
m



	S.-V .
p.»

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT
OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS
DR. W. E. RINGER, HOOGLEERAAR IN DE FACULTEIT
DER GENEESKUNDE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT TE VERDEDIGEN
TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT
DER WIS- EN NATUURKUNDE OP MAANDAG
7 DECEMBER 1936, DES NAMIDDAGS TE 4 UUR
DOOR

Nu door het verschijnen van dit proefschrift mijn studie aan
deze Universiteit een einde heeft genomen, voel ik mij ge-
drongen U. Hoogleeraren, Oud-Hoogleeraren en Lectoren in
de Faculteit der Wis- en Natuurkunde, mijn hartelijke dank
uit te spreken voor alles, wat Gij aan mijn wetenschappelijke
opleiding hebt bijgedragen.

Hooggeleerde DE GRAAFF, Hooggeachte Promotor, mijn
dank gaat wel in het bijzonder naar U uit. die mij in de ge-
legenheid stelde, deze dissertatie zelfstandig te bewerken en
mij van de groote paedagogische waarde van een dergelijk
onderzoek overtuigde.

Ook voor Uw groote belangstelling in mijn werk en voor
Uw critiek. die mij niet alleen voor het nemen van overijlde
conclusies behoedde, maar die mij ook in moeilijke oogenhlik-
ken de te volgen weg duidelijk maakte, zal ik U steeds ten
zeerste erkentelijk blijven.

Tenslotte dank ik het personeel van het Pharmaceutisch
Laboratorium voor de door hen verleende medewerking.

Reeds in de oudheid heeft de mensch te zijnen behoeve
gebruik gemaakt van microbiologische processen. Het is
vooral de bereiding van alcoholhoudende dranken geweest,
die — hoewel in de aanvang natuurlijk nog geheel onbewust
en onbegrepen — hem in aanraking met de micro-organismen
bracht. Het duurde geruime tijd, alvorens in de 17de eeuw
onze landgenoot Antonie van Leeuwenhoek met
behulp van zijn eigenhandig geconstrueerde microscoop voor
het eerst de bacteriën waarnam. Hoewel al spoedig gevonden
werd, dat deze ééncelhge „diertjesquot; ook in gistende en rot-
tende zelfstandigheden voorkwamen, en ook, dat door lang
voortgezet koken, zelfs bij langdurig bewaren onder goede
afsluiting van de lucht, ontleding voorkomen werd, was het
toch pas in de 19de eeuw, voordat Pasteur er in mocht
slagen, zijn meening, dat gisting het uitsluitend gevolg was
van de werkzaamheid van micro-organismen te doen zege-
vieren. Van deze tijd dateert het eigenlijke begin der micro-
biologische wetenschap. Hoewel betrekkelijk jong, heeft de
industrie zich al spoedig meester gemaakt van haar belang-
rijke uitkomsten. Naast de alcoholindustrie, moge hier als
voorbeeld mede de azijnzuurindustrie genoemd worden, waar
volgens verschillende methoden de alcohol door azijnbacteriën
tot azijnzuur wordt geoxydeerd. Een andere belangrijke gis-

ting, zij het niet door bacterie-, dan wel door schimmel-
werking, is de vorming van citroenzuur uit glucose door
verschillende soorten van de geslachten Citromyces en
Aspergillus i).

Tijdens de wereldoorlog werd aceton en daarnaast butyl-
alcohol 2) op groote schaal door vergisting van koolhydraten
bereid, terwijl ook de gewone alcoholische gisting door het
z.g. sulfietproces volgens NeubergS) omgezet werd in
een glycerinegisting, d.w.z. een gisting, waarbij glycerine
hoofdproduct is.

Sorbose is een stof, die door B. xylinum uit lijsterbessen 4)
of uit zuivere sorbiet^) verkregen wordt.

Dioxyaceton wordt technisch^) gemaakt; het is voor pre-
paratieve doeleinden zeer gemakkelijk met behulp der sorbose-
bacteriën te bereiden 7).

Tenslotte moge als voorbeeld van een synthese door levende
organismen nog genoemd worden het kojizuur, dat volgens
voorschrift van M a y en medewerkers 8) uit glucose bereid
wordt door hierop Aspergillus flavus te enten. Hoewel het

2)nbsp;Literatuuroverzicht bij H. J. L. Donker, Bijdrage tot de kennis
der boterzuur-, butylalcohol- en acetongistingen, diss. Delft 1926.

s) C. Neuberg en E. Reinfurth: Bio. Z. 89, 365 (1918), 92,
234 (1918). B. 52, 1677 (1919).

8)nbsp;O. E. May, A. J. Moyer, P. A. Wells en H. T. Herrick:
J. Am. Chem. Soc. 53, 774 (1931).

chemisme van deze reactie nog niet opgehelderd is, kan men
zich voorstellen 1), dat het glucosemolecule daarbij gesphtst
wordt in twee triosemoleculen en dat hieruit, door directe
synthese, het kojizuur gevormd wordt:

In het voorbijgaan moge hier nog de aandacht worden
gevestigd op het verband, dat tusschen gisting en ademhaling
schijnt te bestaan. Reeds Pasteur doelde hierop, toen hij
de gisting als een anaërobe ademhaling voorstelde. P f e f f e r
heeft dit later nog eens onderstreept, toen hij betoogde, dat
er tusschen gisting en ademhaling feitelijk geen principieel
verschil was. Bij de gisting worden de tusschenproducten
opgehoopt, bij de ademhaling worden zij opgeruimd, slechts
onder zeer bijzondere omstandigheden niet. Bij de adem-
haling zijn dan ook kooldioxyde en water de eenig aantoon-
bare eindproducten.

Niettegenstaande een minitieus onderzoek, waaraan vele
onderzoekers deelnamen, is toch van zeer vele der genoemde
ontledingen het verloop en het wezen der reactie bij lange na
niet opgehelderd, maar al te dikwijls heeft men zich tot een
chemie op papier moeten beperken.

Van de gewone alcoholische gisting werd door L a v o i s i e r
in het einde der 18de eeuw gevonden, dat daarbij alcohol en
kooldioxyde ontstaan. Vijfentwintig jaar later stelde men
daarvoor de volgende formule op:

In 1897 ontdekte B u c h n e r, dat ook celvrij perssap de
gisting tot stand kon brengen.

Vele theorieën zijn er in de loop der tijden over het che-
misme opgesteld. Het is onnoodig deze hier te herhalen. Ook
het bekende schema van Neubergi), dat zich, ondanks
zijn bezwaren, gedurende twintig jaar heeft kunnen hand-
haven, wordt thans weder verlaten; desondanks mogen
zeker de groote verdiensten en voordeelen, die het gehad
heeft, niet vergeten worden, omdat het in hooge mate er
toe heeft bijgedragen ons inzicht te verruimen.

Willen wij een indruk geven, op welke wijze men zich
thans het verloop der gisting voorstelt, dan moet er allereerst
op worden gewezen, dat de tegenwoordige inzichten over de
alcoholische gisting vooral het gevolg zijn van de grond-
leggende onderzoekingen van E m b d e n en zijn mede-
werkers over de glycolyse.

Wij zullen daarom met een zeer korte beschouwing, aan
dit proces gewijd, beginnen, te meer, omdat het ook uit een
ander oogpunt van belang is, nl. om het feit, dat hierbij
melkzuur gevormd wordt, welke stof ook bij vele bacteriëele
suikervergistingen een groote rol speelt of althans schijnt
te spelen.

Bij beide processen neemt het fosforzuur een belangrijke
plaats in. Reeds Harden en Young hadden in 1905 bij
de celvrije gisting een fructosedifosforzure ester geïsoleerd.
E m b d e n slaagde er in uit de spier een hexosemonofosfor-
zure ester te isoleeren, het zoogenaamde lactacidogeen. In
beide gevallen neemt dus het fosforzuur aan de totstand-
koming van het reactieverloop actief deel.

Volgens Lohmann^) is de glycolyse van het glycogeen
alleen mogelijk, indien adenosine-trifosforzuur aanwezig is.

1)nbsp;C. Neuberg: Die Gärungsvorgänge und der Zuckerumsatz der
Zelle, Jena 1913.

De structuur van deze verbinding wordt door genoemde
onderzoeker als volgt aangenomen: i)

Par nas 2) meent nu, dat de twee fosforzuurresten, die
als pyrofosforzuur aanwezig zijn, direct, onder opname van
één molecule water op één glycogeen-eenheid (=C6H]o05)
worden overgedragen, waarbij een fructosedifosforzuur ont-
staat.

Het ontstaan van deze verbinding is het begin van de
glycolyse, die volgens E m b d e n 3), dan als volgt zou ver-
loopen.

Door intramoleculaire omzetting en daarop volgende split-
sing ontstaan uit het fructosedifosforzuur één molecule
dioxyacetonfosforzuur en één molecule glycerinealdehyde-
fosforzuur, die dismutatief met elkaar reageeren onder vor-
ming van glycerinefosforzuur en glycerinezuurfosforzuur
(fosfoglycerinezuur).

Door Embden en Deuticke^) is aangetoond, dat
het glycerinezuurfosforzuur in de spier fermentatief ontleed
wordt in pyrodruivenzuur en fosforzuur. Voor het mecha-

Melkzuur wordt gevormd door een oxydo-reductie van
pyrodruivenzuur en glycerinefosforzuur, waarbij dit laatste
tot glycerinealdehydefosforzuur wordt geoxydeerd. Dit
glycerinealdehydefosforzuur gaat door dismutatie over in
glycerinefosforzuur en glycerinezuurfosforzuur, welke stoffen
ook in het begin van het schema voorkomen. Het blijkt dus,
dat op deze wijze successievelijk alles in melkzuur overgaat,
welke stof als eindproduct kan worden beschouwd:

1) K. Lohmann en O. Meyerhof: Bio. Z. 273, 60 (1934).
O. Meyerhof en W. Kiessling: Bio. Z. 276, 239 (1935).

cooh

ch,

Wat nu de alcoholische gisting betreft, is het begin te
zoeken in de zoogenaamde fosforyleering van het hexose-
molecule, waarbij eerst een monofosforzure ester, de z.g.
Robison-ester, ontstaat (die waarschijnlijk identiek is met
het lactacidogeen van E m b d e n) en vervolgens een di-
fosforzure ester, de z.g. Harden-Young-ester 1). Deze laatste
splitst zich nu op de wijze, als is aangegeven in het schema
van E m b d e n, in glycerinefosforzuur en glycerinezuur-
fosforzuur. Uit dit laatste ontstaat weer pyrodruivenzuur, dat
onder de invloed van de carboxylase wordt gesplitst in
aceetaldehyde en kooldioxyde. Het aceetaldehyde reageert

met het aanwezige glycerinefosforzuur op oxydo-reductieve
wijze, waardoor glycerinealdehydefosforzuur en aethyl-
alcohol ontstaan:

Wat de verschillende genoemde tusschenproducten betreft,
zijn glycerinefosforzuur en glycerinezuurfosforzuur bij de
celvrije gisting inderdaad aangetoond, het dioxyacetonfosfor-
zuur bij de glycolyse; slechts de omzetting in glycerinealde-
hydefosforzuur is nog zuiver hypothetisch.
Het valt in het boven uiteengezette schema op, dat het
methylglyoxaal, dat bij Neuberg een zoo op de voor-
grond tredende, belangrijke plaats inneemt, geheel niet meer
genoemd wordt.

Dat Neubergi) bij zijn vijfde vergistingsvorm uitslui-
tend methylglyoxaal vindt, is volgens Meyerhof2) te
verklaren uit het feit, dat het glycerinealdehydefosforzuur
gemakkelijk in methylglyoxaal overgaat. In de genoemde ver-
gistingsvorm werkt Neuberg met, aan co-ferment sterk
verarmd, gistextract (plasmolysesap), terwijl de normale dis-
mutatie van het glycerinealdehydefosforzuur slechts in tegen-
woordigheid van co-ferment tot stand komt, zoodat door het
ontbreken van dit lichaam het glycerinealdehydefosforzuur
gelegenheid krijgt zich om te zetten tot methylglyoxaal.

1)nbsp;C. Neuberg en M. Kobel: Bio. Z. 203, 463 (1928); 210 466
(1929); 229, 255 (1930).

vormen de biologische oxydaties. Hun beteekenis ligt hierin,
dat zij, zooals W i e 1 a n d het voor het eerst heeft aange-
toond, in een zuurstofvrij medium kunnen verloopen.

Wel was reeds lang bekend, dat de oxydeerende werking
in de cel van fermenten uitging, maar W i e 1 a n d was de
eerste, die deze werking nader bestudeerde en er een plau-
sibele voorstelling van gaf.

In 1913 publiceerde hij zijn dehydreeringstheorie, die, in
enkele woorden samengevat, zegt, dat biologische oxydaties
eigenlijk dehydreeringen zijn, d.w.z. dus niet verloopen onder
opneming van zuurstof, maar onder afgifte van waterstof.
Deze waterstof kan zich daarbij met verschillende stoffen,
v/aterstofacceptoren genaamd, verbinden en zich dus aan
directe waarneming onttrekken.

In de cel voltrekt de oxydatie zich echter wel met behulp
van zuurstof. Toch speelt ook hier het dehydreeringsferment,
dehydrase genaamd, de belangrijkste rol, want volgens
W i e 1 a n d is zuurstof de natuurlijke waterstofacceptor, die
zich met de, door de dehydrasen geactiveerde, waterstof ver-
bindt; hierbij ontstaat evenwel geen water, maar waterstof-
peroxyde:

Inderdaad is in enkele gevallen dan ook waterstofperoxyde
gevonden i), maar daar in bijna alle levende cellen katalase
voorkomt, zal het nooit tot een ophooping van deze, voor de

J. W. McLeod en J. Cordon: J. path. Bact. 25, 139 (1922);
26, 326, 332 (1923); 28, 155 (1925); Biochem. J. 16, 499 (1922).

Volkomen in overeenstemming met deze voorstelling van
zaken is het feit, dat in de cellen van anaërobe organismen
geen katalase voorkomt. Dit enzym is ook niet noodzakelijk;
immers, waar deze organismen slechts in een zuurstofvrije
omgeving kunnen leven, zal er van vorming van waterstof-
peroxyde geen sprake zijn.

Wat de aard der dehydrasen betreft, hierover zijn wij nog
zeer slecht georiënteerd. Het behoeven echter geen stoffen
te zijn van een buitengewoon ingewikkelde samenstelling.
Wij kunnen ons glutathion als een dehydrase denken:

Deze stof is zoowel een waterstofactivator als een water-
stofoverdrager. Zij wordt dan ook in bijna alle levende weef-
sels en cellen aangetroffen. Aan de lucht treedt echter oxy-
datie op, waarbij waterstofperoxyde ontstaat, omdat de zuur-
stof weder als waterstofacceptor dienst doet:

Dit geoxydeerde product kan nu weer door waterstof-
donatoren gereduceerd worden. Onder anaërobe omstandig-
heden zal er, zoodra het bovengenoemde product (aan te
duiden als G.S.S.G) totaal gereduceerd is, geen verdere over-
dracht van waterstof plaats vinden. Is er echter een water-
stofacceptor, b.v. methyleenblauw, aanwezig, dan zal dit de
waterstof van het gevormde glutathion opnemen, waardoor
dit weer in G.S.S.G overgaat en dan weer reduceerbaar is.

Wat het voorkomen van glutathion in bacteriën betreft,
het is reeds aangetoond bij B. alcaligenes, B. pyocyaneum,
B. prodigiosum en B. fluorescens i).

Er moet hier op gewezen worden, dat het vrijmaken van
twee waterstofatomen niet op zichzelf plaats vindt, daar dit

een reactie is, die verloopt onder toename van de vrije
energie. Door de hydreering van de acceptor neemt de vrije
energie echter meer af, dan zij toeneemt door de dehydreering
van de donator, zoodat het eindresultaat toch een afneming
van de vrije energie is, wat een noodzakelijkheid voor het
verloopen van een chemische reactie is.

Wat de dehydrasen doen, is een activeeren van de water-
stofatomen. De bij de dehydreeringsreacties vrijkomende
energie wordt door de cel voor haar levensverrichtingen
gebruikt.

Onder de melkzuurbacteriën komen er enkele voor, die
geen katalase bevatten: B. Delbrücki, B. iugurt en B. acido-
philus. Bij oxydatieve gistingen door deze organismen is dan
ook veel waterstofperoxyde gevonden i).

Een geheel ander gistingstype geeft ons de glucosevergis-
ting door de bacteriën der coli-typhusgroep te zien. Men
wordt vooral getroffen door het groote aantal stoffen, dat
hierbij ontstaat. Naast de normale producten der gewone
alcoholische gisting, als aethylalcohol en kooldioxyde, en van
die der glycolyse, melkzuur, worden hier bovendien nog aan-
getroffen: waterstof, mierenzuur, azijnzuur, barnsteenzuur en
soms ook acetylmethylcarbinol en 2-3 butyleenglycol; deze
twee laatstgenoemde stoffen bij vergisting door B. lactis
aerogenes en eenige typen van B. pneumoniae 2).

Over het verloop van deze gisting, de z.g. gemengd-zure
gisting, zijn in de literatuur zeer verschillende meeningen
geuit. Wij zullen hiervan slechts enkele noemen, zonder daar-
bij de bedoeling te hebben het vóór en het tegen hiervan aan
een critische bespreking te onderwerpen.

De eerste onderzoeker, die zich een voorsteUing poogde
te vormen van deze gisting, was Hardeni), die de vol-
gende formuleering gaf:

Hij stelt zich twee verschillende reacties voor, waarvan
ééne uitsluitend tot de vorming van melkzuur zou leiden. De
beide gasvormige producten, waterstof en kooldioxyde,
zouden het uitsluitend gevolg zijn van een splitsing van
mierenzuur:

In 1914 gaf Grey2) een schema, waarin hij wel spreekt
over dit zuur, maar er in zijn schema toch geen plaats voor
inruimt. Ook deze onderzoeker ziet het proces in twee deelen
voltrokken, waarvan het ééne zich tot melkzuur stabiliseert
en het andere, via een metastabiel tusschenproduct, tot
mierenzuur en aceetaldehyde leidt.

In het mierenzuur zoekt G r e y eveneens de oorzakelijke
bron van waterstof en kooldioxyde.

Het aceetaldehyde gaat door een Cannizarro-reactie over
in aethylalcohol en azijnzuur:
CeHigOfl

Aan NeubergenGorri) is het gelukt methylglyoxaal
met behulp van B. coli om te zetten in melkzuur. Op grond
hiervan stellen zij een schema voor de gemengd-zure gisting
op, dat aanvankelijk verloopt als de alcoholische gisting (vol-
gens schema van Neuberg), nl. tot de trap van het
methylglyoxaalhydraat. Dit stabiliseert zich dan gedeeltelijk
tot melkzuur en gedeeltelijk tot pyrodruivenzuur:

Ook De Graaff2) ziet het gistingsproces bestaande
uit twee van elkaar onafhankelijke reacties. Het glucose-
molecule wordt in tweeën gesplitst. Het ééne deel stabiliseert
zich tot melkzuur, het andere deel gaat over in pyrodruiven-
zuur en waterstof. Het pyrodruivenzuur wordt gedecarboxy-
leerd, waarbij aceetaldehyde ontstaat en uit dit aceetaldehyde
worden door de volgende reacties de verschillende gistings-
producten gevormd:

2)nbsp;W. C. d e G r a a f f : Ned. Tijdschr. voor Hyg., Microbiol, en Serol.
1, 43 (1926).

Virtaneni) denkt zich de zaak weer anders. Aan de
ééne kant ontstaat, via een hexosefosfaat, methylglyoxaal en
aan de andere kant geeft een directe splitsing van het glu-
cosemolecule aanleiding tot het ontstaan van barnsteenzuur
en aceetaldehyde.

Tenslotte nog de voorstelling, welke Scheffer2) en
Kluyver 3) van de gemengd-zure gisting ontworpen
hebben.

Zij nemen allereerst een fosforyleering van het hexose-
molecule aan met daaropvolgende splitsing in 2 Cs-stukken,

2)nbsp;M. A. Scheffer: De suikervergisüng door bacteriën der coli-
groep, Diss. Delft, 1928.

®) A. J. Kluyver: The chemical activities of microorganisms, Univ.
London Press, 1931.

glycerinealdehyde, die door intramoleculaire reactie over-
gaan in methylglyoxaalhydraat. Deze laatste stof ondergaat
nu een drietal ontledingen:

c.nbsp;ontleding in pyrodruivenzuur en waterstof en decar-
boxylatie van het pyrodruivenzuur, waarbij aceetalde-
hyde ontstaat.

Voor het ontstaan van barnsteenzuur nemen zij een andere
splitsing van het hexosemolecule aan, nl. in een C4-stuk en
een Ca-stuk, resp. wijnsteenzuurdialdehyde en glycol. Uit
het eerste moet nu door een intramoleculaire omzetting barn-
steenzuur, uit het glycol aceetaldehyde ontstaan.

Het uit deze drie bronnen afkomstige aceetaldehyde kan
door Cannizarro, condensatie en reductie de verschillende
gistingsproducten geven: aethylalcohol, azijnzuur, acetyl-
methylcarbinol en 2-3 butyleenglycol (zie blz. 17).

Ook dit schema toont nog zwakke punten, als b.v. de ver-
klaring voor de vorming van acetylmethylcarbinol langs het
z.g. pyrodruivenzuurschema en dan mede het ontstaan van
barnsteenzuur.

Duidelijk is wel, dat de suikervergisting door de bacteriën
der coli-typhusgroep een ingewikkeld proces is. Om hier-
van een bevredigende verklaring te geven, zal het hoogst
wenschelijk zijn eerst de verbindingen met een geringer aantal
koolstofatomen op hun ontleedbaarheid te onderzoeken, om,
met de gegevens hierdoor verkregen, te trachten met meer
zekerheid conclusies te kunnen trekken aangaande het eigen-
lijke wezen der gemengd-zure gisting. Het belang hiervan
springt des te meer in het oog, als men bedenkt, dat bij de
vergisting van pentosen dezelfde producten ontstaan, die bij
de glucosevergisting gevonden zijn.

Hierbij zullen dus zeker eenige veranderingen in de voor-
gestane opvattingen noodig blijken.

Wij hebben ons oog allereerst gericht op het melkzuur.
Hoewel deze stof vrij algemeen als eindproduct bij de ge-
mengd-zure gisting wordt beschouwd, hebben wij ons toch
een oordeel willen vormen, in hoeverre deze stof een rol
speelt in het vergistingsschema, te meer, daar de meest waar-
schijnlijke splitsing van het hexosemolecule tot de vorming
van twee triosen leidt en ook melkzuur zulk een triose is.

Vervolgens hebben wij een onderzoek ingesteld naar de
vergisting van het eerste ontledingsproduct van het melkzuur,
nl. pyrodruivenzuur. Tenslotte hebben wij ook eenige andere
oxyzuren in ons onderzoek betrokken.

Voor ons onderzoek hebben wij gebruik gemaakt van de
navolgende vertegenwoordigers der coli-typhusgroep:

Alle genoemde bacteriën waren laboratoriumstammen, af-
komstig uit de verzameling van de bacteriologische afdeeling
van het Pharmaceutisch Laboratorium te Utrecht.

Voor het gebruik zijn alle stammen via de plaatmethode
opnieuw geïsoleerd en met behulp van hun morfologische en
biochemische eigenschappen gecontroleerd. Zij bleken daarbij
rein en juist.

Daar tot de eigenlijke coligroep (als B. coli beschreven)
verschillende organismen met uiteenloopende eigenschappen
worden ondergebracht, geven wij de resultaten van het on-
derzoek van deze stammen hier weer.

Glucose .
Fructose .
Galactose
Mannose.
Saccharose
Maltose .
Lactose .
RafBnose.
Rhamnose
Arabinose
Xylose .
Glycerine
Dulciet .
Sorbiet .
Manniet .
Adoniet .
Erythriet.
Citraat .
Indol uit
Melk .
Gelatine

Morfologie: Polymorphe, asporogene, fac. anaërobe, zwak
bewegelijke. Gram-negatieve staafjes.

B. pneumoniae vertoonde een negatieve reactie van
Voges en Proskauer en was positief op citraat. Dit
organisme behoort dus tot de z.g. Friedländergroep i ).

LITERATUUROVERZICHT OVER DE AANTASTING
VAN MELKZUUR EN MELKZURE ZOUTEN DOOR
MICRO-ORGANISMEN.

De eerste onderzoekingen over de bacteriëele ontleding
van lactaten zijn afkomstig van Louis Pasteuri), die
met een boterzuurferment, een anaëroob organisme, werkte.
Gekweekt op een oplossing van ammoniumlactaat, waaraan
fosfaat was toegevoegd, bleek het organisme het lactaat in
waterstof, kooldioxyde en boterzuur te ontleden.

Later heeft F i t z zich intensief beziggehouden met de ver-
gisting van melkzuur.

Met een uit koefaeces geïsoleerde micrococcus 2) verkrijgt
hij uit melkzuur: n-boterzuur met sporen capronzuur, azijn-
zuur en barnsteenzuur.

Een bepaalde streptobacil 3) doet propionzuur ontstaan met
sporen boterzuur en azijnzuur.

Met een derde, niet nader omschreven organisme 4), ver-
gist hij lactaat tot propionzuur met sporen boterzuur en alcohol.

Nog weer een andere bacterie 5) geeft eveneens propion-
zuur met daarnaast sporen azijnzuur, barnsteenzuur en alcohol.

2)nbsp;A. Fitz: B. 11, 46 (1878).
8)nbsp;A. Fitz: B. 11, 1891 (1878).
1)nbsp;A. Fitz: B. 12, 479 (1879).
6)nbsp;A. Fitz: B. 13, 1309 (1880).

Ook constateert hij het optreden van valeriaanzuur met
sporen alcohol en kooldioxyde.

Met het boterzuurferment van Pasteur vindt F i t z :
waterstof, kooldioxyde, aethylalcohol, butylalcohol, propion-
zuur, boterzuur (voornaamste product) en valeriaanzuur.

Tenslotte vindt Fitzi) een organisme, dat naast boter-
zuur ook propionzuur en sporen kooldioxyde, azijnzuur, barn-
steenzuur en een niet geïdentificeerde alcohol produceert.

Lewkowitsch2) ontdekt, dat Pénicillium glaucum op
ammoniumlactaat gekweekt, alleen het linksdraaiende zout
aantast.

BaginskyS) vindt, dat bij de vergisting van lactaat
door B. lactis aerogenes boterzuur en sporen aethylalcohol
ontstaan.

Kerry en FraenkeH) stellen vast, dat Bac. oede-
matis maligni de volgende vergistingsproducten geeft: propyl-
alcohol, mierenzuur en boterzuur.

LinossierS) beweert, in tegenstelling met Lew-
k O w i t s c h, dat Pénicillium glaucum, op lactaat gekweekt,
het rechtsdraaiende zout aantast.

Frankland en MacGregor^) vergisten met een
niet nader omschreven organisme; hierbij ontstaan voor-
namelijk boterzuur en sporen lagere vetzuren, waarbij
hoofdzakelijk het rechtsdraaiende zout vergist wordt. Bij
langdurige vergisting wordt echter ook het linksdraaiende
isomeer ontleed. Zij vinden geen vergisting door Bac. aetha-
ceticus en Bac. aethaceto-succinicus.

Schattenfrohi) krijgt met de Bac. oedematis maligni
geen vergisting. Wel kan hij lactaten vergisten met Bac.
anthrax. Uit calciumlactaat ontstaat dan gas, boterzuur en
propionzuur.

Ulpiani en Condelli^) enten choleravibrionen op
een oplossing van natriumlactaat en zien, dat na verloop van
tijd het rechtsdraaiende zout achterblijft.

Volgens Banning 4) geven sommige azijnbacteriën, op
melkzuur gekweekt, oxaalzuur.

Maze 5) heeft gevonden, dat melkzuur door een Euro-
tyopsissoort wordt geassimileerd. Er ontstonden daarbij kool-
dioxyde en alcohol met daarnaast ook nog aceetaldehyde.

Wehmer6) kweekt Oidium lactis en Mycoderma aceti
op 1.2 % vrij melkzuur. Het zuur wordt geneutraliseerd en
er ontstaat zelfs een alkalische reactie. Het proces is streng
aëroob.

McKenzie en Harden'') vergisten lactaat met
Bac. subtilis. Volgens hen blijft daarbij het linksdraaiende
zuur achter.

Aspergillus niger en Aspergillus griseus, op ammonium-
lactaat gekweekt, tasten daarentegen juist het linksdraaiende
zuur aan. Ook een Penicillium en enkele Saccharomyces-
soorten, waaronder Saccharomyces cerevisiae, op kalium-

1)nbsp;A. Schattenfroh en R. Grassberger: Arch. Hyg. 48, 1
(1903); C. 1903, II, 843.

lactaat gekweekt, breken het linksdraaiende isomeer het eerst
af. In deze gevallen wordt, zij het veel langzamer, ook het
rechtsdraaiende zuur aangetast.

Volgens Buchner en Meisenheimeri) ontstaan
bij de inwerking van Bac. butyhcus op melkzuur hoofdzake-
lijk boterzuur met daarnaast aceetaldehyde en mierenzuur.

Herzog en Ripke^) entten Mycoderma aceti en
Oidium lactis op een oplossing, die bestond uit 0.6—0.7 %
ammoniumlactaat, 3—4 % glycerine en anorganische zouten;
tevens was vrij melkzuur toegevoegd. Na zes weken was
68—94 % van het vrije zuur verdwenen. Ook nadat de schim-
mels door aceton en aether gedood waren en daarna geënt
werden op een oplossing van vrij melkzuur in water, waar-
aan eenig toluol was toegevoegd, had nog decarboxylatie
van het melkzuur plaats. De toevoeging van natriumlactaat
werkte hier ongunstig.

M a z é 3) vindt bij de vergisting van lactaat door de Bac.
aethaceto-succinicus van Frankland alcohol, mierenzuur
en azijnzuur:

2)nbsp;R. O. Herzog en O. Ripke: H. S. 73, 284 (1911).
8) P. Mazé: C. r. 156, 1101 (1913).

Bij de oxydatie neemt hij pyrodruivenzuur aan als tusschen-
product. Hij kan dit zuur echter niet isoleeren. Bij vergisting
met Mycoderma aceti ontstaat als hoofdproduct acetylmethyl-
carbinol.

Volgens Oppenheimeri) wordt melkzuur zelf niet
door gistsap aangetast. Het wordt echter wel aangegrepen,
indien aan de oplossing zouten van pyrodruivenzuur worden
toegevoegd.

Palladin en Ssabinin2) verklaren dit als volgt:
pyrodruivenzuur wordt door de carboxylase ontleed in
aceetaldehyde en kooldioxyde. Het aceetaldehyde zal nu met
het melkzuur reageeren volgens een oxydoreductie:

Toevoeging van pyrodruivenzuur beïnvloedt gunstig de
vorming van alcohol en kooldioxyde. De verhouding aethyl-
alcohol : kooldioxyde is echter gering, nl. 0.18—0.27.

M a z é 3) kweekte een 12-tal stammen, die hij niet nader
beschrijft, op lactaat. Er ontstond, afhankelijk van de ge-
bruikte stam, na 4-32 dagen pyrodruivenzuur. Door sommige
bacteriestammen wordt hiernaast nog acetylmethylcarbinol
gevormd en in enkele gevallen tevens sporen diacetyl.

M a z é vindt geen mierenzuur en geen 2-3 butyleenglycol.
Door het ontbreken van laatstgenoemde stof veronderstelt
hij, dat het diacetyl niet is ontstaan door oxydatie van acetyl-

2)nbsp;W. Palladin en D. Ssabinin: Biochem. J. 10, 183 (1916).
8) P. Mazé: C. r. Soc. de biol. 81, 1150 (1918).

methylcarbinol. Om het ontstaan van diacetyl te verklaren,
neemt M a z é dan de volgende reacties aan:

Ook het pyrodruivenzuur wordt weer verder ontleed. Er
ontstaat azijnzuur in wisselende hoeveelheden, van sporen
tot 50 % toe.

Dezelfde onderzoeker 1) had reeds vroeger lactaten met
behulp van een bepaalde Mucorsoort tot pyrodruivenzuur
geoxydeerd.

Met verschillende gistsoorten konden Mazé en Ruot^)
zoowel lactaten als vrij melkzuur oxydeeren tot pyrodruiven-
zuur. De oxydatie geschiedt met behulp van luchtzuurstof.
De opbrengst is ± 50 %.

Kerbs) wijst er op, dat cultuurgisten niet in staat zijn
het melkzuur te oxydeeren.

2)nbsp;P. Mazé en M. Ruot: C. r. Soc. de biol. 80, 336 (1917).
8) J. Kerb: B. 52, 1795 (1919).

J. Kerb en K. Zeckendorf: Bio. Z. 122, 307 (1921).
4) A. Fernbach en M. Schoen: C. r. 157, 1478 (1913); 158,
1719 (1914); 170, 764 (1920).

Een analoge oxydatie van melkzuur door Aspergillus niger
is geconstateerd door Kayseri), Quastel^) en
W alker en Coppock^).

K ays er 4) heeft gevonden, dat er verschillende gist-
rassen zijn, die, op melkzuur gekweekt, relatief veel vale-
riaanzuur doen ontstaan.

Reeds eerder hadden Neuberg en ArinsteinS) het
ontstaan van valeriaanzuur bij verschillende gistingen ver-
klaard uit een aldohseering van primair ontstaan pyro-
druivenzuur:

De voor de reductie benoodigde waterstof zou dan ge-
leverd worden door het melkzuur zelf, dat in dit geval in
pyrodruivenzuur overgaat. Ook de vorming van boterzuur,

1) E. Kay ser: Buil. Soc. chim. biol. 6, 234 (1924).
s) J. H. Quaste 1, M. Stephenson en M. D. Whetham:
Biochem. J. 19, 304 (1925).

propionzuur en butylalcohol trachten Neuberg en Arin-
stein uit een dergehjk pyrodruivenzuuraldol te verklaren.

M a u r e r 1) het melkzuur vergisten door B. propionicum.
Er ontstonden propionzuur, azijnzuur en kooldioxyde:

Van belang is ook het door W e h m e r 2) gevonden feit,
dat het kation groote invloed kan uitoefenen.

Wehmer kweekte een Aspergillus niger stam op cal-
ciumlactaat eenerzijds en op natrium-, kalium- en ammonium-
lactaat anderzijds. In het eerste geval kreeg hij uitsluitend
calciumcarbonaat afgescheiden; in het tweede geval ont-
stonden respectievelijk natrium-, kalium- en ammonium-
oxalaat.

Volgens W e h m e r is het niet zeker, dat bij het calcium-
zout ook eerst calciumoxalaat is gevormd; in het geval, dat
wel calciumoxalaat zou ontstaan, zou dit dan toch oogen-
blikkelijk ontleed moeten worden.

Eenzelfde gedrag ten opzichte van de verschillende ka-
tionen stelde T h i e s 3) vast voor een Aspergillus fumaricus.

Berron en Hastings 4) hebben een suspensie van
gonococcen, die eenige tijd in de ijskast (3° C) had gestaan,
op melkzuur geënt. Na drie kwartier is het melkzuur voor

97 % tot pyrodruivenzuur geoxydeerd, maar de bacteriën
hebben de eigenschap verloren om dit zuur verder af te
breken.

Volgens deze auteurs zouden er twee enzymen in het spel
zijn, nl. een dehydrase, die het melkzuur instabiel maakt en
een ademhalingsferment, dat oxydeerend werkt.

Aubeli) isoleerde een bacterie uit water, die melkzuur
aantast en hieruit azijnzuur en aceetaldehyde vormt.

Neuberg en Tir^) laten levende gist en gistprepara-
ten inwerken op melkzuur. Er heeft gasontwikkeling plaats,
welk gas uit kooldioxyde blijkt te bestaan.

N a g a i 3) vergist melkzuur als natrium- en calciumlactaat
met behulp van de sulfietmethode van Neuberg, door aan
de cultuurvloeistof 2 % natriumsulfiet toe te voegen.

Met B. lactis aerogenes krijgt hij uit 2 g calciumlactaat
maximaal 48 mg aceetaldehyde.

Ook Walker en Coppock^) passen de sulfiet-
methode toe. Bij vergisting met Aspergillus niger vinden zij
geen aceetaldehyde. ToCh wordt dit als tusschenproduct
aangenomen, daar zij na 4 weken sporen aethylalcohol
vinden.

Er zijn in de literatuur nog een groot aantal onderzoekin-
gen vermeld, waarin melkzuur door verschillende bacteriën
geoxydeerd wordt en wel, bij aanwezigheid van methyleen-
blauw of andere waterstofacceptoren. Wij noemen hiervan
de volgende:

Palladin en Lowtschinowskajai) brengen
gist samen met melkzuur en methyleenblauw. Er ontstaat
pyrodruivenzuur, dat zelf weer gedecarboxyleerd wordt.

Harden en Norris^) vinden, dat melkzuur door ge-
droogde gist snel geoxydeerd wordt, als methyleenblauw
aanwezig is. Er ontstaat aceetaldehyde, dat volgens hen af-
komstig is uit pyrodruivenzuur. Dit zuur konden zij echter
niet aantoonen. Ook ontstaan sporen aethylalcohol. Een groot
gedeelte van het lactaat wordt echter niet teruggevonden.

Volgens Palladin en Ssabinin^) gaat de vergis-
ting van melkzuur met behulp van methyleenblauw sneller
dan met behulp van pyrodruivenzuur (pag. 26). In dit geval
wordt ook een weinig aceetaldehyde gevonden, maar meer
aethylalcohol.

In het eerste geval is de vorming van aethylalcohol niet
mogelijk door de aanwezigheid van groote hoeveelheden
waterstofacceptor, i.c. methyleenblauw.

Cook en Stephenson^) oxydeeren melkzuur m.b.v.
B. coli. Per molecule lactaat worden ± 4 atomen zuurstof
opgenomen. Zij wijzen tevens op het merkwaardige feit, dat
bij een oxydoreductie aceetaldehyde nooit geoxydeerd wordt.

Cook, Haldane en MopsonS) dooden B. coli met
toluol. Het blijkt, dat deze gedoode bacteriën nog in staat
zijn melkzuur tot pyrodruivenzuur te oxydeeren. Dit laatste
zuur blijft echter onaangetast. De reactie gaat ook anaëroob,
indien van methyleenblauw wordt gebruik gemaakt. Zij

1)nbsp;W. Palladin en E. L o w t s ch i no w s k a j a : Bio. Z. 65, 129
(1914).

R. P. Cook en M. Stephenson: Biochem. J. 22, 1368 (1928).
6) R. P. Cook, J. B. S. Haldane en L. W. Mopson: Naturw.
18, 848 (1930); Biochem. J. 25, 534 (1931).

B a a r s 1) heeft aangetoond, dat een sulfraatreduceerende
bacterie. Vibrio rubentschickiï, melkzuur onder strikt ana-
erobe omstandigheden, als waterstofdonator kan gebruiken,
waarbij dit zuur volkomen in kooldioxyde en waterstof ge-
splitst wordt:

Voor een stam van Vibrio desulfuricans vond Baars, dat
de splitsing minder ver ging. Het gefermenteerde lactaat werd
teruggevonden als 60.5 % azijnzuur en 33.9 % kooldioxyde.

Stickland 3) gebruikt als waterstof acceptor natrium-
nitraat. B. coli oxydeert melkzuur dan zoowel aëroob als
anaëroob tot pyrodruivenzuur, waarbij het nitraat tot nitriet
wordt gereduceerd.

i) J. K. Baars: Over sulfaatreductie door bacteriën. Diss. Delft, 1930.
3) A. J. Kluyver: The chemical activities of microorganisms, Univ.
London Press, 1931.
8) L. H. Stickland: Biochem. J. 25, 1543, (1931).
i) H. Braun en P. H. Wördehoff: C. Bakt le Abt. 128, 50
(1933).

pyrodruivenzuur geoxydeerd met behulp van methyleen-
blauw, fumaarzuur en kaliumnitraat als waterstofacceptor.
Zij gebruikten stammen van B. coli en B. dysenteriae Flexner.

Voor het verloopen van een dergelijke oxydo-reductie
geven zij de volgende voorwaarden:

a.nbsp;beide stoffen moeten geactiveerd kunnen worden; de
ééne als donator, de andere als acceptor;

b.nbsp;de voor de groei noodige energie moet bij het oxydo-
reductieproces vrij komen;

A a r o n 1) heeft voor de paratyphus B organismen na-
gegaan, welke stoffen als waterstofacceptor kunnen dienen
bij de anaërobe dehydreering van lactaat. Volgens genoemde
auteur komen hiervoor in aanmerking: methyleenblauw,
nitraat, fumaraat, malaat, asparaginaat en asparagine.

Resumeeren wij nu, wat het resultaat is van de vergisting
van lactaten door bacteriën van de coh-typhusgroep, dan
krijgen wij het volgende:

Voor vergistingsproeven is het melkzuur als zoodanig niet
geschikt. Evenals alle oxyzuren heeft het een sterk bacteri-
cide werking. Deze giftige werking is, volgens T e k e 1 e n-
bu r g 1), het gevolg, zoowel van de waterstofionen, als van
de ongedissocieerde zuurmoleculen. De invloed van de
anionen is hiernaast verwaarloosbaar klein. Bovendien
hebben de verschillende, ongunstig werkende invloeden nog
een versterkende werking op elkaar.

In zoutvorm daarentegen kunnen de zuren dienen als kool-
stofbron voor de bacteriën. Daarnaast is echter ook nog
een stikstofbron noodig. Hiervoor ziet men meestal pepton-
of gistwater gekozen. Het bezwaar hiervan is, dat deze stof-
fen een niet geheel bekende samenstelling hebben, terwijl ook
de samenstelling van verschillende monsters, zelfs afkomstig
uit dezelfde bron, niet steeds gelijk is.

Voor een analyse der vergistingsvloeistoffen is het na-
tuurlijk ten zeerste gewenscht, dat beschikt kan worden over
een scherp gedefinieerd medium.

1) F. Tekelenburg: De afsterving van micro-organismen onder
den invloed van temperatuur, waterstofionen en ongedissocieerde zuren,
Diss. Utrecht, 1926.

3) W. C. de Graaff: De biochemische eigenschappen der para-
typhus bacillen, Leiden, 1918.

reeds op gewezen, dat de paratyphusbacteriën ook met secun-
dair ammoniumfosfaat als stikstofbron kunnen toekomen.

Braun en Cahn-Bronneri) hebben voor de ver-
schillende groepen der coh-typhusorganismen nagegaan,
welke organische zuren kunnen dienen als koolstofbron, wan-
neer als stikstofbron uitsluitend het ammoniumzout van die
zuren aanwezig is. Zij kwamen tot het resultaat, dat in aërobe
omstandigheden B. coh en B. paratyphi B, in een milieu,
waarin alleen ammoniumlactaat als koolstof- en stikstofbron
aanwezig is, een fhnke groei te zien gaven, terwijl B. para-
typhi A, B. typhi en B. dysenteriae Shiga Kruse te verdeden
waren in ammoniak wel- en ammoniak niet-assimileerende
stammen.

Hierdoor aangelokt hebben wij een voedingsbodem bereid,
bestaande uit 2 % ammoniumlactaat. Deze oplossing werd
gesteriliseerd door haar gedurende Yi uur op 110° C in
de autoclaaf te verhitten. Voor wij de oplossing gebruikten
hebben wij haar, evenals alle volgende oplossingen, gecon-
troleerd door haar 2 X 24 uur bij 35° C te plaatsen en door
overenting op steriele bouillon. Hierna werd de oplossing
geënt met een, met steriel water afgeslibde, 24 uur oude
agarcultuur van B. coli no. 4. Deze stam had reeds eerder
getoond op verschillende suikers en meerwaardige alcoholen
door een sterke groei uit te munten.

Na 14 dagen zetten wij de vergisting stop en begonnen
met de analyse der cultuurvloeistof. In die tijd hadden de
bacteriën zich sterk vermeerderd, daar de vloeistof geheel
troebel was geworden.

1) H. Braun cn C. E. C a h n - B r o n n e r : Bio. Z. 131, 226, 272
(1922).Klin. Wochenschr. 1, 1824 (1922).

In het algemeen kunnen wij de vergistingsproducten in een
vijftal groepen verdeelen. Dit zijn de volgende:

a.nbsp;gasvormige producten. Bij de coli-typhusgroep zijn tot
dusverre als gassen alleen kooldioxyde en waterstof
aangetroffen.

b.nbsp;vluchtige, neutrale en basische producten. Hieronder
worden gerangschikt aldehyden, alcoholen en ketonen
en verder de basische producten als ammoniak, aminen
en indol, die kunnen voorkomen in het geval, dat pepton
als stikstofbron wordt gebruikt.

e.nbsp;niet-vluchtige, neutrale en basische verbindingen. In deze
groep treffen wij verbindingen aan als koolhydraten,
glycerine, 2-3 butyleenglycol.

Van de uitgegiste vloeistof worden 100—200 cm^ aan een
destillatie onderworpen. Is de vloeistof alkalisch, dan is het
raadzaam, deze eerst met verdund zwavelzuur tot zwak zure
reactie op congopapier aan te zuren. Het doel is uitsluitend
het zeer hinderlijke schuimen van dergelijke vloeistoffen te
voorkomen of althans zeer te beperken.

De vloeistof werd gedestilleerd uit een Kjeldahlkolf van
300 cm3, die door een spathelm met een koeler verbonden was.

In de eerste cm^, die overgingen, reageerden wij op aceetal'
dehyde, waarna wij verder i 2/3 gedeelte van de oplossing
afdestilleerden. Het destillaat, na zwak alkalisch te zijn ge-
maakt met 10 % natriumhydroxyde, werd opnieuw aan een
destillatie onderworpen. Ook hier gingen wij door tot
gedeelte was overgegaan en wij herhaalden deze bewerking
met het destillaat, totdat een voldoende concentratie van de

vluchtige vergistingsproducten verkregen was. Het laatste
destillaat onderzochten wij op aethylalcohol.

De zure rest van de eerste destillatie en de alkalische rest
van de tweede destillatie werden bij elkaar gevoegd en met
4 N zwavelzuur aangezuurd tot juist zuur op congopapier.
Wij brachten deze vloeistof in een Kjeldahlkolf van 500 cm^
en destilleerden hieruit met stoom de vluchtige zuren af. De
kolf was, om overspatten te voorkomen, weer van een spat-
helm voorzien. Het destillaat werd gecondenseerd met behulp
van een spiraalkoeler, daarna van een bolkoeler. De destil-
latie van mierenzuur levert geen moeilijkheden op. De andere
vetzuren daarentegen wel, daar het veel tijd kost hen geheel
over te stoomen. Hieraan kan echter tegemoet worden ge-
komen 1) door de warme vloeistof met magnesiumsulfaat te
verzadigen en vervolgens een zoo krachtig mogelijke stoom-
straal door te leiden. Hierbij moet er voor gezorgd worden,
dat het volume daarbij niet toeneemt.

Het destillaat vingen wij in gedeelten van 200 cm^ op.
Meestal was, nadat liter overgedestilleerd was, alle zuur
uit de te onderzoeken vloeistof verwijderd. Het destillaat
neutraliseerden wij met 10 % natriumhydroxyde en dampten
de vloeistof tot een kleine rest in.

Een gedeelte van de ingedampte, geneutraliseerde oplossing
werd gebruikt voor het onderzoek op mierenzuur. De rest
dampten wij tot droog en onderzochten deze op de aanwezig-
heid van andere vluchtige zuren, o.a. azijnzuur.

De vloeistof, die in de destillatiekolf is achtergebleven, dient
vervolgens voor het onderzoek naar de niet-vluchtige zuren.
Om deze zuren hieruit te isoleeren, neutraliseert men de in-
houd van de destillatiekolf met een 10 % natriumhydroxyde-
oplossing en dampt vervolgens op een waterbad in. Als een

1) W. H. Olmsted, W. M. Whitaker en C. W. Duden:
J. biol. Chem. 85, 109 (1929/'30).

dikke stroop is overgebleven, zuurt men met verdund zwavel-
zuur weer aan tot de reactie juist zuur op congopapier is en
maakt het geheel met uitgegloeid natriumsulfaat vast. Na 24
uur in de exsiccator gestaan te hebben, wordt de massa in
een mortier fijngewreven en opnieuw 24 uur in de exsiccator
gezet. Dit droge poeder wordt vervolgens in een Soxhlet-
apparaat gedurende 12 uur met droge aether geëxtraheerd.
In de aether lossen de niet-vluchtige zuren op. De aether
wordt op een waterbad door destillatie verwijderd en de niet-
vluchtige zuren blijven achter. In het geval, dat pepton ge-
bruikt is, zijn de niet-vluchtige zuren sterk verontreinigd
door ontledingsproducten van het pepton. Hebben wij met
een vaste massa te doen, dan kan een gedeelte gebruikt
worden om door sublimeeren barnsteenzuur te verkrijgen.
Is dit echter niet het geval, dan worden de niet-vluchtige
zuren opgelost in 96 % alcohol en de oplossing gefiltreerd.
Daarna kookt men, voegt eenige druppels phenolphtaleïne
toe en vervolgens een gefiltreerde, verzadigde oplossing van
bariumhydroxyde, tot de vloeistof juist even rood gekleurd
is. Hierbij moet er op gelet worden, dat de alcoholconcen-
tratie niet beneden 70 % komt. Er slaat bariumsuccinaat neer.
Is de alcoholconcentratie beneden 70 %, dan slaat ook
bariumlactaat neer.

Het barnsteenzuur kan uit het succinaat vrijgemaakt
worden door het bariumzout in zoutzuur op te lossen en de
oplossing daarna droog te dampen. Door sublimeeren krijgt
men tenslotte het barnsteenzuur vrij.
In het fikraat blijft melkzuur achter.

Voor het onderzoek hiernaar kweekt men in gistkolfjes.
Het gas, dat ontstaat, verzamelt zich voor een groot gedeelte

boven de vloeistof in het gesloten been. Is er kooldioxyde
aanwezig, dan vindt men dit, door in de vloeistof een stukje
vast kaliumhydroxyde op te lossen. De hoeveelheid kool-
dioxyde in het boven de vloeistof staande gas wordt aan-
gegeven door de vermindering van het gasvolume. De rest
van het gas is waterstof, wat blijkt uit het feit, dat het met
lucht een explosief mengsel geeft. Echter, ook koolwater-
stoffen doen dit. Daarom brachten wij het gas over in een
eudiometerbuis en voegden een overmaat zuivere zuurstof
toe. 1) Uit het verschil der gasvolumina voor en na de
explosie kan dan de aard van het gistingsgas vastgesteld
worden. Was er een koolwaterstof voorhanden, dan kan het
ontstane kooldioxyde na de explosie met kahumhydroxyde
aangetoond worden.

Als voorproef op de aanwezigheid van aldehyden en keto-
nen, voegt men een oplossing van 2-4 dinitrophenyldrazine
toe (2 g 2-4 dinitrophenylhydrazine, 40 cm^ 25 % zoutzuur
en 80 cm3 water. 2)

Hierop reageert men, indien de hoeveelheid dinitrophenyl-
hydrazon te klein is om een smeltpunt te kunnen bepalen,
met de reactie van R i m i n i 3). Hiertoe wordt de te onder-
zoeken vloeistof gevoegd bij een mengsel van oplossingen
van nitroprussidnatrium en een secundair amine; voor dit
laatste namen wij piperidine. De samenstelling van het meng-

1)nbsp;Uit blanco proeven met zuivere waterstof bleek, dat de verontreini-
ging van de toegevoegde zuurstof ± 0.7 % bedroeg.

Hierop wordt gereageerd met de jodoformproef van
Liebeni): 5 cm^ worden verwarmd 40—50° C en hier-
aan toegevoegd 6 druppels 10 % kaliumhydroxydeoplossing;
daarna voegt men joodjoodkaliumoplossing toe tot de vloei-
stof zich bruin kleurt, ontkleurt met kaliumhydroxyde en
koelt af. Bij aanwezigheid van aethylalcohol ontstaan zes-
hoekige kristallen van jodoform.

Was de aanwezigheid van aceetaldehyde vastgesteld, dan
moest dit eerst verwijderd worden, waartoe wij de vloeistof
in een kolfje, voorzien van een opstijgende koeler, gedurende
één uur met een 2-4 dinitrophenylhydrazineoplossing op het
waterbad verwarmden. Na afloop werd de alcohol afgedes-
tilleerd en in het destillaat de jodoformreactie uitgevoerd.

De bacteriën worden gedurende vijf dagen gekweekt in
een peptonhoudende voedingsoplossing. Na deze tijd wordt
eenzelfde volume 10 % kaliumhydroxydeoplossing toege-
voegd. Bij aanwezigheid van één of beide bovengenoemde
verbindingen, ontstaat een roode eosine-achtige verkleuring.

De reactie berust op een oxydatie van het acetylmethyl-
carbinol — die in deze alkalische omgeving zich reeds aan
de lucht voltrekt — tot diacetyl. Dit diacetyl geeft met be-
paalde bestanddeelen van de pepton (kreatine en kreatinine)
de roode verkleuring.

25 cm3 van de cultuurvloeistof worden met azijnzuur zwak
aangezuurd. Het acetylmethylcarbinol wordt geoxydeerd tot
diacetyl door 10 cm^ 20 % ferrichlorideoplossing toe te
voegen en vervolgens 10 cm^ af te destilleeren. In het des-
tillaat reageert men op het diacetyl als volgt: De vloeistof
wordt met sodaoplossing geneutraliseerd op lakmoes. Daar-
na voegt men toe: 15 druppels 20 % zoutzuurhydroxylamine-
oplossing en 20 druppels 20 % natriumacetaatoplossing. Men
verhit tot koken en voegt 5 druppels 10 % nikkelchloride-
oplossing toe, kookt nog eenige minuten door en koelt af.
Bij aanwezigheid van diacetyl ontstaat een rood neerslag van
nikkeldimethylglyoxim.

Van de basische producten is alleen het indol van belang.
Hierop reageerden wij bij het onderzoek op de zuiverheid van
de verschillende stammen, die wij in hoofdstuk II noemden.

Gereageerd werd met het reagens van E h r 1 i c h, be-
staande uit een oplossing van p-dimethylamidobenzaldehyde
in zoutzure alcohol (1 deel p-dimethylamidobenzaldehyde,
21 deelen geconcentreerd zoutzuur en 100 deelen 96 % alco-
hol) en een verzadigde kaliumpersulfaatoplossing. Bij 1 deel
cultuurvloeistof 0.5 deel p-dimethylamidobenzaldehydeoplos-
sing en 0.5 deel kaliumpersulfaatoplossing.

Na enkele minuten ontstaat een roodkleuring. De kleurstof
is met amylalcohol uit te schudden.

Het onderzoek hiernaar wordt bemoeilijkt door het feit, dat
er voor de verschillende zuren weinig specifieke reacties be-

1) A. J. Kluyver, H. J. L. Donker en F. Visser 't Hooft:
Bio. Z. 161, 361 (1925).

staan. Het mierenzuur maakt hierop een gunstige uitzondering.
Men kan hiervoor gebruik maken van de sterk reduceerende
eigenschappen van dit zuur. Aan de neutrale oplossing der
zuren wordt een sublimaatoplossing toegevoegd en het ge-
heel op een waterbad verwarmd. Bij aanwezigheid van
mierenzuur scheidt zich na eenige tijd calomel af, dat bij
toevoegen van ammonia zwart wordt. Ook een zilvernitraat-
oplossing wordt gereduceerd onder afscheiding van zilver.
Van de ingedampte rest, bevattende de natriumzouten der
verschillende vluchtige zuren, werd met behulp van het
p-phenyl m-broomacetophenon i) de overeenkomstige ester
gemaakt:

15 mg van de natriumzouten worden met 60 mg p-phenyl
ü)-broomacetophenon en 0.9 cm^ 96 % alcohol gedurende
1 uur op het waterbad verwarmd. Na afkoelen kristalhseeren
de esters uit, die uit 70 % alcohol omgekristalliseerd worden.
Zoo noodig kan met kool ontkleurd worden. Door gefrac-
tioneerde kristallisatie worden de esters gescheiden.

Naast alle smeltpunten, die bepaald zijn, hebben wij ook
de mengsmeltpunten van de verkregen stof en de ester van
het zuivere overeenkomstige zuur vastgesteld.

Hierop hebben wij ook nog microchemisch gereageerd
met natriumuranylformiaat 2). Er ontstaan fraaie, karakteris-
tieke, tetraëdrische kristallen.

Hierop wordt gereageerd met het reagens van D é n i-
g ès 1) : 0.2 cm^ oplossing worden met 2 cm^ geconcentreerd
zwavelzuur gedurende twee minuten in het waterbad verhit.
Alle a-oxyzuren, op deze wijze behandeld, splitsen mieren-
zuur af.

Na afkoelen wordt het tevens ontstane aceetaldehyde aan-
getoond door toevoegen van 2 druppels guajacoloplossing.
De vloeistof kleurt zich donkerrood.

Ook kan gebruik gemaakt worden van de reactie van
R i m i n i door een, in een nitroprussidnatrium- en piperidine-
oplossing gedrenkt, papiertje in de damp boven de vloeistof
te houden.

In het sublimaat kan met loodacetaat microchemisch op
barnsteenzuur gereageerd worden. Er ontstaan ruitvormige
kristallen, die bij het zuivere zuur zeer karakteristiek zijn,
maar bij aanwezigheid van verontreinigingen vrij sterk ge-
deformeerd kunnen zijn.

Verder hebben wij ook hier de p-phenylphenacylester ge-
maakt. Voor de tweebasische zuren is het noodig de verhit-
ting met alcohol gedurende 2 uur voort te zetten.

Smeltpunt barnsteenzure ester 208° C.
Voor het aantoonen van barnsteenzuur ziet men wel eens
de pyrrolreactie gebruiken. Ten aanzien van deze reactie
moge opgemerkt worden, dat de uitkomst hiermede verkre-

gen niet altijd betrouwbaar is, daar ook andere stoffen, waar-
van wij hier alleen het melkzuur i) noemen, deze reactie
geven. Door de gevoeligheid van deze reactie is een spoor
melkzuur reeds voldoende om een foutieve conclusie te
trekken.

Hierop wordt gereageerd in de met ferrichloride geoxy-
deerde cultuurvloeistof 2), waaruit door destillatie het dia-
cetyl verwijderd is. Men voegt 2 cm^ broom en 3 g natrium-
acetaat toe en verhit gedurende 20 minuten, in een kolf met
opstijgende koeler, op het waterbad. Na afkoelen wordt de
overmaat broom met natriumthiosulfaat weggenomen en het
ontstane diacetyl afgedestilleerd. Hierop wordt gereageerd
op de wijze, die reeds vroeger beschreven is (pag. 41).

Tenslotte moeten wij nog de reactie beschrijven op een zuur,
dat bij de gevolgde methode niet geïsoleerd wordt, daar het
tengevolge van de hooge temperaturen ontleed is. Wij be-
doelen het:

Hierop kan direct in de cultuurvloeistof gereageerd worden.
Het meest geschikt is hiervoor de reactie van S i m o n 3):

Aan 1 deel der cultuurvloeistof wordt toegevoegd 1 deel
verzadigde ammoniumsulfaatoplossing en 0.5 deel 4 % nitro-
prussidnatriumoplossing. Na doorschudden voegt men 1 deel

3) H. R. Braak: Onderzoekingen over de vergisting van glycerine,
Diss. Delft, 1928.
8) L. J. Simon: C. r. 125, 534 (1897).

Zooals later beschreven zal worden, kan in een samen-
gesteld milieu als een gistingsvloeistof, deze kleur sterk
varieer en.

Meer zekerheid verkrijgt men dan ook door het pyro-
druivenzuur neer te slaan als dinitrophenylhydrazon. Om dit
zuiver in handen te krijgen is het wenschelijk, eerst het
pepton en de bacterieëiwitten uit de cultuurvloeistof te ver-
wijderen. Hiervoor is zeer geschikt het neerslaan van de
genoemde producten met fosforwolfraamzuur i):

Aan 5 deelen der cultuurvloeistof worden toegevoegd 2
deelen fosforwolfraamzuur (5 g fosforwolfraamzuur opgelost
in 100 cm3 3 % zwavelzuur). Na 24 uur wordt af gefiltreerd
en met water uitgewasschen. Daarna de 2-4 dinitrophenyl-
hydrazineoplossing toegevoegd (2 g 2-4 dinitrophenylhydra-
zine in 120 cm^ 2 N zoutzuur). Na 24 uur afgefiltreerd, uit-
gewasschen met verdund zoutzuur en daarna met water. Het
neerslag wordt opgelost in 1 N sodaoplossing en, na fil-
treeren, met zoutzuur opnieuw neergeslagen. Het gefiltreerde
en uitgewasschen neerslag wordt bij 100°—110° C gedroogd.

Zooals boven reeds is medegedeeld, was de cultuur
aangeslagen op een voedingsbodem, waarin uitsluitend am-
moniumlactaat voorkwam. Van de hiervoor genoemde ver-
gistingsproducten werd alleen een spoortje vluchtig zuur ge-
vonden. Er was geen gas gevormd, terwijl de Pp^ nagenoeg
onveranderd was. De Ppj van de oplossing, waarvan wij
waren uitgegaan, was 7.2. Van een verder onderzoek in deze
richting werd daarom afgezien.

Vervolgens bereidden wij een voedingsbodem, die de vol-
gende samenstelling had:

Over de samenstelling van deze oplossing het volgende:
Om niet afhankelijk te zijn van een wisselende samenstelling
van de pepton, werd hiervan een groote voorraad aangelegd.
Door goed mengen in een mortier was deze hoeveelheid zoo
homogeen mogelijk gemaakt. Wij bewaarden het preparaat
in een flesch voorzien van een stop, gevuld met ongebluschte
kalk.

Wij hadden de beschikking over een preparaat zuiver
melkzuur van K a h 1 b a u m. Door neutralisatie in de warmte
met ammonia kregen wij een ammoniumlactaatoplossing.

Wat betreft de toevoeging van fosfaat diene het volgende:
Bij de vergisting van glucose was ons gebleken, dat, bij toe-
voeging van verschillende hoeveelheden secundair ammo-
niumfosfaat, een toevoeging van 0.5 % hiervan de groei het
meest stimuleerde.

Ook de toevoeging van keukenzout schijnt in het algemeen
de groei te bevorderen. Wat hiervan de oorzaak is, staat
niet vast. Wij kunnen zoowel denken aan een verhooging
van de osmotische druk als aan een specifieke werking van
het natriumchloride.

Alvorens met de analyse te beginnen, bepaalden wij steeds
de waterstofionenconcentratie met behulp van buffer-oplos-
singen van bepaalde Pp^ en neutraalrood of broomthymol-
blauw als indicator. Bij de beoordeeling van het resultaat
hiervan, moet natuurlijk wel in het oog gehouden worden,
dat, indien pepton als stikstofbron gebruikt wordt, hieruit

basische producten ontstaan, zooals ammoniak en aminen, die
zich kenbaar maken door een verhooging van de Pj^.

Met de bovengenoemde voedingsoplossing vulden wij gist-
kolfjes en entten deze met de verschillende bacteriën der coli-
typhusgroep, om de gasvorming, door deze organismen ver-
oorzaakt, na te gaan. In het gesloten been van deze gist-
kolfjes leven de bacteriën onder vrijwel anaërobe omstandig-
heden. Dit kan voor sterk aërobe organismen een bezwaar
zijn. Oxydatieve gistingen zullen zich practisch alleen in het
open been voltrekken en van een eventueele gasvorming zal
men dan niet veel bemerken. Inderdaad vertoonden onze cul-
turen wel groei in het open been, maar niet in het gesloten
been. Daarom hebben wij de bacteriën ook geënt in wijde
cultuurbuizen, voorzien van een klein gasbuisje, waarbij er
voor gezorgd werd, dat de vloeistof niet te hoog in de cul-
tuurbuis stond. Terwijl wij in de gistkolfjes nooit een spoor
gas hebben gevonden, konden wij in de cultuurbuizen enkele
malen het ontstaan van gas constateeren.

Een overzicht van de gevormde vergistingsproducten vindt
men in tabel II. Deze heeft betrekking op de vergisting van
250 cm3 voedingsoplossing in Erlenmeijerkolven van 500 cm^.
De voedingsbodem werd in alle gevallen geënt met een
afgeslibde, 24 uur oude, agarcultuur van de betreffende
bacterie.

De typhusstam no. 38 werd ook onderzocht na een vergis-
tingsduur van 84 dagen. Het resultaat was hetzelfde.

Duidelijk blijkt wel, dat mierenzuur en azijnzuur feitelijk de
eenige vergistingsproducten zijn. Wij constateerden ook, dat
het azijnzuur in grootere hoeveelheden voorkwam dan het
mierenzuur. Dit is echter niet verwonderlijk, daar, zooals
uit het hoofdstuk over de vergisting van mierenzuur zal blij-

ken, de meeste organismen dit zuur ontleden in waterstof en
kooldioxyde. Daar vooral B. coli dit in sterke mate doet, is
het voorkomen van mierenzuur in slechts sporen bij B. coli
verklaard.

Echter, er is een maar. Bij de vergisting van mieren-
zuur ontstaan, zooals gezegd, waterstof en kooldioxyde. Beide
zijn gassen, maar wij vinden in slechts enkele gevallen een
waarneembare gasvorming en wonderlijk, juist niet bij B. coli.

Bij het onderzoek van het gevormde gas bleek, dat daarin
geen kooldioxyde voorkwam, zoodat het uitsluitend uit
waterstof bestaat. Wij moeten dus aannemen, dat de ge-
vormde hoeveelheden gas zeer gering zijn, zoodat zij, althans
voor een groot gedeelte, in oplossing blijven. Deze oplosbaar-
heid is echter vooral voor waterstof niet groot. Maar er is
nog een andere mogelijkheid, n.1. de adsorptie van beide
gassen aan het pepton.

Voor de waterstof is dit reeds aangetoond door B r a a k i)
en Groenewegen^). Uit de onderzoekingen van
Braak kan men eveneens met eenige waarschijnlijkheid
concludeeren, dat deze adsorptie van het kooldioxyde veel
geringer is.

Om te onderzoeken of er kooldioxyde in de cultuurvloeistof
in opgeloste toestand aanwezig was, hebben wij deze vloei-
stof met verdund zwavelzuur vrij sterk aangezuurd. Door
verwarming dreven wij het gas uit en leidden dit met behulp
van een kooldioxyde-vrije stikstofstroom in een heldere baryt-
oplossing. Inderdaad ontstond er al spoedig een dik neerslag
van bariumcarbonaat. Bij de bacteriën der typhus- en dysen-
teriegroep ontstond echter geen neerslag.

1)nbsp;H. R. Braak: Onderzoekingen over de vergisting van glycerine.
Diss. Delft, 1928.

2)nbsp;H. J. Groenewegen:De vergisting van aethaandiol- (1.2) door
de bacteriën der coli-, typhus-, dysenterie-groep, Diss. Utrecht, 1935.

Overzicht van de vergisting van ammoniumlactaat door de organismen der coli-typhusgroep.

Bij deze laatste organismen wordt vrij veel mierenzuur
gevormd. Dit blijkt ook uit de lage waarde van de Pj^ bij
die bacteriën, welke niet in staat zijn het mierenzuur te ont-
leden.

Een groot gedeelte van het melkzuur vindt men na de ver-
gisting onveranderd terug; het wordt dus slechts weinig of
moeilijk aangetast.

a.nbsp;een directe splitsing van het melkzuurmolecule in aceet-
aldehyde en mierenzuur en oxydatie van het aceetaldehyde
tot azijnzuur. Hiervoor zou pleiten het vinden van kleine
hoeveelheden aceetaldehyde bij de typhus- en dysenterie-
bacteriën nevens mierenzuur en azijnzuur:

Evenwel, wij kunnen ons deze laatste reactie ook als een
hydroxydatie voorstellen:
CH3

c. een oxydatie van het melkzuur tot pyrodruivenzuur en
daarop volgende hydrolytische splitsing van dit laatste zuur:

Over het verloop van de oxydatie tot pyrodruivenzuur
kunnen wij twee mogelijkheden veronderstellen:

De grootste steun vindt deze laatste opvatting in het feit,
dat het methylglyoxaal als een typische voortrap van het
pyrodruivenzuur wordt aangenomen. In de laatste tijd is
echter aan dit „typischequot; voorkomen in enkele gevallen
ernstige twijfel gerezen. Het is ons ook niet gelukt deze stof
in de uitgegiste vloeistof aan te toonen, hoewel natuurlijk
de mogelijkheid bestaat, dat het gevormde methylglyoxaal in
een zóó metastabiele vorm aanwezig is, dat het oogenblik-
kelijk weer verder omgezet wordt. Door dehydreering ont-
staat dan uit het methylglyoxaal het pyrodruivenzuur:

Onzerzijds moet er op gewezen worden, dat deze intra-
moleculaire omzetting zuiver hypothetisch is.

Naast de onder c. reeds genoemde ontledingswijze van het
pyrodruivenzuur kunnen wij ons tenslotte ook nog de vol-
gende splitsingen van dit zuur denken:

dus een decarboxylatie, waarbij het ontstane aceetaldehyde
weer verder geoxydeerd kan worden of door een hydroxy-
datie, als boven reeds genoemd, in azijnzuur omgezet kan
worden.

De onder c. genoemde meening, dat pyrodruivenzuur tus-
schenproduct zou zijn, heeft veel voor. Zij wordt gesteund
door het feit, dat wij in onze culturen eenige malen het pyro-
druivenzuur aantroffen.

Om het optreden van deze stof nader te controleeren zou
het wenschelijk zijn het pyrodruivenzuur vast te leggen,
d.w.z. voor verdere aantasting door de micro-organismen te
vrijwaren.

Bij de alcoholische gisting slaagde Neuberg er destijds
in, het aceetaldehyde als bisulfietverbinding te blokkeeren.

1) N.B. Over de ontleding van pyrodruivenzuur door de bacteriën der
coli-typhusgroep zal in een volgend hoofdstuk nader gesproken worden.

Nu is dit voor het pyrodruivenzuur niet mogelijk, daar de
sulfietverbinding even snel wordt aangetast als het zuur zelf.

Ook het vastleggen als een, al of niet gesubstitueerd,
phenylhydrazon is niet mogelijk wegens de groote giftigheid
van deze producten voor de levende cel.

Wij hebben een meer uitgebreid en afzonderlijk daarop
gericht onderzoek ingesteld naar het voorkomen van pyro-
druivenzuur bij de vergisting van lactaat door de bacteriën
der coli-typhusgroep. Wij entten daartoe de verschillende
organismen in cultuurbuizen, die ieder ± 10—15 cm^ van de
lactaatoplossing bevatten. In iedere buis entten wij met een
pipet Pasteur eenige druppels van een dik troebele bac-
teriesuspensie.

Na 14 dagen werden alle buizen met de reactie van
Simon op pyrodruivenzuur onderzocht. Het resultaat van
dit onderzoek is ondergebracht in tabel III. Daaruit blijkt, dat
op een totaal van 59 stammen slechts 15 maal een positieve
pyrodruivenzuurreactie voorkomt.

B. typhi: 2 maal op 7 onderzochte stammen
B. paratyphi B: 2 maal op 9 onderzochte stammen
B. paratyphi A: 1 maal op 6 stammen.

Het was ons reeds eerder opgevallen, dat de paratyphus
A- en de typhusbacteriën in het algemeen slecht groeien op
de lactaatvoedingsbodem. Een cultuur van B. typhi no. 36,
die aanvankelijk een negatieve reactie op pyrodruivenzuur
had gegeven, was nog geruime tijd in de broedstoof blijven
staan, vnl. om na te gaan of de groei der bacteriën zou
toenemen.

Overzicht over het ontstaan van pyrodruivenzuur bij de vergisting van
ammoniumlactaat door de bacteriën der coli-typhusgroep.

Na een verblijf van 3 maanden in de broedstoof, was de
vloeistof nog steeds zeer licht troebel. De reactie op pyro-
druivenzuur was toen echter sterk positief geworden. Uit
enkele cm^ cultuur werd voldoende neerslag met 2-4 dini-
trophenylhydrazine verkregen om daarvan het smeltpunt te

bepalen. Het neerslag werd nog gezuiverd volgens de metho-
de, in het begin van dit hoofdstuk beschreven. Het smelt-
punt werd vastgesteld op 209° C. Het mengsmeltpunt met
zuiver pyrodruivenzuur 2-4 dinitrophenylhydrazon op 211° C.

Dit resultaat deed bij ons het vermoeden opkomen, dat de
door de bacteriën veroorzaakte oxydatie van het melkzuur
tot pyrodruivenzuur, van enzymatische aard zou zijn, terwijl
daarentegen het ontstaan van het uit dit zuur gevormde
mierenzuur en azijnzuur het gevolg zou zijn van de werk-
zaamheid van de levende cel.

Wij wilden nu trachten ook bij andere bacteriën het pyro-
druivenzuur aan te toonen door de cultuurvloeistof met een
zeer gering aantal bacteriën te enten, in de hoop, dat het
ontstaan van pyrodruivenzuur in dat geval sneller zou ge-
schieden dan de ontleding van dat zuur.

In cultuurbuizen, bevattende ± 10—15 cm^ voedingsoplos-
sing, werd met een entnaald zeer weinig bacteriemateriaal
gebracht. Na 3 weken broeden bij 35° C onderzochten wij
de cultuur met de reactie van Simon. De groei van de
paratyphus A-, de typhus- en de dysenteriebacteriën was
zeer matig, terwijl daarentegen de bacteriën van de coli- en
de paratyphus B groep zich vrij goed ontwikkeld hadden.

In tabel IV vindt men het resultaat van dit onderzoek.
Het blijkt hieruit, dat de meeste stammen inderdaad een posi-
tieve reactie geven, maar het was de vraag of de sterk af-
wijkende kleurreacties wel als van pyrodruivenzuur afkom-
stig mochten worden beschouwd. Om dit na te gaan hebben
wij 50 cm3 van de lactaatoplossing in kolfjes geënt met één
oogje cultuur van de stammen: B. enteritidis Gärtner no. 33,
B. paratyphi A no. 10, B. paratyphi A no. 13 en B. coli no. 4.

Deze laatste gold tevens als blanco proef, daar bij deze
stam wèl de karakteristieke blauwkleuring optrad, die ken-
merkend is voor pyrodruivenzuur bij toevoeging van nitro-
prussidnatrium en ammoniak.

Overzicht over het ontstaan van pyrodruivenzuur bij de oxydatie van
melkzuur door een geringe hoeveelheid bacteriën van de coli-typhusgroep.

Aertrijck no. 34
typhi no. 35
„ „ 36
„ 37
„ 38
„ .. 39
„ „ 40
.. „ 41
dysenteriae Flexner no 42

9
10
11
12

15
23
26

donkerblauw
donkerblauw
heldergroen
donkerblauw
donkerblauw
intensief donkergroen
donkerblauw
donkerblauw
blauwgroen

intensief donkergroen
donkerblauw
donkerblauw
donkerblauw
donkerblauw
donkerblauw
donkerblauw
donkerblauw
donkerblauw
blauwgroen
groen
groen
blauw
groen
blauwviolet

Na drie weken bij 35° C gebroed te hebben, kwam de cul-
tuur in onderzoek. Allereerst werd, ter verwijdering van het
pepton, deze stof met fosforwolfraamzuur neergeslagen i) en
in het heldere fikraat met 2-4 dinitrophenylhydrazine ge-
reageerd.

Bij alle vier onderzochte stammen ontstond een geel neer-
slag. Dit werd afgefiltreerd, gewasschen met verdund zout-
zuur en water, opgelost in 1 N natriumcarbonaatoplossing en
hieruit weer met verdund zoutzuur de 2-4 dinitrophenyl-
hydrazonen neergeslagen.

Hieruit volgt dus, dat wij ook bij deze, geheel afwijkende,
kleurreacties toch met pyrodruivenzuur te doen hebben. Wat
de oorzaak van deze afwijking is, weten wij niet. Gezien
echter de ingewikkelde en gedeeltelijk zelfs onbekende samen-
stelling (pepton) van ons milieu, is het zeer verleidelijk hierin
de oorzaak van het „kleurenspelquot; te zien.

Zooals uit tabel IV blijkt, bleven er nog eenige gevallen
over, waarbij het niet mogelijk was, op deze manier pyro-
druivenzuur aan te toonen. Wij hebben getracht, ook in deze
gevallen een positief resultaat te bereiken, door binnen
nauwer tijdgrenzen op deze stof te reageeren.

Wij kozen hiervoor B. lactis aerogenes no. 5 en onder-
zochten hiernaast ook twee positieve stammen, nl. B. coli
no. 4 en B. typhi no. 38. Het resultaat toont tabel V.

De drie culturen waren met zeer weinig bacteriën geënt.
De stam van B. lactis aerogenes no. 5 groeit echter snel. Na
acht dagen was de cultuurvloeistof reeds dik troebel gewor-
den. Het inmiddels gevormde groote aantal bacteriën zal het
optreden van pyrodruivenzuur wel weten te beletten, omdat
ieder molecule, dat van dit zuur ontstaat, onmiddellijk door
een bacterie aangetast wordt.

Overzicht over het ontstaan van pyrodruivenzuur bij de vergisting van
melkzuur door bacteriën der coli-typhusgroep.

Het is ons dus op grond van deze proeven niet mogelijk
uit te maken of de oxydatie van melkzuur door B. lactis
aerogenes geschiedt via het pyrodruivenzuur, omdat dit zuur
oogenblikkelijk ontleed kan worden en aan onze waarneming
wordt onttrokken, of wel, dat deze oxydatie een direct aan-
grijpen van het melkzuurmolecule tengevolge heeft, waar-
door zonder tusschentrap mierenzuur en azijnzuur ontstaan:

Wat het eerste geval betreft, kunnen wij ons ook denken,
dat de enzymconcentratie van B. lactis aerogenes slechts
gering is.

gevolg zou moeten zijn, wordt echter weer verhoogd door
de snelle ontwikkeling der bacteriën, zoodat het eindresultaat
weer hetzelfde kan zijn als bij de andere bacteriën van de
coli-typhusgroep.

Wij hebben nog getracht ter verdere oplossing van dit
vraagstuk de enzymreactie vrij te maken van de reactie, die
door de levende cel zelf tot stand komt.

In principe zijn hiervoor verschillende wegen mogelijk. Wij
kunnen b.v. een peptonwatercultuur van de bacterie door
een of ander bacteriefilter filtreeren en met het steriele fil-
traat de proeven uitvoeren. Daarnaast kunnen wij de bacterie
dooden met behulp van aceton, toluol e.d., zonder dat de
enzymwerking verhinderd wordt.

Wat de eerste methode betreft, deze kan in slechts enkele
gevallen succes hebben.

b.nbsp;endo-enzymen: dit zijn de in het „Zellgerüstquot; onoplosbare
enzymen;

c.nbsp;desmo-enzymen: deze zijn aan het protoplasma verbonden.
Alleen wanneer de enzymen vrij voorkomen en niet aan

de bacterie gebonden zijn, zullen wij hen in het bacteriefiltraat
kunnen verwachten. Het is duidelijk, dat alleen de onder a.
genoemde enzymen aan deze voorwaarde voldoen. De vraag
rijst: Onder welke groep hoort het oxydeerende ferment van
de bacteriën uit de coli-typhusgroep thuis?

Om deze vraag te kunnen beantwoorden, hebben wij van
de navolgende stammen een peptonwatercultuur aangelegd:
B. coli no. 4
B. paratyphi A no. 8
B. typhi no. 35
B. dysenteriae Sonne no. 52.
1) R. Will stat ter: H. S. 229, 251 (1934).

Deze culturen werden 14 dagen bij 35° C bebroed. Na
afloop hiervan werden de culturen door een van te voren
gesteriliseerd Seitz E.K. bacteriefilter gefiltreerd. Het glas-
heldere fikraat controleerden wij op steriliteit door het ge-
durende 2 X 24 uur in de broedstoof te plaatsen. De vloeistof
bleef volmaakt helder. Daarna entten wij met deze oplossing
een lactaatvoedingsbodem, waarvan de samenstelling gelijk
was aan diegene, die voor de vorige proeven gebruikt werd.

Iedere twee dagen reageerden wij op pyrodruivenzuur. Na
twee weken was het resultaat echter nog negatief, zoodat
naar alle waarschijnlijkheid het gezochte ferment niet onder
de bovengenoemde lyo-enzymen thuishoort, maar op een of
andere wijze aan het bacterielichaam is gebonden. Hoe en
van welke aard deze binding is, blijft echter een onopgeloste
vraag.

Vervolgens hebben wij de tweede weg bewandeld. Hiertoe
werd een 24 uur oude agarcultuur van de betreffende
bacterie met steriel water afgeslibd en daaraan eenige drup-
pels toluol toegevoegd. De toluol schudden wij goed door
de bacterie-emulsie heen en herhaalden dit, nadat de vloeistof
zich weer in twee lagen gescheiden had, nog verscheidene
malen.

Vervolgens controleerden wij of de bacteriën gestorven
waren door een druppel van de bacterie-emulsie op alkalische
bouillon te enten en bij 35° C te broeden. De bouillon bleef
helder; ook na overenten op een tweede buis met alkalische
bouillon konden wij hierin geen leven meer constateeren,
ook niet bij overenting op een plaat.

Nu konden de gedoode bacteriën op de lactaatoplossing
geënt worden. Na 12 dagen bij 35° C gestaan te hebben,
onderzochten wij alle culturen op de reactie van Simon.
Ook controleerden wij nogmaals of de inhoud van de, met
lactaatvoedingsbodem gevulde, buizen steriel gebleven was.

Overzicht over de oxydatie van melkzuur met door toluol gedoode
bacteriën van de coli-typhusgroep.

B. pneumoniae Friedländer no
B. paratyphi A no. 8 .
B. „ B 14 .
B. .. C 23 .
B. typhi murium no. 30
B. psittacosis no. 31 . .
B. enteritidis Gartner no. 33
B. typhi no. 35 . . .
B. dysenteriae Flexner no. 42
B. „ Sonne „ 50
B. „ Shiga Kruse no

lichtgroen
heldergroen

groen
heldergroen
lichtgroen

groen
heldergroen
lichtgroen
groen
groen
heldergroen
groen
groen
lichtgroen

Wij kunnen dus besluiten, dat, vast verbonden met het bac-
terielichaam, een ferment voorkomt, dat in staat blijkt, on-
afhankelijk van de functies van de levende cel, melkzuur tot
pyrodruivenzuur te oxydeeren.

Dit geldt ook voor die bacteriën, die, zooals B. lactis aero-
genes, bij de culturen met levende cellen geen aantoonbare
hoeveelheden pyrodruivenzuur vormen!

Nu zijn reeds vroeger door Engelsche onderzoekers i) on-
derzoekingen gedaan over de oxydatie van melkzuur door B.
coli in tegenwoordigheid van methyleenblauw. Het methy-
leenblauw werkt hier als waterstofacceptor. Wij hebben in
onze proeven echter geen specifieke waterstofacceptor toe-
gevoegd. In ons geval blijven dan ook twee mogelijkheden
over:

In de eerste plaats bestanddeelen uit de pepton. Hierop zou
b.v. kunnen wijzen de moeilijke vergisting van een lactaat-
oplossing, waaraan geen pepton is toegevoegd. Wij weten,
dat pepton ook waterstof kan adsorbeeren; het schijnt dus
van te voren niet onmogelijk, dat het als waterstofacceptor
kan dienst doen.

In de tweede plaats kan de zuurstof uit de lucht als water-
stofacceptor fungeeren. Volgens W i e 1 a n d is zuurstof zelfs
de natuurlijke waterstofacceptor.

De methyleenblauw-methode gaat ook door onder ana-
erobe omstandigheden. Dit is trouwens heel begrijpelijk,
omdat de luchtzuurstof in dit geval geen rol speelt. De reeds
bovengenoemde onderzoekers werken eveneens met, door
toluol gedoode, bacteriën, zoodat ook zij uitsluitend met de
aanwezige enzymen werken.

Om nu uit te maken, wat in ons geval de waterstofacceptor
is, zal het noodig zijn de proeven in een anaërobe omgeving
te doen plaats hebben. Voor het geval, dat in de pepton een
geschikte waterstofacceptor voorkomt, zullen wij pyro-
druivenzuur vinden; voor het geval, dat alleen zuurstof als
waterstofacceptor fungeert, zullen wij deze stof niet vinden.

Het apparaat, waarin wij deze anaërobe gisting lieten
plaats vinden, bestond uit een vacuumexsiccator, waarvan
wij allereerst nagingen, dat deze luchtdicht afsloot. De ex-
siccator bezat een helmvormig bovenstuk, voorzien van een
ringvormige goot, welke laatste gevuld werd met een alka-
lische pyrogalloloplossing. In de exsiccator zelf plaatsten wij
de, met de bacteriën geënte, cultuurbuizen, die wij op 40° C
verwarmd hadden. Vervolgens moest de exsiccator met stik-
stof gevuld worden. Daar het er in ons geval ten zeerste op
aankwam, dat inderdaad alle zuurstof verwijderd was, moest
hieraan groote zorg besteed worden.

Een geconcentreerde, waterige oplossing van pyrogallol
werd gekookt en onder doorleiding van zuivere stikstof (zie
sub b.) afgekoeld. Eenzelfde volume 30 % natriumhydroxyde
werd eveneens opgekookt ter verwijdering van opgeloste
lucht en daarna, terwijl stikstof werd doorgeleid, afgekoeld.

Deze twee oplossingen mengden wij niet dadelijk, maar
brachten eerst alleen de pyrogalloloplossing in de ringvormige
goot van de exsiccator. Daarna sloten wij de exsiccator.

Dit gas, dat wij uit een gascylinder verkregen, bevatte vrij
veel zuurstof. Wij leidden het daarom door een oven, waarin
twee buizen van moeilijk smeltbaar glas, gevuld met rolletjes
kopergaas. Het gedeeltelijk reeds geoxydeerde koper redu-
ceerden wij door methylalcoholdamp door de verhitte buizen
te leiden. Over het op deze wijze gereduceerde gaas leidden
wij nu de stikstofstroom. Voordat wij deze zuurstofvrije stik-
stof in de exsiccator toelieten, controleerden wij het gas nog-
maals door het door een alkalische pyrogalloloplossing te
leiden, die zich in drie achter elkaar geschakelde wasch-
fleschjes bevond. Bij het afbreken van de leiding kon er
wel zuurstof in de twee buitenste waschfleschjes binnendrin-
gen; het middelste mocht niet donker worden.

Met behulp van een waterstraalluchtpomp pompten wij de
exsiccator leeg (de druk was toen ±15 mm). Door middel
van een driewegkraan zetten wij nu de pomp af en lieten de
stikstof toestroomen, totdat de druk weer één atmosfeer was
geworden. Toen brachten wij opnieuw de pomp in verbin-
ding met de exsiccator en pompten deze opnieuw leeg. Nadat
nogmaals stikstof toegevoerd was, werd de geheele bewer-
king nog eens herhaald. Eerst nu werd de natriumhydroxyde-
oplossing toegevoegd. Hiertoe maakten wij de gummistop,
waarmee het helmvormige bovenstuk van boven was ge-
sloten, los en lieten met een pipet de loogoplossing bij de

pyrogalloloplossing vloeien. Nadat de toestel weer gesloten
was, pompten wij hem voor de laatste maal leeg en lieten
toen stikstof toe, totdat de druk ± 600 mm was. Dit om te
voorkomen, dat door uitzetting van het gas in de broedstoof
het bovenstuk er af gedrukt zou worden.

Dat al deze maatregelen voldoende waren, bleek wel uit
het feit, dat de pyrogalloloplossing zich niet donker kleurde.

De culturen werden gedurende 25 dagen in de broedstoof
bij 35° C bebroed. Daarna openden wij de exsiccator en on-
derzochten de culturen.

Overzicht over het ontstaan van pyrodruivenzuur bij de anaërobe
vergisting van ammoniumlactaat door de bacteriën der coli-typhusgroep.

B. dysenteriae Flexner no. 42
B. „ „ „ 49
B. „ Sonne „ 50
B. „ „ „ 52
B. „ Shiga Kruse no
B. „nbsp;......

In de eerste plaats viel ons op, dat zeer weinig groei te zien
was. Daarna reageerden wij op pyrodruivenzuur met nitro-
prussidnatrium en ammoniak.

In geen enkel geval van de onderzochte 24 stammen kregen
wij dus met de reactie van S i m o n een positief resultaat.

Hieruit volgt, dat het de luchtzuurstof is, die de oxydatie
tot stand brengt en daarbij als waterstofacceptor optreedt.
Wij hebben er in hoofdstuk I reeds op gewezen, dat voor
deze dehydreeringen de volgende formule wordt aangenomen:

Daar echter de organismen van de coli-typhusgroep een
sterke katalasewerking hebben, is het niet mogelijk dit water-
stofperoxyde aan te toonen, daar het direct weer ontleed
wordt.

Bij de bespreking van de door ons bij de vergisting van
ammoniumlactaat verkregen resultaten, hebben wij ook ge-
wezen op de mogelijkheid van de volgende sphtsing van het
melkzuurmolecule:

Dit in verband met het vinden van aceetaldehyde en
mierenzuur. Het aldehyde zou dan voor het grootste gedeelte
in azijnzuur moeten worden omgezet, daar dit aldehyde
slechts in sporen, en dan nog maar in enkele gevallen, kon
worden aangetoond, terwijl condensatie tot acetylmethyl-
carbinol of diacetyl niet plaats vindt.

Wij hebben aan dit feit nog eens bijzondere aandacht ge-
schonken in verband met het door Nagaii), met behulp
van de sulfietmethode, verrichte onderzoek over de vergis-
ting van calcium- en natriumlactaat met B. coli en B. lactis
aerogenes.

Volgens genoemde onderzoeker ontstaat zonder sulfiet
geen aceetaldehyde, wat in overeenstemming is met de ook
door ons voor die organismen verkregen resultaten.

Zijn sulfietvoedingsbodem heeft de volgende samenstelling:
10 g calciumlactaat
500 cm3 gistwater
2.5 g ammoniumsulfaat
30 g krijt

Deze oplossing ent hij o.a. met 15 oogjes van een cultuur
van B. lactis aerogenes en onderzoekt na verschillende tijden
de hoeveelheid aceetaldehyde.

Rekenen wij uit hoeveel dit is, dan blijkt het resp. ± 4 %,
± 6 % en ± 2 % te zijn van de theoretisch mogelijke hoe-
veelheid, als wij de volgende splitsing aannemen:

Voor een ophoopingsmethode kan dit zeker niet als een
bijzonder treffend resultaat worden aangemerkt. Meer eigen-

aardig is echter nog het resultaat, dat hij na 20 dagen krijgt,
waar nl. de hoeveelheid aceetaldehyde tot op minder dan
1/3 gedeelte van de opbrengst van 14 dagen is verminderd!

Wij hebben deze proeven voor een groot aantal organismen
der coli-typhusgroep nagewerkt. In de eerste experimenten
van Neuberg werkt hij met natrium- of calciumbisulfiet.
Deze stof is echter in ons geval ongeschikt, daar zij voor de
bacteriën giftige eigenschappen heeft. Echter kan gebruik
gemaakt worden van het natriumsulfiet. Ook deze stof ver-
bindt zich met aldehyden tot een product, dat door de bac-
teriën niet verder aangetast wordt:

Er ontstaat dus een alkalische reactie bij deze sulfiet-
gisting. Wij hebben uit de oplossing het calciumcarbonaat,
dat N a g a i toevoegt, weggelaten. Deze stof voegt men al-
leen toe om groote hoeveelheden zuur te neutraliseeren. Nu
hebben wij bij de normale gistingen, althans voor de gas-
vormende bacteriën der coli-typhusgroep, geen hooge zuur-
graad aangetroffen. In de tweede plaats zal de hoeveelheid
natriumhydroxyde, die bij de aceetaldehydebinding vrij komt,
neutraliseerend werken.

2 % ammoniumlactaat
1 % pepton „Wittequot;
0.16 % secundair ammoniumfosfaat
0.5 % natriumchloride
1 % natriumsulfiet.
De Ppj van deze oplossing was 7.2.

Wij sterihseerden haar door filtratie door een Seitz E.K.
bacteriefilter, vulden vervolgens steriele cultuurbuizen met

± 20 cm3 van deze oplossing en entten daarna met een 24
uur oude agarcultuur van de verschillende stammen. De
stammen werden onderzocht, zoowel na 14 dagen als na
4 weken.

Overzicht over het ontstaan van aceetaldehyde bij de vergisting van
ammoniumlactaat door de bacteriën der coli-typhusgroep.

Hierboven hebben wij reeds medegedeeld, dat onder ana-
erobe omstandigheden geen pyrodruivenzuur wordt gevormd.
Het zou echter mogelijk kunnen zijn, dat onder deze omstan-

1) De aanduiding „spoorquot; in deze tabel heeft betrekking op hoeveel-
heden van ± 0.5 mg aceetaldehyde.

Om deze mogelijkheid te toetsen, kweekten wij een aantal
stammen van de coli-typhusgroep in cultuurbuizen op de nor-
male lactaatvoedingsbodem. Deze werden op de reeds eerder
beschreven methode 1) anaëroob gekweekt. Volledigheids-
halve hebben wij dezelfde stammen ook op de sulfietvoedings-
bodem anaëroob gekweekt.

De resultaten van deze beide onderzoekingen zijn eveneens
in tabel VIII opgenomen.

Het resultaat is dus, dat bij de melkzuurvergisting, althans
onder deze omstandigheden, geen aceetaldehyde gevormd
wordt. De sporen aceetaldehyde, die bij de anaërobe sulfiet-
gisting ontstaan, mogen zeker niet beschouwd worden als een
normaal product van de bacteriestofwisseling.

Om de gevoeligheid van de reactie op aceetaldehyde te
vergrooten, hebben wij haar op de volgende wijze uitgevoerd:

De uitgegiste vloeistof brachten wij in een Jena rondbodem-
kolf van 250 cm^, welke gesloten werd door een gummistop,
voorzien van twee doorboringen. Door de eene doorboring
ging een korte, rechte koeler, door de andere een inleidbuisje,
dat onder de vloeistofspiegel in de kolf uitmondde. De koeler
was aan de bovenzijde verbonden met een tweemaal recht-
hoekig omgebogen buisje, welk buisje aan de andere zijde
verbonden was met een lange inleidbuis, die geplaatst was

in een lange, wijde, aan één zijde toegesmolten buis. De in-
leidbuis reikt nagenoeg tot de bodem. In de wijde buis komt
een mengsel van:

5 cm3 4 % nitroprussidnatriumoplossing en
10 cm3 3 % piperidineoplossing,
zijnde het reagens van R i m i n i.

De kolf met de gistingsvloeistof werd nu zacht verwarmd,
waardoor het aceetaldehyde vrij kwam. Het inleidbuisje was
verbonden met een stikstofcylinder. Door een stikstofstroom
door de toestel te leiden kon het aceetaldehyde meegesleept
worden in het reagens van R i m i n i. Al naarmate de hoe-
veelheid aceetaldehyde, kleurt dit mengsel zich van geel,
geelgroen, groen, groenblauw tot blauw. Zijn er slechts
sporen aldehyde aanwezig, dan ziet men, als de stikstofstroom
wordt uitgeschakeld, een blauw wolkje onder de meniscus
in de inleidbuis.

Bij de sulfietgisting krijgt men het aceetaldehyde door ver-
warming wel vrij uit de verbinding met het sulfiet, maar om
het daarbij tevens ontstane natriumbisulfiet te binden, wordt

Wij hebben ons nog een indruk willen vormen over de
hoeveelheid melkzuur, die vergist wordt.

Als vergistingsproducten hebben wij gevonden: pyro-
druivenzuur, mierenzuur en azijnzuur. Laat men de vergisting
plaats vinden door een groot aantal bacteriën, dan vindt
men geen, of slechts een spoor, pyrodruivenzuur. Uitgezon-
derd de typhus- en dysenteriebacteriën splitsen alle organis-
men het mierenzuur in waterstof en kooldioxyde. Bij B. coli

no. 4 gaat dit zóó ver, dat men slechts sporen mierenzuur
aantreft. Het gevormde zuur is dus practisch uitsluitend
azijnzuur.

Wij hebben van de volgende stammen de hoeveelheid
vluchtig zuur bepaald, nl. B. coli no. 4, B. typhi no. 36 en
38, B. dysenteriae Flexner no. 49 en B. dysenteriae Sonne
no. 52.

Voor B. coli hebben wij gerekend, dat alle zuur azijnzuur
is, bij de andere stammen, dat in het vluchtig zuur gelijke
hoeveelheden mierenzuur en azijnzuur aanwezig zijn. Van de
gevonden hoeveelheid trokken wij eerst nog de hoeveelheid
vluchtig zuur af, die ontstaat bij de vergisting van een blanco
peptonoplossing door de betreffende bacterie. Deze hoeveel-
heid schommelt voor 100 cm^ 1 % peptonoplossing tusschen
5.5 en 8.6 cm^ 0.1 N natriumhydroxyde.

Daar uit één grammolecule melkzuur één grammolecule
azijnzuur ontstaat, geeft de hoeveelheid ontstaan azijnzuur
(in grammoleculen) tevens de hoeveelheid melkzuur (even-
eens in grammoleculen), die vergist is.

In de volgende tabel is het resultaat opgenomen. De oplos-
sing bevat 2.38 % ammoniumlactaat.

dat de hoeveelheid vergist melkzuur vrij aanzienlijk wordt.
Tevens kan men hieruit besluiten, dat — indien een koolstof-
bron aanwezig is, die gemakkelijk vergist wordt, zooals bij de
gemengd-zure gisting het geval is, waar de vergisting na
eenige dagen is afgeloopen — de vergisting van het melk-
zuur een practisch te verwaarloozen factor is.

In het voorgaande hoofdstuk hebben wij gezien, dat het
primaire ontledingsproduct van melkzuur het pyrodruiven-
zuur is. Wij hebben daarvan toen aangenomen, dat het ge-
splitst werd in mierenzuur en azijnzuur. Deze reactie zou ver-
bonden zijn aan de levende cel.

Wij hebben daarom, aansluitend aan de melkzuurvergis-
ting, ook de vergisting van pyrodruivenzuur door de bac-
teriën der coli-typhusgroep ter hand genomen.

Neubaueri) heeft ontdekt, dat het pyrodruivenzuur
door levende gistcellen vergist wordt. De ontleding is een
decarboxylatie:

Het ferment, dat deze werking uitoefent, is later door
Neuberg2) met de naam cafboxylase bestempeld.

1) O. Neubauer en K. Fromherz: H. S. 70, 350 (1910ni).
ä) C. Neuberg: B. 44, 2479 (1911).

gen in het werk gesteld om een vergisting van het pyro-
druivenzuur te verkrijgen. Aanvankelijk met weinig succes i),
slaagden zij er later eveneens in dit zuur te doen ver-
gisten 2, 3).

Neuberg4) ontdekt, dat rottingsbacteriën het pyro-
druivenzuur niet decarboxyleeren, maar geheel andere pro-
ducten doen ontstaan, nl. azijnzuur, waterstof en kooldioxyde.
Deze twee laatste stoffen denkt hij zich ontstaan uit een
splitsing van mierenzuur:

De vergistingsproducten zouden dus zijn mierenzuur en
azijnzuur. Hij komt hierdoor tot de volgende vergelijking:

Mazés) schrijft aan bepaalde organismen, die hij niet
nader beschrijft, het vermogen toe pyrodruivenzuur te oxy-
deeren tot diacetyl:

3)nbsp;C. Neuberg en J. Kerb: Bio. Z. 53, 406 (1913).
i) C. Neuberg: Bio. Z. 67, 90, 122 (1914);

C. Neuberg en B. Rewald: Bio. Z. 71, 122 (1915).
6) P. Maze: C. r. Soc. de Biol. 81, 1150 (1918).

Nagayamai) ontdekt, dat een schimmel: Aspergillus
niger mutante en ook andere schimmels het vermogen bezit-
ten pyrodruivenzuur te decarboxyleeren.

Bij de inwerking van boterzuurbacteriën op pyrodruiven-
zuur vinden Neuberg en Arinstein^) eveneens
mierenzuur en azijnzuur.

N a g a i 3) laat pyrodruivenzuur door B. coli vergisten bij
aanwezigheid van natriumsulfiet. Zijn resultaat is, dat er
aceetaldehyde wordt gevormd.

Virtanen4) kweekt propionzuurbacteriën op pyro-
druivenzuur. Deze organismen vergisten dit zuur tot propion-
zuur, azijnzuur en kooldioxyde:

Le FèvreS) beschrijft in zijn dissertatie de inwerking
van B. coli op pyrodruivenzuur. Er ontstaan volgens deze
auteur: waterstof en kooldioxyde in de verhouding 3 : 5, azijn-
zuur en sporen acetylmethylcarbinol. Geen aceetaldehyde,
melkzuur en barnsteenzuur.

Bij de z.g. sulfietgisting ontstaat daarentegen met boven-
genoemd organisme wel aceetaldehyde.

Bij de verklaring van de gemengd-zure gisting nemen
zoowel Neuberg en Gorr®) als Scheffer 7) en

2)nbsp;C. Neuberg en B. Arinstein: Bio. Z. 117, 269 (1921).
8) K. Nagai: Bio. Z. 141, 266 (1923).

*) A. J. Virtanen: Soc. Scient. Fenn. 1, 36 (1923); 2, 20 (1925).
Virtanen en Karström: Acta Chim. Fenn. 7, 17 (1931).

6)nbsp;A. J. le Fèvre: Bijdrage tot de kennis der bacteriëele gisting.
Diss. Utrecht, 1924.

7)nbsp;M. A. Scheffer: De suikervergisting door bacteriën der coli-
groep, Diss. Delft, 1928.

K 1 u y V e r 1) aan, dat het in het schema van deze vergisting
voorkomende pyrodruivenzuur door de cohgroep ontleed
wordt onder afsphtsing van kooldioxyde:

Neuberg en W i n d i s c h 3) vinden, dat azijnbacteriën
het pyrodruivenzuur eerst decarboxyleeren en dat daarna
het ontstane aceetaldehyde tot azijnzuur en aethylalcohol
wordt gedismuteerd, waarna de alcohol weer tot aceetalde-
hyde wordt geoxydeerd.

Aan Gottschalk^) gelukt het, door middel van een
bepaalde stam van Rhizopus nigricans, uit pyrodruivenzuur-
calcium als eenige koolstofbron, in vrij groote hoeveelheden
fumaarzuur te verkrijgen (tot 32 % van de theoretische hoe-
veelheid); daarnaast worden azijnzuur en sporen melkzuur
gevormd. Als hem later deze vergisting niet meer gelukt,
schrijft hij dit toe aan een degeneratie van de oorzakelijke
schimmelcultuur 5).

Maurer 6) kweekte propionzuurbacteriën op pyrodrui-
venzuur. Zijn resultaten stemmen overeen met die van

1)nbsp;A. J. Kluyver: The chemical activities of microorganisms, Univ.
of London Press, 1931.

2)nbsp;W. C. de Graaff: Ned. Tijdschr. voor Hyg., Microbiol, en
Serol., 1, 43 (1926).

A. Gottschalk: H. S. 152, 136 (1926); 172, 314 (1927).
6) A. Gottschalk: H. S. 182, 311 (1929).
6) K. Maurer: Bio. Z. 191, 83 (1927).

Bij de vergisting van pyrodruivenzuur door B. coli vindt
Van den Berghi) als eenige vergistingsproducten
mierenzuur en azijnzuur.

Bij de sulfietgisting daarentegen zou de splitsing anders
verloopen en wel als een gewone decarboxylatie, dus vor-
ming van aceetaldehyde en kooldioxyde.

Volgens Cook en Stephenson2) ontstaat bij de
vergisting van pyrodruivenzuur door B. coli een stof, die
geen aldehyde eigenschappen heeft (reactie van Rimini
negatief), maar deze eigenschappen wel verkrijgt na ver-
hitting met weinig alkali.

Quastel en Wooldridge^) vinden bij de vergis-
ting van pyrodruivenzuur door B. coH: mierenzuur, lagere
vetzuren en melkzuur.

Tikka4) geeft aan, dat bij de vergisting van pyro-
druivenzuur door B. coh ontstaan: mierenzuur en azijnzuur.
Het mierenzuur ondergaat hierna een ontleding tot waterstof
en kooldioxyde. De hierbij ontstane waterstof reduceert het
pyrodruivenzuur gedeeltelijk tot melkzuur.

Wij hadden de beschikking over een preparaat pyro-
druivenzuur, afkomstig van Fraenkel en Landau,
„reinstquot;. Alvorens dit te gebruiken, destilleerden wij het in
vacuum. Kpt. 15 mm 62° C.

1) V. H. vandenBergh: Bijdrage tot de kennis van de biochemie
der dysenteriebacteriën. Diss. Utrecht, 1928.

S) R. P. Cook en M. Stephenson: Biochem. J. 22, 1368 (1928).
S) J. H. Quastel en W. R. Wooldridge: Biochem. J. 23, 115
(1929).

gende gegevens: Getitreerd met 0.1 N natriumhydroxyde
vonden wij een gehalte aan pyrodruivenzuur van 99.16
neergeslagen als 2-4 dinitrophenylhydrazon vonden wij
95.79 %.

Het gedestilleerde zuur neutraliseerden wij met een 5 %
natriumcarbonaatoplossing.

2 % pyrodruivenzuurnatrium
1 % pepton „Wittequot;
0.5 % secundair ammoniumfosfaat
0.5 % natriumchloride.

Deze voedingsbodem kan niet door hooge verhitting ge-
steriliseerd worden. Daarom filtreerden wij de vloeistof door
een Seitz E.K. bacteriefilter.

Het spreekt vanzelf, dat het geheele filterapparaat, zoowel
hier als in de vroeger genoemde gevallen, van te voren ge-
sterihseerd werd. Wij deden dit door het in een autoclaaf
30 min op 120° C te verhitten.

Nadat wij gecontroleerd hadden, dat de oplossing steriel
was, vulden wij hiermede steriele gistkolfjes en entten hierop
de verschillende bacteriën der coli-typhusgroep, teneinde
eventueele gasvorming na te gaan. Reeds na 24 uur waren
in verscheidene van deze kolfjes gasbellen te zien. De gisting
verliep snel. Na vijf dagen trad geen verandering in het gas-
volume meer op. Wij onderzochten het gas volgens de in
hoofdstuk IV besproken methode. Het resultaat is opgenomen
in Tabel IX.

Tevens onderzochten wij de Ppj van de uitgegiste vloei-
stof. Deze is eveneens in Tabel IX aangegeven.

Vergisting van pyrodruivenzuur door de eoli'typhusbacteriën.
Overzicht van de zuur- en gasvorming.

Het blijkt, dat op een enkele uitzondering na, de voedings-
oplossing sterk zuur is geworden, hetgeen al een aanwijzing
is, dat de splitsing van het pyrodruivenzuur aanleiding is tot

het ontstaan van mierenzuur en azijnzuur. Eén van de beide
zuren zal hierbij in de vorm van zijn natriumzout ontstaan,
voor de ander is hiertoe geen gelegenheid. Het is ook vol-
komen begrijpelijk, dat het gasvolume na eenige dagen niet
meer verandert. De hooge zuurgraad belemmert nl. de groei
der bacteriën. Onverklaarbaar is echter het gedrag van ß.
pneumoniae no. 7. Wij kunnen wel aannemen, dat mieren-
zuur voor het grootste gedeelte ontleed wordt, maar hierbij
ontstaan gelijke hoeveelheden kooldioxyde en waterstof. Het
kooldioxyde kan ook niet als bicarbonaat in oplossing zijn,
daar dit door het, dan vrije, azijnzuur ontleed wordt.

Bij een vergaande ontleding van het mierenzuur is het
begrijpelijk, dat de Ppj weer stijgen zal.

Wij hebben hierna nog een vergelijking willen maken van
de invloed, die de verschillende kationen uitoefenen. Hier-
voor gebruikten wij het calcium- en het natriumzout. Om
deze twee zouten te kunnen vergelijken, lieten wij uit de voe-
dingsbodem het fosfaat weg. Verder is de samenstelling,
zooals wij die reeds boven aangaven. De Pj^ voor beide
oplossingen bedroeg 7.4.

In Tabel X zijn de resultaten van deze proeven opgeno-
men. Er zijn in deze tabel verschillende feiten, die opvallen.
In de eerste plaats: als wij deze tabel vergelijken met de
vorige, springt het duidelijk in het oog, dat de Pp^ bij na-
genoeg alle stammen hooger geworden is. Dat dit een gevolg
is van de langere vergistingsduur wordt waarschijnlijk, als
men ziet, dat de culturen, die slechts zeven dagen gegist
hebben, ook een lagere Pj^ hebben.

In de tweede plaats: B. pneumoniae no. 7 heeft een geheel
andere verhouding kooldioxyde : waterstof gekregen. Daar-
entegen zijn er weer andere stammen, die plotseling uitslui-
tend waterstof als gasvormig product geven. Hieruit volgt,
dat de groote wisselingen niet te verklaren zijn uit een
verschil in oplosbaarheid der beide gassen. Vooral bij de

Overzicht over de vergisting van pyrodruivenzuurnatrium en 'calcium door de
bacteriën der coli-typhusgroep.

16 d
12 „

12
16

7
16

7
7
7

16
7

16
12

7
7
16

8.2
7.4

7.3
7.2

7.2
7.0

6.4
7.0
6.8

8.4
6.2

9.0
6.8

6.6

6.3
7.0

12 d
12 „

12 „
16 „

12 „
12 „

16 „
14 „
16 „

16 „
14 „

16 „
12 „

6.1
7.4

7.4

7.3

6.6
6.2

6.2
6.0

7.2

7.4
6.9

6.6
7.4

7.4

7.0
7.4
6.2

6.1
6.2

6.3
6.0
6.0
6.0
6.3
6.2

geen gas
1 : 4

1nbsp;: 4

geen

CO,
1 : 2
geen
CO,

2nbsp;: 3
2 : 3
2 : 5

1 : 8
1 : 2

1 : 2
1 : 2

83 0/0

86 0/0
86 0/0

89 o/o
82 0/0

87 0/0
910/0
89 0/0

810/0
92 0/0

B. enteritidis Gärtner no. 33
B. „ Aertrijck „34
B. typhi no. 35 . . .
B. „ „ 36 . . .
B. dys. Flexner no. 42
B.nbsp;..nbsp;.. 49

vergisting van het calciumzout treden zeer groote verschillen
op. In de gevallen, dat geen gas is gevormd, is de Pj.j, in
vergelijking met de andere wel-gasvormende stammen, aan-
merkelijk lager. Het schijnt, dat de organismen het calcium-
formiaat minder snel aantasten dan het overeenkomstige
natriumzout.

De percentages waterstof, opgenomen in de 5de en 9de
kolom, slaan op de hoeveelheid waterstof, aanwezig in het
gas, dat overblijft na absorptie van het kooldioxyde. Deze
hoeveelheid waterstof werd in een eudiometer bepaald door
menging met zuurstof enz., zooals in Hoofdstuk III beschre-
ven is.

Dat het van kooldioxyde bevrijde gas geen 100 % water-
stof is, kan het gevolg zijn van uit de voedingsoplossing mee-
gesleepte lucht en van waterdamp.

Er zijn geen koolwaterstoffen bij de vergisting gevormd.
Het gas, dat na de verbranding overblijft, bevat nl. geen
kooldioxyde. Bij schudden met kaliumhydroxyde neemt het
volume niet af.

Voor de groote verschillen in de gassamenstelling, hebben
wij echter geen verklaring kunnen vinden. Bij vergelijking
van Tabel IX en X, krijgt men de indruk, dat de afwijkingen
van de verhouding 1 : 1 grooter worden, naarmate de vergis-
tingstijd langer duurt en men zou geneigd zijn, hierin een
absorptie of een verbruik van het kooldioxyde te zien.

Wat het oploopen van de Pp^ betreft, hierin behoeft men
niets abnormaals te zien. Het is een bekend feit, dat bacteriën
een zuur of alkahsch milieu trachten te neutraliseeren door
de vorming van basische resp. zure producten; in dit geval
kunnen het basische stoffen uit de pepton zijn.

Vervolgens hebben wij een onderzoek ingesteld naar de
andere niet-gasvormige vergistingsproducten.

imelkzuurvergisting gebezigd, evenals de gebruikte reacties
ter identificatie van de gevormde producten.

Wij gingen uit van de voedingsoplossing, die in het begin
van dit hoofdstuk is beschreven, d.w.z. het calciumzout van
het pyrodruivenzuur zonder fosfaat.

Om de vergisting niet te belemmeren door een te groote
hoeveelheid vrij zuur, voegden wij aan alle voedingsoplossin-
gen gesteriliseerd krijt toe. Dit krijt is een bron van infectie;
het is daarom noodzakelijk dit eerst gedurende één uur bij
180° C droog te steriliseeren. Het is niet voldoende als men
het in peptonwater gedurende een half uur in de autoclaaf
op 110° C verhit.

aldehyde, aethylalcohol, diacetyl en acetylmethylcarbinol,
hebben wij in geen der onderzochte gevallen aangetroffen.

Mierenzuur werd bij alle stammen gevonden, uitgezonderd
bij B. coli no. 4. Een spoor mierenzuur vonden wij bij B.
lactis aerogenes no. 5.

Azijnzuur kwam bij alle gistingen voor. Dat bij B. coh
alleen azijnzuur ontstaat, zal waarschijnlijk hieraan te wijten
zijn, dat alle mierenzuur gedurende de vergisting ontleed is.
Dit is eerder aan te nemen, dan dat er een splitsing zou zijn
in aceetaldehyde en kooldioxyde, gevolgd door een hydroxy-
datie van het aceetaldehyde.

Melkzuur vonden wij bij de navolgende organismen: B. coli,
B. lactis aerogenes, B. pneumoniae, B. paratyphi A, B. para-
typhi B, B. paratyphi C, B. typhi murium, B. psittacosis, B.
enteritidis Gärtner en B. enteritidis Aertrijck.

Dit zijn juist de gasvormende bacteriën, zoodat het voor
de hand ligt, het ontstaan van melkzuur hiermede in verband
te brengen. Met een bacteriëele werking heeft dit niets uit-
staande; wij hebben alleen te maken met een chemische re-
ductie van het pyrodruivenzuur door de gevormde waterstof.

Bij de andere, niet-gasvormende bacteriën hebben wij geen
spoor melkzuur gevonden.

Barnsteenzuur. Van dit zuur vonden wij geringe hoeveel-
heden bij alle gebruikte stammen. Het is echter niet zeker,
dat dit inderdaad door een biochemische reactie uit het
pyrodruivenzuur afkomstig is. Uit een blanco peptonvoedings-
bodem konden wij nl. eveneens geringe hoeveelheden barn-
steenzuur isoleeren.

Naar aanleiding van mededeelingen van Nagaii), Le
Fèvre2) en Van den Bergh^), als zou bij de z.g.
sulfietgisting van pyrodruivenzuur door de coli-typhus-
bacteriën ook aceetaldehyde ontstaan, hebben wij deze proe-
ven herhaald. Wij gebruikten hiervoor de volgende voedings-
bodem:

3 % pyrodruivenzuurnatrium, resp. -calcium
1 % pepton „Wittequot;
0.5 % natriumchloride
1 % gekristalhseerd natriumsulfiet {Na2S037aq)
Ph = 7.0.

Ook deze oplossing werd gesteriliseerd door filtreeren
door een Seitz E.K. bacteriefilter.

Wij entten in wijde cultuurbuizen 20 cm^ oplossing met een
groote hoeveelheid bacteriën en onderzochten, na 18 dagen
broeden bij 35° C. op de gebruikelijke wijze 4), de cultuur
op aceetaldehyde.

Het blijkt, dat in ± 50 % van de gevallen aceetaldehyde
ontstaat, zij het dan ook in zeer geringe hoeveelheden. Ook
zou men uit de tabel kunnen opmaken, dat uit de natrium-
verbinding iets meer aldehyde gevormd wordt.

Wij hebben nog enkele andere stammen onderzocht; wij
kweekten deze stammen alleen op het natriumzout en rea-
geerden na 14 dagen op aceetaldehyde.

2)nbsp;A. J. le Fèvre: Bijdrage tot de kennis der bacteriëele gisting,
Diss. Utrecht, 1924.

8) V. H. vandenBergh: Bijdrage tot de kennis der biochemie der
dysenteriebacteriën, Diss. Utrecht, 1928.

B. coli no. 4 ... .
B. lactis aerogenes no. :
B. pneumoniae no. 7 .
B. paratyphi A no. 8
B.nbsp;B .. 14

B. „ C 23
B. typhi murium no. 30
B. psittacosis no. 32 .
B. enteritidis Gartner no.
B. „ Aertrijck no. 34

— = geen aceetaldehyde. sp. = spoor. z.w. = zeer weinig, ± 1.5 o/o
w. = weinig, ± 2.5 o/o. = ± 4 o/o.

Resultaat van de sulfietgisting van pyrodruivenzuurnatrium
door de coH-typhusbacteriën.

w.
sp.

sp.

z.w.
sp.

B. dysenteriae Flexner no. 49 . .
B. „ Sonne „ 52 . .
B. „ Shiga Kruse no. 59

Zooals wij wel verwachtten, komt het resultaat overeen met
dat in de vorige tabel. Er ontstaan slechts geringe hoeveel-
heden aceetaldehyde, waarbij in de verschillende onder-
groepen nog variaties optreden.

Wij kunnen hieruit dus besluiten, dat door toevoeging van
sulfiet de vergisting voor een klein gedeelte in de richting
van de decarboxylatie wordt geleid, maar dat de normale
vergistingsvorm toch blijft: de ontleding in mierenzuur en
azijnzuur.

Bij de sulfietgisting namen wij nog het volgende waar: Bij
het leiden van de aceetaldehyde-houdende stikstofstroom
door het mengsel van nitroprussidnatrium en piperidine, ont-
stond in vele gevallen, naast of in plaats van de blauwe kleur,
een roodbruine kleur. Wij hebben bij eenige vergistingen,
waar deze kleurreactie vrij sterk was, het gasmengsel in een
warme 2-4 dinitrophenylhydrazine oplossing geleid. Er ont-
stond hierbij echter geen neerslag, maar in het uitstroomende
gas werd een papiertje, gedrenkt in de oplossing van
Rimini, violet gekleurd. Wij zijn er niet in geslaagd deze
vluchtige stof, die dus geen aldehyde of keton is, te iden-
tificeeren. Wij vonden deze stof vnl. bij: B. coli no. 1, B. lactis
aerogenes no. 5 en 6, B. pneumoniae no. 7, B. paratyphi A
no. 12, B. paratyphi B no. 14 en 15, B. paratyphi C no. 23, B.
typhi murium no. 30, B. psittacosis no. 31 en 32, B. enteritidis
Gärtner no. 33, B. enteritidis Aertrijck no. 34, B. typhi no. 36
en B. dysenteriae Flexner no. 49.

Tot slot nog de volgende opmerking. Neuberg heeft
de sulfietgisting toegepast om tusschenproducten, die anders
door verdere omzetting aan onze waarneming zouden ont-
snappen, vast te leggen. Bij het pyrodruivenzuur daarentegen
is aceetaldehyde — indien gevormd — juist eindproduct. Bij
de normale vergisting van dit zuur door de bacteriën der
coli-typhusgroep ontstaat geen aceetaldehyde. Als deze stof

dus bij de sulfietgisting ontstaat, kan dit alleen, doordat de
vergisting in een geheel andere richting wordt geleid. Bij de
gewone alcohohsche gisting ontstaat door sulfiettoevoeging
weliswaar ook een ander eindproduct, maar dat is alleen het
gevolg van het feit, dat door het vastleggen van het aceet-
aldehyde de normale reactie niet kan verloopen, wat iets
anders is dan de gedwongen omlegging bij de pyrodruiven-
zuursulfietgisting.

Het is reeds sinds lang bekend, dat mierenzuur gemakkelijk
vergist wordt. Braun i) heeft er echter op gewezen, dat
formiaten eigenlijk geen goede koolstofbronnen zijn, daar
groei hierop slechts optreedt, als organische stikstof i.e. een
pepton aanwezig is. Braun werkte met organismen van de
coli-typhusgroep, waarvan werkzaam zijn de coli- en para-
typhusbacteriën.

Duclaux2) nam waar, dat gist in staat was een ver-
dunde mierenzuuroplossing (0.04—0.07 %) te verbranden.
Eveneens was Tyrothrix tenuis hiertoe in staat.

Maassen^) onderzocht een reeks bacteriën op hun
vermogen om mierenzuur te splitsen. Hij verdeelt deze in drie
soorten:

a)nbsp;bacteriën, die gemakkelijk mierenzuur aantasten. Hier-
onder rangschikt hij: Bac. acidi lactici, Bac. cyanogenes, Bac.
diphtheriae columbarum, Bac fluorescens, Bac. fluorescens
putidus, Bac. prodigiosus, Bac. pyocyaneus en Proteus vul-
garis.

b)nbsp;organismen, die mierenzuur minder sterk aantasten,
waaronder volgens hem thuis behooren: Bac. pneumoniae

1)nbsp;H. Braun en C. E. Cahn-Bronner: Klin. Wochenschr. 1,
1824, (1922); Bio. Z. 131, 226, 272 (1922).

Friedländer, Bact. coli commune, Bac. typhi abdominalis en
Bact. lactis aerogenes.

c) Organismen, die mierenzuur niet aantasten. Hiertoe
rekent hij: Bac. diphteriae hominum en Bac. cholerae asiaticae.

Daarna doen Pakes en Jollymani) een uitgebreid
onderzoek over de vergisting van mierenzuur.

Zij vergisten natriumformiaat met behulp van B. enteritidis
Gärtner. Er wordt gas gevormd, bestaande uit kooldioxyde
en waterstof. De hoeveelheid kooldioxyde is ± 21 %. De
rest van het kooldioxyde is als bicarbonaat gebonden:

Zij hebben hun onderzoek met verscheidene andere bac-
teriën herhaald. Wij noemen enkele hiervan, ter vergelijking
met het onderzoek van M a a s s e n.

Zij verkregen een positief resultaat bij: 80 stammen van
B. coli communis, 2 stammen B. enteritidis Gärtner, 2 stam-
men B. pneumoniae Friedländer, 2 stammen B. lactis aero-
genes, B. cloacae, B. cholerae gallinarum, Proteus vulgaris
en B. prodigiosus.

Geen ver gisting bij: B. typhi abdominalis, 2 stammen B.
pyocyaneus, B. fluorescens non-liquefaciens, B. cholerae suis,
Vibrio cholerae, e.a.

In een volgende publicatie 2) vergisten zij natriumformiaat
bij aanwezigheid van natriumnitraat. Er ontstaat nu in het
geheel geen gas (dus ook geen kooldioxyde!). Het nitraat
heeft als waterstofacceptor dienst gedaan:

staan kooldioxyde en stikstof. Zij deden deze proeven met
B. coli communis en B. enteritidis Gärtner.

Omelianskyi) isoleert een bacterie uit paarden-
faeces, die hij de naam B. formicicum geeft en die eveneens
calciumformiaat ontleedt in kooldioxyde en waterstof. Ook
hier ontstaat vrij kooldioxyde in hoeveelheden tot 33.5 % toe.
De bacterie is facultatief anaëroob.

De latere onderzoekingen komen alle met de genoemde
overeen in zooverre, dat er een splitsing in kooldioxyde en
waterstof wordt aangenomen. Over het voorkomen van kool-
dioxyde in het gistingsgas wordt weinig medegedeeld. In
zijn reeds meerdere malen aangehaalde dissertatie beschrijft
Van den Bergh, dat hij bij de vergisting van mieren-
zuur alleen waterstof als gas krijgt. Het leek ons daarom
nuttig deze proeven nog eens te herhalen.

Wij konden de mededeeling van Braun, dat de coli- en
paratyphusorganismen niet op formiaat alleen kunnen groeien,
bevestigen. Men mag hiertoe geen groote hoeveelheden bac-
teriën enten, daar in dat geval een gedeelte der bacteriën
ten koste van het andere deel leeft.

Wij maakten ook gebruik van het calciumzout en heten
dan het fosfaat weg. Van deze oplossing was de Pj^ 7.2.

Bij de typhus- en dysenteriebacteriën namen wij nooit
eenige vergisting waar. Bij de meeste andere bacteriën had
een gasvorming plaats, die soms vrij gering was. Het gas
bestond uitsluitend uit waterstof. Bij de natriumzouten hep de
Pj^j sterk omhoog en in de oplossing was carbonaat aan-
wezig. Bij de calciumzouten bleef de Ppj op het aanvangs-
peil, maar ook hier was carbonaat gevormd.

In de volgende tabel (tabel XIII) geven wij de vorming
van waterstof bij deze twee zouten weer. Wij lieten ter ver-
gelijking het fosfaat uit de eerste oplossing weg.

Vorming van waterstof bij de vergisting van formiaten door bacteriën
der coli' en paratyphusgroep.

De culturen bevonden zich in groote gistkolven. Wij entten
± 150 cm3 met 2 afgeslibde, 24 uur oude agarculturen van
de bacteriën.

Het blijkt, dat deze colibacterie een slechte gasvormer is.
Ook bij de vergisting van pyrodruivenzuur had deze stam
geen of slechts een spoor gas gevormd. B. paratyphi C vormt
veel meer gas uit het calcium- dan uit het natriumzout. B.
psittacosis geeft uit het calciumzout aanvankelijk ook meer
gas, maar na acht dagen is daarentegen de gasvorming uit
het natriumzout grooter. B. lactis aerogenes groeit slechts
matig, maar past zich beter bij het natriumzout aan. Eerst na
langere tijd schijnt het organisme ook het calciumzout te
kunnen assimileeren.

Het is merkwaardig, dat de gebruikte B. coli de Ppj van
de voedingsbodem met natriumformaat sterk verhoogt, zonder
nochtans het mierenzuur te splitsen.

Bij de calciumzouten kon de vorming van carbonaat ge-
constateerd worden door de vorming van korsten calcium-
bicarbonaat, die de oppervlakte van de gistingsvloeistof be-
dekten.

Het uitblijven van gasvorming bij B. coli no. 1 zou het
gevolg kunen zijn van een reduceerende werking, b.v. van
een reductie van het mierenzuur tot formaldehyde via
glyoxylzuur:

Wij hebben hierop gereageerd met galluszuur en gecon-
centreerd zwavelzuur 2) en tevens met morfine en gecon-
centreerd zwavelzuur 3). Het resultaat was negatief. Dit was
ook wel te verwachten. Uit de biochemische eigenschappen

1)nbsp;Deze hypothese is reeds geuit door O. Loew: C. Bakt. 1 Abt.
12, 462 (1892).

van deze bacterie i) blijkt duidelijk, dat dit organisme een
niet-gasvormer is. Ook bij eenige gasvormers hebben wij
tevergeefs naar formaldehyde gezocht. Wij hebben trouwens
nooit een ander vergistingsproduct gevonden dan de beide
genoemde gasvormige, nl. waterstof en kooldioxyde.

Bij het onderzoek van het gevormde gas kregen wij voor
de hoeveelheid waterstof waarden, die overeenkomen met
die, gevonden bij de pyrodruivenzuurvergisting. Dit was
eveneens het geval bij de anaërobe mierenzuurvergisting. Wij
zullen er daarom van afzien, deze in extenso weer te geven
Bij de anaërobe vergisting, die practisch geheel verhep als de
aërobe vergisting, deed zich nog het merkwaardige feit voor,
dat de gasvorming bij het natriumzout grooter was dan bij het
calciumzout, terwijl dit bij de aërobe vergisting in het alge-
meen juist tegengesteld was.

In Tabel XIV is het resultaat opgenomen van een vergis-
ting, die na 14 dagen stopgezet is.

Vergelijking van de hoeveelheid waterstof, ontstaan bij de aërobe en anaërobe
vergisting van natrium' en calciumformiaat.

De anaërobe vergisting werd uitgevoerd in het apparaat,
dat reeds eerder in Hoofdstuk IV beschreven is.

Het is ons, zooals reeds boven medegedeeld is, nooit
gelukt, kooldioxyde in het gistingsgas aan te toonen, wat
vroegere onderzoekers als P a k e s en } o 11 y m a n en ook
Omeliansky wel vinden. Trouwens, het lijkt eenigszins
onwaarschijnlijk, dat dit gebeurt. Wordt natriumformiaat ge-
sphtst, dan ontstaat er naast kooldioxyde tevens natrium-
hydroxyde, welke stoffen zich dadelijk tot natriumbicarbonaat
zullen verbinden.

De formule van Omeliansky klopt goed met het ex-
periment; waarschijnlijk is het proces ook hier via het bicar-
bonaat verloopen.

De bedoeling hiervan was, na te gaan, in hoeverre behalve
melkzuur ook andere oxyzuren door de bacteriën der coli-
typhusgroep worden aangetast, vnl., of ook hier de hydroxyl-
groep wordt geoxydeerd.

Wij hebben hiervoor gekozen: glycolzuur (C2), j8-oxypro-
pionzuur (C3), a-oxyboterzuur en j8-oxyboterzuur (C4).

Over de vergisting van dit zuur komen in de literatuur
slechts zeer weinig gegevens voor.

B a n n i n g 1) ziet, dat azijnbacteriën op glycolzuur ge-
kweekt, hieruit oxaalzuur doen ontstaan.

Volgens Harden en Norris2) wordt glycolzuur door
gedroogde gist, in tegenwoordigheid van methyleenblauw,
slechts langzaam geoxydeerd.

Raistrick en Clark^) zeggen, dat Aspergillus niger
goed op glycolzuur groeit. Wat de stofwissehngsproducten
betreft, zeggen deze onderzoekers alleen, dat geen oxaal-
zuur ontstaat.

Le Fèvrei) ontdekt, dat de colibacteriën bij de sulfiet-
gisting van glycokuur uit dit zuur aceetaldehyde vormen.

Aan Challenger, Subramaniam en Walker^)
gelukt het glycolzuurammonium met behulp van Aspergillus
niger in oxaalzuur om te zetten. Gebruikten zij het calcium-
zout, dan konden deze onderzoekers ook glyoxylzuur aan-
toonen.

Butterworth en Walker 3) maken de afbraak van
azijnzuur door B. pyocyaneum via glycolzuur en glyoxylzuur
waarschijnlijk.

Bernhauer en Siebenauger^) kweeken Asper-
gillus niger op glycolzuurnatrium. Er ontstaan citroenzuur
en oxaalzuur.

2 % glycolzuur, geneutraliseerd met ammonia
0.5 % secundair ammoniumfosfaat
1 % pepton „Wittequot;
0.5 % natriumchloride.

Wij entten op deze oplossing de verschillende reeds meer-
malen genoemde vertegenwoordigers der coli-typhusbacte-
riën. Het bleek ons al spoedig, dat dit zuur geen geschikte
voedingsbodem is, daar alleen de coliorganismen zich hierop

1)nbsp;A. J. le Fèvre: Bijdrage tot de kermis der bacteriëele gisting,
Diss. Utrecht, 1924.

2)nbsp;F. Challenger, V. Subramaniam en T. K. Walker:
J. Chem. Soc. 130, 200 (1927).

8) ƒ. Butterworth en T. K. Walker: Biochem. J. 23, 926 (1929).
4) K. Bernhauer en H. Sieb enäuger: Bio. Z. 240, 231 (1931).

vermeerderden. Wij hebben het onderzoek toen alleen met
B. coh no. 4 voortgezet.

Na 14 dagen was de cultuur sterk alkalisch geworden.
Dat dit het gevolg was van het ontstaan van carbonaten,
konden wij aantoonen door de oplossing met verdund zwavel-
zuur aan te zuren en een koolzuurvrije stikstofstroom door
de vloeistof te leiden. Het uitstroomende gasmengsel deed in
een heldere barytoplossing een neerslag ontstaan.

Wij konden geen vluchtige en niet-vluchtige, neutrale ver-
bindingen, noch vluchtige of niet-vluchtige zuren aantoonen.

Dit leidde er toe, dat wij de mogelijkheid van een totale
verbranding van het glycolzuur in overweging namen. Hier-
toe was het noodig de hoeveelheid ontstaan kooldioxyde
quantitatief te bepalen.

Deze oplossing entten wij met B. coli no. 4 en broedden
gedurende 6 weken bij 35° C, waarna wij de vergisting stop-
zetten.

In een afzonderlijke proef hadden wij geconstateerd, dat bij
deze vergisting geen gasvorming optreedt. Al het kooldioxyde
is dus als carbonaat of bicarbonaat gebonden.

De wattenprop, die de vergistingskolf afsloot, vervingen
wij door een rubber stop, waarin drie doorboringen; hier-
door gingen een inleidbuis, reikend tot aan de bodem, een
afvoerbuis, vlak onder de stop uitmondend en een druppel-
trechter. Het afvoerbuisje verbonden wij met twee wijde.

achter elkaar geschakelde, aan één zijde toegesmolten buizen,
beide voorzien van inleid- en afvoerbuis. Deze wijde buizen
vulden wij resp. met 20 en 10 cm^ verzadigde barytoplossing.
Het laatste afvoerbuisje was met een natronkalkbuisje ver-
bonden. De inleidbuis in de gistkolf verbonden wij, via een
waschfleschje, gevuld met 50 % kaliumhydroxydeoplossing,
met een stikstofcylinder. De druppeltrechter vulden wij met
25 % zoutzuur. Nu heten wij het zoutzuur in de gistkolf
vloeien en dreven onder zachte verwarming het vrijgemaakte
kooldioxyde met een stikstofstroom in de barytoplossing.
Nadat alle kooldioxyde gebonden was, titreerden wij de
barytoplossing met 0,1 N zoutzuur.

Uit 100 cm3 van een 3 % glycolzuurnatriumoplossing met
0.5 % secundair ammoniumfosfaat, 0.5 % natriumchloride en
1 % pepton „Wittequot;, verkregen wij, na 4 weken broeden
met B. coli no. 4, 64.4 mg kooldioxyde.

Het is mogelijk, dat het glycolzuur totaal verbrand wordt;
de hoeveelheden hiervan zijn echter zóó gering, dat wij
kunnen zeggen, dat deze stof practisch niet vergist wordt.

a) een directe oxydatie tot oxaalzuur en verbranding hier-
van tot kooldioxyde en water:

zuur aangetroffen. In Hoofdstuk Vlll zal nog nader over
de vergisting van oxaalzuur worden gesproken.

b)nbsp;oxydatie tot glyoxylzuur en hydrolytische splitsing tot
mierenzuur, dat verbrand wordt tot kooldioxyde en water:

Wij hebben echter nóch glyoxylzuur, nóch mierenzuur ge-
vonden, terwijl mierenzuur niet totaal verbrand wordt, maar
gesphtst in kooldioxyde en waterstof (zie Hoofdstuk VI).

c)nbsp;als derde mogelijkheid is te denken aan een decarboxy-
latie tot methylalcohol, gevolgd door een oxydatie tot formal-
dehyde en mierenzuur:

d)nbsp;een directe verbranding zonder tusschentrappen. Voor
deze laatste meening pleit het feit, dat wij bij de anaërobe
vergisting van glycolzuur door verschillende stammen der
coh-typhusgroep geen groei waarnamen.

op oxaalzuur met calciumacetaat. Er ontstond geen neer-
slag; ook onder het microscoop zagen wij geen kristallen;

op glyoxylzuur met 2-4 dinitrophenylhydrazine. Fehling's
oplossing werd niet gereduceerd;

op methylalcohol door oxydatie met kaliumpermanganaat
en fosforzuur tot formaldehyde i) en dit gas te leiden in
dimedonoplossing: resultaat negatief.

op formaldehyde met geconcentreerd zwavelzuur en gallus-
zuur 1), eveneens met negatief resultaat.

Le Fèvre2) heeft medegedeeld, dat bij de sulfietgisting
van glycolzuur aceetaldehyde ontstaat. Bij de gewone gisting
van B. coli no. 4 hadden wij deze stof niet gevonden. De
vorming daarvan moet wel langs een ingewikkelde weg ver-
loopen, daar een sterke reductie noodig is om uit glycolzuur
aceetaldehyde te verkrijgen. In de volgende tabel (tab. XV),
is het resultaat opgenomen van de proeven, die wij gedaan
hebben. Inderdaad is het niet te ontkennen, dat bij de aërobe
sulfietgisting aceetaldehyde ontstaat. Wij hebben ons er van
overtuigd, dat dit niet zijn oorzaak in de gebruikte pepton
vindt.

Een voedingsbodem, bestaande uit pepton sulfiet
fosfaat keukenzout en geënt met de verschillende coli-
typhusbacteriën, geeft nl. geen reactie op aceetaldehyde.

Echter, gezien het resultaat van deze sulfietgisting bij
pyrodruivenzuur (Hoofdstuk V), vragen wij ons af, of wij
in het toegevoegde sulfiet wel alleen een neutraal en onschul-
dig middel tot het vastleggen van aldehyde moeten zien en
of het niet veeleer zèlf een rol (en mogelijk een groote rol)
speelt. Het schijnt ons, dat het niet juist is, de conclusies,
gebaseerd op een sulfietgisting, zonder meer over te brengen
op de gewone, normale gisting 3).

ï) A. J. le Fèvre: Bijdrage tot de kennis der bacteriëele gisting.
Diss. Utrecht, 1924.

S) zie ook: H. Vinkenborg: Die Bedeutung des Acetaldehyds bei
der alkoholischen Gärung, Diss. Utrecht, 1931.

Overzicht over het ontstaan van aceetaldehyde bij de vergisting van
glycolzuur door de coH-typhusbactericn.

Dit zuur vertoont de meeste overeenkomst met het melk-
zuur. In de literatuur hebben wij echter niets gevonden over
vergisting van a-oxyboterzuur.

Het ging er ons voornamelijk om, na te gaan of dit a-oxy-
zuur, evenals melkzuur, tot ketonzuur geoxydeerd wordt.

Wij entten de oplossing daarom met de verschillende bac-
teriën der coli-typhusgroep in cultuurbuizen, bevattende
± 20 cm3 van deze vloeistof en broedden bij 35° C.

Na H dagen reageerden wij op de aanwezigheid van het
ketonzuur met een oplossing van 2-4 dinitrophenylhydrazine
(2 g 2-4 dinitrophenylhydrazine in 120 cmS 2 N zoutzuur).

In de derde kolom van deze tabel is aangegeven de ver-
gisting van dezelfde oplossing door middel van bacteriën,
die vóór het enten met toluol gedood waren. Zooals reeds
bij de melkzuurvergisting beschreven is, controleerden wij de
bacterie-emulsie eerst op de aanwezigheid van levende kie-
men, opdat wij er zeker van zouden zijn alleen met enzym-
werking te doen te hebben. Ook deze oplossingen werden
na 14 dagen broeden bij 35° C onderzocht.

Uit de tabel ziet men duidelijk, dat de oplossingen, die met
gedoode bacteriën waren geënt, in het algemeen meer neer-
slag geven dan die met levende organismen. Echter, ook het
tegengestelde komt enkele malen voor.

Overzicht over de vergisting van a-oxyboterzuur door de bacteriën
der coli-typhusgroep.

A „ 12 .
B „ 14 .
B „15.
C „ 23 .
C „ 26 .
typhi murium „ 30 .
psittacosis „ 31 .

-H-

I I I I
I I It

o. 42

50
52
57

„ 59

treft, is het niet mogelijk te zeggen of dit een toevalligheid is,
dan wel of het enzymcomplex door de toluol of anderszins
verstoord is.

Het neerslag hebben wij volgens de, bij het pyrodruiven-
zuurdinitrophenylhydrazon reeds beschreven, methode gerei-
nigd. De stof loste slechts onder verwarming in 1 N natrium-
carbonaat op; bij afkoelen kwam zij er in roodbruine amorfe
vlokken weer uit. Wij filtreerden de warme oplossing en
sloegen in het filtraat, door voorzichtig aanzuren met ver-
dund zoutzuur, het dinitrophenylhydrazon weer neer. Daar
het in natriumcarbonaat oplosbaar is, bewijst het een car-
boxylgroep te bezitten. Nadat wij het afgefiltreerd en uitge-
wasschen hadden met verdund zoutzuur en water, droogden
wij het eerst tusschen filtreerpapier, daarna in een exsiccator.
De fraaie gele kleur, die het aanvankelijk had, veranderde
hierbij in een geelbruine tint. Het had een scherp smeltpunt,
dat wij vaststelden op 175° C.

Helaas hadden wij niet de beschikking over een zuiver
preparaat a-ketoboterzuur, zoodat wij een mengsmeltpunt van
het dinitrophenylhydrazon hiervan met het door ons ver-
kregen product niet konden bepalen.

Wij hebben tenslotte nog nagegaan, welke de eindproduc-
ten van deze vergisting zijn. Hiertoe entten wij in een Erlen-
meyerkolf 200 cm^ van de bovengenoemde oplossing met
één afgeslibde agarcultuur van B. coli no. 4 en analyseerden
de vloeistof na 14 dagen broeden bij 35° C volgens de
methode in Hoofdstuk IV beschreven.

Het eerste zuur toonden wij aan door de reductie van een
sublimaatoplossing. De hoeveelheid mierenzuur was niet zeer
groot; het zuur ondergaat echter door B. coli weer een split-
sing, zoodat deze geringe hoeveelheid ons niet verwondert.

In de niet-vluchtige zuren vonden wij nog groote hoeveel-
heden onvergist a-oxyboterzuur.

De eerste reactie, nl. tot a-ketoboterzuur, verloopt enzy-
matisch. Wij zien dus, dat het verloop der gisting overeen-
stemt met de ontleding van melkzuur.

Dit zuur speelt een belangrijke rol bij de oxydatie van
boterzuur tot acetylazijnzuur. Volgens de bekende regel van
Knoop en Dakin grijpt de oxydatie van vetzuren in het
dierlijk organisme op de ;8-plaats aan. De eerste trap voert
tot ;8-oxyboterzuur, welke stof dan ook in de urine van dia-
betici wordt aangetroffen; de tweede trap gaat tot acetyl-
azijnzuur, dat ook weer verdere ontledingen — tot aceton —
kan ondergaan. Wat echter de ontleding van dit j8-oxyboter-
zuur door micro-organismen betreft, hierover zijn slechts
zeer schaarsche mededeelingen te vinden.

Bierry en Portieri) isoleeren een bacterie uit de
testis van een duif, die, op /8-oxyboterzuur gekweekt, hieruit
aceetaldehyde en aceton vormt. Hun voedingsbodem bevatte
1 % alkahzout van j8-oxyboterzuur pepton nitraten.
De reactie gaat waarschijnlijk via ,8-ketoboterzuur.

Raistrick en Clark2) zien, dat Aspergillus niger
goed op ;8-oxyboterzuur groeit. Van de vergistingsproducten
vertellen zij alleen, dat er geen oxaalzuur gevormd wordt.

Kühnau3) vindt bij de inwerking van lever fermenten
op ^-oxyboterzuur: barnsteenzuur, fumaarzuur, appelzuur,
acetylazijnzuur, aceetaldehyde, pyrodruivenzuur, 1-3 buty-
leenglycol en sporen azijnzuur. Hoewel wij hier niet met
micro-organismen te doen hebben, geven wij deze publicatie
toch om een indruk te geven van het fermentatief vermogen
van de lever.

Coppock, Subramaniam en Walker 4) vinden,
dat Aspergillus niger het j8-oxyboterzuur oxydeert tot acetyl-
azijnzuur en dit laatste zuur decarboxyleert tot aceton.

*) P. D. Coppock, V. Subramaniam en T. K. Walker:
J. Chem. Soc. 131, 1422 (1928).

Wij entten dezelfde bacteriën, die ook voor het onderzoek
naar de vergisting van a-oxyboterzuur gebruikt zijn, in wijde
cultuurbuizen op deze voedingsbodem en onderzochten na
drie weken broeden bij 35° C met 2-4 dinitrophenylhydrazine
of een carbonylgroep gevormd was, i.e. acetylazijnzuur.

Hetzelfde deden wij ook met bacteriën, die wij eerst met
behulp van toluol gedood hadden.

Bij de laatstgenoemde proeven kregen wij bij alle stam-
men een negatief resultaat. Bij de vergisting met levende
organismen kregen wij een zeer zwakke reactie bij de na-
volgende stammen:

B. coli no. 1 en no. 4
B. lactis aerogenes no. 5 en no. 6
B. pneumoniae no. 7
B. paratyphi C no. 26
B. typhi murium no. 30.

Over dit zuur hebben wij in de literatuur geen gegevens
gevonden, wat betreft een vergisting door micro-organismen.

Wij maakten een voedingsbodem, die bestond uit:
2 % ^-oxypropionzuurcalcium (een preparaat
van Fraenkel en Landau)

Wij entten deze oplossing met B. coh no. 4 en onderzoch-
ten na 6 weken broeden bij 35° C. De cultuur sloeg zeer slecht
aan. Wij konden geen vergistingsproducten vinden, waaruit
wij concludeeren, dat deze stof niet geschikt is als koolstof-
bron. Daar de configuratie van dit zuur het meest met glycol-
zuur overeenstemt — beide hebben een eindstandige hy-
droxylgroep — is deze structuur blijkbaar moeilijk voor de
bacteriën toegankelijk. Met zekerheid valt hier natuurlijk nog
niets over te zeggen; slechts een uitgebreid onderzoek zal
hierover licht kunnen verspreiden.

In verband met een mogelijke snelle vergisting van oxaal-
zuur, ontstaan bij de vergisting van glycolzuur, hebben wij
ook van oxaalzuur de invloed nagegaan, hierop uitgeoefend
door B. coli.

In de literatuur 1) staan al zeer weinig gegevens over de
vergisting van oxaalzuur aangegeven en deze wijzen alle op

Wij hebben slechts één geval gevonden, waarbij het oxaal-
zuur werd aangegrepen. Bac. extorquens 2), een uit de excre-
menten van regenwormen verkregen organisme, splitst oxaal-
zuur oxydatief, met behulp van luchtzuurstof, in carbonaten.

Ook Scholder en medewerkers) meenen een oxalaat-
vergistende bacterie gevonden te hebben. Zij zijn echter niet
in staat dit organisme in een reincultuur te kweeken.

Wij gingen uit van de volgende voedingsbodem:
2 % natriumoxalaat
0.4 % pepton „Wittequot;
0.5 % natriumchloride
0.5 % secundair kaliumfosfaat.

De ongewone verhouding koolstofbron-stikstofbron hgt
hierin, dat grootere hoeveelheden pepton met natriumoxalaat
een neerslag geven.

100 cm3 van deze oplossing entten wij met één afgeslibde
agarcultuur van B. coli no. 4. De cultuur sloeg slecht aan.
Na drie maanden zetten wij de vergisting stop, alhoewel de
groei nog maar zeer matig was.

Daarna sloegen wij in de cultuur het pepton neer met
40 cm3 fosforwolfraamzuur, filtreerden na eenige uren af en
waschten goed met water uit. De heldere oplossing werd tot
koken verwarmd en hierbij 80 cm^ van een eveneens warme
oplossing van 1 N calciumacetaat gevoegd. Wij verwarmden
nog 30 min op het waterbad en heten het neerslag een nacht
staan. De volgende dag zogen wij het neerslag af in een
glazen filterkroes en waschten goed uit. Daarna losten wij
het neerslag op in 4 N zwavelzuur en titreerden het oxaal-
zuur met 0.1 N kahumpermanganaatoplossing. Hetzelfde
deden wij ook met 25 cmS van een niet-geënte oxaalzuur-
oplossing.

Het in zwavelzuur opgeloste neerslag, afkomstig uit de
gegiste cultuur, vulden wij in een maatkolf je aan tot 100 cmS,
pipetteerden hieruit telkens 25 cmS en titreerden deze hoe-
veelheid met kaliumpermanganaat.

voor de uitgegiste oplossing, gem. 76.41 cm^
voor de blanco oplossing .... 76.42 cmS

Hieruit volgt dus, dat de hoeveelheid oxaalzuur na drie
maanden nog onveranderd was en dat wij geen rekening
hebben te houden met een spoedige ontleding, indien het bij
de glycolzuurgisting gevormd zou worden.

Uit de titratiecijfers volgt tevens, dat de juiste hoeveelheid
natriumoxalaat, in de oplossing aanwezig, was 2.0481 g.

Volledigheidshalve hebben wij de cultuur nog onderzocht
op vluchtige neutrale producten, vluchtige en niet-vluchtige
zuren. Het resultaat was negatief.

Een onderzoek werd ingesteld naar de werking van de
bacteriën der coli-typhusgroep op eenige a~ en ;8-oxyzuren.

Het bleek, dat deze organismen een enzym bevatten, dat in
staat is a-oxyzuren, waarbij de hydroxylgroep niet eindstan-
dig is, te oxydeeren tot de overeenkomstige ketonzuren.

De andere oxyzuren bleven door de inwerking van dit
enzym onveranderd; tevens bleek de afwezigheid van een
„y8-hydroxydasequot;.

De oxydatie heeft plaats met behulp van luchtzuurstof. Het
proces is streng aëroob; alleen, indien een waterstofacceptor
aanwezig is, kan de reactie, die als een dehydreering is op te
vatten, ook anaëroob plaats vinden.

De bij de oxydatie ontstane ketonzuren worden door de
levende cel ontleed op een zoodanige wijze, dat onder opname
van een molecule water het zuur gesplitst wordt in mieren-
zuur en een hooger vetzuur.

Mierenzuur wordt door coli- en paratyphusbacteriën ver-
gist tot waterstof en kooldioxyde. Zij doen dit alleen, indien
nog een organische stikstofbron aanwezig is. De typhus- en
dysenteriebacteriën tasten dit zuur niet aan.

Oxaalzuur is voor B. coli een ongeschikte koolstofbron.
De geheele hoeveelheid toegevoegd zuur wordt onveranderd
teruggevonden.

Het verdient aanbeveling voor de z.g. Eykmanproef bij
het bacteriologisch wateronderzoek het pepton door glutamine-
zuur te vervangen.

Vele thermoluminescentie-verschijnselen moeten als chemo-
luminescentie opgevat worden.

De proeven van H i d n e r t vormen een onvoldoende bewijs
voor zijn meening, dat antimoon tusschen 20° en 560° C
geen polymorphie vertoont.

De methode ter bepaling van keto-enolevenwichten volgens
Seidel en medewerkers biedt in het algemeen geen voor-
deelen boven die van K. H. Meyer.

Uit het onderzoek van Malachowski en medewerkers
zijn geen conclusies te trekken omtrent het verloop der reactie
tusschen natrium-benzyl-malonester en fumaarzure ester.

De meest aannemelijke verklaring van het electrophore-
tisch gedrag van kool in water is die van Verwey en
de Boer.

Voor het microchemisch aantoonen van kalium verdient
de reactie met dipikrylamine de voorkeur.

\	/
co 1	co
1 ch,	ch,
1 ch,	ch,
chnh,	1 chnh,
cooh	1 cooh

B. coli........	4 stammen	(no. 1 t/m 4)
B. lactis aerogenes ....	2	(no. 5 en 6)
B. pneumoniae.....	1	(no. 7)
B. paratyphi A.....	6	(no. 8 t/m 13)
B. paratyphi B.....	8	(no. 14 t/m 22)
B. paratyphi C.....	7	(no. 23 t/m 29)
B. typhi murium . . . .	1	(no. 30)
B. psittacosis......	2	(no. 31 en 32)
B. enteritidis Gärtner . . .	1	(no. 33)
B. enteritidis Aertrijck . .	1	(no. 34)
B. typhi .......	7	(no. 35 t/m 41)
B. dysenteriae Flexner . .	8	(no. 42 t/m 49)
B. dysenteriae Sonne . . .	7	(no. 50 t/m 56)
B. dysenteriae Shiga Kruse.	3	(no. 57 t/m 59)

			Hoeveel-	Vluchtige	Aantal gr. mol. azijnzuur	Hoeveel-
Stammen		Duur der	heid	zuren in		heid ver-
Stammen		vergisting	cultuur-	cm' 0.1 N		gist melk-
		vergisting	vloeistof	NaOH		zuur
B. coli no. 4		17 dagen	250 cm'	200 cm'	0.02	36.4 o/o
B. typhi no. 36		84 „	200 .,	158 ,.	0.0079	18.0 o/o
B. typhi no. 38		21 .,	250 „	52 „	0.0026	4.7 0/0
B. typhi no. 38		84 „	200 „	150 „	0.0075	17.0 O/o
B. dysenteriae Flexner no.
B. dysenteriae Flexner no.	49	56 quot;„	200 ,.	240 „	0.012	27.3 o/o
B. dysenteriae						27.3 o/o
Sonne no.	52	35 „	200 .,	281	0.014	31.8 0/0

Stammen	Natriumformiaat				Calciumformiaat
	Aëroob		Anaëroob		Aëroob		Anaëroob
	Ph	water- stof	Ph	water- stof	Ph	water- stof	Ph	water- stof
B. coli no. 4......	8.2	47 cm'	8.8	93 cm'	7.4	102 cm'	7.6	72 cm'
B. lactis aerogenes no. 5 .	8.8	14 „	8.8	50 „	7.6	19 „	8.0	4 „
B. pneumoniae Frl. no. 7 .	7.0	22 „	8.7	51 „	7.6	20 „	8.0	27 „
B. paratyphi A no. 12 . .	8.5	34 „	8.7	26 „	7.4	48 „	8.0	5 „
B. ,. B „ 14 . .	9.0	60 „	8.8	68 „	7.4	78 „	7.8	56 „
B. „ C „ 26 . .	8.7	16 „	8.8	60 „	7.2	116 „	8.0	77 „
B. typhi murium no. 30 .	9.0	26 „	8.6	4 „	7.6	27 „	8.0	34 „
B. psittacosis no. 31 . . .	8.0	15 „	8.8	52 „	7.5	46 „	7.9	35 „
B. enteritidis Gärtner no. 33	9.0	33 „	8.8		7.5	40 „	7.8	76 „
B. „ Aertrijck „ 34	8.8	30 „	9.0	52 „	6.4	38 „	8.0	24 „

1 fï; .■• f	iîi'v^Çj'v , ; .V
' -t. lt;	tiiliïKïï'fe

	V i
	lt; *

STAMMEN	u d	.2 3 J3 Ö5 .»c p s	'■s cQ r	2 2 10 0	Is	E d ra a	3 So 0. 3 fn È-'C . 3 0	.2 quot;O u c S m 'C a ^ li ó	d	3 00	a ra O 0 w (U 0	Si .2 iri Is Si
	aa	® s	'■s cQ r				cd a 0		CQ 0	CQ «	O	^^ s quot;O O
				ffl	CQ	BQ		CQ			CQ	. 0 OQtfl
Duur der vergisting in dagen	17	20	27	25	14	28	84	25	84	21	56	35
Ph..........	7.4	7.8	7.4	7.6	7.6	6.9	7.2	7.4	6.3	7.1	6.2	6.0
Gasvorming......	—	—	_		_
Aceetaldehyde..... Aethylalcohol......	—	—	—		—			—	-	spoor	spoor	spoor
Diacetyl........	_	—	_	_	_	_	__
Acetylmethylcarbinol . .	—	—	—	—	_	—	_	_	_	_	_	_
Mierenzuur.......	spoor
Azijnzuur.......
Andere vluchtige zuren .	—	—
Pyrodruivenzuur ....		—	—	—	—	—	—	_			_
Barnsteenzuur...... 2-3 butyleenglycol. . . .	spoor	spoor	spoor	-	-	spoor	spoor	spoor	spoor	spoor	spoor	spoor

Stammen				Pyro- druiven- zuur	Stammen			Pyro- druiven- zuur
B. coli no. 1 . .				-1-	B. psittacosis no. 31 .			_
B.		.. 2 . .	. . •	-H	B.	32 .		_
B.		3 . .			B. enteritidis Gartner no. 33			—
B.		„ 4		-1-	B.	Aertrijck ,	, 34	—
B.	lactis	aerogenes	no. 5 .	—	B. typhi	no. 35 , , ,		-t-
B.			6 .	—	B. „	.. 36 , , ,		—
B.	pneumoniae Friedl. no. 7			—	B.	„ 37		—
B. paratyphi A no.			8 . .	4-	B.	„ 38		4-
B.		A	9 . .	—	B. „	„ 39		_
B.		A „	10 . .	—	B.	„ 40
B.		A „	11 . .	_	B.	., 41 . . .
B.		A „	12 . .	—	B. dysenteriae Flexner no. 42			■
B.		A „	13 . .	—	B.		43	4-
B.		B	14 . .		B.	„	44
B.		B „	15 . .	_	B.		45	-h
B.		B	16 . .		B.	„	46
B.		B „	17 . .		B.		47
B.		B	18 . .	■	B.		48
B.		B „	19 . .	—	B.		49
B.		B „	20 . .	_	B.	Sonne „	50
B.		B „	21 . .	—	B.		51	_
B.		B „	22 . .	—	B.		52	_
B.		C	23 . .	—	B.		53	_
B.		C	24 . .	—	B.		54	_
B.		C ..	25 . .	—	B.		55	_
B.		C „	26 . .	—	B.		56	—
B.		C „	27 . .	—	B.	Shiga Kruse „	57	—
B.		C	28 . .	—	B.	Shiga Kruse „	58	—
B.		C .,	29 . .	—	B.		59	—
B. typhi murium „			30. .	—

Reactie van Simon na:	B. coh no. 4	B. typhi no. 38	B. lactis aero- genes no. 5
1 uur	_	_	_
PA ..	—	—	—
2V. ..	—	—	—
	-	-	-
0 „ 24	_	—	—
31	—	-1-	—
48	—	-1-	-
72	spoor		—
96	-1-		—
5 dagen	-H		—
6 „			—
7nbsp;„ 8nbsp;,.			-

B. „		„ 6 .
B. pneumoniae Friedländer
B. paratyphi A no.		. 8 . .
B.	A „	12 . .
B.	B „	14 . .
B.	B „	15 . .
B.	C „	23 . .
B.	C „	26 . .
B. typhi murium „		30 . .
B. psittacosis	„	31 . .
B.	,,	32 . .

Stammen		Ph (na 5 dagen)	Gas	Ver- houding CO, : H,
B. coli no. 1......		6.2	spoor
B..... 101......	....	6.2		2 : 1
B. lactis aerogenes no. 102 .		6.6		1 : 1
B. pneumoniae Friedländer no.	7 . .	7.4		1 : 9
B.	103 . .	6.6	—
B. paratyphi A no. 8 . .		6.2	—
B. „ A .. 12 . .		6.4		1 : 1
B. „ A „ 104 , ,		6.6	—
B. „ B „ 14 , .		6.4		2 : 3
B. B ,. 15 . . ,		6.4		1 : 1
B. „ B „ 105 , ,		6.6	-1-	3 : 1
B. „ C „ 23 . .		6.6		1 : 2
B. ,. C .. 26 . .		6.6		1 : 2
B. ., C „ 106		6.2		1 : 4
B. typhi murium no. 30 . .		6.2		1 : 1
B. psittacosis no. 31 ... .		6.2		1 : 1
B. enteritidis Gärtner no. 33		6.6		1 : 1
B. „ .. „ 107		6.4		1 : 2
B. „ Aertrijck „ 34		6.2		1 : 1
B. typhi no. 35......		6.4	—
B.....36......		6.4	—
B.....108.......		6.2	—
B. dysenteriae Flexner no.	42 . . .	6.2	—
B.	46 . . .	6.2	—
B.	49 . . .	6.2	—
B. „ Sonne	50. . .	6.0	—
B.	52 . . .	6.2	—
B.	55. . .	6.0	—
B. „ Schmitz	109 . . .	6.2	—
B. „ Hiss	110. . .	6.2	weinig	2 : 3
B. „ Shiga Kruse „	57 . . .	6.2	—
B. „ ......	59. . .	7.2	— bact. t
B. „ ......	Ill . . .	6.6	—
B. faecalis alcaligenes no. 112	....	8.2

geen gas	—
geen	85 0/0
CO,
2 : 5	90 o/o
1 : 3	83 0/0
2 : 5	910/0
geen gas	—
geen gas	—
1 : 2	88 0/0
geen	86 0/0
CO,
1 : 6
geen	82 0/0
CO,
geen gas	—
geen	82 0/0
CO,
2 : 7	940/0
1 : 2	930/0
2 : 7	870/0
geen gas	—

Stammen	Tijd in dagen; hoeveelheid in cm'										Ph
Stammen	Na 1	2	3	4	5	7	8	14	21	63	Ph
Natriumformiaat B. coli no. 1...... B. paratyphi C no. 26 . . B. psittacosis no. 32 . . . B. lactis aerogenes no. 5 .	5 5 sp.	22 24 8	26 40 12	28 50 17	30 55 20	31 57 22	31 58 24	35 66 28	35 70 26		8.6 9.0 9.0 9.0
Calciumformiaat
B. coli no. 1......		_	_	_	—	_	_	_	_		7.4
B. paratyphi C no. 26 . .	10	26	36	43	53	57	61	78	83		7.2
B. psittacosis no. 32 . . .	7	27	47	47	51	55	56	62	65		7.4
B. lactis aerogenes no. 5 .	sp.	3	4	3	3	3	3	5	11	52	7.4