CAROTINE, VITAMINE A EN
VITAMINE C IN KOEMELK

STELLINGEN.

I.

Tegen de methode van Rosenthal voor de bepaling
van vitamine A zijn ernstige bezwaren in te brengen.

Bioch. Z. 271. 414 (1934).

Klin. Wochenschr. 14. 829 (1935).

II.

De bepaling van flavinen volgens Koschara is te ver-
kiezen boven die volgens Warburg.

Z. physiol. Chem. 232, 101 (1935).

Bioch. Z. 266. 377 (1933).

III.

Het is tot nu toe niet mogelijk vitamine C chemisch te
bepalen in suikerhoudend materiaal, dat droog verhit is
geweest.

IV.

De methode van Bernal en Crowfoot voor de be-
paling van de dichtheid van kristallen verdient aanbeveling,
wanneer men slechts over kleine hoeveelheden beschikt.

Nature 134. 809 (1934).

J. C. H. VAN WIJNGAARDEN.

't '.kV

Het schema, dat H a u r o w i t z geeft van de verschijn-
selen. die optreden bij denaturering van eiwitten, is onjuist.

Koll. Zeitsch. 71, 198 (1935).

VI.

Het bestaan van chlorophyl C is niet bewezen.

F. P. Zscheile, Bot. Gaz. 95. 529 (1934).
A. W i n t e r s t e i n en K. S c h ö n, Z. physiol. Chem.

230, 145 (1934).

VII.

Tussen filtreerbaar virus en bacteriën bestaat slechts een
gradueel en geen principieel verschil.

J. E. Barnard, Brit. J. Exp. Path. 16, 129 (1935).

CAROTINE, VITAMINE A EN
VITAMINE C IN KOEMELK

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD
VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN
DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG
VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS Dr. H. BOLKESTEIN,
HOOGLEERAAR IN DE FACULTEIT DER LETTEREN
EN WIJSBEGEERTE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT IN HET OPENBAAR TE
VERDEDIGEN OP MAANDAG 8 JULI 1935, DES VOOR-
MIDDAGS TE 10 UUR

DOOR

JOHANNA, CORNELIA, HUIBERDINA
VAN WIJNGAARDEN

GEBOREN TE RHENEN

m O mm/if^n v

t-

•4 • «

.-V :

. 'snbsp;.

AAN MIJN OUDERS

Een goede traditie schenkt mij de gelegenheid op deze
plaats allen, die hebben medegewerkt aan mijn wetenschap-
pelijke vorming en aan het tot stand komen van deze disser-
tatie mijn dank te betuigen.

Hooggeleerde Cohen, voor Uw onderricht in de physische
chemie, waarbij Gij zoveel nadruk legt op de noodzakelijkheid
van nauwkeurig werken, ben ik U zeer erkentelijk.

Hooggeleerde Kruyt, U ben ik zeer verplicht voor Uw
belangrijke colleges over Phasenleer en Kolloidchemie, die een
diepe indruk op mij hebben gemaakt.

Aan U, Hooggeleerde Kögl, ben ik veel dank verschuldigd
voor het onderricht in de organische chemie.

Hooggeleerde Schoor 1, U dank ik, dat ik onder Uw
leiding heb mogen kennisnemen van de analytische methodes
voor het onderzoek van voedingsmiddelen.

Hooggeleerde de Graaf f, voor het vele, dat ik op Uw
colleges en practica heb mogen leren, betuig ik U mijn
erkentelijkheid.

Hooggeleerde W o 1 f f. Hooggeachte Promotor, voor de
hulp mij bij de keuze en bewerking van het onderwerp van
mijn dissertatie verleend, ben ik U grote dank verschuldigd;
in het bijzonder waardeer ik de welwillendheid, waarmee Gij
mij, ondanks Uw dikwijls zo druk bezette tijd, steeds met raad
en daad terzijde hebt willen staan.

Zeergeleerde E m m e r i e. Uw grote kennis en ervaring op
het gebied van het vitaminenonderzoek zijn voor mij van grote
betekenis geweest. Wil hiervoor mijn oprechte dank aan-
vaarden.

Zeergeleerde van Eekelen, ook U ben ik zeer erkente-

lijk voor Uw hulp tijdens het bewerken van dit proefschrift.

Zeergeleerde Brouwer, voor de vriendelijke medewerking
bij het verkrijgen van de melkmonsters ben ik U veel dank
verschuldigd.

Tevens wil ik hier mijn dank betuigen aan de directie van
de U. M. I. te Utrecht voor de bereidwilligheid, mij steeds van
melkmonsters te willen voorzien.

Tenslotte bedank ik allen, die aan het Hygiënisch labora-
torium verbonden zijn, voor de hulp en bereidwilligheid tijdens
het bewerken van dit proefschrift.

INHOUD.

Blz.

Inleiding................ I

HOOFDSTUK I.

OVERZICHT VAN HET VITAMINE A EN
HET CAROTINE.

A.nbsp;Historie.............. 3

B.nbsp;Het verband tussen vitamine A en het Carotine 4

C.nbsp;De chemie van Carotine en vitamine A . . . . 6

D.nbsp;Verschijnselen, die optreden door vitamine A-
gebrek bij mens en dier ...... . . 7

HOOFDSTUK II.

DE BEPALING VAN HET VITAMINE A- EN
CAROTINE-GEHALTE.

A.nbsp;Bepaling van het vitamine A-gehalte .... 8

1.nbsp;De dierproef........... 8

2.nbsp;De chemisch-colorimetrische methode ... 10

3.nbsp;De physisch-chemische methode.....11

4.nbsp;De vitamine A-eenheden ....... 12

B.nbsp;De bepaling van het carotinegehalte .... 13

C.nbsp;De Lovibond Tintometer........14

HOOFDSTUK III.

BESPREKING VAN DE LITERATUUR OVER
HET VITAMINE A- EN CAROTINE-
GEHALTE VAN KOEMELK.

A.nbsp;Dierproeven .............

B.nbsp;Chemisch-colorimetrische methodes.....20

C.nbsp;Spectroscopische bepalingen ....... 24

HOOFDSTUK IV.

BEPALING VAN HET VITAMINE A- EN
HET CAROTINE-GEHALTE VAN KOEMELK.

A.nbsp;Bepaling van het vitamine A-gehalte .... 29

B.nbsp;Bepaling van het carotine-gehalte.....31

C.nbsp;De scheiding van lycopine en Carotine .... 33

D.nbsp;Kort overzicht van de gehele methode voor de
bepaling van het Carotine- en vitamine A-gehalte

van melk..............39

E.nbsp;De berekening van de hoeveelheid Carotine uit

de Lovibondwaarden ..........40

F.nbsp;De berekening van de hoeveelheid vitamine A

uit de Lovibondwaarden........41

G.nbsp;Toevoeging van een bekende hoeveelheid Caro-
tine en vitamine A..........42

HOOFDSTUK V.

RESULTATEN VAN HET VITAMINE A- EN
CAROTINE-ONDERZOEK VAN KOEMELK.

A.nbsp;Monsterneming................44

B.nbsp;Het Carotine- en vitamine A-gehalte van rauwe
marktmelk.............45

C.nbsp;Het vitamine A- en carotine-gehalte van gepas-
teuriseerde melk ...........47

D.nbsp;Invloed van het diëet van de koe op het Caro-
tine- en vitamine A-gehalte van de melk ... 49

1.nbsp;De bepaling van het carotine-gehalte van de
voedingsmiddelen .........50

2.nbsp;Het vitamine A- en carotine-gehalte van de
melk tijdens de verschillende diëten ... 51

HOOFDSTUK VI.

HET CAROTINE- EN VITAMINE A-
GEHALTE VAN BOTER.

A. Bepaling van het Carotine- en vitamine A-gehalte

van boter.......................57

HOOFDSTUK VII.

DIERPROEVEN............59

HOOFDSTUK VIII.

OVERZICHT VAN HET VITAMINE C.

A.nbsp;Verschijnselen, die optreden bij vitamine C-
gebrek ..............64

B.nbsp;Historie..............64

C.nbsp;Constitutie van het Ascorbinezuur ..... 67
HOOFDSTUK IX.

BEPALING VAN HET VITAMINE C-
GEHALTE.

A.nbsp;De dierproef ............ 69

B.nbsp;Chemische bepalingsmethodes......70

C.nbsp;Reductie met H^S...........71

D.nbsp;De kwikacetaatbehandeling.......72

HOOFDSTUK X.

BESPREKING VAN DE LITERATUUR OVER
HET VITAMINE C-GEHALTE VAN KOE-
MELK.

A.nbsp;De dierproef............74

B.nbsp;De chemische bepalingsmethode......75

HOOFDSTUK XI.

HET BEPALEN VAN HET VITAMINE C-
GEHALTE VAN KOEMELK.

A.nbsp;Uitvoering van de bepaling.......78

B.nbsp;Berekening van het vitamine C-gehalte uit de
titratiewaarden ............ 79

C.nbsp;De bereiding en het stellen van de oplossing

van 2-6-dichloorphenolindophenol ..... 80

D.nbsp;Toevoeging van een bekende hoeveelheid vita-
mine C.....................81

E. De kwikacetaatmethode.........81

HOOFDSTUK XII.

RESULTATEN VAN HET VITAMINE C-
ONDERZOEK VAN KOEMELK.

A.nbsp;Het vitamine C-gehalte van rauwe melk ... 83

B.nbsp;Het vitamine C-gehalte van gepasteuriseerde
melk.............. 84

C.nbsp;Invloed van het diëet van de koe op het vita-
mine C-gehalte van de melk.......84

HOOFDSTUK XIII.

BESPREKING VAN DE RESULTATEN ... 89
Samenvatting . ..............92

INLEIDING.

Vitaminen zijn organische voedingsbestanddelen, wier aan-
wezigheid in het organisme het optreden van „deficiëntie-
ziektenquot; voorkomt. Ze zijn naast eiwitten, vetten, kool-
hydraten en zouten noodzakelijk voor het organisme en ver-
schillen van de eerste drie, doordat zij in dergelijk kleine
hoeveelheden werkzaam zijn, dat hun gebruik voor verbran-
ding of vorming van de cel uitgesloten is.

Wij dienen er dus voor te zorgen, dat ons voedsel genoeg
vitaminen bevat. Hiervoor is het nodig, dat wij het vitaminen-
gehahe van onze voedingsmiddelen kennen. Aanvankelijk
was dit alleen mogelijk door middel van de dierproef. Bij deze
methode kunnen echter zeer grote fouten gemaakt worden en
de resultaten hiervan zijn reeds bevredigend, wanneer afwij-
kingen van 50 % gevonden worden.

Het is dan ook geen wonder, dat men ijverig gezocht heeft
naar een chemische methode om quantitatief vitaminen te
kunnen bepalen. Hierin is men reeds geslaagd voor vita-
mine A, vitamine C en in de allerlaatste tijd ook voor vita-
mine B^. Behalve de grotere nauwkeurigheid heeft de che-
mische methode ook nog het voordeel, dat men in een zeer
veel kortere tijd een bepaling kan doen en bovendien, dat
men van de te onderzoeken stof veel geringere hoeveelheden
nodig heeft.

Daar koemelk het hoofdvoedsel. vaak zelfs het enige
voedsel van kunstmatig gevoede zuigehngen is, is het dus

van groot belang de oorzaken na te gaan, waardoor het vita-
minen-gehalte van de melk beïnvloed wordt. Daar het bekend
is, dat de samenstehing van de melk wisselt met de samen-
stelling van het voedsel van de dieren, ligt het voor de hand
de invloed hiervan op het vitaminen-gehalte van de melk te
onderzoeken.

Bij mijn onderzoek heb ik mij beperkt tot die vitaminen,
die, toen ik in 1933 begon, chemisch te bepalen waren, nl.
vitamine A en vitamine C.

HOOFDSTUK I.

OVERZICHT VAN HET VITAMINE A EN HET
CAROTINE.

A. Historie.

De eerste aanwijzingen voor het bestaan van'vitamine A
zijn te danken aan de proeven van Mc. Collum en
Davis 1) en Osborne en Mendel.

Zij gaven ratten een kunstmatig samengesteld voedsel,
bestaande uit koolhydraten, vetten, eiwitstoffen en zouten.
De dieren kregen dus volgens de toenmalige opvatting alles
wat zij nodig hadden voor normale groei. Het bleek den
schrijvers echter al spoedig, dat dit niet het geval was; de
dieren groeiden slecht, gingen in gewicht achteruit en stierven
tenslotte. Goede groei volgde echter na toevoeging van een
kleine hoeveelheid melk of boter aan het dieet, terwijl even-
eens het aetherextract van eigeel bij deze ratten groeibevor-
derend werkte.

Reeds vóór deze proeven was bekend, dat er oogstoornissen
optraden bij kinderen, die voedsel van eenzijdige samen-
stelling kregen. Zo deed Mori 3) in 1904 reeds de belang-
rijke ontdekking, dat deze oogziekte kon worden voorkomen
door het gebruik van levertraan. Ook Bloch nam waar,
dat deze ziekte, xerophtalmie, een gevolg was van een een-
zijdig dieet en dat boter en levertraan genezend werkten. Er
moest dus in levertraan en boter een stof voorkomen, die
noodzakelijk is voor de voeding van het kind.

Veel overeenkomst met genoemde oogstoornissen bij kin-
deren vertoonden de afwijkingen bij de ratten, die bovenver-
meld kunstmatig samengesteld voedsel kregen, zodat het
voor de hand lag aan te nemen, dat beide verschijnselen een
gevolg waren van een tekort aan een bepaalde nog onbekende
stof. Deze stof, die in vet oplosbaar bleek te zijn, werd
vitamine A genoemd.

Het al of niet optreden van genoemde oogziekte bij
de ratten is daarna gebruikt om een voedingsmiddel op
vitamine A te onderzoeken.

Pas in 1926 is het Carr en Price gelukt om vitamine A
door middel van een chemische reactie te bepalen.

B. Het verband tussen vitamine A en het carotine.

Drummond ®) is de eerste geweest, die het planten-
pigment carotine in het vitaminen-onderzoek heeft betrok-
ken. Hij vond, dat een onzuiver carotine-praeparaat een
geringe physiologische werking vertoonde, een gezuiverd
praeparaat had volgens hem niet de minste werking.

Steenbock was een tegenovergestelde mening toe-
gedaan. Hij wees erop, dat er in voedingsstoffen een even-
redigheid bestaat tussen het gehalte aan gele pigmenten en
vitamine A en sprak als zijn mening uit, dat het in vet op-
losbare groeibevorderende vitamine een geel plantenpigment
of een nauw verwante stof was. Verder vond hij, dat meer-
malen omgekristalliseerd carotine vitamine A-werking bezat.

Daarentegen konden Stephenson, ®) Drummond,
Channon en Coward, ®) Palmer en Kennedy ^o)
deze waarnemingen niet bevestigen. De oorzaak van de
negatieve resultaten, zowel van deze onderzoekingen als
van latere proeven van Dulière, Morton en Drum-
mond ligt hierin, dat de onderzoekers bij de dierproeven
als oplosmiddel voor carotine aethyloleaat gebruikten, waarin

het Carotine onbestendig is, hetgeen door H u m e en Mc.
Lean i^) evenals door Drummond, Ahmad en Mor-
ton bewezen is.

Nieuwe inzichten omtrent het verband tussen Carotine en
vitamine A brachten Eu Ier en Hellström, i^) Met
inachtneming van de nodige voorzorgen vonden zij bij hun
dierproeven, dat gezuiverd Carotine in dagdoses van lOy
groeibevorderend werkte. Zij wezen er verder op, dat Caro-
tine evenals vitamine A een blauwe kleur geeft met SbClg,
doch bij spectroscopisch onderzoek bleken deze beide kleuren
verschillende absorptiebanden te bezitten. Hierdoor kwamen
zij ertoe aan te nemen, dat vitamine A een met Carotine ver-
wante stof is. De vitamine A-werking van Carotine werd
hierna door verschillende onderzoekers bevestigd, i®) i®)

18) 19) 20)

Hoewel dus de physiologische werking van Carotine vast-
stond, was dit nog geen bewijs, dat Carotine en vitamine A_
identiek zijn.

Zeer zorgvuldige onderzoekingen van Moore ^i) hebben
aangetoond, dat het Carotine in het dierlijk organisme in het
eigenlijke vitamine wordt omgezet. Hij gaf zuiver Carotine
aan ratten, die op een vitamine A-vrij diëet waren gezet en
waarvan het leverextract geen blauwe kleur meer gaf met
SbClg. Hij kreeg dan uit de lever van deze dieren een extract,
dat een absorptieband bij 328 m^ vertoonde en bovendien
een duidelijke blauwe kleur met SbClg gaf, welke eigen-
schappen karakteristiek zijn voor vitamine A. Deze proeven
zijn van verschillende kanten bevestigd (Karrer c.s., 22)
Gapper c.s., 23) Wolff c.s. 24)).

Carotine is dus als provitamine A te beschouwen.

Wanneer we dus van een voedingsmiddel de vitamine A-
werking willen bepalen, dan moet zowel het Carotine- als
het vitamine A-gehalte bepaald worden.

Toen de formules van Carotine en vitamine A bekend waren
is de samenhang tussen Carotine en vitamine A ook structuur-
chemisch duidelijk geworden.

C. De chemie van Carotine en vitamine A.

Er zijn 3 isomere Carotinen gevonden, a-, ß- en y-carotine
met de formule C^^Hgg. Deze isomeren kan men scheiden
met behulp van de z.g.n. chromatografische methode volgens
Tswett, 25) waarbij gebruik gemaakt wordt van het verschil
in adsorptiesnelheid aan adsorberende stoffen zoals CaCOj,
AI2O3 enz.

De formule van ß-carotine is:

H.C CH.nbsp;H.C CH.

Ynbsp;CH.nbsp;CH.nbsp;CH,nbsp;CH.nbsp;Y

H,C/V-CH = CH- C = CH-CH =CH-C = CH-CH = CH - CH= C-CH = CH-CH =C-CH =CM-C/VH,

H,cyC-CH,nbsp;H.C-CyCH.

ß-carotine.nbsp;***

Hierin zijn dus 2 ß-jononringen en 4 isopreenresten aan-
wezig.

Het verschil met a-carotine is, dat dit inplaats van 2 ß-jonon-
ringen 1 ß- en 1 a-jononring bevat, terwijl y-carotine slechts
1 ringsysteem heeft, nl. de ß-jononring.

Hoewel het Karrer, Morf en Schopp ^s) niet gelukt
was het vitamine A geheel zuiver in handen te krijgen, waren
zij in staat de formule van vitamine A op te stellen.

HaC^j^ y^CH}nbsp;CHjnbsp;CH3

= I

!

C

H.3

Vitamine A.

Naderhand konden zij uitgaande van P-jonon het perhydro-
vitamine A synthetisch maken, dat identiek bleek te zijn met
het gehydreerde natuurlijke vitamine. (Karrer c.s. 2'?)).

Volgens deze formule kan vitamine A ontstaan door spht-
sing van het P-carotine in 2 gelijke helften, waarbij HgO
wordt opgenomen en 2 moleculen vitamine A ontstaan

2 H,0 = 2 CAO.

Dit is echter alleen maar mogelijk bij het symmetrische
P-carotine en niet bij het a- en y-carotine. Hieruit ontstaat bij
splitsing van 1 molecule slechts 1 molecule vitamine A. Hier-
mee is tevens de tweemaal zo sterke vitamine A-werking
van het p-carotine verklaard.

D. Verschijnselen, die optreden door vitamine A-gebrek bij
mens en dier.

Zoals reeds in het historisch overzicht besproken is, is
de groeistoornis een van de verschijnselen, die bij vitamine A-
gebrek optreden.

Een andere afwijking, die meer specifiek is dan de groei-
stoornis, is de xerophtalmie, een oogziekte. De verschijnselen
hiervan bestaan in een verhoorning van het epitheel van de
conjunctiva en de cornea. Een andere oogziekte, die ook aan
vitamine A-gebrek wordt toegeschreven is de hemeralopie of
nachtblindheid, welke dikwijls de xerophtalmie voorafgaat.
Verdere afwijkingen zijn: nier- en blaasstenen, etterige darm-
ontstekingen en andere etterprocessen. Een verhoogde infec-
tiekans wordt ook vaak aan vitamine A-gebrek geweten. Ten-
slotte noem ik nog de verhoorning van andere epitheliën.
Talrijk zijn nog de verschijnselen, die men meent in verband
te moeten brengen met vitamine A-gebrek. Voor een uit-
voerige beschrijving hiervan verwijs ik naar de dissertatie
van M enken, ^s)

HOOFDSTUK II.

DE BEPALING VAN HET VITAMINE A- EN
CAROTINE-GEHALTE.

A. Bepaling van het vitamine A-gehalte.

Het vitamine A kan bepaald worden:

1.nbsp;door middel van de dierproef.

2.nbsp;volgens de chemisch-colorimetrische methode.

3.nbsp;volgens de physisch-chemische methode.

1. De dierproef.

Als proefdieren voor de vitamine A-bepaling gebruikt
men meestal ratten, terwijl als criterium voor het al of niet
aanwezig zijn van avitaminose verschillende methodes in
gebruik zijn.

1 De methode van Drummond en Sherman,
waarbij het lichaamsgewicht als criterium wordt ge-
nomen. Deze methode kan curatief of prophylactisch
gebruikt worden.

2quot;. De methode, waarbij de genezing van xerophtalmie
als criterium wordt gebruikt.

30. De kolpokeratosetest van Hohlweg en Dohm, 2»)
die gebruik maakt van het optreden van verhoor-
ningen van de cellen in de vagina (Wolff en Over-
hoff, 30) van Eekelen

4quot;. De resistentietest van Boynton en Bradford

Hierbij wordt gebruik gemaakt van de resistentie-
vermindering van ratten ten opzichte van een infectie
van Bact. mucosus capsulatus.

De bekendste methode is de curatieve groeitestmethode,
waarvan nog verschillende modificaties in gebruik zijn. Deze
methode heb ik bij mijn dierproeven toegepast, hij komt in
het kort op het volgende neer:

De dieren worden op een vitamine A-vrij dieet gezet en
het verloop van hun hchaamsgewicht wordt nauwkeurig na-
gegaan. Wanneer een duidelijke afneming van het gewicht
optreedt, wordt begonnen met het toedienen van de stof,
waarvan het vitamine A-gehalte bepaald moet worden. Men
geeft aan verschillende groepen van dieren opkhmmende
hoeveelheden van de te onderzoeken stof. De toeneming van
het gewicht wordt gebruikt als maat voor de hoeveelheid
vitamine A.

Het is duidelijk, dat aan deze bepaling zeer veel bezwaren
verbonden zijn. De grootste moeilijkheid bij de biologische
ijking is wel gelegen in de individuele groeiverschillen der
proefdieren. Om de invloed van deze factor op het resultaat
van de proef zo gering mogelijk te maken, moet het aantal
proefdieren bij de bepahng zo groot mogelijk zijn. Het behoeft
echter geen betoog, dat de praktijk grenzen stelt aan het
aantal voor één proef te gebruiken dieren.

Behalve individuele verschillen zijn er nog een groot aantal
factoren, die invloed kunnen hebben op de resultaten van
de biologische bepaling, bv. stalomstandigheden, ras, seizoen
enz. Om de invloed van deze factoren zoveel mogelijk uit te
schakelen is men ertoe overgegaan standaardpraeparaten te
gebruiken, waarmee bij iedere proef de werking van het
onbekende praeparaat wordt vergeleken. Voor het vitamine A-

onderzoek wordt hiervoor gebruik gemaakt van carotine-
praeparaten.

Toch zijn bij de biologische bepalingsmethode schomme-
lingen van 50% ^100% geen zeldzaamheid, zodat de resul-
taten, die men hiermee verkrijgt, dan ook altijd zeer critisch
moeten worden beschouwd.

2. De chemisch-colorimetrischc methode.

In 1922 vonden Drummond en Watson, dat
geconcentreerd H2SO4 toegevoegd aan levertraan een blauw-
gekleurd reactieproduct gaf. Zij meenden, dat er evenredig-
heid bestond tussen deze blauwe kleur en de vitamine A-
waarde, die bepaald was met behulp van de dierproef. De
kleur was echter weinig stabiel, maar kon toch gebruikt
worden om verschillende tranen onderling te vergelijken.

F ear on gaf een kleurreactie met pyrogallol aan, maar
deze reactie bleek niet specifiek te zijn voor vitamine A, wat
door M o o r e ) en door Rosenheim en Webster
werd aangetoond.

Het bleek Rosenheim en Drummond in 1925,
dat AsClg met levertraan een blauwe kleur gaf. Volgens hen
zou deze kleurreactie specifiek zijn voor vitamine A, terwijl
de gevoeligheid veel groter was dan de kleurreactie met
HgSO^ en de kleur bovendien stabieler.

Carr en Price gebruikten SbCl, inplaats van AsClg
en wel een verzadigde oplossing van deze stof in CHCI3.
Ook de op vitamine A te onderzoeken stof werd in CHCI3
opgelost. Bij 0,2 cc van deze oplossing voegden zij 2 cc SbClg-
oplossing en de intensiteit van de blauwe kleur, die ontstaat,
werd bepaald met behulp van de Lovibond tintometer. Deze
reactie wordt ook nu nog gebruikt voor de chemisch-colori-
metrische bepahng van het vitamine A. De resultaten komen
in 't algemeen overeen met die van de dierproef, hoewel deze

laatste, zoals reeds meegedeeld is, sterk uiteenlopende waar-
den geeft.

Verschillende onderzoekers hebben gevonden, dat men pas
goede resultaten krijgt bij de chemisch-colorimetrische bepa-
ling als men vooraf de op vitamine A te onderzoeken stof
verzeept en de reactie uitvoert met het onverzeepbare ge-
deelte.

Er moet echter de nadruk op gelegd worden, dat tal van
andere stoffen ook met het reagens van Carr en Price
reageren; om in een onbekende stof naar het vitamine te
zoeken is het nodig ook het absorptiespectrum van het
reactiemengsel na te gaan.

Vitamine A geeft met het reagens twee banden; in ver-
zeepte praeparaten hggen deze bij 580 en 620 m^. Caroti-
noiden reageren ook met het SbClg-reagens; behalve dat de
absorptiebanden anders hggen (bij carotine bv. bij 590 mtj.),
is ook de hoeveelheid, nodig om een duidelijke kleur te geven
wel 20 maal groter dan die van vitamine A.

Op blz. 41 wordt besproken hoe het mogelijk is, vitamine A
naast carotine te bepalen met behulp van de reactie van Carr
en Price.

3. Dc physisch-chemischc methode.

Vitamine A heeft een electieve absorptieband bij 328 mj^.
De intensiteit van deze band is evenredig met de hoeveelheid
vitamine A, die in oplossing aanwezig is. Hierop berust de
physisch-chemische methode. Daar ik deze methode niet ge-
bruikt heb, wil ik hierop niet nader ingaan, alleen nog mee-
. delen, dat deze methode gebruikt is om de betrouwbaarheid
van de reactie van Carr en Price te controleren.

Zoals we gezien hebben, is dit ook reeds gedaan door
middel van de dierproef, maar door de onnauwkeurigheid van
de dierijking zijn hieraan bezwaren verbonden.

Josephy s®) vergeleek daarom de intensiteit van de
absorptieband bij 328 mj^ met de intensiteit van de blauwe
kleur, die ontstaat bij de reactie van Carr en Price. Het
bleek hem, dat de ultraviolette absorptie bij 328 mj/, van ver-
schillende soorten levertraan en vetten na verzeping even-
redig was met de kleurintensiteit van de Carr en Price-
reactie, die gemeten werd in de Lovibond tintometer. Ook
door Morton en Heilbron 3®) en door Drummond
en Morton zijn analoge waarnemingen gedaan.

Om snel met beliulp van absorptiemetingen bij 328 mj/,
vitamine A te bepalen, heeft de firma Hilger een nieuw
toestel, de z.g.n. „vitameterquot;, in de handel gebracht.

Wolff en van Eekelen hebben de nauwkeurig-
heid van de vitamine A-bepaling met dit toestel onderzocht
en gevonden, dat dit toestel voor de praktijk wel voldeed,
hoewel de bepalingen minder nauwkeurig zijn dan wanneer
de fotografische methode gebruikt wordt.

4. De vitamine A'Cenheden.

In de hteratuur worden zeer veel verschillende eenheden
gebruikt, om de hoeveelheid vitamine A aan te geven. Dit
geeft vaak aanleiding tot verwarring.

Daarom geef ik in aansluiting op het overzicht van de
bepalingsmethodes, een tabel van de meest gebruikelijke een-
heden en hun onderling verband. Met behulp van deze tabel
zijn we in staat bij de bespreking van de literatuur de waarden
in één eenheid uit te drukken.

In 1931 werd op de le Internationale Vitaminenconferentie
aangenomen, dat de werking van ly Carotine uit wortelen
gelijk was aan 1 internationale eenheid vitamine A.

Op de 2e internationale conferentie in 1934 werd inplaats
van het onzuivere Daucus-carotine zuiver ß-carotine als vita-
mine A-standaard ingevoerd.

De eenheid zelf werd niet veranderd, daar O.óy ß-carotine
als eenheid aangenomen werd en deze hoeveelheid dezelfde
werking had als ly van de oude standaard.

Van het zuiverste vitamine A-praeparaat, dat tot nu toe
bereid is, heeft 0,6y dezelfde biologische werking als 1 int.
eenheid.

1

Dit praeparaat had een extinctie-coefficient E = 1600

(in alcohol of cyclohexaan).

Door v a n E e k e 1 e n, E m m e r i e en W o 1 f f 2ijn de

in de literatuur gebruikte eenheden omgerekend in deze inter-
nationale eenheid, waarvan hier de tabel volgt.

Tabel 1.

1.nbsp;Intern. E. = 0,6y ß-carotine = ly Daucus Carotine =

= 0.6v vitamine A. (Enbsp;16001.

Inbsp;1 cm

2.nbsp;Blue Unit (Drummond en Hilditch)j

Blue Value (Brit. Pharmacopoeia) |l E = 20,8 int. eenh.
Antimony trichloride blue value j

3.nbsp;1 Blue Unit (Moore) = 0,39 int. eenh.

4.nbsp;1 C.L.O. Unit (Rosenheim en Webster) = 208 int. eenh.

5.nbsp;1 Lovibond eenheid (Wolff) = 4,2 int. eenh.

6.nbsp;1 Sherman, A.D.M.A. Unit (American Drug. Manuf.
Ass.) = 1,4 int. eenh.

7.nbsp;1 U.S.P. Unit (Un'ited States Pharmac.) herzien in
1934 = 1 int. eenh.

B. De bepaling van het carotinegehalte.

De bepaling van het carotine-gehalte is veel eenvoudiger
dan die van het vitamine A-gehalte.

De gele kleur van het Carotine maakt het mogelijk colori-
metrisch de concentratie van een carotine-oplossing te meten.

De kleur van de oplossing kan men vergelijken met een
standaard, hiervoor gebruikte men vroeger een bichromaat-
oplossing.

Nauwkeuriger en gemakkelijker kan men de kleur echter
meten met de Lovibond tintometer of met de Stuphenphoto-
meter van Zeiss. Wanneer men voor beide toestellen beschikt
over een curve, die het verband aangeeft tussen de intensiteit
van de gele kleur en de hoeveelheid carotine, kan men met
behulp hiervan de onbekende hoeveelheid carotine berekenen.

Men moet natuurlijk zeker zijn, wanneer men de intensiteit
bepaalt, dat de gele kleur afkomstig is van het carotine.
Wanneer in de oplossing andere gekleurde stoffen aanwezig
zijn, moeten deze vooraf verwijderd worden.

C. De Lovibond Tintometer.

Bij mijn onderzoek maakte ik gebruik van de chemisch-
colorimetrische methode om het vitamine A te bepalen,
waarbij de blauwe kleur met de Lovibond tintometer gemeten
werd. Ook voor het bepalen van het carotine-gehalte maakte
ik van dit toestel gebruik. Het gebruik van de Lovibond
tintometer bij het vitamine A-onderzoek is ingevoerd door
Rosenheim en Schuster. Het is een toestel, waar-
mede het mogelijk is, door het verschuiven van glaasjes, die
opklimmen in kleurintensiteit, snel de kleur van de te onder-
zoeken vloeistof te meten. De kleurstofoplossing bevindt zich
in een cuvet of buisje van 10 mm doorsnede in een opening
aan de achterkant van het toestel.

Achter de tintometer staat een lichtbron, waardoor het
mogelijk is steeds onder constante belichting te vergelijken.
Men kijkt door een kijker zonder lenzen en ziet dan 2 recht-
hoekige gezichtsvelden, het bovenste heeft de kleur van de
te onderzoeken stof, het onderste de kleur van een glaasje,
dat men ervoor geschoven heeft.

Het is mogelijk de glaasjes snel te verschuiven, waardoor
men spoedig het glaasje kan vinden, dat dezelfde kleur-
intensiteit heeft als de te onderzoeken vloeistof. In het toestel
zijn 3 soorten glaasjes, rode, gele en blauwe. Van elk der
kleuren heeft men één rij glaasjes, die 0,1 eenheid in kleur-
intensiteit verschillen, benevens één rij, die 1 eenheid in
kleurintensiteit verschillen. Bovendien is nog van elk der
kleuren een glaasje aanwezig van 10 eenheden en een glaasje
van 20 eenheden. Door het voor elkander schuiven van ver-
schillend gekleurde glaasjes kan men ook mengkleuren meten.

Bij het meten van de blauwe kleur, die ontstaat bij de
reactie van Carr en Price, moet men erop bedacht zijn,
dat men in veel gevallen niet alleen met de blauwe glaasjes
van het toestel een zelfde kleur als het reactiemengsel kan
verkrijgen. Om dit te bereiken moet men tevens gebruik
maken van de gele of rode glaasjes. Wanneer men van deze
steeds zo weinig mogelijk gebruikt, krijgt men reproduceer-
bare resultaten, zoals door van Eekelen, Emmerie,
} u 1 i u s en W o 1 f f is aangetoond.

Zij vergeleken de waarden, die met dc Lovibond werden
afgelezen, met die welke zij verkregen bij metingen, waarbij
het mogelijk was alleen de blauwe kleur te bepalen.

In de eerste plaats deden zij dit met de Stuphenphoto-
meter van Zeiss. Met dit toestel is men in staat intensiteits-
metingen te doen in beperkte spectraalgebieden.

Het bleek hun, dat zij met deze methode resultaten kregen,
die minder dan 5 % verschilden van die, welke met de
Lovibond gevonden waren. Daar de metingen met de Lovi-
bond tintometer, zowel als die met de stuphometer subjectief
zijn, hebben zij de kleurintensiteit van de blauwe kleur, die
bij de Carr en Price-reactie ontstaat, bovendien nog ge-
meten volgens 2 objectieve methodes.

Bij de ene methode maakten zij gebruik van een apparaat
voor objectieve absorptiemetingen van Moll en Burger,
gecombineerd met een spectrograaf. Hiermede werd de
absorptie bij 620 mj^ gemeten.

Bij de andere methode valt het licht van een lamp op een
dubbele monochromator (van Cittert) door middel van
een lens; het spectraallicht valt dan op een selcniumphotocel;
de electrische stroom van de photocel wordt gemeten met
een microgalvanometer van Moll.

De schrijvers komen tot de conclusie, dat de extinctie in
het gebied van 620 mji, evenredig is met de concentratie van
het vitamine A in de oplossing. De 4 methodes, volgens welke
zij de kleurintensiteit van de blauwe kleur gemeten hebben,
gaven overeenkomstige resultaten, zodat ze hebben aan-
getoond, dat de Lovibond tintometer gebruikt kan worden
door een geoefend onderzoeker om het vitamine A snel te
bepalen.

HOOFDSTUK III.

BESPREKING VAN DE LITERATUUR OVER HET
VITAMINE A- EN CAROTINE-GEHALTE
VAN KOEMELK.

Melk was een der eerste voedingsmiddelen, waarvan ont-
dekt werd, dat daarin nog andere voedingsstoffen aanwezig
waren dan eiwitten, vetten, koolhydraten en zouten.

Lunin wees hierop reeds in 1881, terwijl H op-
kin s eveneens dergelijke waarnemingen deed.

Osborne en Mendel 2) deden hun eerste ont-
dekkingen over vitamine A met behulp van melk.

Funk uitte in 1913 reeds de veronderstelling, dat
het gehalte van de melk aan vitaminen afhankelijk zou zijn
van het voedsel. Wat betreft het vitamine A waren Mc
Collum c.s. Steenbock c.s. 4») en Hess c.s.
het met deze veronderstelling eens.

A. Dierproeven.

Verscheiden onderzoekers hebben daarna met behulp van
dierproeven de groeibevorderende werking van melk onder-
zocht en de werking van weidemelk vergeleken met die van
stalmelk.

Drummond, Coward en Watson^i) toonden
aan, dat 0,2 g boter van stalmelk afkomstig als dagelijkse
hoeveelheid aan ratten gevoerd geen groeibevorderende

werking had, terwijl dit bij eenzelfde hoeveelheid boter van
weidemelk gemaakt, wel het geval was. Ook latere proeven
van Drummond c.s. bevestigden de gunstige werking
van weideboter.

Volgens Kennedy en Dutcher^®) was als enige
vitamine A-bron in het voedsel van ratten de dagelijkse
dosis van 15 cc melk, afkomstig van koeien, die niets anders
kregen dan haverstroo en krachtvoer onvoldoende, terwijl
10 cc weidemelk als dagelijkse dosis voldoende was.

Steenbock, Sell en Buells^) vonden, dat boter
aan het einde van de stalperiode minder vitamine A-werking
had dan boter van dezelfde koeien tijdens de weideperiode.

Holmes bestudeerde de vitamine A-werking van
botervet van verschillende rassen koeien, maar vond zijn
proeven onvoldoende, om hieruit conclusies te trekken, ter-
wijl Hume ®®) er niet in slaagde de groeibevorderende.
werking van stalmelk aan te tonen, hoewel de koeien over-
vloedig groenvoer kregen.

Reyer voedde kinderen met melk van koeien, die
een dieet bestaande uit groenvoer kregen, daarna gaf hij de
kinderen melk van koeien, die droogvoer aten; in 't laatste
geval ging het gewicht van de kinderen niet vooruit.

Luce was de eerste, die bij haar proeven meer
quantitatief te werk ging. Zij drukte het vitamine A-gehalte
uit in eenheden. Als eenheid nam zij aan de kleinste
hoeveelheid vitamine A, die per dag toegediend een rat
10 a 12 g per week doet groeien. Zij vond ong. 12 eenheden
in 100 g stalmelk, terwijl als de koeien gras en klaver kregen
er 26 tot 41 eenheden in de melk werden gevonden. Haar
conclusies zijn in het kort de volgende:

De groeibevorderende factor van de melk wordt alleen
door het diëet van de koe bepaald en is onafhankelijk van

het feit of de koe buiten in het zonlicht of in een donkere stal
gehouden wordt.

De reeds genoemde onderzoekers hebben bij hun proeven
nooit erop gelet of vitamine D-gebrek ook een rol speelde;
dit vitamine werd nl. pas in deze periode ontdekt. Daarom
zetten Chick en Roscoe®®) de proeven van Luce voort
en letten daarbij speciaal op de vitamine D-voorziening. Zij
kwamen echter tot dezelfde resultaten als L u c e en vonden,
dat 100 g melk tijdens het winterrantsoen 8 a 12 eenh.
bevatte en tijdens de weideperiode 50 a 100 eenh.

Golding, Soames en Zilva kwamen tot de con-
clusie, dat boerenkoolvoedsel in de winter de groeibevorde-
rende werking van de melk deed stijgen. Ook het toedienen
van levertraan veroorzaakte een stijging. Dit had echter
volgens hen het nadeel, dat het vetpercentage van de melk
erdoor achteruitgaat.

Volgens Scheunert bevatte weideboter ruim 2 maal
zoveel vitamine A als boter van koeien, die hooi, voeder-
bieten en krachtvoer kregen. Hij vond nl. bij zijn dier-
proeven, dat 0,25 g weideboter voor een rat als dagelijkse
hoeveelheid voldoende was, terwijl 0,5 g stalboter onvol-
doende was.

Ook Fraps en Treichjler deden rattenproeven
met boter en volgens hen zijn in normale weideboter 33 E
aanwezig. Als eenheid nemen zij aan die hoeveelheid, die
bij ratten een gemiddelde gewichtstoename van 3 g per week
gedurende 8 weken veroorzaakt.

Mc. Leod, Brodie en Mc. Loon toonden aan,
dat variaties in de vitamine A-waarden alleen een gevolg
zijn van voedselverandering en niet van seizoenwisseling. Zij
hielden een groep koeien gedurende het hele jaar op stal en
vonden, dat bij een goede stalvoedering de vitamine A-
waarde van de melk gedurende het hele jaar practisch con-

stant bleef. Het bleek hun, dat 0,5—0,75 cc melk als enige
vitamine A-bron dagelijks aan ratten gevoerd bij deze dieren
een gemiddelde gewichtstoename gaf van 3 g per week ge-
durende 8 weken. De melk zou dus 1,3 tot 2 ratten-eenheden
vitamine A per gram bevatten, hetgeen dus wel zeer veel is.

Uit het hier gegeven overzicht van de dierproeven over
het vitamine A-gehalte van melk en boter, blijkt wel, dat
over het algemeen zeer verschillende wa'arden werden ge-
vonden.

Dit is een gevolg van de fouten, die bij de uitvoering van
de dierproef gemaakt kunnen worden. Vooral wanneer bij de
proef niet een groot aantal dieren gebruikt worden en men
conclusies trekt uit het gedrag van 1 of 2 ratten, zoals bv.
Fraps en Treichler deden.

Bovendien vergeleek geen van de onderzoekers de wer-
king van boter met die van carotine-standaardpraeparaten,
zodat de resultaten beïnvloed zijn door verschillende factoren
zoals stalomstandigheden, gronddiëet enz., die op de labora-
toria van de onderzoekers verschillend zijn.

Absolute waarden leverden deze proeven ons dus niet;
we kunnen er echter wel uit concluderen, dat het vitamine A-
gehalte van zomermelk in het algemeen hoger is dan dat
van wintermeik.

B. Chemisch-colorimetrische methodes.

Op zuiver chemische wijze hebben Palmer en
Eckles reeds in 1914 een uitgebreid onderzoek inge-
steld naar de pigmenten van het melkvet. Zij verzeepten
boter met alcoholische kali en het onverzeepbare deel werd
door extractie in aether opgenomen.

Door te onderzoeken:

1quot;. Het gedrag van de pigmenten t.o.z. van alcohol en
petroleumaether (resp. C.Sg),

2quot;. het gedrag bij de adsorptieanalyse met CaCOg volgens
T s w e 11,

3®. door spectroscopisch de absorptiebanden te meten,
vonden zij, dat de pigmenten van het melkvet als hoofd-
bestanddeel carotine bevatten en dat daarnaast nog weinig
xanthophyl aanwezig was. De intensiteit van de gele kleur,
die zij verkregen na scheiding van de xanthophylfractie met
alcohol werd gemeten in de Lovibond tintometer.

Zij constateerden een invloed van het voedsel op het caro-
tine-gehalte van het melkvet.

Het vitamine A-gehalte, waaraan toen bij het chemisch
onderzoek nog niet gedacht werd, lieten zij buiten be-
schouwing. Langs analytische weg werd dit voor het eerst
in 1929 bepaald. Rösiö ®®) gaf hiervoor een methode aan:

Omdat dit in vet oplosbare vitamine geheel in het melkvet
aanwezig is, maakte hij van de melk eerst boter. De boter
werd met CHClg geëxtraheerd. Het extract werd volgens
Carr en Price op het vitamine A-gehalte onderzocht. De
boter werd dus niet verzeept. Zoals nog blijken zal, geeft
dit aanleiding tot te lage resultaten.

Door omrekening hoeveel melk voor een bepaalde hoeveel-
heid boter gebruikt is, verkreeg Rösiö het vitamine A-
gehalte van de melk.

Doordat toen nog niet de samenhang tussen carotine en
vitamine A bekend was, bepaalde hij niet het provitamine A,
carotine, zodat we ook uit zijn proeven niet de totale vitamine
A-waarde van de melk weten. Hij vond in melk 23—163
Lovibond eenheden per KG. Daar zijn eenheden gelijk zijn
aan ^ L. E. Wolff, waren er dus volgens hem in 1 KG
melk 18—124 int. eenh. aanwezig. (Zie tabel 1).

Lundborg trachtte het carotine-gehalte van de melk

te bepalen. Hij kwam na verschillende proefnemingen tot
het resultaat, dat dit op de beste en snelste manier geschiedde,
wanneer hij het vet uit de melk afscheidde volgens een ge-
wijzigde Röse Gottlieb-methode, dit vet verzeepte en in het
onverzeepbare gedeelte de Carr en Price-reactie uitvoerde.
De blauwe kleur, die dan ontstond, schreef hij ten onrechte
uitsluitend toe aan het Carotine.

In een volgende publicatie bepaalde hij het carotine-
gehalte van botervet colorimetrisch door dit na verzeping uit
te schudden met CHClg en de intensiteit van de gele kleur
van de CHClg-oplossing te meten door deze te vergelijken
met een KgCr^O^-oplossing, die vooraf geijkt was met een
zuivere carotine-oplossing. Hij kwam hierbij tot de ontdek-
king, dat hij op deze wijze lagere waarden vond, dan wan-
neer hij het Carotine met behulp van de Carr en Price-reactie
bepaalde. Een aan de melk toegevoegde hoeveelheid Carotine
vond hij echter quantitatief terug. Hieruit besloot hij, dat er
naast Carotine nog een stof aanwezig was, welke hij ,,Caro-
tinoid Xquot; noemde, die ook de Carr en Price-reactie gaf en
welke waarschijnlijk vitamine A zou zijn.

Het is duidelijk, dat de intensiteit van de blauwe kleur,
die Lundborg met behulp van de Carr en Price-reactie
bepaalde, de som was van de intensiteiten van de blauwe
kleur, die ontstaat tengevolge van het vitamine A en die van
het Carotine. Op blz. 41 is te zien, dat het gedeelte van de
blauwe kleur, dat toegeschreven moet worden aan het aan-
wezige Carotine zeer klein is en zelfs dikwijls verwaarloosd
kan worden, zodat Lundborg dus met de Carr en Price-
reactie niet het Carotine bepaalde, maar practisch alleen het
aanwezige vitamine A. Hij vond 9 Lovibond eenheden per
g vet = 7,6 int. eenh.

Wolff, Overhoff en van Eekelen 24) waren de

eersten, die zowel het vitamine A als het carotine in boter
bepaalden.

Na verzeping van boter werd de massa geëxtraheerd met
petroleumaether. Hierin losten het carotine en het vitamine A
op. Deze scheidden zij door de petroleumaether-oplossing met
90 % alcohol uit te schudden, waarbij het vitamine A in de
alcoholphase overging. Het vitamine A werd dan met behulp
van de Carr en Price-reactie bepaald, terwijl het carotine in
de petroleumaetherphase colorimetrisch gemeten werd.

In 1 monster zomerboter vonden zij 10 mg carotine en
300 L.E.B. (Lovibond eenheden blauw) vitamine A per kg.
De vitamine A-waarde was dus 1126 int. eenh. per 100 g
boter.

Zoals nog blijken zal vonden zij een zeer laag vitamine A-
gehalte. Dit is waarschijnlijk te wijten aan het feit, dat het
zeer moeilijk is, door uitschudden met 90 % alcohol het
vitamine A quantitatief in de alcoholphase te doen overgaan.

In 1932 bepaalde Moore eveneens zowel het vita-
mine A- als het carotine-gehalte van boter.

Na verzeping met alcoholische KOH-oplossing werden
carotine en vitamine A geëxtraheerd met aether. Dit aether-
extract werd met water gewassen om de zepen te verwijderen,
daarna werd de aether afgedampt en de rest in CHClg op-
gelost. In deze CHClj-oplossing werd het carotine colori-
metrisch bepaald met de Lovibond tintometer; het vitamine A
werd met behulp van de Carr en Price-reactie eveneens in
de Lovibond tintometer gemeten.

Hij vond in winterboter 3 Y.U. (= Yellow units) carotine
en 10 B.U. (= Blue units) vitamine A per gram vet, dit is
2y carotine en 2,3y vit. A en dus in totaal gelijk aan 5,8
int. eenh. per gram vet. In zomerboter vond hij 25 Y.U. en
11 Y.U. carotine en 20 B.U. en 25 B.U. vitamine A per g
vet, dit is 16 en 7,5y carotine en 4,6 en 5,7y vit. A en in

totaal gelijk aan 24 en 17 int. eenh. per gram vet.

In samenwerking met Booth, Kon en Dann ®®) publi-
ceerde hij later nog een onderzoek over het carotine- en
vitamine A-gehalte van zomer- en winterboter, waarbij de-
zelfde bepalingsmethode gebruikt werd. In winterboter werd

2.6nbsp;Y.U. en 3,5 B.U. of 1,7y carotine en Sy vitamine A =
15 intern, eenh. per gram vet gevonden en in zomerboter

1.7nbsp;Y.U. en 6,5 B.U. of lOy carotine en ISy vitamine A =
35 int. eenh. per gram vet.

Bovendien merken deze onderzoekers op, dat een 5 tot
10 maal lager vitamine A-gehalte gevonden werd, wanneer
dit niet bepaald werd in het onverzeepbare gedeelte van de
boter, dus wanneer de boter niet werd verzeept. Volgens hen
zou dit toe te schrijven zijn aan de storende werking van
stoffen, waarvan bekend is, dat zij de Carr en Price-reactie
onderdrukken. (Norris en Church ''o) en Emmerie ^i))
In zomerboter vonden zij een grotere toeneming van het
vitamine A-gehalte na verzeping dan in winterboter, zodat
volgens hen tussen deze beide soorten een verschil in gehalte
aan storende substanties bestaat.

C. Spectroscopische bepalingen.

Spectroscopische bepalingen van het carotine- en vitamine
A-gehalte van boter werden gedaan door Baumann en
Steenbock. ^2)

Voor carotinebepalingen werden de absorptiewaarden in
het gebied van de maximum absorptie bij 460 en 485 mjj[,
gemeten. Door de waarden, die hierbij voor boter werden
gevonden te vergelijken met die van een standaardoplossing
van carotine in katoenzaadolie, berekenden zij de hoeveelheid
carotine, die in boter aanwezig was.

Het vitamine A werd bepaald door het absorptiespectrum
van het onverzeepbare deel van de boter opgelost in CHoOH

te fotograferen en de extinctie in het gebied van de maximum
absorptie bij 328 mjji te bepalen. De hoeveelheid vitamine A
werd hieruit berekend door gebruik te maken van de waarde,
die Heilbron voor de extinctiecoëfficient had gevonden.

Deze was Enbsp;= 1300. Zij vonden op deze wijze in

1 cm

100 g zomerboter óOOy carotine en IZOOy vitamine A, dus
totaal 3433 int. eenh.; in winterboter 200y carotine en lOOOy
vitamine A, totaal 1866 int. eenh. per lOO g.

Later echter hebben Carr en Jewell voor een zuiverder

vitamine A-praeparaat gevonden dat Enbsp;= 1600, zodat

1 c.m,

wanneer deze waarde gebruikt wordt bij de berekening van
de resultaten van B a u m a n n c.s. het gevonden vitamine A-
gehalte lager wordt.

In een tweede publicatie gebruikten zij dan ook de
waarde van Carr en Jewell en vonden toen een overeen-
komstig lager vitamine A-gehalte.

Dergelijke spectroscopische carotine- en vitamine A-bepa-
lingen deden ook Gillam, Heilbron, Morton,
Bishop en Drummond. Zij vonden in winterboter
gem. 11 Oy carotine en 320y vitamine A of 643 int. eenh. per
100 g; in zomerboter gem. 550y carotine en 660y vitamine
A = 1750 int. eenh. per 100 g. Tevens bleek hun, dat
voedering van kunstmatig gedroogd gras het carotine- en
vitamine A-gehalte van de winterboter deed stijgen, het
voeren van kuilgras daarentegen deed dit gehalte weinig
stijgen.

In de loop van 1934 publiceerden dezelfde schrijvers in
samenwerking met Watson een nieuw onderzoek over
de invloed van het rantsoen op het carotine- en vitamine A-
gehalte van de boter, waarbij zij van dezelfde methode gebruik
maakten om dit te bepalen. Zij vonden in normale winter-
boter gem. 150y carotine en 280y vitamine A, de vitamine A-

waarde is dus 616 int. eenh. per 100 g botervet: in zomer-
boter vonden zij gem. 600y carotine en 700y vitamine A of
1766 int. eenh. per 100 g botervet, terwijl zij bij voedering
van kuilgras geconserveerd volgens Virtanen in de
winter een hoger carotine- en vitamine A-gehalte van de boter
kregen, nl. 350y carotine en 550y vitamine A. dus 1267 int.
eenh. per 100 g vet.

Verschillende onderzoekers hebben de invloed van het ras
nagegaan op het carotine- en vitamine A-gehalte van de melk.

Crawford, Perryen Zilva onderzochten dit met
behulp van dierproeven en vonden geen verschil van bete-
kenis in monsters boter van koeien van verschillend ras,
waarbij de koeien natuurlijk eenzelfde diëet kregen.

Tot dezelfde conclusie kwamen Wilbur, Hilton en
Hauge die eveneens de groeibevorderende werking be-
paalden met behulp van de dierproef. Wel vonden zij verschil
in het carotine-gehalte, dat colorimetrisch bepaald werd. Zij
namen daarom aan, dat in gevallen waarbij het carotine-
gehalte van de boter hoog is, het vitamine A-gehalte laag is.

Kon en Booth '^s) evenals Baumann en Steen-
bock bewezen, dat deze veronderstelling juist was.

Kon en Booth onderzochten de boter van Shorthorn- en
Guernsey-koeien, die hetzelfde diëet kregen.

Zij bepaalden het carotine colorimetrisch en vonden een
groot verschil in gehalte tussen de boter van beide rassen.
Daarentegen bleek de groeibevorderende werking van beide
soorten boter bij rattenproeven gelijk te zijn. Daarom be-
paalden zij eveneens het vitamine A-gehalte in het onver-
zeepbare gedeelte van de boter met behulp van de SbClg-
reactie en vonden tussen de beide soorten weer een groot
verschil, maar nu in tegengestelde richting.

Baumann en Steenbock vonden met behulp van hun
spectroscopische methode soortgelijke variaties, zoals uit
onderstaande tabel blijkt.

Tabel 2.
Wintermelk.

Zomermelk.

In de laatste kolom staan de waarden, die ik verkregen
heb, door hun gegevens voor carotine en vitamine A om te
rekenen in int. eenh. en deze beide op te tellen. Hieruit is
duidelijk te zien, dat de totale vitamine A-waarden van de
verschillende rassen practisch constant zijn.

Na deze pubhcaties is het dus wel zeer waarschijnlijk, dat
het ras niet veel invloed op de totale vitamine A-waarde van
de boter heeft.

Anders is het met de invloed van het voedsel. Uit het

literatuuroverzicht is wel gebleken, dat er een invloed van
het voedsel van de koeien op de vitamine A-waarde van de
melk is waar te nemen en wel, dat voedsel, dat veel carotine
bevat een gunstige invloed heeft. De resultaten van de ver-
schillende onderzoekers lopen echter zeer uiteen. Het leek
daarom van belang, de vitamine A-waarde van de Neder-
landse melk in verband met de in Nederland gebruikelijke
voeding en onder de hier heersende omstandigheden na
te gaan.

HOOFDSTUK IV.

BEPALING VAN HET VITAMINE A- EN HET
CAROTINE-GEHALTE VAN KOEMELK.

In het vorig hoofdstuk hebben we gezien, dat voor de be-
paling van het vitamine A- en het carotinegehalte van melk,
deze nooit direct werd gebruikt. De onderzoekers maakten
van de melk steeds eerst boter en bepaalden hierin de hoe-
veelheid carotine en vitamine A.

Deze werkwijze is echter zeer tijdrovend. Daarom ben ik
bij de carotine- en vitamine A-bepaling steeds direct van
de melk zelf uitgegaan. Dit was als volgt mogelijk.

A. Bepaling van het vitamine A-gehalte.

Naar analogie van de vitamine A-bepaling in boter, heb
ik de melk verzeept met alcoholische KOH-oplossing. Hier-
voor bleek 1 uur verzepen voldoende te zijn.

De verzeepte massa wordt geëxtraheerd met petroleum-
aether of peroxydvrije aether. Hierin lossen de aanwezige
Carotinoiden en vitamine A op.

Door de aanwezige zepen treedt gemakkelijk emulsie-
vorming op, speciaal bij het uitschudden met petroleum-
aether. Het bleek echter, dat deze moeilijkheid te omzeilen
was, indien ervoor gezorgd werd, dat de alcoholconcentratie
in de waterige laag 50% was.

Om na te gaan hoeveel extracties nodig waren om alle

carotinoïden en vitamine A uit de verzeepte melk te schud-
den, deed ik 4 extracties met 100 cc petroleumaether en
bepaalde in elke extractie afzonderlijk het vitamine A- en
carotine-gehake. Het carotine bleek in het tweede extract
practisch reeds geheel te ontbreken, terwijl voor het vitamine
A 3 maal uitschudden voldoende was.

In de petroleumaether lost bij het uitschudden ook een ge-
deelte van de ontstane zepen op, die verwijderd moeten
worden. Hiertoe worden de verzamelde extracten enkele
malen met water gewassen en dan met watervrij Na,SO^
behandeld om het aanwezige water op te nemen, daar de
oplossing anders bij het indampen troebel wordt.

Na affiltreren van het Na^SO^ hebben wij nu een petro-
leumaetheroplossing, waarin alle carotinoïden en vitamine A
aanwezig zijn. Deze oplossing is echter veel te verdund en
wordt dus ingedampt. Voor het indampen werd gebruik ge-
maakt van Soxhletapparaten, die het voordeel hebben, dat de
opstelling weinig ruimte inneemt, zodat verschillende bepa-
lingen naast elkaar op het waterbad gedaan konden worden.
Het indampen werd voortgezet tot de concentratie van het
vitamine A zodanig was, dat bij de Carr en Price-reactie een
duidelijke blauwe kleur optrad.

Van deze oplossing brengt men 0,2 cc in het Lovibond-
buisje, voegt daarbij 2 cc SbCl^-oplossing in chloroform en
1 druppel azijnzuuranhydride. De intensiteit van de blauwe
kleur, die ontstaat, wordt snel in het Lovibond-toestel ge-
meten.

Het azijnzuuranhydride wordt toegevoegd om nog sporen
aanwezig water op te nemen. De aanwezigheid van water
veroorzaakt dadelijk een troebeling tengevolge van de SbClg,
waardoor het meten onmogelijk wordt. (Bertram squot;)).

De nauwkeurigste aflezing van de intensiteit van de blauwe
kleur in de Lovibond tintometer is mogelijk in de buurt van

5 Lovibond eenheden blauw (L.E.B.), zodat de verdunning
van de petroleumaetheroplossing zo gekozen wordt, dat onge-
veer deze Lovibondwaarde afgelezen wordt. Na enige oefe-
ning is men in staat de meting zo uit te voeren, dat de maxi-
male fout ten hoogste 0,2 L. E. B. is, hetgeen dus neerkomt
op een fout van ten hoogste 5 %.

B. Bepaling van het carotine-gehalte.

Voor de bepaling van het carotine-gehalte van de melk
gebruikte ik dezelfde methode als voor de vitamine A-bepa-
ling. De melk wordt verzeept, met petroleumaether geëxtra-
heerd, de extracten worden gewassen, gedroogd en ingedampt
tot een volume, waarbij de intensiteit van de gele kleur colori-
metrisch goed te bepalen is in de Lovibond tintometer.

Om uit de intensiteit van de gele kleur de hoeveelheid
carotine te kunnen berekenen moeten we er zeker van zijn,
dat de gele kleur uitsluitend afkomstig is van carotine en niet
van andere gele pigrnenten, zoals xanthophyl en lycopine, die
beide in het voedsel van de koe kunnen voorkomen.

Eerst werd nagegaan of xanthophyl ook in meetbare hoe-
veelheid aanwezig was. Hiervoor maakte ik gebruik van de
volgende scheidingsmethode voor xanthophyl en carotine.

Schudt men een petroleumaetheroplossing, die carotine en
xanthophyl bevat met 85 % alcohol, dan gaat het xanthophyl
over in de 85 % alcohol, terwijl de carotine in de petroleum-
aetherlaag achterblijft, «i) ^2) 83) ik verzeepte hiervoor 100 cc
melk, extraheerde met petroleumaether, waste met water,
droogde met NagSO^ en concentreerde de oplossing door
indampen tot 10 cc. Hierna werd de intensiteit van de gele
kleur bepaald met de Lovibond tintometer.

De oplossing werd daarna met 85 % alcohol uitgeschud.
De petroleumaetherlaag werd afgescheiden, met water ge-
wassen, met Na2SO^ gedroogd en het volume weer nauw-

keurig op 10 cc gebracht, waarna de intensiteit van de gele
kleur opnieuw bepaald werd. Geen merkbaar verschil met de
eerstbepaalde kleurintensiteit werd gevonden.

Bovendien werd de alcohollaag na verdunning met water
uitgeschud met petroleumaether. Deze petroleumaetheroplos-
sing werd ingedampt tot 1 cc. Het bleek toen, dat deze op-
lossing slechts zeer weinig geel gekleurd was (minder dan
1 L. E. G.). De hoeveelheid xanthophyl was zo gering, dat
bij de carotinebepaling, waar voor het meten van de inten-
siteit van de gele kleur een volume van 5 tot 10 cc gebruikt
wordt, de concentratie van het xanthophyl zodanig is, dat
invloed hiervan op de intensiteit van de gele kleur binnen de
proeffout hgt, hetgeen dus in overeenstemming is met de
bovenstaande bepaling, waarbij geen andere waarde werd
gevonden na verwijdering van het xanthophyl.

Dit is ook in overeenstemming met de resultaten van
Gill am en Heilbron, die bij hun spectroscopische
bepalingen ook slechts zeer weinig xanthophyl vonden.

Daar de mogelijkheid bestond, dat xanthophyl in grotere
hoeveelheid in de melk zou voorkomen, wanneer de koeien
een ander diëet kregen, werd bovenstaande proef iedere keer
herhaald, wanneer het voedsel van de koeien veranderd werd.
Steeds echter was de hoeveelheid xanthophyl zo gering, dat
deze binnen de proeffout lag.

Bij de bepaling van het carotine hoeft dus geen correctie
aangebracht te worden voor de aanwezigheid van xanthophyl.

In de tweede plaats moeten we rekening houden met de
eventuele aanwezigheid van lycopine.

Om dit na te gaan, heb ik gebruik gemaakt van de
scheidingsmethode van Kuhn en Brockmann voor
carotine en lycopine.

Om zeker te zijn, dat ik volgens deze methode een goede
scheiding tussen carotine en lycopine verkreeg, heb ik eerst
gewerkt met een mengsel van beide stoffen.

Het benodigde lycopine werd bereid uit tomatenpuree vol-
gens een voorschrift van Wils tatter en Escher.

Bereiding van lycopine:

11 kg tomatenpurée werden met 6 L 96 % alcohol geroerd.
Dit mengsel liet ik 24 uur staan, waarbij zo nu en dan de
massa omgeschud werd. Het bezinksel werd door een doek
gefiltreerd. De aldus verkregen brei werd opnieuw met 3 L
alcohol geschud en weer gefiltreerd. Daarna werd de alcohol,
die nog aanwezig was, verwijderd met behulp van een filter-
pers. De kruimehge massa, die overbleef, werd bij 40° ge-
droogd en dan gemalen.

Het tomatenmeel werd met CSj geëxtraheerd in Soxhlet-
apparaten, en de verkregen oplossing ingedampt in COg
atmosfeer onder verminderde druk.

De bruinrode rest werd met het drievoudige volume abso-
lute alcohol verdund en gefiltreerd, waarna met petroleum-
aether nagewassen werd. Het ruwe product werd gereinigd
door het uit een CSj-oplossing met absolute alcohol neer te
slaan. Nadat dit vijf maal herhaald was, werd 0,9 g van het
eindproduct verkregen. Dit werd gedroogd in een vacuum-
exsiecator boven PgOg. De exsiccator werd voor het evacueren
met CO2 gevuld, daar het lycopine zeer oxydabel is. Om
deze reden werd het lycopine ook in een toegesmolten buisje,
gevuld met CO^, bewaard.

Het smeltpunt van dit praeparaat was 170°.

C. De scheiding van lycopine en carotine.

Bij de methode van Kuhn en Brockmann wordt ge-
bruik gemaakt van het principe van de chromatografische
adsorptiemethode van Tswett, die berust op het verschil
in adsorbeerbaarheid van de te scheiden componenten. Kuhn
en Brockmann nemen voor de scheiding van lycopine en

Carotine een mengsel van 10 delen „Fasertonerdequot; (M e r c k)
en 40 delen AlgOg (grofkorrelig).

Het adsorbens bevindt zich in een buis van ong. 30 cm
lengte en 8 mm doorsnede. Deze buis heeft aan de onderkant
een vernauwing, welke voorzien is van een wattenprop, en
is op een zuigerlenmeyer gemonteerd.

Voor het vullen van de buis suspendeerde ik het adsorbens
in petroleumaether en bracht de suspensie onder afzuigen
in de buis tot een laagdikte van 12 cm.

Nadat het adsorptiemengsel met petroleumaether gewassen
was, werd een oplossing, die carotine en lycopine bevatte
door de adsorberende laag gezogen.

Omdat lycopine sterker door het gebruikte adsorbens ge-
adsorbeerd wordt dan carotine, kan het carotine quantitatief
uitgewassen worden met petroleumaether, terwijl het lycopine
een rode ring vormt in de adsorberende laag, die bij het
wassen met petroleumaether slechts langzaam verschuift.
De lycopine kan daarna met petroleumaether, die 1 % aethyl-
alcohol bevat, geëlueerd worden.

Om na deze werkwijze te kunnen controleren of het caro-
tine en lycopine gescheiden zijn, moeten we de concentratie
van de beide stoffen in petroleumaether bepalen. Voor caro-
tine geschiedde dit met behulp van de Lovibond colorimeter.
Deze bleek echter niet geschikt voor de bepaling van het
lycopine, omdat dan met 2 kleuren gemeten moest worden
(geel en rood).

Daarom maakte ik hiervoor gebruik van de Stuphenphoto-
meter van Zeiss, waarmee we in staat zijn de licht-
absorptie in een bepaald golflengtegebied te meten.

Door het meten van de absorptie van lycopine-oplossingen
met bekende concentratie werd het verband bepaald tussen
de absorptie en de concentratie in het golflengtegebied, dat

bestreken wordt door het fiUer S 47, dat bij het toestel
behoort.

Onderstaande tabel geeft de waarden aan van de absorptie
in % van het invallend licht, wanneer een cuvet van 10 mm
dikte gebruikt werd.

Tabel 3.

In fig. I is de grafische voorstelling te zien van boven-
staande waarden, waarbij de x-as de lycopineconcentratie
aangeeft en de y-as, die logarithmisch verdeeld is, de stupho-
meterwaarden. Met behulp van deze kromme kunnen we de
concentratie van een lycopine-oplossing bepalen.

Van een lycopinepraeparaat en van een standaardpraepa-
raat van carotine werden oplossingen gemaakt van bekende
concentratie. Van deze oplossingen maakte ik een mengsel,
waarvan dus het lycopine- en carotine-gehalte bekend was.
Dit mengsel werd volgens de beschreven methode gescheiden.

Nadat de oplossingen na de scheiding door indampen ge-
concentreerd waren, werd het gehalte aan lycopine en caro-
tine bepaald. Het bleek hierbij, dat dc beide stoffen niet
quantitatief teruggevonden werden, zoals uit Tabel 4 te
zien is.

6 7 ö 9 IC
tïCOPmE ï/c.i

Fig. I.

Tabel 4.

Oorspronkelijk aanwezige
hoeveelheid in 't mengsel.

Teruggevonden hoeveelheid

Volgens het voorschrift van Kuhn en Brockmann
moest bij de adsorptie-analyse grofkorrelig Al^Og van Merck
gebruikt viforden, dit was bij deze firma echter niet te ver-
krijgen, zodat de proef met fijnkorrelig AlgOg gedaan werd,
hetgeefi waarschijnlijk de oorzaak was van het mislukken van
de scheiding. Daarom werd bij prof. Kuhn geïnformeerd,
waar dit adsorbens te verkrijgen was.

Prof. Kuhn was zo welwillend ons een monster ,,adsorp-
tiemengsel volgens Brockmannquot; te sturen, waarmee zonder
meer een adsorptie-analyse uitgevoerd kon worden.

Bovendien deelde prof. Kuhn mee, dat gebleken was, dat
bij de carotine-lycopine scheiding het gebruik van een mengsel
van petroleumaether en benzol (1:1) als wasvloeistof beter
voldeed.

De adsorptie-analyse werd nu opnieuw uitgevoerd met dit
nieuwe adsorptiemateriaal en met de aangegeven wasvloei-
stof, waarbij nu goede resultaten verkregen werden. (Tabel 5).

Tabel 5.

Het was mij hierna dus mogelijk carotine en lycopine
quantitatief te scheiden.

Daar in de koolraap relatief veel lycopine voorkomt,
(3 mg/kg) heb ik melk onderzocht van een koe, die veel
koolraap als voedsel kreeg.

400 cc van deze melk werden op de bekende manier ver-
zeept en het petroleiimaether-concentraat met behulp van de
adsorptie-analyse op de aanwezigheid van lycopine onder-
zocht. Ik kon echter geen lycopine aantonen.

In gevallen, waarin de koe minder lycopine in het voedsel
kreeg, leek het mij overbodig om volgens deze methode te
onderzoeken of de melk ook lycopine bevatte, vooral omdat
de kleurstofoplossing altijd spectroscopisch onderzocht werd,
wanneer het voedsel der koeien veranderde. Behalve de boven-
genoemde adsorptieanalyse kan het absorptiespectrum n.1.
ook nog aanwijzingen geven omtrent de aanwezigheid van
lycopine.

Een carotine-oplossing in petroleumaether vertoont banden,
waarvan de extinctiemaxima hggen bij 484 en 451 mj;^.

Een lycopinc-oplossing heeft banden bij 506, 474 en 446 mjx-
De hoogste band bij carotine ligt dus beneden 500 mj^, terwijl
die van lycopine boven 500 m^i, hgt.

Nemen we nu een carotine-oplossing en voegen hierbij wat
lycopine-oplossing, dan wordt de band zeer duidelijk naar de
langere golflengten verschoven.

Natuurlijk zijn kleine hoeveelheden lycopine volgens deze
methode niet aan te tonen, daar de banden in het spectrum
dan te weinig verschuiven. Dit was echter een gemakkelijke
controlemethode, die ik altijd toepaste, wanneer het diëet van
de koeien veranderde. Hierbij heb in geen enkel geval een
band boven 500 mjji, aangetroffen, ook niet bij de melk van
de koe, die voornamelijk koolraap, dus lycopinehoudend
voedsel kreeg.

Opgemerkt moet nog worden, dat dit in overeenstemming
is met de resultaten van Gillam en Heilbron, s») Nadat
ik mijn onderzoek reeds afgesloten had, publiceerden zij een
verhandeling, waarbij zij door middel van de chromato-
grafische- en spectroscopische methode de Carotinoiden van
de boter onderzochten.

Zij vonden, dat deze practisch geheel uit a- en ß-carotine
bestonden, terwijl de verhouding van de hoeveelheid a- en ß-
carotine wisselde.

In enige botermonsters, die veel pigment bevatten, konden
zij een spoor kryptoxanthine aantonen, terwijl zij alleen in
1 monster Deense boter een spoor lycopine konden aan-
tonen.

Daar xanthophyl en lycopine bij de bepalingen dus niet
UI storende hoeveelheden aanwezig zijn, heb ik bij de be-
rekening van de hoeveelheid carotine uit de intensiteit van
de gele kleur hiermee geen rekening gehouden.

D. Kort overzicht van de gehele methode voor de bepaling
van het carotine- en vitamine A-gehalte van melk.

Hier volgt een beschrijving van de wijze, waarop in een
bepaald geval de methode toegepast werd.

100 cc melk werden gedurende een uur op een waterbad
met 100 cc vers bereide 20% alcoholische KOH-oplossing,
verzeept.

De verzeepte massa werd met petroleumaether in een
scheitrechter uitgeschud, resp. met 100, 100 en 50 cc. De
petroleumaetherextracten werden verzameld en in een schei-
trechter met water gewassen. De oplossing werd gedroogd

met watervrij Na2SO^.

Nadat door filtreeren het Na„SO^ verwijderd was, werd
de oplossing ingedampt tot 5 cc en de intensiteit van de gele
kleur werd in de Lovibondtintometer bepaald. Het volume
werd door indampen op 1 cc gebracht.

Voor de Carr en Price-reactie werd hiervan 0,2 cc in het
Lovibondbuisje gebracht; hierbij werd 2 cc SbClg-oplossing
en 1 druppel azijnzuuranhydride gevoegd.

De intensiteit van de blauwe kleur werd dan snel in het
Lovibondtoestel gemeten.

E. De berekening van de hoeveelheid Carotine uit de Lovi-
bondwaardcn.

Om uit de gevonden kleurintensiteit de hoeveelheid Caro-
tine te berekenen, werd gebruik gemaakt van Fig. II, waarvan
de kromme het verband aangeeft tussen de carotineconcen-
tratie en de afgelezen Lovibond eenheden geel (L. E. G.)
(van Eekelen, Emmerie, Julius en Wolff ^4)),

Bij hoeveelheden van meer dan 25y carotine per cc
(gt;5 L. E. G.) wordt het aflezen in het Lovibond toestel on-
nauwkeurig.

Het volume van de ingedampte petroleumaether-oplossing
werd daarom zo gekozen, dat het aantal y carotine per cc

niet hoger was dan deze waarde. Het is dan mogelijk het
carotine te bepalen met een fout van ten hoogste 5%.

F. De berekening van de hoeveelheid vitamine A uit de
afgelezen Lovibondwaarden.

Om uit de gevonden kleurintensiteit de hoeveelheid vita-
mine A te kunnen bepalen, moeten we er rekening mee
houden, dat carotine ook een blauwe kleur geeft met SbClg
oplossing.

Wij lezen dus met de Lovibondtintometer een blauwe kleur
af, die de som is van die, veroorzaakt door vitamine A en
die, veroorzaakt door carotine. We moeten dus de hoeveel-
heid Lovibond eenheden blauw (L. E. B.), veroorzaakt door
het carotine aftrekken van het aantal L. E. B., dat afgelezen
werd.

Daar de hoeveelheid carotine reeds bepaald is, kan het
aantal L. E. B. berekend worden, die deze hoeveelheid ca-
rotine geeft. Hiervoor werd gebruik gemaakt van Fig. III,
waarvan de curve aangeeft hoeveel L. E. B. 0,2 cc van een
bekende hoeveelheid carotine met 2 cc SbClg-oplossing geeft.

In de meeste gevallen was in de oplossing, die voor de
Carr en Price-reactie gebruikt werd, de carotine concen-
tratie beneden 20 y/cc. Voor deze concentratie wordt volgens
deze kromme een Lovibondwaarde van 0,2 L. E. B. afgelezen.
Daar deze waarde binnen de proeffout valt, heb ik in deze
gevallen bij de vitamine A-bepaling geen rekening gehouden
met de blauwe kleur, die veroorzaakt v.^ordt door het aan-
wezige carotine. In een paar gevallen echter werd bij de
berekening van de vitamine A-waarde een correctie voor de
Carr en Price-reactie van carotine aangebracht.

G. Toevoeging van een bekende hoeveelheid carotine en
vitamine A.

Om te controleren of bij de bewerkingen voor de bepaling
van carotine en vitamine A geen verliezen optreden, werd
aan melk, waarvan ik eerst het carotinegehalte bepaald had,
een bekende hoeveelheid carotine toegevoegd.

Door hierna opnieuw het carotinegehalte te bepalen, was

na te gaan, of de toegevoegde hoeveelheid carotine quantita-
tief werd teruggevonden.

Ditzelfde deed ik ook met een bekende hoeveelheid vita-
mine A.

De carotine werd toegevoegd opgelost in petroleumaether.
Hiervan werd een verdunde oplossing gemaakt, waarvan het
gehalte eerst colorimetrisch bepaald werd.

Voor de toevoeging van vitamine A gebruikte ik een traan,
waarvan de hoeveelheid vitamine A bekend was en waarvan
een oplossing gemaakt werd in petroleumaether, die geschikt
was voor het doel, dus ongeveer van dezelfde concentratie
als die in melk.

Tabel 6.

Uit de tabellen 6 en 7 blijkt, dat de toegevoegde hoeveel-
heden carotine en vitamine A met een fout van minder dan
10 % werden teruggevonden.

HOOFDSTUK V.

RESULTATEN VAN HET VITAMINE A- EN
CAROTINE-ONDERZOEK VAN KOEMELK.

In het vorig hoofdstuk is de methode beschreven, volgens
welke het carotine- en vitamine A-gehalte van een groot
aantal monsters werd bepaald.

A. Monsterneming.

Door bemiddeling van de U. M.I. ontving ik elke week
van bepaalde boeren monsters rauwe melk.

Tevens kreeg ik elke week gepasteuriseerde melk en zgn.
,,Stassanomelkquot;. Dit is melk, die gepasteuriseerd is, door
deze gedurende zeer korte tijd (ong. 15 sec.) in uiterst dunne
laag bloot te stellen aan verhitting op 75quot;. Dit geschiedt in
een gesloten, dubbelwandig buizensysteem, waarvan de
wanden op 1 mm afstand van elkaar geplaatst zijn.

De bedoeling van het onderzoek van deze monsters was
het vitaminengehalte van de marktmelk na te gaan, gedurende
de loop van het jaar.

Bovendien zond het Rijksproefstation te Hoorn wekelijks
monsters van 7 koeien. De melk van deze koeien werd onder-
zocht om de invloed van diëetsverandering op het vitaminen-
gehalte van de melk na te gaan.

B. Het carotine- en vitamine A-gehalte van rauwe markt-
melk.

De marktmelk werd onderzocht van eind September tot
eind Mei, zodat dus de stalperiode en de weideperiode in het
onderzoek betrokken waren.

Van de melkmonsters van 5 verschillende stallen werden
elke week het carotine- en vitamine A-gehalte bepaald.

Uit de tabellen 8—12 en nog beter uit de krommen van
fig. IV zien we, dat tijdens de weideperiode het vitamine A-
gehalte zowel als het carotinegehalte het hoogst is.

Het gemiddelde vitamine A-gehalte van de weidemelk be-
draagt 7,7 L.E.B, per 100 cc, terwijl dit voor stalmelk
3,3 L.E.B, is.

Het gemiddelde carotinegehalte is 24,9y carotine per
100 cc weidemelk, voor stalmelk is dit Sy per 100 cc.

Zoals in fig. IV te zien is, was het vitamine A- en het
carotinegehalte, toen ik mijn bepalingen begon, lager dan in
de verder» weideperiode, dit is waarschijnlijk een gevolg van
het feit, dat alle koeien toen mond- en klauwzeer hadden.

Onmiddellijk nadat de koeien op stal zijn gekomen zien
we een daling in het carotine- en vitamine A-gehalte op-
treden. Het vitamine A-gehalte daalde onmiddellijk tot het
niveau, waarop het gedurende de winter bleef, de hoeveelheid
carotine daarentegen nam minder snel af.

In de loop van de winter bleven de waarden vrij constant.

Omdat er zo weinig verandering optrad in het carotine-
en vitamine A-gehalte, heb ik na 20 Maart met de bepalingen
gewacht tot de koeien weer in de weide kwamen. Dadelijk
nadat de koeien weer vers gras kregen, werden hogere waar-
den gevonden.

Van de melkmonsters werd ook het vetgehalte volgens de
methode van Gerber bepaald. Hierdoor is het mogelijk het
vitamine A- en carotinegehalte per gram vet op te geven.

ogt;
2

L»

2
r-

T

I

I
I
t
I

VJgt;

g

u

lt;rN

Daar het vetgehaUe echter betrekkehjk weinig verande-
ringen ondergaat, geven de waarden voor het carotine- en
vitamine A-gehaUe per gram vet hetzelfde beeld te zien als
die per 100 cc melk.

Tabel 13.

Uit tabel 13 zien we, dat de vitamine A-waarden van de
melk van de verschillende stallen tijdens de weideperiode niet
veel uiteenlopen. De verschillen zijn groter, wanneer de
koeien op stal zijn. Zoals hierna nog zal blijken, moeten we
dit toeschrijven aan een verschil in voeding van het vee.

en carotine-gehalte van gepasteuri-

Hoewel er geen reden is te veronderstellen, dat gepasteu-
riseerde melk een ander vitamine A- en carotinegehalte had
dan rauwe melk, werd van deze melk toch het vitamine A-
en carotinegehalte bepaald, daar we hierdoor een goed beeld
krijgen van het vitamine A- en carotinegehalte van mengmelk.

Omdat ik deze monsters kreeg voor het bepalen van het
vitamine C-gehalte, was het makkelijk deze hiervoor te ge-
bruiken.

Tabel 14.
Gepasteuriseerde melk.

Tabel 15.
Stassanomelk.

Uit de tabellen 14 en 15 is duidelijk te zien, dat de waar-
den practisch overeenkomen met die van rauwe melk.

D. Invloed van het diëet van de koe op het carotine- en
vitamine A-gehalte van de melk.

Nadat vastgesteld was, dat marktmelk in de winter weinig
carotine en vitamine A bevat, werd in samenwerking met het

Rijks-Landbouwproefstation te Hoorn geprobeerd om dooi
diëetsverandering wintermeik te krijgen met een hoger caro-
tine- en vitamine A-gehalte.

Hiervoor werd de melk van 7 koeien onderzocht, die in de
loop van de winter op verschillende diëten gezet werden,
waarbij tevens het carotinegehalte van de voedingsmiddelen
werd bepaald.

1. De bepaling van het carotine-gehalte van dc voedingsmiddelen.

Voor het bepalen van het carotinegehalte in de voedings-
middelen gebruikte ik de methode, die door Vermast
aangegeven wordt.

Voor het onderzoek wordt het plantenmateriaal in kleine
stukjes gesneden, daarna met zand en watervrij NajSO^
samengewreven om de plantendelen te verbrijzelen en tevens
te drogen.

De droge massa wordt in een Soxhlet apparaat met petro-
leumaether geëxtraheerd gedurende 5 uur. Hierna wordt deze
oplossing met alcoholische KOH-oplossing verzeept. De ver-
zeepte massa wordt met water verdund, tot de alcohol-con-
centratie 50 % is en in een scheitrechter gebracht, waarna de
petroleumaetherlaag wordt afgetapt. Dan wordt nog enige
malen met petroleumaether uitgeschud tot de petroleum-
aetherlaag niet meer geel gekleurd is. De verzamelde petro-
leumaetherextracten worden met water gewassen en dan ge-
concentreerd door indampen. Deze oplossing bevat nu caro-
tine en xanthophyl.

Het xanthophyl wordt verwijderd door uit te schudden
met 85% alcohol, waarbij de carotine dus in de petroleum-
aetherlaag achterblijft (zie blz. 31) en de xanthophyl in de
85% alcohol oplost.

Door de petroleumaetheroplossing uit te wassen met water
wordt de alcohol, die hierin achtergebleven is, verwijderd.

Daarna wordt de oplossing ingedampt tot een dergelijk
volume, dat de intensiteit van de gele kleur in de Lovibond
tintometer bepaald kan worden.

Nadat ik op deze wijze het carotine uit de voedingsmiddelen
afgescheiden en bepaald had, werd ter controle tevens het
absorptie spectrum van de verkregen petroleumaetheroplos-
singen onderzocht. In alle gevallen gaf dit een carotine-
spectrum te zien.

Bij het onderzoek van het spectrum der oplossing, die ver-
kregen werd voor de bepaling van carotine in hooi was dit
niet goed te zien door de aanwezigheid van Sterinen. Deze
konden echter door uitvriezen voor een groot gedeelte ver-
wijderd worden; daarna was het spectrum duidelijk.

Voor het berekenen van de hoeveelheid carotine uit de ge-
meten kleurintensiteit maakte ik gebruik van Fig. II.

Tabel 16 geeft de hoeveelheden carotine aan, die in de
voedingsmiddelen gevonden werden.

Tabel 16.

2. Het vitamine A- en carotine-gelialte van de melk tijdens dc verschil-
lende diëten.

Gedurende de eerste periode van 19 December—25 Ja-
nuari en ook reeds enige tijd daarvoor kregen de koeien een
normale wintervoeding.

Hieronder volgt het dagelijks rantsoen van de koeien met
de daarin aanwezige hoeveelheid carotine.

PERIODE I.

Uit de tabellen 16—22 (blz. 99—105) is te zien, dat na
een diëetsverandering het carotine- en vitamine A-gehalte van
de melk de eerste weken niet constant is, omdat dan nog de
invloed van het vorige diëet te merken is. Daarom geven de
cijfers van de laatste weken van een periode een duidelijker
beeld van de samenhang tussen het carotine- en vitamine A-
gehalte van de melk en het diëet in de verschillende perioden.

Om de gemiddelde waarden van het carotine- en vita-
mine A-gehalte tengevolge van een bepaald diëet te berekenen,
heb ik daarom alleen de cijfers van de 3 laatste weken van
een voedingsperiode gebruikt.

Het gemiddelde carotinegehalte gedurende de laatste
3 weken van de le periode was 6,5y carotine en het gemid-
delde vitamine A-gehalte 3,4 L. E. B. per 100 cc melk. De
totale vitamine A-waarde was dus 21 int. eenh.

Gedurende periode II van 29 Januari—2 Maart kregen de
koeien het volgende rantsoen.

1nbsp; Het krachtvoer bestond uit 1 dl. suikerpulp, 1 dl. cocosmeel, 1 dl.
maïsmeel, 1 dl. gerstemeel, 1 dl. lijnmeel en dl. grondnotenmeel.
Hieraan was nog % % keukenzout toegevoegd.

Fig. V. Melk uit Hoorn. Vitamine A en Carotine.

PERIODE II.

Hoeveelheid carotine in mg,
hierin aanwezig.

35 kg voederbiet
2,5 kg haverstroo
4 kg hooi

1,75 kgnbsp;soyakoek

1 kgnbsp;krachtvoer

Het gemiddelde carotinegehalte bij dit diëet was hjy en
het gemiddelde vitamine A-gehalte 3,3 L. E. B. per 100 cc
melk. De totale vitamine A-waarde is dus 17,6 int. eenheden
per 100 cc melk.

We zien hieruit, evenals uit fig. V, dat het vitamine A-
gehalte practisch gelijk bleef, terwijl het carotinegehalte nog
afnam, zodat de totale vitamine A-waarde dus lager werd.

In de 3e periode, die duurde van 4 Maart—7 April kregen
de koeien hoofdzakelijk zoutzuursilage. Dit is ingekuild gras,
dat bereid is onder toevoeging van verdund HCl. Een der-
gelijke zuurtoevoeging heeft tot gevolg, dat het materiaal van
het begin af aan vrij sterk zuur reageert, hetgeen de conser-
vatie ten goede komt.

De volgende tabel geeft de hoeveelheden, die de koeien
dagelijks kregen.

PERIODE III.

De opgenomen hoeveelheid carotine is in deze periode dus
veel groter. Bij dit diëet werd dan ook dadelijk een hoger
carotine- en vitamine A-gehalte gevonden (zie tabellen
16—22 en fig. V).

Het carotinegehalte steeg langzamer dan het vitamine A-
gehalte, het hoogste vitamine A-gehalte werd reeds na een
week gevonden.

De gemiddelde waarden gedurende de laatste 3 weken
van deze periode bedroegen 26y carotine en 4,9 L. E. B. vita-
mine A per 100 cc melk. De vitamine A-waarde per 100 cc
melk is dus 46,6 int.eenh.

In de 4e periode, die duurde van 7 April—16 Mei werd het
zoutzuur silage vervangen door eenzelfde hoeveelheid Hol-
lands kuilgras, dit is gras, dat ingekuild is zonder toevoeging
van HCl. De hoeveelheden hooi en krachtvoer bleven de-
zelfde als in periode III. Het kuilgras, dat de koeien in deze
periode kregen, was van minder goede kwaliteit. De geur was
zeer onaangenaam, hetgeen ermee samenhing, dat een ge-
deelte reeds een jaar tevoren ingekuild was.

Het carotinegehalte van dit rantsoen was lager dan dat
van het vorige, zoals uit onderstaande tabel blijkt.

PERIODE IV.

Voor het carotinegehalte werd tijdens dit dieet gemiddeld
17y en voor het vitamine A-gehalte 4,1 L. E. B. per 100 cc

melk gevonden, de totale vitamine A-waarde is dus 34,2 int.
eenh. per 100 cc. Hieruit blijkt, dat zowel het carotine- als
het vitamine A-gehalte lager waren dan die van de vorige
periode. Toch waren deze cijfers nog aanzienlijk hoger dan
die van de eerste 2 perioden.

Bij de berekening van de gemidd. waarden van het caro-
tine- en vitamine A-gehalte van de koeien op 26 April zijn
de koeien 27 en 29 buiten beschouwing gelaten, omdat deze
koeien toen ziek waren en tengevolge daarvan abnormaal veel
carotine en vitamine A in hun melk hadden, zodat deze cijfers
geen beeld gaven van de normale toestand.

Gedurende periode V van 22 Mei—27 Juni vertoefden de
dieren, zoals in bijna alle delen van ons land gebruikelijk is,
dag en nacht in de weide, waarbij geen extra bijvoeder werd
toegediend.

Het carotine- en vitamine A-gehalte van de melk werd
toen hoger en bereikte de waarden van 39y carotine en
8,1 L. E. B. vitamine A per 100 cc melk, wat dus 73 int. eenh.
vitamine A per 100 cc melk is.

Vergelijken we de gemiddelde waarden van het vitamine A-
en carotine-gehalte van de melk van de koeien onderhng
tijdens de verschillende perioden, zoals deze aangegeven zijn
in de tabellen 16—22, dan zien we, dat er niet veel variatie
optreedt. Nog minder verschil treedt op, wanneer we het
carotine- en vitamine A-gehalte per gram vet vergelijken. Dit
is zeer opmerkelijk, daar de gemiddelde dagelijkse melk-
opbrengst van de afzonderlijke koeien vrij sterk uiteenloopt,
zodat er van eenig verband tussen de vitamine A-waarde
van de melk en de melkproductie geen sprake is.

HOOFDSTUK VI.

HET CAROTINE- EN VITAMINE A-GEHALTE
VAN BOTER.

Om de chemische bepaling te vergelijken met de biolo-
gische. werden zoals in het volgende hoofdstuk besproken
zal worden, dierproeven gedaan met ratten, die als enige
vitamine A-bron boter kregen.

Het carotine- en vitamine A-gehalte van deze boter werden
bepaald volgens een methode, die in hoofdzaak parallel loopt
met de bepaling van carotine en vitamine A in melk.

A. Bepaling van het carotine- en vitamine A-gehaltc van
boter.

5 g boter werden verzeept met 2,5 cc verzadigde KOH-
oplossing in water en 10 cc alcohol gedurende 1/2 uur op een
waterbad. ®®)

De oplossing werd na de verzeping verdund met 40 cc
water, bovendien werden 40 cc alcohol toegevoegd om de
alcoholconcentratie op 50 % te brengen.

De oplossing werd met petroleumaether geëxtraheerd.
Hierbij bleek, dat 3 maal extraheren met resp. 100, 100 en
50 cc petroleumaether niet voldoende was om alle vitamine A
te kunnen uitschudden, 5—7 maal extraheren met 70 cc
petroleumaether was echter voldoende.

De petroleumaether-extracten werden dan gewassen, met
watervrij Na^SO^ gedroogd en ingedampt om in de Lovibond
colorimeter de intensiteit van de gele kleur te kunnen bepalen.
Uit de kleurintensiteit kunnen we het carotine-gehalte met
behulp van Fig. II berekenen.

Voor de vitamine A-bepahng moest het extract geconcen-
treerd worden tot een volume van 1 a 2 cc.

De intensiteit van de blauwe kleur, die met de SbCL-

3

oplossing verkregen wordt, werd eveneens op de bekende
wijze in de Lovibond colorimeter bepaald. (Zie blz. 30).

Voor de berekening van het vitamine A-gehalte verwijs ik
ook naar de bepahng in melk.

In Tabel 23 zijn de waarden aangegeven, die in de ver-
schillende monsters boter gevonden werden. De gebruikte
boter was gewone marktboter, die ik van de U. M. I. ontving.

Tabel 23.

In de winter wordt de handelsboter gekleurd met bixine.
Dit is een mono-ester van een dicarbonzuur. Wanneer de
boter dus verzeept wordt en het carotine bepaald door de
intensiteit van de gele kleur te meten in het onverzeepbare
deel, stoort de aanwezigheid van bixine in de boter bij de
bepahng niet,--omdat het bixine dan ook verzeept is.

HOOFDSTUK VII.

DIERPROEVEN.

De dierproeven werden uitgevoerd om de chemische be-
pahng van de vitamine A-waarde van botervet te vergelijken
met de biologische bepaling.

Zoals reeds meegedeeld is, gebruikte ik bij de dierproeven
de curatieve groeitestmethode, waarbij ik de werking van het
botervet vergeleek met die van een standaardpraeparaat van
carotine.

Als proefdieren gebruikte ik ratten, waarvan het gewicht
bij het begin van de proef 60—80 gram bedroeg. Deze ratten
werden op het volgende vitamine A-vrije diëet gezet:
caseïne (vetvrij)nbsp;100

amylum oryzaenbsp;273

zoutmengscl (Mc Collum 185) 25
arachisohenbsp;50

gedroogde gist _nbsp;50

vitamine Dnbsp;500 eenheden per kg

Het zoutmengsel bestond uit:

NaH^PO^.H^O 10,41
NaClnbsp;5,19

MgSO,nbsp;7,98

K,HPO,nbsp;28,62

Ca(H2P0J2-H20 16,20
calciumlactaatnbsp;39,0

ijzercitraatnbsp;3,54

jodiumnbsp;spoor.

De dieren werden tweemaal per week gewogen.

Eenige tijd nadat de dieren alleen een vitamine A-vrij diëet
krijgen, treedt een gewichtsstilstand op, tenslotte vallen de
dieren af. Dat is het ogenblik, waarop met het toedienen van
de carotine en het botervet begonnen wordt.

Tijdens deze periode sterven echter reeds veel dieren. Door
sectie-onderzoek wordt nagegaan of dit een gevolg is van
vitamine A-gebrek, waarbij speciaal gelet wordt op de toe-
stand van de ogen, etterige darmontstekingen, het optreden
van nier- en blaasstenen enz.

De gevoerde carotine-oplossing.

Het carotine, waarvan ik uitging was een internationaal
standaardpraeparaat van a- en ß-carotine, waarvan ly over-
eenkwam met de internationale eenheid.

10 mg van dit praeparaat werden opgelost in benzol en
gemengd met 50 cc gezuiverde arachisolie. De benzol werd
daarna in vacuum afgedampt. De olie-oplossing werd zodanig
verdund, dat 1 druppel uit het gebruikte druppelflesje ly
carotine bevatte.

Van de aldus verkregen oplossing werden aan 2 groepen
ratten dagelijkse hoeveelheden gevoerd, die 2 en 3y (a ß)
carotine bevatten, daar over 't algemeen gevonden werd, dat
de werkzame dosis carotine tussen deze grenzen ligt.

De verschillende doses carotine-oplossing werden in de bek
van de rat gedruppeld.

Opgemerkt moet worden, dat gecontroleerd werd, of het
carotinegehalte van de olie-oplossing tijdens de proef con-
stant bleef.

Het gevoerde botervet.

Het botervet werd in gesmolten toestand gevoerd. Met een
verdeelde 1 cc pipet werd het botervet afgemeten en in de

bek van de rat gepipetteerd, zodat ik er zeker van was, dat
alles opgenomen werd.

Door van te voren verschillende met de pipet afgemeten
volumina te wegen, wist ik het gewicht van de toegediende
hoeveelheden botervet.

Van het botervet werden dergelijke hoeveelheden gegeven,
dat de ratten volgens de chemische bepaling tussen de 2 en 3
int. eenheden vitamine A kregen, waardoor het mogelijk was
de werking van het botervet met die van de carotine te ver-
gelijken.

Hieronder volgt een overzicht van deze proeven:

Uit deze zeker niet geheel voldoende proefreeks is af te
leiden, dat bij de omstandigheden, waaronder de ratten
leefden, de dagdosis (a ß) carotine ruim 2 internationale
eenheden is.

Het toedienen van 2 int. eenh. was niet genoeg, daar hier
van de 8 ratten 6 gestorven zijn; 3 int. eenheden was zeker
een te grote dosis, omdat de gemiddelde gewichtstoename in

5 weken 38 g was, terwijl over het algemeen aangenomen
wordt, dat ratten juist genoeg vitamine A krijgen, wanneer
de gemiddelde gewichtstoename in 5 weken 15 g bedraagt.

Hieronder volgen de gegevens van de ratten, die botervet
kregen.

Uit dit overzicht is te zien, dat ratten, die zoveel botervet
kregen, dat zij volgens mijn bepalingen 3,3 int. eenh. vita-
mine A ontvingen, zeer snel in gewicht toenamen, zodat dit
zeker een te grote dosis was.

Bij ratten, die 2,2 int. eenh. kregen, was deze hoeveelheid
ongeveer voldoende, hetgeen hieruit blijkt, dat dit in het ene
geval iets te veel, in het andere geval te weinig was, terwijl
bij 2 ratten 2,4 int. eenheden vitamine A ook ruim vol-
doende was.

Bij het botervet werd dus eveneens gevonden, dat de dag-
dosis voor de rat tussen de 2 en 3 int. eenh. lag. Dit komt
dus geheel overeen met de controleproeven, zodat we kunnen
concluderen, dat de resultaten van de chemisch-colorim.etrische
bepaling van het- botervet en dus ook van melk een beeld
geven van de vitamine A-waarde.

HOOFDSTUK VIII.
OVERZICHT VAN HET VITAMINE C.

A.nbsp;Verschijnselen, die optreden bij vitamine C-gebrck.

De avitaminose C draagt de naam van scheurbuik of scor-
buut, een ziekte, die vroeger veel voorkwam, vooral op
schepen.

Scorbuut kenmerkt zich door de volgende verschijnselen:
tandvleesbloedingen, subcutane bloedingen, pijnlijke en ge-
zwollen gewrichten en anaemie. Bovendien is één van de
typische verschijnselen, het zwaktegevoel, waardoor de men-
sen alle energie missen om te werken.

B.nbsp;Historie.

Dat de ziekte met een onvoldoend diëet te maken had, was
sinds lang bekend en reeds in het midden van de 18e eeuw
wees een Brits marinedokter James Lind erop, dat
het gebruik van verse groenten en vruchten een geneesmiddel
was tegen scheurbuik.

De eerste belangrijke stap in de goede richting bij het
wetenschappelijk onderzoek is in de jaren 1907—1912 gedaan
door twee Denen Holst en Fröhlich, s») Het is aan
hen voor het eerst gelukt de toen alleen nog maar bij mensen
bekende ziekte kunstmatig op te wekken bij caviae, door deze
te voeren met zemelen, haver en aan de lucht verhit melk-

poeder, botervet, wat zout en water. De dieren vertoonden
na 1 maand op dit diëet geleefd te hebben ziekteverschijnselen,
die precies overeenkwamen met de scheurbuik bij de mens.
Holst en Fröhlich konden daarbij de genezende werking
van verse vruchten en groenten vaststellen.

Na dien tijd zijn er zeer veel onderzoekingen gedaan over
de anti-scorbutische stof, die vitamine C genoemd werd. Men
heeft getracht het vitamine uit de plantensappen te isoleren,
maar stuitte daarbij op de moeilijkheid, dat het vitamine zeer
onbestendig bleek.

In 1927 werd door T i 11 m a n s ) gevonden, dat uit-
geperst citroensap en de antiscorbutische fracties daarvan
phenohndophenol reduceren. Deze eigenschap gaat in alka-
lisch milieu bij aanwezigheid van lucht verloren, evenals de
antiscorbutische werkzaamheid.

Z i 1V a, ) die zich ook veel met het vitamine C-probleem
heeft beziggehouden, vond, dat er geen correlatie bestond
tussen het reductievermogen en de antiscorbutische werking
van citroensap. Hij vermoedde daarom, dat de reducerende
stof een begeleider was van het antiscorbutische agens.

Eind 1931 publiceerde Rygh »2) zijn opzienbarende ont-
dekking betreffende de chemische samenstelhng van vita-
mine C. Hij bereidde uit het aetherextract van zwak alkalisch
gemaakt sinaasappelsap een praeparaat, dat volgens hem zeer
actief was. Dit bestond uit kristallen van het alkaloïd narco-
tine en een olie, welke laatste de drager van het vitamine C
zou zijn. Narcotine beschouwde hij als provitamine C.

Door bestraling van narcotine met ultraviolet licht be-
reidde hij verschillende derivaten, waarvan het methylnor-
narcotine reeds bij een dagelijkse dosis van 0,02 mg caviae
voor scheurbuik kon behoeden. Volgens hem was methylnor-
narcotine identiek met vitamine C.

Natuurlijk werd het door Rygh gevondene spoedig ge-

controleerd. Tillmans en Hirschnbsp;Dalmer en

M oil, Ott en Packendorf, Brüggemans
Grant, Smith en Zilva s^) kwamen daarbij tot con-
clusies, die als volgt samen te vatten zijn:

1.nbsp;Methylnornarcotine of andere narcotineproducten heb-
ben geen antiscorbutische werking.

2.nbsp;Rygh's narcotine-praeparaten vertonen ten opzichte
van de indicator van Tillmans niet het voor vita-
mine C karakteristieke reductievermogen.

3.nbsp;Narcotine kan niet uit sinaasappelen geïsoleerd worden.

Het behoeft dus geen betoog, dat deze schrijvers eenparig

van mening waren, dat methylnornarcotine en vitamine C
niet identiek waren.

Rygh 98) bleef bij zijn oorspronkelijke mening. Hij vond
echter bovendien, dat bij scorbuutzieke dieren de glucuron-
zuurafscheiding in de urine ophield. Toedienen van glucuron-
zuur beïnvloedde de scorbuut niet, wel methylnornarcotine 4-
glucuronzuur. Daarom beschouwde hij nu het complex glucu-
ronzuur methylnornarcotine als de antiscorbutische factor.

Weer werden R y g h's waarnemingen gecontroleerd, maar
weer kon niemand ze bevestigen, quot;s) loo) loi) 102)

Toch hebben Rygh's publicaties wel enige verdienste
gehad. Hierdoor werd n.1. het vitamine C-probleem door ver-
schillende onderzoekers aangepakt.

Intussen hadden T i 11 m a n s lo^) medewerkers in tegen-
stelling met Zilva gevonden, dat er wel correlatie bestaat
tussen het vitamine C-gehalte en het reductievermogen ten
opzichte van de indicator 2-6-dichloorphenohndophenol.

Deze onderzoekingen brachten Szent Györgyi lo-t)
ertoe terug te komen op zijn proeven van 1928. Hij had toen
bij een onderzoek van peroxydase-systemen in plantensappen
(koolbladen en sinaasappels) en in de bijnieren van het rund
een sterk reducerende stof ontdekt. Het gelukte hem deze stof

te isoleren en het meloculairgewicht te bepalen. Uit de ele-
mentairanalyse en het moleculairgewicht volgde, dat de
samenstelling CgHgOg was. De stof gaf alle typische kool-
hydraatreacties, zodat Szent Györgyi kon besluiten, dat
het een isomeer was van glucuronzuur, hij noemde het hexuron-
zuur. Dit hexuronzuur ging hij na de pubhcatie van Till-
mans onderzoeken op de antiscorbutische werkzaamheid.
Hij 1quot;®) nam proeven met caviae en vond, dat ongeveer 1 mg
per dag deze dieren voor scheurbuik kon behoeden.

King en Waugh, loe) Ti limans, »3) Harris en
Ray 107) gji Brüggemanni®®) kregen hierna overeen-
komstige resultaten. Zij zijn overtuigd, dat het hexuronzuur
van Szent Györgyi, later ascorbinezuur i»») genoemd,
identiek is met vitamine C.

C. Constitutie van het Ascorbinezuur.

Nadat men wist, dat het vitamine C identiek is met ascor-
binezuur, werd snel gewerkt om de constitutie op te helderen.

Hieraan hebben vooral Szent Györgyi c.s., quot;o) Kar-
rer c.s., iquot;) Hirst c.s. quot;2) Micheel en Kraft quot;3)
deelgenomen.

Als resultaat van deze onderzoekingen werd de volgende
formule aangenomen.

I

o=c

2 H

H-C-O
HO—C—H

CH2OH
dehydro-ascorbinezuur

De juistheid van deze structuurformule werd tenslotte be-
wezen, door de synthetische bereiding van 1. ascorbinezuur.

De synthese is het eerst gelukt aan R ei c Hst ein H'') en
ongeveer gelijktijdig aan Haworth.

Het synthetische 1. ascorbinezuur bleek zowel bij de dier-
proef en ook als geneesmiddel voor lijders aan scheurbuik
dezelfde werkzaamheid te bezitten als het uit planten gewon-
nen materiaal.

Volgens bovenstaande formule is zowel het zure karakter
als het reducerend vermogen te danken aan de endiolgroep;
het dehydro-ascorbinezuur en het dimethyl-ascorbinezuur
hebben deze eigenschappen verloren.

Over de specifieke werking van het vitamine in het orga-
nisme is weinig bekend. Uit het feit, dat d. ascorbinezuur bij
de dierproef onwerkzaam is, blijkt wel, dat dit niet eenvoudig
te verklaren is door te wijzen op het feit, dat I. ascorbinezuur
als oxydatie-reductiesysteem kan optreden.

HOOFDSTUK IX.
BEPALING VAN HET VITAMINE C-GEHALTE.

A. Dc dierproef.

De bepaling van het vitamine C-gehalte geschiedde oor-
spronkelijk alleen met behulp van de dierproef en als proef-
dier werd meestal de cavia gebruikt. Een enkele maal werkte
men wel eens met apen, maar dit is om practische redenen
tot weinige gevallen beperkt gebleven.

Ook bij de dierproef voor de vitamine C-bepaling zijn cura-
tieve en prophylactische testmethodes in gebruik.

Bij de prophylactische methode bepaalt men de kleinste
hoeveelheid van de op vitamine C te onderzoeken stof, die
juist de proefdieren scorbuutvrij kan houden. Hiervoor wor-
den de dieren op een vitamine C-vrij gronddieet gezet en
opklimmende hoeveelheden van de stof, waarvan het vita-
mine C-gehalte bepaald moet worden, bijgevoerd. In den
beginne gebruikte men citroensap of sinaasappelsap als
controlemateriaal. Tegenwoordig neemt men hiervoor zuiver
ascorbinezuur.

Voor de scorbuutdiagnose worden de dieren geseceerd,
terwijl tevens de gewichtscurve in het oog gehouden wordt.
Bij de sectie let men voornamelijk op de toestand van de
tanden, beenderen, ribben en op hamorrhagiën.

Een andere prophylactische methode is de methode van

Höjer, waarbij gebruik gemaakt wordt van het feit, dat
reeds lang voor het optreden van duidelijke scorbuutsymp-
tomen veranderingen aan de wortels van de snijtanden ge-
vonden worden bij een histologisch onderzoek van deze
tanden.

De curatieve methode berust op het verschijnsel, dat dieren,
die op een vitamine C-vrij gronddieet leven, na enige tijd
niet meer groeien en in gewicht afnemen, waarna ze door het
voeren van de vitamine C-houdende stof weer zwaarder
worden. De toeneming van het gewicht is binnen zekere
grenzen een maat voor de hoeveelheid vitamine C, die de
dieren krijgen.

Evenals bij de vitamine A-bepaling reeds opgemerkt is,
is de biologische proef langdurig en bewerkelijk, terwijl boven-
dien de variatie in de gevoeligheid van de proefdieren een
factor is, die tot het maken van grote fouten aanleiding kan
geven.

Er is dan ook naar een chemische reactie gezocht, om het
vitamine C quantitatief te kunnen bepalen.

B. Chemische bepalingsmethodes.

Reeds in 1921 heeft B e z z o n o f f n®) een reagens voor
vitamine C aangegeven. Dit reagens, een complex phosphor-
molybdeenwolfraamzuur geeft met vitamine C-houdende op-
lossingen in zuur milieu een blauw violette kleur.

Glassmann en Posdeew n^) toonden aan, dat dit
reagens niet voor een quantitatieve bepaling van vitamine C
in aanmerking kon komen, omdat koolhydraten dezelfde
kleurreactie geven.

Daarna hebben Till mans c.s. 103) ^et 2-6-dichloor-
phenohndophenol als reagens aanbevolen. Dit wordt ook nu
nog gebruikt voor de bepaling van vitamine C. De hoeveel-

heid wordt door titratie met het 2-6-dichloorphenolindophenol
als indicator vastgesteld. De in neutraal milieu blauwe, in
zuur miheu rode kleurstof wordt door het vitamine geredu-
ceerd tot zijn leukovorm. Het eindpunt van de titratie is dus
het zichtbaar blijven van een blauwe, resp. rode kleur.

Tillmans i®®) titreerde in practisch neutraal milieu.
Door de resultaten van een groot aantal titraties te vergelijken
met die van de dierproef concludeerde hij, dat de vitamine C-
werking toe te schrijven is aan de getitreerde reducerende
stof.

Harris en Ray kregen betere resultaten, wanneer
zij de titratie van vitamine C met 2-6-dichloorphenolindo-
phenol uitvoerden in zuur milieu. De oorzaak hiervan is, dat
het vermogen om 2-6-dichloorphenolindophenol te reduceren,
een eigenschap is, die niet specifiek is voor vitamine C, maar
die alle redox-systemen bezitten, die eenzelfde of lagere
oxydatie-reductiepotentiaal dan ascorbinezuur hebben bij
een bepaalde p^^. Zij vonden, dat gluthation in zuur milieu
niet de indicator reduceerde, wèl echter onder de omstandig-
heden, waarbij Tillmans titreerde. Daar in biologisch
materiaal vaak gluthation voorkomt, raden zij aan, de titratie
in zuur miheu uit te voeren.

Ook Wolff c.s. 120) geven de voorkeur aan titratie in zuur
milieu.

Uit het voorgaande blijkt dus, dat we de op vitamine C te
onderzoeken stof in zuur milieu moeten brengen of met een
zure oplossing moeten extraheren. Hiervoor wordt meestal
3 % trichloorazijnzuur gebruikt. In dit miheu kunnen we de
titratie uitvoeren.

C. Reductie met H^S.

Daar zowel de reversibel geoxydeerde- als de gereduceerde
vorm van het ascorbinezuur antiscorbutische werkzaamheid

bezitten, is het noodzakehjk bij de titratie van de vitamine C-
waarde beide vormen te bepalen.

Met de indicator 2-6-dichloorphenolindophenol bepalen we
alleen de gereduceerde vorm van het ascorbinezuur. Wanneer
we de totale vitamine C-waarde met dit reagens willen be-
palen, dan dienen wij ervoor te zorgen, dat alle aanwezige
vitamine C in de gereduceerde vorm aanwezig is.

Dit is mogelijk met behulp van H^S, zoals T i 11 m a n s 103)
dit het eerst aangegeven heeft. De reductie geschiedt gedu-
rende 6 uur in zwak zuur miheu, omdat in alkalisch miheu
reducerende zwavelverbindingen ontstaan.

Wanneer geëxtraheerd wordt met trichloorazijnzuuroplos-
sing moet men deze voor de H2S-behandehng eerst neutrali-
seren, daar het vitamine C-gehalte bij een dergelijke zuur-
graad op den duur achteruitgaat. (Emmerie c.s. 121)^

Na afloop van de reductie moet het HgS weer geheel ver-
wijderd worden, daar dit zelf ook de indicator kan reduceren.
Om het HjS te verdrijven wordt een Nj-stroom doorgeleid.
Daarna wordt vóór de titratie de oplossing weer aangezuurd.

Door het titreren in zuur milieu na voorafgaande behan-
deling met H^S zijn we in staat in veel gevallen het vita-
mine C-gehalte nauwkeurig te bepalen.

D. De kwikacetaatbehandeling.

We kunnen echter bij deze methode in sommige gevallen
foutieve uitkomsten krijgen, doordat cysteine, ergothioneïne
en thiosulfaten 122) ju ^uur miheu ook de indicator reduceren.

Volgens Emmerie 123) k^n ^^^ cysteine, ergothioneïne
e.a. reducerende zwavelverbindingen verwijderen met behulp
van mercuri-acetaat-oplossing.

Voegt men bij een oplossing, die vitamine C naast boven-
genoemde verbindingen bevat, mercuriacetaatoplossing. dan
worden cysteine enz. gepraecipiteerd, terwijl vitamine C in

oplossing blijft. Het vitamine C wordt bij deze behandeling
reversibel geoxydeerd, zodat reductie met HgS nodig is om
het te kunnen titreren. Deze praecipitatie met kwikacetaat-
oplossing heeft tevens het voordeel, dat de rode kleurstoffen,
die in sommige vruchten voorkomen en dan de titratie on-
mogelijk maken tegelijkertijd worden verwijderd.

Na deze verbetering van de methode kunnen we deze
toch nog niet in alle gevallen toepassen, zoals blijkt uit de
publicaties van Euler en Martius ^^ van Eeke-
len en Ruyssen.

Euler en Martius verkregen door verwarming van
glucose in alkalisch miheu stoffen, die zij reductonen noem-
den. Deze reductonen reduceren de indicator 2-6-dichloor-
phenolindophenol in zuur milieu, bezitten echter geen antiscor-
butische werking. (Svirbely en Szent Györgyi

Van Eekelen en Ruyssen wezen erop, dat bij pro-
cessen, waarbij suikers verhit worden, zoals o.a. branden van
koffiebonen, bakken van brood, dergelijke reductonen ont-
staan, die niet neergeslagen worden met kwikacetaatoplossing
en in zure oplossing de indicator reduceren.

We komen dus tot de slotsom, dat niettegenstaande dit
bezwaar de titratie met de indicator 2-6-dichloorphenolindo-
phenol in zuur milieu, na praecipitatie met kwikacetaat,
momenteel de meest betrouwbare manier is om vitamine C
chemisch te bepalen. In bepaalde gevallen zal de dierproef
echter te hulp moeten worden geroepen.

HOOFDSTUK X.

BESPREKING VAN DE LITERATUUR OVER HET
VITAMINE C-GEHALTE VAN KOEMELK.

In het vorig hoofdstuk hebben we gezien, dat het vroeger
alleen mogelijk was het vitamine C-gehalte met behulp van
de dierproef te bepalen. Door verschillende onderzoekers is
deze methode ook toegepast voor de vitamine C-bepaling
van melk.

A. De Dierproef.

Chick c.s. 127) vonden in 1918, dat caviae op een vita-
mine C-vrij diëet geheel tegen scorbuut beschermd werden,
wanneer zij gemiddeld 85 cc verse melk per dag kregen.

Hart c.s. 128) onderzochten de melk van koeien, die een
verschillend diëet kregen. Zij kwamen tot het resultaat, dat
dagelijks 50 cc zomermelk, d.w.z. melk van koeien, die vers
gras kregen, voldoende was om een cavia scorbuutvrij te
houden, terwijl van wintermeik 75 cc dagelijks nodig was.
Volgens hen bevatte zomermelk dus meer vitamine C dan
wintermeik.

Tot dezelfde conclusie kwamen D u t c h e r en mede-
werkers. 129) Zij gebruikten voor hun onderzoek winter- en
zomermelk van dezelfde koeien om individuele invloeden uit
te schakelen.

Dergelijke proeven namen ook Hess c.s. i^o) Zij vonden

eveneens dat weidemelk meer vitamine C bevat dan stalmelk.
Doordat zij de melk volgens het walsenproces droogden en
enige tijd bewaarden (hetgeen zeer zeker het vitamine C-
gehalte beïnvloedt), voordat zij deze aan de caviae voerden,
hebben hun proeven echter weinig waarde.

Reyer beweerde ^^i)^ dat koeien, die op een vitamine C-
arm diëet geleefd hebben, ongeveer 2 a 3 maanden met vita-
mine C-rijk voedsel gevoerd moesten worden, voordat zij
vitamine C-rijke melk leverden. Dit laatste is niet in overeen-
stemming met de waarnemingen van Dutchcr c.s., 129) jjg
2 weken na een diëetsverandering al een duidelijk verschil in
vitamine C-gehalte van de melk vonden.

Kieferle en Zeiler i®^) vergeleken melk van koeien,
die met silage gevoerd werden met wintermeik. Zij vonden,
dat resp. 45 cc en 60 cc melk voldoende waren om caviae
scorbuutvrij te houden.

Na een dergelijk vergelijkend onderzoek kwam M c.
Leod 1®®) tot de slotsom, dat men door middel van silage-
voer de seizoenvariaties in het vitamine C-gehalte kan Voor-
komen.

Een zelfde onderzoek hadden Olson en Copeland i®^)
reeds in 1924 gedaan, waarbij zij eveneens vonden, dat
silagemelk meer vitamine C bevatte.

Tegenover Hart c.s., D u t c h e r c.s., Hess c.s. en
Reyer staan andere onderzoekers, die van diëetsverande-
ring geen invloed waarnemen, n.l. Hughes en mede-
werkers, terwijl ook de Ruyter de Wildt en Brou-
wer 1®®) bij een 2-jarig onderzoek van weidemelk en stal-
melk geen opvallend verschil in vitamine C-gehalte konden
aantonen.

B. De Chemische bepalingsmethode.

Sch lemmernbsp;en medewerkers zijn de eersten, die

een uitgebreid onderzoek naar het vitamine C-gehaUe van
de melk instelden door middel van de titratiemethode met
de indicator 2-6-dichloorphenol-indophenol.

Hun methode is als volgt: De melk werd met neutraal
loodacetaat onteiwit, de overmaat Pb. verwijderd met
Na^SO^ en afgefiltreerd. Het verkregen serum werd geti-
treerd volgens Ti limans. Zij reduceerden niet met H,S,
waardoor de reversibel geoxydeerde vorm van vitamine'c
dus niet getitreerd werd.

Het is dus geen wonder, dat zij grote schommehngen in
hun titratiewaarden kregen. Zij vonden voor melk van de-
zelfde koe op hetzelfde diëet meermalen waarden, die 90 tot
95% verschillen voor 2 opeenvolgende bepahngen. Zij ver-
klaarden deze verschillen door invloeden van temperatuur,
weersverandering en stalomstandigheden. Het is echter dui^
delijk, dat deze verschillen aan hun methode te wijten zijn.

Zelf merkten zij reeds op, dat het een nadeel van hun
methode is, dat de reduceerende factor in de onteiwitte
melk sterk achteruitgaat, nl. binnen een uur 60%.

De storingen, die hiervan het gevolg zijn, trachtten zij op
te heffen door te werken onder steeds reproduceerbare om-
standigheden, wat hun blijkbaar niet gelukt is. Daar zij de
HgS reductie niet toepasten, moet deze snelle achteruitgang
toegeschreven worden aan de reversibele oxydatie, die in
het neutrale milieu, waarin zij werkten nog sneller verloopt
dan in zwak zuur milieu. Tenslotte moet nog opgemerkt
worden, dat ascorbinezuur in neutraal milieu door loodacetaat
gedeeltelijk gepraecipiteerd wordt, zodat dit ook hun resul-
taten beïnvloed heeft.

Zij vonden per 100 cc melk hoeveelheden vitamine C die
varieerden van 0,14 tot 3,40 mg. Zij konden geen invloed
van het dieet op het vitamine C-gehalte van de melk waar-
nemen.

Na het voorafgaande is het echter duidehjk, dat we aan
hun resuhaten en conclusies niet veel waarde kunnen
hechten.

Kon, 138) cjje ook de invloed van het voedsel op het vita-
mine C-gehalte van de melk onderzocht, is de twede, die
hiervoor de titratiemethode toepaste. Hij titreerde volgens
H ar r is en Ray, dus in zuur milieu. De melk werd met
trichloorazijnzuuroplossing onteiwit. Hierna bepaalde hij het
aantal cc trichloorazijnzuurfiltraat, dat nodig is om 0,05 cc
van een 0,1% oplossing van de indicator te ontkleuren.

Een nadeel van deze methode lijkt mij het vullen van de
microburet met het melkserum inplaats van met de indicator.
Voor elke bepaling moet de microburet opnieuw schoon-
gemaakt en gevuld worden. Doordat Kon evenals Schlem-
mer c.s. het reversibel geoxydeerde vitamine C vóór de
titratie niet met HjS reduceerde, bepaalde hij ook niet het
totale vitamine C-gehalte, maar alleen de gereduceerde vorm
hiervan. Hij vond dan ook, dat het vitamine C-gehalte van
de melk zeer snel achteruit ging. Het is duidelijk, dat dit
voornamelijk aan de reversibele oxydatie te wijten is.

Uit het geringe aantal bepalingen, die hij tijdens de winter-
en zomervoeding gedaan heeft, kon hij geen conclusies trek-
ken over de invloed van het voedsel op het vitamine C-
gehalte, daar hij evenals Schlemmer te grote fluctuaties
vond in het gehalte van de melk van koeien, die hij bij ge-
lijke voedingsomstandigheden dagelijks onderzocht.

Kon publiceerde de titratiewaarden van de onteiwitte
melk. Hieruit kunnen we het vitamine C-gehalte van de melk
echter niet berekenen, daar hij niet opgaf, hoeveel trichloor-
azijnzuuroplossing hij gebruikte om de melk te onteiwitten.

HOOFDSTUK XI.

HET BEPALEN VAN HET VITAMINE C-GEHALTE
VAN KOEMELK.

Voor de bepaling van het vitamine C-gehalte van melk
moet deze eerst onteiwit worden, daar dan een helder kleur-
loze vloeistof verkregen wordt, die makkelijk te titreren is.

De melk werd onteiwit met metaphosphorzuur- of trichloor-
azijnzuur-oplossing.

Om te bepalen hoeveel HPO3 resp. CCI3COOH hiervoor
nodig is, werd een reeks buizen gevuld met 10 cc melk en
hieraan opklimmende hoeveelheden 10 % HPO3 (resp. 20 %
CCI3COOH) toegevoegd.

Het gecoaguleerde eiwit werd afgefiltreerd en de fikraten
werden opnieuw met HPO3 resp. CCI3COOH behandeld.

Gevonden werd, dat voor 10 cc melk 6 cc 10 % HPO -
oplossing of 6 cc 20 % CCl3COOH-oplossing nodig zijn om
de melk te onteiwitten.

A. Uitvoering van de bepaling.

25 cc melk worden onteiwit met 15 cc 10 % metaphosphor-
zuur- of met 15 cc 20 % trichloorazijnzuur-oplossing

5 cc van het fikraat worden dadelijk getitreerd met een
gestelde 2-6-dichloor-phenolindophenoloplossing, die zich
in een microburet bevindt (titratie vóór reductie). Omdat het
vitamine C onbestendig is in een dergelijk zuur miheu brengt

men bij de rest van het filtraat vast CaCOg, waardoor de
Pj^ ongeveer 5 wordt. Om het reversibel geoxydeerde vita-
mine C om te zetten in de gereduceerde vorm wordt in deze
oplossing 10 minuten H2S geleid; de reageerbuis, waarin de
vloeistof aanwezig is, wordt met een kurk afgesloten, waarna
men deze ongeveer 6 uur laat staan. Na de reductie wordt
10 cc van de aldus verkregen oplossing aangezuurd met
1 cc HPO3- of CClgCOOH-oplossing en de H^S wordt met
een Ng stroom verdreven. Door een loodacetaat-papiertje
boven de oplossing te houden, terwijl Ng doorgeleid wordt,
wordt gecontroleerd of alle H2S verdreven is. Hierna wordt
5 cc getitreerd met de indicator (titratie na reductie). Men
titreert tot de invallende druppel van de blauwe indicator-
oplossing, die in het zure milieu naar rood omslaat, de oplos-
sing rood kleurt. De kleuromslag is het beste waar te nemen,
wanneer men titreert in een wit porceleinen schaaltje.

Na enige oefening is het mogelijk de bepaling met een
nauwkeurigheid van 5 % uit te voeren.

B. Berekening van het vitamine C-gehalte uit de titratie-
waarden.

Titratie vóór reductie.

Stel gebruikte aantal cc indicator = x en a cc indicator
ooi mg ascorbinezuur.

Dan bevat 100 cc melk ^ X T X ^ ascorbinezuur.

Titratie na reductie.

Stel gebruikte aantal cc indicator = y.

Dan bevat 100 cc melk ^ f X ï^ X f
binezuur.

C. De bereiding en het stellen van dc oplossing van
2-6-dicliloorphenolindopIienol.

300 mg van het natriumzout van 2-6 dichloorphenolindo-
phenol worden opgelost in heet. uitgekookt water. Daarna
wordt de oplossing afgefiltreerd om onoplosbare oxydatie-
producten te verwijderen. Hierna wordt aangevuld tot 1 L.

Handelspraeparaten zijn meestal onzuiver, zodat afwegen
alleen nooit voldoende is om een oplossing van bepaalde
sterkte te krijgen. De indicatoroplossing wordt daarom ge-
steld op ascorbinezuuroplossing, waarvan het gehalte be-
paald is door titratie met een jodiumoplossing.

De ascorbinezuuroplossing verkregen we als volgt: 25 mg
ascorbinezuur worden opgelost tot een volume van 25 cc
met uitgekookt, gedestilleerd water, terwijl CO^ ingeleid
wordt om de oxydatie tegen te gaan. Bij 5 cc van deze
ascorbinezuur-oplossingen voegen we 1 cc 3 % trichloor-
azijnzuur, 1 cc 20% KJ-oplossing en 5 cc jodiumoplossing
(0,02 N.), die gesteld is op 0,02 N. natriumthiosulfaat-
oplossing. De overmaat jodium wordt met thiosulfaat terug-
getitreerd, waarbij zetmeel als indicator gebruikt wordt.

Bij deze titratie in zuur milieu reageert alleen de geredu-
ceerde vorm van ascorbinezuur met jodium en wel 1 gram-
molecule ascorbinezuur met 2 gramatomen jodium.

De indicatoroplossing wordt in een microburet gebracht.
De gestelde ascorbinezuuroplossing wordt tien maal verdund
met uitgekookt water, waarin CO^ geleid wordt. Van deze
verdunde oplossing brengen we 1 cc in een wit porceleinen
schaaltje en voegen daarbij 3 cc water en 1 cc 3 % trichloor-
azijnzuur-oplossing. Hierna kan op de beschreven wijze
getitreerd worden.

De indicator-oplossing wordt in het donker bewaard en
wordt iedere week opnieuw gesteld.

D. Toevoeging van een bekende hoeveelheid vitamine C.

Om te controleren of bij deze methode om vitamine C te
bepalen geen verhezen optreden, werd aan melk, waarvan
eerst het vitamine C-gehalte bepaald was een bekende hoe-
veelheid ascorbinezuur toegevoegd. Nadat opnieuw het
vitamine C-gehalte van deze melk bepaald was, kon bere-
kend worden of de toegevoegde hoeveelheid ascorbinezuur
met deze methode quantitatief teruggevonden werd.

Tabel 24.

Uit tabel 24 blijkt, dat de toegevoegde hoeveelheid ascor-
binezuur binnen de proeffout werd teruggevonden.

E. De kwikacetaatmethode.

Zoals op blz. 72 reeds opgemerkt is, kunnen met behulp
van kwikacetaatoplossing de bij de titratie in zuur milieu
storende stoffen, cysteïne, ergothioneïne e.a. reducerende
zwavelverbindingen verwijderd worden. Daarom heb ik de
melk met kwikacetaat onteiwit.

Hiervoor werd bij 25 cc melk 15 cc 20 % kwikacetaat-
oplossing gevoegd. De gecoaguleerde eiwitten werden afge-
filtreerd, het filtraat met H^S behandeld en het HgS, dat
ontstaat, afgefiltreerd. Hierna werd nog enige minuten HgS
ingeleid en de reageerbuis, waarin de oplossing zich bevond

met een kurk afgesloten. Na 6 uur werd de overmaat HgS
op de reeds beschreven wijze verdreven. Na aanzuren met
3 % trichloorazijnzuur-oplossing werd het reducerend ver-
mogen met de indicator-oplossing bepaald.

Uit onderstaande tabel blijkt, dat met deze methode
dezelfde waarden gevonden werden als bij het onteiwitten

met HPO3.

Tabel 25.

We kunnen hieruit concluderen, dat er in de onteiwitte
melk geen reducerende stoffen aanwezig zijn, die door
kwikacetaat verwijderd kunnen worden.

HOOFDSTUK XII.

RESULTATEN VAN HET VITAMINE C-
ONDERZOEK VAN KOEMELK.

Volgens de methode, die in het vorig hoofdstuk beschre-
ven is, werden de melkmonsters, die ik voor de carotine-
en vitamine A-bepaling gebruikte ook op hun vitamine C-
gehalte onderzocht.

Zoals reeds bij het vitamine A-onderzoek is medegedeeld,
werd de melk van de koeien uit Hoorn onderzocht om de
invloed van diëetsverandering op het vitaminen-gehalte na
te gaan.

Het is duidelijk, dat we hiervoor de werkelijk geprodu-
ceerde hoeveelheid vitamine moeten bepalen. Het transport
mag dus geen invloed op de resultaten van de bepalingen
hebben. In tegenstelling met het carotine- en vitamine A-
gehalte gaat het vitamine C-gehake tijdens het vervoer
achteruit. Daarom werd de melk in Hoorn direct na het mel-
ken volgens de op blz. 78 beschreven methode onteiwit, ge-
neutraliseerd en met HgS verzadigd verstuurd.

Onder deze omstandigheden blijft het vitamine C-gehalte
constant en was het dus mogelijk het oorspronkelijke vita-
mine C-gehalte te bepalen.

A. Het vitamine C-gehalte van rauwe melk.

Zoals uit de tabellen 8-12 (blz. 94) blijkt, werd een ge-

middeld vitamine C-gehalte gevonden van 2,1 mg/100 cc
melk, terwijl de waarden varieren tussen 1,6 mg en 2,65
mg/100 cc melk. Het gemiddelde gehalte van de melk van
alle stallen tijdens de weideperiode was 2,08 mg/100 cc,
terwijl dit in de stalperiode 2,17 mg/100 cc was.

Er is dus wat het vitamine C-gehalte betreft, practisch
geen verschil waar te nemen tussen stal- en weidemelk,
zoals ook in fig. VI te zien is.

Het gemiddelde vitamine C-gehalte van de melk
van stal 1 was 2,00 mg/100 cc,
„ 2 „ 2,09 mg/100 cc,
„ 3 „ 2,17 mg/100 cc,
„ 4 „ 2,24 mg/100 cc,
„ 5 „ 2,15 mg/100 cc.
Hieruit blijkt, dat het vitamine C-gehalte van monsters
van verschillende herkomst practisch geen verschillen ver-
tonen.

B.nbsp;Het vitamine C-gehalte van gepasteuriseerde melk.

Zoals te verwachten was, heeft gewone gepasteuriseerde
melk een lager vitamine C-gehalte dan rauwe melk. (tabel
14 en fig. VII). De waarden varieren van 0,26—1,07 mg/
100 cc melk. Het gemiddelde gehalte was 0,6 mg/100 cc.

Daarentegen is het gehalte van „Stassanomelkquot; practisch
gelijk aan dat van rauwe melk. (zie tabel 15 en fig. VII).
Het gemiddelde hgt hier bij 1,90 mg per 100 cc, terwijl de
grenzen 1,54 en 2,24 mg per 100 cc melk zijn.

C.nbsp;Invloed van het diëet van de koe op het vitamine
C-gehalte van de melk.

In de tabellen- 16—22 (blz. 99) is het vitamine C-gehalte
aangegeven van de melk van de koeien, die verschillende

2.20
2.00
I.SO
1.60
1,40
1.20
1.00
0,80
0.60
0,40
0.20

I I I I I I I_L.

M.(j \/iT.C^rooc.c McLu

2X0
2.20
2.00
1.80
1.60
1.4 0
1.2 0
1.00
o.ao
0.6Q
Q.AO
0.20

'/lO

Fig. VII. Melk uit Hoorn. Vitamine C.

diëten kregen. De samenstelling van deze diëten is in hoofd-
stuk V besproken.

Zoals uit de tabellen blijkt zijn de verschillen in vitamine C-
gehalte van de melk van de koeien onderling niet groot, dit
is nog beter te zien, wanneer we het gemiddelde vitamine C-
gehalte van de melk van de koeien onderhng vergelijken.

Het gemiddelde vitamine C-gehalte van de melk
van koe 4 is 2,15 mg per 100 cc melk,
21 „ 1,84 mg „ 100 „
„ 27 „ 2,06 mg „ 100 „
., 29 „ 1,89 mg „ 100 „
„ 42 „ 2,03 mg „ 100 ..
„ 46 „ 1,68 mg „ 100 „
„ „ 68 „ 2,00 mg „ 100 „

Daar de verschillen in de door de koeien geproduceerde
hoeveelheid melk vrij groot zijn, zien we, dat er geen ver-
band bestaat tussen de melkproductie en het vitamine C-
gehalte.

In Fig. VIll is het gemiddelde vitamine C-gchalte van de
melk van de 7 koeien aangegeven gedurende de verschil-
lende voederperioden. Hieruit blijkt, dat het vitamine C-
gehalte weinig verandert, wanneer de koe een ander diëet

krijgt.

Tijdens de weideperiode werden de laagste waarden ge-
vonden, de verschillen zijn echter niet groot.

/v.c?. l//r. C//OO c c. nELi^
2.40

2.20
2.oa
I.ÖO
1.60
1.40
1.20
1,00
0.80
0.60
Q./O
0.20

J_I_I_I '

%nbsp;5/4nbsp;3/5

Fig. VIII. Gepasteuriseerde en rauwe melk uit Utrecht.

HOOFDSTUK XIII.

BESPREKING VAN DE RESULTATEN.

Zoals we uit het literatuuroverzicht gezien hebben, werd
door de onderzoekers het carotine- en vitamine A-gehalte
van botervet bepaald, zodat we hun resultaten moeten ver-
gelijken met de waarden, die ik per gram vet gevonden heb.

Hieronder volgen de waarden van het carotine- en vita-
mine A-gehalte uit de literatuur.

Tabel 26.

lt;8

Moore

Booth—Moore «8) . . .
Baumann, Steenbock

Baumann, Steenbock

Gillam, Heilbronnbsp;. .

Gillam, Heilbronnbsp;.nbsp;.

Eigen onderzoek . .nbsp;. .

winterboter

zomerboter

winterboter
zomerboter
winterboter

zomerboter

winterboter
zomerboter
winterboter
zomerboter
winterboter
zomerboter
winterboter
zomerboter

1nbsp; Steenbock neemt aan E ^ = 1300, tegenwoordig wordt hiervoor
1600 aangenomen, de cijfers tussen haakjes geven de waarden aan, om-
gerekend op dit bedrag.

De gegevens van zomer- en winterboter, die de Engelsen
hebben gepubliceerd, komen overeen met die, welke ik ge-
vonden heb, de Amerikanen geven echter hogere waarden
aan. In Amerika worden echter ook vaak afwijkende waarden
voor het vetgehalte gevonden.

De snelle achteruitgang in het carotine- en vitamine A-
gehalte, wanneer de koe vanaf de weide een z.g. winterdiëet
krijgt, is zeer merkwaardig, vooral wanneer we in aanmer-
king nemen, dat de geproduceerde hoeveelheden carotine en
vitamine A in de melk slechts een zeer gering deel zijn van
de opgenomen hoeveelheid carotine. Dit blijkt wel, wanneer
we de cijfers nemen van periode I, waarin de koeien een
normaal Hollands winterdiëet kregen. De koeien kregen met
hun voedsel 15600 intern, eenh. per dag, terwijl bij een ge-
middelde dagelijkse melkopbrengst van 15,4 L en een ge-
middelde vitamine A-waarde van 21 intern, eenh. de gepro-
duceerde hoeveelheid 323 intern, eenh. bedraagt. Hieruit
zien we, dat de afgescheiden hoeveelheid slechts 2% is van
de opgenomen hoeveelheid.

Hoewel gebleken is, dat het carotinegehalte van het voed-
sel een grote invloed heeft op het carotine- en vitamine A-
gehahe van de melk resp. de boter, en het laatste op en neer-
gaat met het eerste, bestaat er toch geen evenredigheid,
zoals uit onderstaande tabel blijkt.

In tegenstelling met de resultaten van het grootste deel der

onderzoekers, die het vitamine C met behulp van de dier-
proef bepaalden, bleek mij, dat er van een invloed van het
diëet op het vitamine C-gehalte van de melk geen sprake is.
Alleen Brouwer, de Ruyter de Wildt i®«) en
Hughes i®®) zijn bij hun dierproeven tot hetzelfde resul-
taat gekomen.

Het is echter in overeenstemming met het feit, dat avita-
minose C bij runderen eigenlijk niet bekend is. Wel heeft
men enkele malen een ziekte beschreven, die iets op scorbuut
leek, maar een bewijs, dat hier werkelijk scheurbuik aanwezig
was, werd niet gegeven.

Thurnston, Palmer en Eckles, i®») die een onder-
zoek instelden naar de avitaminose C bij runderen konden
geen scheurbuik aantonen. Kalveren, die op een vitamine C-
vrij diëet gezet werden, groeiden op dit rantsoen even snel
als de controledieren, die bovendien als extra vitamine C-
bron nog tomatensap kregen.

Bovendien vonden zij in de lever van de kalveren, die een
vitamine C-vrij dieet kregen wel vitamine C, hetgeen dus een
bewijs is, dat het rund het vermogen bezit vitamine C zelf

te synthetiseren.

Brouwer en De Ruyter de Wildtnbsp;konden

deze proeven bij geiten bevestigen.

Na een publicatie van de waarden, die ik gevonden had,
delen Har ris en Ray iquot;) mede, dat zij volkomen over-
eenstemmende waarden gevonden hebben voor het vita-
mine C-gehalte van koemelk in Engeland en dat zij dus ook
geen invloed gevonden hebben van het diëet of het seizoen
op het vitamine C-gehalte van de melk.

SAMENVATTING.

Voor de bepaling van het carotine- en vitamine A-gehalte
van melk werd een chemisch-colorimetrische bepalings-
methode gegeven.

Hierbij wordt de melk na verzeping geëxtraheerd met pe-
troleumaether. Het carotine wordt colorimetrisch bepaald
door meting van de intensiteit van de gele kleur van het
petroleumaether extract in de Lovibondtintometer, terwijl
voor de bepaling van het vitamine A de intensiteit van de
blauwe kleur, die met SbClg ontstaat eveneens in de Lovi-
bondtintometer gemeten wordt.

Xanthophyl en lycopine werden niet in dergelijke hoeveel-
heden gevonden, dat ze storend werkten bij de bepaling van
carotine.

De invloed van het voedsel van de koe op het carotine- en
vitamine A-gehalte van de melk werd nagegaan. Het carotine-
en vitamine A-gehalte van de melk bleek op en neer te gaan
met de hoeveelheid carotine in het voedsel, er bestond echter
geen evenredigheid. Door kuilgrasvoeding krijgt men in de
winter melk met een hoger vitamine A- en carotine-gehalte
dan bij normale wintervoeding.

De verschillen in carotine- en vitamine A-gehalte van de
melk van de kofeien onderling op hetzelfde dieet waren klein,
zelfs wanneer de dagelijkse melkproductie zeer uiteenliep,
zodat de dagelijkse carotine- en vitamine A-productie min of
meer evenredig is met de dagelijkse melkproductie.

De resultaten van de chemisch-colorimetrische methode
werden vergeleken met die van de biologische, waarbij een
overeenkomst werd gevonden.

Bovendien werd het vitamine C-gehalte van melk bepaald.

Hiervoor werd de melk onteiwit, met HgS behandeld en in
zuur miheu getitreerd met de indicator 2-6-dichloorphenolin-
dophenol.

Er bleek geen invloed van het voedsel van de koe op het
vitamineC-gehalte van de melk te bestaan.

Gepasteuriseerde melk (Dauerpasteurisatie) heeft een veel
lager vitamine C-gehalte dan rauwe melk, terwijl bij pasteuri-
satie volgens de nieuwere methodes (o.a. Stassano) het vita-
mine C-gehahe practisch gelijk is aan dat van rauwe melk.

5,6
4,6
6.0
10,0
8,0
8,4

9.4

5.6

1.5

2,3
2,2

1,9

3.5
3,3

2.7
2.9
2.7
2,3

8,0
8,1

6.6
7,3
8,0

9—10
16—10
23—10
30—10
6—11

13—11
20—11
27—11

4—12
11—12
8—1
15—1

29—1
12—2
26—2
12—3

23—4

30—4
7—5

14—5
22—5

PERIODE I.

Gemidd. dagel. melkopbrengst 10,88 kg.