TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR
IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKS-
UNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VAN DEN
RECTOR-MAGNIFICUS Dr. H. BOLKESTEIN, HOOG-
LEERAAR IN DE FACULTEIT DER LETTEREN EN
WIJSBEGEERTE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT TE VERDEDIGEN
TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT
DER WIS- EN NATUURKUNDE OP MAANDAG 18
MAART 1935 DES NAMIDDAGS TE 4 UUR

Bij het eindigen van mijn studietijd zij het mij vergund
allen dank te zeggen, die tot mijn wetenschappelijke
vorming hebben bijgedragen.

In de eerste plaats dank ik U, Hooggeleerde Kögl,
Hooggeachte Promotor, voor het vele, dat ik van U mocht
leeren. Steeds hebt Gij mij bij mijn onderzoek met goeden
raad ter zijde gestaan, en mij door Uw stuwkracht aan-
gespoord. Een groot voorrecht beschouw ik het Uw assi-
stent te mogen zijn.

Hooggeleerde van Romburgh, door Uw interessante col-
leges hebt Gij niet weinig bijgedragen tot mijn enthou-
siasme voor de studie der organische chemie. Voor de
welwillende raadgevingen, die ik tijdens mijn studie van
U heb mogen ontvangen, blijf ik U erkentelijk.

Ook U, Hooggeleerde Cohen, ben ik zeer dankbaar voor
hetgeen ik onder Uw leiding op het van 't Hoff labora-
torium heb mogen leeren.

Hooggeleerde KRiri'T, Uw boeiende colleges hebben ten
zeerste mijn belangstelling voor de phasenleer en de
kolloidchemie gewekt.

U, Hooggeleerde Schoorl, dank ik voor het feit, dat Gij
mij vertrouwd hebt gemaakt met de micro-chemische
analyse. Zelden was ik in de gelegenheid op een curso-
risch practicum van slechts korten duur zooveel te leeren.

Hooggeleerde de Graaff, dat Gij mij bekend maaktet
met de beginselen der micro-biologie was voor mij van
groote waarde bij het bewerken van dit proefschrift.
Hiervoor betuig ik U mijn welgemeenden dank.

Zeergeleerde Lobry de Bruyn, gedurende de gelegen-
heden die gij mij boodt op Uw laboratorium werkzaam

te zijn, vormde zich bij mij een xvarme belangstelling
voor de chemische en de chemisch-technische analyse.
Ontvang voor Uw gastvrijheid en Uw leiding mijn op-
rechten dank.

Zeergeleerde Tonnis, tallooze malen is Uw groote erva-
ring op het gebied van het bios-onderzoek mij tot steun
geweest. Wees verzekerd, dat ik Uw waardevolle raad-
gevingen op hoogen prijs heb gesteld.

^ • Zeergeleerde Hoogland, voor de hulp, die gij mij ver-
leende! bij het prepareeren van een aantal dierlijke

Ten slotte wil ik mijn dankbaarheid betuigen aan
allen, die mij bij mijn werk op het Organisch Chemisch
Laboratorium met raad en daad ter zijde stonden.

Hij hoogere planten dient men een onderscheid te
maken tusschen groei door celdeeling en groei door cel-
strekking.

Door botanische onderzoekingen, en wel in het bijzon-
der die, welke zijn verricht door de school van F. A. F. C.
Wkxt te Utrecht, werd bewezen, dat de ceXstrekking
wordt teweeggebracht door den invloed van bepaalde
groeistoffen, de auxinen.

In het Organisch Chemisch Laboratorium der Rijks-
universiteit te Utrecht gelukte het F. Kögl en medewer-
kers deze auxinen in gekristalliseerden vorm te isoleeren.
Naast auxine a (C1SH32O5) en auxine b (C18H30O4) werd
naderhand hetero-auxine (,S-indoM-azijnzuur) als een
derde uiterst actief phytoliormoon der celstrekking ont-
dekt. Hetero-auxine behoort chemisch tot een geheel
andere groep van stoffen dan de eerstgenoemde auxinen.

Kort geleden deelde F. Kögl mede, dat het hem in sa-
menwerking met B. Tonnis gelukt was ook een gekristal-
liseerd phytohormoon van den „cek/ep/j'nö'sgroeiquot; te iso-
leeren, dat biotine werd genoemd.

Het biotine is vermoedelijk de belangrijkste factor van
een groep van stoffen, die den groei van gist bevordert
en die reeds lang bekend staat onder den naam „b i o squot;.

In verband met deze onderzoekingen werd aan schrij-
ver dezer dissertatie opgedragen de andere bios-factoren,
die de werking van het biotine verhoogen, te bestudeeren.

Het onderzoek naar het bestaan en de samenstelling
van bios vindt zijn oorsprong in het werk van Pasteur
en Liebig. Het is de verdienste van E. Wildiers, het
bestaan van deze stof door experimenten aannemelijk
gemaakt te hebben. De ontdekking van de vitaminen
wierp een nieuw licht op de functie van bios, waardoor
men opnieuw pogingen deed dit laatste als chemisch ge-
definieerde stof te isoleeren, hetgeen tot gedeeltelijk suc-
ces heeft geleid.

De geschiedenis van het bios-onderzoek kan aldus in
twee periodes worden gescheiden. In de eerste vindt men
de onderzoekingen, die het aannemen van bios voorbe-
reidden. Tevens vindt men hierin beschreven hoe de
juistheid van deze aanname in twijfel werd getrokken en
welke critiek zij uitlokte. De tweede periode treedt in
na het bekend worden van de vitaminen, waardoor ook
het begrip bios werd geaccepteerd. Deze periode onder-
scheidt zich door betere methodes van onderzoek.

Het hierna volgend overzicht maakt geen aanspraak
op volledigheid, doch behandelt slechts die onderzoekin-
gen, welke van beteekenis zijn voor den tegenwoordigen
stand van het vraagstuk.

De literatuur tot 1925 is vrijwel volledig besproken
door F. W. Tanner (58) in de „Chemical Reviewsquot;. Een

De in dit hoofdstuk tusschen haakjes geplaatste nummers
verwijzen naar de hier achter volgende alphabetische lijst van
geraadpleegde literatuur.

uitvoerige opsomming van publicaties vindt men ook in
Klkin's „Handbuch der Pflanzenanalysequot; (1933). Van de
hand van W. Lash Miller (45) verscheen in 1930 een kort
en duidelijk overzicht over bios.

In 1860 verscheen de bekende publicatie van Pasteur
(ÓO) getiteld: „Mémoires sur la Fermentation Alcooliquequot;.
Hierin beschrijft hij o.a. proeven met voedingsbodems,
die bestonden uit suiker en eenige anorganische zouten,
op welke gist en andere organismen zich volgens hem
normaal ontwikkelden. Het was liem bekend, dat toe-
voegen van druiven-, beetwortel- of gistsap de gistings-
intensiteit aanzienlijk verhoogt. Zijn waarnemingen kon-
den door verschillende onderzoekers worden bevestigd.

In 1871 protesteerde Liebig (38) tegen de opvattingen
van Pasteur. In den strijd over den aard van het gistings-
proces, die nu tusschen de twee geleerden ontbrandde,
is één' twistpunt voor het bios-vraagstuk speciaal van
belang Het gelukte Liebig n.1. niet, gist te doen groeien
in een voedingsoplossing, welke uitsluitend bestond uit
suiker en anorganische zouten, zooals door Pasteur was
aangegeven. Hij beweerde zelfs, dat wat Pasteur voor
rtist aanzag, iets anders moest zijn.

Overtuigd van de juistheid van zijn waarnemingen
roept laatstgenoemde in zijn antwoord (51) tenslotte uit:
Mais œmment éclairer le public? Comment sortir
de'l'embarras que soulèvent ces affirmations contradic-
toires également honorables? Voici le moyen que j'offre
à M Liebig: il choisira officieusement, dans le sein de

l'Académie, un ou plusieurs de ses Membres, en leur
demandant de se prononcer entre lui et moi. En leur
présence, et avec des substances que M. Liebig pourra
fournir lui même, je reproduirai les deux expériences
capitales dont M. Liebig conteste la vérité. Je préparerai,
dans un milieu minéral, autant de levûre de bière que
M. Liebig pourra raisonnablement en demander, à la
condition toutefois qvi'il veuille bien faire la dépense
des expériences. S'il le désire même et toujours à cette
condition, je pourrai préparer quelques kilogrammes de
chair de vibrions, dont tout le carbone, tout l'azote, tout
le soufre, tout le phoshore, toutes les matières grasses,
cellulosiques et autres, sortiront exclusivement d'un
milieu à principes minéraux cristallisables et de la ma-
tière organique fermentescible....quot;

Liebig antwoordde hierop niet; Pasteur's opvattingen
zegevierden en het is zeker aan zijn autoriteit toe te
schrijven, dat bovengenoemd vraagstuk, hetwelk natuur-
lijk geenszins als opgelost kon worden beschouwd, pas
dertig jaar later weder te voorschijn kwam.

In 1901 maakte E. Wildiers (61) uit Leuven toebereid-
selen voor een onderzoek naar de phosphorhoudende
organische verbindingen in gist. Tot zijn verbazing wilde
deze, alle voorzorgsmaatregelen ten spijt, op een syn-
thetischen voedingsbodem niet groeien. Wildiers entte
met een cultuur van Saccharomyces cerevisiae I (Hansen)
op steriele mout. Hij gebruikte hiervan aanvankelijk zeer
kleine hoeveelheden, om de hoeveelheid onbekende or-
ganische stoffen in zijn gistkolven zooveel mogelijk te
beperken. Hij constateerde, dat bij enten met een grootere
hoeveelheid gist-suspensie wèl groei optrad en bewees,
dat dit effect niet was te danken aan het grooter aantal

gistcellen, maar aan de grootere hoeveelheid mout. Ook
een steriel gistextract veroorzaakte het zelfde effect.

Uit deze simpele waarnemingen concludeerdeWiLDiERS,
dat een gistcultuur, behalve suiker en anorganische zou-
ten, nog minimale hoeveelheden van „iets andersquot; noo-
dig had, dat blijkbaar aanwezig was in mout en m gist-
extract. Hij doopte deze stof met den naam bios en ver-
onderstelde, dat zij onmisbaar zou zijn voor alle gist-
soorten.

Het geschilpunt tusschen Liebig en Pasteur verklaarde
wildiers door aan te nemen, dat Pasteur met dusdanig
groote hoeveelheden gistcultuur entte, dat daarmede ge-
noeg bios in de voedingsoplossing werd gebracht om
normale ontwikkeling mogelijk te maken.

Hij deed verder eenige pogingen om bios te identifi-
ceeren met behulp van de volgende „testquot;. In kolven,
waarin zich een bepaalde hoeveelheid oplossing van
suiker en anorganische zouten bevond, bracht hij een
zeker quantum van de te onderzoeken stof en een con-
stante hoeveelheid gist. Door deze kolven dagelijks te
wegen, bepaalde Wildiers het gewicht van het ontwij-
kende koolzuur, en daarmede dus de intensiteit van de
gisting.

1°: niet aanwezig is in de asch van gist, en dus een orga-
nische stof moet zijn,
2° ■ gemakkelijk door perkamentpapier diffundeert,
30quot;: niet wordt aangegrepen door een halt uur koken met

6°: onoplosbaar is in aether en absolute alcohol,
7°: niet kan worden vervangen door: ureum, asparagine,
aniline, tyrosine, nucleïnezuur, adenine, guanine, crea-
tine, en door pepsine en trypsine afgebroken albumine.

De publicatie van Wildiers was zijn tijd vooruit. Daar-
voor zijn verschillende oorzaken aan te geven. In de
eerste plaats gold bij velen nog steeds onbeperkt het
gezag van Pasteur, met wiens zienswijze volgens hen „une
nouvelle substance, indispensable pour le développement
de la levûrequot; in flagranten strijd was. In de tweede plaats
was over de physiologie van diverse gistsoorten nog be-
trekkelijk weinig bekend. Bij het bestudeeren van de
variabiliteit van de gist zaten waarschijnlijk meer com-
mercieele dan wetenschappelijke belangen voor. In de
derde plaats wist men in dien tijd nog niets van vita-
minen en hormonen, waardoor zich de bios-hypothese
niet van zelf opdrong.

In onzen tijd zou niemand het belang van Wildiers'
publicatie zijn ontgaan. Uit de bezwaren, die men er
dertig jaar geleden tegen in bracht, blijkt hoe slecht men
de quintessens van bedoelde publicatie begreep. In
ieder geval was het niet verwonderlijk, dat Wildiers'
vooruitstrevende denkbeelden van verschillende zijden
heftig werden bestreden. Jammer genoeg hebben de
meesten van deze bestrijders het bios-probleem niet ver-
der gebracht. Kenmerkend voor de bekrompenheid van
hunne critiek is, dat zij wel degelijk de stimuleerende
werking van gist-extract, mout, e.d. erkenden, maar het
belang van deze waarneming op allerlei manieren tracht-
ten te negeeren. Zoo meden zij zorg\'uldig het woord

„biosquot;, maar spraken b.v. wèl over „een in het bijzonder
voor gist geschikte voedingsstofquot;; Wildiers had oor-
spronkelijk niets anders bedoeld. Tot eiken prijs bleven
deze onderzoekers vasthouden aan de theorieën van
Pasteur. Het eenige wat het vraagstuk tot klaarheid kon
brengen was de isolatie van de onbekende stof, maar dit
strookte niet met de opvattingen van de aanhangers van
Pasteur. Typeerend is ook, dat hun beweringen soms
zelfs niet eens op proeven waren gebaseerd.

Ter toelichting van het bovenstaande volgen hier in het
kort eenige bijzonderheden over het werk van Wildiers'
tegenstanders.

A. Fernbach (19) en W. Windisch (74, 75, 76) veronderstel-
den, dat Wildiers' voedingsoplossing een giftige stof zou heb-
ben' bevat. Windisch dacht daarbij in het bijzonder aan de
proeven van nageli.die den invloed bestudeerde, dien sporen
metaalzout uitoefenen op de ontwikkeling van micro-organis-
men. In het water zouden o.a. sporen koper voorkomen, die
door de eiwitten, aanwezig in het toegevoegde gist-extract,
zouden worden gebonden. Bij beide onderzoekers blijft het
bij een veronderstelling; vergeefs zoekt men naar een experi-
menteel bewijs.

T. Chrzaszcz' (4) resultaten moeten wel op technische
fouten berusten. Hij slaagde er in vier verschillende gisN
soorten te kweeken op een voedingsbodem, bestaande uit
suiker en anorganische zouten, opgelost in meerdere malen
gedistilleerd water. Nam hij één maal gedistilleerd water, dan
groeiden de cellen niet. Chrzaszcz concludeerde eveneens tot
de aanwezigheid van giftige stoffen en ontkende het bestaan
van bios.

H. Pringsheim (54), een fel tegenstander van de bios-
theorie, stelde zich als verklaring van de door Wildiers
waargenomen verschijnselen voor, dat gist in een voedings-
bodem, bestaande uit suiker en anorganische zouten, zou
moeten acclimatiseeren. Het groeien in een dergelijke op-

lossing zou met een grooteren „Energie-Aufwandquot; gepaard
gaan dan in een organisch milieu. Pringshkim vermoedde,
dat bios een in het bijzonder voor gist geschikte eiwit-ach-
tige stof was.

De verschillen, die Wildiers waarnam bij enten met kleine
en groote hoeveelheden gistsuspensie, verklaarde Pringsheim
aldus: Bij een groote enting is er meer kans, dat er krachtige
cellen zijn, die zich gemakkelijk aan het suiker-zout-milieu
kunnen aanpassen en worden door afsterven van cellen, spoe-
dig voedingsstoffen gevormd, die ten goede komen aan een
jongere generatie.

Pringsheim vergat, dat Wildiers bij zijn entingen nooit den
nadruk legde op het kleinere of grootere aantal cellen, maar
alleen op de met die cellen toegevoegde hoeveelheid mout.
Wij merken op, dat de groote verschillen in voortplantings-
snelheid bij Wildiers' proeven nooit gelegen kunnen hebben
in het verschil van het aantal geënte cellen. Hij schreef o.m.:
„II est d'ailleurs impossible d'admettre que, si le milieu est
réellement suffisant, la marche de la fermentation et du déve-
loppement puisse différer si fort, suivant qu'on ensemence
avec dix milles cellules vivantes, ou avec cinquante milles.
Si rien ne manque à ces cellules, c'est tout au plus de quelques
heures que les dix milles cellules pourront être en retard sur
les cinquante milles ...quot;

W. Lash Miller (45) merkt terecht op, dat Wildiers voor
zijn kleinste entingen minstens een millioen cellen moet heb-
ben gebruikt, waarbij de kans op een tekort aan levenskrach-
tige individuen practisch is uitgesloten en dat dus hieruit niet
de conclusies mogen worden getrokken, die volgen uit proe-
ven bij welke men had geënt met 5 of 50 cellen, zooals b.v.
door H. Naumann (49) werd beschreven.

Het eenige productieve werk in deze periode werd ge-
leverd door de Leuvensche school. Terecht kantten M. Ide
en zijn medewerkers zich tegen hen, die theoretische
bezwaren opperden zonder experimenteelen grond. Hoe-
wel hun werk niet vrij is van een zekere vooringenomen-

heid met de bios-hypothese, moet men toegeven, dat hun
experimenteele bewijsvoeringen heel wat beter zijn dan
bovengenoemde theoretische critiek.

A. Amand (1, 2) ontzenuwde door overtuigende experi-
menten het grootste deel van de bezwaren van Fernbach
en Windisch. Bovendien constateerde hij, dat wanneer
men gist kweekt in een oplossing, waarin zich voldoende
bios bevindt, deze stof na eenigen tijd uit die cultuur ver-
dwenen is. Uit de gistcellen was zij door gewone extractie

Amand vond verder, dat het bios-gehalte der cellen al
naar gelang van de samenstelling van den voedings-
bodem sterk varieert.

Een zeer belangrijke publicatie der Leuvensche school
verscheen van de hand van R. Devloo (7). Deze kon de
resultaten van Wildiers geheel bevestigen en zette diens
pogingen tot isolatie van bios voort. Hij vond, dat de
actieve stof voorkomt in zuivere lecithine-preparaten.
Het was een stikstofhoudende base, die geen verband
hieid met choline en hiervan was te scheiden door pre-
cipitatie met mercurichloride en bariumhydroxyde. Cho-
line en derivaten bleken evenals een aantal alkaloïden
onwerkzaam te zijn; opium en belladonna-extract bevat-
ten rijkelijk bios.

De aanvallen van Pringsheim e.a. werden afgeslagen
door Ide (30). Deze merkte op, dat Pringsheim met op
ammoniumzouten ingestelde gist nooit die intensieve
gisting verkreeg, welke optreedt wanneer men niet ge-
Lclimatiseerde cellen laat groeien op een bios-rijken
voedingsbodem. Niet alleen, dat hij van een acclimati-
seeren van de door hem gebruikte gist niets kon ontdek-
ken, Ide vond zelfs, dat cellen, die lang op een bios-arme

voedingsoplossing hadden geleefd, dusdanig pathologisch
waren verzwakt, dat zij bij toevoeging van bios niet meer
tot normale gisting waren te brengen. Ide laat geheel in
het midden of bios onontbeerlijk, of alleen „höchst vor-
teilhaftquot; is, of het dient tot opbouw van eiwitten en of
het op alle gistsoorten denzelfden invloed uitoefent. Het
was hem alleen te doen om die stof te isoleeren, welke
noodzakelijk blijkt te zijn voor het teweeg brengen van
een normaal gistingsbeeld.

Een interessant onderzoek van A. Kossowicz (34, 35)
mag niet ongenoemd blijven. Hij ontdekte, dat wanneer
men bacteriën en schimmels entte op een gistcultuur met
anorganische zouten en suiker als voedingsbron, deze
cultuur zich normaal ontwikkelde. Ook dood mycelium
was in staat den groei te versnellen. Evenals Wildiers
erkende hij, dat sporen van bepaalde organische stoffen
een grooten invloed hebben op de voortplantingssnel-
heid van gist.

Het vitamine-vraagstuk ontwikkelde zich bijna gelijk-
tijdig met het bios-probleem. In 1896 verscheen C. Eyk-
man's eerste publicatie (18a) van zijn klassieke onderzoe-
kingen over beri-beri. Evenmin als Wildiers ontkwam
hij aan den invloed van de aanhangers van Pasteur. Het
onderzoek van Polyneuritis werd met kracht voortgezet,
dank zij het groote belang, dat men er in Nederlandsch-
en Engelsch-Indië bij had de oorzaak en, indien mogelijk,
een therapie van beri-beri te vinden. De resultaten van het
onderzoek van Eykman waren oorzaak, dat het begrip
„vitaminequot; spoedig algemeen werd geaccepteerd. Hier-
door leek het niet meer zoo verwonderlijk, dat ook gist

voor een normale ontwikkeling een dergelijk vitamine
noodig zou hebben en men erkende de mogelijkheid, dat
bios deze rol zou vervullen.

Het nieuwe inzicht in de functie van bios leidde tot de
foutieve veronderstelling, dat deze stof identiek zou zijn
met het vitamine van Eykman. De ontwikkeling, die het
vraagstuk hierna doormaakte, was aanvankelijk gering.
Pas in 1923 werd definitief vastgesteld, dat bios niet ge-
lijk is te stellen met vitamine B. In dezelfde periode werd
ook bewezen, dat bios niet identiek kan zijn met het co-
enzyme van Harden en Young. Tegelijkertijd ontstond
opnieuw een strijd over het bestaan en de onmisbaarheid
van bios, die van veel belang was voor de physiologie
van het vraagstuk. In dezelfde jaren kwam men tot een
juister inzicht omtrent de voorzorgen, die bij het bios-
onderzoek dienen te worden betracht. Ook de techniek
van dit onderzoek werd aanzienlijk verbeterd.

Hier volgt een kort overzicht van de belangrijkste publi-
caties uit dit tijdperk.

U SuzLKi (57a) bereidde uit rijst het oryzanine, dat sterk
anti-neuritisch werkzaam was. K. Kurono (36) bewees, dat
dezelfde stof in kleine concentraties den groei van gist be-
vorderde. R. J. Williams (62) nam aan, dat gist, evenals
dieren, een vitamine noodig zou hebben om zich krachtig te
kunnen ontwikkelen. Op grond van het feit, dat de stof, die
den groei van gist bevorderde dezelfde eigenschappen ver-
toonde als het anti-heri-beri-vitamine en steeds tegelijk hier-
mede in verschillende extracten aanwezig was, concludeerde
hij dat de beide stoffen identiek moesten zijn. Daaruit zou
volgen, dat men in plaats van kostbare proefdieren ook gist
als ijkmateriaal kon gebruiken voor de waardebepaling van
vitamine-B extracten. Als maatstaf voor het vitamine-gehalte
koos Williams de gevormde hoeveelheid gist (63). F. Bach-
mann (3) kwam tot dezelfde conclusies. Zij bepaalde echter

de groeitoename door meten van tiet ontwikkelde koolzuur.
W. H. Eddy en H. C. Stevenson (10, 11, 12) volgden ongeveer
de methode van Williams, centrifugeerden de gist in een
soort trommsdorff-buisje en kwamen evenals F. Swoboda
(59) en G. Funk en H. E. Dubin (25, 27) tot de overtuiging,
dat de gist-quot;testquot; specifiek was voor vitamine B. C. Funk en
J. B. Paton (29) constateerden, dat sommige anti-neuritisch
werkzame extracten geen invloed uitoefenden op gist. In
plaats van aan de identiteit van bios en vitamine B te twij-
felen, namen zi] aan, dat deze extracten een voor gist giftige
stof zouden bevatten.

Een jaar na de publicaties van Williams kwam critiek van
de zijde van A. D. Emmet en M. Stockholm (14), die vonden,
dat bepaalde preparaten met sterke bios-werking niet in
staat waren de ontwikkeling van op vitamine B-vrij diëet
gekweekte jonge ratten te bevorderen. Zij trokken de waarde
van de gist-„testquot; voor de quantitatieve bepaling van het anti-
neuritische vitamine in twijfel en maakten de gevolgtrekking,
dat deze stof niet identiek kon zijn met de substantie, die den
groei van gist beïnvloedde. Tot gelijkluidende resultaten
kwamen: G. de P. Souza en E. V. McCollum (55), W. D.
Fleming (20), E. I. Fulmer, V. E. Nelson en F. F. Sherwood
(23) en M. B. McDonald en E. V. McGollum (42, 43). Ook
Funk en Dubin (26) veranderden van meening, toen zij de
belangrijke ontdekking deden, dat gist-extract was te schei-
den in twee fracties, waarvan één anti-neuritisch werkzaam
was, terwijl de andere de gist-ontwikkeling versnelde. Hun
voorstel om het „gist-vitaminequot; voortaan vitamine D te noe-
men vond geen bijval.

De functie van bios werd nog verder gepreciseerd door
H. voN Euler en medewerkers (16,17), die door vergelijkende
quantitatieve metingen der celtoename en der koolzuur-pro-
ductie^) aantoonden, dat bios de levensuitingen van de gist-
cel anders beïnvloedt dan het co-enzyme van Harden en

1) von Euler kwam tot de conclusie, dat de gisting en de cel-
deeling door verschillende „bio-katalysatorenquot; (resp. „I-aktor Z
(18) en , biosquot;) zouden worden beïnvloed. Deze opvatting werd
gesteund door een onderzoek van T. Philipson (52) doch weer

Young. T. Tholin (60) bewees bovendien, dat deze laatste stojquot;
zich van den groeifactor tevens onderscheidt door een groo-
tere gevoeligheid voor zuur en een geringere bestendigheid

Niettegenstaande in deze jaren talrijke onderzoekingen
overtuigend hadden bewezen welk een belangrijke rol bios
speelt bij de voortplanting van de gist, vindt men in denzelf-
den tijd tóch nog publicaties, die het belang er van negeer-
den. Zelfs werd door enkelen [b.v. P. Lindner (39, 40) en
H. Naumann (49)] het bestaan van bios tegengesproken! De
hierop betrekking hebbende onderzoekingen zijn vol tegen-
strijdigheden. Door gebrek aan uitvoerige gegevens omtrent
de zuiverheid der gebruikte chemicaliën en omtrent de ver-
gelijkbaarheid der gistsoorten, is de waarde van deze proef-
nemingen gering. Een viertal publicaties is karakteristiek
voor de verwardheid van de situatie.

McDonald en McCollum (42, 43) kwamen tot de conclusie,
dat gist kon groeien op een door hen uit rietsuiker en eenige
anorganische zouten samengestelde voedingsoplossing. Naar
aanleiding hiervan verscheen een artikel van M. Ide (31) —
leider van de reeds genoemde Leuvensche school —, die er
nog eens op wees, dat men twee soorten gist-ontwikkeling
scherp dient te onderscheiden, n.1. een abnormaal langzame,
die op den duur aanleiding kan geven tot degeneratie; en een
snelle, die te danken is aan de aanwezigheid van bios. Vol-
gens Ide behoorde het door McDonald en McCollum bestu-
deerde gistproces ongetwijfeld tot de eerste soort. C. Funk
en L. Freedman (28) constateerden, dat rietsuiker een stof
bevatte, die den groei van gist versnelde en die was te ver-
wijderen, door de suiker uit 80 % alcohol om te kristalli-
seeren. Hierdoor was de waarde van onderzoekingen, die de
mogelijkheid van een normale gist-ontwikkehng op een „syn-
thetischequot; voedingsbodem moesten bewijzen, twijfelachtig
geworden 2). Vrij van dezen twijfel is alleen de onderzoeking

tegengesproken door H. v. Euler en H. Larsson (15), die tot de
identiteit van bios II en Faktor Z besluiten.

2) Het lijkt mij niet uitgesloten, dat dit de oplossing zou zijn
van het twistpunt tusschen Pasteur en Liebig.

van E. I. Fijlmer, V. E. Nelson en A. White (24), die aan-
toonden, dat de volgens Loew uit formaldehyde bereide
„methosequot;, gecombineerd met eenige anorganische zouten
een voortreffelijken voedingsbodem voor de door hen ge-
bruikte gist vormde.

Een gedeeltelijke oplossing der problemen, die in deze
periode waren ontstaan, vindt men in het werk van A.
M. CoppiNG (6) en in eenige onderzoekingen van Williams
(64, 71, 72, 73), die duidelijk aantoonen hoe verschillend
zich de diverse rassen van Saccharomyces cerevisiae ge-
dragen en hoe voorzichtig men dientengevolge moei zijn
bij het vergelijken der resultaten van verschillende on-
derzoekers.

A. M. CoppiNG onderzocht het effect van „Marmitequot;
(= gist-extract) op een twintigtal gistsoorten, die variëer-
den van wilde tot sterk veredelde rassen. Bovendien ge-
bruikte zij vijf verschillende voedingsbodems. Het bleek,
dat de veredelde rassen hierop slechts zeer gebrekkig
groeiden, maar dat zij na toevoeging van „Marmitequot; een
belangrijke opleving vertoonden. De wilde soorten wa-
ren daarentegen ongevoelig voor dit gist-extract en ont-
wikkelden zich zonder eenig toevoegsel volkomen nor-
maal. Ook merkte zij op, dat de behoefte aan bios waar-
schijnlijk zou samenhangen met de gistings-intensiteit.
Toevoegen van gist-extract veroorzaakte n.1. een ver-
hoogde koolzuur-productie en een krachtiger adem-
haling; zij kon echter niet uitmaken of dit laatste te
danken was aan het grootere aantal cellen of aan een
werkelijke verandering in de stofwisseling.

Williams toonde aan hoe de cultuurgisten ook ten
opzichte van de bios-factoren een zeer uiteenloopende
kieskeurigheid vertoonen.

Kenmerkend voor het verschillend gedrag der gistras-
sen is ook de volgende mededeeling van Mhxer: „Lucas
compared Toronto-yeast with two races brought by pro-
fessor Eddy to the B.A. meeting 1924; both gave larger
crops with bios, but one a larger crop without the bios,
than the other with itquot;. Het spreekt vanzelf, dat ook
hierin een verklaring zou kunnen liggen van de on-
eenigheid tusschen Pasteur en Liebig.

Na het werk van Devloo, was het bios-onderzoek
min of meer op een dwaalspoor geraakt. Weliswaar had
men eenige vorderingen gemaakt op physiologisch ge-
bied en had men kunnen vast stellen wat bios niet was.

Men zou echter niet veel verder zijn gekomen, indien
men zich na 1923 niet weer geconcentreerd had op de
isolatie, van chemisch gedefinieerde stoffen.

De mededeeling van W. H. Eddy (9) over het „thio-amino-
zuurquot; van J. H. Mueller (47) en het werk van V. Lepeschkin
(37) met het „gekristalliseerde vitaminequot; van Funk zijn van
weinig waarde, daar beide preparaten zonder eenigen twijfel
onzuiver waren. Ook het belang van een reeks Japansche
onderzoekingen is eenigszins twijfelachtig. Het zou evenwel
de moeite waard zijn de door Y. Kinugasa (33) uit rijstzeme-
len geïsoleerde stof met de formule C10H8N4 te „testenquot; op
de door Williams of Miller gebruikte gistsoorten en haar
activiteit te vergelijken met andere preparaten. Minder be-
langrijk lijken mij in dit verband de door B. Suzuki en mede-
werkers (56, 57) geïsoleerde producten.

Het bios-vraagstuk werd nog een graad ingewikkelder
toen langzamerhand bleek, dat bios geen enkelvoudige
stof was.

De eerste mededeeling in die richting kwam van E. I. Ful-
mer, W. W. Duecker en V. E. Nelson (22). Zij extraheerden

gedroogd Alfalfa-gras eerst met absoluten alcohol (extr. I),
vervolgens met water (extr. II). Beide extracten vertoonden
bij een bepaalde concentratie een maximaal groei-effect.
Door de oplossingen te combineeren werd echter een veel
grootere uitwerking waargenomen.

\V. H. Eddy, R. W. Kerr en R. R. Williams (9) behandel-
den een extract uit ge-autolyseerde gist bij verschillende Ph
met een ferri-hydroxyde-sol. Uit één der aldus verkregen
neerslagen kon een actieve kristallijne stof worden geïso-
leerd, die bij 223° smolt en die de formule C5H11NO3 bleek te
hebben. Met deze stof alleen kon de werkzaamheid van het
oorspronkelijke gist-autolysaat niet worden verklaard. Het
gelukte Kerr (32) uit hetzelfde extract door electrodialyse
een a-, ß- en ^-bios af te scheiden; volgens hem was geen der
drie fracties chemisch zuiver.

De meest waardevolle gegevens over de bios-factoren
danken wij in hoofdzaak aan W. L. Miller uit Toronto
en aan R. J. Williams uit Oregon. Aangezien hun resul-
taten moeilijk vergelijkbaar zijn, zal ik deze afzonder-
lijk bespreken.

De eerste twee publicaties uit Miller's school, van C.
G. Fraser en van N. A. Clark, zijn van fundamenteel be-
lang voor de quantitatieve bepalingsmethode van bios.
Fraser (21) verbeterde de kweekmethode door de gist
te laten groeien in L-vormige buizen, die in een thermo-
staat voortdurend werden geschud. Hierdoor bleven de
gistcellen steeds in suspensie en men was zeker van vol-
doende luchttoevoer. Van deze technische verbeteringen
maakte Clark (5) gebruik, toen hij de voortplantings-
snelheid van gist in wort bestudeerde. Hij gebruikte een
gistsoort, die in een „synthetischequot; voedingsoplossing
zonder bios zeer langzaam groeide, maar die zich na toe-
voegen van de bios-rijke wort zeer snel deelde. De voort-

plantingssnelheid bleek onafhankelijk te zijn van de hoe-
veelheid toegevoegde wort; zij was echter op ieder wille-
keurig oogenblik evenredig met het op dat moment aan-
wezige aantal cellen. De celvermeerdering bleek, mits
een teveel aan gevormden alcohol niet de rol van beper-
kenden factor speelde, een zuiver logarithmische func-
tie te zijn. De voortplanting hield practisch gesproken
op, wanneer het aanwezige bios was verbruikt. De gist-
opbrengst werd bepaald met behulp van een haemacyto-
meter; hij was ten naastebij evenredig met de hoeveel-
heid toegevoegd bios en onafhankelijk van het aantal
cellen waarmee werd geënt. Zette men de procentueele
toename logarithmisch uit tegen den tijd, dan was de
hoek, die de verkregen lijn maakte met de tijd-as karak-
teristiek voor een bepaald preparaat (45). Op deze ge-
gevens is de meetmethode van Miller en medewerkers

G H. W. Lucas (41) ontdekte, dat bios-preparaten uit
zeer uiteenloopende dierlijke en plantaardige producten
door behandeling met bariet in alcoholische oplossing
waren te scheiden in twee factoren. De factor in het
neerslag, die tevens wordt geprecipiteerd door basisch
lood-acetaat, werd bios I, die in het filtraat bios II ge-
doopt.nbsp;.

E. V. Eastcott (8) bereidde bios I uit thee en identi-
ficeerde deze factor als meso-inosiet.

In 1924 vermeldde Miller (44) terloops, dat Fraser
erin was geslaagd bios II verder te fractioneeren. Pas in
1933 (46) publiceerde hij hierover een uitgebreid verslag,
waarin werd beschreven hoe van bios II uit gist bij be-
handeling met kool een gedeelte werd geadsorbeerd
(bios II-B) en een ander deel (bios II-A) in oplossing

bleef. Bios II-B was met behulp van verdunde aceton
en ammonia van de kool te elueeren. De combinatie der
drie aldus gescheiden factoren had ongeveer dezelfde
activiteit als het oorspronkelijke gist-extract. Toegevoegd
aan een gist-suspensie veroorzaakte factor II-B alleen
reeds een geringe groeitoename, terwijl de beide andere
factoren, afzonderlijk toegevoegd, geen activiteit vertoon-
den. Muxer werkte met een reincultuur van Fleisch-
mann-gist. De drie factoren werden echter ook op andere
gistrassen „getestquot;. Hierbij bleken de door Wu.diers ge-
bruikte gist en vier specimena van de American Type
Cvilture Collection op dezelfde wijze te reageeren.

De resultaten van T. Philipson (53) zijn geheel in overeen-
stemming met die van Miller, wat betreft de splitsing in
bios I en II. Koolbehandeling leidde bij Philipson evenwel
niet tot de ontdekking van een derden factor.

B. T. Narayanan (48) en Williams (72) meenden te moeten
ontkennen, dat inosiet een rol zou spelen als bios-factor. Aan-
gezien echter geen van beiden de scheiding met bariet en
alcohol of met basisch lood-acetaat heeft toegepast, is het
zeer waarschijnlijk, dat hun actieve extracten genoeg inosiet
bevatten om het uitblijven van een effect bij toevoegen van
inosiet te verklaren.

Williams (70) kwam tot een scheiding der bios-factoren
met behulp van voller's aarde. De verkregen fracties
werden afzonderlijk en gecombineerd „getestquot; op een
reeks gist-soorten, die zeer verschillend reageerden (72).
Twee soorten waren voor den geadsorbeerden factor
ongevoelig; zij vertoonen in dit opzicht overeenkomst
met de door Miller gebruikte gisten. Williams en E. M.
Bradway (64) slaagden er in de door voller's aarde ge-
adsorbeerde fractie van een rijstzemelen-extract in drie

verschillende factoren te splitsen, waarvan er één iden-
tiek was met het vitamine van B. C. P. Jansen en W. F.
Donath (Sla). Terecht concludeert Williams m.i., dat deze
factoren niets gemeen hebben met die van Miller, aan-
gezien deze laatste niet worden geadsorbeerd door vol-
ler's aarde.

Tegen het einde van 1931 publiceerde Williams (6o)
hoe hij met behulp van electro-dialyse tot een bios-
scheiding was gekomen. De verkregen fracties zouden
allen t.o.v. de gist van Wildiers een aanvullende wer-
king vertoonen. Daarentegen werd „Gebrüde Mayerquot;-
gist alleen door den zuren factor zeer sterk beïnvloed.
Williams (66) paste zijn scheidingsmethode toe op de
meest uiteenloopende plantaardige en dierlijke extrac-
ten vond, dat allen dezen factor bevatten en doopte hem
Pantothenic-acidquot;. In welk verband de „electrolyse-
factorenquot; staan tot de met voller's aarde verkregen fac-
toren is voorloopig niet duidelijk.

Uit acetvleerings- en veresteringsproeven met totaal
onzuivere preparaten concludeerde Williams (66), dat
pantotheenzuur een verzadigd alifatisch poly-oxy-zuur
zou zijn. Wanneer men bedenkt, dat het uitgangsmate-
riaal voor deze proeven misschien niet meer dan 1 o/oo
actieve substantie bevatte, lijken mij deze gevolgtrekkin-
gen eenigszins voorbarig. Hetzelfde geldt m.i. voor
Williams' bepaling van de dissociatie-constante van
pantotheenzuur (68). Het meest belangrijk is waarschijn-
lijk de vermelding van het moleculair gewicht, dat met
behulp van de diffusie-methode werd bepaald op 150 a
200 In een, onlangs verschenen, voorloopige publicatie
vergelijkt W^illiams (71) het effect van pantotheenzuur,
inosiet en vitamine B^, in verschillende combinaties „ge-

testquot;, op diverse gist-soorten en komt tot resultaten, die
gedeeltelijk in tegenspraak zijn met zijn vroegere mede-
deelingen.

De laatste mededeeling over liet bios-vraagstuk, de
publicatie van F. Kögl over bet isoleeren van biotine uit
eigeel, zal in hoofdstuk III nog nader worden vermeld.

Hiermede is in korte trekken de geschiedenis van het
bios-onderzoek geschetst. Van critiek heb ik mij bijna
geheel onthouden, daar dit de overzichtelijkheid zou
hebben geschaad.

Samenvattend valt het volgende op te merken. De
grootste moeilijkheid bij het bestudeeren der bios-htera-
tuur ligt in het feit, dat de resultaten van verschillende
auteurs buitengewoon slecht zijn te vergelijken. Bij dit
vergelijken zijn de volgende punten van groot belang:

De bios-factoren, in water opgelost, zijn niet te extra-
heeren met de gebruikelijke oplosmiddelen. Men is daar-
door, bij poging tot hun isolatie, genoodzaakt gebruik te
maken van methodes, gebaseerd op neerslaan en ad-
sorptie. Men vindt in de literatuur dan ook vele opgaven
over oplosbaarheid en mogelijkheden van precipitatie
etc., die echter meestal betrekking hebben op ruwe

1) Niet behandeld zijn de publicaties over stoffen, die den
groei bevorderen van bacteriën en schimmels, hoewel het niet
onmogelijk is, dat deze ten nauwste met bios verwant zijn.

extracten of op zeer onzuivere preparaten. Nu kan de
mate, waarin verontreinigingen in extracten voorkomen,
beslissend zijn voor het al of niet neerslaan of geabsor-
beerd worden van een actieve stof. Ook op de oplosbaar-
heid in organische oplosmiddelen hebben deze veront-
reinigingen dikwijls een zeer grooten invloed. Belangrijk
zijn natuurlijk ook de verdunning, de P^, de tempera-
tuur en tal van andere omstandigheden, waarbij men
precipiteert of waarbij men adsorbeert. Het onvolledig
vermelden van deze gegevens is dan ook de reden van het
waardeloos zijn van vele opgaven omtrent de eigenschap-
pen van bios.

(1934). Zie ook Chem. Abstr. 28, 5838 (1934).
Buston, H. W. en Kasinathan, S. Biochem. J. 27, 1859 (1933).
Buston, H. W. en Pramanik, B. N. Biochem. J. 25, 1671 (1931).
Blston, H. W. en Pramanik, B. S. Biochem. J. 25, 1656 (1931).

13.nbsp;Emmett, a. D. en Luros, G. O. J. Biol. Chem. M, 265 (1920).
14 Emmett, a. D. en Stockholm, M. J. Biol. Chem. W, 287 (1920).
U. Euler, H. von, en Larsson, H. H.S. 223, 189 (1934).

17.nbsp;Euler, H. von, en Petterson, A. H.S. 114, 4 (1921).
Euler, H. von, en Philipson, T. Biochem. Z. 2M, 418 (1932).

(1901). Zie ook Wochenschr. f. Brauerei 19, 2 (1902).
, 20. Fleming, W. D. J. Biol. Chem. M, 119 (1921).
21. Eraser, C.G. J. Phys. Chem. 25, 1 (1921).

29.nbsp;Funk, C. en Paton, J. B. J. Metabol. Res. 1, 737 (1922).
Guha, B. C. Nature blz. 131 (1931).

30.nbsp;ide, M. Cent. Bakt. II, 18, 193 (1907).
^31. ide, M. J. Biol. Chem. M, 521 (1921).

' 35nbsp;Kossowicz, A. Z. Landw. Versuchsw. Oesterr. 17, 688 (1906).
Kruse, H. D. en McCollum, E. V. Physiol. Rev. 9, 126 (1929).

Miller, W. Lash, Eastcott, E. V. en Sparling, E. M. Chem.
Abstr. 27, 1649 (1933). Zie ook Proc. Trans. Roy. Soc. Ca-
nada III, 26, 165 (1932).

. 49. Naumann, H. Zschr. Techn. Biol. 7, 1 (1919).
Nielsen, N. Biochem. Z. 237, 244 (1931).
Nielse.v, N. en Hartelius, V. Biochem. Z. 256, 2 (1932).
Nielsen, N. en Hartelius, V. Biochem. Z. 259, 340 (1933).

51.nbsp;Pasteur, L. Ann. Chim. Phys. 4de serie, 25, 145 (1872).
, Peskett, G. L. Biochem. J. 18, 866 (1924).

53.nbsp;Philipson, T. Biochem. Z. 258, 244 (1933).
, 54. Pringsheim, H. Cent. Bakt. 16, 111 (1906).

Reader, V. Biochem. J. 21, 904 (1927).
Reader, V. Biochem. J. 22, 434 (1928).
Reader, V. Biochem. J. 23, 61 (1929).
Richards, O. \V. J. Biol. Chem. 96, 416 (1932).

Stantial, H. Proc. Trans. Roy. Soc. Canada. III. 26, 163
(1932). Zie ook Chem. Abstr. 27, 1915 (1933).

Zie ook Chem. Abstr. 17, 2907.
57a. Suzuki, U., Shimamura, T. en Odake, S. Biochem. Z. M, 89 ('12).

76.nbsp;Windisch, W. Wochenschr. f. Brauerei. 19, 527 (1902).
Zeller, H. Biochem. Z. 266, 367 (1933) ; en andere publicaties.

In de literatuur vindt men een aantal methodes be-
schreven, die ten doel hebben den invloed te bestudeeren,
welke bios uitoefent op gistcellen. Vergelijkt men deze
methodes, dan valt in de eerste plaats op, dat verschil-
lende onderzoekers geheel verschillende effecten heb-
ben gemeten.

WH.diers, Amand en Devloo bepaalden het door k o o I-
z uurontwikkeling veroorzaakte gewichtsverlies
van hun culturen. Kossowicz bepaalde daarnaast ook
nog de toename van de hoeveelheid gevormde
alcohol.

Hiertegenover staan een reeks onderzoekers, die de
gistproductie hebben gemeten. Deze werd op zeer
verschillende wijzen bepaald. Funk en Dubin waren de
eersten, die de gist afcentrifugeerden en door meten van
de hoogte van de gistkolom in de centrifugebuis, de
volumen-toename bepaalden. Williams filtreer-
de de gevormde gist af en beoordeelde het bios-effect
naar de g e w i c h t s t o e n a m e, een methode, die
ook door anderen werd toegepast. Bij latere onderzoe-
kingen gebruikte Williams een nephelometer; de hier-
mede gevonden extinctie is een maat voor de volu-
men-toename. Miller en zijn leerlingen telden het
aantal cellen met behulp van een haemacytometer, het-

geen theoretisch de beste methode is ter bepaling van de
voortplantingssnelheid. Hoewel echter bij
gist de groei, de gisting en de voortplantingssnelheid ten
nauwste met elkaar verband houden, is het onjuist deze
levensuitingen, wat hun intensiteit betreft, evenredig te
stellen. Het is b.v. bekend, dat cellen nog kunnen fer-
menteeren nadat de groei reeds heeft opgehouden ; het
valt dus niet aan te bevelen den groei te beoordeelen
naar de koolzuur-productie. Daar Slator vond, dat na
stilstand der celdeeling het volume van de gist nog 20 %
kon toenemen, blijkt, dat men uit volumen-veranderin-
gen niet zonder meer conclusies mag trekken over de
voortplantingssnelheid. Uit dit alles is duidelijk hoe
slecht de resultaten van verschillende onderzoekers zijn
te vergelijken.

In verband met de tallooze variaties, die in de meet-
methodiek zijn aan te brengen, valt nog het volgende op
te merken. Voor den bioloog zijn alle zijpaden van dit
probleem van belang, omdat zij hem een vollediger beeld
van de physiologie der gist geven. De chemicus zal zich
echter moeten beperken. Hem is het er n.1. om te doen,
met behulp van een zoo betrouwbaar en zoo snel moge-
lijke biologische „testquot;, die stof of dat complex van stof-
fen te vinden, die oorzaak zijn van het effect, waarop de
door hem gekozen „testquot; berust. Heeft hij deze stof of
dit complex van stoffen gevonden, dan dient hij te be-
denken, dat deze substantie zonder meer alleen specifiek
is voor het effect, dat hij onder bepaalde omstan-
digheden, aan een bepaalde levensfunc-
t i e van een bepaalde gistsoort heeft geme-

ten, m.a.w., dat hiermede het bios van Wiluiers in den
ruimsten zin nog niet in zijn geheel behoeft te zijn op-
gehelderd.

Hier volgt een beschrijving van de op het Org. Chem.
Laboratorium te Utrecht door F. Kögl en B. Tonnis uit-
gewerkte meetmethode, welke nog niet uitvoerig is ge-
publiceerd. Het is mij een behoefte ook op deze plaats
laatstgenoemde mijn welgemeenden dank te betuigen
voor de wijze waarop hij mij de methode leerde toe te
passen.

De eerste verbetering gold het verkorten van de kweek-
periode der gist, die door Tonnis werd teruggebracht tot
vijf uren. Behalve dat hierdoor de duur van het onder-
zoek belangrijk werd verkort, werd tegemoet gekomen
aan een bezwaar, dat allen langen kweekperiodes aan-
kleeft. Men loopt daarbij n.1. het gevaar het resultaat
vertroebeld te zien door het optreden van een of anderen
beperkenden factor, in den vorm van remmende stofwis-
selingsproducten, het uitgeput raken van voedingsbe-
standdeelen of andere complicaties. Door het verkorten
der kweekperiode werd de grootte van het waar te nemen
effect natuurlijk sterk gereduceerd; dank zij het gebruik
van een gevoeligen nephelometer was het niettemin nog
ruimschoots voldoende voor het verrichten van nauw-
keurige bepalingen.

Een tweede verbetering betrof het meten van bios in
een iets hoogere concentratie dan bij een aantal onder-
zoekers gebruikelijk was. Tonnis vond, dat een effect van
omstreeks 100 % veel beter reproduceerbaar was dan
een groeitoename veroorzaakt door concentraties, waar-
bij de invloed van bios juist merkbaar begint te
worden. Op blz. 33 wordt hier nog nader op ingegaan.

Fig. 1. Verband tusschen toename van den groei, concentratie
van bios en kweektijd.

De grootste vooruitgang was de mogelijkheid tot
nauwkeurig quantitatief meten. Hierbij leidden hem de
volgende overwegingen. Een quantitatieve bepaling is
alleen dan mogelijk, wanneer men meet onder omstan-
digheden, waarbij de toename van het celmateriaal even-
redig is aan de hoeveelheid toegevoegd bios, m.a.w. in
een gebied waar beperkende factoren nog geen rol spe-
len en waar men alleen het door bios veroorzaakte
effect meet.

Het lag voor de hand, dat alleen de lage bios-concen-
traties, gemeten in een kort tijdsverloop, aan deze voor-
waarden zouden voldoen. Wanneer men grafisch tegen
elkaar uitzet de verschillende verdunningen en de daar-
door veroorzaakte effecten, blijkt een kromme te ont-
staan, waarvan inderdaad het eerste stuk hneair ver-
loopt. (ABC in fig 1).

De methode van Kögl en Tonnis verschilt principieel
van de meest gebruikelijke meetwijze, zooals b.v. door
Miller wordt toegepast. De eersten meten de gisttoename
als functie van de bios-concentratie; de laatste meet die
toename als functie van den tijd, bij een constante bios-
concentratie. In fig. 1 is de situatie grafisch voorgesteld.
De punten A en F op de tijd-as liggen resp. bij 5 en
bij 24 uur. Tonnis meet de curve ABCD, berekent het
bios-gehalte uit de punten B en C, terwijl de hoogte van
punt D (voor gist-extract gemiddeld 600 %) aangeeft tot
welke „topprestatiequot; de gist, na 5 uur groeien, door een
bepaalde oplossing in staat wordt gesteld.

Het vlakke verloop van de curve bij de hoogere concen-
traties is niet te wijten aan een beperkenden factor van stof-
felijken aard. De groei wordt echter gelimiteerd door den

tijd. Ieder bios-preparaat deelt aan de gist een voor dat pre-
paraat karakteristieke groei-snelheid mede, die sterk vermin-
dert, wanneer het bios, of één der bios-factoren, is verbruikt.
Dit laatste is het geval bij de punten B en C. Bij punt D en bij
hoogere concentraties wordt de bios-voorraad niet uitgeput,
daar de groei-snelheid niet toereikend was om in 5 uren zóó-
veel gist te doen ontstaan als daartoe noodig zou zijn geweest.
Voor een dergelijke groei-periode heeft de gist vanaf punt D
dus alles wat zij noodig heeft en zal zich vanzelfsprekend on-
verschillig toonen voor hoogere bios-concentraties.

Miller bepaalt daarentegen de curve DE, waarvan hij
de ordinaten logarithmisch uitzet. De hoek, die de ver-
kregen rechte lijn maakt met de tijd-as, is karakteristiek
voor den aard van het preparaat. Punt E geeft aan de
maximale opbrengst, die met de te onderzoeken oplos-
sing is te verkrijgen (aangenomen, dat de gist zonder bios
zeer weinig groeit); GE is dus de maat voor de aanwe-
zige hoeveelheid bios.

Dit principieele verschil in meten maakt het vergelij-
ken van onze resultaten met die van anderen voorloopig
niet mogelijk.

Wat de uitvoering betreft komt onze methode in groote
lijnen neer op het volgende: Een bepaalde hoeveelheid
gist wordt ingewogen en door schudden fijn verdeeld in
een voedingsoplossing, die behalve glucose, eenige on-
misbare anorganische zouten bevat. Van deze suspensie
wordt 1 c.c. gepipetteerd in kolfjes, die de te onderzoeken
vloeistof in verschillende verdunningen bevatten. Ver-
volgens woorden deze kolfjes bij 30° C. in een thermo-

1) Voor vergelijken van de resultaten van twee laboratoria zou-
den de preparaten tegelijkertijci volgens de verschillende metho-
des moeten worden gemeten.

staat gedurende 5 uren geschud, waarna aan ieder kolfje
een hoeveelheid 1 o/oo chloorkresol-oplossing wordt toe-
gevoegd om de gist te dooden. Hierna wordt de inhoud
van de kolfjes nephelometrisch onderzocht, waarna het
mogelijk is de procentueele toename van het celmateriaal
uit te rekenen. Zet men deze waarden graphisch uit tegen
de gebruikte concentraties, dan ontstaat in het geval van
een normaal gist-extract b.v. een curve zooals OABC in
fig. 2a. Uit het rechte stuk OB laat zich dan gemakkelijk
de hoeveelheid bios berekenen. Hiervoor werd als
eenheid aangenomen, de hoeveelheid bios,
die onder de hierna nauwkeurig te
O m s c h r ij V e n omstandigheden in staat
is een toename van cel materiaal te
geven van 100%. Deze wordt aangeduid met
Saccharomy ces-eenheid (S. E.).

Zooals later zal blijken is deze curve niet alleen bruik-
baar voor de quantitatieve bepaling van bios, maar even-
eens voor het quantitatief onderzoek naar de splitsing in
factoren.

In de volgende paragraphen vindt men eenige bijzon-
derheden over de practische uitvoering van deze meet-
methode.

Als „testquot;-object gebruikten wij de z.g. „Heferasse Mquot;^),
een „Brennerei Oberhefequot; welke door het Institut für
(larungsgewerbe te Berlijn in het groot wordt gekweekt.

1) Door het In.stitut für Garungsgewerbe werd ons medege-
deeld, dat „Heferasse Mquot; een uit vier „Unterrassen samenge-
stelde menegist is, die sedert vele jaren ten behoeve van bran-
derijen en gistfabrieken wordt gekweekt. In hoeverre de door ons

Uitdrukkelijk zij vermeld, dat deze gist geen reincultuur
is. Haar groote gevoeligheid voor bios maakte haar voor
ons doel zeer geschikt. Op de door ons gebruikte voe-
dingsoplossing van V. Reader groeide zij slecht, terwijl
toevoeging van een minimale hoeveelheid gist-extract
een sterke verhooging van de celproductie ten gevolge
had. Dank zij de constante eigenschappen van deze gist-
soort waren onze metingen gedurende meer dan drie
jaren goed reproduceerbaar.

Hoewel onze gist geen reincultuur was, werd natuurlijk
bij iedere behandeling toch zooveel mogelijk steriel ge-
werkt. Na aankomst werd de gist in een mortier door
voorzichtig wrijven zoo goed mogelijk fijn verdeeld en
daarna bij 0° C. bewaard in een flesch, voorzien van een
doorboorde kurk met een buisje, afgesloten door een
wattenprop.

In alle opzichten trachtten wij onze bepalingen steeds
zooveel mogelijk onder dezelfde omstandigheden uit te
voeren. Om dan ook het aantal cellen, waarmee wij ent-
ten, zoo constant mogelijk te houden, werd voor iedere
serie bepalingen de gist ingewogen. Al naar mate deze
meer of minder water bevatte, gebruikten wij 10 a 12
milligram. Deze werden gesuspendeerd in 50 cc. voe-
dingsoplossing.

Wij gebruikten een door Reader aangegeven oplossing,
bestaande uit:nbsp;___________

gebruiktrbios-factoren op ieder dezer stammen een invloed uit-
oefenen of in welke mate de groei van een bepaalde stam wordt
begunstigd hebben wij niet nagegaan.

Van deze stoffen werd steeds de qualiteit „pro analysequot;
gebruikt. Van de oplossing werd 50 cc. afgemeten in
nauwmondsche stopfleschjes van 100 cc., die, voorzien
van een wattenprop, tweemaal gedurende 45 min. wer-
den gesteriliseerd bij 100° C., met tusschenpoos van een
dag.

De oplossing van Reader is eigenlijk bedoeld als voe-
dingsbodem voor Streptothrix corallinus. Zij bleek ons
echter ook voor gist zeer goed bruikbaar.

Zooals ons proefondervindelijk bleek, diende men voor
het verrichten van nauwkeurige metingen binnen een
zeker concentratie-traject van bios te blijven. De hoogste
concentratie wordt bepaald door het punt, waar de
curve gaat afwijken van een rechte (meestal bij 300 %).
Dit is zonder meer duidelijk uit de beschouwingen op
blz. 29; voor de laagste concentratie gebruikten wij een
dusdanige bios-verdunning, dat de procentueele toename

1) Ook de concentraties daarboven werden gemeten. Uit het
verloop van dit deel van de curve kan men n.1. belangrijke con-
clusies trekken omtrent eventueele aanwezigheid van giftige stof-
fen, aard der bios-factoren, enz.

ongeveer 100 % bedroeg. Wij vonden, dat bij grootere
verdunningen deze toename onderhevig was aan met
controleerbare schommelingen, die de nauwkeurigheid

in geringere mate vertoonden ook de metingen binnen
het gunstigste concentratie-traject zekere schommelin-
gen, die, in tegenstelling met de afwijkingen bij te kleine
concentraties, wèl controleerbaar bleken te zijn. Werden
n 1 eenige dagen achtereen dezelfde oplossingen geme-
ten dan was het opvallend, dat den eenen dag alle me-
tingen hoog waren, terwijl ze een anderen dag alle iets
lager uitvielen. Deze paralleliteit bewijst, dat men met
een „dag-invloedquot; te doen heeft. Om deze zooveel mo-
gelijk te elimineeren werd iederen dag een „standaard-
oplossingquot; van bios gemeten.

Een i kg gist werd gedurende twee uren gekookt met de
viervoudige hoeveelheid water, na afkoelen werd het cel-
materiaal afgecentrifugeerd en de vloeistof door een z.g.
Ultra-Cella-Filter gefiltreerd. Het volumen van het filtraat
werd op 2 1 gebracht. Deze oplossing, tienvoudig verdund,
bleek, na vele malen gemeten te zijn, een gemiddeld gehalte
van 12 S E. per cc. te bevatten. De geconcentreerde oplossing
werd steriel in toegesmolten buisjes in de frigidaire bewaard;,
zij bleef voor zoover dit was na te gaan, volkomen onveran-
derd. Een nieuwe standaard-oplossing werd steeds geijkt op
de oude en daarna zoodanig verdund of ingedampt, dat zij,
dezelfde bios-concentratie als deze bevatte.

De metingen van alle preparaten werden vergeleken
met die van de standaard-oplossing. Al naarmate deze
laatste metingen positieve of negatieve afwijkingen ver-
toonden van de gemiddelde waarde van 12 S.E. per cc..

werden de andere waarnemingen gecorrigeerd door ver-
menigvuldigen met een factor resp. kleiner of grooter
dan 1.

Ook bij onderzoekingen naar de Mos-factoren, werden
de metingen steeds vergeleken met die van de standaard-
oplossing. Het was in verband met deze proeven wen-
schelijk twee begrippen in te voeren:

1°: „Standaard-concentratiequot;. Een bios-oplossing
bevat de standaard-concentratie, wanneer 0,1 cc.
daarvan een groei-toename van 120 % veroor-
zaakt.

2°. „Standaard-curvequot;, dat is de curve, die ontstaat
wanneer men de standaard-oplossing in verscbil-

1) De „uitgangswaardequot; geeft de extinctie aan, veroorzaakt
door 1 cc. water 1 cc. gist-suspensie, die onmiddellijk met 20 ec.
chloorkresol-oplossing werden behandeld.

De „blanco-waardequot; geeft de extinctie aan, veroorzaakt dooi
1 cc. water 1 cc. gist-suspensie, die gedurende 5 uren werden
gekweekt, zonder toevoeging van bios en pas daarna met 20 cc.
chloorkresol-oplossing werden behandeld.

lende concentraties (hoeveelheden van 0,1 tot
1 cc.) meet en deze concentraties graphisch uit-
zet tegen de overeenkomstige groei-effecten.
Deze cvirve werd normaal genoemd, wanneer
1 cc. van de standaard-oplossing een groei-toe-
name veroorzaakte van ± 600 %. (Zie fig. 2a).

Uit proeven bleek ons, dat wanneer wij het bios-gehalte
van twee preparaten nauwkeurig wilden vergelijken,
deze ongeveer tot dezelfde concentratie moesten worden
verdund. Gemakshalve namen we hiervoor de standaard-
concentratie, dus ± 12 S.E. per cc. Hoe groot de fouten
kunnen zijn, wanneer men zich niet aan deze verdun-
ningsbepaling houdt, blijkt uit het voorbeeld op blz. 39.

De oplossing met onbekend gehalte brachten wij na
eenige voorloopige metingen op een gehalte van ten
naaste bij 12 S.E. per cc. Daarna kon de eigenlijke nauw-
keurige meting plaats vinden. Tot dit doel werden in een
serie Jena-Erlenmeyers van 20 cc. met wijden hals de in
bovenstaande tabel aangegeven hoeveelheden afgemeten.
Ieder kolfje bevatte steeds hetzelfde volumen vloeistof.

Een half uur na het maken van de gist-suspensie werd
hiervan aan ieder kolfje 1 cc. toegevoegd, waarna deze
werden gesloten met een met collodium behandeM
kurkje. De geheele reeks werd dan, behalve de twee „uit-
gangswaardenquot;, onmiddellijk in de electrisch op 30° C.
gereguleerde thermostaat gebracht en daarin gedurende
vijf uren geschud met een snelheid van ongeveer 200
schommelingen per minuut. Hierna werd aan alle kolfjes
20 cc. chloorkresol-oplossing toegevoegd om de gistcellen
te dooden.

De toename van het cehnateriaal bepaalden wij door
van de verkregen gist-suspensies de extinctie te meten
met een Nephelometer van Moll. Dit door de firma Kipp
te Delft in den handel gebrachte toestel voldeed, wat de
gevoeligheid betreft, volkomen aan de gestelde eischen.

De cuvetten werden voor iedere meting zorgvuldig
uitgespoeld met water en aceton, daarna met een zeemen
lapje afgedroogd.

Vervolgens werd de inhoud van een meetkolfje voor-
zichtig geschud, zoodat zich geen luchtbelletjes vormden,
die de meting zouden storen; daarna werd de verkregen
suspensie in de cuvette gegoten. Het meten geschiedde
daarna zooals is beschreven in de publicatie van
W. .T. H. Moll^).

De procentueele toename aan celmateriaal laat zich
uit de gemeten extinctie gemakkelijk berekenen volgens

Theoretisch was het natuurlijk juister geweest om voor
a niet de uitgangswaarde, maar de blanco-waarde te
nemen. De ervaring leerde echter, dat dit laatste getal
veel meer aan schommelingen onderhevig was dan het

het bios-gehalte is te berekenen, wordt verduidelijkt door
het voorbeeld in Tabel 2.

Wij gebrviikten voor de berekening van het bios-gehalte
de metingen, correspondeerend met de verdunningen van
0,1 en 0,3 cc. en namen het gemiddelde van de verkre-
gen uitkomsten.

0,1 cc. standaard-oplossing een gehalte van 1,3 S.E.,
correspondeerende met 13 S.E. per cc.

0,3 cc. geeft een gehalte van 3,8 S.E., correspondeeren-
de met 12,5 S.E. per cc.

De aldus verkregen waarden zijn slechts van belang
in betrekking tot elkaar, aangezien zij geheel afhankelijk
zijn van alle bijzonderheden van een willekeurig geko-
zen meetmethode.

Zooals reeds op blz. 36 werd gezegd, mag het bios-
gehalte van de te meten vloeistof niet te veel verschillen
van de standaard-concentratie, m.a.w. van 12 S.E. per cc.
Het volgende voorbeeld geeft een indruk van de grootte
van de fout, die men kan maken door het meten bij een

Een extract van 1 g peterseliezaad op 5 cc. water gaf
in een verdunning van 1 : 20 de volgende waarden:
0,1 cc. . . . . 360 % toename.
0,3 cc..... 585 % toename.

Uit de eerste meting vindt men, dat peterseliezaad een
bios-gehalte heeft van 2100 S.E. per g, uit de tweede
(juiste meting) volgt 490Ö S.E. per g.

Volledigheidshalve volgen nog eenige ervaringen, die
Tonnis en ik opdeden gedurende de eerste drie jaren van
ons bios-onderzoek.

Evenals bij de meeste biologische „testquot;-metbodes is
men afhankelijk van de variabiliteit in wezen en gedrag
van een levend organisme. De factoren, die onze metin-
gen aan schommelingen onderhevig deden zijn, waren,
voor zoover was na te gaan, tweeërlei:
1° de d a g-i n V 1 o e d. De oorzaak hiervan is nog
niet bekend; een enkele maal leek het of groote af-
wijkingen samen vielen met meteorologische veran-
deringen. Zooals uit het onderzoek van F. Kögl en
A. J. Haagen Smit^) bekend is, schommelt ook de
gevoeligheid van haverplantjes voor auxine op ver-
schillende dagen zeer sterk, maar ook bier was het
niet mogelijk over de oorzaak van dit verschijnsel
definitieve conclusies te trekken.
2° de qualiteit van de gist. In den eersten
tijd van het onderzoek varieerde de kleur der voor
het meten gebruikte gist van bijna wit tot vuil bruin-
grijs. De eerste soort was meestal erg droog en zeer
gemakkelijk te homogeniseeren. Over het algemeen
voldeed deze qualiteit het best. De standaard-oplos-
sing gaf hiermede meestal een „normalequot; curve (zie
fig. 2a), d.w.z. de verdunning 0,1 cc. gaf ± 120, de
verdunning 1,0 cc. 500 a 700 % toename van het cel-
materiaal. Met de bruin-grijze qualiteit werden dik-
wijls afwijkende resultaten verkregen (zie fig. 2b).

Fio 2a. „Normalequot; groei-curven veroorzaakt door bios II, bios
' I II en door de standaard-oplossing.

Fig 2b „Gedruktequot; groei-curven veroorzaakt door dezelfde op-
lossingen als in fig. 2a.

De standaard-oplossing gaf een „gedruktequot; curve
met als hoogste groeitoename 350 ä 400 %. Zoolang
nu de blanco-waarde (gewoonlijk 30 ä 40 %) nor-
maal bleef, had dit op de quantitatieve metingen
van bios weinig invloed. Het meten van de stand-
aard-oplossing gaf, mits de afwijkingen niet al te
groot waren, steeds de gewenschte correctie.

Meer last ondervonden wij van een „gedruktequot; curve
bij het meten van de effecten der h\o%-factoren, aange-
zien het meten hiervan juist berust op de „hoogteverschil-
lenquot; van de curve. Uit bovenstaande graphische voorstel-
lingen ziet men duidelijk hoe onder deze omstandighe-
den de figuur als een waaier in elkaar wordt geschoven.
Hierdoor kan b.v. het hoogteverschil tusschen de krom-
men I II en I II -f HI gaan naderen tot de proeffout,
en het quantitatief meten der factoren was dan onmo-
gelijk.

Een enkele maal gaf een monster van ons gistras ook
zonder toevoeging van bios meer dan 100 % toename
van den groei (in plaats van de normale 30—40 %). In
dat geval was de gist bruin-grijs en kleverig; het ligt
voor de hand aan te nemen, dat deze tamelijk veel dood
celmateriaal bevatte, dat als bios-bron diende.

Nadat wij genoemde onaangename ervaringen hadden
opgedaan verzochten wij het Institut für Gärungsgewerbe
ons inlichtingen te geven over de oorzaak van de variee-
rende qualiteit der gist. Dit instituut deelde ons daar-
omtrent het volgende mede: „ . .. Die Hefe fällt je nach
der Generation, die zum Versand kommt, etwas ver-
schieden aus. Sie wird in den einzelnen Generationsstu-
fen verschieden ernährt und zwar in den ersten Stufen
ausschliesslich organisch, während in der letzten Stufe

die Hefe fast ausscliliesslich anorganisch ernälirt wird.
In den ersten Generationsstiifen ist die Hefe meist etwas
grauer und die Konsistenz etwas zäher.quot; Hiermede had-
den wij de verklaring van het wisselend gedrag der gist.
Het is immers zeer aannemelijk, dat de op organischen
voedingsbodem gekweekte gist meer bios bevat dan de
anorganisch gekweekte en dat daardoor de eerste soort
minder sterk reageert op toegevoegd bios. Wij gebruik-
ten daarna uitsluitend anorganisch gekweekte gist, het-
geen tot resultaat had, dat het aantal afwijkingen bij het
meten sterk verminderde.

Toen F. Kögl en B. Tönms in 1931 begonnen met hun
onderzoek van bios, stond op grond van onderzoekingen
van E. V. Eastcott alleen vast, dat bios I door meso-
inosiet kon worden vervangen. Over het chemisch karak-
ter der andere bios-factoren tastte men nog zeer in het
duister en bovendien wist men ook nog niet of de voor
een bepaald gist-ras werkzame factoren ook voor andere
rassen beteekenis hadden en of b.v. onze „Heferasse Mquot;
eveneens meerdere bios-factoren voor haar groei noodig
had. Het leek daarom de aangewezen weg bios eerst als
enkelvoudige verbinding te beschouwen, totdat het ver-
dwijnen der activiteit bij een bepaalde bewerking gedu-
rende de zuivering op een splitsing in factoren zou wij-
zen. Een dergelijk verdwijnen der werkzaamheid trad
echter niet op en het door F. Kögl en B. Tönnis in 1934,
na een drie millioen-voudige concentratie, in gekristalli-
seerden toestand verkregen biotine toonde ook zonder
toevoeging van andere factoren een zeer groote activiteit.
Nog voor dat de gekristalliseerde verbinding was ver-
kregen, kon echter al aan onzuivere oplossingen van
biotine worden geconstateerd, dat bij de zuivering een
andere factor was afgescheiden. Deze was weliswaar op
zichzelf niet werkzaam, maar verhoogde de activiteit
van biotinc-oplossingen aanzienlijk. Het lag voor de hand
te onderzoeken of deze factor niet met meso-inosiet
identiek was. Inderdaad kon deze meerwaardige alcohol

den afgescheiden factor ten deele vervangen. Het bleek,
dat de scheiding tusschen biotine en bovengenoemden
factor plaats heeft bij de behandeling der ruwe extracten
met dierlijke kooP). Hierbij wordt het biotine aan de
kool geadsorbeerd, terwijl bios I in oplossing blijft.

In dit stadium begon ik zelf aan het onderzoek deel te
nemen; als eerste taak werd mij opgedragen na te gaan
of inderdaad de bovenvermelde, niet aan kool adsor-
beerbare factor, volkomen gelijk te stellen is met meso-
inosiet.

Eastcott onderzocht diverse producten op hun gehalte
aan bios I. Theestof bleek van deze producten het meest
van genoemden factor te bevatten en werd daarom als
uitgangs-product voor de isolatie van bios I gekozen.

Zij werkte volgens de methode van Lucas, scheidde bios I
uit het thee-extract af door behandeling met bariet en alco-
hol en zuiverde de actieve fractie vervolgens door precipi-
teeren met loodacetaat en ammonia. Het loodneerslag werd
ontleed en de verkregen bios I-oplossing met kool ontkleurd.
Eascott nam waar, dat de activiteit van deze oplossing drie
maal zoo groot werd door koken met 20 % zoutzuur, terwyl
gedurende deze bewerking veel bijproducten verkoolden, ^a
affiltreeren van een onoplosbare zwarte massa en nogmaals
ontkleuren met kool werd de oplossing tot op een klem volu-
men ingedampt en hieraan langzaam methylalcohol toege-
voegd De actieve stof, die zich hierna afscheidde, werd vele
malen omgekristalliseerd en bleek identiek te zijn met meso-
inosiet.

Deze bewerking laat de mogelijkheid open, dat hierbij
bios I verandert. Het zou^^ k^nen zijn, dat mosiet

quot; i7 Hpt f7it dat een der bios-factoren aan kool is te adsorbeeren,
we d t ee st terloops vermeld door W. L.

oorspronkelijk als phosphorzure ester aanwezig was.
Deze zou bij de behandeling met 20 % zoutzuur zonder
twijfel hydrolytisch worden gesplitst. In dit geval zou
inosiet niet het origineele bios I zijn. Dat de behandeling
met zoutzuur veranderingen teweeg kan brengen, blijkt
trouwens uit Eastcott's vermelding van een door dit
zuur veroorzaakte stijging van het gehalte aan bios I.
Afgezien van het feit, dat door genoemde behandeling
gevaar voor secundaire veranderingen bestond, leek het
gewenscht, de actieve stof achteraf ook uit de oorspron-
kelijke bron — dus de gist — te isoleeren. Naar aanlei-
ding van de publicatie van Eastcott doen zich dus de
volgende vragen voor.

Is bios I uit gist identiek met bios I uit thee? Zoo ja,
is dan inosiet als zoodanig verantwoordelijk voor de
bios I-werking van gist-extract of hebben we te maken
met een inosiet-derivaat?

Een antwoord op deze vragen is alleen te geven door
de gist zoo voorzichtig mogelijk te verwerken en daarbij
het gebruik van sterk ingrijpende reacties te vermijden.

Ten slotte rees de vraag of er nog andere chemisch
eventueel op meso-inosiet gelijkende stoffen waren, die
eveneens de werking van bios I vertoonen, dus of de
activiteit van meso-inosiet op specifieke wijze met zijn
constitutie samen hangt.

Reeds bij een der eerste zuiveringstrappen deed zich
een moeilijkheid voor. Het bios I uit gist werd n.1. neer-
geslagen met loodacetaat en ammonia en het gevormde

neerslag met zwavelwaterstof van lood bevrijd. Het
filtraat van het loodsulfide, toegevoegd aan den factor
uit het kool-eluaat „verhoogdequot; de groeikromme. Voor
het bereiken van de standaard-curve (600 %) moest aan
het kool-eluaat echter 8 ä 10 maal de berekende hoeveel-
heid (berekend op de oorspronkelijke concentratie van
den factor in het uitgangsmateriaal) van dit filtraat
worden toegevoegd. Dit was des te meer opvallend, om-
dat men bij een dergelijke „onschuldigequot; behandeling
met loodacetaat en ammonia een quantitatieve opbrengst
zou verwachten. Drie verklaringen waren mogelijk:
1°. Bij deze behandeling is 90 % van de actieve stof ver-
loren gegaan. 2°. Bij de adsorptie of bij de elutie heeft
de aan kool adsorbeerbare factor chemisch een veran-
dering ondergaan. In het koolfiltraat bevindt zich
nog een derde factor. Het volgende experimenteele on-
derzoek bewees, dat deze laatste veronderstelling de

De gist verwerkte ik daartoe als volgt:
1 kg bakkersgist (koningsgist, Delft) werd met 3,5 1
water gedurende een uur gekookt, waarna het extract
door centrifugeeren werd gescheiden van het celmate-
riaal.

Bij deze en de volgende metingen zijn duidelijkheidshalve
de uitkomsten vermeld in sterk afgeronde getallen. Het ver-
dunningsgetal geeft aan tot hoever men een bepaald extract
kan verdunnen, opdat 0,1 cc. daarvan nog een groei-toename
van ipO % veroorzaakt, m.a.w. de standaard-concentratie
bezit. ^

het hinderlijke schuimen kon worden vermeden door af
en toe een spoortje n-decyl-alcohol toe te voegen. Na de
indamprest te hebben opgenomen in weinig water, werd
zooveel alcohol toegevoegd, dat de oplossing tenslotte
80 % hiervan bevatte. Het gevormde neerslag werd af-
gefiltreerd en het filtraat door indampen in vacuo van
alcohol bevrijd.

Ondanks een verlies van ongeveer 30 %, blijken dus
nog alle factoren aanwezig te zijn.

De rest van het „alcoholisch filtraatquot; werd opgenomen
in 2 1 water, aan deze oplossing werd 25 g (overmaat)
loodacetaat, opgelost in weinig water toegevoegd en het
gevormde neerslag afgefiltreerd. Een proefje van het
filtraat bleek na verwijderen van het lood nog de volle
activiteit te bezitten. Aan de rest van het filtraat werd
ammonia toegevoegd, tot de overmaat lood was neer-
geslagen. Het precipitaat werd gecentrifugeerd, met wa-
ter uitgewasschen, vervolgens in 2 1 water gesuspendeerd
en evenals het filtraat met zwavelwaterstof van lood
bevrijd.

dus een scheiding in factoren te weeg gebracht, waarbij
geen actieve substantie is verloren gegaan.

Het „lood-filtraatquot; werd volledig bevrijd van ammonia
en lood, hierna verdund tot een volumen van 5 1 en ver-
volgens tweemaal geschud resp. met 50 en 25 g kool.
Na een half uur werd gefiltreerd, met water uitgewas-
schen en daarna geëlueerd met 0,1 N bariet in 60 %
aceton (per g kool werden 20 cc. van deze oplossing ge-
bruikt). Door indampen in vacuo en behandeling met
verd. zwavelzuur werden uit het eluaat aceton en barium
verwijderd.

„kool-eluaatquot; (verd. tot 20 1) „fee^neerslagquot; (verd. 20 1)
„kool-filtr.quot; (verd. 20 1):nbsp;curve tot 600 %.

„kool-eluaatquot; (verd. 20 1) „kool-filtraatquot; (verd. 20 1)
inosiet:nbsp;curve tot 600 %.

Uit deze reeks metingen blijkt het volgende:
1°: Met de aan kool adsorb eerbare
en d e- d o o r loodacetaat en ammonia
neergeslagen factoren is de werk-
zaamheid van een gist-extract niet
volledig verklaard. Er bestaat dus
nog minstens een derde factor.

vervangen door de actieve substantie
uit het „Iood-neerslagquot;in8al0-voudige
overmaat toe te voegen.

4°: Deze proeven geven een afdoende verklaring van
het oogenschijnlijk verlies van 90 %, genoemd op blz. 47.

De factor uit het kool-eluaat: bios II (corresp. met
Miller's bios II-B, waaraan later door Kögl en Tonnis de
naam biotine werd gegeven).

Om het onderzoek van bios I op quantitatieve wijze
verder voort te kunnen zetten werd een maatstaf aan-
genomen, waarin de activiteit van een bios-I-preparaat
was uit te drukken. Op grond van eenige voorloopige
proeven bleek deze het best als volgt te definieeren: d e
hoeveelheid, die, gecombineerd met
1 cc. van een mengsel van bios II en
-III in dubbele^) standaard-concentra-
tie, dezelfde groeitoenanie veroor-

Het mengsel van bios H en Hl werd gemaakt uit het
in meting No. 3 genoemde „lood-filtraatquot;, dat ik in een
oplossing met 10 maal de vereischte concentratie (dus
20 X de standaard-concentratie) gefractioneerd sterili-
seerde bij 100° en daarna in de ijskast bewaarde. Eerst

werd met behulp van deze oplossing de activiteit van
zuiver inosiet (Merck) bepaald. Hoeveelheden varieerend
van 0,01 tot 10 y, werden ieder met 0,1 cc. van de steriele
voorraadsoplossing gemengd en vervolgens met water tot
1 cc. verdund. Het resultaat van de metingen van de
aldus verkregen oplossingen is in tabel 3 en fig. 3 sa-
mengevat.

De punten A en B in fig. 3 (blz. 52) geven de gisttoe-
name aan, veroorzaakt resp. door 1 cc. van de oplossing
der factoren II en III (in dubbele standaard-concentratie)

en van 1 cc. der tegelijkertijd gemeten standaard-oplos-
sing. Hieruit blijkt volgens de bovengenoemde definitie.

Fig. 3. De curve geeft aan, welke toename van den groei wordt
veroorzaakt door toevoegen van verschillende hoeveelheden
inosiet aan een constante hoeveelheid bios II 111.

dat meso-inosiet een activiteit heeft van 3 y, terwijl reeds
bij toevoegen van 0,25 y een duidelijk effect is waar te
nemen.

In fig. 4 is graphisch voorgesteld hoeveel inosiet men moet
toevoegen aan wisselende concentraties bios II III, om een

groeitoename van 600 % te bereiken. Aan dc eene zijde ehi-
digt de lijn in een punt, waarbij de concentratie van bios
11 III, aan de andere zijde in een punt, waarbij de inosiet-
concentratie als beperkende factor optreedt. Punt D geeft de
concentraties in de standaardoplossing, terwijl de ordinaat
van punt C de concentratie geeft van de factoren II en III in
de oplossing waarmee bios I wordt gemeten.

Men dient dus in het oog te houden, dat uit het feit dat een
oplossing de standaard-curve geeft, niet zonder meer het
bios I-gehalte valt te concludeeren, aangezien de werkzaam-
heid van een bepaalden bios-factor een functie is van de con-
centratie der andere factoren, waarmee hij in combinatie ge-
meten wordt.

De activiteit van bios I-oplossingen werd op dezelfde
wijze gemeten als inosiet en, om de dag-invloeden zoo-
veel mogelijk uit te schakelen, steeds met inosiet-oplos-
singen Vergeleken. Tabel 4 is een voorbeeld van een
meting van bios I.

De standaard-curve werd bij deze meting bereikt door
0.45 cc. van de bios I-oplossing met onbekend gehalte.
Deze hoeveelheid correspondeert met 3 y inosiet. De op-
lossing bevat dus 6,7 y per cc.

Om een voordeelige bereidingsmethode te vinden on-
derzocht ik hoe men uit gist de beste opbrengst aan bios I
krijgt en tevens welke methode het zuiverste en meest
actieve product oplevert. Hierbij werd eveneens nage-
gaan hoeveel bios I werd meegesleept in het „alcohol-
neerslagquot; (zie meting No. 2, blz. 48), waarvan quantiteit
en samenstelling zeer uiteenloopend zijn bij verschillende
methodes.

Het „alcoliol-neerslagquot; werd hiertoe, evenals de hoofdfrac-
tie uit het „alcohol-filtraatquot;, met loodacetaat en ammonia be-
handeld. Het ontleden van het „lood-neerslagquot; bracht een
moeilijkheid mede. Bij inleiden van zwavelwaterstof bleef
het loodsulfide colloïdaal in oplossing, waarschijnlijk door
de in het „alcohol-neerslagquot; aanwezige eiwitten. Door toe-
voegen van een gelijk volumen alcohol en een weinig zout-
zuur was dit euvel te verhelpen.

Van de oplossingen, die voor verder verwerken niet
in aanmerking kwamen, werd geen droogrest bepaald. In
tabel 5 (blz. 56) werd daarom in plaats van de activiteit
alleen de „hoeveelheidquot; bios I vermeld, welke hoeveel-
heid werd aangegeven door het aantal liters bios-oplos-
sing met standaard-concentratie, die uit bovengenoemde
oplossingen te bereiden waren. Deze getallen geven dus
alleen quantiteit en geen qualiteit aan. Onderzocht wer-
den door koken, door autolyse en door plasmolyse bereids
gist-extracten.

De bereiding van bios I uit een door koken verkregen gist-
extract werd reeds op blz. 47 van dit hoofdstuk besproken.
Het autohjse-extract maakte ik op de volgende manier i): 2 kg
gist werden met 2 1 water, 200 cc. toluol en 200 cc. aethyl-
acetaat in een broedstoof gedurende 4 dagen op 35° C. ver-
warmd en het mengsel af en toe krachtig geschud. Vervol-
gens werd onder roeren langzaam 3 1 alcohol toegevoegd en
het daarbij gevormde neerslag afgecentrifugeerd. De oplos-
sing werd in vacuo drooggedampt, de rest opgenomen in
300 cc. water en hieraan onder roeren 800 cc. alcohol toe-
gevoegd. Na affiltreeren van een hoeveelheid uitgekristal-
liseerde zouten werd het alcoholische filtraat drooggedampt
en de rest op de gebruikelijke wijze behandeld met lood-
acetaat (iets meer dan bij de kookmethode) en ammonia. Het
plasmolyse-extract verkreeg ik door 1 kg gist te mengen met
100 g natriuniacetaat. Na 24 uur werd het mengsel aange-

roerd met 2 1 water en gecentrifugeerd. Het celmateriaal werd
daarna nog eens met 2 1 water uitgetrokken, vervolgens de
vereenigde extracten in vacuo ingedampt en de rest op de-
zelfde manier verwerkt als tiet kook-extract.

Na liet ontleden van de loodneerslagen werden alle
bios I-oplossingen geschud met 2 g kool om sporen bios II
te verwijderen en vervolgens in vacuo drooggedampt.

Het residu was in alle drie gevallen een lichtbruin
stroopje, waaruit zich, ook bij lang staan, geen kristallen
afzetten. Door drogen in vacuo boven phosphorpentoxy-
de ontstond een harde, hygroscopische massa. Van de
aldus gedroogde resten werd de activiteit bepaald. De re-
sultaten zijn in tabel 5 samengevat en geven de opbreng-
sten aan uit 1 kg gist.

De autolyse-methode bleek verreweg de voordeeligste
te zijn. De hiermede bereide fractie, met een werkzaam-
heid van 30 7, vormde het uitgangsmateriaal, dat ik op
verschillende manieren probeerde te zuiveren.

Allereerst trachtte ik dit te bereiken door de actieve
stof herhaalde malen neer te slaan met loodacetaat,
cadmiumnitraat en ammonia volgens Meillère en
Flelry^). Dit gaf geen verhooging der werkzaamheid.
Ook neerslaan met andere metaalzouten had weinig suc-
ces. De kleine hoeveelheden neerslag, die ontstonden
door toevoegen van kwik- en koperacetaat waren in-
actief.

Een aantal gebruikelijke reagentia op alkaloïden gaf in
verdunde oplossing geen neerslag; de in geconcentreerde
oplossing gevormde precipitaten waren onwerkzaam.

Vergeefs trachtte ik een zuivering te verkrijgen door
neer te slaan met bariet in alcoholisch milieu volgens
Lucas .

Hiertoe werden 100 mg uitgangsproduct opgelost in 40 cc,
water en 4 g bariet, opgelost in 20 cc. water, toegevoegd.
Hierin werden langzaam onder roeren 40 cc. alcohol gedrup-
peld. Na 10 uur werd het neerslag afgecentrifugeerd en ge-
wasschen met 60 % alcohol. Het filtraat waschvloeistof
werd evenals het neerslag bevrijd van alcohol en bariet. De
droogrest van het neerslag was tweemaal zoo groot als die
van het filtraat, terwijl de activiteit van beide resten dezelfde
was als van het uitgangsproduct. Ook bij herhaling van de
proef vond ik, dat bios I door deze methode allerminst quan-
titatief wordt neergeslagen, hetgeen bij vroegere onderzoe-
kers van invloed kan zijn geweest.nbsp;____

Een beter resultaat werd verkregen door de actieve
stof in een oplossing van het uitgangsmateriaal gefrac-
tionneerd neer te slaan met alcohol.

2,8 g autolyse-rest werden opgelost in 10 cc. water en onder
roeren langzaam 25 cc. alcohol toegevoegd. Na 6 uur werd het
neerslag (440 mg = rest 1) afgezogen en nagewasschen met
15 cc. 70 % alcohol. Aan filtraat waschvloeistof werd op-
nieuw 50 cc. alcohol toegevoegd. Na 24 uur staan in de ijs-
kast had zich 730 mg (= rest 2) van een visceuse massa afge-
scheiden. De bovenstaande vloeistof gaf na afschenken en
indampen een droogrest van 1,62 g (= rest 3).

De resten 1, 2 en 3 werden gemeten en hadden een activiteit
van resp. 90, 50 en 20y. De zuiverste fractie (3) was op geen
manier tot kristalliseeren te brengen.

Een analoge behandeling met aceton had ongeveer
hetzelfde resultaat. Neerslaan met aceton na fraction-
neeren met alcohol gaf geen verbetering.

Ik trachtte het product met een activiteit van 20 y na
intensief drogen in hoogvacuum te distilleeren. Bij een
vacuum van 0,01 mm sublimeerde na langzaam verwar-
men tot 360° alleen een weinig benzoëzuur; de rest
verkoolde.

Vergeefs waren ook de pogingen om bios I te adsor-
beeren aan voller's aarde, silicagel en permutiel.

Vervolgens probeerde ik of de eigenschappen der in-
actieve begeleidende stoffen waren te veranderen door
oxydatie. Het was n.l. gebleken, dat het uitgangsproduct
reduceerend werkte op Fehling's proefvocht en op een
ammoniakale zilveroplossing, terwijl de activiteit door
deze reacties niet werd beïnvloed.

Daar inosiet kan worden aangetast door ammoniakaal zil-
ver, werd gebruik gemaakt van Fehling's proefvocht. Na de

oxydatie werd liet gevormde Cupro-oxyde afgefiltreerd en
het reactiemengsel geneutraliseerd met zoutzuur. Het koper
werd verwijderd met zwavelwaterstof, het filtraat tot een
klein volumen ingedampt en de daarin opgeloste stoffen met
alcohol gefractionneerd neergeslagen. Uit de actieve fractie
was geen product te krijgen met een hoogere werkzaamheid

Tenslotte nam ik mijn toevlucht tot acetyleeren, hoe-
wel deze methode minder „einwandfreiquot; was dan de tot
nu toe gebezigde precipitatie- en adsorptie-reacties.

100 mquot; van een preparaat met een activiteit van 20y wer-
den met^ó cc. versch gedistilleerd azijnzuur-anhydride gedu-
rende 45 min. op een waterbad verhit. Na affiltreeren van
7 m'^ van een onoplosbare witte stof werd in vacuo zooveel
mogelijk vloeistof verdampt. Het na de acetyleering verkregen
residu woog 148 mg. Dit werd opgenomen in 5 cc. chloro-
form en daarna werd de oplossing drie maal uitgeschud met
5 cc water. Deze laatste extracten hadden een gezamenlijke
droogrest van 47 mg. De rest was oplosbaar in absoluten
alcohol en bleek bij meten onwerkzaam te zijn. De chloro-.
form bevatte 98 mg van een eveneens onwerkzaani product.
Beide resten werden verzeept door met 15 cc. 5 % zwavel-
zuur gedurende 30 min. te verhitten op een waterbad. Na
verwijderen van het zwavelzuur werd de activiteit gemeten.
Van de chloroform-rest was deze 30^ en van het waterig ex-
tract 10 a 15^, terwijl van bios I na acetyleeren en verzeepen
in totaal 35 % werd teruggewonnen.

De droogrest van het waterige extract was het eerste
preparaat,^dat de reactie op inosiet volgens Salkowski^)
duidelijk positief vertoonde; bij producten met een acti-
viteit van 20 -y en minder was de uitkomst van deze
reactie steeds zeer weinig ov^rtmgend^eweest. Het in-

tensief gedroogd« preparaat werd hierna nog eens geace-
tyleerd volgens E. G. Griffln en J. M. Xelson met
acetylbromide, waarin het na een half uur koken vol-
ledig oploste. Vervolgens werd het reactieproduct uit-
gegoten in ijswater en deze oplossing met chloroform
uitgeschud. Het extract werd gedroogd en ingedampt tot
een kleine rest, waarin zich kristallen afzetten, die na
twee maal omkristalliseeren identiek bleken te zijn met
het hexa-acetaat van meso-inosiet.

smp. inosiet-hexa-acetaat . : 212°.
smp. van het product uit gist : 210°.
mengsmeltpunt.....: 211°.

Na verzeepen van 50 mg van dit product kon inder-
daad een kleine hoeveelheid inosiet worden geïsoleerd,
die, evenals het preparaat van Merck, een activiteit had
van 3 y.

smp. inosiet Merck . . . . : 217°.
smp. van het product uit gist : 216°.
mengsmeltpunt.....: 216—217

Voor de analyse werd de stof bij 100° in vacuo ge-
droogd boven phosphorpentoxyde.

4,367 mg stof gaven 6,384 mg CO. en 2,594 mg HgO.
berekend voor CgHiaOe: C 40,00 %; H 6,67
gevonden.....: C 39,87 % ; H 6,61 %.

-) Deze micro-analyse werd uitgevoerd bij Dr. A. Schoeller,
Berlin-Schmargendorf.

Noch uit het autolyse-, noch uit het plasmolyse-extract
was het mogelijk een grootere opbrengst van zuiver hexa-
acetaat te krijgen dan ± 10 aangenomen, dat de totale
bios I-werkzaamheid was te danken aan inosiet. Deze
laatste veronderstelling kon evenwel meer aannemelijk
worden gemaakt door de volgende proeven.

Een hoeveelheid van een bios I-preparaat met een
werkzaamheid van 30 y werd gedurende een uur gekookt
met overmaat acetylbromide, waarin het bijna geheel
oploste. Vervolgens werd in vacuo zoo ver mogelijk in-
gedampt en de achterblijvende rest verzeept door koken
met 5 % zwavelzuur. De activiteit bleek na deze bewer-
kingen geheel onveranderd te zijn, waarmee is bewezen,
dat bios I door de voor de isolatie gebezigde acetylee-
rings-methode geen chemische veranderingen heeft on-
dergaan.

Hetzelfde preparaat werd gedurende 24 uur gekookt
met 20 % zoutzuur. Daarna werd de vloeistof in vacuo
drooggedampt, de rest in water opgenomen en deze op-
lossing gefiltreerd. Ten slotte werd ontkleurd met een
weinig kool. Ook in dit geval was de werkzaamheid ge-
heel gelijk gebleven.

Het is dus in hooge mate waarschijn-
lijk, datbiosluit gist-extract identiek
is met meso-inosiet.

1° Uit tabel 5 volgt, dat men door autolyse ongeveer
driemaal zooveel bios I uit gist krijgt als door koken. Ik
trachtte nu uit te maken of deze stof door de fermenta-
tieve destructie der cellen gemakkelijker kan vrijkomen

dan door koken of dat bij autolyse nieuw inosiet wordt
gevormd. Daartoe werd bij beide methodes zoowel het
celmateriaal als het extract ontleed door koken met 20 %
zoutzuur, vervolgens werd het inosiet van de andere fac-
toren gescheiden met loodacetaat en ammonia en het
bios I-gehalte gemeten van het neerslag. Uit tabel 6, waar-
in de resultaten zijn samengevat, blijkt dat bij autolyse
het grootste quantum inosiet (uitgedrukt in milligrammen
per gram gist) zich in het extract, en slechts een klein
gedeelte zich in het celmateriaal bevindt. Bij koken van
gist is het juist omgekeerd.

Ook het gehalte van bios II en III liet zich — ondanks
het koken met zoutzuur — bepalen. ffo,ewel in combi-
natie met inosiet geen standaard-curve werd verkregen,
was toch een onderlinge vergelijking mogelijk. Het ge-
halte aan de factoren II en III bleek evenredig te zijn
met dat van inosiet.

Blijkbaar komt de inhoud der cellen gemakkelijker vrij
door autolyse dan door koken. Er is voorloopig geen re-
den om aan te nemen, dat bij autolyse nieuw inosiet
wordt gevormd.

mij afgevraagd of er nog andere, cliemisch eventueel op
inosiet gelijkende, stoffen waren, die eveneens de wer-
king van bios I vertoonden. Met dit doel had Miller
reeds een aantal meerwaardige alcoholen onderzocht en,
naar aanleiding van het negatieve resultaat, gewezen op
het feit, dat de activiteit van meso-inosiet blijkbaar op
specifieke wijze verband houdt met zijn constitutie.

Het leek mij van belang om ook voor de door ons ge-
bruikte „Heferasse Mquot; na te gaan of andere meerwaar-
dige alcoholen geheel of gedeeltelijk in staat zijn meso-
inosiet te vervangen. De volgende stoffen werden ge-
meten en inactief bevonden: adoniet, arabiet, dulciet,
erythriet, manniet, 1-inosiet, scylliet en sorbiet. Aanvan-
kelijk werd bij 1-inosiet en scylliet een zwakke bios I-
werking aangetoond. Na vijf maal omkristalliseeren wa-
ren beide stoffen echter inactief. Ook phytine bleek on-
werkzaam te zijn.

3°: Het inosiet-gehalte werd bepaald van gistcellen,
die zich op een „.synthetischequot; voedingsbodem hadden
ontwikkeld.

50 mg gist werd geënt op 250 cc. voedingsoplossing met
de volgende samenstelling:

water ....	. 240
glucose ....	. 22,5
kH2P04 . • •	1
MgS04. 8 H2O .	0,5
NH4NO3 . • •	1,9
CaCl2 . . • •	0,08

Deze cultuur werd in een broedstoof gedurende 6 da-
gen geschud bij een temperatmn^vanJ30° C. In dien üjd

hadden zich ongeveer 800 mg gist gevormd, die met zout-
zuur werden gedestrueerd en op de gebruikelijke manier
verder werden behandeld. Het inosiet-gehalte bleek
500 y te bedragen. Daar de gist per milligram onge-
veer 15.000.000 cellen bevat, komt dit overeen met
OA X iö—13 g. inosiet per cel.

Uit tabel 5 volgt, dat onder normale omstandigheden
gekweekte gist Ö,S X iO-is g inosiet per cel bevat. Deze
getallen stemmen goed overeen met die van Eastcott^).
Zij vond resp. 0,5 en 1,2 Xnbsp;g per cel.

Ten slotte zij opgemerkt, dat deze biochemische me-
thode voor de quantitatieve bepaling van inosiet, vooral
van kleine hoeveelheden en bij aanwezigheid van veel
verontreinigingen, belangrijk sneller en nauwkeuriger is
dan de gebruikelijke methodes^), waarbij men genood-
zaakt is inosiet als zoodanig af te scheiden. Tot nu toe
is echter nog niet bewezen, dat inosiet de eenige stof is,
die de bios I-werking vertoont. De specificiteit van de
methode zou dus nog nader dienen te worden gecon-
troleerd.

Uit meting 4 op blz. 49 bleek, dat het door een gist-
extract veroorzaakte effect niet voldoende wordt ver-
klaard door de werkzaamheid van de factoren I en II,
en dat voor het bereiken van de standaard-curve nog
een derde stof (of complex van stoffen) noodzakelijk is,
welke zich bevindt in het „kool-filtraatquot;. Deze stof (of
complex van stoffen) noemden wij bios III.

lood-neerslag, ontleed
met HaS.
90 % opbrengst
activiteit 30 -/
125X geconcentreerd.

Acetvleering met acetyl-
bromide; scheiding v.h.
acetylprod. met water
en chloroform
chloroform-extract

10% opbrengst (IX om-
gekrist. hexa-acetaat)
activiteit v.h. verzeepte
prod.: 3r-nieso-inosiet
1150X geconcentreerd.

De werkzaamheid van den derden factor manifesteert
zich in het verschil der gist-productie, veroorzaakt door
alle factoren tezamen (standaard-oplossing) en die,
welke wordt veroorzaakt door bios I en II. Naar analo-
gie van het onderzoek naar factor I, nam ik als maatstaf
voor de activiteit van bios Ill-preparaten: die hoeveel-
heid van een preparaat, die tezamen met 1 cc. bios II-
oplossing van dubbele standaard-concentratie en 5 y
inosiet, dezelfde groeitoename veroorzaakt als 1 cc. van
de standaard-oplossing.

Met behulp van dezen maatstaf werd de bepaling der
activiteit als volgt uitgevoerd. Een oplossing van factor II
(uit het „kool-eluaatquot;) in 20-voudige „standaard-concen-
tratiequot;, waaraan per cc. 50 y inosiet was toegevoegd, werd
gefractionneerd gesteriliseerd bij 100°. Voor een meting
werd 1 cc. van deze vloeistof gemengd met een bepaalde
hoeveelheid bios III, daarna met water verdund tot 10 cc.
en het door deze oplossing veroorzaakte effect vergele-
ken met dat van de standaard-oplossing. Deze methode
leidt echter niet tot een nauwkeurige bepaling van biosIII,
omdat

a.nbsp;het door de toevoeging van factor III veroorzaakte
effect te klein (maximaal 1,50 %) en daardoor de
meetfout, vooral op dagen dat de standaard-curve
„laagquot; was, te groot werd, en verder omdat

b.nbsp;het effect, door een later opgehelderde oorzaak, tus-
schen 10 en 150 % varieerde.

Verondersteld werd, dat bij de tot nu toe gevolgde
scheidingsmethode factor II verontreinigd bleef met een
lioeveelheid bios III en dat een vollediger scheiding het
door laatstgenoemden factor veroorzaakte effect moest
vergrooten. Het was dus van belang iets naders te weten
te komen over de mate, waarin factor drie aan kool
wordt geadsorbeerd. De experimenten hadden tot dusver
alleen geleerd, dat bios H gemakkelijker wordt „uitge-
schudquot; dan de derde factor. Het was evenwel niet uitge-
sloten, dat door een teveel aan kool een zekere quantiteit
van dezen factor wordt meegesleept. Ter toetsing van
deze veronderstelling werd een proef genomen om met
meerdere zekerheid factor II van bios IIT te bevrijden.
De oplossing van tweeden en derden factor werd met
een hoeveelheid kool geschud, die hoogstens toereikend
was om de helft bios H (fractie a) te adsorbeeren. Uit
het filtraat werd de resteerende tweede factor met over-
maat kool verwijderd (fractie b). Ten opzichte van bios
III en inosiet vertoonden de beide fracties echter niet
het minste verschil.

Ook werd een aantal adsorptie-proeven uitgevoerd met
varieerende concentraties der actieve stoffen en bij wis-
selende pj^. Hierbij werden alle mogelijke combinaties
„getestquot;, zooals b.v. een uit zuur milieu geadsorbeer-
de factor H met een in basisch milieu achtergebleven
factor HI en vice versa. Geen dezer proeven veranderde
iets aan de eigenschappen van bios II, waaruit volgt, dat
öf de eventueele adsorptie van den derden factor aan
kool door geen der bij die proeven gekozen omstandig-
heden wordt verhinderd, 6f dat de fractie van bios II

Een viermaal met hetzelfde preparaat herhaalde ad-
sorptie en elutie van den tweeden factor leverde even-
min iets nieiiws op. Ook voorzichtig iiitwasschen van de
bios II bevattende kool met water en met 50 % alcohol
gaf niet het gewenschte resultaat. In den alcohol loste
een hoeveelheid stof op, die een deel van het bios II
bevatte; de eigenschappen van den tweeden factor in
het eluaat der uitgewasschen kool waren echter vrijwel
onveranderd gebleven.

Door de concentraties van bios II en van inosiet ieder
afzonderlijk of tegelijkertijd te verhoogen, werd het door
factor III veroorzaakte effect niet grooter.

Er bestond een mogelijkheid, dat de wisselvalligheid
der meet-resultaten te wijten was aan vrij bios III, ont-
staan uit celmateriaal dat tijdens het bewaren afgestor-
ven was. De gist werd daarom eenige malen met water
uitgewasschen, hetgeen echter tot eenig gevolg had, dat
de standaard-curve „daaldequot;, terwijl het door factor III
veroorzaakte effect eerder kleiner dan grooter werd.

Herhaaldelijk was gebleken, dat gesteriliseerde oplos-
singen van bios II, na eenigen tijd in de ijskast bewaard
te zijn geweest, een verandering hadden ondergaan. Door
toevoegen alleen van inosiet — en wel zonder bios III —
vertoonden de metingen dezer oplossingen reeds de

standaard-curve. Bios III scheen in zulke gevallen dus
overbodig te zijn. Aanvankelijk meende ik dit te moeten
toeschrijven aan een^nfectie door bacteriën in een enkel
kolfje. Daar het verschijnsel evenwel herhaald,elijk op-
trad en in de bewuste kolfjes, ook bij microscopisch on-
derzoek, nooit micro-organismen waren aan te toonen.

moest er een andere oorzaak zijn. Om deze na te gaan
mat ik vier maal achtereenvolgens, met verschillende
tusschenpoozen, combinaties van inosiet en opnieuw ge-
scheiden bios II en III. Het resultaat wijst op een chemi-
sche verandering in de bios Il-oplossingen, zooals blijkt
uit tabel 8, waarin de getallen de door de oplossingen
veroorzaakte procentueele toename van den groei aan-

Een dergelijke reeks metingen werd viermaal her-
haald, steeds met hetzelfde gevolg. De meting e bewijst,
dat bios II niet chemisch verandert daar deze factor.

direct gemeten na lierhaalde adsorptie en elutie, weer
de oorspronlcelijke gevoeliglieid ten opzichte van bios III
vertoont. In de bios Il-oplossing is'echter nieuw l)ios III
ontstaan, hetgeen aangetoond werd door de werkzaam-
heid van het kool-filtraat, verkregen door de herhaalde
adsorptie (zie laatste kolom van tabel 8). Het ontstaan
van nieuw bios III vooronderstelt de aanwezigheid van
een „pro-bios UIquot; in de bios Il-oplossing. Het nieuw ge-
vormde bios III verhoogt de door de bios Il-oplossing
veroorzaakte groei-toename, stoort dus de bepaling van
bios III en wel toenemend naarmate de bios Il-oplossing
ouder wordt. Deze toenemende storing verklaart het
variabele effect der bios Ill-metingen, dat in zijn oorzaak
dus moet worden toegeschreven aan het zoo even Ije-
doelde pro-bios III.

De pro-factor wordt pas in bios III omgezet, nadat hij
van deze laatste stof is gescheiden. Men denkt daarbij
onwillekeurig aan een evenwicht, dat door overmaat
bios III naar links wordt verplaatst, wanneer men voor
de omzetting de volgende vergelijking opstelt: pro-
bios III bios III. Door overmaat bios III wordt de
reactie naar links gedrongen, terwijl pas na verwijderen
van dezen factor een omzetting naar rechts mogelijk is.
Deze voorstelling van zaken wint aan waarschijnlijkheid
door meting f (tabel 8), waaruit blijkt, dat na een her-
haald verwijderen van bios III opnieuw een omzetting
wordt mogelijk gemaakt.

Getracht werd de pro-factor totaal te ontleden door
bios II met tusschenpoozen van vier dagen telkens te
adsorbeeren en weer te elueeren. Gedurende deze tus-
schenpoozen kreeg pro-bios III n.1. de gelegenheid zich
om te zetten in bios III. Door dit laatste iederen vierden

dag af te zonderen in het kool-filtraat hoopte ik boven-
staande reactie afloopend te kunnen maken en zoodoen-
de een voor het meten beter geschikt bios II in handen
te krijgen. Na een vijf maal herhaalde adsorptie ontstond
een product, dat weliswaar gedurende eenige weken
constante resultaten leverde, maar uiteindelijk zijn ge-
voeligheid ten opzichte van bios III tóch weer verloor.
Dit onderzoek werd niet verder voortgezet.

F. Kögl en B. Tönnis hadden aangetoond, dat het uit
eigeel geïsoleerde biotine in combinatie met inosiet een
toename van den groei veroorzaakt van ten hoogste 300
a 350 %, terwijl het effect van den factor uit gist onder
dezelfde omstandigheden 400 a 500 % bedraagt. Dit gaf
mij aanleiding na te gaan op welke wijze de groei-
kromme van bios II uit eieren in tegenwoordigheid van
inosiet, wordt beïnvloed door bios III. Hierbij bleek de
additieve groeitoename, evenals bij bios II uit gist, slechts
ongeveer 150 % te bedragen, m a a r h e t e f f e c t w a s
constant. Door het gebruik van bios II
uit eieren ondervangt men derhalve
het bezwaar van het variabele effect,

Bij deze proeven bleek tevens, dat ook bij toevoegen
van quot;grootere hoeveelheden derden factor en inosiet, de

standaard-curve nooit wordt Ijereikt. De uit deze meting-
voortvloeiende conclusies worden uitvoeriger beliandeld
op blz. 93.

Hoewel de methode door het meten met bios H uit
eieren dus ten deele bruikbaar was geworden, was de
grootte van het veroorzaakte effect niet toegenomen.
Door de hieronder beschreven proeven slaagde ik erin
ook dit bezwaar weg te nemen.

Tot dusverre had ik mij bij het quantitatief bepalen
der bios-factoren gehouden aan de in hoofdstuk II be-
schreven werkwijze en dus — zulks terwille van de ver-
gelijkbaarheid der resultaten — steeds dezelfde gistsoort
en denzelfden voedingsbodem gebruikt en evenmin was
ik afgeweken van den kweektijd van 5 uren. Daar echter
reeds zoovele ])ogingen tot het vinden van een geschikte
meet-methode van bios III hadden gefaald, leek het mij
tóch van belang een oplossing van het vraagstuk te zoe-
ken door de werkwijze in dit opzicht te wijzigen.

Het gebruik van een andere gistsoort was voorloopig
natuurlijk niet wenschelijk, aangezien „Hefe-rasse Mquot; nu
eenmaal het uitgangspunt van ons onderzoek was. Ik
verlengde daarom den kweektijd. Daar de mogelijkheid
bestond, dat de oplossing van Reader hiervoor niet ge-
noeg voedingsstoffen zou blijken te bevatten, werden
bovendien de metingen tegelijkertijd uitgevoerd met den
voedingsbodem van Clark, die o.a. ook werd gebruikt
door Miller i) voor een kweektijd van 24 uur. Deze op-
lossing heeft de volgende samenstelling:

Het belangrijkste verschil met de oplossing van Reader
is een tienvoudig gehalte aan glucose en een drievoudige
lioeveelheid der anorganische zouten.

bios I II III en de „standaard-oplossingquot;, na verschillende kweektijden bij-
gebruik van den voedings-bodem van Cl.\rk.

tabellen 9 en 10, waarin de getallen de waargenomen
procentueele toename aangeven. De resultaten uit tabel
10 worden verduidelijkt door de graphiek in fig. 5. De
hierin afgebeelde krommen zijn vergelijkbaar met de

Deze proeven werden genomen met versche (één dag
van te voren gescheiden) oplossingen van de factoren II
en III uit gist. Zij geven aanleiding tot de onderstaande

1.nbsp;Het door bios III veroorzaakte ef-
fect wordt aanmerkelijk grooter door
het verlengen van den k w e e k t ij d. Bij de
gegeven concentraties der bios-factoren wordt het beste
resultaat bereikt door een kweektijd van 10 uren.

2.nbsp;Dit resultaat werd bereikt zoowel op den voedings-
bodem van Reader als op dien van Clark, maar het effect
op laatstgenoemden was het grootst.

De verlenging van den kweektijd werd nu herhaald
met bios II uit eieren. Zooals te verwachten was, werden
hierdoor minder sterke groei-effecten waargenomen, die
echter onderling dezelfde verschillen vertoonden als bij
Jiet gebruik van bios II uit gist, zooals blijkt uit meting 6.

G e Ij 1 e k e n is thans, dat het gebruik
van bios II uit eigeel met verlengden
k w e e k t ij d een alleszins bruikbare
m e t h o d e voor de b e p a 1 i n g van bios III
oplevert.

Door de in de meet-nietliode aangebrachte veranderin-
gen werd het nu ecliter noodig een nieuwe maatstaf te
zoeken voor de activiteit van bios III. Vergelijken met de
standaard-curve, zooals dit bij het onderzoek van bios I
geschiedde, was bij het toepassen van bios II uit eieren
niet meer mogelijk. Ik bereidde daarom een standaard-
oplossing van bios III, welker verschillende verdunnin-
gen, bij gebruik van den voedingsbodem van Clark, een
groei-toename veroorzaakten, die begon bij ± 550 %
(lioogste waarde bereikt door bios II inosiet) en steeg
tot ± 2(M)() %. Het gunstigste traject voor het verrichten
van reproduceerbare metingen lag tusschen 580 en 950 %.
Deze laatste waarde werd bereikt door meten van 1 cc.
van een oplossing, waarin zich bevonden

2.nbsp;bios II (gezuiverde preparaat 519b van Tonnis met
36.000.000 S.E. per g) in dubbele standaard-concen-
tratie .

3.nbsp;0,05 cc. standaard-oplossing van bios III (overeenko-
mend met 257 droog standaard-preparaat)

De activiteit van een bios III - h o u-
(lende stof werd aan g e g e v e n d oor die
hoeveelheid van die stof, welke na
e ,e n k w e e k t ij d van 10 uur dezelfde
groeitoename v e r.o orzaakt als 0,05 cc.

Het spreekt vanzelf, dat deze onderzoekingen later herhaald
zullen moeten worden met gekristalliseerd biotine. Dit was ten
tijde van mijn onderzoek nog niet in voldoende hoeveelheid be-
schikbaar.

Van 1) en 2) gecombineerd werd een steriele voorraads-
oplossing met de tienvoudige concentratie gemaakt. Deze werd
evenals de standaardoplossing van bios III in de ijskast bewaard.

der s t a n d a a r d-o p 1 o s s i n g van b i o s III,
wanneer deze beide oplossingen (in
bovengenoemde concentraties) worden

gecombineerd met inosiet en bios II.
Met de standaard-oplossing van bios III werden dus alle
te onderzoeken preparaten vergeleken. Tabel 11 is een
voorbeeld van een bios Ill-meting.

De activiteit van het preparaat werd hieruit op de
volgende manier berekend. 0,04 cc. van de bios HI-opIos-
sing met onbekend gehalte correspondeert met 0.05 cc.
van de standaard-oplossing. Aangezien de oplossmg van
het gemeten preparaat 400 ^ vaste stof per cc. bevat, is
de activiteit hiervan dus 16 7.

Op hlz. 49 werd aangetoond, dat de derde factor zich
bevindt in hct„liool-filtraatquot;. Het isoleeren van bios III
uit deze vloeistof brengt, onverschillig welk uitgangs-
materiaal men gebruikt, in het algemeen twee moeilijk-
lieden met zich mede. Het bevat n.l. in de eerste plaats
onvermijdelijk alle inactieve begeleidende stoffen van
het oorspronkelijke bios-extract, behalve die, welke zich
door loodacetaat en ammonia en door 80 % alcohol laten
neerslaan, en die, welke door kool worden geadsorbeerd.
In de tweede plaats treft men er in aan een vrij groote
hoeveelheid ammonium-acetaat, ontstaan door de af-
scheiding van bios I. Aangezien dit ammonium-acetaat
zeer moeilijk is te verwijderen, deed ik eenige pogingen
om inosiet op een andere wijze uit de oplossing af te
scheiden. Het lag voor de hand dit te probeeren met bariet
en alcohol volgens Lucas. Hierbij is mij gebleken, dat vol-
gens deze methode bios I op zeer onvolledige wijze neer-
slaat. Zelfs na een twee maal herhaalde behandeling was
in het filtraat nog duidelijk inosiet aan te toonen. Ook
trachtte ik inosiet uit de oplossing te verwijderen met
versch geprecipiteerd loodhydroxyde. Het gewenschte
resultaat werd hierdoor echter niet bereikt.

Tenslotte werd deze moeilijkheid voorloopig aldus op-
gelost. Door meten werd vastgesteld, dat de groei-toe-
name, veroorzaakt door een oplossing van bios I, II en
III, niet noemenswaard stijgt, wanneer men hieraan 2 a 3
maal zooveel inosiet toevoegt. Hieruit volgt, dat een zeker
inösiet-gehalte van een bios Ill-preparaat het meten van
dezen laatsten factor niet zal beïnvloeden. Daar eenige
milligrammen inosiet als begeleidende stof minder on-

aangenaam zijn dan vele grammen ammonium-acetaat,
werd dan ook vooreerst van het verwijderen van bios I
afgezien. In dit stadium correspondeeren 3 y inosiet met
ongeveer 200 y van het ruwe bios III. Het is m.i. niet
onwaarschijnlijk, dat één der vele zuiveringstrappen, die
deze laatste factor nog moet ondergaan, een scheiding
van bios I en III zal teweeg brengen.

Oorspronkelijk was het mijn bedoeling bios III te iso-
leeren uit gist. Toen ik echter kon aantoonen, dat deze
factor met' een zelfde qualitatieve werkzaamheid ook
voorkomt in eieren en dat de activiteit van het droog-
gedampte „kool-filtraatquot; hierbij vijf maal zoo groot is als
bij gist, leek mij eigeel als uitgangsproduct verkieslijker.
Dat hiervoor een bijproduct kon worden gebruikt van
het op het Org. Chem. Laboratorium te Utreclit in zeer
groote hoeveelheden verwerkte Chineesche eigeel, was
een niet gering voordeel.

Dit laatste product werd volgens een door KÖgl en Tonnis
uitgewerkte metliode behandeld. Het fijngemalen eigeel werd
met dc vijfvoudige hoeveelheid koud water gedurende lü mi-
nuten mechanisch geroerd. Na 12 uur was het eigeel voor een
deel bezonken; een ander deel kwam boven drijven. De hel-
dere vloeistof, (die geen bios bevatte), tusschen deze lagen
werd zoo goed mogelijk afgeheveld. Daarna werd de koude
brei gedurende 1 uur onder roeren met de vijfvoudige hoe
veelheid water gekookt en vervolgens, na afkoelen tot 50° C.,
«efiltreerd. Het afgefiltreerde eigeel werd hierna nog eens
met dezelfde hoeveelheid water gekookt en geëxtraheerd.
Het gezamenlijke extract werd in vacuo bij zoo laag moge-
lijke temperatuur ingedampt tot 1/30 van het volumen. Aan de
aldus verkregen rest werd onder mechanisch roeren een ge-
lijk volumen (gedistilleerde) aceton toegevoegd, waarbij een
dik licht-geel gekleurd neerslag ontstond, dat werd afgecen-
trifu«eerd. De vloeistof werd in vacuo ingedampt tot ^/lo van

het volumen en vervolgens werd onder flink roeren een vier-
voudig volumen absoluten alcohol bijgedruppeld. Het neer-
slag werd gefiltreerd, het filtraat door gedeeltelijk indampen
van alcohol bevrijd en de vloeistof, na weer te zijn terugge-
bracht op het oorspronkelijk volumen met zooveel lood-
acetaat-oplossing behandeld, tot geen neerslag meer ontstond.
Na centrifugeeren van het precipitaat werd de vloeistof ge-
neutraliseerd met zoutzuur en het lood met HsS verwijderd.
De vloeistof werd door indampen tot quot;•^/s van het volumen
van H2S bevrijd, vervolgens gedurende 10 a 15 minuten met
kool geschud [per 45 kg eigeel ± 500 g kool (Merck)] en
gefiltreerd. Het filtraat, dat nu geen bios II meer bevatte, werd
in vacuo ingedampt tot een dikke, lichtbruin gekleurde,
stroop.

Dit product vormde het uitgangsmateriaal voor de
hierna beschreven proeven. De activiteit bleek 50 y te
bedragen.

In verband met de nauwkeurigheid van het meten,
ging ik na welke invloed het uitgangsproduct uitoefende
bij hoogere concentraties. Vergeleken met bios III uit
versche eieren bleek het materiaal in geringe mate giftig
te werken. Later kon ik aantoonen, dat deze giftige stof
is te verwijderen door koken met verdund zwavelzuur of
door behandeling met phosphorwolfraamzuur.

De werkzaamheid van bios III gaat verloren, wanneer
het uitgangsmateriaal wordt verkoold; het is dus een
organische substantie.

Eenige proeven werden genomen met het doel een in-
druk te krijgen van de stabiliteit van dezen factor. Daar-
toe werden 200 mg van het uitgangs-materiaal gedurende
twee uren gekookt resp. met 50 cc. 5 % bariet-oplossing

en met 50 cc. 5 % zwavelzuur. De activiteit was door deze
behandeling twee maal zoo groot geworden, terwijl de
door de hoogere concentraties veroorzaakte groei-toe-
name sterker bleek te zijn dan bij het uitgangsproduct.
Ik meen dit verschijnsel voorloopig te moeten verklaren
door aan te nemen, dat de bovengenoemde giftige stoffen
zoowel door het zuur als door het alkali in niet-giftige
verbindingen zijn omgezet.

Het met zwavelzuur behandelde product werd gebruikt
voor de bereiding der standaard-oplossing van bios HI
(zie blz. 76). Hiertoe werden 100 mg van het preparaat
gebracht in 200 cc. water en deze oplossing, verdeeld
over een achttal kolfjes van 25 cc., gefractionneerd ge-
steriliseerd bij 100°.

Een hoeveelheid onzuiver bios HI werd gedurende een
etmaal aan een terugvloeikoeler gekookt met 20 % zout-
zuur. De oplossing veranderde hierdoor nauwelijks van
kleur en had na verwijderen van het zuur haar activiteit
volkomen behouden.

Onderzocht werd verder hoe factor III reageert op
zwakke oxydatieniiddelen, zooals een ammoniakale op-
lossing van zilver-oxyde, Fehling's proefvocht en de op-
lossing van H.\ines Mijn uitgangs-preparaat vertoonde
in alle drie gevallen een zeer zwak, maar duidelijk re-
ductie-vermogen. Na het verwijderen der reagentia bleek
d,e werkzaamheid onveranderd te zijn.

1) Zie M. ivlopstock en A. Kowakski. Untersuctiungsmettioden.
10e druk. U'Rban amp; Schwarzexberg, Berlijn 1932), blz. 175.

eerste plaats behandelmg met verschillende organische
oplosmiddelen in aanmerking. Ik stelde vast, dat de
derde factor zich door aether, chloroform of benzol niet
laat extraheeren uit een waterige oplossing. Vervolgens
werd een zeker quantum van het uitgangsmateriaal op-
gelost in dezelfde gewichtsboeveelheid water en hierna
door toevoegen van alcohol het actieve product in drie
fracties gescheiden (twee als neerslag, de derde als 90 %
alcoholische oplossing). Noch deze, noch een bewerking
met aceton bracht eenige vooruitgang. Het resultaat van
een herhaling der gefractionneerde precipitatie met
alcohol-aether en met aceton-aether had evenmin succes.

Nu ik beschikte over een nauwkeurige meet-methode
werd nog eens nagegaan in welke mate bios III door
kool wordt geadsorbeerd. Ik kon aantoonen, dat zelfs
groote hoeveelheden (5 maal het gewicht van de droog-
rest der oplossing) hiervan geen bios III uit de oplos-
sing verwijderen.

Vervolgens werd geprobeerd bios III te concentreeren
door adsorptie aan de volgende middelen: voller's aar-
de, sihcagel, frankoniet, frankoniet C^, silitoniet en fran-
koniet S. Van de vier laatste stoffen werden ons door de
N.V. Chemicaliën lm- en Export Maatschappij te Amster-
dam, welwillend monsters toegezonden, waarvoor ik
haar hierbij mijn oprechten dank betuig. De proeven
werden als volgt uitgevoerd. Ik bracht 3 g van een bios
Ill-preparaat, met een activiteit van 30 7, in 50 cc. water
en schudde deze oplossing gedurende een uur met 6 g
van het adsorptie-middel. Daarna werd afgefiltreerd, het
filtraat ingedampt en zoowel de werkzaamheid als de
hoeveelheid der droogrest bepaald (in mg droogrest in
10 cc. oplossing):

De werkzaamheid was in elk der gevallen onveranderd
gebleven en de hoeveelheid was alleen bij frankoniet
verminderd. Te onderzoeken blijft dus nog of uit dit
frankoniet door gefractionneerde elutie een zuiverder
preparaat van bios 111 is te bereiden.

Een hoeveelheid oplossing van bios III werd langzaam
gezogen door een kolom vast aangestampt natrium-
permutiet. Deze proef had in de eerste plaats tot doel, na
te gaan of bios III door permutiet wordt geadsorbeerd
en in de tweede plaats na te gaan of door deze behan-
deling aanwezige zouten van ammoniak en aminen wa-
ren om te zetten in de overeenkomstige natrium-verbin-
dingen, welke door precipitatie met 80 % alcohol zouden
zijn te verwijderen. De proef werd uitgevoerd met 1 g
bios Ill-preparaat (act. 30 y) opgelost in 50 cc. water en
een zuil grondig uitgewassen permutiet van 1 cm dikte
en 15 cm lioogte. Na afloop werd nagewasschen met
40 cc. gedist. water. De vereenigde filtraten gaven een
droogrest van 850 mg met een (onveranderde) activiteit
van ± 30 7. Bij behandeling met 80 % alcohol sloegen
slechts 50 mg van een vaste, witte stof n,eer. Deze me-
thode komt dus voor een zuivering van bios III niet in
aanmerking.

bios III is neer te slaan in den vorm van een onoplosbare
verbinding. In de eerste plaats koos ik sublimaat. 100 mg
van het uitgangsmateriaal (activiteit 80 y) werden opge-
lost in 2 cc. water en hieraan werd een verzadigde op-

lossing van sublimaat toegevoegd tot geen neerslag meer
ontstond. Het precipitaat (138 mg) werd met zwavelwa-
terstof ontleed, waarbij een inactieve rest van 15,5 mg
achterbleef. Het filtraat werd eveneens van kwik bevrijd.
Bij indampen van het filtraat van het kwik-sulfide kon
een product met niet noemenswaardig veranderde acti-
viteit worden teruggewonnen.

Daarna werden nog eenige proeven genomen met op-
lossingen van bios III in alcohol, bij welke zich óf een
actief neerslag met onveranderde werkzaamheid, óf een
inactief precipitaat vormde (zie tabel 12).

In de tweede plaats ging ik na welke reacties een op-
lossing van bios III vertoonde bij toevoegen van reagentia
op alkaloïden. Verdunde (10 %) oplossingen van bios III
gaven hiermede geen neerslagen, behalve phosphor-
wolfraamzuur. tieconcentreerde (1 g uitgangsmateriaal
op 1 cc. water) oplossingen gaven het volgende resultaat.

Alleen door de behandeling met phosphorwolfraam-
zuur is dus een zuivering van bios III te weeg gebracht.

De neerslagen met flaviaanzuur, rufiaanzuur, pikrinezuur,
pikrolonzuur, sozojodolzuur en Reinecke zout werden ver-
kregen door een kleine overmaat van koud verzadigde op-
lossingen dezer reagentia toe te voegen aan een hoeveelheid
eener oplossing van 10 g bios Ill-preparaat (act. 30y) in
10 cc. water. De neerslagen en de filtraten werden op de ge-
bruikelijke wijze van de reagentia bevrijd.

Voor de precipitatie met phosphorwolframzuur werden
10 g van het uitgangsmateriaal opgelost in 10 cc. 5 % zwavel-
zuur. Hieraan werden toegevoegd 15 g phosphorwolframzuur
eveneens opgelost in 15 cc. 5 % zwavelzuur. Direct na de toe-
voeging werd eenigen tijd heftig geschud. Er ontstaat een
groote hoeveelheid neerslag, die werd gecentrifugeerd en
gewasschen met 8 cc. sterk verdund zoutzuur. Het neerslag
werd nu gesuspendeerd in 200 cc. 5 % zoutzuur en in een
scheitrechter drie maal geschud met een mengsel van gelijke
deelen aether en amyl-alcohol. De op deze wijze van vrij
phosphorwolframzuur bevrijde oplossing werd met bariet
van sporen zwavelzuur ontdaan en in vacuo drooggedampt.

De rest woog 6,009 g. Het filtraat werd op dezelfde wijze van
phosphorwolframzuur en zwavelzuur bevrijd en gaf een
droogrest van 3,645 g. Aangezien de opbrengst van bios Hl bij
deze behandeling 136 % zou bedragen, is het waarschijnlijk
dat de zuivering gedeeltelijk berust op de verwijdering van
giftige producten.

Het uitblijven van een reactie met kopersulfaat en
natrium-bisulfiet wijst op de aanwezigheid van slechts
zeer kleine hoeveelheden adenine en urinezuur.

Uit proeven van Kögl en Tonnis was gebleken, dat
men met een zeer groote overmaat inosiet (lOOO y in
plaats van 3 y) de werking van bios Hl kan nabootsen.
Deze waarneming doet aan de mogelijkheid denken, dat
bios III een chemisch aan inosiet verwante stof is. Ik
onderzocht daarom mijn uitgangsmateriaal op suiker-
alcoholen en trachtte volgens Melnier '-) een benzal-ver-
binding te doen ontstaan. Hiertoe werd 1 g uitgangs-
materiaal opgelost in 5 cc. zoutzuur (s.g. 1.19). Na fil-
treeren van een kleine hoeveelheid onopgelost zout werd
0,5 cc. benzaldehyde toegevoegd en werd het mengsel
in de ijskast bewaard. Zelfs na drie dagen had zich geen
neerslag gevormd.

Het uitgangsproduct gaf een sterk positieve reactie met
ninhydrin. Naar aanleiding hiervan onderzocht ik of
soms een der bekende aminozuren de werking van bios
III vertoonde. (Zie tabel 14).

Ook werden nog gemeten adenine, asparagine, gluta-
thion (S-S) en vitamine B, De eerste drie stoffen ge-
il Z. f. Krebsforschung 40, 203 (1934), pag. 215.
2) Meuxier. Compt. Rend. 106, 1425 en 1732 (1888); 107 910
(1888); 108, 408 (1889). Zie ook: E. Fischer. Ber. 27, lo3o (1894).

■■lt;) Verseliik hiermede de in Dec. 1934 verschenen publicatie
van Williams en Saunders [Biochem. J. 28, 1887 (1934)], die ver-

droegen zich als de aminozuren; alleen het vita-
mine Bi vertoonde een sterkere a c-
t i V i t e i t. B ij e e n nader onderzoek bleek,
d a t 0,02 Y van d i t v i t a m i n e a e q u i v a 1 e n t te
z ij n 'm e t 30 v van m ij n u i t g a n g s p r e p a-
raat van bios III.

mii m, dat mij welwillend was afgestaan .ioor de I.G. tarben-
industrie A.G. te Elberfeld.

In tabel 15 ') zijn voorgesteld de activiteiten van doses
vitamine varieerend tusschen 0,ÜÜ2 en 1 -y. Als uit-
gangsmateriaal voor deze proef werd het pikrolonaat
van vitamine B^ gebruikt. Dit werd in water opgelost en
van pikrolonzuur bevrijd met een weinig, zorgvuldig uit-
gewasschen, ongebleekte woP). Daar het niet zeker is,
dat bij deze ontleding het vitamine quantitatief werd
teruggewonnen, stellen de getallen in tabel 15 minimum
waarden voor.

In verband met de werkzaamheid van vitamine B,
werd onderzocht of omgekeerd het onzuivere prepa-
raat van bios III ook anti-neuritische activiteit bezat.
Windaus') geeft aan, dat 2,4 y vitamine B^, dagelijks
aan een duif toegediend, deze behoedt voor polyneuritis.

1)nbsp;N.B. De tiierin vermelde metingen werden uitgevoerd in een
periode, dat de standaard-oplossing zeer „lagequot; waarden gaf (1 cc.
veroorzaakte (na 5 uur kweeken) een groeitoename van slecht.s
450 %).

Daar 30 y van mijn bios Ill-preparaat correspondeerden
met 0,02 y vitamine, laat zich hieruit — voor het geval, dat
de activiteit van mijn bios lll-preparaat op het gehalte
aan anti-nenritisch vitamine berust—berekenen, dat 6 mg
van het bios Ill-preparaat als dagelijksche dosis voor
een duif voldoende moet zijn. Deze berekening is geba-
seerd op de in tabel 15 vermelde metingen, welke zijn
uitgevoerd met een oplossing van vitamine Bi, bereid uit
liet pikrolonaat, bij welke bereiding M^erd aangenomen,
dat 100 % van het vitamine wordt teruggewonnen. De
dosis van 6 mg stelt dus, evenals de getallen in tabel 15
een minimum waarde voor. De vergelijkende proef dan-
ken wij aan de I.G. Farbenindustrie A.G. te Elberfeld.
Het resultaat luidde als volgt: „Die Prüfung wurd,e an
10 Beriberi-Tauben durchgeführt. 1 Gramm des über-
sandten Präparates enthält danach 80 Taubeneinheiten
(kurativ), d.h. 1 Einheit ist enthalten in 12,5 Mg. Ihres
Präparates. Zum Vergleich ist die getrocknete Wicküler
Bierhefe heranzuziehen, die in 8 Mg. 1 Einheit enthält.quot;

De gevonden waarde van 12,5 mg stemt, wat orde van
grootheid betreft, goed overeen met de berekende. Dit
is dus een steun voor de hypothese, dat bios III en vita-
mine Bl identiek zouden zijn. Tenzij men aanneemt, dat
de eigenschappen van vitamine Bi in het onzuivere
bios Ill-preparaat geheel worden gemaskeerd, is deze
veronderstelling in strijd met de waarnemingen, die aan-
toonden, dat bios III

Aan het einde dezer onderzoekingen over de bios-
factoren zij nog een proef vernield, die tot doel had te
bestudeeren in hoeverre deze factoren door de groeiende
gist worden opgenomen.

Kögl en Tonnis vonden, dat bij gebruik van den voe-
dingsbodem van Reader door 240 y gist gedurende een
kweektijd van 5 uren uit 1 cc. standaard-oplossing, het
inosiet geheel wordt verwijderd, terwijl in denzelfden
tijd van het bios II hoogstens 10 % door de cellen wordt
opgenomen.

Naar aanleiding van mijn onderzoek van bios III en
den tot 10 uur verlengden kweektijd, leek het mij van
belang de proef van Kögl en Tonnis in uitgebreiden vorm
te herhalen. Hiertoe werden gedurende 10 uren bij 30° C.
oplossingen geschud, die resp. bestonden uit:

Na het kweeken werden de oplossingen gefiltreerd en
van ieder de ééne helft met 1 g kool geschnd (ter controle
van eventueel gevormde giftige stoffen) en de andere
helft direct verw.erkt. Op deze wijze werden dus vier
filtraten verkregen, ieder met een volumen van cc.
Deze vier oplossingen werden in drie porties van 10 cc.
verdeeld, waaraan resp. werd toegevoegd:
25 y inosiet 3,5 y bios II (prep. 519 b)
25 y inosiet 0,5 mg bios III (prep. act. 30 y)
25 y inosiet 0,5 mg bios III (prep. act 30 ï)

waarna het volumen van ieder mengsel werd terugge-
bracht op 10 cc. De door deze oplossingen veroorzaakte
toenamen van den groei zijn weergegeven in tabel 22,
waarin, ter vergelijking van de opgenomen quantiteiten
bios II en III, twee reeksen metingen zijn opgenomen,
één met constante hoev,eelheden bios I IH en wisse-
lende concentraties bios II, een andere met constante
hoeveelheden bios I II en wisselende concentraties
bios III. Hieruit blijkt, dat onder de gegeven omstandig-

n de factoren I, II en III vrijwel geheel worden
opgenomen door de zich vormende cellen,

2)nbsp;dequot; opname van de factoren I en II onafhankeli.)k
is van de aanwezigheid van bios III.

3)nbsp;de lt;^ist, zoowel op een voedingsoplossing met bios
I en II als met bios I, II en III, een weinig giftige
stof produceert, die door adsorptie met kool is

4)nbsp;de aanwezigheid van 0,5 cc. voedmgsoplossmg
van Reader in de te meten oplossingen geen in-
vloed kan hebben uitgeoefend op de resultaten.

Op blz. 72 werd reeds de aandacht gevestigd op het
feit, dat bios II uit eigeel, in combinatie met bios III en
inosiet een veel kleinere groeitoename veroorzaakt, dan
bios II uit gist, onder dezelfde omstandigheden gemeten.

Deze waarneming was aanleiding tot een nauwkeuri-
ger bestudeering van de bios-factoren uit eieren. Een
extract van versche eidooiers werd daartoe op de vroe-
ger beschreven wijze verwerkt en gescheiden in fracties
met bios I, II en III. Het bios I-gehalte werd bepaald
volgens de methode beschreven in hoofdstuk H sub B.
Het eigeel bleek per gram 0,1 mg inosiet te bevatten. In
hoofdstuk IV werd onder C reeds vermeld, dat bios III-
preparaten uit eieren qualitatief dezelfde werking ver-
toonen als overeenkomstige preparaten uit gist. Bios II is
dus blijkbaar de eenige factor uit het eigeelextract, die in
zijn gedrag afwijkt van den correspondeerenden factor
uit gist.

Om na te gaan of het kleinere groeieffect veroorzaakt
door bios H uit .eigeel eventueel is toe te schrijven aan
een bijgemengde giftige substantie, werd een hoeveel-
heid van dezen factor toegevoegd aan de standaard-
oplossing en gecontroleerd of de standaard-curve hier-
door werd „verlaagdquot;. Aangezien in tegendeel een kleine
verhooging optrad, was er geen reden om aan te nemen,
dat stoffen aanwezig waren, die remmend werken op

Het grootere groeieffect veroorzaakt door de factoren
nit gist Iaat zich dan nog slechts verklaren door

1)nbsp;aan te nemen, dal hios 11 uit eigeel niet identiek is
met bios 11 uit gist,

3)nbsp;de cumwezigheid van één of meer specifieke voe-
dingsstoffen in de bios ll-fractie uil gist.

Dit werd tot nu toe niet verder onderzocht.
Zooals te verwacliten was, vertoonde bios II uit eiwit
dezelfde eigenschappen als bios II uit eigeel.

ressant ook den aard van de bios-factoren lut een kip-
penembryo na te gaan. Daartoe werden een serie be-
vruchte eieren eerst in onbebroeden toestand, vervol-
oens na 7 dagen bropden onderzocht. Uit het resultaat,
dat is weergegeven in fig. 6 blijkt, dat gedurende dit pro-
ces een omzetting heeft plaats gehad, die maakt dat de
groeicurve wordt „verhoogdquot;.

In aansluiting met de mogelijke verklaringen van bet
verschil in groeitoename veroorzaakt door bios uit eigeel
en bios uit gist, is dit verschijnsel te verklaren door aan

Aangezien bij den groei van het embryo de omzptting
van eiwitstoffen een belangrijke rol speelt, ging ik na ot
bij de proteolvtische ontleding van kippeneiwit derge-
lijke veranderingen der bios-factoren waren te consta-
teeren als hierboven beschreven. Hiertoe bppaalde ik de
«roeicurven van oplossingen van kippeneiwit, die in
fleschjes gedurende 3 en 6 uur met een kleine hoe-
veelheid pepsine werden geschud bij een temperatuur
van 37° C Bij deze proeven werd zooveel mogelijk steriel
«ewerkt, om'een bios-vorming door eventueele bacteriën
Te voorkomen. De in fig. 7 (blz. 96) voorgestelde resul-
taten konden twee maal worden gereproduceerd. Inder-
daad blijkt bij deze reactie een stof te ontstaan, die de

schijnsel waargenomen als bij bios uit eigeel. 1 cc. van
een met water tot standaardconcentratie verdunde urine
geeft na 5 uur kweeken een groeitoename van hoogstens
350 %. Het feit, dat de curve in sommige gevallen daalt,
nadat een maximum is overschreden, wijst er op, dat in

Fig. 7. Vergelijking der groeikronimen verkregen door meten van
eiwitoplossingen, die door pepsine in verschillende mate waren
gesplitst.

urine stoffen voorkomen, die remmend werken op de
ontwikkeling der gist. Dat dit inderdaad het geval is,
werd aangetoond door de verlaging van de standaard-
curve, die optreedt wanneer men de groeitoename meet,
veroorzaakt door een standaard-oplossing, waaraan een
zekere hoeveelheid urine is toegevoegd (zie meting 7).

De bios-factoren uit urine werden eveneens nader on-
derzocht. Het resultaat is weergegeven in de volgende
metingen.

1)nbsp;hij scheiding der factoren de giftige stoffen wor-
den meegevoerd in de fractie van bios II en III,

2)nbsp;na de scheiding van de factoren II en III de gif-
tige stoffen achterblijven in de kool,

3)nbsp;na verwijdering van de giftige stoffen, de factoren
uit urine hetzelfde gedrag vertoonen als die uit
eieren.

De verklaring van de kleinere groeitoename veroor-
zaakt door urine is dus dezelfde als bij het extract van

Tegenover extracten uit een aantal dierlijke organen,
die een „normalequot; groeikromme veroorzaken, staan ex-
tracten, die evenals bios-preparaten uit eieren en urme,
een „verlaagdequot; groeikromme vertoonen. In de laatste
gevallen zou men dus kunnen concludeeren, dat of bws II,
'of een eventueele vierde factor, of onspecifieke voedings-

stoffen in het dierlijk organisme een verandering kunnen
ondergaan (b.v. door oxydatie of door reductie).

E. BEPALING VAN HET BIOS-GEHALTE IN STOF-
FEN VAN DIERI.I.IKEN EN VAN PLANTAARDI-
GEN OORSPRONG.

Ten behoeve van de onderzoekingen ter isolatie van
biotine, hield ik mij bovendien nog bezig met de bepalin-
gen van het bios-gehalte in stoffen van dierlijken^) en van
plantaardigen oorsprong ten einde een product te vin-
den, dat door zijn hoog bios-gehalte een geschikt uit-
gangsmateriaal zou vormen. Natuurlijk is hiermede dit
doel slechts ten deele bereikt. Het antwoord op de vraag
of een stof geschikt is als uitgangsmateriaal voor de
isolatie van bios II kan pas worden gegeven bij het
verwerken der extracten. Het criterium voor de geschikt-
heid is n.1. niet alleen een hoog bios-gehalte, doch tevens
de mogelijkheid van een gemakkelijke verwijdering der
begeleidende inactieve stoffen.

Dergelijke bepalingen konden tevens van belang zijn
om iets te weten te komen over een functie, die bios in
het dierlijk organisme te vervullen heeft.

Het bios-gehalte werd zooals gewoonlijk gemeten door
d,e groei-toename van gist te bepalen, welke veroorzaakt
wordt door de extracten van bovengenoemde stoffen.
Hierbij is verondersteld, dat deze groei-toename teweeg
gebracht werd door eenzelfde complex van groeistoffen.

Door onderzoekingen van Easïcoït, Wuxiams, e.a. was
reeds bekend geworden, dal stoffen, die de voortplan-

1) Dr. H. .1. M. Hooglaxu was zoo vriendelijk de benoodigde
organen te prepareeren.

lingssnelheid van gist verlioogen, in het planten- en
dierenrijk zeer algemeen voorkomen. De meeste dezer
onderzoekingen waren meer qualitatief dan quantitatief.

De in de volgende tabellen vermelde waarden zijn
verhoudingsgetallen, die alleen betrekking hebben op het
gebruik van „Heferasse Mquot;, gekweekt onder de voor-
waarden beschreven in hoofdstuk 11. Daar het mogelijk
is, dat het gebruik van een ander gistras verschillende
verhoudingen van het bios-gehalte met zich mede zou
brengen, zijn de vermelde cijfers dus niet van absolute
waarde. Voor het verrichten van deze bepalingen werd
het te onderzoeken materiaal zoo goed mogelijk fijn ver-
deeld en vervolgens geëxtraheerd door met 5 cc. water
per gram vaste stof gedurende 30 min. in kokend water te
verhitten in een met een wattenprop gesloten kolfje. Het
extract werd daarna gefiltreerd door een z.g. membraan-
filter.

Aangezien tijdens het uitvoeren van deze bepalingen nog
niets bekend was over de moleculairgewichten der bios-fac-
toren, werd nagegaan, of de poriën-wijdte van deze filters
ook eenigen invloed had op het bios-gehalte. Hiertoe mat ik
een aantal filtraten, verkregen door eenzelfde extract te fil-
treeren door filters van zeer uiteenloopende doorlaatbaar-
heid. Het bios-gehalte van alle filtraten was gelijk aan dat
van het niet gefiltreerde extract.

De gefiltreerde oplossingen werden, na eenige voor-
loopige metingen, zoodanig verdund, dat 0,1 cc. van het
verdunde extract een groeitoename van omstreeks 120 %
gaf^). Het daarna nauwkeurig bepaalde bios-gehalte is

Terwille van de vergelijkbaarheid zijn de metingen in
stoffen van dierlijken oorsprong, indien eenigszins mo-
gelijk, uitgevoerd met organen afkomstig van eenzelfde
specimen.

Ten einde na te gaan of de verschillen in bios-gehalte
worden veroorzaakt door een wisselend watergehalte
dezer organen, werd dit in enkele gevallen bepaald.

Uit deze getallen, die betrekking hebben op tabel 18
(blz. 103), blijkt, dat het watergehalte slechts weinig
varieert.

Over de vraag, of bios in het d i e r 1 ij k
organisme een functie te vervullen
heeft, z ij n aan de hand der uitgevoer-
de bepalingen nog geen conclusies te
trekken, ofschoon de volgende feiten opmerkelijk
zijn.

Bij den hond (tabel 17, blz. 102) is practisch in alle or-
ganen bios aan te toonen. Nergens vindt men echter een
concentratie, die van het algemeene tamelijk lage „bios-
niveauquot; afwijkt.

Bij de koe (tabel 18, blz. 103) treedt eveneens een „bios-
niveauquot; op, maar het is opvallend, dat bij specimen B,

waar in liet bijzonder ook het bios-gehalte van het maag-
darmkanaal (en ook zijn inhoud) nauwkeurig werd on-
derzocht, een toename van dit gehalte van slokdarm tot
ileum optreedt. Mogelijk houdt dit verband met een bios
produceerende darm-flora. Bij specimen C is het bios-ge-
halte van het darmkanaal niet verhoogd; dit kan samen-
hangen met het feit, dat het hier een kalf betreft, hetwelk
alleen moedermelk gedronken heeft.

Bij de kip (tabel 20, blz. 105) blijken zoowel de nieren,
de lever en het eigeel een uitzonderlijk hoog bios-gehalte
te bezitten. Opvallend is het verschil in bios-gehalte der
eifollikels. Dit gehalte stijgt naarmate de follikel ouder
wordt. Om zeker te zijn, dat dit verschijnsel niet wordt
veroorzaakt door een verschil in het watergehalte, werd
dit laatste bepaald in de follikels van 2,2, 5,4, 12,0 en
18,1 g. Het bleek resp. te bedragen 46,2, 46,3, 45,9 en
46,6 %.

Het „bios-niveauquot; in de organen van de kip is hooger
dan in de organen van de andere onderzochte dieren,
hetgeen wellicht samenhangt met het voedsel.

B.nbsp;mannelijk exemplaar; oud 10 ä 12 mnd.; geen afwij-
kingen; gewicht 11,5 kg.

nier merg
,. schors
melklier
ovarium
corpus lufeum
follikel-vocht (S.E. per cc.)
testikels
penis

80
43

151

76
72
O
30
170

Bios-gehalte in eenige organen van het varken.
(afkomstig van verschillende specimen van
onbekenden leeftijd).

TABEL 20.
Bios-gehalte in eenige organen der kip.
Ouderdom ± 1 jaar; geen afwijkingen.

1)nbsp;Voor de bestudeering van bet bios-vraagstuk werd
nagegaan welke stoffen voor den groei van een
„Brennerei-Oberhefequot; (Rasse M van het Institut für
Gärungsgewerbe te Berlijn) noodzakelijk zijn.
Deze gistsoort ontwikkelt zich in een voedingsbodem
bestaande uit een oplossing van glucose en eenige
anorganische zouten slechts zeer langzaam. Voor
een normalen groei zijn behalve het biotine van Kögl
en Tonnis nog minstens twee andere groeistoffen
noodig, ^velke hier bios I en bios III werden ge-
noemd.

2)nbsp;De beide laatstgenoemde bios-factoren onderschei-
den zich door de volgende eigenschappen.

Bios I wordt neergeslagen door loodacetaat en am-
monia en gedraagt zich dus als het bios I van Lucas,
dat door Eastcotï uit theestof werd geïsoleerd en
kon worden geïdentificeerd als meso-inosiet.
Bios III blijft achter in de oplossing, w-aaruit het
biotine met kool, en het bios I met loodacetaat en
ammonia zijn verwijderd.

.3) Een methode werd uitgewerkt ter quantitatieve be-
paling van bios I en deze stof op een dusdanige
manier uit gist geïsoleerd, dat in tegenstelling met
de werkwijze van Eastcott de mogelijkheid van se-
cundaire veranderingen van de oorspronkelijke ac-
tieve verbinding vrijwel geheel werden uitgesloten.
Ook bios I uit gist bleek identiek te zijn met meso-
inosiet.

4)nbsp;Andere meerwaardige alcoholen, waaronder de ste-
reo-isomeren scylliet en 1-inosiet, waren niet in staat
meso-inosiet te vervangen. De activiteit van meso-
inosiet houdt dus op zeer specifieke wijze verband
met zijn constitutie.

6)nbsp;Bios III blijkt een organische stof te zijn, bestand
tegen verhitting met 20 % zoutzuur en een 5 % oplos-
sing van bariet. Het verandert niet door oxydatie met
een ammoniakale oplossing van zilveroxyde. Uit het
zuiverste door mij verkregen preparaat van bios III
Iaat zicli de actieve stof noch door pliosphorwolf-
raamzuur, noch door andere reagentia op alkaloïden
neerslaan. Bios III wordt gedeeltelijk door „Franko-
nietquot; geadsorbeerd.

7)nbsp;De bekende aminozuren zijn niet in staat de wer-
king van bios III te imiteeren, daarentegen blijkt
vitamine B^ den derden factor geheel te kunnen
vervangen.

Uit de vrij goede overeenstemming tussclien de be-
rekende en de gemeten antineuritische werkzaam-
heid van het onzuivere preparaat van bios III zou
men kunnen besluiten tot de identiteit van den der-
den factor en vitamine B,. Het chemisclie gedrag
van genoemden factor is hiermede echter in strijd,
tenzij men aanneemt, dat de eigenschappen van
vitamine B^ in het onzuivere preparaat van bios III
geheel worden gemaskeerd.

8)nbsp;Gedurende den groei woorden zoowel bios I, bios III
als biotine vrijwel quantitatief door de gist ojjge-
nomen.

9) Een vergelijking van de werkzaamheid der bios-
factoren uit eigeel en urine met die uit gist leidde
tot de veronderstelling, dat in de bios Il-fractie uit
gist nog een vierde factor of één of meer niet spe-
cifieke voedingsstoffen aanwezig moeten zijn. Te-
vens bestaat echter de mogelijkheid, dat biotine uit
gist niet identiek is met biotine uit dierlijk materiaal.

10) Het bios-gehalte van dierlijke weefsels werd bepaald
door oriënteerende proeven, die echter nog geen
licht werpen op een eventueele functie van bios in
het dierlijk organisme.

1)nbsp;Im Zusammenhang mit Studien über das Biospro-
blem wurde untersucht, welche Stoffe für das
Wachstum einer Brennerei Oberhefe (Rasse M vom
Institut für Gärungsgewerbe, Berlin) notwendig
sind.

Die genannte Heferasse entwickelt sich auf einem
Nährboden, der Glucose und einige anorganische
Salze enthält, nur sehr langsam. Für ihr normales
W^achstum sind ausser dem Biotin von K()gl und
Tönms noch mindestens zwei andere Wuchsstoffe
nötig, die als Bios I und Bios III bezeichnet wurden.

2)nbsp;Die beiden letzteren Biosfaktoren untersclieiden sich
in folgenden Eigenschaften.

Bios I wird durch Bleiacetat und Ammoniak gefällt;
es verhält sich also wie das Bios I von Lucas, das von
Eastcott aus Theestaub isoliert und als Meso-Inosit
identifiziert werden konnte.

Bios III bleibt in den Extrakten, aus denen Biotin mit
Kohle und Bios I mit Bleiacetat und Ammoniak ent-
fernt worden sind, in Lösung zurück.

3)nbsp;Es wurde eine Methode für die quantitative Bestim-
mung von Bios I ausgearbeitet und diese Verbindung
aus Hefe isoliert. Die Aufarbeitungs-Methode wurde
im Gegensatz zu Eastcott so gewählt, dass die Mög-
lichkeit sekundärer Veränderungen der ursprüng-
lichen aktiven Verbindung so gut wie ausgeschlos-
sen wurde. Auch das aus Hefe isolierte Bios I erwies
sich als identisch mit Meso-Inosit.

4)nbsp;Andere mehrwertige Alkohole, so auch die Ste-
reo-isomeren ScYllit und 1-Inosiet waren niclü im-
stande den Meso-Inosit zu ersetzen. Die Aktivität des
Meso-Inosits ist also konstitutionsspezifisch.

5)nbsp;Es wird eine Messmethode für Bios III angegeben.
6 Bios III ist eine organische Verbindung, die gegen

Kochen mit 20 %iger Salzsäure und 5 %iger Baryt-
lauge beständig ist. Sie wird durch Oxydation mit
ammoniakalischer Silberoxydlösung nicht veran-
dert. Aus meinem reinsten Präparat von Bios III lasst
sich die aktive Verbindung weder durch Phosphor-
wolframsäure noch durch andere Alkaloidreagenzien
fällen. Bios III wird teilweise an Frankonit adsor-

Wirkung, dagegen scheint Vitamin B, den dritten
Faktor vollkommen ersetzen zu können.
Aus der ziemlich guten Übereinstimmung zwischen
der berechneten und gefundenen antmeuritischen
^^4ksamkeit des rohen Bios Ill-Präparates konnte
man auf die Identität des dritten Faktors mit Vita-
min B, schliessen. Hiermit steht jedoch das chemi-
sche Verhalten des dritten Faktors in Widerspruch,
wenn man nicht annehmen will, dass die Eigen-
schaften des Vitamin B, im rohen Bios Ill-Praparat

8)nbsp;Während des Wachstums werden sowohl Bios I,
Bios III als auch Biotin beinahe quantitativ von der

9)nbsp;KifverleTcHrWirksamkeit der IMosfaktoren aus
^ Sin und Harn mit denen aus Hefe führte zu der

ein vierter Faktor oder ein oder melirere unspezifi-
sche Nahrungsstoffe vorhanden sein müssen. An-
dererseits besteht auch die Möghchkeit, dass Biotin
aus Hefe nicht mit Biotin aus tierischem Material
identisch ist.

10) In orientierenden Versuchen wurde der Bios-Gehalt
tierischer Gewebe bestimmt; es ergab sich noch kein
Hinweis auf eine etwaige Funktion der Bios-Fakto-
ren im tierischen Organismus.

1)nbsp;In studying the bios-problem we have tried to ascer-
tain which substances are necessary for the growth of
a „Brennerei Oberhefequot; (Basse M from the Institut
für Garungsgewerbe, Berlin). In a solution of glucose
and some inorganic salts this yeast-race develops very
slowly. Besides the biotin of Kögl and Tönnis at
least two more growth-substances,which in this thesis
are called bios I and bios III, are needed for normal
growth.

Bios I is precipitated by lead-acetate and ammonia
and thus behaves like Lucas' bios I, which was isolat-
ed from teadust by Eastcott and identified as meso-
inositol.

Bios III remains in the solution from which biotin
and bios I have been removed respectively by charcoal
and by lead-acetate and ammonia.

3)nbsp;After having worked out a method for the quantitative
determination of bios I, the latter was isolated from
yeast.This method, contrary to Eastcott's procedure,
practically precludes the possibility of secundary
transformations of the original active substance. Bios I
from yeast also proved to be identical with meso-
inositol.

4)nbsp;Other polyalcohols, among which were scyllitol and
1-inositol, were not able to replace meso-inositol. The
activity of the latter thus is very specifically con-
nected with its constitution.

6)nbsp;Bios III proved to be an organic substance, which is
not altered by heating with 20 % hydrochloric acid
and a 5 % solution of baryta. It will not change by
oxydation with an ammoniacal solution of silver-
oxyde. At the degree of purity reached up to now
bios III is neither precipitated by phosphotungstic acid
nor by other reagents on alcaloids. It is partially ad-
sorbed by „franconitequot;.

7)nbsp;The common amino-acids cannot imitate the effect
of bios III, but then it was proved that this factor can
be completely replaced by vitamin B^.

The calculated and the estimated antineuritic activity
of the crude preparation of bios III agree to an extent
as would justify the identity of vitamin Bx and the
third factor. The chemical behaviour of the latter,
however, contradicts this assumption unless the pro-
perties of vitamin B^ are fully masked in the crude
preparation of bios III.

8)nbsp;During growth bios I, bios III as well as biotin are
almost quantitatively taken up by the yeast.

8) During growth bios I, bios III as well as biotin are
yolk and urine with those from yeast lead to the sup-
position that either a fourth factor or one or more
non-specific foodstuffs must be present in the bios II-
fraction from yeast. At the same time there is a
possibility of biotin from yeast being not identical
with biotin from animal sources.

10) The bios-content of animal tissues was determined by
preliminary experiments which, however, do not yet
throw light on a possible function of bios in the animal
organism.

De door Wrede opgestelde formule voor het prodigio-
sine is aan bedenkingen onderhevig.

Het vraagstuk van het haematoprosthetine kan noch door
de onderzoekingen van H e r z o g, noch door de hiertegen
aangevoerde argumenten van Fischer en Zeile als
opgelost worden beschouwd.

De conclusie van A o y a m a en M o n n a, dat Bismuth
niet allotroop is, berust op zwakke gronden.

De bewering van Mme D o b r y, dat de solvatatie als
verklaring van de relatieve viscositeits-verhooging van
colloïde oplossingen onaanvaardbaar zou zijn, moge in
sommige gevallen juist wezen, doch zij houdt niet rekening
met het gedrag van vele colloïde oplossingen in water.

Ook door nieuwere onderzoekingen wordt de opvatting
van d' H é r e 11 e omtrent de natuur van den bacteriophaag
gesteund.

Vele extracten van Secale cornutum zijn niet voldoende
betrouwbaar. Het ware te wenschen, dat men evenals bij
digitalisbladen, kon beschikken over houdbare en door een
centraal instituut physiologisch geijkte preparaten.

Aqua dest. . .	. 1000
Glucose . . .	10
(NH4)2S04 . .	3
MgS04.8 H2O .	0,7
KH2PO4 . . .	1
K2HPO4 . . .	0,16
NaCl ....	0,5
Ca(N03)2. • •	0,4

	Verdunnung	Extinctie	Proc. toename
Uitgangswaarde.	—	2,5	—
Blanco-waarde.		3,3	32
Standaard opl.	n.1 0,3 0,5 1,0	5,8 10,0 16,2 18,5	132 300 548 640
Onbekende opl.	0,1 0,3 0,5 1,0	6,2 : 11,9 16,5 18,0	148 376 560 620

hoeveelh. inosiet toege-	procentueele	hoevcclli. inosiet toege-	procentueele
voegd aan Bios II III	toename	voegd aan Bios 11 III	toename
	220	0.6 y	408
0.01 r	235	0.8 „	465
0.02 „	240	1.0 „	525
.04 „	231	2.0 „	560
.06 „	244	3.0 „	592
.08 „	234	4.0 „	600
0.1 „	250	5.0 „	610
0.2 „	265	10.0 „	618
0.4 „	340	standaard-	595
		oplossing

	Extinctie	®/9 toename
Uitgangswaarde	2,5
bios 11 III	9,6	284
»» ,, 0,5 r inosiet	13,8	452
»' gt;» quot;hl jj ,,	15,0	500
ff ff 2 „ ,,	16,7	568
quot; ff 3 gt;» fj	18,2	628
ff ff 4 » gt;»	18,9	656
bios II III 0,1 cc. bios I-opl.	13,5	440
„ „ 0,2 cc. „ „	14,7	488
0,3 cc. „	16,3	552
0,4 cc. „	17,8	612
„ 0,5 cc. „ „	18,6	644
Standaard-oplossing 0,1 cc.	5,6	124
0,3 cc.	9,7	288
0,5 cc.	15,6	524
1 cc.	18,3	632

	Kook-extract			Autolyse-extr.			Plasmolyse-extr.
	'S u ca	.st 2-2 0) ca j= ca	Clio B S quot;S lt;u lt;u gt; 01 O	N quot;S u ca	1 i - quot;5. 1 .= O S-2 0) Cd 1 CÖ gt; g « £	6i) B ;a quot;S 0) gt; agt; O	c 'S *gt; O ca	.at s'S '53 ca ca g co f	tio B •O '33 £ quot;3 (U gt; OJ O
Hoofdfractie	100	24	2308	30	108	3256	15	37	, 550
Alcoh. neerslag		50			125			3
Totaal		74			233			40

	mg nosiet per g gist volgens:
	.autolyse- methode	kook methode directe bepaling
Celmateriaal.	0,132	1,0 1
Filtraat.	0,9	0,2
Totaal.	1,032	1,2 1,24

bios III- preparaat '	cc. water ■ j i	cc. al)s. aicoiiol	cc. verz. ulcoh. HgCl.^ opi.	; resultaat 1
2	3	10	10	1 actief neerslaquot;
2	4	10	10	! „
2	i 4	8	10	I inactief „
2	4	5	10	,, ,,
1	5	20	10	geen

Toegevoegd aan Mos 1 n	Procentueele toename
Zonder toevoeging	468
0,05 cc. stand.-opl. van Mos 111	652
vitamine Bi 0,002 r	448
0,006 „	468
0,012 „	468
0,016 „	580
0,02 „	660
0,1 „	724
1	732

gist gekweekt op:	Itoolbe- liandeling	j toegevoegd	proc. toename
I II	zonder	II III	155
gt;i		I II	625
ff	„	I III	405
ff		1 11 III	830
ff	met	II III	186
ff		I II	655
ff		I III	235
ff		I II 111	1085
I II III	zonder	II III	160
		I II	615
ff		I III	365
ff		i ir iii	790
ff	met	II III	195
ff i		1 I II	680
ff		I III	125
ff		1 11 III	1110
oorspr.opl.		1
van I II	—	—	615
ff ff	—,	opl. v. I^eader	645
„ 1 II 111	—	-	1110

	bios gehalte per			bios gehalte per
Orgaan	g. versch weefsel		Orgaan	g. versch weefsel
Orgaan			Orgaan
	A	B		A	B
slokdarm	54		testikels		^ 109
maagfundus \			epidydimis		212
epitheel /	148	204	corpus cavernosum		26
maag-fundus i	148		prostaat		76
spierweefsel '		84	ovarium	60
maag pylorus \ epitheel 1			uterus	91
maag pylorus \ epitheel 1	129	47	groote hersenen	200	144
maag pylorus i	129		kleine „	187	169
spierweefsel /		53	halsmerg		139
duodenum	132	65	verlengde merg		148
ileum	113	49	borstmerg	134	150
jejunum		54	lendemerg		145
colon	128	84	beenspier		46
rectum epitheel		84	rugstrekker	79	46
„ spierweefsel		88	biceps brachys		68
lever	113	133	musc. semi-
gal (S.E. per cc.)		71	membranosis	63
pancreas	195	160	hartspier	98	78
milt	121	121	aorti 1 borst)	103
schildklier	140	108	bloedplasma	28
hypophyse	270		erythrocyten	40
lymphkiier			gehomog. bloed	59
(mesenteriaal)	83		long	124	62
parotis		237	huid	78	50
nier schors	113	103	vetweefsel omentum	61
„ merg	82 i	72	„ subcutaan	41 ]
blaas	102	84		i

Orgaan	Bios-gehalte per g versch weefsel
Orgaan	A	B	c	D
inhoud pens		i 420
„ netmaag		414		1
,, lebmaag		346	300
„ boekmaag		576
„ duodenum		424
„ ileum		1 1259	156
„ colon		1187	156
„ appendix			142
„ rectum		1229
slokdarm	81	i 144		135
pens		223
boekmaag wand		227
„bladen'		i 243
lebmaag spierweefsel	90	167		110
epitheel	166	274	185	160
netmaag		174
duodenum	233	330		230
ileum		860	126
jejunum	275
colon		603	96	265
rectum epitheel	450 i	382	109
„ spierweefsel	160	148	109
appendix			97
huid		94	197
vetweefsel	59	55
groote hersenen	123	200	310	160
kleine ,,	128	146	366	170
ruggemerg'	71	110 1	264	125

A	B	C	D
192	' 223	217	i 180
129	i 109	246
		107	120
270	1 285	225	170
150	; 158	189
218	! 212	194	140
149	160	229
337	329	316
	224	i
	138		150
81	63		110
181	197		200
60	63		80

	bios-gelïaite		bios-gehalte
orgaan	per g verscii	orgaan	per g versch
	wcerset		weefsel
ruggemerg	140	milt	80
slokdarm	130	bijnier	150
maag	110	nekspier	160
ileum	140	bilspier	86
pancreas	90

			ü-g
orgaan	%h S ïfs	orgaan	lil sg.
Krop	138	borstspier	48
kliermaag	321	beenspier	73
spiermaag spierweefsel	241	vetweefsel (omentum)	58
„ bindweefsel	79	wand oviduct 1 (bij cloaco)	215
„ epitheel	462	, 2	155
middendarm	776	yy ^	166
elnddarm	281	„ 4	200
appencix	828	5	207
lever	1652	6 (bij
gal (S E. per cc.)	489	ovarium)	214
milt	707	ovarium	465
pancreas	874	kleinste eifollikels ( vlies)	355
nier	2563	eifollikel (-f vlies) 0,7 g	439
hersenen	186	„ (inhoud) 2,2 g	807
long	150	5,4 g	1021
hartspier	235	„ 12,0 g	1197
kam	136	18,1 g	1562

peulen	!)Ü0	pluksla	1813
snijbiet	.378	kropsla	2760
zeekool	708	snijsla	3450
witte kool	1Ü65	veldsla	657
roode kool	650	cichorij	1017
spruit kool	1400	postelein	545
bloemkool	1640	komkommer	863
savoye kool	972	schorseneeren	1995
boeren kool	1280	asperge zuring	530
pronkboonen	695	asperge zuring	595
stam snijboonen	530	capucijners	975
tuinboonen	760	kervel	785
stok slaboonen	760	rapen	1890
stok snijboonen	1040	wortelen	2190
doperwten	1730	uien	1480
tomaten	2018	radijs	1978
peterselie	4903	koolraap	1270
tuinkers	5150	bieten	605
augurken	864	andijvie	2864
rabarber	2330	prei	2213
anijs	2655	raapstelen	2175
spinazie	820	ramenas	1860
maïs	600

pepsine	70
trypsine	1200
pepton (Witte)	400
fibrine	80
gelatine	160
caseïne	25.
kippen-ei (geheel)	400
duiven-ei „	760
kieviets-ei „	1250
urine (mensch) in S.E. per cc.	200
„ (paard) „ „ „ „	290
„ (koe) „ „ „ „	320