DE VERGISTING VAN
AETHAANDIOL-(i.2)
DOOR DE BACTERIËN DER
COLI-TYPHUS-DYSENTERIE-GROEP

De vergisting van Aethaandiol-(i.2)
door de Bacteriën der Coli-Typhus-
Dysenterie-groep

Proefschrift ter verkrijging van den graad van Doctor in
de Wis- en Natuurkunde aan de Rijks-Universiteit te
Utrecht, op gezag van den Rector-Magnificus Dr. H. Bol-
kestein, Hoogleeraar in de Faculteit der Letteren en Wijs-
begeerte, volgens besluit van den Senaat der Universiteit
tegen de bedenkingen van de Faculteit der Wis- en Na-
tuurkunde te verdedigen op Maandag 8 Juli 1935, des
namiddags te 3 uur, door HERMAN JAN GROENE-
WEGEN, geboren te Amsterdam.

N.V. UITGEVERS-MAATSCH. W. GOSLER amp; CO. - HILVERSUM
KEMINK EN ZOON N.V. ^ OVER DEN DOM - UTRECHT - 1935

AAN DE NAGEDACHTENIS MIJNER OUDERS.
AAN MIJNE TOEWIJDINGSVOLLE VROUW
EN LIEVEN JONGEN.

U, mijne Ouders, ben ik zeer dankbaar, dat Gij mij in staat
steldet in de chemie te gaan studeeren; dat Gij de bewerking en
voltooiing van dit proefschrift helaas niet meer mocht beleven,
is mij eene groote droefenis.

Bij het beëindigen van dit proefschrift rust op mij de aange-
name taak U, Oud-Hoogleeraren, Hoogleeraren en Lectoren aan
de Rijks Universiteit te Utrecht, mijn groote dankbaarheid te be-
tuigen voor de moeite, welke Gij U getroost hebt, mij, in de
gekozen studierichting, op te leiden.

U, Hooggeleerde de Graaff, Hooggeachte Promotor, ben ik
zeer'veel dank verschuldigd, dat Gij mij de gelegenheid gaf bij
U te mogen promoveeren; Uw ruime kennis, Uw welgemeende en
opbouwende kritiek en groote hulpvaardigheid, gaven mij veel
steun bij de bewerking van dit proefschrift. Ook de hartelijkheid
waarmede U mij steeds tegemoet trad, deden mij weldadig aan.

Hooggeleerde van Romburgh, dat Gij mijn leermeester in de
organische-chemie zijt geweest stel ik steeds op hoogen prijs,
den tijd, dat ik Uw assistent mocht zijn, behoort, mede door de
samenwerking, welke ik van U mocht ondervinden, tot de aan-
genaamste periode van mijn studietijd. De belangstelling, die U
bovendien steeds voor mij en mijn gezin aan den dag legde, ge-
tuigde van een oprecht medeleven.

Hooggeleerde Ruzcika, dat Gij mij verder in de organische-
chemie, en wel hoofdzakelijk, in die der aetherische olieën, be-
kwaamdet, daarvoor betuig ik U hierbij mijn dank.

U, Hooggeleerde Kögl, ben ik erkentelijk, dat Gij mij micro-
chernisch leerdet werken; het assistentschap bij U heb ik zeer
gewaardeerd.

U, Hooggeleerde Cohen, onderwees mij de physische-chemie;
dit en Uw groote vriendschappelijkheid dwingen mij tot oprech-
ten dank.

Hooggeleerde Kruyt, dat juist Gij, met Uw groote kennis en
zeer bijzondere wijze van college geven, het waart, die mij in de
phaseleer en colloidchemie inleiddet, waardeer ik ten zeerste.

U, Hooggeleerde Schoorl, betuig ik mijnen dank voor de welwil-
lendheid en moeite, waarmede gij problemen, die zich tijdens de
bewerking van dit proefschrift voordeden, oplostet, mede voor de,
in Uw laboratorium genoten gastvrijheid, gevoel ik mij zeer ver-
plicht.

U, Hooggeleerde Went, zeg ik dank voor het onderwijs in de
botanie, Uw onderricht in de microscopie is mij bij mijn bacterio-
logische studiën van groot nut geweest.

U, Hooggeleerde Mol!, betuig ik mijnen dank voor de natuur-
kundige opleiding, welke ik bij U genoot.

Gij, Hooggeleerde Rutten, waart 't, die mijn eerste schreden
bestuurdet op het moeilijke pad der kristallographie; hiervoor zeg
ik U ten zeerste dank.

Van U, Hooggeleerde van Everdingen en Zeergeleerde Canne-
gieter, apprecieer ik ten zeerste de bereidwilligheid, waarmede Gij
aan mijne wenschen betreffende een barograaf, voldeedt.

U, Zeergeleerde Strengers, ben ik veel dank'verschuldigd voor
de anorganische-opleiding die Gij mij gaaft.

U, Zeergeleerde van Romburgh en Zeergeleerde Moesveld, be-
tuig ik mijne erkentelijkheid voor alles waarin Gij mij steeds'ter-
zijde stondt.

Jou Noor, ben ik heel dankbaar voor de hulp, die je mij de laat-
ste maanden verleendet.

Verder wil ik allen die mij bij het bewerken van dit proefschrift
behulpzaam waren, en hen van wie ik in mijn studententijd vriend-
schap mocht ontvangen, — in de eerste plaats, denk ik hierbij
aan het Utrechtsch Studenten Corps, welks bloei mij immer zal
verheugen, — nog eens mijn oprechten dank betuigen.

En tenslotte ben ik zeer gevoelig voor de groote ijver en kunde,
waarmede het technisch personeel van het Pharmaceutisch- en
het Organisch-chemisch laboratorium, mij hulp verleende.

HOOFDSTUK I. ^^
Inleiding ...............................................................

Vroegere onderzoekingen betreffende de vergistmg van
aethaandiol-(1.2) ..................................................

Bacteriemateriaal en chemicaliën, welke bij de vergistmg
van glycol gebruikt werden ....................................... 23

Het qualitatieve onderzoek naar de vergistingsproducten
van glycol ............................................................

ƒ. Vergisting van glycol met successieve toevoegingen van 5 %
peptonoplossing .........................................................

Vergisting van glycol, terwijl waterstof door de gistende
vloeistof werd geschud ........................gif-tenae

ciumformiaat was toegevoegd .... j ra cai
Vergisting van aethyleenoxyde ....................................

Ter inleiding van het volgende onderzoek, zij een zeer beknopt
overzicht gegeven van de verschillende phasen, die in het vergis-
tingsvraagstuk op den voorgrond traden.

De eerste, die een quantitatief onderzoek naar de suikerver-
gisting instelde, was Lavoisier (1789); hoewel hij noch de samen-
stelling van suiker, noch die van alkohol kende, geraakte hij door
een toevallige compensatie van fouten, tot een juist resultaat.
Door hem werden alkohol, koolzuur en een weinig azijnzuur ge-
vonden.

Met deze uitkomst stelde men zich gedurende het grootste
gedeelte van de 19e eeuw tevreden en vroeg zich niet af hoe
dit resultaat inderdaad tot stand kwam, doch beijverde zich
de oorzaken te leeren kennen, die tot deze reactie aanleiding
gaven. Er ontstond een strijd tusschen Pasteur eenerzijds en
Liebig anderzijds over het vraagstuk of deze vergisting al dan
niet door het levende organisme bewerkt werd.

Hierop volgde in 1897 de ontdekking van Büchner, dat, uit
door kwartszand stuk gewreven gistcellen, een cel-vrij sap kon
geperst worden, dat in staat is, om suiker te vergisten. Het fer-
ment, dat deze reactie teweeg brengt, werd zymase genoemd.

Pogingen, om een beter inzicht in het chemisme der suikerver-
gisting te verkrijgen, werden daarna ingesteld door: von Bayer,
Nencki, Buchner en Meisenheimer, waarbij de zgn. triosehypo-
these geboren werd nl., het uitéénvallen van het hexose-mole-
cule in twee triose-moleculen.

Vele triosen worden dan als tusschenproducten aangenomen:
A. von Bayermelkzuuranhydride, Büchner en Meisenheimer^)

dioxyaceton, Loeb») glycerinealdehyde en Wohl methylgly-
oxaal; daar de genoemde triosen slechts moeilijk en langzaam
door de gistcel aangetast werden, zou deze theorie doodgeloopen
zijn, zoo niet Fernbach en Schoen®) bij alkoholische gisting —
waarbij aan de te vergisten vloeistof calciumcarbonaat was toe-
gevoegd, — pyrodruivenzuur hadden gevonden; parallel hier-
mede ging het onderzoek van Neubauer®), die een biologische
omzetting der aminozuren tot a-ketonzuren vaststelde; daarna
ontdekte Ehrlich dat a-aminozuren, bij de zoogenaamde alko-
holische gisting der aminozuren, tot primaire alkoholen worden
omgezet, waardoor tevens het ontstaan van foezelolie uit eiwitten
en niet uit suikers, werd bewezen.

Vervolgens ontdekken Neuberg en Fromherz®), zoowel als
Neuberg en Hildesheimer »), de gemakkelijke vergistbaarheid van
het pyrodruivenzuur.

Neuberg herstelt de theorie van Wohl in eere door aan te
nemen, dat het hexose-molecule uiteenvalt in twee triose-mole-
culen, deze zijn dan in nauw verband gedacht met het methyl-
glyoxaal, het aldehyde van het pyrodruivenzuur. De triosen
worden omgezet in pyrodruivenzuur, dat op zijn beurt door
decarboxylatie tot acetaldehyde wordt afgebroken. Door reductie
ontstaat uit laatstgenoemde verbinding, dus secundair, de aethyl-
alkohol.

Neuberg ondervangt het bezwaar van de onvergistbaarheid van
methylglyoxaal, door aan te nemen, dat deze verbinding, bij het
ontstaan uit het hexose-molecule, in een anderen isomeren vorm
optreedt, dan de stabilere vorm, waarin het door synthese verkre-
gen wordt. Neubergquot;) stelt in 1913 een schema op, dat in het
laatste gedeelte van dat van Wohl afwijkt; het schema, dat gedu-
rende bijna 20 jaar als het schema zou gelden, dat de alkoholische
gisting weergeeft.

Het glucose-molecule zou onder waterafsplitsing overgaan in
een theoretisch tusschenproduct (2.), dat vervolgens uiteenvalt
in twee moleculen methylglyoxaal (3.). De twee moleculen methyl-
glyoxaal ondergaan vervolgens de reactie van Cannizzaro en
geven glycerine en pyrodruivenzuur.

Voor de vorming van alkohol is dan nog een tweede reactie vol-
gens Cannizzaro noodig, en wel tusschen één molecule acetal-
dehyde en één molecule methylglyoxaal:

Het ontstane pyrodruivenzuur valt dan weer uiteen in acetal-
dehyde en koolzuur. De reactie-snelheid van de gemengde reactie
van Cannizzaro is zóóveel grooter, dan die, welke zich ont-
wikkelt bij de reacti« tusschen twee moleculen methylglyoxaal,
dat aan het einde der gisting maar weinig glycerine ontstaan is.
Neuberg noemde dit de eerste vergistingsvorm. Zoo werden ver-
gistingen, die onder toevoeging van bepaalde stoffen verliepen,
tweeden-, derden-, enz. vergistingsvorm genoemd.

De derde vergistingsvorm treedt op als de vergisting in zwak alka-
lisch miheu plaats grijpt-), hierbij reageeren twee moleculen
acetaldehyde volgens de reactie van Cannfzzaro e geveT kot

en azijnzuur waarbij tevens als bijproducten glycerine erkol
zuur gevormd worden.nbsp;^^ ne en kooi

Onderwerpen wij nu het schema van Neuberg aan een nadere
beschouwmg dan is het ontstaan van acetaldehyde en koolzuur

I ik daÏT'f H «-^-d'gheden, wel bewezen. Ook is het moge-
lijk, dat acetaldehyde volgens een reactie van Cannizzaro tot alfo-
ho gereduceerd kan worden, doch hierbij moet tevens een antoe
verbmding geoxydeerd en dat dit nu juist methylglyoxaarmre
z.jn IS de zwakke plek in Neuberg's schema.

Men zou het ontstaan van glycerine gemakkelijker kunnen ver
klaren door een reactie volgens Cannizzaro me behulp Jln 7y
cennealdehyde, dan met methylglyoxaal; immers hier ij'n^oet nog

gelijktijdige opname van water aan een geënoliseerde verbinding
plaats grijpen, hetwelk tot nu toe nog niet in vitro mogelijk bleek.

Waar het echter door Neuberg bewezen is, dat zijn ketonalde-
hydemutase (de glyoxalase van Dakin) in staat is, het methyl-
glyoxaal in melkzuur om te zetten, verkiest hij het methylglyoxaal
boven glycerinealdehyde. Dat het methylglyoxaal, zoowel als het
glycerinealdehyde en dioxyaceton, moeilijk tusschenproducten
kunnen zijn, volgt wel, uit de tot nu toe bestaande onmogelijk-
heid, deze stoffen te laten vergisten.

Zooals reeds eerder werd opgemerkt, zegt Neuberg nu: „het
methylglyoxaal speelt niet als zoodanig de rol van tusschenpro-
duct bij de alkoholische gisting, doch een tautomerevorm.quot; Hier-
tegen is in te brengen, dat dan deze andere vormen van methyl-
glyoxaal toch in dynamisch evenwicht moeten zijn met het ge-
wone methylglyoxaal, en wanneer dus een gedeelte van den ande-
ren vorm door de gisting verdwijnt, zal deze steeds weer uit het
gewone methylglyoxaal worden aangevuld, zoodat dit ten slotte

Dit is dan de omgekeerde volgorde van die, waarbij methyl-
glyoxaal in den gewonen vorm in het gistingssubstraat ontstaat.

In 1914 stelde Lebedewquot;) zijn gistingsschema op; over het
algemeen komt dit overeen met dat van Neuberg; de voornaam-
ste afwijking is, dat Lebedew glycerinealdehyde als eerste tus-
schenproduct aanneemt. Volgens hem wordt het glycerinealde-
hyde niet in methylglyoxaal omgezet, doch tot glycerinezuur ge-
oxydeerd; dit laatste gaat dan, onder wateruittreding, over in
pyrodruivenzuur.

De hierboven ontwilcicelde theorie paste men eveneens toe op
de gemengd-zure-gisting.

Onder „gemengd-zure-gistingquot; v^rordt verstaan de 'omzetting
van koolhydraten tot verbindingen met anderen (meestal kleine-
ren) energie-inhoud, waarbij de veelsoortigheid van de verbindin-
gen, die hierbij tegelijkertijd ontstaan, dadelijk in het oog springt.
Aan de vele zuren, die men onder deze verbindingen aantreft,
wordt de naam „gemengd-zure-gistingquot; ontleend.

Voornamelijk zijn het de organismen van de coli-typhus-groep,
die deze wijze van ontleding van suikers, teweegbrengen. Daar
deze ontledings-producten, — al is het vaak in andere verhou-
dingen tot elkander, — eveneens onder streng anaërobe omstan-
digheden gevormd worden, wordt — met Pasteur als grondleg-
ger dezer theorie — algemeen aangenomen, dat de bacteriën door
middel van deze afbraak in hun energie-behoefte voorzien, welke
energie noodzakelijk is voor het voortbestaan van het organisme
en zijne voortplanting, zonder daarbij van zuurstof gebruik be-
hoeven te maken.

Het zou ons te ver voeren al het werk, dat noodig was om tot
een inzicht in deze zoo samengestelde koolhydraat-ontleding te
kunnen komen, in extenso te bespreken, doch willen slechts en-
kele, in verband met dit onderzoek, belangrijke schema's be-
schrijven.

A. Harden isoleerde uit anaërobe vergistingen van suikers en
polyalkoholen door B. coli communis: koolzuur, waterstof, aethyl-
alkohol, melkzuur, azijnzuur, barnsteenzuur en soms wat mieren-
zuur.

De hoeveelheden alkohol en azijnzuur werden door hem bij be-
nadering aequivalent gevonden.

Hij geeft als zijn meening te kennen, dat alkohol en azijnzuur
uit het zelfde tusschenproduct ontstaan en dat dit tusschenpro-
duct weer in aequimoleculaire hoeveelheid met het mierenzuur
gevormd zou worden, terwijl de melkzuurvorming onafhankelijk
van deze processen, verloopt.

Voor tusschenproduct A neemt hij de mogelijkheid van methyl-
glyoxaal, en voor B, acetaldehyde aan.

In 1919 gelukte het aan Neuberg quot;) en zijn medewerkers, even-
als bij de alkoholische-gisting, ook bij de vergistingen van glucose
door B. lactis aërogenes en B. coli, met behulp van sulfiet, acetal-
dehyde vast te leggen.nbsp;_

In het „Nederlandsch tijdschrift voor Hygiëne, Microbiologie
en Serologiequot; geeft W. C. de Graaff een verhandeling over
de gemengd-zure gisting; wij willen volstaan met het overnemen
van zijn schema:

De barnsteenzuurvorming zou zich ook kunnen vohrekken, te be-
ginnen bij acetylmethylcarbinol over het 1.4 butyleenglycol en
maleïnezuur of fumaarzuur, tot barnsteenzuur (welke laatste
reactie's dan door een hydro-oxydatie zouden verloopen).

Betreffende de vorming van mierenzuur deelt de Graaff nog
mede, dat dit zuur gevormd kan zijn door splitsing van CgHeOg
nevens acetaldehyde, en door reductie van kooldioxyde.

Scheffer^») en Kluyver^) geven een zeer uitgebreid schema
voor de glucose-vergisting.

Door phosphoryleering ontstaat eerst een hexose-mono-phos-
phorzure ester; hieruit ontstaan eerst twee moleculen glycerine-
aldehyde, die over hun hydraten, door intra-moleculaire oxydo-
reductie-reactie's, tot methylglyoxaalhydraat omgezet worden
Dit laatste wordt eenerzijds gestabiliseerd tot melkzuur, dat bij
anaerobe gistingen niet verder wordt afgebroken; anderzijds
wordt het ontleed tot mierenzuur en acetaldehydehydraat en ten
derde heeft een ontleding in pyrodruivenzuur en waterstof plaats

De volgende onderzoekers beschrijven het ontstaan van ver-
schillende stoffen uit glycol ¹):

Brown zegt, dat uit glycol, onder invloed van een azijnzuur-
bacterie, glycolzuur ontstaat.

Seifert®®) toont eveneens de vorming van glycolzuur uit glycol,
door B. pasteurianum en B. kutzingianum, aan.

A. Harden en Mrs. D. Norris bepaalden quantitatief de hoe-
veelheid butyleenglycol, die door B. lactis aërogenes, uit glycol
gevormd wordt.

F. Visser 't Hooft vond, dat bij de oxydatie van glycol, on-
der invloed van A. xylinum, A. melanogenum en A. suboxydans,
glycolzuur ontstaat.

Siegwart Hermann^'') beschrijft de omzetting van glycol in
zuur, door B. gluconicum.

Ida Smedley Maclean en Dorothy Hoffert^®) wijzen op de
slechte vergistbaarheid van glycol door gist.

Teizo Takahaski en Toskinobu Asai vermelden de vergis-
ting van glycol tot glucuronzuur door B. hoshigaki var. glucuro-
nicum L nov. spec.

Hans Mosel vindt, dat B. ascendens minder zuur uit glycol
doet ontstaan, dan B. aceti.

Bij Grey vinden we een quantitatief onderzoek over de ver-
gisting van glycol door B. coli, Esch., welke bacterie in zeer groote
hoeveelheden aan de te vergisten vloeistof, werd toegevoegd. Hij
vond geen gas, weinig alkohol, en betrekkelijk groote hoeveel-

heden azijnzuur en melkzuur. Grey voegde aan zijn voedings-
bodem calciumformiaat toe met het doel een betere neutralisatie
te verkrijgen van de, tijdens de vergisting, gevormde zuren, dan
met gesuspendeerd krijt mogelijk was ¹).

In de dissertatie van Le Fèvre®^), beschrijft deze onderzoeker
de vergisting van vele koolhydraten, zuren, aldehyden en meer-
waardige alkoholen; onder deze laatsten wordt ook het glycol
besproken. In verband met ons onderwerp refereeren wij slechts
deze onderzoekingen.

De voedingsbodem welke L.F. gebruikte, om de vorming van
acetaldehyde uit de onderzochte stoffen vast te stellen, bevatte:

Hij liet het glycol in deze oplossing vergisten door 3 Coli-,
9 Paratyphus B-, 2 Paratyphus A-, 2 Typhus-, en 5 Dysenterie-
stammen, en vond, bij het qualitatieve onderzoek, zooals uit de
tabel op blz. 29 van zijn diss, blijkt, bij de Colistammen een
duidelijke acetaldehydeproductie, terwijl de andere stammen
slechts sporen hiervan vormden.

Voor het qualitatieve onderzoek naar de andere ontledings-
producten, maakte L.F. gebruik van een voedingsbodem van de
volgende samenstelling:

De glycol was gezuiverd door destillatie, kpt. 197°. Hij entte
met B. coli en broedde gedurende 26 dagen bij 37°. In het des-
tillaat werd acetaldehyde, ammoniak en een spoor indol gevon-
den. Zoowel volgens de proef van Rimini, als door de hydrazon-
vorming, vond hij een sterk positieve reactie op acetaldehyde.
De reactie's op andere mogelijke, neutrale ontledingsproducten
vielen negatief uit.

Van de vluchtige zuren werd alleen azijnzuur gevonden. Ook
de reactie's op barnsteen- en melkzuur waren zonder eenig
resultaat.

Glycol gaf geen gasvormige producten, noch met B. coli, noch
met de andere bacteriën van deze groep.

Met een Paratyphusstam verkreeg hij de zelfde producten als
met B. coli, maar in veel kleinere hoeveelheden®^).

Eveneens stelde Le Fèvre een quantitatief onderzoek in naar
de ontledingsproducten van glycol®^).

Voor de quantitatieve bepaling van deze verbinding gebruikte
hij een extractie-methode met aceton; het sterk ingedampte sub-
straat liet hij 24 uur met aceton staan, filtreerde, verdampte de
aceton en woog het achter gebleven glycol, nadat het gedurende
eenige dagen in een exsiccator, boven zwavelzuur, gestaan had.

Hij verklaart, dat deze methode geen al te beste resultaten op-
leverde, maar past toch de extractie-methode toe, daar een oxy-
datie in alkalisch milieu met permanganaat, na aanzuren en terug-
titreeren van het niet verbruikte permanganaat, geheel mislukte;
dit was volgens L.F. te wijten aan de geringe concentratie van het
glycol in de oplossing, zoodat er bijna geen verschil was waar
te nemen tusschen een 1 %-glycol-oplossing en een blanco pep-
tonwateroplossing. Zijn resultaten, per 50 cm'' vloeistof, worden
door onderstaande tabellen weergegeven.

Hij wijst op de opvallend groote hoeveelheid onaangetaste glycol
en meent de oorzaak hiervan te moeten zoeken bij een te groote
acetaldehyde-concentratie aan het einde van de proef®®).

Wat het chemisme van de ontleding van glycol betreft, be-
schrijft L.F. op blz. 80—82 van zijn diss., dat uit glycol 'door
afsplitsing van de bestanddeelen van water, aethyleenoxyde ont-
staat, dat zich omlegt tot acetaldehyde, hetwelk ten slotte, met be-
hulp van de zuurstof der lucht, tot azijnzuur geoxydeerd wordt.

In de opvatting, dat het glycol zich eerst zou omzetten in acetal-
dehyde, meent hij gesteund te worden door het onderzoek van
Ipatiew®«), die deze reactie bij 250°, in tegenwoordigheid van
aluminiumoxyde, liet verloopen.

Dat de oxydatie door de zuurstof der atmosfeer tot stand komt,
meent hij te kunnen verklaren, uit een door hem uitgevoerde proef'
waarbij hij tijdens de vergisting een stroom waterstofgas door dé
apparatuur leidde; hij vond toen groote hoeveelheden acetal-
dehyde, maar geen spoor van azijnzuur.

Le Fèvre komt tot de conclusie, dat bij de ontleding van glycol,
de atoomverschuiving de energiebron moet zijn en dat hier pyro-
druivenzuur geen tusschenproduct is, ondanks het feit, dat acetal-
dehyde ontstaat.

Ten slotte geeft hij op blz. 95 nog een tabel, waaruit blijkt, dat
uit glycol door 3 Colistammen, zuur werd gevormd; 9 Paratyphus
B-, 2 Paratyphus A- en 2 Typhusstammen gaven slechts sporen
zuur, terwijl verschillende Dysenteriestammen geen zuur vorm-
den.

Voor onze vergistingen gebruiicten wij, het in onderstaande
tabel omschreven bacteriemateriaal.

De reinculturen entten we steeds na twee weken op schuine-
bouillon-agar over en controleerden, tijdens het onderzoek, meer-
dere keeren de meest kenmerkende eigenschappen. Zooals nog
nader beschreven zal worden, onderzochten we tevens, voordat
met het opwerken van een vergisting begonnen werd, door enten
van een oogje van het gistingssubstraat op schuine-bouillon-agar,
of de bacteriën nog in leven waren en gebruikten de aangeslagen
culturen voor de beoordeeling, of er geen infectie met andere bac-
teriën had plaats gevonden.

De nummers: 1—4, 20—29, 31 en 38—52, waren afkomstig
uit de verzameling van de bacteriologische afdeeling van het
Pharmaceutisch laboratorium te Utrecht.

De nummers: 5, 6, 11, 16, 17, 19 en 37 kregen wij uit de ver-
zameling van het Centraal laboratorium te Utrecht.

De nummers: 9, 10, 10a, 14, 15 en 34—36 van het Instituut voor
tropische hygiëne, afd. van het Koninklijk Koloniaal Instituut te
Amsterdam en ten slotte de nummers: 7, 8, 12, 13, 18, 32 en 33,
uit de collectie van het Instituut voor tropische geneeskunde te
Leiden; voor deze welwillende medewerking zeg ik den direc-
teuren van genoemde instellingen nogmaals mijn welgemeenden
dank.

Nadat genoemde bacteriën zoo noodig in rein-cultuur waren ge-
bracht, onderzochten wij de stammen zoowel morphologisch,
als physiologisch, (door enten op de voor dit doel gebruikelijke
suiker- en andere oplossingen), op hunne eigenschappen; hieruit
bleek ons, dat wij de voor genoemde bacteriën, specifieke soorten
zuiver in handen hadden.

Wij streefden naar een zoo groot mogelijke zuiverheid van de,
voor het bereiden der voedingsbodems, gebruikte chemicaliën.
Pepton.

pepton „Wittequot;. Ter voorkoming van afwijkingen in de samen
s ellmg zooals zich zouden kunnen voordoen bij het v rweXn
V n pepton welke afkomstig was van verschillende zendquot; gen
namen w.j een Kg, mengden dit goed dooreen en verdeeld n hë;
over eemge flesschen, welke met een, met ongebluste tik .e
vulde stop, gesloten werden.nbsp;^

stant mogehjke samenstelling, waaruit wij voor de verschihendequot;
vergistmgen telkens putten konden.nbsp;verscniiiende

Het, bij de sulfiet-gistingen, toegepaste natriumsulfiet voldeed
aan de eischen van zuiverheid.nbsp;vuiueea

Het glycol was geleverd door de firma Schering-Kahlbaum als
pr paraa voor wetenschappelijke doeleinden; wij de ti Sdt

dmgen bleken er met in aanwezig te zijn. Direct na de destillatie
bewaar en wij het in een gesloten flesch, welke in een c

Wij gebruikten een preparaat van Fraenkel en Landau reinst
Derger ) en daarna nog eens door uitvriezen, gezuiverd.

wordt voorgesteld. Lourengo bereidde het in 1863; in het zelfde
jaar maakte Würtz het door condensatie van glycol en aethyleen-
bromide. In 1906 publiceerde Faworsk®®) een bereiding van
dioxaan, door glycol met 4 % geconcentreerd zwavelzuur te des-
tilleeren.

Het dioxaan mengt zich zoowel met water, als met de gebrui-
kelijke, organische oplosmiddelen. Het is zeer hygroscopisch,
heeft een kookpunt van 101,4° 760 mm en een smeltpunt
van 11,8°.

Voor de zuivering en eigenschappen van het dioxaan zij ver-
der naar de, deze onderwerpen uitgebreid behandelende dis-
sertatie van den Heer F. Ph. A. Tellegen verwezen.

Het aethyleenoxyde betrokken wij eveneens van Fr. en L. Wij
destilleerden het bij zoo laag mogelijke temperatuur op steriele
wijze, waardoor het tevens nog een zuivering onderging. De af-
wezigheid van sporen acetaldehyde konden wij niet met zeker-
heid vaststellen, daar aethyleenoxyde met het reagens van Rimini
een roode- tot violette verkleuring geeft.

Wij vingen het onderzoek naar de gistingsproducten aan, met
het bestudeeren van alle hierbij te pas komende reactie's op de
afzonderlijke stoffen, welke bij de gisting te verwachten waren.
Vervolgens werden mengsels van deze stoffen door de hieronder
beschreven scheidingsmethoden weder gescheiden en de verbin-
dingen op dezelfde wijze aangetoond.

De, bij de vergisting van suikers en meerwaardige alkoholen,
optredende vergistingsproducten kunnen gerangschikt worden
volgens de groepen:

Te weten: alkoholen, acetaldehyde, acetylmethylcarbinol,
diacetyl, dioxaan, ammoniak, indol en aminen.

Wij namen het qualitatieve onderzoek nu ter hand, door voor
een reeks van veertien bacteriestammen (tot de coli-, typhus-
paratyphus- en dysenteriegroep behoorende), in groote (± 30Ó
cm'' bevattende) gistbuizen, vergistingsproeven uit te voeren De
steriele gistbuizen vulden we met een 1 % pepton-oplossing waar-
aan % keukenzout en 2 % glycol was toegevoegd, doch geen

De gistbuizen werden geënt met een suspensie van de ge-
wenschte bacteriën, welke suspensie wij verkregen, door vier-en-
twintig-uur-oude, schuine bouillonagar-kulturen met een weinig
peptonwater af te spoelen en vervolgens gedurende 10 dagen bij
37° te bebroeden.

Een tweede proef werd ingezet, waarbij aan bovenstaande pep-
ton-10 % lakmoes-oplossing was toegevoegd en de vloeistof zich
in, van gasbuisjes voorziene, kuituurbuizen bevond.

Behalve de resultaten, welke nog nader besproken zullen wor-
den, is hier slechts van belang, dat er in beide gevallen bij deze
veertien stammen geen gas werd gevonden.

Na aan de helft van den inhoud der gistbuizen 1 N kaliloog
toegevoegd te hebben, tot een even alkalische reactie op lakmoes
verkregen was, destilleerden wij de neutrale producten af.

In de eerst overkomende druppels werd op acetaldehyde ge-
reageerd.
Acetaldehyde.

Dit toonden wij aan met de reactie van Rimini welke wij als
volgt uitvoerden: ongeveer 3 cm® van de te onderzoeken vloei-
stof werden met 0,5 cm® 4 % nitroprussidnatrium-oplossing ver-
mengd en aan het mengsel 1 cm ® van een 3 % oplossing van
piperidine toegevoegd; een blauwe verkleuring kenmerkt de aan-
wezigheid van acetaldehyde.

Wanneer deze reactie een positief resultaat opleverde, vingen
wij verder het destillaat, in, door ijs gekoeld water op.

Hieruit werd later het aldehyde weer afgedestilleerd, met
p. nitrophenylhydrazine, in azijnzure-oplossing, onder zachte ver-
warming het hydrazon gemaakt en door smeltpunts- en meng-
smeltpuntsbepaling met het p. nitrophenylhydrazon van acetal-
dehyde, als dit laatste hydrazon, geïdentificeerd.
Acetylmethylcarbinol en diacetyl.

met de door mij gebruikte bacteriestammen, bleek uit de nega-
tieve uitkomst, die verkregen werd, door met een gedeelte van
het gistingssubstraat de reactie van Voges-Proskauer uit te
voeren.

Bij 5 cm® substraat voegden we 5 cm® 10 % KOH-oplossing;
af en toe doorschuddende bleef dit mengsel gedurende 24 uur in
een open Erienmeyertje staan.

De eosine-achtige kleur, die bij een positieve uitslag van de
reactie moest optreden, bleef achterwege; zelfs was bij doorval-
lend booglicht geen groene fluorescentie waar te nemen ¹).

De aanwezigheid van ammoniak en aminen werd bewezen door
het blauw kleuren van een vochtig, rood lakmoespapiertje, dat in
het gistingsvat was opgehangen. Bij sommige gistingsproeven
werd indol gevonden. Het was aan te toonen volgens de reactie
van Ehrlich, nl. 10 cm® bedeelen met 5 cm® van een oplossing
van 4 g. p-dimethyl-amido-benzaldehyde in 380 g. 96 % alkohol
en 80 g. geconcentreerd HCl. Daarna werd 5 cm® van een ver-
zadigde kaliumpersulfaat-oplossing in water, toegevoegd en Ge-
schud.

Bij indolvorming had rood-kleuring binnen 5 min. plaats. De
kleurstof was met amylalkohol uit te schudden.

In het destillaat reageerden we eerst op acetaldehyde met de
reeds genoemde reactie van Rimini: was acetaldehyde aanwezig,
dan werd dit — alvorens tot de alkohol bepaling over te gaan,
verwijderd, door eenigen tijd te koken onder een opstaande koeler
met p-nitrophenylhydrazine in 30 % azijnzuur en vervolgens de
vloeistof voor twee derde gedeelte af te destilleeren.

In de eerst overkomende druppels reageerden we op acetal-
dehyde; zoo dit nog niet geheel vastgelegd was, zetten we het
koken onder opstaande koeler vanzelf sprekend, nog eenigen tijd
voort, alvorens de alkohol verder af te destilleeren.

De aanwezigheid van alkohol was vast te stellen met behulp van
de jodoformreactie van Lieben, uitgevoerd volgens F. Emich :
In een uitgetrokken buisje voegt men aan het destillaat kaliloog en
daarna jood-joodkali (1 : 1 : 10) toe, tot er een gele kleur op-
treedt, en dan nog zooveel loog tot de gele kleur verdwijnt. Vaak
werden nu onder den mikroscoop de kenmerkende, gele kristallen
van jodoform waargenomen; was dit niet het geval, dan werd
getracht, door eenige malen destilleeren, den alkohol voldoende te
concentreeren om de, na toepassing van de jodoform-reactie, ge-
vormde kristalletjes, te kunnen waarnemen. In die gevallen, waar
het onmogelijk bleek de kristallen te onderscheiden, volstonden
we met het duidelijk waarnemen van den jodoformgeur om tot de
aanwezigheid van aethylalkohol te besluiten

Het verdient nog opmerking, dat glycol geen jodoformreactie
geeft, zooals geconstateerd werd; hierdoor is het dus uitgesloten,
dat eventueel mee overgegane glycol, oorzaak van de jodoform-
vorming kon zijn.

Betreffende het diaethyleendioxyde, 1-4-dioxaan, was tot nu
toe betrekkelijk weinig bekend. Door het verschijnen van de dis-
sertatie van F. Ph. A. Teilegen'''') is dit, wat de derivaten aangaat,
sterk veranderd, doch de isoleering van dioxaan en het aantoonen
van deze stof, wanneer zij in kleine hoeveelheden in water voor-
komt, is nog niet beschreven.

Voor het aantoonen van dioxaan achten wij het meest geschikt:
de verbinding met broom het pikraat'''^) en de verbinding
met sublimaat

Hiervan leek ons het pikraat het meest aanlokkelijke, daar het
in aetherische oplossing gevormd wordt, vrij stabiel is en tot smp.,
66° heeft.

Voor ons doel bleek het echter ongeschikt, daar het alleen in
geconcentreerde, aetherische oplossing en dan nog pas na langen
tijd staan, uitkristalliseerde.

De broom-verbinding was doeltreffender, doordat zij direct en
met sporen dioxaan ontstaat in den vorm van karakteristieke

gele naalden met smp. 65—66°; nadeelen waren, dat het dioxaan
droog en liefst niet opgelost, voor deze reactie gebruikt moet
worden en dat de verbinding, vooral bij aanwezigheid van vocht,
snel weder ontleedt.

De verbinding met sublimaat leende zich niet tot identificatie
van dioxaan daar de lange naalden groote overeenkomst ver-
toonden met sublimaat-kristallen en geen smeltpunt kon worden
vastgesteld; wel bleek zij uitermate geschikt voor de isolatie van
dioxaan, zoowel uit zijn oplossing in water, als in aether.

Zoodat wij besloten de beide laatste verbindingen voor ons
onderzoek te gebruiken.

De verbinding van broom met dioxaan, die opgevat moet wor-
den te bestaan uit één molecule dioxaan en twee atomen broom,

vormt zich het beste door inwerking van broomdamp; gebruikt
men nl. broom in vloeibaren vorm, dan worden de naalden
oranjegeel door het overmatige broom, dat mede door de snelle
ontleding van de verbinding in oplosmiddelen, moeilijk te verwij-
deren is en het smpt. verlaagt.

Ten onrechte wordt dan ook in de litteratuur de kleur dezer ver-
binding „oranjequot; genoemd.

Wij werkten als volgt: in een groot model weegflesch met in-
geslepen stop bevond zich een weinig broom; in de flesch stond
een glazen driepootje; hierop legden we een horloge glaasje met
een hoeveelheid dioxaan en sloten het vat; direct begonnen de
lange gele naalden van de broomverbinding, uit te schieten. Reeds
bij geringe sporen dioxaan was het verschijnsel goed waarneem-
baar.

Maakte men de verbinding bij grootere hoeveelheid, dan ge-
lukte het, bij snel werken, het smeltpunt vast te stellen.

Het aantoonen van dioxaan was hiermede opgelost, restte dus
nog de isoleering uit zeer verdunde oplossingen in water.

Met aether was het dioxaan uit water uit te schudden, doch dan
alleen, wanneer de concentratie niet al te gering was.

Daar wij verwachten konden, dat b.v. in een liter gistingssub-
straat een spoortje dioxaan zou kunnen voorkomen, leek ons de
perforatie met aether een geschikter methode; wij konden echter,
na voorzichtig afdampen van den aether — zelfs als dit bij kamer-
temperatuur, al dan niet onder een klein vacuum en uitsluiting van
waterdamp geschiedde — geen dioxaan door middel van het bro-
mide aantoonen.

Het meest voor de hand liggend was een te groote vluchtigheid
van het dioxaan, hoewel bij 101,4° kokende.

Hier kwam ons de sublimaatverbinding, welke spontaan ont-
staat, wanneer men dioxaan in een verzadigde sublimaat-oplos-
sing brengt, te hulp, deze vormt zich eveneens, als men een aethe-
rische oplossing van dioxaan met een verzadigde sublimaat-oplos-
sing schudt; het dioxaan laat zich aldus uit aether uitschudden.

In plaats van het kookkolfje direct aan een perforator te ver-
binden, bevestigden we eerst, met een kurk, een ongeveer 20 cm
lange, van onderen dichtgesmolten buis met 2 cm diameter, aan
den afvoer van den perforator; ongeveer 4 cm onder den rand
van deze nieuwe buis was een naar beneden omgebogen dito ge-
smolten, gelijk aan de afvoerbuis van den perforator, waaraan nu
het kookkolfje door middel van een kurk werd bevestigd. In de
tusschengevoegde buis stond een trechtertje met langen steel, die
tot den bodem reikte en hier voorzien was van zijdelingsche
openingen.

De rand van dit trechtertje bevond zich een paar centimeters
boven de laatste afvoerbuis.

De beste voorstelling van het geheel is: een kleine perforator
met een groote, verbonden op de plaats waar zich anders de kook-
kolf bevindt.

weinig dioxaan in water en in de kleine werd een verzadigde op-
lossing van sublimaat gedaan, ter hoogte van ongeveer 5 cm Nu
extraheerden we met aether; na de te extraheeren vloeistof gepas-
seerd te zijn, vloeide de aether in den trechter van den kleinen
perforator en werd aldus gedwongen door de sublimaat-oplossing
te gaan, waarna hij zich in het bovengedeelte van den kleinen
perforator verzamelde en ten slotte in het kookkolfje terugvloeide.

Wij verwachtten nu, dat zich in den kleinen perforator de lange
naalden van de dioxaansublimaat-verbinding zouden vormen, het-
geen echter niet het geval was; dit werd veroorzaakt doordat'deze
verbinding vrij goed in aether oplosbaar was, want na afdampen
van den aether uit het kookkolfje, op een kokend waterbad, bleef
de sublimaatverbinding achter als witte kristallen, die volgens de
hieronder beschreven werkwijze, op dioxaan onderzocht werden.

Wij beschrijven deze extractie-methode zoo uitvoerig, daar zij
niet alleen van belang is voor de extractie van andere verbindin-
gen, die eveneens niet te perforeeren zijn wegens te groote vluch-
tigheid met de perforeerende vloeistof, (natuurlijk moet dan een
passend bindmiddel gekozen worden), maar ons eveneens ge-
schikt voorkomt voor de extractie van verbindingen, die niet tegen
de langdurige verhitting in de kookkolf kunnen, b.v. voor gevoe-
lige natuurproducten; vanzelf sprekend moet dan in den kleinen
perforator een vloeistof gedaan worden, die bedoelde verbindin-
gen daar ter plaatse ook vasthoudt.

Het aantoonen van dioxaan in de sublimaatverbinding ge-
schiedde als volgt: na de extractie dampten we den aether af, tot
er zich kristallen begonnen te vormen; dan voegden we wat
petroleumaether toe, waardoor de sublimaatverbinding werd
neergeslagen en filtreerden deze af.

Dan brachten we een weinig van genoemde stof in een micro-
sublimeerapparaatje (een wijde reageerbuis, waarin een klein
koelbuisje hangt, waardoorheen water kan stroomen); met enkele
druppels kaliloog van 50 % stelden we het dioxaan weder in vrij-
heid en destilleerden het, door verhitten van het apparaatje in een
oliebad op ± 130°, snel af; het dioxaan condenseerde tegen
het koelertje, waarna het afgestreken werd op een horiogeglaasje

en met behulp van broom, op de boven beschreven w^ijze, kon w^or-
den aangetoond.

In 70 cm® water deden we 0,2 cm® dioxaan en extraheerden
met aether, volgens boven vermelde methode, gedurende 4 uren;
na afdestilleeren van den aether verkregen we de witte kristallen
van de sublimaatverbinding; uit een gedeelte hiervan werd het
dioxaan op de reeds beschreven wijze in vrijheid gesteld en met
broom aangetoond: de gele naalden waren duidelijk waar te
nemen.

Een proefextractie van water met aether zonder dioxaan lever-
de eveneens weinige witte kristallen op, die volgens het nega-
tieve resultaat van de broomreactie geen dioxaan bevatten.

Hieronder laten we nog enkele proeven volgen, welke van nut
konden zijn, alvorens tot de bepaling van dioxaan in een gistings-
substraat met glycol, werd overgegaan.

naalden.
Na toevoegen
van een spoor
dioxaan aan het
reactie mengsel
en wederom
destilleeren,
wel gele naalden.

En ten slotte nog een extractie van dioxaan uit een liter pepton-
water van 1 %, waaraan was toegevoegd: ^ % ilt;eukenzout, 2 %
glycol en 0,2 cm®, dioxaan; na het toevoegen van het dioxaan
deden we er nog wat alkohol en azijnzuur bij en maakten het
geheel alkalisch ten opzichte van lakmoes, kortom, we stelden een
synthetisch gistingssubstraat samen.

Na acht uur extraheeren konden wij, op de aangegeven wijze,
in een gedeelte van de witte kristalmassa, duidelijk dioxaan aan-
toonen.

Nadat de rest geheel in de dioxaanbroom-verbinding was om-
gezet, werden de zoo verkregen kristallen gemengd met die, welke
uit zuiver dioxaan en broom gemaakt waren; het smpt. bleek nu
65—66° te bedragen, waarmede bewezen was, dat het inderdaad
de dioxaanbroom-verbinding was.

De rest van de vloeistof, waaruit acetaldehyde en alkohol
waren afgedestilleerd, zuurden we met verdund zwavelzuur aan
tot congoroodpapier juist blauw kleurde, waarna de aanwezige
zuren met stoom afgedestilleerd konden worden.

Na neutralisatie van het destillaat met loog, dampten we het op
een waterbad in.

Met de reactie van Sérulas : na aanzuren van 10 cm® te on-
derzoeken vloeistof, HgO toevoegen en schudden, na affiltreeren
van de overmaat HgO, verwarmen. De aanwezigheid van mieren-
zuur wordt gekenmerkt door een wit neerslag, dat zich allengs
grijs tot donkergroen kleurt.

Microchemisch werd de ingedampte vloeistof met ceriumnitraat
op mierenzuur onderzocht.

Bij de door ons gebruikte stammen kon geen vorming van mie-
renzuur waargenomen worden.

De aanwezigheid van azijnzuur bleek uit een positieve kako-
dylreactie. Een gedeelte van de geneutraliseerde oplossing damp-

ten we droog en verhitten daarna met watervrije soda en een
weinig arseentrioxyde. In alle gevallen kon de onaangename reuk
van het kakodyloxyde worden waargenomen.

Ten slotte werd in de zuur-destillatie-rest op barnsteenzuur en
melkzuur gereageerd.

Na neutralisatie met soda en indampen op een waterbad tot
droog, zuurden we met ongeveer 2 cm® 50 % zwavelzuur, gecon-
troleerd op congoroodpapier, aan en maakten het geheel met
watervrij natriumsulfaat vast, om dan gedurende 8 uur in een
Soxhletapparaat, de zuren met aether te extraheeren. Na afloop
van de extractie werd de aether afgedestilleerd en het residu in
100 cm® 96 % alkohol, opgenomen^®).

Aan de kokende, alkoholische oplossing werd een gefiltreerde,
koud verzadigde oplossing van bariumhydroxyde toegevoegd tot
het bijgedruppeld phenolphthaleïne juist rood kleurde.

Na afzuigen van het neergeslagen bariumsuccinaat konden we
het barnsteenzuur door zoutzuur in vrijheid stellen, en na ver-
dampen van dit laatste, het voorzichtig boven een microvlammetje
tegen een horlogeglas sublimeeren, waarna het te identificeeren
was als lanthaan- of loodzout.

Eveneens gebruikten we de pyrol-reactie om de aanwezigheid
van barnsteenzuur vast te stellen.

In een reageerbuisje dampten we voorzichtig de aangezuurde
oplossing tot klein volumen in, voegden zink-stof toe en gloeiden;
een in den mond van het buisje gehangen, met zoutzuur bevoch-
tigd houtstofpapiertje, werd, bij aanwezigheid van barnsteenzuur,
door het gevormde pyrol, licht- tot donkerrood gekleurd.

Het bovengenoemde filtraat dampten we in op een waterbad;
vervolgens voegden we 10 % zwavelzuur toe, verwarmden dit,
en druppelden 2 % kaliumpermanganaat-oplossing bij; bij aan-
wezigheid van melkzuur ontstond dan acetaldehyde, dat door de
reactie van Rimini, (papiertje gedrenkt in oplossing van nitro-
prussidnatrium en piperidine) kon worden aangetoond.

We behandelden een gedeelte van het substraat met broom,
terwijl met zonlicht of een sterke, electrische lamp belicht werd'
het eventueel gevormde diacetyl destilleerden we, na verwijdering
van de overmaat broom met natriumsulfiet, af en toonden dit
m het destillaat aan, door hierop de reeds boven beschreven
reactie van Voges-Proskauer of de reactie met een nikkelzout,
uit te voeren

Een eosine-achtige roode kleur of het neerslag van dimethyl-
glyoxim-nikkel bewezen de aanwezigheid van 2.3. butyleengly-
col, dat in sommige gevallen kon worden aangetoond.

Aansluitend aan dit hoofdstuk en als overgang tot het volgen-
de, waarin het quantitatieve onderzoek zal besproken worden
diene de beschrijving van het semi-quantitatieve onderzoek naar
acetaldehyde.

Dit semi-quantitatieve onderzoek naar acetaldehyde diende
met alleen om een overzicht te verkrijgen van de acetaldehyde-
productie van verschillende, tot de coli-typhus-groep behoorende
bacterien, maar tevens bleek hiermede een zeer gevoelige methode
verkregen te zijn om met behulp van de reactie van Rimini zelfs
de kleinste spoortjes acetaldehyde, qualitatief aan te toonen.

Het toestel was hetzelfde als gebruikt werd voor de quantita-
tieve bepaling van acetaldehyde en de quantitatieve bepaling van
melkzuur, volgens de methode van Fürth en Charnasz in de modi-
ficatie van Friedemann en Kendall«), welke methode ten slotte
eveneens berust op een quantitatieve acetaldehyde-bepaling Dit
toestel bestaat uit een rondbodem van pyrex-glas van 200 cm®
mhoud met een vrij wijde hals, de kolf wordt gesloten met een
stop met drie doorboringen; door de eerste gaat een nauw, tot op
den bodem der kolf reikend, rechthoekig omgebogen buisje, door

de tweede de buis van een druppel-trechter en door de derde
een betrekkelijk wijde buis, die onder de stop uitmondt en
van een mantel, waarin water kan stroomen, omgeven is, zoo-
dat het geheel als koeler werkt. De lengte van het koelend
gedeelte bedraagt ongeveer 25 cm. Het boveneinde van den koeler
wordt door middel van een tweemaal rechthoekig omgebogen
buisje (waarvan het einde in een slijpstuk overgaat) verbonden
met een rechte buis, die in een punt uitmondt op den bodem van
een wijdere buis (diameter ± Ij^ cm en ongeveer 50 cm lengte),
welke laatste hier tot een bolletje is uitgeblazen.

De wijdere buis is door middel van een gummistop gesloten en
door twee rechthoekig omgebogen buisjes, die door een slijpstuk
met elkander vereenigd zijn, met een tweede, wijdere buis, gelijk
aan de eerste, verbonden. De invoer reikt wederom tot den
bodem. De tweede wijdere buis is eveneens met een gummi-stop
gesloten, waarin nog een rechthoekig omgebogen buisje steekt,
ter afvoer van de spoel-stikstof. Bij het doorvoeren van stikstof
werd vaak last ondervonden, doordat de stikstof-bellen niet regel-
matig door de vloeistof, waarmede de wijdere buizen gevuld
waren, borrelde, doch stootsgewijze doorgingen; om dit euvel te
ondervangen werd het afvoerbuisje door middel van een gummi
slangetje verbonden met een glazen buis, die op den bodem van
een met water gevulde maatcilinder, van b.v. 250 cm^, uit
kwam. Door nu het slangetje met een schroefklemkraantje gedeel-
telijk dicht te knijpen, kon de stikstofstroom zoodanig geregeld
worden, dat er regelmatig enkele kleine bellen opstegen. Ten slotte
werd de druppeltrechter nog met een, door een schroefklemkraan-
tje afsluitbaar slangetje, aan de stikstof-toevoer-leiding verbon-
den, opdat in dezen trechter dezelfde druk, als in het geheele toe-
stel, zou heerschen.

Voor de semiquantitatieve acetaldehyde-bepaling werden de
w^ijdere buizen elk gevuld met een oplossing van 5 cm® 4 %
nitroprussidnatrium, waaraan even vóór het gebruik 10 cm® 3 %
piperidine-oplossing was toegevoegd.

Voor de bepaling van acetaldehyde bij de gewone gistingen
werd een zekere hoeveelheid van het substraat in het kolfje ge-
bracht en stikstof doorgeleid; om het acetaldehyde af te desFil-

leeren, vingen we na 10 min. aan met de vrije vlam te verwarmen
zoodat de inhoud zacht kookte.

Bij de sulfiet-gistingen werd het substraat eveneens in den
rondbodem gebracht, maar nu heten we uit den druppeltrechter
20 cm® 20% bariumchloride-oplossing toevloeien, bovendien
was aan het substraat (zoo niet reeds aanwezig), wat krijt toe-
gevoegd, om het acetaldehyde uit de sulfiet-verbindine in vrii-
heid te stellen.nbsp;^

Het acetaldehyde, door den stikstofstroom medegenomen
kleurde de nitroprussidnatrium-oplossing, al naar gelang van de
gevormde hoeveelheid acetaldehyde, groen tot blauw.

Was een spoor acetaldehyde aanwezig, dan zag men alleen in
de bmnenbuis aan het oppervlak van de op en neer gaande vloei-
stof-kolom, een blauw wolkje optreden, dat scherp afstak tegen-
over de omringende geel gekleurde vloeistof.

Meer acetaldehyde manifesteerde zich door een groenkleuring
van den geheelen buis-inhoud, reeds quantitatief te bepalen hoe
veelheden acetaldehyde kleurden den buis-inhoud blauw terwijl
nog grootere hoeveelheden, deze geheel ondoorzichtig maakten
Daar steeds het acetaldehyde in de eerste buis geheel geabsor-
beerd werd, bleef de inhoud van de tweede buis zijn gele kleur
behouden; hierdoor kon een kleuromslag goed worden waarge-
nomen.nbsp;^

Overtuigd van de moeilijkheden, die zich zouden kunnen voor-
doen bij het quantitatieve onderzoek van de bij de gisting ont-
stane producten, — welke moeilijkheden werden veroorzaakt,
zoowel door het optreden van verschillende vergistingsproducten,
als door de aanwezigheid van pepton in het gistingssubstraat, —
werd het quantitatieve onderzoek aangevangen met de bepaling
van de hoeveelheden van de te verwachten stoffen, elk afzonder-
lijk en in bekende concentratie in water opgelost. Vervolgens wer-
den mengsels van meerdere dezer stoffen quantitatief onderzocht,
om ten slotte over te gaan tot het analyseeren van deze mengsels
in een oplossing die 1 % pepton bevatte.

Nadat met het analyseeren van deze synthetische gistingssub-
straten voldoende inzicht en routine was verkregen, werden de
uitgegiste vloeistoffen onderzocht, volgens de hieronder nader be-
schreven methodes.

Bepaling van het oorspronkelijk aanwezige en van het
na gisting overgebleven glycol.

Veelal worden verbindingen zooals glycol, bepaald, door de, op
deze stof te onderzoeken oplossing, voorzichtig in te dampen en
vervolgens onder toevoeging van zand, het residu te extraheeren
met aether of aceton, het extractie middel te verdampen en het
glycol na droging te wegen

2e. Men extraheert tevens andere stoffen uit het substraat,
welke men dus mede als glycol bepaalt.

water-aantrekkende werking van glycol op, waardoor dus steeds
te veel glycol gevonden zal worden.

Behalve de bovengenoemde bezwaren, komt hier nog het groote
tijdverlies door indampen en extraheeren bij.

Ons scheen derhalve een directe bepaling van het glycol in het
gistingssubstraat, verreweg de voorkeur te verdienen.

Le Fèvre heeft ook getracht het te bepalen door oxydatie
met permanganaat in alkalisch milieu en het niet verbruikte per-
manganaat, na aanzuren, terug te titreeren. Volgens hem gelukte
deze methode niet door de kleine concentratie van het glycol in
de oplossing, waardoor hij bijna geen verschil vond tusschen
een 1 % glycol-oplossing en een blanco peptonwater-oplossing.

Daar hij echter niet eerst het pepton verwijderde, alvorens tot
oxydatie over te gaan, is het mogelijk, dat hieraan zijn negatief
resultaat te wijten is.

Wij kozen nu de oxydatie van glycol tot koolzuur door mid-
del van kaliumpermanganaat in zuur milieu, het COg werd dan
door weging bepaald.

De gebruikte apparatuur bestond uit een zgn. vet-extractie
kolfje, afgesloten door een rubber stop met drie doorboringen. In
deze gaten staken: een opstaande koeler, een rechthoekig omge-
bogen buisje (van voldoende lengte, om den bodem van de kolf
te bereiken) en een druppeltrechter. Het boveneinde van den
koeler werd, onder tusschenvoeging van een U-vormige, van twee
kranen voorziene, chloorcalciumbuis, met een kaliapparaatje ver-
bonden. Nadat de chloorcalciumbuis gevuld was, verzadigden we
den inhoud met koolzuur, waarna door een koolzuur-vrije-lucht-
stroom, het overmatige gas verdreven werd.

Door het omgebogen buisje leidden we koolzuur-vrije-lucht in
en verbonden de luchtleiding eveneens met de opening van den
druppeltrechter (waarin zich een kaliumpermanganaat-oplossing
bevond), waardoor de druk op deze oplossing gelijk was aan die,
welke in het geheele toestel heerschte.

Links flesschen voor het doorpersen van lucht; aansluitend een, in duplo,
uitgevoerde luchtreinigingsinstallatie; vervolgens de vier oxydatie-toestellen met
bovenaan de U-vormige, van kranen voorziene, chloorcalciumbuisjes, waarmede
de kali-apparaatjes zijn verbonden.

g H2SO4 noodig, er ontstaat dan 1,4185 g CO2; om dit te bin-
den is tlieoretisch 3,6257 g KOH noodzakelijk. Teneinde vol-
doende zekerheid te hebben, dat al het koolzuur werd vastgelegd,
gebruikten we 130 cm® 50 % KOH oplossing per g glycol; dit
vertegenwoordigt 18 keer de theoretische hoeveelheid; zooals dan
ook bleek, kon dezelfde vulling voor twee bepalingen gebruikt
worden.

We maakten de volgende standaardoplossingen; KMn04 op-
lossing 60 g per liter, H2SO4 oplossing 500 g per Hter, en ver-
der, om de reactie's en methode te kunnen bestudeeren, en ook om
de apparatuur te kunnen controleeren, een glycol-oplossing, die
20,125 mg watervrije glycol per cm® bevatte.

5 cm® van deze standaard oplossing komt overeen met
5 X 20,125 mg = 0,100625 g glycol.

Bij de bepalingen werd zooveel mogelijk van deze hoeveelheid
uit gegaan daar we gebonden waren aan de afmetingen van de
gebruikte kaliapparaatjes. Hiervoor was dikwijls eerst een oriën-
teerende bepaling noodzakelijk.

Ig 0,100625 = 00271
mol.gew. glycol = 62,0478 Ig = 79272
mol.gew. CO2 =88 Ig = 94448

Voor het berekenen van de verkregen resultaten gebruikten we
den hieronder vermelden factor:

1.nbsp;Uitgegaan van 5 cm® standaard glycol-opl.=0,10063 g glycol
Gevonden gewicht koolzuur 0,1279 g COg

Uit bovenstaande berekeningen, waarvan de gegevens verkre-
gen werden door de bepaling op verschillende wijze uit te voeren,
b.v. door het zwavelzuur direct aan de glycol-oplossing, of een
gedeelte van genoemd zuur aan het bij te druppelen kaliumper-
manganaat, toe te voegen, mede door de tijden van doorspoelen,

reactie, en wederom doorspoelen te veranderen, werd de volgen-
de werkwijze, als de beste resultaten gevende, gekozen:

In de kookkolf bevond zich de glycol-oplossing, waaraan 10
cm® standaard zwavelzuur-oplossing was toegevoegd. Onder ver-
warming leidden we gedurende 15 minuten koolzuur-vrije-lucht

Vervolgens werd gedurende ongeveer 20 minuten 25 cm® stan-
daard kaliumpermanganaat, waaraan eveneens 10 cm® stan-
daard zwavelzuur-oplossing was toegevoegd, bij gedruppeld, on-
derwijl werd de temperatuur tot zacht koken der vloeistof opge-
voerd. Eerst ziet men de druppels permanganaat snel ontkleuren,
dan gaat dit steeds langzamer, waardoor men goed het verloop van
de reactie kan volgen. Duidelijk ziet men, na verloop van eenigen
tijd, koolzuur-ontwikkeling optreden. Nadat al het kaliumperman-
ganaat was toegevoegd werd nog gedurende ongeveer één uur
een koolzuur-vrije luchtstroom doorgeleid en de vloeistof even aan
de kook gehouden; door goede koeling en een voorgeschakelde
chloorcalciumbuis werd voorkomen, dat waterdamp in het kali-
apparaatje kon dringen. Na afloop werd het opgenomen koolzuur,
door weging van het kali-apparaatje, bepaald.

quot;Vóór de oxydatie verwijderden we het pepton door het neer te
slaan met phosphor-wolfraamzuur.

Aan 4 cm® van een standaard glycol-pepton-oplossing, bevat-
tende 1,3053 g glycol per 50 cm® peptonwater = 0,026106 g per
cm®, en 0,025 g pepton per cm®, werd 40 cm® van een phosphor-
wolfraam-zuur-oplossing (5 g per liter bevattend) toegevoegd.
Het ontstane neerslag werd gecentrifugeerd, vervolgens de vloei-
stof af geschonken en gefiltreerd, terwijl het neerslag goed uitge-
wasschen en telkens de vloeistof ter dege afgezogen en bij het
vorige filtraat gevoegd werd.

In de zoo voorbereide oplossing bepaalden we het glycol door
oxydatie met kaliumpermanganaat.

Deze werkwijze leverde nog geen bevredigend resultaat op.
le. Werd, waarschijnlijk door verdamping van water tijdens het

afzuigen, te veel glycol gevonden.
2e. Nam het filtreeren zeer veel tijd in beslag.

Aan 25 cm® van de, glycol bevattende, pepton-oplossing 10 cm®
(zoowel de 25 cm® als de 10 cm® werden nauwkeurig afgepipet-
teerd) van een 5 % phosphorwolfraamzuur-oplossing (50 g
phosphorwolfraamzuur, 970 cm® water, 30 cm® geconcentreerd
zwavelzuur toevoegen. Na een paar uur staan door een vouw-
filter filtreeren en van de zoo verkregen heldere oplossing, 5 cm®
voor elke glycol-bepaling nemen.

Uit de volgende proeven was gebleken, dat glycol met water-
damp, nog betrekkelijk vluchtig was.

3,9775 g glycol werd opgelost in 250 cm® water. Door deze op-
lossing leidden we stoom tot 1 1. was af gedestilleerd. In de kolf
was toen 121 cm® achter gebleven, die wij aanvulden tot 250 cm®.
Van deze oplossing werd 10 cm® voor de glycol bepalingen geno-
men, terwijl hiervoor van het destillaat 100 cm® gebruikt werd.
Het bleek toen, dat er van 5,03 tot 6,70 % glycol over gegaan was,
terwijl we in totaal 98,32—98,84 % glycokterug vonden.

Uit 40 cm® van het gistingssubstraat werden de aanwezige hoe-
veelheden acetaldehyde en alkohol verwijderd door ongeveer ^
van het volumen af,te destilleeren, opnieuw aan te vullen met water
en weer % af te destilleeren.

1. Reductie-oven. 2. Controle-apparaat. 3. Buis met steriele watten-prop voor het '^«quot;houden ^

stof 4 Veraistinasvat 5 Niet-vluchtige-zuren-extractie. 6. Dioxaan-extractie. 7. Alkohol-destillatie. 8. btikstot-leidlng.
rLeiall7yde en melkzuur-bepaling.'lO. Alkohol-oxydatie. 11. Schroefwaschfleschje voor het tegenhouden van alkohol.
12. Stoomdestillatie der vluchtige-zuren.

Het residu vulden we weer nauwkeurig aan tot 40 cm® ; op deze
wijze destilleerden slechts sporen glycol mee over.

In het zoo voorbereide substraat was dus nog het ontstane
azijnzuur aanwezig. Er werden nu de volgende proeven genomen,
om te constateeren of het mogelijk was glycol direct naast azijn-
zuur te bepalen.

Aan een oplossing, welke 0,0923 g azijnzuur per 5 cm® bevatte,
werd bij deze hoeveelheid 10 cm® standaard-zwavelzuur-oplos-
sing gevoegd en onder verwarmen 25 cm® std. kaliumperman-
ganaat-opl. -f 10 cm® standaard-zwavelzuur-opl. bij gedruppeld.
Wij vonden een gemiddelde van 0,0011 g CO2; dit komt overeen
met 0,8 % van het toegevoegde azijnzuur.

Om te zien of het azijnzuur soms door de doorstroomende
lucht werd meegevoerd, verwarmden we 5 cm® van bovenstaande
azijnzuur-oplossing met 10 cm® st.d. zwavelzuur-opl., doch zon-
der kaliumpermanganaat-opl., maar wel aangevuld met 35 cm®
water en leidden, gedurende denzelfden tijd als bij de vorige proef,
koolzuur-vrije-lucht door. Het gewicht aan koolzuur bleek nu
0,0009 g te bedragen, een hoeveelheid, welke ook als gemiddelde
gevonden was bij de blanco-proeven, genomen ter controle van de
apparatuur en welke tevens in de orde van grootte lag, die wij
verkregen bij de oxydatie van azijnzuur. Hieruit blijkt wel, dat het
zeer goed mogelijk is, het glycol direct naast het azijnzuur te
bepalen.

Nu werd, zooals boven beschreven, het pepton verwijderd door
25 cm® van deze oplossing af te pipetteeren, hieraan 10 cm®,
phosphorwolfraamzuur toe te voegen en na een paar uur af te
filtreeren. Van het filtraat namen we 5 cm® voor elke glycol-be-
paling, welke in duplo w^rd uitgevoerd, zooals eerder beschre-
ven is.

Het kali-apparaatje wogen we vóór en na de oxydatie en be-
rekenden uit het gewichtsverschil de hoeveelheid glycol.

Vóór dat wij tot bepah'-'g van de gistings-producten overgingen
leidden we ged. Yi uur, nog warm uit de broedstoof, zuur-

stof-vrije-stikstof door, terwijl het opvangapparaat nog aange-
sloten was. Hierdoor werd het, eventueel niet in het substraat op-
geloste, acetaldehyde uitgedreven en in de bisulfiet-opl. vastge-
legd. Dan openden we de kolf en pipetteerden 40 cm® van het
filtraat in een rond-bodem, deze rondbodem *) daarna met behulp
van een gummistop aan een opstaanden koeler bevestigend, welke
koeler met een glazen buisje verbonden was aan de opvang-toe-
stellen, bestaande uit twee 45 cm lange buizen met ongeveer 1 cm
doorsnede van onderen verwijd tot een bolletje, waarin de inleid-
buisjes met een uitgetrokken punt uitmondden. De twee buizen
waren achter elkaar geschakeld. In elke buis bevond zich onge-
veer 20 cm® 1 % bisulfiet-oplossing. Nu werd gedurende 30 minu-
ten een langzame, zuurstofvrije stikstofstroom door het toestel
geleid, terwijl de vloeistof zacht kookte. Alle aanwezige acetal-
dehyde bleek dan vastgelegd te zijn in de bisulfiet-oplossing, zoo-
als bij de volgende proeven waargenomen was.

In een oplossing van acetaldehyde in peptonwater bepaalden
we direct het acetaldehyde-gehalte in 40 cm® van deze oplossing,
terwijl ook 40 cm® op bovenstaande wijze behandeld en vervol-
gens het acetaldehyde-gehalte van de bisulfiet-oplossing, vast-
gesteld werd.

De oorspronkelijke opi. bevatte 3,15 mg per 40 cm® Na des-
tillatie vonden we 3,13 mg per 40 cm® d.i. 99,36 %.

Na het afdestilleeren van het acetaldehyde werd de 40 cm® aan
een destillatie, zooals beschreven voor glycol ter verwijdering van
de alkohol, onderworpen en, na het volumen weer op 40 cm®
gebracht te hebben, de glycol-bepaling met deze vloeistof uitge-
voerd.

Ter bepaling van het acetaldehyde kozen wij de methode, die
door Theodore E. Friedemann en Arthur I. Kendall uitgewerkt
is voor het ontwikkelde acetaldehyde uit melkzuur.

Wij weken in zooverre van genoemd voorschrift af, dat wij niet
den inhoud van beide buizen verzamelden, doch van elke buis af-
zonderlijk het acetaldehydegehalte bepaalden; in de tweede buis
vonden we geen of nagenoeg geen acetaldehyde, aldus de absorp-
tie van het acetaldehyde controleerend. Wij voegden 2^ cm®

2 % stijfseloplossing toe en titreerden met 1/10 N jodiumoplossing
tot even blauwkleuring, waardoor het niet gebonden bisulfiet werd
weggenomen; na deze kleine overmaat jodium met een druppel
1/10 N thiosulfaat-oplossing verwijderd te hebben, riepen we met
1/100 N jodiumoplossing de blauwe kleur weer juist te voorschijn
en voegden 25 cm® verzadigde natriumbicarbonaatoplossing toe,
waardoor het (aan acetaldehyde gebonden bisulfiet), in vrijheid
werd gesteld en titreerden dit bisulfiet met een 1/100 N oplossing
van jodium, totdat de blauwe kleur, welke één minuut moet blij-
ven bestaan, juist zichtbaar was.

Uit de volgende berekening blijkt, dat 1 cm® 1/100 N jodium-
oplossing, overeen komt met 0,00022 g acetaldehyde. Nu komt
1 mg mol. jodium overeen met 1 mg mol. acetaldehyde en dus
1 cm® 1/100 N J2 opl. met 1/200 mg mol. acetaldehyde.

Deze titratie heeft tot nadeel, dat zij langzaam afloopt en het
acetaldehyde-gehalte te laag gevonden wordt, nl. ongeveer 1
ten opzichte van de, volgens Ripper uitgewerkte en door Kolt-
hoff, verbeterde acetaldehyde-titratie.

Toch meenden wij de titratie volgens Friedemann en Kendall
te moeten verkiezen, daar deze eenige voordeelen bood: le. Gin-
gen de bepalingen sneller, doordat de bisulfiet-oplossing niet
vooruit gesteld behoefde te worden; 2e. en dit is zeker wel het
grootste voordeel, stelde deze methode ons in staat direct het
acetaldehyde te bepalen in de tijdens de gistingen voorgelegde
bisulfiet-oplossing van de opvang-apparaatjes. Deze bisulfiet-op-
lossing verbleef, gedurende 14 dagen of langer, in de broedkamer
bij een temperatuur van 37°; het was dus zeker, dat een ge-
deelte geoxydeerd werd door de zuurstof uit de lucht, zoodat een
vooraf stellen van deze oplossing geen zin had. Wij zouden dus
eerst het opgevangen acetaldehyde uit deze vloeistof hebben
moeten vrij maken en vervolgens in een gestelde bisulfiet-oplos-
sing destilleeren.

Als derde voordeel kan nog worden genoemd, dat wij dadelijk
— na de vrij ruwe titratie met 1/10 N jodiumoplossing, om de
overmaat bisulfiet weg te nemen —, door het blijven bestaan van
de blauwe kleur, na toevoeging van de verzadigde bicarbonaat-
oplossing, konden waarnemen, dat er geen acetaldehyde aanwe-
zig was.

kleine fout achtten wij in dit geval van niet zoo'n groot
belang, daar hij toch weinig afbreuk aan de resultaten der ana-
lyses deed.

Bij het opwerken der sulfiet-gistingen voegden we, door mid-
del van een druppeltrechter, 20 cm® verzadigde bariumchloride-
oplossing toe ten einde het acetaldehyde in vrijheid te stellen.

Van het gefiltreerde substraat namen we 100 cm®, en maakten
het met wat soda alkalisch. Dan werd ongeveer % afgedestil-
leerd; vervolgens weer aangevuld met water en wederom af ge-
destilleerd.

Uit het residu, — nadat dit voorzichtig op congoroodpapier
met verdund zwavelzuur aangezuurd was — stoomden we de
vluchtige zuren over, totdat 13^2 h was overgedestilleerd. Het was
noodzakelijk om dit vrij groote volumen over te stoomen, ten ein-
de zeker te zijn, dat al het gevormde zuur meekwam.

Voor dit volumen moest een correctie aangebracht worden, door,
van de bij de titratie gevonden waarden, 3,76 cm® 0,1 N loog af te
trekken®®) want wij titreerden het geheele volumen tegelijkertijd
op de aanwezige vluchtige zuren. Een groot bezwaar vonden wij,
dat dit getal lang niet constant bleek te zijn, ook leverde de titra-
tie van deze groote hoeveelheid, moeilijkheden op. Om deze rede-
nen sloegen we den volgenden, reeds door Olmsted®®) aangegeven
weg in voor de destillatie der vluchtige zuren. Aan het zuur
gemaakte substraat, voegden we zooveel magnesiumsulfaat toe,
dat de oplossing bij verwarming nog verzadigd bleef; stoomden

vervolgens de vluchtige zuren over, vingen dan het destillaat in
fracties van 250 cm® op en titreerden elke fractie afzonderlijk
met 0,1 N loog op phenolphthaleïne; meestal begonnen we na de
vierde fractie voor deze titratie een constant getal te vinden van
ongeveer 1 cm® 0,1 N loog en beschouwden dan de destillatie als
afgeloopen.

Vanzelfsprekend werden de, voor de verschillende fracties ge-
vonden getallen, bij elkaar opgeteld om de totaal aanwezige hoe-
veelheid vluchtig zuur te leeren kennen. Ten slotte trokken wij
nog voor elke fractie, waarin zich zuur bevond, 0,9 cm® 0,1 N
loog, ter correctie, af.

Wij vonden bij deze vergistingen geen mierenzuur, zoodat de
gevonden waarden direct de hoeveelheid gevormd azijnzuur aan-
gaven.

Alleen bij de vergisting van glycol met natriumformiaat-toe-
voeging, kwam wel een mierenzuurbepaling in het geding; deze
bepaling voerden wij uit volgens de methode van Finckequot;),
welke berust op de reductie van sublimaat tot calomel door het
mierenzuur. Het geneutraliseerde destillaat werd ingedampt tot
op 50 cm® en hieraan toegevoegd 10—50 cm® (al naar gelang
van te verwachten hoeveelheid mierenzuur) van een oplossing in
water, van 10 % HgClg, 3 % NaCl en 4 % natriumacetaat,
twee uur op waterbad verwarmd, vervolgens warm, door een, te
voren gewogen, glazen filter gefiltreerd en het gevormde neer-
slag achtereenvolgens uitgewasschen met water, alkohol en aether
en gedurende één uur bij 100° gedroogd.

Door wegen laat zich het gewicht aan gevormd calomel bepa-
len; het gevonden getal vermenigvuldigd met 0,0977 geeft de hoe-
veelheid aanwezig mierenzuur aan. Dit getal van de totaal ge-
vonden hoeveelheid zuur afgetrokken, doet ons het gewicht aan
gevormd azijnzuur kennen.

De azijnzuur-bepaling heeft een fout van 2—3 %, voor de
mierenzuur-bepaling is dit ongeveer 4

Het residu van de voorgaande stoomdestillatie, maakten we
alkalisch en dampten het, tot bijna droog, op een waterbad in.

Na aanzuren op congoroodpapier met 50 % zwavelzuur (3—6
cm® ) roerden we de massa met watervrij natriumsulfaat goed
dooréén, tot een vrijwel vaste massa was verkregen, waarop nog
minstens 12 uur staan in een exsiccator volgde, tot het geheel goed
droog en korrelig was geworden; zoo noodig werd het in een
mortier fijn gewreven en in een Soxhlet met drogen aether, gedu-
rende acht uur geëxtraheerd. Na verdampen van den aether, namen
we in water op, vulden tot 100 cm® aan en filtreerden de hars-
achtige producten af.

Eventueel aanwezige, niet-vluchtige-zuren, moeten zich dan in
deze oplossing bevinden; de hoeveelheid werd bepaald door
25 cm® dezer oplossing, (na toevoeging van een paar druppels
phenolphthaleïne) even te koken ter verwijdering van koolzuur en
dan een bekende hoeveelheid, doch overmaat, 0,1 N loog, bij te
laten loopen; wederom te koken — ten einde het melkzuur-lacton
in melkzuur om te zetten, — om vervolgens de niet verbruikte loog
met 0,1 N zoutzuur terug te titreeren.

In het residu konden meestentijds geen noemenswaardige hoe-
veelheden zuur gevonden worden, dus waren in die gevallen bij
de vergisting geen niet-vluchtige-zuren gevormd.

Bij enkele gistingen werden ze echter wel aangetroffen; dit
wordt nog daar ter plaatse nader beschreven; hier zij alleen de
bepaling van deze zuren genoemd.

Voor deze bepaling vervingen wjj de pyrex-kolf van 200 cm®
door één van 500 cm® in het reeds, bij de semi-quantitatieve en
quantitatieve bepaling van acetaldehyde, beschreven toestel ¹) en
bepaalden het melkzuur volgens de methode van Friedemann en
Kendall^®). In de pyrex-kolf voegden we aan 25 cm® van de
boven verkregen oplossing der niet-vluchtige-zuren, 5 cm® 6 N
phosphorzuur, 20 cm® 10 % mangaansulfaat-oplossing, 100 cm®
gedestilleerd water en een mespuntje talk toe. Stikstof werd door-
geleid en de vloeistof tot zacht koken verwarmd.

Uit den druppeltrechter Heten we langzaam een 1/100 N kalium-
permanganaat-oplossing bij druppelen en gingen hiermede door
totdat de bruine kleur van overmaat MnOg minstens een kwartier
bleef bestaan, waarna nog, gedurende een half uur, stikstof werd
doorgeleid om het ontstane acetaldehyde quantitatief in de bisul-
fiet-oplossing te spoelen; om dan vervolgens deze oplossing op
de reeds beschreven wijze te titreeren. De gevonden waarde, uit-
gedrukt in cm® 1/100 N jodiumoplossing, vermenigvuldigd met
0,00045 gaf het gewicht aan melkzuur weer; dit, afgetrokken van
de totale hoeveelheid niet-vluchtig-zuur, deed ons het gewicht aan
barnsteenzuur kennen.

De, onder vluchtige-zuren vermelde, uit 100 cm® substraat,
verkregen destillaten, werden samen gevoegd en met verdund
zwavelzuur goed aangezuurd — ter binding van aanwezige
vluchtige basen — en vervolgens gedestilleerd.

Bij alle destillaties, waarbij alkoholhoudend-destillaat over-
kwam, vingen wij dit onder een weinig water op, in een, door een
twee iTiaal doorboorde rubber stop afgesloten, maatglas; door de
eene boring stak een rechthoekig omgebogen buisje, dat even
onder de stop eindigde en het maatglas met een, met water ge-
vuld, schroefwaschfleschje verbond; door het tweede gat ging een
alonge tot op den bodem van het maatglas, dit met den langen
koeler verbindend. Het maatglas en waschfleschje stonden in ijs-
water.

Na afloop der destillatie voegden we den inhoud van het wasch-
fleschje, bij dien van het maatglas.

Om uit het destillaat, afkomstig van gistingen waarbij acetal-
dehyde ontstond, dit te verwijderen, volgden we eerst de methode
van Gorr en Wagnet : het acetaldehyde wordt hierbij vastge-
legd als een niet-vluchtig „mercarbidequot;.

Men voegt bij de acetaldehyde bevattende vloeistof, voor ieder
g mol. acetaldehyde, zóóveel N of 2 N natronloog, als noodig
is, om uit ongeveer 9/10 gedeelte van het toegevoegde sublimaat,
kwikoxyde in vrijheid te stellen. Daarna wordt het mengsel, ge-

Vervolgens werd de alkohol afgedestilleerd en het destillaat
aangevuld tot 200 cm®.

Het acetaldehyde zou onder deze voorwaarden quantitatief om-
gezet worden, terwijl de alkohol niet wordt ontleed.

Ons bleek echter, dat ook na herhaalde behandeling met kwik-
oxyde, steeds nog een weinig acetaldehyde in het destillaat aan-
wezig was, hetwelk bij de door ons gevolgde methode van
Northrop — voor de bepaling van het alkohol-gehalte, door mid-
del van oxydatie — een te hooge uitkomst voor dit gehalte zou
geven; desondanks vonden wij bedoelde waarde te laag, waar-
schijnlijk dus gaat een gedeelte van den alkohol te loor, hetzij door
omzetting, hetzij door verliezen, die optreden bij het koken onder
opstaanden koeler. We trachtten dit nog te ondervangen, door het
boveneinde van den koeler, met een, in ijswater geplaatst, schroef-
waschfleschje te verbinden en voor een goede sluiting van het toe-
stel zorg te dragen, doch ook dit middel mocht niet baten. Het ver-
dient hierbij nog opmerking, dat er bij deze gistingen zeer weinig
alkohol gevormd werd.

Om deze redenen kozen wij een anderen weg, die ons betere
resultaten opleverde, en bepaalden het acetaldehyde-gehalte van
de alkoholische oplossing door middel van titratie, stelden ver-
volgens de hoeveelheden alkohol en acetaldehyde gezamenlijk
vast, met de hieronder te beschrijven methode van Northrop®®),
en vonden dan, door hiervan het acetaldehyde af te trekken, de
hoeveelheid alkohol. Deze bepaling berust dus op een „verschil-
methodequot; en is daarom niet fraai te noemen, toch gaf zij ons nog
de beste resultaten.

In 10 cm® alkoholhoudende-oplossing oxydeerden we de alko-
hol tot azijnzuur met 20 cm® 2 N kaliumbichromaat-oplossing en
20 cm® zwavelzuur van 50 % (beide hoeveelheden gepipetteerd),
door dit mengsel gedurende drie kwartier in een goed sluitend
drukfleschje, in een kokend waterbad te verwarmen.

Vervolgens werd de inhoud van het drukfleschje in een Erlen-
meijer van 1 1. gespoeld en 300 cm® gedestilleerd water toege-
voegd; deze verdunning vergemakkelijkt het waarnemen van de

kleuromslag bij de titratie van het onverbruikte bichromaat, dat
we, na toevoeging van 10 cm® 20 procentige kaliumjodide-oplos-
sing en wat stijfsel als indicator, met een 1/10 N thiosulfaat-op-
lossing bepaalden. Deze hoeveelheid bichromaat, afgetrokken van
het, bij een blanco-bepaling gevonden bichromaat, uitgedrukt in
cm® 1/10 N thiosulfaat en vermenigvuldigd met 0,001151, leverde

Wanneer acetaldehyde aanwezig is, moet men van het gevon-
den thiosulfaat, nog aftrekken een hoeveelheid thiosulfaat, bere-
kend naar het aantal cm® 1/100 N jodium-opl., dat voor het acet-
aldehyde noodig was.

In dit lioofdstuk zal de apparatuur en de wijze van uitvoering,
welke bij de gisting zelf werden toegepast, besproken worden.

De vergistingen, welke voor qualitatief onderzoek bestemd
waren, werden ten deele in gistbuizen van 250 cm® inhoud, ten
deele in groote kuituurbuizen uitgevoerd.

Allereerst werd de vorming van gas, met behulp van gistbuizen
onderzocht; het bleek, dat bij de vergisting van glycol geen gas-
sen ontstonden, zoodat voor het qualitatieve onderzoek gebruik
gemaakt kon worden van groote kuituur-buizen, die na, voor de
helft met bovengenoemden vloeibaren voedingsbodem gevuld te
zijn, bij 110° gestereliseerd werden.

Was het gewenscht de gisting onder anaërobe omstandigheden
uit te voeren, dan verwarmden wij de kuituur-buizen na enting,
tot 40° en plaatsten ze te zamen in een vacuum-exsiccator.

Deze exsiccator bestond uit een cilindrisch gedeelte, even hoog
als de buizen en een helmvormig bovenstuk, dat van een ringvor-
mige goot, welke met een alkalische pyrogallol-oplossing gevuld
werd, voorzien was.

Door de exsiccator met een waterstraalluchtpomp te evacueeren
tot 18 cm kwikdruk, kookte alle lucht uit de kuituur-vloeistof.

Vervolgens werd stikstof toegelaten en aan de reeds in de ring-
vormige goot aanwezige pyrogallol-oplossing, de benoodigde

hoeveelheid natronloog toegevoegd; hierdoor werd een te vroeg-
tijdige oxydatie van deze oplossing door de zuurstof der lucht,
voorkomen. Het evacueeren en weder inlaten van stikstof her-
haalden wij nog twee maal.

De laatste maal werd een klein vacuum tot ongeveer 60 cm
kwik behouden, waardoor de exsiccator, nadat hij in de broed-
stoof op 37° was verwarmd, nog goed bleef sluiten.

Voor het opwerken der gistingen vulden wij dit vacuum weder
met stikstof aan en openden de exsiccator; namen het aantal bui-
zen, dat in ongeveer één uur tijds opgewerkt kon worden er uit,
waarna de exsiccator, na wederom geëvacueerd te zijn, met stik-
stof gevuld werd.

Aan de gebruikte stikstof moest de grootst mogelijke zorg be-
steed worden om haar zuurstof-vrij te maken. Hiertoe leidden we
het gas achtereenvolgens door twee buizen, die gevuld waren met
rollen kopergaas. Beide buizen bevonden zich naast elkander in
een brandenden gasoven.

Wanneer het kopergaas in de eerste buis door oxydatie zwart
was geworden, reduceerden we het gaas in beide buizen alvorens
het verder voor de reiniging van stikstof te gebruiken, zoodat
steeds minstens één volle buislengte van gereduceerd kopergaas,
beschikbaar bleef. Vervolgens werd de stikstof — door zeef-
plaatjes fijn verdeeld — twee-maal door een alkalische pyrogal-
lol-oplossing geleid om dan een controle apparaatje, bestaande
uit twee kleine waschfleschjes, te passeeren. Het vullen van de
waschfleschjes geschiedde als volgt: een oplossing van pyrogal-
lol in water werd even gekookt, waarna ze onder doorleiden van
stikstof afkoelde; met deze oplossing vulden we de waschflesch-
jes en voegden — steeds stikstof doorleidende — een eveneens
uitgekookte en onder stikstof bekoelde natronloog-oplossing, toe.
Het voornaamste hierbij was, dat de vloeistof in het eerste wasch-
fleschje van het controle apparaatje (gerekend van de zijde waar
de gasstroom intrad) kleurloos of tenminste lichtbruin gekleurd
bleef. Tijdens het gebruik van stikstof mocht deze oplossing dan
ook niet donkerder van kleur worden.

Het behoeft geen betoog, dat de inhoud van het eerste wasch-
fleschje — hoewel het tweede-, dat als zuurstof-slot moest die-

nen om tijdens het aansluiten van toestellen een binnendringen
van luchtzuurstof in het eerste te voorkomen, deze functie goed
na kwam — toch op den duur bruiner kleurde doordat een weinig
lucht door slangen en verbindingen heen difundeerde. Een nieuwe
vulling bracht dan alles weer in orde.

De quantitatieve gistingen werden uitgevoerd in een apparaat,
bestaande uit een Erlenmeyer met een aangesmolten bol van on-
geveer 100 cm®. Dit vat werd geijkt met een uitgewogen hoeveel-
heid water (b.v. 200 cm® ) en het geheel zoodanig gekozen, dat
de vloeistof-spiegel van dit water, zich in het vernauwde gedeelte
van het apparaat bevond; hierdoor verkregen we later een groo-
tere nauwkeurigheid bij het weder aanvullen met water, na af-
loop van de gisting.

Het bolvormige gedeelte neemt, bij uitzetting van de vloeistof
of bij schuimvorming, beide op.

De door mij gebruikte apparaten werden vervaardigd uit een
„Jenaquot; rondbodem van 100 cm® en een „Jenaquot; Erlenmeyer van
200 cm®.

Het bolvormige gedeelte werd afgesloten met een tweemaal
doorboorde gummi-stop, vastgehouden met behulp van een
stropje van koperdraad.

In één doorboring stak een, op den bodem van het vat eindigen-
de glazen buis, welke van boven een verwijd gedeelte, ter lengte
van ± 7 cm en Ij^—2 cm diam. had, waarin zich een watten-
prop bevond. Door de andere doorboring ging een rechthoekig
omgebogen buisje, precies onder de stop eindigende, eveneens van
een dergelijke verwijding met watten-prop voorzien. De rechte
buis werd afgesloten met een gummi-stop en het omgebogen
buisje met behulp van een doorboorde gummi-kurk, aangesloten
aan een opvang-apparaatje om eventueel ontwijkend acetalde-
hyde, tegen te houden. Dit apparaatje bestond uit drie, (door tus-
schenkomst van dubbelomgebogen buisjes met bolletjes en twee-
maal doorboorde gummi-stopjes), met elkaar verbonden buizen
van ongeveer 50 cm® inhoud.

De eerste buis bevatte water, de tweede en derde een verza-
digde bisulfiet-oplossing.

in het gistingsvat, vloeistof uit het opvang-apparaatje in dit vat
zou komen, en konden de in de buizen aanwezige vloeistof volu-
mina, gemakkelijk bevatten. Het water in de eerste buis belette,
eventueel uit de andere buizen ontwijkend zwaveldioxyde, in het
gistingsvat te komen.

200 cm® voedingsbodem werden bij kamertemperatuur in het
gistingsvat gepipetteerd, de vloeistofspiegel moet dan gelijk met
den ijk-ring, in de vernauwing staan. We sloten het vat met de van
buizen voorziene stop en bevestigden deze met een koperdraadje.

Het geheel werd bij 110° gestereliseerd; tijdens de sterelisatie
zijn beide buizen alleen met een watten-prop gesloten.

Voor anaërobe gistingen namen wij het gistingsvat zoo warm
mogelijk uit de autoclaaf en verbonden het met de opvang-appa-
ratuur om dan door de rechte buis steriele stikstof in te leiden.

Na bekoeling kon tot enten worden overgegaan; daartoe ver-
wijderden we, na even flambeeren van het boveneinde van de
rechte buis, de watten-prop en brachten door deze buis een bac-
terie-emulsie in het vat (tijdens deze manipulatie werd de verbin-
ding met de opvang-inrichting verbroken om een wegvloeien van
de bacterie-emulsie te vergemakkelijken). Na flambeeren brach-
ten we de watten-prop weer op haar plaats en verbonden de buis
met de stikstof-leiding; nadat het opvang-apparaatje aangesloten
was werd nog gedurende eenigen tijd stikstof doorgeleid en ver-
volgens na afsluiting met een gummi-stop, het toestel in een broed-
stoof of broedkamer geplaatst.

Voor het opwerken lieten we de geheele apparatuur tot kamer-
temperatuur afkoeleft en vulden daarna, zoo noodig, met steriel
water aan, tot de vloeistofspiegel wederom gelijk met den ijk-ring
stond.

Voor deze vergistings-proeven gebruikten we als gistingsvat
een mengcilinder van één liter inhoud met verdeeling; hierop was,

met behulp van een driemaal doorboorde gummi-stop, een cilin-
dervormige opzet, met een inhoud van 200 cm® en een verdeeling
van 10 cm®, bevestigd, door de aangesmolten kraan in de eerste
boring van de stop te steken, tot het uiteinde er even buiten stak.
Boven aan den opzet was wederom een Ij/a—2 cm wijde buis
gesmolten, welke een watten-prop bevatte; tevens was aan dit
einde een zijbuis bevestigd, die door de tweede doorboring van de
stop ging en aldus veroorloofde, dat het gas in den mengcilinder
de uit den opzet wegvloeiende pepton-oplossing, kon vervangen.
Het verdient aanbeveling om in deze buis eveneens een watten-
prop aan te brengen, om infectie — welke ons bleek mogelijk te
zijn — van den voedingsbodem, in den opzet, vanuit het gistings-
vat te voorkomen. Door de derde boring stak een, even onder de
stop eindigend, rechthoekig omgebogen buisje met verwijding
voor watten-prop, hetwelk de verbinding vormde met het reeds
boven beschreven opvang-toestelletje voor acetaldehyde.

Voor het enten en stikstof doorleiden was ten slotte nog een
vierde, tot op den bodem van den mengcilinder reikende, eveneens
van verwijding voor watten-prop voorziene buis aanwezig.

Het vullen van den mengcilinder met voedingsvloeistof, waar-
van het volumen op de verdeeling kon worden afgelezen, geschied-
de door de stop met den opzet te verwijderen;nadat de gewenschte
hoeveelheid was toegevoegd werd de cilinder weder met den opzet
gesloten en deze met koperdraad stevig bevestigd. Terwijl alle
daartoe bestemde buizen van watten-proppen voorzien waren,
werd gestereliseerd; vervolgens tijdens het bekoelen, op de reeds
beschreven wijze stikstof doorgeleid en het geheele toestel er
mede gevuld. Na enten met een bacterie-emulsie leidden we nog
een tijdje stikstof door, waarna de opzet, en de stikstof-invoerbuis,
van gummi-stoppen voorzien werden; het opvang-apparaat was
reeds eerder aangesloten.

Den opzet vulden we — na verwijdering van de gummi-stop,
flambeeren der buis en uitnemen van de watten-prop — met de
later toe te voegen, van te voren gestereliseerde, oplossing, waar-
na steriele stikstof in den opzet geleid en deze, na flambeeren,
wederom met dé gummi-stop, gesloten werd.

Links manometer, aan de voorzijde reservoir voor spervloeistof, rechts vergistings-
vat. Het geheel kan, om een, in het midden aangebrachte as slingeren en wordt
door den, op den voorgrond staanden electro-motor, aangedreven.

14 Formiaat-gisting. 15. Gisting met successieve-pepton-toevoegingen. 16. links
toestel voor de vergisting met kleine hoeveelheden vloeistof, rechts voor vergistmg
met grootere hoeveelheden.

bepaalde, op de verdeeling af te lezen, hoeveelheid vloeistof uit
den opzet tot den mengcilinder worden toegelaten zonder dat er
stikstof uit het toestel ontweek of lucht erin kon toetreden.

Toestel voor het uitvoeren van gistingen, terwijl waterstof door
de gistende vloeistof geschud werd.

Dit toestel bestond uit een rondbodem van 500 cm® met aan-
gesmolten slijpstuk, waarop een aan weerszijden van slijpstukken
voorziene rechthoekig omgebogen buis (diam. ± IM cm) kwam.
In het in de kolf stekende slijpstuk, was een nauwer buisje
gesmolten, dat tot aan het oppervlak van de, in de kolf aanwezige
vloeistof, reikte; beneden deze aanhechting was een, naar boven
gekeerde zijbuis aangesmolten, eindigende in een verwijding voor

Eveneens bevond zich een watten-prop in het verwijde ge-
deelte achter het slijpstuk, waarmede het horizontale einde van
de omgebogen-, verbonden was met een U-vormige buis.

Deze U-vormige buis was uitgevoerd als open-manometer. Aan
het eene been, bij de bovengenoemde aansluiting, was een zij-
buisje met kraan, aan de onderzijde van het andere, een zijbuisje
aangesmolten. Het, met de kolf verbonden been, was vervaardigd
uit een buret, die 50 cm® kon bevatten. Het onderste zijbuisje
werd door middel van een rubber-slang verbonden met een reser-
voirtje en het geheel met water gevuld; door nu het reservoirtje
hooger of lager te stellen konden de niveaux, ter aflezing van het
volumen, gelijk gezet worden. Het volumen van kolf enz. tot aan
de nulstreep van den manometer, bedroeg 720 cm®.

De, van 300 cm® voedingsbodem voorziene, door een watten-
prop gesloten kolf en de afzonderlijk ingepakte, rechthoekig om-
gebogen buis, werden op de gewone wijze, gedurende uur bij

Na bekoeling zetten wij het toestel weer in elkander en beves-
tigden het op de schudmachine, om dan vervolgens door het
kraantje waterstof in te leiden; de hierdoor verdrongen lucht werd
gelegenheid gegeven, door de recht opstaande zijbuis, te ontwij-
ken. Ongeveer een uur leidden we waterstof door en sloten dan

de zijbuis met een gummi-stop, waarna tiet gecalibreerde been
van den manometer met waterstof gevuld, de kraan gesloten, en
de verbinding met den waterstof-cilinder verbroken werd; het
geheel was dan voor gebruik gereed.

In het vorige hoofdstuk deelden wij reeds mede, dat de vor-
ming van gassen bij vergisting van glycol, onderzocht werd in
gistbuizen (zgn. Einhorn) van 250 cm® inhoud. We vulden deze
buizen met een voedingsbodem, die 1 % pepton, ^ % keuken-
zout, en 2 % glycol, doch geen krijt bevatte; het vrij maken van
koolzuur, door de bij de gisting ontstane zuren, schakelden wij
hierdoor uit.

Bij deze proeven konden wij de afscheiding van gassen uit de
oplossing niet waarnemen, ook bij het onderzoek onder anaërobe
omstandigheden trad geen gas op.

Dit stemde dus overeen met de resultaten van vorige onderzoe-
kers, die bij de vergisting van glycol eveneens geen gassen von-
den.

Na veertien dagen onderzochten we zoowel de vloeistof der
gistbuizen, als het substraat van anaërobe vergistingen en vonden:
azijnzuur, alkohol, zeer weinig melk- en barnsteenzuur, sporen
acetaldehyde en in enkele gevallen 2.3. butyleenglycol.

Tevens onderzochten we, volgens Voges-Proskauer, de vloei-
stoffen op diacetyl en acetoïne, doch konden beide verbindingen
niet aantoonen.

Voor deze vergistingen gebruikten wij de onder nummer: 1—6,
11, 16, 17, 19, 29, 31 en 37, in onderstaande tabel aangeduide,

Bij dit onderzoek trof het ons, dat acetaldehyde in sommige
substraten wel, in andere niet voorkwam.

Wij besloten dit nader te onderzoeken en tevens in het onder-
zoek meerdere stammen te betrekken.

Bovendien achtten wij het gewenscht het acetaldehyde semi-
quantitatief te bepalen, welke bepalingen wij, in het op blz. 38
beschreven toestel, uitvoerden.

ton „Wittequot;, 2 % natriumsulfiet (NaaSOg.THaO), 1 % krijt en
1 % glycol in leidingwater en steriliseerden in wijde kuituur-
buizen gedurende een half uur bij 110°.

Wij voerden deze proeven in vier groepen uit: Aëroob, mèt en
zonder sulfiet; anaëroob met en zonder sulfiet.

De aërobe gistingen werden, in door watten-proppen gesloten
buizen, in een stoof gedurende 10 dagen bebroed; bij de anaërobe
gistingen zetten we gedurende den zelfden tijd, de buizen in een
met stikstof gevulden exsiccator ¹), in de broedstoof.

Na het broeden namen we uit elke buis een oogje en streken
dit op schuine-agar af; na vierentwintig uur staan bij 37° konden
we dan, door het aanslaan van deze kuituur, constateeren of de
bacteriën, bij het afbreken der gisting, nog leefden.

De resultaten zijn vereenigd in onderstaande tabel, waarvoor
wij de volgende normen vaststelden:

Er vertoont zich een wolkje, spoor
De vloeistof wordt even groen, zeer weinig
Blauw-groene kleur, weinig
Blauw,

Semi-quantitaticf onderzoek naar de productie van acet-
aldehyde bij de vergisting van glycol.

Scmi-quantitatief onderzoek naar de productie van acetaldehyde
bij de vergisting van glycol, zonder dat krijt was toegevoegd en
onder aërobe omstandigheden.

Bekijken we de tabel, dan zien we, dat over het algemeen, zoo-
als te verwachten was, de grootste hoeveelheden acetaldehyde
ontstaan bij de toevoeging van sulfiet, doch tevens, dat bij de
anaërobe gistingen meer acetaldehyde ontstaat, dan bij de aërobe,
zóó zelfs, dat de opbrengsten aan acetaldehyde bij de anaërobe
gisting zonder sulfiet, grooter zijn dan die bij de aërobe gistingen
met sulfiet.

In de meeste gevallen kunnen we een stijgende lijn consta-
teeren in de opbrengst van acetaldehyde, wanneer we de volg-
orde, aëroob zonder-, aëroob met sulfiet, anaëroob zonder- en
anaëroob met sulfiet, kiezen, in welke volgorde ook de tabel op-
gesteld is.

Bacterium coli gaf aëroob zoowel zonder-, als met sulfiet, geen
acetaldehyde; anaëroob zonder sulfiet spoor- en met sulfiet zeer

Bacterium typhi zonder sulfiet en aëroob geen acetaldehyde,
aëroob en met sulfiet spoor-, anaëroob zonder sulfiet spoor- en
anaëroob met sulfiet weinig acetaldehyde.

Voor de bacteriën paratyphi A., B. en C. wordt dit: zonder
sulfiet en aëroob A. en B. geen acetaldehyde, C. zeer weinig;
aëroob en met sulfiet A. geen-, B. en C. weinig acetaldehyde, en
voor de anaërobe gistingen A. een spoor acetaldehyde, B. en C.

zeer weinig, wanneer er geen sulfiet was toegevoegd; was sulfiet
wel aanwezig, dan geeft A. een spoor, B. veel en C. weinig acet-
aldehyde.

Voor B. enteritidis Gärtner wordt dit respectievelijk: een spoor,
matig veel, matig veel en zeer veel acetaldehyde.

De dysenterie-bacteriën leverden ten slotte een zeer slechte op-
brengst aan acetaldehyde op, nl.: bij de aërobe vergistingen geen
en bij de anaërobe vergistingen sporen acetaldehyde.

Over het algemeen konden de Typhus-, de Paratyphus A-, en
de Dysenterie-bacteriën de sulfiet-toevoeging slecht verdragen.
Bij de stammen, welke wij van het Instituut voor Tropische Hy-
giëne te Amsterdam en van dat te Leiden, voor dit onderzoek ont-
vingen, was dit zelfs zoo sterk, dat bij onze eerste proeven, in een
milieu waaraan 2 % sulfiet was toegevoegd, zoowel bij de aërobe-
als bij de anaërobe vergistingen, de bacteriën dood waren gegaan.
Waarschijnlijk was dit gedeeltelijk aan het, met te groote tus-
schenpoozen, overenten, te wijten. Nadat wij gedurende ander-
halve maand iedere vijf dagen deze stammen hadden overgeënt,
gelukte het ons ze in een voedingsbodem, waaraan 1 % sulfiet
was toegevoegd, in het leven te houden, hoewel er toch nog eenige
stammen bij waren, welke in dit milieu eveneens stierven. In de
tabel zijn, voor deze stammen, de resultaten van vergistingen in
tegenwoordigheid van 1 % sulfiet, vermeld.

Na het enten, met een oogje van de vergistingssubstraten der
Dysenterie-bacteriën, op schuine-bouillon-agar, sloegen de kui-
turen meestentijds moeilijk aan en vertoonden een dunnen groei.

Ten slotte zij nog opgemerkt, dat in de meeste gevallen, het sul-
fiet beter werd verdragen bij de aërobe-, dan bij de anaërobe ver-
gistingen.

Wanneer we de uitkomsten van dit semi-quantitatieve onder-
zoek naar de opbrengst aan acetaldehyde, vergelijken met de
resultaten, welke wij verkregen bij de quantitatieve bepalingen,
dan blijken deze voor het quantitatieve onderzoek zonder krijt
(tab. 9—14) goed overeen te stemmen; vonden echter de vergis-
tingen onder aërobe omstandigheden plaats, dan traden voor ge-
noemde stammen verschillen op. Het quantitatieve onderzoek,
waarbij géén krijt aan de te vergisten vloeistof was toegevoegd

(tab. 3—8) leverde meer acetaldehyde op, dan het semiquantita-
tieve onderzoek, waarbij wèl krijt was toegevoegd, daarom stelden
wij nog een semiquantitatief onderzoek in naar de vorming van
acetaldehyde bij deze stammen als de vergisting plaats greep in
een milieu zonder krijt en onder aërobe omstandigheden. De resul-
taten, welke wij onderaan tabel 2 vermeldden, stemmen, behou-
dens voor stam No. 16, goed overeen.

De toevoeging, zoowel als het weglaten, van stoffen aan den
voedingsbodem, waarin de vergisting moet plaats hebben, heeft
niet alleen ten gevolge, dat bepaalde chemische reactie's niet kun-
nen verloopen — zooals b.v. le. het vastleggen van acetaldehyde
met sulfiet, waardoor het aan verdere chemische reactie's onttrok-
ken wordt; 2e. het uitvoeren van de gistingen onder anaërobe om-
standigheden, (dus het wegnemen van zuurstof), waardoor oxy-
datie reacties, door middel van deze zuurstof, opgeheven worden
— doch tegelijkertijd beïnvloedt men de conditie's, waaronder
het levende organisme verwijlt; erger nog: door bepaalde toe-
voegingen kan men het organisme schaden, waardoor het, zoo
het niet gehéél te gronde gaat, toch sterk in zijn levensfunctie's
wordt geremd. Men mag dus ook de resultaten van een dergelijk
onderzoek niet beschouwen in overeenstemming te zijn, met die,
welke het zelfde organisme zou opleveren zoo het zich onder nor-
male omstandigheden kon ontwikkelen, zonder er zich van over-
tuigd te hebben, dat de afwijkingen niet groot zijn of althans uit
de conditie-verandering verklaard kunnen worden.

Met andere woorden: alvorens het onderzoek in bepaalde banen
te leiden, is het goed, eerst de proeven onder normale omstandig-
heden te laten verloopen, en de hierbij bekomen resultaten te ver-
gelijken met die, welke onder abnormale omstandigheden wer-
den verkregen.

Mede zij er op gewezen, dat zeer kleine concentratie's voor het
organisme reeds voldoende kunnen zijn, om het tot een geheel
andere leefwijze te noodzaken.

Het leek ons dan ook gewenscht, om de vergisting van glycol
eerst te onderzoeken in een milieu, waaraan verder niets anders
was toegevoegd dan de noodzakelijke voedingsstoffen.

Bij voorkeur wilden we de vergistingen laten verloopen in een
vloeistof, waaraan, behalve het glycol, slechts anorganische voe-

dingszouten of gedefinieerde organisclie verbindingen, waren toe-
gevoegd, doch het bleek ons onmogelijk hierin een noemenswaar-
dige vergisting van dit lichaam, te verkrijgen. Wij meenen dit
gedeeltelijk te moeten wijten aan het giftige karakter van glycol
voor bacteriën. Een tweede mogelijke oorzaak zal nog nader be-
sproken worden onder paragraaf f. en g. blz. 92, 96 en in hoofd-
stuk 9 blz. 114.

De geringe giftigheid van glycol mogen wij afleiden uit de vol-
gende publicatie's:

Toxiciteit van aethyleenglycol grooter dan die van propyleen-
glycol. JVl. A. Seidenfeld en P. J. Harzlik«quot;).

Houdbaar maken van eierpreparaten met aethyleenglycol. Wolf
Kritchevsky, Benz. Harris, Carl J. Beckert«^).

Reid Hunt«^) onderzocht de giftigheid van aethyleenglycol,
in verband met het gebruik van deze stof in voedingsmiddelen
en pharmaceutische producten, in plaats van glycerine. Door dier-
proeven is hem gebleken, dat glycol een giftige werking uit-
oefende, welke met die van methylalkohol overeenkomt.

De slechte vergisting in anorganisch-milieu dwong ons dus
pepton als voedingsstof te gebruiken, hoewel deze stof uit analy-
tisch oogpunt nu juist niet als ideaal is te beschouwen door haar
wisselende en gedeeltelijk nog onbekende samenstelling, terwijl
ze bovendien nog vluchtig zuur bevat.

Tweemaal 100 cmquot; peptonwater, dat 1 % pepton bevatte, wer-
den gedurende uur bij 110° gestereliseerd, waarna we op de
aangegeven wijze het vluchtige zuur af destilleerden; bij titratie
vonden wij voor de verschillende fractie's de volgende hoeveel-
heden Ö,1 N loog.

Eveneens bepaalden wij voor een niet gestereliseerde pepton-
oplossing, die 10% pepton bevatte, in tweemaal 100 cm® de hoe-
veelheid vluchtig zuur; dit kwam overeen met de volgende hoe-
veelheden 0,1 N loog.

Hieruit blijkt wel, dat de pepton belangrijke hoeveelheden
vluchtig zuur bevatte.

Ten slotte bepaalden we nog den invloed, welke een Coli-stam
op de pepton uitoefende. Tweemaal 100 cm' 1 % peptonwater
werd, na bij 110° gesteriliseerd te zijn, met B coli st. No. 4 ge-
ent; na zes dagen broeden bij 37°, destilleerden we het vluchtige
zuur met stoom af en titreerden de afzonderlijke fracties:

Behalve pepton werd steeds % keukenzout toegevoegd, daar
dit volgens sommigen den bacteriën-groei en de vergisting stimu-
leert.

Bij het analyseeren van het substraat veroorzaakt het keuken-
zout geen last, want, het hieruit, door het zwavelzuur vrij ge-
maakte zoutzuur, komt bij de destillatie van de vluchtige zuren
niet over; dit was te verwachten en kon door ons herhaalde malen
geconstateerd worden.

a. Aërobe vergisting van glycol in peptonwater, waraan geen
krijt was toegevoegd.

Deze vergistingen werden uitgevoerd in de op blz. 58 beschre-
ven apparatuur, nl. een Erlenmeyer waaraan een rondbodem ge-
smolten was, verbonden met een toestelletje om het ontwijkende
acetaldehyde vast te leggen. Het was tot aan de merkstreep ge-
vuld met een oplossing, die 1 % pepton, % keukenzout en
2 % glycol bevatte, en met inhoud gestereliseerd bij 110°.

V^ij entten den voedingsbodem met een oogje van een vieren-
twintig uur oude bouillon-kuituur van de gewenschte bacterie-
stam en bebroedden bij 37° gedurende 10 dagen (eens per dag
steriele lucht door het toestel leidende), waarna de vloeistof ge-
analyseerd werd, waarvan de resultaten in onderstaande tabellen

In de eerste kolom worden de gewichten der respectievelijke
stoffen, zooals ze bij de analyse gevonden werden, aangetroffen.
In het bovenste gedeelte van de tweede kolom zijn de, uit de, voor
glycol gevonden waarden, berekende percentage's onvergiste-
en vergiste glycol (toegevoegde glycol is 100 % gesteld) ver-
meld. In de derde kolom zijn de percentage's glycol vereenigd,
die bij het ontstaan van respectievelijk: acetaldehyde, azijn-
zuur en alkohol, zijn verdwenen; hierbij is de totale hoeveel-

heid vergiste glycol, dus laatste waarde, bovenste gedeelte van de
eerste kolom, op 100 % gesteld. Onder „totaalquot; is in de derde ko-
lom de som van deze percentage's vermeld. In de vierde kolom
treft men de aantallen moleculen aan, die met de gewichten in de
eerste kolom correspondeeren. En ten slotte geeft de vijfde kolom
het aantal koolstof-atomen weer, dat zich in deze moleculen be-
vond.

b. Anërobe vergisting van glycol in peptonwater, waaraan
geen krijt was toegevoegd.

De voedingsbodem was van gelijke samenstelling als de be-
schrevene. Het toestelletje namen we zoo warm mogelijk uit de
autoclaaf en leidden direct op de, op blz. 59 besproken wijze,
zuurstof-vrije- en steriele-stikstof door het geheele apparaat.

Na bekoeling werd wederom geënt met een oogje van een
24 uur oude bouillon-kuituur en, nadat nog stikstof was door
geleid, gedurende 10 dagen bij 37° bebroed, in welken tijd het
geheel goed gesloten bleef.

Het beste verliep de vergisting onder aërobe omstandigheden
bij de Colistam; voor de Typhus-, Paratyphus A. en B.- en Ente-
ritidisstammen was het percentage vergiste glycol zeer laag, onge-
veer 12 %, terwijl de Dysenterie Flexner-stam een buitengewoon
slechte ontleding opleverde.

Bij de anaërobe vergistingen wordt het percentage vergiste
glycol nog geringer, hoewel de verhouding der vergistingsinten-
siteit voor de respectieve stammen ongeveer het zelfde blijft, (met
uitzondering van de Coli-, Typhus- en Paratyphus A. stammen,
die in dit geval een uiterst laag percentage bereikten).

De oorzaken van de geringe ontleding van glycol, konden gele-
gen zijn: le. bij een te groote zuur-concentratie, 2e. aan de moei-
lijke vergistbaarheid van glycol en 3e. aan een giftige uitwer-
king op de bacteriën.

Wij besloten, om te groote zuur-concentratie tegen te gaan, aan
den voedingsbodem krijt toe te voegen en de twee andere oor-
zaken zoo veel mogelijk op te heffen, door, met een grootere
hoeveelheid bacteriën, te enten.

De vergistingen werden, als onder § a. beschreven, uitgevoerd;
behalve de daar reeds genoemde stoffen, voegden we nog 2 %
krijt aan den voedingsbodem toe.

Wij brachten de grootere hoeveelheid bacteriën in, door een
schuine bouillon-agar-kultuur met 5—10 cm® peptonwater af te
schudden en met deze suspensie de te vergisten vloeistof, te enten.

Na 10 dagen broeden bij 37° (gedurende welken tijd iederen
dag wat lucht werd doorgeleid) analyseerden we het substraat;
de verkregen resultaten zijn hieronder getabeleerd.

Vergelijken we deze resultaten met die van de vergistingen
zonder krijt, dan zien we voor de overeenkomstige stammen bij'
de aërobe vergistingen, dat in het algemeen de toevoeging van
krijt, het percentage vergiste glycol verhoogt, nl. voor: B. para-
typhi B. van 13 op 25 %, B. dysenteriae Flexner van 4,5 op 17 %;
voor B. coli blijft het echter vrijwel gelijk nl. 39 en 41 %.

De verschillen tusschen de percentage's zuur en alkohol wor-
den voor B. paratyphi B. en B. dysenteriae Flexner, kleiner, nl.
van 63 — 33 = 30 (tab. 6) tot 59 — 41 18 (tab. 16) en
71 — 24 = 47 (tab. 8) tot 62 — 31 = 31 (tab. 17).

Bij B. coli neemt het verschil toe van 53 — 43 = 10 (tab. 3)
tot 59 — 36 = 23 (tab. 15).

De percentage's gevormd zuur wijken niet veel af van die, welke
bij de vorige vergistingen gevonden werden; alleen B. dysenteriae
maakte onder deze omstandigheden wat meer zuur.

Vergelijken we eveneens de anaërobe vergistingen zonder en
met krijt, dan is over de geheele linie het percentage vergiste glycol
grooter geworden door de toevoeging van krijt.

Bij de Coli- en Enteritidisstammen zijn de percentage's zuur en
alkohol nagenoeg gelijk aan elkaar geworden; bij de paratyphus
B. stam is meer zuur en bij de Dysenteriestam nog steeds véél
meer zuur dan alkohol gevormd, hoewel nu ook het verschil
tusschen de percentage's zuur en alkohol kleiner is geworden
64 _ 32 = 32 (tab. 14) en 60 — 37 = 23 (tab. 22).

Vergelijken we nog de aërobe en anaërobe vergistingen, beide
met krijttoevoeging, dan is het percentage vergiste glycol bij de
paratyphus B.-stam en de Colistam gedaald, bij de Dysenterie-
stam is dit gelijk gebleven.

De hoeveelheden gevormd zuur zijn nagenoeg hetzelfde geble-
ven voor B. paratyphi B. en dysenteriae, respectievelijk 59—53 %

Over het algemeen is het percentage vergiste glycol door de
krijttoevoeging, ten opzichte van de gistingen zonder krijt, sterk
gestegen; toch konden wij niet dat van ongeveer 50 %, hetwelk
Le Fèvre bij zijn glycol-vergistingen vond, bereiken; het is

mogelijk, dat bij langduriger verblijf in de broedstoof (L.F. liet
zijn gistingen minstens gedurende 30 dagen staan) dit percentage
stijgt; wij namen dit echter niet waar.

e. Anaërobe vergisting van glycol in peptonwater, waaraan
krijt en natriumsulfiet was toegevoegd.

Acetaldehyde was in de substraten niet of slechts in geringe
hoeveelheden aanwezig, een uitzondering hierop werd gemaakt
door B. paratyphi B. No. 16, waarbij onder anaërobe omstandig-
heden ongeveer 6 % acetaldehyde in het substraat te vinden was.

Le Fèvre®®) berichtte het vinden van ongeveer 54 % van het
verdwenen glycol als acetaldehyde, 40 % als azijnzuur, doch vond
geen alkohol; het totale percentage bedroeg dus 94 %, terwijl on-
geveer 50 % van het toegevoegde glycol, vergist was, wanneer hij
deze verbinding, in tegenwoordigheid van krijt en sulfiet, onder
aërobe omstandigheden liet ontleden door een Coli-stam.

Naar aanleiding hiervan en de betrekkelijk geringe resultaten,
die wij bij de gewone vergistingen betreffende het acetaldehyde,
verkregen, leek het ons gewenscht, deze vergistingen eveneens als
„sulfietgistingquot; uit te voeren.

Wij stelden daarom eerst, het op blz. 64 beschreven, semi-
quantitatieve onderzoek naar acetaldehyde in, en volgens de daar
verkregen resultaten, bepaalden we onze keus tot anaërobe-sul-
fiet-gisting van glycol door B. coli No. 4, B. paratyphi A. No. 11,
B. paratyphi B. No. 16 en B. dysenteriae Flexner No. 37.

Bij B. coli en B. paratyphi B. mochten we namelijk, op grond
van de uitkomsten van het semi-quantitatieve onderzoek, acetal-
dehyde verwachten; bij B. paratyphi B. zelfs zeer veel.

Voor B. paratyphi A. had dit onderzoek sporen acetaldehyde
opgeleverd, terwijl voor de Dysenteriestammen in het algemeen
geen acetaldehyde gevonden kon worden, of in enkele gevallen
slechts sporen.

Het was juist daarom van belang, na te gaan of het quanti-
tatieve onderzoek dezelfde resultaten zou geven.

verkrijgen in de andere, bij de sulfiet-gisting gevormde, producten
en tevens hunne percentsgewijze verhouding te leeren kennen.

Deze vergistingen heten we, evenals de vorige anaërobe-, in
dezelfde gesloten en met stikstof gevulde apparatuur, verloopen.

Als voedingsbodem diende, een door Le Fèvre reeds beschreven
vloeistof, (blz. 20) welke was samengesteld uit 1 % peptonwater,
1 % glycol, 2 % natriumsulfiet en 1 % (vooraf gesteriliseerd)

Wij konden verwachten, dat bij de sulfiet-gisting de bacterie-
groei belemmerd zou worden, daarom entten we deze vergistingen
met nog meer bacteriemateriaal dan bij de vorige proeven ge-
bruikt was.

Dit bacteriemateriaal verkregen we, door een, van bouillon-
agar voorziene flesch volgens Roux, met een vierentwintig uur
oude bouillon-kuituur te enten, welke enting op de volgende wijze
uitgevoerd werd:

Nadat de bouillon-kuituur was toegevoegd, legden we de flesch,
horizontaal, met de agar naar beneden gekeerd, gedurende 15 mi-
nuten in een broedstoof van 37°; daarna lieten we de overtollige
bouillon wegvloeien en plaatsten nu de flesch, gedurende 24 uur,
wederom met de agar naar beneden, doch iets hellend, in de
broedstoof; aldus verkregen we de geheele oppervlakte regelmatig
overgroeid.

De bacteriën werden met 10 cm® peptonwater afgeschud en
deze suspentie voor het enten van de te vergisten vloeistof, ge-
bruikt

Bij het opwerken van deze vergistingen moest met de aanwezig-
heid van het natriumsulfiet rekening worden gehouden: le. bij de
acetaldehyde-bepaling. Het acetaldehyde werd door bij druppelen
van een verzadigde bariumchloride-oplossing, in tegenwoordig-
heid van krijt, uit de sulfiet-verbinding in vrijheid gesteld. 2e. Bij
de glycol-bepaling. Hier werd de — na verwijdering van de pep-
ton — sterk zuur geworden oplossing, op phenolphthaleïne zwak
alkalisch gemaakt (van zelf sprekend gebeurde dit, met de voor
de glycol-bepaling afgepipetteerde hoeveelheid) en in deze alka-
lische vloeistof, alvorens te gaan verhitten, het aanwezige sulfiet

met niet aangezuurde permanganaat-oplossing, geoxydeerd. On-
der deze omstandigheden ontstond uit het glycol hoogstens
oxaalzuur, terwijl geen zwaveldioxyde in de kaliapparaatjes kon
geraken, daar het in zwavelzuur werd omgezet. Vervolgens verhit-
ten we, onder doorleiden van koolzuur-vrije-lucht (eerst zonder
dat de kaliapparaatjes aangesloten waren, ter verwijdering van
aanwezig koolzuur) en verbonden daarna de kaliapparaatjes,
zuurden wederom aan met zwavelzuur en lieten verder het kalium-
permanganaat-zwavelzuur-mengsel bij druppelen, waardoor het
gevoj-mde oxaalzuur evenals het glycol, geheel tot koolzuur werd
geoxydeerd. 3e. Titreerden we het, bij de vluchtige-zuren-destil-
latie mede overgekomen zwaveldioxyde en trokken later de aequi-
valente hoeveelheid zuur af.

Het verdient nog opgemerkt te worden, dat we bij alle vergis-
tingen, voordat ze geënt werden, de voedingsbodem op steriliteit
onderzochten; eveneens controleerden we (door er direct na ope-
ning van de toestellen, een oogje uit te nemen en dit af te strijken
op bouillon-agar en te bebroeden) of de bacteriën nog in leven
waren; deze kuituur diende dan tevens, ter vaststelling van de
zuiverheid van het organisme.

De uitkomsten van het acetaldehyde komen overeen met die,
welke bij de andere vergistingen verkregen werden.

De Colistam leverde een gering percentage aan acetaldehyde
op; voor de Paratyphi B.-stam was dit zelfs zeer hoog, overeen-
komstig de resultaten der andere gistingen, waarbij voor deze
stam ook steeds een grooter percentage acetaldehyde werd gevon-
den, terwijl ook met deze proeven bij de Paratyphi A.- en Dysen-
terie Flexner stammen slechts een spoor gevonden acetaldehyde
kon worden aangetoond.

Vermeldenswaard is hier het feit, dat azijnzuur en alkohol in
bijna gelijke verhouding ontstaan, hetgeen bij de vorige vergis-
tingen niet het geval was. De Dysenterie Flexnerstam produceerde
hier, overeenkomstig zijn gewoonte, veel meer zuur dan alkohol.

Dat het percentage vergiste glycol zoo laag blijft, kan geen
verwondering baren daar het natriumsulfiet mede een giftige wer-
king op het bacterie-organisme uitoefent.

In het algemeen werd bij de anaërobe vergistingen, in verhou-
ding tot den gevormden alkohol, een groote hoeveelheid vluchtig
zuur gevonden. Daar het gevormde vluchtige zuur, azijnzuur
bleek te zijn, kon het, aan alkohol evenredige gedeelte, door een
hydro-oxydatie-reactie ontstaan zijn, (b.v. volgens een reactie van
Cannizzaro); een ander gedeelte kon verklaard worden, doordat
wij vaststelden, dat in het pepton oorspronkelijk reeds vluchtig
zuur aanwezig was; dan restte nog een deel, dat — waar
er geen vrije zuurstof aanwezig was — slechts verklaard kon
worden uit een hydro-oxydatie-reactie, waarbij dan andere stof-
fen, die in het pepton aanwezig waren, gereduceerd werden. Dit
kon mede de oorzaak zijn van het gedeeltelijk vergisten van het
glycol; doordat de reduceerbare verbindingen opgebruikt waren,
kon geen verdere vergisting meer plaats hebben.

Braak vond bij de vergisting van glycerine, dat er na eenigen
tijd stagnatie in de gas-ontwikkeling optrad; door nu pepton-
water toe te voegen, verkreeg hij een nieuwe gasontwikkeling, die

na eenige dagen wederom stagneerde, om, na toevoeging van
peptonwater, opnieuw aan te vangen; dit liet zich meerdere malen
herhalen.

Wij wilden hetzelfde bij glycol onderzoeken, doch hierbij deed
zich het bezwaar voor, dat bij de vergisting van glycol geen gas-
ontwikkeling plaats greep; we konden dus het oogenblik, waarop
stagnatie in de vergisting optrad, niet vaststellen.

Wij besloten nu, de vergisting gedurende 5 dagen zijn gang te
laten gaan, daarna iederen tweeden dag 20 cm® 5 % peptonwater
toe te laten vloeien, dit vijftien keer te herhalen, om dan tot op-
werken over te gaan.

Deze vergistingen voerden we uit in het, op blz. 59 beschreven
toestel; in de mengcilinder brachten we 400 cm® van de, bij de
gewone vergistingen gebruikte voedingsbodem: peptonwater van
1 2 % glycol, 2 % krijt en % keukenzout. Den opzet vulden
we rnet 200 cm® peptonwater van 5 %, waarna het geheel bij 110°
werd gesteriliseerd. Nog warm uit de autoclaaf, leidden we stik-
stof door en entten na bekoeling, met een suspensie van den ge-
wenschten bacteriestam. Wij kozen voor deze vergisting de stam-
men: Coli No. 4, Paratyphus B. No. 16 en Enteritidis Gärtner
No. 19, daar gebleken was, dat deze het glycol nog het beste
fermenteerden.

Na aansluiting van het opvangapparaat voor acetaldehyde, stel-
den we het geheel op in de broedkamer en lieten gedurende 5 da-
gen de gisting zijn gang gaan.

Na den vijfden dag voegden we — door openen van de, tus-
schen opzet en mengcilinder, aangebrachte kraan — om de twee
dagen 20 cm® van de 5 % pepton-oplossing toe en herhaalden dit
vijftien maal. Steeds werd twee keer per dag doorgeschud om het
krijt weder in de vloeistof te suspendeeren.

Nadat de 200 cm® 5 % pepton-oplossing weggevloeid waren,
werd de opzet opnieuw met 200 cm® gesteriliseerd en warm met
stikstof verzadigd 5 % peptonwater, gevuld en stikstof door het
toestel geleid om eventueel toegetreden lucht weder te verdrijven.

Naast deze vergistingsproeven zetten we tevens, geheel op de
zelfde wijze en gedurende den zelfden tijd, proeven in, die we

blanco-proeven zouden kunnen noemen, daar aan den boven be-
schreven voedingsbodem het glycol ontbrak.

De analyse-resultaten, die we van deze laatste proeven verkre-
gen, trokken we af van die, welke bij de glycol-vergistingen ge-
vonden werden; zoodoende de producten, die uit de pepton ont-
staan waren, elimineerende.

B. enteritidis Gärtner No. 19 Met krijt en pepton toevoeging, doch zonder glycol-

Uit de verkregen resultaten blijkt wel, dat de hoeveelheid ver-
giste glycol sterk is toegenomen, zoodat we bij de glycol-vergis-
tingen de oorzaak van de moeilijke vergistbaarheid eveneens
moeten zoeken bij de remming van een hydro-oxydatiereactie,
door het optreden van een te groote waterstof-concentratie.

Acetaldehyde was voor alle drie de gebruikte stammen in ge-
lijke, doch geringe hoeveelheid, aanwezig, terwijl azijnzuur en
alkohol in aequivalente hoeveelheden ontstonden.

In de substraten van de voorgaande vergistingen konden wij in
het residu van de aetherextractie (extractie van niet vluchtige-
zuren) slechts zeer geringe hoeveelheden zuur vaststellen.

Bij de vergistingen met successieve toevoegingen van pepton,
was te verwachten, dat de hoeveelheden niet-vluchtig-zuur, groo-
ter zouden zijn, zoowel indien deze zuren uit het glycol zouden
zijn ontstaan, als wanneer de bron dezer zuren in het pepton ge-
zocht moest worden; immers was de pepton-concentratie bij deze
TCrgistingen grooter.

Inderdaad ontstonden bij deze gistingen grootere hoeveelheden
melk- en barnsteenzuur.

In de volgorde B. coli, B. paratyphi B. en B. enteritidis Gärt-
ner werden bij de proeven, waarbij glycol aan den voedingsbodem
was toegevoegd, respectievelijk: 0,0231, 0,0437 en 0,0409 g
melkzuur en 0,5513, 0,7130 en 0,3577 g barnsteenzuur gevon-
den.

Voor de vergistingen waaraan geen glycol was toegevoegd be-
droegen deze hoeveelheden in dezelfde volgorde respectievelijk:

0,0409, 0,0000 en 0,0166 g melkzuur en 0,1269, 0,0293 en
o',1469'g barnsteenzuur, zoodat de Colistam 0,0178 g minder
melkzuur en 0,4244 g meer barnsteenzuur gevormd heeft. Voor
de Paratyphi B stam vinden we 0,0437 g melkzuur en 0,2108 g
barnsteenzuur meer, en voor de Enteritidis Gärtnerstam is het
0,0243 g melkzuur en 0,2108 g barnsteenzuur meer.
' Door'de toevoeging van glycol wordt dus steeds meer barn-
steenzuur gevormd; terwijl alleen B. coli minder melkzuur, de
beide andere stammen meer melkzuur vormen.

Vergelijken we nog de moleculaire hoeveelheden azijnzuur,
melkzuur en barnsteenzuur, die bij de blanco-proeven ontstaan
zijn onderling, dan zien we noch verband optreden tusschen het
azijnzuur en de beide andere zuren, noch tusschen melkzuur en
barnsteenzuur.

De moleculaire hoeveelheden zijn in de volgorde: azijnzuur,
melkzuur en barnsteenzuur, voor:

B. p. typhi B. 0,00339, 0,00000, 0,00025
B. enteritidis 0,00328, 0,00018, 0,00124

g. Vergisting van glycol, terwijl waterstof door de gistende
vloeistof werd geschud.

Bij het vorige onderzoek was gebleken, dat de toevoeging van
pepton een gunstigen invloed uitoefende, zoowel t.o.v. de hoe-
veelheid vergiste glycol, als op de vorming van aequimoleculaire
hoeveelheden azijnzuur en alkohol. Dit meenden wij te mogen toe-
schrijven aan een betere opname en in reactie brengen van de ge-
vormde waterstof.

Wij dachten aan een katalytische reductie van bestanddeelen
der pepton. Om dit nader te onderzoeken, hydreerden we 15 cm®
van een 1 %-pepton-oplossing in gedestilleerd water, met behulp
van een micro-hydreer-apparaat, door middel van waterstof met
50 mg Pt katalysator, volgens Adam Schreiner, en vonden, dat er
12,4 cm® waterstof door het pepton was opgenomen. Bij een her-
haling van deze proef vonden wij 12,2 cm®

plasma op de opname van waterstof, door 15 cm® van genoemde
peptonoplossing, met een cultuur van Coli-bacteriën te enten en
gedurende 4 dagen bij 37° te laten broeden, waarna op de boven
beschreven wijze, met 50 mg Adam Sch. katalysator en waterstof,
werd gehydreerd. De opgenomen hoeveelheid waterstof bedroeg
nu 13,2 cm®; blijkbaar werd geen of uiterst weinig waterstof aan
het bacterieprotoplasma geadsorbeerd.

Vervolgens herhaalden we dit onderzoek, zonder dat een kata-
lysator was toegevoegd en vonden nu dezelfde hoeveelheden voor
de opgenomen waterstof.

Hier kon dus ook een adsorptie van waterstof aan het opgeloste
pepton in het spel zijn.

Dit onderzochten wij, door grootere hoeveelheden van 1 %-
peptonoplossingen met waterstof, door schudden op een schud-
machine, te verzadigen en vervolgens het opgenomen gas, onder
verwarming, weder uit te drijven (wij moesten hierbij tot koken
der oplossing verhitten) en vonden nu, dat de hoeveelheden opge-
nomen- en uitgekookte waterstof vrijwel gelijk waren. De water-
stof-adsorptie aan pepton, bleek dus mogelijk te zijn.

Het leek ons daarom van belang den invloed van een overmaat
waterstof op de vergisting van glycol te onderzoeken. Om een
innige vermenging van de waterstof met de vloeistof te bevor-
deren, lieten we het apparaat gedurende den geheelen vergistings-
tijd op een schudmachine schudden, gelijk dit bij katalytische
hydreeringen wordt toegepast. Het toestel beschreven we reeds
op blz. 61.

Als voedingsbodem gebruikten we een oplossing, die 1 % pep-
ton, 2 % glycol, % keukenzout en 2 % krijt bevatte. Deze op-
lossing werd in de kolf van het apparaat gebracht, de kolf met
een watten-prop gesloten en bij 110° gestereliseerd; direct hier-
na, namen we de watten-prop eraf en plaatsten het omgebogen,
van slijpstukken voorziene gedeelte, dat te voren gesteriliseerd
was, op de kolf.

Nadat het geheel verder in elkander gezet was, bevestigden we
het op de schudmachine en leidden gedurende een half uur water-
stofgas door het toestel, zonder te schudden; nadat de lucht ver-
drongen was, werd geënt met een afslibbing van een Colistam op

Door, met behulp van de aangesmolten kraan, wat waterstof
te laten ontsnappen, brachten we het niveau in de gecalibreerde
buis op ongeveer een derde van de hoogte en stelden vervolgens,
door omhoog schuiven van het reservoirtje, het niveau in het an-
dere been ongeveer 10 cm hooger.

De luchtdruk werd door een barograaf opgenomen, terwijl we,
het constant blijven van de temperatuur, op een thermograaf af-
lazen.

Zoo noodig konden we door bovengenoemde kraan de ver-
bruikte waterstof weder aanvullen.

Gedurende de zeventien dagen, dat we lieten gisten, contro-
leerden we regelmatig het volumen en hielden het niveau in het
open been van den manometer, zoo goed mogelijk 10 cm hooger
dan het niveau in het gesloten been, aldus voor een vrij constan-
ten, geringen overdruk in het toestel, zorg dragende.

Opmerkelijk is de vrij groote hoeveelheid acetaldehyde, welke
bij deze vergisting kon worden aangetoond; zij overtrof nog het
quantum, dat we bij de sulfietgisting met denzelfden bacteriestam,
(tab. 23) verkregen, met 0,59 %.

Zooals wij verwachtten was er bij deze vergisting veel meer
alkohol ontstaan, (namelijk 0,00259 mol. meer), dan met het ge-
vormde azijnzuur overeenkomt; wanneer deze hoeveelheid alkohol
ontstond door reductie van acetaldehyde met de toegevoerde
waterstof, was hiervoor 65,9 cm® bij 76 cm en 37°, noodig.

Het percentage vergiste glycol is zelfs ten opzichte van de sul-
fietgisting zeer laag te noemen; eenerzijds kan dit veroorzaakt
zijn door het voortdurende schudden, anderzijds door de rem-
mende werking van de waterstof.

Wij merkten op, dat het gecorrigeerde gasvolumen na eenige
dagen gisten toenam, om dan weder na korten tijd af te nemen,
hetgeen zich eenige malen tijdens de gisting herhaalde.

Dit verschijnsel kon veroorzaakt worden, door het snel ver-
bruiken van een opgehoopte hoeveelheid waterstof (afname van
het volumen) gevolgd door een hydro-oxydatie, waarbij water-
stof vrij kwam (toename van het volumen).

Een andere oorzaak kon gelegen zijn in de aanwezigheid van
krijt; uit dit krijt kon, door de tijdens de vergisting ontstane zuren,
koolzuur ontwikkeld worden, dat echter niet vrij kwam, doch in
de vloeistof opgelost bleef en hieruit de waterstof verdrong. Trad
de zuurvorming in een zekere frequentie op, dan zou dus een
phase van sterke zuurvorming gepaard gaan met toename van
het volumen; volgde hierop een phase van weinig of in het geheel
geen zuurvorming, dan nam het regelmatige waterstofverbruik
wederom de overhand en verminderde het volumen. Deze laatste
oorzaak leek ons de meest voor de hand liggende. Een zelfde ver-
gisting, doch zonder krijt, zou hier dus uitsluitsel kunnen geven.

De resultaten stemmen goed met die van de vorige tabel, over-
een; vanzelfsprekend is de hoeveelheid vergiste glycol hier nog
geringer.

Opvallend is echter, dat bij deze vergisting minder acetaldehyde
in het substraat aanwezig was; men zou toch in dit zure milieu
verwachten, dat een geringer gedeelte van het acetaldehyde door
een reactie van Cannizzaro, in azijnzuur en alkohol werd omge-
zet; dientengevolge moest er dan ook een grooter percentage acet-
aldehyde t.o.v. azijnzuur en alkohol, over blijven.

Wederom was er meer alkohol dan azijnzuur ontstaan en wel
0,00042 mol meer; dit komt overeen met 10,68 cm® waterstof bij
76 cm en 37°.

Tijdens deze vergisting kon geen noemenswaardige toename
van het volumen worden waargenomen, de waterstof werd regel-
matig verbruikt, zoodat we, het onder de vorige tabel besproken
verschijnsel, aan het vrij komen van koolzuur uit het krijt, moeten
toeschrijven, welk koolzuur dan de geadsorbeerde waterstof ver-
dringt.

Het bleek ons, dat gedurende deze proeven betrekkelijk groote
hoeveelheden waterstof geadsorbeerd werden, dit is in overeen-
stemming met het onderzoek van «D. D. van Slyke«^), die vond,
dat belangrijke hoeveelheden waterstof in bloed en bloedserum
konden oplossen.

TABEL 3L
B. coli No. 4.

Gisting met waterstof zonder krijt.

Producten	Grammen	% der toegev. glycol	% der vergiste glycol	Gram- moleculen	Berekend als gram atm. C.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	6,9297 6,6612 0,2685	96,13 3,89		0,00433	0,00866
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,0020 0,1126 0,1059		1,05 43,35 53,15	0,00005 0,00188 0,00230	0,00010 0,00276 0,00460
Totaal			97,55	0,00423	0,00746

Bij de vergisting, welke zonder krijttoevoeging verliep, verza-
digden wij eerst de nog warm uit de autoclaaf genomen pepton-
oplossing met stikstof, schudden gedurende twee dagen met dit
gas en vervingen vervolgens de, boven de vloeistof aanwezige
stikstof, door waterstof, welke wederom in belangrijke mate werd
opgenomen; nadat de oplossing met waterstof verzadigd was,
werd met de bacterie geënt.

Bij schudden van de oplossing met stikstof, nam deze slechts
weinig van dit gas op; een zelfde resultaat verkreeg Stoddard ®®)
met een onderzoek betreffende de oplosbaarheid van stikstof in
oplossingen, welke proteïnen bevatten.

h. Vergisting van glycol in peptonwater, waaraan krijt en
calciumformiaat is toegevoegd.

In hoofdstuk II deelden we reeds mede, dat door E. Ch. Grey
een onderzoek was ingesteld naar de vergisting van glycol in
tegenwoordigheid van calciumformiaat.

Grey voerde de vergisting uit in een vloeistof, die 12 g glycol,
5 g calciumformiaat, 10 g krijt en 300 cm® van een bacterie-
emulsie, welke b.v. 0,3 g (op droog gewicht berekend) bacteriën
bevatte; het geheel werd met water aangevuld tot 1000 cm®_

Grey meende uit de groote tioeveelheid melkzuur, die bij deze
vergisting ontstond, te moeten afleiden, dat de vergisting van
glycol niet op eenvoudige w^ijze verliep, daar er melkzuur uit het
glycol gesynthetiseerd werd.

Het leek ons interessant eveneens de vergisting van glycol in
een calciumformiaat bevattenden voedingsbodem te bestudeeren.

Bij de voorgaande vergistingen werd door ons, zij het in ge-
ringe hoeveelheden, melkzuur naast azijnzuur gevonden, doch
eveneens melkzuur in substraten, waaraan geen glycol was toe-
gevoegd. Een formiaat-gisting kon hier wellicht uitsluitsel geven.
Om deze proeven in overeenstemming te brengen met het voor-
gaande onderzoek, konden wij geen gebruik maken van de groote
hoeveelheden bacteriën, zooals dit door Grey gedaan was, doch
voegden wel pepton toe.

Wij stelden de volgende gistings-vloeistof samen: 12 g glycol,
5 g calciumformiaat, 10 g krijt, 10 g pepton en 5 g keukenzout,
in 1000 cm® water.

De vergisting werd uitgevoerd in een, van een verdeeling voor-
zienen, pyrex-platbodem van ongeveer 2,5 1 totalen inhoud. De
kolf was gesloten met een tweemaal doorboorde rubber stop. In
het eerste gat, stak een, tot aan den bodem der kolf reikende,
kraan-trechter; in het tweede een driewegkraan, die aan de twee
andere uiteinden voorzien was van verwijdingen voor het inbren-
gen van watten.proppen. Deze kolf vulden we met 2 1 van den
hierboven vermelden voedingsbodem en sloten de uiteinden van
de driewegkraan en den trechter met watten-proppen kiemvrij af.
Nadat het geheel met geopende driewegkraan gedurende een half
uur bij 110° gesteriliseerd was, werd de kolf zoo warm moge-
lijk uit de autoclaaf genomen en stikstof door den kraantrechter
ingeleid; na bekoeling entten we, met een — door afschudden met
peptonwater van een, op bouillon-agar, in een flesch volgens Roux,
gekweekte coli stam — verkregen bacteriënsuspensie, waarna de
kolf met behulp van de driewegkraan aangesloten werd aan drie
met elkaar verbonden fleschjes, die respectievelijk 200, 150 en
50 cm® 4 N kaliloog bevatten, waarna nog een leeg fleschje volg-
de; het geheel diende om het ontwikkelde koolzuur tegen te hou-
den. Het laatste fleschje was verbonden met een in een bak met

paraffine-olie staande, gecalibreerde, aan het boveneinde van een
capillair voorziene, cilinder van 2 1 inhoud, waarin het gevormde
waterstofgas kon worden opgevangen.

Vóór het enten, namen we, na eerst goed doorgeschud te heb-
ben, 200 cm® van den voedingsbodem uit den kraantrechter,
waarin de vloeistof, door middel van een kleinen overdruk in de
kolf, geperst was. Deze hoeveelheid vloeistof analyseerden we op
de hoeveelheden: glycol, koolzuur, mierenzuur en ander vluchtig-
zuur, die vóór de gisting aanwezig waren.

Grey heeft de bepaling van koolzuur en mierenzuur nagelaten,
welke bepalingen echter wel van belang kunnen zijn om den oor-
sprong van het ontstane melkzuur te ontdekken.

Nadat het toestel op temperatuur was gekomen, vulden we den
geheelen cilinder met paraffine-olie, sloten de capillair met be-
hulp van een rubber slangetje met klemkraantje en lieten ge-
durende twaalf dagen vergisten, waarna tot het analyseeren van
de gevormde producten werd overgegaan.

Bij de bepaling van het glycol in de oorspronkelijke oplossing,
evenals in de gistingsvloeistof, moest rekening worden gehouden
met de aanwezigheid van mierenzuur. In deze gevallen destilleer-
den we de vluchtige-zuren met stoom af en vulden daarna weder
tot het oorspronkelijke volumen aan, alvorens de glycol-bepaling
uit te voeren. De resultaten zijn in onderstaande tabel weerge-
geven.

Ontleed
73,52 % v/d vergiste glycol. Overm. t.o.v. alkohol =
32,44 % „ „ ,, 0,00598 val.

Onder deze omstandigheden was een gelijke hoeveelheid melk-
zuur gevormd als bij de blanco-proef van tabel 27; deze hoeveel-
heid melkzuur bleef verre ten achter bij die, welke door Grey ge-
vonden werd; ook ten opzichte van het gevormde azijnzuur was
de verhouding geheel anders, nl. 0,64 g azijnzuur en 0,06 g
melkzuur en bij Grey respectievelijk 2,22 en 1,5 g.

Wij vonden meer alkohol dan Grey, terwijl door ons tevens
barnsteenzuur gevonden werd.

De verhouding van de onvergiste- tot de vergiste glycol kwam
hier overeen met die, van de door ons uitgevoerde anaërobe ver-
gisting zonder krijt toevoeging (zie tabel 9); alleen was bij de for-
miaat-gisting meer azijnzuur dan alkohol gevormd.

Wij kunnen dus niet besluiten tot een meer gecompliceerde ver-
gisting van het glycol en meenen het ontstaan van een grootere
hoeveelheid melkzuur, zooals Grey die vond, te moeten verklaren,
doordat tegelijkertijd met het enten met de groote hoeveelheid
bacterie-emulsie, verbindingen werden toegevoegd, die later tot
melkzuur ontleed werden. Ook was het mogelijk, dat het melk-
zuur ontstond door synthese uit een molecule acetaldehyde en een
molecule mierenzuur, welk geval wij dan ook in de tabel bereken-
den. Er was meer mierenzuur verdwenen, dan overeenkwam met
de gevormde hoeveelheden koolzuur en waterstof.

Nemen we dan nog aan, dat het gedeelte van het azijnzuur,
dat niet in aequimoleculaire hoeveelheid met den alkohol ontstaan
is, gevormd werd door een hydro-oxydatie-reactie, waarbij water-
stof vrij komt, dan blijft tenslotte nog 21,58 cm® niet verant-
woorde waterstof, over.

In hoofdst. 11 blz. 22 beschreven wij reeds, het door Le Fèvre «quot;)
veronderstelde optreden van aethyleenoxyde, als tusschenproduct
bij de vergisting van glycol.

Deze veronderstelling wilden we, zoo mogelijk, aan een experi-
ment toetsen en kozen daartoe de vergisting van aethyleenoxyde
in peptonwater.

Deze vergisting werd, wegens de groote vluchtigheid van het
aethyleenoxyde, uitgevoerd in toegesmolten buizen.

Wij wilden de vergisting tot stand brengen met een Colistam
No. 4, een Paratyphus B.-stam No. 16 en een Enteritidisstam
No. 19 en zetten de volgende proeven in: peptonwater van 1 %
met 2 % aethyleenoxyde, peptonwater van 1 % met 2 % aethy-
leenoxyde en 2 % krijt, (daarbij telkens een niet geënt buisje voe-
gende), en uitsluitend peptonwater van 1 %, en peptonwater van
1 % plus 2 % krijt; alles werd onder anaërobe omstandigheden
uitgevoerd.

Een gedeelte van de buizen, die aan het boveneinde tot een
sterke vernauwing waren uitgetrokken, werd van de gewenschte
hoeveelheid krijt voorzien, vervolgens brachten we in alle buizen
dezelfde hoeveelheid peptonwater, en steriliseerden dezen.

De buizen werden daarna met een halve cm® van een bacterie-
emulsie van de bovengenoemde bacterie-stammen, geënt.

Onder vacuum kookten we dan bij 40° de aanwezige lucht uit,
en vervingen deze door stikstof, waarna we de buizen in een koud-
makend mengsel van —12° zetten.

Voor het toevoegen van het aethyleenoxyde bedienden we ons
van de volgende techniek: het aethyleenoxyde werd eerst op
steriele wijze in een ampul met langen hals gedestilleerd; vervol-
gens trokken we dezen hals tot een dunne capillair uit en vulden,
door deze capillair in de nauwe lange halzen van kleine ampul-
letjes te steken, deze laatsten met de gewenschte hoeveelheid
aethyleenoxyde. Om de halzen van de kleine ampulletjes, bevon-
den zich aan beide uiteinden, door watten-proppen afgesloten
buisjes (de ampulletjes waren, vóór het vullen, met buisje en al
gesteriliseerd); het, buiten de watten-prop uitstekende gedeelte
van den hals werd, na vulling, dicht gesmolten, zoodat de ampul-
letjes tot nader gebruik bewaard konden blijven. Het behoeft geen
betoog, dat tijdens het vullen, de ampulletjes in een koudmakend

We verwijderden het omhullende buisje en braken het halsje
zoodanig af, dat we een steriel gedeelte over hielden, staken dit in
de vernauwing van de voorbereide vergistingsbuizen, en dreven
vervolgens het aethyleenoxyde — door met de hand het ampul-
letje te verwarmen — in het peptonwater, waarna de buis dade-
lijk bij de vernauwing, werd dicht gesmolten.

Na zeven dagen broeden bij 37° openden we de buizen, entten
direct een oogje van den inhoud op bouillon, om te kunnen con-
stateeren of de bacteriën nog in leven waren en onderzochten den

Na opening konden we slechts bij één buis nog een weinig over-
druk waarnemen.

	6,8
	6,9
	7
	7,3
	7,6
	7,6

Opmerkelijk is de sterke toename van de pH na toevoeging
van aethyleenoxyde, w^elk toename we eveneens opmerkten bij de
buizen, waarin geen bacteriën gebracht waren.

Daarom besloten we het gedrag van aethyleenoxyde t.o.v. pep-
tonwater, nog nader te onderzoeken; hiervoor werden de volgende
proeven ingezet. Dezelfde methodiek werd gevolgd.

De zeer sterke toename van de pH van peptonwater, waaraan
aethyleenoxyde is toegevoegd, wijst op het ontstaan van een ver-
binding van het aethyleenoxyde met bestanddeelen van het pepton.

Wanneer er dus bij de vergisting van glycol eveneens aethyleen-
oxyde als tusschenproduct zou ontstaan, zou dit ook aan de pep-
ton gebonden worden, waardoor de pH zou moeten stijgen; dit
namen we echter bij de vergisting van glycol, niet waar.

De bacteriën bleken de toevoeging van aethyleenoxyde niet te
overleven. Dit zou eveneens op een verbinding tusschen het bac-
terie-eiwit en aethyleenoxyde wijzen.

Het lijkt ons derhalve niet waarschijnlijk, dat, bij de vergisting
van glycol, aethyleenoxyde als tusschenproduct optreedt.

Zooals nog nader in hoofdstuk IX zal worden besproken, be-
trokken we ook dioxaan in dit onderzoek om te kunnen vaststel-
len, of dit als tusschenproduct bij de vergisting van glycol zou
optreden.

Het dioxaan is een kleurlooze vloeistof met kpt. van ± 111°,
doch zeer vluchtig; door deze eigenschappen waren we genood-
zaakt, de vergisting in een dicht gesmolten vat te laten verloopen.

De qualitatieve vergisting ondernamen we op gelijke wijze als
reeds, onder paragraaf i. van dit hoofdstuk, beschreven werd voor
aethyleenoxyde.

De toevoeging van de 2 % dioxaan ging echter veel eenvou-
diger. Na het dioxaan steriel gedestilleerd te hebben, pipetteer-
den wij de gewenschte hoeveelheid met behulp van een — in de
vernauwing van de kuituur-buis passends - - steriele pipet in den

Na 7 dagen broeden, onderzochten /e de vloeistof op levende
bacteriën, acetaldehyde en pH; de resultaten zijn in onderstaande
tabel vereenigd.

Het dioxaan had dus geen giftige uitwerking op deze organis-
men; het werd er door ontleed onder vorming van zuur en in som-
mige gevallen van acetaldehyde. Deze resultaten wilden we nog
eens nader toetsen aan een quantitatieve vergisting.

De vergisting voerden we in dezelfde apparatuur, welke we ook
voor de glycol vergistingen gebruikten, nl. een Erlenmeyer met
aangesmolten rondbodem, onder anaërobe omstandigheden, uit.

Als voedingsbodem diende: 200 cm® peptonwater van 1 %,
Yi % keukenzout en 2 % krijt; hieraan voegden we, na de sterili-
satie, 2 % steriel dioxaan toe.

We voorzagen de eerste buis van het opvang-toestelletje met
een verzadigde sublimaat-oplossing; door het ontstaan van een
neerslag in deze buis konden we zoodoende controleeren of er
dioxaan uit het gistingsvat ontweek.

De tweede en derde buis werden met bisulfiet-oplossing ge-
vuld, om het, eventueel ontwijkende acetaldehyde, vast te leggen.

Na 12 dagen broeden bij 37° bepaalden we de quanta gevormd
acetaldehyde en azijnzuur.

Het vaststellen der hoeveelheden van het niet ontlede dioxaan
en de gevormde alkohol, werd, wegens de groote moeilijkheden
welke deze bepalingen thans zouden opleveren, achterwege ge-
laten.

Wij lieten het dioxaan door de Coli-stam No. 4 en door de
Enteritidis Gartner-stam No. 19, vergisten en vonden voor beide
stammen slechts sporen acetaldehyde en respectievelijk 0,1141
en 0,0852 g uit dioxaan gevormd, azijnzuur.

Het blijkt dus wel, dat dioxaan door deze organismen ontleed
wordt, hoewel de. vergistingssnelheid achterblijft bij die van
glycol.

De mogelijkheid van dioxaan als tusschenproduct bij de ver-
gisting van glycol, werd door de resultaten van deze proeven in
ieder geval niet uitgesloten, doch zou alleen bevestigd kunnen
worden door het vinden van dioxaan in het vergistingssubstraat.

Daartoe zetten wij drie kolven, ieder met 1 liter van den ste-
rielen voedingsbodem, bestaande uit: 1 % pepton (Witte), Yi %
keukenzout en 2 % glycol, in; de kolven waren, evenals bij de
voorgaande proeven, warm met stikstof verzadigd, en gesloten

met een stop, welke van doorboringen, waarin de gebruikelijke
buizen staken, voorzien was. De afvoer was aangesloten aan het
reeds eerder beschreven, met bisulfiet oplossing gevulde, appa-
raat voor het opvangen van eventueel ontwijkend acetaldehyde
en tevens om het geheel van de lucht af te sluiten. Een van de
kolven lieten wij steriel, de twee andere werden respectievelijk
geënt met een suspensie van B. enteritidis Gärtner No. 19 en B.
coli No. 4. Na een verblijf van tien dagen in de broedkamer bij
37°, goten wij de inhouden der kolven in perforatoren, en extra-
heerden, gedurende acht uur, met aether, zooals reeds op blz. 33
beschreven werd. Daar de beide substraten zwak zuur reageer-
den, maakten we ze vervolgens zwak alkalisch, extraheerden nog-
maals gedurende acht uur en onderzochten de extracten, volgens
de op bladz. 34—36 beschreven methode, op dioxaan.
Uit geen dezer kon genoemde verbinding geïsoleerd worden.
De mogelijkheid van het ontstaan van dioxaan gronden wij

Wij namen waar, dat bij sommige vergistingen, na eenigen tijd
een roode verkleuring van het substraat optrad, nadat het phos-
phor-wolfraamzuur-zwavelzuur-mengsel toegevoegd was, tevens
werd de bovenste laag van het pepton-neerslag rood gekleurd, welk
verschijnsel slechts optrad bij de, door indol-vormende-bacteriën
veroorzaakte vergistingen. Deze roode kleur had een andere nuan-
ce, dan die, welke ontstaat bij de indol-reactie volgens Kitasato,
(rnet zwavelzuur en kaliumnitriet-oplossing); bovendien konden
wij in het gistingssubstraat, noch nitriet, met het reagens van
Griess-Romijn, noch nitraat met de reactie volgens Tillmans,

Nitriet-vrij-peptonwater, waaraan eenig indol en dioxaan was
toegevoegd, gaf na eenigen tijd staan met phosph. wolfrz.opl. de-
zelfde roode verkleuring, welke wij na toevoeging van dit reagens
aan het vergistingssubstraat, verkregen, terwijl peptonwater plus
een weinig indol, de rood-kleuring door phosph. wolfrz. niet ver-
toonde.

De vergisting van aetiiyleenglycol werd bestudeerd in de ver-
onderstelling, dat deze eenvoudige verbinding ook een eenvoudig
gistingsschema zou opleveren, waaronder te verstaan is: weinige,
en direct uit glycol af te leiden gistings-producten. Hiervoor wer-
den alleen acetaldehyde, azijnzuur en alkohol gevonden.

Daar het ontstaan dezer producten niet direct uit glycol af te
leiden is, nam Le Fèvre aan, dat aethyleenoxyde hier als tus-
schenproduct zou kunnen optreden; dit ging dan door intra-mole-
culaire omlegging over in acetaldehyde, hetwelk op zijn beurt tot
azijnzuur werd geoxydeerd.

Het ontstaan van aethyleenoxyde baseert hij op het volgende:
glycol laat zich, door verhitten op 500—550° omzetten tot acet-
aldehyde, terwijl ook het aethyleenoxyde bij deze temperatuur
hierin overgaat Ipatiew®®) verkreeg genoemde onzetting bij
250°, door aluminiumoxyde als katalysator te gebruiken.

Hiermede wordt echter nog niet bewezen, dat glycol, bij de
vergisting, onder uittreding van de elementen van het water, in
aethyleenoxyde zou kunnen overgaan.

Deze reactie is, juist door het ontstaan van een niet spannings-
vrijen ring, in het laboratorium tot nu toe niet te verwezenlijken
geweest; immers, onder invloed van wateronttrekkende stoffen®'^),
ontstaat dan acetaldehyde.

Ondanks deze overwegingen hebben wij getracht de mogelijk-
heid van het optreden van aethyleenoxyde als tusschenproduct,
experimenteel — door het te laten vergisten — te onderzoeken.
Hierbij bleek ons, dat de pH van een pepton-oplossing, door de

toevoeging van aethyleenoxyde, sterk toenam en de bacteriën in
deze oplossing niet in leven bleven ¹).

De verhooging van de pH zouden we kunnen verklaren, door-
dat het aethyleenoxyde zich verbindt met de aminogroepen der
bestanddeelen van het pepton en er zich aethylol-aminozuren vor-
men, evenals dit het geval is bij de reactie van aethyleenoxyde op
ammoniak in water (o.a. Knorr) waardoor dan wellicht, meer
alkalisch reageerende verbindingen ontstaan; wij denken hierbij
aan de mogelijkheid van lacton-vorming der carboxylgroep met

Het is niet onwaarschijnlijk, dat het aethyleenoxyde zich op
dezelfde wijze met het bacterie-eiwit verbindt, waardoor dit laat-
ste verandert en het organisme te niet gaat; dit zou de mogelijke
verklaring kunnen geven voor het afsterven der bacteriën.

Op deze gronden meenen wij de vorming van aethyleenoxyde,
als tusschenproduct der glycol-vergisting, te moeten afwijzen.

De mogelijkheid werd onderzocht, of een andere verbinding,
die ontstaat door het uittreden van de elementen van water uit
twee moleculen glycol, nl. het diaethyleen-dioxyde of 1.4-
dioxaan, de rol van tusschenproduct bij deze vergisting zou kun-
nen spelen.

Vooral de gemakkelijkheid, waarmede dioxaan, door uittreden
van de elementen van water uit twee moleculen glycol, ont-
staatmaakt de vorming van deze verbinding onder den
invloed van bacteriën, niet onmogelijk.

Wij stellen ons het chemisme der glycol-vergisting aldus voor:
twee moleculen glycol gaan over in dioxaan; dit wordt, met behulp
van luchtzuurstof en/of door een hydro-oxydatiereactie, tot mono-
0x0-1.4-dioxaan, (een glycolzure-aethyleenester of inwendige

Deze stof is door Bischoff en Walden 8») verkregen door des-
tilleeren van de verbinding, die ontstaat als men mononatrium-
glycol en monochloorazijnester op elkaar laat inwerken.

le. Door reductie met de bij de hydro-oxydatie verkregen vier
atomen waterstof, ontleding tot 1 mol. azijnzuur en 1 mol. alkohol.

2e. Uit het lacton wordt, door hydrolyse, gevolgd door reduc-
tie, één molecule glycol teruggevormd en ontstaat tevens één mole-
cule azijnzuur; hiervoor zijn dan slechts twee atomen waterstof
noodig.

Bij de anaërobe gistingen, waar dus de oxydatie tot lacton,
met behulp van een hydro-oxydatie-reactie moet verloopen, zal

er dientengevolge waterstof overblijven; evenals dit het geval zou
zijn, wanneer door dezelfde oxydatie, uit acetaldehyde, azijnzuur
zou ontstaan.

3e. Kan het ontstaan van acetaldehyde, door atoom-verschui-
ving in het molecule van het dioxaan verklaard worden:

Behalve op de reeds genoemde gronden zouden wij voor de
veronderstelling, dat dioxaan als tusschenproduct bij de vergis-
ting van glycol optreedt, nog willen aanvoeren: het ontstaan van
pyronderivaten in de natuur en de vorming van heterocyclische
stikstof-verbindingen door bacteriën, b.v. het chlororaphine
door Bacillus chlororaphis.

Den voornaamsten steun vinden wij echter, in de, zoowel quali-
tatief als quantitatief, onderzochte vergisting van dioxaan, die
beschreven werd op blz. 105—107. De quantitatieve vergisting le-
verde echter niet dezelfde hoeveelheden azijnzuur op welke voor de
overeenkomstige bacteriën, bij de vergisting van glycol gevonden
werden.

Wij trachtten volgens dezelfde ¹) methode, welke wij toepasten
om uit een synthetisch substraat, de kleine hoeveelheid toegevoegd
dioxaan, te isoleeren, dit eveneens uit eenige vergistingssubstraten
af te zonderen, doch het is ons tot nu toe niet gelukt, in deze sub-
straten dioxaan aan te toonen.

Wel viel het ons op, dat bij eenige vergistingen, na toevoegen
van phosphor-wolfraam-zwavelzuur — waarmede wij het pepton

verkregen wij een roode verkleuring na vermenging met phosphor-
wolfraam-zwavelzuur, van een vloeistof, welke dezelfde samen-
stelling had, als de voor de vergistingen gebruikte steriele voe-

dingsbodem, waaraan bovendien een weinig dioxaan was toege-
voegd. Zonder dioxaan kleurde de vloeistof zich niet met boven-
genoemd reagens.

Het zou te gewaagd zijn, hieruit tot de aanwezigheid van
dioxaan in de vergistingssubstraten te besluiten; de mogelijkheid,
dat de roode verkleuring door dioxaan veroorzaakt wordt is ech-
ter op grond hiervan, niet uit te sluiten.

Bezien wij de veronderstelling van het optreden van een tus-
schenproduct, dat eerst geoxydeerd wordt, alvorens het in azijn-
zuur en alkohol overgaat, in verband met de door ons verkregen
resultaten en nemen wij aan, dat dit msschenproduct dioxaan zou
zijn, dan kunnen we de grootere hoeveelheid azijnzuur ten op-
zichte van alkohol bij de aërobe vergisting, op de volgende wijze
verklaren: het dioxaan wordt ten deele met behulp der luchtzuur-
stof, ten deele door een hydro-oxydatie-reactie, geoxydeerd. Nu
zal ér niet voldoende waterstof aanwezig zijn voor de totale reduc-
tie van het mono-oxo-dioxaan, waardoor aequimoleculaire hoe-
veelheden azijnzuur en alkohol gevormd zouden worden; er vindt
nu tegelijkertijd een verzeeping van een gedeelte van het lacton
plaats, waardoor glycol teruggevormd wordt en slechts azijnzuur
ontstaat. Door deze beide oxydatie-reactie's wordt al het dioxaan,
of bijna al het dioxaan in zijn oxo-verbinding omgezet en blijft
er weinig over voor het, door intra-moleculaire omzetting, ont-
stane acetaldehyde: er kan dus weinig acetaldehyde gevormd wor-
den. Bij de anaërobe vergisting, kan slechts de hydro-oxydatie-
reactie optreden, het, bij deze vergisting in overmaat gevormde
azijnzuur, kan wederom ontstaan door een gedeeltelijke verzee-
ping van het lacton, maar dan blijven er nog twee atomen water-
stof onverbruikt, die aan het pepton geadsorbeerd worden. Bij
deze vergisting kan er niet-geoxydeerd dioxaan overblijven, dat

De grootere hoeveelheid acetaldehyde, die ontstaat bij aanwe-
zigheid van sulfiet, volgt uit de verschuiving van het evenwicht
mono-oxo-dioxaan — dioxaan, in de richting van het dioxaan,
doordat het hieruit gevormde acetaldehyde aan het sulfiet gebon-
den wordt. De betrekkelijk groote hoeveelheid acetaldehyde, welke
gevonden werd quot;in de substraten der gistingen, die in tegenwoor-

digheid van waterstof verliepen, vindt eveneens in een verschui-
ving van genoemd evenwicht in dezelfde richting zijn verl^laring,
aangezien de hydro-oxydatie-reactie teruggedrongen wordt door
de overmaat waterstof. Het dioxaan wordt nu niet geoxydeerd,
doch ontleedt in acetaldehyde, dat op zijn beurt door de aanwe-
zige waterstof tot allcohol gereduceerd wordt, waardoor tevens de
overmaat alkohol t.o.v. azijnzuur bij deze vergistingen ver-
klaard is.

Wanneer dioxaan als tusschenproduct bij de vergisting van
glycol op zou treden, kan de noodzakelijkheid van het acetalde-
hyde voor de vorming van azijnzuur en aethylalkohol, vervallen.
Het acetaldehyde gaat dan slechts de rol van bijproduct spelen,
dit stemt ook beter overeen met de resultaten, welke in tabel 2
vereenigd zijn. Bij de quantitatieve sulfiet-gistingen werd, be-
halve door de Paratyphi B.-stam 16, geen of stechts zeer weinig
acetaldehyde gevonden, hoewel het ontstaan van azijnzuur en
alkohol er op wezen, dat er wel een ontleding van glycol plaats
plaats had.

Nog opmerkelijker is het als wij de percentages glycol verge-
lijken, welke door B. coli st. 4 bij de volgende anaërobe-gistingen,
in acetaldehyde omgezet werden:

Dan blijkt bij de vergisting in een waterstof-atmosfeer zelfs
meer acetaldehyde gevormd te zijn, dan bij de sulfiet-gisting ont-
staan is.

Uit deze resultaten meenen wij te mogen afleiden, dat het acet-
aldehyde niet als tusschenproduct bij de vergisting van glycol op-
treedt, doch dat het bij een nevenreactie gevormd wordt.

Deze feiten zijn zeer goed te verklaren, wanneer dioxaan als
tusschenproduct optreedt; door de aanwezigheid van waterstof
wordt de oxydatie van dit laatste tot mono-oxo-verbinding, be-

Wij vonden evenals Le Fèvre en anderen, dat het glycol moei-
lijk vergistbaar is. Ten deele kan dit toegeschreven worden aan
een geringe giftige werking van het glycol, waardoor de groei
van de bacteriën verminderd wordt, doch zeker is het, dat hier de
waterstof acceptie eveneens een rol speelt¹), zooals reeds door
Braak bij de glycerine-vergisting onderzocht werd.

De moeilijke vergistbaarheid zou veroorzaakt kunnen worden,
doordat de som der vrije energieën van de verschillende reactie's
gering is; in dit geval zou de energie, die vrij komt bij de adsorp-
tie van waterstof aan het pepton, een rol kunnen gaan spelen.
Naar mate het pepton meer met waterstof verzadigd raakt komt
er minder beschikbaar, waardoor de bacteriën geen voldoende
energie meer kunnen ontleenen aan de reactie's om nieuwe glycol
om te zetten; hierdoor komt dan de vergisting tot staan.

Dit zou tevens een verklaring kunnen geven, waarom een ver-
gisting van glycol in een milieu zonder pepton, waar slechts anor-
ganische voedingszouten aanwezig zijn, niet tot stand komt. Tot
op heden is er echter van de thermodynamica dezer reactie's nog
tè weinig bekend, dan dat er met zekerheid een conclusie uit ge-
trokken kan worden.

Bij de vergisting van glycol door de bacteriën der Coli-typhus-
groep, ontstonden steeds azijnzuur en alkohol; acetaldehyde werd
alleen bij de anaërobe vergistingen gevonden; de organismen der
Dysenterie-groep vormden onder deze omstandigheden steeds
sporen van dit aldehyde. Door het toepassen van de zgn. sulfiet-
gisting konden we voor 46 stammen de acetaldehyde-productie
vaststellen.

Voor een Coli-, Typhus-, Paratyphus A-, Paratyphus B-,
Enteritidis Gärtner- en een Dysenterie Flexnerstam, werd een
quantitatief onderzoek ingesteld naar deze vergistingsproducten.

Onderzocht werd, in hoeverre waterstof- en peptontoevoeging
invloed op de vergisting uitoefenden; dit in verband met de accep-
tie van waterstof door het milieu.

Er werd geconstateerd, dat peptontoevoeging een vergrooting,
en waterstoftoevoeging een vermindering van de vergiste hoe-
veelheid glycol te weeg bracht. De adsorptie van waterstof aan
opgeloste pepton konden wij bewijzen.

Tevens meenden wij, uit het al dan niet aanwezig zijn van acet-
aldehyde in de verschillende vergistingsubstraten, op te mogen
maken, dat het acetaldehyde niet als tusschenproduct bij de ver-
gisting van aethyleenglycol optreedt, doch de vorming door een
nevenreactie plaats vindt.

Wij namen aan, dat er een tusschenproduct ontstaat, hetwelk
eenerzijds geoxydeerd, anderzijds door intra-moleculaire atoom-
verschuiving, tot acetaldehyde omgezet wordt. Uit de geoxydeer-
de verbinding zouden dan azijnzuur en alkohol ontstaan. Voor
dit tusschenproduct maakten wij het dioxaan aannemelijk, terwijl
wij het optreden van aethyleenoxyde in dit verband moesten ver-
werpen.

6nbsp;Neubauer, Dtsch. Arch. klin. med. 95, 120 (1909). Zs. phy-
siol. Chem. 70, 326 (1911).

9nbsp;Neuberg en Hildesheimer, Bio. Zs. 31, 170 (1911).
Neuberg en Hildesheimer, Bio. Zs. 58, 158 (1913).

17nbsp;C. Neuberg en F. F. Nord, Bio. Zs. 96, 133 (1919); C. Neu-
berg en F. F. Nord en E. Wolff, Bio. Zs. 112, 144 (1920).

18nbsp;W. C. de Graaff, De gemengdzure-gisting Ned. Tsch. Hyg.
Micrbiol. en Serologie 1, 43—70 (1926).

19nbsp;M. A. Scheffer, De suikervergisting door bacteriën der Coli-
groep. Diss. Delft (1928).

20nbsp;A. J. Kluyver, The chemical activities of microorganisms;
Univ. of London Press. Ldt. (1931).

25nbsp;A. Harden en Mrs. D. Norris, Proc. Roy. Soc. Ser. B. 84,
492—499 (1912).

43nbsp;A. Würtz, Ann. ch. (3) 69, 323 (1863); J. 485 (1863); zie
eveneens H. Reinboldt und R. Boy, J. prakt. Ch. (2) 129, 273
(1931).

49nbsp;Theodore E. Friedemann and Arthur 1. Kendall, The deter-
mination of Lactic acid, J. Biol. chem. Vol 82, 24 (1929).

54nbsp;Ripper, Monatsh. f. Chem. 22, 1079 (1900); zie eveneens
Lange-Dijk, Ree. W, 219 (1927).

55nbsp;M. A. Scheffer, Diss. Delft (1928), 77; Dr. A. Tasman en
Dr. A. W. Pot Antonie van Leeuwenhoek, Ned. tschr. voor
Hyg. Microb. en Serologie, Deel 2, 14 (1934).

58nbsp;Gorr en Wagnet, Bioch. Zs. 161, 488 (1925); H. R. Braak,
Diss. Delft (1928), 72.

60nbsp;M. A. Seidenfeld en P. J. Harzlik, C. (1932) II, 242; J. Phar-
macol. exp. Therapeutics kk, 109—121 (1932).

61nbsp;Wolf Kritchevsky, C. (1932) I, 95; C. (1931) II, 2032; J.
Pharmacol, exp. Therapeutics M, 355—372 (1931).

69nbsp;Bischoff en Walden, B. 27, 2940 (1894); Bischoff, B. 40,
2803 (1907); Henry, Bull, de l'Acad. royale de Belgique M2,
558 (1902).

70nbsp;Kögl en Postowsky, A. MO, 280—297 (1930); Kögl, Tönis
en Groenewegen, A. M?, 265—289 (1932).

De door Kritschewski en Panomarewa als ware pleomorphe
individuen aangeduide vormen voor B. paratyphi B, moeten als

Zbl. f. Bakteriologie, Parasitenkunde und Infektionskrankh. Bd.
91, 485 (1934—'35).

De aan gedestilleerd water toegeschreven bactericide werking
kan door sporen van colloidale verontreinigingen veroorzaakt
worden.

Prica, M., Zbl. f. Bakteriologie, Parasitenkunde und Infekt.-
krankh. Bd. 91, 486 (1934—'35).

Bij het vergelijken van de, door bacteriën geproduceerde hoe-
veelheden gas, moet met de eventueele verandering in de, tot de
vergistingen toetredende, lichtstralen rekening worden gehouden.

Guerrini, G., Boll, della Sez. Ital. Soc. Intern, di JVlicrobiol. Vol.
6, 124—126 (1934).

Elvehjem and Koehn, j. Biol. Chem. 108, 709 (1935).
Chick, Copping, Edgar, Bioch. J. 29, 722 (1935).
üyorgy,nbsp;„ „ 29, 741 „

Voor talrijke proeven in het onderzoek van Katsurai, betref-
fende den invloed van temperaturen boven de 100° op eenige an-
organische colloiden, is het, voor hem blijkbaar onverwachte
resultaat, vooruit te voorspellen.

R Dietzel u. R. Krug, B. 58, 1307 (1925) II.
R Eder u. Kutter, Helv. Chim. Act. IX, 355, 557 (1926).
M. Gehrke u. H. H. Willrath, Zschrt. f. Physk. Chem. Bd. 142,
301 (1929).

■ tsJ • •■• :

tt - J
tt - J	,r

verdwenen stof	gevormde producten \| berekend als C. in mg
229 mg. glycol; berekend als C. 88,6 mg	acetaldehyde 89 mg azijnzuur 87 „	48,5 mg 34,8 „
! totaal 176 mg		83,3 mg of 94 %
222 mg. glycol; berekend als C. 86 mg	acetaldehyde 83 mg azijnzuur 89 „	45,2 mg 35,6 „
	totaal 162 mg	80,8 mg of 93,9 %

31	B. dys. Sh.-Kr.	st.	48 B.
32	B. „ Sh.	st.	149
33	B. „ Sh.	St.	151
34	B. „ Deli Shiga	St.	22
35	B- ï) jgt; j)	St.	Schneider-Krall
36	B- ?gt;	St.	Podhaga

37	B. dvs. Flexner		St.		Ctr. 1.
38	B.		St.	V. Oxford	Ph. 1.
39	B.		St.	W. Oxford 25/10	gt;y
40	B.		St.	„ 1138 Borculo
41	B.	yy	St.	790 '26 Sleen	»
42	B.		St.	VI. 623 Bergen op Zoom
43	B.		St.	VI. 1474 Staphorst	»
44	B.		St.	VI. Nieuweroord 1934	»
45	B.	yy yy	St.	Z. Oxford 25/10	jf
	Dysenterie Sonne-groep
46	B. dvs. Sonne		St.	2254 Opeinde	»
47	B.		St.	2505 Woudrichem
48	B.	yy yy	St.	588 Zuidlaren	»
49	B.		St.	1291 Bussum
50	B.		St.	2337 Oudewater
51	B.		St.	2282 Hilversum	gt;f
52	B.	yy yy	St.	631 Goedereede	jy

Sublimaat	Witte krist, verkregen bij een extractie van water zon- der dioxaan.	Witte krist, verkregen bij een extractie van water met glycol.	Witte krist, verkregen bij een extractie van water en dioxaan.
Het neerslag dioxaan afged	l werd met loog b estilleerd en met b	ehandeld en event room aangetoond.	ueel aanwezig

le. 250		1,56	1,51	cm®
2e. „	n	1,42	1,1
3e. „	ïj	1,2	0,9	,,
4e. „	ïï	0,5	0,8
5e. „	ïj	0,4	0,6	,,
totaal		5,08	4,91	cm^
gem. per	fractie	1,02	0,98

	Typhus-groep
5	B. typhi	st.
6	B. „	st.
7	B.	st.
8	B. „	st.
9	B. „	st.
10	B. „	st.
10a B. „ Schaap
	Para-typhus A-groep
11	B. para-typhi A.	st.
12	B. „ „ A.	st.
13	B. „ „ A.	st.
14	B. „ „ A.	st.
15	B. „ „ A.	st.
	Para-typhus B-groep
16	B. para-typhi B.	st.
17	B. „ „ B.	st.
18	B. „ „ B.	st.
19	B. enteritidis Gärtner	st.
	Para-typhus C-groep
20	B. para-typhi C.	st.
21	B. „ „ C.	st.
22	B. „ „ C.	st.

	Aërobe gisting		Anaërobe gisting
	zonder \	met	zonder	met
	sulfiet	sulfiet !	sulfiet	sulfiet
No. Coli-groep
1	—	sp	sp	w
2	—.		sp	zw
3	—	sp	w	sp
4	—	_	sp !	zw
Typhus-groep			j
5	—-	—■	sp	zw
6	—	sp	zw
7	—		—	sp
8	—	0	sp	0
9	—•	sp	sp	w
10	—	sp	w
10a	1			sp
Paratyphus A-
groep
11	—	—	sp	sp
12	—•	—	sp	sp
13	—	—	—■	0
14	—	—	—	sp
15	—	-		0
Paratyphus B-
groep
16	sp	V	zw	zv
17			sp
18	sp	w	J-	v
19	sp			zv

met	zonder	met
sulfiet	1 sulfiet	sulfiet
w	zw	zw
w	sp	zw
zw	w
w	1 zw
zw	sp	—
sp	sp	sp
sp	1 zw	sp
	1 w	V
	zw	V

le. 250 cm®	1,8	1,19 cm®
2e. „ „	1,6	0,94 „
3C. fy	0,6	0,6 „
4e. „	0,5	0,6 „
totaal	3,5	3,33 cm®
gem. per fractie	0,88	0,83 „

le. 250	cm®	9,51	10,05 cm®
2e. „		6,0	6,2 „
3e. „	ïj	4,98	4,5 „
4e. „		4,9	3,8 „
5e. „		3,43	3,5 ,,
6e. „	ï,	2,7	2,8 „
7e. „		1,2	1,45 „
8e. „		0,6	0,62 „
9e. „		0,6	0,5 „
totaal		33,92	33,42 cm®

Producten	Grammen	% ; % der toegev. der vergiste glycol 1 glycol		Gram- moleculen ^	Berekend als gram atm. C.
T'oegevoegde glycol ^nvergiste „ Vergiste	3,5092 i i 3,4217 97,51 , 0,0875 ' 2,49 \|			0,00141	0,00282
^cetaldehyde ^zijnzuur Alkohol	sp. 1 0,0422 ! 0,0332 1		49,82 51,05 1	0,00070 : 0,00072	0,00140 0,00144
^otaal	1 1 100,87 i 0,00142 1 0,00284
quot;Ï^ABEL 10. typhi No. 5.
^oegevoegde glycol ^nvergiste „ ^^rgiste	3,7136 3,5379 95,27 0,1757 ; 4,73			1 0,0028 j 0,0056
Jcetaldehyde ^^ijnzuur Alkohol	sp. 0,1191 0,0304		70,08 23,31	0,00200 0,00066	0,00400 0,00132
l2.taal			93,39 1 0,00266		1 0,00532
quot;^ABEL 11. Para typhi A. No. 1	.1.
Y ^ --- fs'^egevoegde glycol ^Vergiste	3,2851 i i * 3,2045 : 97,55 \| 0,0806 1 2,45 I ! 0,00127				0,00254
^etaldehyde Jf'jnzuur Alkohol	sp. 0,0632 0,0060	1 j i 81,09 i 0,00105 1 ' 10,05 i 0,00013			0,00210 0,00026
			91,14	0,00118 1 0,00^ JO

80 TABEL 15. No. 4. ^ Aërobe vergistiiig plus krijt.						81 d. Anaërobe vergisting van glycol in peptonwater, waaraan krijt was toegevoegd. De voedingsbodem had dezelfde samenstelling als onder § c. beschreven. De lucht werd door stikstof vervangen, zooals onder § b. be- sproken is; na bekoeling entten we met 5—10 cm® bacterie- suspensie, bebroedden gedurende 10 dagen en analyseerden den inhoud van het toestel. De Voges-Proskauer reactie was negatief. TABEL 18. B. coli No. 4. Anaërobe vergisting plus krijt.
Producten	i % Grammen der toegev I glycol		% der vergiste j glycol	Gram- moleculen	Berekend als gram atm. C.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	4,679 2,7597 1,9193	1 ! 58,98 I 41,02 i		0,03093	0,06186
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	1,1015 ï 59,32 0,5093 1 ; 35,76			0,01835 ! 0,01106	0,03670 0,02212
Totaal	! 95,08 1 0,02941 0.05882
TABEL 16. B. paratyphi B. 16.
						Producten	1 Grammen der toegev. glycol		% der vergiste glycol	Gram- moleculen	Berekend als gram atm. C,
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	2,7138 2,0433 0,6705	75,29 24,71		0,01081	0,02162
						Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	3,9482 2,6895 1,2587	! 68,12 31,88	0,02029		0,04058
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol Totaal	0,0085 0,3826 0,2052	1 1,78 1 58,97 41,21 1 ni nfi		0,00019 0,00637 0,00445	0,00038 0,01274 0,00890
						Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	sp. 0,6217 0,4395		51,05 47,05	! 0,01036 0,00954	0,02072 0,01908
				u,uiiui t UjUziyz		lotaal			98,10	0,01990	0,03980
TABEL 17. B. dysenterie Flexner. No. 37.						TABEL 19. B- paratyphi A. No. 11.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	4,2245 j 3,5032 0,7213	82,93 17,07		0,01163	Toegevoegde glycol Onvergiste „ 0,02326 Vergiste		3,9482 ! 2,9800 1 75,48 0,9681 1 24,52			0,01560	0,03120
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,4339 1 0,1676 i 1		62,04 31,30	0,00721 0,00364	--—' ( ------ i Acetaldehyde 0,01442 ! Azijnzuur 0,00728 ! Alkohol		sp. i 0,4994 i 1 53,32 0,3141 j i 43,72			0,00832 0,00682	0,01664 0,01364
1 otaal			93,34 j 0,01085 0,02170 'lotaal				; ! 97,04			0,01514	0,03028

	in g	in %
Koolzuur	_	—
Mierenzuur	—	—
Azijnzuur	2,22	39,30
Melkzuur	1,50	22,13
Barnsteenzuur	—	—
Alkohol	0,020
Residu	6,35
Totaal	10,09	61,43

	„ No. 4		—
	„ » 16		—
-t-	„ „ 19		—
	„ krijt
	» »	No. 4	—■
	» „	„ 16	—
	„ »	„ 19	—

12 cm® peptw. 4- aethyl.ox.	na 7 dagen	staan	bij 35°	12
12 „ „ zonder	7 rj '	!gt;	„ 35°	6,8
12 „ water -f	„ 7 „	y,	„ 35°	6,7
peptw. vóór sterilisatie zonder		ï)	„ 35°	6,8
nä	ÏJ	ï?	„ 35°	6,8
water -j- aethl.ox.	JJ	gt;gt;	„ 35°	5,4
zonder „	J)	)ï	„ 35°	5,3
gesterilis. „	»	jf	„ 35°	6

1	HCO
COH	1
11	CO
CH2	1
	CH:
2.	3.

Producten	Grammen	% der toegev. glycol	% der vergiste glycol	Gram- moleculen	Berekend als .i gram atm.	Tabel 6. paratyphi b. no. 16.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	3,041 1,8521 1,1889	60,9 39,1		0,01916	0,03832	quot;toegevoegde glycol Onvergiste Vergiste	3,1177 2,7008 86,62 0,4169 13,37		0,00671 0,01342
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,0040 0,6113 0,3821	1	0,47 53,15 43,30	0,00009 0,01020 0,00830	0,00018 0,02040 0,01660	Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,0062 0,2542 0,1012	2,10 63,02 32,71	0,00014 0,00424 0,00220	0,00028 0,00848 0,00440
Totaal			96,92	0,01859 1 0,03718		lotaal		97,83	0,00658 j 0,0131 b
1 tabel 4. b. typhi No. 5.						t'abel 7. enteritidis Gärtner. No. 19.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	3,7846 3,2295 0,5551	85,33 14,64	! i	1 0,00895	0,01790	! J'^oegevoegde glycol ^nvergiste ^giste	4,2110 ! 3,7230 i 88,41 0,4880 1 11,59		0,00787	1 0,01574
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol Totaal	0,0053 0,4397 0,0437	i	1,35 ; 0,00012 ! 81,88 1 0,00733 10,60 0,00095 93,83 1 0,0084		0,00024 0,01466 0,00190 ! 0,0168^	^cetaldehyde ^fijnzuur Alkohol I^l^al	sp. 0,4018 0,0484	85,11 13,36 1 98,47	0,00669 0,00105 0,00774	0,01338 0,00210 0,01548

Producten	Grammen	% der toegev. glycol	% der vergiste glycol	Gram- moleculen	Berekend als gram atm.	Tabel 6. ö. paratyphi B. no. 16.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	3,041 1,8521 1,1889	60,9 39,1		0,01916	0,03832	T'oegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste	3,1177 2,7008 0,4169 ;	86,62 13,37		j 0,00671 :	0,01342
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,0040 0,6113 0,3821		0,47 53,15 43,30	0,00009 0,01020 0,00830	0,00018 0,02040 0,01660	Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,0062 0,2542 0,1012		2,10 i 63,02 32,71	0,00014 0,00424 0,00220	0,00028 0,00848 0,00440
Totaal			96,92	0,01859	0,03718	lotaal			97,83	0,00658	0,01316
TABEL 4. b. typhi No. 5.						quot;•quot;abel 7. enteritidis Gartner. No. 19.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	3,7846 3,2295 0,5551	85,33 14,64		0,00895	0,01790	Jï'oegevoegde glycol ^nvergiste Vergiste	4,2110 3,7230 0,4880	88,41 j 11,59		0,00787	i 0,01574
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol Totaal	0,0053 0,4397 0,0437	1	' 1,35 81,88 ; 10,60 93,83	i 0,00012 0,00733 0,00095 0,0084	0,00024 0,01466 0,00190 1 0,01680^	^cetaldehyde Azijnzuur Alkohol X^laal	sp. 0,4018 0,0484		85,11 13,36 98,47	0,00669 0,00105 0,00774	0,01338 0,00210 0,01548

Producten	Grammen	% der toegev. glycol	% der vergiste glycol	Gram- moleculen	Berekend als gram atm. C
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	3,7284 3,3076 0,4208	88,71 11,29	1 ) 0,00678		0,01356 0,00086 0,00590 0,00608
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,0191 0,1768 0,1398		i 6,40 43,42 44,77	0,00043 0,00295 0,00304	0,01356 0,00086 0,00590 0,00608
Totaal	1 [ 94,59			0,00642 : 0,01284
TABEL 13. B. enteritidis Gartner. No. 19.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	3,5744 3,2666 0,3078	91,39 8,61		1 0,00496	0,00992
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,0028 0,2220 0,0499 ;		1,28 74,56 21,86	0,00006 0,00370 0,00109	0,00012 0,00740 0,00218
Totaal			97,70	0,00485	0,00970
TABEL 14. B. dysenterie Flexner. No. 37.
Toegevoegde glycol Onvergiste „ Vergiste „	3,1479 3,0426 0,1053	96,65 3,35		0,00170	0,00340
Acetaldehyde Azijnzuur Alkohol	0,0650 0,0253 ; 1		63,81 32,30	0,00108 ^ 0,00055 i	0,00216 0,00110
Totaal			96,11	0,00163 j 0,00326