COMPLEXCOACERVATIE MET CHONDROITINEZWAVEL-
ZUUR EN MUCOITINE.
BIJDRAGE TOT DE KENNIS DER VERHOUDING VAN
KOLLAGEEN EN GELATINE.

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN
DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKSUNIVER-
SITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VAN DEN RECTOR-
MAGNIFICUS DR. C. G. N. DE VOOYS, HOOGLEERAAR
IN DE FACULTEIT. DER LETTEREN EN WIJSBE-
GEERTE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER
UNIVERSITEIT TE VERDEDIGEN TEGEN DE BEDEN-
KINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUUR-
KUNDE OP MAANDAG 16 JANUARI 1933, DES NAMID-
DAGS TE VIER UUR

Bij de voltooiing van dit proefschrift wil ik gaarne gebruik maken
van de gelegenheid om U, Oud-Hoogleeraren en Hoogleeraren van
de Faculteit der Wis- en Natuurkunde, te bedanken voor het van U
genoten onderwijs.

Hooggeleerde K r u y t, Hooggeachte promotor, ik betuig U mijn
hartelijken dank voor Uw belangstelling en steun, welke ik in mijn
studietijd in zoo ruime mate mocht ondervinden. In het bijzonder
geldt mijn dankbaarheid de groote vrijheid, die Gij mij bij de prac-
tische uitwerking van dit onderwerp hebt gelaten.

U, Hooggeleerde C o h e n, ben ik dankbaar voor Uw onderricht,
in het bijzonder wat betreft de practische opleiding in Uw labora-
torium.

Hooggeleerde van R o m b u r g h, ik dank U voor Uw onder-
wijs in de organische chemie. Ook U, Hooggeleerde R u z i c k a,
ben ik daarvoor erkentelijk.

Hooggeleerde W o I f f, Hooggeleerde B a r r a u, aanvaardt mijn
dank voor de wijze, waarop Gij tot mijn wetenschappelijke vorming
hebt bijgedragen door Uw leiding bij de studie van de wiskunde.

Tevens wil ik hierbij mijn dank betuigen aan de zeer velen, die
mij op eenigerlei manier hebben geholpen bij de practische uit-
werking van dit onderzoek, in het bijzonder den directeur van de
gemeentelijke slachtplaats te Utrecht, den Heer J. P. van der
S I o 0 t e n, voor zijn hulp bij het uitzoeken van geschikt materiaal;
den Heer 1. Slis W z n, assistent van het pharmaceutisch labo-
ratorium der Universiteit en D r. G. van R o m burg h, conser-
vator aan het organisch laboratorium der Universiteit, voor hun hulp
de mechanische bewerking van dat materiaal; en den Heer
H. Kisjes voor zijn hulp bij de verdere bewerking.

H. R. K r u y t heeft in een lezing voor de Bio-
chemische en Colloidchemische secties der Neder-
landsche Chemische Vereeniging^) het kollageen
voorgesteld als

„een complexcoacervaat van twee stoffen,
moederstoffen van eenerzijds „gelatinequot; an-
derzijds „miicinequot;, die gescheiden worden
door kalk, waarin slechts de mucine oplost.quot;

Het doel van dit onderzoek is deze hypothese
te toetsen aan het feitenmateriaal, dat in de litera-
tuur aanwezig is, en dat eigen experiment ons zal
verschaffen.

a. De fotometcr 28; b. Meting van de trocbdinR bij mengsels
van solen van chondroitinezwavelzuur en gelatine .10; c. In-
vloed van electrolyten op de troeheling 32.

a. Uitvoering van de metingen 52-, b. Invloed van de gelatine-
concentratie op de iso-electrische troeheling 53; c. Invloed van
electrolyten op de iso-electrische troeheling bij verschillende
pH's 54.

2.nbsp;Isoleering van mucine en eiwit uit het kollageen . . . 04
a. (Jriënteerende proefnemingen 64; h. Het nuicine 65; c. Met
eiwit verkregen door behandeling met zout 67.

3.nbsp;Experimenten met de gelatine, bereid door uittrekken
met zout................

Het onderzoek van H. R. Kruyt en zijn medewerkers heeft
bewezen, dat het verschil tusschen suspensoide en emulsoide solen
is gelegen in de eigenschap van deze laatste kolloiden, dat zij, na
ontlading, nog voor uitvlokken worden beschut, doordat zij een
hoeveelheid water zeer vast aan zich binden. Voor het uitvlokken
van een sol is dan niet alleen noodig het wegnemen van de lading
van de deeltjes, maar ook een verwijderen van dit water, daar het
een vereeniging tot vlokken belet. Voegt men b.v. bij een ontladen
sol een groote overmaat alkohol, dan krijgt men een neerslag, even-
als bij uitvlokking van een suspensoid.

We moeten ons dit gebonden water niet voorstellen als een be-
paalde hoeveelheid, scherp gescheiden van de overige vloeistof. Een
dergelijke grens zou beteekenen een oppervlakte-energie, waardoor
de begrensde omhulsels de neiging zouden vertoonen zich te ver-
eenigen. Met van B e m m e I e n quot;') moeten wc aannemen, dat het
water aan de oppervlakte van het deeltje zeer vast gebonden is, en
geleidelijk minder sterk wordt beïnvloed, naarmate het verder van de
kern verwijderd is.

Deze opvatting vindt steun in het feit, dat we ook in staat zijn
het water gedeeltelijk weg te nemen. Voegt men bijvoorbeeld in het
bovenstaande voorbeeld de alkohol druppelsgewijs toe, dan scheidt
de kolloide stof zich niet af als amorfe vlokken, maar als fijne
druppeltjes, die zich onder daarvoor geschikte omstandigheden tot
een laag vloeistof vereenigen. H. ü. B u n g e n b e r g de Jong
en H. R. K r u y t ■•) geven aan dit verschijnsel den naam coacervatie.

De afscheiding van de kolloide stof als een vloeistof beteekent,
dat de vaste deeltjes water meevoeren in een toestand, waarin het
niet mengbaar is met de overige vloeistof. Door het wegnemen van
een deel van het water is er iets gebeurd aan de buitenzijde van het
gehydrateerde deeltje. De scheiding tusschen vrij en gebonden wa-

ter, die eerst niet aanwezig was, treedt nu op; er is een grensvlak-
energie ontstaan, die leidt tot een vereeniging van de waterlagen
van verschillende deeltjes. Toch is er binnen deze mantels nog de
zelfde toestand als te voren. De eigenlijke deeltjes krijgen geen ge-
legenheid zich te vereenigen, wat blijkt uit het feit dat de coacervatie
bij toevoeging van een weinig water oogenblikkelijk verdwijnt.

Voor dit geval, het eenvoudigste van alle vormen van coacervatie,
bezitten we geen verklaring, die ons duidelijk maakt wat er precies
aan de hydratatie is veranderd. Dat maakt het zooveel te moeilijker,
een inzicht te krijgen in het ingewikkelder geval, dat de titel
noemt: De complexcoacervatie. Hieronder verstaan we de ontmen-
ging, die optreedt bij het samenvoegen van twee tegengesteld gela-
den lyophiele solen.

Het best onderzochte voorbeeld is het systeem gelatine-arabische
gom. Bij een pH beneden 4,7 treedt daarin coacervatie op.

bestudeeren dit stelsel als volgt: Bij een bepaalde pH wordt de vis-
cositeit gemeten (boven 40°) van de solen van gelatine en arabische
gom en van mengsels daarvan in verschillende verhoudingen. Boven
het iso-electrische punt van de gelatine, waar beide solen negatief
zijn, is de viscositeit van de mengsels gelijk aan de som van die van
de samenstellende hoeveelheden sol, met water tot hetzelfde totale
volumen verdund. Beneden pH 4,7, dus als de gelatine positief gela-
den is, blijkt de gevonden waarde steeds lager dan de zoo berekende,
en wel des te meer, naarmate de mengsels sterker troebel zijn.

Een groote verdienste van de genoemde onderzoekers is, dat zc
deze verlagingen beter vergelijkbaar maken door de gemeten
waarden uit te drukken in % van de additief berekende viscositeit.
Immers het blijkt, dat deze procentueele waarden de sterkte der
coacervatie bepalen, en wel in dien zin, dat de coacervatietroebeling
het grootst is bij dezelfde mengverhouding der componenten als
waarbij deze procentueele viscositeitswaarde een minimum is.

B u n g e n b e r g de Jong en Dekker bepalen vervol-
gens voor verschillende pH bij welke verhouding van de componen-
ten de grootste coacervatie optreedt. Deze verhouding verschuift
naar een lagere gelatineconcentratie bij dalende pH-waarden.

biliteitsfactoren zijn. Voor de beide solen afzonderlijk zijn het de
hydratatie en de lading, voor de arabische gom is de laatste negatief,
voor de gelatine positief. In het mengsel beletten deze ladingen het
samentreden van de deeltjes niet, integendeel, de electrische tegen-
stelling trekt de deeltjes met kracht bijeen, tegen het streven van de
hydratatie in. Er ontstaat een evenwicht tusschen deze beide ten-
densen. De deeltjes blijven niet geheel vrij, maar toch heeft geen
uitvlokking plaats; er ontstaat een tusschentoestand, het coacervaat.

Het is duidelijk, dat aan dezen evenwichtstoestand de meeste stof
deelneemt, als de grootst mogelijke electrische tegenstelling bestaat,
d.w.z. als de totale hoeveelheid positieve electriciteit gelijk is aan de
totale hoeveelheid negatieve. Deze totale hoeveelheden worden be-
paald door het product van de hoeveelheid stof en de lading per
oppervlakteëenheid. Deze laatste kunnen wij voor gelatine in het
isoëlectrisch punt als nul beschouwen, terwijl de (positieve) lading
stijgt bij dalende waarden van de pH beneden 4,7. De invloed van
het waterstofion op de arabische gom is klein, de lading behoudt
over groote pH-gebieden practisch de zelfde negatieve waarde. Zoo
is het duidelijk, dat er bij afnemende pH steeds minder gelatine noo-
dig is om een bepaalde lading van de arabische gom te neutralisee-
ren. Dit brengt dan tevens mede, dat de minimum-viscositeit (uitge-
drukt in %, als boven) bij dalende pH ook naar kleinere gelatine-
concentratie verschuift.

Het eenvoudigste gedraagt zich het mengsel, waarbij de ladingen
elkaar precies opheffen, doordat we bij een gegeven pH de juiste
mengverhouding hebben uitgekozen. Bij de menging ontstaat een
afscheiding in kleine druppeltjes, waarin zich vrijwel alle kolloide
stof ophoopt. Ze bezitten geen lading, en daardoor is er niets dat ze
belet langzaam samen te vloeien tot een laag vloeistof.

Is er een overmaat van één van de componenten, dan is er welis-
waar een begin van vereeniging van tegengesteld geladen deeltjes,
maar door de overmaat van één soort komt aan elke ophooping
een eind. Er blijft een lading over die verder samengroeien belet.
Hierdoor ontstaat een sol van grootere deeltjes, die niet samen-
vloeien. De grootte van de deeltjes hangt af van de hoeveelheid la-
ding die overschiet. Dicht bij het maximum ontstaan nog micros-
copisch zichtbare bolletjes, die alleen de neiging tot samenvloeien
nu'ssen. Naarmate we ons verder van dit punt verwijderen worden

ze steeds kleiner en al zeer spoedig blijven de mengsels helder; de
beïnvloeding blijkt dan nog alleen uit de viscositeit. Aan deze gedeel-
telijk gecoacerveerde solen geeft H. G. Bungenberg de
Jong®) den naam complexsolen.

Door de electrische tegenstelling weg te nemen wordt de coacer-
vatietoestand opgeheven. Niet alleen gebeurt dit als de positieve
lading van de gelatine wordt weggenomen door de pH te verschui-
ven tot boven 4,7 , het heeft ook plaats wanneer zooveel zoutoplos-
sing wordt toegevoegd, dat de lading van een of beide componenten
wordt weggenomen. Het is voor den eindtoestand onverschillig, of de
componenten eerst worden gemengd, en de electrolyt wordt toege-
voegd, nadat de druppeltjes zijn ontstaan, of dat de beide solen er
te voren van zijn voorzien en eerst daarna samengevoegd. Als de
concentratie van het zout groot genoeg is, wordt het mengsel helder,
mits de temperatuur boven de gelatineeringstemperatuur blijft.

1 t\ -1 1 1	nsali V-I	1 / /	/^t 3. /	'nQ, . /tal 2	'k
t 1 1	/' /			1	1
y	—r- / /	/			1-
1 /	-
f/	r				1
f					j
/				---	-—
				---	-—

m.Aeq.

	J f	1 fep.	/J
/		/
/	/			W
i	r .
W\
V
f
f
■

m. Aeq.

van dezelfde hoeveelheid KCl. Met meerwaardige ionen wordt de
additiviteit al bij een veel lagere electrolytconcentratie bereikt; de
hoeveelheid electrolyt, nt)odig om de coacervatie op te heffen, is voor
K2SO4 kleiner dan voor KCl, en voor KgFefCN]^ weer kleiner dan
voor K2SO4. Evenzoo geldt, dat de voor opheffing benoodigde con-
centratie BaClg kleiner is dan die voor KCl en dat die voor LuClg
nog weer kleiner is. We zien hieruit duidelijk, dat de componenten in
het gecoacerveerde systeem een gelijkwaardige plaats innemen; het
is onverschillig of we eerst de gelatine (de positieve component) of
eerst de arabische gom (de negatieve component) ontladen.

We hebben op pag. 4 de voorstelling gegeven, dat de deeltjes los
opeengehoopt zijn, verbonden door hun tegengestelde ladingen, die
het streven van de deeltjes naar een grootere hydratatie in bedwang
houden. Het gedrag van het coacervaat bij toevoeging van electrolyt
past goed in deze voorstelling: Zoodra de lading van één van beide
componenten (of van beide tegelijk) voldoende vermindert, pepti-
seert dit streven naar solvatatie de deeltjes tot een sol.

Deze opheffing van de verlaging van de viscositeit geldt (in ster-
kere of mindere mate) voor elke pH en voor alle concentratiever-
houdingen, waar van een verlaging sprake is, ook voor complexsolen.
Dit beteekent echter niet dat aan deze laatste, als zij zonder elec-
trolyt al niet of nauwelijks troebel zijn, niets bijzonders waar te
nemen valt. Integendeel, door alleen de viscositeit van de mengsels
te beschouwen, zouden we aan een zeer belangrijk verschijnsel voor-
bijgaan.

We hebben gezien, dat er mengsels zijn, die niet coacerveeren,
omdat een overschot van lading een onbegrensd samengroeien van
de deeltjes belet. H. (]. B u n g e n b e r g de Jong en A. F. W e s-
t e r k a m p quot;) voegen nu aan een dergelijk complexsol (gelatine met
lecithine) electrolyt toe en bestudeeren den invloed op de troebeling.
Zij kiezen daarvoor een mengsel met een overschot van positieve la-
ding uit. Hieraan onderzoeken ze den invloed van KCl, K0SO4,
K3Fe(CN),j. De eerste hoeveelheden daarvan geven een sterke toe-
neming van de troebeling, en wel ongeveer tot aan hetzelfde niveau
als voor het best coacerveerende mengsel bij de gekozen pH. Deze
waarde bereiken zij bij een kleinere concentratie, naar gelang ze
KCl, K2SO4 of K3Fe(CN),j gebruiken.

phoob sol. Als de geringe overmaat lading aan de buitenzijde wordt
weggenomen, krijgen de kleine aggregaten van deeltjes gelegenheid
tot coacervaten samen te vloeien. Eerst bij grootere concentraties
electrolyt treedt het opheffen van de tegengestelde ladingen in en
verdwijnt dus een voorwaarde voor complexcoacervatie; er heeft
dus een snelle vermindering van de troebeling plaats.

Na deze algemeene eigenschappen van complexcoacervaten moe-
ten hier nog twee bijzondere gevallen worden besproken, omdat ze

1°. Bungenberg de Jong^) stelde zich de vraag, of coa-
cervatie mogelijk is onder de omstandigheden zooals ze in het dier-
lijk lichaam voorkomen, namelijk bij een neutrale reactie en bij een
belangrijke concentratie aan zouten. Daarvoor is allereerst noodig
een eiwit met een iso-electrisch punt, dat bij een veel hooger pH ligt
dan dat van gelatine, d.w.z. één dat bij pH 7 positief geladen is.
Bovendien moet het coacervaat een grooten weerstand tegen electro-
lyten bezitten. Bij de combinatie gelatine-arabische gom is öOm.mol.
KCl voldoende voor opheffing, terwijl in dierlijke weefsels de con-
centratie van 160 m. mol NaCl enkele m. molen Caquot; normaal is.

Door uitkiezen van geschikte componenten wist hij enkele gevallen
te verwezenlijken, waarbij inderdaad onder deze omstandigheden
complex-coacervatie optrad. Als positieve component nam hij clu-
peïne, dat zijn isoëlectrisch punt heeft bij pH 12,1. Als negatief
bestanddeel waren bijvoorbeeld thymusnucleïnaat en soyaboonen-

regel het vermogen, om bij kamertemperatuur te gelatineeren, niet
verloren gaat als men een gelatinesol laat coacerveeren. Het in de
warmte ontstane macrocoacervaat stolt dan na afkoeling tot een
gel, evenals het oorspronkelijke sol. Hieruit ziet men duidelijk, hoe
door de coacervatie alleen de buitenzijde van den watermantel ver-
andert, en de kern van het deeltje onveranderd blijft; als de kern
werkelijk beïnvloed was, zou de gelatineering daarvan een merk-
baren invloed hebben ondergaan. Omgekeerd is het gelatinesol door
gelatineering niet van zijn coacervatiemogelijkheid beroofd. De bo-
vengenoemde onderzoeker mengde in de warmte gelatine- en arabi-
sche-gomsolen bij een pH, waarbij geen complexcoacervatie plaats

vond. Hij legde het gel, dat hieruit bij afkoelen ontstond, in verdund
zuur en veranderde zoo de pH tot in het gebied, waarin bij solen
coacervatie mogelijk is. Het gel werd daarbij troebel en verloor zijn
neiging tot opzwellen; bij toevoeging van electrolyten verdween de
troebeling en kwam de neiging tot opzwellen terug.

Deze resultaten maken het geoorloofd, bestanddeelen van het
dierlijk lichaam als coacervaten te beschouwen; vaste deelen daar-
van, zooals het kollageen, kan men veronderstellen te zijn ontstaan
door een coacervatie en een gelatineering, terwijl hun bestendigheid
nog geheel of gedeeltelijk aan den coacervatietoestand is toe te
schrijven.

Uit kollageen zijn een drietal substanties te bereiden, die onze
aandacht vragen uit een oogpunt van complexcoacervatie:

Bij de gewone bereidingswijze van gelatine behandelt men het
kollageen gedurende vele weken met kalkmelk. Een gedeelte van de
eiwitten gaat daarbij in oplossing. Na een bepaalden tijd wordt deze
bewerking onderbroken. De vaste stof die dan overblijft, wordt met
aangezuurd water gewasschen en met warm water in een oplos-
baren vorm, de gelatine, gebracht.

De gelatine-industrie stelt zich hierbij niet ten doel een bepaalde
chemische stof te isoleeren. Integendeel, men wijzigt de details van
het proces naar gelang van het doel, waarvoor het product moet
dienen, en daardoor ontstaan gelatines met zeer uiteenloopende
eigenschappen.

In kolloidchemisch opzicht hebben deze gelatines verschillende
punten van overeenkomst. Het isoLMectrisch punt b.v. ligt steeds in
de buurt van pH 4,7. Er is een reeks van eigenschappen, die bij dit
punt een uitgesproken maximum of minimum bezitten. Zoo hebben
de solen hier een minimum voor de viscositeit, voor het electrisch
geleidingsvermogen en voor de hoeveelheid alkohol noodig voor pre-
cipitatie. De gelen hebben een minimum sterkte in dit punt.

Een zeer karakteristieke gelatine-eigenschap is de isoëlectrische
troebeling. Laat men een 1 % gelatinesol van pH 4,7 eenige uren bij
kamertemperatuur staan, dan wordt het sterk opalescent. K r a e-
m e r») en Briefer^quot;) onderzochten den invloed van de pH op
de troebeling bij verschillende temperaturen. Het sol bezit bij 40°
bij iedere pH hetzelfde, zeer geringe Tyndall-licht. Bij temperaturen
beneden 30° heeft de intensiteits-pH-kromme een scherpe piek; het
gel is helder behalve voor een klein pH-gebied bij het isoLMectrische
punt. Een verschuiven van de pH met ongeveer 0,5 is voldoende
om het verschijnsel geheel te doen verdwijnen.

ander verloop krijgt bij het toevoegen van zouten. Bij stijgende zout-
concentratie wordt het maximum steeds lager, en bovendien wordt de
kromme vlakker. Uit de bijgevoegde afbeelding blijkt, datde troebe-
ling voor een pH, vlak boven of beneden het iso-electrische punt,
eerst sterker, dan weer minder wordt.

Deze invloed van electrolyten vertoont een sterke overeenkomst met
de opheffing van een complexcoacervaat. Een uitgebreider feiten-
materiaal zal moeten uitmaken in hoeverre we hier werkelijk met
hetzelfde verschijnsel te doen hebben.

.Er is onder den naam gelatine nog een tweede product in den
handel, dat in chemisch opzicht zeer veel van de gewone qualiteiten
verschilt. Men noemt het „pigskinquot;gelatine.

Een nauwkeurige beschrijving van de bereidingswijze is in de
literatuur niet te vinden. Bij de bereiding verwerkte men oorspronke-
lijk varkenshuid. Toch kan in het uitgangsmateriaal niet de oorzaak
liggen ,van het verschil in chemische eigenschappen, omdat Brie-
fer uit de eene helft van een kalfshuid „pigskinquot;-, uit de andere
helft gewone gelatine bereidde. Hij vermeldt, dat hij voor de be-
reiding van de „pigskinquot;gelatine het kollageen omzet met zwavel-
zuur, zonder daarbij nadere bijzonderheden op te geven. Ook in de
andere artikelen over deze gelatinesoort ontbreken nadere bij-
zonderheden.

Men isoleert door deze behandeling met zuur een geheel andere
stof. Deze heeft zijn isoëlectrisch punt bij 8, wat beteekent, dat de
twee gelatinesoorten ongeveer evenveel uiteenloopen in eigenschap-
pen als een zwak zuur en een zwakke base. Over een groot pH-ge-
bied zijn ze tegengesteld geladen.

De eigenschappen, die we bij de gewone gelatine noemden, heb-
ben bij de „pigskinquot;gelatine lang niet zulke scherpe maxima of
minima. Briefer en C o h e n geven o.a. een viscositeits-pH-
kromme met een vlak gedeelte van pH 5,5 h 6,0 tot omstreeks 8,0.
Onder verschillende andere voorbeelden is de eenige uitzondering
hierop, een functie, die hij „jelly-consistencyquot; noemt, met een scherp
minimiun bij pH 7,5.

voor, alleen treedt ze op in een veel grooter pH-gebied. K r a e-
m e r vond, dat de gelen troebel zijn van pH 6-8.

Door deze vlakke maxima en minima kunnen we het isoëlectrisch
punt niet met een zeer groote nauwkeurigheid aangeven; het sol
is waarschijnlijk in het geheele traject van pH 6-8 slechts zwak
geladen.

Het derde product behoort tot de groep van mucinen en mucoiden.
Hammarsten rangschikt deze stoffen onder de glycoprotei-
den, waarmede bedoeld worden die eiwitten, die o.a. koolhydraten
als afbraakproducten hebben. Hij grondt een scheiding tusschen de
mucinen en de andere stoffen uit deze groep op de eigenschap, dat
„ihre natürlichen oder mit einer Spur Alkali dargestellten Lösungen
schleimig fadenziehend sind und mit Essigsaure einen in einem
Ueberschusse der Säure unlöslichen oder jedenfalls sehr schwer
löslichen Niederschlag geben.quot; Tot de mucoiden worden gerekend
alle Stoffen uit deze groep, die een van deze eigenschappen niet
bezitten.

Een iets nauwkeuriger afbakening van het begrip mucine of mu-
coid geeft het handboek van O p p e n b e i m e r door te bepalen,
dat onder de splitsingsproductcn een belangrijke hoeveelheid gluco-
samine (beter en algemeener zou zijn hexosamine) aanwezig moet
zijn. Ter vereenvoudiging zullen we verder steeds spreken van mu-
cine, ook waar anders soms de naam mucoid gebruikt wordt.

In alle fibrillair bindweefsel in het dierlijk lichaam is een grootere
of kleinere hoeveelheid mucine aanwezig. De grootste hoeveelheid
bevindt zich in het kraakbeen waar het in ballen tusschen de
kollagene vezel ligt. H a w k en G i e s toonden het aan in osse-
ine, de kollagene stof uit been. L o e b i s c h i')- vond het in pezen,
van Lie r^®) in de huid. Deze stoffen hebben nogal uiteenloopende
eigenschappen afhankelijk van het materiaal, waaruit ze zijn bereid;
als regel ontbreekt de eigenschap, dat de oplossing „fadenziehendquot; is.

De histologen uit de tweede helft van de vorige eeuw beschouw-
den het mucine als een bind- of plakmiddel, waarmee de kollageen-

fibrillen waren verbonden^®). Volgens deze opvatting behoort het
dus niet tot de eigenlijke kollagene stof.

Indien deze meening algemeen als juist werd erkend, zou een
verder onderzoek van deze stoffen achterwege kunnen blijven. We
zouden er dan toch niets uit leeren over het kollageen zelf. N a-
g e O 11 e -quot;) en L e V i ontkennen echter het bestaan van een der-
gelijke intermicellaire stof. Daarom stelt dit onderzoek zich op het
standpunt, dat de mucinen een wezenlijk deel van het kollageen zijn.

De mucinen uit de verschillende soorten kollageen hebben allen
gemeen, dat het gedeelte van de stof, dat de koolhydraatreacties
geeft, er uit is af te scheiden in den vorm van een stikstof- en zwa-
velhoudende verbinding, het chondroitinezwavelzuur.

Reeds aan B o e d e k e r was het bekend, dat er door kraak-
been met zuren te koken, een oplossing ontstaat die een alkalische
koperoplossing reduceert. C. T h. M ö r n e r was de eerste wien
het gelukte het chondroitinezwavelzuur af te scheiden uit het meng-
sel met eiwitten, waaruit het chondromucine bestaat.

Hij behandelde het kraakbeen met kaiiloog en verwijderde uit deze
oplossing de eiwitten door indampen met bariumcarbonaat en azijn-
zuur, gevolgd door een neerslaan met tannine. Zoo verkreeg hij een
kolloide stof, die hij eerst „Chondroitsäurequot; noemde. In het tweede
artikel voerde hij den naam chondroitinezwavelzuur in, omdat het, bij
koken met zoutzuur, zwavelzuur afsplitste.

' Met eiwitten geeft het na aanziiren met verdimd azijnzuur een
neerslag, waarvan de volgende beschrijving wordt gegeven:

„Ein mechanisches Gemenge von Chondroitsäure und Glutin in
welchem das letztere in ziemlich grossem Ueberscluiss vorhanden
sein muss, bietet Reagentien gegenüber ein interessantes Verhalten
dar; es gibt eine solche Lösung mit Essigsäure eine im Ueberschuss
unlösliche, aus feinen, microscopisch kleinen Kugelchen verschie-
dener Grösse bestehende, flockige Fällung; mit Salzsäure, Schwefel-
säure, Salpetersäure eine in ueberschüssiger Säure leicht lösliche
Fällung von derselben physikalischen Beschaffenheit; Kochsalz oder
Ferrocyankalium verhindert das Auftreten dieser Fällungen und löst
sie, wenn entstanden, wieder auf.quot;

De beschrijving, dat het neerslag uit bolletjes, bestaat en oplost in
zouten, wekt het vermoeden, dat we hier te doen hebben met een
coacervatieverschijnsel.

Na C. T h. M ö r n e r is het chondroitinezwavelzuur nog door
een groot aantal andere onderzoekers bereid en onderzocht. Hun
aandacht werd geheel in beslag genomen door het organisch-che-
misch onderzoek van de afbraakproducten. Schmiedeberg'-^®)
ontdekte dat er bij koken van zijn preparaten met zoutzuur eenhexos-
amine ontstond, verkregen via verschillende niet nauwkeurig gede-
finieerde tusschenstadia. Hij hield dit eindproduct voor glucosamine.
Door P. A. L e V e n e is echter uitvoerig bewezen, dat het hexos-
amine uit het chondroitinezwavelzuur van het kraakbeen niet is glu-
cosamine, maar zijn isomeer chondrosamine. Voor ons onderzoek is
dit verschil van zeer weinig belang.

Geen van deze schrijvers geeft meer eenige aanwijzing over een
neerslag van hun preparaten met eiwitten.

De directe weg tot toetsing van de in de inleiding geformuleerde
hypothese, zou zijn, te trachten aan het kollageen zelf eigenschappen
te ontdekken, die typisch zijn voor een complexcoacervaat. Deze
weg leek ons als begin niet zeer vruchtbaar, daar het kollageen niet
oplost onder omstandigheden, die de lading van een of beide com-
ponenten zou opheffen, b.v. in een sterke zoutoplossing. Dit is niet
in strijd met onze hypothese. Het is mogelijk, dat het kollageen als
complexcoacervaat is ontstaan, terwijl toch het verouderde, tot een
bepaalden vorm gegroeide materiaal, ten gevolge van zijn structuur
geen zeer typische coacervaateigenschappen meer vertoont.

Het in de vorige bladzijden gegeven overzicht geeft ons drie an-
dere indirecte wegen, met name een verdere bestudeering van:

3.nbsp;het neerslag van het chondroitinezwavelzuur van M ö r n e r
met eiwitten.

Het volgen van den onder 3 genoemden weg leek het beste resul-
taat op te zullen leveren bij een aanvatten van het vraagstuk. Daar-
om vangt het experimenteel gedeelte daarmede aan.

B. EXPERIMENTEEL GEDEELTE.
L Coacervatie van chondroitinezwavelzuur met eiwitten.
1. Bereiding van het chondroitinezwavelzuur.

Voor de bereiding gebruikten we kraakbeen van den neus van
koeien en van den neus, de schouderbladeren en de quot;b^n van kal-
veren. Deze beenderen werden ten minste dne dagen m 30 % alkohol
bewaard, waarna alle vliezige aanhangsels gemakkelijk konden wor-
den verwijderd. 5 Kilogram fijngesneden stukken werden met water
gewasschen, in een vleeschmolen gemalen en gedurende twee dagen
Landeld met 10 L. 2 % kaliloog. We schonken de vloeistof af,
trokken de rest opnieuw gedurende 12 uur met kaliloog ui en
waschten de toen nog overgebleven stof ten slotte tweemaal met dne
liter water. Nogmaals met loog behandelen leverde geen verdere

verwijderde het neerslag, dat daarbij ontstond behandelde het
filtraat met tannine om de eiwitten neer te slaan. Na filtratie ov r-
tuigde hij zich dat er, door meer tannine toe te voegen, noch bij
zure, noch bij alkalische, noch bij neutrale reactie een neerslag on -
stond. Daarna verwijderde hij de overmaat tannine met loodacetaat-
oplossing, en een overmaat van dit laatste met zwavelwaterstof. Het
fiWaat dialyseerde hij tegen gedestilleerd water. Ten slotte sloeg h.j
het preparaat neer door toevoeging van alkohol en een weinig zout-

M ö r n e r de eenige is, die aangeeft, dat het chondroitine-
zwavelzuur met eiwitten een neerslag geeft, hebben we eerst dit
voorschrift op kleine schaal nauwkeurig nagewerkt. Inderdaad bleek
een oplossing van dit preparaat met gelatine coacervatieverschijnse-
len te vertoonen. Er ontstonden bij menging op 40° kleme dnippel-
tjes en bij menging van vrij geconcentreerde oplossingen bij wat
hoogere temperatuur gelukte het een macrocoacervaat te krijgen^
Tegen de bereidingswijze van M ö r n e r is intusschen als be-

zwaar aan te voeren, dat het in het geheel niet zeker is, dat geen
tannine of verontreinigingen van het gebruikte tanninepreparaat ach-
terblijven. Het is mogelijk, dat de coacervatie geheel hierdoor veroor-
zaakt zou zijn. Ter controle deden we daarom een blancoproef: On-
geveer dezelfde hoeveelheid tannine, als bij de bereiding van het
preparaat was gebruikt, werd neergeslagen met een loodacetaatop-
lossing. Na verwijdering van het lood gaf het filtraat met een gela-
tineoplossing geen neerslag.

Toch loopen we een kans op noodelooze verontreiniging van het
preparaat. Een tweede hoeveelheid werd daarom volgens een voor-
schrift van L e v e n e verwerkt.

L e V e n e zuurde het alkalische extract van 5 K.G. kraakbeen
met azijnzuur aan en dampte de vloeistof op waterbad in tot het
halve volumen onder toevoeging van bariumcarbonaat. Na verwijde-
ring van het neerslag door decanteeren en centrifugeeren dampte hij
opnieuw in onder toevoeging van bariumcarbonaat en azijnzuur tot
een volumen van 2 Liter. Hij centrifugeerde de vloeistof en schonk
de heldere gele oplossing onder heftig roeren in 16 L. ijsazijn uit.
Het chondroitinezwavelzuur sloeg neer in den vorm van een „zuur
kaliumzoutquot;; hij waschte dit met azijnzuur, alkohol en aether en
droogde het.

Dit ruwe product verwerkte hij tot het „bariumzoutquot; door het op
te lossen en vervolgens neer te slaan met basisch loodacetaat; dit
neerslag werd na uitwasschen gesuspendeerd in een oplossing, die
20 gram bariumacetaat en 10 cm' ijsazijn per liter bevatte. Door
langdurig inleiden van zwavelwaterstof zette hij zoo het loodzout
om in het bariumzout, terwijl zich een goed filtreerbaar loodsulfide
vormde.

Ook dit preparaat gaf met gelatineoplossing een complexcoacer-
vaat. Het groote gehalte aan barium (28% asch!) maakte echter
dit product onbruikbaar voor een nauwkeurige bestudeering van de
coacervatie. Een poging om het bariumacetaat te vervangen door een
^equivalente hoeveelheid natriumacetaat mislukte, daar er bij deze
bewerking een zeer stabiel loodsulfidesol ontstond. De methode werd
daarom voor de eerste preparaten (genummerd LI tot L 5) zoo
gewijzigd, dat het lood werd neergeslagen in een 10% natrium-
acetaatoplossing. We waren toen genoodzaakt, de oplossing van dit
laatste zout te bevrijden door een langdurige electrodialyse.

Dit tusschen perkamenten membranen gedialyseerde sol werd in-
gedampt door er een warmen luchtstroom (beneden 30°) over te
leiden. Het droogt dan in tot doorschijnende bruine blaadjes (L 1
en L2).

Dit product heeft een sterk zuur karakter, een % oplossing
had een pH van ± 2,3. Direct na de bereiding gaf een oplossing
geen neerslag met bariumchloride. Reeds na enkele weken begon
het echter blijkbaar om te zetten; de oplossing in water vertoonde
dan sulfaatreactie, de vaste stof werd kleverig en vervloeide ten
slotte tot een bruine stroop. Voor het uitvoeren van nauwkeurige
experimenten was dit preparaat dus evenmin geschikt, daar het tij-
dens het gebruik te sterk veranderde.

Voor het eerste deel van het onderzoek werd de oplossing gevon-
den door de dialyse tot het hoog noodige te beperken, en het sol niet
in te dampen, maar het direct na de dialyse in de ijskist te plaatsen
en daar te bewaren. Na deze gewijzigde bewerking was er geen
merkbare ontleding, er trad gedurende een maand geen merkbare
verandering van de viscositeit op, en in dienzelfden tijd had de sul-
faatreactie steeds negatief resultaat (solen no. L 3 en L 5).

Later kwamen we op de gedachte het basisch-loodacetaat-neer-
slag niet om te zetten met zwavelwaterstof, maar suspendeerden we
het in verdund azijnzuur en onderwierpen deze suspensie aan electro-
dialyse. Het lood scheidde zich af in den vorm van naaldjes op de
negatieve electrode en op het membraan, dat zich tegen deze electrode
bevond. Toen al het metaal zich had afgezet, en het sol bij inleiden
van zwavelwaterstof geen neerslag of sterke bruinkleuring meer ver-
toonde, ververschten we de membranen, en dialyseerden nog eenigen
tijd door. We verkregen daarmede aschvrije solen, die, in de ijskist
geplaatst, maanden lang goed bleven (L6 en L8).

De droge preparaten, ook het bariumzout, gaven een sol door ze
even bij kamertemperatuur met water te schudden. De zoo bereide
solen en ook de solen L 3 - 8 waren vrij van eiwit, ten minste ze
gaven geen biureetreactie. Het waren typisch solen van lyophiele kol-
loiden, ze waren n.1. viskeus, en na toevoegen van een overmaat
alkohol vlokten ze uit na ontlading met electrolyten.

met die van andere onderzoeilt;ers bepaalden we als regel het asch-,
stikstof- en zwavelgehalte. Hierbij leverde het drogen van de pre-
paraten eenige moeilijkheden. De preparaten LI en L 2 ontleedden,
zoowel in een vacuumexsiccator als bij verwarmen op 100°—105°.
Ook de later bereide solen L 3 - L 8 lieten zich niet tot constant
gewicht drogen. Op geen van beide manieren was een nauwkeurige
bepaling van het gehalte aan droge stof van de preparaten uit te
voeren.

We hebben daarom voorloopig de analyses van de vaste stoffen
LI en L 2 berekend op de aan de lucht gedroogde preparaten, zoo-
als ze voor oriënteerende experimenten zijn gebruikt. De berekening
bij de solen L 3 - L 8 is gedaan op een onnauwkeurige bepaling van
de vaste stof, die geschiedde door het sol op waterbad in te dampen
en uur op 100°—105° Ie verwarmen. Gezien het feit, dat zelfs
de verhouding stikstof—zwavel in de verschillende preparaten sterk
uiteenliep, was het onmogelijk uit deze analyses conclusies te trek-
ken; men kan dus zonder bezwaar met deze onnauwkeurige bepaling
genoegen nemen.

Het aschgehalte werd bepaald door de op 100 '—105° gedroogde
stof in een oven te verbranden en de asch daarin bij 500° tot con-
stant gewicht te gloeien.

De stikstofbepaling geschiedde als micro-Kjeldahl-bepaling. De
goede werking van het apparaat werd daarbij steeds van te voren
gecontroleerd door het analyseeren van een oplossing van acetanilide
van bekende sterkte.

Het gehalte aan als zwavelzuur afsplitsbare zwavel werd bepaald
door het chondroitinezwavelzuur eenige malen met salpeterzuur in
te dampen. Dit indampen geschiedde met verschillende hoeveelheden
salpeterzuur en gedurende verschillende tijden. Het gevormde zwa-
velzuur werd bepaald als bariumsulfaat. Er bleek een goede over-
eenstemming te bestaan tusschen bepalingen aan eenzelfde prepa-
raat, dat op verschillende wijze met salpeterzuur behandeld was.

De resultaten van deze analyse zijn vermeld in tabel 1. Stikstof-
en zwavelgehalte, die daarin voorkomen, zijn berekend op de vaste
stof minus de daarin aanwezige asch.

We maten de viscositeit van een sol bij verschillende pH, om uit
te maken of het chondroitinezwavelzuur zich gedraagt als een steeds
negatief geladen kolloid of als een eiwit, dus amphoteer.

In tabel 2 vindt men de uitkomsten van deze metingen, gedaan
bij 25°. Kolom 2 bevat de verhouding van de uitvloeitijd van een
sol met een chondroitinezwavelzuurconcentratie van 1 dat met
loog op verschillendepH was gebracht, tot den uitvloeitijd van water.

Het is onnoodig deze verhouding om te zetten in een relatieve
viscositeit door rekening te houden met het spec. gewicht van het
sol t.o.v. water van dezelfde temperatuur; dit spec. gew. verschilde
voor deze solen minder dan 0,001.

Een Yi % sol voldeed onder de omstandigheden van onze ex-
perimenten aan de wet van Poiseuille. Het gaf in den viscosimeter
volgens Bungenberg de J o n g'-'») („driebollenviscosi-
meterquot;) bij drie verschillende drukken, waarbij de uitvloeitijden
voor water waren 243,3; 314,8 en 434,7 sec., een verhouding van
de uitvloeitijden (U/u) van 1.089; 1,089; 1,087.

Uit tabel 2 en ook uit tabel 4 en fig. 2, die dezelfde waarden ver-
melden voor het sol L 5 bij 42,36°, blijkt, dat er geen minimum in
viscositeit voorkomt. Het chondroitinezwavelzuursol is in het ge-
heele onderzochte pH-gebied negatief geladen.

Bij de bereiding van het chondroitinezwavelzuur deelden we reeds
mede, dat deze stof gemakkelijk ontleedt. De gedachte lag nu voor
de hand, dat de omzetting van het kollageen in de lijmfabriek be-
schouwd kan worden als de opheffing van het coacervaat door af-
braak van de negatieve component, het chondroitinezwavelzuur.
Daarom onderzochten we iets nauwkeuriger onder welke omstandig-
heden van temperatuur en zuurgraad een totale ontleding snel tot
stand komt.

Als criterium voor de mate van ontleding gebruikten we steeds het
vermogen gelatine te coacerveeren. We namen ongeveer dezelfde
hoeveelheid sol, dat we (zoo noodig) aanzuurden tot een pH van
omstreeks 3. Dit sol werd zeer verdund, zoodat eventueel toegevoeg-
de zouten niet konden storen; vervolgens voegden we eenige
druppels gelatinesol toe. We noemden het sol ontleed, zoodra hierbij
geen neerslag meer optrad. Deze ontleding ging steeds gepaard met
het optreden van een sterke sulfaatreactie (neerslag met barium-
chloride).

Om het gedrag van het sol bij verwarming te bepalen, hielden we
gedurende verschillende tijden afgemeten hoeveelheden sol (in toe-
gesmolten glazen buizen) op een bepaalde temperatuur. Na 1, 2,

3, 6 en 10 uur verwarmen werd een buis geopend en de coacervatie
op de beschreven wijze getoetst.

Om een verandering van de pH door het ontstane zwavelzuur te
voorkomen, werd verhit in een bufferoplossing, bereid door aan het
sol een gelijk volumen 10 % natriumacetaatoplossing en zuur of
alkali toe te voegen.

Het zuivere sol L 5 (pH 2,5) zette zich bij 100° in 4 uur om. Ge-
neutraliseerde solen (pH ± 6,0) waren bij 100° zeer bestendig, ze
waren in 10 uur nog niet sterk ontleed.. Het was noodig, daarvoor
de temperatuur hooger op te voeren. Bij 130° trad ook bij neutrale
solen in 10 uur omzetflng op; gebufferde solen van pH 4,0 en 4,6
ontleedden in drie uur, een gebufferd sol pH 6,0 in 10 uur.

5. Meting der viscositeit van coacerveerende mengsels van chondroitine-
zwavelzuur en gelatine.

Voor een kwantitatieve bestudeering van de complexcoacervatie
in mengsels van gelatine en chondroitinezwavelzuur volgen we de
methode van Bungenberg de Jong en Dekker'^),
door de viscositeit van de solen en hun mengsels te meten. De ver-
houding van deze gemeten waarde tot de, uit de viscositeit van de
componenten additief berekende waarde is daarbij een maatstaf voor
de sterkte van de coacervatie.

De genoemde onderzoekers brachten eerst de afzonderlijke solen
op dezelfde pH en maten de viscositeit van deze isohydrische solen
en hun mengsels. In hun geval (gelatine en arabische gom) was
daartegen geen bezwaar. Geen van beide solen was oorspronke-
lijk sterk zuur of sterk alkalisch en ze waren beide practisch elec-
trolytvrij. Voor het bereiken van een bepaalde pH in het gebied,
waarin coacervatie optreedt, moest aan beide solen zuur worden
toegevoegd. Deze aangezuurde mengsels liepen zoo niet sterk uit-
een in electrolytgehalte.

In een later artikel waarschuwt Bungenberg de Jong-^)
tegen het toepassen van deze methode op solen, die sterk in pH
verschillen.

Men moet dan voor tusschenliggende pH-waarden aan het eene
sol zuur, aan het andere alkali toevoegen, zoodat in de verschil-
lende mengsels verschillende zoutconcentraties ontstaan. Men moet
zich dan voor elke verhouding en voor elke pH afzonderlijk reken-

schap geven van het electrolytgehalte, en de additieve viscositeit be-
rekenen uit de viscositeit van de componenten, die deze zelfde hoe-
veelheid electrolyt bevatten. In ons geval was het wel zeer ingewik-
keld. We hadden een sol, met een zeer lage pH, dat voor het bereiken
van de pH 4,7 een hoeveelheid alkali gebruikte van ongeveer 8 m.
aeq. per L. Bovendien bezat het sol een gehalte natriumacetaat van
bijna 20 m. aeq. per L.

Om de hoeveelheid electrolyt niet grooter te maken dan strikt
noodig was, gingen we als volgt te werk:

We mengden chondroitinezwavelzuur- en gelatinesolen in een be-
paalde verhouding en voegden bij dit mengsel achtereenvolgens
verschillende hoeveelheden zuur en alkali. Van elk van deze meng-
sels bepaalden we de viscositeit (tabel 3 en 4). De verkregen
resultaten stelden we voor in de krommen van fig. 2 en 3. Nadat
deze bepaling voor een aantal mengsels en voor de afzonderlijke
componenten was geschied in het pH-gebied van 2,3 tot 4,7, inter-
poleerden we voor alle mengsels bij één bepaalde pH de juiste
viscositeit. Op deze waarden pasten we de rekenwijze van B u n-
g e n b e r g de Jong en Dekker toe. Men vermijdt zoo niet
alleen een te groote zoutconcentratie, maar ook alle fouten in de
pH-bepaling, die door het steile verloop van de viscositeits-pH-
kromme van gelatine een zeer grooten invloed op het resultaat kun-
nen hebben.

We gebruikten een fotografische gelatine van de Lijm- en Gela-
tinefabriek te Delft, hetzelfde preparaat dat H. Ü a I e m abij
zijn onderzoek gebruikte. We reinigden deze gelatine door wasschen
met 0,003 n. zoutzuur, volgens het voorschrift van Loebquot;)'. Na
een uur inweeken in water bij kamertemperatuur werd een oplossing
verkregen door 30 minuten op 60° te verwarmen. De irreversibele
reactie van dit sol bij 42,36° bedroeg in tien uur omstreeks 2 % van

teren tijd na de bereiding werden uitgevoerd, behoefde als regel
hiervoor geen correctie te worden aangebracht.

De pH-metingen werden uitgevoerd aan den viscosimeterinhoud
na afloop van de viscositeitsmeting. Elke bepaling werd gedaan met

de chinhydronelectrode, steeds colorimetrisch gecontroleerd met
broomkresolgroen of thymolblauw. Van tijd tot tijd deden we ook
een bepaling met de waterstofelectrode. De met zh aangeduide bepa-
lingen zijn slechts volgens één methode gemeten.
Ook de zeer sterk gecoacerveerde mengsels voldeden aan de

wet van Poiseuille. Een mengsel van 4 c.c. Yi % gelatinesol en
1 c.c. 0,35 % sol L 5 gaf, bij drie verschillende drukken in den
„driebollenviscosimeterquot; voor de uitvloeitijden voor water 243,3;
314,8; 434,7 sec., een verhouding van de uitvloeitijden ts/to
resp. 1,033; 1,033; 1,032 (temperatuur 42,36°).

Ook hier is de viscositeit alleen uitgedrukt in de verhouding ts/to
Bij omzetting in de relatieve viscositeit zou men het s.g. in reke-
ning brengen, om het bij de berekening van de additieve viscositeit
er weer uit te deelen. We hebben ons dit overbodige werk bespaard.

In tabel 4 zijn de uitkomsten van de metingen gerangschikt vol-
gens de mengsels, zooals die in tabel 3 zijn omschreven. Deze waar-
den zijn grafisch voorgesteld in fig. 2 en 3. Uit deze krommen
hebben we voor een bepaalde waarde van de pH de viscositeit ge-
ïnterpoleerd, zoowel voor de afzonderlijke componenten als voor

de vierde kolom. In de vijfde kolom bevinden zich de getallen, die
aangeven hoeveel % de gevonden waarde van de berekende uit-

1nbsp; Daar deze solen na een- of tweemaal doorloopen den viscosimeter ver-
stopten is de nauwkeurigheid van deze metingen niet groot.

in de figuren 4-8 zijn deze verhoudingen grafisch voorgesteld als
functie van de verhouding van de componenten. Deze figuren geven
ons een duidelijk overzicht van de sterkte van de coacervatie bij

TABEL 5. Gemeten viscositeit van de mengsels van chondroitine-
zwavelzuur- en gelatinesolen uitgedrukt in % van de be-
rekende waarde.

wisselende pH en mengverhouding. De minima in deze krommen val-
len samen met de maxima van de troebeling, zooals ze visueel zijn
beoordeeld aan de mengsels, die voor de bovenstaande metingen

Fig. 4 — 8. Procentueele viscositeit van mengsels van chondroitine-
zwavelzuur en gelatine.
Fig. 9. Troebeling van het mengsel bij pH 3.8.

Evenals bij Bungenberg de Jong en Dekker
verschuift het minimum uit deze figuren (dus het maximum van de
coacervatie) bij daling van de pH naar een steeds kleinere verhou-

ding gelatine-chondroitinezwavelzuur. Daar dan de lading van een-
zelfde hoeveelheid gelatine steeds toeneemt, is er ook hier bij het
minimum steeds een ongeveer constante verhouding van de hoeveel-
heid lading van positieve en negatieve component.

Het blijkt duidelijk, dat de verhouding van de deelnemende massa
onbelangrijk is. Een sterke coacervatie krijgt men alleen, wanneer er
tusschen de hoeveelheid positieve en negatieve lading een bepaald
evenwicht bestaat.

6. Invloed van kleine eletrolytconcentraties op de viscositeitsmetingen
aan coacerveerende mengsels van chondroitinezwavelzuur en gelatine.

quot;Bij de berekening van de procentueele verlaging van de viscosi-
teit, zooals die is voorgesteld in de figuren 4-8, is geen rekening
gehouden met het verschillend gehalte aan electrolyt, dat de meng-
sels bevatten. Er zou hierdoor een belangrijke fout kunnen zijn ont-
staan. Toen bij latere waarnemingen bleek, dat kleine concentraties
electrolyt een grooten invloed op de troebeling van deze mengsels
hebben en wij ook de beschikking hadden over een beter aschvrij
sol, voerden we een aantal viscosimetrische bepalingen uit om na
te gaan, hoe groot de gemaakte fout zou zijn.

We kozen daarvoor één pH en wel de eigen pH van het sol L 8
(2,5). We maten de viscositeit van dit sol, van een op pH 2,5 ge-
bracht 34 % gelatinesol en van mengsels van deze twee, eerst zon-
der electrolyt cn vervolgens met een concentratie van resp. 5, 10
en 20 m. aeq. per L. kaliumchloride. In tabel 6 staan deze metin-
gen vermeld, geheel op dezelfde wijze uitgevoerd als de vorige.
De zesde kolom geeft evenals de vierde kolom van tabel 5 een bere-
kende waarde en de zevende kolom geeft aan welk percentage het
gevonden getal is van het berekende.

Uit de geringe verschillen van de getallen in de laatste kolom voor
één mengsel bij verschillende concentraties KCl is duidelijk dat KCl-
concentraties tot 20 m. aeq. per L. geen merkbaren invloed hebben
op de op deze wijze berekende verlaging van de viscositeit. Voor
fouten in de uitkomsten van tabel 5 ten gevolge van aanwezige elec-
trolyt behoeft dus niet te worden gevreesd. Een verdere bespreking
van deze getallen zullen we uitstellen tot na de troebelingsmetin-
gen (pag. 32).

TABEL 6. Viscositeit van mengsels van gelatine- en chondroitine-
zwavelzuursolen waaraan kaliumchloride is toegevoegd.
pH 2,5; temperatuur 42,36°.

We vergeleken de troebeling van de coacerveerende mengsels bij
de meting van de viscositeit door ze in reeksen buisjes in opvallend
licht te plaatsen en te noteeren welke mengsels bij deze opstelling
het sterkst troebel leken. Aangezien we de mengsels van één pH
dikwijls eerst eenige dagen na elkander maten, ontstond de behoefte
de troebeling in een getal vast te leggen, om zoo de verschillende
reeksen te kunnen vergelijken. Het laboratorium bezat hiervoor een

instrument, een fotometer van J o b i n, die ook door v. d. M i n-
n e is gebruikt.

Men vergelijkt de sterkte van twee lichtbundels, door ze ieder één
van twee naast elkaar gelegen vlakjes te laten verlichten, die door
een scherpen rand gescheiden zijn. Zoodra de beide vlakjes gelijk
verlicht zijn, ziet men deze afscheiding niet meer.

De eerste lichtbundel passeert een cuvet, waarin de te meten
troebele vloeistof zich bevindt; de tweede gaat door een verschuif-
bare wig van gelijkmatig troebel materiaal. Op deze wig is een
schaalverdeeling aangebracht; bovendien behooren bij het instru-
ment eenige troebele glaasjes, waarvan de troebeling gelijk is aan
een bekend aantal schaaldeelen van de wig. Deze glaasjes kunnen in
een van beide bundels worden ingeschakeld en maken door het ge-
bruik in passende combinatie het toestel ook voor zeer troebele vloei-
stoffen bruikbaar.

Men meet de troebeling van een vloeistof door combinatie van
deze glaasjes, gevolgd door een verschuiven van de wig, totdat de
grens tusschen de verlichte vlakjes verdwenen is.

Vóór het gebruik moet worden uitgezocht, welke lichtsterkte voor
een bepaald materiaal een aangename vergelijking mogelijk maakt.
Verder moet men uit verschillende gekleurde glaasjes een keus doen,
cn ze inschakelen in een of beide lichtbundels, zoodat de beide vlak-
jes dezelfde kleur hebben. Tenslotte moet voor elke meting opnieuw
worden gecontroleerd, of de lichtbundel op de juiste wijze door het
toestel valt en niet door onderdeelen gedeeltelijk wordt onderschept.
Dit geschiedt door in de lichtbundels een loupe plaatsen en de ver-
schillende prisma's, die de stralen op een plaats vereenigen, te ver-
stellen, totdat twee beelden van de lichtbron, elk afkomstig uit een
der bundels, nauwkeurig samenvallen.

De troebeling werd steeds genoteerd in schaaldeelen van den
fotometer, met een groote troebeling kwam overeen een groote
waarde van deze verdeeling. Van alle waarnemingen trokken we
af de aflezing voor een gelijke cuvet, gevuld met gedestilleerd wa-
ter, zoodat een heldere oplossing wordt aangegeven door de notatie
O- Het gelukte mij na eenige oefening verschillende bepalingen aan
l'etzelfde troebele mengsel binnen 0,3 schaaldeelen te doen over-
eenstemmen. Alleen de weinig troebele mengsels gaven moeilijkhe-

den; als de te nieten waarde minder dan 3 schaaldeelen van die
van gedestilleerd water verschilde, was een goede overeenstemming
— hier dubbel noodig — niet te bereiken. In geval van twijfel zijn
deze gevallen niet aangeduid met een getal, maar met de aanwijzing
„opal.quot; en „zw. opal.quot;. Voor de latere metingen van de troebeling
van gelatinegelen is de nauwkeurigheid in dit gebied vergroot door
den lichtbundel een 5 maal längeren weg door de vloeistof te laten
afleggen. Bij dezelfde troebeling wordt het aantal schaaldeelen
dan ook omstreeks 5 maal zoo groot en de fout door de meting
daardoor naar verhouding 5 maal zoo klein.

De coacerveerende mengsels met gelatine als component moesten
worden gemeten boven 40°, daar bij kamertemperatuur de drup-
peltjes gelatineeren en de troebeling slecht reproduceerbaar is.

Op een dergelijke verwarming was de fotometer niet ingericht,
en door den zeer compacten bouw was een verwarming op con-
stante temperatuur, b.v. door stroomend water, ook moeilijk aan
te brengen.

Ik ging daarom als volgt te werk: De afgemeten hoeveelheden
van de solen werden afzonderlijk in een thermostaat van 42,5°
gehangen; ze bleven daarin minstens 15 minuten. Ook de cuvet van
den fotometer werd van te voren op deze temperatuur gebracht.

Ik mengde de solen, vulde oogenblikkelijk de cuvet en plaatste
die in den fotometer. De instelling van de wig 60 sec. na menging
werd als de juiste waarde genoteerd. In deze minuut had ik steeds
gelegenheid enkele malen opnieuw in te stellen en af te lezen.
Indien deze waarden sterk schommelden werd de proef als mislukt
beschouwd en herhaald.

De troebeling bleef als regel IJ/^ ä 2 minuten goed constant,
daarna werd de invloed van het uitzakken van de druppeltjes merk-
baar. Daar we maten op geringe hoogte boven den bodem van de
cuvet nam dan de lichtsterkte van den te meten lichtbundel sterk af.

b. Meting van de troebeling b ij mengsels
van solen van chondroitinezwavelzirur
e n g e I a t i n e.

De hoeveelheid van het sol L 5 die, na de metingen, in tabel 4
vermeld, was overgebleven, was niet groot genoeg om daarmede
geheel op dezelfde manier ook de troebeling te bestudeeren. We

moesten genoegen nemen met een kleiner aantal experimenten
waarbij slechts één methode gevolgd werd en wel die, waarbij we
de afzonderlijke solen voor de menging op een bepaalde pH
brachten.

We bereidden hiervoor een % gelatinesol en brachten het met
een gelijk volume verdund zoutzuur op een pH resp. 2,6, 3,8
en 4,5. Evenzoo brachten we het 0,7 % chondroitinezwavelzuursol
met een gelijk volumen loog op dezelfde pH.

TABEL 7. Troebeling van mengsels van solen van chondroitine-
zwavelzuur en gelatine bij verschillende pH.

Tabel 7 geeft een overzicht van de troebeling van de hiermee
gemaakte mengsels. Bij pH 2,6 ligt een weinig scherp maximum
bij de mengsels met 4 en 3 cm', gelatine. Dit ligt bij dezelfde ver-
houding als het minimum in tabel 5, 5e kolom voor de pH 2,5.

Bij pH 3,8 ligt het maximum zeer scherp bij de verhouding
4,5-0,5; wat ook met tabel 5 overeenstemt. Bij pH 4,5 is alleen
bij solen met zeer weinig chondroitinezwavelzuur nog een spoor
van troebeling waar te nemen. De verlaging van de viscositeit is in
overeenstemming hiermede veel minder sterk.

Zeer fypisch is het verschil tusschen de kromme van de foto-
meteraflezing bij pH 3,8 (fig. 9) en die van de verlaging van de
viscositeit bij dezelfde pH (fig. 6). Hier is duidelijk zichtbaar het
verschijnsel van het complexsol; de viscositeit wijst uit, dat de solen
elkaar bij alle verhoudingen reeds sterk beïnvloeden. Voor een
macroscopische-ontmenging is bovendien noodig, dat de solen el-
kaar in electrisch opzicht precies neutraliseeren. In paragraaf c.
komt dit nog veel sterker uit.

Zoodra we beschikten over een goed electrolytvrij chondroitine-
zwavelzuurpreparaat, bestudeerden we den invloed van electrolyten
op de troebeling. We werkten hierbij met één bepaalde pH n.1. 2,5,
de eigen pH van het sol L 6. In de thermostaat werden geplaatst
een afgemeten hoeveelheid van een y^ % gelatinesol, dat met zuur
op pH 2,5 was gebracht, en een afgemeten hoeveelheid sol L 6.
Het volumen van deze beide solen was tezamen steeds 5 cm''. Aan
het chondroitinezwavelzuur voegden we dan nog 5 cm® electrolyt-
oplossing toe. De mengsels werden gemeten met den fotometer, op
de wijze zooals op pag. 28 uitvoerig beschreven is.

Voor een totale verdwijning van de troebeling voor alle verhou-
dingen is noodig een concentratie aan KCl, BaCl2 of K2SO4 van
160 m. aeq. per L. Bij de driewaardige electrolyten K3Fe(CN)6 en
La(N03)3 zijn alle mengsels helder bij 75 m.aeq. per L.

In tabel 8 bevinden zich de uitkomsten van deze metingen. Uit
de verschillende verhoudingen zijn er drie uitgekozen en in een
grafiek uitgezet. Fig. 10 geldt voor het mengsel, dat zonder elec-
trolyt de hoogste troebeling bezit en waar dus de hoeveelheden
tegengestelde lading gelijk zijn. Fig. 11 geldt voor een mengsel met
overmaat positieve lading in verhouding 2 : 1 en fig. 12 voor een
mengsel met overmaat negatieve lading in de verhouding 1 : 2. De
mengsels zijn aangeduid volgens dezelfde methode als in tabel 3:
Het eerste getal is een volumen gelatinesol, het tweede een volumen
chondroitinezwavelzuursol. Doordat het sol L 6 een andere con-
centratie bezit dan het sol L 5 is de verhouding van de gewichts-
hoeveelheden een andere dan in tabel 3; de gewichtshoeveelheden
van de componenten verhouden zich als de opgegeven volumina.

Nog veel duidelijker dan bij B u n g e n b e r g d e J o n g en
Westerkampquot;) komt uit deze figuren naar voren het ver-
schijnsel van de vorming van een „complexsolquot;.

Het wezenlijke in het coacervatieverschijnsel is de wederzijdsche
verlaging van de hydratatie. In de verlaging van de viscositeit, zoo-
als we die in tabel 5 en 6 hebben berekend, hebben we een maat-
staf, waarnaar we de grootte van deze beïnvloeding kunnen beoor-
deelen. Uit tabel 6 blijkt nu, dat kleine electrolytconcentraties

Invloed van electrolyten op de troebeling van mengsels
van chondroitinezwavelzuur- en gelatinesolen,
pH. 2,5; temperatuur 42,5°.

daarbij geen invloed hebben, ondanks het feit, dat ze voor de afzon-
derlijke solen de viscositeit merkbaar verlagen, en daar dus waar-
schijnlijk een verandering in ladings- en hydratatietoestand hebben
veroorzaakt. Eerst bij veel grootere concentratie geeft toevoeging
van zouten een opheffing van het verband, dat het coacervaat
bijeenhoudt.

Wat betreft den uitwendigen vorm van het verschijnsel vindt men
daarentegen wel een invloed van kleine electrolytconcentraties.
Mengsels, waarin door een overmaat van een component een over-
schot van lading aanwezig is, worden niet sterk troebel, omdat de
lading kleine complexen van deeltjes stabiliseert. Een dergelijk sol
(overmaat negatieve component) met een troebeling van 6,7 , ver-
toonde onder het microscoop een groot aantal zeer kleine deeltjes,
waarvan de grootte varieerde van 1 tot 4 micron.

Fig. 10. Invloed van electrolyten op de troebeling van het
positief geladen mengel 4.5—0.5.

Fig. 12. Invloed van electrolyten op de troebeling van het negatief
geladen mengsel 2.0—3.0.

Deze overmaat lading wordt door een kleine concentratie aan
tegengesteld geladen ion weggenomen; voor de meerwaardige ionen
geschiedt dit bij concentraties in de verhouding van den Schultze-
Hardy-regel. Het sol van kleine deeltjes gedraagt zich dan als een
lyophoob sol, dat uitvlokt, en waarbij de kleinere druppeltjes tot
grootere samenvloeien. Hetzelfde mengsel van de vorige alinea,
voorzien van 80 m. aeq. KCl per L., bestond uit veel grootere deel-
tjes, bijna alle grooter dan 4 micron en als regel met een doorsnee
van 8-12 micron (troebeling 27,9).

Om de gelijkenis met kollageen te bestudeeren bereidden we uit
het sol L 3 en gelatine een grootere hoeveelheid macro-coacervaat.
Dit stolde bij kamertemperatuur tot een stevig gel, dat bij verwar-
men tot 32—33° weer vloeibaar werd. Het gevormde coacervaat
bevatte 34 % vaste stof. Een structuur was er niet aan te ontdek-
ken. Onder gekruiste niçois was het donker. Het is er dus nog ver
vandaan, dat we hiermede een synthetisch kollageen zouden heb-
ben bereid.

Wilson®'') bestudeerde van het kollageen de zwelling in vloei-
stoffen van verschillende pH.

Het leek ons de moeite waard na te gaan of een macrocoacervaat
zich daarbij op dezelfde wijze gedraagt.

Hiervoor sloegen we een aantal pastilles van gelijken vorm en
gelijk gewicht. Deze werden gelegd in herhaald ververschte buffer-
oplossingen. Na telkens 24 uur wogen we de stukjes, na ze tusschen
filtreerpapier van aanhangende vloeistof te hebben ontdaan.

In een natriumfosfaat-citroenzuurbuffer (totale conc. 100 ni. mol)
zwollen de stukjes in enkele dagen bij elke pH zoo sterk, dat ze
scheurden en uiteenvielen. Blijkbaar heffen de meerwaardige ionen
de coacervatie op en de nu vrijgekomen gelatine zwelt tot een veel
grooter volumen.

In een natriumacetaat-azijnzuurbuffer van dezelfde concentratie
waren de stukjes bij een pH 3,2 - 4,6 bestendig, d.w.z. stukjes van
87 à 93 mg. bereikten een evenwichtstoestand tusschen 80 en 100 mg.
In de mengsels boven pH 4,6 vielen ze eveneens uiteen.

kromme bij Wilson uit dit oogpunt te verklaren. De kromme
vertoont twee minima gescheiden door een weinig hooger gelegen
maximum. Ziet men nu af van dit maximum, dat misschien zijn
oorzaak vindt in een systematische fout, dan is deze kromme ge-
lijkvormig aan een uit onze metingen met acetaatbuffer te teekenen
kromme.

Later deed zich een verklaring voor, die zich bij onze eigen ex-
perimenten aan kollageen beter aansluit (zie pag. 70).

Het is ons niet gelukt om met albumine een coacervaat te krijgen.
Er ontstaat wel een neerslag, als men de solen mengt, maar het
is vlokkig en onder het microscoop ziet men geen druppels. Het is
niet oplosbaar in zoutoplossing, hoewel dezelfde zoutconcentratie
het mengsel helder doet blijven, als men het voor de menging aan
de afzonderlijke componenten toevoegt. Alleen in verdunde natron-
loog lost het neerslag snel op.

Het mengsel leent zich niet voor bestudeering met den viscosi-
meter, daar het de buis verstopt. Fotometrisch waarnemen gaf ook
geen reproduceerbare waarden.

We trachtten een coacervaat zeer geleidelijk te laten ontstaan,
door aan de beide solen zooveel zout toe te voegen, dat bij men-
ging geen neerslag ontstond. Voegden we nu druppelsgewijs water
toe, tot juist een neerslag zichtbaar was, dan was dit al dadelijk
niet meer oplosbaar bij toevoeging van meer zout.

Blijkbaar gaat de coacervatie hier steeds gepaard met een de-
naturatie van de albumine.

We zijn er in geslaagd een complexcoacervatie aan te toonen
tusschen twee stoffen, die beide uit het dierlijk lichaam zijn te be-
reiden, en die misschien beide in het kollageen voorkomen.

Dit coacervaat is niet bestendig onder physiologische condities.
Daarvoor is de pH, waarboven geen coacervatie meer kan voor-
komen, namelijk het iso-electrisch punt van de gelatine (4,7), veel
te laag. We moeten daarom zoeken, of uit het kollageen een stof
te bereiden is, die bij een veel hoogere pH nog positief geladen is.

Wat betreft de negatieve component, ook deze behoeft niet be-
sHst dezelfde stof te zijn, als die we uit het kraakbeen hebben be-
reid. Wel is het waarschijnlijk, dat in het kollageen een stof uit de
groep van de mucinen voorkomt. Het leek ons daarom van belang
dit onderzoek uit te breiden op andere mucinen van het dierlijk
lichaam. Daarvoor kozen we het mucine, dat voorkomt in het glas-
achtig oogvocht.

Om bij de mucinen in het algemeen te onderzoeken, of zij stoffen
bevatten, die met eiwitten complexcoacervatie kunnen geven, was
het belangrijk als tweede vertegenwoordiger van deze groep een
stof te nemen, die in eigenschappen sterk van het chondromucine
afwijkt.

We lieten ons daarbij leiden door de resultaten van L e v e n e
Deze klassificeerde de mucinen naar gelang van de suikers, die ze
bij afbraak leverden. Uit het chondroitinezwavelzuur ontstond
daarbij chondrosamine; uit de stof, die hij op dezelfde wijze uit
een aantal andere mucinen afzonderde, bereidde hij glucosamine.
Op grond van dit verschil maakte hij onderscheid tusschen chon-
droitinezwavelzuur uit kraakbeen en uit sommige andere bindweef-
sels, en mucoitinezwavelzuur uit een groot aantal slijmstoffen.

Van de mucoitinezwavelzuur bevattende stoffen uit het onder-
zoek van L e V e n e was het eenige mucine, dat voor ons in vol-
doende hoeveelheid te verkrijgen was, dat uit het glasachtig vocht
van runderoogen.

In de oudere literatuur komt telkens opnieuw de vraag naar
voren, of er in het glasachtig vocht wel een mucine voorkomt. Men
twijfelt er aan, omdat er als regel geen duidelijk neerslag ontstaat,
als men de vloeistof aanzuurt, die langzaam uit het geleiachtige
lichaam uitlekt. De oorzaak van deze moeilijkheid ligt vooral in
het buitengewoon geringe totaal aan vaste stof in deze vloeistof;
het is niet gemakkelijk bij het toch al zoo geringe gehalte aan eiwit-
stoffen nog verschillende bestanddeelen te onderscheiden.

Evenals bij het chondromucine is het C. Th. M ö r n e r die
het bestaande feitenmateriaal ordent en aanvult. Hij brengt hel
alleen niet zoo ver als bij het kraakbeen; hij bewijst dat er een
glycoproteid aanwezig is en gaat na onder welke omstandigheden
er een neerslag met azijnzuur ontstaat, maar hij komt niet op hel
denkbeeld eveneens de eiwitten te verwijderen.

dat zijn mucoitinezwavelzuur een veel geringer zwavelgehalte heeft
dan het chondroitinezwavelzuur. Hij veronderstelt, dat het tijdens
de berefding gedeeltelijk is ontleed.

Ik sneed 425 runderoogen open en perste het glasachtig lichaam
er uit, zooveel mogelijk zonder aanhangende deelen zooals lens en
netvlies. Aan deze gelei werd 34 van zijn volumen 5 % kaliloog
toegevoegd. Na een nacht inwerken bij kamertemperatuur was vrij-
wel alles omgezet tot een door verontreinigingen bruingekleurde
stroop, die het typische kenmerk vertoonde van een mucine: Met
een staafje waren er lange draden uit te trekken, die slechts lang-
zaam tot druppels samentrokken.

De alkalische vloeistof werd geheel volgens dezelfde methode
bewerkt als bij het kraakbeen; ze werd aangezuurd, ingedampt met
bariumcarbonaat en uitgegoten in azijnzuur. Ik loste het neerslag,
dat zich vormde, op in water en sloeg deze oplossing neer met
basisch-loodacetaatoplossing. Het lood werd ten slotte verwijderd
door electrolyse en electrodialyse.

Na deze bewerking verkreeg ik een volkomen helder sol met een
pH van omstreeks 3. Het werd in de ijskist bewaard.

Het sol bevatte 0,21 % vaste stof. Het aschgehaite was minder
dan %; het stikstofgehalte was 2,84 % (beide berekend op de
vaste stof).

Op de wijze, zooals bij het chondroitinezwavelzuur is beschreven
(pag. 17), was er in het sol geen gebonden zwavelzuur aan te
toonen. 30 cm® sol gaven na herhaalde behandeling met salpeter-
zuur geen neerslag met bariumchloride.

Daar er in dit preparaat geen gebonden zwavelzuur aanwezig
is, heeft het ook geen zin om 'den naam „mucoitinezwavelzuurquot; te
gebruiken en kan met het woord „mucoitinequot; worden volstaan. We
bedoelen met dit woord niet, zooals L e v e n e, dat het product zijn
zwavel door ontleding heeft verloren. We hebben daarvoor geen
enkele reden. Veeleer is het waarschijnlijk, dat ook in de vloeistof
in het oog het mucine reeds geheel of grootendeels uit een zwavel-
vrij mucoitine is opgebouwd. Als argument hiervoor geldt dat, zoo-
als uit het volgende onderzoek zal blijken, het product zijn eigen-

schap, eiwitten te coacerveeren, niet verloren heeft. Een ontleed
„mucoitinezwavelzuurquot; zou deze eigenschap evenmin bezitten als
een ontleed chondroitinezwavelzuur.

Het sol vertoont tusschen pH 2,4 en 4,5 de viscositeits-pH kromme
van een steeds negatief geladen lyophiel kolloid (tabel 9 en fig 13).

TABEL 9. Viscositeit van mengsels van 10 c.c. mucoitinesol en
5 c.c. zuur of alkali bij 23,75°.

Onder de omstandigheden van deze metingen voldoet het aan de
wet van Poiseuille: Bij uitvloeitijden voor water in den „drie-
bollen-viscosimeterquot; van 310,4; 408,5; 578,9 sec. was de ver-
houding ts/to resp. 1,341; 1,339; 1,339.

Ph 2.S 3 0 3.S 4.0 4.S
Fig. 13. Viacositeit van het mucoitinczwavelzuursol bij verschillende pH's.

Bij menging van mucoitine- en gelatinesolen bij een pH beneden
4,7 ontstaat een troebeling, die vooral boven 40° zeer duidelijk uit
microscopisch kleine druppeltjes bestaat. Deze druppeltjes lossen
op in alkali en boven 40° in een y^ n. zoutoplossing.

Wegens de geringe hoeveelheid preparaat moesten we ons be-
perken tot enkele metingen met den fotometer; we maten de troe-
beling van mengsels bij verschillende pH bij 42,5° (tabel 10) en

TABEL 10. Mengsels van gelatine en mucoitine bij verschillende
pH. (temp. 42,5°).

den invloed van enkele electrolyten op de troebeling bij pH 3,1 ,
de eigen pH van het mucoitinesol (tabel 11).

Het mengsel van mucoitine- en gelatinesolen gedraagt zich geheel
zooals een mengsel van chondroitinezwavelzuur en gelatine: Het
vertoont een troebeling bij verschillende pH en electrolytgehalten
die typisch is voor de complexcoacervatie.

Door centrifugeeren van het bij 42° ontstane coacervaat gelukte
het een macrocoacervaat te krijgen, dat bij kamertemperatuur in
eenige uren stolde tot een gel.

Het mengsel van mucoitine en gelatine gedraagt zich typisch als
een mucine. Een enkele maal gelukte het ons om bij afkoelen van
een bij 40° gemengd troebel sol een vloeistof te krijgen, die „faden-
ziehendquot; was.

Uit een tweetal mucinen hebben we afgezonderd de stoffen, die
bij afbraak van de proteiden van deze groep de koolliydraatreacties
geven. Het zijn twee producten met zeer verschillende eigenschap-
pen. Het chondroitinezwavelzuur heeft een gehalte van 6 % aan
gemakkelijk afsplitsbaar zwavelzuur. In het mucoitine is geen als
zwavelzuur gebonden zwavel aan te toonen. Volgens L e v e n e

zijn er wel is waar uit beide stoffen aminohexosen te verkrijgen,
maar verschillende, n.1. chondrosamine en glucosamine.

Uit het u'erk van L e v e n e zou men kunnen opmaken, dat de
eigenlijke reden, waarom chondromucine en het mucine uit oogen
in dezelfde groep zijn gerangschikt, ligt in de overeenkomst in
chemische eigenschappen van deze hexosaminen. Ons onderzoek
bewijst daarentegen, dat deze overeenkomst een toevallige is, en
dat ze tot de mucinen worden gerekend om de eigenschap, die
daarvoor in de physiologische chemie als eenig criterium geldt, n.1.
— volgens de genoemde definitie van H a m m a r s t e n — dat
hun neutrale of alkalische oplossing met azijnzuur een neerslag
geeft.

Ons onderzoek heeft bewezen, dat een tweetal negatieve kolloiden,
die men uit de mucinen kan isoleeren, in staat zijn met eiwitten
complexcoacervatie te geven. Dit is een krachtig argument voor
de hypothese, dat men door het toevoegen van azijnzuur aan een
oplossing van een mucine niets anders doet, dan de pH van een
mengsel van eiwitten met een negatieve component zoo te verschui-
ven, dat men komt in een gebied, waar complexcoacervatie optreedt.
De mucine is dus niets anders dan een dergelijk mengsel van eiwit-
ten en een „koolhydraatquot;, dat in staat is complexcoacervatie te
geven.

Het is merkwaardig, dat de opvatting van mucine als een mengsel
van twee stoffen ook de eerste hypothese is geweest, die over de
mucinen is opgesteld, en wel door Landwehr'quot;) in het jaar
1881.

Aan het eind van het experimenteel gedeelte over het chondroitine-
zwavelzuur zochten we naar een eiwit met een isoëlectrisch punt
hooger dan pH 7, dat een van de bestanddeelen van het kollageen
zou kunnen zijn. Op het eerste gezicht leek het, dat dit te vinden is
in de „pigskinquot;-gelatine. Men vermeldt hiervan immers als isoëlec-
trisch punt pH 8,0. Als het werkelijk zou blijken, dat dit eiwit bij
neutrale reactie positief geladen is, dan zou dat een zeer groote
steun zijn voor onze hypothese over het kollageen.

Daarom bestudeerden we aan deze gelatine eenige eigenschappen,
die in het isoëlectrisch punt een uitgesproken maximum of minimum
hebben, en onze keus viel daarbij op de viscositeit en op de hoeveel-
heid alkohol, die juist een troebeling teweeg brengt. Vervolgens
bestudeerden we met behulp van den fotometer de omstandigheden,
waaronder „pigskinquot;-gelatine als positieve component aan complex-
coacervatie kan deelnemen.

We ontaschten deze gelatine, een preparaat merk „Grayslakequot;,
volgens de methode van Loeb'quot;*^), door wasschen met 0.003 n.
zoutzuur. Daarbij kregen we een preparaat, waarvan een % % sol
een pH van 3,8 had, en dat dus zeker nog een groote hoeveelheid
zuur bevatte. We moesten onze metingen tot boven pH 8,0 uit-
strekken en zouden dus al dit zuur met loog moeten neutraliseeren,
d.w.z. dat we het sol onnoodig op een groote zoutconcentratie zou-
den brengen.

De invloed van een dergelijke toevoeging van zouten is onder-
zocht door H o 11 e m a n •■'■'); hij vindt, dat elke toevoeging van
electrolyten de viscositeits-pH-kromme nivelleert. Op deze manier
zouden we het effect, dat we wilden meten, voor een kleiner of
grooter gedeelte kwijtraken als gevolg van het toevoegen van alkali.

Om dit te vermijden behandelden we de „pigskinquot;-geiatine met
verdunde natronloog. Met een drietal baden (10, 10 en 20 m. mol)
brachten we de pH tot boven 8,0. De overmaat alkali werd ver-
wijderd door het sterk gezwollen gelatinepoeder met koud gedestil-

leerd water te overgieten, een half uur te laten staan en dan de
bovenstaande vloeistof af te schenken. Dit geschiedde twaalf maal
achtereen, de pH daalde daarbij tot 6,2. Van dit product konden
we verwachten, dat het electrolytgehalte tot een zeer gering bedrag
was teruggebracht. (Het aschgehalte was beneden 0,2 %.)

De bereiding van de solen voor de viscosimetrische bepalingen
en de metingen zelf geschiedden geheel op dezelfde wijze als bij
de gewone gelatine. De uitkomsten van de metingen staan vermeld
in tabel 12 en fig. 14. De getallen werden gecorrigeerd voor irre-
versibele reactie; deze correctie bedroeg niet meer dan 2 eenheden
in de laatste decimaal.

TABEL 12. Viscositeit van een 34 % sol van „pigskinquot;-gelatine bij
verschillende pH (temperatuur 42,36°).

Onze metingen van de viscositeit van de „pigskinquot;-gelatine stem-
men in hoofdzaak overeen met die van B r i e f e r De viscosi-
teits-pH lijn van fig. 14 bezit een zeer vlak traject van pH 6,2 tot
8,0, met een zwak minimum bij 8,0. Uit dit gedrag van het verloop
van de viscositeit bij verandering van de pH is af te leiden, dat de
lading van de gelatine in dit geheele gebied gering is, doch waar-
schijnlijk positief en dat het isoëlectrisch punt, hoewel het niet zeer
duidelijk waarneembaar is, ligt in de nabijheid van pH 8.

Voor een dergelijk vlak gedeelte in een overigens sterk stijgende
en dalende viscositeits-pH kromme kunnen we een reden vermoe-

den: We kunnen te maken hebben met een mengsel van twee stoffen,
waarin coacervatie optreedt.

Indien dit bij de „pigskinquot;-gelatine het geval was, zouden we
bij een bepaalde pH de juiste uitbalanceering van de ladingen heb-

ben en dus een coacervatie moeten zien. Hiervan is echter geen
sprake; de solen zijn helder in het geheele pH-gebied van 6 tot 8.

Het is niet onmogelijk, dat we deze coacervatie niet zien, omdat
de tegenstelling tusschen de ladingen niet groot genoeg is om de

TABEL 13. Alkoholgetallen voor een % sol van „pigskinquot;-ge-
latine bij 42,5°.

hydratatie te overwinnen. Om een coacervatie te krijgen zouden we
dan slechts de hydratatie moeten verminderen b.v. door toevoeging
van alkohol. M.a.w. we verwachten, dat de hoeveelheid alkohol,
noodig om in het gelatinesol juist een troebeling teweeg te brengen,

ergens midden in het gebied tusschen pH 6 en 8 een scherp minimum
zal vertoonen.

Om dit na te gaan brachten we 5 cm^ y^ % sol in een thermo-
staat op 42,5° en druppelden daarbij alkohol, die eveneens van te
voren op dezelfde temperatuur was gebracht. Daarvoor gebruikten
we een verdeelde pipet voorzien van een mantel, waar door warm
water stroomde. Zoodra de troebeling, veroorzaakt door bijvoegen
van een druppel alkohol, bij omschudden niet meer verdween, noteer-
den we hoeveel alkohol was toegevoegd. Het resultaat is opgetee-
kend in tabel 13.

Van een scherp minimum is geen sprake. Uit deze alkoholgetallen
kunnen we dezelfde conclusie trekken als uit de viscositeit: De
lading van de „pigskinquot;-gelatine is in het pH gebied van 6-8
gering, en het iso-electrisch punt ligt omstreeks pH 8.

3. De complexcoacervatie van solen van „pigskinquot;-gelatine met die van
chondroitinezwavelzuur en arabische gom.

De coacervatie van „pigskinquot;-gelatine met chondroitinezwavel-
zuur verloopt in het pH-gebied 2,5 - 4,5 precies zooals die van ge-
wone gelatine. Op dezelfde manier als in tabel 7 is in tabel 14 ver-

TABEL 14. Troebeling van mengsels van solen van ,,pigskinquot;-ge-
latine en chondroitinezwavelzuur (sol 26).

meld de troebeling van verschillende mengsels bij een tweetal waar-
den van de pH (temperatuur 42,5°). De maxima liggen bij dezelfde
verhouding van de componenten; de coacervatie wordt bij pH 2,5

door dezelfde zoutconcentraties opgeheven, namelijk 160 m. aeq.
KCl, K2SO4 en BaClo per L.

Boven pH 5,6 vindt in het geheel geen coacervatie meer plaats.
Dit zou natuurlijk, behalve een vermindering van de lading van de
gelatine, ook gelegen kunnen zijn in een specifieke eigenschap van
het chondroitinezwavelzuur. Om deze mogelijkheid uit te sluiten,
werden de experimenten herhaald met arabische gom. Daarbij had-
den we dezelfde ervaring: Boven pH 5,6 a 5,8 is er bij geen enkele
verhouding van de componenten meer een troebeling te ontdekken.

Het wordt hierdoor wel niet zeer waarschijnlijk gemaakt, dat de
„pigskinquot;-gelatine als positieve component zou kunnen optreden in
het complexcoacervaat kollageen. We moeten er immers rekening
mede houden, dat er in het dierlijk lichaam ook nog een groote
concentratie aan zouten is, zoodat, zelfs als er in de mengsels
van „pigskinquot;-gelatine en negatieve component bij pH 6 a 7 een
spoor van coacervatie zou zijn aan te toonen, deze toch geheel zou
verdwijnen na toevoegen van b.v. 150 m. aeq. KCl per L.

De „pigskinquot;-gelatine heeft ons dus voor het doel van ons onder-
zoek alleen negatief resultaat opgeleverd.

Nadat we door de meting aan mengsels van chondroitinezwavel-
zuur en gelatine ervaring gekregen hadden over de troebeling van
coacerveerende mengsels, pasten we deze ervaring toe op de iso-
electrische troebeling van gelatine.

Daarbij kwam het er op aan, een zeer zuiver preparaat te berei-
den, omdat kleine hoeveelheden electrolyt de troebeling sterk ver-
minderen. Het wasschen met zoutzuur volgens de methode van
Loeb®^) was hier niet voldoende, daar er zuur achterblijft, waar-
door de troebeling veel van zijn sterkte verliest. Uit voorloopige
proefnemingen bleek, dat het zeer wenschelijk v^'as de troebeling
veel verder op te voeren door een betere zuivering.

We onderwierpen daarvoor de gelatine aan een verdere reiniging
volgens een voorschrift van Knaggs-quot;*^). In de middelste kamer
van den electrodialysator brachten we een gel met een concentratie
van ongeveer 10%. Dit gel werd onderworpen aan een electro-
dialyse, zonder membranen, tegen stroomend gedestilleerd water.
Nadat geconstateerd was, dat door deze bewerking het geleidings-
vermogen niet meer daalde, zetten we de dialyse nog twee dagen
voort met een stroom van dubbel gedestilleerd water. Aan het ge-
zuiverde gel werd een weinig thymol toegevoegd, om sterken groei
van micro-organismen te voorkomen. De droging geschiedde in een
warme luchtstroom.

K n a g g s verkreeg zoo een gelatine met de bijzondere eigen-
schap, dat gelen van 2 % of minder niet alleen zeer troebel waren,
maa^ bovendien na 24 ä 48 uur uitzakten tot een volumineus pre-
cipitaat.

Het gelukte ons niet, de stabiliteit van het gel zoo ver te be-
ïnvloeden. Hoewel het geleidingsvermogen van het gel ongeveer
dat van gedestilleerd water was, zoodat er geen electrolyt meer
aanwezig kon zijn, waren gelen van 1 % bij kamertemperatuur zeer
lang bestendig. Wel trad na eenige dagen een sterke synerese op,
maar van uitvlokken was geen sprake. Ook Y^fo en 34 % gelen
vlokten niet uit.

We begonnen het onderzoek van deze gezuiverde gelatine ermede,
dat we eenige malen een isoëlectrisch sol lieten afkoelen en het dan
onder microscoop en ultramicroscoop bekeken.

Behalve de onvermijdelijke kleine verontreinigingen zijn er onder
het microscoop geen deeltjes te zien. Van een eigenlijke coacervatie
is dus geen sprake.

Onder het ultramicroscoop neemt men wel iets waar van de troe-
beling. Natuurlijk is er een sterk Tyndall-licht. Bovendien kregen
we den indruk, dat er in het beeld een zekere structuur aanwezig
is. Herhaaldelijk zagen we, na scherpe instelling op een van de wei-
nige goed zichtbare deeltjes, een aantal kleine lichtende puntjes, die
flikkerden en uitdoofden als we de lichtkegel een weinig verschoven.
Toch was er geen sprake van een karakteristiek beeld; het was
bijvoorbeeld nooit zoo duidelijk, dat men er zonder fantasie een
teekening van zou kunnen maken.

Ditzelfde experiment was reeds eerder gedaan door B a c h-
mann®quot;). Hij liet een gelatinesol afkoelen onder de microscoop.
Daarbij vormden zich geleidelijk vlokjes, die zich bij voortgaande
gelatineering tot grootere groepen aaneensloten. Het beeld, dat zoo
ontstond, was duidelijk genoeg om het door een niet deskundige te
doen nateekenen. Deze teekening geeft enkele stukken gel eenigs-
zins schematisch weer in den vorm van een netwerk.

Hij deelt mede dat dit netwerk niet bij alle gelatinesoorten duide-
lijk zichtbaar is; hij heeft voor het onderzoek een geschikte soort
uitgezocht. Jammer genoeg vermeldt hij niets over de pH van zijn
sol, hetgeen te begrijpen is, daar in 1912 nog niet voldoende bekend
was, hoe sterk de eigenschappen van een eiwit veranderen met de
pH. Tot onze spijt is de pH ook niet meer na te gaan, daar Dr. W,
Bachmann op ons verzoek om inlichtingen mededeelde, dat hij
het materiaal niet meer bezat. Ongetwijfeld hangt deze netvormige
structuur samen met de isoëlectrische troebeling van de gelatine.

K. K r i s h n a m u r t i zag in iso-electrische gelatine bolvor-
mige deeltjes.

We herhaalden het experiment van Bachmann met verschil-
lende gelatinesoorten in verschillende concentraties. Als materiaal
gebruikten we behalve de fotografische gelatine, die gezuiverd was

zooals op pag. 50 is beschreven, ook nog een preparaat, gemerkt
„Winterthur Hartquot;, dat aschvrij gemaakt was door wasschen met
0,001 n. zoutzuur. Een sol van dit preparaat had een pH van 4,7;
bij afkoeling ontstond daaruit een zeer troebel gel.

De concentratie van het gel varieerden we van 34 tot 2 We
hebben deze praeparaten door verschillende andere personen laten
bekijken; geen van hen zag een netvormige structuur. In al deze
preparaten zagen we slechts een zeer sterk, weinig gedifferentieerd
Tyndall-licht.

Aan een niet isoëlectrisch gel is geen ultramicroscopisch beeld
waar te nemen. Een gel met pH 3,5 of 4,0 bijvoorbeeld geeft slechts
een flauwe Tyndall-kegel, te zwak om er nog een structuur in te
onderscheiden.

3. Invloed van pH, concentratie en electrolytgehalte op de isoëlectrische
troebeling.

Evenals alle eigenschappen van gelen is de isoëlectrische troebe-
ling sterk afhankelijk van kleine veranderingen in de bereidings-
wijze; om reproduceerbare waarden te verkrijgen bleek het noodig
alle experimenten nauwkeurig volgens hetzelfde voorschrift uit te
voeren:

We lieten de gelatine nu'nstens een uur zwellen in water, en losten
ze op door 30 min. te verwarmen op 60°. Daarna brachten we de
kolf in een thermostaat op 40° en mengden het sol bij die tempera-
tuur met electrolytoplossingen en eventueel met zuur of alkali. We
plaatsten deze mengsels in de cuvetten van den fotometer van Jobin
in een thermostaat op 20° (binnen 0,05° constant).

Na de bereiding nam de troebeling eerst sterk toe, meestal was
na 4 uur de grootste vermeerdering geëindigd, maar zelfs na 24 uur
was soms nog geen evenwichtstoestand bereikt. Als meest geschikte
tijd voor de beoordeeling werd gekozen 18 uur na plaatsing op 20°.
In de 20 a 30 minuten, noodig voor het meten van een serie gelen,
was de verandering, die dan optrad, te verwaarloozen.

Na 18 uur werden de cuvetten geplaatst in den fotometer van
Jobin en werd de troebeling gemeten, zooals op pag. 28 is aan-
gegeven.

Naar gelang van de sterkte van de troebeling gebruikten we
twee soorten cuvetten. De lichtbundel had hierin 1 c.m. resp. 5 c.m.
te doorloopen. Deze cuvetten waren gemaakt van spiegelglas, dat
door „Dekhotinsky-cementquot; werd bijeengehouden. In de richting
waarin de lichtbundel de cuvetten moest doorloopen, werden ze
zorgvuldig op de juiste lengte gebracht door het inpassen van een
houten vorm.

Het schoonmaken van deze cuvetten leverde eenige moeilijkheden
op. Er was geen sprake van om ze te ontvetten met zuren en ze uit
te stoomen (zooals we deden met al het andere glaswerk), daar dan
het kitmiddel losliet. Het samenplakken van deze glaasjes was een
tijdroovende bezigheid en het lukte niet altijd even goed, omdat het
glas door de herhaalde verwarming spoedig barstte. Bij het schoon-
maken vermeden we daarom zoo lang mogelijk om de kit los te
maken: we spoelden de cuvetten enkele malen om met water van
45° a 50°, en lieten ze dan twee uur staan met herhaald ververscht
gedestilleerd water.

Men loopt bij een dergelijke oppervlakkige omspoeling eenig
risico, dat er resten van het gel en van de daarin aanwezige elec-
trolyt in de naden achterblijven. Een invloed daarvan op de volgende
meting werd zooveel mogelijk verminderd door een systematische
opeenvolging van de experimenten. We gebruikten de cuvetten bij
alle series in dezelfde volgorde, zoodat in elke cuvet steeds een onge-
veer even troebel gel aanwezig was. We begonnen met de éénwaar-
dige ionen en eindigden met de driewaardige. Daardoor kon een
grondiger reiniging worden beperkt tot enkele gevallen, waarin we
een geheel nieuwe reeks begonnen.

b. Invloed van de g e I a t i n e-c o n c e n t r a t i e op
de iso electrische troebeling.

De troebeling van de gelen is niet evenredig met de concentratie.
Beneden % % is er geen merkbare gelatineering en daarmede ook
geen troebeling. Dan volgt er een gebied waar de fotometeraflezing
(vermeld in tabel 15) een groote waarde aanneemt. Het maximum
ligt bij 1 % ; dan nemen de waarden weer af. De concentraties van
5 % en hooger zijn helder; de kleme waarden van tabel 15 voor de
concentraties 5 cn 10 % zijn geheel veroorzaakt door verontreini-

We bestudeerden den invloed van electrolyten op de troebeling
aan 1 % gelatinegelen bij drie verschillende waarden van de pH.
Deze waarden kozen we zoo, dat we, evenals bij de mengsels van
chondroitinezwavelzuur en gelatine, bestudeerden den invloed op
een positief, een neutraal en een negatief geladen gel.

De eerste serie metingen, vermeld in tabel 16, werd uitgevoerd
bij pH 4,45. Daarvoor moest bij de bereiding zoutzuur worden toe-
gevoegd tot een concentratie van 0,25 m. aeq. per L.

Voor de tweede serie metingen (tabel 17) gebruikten we gelen
bereid uit het gelatinepreparaat zonder zuur of alkali. De pH van
deze gelen was 4,7.

Bij de derde serie (tabel 18) brachten we de pH op 4,85 dooi
toevoegen van 0,5 m. aeq. per L. natronloog.

De getallen uit de tabellen 16, 17 en 18 zijn uitgezet in fig. 15,
16, resp. 17.

De invloed van de pH op de isoëlectrische troebeling is zeer
groot; het gel zonder toevoeging van electrolyt is bij pH 4,7 sterk
troebel, bij pH 4,45 en 4,85 bijna geheel helder. Een scherpe con-
trole van de pH was daarom noodig, ze werd uitgevoerd colorime-
trisch (met broomkresolgroen) en met de waterstofelectrode voor
zoover het geleidingsvermogen dat toeliet.

Om te zorgen, dat eventueele scherpe maxima ons niet zouden
ontgaan, maten we een zoo groot mogelijk aantal verschillende con-
centraties en besteedden minder aandacht aan het doen van duplo-
bepalingen. Over het algemeen is de overeenstemming van de in de
tabellen vermelde duplobepalingen bevredigend, en ook waar een
dergelijke controle ontbreekt, liggen de waarden bij grafische voor-
stelling vrij goed op een vloeiend verloopende kromme. Bij elke
serie werd steeds een gel zonder electrolyt bij de zelfde pH gemeten,
de troebeling hiervan verschilde zelden meer dan een schaaldeel;
als ze meer dan een eenheid van het gemiddelde afweek werd de

TABEL 17. Invloed van electrolyten op de troebeling van 1
gelatinegelen bij pH 4,7.

geheele serie afgekeurd en overgedaan. In de tabellen is van deze
bepalingen alleen het gemiddelde vermeld.

Bij de gekleurde driewaardige zouten namen we de voorzorg, na
te gaan of de kleur invloed op de fotometeraflezing had. Voor de
oplossingen van deze electrolyten in de grootste gebruikte concen-
tratie was de instelling van den fotometer dezelfde als die voor
gedestilleerd water.

We bestudeerden behalve de invloed van meerwaardige positieve
en negatieve ionen ook nog die van de lyotrope reeks KCI-KBr-
KNO3 - KJ - KCNS. De invloed van deze zouten op de troebeling
is vermeld in tabel 19, de verschillen, die daar in één kolom vermeld

TABEL 18. Invloed van electrolyten op de troebeling van 1 % ge-
latinegelen bij pH 4,85.

TABEL 19. Invloed van de lyotrope reeks van anionen op de troe-
beling van 1 % gelatine bij pH 4,7.
Lengte van de cuvet bij de beide laagste concentraties
1 cm, bij 5 m. aeq. per L. 5 cm.

Staan, zijn zeker kleiner dan de experimenteele fout; eenige lyotrope
werking is dus met deze waarnemingen niet aangetoond.

Conc. in m. aeq. per L.
Fig. 16. Troebeling van 1 quot;/„ gelatinegel bij pH 4.7.

Zoowel uit de literatuur als uit onze eigen ervaring weten we,
dat in het isoëlectrische gelatinesol geen coacervatie voorkomt en
dat er ook bij afkoelen geen werkelijk coacervaat ontstaat. In tegen-
stelling tot het ontstaan van een coacervaat komt de troebeling lang-
zaam te voorschijn, het duurt drie è vier uur eer een zichtbare
verandering is opgetreden. Daarentegen wordt de gelatine weer
helder, zoodra we het gel in een sol omzetten. Als men een blokje
gel op 35° a 40° brengt, zijn de eerste druppels vloeistof, die bij
het smelten ontstaan, reeds geheel helder. De isoëlectrische troebe-
ling is dus een typisch gelatineeringsverschijnsel.

Het is natuurlijk mogelijk om het toch als een coacervatiever-
schijnsel op te vatten. Daarvoor zouden er in het gel andere omstan-
digheden van lading resp. hydratatie moeten zijn dan in het sol.
Het is niet onmogelijk, dat er bij den overgang van sol- in gel-
toestand dergelijke groote veranderingen voorkomen; de mutarota-
tie die daarbij optreedt, geeft ons reden te veronderstellen, dat

er een belangrijke verandering komt in de moleculen, waaruit de
gelatinemicellen zijn opgebouwd.

Er zijn echter in onze experimenten twee redenen te vinden om
deze verklaring als onjuist te beschouwen.

De eerste is de invloed van de gelatineconcentratie. Uit de litera-
tuur kenden we reeds het maximum uit tabel 15; we schreven het
toe aan een verontreiniging van de gelatine met b.v. zoutzuur, waar- -
mede het was gewasschen. In de hoogere gelatineconcentraties zou
dan het eigen electrolytgehalte hoog genoeg worden om de troebe-
ling niet te doen ontstaan. Bij onze gelatine bereikt het electrolyt-
gehalte van de gelatine de daarvoor noodige concentratie niet; het
10 % gel heeft een geleidingsvermogen, dat van de orde van grootte
van dat van gedestilleerd water is. We zijn hier dus nog ver van
de 4 a 5 m. aeq. per L. eenwaardig electrolyt, die noodig zijn om
een 1 % gel van dezelfde pH zijn troebeling te ontnemen.

Onze oorspronkelijke hypothese, dat de isoëlectrische troebeling
een coacervatieverschijnsel zou zijn, is niet in'staat, voor den invloed
van de concentratie een verklaring te geven. We zouden een troebe-
ling verwachten ongeveer evenredig met de gelatineconcentratie,
zeker geen maximum.

De tweede reden is de invloed van electrolyten op de troebeling.
Als we hier met een coacervatieverschijnsel te maken hadden, dan
zou de invloed van electrolyten in hoofdzaak moeten overeenstem-
men met die op het systeem chondroitinezwavelzuur-gelatine. In het
bijzonder brengt de theorie van de uitvlokking van het complex-
coacervaatsol met zich mede, dat de troebeling bij toevoeging van
de eerste hoeveelheden electrolyt wel grooter kan worden, maar dat
de stijging van de fotometerwaarden eindigt, zoodra alle sol is uit-
gevlokt. D.w.z. onverschillig de waardigheid van de toegevoegde
ionen komt de maximale troebeling altijd op ongeveer dezelfde
hoogte: De troebeling van een mengsel, waarin alle kolloide stof
aan de coacervatie deelneemt.

In fig. 15 ziet men, dat de toevoeging van meerwaardige ionen
een geheel andere invloed uitoefent. De gelen worden door toevoegen
van kaliumferricyanide drie tot vier maal zoo troebel als met kalium-
chloride. We kunnen ons dit moeilijk als een utivlokking van een
complexcoacervaatsol denken.

zekere overeenkomst tusschen onze resultaten bij toevoegen van
zouten aan gelatinegelen en de resultaten van Gal erna®quot;), die
den invloed onderzocht van electrolyten op de viscositeit van solen
bij 42°. In het bijzonder heeft zijn fig. 2 groote gelijkenis met onze
fig. 15, wanneer men een van beide omgekeerd denkt. Men vindt
daar denzelfden invloed van KCI, K2SO4, K3Fe(CN)o.

Met kleine concentraties wordt van elk van deze drie zouten de
viscositeit van een gelatinesol sterk verlaagd; bij verdere toevoeging
van electrolyt bereikt de viscositeit een minimum, om bij hoogere
concentraties weer vrij sterk te stijgen. Bij G a 1 e m a komt steeds
naar voren, dat deze minima op zeer verschillende hoogten liggen,
het minimum voor K2SO4 is lager dan dat voor KCI, en het minimum
voor K3Fe(CN),i is weer veel lager dan dat voor K2SO4.

Onze metingen hebben met die van G a 1 e m a •quot;') gemeen, dat
de maxima in troebeling in dezelfde volgorde liggen als de minima
van de viscositeit en dat de verhouding van de maxima hier onge-
veer dezelfde is als die van de minima daar.

We willen nu deze overeenkomst verklaren door te veronder-
stellen, dat ladings- en hydratatietoestand van sol en gel in hoofd-
zaak overeenstemmen. Een maximum van de troebeling valt dan
samen met een minimum hydratatie.

Met deze veronderstelling hebben we de mogelijke verklaring van
de isoëlectrische troebeling tot twee vragen teruggebracht. De eerste
vraag is, waarom de hydratatietoestand van de gelatinedeeltjes bij
toevoeging van electrolyten op de beschreven wijze verandert. Voor
het antwoord hierop sluiten we ons aan bij de bespreking van dit
verschijnsel door Kruyt en (jaleniaquot;). Deze onderzoekers
verklaren den invloed van de verschillende electrolyten als een resul-
tante van de verandering van den hydratatietoestand door de ont-
ladende, resp. omladende werking van de ionen eenerzijds en van
de verandering door hun lyotrope werking anderzijds.

De tweede vraag is hoe men zich begrijpelijk moet maken, dat
de troebeling groot is bij kleinen omvang van de hoeveelheid ge-
bonden water. Daarvoor moeten we nagaan, welke functie de hydra-
tatie heeft in de bouw van het gel.

De gclstructuur wordt veroorzaakt door een kracht, die de deel-
tjes samenbindt. Dat er een dergelijke kracht bestaat, merken we
als we het gel uiteentrekken: Het bezit een zekere trekvastheid.

Deze kracht zal er naar streven de deeltjes zoo dicht mogelijk
samen te pakken, d.w.z. het sol bij gelatineeren uit te vlokken. Dat
dit in werkelijkheid niet gebeurt, is een gevolg van het streven naar
hydratatie, dat zich tegen deze opeenpakking verzet. Op den duur
ontstaat er tusschen deze beide factoren een evenwicht.

Allereerst moet er hier op worden gewezen, dat de kracht die het
gel samenhoudt niet van denzelfden aard is als de kracht, die een
complexcoacervaat doet ontstaan, want de gelatineering wordt niet
opgeheven door toevoeging van electrolyt. We kunnen nu het ver-
moeden uitspreken, dat het ontstaan van deze kracht een chemische
oorzaak heeft, n.1. dat de deeltjes van het gel uit andere moleculen
zijn opgebouwd dan die van het sol. Deze verklaring vindt steun in
onze opvatting van de mutarotatie (pag. 59).

Uit de gegeven voorstelling van een gel, als strevende naar een
evenwichtstoestand tusschen hydratatie en een aantrekkende kracht
tusschen de deeltjes, ontstaat de volgende beschouwing over de
ontwikkeling van den geltoestand •■quot;•):

Bij het begin van de gelatineering treedt een chemische omzetting
op, waardoor er op enkele plaatsen op de deeltjes centra van aan-
trekking ontstaan. De deeltjes van het sol worden daardoor eenigs-
zins vastgelegd, waarbij hun stand weinig verschilt van de plaats,
waarop ze zich toevallig in het sol bevinden. In dit eerste bouwsel
heeft er een verdere ontwikkeling van de gelstructuur plaats, die
wordt veroorzaakt door vermeerdering van het aantal centra van
aantrekking. Deze vermeerdering heeft slechts geleidelijk invloed
op den stand van de deeltjes. Slechts wanneer er door Brownsche
beweging een deeltje uit het verband raakt, krijgt dit gelegenheid
die stand in te nemen, welke het zoo dicht bij de omringende deeltjes
brengt als de hydratatie maar toelaat.

Bij een sterk gehydrateerd sol is deze nawerking gering; de even-
wichtstoestand verschilt dan niet zoo veel van de verdeeling van de
deeltjes, zooals die in het sol was. Als dit sol helder was, is er geen
enkele reden, waarom het gel troebel zou zijn.

Ook bij een geconcentreerd sol is deze nawerking niet groot, om-
dat het groote aantal deeltjes de onderlinge verschuiving zeer be-
lemmert en omdat de hoeveelheid gebonden water uiteraard zooveel
grooter is t.o.v. het totale volumen dan bij een verdund sol. Ook
hier ziet men gemakkelijk in, dat de evenwichtstoestand niet zooveel

zal verschillen van de verdeeling van de deeltjes, zooals die in het
sol was; ook deze gelen zijn helder.

In een weinig gehydrateerd, verdund sol is de toestand anders.
Daar kunnen we ons wel degelijk een sterke nawerking indenken.
Na verloop van tijd worden de geldeeltjes in groepjes opeengehoopt.
In andere deelen van het gel ontstaan er dan plekken, waar minder
deeltjes zijn dan tevoren; de regelmatige verdeeling van de stof
wordt door de nawerking verstoord en dit nemen we waar als iso-
electrische troebeling.

Op den duur zullen de deeltjes in totaal een kleiner volumen
innemen dan in het sol, er blijft een hoeveelheid intermicellaire
vloeistof over. We zijn gewoon dit aan te duiden met het woord
syneresis.

Ten slotte, als de hydratatie zeer gering is, kan men zich indenken
dat er gebeurt, wat Knaggs^) beschrijft, n.1. dat de gelatine
geheel ineenzakt en „uitvloktquot;.

Aan het slot van het literatuuroverzicht merkten we op, dat het
kollageen een weinig aanlokkelijk materiaal is voor kolloidchemische
experimenten. Toch eischt onze werkhypothese, dat we enkele ver-
onderstellingen aan deze stof zelf zullen toetsen, te meer nu het
onderzoek van de „pigskinquot;-gelatine ons zoo weinig heeft op-
geleverd.

In de eerste plaats moeten we experimenteel bevestigen, dat het
kollageen een stof bevat, die met eiwitten complexcoacervatie kan
geven. Wel is waar hebben vele onderzoekers, waaronder L e-
vene'^quot;), uit pezen en huid stoffen afgezonderd, waaraan ze den
naam chondroitinezwavelzuur geven, maar een identiteit met het
overeenkomstige product uit kraakbeen staat allerminst vast. Deze
identiteit is tenslotte voor ons niet het belangrijkste; beslissend voor
dit onderzoek is alleen de vraag, of de stof, die b.v. L e v e n e uit
pezen isoleert, in staat is met eiwitten complexcoacervatie te geven.

In de tweede plaats moeten we het eiwit uit het kollageen af-
scheiden in een voor kolloidchemisch onderzoek toegankelijken,
d.w.z. oplosbaren vorm, waarbij de ontleding zoo gering mogelijk
moet zijn. De kans bestaat, dat we zoo de eiwitcomponent krijgen,
die we in de „pigskinquot;-gelatine tevergeefs zochten: Een eiwit, dat
bij pH 7 nog positief geladen is.

Door langdurige inwerking van zuren of alkaliën wordt het kol-
lageen omgezet in een stof, die beter oplosbaar is in warm water.
Indien deze bewerking een opheffing van den coacervatietoestand
is, moeten we zuur of alkali kunnen vervangen door een zoutoplos-
sing. We hebben daarom onze isoleering van de bestanddeelen van
het kollageen uitgevoerd door extractie met een natriumchloride-
oplossing; aan een minder snelle werking van dit reagens zijn we
tegemoet gekomen door verhooging van de temperatuur.

pezen van runderpooten. We ontdeden ze van alle aanhangende
vleesch en los weefsel en gebruikten alleen de stevige blanke stukken.

Het was noodig deze pezen voor het gebruik goed te ontsmetten.
We waschten ze daarvoor eenige malen met v^'ater, waaraan aether
was toegevoegd. Ondanks deze ontsmetting ontstond er uit enkele
hoeveelheden een rottingsproduct, dat zoo kwalijk riekte, dat we
niet licht in de verzoeking zoifden zijn gekomen om ze verder te
verwerken.

Bij voorloopige proefnemingen hadden we gevonden, dat men
bij een zoutconcentratie van ± 34 een temperatuur van 42°
belangrijke hoeveelheden materiaal uit de pezen uittrekt. Zoowel
bij een lagere als bij een hoogere zoutconcentratie geschiedt de aan-
tasting van de pezen veel langzamer.

Verder deden we vooraf nog een onderzoek om uit te maken of
men met deze methode van uittrekken soms een interfibrillaire stof
verwijdert en dus de fibrillen van elkander losmaakt (zie pag. 10).
Daarvoor sneden we van een pees een aantal dunne schijfjes ter
dikte van 3/^ tot 1 m.m. loodrecht op de richting van de vezels; bij
het uittrekken met zout zouden de korte stukjes vezel dan zeer
gemakkelijk los moeten laten. Dit was niet het geval; de schijfjes
bleven intact bij behandeling bij 42° met een zoutoplossing, die
telkens na 24 uur werd ververscht, zoo lang tot er geen mucinen
meer in de zoutoplossing overgingen.

We hebben hier een argument tegen de opvatting van de mucinen
als een interfibrillaire stof en een steun voor de meening, dat deze
stoffen tot de kollagene vezel zelf behooren.

Voor het onderzoek naar het mucine uit het kollageen werd I K.G.
van het gereinigde materiaal gemalen en vervolgens met 2 liter 14 n.
nalriumchlorideoplossing op 42° gebracht. Telkens na twee of drie
dagen schonken we de vloeistof af en voegden nieuwe zoutoplossing
toe. In deze extracten ontstond een neerslag bij verdunnen en aan-
zuren. Het uittrekken werd voortgezet, totdat de vloeistof op deze
wijze geen neerslag meer gaf; dit duurde tien dagen.

We verdunden het extract met een gelijk volume water en voeg-
den zoutzuur toe, om het mucine neer te slaan. De hoeveelheid

zoutzuur, die daarbij het meeste neerslag gaf, werd opgezocht met
behulp van een reeks reageerbuisproefjes. We verzamelden de neer-
slagen uit alle extracten en verkregen in totaal enkele grammen
van het nog vochtige product.

Om hieruit het chondroitinezwavelzuur te isoleeren volgden we
de methode van L e v e n e, zooals op pag. 15 is beschreven. Om
al te groote verliezen op de toch al zoo geringe hoeveelheid stof te
voorkomen, sloegen we de behandeling met bariumcarbonaat en
azijnzuur over, uit de overweging, dat eiwitten van het type van
gelatine op deze wijze toch niet te denatureeren zijn.

We losten het neerslag op in verdunde alkali en goten deze op-
lossing uit in de achtvoudige hoeveelheid ijsazijn. Het neerslag werd
opgelost in verdunde alkali en de behandeling met ijsazijn werd
herhaald. Vervolgens werd het neerslag opgelost in verdunde alkali
en neergeslagen met basisch-loodacetaatoplossing. Het lood werd
uit dit neerslag verwijderd door inleiding van zwavelwaterstof in
een azijnzure oplossing. De zoo verkregen vloeistof bezat niet het
vermogen, om met eiwitten coacervatie te geven, en met een over-
maat alkohol, na toevoeging van een weinig zoutoplossing, ontstond
er geen neerslag. Er was dus bij deze handelwijze blijkbaar in het
geheel geen kolloid overgebleven.

Dat we met deze methode geen spoor van een negatief kolloid
isoleerden, kon in de eerste plaats het gevolg zijn van het feit, dat
we bij uittrekken met zout op 42° zooveel eiwitstoffen hadden
meegesleept, dat het chondroitinezwavelzuur bij de bewerking in
de verschillende eiwitneerslagen was achtergebleven. In de tweede
plaats kon het te wijten zijn aan het overslaan van de behandeling
met bariumcarbonaat en azijnzuur.

Om hierover zekerheid te krijgen trokken we een voorraad pezen
bij kamertemperatuur gedurende vier dagen uit met Vso NaOH.
Het filtraat behandelden we met bariumcarbonaat en azijnzuur pre-
cies zooals op pag. 15 voor het kraakbeenextract is beschreven, liet
dikke neerslag, dat bij indampen ontstond, bewees, dat er wel dege-
lijk iets uit de pezen was getrokken. Bij filtreeren en uitgieten van
het filtraat in azijnzuur ontstond er echter geen spoor van neerslag.

We hebben dus uit pezen geen stof geïsoleerd, die in staat is om
met eiwitten coacervatie te geven. Dat wil niet zeggen, dat we op

grond hiervan ontilt;ennen dat de mogelijkheid bestaat, dat een derge-
lijke stof in kollageen zou voorkomen; het onbevredigde resultaat
van deze pogingen tot isoleering maakt het alleen waarschijnlijk,
dat er niet in alle kollageen een groote hoeveelheid van deze stof
aanwezig is.

Wat er overbleef na de op pag. 54 genoemde extractie met zout,
gebruikten we om de eiwitten van het kollageen langs een zoo min
mogelijk ingrijpende weg te isoleeren.

Er was bij deze bewerking oogenschijnlijk nog niet veel veran-
derd. De pezen waren vrijwel niet gezwollen en bij bezien in gepo-
lariseerd licht was het prachtige kleurenspel blijven bestaan. Het
bleek dan ook niet mogelijk dit kollageen in warm water tot een
gelatine op te lossen. Bij verwarmen met water krulden de stukjes
om tot harde bolletjes, die eerst na uren koken gedeeltelijk in oplos-
sing gingen. Het resultaat was dan, dat de afbraak van het kollageen
geen bruikbaar preparaat gaf, omdat de ontstane gelatine ook weer
werd afgebroken (wat bleek uit het feit, dat de oplossing niet
gelatineerde).

Voor het oplossen was noodig een voorafgaande opzwelling, hetzij
met zuren, hetzij met alkaliën.

Om ook bij deze zwelling zoo min mogelijk afbraak van het
kollageen te verkrijgen, volgden we de volgende methode:

De stukjes kollageen werden eerst met gedestilleerd water om-
geroerd, om de hoofdmassa van het zout te verwijderen. Dan werd
het water vervangen door verdund zoutzuur (concentratie 10 m.
mol. per L.). We ververschten dit tweemaal in den loop van een
dag en lieten het kollageen ten slotte gedurende den nacht er in
staan. De geheele inwerking geschiedde bij kamertemperatuur, d.w.z.
beneden 20°. De pH daalde daarbij hoogstens gedurende zeer korten
tijd beneden 3,9.

Het sterk gezwollen product was gemakkelijk oplosbaar door
verwarmen op 70 - 80°. We hielden de pH daarbij op 3,9 door toe-
voegen van zoutzuur. Na twee uur verwarmen schonken we de
vloeistof af; de nog overgebleven stukjes kollageen werden toen

nogmaals twee uur met water verwarmd. Het grootste deel van het
uitgangsproduct werd op deze wijze opgelost. De oplossing werd
gefiltreerd en ingedampt in een luchtstroom; de overmaat electrolyt
werd verwijderd door electrodialyse van het gel op de wijze als
bij de gelatine geschiedde. Hoewel de stroomsterkte daarbij daalde
tot ± \y2 maal die voor gedestilleerd water, verkregen we een
product met een aschgehalte van 1,76 %.

Om te weten te komen, of we hier werkelijk te doen hadden met
een eiwit, dat bij pH 7 positief geladen was, bepaalden we de vis-
cositeit van een 14 % sol bij verschillende pH (tabel 20). Uit de
tabel ziet men duidelijk, dat de viscositeit gelijk blijft bij verschuiven

TABEL 20. Invloed van de pH op de viscositeit van het gelatine-
preparaat, bereid uit pezen.

van de pH van 5,75 tot 7,7, en dat we dus een gelatine hebben
bereid overeenkomend met de „pigskinquot;-gelatine.

Het verschil tusschen de viscositeit bij pH 5,8 en die bij pH 7,7
is hier nog minder dan bij de „pigskinquot;-gelatine; waarschijnlijk
ligt dat voor een deel daaraan, dat we de daar besproken fouten

niet konden vermijden (vgl. blz. 45). Een ^ % sol had namelijk
een pH van 3,9; door de geringe opbrengst (8 gram) konden we de
bij de „pigskinquot;-gelatine beschreven wassching niet toepassen.

Dit resultaat van de viscositeitsmetingen gaf niet veel hoop, dat
er bij pH 7 nog een coacervatie met chondroitinezwavelzuur zou
plaats hebben. Inderdaad was er geen coacervatie aan te toonen.
De mengsels van een sol van het preparaat met het sol L 8 waren
bij alle verhoudingen van de componenten helder bij elke pH boven
5,7.

Beneden deze pH verliep de coacervatie op dezelfde wijze als bij
de mengsels van „pigskinquot;-gelatine en chondroitinezwavelzuur, zoo-
als blijkt uit de troebelingsmetingen van tabel 21.

TABEL 21. Troebeling van mengsels van het gelatinepreparaat, be-
reid uit pezen, en chondroitinezwavelzuur, temp. 42,5°.

Voor de hypothese, dat de oorzaak van de onoplosbaarheid van
het kollageen ligt in een complexcoacervatietoestand, heeft dit deel
van ons onderzoek weinig opgeleverd.

We zijn er niet in geslaagd, uit dit materiaal twee stoffen te
isoleeren, die samen complexcoacervatie geven. Daaruit volgt, dat
de samenstelling van het kollageen niet zoo eenvoudig is als we
dachten.

Wel hebben we aangetoond, dat er met een y^ n. natriumchloride-
oplossing uit pezen een substantie wordt opgelost, waardoor het

overblijvende deel beter oplosbaar wordt in water. Dit feit is echter
geen krachtig argument voor het aannemen van een complexcoacer-
vatietoestand.

Toch leert dit onderzoek ons wel iets over de verhouding van
kollageen en gelatine. Onze bereidingswijze van gelatine uit pezen
was er op gericht, om zoo veel mogelijk alles te vermijden, wat een
belangrijke verandering van de eiwitstoffen in de hand zou werken.
We mogen daarom de conclusie trekken, dat de bereiding van de
gewone gelatine een veel ingrijpender proces is dan de fabricage
van de „pigskinquot;-gelatine.

Een tweede argument voor deze conclusie volgt uit de zwelling
van het kollageen, zooals die is beschreven door W i I s o n (zie
pag. 28). Een gel van „pigskinquot;-gelatine zal ongeveer hetzelfde
verschijnsel vertoonen dat W i I s o n bij het kollageen waarneemt,
n.1. dat de zwellings-pH-kromme een vlak verloop heeft van pH
5 tot 8. Uit deze overeenkomst volgt eveneens, dat het kollageen
in chemisch opzicht veel meer gelijkt op de „pigskinquot;- dan op de
gewone gelatine.

We zijn uitgegaan van de hypothese, dat de onoplosbaarheid van
het kollageen geheel of ten deele het gevolg zou zijn van een com-
plexcoacervatietoestand.

Als schakel in het bewijs van deze hypothese onderzochten we
het coacervatieverschijnsel in mengsels van solen van gelatine met
die van chondroitinezwavelzuur en mucoitine. Dit onderzoek heeft
ons geleid tot de conclusie, dat de mucinen moeten worden be-
schouwd als mengsels van eiwitten en negatief geladen kolloiden
en dat het neerslag, dat ontstaat bij aanzuren van een alkalische
oplossing van een mucine, een complexcoacervaat is.

Indien er in het kollageen een mucine aanwezig is, dan is er dus
ook een negatief lyophiel kolloid, dat als negatieve component van
een complexcoacervaat zou kunnen optreden.

Een positieve component meenden we te hebben gevonden in de
„pigskinquot;-gelatine. Dit bleek niet waar te zijn, daar dit eiwit met
chondroitinezwavelzuur en met arabische gom geen complexcoacer-
vatie vertoont boven pH 5,7.

Het verschijnsel van de iso-electrische troebeling van gelatine
beschouwden we eveneens oorspronkelijk als een complexcoacer-
vatieverschijnsel: Ook dit bleek niet juist. Ons onderzoek van den
invloed van temperatuur, concentratie en electrolyttoevoeging op
deze troebeling liet geen twijfel, dat het verschijnsel een typische
eigenschap van het gel is. Duidelijk bleek, dat de troebeling daarin
alleen optreedt als de hydratatie van de gelatine gering is.

Ten slotte trachtten we uit pezen zoowel de negatieve als de
positieve component te winnen. Het gehikte ons niet, stoffen te iso-
leeren, die samen complexcoacervatie gaven. Daardoor wordt onze
hypothese onwaarschijnlijk; we hebben ons den toestand veel te
eenvoudig voorgesteld. Als eenig argument ter verdediging van onze

voorstelling blijft over het feit, dat het ons gelukt is een klein deel
van het kollageen in oplossing te doen gaan door uittrekken met
een zoutoplossing.

Ten slotte hebben we uit de poging om uit pezen een gelatine te
bereiden door uittrekken met een zoutoplossing geleerd, dat bij de
bereiding van de gewone gelatine een veel sterkere afbraak van
het kollageen plaats heeft dan bij de bereiding van de „pigskinquot;-
gelatine.

4.nbsp;H. G. Bungenberg de Jong en H. R. Kruyt,
Proc. Acad. Sei. Amsterdam, 32, 849 (1929). Kolloid-Z 5o'
39 (1930).nbsp;' '

5.nbsp;H. G. B u n g e n b e r g d e J o n g en W. A. L. Dekker
Biochem. Z. 212, 318 (1929).

6.nbsp;H. G. B u n g e n b e r g de Jong en R. F. W e s t e r-
kamp, Biochem. Z. 234, 367 (1928).

9. 0. Kraemer, J. Phys. Chem. 31, 764 (1927); 32, 384
(1928). Coll. Symposium Mon. 4, 102 (1926).

11.nbsp;Behalve no. 9 ook nog: A. C. D a h 1 b e r g, Ind. Eng. Chem
20,397 (1928).

13.nbsp;O. H a m m a r s t e n, Lehrbuch der physiologischen Chenue,
München 1926, pag. 127.

15.nbsp;C. T h. M Ö r n e r, Skand. Arch. f. Physiologie, 1, 228 ( 1889) ;
Z. physiol. Chem. 20, 357 (1894).

F. Müller, Zeitschrift für Biologie 42, 534 (1901); Ergeb-
nisse der Physiologie 1, 83 (1902).
H. Steudel, Z. physiol. Chem. 34, 359 (1902).
A. 0 r g 1 e r en C. N e u b e r g, Z. physiol. Chem. 37, 407
(1903).

S. Fränckel, Ann. 351, 344 (1906).
F. AI zona, Biochem. Z. 66, 408 (1914).
O. S c h m i e d e b e r g, Arch. f. exp. Pathol, u. Pharmacol.
87, 1 en 47 (1920).

K. H a r p u d er, Biochem. Z. 169, 308 (1926).
E. Jorpes, Biochem. Z. 204, 354 (1926).
W. W. S a V j a 1 0 V, Z. physiol. Chem. 126, 219 (1923); Chem.
Zentr. 1930, 1, 2571.

25.nbsp;O. S c h m i e d e b e r g. Arch. f. exp. Pathol, u. Pharmacol.
28, 355 (1891).

26.nbsp;P. A. L e V e n e, Hexosamines, mucins and mucoids, Monog.
Rock. Inst. 18. New York 1922.

27.nbsp;H. G. Bungenberg de Jong en 0 n g S i a n
Gwan, Biochem. Z. 221, 182 (1930).

35.nbsp;J. K n a g g s, A. B. Manning en S. B. S c h r ij v e r,
Biochem. J. 17, 483 (1923).

37.nbsp;H. R. K r u y t en H. J. C. T e n d e 1 o o, J. Phys. Chem 29
1303 (1925).

H. R. Kruyt, Colloids, 2de druk. New York 1930, pag. 234.
H. G. B u n g e n b e r g d e J o n g, Z. physik. Chem. 130,
205 (1927).

41.nbsp;H. R. Kruyt en H. P. G a I e m a, artikel in Kolloidchem.
Beihefte in druk.

L De schematische voorstelling van de electrische dubbellaag
bij E u c k e n is in strijd met de berekeningen van Müller.
A. Eucken, Z. physik. Chem. B 1, 375 (1928).
H. Müller, Kolloidchem. Beihefte 26, 274 (1927).

H. Het bestaan van allotropie bij het zink is zeer twijfelachtig.
M. S trau man is, Z. physik. Chem. B 13, 316 (1931); 19, 63
(1932).

III.nbsp;De poging van K ra eek, om zijn verklaring van de on-
regelmatigheden in de spec, warmte van natriumnitraat te
gebruiken ter verklaring van de polyniorfie van ammonium-
nitraat en andere nitraten, is aan bedenking onderhevig.

IV.nbsp;De wijze, waarop Stau dinger uit de viscositeit van
solen van sterk gesolvateerde kolloiden conclusies trekt be-
treffende de constitutie van deze stoffen, is onjuist.

V.nbsp;C h e s s i n leidt af, dat als een holomorfe functie met reëele
periode aan het eene einde van een periodenstrook een limiet
heeft, ze ook een limiet heeft aan het andere einde. Deze
afleiding is onjuist.

VI. Het ontbreken van optische isomeren bij benzidine-2-2'-
disulfonzuur en het bestaan van optische isomeren bij phenyl
benzidinedisulfonaat toont aan, dat de „obstakeltheoriequot;
voor diphenylderivaten geen absolute geldigheid bezit.
W. M. Stanley en R. Adams, J. Am. Chem. Soc. 52,4471 (1930).
M. S. L e s s 1 i e en E. E. T u rn e r, J. Chem. Soc. Juli 1932 pag. 2021.

VII. De methode van Criegee verschaft ons geen volkomen
zekerheid inzake de ringstructuur van suikers.
Criegee, Ann. 495, 211 (1932).

VIII. Het is weinig waarschijnlijk, dat het deel van de gelatine,
dat Sheppard afscheidt door coagulatie bij verwarming,
identiek is met de fractie, die Kunitz en Northrup
uit de gelatine afscheiden door zuivering volgens K n a g g s.
S. E. Sheppard, J. H. H u d s o n en R. C. H o u c k,
Kolloid-Z. 58, 348 (1931).

Preparaat	Concentratie van het sol	Asch- gehalte	Stikstof- gehalte	Zwavel- gehalte	Verhouding van het aantal mole- culen zwavel en stikstof
bereid volgens Mörner	—	21.6°/o	2.36°/,	5.94 7.	1.10
L 1	—	0.4°/.	2.35°/, 2.38°/.	6.20°'. 6.26°/.	1.15
L 3	—	5.2°/.	2.50°/.	5.76°/.	! 1.01
L 5	0.70°/.	14°/.	3.09°/. 3.13°/.	6.54°/. 6.42°/.	* 0.92
L 6	0.52°/,	0.97.	2.84 7.	6.18°/.	1 0.95 (
L 8	0.21 • ,	2.4°/.	—	—	1 i

pH	t^to
2.3	1.189
26	1.203
3.0	1.208
3.8	1.220
4.4	1.223
6.4	1.224
8.0	1.112

Volumenverhouding van de solen		Concentratie van het sol in gewichts quot;la		Verhouding van de componenten in /„ van dfc totale conc.		Notatie
Gelatine	Chondroi- tinezwa- velzuur	Gelatine	. Chondroi- tinezwa- velzuur	! 1 Gelatine '	Chondroi- tinezwa- velzuur
5.0	0	0.25	0	100	0	5.0-0.0
4.9	O.i	0.245	0.007	97	3	4.9-0.1
4.5	0.5	0.225	i 0.035	87	13	4 5-0.5
4.0	1.0	0.20	0.07	74	26	4.0-1.0
3.0	2.0	0.15	; 0.14	51	49	3.0-2.0
20	3.0	0.10	0.21	32	68	2.0-3.0
1.0	4.0	0.05	0.28	15	85	1.0-4.0
0	5.0	0	0.35	0	100	0.0-5.0

alle mengsels (tabel 5 kolom 3). Indien bij deze pH geen coacer- vatie van de mengsels optrad, zou hun viscositeit te berekenen zijn uit die van de gelatine (a) en het chondroitinezwavelzuur (b); voor TABEL 4. Viscositeit van de mengsels uit tabel 3 bij verschillen- de pH.
Mengsel	pH ! ts/to	1 Mengsel	pH U/to
5.0-0.0	4 72 1.080 1.079 4.47 1.089 4.40 1.094 4.24 1.160 4.14 1.174 3.88 1.262 3.40 1.444 -f-3.4 1.459 2.33 1.366	'4.0-1.0	5.05 4.47 3.85 3,3 3.02 2.23	1.103 1.040 1.025 1 019 1.017 1.018
5.0-0.0		3.0-2.0	5.08 4.43 3.98 3.33 2,39	1.105 1.085 1.064 .1.057 1.026
4.9-0.1	4.96 1.043 4.27 1.046 3.95 1.039 3.78 1.136	2.0-3.0	4.66 4.14 3.75 3.01 2.81 2.39	1.146 1.119 1.113 1.100 1.093 1.070
4.5-0.5	4.85 1.068 4.34 1 1.019 4.04 i 1.008 3.29 1.011 2.25 1.138 ± 3.85 1.003	1.0-4.0	2.91 4.27	1.147») 1.150¹»
4.5-0.5		0.0-5.0	4.56 4.17 3.62 3.17 2,30	1.171 1.187 1 199 1.201 1.193

PH	Mengsel	Viscositeit i : gemterpo- \| berekende leerd uit de . - viscositeit hguur ! 1		Geïnterpo- leerde waarde [ in % van de i berekende !
2.5	5 0-0.0 4.5-0.5 4.0-1.0 3.0-2.0 2.0-3.0 0.0-5.0	1.40 1.11 1.017 1.03 1.08 1.20	1 1.40 1.38 1.36 1.32 1.28 1.20	100 29 5 9 ' 28 100
3.0	5.0-0.0 4.5-0.5 4.0-1.0 3.0-2.0 2.0-3.0 (1.0-4.0) 0 0-5.0	1.45 1.04 1.017 1.05 1.10 i (1.15) 1.20	1.45 1.42 1.40 i 1.35 1 1.30 1 1.25 1 1.20 i	100 10 4 14 33 (60) 100
3.75	5.0-0.0 4.9-0.1 4.5-0.5 4.0-1.0 3,0-2.0 2.0-30 0.0-5.0	1 1.29 1.14 1.01 1.02 1.06 1.11 1.20	1.29 1.29 1.26 1.26 1.25 1.23 1.20	100 48 4 8 24 48 100
4.2	1 5.0-0.0 4.9-0.1 4.5-0.5 4 0-1.0 3.0-2.0 2.0-3.0 (1.0-4.0) 0.0-5.0	1 , 1.16 1.04 1.01 1.035 ! 1.07 1 1.12 (1.15) 1.19 1	i 1.16 100 1.16nbsp;1 25 1.16 1 6 1.17nbsp;21 1.17nbsp;42 1.18nbsp;1 67 1.18nbsp;;. (83) 1.19nbsp;1 100 i
4.65	5.0-0.0 4.9-0.1 4.5-0.5 4.0-1.0 3.0-2.0 1 2.0-3.0 0.0—5.0	1.09 1 043 1.05 1.06 1.09 1.14 1.17	1.09 1.09 1.10 1.11 1.12 1.14 1.17	100 48 50 55 75 100 100

Electro- lytconc.	Concentratie van de compon. in gew. quot;/o		Verhouding	1 Gemeten viscositeit		Gemeten
Electro- lytconc.	Gelatine	Chondroi- tine zwa- velzuur	van de conc. van de com- ponenten	1 Gemeten viscositeit	Berekende waarde in viscositeit' °/o van de berekende 1
0	0.25 0.225 0.20 0.15 0.10 0	0 0.026 0.053 0.105 0.158 ! 0.158	100— 0 90— 10 79- 21 59- 41 39— 61 0-100	1.381 1.132 1.020 1.023 1.053 (1.110)	1.381 1.361 1.341 1.302 1.262 (1.110)	100 37 6 8 20 (100)
5 m. aeq. KCl	0.25 0.225 0.20 0.15 O.IO 0	0 0.026 0.053 0.105 0.158 0.158	100— 0 90— 10 79— 21 59— 41 39— 61 0-100	1.306 1.096 1.015 1 015 1.042 (1.063) 1	1.306 1.286 1.266 1.226 ! 1.185 (1.063»	100 34 6 7 23 (100)
10 m. aeq. KCl	0.25 0.225 0.20 0.15 0.10 0	0 0.026 0.053 0.105 0.158 0.158	100- 0 90- 10 79- 21 59- 41 39- 61 0—100	1.249 1.084 1.014 1.014 1.037 (1.059)	1.249 1.234 1.219 1.188 1.159 (1.059)	100 36 7 8 23 (100)
20 m. aeq. KCl	0.25 0.225 0.20 0.15 0.10 0	0 0.026 0.053 0.105 0.158 0.158	100- 0 90- 10 79— 21 59— 41 39— 61 0—100	1.202 ' 1.074 1.015 1.014 1.038 (1.053)	1.202 I.19I 1.180 1.156 1.134 (1.053)	100 39 8 9 28 (100)

		pH
Mengsels	--
	2.6	i 3.8	4.5
4.9—0.1	0	0.6	\|zw opal.
4.5-0.5	11.9 i	37.2	' 0
4.0-1.0	36.1	6.8	0
3.0-2.0	37 2 !	5.9	! 0
2.0-3 0	25.0	5.2	0
1.0-4.0	10.5	3.3	0

				m. aeq. KCl		per L.		-----	----
Mengsels						----			-----
	0	2	5	10	20	40	80	120	140
4.5-0.5	3.2	' 3.8	12.4	33.3	35.0	33.4	16.5	9.8	2.9
4.0-1.0	38.7	1 37.4	1 34.5	! 34.3	36.2	34.6	28.0	25.0
3.5-1.5	16.7	40.3	33.5	37.9	36.6	35.0	28.9	26.9
3.0-2.0	7.8	23.4	33.5	37.7	36.0	34.0	27.7	25.3
2.5-2.5	5.8	14.4	33.2	36.9	35.4	33.7 !	26.7	25.3
2.0-3.0	4.4	11.4	17.9 j	32.9	35.0 1	33.4	23.4	15.8	8.4

10	40	80 1	120	' 140
11.6	11.0	; 6.8	0	0
—	32.6	—	3.8
—	32.7	30.5	8.9	2.3
—	—	— i	11.0 i	3.5
—	29.8	28.8 j	12.6	3.9
32.9	29.8 1	29.3 i	8.1	3.8

Mengsels	2	1 5 '	m. 10	aeq. K._,S04 per		L.		--------
Mengsels	2	1 5 '	m. 10	20	i 40 ' 1	80	120	140
4 5-0.5	7.0	35.2	1 33.2	1	32.0 1	24.4	4.2	1 0
4.0—1.0	33.6	—	34.2	! —	33.4 !	29.8	10.6	7.0
3.5 — 1.5	36.9	—	35.1	—	32.9 1	30.4	12.6	3.3
3.0-2.0	14.4	- ;	35.2 i	— 1	32.5	30.2	10.6 :	2.9
2.5—2.5	9.2 i	- '	34.2	— 1	32.2	29.2	8.7 i	2.8
2.0—3.0	6.6	~ !	26.7	32.9	30.7 ;	26 0 1	6.6 1	3.0

Mengsels		m. aeq. La(NOa)3 per			L.
Mengsels	1.66		3.33	6.67	27
4.5-0.5	6.4		_	6.3	3.1
4.0-1.0	35.3		—	33.8	—
3.5-1.5	35.7		—	34.7	—
3.0-2.0	35.5		—	32.7	—
2.5-2.5	15.9		—	32.8	—
2.0-3.0	4.5		34.1	22.8	i quot;

Mengsels		m.	aeq. K,Fe(CN), per		L.
Mengsels	0.25	0.75	3	7.5	15	60
4.5-0.5	7.6	36.2	35.3	—	34.1	15.2
4.0-1.0	_	35.1	36.3	—	34.7	14.4
3.5—1.5	_ 1	22.6	37.0	—	34.5	13.6
3.0-2.0	i	9.6	31.0	—	34.2	10.6
2.5-2.5	_ 1	6.7	21.6	—	33.6	8.0
2.0-3.0	] 1	4.1	12.8	25.0	27.0	6.7

pH	ts/to
2.42	1.275
2.59	1.310
3.06	1.339
3.40	1.344
3.72	I.35I
3.89	1.332
4.06	1.310
1. 4.2	1.295
4.39	1.256

Concentraties in gewichts ! Gelatine Mucoitine 1		pH 3.1	pH 3.8 i	pH 4.4
0.123	1 0.0025	0	1 0	2.8
0.120	0.005	0	i 0	6.1
0.113	0.012	0	5.8	2.8
0.100	0.025	2.5	; 26.7	0
0.075	0.050	26.5	i 3.5	0
0.050	0.075	3.9	! 0	0

Concentraties in gewichts quot;/o Gelatine j Mucoitine	0	Conc. Ba( 1	ri... in m. a 5	leq. per L. 10	25
0.100 ! 0.025 0.075 0.050 0.050 0.075	2.5 7.1 26.5 — 3.9 ! 20.3		18.4 23.1 13.0	12.5 20.2 14.0	0 0 0
c. K,SO,.
Concentraties in gewichts Gelatine Mucoitine	( 0	2onc. K,,S04 in m. a 1 1 5		leq. per L. 10	25
0.100 0.025 • 0.075 1 0.050 0.050 1 0.075 1	2.5 26.5 3.9	16.5 13.6	20.1nbsp;i 19.5 23.2nbsp;21.4 15.1 12.7		0 0 0

pH	Wto
3.19	1.814
3.64	1.744
5.02	1.242
5.12	1.228
5.9	1.128
6.28	1.107
6.6	1.108
7.63	1.105
8.0!	1.102
8.57	1.116
9.01	1.133

pH	cm' alkohol
4.45	7.65
4.84	7.25
5.54	7.0
6.52	6.75
6.9	6.75
7.42	6.4
7.98	6.6

Conc.	Troebeling 1 c.m.
r/o	4.4
i 0' i 10	18.0
w	19.7
2»/o	10.2
5°/o	5.0
10%	6.9

	Conc. in	! Troebe-		Conc. in	Troebe-		Troebe-
Electrolyt	m. aeq.	ling	Electrolyt	m. aeq.	ling		ling
	per L.	5 c.m.		per L.	5 c.m.		I c.m.
KCl	0	! 7.7	K.,S04	0	7.7
	0.2	8.6		0.05	i 8.6
	0.4	9.3		0.1	! 14.7
	1.0	14.4		0.2	18.7
	2.0	169		0.5	24.3
	3.0	15.0		1.0	20.4
	4.0	( 14.2		1.5	16.3
		} 14.4		2.0	12.6
	10	8.6		5.0	7.9
	20	6.0		10		6.0
	30	4.4 1		•		6.0
BaCl,	0	7.7	K;,Fe(CN),	0	7.7		2.8
	0.05	8.4		0.002	9.5		_
	0.1	9.1		0.005	9.7		_
	0.2	9.5		0.01		10.4	2.8
	0.5	9.5				9.8
	1.0	8.6		0.03	14.4
	2.0.	7.6		0.05	17.4		4.4
	10.0	4.7		0.10	36.1		II.O
				0.15	40		_
				0.20	oo		14.0
Luteo-	0	7.7		0.30	oo		_
cobalt-	0.02	7.2		0.60	(43		11.5
chloride	0.1	7.0			\|35.5		_
	0.2	7.0		0.75	10.2		_
	0.5	7.0		1.20	12.2		5.0
	2.0	7.8		1.5	10.8
	5.0	6.2		3.0		6.6
						7.1

Mengseh	1 in gewichts quot;U	pH 2.5	pH 4.2
Gelatine	Chondroitine- zwavelzuur	pH 2.5	pH 4.2
0.245	0.005	1.4	2.4
0.225	0.025	8.8	23.9
0.20	0.05	34.2	4.9
0.15	0.10	33.6	2.1
0.10	0.15	25.0	2.2
0.05	020	11.6	0.4

! Electrolyt i (	Conc. in m. aeq. per L	Troebe- ling 1 c.m.	Electrolyt	Conc. in m. aeq. per L	Troebe- ling 1 c.m.
KCl	0	18.7	KSO^	0	18.7
	0.2	16.9		0.1	13 0
	0.4	14.0		0.2	10.5
		14.1		0.5 [	8.8
	1.0	9.7		1.0 '	5.4
	2.0	8.2			4.6
	4.0	6.2		2.0 1 1	; 4.5
	10	(, 3.7		1 lt;	' 4.6
		} 40		5.0 '	3.1
BaCl,	0	18.7	K,Fe(CN)„	0	18.7
	0.1	15.7		0.005	19.7
	02	13.2		0.01	18.5
	0.5	8.4		0.02	17.1
	1.0	6.4		0.03	16.7
	2.0	5.1		0.05	11.6
	5.0	3.2		0.15 i	5.0
				0.25 1	3.4
Lutco-	0 '	18.7		« 1 !
cobalt-	0.04	23.2		1
chloride	0.10 1	19.3		1
		19.3		1
	0.20	13.5
		16.0		1
	0.5	5.6

KCl	9.7	7.5 1	_
KBr	10.4	7.0 1	13.8
KNO,	10.7	7.1	14.8
KJ	10.1	7.3	14.0
KCNS	10.2	6.5 1 1	13.5

pH	Wto
3.9	1.125
4.35	1.075
4.60	1.065
4.80	1.055
5.3	1.054
5.75	1.050
5.8	1.051
6.4	1.051
6.9	1.051
7.7	1.053
8.6	1.054
9.4	1.057