Dj^s.
utrecht

' 1

A. •» '

■Ä'

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT,
OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS
Dr. L. S. ORNSTEIN, HOOGLEERAAR IN DE
FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE.
VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER
UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN
VAN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUUR-
KUNDE TE VERDEDIGEN OP MAANDAG
6 JUNI 1932 DES NAMIDDAGS TE VIJF UUR

1932

Aan het einde van mijn studietijd is het mij een behoefte aller-
eerst een woord van dank te richten tot U mijn ouders, die mij
in de gelegenheid hebt gesteld deze studie te voltooien.

Hooggeleerde W e s t e r d ij k. hooggeachte Promotor, ik ben U
zeer erkentelijk voor de belangstelling en de welwillende critiek,
die ik tijdens de bewerking van mijn proefschrift van U mocht
ondemnden. De groote vrijheid, die gij mij steeds hebt gelaten,
heb ik altijd bijzonder op prijs gesteld. De jaren, die ik onder Uw
opgewekte leiding in het Baarnsche Laboratorium mocht door-
brengen, zijn voor mij van groote waarde geweest en behooren
tot de aangenaamste uit mijn studietijd.

Hooggeleerde Went, ik acht het een groot voorrecht van U
onderwijs te hebben mogen genieten. De wijze, waarop gij Uw
studenten weet te leiden bij het bestudeeren van de plantenphysio-
logie, heeft mij bijzonder getroffen.

Hooggeleerde P u 11 e, met genoegen denk ik terug aan Uw
leerrijke colleges en aan de aangename excursies, welke ik onder
Uw leiding mocht meemaken.

Hooggeleerde Jordan, Uw heldere colleges en boeiende prac-
tica zijn voor mij van groote beteekenis geweest.

Hooggeleerde D e B u s s y. aan Uw interessante colleges zal ik
steeds een aangename herinnering bewaren.

Zeer geachte Van L u ij k, voor de wijze waarop gij mij steeds
hebt bijgestaan bij de bewerking van het mycologisch gedeelte van
mijn werk, breng ik U mijn oprechte dank.

Ik ben het Bestuur van de stichting „Willie Commelin Scholtenquot;
zeer erkentelijk voor de gastvrijheid, welke zij mij op haar labora-
torium heeft verleend.

Ten slotte rest mij nog een woord van dank te brengen aan
het Utrechtsch Studentencorps en daarvan in het bijzonder aan
de Utrechtsche Studenten Roeivereeniging „Tritonquot;, waaraan ik
voor een groot deel mijn onvergetelijke studententijd te danken heb.

■•• ~ ■ /:.....'

De volgende onderzoekingen zijn gedaan met het doel om de
veroorzakers van de ziekte, die hier te lande bekend staat als de
anthracnose van de erwt, nader te onderzoeken zoowel wat betreft
de physiologie van de fungi als wel hun gedrag als parasiet en
verder om het verband tusschen de voeding van de voedsterplant
en de parasitaire aantasting na te gaan.

Als veroorzaker van de vlekziekte van de erwt wordt gewoonlijk
uits uitend Ascochyta pisi Lib. beschouwd. In Amerika echter ver.
deelt men deze erwtenziekte in drie groepen. Men onderscheidt n.1.
Ascochyta leaf and pod spot {A.pisi), M y c o s p h a e-
rella blight (M. pinodes (Berk. 6 Blox.) Stone) en A s-
cochyta footrot r^. pinodella Jones). De afbeeldingen en
beschrijvingen welke men in Europeesche handboeken vindt (So-
rauer. Frank en v. Tubeuf) komen alle overeen met de
symptomen die men in Amerika voor „A s c o c h y t a 1 e a f a n d
pod spot' opgeeft. Kirchener en Boltshauser geven

d langgerekte, donkergekleurde M.cosp/^aereZ/a-aantastingen te
herkennen zijn. Blijkbaar zagen zij deze laatste vlekken voor varia-
ties van de Ascochyta^aantastingen aan.

In het algemeen zijn de beschrijvingen van deze ziekten in de
iiuropeesche handboeken zeer onvolledig.

Verder was het van belang te onderzoeken in hoeverre de be-
mesting van de erwt van invloed kon zijn op de aantasting door

pisi als parasiet, bestond er aanleiding deze proeven niet alleen
te herhalen, maar ook uit te breiden door ook de andere parasieten
te gebruiken.

Over de physiologie van Ascochyta pisi in reincultuur is slechts
weinig bekend. Het eenige onderzoek op dit gebied is dat van
Lu d wig; het leek mij wenschelijk deze proeven te herhalen en
zooveel mogelijk uit te breiden, vooral wat betreft de invloed van
de zuurgraad op de groei van de schimmel, waarover L u d w i g
geen gegevens verstrekt.

In vochtige zomers kan men in iedere erwtenaanplant op de bla-
deren, stengels en peulen van de planten kleine bruine of zwarte
vlekjes en streepjes aantreffen. Vroeger meende men dat deze
ziekte uitsluitend veroorzaakt werd door Ascochyta pisi. L i n f o r d
ö S p r a g u e (34) zagen echter in Amerika dat deze vlekken sterk
verschilden in vorm en kleur: sommige waren bruin en rond en
vertoonden in het midden een lichtgekleurde, doorschijnende plek
waarop de pycniden duidelijk te zien waren („light typequot;)

VOO namelijk het hypocotyl en de wortels van de erwt aantast. De
aantastingen van deze laatste parasiet op de bovenaardsche deelen
deden sterk aan die van Mycosphaerella pinodes denken. De pyc-
nosporen waren echter veel kleiner dan die van M. pinodes, zoodat
Jone^^ olf^ micro-vorm van M. pinodes werd aangeduid. L. K.
M25) bouwde voort op de bovengenoemde waarnemingen

en stelde de volgende termen voor: 1. Ascochyta leaf and
p o d spot, veroorzaakt door A. pisi Lib. en overeenkomend met
het lichte type van Linford amp; Sprague. 2. Mycosphae-
r e 11 a b 1 i g h t, veroorzaakt door M. pinodes (Berk. amp; Blox.)
Stone en overeenkomend met het donkere type. 3. Ascochyta
f O O t r o t, veroorzaakt door de micro-vorm van Linford amp;
Sprague, en die Jones beschrijft als Ascochyta pinodella n.sp.

In 1930 verscheen een onderzoek van Rathschlag (44) waar-
uit blijkt dat deze drie typen ook in Europa voorkomen,
liandelszaad leverden meestal cultures van Ascochyta pisi op.

Het is mij dan ook gelukt om de drie bovengenoemde fungi uit in-
heemsch materiaal te isoleeren. Isolaties uit verschillende monsters
vandaan kwam Ascochyta pisi meer voorkwam dan Mycosphaetella
pinodes en Ascochyta pinodella. Uit een partij erwten die in Baarn
verbouwd was isoleerde ik grootendeels Mycosphaerella pinodes
terwijl ook hierbij Ascochyta pinodella slechts zeer zelden aanwezig
was. De ziekte door deze drie fungi veroorzaakt kan, wanneer
de weersomstandigheden gunstig voor de groei van de voedster-
plant zijn, tot enkele vlekken beperkt blijven zoodat de schade aan
het gewas gering is. Treedt er echter een langdurige regenperiode
in met lage temperatuur, zoodat de planten slecht groeien en de
parasiet integendeel zeer goed, dan kan de ziekte zich snel uit-
breiden en in sommige gevallen groote schade aanrichten.

Men neemt aan dat de pycnosporen door regendruppels, die op
de bladeren spatten, verspreid worden en zoodoende gezonde plan-
ten in de nabijheid infecteeren. Bij materiaal, dat in de kas ge-
kweekt werd, heb ik nimmer een verspreiding van de ziekte op
andere planten, welke naast geïnfecteerde planten stonden, waar-
genomen. Bij planten die in de open lucht stonden was een af-
stand van V/2 meter tusschen gdnfecteerde en gezonde planten
voldoende om een infectie van de laatste te verhinderen. Bij een
erwtenaanplant, waarbij de planten 50 c.M. uit elkaar stonden, kon
ik, eenige dagen nadat er een zware regenbui gevallen was, waar-
nemen dat de ziekte zich van de geïnfecteerde planten op de in
de nabijheid staande gezonde exemplaren verspreidde.

L.K. Jones meent dat een overbrenging van de pynosporen
door insecten mogelijk is, terwijl hij ook een verspreiding van de

ziekte door middel van de ascosporen. die met kracht uit de asci
zouden worden geslingerd, mogelijk acht.

De pycnosporen, welke in een druppel water op een blad terecht
komen ontkiemen spoedig en vormen een kiembuis die door de
cuticula dringt. Dit kan men gemakkelijk op de volgende wijze
zien: ik bracht op erwtenbladeren druppels sporensuspensie en zette
deze bladeren vervolgens in een goed sluitende glazen doos 2 X 24
uur in een thermostaat bij ± 23° C. Hierna werden de preparaten
m alcohol gefixeerd, waardoor tevens de groene kleurstof uit de
b aderen getrokken werd. Werden nu de hyphen nog met katoen-
blauw gekleurd dan was het indringen van de hyphen in het blad-
weefsel duidelijk te zien.

De kiembuis behoeft dus niet door een huidmondje naar binnen
e Komen, doch is in staat de cuticula te doorboren.

Ludwig (36) maakte doorsneden van bladeren waarop Asco-
chyta-conidiën ontkiemd waren en zag nimmer dat de hyphen door
een huidmondje het bladweefsel binnendrongen. Hij geeft aan dat
de hyphen eerst tusschen cuticula en epidermis loopen totdat zij
op een celwand stooten. Dan volgen zij deze dieper in het blad-
weefsel, doordat zij de middenlamel oplossen en daardoor de cel-
len isoleeren en vernielen.

Wanneer de weersomstandigheden gunstig zijn voor de uitbrei-
ding van de ziekte, dus tijdens langdurige regenperioden, kunnen
kleine afzonderlijke vlekjes uitgroeien tot grootere complexen, zoo-
dat geheele bladeren afsterven. Toch is de schade die aan het ge-
was veroorzaakt wordt meestal gering. Wanneer echter de peul
aangetast wordt, kan de parasiet door de vruchtwand naar binnen
dringen en het zaad infecteeren. Wordt zulk besmet zaad uitge-
legd, dan heeft er bij het kiemen een sterke infectie van het kiem-
plantje plaats. Dergelijke plantjes sterven gewoonlijk spoedig aL

Krüger (31) beschrijft twee gevallen waarin een erwtenaan-
plant geheel mislukte door een aantasting van Ascochyta pisi ten-
gevolge van het gebruik van geïnfecteerd zaad. De planten stier-
ven reeds lang voor de bloeitijd af doordat de wortels sterk aan-
getast waren. Het geheele verschijnsel deed volgens Krüger
sterk aan wortelbrand denken.

Juist dit laatste en de vermelding dat de wortels sterk waren
aangetast doen de vraag rijzen of Krüger misschien met Myco-
sphaerella te doen heeft gehad. Ascochyta pisi tast n.1. nimmer
de wortels van de voedsterplant aan.

Het verdient dus aanbeveling om het zaadgoed terdege te selec-
teeren en geïnfecteerde erwten te verwijderen. Het desinfecteeren
van het zaad heeft weinig nut, aangezien de fungus gewoonlijk
te diep in de cotylen gedrongen is om bij een korte behandeling
gedood te worden, terwijl een langdurige behandeling met het een
of andere desinfectans de kiemkracht van de erwt ernstig kan
schaden.

L. K. Jo n e s vermeldt dat een behandeling van het zaad met
droge beits min of meer de aantasting van het hypocotyl, door
M. pinodes en A. pinodella, het zoogenaamd „footrotquot;, kon
tegengaan. De desinfectie had echter geen invloed op de aantas-
ting van de bovengrondsche deelen door A. pisi.

Van links naar rechts: Mycosphaerella pinodes, Ascochyta pinodella, Ascochyta pisi.

tr-i
gt;

Een mislukking van het gewas kan ook plaats hebben wanneer
men het stroo eener aangetaste erwtenaanplant op het land zou
laten liggen en daar het volgend jaar wederom erwten zou ver-
bouwen. Uit de waarnemingen van Stone (54), L. K. Jones
(25) enLinfordÖSprague (34) is namelijk gebleken dat
de peritheciën van M. pinodes. welke in het najaar ontstaan, even-
als de pycniden van A. pisi en A. pinodella, op de erwtenstengels
kunnen blijven leven.

Van A. pisi en A. pinodella is de hoogere vruchtvorm niet be-
kend. Dit leidde tot de veronderstelling van S t o n e (54 en 55),
Vaughan (57) en F. R. J o n e s 6 L i n f o r d (23) dat Myco-
sph^erdla ptnodes het ascus-stadium van Ascochyta pisi zou zijn.

Mijn waarnemingen bevestigen de opvatting van Jones. Er
oestaat een duidelijk verschil tusschen de reincultures van de twee
ovengenoemde schimmels, terwijl ook het infectiebeeld van A. pisi
is dan dat van M. pinodes.

m.m. in diameter, door een duidelijke donkerbruine rand van
is d'^^r^^ bladweefsel afgescheiden. In het midden van de vlek
IS de kleur geelbruin tot witachtig; het doode bladweefsel is op
le plaats eenigszins doorschijnend. Op de stengels en bladstelen

e vlekken zijn op deze deelen duidelijk ingezonken en voorzien
van een verhoogde, donkerbruine rand. De pycniden treft men in
groote getale in het midden van de vlek aan. Aantastingen van
Lnbsp;en de wortels komen niet voor.

Mycosphaerella pinodes (Berk. amp; Blox.) Stone daarentegen
vormt op de bladeren onregelmatig gevormde, donkerbruine tot
zwarte vlekjes, welke meestal veel kleiner zijn dan de vlekken ver-
^rzaakt door Ascochyta pisi. Op de peulen en stengels veroorzaakt
• pinodes kleine, donkere streepjes, welke tot groote, onregel-

matig gevormde, donkerpaars tot zwarte vlekken kunnen uitgroeien.
Op de stengels kunnen deze vlekken soms een groote oppervlakte
innemen zoodat geheele internodiën een donkerpaarse tot zwarte
tint krijgen, terwijl, in afwijking van A. pisL de pycniden met tal-
rijk zijn en meestal in de nabijheid van de rand verspreid liggen.

M pinodes tast de voedsterplant in veel sterkere mate aan dan
A. pisi; in de zomer van 1931 kreeg ik materiaal van een door
M. pinodes aangetaste erwtenaanplant uit de Kreekerakpolder. De
planten waren bedekt met vlekken, zoodat stengels, bladeren en
peulen geheel zwart gekleurd waren. Een dergelijke zware aantas-
ting door pisi is mij niet bekend. Ook J o n e s vermeldt dat in
Amerika M. pinodes een belangrijker parasiet is dan A. pisi.

M. pinodes tast ook het hypocotyl aan (footrot); de aan-
tasting gaat hier vaak zoo diep, dat de stengel op die plaats door-
breekt, waardoor het jonge plantje te gronde gaat.

Ascochyta pinodella Jones. De vlekken die door de aantasting
van deze schimmel veroozaakt worden lijken zeer veel op die van
M. pinodes. Het verschil is dat de vlekken door A. pinodella ver-
oorzaakt grooter zijn, een tamelijk regelmatig ronde vorm hebben
en meestal uit eenige concentrische zones van verschillende kleur

Bij jonge plantjes die uit van tevoren geïnfecteerd zaad gegroeid
zijn is dit verschil in wortelaantasting duidelijk te zien (plaat II)
zooals mij uit de volgende proef is gebleken. De erwten werden
zorgvuldig geselecteerd en alle exemplaren welke een verkleurd
vlekje vertoonden verwijderd. De overgebleven erwten werden nu
24 uur geweekt en vervolgens gedompeld in een sporensuspensie
van de schimmel waarmede de infectie beoogd werd. Na eenige
uren, wanneer verwacht mocht worden, dat de sporen op de bodem
gezonken waren, werd het water zooveel mogelijk afgegoten, waar-
na de zoo behandelde erwten nog een nacht bleven staan zoodat
de sporen goed op de zaadhuid gekleefd werden. De volgende
dag werden deze erwten in gesteriliseerde tuinaarde uitgelegd. Op
de kiemkracht der erwten had deze kunstmatige infectie niet de
minste invloed; alle erwten kwamen in de verschillende potten regel-
matig op.

Verschil in wortelaantasting door de drie fungi.
Van links naar rechts: Ascochyta pinodella, Ascochyta pisi, Mycosphaerella pinodes

bleven doordat een gedeelte van de wortels aangetast was, terwijl
42% afstierf.nbsp;^nbsp;^

planten op met gezonde wortels. Hier waren alleen bladeren en
stengels aangetast.

.. stam M O h e n d r a, „ in Br. Indië.
Mycosphaerella pinodes, stam Jones, geïsoleerd in Amerika.
■ quot;nbsp;„ stam S i b i 1 i a, „ in Italië.

Over het algemeen fructificeerden de versch geïsoleerde stam-
men beter dan de oudere cultures; vooral de No's 4 en 5 waren
Tc W ^^^nbsp;pycniden te brengen. De in de volgende

en isolaties genomen, hoewel ter vergelijking een enkele maal
quot; isolatie van Jones werd gebruikt.

r,ür' vérscWlde wat het beeld op agarbodem betreit, zeet sterk
Sfde Indt'A sta..e„. Verschmen . ^Po—

No. 2, een / °^„'quot;„(..Hebeeld betreft geheel overeen
kwam watnbsp;agarbodem was er echter een ver-

Ve't^^eïï te^^hr^I^nX: ÏÏe betrekking op el.n
isolaties Sver het algemeen vormden deze jonge stammen, die

Reincultures van de drie fungi op havermoutagar.

Van 1. n. r.: Ascochyta pisi, Mycosphaerella pinodes, Ascochyta pinodclla.

Pycniden en pycnosporen van de drie fungi. De pycniden zijn 100 X vergroot, de pycnosporen 680 X-
a. Ascochyta pinodella. b. Ascochyta pisi. c. Mycosphaerella pinodes.

Bij oudere cultures wordt de havermoutagar stroogeel tot licht-
oranje gekleurd. De pycnosporen zijn hyalien en bevatten enkele
oliedruppels. Bij uitzondering vindt men sporen waarbij het tus-
schenschot ontbreekt.

Mycosphaerella pinodes vormt meer luchtmycelium dan A. pisi.
In het midden wordt een zwart stroma gevormd waarop slechts wei-
nige, donker-gekleurde pycniden worden aangetroffen, waaruit
kleine, lichtoranje sporenmassa's vloeien. De pycnosporen zijn alle
twee-cellig. Zij verschillen duidelijk van A. pisi doordaat zij minder
hyalien zijn en vele grootere en kleinere oliedruppeltjes bevatten.

sporen): 16,1 X 6,7. Havermoutagar wordt door de groei van
M. pinodes niet verkleurd. Op moutagar vormt M. pinodes na
ongeveer 3 weken even onder de oppervlakte fijne, veervormige
kristallen, die aan de onderkant duidelijk zichtbaar zijn. De Heer
Dr. A. J. H a a g e n Smit was zoo vriendelijk deze voor mij te
analyseeren. De juiste samenstelling is nog niet bekend, maar zeker
is dat de kristallen van organische samenstelling zijn. Het zijn
waarschijnlijk de kristallen welke Linford 6 Sprague in
hun cultures vonden.

Ascochyta pinodella vormt bijna uitsluitend een zwart stroma
dat de geheele oppervlakte van de voedingsbodem bedekt. De voe-
dingsbodem van oudere cultures is lichtbruin tot donkerbruin
verkleurd.

Er worden donkergekleurde pycniden gevormd, waarvan de uit-
vloeiende sporenmassa's duidelijk te zien zijn. De pycnosporen
zijn zonder uitzondering eencellig en hyalien; aan de uiteinden lig-
gen vaak oliedruppels.

De sporen zijn 5—11 X 23/^—5/x groot, gemiddeld (uit 100
sporen): 8,1 Xnbsp;pinodella vormt evenals M. pinodes op

De hoogere vruchtvorm vond ik alleen van M. pinodes en wel
in het najaar op afgestorven erwtenplanten. De ascosporen waren
weinig grooter dan de pycnosporen. Cultures van deze ascosporen
leverden weer de Mycosphaerella cultures op met pycniden.

In mijn reincultures heb ik nooit peritheciën aangetroffen, hoe-
wel dit naar de mededeelingen van sommige onderzoekers mogelijk
moet zijn. In navolging van deze auteurs entte ik Mycosphaerella
zoowel op gesteriliseerde erwtenstengels als op verschillende agar-
bodems en stelde de cultures afwisselend aan koude en warmte
bloot, echter zonder resultaat.

Over de voedingsphysiologie van Ascochyta pisi is in de lite-
ratuur slechts weinig te vinden. Het eenige onderzoek over dit
onderwerp is in 1928 van de hand van Oskar Ludwig (36)
verschenen. Hij werkte met vloeibare voedingsbodems, welke hij
met een sporensuspensie van de te onderzoeken schimmel entte.

Hij geeft echter veelal geen drooggewichten van de mycelium-
opbrengst op, maar bepaalt zich er toe te vermelden of de schim-
mel goed of slecht groeit.

Hij onderzocht een groot aantal stikstof- en koolstof bronnen op
hun voedingswaarde voor de schimmel en vergeleek de uitkomsten
over de invloed op Ascochyta pisi met die van Aspergillus
niger.

Wat de koolstofbron betreft vindt Ludwig dat Ascochyta pisi
weinig kieskeurig is.- Hij onderzocht de groei van de schimmel op
allerlei koolstof bronnen als: saccharose, dextrose, levulose, galac-
tose, lactose, dextrine, cellulose, verschillende glucosiden en eenige
alcoholen. Lactose bleek een zeer goede koolstofbron voor Asco-
chyta pisi te zijn. Cellulose in de vorm van filtreerpapier kon niet
worden aangetast. Over de invloed van de stikstofbron vermeldt
Ludwig het volgende: nitraat-stikstof maakt de beste groei
mogelijk. De ammoniumzouten van anorganische zuren zijn onge-
schikt, daar de vrijkomende mineraalzuren de groei al spoedig

onmogelijk maken. Op nitriet konden zijn cultures niet groeien,
wat hij echter niet aan een giftige werking wijt, maar aan het
feit, dat Ascochyta pisi niet in staat zou zijn om uit nitriet zijn
stikstofbehoefte te dekken.

Nadat de nitrietcultures weken lang gestaan hadden, kon hij
er nitraat in aantoonen. Er werd blijkbaar nitriet geoxydeerd tot
nitraat, zoodat, wanneer hij de oplossingen ten tweede male met
een sporensuspensie entte, groei mogelijk was.

Ludwig werkte echter steeds met zure oplossingen (pH 4,4—
4,6) zoodat, naar mijn meening, hieraan het onvermogen van .Asco-
chyta pisi om op nitriet te groeien kan worden toegeschreven.

Andere onderzoekers geven namelijk aan dat verschillende
schimmels in alcalisch milieu wel degelijk op nitriet als stikstofbron
kunnen groeien.

Went (61) vond bij Monilia sitophila een even goede groei
op nitraat als op nitriet.

Hochapfel (19) zag verschillende Fusarium-soorten zich
normaal ontwikkelen op een alkalische nitrietbodem.

Brenner (4), die met Aspergillus niger experimenteerde,
toonde aan dat nitriet in zure oplossing zelfs giftig werkt. Voegde
hij bij die oplossing ammoniumoxalaat, dat een uitstekende stik-
stofbron is, dan kon Aspergillus er nóg niet in groeien. Het vrije
salpeterigzuur, resp. de gasvormige afbraakproducten van het
anhydride (NO en NO2) zijn n.1. zeer giftig te noemen.

Dat de giftige werking zich niet alleen tot het kiemstadium be-
paalde, bewees Brenner door een jonge cultuur uit NH4-oxa-
laat op een nitriet-voedingsbodem over te brengen, waardoor de
groei direct ophield.

Wat de invloed van mineralen op den groei van A. pisi betreft,
is door het onderzoek van Ludwig alleen bekend dat ijzer, zink
en koper de groei bevorderen. Over de invloed van mineralen als
magnesium, fosfor, zwavel, calcium, kalium en natrium op de groei
van A. pisi is dus niets bekend. Wel vindt men hierover in de lite-
ratuur opgaven betreffende andere schimmels.

Reeds Raulin (45) kweekte Aspergillus niger op een syn-
thetische vloeibare voedingsbodem en ging de invloed na van ver-
schillende voedingszouten op het gewicht van de droge mycelium-
opbrengst. Hij kwam tot de conclusie dat Aspergillus niger voor

een goede groei behalve stikstof en koolstof noodig heeft: fosfor,
kalium, magnesium, zwavel en in geringe hoeveelheid: ijzer, zink
en calcium.

Van der Veen (59) vond dat cultures van Fusarium en
Verticillium zich slecht ontwikkelden wanneer zij gebrek aan fosfor
leden. De hyphen waren dun en bevatten regelmatig verspreide
oliedruppels. Ook bij zwavelgebrek ontstonden er oliedruppels,
doch deze waren niet zoo regelmatig verspreid. Op het droogge-
wicht van de schimmels was zwavel niet van invloed. Er werden
echter in cultures die aan zwavel gebrek leden weinig conidiën
gevormd.

Het bleek van der Veen dat speciaal toevoegen van ijzer
overbodig was, aangezien dit element als verontreiniging van de
overige voedingszouten reeds in voldoende hoeveelheid in de op-
lossing aanwezig was.

Ook Young amp; Bennett (62) vermelden dat ijzer en zink
in kleine hoeveelheden uit de glaswand diffundeeren, dus niet
speciaal aan de oplossing behoeven toegevoegd te worden.

Volgens de oude opvatting zou calcium voor de groei van schim-
mels onnoodig zijn. In de meeste synthetische voedingsoplossingen
wordt dan ook geen calcium toegevoegd.

In de nieuwere literatuur wordt echter meermalen melding ge-
maakt van een duidelijke invloed van calciumzouten op de groei
van schimmels.

Zoo geeft H o r i (20) aan dat Sclerotinia libertinia, Fusarium
roseum, Entomophtora sp. en Ramularia citri slecht groeien zonder
kalk. Aspergillus niger en Aspergillus flavus groeien echter even-
goed met als zonder kalk.

Young amp; Bennett vonden dat calcium een stimuleerende
werking op de groei van eenige schimmels uitoefent. Wanneer zij
in de voedingsoplossing het KNO3 vervingen door Ca(N03)2,
bleek de opbrengst aan droge schimmelsubstantie belangrijk grooter
te zijn.

Coup in (6) heeft eveneens een invloed van Ca op de groei
van schimmels waargenomen en wel bij Penicillium glaucum,
waarbij bleek dat op voedingsbodems zonder Ca slechts steriel
mycelium werd gevormd; zoodra er een calciumzout werd toege-
voegd, werden rijkelijk conidiën gevormd.

Aan de hand van de hierna beschreven proeven heb ik getracht
de physiologie van Ascochyta pisi vast te stellen.

Bij mijn onderzoek zijn de schimmels steeds op vloeibare voe-
dingsbodem gekweekt in erlenmeyers van 100 ccm inhoud, behalve
in één geval, waar erlenmeyers van 300 ccm inhoud gebruikt
werden. Als voedingsbodem diende R i c h a r d s-oplossing, die als
volgt was samengesteld:

50 g Saccharose, 10 g KNO3, 5 g KH2PO4. 2,5 g MgS04 en
20 mg FeCl2 per 1. gedestilleerd water.

Door nu in deze oplossing de verschillende stoffen één voor
één weg te laten of te vervangen door andere, was het mogelijk
de invloed van verschillende koolstof- en stikstofbronnen en van
enkele mineralen op de groei van A. pisi en M. pinodes na te gaan.

In deze oplossing werd het fosfaat niet direct toegevoegd, daar
dan de pH tijdens het steriliseeren te veel zou veranderen. Het
fosfaat en de rest van de oplossing werden dus afzonderlijk ge-
steriliseerd en naderhand met een steriele pipet bij elkaar gevoegd.
Voorts gebruikte ik niet alleen het primaire kaliumfosfaat, maar
ook K3PO4, K2HPO4 en H3PO4. Van deze stoffen werden 2
N-oplossingen gemaakt. Deze werden 1 uur bij % atmosfeer over-
druk gesteriliseerd.

Door nu de fosfaten in verschillende verhouding bij de voedings-
bodem te voegen, kon ik oplossingen van verschillende pH ver-
krijgen. De zuurgraad werd colorimetrisch bepaald volgens W.
Mansfield Clark. Wanneer verschillende koolstof- of stik-
stofbronnen met elkaar werden vergeleken werd er steeds voor
gezorgd dat de zuurgraad van de oplossing in de verschillende
reeksen gelijk was, zoodat het resultaat steeds op de bepaalde stof-
fen betrekking had en niet beïnvloed was door de zuurgraad.

Van deze oplossing werden, met een steriele pipet, de erlenmeyers
elk van 25 ccm voorzien, waarop de voedingsbodem met conidiën
van de te onderzoeken schimmel werd geënt.

stammen, daar deze veel meer conidiën vormden dan de andere
stammen. Een enkele maal werd ter vergelijking een isolatie van
Jones gebruikt.

Het enten van de voedingsbodem met de te onderzoeken schim-
mel gebeurde door in elk kolfje 1 ccm van een sporensuspensie te
brengen.

Deze sporensuspensie maakte ik aanvankelijk door bij een buis
met een 14 dagen oude cultuur op havermoutagar, 10 ccm steriel
water te brengen en de sporen met een entnaald los te maken.

Van deze sporensuspensie werd nu in ieder kolfje 1 ccm ge-
bracht. Deze kolfjes werden bij gebrek aan ruimte niet in een
thermostaat gezet, maar bleven in de kamer staan bij een tempera-
tuur tusschen 20° en 23quot;^ C.

Na 10 dagen was meestal de hoeveelheid schimmelsubstantie
groot genoeg om op van te voren gewogen filtreerpapiertjes te
worden afgefiltreerd en in een autoclaaf bij 45° C. te worden
gedroogd. Na 2 X 24 uur in de autoclaaf te hebben gelegen wer-
den deze filters gewogen en de hoeveelheid schimmelsubstantie
berekend.

Daar ik bij een zelfde reeks zeer sterk varieerende uitkomsten
kreeg kon verondersteld worden dat dit aan de entmethode moest
worden toegeschreven. Het was natuurlijk mogelijk dat het eene
kolfje meer sporen kreeg dan een ander doordat:

1.nbsp;de cultures waarvan de sporensuspensie werd gemaakt nooit
precies gelijk waren;

2.nbsp;de hoeveelheid van 1 ccm der sporensuspensie, die met behulp
van een gecalibreerde pipet in de kolfjes gebracht werd, niet
zoo nauwkeurig kon worden afgemeten daar dit, om infecties
te voorkomen, vrij snel moest gebeuren.

Ik heb daarom bij al mijn proeven de volgende methode toege-
past, die het mogelijk maakte om alle kolfjes met een meer ver-
gelijkbare hoeveelheid sporen te enten.

Ik nam daartoe een 14 dagen oude buiscultuur op havermout-
agar en voegde hierbij 10 ccm steriel water. Met een entnaald
werden de sporen even losgewoeld en deze sporensuspensie in een
steriele kolf gegoten. Hierbij werd 20 ccm steriel water gevoegd
en van deze verdunde sporensuspensie werd 20 ccm in een groote

kolf met Yi liter voedingsoplossing gebracht. Uit deze laatste kolf
werden nu de kleine erlenmeyers ieder van 25 ccm vloeistof voorzien.

Wanneer men de groote kolf met voedingsoplossing tijdens het
overpipeteeren in de kleine erlenmeyers nu en dan even schudt,
zoodat de sporen niet bezinken, is men er zeker van dat alle kolfjes
op dezelfde wijze worden geënt.

Op deze wijze heb ik steeds vrijwel gelijke uitkomsten gekregen
in dezelfde reeks, zooals uit onderstaande proef moge blijken.

Deze proef werd opgezet om uit te maken in welke oplossing
Ascochyta pisi nog goed groeide, terwijl toch de pH niet te sterk
veranderde.

Als voedingsbodem diende bij de eerste reeks de oplossing van
Richards die als volgt was samengsteld:

Na 10 dagen was de pH van 6,5 veranderd tot 6,8. Het droog-
gewicht der schimmelmassa bedroeg:

91, 92, 92, 92 en 93 mg gemidd. 92 mg
Gaf ik 1%, inplaats van 5% saccharose, dan
veranderde de pH eveneens van 6,5 tot 6,8.
Het drooggewicht van de schimmelmassa der
5 kolfjes was:

51, 53, 53, 52, 51 mg gemidd. 52 mg
Wanneer ik 1% saccharose gaf, maar meer
fosfaat in de oplossing bracht, dan veranderde
de pH slechts van 6,5 tot 6,6.

83, 81, 86, 83 en 84 mg gemidd. 83,4 mg
De drooggewichten zijn dus bij kolfjes van dezelfde reeks nage-

noeg gelijk. De bovenbeschreven methode van enten, die zeer
bruikbaar bleek te zijn, werd daarom in het vervolg steeds toe-
gepast. Verschillen in pH tusschen kolfjes van dezelfde reeks heb
ik nimmer waargenomen.

Uit de gemiddelde waarden van de proef is te zien dat Asco-
chyta pisi zeer goed kan groeien op een geringere hoeveelheid
saccharose dan Richards aangeeft en dat bij toevoeging van
minstens Ij/^ % fosfaat een goede buffering wordt verkregen.

Ik heb in het vervolg de voedingsoplossingen steeds samenge-
steld met 2% saccharose en 2% fosfaat. Bovendien heb ik in
plaats van 1% KNOg in het vervolg 0,5% KNOg gebruikt (of
aequivalente hoeveelheden van andere N-zouten), om ook hier-
door te voorkomen dat de zuurgraad te sterk veranderde.

Wanneer het FeCl2 uit de oplossing werd weggelaten was de
opbrengst aan droge schimmelsubstantie even hoog als bij cul-
tures die wel FeCl2 toegevoegd hadden gekregen. Daar er blijk-
baar als verontreiniging van de overige voedingszouten voldoende
ijzer in de oplossing komt heb ik dit element in het vervolg weg-
gelaten.

Om uit te maken bij welke koolstofbron Ascochyta pisi het beste
groeit, entte ik de schimmel op voedingsoplossingen met verschil-
lende C-bronnen ter sterkte van 2%. Hiervoor werden gebruikt:

Voor iedere C-bron werd een reeks van 10 kolfjes aangezet.
De pH van alle oplossingen was 7,0. Na 12 dagen werd de pH
weer bepaald en de schimmelsubstantie afgefiltreerd, gedroogd en
gewogen.

Ascochyta pisi groeit dus het best met dextrine of amylum
solubile als koolstofbron, minder goed op glucose en saccharose
en slecht op galactose, lactose en gummi arabicum.

Cellulose in de vorm van filtreerpapier wordt niet aangetast.
Werd als voedingsbodem gelatine waaraan fijn verdeeld filtreer-
papier was toegevoegd gebruikt, dan vertoonde Ascochyta pisi
hierop dezelfde slechte groei als op een bodem die uitsluitend uit
gelatine bestond. Er werd een spaarzaam luchtmycelium gevormd:
verkleuring trad niet op, terwijl er geen pycniden gevormd werden,
Ludwig geeft aan dat lactose voor Ascochyta pisi een goede
koolstofbron is, maar uit mijn proef blijkt dat lactose een van de
slechtste C-bronnen is.

Het bevreemdt ook dat Ludwig zegt dat Ascochyta pisi zeer
langzaam groeit en daardoor slechts in geringe mate reageert op
verschillen in concentratie van de diverse voedingszouten.

In de volgende proef, zoowel als in de proeven met verschil-
lende concentraties van de stikstofbron reageerde Ascochyta pisi
heel duidelijk.

met verschillende concentraties van de koolstofbron. Daartoe ge-
bruikte ik glucose in de volgende concentraties: 10%, 1% en 0,1%.

De stikstof werd in deze reeks als NH4CI toegediend. Elke
reeks bestond uit 20 kolfjes, waarvan er elke 2 dagen 4 werden
afgenomen om het drooggewicht te bepalen.

Het hoogste drooggewicht werd bereikt bij 10% glucose; dat
de kromme, die deze gewichtstoename weergeeft, niet rechtlijnig
verloopt, moet worden toegeschreven aan het feit, dat de zuur-

graad van de voedingsoplossing tijdens de proef zoo sterk daalde,
dat de groei belemmerd werd. De pH daalde bij deze reeks n.1.
van 6,5 tot 3,4, terwijl in de reeksen met 1% en 0,1% glucose de
zuurgraad resp. van pH 6,5 op 6,0 en 6,4 terugliep.

De kromme, die de gewichtstoename bij een voedingsoplossing
met 0,1% glucose aangeeft heeft een eigenaardig verloop. Na
5 of 6 dagen is het maximum bereikt, waarna het gewicht heel
langzaam gaat dalen. Hier is dus blijkbaar de koolstofbron na
5 of 6 dagen uitgeput, waarna autolyse plaats vindt.

Daar uit de literatuur bekend is dat de groei van een schimmel
meestal sterk afhankelijk is van de vorm waarin de stikstof wordt
toegediend, heb ik, om het gedrag van eenige Ascochyta-stammen
ten opzichte hiervan te onderzoeken, de onderstaande proeven
genomen.

Als stikstofbron dienden aequivalente hoeveelheden van de vol-
gende zouten: KNO3, NH4NO3, NH4CI en ureum.
De voedingsoplossingen waren als volgt samengesteld:

Iedere reeks bestond uit 20 kolfjes, waarvan er na 5, 7, 9 en 12
dagen telkens 5 werden afgenomen om het gewicht aan schimmel-
substantie te bepalen.

Het resultaat is in de volgende kromme weergegeven.
Zooals uit de figuur blijkt is de groei van Ascochyta pisi sterk
afhankelijk van de vorm waarin de stikstof geboden wordt.
Ammoniumchloride, ammoniumnitraat en ureum zijn betere stik-

stofbronnen dan kaliumnitraat. Het hoogste drooggewicht werd
bereikt met NH4CI als stikstofbron.

Ludwig vond dat nitraten voor Ascochyta pisi een betere
stikstofbron leverden dan ammoniumzouten. Uit al mijn proeven
blijkt echter dat bijv. ammoniumchloride een veel betere N-bron
is dan kaliumnitraat.

nische zuren, wanneer deze als N-bron worden gebruikt, door het
vrijkomen van de mineraalzuren, de oplossing spoedig ongeschikt
voor Ascochyta pisi maken.

Daar Ludwig slechts 0,2% fosfaat in zijn voedingsoplossingen
gebruikte, zullen deze niet sterk gebufferd zijn. Daar ik echter in
mijn oplossing 2% fosfaat gebruikte, had ik nimmer last van te
sterke verzuring van de voedingsbodem.

Ascochyta pinodella zijn de resultaten in onderstaande tabel weer-
gegeven. Voor een beter overzicht heb ik hierbij tevens de waar-
den van Ascochyta pisi stam W e h 1 b u r g gevoegd. Ik moet er
echter op wijzen dat de in de tabellen aangegeven waarden voor
de verschillende schimmels niet met elkaar vergeleken mogen wor-
den, daar ze op de verschillende tijdstippen bepaald zijn; wel draagt
de invloed van de stikstofbron in alle drie groepen hetzelfde
karakter.

Drooggewichten van Ascochyta pisi en Ascochyta pinodella op
verschillende stikstofbron.

Ammoniumzouten worden blijkbaar gemakkelijker opgenomen
dan nitraten. Toch maakt het nog verschil in welke vorm het
ammoniumzout wordt geboden.

In de volgende proeven bestond elke reeks uit 10 kolfjes, waar-
van na afloop van de proef het gemiddelde gewicht aan droge
schimmelsubstantie werd bepaald. Werd Ascochyta pisi geënt op
een voedingsoplossing met (NH4)2S04 als stikstofbron, dan werd
er in 10 dagen gemiddeld 84,3 mg aan drooggewicht gevormd,
terwijl er bij de controle-reeks, waar NH4CI als stikstofbron werd
gegeven in dezelfde tijd gemiddeld 130,2 mg droge stof werd ge-
vormd. Daar het sulfaat bij 1% K2SO4 oplossing niet schadelijk
Werkt (zie blz. 37) kan men uit deze proef, waarin het (NH4)oS04
slechts in geringe hoeveelheid gegeven werd, (3,55 g per 1) hoog-
stens besluiten dat de verbinding waarin het zout geboden wordt
voor Ascochyta pisi verschil maakt.

Wanneer ik Ascochyta pisi verschillende nitraten als stikstof-
bron gaf, dan bleek het dat er geen verschil in groei was bij KNO3
en NaNOg. Bij Ca(N03)2 werd echter veel meer droge stof ge-

vormd. Blijkbaar oefent hier het Ca-ion een stimuleerende werking
uit, zooals ook Young ö Bennett vonden.

Groei van Ascochyta pisi op voedingsoplossingen met aequivalente
hoeveelheden van verschillende nitraten.

vormd. De groei wordt sterker naarmate meer stikstof wordt toe-
gevoegd; bij zeer groote hoeveelheden is een schadelijke invloed
te bemerken die tot uiting komt in het geringere drooggewicht.

In de onderstaande tabel zijn de resultaten weergegeven van
de groei van Ascochyta pisi op voedingsoplossingen met verschil-
lende concentraties KNO3 en NH4NO3.

Wordt nitriet als stikstofbron geboden dan groeien Ascochyta
pisi en Mycosphaerella pinodes op deze voedingsoplossing goed,
mits de oplossing niet zuur reageert. Dit komt ook overeen met
hetgeen Brenner en Hochapfel vonden. Zij geven n.1. aan,
dat schimmels wel op nitriet kunnen groeien wanneer er loog is
toegevoegd, dat het schadelijke HNO2 bindt.

Volgens L u d w 1 g echter kan Ascochyta pisi ook dan niet op
nitriet groeien, daar deze schimmel niet in staat zou zijn om uit
nitriet zijn stikstofbehoefte te dekken.

Ik liet de schimmels groeien in oplossingen waarbij 4,2 g KNO2
per liter was gevoegd en bracht de oplossingen op verschillende
zuurgraad.

Na 14 dagen bleek, dat zoowel Ascochyta pisi als Mycosphaerella
pinodes op nitriet goed groeiden bij pH 7,7, maar dat er totaal
geen groei was waar te nemen bij pH 5,4.

L u d w i g merkt op dat er in een voedingsoplossing met nitriet
^a eenige tijd wat nitraat aanwezig is. Blijkbaar wordt dus lang-
zamerhand het nitriet tot nitraat geoxydeerd. Terwijl de schimmel
de voedingsoplossing eerst niet kon groeien, bleek dit na een
tweede keer enten toch mogelijk.

Hoewel ik de oplossingen van pH 5,4, waarin na 4 weken nog
geen §[roei was waar te nemen, nog eens heb geënt, was er 2 weken
daarna nog steeds geen groei te bespeuren.

Ik meen dus te mogen aannemen, dat de mogelijkheid om op
nitriet te groeien hier afhankelijk is van de aanwezigheid van loog.

Ik liet Ascochyta pisi ook op voedingsbodems met pepton en
asparagine als stikstofbron groeien. Als controle diende een reeks
met NH4CI als stikstofbron. De oplossingen bevatten resp. per
1. 2,84 g NH4CI, 3,6 g asparagine en 5 g pepton.

Ascochyta pisi groeit op pepton even goed als op NH4CI, ter-
wijl asparagine een minder goede stikstofbron blijkt te zijn.

De zuurgraadverschuiving staat sterk onder invloed van de
stikstofbron welke men gebruikt.

Om een duidelijke zuurgraadverschuiving te kunnen zien was
het noodzakelijk dat de cultures minstens 3 weken bleven groeien
zoodat ook een grootere hoeveelheid voedingsoplossing moest ge-
geven worden.

inhoud gebruikt waarbij iedere kolf voorzien werd van 50 ccm voe-
dingsoplossing.

De reeksen bestonden elk uit 10 kolven, waarvan er om de vier
dagen 5 op de zuurgraad werden onderzocht.

de zuurgraad naar de basische kant verschuift, terwijl een ver-
zuring van de oplossing plaats vindt wanneer NH4NO3, NH4CI
en ureum geboden worden.

Wanneer ammoniumnitraat gebezigd wordt tast de schimmel
grootendeels de NH4-groep aan om zijn stikstof uit te betrekken.

Dit blijkt uit het verzuren van de voedingsbodem, daar er HNO3
in de oplossing komt. Dit gebeurt bij KNO3 als N-bron niet, waar
immers de oplossing basisch wordt. Deze voedingsoplossing was
in tegenstelling met die van alle andere proeven slechts gebufferd
met ]/2% fosfaat (bij de andere voedingsoplossingen werd steeds
2% fosfaat toegevoegd, zoodat daar ook nooit een sterke zuur-
graadverschuiving plaats had).

Aan het einde van de proef waren in alle kolfjes pycniden aan-
wezig. Bij de andere proeven die gewoonlijk slechts 10 tot 14
dagen duurden heb ik nimmer pycniden kunnen vinden. Blijkbaar
fructificeeren deze schimmels op een vloeibare synthetische voe-
dingsbodem minder gemakkelijk dan op de vaste voedingsbodems
als havermout-, kers- of moutagar, waarop gewoonlijk na onge-
veer 7 dagen reeds pycniden gevormd werden.

Ascochyta pisi groeit in voedingsoplossingen van pH 3,2 tot en
met pH 9. Of er nog groei mogelijk is bij een pH hooger dan 9
heb ik niet onderzocht.

Bij pH 3,2 is de groei meestal zeer gering, vooral wanneer
KNO3 als stikstofbron gegeven wordt. De schimmel vormt niet
anders dan een zeer dun, kleurloos, slijmerig laagje op de bodem
van de kolfjes; deze hoeveelheid schimmelsubstantie was gewoon-
lijk te gering om te worden gewogen.

Geeft men NH4CI als stikstofbron, dan wordt er meer schim-
melsubstantie gevormd, daar Ascochyta pisi ammoniakstikstof beter
benut dan nitraatstikstof; de pH van de voedingsoplossing ver-
schuift in dit geval echter spoedig tot een punt waarbij geen groei
meer mogelijk is. De schimmel vormt bij pH 3,2 geen gesloten
dek, maar aan de oppervlakte ontwikkelen zich groene klompjes
mycelium (fig. 7) en op de bodem een kleurloos, slijmerig laagje.

optimale groei plaats tusschen pH 4 en 4,9. De schimmel vormt
een zeer dicht, wollig gesloten geheel aan de oppervlakte van de
voedingsoplossing, welke langzamerhand geel gekleurd wordt. Het
mycelium zelf is lichtoranje gekleurd. Naar de basische kant
neemt de groei geleidelijk af. Bij pH 7, 8 en 9 groeit het mycelium
bijna geheel onder de vloeistofoppervlakte. Oplossing en mycelium
blijven ongekleurd.

van optimale groei tusschen pH 7,1 en 7,8. Hier is het mycelium
zoowel boven als onder de vloeistofoppervlakte tot een taaie
massa ineengegroeid.

In dit geval neemt met het dalen van de zuurgraad ook de groei
af. Ook wordt er steeds minder oranje kleurstof gevormd, totdat
de cultures bij pH 5 geheel kleurloos zijn. Merkwaardig is het dat
bij pH ± 3,2 plotseling een groene kleur van de aan de opper-

Invloed van de zuurgraad op de groei van
Ascochyta pisi bij saccharose-KNO, voeding.

Invloed van de zuurgraad op de groei van
Ascochyta pisi bij saccharose-NHiCl-voeding,

vlakte drijvende myceliumklompjes optreedt; de oplossing, evenals
het op de bodem liggende laagje mycelium blijft echter ongekleurd.

Daar in deze proef de zuurgraad, vooral bij NH4CI voeding
sterk veranderde, heb ik de kromme door punten getrokken die
liggen tusschen de punten welke de begin- en de eind pH aangeven.

5 6

Figuur 13.nbsp;I

Invloed van de zuurgraad op de groei van
Ascochyta pinodella bij dextrine-KNOa voeaffl'

Op nitraat groeit de schimmel dus harder in zuur milieu; op
ammoniakstikstof wordt de optimale groei bereikt even boven het
neutrale punt.

Zien we hier dat op een voedingsbodem met een bepaalde stik-
stofbron de groei afhankelijk is van de pH van de voedingsoplos-
sing, evenzeer is dit het geval voor de groei op voedingsbodems
waarin de koolstof in verschillende vorm geboden wordt.

Boven zagen wij dat op een voedingsbodem met saccharose en
KNO3 het optimum ongeveer bij pH 4,5 ligt. Om na te gaan of
dit optimum voor andere koolstofbronnen op dezelfde plaats ligt.

werd de saccharose door dextrine vervangen. Deze proef duurde
14 dagen; iedere reeks bestond uit 10 kolfjes van dezelfde zuur-
graad. Na 7 dagen werd van de helft der kolfjes uit iedere reeks
de opbrengst aan schimmelsubstantie bepaald en na 14 dagen ge-
beurde hetzelfde met de overige kolfjes. Zooals uit fig. 12 blijkt

Een dergelijke proef werd eveneens genomen met Ascochyta
pinodella. Het resultaat dat weergegeven is in fig. 13 komt met dat
der vorige proef overeen.

Uit de literatuur is bekend, dat nitraatstikstof het gemakkelijkst
wordt opgenomen in zuur milieu, hetgeen ook het geval was bij
saccharose-KNOs voeding. Tot mijn verwondering zag ik echter
dat dit niet meer opging wanneer dextrine als koolstofbron ge-

boden werd. Blijkbaar hangt dus de opname van nitraten sterk af
van de vorm waarin de koolstof aanwezig is.

Zagen wij in een vorige proef dat bij een voeding met saccha-
rose en NH4CI het pH-optimum bij 7,5 ligt, zoo blijkt dit naar
de basische kant te verschuiven wanneer de saccharose in de op-
lossing vervangen wordt door dextrine, (fig. 14),

Om de invloed van enkele mineralen op de groei van Ascochyta
pisi en Ascochyta pinodella na te gaan werd weer uitgegaan van
de gemodificeerde Richard s-oplossing, waarin de hoeveelheid
van het te onderzoeken mineraal kon worden gewijzigd of waaruit
het kon worden weggelaten.

Iedere reeks bestond uit 10 kolfjes, waarvan na afloop van de
proef het gemiddelde gewicht aan droge schimmelsubstantie werd
bepaald.

Laten we uit de oplossing het MgS04 weg dan is de ontwik-
keling bij Ascochyta pisi zóó gering, dat er geen drooggewicht van
te bepalen is: 0,01% van het zout is echter reeds in staat een nor-
male hoeveelheid schimmelsubstantie te doen produceeren, terwijl
1% MgS04 schadelijk werkt, daar deze cultures veel minder
schimmelsubstantie opbrengen.

Ascochyta pinodella reageerde op dezelfde wijze als Ascochyta
pisi op de verschillende concentraties MgS04; de resultaten zijn
in de onderstaande tabel weergegeven.

Om na te gaan hoe Ascochyta pisi bij verschillende concen-
traties sulfaat zou groeien werd in de voedingsoplossing het MgS04
vervangen door een aequivalente hoeveelheid MgCl2, terwijl de
oplossingen resp. O g, 1 g, 4g en 10 g K2SO4 p. 1. kregen.

dat belangrijk onder het normale lag. Blijkbaar is dus eenig sul-
faat noodzakelijk om een goede groei mogelijk te maken.

Groei van A. pisi en A, pinodella op voedingsoplossingen
met verschillende concentraties magnesiumsulfaat.

Bij de oplossingen met 0,1%, 0,4% en 1% kaliumsulfaat waren
de drooggewichten ongeveer gelijk, zooals uit de onderstaande tabel
blijkt.

Groei van Ascochyta pisi op voedingsoplossingen met
verschillende concentraties kaliumsulfaat.

Geheel zonder fosfaat ontwikkelen de cultures zich slecht; de
hyphen zijn dun en bevatten onregelmatig verspreide oliedruppels.

Op een voedingsbodem met 0,2% fosfaat is reeds een tamelijk
goede groei waar te nemen, welke steeds beter wordt naarmate

meer fosfaat voorhanden is. Ascochyta pisi kan zeer hooge fosfaat-
concentraties verdragen, hoewel hierbij de groei niet sterk meer is.
Zelfs op een voedingsoplossing die 10% fosfaat bevatte, was

Groei van Ascochyta pisi stam Wehlburg en Ascochyta pisi
stam Jones op voedingsoplossingen met verschillende concen-
traties fosfaat.

nog groei mogelijk, doch deze was op het tijdstip dat het droog-
gewicht van de andere reeksen werd bepaald te gering, om te meten.

Na vier weken had zich in deze cultures echter een flinke hoe-
veelheid mycelium gevormd. De groei beperkte zich tot de rand
van het vloeistofoppervlak, waar een onregelmatige, dikke ring
van mycelium gevormd werd, die bij Ascochyta pisi stam Jones
karmijnrood gekleurd was, bij de eigen isolatie lichtoranje.

Een geringe hoeveelheid kalium schijnt reeds voldoende voor
de groei te zijn. Wanneer alle kalium in de voedingsoplossing ver-
vangen werd door natrium was de opbrengst aan droge schimmel-
substantie even groot. Blijkbaar is dus het kalium dat uit de glas-
wand in de oplossing diffundeert, voldoende. Geeft men in
plaats van KNO3 als stikstofbron een aequivalente hoeveelheid
Ca(N03)2 dan wordt er in dezelfde-tijd een veel grootere hoe-
veelheid droge stof gevormd. Blijkbaar oefent hier het Ca-ion een
stimuleerende werking uit zooals ook Young amp; Bennett
vonden.

Groei van Ascochyta pisi op voedingsoplossingen met
verschillende nitraten als stikstofbron.

Om nu nog eens op een andere wijze de invloed van het calcium
na te gaan, werden in de gewoonlijk gebruikte voedingsoplossing
de volgende hoeveelheden CaCl2 gebracht: 0,1%, 0,5% en 2%.
Deze proef bestond uit 2 series; de zuurgraad verschilde in de reek-
sen onderling zeer weinig, zoodat het resultaat van de proef daar-
door niet beïnvloed kan zijn.

Ascochyta pisi levert bij toevoeging van 0,1 % CaCl2 min-
der schimmelsubstantie op dan bij de controle. Is er echter meer
CaCl2 voorhanden, dan neemt de groei weer toe. Het is niet
onmogelijk dat dit aan een invloed van ionenantagonisme is toe
te schrijven.

Groei van Ascochyta pisi op voedingsoplossingen met
verschillende concentraties CaCl2.

schijnlijk werkt hier de groote hoeveelheid CaClg schadelijk; boven-
dien vormt het calcium in de voedingsoplossing met het opgeloste
kaliumfosfaat het slecht oplosbare calciumfosfaat dat op de bodem
neerslaat en zoodoende het fosfaat buiten bereik van de schimmel
brengt.

Uit de voorgaande proeven is gebleken dat Ascochyta pisi een
duidelijke voorkeur voor enkele koolstofbronnen heeft. Van de
onderzochte koolhydraten zijn dextrine en amylum solubile het

best, dan volgen glucose en saccharose, terwijl lactose en gummi
arabicum als koolstofbron voor Ascochyta pisi minder geschikt zijn.

Wat betreft de stikstofbron worden ammoniumzouten beter be-
nut dan nitraten. Ook op ureum wordt een goede groei bereikt.
Nitriet kan als stikstofbron gebruikt worden mits de voedingsop-
lossing basisch reageert. Zoowel A. pisi als M. pinodes blijken op
nitriet bij pH 7,7 goed te groeien; bij pH 5,4 was er echter in het
geheel geen groei waar te nemen.

Op pepton groeit A. pisi ongeveer even goed als op NH4CI; op
asparagine werd echter belangrijk minder droge schimmelsubstantie
gevormd.

De zuurgraadverschuiving is afhankelijk van de stikstofbron
welke gebezigd wordt. Met KNO3 als stikstofbron wordt de voe-
dingsoplossing basisch, terwijl een verzuring plaats heeft wanneer
ureum, NH4CI of NH4NO3 gebruikt worden.

De groei van A. pisi werd onderzocht bij verschillende zuurgraad
van pH 3 tot pH 9. Bij een pH lager dan 3,2 is geen groei mogelijk.
Bij pH ± 3,2 vormt de schimmel geen normale hyphen, maar
kleine groengekleurde klompjes, welke uit afgeronde, opgezwollen
cellen bestaan. Er wordt hier ook geen gesloten dek van hyphen
gevormd. Bij een zuurgraad hooger dan pH 3,2 is de groei goed.
Er wordt aan de oppervlakte van de voedingsoplossing een ge-
sloten dek van hyphen gevormd; de oplossing wordt langzamer-
hand lichtoranje gekleurd. Daar de proeven gewoonlijk slechts
10 tot 14 dagen duurden, werden er geen pycniden gevormd. In
een geval waarbij de proef 24 dagen duurde waren in alle kolfjes
pycniden te vinden (zie blz. 30).

Bij pH ± 9 is een goede groei waar te nemen, hoewel de hyphen
hier meestal dun zijn en het mycelium voor een groot deel onder
de oppervlakte groeit.

Het pH optimum is afhankelijk zoowel van de koolstofbron als
van de stikstofbron. Bij saccharose-KNOg-voeding ligt het punt
van optimale groei tusschen pH 4 en 4,9; bij saccharose-NH4Cl-
voeding ligt het optimum tusschen pH 7,1 en 7,8.

Werd in de voedingsoplossing de saccharose vervangen door
dextrine, dan bleek het optimum naar de zure kant te zijn ver-
schoven. Voor KNOs-dextrine ligt het optimum bij pH 6,9 en voor
NH4Cl-dextrine bij pH 8.

Men mag dus niet van het pH-optimum zonder meer spreken,
daar dit afhankelijk is van de voedingsbodem.

Wanneer men bij de voedingsoplossing 0,01% MgS04 voegt
wordt er reeds een normale hoeveelheid schimmelsubstantie ge-
vormd.

Ook zwavel en fosfor zijn voor een goede groei noodzakelijk,
hoewel in cultures die aan een van deze twee stoffen gebrek leden
nog wel groei was waar te nemen.

De gewoonlijk gebruikte voedingsoplossing van Richards
bevat geen calcium. Ascochyta pisi groeit op deze oplossing zeer
goed, zoodat men zou vermoeden dat Ca voor de groei onnoodig
was. Toch oefent Ca een duidelijke invloed op de groei van A. pisi
uit, wat uit de volgende feiten blijkt:

a.nbsp;werd in de voedingsoplossing alle KNO3 vervangen door een
aequivalente hoeveelheid Ca(N03)2 dan werd er belangrijk
meer drooggewicht gevormd;

b.nbsp;werden bij de gewone Richard s-oplossing verschillende hoe-
veelheden CaCls gevoegd, dan bleek het dat A. pisi bij geringe
concentraties CaCl2 minder drooggewicht vormde dan bij de
controle-oplossing; bij grootere concentraties CaCl2 werd er
echter meer droge stof gevormd dan bij de controle-oplossing,
terwijl nóg grootere hoeveelheden CaCU de groei belemmerden.

De gevoeligheid van de plant voor de aantasting door parasi-
tische fungi staat sterk onder de invloed van de uitwendige om-
standigheden. Tot deze uitwendige omstandigheden behooren be-
halve de voeding van de gastheer ook de klimatologische factoren
als vochtigheid, temperatuur en belichting, welke laatste omstan-
digheden ook indirect kunnen werken doordat zij de opname van
voedingsstoffen door de gastheer kunnen beïnvloeden.

Zoo vermeldt Gaszner (11), die de invloed van belichting
en COs-gehalte van de lucht op de roestinfectie van granen onder-
zocht, dat sterke belichting de incubatietijd kon verkorten. Even-
eens werd de incubatietijd verkort wanneer er bij constante be-
lichting meer CO2 voorhanden was. Gaszner besluit uit zijn
proeven dat de gevoeligheid van het graan voor roestinfectie ver-
hoogd wordt door een sterkere assimilatie van de gastheer, of deze
assimilatie nu te danken is aan een sterkere belichting dan wel
aan een grooter C02-gehalte van de lucht.

Schaffnit amp; Volk (49) onderzochten de invloed van de
bemesting op de infectie bij een groot aantal cultuurplanten in pot-
cultures en kwamen tot de overtuiging, dat er een zeer duidelijke
invloed van de bemesting op de gevoeligheid voor parasieten merk-
baar was. Zij stelden echter als voorwaarde voor het slagen van
hun proeven dat men materiaal van middelmatige gevoeligheid
gebruikte, dus geen overgevoelige, respectievelijk resistente soor-

ten, daar in dat geval de bemesting geen verandering in resistentie
zou teweegbrengen. Onder meer gingen zij de invloed van de be-
mesting van Pisum sativum op de gevoeligheid voor aantasting
door Ascochyta pisi na en vonden dat planten, die gebrek leden
aan stikstof en fosfor zeer resistent waren, terwijl planten die
overvloedig stikstof kregen, evenals die, welke aan kalium gebrek
leden, sterk aangetast werden.

Ook bij de andere, door hen onderzochte cultuurplanten vonden
zij deze invloed van stikstof en fosfor. Zij formuleeren hun bevin-
dingen als volgt: ,,jede Nährstoffkombination, bei der Stickstoff
oder Phosphorsäure deutlich ins Minimum gerät, hemmt das Pilz
Wachstum. Umgekehrt finden die untersuchten Parasiten die gün-
stigsten Lebensbedingungen auf den Pflanzen, die in keiner Weise
an diesen beiden Nährstoffen Mangel leiden.quot;

Rippel amp; Ludwig (46) die in potcultures de invloed van
de bemesting van gerstplanten op de aantasting door Pleosopora
trichostoma onderzochten, vonden dat planten, die overvloedig N
en P kregen, resistenter waren dan de planten die hieraan gebrek
leden. Hun resultaten zijn dus juist tegenovergesteld aan die van
Schaffnit 6 Volk.

Dit schrijven Rippel amp; Ludwig toe aan het feit dat
Schaffnit amp; Volk een ander type parasiet gebruikten.

De eersten namelijk gebruikten een parasiet die de voedsterplant
in het jeugdstadium aantast en dan met de plant meegroeit en
waaraan zij de naam syngene parasiet gaven.

Schaffnit 6 Volk infecteerden hun planten wanneer deze
volgroeid waren; de parasiet groeit dan niet mee maar blijft plaat-
selijk (metagene parasiet).

Uit het feit dat het voor een syngene parasiet van belang zou
zijn dat de gastheer niet te krachtig groeit, wat bij gebrek aan
N en P het geval is, zouden de uitkomsten van Rippel ö Lud-
w i g, volgens hen zoodoende te verklaren zijn.

Gaszner ö Hassebrauk (12) onderzochten de invloed
van de bemesting van graanplantjes op de roest-infectie. Zij von-
den, evenals Schaffnit ö Volk, dat soorten van middelmatige
resistentie de duidelijkste resultaten opleverden.

Zij gingen de invloed van één bepaalde voedingsstof na, terwijl
zij de overige voedingszouten daarbij al of niet varieerden.

Hierbij bleek dat een stof in het eene geval de gevoeligheid van
de plant voor parasieten kon verhoogen, in het andere geval de
resistentie kon doen toenemen.

Fosfor bijvoorbeeld kan de resistentie van de plant verhoogen
indien het in verhouding tot K en N in overvloed in de bodem
aanwezig is, terwijl de gevoeligheid vergroot kan worden wanneer
K en N tegenover P in de meerderheid zijn.

Mijns inziens mag men in dit geval niet spreken van een afzon-
derlijke invloed van de fosforbemesting, daar kalium en stikstof
eveneens meewerken om de gevoeligheid van de plant te veranderen.

Verder vonden Gaszner amp; Hassebrauk dat bij planten
die volstrekt geen kali tot hun beschikking hadden de aantasting
niet maximaal was. Volgens hen moet dit worden toegeschreven
aan het feit dat de parasiet zich bij totale afwezigheid van kalium
slechts matig kan ontwikkelen. De sterkste aantasting heeft eerst
plaats wanneer de planten een zeer geringe hoeveelheid kalium
krijgen, daar dan de parasiet zich ten volle kan ontwikkelen.

Wat betreft de invloed van enkele mineralen op de infectie van
de plant voor parasieten, treft men dus in de literatuur vele tegen-
strijdige meeningen aan.

Zimmermann (63 en 64) geeft in twee referaten alle resul-
taten die op dit gebied sedert 1925 zijn verkregen. Hieruit blijkt,
dat een zeer groot aantal van de door hem beschreven infectie-
proeven in het veld genomen zijn, hetgeen de gedeeltelijk tegen-
strijdige opgaven verklaren kan. Immers, bij veldproeven kan men
de voedingszouten niet zoo regelmatig en gelijkelijk toedienen als
bij potproeven. Hieraan en aan het feit dat V a v i 1 o v (58) bij
zijn veldproeven over de invloed van de bemesting van graan-
planten op de roestinfectie, zeer resistente graansoorten gebruikte,
kunnen waarschijnlijk zijn negatieve resultaten worden toege-
schreven. Hij besluit uit een van zijn proeven, waar hij 288 k.g.
NaNOs per h a gaf en geen verandering in resistentie zag: ,,Im-
mune Sorten blieben unter allen Umständen immun.quot;

Boven zagen wij dus dat de uitwendige omstandigheden de aan-
tasting van planten door parasieten kunnen beïnvloeden, maar dat
dit niet het geval is wanneer men immune soorten gebruikt.

Men onderscheidt een mechanische of passieve immuniteit, waar-
bij bijzondere eigenschappen van bouw of groei van de plant het

binnendringen van parasieten zouden verhinderen en een physio-
logische of actieve immuniteit. Deze laatste immuniteit berust niet
op anatomische verschillen, maar op een inwendige reactie tusschen
gastheer en parasiet.

De mechanische immuniteit kan onder invloed van het milieu
wel veranderen, de physiologische niet of nauwelijks.

Gaszner (10) komt op grond van zijn onderzoekingen tot
de overtuiging, dat de gevoeligheid van een plant voor een be-
paalde parasiet het product is van uitwendige omstandigheden en
de overgeërfde wijze van reageeren van het organisme.

Hij besluit dus dat niet de dispositie als zoodanig het erfelijke
kenmerk is, maar de eigenschap van het organisme om op de be-
paalde uitwendige omstandigheden juist met deze dispositie te
reageeren.

Ook E. B au r (2) uit zich in deze zin als volgt: „Vererbt wird
immer nur eine bestimmte spezifische Art der Reaktion auf die
Auszenbedingung, und was wir als aüszere Eigenschaften mit
unseren Sinnen wahrnehmen, ist nur das Resultat dieser Reaktion
auf die zufällige Konstellation von Auszenbedingungen, unter denen
das untersuchte Individuum sich gerade entwickelt hat.quot;

Het doel van het volgende onderzoek was nu na te gaan in hoe-
verre de uitwendige omstandigheden, en wel speciaal de bemesting,
van invloed waren op de gevoeligheid van Pisum sativum voor aan-
tasting door Ascochyta pisi en Mycosphaerella pinodes.

De volgende proeven zijn alle genomen met Pisum sativum (var.
Wonder van Amerika) op zandcultures.

Het experimenteeren met planten op watercultures bracht het
bezwaar met zich mee dat nu en dan een geheele cultuur zoodanig
door Pythium werd aangetast, dat alle planten ten gevolge van
wortelrot afstierven. Op zandcultures heb ik van een infectie door
Pythium nooit last gehad. Bovendien is het werken met zandcul-
tures minder tijdroovend, omdat het geregelde ververschen van
de oplossing zooals bij watercultures noodzakelijk is, niet noodig

is, daar iedere pot direct de volle hoeveelheid voedingsstoffen krijgt.
Weliswaar vervalt hierbij het voordeel der watercultures, dat men
na 2—3 weken de voedingsoplossing op de oorspronkelijke samen-
stelling kan terugbrengen. Daar echter de watercapaciteit van de
met zand gevulde potten ongeveer 4 maal het volume van een
voor watercultuur gebruikt jampotje bedraagt, de proefduur daar-
entegen hoogstens 2 maal zoo lang is, namelijk 4—6 weken, wordt
dit bezwaar practisch opgeheven.

Daar de methode, door Schaffnit 6 Volk toegepast (49),
deugdelijk gebleken was, heb ik mij in hoofdzaak hieraan gehouden.

Ik kweekte mijn proefmateriaal in Mitscherlic h-potten op
een mengsel van glaszand en turfmolm. De inhoud van deze
Mitscherlic h-potten is 53^ 1. Onder in de bodem is een
langwerpig gat, waardoor de oplossing in een daaronder staande
bak kan loopen. De cultuurbodem werd geregeld nat gehouden
met de in de bak opgevangen oplossing, of met water. Het glas-
zand, dat betrokken werd van de glasfabriek ,,Leerdamquot; werd voor
het gebruik 3 maal met water goed uitgewasschen en vervolgens
met 10% turf (gewichtsprocenten) vermengd om de watercapaci-
teit te verhoogen en om de bodem losser te maken. Het onver-
mengde glaszand vormde namelijk in vochtige toestand een com-
pacte massa, zoodat de wortels der proefplanten er slecht konden
indringen.

Bij dit glaszand-turf-mengsel in de Mitscherlic h-potten
werden de verschillende voedingsoplossingen gebracht.

Bij het vaststellen van de standaardbemesting hebben Schaff-
nit amp; Volk de geringste hoeveelheid voedingsstoffen genomen,
welke volgens de literatuur en eigen proeven nog een normale ont-
wikkeling der planten mogelijk maakte.

Neemt men de standaardhoeveelheid van een stof namelijk te
hoog, dan bestaat het gevaar dat de plant spoedig die toestand
bereikt heeft, waarbij niets meer van deze stof opgenomen kan
worden.

het gewenschte doel doen bereiken, namelijk een éénzijdige over-
bemesting, maar de plant zou beschadigd worden.

De verhouding waarin zij een bepaalde stof toevoegden was
aanvankeli^ 0:0,4:1:2,4. waarbij 1 de standaardhoeveelheid
voorstelt. Later, toen het Schaffnit ö Volk bleek dat de

plant op de verschillende stoffen ook verschillend reageert werd
voor leder van de te onderzoeken voedingszouten een aparte ver-
houding opgesteld.

Bij het samenstellen van de door mij gebruikte voedingsoplos-
singen heb ik rekening gehouden met de verhouding die zij voor
ae verschillende voedingszouten gebruikten.

In het bovenstaande schema diende pot no. 1 als standaard-
cultuur voor de proeven met stikstof, fosfor en kalium.

Bij de proeven over de invloed van calcium gebruikte ik een
oplossing van eenigszins andere samenstelling, zoodat bij deze
reeksen steeds een aparte standaardcultuur noodig was.

Bij de Ca-reeks werd namelijk het fosfaat niet. zooals bij de
andere proeven, als calciumfosfaat toegevoegd, maar als het secun-
daire kaliumfosfaat. Verder was in deze proeven geen speciale
toevoeging van kali-zouten noodig. aangezien dit element in het
fosfaat reeds in voldoende hoeveelheid aanwezig was

De voedingsoplossingen waren als volgt samengesteld. De ge-
tallen geven de hoeveelheid van de verschillende zouten per pot
in grammen aan.

Deze pH is tamelijk laag. Dit is toe te schrijven aan het toe-
voegen van turf aan de bodem, s'J a c o b (21) geeft aan dat
de optimale groei van Pisum sativum bij pH 5 — 6 ligt. Ik heb
de zuurgraad onveranderd gelaten, omdat er nieuwe stoffen in
de bodem gebracht zouden zijn, indien ik een pH 5—6 had
wilen bereiken.

Bijstellen van de zuurgraad tijdens de proef was onnoodig, daar
de pH niet meer dan eenheid veranderde.

De getallen geven de hoeveelheid van de verschillende zouten
per pot in grammen aan.

Verder werd bij iedere pot nog 0,5 g. MgS04 en 0,3 g. FeCIg
gevoegd. De pH van de bodem bedroeg bij deze proeven 5 — 5,2.
In het glaszand-turf-mengsel, waarbij de voedingsoplossing ge-
bracht was, werden, de gedurende een week op scherp zand ge-
groeide kiemplantjes, gepoot.

Het zaad werd van te voren zorgvuldig op een eventueele aan-
tasting onderzocht en alle kiemplantjes met de geringste aanwijzing
eener infectie afgekeurd.

Het bewerken van het zaad met Uspulun, sublimaat of formaline
liet ik achterwege, aangezien men het op deze wijze volstrekt
niet vrij maakt van Ascochyta of Mycosphaerella, daar mij bleek
dat de fungus gewoonlijk te diep in het weefsel doorgedrongen
was om bij een korte behandeling met het een of ander desinfec-
tans gedood te worden terwijl een langdurige behandeling de kiem-
kracht van de erwt ernstig schaadt.

Wanneer de plantjes ongeveer 10 cm groot waren en 5 of meer
bladeren hadden, werden ze geïnfecteerd.

b.nbsp;door druppels sporensuspensie met een entnaald op de
bladeren te brengen.

2.nbsp;door de parasiet van een reincultuur op vaste voedingsbodem
in kleine stukjes op de plant over te brengen.

Brengt men de suspensie met behulp van een verstuiver op de
plant, waardoor deze geheel met conidiën bedekt wordt, dan zal
er bij een gevoelig exemplaar een zeer groot aantal infecties op-
treden.

Het bezwaar van deze methode is echter dat de druppels sporen-
suspensie op de bladeren en stengels van de plant te snel opdrogen,
zoodat er dan in het geheel geen infectie plaats heeft. Brengt
men echter met een entnaald, waaraan men een oogje gemaakt
heeft, dikke druppels van een sporensuspensie op de bladeren, dan
drogen deze druppels niet zoo gauw op als in het eerste geval,
maar toch altijd nog te snel om zeker te zijn van een goede infectie.

Schaffnit amp; Volk die op deze wijze infecteerden, beschik-
ten over een speciale apparatuur om de lucht vochtig te houden
en zoodoende het opdrogen van de sporensuspensie te voorkomen.

Daar ik niet over een dergelijke inrichting kon beschikken, bracht
ik uit een reincultuur de parasiet in kleine stukjes op de bladeren
en Stengels van de voedsterplant.

Op deze wijze gelukten de infecties op gevoelige exemplaren
altijd. Weliswaar krijgt men zoodoende geen sterke aantasting,
maar het doel, namelijk het verkrijgen van verschil in aantasting
bij planten die verschillend besmet zijn, wordt zeer goed bereikt.

Op elk plantje bracht ik 5 stukjes van een aan blokjes gesneden,
gelijkmatig ontwikkelde reincultuur van de parasiet.

Deze stukjes kleefde ik op de bladeren, op de stengels en tusschen
de blaadjes van de eindknop.

De planten werden nat gehouden door ze geregeld met een
verstuiver te besproeien.

Na 5—7 dagen bleek dan of de infecties gelukt waren; ik liet
echter de planten nog eenige tijd doorgroeien om de parasiet in
de gelegenheid te stellen zich door secundaire infectie nog verder
uit te breiden. Deze secundaire infectie was alleen mogelijk door-
dat de planten rijkelijk besproeid werden, zoodat de sporen met
druppels water op andere bladeren konden spatten.

Na verloop van tijd werden de vlekken, zoowel op de stengels
als op de bladeren geteld en het gemiddelde aantal blad- en stengel-
vlekken per plant berekend. Hiertoe ben ik wel gerechtigd aange-
zien het aantal bladeren en stengels der planten uit de verschillende
potten ten naastebij gelijk was, zoodat de infectiekans voor alle
planten gelijk was.

Uit de onderstaande tabellen blijkt de groote invloed van stik-
stofbemesting op de mogelijkheid van infectie door Ascochyta pisi
en Mycosphaerella pinodes. De proeven b en c werden in de kas
genomen, terwijl bij proef a de potten onder een glazen afdak
in de buitenlucht stonden. In beide gevallen werd een goede infectie
verkregen.

Mycosphaerella bleek over het algemeen een krachtiger parasiet
te zijn dan Ascochyta, daar de eerste soms zelfs aan N-gebrek

c. parasiet: Mycosphaerella pinodes.
geïnfecteerd 27 October,
proefduur 13 dagen.

lijdende planten nog vrij sterk kon aantasten. Ook is de incubatie-
tijd voor Mycosphaerella pinodes korter dan voor Ascochyta pisi.
Bij het infecteeren met de eerste zag ik vaak na 3 dagen al ver-
kleuringen optreden ten teeken dat de infectie gelukt was, terwijl
er bij infecties met Ascochyta pisi minstens 5 dagen verliepen
eer er een vlekje verscheen.

Daar het gedurende de volgende proeven, die in de buitenlucht
onder een glazen afdak genomen werden, dagelijks regende, zoo-
dat de atmosfeer zeer vochtig was, waren de omstandigheden voor
de uitbreiding van de parasiet zeer gunstig. De proefplanten waren
dan ook op 20 Augustus zoo sterk aangetast dat het tellen van de
afzonderlijke vlekken onmogelijk was. Ik heb daarom de aantas-
ting uitgedrukt in:

sterk aangetaste blaadjes (meer dan 10 vlekken),
zwak aangetaste blaadjes (minder dan 10 vlek-
ken).

c. parasiet: Mycosphaerella pinodes.
geïnfecteerd 5 Augustus,
proefduur 15 dagen.

In tegenstelling met de invloed van stikstof blijkt dus kalibe-
mesting de gevoeligheid van de erwt voor aantasting door Asco-
chyta en Mycosphaerella te verminderen.

Het verschil in aantasting tusschen planten zonder kalium en
die met een geringe kalibemesting is betrekkelijk gering. De plan-
ten uit de standaardcultuur vertoonen al een belangrijk mindere

aantasting, terwijl de infectie van de planten met overvloedige
K-bemesting, vergeleken met de andere, gering te noemen is.

c. parasiet: Mycosphaerella pinodes.
geïnfecteerd 5 Augustus,
proefduur 14 dagen.

Evenals bij proef 4 c., welke in dezelfde tijd genomen werd,
heb ik de mate van aantasting niet uitgedrukt in het aantal blad-
en stengelvlekken maar in:

De invloed van de fosforbemesting blijkt duidelijk uit boven-
staande tabellen. Schaffnit amp; Volk vonden eveneens een
dergelijke invloed door fosforbemesting. Evenwel kregen zij bij
planten, welke overvloedig met fosfor waren bemest, weer een
eenigszins verhoogde resistentie, hetgeen zij toeschreven aan het
feit, dat bij de, in verhouding tot de hoeveelheid N, overvloedige K-
en P-voeding, gemakkelijk stikstofgebrek optreedt.

Ik heb deze resistentie-verhoogende invloed niet kunnen waar-
nemen, hoewel ik vergeleken met de proeven van Schaffnit
6 V O 1 k, in verhouding dezelfde hoeveelheid fosfor gebruikte.

De gevoeligheid van planten met overvloedige P-bemesting is
weliswaar niet veel grooter dan van de planten uit de standaard-
cultuur, in ieder geval zijn zij gevoeliger en is er geen sprake van
een verhooging van de resistentie.

Uit de volgende proeven ziet men dat calcium, indien het in
groote hoeveelheid in de bodem aanwezig is, de gevoeligheid van de
erwt voor een aantasting door Ascochyta en Mycosphaerella ver-
hoogt.

Dit behoeft echter niet een directe invloed van het calcium te
zijn. Uit de proeven van Nemec amp; Gracanin (43) bleek n.1.
dat wanneer aan een kalkarme bodem CaCOs werd toegevoegd,
de resorptie van P en K door de plant werd verhoogd.

Bovendien kan volgens Gaszner amp; Hassebrauk fosfor-
zuur de gevoeligheid van de plant voor parasieten verhoogen en
wel des te sterker, naarmate meer kalium aanwezig is.

Het is dus zeer goed mogelijk dat in de volgende proeven door
de toevoeging van CaS04 een verhoogde resorptie van P en K
optrad, waaraan dan de, door Gaszner amp; Hassebrauk ge-
constateerde, grootere gevoeligheid van de planten voor een aan-
tasting door parasieten kan worden toegeschreven.

Uit de voorgaande proeven mogen wij besluiten dat de voeding
van Pisum sativum van duidelijke invloed is op de infectie door
Ascochyta pisi, Ascochyta pinodella, en Mycosphaerella pinodes.

Het duidelijkst is de invloed van stikstof- en kalibemesting. Stik-
stof vermeerdert de infectiekans naarmate zij in grootere hoeveel-'
heid in de bodem aanwezig is. Kalium vertoont een tegenoverge-
stelde werking; hoe meer kali er in de bodem aanwezig is, des
te geringer is de aantasting van de voedsterplant. De bevinding
van Gaszner 6 Hassebrauk dat planten zonder kali resi-
stenter waren dan planten met weinig kali (zie pag. 45), gaat
blijkbaar niet op voor Pisum sativum; steeds werden de planten,
die een totaal gebrek aan kalium hadden, sterker aangetast dan
die welke een geringe hoeveelheid kali tot hun beschikking hadden.
Calcium en fosfor verhoogen beide de gevoeligheid van de erwt
voor aantasting door Ascochyta pisi en Mycosphaerella pinodes.
De bemesting van de voedsterplant heeft bij al deze proeven
weinig invloed op het fructificeeren van de parasiet. Slechts bij
algeheele afwezigheid van stikstof werden uitsluitend steriele blad-
vlekken gevormd. Nimmer waren op bladvlekken uit deze reeks
pycniden te vinden. In alle andere gevallen waren steeds na onge-
veer 14 dagen op de bladvlekken pycniden te zien.

De vlekziekten van de erwt worden veroorzaakt door een drie-
tal fungi n.1. Ascochyta pisi Lib., Ascochyta pinodella Jones en
Mycosphaerella pinodes (Berk. ö Blox.) Stone, die ieder een ver-
schillend ziektebeeld geven.

Een beschrijving van ieder van deze fungi afzonderlijk is ge-
geven, benevens het daarbij behoorende ziektebeeld.

Wat de physiologie van de fungi in reincultuur betreft werd
het volgende gevonden: ammoniumzouten zijn een betere stikstof-
bron dan nitraten; ook vormt A. pisi met NH4CI als N-bron meer
drooggewicht dan op asparagine of pepton. Nitriet blijkt een goede
stikstofbron te zijn, mits de voedingsoplossing basisch reageert.

Worden ammoniumzouten van sterke zuren als stikstofbron ge-
bezigd, dan daalt de zuurgraad van de voedingsoplossing tot pH
± 3,2; bij een lagere zuurgraad is geen groei mogelijk. Wordt
KNO3 als stikstofbron gebruikt dan stijgt de pH van de voedings-
oplossing tot ± 8.

Bij pH ± 3,2 vormt A. pisi geen normale hyphen, maar onregel-
matige, groengekleurde klompjes, bestaande uit dikke, afgeronde
cellen, welke aan de oppervlakte van de voedingsoplossing drijven.

Bij hoogere pH is de groei goed; er worden normale hyphen
gevormd, die aan de oppervlakte van de voedingsoplossing een
gesloten dek vormen.

amylum solubile, glucose en saccharose; de schimmel groeit min-
der goed op galactose, lactose en gummi arabicum. Cellulose in de
vorm van fijn verdeeld filtreerpapier wordt niet aangetast.

Magnesium is noodzakelijk voor de groei van A. pisL Laat men
Mg uit de voedingsoplossing weg dan is er nagenoeg geen groei
te bespeuren, terwijl een hoeveelheid MgS04 van 0,1 g per liter
reeds voldoende is om een normale hoeveelheid schimmelsubstantie
te doen produceeren.

Zonder fosfor of zonder zwavel ontwikkelen de cultures zich
slecht. Er worden dunne hyphen gevormd, die vele oliedruppels
bevatten.

A. pisi kan zeer hooge fosfaatconcentraties verdragen; in een
voedingsoplossing die 10% fosfaat bevatte was nog groei mogelijk.

Calcium blijkt een stimuleerende werking op de groei van A. pisi
uit te oefenen. Geeft men inplaats van KNO3 als stikstofbron een
aequivalente hoeveelheid Ca(N03)2 dan wordt er belangrijk meer
schimmelsubstantie gevormd.

Het pH optimum is niet alleen afhankelijk van de stikstofbron
die gebezigd wordt, maar ook van de koolstofbron. Bij KNO3-
saccharose ligt het optimum tusschen pH 4 en pH 4,9, terwijl bij
NH4Cl-saccharose het optimum tusschen pH 7,1 en pH 7,8 ligt.

Wordt nu de saccharose vervangen door dextrine dan verschuift
het optimum naar de zure kant. Voor KNOa-dextrine ligt het
optimum nu bij pH 6,9 en voor NH4Cl-dextrine bij pH ± 8.

De invloed van de bemesting van Pisum sativum op de aantas-
ting door A. pisi, M. pinodes en A. pinodella is onderzocht. Stik-
stof-, fosfor- en calciumbemesting verhoogen de gevoeligheid van
de voedsterplant voor aantasting door de bovengenoemde para-
sieten terwijl kaliumbemesting een resistentieverhoogende werking
vertoont.

Op het fructificeeren van de parasieten heeft de bemesting van
de gastheer weinig invloed. Slechts bij totale afwezigheid van
stikstof in de bodem werden op de bladvlekken geen pycniden
gevormd.

salt solutions as indicated by the growth of wheat roots.
1929, Bot. Centralblatt 14, 331.
10. GASZNER, G. Untersuchungen über die Sortenempfindlichkeit von Ge-
treidepflanzen gegen Rostpilze.

11- - Die Frage der Rostanfälligkeit als ernährungsphysiolo-
gisches Problem.
1927, Angewandte Botanik 9, 531.

ziehung zwischen Mineralsalzernährung und Verhalten der
Getreidepflanzen gegen Rost.
1931, Phytopathol. Zeitschr. 3. 535.

of the plant in relation to the absorption of ions.
1923, Journal of general physiology 5, 629.

21a. JARIUS, M. Untersuchungen über Ascochyta pisi bei parasitischer und
saprophyter Ernährung.

25.nbsp;JONES, L. K. Studies of the nature and control of blight, leaf- and pot-

spot and footrot of peas caused by species of Ascochyta.
1927, Geneva Agr. Exp. Sta. bull. 547.

Wachstum einiger phytopathogener Bakterien.
1930, Phytopathol. Zeitschr. 2, 443.

die Resorption der Phosphorsäure und des Kali aus dem Boden.
1930, Zeitschr. f. Pflanzenernährung 17, 232.

SCHAFFNIT E. und BONING, K. Die Brennfleckenkrankheit der Bohnen.
1925^ Forschungen auf dem Geb. d. Pfl. krankh. 1 Mitteilung.

^ Empfänglichkeit der Pflanzen für Paratten.
1927. Forschungen auf dem Geb. d. Pfl. krankh. Heft 3 1.
SIDERIS. C. P. Studies on the behavior of Fusarium cromyophthoron in
carbohydrates, glucosides, proteins, etc.

1925, Phytopathology 15, 129.nbsp;r ,nbsp;i
__— The effect of the H-ion concentration of the culture solu-
tion on the behavior of Fusarium cromyophthoron, etc.

1929, Phytopathology 19, 233.
52. SPRAGUE, R. Host range and life history studies of some leguminous

1930.nbsp;Phytopathology 20, 591.
STONE, R. E. The life history of Ascochyta on some leguminous plants 1.

1912,nbsp;Annales Mycol. 10, 564.
_____ The life history of Ascochyta on some leguminous plants 2.

1924, Phytopathology 14, 348.
57. VAUGHAN, R. E. Mycosphaerella pinodes the ascigerous stage of Asco-
chyta pisi.

in synthetic culture media.
1922, Am. Journal of Botany 9, 459.
ZIMMERMANN, A. Sammelreferate über die Beziehung zwischen Parasit
und Wirtspflanze, no. 1. die Erysiphaceen.
1925, Centralblatt f. Bakteriologie 63, 106.

49.

50.

54.

55.

63.

und Wirtspflanze, no. 2. die Uredineen.
1925, Centralblatt f. Bakteriologie 65, 311.

Ir^jV;

Ten onrechte neemt Stone aan dat Mycosphaerella pinodes het
ascus-stadium van Ascochyta pisi is.

Door de onderzoekingen van Johnson en Ogden is voldoende
aangetoond dat tabaksvirus in de bodem kan overwinteren.

Het virus van de tomatenmozaïekziekte kan niet buiten de voed-
sterplant voortgekweekt worden.

Kostytschew's algemeene bezwaren tegen de assimilatieproeven,
die tot nu toe genomen zijn, zijn ongegrond.

Uit de proeven van Brauner en Bünning mag niet geconcludeerd
worden dat electrische verschijnselen bij de geotropische perceptie
een rol spelen.

Door Cuthbertson en Tompsett is bewezen dat pepsine op split-
singsproducten van eiwit een synthetiseerende werking kan uit-
oefenen.

: •

stikstof bron	A. pisi st. Wehlb.	A. pisi st. Jones	A. pinodella
KNO3	103	63	149
NH^NOs	117	128	162
NH4CI	136	141	204
Ureum	124	98,5	181

stikstofbron	drooggew.
KNOa	52,1
NaNO,	51,0
CafNOg),	92,2

KN03	drooggew.	NH^NOa	drooggew.
0,04 »/o	52,4	0,01 7o	69,5
0,25 %	68,7	0,1 7o	162
1%	96,6	1 V„	201
5%	71,9	5%	123,5

MgSO^	gemidd. drooggew. na 13 dagen.
MgSO^	Ascochyta pisi	Ascochyta pinodella
0%	0 mg	4,5 mg
0,01 %	108,6 mg	129,6 mg
0,2 %	109,3 mg	121,6 mg
1%	81,9 mg	100,3 mg

K,S04	drooggew.
0%	50,2 mg
0.1 Vo	77,8 mg
0,4 %	78,0 mg
i7o	79.8 mg

water	1000 g
saccharose	50 g
KNO3	lOg
MgS04	2Mg
•KH2PO4	5g
FeClo	20 mg

koolstofbron	begin pH	eind pH	drooggew. in m.g.
dextrine	7,0	7,2	96.4
amylum solubile	7,0	7,2	94.0
glucose	7.0	7,2	73.5
saccharose	7,0	7,2	71.0
galactose	7.0	7,0	50.0
lactose	7,0	7,0	31,7
gummi arabicum	7,0	7.0	23,4

	zuurgraad	drooggew.
A. pisi	pH 5,4	0
	7.7	101,4
M. pinodes	5,4	0
	„ 7,7	70,9

Fosfaat	gemidd. drooggewicht		na 11 dagen.
Fosfaat	stam Wehlburg	stam Jones
0%	15,0		15,0
0,2 %	53,5		55,0
2%	98,6		109,4

CaClj	serie drooggew. in m g	2e serie drooggew. in m g
0 7o (contrôle)	92,5	101,3
0,1 Vo	63,4	73,3
0,5 »/„	145,3	94,5
2%	111,2	77,8

Pot-	Kalium
nummer	Kalium	Fosfor	Stikstof	Calcium
1 2	standaard hoev.	stand. hoev.	stand. hoev.	stand. hoev.
•j			geen
j 4			geringe hoev.
T C			overvloedig
J		geen	stand. hoev.
6	M	geringe hoev.
7		overvloedig
8	geen	stand. hoev.
9	geringe hoev.
10	overvloedig
11	_
12				geen
13				geringe hoev.
14				stand. hoev.
14				overvloedig

	NH.NOa	Ca(H,PO,),	K^SO^
1 standaardcultuur	0,75	1.6	1,6
2 stikstof gebrek	—	1,6	1,6
3 „ gering	0,2	1,6	1,6
4 „ overvloedig	6 g. in 3 giften	1,6	1,6
5 fosfor gebrek	0,75	—	1.6
6 „ gering	0,75	0,25	1,6
7 „ overvloedig	0,75	6,3 g. in 3 giften	1,6
8 kalium gebrek	0,75	1,6	_
9 „ gering	0,75	1,6	0.2
10 „ overvloedig	0,75	1,6	4 g. in 3 giften

	NH4NO3	K.,HP04	CaSO^
1 calcium gebrek	0,75	2	0
2 calcium gering	0.75	2	0,4
3 standaardcultuur	0,75	2	2
4 calcium overvloed	0,75	2	10 g. in 3 giften

K-gebrek	0 u O quot;o. quot;ra O ni fi	2 quot;w T) -O B amp;) 05	K-gering	a ü a JO quot;p. S ö (0 w	•O -13 B lt;u 03	stand, cultuur	a ü c quot;Ö. c M (0	2 quot;«3 -O 13 quot;b 03	K-overvl.	a 4-» d KJ quot;o. quot;S e « ca	2 13 13 b ogt;
bladvl. 46	5	9,2	bl.vl. 42	5	8,4	bl.vl. 29	5	5,8	bl.vl. 9	5	1,8
stengelvl. 16	5	3.2	st.vl. H	5	2,8	st.vl. 7	5	1,4	st.vl. 2	5	0,4
b. parasiet: Ascochyta pisi. geïnfecteerd 20 October. proefduur 20 dagen.
K-gebrek	n u 1 a quot;B Ö IQ IQ	2 quot;3 •a -a B u CD	K-gering	n u ö ■Q. 5 a a a	2 quot;3 -O •v a D3	stand, cultuur	a « B JS quot;B. S a (0 rt	2 quot;a! 13 13 a w 03	K-overvl.	a u ö i5 13 s 10	13 quot;3 13 13 E ogt;
bladvl. 43	5	8,6	bl.vl. 33	5	6,6	bl.vl. 26	5	5,2	bl.vl. 8	5	1,6
stengelvl. 10	5	2	st.vl. 9	5	1,8	st.vl. 4	5	0,8	st.vl. 1	5	0,2

.H -O t5 T3 iS i\|	K-gebrek	a tj a JS quot;5. B § (S	2 •T3 quot;iS agt;	K-gering	a u a KJ ■5. 0 ro ra	2 quot;3 T3 -0 E 6J 03	stand cultuur	1 a JH quot;o. quot;M a rt re	T3 -O S amp;) 03	K-overvl.	c (j a ra quot;5. quot;ra c ra ra	2 TÜ •0 •a a 03
1	28	5	5,8	14	7	2	4	5	0,8	4	6	0,6
2	59	5	11,8	60	7	8.6	26	5	5,2	15	6	2,5
3	28	5	5,6	36	7	5,1	15	5	3	11	6	1,8
4	7	5	1,4	11	7	1,3	4	5	0,8	3	6	0,5
5	25	5	5	21	7	3	10	5	2	8	6	1,3

^ ß lt;u .s tj iS is	K-gebrek	a (j a (0 quot;o. e « (0	3 quot;ïJ T3 T3 s u ugt;	K-gering	a ß J2 quot;o. quot;co 1 la	T3 •a •O a CJ 03	K-overvl.	ß « ß JS CU 13 a (0 n	T) ^ T3 E 05
1	31	7	4,4	18	6	3	0	4	0
2	80	7	11,4	68	6	11,3	21	4	5,2
3	23	7	3,3	18	6	3	9	4	2,2
4	11	7	1,6	7	6	1,2	3	4	0.7
5	12	7	1.7	6	6	1	2	4	0.5

(U c quot;0 x! 10 1 S « s	P-gebrek	c: W a « O, c K! KJ	2 quot;ïj T3 •a e u 03	P-gering	c u a KJ O. quot;S e KJ KJ	T3 t3 ö3	stand, cultuur	n u c KJ quot;o. s c ra ra	2 quot;3 -o •o e u	P-overvl.	s § quot;o. S a ra ra	-o 2 ctgt;
1	2	7	0,3	3	7	0,4	8	7	1,1	15	6	2.5
2	42	7	6	43	7	6,3	64	7	9,1	65	6	11
3	23	7	3.3	26	7	3,9	29	7	4,1	29	6	5
4	4	7	0,6	6	7	0,8	8	7	1,1	11	6	2
5	7	7	1	9	7	1.3	14	7	2	26	6	4.3





.'.■■'. ■. i ■ .■

Ca-gebrek	R U Ö quot;B. quot;io C to (0	2 it ■a T3 B tj 03	Ca-gering	c u C CO a c (0 (0	XI quot;3 -o -o Ë u 03	stand, cultuur	c u c (0 ■amp; 2 c (0 to	2 -a T3 a u □3	Ca-overvl.	a U a JO 'o. quot;2 c CO CO	2 11 -n •a a u 03
bladvl. 15	5	3	bl.vl. 13	4	3.2	bl.vl. 27	5	5.4	bl.vl. 39	5	7,8
stengelvl. 5	5	1	st.vl. 5	4	1.2	st.vl. 11	5	2.2	st.vl. 14	5	2,8
b. parasiet: Ascochyta pisi. geïnfecteerd 25 September, proefduur 13 dagen.
Ca-gebrek	c lt;n c « quot;o. a (0 «	2 quot;ïJ E u 03	Ca-gering	s c rt quot;5. 2 a S	■ 2 T3 ■a S lt;D 03	stand, cultuur	a lt;u a (0 quot;o. lo c CO CO	2 quot;3 T3 -a a ii 03 1	Ca-overvl.	a u a JO quot;E 2 c s	2 T) 73 a u 03
bladvl. 10	4	2,5	bl.vl. 13	5	2,6	bl.vl. 25	5	5	bl.vl. 38	5	7,6
stengelvl. 3	4	0.7	st.vl. 4	5	0,8-	st.vl. 7	5	1.4	st.vl. 14	5	2,8
c. parasiet: My geïnfecteerd proefduur 2					'cosphaerella pinodes. 28 October. 7 dagen.
Ca-gebrek	s 0 JO quot;o. quot;(3 a la «	2 quot;ai -a -a G w 03	Ca-gering	c u O JO quot;a 2 e lt;0 «	2 quot;3 13 •a S u 03	stand, cultuur	a ftj c (0 quot;d. 2 c (0 (0	2 quot;3 -a •a a V 03	Ca-overvl.	s a (0 a 2 a (0 (0	2 quot;3 T3 T3 a 1gt; 0»
bladvl. 11	5	2,2	bl.vl. 16	5	3,2	bl.vl. 29	5	5,8	bl.vl. 39	5	7.8
stengelvl. 0	5	0	st.vl. 0	5	0	st.vl. 5	5	1	st.vl. 10	5	2