ADEMHALING,
GISTING EN GROEI

EEN ONDERZOEK OVER
DE WERKING VAN AUXINEN EN
VAN BIOTINE

C. ƒ. van Hulssen

SiELIOTHEEK DER
RIJKSUNlVERi5!TE!T

utrecht.

\ r

Î

■ gt;lt;

, ........ ...

mmêâfiifm^M

■ .ernstem
ÄÄÄ'

■(■y

VfeCÎquot;-

ïifiilsii

r^ltJ-

ADEMHALING. GISTING EN GROEI
EEN ONDERZOEK OVER DE WERKING
VAN AUXINEN EN VAN BIOTINE

rijksuniversiteit te utrecht

1778 3725

// z^j/'

ADEMHALING. GISTING
EN GROEI

EEN ONDERZOEK OVER DE WERKING
VAN AUXINEN EN VAN BIOTINE

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DE
GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUUR-
KUNDE AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE
UTRECHT OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNI-
FICUS DR. C. W. VOLLGRAFF, HOOGLEERAAR
IN DE FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJS-
BEGEERTE, VOLGENS BESLUIT VAN DE SENAAT
DER UNIVERSITEIT TE VERDEDIGEN TEGEN
DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER
WIS- EN NATUURKUNDE OP MAANDAG i6
MAART 1936, DES NAMIDDAGS TE VIER UUR
DOOR

CAREL JOHANNES VAN HULSSEN

GEBOREN TE UTRECHT

1936

DRUKKERIJ C. HUIG

BIBLIOTHEEK DER
RIJKSUNIVERSITEIT
UTRECHT.

gt; £'

Aan mijn Ouders.

De voltooiing van dit proefschrift biedt mij een welkome ge-
legenheid, U, Oud-Hoogleeraren, Hoogleerarén en Lectoren van
de Faculteit der Wis- en Natuurkunde hartelijk te danken voor
mijn wetenschappelijke opleiding.

In het bijzonder dank ik U, Hooggeleerde KÖGL, Hooggeachte
Promotor, voor de voortdurende belangstelling, die Gij voor mijn
werk hebt gehad en voor het assistentschap, dat Gij mij hebt
verleend. Verder dank ik al mijn collega's, die mij meermalen
met raad en daad terzijde stonden, de laboranten, die mij be-
hulpzaam waren en het gezamenlijk personeel van het Organisch-
chemisch Laboratorium, waarvan ik steeds alle medewerking
ondervond.

INLEIDING

Ademhaling en gisting zijn levensprocessen, welke de noodige
energie voor de cellen leveren. Deze fundamenteele processen
staan sedert lange tijd in het middelpunt van de belangstelling
en vooral in de laatste tien jaren heeft men door onderzoekingen
van Warburg, Wieland, Keilin, Oppenheimer, Kluyver
over de ademhaling, en door Harden, Neuberg, v. Euler,
Meyerhof, Emden, Kostytschew en anderen over de
gisting, diepere inzichten in het chemisme van deze problemen
verkregen. In hoeverre in een speciaal geval de productie van
energie door ademhaling of door een gistingsproces tot stand
komt is een vraag, waarover men veel gediscussieerd heeft.

Pasteur heeft zijn opvatting over gisting samengevat met de
woorden: „La fermentation est la vie sans air.quot; Hij dacht
aan het alternatief ademhaling óf gisting, met dien verstande,
dat de cel in aanwezigheid van zuurstof ademhaalt en in af-
wezigheid daarvan gist. In tegenstelling daarmee heeft Büchner
geconstateerd, dat bij gist geen verschil in de intensiteit van de
gisting optreedt, indien zuurstof al of niet aanwezig is, een
bezwaar, dat Pasteur niet op overtuigende wijze weerleggen
kon. Dat er inderdaad een samenhang bestaat tusschen adem-
haling en gisting werd eerst veel later door Meyerhof (17)^)
aangetoond. Uit een in het jaar 1925 gehouden voordracht
van deze auteur moge het volgende, dat ons meteen een duide-
lijk inzicht in het vraagstuk geeft, aangehaald worden:

„Pasteur fehlten begreiflicherweise die quantitativen Me-
thoden, die allein eine bestimmte Entscheidung in dieser Frage
hätten herbeiführen können. Er brauchte daher eine eigentüm-

De tusschen haakjes geplaatste nummers verwijzen naar een
alphabetische litteratuurlijst, welke zich aan het eind van dit proefschrift
bevindt.

liehe, von seinen Kritikern mit Recht verworfene Argumenta-
tion, indem er nicht, wie er hätte tun sollen, die Gärungs-
geschwindigkeit einer gegebenen Hefemenge in An- und Ab-
wesenheit von Sauerstoff verglich, sondern vielmehr den
Hefezuwachs unter Aufwand einer bestimmten Zuckermenge.
Da nun die Hefe in Sauerstoff mit Aufwand einer geringeren
Menge Zucker wächst, so drückte er dies so aus, dass die Gär-
kraft pro Einheit zugewachsener Hefe in Sauerstoff schwächer
ist. Aber auch Hans Buchner, der auf diese fehlerhafte Ar-
gumentation aufmerksam macht, irrte doch seinerseits bei
seinem Versuche, Pasteur zu widerlegen, und zwar haupt-
sächlich, weil er nicht imstande war, die Atmung der Hefe
gleichzeitig mit der Gärung zu messen. Bei der gewöhnlichen
Unterhefe der Brauereien, mit der Buchner arbeitete, wird
nämlich von loo Mol. Zucker nur 1—2 Mol. veratmet und
annähernd 99 Mol. vergoren. Die Atmung ist also im Ver-
hältnis zur Gärung ausserordentiich klein. Daher können wir
nur eine geringe Wirkung der Atmung erwarten; diese aber
findet sich in der Tat. Pro Molekül veratmeten Sauerstoffs
wird in der Zeiteinheit aerob annähernd i Zucker-Molekül
weniger vergoren als in Stickstoff. Hier schützt also i Mol.
Sauerstoff, das nur Ve Zucker-Molekül verbrennen kann, un-
gefähr I Zucker-Molekül vor der Spaltung; anders ausge-
drückt, werden für jedes oxydierte Zucker-Molekül gegen
6 Mol. an der Vergärung gehindert, während bei der Milch-
säure-Bildung für jedes oxydierte Zucker-Molekül 3—6 Mol.
vor der Spaltung bewahrt blieben.quot;

Pasteur heeft bij de hier geciteerde proeven al een poging
gedaan ademhaling en gisting in hun relatie met de groei van
de gist te beschouwen. Dit leidt ons tot het eigenlijke onder-
werp „ademhaling, gisting en groeiquot;. Uit de opmerking over
ademhaling en gisting blijkt, dat meer dan een halve eeuw
noodig was om een dieper inzicht in het verband tusschen deze
verschijnselen te verkrijgen. Het spreekt vanzelf, dat het nog

moeilijker zal zijn het chemisme van de groei en zijn relatie
tot ademhaling en gisting op te helderen. Hier is het onderzoek
pas in het beginstadium en uit den aard der zaak kan dit proef-
schrift alleen een kleine bijdrage tot deze vraagstukken brengen,
waarbij wij ons bovendien nog tot de plantaardige groei beperken.

Het is niet overbodig met enkele woorden het begrip groei
en de groeiphasen van een plantaardige cel nader te definieeren.
Volgens F. A. F. C. Went (22) hebben wij algemeen onder
groei te verstaan een irreversibele vergrooting van het volumen
van een plant of plantenorgaan. De opvallende volumen-
vergrooting bij de groei van een hoogere plant berust hoofd-
zakelijk op celstrekking. Bij de celstrekking hebben belangrijke
veranderingen aan de celwanden plaats en wordt water opge-
nomen, daarentegen hebben wij geen, of bijna geen, toeneming
van het protoplasma. De celdeeling heeft op zichzelf geen ver-
grooting van het volumen tengevolge; pas secundair groeien
de dochtercellen tot de grootte van de moedercel, een groei-
phase, voor welke F. Kögl (16), samen met verschillende
botanici de n33iïi ff plasmagroeiquot; voorgesteld heeft. De drie
groeiphasen van een plantaardige cel zijn dus met celdeeling,
plasmagroei en celstrekking aan te duiden; het spreekt vanzelf,
dat de tweede en derde phase niet scherp zijn te scheiden en
geleidelijk in elkaar kunnen overgaan.

Groei berust op stofwisselingsverschijnselen en de daarmee
verband houdende chemische veranderingen konden reeds
lang scheikundig bestudeerd worden, daar het hier om stoffen
ging, welke in relatief groote hoeveelheden in de plant aan-
wezig zijn. Daarentegen is men eerst in de laatste jaren iets te
weten gekomen over stoffen, welke slechts in uitermate geringe
hoeveelheden door de plant geproduceerd worden en welke
toch een beslissende rol bij de groei van de plant spelen. Deze
stoffen zijn algemeen noodzakelijk om een regelende invloed
op de levensverrichtingen van de plant uit te oefenen. Zij too-
nen een belangrijke overeenkomst met de dierlijke hormonen

en worden op voorstel van F. A. F. C. Went en F. Kögl (23)
dienovereenkomstig phytohormonen genoemd. Het begrip
„phytohormoonquot; werd later door F. Kögl (16) nog nader
gepreciseerd: het zijn ,f oligodynamische Stoffe organischer
Natur, deren sich der pflanzliche Organismus für den be-
treffenden physiologischen Effekt selbst bedient.quot; Tot nu toe
zijn slechts enkele phytohormonen bekend, en wel auxine-a,
auxine-b, alsmede het hetero-auxine, welke hoofdzakelijk de
celstrekking bevorderen en verder het biotine, dat bij de plasma-
groei (resp. bij de celdeeling) van bepaalde gistrassen werkzaam
is. Het leek van tevoren niet onmogelijk, dat deze phytohor-
monen in de eerste plaats hun werking uitoefenen op adem-
haling, resp. gisting en dat langs deze weg het physiologisch
effect tot stand komt, dat tot de ontdekking van die phytohor-
monen geleid heeft. Inderdaad concludeerde J. Bonner (2)
in het jaar 1933 uit zijn proeven, dat de auxinen invloed uit-
oefenden op de ademhaling; in het jaar 1934 kwamen
H. v. Euler en H. Larsson (6) tot de conclusie, dat factor Z,
een activator van de gisting, identiek zou zijn met bios IL
Tegen deze conclusies was echter het bezwaar te opperen, dat
met ruwe praeparaten gewerkt was. In tegenstelling met ge-
noemde auteurs hadden wij in het Utrechtsche Laboratorium
het voordeel over de gekristalliseerde phytohormonen te
kunnen beschikken; schrijver van deze dissertatie had de taak
om na te gaan, of inderdaad ook de zuivere auxinen invloed
hebben op de ademhaling en of biotine een activator van het
gistingsproces is.

HOOFDSTUK I
Physiologie en chemie der auxinen

a. Testmethode en bereiding

De isoleering van de auxinen in gekristalliseerde toestand,
welke aan F. Kögl en medewerkers in het Organisch-chemisch
Laboratorium der Rijks-Universiteit te Utrecht gelukt is, be-
rustte op de door F. W. Went (24) uitgevonden quantitatieve
testmethode voor „de groeistofquot;. Deze meetmethode, welke later
ook voor ons eigen onderzoek van belang zal blijken, werkt met
3^5 dagen oude plantjes van haver {Avena sativa).

De groeistof wordt in de top van de coleoptile gevormd en
gedurende de groei polair — van de top naar de basis — ge-
transporteerd. Snijdt men nu de top af, dan heeft gedurende
enkele uren geen groei meer plaats tot langzamerhand de bo-
venste cellagen de functie van de top overnemen („geregene-
reerde topquot;) en opnieuw groeistof gevormd en getransporteerd
kan worden. F. W. Went ontdekte, dat, wanneer men der-
gelijke afgesneden toppen op een dun plaatje agar-agar plaatste,
de groeistof uit de toppen in de agar-agar diffundeerde. Een
op deze wijze met groeistof voorzien agarblokje kan de planten-
top — althans gedurende enkele uren — vervangen. Went
paste verder de volgende kunstgreep toe: Het agar-agarblokje
werd éénzijdig op de gedecapiteerde coleoptile geplaatst. De
naar beneden getransporteerde groeistof komt nu in de eerste
plaats in aanraking met die plantencellen, welke zich onder het
agar-agarblokje bevinden. Het gevolg zal zijn, dat deze cellen
zich gaan strekken, niet echter de diametraal daar tegenover
liggende cellen; het resultaat is een kromming van de cole-
optile. Deze kromming is binnen bepaalde grenzen en onder

bepaalde omstandigheden evenredig met de groeistofconcen-
tratie in het agar-agarblokje.

Om het auxinegehalte van verschillende praeparaten ge-
makkelijk te kunnen vergelijken werd een eenheid gedefinieerd.
Onder een Avena-Eenheid (A.E.) wordt die hoeveelheid groei-
stof verstaan, welke in een agar-agarblokje van Veoo cc aanwezig
moet zijn, om bij de test van F. W. Went aan een gedecapi-
teerde coleoptile binnen twee uren een kromming van io° te
veroorzaken bij een vochtgehalte van 92 % i) en een tem-
peratuur van 22—23° C.; hierbij moeten de uitwendige om-
standigheden in de proefkamer nauwkeurig constant worden
gehouden (10).

b. Isoleering van auxine-a en -b

Als uitgangsmateriaal voor de isoleering van groeistof werd
menschelijke urine genomen; er was nl. gebleken, dat deze
bron veel meer groeistof bevatte dan de toen bekende plant-
aardige materialen. De zuivering (10) berustte in eerste in-
stantie op de oplosbaarheid van groeistof in aether en zijn zure
eigenschappen. Vervolgens werd het ruwe product geëxtraheerd
met verschillende oplosmiddelen, daarna onwerkzame bij-
producten als calcium- en loodzouten neergeslagen, en het
zoover gezuiverde praeparaat na behandeling met methanol
en chloorwaterstof gedestilleerd in hoogvacuum. In de midden-
fracties scheidden zich kristallen af, welke na verdere zuivering
bij 196° C. smolten. De kristallen waren optisch actief en
hadden de bruto-formule CigHsaOs. Hun werkzaamheid bij de
Avena-test bedroeg 50 miUiard AE per gram. De nieuwe stof
kreeg de naam auxine (van a-b^dva = groeien); later werd voor
dit kristallisaat ter onderscheiding van een nauw verwante
verbinding de naam auxine-a ingevoerd.

Het gelukte F. Kögl, A. J, Haagen Smit en H. Erx-
leben (11) ook uit plantaardige materialen, nl. uit maïsolie
Dit vochtgehalte is later tot 87% teruggebracht.

en uit mout, auxine-a te isoleeren; tevens bleek hierin nog een
andere werkzame stof aanwezig te zijn. Deze auxine-b ge-
noemde verbinding had de bruto-formule C13O30O4, het
smeltpunt was 183° C., de activiteit was even groot als die van
auxine-a, nl. 50 milliard A.E. per gram. Ook deze kristallen
waren optisch actief.

c. De structuurbepaling van auxine-a en -b

F. Kögl en H. Erxleben (12) kwamen op grond van hun
onderzoekingen tot de volgende formule voor auxine-a:

T

CH,

-CHnbsp;CH-

De redenen, welke tot deze formule geleid hebben, mogen in
het volgende kort worden samengevat:

Auxine-a is een zuur, dat in evenwicht is met zijn lacton en
wel wordt dit evenwicht zeer snel, in de loop van enkele uren
bereikt. Hieruit kan men dus besluiten, dat een carboxylgroep
en een hydroxylgroep op de ó-plaats in het molecule aanwezig
moeten zijn, terwijl de 7-plaats zeer waarschijnlijk vrij van
hydroxyl is. De andere twee zuurstofatomen moeten eveneens
alcohohsche hydroxylgroepen zijn, daar behandeüng van auxine
met m-dinitrobenzoylchloride een tri- (m-dinitrobenzoyl)-
derivaat geeft. Bij katalytisch hydreeren worden 2 H-atomen
opgenomen, waaruit men kan afleiden, dat het molecule maar
één dubbele binding heeft en, gezien de samenstelling, dus een
koolstofring aanwezig moet zijn.

De dubbele binding bleek voor de oxydatieve afbraak het
meest geschikte uitgangspunt te zijn. Wordt auxine-a met
kahumpermanganaat in soda-alkalisch milieu behandeld, dan

ontstaat een optisch actief dicarbonzuur C13H24O4. Dihydro-
auxine-a geeft bij oxydatie met chroomzuur in ijsazijn een
optisch actief cyclisch keton C13H24O. Deze reacties zijn het
beste te verklaren door aan te nemen, dat de ring de dubbele
binding bevat en dat bovendien bij de afbraak de zuurstof-
houdende keten van de ring wordt afgesplitst.

Het Ci3-dicarbonzuur bleek een aa '-di- (sec. butyl)-glutaarzuur
te zijn, daar het bij verdere afbraak een a-methyl-boterzuur en
een 3-methylpentanon gaf. Deze beide splitsingsproducten
konden door analyse en smeltpunt van de resp. p-phenacylester
en het dinitrophenylhydrazon met de synthetische producten
worden geïdentificeerd. Het ao'-di-(sec. butyl)-glutaarzuur
kon bovendien synthetisch bereid worden (15) en was in
elk opzicht — smeltpunt, mengsmeltpunt, analyse, optische
draaiing — identiek met het auxine-glutaarzuur. Voor al deze
gegevens vormt de boven aangegeven formule voor auxine-a
de beste verklaring.

Auxine-b is als een monocyclisch oxy-ketocarbonzuur met
één dubbele binding op te vatten (13). Het is heel nauw ver-
want met auxine-a, waaruit het door eenvoudige wateraf-
splitsing tusschen de hydroxylgroepen op de a- en ^-plaats
kan ontstaan.

d. Hetero-auxine

Later werd door F. Kögl, A. J. Haagen Smit en H. Erx-
leben (13) nog een andere actieve stof in urine gevonden, welke
eveneens bij de havertest werkt. De physiologisch actieve ver-
binding, welke alleen door absorptie aan calcium-carbonaat
volgens Tswett van de laatste optisch-actieve verontreini-
gingen gezuiverd kon worden, heeft een bruto-formule van
C10H9O2N en een werkzaamheid van 25 milliard A.E./g in de
Avena-test. De verbinding ontving de naam hetero-auxine om
aan te duiden, dat het om een chemisch geheel andere stof ging.

Hetero-auxine bleek identiek te zijn met het reeds lang bekende
-indolylazijnzuur:

-CM,—COOH

Het is volkomen begrijpelijk, dat deze stof als normaal uit-
scheidingsproduct in de urine aangetroffen wordt, daar het een
afbraakproduct der tryptophaanhoudende eiwitten is. Het
gelukte F. Kögl en D. Kostermans (14) aan te toonen, dat
het bij de havertest werkzame bestanddeel van gistextracten
eveneens met jS-indolylazijnzuur identiek is.

Ook door verschillende andere schimmels alsmede door
bacterieculturen wordt een auxine geproduceerd; zoo bereidde
Niels Nielsen (18) een groeistofoplossing (Rhizopine) uit
Rhizopus suinus en Absidia ramosa, Boysen Jensen (5) uit
Aspergillus niger. F. Kögl en D. Kostermans (14) hebben
voor de twee schimmels Rhizopus nigricans en Asper-
gillus niger aangetoond, dat de door deze organismen gepro-
duceerde groeistof met hetero-auxine identiek is. Het lijkt dus
waarschijnlijk, dat lagere organismen in het algemeen alleen
in staat zijn tot vorming van j8-indolyl-azijnzuur, terwijl in de
hoogere planten tot nu toe uitsluitend auxine-a resp. auxine-b
werd gevonden. Hierbij komt auxine gelocaliseerd voor in de
toppen der coleoptilen, vanwaar het naar de groeizone ge-
transporteerd wordt — b.v. bij haver en mais —, of men
vindt geen „auxinecentrumquot; en het wordt dan in alle groeiende
spruitdeelen geproduceerd zooals bij Vicia Faba en de Lupinen.

e. Invloed van de groeistoffen op de plant

De botanische litteratuur over de werking der groeistoffen

op planten heeft in de loop der laatste jaren al een groote om-
vang gekregen; er moge hier gewezen worden op de samen-
vattingen van J. BabiCka (i) en van Boysen Jensen (4), in
welke de talrijke publicaties min of meer kritisch worden
besproken.

De belangrijkste physiologische eigenschap der auxinen is
— zooals reeds beschreven — de bevordering van de cel-
strekking. De in de top van de coleoptile gevormde groeistof
wordt basipetaal geleid en oefent in de groeizone zijn werking
op de jonge cellen uit. Talrijke botanische onderzoekers hebben
zich met het ingewikkelde mechanisme der celstrekking bezig
gehouden. Heyn (9) en Söding (19) nemen aan, dat de pri-
maire invloed van de groeistof niet op de elastische rekbaarheid
van de celwand (reversibele verandering) uitgeoefend wordt.
Of echter primair intussusceptie van nieuwe deeltjes of de
plastische rekbaarheid (irreversibele verandering) beïnvloed
wordt, hierover zijn beide onderzoekers het niet eens. Pfeffer
heeft getracht te bewijzen, dat intussusceptie de primaire oor-
zaak van de groei is. Ook Söding kwam met voorbeelden,
welke deze opvatting steunden. Laatst genoemde onderzoeker
stelt zich op het standpunt van de micellairtheorie (Nägeli),
welke door de onderzoekingen over de bouw van de celwanden
in de laatste jaren steeds meer veld won. Söding denkt zich
tusschen de micellen een visceuze intermicellaire substantie,
welke door turgor wordt gerekt, hetwelk genoemde auteur
echter van ondergeschikt belang acht. De eigenlijke groei be-
staat volgens hem uit het „afzettenquot; van nieuwe glucose-
reeksen aan de micellen. De intermicellaire substantie moet
dan van het plasma uit opnieuw met bouwstoffen worden aan-
gevuld. De stofvermeerdering der celwand heeft dan cel-
strekking tengevolge Deze veronderstelling lijkt heel plau-

1) Bij eigen proeven over de chemische samenstelling der haver-
plantjes hebben wij o.a. ook het gehalte aan glucose bepaald. Daar-
bij is gebleken, dat dit gehahe gedurende de groei toeneemt:

sibel, hoewel daarmee natuurlijk geen verklaring gegeven is,
waar en hoe het auxine zijn invloed uitoefent.

Uit den aard der zaak zijn de onderzoekingen over de werking
der auxinen en over het mechanisme der celstrekking het meest
gevorderd. Maar reeds in het begin van het groeistofonderzoek
kon door de verschillende onderzoekers worden aangetoond,
dat de auxinen ook andere groeiverschijnselen kunnen be-
ïnvloeden. Zoo zouden bijvoorbeeld de photo- en geotropische
krommingen door auxinewerking te verklaren zijn. Bij een één-
zijdige behchting zou in hoofdzaak door geremd transport aan
de hchtzijde, een verschil in groeistofconcentratie tusschen
licht- en schaduwzijde ontstaan. De schaduwkant zou meer
auxine krijgen en zich dus sterker strekken, waardoor de plant
naar het licht toe groeit (F. W. Went).

De positieve geotropische krommingen der wortels zouden
berusten op een grootere auxineconcentratie aan de onder-
zijde, veroorzaakt onder invloed van de zwaartekracht. Daar
de auxinen op de wortelgroei een remmende werking zouden
uitoefenen, zou hiermede de groei „naar benedenquot; te ver-
klaren zijn (Cholodny).

Ook van zuivere auxinen is de remmende invloed op de
wortelgroei bekend uit de onderzoekingen van F. Kögl en
A. J, Haagen Smit (13); reeds zeer kleine concentraties van

Deze toeneming is dus bijzonder groot gedurende de derde dag van
de groeiperiode en wordt daarna langzamerhand weer minder. Ook in
de wortels neemt het suikergehalte in de eerste vier dagen toe, al is dan
de vermeerdering aanzienlijk minder dan in de stengels.

auxine-a, -b, of hetero-auxine in de voedingsoplossing oefenden
een duidelijke werking uit. Gedurende de laatste jaren heeft
men ontdekt, dat de functie van de auxinen zich niet beperkt
tot de reeds besproken verschijnselen. Er werd nl. aangetoond,
dat de auxinen ook voor de wortelvorming verantwoordelijk
geacht moeten worden. F. W. Went (24) kon met gekristalli-
seerde auxine bij erwten en acalypha wortelvorming verkrijgen.
Ook aan internodiën van Tradescantia gelukte het F. Kögl
en A. J. Haagen Smit (16) met hetero-auxine en auxine-a in
zeer kleine concentraties, wortelvorming te verkrijgen. In deze
samenhang zijn o.a. verder op te noemen de door auxine ge-
remde groei der zijknoppen bij Vicia Faba, de callusvorming
aan wondvlakken, welke door celstrekking en celdeeling tot
stand komt en de eveneens op celdeeling berustende secundaire
diktegroei bij zonnebloemen.

HOOFDSTUK II
Auxinewerking en Ademhaling

Inleiding

Als eerste bestudeerde Boysen—Jensen in 1925 of er een
verband tusschen groeistofwerking en ademhaling der planten
bestond. Hij vond, dat de ademhaling bij gedecapiteerde en
niet gedecapiteerde stengels even groot was. Niels Nielsen
en Harte lius konden eveneens geen inwerking van „rhi-
zopinequot; op de ademhaling van Aspergillus niger aantoonen.
J. Bonner (2) onderzocht later de invloed van groeistof
op haverstengels. Hij bracht stukjes van dit plantenorgaan
in groeistofoplossingen en bepaalde de lengtevermeerdering;
deze had het sterkst plaats, wanneer de stukjes werden gebracht
in een oplossing, welke 10 „unitsquot; per cc bevatte. Voor de
toeneming van de lengte is zuurstof noodig, in zuivere stikstof-
atmosfeer had namelijk geen groei plaats. Dit deed hem ver-
onderstellen, dat de inwerking van groeistof en de ademhaling
met elkaar verband hielden. Inderdaad kon hij bij concentraties
van II „unitsquot; per cc een versnelling der ademhaling van
ongeveer 25 % constateeren, terwijl een concentratie van
iioo „unitsquot; vergiftiging der planten tengevolge had. Ook bij
oudere haverplantjes, welke geen groei meer vertoonden in de
auxine-oplossingen, werd de ademhaling verhoogd.

Het door Bonner gevonden effect is niet zonder meer te
verklaren en men zou moeten besluiten, dat de groeistof naast
elkaar twee onafhankelijke functies kan uitoefenen. Men mag
echter niet buiten beschouwing laten, dat deze auteur voor zijn
proeven geen gekristalliseerde groeistof, maar de ruwe op-
lossingen van „rhizopinequot; gebruikte. Men kan veronderstellen,
dat in deze praeparaten bijproducten aanwezig zijn, welke deze
proeven kunnen beïnvloeden. Voor deze opvatting pleit uit
Bonners eigen publicatie het volgende:

Een „plant unitquot; komt volgens Bonner met 4 A.E. overeen.

„Schwabe has shown that various amino-acids in minute
quantities stimulate the respiration of Elodea, Fontinalis and
Potamogeton. These substances do not, as far as investigated,
bring about growth in Avena coleoptiles.quot;

Daar de veronderstelde samenhang tusschen auxine-werking
en ademhaling voor het geheele groeiprobleem van de grootste
beteekenis was, begonnen wij het vraagstuk eveneens te be-
studeeren.

a. De meetmethode

Voor de ademhalingsproeven maakten wij gebruik van de
meetmethode, uitgewerkt door O. Warburg (ai).

De methode berust op het volgende principe: koolzuur is
in water beter oplosbaar dan zuurstof. Brengt men cellen, welke
evenveel koolzuur vormen als zuurstof verbruiken, in een ge-
sloten vat, dan verandert de gasdruk niet, daar de gasvorming
en het gasverbruik elkaar in evenwicht houden. Is echter een
vloeistofvolumen aanwezig, dat overwegend is ten opzichte
van het gasvolumen, dan vermindert dit gasvolumen, doordat
zuurstof opgenomen wordt, terwijl het gevormde koolzuur in
de vloeistof opgelost blijft. In dit geval heeft de ademhaling
dus een vermindering van de gasdruk tengevolge. Er zijn ver-
schillende manometers geconstrueerd om de gasdrukken te
meten. Wij gebruikten het model „Blutgasmanometerquot; van
Haldane en Barcroft (8), een open manometer, welke ons in
staat stelde, de volumenverandering onder constante druk te
meten. Het was mogelijk o,i mm® nauwkeurig af te lezen. De
manometer werd met de Brodiesche vloeistof gevuld. Deze
is een oplossing van 23 gram keukenzout en 5 gram choleine-
zuumatrium in 500 cc water; om de bacteriegroei tegen tc
gaan, worden zooveel cc alcoholische thymol-oplossing toe-
gevoegd, dat de vloeistof er duidelijk naar ruikt. De Brodiesche
vloeistof heeft het voordeel, dat ze glas beter bevochtigt
dan water.

Aan de manometer was met een slijpstuk het ademhalings-
vaatje (zie fig.) aangesloten. Het vaatje (a), dat ongeveer
7 cc inhoud had, was door middel van een slijpstukje met een
retortvormig kolfje (6) van 2 cc inhoud verbonden. Daardoor
was het mogelijk gemaakt, dat het kolfje (6) gedurende de

proefneming gemakkelijk gedraaid kon worden. Het werd ge-
vuld met groeistof-oplossingen, welke na een bepaalde tijd, door
het i8o° te draaien, in vaatje a konden worden gebracht.
Wanneer de vaatjes gevuld en aan de manometers aangesloten
waren, werd het geheele toestel op een rek bevestigd en geschud
met een snelheid van ongeveer 200 schommelingen per minuut.
We werkten steeds met niet meer dan 6 vaatjes, om in verband
met de afleestijd de schudtijd tusschen de aflezingen niet te
kort te doen zijn. Hierbij diende minstens één vaatje om de
schommelingen van de temperatuur te controleeren, daar de
gebruikte manometer-vloeistof vergeleken met kwik i) zeer veel
gevoeliger is voor zelfs geringe temperatuursveranderingen.

Er werd gemeten in de ruimte, waar de haverplanten werden
gekweekt; in deze kamer gebruikten wij oranje licht 2) en er
heerschte een temperatuur van 22—23° C. De vaatjes met
plantenstukjes bevonden zich in een tegen het oranje licht af-
geschermde thermostaat.

6. Ademhaling bij toevoeging van auxinen

De ademhaling werd bepaald van de stengels van Avena
sativa. Zooals bij de testmethode van Went gebruikten wij ook

Een vloeistofzuil van 10.000 mM. staat gelijk met een kwikzuil van
760 mM.

•) Lichtfilter O Ga van Schott, Jena.

voor deze proeven Svalöfs „Siegesquot;haver. De gepelde korrels
werden na een uur weeken in water op vochtig filtreerpapier
uitgelegd, na 20 uren bevestigd in glashouders boven bakjes
met water. Na 88 uren waren de plantjes dan geschikt voor de
proeven. Ze werden gedecapiteerd en 134 uur later in stukjes
van ± 3 mm gesneden. Ieder vaatje werd gevuld met 100—
150 stukjes in 5 cc „verdunningsvloeistofquot;. Deze vloeistof bevat
160 mgr KCl en 0,2 cc ijsazijn per liter gedestilleerd water.

Bij het uitvoeren van de WENTsche testreactie met zuivere
of ver gezuiverde auxinepraeparaten is het F. Kögl en
A. J. Haagen Smit gebleken, dat men de benoodigde ver-
dunningen het best met genoemde „verdunningsvloeistofquot;
bereidt. Klaarblijkelijk is het zwak zure milieu en de aanwezig-
heid van een electrolyt bevorderlijk voor de overgang van de
auxinen van uit het agar-agarblokje in de plant. Ook voor onze
proeven over de ademhaling hadden wij natuurlijk het grootste
belang, dat het toegediende auxine werkelijk snel in de planten-
stukjes dringt, wat bij de toepassing van onze verdunnings-
vloeistof door de ervaring met de test bewezen is. Door andere
onderzoekers werd voor de ademhalingsproeven een M/50
phosfaatbuffermengsel gebruikt. Wij hebben de ademhaling
bij toepassing van dit buffermengsel vergeleken met diegene
in onze verdunningsvloeistof. Er kon geen verschil geconsta-
teerd worden, zoodat wij verder om boven genoemde redenen
voor onze proeven de „verdunningsvloeistofquot; gebruikten.

Het is bekend, dat aan versche snijvlakken de ademhaling
verhoogd is. Wij zijn daarom met de eigenlijke metingen na
uur schudden begonnen, waarbij dan bovendien de toe-
stellen reeds lang een constante temperatuur bereikt hadden.
De stand van de manometers werd dan om het kwartier
afgelezen.

De afgelezen waarden worden uitgezet tegen de tijd, waar-
door een curve van het verloop in fig. i ontstond. Daaruit
is de zuurstofopname per uur gemakkelijk af te lezen.

35
TABEL I

De vaatjes I, II, III, V zijn met stukjes van haverstengels gevuld»
vaatje IV bevatte alleen verdunningsvloeistof, verandering van het
volumen diende hier ter contrôle van de temperatuur. De vaatjes
werden om lo uur gevuld en om 11.30 gesloten.

FIG. I

Curve I verkregen uit de waarden van kolom I.

Curve IV verkregen uit de waarden van kolom IV (temperatuurcurve.)

Wij begonnen onze proeven met het verloop der ademhaling
over een langere tijd na te gaan en kwamen tot de conclusie.

a6

dat de intensiteit eerst na 5 uur langzaam begint af te nemen.
Daar onze proeven altijd binnen deze tijd plaats hadden, zijn
wij zeker, onder „normalequot; en vergelijkbare omstandigheden
te hebben gewerkt.De eigenlijke proeven werden dan zoo uit-
gevoerd, dat de vaatjes na het vullen en aansluiten aan de mano-
meters eerst i %—2 uur werden geschud. Daarna werd eenige
tijd om het kwartier afgelezen en vervolgens uit het zijkolfje de
groeistofoplossing toegevoegd, weer geschud en opnieuw om
het kwartier afgelezen.

In het zijkolfje werd altijd een zoodanig geconcentreerde
oplossing gedaan, dat na de toevoeging het gewenschte aantal
A.E. per cc in het ademhalingsvaatje aanwezig was. Bij de con-
tróleproeven werd het zijkolfje met verdunningsvloeistof ge-
vxild. We onderzochten verschillende concentraties van hetero-
auxine, nl. 15—70—150—300—750—1500 A.E. per cc.

TABEL a

De vaatjes zijn gevuld om 11 uur, de no.'s I en III met hetero-
auxine, 70 A.E. per cc, no. V zonder hetero-auxine, no. II diende voor
de temperatuurcontröle. Om 1.50 werd het auxine bijgevoegd.

berekend op een werkzaamheid van 25 milliard A.E. per gram.

Tabellen en figuren 2 en 3 geven de afgelezen waarden
voor 70 en 1500 A.E. per cc aan.

300
t90

ZfO

J60.
iso'
3uy
2»
220-
210.
aoo

190'
60
170.
160

150
M.
110

2S0'
WO-
130.

ao
»«

200
190
180
170
rbo
150
140
130

FIG. 3 VI met hetero-auxine, I zonder hetero-auxine. Bij de
pijl werd het hetero-auxine toegevoegd.

Van auxine-a onderzochten we oplossingen, die 7—500—
1000 A.E. per cc bevatten, berekend op een werkzaamheid van
50 milliard A.E. per gram. Tabellen en figuren 4 en 5 geven
de afgelezen waarden voor 7 en 1000 A.E. per cc aan.

TABEL 4

De vaatjes werden om 11 uur gevuld, de no.'s len III met auxine-a,
7 A.E. per cc; no. II zonder auxine-a; no. V diende voor de tem-
peratuurcontróle. Om 1.45 werd het auxine toegevoegd.

I met

4 - 150,
auxine-a, II zonder
auxine-a. Bij de pijl
werd het auxine-a 1»
toegevoegd.

De vaatjes werden om ii uur gevuld, dc no.'s I en II met auxine-a,
looo A.E. per cc; de no.'s III en IV zonder auxine-a; no. V diende voor
de temperatuurcontróle. Om 2.30 werd auxine toegevoegd.

FIG. 5

I en II met
auxine-a, III en IV
zonder auxine-a.
Bij de pijl werd het 1»
auxine toegevoegd.

160.

Wanneer auxine of hetero-auxine eenige invloed op de snel-
heid der ademhaling uitoefende, zou men bij het grafisch uit-
zetten der meetresultaten een afwijking der curven naar boven
resp. naar beneden moeten vinden.

In geen enkel geval echter bleek een vertraging of versnelling
der ademhaling door invloed van de auxinen plaats te hebben.

c. Ademhaling en gevoeligheid der planten voor auxinen

Bij onze steeds uitgevoerde contróleproeven zonder auxine-
toevoeging bleek, dat de ademhaling van dag tot dag verschil-
lend kan zijn, ofschoon de planten altijd precies even oud
waren en op gelijke wijze gekweekt werden. F. Kögl en A. J.
Haagen Smit (i6) hadden er reeds op gewezen, dat ook
bij de WENTsche test met haverplantjes belangrijke dage-
lijksche schommelingen optreden, zooals uit het regelmatig
uitmeten van auxine-standaardoplossingen bleek.

We hebben daarom nagegaan of ttisschen deze twee ver-
schijnselen een verband zou kunnen bestaan. Er werd daarom
tegelijkertijd de ademhaling alsmede de gevoeligheid voor
auxine-oplossingen bij de WENTsche testreactie bepaald met
plantjes, welke onder volkomen gelijke omstandigheden ge-
kweekt waren. De bepaling van de groeiwerking van de auxine-
oplossingen werd op de gewone wijze uitgevoerd Om
de intensiteit van de ademhaling vast te stellen, werkten
we met 5 vaatjes zonder zijretort, welke met 5 cc verdun-
ningsvloeistof en 100 stukjes van haverstengels werden
gevuld. Eén vaatje werd weer gebruikt voor de temperatuur-
controle.

Voor de uitvoering hiervan danken wij de heer E. W. F. Visser.

De vaatjes VIII, II, XII, IV en VI waren gevuld met stukjes van
haverplantjes in verdunningsvloeistof. Vaatje I diende voor tempe-

ratuurcontrole.

FIG. 6

II, VI, IV, VIII
en XII uit de ko- 8o-
lommen van tabel
6. I temperatuur- p
curve. Standaard
bedroeg 48 milliard 60
A.E. per gram.

Ter vergelijking met de waarde van de auxinestandaard bij
de Avena-test hebben wij de snelheid van de ademhaling ge-
nomen, uitgedrukt door de tangens der curve.

We gebruikten steeds dezelfde vaten, waardoor de dagelijk-
sche schommelingen van ieder vat afzonderlijk te vergelijken
waren, zonder dat het noodig was met de verschillende vat-

constanten rekening te houden. Men ziet bij beschouwing van
fig. 6 dat bijvoorbeeld voor vaatje no. 2 de tangens 1,19 be-
draagt bij een auxine-standaardwaarde van 48 milliard A.E./g;
de tangens schommelde bij een tiental proeven tusschen
0,71—1,21. Op deze manier werd iedere dag de tangens van
de bepalingen in de vijf in gebruik zijnde vaten berekend en
het gemiddelde hiervan vastgesteld.^)

Fig. 7 geeft voor een langer tijdinterval het verband weer
tusschen de snelheid der ademhaling en de activiteit van de
auxinen in Avena-Eenheden. Behoudens een enkele afwijking

Indien men voor ieder vaatje afzonderlijk de waarden tiitzet, krijgt
men evenwijdige curven.

is er uit deze vergelijking toch een zekere paralleliteit tusschen
ademhaling en gevoeligheid der plantjes voor auxine op te
maken en we stonden nu opnieuw voor de vraag, waaraan de
standaardschommelingen, alsmede nu ook de afwijkingen der
ademhaling te wijten zijn.

Er was reeds uit onderzoekingen van F. Kögl en A. J.
Haagen Smit bekend, dat de gevoeligheid voor auxine bij
planten, welke gekweekt werden in cassetten van zink, lood
en bakeliet, hooger was dan in normale gevallen.

Wij hebben dit onderzoek voortgezet en ook nog uitgebreid
met cassetten van zwart papier.

TABEL 7

N = normaal„standaardquot;nbsp;Zw = Zwart-papier„standaardquot;

Zi = Zink„standaardquot;nbsp;Par = Paraffinedoos„standaardquot;

werkzaamheid in milliarden A.E. per gram.

Zooals uit tabel 7 blijkt, waren de in de verschillende cas-
setten gekweekte planten gevoeliger voor auxine dan de ge-
wone testplanten, welke onder de invloed van het oranje licht
van de proef kamer stonden. In deze samenhang was het in-

teressant om na te gaan of ook de ademhaling bij deze ver-
schillend gekweekte planten anders was dan onder „normalequot;
omstandigheden. Om dit uit te maken, werd van een serie
haverplantjes met precies dezelfde voorbehandeling, een deel
volgens de testmethode van Went op gevoehgheid tegen
auxine onderzocht, terwijl van de rest tegelijkertijd de adem-
haling kon worden gemeten. De desbetreffende proeven wezen
uit, dat bij alle „cassettenplantenquot; de snelheid der adem-
haling ten opzichte van normale planten verhoogd en wel
tamelijk constant verhoogd is. (Zie fig. 8 en 9).

Het essentieele verschil tusschen de gewone testplanten en
de „cassettenplantenquot; is, dat laatstgenoemden niet onder de
invloed van het oranje licht van de proefruimte groeiden. Er
is wel aangetoond, dat dit licht geen (of haast geen) photo-
tropische krommingen veroorzaakt, maar het kan natuurlijk
invloed op onbekende chemische reacties in de plant uitoefenen.
Volgens een vriendelijk advies van Prof. V. J. Koningsberger
zou het bijvoorbeeld ook mogelijk zijn, dat de testplanten onder
invloed van het oranje licht reeds assimileeren. Om dit uit te
maken, zou een speciaal vergelijkend onderzoek noodig zijn,
dat buiten het doel van ons eigen onderzoek ligt.

Wij willen alleen nog op het volgende wijzen: Indien de
plantenstukjes gedurende de meting van de ademhaling assimi-
leerden, zouden de voor de ademhaling gevonden waarden te
klein zijn. Ofschoon dit het verschil tusschen „oranjelicht-
plantenquot; en „casettenplantenquot; zou kunnen verklaren, lijkt ons
deze veronderstelling niet zeer waarschijnlijk, omdat de met de
plantenstukjes gevulde vaatjes zich in de tegen het oranje licht
afgeschermde thermostaat bevonden en bovendien de eigenlijke
meting altijd eerst na uur schudden uitgevoerd werd.

In elk geval gaat onder de beschreven omstandigheden een
grootere gevoeligheid voor auxine samen met een intensievere
ademhaling, en — wanneer we veronderstellen, dat de adem-
haling het primaire effect is — zouden wij de verhooging der

(quot;O

«dtmkalinij

0.9
dg.
OJ-
0«
os
lOO'
90
aO'

70

«O-
SO'

FIG. 8

Ademhaling en standaard in Zink-cassette. Ademhaling in log tg;
werkzaamheid in milliarden A.E. per gram — standaard in cassette
—.—.— standaard normaal.

adcmKallnq

(-1)

IM-

09.
oa-

x»
90
80

rgt;

te

»

40-

20'

29.I0.'3lt;, tot

FIG. 9

Ademhaling in bakeliet-cassette. Ademhaling in log tg; werkzaam-
heid in milliarden A.E. per gram — standaard in cassette —.—,—
standaard normaal.

auxine-werkzaamheid als gevolg daarvan kunnen verklaren.
Natuurlijk is de moeilijkheid daardoor alleen maar verplaatst,
want het blijft nu nog altijd de vraag, aan welke factoren de
versnelling en algemeen de schommelingen bij de ademhaling
te wijten zijn. Het zal niet gemakkelijk worden, al de eventueel
hierbij meewerkende factoren één voor één uit te zoeken, daar
onze kennis van deze verschijnselen nog zeer onvolkomen is.
In de eerste plaats moest worden onderzocht of bij een kunst-
matig beïnvloeden van de ademhaling ook de gevoeligheid voor
auxine met de veranderde ademhaling parallel loopt.

Er bestaan verschillende middelen om de ademhaling
der planten te veranderen; we moesten echter alle inwerkingen,
welke een schadelijke chemische invloed konden uitoefenen,
al van te voren uitsluiten. Zoo hebben we b.v. niet getracht,
de planten met aethyleen, aether enz. te behandelen, maar
begonnen in oriënteerende proeven ermee, de zuurstofdruk te
verhoogen. De planten werden in exsiccatoren met zuivere zuur-
stof gekweekt, waarbij natuurlijk de temperatuur en vooral het
vochtigheidsgehalte zoo veel mogelijk in overeenstemming met
de vroegere proeven gehouden werd. Er was onder deze om-
standigheden een intensievere ademhaling te verwachten en
— wanneer onze redeneering juist was — ook een hoogere
standaardwaarde voor auxine. Inderdaad geven de standaard-
bepalingen iets hoogere waarden voor de planten, gekweekt in
zuurstof. Planten, op normale wijze gekweekt, maar gedurende
de test in zuurstof gebracht, reageeren daarentegen op normale
wijze: tabel 8 en 9.

Als resultaat vonden we dus, dat er geen directe invloed van
zuivere auxine op de ademhaling der Avena-stengels bestaat,
daarentegen gaat bij haverplantjes een hoogere ademhaling ge-
paard met grootere gevoeligheid voor de inwerking van auxine.

H. Bottelier (3) vond bij een onderzoek over protoplasma-

38
TABEL 8

Serie I

Kolom A bevat de waarden voor de auxine-werkzaamheid uitgedrukt
in milliarden A.E. per gram, van planten gekweekt in zuivere zuurstof
(i atmosfeer). Iedere waarde werd verkregen uit een gemiddelde van
12 plantjes.

Kolom B bevat deze waarden voor „normaalquot; gekweekte planten.

TABEL 9

Serie II

Kolom A bevat de waarden voor de auxine-werkzaamheid uitgedrukt
in milliarden A.E. per gram, voor planten, gedurende de test gebracht
in zuurstof van i atmosfeer. Iedere waarde werd verkregen uit een
gemiddelde van 12 plantjes.

Kolom B bevat deze waarden voor normaal gekweekte planten.

Gemiddelde gekweekt in Oj = 55 milliarden A.E. per gram
„ normaalnbsp;= 40 „ A.E. „ „

Gemiddelde normaal gekweekt

maar in Oj getestnbsp;= 42 milliarden A.E. per gram

Gemiddelde normaalnbsp;= 38 „ A.E. „ rt

strooming bij Avena sativa, dat de stroomingsintensiteit iedere
dag verschillend was en zelfs in de loop van de dag kon ver-
anderen. Hij heeft deze schommelingen van de intensiteit ver-
geleken met de schommelingen der standaardwaarden, die
door F. Kögl en A. J. Haagen Smit gevonden zijn en nu
bleek op dagen met groote gevoeligheid tegen auxine ook een
groote stroomingsintensiteit te bestaan. Ook bij de bijzonder
gevoelige „cassettenplantenquot; werd een hoogere stroomings-
intensiteit gevonden. Bottelier komt tot de volgende
conclusie;

„Obgleich die Versuche nicht als endgültig beweisend zu
betrachten sind, ist doch mit grosser Wahrscheinlichkeit zu
schhessen, dass zwischen Intensität der Protoplasmaströmung
und Empfindlichkeit der Zelle für Wuchsstoff ein direkter
Zusammenhang besteht.quot;

De protoplasmastrooming blijkt nu op verschillende wijze
te beïnvloeden, o.a. door verwonding. Speciaal in de nabijheid
der wond treedt een sterke strooming op; aan de andere kant
is het bekend, dat ook de ademhaling bij verwonding versneld
wordt. Wij mogen dus veronderstellen, dat tusschen al deze
verschillende verschijnselen een nauw verband bestaat; welke
fimctie in de plant echter primair beïnvloed wordt door uit-
wendige factoren, blijft een open vraag.

HOOFDSTUK III

Bios en factor Z
a. Overzicht over de ontwikkeling van het bios-probleem

In 1860 kwam Pasteur (46) tot de conclusie, dat voor de
groei van gist alleen anorganische zouten en suiker noodig
waren. Het was in dezelfde tijd, dat Liebig (40) had geconsta-
teerd onder deze omstandigheden geen gisting of groei te
kunnen verkrijgen. Pasteur, die een groot liefhebber was van
het experiment in het openbaar, noodigde Liebig nu uit om bij
hem te komen, daar hij onder zijn controle wilde laten zien,dat
hij wel degelijk in staat was, het gewenschte effect te verkrijgen.
Liebig reageerde niet op deze uitdaging en zoo bleef de open-
bare meening jaren lang ten gunste van Pasteur, zonder dat
het probleem hierdoor was opgelost.

Ongeveer 30 jaren later, in 1901, ontdekte E. Wildiers (49)
in het laboratorium van Ide in Leuven, dat hij geen gist kon
kweeken in een suiker-zout oplossing, wanneer hij met weinig
cellen geënt had, maar dat hierbij nog een toevoeging van een
kleine hoeveelheid gistextract, wort of pepton noodig was. Deze
resultaten kwamen dus geheel overeen met de ondervinding van
Liebig. Wildiers noemde de voor de groei van zijn gist noo-
dige stof, die organisch en thermostabiel bleek te zijn „Biosquot;.

Toch wilde men nog niet aan een dergelijke stof gelooven,
vermoedelijk nog steeds onder de invloed, welke Pasteur op de
wetenschap van zijn tijd uitgeoefend had. Van verschillende
kanten kwam er kritiek op het werk van Wildiers, soms nog
niet eens door experimenten gesteund.

Fernbach (32) en Windisch (50) b.v. namen zonder meer
aan, dat de voedingsoplossingen van Wildiers giftige stoffen
zouden hebben bevat, zooals sporen van metaalzouten, welke dan
door de eiwitten uit het gistextract zouden worden gebonden.

Hoe onhoudbaar een dergelijke veronderstelling is, was door
Krüger (38) bewezen, die juist het tegenovergestelde vond,
n.1. dat sporen metaal de gistgroei kunnen stimuleeren. Ook
Pringsheim (48) was zeer sterk gekant tegen de bios-theorie en
wilde al de door Wildiers waargenomen verschijnselen ver-
klaren door aan te nemen, dat de gist in de synthetische voe-
dingsbodem zou moeten acclimatiseeren. Hij wilde dan wel
gelooven, dat er stoffen waren, die de gistgroei konden bevor-
deren, maar niet aannemen, dat ze onontbeerlijk voor de nor-
male groei waren. Zoo waren er meerdere onderzoekers, die
niet wilden toegeven, dat er een stof als het Bios noodzakelijk
was, al konden zij dan ook niet ontkennen, dat er werkelijk
stoffen bestonden, welke de gistgroei stimuleerden.

Lash Miller (43) merkt in dit verband heel aardig op:
„Thus the new word „Biosquot; was defined; and all who say „no
doubt some chemical in wort makes all the difference, but it
need not be Biosquot; have qualified to join the Last Ditch
Bacon-Club, which holds that Shakespeare's plays were written
not by Shakespeare, but by some other bearing the same
name.quot;

Met al deze tegenkanting werd echter het probleem niet
noemenswaard gediend en er moesten nog jaren verstrijken,
eer aan de afbrekende kritiek het zwijgen kon worden opgelegd.
Pas na de ontdekking van de vitaminen, toen bleek, dat voor
de normale ontwikkeling der dieren behalve de gewone voe-
dingsstoffen ook nog uiterst geringe hoeveelheden van verschil-
lende specifieke verbindingen noodig waren, kon men zich
voorstellen, dat dit ook voor plantaardige organismen en dus
ook voor gist het geval kon zijn.

Volgens Kurono (39) zou het anti-beri-beri-vitamineook de
groei van gist kunnen bevorderen. R. J. Williams (51) ging
zelfs zoover de identiteit van zijn groeiverwekkende factor met
„vitamine Bquot;^) te veronderstellen en baseerde hierop een

') Later vitamine Bi (Aneurine) genoemd.

quantitatieve methode om dit vitamine met behulp van gist
inplaats van met kostbare proefdieren te isoleeren.

Later vonden echter andere onderzoekers, zooals Emmet en
Stockholm (27), Fleming (33), Fulmer (34) en anderen, dat
praeparaten met een sterke bios-werking geen antineuritische
werking hadden en dus niet met „vitamine Bquot; identiek kon-
den zijn.

Een belangrijke vooruitgang voor het geheele bios-probleem
was de door A.M. Copping (25) en R.J. Williams (52) gedane
ontdekking, dat de verschillende gistrassen niet gelijk reageeren
op bios-toevoeging. Wanneer men wilde gist en gecultiveerde
gistrassen uit de praktijk laat groeien op een zelfde voedings-
bodem, dan heeft de laatste soort voor een normale ontwikke-
ling bios noodig, de eerste echter niet. Het bleek heel algemeen,
dat verschillend gecultiveerde gistrassen ook heel verschillende
hoeveelheden bios voor hun groei noodig hadden. Wilde gisten
kunnen bios produceeren en geven dit zelfs aan hun voedings-
bodem af, welke dan zeer geschikt wordt voor het kweeken van
gecultiveerde rassen. Nadat dus aan het bestaan van „biosquot;
niet langer getwijfeld kon worden, begon men ongeveer 12 jaar
geleden zich meer speciaal bezig te houden met de isoleering van
deze cellenvermeerderende stof, en wel met gebruikmaking
van een test, welke op deze eigenschap berustte.

De zaak werd echter nog ingewikkelder, toen in de loop der
volgende onderzoekingen bleek, dat er verschillende bios-
factoren moesten bestaan. G. H. W. Lucas (41) bracht door
behandeling met bariet in alcoholische oplossing een scheiding
in factoren teweeg. De factor in het neerslag, welke hij bios I
noemde, was te praecipiteeren met basisch loodacetaat. In het
filtraat was dan nog een andere factor aanwezig. Eastcott (26)
kon bios I gekristalliseerd verkrijgen en wel uit thee; de ver-
binding bleek identiek te zijn met meso-inosiet.

Lash Miller (44) kon bij bios II uit gist nog een verdere
scheiding bereiken; wanneer hij een extract schudde met kool.

bleek maar een gedeelte der werkzame stof in het filtraat te
zijn gebleven. Met behulp van aceton en ammonia werd een
werkzaam eluaat van kool verkregen, waarvan de actieve fac-
tor bios IIB genoemd werd. De in het filtraat aanwezige actieve
factor noemde hij bios HA. Werd alleen bios IIB bij de gist ge-
voegd, dan vertoonde het een goede werkzaamheid, terwijl de
andere factoren ieder voor zich niet actief waren. Werden de
drie factoren echter weer samengevoegd, dan hadden zij het-
zelfde effect als het oorspronkelijke gistextract.

Ook R. J. Williams (54) kon een scheiding van het bios-
complex teweeg brengen, op een geheel andere wijze,
dan Lash Miller, n.1. met Vollers aarde. De verkregen
fracties reageerden verschillend op een reeks gistsoorten, op
sommige reageerden zij zelfs in het geheel niet. Uit een
rijstzemelenextract kon met behulp van dezelfde methode een
factor verkregen worden, die identiek was met het aneurine van
Jansen en Donath.

Een ander verloop der scheiding verkreeg Williams (53) met
behulp van electro-dialyse. Het gelukte hem hierdoo r een fac-
tor met zure eigenschappen te concentreeren en deze werd door
hem „panthothenic acidquot; genoemd. Volgens hem zou deze
verbinding een verzadigd alifatisch poly-oxy-zuur zijn.

De soms zeer uiteenloopende resultaten der verschillende
onderzoekers zijn heel moeilijk te vergelijken, omdat zij ver-
schillend uitgangsmateriaal gebruikten, alsook voor hun test
verschillende gistrassen. Zooals wij reeds hebben besproken,
is dit van essentieel belang. Bovendien zijn natuurlijk ook de
meetmethoden, de samensteUing der voedingsoplossing en de
kweektemperatuur van invloed, om maar enkele der factoren te
noemen.

F. Kögl en B. Tonnis te Utrecht vatten eenige jaren geleden
het onderzoek over bios op. Eerst werd een goede meetmethode
uitgewerkt, welke hierop neerkomt, dat men het verschil in
troebeling, veroorzaakt door een grootere of kleinere hoeveel-

heid gist, meet met behulp van een gevoelige nephelometer^).

Als testobject gebruikten zij de z.g. „Heferasse Mquot;, een
„Brennerei Oberhefequot; welke door het Institut für Garungs-
gewerbe te Berlijn in het groot wordt gekweekt; het is een meng-
sel van vier onderrassen.

Voor de isoleering der biosfactoren gingen Kögl en Tonnis
(36) uit van Chineesch eigeel, dat meer bios bevat dan gist en
dus als uitgangsmateriaal voor de bereiding van deze stof meer
geschikt is. Natuurlijk zal het in een dergelijk geval noodig zijn,
achteraf de identiteit van de actieve stoffen uit gist en uit eigeel te
bewijzen. Met behulp van de gewone methodes, zooals neer-
slagen met alcohol, loodzouten, sublimaat, phosphorwolfraam-
zuur, broompikrolonzuur, adsorptie aan dierlijke kool en
elueering met aceton-ammoniak, werden onwerkzame stoffen
verwijderd of het werkzame product geconcentreerd. Het zoo
verkregen gezuiverde product werd veresterd en in hoogvacuum
gedestilleerd; uit de zeer actieve middenfractie kristalliseerden
fijne naaldjes, welke na omkristalliseeren een smeltpunt van
148° C. en een werkzaamheid van 25—30 millioen S.E.®)
hadden. De nieuwe stof werd biotine genoemd. Voor de iso-
leering van biotine is een 3 millioenvoudige concentratie noodig,
zoodat de auteurs maar over zeer kleine hoeveelheden konden
beschikken. Indien in gist dezelfde stof aanwezig is, zou men
voor de bereiding van i gram eenige honderden tonnen gist
moeten opwerken.

Kögl en van Hasselt (35) konden verder factor I, welke
door Eastcott reeds uit thee was bereid nu ook uit gist iso-
leeren; het bleek, dat ook bios I uit gist met meso-inosiet iden-
tiek was. Bovendien kon worden bevestigd, dat de werking van
meso-inosiet heel specifiek was; zoo zijn bijvoorbeeld andere

1) Deze meetmethode is nauwkeurig beschreven in de dissertatie van
W. v. Hasselt {35)

») I S.E. is de hoeveelheid biotme, welke een celvermeerdermg van
100% veroorzaakt bij 240 y. gist in a ccvoedingsopiossing (v.Readek)
gedurende 5 uren bij 30° C.

nauw verwante alcoholen, zooals scylliet en 1-inosiet, niet in
staat, het meso-inosiet te vervangen. Meso-inosiet komt zeer
algemeen verbreid voor in plant en dier; zoo vermeldt East-
cott een honderdtal verschillende producten, waarin deze stof
kan worden aangetoond. Het schijnt steeds voor te komen in
groeiende weefsels, maar b.v. niet in zaden. Hierin wordt het
pas weer gevormd, wanneer men deze laat kiemen.

Kögl, Tonnis en van Hasselt vonden, dat met de twee ge-
kristalliseerde factoren meso-inosiet en biotine de volle werking
van het gistextract nog niet was bereikt, maar dat daarvoor nog
één of meer andere factoren noodig waren. Deze factoren heb-
ben op zichzelf bij „ras Mquot; resp. bij de 4 onderrassen ieder
voor zich geen werking, verhoogen echter de werkzaamheid van
het biotine. Van Hasselt vond, dat een dergelijke „co-werkingquot;
ook door aneurine tot stand komt. Het is bekend, dat aneurine
in gist voorkomt, toch is het niet waarschijnlijk, dat bovenge-
noemde co-werking liitsluitend door deze stof veroorzaakt
wordt. Volgens nog niet gepubhceerde resultaten van dit labo-
ratorium speelt hier tenminste nog één andere stof een rol. In
het vervolg wordt deze verbinding voorloopig met „bios
rVquot; en aneurine met „bios IIIquot; aangeduid.

„Bios rVquot; van onze nomenclatuur is misschien identiek met
„bios HAquot; van Lash Miller (45), die deze factor als gekris-
talliseerd koperzout heeft verkregen; volgens deze auteur
schijnt de samenstelling te wijzen op een oxy-amino-boter-
zuur.

Natuurlijk zijn de werkzaamheden van al deze verschillende
factoren niet even groot, maar loopen zelfs zeer uiteen. Om een
indruk hiervan te geven, diene onderstaande tabel van F. Kögl,
welke tevens aantoont in hoeverre een factor door een andere kan
worden vervangen, en ook, hoe zeer de juiste samenstelling der
factoren van belang is voor een optimale werking.

quot;i g Hefe gibt in einer Lösung von 43 g Glukose und 33 g
anorganischen Salzen folgenden Zuwachs:

nachnbsp;nach

5 Stdn.nbsp;lo Stdn.

1.nbsp;ohne Bios-Zusatz .................. 0,4 gnbsp;i—1,5 g

2.nbsp;mit 4 g Bios I (Inosit).............. 0,4 gnbsp;i—1,5 g

3.nbsp;mit 0,000000167 g Biotin............ i gnbsp;4 g

4.nbsp;mit 0,00000167 g Biotin............ 3 gnbsp;7 g

5.nbsp;mit 0,00000167 g Biotin und 4 g Inositnbsp;10 g

Die für das Hefewachstum erforderliche Inositmenge ist
zwar gegenüber der als Kohlenstoffquelle dienenden Glukose
als klein zu bezeichnen; man kann jedoch nicht sagen, dass ein
kalorischer Effekt des Inosits ausgeschlossen wäre. Die Bedeu-
tung des Inosits erinnert lebhaft an jene gewisser unentbehr-
Ucher Aminosäuren beim tierischen Organismus; man kann
auch hier von einem spezifischen Nahrungs- oder Baustoff
sprechen.

Ganz anders liegen die Verhältnisse beim Biotin; seine Akti-
vität steht auf einer Linie mit jener der Auxine, der Zoo-hor-
mone und Vitamine.quot;

Het biotine voldoet aan de definitie van een phytohormoon,
ofschoon natuurlijk nog aangetoond moet worden, dat de over-
eenkomstige stof uit plantaardig materiaal daarmee in chemisch
opzicht identiek is.

b. Bios en factor Z.

Een gistextract heeft, behalve de reeds besproken eigen-
schappen van celstrekkende en celvermeerderende werking,
ook nog het vermogen de gisting te versnellen.

Brengt men in een glucose-phosfaat-oplossing levende gist,
dan verkrijgt men in een bepaalde tijd een bepaalde hoeveelheid
koolzuur. Voegt men nu hierbij nog een kleine hoeveelheid van
een gistextract, dan kan deze koolzuur-productie met eenige
honderden procenten worden verhoogd. Gezien de korte tijd.

waarin dit effect optreedt, kan het niet of ten minste niet uit-
sluitend door een celvermeerdering worden verklaard.

H. von Euler (28), die deze werking het eerst beschreef,
stelde voor de actieve stof „factor Zquot; te noemen. Van de zijde
van Kostytschew kwamen echter bezwaren, want hij meende,
de bovengenoemde werking van het gistextract te moeten toe-
kennen aan de reeds bekende co-zymase (van haieoten en
Young). Karl MYRBacK en von Euler (29) toonden echter
aan, dat co-zymase en factor Z niet identiek waren en wel om
verschillende redenen:

1°. Een zeer zuiver co-zymase praeparaat heeft bij levende
gist geen verhooging van de gisting tengevolge, kan dus factor
Z niet vervangen.

2°. Wordt een gistextract eenige uren gekookt, waardoor de
co-zymase, welke niet thermostabiel is, volledig wordt ver-
nietigd, dan blijft in het praeparaat toch de volle „Z-werkingquot;
bestaan^).

3°. Ook in chemisch opzicht zijn de twee factoren verschil-
lend. Factor Z is oplosbaar in 80 proc. alcohol, terwijl de co-
zymase reeds door 70 proc. alcohol volledig wordt neerge-
slagen. Tenslotte zijn er extracten, zooals b.v. moutextract,
welke wel factor Z bevatten, maar geen co-zymase.

VoN Euler en medewerkers toonden verder aan, dat de
„Z-werkingquot; niet te verkrijgen is door normale stofwisselings-
producten, zooals b.v. tryptophaan en histidine, noch door
hexose-mono-phosfaten, hexose-di-phosfaten, of bekende
aminozuren en purinederivaten. Er werden dan pogingen in
het werk gesteld tot isoleering van de stof. Van de eigenschap-
pen noemden wij reeds de thermostabiliteit en de oplosbaarheid
in 80 proc. alcohol; verder bleek de factor een groote stabiliteit
tegenover zuur en base te bezitten. Neerslagen met bariet.

De opheffing van de co-zymase werking is te testen met een gist,
welke volkomen vrij van co-zymase is (apo-zymase) en ook onder de
beste voorwaarden van phosfaat- en suikerconcentratic geen spoor van
gisting meer vertoont.

phosforwolfraamzuur of lood-, kwik- en zilverzouten hadden
geen succes. Het lag voor de hand te onderzoeken of het anti-
neuritische vitamine als activator van de gisting kon fungeeren.
Om dit uit te maken paste Philipson {47) de scheidingsmethode
van Kinnersley en Peters toe en kon op deze wijze aantoonen,
dat „vitamine Bquot; en factor Z niet met elkaar identiek waren.
De door Lucas en Eastcott voor de scheiding van de bios-
factoren uitgewerkte methode deed hem besluiten, dat de stof
ook niet identiek is met bios.

Tot nu toe hebben we steeds over de factor Z gesproken,
maar Philipson kwam later tot de conclusie, dat ook deze factor
uit meerdere componenten bestaat. Met metaalhydroxyden
was volgens hem n.1. een scheiding te verkrijgen. Een neerslag
met basisch loodacetaat — dus de inosiet-fractie — was na ont-
leding bij zijn testmethode werkzaam; deze fractie kon echter
niet door gekristalliseerd meso-inosiet worden vervangen.

In 1934 verscheen een nieuwe publicatie van von Euler en
Larsson (31), waarin zij de samenhang tusschen bios en
factor Z behandelden. Zij onderzochten een gistextract en
pasten de scheiding van Lucas toe. Het extract werd behandeld
met alcohol, daarna met heete barietoplossing. Aldus werd een
neerslag verkregen, dat bios I bevatte. Deze bios I-fractie had
geen Z-werking en ook maar een zeer geringe celvermeerde-
rende werking. De oplossing, verkregen door affiltreeren van het
Ba-neerslag, werd met aceton behandeld, waardoor een neerslag
ontstond, dat zoowel factor Z als bios II bevatte. Ook bij ver-
schillende chemische bewerkingen bleek de celvermeerderende
werking parallel te loopen met de Z-werking. De fracties, welke
de sterkste bioswerking hadden, hadden ook het hoogste ge-
halte aan factor Z. Von Euler en Larsson kwamen tot dc
volgende conclusie:

„Nun ist der Faktor Bios, wie eingangs wieder erwähnt,
definiert durch seinen Einfluss auf die Vermehrung der
Hefezellen, während bei Untersuchungen des Z-Faktors auf

Grund der Gärungsbeschleunigung immer streng darauf ge-
achtet wurde, dass keine Änderung der Zellenzahl während der
in der Regel 5 Stunden dauernden beschleunigten Gärung eintrat.

Trotzdem scheint es uns jetzt möglich und nahehegend, die
beiden Wirkungen auf den gleichen Stoff oder den gleichen
Stoffkomplex zurückzuführen. Wir glauben also nunmehr
folgende Annahme vertreten zu können: der Faktor Z (bzw. das
betr. Stoffgemisch), welcher die Gärung lebender Hefezellen
beschleunigt, bewirkt dies auf Grund von Veränderungen in
den Hefenzellen, welche innerhalb der Gärungszeit zwar noch
nicht zu einer Vermehrung der Zellenzahl führt, welche aber
die Zellvermehrung bzw. Zellteilung vorbereiten.

Demnach würde ein einziger Faktor ZB = Bios II eine Wir-
kung auf frische Hefe auslösen, welche in 2 Phasen zum Aus-
druck kommt, nämlich

zunächst in der Gärungsbeschleunigung, hervorgerufen
durch Neubildungen innerhalb der Zellen, welche

in der zweiten Phase zur Zellteilung, also Zellenvermehrung
Anlass gibt. Wir halten also—trotz scheinbar ganz verschiedener
Wirkung — die Identität von Z und Bios II für wahrscheinlich''
Von Euler komt dus in zijn laatst genoemd onderzoek tot
een geheel andere conclusie dan Philipson enkele jaren geleden
in het Stockholmsche laboratorium.

Door de onderzoekingen van Kögl en Tonnis stonden ons in
het Organisch chemisch Laboratorium der Rijks-Universiteit te
Utrecht zuivere praeparaten van biotine uit eigeel ter beschikking.

Ofschoon het natuurlijk een kwestie van afspraak is, welke
biosfactor men „bios IIquot; wil noemen, is het een vaststaand feit,
dat biotine zonder toediening van een co-groeistof een celver-
meerderende werking op ras M, een bovengist, uitoefent. Aan de
andere kant heeft ook von Euler voor zijn proeven over de „Z-
werkingquot; een bovengist gebruikt. Het was daarom zeer interes-
sant, na te gaan, of biotine (eventueel identiek met „bios 11quot;) bij
ras M inderdaad een versnelling van de gisting veroorzaakt.

HOOFDSTUK IV
Bioswerking en gisting

a. Meetmethode

Om de werking van factor Z te meten, wordt de koolzuur-
ontwikkeling van een gistsoort bepaald en vergeleken met de
hoeveelheid koolzuur, welke in dezelfde tijd bij aanwezigheid
van een Z-praeparaat wordt gevormd. De uitvoering van de
testmethode geschiedde op de volgende manier:

I gram gist werd afgewogen en door schudden fijn verdeeld
in 20 cc voedingsoplossing, welke 10% glucose en 1% phosfaat-
mengsel (KH2PO4 NaaHPOi) bevatte. De Ph van deze op-
lossing bedroeg ± 5,3. Van deze suspensie werd telkens i cc
gepipetteerd in erlenmeyers van 25 cc inhoud, welke reeds x cc
van de te onderzoeken oplossing bevatten; elk vaatje werd dan
nog aangevuld met (i-x) cc water, zoodat in totaal in ieder
kolfje 2 ccvloeistof aanwezig was.De erlenmeyerswerden door een
gummikurk verbonden met manometers van het op pag. 23
reeds besproken model, met dit verschil, dat we bij onze gis-
tingsproeven als manometervloeistof kwik gebruikten. Deze
manometers stelden ons in staat, het aanwezige gasvolumen op
0,01 cc nauwkeurig af te lezen. Nadat de gevulde kolfjes met
de manometers waren verbonden, werden de kolfjes in een
thermostaat bevestigd, welke electrisch op 30° C (± 0,01)
verwarmd was. Gedurende het schudden (200 schommelingen
per minuut) werd het kwikreservoir van de manometers zoo
laag geplaatst, dat de gisting onder verminderde druk kon
plaats hebben. Om het kwartier werd de schudmachine stop
gezet en de volumenverandering afgelezen.

In de eerste plaats hebben wij nu nagegaan, hoe de door ons
gebruikte gistsoort zich gedroeg bij toevoeging van verschil-

lende hoeveelheden gist-kooksap. Wij maakten uitsluitend
gebruik van gistras „Mquot;, een bovengist voor stokerijen, welke
door het „Institut für Garungsgewerbequot; te Berlijn als mengsel
van vier onderrassen voor technische doeleinden wordt ge-
kweekt.

In de volgende tabel geven wij een voorbeeld van de ver-
snelde gisting, welke bij toevoeging van verschillende hoeveel-
heden gistkooksap plaats heeft:

Van iedere „Z-concentratiequot; werd dus bepaald, hoeveel kool-
zuur per uur werd gevormd; figuur lo geeft het verband weer
tusschen de koolzuurontwikkeling per uur en de hoeveelheid
toegevoegde Z-factor.

6. Eenheden

Het was natuurlijk noodzakelijk bij de bestudeering van het
Z-probleem, een eenheid voor de Z-werking vast te stellen om

dc vele praeparaten met verschillend gehalte gemakkelijker
met elkaar te kunnen vergelijken.

H. von Euler en medewerkers gebruikten in het begin van
hun onderzoek over factor Z een gist, welke bij toevoeging van
kleine hoeveelheden Z een rechtlijnige activiteitscurve gaf.
Daarbij was dus het ontwikkelde koolzuur recht evenredig met
dc toegevoegde hoeveelheid Z-factor en men kon hieruit de

Koolzuurpfoducti»
in c.0. per uur

eonc«ntr«itie

FIG. lo

activiteit der verschillende praeparaten gemakkelijk berekenen.

Later werkten v. Euler en medewerkers met een gist, waar-
van de activiteitscurve een verloop had als in fig. lo is aange-
geven, dus reeds bij kleine hoeveelheden van factor Z niet recht-
lijnig was; het werd dus noodzakelijk, een andere eenheid te
kiezen. Zij bepaalden nu de hoeveelheid Z (in cc of mg), welke
noodig was om de gist totaal te activeeren, zoodat dus verdere
toevoeging van factor Z geen effect meer opleverde. De helft
van deze hoeveelheid werd dan als eenheid genomen en H.A.

(halve activeering) genoemd. Wanneer de activiteitscurve van
de gist altijd hetzelfde verloop had, dan zouden de activiteiten
van de verschillende praeparaten inderdaad goed met elkaar
te vergelijken zijn. Het staat echter vast, dat het buigpunt der
curve bij verschillende metingen soms meer naar rechts, soms
meer naar links verschoven is, zoodat de voor de totale acti-
veering noodige hoeveelheden van factor Z grooter of kleiner
kunnen zijn. Weliswaar wordt deze fout door v. Euler ge-
halveerd door de halve activeering als eenheid aan te nemen,
maar toch lijkt het ons mogelijk, dat hieruit nog aanmerkelijke
verschillen bij het bepalen van het Z-gehalte voortvloeien. Deze
fout zou alleen kunnen worden voorkomen, door iedere dag een
standaardcurve mede te bepalen, d.w.z. een reeds vroeger ge-
meten oplossing met een bekende hoeveelheid Z iedere dag in
verschillende concentraties te meten. Het leek ons om deze
redenen wenschelijk, naar een andere eenheid om te zien.

Wij nemen als eenheid (Z-E) aan die hoeveelheid van factor Z,
welke in i mr tijd de koolzmrontwikkeling van onze gist in de
reeds genoemde voedingsoplossing bij 30° C met 50% verhoogt.

Een praeparaat bijv., waarvan 10 mgr. een koolzuurontwik-
keling gaven van 4,5 cc per uur, terwijl zonder toevoeging
een koolzuurontwikkeling van 3 cc was verkregen, bevat dus
i Z-E. Door op deze manier het gehalte aan factor Z uit te
drukken, zijn we onafhankelijk van de verschillen in de gevoelig-
heid van onze gist.

c. Bios en factor Z.

In het Organisch chemisch laboratorium der Rijks-Univer-
siteit te Utrecht stonden ons zeer zuivere praeparaten van bio-
tine uit eigeel ter beschikking. Wij gingen nu de invloed van
deze praeparaten na in verband met de Z-werking. Hiertoe
werd gebruik gemaakt van het gistras „Mquot;, dat volgens de in
ons laboratorium gedane proeven, zeer gevoelig was voor bios.

Bij deze gistsoort veroorzaakten biotinepraeparaten^) absoluut
geen Z-werking, terwijl wij met een gewoon gistextract wel een
goede versnelling der gisting konden bereiken.

Hieruit moeten wij dus concludeeren, dat de gebruikte gist-
soort wel gevoelig is voor de Z-werking, maar dat deze werking
niet toegeschreven kan worden aan biotine. Wij stelden ons nu
tot taak, na te gaan, of er — nadat de identiteit van biotine
met factor Z weerlegd was — wel een verband tusschen deze
stof en een der andere biosfactoren bestaat.

Zooals reeds in Hoofdstuk III werd besproken, kunnen uit
een gistextract de verschillende bios-factoren worden geschei-
den door het achtereenvolgens te behandelen met lood-acetaat
in basisch miheu en schudden met kool. Wij stelden ons aller-
eerst tot doel, deze scheiding uit te voeren en na te gaan, welke
van de fracties Z-werking zouden hebben. Daarvoor werd gist
als volgt verwerkt:

I kg gist (Koningsgist, Delft) werd gedurende eenige uren
gekookt met ongeveer 2 1 water, waarna het kooksap door cen-
trifugeeren van het celmateriaal werd gescheiden. De oplossing
werd in vacuo drooggedampt, de totale werkzaamheid van het
residu bedroeg 6500 Eenheden^). Dit stroopje werd opgenomen
in weinig water en daarna zooveel alcohol toegevoegd, dat de
oplossing 80% hiervan bevatte. Het gevormde neerslag werd
afgefiltreerd en het fikraat door indampen in vacuo van alcohol
bevrijd. Het residu, dat nog slechts 4100 Z-E bevatte, werd
opgenomen in 2 1 water, aan de oplossing een overmaat van een
verzadigde oplossing van loodacetaat (± 25 g Pb (OCOCH3)2)
toegevoegd en het gevormde neerslag afgecentrifugeerd. Het
neerslag werd in 2 1 water gesuspendeerd en met zwavelwater-
stof van lood bevrijd; daarna werd zoo lang lucht door de op-

Aangezien deze zuivere biotinepraeparaten ook bij groote doseering
zonder Z-werking waren, leek het overbodig, ook nog het zeer kostbare
gekristalliseerde biotinepraeparaat van Kögl en Tonnis voor dit doel op
te offeren.

De getallen zijn afgerond.

lossing gezogen, totdat deze vrij Vi n zwavelwaterstof was. Het
na indampen in vacuo verkregen residu was onwerkzaam. Door
toevoegen van ammonia krijgt men in het centrifugaat een
neerslag, dat na afcentrifugeeren op dezelfde wijze ontleed
werd als het eerste neerslag. In deze fractie bedroeg het aantal
Z-E slechts 700. Het fikraat van de behandeling met basisch
loodacetaat werd eveneens met zwavelwaterstof volledig van
lood bevrijd en daarna de zwavelwaterstof op de gewone manier
verdreven. Deze oplossing, welke 3200 Z-E bevatte, werd drie
maal achtereenvolgens met 25 gram kool geschud. De afgefil-
treerde kool werd uitgewasschen met water en daarna geëluëerd
met 5 cc geconcentreerde NH4OH in 100 cc 60 proc. aceton
(per gram kool werd 10 cc van deze oplossing gebruikt). Door
indampen in vacuo werden aceton en ammonia verdreven; het
verkregen residu bevatte slechts 50 Z-E. In het fikraat van de
kool werden nog 3100 Z-E gevonden. Bovengenoemde resul-
taten hebben wij samengevat in onderstaande tabel:

Hieruit ziet men dus, dat slechts 60% van de totale hoeveel-
heid werkzame stof in alcohol van 80% oplosbaar is. Uk het
basisch loodneerslag werd na het ontleden een fractie ver-

kregen, welke io% van de oorspronkelijk aanwezige factor Z
bevatte; dit moeten wij waarschijnlijk aan adsorptie van onze
factor aan het neerslag toeschrijven en niet als eigenschap van
de stof beschouwen. Wij hebben deze scheiding met loodacetaat
natuurlijk eenige malen herhaald, maar moesten steeds weer
een gedeeltelijk verlies van activiteit — namelijk ongeveer io%
— constateeren. Ook de werkzaamheid van het kool-eluaat moet
waarschijnlijk gedeeltelijk aan adsorptie te wijten zijn, daar het
grootste gedeelte van de Z-werkzaamheid — namelijk 50% —
in het koolfiltraat kon worden gevonden. Wij wisten reeds uit
andere onderzoekingen van dit laboratorium, dat aan deze
fractie alleen bij „ras Mquot; geen bioswerking kan worden toege-
kend, maar dat ze wel in staat is, de werkzaamheid van het kool-
eluaat, dat het biotine bevat, te verhoogen.Het was echter nood-
zakelijk, om ook bij onze eigen fractioneering de bioswerking
van de verschillende fracties en van hun combinaties nog eens
na te gaan. Wij danken Dr. Kostermans voor de bereidwillig-
heid, waarmee hij deze proeven voor ons heeft uitgevoerd. De
metingen, welke op de in ons laboratorium gebruikelijke wijze
werden verricht, toonden, dat het biotine zich grootendeels in
het kooleluaat bevond; ook kon de werkzaamheid inderdaad nog
worden verhoogd door het basisch loodneerslag na ontleden
aan het koolfiltraat toe te voegen. De inosiet-fractie (basisch
loodneerslag) had door adsorptie van eenig biotine een kleine
werkzaamheid. Het koolfiltraat alleen was absoluut onwerk-
zaam; ook een combinatie van koolfiltraat en basisch loodneer-
slag geeft geen verhoogde groei van de gist. Het kooleluaat, dat
dus de eigenlijke bioswerking toonde, had aan de andere kant
haast geen Z-werking. Wij hebben toen nog nagegaan of com-
binaties van de fracties, welke wij bij de scheiding hadden ver-
kregen, wel een Z-werking uitoefenden, of tenminste de Z-
werking van een laag actief praeparaat konden verhoogen. Daar-
toe hebben wij bij het kooleluaat, dat zelf bijna onwerkzaam is,
het basisch loodneerslag gevoegd; de werkzaamheid overschreed

die van het basisch loodneerslag niet. Ook de combinatie van
kool-filtraat, kool-eluaat en basisch loodneerslag gaf geen hoo-
gere werkzaamheid dan te verwachten was.

Factor Z bevindt zich dus grootendeels in het koolfiltraat,
dat op zichzelf bij „ras Mquot; geen bios-werking heeft. Terwijl
von Euler en Larsson veronderstellen, dat de door biotine resp.
„bios Hquot; veroorzaakte celvermeerdering voorbereid wordt door de
geactiveerde gisting, veroorzaakt door dezelfde stoffen, komen wij
door ons onderzoek — tenminste wat „ras Mquot; betreft — tot de
conclusie, dat een celvermeerdering door biotine plaats kan hébben
zonder dat een geactiveerde gisting {Z-werking) voorafgegaan is.
Dat neemt natuurlijk niet weg, dat factor Z identiek zou kunnen
zijn met een van de nog niet nader gekarakteriseerde bios-
factoren, welke bij ons gistras als co-groeistoffen werken. Het
is te hopen, dat deze vragen in niet te verre toekomst door het
verder onderzoek zullen worden opgelost.

Samenvatting.

1.nbsp;Een onderzoek werd ingesteld naar de werking van de
auxinen op de ademhaling van Avena sativa, waarbij bleek,
dat zoowel gekristalliseerd auxine-a als heteroauxine geen
invloed hierop hebben.

2.nbsp;De intensiteit van de ademhaling bij haverplantjes (Avena
sativa) is aan dagelijksche schommelingen onderhevig.

3.nbsp;Deze schommelingen loopen parallel met de door F. Kögl
en A. J. Haagen Smit gevonden dagelijksche schommelingen
in de gevoeligheid der haverplantjes voor auxine en eveneens
met de door Bottelier gevonden schommelingen in de inten-
siteit der protoplasmastrooming.

4.nbsp;Haverplantjes, gekweekt in cassetten van papier of metaal
zijn minder onderhevig aan deze schommelingen; de adem-
haling is hier intensiever en zoo goed als constant, de gevoe-
ligheid voor auxine grooter, maar niet constant. Mogelijk
is hier mede oorzaak de invloed van het gebruikte licht
(oranjerood).

5.nbsp;H. von Eüler heeft het vermoeden uitgesproken, dat aan de
celvermeerderende werking bij gist, welke door bios II
teweeg gebracht wordt, een door dezelfde stof veroorzaakte
versnelling van de gisting (Z-werking) voorafgaat. Dit werd
getoetst aan biotine, waarbij bleek dat biotine-praeparaten
de gisting niet versnellen, ofschoon ze een celvermeerdering
bij de gebruikte gist teweeg brengen.

Zusammenfassung.

1.nbsp;In der vorliegenden Untersuchung wurde der Einfluss der
Auxine auf die Atmung von Avena sativa studiert; hierbei
ergab sich, dass weder Auxin-a noch Heteroauxin irgend-
welche Veränderungen der Intensität hervorrufen.

2.nbsp;Dagegen konnte festgestellt werden, dass sich die Atmungs-
intensität bei den Haferpflänzchen (Avena sativa) sowohl von
Tag zu Tag als auch im Laufe eines einzigen Tages ändern
kann.

3.nbsp;Diese täglichen Schwankungen nehmen den gleichen Ver-
lauf wie die von Kögl und Haagen Smit gefundenen
Schwankungen in der Empfindhchkeit der Haferpflänzchen
gegen Auxine. Ebenso besteht eine Parallelität mit den
von Bottelier untersuchten Intensitätsänderungen der
Protoplasmaströmung.

4.nbsp;Haferpflänzchen, die in Kassetten von Papier oder Metall
aufgezogen werden, zeigen die vorhin genannten Schwan-
kungen in weit geringerem Masse. Die Atmung ist bei ihnen
intensiver als bei den „normalenquot; Testpflänzchen und
bleibt fast konstant, während die Empfindlichkeit gegen die
Auxine auch deuthch erhöht, aber nicht frei von Schwan-
kungen ist. Möghcherweise bedeutet der Ausschluss des
orange-roten Lichtes einen wichtigen Faktor für das ver-
änderte Verhalten der Kassettenpflanzen.

5.nbsp;H. von Euler hat die Vermutung ausgesprochen, dass
beim Hefewachstum der Zellvermehrung, die durch „Bios
IIquot; verursacht wird, eine durch den gleichen Stoff bewirkte
Gärungsbeschleunigung (Z-Wirkung) vorausgeht. Zur Klä-
rung dieser Frage wurde Biotin geprüft; dabei ergab sich,
dass es die Gärung nicht zu beschleunigen vermag, obwohl
es bei der benutzten Heferasse Zellvermehrung hervorruft.

LITTERATUURLIJST

A. Over Auxine

1.nbsp;J. Babicka, Die Wuchsstoffe.

Beih. Bot. Cent. Abt. A, Bd. LII (1934).

2.nbsp;J. Bonner, J. Gen. Physiol. Vol. 17, no. i, 63 (1933).

3.nbsp;H. P. Bottelier, Ree. trav. botan. néerl. 31, 474 (i934)'

4.nbsp;P. Boysen-Jensen, Die Wuchsstofftheorie.

Jena: G. Fischer 1935.

5.nbsp;P. Boysen-Jensen, Ber. dtsch. bot. Ges. 28, 118 (1910).

Biochem. Z. 205 (1931).

tt tt 239, 243 (1931)-
ft it 250, 270 (1932).

6.nbsp;H. VON Euler en H. Larsson, H. S. 223, 189 (1934)-

7.nbsp;N. Cholodny, Jahrb. f. wissensch. Bot. 65 (1926).

Planta 6 (1928).

Ber. dtsch. Bot. Ges. 51, 85 (i933)gt;

8.nbsp;Haldane en Barcroft, J. of Physiol. 28, 232 (1902).

9.nbsp;A. N. J. Heyn, Ree. trav. bot. néerl. 28, 113 (1934).

Proc. Acad. Wetensch. Amsterdam 33 nr. 9, (1930).

i» tt ttnbsp;tt 34 nt. 3, {1931)-

Jb. Bot. 79, 753 (i934)-

10.nbsp;F. Kögl, A. J. Haagen Shit en H. Erxleben, H.S. 2i4t 247 (1933)

11.nbsp;F. Kögl, A. J. Haagen Smit en H. Erxleben, H.S. 225,215 (1934)

12.nbsp;F Kögl en H. Erxleben, H.S. 227, 51 (1934).

13.nbsp;F. Kögl en H. Erxleben, H.S. 228, 90 (1934).

14.nbsp;F. Kögl en D. Kostermans, H.S. 228, 113 (i934)gt;

15.nbsp;F. Kögl en H. Erxleben, H.S. 235, 181 (1935) •

16.nbsp;F. Kögl, Ber. 68, Abt. i, 16 (1935).

Die Naturwissensch. 23, Heft. 50 (1935)-

17.nbsp;O. Meyerhof, Ber. 58, 991 (1925).

18.nbsp;Niels Nielsen, Planta 6, 376 (1928).

Jb. Bot. 72, 66 (1930).
tt tt 73t 125 (1930).
ft 9t 73t 189 (1930)-
Biochem. Z. 237, 344 (i93i)'

19.nbsp;H. SöDiNG, Jahrb. Wiss. Bot. 74,127 (1926).

tgt; gt;t tt 77, 627 (1932).
gt;t » gt;t

79, 231 (1934)-

20.nbsp;H. SöDiNG, Über Wuchshormone. Zellstimulationsforsch. Berlin.

21.nbsp;O. Warburg, Über den Stoffwechsel der Tumoren. 1926 Berlin

Verlag v. Julius Springer.

22.nbsp;F. A. F. C. Went en Kostytschew, Lehrbuch der Pflanzen-Phy-

siologie 2. Bd. S. 254-

23.nbsp;F. Kögl, H.S. 214, 261 (i933)'

24.nbsp;F. W. Went, Proc. Akad. Wetensch. Amsterdam 30, i (1926).

Ree. trav. bot. néerl. 25,1 (1928).

„ tt tt tl 23it 483 (1928).
Jahrb. wiss. Bot. 76, 528 (1932).

B. Over Bios en Factor Z.

25.nbsp;A. M. COPPING, Biochem. J. 23quot;, 2050 (1929).

26.nbsp;E. V. Eastcott, J. Phys. Chem. 32,1094 (1928).

27.nbsp;A. D. Emmet en M. J. Stockholm, J. Biol. Chem. 43, 287 (1920).

28.nbsp;H. V. Euler en Swartz, H.S. 140,146 (1924).

29.nbsp;H. v. Euler en MYRBäcK, H.S. r^j, 297 (i924)'

H.S. 176, 258 (1928).

30.nbsp;H. V. Euler, Brünius en Proffe, H.S. 178, 202 (1928).

31.nbsp;H. V. Euler en Larsson, H.S. 223,189 (1934)'

32.nbsp;A. Fernbach, Ann. de la Brasserie et de la Distillerie pag. 510

(1901).

(ook) Wochenschr. f. Brauerei 19, 2 (1902).

33.nbsp;W. D. Fleming, J. Biol. Chem. 49,119 (1921).

34.nbsp;E. J. Fulmer, J. Biol. Chem. 571397 (1923).

35.nbsp;W. van Hasselt, Dissertatie Utrecht 1935.

36.nbsp;F. Kögl, Ber. 68, Abt. A., 16 (i935)-

37.nbsp;F. Kögl, Die Naturwissensch. i935t 23, Heft 50.

38.nbsp;F. Krüger, Cent. Bakt., Abt. i, 10 (1895).

39.nbsp;K. Kurono, J. Coll. Imp. Univ. Japan 5, 305 (1915)'

40.nbsp;J. v. Liebig, Ann. Chim. Phys. 4de serie 23, 5 (1871).

41.nbsp;G. H. W. Lucas, J. Phys. Chem. 28, 1180 (1924)-

42.nbsp;W. Lash Miller, J. Phys. Chem. 32, 1094 (1928).

43.nbsp;W. Lash Miller, J. Phys. Chem. Education 7, 257 (i93o)'

44.nbsp;Lash Miller, E. V. Eastcott en J. E. Maconachie, Am. Soc. 55,

1502 (1933).

Zie ook: Chem. Abstr. 27,1649 (i933)'

45.nbsp;W. Lash Milleh, Proc. Trans. Roy. Soc. Canada III, 26, 165

(1932).

46.nbsp;L. Pasteür, Ann. Chim. Phys. 3de serie 58, 323 (i860).

47.nbsp;T. Philipson, H.S. 193, 15 (1930).

Biochem. Z. 245, 418 (1932).
» tgt; ^49, 245 (1932).

48.nbsp;H. Pringsheim, Cent. Bakt. 16, m (1906).

49.nbsp;E. Wildiers, La Cellule 18, 313 (1901).

50.nbsp;W. Windisch, Wochenschr. f. Brauerei 19, 527 (1902).

51.nbsp;R. J. Williams, J. Biol. Chem. 38,465 (1919).

gt;f ff 42, 259 (1920).

52.nbsp;R. J. Williams en E. M. Bradway, Am Soc. 55, 783 (1931).

Biochem. J. 28, 1887 (1934).

53.nbsp;R. J. Williams en J. M. Truesdail, Am. Soc. 53, 4171 (1931).

54.nbsp;R. J. Williams en R. R. Roehm, J. Biol. Chem. 87, 581 (1930).

hé

INHOUD

Pag.

INLEIDING ........................................................................9

I.nbsp;PHYSIOLOGIE EN CHEMIE DER AUXINEN

a.nbsp;Testmethode en bereiding ....................................13

b.nbsp;Isoleering van auxine a en b ....................nbsp;14

c.nbsp;De structuurbepaling van auxine a en b ..........nbsp;15

d.nbsp;Hetero-auxine .................................16

e.nbsp;Invloed van de groeistoffen op de plant ...........17

II.nbsp;AUXINEWERKING EN ADEMHALING
Inleiding ......................................nbsp;21

a.nbsp;De meetmethode ............................nbsp;22

b.nbsp;Ademhaling bij toevoeging van auxinen....................23

c.nbsp;Ademhaling en gevoeligheid voor auxinen.........31

III.nbsp;BIOS EN FACTOR Z

а.nbsp;Overzicht over de ontwikkeling van het bios-probleemnbsp;40

б.nbsp;Bios en factor Z ..............................nbsp;46

IV.nbsp;BIOSWERKING EN GISTING

a.nbsp;Meetmethode ................................nbsp;5°

b.nbsp;Eenheden ....................................nbsp;51

c Bios en factor Z ..............................nbsp;53

SAMENVATTING ............................................................58

ZUSAMMENFASSUNG.........................................59

LITTERATUURLIJST ....................................................60

Ai-if

:

STELLINGEN

Gekristalliseerd auxine-a en hetero-auxine hebben geen
invloed op de ademhaling van Avena sativa.

J. Bonner, J. Gen. Physiol., Vol. 17, no. i, 63 (1933).

II

De symmetrische structuur van naphtaline is niet uitsluitend
te bewijzen op grond van chemische reacties.

L. F. Fieser en W. C. Lothrop, — J. Am. Chem. Soc. 57,

1459 (1935).

III

Het is niet mogelijk, een bevredigende structuurformule
voor chlororaphine op te stellen op grond van de theoretische
beschouwingen van Clemo en Mcllwain.

G. R. Clemo en H. Mcllwain, J. Chem. Soc. 738 (1935)

IV

De verklaring van de estercondensatie van Scheibier is aan
ernstige bedenkingen onderhevig.

F. Adickes en M. Meister, Ber. 68, 2191 (1935).

De eisch ,gesteld in de wijziging van het melkbesluit (K.B.
No. 311, 24 Mei 1935), dat de reductasetijd der melk niet korter
mag zijn dan 2 uur, biedt nog geen volledige zekerheid omtrent
de deugdelijkheid der melk.

W. Majoewsky, Chem. Weekbl. 33, 6 (1935).

rr.

- . sf

Jones en Jelen hebben bij de bepaling van de uitzettings-
coëfficiënt van zilverjodide niet rekening gehouden met de
physische zuiverheid van de gebruikte stof.

G. Jones en C. Jelen, J. Am. Chem. Soc. 57, 2532 (i935)'

VII

De theoretische beschouwingen, welke Jermolenko naar
aanleiding van zijn sedimentatie-thixotropie heeft ontwikkeld,
zijn onjuist.

N. Jermolenko, Kolloid. Ztschr. 72, 312 (i935)'

li'»

mi

. -

mi^M

mmmmm

r ' . j 'v-..'- .-V f'.

J 'h

...iHM'V««-';.-»-. .-vl'. t-'i:' V' -f.. •l-'---.nbsp;i.ÏsMKfiS!

tgt;jm

umm

Pm

V

w

«ipœap

mmmrn