiele bacteriën hangt met alleen van de
osmotische druk van de voedingsbodem af, maar ook van de speci-
fieke werking van de zouten; Na kan niet door K worden vervangen.
Het blijkt dus, dat deze bacteriën zich anders gedragen dan de lich-
tende bacteriën, die in oplossingen van een andere samenstelling
dan zeewater, maar hiermee isotonisch, zich evengoed als in zeewater

Baranik-Pikowsky (1927) vond, dat verschillende bacterien, die
hij isoleerde van Limanslijk en -zout (74,65 % NaQ KCl, 0,08 «/o
CaCU, 20,26 % MgCl,, 4,07 % CaSO,,o,i2 % MgC03) uit de om-
geving van Odessa, zich beter in oplossingen van dit zout ontwikke-
L dan in oplossingen van NaCl en dat het Limanzout ook in
hoogere concentratie verdragen wordt dan zuivere NaCl Hij ver-
onderstelt, dat Mg, Ca en K een antagonistische invloed teweeg-

brengen. Golikowa (1930) werkte met verschillende stammen van
een kleurlooze bacterie, geïsoleerd van gezouten visch, deze is staaf-
vormig, beweeglijk en vormt sporen. De bacterie ontwikkelde zich
op agar of in vloeibaar milieu met een zoutconcentratie van 1,5 %
tot verzadigd (optimum bij 15—18 %). Hij deed nu de volgende
proeven:achtereenvolgens werd de 10 % NaCl van de voedings-
bodem vervangen door 10 % van verschillende andere zouten. Het
resultaat was als volgt: in NaCl en KCl zeer goede ontwikkeling, in
Na-citraat en Na-tartraat goede, in NaBr en NaBr NH4CI (samen
10 %) tamelijk goede, in CaCU, NH4CI en KBr tamelijk slechte, in
MgCla slechte. Hij werkte dus niet met vergelijkbare concentraties,
daar hij niet de moleculaire, maar de percentueele concentratie gelijk
maakte, daarenboven schonk hij geen aandacht aan het noodzakelijke
verschil in pH tusschen enkele van de zoutoplossingen. Toch is het
resultaat zeer opmerkelijk. De kleurlooze bacterie blijkt in tegen-
stelling met Bacterium halobium en Sarcina morrhuae zeer onge-
voelig te zijn voor vervanging van de NaCl door andere zouten. Zoo-
wel het Na als het Cl kunnen geheel door andere elementen ver-
vangen worden. Saslawsky en Harzstein (1930) werkten met bac-
teriën uit Limanslijk, die thiosulfaat oxydeeren, en die zich ontwikke-
len in oplossingen met i—22 % NaCl met een optimum bij 6 % = ±
I mol. Zij vervingen ook de NaCl door verschillende andere zouten.
Het bleek echter, dat deze bacterie weer veel gevoeliger voor een
dergelijke verandering is dan die van Golikowa (1930). Geen groei
en oxydatie had plaats in NaNOg, Na2S04, KCl, NH^Cl, KCl
-t-NH4Cl in een concentratie van 1/4, 1/2, ^ i, 1V2, 1^/4 of 2 mol;
in LiCl en NaBr ontwikkelde de bacterie zich zeer zwak, respec-
tievelijk bij een concentratie lager dan ± V4 «lol en J:: i mol; in
MgCla of CaCla goed in een concentratie lager dan Y^ Toch
namen zij waar, dat de zouten, waarbij geen ontwikkeling plaats
heeft, niet altijd schadelijk zijn, want zóó gecombineerd, dat zoowel
Na als Cl aanwezig zijn, zijn zij wel in staat het NaCl te vervangen
(b.v. NaBr KCl, zelfs in een concentratie ieder van 1^/2 mol, of
NaNOg NH4CI). De conclusie, die zij trekken, is, dat beide
elementen Na zoowel als Cl noodig zijn, zoodat de werking van
NaCl niet alleen is terug te voeren op een verhooging van de osmoti-

sehe druk, maar ook op een specifieke inwerking van dit zout. Op
deze werking gaan zij niet nader in. Het lijkt mij b.v. mogelijk, dat
Na en Cl in de cultuurvloeistof, waarin zij worden toegevoegd in de
vorm van NaBr en KCl slechts werken als antagonisten. K , Br ,
NH4 en NO3- zouden dan toch vergiftig zijn, welke vergiftigheid
echter door andere ionen als Na en Clquot; kan worden opgeheven.
Ook wanneer NaCl op zichzelf noodzakelijk is, behoeven Na en Cl
nog niet bij de opbouw van de cel noodzakelijk te zijn. Het is mogelijk,
dat het protoplasma slechts in NaCl de juiste physisch-chemische
hoedanigheid (b.v. watergehalte) bezit.

Baas-Becking (1930) gaat op een eenigszms andere wijze na,
welke zouten en ionen vergiftig werken. Hi) onderzocht in welke
zouten Dunaliella viridis Teod., een groene flagellaat, die in pekels
van verschillende samenstelling wordt aangetroffen, ongeschaad
6 uur kan verblijven. Het resultaat is, dat binnen de pH-grenzen
4 en II dit het geval is met zeer veel Na- of K- zouten, zoowel met
één als met 2-waardige anionen in een concentratie van 2,5 mol.
Zelfs zouten met anionen als CrO^ of CNS- bleken het oragnisme
in een zeer groote concentratie binnen 6 uur met te schaden. Met
kationen bleek het echter anders gesteld: terwijl monovaleme katio-
nen, als Na, K en Li eveneens niet schadelijk zijn, binnen dit tijds-
verloop in een concentratie van 2,5 mol, is i i mol de concentratie-
grens voor MgCU, waarin Dunaliella na i uur nog levend is, terwijl
voor chloriden van 2-waardige kationen als Ca, Ba, Sr e.a. dit
i 0,01 mol en voor een 3-waardig ion als Al ± 0,005 mol is. Baas-
Becking (1930) concludeert hieruit, dat de wand en het protoplasma
aan de oppervlakte van Dunaliella zich als negatief geladen kolloiden
gedragen. Verder bleek, dat stoffen, die phenolgroepen bevatten, een
overeenkomstige werking uitoefenen op Dunaliella als op een agar-
sol: hoe meer phenolgroepen aanwezig zijn, hoe schadelijker de wer-
king op Dunaliella en hoe eerder dehydratatie van het agarsol. Ook
de werking van aethylalcohol is voor beide overeenkomstig. De con-
clusie, die hij hieruit trekt, is, dat de cellen van Dunaliella zich ook
als hydrophiele kolloiden gedragen. Hij verwachtte dit trouwens
reeds, toen de lyotrope reeks zich deed gelden bij de vergiftigheid van
kationen(Mgisveel minder vergiftig dan de andere bivalente kationen).

In „Salt effects on eggs and nauplii of Artemia salina L.quot; beschrij-
ven Boone en Baas-Becking (1931) een onderzoek met Artemia
salina L. een kreeftje, dat in verschillende pekels wordt aangetroffen.
Dit onderzoek bevestigt het eigenaardige feit, hetwelk Martin en
Wilbur (192i) reeds opmerkten, dat K zeer schadelijk is voor
Artemia, De nauplii ontwikkelden zich niet in oplossingen, die meer
dan 0,1 mol KCl bevatten. Artemia bleek zich ook in andere opzich-
ten anders dan Dunaliella te gedragen, daar anionen en kationen
even schadelijk kunnen zijn, een anion als NO3 was zelfs vergiftiger,
dan een kation als Ca. Verder werd nagegaan of er een antagonisti-
sche werking tusschen Na, K, Mg en Ca bestaat. Te dien einde wer-
den voedingsoplossingen gemaakt, waaraan deze elementen als chlori-
den in zeer veel combinaties werden toegevoegd, zoodat steeds in
het geheel i mol chloride aanwezig was. Er werd nagegaan in welke
combinaties de ontwikkeling tot nauplii plaats had. Het resultaat
van het onderzoek was: Na oefent een antagonistische werking op
K uit en dit antagonisme blijft bestaan, als 0,5 mol MgClg of 0,3 mol
CaClg aanwezig zijn.

Eveneens in 1931 ging Baas-Becking (a) na of bij Dunaliella ook
een antagonisme voorkomt. Het bleek, dat voor dit organisme Ca en
Mg antagonistisch zijn. Verder kwam een eigenaardig verschijnsel
aan den dag n.1. dat dit antagonisme afhankelijk is van de concen-
tratie van de pekel: in een concentratie van i mol NaCl heffen Mg
en Ca elkanders vergiftigheid op in een verhouding Mg : Ca = 4 ä 5,
terwijl in 4 mol NaCl deze verhouding = 20. Deze bepalingen wer-
den gedaan bij een pH = 9. Andere organismen uit de pekel van
zouttuinen gedragen zich overeenkomstig. Een blauw wier ontwikkel-
de zich bii een NaCl concentratie van 4 mol niet, als er bivalente
kationen aanwezig waren, terwijl bij een concentratie van NaCl van
1,56 mol de verhouding Mg : Ca = 0,13 :0,012 = 10,8 moest
zijn.

Vergelijkt men het resultaat van al deze onderzoekingen, dan is
wel het meest opvallende, het volkomen verschillende gedrag van
de onderzochte pekelorganismen. De eenige overeenkomst is, dat
NaCl tot zeer hooge concentraties wordt verdragen. De andere zouten
zijn alle in verschillende mate schadelijk of niet schadelijk en ook

n.o.
n.o.
n.o.
n.o.
n.o.

n.o.

n.o.
n.o.
n.o.
n.o.
n.o.
n.o.

n.o.

geringe
ontwik-
keling
n.o.

n.o.

n.o.
n.o.
n.o.

n.o.
n.o.
n.o.
n.o.

n.o.

Het teeken beteekent ontwikkeling, het teeken - geen ontwikkeling
de bacteriën, n.o. = niet onderzocht.

het antagonisme, ais het voorkomt, kan bij de verschillende organis-
men van geheel verschillende aard zijn. Het blijft natuurlijk de vraag
of men nauplii van Artemia mag vergelijken met wieren en bacteriën.

Uit de tabel IV blijkt, dat in tegenstelling met de andere onder-
zochte bacteriën in geen van de synthetische milieu's d.w.z. in de
voedingsbodems met een organische stof, waarvan de samenstelling
geheel bekend is, ontwikkeling plaats had. Er werd voor gezorgd, dat

de gebruikte vloeibare voedingsbodems 30 % NaCl bevatten en dat
de reactie neutraal was. De proeven werden gedaan met de volgende
organische stoffen: eiwit, pepton, asparagine, glycocol, ureum en
glucose. Eiwit of pepton blijkt dus voor zoover onderzocht, nood-
zakelijk; toch viel op, dat de verschillende soorten pepton in het ge-
heel niet een even gunstig resuhaat opleverden. Pepton „Poulencquot;
was verreweg het meest geschikt, zich uitende in de kortste incubatie-
tijd. Terwijl voor de ontwikkeling tot een bacterie-huidje aan de
oppervlakte van de voedingsoplossing, indien pepton „Poulencquot; ge-
bruikt was, ongeveer acht dagen noodig was, was dit voor pepton
„Riedelquot; ongeveer 12 dagen en voor pepton „Cogitquot; ongeveer 25
dagen. Voor pepton „Wittequot;, wat eigenlijk geen pepton is, maar een
stof, die tusschen pepton en eiwit in staat, bedroeg dit eveneens
ongeveer 12 dagen.

Ook Harrison en Kennedy (1922) konden geen ontwikkeling
verkrijgen in media met als organische stof eenvoudiger N-verbin-
dingen dan pepton (b.v. NH^-tartraat of asparagine).

Vervolgens werd nagegaan, in hoeverre het mogelijk was, bij deze
bacterie verandering in hét anorganisch milieu aan te brengen. Tot
nu toe werd de bacterie slechts gekweekt met 30 % ruw NaCl in
de voedingsbodem. Het bleek, dat de bacterie evengoed tot ont-
wikkeling kwam in een oplossing van de volgende samenstelHng:
NaCl 4.3—5.25 mol, MgS04 0,02 %, K0HPO4 0,02 %, pepton
„Poulencquot; I %. De pH van deze oplossing, die bij de volgende
proeven als controle-oplossing dienst deed, is 5,6, die van de oplos-
sing met ruw NaCl 5,9, als pepton „Poulencquot; werd gebruikt. Als
met KOH de pH van deze oplossingen tot 7,5 verhoogd werd, dan
ontwikkelde Bacterium halobium zich ook zeer goed. Nu werd na-
gegaan in hoeverre het mogelijk was de zouten uit de controle-
oplossing geheel of gedeeltelijk door andere te vervangen, zoodat de
oplossing geen lagere osmotische druk verkreeg dan overeenkwam
met 4,3 mol NaCl, terwijl er voor gezorgd werd, dat de pH binnen
de grenzen 5,5—7,5 bleef. De gebruikte zouten waren voor analyti-
sche doeleinden geleverd door de Utrechtsche Pharmaceutische
Groothandel. Het water was gedestilleerd. Voor de culturen werden
cultuurbuizen van gewoon glas gebruikt. Bij het enten werd er voor

Het tecken beteekent ontwikkeling, het teeken - geen ontwikkeling van
de bacteriën, n.o. = niet onderzocht.

gezorgd, dat geen voedingsbodem mee werd overgeënt, door steeds
van een cultuur op vaste bodem te enten. De proeven werden min-
stens met drie stammen uitgevoerd. Het bleek, dat uit de controle-
oplossing de MgS04 niet door NxßO^ of CaS04 kon worden ver-
vangen. Het magnesium, dat mogelijk door het glas wordt afgegeven

of als verontreiniging in de andere gebruikte chemicaliën aanwezig
was, is dus niet voldoende voor de ontwikkeling van deze bacterie.
Het bleek, dat Mg niet alleen in kleine hoeveelheden noodzakelijk is,
maar dat het ook in groote hoeveelheden verdragen werd, de hoogste
concentratie van MgS04, waarbij ontwikkeling mogelijk was, bedroeg
n.1. 1,5 mol (zie tabel V). KCl is het eenige zout behalve natuurlijk
NaCl, dat in grootere concentratie de groei niet belemmert. KCl
werd n.1. verdragen in de hoogst mogelijke concentratie d.i. 3,1 mol.
Hier volgen van enkele andere zouten de hoogste concentraties,
waarin deze in de voedingsoplossing aanwezig mogen zijn, zal ont-
wikkeling plaats hebben: Li Cl 0,5 mol, KNO3 0,5 mol, CaCl^ 0,1 mol,
BaCla 0,05 mol, KBr 0,02 mol, Na2B407 0,005 mol, terwijl KJ in
een concentratie van 0,02 mol niet wordt verdragen (zie tabel V).
Nu is het echter mogelijk, dat er fouten zijn opgetreden bij het ge-
bruik van niet op zuiverheid gecontroleerde zouten. Het zou b.v.
mogelijk zijn, dat de schadelijke werking van een zout, dat in een
bepaalde concentratie aanwezig is, teweeggebracht wordt door een
zeer vergiftig werkende verontreiniging, die bij deze concentratie in
zoodanige hoeveelheid voorkomt, dat de ontwikkeling van de bac-
teriën hierdoor wordt belemmerd. Om een dergelijke fout te voor-

Het teeken beteekent ontwikkeling, het teeken — geen ontwikkeling van
de bacteriën, n.o. = niet onderzocht.

komen, werden de volgende zouten tweemaal omgekristalliseerd:
Li Cl, KNO3, KBr, KJ, BaCl^ en Na.A07 en de proeven, m de
tabel V met een sterretje voorzien, herhaald. (N.B. alleen metSacie-
rium halobium). Het resultaat was echter hetzelfde.

CaCU wordt dus verdragen in een concentratie van 0,1 mol. Het
bleek echter, dat als Mg in een bepaalde concentratie aanwezig was,
de oplossing meer Ca kon bevatten, zonder dat de ontwikkehng
werd geremd. Tabel VI geeft een beeld van deze antagonistische
werking. Men ziet, dat Mg de meest ontgiftende werking uitoefent

Het is nu interessant om na te gaan of de ervaringen met de bac-
teriën in cultuur gedaan, het onder bepaalde omstandigheden mas-
sale optreden van de bacteriën in de natuur kunnen verklaren.
Hierbij wordt aangenomen, dat de roode bacteriën, die in zouttuinen
worden aangetroffen, tot Bacterium halobium behooren. Men moet
dus nagaan onder welke omstandigheden deze bacterien optreden.

In 1931 gaat Baas-Becking (a) aan de hand van gegevens van
UsiGLio (1849) na, wat er gebeurt bij het indampen van zeewater.
Het blijkt, dat de concentratie van de magnesium in de pekel voort-
durend toeneemt, terwijl bij een concentratie van NaCl van ongeveer
I mol een deel van het calcium in de vorm van CaCOg neerslaat, bij
een concentratie van NaCl van ongeveer 2,6 mol een tweede gedeelte
in de vorm van CaSO^. Het gevolg is, dat bij een concentratie van
NaCl = 3,8 mol, de concentratie van MgCl^ = 0,426 mol, van

een concentratie van NaCl = 0,5 mol, deze verhouding = Een
tweede gevolg van het neerslaan van het CaCOg is, dat de pH, die
in de eerste phase van indamping onder invloed van de koolzuur-
assimilatie van groene wieren tot 9,2 kan stijgen, daalt tot ± 7 (Baas-
Becking (1932)). Baas-Becking (i93i(a)) neemt waar, dat tijdens
de eerste stadia van het indampingsproces Dunaliella in de zout-
oplossing voorkomt. Wanneer echter een bepaalde concentratie is

bereikt, sterft dit organisme en roode bacteriën treden op. De om-
standigheden in de pekel zijn dan de volgende: hoog zoutgehalte,
neutrale reactie, hooge concentratie van magnesium, nagenoeg geen
calcium (zie ook Peirce (1914), die vermeldt, dat de pekel, als de
roode bacteriën er in voorkomen, rijk is aan Na, Mg, K, Cl en SO4,
arm aan Ca, Fe en NO3). Baas-Becking (1931a) gaat aan massa-
culturen na, onder welke omstandigheden de roode bacteriën uit de
zouttuinen zich ontwikkelen. Hij komt tot de conclusie, dat zij een
hoog zoutgehalte, hooge concentratie van magnesium, hooge pH en
geen calcium verlangen. Deze conclusie trekt hij echter met reserve,
daar de bacteriën ook van organische stoffen in het milieu afhanke-
lijk zijn.

We kunnen dus nu aan de hand van de genomen proeven nagaan
of de genoemde (anorganische) omstandigheden werkelijk bepalend
voor de ontwikkeling van de bacteriën zijn. In hoofdstuk IV is met
zeer groote waarschijnlijkheid de noodzaak van een hoog zoutgehalte
aangetoond. Wat de hooge concentratie van Mg betreft: deze blijkt
niet noodzakelijk. Wel kwam ook in cultuur tot uiting, dat Mg in
groote concentratie verdragen wordt. Ook de zeer geringe concen-
tratie van Ca in de pekel op het oogenblik, dat de roode bacterien
in de zoutpannen optreden, blijkt niet bepalend voor dit optreden.
Een tamelijk hooge concentratie van Ca-zouten bleek verdragen te
worden (0,2 mol CaCl^, als Mg aanwezig is). Wat de pH betreft,
het blijkt, dat de Bacterium zich bij een neutrale en zelfs bij een
eenigszins zure reactie zeer goed ontwikkelt. Er werd nagegaan of
dit ook het geval was bij een pH van 9,1 (verkregen met een mengsel
van Na-carbonaat en -bicarbonaat). Het bleek niet het geval te zijn.
Dit is dus in tegenstelling met de waarneming van Baas-Becking
(i93i(a)), maar in overeenstemming met het optreden van de bac-
teriën in de natuur. Ook Harrison en Kennedy (1922) verkregen
slechts ontwikkeling bij een pH tusschen 5,6 en 8,6, met een optimum
bij 6, Het blijkt dus, dat het optreden van de roode bacteriën in de
zouttuinen op een bepaald tijdstip van het indampingsproces waar-
schijnlijk slechts het gevolg is van de bereikte zoutconcentratie,
samengaande met het grooter gehalte aan beschikbare organische
stof door de dood van Dunaliella en Artemia, in ieder geval wordt

het optreden niet bepaald door het gehalte aan Mg en Ca in de pekel
Dit seldt dus slechts, als werkelijk de bacterie uit de puttuinen tot
BacLum halobium behoort. Het kan natuurlijk ook si,n, d^t^l moet
deze tot Bacterium halobium gerekend werden, de verschillende
stammen zich eenigszins anders gedragen. H-e-- ^ ^
lend resultaat van Baas-Becking en mi,, wat betreft de pH geweten

Jirïfhquot; ^niet st'eTlen/valt het verschillend gedrag ten
opzichte van Mg en Ca op. Dunaliella verdraagt veel mmder van deze
elementen dan Bacterium halobium (Baas-Becking (1930 M-
Lr Ca is dit opvallend, daar Dunaliella ,uist m de pekel van de
zouttuinen voorkLt (in tegenstelling met de Bactermm), als hiemi
de Ca nog niet is neergeslagen. Er moet echter vermeld worden, dat
d vergitóghe d v,n cl voor DunaLlla door Baas-Becking in 1930
b pa^d werd bij een tamelijk lage pH. In 1931 neemt Baas-Bec-
k NcTa) Lar, d t Dunaliella Ca en Mg bij een pH van 9 veel beter
3raagt dai^ bij een pH van 6. Ook in de pekel m de zoutpannen

de aanwezige carbonaten, zeer hoog (± 9). Ook het Ca-Mg antago-
nisme is bij beide organismen verschillend: bi, een concemratie van

'Itweede groot verschil tusschen Dunaliella en Bacterium halo-
bium blijkt uit hun beider gevoeligheid ten opzichte van amonen en
tollen Terwijl voor Dunaliella kationen zeer vee vergiftiger 2i,n
dan anionen, bestaat voor de Bacterium dit verschi in gevoehgh id
niet zoowel anionen als kationen kunnen schadelijk zi,m Zouten
m 'tweewtd%e kationen als Ca en Ba blijken voor Bactermm
halobium zelfs minder schadelijk te zijn dan zouten -t eenwaard^
anionen als Br en J, terwijl een éénwaardig kation als Li a h geheel
anders gedraagt dan de éénwaardige ^«»nen Na en K D t van de
anionen NO, voor Bacterium halobium schadeh,ker 1 dan Cl of SO,,
kan het gevolg zijn van het vermogen van de bacterien mtraten tot de
in het algemeen meer vergiftige nitrieten te reduceeten. Wel treedt

evenals bij Dunaliella de uitzonderlijke positie van magnesium tus-
sehen de bivalente kationen in het oog. Dat anionen en kationen een
even sterk vergiftige werking op Bacterium halobium kunnen uit-
oefenen, heeft dit organisme met de andere in het literatuuroverzicht
besproken pekelorganismen gemeen. Bij deze organismen bevindt
Zich het protoplasma waarschijnlijk dichter bij het iso-electrische
punt dan dit bij Dunaliella het geval is. Toch gedragen ook deze
organismen zich niet op dezelfde wijze als Bacterium halobium. Al
deze organismen verdragen b.v. bromiden in grootere concentratie
dan Bacterium halobium. Een overeenkomst tusschen de larven van
Artemia en de Bacterium komt tot uiting in de ongelijke gevoeligheid
van beide voor éénwaardige kationen. Het eigenaardige feit, dat Li
veel schadelijker is dan K en Na voor Bacterium halobium is
te vergelijken met het nog opvallender feit, dat voor de nauplii
van Artemia zoowel Li als K zeer veel schadelijker zijn dan Na.
Vergelijkt men Bacterium halobium met de bacteriën, die Golikowa
(1930) onderzocht, dan blijkt, dat de volgorde van de zouten, waarop
deze in toenemende mate de ontwikkeling belemmeren, nagenoeg
gelijk IS, slechts MgCl^ staat op een andere plaats in de reeks. Een
groot verschil tusschen deze twee bacteriën is echter het feit, dat de
bacterie van Golikowa zich geheel zonder NaCl kan ontwikkelen.
Voor Bacterium halobium bleek dit niet mogelijk, tenminste er trad
geen ontwikkeling op, als in plaats van NaCl, KCl in de voedings-
oplossing aanwezig was. Daar een dergelijke voedingsoplossing
slechts een concentratie van 3,1 mol kan hebben, werden verschil-
lende stammen, voordat zij in deze oplossing geënt werden, op een
bodem met 3,1 mol NaCl gekweekt. Wanneer zij zich hierop eenige
tijd goed ontwikkeld hadden (en de stammen uit groep H weer gas-
vacuolen vormden), werden zij van deze bodems in de voedings-
oplossing van KCl geënt. Er trad echter in het geheel geen ontwikke-
ling op. Daar 3,1 mol KCl, als NaCl aanwezig is, zeer goed verdragen
wordt, wijst dit op een antagonistische werking tusschen Na en K.
Het IS dus hetzelfde verschijnsel als Saslawsky en Harzstein (1930)
bij dethiosulfaat-bacteriënuit Liman-zout waarnamen. Zooals vroeger
reeds vermeld is, was evenmin groei van de Bacterium te constateeren
m een oplossing, die in plaats van NaCl 4,5 mol saccharose bevatte.

Er werd op verschillende plaatsen over vergiftigheid van ionen en
ionen-antagonisme gesproken. Daar echter bij een hooge concen-
tratie de zouten waarschijnlijk slechts voor een gedeelte in ionen zijn
gespHtst, kan het zijn, dat men de invloed van verschillende elemen-
ten ten deele terug moet voeren tot een invloed van de moleculen,
waarin deze voorkomen,

Zooals uit tabel IV blijkt, heeft ontwikkeling van beide bacteriën
plaats in verschillende voedingsbodems met eenvoudige stikstof-
verbindingen. De onderzoekingen naar het potentieele milieu, wat
anorganische stoffen betreft, dragen nog slechts een voorloopig
karakter. De zouten uit de oplossingen waren voor analytische doel-
einden geleverd door de Utrechtsche Pharm. Groothandel, het water
was gedestilleerd. Daar Sarcina morrhuae zich zeer slecht in vloei-
baar milieu ontwikkelt, werd voor deze bacterie aan de verschillende
oplossingen agar toegevoegd, terwijl slechts dan van een negatief
resultaat werd gesproken, wanneer de bodem, waarop geen ont-
wikkeling plaats had, een vaste consistentie had. Om dit laatste te
bereiken, was het noodig, dat de reactie ongeveer neutraal was.
Hierin werd voorzien door toevoegen van KOH. Orienteerend zijn
de proeven ook in dit opzicht, dat zoowel glaswerk, als agar, als de
chemicaliën in de oplossing niet extra werden gereinigd. De controle-
oplossing voor deze bacteriën was dezelfde als die voor Bacterium
halobium. Hier volgen voor Sarcina morrhuae de hoogste concen-
traties van enkele zouten, die verdragen kunnen worden, als NaCl
aanwezig is: KCl 3,1 mol, KBr 0,5 mol, LiCl 0,5 mol, KJ 0,1 mol,
BaCla 0,05 mol, Na^B^O, 0,01 mol, terwijl KNO3 m een concentratie
van 1,5 mol of meer, CaCl^ in een van 0,3 mol of meer en MgCl^ m
een van 0,2 mol of meer worden verdragen (zie tabel V en VI). Het
bleek, dat Na niet door K, Cl niet door NO3 kon worden vervangen,
er had n.1. geen ontwikkeling plaats, als in plaats van de NaCl 3,1
mol KCl of 2,2 mol KNO3 was toegevoegd, terwijl de Sarcina toch
zeer goed verlaging van de concentratie verdraagt. In het algemeen
gedraagt Sarcina morrhuae zich dus, wat de schadelijke werking
van zouten betreft, evenals Bacterium halobium, behalve dat de

meeste zouten in mindere mate vergiftig zijn. Deze laatste conclusie
is echter misschien niet geoorloofd, daar de Sarcina op vaste bodem,
de Bacterium in vloeibaar milieu werd gekweekt. Verder blijkt, dat
het gedrag ten opzichte van KCl niet klopt met de proeven van
Klebahn (1919), die vond, dat de bacterie zich niet ontwikkelde, als
meer dan 20 % (= i 2,6 mol) aanwezig was. Klebahn vermeldt
echter, dat zijn proeven slechts voorloopige waarde bezitten („Ins
besondere können die Zahlen auf Genauigkeit keinen Anspruch
mächenquot;). Wat Bacterium trapanicum betreft, voor de zeer weinige
proeven met deze bacterie genomen, verwijs ik naar de tabellen IV,
V en VI. Opvallend is, dat Li voor deze bacterie in nog grootere
mate schadelijk is, dan voor de beide andere.

De in dit hoofdstuk besproken pH bepalingen werden langs
electrische weg met behulp van een waterstofelectrode verricht. Voor
het gebruik van het toestel in het Laboratorium voor Vergelijkende
Physiologie van de Rijksuniversiteit te Utrecht dank ik Prof. Dr.
H. J. Jordan ten zeerste.

Een reincultuur werd verkregen volgens de uitstrijkmethode. De
cellen zijn 3-6 in diameter groot, zij komen afzonderlijk, in paren
en in pakjes voor. Foto d geeft een beeld van deze groote Sarana
in verzadigde pekel. Het proto-
plasma is homogeen. In water ver-
andert het uiterlijk van de cellen
niet, behalve dat het protoplasma
korrelig wordt. De bacterie is gram-
positief en katalase-positief. De
kolonies op agar (30 % NaCl) zijn
rond en ondoorzichtig. De bacterie
is aëroob. Op sommige voedings-
bodems kan zij een bruinachtig-gele
kleur vertoonen. De optimum tem-
peratuur is 20° C. Met suikers of
in aangezuurde mout (beide 30 %
NaCl) heeft geen gisting plaats.
De Sarcina is weinig gevoelig
voor wisseling van de concentratie

van het zout fn de voedingsbodem; zi, kan van een bodem met 30 %
NaCl onmiddellijk op een met 5 % NaCl geent worden^^^^^^^
groei nog eenigszins verbeterd wordt Op een met 3 % NaCl (ent-
Lteriaafvan een bodem met 5 %) heeft ook nog ontwikkeling plaats,
echter in mindere mate. Nitraten worden met gereduceerd tot ni-
trieten. In vele eigenschappen komt deze 5arcrna dus overeen met
Sarcina morrhuae. Een verschil maakt de afmeting, de kleur, het

gedrag ten opzichte van nitraat en de gramkleuring. Daar het ver-
schil in grootte echter zeer aanzienlijk is, kan ik vooreerst niet anders
doen dan aan te nemen met een nieuwe soort te doen te hebben,
die in de voorloopige mededeeling (1931) van dit onderzoek reeds
Sarcina gigantea werd genoemd. Uit tabel IV op bladz. 95 blijkt,
dat in voedingseischen eveneens overeenstemming bestaat tusschen
Sarcina gigantea en Sarcina morrhuae.

Een opmerkelijk verschijnsel deed zich bij Sarcina gigantea voor.
Wanneer men bij een preparaat van de bacteriën in verzadigde NaCl-
oplossing, een oplossing van twee of meer mol saccharose of glucose
laat toestroomen, dan contraheert de cel-inhoud. Vooral aan mono-
en diplococcen is dit verschijnsel zeer goed waar te nemen. Laat
men daarna weer een verzadigde oplossing van NaCl toestroomen,
terwijl men de suikeroplossing met filtreerpapier wegzuigt, dan
neemt de cel-inhoud weer in volume toe en de bacteriën krijgen weer
het normale uiterlijk. Het verschijnsel doet sterk aan plasmolyse
denken. Het verschil is echter, dat de inhoud, die bij de contractie
de bolvorm blijft behouden, niet van de wand loslaat, doordat deze
wand opzwelt. Het verschijnsel komt dus overeen met de afwijkende
vorm van plasmolyse, die Walter (1923) waarnam bij de roode
wieren Bangia en Lemanea. Wel had in een osmotisch werkzame
oplossing contractie van de inhoud van de cellen van deze wieren
plaats, maar doordat de wand opzwol, bleef het contact van inhoud
en wand bewaard. De celwand van deze wieren bestaat dus uit een
stof, die zeer zwelbaar is. Deze wand vertoont de reacties van pectine,
evenals agar. Het is zeer goed mogelijk, dat de wand van dezelfde
samenstelHng is als agar, daar deze uit de celwanden van andere roode
wieren wordt verkregen. Gecompliceerder wordt het verschijnsel bij
de roode wieren, doordat de plasmolyse ook in het volgende opzicht
afwijkend is. Het volume van de cel-inhoud is niet omgekeerd even-
redig met de concentratie van de oplossing, waarin de cel zich be-
vindt, zooals met de cel-inhoud van planten met normale plasmolyse
het geval is. Eerst als de wieren in een ongeveer verzadigde oplossing
van suiker of keukenzout worden gebracht, heeft een eenigszins
aanmerkelijke volume-vermindering van de inhoud plaats. Dit moet
volgens Walter het gevolg zijn van het feit, dat er geen of slechts zeer

kleine vacuolen voorkomen. De geconcentreerde oplossingen zullen
imbibitiewater onttrekken aan het protoplasma, waarvan Walter
aanneemt, dat het ondoorlaatbaar is voor suiker en zout. (Dat hij het
protoplasma vergelijkt met stoffen als nucleïne, zetmeel, gelatine en
caseïne, waarvan Katz (1918) de z.g. zwellingskromme bepaalde
(volume als functie van de relatieve dampspanning) kan hier buiten
beschouwing blijven.) De volume-vermindering van het protoplasma
moet echter veel geringer zijn dan het geval zou zijn, als zuivere os-
mose plaats had, dus als een vacuole aanwezig was. Over dit alles werd
reeds in hoofdstuk IV gesproken. Het mechanisme van de cel be-
schrijft Walter (1923) nu als volgt: In de cel werken op elkaar in:
1° de zwellingsdruk van het protoplasma, 2° de zwellingsdruk van
de wand en 3° de elastische spanning van de cuticula. In de normale
cel wordt door de druk van het protoplasma en de cuticula de wand
samengeperst. Contraheert nu het protoplasma, dan krijgt de wand
gelegenheid op te zwellen, hij zal dit doen in de mate de stof, die
het protoplasma doet contraheeren, dit toelaat.

Met carposporen van Lemanea verkreeg Walter (1923) teruggang
van „plasmolysequot; met NaCl oplossingen. Hier is dus blijkbaar het
protoplasma sterk doorlaatbaar voor NaCl.

Men kan nu de contractie van de cel-inhoud van de Sarcina op
dezelfde wijze verklaren als Walter (1923) dit verschijnsel bij de
roode wieren verklaarde. Men kan het ook toeschrijven aan normale
plasmolyse voor het geval er een vacuole in de cel van de Sarcina
voorkomt. In dit laatste geval moet het protoplasma voor NaCl geheel,
voor suikers niet permeabel zijn. Ik wil op de verklaring van de con-
tractie van de cel-inhoud volgens Walter iets dieper ingaan. Deze
verklaring geldt dus voor het geval, dat er geen vacuole aanwezig is.
Er bestaan nu twee mogelijkheden: A. Het protoplasma is voor
NaCl geheel, voor suikers niet permeabel. B. Het protoplasma is
voor beide permeabel. Brengt men een cel in een suikeroplossing,
dan zal, als we met het geval A te doen hebben, het protoplasma
als lyophiel kolloid, tengevolge van de osmotische wateronttrekking
van de geconcentreerde suikeroplossing water afgeven. Het NaCl,
waarvoor in dit geval aangenomen werd, dat het protoplasma per-
meabel is, zal aan de osmotische werking geen aandeel hebben. Wel

zal het naar buiten diffundeeren en daardoor minder dehydrateerend
op het protoplasma inwerken; dit zal echter niet opwegen tegen de
wateronttrekkende werking van de geconcentreerde suikeroplossing.
Ook is het mogelijk, dat deze diffusie door een eventueel voor-
komend DoNNAN-evenwicht wordt tegengegaan. Maar ook als het
geval B zich voordoet, is het misschien mogelijk, dat het protoplasma
water afgeeft bij overbrenging in een suikeroplossing, n.1. als de
kolloïdale deeltjes van het protoplasma in een suikeroplossing minder
water kunnen binden dan in NaCl. Geval A lijkt mij in ieder geval
veel aannemerlijker dan B.

Ook al komt een vacuole voor, toch blijft de plasmolyse afwijkend
door de zwelling van de wand. Deze zwelling kan men zeer goed
volgens Walter (1923) verklaren. Men moet dan aannemen, dat de
buitenste laag van de wand uit een stof bestaat, die in eigenschappen
met die van een cuticula overeenkomt. Het is mogelijk, dat een
cuticula aanwezig is, zij is dan echter te smal om met reagentia aan
te toonen. De opzwelling van de wand moet het gevolg zijn van de
opheffing van de druk op deze zwelbare wand, al of niet samen-
gaande met een invloed van de suiker op de zwelling van deze. Als
deze dezelfde eigenschappen heeft als agar en de wand van de roode
wieren, waarmee Walter (1923) werkte, dan zal suiker geen invloed,
NaCl echter een wateronttrekkende invloed op deze wand moeten
hebben (Walter (1923)). Dit zal dus een versterkende invloed op
het verschijnsel uitoefenen.

1.nbsp;Van verschillende soorten gezouten visch en van een monster
zout, afkomstig van een vischzouterij, werden de volgende aëroob
te kweeken bacteriën geïsoleerd: a) Bacillm halobius ruber Klebahn,
waarvan de naam veranderd werd in Bacterium halobium b) een
rood gekleurde Sarcina, c) een oranje gekleurde staafvormige bacterie
(Bacterium trapanicum n. sp.) en d) een ongekleurde Sarcina (Samna
gigantea n. sp.). De roode Sarcina komt, doordat zij m verschillende
groeivormen optreedt, zoowel met Sarcina morrhuae Farlow, als
met Micrococcus (Diplococcus) morrhuae Klebahn overeen, zoodat
blijkt, dat deze tot dezelfde soort behooren, die Sarcina morrhuae
Klebahn werd genoemd. Hoogstwaarschijnlijk zm de vele in de
literatuur beschreven bacteriën, die het rood worden van gezouten
visch veroorzaken, tot Bacterium halobium en Sarcina morrhuae
Klebahn terug te voeren. Aan deze veroorzakers van het „rood
moet waarschijnlijk Bacterium trapanicum nog worden toegevoegd

2.nbsp;Het onderzoek van Klebahn wordt bevestigd, wat betreft
de gevoeligheid van Bacterium halobium ten opzichte van verlaging
van de zoutconcentratie van de gebruikte voedingsbodem (30 /„
NaCl, I % pepton). De twee Sarcina's zijn veel minder gevoelig
voor een dergelijke verlaging. De mogelijkheid werd naar voren
gebracht, dat de opzwelling, die Bacterium halobium vertoont ten-
gevolge van verlaging van het zoutgehalte van de omgeving, het
gevolg is van imbibitie van het protoplasma.

3.nbsp;Bacterium halobium komt in verschillende stammen voor.
Deze stammen zijn te verdeelen in 2 groepen Groep I heeft een
helder, doorzichtig uiterlijk in cultuur. Groep II is ondoorzichtig,
troebel in cultuur, als gevolg van het voorkomen van z.g. gasvacuolen.
Binnen de groepen wisselt de kleur van de stammen tusschen paars

en oranje. Waar deze vacuolen nagenoeg de geheele cel vullen, ver-
kenen zij de bacteriën het vermogen aan de oppervlakte van water
of pekel te drijven. Door het voorkomen van stammen met en zonder
de vacuolen was het zeer goed mogelijk, de theorie van Klebahn,
dat de vacuolen gas bevatten, te toetsen. De verschillende waarnemin-
gen en proeven spraken voor deze, door hem zoo goed als bewezen
theorie. De voornaamste hiervan zijn: door druk en tengevolge van
verschillende reagentia zijn de gasvacuolen uit de bacteriën te ver-
wijderen, terwijl de bacteriën overigens onveranderd blijven. Na deze
verwijdering zijn gasbellen tusschen de bacteriën waar te nemen.
Ook door koken van een suspensie verdwijnen de vacuolen. De
brekingsindex van de inhoud van de gasvacuolen is lager dan die
van water. De theorie van Kolkwitz en Canabaeus, dat de gas-
vacuolen bij zuurstofgebrek ontstaan en gistingsgassen bevatten,
kan niet voor de aërobe Bacterium halobium gelden. In de vacuolen
kon geen zuurstof met gereduceerd indigokarmijn aangetoond wor-
den. Hoogstwaarschijnlijk blijven de bacteriën, die door druk van de
gasvacuolen zijn ontdaan, levensvatbaar.

4. De roode kleur van culturen van Bacterium halobium, Bacte-
rium trapanicum en Sarcina morrhuae is het gevolg van het voor-
komen van carotinoïde kleurstoffen in de cel. De kleurstof van
Bacterium halobium werd nader onderzocht, zij bleek uit twee com-
ponenten te bestaan, deze werden kristallijn verkregen en bacterio-
ruberine aen ^genoemd, a komt in veel grootere hoeveelheid voor
dan^ö. In methylalcohol vertoont a de volgende banden: I max. bij
522 fi!^, II max. bij 490 fi[M, III max. bij 466 /u^; : I max. bij 502 ^ifx,
II max. bij 482 jM/i. Zij worden beide in CS2, zoowel als in petr.-
aether opgelost, aan CaCOg geadsorbeerd en gedragen zich in het
systeem petr.-aether/methylalcohol 85 % hypophasisch. a komt in
minstens drie zeer nauw verwante componenten in de bacterie voor,
die verschillend sterk aan CaCOg worden geadsorbeerd. De ver-
schillende stammen bevatten dezelfde componenten in even groot
aantal, waarschijnlijk ook in dezelfde quantitatieve verhouding. De
kleurstof van Bacterium halobium is dus een geheel andere dan
bacterio-purpurine en dan prodigiosine. Deze bacterie behoort niet
tot de purperbacteriën en is ook niet verwant met Bacillus prodigiosus.

5.nbsp;Bacterium halobium groeit niet in media zonder pepton of
eiwit. De andere geïsoleerde bacteriën kunnen zich ook in media met
eenvoudiger organische N-verbindingen ontwikkelen. Het onderzoek
van Klebahn wordt bevestigd, wat betreft de noodzakelijkheid van
NaCl in de voedingsbodem van Bacterium halobium en Sarcina
morrhuae. Na kan n.1. niet geheel door K vervangen worden. Waar-
schijnlijk moet dit toegeschreven worden aan een antagonistische
werking van Na op K. De mate van vergiftigheid van verschillende
andere zouten dan NaCl werd voor Bacterium halobium nagegaan.
Het bleek, dat zoowel anionen als kationen vergiftig kunnen zijn.
De volgorde, waarin de schadelijke werking van de verschillende
zouten toeneemt, is de volgende: KCl, MgSO^, KNO3, LiCl, CaCl„
BaClo, KBr, Na^ B4 O^. Opvallend is de groote vergiftigheid van Li
ten opzichte van Na en K. Verder kwam een uitgesproken Mg-Ca-
antagonisme tot uiting. Overeenkomstige proeven, die echter nog
een voorloopig karakter dragen, werden met Sarcina morrhuae en
Bacterium trapanicum uitgevoerd, zonder een groot verschil in resul-
taat op te leveren.nbsp;.. , , „

en Lemanea (twee roode wieren, die door Walter zijn onderzocht)
bij overbrenging in een geconcentreerde oplossing van suiker: de
inhoud trekt samen, terwijl de wand opzwelt. Wanneer de bacterie
daarna weer in een geconcentreerde oplossing van NaCl wordt ge-
bracht, treedt de oorspronkelijke toestand weer in. Het verschijnsel,
kan ongeveer op dezelfde wijze verklaard worden, als Walter (1923)
dit deed bij de genoemde wieren: de suikeroplossing onttrekt osmo-
tisch water aan het celvocht of het protoplasma. Een dergelijke
wateronttrekking kan echter alleen plaats hebben als het protoplasma
voor het zout geheel en voor de suiker niet doorlaatbaar is. Dit moet
dus het geval zijn. De opzwelling van de wand moet het gevolg zijn
van de aanwezigheid van een cuticula, die in het normale geval
tezamen met het protoplasma de zwelling van de wand tegengaat.

Baars, (1930), Over sulfaatreductie door bacterien. Diss. Delft.
Baas-Becking, (1928), On organisms living in concentrated brine. Tijdschr.
Ned. Dierk. Ver. 3e serie. i.

van het ambt van gewoon Hoogleeraar aan de Rijks Universiteit te Leiden,
M. Nijhoff, 's-Gravenhage.

Baranik-Pikowsky, (1927), Ueber den Einflusz hoher Salzkonzentration auf
die Limanbakterien. Centralbl. f. Bakt. II. 70.

Beckwith, (1911), The bacterial cause of the reddening of cod and other allied
fish. Centralbl. f. Bakt. I. 60.

Beyerinck, (1889), Le photobacterium luminosum, bacterie lumineuse de la
mer du nord. Archiv Néerl. 23.

Boone and Baas-Becking, (1931), Salt effects on eggs and nauplii of Artemia
salina L. Journ. of Gen. Physiol. 14.

Brand, (1901), Bemerkungen über Grenzzellen und über spontane rote Inhalts-
körper der Cyanophyceen. Ber. D. Bot. Ges. 19.

Buder, (1919), Zur Biologie des Bakteriopurpurins und der Purpurbakterien.
Jahrb. f. wiss. Bot. 58.

Canabaeus, (1929), Ueber die Heterocysten und Gasvakuolen der Blaualgen.
Kolkwitz' Pflanzenforschung 13.

Gittert, van (1923), Un monochromateur de grande luminosité et avec peu de
lumière diffuse. Revue d'optique théorique et instrumentale 2.

Cloake, (1923), Red discolouration (so-called „Pinkquot; or „Pink Eyequot;). Dep. of
Scientific and Ind. Research. Food Investigation board 18.

chromes from animal and plant tissues. Bioch. Journ. vol. 18.
Deventer, van, (1930), De kleurstoffen van Neurospora (Monilia) sitophila

Shear et Dodge. Diss. Utrecht.
Edington, (1887), An investigation into the nature of the organisms present
in „redquot;cod, and as to the cause of the red coloration. VI Annual report
of the fishery board of Scotland P.Ill Edingburgh 1888 (naar

Eykmann, (1904), Ueber thermolabile Stoffwechselprodukte als Ursache der
natürlichen Wachstumshemmung der Mikroorganismen. Centralbl. f.

Farlow, (1880), On the nature of the peculiar reddening of salted codfish
during the summer season. U.S. comm. of fish and fisheries. Washington

Goppelsroeder, (1901), Capillaranalyse, beruhend au Capillantats- und Ad-
sorptionserscheinungen. Verhl. der Naturf. Gesellschaft. Basel. 14.
Hanzawa and Takeda, (1930), On the reddenmg of Boned Codfish. Archiv

Royal Soc. of Canada. Proc. and Trans. 3 series, vol. 16.
Hylkema, (1916), De permeabiliteitsverhoudingen bi, gistcellen en bacterien.

Katz, (1918), Die Gesetze der Quellung. Kolloidchem. Beih. 9.
Kellerman, (1914), Micrococci causing red Deterioration of salted Codfish.

Centralbl. f. Bakt. IL 42.
Klebahn, (1895), Gasvakuolen, ein Bestandteil der Zellen der Wasserblute

von Gasvacuolen bei den Phycochromaceen. Forschungsber. a. d. Biol.
Stat. zu Plön. 4.

--gt; (1919)/ Die Schädlinge des Klippfisches. Mitteilungen a. d. Inst. f. Alg.

Kraft, (1902), Beiträge zur Biologie des Bacterium prodigiosum und zum
chemischen Verhalten seines Pigmentes. Diss. Würzburg.

Kuhn und Lederer, (1931), Zerlegung des Carotins in seine Komponenten. Ber
D. Chem. Ges. 64.

Kuhn und Winterstein, (1931), Viola-xanthin, das xanthophyll des gelben
Stiefmütterchen (Viola tricolor). Ber. D. Chem. Ges. 64.

Kuhn, Winterstein und Lederer, (1931), Zur Kenntnis der Xanthophylle.
Hoppe-S. Ztschr. f. Physiol. Chem. 197.

Lauterborn, (1914—'17), Die sapropelische Lebewelt. Ein Beitrag zur Biologie
des Faulschlammes natürlicher Gewässer. Verh, des Naturhist.-med. Ver-
eins z. Heidelberg N. F. 13.

Liebert, (1924), Die Grundlagen der Bereitung von Pökelhering auf hollän-
dische Art. Der Fisch. 2.

Fiebert und Deerns, (1930), Ueber die Ursache des „Rotwerdensquot; von
Pökelhering. Centralbl. f. Bakt. II. 80.

Lippmaa, (1925), Das Rhodoxanthin, seine Eigenschaften, Bildungsbedingungen
und seine Funktion in der Pflanze. Naturf. Ges. b. d. Univ. Tartu. 24.

Martel et Germain, (1931), Sur le rouge des salaisons. Isolement de l'agent
spécifique. C. R. Ac. Médecine. (Naar Tattevin).

Martin and Wilbur, (1921), Salt antagonism in Artemia.Am. Journ. of Phy-
siol. Vol. 55.

Mauriac, (1886—'89), Causes of poisoning, caused by spoiled codfish.Rep.
of the Fish Comm. Part. 14. (Naar Hanzawa en Takeda).

Matzuschita, (1900), Die Einwirkung des Kochsalzgehaltes des Nährbodens
auf die Wuchsform der Mikroorganism. Ztschr. f. Hygiene 35.

(Carotins) im Blatte. Ber. D, Bot, Ges. 14.
_, (1903), Die sogenannten Gasvacuolen und das Schweben gewisser Phy-

Moll and Burger, (1925), The sensitivity of a galvanometer and its amplifica-
tion. Philos. Mag. Vol. i.nbsp;r , ■ j
Niel, van, (1931), On the morphology and physiology of the purple and green

Oesterle und Stahl, (1929), Untersuchungen über den Formenwechsel und
die Entwicklungsformen bei Bacillus mycoides. Centralbl. f.Bakt. IL 79.
Palmer, (1922), Carotinoids and related pigments. New York
Palmer and Eckles, (1914), Carotin. The principal natural yellow pigment of
milkfat. Part. IL Missouri Agr. Exp. Sta. Res. Bull. 10. (Naar Palmer).
Patouillard, (1885), In Roumeguère, Les Microphytes de la morue rouge et
du pore rouge, récemment observés au Havre et a Bordeaux. Revue Mycol.

Meddel. fra den naturk. Foreni. Kjobenhavn (Naar Klebahn),
Plowe, (1931), Membranes in the plant cell. i. Morphological membranes at
protoplasmatic surfaces, 2. Localization of differential permeability in the

Plöner Sees. Forchungsber. a. d. Biol. Stat, zu Plön. 2.
Ruhland und Hoffmann, (1925), Di^ Permeabilität von Beggiatoa mirabihs.

obligat halophile Thionsäure-bakterien. Centralbl. f. Bakt. IL 80.
Strodtmann, (1895(a)), Bemerkungen über die Lebensverhältnisse des Süss-

wasserplankton. Forschungsber. a. d. Biol. Stat. zu Plön. 3.
_, (1895(b)), Die Ursache des Schwebvermögens bei den Cyanophyceen,

Teessler, (1923), Marine products of Commerce. Chem. Catal. Co. New-York.
Tswett, (igo6(a)). Physikalisch-chemische Studien über das Chlorophyll. Die

Adsorptionen. Ber. D. Bot. Ges. 24.
-, (1906(b)), Adsorptionsanalyse und chromatographische Methode. An-
wendung auf die Chemie des Chlorophylls. Ber. D. Bot. Ges. 24.
-, (1911), Ueber den makro-und mikrochemischen Nachweis des Carotins.

Ber. D. Bot. Ges. 29.
UsiGLio, (1849), Analyse de l'eau de la Méditerranée sur les côtes de France.

Ann. chim. et phys. 27, série 3. (Naar Baas-Becking).
Vermast, (1931), Over Carotine. Diss. Utrecht.

f. wiss. Bot. 62.
Wehmer, (1897), Centralbl. f. Bakt, II. 3. (Naar Golikowa).
Wille, (1902), Ueber Gasvakuolen bei einer Bakterie. Biol, Centralbl.22.
Willstätter und Escher, (1910), Ueber den Farbstoff der Tomate, Ztschr, f,

physiol, Chemie. 64.
Willstätter und Page, (1914), Chlorophyll 24, Ueber die Pigmente der

Braunalgen, Ann, 404,
Willstätter und Stoll, (1913), Untersuchungen über Chlorophyll. Berlin.
w1nogradsky, (1887), Ueber Schwefelbakterien. Bot. Ztg. 45.
Wisselingh, van, (i9i5),Ueber die Nachweisung und das Vorkommen von

Carotinoiden in der Pflanze. Flora 107.
Weede, (1930), Ueber das Prodigiosin, den Farbstoff des Bacillus prodigiosus.

Ztschr. f. Hygiene Bd. 111.
Zechmeister und Cholnoky, (1927), Ueber Paprika-Farbst. I. Ann. 454.
Zopf, (1891),Ueber Ausscheidung von Fettfarbstoffe seitens gewisser Spalt-
pilze. Ber. D. Bot. Ges. 9.

Het is zeer waarschijnlijk, dat de bacterien, die in de literatuur
als veroorzakers van het rood worden van gezouten visch beschreven
Zijn, alle behooren tot Sarcina morrhuae Kl. of Bacterium halobium.

Inde verschillend gekleurde stammen van Bacterium halobium ko-
men dezelfde carotinoïden in dezelfde quantitatieve verhouding

Het al of niet plasmolyseeren van zoetwaterbacterien in osmotisch
werkzame oplossingen berust op het al of niet voorkomen van een

De bacteriophaag is een product van de levende bacterie-cel.
Den DooREN de Jong. Proc. Kon. Akad. v. Wetensch. Amst. 33 en 35

Het is gewenscht voor het xanthophyl uit groene bladeren
(C4(,H5602, smeltp. 193° (gecorr.)) de naam luteïne te gebruiken.

Het is zeer waarschijnlijk, dat alle chemische veranderingen, die
worden teweeggebracht door levende cellen (dus zoowel assimilatie-
als dissimilatieprocessen), teruggebracht kunnen worden tot een
keten van reacties, waarvan elk bestaat uit een katalytische over-
dracht van Hg. Dit sluit in geen geval uit, dat ook een aêtivatie van
de Hg-acceptoren noodzakelijk kan zijn.

In vele gevallen berust de z.g. stimuleerende werking van zaad-
beitsmiddelen op desinfectie.

Ten onrechte meent Stapp te hebben aangetoond, dat de Euro-
peesche bladvlekkenziekte, de „wildfirequot; en de hoekige bladvlekken-
ziekte van de tabak door dezelfde bacterien worden veroorzaakt.

De erfelijke endo-symbionten (bacterien en gisten), die bij in-
secten voorkomen, leveren geen enzymen, die noodzakelijk ziin
voor de voedselvertering van de gastheer. Bij bepaalde voeding-
specialisten kunnen deze symbionten van beteekenis voor de gast-
heer zijn, doordat zij stoffen vormen, die noodzakelijk zijn voor deze»

Bij het onderzoek naar het verband tusschen de pH, waarbij op-
timale werking van een enzym plaats heeft en de toestand van het
substraat moet men rekening houden met de invloed, die het buffer-
mengsel op het substraat uitoefent.

In het plantenrijk kunnen nieuwe soorten ontstaan tengevolge
van entreme uitwendige omstandigheden, wanneer deze polyploïdie
veroorzaken.

Men kan in het algemeen niet spreken van kalkplanten en kalk-
schuwe planten, daar het gedrag ten opzichte van kalk afhankelijk
kan zijn van andere in de bodem aanwezige kationen, waarop Ca voor
de plant een antagonistische werking uitoefent.

Het voorkomen van gasvacuolen bij Schizophyceae en Schizo-
mycetes is een argument voor dever wantschap tusschen deze groepen
van planten.

•■ ■■nbsp;- , ■■■(■•-i. (vi ^^ v • inbsp;: ■nbsp;'^■...t:. • ■ f r at

			Bacterium halobium	Sarcina morrhuae	Bacterium trapanicum
3.1	mol	KCl
2	mol	MgS04	—	n.o.	n.o.
1.5	mol	MgSOi		n.o.
1,25	mol	LiCl*	—		n.o.
0,5	mol	LiCl*
0,5	mol	(NH,)^ SO4	geringe	n.o.	n.o.
0,5		(NH,)^ SO4	ontwikkeling
1.5	mol	KNO3*	—		n.o.
I	mol	KNO3*	—	n.o.	n.o.
o,5	mol	KNO3		n.o.	n.o.
o,oi	mol	KNO3		'
1,25	mol	KBr	—	-	n.o.
o,5	mol	KBr	—		n.o.
o,i	mol	KBr*	—	n.o.	n.o.
0,02	mol	KBr*		n.o.	n.o.
o,5	mol	KJ	—	■	n.o.
0,1	mol	KJ	—		n.o.
0,02	mol	KJ*	—	n.o.	n.o.
o,i	mol	BaClz*	—		n.o.
0,05	mol	BaCL*	geringe		n.o.
0,05			ontwikkeling
0,1	mol	Na2B407	—	-	n.o.
0,01	mol		—		n.o. 1
0,005	mol	Na^BiOy		-f
0,3	mol	CaCla	—	-1-	n.o.
0,15	mol	CaCU	—	n.o.
0,1	mol	CaCla		n.o.

	Bacterium	Bacterium	Sarcina
	halobium	trapanicum	morrhuae
0,15 mol CaCla
0,1 mol CaCla		-1-
0,5 mol CaCla 0,5 mol MgCL	—	n.o.	n.o.
0,3 mol CaCla 0,2 mol MgCla	geringe	n.o.
	ontwikkeling
0,2 mol CaCIa 0,15 mol MgClj	geringe	n.o.
	ontwikkeling
0,2 mol CaCla 0,1 mol MgClg
0,5 mol CaClg 3,1 mol KCl	—	n.o.	n.o.