Diss.
Utrecht

19S5.

TER VERKRI)GING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT.
OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS
Dr. C. G. N. DE VOOYS, HOOGLEERAAR IN
DE FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJS-
BEGEERTE. VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE
BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER
WIS- EN NATUURKUNDE, TE VERDEDIGEN
OP MAANDAG 3 JULI 1933 DES NAMIDDAGS
TE VIER UUR

Bij het voltooien van mijn proefschrift, maak ik gaarne van de
gewoonte gebruik, allen te bedanken, die tot mijn wetenschappe-
lijke opleiding hebben bijgedragen.

Hooggeleerde W e s t e r d ij k. Hooggeachte Promotor, U vooral
ben ik zeer veel dank verschuldigd. De wijze, waarop U óns in de
Phytopathologie inwijdt, wekte mijn liefde voor Uw vak op en
werd beslissend voor de richting in mijn verdere studie. Dat ik
nog verder onder Uw leiding in Baarn kan blijven werken, stel ik
zeer op prijs. De jaren, die ik in Baarn doorbracht, zullen steeds
tot de aangenaamste herinneringen van mijn studietijd blijven be-
hooren.

Hooggeleerde Went, het is mij een groot voorrecht onder Uw
leiding de Plantenphysiologie te hebben mogen bestudeeren. Uw
persoonlijke belangstelling voor de studenten heeft mij altijd bij-
zonder getroffen.

Hooggeleerde Pu 11e en R u 11 e n, aan Uw colleges, practica
en niet het minst aan de leerrijke excursies denk ik steeds met ge-
noegen terug.

Hooggeleerde Nierstrasz en de Bussy, ook U dank ik
voor Uw interessante colleges.

U, Zeergeachte van L u ij k, dank ik voor Uw groote hulpvaar-
digheid. De wijze waarop U mij steeds met raad en daad bijstond,
zal ik niet licht vergeten.

Den Heer J. G o o s s e n, oud-hortulanus van het Cantonspark,
dank ik voor zijn hulpvaardigheid.

Verder een woord van dank aan allen, die mij op eenige wijze
behulpzaam waren bij het samenstellen van dit proefschrift.

Tenslotte rest mij nog een woord van dank aan het Bestuur van
de Stichting ,,Willie Commelin Scholtenquot; voor de gastvrijheid,
welke ik in haar laboratorium mocht genieten.

Wanneer men voor infectieproeven gebruik maakt van rein-
cuitures van schimmels, dan heeft men in het algemeen te maken
met schimmels, die reeds eenige tijd op een voedingsbodem ge-
kweekt worden, vóórdat men er de planten mee infecteert. Nu
2«)n sommige onderzoekers de meening toegedaan, dat schimmels
aoor de kunstmatige cultuur in virulentie achteruitgaan, of zelfs
^laar virulentie geheel verliezen. Onder virulentie wordt hier ver-
staan de graad van het infectievermogen van een schimmel voor
een bepaalde plantensoort. Virulentie moet dus onderscheiden wor-
«len van parasitair vermogen, d.i. het vermogen om verschillende
plantensoorten aan te tasten.

Ofschoon het hier een kwestie geldt, die voor de Phytopathologie
van zeer veel belang moet worden geacht, waren er tot nu toe
nooit systematische proeven genomen om uit te maken, of een be-
paalde schimmel inderdaad minder virulent wordt voor een be-
Paalde plant, wanneer zi; gedurende eenige tijd op verschillende
^gt;J2e in reincultuur is gekweekt en dus saprophytisch is gevoed.

Ook de vraag, of een éénvormige voeding in dit opzicht verschilt
van een meer gevarieerde, had men nog niet op exacte wijze trach-
ten op te lossen.

Het doel van deze onderzoekingen was dan ook om na te gaan.
'n hoeverre er inderdaad sprake kan zijn van de invloed van
sa^ophytische voeding op de virulentie van een schimmel.

Voor de proeven werden gebruikt Sclerotinia sclerotiorum (Lib.)
^assee en Rhizoctonia solani Kühn. Beide schimmels zijn para-
S'eten. die zich normaal en vlug ontwikkelen op zeer verschillende
Voedingsbodems.

^^ De graad van het infectievermogen van deze schimmels ten op-
^'chte van kiemplanten van resp. tomaten en raapstelen werd on-
erzocht. Het werken met kiemplanten heeft het groote voordeel.

dat de infectie over het algemeen snel verloopt en dat het ziekte-
beeld duidelijk is. Bovendien kan men makkelijk met een groot aan-
tal kiemplanten werken.

Onder normale omstandigheden sterven na infectie met Sclero-
tinia sclerotiorum een groot percentage van de tomatenkiemplan-
ten; na infectie met Rhizoctonia solani sterven zelfs 100% van
de raapstelenkiemplanten. Door de schimmels op verschillende
voedingsbodems te kweeken, vóórdat zij voor de infectieproeven
werden gebruikt, moest nu worden nagegaan, of het infectie-per-
centage aan verandering onderhevig was en men dus zou kunnen
spreken van een invloed van de voeding op de virulentie.

Over het begrip virulentie van een schimmel en over de veran-
dering van de virulentie vindt men in de literatuur uiteenloopende
meeningen.

Fische r-G ä u m a n n (1929) onderscheiden in hun handboek
aggressiviteit en virulentie. Onder aggressiviteit verstaan zij het
parasitaire vermogen van de schimmel in het algemeen: dit is een
absolute waarde en deze kan niet gemeten worden. Virulentie
daarentegen is de graad van de pathogene werkzaamheid van de
schimmel t.o.v. een bepaalde gastheer. De virulentie kan ge-
meten worden naar de werking van de parasiet op een bepaalde
plant; hoe grooter de werking, des te grooter is de virulentie.
Meestal worden deze begrippen echter niet uit elkaar gehouden
en wordt alles onder virulentie samengevat. Zoo zegt M a r c h a 1
(1925) b.v.: „de virulentie is de eigenschap van parasitaire schim-
mels om levend weefsel aan te tasten. Bij obligate parasieten is
deze virulentie een vast begrip, maar bij de facultatieve parasieten
niet.' waarbij dan ook drie gevallen zijn te onderscheiden en wel:
verkrijgen van virulentie, verhoogde virulentie en verlies ervan.
De virulentie van een schimmel kan zoodanig zijn, dat zij het ver-
mogen heeft planten uit verschillende groepen aan te tasten. De
polyphage schimmels zijn meestal facultatieve parasieten; bij de
obligate parasieten ziet men echter, dat ze slechts leven kunnen
op één soort, variëteit of ras óf op een groep van planten, die nauw
verwant zijn.quot; Hier worden dus de begrippen aggressiviteit en vi-
rulentie door elkaar gebruikt.

Over het veranderen van de virulentie van schimmels zijn in
de literatuur verschillende gegevens tc vinden, de meeningen ech-
ter loopen vaak uiteen. Zoo vinden sommige onderzoekers wel

achteruitgang van de schimmel, wanneer ze in cultuur gehouden
wordt, anderen daarentegen merken dit niet op.

Laurent (1899) wijst er op, dat men bij schimmels en bac-
teriën heel vaak het verschijnsel heeft, dat ze zoowel saprophytisch
als parasitair kunnen leven. Hierbij kan men dus de ontwikkeling
van de virulentie nagaan. Bij Bacillus coli communis ziet men het
volgende: deze bacterie is onder normale omstandigheden niet para-
sitair voor levende planten, zij ontwikkelt zich b.v. niet op aard-
appels. Dompelt men nu de aardappels eenige tijd in een alkalische
oplossing, dan gaat de resistentie van de aardappel achteruit en
kan men de bacterie kweeken op schijfjes van deze aardappel.
Men krijgt zoo een Bacillus coli communis, die virulent is en ook
normale aardappels aantast. Men kan deze virulentie weer doen
verdwijnen door de bacterie op niet levend materiaal te kweeken,
b.v. op gedoode aardappels of op minerale voedingsoplossingen.

Men kan de resultaten van deze proeven echter niet zonder voor-
behoud als juist aannemen. Ten eerste is het tegenwoordig be-
kend, dat Bacillus coli communis heel gemakkelijk mutaties vormt;
bovendien werkte men in die tijd ook lang niet altijd met rein-
cultures. Het veranderen van de virulentie, wat Laurent zag,
kan dus ook wel veroorzaakt zijn door het optreden van een mu-
tatie. Daarbij weet men ook niet. wat er verandert, wanneer men
aardappels in een alkalische oplossing dompelt, zoodat men. alles
bij elkaar genomen, niet te veel waarde aan deze proeven mag
hechten.

Edson en Shapovalov (1918) vonden, dat de viru-
lentie van de verschillende stammen van Rhizoctonia solani,
waarmee zij werkten, geen verband houdt met de tijd. ge-
durende welke ze kunstmatig in cultuur zijn gehouden. Ze
zagen wel verschil in virulentie, indien zij infecteerden met cultures
van verschillende voedingsbodems. Er had weinig of geen infectie
plaats met een cultuur die gegroeid was op Melilotusstengel (dit is
geen goed medium voor de schimmel) en een sterke aantasting met
cultures van rijst of aardappel.

Evenals de vorige onderzoekers zag SimonThomas (1925)
geen achteruitgang van de virulentie. Bij een van zijn Rhizoctonia
so/an(-stammen was de virulentie zelfs door een kunstmatige cul-
tuur van 10 jaar niet te gronde gegaan.

S m a 11 (1927) vond achteruitgang van de virulentie van Rhi-
zoctonia solani Kühn, wanneer deze schimmel eenige tijd in cultuur
werd gehouden; dit ging samen met een verminderde productie
van pseudosclerotiën.

El mer (1932) werkte met verschillende stammen van Rhizoc-
tonia solani en vond, dat deze stammen, wat hun virulentie betrof,
groote verschillen vertoonden en dat ze deze eigenschappen behield-
den na een tijd in cultuur te zijn geweest. Daar deze publicatie
slechts een korte mededeeling is, weet ik niet op welke wijze de
schimmels in cultuur werden gehouden en hoe lang. Zoodoende kan
ik niet bepalen, in hoeverre zijn resultaten met de mijne kloppen.

Bij Sclerotinia sclerotiorum vond Westerdijk (1911) geen
achteruitgang van de virulentie na een langdurige saprophytische
voeding. Een cultuur op pruim-agar, waarop de schimmel slecht
groeide, was wel minder virulent geworden.

Evenzoo vond Wormald (1919), dat de virulentie van 5c/ero-
f'nia cinerea f. mali niet veranderd was, wanneer deze schimmel
2 jaar lang saprophytisch op aardappel gekweekt was.

Bij Fusarium is o.a. het volgende gevonden: Appel en W o 1-
lenweber (1913) zagen in sommige gevallen een verandering
'n de morphologie en de biologie bij species van het geslacht
Fusarium, welke lange tijd op kunstmatig medium gegroeid waren.
Ze onderscheidden „An-, Norm- en Abkulturquot;. Toch komt deze
..Abkulturquot; over het algemeen weinig voor en ziet men, dat de
cultures op gekookt plantaardig medium hun virulentie niet ver-
biezen, wanneer ze 2 jaar in cultuur zijn geweest.

Het is wel van belang op welke voedingsbodem de schimmel
groeit. Zoo zag Wollenweber (1913), dat die voedingsbo-
dems. welke de levensduur van Fusarium niveum Smith vermin-
*^erden, de virulentie achteruit deden gaan. Zoo was b.v. deze
schimmel, nadat zij een maand gegroeid was op filtreerpapier, ge-
doopt in 2% suikeroplossing, nog virulent, terwijl even oude cul-
tures op gekookte aardappels het niet meer waren. In zoo'n geval
's de relatieve ouderdom van een cultuur van invloed. De cultuur
op de voedselrijke aardappels was al afgeleefd, terwijl de arme-
1'jke cultuur op filtreerpapier de schimmel kunstmatig jong had
gehouden. Een jonge cultuur op aardappel kan heel actief zijn.

kuituren- bij Fusarium, maar hij geeft alleen verandermg van kleur
oo en zeqt niets over een virulentie-verandermg.

B u r k h O 1 d e r (1925) vond bij een Fusarmmstam van boonen.
dat deze na 6 jaar in cultuur te zijn geweest, minder virulent was
Geworden. De kleur van de cultuur was ook veranderd.

Door er boonenplanten mee te infecteeren en dan de schimmel
terug te isoleeren, herkrijgt hij de oorspronkelijke virulente vorm.
Na de eerste terugisolatie is de virulentie nog niet veel sterker,
maar na 2 keer heeft ze weer haar oude virulentie.

Brown (1926) ziet bij zijn cultures van Fusarium dikwijls
sectoriale mutanten optreden; deze zijn vaak minder sterk parasi-
tair dan de moedercultuur. Er is dan wel beweerd, dat parasitaire
schimmels in cultuur haar virulentie verliezen, maar dit is volgens
Brown bij Fusarium niet het geval; er ontstaat echter een sapro-
phytische mutant in de virulente stam. Indien er goed wordt gelet
op de moedercultures, dan is er geen reden tot bezorgdheid, dat de
virulentie achteruit zal gaan. Men kan in zooverre van een invloed
van de bodem spreken, doordat op de eene voedingsbodem de mu-
tatie vaker optreedt dan op de andere, b.v. vaak op Richards oplos-
sing Brown verklaart dit als volgt: de oudervorm heeft het ver-
mogen tot mutatie; wanneer nu de groei van een cultuur gauw op-
houdt, dan heeft er weinig mutatie plaats; raakt de cultuur met gauw
uitgeput, dan heeft er meer mutatie plaats. Gebruikt men dus weinig
voedende bodems en ent men vaak over, dan krijgt men constante

dat sommige onderzoekers vinden, dat schimmels in cultuur haar
virulentie verliezen. Hij stelt zich deze verandering als volgt voor:
wanneer een parasitaire schimmel saprophytisch gevoed wordt,
ontstaan er mutaties, welke saprophytische stammen geven; deze
groeien beter dan de parasitaire mutanten en overheerschen dus.
Groeien ze vervolgens weer parasitair, dan krijgen de parasitaire
vormen de overhand en de schimmel wordt weer virulent.

Het verlies van virulentie zal dus afhangen van het vermogen
van de verschillende schimmels om te muteeren; hebben ze dit
vermogen niet, dan zal er dus geen verlies van virulentie plaats

van andere schimmels, wanneer ze kunstmatig in cultuur worden
gehouden. Zoo vinden Foëx en Rosella (1928) bij hun proe-
ven, waarbij zij gerst infecteeren met cultures van Helminthosporium
sativum, dat de resultaten onregelmatig en vaak negatief waren,
indien de schimmel gegroeid was op boon-gelatine. Zij weten ech-
ter niet, wat de oorzaak ervan is; verminderde virulentie kan een
rol spelen, maar er kunnen ook minder sporen gevormd zijn.

Donandt (1932) vindt geen achteruitgang van de virulentie
van Verticillium alboatrum door langdurige saprophytische voe-
ding. Ook Wollenweber (1930) vond, dat de morphologie
van Verticillium in cultuur vrij constant was en dat er geen achter-
uitgang van de virulentie plaats had.

Achteruitgang van de virulentie, maar niet door saprophytische
voeding, kreeg Volk (1931). Hij deed n.1. voedingsproeven met
tomaten, die hij infecteerde met sporen van Cladosporium fulvum.
Hij vond nu, dat conidiën van de schimmel, die 2 tot 3 generaties
op tomaten met phosphor-gebrek gegroeid waren minder sterk
infecteerden dan die. welke op normaal gevoede planten ontston-
lt;len. Werden ze hierna gekweekt op gezonde planten, dan herkreeg
men weer conidiën. die 100% infecteerden. Hij noemt dit een ver-
andering van de agressiviteit; het percentage van de kieming van
sporen is nog wel normaal, maar de schimmel is blijkbaar min-
der goed in staat de voedingsstoffen uit de plant te halen; er heeft
^Ä'aarschijnlijk een verandering plaats gehad van de specifieke enzy-
matische werking van de parasiet. Hij vindt in die gevallen, waar
lt;Ic aantasting gelukte, dat de vlekken kleiner bleven dan na infectie
met normale conidiën en zegt, dat dit komt, doordat ook de virulen-
tie verminderd is. Naar mijn meening is echter, wat V o 1 k een ver-
andering van de aggessiviteit noemt, ook het gevolg van de ver-
minderde virulentie.

Tenslotte heeft men nog die gevallen, waarbij men, in plaats
van een achteruitgang van de virulentie, ziet, dat saprophytische
schimmels parasitair worden. Butler (1918) bespreekt in zijn
^ek „Fungi and Disease in plantsquot; dergelijke gevallen. Door
Begoniabladen met suikeroplossingen te injiceeren, kan men Tri-
chothecium parasitair doen worden. Ook heeft men wel, dat er op
een plant kliertjes voorkomen, die .suiker afscheiden; de schimmel
^an zich hiermee eerst voeden en wordt tenslotte parasitair.

Volgens Young (1926) zijn er betrekkelijk weinig saprophy-
tische schimmels: onder bepaalde omstandigheden kunnen de
meeste schimmels levende planten binnendringen en één of meer
cellen ziek maken. Facultatieve parasieten zijn heel belangrijk voor-
al met het oog op het eventueel virulenter worden van dergelijke
schimmels. Het komt vaak voor, dat ziekten, die eerst weinig be-
langrijk zijn, plotseling ernstig worden en zich ook verbreiden.

Als we nagaan, hoe weinig er over virulentieverandering bekend
is, lijkt het wel de moeite waard om te onderzoeken, welke invloed
saprophytische voeding op de virulentie van parasitaire schimmels
heeft, al zullen de verkregen resultaten nooit te generaliseeren zijn
en alleen gelden voor de twee onderzochte schimmels.

Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) Massec en Sclerotinia libertiana
Fuckel zijn synoniem: het blijkt echter, dat de eerste naam de voor-
keur geniet. Wake field (1924) geeft een literatuuroverzicht
over deze nomenclatuurkwestie. De schimmel werd in 1837 be-
schreven door Madame Li bert in het latijn als Peziza sclero-
tiorum in haar PI. crypt. Ardennae Fase. IV, N. 321, Fuckel
brengt in zijn Symbolae mycologicae (1869) deze species over in
het door hem genoemde geslacht Sclerotinia en verandert tegelijk
de naam in Sclerotinia libertiana. blijkbaar alleen, omdat hij de com-
binatie Sclerotinia sclerotiorum nict mooi vond. Het is beslist de-
zelfde schimmel, want hij geeft als synoniem Peziza sclerotiorum
Lib. en Peziza sclerotii Fuckel. Deze naamsverandering van
Fuckel is tegen de internationale regel van nomenclatuur, waarbij
bepaald is, dat, wanneer er een soort van een geslacht onder een
ander geslacht wordt gebracht, dc originecle soortsnaam behouden
blijft, tenzij dc dan verkregen combinatie al bestaat. Bij Sclerotinia
sclerotiorum was dit laatste echter niet het geval, daar Fuckel
zelf het genus Sclerotinia voorstelde. Dc meeste Europeesche onder-
zoekers gebruikten dc naam, die door Madame L i b e r t gegeven
^as. Massee gebruikte dc combinatie Sclerotinia sclerotiorum

het eerst in zijn British Fungus Flora vol. IV 1895; sedertdien is
deze naam in de Engelsche literatuur gebleven. Tegenwoordig
vindt de naam Sclerotinia sclerotiorum vrijwel algemeen ingang.
Men vindt soms de auteursnaam „Saccardo et Trotterquot; vermeld; dit
is echter niet juist; zij hebben pas in 1913 de combinatie Sclerotinia
sclerotiorum gebruikt.

Sclerotinia sclerotiorum is reeds lang bekend als een parasiet van
zeer veel verschillende planten, welke gemakkelijk van de eene
plant op de andere overgaat: er worden dus geen physiologische
rassen gevormd (Westerdijk, 1911).

Het klassieke onderzoek over Sclerotinia sclerotiorum is van D e
Bary (1868), hij geeft een heel duidelijk overzicht van de bio-
logie en de physiologic van de schimmel.

Heel vaak werd beweerd, dat Sclerotinia sclerotiorum en Botrytis
cinerea bij elkaar hooren, b.v. door Behrens (1891), Frank
(1895) en Humphrey (1891). Dit komt, omdat Botrytis heel
gemakkelijk op doode plantendeelen kan voorkomen. Maar na de
onderzoekingen van De Bary (1886), Kissling (1889),
Smith (1900), Appel en Bruck (1907) en Westerdijk
(1911) is het wel zeker, dat het 2 afzonderlijke schimmels zijn.
Zelf zag ik ook nooit in mijn cultures van Sclerotinia Botrytis op-
treden.

Sclerotinia sclerotiorum vormt een wit mycelium; de hyphen zijn
sterk vertakt en bestaan uit cellen van verschillende lengte. Wan-
neer de hyphen tegen een vaste wand aankomen, vormen ze appres-
soriën. Op het mycelium ontstaan de sclerotiën, die soms in concen-
trische ringen gevormd worden, soms verspreid ontstaan; ook de
grootte van de sclerotiën wisselt sterk (2—4 mM breed cn 3—12
mM lang). Men kan bij de sclerotiën een donkere wand cn een wit
merg onderscheiden.

Dc sclerotiën zijn vaak bedekt met druppels; De Bary (1886)
heeft aangetoond, dat dit vocht in water oplosbare zouten van
oxaalzuur bevat. Vaak wordt aangenomen, dat sclerotiën ontstaan
bij ongunstige omstandigheden, maar men moet toch niet aanne-
men, dat ze ontstaan bij slechte voeding (Killian, 1926).

De verdere ontwikkeling van dc schimmel is deze: uit hct Sclero-
tium ontwikkelt zich hct apothecium; volgens sommige onderzoekers

moeten de sclerotiën eerst een periode van rust doormaken (K i s s-
1 i n g, 1889; W e s t e r d ij k, 1911), terwijl andere vinden, dat dit
niet noodig is (Appel, 1907; Ramsey, 1926; Iwao H i n o.
1930). Wanneer men de schimmel in reincultuur heeft, ziet men
nooit apotheciën ontstaan en krijgt men ook geen apotheciumvor-
ming, wanneer men sclerotiën uit reincultures brengt in vochtig
zand, hoewel dit een methode is, waardoor volgens Ramsey, heel
gemakkelijk uit de sclerotiën de apotheciën ontstaan. In het apo-
thecium ontstaan de asci met de ascosporen; de kiemende asco-
sporen geven het witte mycelium. Ook de sclerotiën kunnen weer
opnieuw mycelium vormen.

Verder worden er soms micro-conidiën gevormd. Volgens de
meeste onderzoekers ontstaan ze bij voedselgebrek (De Bary,
1886; Appel, 1907; Ramsey. 1926) en dus vooral in oude cul-
tures. Ramsey wijst er op, dat ze vrijwel nooit in jonge cultures
ontstaan, maar pas na 20—30 dagen. Daarom zijn ze vaak over
het hoofd gezien. Op de aangetaste planten vindt men ze bijna
nooit: dit komt omdat ze pas ontstaan, als het weefsel van de voed-
sterplant bijna geheel verbruikt is en dan gooit men meestal de
planten weg zonder ze verder na te zien.

Zelf heb ik ook micro-conidiën gevonden in cultures, welke 3
weken oud waren; zoowel op die bodems, waar de virulentie klein,
als op zulke, waar ze nog groot was.

Meestal worden micro-conidiën als gedegenereerde conidiën be-
schouwd, omdat ze niet kiemen (Brefeld, 1881; De^Bary.
1886: Schellenberg, 1909). Ramsey (1926) zag nu en dan
wel een kieming, maar meestal stierven de kiembuizen af. Hum-
phrey (1893) vond kieming van micro-conidiën bij Sclerotinia
fructigena in een voedingsoplossing. Ei dam (1877) hield de
micro-conidiën voor spermatiën; dit is echter niet juist.

Het blijkt, dat Sclerotinia sclerotiorum heel goed saprophytisch
kan leven en op zeer veel verschillende kunstmatige voedingsbo-
dems groeit. De temperatuur heeft een vrij groote invloed op de
groei; bij 28° en 30° C geen groei: de groei bij 25° C is heel
goed; minder bij 20° C en bij 10° C vrij langzaam: fig. 1 geeft
dit weer. De groeisnelheid werd bepaald, door elke dag de door-
snede van de cultuur te meten: op de abscis is de tijd aangegeven
en op de ordinaat de doorsnede van de cultuur resp. na 1. 2. 3 enz.

dagen. Het blijkt, dat bij 25° C de schaal na 4 dagen al volge-
groeid is, bij 20° C na 5 dagen en bij 10° C pas na 13 dagen.

Over de wijze, waarop Sclerotinia en Botrytis de planten aantas-
ten, zijn zeer veel verschillende onderzoekingen; er blijkt een groote
overeenkomst tusschen deze beide schimmels te bestaan, alleen
doodt Sclerotinia het weefsel op eenige afstand voor de binnen-
dringende hyphen (De Bary 1886, Boyle 1921), terwijl Botry-
tis dit volgens de meeste onderzoekers niet doet (Nordhausen
1899, Brown 1917), hoewel Vasudeva (1930) vindt, dat ook

^90

-S70
0)

«CO

-§50

^AO

^30

§20
Ui

bij Botrytis cinerea het dooden van het weefsel verder gaat dan
de schimmel gegroeid is.

Men moet bij het aantasten 2 processen onderscheiden: le. het
dooden van de cellen en 2e. het oplossen van de celwand. Het
eerste proces (dooden van de cel) wordt volgens sommige onder-
zoekers door een enzym veroorzaakt (Nordhausen. 1899;
Brown. 1912), terwijl andere tot de conclusie komen, dat het
geen enzym is, want door koken verliest het zijn werking niet;
De Bary (1886), Behrens (1898) en Smith (1902) ge-
looven, dat oxaalzuur een rol speelt, terwijl Büsgen (1918), hoe-

wel hij meent te vinden, dat het geen enzymwerking is, er op wijst
dat oxaalzuur een heel andere beschadiging veroorzaakt. Ook
Nordhausen vindt, dat oxaalzuurbeschadiging heel andere ver-
schijnselen te voorschijn roept.

Brown (1917) wijst er op, dat men bij deze proeven geen oude
cultures en geen extracten van ziek weefsel mag gebruiken, zooals
zoo vaak gebeurt. Hierin toch zitten allerlei stoffen, die men niet
kent en die op zich zelf ook een werking kunnen uitoefenen.

Het 2e proces (het oplossen van de celwand) is een enzymatisch
proces; hierover zijn de verschillende onderzoekers het eens (De
Bary 1886, Behrens 1898, Smith 1902, Brown 1917).
Sommigen beweren echter, dat alleen de middenlamel opgelost wordt
(Schellenberg 1908), terwijl Otto (1918) soms wel, soms
geen oplossing van cellulose vindt, maar gelooft, dat Botrytis,
onder bepaalde omstandigheden, in staat is cellulose op te lossen.
B e h r e n s (1898) is van meening dat de schimmel zelf regelend het
enzym, dat de cellulose oplost, vormt, wanneer er tenminste geen
suiker tot zijn beschikking is. Iets dergelijks heeft Otto ook ge-
vonden: wanneer de gunstige koolstofbron in lage concentratie aan-
wezig is, dan heeft er geen invloed op de enzymafscheiding plaats:
zijn deze stoffen in hoogere concentratie aanwezig, dan blijft de
secretie achterwege. Smith (1902) stelt zich voor, dat er ver-
schillende cellulose-oplossende enzymen zijn, daar de samenstelling
van de cellulose ook vaak verschillend is. Maar de midden-
lamel, welke uit hemicellulose cn pectine bestaat, wordt altijd op-
gelost. Ward (1888) vond bij zijn Botrytis een eigenaardige op-
zwelling van de celwand door dc enzymwerking; dit is echter een
uitzonderingsgeval.

Verder blijkt de werking van de enzymen in een zuur milieu het
grootst te zijn (Laurent. 1898; Vasudeva 1930).

Voordat de enzymen echter hun werking kunnen uitoefenen
quot;loet de schimmel eerst de cuticula doordringen; dit is een zuiver
mechanisch proces (Brown cn Harvcy 1927). Dc Bary
quot;leende, dat dc cuticula ook werd opgelost, wat echter niet hct ge-
val is; hierop wees Boyle (1921) ook al, terwijl Kissling
(1889), Nordhauscn (1899) en Brooks (1908) vinden, dat
de sporen van Botrytis niet door gccutinisecrdc deden kunnen bin-
nendringen, wanneer deze niet verwond zijn en geen huidmondjes

hebben Ook werd wel beweerd, dat het een chemotropisch proces
is- zoo vindt Miyoshi (1885) een positieve chemotropie, Ful-
ton (1906) daarentegen negatieve chemotropie. De producten,
die de schimmel zelf afscheidt, veroorzaken groei naar een om-
geving. waar geen hyphen zijn. Graves (1916) vond zoowel
negatieve als positieve chemotropie; de negatieve komt het meest
voor. De onderzoekingen van B r o w n en H a r v e y (1927) maken
het echter heel waarschijnlijk, dat het binnendringen zuiver een
mechanische reactie is. Uit deze theorie volgt niet de conclusie,
dat elke schimmel nu iedere plant kan binnendringen: het ver-
mogen van de schimmel om te kunnen kiemen in de hoeveelheid
voedsel, disponibel op de bepaalde plant, en het vermogen om de
weerstand van de cuticula te overwinnen, zijn belangrijke factoren.
Tegen de opvatting, dat het binnendringen geschiedt, doordat een
enzym de cuticula oplost, spreekt ook het feit dat gecutiniseerd
materiaal erg resistent is en moeilijk aan te tasten, zoodat zelfs
onder de meest gunstige omstandigheden het proces heel langzaam
verloopt: het binnendringen van de hyphen echter gaat vrij snel (in
enkele uren). Bovendien is gebleken, dat bij het binnendringen de
turgor van het weefsel ook een groote rol speelt.

Is de hyphe eenmaal binnen gedrongen, dan krijgt men de wer-
king van de enzymen.

ONDERZOEKINGEN OVER DE INVLOED VAN DE
VOEDING VAN DE SCHIMMEL OP HAAR VIRULENTIE.

Om de invloed van de voeding van Sclerotinia op haar virulen-
tie na te kunnen gaan. werden, als test. infectieproeven met deze
schimmel genomen; hiertoe werden tomatenkiemplanten geïnfec-
teerd met Sclerotinia sclerotiorum, die op verschillende voedings-
bodems gekweekt was. Op de volgende manier werd te werk ge-
gaan:

De schimmel werd gekweekt in petrischalen met een middellijn
van 9 cM. die ongeveer 25 cM3 van de bepaalde voedingsbodem be-
vatten. Een groot aantal verschillende voedingsbodems werd ge-
bruikt, waarvan de recepten hieronder volgen zullen.

De schalen werden na enting in het donker geplaatst bij kamer-
temperatuur (± 20quot; C). De tijd. gedurende welke de schimmel op
de verschillende voedingsbodems groeide, werd gevarieerd. Het
bleek n.1. uit een aantal experimenten, dat de ouderdom van de
cultuur een groote invloed op de virulentie heeft. Vergeleken wer-
den cultures, welke resp. 8, ± H en ± 21 dagen oud waren.

Wanneer de schimmel dc aangegeven tijd op de bepaalde bodem
gestaan had, werd hiermee bladaardc, waarmee potten gevuld waren,
geïnfecteerd. Dc potten hadden een diameter van 10 cM. De blad-
aarde werd nict gesteriliseerd, want zooals bekend is, is het gedrag
van schimmels in gesteriliseerde aarde dikwijls anders; zoo zijn
b.v. vaak veel sterker parasitisch. De ongcstcrilisecrde aarde

leverde geen bezwaar op, want slechts zelden tradeh infecties van
andere schimmels op. Alleen in de koude maanden November en
December was er soms een Pyfftzum-aantasting waar te nemen.
Hiervan was het ziektebeeld echter geheel anders en duidelijk te
onderscheiden van een Sc/erofinia-aantasting. Bovendien werd er
voor controle ook wel ziek materiaal uitgelegd en kon men zoo
heel makkelijk Sclerotinia of Pythium terugisoleeren.

Om de aarde te infecteeren werd de schimmel met een spateltje
voorzichtig van de agar afgeschept, zoodat er zoo min mogelijk
agar meekwam. Deze massa werd nu met het bovenste deel van
de aarde vermengd; het was beter om het infectiemateriaal niet
door de heele pot te mengen, want de aantasting heeft n.1. het
sterkste plaats daar, waar het hypocotyl van het tomantenplantje
boven de aarde komt. Dit is wel meer gevonden: zoo vond b.v.
A t i e n z a {1927) bij Sclerotium Rolfsii dat 80% van de infecties
slaagde, wanneer hij de sclerotiën 0,5 tot 1,5 cM diep in de bodem
bracht. Bracht hij ze dieper dan 1,5 cM, dan had slechts 15% van
de infecties een positief resultaat.

In elke pot werd de schimmelmassa van één petrischaal ge-
bracht. Was de schimmel slecht gegroeid, dan zelfs 2 schalen
per pot. Dit is vrij veel, maar er moest een overmaat van infectie-
materiaal zijn, zoodat het niet-slagen van een proef niet kon komen,
doordat de planten niet voldoende infectie-materiaal gehad hadden.

De geïnfecteerde potten bleven een dag staan en werden goed
vochtig gehouden. Ze werden hiertoe in een verwarmde kas in
een bak met turfmolm ingegraven. Het is van het grootste be-
lang, dat de aarde goed vochtig blijft, want het mycélium is zeer
gevoelig voor droogte. Ook de temperatuur speelt een groote rol,
de gunstige temperatuur bleek wel ± 20° C te zijn. trouwens dit
zijn bekende feiten, die vaak in de literatuur vermeld worden
(We ster dijk. Ramsey. Letow). De temperatuur liep ech-
ter in de kas sterk uiteen, wat bij de proeven vaak moeilijkheden
opleverde. Geheele series vielen uit.

Nadat de geïnfecteerde potten zoo een dag gestaan hadden,
werden de tomatenkiemplanten hierin overgeplant en wel 3 per pot.
De tomaten, die gebruikt werden, behoorden tot de variëteit ..Deen-
sche exportquot;. Deze variëteit is zeer gevoelig voor de aantasting van
Sclerotinia sclerotiorum (Sander 1931). Het zaad werd 20 min.

in een 0,25% germisanoplossing gedesinfecteerd en hierna, gedu-
rende één uur, goed gespoeld met leidingwater. Ze werden uitge-
zaaid in platte bakken: wanneer de kiemplanten de gewenschte
grootte bereikt hadden, werden deze overgeplant in de potten met
geïnfecteerde aarde.

De infectie verloopt vrij snel: reeds na een paar dagen ziet men
een verwelking van de aangetaste plantjes optreden: het mycelium
omgroeit het hypocotyl geheel, dringt er in: het plantje valt
om. Deze zeer jonge tomatenplanten gaan óf dood. óf zij blijven
volkomen gezond. Na H dagen is zoo'n proef afgeloopen.

Om na te gaan, of de voedingsbodem, die men tegelijk met de
schimmel in de aarde brengt, zelf ook een schadelijke invloed op
«Ie planten heeft, werden er ook proeven genomen, waarbij de
aarde vermengd werd met een aantal verschillende bodems. De
planten bleven hierin echter steeds volkomen gezond.

Van Sclerotinia sclerotiorum werden 2 stammen gebruikt en wel
ten eerste de stam C. B. S.: dit is de oudste stam van Sclerotinia
sclerotiorum uit het „Centraal Bureau voor Schimmelculturesquot;; hij
'^'erd in 1922 van sla geïsoleerd. Deze stam werd gekozen, daar hij
van de 3 stammen, die begin 1930 in het „Centraal Bureau voor
Schimmelculturesquot; aanwezig waren, verreweg de virulentste was; de
beide andere stammen waren resp. in 1924 en 1926 geïsoleerd. Scle-
rotinia's. die ik zelf isoleerde van kool en van zonnebloemen, bleken
zeker niet virulenter te zijn: hier zijn verder dan ook geen proeven
nieer mee genomen. Wel was dit het geval met een stam uit Ame-
rika, die in 1931 van Limaboonen {Phaseohis lunatus) geïsoleerd
Was. Bij een bezoek van professor W h e t z e 1 aan het „Centraal
Bureau voor Schimmelculturesquot; verklaarde hij, dat de daar aanwe-
zige stammen van Sclerotinia sclerotiorum „run outquot; waren en daar-
om werd door hem een nieuwe stam gestuurd. Met deze stam werden
ook proeven gedaan, maar er bleek weinig verschil te zijn met de
stam C. B. S. Hoewel deze dus in virulentie vrijwel gelijk zijn, is er
inderdaad macroscopisch een verschil te zien: de nieuwe Ameri-
b«aansche stam vormt veel sneller sclerotiën cn in een grootere hoe-
veelheid. Hieruit blijkt dus tevens, dat uit de morphologie van een
schimmel niet altijd de graad van virulentie kan worden afgeleid.

Hieronder volgen nu nog de recepten van de voedingsbodems,
Welke gebruikt werden.

Aardappelen worden geschild, grondig afgewasschen en fijngemalen door een
vleeschmolen. Hiervan wordt 100 gr. genomen op 300 cc. water. Deze massa
laat men een nacht over staan op een koele plaats. Hierna zeven en stenhseeren.

De gemalen boonen eerst aan de kook brengen, hierna een uur laten trekken
en filtreeren. daarna eerst apart steriUseeren cn vervolgens de agar toevoegen
en nogmaals stcriliseercn.

Dc gemalen malsmeclkorrcls eerst aan de kook brengen, daarna een uur laten
trekken en filtreeren.

Om na te gaan, of de voeding van een schimmel invloed heeft
op haar virulentie, werd Sclerotinia sclerotiorum stam C. B. S.
eerst gekweekt op allerlei verschillende voedingsbodems, die in
het laboratorium aanwezig waren. Het bleek, dat de schimmel op
de meeste van deze bodems uitstekend groeide. Zoo was de groei
heel goed op moutsalep-, mout-, bouillon-, alkalische bouillon-,
pepton-glucose-saccharose- en X-agar, er had een flinke mycelium-
ontwikkeling en vorming van veel sclerotiën plaats. Iets minder
goed was de groei op aardappel- en boon-agar, terwijl op maismeel-
en op 1% pepton-agar de mycelium-ontwikkeling nog wel behoor-
lijk was. maar slechts zelden sclerotiën gevormd werden.

Op cellulose-agar was de groei slecht; er werd alleen een dun
laagje substraat-mycelium gevormd en er had in het geheel geen

Nadat Sclerotinia nu 14 dagen op de verschillende genoemde
bodems gegroeid had, werden er infectieproeven mee gedaan op
de reeds beschreven wijze (blz. 15). Er bleek eenig verschil in
virulentie te zijn; men kreeg met cultures van Sclerotinia, die op
1 % pepton- en op cellulose-agar gegroeid hadden, slechts een ge-
ringe aantasting, terwijl de virulentie van de schimmel op pepton-
glucose-saccharose-agar bijzonder groot was; in de overige gevallen
kreeg men overal een vrijwel even groote aantasting. Tabel 1 geeft
een overzicht van de verkregen resultaten.

De percentages geven in deze tabel niet altijd een geheel juist
beeld weer, omdat in sommige gevallen het aantal planten klein
was. Toch is het aantal doode planten in deze tabel in percentages
uitgedrukt om het geheel overzichtelijker te maken.

De tabel is samengesteld uit verschillende series. Het aantal ge-
slaagde infecties liep echter in de verschillende series van één-
zelfde voedingsbodem nogal uiteen (alleen met pepton-glucosc-
saccharose-agar kreeg men steeds een sterke infectie), zoodat in

tabel II voor enkele bodems de resultaten in de verschillende series
apart worden opgegeven. In deze tabel wordt ook aangegeven, hoe
de temperatuur de eerste dagen na de infectie was. Daar de tem-
peratuur in de kas zeer sterk wisselde, werd de min. en max. tem-
peratuur opgegeven (maar. zooals uit de tabel volgt, varieerde ook
het gemiddelde hiervan nog sterk).

Nu werd nagegaan, hoe de infectie verliep na een cultuur op 1 %
pepton-, cellulose-, moutsalep-. X-, en pepton-glucose-saccharose-
agar. wanneer men infecteerde met een cultuur, die slechts 7—9
dagen oud was. Men kreeg in dit geval na een infectie met een
cultuur op 1% pepton-agar wel een aantasting; ook met een cul-
tuur van cellulose-agar kreeg men nu een grootere aantasting dan
na een infectie met een cultuur van 14 dagen oud. In de overige
gevallen was er weinig verschil, daar de aantasting groot bleef.
Tabel III laat zien, hoe de infecties verliepen.

Dat men met een zeer jonge cultuur van Sclerotinia op 1 % pep-
ton wel een aantasting krijgt, maar niet met een cultuur van 14
dagen, wat toch ook nog een jonge cultuur is, geeft een aanwijzing,
dat men hier wellicht met een schadelijke werking van stofwisse-
lingsproducten heeft te doen. Nu heeft Butkewitsch (1903)
bij Aspergillus niger gevonden, dat men daar, waar men pep-
ton als eenige C- en N-bron gaf, een schadelijke ophooping van
ammoniak kreeg. De groei hield in dergelijke cultures op. Het
^as hoogst waarschijnlijk, dat men hier bij Sclerotinia ook zoo'n
opeenhooping kreeg. Inderdaad kon ik met Nessler's reagens aan-
toonen, dat er in cultures van Sclerotinia op 1% pepton na 14
dagen vrij veel ammoniak gevormd was: er ontstond een oranje
neerslag. In cultures, die slechts één week oud waren, gaf Nessler's
reagens een zwak oranje neerslag: er was dus minder ammoniak
gevormd. Men kan zich voorstellen, dat het mycelium door deze
ammoniakophooping niet meer in staat is te groeien. Er heeft dan
®ok geen enzymafscheiding meer plaats. Ent men van zoo'n cul-
tuur over op een goede voedingsbodem, dan krijgt men, na een
groei hierop van 14 dagen, weer een sterke aantasting.

De ouderdom van een cultuur kan dus blijkbaar een groote rol
spelen, waarom met cultures van Sclerotinia sclerotiorum op pepton-
glucose saccharose-agar van verschillende leeftijd geïnfecteerd
^erd. Het bleek, dat men met cultures welke ouder waren dan 18
^agen, geen aantasting meer kreeg. Ook dit is te verklaren door
stofwisselingsverschijnselen. Zooals later zal blijken, kan men de
schadelijke ammoniakophooping bij de omzetting van pepton doen
Verminderen door toevoeging van suiker, waardoor deze ammoniak
verbruikt wordt (Butkewitsch 1903).

Bij oudere cultures echter is de hoeveelheid suiker niet voldoende
krijgt men toch een ophooping van ammoniak. Met Nessler's
reagens krijgt men in een cultuur van pepton-glucose-saccharose-
®gar van 14 dagen geen oranje neerslag, wel echter in een cultuur
Van 3 weken. Later zal echter op deze invloed van dc koolhydraten
»^ader worden ingegaan (blz. 40).

In alle vorige gevallen stond de schimmel slechts een korte tijd
op dezelfde voedingsbodem. Men zou zich echter voor kunnen
stellen, dat slechts na een langdurige groei op een bepaalde voe-
dingsbodem een invloed hiervan op de virulentie te bemerken is.
Daartoe werd Sclerotinia eenige tijd op dezelfde bodem gehouden,
waarop dus steeds weer op deze wijze overgeënt werd. Nadat de
schimmel eenige maanden tot meer dan een jaar op verschillende
bodems had gestaan, werden er infectie-proeven mee gedaan. Er
werden zoowel cultures van 7—9 dagen als van 14 dagen gebruikt.
Het bleek, dat alleen bij moutsalep en saccharose 4% en 40% een

de schimmel verdwenen. Macroscopisch ziet de cultuur er ook an-
ders uit: het mycelium is vaak bruinachtig gekleurd en langs de
rand heeft stromavorming plaats: er worden weinig sclerotiën ge-
vormd. terwijl het substraatmycelium een taaie laag vormt.

Microscopisch is er echter weinig verschil: de inhoud van de
cellen blijft onveranderd: alleen ziet men. dat de vaste laag gevormd
wordt, doordat de hyphen zich samen vlechten.

Ent men van een dergelijke cultuur over op pepton-glucose-sac-
charose-agar, dan ziet de cultuur hierop er zeer abnormaal uit;
het mycelium is n.1. bruin en grijs, dus afwijkend gekleurd, en vormt
weer. evenals op moutsalep, een vaste laag. Ook heeft er stroma-
vorming plaats, terwijl er geen Sclerotien ontstaan. Infectieproeven
met dergelijke cultures geven een negatief resultaat.

Op foto I ziet men deze abnormale cultures op moutsalep en
pepton-glucose-saccharose-agar naast de normale 14-daagschc cul-
tures op deze bodems.

Op 4% en 40% saccharose-agar was de schimmel slechts eenige
maanden te houden, want de groei hield tenslotte op. Zoolang er
groei was kreeg men evenwel ook nog infectie.

Met cultures op 1 % pepton kreeg men weer na 7 dagen wel een
infectie, met cultures, die 14 dagen oud waren, daarentegen geen
infectie.

Tabel IV geeft de resultaten weer van infectieproeven met 14-
daagsche cultures, die eenvormig gevoed waren.

M daagschc reincultures van Sclerotinia sclerotiorum,
beneden links: Na eenvormige voedmg op moutsalep:
rechts: Normale cultuur op moutsalep.
boven links: Overent v. d. abnormale cultuur op moutsalep

op pepton-glucosc-sacch.-agar;
rechts: Normale cultuur op pepton-gluc.-sacch.-agar.

In de meeste gevallen zien we dus. dat bij Sclerotinia sclerotiorum
een eenzijdige voeding geen schadelijke invloed op de virulentie
heeft, waarbij de cultures op moutsalep een uitzondering maken.

Met de stam Whetzel II van Sclerotinia sclerotiorum werden
slechts enkele proeven genomen. Met cultures, die gegroeid waren
op aardappel-, boon- en mout-agar, kreeg men een flinke aan-
tasting. Er was, wat de virulentie na een groei op deze voedings-
bodems betreft, geen verschil te zien met de oude stam C. B. S.

Uit de voorgaande proeven is gebleken, dat. hoewel in enkele
gevallen wel een invloed van de bodem op de virulentie te zien
is, dc virulentie, door hct kunstmatig in cultuur houden van dc
schimmel, toch niet achteruit behoeft te gaan. Hierop wijst ook hct
feit, dat de 10 jaar in cultuur zijnde stam van Sclerotinia sclero-

Verder blijkt, dat men uit hct al of niet goed groeien van een
schimmel op een bepaalde bodem niet met zekerheid conclusies kan
trekken omtrent haar virulentie. Dc mate van groei is geen cri-
terium. Op 1% pcpton-agar groeit dc schimmel vrij behoorlijk,
waarbij echter geen infectie plaats heeft, terwijl op 4% cn 40%
saccharose-agar dc groei slecht is cn daarbij toch een groote viru-
lentie bestaat.

Ook hct al of niet vormen van sclerotiën is niet belangrijk in
dit opzicht: bovendien wisselt deze sclcrotiënvorming sterk, zelfs

bij één bepaalde bodem. Maar vergelijkt men de proeven, waarbij
tomatenplanten geïnfecteerd werden met Sclerotinia uit schalen
zonder Sclerotien, met die, waarbij geïnfecteerd werd met mycelmm
Sclerotien, dan blijkt er geen verschil te zijn.

Al is er in de literatuur vrijwel niets bekend over de invloed
van de stikstofvoeding op de virulentie, toch hebben verscheidene
onderzoekers de groei van Sclerotinia sclerotiorum en verwante
schimmels bij verschillende N-verbindingen onderzocht, terwijl ook
de stofwisseling van Aspergillus niger, die evenals Sclerotinia veel
oxaalzuur afscheidt, nauwkeurig onderzocht is.

Behrens (1893) zag bij Sclerotinia libertiana (= 5c/. sclero-
tiorum) en Sclerotinia fuckeliana een goede groei op voedings-
oplossingen met pepton. asparagine, KNO3 of (NH4)2S04 als
eenige N-bron, op de laatste 3 bijna even overvloedig.

L a u r e n t (1888, 1889) onderscheidde schimmels, die met KNO3
goed groeiden {Cladosporium herbarum. Mucor racemosus, Asper-
gillus glaucus en Alternaria tenuis) en andere, die beter met
(NH4)2S04 groeiden {Aspergillus niger. Botrytis). Toch zijn die
uit de eerste groep niet als echte nitraatschimmels te beschouwen,
want geeft men ze b.v. NH4H2PO4. dan groeien ze hierop heel goed.

Nikitinsky (19(M) heeft de invloed van de voeding op het
vormen van stofwisselingsproducten uitgebreid onderzocht, speciaal
bij Aspergillus niger. Het blijkt dat de N-voeding allerlei veran-
deringen in de stofwisseling teweeg kan brengen. Zoo krijgt men
b.v. bij Aspergillus niger o.a. met NH4NO.,, pepton. ammonium-
oxalaat, ammonium-phosphaat en KNO3 vrij veel oxaalzuurvor-
ming, echter niet (onder dezelfde omstandigheden) met NH4CI en
(NH4)2S04. Wanneer de N in de vorm van een zout wordt ge-
geven, icomt bij het verbruik van de stikstof het zuur vrij. Al naar
het vermogen van de schimmel om dit zuur verder te verwerken
of niet krijgt men wel of niet een ophooping van het zuur. De
ophooping van dit zuur kan weer schadelijk zijn voor de ontwik-
keling van de schimmel; de groei houdt op. Men ziet zoo bij ge-
bruik van ammoniumzouten van organische zuren geen remming

in de groei optreden. Het blijkt dus, dat de remming, die optreedt,
in heel veel gevallen niet door oxaalzuur veroorzaakt wordt, zooals
meestal wordt aangenomen, maar door het zuur, dat vrij komt uit
de N-bron. Toch kan de vorming van oxaalzuur ook wel optreden
en schadelijk werken, b.v. wanneer men KNO3 als stikstof voeding
geeft.

Ritter (1909, 1911) vindt, dat Aspergillus niger en Botrytis
cinerea een grootere opbrengst geven met (NH4).jS04 dan met
KNO3. Hij vindt verder, dat ammonium-nitraat, dat zoo vaak als
N-bron voor schimmels wordt gebruikt, dikwijls een kleine oogst
geeft en evenmin als NH4CI geschikt is. Hij bespreekt ver-
der ook nog de nitraat-assimilatie. Meestal wordt aangegeven, dat
de nitraten eerst tot nitriet, dan tot ammoniak worden gereduceerd.
Maar het is slechts voor een enkele schimmel bewezen. Laurent
vond de reductie tot ammoniak wel bij Cladosporium herbarum,
f^enicillium glaucum, Mucor racemosus en Alternaria tenuis, niet
bij Aspergillus niger, Aspergillus glaucus en Botrytis cinerea.

Ritter vindt het onwaarschijnlijk, dat. waar zoowel bij de
hoogere planten als bij de nitraat assimileerende bacteriën het ver-
mogen bestaat om de nitraten te reduceeren. dit vermogen bij de
schimmels ontbreken zou. Hij wijst er op, dat de nitrieten in zure
oplossingen erg onbestendig zijn. en wijt het hieraan, dat Lau-
rent geen nitrieten vond. Hij doet de proeven daarom nog eens
over en vindt nitrietvorming bij alle nitraat-assimileerende schim-
mels; hoe het proces verder gaat na de nitrietvorming is niet posi-
tief bekend. Vaak wordt beweerd, dat er ammoniak gevormd wordt,
^at wel waarschijnlijk, maar volgens Ritter niet bewezen is. De
ammoniak, die vaak in de schimmelcultures ontstaat, kan volgens
hem ook een product van proteolyse zijn.

Wcsterdijk (1911) vond bij Sclerotinia libertiana
lt;== 5c/. sclerotiorum) met pepton, proteïne, legumine, KNO3 cn
lt;NH4).^S04 nergens bijzonder goede groei, het beste nog met
pepton.

K i 11 i a n (1921) wijst er op. dat het van de organische N-vcr-
b'ndingen als pepton, albuminc bekend is. dat zij dc vorming van
•uchtmycelium cn de intensiteit van de klcurstofvorming bevorde-
ren. Dc concentratie van de N-zoutcn kan sterk veranderen, zonder
^at er ccn invloed te bespeuren valt; dit is in tegenstelling met dc

Killian komt tot de conclusie: hoe meer een organisme ge-
specialiseerd is, des te hoogere N-verbinding heeft het voor zijn
voeding noodig. Nitraat is niet voor alle schimmels geschikt, om-
dat het de bodem alkalisch maakt, zoodat alleen die schimmels er
op groeien, welke door zuur-afscheiding dit alkali kunnen binden.

Vasudeva (1930) doet infectieproeven met Botrytis allii.
waarmee hij appels infecteert. Hij infecteert door sporen in een
wond te brengen en voegt hierbij een druppel van verschillende
synthetische voedingsoplossingen. Het blijkt, dat hier vooral
de stikstof een groote rol speelt; neemt hij b.v. een druppel
B r O w n'sche voedingsoplossing i). dan heeft er een sterke aantas-
ting plaats. Laat hij echter de asparagine weg. dan is de aantas-
ting veel minder sterk; laat hij de glucose weg. dan ziet men min-
der invloed. Met asparagine alleen is de aantasting even sterk als
met een volledige voedingsoplossing. In een oplossing met pepton,
glucose en mineralen is de pepton het voornaamste. Hij neemt ook
nog andere N-verbindingen als KNO3. NH4NO3. NH4CI en
(NH4)2S04, waarbij hij overal een fhnke aantasting krijgt.

Hij doet ook proeven met Monilia fructigena en krijgt hierbij ook
een sterkere aantasting door toevoeging van stikstofverbindingen.

Vasudeva ziet, dat de toevoeging van N-verbindingen een
invloed heeft op de vorming van pectinase, een enzym, dat Botrytis
allii afscheidt. Kweekt hij Botrytis allii in zijn appelextract, dan
heeft er geen enzymvorming plaats; voegt hij N toe, dan wel. Het
blijkt ook. dat sterke groei niet altijd sterke enzymvorming ten
gevolge hoeft te hebben.

Om de invloed van de stikstofvoeding op de virulentie van
Sclerotinia sclerotiorum na te gaan. werden verschillende synthe-
tische voedingsbodems gemaakt, bevattend:

2% saccharose; 0,5% KH2PO4; 0,25% MgS04: 1% KNO3 en
2% agar, terwijl in plaats van 1% KNO3 telkens andere N-ver-
bindingen gegeven werden; de concentratie van deze verbindingen

Brown'schc voedingsoplossing bevat per L. 2 gr. glucose. 2 gr. aspa-
ragine cn 1.25 gr. K.iP04.

De reden, dat hier agar-bodems genomen werden en geen voe-
dingsoplossingen, is de volgende: het bleek, dat Sclerotinia sclero-
tiorum wel in vloeibaar medium groeide, maar langzamer dan op
vaste bodems. Bovendien was het resultaat van infectieproeven
met een schimmelmassa uit de voedingsoplossingen ook niet zoo
goed; het bleek, dat het mycelium zich dan niet zoo goed in de
grond ontwikkelde. Letow (1930) vindt bij zijn proeven met
Sclerotinia libertiana, dat deze schimmel, als reincultuur in de grond
gebracht, zich hierin niet verder ontwikkelt. Voor mijn verdere
proeven heb ik dus steeds agar-bodems gebruikt: de reeksen wor-
den alleen naar de N genoemd.

Met 1% KNO3: 0,5% (NH4)2S04; 4% NH4NO3; 0,5%
NH4CI: 0,5% (NH4)3P04: 0,3% ureum; 0,5% asparagine en
1% asparagine was de groei van Sclerotinia sclerotiorum stam
C. B. S. heel goed: flinke mycelium- en sclerotiënvorming. Met
KNO, kreeg men soms een groote hoeveelheid kleine sclerotiën van
2X2 mM, terwijl de normale grootte 3—4 X 8 mM bedraagt.

Met 2% pepton ') was de groei ook heel goed, maar het myce-
lium vormt soms een taaie laag en de sclerotiën worden vaak, be-
halve over de schaal verspreid, ook langs de rand aangelegd. Foto
bl geeft cultures van Sclerotinia sclerotiorum te zien, die 14 dagen
oud zijn: bovenste rij links met NH4CI, rechts met pepton als
^-bron: onderste rij links met NH4NO3, rechts met asparagine:
de sclerotiën langs de rand bij pepton zijn duidelijk te zien.

Een paar proeven werden gedaan met resp. 1% en 1,5%
(NH4)^S04 om te zien of verhooging van de concentratie invloed
liad: de groei op deze bodems was geheel gelijk aan die met 0,5%
(NH4)2S04.

Met cultures van Sclerotinia, die 14 dagen op deze verschillende
l^odems gestaan hadden, werden nu infectieproeven gedaan op de
'■eeds beschreven manier (blz. 15).

Het bleek, dat met de meeste N-verbindingen de virulentie grpot
Was. Alleen met pepton was er een vermindering te bemerken, ter-
wijl het gedrag bij toevoeging van KNO3 en asparagine wisselend
soms was de aantasting groot, soms klein.

Verder bleek. dat. wanneer de uitwendige omstandigheden bij-
zonder gunstig voor de infectieproeven waren (dus niet te hooge
temperatuur en een groote vochtigheid), men ook met een cultuur,
die als N-bron pepton had gehad, soms een flinke aantasting kreeg.

Foto III geeft het beeld van een serie weer, 6 dagen nadat de
tomatenplanten verspeend waren in de geïnfecteerde grond.

Van links naar rechts ziet men planten geïnfecteerd met cul-
tures, die als N-bron resp. kregen pepton. asparagine. (NH4)2S04
en KNO3.

Tabel V geeft de resultaten weer van de infectieproeven met
H-daagsche cultures met verschillende voeding.

1nbsp;lt;quot;, KNO, . . .
0.5 (NH,),S04 .
0.4«/, NH.NO, .
0,5 «/i NH^Cl . .
O.Squot;/, (NH,),P04.
0,3 % ureum . .
0.5'/o asparagine,

59.9
70,9
88,1
80,2

78.1
62,1
43,8

53.3

36.4

75.2

92.5

78
104
142

89
54
71

24
60

Er is dus wel eenig verschil te zien; met pepton slaagt slechts
36.4% van de infecties, terwijl ook met KNO3, asparagine en
ureum het percentage in vergelijking met de rest vrij laag is; ammo-
niumverbindingen zijn blijkbaar een goede N-bron voor Sclerotinia
sclerotiorum.

Verder blijkt verhooging van de concentratie van de N-bron
weinig invloed te hebben. Vergelijkt men de resultaten van 0.5%

daagsche reinciilturcs van Sclerotinia sclerotiorum met verschillende N-bron.
links: met NH^Cl; rechts met pepton. beneden links: met NH,NO,: rechts met asparagine.

Tomatenkiemplanten geïnfecteerd met H daagsche cultures van
Sclerotinia sclerotiorum na versch. N-voeding v. d. schimmel.
Van \inks naar rechts: Met KNO,. (NH,),SO«: aspnragine en pepton.

asparagine met die van 2%, dan loopt het percentage gedoode
planten slechts weinig uiteen. Evenzoo is dit het geval met 0.5%
en 1% (NH4)2S04: het heel hooge percentage bij 1,5%
(NH4)oS04 is natuurlijk niet geheel met de andere te verge-
lijken, aangezien het aantal gebruikte planten hier heel klein was.
Men kan pas een conclusie trekken uit een groot aantal planten.
Werkt men met kleine series, dan kan men vaak tot verkeerde con-
clusies komen, daar de individueele verschillen ook een rol spelen.

De getallen uit tabel V zijn verkregen uit verschillende reeksen;
tabel VI nu geeft weer, hoe de infectie in die verschillende series
verliep, tenminste voor een paar bodems. Tevens is hierbij weer
aangegeven de temperatuur gedurende de proef.

Zooals vroeger reeds gezegd is, varieerde de temperatuur in de
kas sterk, zoodat ook hier weer de gemiddelde min. en max. tem-
peratuur genomen is. Eén serie bij 0,5% asparagine werd buiten
in de schaduw ingegraven, aangezien het toen zoo buitengewoon
warm was, dat de temperatuur in de kas de geheele dag boven

Uit dergelijke uitkomsten kan men dus alleen de conclusie trek-
ken, dat met pepton als N-bron in de meeste gevallen een vermin-
derde virulentie optreedt, tenminste bij deze cultures, die 14 dagen
oud zijn.

Toch is de groei, zooals reeds gezegd is, op deze bodems met
pepton juist bijzonder goed: er wordt veel mycelium gevormd en
de sclerotiën zijn groot. Microscopisch ziet men geen verschil met
de andere cultures.

De cultures, die voor de vorige proeven gebruikt werden, waren
14 dagen oud, wat betrekkelijk jong is. Er werd nu nagegaan, hoe
de infectie verliep, wanneer men cultures gebruikte die 19—21

Men kreeg nu een veel grooter verschil te zien. Er hebben alleen
duidelijke infecties plaats met cultures die (NH4)2S04 NH4CI
of NH4NO3 als N-bron gehad hadden. Tabel Vll geeft hct resul-
taat weer.

de schimmel veel sneller zijn virulentie dan op de andere. Deze
achteruitgang van de virulentie bij de oudere cultures wordt waar-
schijnlijk veroorzaakt door ophooping van stofwisselingsproducten;
macroscopisch cn microscopisch ziet men geen verschil met dc
jonge cultures. Nikitinsky (1904) heeft er al op gewezen, dat
de stofwisselingsproducten sterk veranderen met de voedingsbodem;

Infectieproeven met cultures van Sclerotinia sclerotiorum,
die 14—21 dagen oud zijn

tuur, waarbij de groei verminderd of opgehouden is. Deze ontstaat
niet. doordat de voedingsstoffen uit dc voedingsbodem gehaald zijn.
maar doordat dc schimmel zelf stoffen afscheidt, die tenslotte de

groei belemmeren. Brown onderscheidt het .staling type' en het
,non-staling type'; tot het eerste type behoort Fusarium, tot het
tweede Botrytis. Op de eene voedingsbodem heeft het proces ster-
ker plaats dan op de andere; ook de dikte van de voedingsbodem en
de temperatuur spelen een rol. De stoffen, die het veroorzaken, zou-
den gasvormig zijn en ontstaan door de stofwisseling van de schim-
mel. Volgens B r o w n is het v.n.1. ammoniak en dit zou in de voe-
dingsbodem oplossen.

Het is hoogst waarschijnlijk, dat de achteruitgang van de viru-
lentie, die ik in sommige gevallen in mijn cultures van Sclerotinia
sclerotiorum zag optreden, veroorzaakt wordt door een dergelijke
ophooping van stofwisselingsproducten. Hiervoor spreekt ook het
feit dat. wanneer men met cultures, die pepton als N-bron hadden
gehad en die slechts 8 dagen oud waren, infecteerde, men dan
wel een sterke infectie krijgt (van de 84 planten gingen er 69
dood), terwijl, zooals vroeger reeds gevonden is, met,cultures die
14 dagen oud zijn slechts een geringe infectie plaats heeft en na
3 weken geen infectie meer.

Inderdaad kon ik met Nessler's reagens aantoonen, dat er in
cultures, die pepton als stikstof hadden gekregen en 8 dagen oud
waren, slechts weinig ammoniak gevormd was: er ontstond een
geel neerslag. In cultures die 2 en 3 weken oud waren kreeg ik
een oranje neerslag.

Wanneer men KNO3 als N-bron gegeven had. zag men het vol-
gende: na 14 dagen kreeg men met Nessler's reagens een geel tot
licht oranje neerslag, na 3 weken een oranje neerslag. Zooals we
reeds gezien hebben, was de virulentie in dergelijke 3 weken oude

Ent men van zoo'n 14-daagsche cultuur op pepton over op b.v.
NH4NO3 en infecteert men met een dergelijke cultuur, nadat zij
14 dagen op deze bodem gegroeid is. dan krijgt men direct
weer het normale percentage van infectie (van de 74 planten gingen
er 64 dood).

Opmerkelijk is, dat, zooals vroeger al werd beschreven, de viru-
lentie van de cultures op de voedingsbodem pepton-glucose-saccha-
rose-agar zoo groot was. Hierop zal echter verder worden inge-
gaan in het volgende hoofdstuk, waar de invloed van de C-bron
zal worden besproken.

Bovendien werd nog nagegaan, of men een invloed kon bemer-
ken, wanneer de schimmel geregeld op dezelfde bodem werd over-
geënt. Hiertoe werd op de bodems met pepton, asparagine.
(NH4 )2S04 en KNO3 als N-bron de schimmel ook weer een jaar
gehouden. Er had dus geen overenting plaats, zooals gewoonlijk,
van de eene voedingsbodem op de andere. Infectie met dergelijke
cultures, die 12 dagen oud waren, gaven weer hetzelfde beeld: op
pepton een groote achteruitgang van de virulentie (van de 40 plan-
ten ging er maar één dood). Met de andere cultures kreeg men een
behoorlijke infectie: met asparagine als N-bron ging er 60% van de
planten dood, met (NH4)2S04 95,2% en met KNO3 96,9%. In-
fecteert men echter met dergelijke pepton-cultures. wanneer ze pas
7 dagen oud zijn, dan krijgt men hiermee weer een sterke infectie.
Dit wijst er ook weer op, dat men door stofwisselingsproducten bij
oudere cultures een schadelijke werking krijgt. Verder blijkt uit deze
proeven, dat men ook op synthetische bodems geen verandering
van de virulentie krijgt door eenzijdige voeding.

De vorige proeven zijn allemaal genomen met de stam C. B. S.
van Sclerotinia sclerotiorum. Ook met de stam Whetzel II werd
nu het gedrag bij verschillende stikstofvoeding nagegaan.

Er bleek een groote overeenkomst te zijn met de vorige stam, al-
leen was over het algemeen genomen deze nieuwe stam iets minder
virulent. De grootste virulentie werd weer gevonden, wanneer men
ammoniumverbindingen alsquot; N-bron gaf; met ureum kreeg men ook
nog een vrij sterke aantasting, minder sterk met KNO3 en met
asparagine een heel klein percentage, terwijl men met pepton als
N-bron vrijwel geen aantasting kreeg.

Tabel VIII geeft de resultaten weer van de infectieproeven met
cultures, die 12 tot 14 dagen oud waren.

Deze stam, hoewel pas 2 jaar kunstmatig voortgekweekt, is toch
zeker niet virulenter dan de oude stam, die nu reeds 10 jaar kunst-
matig. gekweekt wordt.

Het is bekend dat Sclerotinia sclerotiorum oxaalzuur vormt; dit
werd al door De Bary in 1886 gevonden. Door mij werd nu
nagegaan, of de pH van de bodem sterk veranderde en of dit
varieerde bij de verschillende stikstofvoeding. Nikitinsky
(1904) heeft er al op gewezen, dat men bij Aspergillus niger bij
de stofwisseling niet alleen een ophooping van oxaalzuur kan
krijgen, maar ook van het zuur van het gegeven zout.

De pH van de bodem werd colorimetrisch bepaald. In die ge-
vallen, waar de voedingsbodem sterk geel gekleurd was, dus vooral
bij de peptonbodems, werd de foliën-kolorimeter met indicator-
foliën naar Wulff gebruikt.

Zoo werd eerst de pH van de bodem bepaald en verder de pH,
nadat de schimmel er 14 resp. 21 dagen op gegroeid had.

In de verschillende schalen van éénzelfde serie liep de pH soms
sterk uiteen, ook dan, wanneer in de verschillende schalen dc schim-
mel even sterk gegroeid was. Toch zal cr wel een verschil zijn, wat
ccn eerder of later optreden van de stofwissclingsvcrschijnselcn
ten gevolge heeft.

Vooral op pepton wisselde dc pH sterk; hiermee kan ook samen-
hangen het verschil, dat soms optreedt bij de infectie. In die ge-
vallen, waar de pH 6,5—6,2 was, kreeg men juist vrijwel geen
infectie. Maar daar in het begin van het onderzoek niet geregeld
de pH van elke cultuur, gebruikt voor infectieproeven, bepaald
werd, zijn hiervoor niet voldoende bewijzen.

In de meeste gevallen was de bodem na 14 dagen overal erg
zuur geworden; na 3 weken was er een duidelijk verschil te zien.

Het bleek nu, dat juist in die gevallen, waar men na infectie
met 3 weken oude cultures nog een groote aantasting kreeg, de
pH vrijwel niet veranderd was, terwijl in de overige gevallen de
bodem minder zuur was geworden. De volgende tabel geeft een
overzicht van de verandering van de pH.

Deze resultaten maken het inderdaad zeer waarschijnlijk, dat de
achteruitgang van de cultures komt door een ammoniakophooping,
zooals Butkewitsch (1903) dit voor Aspergillus niger heeft
gevonden, want hierdoor wordt de bodem minder zuur. Naast
de schadelijke ammoniakophooping is misschien ook belangrijk voor
de verminderde virulentie het feit. dat de enzymen van de schim-
»nel het beste in een zuur milieu werken (Laurent, 1899; V a s u-
deva, 1930). Toch is dc hoogere pH op zichzelf niet schadelijk,
^at uit de volgende proeven blijkt. Bij de bodems met pepton.
KNO3, (NH4)2S04. NH4CI. en NH4NO3 als N-bron. werd. door
quot;aast KH2PO4 ook K2HPO4 als phosphaat te geven, de pH ver-
'^oogd tot 6, 5—6, 7. De groei op deze bodems was heel goed,

Infectieproeven met dergelijke cultures gaven weer met pep-
ton vrijwel geen aantasting en met ammoniumverbindingen een
«erkerc aantasting dan met KNO3. Men kreeg hier dus ook weer
•^et gewone verloop. De pH liep ook weer sterk terug; tabel X geeft
dit Weer.

Wanneer we dus de resultaten van alle vorige proeven samen-
. vatten, dan zien we, dat bij de oudere cultures de stikstofvoeding
een invloed op de virulentie kan uitoefenen, doordat er een schade-
lijke ophooping van stofwisselingsproducten plaats heeft; vooral de
gevormde ammoniak speelt hier een groote rol.

Over het gedrag van schimmels bij verschillende koolstofvoeding
zijn vele onderzoekingen gedaan, hoewel er niet op de verandering
van de virulentie gelet werd. In het algemeen blijkt wel, dat ver-
andering van concentratie van de koolstofbron een groote verande-
ring in de ontwikkeling van de schimmel teweegbrengt. Dit is
dus heel wat anders dan bij stikstof het geval was.

Butkewitsch (1903) vindt bij zijn proeven met Aspergillus
niger, dat, wanneer men deze schimmel pepton als eenige C- en
N-bron geeft, men een schadelijke ophooping van ammoniak krijgt.
Wanneer hij bij de peptonbodems veel suikers toevoegt, dan heeft
er geen ammoniakophooping plaats; zoo krijgt hij b.v. met 4%
pepton en 10% suiker geen ophooping, wel met 0.2% en 6% suiker.
Het blijkt, dat bij deze lage concentraties alle suiker aan het eind
van de proef uit de oplossing verdwenen is.

Nikitinsky (1904) vindt sterke stijging in het schimmel-
drooggewicht bij verhoogde concentratie van de C-bron (bij zijn
experimenten met Aspergillus niger). Suiker blijkt hier bij hooge

concentratie een minder goede C-bron te zijn, bij lage concen-
tratie een heel goede.

Westerdijk (1911) vond bij Sclerotinia libertiana op glu-
cose, saccharose en fructose een vrij langzame groei. Lactose en
zetmeel scheen Sclerotinia niet goed te kunnen verteren; verder
was de schimmel in staat met cellulose als eenige C-bron te groeien.

Killian (1921) ziet bij zijn Monilia cinerea goede groei op
verschillende koolhydraatbodems, b.v. op arabinose, dextrose, fruc-
tose, galactose, mannose, saccharose en maltose (lactose iets min-
der goed). Dextrinum en raffinose zijn niet goed en inuline, zetmeel
en cellulose zijn slecht geschikt: op de laatste heelemaal geen groei,
op de andere twee vrijwel geen vorming van luchtmycelium, alleen
wat substraatmycelium. Hij vindt, dat het C-gehalte van de vloei-
stof alleen invloed uitoefent op de groeisnelheid. Een vermindering
van het C-gehalte geeft direct vermindering in myceliumontwik-
keling.

Vasudeva (1930) vindt bij zijn infectieproeven met Botrytis
alia op appels, dat de verhitte appels, welke minder saccharose, maar
meer gereduceerde suikers bevatten, heviger worden aangetast. Hij
begrijpt niet, waardoor het komt, want ze groeien op bodems met
deze beide verschillende suikers even goed. Hij komt dan tot de con-
clusie, dat hier een veranderde permeabiliteit een rol speelt, waar-
door de N beter naar buiten kan diffundeeren. Hij vond n.l. door
toevoeging van N een betere aantasting; maar de hoeveelheid N in
de verhitte en onverhitte appels blijft dezelfde. Misschien kan de
oplosbare N beter uit de verhitte appels diffundeeren. Toch is het
best mogelijk, dat de suiker hier ook een rol speelt.

Bij mijn proeven over de invloed van de stikstof werd een groot
verschil in virulentie gevonden tusschen de cultures, welke naast
pepton als N-bron alleen saccharose als C-bron kregen en die,
waarbij glucose-saccharose was toegevoegd. Nu is de verdere
samenstelling van de pepton-glucose-saccharose-bodem ook ver-
schillend, o.a. bevat het Ca(N03)2. Het zou dus ook een invloed
van nitraat of Ca kunnen zijn. Daarom werd het calciumnitraat
weggelaten: ook nu werd een sterke infectie verkregen. Bovendien
bevatte het slechts 1% pepton, terwijl de pepton-saccharose-agar

2% bevatte. Verwisselt men dit, dan krijgt men evenwel toch geen
ander resultaat.

Daar echter ook de samenstelling van het milieu, wat de mine-
rale zouten betreft, anders was, werd nu de volgende bodem ge-
maakt: 2% pepton, 0.5% KH2PO4, 0,25% MgS04, 3% glucose.
2% saccharose, 2% agar. Hiermee kreeg men ook weer een sterke
aantasting, en ook, indien men in plaats van 2% pepton 1% pep-
ton nam.

Nu was het percentage aan koolhydraten in de pepton-saccha-
rose-agar eenerzijds en in de pepton-glucose-saccharose-agar an-
derzijds ook verschillend, dit was n.1. in het laatste geval grooter.
Daarom werd nagegaan, hoe de infectie met de cultures van de
pepton-saccharose bodems verliep, wanneer men in plaats van 2%
saccharose 5% en 10% gaf.

Met 5% saccharose kreeg men nog een geringe aantasting, maar
met 10% kreeg men een sterke infectie, van de 36 planten gingen
er 31 dood. Dit zou er op wijzen, dat de schadelijke invloed werke-
lijk door een ophooping van ammoniak bij lage C-concentratie
komt, zooals Nikitinsky en Butkewitsch vonden voor
Aspergillus niger. Inderdaad krijgt men met Nessler's reagens in
de cultures met pepton, W33r3.3n sscchsrosc wss toeQfevoeQfd
na 14 dagen nog een oranje neerslag; voegt men 10% saccharose
toe, dan krijgt men na 14 dagen geen neerslag.

Er werden verder proeven genomen, waarin naast pepton en de
mineralen verschillende suikers werden gegeven, en wel resp.: 2%
glucose, 2% fructose, 2% lactose en 2% maltose. Infecteerde men
met cultures van Sclerotinia sclerotiorum (stam C. B. S.), die 14
dagen op deze bodems hadden gestaan, dan zag men onderhng
weinig verschil; toch kreeg men een betere infectie dan met saccha-
rose, echter niet zoo goed als met glucose-saccharose. Tabel XI
geeft de resultaten weer.

Waardoor nu echter het groote verschil tusschen saccharose
eenerzijds, de andere koolhydraten anderzijds, werd veroorzaakt,
bleef onopgelost. De groei was op de verschillende bodems heel
goed. Het is mogelijk, dat men resp. met glucose, fructose, lactose
en maltose een andere stofwisseling krijgt, waardoor minder
ammoniak opgehoopt wordt. Hierop wijst ook het feit, dat de pH
met de andere koolhydraten ook niet zoo hoog wordt als met

saccharose. Met glucose, waar soms een vrij groote, soms een ge-
ringe aantasting plaats heeft, blijkt juist in die gevallen, waar de
pH 3,4 tot 4,7 werd, een groote aantasting plaats te hebben. Waar

12-14
3-8
11

12-14
12-14
12-14

15
9
1

19
25
22

glucose

fructose

lactose

maltose

De volgende tabel geeft de pH-verandering weer op de pepton-
bodems met verschillende koolstofbron.

glucose 2 %
maltose 2 quot;U ■
lactose 2 % . •
saccharose 2 quot;/o

5 °/o

10 7o

glucose 3 Vo sacch. 2 %

Vervolgens werd nagegaan, of er verschil in virulentie was met
varieerende C-bron en 0.5% (NH4)2S04 als N-bron; verder be-
vatte de voedingsbodem 0.5% KH2PO4. 0.25% MgS04 en 2%
agar. Met 2% saccharose, 2% glucose. 2% fructose en 2% galac-
tose was de groei goed; er had sclerotiënvorming plaats. Met 2%

dextrinum, 1% maltose en 1% amylum solubile was de groei vrij
goed; er had sclerotiënvorming plaats; de sclerotiën waren bij mal-
tose vrij klein. Met cellulose was de groei ook vrij goed, doch er
werden geen sclerotiën gevormd. Met 1% gummi arabicum was de
groei heel slecht.

Er werden nu weer tomatenkiemplanten geïnfecteerd met cul-
tures, die 10 tot 16 dagen op deze verschillende bodems gestaan
hadden. Het bleek, dat er weinig verschil in aantasting was.
Alleen in die gevallen, waar gummi arabicum, amylum solubile of
cellulose gegeven werd, kreeg men een heel geringe aantasting.
Nu was met gummi arabicum de groei ook heel slecht, maar met
amylum solubile en cellulose kreeg men een vrij behoorlijke groei.
Door verscheidene onderzoekers is gevonden, dat verschillende Scle-
rotinia- en Botrytis-sooiten in staat zijn cellulose door een enzym
op te lossen (De Bary (1886), Marshall Ward (1888),
Behrens (1898), Smith (1902)). Zoodoende zijn ze in staat
om op cellulose als eenige C-bron te groeien, hoewel niet overvloe-
dig; ik kreeg evenwel met dergelijke cultures vrijwel geen infectie.

De pH na 14 dagen was met amylum solubile 3.3—3.4, met gum-
mi arabicum 3.7—4.4 en met cellulose 4.3—4.8, terwijl hij in de
overige gevallen 2.8 was. Men ziet hier dus niet zulke groote pH-
veranderingen als bij de pepton-bodems. Waarschijnlijk heeft men
hier niet te doen met een schadelijke ophooping van stofwisselings-
producten, maar met een minder goede voeding van de schimmel.

Tabel XIll geeft een overzicht van de resultaten van de infectie-
proeven met cultures, die 10 tot 16 dagen oud waren.

Bovendien werden nog tomaten geïnfecteerd met cultures, die
als C-bron glucose kregen en als N-bron resp. KNO3 en aspara-
gine. De groei hierop was goed. Men kreeg met KNO3 93.7%
infectie en met asparagine 59.4%. Ook met andere stikstofverbm-
dingen is glucose een geschikte C-bron voor Sclerotinia.

De vorige proeven werden alle uitgevoerd met de stam C. B. S.
Met de stam Whetzel II werden nu slechts nog enkele proeven
gedaan; er werd nagegaan, of men hier ook met amylum solubile
en gummi arabicum een verminderde virulentie kreeg Dit bleek
inderdaad het geval te zijn. Op gummi arabicum was de groei ook
weer slecht, een dun laagje mycelium en slechts enkele Sclerotien.
De groei en de sclerotiënvorming op de andere koolhydraten bleken
ook dezelfde te zijn als bij de vorige stam. Met gummi arabicum
gingen er slechts 5.8% planten dood, met ^««ylquot;«^^nbsp;^2.8%.

Uit de verschillende proeven over de invloed van de koolhydraat-
voeding op de virulentie blijkt, dat er over het algemeen weinig
verschil is tusschen de verschillende koolhydraten: alleen blijkt met
amylum solubile, hoewel hierop een vrij behoorlijke groei is, de
virulentie gering te zijn. Cellulose en gummi arabicum zijn niet ge-
schikt als C-bron.nbsp;1 .. 1 j .

toevoeging van de koolhydraten een verminderde ophooping van
de schadelijke stofwisselingsproducten krijgt; dit is vooral het ge-
val. indien men pepton als N-bron heeft.

Over Rhizoctonia solani Kühn is reeds zeer veel gepubliceerd.
Allereerst werd er strijd gevoerd of de uiteenloopende vormen
op te vatten zouden zijn als verschillende soorten van Rhizoctonia,
óf dat men met verschillende stammen van Rhizoctonia solani te
doen had. Het bleek nu, dat dikwijls stammen van Rhizoctonia
solani als nieuwe soorten beschreven zijn, waardoor veel verwar-
ring gesticht werd.

De groote moeilijkheid is, dat men in de meeste gevallen de
basidiumvorm niet vindt; in cultuur worden zelden basidiosporen
'gevormd. Bij Müller (1923) vindt men vermeld, dat hij een
enkele maal in zijn cultures het ontstaan van basidiosporen gezien
heeft.

Simon Thomas (1925) geeft een uitgebreid literatuurover-
zicht. Hij komt tot de conclusie, dat de verschillende Rhizoctonia's,
waarmee hij werkte, verschillende stammen van Rhizoctonia solani
zijn en dat dit tevens het geval was met de schimmels, die bekend
zijn onder de naam Moniliopsis Aderholdii en met de door hem
gebruikte orchideeënschimmels.

Briton-Jones (1924) was tot dezelfde conclusie gekomen.
Al ziet men macroscopisch verschil, toch moet men de verschillende
vormen beschouwen als behoorende tot Rhizoctonia solani: micros-
copisch zijn de verschillen gering.

een steriele vorm van Botrytis cinerea beschouwd (o.a. door Beauve-
rie 1899). Ruhland (1906) bewees echter, dat het een geheel
andere schimmel is. Omdat er Moni/ra-achtige cellen gevormd wor-
den stelt hij de naam Moniliopsis voor en noemt haar dan Mont-
liopsis Aderholdii Ruhl. Zooals reeds gezegd is. blijkt ook dit een

Ook is er verschil van meening over de naam van het fructificee-
rende stadium van Rhizoctonia solani. Volgens de Amerikaansche
onderzoekers is dit Corticium vagum Berk. 6 Curt. (R o 1 f s 1904;
Duggar. 1915; Richards, 1921; Briton-Jones. 1924),
terwijl de Europeesche onderzoekers van meening zijn, dat het
geen Corticium. doch een Hypochnus is en

Prill. 6 Delacr. (A u b e r t, 1906; P e t h y b r i d g e, 1916; W o 1-
lenweber. 1920; Müller, 1923, 1925). Deze beide namen

De hier besproken literatuur is slechts een klein deel van de
over Rhizoctonia verschenen literatuur. Uitgebreid behandeld vmdt
men deze in de monographie van B r a u n (1930).

Rhizoctonia solani is een schimmel, waarvan het uiterlijk zeer
verschillend kan zijn. Niet alleen de verschillende stammen, maar
ook de cultures van één stam kunnen onderling zeer sterk variee-
ren al naar gelang van de voedingsbodem, waarop ze gekweekt
worden; zoo is b.v. de kleur van de cultuur variabel.

Rhizoctonia vormt pseudoconidiën en pseudosclerotien. De pseu-
doconidiën ontstaan, doordat in een zijhyphe een aantal dwars-
wanden wordt gevormd, zoodoende ontstaat een reeks korte
cellen. Doordat zoon hyphe slechts zelden en dan in onregelmatige
stukken uiteenvalt, onderscheiden de pseudoconidiën zich van de
echte conidiën. De pseudosclerotiën bestaan uit een homogene massa
van door elkaar gevlochten hyphen en pseudoconidiën-kettingen
en ze hebben niet, zooals de echte sclerotiën, een centraal deel met

De vorm van de pseudosclerotiën kan bij de verschillende stam-
men zeer verschillend zijn, in sommige gevallen ontbreken ze zelfs.

De temperatuur speelt bij Rhizoctonia een voorname rol; de op-
timumtemperatuur voor de groei loopt voor de verschillende stam-
men sterk uiteen.

ken: de verschillende stammen zijn in staat andere planten dan
hun oorspronkelijke voedsterplant aan te tasten.

M atsumoto (1923) onderzocht, op welke wijze Rhizoctonia
solani binnendringt. Het blijkt, dat het proces veel overeenkomst
vertoont met dat bij Sclerotinia; hij vindt zoowel mechanische als
enzymatische werking; de middenlamel wordt opgelost door extra-
en intracellulair gevormde pectinase. Verder wordt er ook cellu-
lase gevormd. Bovendien gelooft hij, dat ook de cuticula aangetast
wordt en dat dus bij het doordringen hiervan door de hyphen
niet alleen een mechanische werking plaats heeft. Wel is waar
krijgt hij geen aantasting van de cuticula door een mycelium-
extract, maar hij vindt, dat men hieruit niet mag concludeeren, dat
er dus absoluut geen oplossing van de cuticula plaats heeft, want
het levende mycelium kan heel anders werken dan het extract.

Hij ziet bovendien, dat de cuticula onder de eroverheen groeiende
hyphen dunner is dan normaal en soms zelfs ontbreekt.

Verder gaat hij na, of Rhizoctonia solani een duidelijk pH-op-
timum voor haar groei heeft. Dit blijkt niet het geval te zijn. Het
optimum wisselt sterk met de verschillende bodems, maar de groei
is overal goed binnen de pH 3,0—7,0.

De stam van Rhizoctonia solani, waarmee ik mijn proeven deed
was door van L u ij k in 1931 geïsoleerd van graszaad. In navol-
ging van S i m o n T h o m a s (1925) zou ik deze stam willen noe-
men Rhizoctonia solani graminis.

Deze stam vormt weinig luchtmycelium; het substraatmycelium
vormt een dichte laag. De kleur van dit mycelium varieert van wit
tot bruin.

De bruine pseudosclerotiën, die tegen de wand van de cultuur-
buis gevormd worden, zijn klein (1—1 a 2 mM.), soms worden
er heele korsten van dergelijke kleine, aan elkaar hangende pseudo-
sclerotiën gevormd. De pseudosclerotiën, die op de voedingsbodem
ontstaan, zijn grooter; de grootte varieert echter sterk, gemiddeld
bedraagt ze 3 ä 4—3 ä 7 mM. Maar in sommige gevallen kunnen
ze veel grooter worden, b.v. 7—14 mM in 3 maanden oude cultures
op pepton-glucose-saccharose-agar; ook op bouillon-agar zijn de
pseudosclerotiën vaak heel groot.

De optimumtemperatuur voor de groei ligt bij deze stam heel
hoog, ± 31° C. Boven deze temperatuur neemt de groei sterk af

en wordt bovendien erg onregelmatig. Fig. 2 geeft een grafische
voorstelling van de groei bij verschillende temperaturen en wel bij
10. 20, 24, 26, 28, 31 en 35° C; bij 37° C was de groei zoo onregel-
matig, dat er geen gemiddelde van te bepalen viel. Bij 10° C was
de groei heel langzaam, pas na 23 dagen was de schaal volgegroeid.

Om de groeisnelheid te meten werd de schimmel in petrischalen
op moutsalep gekweekt en de doorsnede van de cultuur na 1, 2...
enz. dagen gemeten. Wanneer de schaal volgegroeid was. bedroeg
de doorsnede 88 mM. Op de abscis is de tijd aangegeven, op de
ordinaat de gemiddelde doorsnede in mM.

110

. 100
z

É 90

^ 80
0)

quot;2 70
c

-8 50

11
-D
■D

I 20

Het is wel opmerkelijk, dat het groeioptimum van deze schimmel,
die van graszaad geïsoleerd is, zoo hoog ligt. Simon Thomas
(1925) kon bij zijn Rhizoctonia-stammen twee groepen onderschei-
den; een groep met een hooge optimumtemperatuur (hiertoe be-
hooren stammen, die uit een warme omgeving afkomstig zijn) en
een groep met een lage optimumtemperatuur; in deze laatste groep
treft men de stammen uit de gematigde streken aan. Toch kwamen
er bij Simon Thomas ook uitzonderingen voor; hij vond n.l.
dat de symbionten van twee tropische orchideeën ook een lage
optimumtemperatuur hadden.

Om de invloed van de voeding op de virulentie te kunnen be-
palen werd wederom gebruik gemaakt van infectieproeven; hier-
toe werd als volgt te werk gegaan: de schimmel werd in dit geval
in buizen inplaats van op petrischalen gekweekt. Dit werd gedaan,
omdat gebleken was, dat men bij Rhizoctonia een beter resultaat
kreeg, wanneer men niet de aarde van de heele pot infecteerde, maar
direct bij elk plantje wat infectiemateriaal bracht. Zoodoende was
het niet noodig de schimmel op petrischalen te kweeken.

Met de Rhizoctonia werden jonge raapsteelplanten geïnfecteerd.
Daar men bij de gewone raapstelen uit de tuinbouw nooit precies
weet, met welke variëteit men werkt, gebruikte ik de kiemplanten
van Brassica chinensis.

Er werd eerst nagegaan of er verschil in vatbaarheid is tusschen
de gele varieteit {Brassica chinensis var. Nunhem) en de groene
{Brassica chinensis var. Lungbok). Er bleek geen verschil te zijn;
voor de verdere proeven werd alleen de groene variëteit gebruikt.

Het zaad werd gedesinfecteerd in een 0,25% Germisahoplos-
sing gedurende 20 minuten en hierna een uur gespoeld met lei-
dingwater en vervolgens uitgezaaid in zaaipannen. Na 7 tot 12
dagen, wanneer de planten de gewenschte grootte bereikt hadden,
werden ze verspeend; ze hadden dan goed ontwikkelde kiembladen.
Naarmate de temperatuur in de kas hoog of laag was, duurde dit

natuurlijk korter of langer, vandaar dat er meer op de grootte dan
op de leeftijd gelet werd. Er werden telkens 5 planten in een pot
met bladaarde geplant; de pot had een doorsnede van 10 cM. Ook
in dit geval was het, evenmin als bij Sclerotinia noodig de
bladaarde te steriliseeren. De potten werden in de verwarmde kas
in turfmolm ingegraven en goed vochtig gehouden. De volgende
dag werden de planten pas geïnfecteerd; zoodoende kon men ook
nagaan of er door het verspenen geen plantje beschadigd was ge-
worden. Een enkele maal kwam dit voor (de jonge raapsteelplanten
zijn zeer bros), maar dankenden er nieuwe planten voor in de plaats
gezet worden. Bij het infecteeren werd de aarde om het hypocotyl
wat los gemaakt, dan werd er een stukje voedingsbodem met
schimmel tegen aangebracht en dit weer met aarde toegedekt.

Bij de gunstigste temperatuur (± 24° C) ziet men reeds na een
paar dagen een aantal planten verwelken. De temperatuur speelt
bij de infectie een groote rol (zie ook R i c h a r d s. 1921; S i m o n
Thomas, 1925). Indien de temperatuur in de kas de geheele
dag beneden de 20° C bleef, verliep de infectie buitengewoon lang-
zaam. Zoodra de potten bij een hoogere temperatuur gebracht wer-
den, kreeg men weer het snelle verloop. Bij de gunstige temperatuur
groeit het mycelium zeer goed in de aarde en breidt zich sterk uit.

De stam van Rhizoctonia solani, welke gebruikt werd, is reeds
in het vorige hoofdstuk beschreven en wordt Rhizoctonia solani
graminis genoemd. Deze stam is nu 2 jaar in cultuur en infecteert
nog 100% onder gunstige omstandigheden.

Evenals Sclerotinia werd Rhizoctonia gekweekt op verschillende
voedingsbodems, die in het laboratorium aanwezig zijn; dit zijn
v.n.1. natuurlijke bodems, echter ook eenige synthetische (de recep-
ten van de gebruikte voedingsbodems werden op p. 17 gegeven).

De schimmel vertoonde op de meeste van de onderzochte bodems
een uitstekende groei. Zoo was de groei zeer goed met flinke my-
celium- en pseudosclerotiënvorming op: pepton-glucose-saccharose-
agar, mout-, X-, bouillon- en boon-agar. Alleen de kleur van de
cultures was verschillend: bij de eerste drie was deze bruin, bij
de cultures op bouillon- en boon-agar wit.

Rijke mycelium-, maar geringe pseudosclerotiënvorming had
plaats op 1% pepton- en op aardappel-agar; de kleur van de cul-
tures was bruin.

Op maismeel-agar was de groei wat minder goed, ook was de
pseudosclerotiënvorming niet zoo sterk; de kleur van de cultures
was wit.

Bepaald slecht was de groei te noemen op cellulose- en 2% agar;
er werd een heel dun laagje mycelium gevormd, terwijl de pseudo-
sclerotiën bijna geheel ontbraken.

Jonge raapsteelplanten werden geïnfecteerd met deze verschil-
lende cultures van Rhizoctonia solani graminis. Er werden jonge
cultures gebruikt (6—10 dagen oud) en oudere cultures (18—23
dagen oud).

Bij de goede voedingsbodems maakte dit verschil in leeftijd
weinig uit, maar met de cultures op 2% agar was er een groot
verschil. Infecteerde men met jonge cultures van deze bodem, dan
kreeg men nog een sterke aantasting: van de 25 planten gingen
er 21 dood. Met de oudere cultures kreeg men bijna geen aantas-
ting meer (van de 49 planten gingen er maar 4 dood).

Bij de cultures van de overige voedingsbodems was de virulentie
van de schimmel even groot in de jonge als in de oude cultures;
ook tusschen de meeste van de cultures van de verschillende voe-
dingsbodems is onderling weinig verschil in virulentie te zien. Een
uitzondering maken de cultures van cellulose- en aardappel-agar,
want, terwijl in de overige gevallen de infectie zeer snel gaat en
100% bedraagt, gaat het hier langzamer en niet ahijd tot 100%;
toch is de aantasting soms nog groot.

Uit deze resultaten blijkt dat Rhizoctonia zeer goed kunstmatig
te kweeken is en dat zij geen bijzondere voorkeur voor een be-
paalde voedingsbodem heeft. Alleen indien de voedingsbodem
slecht is, is de aantasting geringer, b.v. met 2% agar. Ed son
enShapovalov (1918) vonden iets dergelijks. Zij kregen wei-
nig of geen infectie, wanneer ze aardappels infecteerden met een
cultuur van Rhizoctonia solani die gegroeid was op Melilotusstengel
en een sterke aantasting met een cultuur van rijst en aardappel.

schadelijke invloed, wat het geval was bij Sclerotinia. Nadat Rhi-
zoctonia 10 dagen op 1% pepton-agar gegroeid was, kreeg men al
met Nessler's reagens een oranje neerslag, wat op ammoniakop-
hooping wijst; toch was de virulentie hier nog groot.

Voor de proeven om de werking van de stikstof na te gaan, wer-
den de volgende voedingsbodems gemaakt, bevattende:

2% saccharose; 0,5% KH2PO4; 0,25% MgS04: 1% KNO3 en
2% agar. KNO3 werd in andere series door verschillende N-ver-

De groei was op deze verschillende bodems heel goed; met 0,5%
(NH4)2S04; 0,5% NH4CI en 0,4% NH4NO3 werden er veel
pseudosclerotiën gevormd en was het mycelium wit.

Met 0,3% ureum en 0,5% asparagine was het mycelium licht
bruin gekleurd, terwijl er ook weinig pseudosclerotiën ontstonden.

Met 1 % KNO3 tenslotte was het mycelium ook bruin, maar de
pseudosclerotiën waren heel klein en weinig talrijk.

Infectieproeven met dergelijke cultures, die 6—10 dagen oud
waren, gaven weinig verschil te zien: na 5 dagen was er vrijwel
in geen enkele serie een gezonde plant meer over, terwijl na 3
weken alle planten dood waren.

Met cultures, die 18—23 dagen oud waren, is er wat meer ver-
schil te zien. Bovendien ging de infectie hiermee langzamer. In
tabel XIV is weergegeven, hoe de infectie met cultures van 18—23
dagen verliep. Vijf dagen na de infectie werden de planten
onderscheiden in: gezond, licht aangetast, zwaar aangetast. Onder
licht aangetast werd een beginnende verwelking verstaan, terwijl
zwaar aangetaste planten geheel omgevallen waren, maar nog niet
afgestorven. Na 3 weken werden de overgebleven planten onder-
zocht; vaak bleken planten, die er gezond uitzagen, toch aange-
tast. De verschillende sterkte van aantasting wordt in de tabel als
volgt onderscheiden:

1.nbsp;de schors van het hypocotyl vertoont enkele bruine vlekjes; de
plant ziet er verder gezond uit;

2.nbsp;een grooter deel van de schors is bruin verkleurd; de plant ziet
er echter nog gezond uit;

5.nbsp;er is bijna niets meer van de plant over, terwijl het hypocotyl
geheel doorgerot is en nieuwe wortels gevormd zijn.

Verloop van infectieproeven met cultures van
Rhiz. solani graminis (18—23 dagen oud)

Van een duidelijke invloed van de stikstofvoeding van de schim-
mel op haar virulentie is hier bij Rhizoctonia solani niets te zien.
Met pepton is in enkele gevallen de virulentie wel iets minder, ter-
wijl ook met 0,5% NH4CI de aantasting in één serie wat geringer
was; maar daar tegenover staan weer series met cultures van deze
bodems, waar de aantasting sterk was.

De invloed van de temperatuur is in deze tabel goed te zien. In
de series met asparagine, ureum en NH4NO3 als stikstofbron liep
de temperatuur hoog op en het resultaat was, dat de infectie hier

Verschillende stadia van aantasting bij raapstelen door Rhizoctonia solani.
Van links naar rechts: Controle, stadium 1. 2, 3, 4 en 5.

veel sneller verliep dan in de overige gevallen. Er werd natuurlijk
voor gezorgd, dat het mycelium niet uit kon drogen.

Bij de volgende proeven werden cultures gebruikt, die al eenige
maanden telkens op dezelfde bodem overgept —• ^ ^^
jonqe cultures was de infectie na een stikstofvoedmg van ICNO3.
NhTcI (NH4).S04 en pepton overal nog 100%; alle planten

dttdere cultures kreeg men nog wel een flinke aantasting,
maar niet alle planten gingen dood. Tusschen de diverse N-senes
onderling is weinig verschil te zien (zie tabel XV).

Invloed van een eenvormige voeding bij cultures van Rhizoctonia,
die 21 dagen oud zijn

21
4

6
20
6

Toch kan men hier niet spreken van een achteruitgang van de
virulentie door eenvormige voeding; het verschil is te klem. ook
doordat de uitwendige factoren een rol bij de mfectie spelen, dan
dat men een dergelijke conclusie mag trekken.

Om uit te maken, hoe Rhizoctonia reageerde op verschillende
C voeding werd deze schimmel gekweekt op synthetische voedings-
bodems met varieerende C-bron. De voedingsbodem bevatte be-

halve 2% van de verschillende koolhydraten nog: 0,5% KH2PO4;
0,25% MgS04; 0,5% (NH4)2S04 en 2% agar.

De groei was op de verschillende onderzochte bodems uitstekend,
terwijl de kleur van de cultures in alle gevallen wit was.

Het eenige verschil was, dat met 2% gummi arabicum en 2%
lactose vrij weinig pseudosclerotiën werden gevormd en dat met
2% dextrinum, 2% amylum solubile, 2% saccharose, 2% maltose
en 2% glucose de vorming van de pseudosclerotiën behoorlijk was.
Op foto V is het verschil tusschen lactose eenerzijds en glucose en
maltose anderzijds te zien; deze cultures waren 16 dagen oud.

Wanneer men nu jonge raapsteelplanten met dergelijke cultures
infecteert, dan blijkt, dat de cultures, die lactose als C-bron kregen,
minder virulent waren dan de andere. Het verschil is wel niet
groot, maar de infectie verloopt ook langzamer in geval van jonge
cultures. Met de overige koolhydraten kreeg men overal een sterke

Lactose is dus blijkbaar niet zoo geschikt als C-bron voor deze
stam van Rhizoctonia solani; vooral na infectie met oudere cultures
is dit te zien. Met amylum solubile verloopt de infectie in beide

Foto VI geeft het beeld van een serie, waarbij geïnfecteerd was
met een cultuur van 11 dagen, gefotografeerd 7 dagen na de in-
fectie. Van links naar rechts had de schimmel als C-bron gekregen:
maltose, glucose en lactose, geheel rechts is de controle.

De groei was heel goed op deze bodem (kleur van de cultuur
bruin), maar er werden weinig pseudosclerotiën gevormd.

Het resultaat van de infectieproeven met dergelijke cultures, die
18—23 dagen oud waren, was als volgt:

Indien de C-bron amylum solubile is, krijgt men dus met pepton
als N-bron een minder goed resultaat dan met (NH4)2S04, al is

Resumeeren we dus de verschillende resultaten over de invloed
van de koolstofbron op de virulentie van Rhizoctonia solani, dan
zien we dus weer, dat ook hier weer bijna overal de virulentie groot
was; alleen met lactose als C-bron was de virulentie wat minder

Verder verloopt in de meeste gevallen de infectie met oudere
cultures langzamer dan met jonge cultures. Alleen met amylum
solubile als C-bron en (NH4)2S04 als N-bron krijgt men met 3
weken oude cultures nog een vrij snelle aantasting.

de jonge cultures gaat de infectie wel langzaam, maar het eind-
resultaat geeft toch een groot percentage doode planten.

De virulentie van Rhizoctonia solani Kühn is dus niet zoozeer af-
hankelijk van de voedingsbodem als wel van de leeftijd van de
cultuur. Indien men jonge cultures gebruikt, krijgt men overal een
sterke aantasting, ook wanneer de schimmel al een paar jaren kunst-
matig gekweekt is.

Bij de voorgaande proeven werd nagegaan, in hoeverre er sprake
is van een invloed van de voeding van schimmels op de virulentie.
Eerst werd het gedrag van Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) Mas-
see nagegaan.

1.nbsp;Er werden cultures van 14 dagen vergeleken, met verschillende
stikstofverbindingen als N-bron en saccharose als C-bron. Met
ammoniumverbindingen is de virulentie het grootst, KNO3
geeft in een aantal gevallen een minder goed resultaat. Van
de organische stikstofverbindingen krijgt men met ureum de
sterkste infecties, maar toch minder sterk dan met de anorga-
nische N-verbindingen; dan volgt asparagine, terwijl op pepton
de virulentie veel geringer is. De groei is op al deze bodems

2.nbsp;Proeven, waarbij de invloed van de verschillende koolhydraten
(met (NH4)2S04 als N-bron) werd nagegaan, gaven het vol-
gende resultaat: met cellulose en gummi arabicum een slechte
groei en gering infectievermogen: met amylum solubile een vrij
behoorlijke groei, maar toch geringe virulentie. Met saccharose,
glucose, fructose, galactose, dextrinum. maltose en lactose was

3.nbsp;De ouderdom van de cultures speelt een belangrijke rol. daar
er in de oudere cultures een schadelijke ophooping van ammo-
niak kan optreden. Het is natuurlijk mogelijk, dat er nog
andere stofwisselingsproducten een rol spelen, maar deze zijn

groot, zoodat de virulentie bij cultures van 14 dagen al gering
is; cultures van een week geven nog een flinke aantasting; er
zijn dan slechts weinig stofwisselingsproducten gevormd. Met
3 weken oude cultures krijgt men alleen met ammoniumverbin-
dingen als N-bron een behoorlijke aantasting.

4.nbsp;Door suiker in groote hoeveelheid toe te voegen wordt de scha-
dehjke ophooping van de ammoniak bij de pepton-bodems tegen-
gegaan, daar de gevormde ammoniak dan weer verbruikt kan
worden.

5.nbsp;Met de verschillende natuurlijke voedingsbodems bleef de viru-
lentie groot.

6.nbsp;Langdurige groei op dezelfde bodem heeft in enkele gevallen
een nadeelige invloed. Na eenvormige voeding met 4% en 40%
saccharose-agar is de virulentie na 5 maanden nog sterk. Na
een half jaar is de groei echter zoo gering, dat de cultures niet
meer te gebruiken zijn.

Na een groei van een jaar op moutsalep (na geregelde over-
enting) is de virulentie verdwenen. Macroscopisch ziet zoo'n
cultuur er ook anders uit. Bij overenting van een dergelijke cul-
tuur op pepton-glucose-saccharose-agar, ziet deze er zeer abnor-
maal uit en ook hiermee geven de infectieproeven een negatief
resultaat. In de overige gevallen was er geen nadeelige invloed
van eenvormige voeding te zien.

de bodem op de virulentie te bemerken; de proeven gaven het vol-
gende resultaat:

L De virulentie van de cultures, met de verschillende stikstofver-
bindingen als N-bron, is overal sterk.

2.nbsp;Van de onderzochte koolhydraten is lactose het minst geschikt
als C-bron; de infectie verloopt in dit geval langzamer dan in
de overige gevallen: amylum solubile als C-bron geeft daaren-
tegen zeer goede resultaten.

3.nbsp;De leeftijd van de cultuur is van belang: na gebruik van cul-
tures van 3 weken verloopt de infectie langzamer dan met
jongere.

4.nbsp;Na een eenvormige voeding van eenige maanden is de viru-
lentie op de onderzochte bodems, met KNOg, NH4CI,
(NH4)2S04, pepton en asparagine als N-bron, nog sterk.

APPEL. O., BRUCK. W. F.. Sclerotinia Libertiana Fuekel als Schädiger von
Wurzelpflanzen.

1907. Arb. Biol. Reichsanst., Bd. 5, p. 189.
APPEL, O.. WOLLENWEBER, H. W., Grundlagen einer Monographie der
Gattung Fusarium (Link).
1913, Arb. Biol. Reichsanst., 8., p. 1.
ATIENZA. M., Sclerotium disease of Tomato and Pepper.

1927, Philipp. Agr., vol. 15, p. 579.
BARY. A. DE, Ueber einige Sderotinien und Sclerotienkrankheiten.
1886, Bot. Zeit.. Bd. 44, p. 377.

BEHRENS, J.. Ueber das Auftreten des Hanfkrebses in Elsasz.
1891, Zeitschr. f. Pflanzenkr., Bd. I. ^ 208.

1898, Centn Bl. Bakt. Abt. II. Bd. 4 p. 514.
BOYLE, C.. Studies in the Physiology of Parasitism. VI.

1921 Ann. of Bot., vol. 35. p. 337.
BRAUN A., Der Wurzeltöter der Kartoffel Rhizoctonia solam K.

1930, Julius Springer Verlag.
BREFELD, O.. Botanische Untersuchungen über Schimmelpilze.

1924. Transact. Brit. Myc. Soc.. vol. 9. p. 200.
BROOKS F T.. Observations on the Biology of Botrytis cinerea.

1917 The New Phytologist. vol. 16, p. IW.
__L Experiments on the growth of Fungi on culture media.

1923, Ann. of Bot., vol. 37. P-
__Studies in the genus Fusarium. IV On the occurrence of saltations

BROWN, W., HARVEY, C. C., Physiology of Parasitism. X On the entrance
of parasitic Fungi into the host plant.

BURKHOLDER, W. H., Variation in a member of the genus Fusarium grown
in culture for a period of five years.
1925, Am. Journ. of Bot. vol. 12, p. 245.
BÜSGEN, M.. Ueber einige Eigenschaften der Keimlinge parasitische Pilze.
1893, Bot. Zeit., Bd. 51, p. 53.

1918, Flora, Bd. 111/112, p. 606.
BUTKEWITSCH. Wl., Umwandlung der Eiweissstoffe durch die niederen Pilze
im Zusammenhange mit einigen Bedingungen ihrer Entwicklung.
1903, Jahrb. wiss. Bot., Bd. 38, p. 147.
BUTLER, E. J., Fungi and Disease in plants.

1918, Thacker, Spink amp; Co, Calcutta.
DONANDT, S., Untersuchungen über die Pathogenität des Wirtelpilzes Verticil-
lium alboatrum.
1932, Ztschr. f. Parasitenkunde. Bd. 4, p. 653.
DUGGAR, B. M., Rhizoctonia crocorum (Pers) D. C. and Rhizoctonia solani
Kühn (Corticium vagum B. amp; C.) with notes on other spedes.

1915,nbsp;Ann. Missouri Bot. Garden, vol. 2, p. 403.
EDSON, H. A.. SHAPOVALOV, M., Potato-stem lesions.

1918, Journ. Agr- Res., vol. 14, p. 213.
EIDAM, Culturversuche der Lupinensclerotien.

1877, Jahres-Ber. d. Schles. ges. f. vaterl. Cultur. 55, p. 149.
ELMER, O. H., Pathogenic and cultural comparisons of strains of Rhizoctonia
solani.

1932, Phytopath., vol. 22, 1, p. 8.
FISCHER, E., GÄUMANN. E., Biologie der pflanzenbewohnenden parasitischen
Pilze.

1928,nbsp;Ann. des Epiphytes 14e année no. 4.
FRANK, B., Die Krankheiten der Pflanzen, Bd. 2.

1906, Bot. Gaz.. vol. 41, p. 81.
GRAVES, A. H., Chemotropism in Rhizopus nigricans.

1893, Bot. Gaz. vol. 18, p. 85.
IWAO HINO, Notes on Sclerotia of milk vetch Rot Fungu.s.

KILLIAN. K., Ueber die Ursachen der Spezialisierung bei den Askomyceten.
I Die Monilia cinerea der Kirschen.
1921, Centr. Bl. f. Bakt. Abt. II, Bd. 53. p. 560.
KISSLING. E.. Zur Biologie der Botrytis cinerea.

1906, Bot. Centrbl, 102, p. 527.
LAURENT M E., Recherches expérimentales sur les Maladies des Nantes

18^1 L. de rinst. Pasteur, 13. p. 1; 1888, 2, p 593; 1889, 3, p. 362.
LETOW, A. S., Ueber die Bedeutung der Sclerotinia Libertiana auf Sonnen-

1930, Phytopath. Zeitschr., Bd. 2, p. 167.
MARCHAL, E., Elements de Pathologie végétale.

1925, Jules Duculot, Gembloux.
MATSUMOTO, T., Further Studies on Physiology of Rhizoctonia solani Kühn.
1923, Bull. Imp. Coll. Agr. and Forestry. Morioka. Japan No. 5.
1924 idem no. 8. Supplementary note on the enzyme activity of Rh. solam.
MIYOSHI. M.. Die Durchbohrung von Membranen durch Pilzfâden.

1885. Jahrb. wiss. Bot.. Bd. 28. p. 269.
MÜILER. K. O., Ueber die Beziehungen zwischen Rhizoctonia solani Kühn
und Hypochnus solani Prill, et Del.

NIKITINSKY J.. Ueber die Beeinflussung der Entwicklung einiger Schimmel-
pilze durch ihre Stoffwechselprodukte.

1904. Jahrb. wiss. Bot. Bd. 40, p. 1.
NORDHAUSEN. M.. Beiträge Biologie parasitärer Pilze.

1899. Jahrb. wiss. Bot., Bd. 33. p. 1.
OTTO, H., Untersuchungen über d. Auflösung v. Zellulosen u. Zellwänden
durch Pilze.

1918, Beiträge zur Allgem. Bot., Haberlandt, Bd. 1, p. 190.
PETHYBRIDGE, G. H., Investigations on Potato diseases.

1916, Dept. Agr. and Techn. Instr. for Ireland, vol. 16, no. 4. p. 27.
RAMSEY, G. B., Sclerotinia spec, causing Decay of vegetables under transit
and market conditions.

RICHARDS, B. L., Pathogenicity of Corticium vagum as affected by Soil
Temperature.

RITTER, G., Ammoniak und Nitrate als Stickstoffquelle für Schimmelpilze.
1909, Ber. D. Bot. Ges., Bd. 27, p. 582.

1931, Obst u. Gemüsebau, 77, 2, p. 36.
SCHELLENBERG, H. C., Untersuchungen über das Verhalten einiger Pilze
gegen Hemizellulose.

1909,nbsp;Centr. Bl. f. Bakt. Abt. II, Bd. 17, p. 188.
SHERBAKOFF, C. D., Fusaria of Potatoes.

1915, Cornell Agr. Exp. Stat. Mem., 6, p. 85.
SIMON THOMAS, K., Onderzoekingen over Rhizoctonia.

1925, Utrecht, Electr. drukkerij „de Industriequot; (diss.).
SMALL, T., Rhizoctonia Foot-rot of the Tomato.

1927, Ann. Appl. Biol., vol. 14, p. 290.
SMITH, R. E., Botrytis and Sclerotinia; their relation to certain plant diseases
and to each ether, v - -

VASUDEVA, R. S., Studies in the Physiology of Parasitism, XII, an analyse
of the factors underlying specialisation of Parasitism with spec, refe-
rence to the fungi Botrytis allü Munn. and Monilia fructigena Pers.

VOLK, A., Einflüsse des Bodens, der Luft und des Lichtes auf die Empfänglich-
keit der Pflanzen.

WAKEFIELD, ELSIE, M., On the name Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) Massee
and Sclerotinia libertiana Fuckel.
1924, Phytopath., vol. 14, p. 126.
WARD, M., On a lily disease.

1888, Ann. of Bot., vol. 2, p. 319.
WESTERDIJK, JOH a., Untersuchungen über Sclerotinia Libertiana Fuck, als
Pflanzenparasit.

1911, Med. Phytopath. Lab. „Willie Commelin Scholtenquot; II.
WOLLENWEBER, H. W., Pilzparasitäre Welkekrankheiten der Kulturpflanzen.
1913, Ber. D. Bot. Ges., Bd. 31.

WOLLENWEBER, H. W., Die Wirtelpilz-Welkekrankheit (Verticilliose) von
Ulme, Ahorn und Linde, usw.
1930, Arb. Biol. Reichsanst., 17, p. 273.
WORMALD, H., The brown rot disease of fruit trees with special reference
to two biologic forms of Monilia cinerea.
1919, Ann. of Bot., vol. 33, p. 361.
YOUNG, P. A., Facultative Parasitism and Host Ranges of Fungi.

ZIMMERMANN. A., Sammelreferate über die Beziehungen zwischen Parasit
und Wirtspflanze, Nr. 3, Sclerotinia, Monilia und Botrytis.

Uit de morphologie van een schimmel mag men niet zonder meer
conclusies omtrent haar virulentie trekken.

Het narcissenaaltje is niet door adaptatie uit het hyacinthen-
aaltje ontstaan: het zijn twee duidelijk te onderscheiden rassen;
daar er cok morphologische verschillen zijn. is het gewenscht ze
te onderscheiden als Tylenchus devastatrix narcissi en Tylenchus
devastatrix hyacinthi.

Het tot genus maken van het sub-genus Nematosporan-
gium A. Fischer brengt veel bezwaren met zich mee.

De periodieke beweging der bladen van Phaseolus multiflorus
is niet alleen autonoom, maar ook erfelijk.

De meening van Mellanby, dat ongesplitst vet, waaraan alleen
gal wordt toegevoegd, geresorbeerd kan worden, is onjuist.

Bodem	Aantal geïnfecteerde planten	! Aantal planten dood	®/o dood
Moutsalcp . , .	54	34	62.9
mout.....	51	40	78,6
alk. bouillon. , .	24	21	87,5
bouillon ....	12	10	83,3
pept. gluc. sacch. .	132	119	90,1
X.....	27	19	70,3
boon.....	27	23	85,2
aardappel ....	12	9	76,6
maismeel ....	12	8	66,6
saccharose i ®/o . .	18	8	42,2
saccharose 40% •	18	16	88,8
cellulose ....	21	3	14.3
pepton 1 quot;,9 . . .	42	1	2,4

Bodem	Aantal geïnfect.	Aantal planten	Temp. in » C.
Bodem	planten	dood	1 minimum j	maximum
I ®/o pepton-agar . . .	12 24	8 0	8 11-15	23 35
	27	11	5-^8	19-22
cellulose-agar ....	6 18	5 5	lÓ 10	20-30 23
moutsalep-agar . . . X-agar ...... pepton gluc. «acch.-agar	6 9 12	6 9 12	6-10 6-10 5-8	20-30 20-30 11-25

Bodem	Aantal geïnfect. planten	Aantal planten dood
X-agar......	72	62
pepton-gluc.-sacch.-agar	108 1	101
alk. bouillon-agar. . .	9	8
mout-agar.....	24	11
moutsalep-agar . . .	50	0
cellulose-agar ....	6	2
saccharose-agar 4 quot;o	18	11
saccharose-agar 40 quot; o .	12	9

Bodem	Aantal gcïnfect. planten	Aantal planten dood	Temp. in lt;gt; C.
Bodem	Aantal gcïnfect. planten	Aantal planten dood	minimum	maximum
2 % asparagine . . .	15	5	9-14	24
	6	6	6-12	23
	12	8	3- 8	15-23 ,
	12	5	11	23-30
0.5 .....	12	12	13-16	18-23
	9	7	10-12	26-30
	12	11	9-11	29-33
	51	12	12	' 26-35
	• 60	19	buiten	buiten
	18	10	7-11	28
2quot;/, pepton . . . ,	15	1	1- 9	24
	12	10	6-12	23
	12	12	3- 8	15-23
	12	2	11	23-30
	12	5	13-16	18-23
	18	13	9-11	29-33
	30	5	12	26-35
	18	5	4	25
	36	7	11	25- 28
1 •/. KNO......	15	9	9-14	24
	12	11	6-12	23
	12	11	3- 8	15-23
	12	1	11	23-30
	6	5	13-16	18-23
	12	7	4- 8	30
	12	10	9-11	29-33
	21	3	12	26-35
	9	9	10-15	20-24
' % (NHO.SO, . . .	15	12	9-14	24
	12	12	6-12	23
	12	8	11	23-30
	9	8	17-20	20-23
	12	10	13-16	18-23
	12	4	13-26	20-32
	12	5	1- 7	25-31
	12	12	9-11	25-32
0 (NH,),SO,. . .	9	8	9-11	29-33
0 (NH,),SO,. . .	12	12	17-20	20-23
	12	11	10—14	32
	12	7	1- 7	25-31
	3	3	10-12	27-31
	17	17	11-13	27-30
	54	28	,2	26-35
_		. ____	1

Bodem		Aantal geïnfect.	Aantal planten	Temp. in lt;gt; C.
Bodem		planten	dood	minimum	1 maximum
0.5 •/,		40	29	5.5	25-29
0.5 •/,	NH.Cl ....	40	28	5.5	25-29
0.4 %	NH,NO, . . .	30	17	5.5	25-29
0.3 •/.	ureum ....	60	0	10-11	20-37
0.3		45	1	15	25
0.3 V.		36	2	5-8	12-25
Jv.	KNO,. . . .	60	0	10-11	20-37
IV.		42	1	15	25
17.		36	0	5-8	12-25
0.5 V,	(NH«),PO«. . .	60	I	10-11	20-37
0.5	(NH«),PO«. . .	45	13	15	25
0.5«/,		36	0	5-8	12-25
2%	pepton . . ,	40	0	5,5	25-29
0.5 •/,	asparagine . .	60	4	10-11	20-37
0.5 V.	• I • • •	45	1	15	25
0.5%	»• • • •	36	0	5-8	12-25
zoo	krijgt men b.\	r. met pepton	ccn ophooping van ammoniak
(Butkewitsch).
Brown (1923) heeft onderzoekingen gedaan				over de z.g. ,,sta-

Bodem	Begin pH	pH na 14 dagen	! pH na 3 weken
0.5quot;, (NH,),SO,. . . .	4,8	2,6	2,4
0.5'/, NH.Cl.....	4,6	3.1	2,6
0.4 % NH.NO, ....	4,5	2,4	2,6
0.5 V, (NH,),PO,....	5.4	2.4	± 5.0
1 •/, KNO,......	4,9	2,6-3,5	± 5,2
0.3% ureum.....	6,6	3,3-5.3	5.0-5,4
0.5 Vo asparagine ....	4,8	2,4	4.3-4,4
0 tl ^ pepton......	4,6	4,2-6.4	6.3
■----		___________ ___________

Bodem	Aantal geïnfect. planten	Aantal doode planten	Vo dood
2 Vo saccharose......	122	90	73,8
2 7o glucose.......	29	22	75.8
2 quot;/o galactose......	48	36	75,0
2 7o dextrinum......	102	64	62,4
1 '/o maltose.......	96	37	53.6
1 % lactose.......	48	28	58,3
1 ®/o gummi arab......	122	10	8,2
1 Vo amylum solubile, . . .	105	20	19,4
cellulose........	18 1	4	22.2

Temp.	in ° C.	Bodem	Aantal geïnfect.	Na 5 dagen					Na 3 weken
minimum	maximum	Bodem	planten	dood	gezond	licht	zwaar	dood !lt; 1	gezond	1	2 :
5,5-12	24-29	pepton . .	15	2	5	3	5	7	5	3	0!
6-9	18-30	„ •	25	0	25	0	0	18	0	0	0
13-18	13-26	„	25	0	16	9	0	25	0	0	0
13—18	13-26		25	0	19	6	0	24	0	0	0
13-18	13—26	KNO3 . .	25	0	25	0	0	25	0	0	0
13-18	13—26	NH4CI . .	25	0	19	6	0	24	0	io	1
5,5-12	24-29	„ . •	15	3	11	0	1	5	10	0	0
10-12	30-37	asparagine.	50	48	0	0	2	50	0	0	0
10-12	30-37	ureum . .	50	47	0	1	2	50	0	0	0 i
10-12	30-37	NH,NO, .	50	43	0	3	4	50	0	0 1	0

Bodem	Aantal geïnf. planten	Na 5 dagen				Na 3 weken
Bodem	Aantal geïnf. planten	dood	gezond	licht	zwaar	dood	gezond	1	2	3	4	5
Jonge cultures
g. arab. . . .	80	69	2	1	8	78	0	0	1	1	0	0
dextrinum. . .	75	64	2	1	8	73	0	0	0	0	2	0
amylum solubile	25	24	1	i 0	0	24	1	0	0	0	0	0
saccharose . .	75	73	0	1 2	0	75	0	0	0	0	0	0
lactose. . .	50	9	20	11	0	45	0	0	0	0	2	3
maltose . . .	50	39	1	4	6	49 '	0	0	0	0	0	1
glucose . . .	50	22	6	6	16	49	0	0	0	0	0	1
Oudere cultures
g. arab. . . .	25	4	6	6	9	18	0	0	1	3	1	2
dextrinum. . .	29	8	7	14	0	20	1	0	4	2	0	2
amylum solubile	50	34	2	3	11	46	0	0	0	2	1	1
saccharose . .	25	0	19	6	0	24	0	0	0	0	1	0
lactose. . . .	25	0	25	0	0	8	0	2	5	8	2	0
maltose . . .	30	6	11	13	0	17	0	0	3	8	0	2
glucose . . .	30	3	11 1	16	0	20	0	0	1	7	0	2

	41c	WS^J* i
		Iff