BACTERIOLOGISCHE NORMEN
VOOR DE BEOORDEELING VAN
CONSUMPTIEMELK

V

BIBLIOTHEEK DER
RIJKSUNIVERSITEIT
UTRECHT.

W. H. F. C. MAJOEWSKIJ

■gt;-lt;■ r, , . V

-.quot;f.'.':

: '

BACTERIOLOGISCHE NORMEN VOOR DE
BEOORDEELING VAN CONSUMPTIEMELK

/^S J.

BACTERIOLOGISCHE NORMEN
VOOR DE BEOORDEELING VAN
CONSUMPTIEMELK

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE VEEARTSENIJKUNDE

AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT
OP GEZAG VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS
DR. H. BOLKESTEIN. HOOGLEERAAR IN DE
FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJSBEGEERTE.
VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DER
UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE
FACULTEIT DER VEEARTSENIJKUNDE TE VER-
DEDIGEN OP VRIJDAG 30 NOVEMBER 1934, DES
NAMIDDAGS TE 4 UUR. DOOR

WILHELM HEINRICH FRIEDRICH CHRISTIAAN MAJOEWSKIJ

GEBOREN TE ENSCHEDE

1934

DRUKKERIJ Fa. SCHOTANUS 6 JENS. UTRECHT

BIBUOTHEEK DER
RIJKSUNIVERSITEIT
U T fR E C H T.

Aan mijn ouders.
Aan mijn vrouw.
Aan mijn kinderen.

Bij het voltooien van dit proefschrift voel ik mij gedrongen aan U, Hoog-
leeraren aan de Faculteit der Veeartsenijkunde mijne erkentelijkheid te betuigen
voor het aandeel, dat Gij hebt gehad aan mijne wetenschappelijke vorming.

In het bijzonder naar U. Hooggeleerde VAN OYEN, hooggeachte promotor,
gaat mijn groote dank uit, zoowel voor den raad en den steun, die ik bij de be-
handeling van dit onderwerp steeds van U mocht ondervinden, als zeer speciaal
voor de prettige wijze, waarop Gij mij deze geschonken hebt. De verdieping van
mijn gevoel voor zelfkritiek, die Gij mij hebt gegeven, zal voor mijn geheele verdere
leven van groote waarde zijn.

Ook U, Zeergeleerde HESSELINK, ben ik grooten dank verschuldigd voor
de wijze, waarop Gij mij in de gelegenheid hebt gesteld, dit einddoel mijner
academische opleiding te bereiken, en voor de belangstelling, die Gij mij steeds
hebt betoond.

Van het personeel van den Keuringsdienst van Waren dank ik in het bijzonder
de Heeren HOEGEN, HÜIZER en WANNET, zonder wier toegewijde tech-
nische hulp hef mij niet mogelijk zou zijn geweest, het omvangrijke materiaal te
bewerken.

Tenslotte dank ik de talloos velen, van wie ik alleen den Heer PENNING,
directeur der CAMIZ noemen wil, die mij op eenigerlei wijze bij mijn onderzoek
hunne medewerking hebben verleend.

INHOUD

Eerste Afdceling

HOOFDSTUK

I. Inleiding ......................... ^

II. Eischen te stellen aan een methode ter bepaling der

bacteriologische zuiverheid der melk.......... 5

III. Literatuur.........................

A.nbsp;Wat moeten wij verstaan onder het begrip „cohbacilquot; bij de
beoordeeling der consumptiemelk.............

B.nbsp;De cohachtigen in melk................. 20

1.nbsp;Komen coliachtigen in alle melk voor?........ 21

2.nbsp;In welke mate komen de coliachtigen in melk voor? . . 22

3.nbsp;Welken invloed hebben de diverse factoren, die bij de
winning en behandeling een rol spelen op het colicijfer

der melk?..................... 25

4.nbsp;De invloed van de coliachtigen op de kwaliteit der melk 27

C.nbsp;Heeft het zin eventueele variteiten van B. coli uiteen te houden? 29

a.nbsp;uit een oogpunt van volksgezondheid

b.nbsp;om fouten, bij de melkwinning begaan in het oog te doen
vallen,

en zijn deze variteiten gemakkelijk te herkennen?
Bespreking der methoden om faecale en niet faecale coli uiteen te
houden.......................... ^^

1.nbsp;De glucosevergisting bij 45 a 46° C..........

2.nbsp;Het gedrag in saccharose- en dulciethoudend milieu ... 30

3.nbsp;De verhouding in het in glucose-bouillon gevormde gas

van CO2 tot Hj.................. 32

4.nbsp;De eind-pH bij de vergisting van glucose en het gedrag
t.o.v. methylrood..................

5.nbsp;De vorming in glucose-peptonhoudend miheu van acetyl-
methyl-carbinol, en de reactie hierop volgens Voges-^
Proskauer.................... • ^^

6.nbsp;Het kweeken in synthetische milieu's.........

7.nbsp;De eigenschappen van coU-achtigen van bekende herkomst 37

Bespreking der varieteiten van coh-achtigen in melk gevonden, en
van hun beteekenis voor de volksgezondheid en de melkhygiëne 42

Bladz.

D. Op welke wijze zijn de coli-achtigen in melk aan te toonen? 42

1.nbsp;Algemeene principes..............

2.nbsp;Nadere bespreking der diverse methoden om coli-achtigen

in melk aan te toonen..................^^

A.nbsp;De ophoopingsmethoden......................44

a.nbsp;Kweeken in 1 7o„ carbolzuur-houdend milieu ...nbsp;44

b.nbsp;Kweeken in zuren bouillon bij 37° C..............44

B.nbsp;De selectieve plaatmethoden................45

C.nbsp;De industrieele methoden......................45

a.nbsp;methoden die berusten op de indolvorming in pepton-
houdend milieu..........................45

b.nbsp;Methoden die berusten op de veranderingen in
neutraalroodmilieu.............. 43

c.nbsp;Methoden die berusten op het kweeken in lactose-
bouillon of lactose-peptonwater met of zonder toe-
voeging van indicatoren en/of remmende stoffen . . 49

Tweede Afdeeling

IV. Het eigen Onderzoek....................53

EERSTE DEEL
Een onderlinge vergelijking der gebruikte bodems op hun gevoelig-
heid en betrouwbaarheid, met volledige identificatie, zoo mogelij
der geïsoleerde kiemen.............

Techniek van dit onderzoek..........

A.nbsp;Gebruikte voedingsbodems, hun samenstelling, bereiding en be
oordeeling................

B.nbsp;Het enten van de melk op deze bodems

C.nbsp;Verdere bewerkingen ............

D.nbsp;Identificatie der gevonden kiemen............

Tabellen...............

Samenvatting van de resultaten, verkregen bij het eerste deel van he
eigen onderzoek..............

Voorloopige conclusies........

TWEEDE DEEL
Een nader onderzoek over een grooter aantal monsters melk. om
na te gaan. of bij toepassing der beide voorloopig als de beste
erkende methoden de aanvankelijk geconstateerde betrouwbaarheid

en gevoeligheid behouden blijven............... 118

Inleiding en algemeene beschouwingen............. Hg

Bladz.

Tabellen..................................................122

Samenvatting van het tweede deel van het onderzoek............132

Conclusies . ...............................................136

DERDE DEEL

Inleiding en algemeene beschouwingen..........................137

Techniek van het onderzoek..................................l'^O

I.nbsp;De bemonstering .......................................l'^ö

II.nbsp;De wijze van onderzoek der monsters....................141

De reductaseproef........ .........

De gistingproef......................................146

Het onderzoek op B. coli............................148

De bepaling van het totaalkiemcijfer der melk............152

De reactie van Storch................................154

Het onderzoek van het sediment......................155

Onderzoek der gepasteuriseerde tankmelk......................155

Invloed van naspoeling van het vaatwerk enz. met chloorbleek-

loogoplossing..............................................156

Tabellen en bespreking van de resultaten van het onderzoek bij de

verschillenden bedrijven verkregen............................160

Onregelmatigheden bij de bepaling van den colititer............221

Hooge colititers............................................222

Vergelijking van de resultaten der reductaseproef met het kiem-

cijfer en den colititer........................................223

De resultaten der gistingproef................................225

V. Conclusies ................................................227

Omschrijving van de bacteriologische controle der melk,
ter handhaving van de sub. IV en V der conclusies

onder C. gestelde grondslagen..........................229

Geraadpleegde Literatuur......................................231

Stellingen ......................................................237

EERSTE AFDEELINGnbsp;^

HOOFDSTUK I

INLEIDING

De taak der overheid met betrekking tot de melkvoorziening is
zéér veelzijdig. Niet alleen dient zij er voor te zorgen, dat de ver-
handelde consumptiemelk voldoet aan bepaalde minimumeischen
voor zoover betreft chemische samenstelling en reinheid, maar
tevens, dat zij vrij is van mensch-pathogene, en zooveel mogelijk
vrij van saprophitische kiemen (in verband met hare houdbaar-
heid), en verder, dat zij in diëtetisch opzicht (vitaminengehalte
enz.) voldoende is.

Bezien wij nu de voorschriften op het gebied der melkvoorzie-
ning neergelegd in het Melkbesluit (Stbld. 43—1929) met de
sindsdien verschenen aanvullingen en wijzigingen, dan valt aller-
eerst op, dat aan punt één, de chemische samenstelling en reinheid,
zeer voldoende aandacht is geschonken. In de practijk blijkt dan
ook dat de consumptiemelk, dank zij de eischen gesteld bij art. 2
van het Melkbesluit, in dit opzicht, vergeleken met tien of twintig
jaren geleden, sterk in qualiteit is vooruitgegaan. Fraude in den
vorm van watertoevoeging of ontrooming enz., die vroeger in be-
paalde streken regel was, soms zelfs door onverstandige overheids-
maatregelen (ik noem bijv. het toestaan van den verkoop van z.g.n.
verdunde melk in Amsterdam) bevorderd werd, is gelukkig tot de
uitzonderingen gaan behooren. Ook het aantal gevallen van erger-
lijke vervuiling is zéér veel minder geworden.

Punt twee echter, de hygiënische en bacteriologische hoedanig-
heid der melk, is min of meer stiefmoederlijk behandeld. Wehswaar
geeft art. 24 een aantal voorschriften voor de wijze, waarop winning

en bewaring enz. door den veehouder moeten plaats hebben, en
wordt in art. 25 o.a. bepaald, dat geen melk mag worden afgeleverd
of verkocht, die afkomstig is van dieren lijdende aan met name
genoemde ziekten (open tuberculose, uierontsteking, fluor albus,
darmontsteking met diarrhée gepaard gaande, enz.), maar de con-
trolemiddelen op deze voorschriften of op de winning enz, worden
nergens omschreven.

Skchts geeft art. 2 aan, dat de zuurgraad der melk niet hooger
mag zijn dan 9° S.H., dat er bij het filtreeren van een halven hter
of minder geen of slechts geringe sporen vuil mogen worden af-
gezet, dat Streptococcen niet in belangrijke mate in het sediment
mogen voorkomen, terwijl pathogene micro-organismen in het geheel
niet aanwezig mogen zijn, maar deze voorschriften zijn zóó alge-
meen, ruim, en ten deele zóó negatief gesteld, dat zij met elkaar er
zeer zeker geen aanspraak op kunnen maken een genoegzamen
waarborg te geven voor de hygiënische en bacteriologische betrouw-
baarheid der melk.

Een uitzondering hierop maken tot op zekere hoogte de in andere
artikelen van het M.B. genoemde voorschriften omtrent melk, die
als gepasteuriseerde, gesteriliseerde of als kindermelk wordt ver-
kocht, waarbij meer nauwkeurig omschreven eischen aan de bac-
teriologische hoedanigheid zijn gesteld.

Toch is de bepaling van deze bacteriologische hoedanigheid óók
voor de consumptiemelk van zéér veel belang. In het voorwoord
van de dissertatie van L. Camus wijst Porcher op het volstrekt
onvoldoende zijn van een uitsluitend chemische melkcontróle. Deze
heeft toch nog nooit alle bezwaren der in hygiënisch opzicht slechte
melk kunnen ondervangen.

Porcher vat zijn oordeel ongeveer samen in de stelling, dat het
beoordeelen der melk uitsluitend naar haar chemische samenstel-
ling is „un veritable sophismequot;. De eenige definitie van „goede
melkquot;, die steek houdt, is volgens P.: „Le lait pur est un lait sain
et proprequot;.

Porcher veronderstelt dat deze te verkrijgen is in eenvoudige
stallen, waar de eenige luxe is een doelmatige behandeling, die
langzamerhand geleerd moet worden. Hij wenscht hierop controle
in den vorm van eenvoudige „testsquot;, die tegelijk een waarborg
vormen voor de hygiënische betrouwbaarheid der melk.

In gelijken zin ongeveer uit zich Neisser. Deze schrijver wijst er
op dat de tegenwoordige consumptiemelk in doorsnee in hygiënisch
opzicht absoluut onbetrouwbaar is, en dus gekookt moet worden;
dat echter zoowel in openbare verkoopplaatsen als in de huishou-
ding door verschillende omstandigheden dit koken dikwijls onvol-
doende geschiedt, zoodat het de taak der overheid is, hier preven-
tief werkende voorschriften te geven. Neisser komt tot de conclusie,
dat de overheid pas dân aan deze taak heeft voldaan, wanneer zij
zorgt dat uitsluitend prima melk zóódanig behandeld en gedistri-
bueerd wordt, dat de eventueele schadelijke eigenschappen geëlimi-
neerd, en de goede zooveel mogelijk behouden zijn; dat verder
herinfectie wordt uitgesloten, en dus nogmaals koken achterwege
kan blijven.

N. bepleit voor de groote massa der consumptiemelk Dauer-
pasteurisatie en distributie in de flesch. en stelt voor. als waarde-
meter voor de qualiteit dezer melk o.a. „coli- en bacterietitersquot; vast
te stellen.

Terzake der pasteurisatie wenscht hij een uitzondering te maken
voor de ..Milch welche Selbstversorger gewinnen, oder die die-
jenigen erhalten, die wirklich noch Beziehungen zu einwandfreien
Milchquellen besitzenquot;. Hij vervolgt zijn betoog aldus ..Und es
musz die Trinkmilch als hygienische Norm genommen werden,
trotzdem wir wissen, dasz im Haushalt die Kochmilch die grössere
Rolle spieltquot;.

N. wenscht ten allen tijde garantie te kunnen geven voor het
afgeleverde product, en ziet daarom als noodzakelijkheid een cen-
tralen aanvoer en bewerking van alle melk (met uitzondering van
de bovengenoemde van goede veehouders-slijters afkomstige), die
een zéér strenge controle door de overheid mogelijk maken, en
daarnaast zooveel mogelijk controle aan de bron. Van een nieuwe
melkwet verlangt N. hoofdzakelijk garantie voor hygiënische quali-
teit; de chemische samenstelhng is voor de volksgezondheid van
Blinder beteekenis. Daarbij moet de overheid niet te angstvallig zijn
in het vaststellen van scherpe normen, en van maatregelen ter
bescherming van het werkelijk goed ingerichte en goed beheerde
bedrijf.

In gelijken zin uiten zich Klimmer, Nevot en Orla-Jensen.

In ons land is het o.a. Gorter geweest, die naar aanleiding van

het veelvuldig voorkomen van den bovinen tbc-bacil bij gevallen
van niet-pulmonaire tuberculose bij kinderen, verlangt, dat krach-
tige maatregelen zullen worden genomen, om het gevaar van een
bovine infectie zoo gering mogelijk te maken.

Ook de hygiënische subcommissie, die in 1923 medewerkte aan
het rapport betreffende een gemeentelijk melkbedrijf voor Amster-
dam, spreekt zich aldus uit, dat de volksgezondheid minder gediend
is met een controle op chemische samenstelling, dan met een, die
gericht is op de bacteriologische hoedanigheid der melk.

Tenslotte is het vooral ook Plantenga geweest, die gewezen
heeft op de dringende noodzakelijkheid van een zoodanige winning
en behandeling der melk, dat zij van meet af aan zooveel mogelijk
vrij is van bacteriën en van bacterie-toxinen.

Uit deze aanhalingen moge blijken, dat zoowel hier als in het bui-
tenland behoefte gevoeld wordt aan een nadere regeling, opdat
men het publiek werkelijk garantie voor een in hygiënisch opzicht
betrouwbaar product zal kunnen geven.

Punt drie — de diëtetische waarde der melk — en meer speciaal
het vitaminenvraagstuk — wordt in het Melkbesluit in het geheel
niet aangeroerd. Neisser vat het vitaminenvraagstuk op als van niet
zooveel belang zijnde, vooral, daar zelfs vitamine-vrije melk niet
gemist kan worden, en bovendien de op moderne wijze gepasteuri-
seerde melk niet van haar vitaminen is beroofd, en dus op gelukkige
wijze hygiënische en diëtetische qualiteit aaneen koppelt.

In dit proefschrift zal ik uitsluitend behandelen de bepaling der
bacteriologische qualiteit der melk. Het diëtetisch gedeelte van dit
probleem blijve voor een volgend onderzoek voorbehouden.

HOOFDSTUK II

EISCHEN TE STELLEN AAN EEN METHODE
TER BEPALING DER BACTERIOLOGISCHE
ZUIVERHEID DER MELK

Een goede methode ter bepahng van de bacteriologische zuiver-
heid der melk moet o.m. voldoen aan de volgende eischen:

1.nbsp;Zij moet zijn streng en billijk, d.w.z.: Zij moet gebaseerd zijn
op datgene, dat in de practijk zonder aanzienlijke verhooging
der productiekosten bij voortduring te bereiken is.

2.nbsp;Zij moet gemakkelijk in het groot zijn toe te passen.

3.nbsp;Zij moet geen verwarring kunnen stichten.

Ad 1, De aan te leggen maatstaf zal moeten zijn gebaseerd op
datgene, dat practisch zonder te hooge opdrijving der productie-
kosten bij voortduring kan worden bereikt.

Verliest men dezen eisch uit het oog, dan ontstaat het gevaar,
dat óf wel de winning onoeconomisch wordt voor den ondernemer,
óf wel de prijs voor den consument te hoog.

Immers, als de melk een belangrijk volksvoedsel zal blijven, dan
moet ze allereerst zoo goedkoop mogelijk zijn. Om deze reden kan
men voor het vaststellen van hygiënische normen dus niet uitgaan
van de uitzonderingsbedrijven voor rauwe modelmelkwinning, maar
zal men het oog moeten wenden naar het normale goed gedreven
consumptiemelkbedrijf, een bedrijf dus, dat de beschikking heeft
over wat men in het algemeen verstaat onder een goede outilleering,
en over gezond vee. De eischen die men aan een dergelijk, normaal
goed gedreven consumptiemelkbedrijf redelijkerwijs mag stellen
zijn de volgende:

a- een behoorlijk geventileerde, hchte (of kunstmatig te verlichten

stal) — het type doet er niet toe —, die zindelijk onderhouden is.

b.nbsp;behoorlijk verpleegd vee (d.w.z. met opgebonden staarten en
schoone en opgeknipte achterhand en uier), dat regelmatig ge-
borsteld wordt, en normaal gevoerd.

c.nbsp;melkgerei van goede kwaliteit (liefst naadloos en vertind vaat-
werk, emmers en teemsen), dat behoorlijk gereinigd en onder-
houden is.

d.nbsp;zindelijke winning en behandeling der melk, ongeveer zooals het
op de melkerscursussen geleerd wordt.

e.nbsp;zindelijke gelegenheid voor bewaring, en doelmatige afkoeling
der melk; doelmatig, tijdig en vlug transport naar de distributie-
bedrijven.

f.nbsp;betrouwbaar bedrijfswater.

g.nbsp;geregelde veterinaire controle van den veestapel.

h.nbsp;voor die bedrijven, die niet zelf gewonnen melk in den handel
brengen, een garantie, dat hun leveranciers voldoen aan de
eischen a. tot en met g., en bovendien een nader te omschrijven
goede outilleering en/of wijze van distributie.

Men zal over een langere periode — en — om toeval uit te
sluiten — bij een flink aantal bedrijven hebben na te gaan hoe de
melk van op deze wijze beheerde bedrijven in bacteriologisch opzicht
is te kenschetsen.

Indien blijkt, dat voor op deze wijze gewonnen of behandelde
melk normen zijn vast te stellen, dan is het de plicht der overheid
om te zorgen, dat alle verhandelde consumptiemelk aan deze voor-
waarden voldoet, en zal zij den verkoop van alle andere melk
categorisch moeten verbieden.

Hoewel een zeer geregelde controle op den stal of het melk-
bedrijf, uitgaande van fabriek of melkcontrôlebureau ongetwijfeld
nuttig en noodzakelijk is, zal een volledige preventieve keuring der
melk tot de onmogelijkheden blijven behooren, ten eerste omdat het
niet mogelijk zal zijn deze stalcontrôle enz. voldoende vaak te doen
plaats hebben, wegens gebrek aan geld en personeel, en ten tweede
omdat, zelfs al controleert men nóg zoo vaak, de infectiekansen
voor de melk zóó veelvuldig zijn, dat inspectie en controle deze niet
—• doch technisch juiste werkwijze bij het melken en de behandeling
deze wel kunnen uitsluiten.

De stal- en bedrijfscontrôle zal steeds opvoedend instrument tot
het aanleeren van deze werkwijze moeten zijn, en als controlemiddel

slechts uitzondering blijven.

Regel zal moeten zijn een repressieve, vaak herhaalde proef-
ondervindelijke controle op de verhandelde melk, waarbij boven-
bedoelde normen als maatstaf moeten worden genomen.

Deze controle zal zóó moeten zijn, dat zij door middel van één
of van enkele eenvoudige, door niet wetenschappelijk geschoold
laboratoriumpersoneel uit te voeren proef of proeven, zooveel moge-
lijk de hygiënische en bacteriologische waarde der melk in het
licht stelt.

Hiermede komen wij tot het gestelde:

Ad 2. Dat de qualiteitsbepaling gemakkelijk in het groot moet
zijn toe te passen, wil zij voor de practijk beteekenis hebben.

Dit behoeft na het voorgaande geen nader betoog.

Bezien wij tenslotte het gestelde:

Ad 3. De qualiteitsbepaling moet geen verwarring kunnen
stichten.

De tot op heden door vele laboratoria gevolgde methoden ter
bepaling van de hygiënische qualiteiten der melk hebben in dit op-
zicht verschillende zeer groote nadeelen.

Ten eerste zijn zij ingesteld op de minimumeischen, die het Melk-
besluit in art. 2 tot op heden aan de hygiënische qualiteit der
melk stek (zie boven), en die geen afdoenden waarborg voor
betrouwbaarheid in bacteriologischen zin bieden;
ten tweede kloppen de uitkomsten vaak in het geheel niet, of zeer
onvoldoende, met datgene, dat men bij inspectie ten huize van
den boer, den slijter of in de melkinrichting constateert;
ten derde spreken zij elkaar nogal eens tegen, en
ten vierde is het gevaar niet uitgesloten, dat door het mededeelen
der resultaten (event. het betalen der melk naar de uitkomsten)
van dit „qualiteitsonderzoekquot; aan boer, slijter enz., deze ten
aanzien van de wezenlijke verbetering hunner melkwinning enz.
op een dwaalspoor worden gebracht.

Met name geldt dit van de z.g.n. vuilproef, de busseninspectie,
de alcohol- en de gisting-reductaseproef. Melk, die ten aanzien van

deze factoren „voldoendequot; haalt, blijkt dikwijls onder zeer on-
hygiënische omstandigheden te zijn gewonnen, en bacteriologisch
gesproken zeer slecht te zijn.

Alleen de kiemgetalbepaling, en tot op zekere hoogte het sedi-
mentonderzoek maken hierop een uitzondering.

Alle andere methoden zijn alleen geschikt om ten ruwste de bac-
teriologische qualiteit te bepalen, en dienen afgeschaft, zoo spoedig
een nauwkeuriger, in het groot practisch bruikbare methode er voor
m de plaats gesteld kan worden.

^ De hygiënisch-bacteriologische waarde der melk wordt bepaald
door de navolgende factoren:

1.nbsp;De afwezigheid van pathogene micro-organismen.

2.nbsp;Het aantal saprophitische kiemen.

3.nbsp;De soort dezer kiemen.

Het routine-laboratoriumonderzoek zal zich dus, voor zoover
mogelijk, in den meest eenvoudigen vorm op deze drie zaken hebben
in te stellen, terwijl vooraf de methoden van onderzoek nauwkeurig
zullen moeten worden getoetst.

De afwezigheid of aanwezigheid van de meeste (mensch)patho-
gene micro-organismen in melk is niet gemaklijk te constateeren, en
kan, althans bij den huidigen stand der wetenschap, nooit onder-
werp voor een routineonderzoek worden. De waarborgen, die ten
aanzien van dit punt aan den consument gegeven kunnen'worden,
zullen voorshands geen andere kunnen zijn, dan hoogstens een
geregelde veterinaire controle van den veestapel op voor den
mensch schadelijke ziekten, verder eventueel een medische controle
van het personeel, en ten slotte een zoodanige bewerking en distri-
butie der melk dat, mochten bedoelde kiemen inderdaad ondanks
de beide eerdere genoemde voorzorgsmaatregelen toch nog eens
aanwezig zijn, zij zoo goed mogelijk onschadelijk gemaakt worden
Voor wat betreft het totaal aantal (saprophitische) kiemen zijn
er alreeds zeer goede, wetenschappelijk juist bevonden routine-
methoden ter bepaling van de qualiteit der melk gegeven (aller-
eerst de „grootequot; plaatmethode van Koch, en de „kleinequot; idem van
Frost~Van Oyen—Clarenburg, verder de methoden van Breed—

Skarr—Burri~Bogdanoff~enz. ).

De frequentie der zeer veel verschillende, in melk voorkomende
soorten (saprophitische) micro-organismen wordt echter door
bovengenoemde methoden niet aangegeven.

Toch is het van zeer veel belang deze te bepalen, omdat de
beteekenis dezer verschillende soorten èn voor de qualiteit der
melk. èn voor den consument geheel verschillend kan zijn; ten
eerste omdat zij, bij voorkomen in de melk, in deze veranderingen
van geheel verschillende orde kunnen veroorzaken, waardoor de
melk sóms veranderd in een nog goed te genieten of te verwerken
product (door den invloed van de diverse z.g.n. echte melkzuur-
vormers), sóms onbruikbaar wordt (b.v. door ontwikkeling van
sporevormers, gepaard gaande met bijv. boterzuurgisting of rot-
ting), ten tweede, omdat diverse dezer z.g.n. saprophyten onder
bepaalde omstandigheden óf zelf, óf door hun omzettingsproducten
in de melk, pathogene werking kunnen vertoonen (ik noem bijv.
B. coli—^Proteus—subtilus—mesentericus). en ten derde, omdat hun
aanwezigheid kän wijzen op bepaalde fouten bij de winning of de
behandeling der melk begaan, waardoor deze in hygiënisch opzicht
minder betrouwbaar kan zijn geworden. Zélfs in zeer kiemarme
melk kan het dus wenschelijk zijn om te trachten een inzicht te
krijgen in de soort der infecteerende kiemen, en na te gaan, of
bepaalde, minder gewenschte groepen van micro-organismen aan-
wezig zijn.

Zooals ik in het hoofdstuk „De beteekenis van B. coli in melkquot;
nader hoop aan te toonen, is een aanvulling der bacteriologische
qualiteitsbepahng der melk met een quantitatieve bepaling van dit
micro-organisme speciaal van beteekenis, omdat het hier geldt een
bacteriesoort, die niet alleen ongewenschte eigenschappen bezit,
maar waarvan tevens gebleken is, dat zij in melk voorkomt in des
te grootere hoeveelheid, naarmate de zorg waarmede de melk is
gewonnen en/of behandeld geringer is geweest.

Naast elkander toegepast zijn dus de beide methoden in staat om
een breeder en dieper inzicht te verschaffen in de waarde die wij
aan een bepaalde melk in hygiënisch en bacteriologisch opzicht
moeten toekennen.

Hoewel het natuurlijk in de eerste plaats van belang is, dat de
melk, bacteriologisch gesproken, betrouwbaar zij, dus bijv. weinig

coli-bacteriën bevat. en het voor de overheid, als hoedster der volks-
gezondheid van minder beteekenis is. hoe men dit bereiken wil,

zoo is het toch zéér toe te juichen, wanneer op grond van een coli_

resp. kiemgetalbepaling aan den behoorlijk vakkundigen boer of
slijter enz. een juist en begrijpelijk denkbeeld gegeven kan worden
van de wijze, waarop de winning der melk en de verzorging van
dit product door hem moeten plaats vinden.

In de literatuur vindt men weinig opgaven omtrent de gegevens
der bacteriologische analyse getoetst aan de bedrijfsinspectie, in elk
geval weinig of geen normen, die voor behoorlijk gewonnen melk
van gezond vee op normaal goede bedrijven zijn te stellen, en even-
min normen voor door slijters of melkinrichtingen verkochte rauwe
of zoogenaamde losse gepasteuriseerde melk.

Bij het invoeren van een maatstaf voor de bacterieele reinheid
der melk dringen zich een aantal aan de practijk ontleende vragen
op, die wij hier voor de „coli-normenquot; als volgt kunnen samen-
vatten:

1.nbsp;Wat moeten wij verstaan onder het begrip „coli-bacilquot; bij de
beoordeeling der consumptiemelk?

2.nbsp;Komt een dergelijk organisme in alle melk voor, en zoo ja in
welke dichtheid?

3.nbsp;Door welke oorzaken kan dit organisme in de melk komen, en in
welke hoeveelheden tengevolge van elk dezer oorzaken?
Welken invloed hebben diverse factoren bij de winning enz.?
Welke zijn de nadeelen van Bact. coli voor de melk?

4.nbsp;Heeft het zin eventueele variëteiten uiteen te houden

a.nbsp;Uit een oogpunt van volksgezondheid, of

b.nbsp;Om speciale fouten bij de winning enz. begaan in het oog te
doen vallen?

Zijn deze variëteiten gemakkelijk te herkennen?

5.nbsp;Op welke wijze is B. coli in de melk aan te toonen? Is hiervoor
een routinemethode aan te geven?

6.nbsp;Welke uitkomsten geeft een routinemethode in de practijk; is er
overeenstemming met bij bedrijfsinspectie geconstateerde deug-
den of gebreken in de bedrijfsvoering?

HOOFDSTUK III
LITERATUUR

Aan de hand der gegevens in de Uteratuur dient nu, voorzoover
mogehjk, nader bepaald welk standpunt ingenomen moet worden
t.a.v. de aan het eind van het vorige hoofdstuk genoemde vragen,
die zich voordoen bij het vaststellen van „coli-normenquot;.

Wij komen dus allereerst tot de beantwoording der vraag:

A. Wat moeten wij verstaan onder het begrip „coli-bacir'

bij de beoordeeling der consumptiemelk?

Escherich (cit. n. Mc. Conkey) beschreef in 1885 als eerste een
micro-organisme, geïsoleerd uit de faeces van choleralijders, later
ook uit de faecalien en het colon van volwassen gezonde personen.

Om deze reden noemde hij dit organisme: „bacterium coli com-
munequot;; hij geeft als cultuureigenschappen op:

Op gelatine vormen zich 2 soorten kolonies, een kleine gele, in
de diepte gelegene van d= 1 mm groot, en een groote, blauwwitte
oppervlakkige in den vorm van een tropaeolumblad. De kolonies
bestaan uit korte staafjes, die aanvankelijk géén, maar bij verder
kweeken in bouillon wél eigenbeweging vertoonen, en meestal niet
meer dan 2 a 3 zweepdraden bezitten. Zij vergisten glucose en
lactose onder zuur- en gasvorming, en stremmen melk onder zuur-
vorming binnen hoogstens 5 dagen, terwijl zij in peptonwater
indol vormen.

Eenigen tijd daarna isoleerde E. uit de faeces van borstkinderen
een organisme, dat in eigenschappen heel veel met bact. coli com-
mune overeen kwam, maar toch ook verschilpunten te zien gaf —
hoofdzakelijk den anderen vorm der kolonies op gelatine (deze
zouden dikker zijn en rond) — de onbeweeglijkheid en het gemis

aan indolvormend vermogen. Hij noemde dit organisme „bac. lactis
aërogenesquot;,

Hueppe (cit. n. Mc. Conkey) isoleerde uit melk, die hij bij
37° C. bewaarde een organisme, dat hij noemde „bact. acidi lac-
ticiquot;, (tegenwoordig door Bergey genoemd Escherichia acidi lac-
tici) en dat de volgende eigenschappen zou bezitten:

„Op gelatine dikke ronde niet vervloeiende kolonies vormend,
Gram-negatief onbeweeglijk staafje, indolvormend, glucose en lac-
tose vergistend onder zuur- en gasvorming, dik en slijmig groeiend
op agar-agar.quot;

In het tijdvak gelegen tusschen 1885 en 1905 komen dan van
vele auteurs beschrijvingen van deze of dergelijke organismen
{Theob. Smith, Rothberger, Durham, Jordan. Brown, Johnson.
Savage, Hewlet, Kruse, Prescot, Lehmann, Neumann, Murr, Ritchie
e.a. — gedeeltehjk geciteerd n. Mc. Conkey), waarvan de eigen-
schappen in vele opzichten overeenkomen, maar op ander gebied
weer uiteen loopen; organismen, die zij vooral isoleerden uit faeca-
lien, stof, detritus, melk, water, pathologische processen bij mensch
en dier, en waaraan zij een naam gaven, die vaak met een secun-
daire eigenschap bleek samen te hangen.

Zoo ontstonden bijv. nog de namen: bac. cloacae, bac. pneumo-
niae Friedländer, enz.. Wat de een bact. coli commune noemde,
werd door den ander weer anders betiteld, terwijl omgekeerd vaak
de beschrijving van een met eenzelfden naam aangeduid organisme,
door meerdere auteurs, uiteen loopt.

Reeds in 1897 was de toestand op dit gebied zóó onoverzich-
telijk geworden, dat Orlowski (cit. n. Mc. Conkey) zegt: „Bact.
coli is zeer variabel, in de natuur zijn er veel variëteiten en kan de
eene soort in de andere overgaan onder gunstige omstandighedenquot;.

In 1905 geeft Mc. Conkey een resumeerend overzicht van de
eigenschappen, die tot dien door 23 auteurs, waaronder de zoo
juist genoemde, worden toegeschreven aan B. coli, B. acidi lactici,
B. lactis aërogenes, B. cloacae e.d.

Hij komt tot de slotsom, dat de genoemde micro-organismen op
grond van de onderzoekingen dezer auteurs moeten worden onder-
scheiden in de navolgende groepen:

In bovenstaande tabel is de beteekenis van het ±, resp. het
teeken volgens Mc. Conkey voor de verschillende rubrieken de
volgende:

Lactose ± = altijd zuur- en dikwijls gasvorming
saccharose ± = dikwijls zuur- en gasvorming; soms geen veran-
deringen

indolvorming ±: = dikwijls positief

Ijl = als regel niet aanwezig
beweeglijkheid ± = dikwijls beweeglijk.

Hieruit blijkt alreeds de moeilijkheid, die de oudere auteurs
ondervonden hebben, om te komen tot een bevredigende, scherp
gedefinieerde klasseindeeling dezer micro-organismen, en de betrek-
lijke willekeur van een nadere indeeling naar de bovengeschetste
maatstaven.

Verder zijn vrijwel allen het er over eens, dat B. coli doorgaans
is een korte bacil met ronde einden, die zich niet volgens Gram
laat kleuren, facultatief anaëroob is, en geen sporen vormt. De
groei op agar is grauwwit, op gelatine als regel in den vorm van
het blad van den wijnstok. De beweeglijkheid varieert bij de ver-
schillende stammen.

Over de verhouding van CO2 tot Hg in het gevormde gas. en de
hoeveelheid gevormd zuur uit glucose {Theob. Smith), de ver-
gisting van andere dan de genoemde koolhydraten, de gelatine-

vervloeiing e.d. loopeij de meeningen uiteen, en Mc. Conkey wijt
dit aan het feit. dat men in wezen verschillende soorten alle als
B. coli wil erkennen. Hij komt hier tegen op, omdat hem met een
origineelen van Eschench afkomstigen stam èn van B. coli èn van
B. lactis aërogenes gebleken is, dat na jaren de eigenschappen van
deze, onder ongunstige omstandigheden bewaarde cultures, behou-
dens een kleine variatie in morphologie en groei, nog precies waren
zooals Escherich ze oorspronkelijk had beschreven.

B. lactis aërogenes zou behalve de in de tabel genoemde eigen-
schappen nog de volgende bezitten: In het in glucose-bouillon ge-
vormde gas zou de verhouding CO2 : Hg zijn 1 : 1. of 1 : 1 (vol-
gens Theob. Smith), terwijl Durham (cit. n. Mc. Conkey) beweert,
dat alle tot deze groep behoorende micro-organismen in cultuur in
glucosebouillon de reactie van Voges-Proskauer op acetyl-methyl-
carbinol geven; over indolvorming heerscht geen eenstemmigheid.

Strong (cit. n. Mc. Conkey) verdeelt in 1899 de groep aërogenes
nader in diverse pathogene soorten, die de melk niet coaguleeren.
(B. pneumoniae, ozaena. sputigenes crassus. rhinoscleromatis), en
B. aërogenes en capsulatus, die dat wel doen.

In het bloed van proefdieren ingespoten vormen allen kapsels.
Mc. Conkey meent op grond van de literatuur voor B. aërogenes
te mogen aannemen, dat deze de in de tabel genoemde eigenschap-
pen heeft en bovendien Gram-negatief is, gelatine niet vervloeit,
facultatief anaëroob is, en bij de reactie volgens Voges-Proskaue'r
een positieven uitslag geeft.

Ook de groepen B. acidi lactici, B. pneumoniae en B. cloacae
zijn volgens het literatuur-resumé van Mc. C. alle Gram-negatieve,
facultatief anaërobe staafjes, die geen sporen vormen en. met uit-
zondering van B. cloacae, gelatine niet vervloeien.

Mc. Conkey ging nu na de eigenschappen van allerlei soorten
kiemen, geïsoleerd uit faeces e.d., en die. om in het onderzoek te
worden opgenomen, de navolgende eigenschappen moesten bezit-
ten. Zij moesten zijn asporogene, facultatief anaërobe. Gram-
negatieve staafjes, vertoonend een grijs-witten groei op agar en
gelatine, gelatine in steekcultuur niet of slechts langzaam ver-
vloeiend, melk coaguleerend onder zuurvorming, vergistend onder
zuur- en gasvorming glucose, lactose en manniet, in het algemeen
indol vormend en beweeglijk.

In een suikerhoudend milieu, waaraan hij tot wering van den
groei van buiten deze groep staande micro-organismen Yi % na-
triumtaurocholaat had toegevoegd, bebroedde Mc. Conkey de faeces
c-.d., waarin hij de aanwezigheid van kiemen dezer groep vermoed-
de, om deze zoo de gelegenheid te geven zich te vermeerderen.

Constateerde hij zuur- en gasvorming, dan isoleerde hij via een
selectieve plaat kolonies, waarvan hij nader het gedrag ten opzichte
van verschillende suikers, polysacchariden en hexieten, de vorming
van acetyl-methyl-carbinol uit glucose, en de verhouding van CO2
tot Hg in het in glucose-bouillon gevormde gas (zulks in navolging
van Th. Smith in 1896) naging.

Uit deze proeven trekt Mc. Conkey de conclusie, mede aan de
hand van het onderzoek der origineele stammen, dat er in hoofd-
zaak 4 groepen te onderscheiden zijn, die, terwijl ze overigens veel
eigenschappen gemeen hebben, zich kenmerken door een verschil-
lend gedrag ten opzichte van saccharose, van dulciet, van de ,,gas-
ratioquot; en van de Voges-Proskauer- en de methylroodreactie. De
volgende tabel geeft van de gevonden combinaties dezer eigen-
schappen een schematisch overzicht.

Groepnbsp;Saccharose Dulciet Gelatine Voges- Methylrood

vervl. Proskauer

B. vesiculosusnbsp;—nbsp;—nbsp;—nbsp;—nbsp;

2.nbsp;B. coh communisnbsp;—nbsp; nbsp;—nbsp;—nbsp;

3.nbsp;B. neapolitanusnbsp; nbsp; nbsp;—nbsp;—nbsp;

B. lactis aërog.nbsp; nbsp;—nbsp;( )nbsp; nbsp;—

Groep 4 zou dan nog weer in 4 ondergroepen verdeeld moeten
worden naar aanleiding van het gedrag in gelatine, en t.a.v. de
Voges-Proskauerreactie.

Orla-Jensen beschrijft een groep der zoogenaamde onechte melk-
zuurbacillen (die uit lactose nog andere producten vormen dan
melkzuur). Zij zijn Gram-negatieve, al of niet beweeglijke korte
staafjes, zelden tot kettingen of draden groeiend, vooral aëroob,
gasvormend, gelatine niet vervloeiend; zij hebben voor hun groei
geen organische stikstof noodig.

Jensen onderscheidt daaronder twee hoofdgroepen:
a- Bacillus aërogenes — onbeweeglijk, vormt uit suiker meer CO2
dan H2, tast caseine niet aan. Zij wordt onderverdeeld in 2

ondergroepen, één, die melk niet coaguleert, maar langzaam
verslijmt, en één die dat wel doet, de B, lactis aërogenes in
engeren zin.

b. Bacillus coli — beweeglijk (onderscheid van alle andere melk-
zuurvormers), die caseine aantast (rotting en indolvorming), en
waarbij vele pathogene soorten, die „Weniger Interesse für die
Molkerei als für die Ärtzte habenquot;.

Gorter en De Graa[[ geven als cultureele eigenschappen voor
Bac. coli op: op Endo-fuchsine-natriumsulfiet-agar worden roode
kolonies gevormd met metaalglans, melk wordt gecoaguleerd na
1—7 dagen, indol gevormd binnen 7 dagen, lakmoeswei wordt
rood en troebel, in neutraalrood-lactose-agar ontstaat gasvorming
met fluorescentie na 24 uur. Lactose, glucose, maltose, saccharose
en manniet worden vergist onder zuur- en gasvorming. De beweeg-
lijkheid is zwak. Het is een Gram-negatief, asporogeen staafje, dat
gelatine in steekcultuur niet vervloeid.

De Graa[[ stelt in 1932, in een verhandeling over coli-onderzoek
in drinkwater de vraag: „Wat is B. cohquot;, en geeft dan direct als
zijn opinie te kennen, dat de coli-groep blijkbaar veel variëteiten
heeft, waarvan onze kennis vaak nog te onvoldoende is, om de
werkelijke beteekenis en het wezen der afwijkende vormen te
begrijpen. Wij ontleenen aan dezen arbeid voorts, dat men voor
het wateronderzoek zich vooral moet bezig houden met de darm-
coli (van den mensch), die voor het eerst door Escherich, en vrij
nauwkeurig, is beschreven.

Wij moeten de specifieke eigenschappen dezer bacterie als cri-
terium nemen bij het wateronderzoek, en bepaalde nauw omschre-
ven methodes gebruiken.

De Graaff wijst op de zéér groote moeilijkheid eener classificatie
dezer variabele soorten en vindt in elke nadere indeeling in dit
opzicht iets gekunstelds en incompleets.

Een serologisch verschil is tusschen deze naverwante soorten
niet te bespeuren, en de gevonden variabiliteit behoeft nog geen
aanleiding te vormen om te spreken van soortverscheidenheid. Hij
maakt een onderscheid met betrekking tot het gedrag t.o.v. gela-
tine, die door de coli-achtigen niet, door de proteusachtigen wèl
wordt vervloeid. De laatsten vergisten tevens de hexieten (o.a.
sorbiet en manniet) en laevulose en lactose niet.

De Graaff wijst evenwel tevens op de mogelijkheid van tus-
schenvormen, slaat echter voor om deze groote lijn te blijven vast-
houden, ten einde elkaar beter te verstaan. Hij onderscheidt dan
verder in de coligroep twee hoofdsoorten, hoofdzakelijk naar hun
herkomst, n.L:

1.nbsp;De groep Aërogenes, in kinderfaeces, maar vooral in de vrije
natuur, dus géén specifieke faecaalverklikker, een niet ver-
vloeiend Gram-negatief facultatief anaëroob staafje, dat sorbiet,
manniet en laevulose niet vergist, géén indol vormt uit pepton,
en de reactie van Voges-Proskauer op acetyl-methyl-carbinol
geeft, en

2.nbsp;De groep Coh, vooral in faecaliën, die de genoemde koolhydra-
ten wèl vergist, niet de reactie van Voges-Proskauer geeft, en
na 3—7 dagen uit pepton indol vormt. Tevens is deze groep
thermotolerant, doordat zij bij 46° C. glucose onder zuur- en
gasvorming kan vergisten {Eykman).

Ten aanzien van de conclusie „faecale coliquot; (afkomstig uit men-
schelijke faecaliën — M.) wenscht De Graaff geen andere criteria
aan te leggen dan, en volkomen genoegen te nemen mèt de vol-
gende, waardoor onnoodige moeilijkheden voorkomen worden:

a.nbsp;Gram-negatief, asporogeen, facultatief anaëroob staafje, poly-
morph, zwak beweeglijk, gelatine niet vervloeiend.

b.nbsp;Glucose vergistend onder zuur- en gasvorming bij 45 è 46° C.

c.nbsp;Indolvormend uit pepton.

d.nbsp;Voges-Proskauer negatief, en methylrood positief bij kweeken
in glucose-pepton-water.

e- vergistend onder zuur- en gasvorming bij 37° C. glucose, lactose,
sorbiet, manniet, laevulose, mannose en galactose.
De Graaff heeft geen nut gezien van het gebruik van de citraat-
en urinezuurbodems van Koser,

Gärtner uit zich aldus: Het begrip coli is zeer vaag; men heeft
wel onderscheiden:

1- Typische coli — die zeer veel in menschelijke en dierlijke faeces
20U voorkomen. G. omschrijft de eigenschappen van dit micro-
organisme zooals De Graaff e.a.
2. Atypische coli, met afwijkende eigenschappen.

Volgens Gärtner zijn er vele auteurs, o.a. Konrich, die, zelfs als
eigenschappen als indolvorming en neutraalroodomzetting ontbre-

ken, de coli nog als typisch willen beschouwen. G. is hiervoor
echter zeer huiverachtig. Volgens G. geeft de proef van Eykman
veel miswijzingen door de hooge broedtemperatuur.

Bergey (uitgave 1934) onderscheidt in de familie (,,tribequot;) der
Bacteriae verschillende ondergroepen (..genusquot;), o.a.:

A.nbsp;De groep Escherichia {Castellani en Chalmers 1919), waartoe
o.a. behooren de B. coh commune (Escherich) en de B. acidi
lactici (Hueppe) der oude literatuur, en

B.nbsp;De groep Aërobacter (Beyerinck 1900). waartoe o.a. behooren
de oude B. lactis aërogenes (Escherich), en B. cloacae (Jordan).

Bijna alle tot deze beide groepen behoorende micro-organismen
komen volgens Bergey voor in den tractus intestinahs van gezonde
menschen en (of) dieren, vooral de groep A. De groep B. komt
bovendien veel voor in de vrije natuur, in vuil. in melk of melk-
producten. Beide groepen zijn volgens B. asporogene, facultatief
anaërobe, Gram-negatieve, gelatine als regel niet vervloeiende
staafjes, die glucose en lactose vergisten onder vorming van zuur,
of van zuur en gas, terwijl veelal ook andere suikers, Polysacchari-
den of hoogere alcoholen worden omgezet op dezelfde wijze.

Groep A. — Escherichia — vormt (uit glucose) geen acetyl-
methyl-carbinol. en vervloeit gelatine niet.

Groep B. — Aërobacter — vormt onder deze omstandigheden
wèl acetyl-methyl-carbinol. Sommige vertegenwoordigers uit deze
groep vervloeien gelatine.

Bergey deelt verder de groep Escherichia in naar het al of niet
vergisten onder zuur- en gasvorming van saccharose, en verder
naar gelatinevervloeing (hier komt hij dus alreeds direct in conflict
met de basis, waarop hij zelf de scheiding tusschen groep A. en
groep B. voorstelt), naar beweeglijkheid en naar het gedrag in
dulciet-, salicyne-, melk-, en nitraathoudend milieu. Nergens wordt
door B. bij de nadere indeeling der groep Escherichia gewag ge-
maakt van het gedrag in neutraal-roodmilieu of het kweeken bij
hoogere temperatuur (Eykmanproef).

Hij geeft voor alle 22 soorten die hij in de groep Escherichia
onderscheidt als optimumtemperatuur op 30 a 37° C., behalve voor
één, waarvoor deze 20° C. bedraagt. Aan zijn zeer uitgebreid over-
zicht ontleenen wij voorts, dat alle 22 tot deze groep behoorende
organismen lactose vergisten onder zuur- en gasvorming en 20

eveneens glucose; verder, dat saccharose door ongeveer de helft
der soorten wordt vergist onder zuur- en gasvorming, en maltose,
galactose en manniet, voorzoover ze genoemd worden, door alle.
Vijf soorten vervloeien gelatine (!), melk wordt door 16 dezer
soorten gecoaguleerd onder zuurvorming, indol wordt niet of zeer
zwak gevormd door 7. Het gedrag in andere dan de genoemde
suikers loopt sterk uiteen.

De groep B, — Aërobacter — wordt door Bergey nader inge-
deeld naar het af of niet beweeglijk zijn, de gelatinevervloeing en
de vergisting onder zuur- en gasvorming van saccharose en dulciet.
Hij onderscheidt 7 soorten, die alle een optimumtemperatuur hebben
van 30 a 37° C., behalve 2 speciale „vuilquot; soorten, die wel groeien
tgt;ij deze temperatuur, maar geen gas meer vormen.

Ook hier zijn de vergisting onder zuur- en gasvorming uit glu-
lt;^ose, lactose, maltose, galactose en manniet constant aanwezig,
terwijl door de meeste soorten op deze wijze ook saccharose en
dulciet worden omgezet. Melk wordt door alle gecoaguleerd onder
zuurvorming, gelatine door 3 der 7 vervloeid, indol door 5 der 7
niet gevormd. Meerdere soorten vertoonen in het gevormde gas
een overmaat van CO2 ten opzichte van Hg.

Het gedrag in andere dan de genoemde suikers loopt uiteen.

Bij nauwkeurige beschouwing blijkt, dat ook Bergey's indeeling
hier en daar wat gewrongens heeft, en dat de reeds eerdere ge-
noemde uitspraak van De Graaff over het gekunstelde van een te
'^er gaande indeeling hier op haar plaats is.

Resumeerende kunnen wij dus als antwoord op de vraag: „Wat
moeten wij verstaan onder het begrip coli-bacilquot;? aan de hand der
besproken literatuur de conclusie trekken, dat dit begrip niet scherp

omschreven, maar als aanduiding gebruikt wordt voor een ge-
heele groep van micro-organismen, waarvan in het algemeen als
^^ststaand wordt aangenomen, dat zij de navolgende eigenschap^
pen hebben:

Morphologisch: Polymorphe, kleine, asporogene, Gram-nega-
tieve staafjes.

Cultureel: al of niet beweeglijk, goed groeiend in een miheu
quot;w^aaraan stoffen zijn toegevoegd die een remmenden invloed uit-
oefenen op het groeivermogen van kiemen buiten deze groep (o.a.

Na-taurocholaat v. Mc. Conkey, IOJ^q carbol v. Vincent e.d.); ver-
gistend onder zuur- en gasvorming bij 37° C. glucose, lactose,
maltose, galactose en manniet; coaguleerend melk onder zuurvor-
ming. Vele andere dan de genoemde suikers, Polysacchariden en
hoogere alcoholen worden afwisselend ontleed.

Hieruit blijkt alreeds dat deze groep in morphologisch opzicht
geen bizondere kenmerken vertoont, zooals bijv. de t.b.c. bacil, de
miltvuurbacil, e.d.. Voor het aantoonen van vertegenwoordigers uit
deze groep zal men dus gebruik moeten maken van hare cultureele
eigenschappen.

Er is een streven om de groep in twee ondergroepen te verdee-
len, n.1.:

A.nbsp;De Coligroep in engeren zin, die doorgaans van faecalen oor-
sprong zou zijn, en gelatine niet zou vervloeien in steekcultuur.
Zij zou (doorgaans) wel indol uit pepton vormen, daarentegen
geen acetyl-methyl-carbinol uit glucose; verder in neutraalrood-
milieu een groene fluorescentie geven en als regel saccharose
niet, echter wèl glucose bij 45° C. en dulciet bij 37° C. ver-
gisten onder zuur- en gasvorming.

B.nbsp;De Aërogenesgroep, die wel acetyl-methyl-carbinol, en als regel
geen indol zou vormen, saccharose wel en dulciet niet zou ver-
gisten, dikwijls van niet-faecalen oorsprong zou zijn, en soms
gelatine vervloeien. In het algemeen zouden de kolonies op ge-
wonen èn op Endo-agar wat grooter en slijmiger zijn dan van A.

Op deze indeeling der coli-achtigen hoop ik nog nader terug
te komen.

B. De coli-achtigen in melk

Wij komen nu tot de bespreking der vragen:

„Komen coli-achtigen in alle melk voor, en zoo ja, in welke
dichtheid?quot;

„Door welke oorzaken kunnen deze organismen in de melk
komen, en in welke hoeveelheden tengevolge van elk dezer oor-
zaken?quot;

„Welken invloed hebben diverse factoren bij de winning enz.?quot;

„Welken invloed hebben de coli-achtigen op de qualiteit der
melk?quot;

1. Komen coli-achtigen in alle melk voor?

Zooals gedeeltelijk alreeds uit het voorgaande gebleken is, en
verder nog in het volgende hoofdstuk zal worden besproken, komen
coh-achtigen speciaal voor in faeces, in allerlei soort vuil, in détri-
tus, in melkresten, in water, op granen, kaf en stroo, op het melk-
gereedschap enz., zoodat er gelegenheid té over is, dat bij onvol-
doende voorzorgen, hetzij bij de winning, hetzij bij de verdere be-
handeling, de melk met deze kiemen besmet wordt, en dit wel des
te erger, naar mate de verontreiniging door deze factoren grooter
is geweest.

Op het congres der Amerikaansche melkbacteriologen in 1931
is als resolutie aangenomen dat het zéér moeilijk, zoo niet onmo-
gelijk is, om melk te winnen die vrij van coli-achtigen is.

Van zeer veel beteekenis is hier de vraag, of er alreeds in be-
langrijke mate coli-achtigen voorkomen in de melk op het moment
dat zij den uier verlaat.

Het is uiterst moeilijk om werkelijk steriel te melken.

Verschillende onderzoekers zijn daarin echter vrijwel geslaagd,
en zij komen daarbij tot de conclusie, dat in melk uit gezonde uiers
nooit gasvormende suikervergisters voorkomen, maar vrijwel uit-
sluitend allerlei Gram-positieve micro- en Streptococcen, doorgaans
in zeer gering aantal {Breed, Roberts, Lister, Schulz en Moore,
Harding en Wilson, Steck, Gorini, Evans, v. Freudenreich, Harquot;
tison en Savage, Vassileff en Velthorst (ged. cit. n. Bosma) ).

Coli in melk wordt dan ook algemeen beschouwd als een van
buiten af komende infectie, die misschien wel eens in de tepel-
opening aanwezig kan zijn, maar met de eerste stralen wordt weg-
gespoeld.

Van Nederlandsche zijde is er één mededeeling in het Tijdschrift
voor Microbiologie en Serologie, waaruit een andere meening
spreekt. Bij een gezonde koe uit een modelstal zou B. coli aange-
toond zijn in de steriel gewonnen eerste stralen in 0.000001 cc, in
de middelste in 0.0001 cc, en in de laatste in 0.001 cc.

Deze sterk geïnfecteerde melk vertoonde chemisch, biochemisch,
en microscopisch verder geen afwijkingen. Alleen zou bij vete-
rinaire controle gebleken zijn, dat de sluitspier van den tepel iets
verslapt was (er is niet vermeld of men hier met een zoogenaam-
den lekspeen te doen heeft gehad).

Ik heb persoonlijk eenige tientallen malen melk onderzocht op
een zeer goed bedrijf, waar het cohcijfer der melk hooger was, dan
verwacht mocht worden, en zich dus als vanzelf de gedachte op-
drong, dat bij één of meer kwartieren B. coh met de melk zou
kunnen worden uitgescheiden.

Ik ging daarbij aldus te werk:

De uiers en omgeving werden met een oplossing van % lysol
in pompwater grondig afgewasschen en gedroogd. Daarna werden
de spenen met een wat met brandspiritus goed afgewreven, spe-
ciaal de tepelopeningen, en van elke speen de eerste stralen direct
gemolken in een steriel fleschje. Geheel steriel werd dus nog niet
eens gewerkt. Slechts bij één koe is het mij gelukt, om in de eerste
stralen B. coli aan te toonen. echter niet in grootere hoeveelheid
dan 1 per cc, zoodat ik sterk overhel tot de overtuiging van vrijwel
alle auteurs, dat in praktisch gesproken alle gevallen een belangrijk
colicijfer der melk wijst op een infectie, nadat zij uit den uier is
gekomen.

2. In welke mate komen de coli-achtigen in melk voor?

Hoewel er op dit gebied in de laatste jaren vrij veel onderzoekin-
gen zijn verricht, betreffen haast alle publicaties gepasteuriseerde
melk of modelmelk, en zijn die. waarin de colititer voor gewone
goede rauwe consumptiemelk wordt aangegeven schaarsch.

Velthorst vindt, dat als regel in modelmelk B. coli in 0.1 cc niet
mag voorkomen. In gewone handelsmelk is ze vrijwel steeds in
0.01 cc of kleinere hoeveelheden aan te toonen.

Schmidt wil voor „Vorzugsmilchquot; hoogstens 30 colikiemen per
cc toestaan. Hij vindt in gewone handelsmelk doorgaans zeer hooge
colicijfers (van gepasteuriseerde melk was maar 3.6%, van rauwe
melk maar 0.6% vrij van B. coli in 1 cc).

Klimmer, Haupt en Borchers meenen dat 1000 colikiemen per cc
wijst op onzindelijke melkbehandehng. en dat Vorzugsmilch hoog-
stens 10 B. coli per cc mag bevatten.

Volgens Chalmers mag sedert 1923 in Engeland ..certified milkquot;
geen B. coli in 0.1 cc bevatten bij aflevering aan den klant.

Pien en Bachimont vinden in zéér zuivere melk vaak geen B.
coh in 1 cc.

In gewone handelsmelk daarentegen konden zij vrijwel steeds

dit micro-organisme aantoonen in 1 cc of kleinere hoeveelheden,
vooral in het zomerhalfjaar. Zij vonden, dat bij melk met een totaal
kiemcijfer van:

lt; 10.000nbsp;per cc

10 a 100.000nbsp;„

100 a 250.000nbsp;„

250 a 500.000nbsp;„

meer dan 500.000

geen B. coli was aan te
toonen in 1 cc in

Porcher en Camus zijn van oordeel, dat in melk die zonder
overdrijving, maar toch zindelijk is gewonnen, geen B. coli of
aërogenes mag v/orden aangetroffen. Zij bedoelen vermoedelijk per
1 cc, maar zeggen dat niet.

Nevot vond in 44 monsters melk, die onder bijzondere voorzor-
gen gewonnen waren, in 43.18% cohkiemen in 1 cc.

Lerner houdt het, na onderzoek van 160 willekeurige monsters,
voor mogelijk, dat iedere veehouder, die zonder speciale voorzorgen
melkt, melk aflevert, die vrij is van B, coli in 0.0001 cc. Voor
modelmelk acht hij het een billijken eisch, dat zij vrij is van coli-
achtigen in 1 a 0.1 cc.

H. Peters vond het procentisch gehalte aan colikiemen kleiner,
naarmate het melken zindelijker was geschied.

J. F. Malcolm onderzocht een zeer groot aantal monsters melk
van doorsnee-goede boerenbedrijven, en vond 48.3% vrij van B.
coli in 0.1, 21.4% vrij in 0.01, 14.0% vrij in 0.001, terwijl 16.3%
in 0.001 cc of minder nog coli bleken te bevatten. M. vindt, dat
B. coli een uitnemende indicator is om de mate van besmetting der
melk met „extraneous bacteriaequot; uit te maken, daar ze voorkomt
in alle mogelijke zaken, die de melk bij winning of behandeling
kunnen infecteeren.

Zavagli onderzocht 30 monsters diepgekoelde modelmelk, en
vond daarbij bij 25 B. coli in 1 cc, en bij 6 ook in 0.1 cc, bij kiem-
cijfers die varieerden van 7.000 tot 20.000 per cc, Z. meent dat
voor modelmelk een colititer van hoogstens 1 a 10 per cc (naast
een gering totaalkiemcijfer), en voor gewone melk van hoogstens
100 per cc op het moment der winning aannemelijk is.

Het coli-onderzoek in gepasteuriseerde melk heeft een iets groo-
tere vlucht genomen.

In het algemeen neemt men aan, dat de coli-achtigen sterven bij
een verhitting op 6314° C. gedurende uur, of bij hoogere tem-
peraturen gedurende korteren tijd, hoewel er enkele stammen ge-
vonden zijn (van faecalen aard), waarbij deze kritische temperatuur
of verhittingsduur opgevoerd moesten worden. {Tanner en Wins-
low, Ayers en Johnson, de Jong en de Graaff, Shippen, Peters,
Koning en Ringeling).

Zij sterven dus bij een temperatuur en verhittingsduur, die óf
hooger óf even hoog zijn als die van verschillende, in melk moge-
lijk voorkomende pathogene kiemen, en vormen dus met betrekking
tot het ongestraft gebruik van deze melk, zonder nogmalig koken
een zeer bruikbaren veiligheidsindicator.

Van invloed op het afsterven zou zijn, of vóór het pasteuriseeren
coh-houdende partikeltjes door centrifugeeren uit elkaar geslagen
worden, of niet {H. Peters).

Het „Melkbesluitquot; eischt, dat in gepasteuriseerde melk B. coli
in 5 cc niet aantoonbaar mag zijn.

Pien en Bachimont eischen voor goed gepasteuriseerde en be-
handelde melk, dat zij niet meer coli-achtigen bevat dan 20 à 50
kiemen per liter.

Swenarton verlangt voor een goede gepasteuriseerde melk, dat zij

a.nbsp;vrij is van pathogene kiemen

b.nbsp;een diepkoeling tot op 40° F. heeft ondergaan

c.nbsp;zóó behandeld en verpakt wordt, dat geen herinfectie plaats

vindt.

In flesschenmelk, bereid volgens het systeem der Dauerpasteuri-
satie bij 631^° C. vond hij in Baltimore bij een controle van ver-
schillende bedrijven gedurende längeren tijd in 1924 en 1925, dat
88% van deze melk bij onderzoek van vijfmaal 0.1 cc („the stand-
ard samplequot;) in gentiaanviolet-lactose-bouillon, hoogstens éénmaal
aanwijzing voor de aanwezigheid van B. coli gaf. S. vond dat de
coli-index parallel liep met de outilleering van het bedrijf. Zavagli
is het hiermee in het algemeen eens; hij wijst er echter op, dat bij
de Dauerpasteurisatie bij 63^° C. de thermoresistente coH niet
steeds wordt gedood, en het vinden van deze vormen dus niet
behoeft te wijzen op een foutief procédé.

Peters vindt eveneens, dat bij een goede pasteurisatie vrijwel alle
coli afgestorven moet zijn. Hij heeft echter in bij 6314° C. gepasteu-
riseerde flesschenmelk, die 24 uur bewaard was, weer B. coli kunnen
aantoonen, die blijkbaar ,,hitzeresistentquot; was en zich langzamer-
hand weer begon te ontwikkelen. Voor dergelijke stammen is dus
de pasteurisatie een soort „Auslesequot;, waarop een „Wachstums-
hemmungquot; volgt.

Velen (o.a. Schmidt, Meurer, Swenarton e.a.) klagen er over,
dat melk die goed den pasteur verlaat, in haar verderen loop door
het bedrijf door foutieve behandeling vaak weer geïnfecteerd wordt
üoor leidingen, verpakkingsmateriaal e.d.

3. Welken invloed hebben de diverse factoren, die bij de winning
en behandeling een rol spelen op het colicijfer der melk?

Zooals reeds is uiteengezet, bestaat er vanaf het oogenblik der
winning voortdurend gelegenheid dat de melk met coli-achtigen
besmet wordt, en is het a priori niet te verwachten, dat een of
andere besmettingsoorzaak domineert, hoewel verschillende auteurs
dit beweren, zonder daarvoor nochtans steeds steekhoudende be-
wijzen aan te voeren. Het is trouwens ook van minder belang voor
de waarde die de melk uiteindelijk heeft, als bewezen kan worden
dat in alle opzichten goed, maar zonder overdrijving, gewonnen
en behandelde melk nóóit meer dan een bepaald aantal colikiemen
behoeft te bevatten.

Koning is van meening, dat de stallucht en in het algemeen de
zindelijkheid van koeien en stal van veel invloed zijn op het coli-
gehalte der melk. K. acht zelfs het colicijfer een betere aanwijzing
voor de al of niet zindelijke wijze, waarop de melk is gewonnen,
dan het totaal-kiemcijfer.

Peters is dezelfde meening toegedaan. Hij meent, evenals Koning^
dat de besmetting met B. coh hoofdzakelijk veroorzaakt wordt door
betzij invallende mestpartikehjes, hetzij in de stallucht aanwezig fijn
stof dat met colikiemen beladen is. P. vond een lager procentisch
cijfer, naarmate zindelijker was gemolken, en toonde de luchtinfectie
aan door Endopiaten open in den stal te zetten, en na te gaan
hoeveel kiemen hierop na een bepaalden tijdsduur tot ontwikkeling

kwamen. Volgens P. heeft diepkoelen op B. coli niet zooveel in-
vloed als op andere kiemen.

Stenhouse Williams vestigt de aandacht op het groote belang
van steriel melkgerei. In ons land zijn het vooral Van Oyen en
Treffers geweest, die hierop gewezen hebben.

Lerner zegt, dat alle met zijn methode in melk aangetoonde coli
uit versehe faecahën afkomstig is. en beoordeelt aldus de bij het
melken toegepaste reinheid naar het aantal van deze soort gevon-
den kiemen.

Schmidt, Swenarton, Meurer, e.a. wijzen er op. dat vooral door
melkgerei, verpakkingsmateriaal (flesschen), vuile leidingen enz.
op de fabriek e.d. een coli-infectie plaats vindt.

Schmidt constateerde bij melk die lang niet zindelijk gewonnen
was, in meer dan 50% der gevallen, dat ze geen B. coli per 1 cc
bevatte, en concludeert dan ook: „het coligehalte der melk. dat als
regel zéér hoog is. is meestal een gevolg van een infectie, die niet
in de eerste plaats te wijten is aan onzindelijk melken, maar veeleer
aan een onzindelijke en ondoelmatige behandeling o.a. van het
melkgereiquot;.

Velthorst zegt dat de aanwezigheid van B. coli in melk praktisch
steeds een gevolg is van een besmetting met runderfaecaliën; hij
vindt echter bij de coliachtigen in melk dikwijls B. aërogenes. en
ook tusschenvormen, zoodat hij vermoedt dat deze ook veel in
koeienfaeces voorkomen, en zóó de melk besmetten. Hij verwacht
in het algemeen geen cohinfectie door slechte vaatwerkreiniging.

Kon vond een groot deel der coli-achtigen in melk te behooren
tot het ..soil-typequot;. Zij onderzocht daarna koemest en constateerde
dat daarin vrijwel uitsluitend faecale coli voorkwam (in melk van
37 cultures 4 echte faecale coh tegen 33 andere vormen, in faeces
van 47 cultures 44 echte faecale vormen, en 3 andere). Het is dus
mogelijk, zelfs zeer waarschijnlijk, zegt zij. dat de coli-achtigen in
melk niet in de eerste plaats afkomstig zijn van een faecale besmet-
ting, maar van onrein melkmateriaal en/of voedselbestanddeelen,

Mc. Conkey, Rogers Clark en Evans, Yale en Klines constateer-
den eveneens het relatief zeer veel voorkomen in melk van het
..soiltypequot;.

Zavagli noemt als voornaamste infectiebron het melken en de

stallucht, en terloops ook het melkgerei. Even later zegt hij dat een
colititerbepaling een betrekkelijke waarde heeft, omdat het moeilijk
is geheel coli-vrije melk te winnen, en de best gewonnen melk bij-
verkeerde bewaring en behandeling al spoedig rijk aan B. coli
wordt. Daarom acht hij een coliproef hoofdzakelijk van belang om
te beoordeelen de wijze van bewaring en koeling, niet zoozeer om
aan te toonen dat de winning zoodanig vuil is geweest, dat uit dien
hoofde hygiënische bezwaren tegen de melk gemaakt zouden
moeten worden. Hij spreekt zich zelf dus min of meer tegen. Voor
de bepaling der bacteriologische zuiverheid der melk acht hij het
vaststellen van het totaalkiemcijfer beter dan de bepaling van den
colititer — wenscht dezen laatsten echter voor modelmelk en voor
gepasteuriseerde melk in te voeren.

Uit de aangehaalde literatuur valt dus de slotsom te trekken dat:
B. coli praktisch gesproken in alle melk voorkomt, dat de hoeveel-
heid coli-achtigen in de melk een aanwijzing is voor de wijze, waarop
de winning, en vooral ook de behandeling hebben plaats gevonden,
en dat voor haar aanwezigheid in melk mede voor een belangrijk
deel vuil melkgereedschap en verpakkingsmateriaal aansprakelijk
zijn te stellen, naast een infectie door faecalien.

4. De invloed van de coli-achtigen op de kwaliteit der melk

Hoewel in het algemeen de coli-achtigen worden beschouwd als te
zijn apathogeen, zijn er toch ook vrij veel auteurs, die een andere
meening zijn toegedaan, en die meenen dat, hetzij door woekering
in het jejunum, hetzij door thermoresistente toxinen, deze kiemen
in melk, zélfs in gedooden toestand, onder bepaalde omstandig-
heden gevaarlijk kunnen zijn, speciaal voor kinderen, zieken en
zwakken {Plantenga, Camus, Nevot, Orla-Jensen, Bender, Catell
en Pallaske-, — ook Bergey noemt bij de groep Escherichia meer-
dere menschpathogene soorten). Er zijn er zelfs, die aan B. coh in
melk dezelfde waarde willen toekennen als aan B. coli in water, en
zich daarbij op het standpunt stellen, dat aanwezigheid van B. coli
ä priori niet uitsluit een besmetting met pathogene met de faeces
door menschen uitgescheiden kiemen {Camus, Vassileff),

Dit gaat m.i. wel wat te ver, vooral daar een besmetting der melk
met menschelijke faecaliën, anders dan met sterk verontreinigd

spoelwater althans, tot de zéér groote uitzonderingen, om niet te
zeggen onmogelijkheden zal behooren.

Meer kan ik dan ook gevoelen voor het standpunt van Demeter
Sauer en Miller, die van meening zijn. dat in goede rauwe melk
enkele coh-achtigen geen bezwaar behoeven te zijn.

Een ander zeer reëel nadeel van de coli-achtigen is, dat zij de
houdbaarheid der melk bij een overigens gelijkblijvend kiemcijfer
zeer bekorten.

Barkworth, die in 10 jaren van ongeveer 5000 melkmonsters, op
melkcursussen gewonnen, bepaalde de houdbaarheid, het totaal-
kiemcijfer en den colititer, komt tot de volgende conclusies-

1.nbsp;De aanwezigheid van B. coli verkort den gemiddelden houd-
baarheidsduur.

2.nbsp;Deze verkorting staat in rechtevenredig verband tot het coli-
cijfer.

3.nbsp;de verkorting is het grootst bij den overgang: niet aan te toonen
in 1 cc tot: meer dan 1 ä 10 per cc.

4.nbsp;Lange houdbaarheid is alleen te verwachten bij lage telling
(B. geeft geen temperatuur en duur aan).

5.nbsp;Bij gelijk aantal coli-achtigen per cc wordt de houdbaarheidsduur
korter, naarmate het totaal aantal kiemen stijgt.

B. vond nooit werkelijk lage kiemcijfers als het coligehalte 1 per
0.01 of per 0.001 cc bedroeg.

F. J. Malcolm vond. dat coli-negatieve melkmonsters (negatief
m 0.1 cc) vrijwel steeds een lager kiemcijfer hebben dan coli-
positieve.

Van de 10.458 (in 0.1 cc) coli-negatieve monsters, die hij onder-
zocht, was het totaalkiemcijfer gemiddeld 25.294, van de 11399
coli-positieve 160.577,

Tenslotte is ook uit een zuiveltechnisch oogpunt bezien de aan-
wezigheid van veel colibacteriën in melk een groot nadeel, doordat
ZIJ aanleiding kunnen geven tot de bereiding van een minder goed
product. Voor gegevens hierover zie men de publicaties van
Breed, Ritter, Veenbaas, Orla-Jensen, Yale, Sarles en Hammer
— e, V. a.

C. Wij komen nu tot de beantwoording der vragent

„Heeft het zin eventueele varieteiten van B. coli uiteen te houden

a.nbsp;uit een oogpunt van volksgezondheid

b.nbsp;om fouten bij de melkwinning begaan in het oog

te doen vallen.

en zijn deze variëteiten gemakkelijk te herkennen?quot;

Ad. a. Indien men de coH-achtigen beschouwt als apathogeen
(wat overigens blijkens het voorgaande nog lang niet zeker is),
dan kan men het zoeken naar deze kiemen in water, melk enz.
onder anderen opvatten als het speuren naar een aanwijzing om-
trent het al of niet met menschelijke faecaliën besmet, en dus even-
tueel gevaarlijk zijn (door cholera, typhus e.d.) van het onderzoe-
kingsobject. Uit dit oogpunt bezien is het van belang om te trach-
ten aan te toonen, of een bepaalde coli-achtige van menschelijk-
faecalen oorsprong is, en als scheidingslijn tusschen het al of niet
toe laten voor consumptie te nemen het feit, of besmetting met
menschelijke faecaliën niet dan al heeft plaats gevonden.

Voor melk ondertusschen is de kans van besmetting met humane
colibacillen, als men die met sterk verontreinigd spoelwater uitsluit,
betrekkelijk gering. Daarentegen is de kans op infectie met faecale
coli-achtigen van dierlijke herkomst des te grooter. Deze laatste
zijn, zooals nader zal blijken, niet van die van den mensch te onder-
scheiden, zoodat een nader zoeken naar specifiek menschelijke
faecale colibacteriën niet vruchtdragend kan zijn.

De beteekenis van het opsporen der coli-achtigen in melk ligt
dan ook, zooals in de voorgaande hoofdstukken reeds is uiteen-
gezet, op ander terrein. Een nadere determinatie kan dus hoog-
stens zin hebben om uit te maken, of melk met faecale (mensche-
lijke of dierlijke), dan wel met tot de niet-faecale soorten
gerekende coli-achtigen was besmet, om aan de hand daarvan te
beslissen ten aanzien van de fouten bij de winning enz. begaan.

Vele onderzoekers, speciaal ook Amerikaansche, hebben getracht
een scherp onderscheid tusschen wèl en niet faecale coli te vinden,
en wel door als criteria hiervoor te nemen de navolgende punten:
1. De vergisting onder zuur- en gasvorming van glucose bij 45° C.
[Eykman)

2.nbsp;Het gedrag in saccharose- en dulciethoudend miheu.
(Mc. Conkey)

3.nbsp;De verhouding in het in glucose-bouillon gevormde gas van
CO2 tot H2 {Smith, Rogers Clark en Davis, Rogers Clark en
Evans, en in den laatsten tijd ook Demeter en Sauer)

4.nbsp;De ein-pH bij de vergisting van glucose, en het gedrag ten op-
zichte van methylrood (Clark en Lühs, Winslow Kligler en
Rothberg, Kligler Clark en Lubs, Ayers en Rupp, Paine)

5.nbsp;De vorming in glucose-peptonhoudend milieu van acetyl-methyl-
carbinol. en de reactie hierop van Voges-Proskauer (Voges en
Proskauer, Levine, Harden Walpole en Morris, Chen en Rettger,
Kligler c.s., Ayers en Rupp)

6.nbsp;De groei in synthetische milieu's, als citraat- en urinezuur-
houdende bodems (Koser)

7.nbsp;De eigenschappen van coli-achtigen van bekende herkomst
(Chen en Rettger, Koser, Hicks, Stewart, Klimmer c.s., Kon,
Demeter c.s.. en niet te vergeten Mc. Conkey).

Een korte bespreking der publicaties van de genoemde auteurs
moge hier volgen.

1. De glucosevergisting bij 45 ä 46° C.

Zij berust op de door Eykman ontdekte eigenschap van sommige
in faeces voorkomende coli-achtigen om glucose bij 45 ä 46° C. te
splitsen onder vorming van zuur en gas. Er zijn auteurs, (de
Graaff), die de uitspraak „faecale cohquot; van den positieven uitslag
dezer proef afhankelijk stellen. Nog méér schrijvers echter verkla-
ren zich tegen de Eykmanproef. omdat deze alleen bij een posi-
tieven uitslag iets zeggen kan. maar bij een negatieven niets. Zeer
veel coli-achtigen kunnen bij de hooge broedtemperatuur, ook al
zijn ze van duidelijk faecalen oorsprong, niet groeien, althans geen
gas vormen (Koning, Gärtner, de Graaff en ook Eykman zelf).

Voor de melk zou een positieve Eykmanproef dus besmetting met
faecale coli bewijzen; een negatieve kan. bij aanwezigheid van
andere coli-soorten geen nader besluit over de infectie toelaten.

2. Het gedrag in saccharose- en dulciethoudend milieu
Wij zagen reeds, dat Mc. Conkey op grond o.a. van het gedrag

in voedingsbodems met saccharose en dulciet, meende de coli-
achtigen in vier hoofdgroepen te moeten scheiden, n.1.:

a.nbsp;De groep B. vesiculosus

b.nbsp;„ ,, B. coli communis

c.nbsp;„ „ B. neapolitanus

d.nbsp;„ „ B. lactis aërogenes.

Mc. Conkey isoleerde nu uit faeces van gezonde menschen alle
vier de groepen; het minste groep d) (de aërogenesgroep).

Bij faeces in geval van darmaandoeningen was er niet zooveel
verschil.

Uit 23 monsters faeces kreeg hij 241 stammen, waarvan slechts
65 saccharosevergisters, en maar in totaal 4 keer de eigenlijke B.
aërogenes. B. cloacae {Jordan) vond hij nooit. De verhouding der
groepen was 34 : 38 : 15 : 12.

In 11 monsters dierlijke faeces vond hij alle vier de groepen, maar
nooit B. aërogenes in engeren zin. De groepsverhouding was hier

22 : 27 : 43 : 7.

Bij melk vond Mc. Conkey iets eigenaardigs. Waar er toch een
groote kans is, dat melk met koemest verontreinigd wordt, mocht
men verwachten, dat de verhouding der coli-^achtigen ongeveer
dezelfde was als in koeienfaeces. Het bleek in waarheid juist an-
dersom te zijn n.1.-.

323^ B. vesiculosis 15 B. coli communis 20 B. neapolitanus en
323^ B. lactis aërogenes.

Van de ongeveer 500 stammen uit menschelijke en dierlijke
faeces behoorden er tot groep b. (saccharose —, dulciet ), dus
tot de zuivere B. coh 37%.

Mc. Conkey vermengde menschelijke faeces met water, en liet
dit 45 dagen staan, waarna hij wederom de eigenschappen van
geïsoleerde cultures bepaalde. Ook hierin vond hij geen enkelen
keer de klassieke B. lactis aërogenes, en hij begon als gevolg van
al deze experimenten te twijfelen, of er inderdaad zooveel B. lactis
aërogenes in de faeces voorkwam, als men steeds beweerd had.
Mc. Conkey trekt uit zijn zeer uitgebreide proeven o.a. deze

conclusies:

Van 625 lactosevergisters uit faeces zijn er maar 4 als B. aëro-
genes en 19 als B. cloacae geïdentificeerd. 18 van deze 19 stammen
vervloeiden gelatine niet na 6 weken, wèl na 3 maanden.

De Voges-Proskauerreactie is alleen positief bij aanwezigheid
van B. aërogenes en/of B. cloacae.

Verder zegt Mc. C.:

„Er is geen middel om humane van dierlijke faecale lactose-
vergisters te onderscheiden, of die uit zieke van die uit gezonde
faecesquot;, en vervolgt dan;

,,De groep coli communis (althans de dulcietvergisters) is steeds
aanwezig in de faeces van volwassenen en zuigelingen, (zoowel
menschelijke als dierlijke), en schijnt in nauwer verband te staan
met de faeces dan de andere groepen, wat van belang kan zijn voor
het wateronderzoek.quot;

Een nadere indeeling der coli-achtigen op grond o.a. van de
vergisting van saccharose en dulciet vindt men ook bij de groepen
Escherichia en Aërobacter van Bergey. Evenmin als bij Mc. Conkey
is ook hier te vinden, dat op grond van het bezit of gemis dezer
eigenschappen een bepaalde kiem definitief bij de wèl of de niet
faecale groep van coli-achtigen is in te deelen,

3. De verhouding in het in glucose-bouillon gevormde gas
van CO2 tot H2

Reeds Theob. Smith merkte in 1896 op, dat de eene stam in een
bepaald milieu veel meer gas vormde dan de andere, en dat het
groeien van de totale gashoeveelheid hoofdzakelijk te danken was
aan CO2 toename, terwijl de hoeveelheid H2 min of meer con-
stant bleef.

Rogers, Clark en Davis onderscheiden bij een groot aantal uit
melk verkregen stammen naar de verhouding (ratio) van CO2 tot
H2, en het totale in glucose-bouillon bij 30° C. in 7 dagen ontwik-
kelde gasvolumen 3 groepen, n.1.:

Groep 1. blijkt minder fermentatief vermogen te hebben dan
de andere.

Volgens deze schrijvers komt de groep 1. (low ratio) zeer veel
hoewel niet voor 100%, overeen met de oorspronkelijke door
Escherich beschreven coli, en daarom willen zij deze groep als de
eigenlijke coligroep beschouwen. Zij beschrijven deze groep als
volgt: „Kleine, dikke. Gram-negatieve staafjes, gewoonlijk, maar
niet steeds beweeglijk, Indol wordt door verreweg de meeste cul-
tures gevormd, en nitraat als regel gereduceerd tot nitriet. Onder
anaërobe omstandigheden wordt neutraalrood meestal gereduceerd,
in glucose-bouillon is de gas-ratio COg tot H2 ongeveer 1/1, de
totale hoeveelheid gas 6—8 cc. Lactose, laevulose en galactose
Worden steeds vergist (onder zuur- en gasvorming), gelatine zelden

vervloeid.

Rogers, Clark en Evans onderzochten in aansluiting hieraan
150 uit koeienfaeces geïsoleerde stammen.

Hierbij vonden zij slechts één vertegenwoordiger uit de high-
ratiogroep, hoewel zij op verschillende wijze trachtten deze groep
er speciaal uit te halen.

Bij uit melk geïsoleerde cultures vonden zij daarentegen ongeveer
48% high-ratiostammen; deze komen dus hoogstwaarschijnlijk niet
^it de faeces, maar ergens anders vandaan,

Rogers Clark en Evans vonden bij 166 uit granen geïsoleerde
stammen bijna nooit een lage gasratio, maar bijna steeds een hooge
{gt; 1.90), vrij vaak gelatinevervloeiing, en heel weinig indolvorming.

Zij concludeeren: „Binnen de grenzen der coligroep zijn er di-
verse, wèl te definieeren subgroepen, die elk van bepaalde herkomst
zijn; één hiervan leeft vooral in den digestietractus; deze heeft een
lage gasratio, vormt vrijwel steeds indol, en vergist dulciet. Een
andere soort, met hooge gasratio, is de op granen meestal voor-
komende, die soms gelatine vervloeit, doorgaans geen indol vormt,
saccharose wèl en dulciet niet vergistquot;.

Verder vinden deze schrijvers nog diverse langzame vervloeiers
die om hun eigenschappen in de coligroep thuis hooren.

Gewoonlijk zijn groepen van 2 of 3 eigenschappen al of niet
aanwezig bij de diverse soorten, zoodat tusschen bepaalde eigen-
schappen een soort correllatie schijnt te bestaan.

Demeter en Sauer vonden bij een aantal uit melk geïsoleerde
stammen, dat er een bepaald verband was tusschen totaal gas-

volumen en de verhouding Hg tot COg; hoe meer gas er gevormd
werd, hoe meer CO2 er relatief in voorkwam.

Het zou dus fundamenteel onjuist zijn het begrip ,,bact. cohquot; bij
het melkonderzoek te beperken tot de faecale coli (low-ratio), omdat
men dan de verwante vormen, afkomstig uit andere besmettings-
bronnen, zou missen. Een criterium op de ,.cohinfectie in melkquot;
moet dus zoowel de low- als de high-ratio vormen omvatten, als-
mede de tusschengelegene.

4, De eind-pH bij de vergisting van glucose en het gedrag
ten opzichte van methylrood

Clark en Lubs zeggen, dat blijkbaar de gasratio een aanwijzing
is voor een fundamenteel verschil in metabolisme der onderschei-
dene microorganismen, dat ze echter veel te moeilijk is te bepalen
voor het routineonderzoek, en dat het dus wenschelijk is, te zoeken
naar eigenschappen, die nauwkeurig en rechtstreeks samenhangen
met de gasratio.

In navolging van Michaëlis en Marcora vonden zij, dat lowratio-
stammen in een geschikt milieu zuur vormen tot een concentratie
van 1 tot 5 maal lO'S H (pH 5 a 43^), terwijl de highratiogroep
reeds bij een pH van 6 a ój^ ophield zuur te vormen.

C. en L. gebruikten als milieu a 1 % pepton Witte, a 1 %
glucose en % K2HPO4, dat 3 a 5 dagen bij 30° C. werd
bebroed.

Als indicatoren, die in deze pH-reeks bruikbaar zijn, noemen zij
paranitrophenol v. Sörensen, dat bij pH 5 kleurloos is, en bij pH 6
geelgroen, of methylrood v. Palitzsch, dat bij pH 43/^ a 5 rood is,
bij 5 a 6 begint om te slaan, en boven 6 geel is. Zij prefeeren de
laatste.

De highratiogroep laat het milieu dus geel. de lowratio maakt
het rood; men spreekt dan van een positieve methylroodproef.

Bij hun proeven vonden C. en L. een correllatie van 100%
tusschen eind-pH en gasratio.

Ook Winslow, Kligler en Rothberg zeggen, dat de destructie
van de koolhydraten in hooge mate constant is. en nauw samen-
hangt eensdeels met den aard van het micro-organisme, anderen-
deels met de structuurformule, van den suiker enz.. Zij vonden.

dat de werking van B. coli en B. aërogenes ophoudt, als de pH
kleiner wordt dan 5.

Volgens Levine is voor het ontstaan der methylroodreactie na
48 uur bebroeden een temperatuur van 37° C. noodzakelijk. Be-
broedt men 72 tot 120 uur, dan komt het er niet op aan, of 30°
of 37° C. gebruikt worden.

Conclusie; Men zou dus in de methylroodreactie een criterium
hebben ter onderscheiding van lowratio en highratiovormen, of wel
van echte faecale coli en van elders afkomstige, en daarmede in
deze reactie een aanwijzing kunnen hebben voor de wijze van
besmetting der melk.

5. De vorming in glucose-peptonhoudend milieu van acetyl-methyl-
carbinol, en de reactie hierop volgens Voges-Proskauer

M. Levine vestigt de aandacht op het feit, dat bij vergisting van
glucose, in glucose-peptonwater v. Clark en Lubs, door coli-achti-
gen, ontstaan: CO2, Hg, alcohol, succinezuur, melkzuur, mieren-
=uur en ook 2—3 butyleenglycol CH3—CHOH—CHOH—CH3,
alleen door de aërogenes-cloacaegroep wordt geoxydeerd tot
acetyl-methyl-carbinol CHg—CHOH—CO—CH3, hetwelk met
10%

KOH bij aanwezigheid van pepton eosinerood kleurt. Het
schijnt, dat er door de toevoeging van KOH een verdere oxydatie
plaats vindt tot diacetyl CH3—CO—CO—CH3; dit reageert met
een peptonbestanddeel, en geeft dan meteen een „pink colour with
a green fluorescencequot;.

In 1895 beschreven Voges en Proskauer (cit. n. Tanner) deze
J^eactie voor een cultuur van bac. suipestifer.

Later hebben Harden en Walpole, en Harden en Norris (cit, n.
Tanner) haar ook beschreven, zonder echter een verklaring te
kunnen geven.

Behalve de aërogenes-cloacaegroep zouden ook b. subtilus en b.
mesentericus vulgatus deze reactie geven. Van 167 stammen van
coli-achtigen van verschillende herkomst vond Levine dat alleen
die niet positief reageerden met methylrood, een positieve
voges-Proskauerreactie gaven. Bij stammen uit faeces vond hij
geen enkele V. P. positief.

Gebruikt men andere suikers als glucose, dan schijnt ook de
aecale coli in sommige gevallen acetyl-methyl-carbinol te kunnen

vormen. {Harden, Morris, Ferreira e.a.). Wij moeten dus persé
gebruiken glucose, en wel liefst in j/^ tot 1 % in peptonwater met
bifosfaat.

Er is dus een directe parallel tusschen de methylrood- en Voges-
Proskauerreacties, en de gasratio.

In een nadere publicatie zet Levine dan uiteen, dat in enkele van
zijn bij 30° C. gekweekte stammen een reversie optrad. Deze zouden
eerst methylroodpositief, en vervolgens -negatief geworden zijn.

Chen en Rettger konden soms met 10 tot 14 uur bebroede
bodems al een positieve reactie krijgen; deze schrijvers zeggen
voorts: „De soort pepton, die gebruikt wordt, doet er niet toe, de
duur van bebroeden (1 tot 5 dagen) evenminquot;.

Verschillende stammen vertoonen een heel verschillend inten-
sieve. reactie.

Conclusie: B. coli uit faeces zou dus zijn lowratio, methylrood
positief en Voges-Proskauer negatief.

B. coli van elders zou dus zijn highratio, methylrood negatief en
Voges-Proskauer positief.

6. Het kweeken in synthetische milieu s

Koser poneerde de stelling, dat in de gebruikte voedingsbodems
de koolstofbron niet steeds behoeft te zijn een zoo gecompliceerde
verbinding als een hoogere alcohol of suiker, en dat de stikstof-
bron een anorganische kan zijn. Met synthetische bodems werkende
krijgt men volgens K, een goed inzicht in de minimum-bestaans-
voorwaarden van een bepaalde bacteriesoort, en ervaart dan, dat
B. aërogenes het meest uitgebreid vergistend vermogen heeft. K.
werkte met een standaardvloeistof, waarin 50/00 NaCl. O.IO/qq
MgS04 7 aq., lo/^o NH4H2PO4 en 10/^0 K2HPO4 (als stikstof-
bron werd ammoniumfosfaat gebruikt), waarin hij beurtelings als
koolstofbron 18 verschillende organische zuren deed, tot een con-
centratie van ongeveer I^Iqq, benevens NaOH, tot de pH was
6.7—6.8

Zelfs bij heel lichte enting vanaf een goed gegroeide jonge agar-
cultuur, kreeg hij in dit milieu na 1—7 dagen bij 30° C. goeden
groei.

Vooral de éénbasische lagere vetzuren werkten groeibevorde-
rend, de hoogere niet.

K. ging na bij welke concentratie van het zuur hij het snelste
troebehng kreeg (methode Holm en Sherman) en beschouwde deze
als de beste. Bij de 50 coli-achtigen, die hij naar hun methylrood-
en Voges-Proskauerreacties indeelde in faecale en aërogenes-
stammen, zag hij dat op citraathoudende bodems alleen de laatste
groeiden na 24 a 48 uur. Verder vond hij, dat speciaal aërogenes-
achtigen de eigenschap hebben om als eenige stikstofbron genoegen
te nemen met de stikstof uit den purinekern van urinezuur e.d..

7. De eigenschappen van coli-achtigen van bekende herkomst

Chen en Rettger vinden het voor een classificatie der coh-achti-
gen absoluut noodig dat, naast het toepassen van wèl gedefinieerde
onderzoekingsmethoden, men de normale herkomst der gevonden
bacterie mee laat tellen.

Zij bepaalden de relatieve frequentie van de als B. coli en B.
aërogenes beschreven typen in vuil, dat naar menschelijke bereke-
ning vrij was van faecale besmetting van menschelijken of dier-
lijken oorsprong, en hielden als limiet tusschen deze twee de Voges-
Proskauerreactie, de methylroodreactie en de gasratio. Zij entten
direct van de „soilquot; op platen, om de verhouding waarin de diverse
coli-achtigen voorkwamen beter te doen uitkomen.

Van de 467 stammen uit „soilquot; waren er 20 van het coli- en 447
'Van het aërogenes-type. (V.P. , M.R. —, highratio).

Van de 173 stammen, die zij daarna kweekten uit menschelijke
en dierlijke faeces, behoorde geen enkele tot de aërogenes- of
cloacaegroep.

Veel vertegenwoordigers van het „soir'-type zouden niet goed
groeien bij 37° C. Daarom bevelen de genoemde auteurs aan, om
bij 30° C. de bodems 3—5 dagen te bebroeden, vooral glucose-
Peptonwater voor V.P.- en methylroodreactie. Zij vinden na 3
dagen, speciaal in het synthetische milieu met nitraat en suiker
Voor B. aërogenes vaak een veel lagere pH dan 6,0 (soms tot 4.5).
l^a 5 dagen is in het synthetische milieu, of dat met pepton Witte
geen enkele pH meer beneden 6.0. Bij gebruik van pepton Difco
Waren na 5 dagen nog 26 aërogenesstammen op een pH lt; 6.0, en
dus methylroodpositief. Het grooter worden der pH voor B. aëro-
genes moet geweten worden aan secundaire alcalivorming (NH3
^it pepton).

[Kligler Clark en Lubs hebben zich met deze laatste kwestie ook
bezig gehouden. Zij twijfelen, of alleen NH3 aansprakelijk is te
stellen, en vermoeden dat B. aërogenes minder zuur en meer gas
vormt dan B. coli. Ayers en Rupp verklaren het verschijnsel door
aan te nemen, dat tegelijk een zuur- en een alcahgisting zouden
plaats vinden, waardoor de uit suikers gevormde organische zuren
zouden worden gemaakt tot carbonaten en bicarbonaten.)

Chen en Rettger concludeeren uit hun proeven, dat voor een
onderscheid tusschen B. coh en B. aërogenes voor 100% goed zijn
de methylrood- en de Voges-Proskauerreactie. het urinezuurmilieu
V. Koser, de gasratio en tot op zekere hoogte ook het in de „pre-
sumtive testquot; ontwikkeld gasvolume in de Durhambuis. Van veel
minder beteekenis zijn saccharose- en adoniet-vergisting en indol-
vorming. Zij beschrijven 18 stammen, die M.R. en V.P. beide posi-
tief waren, hoewel de pH maar even beneden 6 lag. Na ettelijke
keeren overenten („replatingquot;). waren van deze 18 stammen er
14, waarvan de pH tot boven 6 gestegen was. Bij 4 gelukte dat
niet; deze bleven dus M.R. en V.P. positief. Alle 18 stammen
vergistten citraat.

F. S. Paine beschrijft stammen, die aanvankelijk M.R. negatief,
en V.P. positief waren, maar bij verder kweken M.R. negatief
bleven, echter V.P. negatief werden, doordat zij de actyl-methyl-
carbinol verder afbraken.

Aan een nadere publicatie van Koser ontleenen wij, dat hij uit
faeces 118 en uit vuil 72 stammen isoleerde, en met de bron van
herkomst vergeleek het citraat- en urinezuurvergistend vermogen,
en de M.R. en de V.P. reactie. K. komt tot de conclusie dat er bij
sommige stammen een variabele M.R. en V.P. reactie is.

Van 118 faecale stammen waren 109 M.R. en V.P. —, 107
citraat- en 108 urinezuur-negatief. 2 M.R. positieve waren dus ook
citraat-positief; deze bleken bij nader onderzoek tot de aërogenes—
groep te behooren.

Koser vond dus bij 118 faecale stammen 9 keer B. aërogenes.

Van de 72 ,.soilquot;-cultures waren 97.2% citraatvergisters, 59.7%
urinezuurvergisters, 52.8% V.P. positief, en 51.4% M.R. negatief.
11.1% waren eerst M.R. en V.P. —, maar werden later defi-
nitief M.R. — en V.P. . 34.7% waren constant M.R. en

V.P. —. Van deze 34.7% M.R. soilstammen (in totaal 25 stuks)
waren er 23 die citraat vergisten.

Dit is dus in lijnrechte tegenspraak met wat de M.R. positieve
Stammen uit faeces te zien gaven.

Dit aantal volgens de M.R. reactie tot de faecale stammen be-
hoorende coli-achtigen uit „soilquot; is veel grooter dan andere auteurs
vinden {Levine, Rettger, Chen, Rogers Clark en Evans).

Koser vindt dus de M.R.- en de V.P.-reactie lang niet altijd
betrouwbaar, en concludeert, dat de beste aanwijzing voor de her-
komst van een bepaalden coli-stam hgt in het al of niet vergisten
van citraat.

De Graaff is het met dit laatste niet eens.

Tenslotte vestigt in 1926 Koser er nog eens de aandacht op, dat
het van het allergrootste belang is, om absoluut zuivere zuren te
nemen. Kleine verontreinigingen kunnen reeds onzuivere uit-
komsten geven. In dit verband is het ook noodig, om op de syn-
thetische bodems zéér kleine hoeveelheden cultuur te enten, daar
anders te veel organische stof mee overgaat.

Hicks vergeleek 150 uit faeces geïsoleerde stammen met 50 uit
..soilquot; waarvan hij vrijwel zeker was, dat het nooit bezoedeld was
geweest door menschelijke of dierlijke faecaliën; hij onderzocht de
Verhouding citraatvergisting: indolvorming: M.R.- en V.P.-reactie,
en komt tot de conclusie, dat de citraatproef een betere indicator
IS voor de herkomst, dan de indolproef.

De M.R.- en V.P.-proef acht hij niet voldoende betrouwbaar.
Hij wil alleen stammen, die citraat en indol — zijn, beschouwen
^Is niet-faecaal.

Hieronder moge volgen een kort overzicht van enkele publicaties
der laatste jaren, die betrekking hebben op het nader determineeren
door middel van de boven omschreven methoden, van coli-achtigen
quot;^le geïsoleerd zijn uit melk.

Klimmer Haupt en Borchers kweekten uit melk een aantal stam-
den, die wel tot de coli-achtigen, maar nóch tot de zuivere coli-,
nóch tot de aërogenesgroep behoorden, maar tusschenvormen
Waren.

Phyllis, M. Kon isoleerde uit melk een aantal stammen (30),
Waarbij de M.R.- en de V.P.-reactie beide positief verliepen. Door

herhaalde malen overenten wist zij een scheiding te maken bij 24
stammen, die aanvankelijk intermediair waren, en meent dus, dat
de oorspronkelijk uit melk verkregen stammen mengcultures van
coli en aërogenes zijn geweest. Bij 6 gelukte dat echter niet en deze
bleven intermediaire eigenschappen vertoonen. Zij vindt de M.R.-
en de V.P.-reactie niet erg betrouwbaar, en prefereert voor schei-
ding tusschen B. coli en B. aërogenes den citraatbodem van Koser,
waaraan 1/2500% brilliantgroen is toegevoegd.

F, J. Malcolm heeft geprobeerd na te gaan of de aard der door
hem uit melk geïsoleerde coli-achtigen (hij zegt uit één monster
meest maar één soort coli te isoleeren) ook wijst op een speciale
wijze van besmetting. In de stalperiode vindt hij 71% der stammen
te behooren tot de faecale coli, en 7.5% tot de groep aërogenes. In
den zomer zijn deze getallen respect. 40.4% en 22.4%.

Ook M. vindt een groot aantal van allerlei varieerende tusschen-
vormen (in totaal ongeveer 21%). Hij zegt verder, dat de her-
komst van B. aërogenes en de intermediaire vormen nog steeds niet
is opgelost. Meerdere auteurs o.a. Hay zouden ze door speciale
ophoopingsmethoden in niet onbelangrijke mate in de faeces hebben
aangetoond, vooral in gevallen van diarrhee.

Malcolm veronderstelt nu, dat de weekere defaecatie als gevolg
van den weidegang, in den zomer oorzaak kan zijn o.a. van het
grootere percentage aërogenes. In elk geval vindt hij het gevaarlijk
om uit de aanwezigheid van een bepaalde soort van coli-achtigen
met zekerheid te willen concludeeren tot een bepaalde wijze van
besmetting der melk (óf met faeces, óf met gewoon vuil, óf door
spoelwater en vaatwerk, enz. enz.).

Malcolm knoopt dan ook betrekkelijk weinig commentaar aan de
bovenstaande, door hem geconstateerde en vermelde procentische
cijfers vast.

Demeter Sauer en Miller isoleerden uit melk 115 stammen van
coli-achtigen, die zij door herhaaldelijk overenten zuiverden. Het
bleek hun, dat van deze 115 stammen maar 15.2% was te rekenen
tot de typische coli (d.w.z. indol , methylrood , Voges-Pros-
kauer —, en citraat —), en 10.1% tot de typische aërogenes
(indol —, methylrood —, Voges-Proskauer , en citraat ).
Verder stonden nog 10.1% der stammen dicht bij de groep coh,
zonder nochtans alle typische eigenschappen te vertoonen, en 9.1%

dicht bij de groep aërogenes. De rest der stammen (55.5% van het
totaal) bestond uit tusschenvormen, die zonder meer niet bij één
der beide groepen waren in te deelen. Na een jaar te zijn bewaard
hadden alle 115 stammen nog dezelfde eigenschappen, als aan het
begin van het onderzoek.

Lipska tenslotte bepaalde de eigenschappen van 200 door haar
uit melk gekweekte stammen, die zij eerst een rigoureus zuiverings-
procédé liet ondergaan. In tegenstelling met de meeste auteurs van
den laatsten tijd heeft zij deze kiemen niet nader ingedeeld naar
hun gedrag bij de M.R.- en de V.P.-reactie en op citraathoudende
bodems enz., maar naar het al of niet vergisten onder zuur- en
gasvorming in een standaardoplossing van pepton en neutraalrood
van: glycerine, sorbiet, dulciet, saccharose, raffinose, en salicine.
Daarnaast gaat zij van de aldus in groepen ingedeelde coli-achtigen
wèl na het gedrag bij de bovengenoemde reacties, en ook indol-

en H2S-vorming.

Zij komt dus tot de oude indeeling in de groepen B. neapoli-
tanus. B. lactis aërogenes, B. coli communior, B. coH commune en
ß. acidi lactici. Ook naar dezen maatstaf ingedeeld blijken er een
aanzienlijk percentage intermediaire vormen te zijn.

Zij deelt tenslotte mede. dat B. lactis aërogenes en B. acidi lac-
tici het meest voorkwamen, en verder, dat de aanwezigheid van de
andere soorten wijst op faecale besmetting. Zij heeft ook nog van
30 uit faeces gekweekte stammen de eigenschappen nagegaan, en
daarbij o.a. gedetermineerd 7 B. coli commune, 3 B. lactis aëro-
genes, echter geen enkele B. acidi lactici. Zij is van meening. dat
niet alle stammen uit de faeces zich vlot in melk kunnen ontwik-
kelen. en omgekeerd evenmin. Een van haar conclusies luidt:
..L'étude des propriétés biochimiques prouve la grande variabilité
des souches de chaque espèce de coli-bacillequot;.

Uit het voorgaande volgt dus, dat het antwoord op de aan het
hegin van dit hoofdstuk gestelde vragen moet luiden:

Uit een oogpunt van volksgezondheid heeft het geen zin om te
trachten, bij het vinden van coli-achtigen in melk. de groep waar-
toe deze behooren nader te determineeren.
h. Evenmin heeft een nadere determinatie beteekenis voor het op-
sporen van bepaalde fouten in de melkwinning; vooral ook, wijl

een zoodanige determineering bij uit melk verkregen stammen
in zeer veel gevallen onmogelijk schijnt te zijn.
Verder blijkt dat het antwoord op de derde vraag moet luiden:

a.nbsp;Dat in een bepaald concreet geval nooit met absolute zekerheid
een scheiding is te maken tusschen wèl en niet faecale coli,
hoewel dit met vrij groote waarschijnlijkheid kan geschieden
door middel van de citraatvergisting, de V.P.- en de M.R.-
reactie, en tot op zekere hoogte door de glucosevergisting bij
45° C.. en de saccharose- en dulcietvergisting bij 37° C.

b.nbsp;Dat een determineering zéér veel en omslachtig werk met zich
brengt, en volgens a. nog niet eens een 100% betrouwbare
uitkomst geeft.

c.nbsp;Dat het vinden van een vertegenwoordiger uit de groep coli in
water, melk e.d. met vrij groote (tot absolute) zekerheid wijst
op faecale besmetting, dat echter vertegenwoordigers van de
groep aërogenes door verschillende auteurs (o.a. Mc. Conkey,
Koser, Bergey en Lipska) soms in niet onbelangrijke mate in
faeces (hoewel weinig in humane faecahën) zijn aangetroffen,
en dat er vrij veel tusschenvormen schijnen voor te komen, waar-
van men uit hun cultureele eigenschappen niet kan concludeeren,
of ze van faecalen dan wel van niet-faecalen oorsprong zijn.

Wij komen nu tot de beantwoording der vraag:

D. Op welke wijze zijn de coli-achtigen in melk aan fc toonen?

1. Algemeene principes

Tot de oudste methoden om coli-achtigen aan te toonen behooren
de z.g.n. ophoopings- of „Anreicherungsquot;methoden, waarbij in een
vloeibaar milieu dat speciaal geschikt is voor den groei van deze
micro-organismen, hun de gelegenheid geboden wordt zich over-
vloedig te vermeerderen. In deze milieu's ontstaan geen typische
veranderingen, en voor het aantoonen van coli-achtigen is het
noodig, dat men deze vanuit het ..Anreicherungsmilieuquot; via z.g.n.
selectieve platen isoleert.

Een tweede methode is het uitzaaien van vermoedelijk colihou-
dend materiaal (melk enz.) op selectieve platen — en te zien, of
zich hierop z.g.n. typische kolonies ontwikkelen, die dan weer nader
worden gedetermineerd.

Als derde methode kent men z.g.n. industrieele methoden, die
met 24 tot 48 uur resultaat geven. Ook bij deze methoden krijgen
de coli-achtigen de gelegenheid om zich (door een speciale samen-
stelling van den voedingsbodem) „op te hoopenquot;, maar tegelijkertijd
wordt deze ophooping naar buiten toe zichtbaar door het optreden
van veranderingen die voor de coh-achtigen als typisch worden
beschouwd. Deze methoden hebben verreweg de meeste toepassing
gevonden.

Vooral in Amerika heeft het colionderzoek in melk, en in het
bizonder in water, een zeer groote vlucht genomen, en is tegen-
woordig als volgt gestandariseerd:

1-nbsp;De „presumptive testquot;, waarbij het betreffende monster zoodanig
wordt bewerkt, hetzij door bebroeden bij een speciale tempera-
tuur, hetzij door kweeken in een milieu, waaraan tot wering van
den groei van andere micro-organismen bepaalde stoffen zijn
toegevoegd of onttrokken, dat eventueel aanwezige coli-achtigen
zich zooveel mogelijk vermeerderen, en dit door een bepaalde,
voor „coliquot; typische, verandering in den voedingsbodem te kennen
geven.

2-nbsp;De „partially confirmed testquot;, waarbij van de positieve of
dubieuze „presumptive testquot; een zekere hoeveelheid wordt afge-
streken op een selectieve plaat, en vorm, kleur enz. der zich
ontwikkelende kolonies wordt nagegaan.

De „totally confirmed testquot;, waarbij de eigenschappen van de
kiemen uit de z.g.n. typische kolonies volgens 2. nader worden
onderzocht, en bewezen te zijn die van „coliquot;.

Niet alle methoden, die voor wateronderzoek te gebruiken zijn,
kunnen worden toegepast op melk, omdat deze laatste doorgaans
veel kiemrijker is, en hier dus grooter gevaar bestaat dan ginds,
dat andere bacteriesoorten de coli-achtigen overwoekeren, of, wat
^og erger zou zijn, doen afsterven door hun stofwisselingsproducten
{Oda -Jensen, Pien en Bachimont, Liixwolda, Swenarton e.a.).

Het is dus zaak, om bij het onderzoek van melk op coli-achtigen
de proef zoo in te richten, dat de „presumtive testquot; eensdeels een
200 groot mogelijk aantal dezer kiemen tot ontwikkeling laat komen,
anderendeels, dat niet tot de coligroep behoorende micro-

organismen de voor deze groep typische veranderingen niet geven.

Hoe betrouwbaarder en vollediger de presumptive test, hoe meer
beteekenis deze krijgt voor het colionderzoek in melk.

Een routineonderzoek der melk op coli-achtigen zal n.1. alléén
beteekenis hebben, als het op snelle en eenvoudige wijze een be-
trouwbaar resultaat geeft, wat practisch hierop neerkomt, dat de
presumptive test beslissend zal moeten zijn. en de partially en
totally confirmed tests wegens hun groote kosten aan tijd en
materiaal achterwege zullen kunnen blijven.

2. Nadere bespreking der diverse methoden om coli-achtigen in
melk aan te toonen

A, De ophoopingsmethoden

Hierbij wordt getracht de coli-achtigen een gunstige kans op
ontwikkeling te geven door:

a.nbsp;Kweeken in IO/qq carbolzuurhoudend milieu {Vincent), voor
melk betrekkelijk weinig toegepast, het meest nog in peptonwater.
Pien en Bachimont prefereeren voor isoleering van coh-achtigen
uit melk het milieu v. Vincent boven alle andere. Zij enten echter
niet direct de melk op carbolpeptonwater. omdat carbol ook de
ontwikkeling van coli remt, maar eerst op gewoon peptonwater.
Krijgen zij hierin indolvorming, dan enten ze hiervan op carbol-
peptonwater, waarin wederom indol ontstaat.

De methode Vincent, Pien en Bachimont is, behalve op den groei
in 10/qq carbolzuurhoudend miheu, gebaseerd op het indolvormend
vermogen. Dit laatste zou lang niet aan alle colistammen inhaerent
zijn. Bovendien heeft de genoemde methode het nadeel, van om-
slachtig te zijn, is dus voor een routineonderzoek voor melk niet
te verkiezen, en bij het onderhavige onderzoek niet toegepast. Even-
min is dit geschied met de methode van Nevot, die na 24 uur
kweeken bij 413^° C. in carbolpeptonwater. nog weer overent op
den mineraalagar van Kufferath.

b.nbsp;Kweeken in zuren bouillon bij 37° C. volgens Ringeling (d.i.
de methode die het Melkbesluit voor gepasteuriseerde melk aan-
geeft), heeft het nadeel dat het veel tijd en materiaal kost; in
den zuren bouillon ontstaan geen bizondere veranderingen, die

op de aanwezigheid van coli wijzen. Daardoor is het noodig, dat

vanuit de bebroede bouillon via een of andere selectieve plaat

coh-achtigen worden geïsoleerd.

Volgens den Dooten de Jong staat de methode Ringeling boven-
dien in gevoeligheid achter bij de ophooping in taurocholaatmilieu,
en volgens Lernet is er bij de methoden van „Anreicherungquot;, die
hij nader bestudeerde, de indol-, de pegallac- en de Ringeling-
methode, niets dat wijst op een voorkeur voor de laatste. Integen-
deel zou deze minder gevoelig zijn dan de „indolmethodequot;. Om
deze redenen is dan ook bij het volgende onderzoek de methode
Ringeling niet toegepast.

De selectieve plaatmethoden

Het uitstrijken of uitgieten op selectieve vaste bodems van be-
paalde hoeveelheden melk wordt ook toegepast, o.a. door Velthorst
en Demeter Sauer en Miller. De eerste maakt hierbij gebruik van
de kleine plaatmethode.

Nagegaan wordt hoeveel typische kolonies zich ontwikkelen,
terwijl sommige platensoorten bovendien het voordeel zouden
hebben, dat direct een onderscheid te maken zou zijn tusschen coli-
en aërogenesachtigen.

Al deze platen bevatten lactose; bij alle is echter de groote moei-
lijkheid ten eerste, om vast te stellen wat nu eigenlijk een typische
kolonie is (hiervoor zijn wel aanwijzingen gegeven door de ver-
schillende auteurs, die echter lang niet steeds opgaan), en ten
tweede, dat men afziet van het beslissende punt: de gasvorming
uit lactose. Om deze redenen, en ook omdat ze te omslachtig zijn,
verdient het geen aanbeveling deze plaatmethoden als beslissende
presumptive test te gaan gebruiken, zéker niet voor melk met haar
talrijke niet-gasvormende zuurvormende microben. Deze opinie
blijken ook Adams, Kessler en Swenarton te zijn toegedaan, terwijl
Lipska zich als volgt uitspreekt: „On voit, que les caractères ma-
croscopiques des colonies sur le miheu d'Endo n'ont que peu de
valeur, et qu'on doit se baser, dans une étude des colibacilles,
davantage sur les propriétés biochimiques qui sont plus stablesquot;.

In dit onderzoek zijn de selectieve plaatmethoden dan ook niet
toegepast als presumptive test. Als selectieve bodems kunnen ove-
rigens in aanmerking komen: de krystalvioletbodem van Conradi

en Drigalski, de fuchsine-natriumsulfietagar van Endo, de meta-
chroomgeelagar van Gassner, de Chinablauwagar van Bitter, de
trypaflavineagar mèt of zonder broomthymolblauw van Klimmer,
de eosinemethyleenblauwagar van Levine, de lakmoidplaat van von
Wolzogen-Kühr, en vele andere bodems {Kufferarth, Krumwiede,
Loef fier).

C. De industrieele methoden,

waarbij bepaalde hoeveelheden melk op verschillende voedings-
bodems worden geënt, en uit het optreden van bepaalde, voor coli-
achtigen als typisch beschouwde veranderingen tot hun aanwezig-
heid wordt geconcludeerd. Zij berusten op verschillende aan de
coli-achtigen toegeschreven eigenschappen.

a. Methoden die berusten op de indolvoming in peptonhoudend
milieu.

Kraus en Uhlenhuth verklaren de indolvorming aldus:

..Indol kan worden gevormd uit tryptofaan (indolalanine), door
afsplitsen van alanine.quot;

Tryptofaan is een aminozuur, dat bijv. wèl in pepton, daaren-
tegen niet in gelatine voorkomt.

Het indol geeft met een weinig nitriet mineraalzuur nitro-
soindol, een roode kleurstof.

Bij nitrietvormende bacteriën (cholera) is toevoeging van zuur
alleen reeds voldoende. Er is voor het gelukken van deze naar
Salskowski genoemde reactie een optimale hoeveelheid nitriet
noodig. Ze is echter niet erg gevoehg.

Men heeft naar andere methoden gezocht om indol te kunnen
aantoonen. Zeer goed is de reactie van Ehrlich met paradimethyl-
aminobenzaldehyd en kaliumpersulfaat, waarbij uit indol binnen
hoogstens 5 minuten rosindol. een roodgekleurd aromatisch alde-
hyde ontstaat.

Volgens Tobey (cit. n. Kr. en U.) e.a. is toevoeging van per-
sulfaat niet noodig. De kleurstof lost op in amylalcohol. die soms
echter zèlf door het reagens wordt rood gekleurd.

De proef is zeer gevoehg (wijst nog 0.01 mgr. in 10 cc aan).

Om de indolvorming te vergemakkelijken geven o.a. Hopkins
en Co/e, Berthelot en Zipfel, Neisser (cit. n. Kr. en U.) en

Folmpers bodems aan, waarin tryptofaan i. p. v. pepton verwerkt is.

Voor indolvorming is zuurstof noodig. De indolvorming zou
volgens Kürschner (cit. n. Kr. en U.) zeer constant zijn, ook in
minder gunstige omstandigheden. Indolpositief zouden zijn B. coli,
diverse proteusachtigen, en verschillende Gram-negatieve patho-
gene kiemen, o.a. cholera- en dysenteriebacillen.

Voor melk is de „indolmethodequot; toegepast in ons land door
Lerner, en in Frankrijk door Pien en Bachimont.

Genoemde auteurs klagen over het feit, dat zij herhaaldelijk con-
stateerden, dat bij enten op peptonwater bij de grootere hoeveelheid
melk (1 cc) géén, bij de kleinere (0.1 cc enz.) wèl indol ontstond.

Lerner meent dit te moeten verklaren uit het coaguleeren van
eiwit, of door het feit, dat B. coli liever lactose gebruikt dan melk-
eiwit, maar geeft hiervoor geen bewijzen.

Pien en Bachimont hebben de oorzaak van dit verschijnsel
nauwkeurig nagegaan. Zij vonden, dat in melk een concentratie van
4 gram melkzuur per liter de grens is, waarboven B. coli niet in leven
blijft. In peptonwater, waarin geen caseine, die als buffer werkt,
aanwezig is, vormt 1 Yi gram per liter de grens.

Enten wij dus 1 cc melk op 10 cc peptonwater (methode Lerner),
dan bestaat de kans, dat tegelijkertijd naast event. weinige coli-
achtigen zéér veel melkzuurstreptococcen aanwezig zijn, zoodat deze
nit de in de melk aanwezige lactose zóó snel, en zóó veel zuur
vormen (tot een concentratie boven X]^ gram per hter), dat de
eerste geen kans krijgen zich te ontwikkelen, en indolvorming

achterwege blijft.

Enten wij daarentegen 1 cc melk op 50 ä 100 gram pepton-
water (methode Pien en Bachimont), dan kan, al wordt alle lactose
vergist, de melkzuurconcentratie nooit stijgen boven Ij^ gram per
liter, en bestaat er geen kans op onderdrukking van den groei der
coli-achtigen, zoodat indolvorming wèl voor den dag komt.

Waar bij deze methoden uitgegaan wordt van een principe, dat
^iet eigen is aan alle coli-achtigen, speciaal niet aan de groep
aërogenes, is het zéér de vraag of deze methode voor melk voldoen
2al. Zij heeft, althans toegepast op de wijze van Lerner, die direct
°ielk of haar verdunningen op peptonwater ent, het voordeel, dat
2e eenvoudig, goedkoop en snel is. Deze laatste overweging, als
niede het feit dat de methode Lerner in ons land nogal aanbevolen

is, en door den auteur geprefereerd wordt boven b.v. de pegallac-
en de Ringelingmethode, heeft mij er toe gebracht om. ondanks de
geschetste nadeelen. deze methode bij het volgend eigen onderzoek
op te nemen.

b. Methoden die berusten op de veranderingen in neutraalrood-

milieu.

De practische toepassing geschiedt voor melk, door bepaalde
hoeveelheden hiervan te kweeken in neutraalroodbouillon met of
zonder lactose; hierbij wordt dan nagegaan kleurverandering,
fluorescentie en eventueel gasvorming.

Rothberger (cit. n. Gärtner) maakte in 1898 als eerste bij water-
onderzoek opmerkzaam op de eigenschap van B. coh om in lactose-
agar, die met neutraalrood gekleurd was, een gele kleur met groene
fluorescentie en gasvorming te geven.

Aan andere onderzoekers bleek, dat veel andere bacteriesoorten
eveneens meer of minder duidelijk deze verandering gaven {Scheff-
Ier, Hunter, Segali, Ferreira Horta en Paredes, Rochaix — ged.
cit.' n. Vassileff). Genoemd worden o.a. B. pyocyaneus, B. fluo-
rescens putridis, B. paratyphi (Schottmüller), B. enteritidis Gaert-
ner, B. mesentericus, B. subtilus, B. tetani, B. mahgn. oedem..

Rochaix, Dufourt en Guerbert (cit. n. Vassileff), en vooral
Vassileff hebben deze zaak nader bestudeerd.

Neutraalrood lost in water robijnrood op; bij toevoeging van
alcali, speciaal NHg. wordt de kleurstofbase vrij, en verandert hier-
door in waterige oplossing de kleur in oranjegeel.

Laat men op neutraalrood in zuur milieu reduceerende stoffen
(waterstof in statu nascendi) inwerken, dan wordt het milieu
aardbeirood met hcht-groene fluorescentie. In alcalisch milieu daar-
entegen geven de reduceerende stoffen een gele kleur met groene
fluorescentie. Er zijn dus twee tempo's

1.nbsp;fluorescentie door reductie.

2.nbsp;geelkleuring door alcali.

De colibacil werkt sterk reduceerend op organische kleurstoffen,
speciaal ook op neutraalrood, terwijl vele andere reduceerende
kiemen dit onaangetast laten. Doordat hij echter zuur uit suiker
vormt, wordt de geelkleuring gestoord.

De meeste der genoemde kiemen geven alleen een groene fluo-
rescentie zonder geelkleuring. Slechts die in staat zijn om in alca-
lisch milieu te reduceeren (alleen B. coli en B. paratyphi A en B),
geven de volledige reactie.

Vassileff beveelt daarom zeer sterk aan voor melk gebruik te
maken van een neutraalroodbouillon zonder lactose, die 24 uur
bij 413^° C. wordt bebroed. Anaëroob kweeken zou nog beter zijn
dan aëroob. Hij maakt verdunningen van de melk, en ent hiervan
5 tot ^ cc op dezen voedingsbodem, en beschouwt den uitslag als
positief, als een gele of geelroode kleur met groene fluorescentie

ontstaat.

Velthorst heeft voor zijn coli-onderzoek gebruik gemaakt van
zuren neutraalrood-lactosebouillon in gistbuisjes, aldus combinee-
rende de ophooping in zuur milieu, gasvorming en fluorescentie.
Hij heeft de deugdelijkheid dezer proef nagegaan, door ook bij
negatieve uitkomsten van de gistbuis te enten op Conradi-
I^rigalskiplaten, en de eigenschappen der zich ontwikkelende kolo-
nies te bepalen.

Ook deze methode heeft het nadeel, dat zij berust op een eigen-
schap die, zooals we reeds zagen, niet inhaerent schijnt te zijn aan
alle coli-achtigen {Lipska geeft in haar juist verschenen studie een
tabel, waaruit blijkt, dat een groot deel der faecale stammen, en
een nog veel grooter deel der niet-faecale, in totaal bijna 50%,
geen fluorescentie in neutraalroodmilieu gaven). Nochtans leek het
^ij gewenscht om een neutraalroodbodem op te nemen bij mijn
onderzoek, omdat èn van officieele Nederlandsche zijde (het Con-
sumptieijs-Besluit schrijft voor coli-onderzoek, mede het gebruik
van zuren neutraalroodlactosebouillon voor), èn van Fransche zijde
bet gebruik van neutraalroodhoudende bodems sterk is aanbevolen.

Van de geschetste methoden heeft die van Vassileff het voor-
deel van te zijn zeer snel en eenvoudig toe te passen; bovendien
geldt bij dezen bodem zuiver en alleen het gedrag ten opzichte van
neutraalrood als criterium. Daarom is mijn keuze op dezen bodem
gevallen.

c. Methoden die berusten op het kweeken in lactosebouillon of

lactosepeptonwater, met of zonder toevoeging van indicatoren

en/of remmende stoffen.

Deze methoden worden verreweg het meest gebruikt in allerlei

variaties. Zij zijn inderdaad de meest belangrijke, omdat een der
weinige zeer constante eigenschappen der geheele coligroep is het
ontleden van lactose onder zuur- en gasvorming.

Tanner geeft aan, dat sinds 1917 de American Public Health
Association voor wateronderzoek eischt, dat deze proef wordt
toegepast als presumptive test. Ontstaat binnen hoogstens 48 uur
niet 10% of meer gas, dan wordt de proef zonder meer als negatief
beschouwd.

De voornaamste variaties, volgens welke deze methode bij het
coli-onderzoek wordt toegepast, zijn de volgende:

1.nbsp;Het gebruik van gewonen 1% lactosebouillon. Deze heeft het

voordeel, dat hij geen enkele remmende stof bevat, en zooveel

mogelijk coh-achtigen tot ontwikkeling laat komen.

Obst vergeleek de uitkomsten bij wateronderzoek tusschen dezen
bodem en galhoudende milieu's. en komt tot de conclusie, dat de
lactosebouillon ongeveer 2.4 a 3.8 maal zooveel coli-achtigen tot
ontwikkeling brengt. Het bezwaar is echter weer. dat wij geen
enkel wapen in de hand hebben tegenover andere zuurvormende
bacteriën, waardoor de mogelijkheid, dat de coli-achtigen over-
woekerd worden, en niet voor den dag komen, niet is uitgesloten.
Dit bezwaar geldt natuurlijk méér voor melk, met haar doorgaans
grooten en gevariëerden kiemrijkdom, dan ten aanzien van water.

N. Ritter heeft naar aanleiding van een vergelijkend onderzoek
tusschen wèl- en niet-galhoudende lactosebouillon bij 1899 water-
monsters gevonden, dat, als alleen de lactosebouillon zonder gal
positief aanwijst, dit in ongeveer 75% der gevallen een miswijzing
beteekent.

Adams Kessler en Swenarton vonden gewonen lactosebouillon
voor melkonderzoek absoluut onbetrouwbaar.

Om gemelde redenen is bij het volgend onderzoek deze voedings-
bodem dan ook niet toegepast.

2.nbsp;Lactosebouillon waaraan gal of galzure zouten zijn toegevoegd.

Jackson was de eerste die dit toepaste. Jordan (cit. n. Tanner)

zeide reeds in 1915, dat de coli-achtigen door dit hulpmiddel in
hun groei kunnen worden belemmerd. Hij weet dit aan de gal, die
door haar wisselende samenstelhng ook wisselende uitkomsten zou
geven. Gal werd toegevoegd tot een concentratie van 5%,

In ons land is o.a. door Veenbaas, voor melkonderzoek gepro-
pageerd de z.g.n. Pegallac-bodem, waarin pepton, gal, lactose en
lakmoes. Coli wordt beschouwd aanwezig te zijn, bij gasontwikke-
hng en kleuromslag. Lerner bericht over miswijzingen met dezen
tgt;odem.

Wegens het bezwaar der verschillende samensteUing der gal
(zie ook Hansma) is men inplaats hiervan gaan gebruiken Na-
triumtaurocholaat, dat in een concentratie van tot 1% aan den
voedingsbodem wordt toegevoegd. Tevens gebruikt men een indi-
cator, waardoor naast gasvorming in taurocholaatmilieu zuurvor-
ming wordt aangetoond.

Zoo maakte Mc. Conkey gebruik van 1 % lactosebouillon J^ %
Na-taurocholaat en lakmoes; Chalmers gebruikt voor melk i. p. v.
lakmoes broomkresolpurper, dat een duidelijker kleuromslag laat
2ien (van blauw naar geel). Hij beveelt dezen bodem sterk aan.

Ädams, Kessler en Swenarton gebruiken, eveneens voor melk,
als rem voor de (meestal Grampositieve) melkzuurvormers — niet
coli-achtigen, gentiaanviolet, terwijl zij tevens, om de remmende
Werking hiervan op coli te verminderen, gal toevoegen tot een

concentratie van 5%.

Salie gebruikt i. p. v. gentiaanviolet krystalviolet.

Volgens genoemde auteurs zou deze proef, die zij vergeleken
lactosebouillon „tout simplequot;, en lactosebouillon met alleen
gentiaanviolet, de beste zijn. en 99 a 100% zekerheid geven, dat
een positieve uitslag aan coli te danken is. Zij zijn met hun bewijs
hiervoor echter niet verder gegaan, dan dat zij de uit de positieve
presumtive test op selectieve platen groeiende „typischequot; kolonie»-
^Is bewijs aanvaardden.

In ons land is het den Dooren de Jong geweest, die, in navolging
Van Mc. Conkey, een taurocholaatlakmoesoplossing gebruikte,
echter gewijzigd. Deze schrijver neemt een oplossing van 1 % Na-
taurocholaat in leidingwater, en voegt lakmoes bij tot diepblauw,
^an gepasteuriseerde melk wordt nu 5 cc bij 5 cc van dezen bodem
gevoegd, waardoor een melksuiker- en eiwitconcentratie van onge-
veer 2% ontstaat. Gasontwikkeling en kleuromslag duiden op de
aanwezigheid van coli; kleuromslag zonder gasvorming is dubieus,
^^n D. d, J. heeft deze methode vergelegen met de ophoopings-
methode van Ringeling, en geconstateerd dat ze beter is.

3. Aan 1% lactosebouillon wordt trypaflavine toegevoegd in een
concentratie van 1/100.000. Bij aanwezigheid van coli-achtigen
ontstaat in dezen bodem gasontwikkeling. Volgens Klimmer
Haupt en Borchers zou deze bodem, speciaal voor melk. goed
voldoen.

Het was voor mij technisch niet goed uitvoerbaar, en m.i. ook
niet noodig, om bij het navolgende onderzoek alle genoemde bodems
in te schakelen, en daarom heb ik mij tot een keus hieruit moeten
beperken. Deze keus is gevallen op:

a.nbsp;Het milieu van den Dooren de Jong, dat door dezen auteur
(voor gepasteuriseerde melk) in ons land op zeer uitgebreide
schaal is toegepast, en waarbij hij geconstateerd heeft, dat deze
methode de voorkeur verdient boven verschillende andere.

b.nbsp;Den Pegallacbodem. wijl deze in ons land zeer veel wordt toe-
gepast, en van verschillende zijden ook sterk is aanbevolen.

c.nbsp;Den broomkresolpurper-lactosebodem van Chalmers, die in
wezen gelijk is aan den klassieken bodem van Mc. Conkey,
maar het voordeel heeft van een duidelijker kleuromslag te
geven. Deze bodem wordt in Engeland veel gebruikt, en is door
Ch. sterk aanbevolen.

d.nbsp;De trypaflavinelactosebouillon van Klimmer, die speciaal van
Duitsche zijde is gepropageerd {Klimmer c.s. en Demeter).
Vooral de laatste auteur heeft uitgebreide vergelijkende onder-
zoekingen gedaan, en daarbij o.a. geconstateerd, dat aan trypafla-
vinebouillon boven gentiaanviolet- en krystalvioletbouillon de voor-
keur gegeven moest worden. Schmidt heeft geen superioriteit voor
de beide laatste bodems kunnen vinden.

Bovendien wordt in de Amerikaansche literatuur hier en daar het
bezwaar genoemd, dat deze kleurstoffen den groei van de coli-
achtigen te zeer zouden tegenhouden. Mede om al deze redenen is
van het gebruik der bodems met de beide violetsoorten afgezien.

Een nadere beschrijving der in het eigen onderzoek gebruikte
bodems komt voor in het volgende hoofdstuk.

TWEEDE AFDEELING

HOOFDSTUK IV

HET EIGEN ONDERZOEK

Dit moest dienen om verschillende aan de studie der literatuur en
aan de practijk ontleende vragen te beantwoorden, en wel:

Ten eerste: Is er voor het snelle en gemakkelijke aantoonen van
coh-achtige micro-organismen in melk een gemakkelijk te hantee-
ren voedingsbodem aan te geven, die eensdeels een zoo groot
hogelijk aantal dezer organismen tot ontwikkeling brengt, en ander-
deels geen „specifiekequot; veranderingen geeft met kiemen buiten
deze groep?

Ten tweede: Welke uitkomsten geeft deze proef in de practijk?
Is er overeenstemming met de, bij de bedrijfsinspectie geconsta-
teerde, deugden of gebreken in de bedrijfsvoering?

Om een antwoord op deze beide vragen te kunnen geven, is het
onderzoek in de navolgende deelen gesplitst:

Een onderlinge vergelijking der reeds genoemde „routine-
methodenquot; op hun gevoehgheid en betrouwbaarheid, met alge-
heele identificatie zoo mogelijk der geïsoleerde kiemen, over een
beperkt aantal monsters.

Een nader onderzoek over een grooter aantal monsters, met de
voorloopig beste methoden, om te zien of deze hierbij de aan-
vankelijk geconstateerde betrouwbaarheid behouden.
3. Een vergelijking van de uitkomsten, welke deze en andere me-
thode(n) ter bepaling van de bacteriologische hoedanigheid der
melk geven, als ze geregeld worden toegepast over een langer
tijdsbestek op melk van bekende herkomst, en verder de over-
weging of de techniek voor zoover het coli-onderzoek betreft,
zóó te vereenvoudigen is, dat deze laatste methode in het groot
practisch bruikbaar wordt.

EERSTE DEEL

EEN ONDERLINGE VERGELIJKING DER GEBRUIKTE
BODEMS OP HUN GEVOELIGHEID EN BETROUW-
BAARHEID, MET VOLLEDIGE IDENTIFICATIE ZOO
MOGELIJK DER GEÏSOLEERDE KIEMEN

Hiertoe werden een aantal gewone, z.g.n. straatmonsters van
verschillende mij bekende zindelijke consumptiemelkstallen, die door
een der keurmeesters in grondig gereinigde, maar niet speciaal
gesterihseerde flesschen werden gehaald, onderzocht. De bemon-
stering geschiedde bijna steeds op Vrijdag n.m. of op Zaterdag v.m..
De monsters kwam tot Zaterdag n.m. op ijs te hggen, en werden
dan in bewerking genomen.

In deze melk mocht uit hoofde van de manier waarop ze gewon-
nen en behandeld was, in het algemeen een laag colicijfer verwacht
worden, en daarom leek zij mij erg bruikbaar voor het doel, n.1.:
Na te gaan het verschil in gevoeligheid der diverse te gebruiken
methoden, dat m.i. meer bij coli-arme, dan bij coli-rijke monsters
zou spreken, en verder, omdat in de eerste de eventueel in gering
aantal aanwezige coli meer kans loopt overgroeid te worden door
andere kiemen, zoodat zich hierbij de remmende kracht van den
bodem op andere dan coli-achtige micro-organismen zou kunnen
demonstreeren.

Verder had ik. door melk van deze stallen te gebruiken, de kans
een (voorloopig) inzicht te krijgen omtrent den coh-rijkdom van
goed gewonnen melk in het algemeen, wat voor het verdere onder-
zoek zijn nut zou kunnen hebben.

Techniek van dit onderzoek

Ä. Gebruikte voedingsbodems, hun samenstelling, bereiding
en beoordeeling

a. De bodem volgens den Dooren de Jong: Natriumtaurocholaat
10 gram oplossen in 1000 gram aq. dest. en Yi uur steriliseeren op
100° C., daarna filtreeren.

Vervolgens 200 cc lakmoesoplossing volgens Kübel en Tiemann
10 minuten verwarmen bij 100° C., en de taurocholaat- en lakmoes-

oplossing heet bij elkaar voegen, en in reageerbuizen met Durham-
buisjes aftappen. Steriliseering 3 X 15 minuten bij 100° C. of
K uur bij 115° C..

Gasontwikkeling en kleursverandering tot rood (of rood-wit) zijn
bewijzend voor de aanwezigheid van coli-achtigen; kleursverande-
ring zonder gasvorming is dubieus.

b.nbsp;De Pegallacbodem: bestaat uit 10 gram pepton, 5 gram lactose,
30 gram rundergal, opgelost tot 1 liter in aq. destill. 3% lak-
moesoplossing. Wordt 15 min. op 100° C. verhit en gefiltreerd.

Vervolgens worden in reageerbuizen met Durhambuisjes 10 a 15
cc afgetapt; hierna volgt sterilisatie gedurende uur bij 100° C..
waarna de buizen snel worden afgekoeld in water ter wille van het
behoud der kleur (er treden n.1. wel eens miskleuren op als men
spontaan laat afkoelen). Bij een positieven uitslag is er gasontwik-
kehng in de Durhambuis, en is de kleur rood (of wit), al naar
gelang er zuurontwikkeling met of zonder kleurstofreductie heeft
plaats gevonden.

c.nbsp;De pepton-lactose-broomkresolpurper-Na-taurocholaatbodem

^an Chalmers: 5 gram Na-taurocholaat. 20 gram pepton, 3 gram
NaCl. 2 gram K2HPO4 in 1000 cc leidingwater onder verwarmen
oplossen, en de pH vaststellen op 6.8 (hier is ongeveer 13 cc 20%
NagCOg opl. voor noodig); vervolgens verwarmen tot 115° C. en
laten afkoelen; koud filtreeren, dan lactose toevoegen (1%), en
broomkresolpurper (60 mgr.) — oplossen en verdeelen over
reageerbuizen met Durhambuisjes. Sterihsatie vindt plaats bij
115° C. gedurende Yi uur.

Bij aanwezigheid van coh-achtigen is er gasontwikkeling in de
Durhambuis. en kleuromslag naar geelrood of geel. Na korten tijd
kunnen sommige colisoorten NH3 uit pepton vormen, en gaat in die
gevallen de kleur weer over naar blauw.

De trypaflavineAactosebouillonbodem v. Klimmer: 5 gram
Liebigs vleeschextract. 10 gram pepton, 3 gram NaCl en 2 gram
K2HPO. samen oplossen in 1000 aq. Bijvoegen lactose (1%), en
®et 4N. NaOH instellen op pH 7.2. Vervolgens 1 cc van een 1 %
Waterige trypaflavineoplossing toevoegen, aftappen in cultuurbui-
zen met Durhambuisjes, en steriliseeren gedurende 3X15 min. bij
100° C., of 1 X 30 min. bij 115° C.. Indien coli-achtigen aanwezig
2ijn, is er groei en gasontwikkehng waar te nemen.

e.nbsp;De peptonbodem van Lerner: 10 gram pepton Witte, 10 gram
NaCl en 250 mgr, NaHCOs onder koken oplossen in 1 liter aq.;
filtreeren, in buizen aftappen, en gedurende 1 uur bij 100 a 110° C.
steriliseeren.

Bij aanwezigheid van B. coli ontstaat in dezen bodem indol —
(volgens Lerner reeds na 24 uur).

f.nbsp;De neutraalroodbodem van Vassileff: 250 gram fijngehakt
vleesch 24 uur aftrekken in 1 liter water, voorzichtig afschuimen,
opkoken en weer afscheppen. Na bekoeling 20 gram pepton en
20 gram NaCl toevoegen, aanvullen tot 1000 cc, 5 min. koken en
laten afkoelen. De reactie moet zwak alcalisch tot neutraal gemaakt
worden (pH 7.0). Daarna toevoegen 10 cc 5% versche neutraal-
roodoplossing in aq. destilL, ]/2 ^^r verwarmen tot 110° C., de pH
opnieuw controleeren, en pas filtreeren als de oplossing weer koud
is geworden. Vervolgens in buizen doen, en 15 min. steriliseeren
bij 110° C.. Afkoelen voor het behoud der kleur is noodig. Deze
bodem is niet gemakkelijk te maken.

Bij aanwezigheid van coli-achtigen is er een kanariegele tot bruin-
gele of bruinroode kleur met groene fluorescentie.

Voor alle bij dit onderzoek aangewende voedingsbodems werd
uitsluitend Pepton Witte gebruikt.

Van de bodems a—d werd na 24 en 48 uur bepaald de kleur en
gasontwikkeling. Getracht werd, om een ongeveer beeld te geven
van de hoeveelheid ontwikkeld gas, door te bezien het gedeelte der
Durhambuis, waaruit de vloeistof was verdrongen. Een zuiver me-
trieke vergelijking is niet mogelijk, omdat de Durhambuizen niet
alle even groot zijn, de bodem vaak zóó troebel, dat de gasbel niet
precies is te onderscheiden, en dus een eventueele gradueering der
buisjes heelemaal niet, en ten leste, omdat lang niet al het ontwik-
kelde gas in de Durhambuis terecht komt.

Daarom werd besloten den navolgenden ongeveeren maatstaf
voor de gasvorming aan te leggen: geen gas is negatief = O, minder
dan 5% negatief tot dubieus == O/dub., 5 a 10% dubieus tot zwak
positief = dub./( ), 10 a 15% zwak positief = ( ), 15 a 50%
positief = , en boven 50% sterk positief = !.

Van bodem e. vond na 24 en 48 uur de indolbepaling plaats.

Volgens sommigen is er na 24 uur al indolvorming {Lerner, Pien

en Bachimont); de laatsten beweren met beslistheid, dat zij nooit
indolvorming kregen bij langer wachten, als deze er na 24 uur niet
was. Volgens anderen doet men, althans voor B. aërogenes, beter
3 a 4 dagen te bebroeden (Kligler).

De indolbepaling vond plaats volgens de methode van Ehrlich,
die volgens Kligler de beste is (zie ook Plimmer, Kraus en Uhlen-
huth en Kovacs).

Uitvoering der reactie: Aan het volume van den voedingsbodem
Worden toegevoegd volume indolreagens A (4 gr. paradimethyl-
aminobenzaldehyd, 380 cc alcohol 96% en 80 cc HCI s.g. 1.19) en

volume reagens B. (verzadigde KsSgOg oplossing).

Volgens sommigen is het wenschelijk om de roode kleur, die bij
aanwezigheid van indol ontstaat, duidelijker naar voren te doen
komen, door uit te schudden met amylalcohol, terwijl toevoeging
van de persulfaatoplossing niet noodig zou zijn.

Mijn ervaring met uitschudden met amylalcohol is niet gunstig;
speciaal de door Kovacs aangegeven wijziging (deze lost de para-
dimethylaminobenzaldehyd direct in amylalcohol op) heeft mij niet
voldaan, in tegenstelling met Pien en Bachimont.

De mij ter beschikking staande amylalcohol kleurde bij toevoe-
9ing der genoemde reagentia zelf min of meer rood.

Hoewel ik steeds persulfaat toevoegde, heb ik nooit een roode
kleur zien ontstaan, als ik die niet reeds met oplossing A. had ge-
kregen. Dit is dus in overeenstemming met wat, volgens Kraus en
Uhlenhuth, Tobey e.a. auteurs vermelden.

'De indolvorming werd geklassificeerd als negatief = 0. zeer zwak
= dubieus =(( )), zwak positief = ( ), en positief = .

De bodems a—e werden bebroed bij 37° C.

Bodem f. werd aëroob bebroed bij 41C.. en na 24 en 48
Uur nagegaan op kleur en fluorescentie.

B. Het enten van de melk op deze bodems

Dit geschiedde als volgt:

Het monster melk werd, uit de ijskast genomen, gedurende 3 a 5
minuten zeer krachtig geschud. Deze tijd is volgens Struve en
^^umgartel de beste, om een zoo gelijkmatig mogelijke verdeeling
der kiemen te krijgen.

Het bleef daarna even staan bij kamertemperatuur, waarbij de

lucht zooveel mogelijk kans kreeg te ontwijken, en vervolgens werd
1 cc met een en dezelfde steriele pipet geënt op de bodems a—f,
(verdunning I), en op een buis met 9 cc physiologische NaCl-
oplossing, die met een steriele gummikap was afgesloten. Deze
laatste buis werd weer grondig geschud, en hieruit weer 1 cc op
de bodems a—f geënt (verdunning II), en tevens op 9 cc physio-
logische NaCl-oplossing, Dit werd nog 2 keer herhaald, zoodat wij
kregen 4 series voedingsbodems a—f, resp, geënt met 1 cc (I), 0.1
cc (II), 0.01 cc (III) en 0.001 cc (IV) van het betrokken monster.

C. Verdere bewerkingen

1. Van de bodems a—f werd, hefst na 24 uur, en anders na
48 uur bebroeden, uit een (doorgaans de hoogste) verdunning, die
een duidelijk positieven uitslag gaf, een fhnke oese vol afgestreken,
aanvankelijk op Gassner metachroomgeel-, maar al heel spoedig op
Endo-agar.

Was er in geen enkele verdunning van een bepaalden bodem een
duidelijk positieve verandering opgetreden, dan werd uit een ver-
dunning met negatieve of dubieuze reactie (meestal I) tóch een
Endopiaat geënt.

De verdunningen waaruit geënt werd, zijn in de tabellen met
dikke cijfers gedrukt. Werd uit meer dan één verdunning geënt,
dan werd die, waarmee verder niet gewerkt werd cursief gedrukt.

De reden, waarom al spoedig de Gassner-agar voor die van
Endo verlaten werd, was gelegen in het feit, dat, hoewel hierop
zich steeds ronde glanzende blauwgroene, soms ook donker- of
hchtgroene kolonies van 1—2 mm doorsnede fhnk ontwikkelden, de
typische blauwkleuring dikwijls erg onduidelijk was.

(Ter controle werden Gassnerplaten met druppels faecesbrei
geënt, en andere met een druppel 0.1 N. HCl, en gedurende 12 uur
in de broedstoof bij 37° C. geplaatst. Duidelijke blauwkleuring ont-
stond niet steeds. Mogelijk is dit een gevolg van een iets te groote
alcahteit van den bodem geweest; ook is het vermogen om zuur te
vormen uit lactose bij de verschillende stammen van coli-achtigen
zeer verschillend ontwikkeld {Lipska) ).

De gebruikte Endo-agar was bereid volgens het recept van
Genung en Thompson, welk procédé mij zeer goed heeft voldaan.

Dit recept luidt als volgt:

a.nbsp;vleeschextract v. Liebig.......... 5 grin

b.nbsp;Pepton Witte............. 10 grxn

c.nbsp;Aq. destill...............1000 cc

d.nbsp;Agar-agar............... 30 grm.

Eerst a en b in c oplossen, daarna d toevoegen en 20 minuten in

den autoclaaf steriliseeren.

Daarna door een sterielen filter in steriele kolfjes filtreeren, nadat
er 10 gram lactose aan is toegevoegd. Vervolgens weer 15 min.
steriliseeren. De pH moet zijn 7.2 a 7.4.

Aanbevolen wordt, om hiervoor van 1 cc gesmolten agar op 4 cc
heet aq. destill. de pH te bepalen (met broomthymolblauw in den
eomparator). Van dit voorschrift is door ons afgeweken, omdat de
pH bepaling in den onverdunden opgesmolten agar ons beter

voldeed.

Vlak vóór het tijdstip waarop de platen worden gegoten, wordt
bij elk opgesmolten kolfje van 100 gram gevoegd 10 cc van een
% zuivere natriumsulfietoplossing, waarin 0.5 cc van een ver-
zadigde alcoholische oplossing van basische fuchsine zijn ontkleurd.
De platen moeten na het gieten uitdampen en harden, waarvoor
gewoonlijk enkele uren voldoende zijn. Met deze platen heeft men
geen last van een te spoedig terugkomen van de roode fuchsine-
kleur, hetgeen bij andere variaties van dezen bodem nogal eens
hinderlijk kan zijn voor het zuivere bepalen der kleur van de zich
ontwikkelende kolonies.

Genoteerd werd na 20 ä 24 uur bebroeden bij 37° C.: dichtheid
van den groei en kleur der kolonies, en ook vaak hun vorm en
grootte, en eventueelen (metaal-)glans. G en T, en met hen vele
anderen beschrijven B. coli als donkerroode, tamelijk platte groen-
achtig-metaalglanzende kolonies; B. aërogenes zou grootere, meer
convexe en paarsroode, niet-metaalglanzende kolonies geven.
2. Tweede bewerking.

Van deze ,.selectievequot; platen werd overgeënt op gewonen schuin
gestolden 1 y^ % bouillonagar; hierop kreeg ik zonder uitzondering
goeden groei, bij een broedtemperatuur van 37° C..

De groei op agar was bij alle stammen een flink glanzend droog
beslag, wit met iets gelen tint, en bij schuin doorvallend licht zwak
iriseerend. Slechts bij 3 stammen was de groei iets slijmig.

Van de 24 uur oude agarcultures, waarvan kleur en groeiwijze
werden genoteerd, werden uitstrijkjes gemaakt, en gekleurd vol-
gens Gram. Tevens werd een steekcultuur in bouillongelatine
( 12% ) aangelegd, welke laatste 7 dagen werd geobserveerd (langer
was om practische redenen aanvankelijk niet goed mogelijk).

3. Nadere determineering van de kiem.

Het beslag op agar werd met eenige cc physiologische NaCl-
oplossing afgespoeld en daarna opgezogen in een steriele pipet.
Vervolgens werden hiermee één of enkele druppels geënt op Chal-
mers bodems met lactose, glucose, saccharose, galactose, maltose
en manniet, op gesteriliseerde ondermelk in buizen, op gewoon
peptonwater volgens Lerner, en hetzelfde met l^/oo carbol {van
Vincent), op neutraalroodbouillon v. Vassileff, en op 1% glucose-
peptonwater (voor de Methylrood- en de Voges-Proskauerreactie),

Toegepast werd dus het enten met groote hoeveelheden cultuur
(heavy inoculation).

Suikerbodems, Het recept voor de Chalmers suikerbodems is
alreeds aangegeven. Van de monosacchariden werd Yi % concen-
tratie genomen, van de disacchariden 1%. De suikerbodems werden
5 X 24 uur geobserveerd op gas- en zuurvorming.

De ondermelk werd in buizen van 10 cc 3 dagen achtereen tel-
kens gesteriliseerd gedurende 15 à 20 minuten op 100 à 105° C.;
controle op coagulatie, gas- en weivorming vond plaats gedurende
5 dagen.

Peptonwater v. Lerner. De samenstelhng en bereiding hiervan
is al bekend. De carboltoevoeging vond plaats vlak vóór het enten
(4 druppels van een 5% carboloplossing op 10 cc peptonwater —
flink omschudden). In peptonwater met en zonder carbol werd na
2 X 24 uur gereageerd op indol volgens de reeds beschreven
methode van Ehrlich.

Neutraalroodbouillon v. Vassileff, Deze werd gedurende 5 X 24
uur nagegaan op kleursverandering en fluorescentie.

Voor de Methylrood- en de Voges-Proskauerreactie werd ge-
bruik gemaakt van het voorschrift van Tanner en Levine. Het glu-
cosepeptonwater hiervoor had een concentratie van 1 % van beide,
en bevatte tevens Y2 % K2HPO4. Het werd in buizen van 10 cc
gedurende 5 X 24 uur bebroed bij 37° C.

De methylroodreactie vond daarna plaats, door bij 5 cc van den

bodem 5 druppels te voegen van een oplossing van 100 mgr. me-
thylrood in 300 cc alcohol 96% — aangevuld tot 500 cc met aq.
destill.

De Voges-Proskauerreactie geschiedde, door bij de resteerende

5 cc te voegen 5 cc 10% KOH-oplossing, en 12 uur bij kamer-
temperatuur te laten staan.

Bij een positieve methylroodreactie was de roode kleur duidelijk
(aangegeven door ). Bij een positieve V.P.-reactie was er na
12 uren een duidelijk oranjeroode verkleuring (in de tabellen even-
eens aangegeven door ).

Zwak verloopende reacties zijn aangegeven door ( ), en nega-
tieve door —.

De beweeglijkheid der gevonden kiem werd bepaald óf wel direct
in een druppel van de afspoeling, of nadat de afgespoelde cultuur,
waarin een restje spoelwater gelaten was, weer eenige uren in de
broedstoof had gestaan. Zij werd aangeduid als ! (sterk),
(matig), ( ) (zwak), (( )) (zeer zwak), en O (niet be-
weeglijk).

D. Identificatie der gevonden kiemen.

Ingevolge de vroeger gegeven definitie van coli-achtigen werd
dus nader nagegaan van de gekweekte kiem:

1- Vorm en Gramkleuring

2.nbsp;Vergisting onder zuur- en gasvorming
in een miheu van ^ % Na-taurocholaat
bij 37° C. van lactose, glucose, galac-
tose, maltose en manniet

3.nbsp;Coagulatie van ondermelk binnen 5
dagen, al of niet met gas- en weivorming

Neutraalroodreductie
5. Beweeglijkheid

Als eigenschappen,
die, hoewel vaak
aanwezig, worden
beschouwd als niet
geheel en al con-
stant te zijn.

6.nbsp;Saccharosevergisting in % Na-tauro-
cholaatmilieu

7.nbsp;Groei en indolvorming in peptonwater
met en zonder l^/oo carbol

8.nbsp;De methylroodreactie

9.nbsp;De Voges-Proskauerreactie

10. Het gedrag in gelatinesteekcultuur

Ter event, onder-
scheiding van coli-
achtigen en aëroge-
nes-achtigen.

Van de glucosevergisting bij 45° C. en de citraat- en urinezuur-
milieus v. Koser is dus geen gebruik gemaakt voor de nadere
determinatie, eerstens wegens het te veel aan benoodigd materiaal,
en bovendien omdat over deze methoden de berichten der verschil-
lende auteurs sterk uiteen loopen, en dikwijls ongunstig zijn.

In de tabellen zijn de navolgende afkortingen opgenomen:

De teekens ( ) en ( ( ) ) geven aan een zwakke, resp. zeer
zwakke reactie e.d., het teeken ! een sterke.

In de rubriek „conclusiequot; is ingevuld het type der event, gevon-
den cohstammen, ingedeeld naar de M.R.- en de V.P.-reactie,
waarbij de navolgende interpretatie geldt:

c! : klassieke faecale coh, die behalve de reeds genoemde alge-
meene eigenschappen, de volgende bezit:

M.R. , V.P. —.

Groei en indolvorming in peptonwater met en zonder carbol-
toevoeging.

Neutraalroodverandering onder geelkleuring en fluorescentie.
Geen gas- en soms ook geen zuurvorming uit saccharose.
Meestal duidelijk beweeglijk.
In gelatinesteekcultuur treedt geen vervloeiing op.

(c): een type, dat volgens de V.P.- en de M.R.-reactie bij de
faecale coli hoort, maar er toch in een of meer der boven-
genoemde eigenschappen van afwijkt,
i : een intermediair type, waarbij de M.R.- en de V.P.-reactie

beide positief verloopen.
(a): een type, dat volgens M.R.- en V.P.-reactie tot de klassieke
aërogenesgroep behoort, maar niet in het bezit is van één of
meer eigenschappen, die aan deze groep worden toegeschre-
ven.

: het klassieke aërogenestype, M.R. — en V.P. .
O : er is niets gekweekt, of wel de geïsoleerde kiem is geen coli-
achtige.

Tenslotte zijn gegeven een samenvatting over dit eerste deel van
het onderzoek, en de daaruit voorloopig te trekken conclusies.

64

Na 24 uur
op schuine
agar

als boven

flinke groei
van tamelijk
donkergroene
glanzende
kolonies

tamelijk flinke

groei van
donkergroene
iets mattere
kolonies

OPMERKING: De uit peptonwater v. Lerner gekweekte stam heeft wel zeer veel
coli-eigenschappen, mag nochtans niet tot de coli-achtigen gerekend worden,
daar uit glucose géén gas wordt gevormd.

^ort. Rauwe morgenmelk van eigen vee d.d, 10-lII-'33.
^erfcomsC. S te B. Monsfername 10-lII-'33 7.30 v.m.

^ezet 11-111-33 4 u. n.m., nadat het monster vanaf 10-III-'33 des n.m. 4 uur
in het ijs had gestaan, en nadat het gewone laboratoriumonderzoek er aan
vohrokken was. Het monster was dus vrij oud en tamelijk ruw behandeld.

Beoordeeling na

48 uur

kleur

licht rood
rood

geen groei

kleurnbsp;gas

niet ingezet
witrose
wit
wit

kleur

geel

gas

!

kleur

geelgroen

groei

indol O
O

.. ( )

geel
roodgeel

onstername. 10-III-'33 v.m. 8.15.

de ijskast. 10-III-'33 n.m. 4 u.
ingezet. Na het gewone laboratoriumonderzoek op ll-lII-'33 n.m. 4 u. Monster was

als boven,
kolonies iets

onregel-
matigen rand

flinke groei
glanzende
lichtgroene
kolonies met
iets onregel-

geënt, geen
groei

als bo'

als bo^

als bo'

^oort Morgenmelk (rauw) van eigen vee d.d. 17-III-'33.
herkomst, v. B. te A.
^onstername. 17-IlI-'33 v.m. 10 uur.

ijskast. 17-III-'33 v.m. 10.15 uur.
ingezet. 18-III-'33 n.m. 3 uur.

niet geënt, daar de voorraad van dezen bodem was opgebruikt.

als boven

als boven

20-111 geen
groei, weer ge-
ënt, 22-111,
slechte groei
van gele en
doffe licht- en
donkergroene
kolonies en
enkele licht-
groene glan-
zende spelde-
knopgroote

spaarzame
groei v. licht-
groene glan-
zende kolo-
nies, 1 a2 mm.

Soort. Morgenmelk (rauw) van eigen vee van H. te A., d.d. 17-lII-'33.
Monstername. 17-111 10 uur v.m.
In ijskast. 17-111 10.15 uur v.m.
Ingezet. 18-111 ± 3 uur n.m.

Tegelijkertijd werden van monster 4 op den bodem van Vassilefi^ verdunningen
ingezet bij 37 ° C; het verloop hiervan was:

Bij overenten op Gassner-
agar ontstonden ook hieruit
(groei?) glanzende licht- en donker-
groene kolonies.

Na 20 ä 24
uur op
Endo-
agar

in beide flinke

groei van glan-
zende roode
kolonies 1 —2
mm. doorsnee-
Verder ge-
werkt met II

als boven als boven

als boven

als boven,
kolonies
1—3 mm.
Sommige
dofïe randzóne

Opmerking. Indolvorming (( )) in peptonwater bij de te identiflceeren stammen
beteekent, dat alleen een iets roode tint Is te bespeuren als het licht in de
lengte door de buis valt.

Soort. Rauwe morgenmelk van eigen vee d.d. 23-III-'33.

Herkomst. Z. te H.

Monsiername. 23-111, 9.15 uur v.m.

In ijskast. 23-III, 4 uur n.m.

Ingezet. 24-III, 5 uur n.m.

Na 20 ä 24
uur op
Endo-
agar

flinke groei v.
roode kolo-
nies, deels
glanzend,
deels dof,
1—3 mm.

als boven

groei

geel
rood