TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR
IN DE GENEESKUNDE AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT
TE UTRECHT. OP GEZAG VAN DEN RECTOR
MAGNIFICUS DR. C. W. V O L L G R A F F, HOOG-
LEERAAR IN DE FACULTEIT DER LETTEREN EN
WIJSBEGEERTE. VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT TE VERDEDIGEN
TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT
DER GENEESKUNDE OP DINSDAG 19 NOVEMBER
1935 DES NAMIDDAGS TE 4 UUR

Bij de voltooiing van mijn proefschrift dank ik U, Hoogleeraren,
Oud-Hoogleeraren en Docenten der Geneeskundige en Philosophi-
sche Faculteit der Utrechtsche Universiteit voor het van U genoten
onderwijs.

In de eerste plaats ben ik U, Hooggeleerde H ij mans van
den Bergh, Hooggeachte Promotor, grooten dank verschuldigd
voor de jaren, die ik onder Uw leiding heb mogen doorbrengen. Ik
ben U dankbaar voor de steun en belangstelling, die mij het bewer-
ken van dit proefschrift mogelijk hebben gemaakt.

Maar nog meer ben ik U erkentelijk voor datgene, wat ik van U
leeren mocht, zoowel aan het ziekbed als daarbuiten. Het zijn jaren,
die ik mij steeds zal herinneren en die tot de aangenaamste van mijn
studietijd hebben behoord.

Het was zeer leerzaam voor mij onder U. Hooggeleerde d e
Langen te hebben mogen werken. Uw uitgebreide kennis en
aangenamen omgang heb ik ten zeerste bewonderd.

Hooggeleerde Bouman, den korten tijd, dien ik in Uw kliniek
werkzaam was, behoud ik in aangename en dankbare herinnering.

U, zeer ervaren Brester en zeergeleerde Hulst, dank ik
voor de voortreffelijke wijze, waarop ge mij steeds met raad en daad
gesteund hebt.

Zeergeleerde Muller cn zeergeleerde Grotepass dank ik
Voor de uren, die wij samen op het laboratorium doorbrachten. Hun
raad, doch niet minder hun bemoediging, waren mij bij mijn werk
onontbeerlijk.

Zeergeleerde van der Hoeden, bijU ben ik nooit tever-
geefs om hulp komen vragen. Op de U eigen aangename wijze hebt
9e mij die steeds verschaft.

Waarde Schouten, Uw heldere uiteenzettingen van physi-
sche problemen zijn mij van groot nut geweest; aan onze samenwer-
king denk ik met genoegen terug.

In het bijzonder dank ik U. mijnen mede-assistenten van nu, maar
tentijd, met andere ontstonden zdke in dez^ i-en-nbsp;^^^^^^

Het aantoonen van bilirubine in bloed van normale personen is nog
niet zoo heel lang met zekerheid mogelijk. Reeds verscheidene schrij-
vers deelden mede, dat hun dit gelukt was (Aucher, Popper,
Lehndorfquot;)). Met eenige waarschijnlijkheid kon het pas door
G i 1 b e r t beweerd worden. Deze gaf een methode aan om biliru-
bine ook in kleine concentraties aan te toonen.

Daar deze methode echter tegelijkertijd een reactie is op luteine,
kan ook van G i 1 b e r t niet gezegd worden, dat hij in alle gevallen
het bilirubine heeft aangetoond.

Het belang van het werk van dezen schrijver en zijn leerlingen
moet echter hoog aangeslagen worden, het heeft ongetwijfeld de
grondslagen gelegd voor het verder onderzoek op dit gebied.

In 1913 deelde Hij mans van den Bergh mede, dat het
diazoreagens van Ehrlich geschikt is om bilirubine in den vorm
van een azokleurstof aan te toonen

Reeds Fr. Pröscherquot;®) had de diazoreactie bestudeerd en
het azobilirubine in zuiveren toestand bereid. In zuur milieu is deze
stof fraai blauw, in neutrale omgeving rood en na toevoeging van.
alkali wordt ze groen. Pröscher stelde vast, dat de reactie slechts
door bilirubine en niet door biliverdine of andere galpigmenten ge-
geven wordt.

Inderdaad is deze reactie, met enkele beperkingen, specifiek voor
bilirubine en aangezien de schrijver positieve reacties verkreeg bij
normale personen kan gezegd worden, dat vanaf dat jaar het bestaan
van een physiologische bilirubinaemie is bewezen. Bovendien ge-
lukte het hem uit het serum van normale personen bilirubine in kris-
tallijnen vorm te isoleeren quot;).

Sindsdien is men er wel algemeen van overtuigd geraakt, dat het
serum van den normalen mensch bilirubine bevat. Onder de latere
onderzoekers vermeldt slechts de M i c h e 1 i dat hij niet steeds

De hoeveelheden, die opgegeven worden in het serum onder phy-
siologische omstandigheden aanwezig te zijn, loopen eenigszins uit-
een.

De hoeveelheid bilirubine, die in het serum aangetroffen wordt,
drukt men in het algemeen in navolging van H ij mans van den
B e r g h uit in eenheden. Onder 1 eenheid wordt verstaan een con-
centratie aan bilirubine van 1 : 200.000,

Fransche onderzoekers drukken de hoeveelheid bilirubine veelal in
de sterkte der verdunning uit en spreken dus van een bilirubinaemie
van 1 : 20.000 of 1 : 30.000. Beter is het de concentratie aan te geven,
zooals men dat met de meeste andere serumbestanddeelen doet, n.1.
in mg %. 1 Eenheid is dus 0,5 mg %.

H ij mans van den Berghgafop getallen te vinden van
0,3—0,5 Eenheden. Herzfeld en Haemmerli*®) vonden met
de methode van Gilbert hoogere waarden, n.1. 60 mg per L,
hetgeen overeenkomt met 12 E. Chabrol, Charonnat cn
Busser®quot;):3E. Sivo^) vond eveneens hoogere getallen en
meent, dat dit verschil te wijten is aan het feit, dat bij
de diazoreactie in haar oorspronkelijken vorm bilirubine met
het eiwitneerslag verloren zou gaan. Hij gebruikte daarom een ver-
anderde methode, die later nog besproken zal worden. Het is echter
niet aannemelijk, dat het eiwitpraecipitaat een eenigszins belangrijke
bron van fouten is. Zooals wij later zullen zien, is dit slechts het
geval bij direct reageerende sera. De opgaven van de meeste onder-
zoekers komen met die van H ij m a n s van den B e r g h over-
een:

J. Förster en B. Försterquot;«) verkregen bij normale perso-
nen waarden van 0,5 tot 1 E.

Ook wij zagen bij normale personen waarden, die naar beneden
door 0,3 en naar boven door de 1 E begrensd worden. Vermeld moet
echter worden, dat men soms bij personen een belangrijke verhooging
van het bilirubinegehalte van het bloed kan vinden, soms gepaard
gaande met icterus, zonder dat er verder ziekelijke verschijnselen
kunnen worden aangetoond. Vaak worden dergelijke hyperbilirubi-
naemieën bij meerdere familieleden gevonden. Dit verschijnsel is
reeds door G i 1 b e r t 50) beschreven onder den naam van cholémie
simple familiale. Dergelijke afwijkingen komen, indien men er op
let, vrij vacik voor. Bij eenigen van dergelijke personen, die een duide-
lijke icterus vertoonden, werd in het bloed een galkleurstofgehalte
van 4 E gevonden. De urine bevatte urobiline. De milt was palpabel,
maar anaemie, verhooging van het aantal reticulocytcn of vermin-
derde resistentie der roode bloedlichaampjes ontbrak, zoodat het
beeld toch wel duidelijk van de haemolytische icterus was af te gren-
zen. Nog onlangs heeft H ij mans van den Bergh een kli-
nische les aan dit onderwerp gewijd quot;), hij gaf het verschijnsel den
naam van constitutioneele hyperbilirubinaemie.

J. Bauer en E. Spiegel®) vonden bij hun onderzoekingen,
dat de bilirubinaemie wel belangrijk uiteenliep bij verschillende nor-
male menschen, maar dat zij bij dezelfde persoon in het verloop van
den dag constant blijft. Zoo liepen de nuchtere waarde en de waar-
den na een rijkelijken maaltijd niet uiteen. Deze bevindingen zijn in
tegenstelling met de latere onderzoekingen van E. C. Meyer en
H. Knüpf fer^quot;»), en K. Fellinger en R. Pfleger®«),
die bijna steeds hoogere nuchtere waarden vonden dan in het verloop
Van den dag en, speciaal 4 a 5 uur na den maaltijd, een daling van de
bilirubinespiegel waarnamen. Bauer en Spiegel deelen ver-
der de oude opvatting van Gilbert, dat de constitutioneele hyper-
bilirubinaemie een uiting is van een aangeboren leverzwakte.

Van bizonder belang is het gebleken, dat het bilirubine, zooals dat
onder pathologische omstandigheden in het bloed voorkomt, op twee
'Wijzen met het diazoreagens kan reageeren, n.1. direct, d.w.z. wan-
neer men het reagens zonder meer bij het serum voegt en indirect,
d.w.2. eerst na toevoeging van alkohol. Het bleek, dat de
sera van lijders aan icterus tengevolge van verhoogde bloedafbraak
(haemolytische icterus) steeds een indirecte reactie gaven en sera

van lijders aan galstuwing of leverbeschadiging op directe wijze
reageerden. Eveneens vond men indirect reageerend bilirubine daar,
waar bloed locaal afgebroken werd, b.v. in exsudaten of haematomen.

Zoo werd de benaming mechanische icterus gesteld tegenover die
van dynamische icterus, d.w.z. icterus door verhoogde bloedafbraak.
Op deze wijze werd de diazoreactie een belangrijk diagnostisch hulp-
middel om beide te onderscheiden. Bovendien meende H ij m a n s
van den Bergh te moeten vaststellen, dat slechts bij de mecha-
nische icterus bilirubinurie optrad en dat de nier een zekere drempel
vormde voor bilirubine. Bilirubinurie werd pas waargenomen, wan-
neer de hoeveelheid bilirubine in het bloed de concentratie van 4 Een-
heden overschreed.

Deze bevindingen en het verschillend reageeren van de galkleur-
stoffen zijn in het algemeen bevestigd geworden, doch de verklaring
ervan heeft tot vele controversen aanleiding gegeven. Bovendien zijn
er in den loop der jaren, zij het ook weinige, uitzonderingen waar-
genomen op den regel, dat bij afsluitingsicterus een directe reactie en
bij haemolytische icterus een indirecte reactie wordt gevonden. Zoo
heeft men eenige malen bij duidelijke afsluitingsicterus een indirecte
reactie gevonden, terwijl sommigen ook bij haemolytische icterus een
directe reactie en zelfs bilirubinurie beweren te hebben waargenomen.

Een der eersten, die de bevindingen van H ij mans van den
Bergh heeft bevestigd, was G. L e p e h n e Hij geeft in een
aantal publicaties een overzicht van zijn onderzoekingen. Hij wees er
reeds op, dat tusschen beide reacties overgangen bestaan, die het
indeelen tot een van beide moeilijk kunnen maken. Lepehne
voelde daarom de behoefte een uitgebreidere indeeling te maken en
sprak slechts van directe reactie, wanneer de maximale kleurinten-
siteit van het gevormde azobilirubine binnen 30 seconden bereikt
werd. Begon de reactie later en wel tusschen de 1 en 15 minuten, dan
sprak hij van vertraagd directe reactie. Begon tenslotte de reactie ter-
stond. doch bereikte zij haar maximale kleurintensiteit pas na länge-
ren tijd, dan sprak hij van diphasische reactie. Vond in het geheel
geen reactie plaats zonder dat alkohol toegevoegd was, dan was de
reactie zuiver indirect. Ook Lepehne nam waar. dat bilirubine
slechts in de urine verscheen, wanneer de galkleurstof direct rea-
geerde en de concentratie hooger was dan 4 Eenheden.

Tot diegenen, die uitzonderingen op de regel waarnamen, hoorden
in de eerste plaats Schiff en Eliasberg^), die zeer merk-
waardige mededeelingen daaromtrent deden. Zij vermeldden n.L een
epidemie van catarrhale icterus bij kinderen. Daarbij vonden zij nu
van October tot Januari bij alle kinderen een indirecte reactie
en na dien laatsten datum bij alle kinderen met catarrhale icterus
steeds een directe reactie. Zij staan met deze waarnemingen, die nog
steeds niet verklaard zijn, alleen, aangezien bijna alle schrijvers mede-
deelen bij icterus catarrhalis een directe reactie te hebben gevonden.

In de tweede plaats namen Schiff en Eliasberg een kind
waar met congenitale atresie van de galwegen, hetgeen later door de
obductie bevestigd werd. Het kind vertoonde sterke geelzucht en
bilirubinurie. Het bilirubine in het serum gaf echter steeds de indi-
recte reactie.

Ook L. B1 u m^quot;*) maakt melding van een uitzondering. Hij be-
schrijft 2 gevallen van icterus met directe reactie, waarbij ook bij ob-
ductie niets van afsluiting of stuwing in de galwegen te vinden was.
In beide gevallen had men te doen met patiënten met een ernstige
beschadiging van de lever. In het eerste geval werden septische necro-
sen in de lever gevonden. In het tweede geval had men blijkbaar te
maken met een acute gele leveratrofie. Hoewel dus bij deze ziekten
inderdaad geen afsluiting van de galwegen bestond, is de directe
reactie in zooverre geheel verklaarbaar, omdat men deze bijna altijd
bij ernstige leverbeschadiging vindt. Men heeft in deze gevallen te
doen met een zgn, hepatocellulaire icterus. Deze kan men zich voor-
stellen als een gevolg van de onvoldoende uitscheiding van bilirubine
door de lever, dus als een vorm van mechanische icterus. De conclusie
van Blum, dat een directe reactie niet steeds op galstuwing wijst,
is juist, wanneer men hieronder verstaat galstuwing in de groote gal-
wegen. Dat zijn beide patiënten echter een mechanische icterus had-
den, daaraan valt o.i. niet te twijfelen.

En tenslotte beschreef Hollos®*) een geval van weliswaar oor-
zakelijk niet geheel duidelijke, maar toch klaarblijkelijke mechanische
icterus. Hierbij werden in het serum ongeveer 16 E bilirubine gevon-
den met, naar mededeeling van den schrijver, indirecte reactie. In
overeenstemming hiermede bevatte de urine geen galkleurstof.

icterus beschreven, waarbij het serum de directe reactie geeft, en soms
bihrubinurie voorkomt. Welhcht zijn hierbij gevallen van cholelithia-
sis, die niet zoo zelden een complicatie van de haemolytische icterus
vormt.

Bij gevallen van haemolytische icterus met een sterke bilirubinae-
mie ziet men soms, wanneer men het reagens bij het onverdunde
serum doet, reeds spoedig een licht rose verkleuring optreden, die
echter slechts zeer langzaam verder gaat. Wij zijn gewend deze
reacties, mede op grond van de curve van het reactieverloop (zie
later), tot de indirecte te rekenen. Vermoedelijk zullen hieruit ook
een deel der mededeelingen omtrent directe reacties bij haemoly-
tische icterus te verklaren zijn.

Ten slotte vermelden verscheidene schrijvers (Rozendaal^))
het voorkomen van teekenen van leverbeschadiging bij de ter obductie
gekomen gevallen van patiënten met haemolytische icterus. Som-
mige onderzoekers (o.a. Rosenthal en Holzer^®)) hebben
bilirubinurie waargenomen bij patiënten, lijdende aan haemolytische
icterus, nadat de milt was weggenomen. Het is natuurlijk moeilijk te
beoordeelen in hoeverre hier operatie en narcose van invloed waren.

van een onderscheid tusschen een directe en een indirecte reactie.
Wanneer hij n.1. de diazoreactie in den vorm van een ringreactie uit-
voert, vindt hij steeds een direct, d.w.z. zonder alkoholtoevoeging,
optreden van den violetten ring. Het spreekt vanzelf, dat men met
het invoeren van de ringreactie de oorspronkelijke uitvoering wel
sterk wijzigt. Bovendien schrijft Chabrol voor, een kwartier tot
Yl uur met het aflezen van het resultaat te wachten. Doet men dit
echter niet, dan is ook bij de reactie volgens Chabrol een duide-
lijk verschil waar te nemen in de snelheden, waarmee de roode ring
ontstaat. Men ziet dezen ring bij directe reacties terstond, doch bij
indirecte reacties pas na 10 minuten of langer te voorschijn komen.
Op grond van al deze feiten, achten wij de argumenten van
Chabrol dan ook niet steekhoudend en het verschillend reagee-
ren van het bilirubine met het azoreagens dan ook geenszins weer-
legd. Over de voordeelen of nadeelen van zijn methode komen wij
nog te spreken.

De verklaring van het verschillend reageeren van het bilirubine is
van verschillende zijden gepoogd te geven. Tot op den huidigen dag
is het echter nog niet op afdoende wijze gelukt. H ij mans van
denBergh noemde reeds verschillende mogelijkheden: hij veron-
derstelt, dat de indirecte vorm van de bilirubine gebonden is aan de
eiwitten of kolloiden van het serum en dat de alkohol deze binding
losmaakt. Aanvankelijk veronderstelde hij, dat bepaalde stoffen,
eventueel uit de gal, de directe reactie zouden bewerkstelligen. Door
toevoeging van bepaalde stoffen, b.v. galzuren, maar ook andere
zwakke zuren, lukt het n.1. een indirect serum direct te doen reagee-
ren. De hoeveelheden, die hiervoor noodig zijn overtreffen echter
verre de hoeveelheden, die in het serum aanwezig zijn. Wat de
galzuren en galzure zouten betreft, wijst o.a. C h a b r o 1 erop, dat
zelfs bij volledige afsluiting van de galwegen na een aanvankelijke
verhooging in het serum en in de urine, een daling optreedt, zoodat
iedere afsluitingsicterus, wanneer de afsluiting blijft bestaan, op
den duur overgaat in een z.g. gedissocieerde icterus, waarbij wel
de bilirubine in serum en urine, doch niet de galzure routen verhoogd
zijn. De reactie blijft echter steeds direct.

A s c h o f fquot;'') neemt eveneens twee soorten bilirubine aan. Hij
stelt voor het indirect reageerende bilirubine I te noemen, tegenover
het directe bilirubine II. Hij huldigt de opvatting, welke eigenlijk
van N a u n y n afkomstig is, dat het bilirubine I extrahepatisch ont-
staat. d.w.z., dat het door het reticulo-endotheliale stelsel gevormd
wordt en bij de uitscheiding door de levercellen overgaat in het bili-
rubine II.

A. Ad Ier') meent de verklaring te moeten zoeken in de ver-
hoogde cholesterinespiegel van het bloed bij mechanische icterus.
Bij haemolytische icterus zou men n.1. in het algemeen een verlaagd
cholesterinegehalte vinden. Van velerlei kanten is echter op het ont-
breken van een samenhang tusschen directe reactie en cholesterine-
spiegel gewezen. Waarschijnlijk ontstaat de cholesterineverhooging
tengevolge van de galstuwing. Het samengaan met de directe reac-

tie is dus begrijpelijk, maar een oorzakelijk verband tusschen beide
behoeft daarom niet te bestaan.

S. J. T h a n n h a u s e r en E. A n d e r s e n , die de oor-
spronkelijke methode van H ij mans van den Bergh gemo-
dificeerd hebben, hebben zich ook bezig gehouden met de verschil-
lende wijze van reageeren van het serumbilirubine. Zij toonden aan,
dat door meer nitriet aan het reagens toe te voegen, ook het serum
van lijders aan haemolytische icterus tot een directe reactie te bren-
gen was. Doet men dit echter, dan wordt de azo-kleur spoedig door
dc overmaat van nitriet geoxydeerd en verdwijnt. Ook korte ver-
warming op een waterbad heeft op de reactie een versnellenden in-
vloed. Na geruimen tijd staan bij 37° wordt echter een aanvankelijk
directe reactie, indirect. Waar dus door betrekkelijk kleine veran-
deringen aan te brengen in de samenstelling van het reagens of in
de temperatuur van het milieu het reeds mogelijk is de indirecte en
directe reactie in elkaar over te voeren, zijn deze onderzoekers van
meening, dat aan de snelheid van reageeren niet te veel diagnos-
tische waarde gehecht kan worden.

Zij hebben verder trachten na te gaan of in vitro galzure zouten
of Cholesterine de reactie versnellen. Een versnelling van de reactie
trad niet op na toevoeging van cholzure natrium, mengsels van gal- en
vetzuren en niet na toevoeging van kolloidale mengsels van Choleste-
rine en cholesterine-palmitine-zure esters of Cholesterine alleen. Zelfs
zagen zij na toevoeging van een mengsel van galzure natrium en vet-
zure natrium de oorspronkelijke directe reactie indirect worden.

Rosenthal en Hölzer^®) hebben eveneens het verband
tusschen den cholcsterincspiegel van het bloed en den aard van de
diazoreactie trachten na te gaan. Zij vonden geen vast verband tus-
schen beide bij mechanische icterus. Integendeel, zij namen bij langer
bestaande afsluitingsicterus vaak waar, dat de cholesterinespiegel
daalde, terwijl de bilirubinespiegel hetzelfde bleef en ook de directe
reactie onveranderd bleef voortbestaan. Bij dc z.g. dynamische vor-
men van icterus vonden zij steeds een normaal en niet een verlaagd
gehalte aan Cholesterine in het bloed. Zij veronderstellen, dat het
indirecte bilirubine in het bloed aanwezig is in een bepaalde binding
en dat de milt misschien deze binding bewerkstelligt, want zooals
gezegd, vonden zij soms, dat na miltexterpatie bij lijders aan hacmo-

lytische icterus, het vroegere indirecte bilirubine direct ging reagee-
ren, terwijl ook bilirubinurie soms ging optreden. Het overgaan van
indirecte in directe reactie na miltexterpatie namen ook wij waar.

Een geheel andere verklaring geven Adler en Strauss®).
Zij meenen, dat het verschillend reageeren van de sera afhankelijk
is van de samenstelling van de eiwitten van het serum. In vitro
namen zij waar. dat na neerslaan van de globulinen door verzadigd
{NH4)2S04 de vertraagde reactie versneld werd. Dit was voor hen
een aanleiding de samenstelling van het serum, wat de eiwitten
betreft, bij lijders aan icterus nader te onderzoeken. Zij vonden nu
in het algemeen, in overeenstemming met hun proeven, een verla-
ging van de globulinenfractie bij mechanische icterus en een ver-
hooging bij dynamische icterus. Hun bevindingen zijn eveneens later
tegengesproken. Zij vermoeden, dat de reactie afhangt van de hy-
dratatie van de eiwitten. Alkohol b.v. zou een versnellende werking
hebben, omdat het de zwellingstoestand van de eiwitten vermindert.
In vitro stelden zij vast, dat alle stoffen, die den zwellingstoestand
van de eiwitten verminderen, ook de reactie bespoedigen, zooals
purinederivaten, ureum en novasurol. In een latere mededeeling
toonden zij aan. dat door toevoeging van deze genoemde stoffen,
de globulinefractie vermindert, zelfs zou dat het geval zijn na in-
jectie van Coffeine of novasurol.

Leschke®®) kon door speciale collodiumfiUers met betrekke-
lijk hooge doorlaatbaarheid het directe bilirubine ultrafiltreeren, het
indirecte echter niet.

Bruléquot;) bevestigde eveneens het bestaan van twee vormen
van reactie, doch ook hij vindt, vooral bij afnemende icterus catar-
rhalis en bij levercirrhose. vele overgangen. Hij wijst op de onder-
zoekingen van B1 a n k e n h O r n . die het bilirubine steeds groo-
tendeels dialysabel vond. wanneer het direct reageerde. Niet dia-
lysabel werd het serumbilirubine gevonden bij de indirecte en de
vertraagde reacties en in die gevallen, waarin ook geen bilirubinurie
bestond. B r u I é meent daarom, dat het indirecte bilirubine aan de
eiwitten gebonden is en daardoor niet dialysabel is en niet in de
urine verschijnt. Ook bij afnemende icterus zou het bilirubine groo-
tendeels aan de eiwitten gebonden zijn. Daaruit meent B r u 1 é ook
het feit te kunnen verklaren, dat bij afnemende icterus de bilirubi-

nurie zoo vaak betrekkelijk vroeg verdwijnt. Zooals we later zullen
zien, is inderdaad bij afnemende icterus een groot gedeelte van de
galkleurstof aan de eiwitten geadsorbeerd. IVfaar dat het indirecte
bilirubine aan de eiwitten gebonden is, staat geenszins vast; het
slaat in ieder geval niet met het eiwit neer.

Levi Crailsheim®*) trachtte door experimenteel onderzoek
te bewijzen, dat het indirecte bilirubine inderdaad aan het eiwit van
het serum gebonden is. Volgens zijn voorstelling bestaat er dus een
bilirubine-eiwit (globuline)-complex. In deze vorm is het bilirubine
in het bloed aanwezig. De lever zou dit complex splitsen en uit het
eiwit met de cholesterine samen de galzuren opbouwen, terwijl het
nu vrij geworden bilirubine in de gal wordt uitgescheiden en in deze
vrije vorm de directe reactie geeft. In vitro trachtte Levi C r a i 1 s-
h e i m hetzelfde te bewerkstelligen door het bilirubine-eiwitcomplex
aan de werking van eiwitsplitsende enzymen, b.v. maagsap of pep-
sine bloot te stellen. Behandelde hij aldus indirecte sera, dan werd
de reactie direct. Bovendien nam hij waar, dat hij hoogere getallen
voor bilirubine in het serum vond, wanneer hij dit serum eerst met
proteolytische enzymen behandeld had. Vanuit dit zelfde gezichts-
punt trachtte hij nu ook een verklaring te geven voor de verschijnquot;
selen, die bij cholaemie optreden. Door de galstuwing namelijk zou
het bilirubine-eiwitcomplex niet uitgescheiden worden en in groote
hoeveelheden in het bloed aanwezig blijven. Dit eiwit nu, zou de
oorzaak zijn van de toxische verschijnselen bij cholaemie. Tegen het
bezwaar, dat men juist bij haemolytische icterus, waar men volgens
de voorstelling van den schrijver ook een verhooging van het bili-
rubine-eiwitcomplex zou hebben, nooit verschijnselen van cholaemie
waarneemt, brengt hij in, dat hier de vermeerdering slechts lang-
zaam optreedt en dus het lichaam tijd tot gewenning heeft. Toxische
verschijnselen zouden slechts voorkomen, wanneer het bloed plot-
seling „overstroomdquot; wordt met het complex. We zouden hier aan
willen toevoegen, dat bij afsluitingsicterus en cholaemie het biliru-
bine steeds de directe reactie geeft en dus volgens de opvatting van
den auteur reeds van het eiwit bevrijd is, zoodat van een overlading
van het bloed met een bilirubine-eiwitverbinding geen sprake kan
zijn.

komen van de directe reactie bij ziekten met leucocytose. De groote
hoeveelheid proteolytisch ferment, die bij deze ziekten in het bloed
aanwezig zou zijn, zou er de oorzaak van worden, dat reeds in de
bloedbaan het complex gesplitst wordt.

Het komt ons voor, dat de directe reactie, bij sepsis bijvoorbeeld,
ook uit de leverbeschadiging te verklaren is.

Ook de M i c h e 1 i^quot;,^*quot;) neemt aan, dat het indirecte bilirubine
door zijn geringe concentratie en zijn langer verblijf in het serum,
aan het eiwit gebonden is. Komen er plotseling groote hoeveelheden
bilirubine in de bloedbaan, dan is de reactie volgens zijn meening
steeds direct. Men kan echter bij lang bestaande mechanische icte-
rus, b.v. bij levercirrhose, voortdurend hoeveelheden bilirubine in
het bloed vinden, die niet grooter zijn dan die, welke bij haemolyti-
sche icterus gevonden worden (5 tot 10 E), terwijl in het eene geval
steeds een directe, in het andere een indirecte reactie wordt ge-
vonden.

Piotrowskineemt aan, dat beide vormen van bilirubine
dezelfde structuurformule hebben, maar ook hij veronderstelt, dat
het indirecte bilirubine gebonden is aan de eiwitten.

Deze binding is volgens Piotrowski afhankelijk van de hoe-
veelheid bilirubine en de hoeveelheid eiwit. Voor de directe reactie
stelt hij dus niet alleen de vermindering van de globulinen aan-
sprakelijk, zooals Adler en Strauss»)dat doen. maar boven-
dien de plotselinge vermeerdering van het bilirubinegehalte. Wan-
neer groote hoeveelheden bilirubine in het serum gevonden worden,
zouden deze volgens Piotrowski steeds de directe reactie ge-
ven. aangezien er dan in verhouding niet voldoende eiwit aanwezig
is. om de galkleurstof te binden. Om deze reden twijfelt hij dan ook
aan de waarde van de diazoreactie, wanneer het gaat om de diffe-
rentiaaldiagnose tusschen mechanische en haemolytische icterus.

C. H. Andrew es*,®) bevestigde de resultaten van het on-
derzoek van Hij mans van den Bergh. Ook hij vond voor
de uitscheiding van het bilirubine in de urine een drempelwaarde
van ongeveer 3,5 E en kon in de urine bij haemolytische vormen van
icterus nooit bilirubine aantoonen.

Andrewes vond bovendien, dat uraemische sera, die dus ge-
woonlijk weinig bilirubine bevatten, met diazoreagens een eigenaar-

dige lecrbruine („buffquot;) kleur geven. Deze reactie vertoont punten
van verschil met de diazoreactie: de kleur is niet rood en wordt met
alkali rose, terwijl de azokleurstof met alkali groen wordt; bovendien
ontstaat ze. zelfs met alkohol, langzaam. Urine geeft de reactie niet,
evenmin ureum, urinezuur of kreatinine. Ook het eiwit is de oorzaak
niet; wat het wel is, is nog onbekend.

G. A. Harrison en R. J. Brom field®®) meenen. dat de
oorzaak van deze reactie ligt in een indoxylverbinding. Ook H e r z-
f e 1 d vond, dat het diazoreagens met indol reageert. Dezelfde
reactie werd onafhankelijk van Andrewes ook waargenomen
en beschreven door F. C h r o m e t z k a Hij toonde aan, dat de
intensiteit van de reactie parallel loopt met de verhooging van de
reststikstof. De stof, die de oorzaak is van de reactie, kon ook hij
niet vinden,

O. Weltmann en F. HückePquot;^) hebben het vraagstuk
van de directe en indirecte reactie nog eens van verschillende kan-
ten onderzocht. De hoeveelheid bilirubine geeft niet de doorslag
voor het reactieverloop, want ook na verdunning van een direct
serum met het serum van een lijder aan chronische nephritis, (dat zeer
weinig bilirubine bevat) blijft de reactie even direct. Door verdere
proefnemingen vonden deze onderzoekers, dat alkohol de zure wer-
king van het zoutzuur remt en daardoor de dissociatie van het salpe-
terzuur bevordert. Daar nu van vele kanten er op gewezen is. dat het
indirecte bilirubine zeer gevoelig is voor zoutzuur, maar dat door
vermeerdering van nitriet (Thannhauser en Andersen)de
reactie versneld wordt, zien de schrijvers hierin de verklaring van
de werking van den alkohol bij het tot stand komen van de diazo-
reactie,

Dc bevindingen van A d 1 e r en S t r a u s s dat verbindingen
van coffeine met natriumbenzoaat of salicylaat eveneens een bevor-
derende werking op de diazoreactie hebben, werd door hen ook
nader onderzocht. Door proeven met de afzonderlijke bestanddeelen
toonden zij aan, dat de werking niet. zooals men dacht, aan het
coffeine, doch aan de benzoe of salicyl toe te schrijven is. De wer-
king is ook niet te verklaren door de dehydratatie van de eiwitten,
zooals Adler en Strauss het voorstellen, want coffeine-
natriumbenzoicum maakt indirect bilirubine niet dialysabel. De ge-

noemde stof heeft echter een bufferwerking en zal dus, evenals alko-
hol. de dissociatie van het salpeterzuur bevorderen ten koste van het
zoutzuur. De schrijvers zien dus als kenmerkend verschil tusschen
de beide bilirubine-soorten de grootere gevoeligheid van de indi-
recte voor zoutzuur en de grootere behoefte ervan aan nitriet.

G. A. Collinson en F. S. Fowweather®') namen
waar. dat het uit de gal geïsoleerde bilirubine de indirecte reactie
geeft. Daar het volgens de onderzoekingen van H. Fischer
waarschijnlijk 2 carboxylgroepen bevat, kunnen er zouten van het
bilirubine gevormd worden. Deze zouten bleken inderdaad de
directe reactie te geven en ook verder de eigenschappen van het
directe bilirubine uit het serum, b.v. wat oplosbaarheid betreft, te
bezitten. Collinson en Fowweather nemen daarom aan,
dat het directe bilirubine als alkalizout van het indirecte in het
plasma aanwezig is. Door toevoeging van verdunde alkali aan in-
direct serum kan men de reactie direct maken. In het serum is echter
de reactie niet zoo alkalisch, dat het bilirubine als natrium- of kalium-
zout aanwezig kan zijn. De onderzoekers veronderstellen daarom,
dat dit zout het ammoniumzout zou zijn. Ook toevoeging van am-
moniak zou de indirecte reactie direct maken. Ter ondersteuning
van hun theorie voeren zij aan:

2.nbsp;Dat de alkaliteit van het serum voldoende is om het bestaan van
ammoniumzouten van bilirubine mogelijk te maken;

3.nbsp;Dat in vitro bij verwarming van (direct reageerend) ammonium-
bilirubinaat de reactie indirect wordt, hetgeen overeenkomt met
het feit, dat direct serum na verwarming overgaat in indirect.

Alles tezamen genomen is dus hun theorie zoo, dat de lever bij de
desamineering van aminozuren ammoniak vormt en dit ammoniak
gebonden aan het bilirubine van het serum in de gal uitscheidt.

D. T. Da vies en E. C. D odds'®) vonden, dat zuur biliru-
bine. mits opgelost in een bufferoplossing, zoodat door toevoeging
van het azoreagens de pH. niet te laag wordt, de directe reactie
geeft. In zuivere oplossingen of in exsudaten doet de toevoeging van
het reagens de pH. snel en sterk dalen, zoodat een directe koppeling
niet mogelijk is. Toch kan hierin echter de verklaring van de indi-
recte reactie niet gelegen zijn, want zoowel icterische als normale

sera hebben een gelijke bufferwerking voor het azoreagens. Zij stel-
den toen verder vast, dat biliverdine de indirecte reactie geeft en
veronderstelden daarom, dat het indirecte bilirubine een oxydatie-
product is van het directe in de richting van biliverdine. Deze ver-
klaring is echter door hen niet verder aannemelijk gemaakt. Biliver-
dine zelf komt in ieder geval niet in de versche sera voor en geeft
trouwens met azoreagens pas na vele uren een reactie, die eigenlijk
niet met de indirecte reactie vergeleken kan worden.

W. Morell Robertsquot;quot;) bestreed de opvatting van Co 1-
linson en Fowweather, dat het directe bilirubine het ammo-
niumzout van het indirecte zou zijn. Door toevoeging van zuur kan
men namelijk de directe reactie niet indirect maken, terwijl een am-
moniumzout toch wel ontleed zou zijn geworden. Wel vertraagt
toevoeging van zuur de reactie, maar pas wanneer de pH. zoo laag
wordt, dat koppeling met het reagens niet meer plaats kan vinden.
Een echt indirect, d.w.z. in chloroform oplosbaar pigment, ontstaat
niet. Toevoeging van ammoniak versnelt volgens dezen onderzoeker
de reactie slechts schijnbaar. Er ontstaat een oranje tint, die ook
optreedt, wanneer men ammoniak toevoegt aan normaal serum met
reagens. En tenslotte nam hij waar, dat ammoniumbilirubinaat, op-
gelost in serum, slechts een vertraagde reactie gaf.

C. E. N e w m a n wees er eveneens op, dat de directe reac-
tie, die na toevoeging van ammonium optreedt, slechts schijnbaar
direct is. De bruine kleur, die optreedt is niet te vergelijken met die,
welke men ziet bij de diazoreactie. Ook vond hij, dat biliverdine niet
de oorzaak kan zijn van de indirecte reactie, want behalve, dat het
groen is, geeft het met reagens pas een reactie na 12 tot 24 uur;
bovendien is het onoplosbaar in chloroform, hetgeen het indirecte
bilirubine wel is. N e w m a n komt tot de conclusie, dat de twee
bilirubines eenigszins verschillende verbindingen zijn. Hij onder-
scheidt 4 soorten bilirubine:

natuur niet voorkomt en dus slechts een kunstproduct is, dat met
alkali uit 1. of 2. gemaakt kan worden.

Steenhout en Bouckaert^®^) gingen na, wanneer bij de
zuivere bereiding van bilirubine uit gal de directe reactie indirect
wordt. Dit is het geval na de zuivering met alkohol. Zij besluiten
hieruit, dat de directe reactie het gevolg is van bestanddeelen uit de
gal, die bij afsluitingsicterus in het bloed aanwezig zijn.

E. For r ai en R. S i v o konden geen bilirubine ultrafiltree-
ren, noch het directe, noch het indirecte. Beide schijnen dus aan de
kolloiden gebonden te zijn. Het gelukte deze binding los te maken
door toevoeging van coffeino-benzoicum natrium.

Uitvoerige onderzoekingen werden verricht door L. Pater-
n i Deze wees nog eens op de onafhankelijkheid van den graad
der bilirubinaemie en de snelheid der reactie. Toch zegt hij nimmer
een hoogere indirecte bilirubinaemie gevonden te hebben dan 3,6 E.
Ook hij kon, in tegenstelling met Collinson en Fowwea-
th e r®*), door toevoeging van ammoniak niet een indirecte reactie
direct maken. Toevoeging van ammoniak geeft een, volgens P a-
terni, lichtrose kleur, die niet te vergelijken is met de azokleur.
Evenmin kon hij de reactie bespoedigen door toevoeging van na-
triumglycocholaat of natriumtaurocholaat. Hij komt tot de slotsom,
dat de galzure zouten en de ammoniumzouten geen rol spelen bij het
tot stand komen van de directe reactie.

T. MaedaenT. Morishima®®) vonden, evenals D a v i e s
en D O d d s. dat in vitro de snelheid van het verloop van de diazo-
reactie afhangt van de waterstofionenconcentratie. Hoe hooger de
Waterstofionenconcentratie was, des te langzamer verliep de reactie.
Het verband tusschen beide is in een hyperbool uit te drukken. Dit
komt dus ook overeen met de bevindingen van Collinson en
P O w w e a t h e r, die bij hoogere alkaliniteit van het serum een
directe reactie waarnamen.

N. Sofue^) meent, dat het serum van lijders aan haemo-
ytische icterus remmende stoffen bevat. Bracht hij namelijk bili-
rubine in substantie of bereid uit serum van patiënten met haemo-
ytische icterus in een direct reageerend serum, waaruit het bilirubine
®erst door de inwerking van licht verwijderd was, dan reageerde
oet oorspronkelijke indirecte bilirubine direct. S o f u e deelt ver-

der mede, dat deze remmende stof in de stromata aanwezig en daar-
uit o.a. te extraheeren is met alkohol en chloroform. Dergelijke proe-
ven werden ook door ons verricht, maar konden niet bevestigd wor-
den. Het oorspronkelijke indirecte bilirubine bleef ook in „directquot;
serum indirect reageeren.

S O f u e meent, dat de hoeveelheid bilirubine in het serum een
belangrijke rol speelt bij het verloop van de reactie. Hoewel de hoe-
veelheid bilirubine, zooals later zal blijken, wel van invloed is op de
snelheid, waarmee de reactie verloopt, is deze invloed toch niet zoo
groot, dat het verschil in reageeren hieruit alleen verklaard kan wor-
den. Reeds H ij mans van den Bergh heeft hierop gewezen.
Men neemt herhaaldelijk, b.v. bij afnemende afsluitingsicterus, een
bilirubinaemie waar van 1,5 E. met vrijwel volkomen directe reactie
en aan den anderen kant vonden wij bij een patiënt met traumatische
haematothorax in het pleurapunctaat een hoeveelheid bilirubine van
HE. met indirecte reactie.

H a y a s h i beschreef de proeven van S o f u e , die in het
serum van lijders aan haemolytische icterus een, de reactie remmen-
de, stof meent aangetoond te hebben, welke stof in de stromata aan-
wezig zou zijn. H a y a s h i stelt zich voor, dat bij de haemolytische
icterus door de haemolyse veel van die stof vrij komt en aldus de
reactie vertraagt. Toevoeging van stromata aan direct serum remt
de reactie; dat dit niet ligt aan het toegevoegde eiwit toonde hij aan,
doordat toevoeging van eiwit alléén, geen remmende werking heeft.
De alkohol, die men noodig heeft om bij indirect reageerende sera
een koppeling tusschen reagens en bilirubine te bereiken, zou er toe
dienen de eiwitten neer te slaan en daarmee ook de stromata. De
reactiesnelheid hangt dus volgens H a y a s h i af van twee facto-
ren: de hoeveelheid bilirubine en de hoeveelheid stromastof.

U. deCastroquot;) heeft de proeven van SofueenHayashi
nagedaan en zag, dat wel kleine hoeveelheden direct bilirubine op-
gelost in sera, afkomstig van patiënten met haemolytische icterus, of
in normale sera indirect reageerden, doch dat grootere hoeveelheden
de directe reactie bleven geven. Dit komt dus wel overeen met de
opvatting van H a y a s h i, doch er zou ook uit kunnen blijken, dat
alle sera een wat remmende werking bezitten. Overigens neemt ook
de Gastro het bestaan aan van twee verschillende bilirubines.

Het directe bilirubine zou volgens hem ontstaan uit het indirecte als
schakel in de keten van verbindingen, die ontstaan bij de afbraak
van haemoglobine.

J. P. Mc Gowan®^) meent, dat bij icterus met indirecte bili-
rubine een verlaagde alkalireserve een oorzakelijke rol zou spelen.
Men kan hierin een overeenstemming vinden met de onderzoekin-
gen van Collinson en Fowweather, die eveneens ver-
band vonden tusschen de alkaliniteit van het serum en de reactie-
snelheid. Mc G O w a n onderzocht varkens, die leden aan een be-
paalden vorm van anaemie door tekort aan ijzer; deze anaemie gaat
soms gepaard met icterus. Steeds vond hij een verlaagde alkali-
reserve bij dieren met een indirecte reactie in het serum. Toevoeging
van een bufferoplossing, die dus de alkalireserve verhoogt, deed de
reactie direct worden. Collinson en Fowweather vonden
ook, dat toevoeging van alkaU de reactie versnelt. Of de verlaagde
alkalireserve de oorzaak is van de indirecte reactie, blijft twijfel-
achtig. De verschillen in alkalireserve, die M c G o w a n mede-
deelt, zijn niet groot en ook bij gezonde personen loopen de waarden
nogal uiteen (50—70 vol. %).

Tenslotte wijdt deze onderzoeker eenige woorden aan de bij var-
kens waargenomen icterus. Deze kan volgens hem slechts door een
stoornis in de leveruitscheiding veroorzaakt zijn geworden en dus
zou dit dan weer een uitzondering op den regel beteekenen, dat een
indirecte reactie wijst op een icterus door verhoogde bloedafbraak.
Het is ons uit de mededeelingen van Mc G o w a n niet duidelijk,
dat hier niet een haemolytische icterus aanwezig is geweest. De
schrijver voert als bewijs, dat er een stoornis in de leveruitscheiding
bestond, aan, dat in de kleine galwegen veel galpigment werd ge-
vonden, dat dus tot obstructie geleid zou moeten hebben. Dit
vinden van veel galpigment bewijst echter nog geen blokkade, aan-
gezien men ze ook bij haemolytische icterus vindt (E p p i n g e r).

G. Monasterioquot;') geeft als zijn meening te kennen, dat
alkohol de reactie versnelt door de temperatuursverhooging van het
mengsel, die ze veroorzaakt en doordat zij het contact tusschen
serum en reagens vergemakkelijkt. Het eerste is in overeenstem-
ming met de ervaring, dat een korte verwarming de reactie directer
maakt. De schrijver vestigt er ook de aandacht op, dat een reactie

soms indirect kan lijken, als er weinig bilirubine aanwezig is. Ook
wij zagen vaak, dat een aanvankelijk direct serum, wanneer het
sterk verdund werd, een meer vertraagde, in den zin van een dipha-
sische, reactie ging geven.

G. H u n t e r nam waar, dat kunstmatig bilirubine, in chloro-
form opgelost, niet reageert met het azoreagens. Ook in alkohol
opgelost reageert het slechts langzaam. Dit was dus eenigszins in
strijd met de mededeeling van HijmansvandenBerg h®®-quot;),
die bilirubine in chloroform oploste, deze oplossing indampte en het
residu in alkohol oploste, welke oplossing de directe reactie gaf.
H ij mans van den Bergh verzuimde echter mee te deelen,
dat bij de indamping toch nog een weinig chloroform aanwezig bleef
en inderdaad, wanneer men het bilirubine in een weinig chloroform
oplost en deze oplossing aan den alkohol toevoegt, dan verloopt de
reactie direct. H u n t e r beschouwt daarom het indirecte bilirubine,
in het serum aanwezig, als opgelost in een middel, dat ook in alkohol
oplosbaar is en gelooft dus niet, dat dit bilirubine aan de eiwitten of
de kolloiden gebonden is. Wat het directe bilirubine betreft, ook hij
gelooft, evenals Collinson en F o w w e a t h e r, dat dit aan-
wezig is als een natriumhydrogeen bilirubinaat.

Chabrol™) paste de diazoreactie, zooals reeds gezegd werd,
toe in den vorm van een ringreactie. Met nadruk wijst hij erop, dat
als men de diazoreactie volgens zijn voorschrift uitvoert, de verschil-
len tusschen directe en indirecte reactie wegvallen, want dat ook het
zgn. indirecte bilirubine binnen het kwartier reageert. Chabrol
schijnt dan ook aan het onderscheid tusschen directe en indirecte
reactie niet veel waarde te willen hechten.

B. V a r e 1 a, E. A p o 1 o en C. V i a n a zijn de eersten,
die in sera de hoeveelheden direct en indirect bilirubine afzonderlijk
hebben bepaald. De interessante methode, die zij daartoe hebben
uitgewerkt, wordt nog afzonderlijk besproken. Reeds nu willen we er
op wijzen, dat dit geen verband houdt met hetgeen W e 11 m a n n
en J o s 1hebben gedaan en die onder indirect bilirubine in hun
publicaties verstaan, de hoeveelheid bilirubine, die gevonden wordt,
nadat het serum met alkohol onteiwit is. V a r e 1 a en zijn medewer-
kers vonden geen vaste verhouding tusschen direct en indirect bili-
rubine, welke verhouding zij „1'index de la bilirubine du sangquot; noe-

men. Ook bij dezelfde ziekten en dezelfde patiënten wisselt deze
index sterk. Opmerkenswaardig is het, dat zij bij catarrhale icterus,
behalve een sterke verhooging van het directe bilirubine, ook een ver-
hooging van het indirecte vonden. Dit zou er dus op wijzen, dat er bij
deze ziekte, behalve de beschadiging van de lever, ook een verhoogde
haemolyse plaats vond. Zij vervaardigden curven van het qehalte der
beide bilirubines in het verloop der catarrhale icterus, Wc«ilfbij bleek,
dat de directe galkleurstof nog maanden in het serum verhoogd kan
zijn, hetgeen overeenkomt met de ervaring, dat de reactie in het
serum nog lang de directe kan blijven.

M. J e n k e kon door de identiteit van bilirubine en haemoto-
idine vast te stellen nogmaals de extrahepatische galkleurstofvorming
bewijzen. Tegelijkertijd beschrijft hij een geval van haemolytische
icterus, waarbij van tijd tot tijd schijnbaar bilirubinurie optrad. De
urine had namelijk een bierbruine kleur en ook het schuim was geel
gekleurd. Bij nader onderzoek bleek echter de kleurstof in de urine
9een bilirubine te zijn: bij de proef van G m e 1 i n ontstond geen
groene verkleuring. Met diazoreagens ontstond pas na uren een ver-
Weuring. De kleurstof was verder niet extraheerbaar met chloroform
en zeer gevoelig voor zuurstof en alkali. J e n k e gaf aan deze stof
de naam van haemorubine en meende hierin een der langgezochte
tusschenstoffen gevonden te hebben, die bij de afbraak van haemo-
globine tot bilirubine gevormd worden.

Acél en Goldgruber^) geven na een kort overzicht van de
toentertijd heerschende opvattingen, de resultaten weer van hun eigen
experimenten. Nogmaals bewijzen zij de onafhankelijkheid van de
samenstelling der bloedeiwitten en de snelheid der reactie. Hetzelfde
kon gezegd worden van de cholesterinespiegel van het bloed. Bijzon-
dere aandacht hebben zij besteed aan de galzuren in het bloed. In-
derdaad vonden zij, wanneer de galkleurstof de directe reactie gaf,
vrijwel steeds een verhooging van de galzuren. (Bepalingen volgens
•^Idrich en Bledsoe). Het gelukte hen echter evenmin als
Paterniquot;^) om door toevoeging van taurocholzure natrium
glycocholzure natrium aan indirecte sera, directe reacties te ver-
ijgen. In de hoop de toestand, zooals die in vivo is, nader te kunnen
omen, isoleerden zij daarom de galzure zouten uit de gal en voeg-
en deze aan de sera toe, echter evenmin met succes. Na decholine

injecties bij proefpersonen zagen zij soms de reactie wel direct wor-
den, helaas waren de resultaten niet steeds dezelfde. Tenslotte von-
den ook zij de onafhankelijkheid van de hoeveelheid bilirubine in het
serum en de reactiesnelheid. Zij beschouwen de verhooging van de
galzure zouten in het bloed als gecoördineerd met de directe icterus,
zonder dat tusschen beide een causaal verband bestaat.

W. J. Griffith en G. Kaye®®) vonden dat het werkelijke
zuivere bilirubine, wanneer men het oplost in serum, de indirecte reac-
tie geeft. Het gelukte hen uit gal een pigment te isoleeren, zij het ook
niet in zuivere toestand, dat opgelost in serum de directe reactie gaf.
Ook verder vertoonde dit „direct-reactionpigmentquot; veelal dezelfde
eigenschappen als het bilirubine, dat bij afsluitingsicterus in het bloed
voorkomt en zij beschouwen beide dan ook als identiek.

F.nbsp;Scott Fowweather^^^) heeft, na de litteratuur vanaf
Davies en Dodds (1927) te hebben gerefereerd, mededeelin-
gen gedaan over onderzoekingen, die hij in navolging van Collin-
son en Fowweather verrichte over de zouten van het bili-
rubine. In tegenstelling met wat genoemde onderzoekers vonden,
vertoonen volgens Scott Fowweather de zouten van het
kristallijne indirecte bilirubine niet steeds een directe reactie. De
schrijver neemt daarom aan, dat zoowel van het indirecte bili-
rubine (À), als van het directe bilirubine (B) zouten bestaan, die op
dezelfde wijze reageeren. Bij passage door de lever meent hij, dat uit
bilirubine A, bilirubine B ontstaat en hieruit weer de zouten van B.
Bij mechanische icterus zouden deze zouten van B in het bloed ,cir-
culeeren. Evenals K ü s t e r ) beschouwt hij het bilirubine A als
een ketoverbinding en bilirubine B als een enolverbinding. Oplossing
in alkohol bevordert het ontstaan der enolvorm.

2.nbsp;Dat door toevoeging van allerlei colloïdale oplossingen als zet-
meel en ovalbumine, die dus het bilirubine eventueel kunnen binden,
de reactie niet vertraagd wordt. 3. Dat door staan bij 37° de directe
reactie in de indirecte overgaat. 4. Alle beide bilirubinesoorten dialy-
seerbaar zijn door een 43^ % collodiumfilter, hetgeen dus in tegen-
spraak is met de onderzoekingen van M. A. Blankenhorn^®),
die het bilirubine slechts dialysabel vond, wanneer er ook bilirubinurie

bestond, dus in het algemeen bij direct reageerende sera. 5. Dat de
globulinefractie niet in verband staat met de reactiesnelheid.

K. Takeshita^®*) vond evenmin verband tusschen globuline-
fractie en directe reactie. Hij onderzocht verder of en zoo ja, door
toevoeging van welke stoffen aan het serum de reactie direct te
maken is. Galzuren, Cholesterine, bestraalde gal, extracten uit konij-
nenlevers, pepsine, minerale zuren, basen en zouten, alkoholen met
stijgende aantallen C-atomen, aromatische zuren, halogenen zijn alle
zonder werking. Monocarbonzuren, purinelichamen en barbituur-
zuurverbindingen hebben een geringe versnellende werking. Ook
kon geen verband tusschen de waterstofionenconcentratie en de
reactie worden waargenomen.

Julesz en Winklerquot;) vergeleken het bilirubinegehalte van
het bloed en van het weefselvocht (cantharidenblaas) en vonden
tusschen beide een vast verband: beide gaven dezelfde reactie. Het
cholesterinegehalte liep echter sterk uiteen, zoodat dus een verband
tusschen de Cholesterine spiegel en de reactie niet kan worden aan-
genomen.

G. Ferrari*®) meent, dat in vitro de diazoreactie versneld
quot;Wordt door stoffen, die het bilirubine oplossen.

G. Fa vil li®®) onderzocht experimenteele afsluitingsicterus en
experimenteele haemolytische icterus, die veroorzaakt werd door de
toediening van toluyleendiamine. Hij vond bij beide vormen overgan-
gen naar de directe reactie en meent op grond van deze proeven, dat
de diazoreactie geen waarde heeft als differentiaaldiagnosticum tus-
schen hepatische of extrahepathische icterus. Zooals onder andere
C h a b r O 1 later ook heeft vastgesteld echter, is toluyleendiamine
niet alleen een bloedgift, doch veroorzaakt het ook leverbeschadiging.
Het is dus zeer begrijpelijk, dat F a v i 11 i bij zijn met dit vergift
behandelde dieren, ook wel eens directe reacties vond.

Vatten wij thans de literatuur samen, dan moet er op gewezen
■Worden, dat de directe en de indirecte reactie in vitro in elkaar over
te voeren zijn. In het algemeen bevordert het toedienen van alkali
aan het serum de directe reactie. Hetzelfde kan bereikt worden door
het serum gedurende korten tijd te verwarmen of door het toevoegen
Van zwakke zuren aan het serum of meer nitriet aan het reagens.
Sterk zuur maken van het serum vertraagt de reactie, doordat de kop-

peling met het reagens dan niet meer plaats kan vinden. Door het
serum längeren tijd te laten staan, wordt de reactie eveneens indirect.

In vivo heeft men in de samenstelling van het bloed niet zulke
constante afwijkingen kunnen vinden, dat daardoor het verschil in
reactie verklaard zou kunnen worden. De verhooging van de gal-
zuren en het cholesterine en de veranderde eiwitsamenstelling geven
daarom geen verklaring van de directe reactie, terwijl ook proeven in
vitro het onwaarschijnlijk gemaakt hebben, dat zij een rol spelen. De
opvatting, dat de graad van de bilirubinaemie de reaictiesnelheid ge-
heel bepaalt wordt door de waarnemingen, die men dagelijks in de
kliniek opdoet, wel weerlegd; dat de hoeveelheid bilirubine op de
reactiesnelheid van invloed is, is echter begrijpelijk. Waar dus van
de chemische eigenschappen van het directe en indirecte bilirubine en
van de factoren, die voor het verloop van de reactie aansprakelijk
zijn, zoo weinig bekend is, zou men zich kunnen afvragen of men wel
het recht heeft tusschen beide een onderscheid te maken en er een
zoo groote beteekenis voor de diagnose aan te hechten. We zouden
hierop het antwoord van G. A. Harrison willen aanhalen: „On
the whole yes, for it stimulated thought and has been to much help
to the physician and therefore to the patients, but it has led to inumer-
able publications, many of which may turn out to be of little interest.quot;

Door het feit dat de indirecte en de directe reactie in elkaar zijn
over te voeren is het bestaan van twee modaliteiten van bilirubine o.i.
geenszins onwaarschijnlijk gemaakt. Want bij het bestudeeren van
twee stoffen, waarvan men redenen heeft om te vermoeden, dat ze
verschillen, zal men moeten trachten de punten van verschil duide-
lijker tot uiting te brengen, doch niet ze te doen vervagen.

Ondanks het feit, dat uitzonderingen op den door H ij mansvan
den Bergh vastgestelden regel zijn waargenomen, kan men zeg-
gen, dat de indirecte reactie slechts voorkomt bij icterus, die op een
verhoogde bloedafbraak berust en dat dus de diazoreactie, mits in
haar principe volgens de oorspronkelijke methode uitgevoerd, haar
differentiaal diagnostische waarde heeft behouden.

Methoden tot bepaling van het bilirubine in het serum zijn reeds
lang in gebruik. Wanneer men afziet van de spectrophotometrische
methode, die in de kliniek voor het dagelijkseh gebruik weinig in-
gang heeft gevonden, kan men ze indeelen naar drie principes: de
eerste is het oxydeeren van bilirubine tot een gekleurd afbraak-
product; dc tweede is de vergelijking van de gele kleur van het
serum met een bepaalde gele standaardvloeistof en de derde het
vormen van een gekleurde verbinding van het bilirubine met be-
hulp van het azoreagens.

Het oxydatie-principe is reeds lang in gebruik. Men kon hier wel
bilirubine qualitatief mee aantoonen, doch quantitatieve schattingen
werden er aanvankelijk niet mede uitgevoerd.

A. Gilbert®quot;) is vermoedelijk de eerste geweest, die, op dit
principe gebaseerd, een bruikbare methode uitdacht, waarmede men
quantitatieve bepalingen kon verrichten. De methode is een z.g.
..reaction limitequot;, d.w.z., dat nagegaan wordt bij welke verdunning
van het serum een bepaalde reactie nog optreedt. Is de gevoeligheid
van de reactie vooraf vastgesteld, dan kan men uit de verdunning
de sterkte van het serum berekenen.

De uitvoering zij hier in het kort beschreven: Er wordt een kunst-
matige eiwitoplossing bereid, waarmede men in een reeks buisjes
opeenvolgende verdunningen van het serum maakt. Bij ieder buisje
Wordt nu het reagens gevoegd, dat bestaat uit acidum nitricum en
nitras natricus. Op den bodem der buisjes komt nu een wit eiwit-
neerslag, dat zich naar het nitriet toe geel kleurt. Tusschen deze
gele en de witte zóne verschijnt, wanneer bilirubine in voldoende
hoeveelheid aanwezig is, een blauwe ring. Volgens G i 1 b e r t be-
vat het buisje, waarin nog juist een blauwe ring aanwezig is, bili-
rubine in een verdunning van 1 : 40.000. De vaststelling, in welk
buisje nog een blauwe ring waarneembaar is, is natuurlijk onder-

hevig aan een subjectieve fout. Vandaar, dat C h a b r o 1 en
DevaPquot;) de gevoehgheid van de reactie hooger vonden, n.1.
1 : 50.000. In ieder geval is G i 1 b e r t de eerste geweest, die on-
derzoekingen van quantitatieven aard heeft gedaan over de sera
van gezonden, zoowel als zieken.

In de Fransche klinieken is deze methode langen tijd in gebruik
geweest, ook al heeft o.a. Scheel^) erop gewezen, dat de
reactie niet specifiek is, aangezien ook luteine tot het vormen van
den blauwen ring aanleiding kan geven. De meeste onderzoekers
waren van meening, dat het luteine bij den mensch zeer zelden en
dan nog in zeer geringe hoeveelheden in het serum zou voorkomen
en dus geen belangrijke bron van fouten kon vormen. Van ver-
scheidene zijden is erop gewezen, dat onder bepaalde omstandig-
heden het menschelijk serum aanzienlijke hoeveelheden luteine kan
bevatten.

Fouchet^o) heeft eveneens een methode bedacht, die in de
kliniek ingang heeft gevonden. Ook hij maakt gebruik van het oxy-
datieproces. Hij slaat n.1. het eiwit met trichloorazijnzuur neer,
■waarna ferrichloride als oxydans toegevoegd wordt. Het gevolg is,
dat een groen-blauw gekleurd neerslag ontstaat, waarvan de kleur
met die van een reeks standaardkleuren vergeleken kan worden. De
gevoeligheid bedraagt volgens F o u c h e t 1 : 15.000. Het spreekt
vanzelf, dat men met deze methode slechts een gedeelte van het
totale bihrubine in het bloed bepaalt, n.1. de fractie, die met het eiwit
neergeslagen wordt. Zooals later vermeld zal worden, is deze fractie
van zeer uiteenloopende grootte, zelfs bij dezelfde patiënt en bij
dezelfde ziekten. De methode kan dus noch op nauwkeurigheid,
noch op gevoeligheid aanspraak maken, maar werd in den tijd,
waarin zij uitgedacht werd (1918) veel gebruikt.

In 1913 publiceerden Hij mans van den Bergh en
Snapper®®) de diazoreactie, waarbij gebruik gemaakt werd van
het azoreagens van E h r 1 i c h om het bilirubine aan te toonen,
doordat het hiermede een roode verbinding, azobilirubine, vormt,
■welke stof als typische eigenschappen heeft, dat de kleur in zuur
milieu blauw en in alkalische omgeving groen wordt. Deze reactie
is ongetwijfeld met enkele onbeteekenende uitzonderingen (zie
H e r z f e 1 d®^)) specifiek voor bilirubine in het bloed, terwijl ook de

gevoeligheid, die van alle andere reacties overtreft en ongeveer
1 : 800.000 bedraagt. De uitvoering van deze methode is zoo alge-
meen bekend, dat de nadere vermelding ervan hier achterwege kan
blijven. Dat aan deze methode in haar oorspronkelijken vorm groote
onnauwkeurigheden verbonden waren, ontging reeds de auteurs
niet. Als voornaamste bezwaren golden, dat, althans bij direct
reageerende sera, een groote hoeveelheid bilirubine met het eiwit-
neerslag meegesleept werd en dus verloren ging, zoodat de waar-
den, die men vond, te laag moesten zijn. H ij mans van den
Bergh wees erop, dat men dit bezwaar kon verminderen door de
sera aanzienlijk te verdunnen, zoodat met alkohol geen neerslag
meer ontstond. Vaak werd dan echter de kleur van het azobilirubine
te zwak en ook bleef de vloeistof lichtelijk troebel, hetgeen de afle-
zing niet gemakkelijker maakte. Het tweede bezwaar was de moei-
lijkheid van het vinden van een goede vergelijkingsvloeistof. Aan-
vankelijk gaf H ij mans van den Bergh aan te gebruiken een
oplossing van kunstmatig bilirubine van 1 op 200.000, welke hoe-
veelheid hij 1 E noemde. Deze oplossing van bilirubine is echter
moeilijk houdbaar en daarom niet te gebruiken, aangezien het
telkens opnieuw vervaardigen ervan omslachtig en kostbaar is.
Hij gebruikte daarom vervolgens een aetherische oplossing van ferri-
rhodanide. De kleur van deze stof verschilt echter niet onbelangrijk
van die van azobilirubine en werd daarom later''quot;*) vervangen door
een oplossing in water van cobaltsulfaat (2,14 g C0SO4 zonder aq.
per L). Deze standaardoplossing, hoewel geenszins ideaal van kleur,
is tot nu toe vrijwel algemeen in gebruik bij hen, die de diazoreactie
toepassen.

De methode werd het eerst gemodificeerd door S. J. T h a n n h a u-
ser en E. Andersen^). Deze trachten het bezwaar, dat biliru-
bine met het eiwitneerslag verloren gaat, te ondervangen, door aan het
serum niet eerst de alkohol, doch eerst het azoreagens toe te voegen.
Bij direct reageerende sera ontstaat dan het azobilirubine, welke stof
zeer goed oplosbaar is in alkohol, zoodat bij toevoeging van alkohol
het eiwit neerslaat, doch de azobilirubine in oplossing blijft. Inder-
daad moet deze modificatie van de oorspronkelijke reactie als een
groote verbetering beschouwd worden, ook al hebben o.a. W e 11-
mann en Jost^)er later op gewezen, dat ook bij deze methode

een gedeelte van het bilirubine nog verloren gaat. De tweede modifi-
catie, die genoemde schrijvers invoerden, was het toevoegen van
zuur aan de alkoholische oplossing van azobilirubine, waardoor de
oorspronkelijke roode kleur in een blauwe overgaat. Deze blauwe
kleur is niet alleen constanter, maar ook intensiever dan de oor-
spronkelijke roode. Inmiddels is dit laatste niet steeds als een voor-
deel te beschouwen, aangezien het daardoor soms noodzakelijk is
de sera sterk te verdunnen, waardoor de fout van de bepaling groo-
ter wordt. Als vergelijkingsvloeistof gebruiken ook Thannhau-
ser en Andersen een oplossing van kunstmatig bilirubine.
Later werd ook gebruikt een oplossing van indigoblauw. De uit-
voering is in het kort als volgt: 2 cc. serum -f I cc. reagens. Wach-
ten tot de maximale kleurintensiteit is bereikt. Toevoeging van
5,8 cc. 96 % alkohol en 2 cc. verzadigd ammonium sulfaat. Centri-
fugeeren, 0,9 cc. filtraat 0,1 cc. geconcentreerd zoutzuur, Dc ver-
dunning bedraagt I op 5. Op deze wijze uitgevoerd, geeft de me-
thode aanzienlijk hoogere waarden dan de diazoreactie in haar oor-
spronkelijken vorm.

Ook de onderzoekingen van Vogl en Zins'«) wijzen erop,
dat met het eiwitneerslag groote hoeveelheden bilirubine verloren
gaan. Hun methode, die erop berust, in navolging van F o u c h e t,
het eiwit met trichloorazijnzuur neer te slaan, welk neerslag aan de
lucht of bij verwarming groen kleurt, toont vooral bij afnemende
icterus soms bilirubine in pathologische hoeveelheden aan. terwijl
de diazo-reactie dan reeds weer normale getallen aangeeft, blijk-
baar. doordat er meer bilirubine met het eiwitneerslag meegaat,
dan er in de alkohol achterblijft. Zooals wij later zullen zien. is dit
steeds bij afnemende icterus met een directe reactie het geval. Het
nadeel van de methode, die bilirubine aantoont in het eiwitneerslag,
is dan ook, dat zij geen bilirubine aantoont met indirecte reactie,
aangezien deze niet of nauwelijks met het eiwit neerslaat. Inderdaad
berichten Vogl en Zins. dat het hun niet gelukt is bij nor-
male personen bilirubine in het serum aan te toonen, terwijl zij over
gevallen van haemolytische icterus niets bericht hebben.
J. Murakami en H. Nishida^»») bevestigden de resul-
taten vanHijmansvandenBerghen vonden eveneens, dat

K. Franke*^) paste een oud reagens op bilirubine toe om dit
in de urine aan te toonen. Na toevoeging van methyleenblauw aan
bilirubinehoudende urine ontstaat n.l. een groene kleur,

Roch^®) heeft er echter op gewezen, dat de groene kleur het
gevolg is van een menging van de kleur van methyleenblauw en
de gele kleur van bilirubine.

Reeds vroeger heeft G. Haselhorst®®) deze methode onder-
zocht en eveneens aangetoond, dat het methyleenblauw geen rea-
gens op bilirubine is. Hij raadde aan als vergelijkingsvloeistof voor
de diazoreactie te nemen een alkoholische oplossing van Bordeaux-
rood, terwijl de kleuren vergeleken werden in een toestelletje, dat
overeenkomst vertoonde met de haemoglobinometer van S a h 1 i.

In 1928 heeft Haselhorst®^) nog eens verslag gedaan over
de ervaringen met zijn bilirubinometer, welke gunstig luidden.

Ook E. de Micheli^) wijst op de moeilijkheid de kleuren te
vergelijken van azobilirubine en ferrirhodanide en meent, dat de
colorimeter volgens Haselhorst de vergelijking gemakkelijker
maakt.

Kapsinow®®) nam waar, dat urine, die bilirubine bevatte, met
Obermayers reagens (wanneer hij dit voor de indicanreactie
gebruikte) een groene kleur gaf. Deze kleur was natuurlijk het ge-
volg van de aanwezigheid van biliverdine, dat door oxydatie uit de
bilirubine ontstaat.

Ook op serum heeft deze auteur de reactie toegepast en volgens
hem heeft zij een vrij groote gevoeligheid, hoewel deze, zooals uit
de berekeningen blijkt, niet zoo groot is als de diazoreactie.

Herzfeld®quot;) bewees, dat de diazoreactie niet geheel specifiek
is voor bilirubine, aangezien ook indol en pyrrhol de diazoreactie
geven. Het is dus mogelijk, dat hierdoor fouten in de bilirubino-
®etrie ontstaan. Hij voert daarom een reactie in, waarbij hij gebruik
maakt van het reagens van Hammersten (salpeterzuur en zout-
zuur), dat bilirubine tot biliverdine oxydeert. Van het serum wordt
een reeks verdunningen gemaakt en aan iedere verdunning een
zekere hoeveelheid reagens toegevoegd. Men gaat na bij welke ver-
dunning nog een groene verkleuring waarneembaar is. Begrijpe-

lijkerwijze is de persoonlijke fout bij het aflezen groot. H e r z f e 1 d
zelf geeft op, dat men met zijn reactie nog 0,016 mgr bilirubine kan
aantoonen.

L. F r i g y e r vergeleek de methoden van H ij mans van
den Bergh en Herzfeld. Hij komt tot de conclusie, dat de
eerste het gevoeligste is. doch dat de laatste waarschijnlijker uit-
komsten geeft bij sterke icterus. Het verschil moet wel in de fout
liggen, die het eiwitneerslag veroorzaakt, doordat het veel bilirubine
bevat. Bij geringe graden van icterus en vooral bij icterus, waarbij
het serum de indirecte reactie geeft, speelt deze adsorbtie geen
groote rol en zijn de uitkomsten van beide methoden vrijwel gelijk.
De schrijver vestigt er echter de aandacht op, dat ook de methode
van Herzfeld Verre van nauwkeurige resultaten geeft.

de toe om het bilirubinegehalte van het bloed te schatten. Hij ver-
geleek daartoe de kleur van het serum met die van een andere gele
oplossing. Aanvankelijk gebruikte hij een ferrioplossing. Later, aan-
gezien die beter houdbaar was, een oplossing van kaliumbichromaat
van 1 op 10.000. Ten onrechte nam hij aan, dat de gele kleur van
het serum steeds alleen door bilirubine veroorzaakt wordt en dat
luteine bij den mensch geen rol speelt. Ook ging hij het verband na
tusschen bilirubinaemie en bilirubinurie. Hoewel hij waarnam, dat
bilirubinurie pas optreedt, wanneer de bilirubinaemie een behoorlijke
waarde heeft bereikt en er dus vermoedelijk een drempelwaarde
bestaat voor bilirubine in de nier, kon hij een nader verband tus-
schen beide niet leggen; natuurlijk ook, omdat hem het verschil tus-
schen het indirecte en het direct reageerende bilirubine moest ont-
gaan. Hoewel dus de methode, zooals vanzelf spreekt, geen speci-
fieke reactie is, is deze tot op den huidigen dag door zijn buiten-
gewone eenvoudigheid nog in algemeen gebruik.

Meulengracht heeft later zijn methode en die van H ij-
mans van den Bergh nog eens aan critiek onderworpen,
doch zegt niet te gelooven, dat de luteinaemie een foutenbron kan
zijn. De methode van H ij mans van den Bergh heeft als
grootste riadeel de eiwitadsorbtie van het bilirubine. M e u 1 e n-
gracht vestigde er reeds de aandacht op, dat de hoeveelheid bili-
rubine, die met het eiwit neerslaat, sterk wisselt. Volgens zijn mee-

ning hangt dit samen met den tijd, waarin de bihrubine in het bloed
blijft. Bij plotselinge afsluiting wil het hem voorkomen, dat er wei-
nig, bij langer bestaande icterus veel bilirubine met het eiwit neer-
geslagen wordt.

J. Förster*®) heeft getracht de methode van M eul en-
gracht te verbeteren door niet de kleur van het serum, doch de
kleur van het alkoholfiltraat te vergelijken. Zeer terecht wijst hij er
n.1. op, dat de uitvoering van de methode Meulengracht be-
moeilijkt of zelfs onmogelijk kan worden, wanneer haemolyse op-
treedt of wanneer het serum sterke opalescentie vertoont. Deze
bezwaren verdwijnen, wanneer men met het alkoholfiltraat werkt.
Omdat het serum hierbij echter sterk verdund wordt (1 op 4), ont-
eiwit Förster niet met alkohol, doch met kleurlooze aceton
(1 op 1). Het bezwaar van de methode Meulengracht, dat
luteine stoort, blijft echter bestaan, terwijl er als nieuw bezwaar
bijkomt, dat ook hier bilirubine met het eiwitneerslag verloren zal
gaan. Resultaten van deze modificatie zijn medegedeeld door J. F ö r-
s t e r en B. F ö r s t e r *®). Zij vonden in den loop van één week
slechts minimale wisselingen bij denzelfden persoon, terwijl nuchter
de bilirubinespiegel meestal iets hooger was. Na een maaltijd konden
zij echter niet steeds een duidelijke verlaging waarnemen.

A. Bernheimquot;) heeft de methode van Meulengracht
toegepast bij allerlei ziekten. Het getal, dat aangeeft hoeveel maal
sterker het serum is dan de vergelijkingsvloeistof (kaliumbichromaat
1 op 10.000), noemt zij de icterus-index. Deze benaming en met haar
dus de methode Meulengracht heeft sindsdien in de Ameri-
kaansche literatuur veel ingang gevonden.

Uit vergelijkingen van de oplossing van kahumbichromaat met
een oplossing van kunstmatig bilirubine in verdunde loog, is ons
gebleken, dat de icterus-index overeenkomt met 0,4 E bilirubine.

Mededeelingen over de toepassing van de icterus-index volgens
A-Bernheiminde kliniek zijn o.a. gedaan door H. P. M a u e ,
G. W. Milroy^quot;®) en Hubbard en Allisson®®).

N. W. Elton®^) heeft de icterus-index vergeleken met de
bilirubinewaarden, die met de diazo-reactie verkregen worden. Bij
een direct reageerend serum komt een bepaalde icterus-index over-
een met een veel geringere hoeveelheid bilirubine dan bij een indi-

reet reageerend serum. Hieruit besluit de schrijver, dat het directe
bilirubine het serum intensiever kleurt dan het indirecte.

Ons lijkt het ook mogelijk, dat de eiwit-adsorptie van het directe
bilirubine een rol speelt en dat daardoor bij een bepaalde icterus-
index een lager gehalte aan direct bilirubine gevonden wordt, dan
dat bij een indirect serum het geval zou zijn. In dit laatste geval
gaat immers geen bilirubine met het eiwitneerslag verloren.

In ieder geval blijkt hieruit, dat de icterus-index geen zekere maat
voor den graad van de bilirubinaemie is.

G. P i o t r O w s k i geeft een kort overzicht van de tot dus-
verre gebruikte methoden n.l. de directe vergelijking van de serum-
kleur, de oxydatie en de diazo-reacties. Hij vergelijkt onder deze
laatste de uitvoering volgens H ij mans van den Bergh,
Haselhorst en Thannhauser en prefereert de laatste.

J. W. McNee en Ch. S. Keef er»») pasten de methode
van Thannhauser toe voor de directe en de oude methode
volgens H ij mans van den Bergh voor de indirecte reactie.
Als vergelijkingsvloeistof gebruikten zij de waterige oplossing van
cobaltsulfaat. Zij deelen hun resultaten en gunstige ervaringen mede.

Walter»^) heeft eveneens de methode van M e u 1 e n-
gracht lichtelijk gemodificeerd. Hij gebruikt n.1. een andere ver-
gelijkingsvloeistof: 10 cc. kaliumbichromaat 1 : 10.000 met 0,2 cc.
oplossing van orange-poirier 1 : 10.000. Verder gebruikt hij in plaats
van het serum het oxalaat-plasma, omdat men op die manier minder
last heeft van haemolyse. Hij geeft een correctie aan voor de bereke-
ning op totaal bloed. Ook hij drukt de waarde van de kleur van
het serum uit, zooals A. B e r n h e i m dat doet, doch spreekt niet
van „icterus-indexquot;, maar van „indice biliaire plasmatiquequot;.

N. Fiessinger en H. W a 11 e r geven een korte op-
somming van de tot 1928 gebruikte methoden. Zij beschouwen de
diazoreactie als dè methode der keuze en geven aan bij welke ziek-
ten het verrichten van deze reactie nut kan hebben.

E. EnriquesenR. Sivo=«) hebben getracht het bezwaar,
dat zooveel bilirubine met het eiwit neerslaat, te ondervangen door
geen alkohol, doch coffeine toe te voegen. Zij voeren de reactie
aldus uit: 0,5 cc. serum en 0,5 cc. 20 % coffeino natrium benzoicum
en 0,2 cc. reagens. Zij vinden getallen, die aanzienlijk hooger liggen

dan die, welke met de diazo-reactie in den ouden vorm werden ge-
vonden, Dit is niet verwonderlijk voor de directe sera, doch zij von-
den ook verschillen van 20 % en meer bij indirecte reacties (haemo-
lytische icterus werd niet onderzocht) en zelfs bij normale sera. Zij
trekken uit deze laatste bevindingen de conclusie, dat ook bij directe
en normale sera een gedeelte van het bilirubine met het eiwit wordt
neergeslagen. Wij betwijfelen de juistheid van deze uitspraak,
temeer daar ons gebleken is, dat de kleur, die men verkrijgt bij deze
methode, niet gemakkelijk met die van de standaardvloeistof te ver-
gelijken is.

L. J e n d r a s s i k en A. C z i k e hebben eveneens het Cof-
feine toegepast om het bilirubine met het azoreagens te laten reagee-
ren. De uitvoering van de reactie wijkt een weinig van die van
Enriques en S i v o af. Zij luidt in het kort als volgt: 2 cc.
serum en Y^. cc. 50 % coffeinonatrium benzoicum en 1 cc. reagens
(10 cc. Ehr lich A en 0,1 cc. Ehrlich B). Na 5 tot 10 min.
'Wordt het filtraat verder verdund met 60 % alkohol.

Weltmann^*®) heeft op andere wijze getracht de fout, die door
de eiwitadsorbtie ontstaat, te verbeteren. Hij vestigt er de aandacht
op. dat, wanneer men de bepaling volgens Thannhauser uit-
■^oert, er een grofvlokkig neerslag ontstaat, dat toch nog een ge-
deelte van het azobilirubine, dat van tevoren gevormd is, meesleept.
Hij voegt daarom niet, zooals Thannhauser, eerst het azo-
reagens en dan den alkohol toe, doch mengt deze beide en voegt
hieraan het serum en vervolgens iets ammoniumsulfaat in substan-
tie toe. Op deze manier toont hij aan hoogere waarden te krijgen
dan met de methode van Thannhauser, dus waarden, die
dichter bij de werkelijke moeten liggen. Bovendien voert hij als voor-
deel aan, dat zijn methode zoowel op het directe als op het indirecte
serum is toe te passen, terwijl Thannhauser zijn methode
slechts op directe sera kan toepassen en voor indirecte sera nog de
oorspronkelijke uitvoering gebruikt. Overigens vergelijkt ook
Weltmann de kleur van het azobilirubine in zuur milieu.

De reactie wordt als volgt uitgevoerd: Y^ cc. reagens (of bij
zwakke sera 0,3 cc.) wordt bij 3,9 cc. (resp. 4,1 cc.) 96 % alkohol
gevoegd. Hierbij wordt 1 cc. serum gedaan, geschud en 5 min. ge-

wacht tot de maximale koppehng bereikt is. Nu wordt nog een
mespunt gepulveriseerd magnesiumsulfaat toegevoegd, 2 min. ge-
schud en gefiltreerd. Bij 0,9 cc. filtraat wordt 0,1 cc. geconcentreerd
zoutzuur gedaan. De verdunning bedraagt 1 : 6.

N. Fiessinger, V. Jourdain en D. Touissoul-quot;)
voeren als bezwaar van de methode van Weltmann aan,
dat zij bij sterke icterus na toevoeging van HCl een te intensieve
blauwe kleur kregen, zoodat de vloeistof aanzienlijk verdund moest
worden. Hierdoor neemt de nauwkeurigheid van de methode natuur-
lijk af. Bij zwakke oplossingen is daarentegen de vloeistof soms te
weinig gekleurd om een aflezing mogelijk te maken. Dit laatste kan
men echter van de diazoreactie in het algemeen zeggen, zoodat van
verschillende zijden erop gewezen is, dat men de hypobilirubinae-
mieën beter kan bestudeeren met de methode Meulengracht.

M. ChirayenF. Thiebaut®®) wijzen op de moeilijk-
heden die men ondervindt bij het colorimetreeren van de azokleur-
stoffen. Noch de aetherische oplossing van ferrirhodanide, noch de
cobaltsulfaatoplossing geven goed te vergelijken kleuren. Zij heb-
ben daarom een apparaatje geconstrueerd waardoor het mogelijk is
een standaardoplossing van bilirubine längeren tijd te bewaren en
dus steeds op gemakkelijke wijze als vergelijkingsvloeistof te kun-
nen gebruiken.

U. de Castro^®) beschrijft een methode om het directe en
het indirecte bilirubine apart te bepalen. Het indirecte bilirubine
wordt n.1. geëxtraheerd uit het serum met chloroform, het directe
wordt bepaald doordat wordt nagegaan, hoeveel S a b a t i n i ' s
reagens (zoutzuur en natriumnitriet) noodig is om het te oxydeeren,
zoodat de diazoreactie wegblijft.

H. Shay en E. Sch lossquot;®) bespreken de moeilijkheid, de
4 vormen van reactie, die L e p e h n e onderscheidt n.1. de directe,
de vertraagd directe, de diphasische en de indirecte reactie, te her-
kennen. Zij vestigen er de aandacht op, dat zelfs bij de volkomen
directe reactie vrijwel nooit aan den eisch van L e p e h n e voldaan
wordt, dat de maximum kleurintensiteit binnen 30 seconden bereikt
is. Ook zij vonden, dat met de modificatie volgens Thannhau-
s e r hoogere waarden verkregen worden, dan met de oorspronke-

lijke methode. In het algemeen vonden zij lagere waarden in het
plasma dan in het serum.

M. S. Nichols en J. Warren Jackson gaven een
verbeterde standaard aan voor bilirubinebepaling. In plaats van de
oorspronkelijk aangegeven waterige oplossing van cobaltsulfaat, ge-
bruiken zij een oplossing van zoutzure cobaltsulfaat, die zij in gesloten
ampullen bewaren. De sterkte van deze oplossing wordt vastgesteld
door vergelijking met kunstmatig bilirubine en op dezelfde wijze wordt
door de vergelijking met de ampullen, de sterkte van de te onderzoe-
ken sera bepaald. We konden ons er zelf van overtuigen, dat inder-
daad de kleur van het zoutzure cobaltsulfaat beter vergelijkbaar is met
die van het geazoteerde serum, dan de gewone neutrale oplossing.

G. H u n t e r ®®) paste bij de bepaling een bufferoplossing toe om
beter vergelijkbare kleuren te verkrijgen. Hij ontdekte, dat de vol-
gens de oorspronkelijke beschrijving van H ij mansvan den
Bergh samengestelde standaardoplossing van bilirubine geen
1 : 200.000 gram bilirubine bevatte, maar 1 : 250.000. Immers aan-
gegeven werd, dat 0,05 mg bilirubine opgelost werd in 12,5 cc.
en niet in 10 cc. alkohol met reagens. De waarden, die in de litera-
tuur in eenheden zijn aangegeven, zijn dus 20 % te hoog. Ook
I- M. R a b i no w i t c h^quot;') heeft tog eens op deze fout de aan-
dacht gevestigd. Het is tenslotte merkwaardig, dat de opmerkzaam-
heid van de onderzoekers er niet eerder op gevestigd is. H u n t e r
meent verder, daf. een oplossing van 1,9 gr Cobaltsulfaat in 100 cc.
quot;Water een goede standaard is en dat een standaard van 2,14 gr, zoo-
als H ij mans van den Bergh en Mc. Nee aangaven, te
hoog is.

E- Chabrol, R. Charonnat en A. Busson*^) verge-
leken de reacties van FouchetenHijmansvanden
Bergh. Zij zijn zeer critisch ten opzichte van deze laatste: terwijl
Waterige oplossingen van bilirubine goed vergelijkbare kleuren ga-
ven, vonden zij in eiwithoudende bilieus een rose-gele kleur, die de
Vergelijking moeilijk maakt. Bovendien werden door hen in even-
redige verdunningen geen evenredige hoeveelheden bilirubine terug-
gevonden.

B. Va rel a en J. Esculierquot;^) hebben de methode van de
«^astro^) om het directe en het indirecte bilirubine apart te

bepalen, verbeterd door het serum niet een keer, doch herhaaldelijk
met chloroform te extraheeren. Met de diazoreactie bepaalden zij
aldus de indirecte bihrubinehoeveelheid. Het directe bilirubine be-
paalden zij op andere wijzen als de Castro het deed, n.1. uit de
geëxtraheerde rest van het serum werd ook door middel van de
diazoreactie de bepaling verricht. In een latere publicatie hebben
B. V a r e 1 a en P. R e c a n t e nog een vereenvoudiging van
deze methode meegedeeld. De uitvoering is als volgt: 1 cc. serum
wordt met 2 cc. 12 % natriumsulfaat gemengd en dit mengsel met
5 cc. chloroform geschud en gecentrifugeerd. De chloroform wordt
afgepipetteerd, waarna het serum nogeens geëxtraheerd wordt door
chloroform en zoonoodig nog meerdere malen tot het chloroform
geen gele kleur meer vertoont. Deze wordt vervolgens op een
waterbad van 80° ingedampt. De droge rest wordt opgelost in
0,2 cc. chloroform, 1,7 cc. alkohol 96% en 0,1 cc. reagens. Na
10 minuten kan men deze vloeistof colorimetreeren. De verdunning
bedraagt 1 op 2. Het directe bilirubine wordt bepaald door bij de
rest van het serum 0,4 cc. reagens te voegen, te mengen, aan te
vullen met 96 % alkohol tot 10 cc., na eenige minuten nog eens
0,2 cc. reagens toe te voegen en te filtreeren. De verdunning be-
draagt voor direct bilirubine 1 op 10. De resultaten van de geschei-
den bepaling der bilirubine zijn door ons elders besproken.

Ook W. Kerppola**, die de chemische eigenschappen
van bilirubine uitvoerig heeft bestudeerd, heeft een chloroform-
extractiemethode aangegeven, die het mogelijk maakt, zoowel het
directe als het indirecte bihrubine, gescheiden te bepalen. Het indi-
recte bilirubine extraheert ook hij met chloroform, nadat het daarin
oplosbaar is gemaakt door toevoeging van zuur. De hoeveelheid
galkleurstof in de extracten bepaalt hij of met de diazoreactie, óf
door de gele kleur van het chloroform direct te vergelijken met een
vergelijkingsvloeistof. Van al deze chloroformextractmethoden kan
men zeggen, dat, zoo ze al exacte waarden geven, ze veel te omslach-
tig zijn voor het dagelijksch gebruik in de kliniek. Bovendien ver-
toonen ze, althans uitgevoerd volgens de methode van K e r p p o 1 a
de fout, dat ze de lipochromen mee opnemen in het chloroform-
extract. Wil men echter de waarden van het directe en indirecte bili-
rubine gescheiden leeren kennen, dan stellen slechts deze methoden

F.nbsp;D. White^^) paste in navolging van Nichols en
Jackson het zoutzure cobaltsulfaat toe en vond, dat hiermee
goede resultaten bereikt werden. Hij paste, evenals Hunter, een
bufferoplossing toe om de maximale koppeling te verkrijgen. Ver-
volgens berekende hij nauwkeuriger de verdunning bij de methode
van Thannhauser en paste deze berekening toe. Hij meent op
deze manier betere uitkomsten te verkrijgen. Ook hij geeft aan, dat
met de oorspronkelijke methode lagere waarden verkregen worden.
In een latere publicatie quot;') heeft White de icterusindex van het
serum vergeleken met die van het filtraat na onteiwitting met alko-
hol, welke hij de „residual icterusindexquot; noemt. De verhouding tus-
schen icterusindex en residual icterusindex noemt hij de „Icteric
ratioquot;. Deze waarde vond hij bij normale personen en bij lijders aan
haemolytische icterus 1, hetgeen dus zeggen wil, dat bij deze per-
sonen geen bilirubine met eiwitneerslag verloren gaat. Hooger dan
1 is zij echter bij obstructie- en toxische icterus. In deze icteric ratio
meent hij dus tusschen de eerste en de laatstgenoemde vormen van
icterus een differentiaaldiagnosticum te hebben.

G.nbsp;D a d d i gebruikt voor de diazoreactie een wat gewijzigd
reagens, n.1. kaliumisoparanitrodiazobenzol opgelost in een 5 tot
10 % formalineoplossing tot een sterkte van I : 1000 tot I : 5000.
Dit reagens geeft met bilirubine een rose kleur; volgens de auteurs
reageeren alle sera hiermee direct.

F.nbsp;F e r r a n t i en G. P i s a n i hebben met succes het rea-
gens van D a d d i toegepast.

G.nbsp;Dominici en G. Marengovergeleken de verschil-
lende modificaties van de methode van H ij mans van den
Bergh (Thannhauser, Weltmann en Jost, Jen-
drassik), die van Weltmann en Jost geeft de hoogste
Waarde. Die van Jendrassik en H ij mans van den
Bergh komen vrij goed met elkaar overeen. De waarden van
Thannhauser liggen tusschen die van Weltmann en
Jendrassik in.

E. H. B e n s 1 y is het opgevallen, dat de verschillen die men
vindt wanneer men de methode van Thannhauser en Hij-

mans van den Bergh vergehjkt, bijzonder groot zijn bij afne-
mende icterus. Blijkbaar gaat dan juist veel bilirubine met het eiwit
verloren. Voor het vaststellen van de z.g. latente icterus zijn beide
methoden even gevoelig.

V. J. Kazakov®®) doet de qualitatieve proef volgens V o g 1
en Z i n s waarbij een eiwitneerslag met trichlorazijnzuur wordt
veroorzaakt en de quantitatieve proef volgens Herzfeld®quot;)
(oxydatie met Hammersten's reagens). Serum wordt dus ver-
dund in een reeks dusdanig, dat de grootste verdunning kleurloos is
en vervolgens wordt bij iedere verdunning in een buisje 1 cc. 20 %
trichloorazijnzuur gedaan. Nagegaan wordt nu, welk residu zich nog
aan de lucht groen kleurt. Aangezien de oplossing, waarin dit plaats
vindt, volgens mededeeling van den auteur 1,56 mgr % bilirubine
bevat, kan men uit de verdunning de hoeveelheid galkleurstof in het
oorspronkelijke serum berekenen.

M. Laemmer en J. Beek®®) meenen de totale hoeveelheid
bilirubine het beste als volgt te kunnen bepalen: 0,5 cc. serum en
0,25 cc. reagens, 2 minuten wachten, toevoegen van 0,25 cc. verzadigd
ammoniumsulfaat, schudden en centrifugeeren. Zij lezen tenslotte
door toevoeging van zoutzuur in sterk zuurmilieu de waarde af.

C. E. May, R. Martindale en W. F. Boyd®») isoleer-
den het bilirubine uit waterige oplossingen door het neer te slaan met
bariumchloride en natriumbifosfaat of trifosfaat en dit neerslag ver-
volgens te azoteeren. Zij probeerden daartoe een reeks azoverbindin-
gen. Ook zij stelden nogmaals vast, dat biliverdine de diazoreactie
niet geeft.

E. Chabrol, R. Charonnat en A. Busson®®) voerden
de diazoreactie als ringreactie uit en wel in den ouden vorm van
Gilbert als „réaction hmitequot;. In het kort beschreven wordt de
reactie als volgt uitgevoerd: het serum wordt in een reeks buisjes
verdund met 15 % magnesiumsulfaat, b.v. serum 1 : 20, 2 : 20, 3 : 20,
4 : 20 en op deze verdunningen wordt het MgS04 19 : 20. 18 : 20,
17 : 20. 16 : 20 reagens gebracht. Wanneer men nu. zooals Cha-
brol voorschrijft. 15 minuten wacht, kan men nagaan bij welke
verdunning nog een roode ring waarneembaar is. Dit buisje bevat,
naar de schrijvers hebben vastgesteld, 2 mg % bilirubine. Al naar-
gelang van de sterkte van het serum zal men dus meer of minder

Sterke verdunningen van het serum moeten maken om de „diazo-
reaction limitequot; te vinden. Heeft men eenmaal een groot aantal be-
palingen met de methode gedaan, dan zal men, afgaande op de kleur
van het serum, weten, welke verdunning men ongeveer moet maken,
maar zoolang men deze ondervinding nog niet heeft, is het maken
van de groote reeks verdunningen, vooral bij wat sterkere sera, een
zeer omslachtig werk. Afgezien van dit bezwaar is de reactie zeer
eenvoudig uit te voeren en geeft ze exacte resultaten. De overwegin-
gen, waartoe ze aanleiding geeft wat betreft het onderscheid tus-
schen directe en indirecte reactie, hebben we reeds eerder bespro-
ken. Men kan erover van meening verschillen wat de voorkeur ver-
dient: een colorimetrische bepaling of de ringreactie. C h a b r o 1
zelf zegt, dat men het eerder eens kan worden over het verschijnen
van den rooden ring, dan over de gelijkheid van 2 kleuren. Wij zijn
geneigd dit te bevestigen daar waar het de diazoreactie betreft, een
reactie, waarbij het vergelijken van de kleuren van azobilirubine en
cobaltsulfaat steeds zoo bijzonder moeilijk was. Sinds echter de afle-
zing in monochromatisch licht is ingevoerd ) en men dus nog
slechts de intensiteit van eenzelfde kleur hoeft te vergelijken, schijnt
ons de colorimetrische bepaling de voorkeur te verdienen.

Vergelijking tusschen de methoden van H ij mans van den
Bergh en Grotepass en van C h a b r o 1.

De twee groote bezwaren van de oorspronkelijke methode
H ij mans van den Bergh n.1. het groote verlies aan bili-
rubine met het eiwitneerslag en de slechte vergelijkbaarheid van de
kleuren in de colorimeter zijn in een modificatie, die de auteur in
1934 met W. G r o t e p a s s beschreven heeft, vrijwel over-
wonnen. De schrijvers bevalen n.1. aan, de colorimetrie in mono-
chromatisch licht te verrichten. Wanneer van de verschillende ge-
azoteerde bilirubineoplossingen (directe, indirecte en kunstmatige)
met behulp van een bufferoplossing bij dezelfde pH. absorptiecurven
gemaakt worden, blijken deze ongeveer hetzelfde verloop te hebben
en in het gebied van de maximale extinctie (520—-546 f*/^, ) samen
te vallen. Met behulp van een groen filter, dat slechts stralen tus-
schen deze golflengten doorlaat (Zeissfilter S 53), kan men de kleu-
ren van geazoteerde sera en een standaardoplossing van bilirubine
vergelijken. Evengoed als door een standaardvloeistof kan men het
licht op constante wijze door een vast tralierooster laten verzwak-
ken. Met de op die manier verkregen constante intensiteit groen kan
men evengoed de azobilirubine vergelijken. Wanneer men van een
dergelijke colorimeter of liever photometer, met behulp van oplos-
singen van kunstmatig bilirubine van bekende sterkten een ijkings-
curve maakt, kan men via deze curve direct den afgelezen stand van
de colorimeter in de sterkte van de te onderzoeken vloeistof herlei-
den. In het kort uitgedrukt hoeft men bij de beschreven wijze van
werken slechts 2 intensiteiten van dezelfde kleur te vergelijken, het-
geen de bepaling gemakkelijker en eenvoudiger maakt.

Onafhankelijk van deze schrijvers, bevelen ook A. K r u p s k i en F. A1-
m a s y aan, de sterkte van het blauwe azobilirubine in monochromatisch licht
te meten. Men moet dan gebruiken het filter S 57 van Zeiss of Schott OG2.

De tweede verbetering, die beschreven wordt, is de vermijding
van een eiwitneerslag. Reeds vroeger had H ij mans van den
Bergh hiervoor aanbevolen het directe serum met physiologisch
water sterk te verdunnen. Doet men dit, dan krijgt men bijna steeds
troebele oplossingen, terwijl bij niet sterke sera dikwijls de verdun-
ning de kleur zoo aanzienlijk doet verzwakken, dat de bepaling
daardoor onmogelijk wordt. De schrijvers vonden, dat, wanneer men
het serum met 50 % alkohol verdunt, er althans bij een juiste onder-

linge verhouding van alkohol, serum en reagens, geen troebeling
ontstaat. Daar de colorimetrie, zooals gezegd, in monochromatisch
licht bij een bepaalde pH. moet worden verricht, wordt ook een
bufferoplossing toegevoegd (buffer van Mc. 11 v a i n e, pH. 6,6).
De uiteindelijke uitvoering wordt nu als volgt gedaan:

aanvullen met aq. dest. tot 5 cc. en met bufferalkohcl (90 deelen alkohol
50 % en 10 deelen Mc. 11 v a i n s buffer) aanvullen tot 10 cc. Na 15 minu-
ten is de koppeling volledig en kan de colorimetrische bepaling verricht
worden.

De beschreven modificatie is alleen te gebruiken voor direct rea-
geerende sera, voor de indirecte wordt de bepaling volgens de
oorspronkelijke methode verricht, maar de aflezing van den colori-
meter kan in monochromatisch licht verricht worden. Hoewel deze
modificatie als een groote verbetering te beschouwen is en de ver-
kregen waarden de totale hoeveelheid direct bilirubine in het serum
uitdrukken, zijn er nog enkele bezwaren aan verbonden. Voor de
aflezing in monochromatisch licht kan men niet den colorimeter van
Authenrieth gebruiken, doch moet men de beschikking hebben
over den veel kostbaarder colorimeter van Klette. Bovendien
moet voor iederen colorimeter met rooster een ijkingscurve gemaakt
Worden, wat voor hen, die geen geoefende chemici zijn, een omvang-
rijk en moeilijk werk beteekent. Over eenigen tijd zullen echter colo-
rimeters met ijkingscurve door de fabriek worden afgeleverd. En
tenslotte is de verdunning (1 : 10) er de oorzaak van, dat de kleur
hij de geringere graden van icterus soms te zwak is om in monochro-
matisch licht te worden afgelezen.

Uit bijgaande tabellen blijkt, dat de methode van H ij mans van
den Bergh en Grotepass hoogere waarden geeft dan die
van Thannhauser en Andersen of die van Welt-
mann en Jost. Met de eerst genoemde zijn de verschillen echter
niet bijzonder groot. Wat de methode van Weltmann en Jost
betreft, deze geeft weliswaar hoogere uitkomsten van de oorspronke-
lijke methode van H ij mans van den Bergh, doch de getal-
len zijn veel (tot 50 %) lager dan die, welke met de nieuwe methode
gevonden worden. De verschillen zijn vooral groot bij de sera met

directe reactie. Dan is het neerslag, dat op het fiher achterbhjft, ook
intensief rood gekleurd. Voor de indirect reageerende sera geeft de
methode van Weltmann en Jost overeenkomstige uitkomsten
met die van H ij m a n s V a n den Bergh, doch dit is in verband
met het ontbreken van eiwitadsorptie bij indirecte reactie niet anders
te verwachten. Dat de Weltmann en Jost, zooals de auteurs
pretendeeren, het totale bilirubine in het serum aantoont, kan echter
als weerlegd beschouwd worden.

Vergelijking tusschen de methoden van H ij m a n s van den
Bergh, Grotepass en Thannhauser en Andersen.

Vergelijking tusschen de methoden van Weltmann en Jost
en H ij mans van den Berg h-G rotepass.

Reeds H ij m a n s van den Bergh had cr op gewezen, dat
het directe bilirubine zich van het indirecte onderscheidt doordat
o.a. na de onteiwitting met alkohol het neerslag geel gekleurd is,
d.w.z. bilirubine bevat, terwijl dit bij het indirecte bilirubine niet het
geval is. Zooals we gezien hebben berust een gedeelte van dc
methoden tot bepaling van het bilirubine in het bloed op oxydatie
van dit geel gekleurde neerslag. Het spreekt vanzelf, dat men met
deze methoden slechts een gedeelte van het totale bihrubine bepaalt,
doch dit bezwaar zou zoo groot niet zijn, wanneer het steeds een
constante fractie betrof. Men heeft feitelijk steeds aangenomen, dat
de hoeveelheid bilirubine, die neerslaat met het eiwit, ongeveer
evenredig is met de totale hoeveelheid in het bloed aanwezige
galkleurstof cn cr zich verder niet mee bezig gehouden. Slechts
enkele onderzoekers (Meulengracht, White, Benslcy)
hadden opgemerkt, dat het neerslag toch wel veel geler was bij af-
dan bij toenemende icterus of hadden gezien, dat juist bij afnemende
icterus zich groote verschillen gingen voordoen tusschen de uit-
komsten van bepaalde methodes, zooals die van H c r z f e 1 d en de
oorspronkelijke methode van Hij mans van den Bergh. De
eerste, die systematisch het verband heeft nagegaan tusschen den
graad der eiwitadsorptie van het bilirubine en den klinischen toe-
stand van den patiënt, was P. W i e m e r Hij onderzocht van
vele icterische sera de hoeveelheid bilirubine, wanneer die langs den
directen weg werd bepaald en de hoeveelheid bilirubine, die in het
serum gevonden wordt na onteiwitting met alkohol, dus volgens de
oorspronkelijke methode. De verhouding tusschen beide getallen
noemde W i e m e r de bilirubinc-index (niet te verwarren met den
icterusindex van A. Bernheim). De bilirubine-index bedraagt
b.v, 1, wanneer de directe waarde en die, verkregen na alkohol-
onteiwitting (door Wiemer ten onrechte de indirecte waarde

genoemd), gelijk zijn. Hij vond nu. dat de bilirubine-index bij ver-
schillende sera sterk wisselde, maar slechts schijnbaar zonder eenige
regelmaat. Bij afsluiting der groote galwegen is de bilirubine-index
(B.I.) n.1, des te lager, naarmate het serum korter na het ontstaan
van de afsluiting onderzocht wordt, steeds is de B.I. echter hooger
dan 1. d.w.z. dat bij afsluitingsicterus altijd een gedeelte van de gal-
kleurstof aan het eiwit geadsorbeerd is. Zoodra echter de oorzaak
van de afsluiting opgeheven wordt, stijgt de B.I. en wel des te sneller
en hooger, naarmate deze oorzaak vollediger opgeheven wordt. De
B.I. kan daarbij waarden van 10 bereiken. Geleidelijk daalt de B.I.
dan weer met het geheel verdwijnen van den verhoogden bilirubine-
spiegel in het bloed.

Hoe komt het. dat bij afnemende icterus een zoo groot gedeelte
van het bilirubine, tot 90 % toe, aan het eiwit geadsorbeerd is? Vol-
gens de voorstelling van W i e m e r bestaat er in het bloed ccn
evenwicht tusschen de bilirubine, die in het plasma werkelijk opge-
lost is en die, welke aan de eiwitten geadsorbeerd is. De galzuren
verhoogen wellicht de oplosbaarheid van bilirubine. Vandaar, dat
volgens W i e m e r bij beginnende afsluiting, als er ook veel gal-
zuren in het bloed teruggestuwd zijn, het bilirubine grootendeels in
oplossing en voor een klein gedeelte slechts aan de eiwitten geadsor-
beerd is. Daalt echter bij afnemende icterus de spiegel van de galzure
zouten in het bloed, dan zal omgekeerd de oplosbaarheid van het bili-
rubine afnemen en de eiwitadsorptie verhoogd worden.

Afgezien van het feit. dat deze veronderstelling van W i e m e r
nog bewezen moet worden, zijn er verschillende argumenten tegen
in te brengen: bij chronische afsluitingsicterus is het bekend, dat de
aanvankelijke verhooging van de galzuren in het bloed kan verdwij-
nen en de reactie van H a y in de urine negatief kan worden, zonder
dat de icterus afneemt. Er ontstaat een ictère dissocié, zooals de Fran-
schen het noemen. De eiwitadsorptie vonden wij bij chronische afslui-
tingsicterus soms wel langzaam iets toenemend, doch een zóó sterke
stijging als optreedt, zoodra de afsluiting opgeheven wordt, namen
we daarbij nooit waar. Zeer gering is ook de adsorptie bij haemo-
lytische icterus, dus daar, waar juist geen verhooging bestaat van de
galzuren in het bloed. Door toevoeging van galzuur aan het serum,
konden wij in den graad der adsorptie aan het eiwit, geen verande-

ring brengen. Het zou nog kunnen zijn, dat door het langer verblijf
van het bilirubine in het bloed, dc eiwitadsorptie toeneemt. Dit werd
reeds door W i e m e r onwaarschijnlijk gemaakt. Bewaart men het
serum in de ijskast, dan stijgt de adsorptie niet. Deze stijgt, doch
gering, wanneer men het serum eenige dagen bij 37° bewaart.

Zooals men ziet, daalt na langer verblijf in de broedstoof. zooals
gewoonlijk, het bilirubinegehalte van het serum, doch de adsorptie
blijft vrijwel gelijk.

O. W e 11 m a n n en J o s t hebben dezelfde waarnemingen
gedaan als P. Wiemer. Het totale bilirubinegehalte bepalen deze
schrijvers met een door hen aangegeven modificatie van de methode
van T h a n n h a u s e r De hoeveelheid bilirubine na alkohol-
ontciwitting wordt ook door hen volgens de oorspronkelijke methode
van Hijmans van den Bergh bepaald. De hoeveelheid bili-
rubine. die aan het eiwit geadsorbeerd is, drukken zij uit in procenten
van de totale hoeveelheid (Adsorptionswert A.W.). Zij stelden in
de eerste plaats hetzelfde vast als Wiemer: toeneming van de
afsluiting, daling van de A.W.. afneming van de afsluiting, stijqinq
van de A.W..

Voor de wisselingen van de adsorptie van het bilirubine aan de
eiwitten in het verloop van een ziekte met afsluitingsicterus geven de
schrijvers een geheel andere verklaring, dan Wiemer dit deed.
Zij stelden zich voor. dat bij afsluiting van de galwegen een gedeelte
van het bilirubine, dat in het bloed opgehoopt wordt, in de weefsels
overgaat en dat bij opheffing van de afsluiting allereerst het biliru-
bme. dat in het bloed aanwezig was zonder dat het met de weefsels
m contact kwam. uit de bloedbaan verdwijnt en dat daarna de weef-
sels het door hen vastgehouden bilirubine weer afgeven. Dit laatste

bilirubine zou door zijn verblijf in de weefsels van eigenschappen
veranderd zijn en nu een sterke adsorptie aan de bloedeiwitten gaan
vertoonen. Daar dus bij afnemende icterus het bloed grootendeels
bilirubine, afkomstig van het weefsel, bevat, zal ook de adsorptie
sterk gestegen zijn. Bij chronische afsluitingsicterus vonden W e 11-
mann en Jost adsorptiewaarden van 30 tot 50 hetgeen met
onze bevindingen overeenkomt. Zoo meenden zij, dat bij het indirecte
bilirubine in principe hetzelfde adsorptieverschijnsel zich voordoet.
Bij icterus met indirecte reactie komen echter belangrijke wisselingen
in de bilirubinaemie niet voor, vandaar, dat ook de adsorptie weinig
wisselt. Bovendien, zoo zeggen de schrijvers, zal door de hoeveel-
heid bilirubine, die in het bloed aanwezig is, slechts weinig contact
met de weefsels plaats vinden. Bereikt echter een haemolytische
icterus een belangrijke hoogte met sterke wisselingen, dan zou men
eveneens een toeneming van de A.W. kunnen zien. Bij wijze van
voorbeeld geven de schrijvers de curve van een patiënt met endocar-
ditis en insufficientia cordis. Zij nemen aan, dat de icterus hierbij van
haemolytischen oorsprong is. Helaas geven zij geen bijzonderheden
over den aard van de reactie van het serum. Uit het feit, dat de urine
bilirubine bevatte, meenen we echter te mogen besluiten, dat dit geval
er een was met directe reactie. Wij zagen, ook bij sterke haemolytische
icterus (15 E.), nimmer eenige eiwitadsorptie van beteekenis blijkens
het witgekleurde neerslag en zouden zelfs willen zeggen, dat het al
dan niet bestaan van een adsorptie van belang is voor de differentieel-
diagnose tusschen direct en indirect bilirubine. Tenslotte hebben
w eltmannenjost de eiwitadsorptie in verband trachten te
brengen met de drempelwaarde van het bilirubine. Zij namen waar,
dat bij afnemende icterus het serum nog vrij veel bilirubine bevat, ter-
wijl toch bilirubinurie ontbrak. De drempelwaarde van 4 E. die
H ij mans van den Bergh indertijd vaststelde, gaat dus blijk-
baar niet steeds op. De schrijvers meenen, dat de mate van eiwit-
adsorptie van groote beteekenis is voor het ontstaan van bilirubinurie:
is deze adsorptie groot, dan ontbreekt volgens hen bilirubinurie, ook
al overschrijdt de totale hoeveelheid bilirubine in het serum de 4 E.
Wellicht kan slechts het niet geadsorbeerde bilirubine de nieren pas-
seeren. Uit hun getallen zou men echter kunnen afleiden, dat op dezen
'egel vele uitzonderingen voorkomen. Zoo geven zij een geval, waar-

bij de totale hoeveelheid bilirubine 10 E bedroeg, doch de hoeveel-
heid niet geadsorbeerde galkleurstof nauwelijks te bepalen was. Hier-
bij bestond echter bilirubinurie. De schrijvers redden zich uit deze
moeilijkheden door aan te nemen dat in de eerste plaats bij albumi-
nurie ook geadsorbeerd bilirubine in de urine overgaat en in de tweede
plaats, dat bij cardiale icterus er een bijzonder hooge drempel in de
nier bestaat als gevolg van de chronische stuwing. In het geheel
onverklaard blijft het ontbreken van bilirubinurie bij haemolytische
icterus, dus daar. waar juist een eiwitadsorptie vrijwel ontbreekt.

Wanneer men de getallen, die W e 11 m a n n en J o s t verzamel-
den, om de drempelwaarde vast te stellen, nagaat, dan ziet men. dat
de meeste van deze getallen met een drempelwaarde van 4 E (wat
de totale hoeveelheid bilirubine betreft) wel overeenkomen, doch dat
deze drempelwaarde in sommige gevallen wordt overschreden. Juist
in deze gevallen zou het ons interesseeren of de reactie in het serum
direct of indirect was, doch zooals gezegd, ontbreken hieromtrent
aanwijzingen. De geringe hoeveelheid adsorptie, die blijkbaar in som-
mige van genoemde gevallen bestaat, doet ons vermoeden, dat de
reactie voor het overschrijden van den drempel een verklaring zou
kunnen geven, aangezien bij indirecte reactie van het serum toch
practisch nooit bilirubinurie wordt gezien. De schrijvers wijzen er nog
op, dat de A.W. voor het stellen van de prognose van belang kan zijn.
Stijging van de A.W. is veelal het eerste teeken van afnemen van de
icterus, daar, waar de huidskleur nog geen veranderingen vertoont,
of de totale hoeveelheid bilirubine met de gebruikelijke methode be-
paald, nog niet duidelijk daalt.

N. Fiessinger, V. Jourdain en D. Toissoul*») heb-
ben de proeven van Weltmann en Jost herhaald. Zij ver-
geleken de methode van deze schrijvers met die van H ij m a n s
van den Bergh en van Jendrassik. In het algemeen
gaven de methoden van Weltmann en Jost en Jendras-
s i k dezelfde resultaten. De oude methode gaf lagere getallen. Bij
directe bilirubinaemieën met lagen spiegel en bij indirecte bilirubi-
naemieën gaf daarentegen de oude methode hoogere waarden, dan
die van W e 11 m a n n en J o s t. Soms was met de methode van
de laatsten in het geheel geen bilirubine meer aan te toonen, terwijl
dit nog wel het geval was met die van H ij m a n s van den

Bergh. Bij sterkere bihrubinaemieën is de blauwe kleur in het
alkalische milieu soms 200 sterk, dat verdund moet worden. De
groote verdunning veroorzaakt een onnauwkeurigheid bij de colo-
rimetrische bepaling, hetgeen Fiessinger als een nadeel van de
methode van Weltmann en Jost ziet. Ook wij vonden, dat
Wanneer men de aflezing deed in het neutrale milieu, de getallen van
W eltmann en Jost geenszins, zooals zij beweerden te doen,
de totale bilirubine weergaven, maar niet onbelangrijk lager liggen
dan die, welke men met de methode van H ij mans van den
Bergh en Grotepass vindt.

Wat de eiwitadsorptie betreft, ook Fiessinger en zijn mede-
Werkers namen een stijging waar, zoodra de afsluiting van de groote
galwegen opgeheven wordt. Merkwaardigerwijze wijken de getal-
len, die zij geven, sterk af van die van Weltmann en Jost en
Wi e m e r. Bij beginnende afsluiting vinden zij n.1. O % adsorptie.
Bij afnemende icterus stijgt de adsorptie tot 50 %, een enkele maal
tot 75 %. Vooral de eerste getallen zijn wel geheel in tegenspraak
met de bevindingen van de eerstgenoemde onderzoekers en die van
ons. O % adsorptie vonden wij nooit bij directe icterus. Bij beginnende
afsluiting is de adsorptie meestal, zoodra de bilirubine in het serum ver-
hoogd is en de directe reactie geeft, grooter dan 0%. Weltmann
en Jost geven op als getallen, die zij in het begin van een afsluiting
vonden: 10 tot 50 %. Ook wij vonden dergelijke waarden. Dat Fies-
singer en zijn medewerkers soms geen adsorptie vonden bij zijn
gevallen van afsluitingsicterus, moet wel aan de door hen gebruikte
techniek tot bepaling van het totale bilirubine liggen. Deze techniek
vermeldden zij echter niet. Om dezelfde reden is het niet duidelijk
Waarom zij bij afsluitingsicterus met de methode van H ij m a n s
Van den Bergh hoogere waarden vonden dan met die van
Weltmann en Jost of Jendrassik. Bijna alle onderzoe-
kers hebben het omgekeerde vastgesteld.

Zij toonden ook aan. dat de adsorptie niet toeneemt door verdun-
ning van het icterische serum met physiologisch water of met serum
Van normale personen of door het serum te bewaren bij 37°. Deze
feiten werden ook door ons vastgesteld. Fiessinger ziet ook
Verband tusschen de adsorptie aan de eiwitten en de reactie van het
bilirubine. Neemt b.v. een catarrhale icterus af, dan stijgt de adsorptie-

waarde, terwijl met het afnemen van de icterus vaak een diphasische
reactie gaat optreden. Men neemt dus tegelijkertijd een verhoogde
adsorpt. en een vertraging van de reactie waar. De schrijvers ge-
looven daarom, dat tusschen beide een oorzakelijk verband bestaat
Fiessinger neemt aan. zooals Weltmann en Jost dat
ook deden, dat bij afnemende icterus het bilirubine uit de weefsels

overtreft. Het bihrubme de retour zou de indirecte reactie geven en
er daardoor de oorzaak van zijn. dat bij afnemende icterus de reactie

ook b, haemolytische icterus als het gevolg van het langdurige con-
tact van het serumbilirubine met de weefsels. Ook hier komt volgequot;
zi,n opvatting slechts bilirubine de retour in het bloed voor Hetïjk
ons. dat zil evenals trouwens enkele andere onderzoekers, geen
scherp onderscheid maken tusschen het indirect reageerende bL-

yo dan toch nog was de reactie volkomen direct. De indirecte
reactie heeft wellicht als meest typisch kenmerk het ontbreken van
een eenigszins belangrijke eiwitadsorptie.

Ook V. Jourdain-) heeft zich met het vraagstuk van de
eiwitadsorptie beziggehouden. Hij heeft tevens nog eens den saLn!
hang tusschen d. cholesterinespiegel van het bloed, het eiwitspectrum

en de diazoreactie nagegaan. Hij kon nog eens bevestigen, dat een
samenhang tusschen de samenstelling van het plasma en de snelheid
van de diazoreactie niet bestaat, iets wat aanvankelijk door sommige
onderzoekers (o.a. Adler en Strauss) beweerd werd.

Dat met het stijgen van de bilirubinaemie de reactie direct wordt,
is een opvatting, die eveneens door vele onderzoekers gehuldigd
wordt, doch door J o u r d a i n weerlegd werd. Voegde hij aan serum
een oplossing van bilirubine in soda toe, welke oplossing direct rea-
geert, dan bleef deze oplossing van alkalisch bilirubine in serum tot in
sterke verdunningen de directe reactie geven. J o u r d a i n neemt, met
vele anderen, twee chemisch verschillende soorten bilirubine aan. Hij
wijst op de onderzoekingen van Griffith en K a y e ), die che-
mische verschillen vonden tusschen het bilirubine uit de direct reagee-
rende sera en het, door toevoeging van alkali aan kunstmatig biliru-
bine, direct reageerend gemaakte bilirubine.

Wat de eiwitadsorptie betreft, bevestigt hij de phenomenen, die
Wiemer en Weltmann en Jost het eerst hebben waarge-
nomen. Dat hij, zooals reeds in de publicatie met N. Fiessinger
vermeld werd, in gevallen, waarbij de intensiteit van de icterus weinig
wisselde, doch de reactie direct was, meestal O % adsorptie vond.
Verbaast ons. Hij vestigt er verder zeer terecht de aandacht op, dat
de vertraagde reactie, die men vaak bij afnemende icterus waarneemt,
tegelijk met de sterke verhooging van de adsorptie aan de eiwitten,
een geheel andere beteekenis heeft, dan de indirecte reactie bij hae-
molytische icterus. Zooals gezegd, maken Weltmann en Jost
en ook Fiessinger tusschen beide geen groot onderscheid. Bij
de echte, indirect reageerende sera, is de adsorptie juist zeer laag. Om
dezelfde reden verwerpt J o u r d a i n ook de veronderstelling van
W eltmann en Jost, dat in de normale sera het bilirubine de
indirecte reactie geeft, omdat het met de weefsels zoo langdurig in
contact geweest is. Wanneer het juist is, dat het indirecte bilirubine
aan de eiwitten gebonden is, dan is deze binding van geheel anderen
aard, dan die van het bilirubine de retour met het eiwit.

Wij hebben bij een groot aantal patiënten de hoeveelheid aan het
eiwit geadsorbeerde bilirubine nagegaan. Wij deden dit op de volgen-
de wijze: de totale hoeveelheid in het serum aanwezige bilirubine
bepaalden wij met de methode, aangegeven door H ij mans van

denBergh en Grotepass. Ongetwijfeld geeft deze methode,
daar vorming van eiwitneerslag geheel vermeden wordt, waarden, die
als de juiste beschouwd moeten worden. Van hetzelfde serum werd
een bepaling gedaan volgens de oorspronkelijke methode, d.w.z. na

onteiwitting met alkohol. Beide colorimetrische aflezingen werden
verricht in monochromatisch licht, zooals dat vroeger beschreven is.
Slechts een enkele maal, als de geazoteerde serumvloeistof te zwak
gekleurd was, hebben wij, om vroeger reeds vermelde redenen, de
bepalingen niet in monochromatisch licht, doch in een colorimeter van
A u t h e n r i e t met cobaltsulfaat als vergelijkingsvloeistof verricht.
We hebben de adsorptie slechts nagegaan bij sera met directe of

althans met diphasisch of vertraagd directe reactie. Bij de indirecte
sera worden immers belangrijke wisselingen in den bilirubinespiegel
van het bloed in het algemeen niet aangetroffen. Ook is de methode
van H ij mansvan den Bergh en Grotepass op indirecte
sera niet uitvoerbaar. Er blijkt nu, dat bij alle directe sera, in welk
stadium wij ze ook onderzochten, een gedeelte van het biftrubine aan

het eiwit geadsorbeerd is. De waarden, die wij bij deze adsorptie von-
den, zijn in het algemeen niet onbelangrijk hooger dan die, welke
door de in den aanvang van het hoofdstuk genoemde schrijvers gege-
ven worden. We schrijven dit toe aan het feit, dat deze onderzoekers
®et hun methode toch nog niet het totale bilirubine in het bloed be-
paalden. Inderdaad geven de methoden van Thannhauser en
Weltmann en Jost lagere uitkomsten, dan de methode van
H ij mans van den Bergh en Grotepass. Soms zijn de
verschillen betrekkelijk gering, doch soms vrij aanzienlijk (zie blz. 41).
oij toenemende icterus was het ons slechts zelden mogelijk het serum
Zeer vroegtijdig te onderzoeken. Meestal toch komen de patiënten met

reeds uitgesproken icterus in het ziekenhuis. Bij catarrhale icterus, die
zich overigens juist zoo goed voor de bestudeering van de adsorptie
leent, is dat wel bijna steeds het geval. Een enkele maal zagen wij
icterus onder onze oogen in het ziekenhuis ontstaan bij eenige patiën-
ten met carcinoom van den kop van het pancreas of met een steen in
de ductus choledochus, die aanleiding gaven tot afsluiting van de

ductus choledochus. Maar ook in deze gevallen was de bilirubinespie-
gel van het bloed, tengevolge van de snel toenemende icterus, reeds
bij het eerste onderzoek aanzienlijk verhoogd. We vonden bij begin-
nende toenemende icterus een percentage adsorptie van minstens 30
tot 50 %. Bij verder toenemende icterus, zooals in het genoemde geval
van carcinoma van het pancreas, nam de adsorptie, die aanvankelijk
ongeveer 40 % bedroeg, geleidelijk af (Fig. 5). Bij patiënten met
chronische icterus, waarbij de bilirubinespiegel weinig van hoogte
wisselt, zooals b.v. bij de gevallen van levercirrhose, leverabces of

leverlues (Fig. 3, 7), bleef de adsorptie vrijwel constant cn schom-
melde tusschen de 50 of 60 %, Wanneer het juist is, dat het gead-
sorbeerde bilirubine het bilirubine uit de weefsels (de retour) is, dan
is dit geval van 50 % wel te begrijpen. Er zal bij deze chronische
gevallen een evenwicht bestaan tusschen het uit de lever in de bloed-
baan teruggestuwde, niet geadsorbeerde bilirubine en de uit de weef-
sels naar het bloed terugstroomende wel geadsorbeerde galkleurstof.
Namen, zooals we dat herhaalde malen zagen, de verschijnselen van
afsluiting toe, dan daalde ook prompt de adsorptiegraad, hoewel deze
daling nooit bijzonder sterk was. Nam daarentegen de bilirubinaemie
af, dan volgde parallel daarmede, vooral in den aanvang, een
sterke stijging van de adsorptie. Daarbij vonden ook wij, dat de hoe-
veelheden geadsorbeerd bilirubine 80 tot 90 % van de totale hoeveel-
heden konden bedragen (Fig. 1, 2, 6, 9, 10, 12, 13). Op den duur
daalde de adsorptiegraad weer. Of deze daling zoo sterk was als
W eltmann en W i e m e r aangeven weten wij echter niet. Met
het afnemen van de bilirubinaemie werd het tenslotte onmogelijk de
hoeveelheden bilirubine nauwkeurig te bepalen. Zooals wij reeds eer-
der hebben gezegd, werd de kleur bij de directe methode tengevolge
van de verdunning 1 op 10, vaak te zwak om nog een goede alezing
mogelijk te maken en na alkoholonteiwitting was vaak geen aflees-
bare kleur meer aanwezig.

Zeer typisch is het verband tusschen adsorptiegraad en bilirubine-
spiegel tot uiting gekomen in het geval van een patiënt met de ziekte
van W e i 1 (Fig. 4). Aanvankelijk, in den aanvang der ziekte, daalde
met het toenemen van de icterus de adsorptie van 50 tot 30 %. Toen
de geelzucht na eenige dagen afnam, volgde een sterke toename van
de adsorptie van 30 tot 60 %. De patiënt kreeg echter, nog voor hij
genezen was, een recidief, met hooge koorts en toenemende icterus.
Daarmede ging gepaard een nieuwe daling van de adsorptie van 60
tot 30 %, tot de patiënt genas en met de snel afnemende icterus de
adsorptie van 30 tot 60 % steeg.

Ook wij hebben nagegaan of, zooals Weltmann en Jost
®eenen, verband bestaat tusschen de eiwitadsorptie en het al dan
niet optreden van bilirubinurie.

Reeds H ij mans van den Bergh meende vast te kunnen
stellen, dat voor de uitscheiding van bilirubine door de nier een drem-

UJ
lt;

'î
a
or

_BJ

'F
a

or
□

a
lt;

I
I

pelwaarde bestond en dat deze drempelwaarde bij ongeveer 4 E. lag.
Het leek ons, nu de hoeveelheid bilirubine in het serum, sinds we de
nieuwe modificatie gebruiken, zooveel meer bedraagt, dan men vroe-
ger dacht, nuttig, nogmaals te trachten de drempelwaarde van bili-
rubine in de nier vast te stellen en daarbij te letten op de hoeveel-
heden geadsorbeerd bilirubine. Onderzoekingen naar de drempel-
waarde zijn juist in den laatsten tijd vooral van Amerikaansche zijde
opnieuw ingesteld.

I. M. Rabinowitchquot;^) stelde allereerst nogeens vast, daf
de diazoreactie vrijwel specifiek is voor bilirubine. Teneinde bilirubine
in de urine aan te toonen, gebruikte hij de zeer gevoelige methode
van G. H u n t e r ««a). waarmee het mogelijk is bilirubine aan te
toonen tot in een verdunning van 1 : 660.000. Hij vond, dat de alge-
meen aangenomen drempelwaarde van 4 E zeker als te hoog moet
worden beschouwd, aangezien het bleek, dat zelfs bij patiënten met
0,4 E bilirubine in de urine kon worden aangetoond. Vooral bij af-
nemende icterus werd bij dergelijke lage waarden bilirubinurie waar-
genomen. Rabinowitch toonde verder aan, dat albuminurie
niet aansprakelijk gesteld kan worden voor het verschijnen van bili-
rubine in de urine, in gevallen met lagen bilirubinespiegel in het bloed.
In een reeks van gevallen, waarin albuminurie ontbrak, vond hij in
een evengroot percentage bilirubinurie, als in die gevallen met albi-
minurie. Zooals gezegd, werden dergelijke lage waarden in het bloed
vooral gevonden bij patiënten met afnemende icterus. Rabino-
witch ziet hierin een overeenkomst met het gedrag van de bloed-
suiker. aangezien ook de nierdrempel voor glucose bij afnemende gly-
cosaemie lager zou zijn, dan wanneer de bloedsuikerspiegel stijgende
is. Hoewel het feit, dat bilirubine niet gevonden wordt in de urine
onder normale omstandigheden, ervoor pleit, dat er een drempel-
waarde voor dit pigment bestaat, wijst het vinden van bilirubine in de
urine bij een zoo lagen bilirubinespiegel van het bloed eerder op het
tegendeel. Rabinowitch gelooft dan ook niet, dat er een drempel
voor bilirubine in de nier bestaat. Het niet vinden van bilirubinurie
bij normale personen, is volgens hem slechts te wijten aan het ontbre-
ken van een voldoende gevoelige methode om bilirubine in de urine
aan te toonen. Het lijkt ons niet moeilijk op de opvatting van R a b i-
n O w i t c h kritiek uit te oefenen. Ook al zou een zeer gevoelige

UI
lt;

'-J

ui
'p

a
or
a

I
I

t-
Q.
U)

a
eg

methode bihrubme m de urine van normale personen aantoonen. dan
zou dat nog met ple.ten tegen het bestaan van een drempelwaarde.
Immers, met zeer gevoelige methode is in de urine ook normaliter
^ucose .n sporen aan te toonen. Toch wordt aan het bestaan van een
drempelwaarde voor de bloedsuiker niet getwijfeld. Nog typiLher
misschien geldt dit voor het eiwit, dat in zeer geringe sporL fn iltre

IS. Als drempelwaarde zouden wij willen kwalificeeren die waarde
waaboven een bepaalde stof. die aanvankelijk niet of slechts Tnaut
waarneembare sporen werd uitgescheiden, in het bloed aanwezig

E H. B e n s 1 e y onderzocht de urine bij patiënten met directe
reactie lager dan 4 E. aangezien het toch we, vaststond, dat bij waa
den daarboven, bilirubinurie regelmatig voorkomt en bij patiënten
met mdirecte reactie hooger dan 1 E. Hij geeft aan. de mithode van
Thannhauser voor de kwantitatieve bepaling te gebruiken Hii
vond. dat er geen verband bestaat tusschen het La,! geha, quot;a^n

rZ oLLf R • ; quot;quot; ' 9-lWeurstof in de urine herhaaide
rl hl Knbsp;vond B e n s 1 e y in het aigemeen

ted reet h--«es als
mdirect beschouwd, waarbij de verkleuring binnen de 60 sec beqon

zooals men die bij afnemende icterus vaak vindt en die o.i, grooten-
deels directe geacht moeten worden. Zijn conclusie luidt, dat het op-
treden van bilirubinurie afhangt van den aard van het bilirubine in
het serum, direct of indirect, en dat voor het directe bilirubine geen
drempelwaarde bestaat. In deze laatste gevolgtrekking sluit hij zich
dus bij R a b i n o w i t c h aan.

Wij onderzochten in het algemeen slechts direct reageerende sera
om de drempelwaarde vast te stellen. Bij indirect reageerende sera
hebben wij nooit bilirubinurie waargenomen, ook al steeg de biliru-
binespiegel tot betrekkelijk hooge waarde. Zoo namen wij nog kort
geleden een geval van haemolytische icterus waar. waarbij de bilirubi-
naemie 14.5 E bedroeg, zonder dat de urine galkleurstof f en bevatte.
Het ontbreken van bilirubinurie schijnt ons een essentieel kenmerk
te zijn van de dynamische icterus, d.w.z. van dc gevallen van icterus,
Waarbij de reactie in het serum indirect is. In de sera werd het totale
gehalte aan bilirubine vastgesteld volgens de methode van H ij m a n s

van den Bergh en Grotepass. Inde urine hebben wij ge-
tracht de galkleurstoffen aan te toonen met de reactie van H u p-
p e r t-S a 1 k o w s k i. Deze reactie, waarbij in de urine een neerslag
van bariumcarbonaat veroorzaakt wordt, welk neerslag de bilirubine

meesleept, lijkt ons zeer gevoelig. Vooral, wanneer het neerslag in
een kleine hoeveelheid zoutzure alkohol wordt opgelost in een wit
mortiertje, kan. ook al is er slechts een geringe hoeveelheid bilirubine
in de urine aanwezig, toch na toevoeging van 0.5 % natriumnitriet de
optredende groenkleuring duidelijk worden waargenomen. Het is
mogelijk, dat er gevoeliger'methoden bestaan om bilirubine in de
urine aan te toonen. .vellicht dat dergelijke methoden zelfs bij nor-

male personen positieve uitkomsten zouden geven. Om vroeger uit-
eengezette redenen achten wij voor het bestudeeren van de drempel-
waarde een zoo verfijnde methodiek niet noodzakelijk. Het is bekend,
dat onderzoekingen naar de drempelwaarde van het bilirubine in zoo-
verre gemakkelijk zijn. dat de bilirubinespiegel van het bloed slechts
langzaam schijnt te dalen of te stijgen. Althans schijnt de spiegel in

het verloop van meerdere uren weinig verandering te vertoonen. Dit
zal wel daaraan hggen. dat bij afnemende icterus de weefsels haar
bilirubine aan het bloed afstaan of omgekeerd bij toenemende icterus
het bilirubine uit het bloed opnemen en dus min of meer als „bufferquot;
fungeeren.

Hoe het ook zij, men meent in het algemeen te kunnen aannemen,
dat het bilirubinegehalte van het bloed op zekeren dag en de urine
van dienzelfden dag wel aan elkaar beantwoorden. Reeds B e n s 1 e y

vroeg zieh af of dit ook opgaat voor snel af- en toenemende icterus
en ook wi, zijn daarom niet geheel zeker van de waarde van de in de
tabel genoemde waarnemingen, waar, bij een bilirubinespiegel van
resp. y en 1 E, geen bilirubine in de urine aangetroffen werd ( Fiq 9 )
Be.de gevallen betroffen patiënten met catarrhale icterus, die snel af-

goed door de nier uitgescheiden wordt als het niet geadsorbeerde, zoo-
als W e 11 m a n n en J O s t meenden. In het algemeen toonen ech-
ter onze cijfers geen duidelijken invloed van de adsorptie aan (Fig. 1.
8 10. 11. 13). We konden Vaststellen, dat in het algemeen bij
daling van den bilirubinespiegel van het bloed beneden de 4 E qal-
kleurstof uit de urine verdwijnt. Het spreekt vanzelf, dat dit getal
van 4 E slechts een globale waarde voorstelt. Het is aan te nemen,
dat individueele verschillen bestaan, terwijl ook de methodiek een
fout van enkele tienden Eenheden met zich brengt. Wanneer we zien
hoe groote verschillen er bestaan tusschen de uitkomsten van de oor-
spronkelijke methode en de door ons gebruikte methode, dan is het
merkwaardig, dat we desalniettemin weer de drempelwaarde öp 4 E
moeten vaststellen.nbsp;^

We vermelden in achterstaande tabellen de door ons gevonden
waarden. In het algemeen hebben wij bij de patiënten bij wie de icte-
rus toenam of verminderde, dagelijks de urine op bilirubine onder-
zocht, terwijl op geregelde tijden ook de bilirubine in het bloed werd
bepaald. Daar, waar de icterus of bilirubinurie duidelijk afnam, werd
dagelijks onderzoek van het bloed verricht. Gevallen, waarbij de icte-
rus, tijdens het toenemen, de drempelwaarde overschrijdt, zijn zeer
zelden waar te nemen. De meeste gevallen, waarbij de drempelwaarde
bepaald werd, waren patiënten met afnemende icterus.

Dc hooge waarden met bihrubinurie of de zeer lage waarden zon-
der bilirubinurie hebben wij vanzelfsprekend in de tabel niet vermeld.

Tenslotte zouden wij nog willen terugkomen op de opmerkingen
van N. Fiessinger*®) over het verband tusschen reactie en
adsorptiegraad. Bij afnemende icterus namen ook wij, gelijk we reeds

meer dan eens deden opmerken, een zeer groote adsorptiegraad
Waar, doch de reactie bleef steeds direct, al was dan ook vaak de
reactie niet zoo prompt direct meer als in den aanvang. Het is ook
begrijpelijk, dat, naarmate er meer bihrubinemoleculen in het serum
aanwezig zijn, de ontwikkeling der roode kleur sneller zal geschieden.
Maar zelfs al daalde de bilirubinespiegel tot bij de 1 E, dan nog bleef
de reactie, zij het ook diphasisch in den zin van L e p e h n e, direct.

Pas nadat de patiënt längeren tijd zijn icterische tint had verloren
en er een normale bilirubinespiegel van het bloed bestond, werd de
reactie volkomen indirect.

Bestaat er verband tusschen bilirubinurie en dialysabiliteit van het
serumbilirubine?

C. F. Hoover en M. A. B 1 a n k e n h o r n vonden het
serumbilirubine tegenover gedestilleerd water dialysabel, wanneer er
bilirubinurie bestond. Niet dialysabel vonden zij het in die gevallen,
die wij thans dynamische icterus zouden noemen (haemolytische icte-
rus en pernicieuse anaemic). Zij dialyseerden door collodiumzakjes.
In een latere mededeeling heeft Blankenhorn nogeens deze
bevindingen bevestigd quot;). Niet dialysabel vond hij het bilirubine in

gevallen van haemolytische icterus en in de gevallen met directe
reactie, waarbij bilirubinurie ontbrak. Blijkbaar beschouwt hij het
passeeren van de galkleurstof door de nier als een dialysatieproces.

M. Brulé, H. Garban en C h. W e i s m a n n quot;) hebben
de proeven van Blankenborn en zijn medewerkers herhaald en
konden de resultaten van deze onderzoekers bevestigen.

Des te meer verwonderde het ons, dat wij er nimmer in slaagden
bilirubine uit het serum door collodiumzakjes te laten dialyseeren.
We onderzochten sera van patiënten met afsluitingsicterus of catar-
rhale icterus, bij wie zeer hooge waarden voor de bilirubinaemie
bestonden (25 tot 30 E) en de urine galkleurstof in groote hoeveel-
heden bevatte. Ook na dialyseeren gedurende 24 tot tweemaal 24
uur konden wij geen bilirubine in het dialysaat aantoonen. Zoowel
sera met als zonder belangrijken graad van adsorptie werden onder-
zocht, doch een verschil werd niet gevonden. Evenmin was het biliru-
bine dialysabel uit het serum van een patiënt met haemolytische icte-
rus (12 E). We gebruikten zoowel collodiumzakjes van verschillende
dikten, vervaardigd volgens het voorschrift, dat Z ai nelquot;®) in
zijn proefschrift daarvoor geeft, als ook perkamenten hulzen van
Schleicher en Schüll. Zoodra echter het collodiumfilter
maar voor sporen eiwit doorgankelijk was, werd bilirubine in het dia-
lysaat aantoonbaar. De zeer geringe sporen bilirubine in het dialysaat
neemt men het beste waar door na te gaan of de vloeistof een gele
tint vertoont. Bij wat grootere hoeveelheden ziet men na toevoeging
van het reagens met alkohol een roode verkleuring optreden. De be-
vindingen, dat bilirubine niet de collodiummembraan passeert, maar
dit slechts doet, wanneer de membraan voor eiwit doorgankelijk is,
komen overeen met de onderzoekingen van Bendien en Snap-
per®). Deze vonden, dat bilirubine niet ultrafiltrabel is door collo-
diumzakjes, doch dat het deze zakjes wel passeert, zoodra ze door-
gankelijk voor eiwitten gemaakt zijn. Deze onderzoekers concludeer-
den daaruit, dat zoowel het indirecte als het directe bilirubine aan het
eiwit gebonden is. Het bleek ons echter, dat ook uit galkleurstof hou-
dende urine de bilirubine niet ultrafiltrabel is, in tegenstelling met
urobiline, die wel de collodiummembraan passeert. Daar de onder-
zochte urines geen eiwit bevatten, kon een binding aan het eiwitmole-
kuul niet als verklaring gelden voor het niet ultrafiltrabel zijn van

bilirubine. Wellicht is dus het molekuul op zichzelf te groot om het
filter te passeeren.

Dialyseerden wij de sera tegenover een mengsel van gelijke deelen
water en 96 % alkohol, dan ging zoowel het directe, als het indirecte,
bilirubine in het dialysaat over.

Samenvattend kunnen wij dus zeggen, dat het directe bilirubine in
het serum gedeeltelijk aan de eiwitten geadsorbeerd is; dat het in het
verloop van een afsluitingsicterus wellicht in de weefsels bepaalde
veranderingen ondergaat en daardoor voor een grooter gedeelte, soms
vrijwel geheel, aan het eiwit geadsorbeerd wordt. Dit geadsorbeerde
bilirubine vertoont echter dezelfde eigenschappen als het niet gead-
sorbeerde en geeft een volkomen directe reactie. Het passeert even-
goed de nier, wanneer de spiegel in het bloed die van 4 E overschrijdt
en het is evenmin als het indirecte bilirubine of het niet geadsorbeerde
directe bilirubine door collodiummembranen dialysabel.

Ongetwijfeld is de waarneming van Hij mans van den
B e r g h'quot;), dat er een directe en een indirecte reactie bestaat, van
theoretisch standpunt uit bekeken, even belangrijk, als de toepas-
sing van de reactie als zoodanig. In de praktijk echter geeft de on-
derscheiding van deze beide vormen van de reactie soms tot moei-
lijkheden aanleiding. Vaak gebeurt het, dat men niet zeker weet of
men de reactie direct of indirect moet noemen. Wel heeft H ij m a n s
van den Bergh reeds in den aanvang voorgesteld de reactie,
waarbij de roode verkleuring binnen de 30 seconden optreedt, direct
te noemen en die. waarbij de verkleuring zich na dien tijd ontwikkelt,
tot de indirecte te rekenen. Doch het spreekt vanzelf, dat een der-
gelijke maat willekeurig is; immers, waarom zou een reactie, die b.v.
na 35 seconden optreedt, niet meer direct genoemd mogen worden,
maar zou men dat wel mogen doen, wanneer de verkleuring enkele
seconden eerder opgetreden was? Wanneer men een principieel ver-
schil aan de twee vormen van reactie toekent, dan is het ook wen-
schelijk een dergelijk verschil duidelijker uit te drukken, dan in een

Maar ook in de praktijk komt men vaak reacties tegen die moeilijk
bij één van de 2 vormen zijn in tc deelen. Zoo heeft men reacties,
waarbij de kleursverandering wel terstond na de toevoeging van het
reagens zichtbaar wordt, doch de verdere verkleuring zich slechts
zeer langzaam ontwikkelt. Deze vorm van reactie werd reeds door
Peigl en Querner®^) de diphasische genoemd. Uit het feit,
dat G. Lepehne de oorspronkelijke indeeling van 2 vormen van

reactie, uitbreidde tot vier (directe-, vertraagd directe-, diphasische-
en indirecte reactie) blijkt eveneens, dat bij de praktische interpre-
tatie van de diazoreactie de onderzoekers meermalen in verlegen-
heid kwamen. Zoo komt het vaak voor. dat de diazoreactie den
clinicus geen hulp kan verkenen bij het stellen van de diagnose,
daar, waar hij juist voor zijn problemen aan het ziekbed van de

reactie hulp verwacht. Dit is er dan ook voor een deel de oorzaak
van, dat vele in hun verwachtingen zijn teleurgesteld en het opge-
geven hebben waarde te hechten aan den uitslag der diazoreactie.
Prof. H ij mans van den Bergh heeft daarom met Grote-
pass een methode uitgewerkt die in staat stelt het verloop van de
reactie te vervolgen en in een curve vast te leggen. De gedachte
welke aan deze methode te gronde ligt, is deze; in het verloop van
de diazoreactie wordt de gele kleur van het serum, die toch voor
het grootste gedeelte aan het bilirubine te danken is, veranderd in
de roode kleur van het azobilirubine.

Om dezen overgang colorimetrisch te vervolgen gebruikten zij een instrument,
dat in zijn oorspronkelijken vorm aldus was samengesteld. In een der bakjes van
een colorimeter van Klett of Dubosq werd het te onderzoeken serum ge-
bracht, waaraan op zeker oogenblik het reagens werd toegevoegd. Het aindere
bakje werd vervangen door twee holle glazen wiggen, die verschoven konden
worden, gelijk bijgaande teekening voldoende duidelijk aangeeft.

De wig A werd gevuld met het te onderzoeken seriun, de wig B met een op-
lossing van azobilirubine, uit dit serum op de gewone wijze vervaardigd. Men
begint het stel wiggen zoo te plaatsen, dat het licht door de met serum gevulde
wig A gaat, voordat men in het colorimeterbakje het reagens aan het senim toe-
voegt. De kleur zal dan in beide gezichtsvelden hetzelfde zijn.

Naarmate nu in het bakje de azobilirubinevorming voortschrijdt, zal het wiggen-
paar moeten worden verschoven, om in het occulair in beide gezichtshelften gelijk-
heid van kleur te behouden. Op bepaalde oogenblikken wordt opgeteekend, over
welken afstand het wiggenstel verschoven werd; aldus ontstaat de gezochte kromme.

Onder één der beide bewegelijke cuvetten (A) van een colori-
meter van Dubosq of Klett wordt een tweede, iets wijdere

cuvette (B) aangebracht. Deze cuvette B is onbewegelijk en A kan
dus in B dompelen (Fig. 1). In B wordt nu een geazoteerd serum
gedaan, in A het niet gediazoteerde serum. Wordt cuvette B zoover
mogelijk omlaag gebracht, zooals in Fig. 1 het geval is, dan zal men,
door den colorimeter kijkend, aan de rechter zijde slechts een gele
kleur waarnemen, want het licht doorloopt aan dien kant slechts het
gele, niet gediazoteerde, serum in A.

In den stand van de colorimeter, weergegeven in Fig. 2, neemt
men een kleur waar, die bestaat uit een mengsel van rood en geel,
want het licht doorloopt eerst de roode vloeistofkolom in B en ver-
volgens de gele in A.

Staat dc colorimeter, zooals aangegeven is in Fig. 3, dan is dc
waargenomen kleur geheel rood, want het licht doorloopt slechts de
vloeistof in B. In den in het eerst genoemden stand, komt de kleur dus
overeen met die van niet gediazoteerd scrum, in de laatstgenoemde
met volledig gediazoteerd scrum. Dc standen, die daar tusschen in
liggen en waarvan Fig. 2 een voorbeeld geeft, komen met kleuren,
die in het verloop van dc diazoreactie optreden, overeen.

Op direct reageerende sera met een behoorlijke sterkte (d.w.z.
meer dan 4 E), wordt de diazoreactie gedaan volgens H ij m a n s
van den Bergh en Grotepass. Hierbij wordt 1 cc. serum
dus tenslotte 10 maal verdund en deze roode oplossing wordt in
cuvette B gebracht. Vervolgens verdunt men een andere cc. van
het serum tot 8 cc. met physiologisch water. Van dit verdunde serum
brengt men gelijke deelen in de beide cuvetten C en A, dus beider-
zijds 4 cc. of 2 cc., al naar gelang dc cuvetten kunnen bevatten.
Vervolgens brengt men de cuvetten A en B aan den eenen kant en
C aan den anderen kant op gelijke hoogten, b.v. 30 mm. Kijkt men
nu door den colorimeter, dan neemt men links en rechts een gele
kleur van gelijke intensiteit waar. Bij C voegt men nu op een
zoo nauwkeurig mogelijk vastgesteld moment 1 cc. (heeft men in de
cuvette 2 cc. verdund scrum gedaan, dan Yi cc.) reagens en bij K.
om dezelfde verdunning te houden, 1, resp. Yi cc. physiologisch
water. Direct na het toevoegen van het reagens in C, zal zich dus in
C de diazoreactie gaan ontwikkelen. Door de cuvette A omhoog te

brengen, kan men voortdurend in den colorimeter rechts en hnks
kleurgehjkheid bewerkstelHgen. C bhjft daarbij op den beginstand.

Telkens, wanneer een nieuwe kleursgelijkheid is verkregen, wordt
de colorimeterstand (van cuvette A dus) afgelezen en tegelijkertijd
op de seconde het tijdstip van aflezing genoteerd. Bij snelverloo-
pende reacties doet men het onderzoek het best zoo. dat één persoon
waarneemt in den colorimeter en de colorimeterstanden afleest en
een andere persoon de standen noteert en met het aflezen den tijd
noteert, waarop de aflezing plaats vond. Deze colorimeterstanden
komen overeen met de hoogte van de vloeistofkolom in cuvette A
en zijn daarom evenredig met de hoeveelheid bihrubine. die per-
centsgewijze in azobilirubine omgezet wordt. Zet men den tijd af op
de abcis. en de colorimeterstanden van 30 tot O op de ordinaat, dan
verkrijgt men een curve, die de snelheid van de reactie tot uitdruk-
king brengt.

Bij de indirecte reactie is de gebruikte verdunning anders. Hier
neemt men volgens het oorspronkelijke voorschrift 3 cc. serum met
6 cc. alkohol, mengt en centrifugeert dit. Neem 6 cc. filtraat. voeg
hieraan toe 0.75 cc. reagens en 1.5 cc. alkohol 96 %. zoodat in deze
roode oplossing het serum 4 maal verdund is. Deze (roode) oplos-
sing gaat weer in cuvette B. Het serum wordt nu ook zoo behandeld,
dat de uiteindelijke verdunning straks 4 zal bedragen: 1 cc. serum
wordt verdund met aqua physiologica tot 3,5 cc. In de cuvetten A en
C worden deze hoeveelheden verdund serum gedaan en op een be-
paald moment bij'A'^ cc. reagens en bijquot;^ i/^ cc. aqua physiologica
gevoegd. Zoowel als men te werk gaat op de eerst beschreven wijze
als op de laatste, wordt er zorg voor gedragen, dat het serum in
A, B en C op dezelfde wijze verdund is en dus de roode kleurstoffen,
die men aan het eind van de proef waarneemt, met elkaar in sterkte
overeenkomen.

Zijn de te onderzoeken sera minder in sterkte dan 4 E. dan is in
het algemeen bicolorimetrie niet mogelijk, omdat de kleur van het
geazoteerde serum te zwak is om een behoorlijke aflezing te kunnen
verrichten.

Verder ontstaat niet zelden na toevoeging van het reagens in C
een troebeling. die wel aan vetten en vetzuren te wijten zal zijn en
die de vergelijking van de kleuren zeer kan bemoeilijken of zelfs

onmogelijk kan maken. Door het, in nuchteren toestand van den
patiënt afgenomen, bloed te gebruiken, kan men het bezwaar dezer
troebeling aanzienlijk verminderen.

Eenigen Üjd, nadat wij ons toestel in gebruik hadden gesteld, is ons gebleken,
dat jaren geleden door Dr. F. C. G e r r i t s e n «) zij het voor een ander doel,
een toestel volkomen gelijk aan het hier boven genoemde, beschreven is, dat door
hem — evenals wij voor ons toestel hadden voorgenomen — bicolorimeter werd
genoemd. Het principe was reeds eerder aangegeven door F. J. G i 11 e s p i e

Wc hebben nu, in opdracht van Prof. Hij mans van den
Bergh met dezen bicolorimeter een aantal dergelijke curven ver-
vaardigd. Eensdeels van sera afkomstig van patiënten met sterke,
ontwijfelbaar mechanische (stuwings) icterus; in de tweede plaats
van vloeistoffen, die ontwijfelbaar extrahepatisch gevormd biliru-
bine bevatten (punctievloeistof uit haematothorax) en van sera van
patiënten met zuiver dynamische icterus (pernicieuze anaemie, hae-
molytische icterus) en tenslotte van sera van patiënten met icterus,
die aan verschillende ziekten leden.

Het serum is afkomstig van een ongeveer 60-jarigen man die
sedert eenigen tijd toenemende icterus kreeg, zonder pijn of andere
bezwaren. Hij had bij opname in de kUniek een intensief gele kleur.
Het serum bevatte 70 Eenheden bilirubine met directe reactie. 40 %

van dit bilirubine was aan het eiwit geadsorbeerd. Uit de curve ziet
men, dat de reactie volkomen direct was; reeds enkele seconden na
het toevoegen van het reagens was de vloeistof intensief rood ge-
kleurd. In ruim 3 minuten was de koppeling maximaal. Hieruit blijkt
reeds dat aan den eisch. die L e p e h n e stelt, wil de reactie vo -
komen direct genoemd mogen worden, n.1. beginnende en maximale
koppeling binnen de 30 seconden, ook bij sterke directe reactie met
voldaan wordt. Het steil verloopen van de curve echter is typisch

hoeveelheid bihrubine in het bloed van invloed was op het verloop
van de curve, d.w.z. op de snelheid van de reactie. Wij hebben
daartoe van een aantal sera met directe reactie zoowel een curve
gemaakt op de gewone wijze, als ook nadat ze verdund waren met
physiologisch water tot een sterkte, die de bicolorimetrie nog juist
mogelijk maakte, dus tot ongeveer 4 E. Zooals uit de curven blijkt
(Fig. 14-15, 16-17, 18-19, 20-21) heeft de verdunning geen noe-
menswaardigen invloed op de reactiesnelheid.

In een andere reeks gevallen hebben wij de sterk icterische sera
verdund met een ander serum, dat zeer weinig bilirubine bevatte,
dus van patiënten met chronische nephritis of met lever behandelde
gevallen van pernicieuse anaemie. Ook door verdunning met deze
sera werd de reactie niet vertraagd (Fig. 22-23 en 24-25).

Voegt men aan een serum, dat zeer weinig bilirubine bevat, wat
versche. door middel van duodenaal sondage verkregen, gal toe.
dan krijgt men eveneens een typisch directe curve (Fig. 26).

Een geheel ander type vertoonen de curven, die men verkrijgt.
Wanneer men sera van lijders aan een dynamische icterus bicolori-
metreert. Allereerst konden wij een dergelijke curve vervaardigen
bij een patiënt, die lijdende was aan een klassieken vorm van hae-
molytische icterus. Zooals men ziet (Fig. 27), begint de reactie hier
zeer traag, zoodat in de eerste minuten geen duidelijke roodkleuring
Waarneembaar is. Deze roode verkleuring neemt in den aanvang
nog iets toe, maar nam verder niet waarneembaar toe, zoodat na
15 minuten nog slechts een vijfde gedeelte van de maximale koppe-
ling bereikt was.

In de tweede plaats onderzochten wij een patiënt, bij wie na een
trauma (messteek) een haematothorax was ontstaan. In het pleura-
Punctaat, dat uit vloeibaar bloed bestond, werd reeds spoedig na
bet trauma een verhoogd gehalte aan bilirubine gevonden, dat na
eenige weken steeg tot 14 Eenheden. Ondanks dit hooge gehalte aan
galkleurstof, was de reactie volkomen indirect (Fig. 28). De biliru-
binespiegel van het bloed was nimmer verhoogd.

Van hoe weinig invloed de hoeveelheid bihrubine in het serum is
op het uitvallen van de reactie, toont Fig. 29 duidelijk aan. De curve
heeft een, voor de indirecte reactie, typisch verloop. De bilirubine-
spiegel bedroeg 20 Eenheden, een ongewoon hoog getal voor een
indirecte reactie. Het bloed was afkomstig uit de miltvene van een
patiënt met haemolytische icterus, bij wie miltextirpatie verricht
werd. Het tegelijkertijd uit de armvene afgenomen bloed, bevatte
13 Eenheden bilirubine.

Curven werden verder nog vervaardigd van sera van patiënten
met pernicicuse anaemie (Fig. 32). constitutioneele hyperbilirubin-
aemie (Fig. 30). en haemolytische icterus (Fig. 31). In deze laatste
gevallen was de verhooging van het bilirubinegehalte van het bloed

echter niet zoo sterk als in de beide eerstgenoemde, doch de curven
geven het indirecte type goed weer. Dat de bilirubinespiegel op
zichzelf van weinig invloed is op de reactie, blijkt nog eens duidelijk,
wanneer men een direct serum van 4,6 E (Fig. 25) vergelijkt met
een indirect van gelijke sterkte: 4,2 E (Fig. 31).

reactie vaak diphasisch was, vonden we de reactie des te directer,
naarmate de bilirubinespiegel sterker verhoogd was. Wellicht heb-

ben we hier te doen met mengsels van direct en indirect bilirubine.
Naarmate de leverbeschadiging en daarmee de stoornis in de lever-
functie sterker is, stijgt ook het bilirubinegehalte van het bloed,
welk bilirubine als elke „stuwingsbilirubinequot; de directe reactie geeft.

Zoo geven de curven voor een gedeelte het directe type te zien,
d.w.z. de koppeling voltrekt zich grootendeels binnen korten tijd
(Fig. 34, 35, 36). Bij het meerendeel van de sera komt het echter
niet tot maximale koppeling, wellicht, omdat het gedeelte, dat uit
indirect bihrubine bestaat, niet in azobihrubine omgezet wordt.

Zoo ondervond men moeilijkheden met de beoordeeling van het
serum van een patiënt, die leed aan hepatitis luetica. De reactie was
verhoogd, diphasisch. zoodat men niet wist of ze tot de directe of dc
indirecte te rekenen viel. Uit de curve (Fig. 33) bleek, dat de reactie

aanvankelijk snel verliep, doch het O-punt niet bereikte, m.a.w. niet
alle in het scrum aanwezige bilirubine werd in azobilirubine om-
gezet. Na eenigen tijd ging de reactie weer langzaam verder. Dat
we in dit geval met een mengsel van direct en indirect bilirubine tc
doen hadden bleek, toen wc de beide fracties afzonderlijk quantita-

tief bepaalden volgens de methode van V a r e 1 a quot;»), die we reeds
eerder vermeld hebben. (Zie pag. 34). Van de totale hoeveelheid
van 5 Eenheden was in chloroform oplosbaar 2,7 E. Dit was dus het
indirecte bilirubine. 2,3 E was niet in chloroform oplosbaar en rea-
geerde dus direct. We vervaardigden vervolgens een bicolorime-
trische curve van een mengsel van gelijke deelen van direct en indi-
rect serum. De curve, die we toen verkregen (Fig. 37). komt met
die van den patiënt overeen.

Zooals we reeds vroeger vermeld hebben, bestaat een der belang-
rijkste punten van verschil tusschen het directe en het indirecte
bilirubine daaruit, dat het eerste met het eiwit een meer of minder
sterke adsorptie vertoont, terwijl het tweede dit niet doet.

Toen wij den adsorptiegraad bij patiënten met een mechanische
icterus vervolgden, verkregen wij niet den indruk, dat er tusschen
den graad van adsorptie en de snelheid van de diazoreactie een ver-
band bestaat. Geenszins konden wij waarnemen, dat sera met een
hoogen graad van adsorptie van het bilirubine aan het eiwit, een
vertraagde reactie geven, zooals door Fiessinger beweerd
wordt.

Aan den anderen kant zou men zich kunnen afvragen, of. als
adsorptie voor direct bilirubine typisch is, deze adsorptiegraad niet

parallel gaat met de snelheid van de diazoreactie. Daarom hebben
wij de bicolorimetrische curven van sera met verschillende graden
van adsorptie onderling vergeleken.

Vergelijkt men een curve, waarbij dc adsorptie 31 % bedroeg, met
de curve van een ander serum met een dubbel zoo sterke adsorptie,
n,I. 68 %, dan is in het verloop van de reactie in beide sera toch
eigenlijk geen noemenswaardig verschil te zien (Fig. 38-39). Even-
min bestaat er een belangrijk verschil tusschen dc curven 40-41, het
eene serum met een adsorptiegraad van 33 % en het andere van
68 %. Dat in het eene serum de diazoreactie toch wat sneller verliep
dan in het andere blijkens de steilere curve, zal wel te wijten zijn aan
het hoogere gehalte aan bilirubine, dat in dit eene serum viermaal
zoo hoog was als in het andere.

Ook uit de vergelijking van de curven 43-43 (adsorpiegraad resp.
30 % en 70 %), blijkt nog eens duidelijk, dat de graad van adsorptie
niet samenhangt met de snelheid van de reactie, doch geheel en al
bepaald wordt door het stadium, waarin de icterus verkeert, zooals
dat vroeger uiteengezet is.

Behalve sera van verschillende patiënten hebben we sera van een-
zelfden patiënt, maar in een verschillend stadium van zijn ziekte,
onderzocht.

Bij den reeds eerder genoemden patiënt met sterke icterus tenge-
volge van een carcinoom van het caput van het pancreas, dat drukte
op de ductus choledochus. werd eerst een bicolorimetrische curve
gemaakt, toen de patiënt opgenomen werd. Het bilirubinegehalte
bedroeg toen 70 E, waarvan 46 % aan het eiwit geadsorbeerd was.

Na de operatie, waarbij een choledocho-gastrostromie verricht
werd, nam dc icterus duidelijk af. Wij hebben toen wederom een
curve gemaakt. Op dat tijdstip bedroeg het bilirubinegehalte 18 E
en hiervan was 90 % aan het eiwit geadsorbeerd. Tusschen beide
curven bestaat weer geen noemenswaardig verschil (Fig. 44-45).
Dat de eerste curve steiler verloopt, wijten we ook nu weer aan het
hoogere bilirubinegehalte.

Het is mogelijk iets meer omtrent de reactiesnelheid van het biliru-
bine te weten te komen door de. met behulp van den colorimeter.
vervaardigde curven, in een wiskundige formule uit te drukken.

Wat geschiedt er bij de diazoreactie? Het reagens bindt zich met
bilirubine tot diazobilirubine.

De hoogte van de vloeistof in cuvette B is een directe maat voor de
gevormde hoeveelheid azobilirubine. De hoogte van de vloeistof in
cuvette A is een maat voor de hoeveelheid bilirubine. die verdwenen
is en omgezet is in azobilirubine. Deze laatste hoogte hebben we op
de ordinaat van onze bicolorimetrische curve afgezet. Bij het begin
van de experimenten bedroeg de hoogte meestal 30 en aan het eind 0.
In deze getallen zijn dus de aanwezige concentraties bilirubine op
elk oogenblik aangegeven.

We kunnen aannemen, dat het reagens in overmaat aanwezig is
en dat dus de concentratie van het reagens in het verloop van de
reactie vrijwel hetzelfde blijft. Dan is de hoeveelheid bilirubine (dc).
die in een zeker tijdsverloop (dt) in azobihrubine wordt omgezet,
evenredig met de concentratie van het bilirubine in het serum (c).en
een zekere constante K, de z.g. reactieconstante.

waarin a de integratieconstante is en e het grondgetal van de natuur-
lijke logarithme.

Wat is nu die a? Neemt men een oogenblik aan, dat t = O is, dan
is e-quot; = 1, want equot; = 1.

Daaruit volgt, dat voor een tijd O, c = a, m.a.w.; a stelt voor de
concentratie van het bilirubine op een tijd O, dus de uitgangscon-
centratie van het bilirubine.

Zetten we nu c op een logarithmische schaal en t op een gewone
lineaire schaal af, dan moeten we, als de formule voor onze bico-
lorimetrische curven opgaat, een rechte lijn krijgen. Uit grafiek A
blijkt, dat dit inderdaad het geval is. Het is zonder meer duidelijk,
dat de helling der lijnen de snelheid van de reactie aangeeft. Meer-
malen zagen we echter, dat het punt, overeenkomende met den tijd O,
niet op de rechte lijn lag. Blijkbaar bestaat er hier een fout in de
bepaling.

Inderdaad is het moeilijk het juiste tijdstip van het begin der
reactie vast te leggen. Herinneren we ons nog eens hoe de bicolori-
metrische bepaling uitgevoerd wordt. Bij het verdunde serum in
cuvette C wordt het reagens gedaan. Er wordt snel gemengd. Dit
oogenblik beschouwen wij als het beginpunt, daar reeds bij de eerste
aflezing in den colorimeter de reactie in gang is. Het spreekt van-
zelf, dat, al naar gelang de menging en het toevoegen van het rea-
gens snel of langzaam plaats vond, ook het oogenbhk, waarop de
reactie begon, minder nauwkeurig was vast te stellen. Een zekere
fout, die we nulpuntsfout zullen noemen, wordt wel steeds gemaakt.
In het kort kunnen we dus zeggen, dat we nooit precies weten, wan-
neer de reactie is begonnen. Vandaar, dat het punt, overeenkomen-
de met den tijd O, niet steeds op de rechte lijn ligt.

Bepalen we dus de concentratie C van het bilirubine op een tijd
2,303 minuten, dan is k = log^

Om de nulpuntsfout te vermijden, moeten we het snijpunt van de
rechte lijn met de ordinaat nemen en dc zoo gevonden concentratie
als dc beginconcentratie a beschouwen.

We zoeken op de abcis het tijdspunt 2,303 min. en trekken van
hieruit een vertikale lijn. Deze lijn snijdt de rechte lijn op een be-
paald punt, dat overeenkomt met een punt c op de ordinaat. Dit
punt geeft de concentratie van bilirubine op den tijd 2,303 minuten
aan. De afstand van het eerstgenoemde punt a tot het laatstgenoem-

aan. Is op dit papier de factor 10, dan moet de afstand a—c dus in
decimeters gemeten worden.

Samenvattend wordt van een bepaald bilirubineserum de reactie-
constante dus als volgt gemeten:

2.nbsp;Deze curve wordt overgebracht op logarithmisch papier, waar-
op op de abcis den tijd en op de ordinaat de concentratie van het
bilirubine is afgezet.

3.nbsp;Op het logarithmische papier wordt eens en vooral een vertikale
lijn getrokken bij t = 2,303 min.

4.nbsp;Nagegaan wordt, waar deze vertikale lijn de rechte snijdt. Dit
snijpunt komt overeen met een punt x op de ordinaat.

5.nbsp;Nagegaan wordt, waar de rechte de ordinaat snijdt. De afstand
van dit punt tot punt x, geeft k aan.

Van direct reageerende sera is het op deze wijze zeer wel moge-
lijk de k met eenige nauwkeurigheid te bepalen.

Probeeren we echter bij indirect reageerende sera de reactie-
constante van het bilirubine te bepalen, dan gaat dit minder gemak-
kelijk. De bicolorimetrische curve, uitgezet op logarithmisch papier,
geeft hier geen fraaie rechte lijn. Dit is vermoedelijk het gevolg
van de onnauwkeurigheid, waarmee bij indirecte sera de bicolori-
metrische bepaling moet geschieden. De kleursveranderingen. die
bij het uitvoeren van de diazoreactie op indirecte sera volgens de
directe methode optreden, zijn n.1. zeer gering en dus niet zoo
nauwkeurig waar te nemen als bij indirecte sera. Om zoodanig
duidelijke kleursveranderingen te zien optreden, dat een eenigszins
nauwkeurige aflezing mogelijk is. moet men de waarnemingen over
längeren tijd, liefst uren, uitstrekken. Praktisch kan men dat niet
steeds doen. aangezien er soms troebelingen gaan optreden in het
mengsel van serum en reagens.

Beschouwen we de waarden, die we voor de reactieconstante
door een globale berekening vinden, dan blijken deze waarden

«	«	M
	n	m
	m	IN

Wanneer wc nu eenige van de curven van patiënten met lever-
cirrhose of hepatitis luetica op logarithmisch papier uitzetten dan
zien wc dat de zoo gevonden rechte lijn een knik vertoont (Ura-
fick C). Zooals we reeds eerder gezegd hebben, vertoont een derge-
lijke bicolorimetrische curve overeenkomst met curven, die men ver-
krijgt. wanneer men direct en indirect reageerende sera met elkaar
mengt. We veronderstelden daarom, dat sera, zooals die b.v. bij den
patiënt met hepatitis luetica gevonden werd, een mengsel van direct
L indirect reageerend bilirubine bevatten. Een steun voor deze op-
vatting vonden we daarin, dat bij de bewerking van het scrum vol-
gens V a 1 e r a een gedeelte van het serum met chloroform te extra-
Leren was en dus het karakter van indirect bilirubine had. terwijl
een ander gedeelte deze eigenschap miste, hetgeen met de aanwezig-
heid van direct bilirubine overeenkomt.nbsp;, u- i •
Het verloop van dc lijn. die men krijgt, wanneer men de bicolon-
mctrische curve op logarithmisch papier uitzet, geeft een nieuwe

Immers, bestaat het serum uit een mengsel van direct en mdirect
bilirubine, dan zullen, na toevoeging van het reagens, beide beginnen
te reageercn,iedcr met hun eigen reactiesnelheid.Inde eerste minuten
is het verloop van dc curve het resultaat van de reactie van het directe
en Ldirecte bilinibine samen, waarbij, doordat het direc^ zooveel
sneller reageert, de curve hoofdzakelijk door dc reactie van het direc e
bilirubine bepaald zal worden. Na eenige minuten is echter ^le
directe bilirubine in azobilirubine omgezet en het verdere verloop
van dc curve wordt dus hoofdzakelijk bepaald door de reactiesnel-
heid van het indirecte bilirubine. dat in het serum aanwezig is.

Het snelle verloop van de reactie gaat dus over in een veel lang-
zamer, hetgeen op logarithmisch papier tot uitdrukking komt in een
aanvankelijk steile lijn, die met een meer of minder scherpe bocht
overgaat in een glooiend verloopende lijn.

Het bleek, dat kunstmatig gemaakte mengsels van direct en in-
direct bilirubine alle een dergelijke bocht vertoonden, wanneer de
bicolorimetrische curven op een logarithmische schaal gebracht wer-
den (Grafiek D). We gelooven dus, dat deze „knikquot; er op wijst, dat
we met mengsels van direct en indirect bilirubine te maken hebben
en dus een grafische uitdrukking zijn van het door F e i g 1 en
Querner en Lepehne ingevoerde begrip van een diphasische
reactie.

Sera, met een behoorlijken graad van bilirubinaemie, waarbij men
in twijfel verkeert omtrent den aard van de reactie direct of indirect,
ontmoetten wij niet zoo vaak als men op grond van de mededeelingen
in de literatuur zou kunnen verwachten. Doet men de qualitatieve
reactie volgens het oorspronkelijk voorschrift, d.w.z. verdunt men het
serum eenmaal met physiologisch water en verdeelt men deze vloei-
stof over 2 buisjes, waarvan men bij één van beide 34 volume reagens
doet, dan is het al dan niet optreden van een roode verkleuring zeer
goed te beoordeelen. Meestal treedt twijfel op, zoodra men met een
zeer geringen graad van bilirubinaemie te doen heeft, zoodat de op-
tredende roode kleur zwak is en dientengevolge ook den tijd van
ontstaan moeilijk te bepalen is. Deze twijfel is echter het gevolg van
de moeilijk waarneembare kleur en dus niet van het feit, dat de diazo-
reactie als zoodanig zich niet beoordeelen Iaat.

Het genoemde geval van hepatitis luetica was een voorbeeld van
een serum met behoorlijke bilirubinaemie (5 E) met een diphasisch
verloop van de reactie (Fig. 33). Bij de extractie van het serum met
chloroform bleken de hoeveelheden direct en indirect bilirubine zich
ongeveer te verhouden als 1 : 1.

Het tweede geval was dat van een patiënte met comonairthrom-
bose, bij wie zich icterus ontwikkelde. De oorzaak van deze icterus
was niet duidelijk. Uit de bicolorimetrische curve, die op een logarith-
mische schaal werd uitgezet, viel af te leiden, dat we vermoedelijk met
een mengsel van direct en indirect bilirubine te doen hadden (Fig. C,

3e lijn). Uit het serum, dat een sterkte had van 10 Eenheden bili-
rubine, werd door middel van extractie met chloroform ongeveer
3 Eenheden verkregen, zoodat de verhouding van direct en indirect
bilirubine in het serum op 7 : 3 geschat moest worden.

Al kon een nadere analyse van de geknikte logarithmische curve
in het aandeel, dat door het directe en indirecte bilirubine geleverd
wordt, nog niet worden verricht, toch gelooven wij. dat dit verloop
er op wijst, dat de diphasische reactie het gevolg is van het gelijk-
tijdig aanwezig zijn van direct en indirect bilirubine in onderling
niet ver uiteenloopende hoeveelheden.

''^'é'::'.ctSher va. belde blUtnblnes »et het d«ns
quot;T: rrSIquot;: . m chlor„,o™ »»oplosbaar, het Indirecte

nemen, dat direct reageerende sera. ie men b») kamertemp^^^^^
laat staan, een groene verkleuring gaan vertoonen. ^^ ^
rekkelijk zeldzaam, aangezien de meeste sera. ook

quot;ZT:... in serum de verschillen in oxydatiesnelheid aantoonen,
aa^eXsL^geo.vdatiemiddele^

tal druppels natriumnitriet toe, dan gaat de gele kleur van het serum
vrijwel direct over in een groene. Weldra wordt de biliverdine verder
geoxydeerd, want de groene kleur gaat over in een bruin-zwarte.

Zoo op het oog is waar te nemen, dat de groene kleur bij direct
reageerende sera eerder en sneller optreedt, dan bij indirect reagee-
rende sera.

Een grafische registratie van dit proces zou theoretisch mogelijk
zijn door in een spectrophotometer de extinctie te meten in een gebied
boven 650 in welk gebied een voor biliverdine typische adsorptie-
band hgt (H e i 1 m e y e r )). Voor een practische uitvoering is deze
methode echter minder geschikt, eensdeels, omdat het eindproduct
biliverdine niet constant is, anderdeels, omdat het proces van omzet-
ting van bilirubine in biliverdine te snel verloopt.

le. Niet de hoeveelheid biliverdine gemeten, die zich door oxydatie
over eenigen tijd zou vormen, doch - op voorstel van Prof.
Hijmans van den Bergh - de hoeveelheid bilirubine. die
na eenigen tijd nog overgebleven was. gelijk die door de diazoreactie

Stelt men het serum bloot aan de inwerking van ultraviolette stra-
len. dan ziet men aanvankelijk op het oog niets geschieden. Dat echter
het bilirubine na eenigen tijd toch voor een gedeelte geoxydeerd is,
blijkt hieruit, dat het gehalte aan deze stof. bepaald met de diazo-
reactie, verminderd is. Blijkbaar ontstaat door de oxydatie van het
bilirubine allereerst een verbinding, die weinig van de eerste verschilt
en dezelfde gele kleur geeft, doch niet met het azoreagens reageert.

Pas na langen tijd bestralen begint het serum de groene Weurƒ jer,
finen die er hit teeken van is. dat zich biliverdine gevormd heef .

D prtf werd nu als volgt uitgevoerd: We brachten een hoeveel-
heid icterisch serum, ongeveer 5 cc., in een open glazen schaalt^ en
plllSen dit onder de kwiklamp. Omdat de Ipp

hoeveelheid warmte produceert, werd het glazen schaaltje m een
brrit «s gl^laatst. t^^^^^ de werking van de hitte op bxhrubme
L eltotèien Op gezette tijden namen wij uit het schaaltje een we.
It^^r^-^ep^n daarin het gehalte aan galkleurstof. Zlt;^ee
ZgdS werd de oxydatiesnelheid van een direct en van een mdu:ect

Zooals uit de curven te zien is. verloopt de afname van bihmbine
teng^o^^e van de oxydatie. veel sneller bij directe, dan b,j md,rechte
si. mj de eerste was meestal na een uur bestraling de diazoreactie.

nadat het bihrubine volgens de
aantoonbaar was. het ook niet meer gevonden kon worden bij de
uitvoerina van de diazoreactie in bijzijn van alkohol.
quot;het bilirubine van den directen in den ^^^^^f^^ZlT^Z
overgegaan, dan zou men na de onteiwHting van het serum met aU.o
hol nog een positieve diazoreactie hebben moeten vinden. Wanneer
het bilLb Jniet geheel uit het serum verdwenen -s
rest direct, hetgeen ook door middel van de bicolorimetrie werd vast

Het mechanisme van de diazoreactie op bihrubine werd nader on-
derzocht. Het bleek, dat de twee vormen waarin zich de reactie kan
voordoen, de directe en de indirecte reactie, uit praktisch en theore-
tisch oogpunt van elkaar te onderscheiden zijn. Ongetwijfeld is het
op velerlei wijzen mogelijk de indirecte reactie in de directe over te
voeren. Ook het omgekeerde kan bewerkstelligd worden. In het alge-
meen bevorderen de toevoeging van zwakke zuren of van loog of de
kortdurende verwarming op het waterbad de directe reactie. De toe-
voeging van sterke zuren of het gedurende längeren tijd bewaren
van het serum bij 37° doet de directe reactie overgaan in een indi-
recte.

Sommige onderzoekers besluiten hieruit, dat de snelheid van de
diazoreactie het gevolg is van het al dan niet aanwezig zijn van
bepaalde stoffen in het bloedserum. Het is echter niet met eenige
mate van zekerheid gelukt dergelijke stoffen in het serum aan te
toonen.

Aan den anderen kant zijn er onderzoekers, die een onderscheid
in directe en indirecte reactie niet erkennen, althans aan een dergelijk
onderscheid geen waarde hechten, doch de snelheid van de reactie
alleen in verband brengen met de hoeveelheid bilirubine, die in het
bloed aanwezig is. Deze laatste opvatting meenen wij weerlegd te
hebben.

Wij sluiten ons aan bij hen, die meenen djit de directe en indirecte
reactie het gevolg zijn van de aanwezigheid van een van twee soorten
bilirubine: het directe en indirecte bilirubine. Deze beide bilirubinen
zullen zeker chemisch na aan elkaar verwant zijn. Wellicht dat het
eene een enolvorm, het andere een ketovorm is van eenzelfde stof
(K ü s t e r). Welhcht ook, dat het directe bilirubine in een anderen
physico-chemischen toestand in het serum aanwezig is dan het indi-
'recte.

Het verschil in oxydatiesnelheid werd grafisch vastgelegd. Nader
bestudeerd werd de adsorptie van de galkleurstof aan het eiwitneer-
slag. De bevindingen van Wiemer, Weltman en Jost en
J O u r d a i n werden in hoofdzaak bevestigd. Het bleek echter, dat
de graad van adsorptie geen invloed heeft op den aard van de diazo-
reactie en dat dus de adsorptie aan het eiwitneerslag geen verklaring
kan geven voor de indirecte reactie. Evenmin werd verband gevonden
tusschen adsorptie en bilirubinurie.

De methode van H ij mans van den Bergh en Grote-
pass werd vergeleken met de meest gebruikelijke andere methoden:
Thannhauser en Andersen, Weltmann en Jost en
C h a b r O 1. Het bleek, dat de hoogste waarden met de eerstgenoem-
de methode gevonden werden en verondersteld mag worden, dat
deze methode voor directe sera de totale bilirubinaemie doet kennen.

Met behulp van de methode werd nog eens de drempelwaarde voor
bilirubine in de nier bestudeerd. Het bestaan van een dergelijke
Waarde werd aannemelijk gemaakt en de drempelwaarde van 4 Een-
heden ongeveer, werd opnieuw vastgesteld.

Verband tusschen bilirubinurie en dialyseerbaarheid van bilirubine
uit het serum werd niet gevonden. In tegenstelling met andere onder-
zoekers kon bilirubine noch uit directe, noch uit indirecte sera gedia-
lyseerd worden. Het was niet ultrafiltreerbaar of dialysabel uit gal
of galkleurstof-houdende urine.

2.nbsp;Met behulp van de bicolorimetrie werd het reactieverloop van
de beide modaliteiten van het bilirubine nagegaan. Daarbij bleek,
dat het onderscheid in reactiesnelheid in een curve vrij typisch is uit
te drukken; dat dus de reactieconstanten van de beide vormen aan-

zienlijk verschillen. Afgeleid werd uit de curven, dat de diazoreactie
een monomolekulaire reactie is.

3. Enkele sera, die een zgn. diphasische reactie gaven, werden be-
studeerd. Waarschijnlijk werd gemaakt, dat de reacties die deze sera
geven, niet het gevolg zijn van overgangen tusschen directe en indi-
recte reactie, doch van het aanwezig zijn van een mengsel van het
directe en indirecte bilirubine.

The mechanism of the diazoreaction on bihrubin was studied.
This reaction can be direct or indirect. It was found that these two
types of reaction differ from a practical and theoretical point of
view.

Addition of weak acids or bases, or slight increase of temperature
generally accelerates the diazo reaction.

The direct reaction is converted into the indirect by the addition
of strong acids or keeping the serum at a temperature of 37° C for
a long time.

On account of this phenomenon some investigators have come to
the conclusion, that the velocity of the diazoreaction is caused bij
the presence or absence of certain substances in the serum.

Another group of investigators again, does not acknowledge a
difference between the direct and indirect reactions or at least does
not consider it of any importance, but tries to explain the the velocity
of the reaction from the amount of bile pigment in the blood.

Our experiments have proved this last conception to be entirely
wrong and have led us to the conclusion, which is also held by a
third group of investigators, that the direct and indirect reactions
are due to two corresponding types of bile-pigment, called direct
and indirect bilirubin. Possibily the one is an enoland the other a
keto-form of the same mother substance (Küster).

It is also possible, that both forms of the bile pigment are present
in the serum in different physico-chemical conditions. The following
arguments speak in favor of this last conception.

The diffence in oxydation velocity is demonstrated in a graph.
Adsorption of the bile pigment to the protein precipitate was studied
more in detail. The results of Wiemer, Weltmann and
J o s t and J o u r d a i n could principelely be corrobarated.

It has been proved that the degree of adsorption has no effect
whatsoever on the caracter of the diazoreaction, which means that
this adsorption cannot explain the indirect reaction.

The method of Hijmans van den Bergh and G r o t e-
p a s s was compared with most of the other current methods:
Thannhauser and Andersen, Weltmann and J o s t,
Chabrol.

The greatest quantities were achieved with the method of H ij-
mans van den Bergh and Grotepass. Presumably this
method gives the total amount of bilirubinemia for specimens of
direct sera.

The threshold for bilirubin in the kidney was determined again
according to this method. The existence of such a threshold seemed
acceptable and its amount of about 4 units was laid down. There
appears to be no relation between bilirubinuria and dialysability
from the sera.

In contradiction to other investigators, bilirubin could not be dial-
yzed from direct and indirect sera, neither could it be ultrafiltered
or dialyzed from bile or urine, containing bile pigment.

2.nbsp;By means of bicolorimetry it was possible to time the reaction
of both modalities of bilirubin. This has shown, that the difference
in reaction velocity can be expressed in a typical graph, indicating
therefore, that the constants of reaction for both forms of bile pig-
ment differ very distinctly.

From these curves the conclusion was made, that the diazo-reac-
tion must be a monomolecular one.

3.nbsp;Some specimens of sera, giving the socalled diphasic reaction
were also investigated. The statement is made acceptable that the
reaction given by these sera, should not be considered as the result
of conversion of the two reactions into one another, but that it should
be interpreted as being due to a mixture of direct and indirect bili-
rubin.

L D. Acél en C. Go 1 d g r ub e r, Ueber den Mechanis-
mus der BiHrubinreaktion.
Z. Ges. Exptl. Med. 84, 787. (1932).

Gallenfarbstoffen und Cholesterin.
Verhandl. deut. Ges. inn. Med. 1922. blz. 72.

chanismus der Bilirubinreaktion im Serum bei Erkrank-
ungen des Blutes und der Leber.

test in jaundice.
Quart. J. Med. 18, 19 (1924),
5 C. H. A n d r e w e s. An unexplained diazo-colour reaction

gen der Gallenfähigen Substanzen (dyscholie). beson-
ders des Gallenfarbstoffs (Ikterus).
Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica 5, 338

over de binding van verschillende serumcolloiden met
behulp van ultrafiltratie.
Geneesk. Bladen 31° reeks I, 1933.

mation of bilirubinemia. )
J. Am. Med. Assoc. 82, 291 (1924).
12a. J. A. Beyers, Urobiline en icterus bij onze plantenetende
huisdieren (dissertatie Utrecht 1923),

im Bihrubingehalt des Serums nach Mahlzeiten,
Ugeskr. Laeg. 1934, blz. 1056; referaat in Kongr, Central
Blatt 78, 307,

comparative des différentes méthodes cholesmimétriques,
Compt.-rend. soc. biol. 107, 692 (1931 ).

dosage de la bilirubine sanguine par une méthode de
Hijmans van den Bergh modifiée.
Presse méd. 1929 (I), blz. 490.

gels des Menschen und die Hyperbihrubinaemie.
Z.ges. exptl. Med. 67, 475 (1929).

rums bei der Urämie, ihre klinische Bewertung und den
ihr zu gründe liegenden Mechanismus.
Z.ges. exptl. Med. 67, 482 (1929).

planation of the two forms of bilirubin demonstrated by
the van den Bergh reaction.
Brit. Med. J. 1926 (I), blz. 1081.
27. G. Daddi, Delia colorazione della biUrubina nei tessuti
animali e di un nuovo metodo per colorarla in essi.
Riv. Clin. Med. 34, 78 (1933).
Centr. 71,611.

28 D T. Davies en E. C. Dodds, A study oft the proper-
ties of pure bilirubin and its behaviour towards the van
den Bergh reagent.
Brit. J. Exptl. Path. 8, 316 (1927).

canismo della reazione diazoica.
Arch. sei. med. 57, 523 (1933).
Centr. 72, 636.

nic of the van den Bergh reaction, icterus index, and
quantitative serum bilirubin.
J. Lab. Clin. Med. 7, 1 (1932).

nei liquidi deH'organismo col diazorcagcnte di Daddi.
Riv, Clin. Med. 32, 353 (1931).
Centr. 63, 790 (1931).

49a. L. J. Gillespie, Colorstandards for the colorimetric mea-
surement of H-ion concentrations.
J. Bact. 6, 399 (1921).

mination of bilirubin in blood by the diazo-method.
Biochem. J. 29, 1337 (1935).

bilirubins durch seine Chloroformlöslichkeit.
Z.ges. exptl. Med. 31, 119 (1923).

icteric index and the direct van den Bergh tests.
Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 26, 438 (1929).

Brit. J. Exptl. Path. 11, 407 (1930).
66a. G. H u n t e r, Canad. Med. Assocn. J. 23, 823 (1930).

serum, with a hypothesis on the nature of the bilirubin in
the serum from haemolytic jaundice.
Brit. J. Exptl. Path. 11, 415 (1930).

J. J. de la Fontaine Schluiter. Studiën over
anhepatische galkleurstofvorming.
Nederl. Tijdschr. Geneeskunde. 1915. I. blz. 811.
Nederl. Tijdschr. Geneeskunde. 1915. I. blz. 900.
Nederl. Tijdschr. Geneeskunde, 1915. I. blz. 1105.
Nederl. Tijdschr. Geneeskunde. 1915. II, blz. 491.

Fontaine Schluiter. The identification of traces
of bilirubin in albuminous fluids.

I. Verbeterde methode van Bilirubinebepaling.
Nederl. Tijdschr. Geneeskunde 1934 I, blz. 259.

rus; constitutioneele hyperbilirubinaemie.
Ncderl. Tijdschrift Geneesk. 1933, III, blz. 4429.

Sovetskaya Vrachebnaya Gazeta, Leningrad 31 V. 34.
(Zie I. Am. Med. Assoc. 103, 382 (1934)).

mination of bilirubin in different body fluids.
Acta Med. Scand. 50. 277 (1932): 76. 479 (1931).

sog. direkten und indirekten Diazoreaktion und die An-
wendung der Reaktionen zur Bestimmung des Bilirubins.
Acta Med. Scand. 76, 479 (1931).

van de bloedbilirubineverhoudingen bij gezonden en zie-
ken in de tropen.
Proefschrift Batavia. 1932.

stoff im Blutserum des Menschen.
Deut. Arch. klin. Med. 135, 79 (1921).
92 G. L e p e h n e. Pathogenese des Ikterus.

Ergebnisse inn. Med. Kinderheilk. 20, 221 (1921).
93. E. L e s c h k e. Berl. klin. Wochschr. 1921. blz. 848.
94 PLeviCrailsheim. Theoretische und experimentelle
Untersuchungen über Bilirubin und Fibrinogen im Blut.
Z. Ges. Exptl. Med. 32,468 (1923).

of the van den Bergh reaction for bilirubin in blood,
Brit. Med. J. 1925 (II), blz. 52.

suchung auf Gallenfarbstoff in Blutserum.
Deut, Arch, klin. Med, 132, 285 (1920).

nischer Bestimmung der Bilirubinmenge im Blute,
Deut, Arch. klin. Med. 137. 38 (1921),

der Nahrungsaufnahme auf den Blutbilirubingehalt,
Deut, Arch, klin. Med. 138, 321 (1922),

to biliare nel sangue mediante la diazo reazione.
Valore pratico e significato clinico della prova,
Arch, patol, clin. med. 2, 58 (1923).
Centr. 28, 283.

Ajch. Internal Med. 40, 195 (1927).
113 J. R. P e t e r. Gesammtfarbstoff und Bilirubin.

Biochem. Z. 262, 432 (1933).
114. G. Piot row ski. Diazo-réactions directe et indirecte,
leur mechanisme.

Archives des Maladies de l'Appareil Digestif et des Ma-
ladies de la Nutrition 15, 798 (1925).

J. Biol Chem. 97, 163 (1932).
118. B. W. Rhamy en P. H, Adams, A new standard for
the van den Bergh test.
J. Lab. Clin. Med. 13.87 (1928).

den mechanischen und dynamischen Ikterusformen.
Deut. Arch. klin. Med. 135, 257 (1921).

typus des Gallenfarbstoffes und über die quantitativen
Verhältnisse von Bilirubin und Cholesterin im Blut bei
verschiedenen Ikterusformen.
Arch, exptl. Path. Pharmakol. 91, 246 (1921).

types of van den Bergh's reaction on bilirubin.
Japan. J. Med. Sei. IV Pharmacology 3, 137 (1929).
Presse méd. 1929 (I), blz. 720.

131 M. J. Steenhout en J. P. Bouckaert. Sur la signi-
fication de la réaction directe de Hijmans van den Bergh.
Compt. rend. soc. biol. 96, 438 (1927).
132. K. Takeshita, Beiträge zur Bihrubinreaktion im Blut-
serum.

der Serumeiweissfraktionen und die Beziehungen zwi-
sehen ihnen und den Bilirubinreaktion im Blutserum.
Mitt. med. Akad. Kioto 6, 2953 (1932).
Centr. 71, 420.

séparation et le dosage des deux bilirubines (directes et
indirectes) du serum sanguin.
Compt. rend. soc. biol. 107, 884 (1931).
138. B. Varela. E. Apolo en C. Viana. Résultats obtenus
avec la nouvelle méthode pour le dosage sépare des bili-
rubines directe et indirecte dans les serums ictériques.
Compt. rend. soc. biol. 108, 1014 (1931).
139 B Varela-Fuentes en P. Recante. Nouvelle tech-
nique simplifiée pour le dosage séparé des deux bilirubi-
nes directe et indirecte, des serums ictériques.
Compt. rend. soc. biol. 116,1193 (1934).

HO. B. Varel a-F uentes en C. Viana, Die Kurven der
direkten und indirekten Bilirubinaemie beim katarrhali-
schen Ikterus.

between the bihrubin content of serum for different types
of jaundice and the icterus index of the serum after
removal of proteins,
Brit. J. Exptl, Path, 14, 17 (1933).

Het diffusibele gedeelte van het serumcalcium is vrijwel geheel
in geïoniseerde vorm aanwezig.

Het jodiumgehalte van schildkherpreparaten is geen maatstaf
voor hun biologische werkzaamheid.

Het is wenschehjk tijdens epidemieën van poliomyelitis acuta
anfertr kinken ac/ief tigen deze ziekte te immuniseeren.

Zijn in het laat-tertiaire stadium der syphilis de liquorreacties
positief, dan verdient de koortstherapie ernstige overweging, ook al
ontbreken verschijnselen van neurolues.

Het ulcus ventriculi perforatum behandele men zoo mogelijk
slechts met overhechting van het ulcus.

Er bestaan vooralsnog geen redenen pemphigus vulgaris en
pemphigus Duhring als dezelfde ziekte te beschouwen.

Diagnose	Hijmans v. d, Bergh— Grotepass	Oorspr. Hijmans v. d. Bergh	Weltmann en Jost
Sera met directe reactie
Levercirrhose	24,4	9,1	12
Decompensatio cordis	8,8	1,6	2,6
Catarrhale icterus	3,5	1.2	1,8
tt	24.	12,2	16,4
tt	31.		15.8
tt	17,6	6,5	10,6
tt	8.2	1,5	4.
tt	7,5	1,3	3,6
Gaisteenen	2.	0,3	0.6
Leverlues	6,2	3,5	3,4
Sera met indirecte reactie. Haemolytische icterus (bloed uit miltvene) Zelfde geval (bloed uit armvene) Pleurapunctaat Decompensatio cordis Constitutioneele Hyperbilirubinaemie Diabetes Decompensatio cordis Idem		10,96 20,5 13,2 1.2 1.5 2.4 1,2 2,1 1.5	10,5 16. 11,9 1.1 1.5 2,7 0,9 2,3 1,2

v.E. 5 Febr.	directe methode	6,9 E.	B.I. 3,8.
na 24 uur bij 37'	indirecte methode	1,8 E.	B.I. 3,8.
na 24 uur bij 37'	directe methode	6,7 E.	B.I. 3.9
na 6 dagen bij 37quot;	indirecte methode	1,7 E.	B.I. 3.9
na 6 dagen bij 37quot;	directe methode	4,4 E.	B.I. 3.
	Indirecte methode	1,48 E.	B.I. 3.

Diagnose	Totaal	Niet geads.	Bilirub.
Diagnose	bilirubine	bilirub.	in urine
Afnemende icterus bij
leverlues	9,3	1.7	—
Afnemende catarrhale
icterus	6,5	3,6	—
Idem, ander geval	11.1	0,8
Cardiale icterus	8,8	1.6	pos.
Catarrhale icterus	8,5	3,5	pos.
Cholelithiasis	4,5	1,6	pos.
Leverabces	4.8	1.5	pos.
Vergiftiging met een
abortivum	5,9	3,3	pos.
Catarrhale icterus	4,8	1.9	pos.
Galsteenen	5,2	0,6	pos.
Catarrhale icterus	5,2	1,2	spoor
Biliaire pneumraiie	3,7	2,1	spoor
Decmnpens. cordis	4,2	—	spoor
Catarrhale icterus	3,5	■1,2
Cholelithiasis	3,5	—	—
'dem, ander geval	4,2	1,2	—
Cholelithiasis	4	0,4	—
'dem, ander geval	3,4	1,5	—
Catarrhale icterus	2,3	0,9
Cholelithiasis	2,3	0,3

Diagnose	Totaal bilirubine	Niet geads. bilirub.	Bilirub. in urine
1. Pat. G. Catarrhale icterus 19nbsp;Sept. 20nbsp;„ 24 „	8,5 7 2,3	3,5 0,3	pos. pos.
2. Pat. V. Ziekte van WEIL 20 Aug. 27 „ 4 Sept.	8,8 4.5 2,25	3,4	pos. spoor
3. Pat. H. Cholelithiasis 27 Febr. I Maart	5.2 4	0.6 0,4	pos.
4.Pat.R. Cholelithiasis 1nbsp;Maart 2nbsp;.. 5	4,5 4 3,4	2.5 1.6 1.5	pos. pos.
S.Pat.B. Catarrhale icterus 21nbsp;Febr. 22nbsp;„	4,75 4,2	1,9 1,2	pos.
6.Pat.V. Catarrhale icterus 24nbsp;Maart 25nbsp;„ 26nbsp;„	3,5	1,2	spoor spoor
7. Pat. S. Catarrhale icterus 24 AprU IMei	5,2 3.5	0,2 0,6	spoor

r		□r	r
(N	Dr	dj	lt;
lLgt;	Q	OJ	Iii
	a ü	r.

diagnose	reactie	Hijmans v. d. Bergh— Grotepass	Chabrol
lues hepatis	direct	6E.	6E.
geronde persoon	indirect	0,3	0,5
idem	„	0,3	0.4
cholelithiasis	direct	4	4
ccBistitutioneele hyperbil.	indirect	2,7	2,9
Pancreas-ca	direct	2«	26
Cholelithiasis?	indirect	3,2	3,3
haemolytische icterus	indirect	11	9,6
pernicieuze anaemie	indirect	2,8	2,2

	-y • - 7-
■ . T
■ . T	'X V rX''/-',
		• i:
i		• ■ ' -.'/' . . .. • -- -, •


r ir i*:'
MVï' vxvV- ^
	iH':- ti-'-