HET PROBLEEM DER ACTIEVE
IMMUNISATIE VAN PLANTEN
TEGEN PSEUDOMONAS
TUMEFACIENS SMITH
EN TOWN.

HET PROBLEEM DER ACTIEVE IMMUNISATIE
VAN PLANTEN TEGEN PSEUDOMONAS TUME^
FACIENS SMITH EN TOWN.

HET PROBLEEM DER ACTIEVE
IMMUNISATIE VAN PLANTEN
TEGEN PSEUDOMONAS TUME-
FACIENS SMITH EN TOWN.

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT
OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS
Dr.H. BOLKESTEIN. HOOGLEERAAR IN DE
FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJSBE-
GEERTE. VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE
BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER
WIS-EN NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN
OP MAANDAG 8 JULI 1935. DES
NAMIDDAGS TE 5 UUR

Nu ik aan het einde van mijn studie ben, wil ik gaarne allen,
die mij daarbij geholpen hebben, danken.

Hooggeleerde W e s t e r d ij k. Hooggeachte Promotor, dit geldt
in de eerste plaats U. De tijd dien ik in Baarn doorbracht, zal mij
als een mooie herinnering bijblijven.

Ik stel de groote vrijheid die U mij bij dit onderzoek liet zeer
op prijs en in het bijzonder dank ikll voor de tegemoetkomendheid,
die ik bij de snelle afwerking van mijn proefschrift van U mocht
ondervinden.

Hooggeleerde Went, zeer veel heb ik van U geleerd, en daar-
voor betuig ik U hier mijn groote dank.

Hooggeleerde P u 11 e, het begrip dat U mij van de planten-
systematiek hebt bijgebracht stel ik op hoogen prijs. Zeer genoe-
gelijke herinneringen bewaar ik ook aan de excursies naar onze
hoogvenen, die ik onder Uw leiding mocht meemaken.

Hooggeleerde Jordan, aan Uw onderricht heb ik een helder
inzicht te danken in vele algemeene problemen en dit heeft mijn
gedachten verdiept, iets waarvoor ik U niet erkentelijk genoeg kan
zijn.

Hooggeleerde Nierstrasz, Uw colleges blijven mij steeds in
de aangenaamste herinnering.

Hooggeleerde Koningsberger, tot mijn groote spijt kon
ik door omstandigheden niet nader met U kennismaken.

Zeergeachte Heer van L u ij k, wat U als raadsman in de meest
verschillende zaken voor een practicant beteekent, is niet makkelijk
uit te drukken. Ik ben U buitengewoon erkentelijk voor Uw kritiek
en behulpzaamheid.

Zeergeachte Heer Florschütz, het was een prettige tijd,
toen U mij in het veenonderzoek inleidde. Ik dank U voor het vele
belangwekkende, dat ik van U leerde.

Hier is het ook de plaats mijn vrienden, in het bijzonder die,
waarmee ik zoo veel moois beleefd heb in het huis op de Oude
Gracht, mijn warmen dank uit te spreken voor alles wat zij voor
mij gedaan hebben.

Liselotte, al zal je het zeker niet goed vinden, toch wil ik
je hier bedanken voor den buitengewoon grooten steun, die jij voor
mij bent geweest bij het werk!

Allen die mij verder nog zoo behulpzaam zijn geweest bij het
samenstellen van dit proefschrift zeg ik hier mijn hartelijken dank.

Het laboratoriumpersoneel ben ik zeer erkentelijk voor de bij-
zondere hulpvaardigheid.

Ten slotte rest mij nog de aangename plicht de Stichting „Willie
Commelin Scholtenquot; dank te betuigen voor de gastvrijheid, die zij
mij heeft verleend.

Het probleem van de actieve immuniseering der planten houdt in
de laatste jaren de phytopathologen hoe langer hoe meer bezig.

Alvorens ik tot een bespreking van de literatuur en de door mij
als bijdrage tot dit probleem verrichte proeven overga, lijkt het mij
goed de vraag te beantwoorden of een experimenteele, actieve
immuniseering van planten in principe mogelijk te achten is.

Een bezwaar, dat velen zullen aanvoeren is, dat de plant geen
gesloten vaatstelsel bezit en ook voor het overige niet als een geheel
reageert, zooals een dier.

De tegenstanders van de invoering der immunisatiebegrippen in
de botanie verstaan dus onder immunisatie in de eerste plaats een
immunisatie van de plant als geheel.

Dit lijkt mij niet juist. Wanneer men bijv. zou kunnen aantoonen,
dat een plant als reactie op een parasiet, die men er in brengt, op de
infectieplaats stoffen vormt, die deze parasiet dooden of in den groei
verhinderen, dan is dit m.i. reeds een voorbeeld van een actieve
afweerreactie van de cellen, die deze stoffen geproduceerd hebben.
En dezen vorm van locale immuniteit bij planten zal men waar-
schijnlijk vaak vinden, waar een plant een parasiet binnen bepaalde
grenzen houdt, zonder dat men mechanische of andere, van te voren
reeds aanwezige belemmeringen voor de indringer kan ontdekken.

Zeker aangetoond zijn deze locale afweerreacties bij het „sym-
biotischequot; proces, dat zich in orchideeënwortels afspeelt.

Met groote mate van waarschijnlijkheid zijn ze waargenomen in
de wortelknolletjes van Leguminosen.

In de tuberkels van de olijf, veroorzaakt door Bacterium Savas-
tanoi, wordt een stof gevormd, die deze bacteriën agglutineert.

constateeren de interpretatie van hun ontstaan zeer voorzichtig ge-
Wen HeMs nl. bekend, dat stoffen in planten voorkomen die
r ? W karaLr van afweerstoffen bezitten maar niet specifiek
' kt Deze stoffel die steeds in die planten optreden en dus niet
d z^n tengevolge van het een of andere parasitaire proces,
furnTn mquot;LtLrtgeli3ke stoffen in bloedserum van dieren

gevallen, die men in de natuur waar kan
.Sn Lt niet uitgesloten te achten, dat men planten kunstmat g
Ckunln mmunisLen, door er toxinen van de parasieten op m
tei Cken. Wellicht kan men het doel beter bereiken door de
planten Te besmetten met verzwakte cultures van de schimmels of

'quot;h? bovenomschreven standpunt tegenover het —e.s-
probleem, dat wordt ingenomen door C a r b o n e en A ^ ^ ^ '
r äumann en anderen, lijkt zeer aannemelijk De beide
^eLemde auteurs zijn echter wel wat snel geneigd, om m de resul-
ïten van proeven öf slechts in gering aantal öf zonder voldoende
ris^^omen, - bewijzen vannbsp;rTrSX^

retorriïrenr^^tcSjSrL gevolg zijn van een
t greet plant doortrekkende afweerreactie De meeste uitkom^
ften die zij o'p dit gebied hebben gepubliceerd, kunnen evengoed
verklaard lorden door aspecifieke invloeden aan te ---

Het is dus het doel van dit onderzoek na te gaan. of ^et mog^ k
,3,quot;de gevoeligheid van planten -- P^^

deze resistentieverhooging van de plant berusr op
stoffen, die direct op de parasiet inwerken

Dat Pseudomonas tumefaciens hier par^-^ ^^
aeschiedde ten eerste, omdat het mi) naar aanleiümg

Tot beter begrip van de door mij genomen proeven volgt in dit
hoofdstuk een kort overzicht van die onderzoekingen, welke zich
met het i m m u n i t e i t s probleem tegen Pseudomonas tumefaciens
bezighouden.

Reeds E. F. Smith (1911) en Brown (1923) was het opge-
vallen, dat planten, die al een gezwel droegen, zich verzetten tegen
een tweede infectie. De gal zou in dit geval kleiner worden. Smith
gaat er echter niet dieper op in, daar hij vermoedt, dat de bacterie-
stam zijn virulentie verloren had bij de reïnoculatie. Soortgelijke
proeven zijn ook door Arnaudi (1925) uitgevoerd, waarbij hij
constateert, dat reïnfecties slecht lukken, vergeleken met infecties op
controleplanten. Deze proeven worden echter gedaan met een zeer
gering aantal planten. Verder wordt hoegenaamd geen rekening ge-
houden met factoren, die een schijnimmuniteit zouden kunnen ver-
wekken en die natuurlijk bij dezen proefopzet aanwezig zijn. Men
behoeft alleen maar te denken aan de groeiremmingen, die een
plantendeel door de vorming van een gezwel ondergaat.

Later zijn dergelijke proeven gedaan door Redaelli (1934)
met Stapelia. Ook deze auteur vindt geringeren groei van de
gal wanneer geïnfecteerd wordt in de buurt van een reeds aan-
wezigen tumor. Dit schrijft hij toe aan verworven immuniteit, zonder
echter bewezen te hebben, dat hier geen aspecifieke factoren (dus
niet-immunitaire reacties) een rol hebben gespeeld. Overigens is
het aantal planten waarmee hij werkte slechts gering.

cfe ter nX vinden, da. de geb.uik.e baCeries.am besmet was
, tocteriophaag. Deze wordt doo, hen geïsoleerd u.t de ge-
r:elL„ L Z Ch'ester bovendien ult;t stenge.stutten van

^'TlTauUTTl^rrd inoculatteproeven, waarb, hj de
ba te ioiag - die hi( uit de t„n,ore„ had geïsoleerd - al o n.e
teTarlt de baeteriën welke voor de infeetie «aren bestemd. De
Seäierplanten. die 1 s r a i 1 s k y voor deze proeven gebru.kt.
tegen inderdaad minder gezwellen, wanneer zi ge.noculeerd
J „ ™,t bacteriën phaag, dan met bacteriën alleen.

evquot;ueele rol van de bacteriophaag b.) de immunitei«ver»h,nsel n
zooals die door S mi t h, C a r b o n e en Ar na ^^^^

de Se tegengaan. Voor zoover dat uit zijn slotconcWs ts op
tnbsp;de'ktli) aan een „passieve' immuniteit, waarbt, dus de

Äen Grund zu behaupten, ^-yLÄ B^e^:
Bakteriophage sich bei der Symbiose d«nbsp;^^

s'r a i 1 s k y komt tot deze conclusie, daar hij uit den inoculatie-
stam van ~o.as .a.efaden. dien hij gebruikt had, geen

phaag kon isoleeren. Evenwel verliest deze bewijsvoering alle kracht,
daar hij later (1927) vindt, dat oude cultures van dezen zelfden

Aangezien dus zoowel bij C h e s t e r als bij I s r a i 1 s k y de
inoculatiestammen reeds met phaag besmet waren, lijken mij de op-
vattingen vanisrailsky enGäumann in verband met het
ontstaan van de phaag in de tumoren onwaarschijnlijk. Deze
is er natuurlijk ingekomen tegelijk met de geïnoculeerde bacteriën.

Hoe zou men zich dan echter het mechanisme van een eventueel
beschermende werking van deze phaag moeten voorstellen? Dit zal
al naar omstandigheden verschillen. Voor het geval dat een reeds
aanwezig gezwel een nieuwe infectie vertraagt of verhindert, moet
men of een virulentieverhooging van de phaag of een resistentie-
vermindering van de bacterie aannemen. Beide veranderingen moe-
ten onder invloed van de plant tot stand komen.

Al roept men dus de phaag te hulp, dan nog schijnt het mij on-
mogelijk een dergelijk proces te verklaren zonder de plant in deze
hypothese een actieve rol te laten spelen.

Met deze verklaringsmogelijkheden moet men natuurlijk rekening
houden. Evenwel ook de hier volgende factoren dienen onderzocht
te worden.

Een tumor remt waarschijnlijk, zoo al niet den groei van de ge-
heele plant, dan toch die van het plantendeel, waarop hij zich
bevindt. Een tweede inoculatie in de buurt van de eerste infectie
zou dus wel eens minder goede gezwellen kunnen opleveren ten-
gevolge van deze groeibelemmering.

De groeivertraging van het plantendeel zelf moet te constateeren
zijn door meting. Waar zij door veroorzaakt wordt, blijft onver-
klaard. Het kunnen vele oorzaken zijn (tekorten aan auxine, bios,

Het is evenwel duidelijk, dat resultaten, die zich alleen baseeren
op metingen der gezwellen, in verband met het bovenstaande
weinig zeggen.

Andere factoren, die den schijn van immuniteit kunnen verwekken,
zijn geringe verschillen in ouderdom van de geïnoculeerde planten-
deelen.

Verder hebben S t a p p en B o r t e 1 s (1931) geconstateerd dat
bloeiende of vruchtzettende planten kleinere tumoren geven dan die.

waarvan men steeds de bloemknoppen afsnijdt. Nadere gegevens
over deze proeven vindt men op pg. 17. Op het zoo juist genoemde
verschijnsel lijkt het gedrag van de bacteriën in wortelknolletjes van
Leguminosen. Volgens Cappelletti wordt n.1. de ontwik-
keling van deze bacteriën plotseling geremd, wanneer de planten
gaan bloeien.

Resumeerende kan men dus ter verklaring van den vertraagden
kankergroei bij reïnoculatie, geconstateerd o.m. door A r n a u d i,
de volgende mogelijkheden aanvoeren:

I.nbsp;De 1ste kanker werkt vertragend op den groei van de plant.
Hierdoor groeit een herinfectie eveneens langzamer.

II.nbsp;Er is niet voldoende op gelet, of proef- en controleplanten
even oud zijn, iets waar men vooral bij klein plantenmateriaal groote
fouten mee kan maken.

III.nbsp;Aangenomen dat punten I en II gecontroleerd zijn en dat
proef- resp. controleplanten zich wat dat aangaat in gelijke con-
dities bevinden, moet men wel aannemen, dat de 1ste kanker op de
een of andere wijze de bacteriën op de tweede inoculatieplaats in
hun groei remt (Illa) of hun uitwerking vermindert (Illb).

Illa. Remming van de bacteriën in hun groei kan tot stand
komen door diffusie van stoffen uit het kankerweefsel in het aan-
grenzende gezonde weefsel. Deze stoffen kunnen zijn:

3.nbsp;Bacteriophaag. Daar deze met de bacteriën bij de 1ste inocu-
latie in de plant is gekomen, en de bacteriën toen — niettegenstaande
deze phaag — groote kankers verwekten, is het niet goed mogelijk,
het diffundeeren van phaag alleen voor de remming van de bacteriën
bij een herinoculatie verantwoordelijk te stellen. Men moet er wel bij
aannemen, dat, of deze phaag in den Isten kanker zijn virulentie
verhoogt, of de bacteriën op de 2de inoculatieplaats verzwakt wor-
den door de stoffen onder 1 en 2 bedoeld, en zoodoende gemakke-
lijker ten prooi vallen aan de phaag, waarmee zij besmet zijn en die
eventueel nog quantitatief versterkt wordt door de vanuit het ge-
zwel gediffundeerde phaag.

Illb. Vermindering van de uitwerking der bacteriën bij een her-
inoculatie door den Isten kanker. Deze mogelijkheid is zuiver theo-

retisch doch mag bij een analyse van dit „immuniteitsquot;-verschijnsel
niet buiten beschouw^ing blijven.

Ook hier moet men m.i. weer aan het diffundeeren van stoffen
uit den Isten kanker denken.

Aangenomen dat de „prikkelsquot;, die de bacteriën op het cel-
deelingsproces uitoefenen, identiek zijn met de werking van be-
paalde stoffen die zij vormen, moet hier gedacht worden aan
stoffen, welke de plant vormt en die eerstgenoemde, de celdeeling
stimuleerende stoffen op de een of andere wijze neutraliseeren in
hun uitwerking.

De in dit onderzoek gebruikte proefplanten waren: Ricinus com-
munis var. major, Bryophyllum crenatum, Impatiens balsamina en
Pelargonium zonale var. Miss Calvin.

Ricinus werd gezaaid in steriel zand of niet sterielen turfmolm.
De zaden werden ± 0,5 uur m%% Ceresan gedesinfecteerd. De
kieming verloopt dan zeer goed, vooropgesteld dat het zaad niet te
oud is en de kiemingstemperatuur minstens 25° C. bedraagt. In
koudere omgeving krijgt men gauw last van infecties door Pythium-
soorten in de wortels. Ook zag ik vaak, dat de hypocotylen blauw-
zwarte strepen gaan vertoonen, waarna de cotylen afsterven. Dit
verschijnsel wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een bacterie in
de vaten.

Wanneer alles naar wensch verloopt is het mogelijk om 10 dagen
na de kieming de plantjes te verspenen. Bij het verspenen werden
steeds planten uitgezocht met roode hypocotylen.

Het zaadmengsel, dat ik gebruikte, bleek zeer heterogeen te zijn.
Behalve het bovengenoemde type leverde het verder nog op: Planten
met groene hypocotylen en zulke met roode hypocotylen, die bedekt
waren met een waslaag. Een meer constant mengsel was niet te
krijgen.

Daar deze verschillende types ongelijk gevoelig zijn voor Pseudo-
monas tumefaciens, was het zeer gewenscht één type uit te zoeken.

De roodstammige varieteit werd genomen, omdat deze het meest
voorkwam en vrij gevoehg was.

Hier — evenals bij alle andere proefplanten — werd steeds ver-
plant in potten, gevuld met ongesteriliseerde, gezeefde bladaarde.
In dit geval stonden in eiken pot 2 Ricinusplanten. Waar niet anders
vermeld wordt, hadden de potten een diameter van 15 cm.

De planten stonden in een experimenteerkas, waarvan tempera-
tuur en vochtigheid slechts binnen vrij wijde grenzen te regelen
waren. De potten werden ingegraven in turfmolm, zoodat ± % van
den pot bedekt was.

Bij het begieten van pas geïnfecteerde planten werd steeds zorg
gedragen, dat de inoculatieplaatsen niet nat werden.

Hiervan werden in hoofdzaak planten gebruikt, die ik verkreeg,
door enkele groote bladen van een plant af te snijden en ze te laten
uitloopen in petrischalen. De jonge plantjes werden voorzichtig van
de bladen losgemaakt en overgeplant in de potten.

Hier kwamen telkens 4 planten in eiken pot. Bryophyllum werd
gebruikt omdat verwacht mocht worden, dat de zoo verkregen
planten zeer regelmatig zouden reageeren.

Deze planten werden uitgezaaid. Bij het verspenen werden zoo-
veel mogelijk gelijk groote planten uitgezocht. De jonge planten
werden weer direct in de potten overgezet, en wel telkens 4 per pot.

Van deze plant werden voornamelijk stekken gebruikt, die ik in
de maanden Augustus—October sneed. De planten, die de stekken
leverden, stonden buiten in den vollen grond.

Steeds werden niet-bloeiende jonge loten uitgezocht. Ze werden
door een snede loodrecht op den stengel vlak onder een blad-

1nbsp; Den heer A. Knol, hortulanus van Cantonspark, dank ik ten zeerste voor
de bereidwilligheid, waarmede hij mij materiaal van Bryophyllum en Pelargonium
beschikbaar stelde.

aanhechting afgesneden. Daarna werd(en) de onderste bladsteel of
-stelen langs den stam verwijderd, zoodanig dat een stuk van den
bast werd weggesneden. Op die manier verkreeg ik stekken m^et
wigvormig ondereinde. Elke stek droeg 3—4 bladen vegetatietop.
Na ± 24 uur droog gelegen te hebben — om rotting te voorkomen
— kwamen de stekken op erlenmeyers met leidingwater. Door
middel van stijf om den stengel heengedraaide watten konden de
stekken stevig in den hals van de erlenmeyers bevestigd worden.
Na eenigen tijd werd het water vervangen door de proefvloeistoffen.
die bij de proefbespreking zelf precies opgegeven zullen worden, en
die op hun beurt weer door water werden vervangen. Vervolgens
kwamen de stekken in potten met aarde. In eiken pot van 10 cm
, diameter werd een stek geplant. In deze potten had de inoculatie
plaats. De tijden, die tusschen al deze manipulaties verliepen, vindt
men bij de proefbespreking zelf opgegeven.

Alle definitieve immuniseeringsproeven werden gedaan met
Pseudomonas tumefaciens stam 245. Deze is geïsoleerd uit Pims
communis door Bela Hus en sinds 1932 op het Laboratorium
„Willie Commelin Scholtenquot; aanwezig. In het begin van dit onder-
zoek had ik evenwel de keuze uit verschillende stammen. Behalve
de bovengenoemde waren op het laboratorium nog aanwezig: de
stammen Pfältzer, III en 261.

De stam Pfältzer werd in 1929 geïsoleerd door Pfältzer uit
gezwellen van Ricinus. Deze stam gold als zeer virulent.
Bij cultuur in vloeibaar mout heeft zich deze stam in 2 componenten
gesplitst, die in het vervolg a en b genoemd worden. Deze sphtsing
bleek bij uitzaaiing van deze vloeibare moutculture op petrischalen
met moutagar. Hierbij ontstonden duidelijk 2 types van kolonies.

De stam III werd in 1927 door Van der Veen geïsoleerd
uit gezwellen van de spruitbasis van framboos. Deze stam is volgens
opgave virulent en wel dateert deze mededeeling van 1932.

Stam 261 werd opgestuurd door B e 1 a H u s en is afkomstig
uit Humulus lupulus. Dateering 1932. Zeer virulent.

Enkele karaktertrekken van bovengenoemde stammen in rein-
cultuur en hun tegenwoordige virulentie wat het vormen van

tumoren aangaat worden in het hoofdstuk „oriënteerende proevenquot;
besproken (pg. 13).

Van de bekende inoculatiemethodes werd de eenvoudigste ge-
kozen, n.1. het prikken met een besmette naald. Ik inoculeerde steeds
in stengeldeelen. Meestal werd voor dit doel van te voren een
suspensie van de bacteriën in steriel water gemaakt, waarmee dan
de naald werd besmet (methode I). Daar het in het geheel niet
onverschillig is, welke weefsels van een plant men treft, werd voor
de zekerheid de naald steeds door den geheelen stengel heenge-
stoken.

Bij sommige proeven werd de naald direct met de bacterie-kolonie
besmet, dus werd deze dan niet gesuspendeerd (methode II). Een
derde inoculatiemethode is de volgende: Eerst werden met een
steriele naald wonden gemaakt, door de naald door het geheele
plantendeel heen te steken. Vervolgens werden deze wonden aan
beide zijden van den stengel ingesmeerd met de bacterie-suspensie
(methode III).

Of de methode I, II dan wel III werd gebruikt, vindt men bij de
proeven zelf vermeld.

Ook wordt daar opgegeven, hoe oud de bacteriën waren, bij
welke temperatuur zij gegroeid hadden enz.

Hiervoor gebruikte ik een eenvoudig instrument, dat het mogelijk
maakte, direct de dikte of lengte van een gezwel of plantendeel af
te lezen. Dit instrument draagt in den handel den naam ,,metalen
schuifmaatquot;. Voor het meten van groote maten werd een gewoon
meetlatje gebruikt.

Om eenigszins een controle te hebben op de fouten, die men op
deze wijze ongetwijfeld maakt, werden de tumoren aan het eind
Van een proef vlak langs den stengel afgesneden en direct gewogen.

Voordat ik kon overgaan tot immuniteitsproeven, moesten ver-
schillende kwesties, waarvan men mocht verwachten dat zij de
resultaten konden beïnvloeden, onderzocht worden.

Ten eerste is het absoluut noodzakelijk, te allen tijde te beschik-
ken over een bacteriestam, die 100 % infecties geeft bij alle hier
gebruikte proefplanten.

Ten tweede is het wenschelijk te weten, of geringe verschillen
in de hoeveelheid bacteriën, gebruikt bij elke afzonderlijke inocu-
latie, van invloed zijn op de grootte van de tumoren, die ten gevolge
van die inoculaties ontstaan. Want al tracht men zoo gelijkmatig
mogelijk te inoculeeren, toch zal steeds de eene inoculatieplaats iets
meer of minder bacteriën krijgen dan de andere.

Ten derde zal men, indien de tumoren veranderen in grootte,
wanneer veel of weinig bacteriën worden geïnoculeerd, voor zijn
inoculaties, die tot doel hebben een eventueel ontstane verhooging
in resistentie op te sporen, steeds zoo weinig mogelijk bacteriën
moeten gebruiken, aangezien men dan de meeste kans zal hebben
deze verschillen in resistentie met de controleplanten te ontdekken.

Aan de punten 2 en 3 moet nog een onderzoek worden vastge-
knoopt naar den invloed van het suspensiemedium op de bacteriën,
wanneer deze er langen tijd in verblijven. Dit is n.1. onvermijdelijk
bij eenigszins groote inoculatieseries. Om een reeks van 80 planten
van gemiddeld 2 inoculaties per plant te voorzien, heeft men
± 60 minuten noodig. Het is dus niet ondenkbaar, dat de bacteriën
tegen het einde van de inoculatiereeks min of meer beschadigd zijn.

Ten vierde is het belangrijk te weten, of de plant als geheel of
onderdeelen ervan, door inwendige oorzaken, kunnen veranderen
in hun gevoeligheid voor Ps. tumefaciens, of in hun vermogen
tumoren te vormen.

De boven reeds genoemde bacterie-stammen hebben op moutagar
zeer verschillende groeivormen. Deze zien er als volgt uit:

245. Rond, vrij sterk verheven boven het oppervlak, slijmig en
weinig visceus. Kleur wit-geel.

Pfältzer. Aanvankelijk rond, daarna ontstaan sterke radiaire
plooiingen. Slijmig, maar visceuser dan 245. Kleur geel-wit.

III, 261, a. Ruw, zeer onregelmatig, met wortelvormige uitloopers.
Droog, in het geheel niet boven het oppervlak verheven. Kleur wit.

b.nbsp;Veel op stam Pfältzer gelijkend, evenwel toch goed er van
te onderscheiden. Het voornaamste verschil is in de kleinere plooien
gelegen.

c.nbsp;Typisch een mengsel van a en b. Daar waar beide soorten
contact krijgen, lost een van beide — waarschijnlijk b — op; er
ontstaan op die plaatsen doorzichtige plekken.

Het is uit deze korte opsomming van macroscopisch zichtbare
eigenschappen wel voldoende duidelijk, dat deze 7 stammen groote
verschillen vertoonen. Dit blijkt ook nog bijzonder goed uit de
resultaten van inoculatieproeven, die met alle 7 stammen werden
uitgevoerd:

De voor de volgende proeven gebruikte inoculatiemethode was
methode III. Bij de /?zcinus-planten werd bovendien inoculatie-
methode I met inoculatiemethode III vergeleken, zonder dat hier
een verschil optrad. De bacteriën waren 7 dagen bij 26° C. gegroeid.

Resultaat: Bij het beoordeelen van de intensiteit der infectie
De inoculatie culturen voor alle proeven groeiden steeds op mout-agar.

werd gelet op de afmetingen van de tumoren en het percentage van
de gelukte infecties.

Bij Ricinus veroorzaakten de stammen 245 en b de grootste ge-
zwellen. Inoculaties gaven 100 % infecties. Pfältzer en c gaven
kleinere tumoren. Aantal infecties ± 60 %. Stam a, III en 261 waren
geheel avirulent.

Pelargonium. Ook hier was 245 de beste galverwekker; b en c
waren voor Pelargonium veel minder \'irulent, d.w.z. de tumoren
bleven belangrijk kleiner, alhoewel hier al deze stammen 100 %
infectie gaven. Stam a was ook voor Pelargonium avirulent. Stam
Pfältzer werd bij Pelargonium niet getest.

Impatiens. De stammen b en c verwekten de grootste tumoren,
maar 245 was ook hier sterk virulent. Het verschil tusschen b en c
eenerzijds en 245 anderzijds is zeer gering. Alle drie de stammen
gaven 100 % infectie. Stam Pfältzer was hier bijzonder weinig
virulent, niet alleen kwam dit in de kankergrootte, maar ook in een
zeer laag infectiepercentage tot uiting. Stam a was volmaakt
avirulent.

In het voorjaar 1935 werden nogmaals inoculatieproeven gedaan
met 5 van de bovengenoemde stammen. Als proefplant werd toen
uitsluitend Impatiens gebruikt. Geïnoculcerd werd volgens methode
III. De ouderdom van de bacteriecultures bedroeg 3 dagen, zij
stonden bij 26° C. 48 Planten dienden voor de proeven. De resul-
taten kwamen volmaakt overeen met die van het vorige jaar. Even-
wel was er nu in het geheel geen verschil meer zichtbaar tusschen
de infecties veroorzaakt door de stammen 245, b en c.

Uit deze inoculatieproeven blijkt duidelijk, dat stam 245 vol-
komen beantwoordt aan de boven in punt 1 gestelde eischen, daar
hij niet alleen 100 % infecties levert bij alle hier gebruikte proef-
planten, maar bovendien steeds virulent bleef.

Het tweede punt werd nagegaan door inoculatieproeven bij
Impatiens. Er werden 4 suspensies van stam 245 gemaakt, en deze
suspensies waren onderling zeer sterk verschillend. De dunste was
nauwelijks zichtbaar troebel, terwijl de dichtste bijna ondoorzichtig
was. De twee andere suspensies vormden een overgang tusschen
beide.

Met elk van deze 4 suspensies werden nu 8 jonge balsamienen
geïnoculeerd. Elke plant kreeg een prik in het hypocotyl dicht onder
de cotylen. Geïnoculeerd werd volgens methode III. Het gevolg van
deze inoculaties was bij alle planten een even groote infectie.

Niet alleen kleine, maar ook zeer groote verschillen in dichtheid
der suspensie schijnen dus geen zichtbaren invloed uit te oefenen
op den tumorgroei. Hiermee lijkt de noodzakelijkheid om punt 3
systematisch na te gaan weg te vallen. Wel is waar bestaat natuur-
lijk de mogelijkheid dat men — nog verder verdunnende als hier-
boven gebeurde — een bacterieconcentratie krijgt, die bij inoculatie
in de plant kleinere kankers geeft, als de meer geconcentreerde,
maar evengoed mogelijk en zelfs waarschijnlijker is het, dat hier
een soort alles-of-niets-wet geldt. De hier verkregen resultaten met
inoculaties van bacteriesuspensies van verschillende concentraties
zijn in volmaakte overeenstemming met die van L e v i n e (1922),
die deze kwestie naging voor Pseudomonas tumefaciens en Nico-
tiana tabacum.

De invloed van leidingwater op de bacteriën schijnt mij niet
groot. Daarvoor spreken alleen al de regelmatige resultaten ver-
kregen bij langdurige inoculatieproeven ter testing van de virulentie.

Voor grootere zekerheid werd de volgende proef gedaan: Van
cultures der stammen 245, Pfältzer. a, b en c op mout-agar werden
watersuspensies gemaakt. Deze bleven 30 uur staan. Vervolgens
werd uit deze suspensies overgeënt op mout-agar. Er ontstonden
na een volkomen normalen groeitijd van alle gebruikte stammen
colonies, die geheel de karaktertrekken vertoonden van de cultures,
waarvan de suspensies waren gemaakt. Het lijkt mij dus wel zeker,
dat het leidingwater als suspensiemedium ook voor langdurige
inoculatieproeven geen schadelijken invloed uitoefent op de
bacteriën.

Daar men in de literatuur herhaaldelijk de waarneming tegen-
komt, dat jonge, snelgroeiende deelen de grootste tumoren vormen,
was het gewenscht na te gaan, of deze verschillen in ouderdom

groot moeten zijn om intensiteitsverschillen in tumorgroei te ver-
oorzaken. Dit te weten is natuurlijk van het grootste belang in
verband met het selecteeren van het materiaal, dat later voor
immunisatieproeven dienst moet doen.

Deze proeven werden gedaan met kiemplanten van Ricinus. In
het totaal werden 48 planten gebruikt. Plaats van inoculatie was
het hypocotyl, en wel kregen alle planten daar 4 prikken volgens
inoculatiemethode III. De planten waren in 3 groepen verdeeld n.1.:

De hypocotylen zelf waren bij geen van de drie groepen reeds
volkomen uitgegroeid.

Het resultaat was, dat groep a kleine, gelocahseerde gezwellen,
de groepen b en c daarentegen zeer veel grootere en met het hypo-
cotyl meegegroeide tumoren kregen. Op het einde van de proef was
tusschen de tumoren der groepen b en c weinig verschil meer te
zien, evenwel was het in het begin duidelijk, dat bij de planten van
groep c de tumoren het snelste groeiden, maar de gezwellen bij a
waren zeer duidelijk kleiner dan die van b en c. Een indruk hiervan
geven de photo's 1 en 2.

Deze zelfde proef werd op 13.5.1935 nogmaals aangezet, ditmaal
gepaard met metingen van den hypocotyl- resp. tumorgroei. Het
resultaat ziet men in tabel 1.

Photo 1. — Zie pag. 16. Inoculatiedatum 11, 5.'34
Gephotografeerd op 16. 6. '34.
3 planten uit groep a.

Photo 2. — Zie pag. 16. Inoculatiedatum 11.5.'34.
Gephotografeerd^op 16. 6.'34.
3 planten uit groep c.

bepaalde Stengeldeelen op eenigerlei wijze verbonden moeten zijn
met de snelheid van den tumorgroei en met de definitieve grootte,
die de gezwellen tenslotte bereiken.

Het lijkt waarschijnlijk, dat de verschillen in tumorgroei direct
samenhangen met de groeisnelheid van de Stengeldeelen van ver-
schillenden ouderdom. Het is dus in ieder geval noodig, bij het
uitzoeken van planten voor immunisatieproeven zooveel mogelijk
materiaal van gelijken ouderdom te nemen.

Naar aanleiding van eenige inoculatieproeven, die S t a p p en
Bortels (1931a) deden bij bloeiende en in den bloei kunstmatig
verhinderde planten en de algemeen bekende — hierboven nog eens
herhaalde — proeven, dat snel groeiende plantendeelen grootere
tumoren vormen, dan minder snel groeiende, werden hun proeven
hier herhaald met hun voornaamste proefplant: Pelargonium.

Stapp en Bortels vonden, dat enting van bloeiende planten
minder groote tumoren opleverde, dan enting van planten, waar
voortdurend de bloemknoppen zijn verwijderd. Hun proeven waren
ongeveer als volgt ingericht:

Bij jonge voorjaarsloten van overwinterde planten werden jonge
internodiën geïnoculeerd. Gelijktijdig werden bij enkele planten de
bloemknoppen verwijderd.

Met tusschenpoozen van 4—6 weken werden nogmaals jonge
internodiën aan deze planten geïnoculeerd. In totaal werd elke uit-
jooper 3 maal geïnoculeerd.

Duidelijke resultaten werden bij de laatste inoculaties verkregen.
Hier waren de tumoren bij de bloeiende planten duidelijk kleiner,
dan bij de in den bloei verhinderde planten.

Evenwel, een verschil was ook te zien bij de gezwellen van de
eerste inoculaties, maar in een ander opzicht: Hier vertoonden n.1.
de tumoren bij de bloeiende planten spruitvorming, bij de niet-
bloeiende traden geen spruiten op.

Het verschijnsel, dat de gezwellen van de derde inoculatie kleiner
bleven bij de bloeiende planten, verklaren Stapp en Bortels,
voor zoover dat met zekerheid uit hun conclusies is op te maken,
door de algemeene theorie, dat bloeien en vegetatieve groei elkaar
wederzijds remmen.

Dat zich uit de tumoren der bloeiende planten spruiten ont-
wikkelen, willen de auteurs begrijpelijk maken door een ,,Umstim-

niungquot; van de plant onder invloed van den bloei aan te nemen,
waardoor in plaats van chaotische tumorgroei een geordende
orgaanvorming optreedt.

De proeven van Stapp enBortels werden hier herhaald,
in de eerste plaats door bloeiende en in den bloei verhinderde
planten te inoculeeren in reeds volgroeide internodiën (a);

Voor proef a en proef b werden telkens 40 planten gebruikt. De
proef a werd in het voorjaar 1934, b in het voorjaar 1935 aangezet.

De planten vertoonden een uitgesproken neiging om te bloeien.
Het waren gedurende het voorafgaande najaar gesneden stekken,
die 's winters onder glas buiten hadden gestaan.

Het resultaat van serie a was, dat hoegenaamd geen verschillen
in tumorgrootte tusschen bloeiende en niet-bloeiende planten te
constateeren waren.

Dit is dus in overeenstemming met het feit, dat Stapp en
B O r t e 1 s bij inoculaties in oudere internodiën geen of slechts ge-
ringe verschillen waarnamen.

De resultaten van proef b gaven ook op geenerlei wijze beïn-
vloeding van den tumorgroei door den bloei van de planten te zien,
hoewel deze zeer intens was. Deze proef moest afgebroken worden
op 19.6.'35. Hij stond aan vanaf 14.5.'35. Het is niet onmogelijk,
dat bij längeren proefduur, wél verschillen opgetreden zouden zijn.
Op 19.6.'35 hadden de tumoren van de niet bloeiende planten een
grootte van 0.4, die van de bloeiende planten een grootte van 0.37
bereikt. Deze getallen geven de verhouding aan van den grootsten
diameter van den tumor tot dien van den stengel er vlak onder. Ver-
schillen in vegetatieven groei, die tamelijk sterk was, traden bij de
bloeiende en in den bloei verhinderde planten n i e t op.

Het is natuurlijk nog altijd mogelijk, dat het negatieve resultaat
van deze proeven te wijten is aan het feit, dat alle planten op het
oogenblik der inoculatie reeds knoppen droegen. Hoewel deze en
de zich later opnieuw vormenden zorgvuldig verwijderd werden,
lijkt mij de mogelijkheid niet uitgesloten, dat men, bij gebruik van
planten, waar in het begin van de proef nog geen zichtbare knoppen
ontwikkeld zijn, beter resultaat in den zin van Stapp zal krijgen.
Overigens hebben ook Stapp enBortels gewerkt met plan-

Stapp enBortels vermelden niet, of zij den groei van hun
planten hebben gemeten. Indien deze bij in den bloei verhinderde
planten werkelijk versneld wordt tegenover dien van bloeiende
planten, dan is de versnelde tumorgroei bij de eerste zeer begrijpe-
lijk. Voor het geval, dat geen duidelijk verschil is te constateeren
tusschen den groei der internodiën bij de twee categorieën van
planten, wordt de zaak echter gecompliceerder. In dit geval zou
misschien niet alleen aan een „Umstimmungquot; in den tumor, die
spruitvorming tot gevolg heeft, gedacht moeten worden, maar ook
aan een verhooging van de resistentie tegen de parasiet.

Wanneer hier of in de tabellen op de volgende pagina's gespro-
ken wordt van de lengte en dikte groei van een internodium of van
de lengte groei van een plant in zijn geheel, over een bepaalde
periode, dan wordt daaronder verstaan de verhouding van de
lengte of dikte op de laatste meetdatum tot die van de vorige.

Nadat gebleken is, welke factoren tot fouten aanleiding kunnen
geven, of een schijnimmuniteit kunnen veroorzaken, kan begonnen
worden met de beschrijving van de proeven, die het doel hadden
uit te maken, of planten op eenigerlei wijze tegen Ps. tumefaciens
te immuniseeren zijn.

De hier volgende proeven werden zoo verschillend mogelijk op-
gezet, aangezien het uit de literatuur niet blijkt welke weg zeker en
direct tot het gewenschte resultaat leidt.

1.nbsp;Het inspuiten van stofwisselingsproducten van Pseudomonas
tumefaciens en van de levende bacterie zelf in bladen van Bryo-
phyllum (Hoofdstuk V).

2.nbsp;Het laten opzuigen door Pelargonium-stekken van levende
bacteriën, van hun stofwisselingsproducten en bovendien van tot
100° C. verhitte bacteriën (Hoofdstuk VI).

3.nbsp;Het laten vormen van een gezwel door Ricinus en Pelar-
gonium en vervolgens in de nabijheid van dit gezwel de gevoeligheid
te testen door een tweede inoculatie (Hoofdstuk VII).

Van eenige groote Bryophyllum-planten werden 34 bladen afge-
sneden. Hiervoor werden middelmatig groote bladen uitgezocht,
die zich ongeveer op halve hoogte van de plant bevonden.

Deze 34 bladen werden in 5 groepen verdeeld n.1. 4 groepen van
8 en 1 van 2 bladen.

Nadat de bladen op de hieronder beschreven wijze waren be-
handeld, werden zij 2 bij 2 in petrischalen gelegd. De behandeling
bestond in het injiceeren van 1 ccm vloeistof via den bladsteel in de
bladschijf. Door het donkergroen worden van de bladen — bij het
binnendringen van de vloeistof wordt de lucht uit de intercellulaire
holtes verdreven — tijdens de injectie kan men met zekerheid weten,
dat de proefvloeistoffen werkelijk met elke cel van het blad in
contact zijn gekomen. Deze proefvloeistoffen waren:

a.nbsp;Een ultrafiltraat van een 22 dagen oude cultuur van Ps. tume-
faciens. (Een beschrijving van de filtratietechniek vindt men in
Hoofdstuk X.) Het cultuurmedium, dat in dit geval gebruikt werd,
had de volgende samenstelling: HgO : 1 1; Glucose: 10 gr; Aspara-
gine: 1 gr; K2HPO4 :0,5 gr; MgS04 :0,2 gr; FeS04 :0,1 gr;
MnS04 : 0.1 gr; CaClg : 0,2 gr.

Deze synthetische voedingsoplossing werd overgenomen uit
Stapp en Bortels (1931b).

De petrischalen met de bladen werden vervolgens in een warme
kas in het volle daglicht geplaatst. Na betrekkelijk korten tijd
— ±10 dagen — begonnen de knoppen in de bladmeristemen uit
te loopen en konden bij de bladen zelf kleurveranderingen gecon-
stateerd worden.

Kleur van de bladen, het aantal en de grootte van de plantjes, die
zich uit de meristemen ontwikkelden op 9. 1. '35.
Injectie-datum 13. 12. '34.

Men kan hieruit opmaken, dat inspuiting van de levende bacterie-
cultuur de bladen het sterkste aantast, want bij serie 2 zijn alle
bladen geel geworden. Bijna even schadelijk werkt inspuiting van
het filtraat (serie 1).

De ongebruikte voedingsoplossing (serie 3) heeft evenwel ook
een ongunstigen invloed, daar het aantal gele bladen hier grooter
is dan bij serie 4, waar alleen water werd ingespoten.

per blad 1 ccm van a. ingespoten,
per blad 1 ccm van b. ingespoten,
per blad 1 ccm. van c. ingespoten,
per blad 1 ccm van d. ingespoten,
werd niet ingespoten.

In serie 2 waren meer kleine, nauwelijks ontwikkelde plantjes
te vinden, dan in de series 3 en 4.

Om na te gaan of deze nieuwgevormde planten in hun gevoelig-
heid voor Ps. tumefaciens onder elkaar verschilden, werden van alle
bladen zooveel mogelijk plantjes losgemaakt en op 16.1.'35 over-
gezet in potten met aarde. Den toestand op dezen dag toont photo 3.

Op 26.3.'35 werden van elke serie 16 planten uitgezocht die onge-
veer gelijk groot waren. De gemiddelde hoogte bedroeg 4 cm.
Al deze planten werden nu geïnoculeerd (methode III) in het

Tumorgroei, diktegroei van de geïnoculeerde internodien en
lengtegroei van de geheele plant.

t. gr. = tumorgroei, d. gr. = diktegroei, 1. gr. pl. = lengtegroei geh.
plant. Zie verder de tekst.

oudste internodium. De cultuur waarmede ik inoculeerde, groeide
op mout-agar en was 25 dagen oud (kamertemperatuur).

2.nbsp;de dikte van het geïnoculeerde internodium vlak boven de plaats
van inoculatie (d);

3.nbsp;de dikte van het geïnoculeerde internodium op de plaats van
inoculatie (d');

Uit de zoo verkregen getallen werden gemiddelden berekend. De
tumorgroei wordt hier en in alle volgende berekeningen steeds
weergegeven door de verhouding [(d' — d) : d] X 100.

De diktegroei van de geïnoculeerde stengeldeelen wordt uitge-
rekend voor de periodes, die tusschen de drie metingen in liggen.
Op dezelfde wijze wordt snelheid van lengtetoename voor de ge-
heele plant opgegeven.

Het heeft geen zin hier den lengtegroei van de geïnoculeerde
internodiën op te geven, aangezien deze practisch gelijk O is.

Men kan hieruit zien, dat de tumorgroei bij de series 3, 4 en 5
sterker is, dan bij series 1 en 2, al is het verschil niet zeer groot.

Tevens blijkt, dat zoowel de dikte- als de lengtegroei van de
geheele plant in de periode van 1—12 April over het geheel ge-
nomen grooter is bij de series 3, 4 en 5, vergeleken bij series 1 en 2.
Dit verschil verdwijnt in de periode van 12.4.'35—30.4.'35, daaren-
tegen wordt de achterstand in tumorgroei niet ingehaald.

Het is duidelijk, dat deze proef herhaald zou moeten worden,
wil men er met volkomen zekerheid gevolgtrekkingen uit opmaken.
Daar er echter veel tijd mee gemoeid is, kon dit in verband met
andere proeven niet meer gebeuren.

Bij de slotconclusies wordt nog verder op de uitkomsten van deze
proef ingegaan.

Het is bekend [Smith (1921), Levine (1919)], dat aan deze
plant bijzonder snel okselknoppen tot zij spruiten uitloopen, indien
vlak onder een bladaanhechting een inoculatie met Ps. tumefaciens
wordt verricht. Deze spruiten wijken in vorm af van normale zij-
spruiten, zoowel wat de dikte van den stengel als wat den vorm
en de grootte der bladen betreft. Inoculeert men onder de blad-
aanhechting, dan ontstaan enkele spruiten — er zijn hier twee oksel-
spruiten gepreformeerd in eiken bladoksel —, wordt echter deze
spruitaanleg zelf geraakt door de entnaald, dan krijgt men ont-
springende uit den tumor tallooze kleine spruiten, die vroegtijdig
afsterven (Smith, 1921).

Photo 3 — Zie pag. 22—23. De letters a, b, c en d correspondeeren met de serie
nummers 1, 2, 3 en 4 in tabei 2 (pag. 22). Men lette op de kleine tumoren aan
de bladstelen van b, daar, waar de injectienaald binnendrong.

lijkc resultaten. De groote zijspruiten, die men verkrijgt door onder
een bladaanhechting te inoculeeren, werden scherp langs den hoofd-
stam afgesneden en in aarde overgezet, in de hoop dat deze stekken
zouden aanslaan, daar zij dan later voor inoculatieproeven gebruikt
konden worden. Het is immers a priori niet onwaarschijnlijk te
achten, dat dergelijke, door een directen prikkel van de parasiet ge-
vormde plantendeelen, in bijzonder sterke mate een immuniseerenden
invloed zullen ondergaan, indien tenminste iets dergelijks in het
plantenrijk mogelijk is.

De meeste van deze stekken gingen echter te gronde, zoodat er
tenslotte slechts 5 bruikbare planten overbleven. Deze groeiden vrij
snel en verloren gaandeweg hun eigenaardig uiterlijk, zoodat er
tenslotte niet veel verschil meer was te zien tusschen deze en de
contróle-zijspruiten, die van planten werden verkregen, welke geen
tumoren droegen.

Op 15.8.'34 werd een groote plant van Bryophyllum crenatum
met Ps. tumefaciens volgens methode I onder verschillende blad-
oksels en in het hoofdvegetatiepunt geïnoculeerd. Het gevolg was
de reeds bovengenoemde vorming van okselspruiten. Ook het
hoofdvegetatiepunt veranderde geheel in tumorweefsel en vormde
afgezien van groote hoeveelheden zeer kleine spruitjes — enkele
groote spruiten (zie photo 4).

Op 16.1.'35 werden alle groote spruiten van de tumoren afge-
sneden (± 12) en in aarde overgebracht. Zooals gezegd schoten er
vijf wortel. Twee daarvan waren afkomstig van den tumor in den
top, de drie anderen kwamen uit den ondersten geïnoculeerden
bladoksel.

Op 26.1.'35 werden 10 normale zijspiuiten van gezonde planten
afgesneden en opgepot. Deze bleven alle in leven.

Op 26.3.'35 werden alle planten volgens methode III met Ps.
tumefaciens geïnoculeerd. Elke plant kreeg 2 prikken en wel een in
het onderste internodium en een in het op 3 na bovenste internodium.

Op 2.4.'35, 12.4.'35 en 8.5.'35 werden de op pg. 23 genoemde
maten opgenomen en daaruit de tabellen 4 en 5 samengesteld.

Zooals uit tabel 5 blijkt, is de tumorgroei in het bovenste inter-
nodium bij de controleplanten iets sterker dan bij de proefplanten
(127 tegen 88). In de onderste geïnoculeerde internodiën is de

Tumorgroei, lengte- en diktegroei van de onderste geïnoculeerde
internodiën. Lengtegroei van de geheele plant.

t. gr. = tumorgroei, 1. gr. = lengtegroei geïnoc. int., d. gr. = dikte-
groei geïnoc. int., 1. gr. pl. = lengtegroei geheele plant.

Uit de tabellen 4 en 5 volgt, dat de diktegroei van de geïnocu-
leerde internodiën bij controle- en proefplanten volkomen gelijk is.
Zooals men uit tabel 5 kan opmaken, is de lengtegroei van deze
internodiën niet uniform. De bovenste internodiën van de controle-
planten zijn iets sterker in de lengte gegroeid dan die van de proef-
planten.

Of hiermede het verschil in tumorgroei is te verklaren, vah met
uit te maken. Er kan alleen op gewezen worden, dat in de periode,
waar het verschil in tumorgroei duidelijk werd, n.1. van 12.4.'35—
8.5.'35, de intensiteit van den lengtegroei bij controle- en proef-

Deze resultaten verkrijgen meer waarde wanneer men hen be-
schouwt in samenhang met de feiten vermeld in Hoofdstuk VII.
Op pg. 45 kom ik dus op de bovenstaande gegevens nog eens terug.

Resumeerende kan hier gezegd worden, dat deze proeven mis-
schien een aanwijzing kunnen zijn voor het optreden van een kleine
lesistentieverhooging tegen Ps. tumefaciens als gevolg van een be-
handeling met levende bacteriën en met het filtraat van hun cultuur-
vloeistof.

Zooals uit de proeven met bladen van Bryophyllum volgt, is de
kans op een resistentieverhooging door behandeling met fikraten of
suspensies van ongefiltreerde levende bacteriën niet uitgesloten.

Daarom werd doorgegaan met proeven te nemen in deze richting
door dergelijke methodes toe te passen op stekken van Pelargonium.

Echter werden de proefvloeistoffen hier niet ingespoten, aange-
zien dat moeilijkheden oplevert. Veel eenvoudiger en wellicht phy-
siologisch ook juister is het, de vloeistoffen door de stekken zelf te
laten opzuigen. Op deze manier worden in 4—6 dagen per stek
gemakkelijk ± 4 ccm opgenomen. Dergelijke hoeveelheden zijn niet
te injiceeren in de stengeldeelen van Pelargonium. Verder heeft
men het voordeel, dat de stekken in de vloeistof zijn ondergedom-
peld, zoodat deze over een groot oppervlak gelijkmatig kunnen in-
werken, iets wat met mjiceeren onmogelijk te bereiken is.

Voor ik hier de gegevens van mijn proeven met Pelargonium ver-
meld, wil ik even samenvatten, wat er in de literatuur bekend is over
immuniseering van deze plant tegen Ps. tumefaciens.

Arnaudi (1925) zag, dat planten met tumoren voor een
tweede infectie minder vatbaar zijn. Verder dat de reeds bestaande
kankers verschrompelen, indien de stengels, waarop zij zich be-
vinden in een vloeistof geplaatst worden, die uit konijnen verkregen
antistoven tegen Ps. tumefaciens bevatten. Deze proeven zijn met
-eer weinig planten genomen, zoodat hun uitkomsten niet veel

gonium-planten door van te voren gemaakte wondjes er mee in te
wrijven of de fikraten te injiceeren. Het laatste veroorzaakte hem
eveneens moeilijkheden. Het resultaat was negatief, want inoculatie
op de behandelde plaatsen gaf normale gezwellen. De door T h u n g
gebruikte Ps. tume[acienS'Stam — afkomstig van M a g r o u —
was vrij van bacteriophaag.

G h e O r g i u (1932) gebruikte bij 60° C geïnactiveerde suspen-
sies van Ps. tumefaciens en liet deze door watten opzuigen. De
watten werden daarna bij wijze van compressen om stengels van
Pelargonium gewikkeld, die van te voren over een groot oppervlak
van hun epidermis waren beroofd. Een inoculatie — ±: 30 dagen
na de behandeling ~ had bij de behandelde planten vrijwel geen
resultaat, de controles kregen groote kankers. Verder schijnt
G h e O r g i u gezien te hebben, dat planten met tumoren, indien zij
op bovengenoemde wijze werden behandeld, deze gezwellen binnen
betrekkelijk korten tijd verloren.

Magrou (1935) tenslotte vindt in perssappen van Pelar-
gonium' en Chrysanthemum-tumoien en stengelstukken boven de
tumoren een agglutineerend en praecipiteerend principe tegen Ps.
tumefaciens. Het agglutineerend principe bleek wel, het praecipi-
teerende niet specifiek. Een dergelijke werking vertoont ook het
perssap van gezonde plantenstengels, echter op een andere wijze.
Dit verschil in werking — dat zich bij de verdunningsseries van de
perssappen manifesteert en dat niet alleen wijst op een quantitatief
verschil — schrijft Magrou toe aan het voorkomen van actief
gevormde antistoffen in de zieke planten.

Deze resultaten schijnen overtuigend, daar het verschijnsel bij
alle 24 onderzochte gevallen optrad. Het ware wenschelijk, deze
interessante kwestie aan grooter materiaal uit te werken.

Het is, alles bijeengenomen, dus niet mogelijk, zich over deze
immuniteitsvraagstukken bij Pelargonium een duidelijk beeld te
vormen.

Zooals gezegd, werd door mij een werkmethode gevolgd die overeenkomt
met die van T h u n g en G h e O r g i u, in zooverre, dat o.a. fikraten en gedood
bacteriesuspensies op de planten konden inwerken. Evenwel, er werd geen andere
wond aan de stekken gemaakt dan die er door het snijden aan ontstond.

De eerst serie stond aan van 17.8.'34 tot 30.1/35, de tweede van 29.9.'34
tot 23.5.'35.

Het totaal aantal stekken in de eerste serie was 95, in de tweede 180.
De stekken werden gesneden zooals op pg. 10 is opgegeven. Daar kan men
tevens vinden, hoe zij werden behandeld. Hier volgen gegevens over:

b.nbsp;Het toedienen van de proefvloeistoffen, de tijd van inwerking, de tijd die
daarna verloopt tot de inoculatie en ten slotte de inoculatie zelf.

1.nbsp;Ps. tumelaciens'CultuuT in synthetische voedingsoplossing (zie pg. 21), 10
min. op 100 ° C verhit.

2.nbsp;Ps. famefaciens'cultunv in synthetische voedingsoplossing, 90 min. op 100 ° C
verhit.

1.nbsp;Ps. iumelaciens'CultuuT in synthetische voedingsoplossing van 5 dagen, die
gedurende 2 min. op 100 ° C werd verhit.

2.nbsp;Ultrafiltraat van een 2 min. op 100 ° C verhitte cultuur in synth. voedings-
oplossing van 5 dagen.

3.nbsp;Ultrafiltraat van een 5 dagen oude levende cultuur in synthetische voedings-
oplossing.

4.nbsp;Ultrafiltraat van een 2 min. op 100° C verhitte cultuur in synth. voedings-
oplossing van 45 dagen.

5.nbsp;Ultrafiltraat van een 45 dagen oude levende cultuur in synthetische voedings-
oplossing.

6.nbsp;Levende, ongefiltreerde 5 dagen oude cultuur in synthetische voedings-
oplossing.

7.nbsp;Levende, ongefiltreerde 45 dagen oude cultuur in synthetische voedings-
oplossing.

De reeksen 1—3 bestonden elk uit 20 stekken. De filtratiemethode wordt op
pg. 76 nader besproken.

Ad. b. De proefvloeistoffen voor de eerste serie werden in groote hoeveel-
heden toegediend, n.1. ± 20 ccm per stek. De stekken, die van tevoren 4 dagen
op erlenmeyers van 100 ccm gevuld met sterielwater hadden gestaan, kregen
dus de vloeistoffen in een verdunning van 1 : 4 toegediend. Gedurende 12 dagen
bleven de stekken in dit mengsel, waarvan tamelijk groote hoeveelheden werden
opgezogen.

Hierin bleven zij 60 dagen. Geregeld werd het water in de erlenmeyers bijgevuld.
Na deze periode werd elke stek in een afzonderlijke pot met gezeefde bladaarde
geplant. Toen de planten goed gingen groeien, werden zij allen geinoculeerd
(methode I). De inoculatiecultuur was 5 dagen bij 26° C. gegroeid. Elke stek
kreeg 2 prikken, een in het onderste deel, wat in direct contact met de proef-
vloeistoffen was geweest en een in het op een na jongste internodium.

De methode van toediening der proefvloeistoffen, die hier werd gevolgd, be-
vredigde niet geheel. Ten eerste worden deze vloeistoffen verdund. Het gevolg
daarvan is, dat men de stekken vrij lang er in moet laten staan, om ze voldoende
ervan te doen opzuigen. Dit heeft tot gevolg, dat er zich in deze vloeistoffen,
waarin tamelijk veel glucose en zouten aanwezig zijn, schimmels gaan ont-
wikkelen.

De stekken werden, na 7 dagen in erlenmeyers -f leidingwater te hebben
gestaan, overgebracht op korte glazen buizen van ± 6 ccm inhoud. In elke
buis kwam 4 ccm van de onverdunde proefvloeistof en daarna werden de stekken
er stevig in bevestigd door middel van watten. Het snijvlak van de stekken
reikte tot op den bodem van de buizen.

Na 6 dagen waren de buizen leeggezogen en werden de stekken weer op
erlenmeyers met leidingwater bevestigd. Op deze wijze heeft men veel minder
last van infecties.

60 dagen bleven de stekken in de erlenmeyers met water, daarna werden zij
overgeplant in aarde. 64 dagen na het overplanten werden zij geïnoculeerd op
dezelfde wijze als bij serie 1. De inoculatiecultuur was 10 dagen oud en had
2 dagen bij 26 ° C. en 8 dagen bij kamertemperatuur gegroeid.

Dat de stekken na de behandeling met de proefvloeistoffen zoolang in de
erlenmeyers met water bleven staan wordt verklaard, doordat het de bedoeling
was, de wortelvorming waar te nemen.

De groote tijdsruimte tusschen het overplanten ia aarde en het inoculeeren
was noodzakelijk, daar deze proef in den winter gedaan werd. Het is bekend
dat Pelargonium-stekken 's winters langzaam groeien en daar men voor tumoren-
vorming flink groeiende planten noodig heeft, moest dus gewacht worden tot
de stekken werkelijk aan den groei kwamen, wat geruimen tijd duurde.

Op het oogenblik dat de stekken werden overgeplant hadden zij
groote hoeveelheden wortels gevormd.

Steeds hadden de stekken, die met levende bacteriën behandeld
waren, de meeste wortels. Ook de fikraten schijnen de wortel-
vorming te stimuleeren vergeleken bij de controles, dus die stekken
welke met ongebruikte voedingsoplossing of met water in contact
waren geweest.

Uit tabel 6 en 7 kan men opmaken, dat deze verschillen inderdaad
vrij duidelijk zijn:

Serie I; percentage van het aantal stekken in elke reeks, dat meer
dan 30 wortels droeg. Verklaring in de tekst.

Bij serie 1 werd op de wortelvorming pas gelet, toen deze reeds
ver gevorderd was. Het bleek onmogelijk te zijn, deze wortels toen
nog te tellen. Daarom werd de wortelvorming geschat door in elke
reeks het percentage te bepalen van het aantal stekken, dat zeker
meer dan 30 wortels droeg.

Bij serie 2 werden de wortels, die zich ontwikkelden, van het
begin af aan nauwkeurig geteld. In de tabel 7 ziet men het aantal
wortels in elke reeks opgegeven in percenten van het aantal stekken
dezer reeks. Hier komen de verschillen veel duidelijker voor den
dag en bovendien is te zien, dat men door te lang wachten met
waarnemen, geen bijzonder duidelijke verschillen zal krijgen. Aan
het einde van de periode, gedurende welke de stekken in het water
stonden, waren ook bij serie 2 geen opvallende verschillen meer
te zien.

Dat Ps. tumefaciens specifiek wortelvormende stoffen zou af-
scheiden, is voor het eerst geopperd door N e m e c (1930). Het

Serie 2; Aantal wortels in % van het aantal stekken per reeks.
Verklaring in de tekst.

veroorzaakt door Ps. tumefaciens, is algemeen bekend. Dit gebeurt
niet alleen bij planten met gepraeformeerde wortelbeginsels, maar
ook en zelfs zeer duidelijk bij die, waar geen praeformatie voorkomt.
Bij de inoculatieproeven op Balsamina, die hier gedaan werden,
traden steeds zeer veel wortels op, zoowel op de tumoren zelf als op
groote afstanden (tot ± 8 cm) daaronder. Zie verder voor het ver-
mogen van Ps. tumefaciens om wortelvorming op te wekken de
volgende auteurs: Stapp (1927), Brown (1929), Riker c.s.

(1928)nbsp;en anderen. Het lijkt dus vrij waarschijnlijk, dat voor deze
wortelvorming inderdaad een rhizocaline in den zin van B o u i 1-
1 è n e en W e n t (1933), door de bacterie gevormd, aansprakelijk
is. Op dit zeer aantrekkelijke thema kon niet worden ingegaan, daar
het veel te ver van de oorspronkelijke vraagstelling zou afleiden, i)

Vermeld moet nog worden, dat van een zichtbare toxische wer-
king, uitgaande van de proefvloeistoffen op de stekken geen sprake
was, daar alle stekken er volmaakt gezond uitzagen. Alleen de
wortelvorming was verschillend en verder ontwikkelden zich aan die
stekken, welke met levende Ps. tumefaciens waren behandeld, hier
en daar kleine tumoren. Deze ontstonden niet alleen op de snijvlak-
ten, maar ook verspreid over het geheele ondergedompelde gedeelte
van den stengel. De tumoren aan de snijvlakten zijn, door de vele
wortels en gewone calluswoekeringen moeilijk te tellen. Bij serie 1
had slechts een der stekken van reeks 4 een kleinen tumor gevormd
op het ondergedompelde stengeloppervlak. Bij serie 2 hadden in
reeks 6, 50 %, in reeks 7, 20 % der stekken tumoren gevormd boven
de snijvlakten aan de stengels. Nooit ontstonden er tumoren op de
stekken, die met fikraten of gekookte bacteriën waren behandeld.
Van ultrafiltreerbare vormen van Ps. tumefaciens, die onder invloed
van de bacteriophaag zouden ontstaan en volgens d'H é r e 11 e en
Peyre (1927), het tumorverwekkende agens zouden zijn, was
geen spoor te bekennen. Hetzelfde negatieve resultaat met derge-
lijke proeven kregen Brown en Quirk (1929), Thung

Bij serie 1 werden op den datum van inoculatie geen maten op-
genomen. Hier werd pas met meten begonnen, toen de tumoren
reeds groot waren. Slechts de volgende maten zijn toen opgenomen:

In tabel 8 zijn de gemiddelde grootten der tumoren opgegeven
voor elke reeks. Deze werd in dit geval bepaald door het product
te berekenen van de gemeten lengte en breedte der gezwellen.

Pelargonium serie 1. Gemiddelde grootte der tumoren en gemid-
delde lengte der planten.

In tabellen 9 en 9a zijn de gegevens van serie 2 verwerkt. Deze
serie werd 5 maal gemeten en wel op 22.2.'35 (inoculatiedatum),
12.3.'35, 25.3.'35, 11.4.'35 en 23.5.'35.

De tumorgrootte wordt hier opgegeven als verhoudingsgetal van
den grootsten diameter der tumoren en dien van de stengels er vlak

De snelheden van lengte- en diktegroei der geïnoculeerde inter-
nodiën zijn uitgerekend voor de periodes, die tusschen twee metin-
gen in liggen en worden aangeduid met // en Ijj, resp. en djj.

De groeisnelheid van de planten is op overeenkomstige wijze be-
rekend en aangeduid met t. 1. Deze waarden vindt men in tabel 9a.

te maken, dat de hierboven beschreven behandehng met een levende
bacteriecultuur een verhooging van resistentie in de stekken tot ge-
volg heeft, want de tumorgroei bij de controles isnbsp;à 2 keer

De uitkomsten van serie 2 schijnen er verder op te wijzen, dat
fikraten van levende cultures een ongeveer even groote resistentie-
verhooging veroorzaken. Daarentegen verdwijnt deze immunisee-
rende werking van het filtraat min of meer, wanneer de cultures
vóór de filtratie 2™!quot; op 100° C worden verhit. De stekken, die met
een 2quot;'quot; op 100° C verhitte bacteriecultuur waren behandeld, blijken
evenmin een resistentieverhooging verkregen te hebben, hetgeen dus
overeenkomt met de werking van het fikraat van deze gekookte
cultuur.

van serie 1 (tabel 8). Want hier bhjkt van een resistentieverhooging
door een filtraat van levende bacteriecultures niets, daarentegen
schijnt de ongefiltreerde, gekookte cultuur eenige weerstandsver-
hooging te geven, zij het dan ook lang niet in die mate als de levende
bacteriecultuur.

Een mogelijke verklaring voor deze gedeeltelijk uiteenloopende
resultaten van de series 1 en 2 kan wellicht gevonden worden in de
feiten, dat

1°. de cultures bij serie 1 jonger waren dan bij serie 2 en
2°. de cultures voor serie 1, 15 resp. 90 minuten werden gekookt,
terwijl bij serie 2 slechts 2 minuten op 100° C werd verhit.

Het onwerkzaam zijn van het filtraat van de levende cultuur in
serie 1 zou dus veroorzaakt kunnen zijn doordat bepaalde stoffen,
die bij toenemenden ouderdom der cultuur in steeds sterkere mate
ontstaan, nog niet in voldoende concentratie aanwezig waren. De
resistentieverhooging door de gekookte cultuur bij serie 1 kan op
de volgende wijze hypothetisch verklaard worden: Door de langere
verhitting worden de bacteriën sterker gedesorganiseerd, waardoor
stoffen vrij komen, die bij kort durende verhitting binnen de
lichamen der bacteriën blijven.

Uit tabellen 8 en 9 kan men overigens nog opmaken, dat de
duidelijkste resistentieverhooging optreedt in het deel van den
stengel, wat in direct contact was geweest met de proefvloeistoffen.

Voorloopige proeven hebben aangetoond, dat de hier gebruikte ultra-filtraten
van Ps. tumelaciens een duidelijk stimuleerende werking op de groei van Asper-
gillus nigev vertoonden. De werking was reeds te zien bij een verdunning van de
fikraten 1 : 25. De verschillen in groei werden gemeten door drooggewichts-
bepalingen van de schimmel.

De groei van Asp. niger was met filtraat ±100% sterker dan bij de controles.
Zie in verband met deze quaestie ook S mit h (1917, in het bijzonder pg. 182
onderaan). Zie noot pg. 34 van dit proefschrift.

Na in het voorgaande te hebben aangetoond, dat de mogehjkheid
van immunisatie der gebruikte proefobjecten tegen Ps. tumefaciens
door inwerking van stofwissehngsproducten enz. van deze bacterie
op de planten niet uitgesloten is, wil ik nu de proeven vermelden,
waarbij nagegaan werd in hoeverre een reeds aanwezige infectie
door Ps. tumefaciens een beletsel kan zijn voor een volgende aan-
tasting door deze parasiet. Zooals men uit de literatuur over actieve
immunisatie tegen Ps. tumefaciens kan opmaken, meenen A r-
naudi (1925), Redaelli (1934) en misschien ook Smith,
Brownen To w n s e n d ( 1911 ) enBrown (1923) een immuni-
seerenden invloed te hebben aangetoond, uitgaande van een tumor.
De methode was bij alle onderzoekingen van deze auteurs gelijk.
Eerst werd een plantendeel geïnoculeerd en nadat er zich een ge-
zwel had ontwikkeld, werd dezelfde plant in de nabijheid van deze
infectie voor de tweede maal geïnoculeerd. Ter controle inoculeer-
den bovenstaande auteurs gezonde planten. Brown ging anders
te werk. Zij sneed gedurende eenige achtereenvolgende jaren stek-
ken van Chrysanthemum planten die tumoren droegen. Deze wer-
den dan, tegelijk met contrölestekken, geïnoculeerd. In het begin
bleek inderdaad resistentie verhooging te zijn opgetreden. Ten slotte
werden echter de stekken van de tumor-dragende planten gevoe-
liger dan de controles, hetgeen Brown toeschreef aan een weer-
standsvermindering van de planten als gevolg van het jarenlange
parasitaire proces.

Bovenstaande auteurs hebben, voorzoover dat is na te gaan, voor
de beoordeeling van het effect slechts de tumor-grootte opgenomen,
dus hielden zij niet voldoende rekening met groeiremmingen van
de proefplanten, die eventueel tengevolge van de eerste infectie
op zouden kunnen treden. Dergelijke proeven werden hier herhaald
met Pelargonium en Ricinus.

Voor Pelargonium week de methode af, bij Ricinus ging ik
precies zoo te werk als Arnaudi en Redaelli.

Bij Pelargonium bestond de afwijking hierin, dat planten werden
uitgekozen, die door de tumoren tot ontwikkeling gekomen zij-
spruiten droegen. In deze „tumorspruitenquot; werd een inoculatie
gegeven op 1—2 cm afstand van den tumor en bovendien in den
hoofdstam, die dezen tumor droeg, maar op ± 12 cm afstand daar-

vandaan (zie fig. 1). In totaal behandelde ik op deze wijze 18 plan-
ten. 12 Andere planten werden op overeenkomstige wijze geprikt,
evenwel bleef hier de inoculatienaald steriel en kregen zij behalve
de hierboven bedoelde 2 prikken nog 3 extra-prikken in den hoofd-
stam, vlak boven den tumor.

Dit prikken met een steriele naald in de nabijheid van een tumor
gebeurde op grond van de volgende overweging: Gesteld dat de
bacteriën uit een tumor in het nabijzijnde, gezonde weefsel kunnen
doordringen — iets wat door Robinson enWalkden (1923)
is bewezen voor Nicotania tabacum en Chrysanthemum [rutescens
— dan is het interessant te weten of zij, indien kunstmatig in dat
weefsel een wond wordt gemaakt, hier een infectie teweeg kunnen
brengen. Wanneer geen tumor ontstaat op deze wondvlakte, kan
men trachten uit deze weefselstukken de bacterie te isoleeren. De
zoo verkregen stammen van Ps. tumefaciens kunnen dan getest
worden op planten, die nooit met Ps. tumefaciens in aanraking zijn
geweest.

Blijken bedoelde bacteriën daar wel tumoren te verwekken, dan
is de waarschijnlijkheid groot, dat het weefsel waaruit zij geïso-
leerd waren, immuun tegen hen was geworden. Zijn evenwel de
bacteriën avirulent, dan moet gezocht worden naar de oorzaken in
de plant, die deze avirulentie hebben teweeggebracht.

Dat men zeer vaak avirulent geworden stammen van Ps. tume-
faciens geïsoleerd heeft uit tumoren, is bekend [S m i t h (1911),
Stapp (1927)], soms werd echter ook het omgekeerde geconsta-
teerd (Brown, 1929).

Het komt mij voor, dat deze kwestie zeer belangrijk is in verband
met het immuniteitsvraagstuk, maar het oplossen ervan is een onder-
zoek op zichzelf, dat mij, gegeven de doelstelling die hier werd
gevolgd, teveel op een zijpad zou hebben gevoerd.

Pelargonium. 30 flinke stekken werden op 27.11.'34 voor
de eerste maal op twee plaatsen geïnoculeerd. Deze inoculatie ge-
schiedde in het op 2 na jongste internodium en in het oudste inter-
nodium.

Beide inoculaties waren op 26.2.'35 uitgegroeid tot groote ge-
zwellen. De tumoren in het jongere internodium waren begrijpe-

Op 26.2.'35 werden nu bij 18 van deze planten 2 inoculaties ge-
geven op de wijze, zooals boven is uiteengezet. Voor alle inocu-
laties werd de methode I gebezigd. Voor de inoculatie op 27.11.'34
waren de bacteriën 5, voor die op 26.2.'35 7 dagen oud en bij 20° C
gegroeid.

1 int. I = lengte van het internodium, waarin op 26.2.'35 een
inoculatie werd gegeven en dat deel uitmaakte van den
hoofdstam.

a I = afstand van de inoculatieplaats in int. I tot den tumor,
die ontstond door de inoculatie op 27.11.'34 in het
jongere internodium.
1 int. II = lengte van het 2de internodium, waarin op 26.2.'35 werd
geïnoculeerd en dat deel uitmaakte van de „tumor-
spruit.

Zooals hieruit blijkt, is de tumorgroei in het internodium van den
hoofdstam duidelijk grooter dan in het internodium van de „tumor-
spruitquot; en deze versnelde tumorgroei kan ook hier niet verklaard
worden uit groeiverschillen van deze internodiën zelf.

Het resultaat van de „sterielequot; inoculaties bij de 12 overige
planten was negatief, d.w.z. er was — ook na 3,5 maand — geen
spoor van zwellingen rondom de inoculatieplaatsen te bespeuren

Er moest nu dus uitgemaakt worden, of uit deze stengelstukken
1—3 cm boven de tumoren Ps. tumefaciens geïsoleerd kon worden.
Gegevens omtrent deze pogingen vindt men in Hoofdstuk IX.

R i c i n u s. Op 23.11.'33 werden 10 i^icinus-kiemplanten met nog
niet geheel volgroeide cotylen op 4 verticaal onder elkaar gelegen
plaatsen van het hypocotyl met Ps. tumefaciens geïnoculeerd.
8 kiemplanten van denzelfden ouderdom werden als controles niet

Op 3.1.'34 werden de 18 planten alle geïnoculeerd in het 1ste
internodium, door elke plant daar twee prikken boven elkaar te
geven.

Alle inoculaties bij deze proefserie gebeurden volgens II. üe ent-
cultuur was ± 5 dagen oud en bij 20° C gegroeid.

Op 3.1.'34 waren de tumoren aan de proefplanten, ontstaan door
de inoculaties van 23.11.'33 zeer sterk gegroeid met het gevolg, dat
de hypocotylen zelf van deze planten min of meer opgezwollen

producten van a en a' in mm^ opgegeven:
1) Getallen ( ) = gemiddeld gewicht van de tumoren in Gr. op 28.5.'35.

Tumorgrootte en lengte van het eerste internodium bij Ricinus.
Nadere gegevens in de tekst.

Zooals hieruit is op te maken, worden de tumoren op de con-
tróle-planten gemiddeld ± 10 maal zoo groot als op de proefplanten,
zonder dat dit gepaard gaat met belangrijke verschillen in den
groei der internodiën, waar zij zich bevinden. Onder de proef-
planten waren er 4, die betrekkelijk kleine tumoren hadden ge-
vormd in het 1ste internodium. De overige 6 proefplanten hadden

Deze proeven, die met in totaal 36 individuen van 2 verschillende
plantensoorten werden verricht, bevestigen dus de resultaten van
Arnaudi (1925) en Redaelli (1934). De hier verkregen
uitkomsten zijn echter met iets grootere zekerheid als een resistentie-
verhooging te beschouwen, daar gelijktijdig met de metingen van
de tumoren de groei van de geïnoculeerde internodiën bij proef- en
controleplanten werd gemeten. Deze uitkomsten gaven geen relatie
tusschen de grootte der tumoren en den groei van de internodiën
te zien.

Of deze resultaten echter zonder meer als het gevolg van een
actief verkregen immuniteit geïnterpreteerd mogen worden, schijnt
mij om de volgende redenen niet zeker:

Niettegenstaande er geen verschil in groei was te constateeren.
kon men — in het bijzonder bij de zoo duidelijk positief uitgevallen
proef met de Ricinus-planten — een verschil in habitus zien tus-
schen de proefplanten en de controles. De laatste hadden
duidelijk beter ontwikkelde bladeren, wat zich uitte in de langere

Het is dus niet ondenkbaar, dat de veel grootere gezwellen in het
1ste internodium van de controleplanten het gevolg zijn van een
sterkeren toevoer van assimilaten. Dat de internodiën zelf bij de
controles niet sneller gegroeid zijn dan bij de proefplanten, zou ver-
klaard kunnen worden door een uitputting tengevolge van den

Deze bedenking vervalt bij de op pg. 25-27 besproken proeven met
Bryophyllum. In dat geval werd immers de tumor, die tot spruit-
vorming aanleiding had gegeven, verwijderd, zoodat deze op de
stofwisseling van de plant geen invloed meer kon uitoefenen. Dat
desondanks de tumoren in het bovenste geïnoculeerde internodium
bij de contrôlespruiten duidelijk grooter waren dan bij de tumor-
spruiten (tabel 5) vergroot de waarschijnlijkheid, dat deze en de
zoo juist besproken resultaten niet op grocibelemmeringen van de
internodiën terug te brengen zijn.

Bij alle aanwijzingen voor een verhooging der resistentie, die wij
in de voorafgaande hoofdstukken hebben meenen te vinden, blijven
natuurlijk onzekerheden bestaan. Er werd dus getracht, deze met
een andere methodiek op te lossen.

In plaats van te beginnen met de planten van te voren te inocu-
leeren en daarna deze ziek geworden planten te vergelijken met
gezonde controles, werden proeven opgezet met vergelijkbare plan-
ten, die alle op denzelfden dag werden geïnoculeerd. Hadden deze
planten 3 internodiën gevormd op het oogenblik van de inoculatie.
dan werden er 3, 2 of 1 internodiën geïnoculeerd en wel door in elk

Wanneer ook bij deze wijze van proefneming de tumoren grooter
zouden worden bij planten, die bijv. 1 inoculatie minder kregen, dan
schijnt het mij toe, dat hier met meer recht op een resistentieverhoo-
ging van de een of andere soort besloten mag worden, daar de
tumoren hier — in ieder geval in het eerste stadium van hun groei —
practisch gelijke kansen hebben wat hun voeding betreft. Natuurlijk
moeten ook bij deze proeven de lengte- en diktegroei van de inter-
nodiën en de totale groei van de planten gemeten worden.

Het is echter ook waarschijnlijk, dat, mochten de op deze manier
aan den dag getreden verschillen het gevolg zijn van immuni-
taire reacties, zij minder duidelijk zullen worden dan bij de hier-
boven bedoelde methode, waar de plant van te voren langen tijd den
invloed van het gezwel kon ondergaan. Dan is er immers meer tijd
voor de vorming van reactiestoffen en zal de positieve uitslag later
duidelijker moeten zijn.

Voor de proeven met deze gewijzigde methodiek werden uitslui-
tend Ricinus-p\anten gebruikt. De eerste serie bestond uit 56 plan-
ten, die elk 4 duidelijk zichtbare internodiën vertoonden. Deze serie

reeks 2 kreeg in het hypocotyl en in het 1ste, 2de en 4de inter-
nodium telkens 1 inoculatie,

Hier en in de volgende proeven worden de internodiën steeds
opklimmend genummerd, te beginnen direct boven het hypocotyl.
Het inoculeeren gebeurde op 2.10.'34 door middel van methode I.
De bacteriecultuur, die voor de suspensie werd gebruikt was
± 6 dagen oud.

De controle van de proef wijkt af van die van de volgende, daar
hier de tumoren gemeten werden door hun grootste lengte en breedte
op te nemen. Verder werden alleen de lengten van de 4de inter-
nodiën gemeten en tevens de totale lengten van de planten.

Deze getallen leiden voorToopig tot de volgende conclusies:
a Inoculeert men het hypocotyl en de 4 daarboven gelegen
internodiën allen gelijktijdig, dan worden de tumoren in het 3de
internodium het grootste. Dan volgen de tumoren m het 4cie, /ae
en 1ste internodium, terwijl de zwellingen in het hypocotyl zeer

b. Wanneer men de inoculatie in het 3de internodium weglaat,
worden de tumoren in de overige internodiën en ook m het hypo-
cotyl belangrijk grooter (reeks 2).

Ricinus, serie 1. Gemiddelde afmetingen der tumoren in mM^ en
gemiddelde lengten van de planten en hun vierde internodiën in c.M.
De cijfers L II en III slaan op de meetdata: 10. 12.'34, 20. 12. '34

(reeks 3), dan heeft dat een nog verdergaande vergrooting van de
tumoren in het 4de internodium tot gevolg. De zwellingen in het
1ste internodium en het hypocotyl blijven ongeveer even groot als
in de vorige reeks.

d. Wordt tenslotte slechts in het hypocotyl en het 4de inter-
nodium geïnoculeerd (reeks 4), dan nemen de tumoren in deze
internodiën nauwelijks meer in omvang toe, vergeleken bij de voor-
afgaande reeks.

Men ziet tevens uit tabel 12, dat de lengte-afmetingen van de
4de internodiën en van de geheele planten bij de 4 reeksen niet
veel uiteenloopen. Verder vertoonden de planten onderling geen
verschil in habitus, hetgeen door photo 5 wordt gedemonstreerd.

Het schijnt dus, dat ook hier de tumoren op elkaar een remmen-
den invloed uitoefenen, en dat deze werking naar boven en naar
beneden gericht is.

Om deze kwestie volledig op te helderen, moet men 15 combina-
ties onderzoeken, wanneer men planten gebruikt, die op den

Photo 5. — Zie pag. 48. Om technische redenen werden bladen verwijderd.
Nummers 1, 2, 3 en 4 correspondeeren met de reeks nummers in
tabel 12 pag. 48. De pijlen wijzen naar de tumoren in het 4de int.

inoculatiedatum behalve het hypocotyl nog 4 internodiën hebben
ontwikkeld. Dit zou het totale aantal planten — indien 10 planten
per reeks worden gebruikt — opvoeren tot 150.

Daar het echter in den winter en het vroege voorjaar ten eerste
zeer lang duurt, voordat de planten de voor dezen proefopzet ver-
eischte lengte hebben bereikt, en het ten tweede veel moeite kostte,
uit het zaadmengsel, dat ik toen tot mijn beschikking had, zooveel
planten tegelijk te kweeken — het kiemingspercentage bedroeg
±: 15 %1 — werd nagegaan of zich hetzelfde verschijnsel ook liet
reproduceeren met jongere planten.

Wanneer planten gebruikt worden met behalve het hypocotyl
2 zichtbaar ontwikkelde internodiën, dan kan men de proef sneller
na het uitzaaien aanzetten en zijn slechts — bij reeksen van 10 —
80 planten voor elke volledige proef serie noodig. Ter oriëntatie
werd daarom op 18.2.'35 de volgende proef aangezet:

35 Ricinus-planten, die op 16.1.'35 waren verspeend cn behalve
een bijna volgroeid hypocotyl 2 jonge internodiën ontwikkeld had-
den, werden ingedeeld in 3 reeksen:

reeks 2 werd in het hypocotyl en het 2de internodium geprikt,
reeks 3 kreeg slechts in het 2de internodium 1 prik.
De hierbij gebruikte inoculatie-methode was methode III, de
bacteriecultuur was bij 20° C gegroeid en 9 dagen oud.

Op 21.2.'35, 8.3.'35, 15.3.'35, 22.3.'35 en 5.4.'35 werden de vol-
gende maten van het hypocotyl alsmede van het 1ste en 2de inter-
nodium opgenomen: lengte, dikte op de inoculatieplaats, dikte vlak
onder de inoculatieplaats. Bovendien werd de totale lengte van de
planten bepaald.

De tumorgrootte wordt weer opgegeven als de verhouding van
[(d' — d) : d] X 100 en deze uitkomsten vindt men in tabel 13.

De lengte- en diktegroei der hypocotylen, 1ste internodiën, 2de
internodiën en totale planten worden in tabel 14 opgegeven:

Vergelijkt men de tumoren van reeks 2 met die van reeks 1. dan
blijken zij bij de eerste belangrijk grooter te zijn. Reeks 2 mist de
inoculatie in het 1ste internodium. Wordt ook nog de inoculatie m
het hypocotyl achterwege gelaten (reeks 3) dan groeit de tumor in
het 2de internodium iets sneller dan bij reeks 2, evenwel het ver-

41
49
70
78

(0.02)

Ricinus, serie 2. Snelheid van lengte- en diktegroei van de hypoco-
tylen en internodiën voor de periode van 8. 3. '35—5. 4. '35.

schil is nu lang niet zoo duidelijk als tusschen de tumoren in het
2de internodium van de reeksen 1 en 2.

Zooals tabel 14 duidelijk laat zien, zijn de dikte- en lengtegroei
van de hypocotylen bij de reeksen 1, 2 en 3 onderling gelijk.

Daarentegen vertoonen deze waarden van den groei voor het 2de
internodium een neiging kleiner te worden bij de reeksen 2 en 3.
ï) Getallen ( ) = gemiddeld gewicht van de tumoren in Gr. op 6.4.'35.

Bedenkt men, dat juist bij deze reeksen de tumoren in het 2de
internodium het grootst zijn, dan wordt het waarschijnlijk, dat een
tumor den groei van het internodium, waarin hij zich ontwikkelt,
remt. Deze groeiremming schijnt plaatselijk te zijn, daar zij noch
in den totalen lengtegroei van de plant, noch in den groei van hypo-
cotyl en 1ste internodium duidelijk tot uiting komt.

Door deze proef is waarschijnlijk geworden, dat ook jonge plan-
ten. die behalve het hypocotyl nog 2 kleine internodiën hebben
ontwikkeld, en waarvan het jongste ± 1—2 mm lang is, geschikt
zijn voor het verwekken van het te onderzoeken verschijnsel. D'aar^
om werden de proeven in het vervolg steeds met planten van dezen
ouderdom herhaald, daar hiermede veel minder tijd en planten ge-
moeid gaan.

In totaal werden nog 190 planten geïnoculeerd. Deze waren in-
gedeeld in 3 series (3—5), te weten: 2 van 80 planten en 1 van 30
planten.

De series van 80 planten waren ingedeeld in 8 reeksen. De in-
oculatie van deze reeksen geschiedde op een wijze, zooals in tabel 15
is aangegeven.

De serie 5 (30 planten) was in 3 reeksen verdeeld. Deze reeksen
kwamen overeen met de nrs. 1, 2 en 6 in tabel 15.

Dat alle mogelijke combinaties werden geprobeerd — zooals uit
bovenstaande tabel 15 blijkt — vindt zijn grond in de volgende
vraagstellingen:

1°. Kan een tumor een anderen tumor aan dezelfde plant alleen
maar remmen als deze tweede tumor zich boven den eersten
bevindt, of werkt deze remming ook naar beneden?
2°. Is de intensiteit van remming afhankelijk van de plaats op de

plant, waar de te remmen tumor zich bevindt?
3°. Kan geconstateerd worden, dat 2 tumoren hun remmende wer-
king addeeren ten opzichte van een derden tumor?

Het was bij voorbaat waarschijnlijk te achten, dat de tumoren
in de jongste internodiën — in dit geval dus het 2de internodmm,
dat op het moment van de inoculatie ± 2 mm lang was — de
grootste verschillen in groei zouden vertoonen.

Voor het geval dat de remming van den tumor tot stand komt
door een zuivere vegetatieve groeivertraging van het internodmm,
waarop hij zich bevindt, is het zonder meer duidelijk, dat deze

Inoculatieschema der series 3 en 4 van Ricinus.
Een -j- beteekent, dat in het betrokken hd werd geïnoculeerd.
In de Ricinus-series 1—5 werden de inoculaties direct onder de
bladaanhechtingen in het internodium gegeven.

Mocht echter de remming van den tumorgroei werkelijk berusten
op een actieve afweerreactie van het internodium, waarop de tumor
zich bevindt, dan is het eveneens aannemelijk, dat jong, nog niet vol-
groeid weefsel gemakkelijker verandert en reactiestoffen kan vor-
men dan volwassen of bijna volwassen weefsel.

Met veel minder zekerheid schijnt het mij van te voren uit te
maken te zijn, welke deelen der planten zich het beste leenen als
uitgangspunten van remming, daar de aard dezer remming geheel
onzeker is. Voor het geval dat zij berust op een vertraging van den
vegetatieven groei, moet natuurlijk aangenomen worden, dat die
internodiën, welke den sterksten tumorgroei geven, na inoculatie
ook het krachtigst als remmingscentrum zullen werken. Dit zouden
dus weer de jonge, onvolgroeide internodiën zijn.

Spelen echter actief gevormde reactiestoffen een rol, dan is wel
is waar waarschijnlijk te achten dat in een grooten tumor — d.w.z.
in een jong internodium — de meeste toxinen resp. antitoxinen ge-
vormd worden — maar evengoed is het mogelijk, dat de cellen voor
deze productie een bepaalden ouderdom bereikt moeten hebben.

Ter beantwoording dezer vragen zou het natuurlijk beter geweest
zijn, planten met meer internodiën te gebruiken, dit was evenwel
om reeds genoemde redenen uitgesloten. Het zaad, dat voor serie 3
werd uitgelegd, kiemde nog voor geen 10 %, zoodat het niet eens
mogelijk was, een goede selectie van de kiemplanten toe te passen.

Deze serie heeft dan ook onregelmatig gereageerd met het ge-
volg, dat de gemiddelde uitkomsten niet zeer overtuigend zijn,
hoewel zij tijdelijk in dezelfde richting als de beide vorige proeven
wijzen.

De inoculatie van serie 3 werd op 29.3.'35 uitgevoerd met een
7 dagen oude cultuur van Ps. tumefaciens. Deze cultuur was de
eerste twee dagen bij 20° C, de 5 overige dagen bij kamertempera-
tuur gegroeid. Gebruikt werd inoculatiemethode III.

De metingen werden verricht zooals op pg. 49 is aangegeven en
uitgevoerd op de volgende data: 27.3.'35, 8.4.'35, 13.4.'35, 18.4.'35,
26.4.'35 en 4.5.'35.

Tumorgroei, lengte- en diktegroei van hypocotyl, 1ste en 2de
internodium en de totale lengtegroei van de planten wordt uitge-
rekend zooals op pg. 49 is aangegeven.

De tumorgroei in de reeksen 1, 2, 5 en 6 is practisch gelijk tot op
18.4.'35. Daarna begint de snelheid van den tumorgroei af te nemen
in de reeksen 2, 5 en 6 en wel is deze vermipdering in reeks 6 het
sterkst. Dit is juist het tegenovergesteld van hetgeen men — gezien
de resultaten van de series 1 en 2 — mocht verwachten.

Dat deze afname niet in verband gebracht kan worden met groei-
verschillen van de hypocotylen zelf, blijkt duidelijk uit tabel 17.

*) De getallen in deze kolom geven de som der tumorgewichten per reeks
in grammen.

De tumorgroei (tabel 16) is in reeks 1 het kleinst tot en met
26.4.'35. In de reeksen 3, 5 en 7 is tot dien datum inderdaad een
iets sterkere groei van de gezwellen te constateeren. In reeks 7 zijn
de gezwellen iets grooter dan in de reeksen 3 en 5, die onderling
ongeveer gelijk zijn. Al deze verschillen verdwijnen geheel in de

De lengte- en diktegroei van de 1ste internodiën — zie tabel 17
— vertoonen in de reeksen 1, 3, 5 en 7 onderling weinig verschil,
evenmin is er een duidelijk onderscheid vergeleken met de reeksen
2, 4 en 6 of met de contrólereeks 8.

Alleen bij reeks 7 kan men misschien van een geringe remming
van den lengtegroei spreken.

Er is dus geen enkele aanwijzing in de gegevens over den groei
van de 1ste internodiën te vinden, die de plotselinge verandering
van den tumorgroei in die internodiën kan verklaren. De dikte- en

s-l
4)

e C

5 JH

O 01
O

O (j

li
D3

a IJ

ra -O

^ ö
■§ gt;

D3 (j

- S
-3 ü

gt;
X

CQ
lt;

a
lt;u

I'S
g s

ró
il -.tj

« O

lt;0
3

-S

'tj

lengtegroei van deze internodiën in de periode van 26.4.'35 4.5. 35,
dus in de periode waarin volgens tabel 16 de groei van de tumoren
zoodanig werd. dat het verschil in de reeksen 1. 3, 5 en 7 practisch

verdween, was in de reeksen 1—8 i 0, zoodat ook hierin geen ver-
klaring gevonden kan worden voor de veranderde snelheid van
tumorgroei.

Uit tabel 16 blijkt, dat tot en met 18.4.'35 de tumoren in het 2de
internodium bij reeks 1—4 ongeveer even groot zijn. Daarna even-
wel komt er eenig verschil; de tumoren van reeks 1 groeien iets
minder snel dan die van de reeksen 2, 3 en 4. Dit groeiverschil blijft
in dit geval behouden tot 4.5.'35. Uit tabel 17 blijkt, dat deze ge-
ringe verschillen in tumorgroei niet verklaard kunnen worden door
verschillen in lengte- of diktegroei van de 2de internodiën zelf, daar
deze bij de reeksen 1—4 onderling practisch gelijk zijn.

Resumeerende kan men dus van de uitkomsten van serie 3 tot en
met 4.5.'35 zeggen, dat zij voor het hypocotyl geheel in strijd zijn
met die van de beide vorige proeven.

Voor het 2de internodium is er overeenstemming, maar de ver-
schillen in tumorgroei zijn bij deze proef voor dat internodium veel
geringer dan bij de twee eerste proefseries.

Het gedrag van de tumoren in het 1ste internodium werd hier
voor het eerst nagegaan, zoodat daarvoor nog geen vergelijkbare

In ieder geval zijn dus de verschillen in serie 3 zoo klein, dat ze
niet als reëel beschouwd kunnen worden. Hier moet aan toegevoegd
worden, dat de planten van deze serie zonder eenige voorafgaande
selectie van het kiemplantenmateriaal gebruikt moesten worden,
gezien het feit, dat van de ± 1000 uitgelegde zaden er 80 kiemden.
Daarbij kwam dat deze zaden nog zeer verschillend snel opkwamen.
Zoodoende waren er onder deze 80 planten tamelijk veel varieteiten,
die afweken van het type dat uitgezocht werd, wanneer voldoende
kiemplantenmateriaal aanwezig was (zie Hoofdstuk II, pg. 8).

Aan deze omstandigheden moeten m.i. de slechts geringe ver-
schillen tusschen de reeksen onderling toegeschreven worden.

Wellicht spelen hier bovendien de zeer groote temperatuur-
schommelingen in de proefkas na 26 April een rol. Na 4.5.'35 wer-
den de planten niet meer gemeten. Op 27.5.'35 werden echter de
tumoren afgesneden en alle tumoren van een bepaald internodium
gezamenlijk reeks voor reeks gewogen. Daarbij bleek, dat de in de

tabel 16 reeds aangeduide veranderingen in groeisnelheid van de
tumoren waren blijven bestaan.

De gewichten van de tumoren op het hypocotyl vertoonen een
onderlinge verhouding, die overeenkomt met de uitkomsten der
meting van 4.5.'35.

Ricinus, serie 4. Grootte der tumoren. Verklaring der getallen zie
Ricinus, serie 4. Grootte der tumoren.
Verklaring der getallen zie pag. 49.

1) De tusschen ( ) geplaatste getallen zijn de gewichten in grammen van de
tumoren per reeks op 27. 5. '35.

De tumoren van het 2de internodium hebben zich echter veel
verder in de reeds op 4.5.'35 voor hypocotyl en 1ste internodium
kenbaar geworden richting ontwikkeld. Een en ander is op te maken
uit de tusschen () staande getallen van tabel 16.

Ditmaal werd met iets beter kiemend zaad gewerkt, zoodat een
selectie van de planten mogelijk was, al kon deze niet zoo intens
zijn, als men wel zou wenschen.

De gebruikte bacteriecultuur was 15 dagen oud. De 7 eerste dagen
waren de bacteriën bij 26° C gegroeid, de 8 volgende dagen bij

De metingen werden op de gebruikelijke wijze uitgevoerd op de
volgende data: 17.4.'35, 3.5.'35, 10.5.'35. 17.5.'35. 23.5.'35 en
27.5.'35.

Uit tabel 18 blijkt, dat de tumoren in het hypocotyl een neiging
vertoonen grooter te worden, wanneer men geen tumoren in het
eerste en het tweede internodium laat groeien (reeks 6); dit blijkt
zoowel uit de waarden van [(d' — d) : d] X 100 als uit de ge-
wichten der tumoren.

Uit tabel 19 zien wij dat de snelheid van dikte- en lengtegroei
der hypocotylen in de reeksen onderling geen duidelijke verschillen
vertoonen, in ieder geval zijn deze zoo klein, dat men ze niet ver-
antwoordelijk kan stellen voor die, welke de tumoren te zien geven.

Het gedrag van dit internodium is, wat den tumorgroei betreft,
tamelijk onveranderlijk, wanneer de tumoren in het hypocotyl,
tweede internodium of in beiden tegelijk weggelaten worden.

De verschillen van de waarden [(d' — d) : d] X 100, die daarbij
optreden, zijn te gering, om er met zekerheid gevolgtrekkingen uit
te maken, hetgeen ook blijkt uit de gewichten van deze gezwellen,
die zeer weinig uiteenloopen. Tabel 19 laat zien, dat nauwelijks
verschillen in snelheid van dikte- of lengtegroei in het 1ste inter-
nodium te constateeren zijn.

g J

y 'S

gt;gt; W
M 05

C W
to T3

U P

X
X

CQ
lt;

6J 4)

fS
g a

to
ö

'E ^

m y

lt;0
3

■5
quot;ö

Er is volgens tabel 19 geen duidelijk verschil in snelheid van
lengte- of diktegroei van de internodiën II tusschen de reeksen 1,

De reeksen, waaruit deze serie 5 bestond, komen overeen met de
reeksen 1, 2 en 6 van de series 3 en 4. De inoculatie van deze
planten wérd op 9.5.-35 uitgevoerd met behulp van methode III. De
gebruikte bacteriecultuur had 48 uur bij 26° C. gegroeid.

De metingen werden verricht op 9.5.'35, 18.5.'35, 24.5.'35 en
30.5.'35. De resultaten hiervan zijn in de tabellen 20 en 21 vast-

Het heeft ook hier weer den schijn, alsof de tumoren boven het
hypocotyl den groei der gezwellen in het hypocotyl zelf iets remmen.
Zooals blijkt is de reactie in het hypocotyl als gevolg van het weg-
laten van de tumoren in het 1ste en 2de internodium niet groot, zoo-
dat men voorzichtig zal moeten zijn, er gevolgtrekkingen op te
baseeren.

Uit tabel 21 zien wij dat de lengtegroei der hypocotylen practisch
stil staat. De diktegroei is iets sterker, zonder echter duidelijke ver-
schillen bij de reeksen onderling te vertoonen.

Daar in deze serie dit internodium slechts bij een reeks werd ge-
ïnoculeerd, zullen wij het hier buiten beschouwing laten.

Het verschil tusschen de tumoren in het tweede internodium van
de reeksen 1 en 2 komt bij deze serie weer duidelijk tot uiting.

Ricinus, serie 5. Lengte- en diktegroei van hypocotylen en inter-
nodiën, alsmede lengtegroei van de geheele plant.

Uit tabel 21 is op te maken dat de 2de internodiën van reeks 2,
die de grootste tumoren dragen, iets minder snel gegroeid zijn, dan

Vergeleken bij reeks 6, waar geen inoculatie in dit internodmm
werd gegeven, vertoonen zoowel reeks 1 als reeks 2 een duidelijke
remming van den lengtegroei.

Wanneer men de uitkomsten van deze series met elkaar verge^kt
dan kan met zekerheid vastgesteld worden, dat gezwellen, verwekt

door inoculaties in het jongste internodium, geremd worden door
tumoren, die ontstaan ten gevolge van gelijktijdige inoculaties m

De verschillen in tumorgroei, die hierbij in het jongste internodmm
optreden, zijn te duidelijk, dan dat men ze aan toevallige variaties

Bij het begin van al deze proefseries had het jongste gemocu-
leerde internodium een lengte van 1-2 mm bereikt, het bevond zich
tijdens de inoculatie in het begin van zijn groote periode.

Het oudere internodium, in de reeksen 2-5, dus het 1ste mter-
nodium, was op het oogenblik van inoculatie midden in de groote
periode; het hypocotyl tenslotte was bij alle proefseries practisch
volgroeid in de lengte, zoodat in dit lid na de inoculatie alleen nog

Zooals uit de resultaten blijkt, worden de tumoren in het 1ste
internodium bij den hier gebruikten proefopzet niet duidelijk grooter,
wanneer men de inoculaties in het hypocotyl resp. het 2de mter-

De tumorgroei in het hypocotyl schijnt bij planten van den hier
gebruikten ouderdom iets sterker beïnvloed te worden door de
infecties in het eerste en tweede internodium, al zijn de versnellingen
in tumorgroei, die bij het hypocotyl optreden als gevolg van het
weglaten van tumoren erboven, veel geringer dan die, welke op-
treden in het tweede internodium door de infecties in de leden

Uit de resultaten van serie 1, waar planten met 5 leden, en uit die
van de series 2—5, waar jongere planten met slechts 3 leden werden
geïnoculeerd, kan men opmaken, dat bij gelijktijdige inoculatie van
alle internodiën het op een na jongste lid steeds de grootste tumoren
vormt. De afmetingen dezer tumoren worden slechts overtroffen
door die van het jongste internodium, indien de inoculatie in het op

Het maakt duidelijk den indruk, alsof een inoculatie in een inter-
nodium, dat zich in zijn groote periode van groei bevindt, tot een
tumorvorming aanleiding geeft, die niet goed te remmen is door

Wanneer men aanneemt, dat remming van de tumoren tot stand
zou kunnen komen door transport van „afweerstoffenquot;, die de ter

plaatse reeds gevormde komen versterken, dan is het begrijpelijk.
Lt de tumor in het 1ste internodium niet geremd wordt, althans in
het begin van zijn ontwikkeling kan er geen sprake zijn van een
vervoer van afweerstoffen van andere tumoren daarheen, aangezien
deze gezwellen zich nog niet gevormd hebben op het moment, dat
de tumor in het 1ste internodium reeds groeit.

Waarom later, wanneer de gezwellen in het hypocotyl en het
2de internodium zich ontwikkeld hebben, niets blijkt van een rem-
ming van den tumor in het 1ste internodium, is niet duidelijk. Mis-
schien mag dat verklaard worden door aan te nemen, dat een
remming alleen daar duidelijk wordt, waar zij aan kan grijpen op
tumoren, die in het begin van hun ontwikkeling staan.

De zeer duidelijke remming van den tumorgroei in het jongste
internodium en de minder opvallende, in enkele series echter toch
te constateeren vertraging in het hypocotyl zouden dan te verklaren
zijn, doordat in beide gevallen de tumorgroei in de eerste weken na
de inoculatie zeer langzaam verloopt. In beide gevallen is dit waar-
schijnlijk te wijten aan geringen vegetatieven groei: het jongste
internodium bevond zich immers nog in een ontwikkelingsstadium,
dat vóór de periode van sterken groei valt, het hypocotyl daaren-
tegen had zijn lengtegroei reeds volbracht.

Dit laatste zal vermoedelijk ook de verklaring zijn voor de veel
duidelijker remming in het jongste internodium, vergeleken bij die
in het hypocotyl. Het is immers wel aannemelijk, dat een duidelijk
groeiverschil tengevolge van een remming alleen maar bij intens

Groeit het gezwel uit zich zelf reeds langzaam, zooals bij deze
proeven in de hypocotylen het geval was, dan kan men met ver-
wachten dat hier nog een duidelijke remming optreedt.

Bovenstaande verklaring van de bij Ricinus waargenomen ver-
schijnselen werd gebaseerd op de hypothese, die mij in dit geval he
waarschijnlijkste voorkomt, n.1.: De tumoren oe enen
groei een remmenden invloed uit, doordat bepaaWe stoffen - d^
men in het algemeen reactiestoffen van de plant kan noemen -
Tuit diffundeeren in het omringende weefsel. Deze^ ^
op een of andere wijze de bacteriën, welke zich m de quot;«bijheid van
dL tumor bevindei, moeten aantasten of hun -tw-^
plant verminderen. Deze conclusie is. o.m. gegrond op de volgende

waarnemingen: Werd de lengtegroei van een internodium, dat een
„geremdenquot;, dus kleinen tumor droeg, vergeleken met lengtegroei
van een internodium, welks gezwel niet door een tumor daaronder
beïnvloed kon worden, dan waren er geen verschillen te consta-
teeren. Mag hier echter uit afgeleid worden, dat in het eerste geval
geen remming van het internodium zelf door den tumor, die zich
daaronder bevond, bestond?

We hebben gezien, dat in enkele gevallen een min of meer duide-
lijke locale remming van den lengtegroei van het internodium te
zien was, wanneer er zich een groote tumor op ontwikkelde en bij
oriënteerende proeven, die hier niet vermeld zijn, was deze locale
groeiremming zonder eenigen twijfel te zien. Maar dan moet men
ook aannemen, dat de grootte van den tumor van invloed is op de
intensiteit van de locale remming van het internodium.

Wanneer dus — zooals bij bovenbeschreven proeven — dit niet
het geval blijkt te zijn, moet daarvoor een oplossing gezocht worden.
Deze ligt voor de hand: Het niet tot stand komen van een geringere
locale remming kan hier verklaard worden door een andere rem-
ming, want juist bij deze gevallen bevond zich een tweede tumor
onder het internodium, dat in het bovenstaande bedoeld werd.

Of deze redeneering al dan niet juist is, kan slechts onderzocht
worden, door bij een reeks van planten de locale groeiremmingen
van een bepaald internodium te meten, die veroorzaakt worden door
tumoren van verschillende grootte.

Mocht het daarbij blijken, dat tumoren — in, grootte niet meer van
elkaar afwijkende dan het geval was bij de hier boven beschreven
proefseries — een duidelijk verschillende locale groeiremming uit-
oefenen op hun internodium, dan zou dit de verklaring van de bij
mijn proeven met Ricinus opgetreden verschillen in tumorgrootte
door de werking van „afweerstoffenquot;, zeer verzwakken.

In dat geval zou men, vóór deze „afweerstoffenquot; zijn aangetoond,
beter aan kunnen nemen, dat genoemde remmingen in den groei van
de tumoren terug te brengen zijn op belemmeringen in groei van het
internodium, waarop zij zich bevinden.

Dit zou men zich veroorzaakt kunnen denken doordat de tumor
een gedeelte van den sapstroom tot zich trekt.

Zoolang echter dit verband met den groei niet door metingen is
aangetoond, schijnt het mij beter te besluiten tot den een of

De remming, die de onderste tumor op den bovensten uitoefent,
is reeds te constateeren wanneer deze onderste tumor nog zoo klein
is, dat hij de groeiende deelen erboven onmogelijk kan beïnvloeden
door het onttrekken van groote hoeveelheden voedingsstoffen.
Verder komt het mij voor, dat een groeiremming van het plantendeel
boven den tumor wel zeer sterk zou moeten zijn, dus duidelijk aan
den dag moet treden, wil zij geheel aansprakelijk gesteld kunnen
worden voor de groote verschillen in tumorgroei. Dit nu was bij
bovengenoemde proeven zeker niet het geval (zie hiervoor ook
photo 5). Tevens zal men in het oog moeten houden, dat immuniteit
en groeiremming elkaar in hun uitwerkingen op den groei van de
tumoren wederzijds zullen versterken, zoodat, al worden groei-
remmingen van de internodiën gevonden, deze nog niet de eenigste
factor behoeven tc zijn.

Voordat nader onderzocht kon worden, of er aanwijzingen te
vinden zijn, dat de in de vorige hoofdstukken beschreven verschijn-
selen op een resistentieverhooging tegen de parasiet berusten, die
het gevolg is van de vorming van bepaalde stoffen door de plant,
moest eerst worden uitgemaakt of:

1.nbsp;Ps. tumefaciens uit de tumoren en de stengelstukken boven de
tumoren te isoleeren is en zoo ja, hoever boven de tumoren hij

2.nbsp;de zoo verkregen bacteriën nog virulent zijn, of hun virulentie
geheel of gedeeltelijk verloren hebben.

Dat Ps. tumefaciens ook in deelen van de plant boven of onder
de gezwellen aangetroffen zou worden, was waarschijnlijk, gezien
de resultaten van Robinson en Walkden (1923), Hill
(1928) en Hill c.s. (1930), die aantoonden, dat Ps. tumefaciens
via de intercellulaire holtes in de plantenstengels tot op groote af-
standen van de tumoren aangetroffen kan worden. Daar kunnen
de bacteriën de vorming van z.g. „smooth tumorsquot; veroorzaken, dat
zijn verdikkingen die niet naar buiten doorbreken. Zij zijn vermoe-
delijk identiek met de zwellingen, welke E. F. S m i t h secundaire
tumoren noemde, in den zin van de terminologie, die in de mensche-
lijke pathologie gebruikelijk is. Deze „smooth tumorsquot; heb ik her-
haaldelijk aangetroffen bij Ricinus, en wel op groote afstanden van
de oorspronkelijke infectieplaatsen. Ook bij Bryophyllum (zie

Om nu te onderzoeken, of Ps. tumefaciens in de tumoren en de
deelen van de plant daarboven en daaronder voorkomt, werd op de
volgende wijze te werk gegaan:

Van Ricinus^, Pelargonium- en /mpafiens-planten, die gezwellen hadden,
veroorzaakt door inoculaties met stam 245, werden eerst de tumoren afgesneden.
Deze tumoren waren bij Ricinus en Impatiens ± 2 maanden oud, bij Pelargomum
± 4 maanden. Allen waren zij nog gaaf. Vervolgens werd van de stengel
stukken boven de gezwellen het onderste deel (± 0,5 cm), dus hetgeen direct
aan den tumor had gegrensd, verwijderd. Van het stengeldeel, dat nu volgde,
werd van onderen af gerekend, een stuk van 1 tot 2 cm lengte afgesneden
en deze stukken werden evenals de afgesneden tumoren, voorloopig in steriele

Als controles bij deze proeven werden Ricinus- en Pe/argonmm-planten, die
nooit met Ps. tumefaciens in aanraking waren geweest, op overeenkomstige
wijze in stukken gesneden en deze tegelijk met die, afkomstig van de tumor-

De verwerking van bovenbedoelde tumoren en stengeldeelen geschiedde direct
na het snijden. De plantendeelen werden eerst in een blauw brandende vl^
uitwendig gesteriliseerd en vervolgens in een steriele mortier fijngewreven. Ue
zoo ontstane weefselbrij werd gemengd met steriele bouillon (recept zie hoofd-
stuk 10). Dadelijk daarna of in sommige gevallen 1 of 2 dagen later werden
van deze extracten in bouillon uitstrijkcultures op platen van bouillonagar
gemaakt. Natuurlijk werd voor elk nieuw te wrijven plantendeel eerst weer
het mortier gesterihseerd, door het met water en vervolgens met alcohol 96 /o
uit te spoelen, waarna de alcohol, die in het mortier achterbleef, werd aan-
gestoken. Hetzelfde gebeurde met den stamper.

De uitstrijksels van den bouillon plantenextracten, afkomstig
van de tumorplanten, leverden groote hoeveelheden bacteriën op,
die in colonievorm varieerden van volmaakt ruw en droog tot glad
slijmig. Van deze slijmige vormen waren er enkele - zoowel uit
tumorextracten als stengelstukken daarboven - die groote overeen-
komst vertoonden met de colonies van Ps. tumefactens stam
Het grootste gedeelte was echter geplooid en geleek op stam

niet te onderscheiden van de ruwe stammen van Ps. tumefaciens
a, III, en 261, die op pg. 13 besproken zijn.

De extracten van de controleplanten gaven tot veel geringeren
bacteriëngroei aanleiding, en verder waren deze bacteriën over-
wegend ruw en droog. Steriel waren de controleplanten dus geens-
zins, maar er was in kwantiteit en kwaliteit van de bacteriën een
duidelijk verschil met de tumorplanten te zien, ook indien men voor
deze vergelijking alleen van de bacteriën uit de stengelstukken boven
de gezwellen uitging. Men ziet dus, dat uit tumoren en stukken van
den stengel daarboven bacteriën te isoleeren zijn en nu moest uit-
gemaakt worden, op welken afstand van de tumoren de bacteriën

Hiertoe werden van Ricinus-planten, die alleen in het hypocotyl
een tumor droegen, de stengels boven deze tumoren afgesneden en
vervolgens in stukken verdeeld, elk van 2 cm lengte. Het vegetatie-
punt met 2 daaronder liggende internodiën vormde het laatste stuk.
Al deze stengeldeelen werden behandeld op de manier zooals boven
is aangegeven.

Het resultaat was, dat uit alle deelen van den stam boven den
tumor tot en met het vegetatiepunt bacteriën groeiden en weer was
deze groei veel rijker en duidelijk verschillend van dien, welke

Nu werd onderzocht of onder deze bacteriën, die uit tumorplanten
geïsoleerd waren, Ps. tumefaciens voorkwam, en zoo ja, of deze
bacterie dan nog de sterke virulentie bezat, die aan den oorspronke-

Voor dit doel werden jonge Ricinus-planten met deze bacterien
geïnoculeerd. De cultures, welke gegroeid waren uit de extracten
van Pelargonium- en Impatiens-turaoven en stengelstukken daar-
boven, werden als mengsel geïnoculeerd door middel van
methode III. Die, welke afkomstig waren van de tumordragende
Ricinus-planten werden eerst gescheiden, zoodat tenslotte geïnocu-
leerd kon worden met de verschillende types in reincultuur. Hierbij
werd methode II gebruikt. Ter controle werden Ricinus-planten met

Uit deze inoculatieproeven bleek duidelijk, dat de bacteriën veel
van hun virulentie hadden verloren. De isolaties uit tumoren en
stengelstukken van Pelargonium gaven alle op een na slechts ge-

De bacteriën uit tumoren van Impatiens waren voor een deel zeer
virulent (2 van de 6 tumorisolaties). De overige isolaties uit de
stengelstukken boven de tumoren en uit de tumoren zelf gaven

De inoculaties met de bacteriën uit de tumoren en stengelstukken
van Ricinus toonden aan, dat de gladde slijmige culturen veel viru-
lenter waren dan de ruwe droge vormen. Deze laatste gaven kleine
zwelhngen, de eerste echter bleken voor 50 % sterk virulent te zijn.
Hieronder waren 2 isolaties uit stengelstukken boven de tumoren.

Alle zwellingen, die hierboven als klein worden aangeduid, waren
slechts weinig grooter dan de wondcalluswoekeringen, die op de
controleplanten ontstonden als gevolg van een prik met een steriele
naald. Niettemin waren zij er meestal toch duidelijk van te onder-
scheiden.

Het is uit deze resultaten waarschijnlijk geworden, dat ook bi)
mijn proefplanten, evenals bij die van R o b i n s o n en W a 1 k-
d e n, Ps. tumefaciens niet alleen in de tumoren, maar ook in de
rest van de plant te vinden is. Tevens heeft een groot deel van de
bacteriën onder invloed van de plant zijn virulentie vrijwel ingeboet.
Dit is merkwaardig, wanneer men bedenkt, dat de stam 245 onder
normale omstandigheden in reincultuur gedurende vele jaren zijn
virulentie heeft behouden. Verder heeft deze stam in de plant aan-
leiding gegeven tot de ontwikkeling van vormen, die in habitus
afwijken van de normale groeiwijze van 245. Ook dit is opvallend,
want stam 245 is in reincultuur zeer constant. Nooit werden varia-
ties van dezen stam opgemerkt, wanneer hij gekweekt werd op
gunstige voedingsbodems als mout- en bouillon-agar. Ook na ge-
groeid te hebben in vloeibare mout of bouillon vertoonde hi) bij
overenting op agarbodems steeds weer den normalen karakteris-
tieken gladden slijmigen groei.

Slechts wanneer een voor de ontwikkeling van bepaalde stadia
van Ps. tumefaciens ongunstige voedingsoplossing werd gebruiict,
kon na overenting van stam 245 uit deze voedingsoplossmg op mout-
agar een duidelijk afwijkende groeivorm waargenomen worden, die
sterk het karakter van een ruwe varieteit had aangenomen. Dit was
de reeds op pg. 21 opgegeven synthetische oplossing. Tegelijk met

den ruwen vorm kwamen in mijn proeven ook nog onveranderde
245-kolonies op. Deze waren echter in de minderheid. Het mengsel
van deze 2 vormen gaf bij inoculatieproeven duidelijke tumoren.

Stapp (1931) heeft het gedrag van Ps. tumefaciens m deze
oplossing bestudeerd en hij vond, dat de bacterie hierin niet over-
gaat tot de z.g. stervorming, die in den normalen cyclus van Ps.
tumefaciens een belangrijke schakel schijnt te vormen. Dat dergelijke
ruwe vormen bij Ps. tumefaciens kunstmatig verkregen kunnen
worden, toonde het onderzoek van A. Q u i r k ( 1931 ) aan, die door
deze bacterie te kweeken in bouilloncultures van p^ 6 of 7 naar
keuze ruwe, avirulente of gladde, virulente groeivormen kon laten

men wellicht aannemen, dat deze bacterie in de hier gebruikte proef-
planten onder ongunstige omstandigheden groeit en daardoor dus
van kenmerken verandert. Daar de zwak virulente vormen van stam
245 in de plant ook buiten den tumor voorkomen, is het met uitge-
sloten dat de remmende invloed van de tumoren op elkaar op de
een of andere wijze verbonden is met de verspreiding van deze

Om dit experimenteel te benaderen, werden proeven aangezet,
waarbij jonge Ricinus-Klanten vlak onder de cotylen geïnoculeerd
werden met den zeer weinig virulenten stam Pfältzer en den aviru-
lenten stam a (zie pg. 13). Direct boven de cotylen in het eerste
internodium, dat bij deze proeven nog zeer jong was, werd ge-
inoculeerd met stam 245. Als contrôles werden planten onder de
cotylen met stam 245 en met een steriele naald geprikt; boven de
cotylen in het eerste internodium kregen zij allen een inoculatie
met 245. Deze proef werd in totaal met 24 planten gedaan, 12 proef-

Het resultaat was, dat inderdaad de tumoren in het eerste inter-
nodium bij de controles duidelijk grooter werden dan bij de proef-
planten De proefplanten, die met den stam Pfältzer in het hypocotyl
waren geïnoculeerd, droegen daar kleine tumoren. Die welke met
den avirulenten stam a waren geprikt, hadden in het hypocotyl geen
tumoren.

proeven is, dat Ps. tumefaciens niet alleen in de tumoren, maar ook
in de gezonde deelen van de plant te vinden is op tamelijk groote

Verder is de virulentie van den zeer pathogenen stam 245 tijdens
het verblijf in de planten sterk verminderd, hetgeen waarschijnlijk
samenging met een verandering van de uiterlijk zichtbare ken-
merken van deze bacterie.

Dit virulentieverlies van Ps. tumefaciens in de plant is opvallend
en werd reeds door den eersten onderzoeker van Ps. tumefaciens.
E. F. S m i t h (1911), gesignaleerd. Na hem hebben andere auteurs
het verschijnsel eveneens waargenomen. S t a p p (1927) legt er nog

Waardoor dit virulentieverlies in de plant wordt veroorzaakt, is
onbekend. Het is echter niet onmogelijk, dat de bacteriophaag hier
een rol speelt.

Ten eerste is het bekend, dat in het algemeen onder invloed van
een bacteriophaag een verandering van gladde virulente bacteriën in
ruwe avirulente vormen plaats kan vinden [zie voor een overzicht
van de kwesties T op ley enWilson (1931) enSchlemper

Ten tweede hebben M u n c i e en P a t e 1 (1930) aangetoond,
dat een gladde vorm van Ps. tumefaciens in reincultuur onder in-
vloed van de phaag verandert in den ruwen vorm. Deze bleek in
dit geval meer of minder resistent tegen de phaag. M u n c i e en
Patel laten zich niet duidelijk uit over de pathogeniteit van dezen
ruwen vorm; het is evenwel zeer waarschijnlijk, dat deze gering
was geworden, gezien de algemeene ervaringen met andere patho-

Ten derde is door de onderzoekingen van Israilsky (IV/ö,
1927),Brown enQuirk (1929), M u n c i e en P a t e 1 (1930)
en C h e s t e r (1933) wel bewezen, dat de bacteriophaag met alleen
uit reincultures van Ps. tumefaciens is te isoleeren, maar ook uit
gezwellen van planten, die met door de phaag besmette cultures
waren verwekt. Chester (1933) tenslotte toont -n. dat men
de phaag behalve uit de gezwellen, ook uit de stengeldeelen boven

Het is dus niet onwaarschijnlijk, dat zich in de plant deze fde
verschijnselen kunnen voordoen als in vitro; d.w.z. onder invloed

van de phaag verandert de gladde virulente vorm van Ps. tame-
faciens in een ruv^e, weinig virulente varieteit. Het schijnt evenwel
niet goed mogelijk, dat deze verandering in de plant zonder meer
tot stand kan komen. Even goed als het in vitro pas na vele passages
en filtraties gelukt, de bacteriën een bijna volkomen lyse te doen
ondergaan met het resultaat, dat alleen de resistente (in dit geval
ruwe) vormen in leven blijven, moet men in de plant de een of
andere oorzaak veronderstellen, die het mogelijk maakt, dat de
bacteriophaag zich sterk vermeerdert ten koste van de bacteriën.

Hoe men zich dezen invloed van de plant op het systeem bacterie-
bacteriophaag moet denken, zal er van afhangen, welk standpunt
men inneemt tegenover het wezen van de phaag. Vat men deze op
als een doode stof, dan moet men aannemen, dat de bacterie onder
invloed van de plant gevoeliger wordt voor de phaag, waardoor deze

Wil men er van uitgaan dat de phaag een zelfstandig op de
bacterie parasiteerend organisme is. dan kan bovenbedoeld effect
zoowel verklaard worden door een virulentieverhooging van de
phaag of een resistentievermindering van de bacterie tegen de phaag
aan te nemen, twee processen, die onder invloed van de plant moeten

Tenslotte moet er op gewezen worden, dat de verandering van
gladde virulente in ruwe avirulente vormen door zeer veel verschil-
lende oorzaken tot stand kan komen. De phaag zou in dat geval
voor het tot stand komen van deze virulentievermindermg van
Ps. tumefaciens in het geheel geen rol behoeven te spelen.

Hoewel ik het volmaakt hypothetische karakter van bovenstaande
beschouwingen geheel inzie, leken zij mij toch van belang in ver-
band met de hierboven opgesomde resultaten en ook met de nu
volgende onderzoekingen, waarbij werd aangetoond, dat de stam
245 van Ps. tumefaciens, die ik voor alle proeven gebruikte, besmet
was met een bacteriophaag ¹).

1nbsp; Indien ik hier en in het vervolg woorden als „besmetquot;, „aantastenquot; enz.
gebruik wil ik mij daardoor in geen geval voor de organisme-theorie van de
phaag verklaren. Ik kies deze bewoordingen slechts daar zij algemeen gebruikelijk

Zooals hierboven is uiteengezet, zouden de verschijnselen, die m
de vorige hoofdstukken zijn beschreven, eventueel met behulp van
een bacteriophaag in de plant gedeeltelijk te verklaren zijn.

Daarvoor moest natuurlijk nagegaan worden, of de inoculatie-
cultuur, die bij al deze proeven werd gebruikt, met een phaag be-
smet was. Indien dit niet het geval mocht blijken te zijn, wordt de
rol van een bacteriophaag bij gebruik van dezen stam als inoculat^^-
cultuur zeer denkbeeldig, vooral waar de onderzoekers op dit gebied
(Chester, 1933; Israilsky. 1926) hebben aangetoond, dat
planten zonder infectie met Ps. tumefaciens geen aantoonbare hoe-
veelheden phaag bevatten.

Chester onderzocht gezonde stengels van Pelargonium en
kon daarin geen phaag tegen Ps. tumefaciens vinden. Bovendien
werkte hij met gezonde wortels van Beta en hieruit konden m
enkele gevallen phagen geïsoleerd worden, die werkzaam waren
tegen Ps. tumefaciens. Chester verklaart de aanwezigheid van
deze phaag in gezonde wortels door aan te nemen dat hij er uit den

I s r a i 1 s k y (1926) onderzocht eveneens gezonde bie^^s
OP hun phaaggehalte tegen Ps. tumefaciens, maar kon hier geen
phaag aLoonen. Bodemonderzoekingen wezen uit^
IJn de bieten groeiden, eveneens geen phaag bevatte^^tgeen
de bovengenoemde veronderstelling van Chester bevestigt.

Daar het verder niet is in te zien, hoe zich bij het Pa-quot;
tusschen een phaagvrijen stam van Ps. tumefaciens en een phaag

vrije plant een bacteriophaag zou kunnen vormen, moet men wel aan-
nemen, dat de phagen, die uit gezwellen en deelen van planten in
de nabijheid van deze gezwellen geïsoleerd worden, er tegelijk met

Indien tóch mocht blijken, dat tumoren, die met een bij vooraf-
gaand onderzoek phaagvrij gebleken stam van Ps. tumefaciens
waren verwekt, phagen tegen deze bacterie bevatten, dan is daar
maar één waarschijnlijke verklaring voor: de bacteriën waren wel
besmet met de phaag, maar deze was er zoodanig aan gebonden,
dat hij met de gewone middelen van onderzoek niet aan te toonen
was Dit houdt dan tevens in, dat de bacteriën resistent waren tegen
die phaag. Pas in de plant moeten in dat geval de omstandigheden
zoodanig geworden zijn, dat de koppeling bacterie-phaag ver-
broken werd.

Dat deze mogelijkheid niet ondenkbaar is, bewijzen de resultaten
van vele onderzoekingen over bacteriophagen [nadere gegevens bij

Het onderzoek naar de mogelijke rol, die een bacteriophaag bij
mijn proeven kon hebben gespeeld, moest dus als volgt worden

te isoleeren? (pg. 81).
2°. Is hetzelfde mogelijk voor de perssappen van tumoren en
plantendeelen boven of onder gezwellen, veroorzaakt door

dezen stam 245? (pg. 83).
Voor de oplossing van deze vragen werd in hoofdzaak de
methode gevolgd, die C h e s t e r (1933) bij een soortgelijk onder-
zoek bezigde. Vóór ik begin met de resultaten dezer proeven te
noemen, wordt eerst een overzicht van deze werkwijze gegeven.

Als medium, waarin de bacteriophaagwerking werd bestudeerd,
werd een bouillon-pepton-NaCl-oplossing gebruikt, van een samen-
stelling, waarmede C h e s t e r de beste resultaten bereikte.

2 kg fijngehakte magere paardenbiefstuk werd in ± 9 1 H2O eenige uren
gekookt, totdat ± 1 1 water verdampt was. Vervolgens werd de brij snel

er 20 gr NaCl in opgelost, waarna nogmaals werd ge«
De pH werd met NaOH bijgesteld op 6,8. Vervolgens werd weer Qester hse d.

Meestal was de bouillon, na nogmaals gefiltreerd en gester.hseerd te zi n
helder. Het is natuurlijk voor deze proeven noodzakelijk over volkomen heldere

Wanneer de vloeistof helder was, werden reageerbuisjes - die een m
weXn diameter van 16 mm hadden - gevuld met 10 -- van deze
bouillon. Van tevoren werden op die wijze groote hoeveelheden buizen klaar-
gemaakt, die, na gesteriUseerd te zijn, in voorraad werden gehouden.

Op deze wijze was het zeker, dat voor vele opeenvolgende proef-
series bouillon van dezelfde samenstelling werd gebruikt. De Ph
werd na de laatste sterilisatie nogmaals gecontroleerd en bleek

Voor het filtreeren van de cultures gebruikte ik collodium-
membranen, die in porseleinen kroesjes volgens Bechhold-

Daar het bij deze membranen slechts met behulp van een vacuum
mogelijk was, een snelle filtratie van de vloeistoffen te verkrijgen^
werden de filterkroesjes, vóórdat zij met de collodium behandeld
werden, luchtdicht op zuigflesschen bevestigd zooals hieronder

Deze trechter is door de gummistop (d) van de zuigflesch (e)
heengestoken en aan de uitmonding van den trechter hangt een

de zuigflesch kon druppelen. Dit werd veroorzaakt, doe --
na de filtratie het vacuum moet opheffen, waarbij natuurlijk het
binnenstroomen van niet steriele lucht onvermijdelijk is.

Moet deze lucht echter eerst nog de stijf aangedraaide watten,
waarmede het buisje aan den trechter is verbonden, passeeren, dan
zijn infecties met fungi en bacteriën uitgesloten. Ook heeft men het
groote gemak, dat de fikraten niet afgeschonken behoeven te wor-
den hetgeen de mogelijkheid van infectie eveneens vermindert.

Wanneer het fikertoestel op deze wijze was samengesteld, werd
het geheel 30 min. bij 0,5 atm. overdruk gesteriliseerd. Nadat alles
was afgekoeld, werden de kroezen met collodium behandeld.

De schietkatoen werd eerst geïmbibeerd met de alcohol. Vervolgens kwam
de aether erbij, waarin de schietkatoen oplost. Het duurde geruimen tijd, voor-
dat dit volledig gebeurd was.

waarvan d'Hérelle (1926) aangeeft, dat zij alle ultravira en
phagen doorlaat, zoodat hier met zekerheid mocht worden aange-
nomen, dat de phaag van Ps. tumefaciens er niet door zou worden

De steriele, droge kroezen werden met deze oplossing gevuld.
Door de collodium er vervolgens weer uit te laten loopen, terwi)l
het kroesje voortdurend gelijkmatig gedraaid werd, kon bereikt
worden, dat het collodiumlaagje op den binnenwand van het

Dit water werd nu om de 20 min. drie keer ververscht, zoodat
men vrij zeker kon aannemen, dat na de laatste verversching geen
qroote hoeveelheden alcohol of aether meer uit het membraan kon-
den oplossen, en dat zoodoende een toxisch effect op de te filtree-

Er werden voor de filtratie steeds 8 van dergelijke filtertoestellen
tegelijk gebruikt, die allen op een waterstraal-pomp aangesloten
konden worden, zoodat het mogelijk was, 8 verschillende fikraten

ongeveer 60 min. duurde, werd in de meeste gevallen direct be-
gonnen met de verdere verwerking van de fikraten.

Door bepaalde omstandigheden bleef het fikraat echter wel eens
een nacht staan, hetgeen aan de resultaten niets veranderde.

In het volgende vindt men een nauwkeurige beschrijving van de
methodes, die bij het onderzoek dezer fikraten gebezigd werden.

Steeds werd van te voren de bouillon geënt met de bacter^^^^
later - na toevoeging van de te onderzoeken fikraten - de aan-

wezigheid van lyse veroorzakende bestanddeelen in die fikraten
zichtbaar moesten maken. Deze bacteriën moeten, wil men onder
zoo gunstig mogelijke voorwaarden voor de aantooning van geringe
hoeveelheden bacteriophaag werken, zelf vrij van bacteriophaag en
tevens goed gevoelig ervoor zijn.

Gebruikt men als bacteriestam voor de test een cultuur, die min
of meer met een phaag is besmet, dan zullen de contrölebuizen
— die dus alleen met deze bacteriën geënt werden — een lyse ver-
toonen, die natuurlijk in sterkte afhangt van verschillende factoren,
o.m. van de hoeveelheid phaag, die de teststam bevat.

Indien deze besmetting met phaag niet te sterk is, dan zal een
dergelijke stam zeer wel te gebruiken zijn voor het aantoonen van
een grootere hoeveelheid phaag in de fikraten, vooropgesteld na-
tuurlijk, dat er onder de met phaag besmette testbacteriën voldoende
individuen voorkomen, die phaagvrij zijn. Volgens de algemeen
geldende opvatting toch, zijn de met phaag besmette bacteriën min
of meer resistent tegen die phaag geworden, zoodat alleen de
phaagvrije individuen in de buizen, waarin een extra hoeveelheid
bacteriophaag toegevoegd wordt, deze kunnen indiceeren door een
sterkere lysse.

Chester (1933) begon te experimenteeren met een test-
stam (Ps. tamelaciens Chrys. 2b Stapp), die bij nadere beschouwing
besmet bleek te zijn met een phaag en ondervond daarbij moeilijk-
heden, want een duidelijk verschil tusschen controle- en proef-
buizen was niet met eenige regelmaat te constateeren. Daarom heeft
hij getracht, uit dezen stam individuen te isoleeren, die vrij van de
phaag waren, hetgeen hem gelukte.

Daartoe werd de stam uitgezaaid op agarplaten en vervolgens
werden van 13 geïsoleerd gegroeide colonies nieuwe cultures aan-
gelegd. Twee van deze 13 stammen bleken — bij verdere bestudee-
ring — vrij van de phaag te zijn. In bouillon manifesteert zich dit
verschijnsel, doordat de phaagvrije stammen dezen bouillon door-
loopend troebel houden, terwijl er weinig agglutinaat in ontstaat.
Is de stam besmet, dan wordt de bouillon na eenigen tijd helder en
komt er veel agglutinaat.

De stam, die voor mijn experimenten het meest in aanmerking
kwam, om als teststam dienst te doen, was Ps. tumefaciens
stam 245.

Wanneer met 24 h oude cultures van dezen stam op mout-agar,
bouillon werd beënt zoodanig, dat de bouillon direct na het enten
nog niet zichtbaar troebel was, dan bleek deze na 24 h tot 48 h bij
kamertemperatuur homogeen troebel te worden. Na verdere 1—2
dagen begon zich een gladde pellicula te vormen en de bouillon
bleef troebel. Pas na 10—14 dagen begon er een duidelijke afname
van de troebeling op te treden. Steeds verzamelden zich op den
bodem van dè buizen vrij groote hoeveelheden agglutinaat.

Daar het niet zeker was, of stam 245 phaagvrij was, werden van
uitzaaiingen van dezen stam op agarplaten subcultures van 10 ge-
isoleerde colonies gemaakt.

Deze vertoonden echter na enting in bouillon geen duidelijke ver-
schillen in groei, zoodat deze poging tot het isoleeren van phaag-
vrij e individuen, voorloopig werd gestaakt.

Het bleek bij de hieronder te beschrijven proeven, dat de stam
245 wel was te gebruiken als teststam, niettegenstaande aangetoond
kon worden, dat hij met phaag was besmet.

Dezelfde ervaringen heeft Israilsky (1926, 1927) opgedaan
bij een onderzoek naar het voorkomen van bacteriophagen tegen
Ps. tumefaciens in tumoren van bieten. De stam, dien hij gebruikte,
om deze phaag aan te toonen, bleek bij een ouderdom van 24 uur
geen bacteriophaag in aantoonbare hoeveelheid te bevatten (I s-
r ail sky 1926, S. 240). Daarentegen kon uit cultures van den-
zelfden stam, wanneer deze ongeveer een maand oud waren, wél
een phaag geïsoleerd worden (Israilsky 1927, S. 307).

Het leek mij dus gewenscht van den stam 245 steeds 24 uur oude
of nog jongere cultures te gebruiken bij de enting van de proef- en
contrölebuizen.

Daartoe werd deze stam eiken dag opnieuw op een groot aantal
buizen met mout-agar overgeënt.

De enting van de bouillonbuizen bestemd voor een proef met fil-
traten werd begonnen, zoodra de filtratie afgeloopen was. Daartoe
werden van de 24 uur oude mout-cultures van stam 245 suspensies
in bouillon gemaakt, zoodanig dat 0,05 ccm van deze suspensie
106—107 bacteriën inhield.

Een dergelijke suspensie kon steeds zonder moeite verkregen
worden, daar eerst door middel van buizen met mastixsuspensies.
van verschillende dichtheid vastgesteld was met welken graad van

troebelheid van de mastixbuizen de gewenschte bacteriënsuspensie
overeenkwam. Deze mastixbuis werd gemerkt en in het vervdg
steeds gebruikt als maat van troebelheid voor de entsuspensie. De
hoeveelheid bacteriën in 0,05 ccm van een suspensie werd van te
voren bepaald door verdunningen te maken in een reeks bouillon-

Wanneer de bacteriesuspensie den vereischten graad van dicht-
heid had verkregen, werden door middel van deze pipet alle voor
de proef benoodigde bouillonbuizen elk met 1 druppel geent_

Daarna werd direct overgegaan tot het inbrengen der fikraten.
Per buis werden na de eerste filtratie 2 ccm Wt-at, na de vo -
gende passages en filtraties daarentegen steeds slechts 0,5 ccm fil-

quot; Merr^ktt werden op deze wijze steeds 4 bouillonbuizen
geënt zoodat men voor het beoordeelen van het effect niet op een
Lis was aangewezen, hetgeen bij mogelijke vari^abiliteit van de
werking natuurlijk tot groote fouten aanleiding had kunnen zi,n.

Natuurlijk werden er steeds 4 buizen, die alleen 1 druppe
bacteriesuspensie hadden gekregen, als controle gebruik . Alle
buizen kregen een nummer, zoodat zij individueel gecontroleerd
konden worden, indien dat ten gevolge van variaties m de sterkte

Behalve de bovengenoemde contrölebuizen werd bij de proeven
met fikraten van perssappen uk tumoren enz. nog een tweede soort
contrôles gebruikt, die bij de behandeling dier proeven ter sprake

Vo°oThet beoordeelen van den graad van opheldering in de proef-
buizen werden deze tegelijk met de -°^trôlebuizen vergeleke^^^^^
een reeks van mastixsuspensies van opklimmende dichthe^. Deze
contrôlemethode. die bij doorvallend licht tegen -
achtergrond het beste voldeed, is ongeveer dezelfde, die C h e s t e r
uitgewerkt heeft. De mastixsuspensies waren als volgt samenge-

Vervolgens werden 2 gr mastixkralen in 100 ccm alcohol 96% opgelost.
Van deze oplossing werden in de buizen met Oranje G een opklimmend aantâl
druppels van 0,05 ccm gevoegd. Zoo verkreeg ik de testbuizen 1—4.

Testbuis 1 kreeg 1 druppel van de mastixoplossing
„ 2 „ 2 druppels „ „nbsp;„

Op deze wijze ontstonden suspensies die onder elkaar duidelijke verschillen
in troebelheid vertoonden zonder dat deze verschillen echter te groot werden.

De buizen werden met een kurk afgesloten en bleven gedurende 4 maanden
homogeen troebel zonder vorming van een neerslag.

Werd de Orange G opgelost in aqua dest., dan ontstonden na toevoeging
van de alcoholische mastixoplossing zulke sterke neerslagen, dat een duidelijk
verschil tusschen de testbuizen niet te constateeren was.

Een nadeel bij het gebruik van zoo samengestelde testbuizen is
de onmogelijkheid suspensies van dezelfde kleur als de bouillon met
bacteriën te verkrijgen. Evenwel, na eenige oefening wordt deze
methode zeer bruikbaar voor qualitatieve proeven, waar het hier om
te doen was.

Het dient hier nog te worden opgemerkt, dat alle proeven met
bacteriophaag gebeurden bij ± 18° C.

Na deze methodische uiteenzettingen volgen hier de resultaten
van het eerste deel van dit onderzoek.

I. Is Ps. tumefaciens stam 245 phaagvrij of bevat h ij
een phaag in aantoonbare hoeveelheden?

Deze vraag werd als volgt opgelost: Bouillonbuizen geënt op de
hierboven aangegeven wijze met den te onderzoeken stam, werden
na ± 5—6 dagen groei gefiltreerd. Van dit filtraat werd 2 ccm
gevoegd bij nieuwe bouillonbuizen, die ook weer met denzelfden
stam waren geënt. Na 5—6 dagen werden ook deze buizen weer
gefiltreerd. Dit gebeurde verscheiden keeren achter elkaar.

Inderdaad bleken reeds na 3—4 passages van 5—6 dagen ge-
ringe verschillen in troebelheid tusschen de buizen met fikraten en
de contrölebuizen op te treden. Deze werden na verdere passages niet
veel duidelijker. In tabel 22 ziet men deze verschillen uitgedrukt door
het teeken . Deze teekens duiden een zekeren graad van helder-
heid van de proefbuizen aan vergeleken met de controles. D'e af-

De werking van de in cukures van Ps. tumefaciens stam 245 aan-
wezige bacteriophaag. Voor de beteekenis der -f-teekens zie de
tekst. • Beteekent dat de reeks niet verder doorgezet werd.

stand tusschen twee van de boven beschreven mastixsuspensies
werd denkbeeldig in 4 trappen verdeeld en elk van deze trappen
door een -teeken aangeduid. Was dus een proefbuis even troebel
als mastixbuis 2 en een contrôlebuis als mastixbuis 3, dan wordt de
graad van helderheid van de proefbuis hier opgegeven als .

Deze verschillen met de controles verdwenen, wanneer de
fikraten voor het pipetteeren 2 min. op 100° C werden verhit. Nog
op andere wijze werd het voorkomen van een thermolabiele lyse-
verwekkende stof in de fikraten van bouillon Ps. tumefaciens
stam 245 aangetoond.

Van het fikraat van de 4de en 5de passage in tabel 22 bedoeld,
werd 8 ccm afgepipetteerd en verdeeld over 2 leege steriele buizen.
De eene buis werd 2 min. op 100° C verhit, de andere buis niet.
Vervolgens werden beide buizen elk met 8 druppels van de sus-
pensie geënt. In dit geval kon dus het onverdunde fikraat inwerken.

Het resultaat is een duidelijk onderscheid in troebeling tusschen
het gekookte en ongekookte fikraat. Het laatste is belangrijk
helderder.

Het optreden van een verschil tusschen proef- en contrôlebuizen
bij elke passage ontwikkelde zich slechts zeer geleidelijk. Na 48
uur was er bij de verdunde fikraten nooit eenig verschil op te mer-

ken. Pas na 3—5 dagen, soms ook na nog längeren tijd, werden de
verschillen goed duidelijk. Dit is ook de reden waarom hier de
passages zoo lang duurden.

Bij de onverdunde fikraten daarentegen trad het verschil veel
sneller op, maar het manifesteerde zich eerst door een sterkere
troebeling in de buizen met het ongekookte fikraat, vergeleken bij
die welke 2 min. op 100° C waren verhit. Dit is in overeenstemming
met de volgende waarnemingen van d'H é r e 11 e (1926) en
anderen: De bacteriophaag kan soms beginnen met een stimulatie
van den bacteriegroei, waarna de lyse optreedt.

Een volkomen opheldering werd bij inwerking van
fikraten van stam 245 op dienzelfden stam na het aantal passages,
dat bij deze proeven werd gebruikt, niet bereikt, ook daar niet,
waar het filtraat onverdund kon inwerken.

De conclusie, die uit dit deel van het onderzoek te trekken valt,
is dus, dat Ps. tumefaciens stam 245 met een phaag is besmet, die
door middel van de hierboven aangegeven methode is aan te
toonen. Deze phaag bereikt na 5 passages van 5—6 dagen elk, nog
niet die concentratie in het onverdunde fikraat, welke vereischt is
voor een volkomen opheldering van bovengenoemde suspensie,
wanneer de bacteriën in de aangegeven hoeveelheid aan het fikraat
worden toegevoegd.

II. Is in de tumoren en stengelstukken boven
of onder de tumoren een phaag aan te
toonen?

Het is duidelijk, dat deze vraag niet met zekerheid positief be-
antwoord kan worden, indien niet tevens blijkt, dat de phaag, die
men uit de tumoren en stengelstukken boven of onder deze tumoren
verkrijgt, een sterkere werking vertoont na evenveel passages door-
gemaakt te hebben dan die, welke uit den teststam 245 zelf af-
komstig is. Men voegt immers bij elke nieuwe passage het fikraat
van de vorige toe. Dit fikraat echter bevat niet alleen phaag uit de
plantenextracten, maar ook — zooals uit het voorafgaande blijkt —
die, welke deel uitmaakt van den teststam zelf.

1.nbsp;Controle 1: 4 buizen, die slechts een druppel van de ent-
suspensie kregen.

2.nbsp;Controle 2: 4 buizen, die behalve een druppel van de ent-
suspensie eerst 2 ccm en bij de volgende passages 0,5 ccm van
de filtraten der vorige passages van deze zelfde buizen kregen.

3.nbsp;Proefbuizen: 4 buizen, die behalve een druppel entsuspensie
eerst 2 ccm en vervolgens 0,5 ccm filtraat van de vorige pas-
sages met tumor- resp. stengelextracten kregen ¹ ).

Ricinus: Werking van de bacteriophaag uit extracten van tumoren
en stengelstukken vergeleken bij controle 2. De gegevens zijn voor
elk extract apart vermeld. In deze tabel beteekent een t achter de
cijfers, dat het extract van een tumor afkomstig is. Hetzelfde getal
zonder t duidt het extract uit het bijbehoorende stengelstuk aan.

tumoren van Ricinus, Pelargonium en Impatiens, bij de laatste
bovendien nog met stengelstukken onder de tumoren.

Op deze wijze werden van Ricinus 5 tumoren en 5 stengel-
stukken, van Pelargonium 4 tumoren en 4 stengelstukken en van
Impatiens eveneens 4 tumoren en 4 stengelstukken onderzocht. De
tumoren en stengelstukken werden gesneden en behandeld zooals
op pg. 67 is opgegeven.

1nbsp; De steriliteit van elk filtraat werd bij elke proef op moutagar getest. Ver-
ontreinigingen bleken nooit voor te komen.

Pelargonium: Werking van bacteriophaag uit extracten van tumo-
ren en stengelstukken; verdere verklaring zie vorige tabel en tekst

Impatiens: Werking van bacteriophaag uit extracten van tumoren
en stengelstukken; o beteekent, dat in de reeks een extract van een
stengelstuk onder de tumor werd gebruikt. Verdere verklaring zie
tabel 24 en tekst (pag. 81).

Nadat de weefselbrij 4—5 dagen in den bouillon was gebleven,
werd voor den eersten keer gefiltreerd. Dit kan men als eerste
passage in aanmerking nemen, hoewel hier geen andere

bacteriën werden toegevoegd dan die, welke reeds in de
weefselbrij aanwezig waren. Toch heb ik dit groeien in bouillon als
1ste passage opgevat en dus moest daarmede rekening worden ge-
houden bij de vergelijking met controle 2.

In de tabellen 23, 24 en 25 ziet men achtereenvolgens de resul-
taten met de extracten van Ricinus, Pelargonium en Impatiens.

Zooals uit deze tabellen blijkt, is het verschil tusschen de proef-
biiizen en de controles 2 tamelijk duidelijk. Ook hier is echter met
het verdunde filtraat nergens een volkomen opheldering opge-
treden.

Anders was dat met de proeven met de onverdunde fikraten, die
bij deze series eveneens gedaan werden.

Twee onverdunde fikraten afkomstig van RicinusAnmoten en
een onverdund fikraat van een Ricinus-stengeïstuk boven den
tumor gaf na enting met 8 druppels bacteriesuspensie in 4 ccm fil-
traat een volkomen opheldering, d.w.z. ook na weken
trad in deze fikraten geen groei meer op. Zij bleven dus helder.

Op photo 7 ziet men de twee tumorfikraten en daartusschen het
bijbehoorende fikraat van controle 2. Deze fikraten waren af-
komstig van de 4de passage.

Op photo 8 ziet men het filtraat van het stengelstuk boven een
tumor van een andere plant als de twee eerstgenoemde fikraten.
Daarnaast staat een buis, die hetzelfde van te voren 2 min. op
100° C verhitte fikraat bevat. Dit was een filtraat van de 5de
passage.

Drie dagen nadat in de buizen met de tumorfikraten de lyse vol-
komen was geworden, werden uit deze buizen en uit de buis, waarin
zich het filtraat van controle 2 bevond, entingen gedaan op bouillon-
agar. Op alle platen kwamen bacterien op, maar de platen, geënt
met de tumorfikraten vertoonden pas 2—3 dagen later groei, dan
die, welke met controle 2 waren geënt. Het aantal bacteriënkolonies
was bij de fikraatplaten veel geringer. De kolonies, die ontstonden,
vertoonden het gladde type.

6 dagen na de volledige opheldering van het fikraat van het
Ricinus-stengelstuk boven den tumor (zie photo 8) begon hierin
opnieuw een troebeling op te treden. Nu werden hieruit en uit de nog
altijd duidelijk troebeler buis, die het gekookte fikraat bevatte, uit-
strijkcultures gemaakt op moutagar-buizen met het resultaat, dat op

Photo. 7 — Zie pag. 84. Buizen 1 en 3 bevatten onverdunde turaorfiltraten na
de 4de passage. Buis 2 bevat het onverdunde filtraat van controle 2. Alle 3 de
buizen werden met dezelfde bacteriën hoeveelheid geënt.
Gephotografeerd 30 dagen daarna. Voor het photografeeren
werden de drie buizen geschud.

1 2
Photo 8. — Zie pag. 85 — 86. Buis 1 bevat 2 min. op 100°
verhit filtraat, buis 2 bevat hetzelfde filtraat, doch onverhit.
Beide buizen werden met dezelfde hoeveelheid bacteriën geënt.
Beide buizen werden voor het photografeeren geschud. De
vloeistof in buis 2 was sterk visceus geworden (zie luchtblazen).

de agarbuizen, beënt met de gekookte fikraten, groei optrad (gladde
vorm), op de andere buizen groeide niets.

Er moet hier naar voren gebracht worden, dat dit de drie eenigste
gevallen waren, waarin een volkomen opheldering te zien was. Bij-
geen van de andere onverdunde fikraten trad zij op. Wel traden
ook hier vaak duidelijke verschillen met controle 2 op, maar een
zoo frappant verschil als in bovengenoemde drie gevallen was met

Hoogst onaangenaam was ook het verschijnsel, dat de fikraten
na een bepaalde passage een duidelijk effect gaven, dat dit effect
na een volgende filtratie sterk verminderde, om na verdere filtraties
weer sterker te worden (zie bij voorbeeld tabel 23). Wellicht moet
hier gedacht worden aan wisselende gevoeligheid van den teststam.

In de buizen, waar geen volledige opheldering optrad, werd het
verschil tusschen proef- en contrölebuizen na verloop van minstens

Dat de verschillen na 7 dagen nog duidelijk te zien waren, blijkt
uit photo 9, die een proef weergeeft met extracten van Impatiens
(4de passage). Men ziet op deze photo afwisselend contrölebuizen 1
en proefbuizen. De nuances in troebelheid komen hier goed uit.

Ongetwijfeld zouden bovenstaande resultaten nog sprekender
uitgevallen zijn, indien de phaag meer passages had doorloopen en
vooral wanneer gewerkt had kunnen worden met een phaagvrijen
teststam. Dat desondanks duidelijke verschillen optraden, verhoogt
de waarde van de geconstateerde feiten.

Hoewel het aantal proeven hier gering was, schijnt het mij ge-
oorloofd — ook in verband met de gelijkluidende resultaten van
Brown en Quirk (1929), Muncie en Patel (1930), Is-
railsky (1926) en Chester (1933) — daaruk de volgende

Uit 3 van de 5 onderzochte Ricinus-planten met tumoren was een
phaag te isoleeren, die duidelijk sterker werkzaam was onder cor-
Lspondeerende omstandigheden dan de phaag die de gebruikte
teststam Ps. tumefaciens stam 245 bevatte. In alle andere gevalkn
waren de fikraten, verkregen uk de planten met tuinoren, weliswaar
sterker werkzaam dan die, welke de teststam zelf leverde, maar
deze werking haalde niet bij de drie zoo juist genoemde.
Het is hier de aangewezen plaats voor de volgende vraag:

Is de phaag in de plant v i r u 1 e n t e r geworden, of was de
beginconcentratie van phagen in de plantenextracten grooter dan
die, welke Ps. tumefaciens stam 245 bevat?

De eerste veronderstelling mag men m.i. pas dan bewezen achten,
wanneer het onmogelijk is, de phaag, die stam 245 bevat, door nog
meer passages als hierboven werden doorgevoerd, te brengen tot
dezelfde activiteit als de phagen uit de tumorextracten.

Chester (1933), die de meening is toegedaan, dat de phaag
in de plant virulenter wordt, heeft deze kwestie, voorzoover uit zijn
publicatie is op te maken, niet nagaan.

De oplossing van de bovengestelde vraag is overigens voor het
immuniteitsvraagstuk van minder belang, aangezien aangenomen
moet worden, dat de plant een invloed uitoefent óf op de virulentie
van de phaag, óf op de gevoeligheid van de bacterie, In elk geval
hebben wij te maken met een actieve rol, die de plant in deze
speelt.

Wanneer wij de resultaten van dit onderzoek met elkaar in ver-
band trachten te brengen, dan valt op, dat bij alle proeven één punt
telkens weer naar voren komt, en dat is de resistentieverhooging,
die optreedt na een behandeling met levende bacteriën. Zooals ge-
zegd, waren de bacteriën, die hiervoor dienden, gegroeid in een
synthetische voedingsoplossing, waarin zij geen optimale groei-
voorwaarden vonden. Het gevolg hiervan was, dat zij in dit medium
veranderden en na eenigen tijd voor het grootste gedeelte over-
gingen in ruwe varianten.

Ook bij isolatie van bacteriën uit de tumoren en de aangrenzende,
niet gezwollen deelen van de plant, bleek het grootste gedeelte der
bacteriën uit ruwe vormen te bestaan, zoodat naar analogie met de
verschijnselen optredende in reincultuur wellicht aangenomen mag
worden, dat de plant ongunstig op de bacterie inwerkt. Deze ruwe
vormen waren volgens inoculatieproeven zeer weinig virulent.

Aangetoond kon worden dat na inwerking van een mengsel
gladruw op bladen of stekken (pg. 21—38) of na uittreding
dezer vormen uit de tumoren in naburige stengeldeelen (pg. 39—72)
de boven bedoelde resistentieverhooging optrad. Het schijnt dus niet
onmogelijk dat de aanwezigheid van deze vormen in de plant het op-
komen van een infectie met virulente bacteriën meer of minder remt.

Wellicht kan men, gezien de resultaten die men op medisch ge-
bied heeft verkregen door behandeling van mensch en dier met
avirulente pathogenen, ook hier de conclusie trekken, dat de plant
als reactie op de aanwezigheid van de weinig, virulente vormen van

Ps. tumefaciens afweerstoffen gevormd heeft tegen deze bacterie.
Dat dit niet de eenige verklaring is, spreekt van zelf, men denke
slechts aan een mogelijk antagonisme dier vormen binnen de plant.

Om deze kwesties verder te analyseeren zou men perssappen
van de zieke planten moeten onderzoeken op hun gehalte aan de
veronderstelde afweerstoffen. Hoeveel moeilijkheden dit onderzoek
kan opleveren blijkt duidelijk uit de herhaling van de proeven van
Kostoff (1929) door Silberschmidt (1931) en Ches-
ter (1932).

Des te meer verbaast het, dat M a g r o u (1935) door een een-
voudige filtratie van perssappen uit tumoren en plantenstengels in
het zoo verkregen filtraat stoffen heeft kunnen aantoonen, die
specifiek agglutineerend werken op Ps. tumefaciens.

Toch komt het mij voor dat de op pg. 24 reeds besproken proe-
ven aandacht verdienen, daar zij door hun controlesysteem ver-
trouwen inboezemen.

Of het dergelijke stoffen zijn, die de bacteriën in de plant hun
virulentie doen verliezen is natuurlijk voorloopig geenszins uit te
maken. Het is misschien mogelijk dat na inwerking van de bedoelde
stoffen op de bacteriën, de bacteriophaag een verhoogde activiteit
kan ontplooien.

Hoe ingewikkeld deze kwesties zijn en hoe voorzichtig men moet wezen bij het
trekken van algemeene conclusies bewijzen overigens proeven van Brown
(1929), die aantoonen dat Ps. tumefaciens in de plant lang niet altijd aan
virulentie verliest. Deze auteur vindt n.1. dat tumoren veroorzaakt door zeer
zwak virulente stammen bacteriën opleveren die veel virulenter zijn geworden.
Wellicht kunnen deze tegenstrijdigheden verklaard worden door dat de ver-
schillende onderzoekers tumoren van verschillenden ouderdom onderzochten.
Bekend is het feit dat Ps. tumefaciens des te moeilijker te isoleeren is naarmate
de tumor ouder wordt. Wanneer men zich echter achter de woorden „des te
moeilijkerquot; de zinsnede „in virulenten vormquot; denkt, dan zou dit wellicht een
verklaring kunnen zijn voor de bovengenoemde tegenstrijdigheid.

Overigens zal het zeker niet onverschillig zijn of men isoleert uit tumoren,
verwekt door sterk virulente stammen, of uit zulke die ontstonden door nauwe-
lijks pathogene bacteriën. In het laatste geval vond Brown na herisolatie een
verhooging der virulentie. Of zij ook gelet heeft op de virulentie van bacteriën
afkomstig uit tumoren van de eerstgenoemde soort, is uit deze publicatie niet op
te maken.

Het virulentieverlies van pathogene stammen van Ps. tumefaciens in de
plant en in reincultuur is echter zoo vaak zonder eenigen twi)fel geconstateerd

(zie vooral Smith en Stapp), dat men het als een vaststaand feit kan
beschouwen.

Het schijnt mij in geen geval geoorloofd, de phaag op te
vatten als een door de plant gevormde afweerstof, zooals G ä u-
mann (1933) en Israilsky (1926) gedaan hebben. Dit is in
strijd met alle gangbare opvattingen omtrent bacteriophagen.

Dat deze phaag echter een rol te vervullen zal hebben in het
proces is niet uitgesloten. Dit kan men slechts onderzoeken door
proeven te doen met phaagvrije stammen van Ps. tumefaciens, wan-
neer deze tenminste bestaan.

Het is hier de plaats een waarschijnlijk analoog verschijnsel te
bespreken, n.1. de vorming der wortelknolletjes bij Leguminosen.
Ook hier zijn er onderzoekingen die de vorming van specifieke
agglutininen aangetoond schijnen te hebben (Cappelletti,
1923). Ook hier worden veranderingen van vorm bij de bacteriën
binnen het weefsel dezer knolletjes gesignaleerd.

Ten slotte is ook uit de knolletjes en de wortels, ja zelfs uit de
stengels een bacteriophaag geïsoleerd, welke op Bacterium
radicicolum werkt (zie Gerritsen c.s., 1923; Israilsky,
1929).

Evenals bij tumoren van Ps. tumefaciens hebben verscheidene
auteurs gevonden, dat van de knolletjes een zekere immuniseerende
invloed uitgaat op den wortel. Deze invloed uit zich daarin, dat
superinfecties alleen gelukken met virulentere stammen. Nu komt
echter het volgende: L ö h n i s (1930) en vele anderen vinden, dat
planten die voldoende stikstofvoeding kregen „immuunquot; zijn tegen
infectie. Volgens Löhnis is nu de „immuniteitquot;, die in de wor-
tels optreedt wanneer deze knolletjes dragen, veroorzaakt door
actieve — dus stikstof assimileerende — bacteriën, aan hetzelfde
toe te schrijven. Dït wordt waarschijnlijk door de waarneming dat
wortels, die knolletjes dragen veroorzaakt door bacteriën welke
geen of weinig stikstof assimileeren, in het geheel niet immuun zijn

Men ziet hoe voorzichtigheid is geboden bij conclusies over im-
muniteit, waarmee niet gezegd wil zijn, dat ook bij de Leguminosen-
knolletjes echte immunitaire reacties geen begeleidende rol zouden
kunnen spelen. Deze verschijnselen zijn zeer gecompliceerd en ver-

schillende oorzaken kunnen samenwerken, om een bepaald zicht-
baar eindeffect te versterken.

Bij de Leguminosenknolletjes is men vrij goed op de hoogte van
de intieme relaties, die bestaan tusschen de bacterie en de plant.
Hetzelfde kan geenszins gezegd worden van de combinatie van
Ps. tumefaciens en zijn gastheer. Welke stofwisselingsverschijnselen
zich bij dit parasitaire proces voordoen, is slechts bij benadering
bekend.

In ieder geval is het zeker, dat ook in dit geval zeer vele factoren
denkbaar zijn, die hetzelfde eindeffect teweegbrengen.

Dit geldt eveneens voor de gevallen waar men een gevoeligheids-
verlaging van planten voor parasitaire fungi heeft geconstateerd als
gevolg van het inwerken van stofwisselingsproducten, dood myce-
lium of verzwakte levende vormen dezer fungi op die planten.

Zo ja (1925) vindt een duidelijke resistentieverhooging van
tarwekiemplanten tegen Helminthosporium sativum indien de zaden
gekiemd waren in een waterig extract dezer schimmel. Zij besluit
tot immuniteit, evenals A r n a u d i (1933) waar deze haar proeven
bespreekt.

Leeman (1932) doet proeven met denzelfden gastheer en
parasiet. Hij bevestigt Z o j a's resultaten doch ziet bovendien, dat
een dergelijke resistentieverhooging tegen Plelminthosporium sati-
vum optreedt na behandeling met extracten van andere parasitaire
en niet-parasitaire schimmels en bacteriën!

Conclusies als die van Z o j a—A r n a u d i zullen dus eerst be-
wezen moeten worden. Eenzelfde houding moet men innemen tegen-
over het laatste onderzoek van A r n a u d i (1933).

Hoewel dus de bij mijn onderzoek verkregen resultaten m het ge-
heel geen definitieve oplossing van het vraagstuk der immuniteit
tegen Ps. tumefaciens opleveren, scheen het mij toch goed, de rol
die avirulent geworden bacteriën al of niet in samenwerking met de
bacteriophaag, bij de door mij geconstateerde resistentieverhooging:
zouden kunnen spelen, naar voren te brengen.

Alle hieronder genoemde resultaten werden verkregen door be-
handeling van de planten met Ps. tumefaciens stam 245, sinds 1932
op het Phytopathologisch Laboratorium „Willie Commelin Schol-
tenquot; aanwezig en geïsoleerd door B. H u s uit Pims communis.

1.nbsp;Door inoculatieproeven bij Ricinus, Pelargonium, Impatiens en
Bryophyllum werd aangetoond, dat deze stam zeer virulent
was en in 100 % van de gevallen infectie veroorzaakte (pg.
13), dat steriel leidingwater een voor deze bacterie onschade-
lijk suspensiemedium is, ook op den langen duur (tot 30 uur)
(pg. 15) en dat zeer groote verschillen in de hoeveelheden
bacteriën, waarmede de planten werden geïnoculeerd, niet den
minsten invloed uitoefenen op de grootte van de tumoren, die
hierdoor ontstaan (pg. 15).

Deze stam is sinds 1932 voortdurend elke maand van moutagar
op moutagar overgeënt en heeft al dien tijd zijn virulentie be-
houden.

Dit laatste is niet het geval geweest met de andere hier onder-
zochte stammen (pg 13).

2.nbsp;Voor de beoordeeling van de infectiegrootte werden de af-
metingen van de tumoren opgenomen; tegelijkertijd werd de
groei van de plantendeelen, waarop zij zich ontwikkelden, ge-
meten.

3.nbsp;Bij oriënteerende proeven is gebleken, dat bij kiemplanten van
Ricinus de geschiktheid van het hypocotyl om tumoren te
vormen afneemt, naarmate het ouder wordt. Wanneer de
periode van lengtegroei (celstrekkingsperiode) is afgeloopen
en de cotylen volgroeid zijn, ontstaan na inoculatie van het
hypocotyl nog slechts kleine tumoren.

Op welk moment van zijn ontwikkeling het hypocotyl het
sterkst reageert op een inoculatie met Ps. tumefaciens, is niet

precies onderzocht. Met groote waarschijnhjkheid kan evenwel
gezegd worden, dat dit even na het begin van de celstrekkings-
periode valt (pg. 16, photo's 1 en 2).

4.nbsp;De gevoeligheid voor Ps. tumefaciens van bloeiende en in den
bloei verhinderde Pelargonium-planten werd onderzocht.
Wanneer bij dergelijke planten werd geïnoculeerd in oude
internodiën, dan was geen verschil in gevoeligheid te consta-
teeren. Werd in jonge, nog groeiende internodiën geïnoculeerd,
dan was na ruim een maand evenmin een verschil te zien tus-
schen bloeiende en niet bloeiende planten. Of er na langere
proefduur wel verschil zou optreden, kon niet verder nagegaan

5.nbsp;Proeven waarbij nagegaan werd, of het op eenigerlei wijze
mogelijk was, de gevoehgheid tegen Ps. tumefaciens experi-
menteel te verlagen, werden gedaan met de volgende planten:
Pelargonium, Bryophyllum en Ricinus.

6.nbsp;Bi] Pelargonium kon een verhoogde weerstand gecon-
stateerd worden ten gevolge van een behandeling van stekken
met levende Ps. tumefaciens in een voor de parasiet ongunstige
voedingsoplossing (pg. 35—36).

7.nbsp;Tevens kon bij Pelargonium aangetoond worden, dat van een
tumor een remmende invloed uitgaat, welke de vorming van
een tweeden, later geïnoculeerden tumor min of meer tegen-
werkt (pg. 43).

8.nbsp;Bij de onder 6 en 7 genoemde gevallen kon aangetoond wor-
den, dat de geringere tumorgroei niet het gevolg was van
vegetatieve groeiremmingen (pg. 38 en 43).

9.nbsp;Na injectie van een cultuur van Ps. tumefaciens groeiende op
de onder 6 bedoelde voedingsoplossing, in afgesneden bladen
van Bryophyllum crenatum, was ten eerste een
duidelijke invloed te zien op het aantal en de grootte van de
zich in de bladmeristemen ontwikkelende plantjes en verder
bleken deze planten, nadat zij overgezet waren in aarde, iets
minder gevoelig te zijn voor Ps. tumefaciens (pg. 23, photo 3).

10.nbsp;Bij een gering aantal spruiten, die zich bij Bryophyllum crena-
tum in de bladoksels ontwikkelden tengevolge van een inocu-
latie met Ps. tumefaciens onder de bladoksels, bleek de
gevoeligheid voor Ps. tumefaciens gedaald te zijn, nadat ge-

11.nbsp;Bij een beperkt aantal planten van Ricinus, die groote
tumoren in het hypocotyl dioegen, bleken inoculaties in het
eerste internodium vrijwel geen succes te hebben, vergeleken
bij controleplanten (pg. 44).

12.nbsp;Bij een groot aantal Ricinus-planten bleken de tumoren, die
door gelijktijdige inoculaties in verschillende internodiën ont-
stonden, elkaar in hun groei te remmen.

Deze remming was reeds vroeg te constateeren, nog vóór de
tumoren zoo groot werden, dat redelijkerwijs aangenomen kon
worden, dat zij den vegetatieven groei van de planten konden
beïnvloeden door voedingsstoffen aan de groeiende deelen te
onttrekken.

Metingen van lengte- en diktegroei van de geïnoculeerde inter-
nodiën wezen uit, dat groeiremmingen optraden, vooral bij den
lengtegroei van de geïnoculeerde internodiën. Deze hadden,
wanneer de planten in hun geheel langzaam groeiden, een
locaal karakter. Wanneer daarentegen de uitwendige omstan-
digheden zoodanig waren, dat de planten sneller groeiden, dan
was ook een duidelijke invloed op de planten in hun geheel te
constateeren.

Gezien echter de duidelijke remming, die de tumoren reeds in
het begin van hun groei op elkaar uitoefenen, is het voorloopig
het waarschijnlijkst hier een rechtstreeksche beïnvloeding van
de tumoren op elkaar aan te nemen (pg. 65).
13. Uit de tumoren en de stengels, waarop deze tumoren gegroeid
waren, kon Ps. tumefaciens geïsoleerd worden (pg. 69).
Deze 'isolaties veroorzaakten slechts voor een gering percen-
tage qroote tumoren. Het grootste aantal gaf bij inoculade van
/?icmu5-planten slechts kleine zwellingen, die evenwel grooter
waren dan de calluswoekeringen, die rondom wonden van
contróleplanten, gemaakt met een steriele entnaald, groeiden

D?z!!r virulente stam boette dus binnen de plant een groot
deel van zijn virulentie in. De bacteriën zijn niet alleen van

virulentie, maar ook van uiterlijk veranderd. Voor het grootste
deel werden n.1. ruwe vormen uit de planten geïsoleerd (pg.
67).

14.nbsp;Nooit werd eenige variabiliteit van Ps. tumefaciens stam 245 in
reincultuur geconstateerd, indien hij gekweekt werd op gun-
stige voedingsmedia als mout-agar, bouillon-agar, vloeibare
mout en vloeibare bouillon. De vorming van ruwe varianten
trad echter op, wanneer deze stam in de voor zijn groei on-
gunstige synthetische voedingsoplossing van Stapp en
Bortels werd gekweekt (pg. 69).

16.nbsp;Eveneens gelukte het een phaag te isoleeren uit tumoren en
stengelstukken van tumordragende planten, waarbij waarge-
nomen kon worden, dat deze phaag na een gelijk aantal pas-
sages op Ps. tumefaciens stam 245 een sterkere lytische wer-
king uitoefende dan die, welke reeds in den stam 245 aanwezig
was (pg. 83—88).

17.nbsp;Het is niet uitgemaakt, of dit verschil in werking berust op een
virulentieverhooging van de phaag in de plant, dan wel op het
feit, dat de phaag in de plant in grootere hoeveelheden voor-
komt dan in de cultures der bacteriën (pg. 88).

18.nbsp;In de cultures van Ps. tumefaciens op de synthetische voedings-
oplossing van Stapp en Bortels, wordt waarschijnlijk
een wortelvormende stof gevormd (pg. 32, 33).

1933 Bull of the Torr. Bot. Club. 60. 583—597.
BOUILLENNE, RAY. et WENT, F. ^-^erches exper^^^^^
sur la neoformation des racines dans les plantules et
les boutures des plantes supérieures.

1933 Arch. l'Inst. Bot. Univ. Liège. 10. 1—177.
BROWN, N. A., Experiments with Paris daisy and rose to produce
resistance to crown gall.

1923, Phytopath. 13. 87—99.nbsp;.
__^_The tendency of the crown-gall orgamsm to pro-
duce roots in conjunction with tumors.

1929, Tourn. Agr. Res. 39. 503—530.
CAPPELLETTI, C., Reazioni immunitarie nei tubercoh radicah

1923 Giorn. di Biol, e Med. sperm. 1. , , ,, ,
____ Reazioni immunmitarie nei tubercoh delle legumi-
nose.

CHESTER: K. S. and WHITAKER, T W.. Studies on the pre-
cipitin reaction in plants. IV.

1933 Am Journ. Bot. 20. 297-308.
CHESTER, K.S., Studies on bacteriophage in relation to phyto-
pathogenic bacteria.

GÄUMANN, E., Neuere Erfahrungen auf dem Gebiete der pflanz-
lichen Immunitätslehre.

1932 CÄÄ Paris. 109. 1387-1389.
d'HERELLÉ, F.. Le bacteriophage et son comportement.

HILL, J B . The migration of Bacterium tumefaciens in the tinue
of tomato plants.

faciens and its host relationship.
1930 Phytopath. 20. 179—186.
ISRAlisKY, W' P. Bakteriophagie und Pfknzenkrebs.

Verqleichende Untersuchungen über die Rassen-
^nbsp;^gentümhchkeiten des B. tumefaciens und verwandter

Zur Biologie der Tumefaciens stamme.
1929, Ztschr. Krebsforsch. 30. 290-294.
KOSTOFF D. Acquired immunity m plants.

1932nbsp;Zentrbl. Bakt. II. 85. 360—376. ^ , , ,
LEVINE M. The mechanism of the formation of the leafy crown

LÖHNIS, M. p., Investigations upon the ineffectiviness of root-
nodules on Leguminosae.

c'r Tstntrd. I'Ac. d. Sc. 200. 256-258.
MUNCIE J. 5. Jnd'pkTEt M. K.. Studies upon a bacteriophage
specific for Ps. tumefaciens.
1930 Phytopath. 20. 289—305.
NEMEC, a.. Bakterielle Wuchsstoffe^

RIKER'A' I^TANjläS.Ä.: WRIGHT, W. H. and
RIKER, A.nbsp;^nbsp;^^lation of certain bacteria to

krankheit des Ölbaumes.
1906, Zentrbl.. Bakt. II. 15. 200-211.
SCHLEMPER, P., Allotropie van bacterien.

1931, Planta: Arch. Wiss. Bot. 13. 114-168.
SMITH, E. F., Bacteria in relation to plant d^eases.

1931, (b) Ztschr. f. Parasitenk. 4. 101—125.
THUNG. F. H., Experimenten met Bact. tumefaciens Sm. et Town.

1929, Tijdschr. PI. ziekten. 35—263.
TOPLEY, W. W. C. and WILSON, G. S., The priciples of bac-
teriology and immunity.
1931, Vol. 1 and 2.
ZOJA, A., L'immunita nelle piante.

Een onderzoek van de cultuurvloeistof van Ps. tumefaciens op
het voorkomen van „groeistoffenquot; zal meer licht op de door deze
bacterie veroorzaakte tumorgroei kunnen werpen dan de vele tot
nu toe verrichte zuiver chemische onderzoekingen van de afschei-
dingsproducten van dit organisme.

Voor een volkomen analyse van de resistentieverhooging van
planten tegen Ps. tumefaciens, die men op verschillende wijzen
experimenteel kan teweegbrengen, is het allereerst noodzakelijk te
weten, welke factoren het zijn, die de tumorgroei veroorzaken.

De fikraten, die Weindling maakte van Trichoderma lignorum-
cultures waren niet steriel. Het is dus niet bewezen, dat de fil-

Uit de proeven van Eglits blijkt, dat een plantendeel tengevolge
van een locale wond of infectiehaard een algemeene temperatuurs-
stijging ondergaat. Hierdoor is het waarschijnlijk geworden, dat
dit deel onder deze omstandigheden als een geheel reageert.

Met Wassink moet men aannemen, dat „reversibele beschadi-
gingquot; van de ademhaling door te hooge temperatuur ontstaat, door-
dat een van de factoren, die het ademhalingsproces beïnvloeden,

De summatie-verschijnselen, die bij dwarsgestreepte Vertebraten-
spieren optreden, kan men het beste verklaren, door aan deze
spieren behalve elastische ook tonische eigenschappen toe te
schrijven.

GROEP	HYPOCOTYLEN		TUMORENGROEI
GROEP	lengtegroei	diktegroei	TUMORENGROEI
c	1,17	1,54	2
b	121	1,55	1,4
a	1,06	1,1	0.6

Serie	AANTAL BLADEN			AANTAL PLANTJES
Serie	groen	groen-geel	geel-bruin	groote (quot;/o)	zeer kleine (7„)	totaal
1	3	5	—	91 (73)	33 (27)	124
2	—	7	1	69 (59)	48 (41)	117
3	4	4	—	98 (82)	20 (18)	118
4	6	2	—	78 (75)	26 (25)	104
5	2	—	—	116 (88)	16 (12)	132

Serie	12.4. '35			30.4. '35
Serie	t. gr.	d. gr.	1. gr. pl.	t. gr.	d. gr.	1. gr. pl.
1	70	1,28	1,34	87	1,57	1,16
2	68	1,30	1,32	79	1,56	1,46
3	87	1,28	1,40	126	1,36	1,19
4	90	1,40	1,60	106	1,50	1,26
5	85	1,40	1,50	104	1,48	1,22

	2.4.'35	12.4. '35				8.5.'35
	t. gr.	t. gr.	l.gr.	d. gr.	1. gr. pl.	t. gr.	l.gr.	d. gr.	1. gr. pl.
tumorspruiten controle-spruiten	8 7	45 62	1,02 1,0	1,15 1,12	1,22 1,23	122 116	1,7 1,17	1,25 1,27	1,47 1,43
			TABEL V
Tumorgroei, lengte- en diktegroei van de bovenste geïnoculeerde internodien. Zie voor verklaring der teekens tabel 4.
	2.4.'35	12.4. '35				8.5. '35
	t. gr.	t.gr.	l.gr.	d. gr.	l.gr. pl.	t. gr.	l.gr.	d.gr.	1. gr. pl.
tumorspruiten controle-spruiten	22 26	40 44	1,21 1,50	1,33 1,33	1,22 1,23	88 127	1,21 1,20	1,50 1,49	1,47 1,43

Reeks	Proefvloeistof.	5.10.'34	15.10.'34	27.10.'34	3.11.'34	7.11.'34
1	5 dagen oude cultu- res 2 min. 100° C.	0	0	47	100	182
2	filtraat van 5 dagen
	oude cultures 2 min. 100° C.....	0	0	36	86	114
3	Altraat van 5 dagen
	oude levende cul- tures .....	0	0	37	83	168
4	filtraat van 46 da-
	gen oude cultures 2 min. 100° C. .	0	0	36	73	209
5	Altraat van 45 da-
	gen oude levende cultures ....	0	6	158	247	477
6	levende, ongeAl-
	treerde 5 dagen oude cultures . .	0	5	85	140	350
7	levende, ongeAl-
	treerde 45 dagen oude cultures . .	0	15	135	255	495
8	controle : voedings- oplossing . . .	0	O	17	64
9	controle : water .	0	O	7	14-	66

Reeks	Proefvloeistof	22,8.'34	20.9.'34	10.10.-34	4.11.'34
1	4 dagen oude cultuur 10 min. 100° C.	0	60	80	100
2	4 dagen oude cultuur 90 min. 100° C.	0	13	88	88
3	Altraat van 4 dagen oude levende cultuur	0	60	90	90
4	levende, ongefiltreerde 4 dagen oude cultuur	0	87	100	100
5	Controle : steriele voe- dingsoplossing . .	0	so	88	lOO
6	Controle: water . .	0	SO	Ss	99

		30. 1. 1935 1		26. 2.	1935
Reeks	gem. grootte v. d. tumor in mM'		gem. lengte van de planten	gem. grootte v. d. tumor in mM'
Reeks	ond. int.	bov. int.	in cM.	ond. int.	bov. int.
1	58	142	17,8	115	335
2	79	169	18,8	131	220
3	99	156	18,7	188	161
4	36	106	20,8	70	248
5	72	122	22,s	131	283
6	93	142	19-3	162	227

	12. 3. '35		25. 3. '35		11. 4. '35		23. 5. '35
Reeks	turn. gr- ond.	tum. gr- bov.	tum. gr- ond.	tum. gr- bov.	tum. gr- ond.	tum. gr- bov.	tum. gr- ond.	tum. gr- bov.
	int.	int.	int.	int.	int.	int.	int.	int.
1	5	8	7	19	14	28	84	159
2	8	13	11	19	15	24	67	135
3	7	10	9	16	12	27	52	140
4	6	9	9	12	12	15	90	133
5	10	18	11	15	9	16	48	133
6	8	7	10	10	12	8	47	90
7	5	3	6	6	7	17	48	115
8	S	8	9	II	i6	14	76	127
9	s	II	7	15	14	27	59	is(gt;

Reeks	11	In	t.1.	dl	dn
1	1,—	1,2	1,1	1,1	1,3
2	1,—	1,2	1,1		1,5
3			1,2	1,2	1,3
4		1,2	1.1	1,1	1,4
5		',1	1,1		1,3
6	I,—	1,3	1,1	1,1	1,2
7	1,—	1,-	1,1	1,1	1,3
8	1,—	1,3	1,-	1,—	1,1
9	1,—	1,1	1,1		1,3

	1 int. I	lint. 11	a 1	a II	d'I	d I	d'il	d II
26. 3. '35 . . . .	16	10,5	206	28,5	6,7	6,7	6,2	6,2
17. 3. '35 . . . ■	20,3	13,6	206	32,5	10.-	9,3	8,9	8,7
4. 4. '35 . . • .	23,5	13,6	206	32.-	11,8	10.-	9,8	9,-
1. 5. '35 . . . .	24,3	15,2	206	33.-	22.-	/I.—	16	10,—
(28. 5. '35) •) . .					(0.53)		(0.25)

	23. 1. '34		30.1.'34		5. 2. '34		12. 2. '34		19,2. '34
	1.	aXa'	1.	aXa'	1.	aXa'	1.	aXa'	1.	aXa'
Proefplanten	5,4	3,75	5,8	10.—	5,8	20,7	5,8	27,5	5,7	32,5
Controle- planten	5,3	J15-.—	6	59.—	5,7	log^S	5,6	ƒ79.-	5,6	303

« tt at a	Tumor hypo- cotyl			Tumor iste inter- nodium			Tumor 2lt;ie inter- nodium			Tumor 3de inter- nodium			Tumor 4^6 inter- nodium			Lengte 4de inter- nodium		Lengte tot pl.
	I	II	III	I	II	III	I	II	III	I	II	III	I	II	III	I	III	I	UI
1	1	3	4	4,5	5	6	32	37	57	75	92	135	41	63	95	1.9	1,9	30,4	\32
2	6	7	9	17	18	20	46	53	75				77	96	140	1,58	1,7	29	.31
3	9	9	9	14	16	20							154	210	250	1,49	1,8	27	28
4	6	9	13										150	209	270	2,2	2,3	31	32

Reeks	Hypocotyl		iste Internodium		2^« Internodium		totale lengte der plant
Reeks	lengte	dikte	lengte	dikte	lengte	dikte	totale lengte der plant
1	1,05	1,31	1,23	1,33	1,8	1,9	1,17
2	1,-	1,3	1,21	1,49	1,58	1,5	1,17
3	1,—	1,3	1,41	1,5	1,75	1,5	1,18

Reeks	Hypocotyl	jäte Internodium	2de Internodium
1
2		—
3	—
4	—	—
5			—
6		—	—
7	—		—
8	—	—	—
(controle)

w o;	oö	có	oó		iri	P in *) oö O)	oö	c6	cö	(Ö ra	in m in	gt;ri *) od (M	P oö	in co	lf5 SP 't oó	in £0 (Ö rgt;)	iri	in co li*) S
1	10	14	29	39	60	(1.4)	17	18	38	58	102	(3,3)	1	20	35	48	75	(3.9)
2	16	14	21	33	47	(0,9)							7	32	44	60	91	(3,9)
3							24	30	44	76	111	(2,7)	4	32	32	68	92	(3,4)
4													5	31	33	71	100	(2,9)
5	13	20	26	28	33	(0 8)	22	30	56	79	106	(32)
6	11	19	32	29	38	(0.8)
7							30	42	66	85	111	(2,8)

i o= 1 s u J	'S c a O.		O) in	ogt; t-;		CM «q			s	8
	2 3 5 §	S CÓ	in	in	tq	in			co	00
	2 3 5 §	^ 1 t3 . c5 CM	lt;q		S	CM	CO CD		co	in
	w H Z	1-1quot; S H ^	tn co	co_	in ■lt;f		CO irj	t-;		oo_
	•a CS	S quot; cö quot; Ri -	oi co	(O co	1 tquot;	1	in ifi	Tf	lt;£gt; coquot;	tquot;
	5 O z		Q	00 O	-			in	CM
	5 O z	CP ^^- V 1 co . •O . co		co co_		to	CD		co_
	oi S z	•si»quot; Ugt; ^		2-		Tf		00 T-;	B	co
	'M	quot; 1 cb 1 -t S quot; Cö	co cm	cm	agt; cm	1 co	y— co	O! cmquot;	B	1 co
		J» 2 có		q		B	^			co
		1 cJgt;- -O . fO CQ	CM	§			co	cm	m cm
	gt; X	■3 4- g co 05	00	L	t		1.	1.	1.	1.
	gt; X	^ 1 C3) 1 ^ C CO . u . co	tr-			r- 1	gt;n CM
s:			-	CM	CO		in	to	r-	00

ü Si a			5			co	co rr	CO	CM
C lt;u O. J	gSi	lt;
s	1 ^ •s t^ 0 O S				•f			co	m
D 5 O z	g' 1	s CN	s oi	00 t—lt; CS	§ CM			in
i	- 1 «			(O	CM CM	CM	^ cm	CM	co_
V	ogt; 1 m g ö — —.	Ol co	O) co		t	co iri	co ici	co •«f	00 có
s 3 8 z	1 gt;o 'S quot; o O S	L	1. 1-h	1.	1.	q	1.	q	p
s 3 8 z	S 1 ^ ^ 2	M CO	CO	ol co	CO			00	1 cmquot;
a w h Z	i gt;0 S o c^	L	1.	1.	1.	1	1.	1.	1.
s quot;ca	Ä 7 4 S . o — lr~	cn	00 o cn	00 o ri	rlt;i oi	oi	to cm	Ol	cm'
	1 ^ ■S t-^ 2 d S	o	t	l	t	m p	p	S	1.
	Ï-T—	co			co	B	co_	00	00
8 Cu gt;H E	- (j)	1	1	co O	1	1	1	1.	1.
8 Cu gt;H E	w
	ogt; 1 S ^ 2	Q	00 O	m	§	00 O	t-h	s
	53133H			co	t		«3		00

a M VI a Cu	1	11	2	2t	3	3t	4	4t	5	5t
2 3	1 1 1	1(11						4-4—1-	1 1 1
4							1 1	1 1 1 t	1 1 1	1 1 1__1__L
5	•	♦	•			■				i 1 r