.IQiji^.

Onderzoekingen over de bereiding en toe-
passing van gezuiverd anatoxine voor a'ctieve
onvat[)aarmal(ing tegen dipiitiierie

J. P. VAN WAASBERGEN

BIBLIOTHEEK DER
RIJKSUNIVERSITEIT
UTRECHT.

I»

i-*f y

. ■

'■v.-

SSM!--:

^ÊMiM

i

, h

v' \ v'

A

■

■ .nbsp;^- .....l;nbsp;A Vim P

l^' - ^nbsp;■nbsp;■ ■■ ■ V- ■■ .

ONDERZOEKINGEN OVER DE BEREIDING EN
TOEPASSING VAN GEZUIVERD ANATOXINE
VOOR ACTIEVE ONVATBAARMAKING TEGEN
DIPHTHERIE

ONDERZOEKINGEN OVER DE DEREIDIN6 EN TOEPASSING
VAN GEZUIVERD ANATOXINE VOOR ACTIEVE ONVAT-
BAARMAKIN6 TEGEN DIPHTHERIE

PROEFSCHRIFT

ter verkrijging van den graad van
DOCTOR IN DE GENEESKUNDE

aan de rijks-universiteit te utrecht
op gezag van den rector magnificus
DR. L. S. ORNSTEIN, hoogleeraar in de facul-
teit der wis- en natuurkunde, volgens
besluit van den senaat der universiteit
tegen de bedenkingen van de faculteit
der geneeskunde te verdedigen op DINSDAG
28 JUNI 1932, des namiddags te 4 uur door

JOHANNES PIETER VAN WAASBERGEN

arts te strijen
GEBOREN TE NIEUWERKERK AAN DEN IJSSEL

V , -

■ J ■ r-ü m n mma

Aan mijn Ouders
Aan mijn aanstaande Vrouw

gt; .

Het verschijnen van dit proefschrift biedt mij de welkome gelegenheid U,
Hoogleeraren, Oud-Hoogleeraren en Docenten der Medische en Philoso-
phische Faculteiten van de Utrechtsche Hoogeschool te danken voor het
onderwijs, dat ik van U mocht genieten.

Gaarne breng ik ook een woord van dank aan de Hoogleeraren
MICHAËL, ENGELHARD en ROCHAT van de Medische Faculteit te
Groningen, die tot mijn medische vorming hebben bijgedragen.

Zeergeleerde REMIJNSE, HEKMAN en KRAMER, U ben ik dank-
baar voor het gedeelte der praktische opleiding, die ik heb mogen ontvangen
in de Rotterdamsche Gemeente-Ziekenhuizen.

Hooggeleerde ALDERSHOFF, Hooggeachte Promotor, mijn warmste
dank ben ik U verschuldigd voor alle moeite en tijd, die gij LI gegeven
hebt, ondanks Uwe drukke bezigheden van velerlei aard, bij de totstand-
koming van dit proefschrift. Uw hartelijke en prettige wijze van omgang,
het voorrecht kennis te hebben mogen nemen van de werkzaamheden in
het Instituut en van Uwe onderzoekingen, hebben den tijd, op Uw Instituut
doorgebracht, tot één der aangenaamste van mijn leven gemaakt.

Zeergeleerde PONDMAN, de vrienschappelijke tegemoetkomende wijze
waarop gij mij verschillende moeilijkheden hebt helpen overwinnen, heeft
mij zeer aan U verplicht.

Zeergeleerde TASMAN, het scheikundig karakter der onderzoekingen
bracht mij met U tot nauwe aanraking en samenwerking. Uw hulp en
raadgevingen heb ik zeer op prijs gesteld en het zal mij aangenaam zijn
U steeds als vriend te mogen blijven beschouwen.

Zeergeleerde BRANDWIJK, Uw inzicht in wetenschappelijk onderzoek,
heeft mij tot steun gediend.

Zeergeleerde JONKHOFF, voor de diensten, welke gij mij bewezen hebt
bij de sectie van proefdieren, ben ik U dank verschuldigd.

Zeergeleerde TIMMERMANS, Uw vriendschappelijke omgang en hulp-
vaardigheid stemmen mij tot dankbaarheid.

Erkentelijk ben ik voor de welwillende medewerking, die ik van het personeel
van het Rijks-Serologisch Instituut mocht ondervinden: in het bijzonder
dank ik hierbij apotheker-assistent VAN DER SLOT en bediende THEO
VAN DE VATHORST voor aan mij bewezen diensten.

-nbsp;43-Vi-: ;,.gt;-.

.V

INHOUD.

Pag.

Inleiding.................... 11

HOOFDSTUK I.

Geschiedkundig overzicht der actieve onvatbaarmaking
tegen diphtherie................ H

HOOFDSTUK II.

Zuivering van anatoxine............. 43

HOOFDSTUK III.
Beschrijving der gevolgde werkwijzen........ 53

HOOFDSTUK IV.
Eigen Onderzoek. Vergelijkende zuiveringsproeven . . 60

HOOFDSTUK V.

Eigen onderzoek. Vergelijkende immunisatieproeven. . 74

HOOFDSTUK VI.
Samenvatting.................. 99

Geraadpleegde literatuur.............104

Stellingen....................119

■

INLEIDING

Reeds in de vroegste tijden werd in Egypte, Syrië en
Palestina de ziekte diphtherie als een zeer gevaarlijke keelziekte
beschouwd. In de Middeleeuwen en later moeten herhaaldelijk
zware epidemieën Europa hebben geteisterd, terwijl ook in
Amerika van 1771 —1772 een uitgebreide en ernstige epidemie
schijnt te hebben gewoed.

De naam diphtherie is door Btetonneau, vermoedelijk in
1855, in de literatuur ingevoerd.

In 1883 deelde Klebs op het congres voor inwendige ge-
neeskunde te Wiesbaden mede, dat hij aan de peripherie
van de diphtherie-membranen, die met methyleenblauw waren
gekleurd, staafjes had gevonden. Deze staafjes geleken op
den tuberculbacil, met dit verschil echter, dat zich sporen aan
de uiteinden bevonden. Het was aan Klebs niet gelukt deze
staafjes in reincultuur te kweeken. Aan Loefßec kwam in
1884 de eer toe de diphtherie-bacil te hebben geïsoleerd.

Loeffler beschouwde het in 1883 reeds door Klebs waar-
genomen en beschreven organisme als de oorzaak der diphtherie.

Vervolgens beschreef Loeffler een aantal experimenten met
dieren, welke waren ingespoten met een reincultuur van
diphtheriebacillen.

Bij de sectie van deze dieren bleken de inwendige organen
steeds vrij te zijn van bacillen, waarom Loeffler als oorzaak
van den dood aannam een van de enting plaats uitgaande
werking der microben. Hij veronderstelde verder, dat op de
plaats van enting giftige stoffen werden gevormd, welke
giffen in den bloedstroom zouden worden opgenomen.

In 1887 deelde Loeffler mede, dat er naast de typische

virulente diphtheriebacil een niet virulente bacil in de keel-
holte voorkwam. Deze laatste vertoonde morphologisch veel
overeenkomst met de diphtheriebacil, hoewel verschillen in
groei en kolonies waren waar te nemen. Loeffler was toen
reeds van meening, dat het dierexperiment noodzakelijk was
om uit te maken of men al dan niet met een virulente stam
had te doen. Dit niet virulente micro-organisme verkreeg den
naam van pseudo-diphtheriebacil. In het zelfde jaar berichtte
Loeffler tevens nog het belangrijke feit, dat twee caviae, die
na enting met diphtheriebacillen waren genezen, in staat bleken
meerdere inspuitingen met diphtheriebacillen te doorstaan.

Dit is een zeer belangrijke ontdekking geweest, omdat
hierop onze tegenwoordige serumtherapie berust.

Behring en Kitasato hebben in 1890 het diphtherie-anti-
toxine gevonden.

Zij merkten op, dat de lichaamsvochten van dieren, welke
waren ingespoten met microbenproducten, verkregen uit cul-
turen van de bacil van Klebs-Loeffler, specifieke antidiphtherische
eigenschappen gingen vertoonen.

De oorspronkelijke gedachte van Behring was toen, dat
een prophylactisch middel tegen diphtherie zou zijn gevonden.
Eerst later bleek dat de hoofdwaarde van het antidiphtherie-
serum op therapeutisch gebied was gelegen.

Na deze onderzoekingen van Behring hebben de werken
van Roux en Yersin, mededeelingen van Martin en Chaiüou
op het congres te Boedapest in 1894 nog meer licht over
de antidiphtherische serumtherapie laten schijnen.

Hier te lande hebben in de jaren 1894—1895 Ringeling,
spoedig gevolgd door Spronck en Schimmel, antidiphtheritisch
paardeserum bereid.

Vanaf dien tijd is de mortaliteit van diphtherie progres-
sief gaan dalen; de invloed op de morbiditeit was natuurlijk
veel minder uitgesproken, daar dit alleen kan geschieden
door middel van actieve onvatbaarmaking.

Reeds voordien in 1887 was het diphtherietoxine ontdekt
door de bekende onderzoekers Roux en Yersin.

Deze zelfde schrijvers hebben ook toen al proeven ver-
richt over de zuivering van het diphtherietoxine, waarvan
de principes zijn aangegeven in hun klassieke werken
(1888-1890).

In die jaren na de ontdekking van het diphtherietoxine
werd veel gewerkt over de zuivering van dit toxine, maar
hoofdzakelijk nog slechts met het theoretisch doel de natuur
van het diphtherietoxine te leeren kennen.

Daarna kwam een periode van inzinking, omdat de proeven
tot geen enkel belangrijk resultaat voerden.

De laatste jaren echter heeft men de studie over de toxine-
zuivering, in het bijzonder van het diphtherietoxine, weer
ter hand genomen, vooral sedert de invoering van het ana-
toxine door Ramon ia de diphtherieprophylaxis.

Hier te lande heeft men, evenals in Engeland en Denemar-
ken, tegen de plaatselijke reactie van het anatoxine, hoewel
onschuldig, eenig bezwaar.

Daarom heeft dit tot nu toe, met uitzondering van Frankrijk,
nog weinig algemeene toepassing gevonden.

Men zoekt nu naar een entstof, die de goede onvatbaar-
makende werking bezit van het anatoxine, maar een minder
sterke plaatselijke reactie veroorzaakt.

De wijze waarop, hier en elders, wordt getracht een hier-
aan beantwoordende bevredigende entstof te vinden, zal in
dit proefschrift nader worden uiteengezet.

HOOFDSTUK I

GESCHIEDKUNDIG OVERZICHT DER
ACTIEVE ONVATBAARMAKING
TEGEN DIPHTHERIE

§ 1, Actieve onvatbaarmaking met diphtheriebacillen

Nadat Loeffler in 1887 reeds een paar waarnemingen hier-
omtrent had gedaan, deed Behring in 1890 mededeeling over
proeven bij caviae, waarbij het hem zou zijn gelukt door
voorbehandeling dezer caviae met diphtheriebacillen, waarvan
de virulentie was verzwakt, hen tegen diphtherie te beschermen.

Om de virulentie dezer diphtheriebacillen te verzwakken,
maakte hij gebruik van chemicaliën, voornamelijk joodtrichloride.

Vele jaren later in 1912 berichtten Hewlett en Nankivell
weer, dat zij er in waren geslaagd caviae, door voorbehandeling
met diphtheriebacillen, tegen de 3-4 voudige doodelijke dosis,
d.l.m., te immuniseeren,

Petruschky in 1912 en Johnson in 1915 raadden aan kin-
deren te immuniseeren tegen diphtherie door inspuiting van met
chloroform gedoode diphtheriebacillen.

Volgens de mededeelingen van Park en Zingher in 1916
zagen deze onderzoekers echter bij toepassing van diphtherie-
bacillenvaccins geen resultaten.

Löwenstein maakte gebruik van de percutane weg om te
immuniseeren tegen diphtherie.

Hij nam voor dit doel culturen van diphtheriebacillen,
niet gefiltreerd, gedood door formol en geëmulgeerd in een
half doorschijnende visceuse vloeistof.

Zoowel bij proefdieren als bij den mensch zou hij met

behulp van deze methode goede resultaten hebben verkregen.

Baar en Grabenhofer berichtten eveneens over goede re-
sultaten met de zalf van Löwenstein door herhaalde inwrijvingen
der huid, 8 maal met een tusschenruimte van 8-14 dagen.

Becker daarentegen, evenals Schmidt, verkreeg met de
methode volgens Löwenstein in het geheel geen resultaten.

In 1930 berichtten Jakopp en Streit (76)¹) nog weer over
proeven, verricht met de zalf van Löwenstein, en waarmede
zij vrij gunstige resultaten zouden hebben bereikt.

De meeste schrijvers zijn het er echter over eens, dat de
waarde van de methode Löwenstein gering is.

Böhme en Riebold (80) hebben in 1924 aanbevolen als
middel ter immunisatie tegen diphtherie huidenting met een
emulsie van levende diphtheriebacillen als een eenvoudige,
ongevaarlijke en werkzame methode.

Deze, „diphtherielymphequot; werd toegepast op dezelfde wijze
als de koepokstof en als de entstof tegen tuberculose van
Ponndorf, waarvan ook Böhme de bereider is.

Op grond van proeven bij caviae hebben zij 62 kinderen
volgens deze methode behandeld.

In de huid der bovenarm werden ongeveer 20 dicht aan-
eengrenzende entstrepen aangelegd, waarna de lymphe hierop
werd gebracht en overgelaten aan opdrooging.

Zij verkregen hiermede goede resultaten en vonden, dat
van het gebruik van levende, toxineafscheidende diphtherie-
bacillen, geen nadeelige gevolgen zijn te vreezen.

Toch bezit deze methode zooveel nadeelen en gevaren,
dat praktische toepassing geen aanbeveling verdient.

Den laatsten tijd hebben Legroux, Ramon, Debré en Thi-
roloix (54) weer bericht over immunisatieproeven bij paarden,
waarbij zij levende diphtheriebacillen als antigeen gebruikten,
welke subcutaan werden ingespoten. Na de inspuiting zouden
ze in het subcutane weefsel gaan groeien en toxinen pro-
duceeren, welke toxinen in het dierlijk organisme worden

1nbsp; De tusschen haakjes geplaatste nummers verwijzen naar de geraadpleegde
literatuurlijst.

opgenomen en tot vorming van specifieke antitoxinen zouden
aanleiding geven.

§ 2. Actieve onvatbaarmaking met diphtherietoxincn

De eerste pogingen om menschen te immuniseeren door
middel van veelvuldige onderhuidsche inspuitingen met lang-
zamerhand stijgende doses diphtherietoxine zijn verricht door
Dserzgowsky (96).

Reeds in 1902 deelde deze schrijver zijn eerste proeven
hieromtrent mede, welke proeven waren verricht bij caviae.

De duur der immunisatieperiode bedroeg ruim 3 maanden
en gedurende deze tijd verrichtte hij 24 inspuitingen. Bij zich
zelf uitgevoerde experimenten hebben hem toen getoond,
dat het inbrengen van diphtherietoxine in het menschelijk
organisme, met in acht nemen van bepaalde voorzorgen,
volkomen onschadelijk en ongevaarlijk is.

Zijn hoop, dat de praktizeeerende artsen deze methode in
toepassing zouden brengen, werd echter niet verwezenlijkt.

Dserzgowsky ging daarom toen over tot andere methoden,
die minder gevaarlijk waren en minder tijd vergden, namen-
lijk intratracheale infusies en -inhalaties, alsmede langs den
weg der gifresorbtie door het slijmvlies der neus- en mondholte.

Hierbij ging deze onderzoeker uit van het denkbeeld, dat
de natuurlijke immuniteit tegen diphtherie bij een bacillen-
drager of een infectie met diphtheriebacillen zich ontwikkelt
door binnendringen der toxinen in het organisme langs de
slijmvliezen van den tractus respiratorius.

Proeven bij paarden hadden gediend als basis om een
zelfde methode uit te werken voor den mensch.

Deze proeven hadden als resultaat opgeleverd, dat immu-
niseering vanuit het slijmvhes der neus door inbrengen van
met toxine gedrenkte wattentampons in de neusgaten, alle
twee dagen gedurende ongeveer een half uur, evenals vanuit
het slijmvlies van de larynx door inhaleeren van een verstoven
toxineoplossing, werkzaam en onschadelijk is. Deze behandeling
werd gedurende vrij langen tijd herhaald.

Op het geneeskundig congres te St.-Petersburg in 1909
heeft Dserzgowsky deze immunisatieproeven bij kinderen
vertoond.

Als voordeel van deze methode werd door Dserzgowsky
genoemd eenvoudigheid, omdat ze ook uitvoerbaar is door
niet-artsen en daardoor voor immuniseering der massa ge-
makkelijk aan te wenden. Bovendien kon ze langen tijd
achtereen worden uitgevoerd zonder reactie van het organisme
en zou een duurzame immuniteit worden verkregen.

Eindelijk zou met deze methode ook nog worden tevoor-
schijn geroepen een locale immuniteit van de tractus respi-
ratorius tegen diphtherie.

In de latere jaren zijn door verschillende onderzoekers
{Blumenau, Magyar en Schick, Boldireff, Moody, Courie,
Bauer, Opitz, Scholz) proeven genomen met de oorspronkelijke
methode van Dserzgowsky, echter met zeer wisselende re-
sultaten.

Door geen van hen is evenwel deze methode in de praktijk
doorgevoerd, omdat een groot aantal inspuitingen noodig zijn,
en bovendien locale reacties en ziektegevallen bij gevoelige
personen kunnen voorkomen.

Voordat Dserzgowsky zijn proeven verrichtte om menschen
onvatbaar te maken met behulp van de beschreven subcutane
methode, was aan Behring bij proeven op paarden reeds
gebleken, dat de onvatbaarheid dezer dieren goed tot stand
was te brengen door subcutaan inspuiten van diphtherie-
toxine.

Om de moeilijkheden der soms doodelijke toxinewerking
te voorkomen, gebruikte Behring eerst joodtrichloride ter
vermindering van de giftigheid.

Ook dit liet hij tenslotte weg en immuniseerde zijn paarden
met behulp van diphtherietoxine, verdund door middel van
physiologische keukenzoutoplossing.

De pogingen van Besredka (66) om langs percutanen weg
bij caviae immuniteit te verkrijgen door het brengen van

diphtherietoxine op de geschoren of gescarificeerde huid,
zijn bijna geheel mislukt.

Denis Szüle hervatte later deze experimenten van Besredka,
maar met vervanging van het vloeibare toxine door toxine,
ingesloten in een mengsel van lanoline en vaseline. Hij was
evenwel met deze proeven niet gelukkiger dan Besredka.

Dezelfde proeven werden ook verricht op het konijn, welke
gevoeliger dan de cavia bleek te zijn voor toxine, dat op
de huid werd gebracht, en waarbij een zekere immuniteit
werd verkregen.

Uit proeven van Brandwijk (15) bij caviae bleek, dat to-
xine, toegediend per os, geen onvatbaarmakende werking heeft.

Volgens de ervaring van het R.S.I., is subcutane inspuiting
van een langzamerhand stijgende dosis diphtherietoxine bij
paarden, op het oogenblik nog de beste methode voor het
verkrijgen van antitoxisch serum.

De proef van Schick, hoewel uitsluitend gebruikt voor
diagnostische doeleinden, oefent eigenlijk ook nog een soort
actieve onvatbaarmaking uit. Deze proef is in 1912 door
Schick ingevoerd en beschreven.

Meerdere malen uitvoeren der proef van Schick is in staat
een vorming van antilichamen te voorschijn te roepen en de
positieve reactie te laten overgaan in een negatieve (Nasso,
Aldershoff). Vandaar is eigenlijk de intracutane reactie met
diphtherietoxine geen geschikte maatstaf voor de waardeering
van een immuniseeringsmethode.

Bieber heeft zich nog eens bezig gehouden met het ver-
krijgen van onvatbaarheid bij menschen door intracutane in-
spuitingen van sterk verdund toxine. Hiertoe waren echter veel
inspuitingen noodig, hetgeen een groot bezwaar vormde en
waarom hij hiervan reeds spoedig weer is teruggekomen.

Bij de reactie van Schick wordt gebruik gemaakt van een
goed gestabiliseerd, met physiologische keukenzoutoplossing
verdund, 0,5 % carbol bevattend diphtherie-vergif, ter sterkte
van Vso d-l.ni' per 0,2 c.c.

Indien de intracutane inspuiting van 0,2 c.c. van deze
gifverdunning geen reactie verwekt, is in het bloed een vol-
doende hoeveelheid diphtherie-antitoxine aanwezig, om het
Individu tegen diphtherie te beschutten.

Met deze inspuiting kan men evenwel niet steeds volstaan,
omdat het diphtherie-vergif, behalve diphtherietoxine, dat niet
in zuiveren toestand te verkrijgen is, nog andere onbekende
bacillaire producten bevat, die bij sommige menschen, voor-
namelijk bij volwassenen, een lichte ontsteking op de plaats
der intracutane inspuiting veroorzaken.

Om deze z.g. pseudoreactie gemakkelijk te onderkennen
van de echte positieve reactie spuit men, in de huid van den
linker onderarm 0,2 c.c. diphtherie-vergif, gedurende 10 minuten
op 75° C. verhit, waarin dus de toxine onwerkzaam is ge-
maakt; in de huid van den rechteronderarm 0,2 c.c. van
hetzelfde vergif, onverwarmd.

De inspuiting vindt plaats aan het bovenste Vs gedeelte
van de buigzijde van den onderarm, tusschen de venen.

Terwijl de oorspronkelijke raad van Schick luidde, de reactie
aftelezen na 2 maal 24 uur, moet dit volgens Aldershoff{\)
zijn „niet eerder dan 3 maal 24 uurquot;, omdat de pseudo-
reactie dan reeds weer aan het verbleeken is en de proef
dus beter te beoordeelen.

Bij het aflezen kunnen wij het volgende onderscheiden:

I. Negatieve reactie: het individu is onvatbaar voor diph-
therie, beschikt althans over voldoende vrij antitoxine om
het toxine bij de reactie ingebracht, te verhinderen zijn wer-
king te ontvouwen.

Van de negatieve reactie onderkent men twee typen:

Type A: aan geen van beide armen treedt ontsteking op.
Het individu is dus bovendien ongevoelig voor aspecifieke
eiwitten.

Type B: „pseudoreactiequot;: kort na de inspuiting treedt aan
beide armen lichte ontsteking van gelijke grootte op, die
binnen 2—3 dagen verdwijnt en te beschouwen is als gevolg

van individueele gevoeligheid voor onbekende stoffen, die
zoowel in het verwarmde, als in het niet-verwarmde diphtherie-
vergif voorkomen.

II. Positieve reactie: het individu is vatbaar voor diphtherie.
beschikt dus niet over voldoende vrij antitoxine om de werking
van het ingebrachte toxine te verhinderen.

Ook van de positieve reactie onderkent men twee typen.

Type A: alleen aan den rechter arm treedt ontsteking op,
gekenmerkt door roodheid en zwelling. In dit geval is elke
ontsteking, al is zij ook gering, als positieve reactie op te vatten.

Type B: „gecombineerde reactiequot;: aan beide armen volgt
ontsteking. Aan den linker arm treedt een lichte ontsteking
op, die binnen 2—3 dagen verdwijnt en veroorzaakt wordt
door de aspecifieke eiwitten van het verhitte toxine. Aan den
rechter arm ontstaat tezelfder tijd een ontsteking grooter dan
die aan den linker arm en toenemende, want ze is de som
der ware toxine- en der aspecifieke reactie, die 5—8 uren
na de inspuiting een aanvang neemt en gewoonlijk haar maxi-
mum bereikt na drie dagen. De ware toxinereactie treedt dus
later op dan de pseudoreactie en blijft langer bestaan. Leest
men de reactie niet eerder dan op den derden dag af, dan
kan men de reactie met verhit toxine achterwege laten. De
aspecifieke pseudoreactie toch is op den derden dag reeds
grootendeels verdwenen, de ware reactie pas op haar maximum.

Algemeen wordt aangenomen dat onvatbaarheid voor
diphtherie daarop berust, dat een voldoende hoeveelheid
antitoxinen in het bloed aanwezig is, of tenminste tijdig door
de lichaamscellen kan worden gevormd. Want enkele per-
sonen met een positieve reactie van Schick kunnen een latente,
cellulaire, histogene onvatbaarheid bezitten; zij vormen bij
infectie snel antitoxinen en hun reactie kan daarop vlug
negatief worden. (Aldershoff, Ten Bokkel Huininck.)

Aan den anderen kant zijn de gevallen toch ook niet zoo
zeldzaam, dat personen met een negatieve reactie van Schick
nog worden aangetast door diphtherie.

Het anti toxine alleen zou niet voldoende beschermen, wan-
neer de overige beschermende krachten ontoereikend zijn.

Hoewel over de beteekenis van het antitoxine zelf geen
twijfel behoeft te bestaan, zou men moeten aannemen, dat
de vorming van antitoxinen slechts is een factor van het
totale weerstandsvermogen tegen diphtherie.

Na inspuiten van een entstof of het uitvoeren der reactie
van Schick kan ook een negatieve phase optreden, gepaard
gaande met een vermindering van de hoeveelheid antitoxine
in het bloed en van het totale weerstandsvermogen tegen
diphtherie, waarom sommige schrijvers, o.a. Siegl (75), actieve
onvatbaarmaking, in tijden dat veel diphtheriegevallen voor-
komen, afraden.

Volgens het bovenstaande kan men dus geen absolute
waarde toekennen aan de reactie van Schick voor de al of
niet aanwezigheid van onvatbaarheid.

De reactie zou negatief uitvallen, naar de opgave van
Schick zelf, wanneer het bloedserum een hoeveelheid antito-
xinen van Vso A.E. of meer bevat. Andere schrijvers weer
(Kolmer en Moshage, Ten Bokkel Huininck. Kassowitz, Wer-
nicke en Schmidt) geven waarden op beneden of boven
deze door Schick aangegeven grens.

Volgens Alderhoff (1) is de proef van Schick niet meer dan
een reactie op de al of niet aanwezigheid van vrij antitoxine;
Kramer (18) drukt zich aldus uit: „ze laat toe een schatting
van het antitoxinegehalte van het bloedquot;.

Glenny en de staatscommissie in Engeland (154) stellen
aan de test-dosis voor de Schick-proef, welke moet beant-
woorden aan Vso d.l.m., bovendien de eisch, dat zijn neutra-
liseerend vermogen moet liggen tusschen Vizbo ^^ Vvbo A.E.

Hiermede is in vroeger jaren niet voldoende rekening ge-
houden, waardoor de statistische opgaven over het resultaat
der methoden tot actieve immunisatie, nagegaan met behulp
der reactie van Schick, veel van hun waarde verliezen.

Hierdoor wordt ook begrijpelijk, dat de verschillende onder-
zoekers niet dezelfde waarde aan antitoxine in het bloed

hebben gevonden, waarbij de proef van Schick negatief
uitvalt.

§ 3. Actieve onvatbaarmaking met diphtherie toxine^
antitoxine mengsels.

Reeds vanaf 1895 werd gebruikt een mengsel van toxinen
en antitoxinen voor actieve onvatbaarmaking tegen diphtherie,
in wisselende onderlinge verhouding, aanvankelijk slechts bij
paarden en caviae.

Babes (1895), Wemicke (1895), Park (1896), Dreyer en
Madsen (1896), hebben dergelijke mengsels gebruikt.

Theobald Smith heeft echter als eerste in 1907, op grond
van zijn succesvolle proeven bij caviae, deze methode ook
aanbevolen voor toepassing bij den mensch.

De eerste entingen bij den mensch met T.A.-mengsels
werden evenwel, na voorproeven gedurende vele jaren bij
dieren, uitgevoerd door Behring en zijn medewerker Hahn (97).

Op het congres voor inwendige geneeskunde te Wiesbaden in
1913 werden hieromtrent door Behring mededeelingen gedaan.

Vooraf ging een voordracht van Hahn, waarin deze aan-
toonde, dat antidiphtherie-serum prophylactisch slechts weinig
nut heeft, wegens de te korte duur der bescherming, als ge-
volg van het feit, dat soortvreemd serum vlug aan Proteolyse
wordt onderworpen.

In aansluiting aan deze voordracht berichtte toen Behring
over een nieuw prophylactisch middel om te gebruiken voor
actieve onvatbaarmaking tegen diphtherie, bestaande uit een
mengsel van toxine en antitoxine.

Het middel was volgens hem volmaakt onschadelijk en er
trad een werkelijke bescherming op, aantoonbaar door de
vorming van een groote hoeveelheid beschermende stoffen
in het bloed der geënten, die alle vrij van diphtherie bleven.

Bij de discussie werd door Matthes eveneens medegedeeld
een geval, waarbij actieve onvatbaarmaking was verricht met
dit nieuwe middel. Een eenigermate levendige reactie hierbij
was echter toen door hem waargenomen.

Behring zegt omtrent zijn nieuw middel alleen het volgende:
»Mein neues Mittel ist eine Mischung von sehr starkem Diph-
theriegift mit Antitoxinen in solchem Verhältnis, das die Misch-
lösung im Meerschweinversuch nur einen geringen oder gar
keinen Toxinüberschuss aufweist.quot;

Hij laat zich dus over de juiste samenstelling van zijn
mengsel niet uit.

Bij het door Atdershoff (1) ingestelde onderzoek naar de
samenstelling van het T.A.-mengsel Behring, afkomstig van
de Behring Werke, bleek dit niet altijd dezelfde te zijn en
de giftigheid vertoonde niet onbelangrijke verschillen.

De door Behring aangegeven methode hield in, dat de
entingen, 3—5 in aantal, intracutaan moesten worden uit-
gevoerd.

Behring heeft deze enting bij den mensch intracutaan toe-
gepast, onder invloed van de toen sterk verbreide meening,
dat de huid een goede vormer van immuunstoffen zou zijn,
een meening, welke in haar algemeenheid echter volstrekt
niet is bewezen.

De ervaringen, opgedaan met de methode Behring, zijn
over het algemeen niet groot, in verhouding misschien nog
het grootst hier te lande (Aldershoff, Ten Bokkel Huininck,
Kramer, Hulshoff Poll).

In ons land zijn door genoemde onderzoekers een groot
aantal kinderen volgens de methode Behring geënt en de
uitkomsten lieten een bevredigend oordeel toe.

Bieber heeft ook nog intracutane entingen verricht met een
T.A. mengsel, waarin meer antitoxine aanwezig was dan in
het mengsel van Behring. Ook hij gaf echter weer niet de
juiste samenstelling op van zijn mengsel.

In verband met de resultaten van zijn inspuitingen meende
Behring te kunnen zeggen, dat bij geregelde toepassing van
zijn T.A.-mengsel, de diphtherie als endemische ziekte tot
verdwijnen zou zijn te brengen en zou ophouden een ge-
vreesde volksziekte te zijn.

De intracutane methode bezat het voordeel dat het verloop

der reactie met het oog kon worden vervolgd. Niettegenstaande
dit voordeel bleken aan deze methode toch eenige belangrijke
nadeelen te kleven:

1.nbsp;De intracutane enting is vooral bij massa-entingen tech-
nisch niet eenvoudig en nogal pijnlijk.

2.nbsp;De herhaalde entingen, telkens gevolgd door de proef
van Schick om hun onvatbaarmakend vermogen na te gaan,
vergden veel van de kinderen en hun ouders, zoowel als
van den arts.

3.nbsp;De juiste samenstelling van het T.A.-mengsel van Behring
was niet bekend.

Bovenstaande bezwaren hebben er toe geleid, dat de in-
tracutane methode van Behring werd vervangen door de
subcutane, een methode, die is aangegeven door Park en Zingher.

Deze onderzoekers begonnen ongeveer tegelijkertijd hun
studies over T.A.-mengsels als Behring, en de groote be-
langstelling, die tegenwoordig de actieve onvatbaarmaking
tegen diphtherie over de geheele wereld geniet, is voor een
niet gering gedeelte aan genoemde Amerikaansche schrijvers
te danken.

Voor hun methode zijn drie subcutane inspuitingen van
1 c.c. noodig, telkens met tusschenruimte van een week.

De samenstelling van het mengsel van Park en Zingher
is nauwkeurig bekend en dit mengsel is op groote schaal
toegepast.

Zooals bekend is, worden bij de toxine-antitoxine-mengsels

3 soorten onderscheiden:
«

1.nbsp;Onderneutrale mengsels, d.w.z. waarin het aanwezige
toxine slechts gedeeltelijk door het antitoxine is geneutrali-
seerd en dat dus een overschot aan toxine bevat.

De onderzoekingen hebben bevestigd, dat de licht toxische
mengsels de beste uitkomsten geven. Onder deze rubriek be-
hoort thuis het mengsel van Park en Zinger, evenals het
reeds genoemde van Behring, en T.A.U.

2.nbsp;Neutrale mengsels, d.w.z. waarin het aanwezige toxine

geheel is geneutraliseerd door het antitoxine. Door bepaalde
voorzorgen wordt dit mengsel zoo bereid dat het niet vlokt.
Een dergelijk mengsel werd door Bieber voor de intracutane
enting gebruikt.

3. Overneutrale mengsels, d.w.z. waarin na neutralisatie
van het aanwezige toxine nog vrij antitoxine over is. Voor
de bescheiden proeven,. welke in Frankrijk door Renault
en Lévy omtrent de subcutane methode van Park en Zingher
zijn verricht, werden zulke overneutrale mengsels gebruikt.

Bij de bereiding van T.A.-mengsels moet van ieder te ge-
bruiken toxine vooraf nauwkeurig het antitoxinebindend ver-
mogen worden bepaald ; men moet dus niet uitgaan van een
schema, ontleend aan de theoretische verhoudingen tusschen
Lf, d.l.m. en A.E.

De oorspronkelijke samenstelling van het T.A.-mengsel
van Park en Zingher was 0,85 L^ 1 A.E. d.w.z. dat een
hoeveelheid antitoxine, die in staat is 100 d.l.m. te binden,
gemengd wordt met het ®Vioo deel van de L^ d.i. de hoe-
veelheid toxine, die gemengd met 1 A.E. nog juist in staat
is een cavia van 250 gr. in 4 dagen te dooden, dus nog
1 d.l.m. vrij toxine bevat. Controle door proeven op dieren
blijft steeds noodzakelijk, waarbij door Banzhaf, die de mengsels
van Park en Zingher standaardiseert, voor dit oude mengsel
0,85 L-j- 4quot; 1 A.E. wordt aangegeven dat 1 c.c. bij een cavia
van 350 gr. slechts een gering infiltraat mag geven en geen
verlamming, terwijl 5 c.c. een duidelijke locale reactie gevolgd
door verlamming, dus geen acute dood, mag veroorzaken.
Dit mengsel bevat dus een groote hoeveelheid toxine, dat
echter voor een groot deel is geneutraliseerd.

Later kwam men tot de overtuiging dat dezelfde uitwerking
was te bereiken door een kleinere hoeveelheid toxine in te
spuiten, die voor een kleiner gedeelte door antitoxine is ge-
neutraliseerd.

Tevens had men hierbij het voordeel, dat een dergelijk
mengsel minder proteinen, afkomstig van bacterielichamen

en den voedingsbodem, en minder eiwit, afkomstig van het
voor neutraliseering toegevoegde serum bevatte. En dit laatste
was zeker als een voordeel te beschouwen, daar toch her-
haalde inspuiting, ook van zeer kleine hoeveelheden vreemd
eiwit, het gevaar voor overgevoeligheid doet ontstaan.

Volgens deze inzichten hebben Park en Zingher hun nieuw
T.A.-mengsel bereid.

Dit bevat per c.c. 0,1 L^ 0,075 A.E., dus per c.c. heel
wat minder toxine, maar absoluut en in verhouding ook
minder antitoxine. Ook dit mengsel wordt gecontróleerd door
dierproeven: 1 c.c. moet steeds verlamming geven, die meestal
na 18 dagen doodelijk afloopt, terwijl 5 c.c. in 10 dagen,
maar niet eerder, den dood veroorzaakt. Dit mengsel is wat
meer toxisch dan het vroeger gebruikte, maar de reactie bij
den mensch is geringer doordat het minder proteinen bevat.

De onvatbaarmakende werking bleek even goed te zijn
als van het vroeger gebruikte mengsel. Na de mededeelingen
van Park en Zingher werd dit laatste mengsel volgens het
beginsel dezer schrijvers door Aldershoff bereid en door het
R.S.I. als T.A.U. (Utrecht) afgeleverd. De samenstelling van
T.A.U. wisselt van 0,1 0,075 A.E. tot 0.1 Lf 0.125
A.E., welk laatste mengsel dan nog licht toxisch is.

Teneinde te voorkomen dat met T.A. behandelde kinderen
tegen paardeeiwit worden gesensibiliseerd en latere inspuiting
met serum afkomstig van paarden anaphylaxie zou kunnen
geven, is in het R.S.I. reeds van den aanvang af T.A.U.
bereid met diphtherieserum afkomstig van schapen. Ook elders
is men daar later toe overgegaan.

Dat dit noodig is, blijkt o.a. uit doodelijke gevallen van
anaphylactische shock na inspuiting van paardeserum bij
kinderen die in Amerika vroeger waren behandeld met T.A.
van paardeserum bereid {Waldbott, The Journ. of the Amer.
Med. Association. Vol. 98, No. 6, 1932).

Het is noodzakelijk de bereide T.A.-mengsels eerst ouder
te laten worden om zoodoende de binding vaster te maken.

Bovendien moet men voor de bereiding dezer mengsels

oude belegen, gestabiliseerde toxinen gebruiken, waarop Behring
reeds de aandacht heeft gevestigd.

Tevens is noodig dat het gebruikte serum een hooge avi-
diteit bezit, dus krachtig toxine bindt.

Het product wordt gecontroleerd op een groot aantal
dieren, daarna eenige maanden bewaard en vóór de uitgifte
weer onderzocht.

In de hteratuur wordt wel beweerd, dat lage temperatuur
in staat zou zijn omzettingen in de mengsels te weeg te brengen.

De strenge winter van 1929 was voor Aldershoff (7) een
geschikte gelegenheid om de invloed van lage temperatuur
op toxine-antitoxinemengsels na te gaan. Uit zijn onderzoek
heeft hij de conclusie kunnen trekken dat het gevaarlijk
giftig worden van een phenolbevattend T.A.-mengsel slechts
bestaat bij mengsels van het type 0,85 L-j- 1 L-j-.

Het T.A.U., dat van het type 0,1 L-|- is, verdraagt be-
vriezing zonder gevaarlijk giftig te worden.

De invloed der lage temperatuur bleek afhankelijk te zijn
van verschillende factoren, in het bijzonder van de samen-
stelling van het T.A.-mengsel, de duur der bevriezing en van
het toegevoegde conserveermiddel. Wanneer aan T.A.-meng-
sels, in plaats van Vs % phenol, 1 7oo superol wordt toege-
voegd, dan vlokken ze niet uit door bevriezing en worden
ook niet giftiger; de ontledende werking van phenol wordt
hiermede dus voorkomen.

Met kleinere giften dan 1 c.c. zouden misschien even goede
resultaten zijn te verkrijgen; het onderzoek van Aldershoff (1)
wees in de richting van een bevestigend antwoord.

Loewenthal sprak zich positief uit door te zeggen dat kleine
giften hetzelfde doen als groote. Hij beval daarom voor sub-
cutane inspuiting hoeveelheden van 0,1 tot 0,2 c.c. aan.

Zeker is dat elke actieve onvatbaarmaking met toxine-
antitoxinemengsels berust op de langzame splitsing der T.A.-
binding in het lichaam, dus op het vrij komen van toxine,
zoodat de geënte persoon wordt onderworpen aan een lang-
durig aanhoudende prikkel. Ook het feit, dat het maximum

aan immuniteit eerst meerdere maanden na de inspuiting op-
treedt, laat zich niet verklaren door de geringe hoeveelheid
vrij gif, waarvan de immuniseerende werking na 2 weken
voorbij is, maar slechts door het langzame splitsen der T.A.-
binding.

De ervaring heeft geleerd dat de tijdsduur, waarna het
maximum aan immuniteit optreedt, des te grooter is naarmate
de T.A. binding vaster is, en dat de hoogte van de tenslotte
te bereiken antitoxinetiter afhangt van de hoeveelheid gif-
eenheden, welke in gebonden vorm worden toegediend, een
soort depötwerking. Daarnaast speelt de omstandigheid of
het T.A.-mengsel neutraal, overneutraal of onderneutraal is,
slechts een rol in verband met de snelheid in optreden van
vrij antitoxine. Is het mengsel ondergeneutraliseerd, dan oefent
het weinige vrije gif een bepaalde ictus immunisatorius uit
en versnelt daarmede het intreden der onvatbaarheid. Bij
gebruik van een overneutraal mengsel speelt het proces der
actieve onvatbaarmaking zich langzamer af.

Glenny heeft door middel van dierproeven met zekerheid
aangetoond, dat een tweede of volgende inspuiting van een
kleine hoeveelheid van een T.A.-mengsel een veel krachtiger
en sneller vorming van antitoxinen tengevolge heeft dan de
eerste inspuiting. Hij sprak van „primary and secundary
stimulusquot;. Bij den mensch is dit aangetoond door Ten Bok-
kel Huininck en Aldershoff.

Zoowel met het mengsel van Behring als dat van Park
en Zingher verloopen minstens twee maanden alvorens de
onvatbaarheid na de enting ontstaat. Volgens Aldershoff^ zou
de onvatbaarheid na behandeling met T.A.U. als regel eerst
ontstaan 6—12 weken na de laatste enting.

Vandaar kon de actieve onvatbaarmaking tegen diphtherie
geen toepassing vinden bij onmiddellijk dreigend besmettings-
gevaar. De verkregen onvatbaarheid met T.A.-mengsels zou
volgens Park en Zingher in minstens 90 % der gevallen een
minimumduur van 7 jaar bezitten. Na de 3 inspuitingen met
het T.A.-mengsel zou in 80 a 85 % d^r gevallen de positieve

reactie van Schick veranderen in een negatieve; Park en
Zingher geven als maximum op 92 % nuttig efFekt. Met het
T.A.U. van het R.S.I. bereikte Seligmann (74) een negatief
worden der reactie van Schick bij 95 % der geënte kinderen.

Deze gegevens verliezen nu echter veel van hun vroegere
waarde na de studie van Glenny over de waardeering der
reactie van Schick.

De meeste entstatistieken toch berusten nog op de resultaten
verkregen door middel van de reactie van Schick. Bovendien
moet men hierbij nog rekening houden met het feit, dat ook
zonder enting ongeveer 70% kinderen op den leeftijd
van 10 jaar Schick negatief wordt. Het statistisch bewijs voor
het praktisch resultaat der actieve onvatbaarmaking kan daar-
om eigenlijk alleen worden geleverd door vergelijking der
ziektecijfers bij geënten en niet-geënten.

Een dergelijk statistisch bewijs over een zeer groot materiaal
is geleverd door Park. Deze vergeleek twee groepen van elk
90.000 schoolkinderen, waarvan de eerste groep bestond uit
57.000 van tevoren Schick negatieve en daardoor niet geïm-
muniseerde kinderen, en uit 33.000 oorspronkelijk Schick posi-
tieve, geïmmuniseerde kinderen, terwijl de tweede groep noch
gecontroleerd, noch geïmmuniseerd was. Bij de niet geïmmuni-
seerde kinderen van groep 2 vond hij het ziektecijfer i 5,5 maal
grooter als bij de geïmmuniseerde kinderen van groep 1,
Hierbij werd verondersteld dat zich onder de tweede groep
ook 57.000 oorspronkelijk Schick negatieve kinderen bevonden,
met hetzelfde lage ziektecijfer als die uit de eerste groep.

Aanvankelijk was men in de voorafgaande jaren over de
verkregen resultaten met het T.A.U. in ons land zeer tevreden.
De gemeente Uitgeest ging daarbij als baanbreker voor toe-
passing van het T.A.U. in andere gemeenten voorop (17).

De statistiek van Overbosch (10) uit Arnhem, loopende
over 1 Febr. 1930—15 Mei 1930, heeft evenwel weer twijfel
doen ontstaan, daar deze èn wat betreft de morbiditeit èn
wat betreft de mortaliteit afwijkt in ongunstigen zin van de
tot nu toe gepubliceerde opgaven uit andere gemeenten. De

laatste statistiek van Seligmann (74) echter, welke een ver-
gelijkend onderzoek heeft ingesteld met anatoxine Ramon,
T.A.U. en de zalf van Löwenstein, is echter weer zeer gunstig
voor het T.A.U.

Over het geheel genomen stond echter bij het onderzoek
van Seligmann het anatoxine aan de spits.

In het algemeen zijn de locale- en algemeene reacties na
de inspuiting van T.A.-mengsels gering. Gewoonlijk doet de
eerste inspuiting het meest intensief reageeren; jeugdige per-
sonen reageeren het minst. Wanneer locale reacties voor-
komen, dan worden deze veroorzaakt gedeeltelijk door het
diphtherietoxine zelf, gedeeltelijk en vaker door niet specifieke
begeleidende stoffen.

Het T.A.U. is bij minstens 150,000 kinderen in ons land
toegepast en reactieverschijnselen van eehige beteekenis, be-
houdens lichte roodheid op de plaats van inspuiting, zijn
daarbij nooit voorgekomen.

Dit feit heeft volgens Aldershoff de enting tegen diphtherie
hier te lande zonder tegenkanting op zoo ruime schaal ingang
doen vinden.

Het voornaamste bezwaar tegen het gebruik van onder-
neutrale T.A.-mengsels is en blijkt hun giftigheid. Zooals
reeds is vermeld, wordt in de literatuur wel beweerd dat
T.A.-mengsels weinig standvastig zijn; de ruime ervaring van
het R.S.I. heeft echter geleerd dat T.A.U., en waarschijnlijk
elk goed bereid T.A.-mengsel, zoo weinig van samenstelling
verandert, dat reeds voor eenige jaren bereid T.A.U. nog
zonder bezwaar is te gebruiken.

Alleen in het buitenland zijn ziektegevallen en gevallen
met doodelijke afloop voorgekomen (5, 46, 68) door: fouten
(Amerika 1919, België 1922 en 1928), verzuimen bij de be-
reiding (Oostenrijk 1924), ondeskundige bewaring (Amerika
1923), fouten tegen de steriliteit der entstof (China, Au-
stralië 1927).

Deze voorgekomen ongevallen doen dan ook niets af aan
de waarde der methode.

Het T.A. -mengsel, goed bereid, goed bewaard en goed ge-
bruikt, is onverdiend er van verdacht kwaad te hebben gesticht.

Het R.S.I. is daarom ook steeds de verantwoordelijkheid
voor het T.A.U. blijven aanvaarden.

Aldershoff [5] schrijft dan ook zeer terecht: „Debereiders
dragen de verantwoordelijkheid voor de goede bereiding, de
geneeskundigen, die het tot heil onzer kinderen benutten,
dragen de verantwoordelijkheid voor het goede gebruik; maar
niet meer en niet minder dan bij de aanwending van allerlei
andere vaccins voor massa-entingquot;.

Door Pockels en Reiter zijn in 1925 bij een klein aantal
kinderen perorale immuniseeringsproeven met T.A.-mengsels
verricht, echter met negatief resultaat.

Ook de proeven van Brandwijk (15), om caviae te immu-
niseeren door middel van toediening door den mond van
T.A.U., leverden een negatieve uitkomst op.

§ 4. Actieve onvatbaarmaking met diphtherie toxine-anti-
toxinevlokken

Bij deze methode wordt gebruik gemaakt van de vlokken,
welke het eerst ontstaan in het neutrale toxine-antitoxine
mengsel volgens de reactie van Ramon.

Door centrifugeeren worden deze vlokken gescheiden van
de overige vloeistof. De vlokken worden daarna meerdere
malen gewasschen met physiologische zoutoplossing en zijn
daardoor bevrijd van de aspecifieke eiwitten. Vervolgens
worden ze geëmulgeerd in physiologische zoutoplossing, waar-
door men een geheel neutrale vlokkenemulsie verkrijgt
(Toxine-Antitoxine Flocken, T.A.F.).

Schmidt en Scholz (83) vonden als doelmatigste vorm voor
«mmuniseering de emulsie der vlokken in een 0,9 % keuken-
zoutoplossing, waaraan een 0,5 % carbol is toegevoegd.
Deze emulsie was dan praktisch onbegrensd houdbaar.

Zij dachten in deze vlokken een ideaal preparaat te hebben
voor actieve onvatbaarmaking. Langs subcutane weg toege-

diend, zou dit het beste werken. Door middel van de T.A.-
vlokken is het mogelijk een groote hoeveelheid gebonden gif
in een klein volumen in te spuiten, ook omdat deze binding
als zoodanig veel vaster is als in den vorm van het toxine-
antitoxinemengsel. Hierbij moet echter worden vooropgesteld,
dat de verwerking van het gifdepót in het lichaam parallel
gaat met actieve onvatbaarmaking, dus met het optreden van
vrij antitoxine.

Wanneer dit echter niet gebeurt, het lichaam dus uit ons
onbekende gronden niet in staat is zich snel genoeg te im-
muniseeren, dan dreigt beslist gevaar. Hierbij moet men zich
dan voorstellen dat het lichaam de toxine-antitoxine verbinding
in den loop der tijd sneller kan splitsen, en als dit gebeurt
op een tijd dat de antitoxinetiter nog niet hoog genoeg is,
dan kan het organisme door toxinewerking zwaar ziek
worden. Dit gevaar is natuurlijk des te grooter naarmate meer
gebonden gif in het ingespoten depót voorhanden is.

Naarmate het vlokkenpreparaat ouder is, wordt door het
vaster worden der binding dit gevaar geringer.

In het algemeen is het genoemde gevaar bij T.A. in
vlokkenvorm geringer als bij T.A. in oplossing, waartegen-
over staat dat in deze laatste vorm veel minder gebonden
gif wordt ingespoten.

De voornaamste bezwaren tegen T.A.F. zijn:

1.nbsp;Het is neutraal en zuiver neutrale mengsels immuniseeren
slechts zeer langzaam. Er is wel eens voorgesteld de vlokken-
emulsie door toevoegen van toxine onderneutraal te maken
om zoodoende een grootere en sneller ontstaande onvatbaar-
heid te verkrijgen. Dit is echter niet logisch, daar men dan
de voordeelen der vlokkenemulsie, waarvan neutraliteit, dus
primaire ongiftigheid, het belangrijkste is, denkbeeldig maakt.

2.nbsp;Voor hen die dissociatie van T.A. vreezen, is T.A.F.
een onlogisch product, want zoo dit niet bewezen gevaar
bestaat, is dit bij de veel geconcentreerder T.A.F.-emulsie
een veel grooter gevaar dan bij de sterk verdunde onder-
neutrale mengsels zooals T.A.U.

De actieve onvatbaarmaking met T.A.F. werd het eerst
in Duitschiand toegepast.

Volgens proeven van 5c/7rei6er is bij inspuiting van 0,3—0,4 c.c.
van bovengenoemde suspensie de locale reactie onbeteekenend
en bijna pijnloos. Herhaalde inspuitingen van kleine hoeveel-
heden voldeden het best. De immuniseering met T.A.F. ver-
loopt echter betrekkelijk langzaam, zoodat het hoogtepunt der
productie van antilichamen eerst na maanden wordt bereikt.

Het bezit van een entstof, die na een enkele dosis vol-
doende onvatbaarheid geeft, zou van groote waarde zijn.

Een groote hoeveelheid T.A.F., als depót in het lichaam
gebracht, zou misschien dit doel kunnen bereiken.

De onvatbaarheid zou dan echter slechts zeer langzaam
ontstaan waarom deze wijze van enten dus alleen in aanmerking
zou komen, indien geen onmiddellijk gevaar voor diphtherie
bestaat. Daar men echter omtrent de splitsing van T.A.-ver-
bindingen in het lichaam nog zeer weinig zekers weet, geeft
het in het Üchaam brengen van een groote hoeveelheid T.A.F.
een onveilig gevoel.

Aan T.A.F. werd vroeger geen immuniseerende werking
toegekend, zooals door Löwenstein in 1924, ook niet door
Ramon in 1925. H. Schmidt en W, Scholz (83) hebben zich
echter in 1926 van het goede immuniseerend vermogen der
T.A.-vlokken overtuigd.

Door hen werd T.A.F. gehouden voor de meest bruik-
bare entstof.

Sordelli en Serpa deelden in 1925 nog mede. dat ze bij
paarden en caviae ook een immuniteit konden opwekken
door het brengen van vlokkenmateriaal op de gescarificeerde
huid en bevalen deze methode toen ook aan voor actieve
onvatbaarmaking bij den mensch.

Veel ingang heeft het echter niet gevonden.

§ 5. Actieve onvatbaarmaking met diphtherieanatoxine

Omdat aan de tot nu toe beschreven entstoffen toch nog
altijd kleefde het nadeel der meerdere of mindere toxiciteit.

heeft men pogingen in het werk gesteld om een geheel on-
giftig toxine, dat echter zijn onvatbaarmakende antigeenwerking
heeft behouden, in handen te krijgen. Verschillende onder-
zoekers hebben zich hiermede bezig gehouden. Het denkbeeld
der atoxische antigenen was reeds afkomstig van Ehrlich, dat
praktisch werd uitgevoerd door Löwenstein, von Eisler e.a.,
en via hen door Glenny. Glenny (118) zou reeds in 1904
door formol gemodificeerde toxinen hebben bereid en gebruikt.

Busson en Löwenstein meenden in 1920, dat door toe-
voeging van formol aan diphtherietoxine en maanden lang
verblijf bij broedtemperatuur, ook de onvatbaarmakende
werking verloren ging. Hun ervaring is echter in strijd met
die van talrijke anderen en onjuist gebleken.

Glenny en Sudmersen vonden, dat caviae na inspuiten van
een oud, met formaline bewaard toxine, onvatbaar werden
en geen reactie vertoonden.

Glenny en Hopkins voegden aan diphtherietoxine toe één
per duizend formaline en verwarmden dit vier weken lang
op 37° C. De giftigheid van het toxine vonden ze hierdoor
sterk verminderd, maar niet geheel verdwenen. Met dit, door
hen benaamde „toxoidquot;, deden zij proeven op konijnen, en het
bleek hierbij dat de onvatbaarmakende werking van diphtherie-
toxine niet verandert, indien het toxine is veranderd in toxoid.
De toxische werking wordt dus door formol weggenomen en de
antigeen- of antistofFenverwekkende werking blijft behouden.

Volgens de theorie van Ehrlich kan men zeggen dat de
toxophore groep van het antigeen is vernietigd en de hapto-
phore groep behouden.

Praktische beteekenis heeft echter dit ontgifte toxine pas
gekregen door den arbeid van Ramon in het Instituut Pasteur
te Parijs. Deze heeft zoowel onze inzichten in, als de toe-
passing van het anatoxine aanmerkelijk verder gebracht en
wel als gevolg van zijn degelijke studie, in het jaar 1923,
over de reacties tusschen antigeen en antitoxine (22).

Zonder aan de groote verdiensten van Ramon iets af te
doen, moet toch eerlijkheidshalve worden opgemerkt, dat dit

anatoxine van Ramon niets anders is dan het toxoid van
Glenny e.a., die evenals Löwenstein reeds eerder met formol
het diphtherietoxine ongiftig hadden gemaakt, maar pas Ramon
zag de antigeenwaarde er van voldoende in.

Ramon vond, dat zich in een mengsel van diphtherietoxine
en -antitoxine een vlokkig neerslag vormt, het duidelijkst bij
37° C. Het neerslag ontstaat het eerst in dat mengsel, waar
het toxine juist door het antitoxine wordt geneutraliseerd,
en waarin dus geen vrij toxine of vrij antitoxine meer voor-
komt („floculation initialequot;).

Deze vlokking is specifiek, want ze treedt niet op met
normaal serum, of eenig ander antiserum. Ze treedt ook niet
op met diphtherietoxine, dat gemodificeerd is door verwarming
op 100°.

Ramon schrijft; „Elle est la manifestation visible la plus
caractéristique de la réaction entre la toxine et 1' antitoxine
diphtériquesquot;.

Met behulp van deze vlokkingsreactie is de sterkte van
een antitoxine of toxine te bepalen, indien men een toxine
of antitoxine van bekende sterkte in handen heeft. Onder
antigeenwaarde verstaat men de hoeveelheid eenheden anti-
toxine, die de initiale vlokking veroorzaakt in 1 c.c. toxine of
anatoxine.

Deze methode geeft veel snellere uitkomsten dan de titratie
volgens Ehrlich op dieren en spaart vele dieren uit. De toe-
passing is eenvoudig, hoewel natuurlijk ervaring voor be-
trouwbare aflezing wordt vereischt.

Evenwel geeft de titratie volgens Ramon niet steeds dezelfde
uitkomst als de dierproef en kan deze laatste voor nauw-
keurige titratie niet worden gemist.

Het denkbeeld om antitoxische sera te titreeren door
middel van uitvlokking met toxine, is niet van Ramon af-
komstig.

Reeds in 1909 gebruikten Calmette en Massol de vlokkings-
reactie bij het titreeren van antislangenbeetserum.

Daarna hebben Nicolle, Césari en Debains het beginsel

in toepassing gebracht bij het titreeren van diphtherie- en
tetanusserum door middel van een ringreactie, die ontstaat,
als met toxine vermengde gestolde gelatine wordt overgoten
met antitoxisch serum.

Georgi vond, onafhankelijk van de genoemde onderzoekers,
dat antitoxische sera door uitvlokking kunnen worden geti-
treerd. Hij voegde evenwel ook nog toe gecholesterineerd
hartextract; hem was dus ontgaan, dat ook reeds door een-
voudig vermengen van toxine en antitoxine een neerslag
ontstaat.

Ramon vond na verschillende proefnemingen als de beste
methode voor het bereiden van anatoxine toevoeging aan
diphtherietoxine van 3 a 4 per duizend formaline en blootstellen
gedurende 4—5 weken aan een temperatuur van 37°—42° C.

Op welke wijze deze omzetting in anatoxine geschiedt,
heeft men eigenlijk nog niet goed kunnen doorgronden. Een
dergelijk toxine, dat daarna zijn toxische eigenschappen mist,
heeft zijn uitvlokkend vermogen en ook zijn immuniseerende
eigenschappen behouden.

Het vlokt wel iets langzamer dan het oorspronkelijke toxine.
Volgens Ramon zou de immuniseerende werking van het
anatoxine in rechtstreeksche verhouding staan tot zijn uit-
vlokkend vermogen. Hoe meer antitoxine-eenheden een be-
paalde hoeveelheid anatoxine noodig heeft voor zijn begin-
uitvlokking, „floculation initialequot;, en hoe sneller deze optreedt,
des te sterker zou dan zijn immuniseerend vermogen zijn.

In het R.S.I. voegt men, evenals Ramon, aan diphtherie-
toxine toe 3 a 4 per duizend formaline, en past een lang-
zame ontgifting gedurende 4—5 weken bij 40° C. toe.

Bij verhitten van toxine is het overblijvend onvatbaar-
makend vermogen gering en verdwijnt het uitvlokkend ver-
mogen. Wanneer evenwel het toxine volgens de beschreven
methode geheel in anatoxine is omgezet, doet daarna ver-
warming tot 72° C. aan de onvatbaarmakende werking en
het uitvlokkend vermogen geen afbreuk meer.

Hieruit blijkt dus dat toxoid iets anders is dan door for-
maline ongiftig gemaakt toxine en in wezen daarvan verschilt.

De atoxiciteit van het anatoxine wordt nagegaan door
5 c.c. subcutaan in te spuiten bij een cavia van 300 gram.
Het dier wordt gedurende een maand in observatie gehouden
en om de 2 dagen nagezien. Wanneer het gedurende dien
tijd geen enkel verschijnsel van locale of algemeene diphthe-
rie-intoxicatie vertoont en regelmatig in gewicht toeneemt,
dan wordt atoxiciteit van het anatoxine aangenomen.

Volgens Schmidt (127) is, voor toepassing der onschade-
lijkheidsproef van het anatoxine bij caviae, observatie ge-
durende 6 weken noodzakelijk.

De laatste tijd wordt de onschadelijkheidsproef van Ramon
nog wel aangevuld met een intracutane proef bij de cavia
en het konijn.

Moloney voert deze proef bij de cavia uit op de volgende
wijze: 0,1 c.c. van het anatoxine wordt intracutaan ingespoten.

Wordt hierdoor geen reactie tevoorschijn geroepen grooter
dan 12 m.M. in doorsnede, dan wordt aangenomen dat het
anatoxine voldoende is ontgift. Ook spuit hij wel 0,1 c.c.
intracutaan in van een verdunning 1 op 10, welke dosis dan
geen reactie mag geven grooter dan 5 m.M. in doorsnede.

S. Schmidt (127) spuit 0,2 c.c. van het anatoxine intracutaan
in bij het konijn, hetgeen dan nog een geringe roodheid
veroorzaakt, of 5 c.c. Intraveneus bij een konijn van 3 K.G.,
dat gedurende 2 maanden in observatie wordt gehouden en
geen verschijnselen van locale of algemeene diphtherie-into-
xicatie direkt of later optredend, mag vertoonen.

Anatoxine bezit de volgende voordeelen:

1.nbsp;Absolute onschadelijkheid,

2.nbsp;Het bevat geen serum.

3.nbsp;Goede antigeenwaarde.

4.nbsp;Stabiliteit,

Nadat Ramon bij proefdieren goede resultaten had ver-
kregen, werd door hem het anatoxine ook gebruikt om
kinderen tegen diphtherie te immuniseeren.

Eerst werd subcutaan Vs c.c. anatoxine ingespoten, 3 weken
later 1 c.c. eveneens subcutaan cn 15 dagen na deze tweede
inspuiting nog iVa c.c. anatoxine subcutaan.

Later kan de Immuniteit nog weer aanzienlijk worden ver-
sterkt door een nieuwe inspuiting van anatoxine, de z.g.
„injection dc rappelquot;.

De eerste proeven hieromtrent zijn verricht door Martin,
Darré, Loiseau, Laffaille, Roubinowitsch en Zoeller (51, 52,
57, 58 en 59).

Uit hun onderzoekingen is af te leiden, dat de vorming
van antitoxinen sneller plaats vond dan met T.A.-mengsels.

De resultaten werden nagegaan door toepassing der proef
van Schick en bepaling van de antitoxinetiter van het serum
vóór en na de enting.

De onvatbaarheid ontstond bij 88,7 % der geënten na
5—6 weken en bij 98,8 % na 8 weken. Bij gebruikmaken
van z.g. „vaccins associésquot;, d.w.z. mengsels van anatoxine met
andere prikkelende stoffen, o.a. typhusvaccin, werden nog
betere resultaten verkregen en wel in 100% der gevallen
immuniteit, althans negatieve Schick. Volgens deze onder-
zoekers is de plaatselijke en algemeene reactie zelden merkbaar
en van weinig beteekenis. De locale reactie moet worden
toegeschreven aan de aanwezigheid in anatoxine van eiwit-
stoffen afkomstig uit de bouillon, waarin de diphtheriebacillen
zijn gekweekt, en van de bacillen zelf.

Hierbij dient echter te worden opgemerkt, dat de proeven
van bovengenoemde onderzoekers werden verricht bij kinderen
beneden de 6 jaar.

Bij deze kinderen is de plaatselijke reactie geringer dan bij
oudere kinderen en verdwijnt weer spoedig.

De algemeene reactie uit zich alleen in een lichte temperatuurs-
verhooging.

Ramon raadt daarom aan voor het immuniseeren met
anatoxine den leeftijd van iVs'-ö jaar, omdat die kinderen
meestal nog niet gesensibiliseerd zijn voor de bacteriënproteinen.

Bovendien eischt de diphtherie 60 % van haar slachtoffers

tusschen den 2- en 6-jarigen leeftijd; deze dienen dus aller-
eerst te worden beschermd.

Door het Instituut Pasteur te Parijs worden slechts die
monsters anatoxine voor actieve onvatbaarmaking in den
handel gebracht, waarvan de antigeenwaarde op zijn minst
8 A.E. bedraagt, door het R.S.I. met minstens 12 A.E.

In Frankrijk zijn sedert 1923 zeker een millioen kinderen
geïmmuniseerd met anatoxine.

Bij entingen met anatoxine, die Aldershoff (9) in Frankrijk
kon bijwonen, heeft deze toch reacties waargenomen, die,
hoewel op zichzelf onschadelijk, toch hier te lande ongaarne
worden gezien.

Ook Bessemans (45) en De Potter (48) hebben hierop
gewezen.

Park en Zingher hebben in 1924 ook reeds de onvatbaar-
making met toxoid bij kinderen ter hand genomen. Zij voegden
aan het diphtherietoxine toe één per duizend formaline en
plaatsten dit 4—5 weken bij 38° C., waarna de toxiciteit
wel niet geheel was verdwenen, maar toch zeer sterk afge-
nomen, Zij voegden echter nog antitoxine toe, zoodat zij
dus eigenlijk werkten met een toxine-antitoxinemengsel, waarin
verzwakt toxine aanwezig was. De plaatselijke reactie vonden
zij bij kinderen echter zeer sterk.

Later gingen zij er ook toe over geheel atoxisch anatoxine
te bereiden volgens de methode Ramon door toevoeging van
2 a 3 per duizend formaline en verwarmen gedurende 4—5
weken bij 38° C. Toch is tot op heden ook in New-York
het T.A.-mengsel de meest gebruikte entstof gebleven.

Onderzoekingen van Brandwijk (15) over immuniseering
van caviae door toediening van anatoxine per os leverden
geen resultaat op.

De gewijzigde zalf van Löwenstein, welke anatoxine en
gedoode diphtheriebacillen bevat, waarmee de huid wordt
ingewreven, gaf ook zeer onvoldoende resultaten, evenals
het inbrengen in de neus van in anatoxine gedrenkte tampons.

Deze beantwoorden te weinig aan het doel onvatbaarheid

te verwekken, en zijn daarom slechts aan te raden, indien
tegen inspuiting onoverkomenlijke bezwaren bestaan.

Ook bij paarden is met anatoxine onvatbaarheid te ver-
wekken. Het paard wordt bij deze behandeling niet telkens
weer bloot gesteld aan den toxineprikkel, zoodat de gezond-
heidstoestand van het dier veel beter blijft en het paard ook
veel langer is te gebruiken.

De ervaringen in het R.S.I., opgedaan met hyperimmu-
nisatie van paarden door middel van anatoxine, zijn echter
niet zoo gunstig als die van Ramon, vooral wat betreft de
eindtiter van het verkregen serum.

Ramon (23, 37) heeft ook nog getracht een versterking
van de immuniseering bij paarden te verkrijgen door tapioca-
poeder aan het diphtherieanatoxine toe te voegen en dit
mengsel subcutaan in te spuiten.

Hij was hiertoe overgegaan, omdat hij opmerkte dat paarden,
welke op de plaats van inspuiting een meer of minder leven-
dige ontsteking kregen, vaak gevolgd door een absces daar
ter plaatse, een vrij aanzienlijke verhooging van het anti-toxine-
gehalte van het serum vertoonden. Het sterke ontstekings-
oedeem heeft tengevolge een langzame resorptie van het antigeen.

Glenny, Pope, Waddington en Wallace (114) vonden in
1926 dat ook toevoeging van aluin aan anatoxine de anti-
geenwaarde sterk deed toenemen; ook hier is het locale
oedeem wel de oorzaak.

In den laatsten tijd nam Ramon (23, 37) waar, dat een
analoog efFekt als met tapioca, kan worden verkregen door
toevoeging aan het antigeen van 0,5 % chloorcalcium, dat
een neerslag verwekt van calciumfosfaat, hetgeen een meer
of minder groot gedeelte van het antigeen fixeert.

Tot nu toe werd hier te lande voor actieve onvatbaar-
making tegen diphtherie de volgende gedragslijn aangenomen:

1.nbsp;Kinderen boven de 6 jaar immuniseeren met T.A.U.

2.nbsp;Voor kinderen beneden de 6 jaar wordt anatoxine aan-
bevolen.

Een anatoxine, bevrijd van aspecifieke eiwitstoffen, dat dus
ook bij oudere kinderen en volwassenen kan worden aan-
gewend, blijft echter het ideaal, waarnaar in het R.S.I. met
goede kans op succes wordt gezocht.

§ 6. Actieve onvatbaarmaking met diphtherie anatoxine-
antitoxinevlokken

Hierbij gebruikt men de vlokken, welke het eerst ontstaan
in het neutrale anatoxine-antitoxinemengsel volgens de reactie
van Ramon (A.A.F. of Ananti Aldershoff). De verdere be-
werking der vlokken geschiedt op dezelfde wijze, zooals is
uiteengezet voor de toxine-antitoxinevlokken. Voor hen, die
dissociatie van T.A.-verbindingen vreezen, is het logischer
gebruik te maken van Ananti dan van T.A.F., omdat bij
splitsing slechts een niet giftige stof ontstaat; hier zal snel
loslaten eerder een voordeel beteekenen, tenzij men de grootste
waarde legt op een depötwerking.

Ananti heeft in dierproeven bewezen goed te immuniseeren:
het maakt echter volgens Aldershoff (3, 4 en 9) slechts lang-
zaam onvatbaar. In Engeland maakt men er toch in de
praktijk gebruik van.

Door subcutaan inspuiten van Ananti zou slechts een ge-
ringe plaatselijke reactie optreden.

In Ananti is, daar anatoxine ongiftig is, antitoxine over-
bodig, indien men geen depótwerking aanneemt. Wanneer
dus uit de binding Ananti het antitoxine weer kon worden
verwijderd, zonder het antigeen te schaden, dan zouden we
een ideale entstof verkrijgen, n.1. het atoxische antigeen in
zuiveren vorm.

Brandwijk (15) heeft hieromtrent verschillende onderzoekingen
gedaan:

1.nbsp;De invloed van hoogere temperatuur.
Deze proeven hebben niets opgeleverd.

2.nbsp;Toevoeging van formaline aan een emulsie van Ananti
om dit van antitoxine te bevrijden.

Hiermede werden eveneens geen resultaten verkregen.

3.nbsp;Aanzuren en daarna weer alkalisch maken van een
Anantiemulsie. Hallauer had n.I. opgemerkt dat, wanneer
diphtherietoxine krachtig werd aangezuurd, dit dan zijn giftige
werking verliest, welke echter na toevoeging van natronloog,
juist tot het neutrale punt weer terugkeert.

Brandwijk kon dit bevestigen. Door toepassing van dit
principe op Ananti, kreeg Brandwijk een deel van het anti-
geen vrij aanwezig. Zoodoende werd dus eigenlijk een
onderneutraal Anantimengsel verkregen. Dit gezuiverde Ananti
heeft hij toegepast bij caviae, welke een goede onvatbaarheid
vertoonden, maar eerst na ongeveer zes weken. Het nadeel
der ietwat vertraagde onvatbaarheid zou men kunnen onder-
vangen door grootere giften.

Na het inspuiten van gezuiverd Ananti ontstond bijna geen
locale reactie.

4.nbsp;Door adsorptie van het aan het antigeen gebonden
antitoxine aan een stof met een zoo sterke aantrekking tot
antitoxine, dat dit uit de binding Ananti wordt vrij gemaakt,
zonder echter het anatoxine te schaden. Dit adsorptiemiddel
moet echter weer gemakkelijk uit de oplossing verwijderd
kunnen worden, opdat het eindproduct geen vreemde stoffen
bevat, welke voor den mensch schadelijk zouden kunnen
zijn. Uit onderzoekingen van Zunz. Rakusin en Flieher was
gebleken, dat diphtherieantitoxine wordt geadsorbeerd door
acidum silicicum, dierlijke kool en aluminiumhydroxyde.

Door proeven werd gevonden dat het eerste en het laatste
moeilijk uit de oplossing waren te verwijderen, terwijl dit
bezwaar bij kool niet bestond.

Na deze proeven van Brandwijk werd de mogelijkheid
niet uitgesloten geacht, dat in de toekomst bij den mensch
voldoende onvatbaarheid is te verkrijgen door een enkele
enting, aangezien een groote gift van het zuivere Ananti
geen bezwaar meer zou vormen.

HOOFDSTUK II
ZUIVERING VAN ANATOXINE

Na de bekende onderzoekingen van Roux en Yersin had
men niet zooveel belang meer gesteld in de zuivering van
diphtherietoxine, zooals reeds in de inleiding is uiteengezet,
omdat de geringe resultaten weinig voor de toekomst deden
verwachten. Toen evenwel de proteinechemie meer en meer
tot ontwikkeling was gekomen, heeft men, na een rustperiode
van tientallen jaren, de zuivering van het diphtherietoxine en
-anatoxine weer ter hand genomen.

De proeven over zuivering van toxine en anatoxine hebben
een tweeledig doel:

1.nbsp;Een zuiver theoretisch belang om de natuur van het
diphtheriegif te ontsluieren.

2.nbsp;Een praktisch belang om krachtig werkende antigenen te
verkrijgen.

Hoofdzakelijk heeft men getracht zijn doel te bereiken op
drie manieren:

1°. Neerslaan der proteinen van de toxinebouillon met
verschillende neutrale zouten, vooral natriumsulfaat of ammo-
niumsulfaat, met opvolgende dialyse. Neerslaan met alcohol
of door middel van zuren en opvolgend oplossen van het
neerslag in zwak alkalische vloeistoffen.

Aan Brieger en zijn medewerkers danken wij een groot
deel dezer onderzoekingen en het gelukte hun op deze wijze

reeds vrij zuivere preparaten te bereiden, echter ging bij deze
proeven de antigeenwaarde meestal achteruit.

Abt heeft in de laatste tijd een methode verbeterd, welke
in principe reeds was aangegeven door Roux en Yersin
n.1.: neerslaan van het ruwe toxine met oplosbare calcium-
zouten, welke met de fosfaten uit de bouillon onoplosbare
neerslagen vormen en waardoor het toxine wordt geadsor-
beerd. Het neerslaan door middel van zuren (118, 143 en
144) is een vooral in de laatste jaren veel gebruikte methode
(Glenny en Walpole, Watson en Wallace, Kissin en Bron-
stein, Watson en Langstaff, Schmidt en Kjaer).

Deze methode schijnt bij doelmatige toepassing vrij zuivere
preparaten te geven, is eenvoudig en niet duur.

Volgens Kissin en Bronstein is een voorproef met kleine
hoeveelheden gewenscht, om te weten hoeveel zuur men
ongeveer moet toevoegen. Na centrifugeeren en wasschen
wordt het neerslag weer opgelost in een kleine hoeveelheid
alkalische vloeistof. Op deze wijze kan men in een heel klein
volumen een bepaald percentage van het werkzame bestand-
deel verkrijgen.

Het grootste gedeelte der stikstofhoudende, niet specifieke
stoffen wordt op deze wijze verwijderd. Het meest werd nog
gewerkt met zoutzuur, waarbij een opbrengst van 50—60 %
werd verkregen; bij gebruiken van azijnzuur was de opbrengst
te gering.

De beste resultaten vond men wanneer het uitgangsproduct
op Ph 3,5—4,1 werd gebracht, bij lage temperatuur en korte
inwerkingstijd van het zuur, niet langer dan 3V2 uur.

Het immuniseerend vermogen van de op deze wijze ge-
zuiverde toxinen en anatoxinen was echter slechter dan dat
der ruwe producten; ook de houdbaarheid dezer gezuiverde
producten was niet zoo goed.

Zuivering door middel van aethylalcohol, methylalcohol en
aceton gaf geen bevredigende resultaten en is bovendien
kostbaar.

Glenny, Pope, Waddington en Wallace (114) toonden in

1926 aan, dat de antigeenwaarde van diphtherietoxoiden werd
verbeterd door toevoeging van aluin [K2Al2(S04)3], zonder
scheiden of met weer oplossen van het precipitaat. Aluin
werd het eerst gebruikt in 1925 door Glenny (113), toen
deze het effect van vertraagde resorptie trachtte na te gaan
door toxoid in betrekkelijk onoplosbare vorm te brengen.

Maximale precipitatie werd verkregen bij toevoeging van
1,5—2% aluin; met een grootere hoeveelheid aluin, van
3,5'—10 neemt de zuiverheid van het precipitaat toe, ter-
wijl de opbrengst afneemt. Aluin werd als vaste stof toegevoegd.

Het mengsel bleef gedurende 18 uren staan, voordat het
werd gefiltreerd. Nadien werd het overblijvende precipitaat
tweemaal gewasschen met een 1 % oplossing van natrium-
chloride. De hoeveelheid waschwater bedroeg telkens het
volumen van het oorspronkelijke toxoid.

De gewasschen predpitaten werden geperst tusschen vloei-
papier om vocht te verwijderen en daarna gesuspendeerd in
physiologische zoutoplossing, waaraan een Vs % phenol was
toegevoegd. Glenny en zijn medewerkers gebruikten hoofd-
zakelijk alleen deze suspensie van aluinvlokken voor de actieve
onvatbaarmaking tegen diphtherie.

Om de antigeenwaarde der precipitaten te bepalen met de
vlokkingsreactie volgens Ramon, werden deze opgelost in een
2 o/o oplossing van natriumkaliumtartraat (Seignette zout).

Glenny en Waddington deelden in 1928 vergelijkende
proeven mede omtrent het antigeenvermogen van toxoid en
aluintoxoid, waarbij duidelijk de superioriteit van het aluin-
toxoid aan den dag kwam. Verdere mededeelingen zijn in
1930 gedaan door Glenny (113), welke de voordeelen aan-
toonde van het toevoegen van aluin aan diphtherietoxoid
om paarden te immuniseeren voor het verkrijgen van thera-
peutische sera.

Het grootste gedeelte van gewoon toxoid wordt geëlimi-
neerd binnen de eerste 24 uur en na 3 dagen blijft nog slechts
een spoor over: dit gedeelte is echter van aanzienlijk belang
voor de ontwikkeling der immuniteit.

In aluintoxoid is het antigeen aanwezig in den vorm van
een betrekkelijk onoplosbaar precipitaat, dat voldoende lang
in het lichaam blijft om als continue prikkel te werken, nadat
de cellen op den eersten prikkel hebben gereageerd; de ver-
meerdering van het antigeenvermogen van aluintoxoid moet
dan ook worden toegeschreven aan de langzame resorptie en
ehmineering.

De mogelijkheid bestaat, met dit product door één enkele
inspuiting een actieve onvatbaarheid te verwekken.

Volgens Glenny geeft subcutane inspuiting van aluintoxoid bij
caviae een matig sterke reactie, bij paarden een zeer sterke reactie.

Glenny heeft ook enkele honderden kinderen en volwassenen
met aluintoxoid geënt.

Bij kinderen was eveneens een duidelijke reactie waar te
nemen, maar niet zoo sterk als bij caviae, volgens Glenny:
bij volwassenen was de reactie minder sterk.

Uit proeven van Pondman en Tasman (162) bleek echter
dat bij caviae reeds zeer groote infiltraten zich ontwikkelden,
zoodat in het R.S.I. deze methode als niet praktisch toepasbaar
wordt beschouwd.

Park voegt aluin in poedervorm toe aan het anatoxine (130)
en schijnt goede resultaten te hebben verkregen door kinderen
met een dergelijk mengsel te immuniseeren; over de reactie
spreekt hij niet.

In 1931 is door Tasman en Pondman (161) nog een bijzondere
methode uitgewerkt.

Zij voegden toe aan 1 liter van het uitgangsproduct 13,2 gram
aluminium-sulfaat [Al2(S04)8 9 HgO]. In hun proeven werd als
precipiteerende stof aluminium-sulfaat gebezigd, omdat met
een aequivalente hoeveelheid aluminium-sulfaat dezelfde
resultaten bereikt werden als met aluin.

Na eenige malen omschudden werd na drie uur staan het
neerslag afgezogen, eenmaal gewasschen met 300 c.c. ge-
destilleerd water en daarna gesuspendeerd in 200 c.c. van
een 10% natriumfosfaat-oplossing (NagHPOi 12 HgO) voor
elueering. Na 2 maal 24 uur werd wederom afgezogen en

het fikraat ter afkoeling enkele uren in de ijskast geplaatst.

Daarna enting dezer vloeistof met enkele natriumfosfaat-
kristallen en voor uitvriezen van de overmaat natriumfosfaat
weer gedurende 24 uur in de ijskast geplaatst.

Vervolgens wordt de vloeistof door filtratie van de gevormde
kristallen natriumfosfaat gescheiden en tenslotte nog door een
..Seitz-Entkeimungsfilterquot; gefiltreerd.

Door middel van deze precipitatiemethode verkregen de
schrijvers vrij zuivere producten en het immuniseerend ver-
mogen bleek eveneens goed te zijn.

2°. Adsorptie van het werkzame bestanddeel der toxine-
bouillon door toevoeging van metaalhydroxgden.

Ook heeft men bij de adsorptiemethode wel gebruik ge-
maakt van dierlijke kool en kaoline.

Op initiatief van Sörensen, zijn S. Schmidt en K. Linder-
ström^Lang (122 en 123) in 1929 begonnen met onder-
zoekingen over de zuivering van diphtherietoxine en -anatoxine
met behulp van een methode in gebruik bij de enzymchemie,
n.1. door middel van eene suspensie van aluminiumhydroxyde.
Zij bereidden aluminiumhydroxyde volgens het principe, zoo-
als dit in 1923 reeds door Willstätter (77, 78 en 79) was
aangegeven, waardoor het mogelijk werd, voortdurend een
suspensie van aluminiumhydroxyde te bereiden van een bijna
gelijksoortige en constante samenstelling.

De aangevangen onderzoekingen van 5. Schmidt en K. Linder-
ström—Lang werden voortgezet door 5. Schmidt. A. Hansen
en K.A. Kjaer.

Voor het bereiden der suspensie van aluminiumhydroxyde
gingen Schmidt. Hansen en Kjaer (139, 142) te werk op de
volgende wijze:

100 c.c. van een 10 % ammoniakoplossing worden gegoten
bij een oplossing van 22 gram ammoniumsulfaat in 600 c.c.
gedestilleerd water, welke van te voren is verhit op 63° C.

Daarna wordt dit mengsel afgekoeld tot 58° C. Hieraan
wordt snel toegevoegd een oplossing van 76,7 gram aluminium-

ammoniumsulfaat 12 a.q. in 150 c.c. gedestilleerd water,
eveneens op 58° C. verhit. Hierbij precipiteert het aluminium-
hydroxyde. Vervolgens wordt dit totale mengsel verwarmd
op 61° C. en gedurende 10 minuten flink geroerd.

Schmidt wijst met nadruk op het belang, gedurende het neer-
slaan van aluminiumhydroxyde er voor zorg te dragen, dat de
temperatuur niet beneden 58° C. en ook niet boven 61° C.
komt, daar dan het aluminiumhydroxyde geheel andere eigen-
schappen kan aannemen.

Nadat gedurende 10 minuten flink is geroerd, wordt het
geprecipiteerde aluminiumhydroxyde uitgegoten in 7,2 L. ge-
destilleerd water, waaraan is toegevoegd 12,5 c.c. van een
10% ammoniakoplossing. Dit geheel wordt krachtig geschud
en het predpitaat daarna rustig aan bezinking overgelaten.

Vervolgens wordt de bovenstaande vloeistof door centri-
fugeeren of afzuigen verwijderd en het neerslag nogmaals
gewasschen met 7,2 L. gedestilleerd water, waaraan nu 25 c.c.
van een 10 % ammoniakoplossing is toegevoegd.

Tenslotte wordt, na bezinking van dit neerslag en afzuigen
van het waschwater, telkens met 7,2 L. gedestilleerd water,
maar nu zonder ammoniak, zoolang gewasschen totdat de
bovenstaande vloeistof troebel blijft. Volgens Schmidt is het
belangrijk zoo snel mogelijk te werk te gaan met het wasschen
van het geprecipiteerde alumiumhydroxyde en dit zoo mogelijk
in 2,5 uur te verrichten.

Mijn ervaring, zooals nog uit te beschrijven proeven zal
blijken, is, dat dit laatste niet strikt noodzakelijk is.

Hierna wordt zooveel mogelijk water afgeheveld en houdt
men ongeveer een halve liter suspensie over.

De suspensie moet worden gereed gemaakt, de dag vóór
de zuivering, omdat men de suspensie versch bereid moet
gebruiken en niet kan laten verouderen.

Merkwaardigerwijze vindt men slechts op één plaats in de
verschillende publicaties van Schmidt (130) een opgave over
het gehalte aan aluminiumoxyde van de door hem gebruikte
suspensies, n.1. 0,0007 gram AlgOg per c.c. Zooals nog uit

mijn te vermelden proeven zal blijken, ligt deze waarde
ver beneden die, welke voor de door mij gebruikte,
volgens Schmidt's voorschrift bereide suspensies, werden
gevonden.

Schmidt en zijn medewerkers geven op in hun publicaties,
dat per 100 c.c. toxine of anatoxine wordt toegevoegd 20 c.c.
suspensie. De toxinen worden volgens Schmidt (127) het best
geadsorbeerd bij Ph 7—8, terwijl voor de anatoxinen het
Ph optimum werd gevonden bij P^ 5,5—6,5.

Maschmann, Küster en Fischer geven als gunstigste
waterstofionenconcentratie voor de adsorptie van diphtherie-
en tetanustoxine aan aluminiumhydroxyde de waarde
Ph = 6 op.

Om de Ph der toxinen en anatoxinen te verlagen werd
gebruik gemaakt van 10 % azijnzuur.

De adsorptie geschiedt volgens Schmidt bijna oogenblik-
kelijk.

Nadat het toxine of anatoxine zorgvuldig met de sus-
pensie is gemengd, wordt gecentrifugeerd of door een
Buchner-filter gefiltreerd. Het neerslag wordt tweemaal ge-
wasschen met zooveel gedestilleerd water, als het volumen
uitgangsproduct suspensie bedroeg. Daarna wordt het
neerslag geëlueerd met Vs van het volumen van het uitgangs-
product eener oplossing van 2,4 % NagHPO^ 12 HgO in
gedestilleerd water. Later (139) werd het neerslag ook wel
verwreven met deze vermelde hoeveelheid vast fosfaat
en vervolgens langzaam kleine hoeveelheden gedestilleerd
water toegevoegd totdat het bovengenoemde volumen was
bereikt.

Ook heeft Schmidt (132 en 133) voor deze elueering nog
wel gebruik gemaakt van 15 % Nag HPO^ 12 HgO, of op-
gelost in gedestilleerd water.

Het werkzame bestanddeel zou bijna ©ogenblikkelijk in de
fosfaatoplossing overgaan.

Schmidt en zijn medewerkers hebben ook proeven verricht
met andere elutievloeistoffen, zooals een oplossing van na-

triumsilikaat, kaliumantimonaat en natriumcarbonaat; geen
enkele gaf evenwel voordeelen boven de fosfaatoplossing.

Elutie met ammoniak gelukte ook goed, maar de elutie-
vloeistof is dan sterk opalesceerend en geeft moeilijkheden
bij het bepalen der antigeenwaarde volgens Ramon.

Bij gebruik maken van 2,4 % Nag HPO^ 12 HoO is, na centri-
fugeeren of filtreeren, het gezuiverde product gereed, het-
welk daarna nog door een Seitz-Entkeimungsfilter wordt ge-
filtreerd.

Wanneer 15 % Na2HP04 12 HgO wordt gebruikt, moet.
na centrifugeeren of filtreeren, het gezuiverde product nog
door uitvriezen gedurende 24 uur met opvolgende filtratie
bevrijd worden van het overtollige fosfaat. Hierna wordt
dit gezuiverde product nog gefiltreerd door een Seitz-Ent-
keimungsfilter.

Het eindproduct, licht van kleur, bevat een meer of minder
groot gedeelte van het toxine of anatoxine, maar zeer weinig
niet specifieke proteinesubstanties.

Men kan een bijna kleurloos product verkrijgen door,
tegelijkertijd bij de adsorptie met aluminiumhydroxyde, ook
nog 2 % dierlijke kool toe te voegen. Door deze toe-
voeging van kool heeft echter wat meer verlies aan anti-
geen plaats.

Bij deze methode volgens Schmidt (127) kon door de
zuivering ± 97 % der niet specifieke proteinesubstanties
worden verwijderd; de gemiddelde opbrengst bedroeg onge-
veer 52 %.

De gezuiverde toxinen volgens de methode Schmidt zijn
minder toxisch dan de ruwe toxinen; het antitoxinebindend
vermogen is echter onveranderd.

Schmidt geeft op, dat de gezuiverde toxinen en anatoxinen
met de zelfde snelheid vlokken als de ruwe producten, die
voor hun bereiding hebben gediend.

Mijn ervaring, zooals nog nader zal blijken, is, dat de
gezuiverde producten steeds sneller vlokken.

De door immuniseeringsproeven van Claus Jensen (152)

verkregen resultaten hielden in, dat de gezuiverde anatoxinen
minstens even goed waren als de ruwe anatoxinen en dat
zij tot geen sterker reacties aanleiding gaven dan de ruwe
producten.

3®. Ramon, Legroux en Schoen (43 en 44) hebben in 1931
getracht het anatoxine door dissociatie vrij te maken uit de
verbinding anatoxine-antitoxine, een procédé, dat in 1923
reeds door Ramon is gebruikt om het complex toxine-anti-
toxine te dissocieeren en het antitoxine aldus weer terug te
krijgen. Eerst wordt een mengsel gemaakt van een bepaalde
hoeveelheid anatoxine, van bekende antigeenwaarde, met de
daarvoor benoodigde hoeveelheid antidiphtherieserum ter
initiale uitvlokking. Dit mengsel wordt in een waterbad bij
50° C. geplaatst. Wanneer de vlokking duidelijk waarneem-
baar is, wordt gecentrifugeerd en daarna de bovenstaande
vloeistof verwijderd.

Het aldus verkregen floculaat wordt gewasschen met physiolo-
gische zoutoplossing en opnieuw gecentrifugeerd. Na verwijde-
ring van het waschwater wordt V4 van het uitgangsvolumen,
anatoxine serum, aan gedestilleerd water toegevoegd.

Deze bereide suspensie wordt nu gedurende 20 minuten
verwarmd in een waterbad bij 82° C. Na deze verwarming
vertoont de oplossing slechts een lichte opalescentie.

Het antitoxine is dan, of geheel vernield, óf op zijn
minst inactief geworden, terwijl het anatoxine daarentegen
zich dan weer voor een groot gedeelte in actieven toestand
bevindt.

Met behulp van deze methode zou ook minstens 97 % der
niet specifieke proteinesubstanties van het ruwe product
worden verwijderd; verder werd door de schrijvers in vele
gevallen ook een goede opbrengst verkregen. Het immuni-
seerend vermogen der aldus gezuiverde anatoxinen was minstens
gelijk aan dat van het ruwe anatoxine. Het nadeel dezer
methode is, dat met het serum soortvreemd eiwit in het
product wordt gebracht.

Vanicek (160) heeft nog een methode beschreven om
diphtherietoxine en -anatoxine te zuiveren door middel van
dialyse.

Het ruwe product werd gebracht in een dialysezak, welke
zak zich weer bevond in een 50 % suikeroplossing. Daar deze
suikeroplossing een belangrijk grootere osmotische water-
attractie heeft dan het electrolytarme ruwe product, gaat
het water, dat zich in dit ruwe product bevindt, dus naar
de suikeroplossing. Met deze methode vindt echter alleen
concentreering, en geen eigenlijke zuivering plaats.

HOOFDSTUK III

BESCHRIJVING DER GEVOLGDE WERK-
WIJZEN

1. Precipitatie met aluminiumsulfaat.

Aan 1 liter van het uitgangsproduct werd, zonder eenige
Ppj-correctie, 13,2 gram aluminiumsulfaat [Alo(S04)8 9 HjO]
toegevoegd. Na eenige malen omschudden werd na drie uur
staan het neerslaan afgezogen, tweemaal met 600 c.c. ge-
destilleerd water gewasschen en gesuspendeerd in 200 c.c.
10% natriumfosfaatoplossing. (NagHPO^, 12 HgO).

Na tweemaal 24 uur werd wederom afgezogen, het filtraat
door uitvriezen van de overmaat natriumfosfaat bevrijd en
tenslotte nog door een Seitz-Entkeimungsfilter gefiltreerd.
Van het begin- en eindproduct werd steeds de antigeen-
waarde, het totaal stikstofgehalte en de waterstofionencon-
centratie bepaald.

Als zuiveringsfactor werd beschouwd het quotiënt:

gezuiverd product

A.W.nbsp;, ^

ruw product

N

waarin A.W. de antigeenwaarde en N het stikstofgehalte
aangeeft.

Alle bij deze proeven verkregen gezuiverde eindproducten
werden bewaard onder toluol en op geregelde tijden hiervan
de antigeenwaarden bepaald om op deze wijze een indruk
van de houdbaarheid der gezuiverde producten te verkrijgen.

2. Adsorptie met aluminiumhydroxyde.

a. Bereiding en bepaling van het aluminiumgehalte der
suspensies.

De suspensie werd bereid, door aan een op 63° C. ver-
hitte oplossing van 22 gram ammoniumsulfaat in 600 c.c.
gedestilleerd water, waarbij kort vóór de menging 100 c.c.
10% ammoniak werd gevoegd, toe te voegen een op 58° C.
verwarmde oplossing van 76,7 gram aluminiumammonium-
sulfaat 12 a.q. in 150 c.c. gedestilleerd water.

Hierbij precipiteert het aluminiumhydroxyde. Dit mengsel
werd onder voortdurend roeren gedurende 10 minuten op
58°a61°C. gehouden, daarna uitgegoten in 7,2 liter gedestil-
leerd water, waaraan 12,5 c.c. 10 % ammoniak was toegevoegd.

Na bezinken werd de bovenstaande heldere vloeistof met
behulp van een waterstraalzuigpomp weggezogen en opnieuw
7,2 liter gedestilleerd water, benevens 25 c.c. 10% ammoniak
toegevoegd.

Na bezinken werd wederom de bovenstaande vloeistof
weggezogen en 7,2 liter gedestilleerd water, nu zonder am-
moniak, toegevoegd. Deze laatste behandeling werd zoolang
voortgezet, totdat de suspensie niet geheel helder meer bezonk.
Meestal was dit na 4—-6 maal wasschen bereikt.

Daarna werd de suspensie afgezogen, gecentrifugeerd en
tot 500 c.c. aangevuld. Het geheele procédé werd in den
beginne in twee dagen, later in één dag en eenmaal ook in
2,5 uur uitgevoerd.

Zoo spoedig mogelijk, meestal den volgenden dag, werd
de aldus verkregen suspensie voor de adsorptie gebruikt.

De bepaling van het almuniumgehalte der suspensies is
zeer eenvoudig.

Een bepaalde hoeveelheid hiervan, b.v. 20 c.c., wordt in
duplo in een droogstoof bij ongeveer 150° C. ingedroogd en
vervolgens gegloeid tot constant gewicht. Het teruggewogen
AljOs wordt omgerekend tot grammen AlgOg per c.c. sus-
pensie. Als hoeveelheid grammen AljOs per c.c. suspensie
wordt aangenomen het gemiddelde der duploproef.

b. Adsorptie met de aluminiumhydroxydesuspensie.

Aan 1 liter van het al dan niet met 10% azijnzuur ten
opzichte van P^ gecorrigeerde toxine of anatoxine werd
200 c.c. der bovenbeschreven suspensie toegevoegd. Na een
kwartier staan, gedurende welken tijd eenige malen krachtig
werd doorgeschud, werd afgezogen, het residu tweemaal met
600 c.c. gedestilleerd water gewasschen en daarna opgewreven
met 200 c.c. 2,4% natriumfosfaatoplossing. (NaoHPO. 12

HgO.)

Na 1-2 uur staan werd wederom afgezogen en de hel-
dere vloeistof door een Seitz-Entkeimungsfilter gefiltreerd.

Werd het residu opgewreven met 200 c.c. 15% natrium-
fosfaatoplossing, dan werd na afzuigen het filtraat eerst
door uitvriezen van de overmaat natriumfosfaat bevrijd
en daarna de heldere vloeistof door een Seitz-Entkeimungs-
filter gefiltreerd. Van het begin- en eindproduct werd steeds
de antigeenwaarde, het totaal stikstofgehalte en de water-
stofionenconcentratie bepaald.

Als zuiveringsfactor werd ook hier weer beschouwd het
quotiënt:

A-W. , . ^

gezuiverd product.

KWnbsp;]

—j^j— ruw product.

De bij deze proeven verkregen gezuiverde eindproducten
werden eveneens bewaard onder toluol en op geregelde tijden
hiervan ook de antigeenwaarden bepaald om een indruk van
de houdbaarheid dezer gezuiverde producten te verkrijgen.

3. Bepaling der antigeenwaarden.

De antigeenwaarden der ongezuiverde en gezuiverde pro-
ducten werden bepaald met behulp van de vlokkingsreactie
volgens Ramon (22). Hierbij wordt gebruik gemaakt van een
serum van bekende sterkte, hetwelk zoo sterk wordt verdund,
dat deze serum verdunning 100 of 200 A.E. per c.c. bevat.

Aan een rij buisjes, waarin eerst 5 c.c. van het te onder-

zoeken product is gebracht, worden nu opklimmende hoeveel-
heden antitoxine-eenheden toegevoegd, benoodigd voor de
antigeenwaarde, die men in elk buisje vermoedt. Daarna
worden de buisjes geplaatst in een waterbad bij 50° C. Het
buisje waarin het eerst vlokking optreedt, geeft dan de ge-
zochte antigeenwaarde aan.

4. Bepaling der totaal stikstofgehalten.

Het stikstofgehalte der ongezuiverde en gezuiverde pro-
ducten werd bepaald met een eenigermate gewijzigde methode
volgens Kjeldahl. Deze methode werd steeds uitgevoerd in
duplo en dan het gemiddelde hiervan als vaste waarde aan-
genomen.

In een Kjeldahlkolf wordt gebracht een schepje van het
mengsel: 97,5% KgSO^ 2,5 % CuSO^. Met een geijkte
pipet wordt 5 c.c. van het te onderzoeken product in de zelfde
kolf gebracht, waarna nog 20 c.c. geconcentreerd zwavelzuur
wordt toegevoegd. Dit geheel wordt, na goed mengen, verhit
op een zandbad totdat de vloeistof in de kolf een licht
blauwgroene tint aanneemt. Het bovengenoemde mengsel
wordt toegevoegd, om de verbranding der organische stoffen
te bespoedigen. Door over te gaan van cupri- in cupro-
verbinding, draagt kopersulfaat de zuurstof over op de te
oxydeeren stoffen. Zelf wordt de cuproverbinding door de
zuurstof uit de lucht, benevens het zwavelzuur weer gemak-
kelijk tot cupriverbinding geoxydeerd.

Door de verhitting worden de stikstofhoudende bestand-
deelen van organischen aard vernield, waarbij steeds de stik-
stof in den vorm van ammoniak vrij komt en deze zich met
het zwavelzuur verbindt tot ammoniumsulfaat.

Wanneer de blauwgroene kleur aanwezig is kan men
aannemen, dat alle stikstof aanwezig is in den vorm van
ammoniumsulfaat. Hierna wordt verdund met 250 c.c. leiding-
water, geschud en eenig puimsteen toegevoegd. Vervolgens toe-
voeging van 50 ä 60 c.c. 50 % natronloog, waardoor de vloei-
stof alkalisch wordt gemaakt en de ammoniak in vrijheid gesteld.

Door overdestilleeren vangt men deze ammoniak op in een
Erlenmeyer, waarin zich bevindt een schepje boorzuur, 90 c.c.
gedestilleerd water en 5 druppels eener 0,5 % oplossing van
broomkresolgroen in alcohol als indicator.

Men destilleert circa 150 c.c. over. Boorzuur bindt de
ammoniak volledig.

Vervolgens wordt getitreerd met ^/lo normaal zoutzuur,
totdat de blauwe kleur der vloeistof in een even groene ver-
kleuring overgaat. Bij gebruik maken van boorzuur wordt de
ammoniak direkt teruggetitreerd, omdat ammoniumboraat zich
weer gemakkelijk splitst en bovendien behoeven we hierdoor
de gebruikte hoeveelheid boorzuur niet te kennen. Verder
geeft boorzuur ook geen moeilijkheden bij het omslaan van
de indicator.

Een blancoproef, waarbij men als organische substantie die
vernield wordt, zuivere stikstofvrije glucose gebruikt, wordt
op bekende wijze in rekening gebracht.

5.nbsp;Bepaling der waterstofionenconcentraties.

De PH-bepalingen der begin- en eindproducten werden
verricht met het toestel, hetwelk is uitgevoerd door Barendrecht
en volgens een gewijzigde techniek beschreven door Jan
Smit (163).

6.nbsp;Bepaling der hoeveelheid antitoxinen in het serum.

De hoeveelheid antitoxinen in het serum werd bepaald met

behulp van de intracutane titratiemethode, zooals deze in
1909 is voorgesteld door Römer en Sames. Nadien heeft
deze methode eenige wijzigingen ondergaan: in 1922 door
Kellogg, welke slechts bepaalde of het serum meer of minder
dan Yso A.E. per c.c. bevatte. De laatste wijziging der
intracutane titratiemethode is in 1931 beschreven door Glenny
en Mona Llewellyn — Jones {\2l) en hier te lande uitgewerkt
door Pondman en Tasman (162).

Volgens deze techniek werd hier hoofdzakelijk te werk
gegaan.

Voor de proeven werden alleen gebruikt witte caviae met
een gewicht van 300 gram of meer.

De huid der caviae mag niet gelaedeerd zijn. Eerst werden
de haren aan de zijkanten geknipt, op den rug werd een
smalle streep haar overgelaten. Na het knippen behandelde
men de huid met een ontharingspasta van de volgende samen-
stelling :

bariumsulfide 7 deelen, meel 7 deelen, talk 7 deelen, ge-
poederde harde zeep 1 deel.

Een kleine hoeveelheid van dit mengsel werd met wat
water tot een papje verwerkt. Deze pasta werd nu op de
huid gebracht en eenigen tijd hierop gelaten. Daarna kon de
pasta, met inbegrip der haren, gemakkelijk worden verwijderd.

Voorafgaande aan de eigenlijke titratie wordt eerst standaard-
serum (Frankfurt) getitreerd tegenover een toxine van bekende
sterkte. Eén c.c. eener verdunning van standaardserum, welke
Vio A.E. per c.c. bevat, wórdt gemengd met afdalende hoe-
veelheden van een toxine van bekende sterkte en elk dezer
aldus verkregen mengsels met physiologische zoutoplossing
aangevuld tot 10 c.c. Na goed schudden wordt van elk dezer
mengsels 0,2 c.c. intracutaan ingespoten bij een cavia om zoo-
doende de „minimal reaction dosisquot; (M.R.D.) volgens Glenny
te leeren kennen. Hieronder wordt verstaan die hoeveelheid
toxine, welke, gemengd met Vio A.E., nog juist bij intracu-
taan inspuiten als reactie een kleine roodheid te zien geeft.
De plaatsen van inspuiting kunnen worden gemarkeerd met
Oost-Indische inkt. Na 24 uur wordt afgelezen.

Op de zoodoende vooraf bepaalde M.R.D. wordt nu in-
gesteld om het antitoxinengehalte van het serum te bepalen.

Verschillende opklimmende serumhoeveelheden worden ge-
mengd met die hoeveelheid toxine, welke men in de M.R.D.
heeft leeren kennen. Deze mengsels worden eveneens met
physiologische zoutoplossing aangevuld tot 10 c.c. en, na
goed schudden, wordt van elk dezer mengsels weer 0,2 c.c.
intracutaan bij een cavia ingespoten en na 24 uur afgelezen.

Die hoeveelheid serum, gemengd met de hoeveelheid toxine

van het mengsel der M.R.D., welke een reactie geeft over-
eenkomende met die van de M.R.D., bevat dan Vio A.E.
De hoeveelheid antitoxine-eenheden per c.c. serum kan nu
worden berekend.

Deze methode is zeer betrouwbaar en economisch, kost
weinig dieren en de uitkomsten zijn vlug bekend.

Op deze wijze zou het volgens Glenny zelfs mogelijk zijn
V2000 tot Vbooo A.E. per c.c. serum te bepalen.

Door mij werd voor deze intracutane titratiemethode ook
nog gebruik gemaakt van witte konijnen, zooals deze in
1931 is aangegeven door Claus Jensen (151).

Hiervoor werden gebruikt gezonde mannelijke witte konijnen
van ongeveer 3 K.G., welke ook op de beschreven wijze
werden onthaard en ingespoten. Aflezing geschiedde hierbij
echter eerst na tweemaal 24 uur.

Volgens mijn ervaring is ook de methode van Claus Jensen
zeer betrouwbaar en bovendien kunnen op het konijn meer
inspuitingen geplaatst worden dan bij de cavia.

De locale reacties bij het konijn geven meer aanleiding tot
necrose dan bij de cavia en er zijn scherpere verschillen waar
te nemen bij het afnemen in sterkte der reacties, welke door
de mengsels worden veroorzaakt.

HOOFDSTUK IV
EIGEN ONDERZOEK

VERGELIJKENDE ZUIVERINGSPROEVEN

§ 1.

Zuivcringsprocvcn volgens de precipitatiemethode
Zuiveringsproeven volgens de adsorptiemethode,
Zonder correctie van dc Ph

Als voorbeeld van toxinezuivering en anatoxinezuivering,
uitgevoerd volgens de precipitatiemethode en volgens de
adsorptiemethode zonder correctie van de P^, worden hier-
onder de verschillende bepalingen van toxine No, 204, met
inbegrip der resultaten, weergegeven.

Toxine No. 204.

A.W. = 10. Kf. = 24 min. totaal N = 0,299,
A W

Resultaten t

Precipitatiemethode: A.W. = 38. Kf = 7 min, totaal N=:0,164.
A W

^ = 232. Ph = 7,69.
Opbrengst = 76 Zuiveringsfactor = 7.
Adsorptiemethode: suspensie van aluminiumhydroxyde be-

reid in 2 dagen, 4 maal gewasschen; bevatte 0,01662 gram
AlgOg per c.c.

A.W. = 28. Kf = 9 min. totaal N = 0,032.

^^ =: 875. Ph = niet verricht.

Opbrengst = 60 % Zuiveringsfactor = 27.
De elutie geschiedde met 2,4 o/o Na2HP0412 H3O.
Hierbij moet, ter nadere verklaring der gebruikte teekens,
het volgende worden opgemerkt:

A.W. = antigeenwaarde.
Kf = uitvlokkingssnelheid.
N = stikstofgehalte.
Pf^ waterstof ionenconcentratie.

gezuiverd product.

Zuiveringsfactor = ^ ^

N

De suspensies van aluminiumhydroxyde, gebruikt voor toe-
passing der adsorptiemethode, werden in de hieronder aan-
gegeven tijden bereid en bij de ter plaatse genoemde toxinen
en anatoxinen toegepast.

Een der door mij bereide suspensies van aluminiumhydroxyde
werd nog verdund tot het gehalte 0,0007 gr. AlgOg per c.c.,
welk gehalte op één plaats in de literatuur (130) door 5c/Im^c/^
wordt opgegeven.

TABEL I.

UITGANGSPRODUCT

gelukte toxinen •
gelukte anatoxin^ '

gezuiverde producten

Precipitatiemethode

•u

B

'53

toxinen 9
gelukte anatoxinen 8

Aan 1 liter uitgangsvloeistof werd 200 c.c. van deze ver-
dunde suspensie toegevoegd. Er ontstond slechts een zeer
weinig troebele vloeistof, geen neerslag. Een dergelijke, ge-
ring troebele vloeistof bleek praktisch niet voor verwerking
vatbaar te zijn, zoodat de opgave van Schmidt vermoedelijk
op een vergissing zal berusten.

Bij alle zuiveringen volgens de precipitatiemethode vond
de elutie plaats met 10 7o NagHPOi 12 HgO en opvolgend
uitvriezen.

Bij de zuiveringen volgens de adsorptiemethode werd hier-
voor 2,4% Na2HP04 12 HgO gebruikt, uitgezonderd bij de
hieronder genoemde toxinen en anatoxinen, waar de elutie
geschiedde met 15 7o NaaHPO^ 12 HgO en opvolgend uit-
vriezen.

Toxine T2nbsp;Anatoxine 202(c)

200nbsp;„ 203(a)

203(b)
Tl

Overigens wordt voor de door mij verrichte zuiveringen
volgens de precipitatiemethode en volgens de adsorptiemethode
zonder correctie van de Ph verwezen naar tabel 1, voor de
hierbij gevolgde zuiveringstechniek en werkwijzen naar hoofd-
stuk III.

Uit tabel I volgt dat van de 10 toxinezuiveringen volgens
de adsorptiemethode er 8 gelukt en 2 mislukt zijn.

Van de 7 anatoxinezuiveringen volgens de adsorptiemethode
zijn er 3 gelukt (waarvan 1 slecht) en 4 mislukt.

Het aantal mislukkingen bij de anatoxinen is dus naar ver-
houding grooter dan bij de toxinen.

Als mislukt werd de adsorptie beschouwd, wanneer van
het verkregen product door middel van uitvlokking geen
antigeenwaarde (A.W.) was te bepalen. Zooals verder zal
blijken speelt hierbij de Ph van het uitgangsproduct waar-
schijnlijk een rol. Het gehalte aan AlgOg der suspensies van
aluminiumhydroxyde is niet de beslissende factor, zooals de
tabel leert.

De gemiddelde zuiveringsfactor bij de gelukte toxinezuive-
ringen volgens de adsorptiemethode bedroeg 26, de gemiddelde
opbrengst 48%.

De gemiddelde zuiveringsfactor bij de gelukte anatoxine-
zuiveringen volgens de adsorptiemethode bedroeg 13, de ge-
middelde opbrengst 47 %.

De 10 toxinezuiveringen volgens de precipitatiemethode zi]n
allen gelukt; gemiddelde zuiveringsfactor 9, gemiddelde op-
brengst 71 7o'

Van de 7 anatoxinezuiveringen volgens de precipitatie-
methode zijn er 6 gelukt en 1 mislukt; gemiddelde zuiverings-
factor der gelukte anatoxinen 8, gemiddelde opbrengst der
gelukte anatoxinen 74 %.

TABEL II.

Verandering in antigeenwaarde der gezuiverde toxinen en anatoxinen,
telkens met één maand tusschentijd bepaald.

TABEL II (vervolg van blz. 65).

gez. tox.
199

gez. ana'
tox.T2
gez. ana-
tox.203

gez. ana-
tox. 198
gez. ana-
tox.200

gez. tox.
T2

gez. tox.
195

gez. ana-
tox.195

gez. tox.
200

gez. tox.
197
gez. tox.
T6

In tabel II is overzichtelijk weergegeven de verandering
in antigeenwaarde van elk gezuiverd diphtherietoxine en
-anatoxine. dus de houdbaarheid dezer producten, bepaald
met de vlokkingsreactie volgens Ramon.

Voor beide methodes neemt de antigeenwaarde der ge-
zuiverde producten met de tijd zeer weinig en in ongeveer
gelijke mate af.

De houdbaarheid is dus dezelfde.

Waar bij enkele producten de A.W.-waarde schijnbaar is
toegenomen, moet daarvan de verklaring zijn kleine afwijkingen
in het bindend vermogen van het gebruikte serum of het ge-
lijktijdig vlokken in naburige buisjes, dus het moeilijk vast-
stellen van de „floculation initialequot;.

Wanneer men de gezuiverde producten koud en in het
donker onder toluol bewaart, is de vermindering der anti-
geenwaarde binnen een niet al te groote tijdruimte slechts
gering.

§2.

Zuiveringsproeven volgens de precipitatiemethode.

Zuiveringsproeven volgens de adsorptiemethode
met correctie van de Pjj.

De Ph van toxinen, bestemd voor de zuivering volgens
de adsorptiemethode, werd gebracht op i 7,5; de Ph van
anatoxinen, bestemd voor de zuivering volgens de adsorptie-
methode, werd gebracht op i 6.

Hiervoor werd gebruik gemaakt van 10 % azijnzuur.

De suspensies van aluminiumhydroxyde, gebruikt voor toe-
passing der adsorptiemethode, werden allen in 1 dag bereid,
maar een verschillend aantal keeren gewasschen, varieerende
van 4—7 maal.

Bij alle zuiveringen volgens de precipitatiemethode geschiedde
de elutie met 10 % NagHPO^ 12 HgO en opvolgend uit-
vriezen.

Bij alle zuiveringen volgens de adsorptiemethode werd voor
de elutie 2,4 % NasHPOi 12 HgO gebruikt.

Voor de door mij verrichte zuiveringen volgens de pre-
cipitatiemethode en volgens de adsorptiemethode met correctie

TABEL III.

Deze waarde ligt Iets beneden die, welke wij vonden voor suspensies, welke 1®
twee dagen bereid waren, daar in het laatste geval uit hoofde van de grooter^
tusschenruimten bi) de waterververschingen het neerslag vollediger bezinken ka»
en dus minder aluminiumhydroxyde met het waschwater verwijderd wordt.

Precipitatlemethode

van de Ph wordt verder verwezen naar tabel 3, voor de
hierbij gevolgde zuiveringstechniek en werkwijzen naar
hoofdstuk III.

Uit tabel III blijkt dat na correctie der Ph van de 17 to-
xinezuiveringen volgens de adsorptiemethode er 16 zijn gelukt
en slechts 1 mislukt.

De 10 anatoxinezuiveringen volgens de adsorptiemethode
zijn allen gelukt, waaruit volgt dat de Ph van het uitgangs-
product, vooral van de anatoxinen. voor het gelukken der
zuiveringen volgens de adsorptiemethode blijkbaar van groote
beteekenis is.

De gemiddelde zuiveringsfactor bij de gelukte toxine-
zuiveringen volgens de adsorptiemethode bedroeg 25, de
gemiddelde opbrengst 44

Deze waarden verschillen dus niet veel van die der gelukte
toxinezuiveringen volgens de adsorptiemethode uit tabel I,
waarbij geen aandacht werd geschonken aan de Ph van
het uitgangsproduct.

De gemiddelde zuiveringsfactor bij de gezuiverde anatoxinen
volgens de adsorptiemethode bedroeg 14 en de gemiddelde
opbrengst 62 %.

Deze gemiddelde zuiveringsfactor verschilt dus weinig van
die der gelukte anatoxinen volgens de adsorptiemethode uit
tabel I, de gemiddelde opbrengst blijkt echter belangrijk
hooger te zijn nu aandacht is geschonken aan de Pyi van
het uitgangsanatoxine.

De 17 toxinezuiveringen volgens de precipitatiemethode zi\n
allen gelukt; de gemiddelde zuiveringsfactor bedroeg 10, de
gemiddelde opbrengst 76

De 7 anatoxinezuiveringen volgens de precipitatiemethode
zijn eveneens allen gelukt; de gemiddelde zuiveringsfactor
bedroeg 9, de gemiddelde opbrengst 83 %.

Wanneer wij nu de adsorptiemethode en de precipitatie-
methode aan een nadere beschouwing onderwerpen, dan
blijkt dat de gemiddelde zuiveringsfactor van de gezuiverde
toxinen volgens de adsorptiemethode belangrijk hooger is

dan die der gezuiverde toxinen volgens de precipitatiemethode.

De gemiddelde zuiveringsfactor van de gezuiverde ana-
toxinen volgens de adsorptiemethode is ook hooger, evenwel
in geringere mate dan die der gezuiverde anatoxinen volgens
de precipitatiemethode; de gemiddelde opbrengst der ge-
zuiverde anatoxinen volgens de adsorptiemethode blijft echter
veel lager dan die der gezuiverde anatoxinen volgens de
precipatiemethode.

TABEL IV.

Verandering in antigeenwaarde der gezuiverde toxinen en anatoxinen«
telkens met één maand tusschentijd bepaald.

No;

gez. tox.
TIO

gez. tox.
T3A
gez. ana-
tox. 198

gez. tox.
T 14

gez. tox.
Til

gez. ana-
tox.T2A
gez. ana-
tox. T 1

gez. tox.
T15

gez. tox.
T12

gez. ana-
tox. 194
gez. ana-
tox. 203

gez. tox.
T16

TABEL IV (vervolg van blz. 71).

No.

gez. ana-
tox. T8

gez. tox.
T9
gez. tox.
211
gez. tox.
T18

gez. ana-
tox. T9
gez. ana-
tox. T6

gez. tox.
T7
gez. tox.
T19

In tabel IV is aangeteekend de verandering in antigeen-
waarde van elk gezuiverd diphtherietoxine en -anatoxine,
dus de houdbaarheid dezer producten, bepaald met de vlok-
kingsreactie volgens Ramon.

De gezuiverde producten werden koud en in het donker
onder toluol bewaard.

Voor beide methodes neemt weer de antigeenwaarde der

gezuiverde producten binnen een niet al te groote tijdruimte
zeer weinig en in ongeveer gelijke mate af.
De houdbaarheid is dus dezelfde.

Waar bij enkele producten de A.W.-waarde schijnbaar is
toegenomen, moet daarvan de verklaring weer zijn kleine
verschillen in het bindend vermogen van het gebruikte serum
of het gelijktijdig vlokken in naburige buisjes, dus het moeilijk
vaststellen van de „floculation initialequot;.

HOOFDSTUK V
EIGEN ONDERZOEK

VERGELIJKENDE IMMUNISATIEPROEVEN

§1.

Nagegaan werd:

1°. Of de antigeenwaarden (A.W.'s) van een ongezuiverd
zwak anatoxine, een ongezuiverd sterk anatoxine, een gezuiverd
zwak anatoxine en een gezuiverd sterk anatoxine gelijk-
waardig zijn;

2°. het resultaat van het toedienen van eenzelfde hoeveel-
heid A.W.'s in één inspuiting of verdeeld over drie inspuitingen;

3°. de invloed van een depötwerking door inspuiting der
Ramonvlokken van het ongezuiverde product en van het
gezuiverde product, dus van antigeen gebonden aan anti-
toxin, „Anantiquot;.

De gebruikte gezuiverde producten werden verkregen uit-
sluitend door middel van de precipitatiemethode.

De onderstaande dierproeven werden hiertoe verricht.

Groep It ongezuiverd zwak anatoxine, 3 maal.

10 caviae werden 3 maal subcutaan ingespoten met 0,7 c.c.
(= 5 A.W.) ongezuiverd zwak anatoxine A.W. 7. In het
geheel krijgen deze caviae dus subcutaan 15 A.W. Als tusschen-
ruimten voor de inspuitingen werden genomen resp. 3 en
2 weken.

Gebruikt werd anatoxine No. 134: A.W. = 7. Kf = 48 min.
A W

tot. N = 0,300. = 23.

Ter conserveering werd steeds 0,5% carbol toegevoegd.
De steriliteit werd steeds nagegaan door enten in runder-
bouillon en op ascitesagar; na 2 dagen werd definitief afgelezen.

Groep II t ongezuiverd sterk anatoxine, 3 maal.
10 caviae werden 3 maal subcutaan ingespoten met 0,4 c.c.
(= 5 A.W.) ongezuiverd sterk anatoxine A.W. 13. In het
geheel krijgen deze caviae dus subcutaan ook 15 A.W.

Als tusschenruimten voor de inspuitingen weer resp. 3 en
2 weken.

Gebruikt werd anatoxine No. 194 D: A.W. = 13. Kf=:30
A W

min. tot. N = 0.305. ^^^=43.

Groep III: gezuiverd zwak anatoxine, 3 maal.
10 caviae werden 3 maal subcutaan ingespoten met 0,33 c.c.
(= 5 A.W.) gezuiverd zwak anatoxine A.W. 15. In het ge-
heel krijgen deze caviae dus subcutaan ook weer 15 A.iy.
Als tusschenruimten voor de inspuitingen resp. 3 en 2 weken.
Gebruikt werd gezuiverd anatoxine No. 134: A.W. = 15.

Kf =: 30 min. tot. N = 0,101. ^^ = 149.

Zuiveringsfactor = 6. Opbrengst = 43

Groep IV t gezuiverd sterk anatoxine, 3 maal.
10 caviae werden 3 maal subcutaan ingespoten met 0,12 c.c.
(= 5 A.W.) gezuiverd sterk anatoxine A.W. 43. In het ge-
heel dus ook weer 15 A.W. subcutaan toegediend.
Als tusschenruimten voor de inspuitingen resp. 3 en 2 weken.
Gebruikt werd gezuiverd anatoxine No. 194 D: A.W. = 43.

Kf = 11 min. tot. N = 0,168. ^^ = 256.

Zuiveringsfactor = 6. Opbrengst = 66 %.

Groep Vt ongezuiverd sterk anatoxine, 1 maal.

10 caviae werden 1 maal subcutaan ingespoten met 1,16 c.c.
(= 15 A.W.) ongezuiverd sterk anatoxine A.W. 13. Elke
cavia van deze groep krijgt dus ook 15 A.W. subcutaan,
hier echter in één keer toegediend.

Gebruikt werd weer anatoxine No. 194 D.

Groep VI: gezuiverd sterk anatoxine (verdund), 3 maal.

10 caviae werden 3 maal subcutaan ingespoten met 1 c.c.
gezuiverd sterk anatoxine A.W. 43, dat tevoren met phy-
siologische zoutoplossing 8,6 maal was verdund (= 5 A.W.)

In het geheel krijgt elke cavia van deze groep dus sub-
cutaan ook weer 15 A.W.

Als tusschenruimten voor de inspuitingen resp. 3 en 2 weken.

Gebruikt werd gezuiverd anatoxine No. 194 D.

Groep VIII gezuiverd sterk anatoxine, 1 maal.

10 caviae werden 1 maal subcutaan ingespoten met 1 c.c.
gezuiverd sterk anatoxine A.W. 43, waarvan de antigeen-
waarde met physiologische zoutoplossing was teruggebracht tot
30 A.W. per c.c. In het geheel krijgt elke cavia van deze
groep dus 30 A.W. subcutaan in één keer toegediend.

Gebruikt werd gezuiverd anatoxine No. 194 D.

Groep VIII t vlokken uit gezuiverd sterk anatoxine, 1 maal.

10 caviae werden 1 maal subcutaan ingespoten met 1 c.c.
eener hieronder beschreven vlokkensuspensie.

30 c.c. gezuiverd sterk anatoxine A.W. 43 werden met
behulp van 56 c.c. physiologische zoutoplossing teruggebracht
tot 15 A.W. per c.c., dus dan 86 c.c. van 15 A.W. per c.c.

Hiervan wordt op steriele wijze 30 c.c. gemengd met
30 X 15 = 450 A.E. van het standaardserum (Frankfurt) en
in het waterbad bij 50° C. geplaatst. Na de uitvlokking
blijft dit nog een uur in het waterbad staan en wordt hierna
gedurende 2 maal 24 uur in de ijskast geplaatst.

Vervolgens wordt gecentrifugeerd en de bovenstaande

vloeistof afgegoten. De vlokken worden nog één maal met
physiologische zoutoplossing gewasschen en gecentrifugeerd.

De vlokken worden tenslotte gesuspendeerd in 30 c.c. ge-
zuiverd sterk anatoxirte van 15 A.W. per c.c.

1 c.c. dezer suspensie bevat dus 30 A.W., waarvan 15 A.W.
opgelost en 15 A.W., in aan antitoxine gebonden vorm, als
vlokken.

Voor het bereiden der suspensie werd gebruikt gezuiverd
anatoxine No. 194 D.

Groep IX t vlokken uit ongezuiverd sterk anatoxine. 1 maal.

10 caviae werden 1 maal subcutaan ingespoten met 1 c.c.
eener hieronder beschreven vlokkensuspensie.

30 c.c. ongezuiverd sterk anatoxine A.W. 13 werden op
steriele wijze gemengd met 30 X 13 = 390 A.E. van het
standaardserum (Frankfurt) en hierna in het waterbad bij
50° C. tot vlokken gebracht.

De verdere bewerking dezer vlokken geschiedde op dezelfde
wijze als voor de vlokken van groep VIII is uiteengezet.

De vlokken worden tenslotte gesuspendeerd in 26 c.c. ge-
zuiverd sterk anatoxine A.W. 43. waarvan de antigeenwaarde
met behulp van physiologische zoutoplossing is teruggebracht
van 43 A.W. op 15 A.W. per c.c.

1 c.c. dezer suspensie bevat dus ook 30 A.W., waarvan
15 A.W. opgelost en 15 A.W., in aan antitoxine gebonden
vorm, als vlokken.

Voor het bereiden der suspensie werden gebruikt anatoxine
No. 194 D en gezuiverd anatoxine No. 194 D.

Van groepen VIII en IX werden de locale reacties nagegaan.

De eerste dag na de inspuiting waren bij beide groepen
op de entingplaats infiltraten te voelen.

De infiltraten van groep VIII (behandeld met Ananti-
vlokken van het gezuiverde anatoxine), waren grooter dan
die van groep IX (behandeld met Anantivlokken van het
ongezuiverde anatoxine).

Na 5 dagen waren bij 4 caviae van groep VIII nog duide-
lijke infiltraten te voelen, de infiltraten der andere 6 caviae
van groep VIII waren klein.

Van groep IX waren bij alle 10 caviae na 5 dagen kleine
infiltraten te vinden.

De locale reacties, welke zich vormen na de inspuiting
van anatoxine en gezuiverd anatoxine, zullen in latere im-
muniseeringsproeven nog nauwkeurig ter sprake komen.

Teneinde na te gaan in hoeverre de inspuitingen met
anatoxine, gezuiverd en ongezuiverd, en met vlokken door
de dieren zonder schade werden verdragen, werd het lichaams-
gewicht der dieren geregeld gecontroleerd, waarbij bleek dat
dit regelmatig toenam.

Door verbloeding na de hartpunctie of door intercurrente
ziekten verloor ik in

groep I: 1 proefdier
II: 5 proefdieren
III: 3
.. IV: 3
.. V: 4 „
.. VI: 4
.. VII: 6
„ VIII: 5
.. IX: 5

Bij geen dezer dieren werden bij de sectie verschijnselen
van diphtherievergiftiging gevonden.

Antitoxinegehalte 7 weken na de eerste inspuiting

Om van de verkregen immuniteit der behandelde proef-
dieren een indruk te krijgen, werd 7 weken na de eerste
inspuiting van alle dieren door middel van hartpunctie bloed af-
genomen. Het bloed van alle caviae uit één groep werd gemengd
en na het stollen het uitgeperste serum afgecentrifugeerd.
Voor conserveering werd 1 7oo superol aan de sera toegevoegd.

Voor de titratie dezer sera werd gebruik gemaakt van de

door Glenny verbeterde Römer-methode, welke hier te lande
is uitgewerkt door Pondman en Tasman, beschreven in
hoofdstuk III op blz. 57.

De titratie werd verricht op de cavia en op het konijn.

Om de bindingswaarde van het te gebruiken toxine te
bepalen, werd gewerkt met standaardserum (Frankfurt) en
een toxine met A.W. = 14 en d.l.m. = 2,5 m.gr.

De resultaten dezer bepaling, uitgevoerd op de cavia en
op het konijn, zijn van de bijgaande photo's af te lezen en
in tabel V overzichtelijk weergegeven.

TABEL V

Bepaling bindingswaarde van het gebruikte toxine.

Huidreactie na
2X24 u. bij het
konijn

Uit tabel V volgt dat de mengsels 5,6 en 7 per 10 c.c.
0,1 A.E. en resp. 8,6 en 4 d.l.m. bevatten of in 0,2 c.c.
Vboo A.E. en resp. 0,16, 0,12 en 0,08 d.l.m.