ter verkrijging van den graad van
doctor in de veeartsenijkunde aan de
rijks-universiteit te utrecht op gezag
van denrector-magnificus dr.w.e.
ringer, hoogeeeraar in de faculteit
der geneeskunde, volgens besluit van
den senaat der universiteit tegen de
bedenkingen van de faculteit der
veeartsenijkunde te verdedigen op
donderdag lo december 1936,
des namiddags te 4 uur

Nu dit proefschrift persklaar is, gaan mijn gedachten uit naar
de daarin verwerkte onderzoekingen en naar de hierbij verkregen
resultaten. Ben bijdrage te hebben kunnen leveren tot de kennis van
het geslacht „Haemophilusquot; stemt mij tot vreugde.

De voldoening die hieraan ten grondslag ligt, gaat uiteraard ge-
paard aan dankbaarheid jegens allen, die mij direct of indirect hij
studie en arbeid behulpzaam waren.

Allen, maar vooral U, Hoogleeraren, die door voortreffelijk on-
derwijs in mijn wetenschappelijke vorming een aandeel gehad
hebben, ben ik zeer erkentelijk.

U, Hooggeleerde de BliECK, Hooggeachte Promotor, dank ik voor
de gëlegenheid tot werken, die Gij mij hoodt, alsmede voor de leiding
en medewerking, welke ik van U mocht ondervinden. Het was vooral
Uw onderwijs — waarbij een hooge mate van zelfstandigheid ge-
eischt was — dat bij mij een drang tot onderzoeken ontwikkelde.
Aan Uw instituut juist op dit onderwerp mijn krachten te mogen
beproeven, was mij een groote eer.

Voorts deelen in mijn dank medewerkers en personeel, verbonden
aan het Instituut voor Parasitaire en Infectieziekten, die mij bij
mijn proefnemingen van dienst waren. De aangename sfeer, aange-
troffen in Uw midden, en Uw aller hulpvaardigheid zullen blijvend
in mijn geheugen bewaard .zijn.

Ook voor de mij bij het tot stand komen van dit proefschrift
verleende hulp van hen, die staan buiten het Instituut voor Para-
sitaire en Infectieziekten, heb ik groote waardeering.

Coryza infectiosa gallinarum is een meestal enzoötisch
voorkomende kippenziekte, die gekenmerkt wordt door een
muceuse of mucopurulente neusuitvloeiïng en in ons land
algemeen bekend is onder de naam „snotziektequot;.

In 1931 ontdekte DE Bliëck een haemophiele bacil als
oorzaak van deze ziekte. Met reinculturen van deze bacil,
die hij noemde Bacillus haemoglobinophilus corysae galli-
narum, kon hij coryza opwekken bij kippen na intranasale
indruppeling.

De bedoeling van dit onderzoek was bij te dragen tot de
kennis van deze nog onvoldoende onderzochte bacil van de
Blieck in het bijzonder en tot de kennis der haemophiele
bacillen in het algemeen.

Het onderzoek van de coryzabacil van de Blieck was in
de eerste plaats een vergelijkend onderzoek van deze bacil
met Haemophilus influenzae, het type van het geslacht
Haemophilus, om hierdoor Ie. een juiste plaatsing van ge-
noemde bacil ten opzichte van Haemophilus influenzae te
verkrijgen in het bacteriologische systeem en 2e. te kunnen
profiteeren van de door vele onderzoekingen verworven
kennis van Haemophilus influenzae. In dit werk werden
beide bacillen daarom gezamenlijk behandeld.

Voor Bacillus haemoglobinophilus coryme gallinarum
werd de juister gebleken naam Haemophilus coryzae

Door het regelmatig voorkomen van de namen Haemo-
philus influenzae, Haemophilus coryzae en coryza infectiosa
gallinarum werden deze afgekort respectievelijk als Hi, Hc
en coryza.

I. HAEMOPHILUS CORYZAE
IN EEN VERGELIJKEND ONDERZOEK MET
HAEMOPHILUS INFLUENZAE.

Volgens de; Bi.ie;ck 1931, 1934 was Bacillus haemoglobi-
nophilus coryzae gallinarum een gramnegatieve, pleomorphe
bacil, met ovoïde vormen, plompe staafjes, korte en lange
draden. De koloniën van Bacillus haemoglobinophilus cory-
zae gallinarum waren — behalve de grootste, die iets wazig
waren — rond, glad, glanzend, doorschijnend en steeds
kleiner dan de koloniën van Haemophilus influenzae. Waar-
schijnlijk had de bacil X- en V factor noodig. Het beste
groeide ze op 25% paardenbloedagar tot 65° C. verhit. Op
Fildesagar vormde ze geen duidelijke koloniën. Met gist-
extract werd geen groeivermeerdering verkregen. Op agar,
serumagar, in bouillon en serumbouillon groeide ze niet.
Zonder andere bacillen was het moeilijk de culturen aan te
bouden. De bacil was niet pathogeen voor muizen en
konijnen.

Verschillende Amerikaansche onderzoekers beschreven
eveneens haemophiele bacillen bij coryza. NëLSOn in New
Jersey 1933, D^laplane;, Erwin en Stuart in Rhode Island
1934, Miss Eliot en Miss Le;wis in Maryland 1934,
Schalm en Bkach in California 1934 toonden bacillen bij
deze ziekte aan, waarmede zij coryzaverschijnselen konden
opwekken. De;laplanë en Miss Eliot gaven beiden aan
hun bacillen de naam Haemophilus gallinarum.

Ongetwijfeld zullen deze Amerikaansche bacillen onder-
ling en met de bacil van de Blieck nauw verwant zijn. Daar

echter geen vergelijkend onderzoek van genoemde bacillen
had plaats gehad en ze tevens onvolledig onderzocht werden,
leek het mij juist deze Amerikaansche bacillen voorloopig
als niet identiek met Haemophiliis coryzae te beschouwen.
(Zie blz. 112).

Doordat toegezonden Amerikaansche stammen dood aan-
kwamen, konden deze niet onderzocht worden.

Morphologisch deed Hc zieh bij mijn onderzoek,
evenals Hi, steeds voor als een zeer pleomorphe b a c i b
Er bestond eenig verband tusschen zijn vorm en het me-
dium van groei. In bloedbouillon varieerde Hc van cocco-
bacil tot lang staafje. Hierbij lagen de bacillen vaak twee
aan twee achter elkaar of in korte ketens. Lange draden en
ketens waren zeldzaam. In bijzondere media als aardappel-
bloedbouillon en leverbloedbouillon (zie blz. 31) overwogen
lange ketens van bacillen, die zich konden uitstrekken over
meerdere gezichtsvelden. Op vaste media waren de bacillen
vaak regelmatiger van vorm met neiging tot keten- en
draadvorming.

Hc kleurde zich goed met Löfflers Methyleenblauw 2
minuten en was gramnegatief. Bij oude culturen werd de
kleuring onregelmatig. Er traden veel vervalvormen op. De
bacillen waren niet meer duidelijk omlijnd. Op vaste media
vertoonden de bacillen reeds vanaf de derde dag deze ver-
anderingen.

In een bepaald percentage werden hier en daar intensief
gekleurde bolletjes waargenomen, soms verbonden aan het
eind van een staafje. Deze lichamen kwamen overeen met
door Kristensen beschreven vormen van Hi. (Zie foto).

De koloniën waren dauwdruppelachtig, glad, glan-
zend, volkomen doorschijnend en gaafrandig. Alleen de
grootste koloniën konden centraal iets wazig zijn. Deze
laatste werden gevormd op chocoladeagar in gesloten
ruimte en waren ruim I mm. groot {Hi 2-3 mm.).

In verhouding tot /fï-koloniën waren i/c-koloniën nog
kleiner, nog glänzender, nog helderder en nog regelmatiger,
i/ï-koloniën waren in verhouding tot i/c-koloniën fluweel-
achdg zacht. Evenals f/z-koloniën konden //c-koloniën een
eenigszins conisch centrum hebben.

Aan de biochemische activiteit van de hae-
mophiele bacillen werd in de literatuur veel aandacht be-
steed. Deze activiteit had vooral betrekking op de vergis
ting van koolhydraten, de vorming van indol en de vorming
van haemolysine.

Er bestond een groote onregelmatigheid in de v e r g i s-
ting van koolhydraten door Hi (Levinthai,
1918, Stillman en Bournë 1920, Rivers en Kohn 1921).
Het gelukte niet met deze suikervergisting Hi te typeeren
of hiermee een constante onderverdeeling te verkrijgen. De
vergisting bleek zeer afhankelijk van de gebruikte media.
Bouillon voldeed slecht.

De koolhydraatvergisting van Hi werd geheel ontkend
door het nauwkeurig onderzoek van Kristensen 1922.
Kristensen kon noch in vloeibare noch op vaste media het
geringste vermogen van Hi aantoonen tot vergisting van
koolhydraten. Hij toonde aan, dat de zuurvorming van Hi
in glucoseagar en glucosebouillon niet grooter was dan in
dezelfde media zonder glucose. De glucosevrije media wer-
den verkregen door colifermentatie. Door colivergisting
werden de wisselende hoeveelheden spiersuiker uit bouillon
verwijderd. Dezelfde resultaten werden verkregen voor
andere koolhydraten.

Deze onregelmatigheid van koolhydraatvergisting kwam
echter niet in de geheele groep tot uiting. Rivers en
Leuschner 1921 gaven aan, dat Bacillus haemoglobinophi-
lus canis een sterke suikervergister was en Kristensen
kon dit bevestigen.

Voor de koolhydraatvergissing van He werd uitgegaan
van bouillon. Bouillon werd gebruikt, omdat in andere

media de groei van Hc onvoldoende was. Er werden 2 rijen
proeven genomen voor iedere stam. In totaal werden 6
stammen onderzocht.

I. Bouillon (Ph 7,4) 1% van verschillende koolhydra-
ten, respectievelijk glucose, lactose, galactose, dextrine,
maltose, saccharose of inuline, 5% lakmoes, werden
gesteriliseerd en daarna werd hieraan toegevoegd 10%
gedefibrineerd paardenbloed.

In de onder I en II beschreven media gaf Hc geen kleur-
verandering en geen gasvorming, zelfs niet na 10 dagen
bebroeden. Microscopisch was in de proefmedia hetzelfde
aantal bacillen aanwezig als in contrólebloedbouillon zonder
kleurstof en zonder suiker. De negatieve resultaten waren
dus niet toe te schrijven aan een groeiremmende werking.

Uit de beoordeeling van de resultaten was echter niet
zonder meer tot een onvermogen van Hc om koolhydraten
te vergisten te besluiten. Steeds was de groei van Hc in
bloedbouillon matig en het bleef mogelijk, dat door dit
beperkt aantal bacillen de omzetting te gering was om een
kleurverandering te geven.

Naar de vorming van indol kon Hi verdeeld
worden in indolpositieve en in indolnegatieve stammen. De-
ze indolvorming was een constante eigenschap van de stam-
men. Indolpositieve stammen behielden hun indolvormend
vermogen, ook na lang voortkweeken. Indolnegatieve stam-
men vormden nooit indol. (o.a. RhEin 1919, RivERS en
Kohn 1921, Yabe 1921, Kristensen 1922).

De indolvorming van bacteriën berust hoofdzakelijk op
een omzetting van tryptophaan en kan worden aangetoond
door de reactie van Ehrlich-Böhme. KrisTEnsEN gebruikte
bouillon (-f- haemoglobine)-culturen voor zijn indolproe-
ven. Bij 1 volume bouilloncultuur deed hij V2 volume van

het volgende mengsel: paradimethyl-amido-benzaldehyde
4, 96% alcohol 380, geconcentreerd zoutzuur 80. Na zacht
schudden werd V2 volume van een verzadigde oplossing van
kaliumsulfaat toegevoegd. Bij aanwezigheid van indol ont-
stond een purperroode kleur. De kleur kon langzaam ont-
staan en daarom moest het resultaat eerst na 10 tot 15 minu-
ten worden afgelezen. Kristensen beval aan, het kalium-
sulfaat niet geheel weg te laten, zooals verschillende onder-
zoekers deden, daar anders de reactie niet altijd even scherp
was.

Volgens de boven beschreven methode werden door mij 6
Hc-stammen onderzocht. In de bovenstaande vloeistof van
bloedbouillonculturen van deze stammen kon na I, 2, 3, 4
en 5 dagen bebroeden geen indol worden aangetoond. Ook
in een aetherextract van deze culturen — zooals gebruikt
werd door Rivers en Kohn 1921 om indol te concentreeren
— kon geen indol worden aangetoond met het reagens van
Ehrlich.

De vorming van haemolysine, kenbaar door
de daarmee samenhangende haemolyse van bloed, was voor
Hi uitzondering. Bacillus „Xquot; van Pritchett en Stillman,
die in tegenstelling tot Hi wel haemolysine vormt, moest
om zijn afwijkende groeivoorwaarden (zie „Andere hae-
mophiele bacillenquot;) een afzonderlijke plaats in deze groep
worden toegekend. Eerst Fildes 1924 en later Valentine
en Rivers 1927 beschreven haemolytische stammen, die in
groeivoorwaarden met Hi (X- en V factorbehoefte) over-
eenstemden. Consequent blijvend kwam aan deze stammen
de naam Hi var. haemolytica toe en niet aan Bacillus
„Xquot;. Hc was in dit onderzoek steeds een niet haemolytische
bacil.

De levensduur van Hi (eigenlijk van //z-cultuur)
bleek te varieeren tusschen één maand en langer. De gege-
vens hieromtrent waren echter uitermate schaarsch. Rivers
en Kohn 1921 vonden een levensvatbaarheid van één maand

en meer voor Hi in bloedbouillon bij kamertemperatuur.
Andere onderzoekers beperkten zich tot een vermelding van
de levensduur zonder meer. Het leek daarom gewenscht
tevens een onderzoek in te stellen naar de levensduur van
Hi (gebruikt werd een sputumstam).

: goede groei Hc - matig koloniën of bacillen voor Ht.
± : enkele Hi- respectievelijk /Jc-koloniën of bacillen.
— : geen groei.

De bloedbouillon en chocoladeagar werden 2 dagen be-
broed, daarna respectievelijk geplaatst bij 0° C. in de ijskast,
bij 16° C. in het donker of bij 37° C. in de broedstoof. De
chocoladeagar was in buisjes, die om het uitdrogen te voor-
komen gedurende de geheele proef met gummikurken afge-
sloten waren. Deze maatregel werd genomen, omdat mij
gebleken was, dat Hi en Hc op chocoladeagar zonder kurken

zeer spoedig doodgingen. Hc was dan in de meeste gevallen
reeds na 5 dagen afgestorven, terwijl Hi hierbij varieerend
tusschen 7—14 dagen na enting niet meer levensvatbaar
bleek. Iedere week werden de proefbuisjes gecontroleerd op
levensvatbaarheid. Deze controle bestond uit het enten ervan
op de volgende nieuwe media: 1. bloedbouillon, 2. chocolade-
agar en 3. serumagar. Hierbij werd gelet voor I op de ont-
wikkeling van typische bacillen, voor 2 op de vorming van
typische koloniën, terwijl 3 nooit groei mocht vertoonen
Uit de tabel blijkt :

2.nbsp;dat de levensduur van Hi, zoowel als van Hc, het kortst
was bij het bewaren van de media bij 16° C. in het don-
ker, langer bij het bewaren der media bij 0° C. in de
ijskast en het langst bij voortdurend verblijf van de
media in de broedstoof van 37° C.

Mag voor Hi onder wisselende omstandigheden op een
levensduur van 4 weken gerekend worden, voor Hc is deze
levensduur op zijn hoogst beperkt tot 2 weken.

Deze resultaten werden verkregen met van te voren regel-
matig overgeënte culturen. Regelmatig in dien zin te ver-
staan, dat Hc wekelijks en Hi om de twee weken overgeënt
werd. Werd bij deze proef echter uitgegaan van oude cul-
turen, d.w.z. voor Hc 2 weken oude culturen en voor Hi 4
weken oude culturen, dan waren de leeftijden veel korter.
Deze oude culturen bleken dus niet meer volwaardig.

Deze mindere vitaliteit van oude culturen kwam ook nog
tot uiting door het optreden van een groeivertraging. Van
regelmatig overgeënte Hi- en //c-culturen ontwikkelden
zich reeds na 24 uren mooie koloniën, die na 48 uren hun
groeimaximum bereikten. Bij gebruik van oudere culturen
waren na 24 uren vaak nog geen koloniën te bespeuren, ter-

wijl zich in de volgende 24 uren vele koloniën ontwikkelden.
Deze groeivertraging trad niet op bij gebruik van culturen,
die voortdurend in de broedstoof bij 37° C. waren gehouden.

Lang gold Hi als een streng aërobe bacil (PpëiFFEr).
Loewenthal 1918, Kondo 1922, Knorr 1925 e.a. verkre-
gen ook groei van Hi in media die geschikt waren voor het
kweeken van streng anaërobe bacillen. Hierdoor ontstond
twijfel omtrent de zuurstofbehoefte van Hi. De
groei onder anaërobe omstandigheden van Hi was echter
minder goed (SchëLLËR 1921). Degeneratievormen traden
meer op de voorgrond, vooral bij passageënting (Fildes
1921). Tevens waren absoluut anaërobe omstandigheden
voor Hi niet te verwezenlijken, omdat zuurstof absorbee-
rende (zich dehydreerende vlg. WiELANd) weefselbestand-
deelen niet konden worden uitgesloten. De mogelijkheid
bleef bestaan, dat Hi zijn zuurstof kon onttrekken aan die
weefselbestanddeelen. De zuurstof affiniteit van Hi moest
dan grooter zijn dan de zuurstof absorptiekracht van de
weefselbestanddeelen (Fii^des 1921, LoEwEnThai, 1918).

In de vacuumklokken van Zeissier waren de iJc-koloniën
— op chocoladeagarplaten — slechts weinig kleiner
dan in de buitenlucht. Ook de tweede overenting was
goed gegroeid in vacuum.
2- In leverbloedbouillon (zie blz. 31), afgesloten door
vaseline, groeide Hc ook in de eerste en tweede
overenting. Microscopisch was het aantal bacillen in de
met vaseline afgesloten buizen als in de open buizen. In
de afgesloten buizen traden spoedig vervalvormen op,
soms reeds na 24 uren. Vaseline werd gebruikt als af-
sluiting om haar reduceerend vermogen (Olitsky en
Gates 1921). Leverbloedbouillon 0,1 cc. van een
waterige oplossing van Methyleenblauw, afgesloten door
vaseline, was na 2 uren ontkleurd.

3. Chocoladeagarplaten - voor de eene helft geënt met
Hc en voor de andere helft met Serratia marcescens
~ afgesloten door boetseerklei, gaven goede groei van
nc (Anaerobemethode volgens Fortner)
De anaërobe groei van Hc kon niet bewezen worden De
mmder goede groei van Hc in anaërobe media, de gunstige
werkmg van meer zuurstof, het niet kunnen uitsluiten van
weefselbestanddeelen in de media, wezen in de richting van
een permanente zuurstofbehoefte voor de groei van Hc

De p a t h o g e n i t e i t voor proefdieren varieerde sterk
bij de verschillende ^/.-stammen. Zoowel pathogene als apa-
hogene stammen werden beschreven. De meeste onderzoe-
kers schreven de pathogeniteit van Hi toe aan een endo-
toxine-werking (Pfeiffer e.a.), daar met gedoode bacillen
dezelfde verschijnselen verkregen werden en in bloed en
organen geen vermeerdering der ingebrachte bacillen kon
worden vastgesteld. Door een bijzondere pathogeniteit vie-
len de menmgitisstammen van Cohen 1909 op. Deze gaven
nl. bactenaemie bij konijnen na intraveneuze injectie. Mar-
tha Woi^lstein 1919 en Kapsenberg 1929 konden met
een groot gedeelte van hun meningitisstammen ook bacteri-
aemie bij konijnen veroorzaken. Na Cohen werd ook met
sputumstammen bacteriaemie opgewekt. Er was dus viru-
lentiewillekeur van Hi bij proefdieren. Margaret Pitt-
man 1931 e.a. brachten eenige regelmaat in deze willekeur
doordat zij aantoonden, dat bacteriaemie bij konijnen ver-
oorzakende Hi anders groeide dan gewone sputumstam-
men, nl. met een sterke lichtschifting van jonge culturen
bij schuindoorvallend kunst- of zonlicht. (Zie ook , Andere
haemophiele bacillenquot;).

Een virulentieverandering werd aangetoond in de proe-
ven van Blake en Cecii. 1920. Door passageënting van 11
muizen en 13 caviae werd een virulentievermeerdering ver-
kregen, waardoor Hi pathogeen werd voor apen. Bij voort-
kweeken in kunstmatige media verdween deze virulentie

weer buitengewoon snel. Ishiwara 1923 toonde een terug-
gang in virulentie aan bij Hi na kunstmatig voortkweeken.
Stammen, die aanvankelijk een bacteriaemie bij de muis
veroorzaakten, werden avirulent. Twort 1931 toonde aan,
dat op versche lever en nier gekweekte Hi voor konijnen
toxischer waren dan bacillen, die op bloedagar of bloed-
bouillon waren gekweekt.

Voor Hi nam het pathogeniteitsonderzoek bij proefdie-
ren steeds een groote plaats in om vooral hierdoor meer
van de beteekenis van Hi voor de influenza van de mensch
te achterhalen. Meer om het pathogeen karakter dan
oni de aetiologische beteekenis van Hc te kennen, werd de
reactie van een beperkt aantal proefdieren op Hc nagegaan.
Hierbij bleken konijnen en duiven niet te reageeren. Ze
Verdroegen groote hoeveelheden pas geïsoleerde bacillen,
subcutaan of intraveneus, zonder ziek te worden. Ook mui-
len, intraperitoneaal ingespoten, bleven gezond. Kippen,
die intraveneus of intraperitoneaal pas geïsoleerde bacillen
kregen toegediend, vertoonden geen verschijnselen. Indien
pas geïsoleerde i/c-bacillen subcutaan werden aangebracht.
Vertoonden kippen in sommige gevallen een locale zwelling
zonder ziek te worden. Bij één dier, dat pas geïsoleerde Hc-
bacillen subcutaan onder het oog kreeg toegediend, ontwik-
kelde zich binnen 48 uren coryza.

Overeenkomstige resultaten verkreeg NëLSon met zijn
coryzabacil bij kippen na extranasale toediening. Behalve
^en locale ontsteking na subcutane inspuiting en in enkele
gevallen geringe veranderingen aan het Omentum na intra-
Peritoneale inspuiting, kon hij door subcutane, intraperito-
quot;eale en intraveneuze injectie geen verschijnselen opwek-
ken. Evenwel was na intraperitoneale inspuiting zijn bacil
dikwijls in de neus terug te vinden zonder coryza te ver-
oorzaken. Er konden dus dragers gevormd worden. Bij vele
van die dragers waren met Hc-cnltnxxr tevens geen coryza-
verschijnselen op te wekken.

Geheel afwijkend hiervan waren de resultaten bij kip-
pen van Delaplane, Erwin en Stuart. Zij gebruikten 24
uren oude pas geïsoleerde culturen. Werden deze in een
hoeveelheid van Va cc., verdund met Vé cc. physiologische
NaCl, onder de huid van een poot ingespoten, dan ontstond
na 24 uren een zwelling op de plaats van inspuiting. De
behandelde dieren vertoonden gedurende eenige dagen de-
pressieverschijnselen en een zeker percentage was verlamd
in de ingespoten poot, doch herstelde nadien. Circa 20 da-
gen na de inspuiting kregen de dieren coryzaverschijnselen.
Ook injectie in de lel veroorzaakte een locale zwelling. Zon-
der dat verdere verschijnselen waren opgetreden ontwikkel-
de zich binnen 3 dagen coryza. Intraperitoneale inspuiting
gaf geen huidreactie, alleen ontstond daarbij coryza na ±
9 dagen.

Nu zijn deze laatste resultaten weer niet opvallend
vreemd, indien het volgende in aanmerking wordt ge-
nomen :

1.nbsp;dat de door Delaplane;, Erwin en Stuart onderzochte
ziektegevallen opvielen door een groote mortalifeit;

2.nbsp;dat ook hun bacil naast een rhinitis in de meeste ge-
vallen een zwelling van de kop en hals gaf;

3.nbsp;dat kippen, immuun voor de bacil van Nelson, slechts
gedeeltelijk immuun bleken voor de bacil van Delaplane,
terwijl omgekeerd kippen, welke immuun voor de cory-
zabacil van Delaplane waren, dit eveneens bleken te zijn
voor de bacil van Nelson.

Ook uit deze aangehaalde punten blijkt een bijzondere
virulentie en toxiciteit van de bacil van Delaplane.

Van beteekenis leek het mij van Hc de virulentieverhou-
dingen bij coryza te kennen. Door NëLSon werd reeds op
een apathogeen worden van zijn coryzabacil na kunstmatig
kweeken gewezen. Ook Delaplane; wees op een achteruit-
gang in virulentie van zijn stamculturen. Hieronder wordt
weergegeven de virulentieafname van twee i^c-stammen,
die wekelijks overgeënt werden op bloedbouillon.

Stam I : pas geïsoleerd : incubatie 1 dag ; ziekte 8-9 dagen,
na 4 weken .. : incubatie 1 dag; ziekte 3-4 dagen,
na 7 weken .. : geen ziekte.

Stam II: pas geïsoleerd : incubatie 2 dagen; ziekte 6 dagen,
na 3 weken . . : incubatie 1 dag;. . . ziekte 4 dagen,
na S weken .. : geen ziekte.

„Stam I : na 7 wekenquot; werd tevens geënt op rauwe-aard-
appelbloedbouillon en hierbij was deze cultuur wel in staat
coryza op te wekken : incubatie 1 dag ; ziekte 8 dagen.

„Stam I : na 9 wekenquot; werd geënt op: 1. bloedbouillon; 2.
rauwe-aardappelbloedbouillon; 3. rauwe-aardappelbouillon;
4. rauwe-aardappelpeptonNaCl. Met deze culturen werden
van ieder 2 kippen geënt (met de vorige slechts 1). Alleen
de versche-aardappelpeptonNaCl was pathogeen, waarbij :
kip I: incubatie 1 dag; ziekte 14 dagen,
kip II: incubatie 2 dagen; ziekte 5 dagen.
Hc bleek dus reeds spoedig avirulent te worden in bloed-
bouillon. Dit was het geval met alle stammen. Het medium
Van groei bleek tevens van invloed te zijn op de virulentie.

Na veel mislukte pogingen gelukte het PPEiFFER Hi te
kweeken op schuingestolde agar, waarop enkele druppels
steriel bloed waren aangebracht. Bij voorkeur gebruikte hij
hierbij duivenbloed, dat op de agaroppervlakte met het ent-
materiaal uitgestreken werd.

Pfeiffer en zijn medewerkers hielden aan deze kweek-
methode vast. Vele onderzoekers gingen er echter toe over
het bloed met de nog vloeibare agar te mengen. Aan deze
modificatie is in de literatuur meest de naam VoGES 1894
verbonden, hoewel dit niet geheel juist is. Reeds Borchardt
roemde, in het begin van het jaar 1894, ileze methode als
technisch eenvoudiger en met beter te beoordeelen groei.
Toch kreeg deze bloedagar volgens Borchardt reeds spoe-
dig andere media naast zich, die in sommige opzichten beter
voldeden. Voor het beoordeelen van het haemolytisch ver-
mogen van de haemophiele bacillen bleef het hèt aangewezen
medium.

Verhitting van het bloedagarmengsel werd ook reeds
vroeg toegepast. VoGES 1894 voegde agar van 100° C. bij
enkele druppels menschenbloed in een petrischaal, waarna
hij het mengsel goed schudde. In zijn tweede publicatie ge-
bruikte de Weensche onderzoeker Grassberger 1898 deze
methode. Hij nam versch bloed of gedefibrineerd bloed.
De goede groei, die hij hiermede verkreeg, schreef hij toe
aan de 100° C. heete agar.

Een langduriger verhitting van het agarbloedmengsel
werd toegepast door Cohen en Fitzgerald 1910. Ze ver-
hitten het agarbloedmengsel 3 minuten bij 80° C. in een
waterbad, waardoor het medium een chocoladebruine tint
verkreeg. Het was de eerste bijdrage voor de bereiding van
chocoladeagar.

Eerst later vond de chocoladeagar algemeen ingang in
Europa door toedoen van Hundeshagen 1918. In Amerika
werd ze toen reeds veel gebruikt.'

Van 1918 tot 1920 dateeren meerdere goede media. Bij
alle worden de bloedcellen aangetast en vernield, waardoor
de voor Hi actieve stoffen vrijkomen en in het agarmedium
beter kunnen diffundeeren.

Eevi-nthal 1918 liet het agarbloedmengsel boven de
vlam koken. Door deze intensieve inwerking van warmte
ontstonden bruine stolsels. Een helder optimaal medium
voor Hi bleef over.

Hundeshagen 1918 maakte eveneens gebruik van ver-
hitting van het agarbloedmengsel. Hij voegde bloed bij de
agar van 95-100° C. en zette daarna het agarbloedmengsel
nog eenige minuten in een waterbad van 100 C. Het me-
dium kreeg een chocoladebruine tint. Hundeshagen nam
deze chocoladeagar van de Amerikanen over in 1915 en
noemde ze ook „Amerikanische Nährbodenquot;.

Tocunaga 1919 behandelde bloed met alcali, FeEmming
met sterk zuur. Echter noch met alcali, noch met zuurbe-
handeling van bloed waren media te bereiden die speciale
aanbeveling verdienden.

Matthews 1918 was de eerste, die bloed tot een bepaal-
de graad liet verteren en het daarna met succes gebruikte
voor de bereiding van een influenzamedium. Hij Het tryp-
sine inwerken op bloed. Daar echter trypsine andere bloed-
soorten niet ver genoeg verteerde, was hij aangewezen op
menschenbloed.

Fildes 1919 maakte gebruik van pepsinevertering. Pep-
sine werkte op alle bloedsoorten. Hij liet bloed verteren door
pepsine en HCl. Dit principe was al oud en reeds door
Cantani 1901 — echter zonder succes — gebruikt. Cantani
gebruikte te weinig pepsine (Kristensen) en kreeg daar-
door slechte resultaten.

Mijn onderzoek had alleen betrekking op de meest ge-
bruikelijke influenzamedia. Deze zijn hier uitvoeriger be-
sproken.

B 1 O e d a g a r. Bloed wordt toegevoegd aan de nog juist
vloeibare agar (40° C.). Het bloedgehalte kan varieeren.

Voor het gebruik verdient het aanbeveling versch be-
reide bloedagarplaten en -buisjes 24 uren in de broedstof te
plaatsen. Hierdoor heeft men niet alleen een controle op
steriliteit, maar in die 24 uren krijgen de voor Hi actieve
stoffen tevens beter gelegenheid uit de bloedcellen in de
omgeving over te gaan. Volgens Levinthal zou op versehe
platen Hi vaak geremd worden. De bloedagarplaten worden
in die 24 uren tevens bevrijd van overtollig condensvocht,
waardoor het gemakkelijker is de culturen rein te houden'

L e V i n t h a 1 a g a r. Dit is een van de media, die als in-
fluenzamedium optimaal genoemd kunnen worden. Volgens
voorschrift van Levinthal 1921 wordt dit medium als
volgt samengesteld:

2—21/2% Agar wordt vervloeid en tot 70° C. afgekoeld in
een kolf. Hierna wordt bloed toegevoegd en het geheel goed
gemengd. Men kan zoowel bloed van mensch als van dier
nemen. Levinthae gebruikte reeds sinds jaren gedefibri-
neerd paardenbloed, dat eventueel eenige tijd in de ijskast
bewaard kon worden. Het bloedpercentage kan tusschen
bepaalde grenzen schommelen. Aanbevolen wordt 5%.

Worden slechts kleine hoeveelheden van 100-200 cc. ge-
maakt, dan kan de kolf op een gaasje boven de vlam verhit

worden. De bloedagar wordt steeds donkerder bruin, begint
dan te koken en stijgt omhoog in de hals van de kolf. Het
mengsel wordt nu vlug van de vlam afgezet en onmiddellijk
daarna onder omschudding opnieuw opgekookt. Vervolgens
wordt dit verhitte mengsel gefiltreerd door glaswol. Van
het filtraat wordt de Ph bepaald met lakmoes, waarbij een
geringe blauwkleuring gewenscht is. De agar is daarna voor
gebruik gereed. Men kan er eventueel buisjes mee vullen,
die voor het gebruik dan vervloeid worden door ze 1—2
minuten in een reeds kokend waterbad te plaatsen.

Voor grootere hoeveelheden moet men in plaats van de
vlam waterdamp van 100° C. (Koch) gebruiken, evenwel
niet langer dan 5—10 minuten al naar de hoeveelheid, die
men maken wil.

Chocoladeagar. Onder chocoladeagar kunnen ver-
schillende media schuil gaan, die alleen de kleur en de' be-
reiding onder verhitting gemeen hebben. Wisselen kunnen:
de tijd van inwerking der temperatuur, de temperatuurs-
graad en het bloedpercentage. Chocoladeagar dient daarom
steeds nader te worden aangeduid. Hundeshagenagar moet
eenige minuten in een waterbad van 100° C. verhit worden.
E^r ontstaat dan een optimaal medium.

Een voordeel van de Levinthalagar boven de Hundesha-
genagar is zijn doorschijnendheid. Als nadeelen van de ge-
filtreerde Levinthalagar ten opzichte van Hundeshagenagar
en ten opzichte van ongefiltreerde Levinthalagar worden

a- de kortere levensduur van Hi hierop. HundijshagiJn ge-
lukte het vaak niet meer 3 dagen oude culturen op gefil-
treerde Levinthalagar over te enten,
het groote materiaalverlies bij filtreeren.

Voor het voortkweeken van Hi in reincultuur, waarbij de
doorschijnendheid van weinig beteekenis is, geeft Hundës-
Hagen de voorkeur aan een medium, dat de bloedbestand-
deelen in zijn geheel bevat.

Een karakteristiek verschil tusschen Levinthal- en choco-
ladeagar in het algemeen is, dat bij de eerste een intensievere
mwerkmg van warmte heeft plaats gehad.

Ter conserveering wordt 0,25% chloroform toegevoegd.
Voor het gebruik worden met een steriele pipet hoeveelheden
van 2—5% bij vloeibare agar gedaan. Het is daarbij niet
noodig de chloroform te verwijderen.

Fildesagar werd veel gebruikt door Kristensen en in
zijn standaardwerk (1922) aanbevolen voor het aanhouden
van reinculturen. Ze gaf een goede groei van Hi. Voor de
grootst mogelijke massacultuur zou een verhit agarbloed-
mengsel misschien beter zijn.

Fildesagar is iets donkerder van kleur dan Levinthalagar
doch eveneens helder.nbsp;'

Voor het isoleeren van Hc werd regelmatig de volgende
methodiek aangewend. Een weinig materiaal (zie hier-
onder) werd gebracht op een chocoladeagarplaat en zig-zag
hierop uitgestreken met een steriele spatel van Drigalsky.
Hierbij werd er voor gezorgd, dat niet tweemaal dezelfde
plaats van het medium bestreken werd. Op dezelfde manier
werden twee verdunningsplaten geënt. Na 24 uren bebroe-
den van de geënte platen (afgesloten in Weckflesschen) bij
37° C. werd hiervan de geschiktste plaat uitgezocht voor het
overenten van typische glasheldere //c-koloniën. Dit over-
enten was eenvoudig te doen met een scherpe entnaald onder
een binoculair microscoop.

Indien geënt werd met materiaal, afkomstig van jonge
coryzagevallen, was deze regelmaat ternauwernood ver-
eischt, daar, vooral op de verdunningsplaten daarbij, vaak
al een bijna reincultuur van Hc aanwezig was. Anders was
dat met materiaal van oudere coryzagevallen en in vele ge-
vallen ook met materiaal van spontane coryzagevallen, in
hetwelk in verhouding tot andere bacteriën maar weinig
^c-bacteriën bleken voor te komen. Op platen hiermede
geënt waren na 24 uren zig-zag-banden van een mengsel
van bacteriënkoloniën gegroeid. Op de bijbehoorende ver-
dunningsplaten bleken deze banden veel dunner bezet met
koloniën, hetgeen ook afhankelijk was van de hoeveelheid
opgebracht materiaal. Platen, die dun bezet waren met
koloniën, vertoonden meestal geen Hc-koloniën en kwamen
daardoor niet in aanmerking om ervan over te enten. Op
platen met goed begroeide banden, met toch nog afzonder-
lijke koloniën, boden juist de open plekken tusschen de zig-
zag-banden mooie gelegenheid om Hc in reincultuur over
te brengen. Het was als het ware of in de banden Hc-kolo-
nién overwoekerd werden, terwijl zij aan de randen onbe-
lemmerd en geïsoleerd opdoken. Aan de ruimten tusschen
de banden werd daarom steeds bijzondere aandacht besteed.

De uitgezochte koloniën werden overgebracht in bloed-
bouillon. Vervolgens werd nagegaan of de aldus verkregen
culturen Hc-stammen waren. Hiertoe werden ze intranasaal
ingedruppeld bij kippen. Alleen culturen, die coryza veroor-
zaakten, werden als Jfc-stammen aangehouden. Toen bleek,
dat alle coryza veroorzakende stammen in bloedbouillon
karakteristieke cultureele eigenschappen hadden (zie
„Bloedbouillonquot;), waren deze reeds hierdoor met vrij groote
zekerheid te onderkennen. Toch werd het pathogeniteits-
onderzoek bij de kip ook nu niet nagelaten.

Keuze van materiaal. Overeenkomstig de metho-
de van de Blieck werden, vooral bij oude gevallen en bij
spontane gevallen van coryza, zoo steriel mogelijk stukjes
slijmvlies en slijm, uit neus en infraorbitale ruimten van de
meest aangetaste zijde van de kop, genomen. Deze deelen
werden met een weinig physiologische NaCl goed fijnge-
wreven in een steriele mortier. Een druppel hiervan werd
op een plaat gebracht.

Was er bezwaar, dat een kip werd opgeofferd, dan werd
uit de neus gedrukt materiaal voor het isoleeren gebruikt.
Hiertoe werd vooraf de neus gereinigd van vuil.

Met materiaal, gewonnen volgens eerstgenoemde metho-
de, werden de beste resultaten bereikt. Goed fijn wrijven
van het slijmvlies was hierbij gewenscht. Misschien komen
hierdoor Hc-bacillen vrij en wordt het gehalte daarvan
dientengevolge verhoogd.

Desalniettemin gelukte het mij ook in den regel uit mate-
riaal, verkregen volgens de laatste methode, Hc te isoleeren.
Op de met zulk materiaal geënte platen waren evenwel
andere koloniën in grooter getal aanwezig. Soms was
slechts van enkele koloniën over te enten.

Slijm, gewonnen met een entnaald door de geopende bek,
via de gehenieltespleet, bleek weinig geschikt. Hoewel dit
slijm gemakkelijk bij een levende kip verkregen werd en er
ook niet teveel bacteriën in voorkwamen van andere soort.

ontwikkelden zich uit de overgeënte glasheldere koloniën
vaak haemophiele stammen met van Hc afwijkende eigen-
schappen, waarmede ook geen coryzaverschijnselen waren
op te wekken. Mogelijk was het voorkomen van dergelijke
afwijkende stammen toe te schrijven aan de methode van
materiaalwinning via de keel. In de keel treft men immers
ook bij de mensch dikwijls veel haemophiele bacillen aan.

Methode van Delaplane. Bij dieren met oede-
mateuze zwellingen aan de kop, kon Delaplane; zijn cory-
zabacil uit het oedeemvocht in reincultuur isoleeren. Nu
traden, zooals reeds gezegd werd, bij de door Delaplane
onderzochte ziektegevallen in den regel zwellingen op en
kreeg deze bevinding daarom voor hem beteekenis voor het
regelmatig isoleeren van zijn bacillen. Later bleek hem nog,
dat hij de eerste 24 uren nadat de zwellingen ontstaan
waren, moest benutten, daar later het isoleeren van zijn
coryzabacil steeds minder vaak gelukte.

Daar bij mijn gevallen sporadisch zwellingen optraden,
konden in totaal slechts enkele oedeemvochten onderzocht
worden. In één geval werden de zwellingen aangetroffen bij
een spontaan coryzageval. Hierbij, evenals bij een kunst-
matige infectie, waarbij de zwellingen 48 uren aanwezig
waren, kon Hc niet uit het oedeemvocht geïsoleerd worden.
Wel gelukte het Hc uit het oedeemvocht te isoleeren bij een
cultuurcoryzageval met zeer op de voorgrond tredende
zwellingen, die 24 uren aanwezig waren. Enkele ösen
oedeemvocht, steriel gewonnen, werden bij mijn onderzoek
in bloedbouillon gebracht. Tevens werden met oedeemvocht
chocoladeagarplaten geënt. Op chocoladeagarplaten, geënt
met oedeemvocht van het laatste geval, ontwikkelde zich een
reincultuur van Hc.

De methode van Delaplane zou slechts gebruikt kunnen
worden voor genoemde specifieke gevallen en dan nog
alleen, indien de zwellingen niet ouder dan 24 uren zijn.
Tevens bleek mij, dat deze methode moeilijk van toepassing-

kon zijn bij een levend dier. Ook bij deze specifieke gevallen
lijkt mij daarom de beschreven plaatmethode meer geschikt.

Ik wil er hier nog op wijzen, dat alleen materiaal, afkom-
stig van coryzagevallen met korte incubatie, te gebruiken is
om Hc te isoleeren. (Zie verder blz. 97).

De bedoeling was in de eerste plaats een goed medium
voor het kweeken van Hc te vinden. Hiertoe werden ver-
schillende proeven genomen.

De BliEck gebruikte voor het isoleeren en kweeken van
Hc 25% bloedagar en 25% chocoladeagar. De chocoladeagar
werd 10 minuten op 65° C. verhit in een waterbad. Steeds
werd gedefibrineerd paardenbloed gebruikt. Beide media
werden onderzocht.

De chocoladeagar gaf betere groei van Hc dan de bloed-
agar. Chocoladeagar gaf in den regel goede groei, die echter
niet steeds constant was. Soms was de groei veel minder
goed en waren de koloniën niet grooter dan speldepunten.
Bij goede groei waren de koloniën ruim V2 millimeter groot.
Op bloedagar was de groei vaak niet meer dan juist zicht-
baar. In de buurt van satellieten ontwikkelden zich in sterke
mate reuzenkoloniën. Zoowel op chocoladeagar als op bloed-
agar waren de koloniën steeds glashelder.

Evenals voor Hi was dus de groei van Hc op chocolade-
agar veel beter. Voor Hi was daarvan de oorzaak, dat groei-
bevorderende stoffen uit de bloedcellen door het medium
verspreid waren en in nauw contact konden treden met de
bacillen. Daarbij werden nog eventueele groeibelemmerende
stoffen door de verhitting vernietigd. Bij bloedagar viel
steeds de aanwezigheid van een dun licht-gekleurd laagje
aan de oppervlakte op, waardoor het contact van Hi met de
bloedcellen bijna geheel uitgesloten moest zijn en de bron
van levensnoodzakelijke stoffen voor Hi hoofdzakelijk
moest ontstaan door het dif fundeeren van deze uit de bloed-

cellen. Uit latere proeven werd duidelijk, dat de betere groei
van Hc op chocoladeagar eveneens toegeschreven moest
worden aan het betere contact met noodzakelijke bloedcel-
bestanddeelen.

Nelson 1933 verkreeg voor de door hem geïsoleerde
coryzabacil veel betere groei in afgesloten petrischalen. Hij
plaatste de geënte petrischalen zonder deksel op platen klei,
waarop een steriel papier was aangebracht. Onderzocht
werd, of door afsluiting ook betere groei van Hc te ver-
krijgen was.

Geënte petrischalen met chocoladeagar, zonder deksel,
werden op steriele glasplaten geplaatst, waarna afsluiting
volgde met boetseerklei. Ter vergelijking werden eveneens
geënte open chocoladeagarplaten in de broedstoof gezet. Het
bleek, dat de gewijzigde methode Nelson goed was. In de
gesloten platen waren de koloniën aanmerkelijk grooter dan
in de open platen en de groei was steeds constant goed. Ze
verkregen in de gesloten platen een grootte van ruim 1
niillimeter. Bij de grootste koloniën was soms in het centrum
een geringe witte troebeling opgetreden.

Getracht werd uit dit principe van afsluiting een prac-
tische methode op te bouwen voor het kweeken van Hc. De
methode Nelson moest als weinig practisch zoo gauw moge-
lijk vervangen worden, temeer daar het moeilijk was op die
manier de culturen rein te houden. Een practische methode,
gebaseerd op het principe Nelson, werd gevonden door
toepassing van Weckflesschen. Gebruikt werden Weckfles-
schen, die voldoende ruim waren om 6 petrischalen te kun-
nen herbergen en voorts goed afgesloten konden worden
met gummiring, deksel en beugel. Hierin werden geënte
petrischalen omgekeerd geplaatst.

Bij vergelijkende proeven tusschen open platen, platen
die afgesloten werden volgens gewijzigd Nelson en platen

die in Weckflesschen werden afgesloten, was de groei in
beide laatste groepen evengoed, terwijl open platen kleinere
koloniën vertoonden.

Door de goede resultaten en de eenvoudige toepassing
werd deze Weckafsluiting in volgende proeven steeds toe-
gepast. Ook voor het isoleeren van Hc beteekende deze me-
thode een vooruitgang.

De oorzaken van deze betere groei onder afsluiting bleven
onbekend. Mogelijk spelen CO2 en vochtigheidsgraad hierbij
een rol.

DeIvAPlane wees op de betere groei van zijn Haemophilus
gallinarum in een „vochtige kamerquot;. Schalm en Beach ver-
kregen betere groei in een atmosfeer, die 10% CO2 bevatte.
Duidelijk werd echter niet of hun toevoegingen van vocht
en CO2 noodig waren.

Zooals reeds gezegd werd, kan de samenstelling van
chocoladeagar verschillen. De vraag was daarom, welke
chocoladeagar het meest geschikt was voor het kweeken van
Hc. Hiertoe werden verschillende proeven genomen.

Uitgegaan werd van chocoladeagar van de Blieck, waar-
bij één van de factoren — 1. tijd van inwerking van tempe-
ratuur (temperatuurstijd), 2. temperatuursgraad en 3.
bloedpercentage — systematisch veranderd werd.

Proef 1. Verschillende hoeveelheden chocoladeagar
werden bereid met temperatuursgraad 65quot; C. en bloedpercen-
tage 25 als constanten, temperatuurstijd als veranderlijke
component. De temperatuurstijd van de verschillende hoe-
veelheden was respectievelijk 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
en 30 minuten. De verhitting van de chocoladeagar vond
plaats in een waterbad van 65° C. Van iedere hoeveelheid
werden 100 cc. gemaakt, uitgegoten tot 6 platen. De groei
na 24 uren bebroeden werd vergeleken.

gelijkmatige groei van Hc. De groei op 7 en 8 minuten was
slechter. Door het optreden van veel stolsels kwam de hoe-
veelheid van 30 minuten niet als medium in aanmerking en
kon verder buiten beschouwing gelaten worden. Waar-
schijnlijk was de groote hoeveelheid stolsels veroorzaakt
door het groote percentage bloed. Chocoladeagar 5% bloed
30 minuten gaf een goed medium, echter met onvoldoende
groei.

De keuze van de beste chocoladeagar lag dus tusschen 9
en 15 minuten. Hierbij gaf 9 tot 10 minuten een gelijkmatig
bruin medium, 11 minuten en hooger een ongelijkmatig
grauw gekleurd medium (stolsels), 7 en 8 minuten een rood
tot roodbruin gekleurd medium.

De kortste tijd van verhitting — noodig voor een goede
groei van Hc — voor 25% chocoladeagar 65° C. was dus
9—10 minuten. Hierbij werd een gelijkmatig bruin ge-
kleurd medium verkregen. Een hoogere temperatuur kon
die groei niet verbeteren.

Na eenige ervaring was bijna met zekerheid na het be-
oordeelen van chocoladeagarplaten of -buisjes te zeggen of
de 25% chocoladeagar 65° C. te kort of te lang verhit was.
Bij te korte verhitting was het medium te rood, terwijl te
lange verhitting een ongelijkmatig grauw medium gaf.

Proef II. Opzet geheel als bovenstaande. Tempera-
tuurstijd 10 minuten en bloedpercentage 25, constanten;
temperatuursgraad, wisselende component. De temperatuur
van de verschillende hoeveelheden was: 55°, 60°, 65°, 70°,
75°, 80°, 85°, 90°, 95° en 100° C.

Bij verhitting op 80° en hooger werd het uitgieten be-
moeilijkt door het spoedig optreden van stolsels. De groei
bij verhitting op 65°, 70° en 75° was goed en gelijkmatig;
bij verhitting op 55°, 60°, 80° en hooger was de groei min-
der goed. Van 65°, 70° en 75° gaf alleen 65° een gelijkmatig
bruin medium, terwijl 70° en 75° een ongelijkmatig grauw
medium te zien gaven.

De temperatuur 65° C. van chocoladeagar met 25% bloed,
10 minuten verhitting, was dus de eenigste temperatuur die
met goede groei van Hc een gelijkmatig gekleurd medium
gaf. Reeds een temperatuur van 67° C. bleek een minder ge-
lijkmatig gekleurd medium te geven.

Door het veranderen van een der factoren temperatuurs-
tijd of temperatuursgraad was de chocoladeagar van de
Blieck dus niet te verbeteren als medium voor Hc.

Proef III. Temperatuursgraad 65° C. en tempera-
tuurstijd 10 minuten, constanten; bloedpercentage variee-
rend. Hoeveelheden met 5, 25, SSVs en 40% bloed. Percen-
tage berekend in volumeprocenten, waarbij het agargehalte
werd beschouwd als van geen beteekenis te zijn, daar steeds
werd uitgegaan van 200 cc. 2% agar.

Op 25% was de groei goed, op 33V3% was ze nog iets
beter, op 40% als op 33 V3%, op 5% minder goed dan op 25%.

Door het bloedpercentage van 25 op 33V3 te brengen kon
de chocoladeagar van de Blieck dus nog een geringe verbe-
tering ondergaan als medium voor Hc.

De bij bovenstaande proeven verkregen resultaten waren
aanleiding om de bereiding van chocoladeagar voor Hc als
volgt te doen geschieden:

Bij 200 cc. 2% agar — hoeveelheden, die in kolven in
voorraad werden gehouden — vloeibaar gemaakt en afge-
koeld tot 65° C., werden gevoegd 100 cc. voorverwarmd ge-
defibrineerd paardenbloed. Na voorzichtig mengen der be-
standdeelen werden deze 10 minuten verhit in een waterbad
van 65° C. onder langzaam wentelen (voorkomen van
schuim) van de kolf. Daarna was de massa voor gebruik ge-
reed. Gedefibrineerd paardenbloed werd in hoeveelheden
van 100 cc. in steriele fleschjes bewaard in de ijskast. Na
één maand bewaren was het nog goed te gebruiken.

7. GROEI VAN HABMOPHYLUS CORYZAE EN HAEMOPHILUS
INFLUENZAE OP DE MEEST GEBRUIKELIJKE INFLUENZAMEDIA.

Een vergelijkend onderzoek werd ingesteld tusschen de
groei van Hi en Hc op influenzamedia. Het was de vraag,
hoe de groei van Hc op de verschillende media zou zijn. De
resultaten van dit onderzoek werden vastgelegd in onder-
staande tabel.

1) Levinthalagar 25% was niet meer te gebruiken door de vele stolsels.
Het aantal kruisjes geeft de mate van groei aan, waarbij voor Hi en Hc een
eigen maatstaf werd aangelegd. -|—|—\-Hi beteekent een weelderiger groei en
grootere koloniën dan -)—|—

De bereiding der media was geheel volgens de op blz. 18
aangegeven methodes. Fildes pectic digest werd 6 uren bij
55° C. in een zelf regelend waterbad verhit. Chocoladeagar
was 10 minuten verhit op 65° C. De geheele proef werd
gelijktijdig genomen.
Uit deze proef bleek:

dat Hc beter groeide op 25% chocoladeagar dan op 5%
chocoladeagar. Hi kon reeds op 5% chocoladeagar zijn
optimale groei ontwikkelen.

dat chocoladeagar, Levinthalagar en Fildesagar, zoowel
5 als 25%, een optimale groei van Hi gaven. Opvallend
was daarentegen het uitblijven van de groei van Hc op
Levinthal- en Fildesagar. Om zeker te zijn, dat dit
een constant verschijnsel was, werden meermalen an-
dere hoeveelheden Levinthal- en Fildesagar onderzocht.

Er was dus een karakteristiek verschil tusschen de groei
van Hi en Hc op influenzamedia. Als oorzaak daarvan moet
worden gewezen op de behoefte van Hc aan een zeer ther-
molabiele substantie, zooals nog zal blijken.

Terwijl Hi in vloeibare media met voldoende X- en V
factor goed — en steeds in dezelfde vorm — groeit en de
bereiding van deze vloeibare media, met inachtneming van
de aanwezigheid van bestanddeelen met voldoende X- en V
factor, geen bijzondere eischen stelt, was voor Hc een nader
onderzoek noodig. Een goed vloeibaar medium moest van
beteekenis geacht worden voor het aanhouden van Hc-
culturen.

Achtereenvolgens zullen enkele onderzochte vloeibare
media voor Hc besproken worden.

1. vloeibare media met bloed,
a. Bloedbouillon. Bouillon, waaraan 10% gedefi-
brineerd paardenbloed werd toegevoegd. Zoowel Liebig- als
vleeschextractbouillon werden gebruikt. Toen echter bleek,
dat Hc geen voorkeur had voor een van beide, werd Liebig-
bouillon in verband met het prijsverschil meer gebruikt. Het
bloed werd bij de bouillonbuisjes gedaan met een steriele
pipet. Als de bloedcellen bezonken waren, was in de bloed-
bouillonbuisjes de bovenstaande vloeistof geheel helder. Ter
controle op steriliteit werden de buisjes 24—48 uren in de
broedstoof geplaatst, waarna de bouillon volkomen helder
moest blijven.

De groei van Hc in bloedbouillon was karakteris-
tiek. Hij beperkte zich tot de naar de bodem gezakte bloed-
cellen. De bovenstaande bouillon bleef — tenminste de

eerste tijd, later was dit door haemolyse minder goed te be-
oordeelen — volkomen helder. In microscopische
preparaten, gemaakt uit het bloed, was steeds slechts een
matige hoeveelheid bacillen aanwezig. Deze
bacillen waren polymorph en lagen vaak twee aan twee ach-
ter elkaar of in korte ketens. Lange ketens kwamen zelden
voor. Preparaten van de bovenstaande bouillon vertoonden
slechts hier en daar een verdwaalde bacil.

Een nadeel bij het regelmatig gebruik van bloedbouillon
was, dat de groei van Hc in dit medium, door het helder
blijven van de bouillon, alleen kon worden vastgesteld door
het maken van een microscopisch preparaat. Een voordeel
bij dat gebruik was, dat verontreinigingen, niet alleen van
ongeënte, maar ook van met Hc geënte bloedbouillon, zich
openbaarden door het troebel worden van de bouillon. De
matige bacillenrijkdom bleek geen bezwaar om dit medium
voor het aanhouden van Hc te gebruiken. Door zijn eenvou-
dige bereiding — in vergelijking tot de andere — had dit
medium de voorkeur. Door mij werd bloedbouillon daarom
regelmatig gebruikt voor het aanhouden van Hc en tevens
veel toegepast voor andere doeleinden.

b.nbsp;A g a r-b 1 O e d. Hiermee werd bedoeld een vloeibaar-
vast medium, bestaande uit buisjes schuingestolde agar,
waaraan op de oppervlakte met een steriele pipet V2 cc. bloed
was toegevoegd. Shopë gebruikte dit medium bij voorkeur
voor zijn Haemophilus influenzae suis.

Ook Hc groeide in dit medium. Het bloed aan de basis
van de agar vertoonde een grootere bacillenrijkdom dan het
bloed van bloedbouillon. Een nadeel was, dat noch de groei,
noch de reinheid van dit medium eenvoudig gecontroleerd
kon worden. Voor het aanhouden van Hc-stammen ver-
diende bloedbouillon daarom de voorkeur.

c.nbsp;Lever bloedbouillon. Leverbouillon van Ta-
rotzy, waaran 10% bloed werd toegevoegd.

Aqua communis 100, Liebig's vleeschextract 1, Pepton
(Witte) 1, NaCl V2, Runderlever 10. Voor het toevoegen
der runderlever moet de Ph op 7,6 gebracht worden. Het
geheel wordt 15—30 minuten verhit op 100° C., daarna ge-
filtreerd. De lever wordt nu in stukjes van 3—4 gr. bij 10 cc.
filtraat in buisjes gedaan. De buisjes worden gedurende V2
uur op 110° C. gehouden.

Dit medium werd hier vermeld om zijn bijzondere vorm
van groei voor Hc. Hc groeide in dit medium uitsluitend
in lange ketens of draden in matige hoeveelheid. Dit ver-
schijnsel was steeds constant.

2. vloeibare media met aardappel.
a. Het winnen van steriele stukjes aard-
appel. ThjöTTa en AvEry gaven de volgende methode
aan:

Gladde aardappels werden gewasschen en gedroogd. Met
een steriel mes werd er een manchet afgeschild, waardoor
een circulaire gladde vlakte ontstond. Deze vlakte werd ge-
brand met een gloei-ijzer. Daarna werden de aardappels
gekliefd door de gebrande vlakte en steriele stukjes werden
uit de sneevlakte gesneden. Deze stukjes werden in steriele
petrischalen gedaan en op gewenschte grootte gebracht.

De bezwaren van deze methode waren, dat niet mooie
uniforme stukjes verkregen werden en dat het nog niet zoo
eenvoudig was op deze manier steriel te werken. Een tame-
lijk groot percentage verontreinigingen kwam voor.

Een betere methode werd gezocht en gevonden. Liefst
groote aardappels werden gewasschen en gedroogd. Beide
polen werden in de vlam geschroeid. Met een in de vlam ge-
steriliseerd mes werden van beide polen kapjes afgesneden.
Daarna werden met een van te voren gesteriliseerde cylin-
derboor, doorsnede 1 cm., uit de geschroeide aardappels

steriele cylinders geboord. Deze aardappelcylinders werden
langzaam, met een eveneens van te voren gesteriliseerde
staaf — of met een in de vlam uitgegloeide staaf — uit de
cylinderboor geschoven. Een helper sneed met een steriel
mes stukjes van V2 cm. af, die dadelijk in de diverse media
gedeponeerd werden.

Met deze methode werden mooie uniforme aardappel-
cylinders verkregen van 1 cm. doorsnede en V2 cm. lengte.
Verontreinigingen, door niet steriel werken, behoorden tot
de uitzonderingen. Deze methode leek zeer ingewikkeld,
doch bleek practisch goed uitvoerbaar en voldeed best.

b.nbsp;Rauwe-aardappelbouillon. Buisjes bouillon
met steriele aardappelcylinders. Na 24 uren controle in de
broedstoof was de bouillon bijna zonder uitzondering helder.

Hc veroorzaakte een lichte troebeling in dit medium.
Microscopisch waren vele bacillen aanwezig, die vaak iets
fijner van vorm waren dan in bloedbouillon. Ketens en dra-
den kwamen weinig voor.

c.nbsp;Rauwe-aardappelpeptonNaCl. 1% Pepton
(Witte), y2.% NaCl, aardappelcylinder.

Hc veroorzaakte in dit medium een niet duidelijk zicht-
bare troebeling. Microscopisch werden matig bacillen aan-
getroffen. Toch was Hc in passage voort te kweeken. Na 3
overentingen waren kippen met een dergelijke cultuur te
infecteeren.

d.nbsp;Rauwe-aardappelbouillon. Bloedbouillon,
waaraan aardappelcylinders werden toegevoegd.

Hierin groeide Hc zeer weelderig. Opvallend was het
groot aantal ketens en draden, dat in het meerendeel der
gevallen overwegend was (zie foto).

Werd in plaats van rauwe aardappel, verhitte aardappel
(100° C., y2 uur) toegevoegd, dan ontstond een weelderige
groei ; de bacillen waren echter vaak iets plomper.

L e V i n t h a 1 b O u i 11 on. 10% Bloedbouillon, geduren-
de 5 minuten gekookt, gefiltreerd door filtreerpapier en
daarna door Berkefeld N.

Om de optimum Ph te bepalen van media voor Hc
werd een systematisch onderzoek ingesteld. Voor Hi was de
beste Ph 7,3—7,5 (Winscheeiv en Stielman 1919, Bell
1920, Knorr 1925 e.a.). De vraag was tevens of met een
Ph-verandering van het medium een vormverandering van

: matig bacillen per gezichtsveld.
: weinig bacillen per gezichtsveld.
; enkele bacillen per gezichtsveld.
: geen bacillen per gezichtsveld.

Hc samenging. Reëd en Orr 1923 verkregen bij een Ph 7,4
steeds een regelmatige vorm van Hi, terwijl bij afwijkende
reactie, zoowel in zure als in alcalische richting, zich mor-
phologische variaties voordeden, als lange draden, gezwol-
len en onregelmatige vormen.

De Ph werd bepaald in de bovenstaande vloeistof van
bloedbouillon, gereed voor gebruik, met de comparator van
Walpole-Michaelis. Dagehjks werden de geënte media
microscopisch onderzocht, waarbij gelet werd op het aantal
en de vorm van de bacillen. Na 3 dagen bebroeden werd
weer de Ph in de bloedbouillon bepaald.

1.nbsp;dat de snelste vermeerdering van Hc plaats had in bloed-
bouillon van Ph 7,4;

2.nbsp;dat over een gebied van Ph 7,0 tot 7,8 de maximum
groei bereikt werd na drie dagen;

Het optimum van groei voor Hc werd dus verkregen bij
de Ph 7,4. Tevens bleek Hc over een uitgebreid Ph-gebied
tot vermeerdering in staat. Vormvariaties als aangegeven
werden door Ree;d en Orr bij Hi werden niet waarge-
nomen.

Bij de ontdekking- van Hi in 1892 verkreeg PeeiFPER
alleen in de eerste generatie groei op 1^2% suikeragar.
Kweeken in passage was op dit medium onmogelijk. PeeiF-
eer veronderstelde, dat stoffen uit het op de agar gebrachte
materiaal — bestaande uit sputum of longetter — voor de
groei van Hi noodzakelijk waren. Een jaar later, in 1893,
gelukte het Peeifeer Hi in passage voort te kweeken op
schuingestolde agar met op de oppervlakte een druppel ste-
riel menschenbloed. Hij stelde vast, dat haemoglobine ver-
moedelijk het werkzame bestanddeel was, door gebruik te
maken van een bijna zuivere oplossing van haemoglobine in
aqua destillata met 0,6% NaCl. Deze oplossing werd verkre-
gen door bevriezen en ontdooien of door schudden van
roode bloedcellen in aqua destillata met aether, waarna de
gehaemolyseerde roode bloedcellen werden gefiltreerd om
het stroma terug te houden.

Grassberger 1897 verkreeg het eerst „Riesenwachstumquot;
van Hi rondom Staphylococcus aureus en albus. Er ontstond
een zóne van „Riesenkolonienquot; rondom de genoemde sta-
phylococcen op vast bloedmedium. Hetzelfde nam MeuniER
1898 waar en noemde het „Satellitisme culturelquot;. Grass-
berger en Meunier verklaarden deze „symbiosequot; door aan
te nemen, dat er een omzetting van de bloedkleurstof plaats
vond, bewerkt door bacteriënproducten, waarna deze kleur-
stof beter geassimileerd kon worden door Hi.

Volgens GehlEn 1923 gaven, behoudens enkele uitzon-
deringen {Bac. pyocyaneus en Bac. subtilis, Wolf), waar-

schijnlijk alle pathogene en niet pathogene microörganismen
„Riesenwachstumquot;; //z-zelf echter niet.

Volgens een tweede publicatie 1898 verkreeg Grassber-
ge;r op haematineagar met staphylococcen reuzenkoloniën.
Haematineagar alleen was niet voldoende voor de groei van
Hi (Ghon en v. Prëys 1902).

De groeibevorderende bacteriën werden na het uitstrijken
van Hi puntvormig uitgezet. Allen 1910 mengde deze in
geschikte hoeveelheid met het vloeibare agarmedium; Hi
werd op het medium uitgestreken.

Cantani, Ghon en v. Preys (1900, 1902) vonden, dat
gal van sommige personen zich gedroeg als haematine. Gal-
pigment en galzure zouten gaven geen groei van Hi. Daar
gal van verschillende personen varieerde in ijzergehalte,
dachten zij, dat dit gehalte de oorzaak van het verschillend
gedrag was.

Ghon en v. Preys stelden tevens vast, dat bloed respec-
tievelijk haemoglobine alleen toegevoegd aan een water-
agar, niet voldoende was voor Hi, maar dat nog een be-
standdeel van bouillon of melk mede noodig was (LueRSSEn
1903, Thalamer 1914, Davis 1917, Olsen 1920, Fildes
1921, Kollath 1924, Knorr 1924).

Cantani 1900 en NeiSSEr 1903 kweekten Hi op bloed-
vrije agar bij aanwezigheid van zgn. „Ammenkolonienquot;
(Neisser), b.v. Bac. xerosis of staphylococcen. Hi werd
niet Bac. xerosis gemengd en op agar uitgestreken. Groei
ontstond in mengkoloniën, die tot 20 generaties voortge-
kweekt werden. Ghon en v. Preys, Putnam en Gay her-
haalden deze onderzoekingen en konden ze maar gedeelte-
lijk bevestigen. Ghon en v. Preys verkregen met stammen,
die hen toegezonden waren door Cantani, zoo nu en dan
deze groei in mengkoloniën. Ze vonden tevens, dat bestrij-
ken van de agar met cyaanijzer deze groei begunstigde. De
groei van Hi beperkte zich tot en in de onmiddellijke om-
gevmg van de „Ammenkolonienquot;. Een verklaring van de

„Ammenwachstumquot; werd gegeven door KolIvATh 1925, die
tevens de begrippen „Riesenwachstumquot; en „Ammenwachs-
tumquot; precies definieerde. (Zie pag. 43).

LuERSSEn 1903—1904 verkreeg groei van Hi op agar
met bijmenging van gedoode Bac. prodigiosis-cnltnrtn. Bac.
prodigiosis kon ijzer opnemen, maar dit was niet levens-
noodzakelijk. Volgens hem werden de groeibevorderende
stoffen voor Hi in de prodigiosis-lichamen gevormd, om
eerst na de dood in de omgeving te diffundeeren.

Davis 1917 was de eerste die aantoonde, dat Hi voor
zijn groei 2 gescheiden substanties — factoren — noodig
had, de een aanwezig in haemoglobine of daarvan afgeleid,
de andere aanwezig in de weefsels van verschillende planten
en dieren. Laatstbedoelde substantie kon gevormd worden
door de meeste bacteriënsoorten, behalve door Hi. Ze ver-
toonde overeenkomst met een vitamine. Het phenomeen van
Grassberger zou ontstaan door diffundeeren van de vita-
mineachtige stof — die de omringende bacterie vormde —
in haar omgeving, waar deze stof de groei van Hi zou sti-
muleeren. Hierbij werd dus niet meer in de eerste plaats
gedacht aan een inwerking van bacteriënproducten op de
bloedkleurstof (Grassberger, Meunier).

De vitamineachtige stof was betrekkelijk thermolabiel;
30 minuten 120° C. inactiveerde haar. Ze passeerde Berke-
feld. (Davis 1921).

Agulhon en Legroux 1918 wezen op een „substance ac-
tivequot; voor Hi in waterige of alcoholische extracten van
roode bloedcellen. Aguehon en Mesnard 1920 kenden aan
de „substance activequot; geen voedende waarde als zoodanig
toe. Ze vonden de substantie ook in geautolyseerde organen.
Een scheiding in tweeën werd niet gemaakt en ze spraken
van „hormones croissancequot; (groeihormonen).

Olsen 1920 toonde aan, dat Hi zonder symbiose groeide
bij aanwezigheid van haemoglobine, methaemoglobine en
CO-haemoglobine. Bij aanwezigheid van haematine en hae-

mine, die beide eiwitvrij en ijzerhoudend zijn, werd groei van
Hi alleen waargenomen in symbiose met andere bacteriën.
IJzervrije haematoporphyrine gaf met en zonder symbiose
geen groei. Hetzelfde gold voor haemocyanine, een koper-
in plaats van ijzerhoudend bloedpigment van lagere dieren
{Crustaceae), verder ook voor bilirubine, chlorophyl en
pyrrol. Olsen constateerde een hand in hand gaan van gua-
jac-hars-reactie en thermostabiele groeifactor van Hi. Hij
vermoedde tenslotte, evenals PfeiPPER, in de ijzerhoudende
component van haemoglobine en derivaten het werkzame
agens en dacht daarbij aan de werking van oxydasen of
katalytische werkingen met specifieke natuur van andere
soort. De globinefractie van haemoglobine zou overeenko-
men met de vitamineachtige substantie (Davis) en zou de
reuzenkoloniën geven.

Olsen toonde dus het belang aan van de ijzerhoudende
component in haemoglobine en derivaten voor Hi. Tevens
maakte hij voor het eerst gebruik van de guajac-hars-reactie
en deed daardoor een katalytische functie van het ijzer ver-
moeden.

Tokunaga 1920 schreef de groeibevorderende eigen-
schappen van bloed toe aan de globinefractie van haemo-
globine. In het licht van de nieuwere opvattingen omtrent
groeifactoren moeten deze onderzoekingen echter anders
worden uitgelegd.

Thjötta 1921 kon met slijmvormende bacteriën — Bact.
friedlander, Bac. osaena — in bouillon Hi in een bepaald
aantal generaties voortkweeken. 1 Uur 70° C. verhitting van
deze bacteriën verhinderde hun groeibevorderende werking
niet. Kookextracten — door centrifugeeren van bacteriën-
lichamen bevrijd — waren ook werkzaam. De groeibevor-
derende stoffen diffundeerden dus uit de bacteriënlichamen.
Ook proteus-txtractamp;n waren werkzaam, de kapselbacteriën
gaven echter betere groei. Daar door het werk van ToEniES-
SEN bekend was, dat de kapsels rijk waren aan een polysac-

charide nl. galacton, werden aan proteus-^^irzoXtn verschil-
lende suikeroplossingen toegevoegd en hiermee werd goede
groei van Hi verkregen. Dextrose werd hierbij rood, de
andere suikers bleven onveranderd. De bacteriënextracten
passeerden Berkefeld N, zonder hun werkzaamheid te ver-
liezen.

Thjötta en Av^ry 1921 publiceerden systematische on-
derzoekingen over de groeifactoren van Hi. De tweeledig-
heid der groeifactoren, waarop Davis reeds wees, werd
onomstootelijk aangetoond.

Begrip X- en V factor. In bouillon, waaraan
gistextract werd toegevoegd, geënt met een inoculum van
cultuur in vloeibaar bloedmedium, groeide Hi. Kweeken in
passage was in dit gistextract-bouillonmedium niet moge-
lijk. Thjötta en A very besloten hieruit, dat met het ge-
noemde inoculum een onbekende factor overgeënt was en
noemden die X factor.

Bouillon, geënt met een inoculum van een cultuur in een
vloeibaar bloedmedium, gaf geen groei van Hi. In gist-
extract was dus een tweede factor aanwezig, die voor de
groei van Hi noodzakelijk was. Deze factor had overeen-
komst met de vitamineachtige factor van Davis. Zij noem-
den deze factor V factor.

Beide factoren hadden een zelfstandig karakter en
waren onafhankelijk van elkaar.

De X factor kwam voor in bloed, vooral in bloedcellen;
ook kwamen geringe hoeveelheden voor in bloedserum,
waarschijnlijk door diffundeeren vanuit de bloedcellen.
Kristalhaemoglobine kon als X factor fungeeren. De X
factor was verbonden met haemoglobine en derivaten en
gelijk aan de thermostabiele factor van Davis. Tevens
waren banaan en aardappel X factorhoudend.

cellen. Serum als zoodanig kon niet als V factor dienen.
De V factor was ook aanwezig in gist, tomaten, erwten en
boonen of hun extracten. Aardappel en banaan waren ook

Voor Hi waren beide factoren levensnoodzakelijk. Hier-
bij was het van geen beteekenis of X- en V factor uit ver-
schillende bronnen betrokken werden.

De X factor was thermostabiel. Na een verhitting van
30 minuten op 120° C. kon zij nog als zoodanig dienen. De

Vnbsp;factor was na een verhitting van 30 minuten op 120° C.
vernietigd en daarom thermolabiel.

Beide factoren werkten nog in groote verdunning en
juist daardoor bleek hun accessoir, in tegenstelling van voe-
dend, karakter. Kristalhaemoglobine in de verdunning
1 : 2.000.000 kon nog als X factor fungeeren. Extracten
van gist, tomaten, erwten en boonen, in verdunning
1 : 1000 waren nog als V factor werkzaam.

Carbo animale absorbeerde X- en V factor, maar vooral
de X factor. Deze absorptie gebeurde vlugger onder invloed
van warmte (37° C.) en was afhankelijk van de hoeveel-
heid kool, de X factor-concentratie en de tijd van inwerking.

De X factor uit bloed, evenals benzidine- en guajac-hars-
reacties gevende substanties in bloed, vertoonden een merk-
waardige resistentie t.o.v. verhitting en gingen hierin
parallel.

Ook aardappel gaf blauwkleuring van het benzidine-
reagens. Een uitzondering vormden bananen, die X- en

Nadat Davis reeds met plantenweefsel op vaste media
reuzengroei van Hi had verkregen, toonden ThjöTTa en
Avery de onafhankelijkheid van Hi t.o.v. bloed aan bij
aanwezigheid van aardappel of banaan. In een phosphaat-
buffermengsel (Ph 7,5) was aardappel alleen voldoende
voor Hi. Naast de levensfactoren konden de Ht-bacillen hun

voedingsstoffen uit dit medium putten, geheel onafhanke-
lijk van stoffen van dierlijke oorsprong.

Rivers en Poole 1921 gebruikten gefiltreerd gist-
extract als V factor en in de autoclaaf verhit bloed als X
factor.

Onafhankelijk van Thjötta en Avery toonde Fildes
1921 de tweeledigheid der groeibevorderende factoren van
Hi in bloed aan. Bij de bereiding van zijn „peptic digestquot;
precipiteerde de haematine soms geheel, waarschijnlijk
doordat het mengsel te zuur werd gelaten. Precipitaat en
bovenstaande vloeistof waren tezamen noodig om de groei
van Hi te verkrijgen.

In 1923 gaf Fildes een eenvoudige methode aan om
bacteriën te determineeren naar hun behoefte aan X- en
V factor.

Als basismedium gebruikte hij 1V2% bacto-peptonwater,
waarin geen V factor aanwezig was, als X factor een hae-
matineoplossing en als V factor gistextract volgens Thjöt-
ta en Avery, gefiltreerd door Berkefeld N om sporen X fac-
tor weg te nemen, die geadsorbeerd waren aan gesuspen-
deerde gistpartikeltjes. Door toevoeging van haematine of
gistextract, of van beide, aan het bacto-peptonwater was uit
te maken welke factoren noodig waren.

Hierbij diende het inoculum verkregen te zijn van een
cultuur in een medium, dat een minimum van bloedpigment
bevatte. Tevens moest die cultuur jong zijn om adsorptie
van de haematine door de bacteriën tot een minimum te be-
perken. De geënte hoeveelheid moest zoo klein mogelijk zijn.

Hij deed tevens duidelijk uitkomen, dat het phenomeen
van Grassberger op rekening geschoven moest worden van
de V factor-productie door de centrum-bacteriën. Haema-
tineagar als zoodanig gaf geen groei, haematineagar -[-
gistextract of centrum-bacteriën gaven wel groei van
Hi, waaruit moest worden besloten, dat gistextract en de
omringende bacteriën dezelfde functie hadden ten opzichte
van Hi.

Knorr en Gehlën 1925 verkregen met nieuwe aard-
appels betere resultaten dan met oude. Door lange tijd
drogen werd de V factor in aardappel vernietigd. Toevoe-
ging van citroensap (V factorhoudend) maakte gedroogde
aardappels weer geschikt. Bananen, benzidine-negatief bui-
tenste en benzidine-positief binnenste vleesch van kokos-
noten, kokosmelk, gele wortelen en mangelwortelen waren
X- en V factorhoudend.

Knorr 1924 stelde de filtreerbaarheid van X- zoowel
als van V factor in opgeloste toestand vast. Cultuurfiltra-
ten van Bac. coli bevatten V factor.

Kollath 1924, 1925, kookte aardappel gedurende 5 mi-
nuten met water. De bovenstaande vloeistof was V factor-
houdend, bevatte geen X factor. In het filtraat van de
vloeistof was de V factor behouden (Berkefeld).

Met kolloïdaal opgelost ijzer (Ferrum oxydatum ammo-
niatum 1 : 1000) en met kaliumferrocyanide, geactiveerd
door ultraviolette stralen (1926), gevoegd bij agar, ver-
kreeg hij de door NeiSSER beschreven vorm van „Ammen-
vvachstumquot; indien Bac. faecalis alcaligenes of een lucht-
coccus dienst deden als „Ammenquot;. Zonder „Ammenquot; ver-
kreeg hij geen groei. „Ammenbacterienquot; moesten het ijzer
geschikt maken en veranderen in een vorm, die in samen-
stelling met de X factor overeenkwam. Voor groei van Hi
moesten de „Ammenbacterienquot; tevens geringe hoeveelheid
V factor produceeren, tenzij deze, uit andere bron verkre-
gen, toegevoegd was. De door de bacteriën gevormde X
substantie diffundeerde maar weinig in de omgeving. De
groei van Hi bleef grootendeels beperkt tot binnen de
»Ammenkolonienquot;. Hier waren de bacteriën niet willekeurig
door elkaar gemengd, maar er vormden zich ifi-koloniën in
de „Ammenkolonienquot;.

Gebaseerd op dit onderzoek maakte Koi.i,ath een strenge
scheiding tusschen de „Riesenwachstumquot; van Grassberger
en de „Ammenwachstumquot; van Neisser. Terwijl de eerste

gekarakteriseerd was door de V factor-productie en aan-
wezigheid van de X factor noodzakehjk was, bestond de
tweede in de vorming van de X factor en gelijktijdige pro-
ductie van de V factor, tenzij deze laatste uit andere bron
voorhanden was.

Op een „Hungernahrbodenquot;, bestaande uit wateragar
met voldoende X- en V factor, zou volgens Koelath Hi in
staat zijn de derde noodige voedende substantie te betrek-
ken uit zijn doode soortgenooten. Hij noemde dit vermogen
van Hi „Kannibalismusquot; en voerde er voor aan, dat Hi op
de „Hungernahrbodenquot; alleen groeide nabij plaatsen van
opgebracht materiaal. Ook Knorr deelde deze opvatting. Op
wateragar met sporen X factor verkreeg hij slechts groei
in mengkoloniën met andere bacteriën. Als derde voedende
substantie zouden vervalproducten van de „Ammenbacte-
rienquot; gebruikt worden, die slechts weinig in de omgeving
diffundeerden.

Door aan te nemen, dat de agar van N^isser en Can-
tani met toevallige hoeveelheden ijzerverbindingen ver-
ontreinigd was, verklaarde Kollath hun positieve resulta-
ten met „Ammenbacterienquot;, terwijl anderen, die hun
onderzoekingen herhaalden en met agar gewerkt zouden
hebben, waarin geen geschikte ijzer verbindingen voorkwa-
men, hierdoor negatieve resultaten verkregen. Ghon en v.
PrEys merkten ook reeds op, dat cyaanijzer de „Ammen-
wachstumquot; begunstigde.

Merkwaardig was echter, dat Kollath geen groei ver-
kreeg van Hi op agar, waaraan Friedlanderbacteriënemul-
sie was toegevoegd, dit in tegenstelling met Cantani,
Ghon, en v. Pruys, alsmede Wolf, die op vaste en
Thjötta en Tinti, die in vloeibare media zonder groei-
factoren met Friedlanderbacteriën wel groei van Hi ver-
kregen.

Kollath deed zijn proeven met gecontroleerd ijzervrije
agar en voegde slechts één ijzerverbinding toe. Mogelijk is:

1.nbsp;dat de Friedlanderbacteriën andere ijzerverbindingen
noodig hebben om X factor te vormen en

2.nbsp;dat deze ijzerverbindingen aanwezig waren in de me-
dia, die door de andere onderzoekers gebezigd waren.

KoIvIvATH gaf aan, dat bijna iedere agar ijzerhoudend was
als niet bijzondere voorzorgsmaatregelen genomen werden
(ijzer afkomstig van gebezigd glaswerk, enz.).

Juist dit denkbare ijzerverschil — aannemende, dat het
ijzer voor de X factorvorming die beteekenis heeft, als
Kollath aangaf — zou het mogelijk kunnen maken
vele andere tot nu toe onverklaarbare onderzoekingen te
doen begrijpen. Hiertoe zijn te rekenen o.a. de onderzoe-
kingen van Williams en Povitsky, alsmede die van
Kalkbrenner.

Williams en Povitsky 1921 verkregen in symbiose met
diphteriebacillen goede groei van Hi op agar. Tarwebloem-
agar -— die zeker bloedvrij was — met diphteriebacillen,
gaf eveneens groei van Hi in mengkoloniën, meestal 2—7
generaties, soms echter tot 20 generaties. Met andere
tarwebloem werd geen groei van Hi verkregen.

Kalkbrenner 1921 kon ijzer niet uitsluiten in diphte-
riebacillen, die op peptonagar — zonder bouillon — als
„Ammenbacterienquot; konden fungeeren. De diphteriebacil-
len bevatten geringe maar duidelijk aan te toonen hoeveel-
heden ijzer, evenals de peptonagar.

De capaciteiten van „Ammenbacterienquot; zouden dan ook
een rol spelen als verschillende bacteriënsoorten verschil-
lende ijzerverbindingen noodig hadden om X factor te
vormen.

In een volgende publicatie 1925 behandelde Kollath o.a.
de beteekenis van de X factor voor de groei van Hi.

Als reactie op ijzer gebruikte KollaTh rhodaanammo-
nium (op 3-waardig ijzer). De te onderzoeken massa werd
een weinig zuur gemaakt door enkele druppels 5% HCl. Om
de roode kleurstof te concentreeren werd deze met een wei-

nig aether uitgeschud. Deze reactie was gevoeliger dan de
reactie met Berlijnsch-blauw en kon sporen 3-waardig ijzer
aantoonen. Hiermede stelde hij vast, dat bijna iedere agar
ijzerhoudend was.

De als „Ammenbacterienquot; bekende bacteriën, Bac. xe-
rosis, staphylococcen en de aangewende luchtcoccus, gewas-
schen, verascht, gemengd met water en zuur gemaakt door'
HCI, hadden positieve ijzerreactie. Bac. typhi, Bac. flexner,
Bac. shiga enz. gaven geen ijzerreactie. De verondersteIHng,
dat de „Ammenbacterienquot; bij het geschikt maken van het
ijzer voor X factor dit opnamen, was dus gegrond, temeer
daar, naast de mogelijkheid het ijzer op te nemen, het on-
waarschijnlijk was, dat de X factorvorming zou ontstaan
door een werking op afstand.

Hï-bacillen, gewasschen, verascht, opgenomen in water
en zuur gemaakt door HCl, hadden een positieve ijzerreac-
tie. Hi gebruikte voor de opbouw van zijn lichaam dus ijzer.
Daar Hi ijzerhoudend was en de X factor ook steeds als
ijzerhoudend beschreven werd, lag het voor de hand, dat
Kollath het oude standpunt van Pfëiffkr — dat ijzer in
een of andere vorm (volgens Kollath overeenkomende met
de X factor) noodig was voor de stofwisseling van Hi —
weer naar voren bracht.

Hiermede werd afgestapt van de sedert Olsen gehuldig-
de meening omtrent de katalytische werking van het ijzer,
tenzij een combinatie mogelijk is, waarbij dan het ijzer door
Hi opgenomen moet worden om genoemde katalytische wer-
king te kunnen uitoefenen.

Opgemerkt dient nog te worden, dat de onderzoekingen
van Kohath omtrent ijzerhoudendheid, voor zoover het
negatieve resultaten betreft, slechts een betrekkelijke waar-
de vertegenwoordigen, daar alleen gelet werd op 3-waardig
ijzer. Ook de gecontroleerd ijzervrije agar was slechts on-
derzocht door verkoolde monsters hiervan te laten reageeren
met rhodaanammonium zonder dat hierbij eerst al het even-
tueel aanwezige ijzer tot ferri werd geoxydeerd.

Nu we weten, dat de X factor in groote verdunningen
werkzaam is — en de theorie van Kollath aannemende —
is zeker een gevoelige reactie noodig om ijzer in dergelijke
verdunningen aan te toonen. Hieruit is te concludeeren:

1.nbsp;dat bij onderzoekingen, het ijzer van de X factor betref-
fende, voorafgaande nauwkeurige onderzoekingen over
de gevoeligheid van de toegepaste reactie gewen,seht
waren geweest;

2.nbsp;dat onderzoekingen omtrent ijzerhoudendheid van „Am-
menbacterienquot; met niet gevoelige reacties van weinig
belang zijn geweest. De reactie met Berlijnsch-blauw
is niet gevoelig genoeg om hoeveelheden ijzer, ais noo-
dig zijn in de vorm van X factor voor Hi, aan te toonen.
Kollath gaf aan, dat met zijn ijzerreactie sporen
3-waardig ijzer werden aangetoond. De verdunning van
de ijzeroplossing, die nog een positieve reactie gaf, werd
echter niet aangegeven.

Kopp 1927 verkreeg goede groei van Hi onder anaërobe
omstandigheden. Onder anaërobe omstandigheden was de
X factor niet noodzakelijk, wel de V factor. Hieruit conclu-
deerde hij, dat Hi obligaat-anaëroob was en de X factor de
taak had de voor Hi schadelijke zuurstof op een of andere
manier onschadelijk te maken.

Eirund 1929 bevestigde de onderzoekingen van Kopp.
Hij onderzocht een groot aantal stammen en kwam tot de
conclusie, dat vele Hi-stammen geen X factor noodig had-
den onder anaërobe omstandigheden.

Meyer 1934 toonde aan, dat bijnierschors — waarvan be-
kend is, dat het groote hoeveelheden vitamine C bevat — niet
als V factor kon dienen. Dit was in strijd met verschillende
onderzoekers, die erop wezen, dat de eigenschappen en het
voorkomen van de V factor overeenkwamen met die van
vitamine C (Knorr e.a.). Ook kon Meyër het zuivere vita-
mine C, het ascorbine zuur (A. von Szënt-Györgyi) niet
als V factor gebruiken.

Reeds v. Nesteinger 1918 en Davis 1921 wezen op een
remmende werking van versch serum en ascitesvloeistof bij
de groei van haemophiele bacillen. Davis stelde vast, dat
versch bloedserum het satellitisme belemmerde.

Terada 1922 beschreef een fermentachtige werking van
serum op gehaemolyseerde roode bloedcellen, waardoor de
groei van Hi hiermee onmogelijk werd. Hij nam hierbij
geen notitie van de dubbele natuur der groeifactoren. De
meeste proeven deed hij met paardenserum. Enkele proeven
met konijnen- en caviaeserum gaven dezelfde resultaten.

Knorr 1924 stelde vast, dat deze fermentatieve werking
van versch serum de V factor vernietigde. Schapen-, konij-
nen-, caviae-, paarden- en rattenserum vormden een serie van
verminderde activiteit in dit opzicht. Serum van menschen,
duiven en katten had geen vernietigende werking. Het was
van geen beteekenis uit welke bron de V factor betrokken
werd.

Meyer 1934 verkreeg met menschen- en duivenserum
geen, met paardenserum veelal geen remmende werking,
met konijnen-, runder-, schapen-, varkens- en soms met
paardenserum gering remmende werking.

Meyer 1934 toonde een remmende werking aan in het
stroma van bloedcellen. Dit stroma werd uit een gehaemo-
lyseerde oplossing van gewasschen bloedlichaampjes verkre-
gen door centrifugeeren. Daarna werd het meermalen
gewasschen. De bloedlichaampjes waren gehaemolyseerd in
aqua destillata en om de afscheiding te bevorderen werd
de gehaemolyseerde oplossing aan bloed isotonisch ge-
maakt door 1,7% NaCl-oplossing.

Deze remmende werking was gericht tegen de V factor.
Bac. parainfhienzae, Bacillus „Xquot; en Hi (die alle V factor
noodig hebben) werden geremd, Bac. haemoglobinophilus

Hij toonde duidelijk aan, dat de remmende werking van
het stroma veroorzaakt werd door een ferment, waarvan de
werking waarschijnlijk berustte op een oxydatie van de

De inactiveering van de V factor ging langzaam en eerst
na dagen bereikte ze haar einde. Onbeperkte hoeveelheden

Vnbsp;factor konden geïnactiveerd worden. Dit proces voltrok
zich vlugger bij 37° C. Ook V factor van plantaardige oor-
sprong werd geïnactiveerd.

Het inactiveerend ferment werd vernietigd door alcohol
en door verhitting op 70° C. gedurende 15 minuten (zoo
goed als geheel) ; door verhitting op 56° C. gedurende 1 uur
werd het niet vernietigd, zijn werkzaamheid werd daardoor
niet verminderd. Voorts was het ferment vast verbonden
met het stroma; van de structuur van het stroma bleek het
evenwel onafhankelijk, aangezien dit, opgelost in 1% na-
trium-desoxycholaat, nog volkomen werkzaam was.

Stroma van runderen, schapen, varkens, menschen, ko-
nijnen en caviae vormde een serie van verminderde activi-
teit in dit opzicht. Paarden- en duivenstroma was onwerk-
zaam. Als paardenbloed werkzaam was kwam dit door het
serum.

Volgens Oesen berustte de functie van haemoglobine en
derivaten op een katalytische werking. Hij constateerde een
hand in hand gaan van de peroxydase-reacties (benzidine-
en guajac-hars-reactie) en het groeibevorderend vermogen
van haemoglobine en derivaten.

Deze peroxydase-reacties berusten op een overgang van
zuurstof van een peroxyde (H2O2) naar benzidine of gua-
jac-hars bij aanwezigheid van een peroxyde, waardoor ben-
zidine respectievelijk guajac-hars tot gekleurde verbinding
geoxydeerd wordt.

Thjötta en Avery vonden, dat peroxydase-reacties ge-
vende substanties in bloed, evenals de X factor in bloed, een
merkwaardige resistentie tegen hitte hadden. Aardappel
(X factorhoudend) gaf ook een positieve benzidine-reactie.
Bananen, die X factor bevatten, gaven geen peroxydase-
reactie.

Fildes vond een parallellisme tusschen het optreden van
peroxydase-reacties en de aanwezigheid van X factor in
aardappel. Hij veronderstelde, dat de functie van de X fac-
tor in bloed en plantenweefsel op dezelfde katalytische wer-
king berustte.

Knorr en GehlEn verkregen niet alleen met bananen,
maar ook met kokosvleesch negatieve benzidine-reactie. Zij
stelden tevens vast, dat het moeilijk was uit het ontbreken
van peroxydase-reacties — zoowel in bloed (2) als in
plantenweefsel (1) — tot afwezigheid van peroxydase te
besluiten.

1.nbsp;In bananen was volgens GriebEL — al naar hun
rij pingstoestand — opgeloste of onopgeloste looistof
aanwezig. Looistoffen zouden nu reeds in sporen de per-
oxydevorming verhinderen.

2.nbsp;Knorr en Gehlën gebruikten als benzidine-reagens een
verzadigde oplossing van benzidine in ijsazijn, die voor
de reactie vermengd werd met 3% H202-oplossing in
verhouding I : 5. 1 cc. Reagens werd gevoegd bij 6—8
cc. te onderzoeken oplossing. Haemoglobine, opgelost
in aqua destillata, gaf hiermee nog een positieve reactie
in verdunning I : 500.000. De reactie verloor haar ge-
voeligheid door verhitten van de haemoglobine of door
toevoegen van andere stoffen b.v. NaCl 0,6%. In de
gebruikelijke pepton-bouillonagar was de reactie weinig-
gevoelig en alleen positief met haemoglobine in verdun-
ning 1 : 40.000. Negatieve peroxydase-reactie was hier
dus geen bewijs voor afwezigheid van haemoglobine.

nog in verdunning 1 : 2.000.000 (Thjötta en AvEry) bij
aanwezigheid van voldoende V factor.

Ciroei van Hi vormde een gevoeliger reactie voor het
aantoonen van bloed dan de peroxydase-reacties (Knorr
en GëhlEn, Kollath, Fildes).

Ook aardappel, die door verhitting geen peroxydase-
reacties meer gaf, gaf nog groei van Hi. Fildes besloot
hieruit, dat groei van Hi een gevoeliger reactie was voor
het aantoonen van de X factor dan de peroxydase-reacties.

Stoffen, die niet als X factor kunnen fungeeren, kunnen
ook positieve peroxydase-reacties hebben. Naast bloed en
plantenweefsel is uit de medische praktijk bekend, dat
ijzervitriool, ijzerroest, stijfsel, caseïne, melk, etter, ijzer-
chloride en KMn04 een positieve benzidine-reactie hebben.
Bij ijzerchloride en KMn04 trad zelfs blauwkleuring op zon-
der H2O2 (Puppe). Ook haemocyanine — de koperhoudende
bloedkleurstof van lagere dieren — heeft een positieve
benzidine-reactie, doch kon niet als X factor fungeeren.

Samenvatting: Als deze peroxydase-theorie juist
is, is Hi niet in staat zuurstof van de atmosfeer te gebrui-
ken, maar heeft ze gebonden zuurstof noodig, die verkre-
gen wordt met behulp van een Peroxydase (X factor). Zijn
de bevindingen van Kollath juist, dan moet het ijzer (X
factor) opgenomen worden door Hi om de gebonden zuur-
stof uit zijn omgeving vrij te maken.

Bij een ruimere opvatting van de peroxydase-theorie
behoudt Hi het vermogen om zuurstof van de atmosfeer te
gebruiken, maar is hierbij de hulp noodig van een kataly-
sator (X factor). Die katalysator zou daarbij moeten wer-
ken als ijzerchloride en niet als haemoglobine bij de benzi-
dine-reactie. Beter nog zou dan zijn werking vergeleken
kunnen worden met die van het ademhalingsferment (een
haemine) van Otto Warburg, waarbij de zuurstof zich
tegen het ijzer — dat gebonden is aan het pyrrolcomplex —
legt tot een peroxyde en dan geactiveerd wordt.

Onder anaërobe omstandigheden treedt de vrije zuur-
stof op de achtergrond en zou een daarvoor dienende kata-
lysator eventueel gemist kunnen worden. Hierdoor zou dan
ook een andere verklaring gegeven zijn aan de onderzoe-
kingen van Kopp, die de afwijkende meening openbaar
maakte, dat de X factor alleen noodig was onder aërobe
omstandigheden om de voor Hi schadelijke zuurstof te
binden. Hoe dan echter bij die anaërobe omstandigheden
de energievoorziening van Hi zou zijn, laat zich moeilijk
beoordeelen.

Bovenstaande uiteenzetting had betrekking op de X
factor. Omtrent de functie van de V factor is nog weinig
bekend en een bespreking van die functie zou daarom geen
zin hebben. Er kan volstaan worden met erop te wijzen,
dat de V factor als een vitamineachtige stof wordt be-
schouwd of als een voedingsbestanddeel met accessoir
karakter.

De X- en V factor zijn voor Hi levensnoodzakelijk.
Daarnaast is een derde nl. een voedende sub-
stantie noodig, die niet van dierlijke oorsprong behoeft
te zijn. Ook weefsel van plantaardige oorsprong kan er
voor dienen. Waarschijnlijk moet de derde substantie wel
van organische natuur zijn.

De X factor is waarschijnlijk ijzerhoudend, werkt
in groote verdunning (1 : 2.000.000), misschien als kataly-
sator.

Hij is aanwezig in bloed, haemoglobine en ijzerhoudende
derivaten, zoo ook in vele plantenweefsels (aardappel,
banaan). Hij kan waarschijnlijk gevormd worden uit be-
paalde ijzerverbindingen door geschikte bacteriënsoorten.

Hij is — vooral in bloed, waarschijnlijk minder in aard-
appel — thermostabiel.

Hij is filtreerbaar en wordt geadsorbeerd door fijn ver-
deelde stof als carbo animale.

De V factor heeft een vitamineachtige natuur en
werkt in minder groote verdunningen dan de X faictor
(1 : 1000).

Hij is aanwezig in bloed — vooral in bloedcellen — en
in bijna alle plantenweefsels en hun extracten. Hij wordt
gevormd door bijna alle pathogene en apathogene kiemen,
behalve door de V factor noodig hebbende bacteriën.

Hij is betrekkelijk thermolabiel (na 20 minuten 120° C.
vernietigd; nog aanwezig na 10 minuten 100° C.).

Hij is filtreerbaar, wordt weinig geadsorbeerd door car-
bo animale en diffundeert gemakkelijk vanuit aardappel in
water.

De X - en V factor hebben een zelfstandig karak-
ter en zijn onafhankelijk van elkaar.

Bij dit onderzoek naar de behoefte aan X- en V factor
werd de methode van Fildes gevolgd. Als b a s i s m e-
d i u m werd gebruikt 10 cc. peptonNaCl, waarin 1% pepton
(Witte) en NaCl, Ph 7,4.

X factor. Deze bestond uit een 1%-oplossing van
haematine (Merck) in aqua destillata. Hiertoe werd de
haematine opgelost in een minimum van NaOH, daarna
aangevuld met aqua destillata tot de gewenschte I%-
oplossing.

Om een heldere oplossing te houden werd slechts een
geringe — evenwel voldoende — hoeveelheid X factor toe-
gevoegd, nl. 0,025 cc. van de 1%-haematineoplossing bij
10 cc. basismedium. Hier was dus de haematine aanwezig
in een verdunning I : 40.000 en de geringste troebeling van
dit medium kon afgelezen worden. De gering alkalische
haematineoplossing veranderde de Ph 7,4 zelfs niet met 0,1.

100 Gr. brouwersgist werd geëmulgeerd in 400 gr. aqua
destillata, gebracht op Ph 7,6 en gedurende 10 minuten bo-
ven de vlam gekookt. Daarna werd het in de ijskast bewaard,
waardoor de gistcellen gelegenheid kregen om uit te zakken.

Voor het gebruik werd de bovenstaande vloeistof gefil-
treerd door Chamberland L3 om sporen X factor, die aan
gistpartikeltjes geadsorbeerd zijn, er uit te verwijderen.
Deze filtratie geschiedde tevens om grootere zekerheid te
hebben voor steriliteit.

Aan 10 cc. basismedium werden toegevoegd X factor,
V factor {¥2. cc. gistextract) of beide.

Inoculum. Voor Hi moest uit een cultuur in een
medium, dat minimale hoeveelheden bloed bevatte, geënt
worden. Dit medium bestond uit 1 öse van 4 mm.® 10%
bloedbouillon op 10 cc. bouillon -f ¥2 cc. gistextract. De
bloedverdunning van dit medium was dus 1 : 25.000. 1 Öse
van dit medium veranderde practisch niets aan de X factor-
concentratie van de daarmee geënte media.

Het inoculum voor Hc bestond daarom uit een minimale
hoeveelheid van een öse 10% bloedbouilloncultuur, die geen
zichtbare troebeling van de hiermee geënte media gaf.
Vloeibare media met voldoende groeifactoren voor Hc
gaven met dit inoculum steeds positieve groei.

Bij verdere proeven werd voor Hi steeds het hierboven
daarvoor aangegeven minimale bloedmedium als uitgangs-
medium gebruikt, terwijl voor Hc steeds — tenzij anders
vermeld — werd uitgegaan van de in de vorige alinea ver-
melde minimale hoeveelheid bloedbouilloncultuur.

zoek, 2. bepaling van troebelheid en 3. subcultuur op choco-
ladeagar. Op serumagar mocht nooit groei optreden.

Om de invloed van mogelijke adsorptie van X- en V
factor (Fildes, Knorr) door geënte Hi te elimineeren,
werd Hi in het basismedium met X- en V factor tot 6 pas-
sages voortgekweekt, waarbij steeds hetzelfde resultaat.

Met grootere hoeveelheden X factor en met als basis-
medium bouillon werd eveneens geen groei van Hc
verkregen.

Zoowel Hi als Hc konden uit aardappel hun levensnood-
zakelijke groeifactoren putten. De toevoeging van bloed
was hiervoor niet noodzakelijk. In bouillon met steriele
stukjes rauwe aardappel kon Hc in passage voortgekweekt
worden.

Getracht werd met behulp van aardappel iets te achter-
halen van de bijzondere eischen, die Hc stelt.

De techniek voor het winnen van steriele stukjes rauwe
aardappel werd op blz. 32 beschreven.

P r O e f I: Gedrag van de groeifactoren in aardappel ten
opzichte van de temperatuur 100° C.

Rij 1: Buisjes met steriele stukjes rauwe aardappel in
bouillon, verschillende tijden verhit bij 100° C.

Rij 2: Hiervoor werden steriele stukjes rauwe aardappel
in 2 cc. aqua destillata verschillende tijden verhit
bij 100° C. en daarna gedaan in buisjes met
bouillon.

Rij 3: De overgebleven aqua destillata uit rij 2, gevoegd
bij buisjes bouillon, vormde de derde rij. '

Rij 4: Ter vergelijking werden buisjes met 10% bloed-
bouillon eveneens verschillende tijden verhit op
100° C.

De buisjes van een dezer groepen werden geënt met Hc,
de andere met Hi. De groei van Hi en Hc werd vastgelegd
in onderstaande tabel. De beoordeeling van de groei in de
buisjes geschiedde door: 1. microscopisch onderzoek, 2. be-
paling van troebelheid en 3. subcultuur op chocoladeagar.
Tevens werd als controle op reinheid uit alle gegroeide
buisjes geënt op serumagar.

(veel bacillen, sterke troebeling, veel koloniën).
: goede groei van Hc (matig bacillen per gezichtsveld, duidelijke

troebeling, matig koloniën).
: matige groei van Hc (weinig bacillen per gezichtsveld, geringe troe-
beling, weinig koloniën).
: minimale groei van Hc (enkele bacillen per gezichtsveld, juist

zichtbare troebeling, enkele koloniën).
: geen groei (geen bacillen, geen troebeling, geen koloniën).

In de eerste rij buisjes was door verhitting van aard-
appel in bouillon troebeling ontstaan. De tweede rij buisjes
was ongeënt volkomen helder. In de eerste rij buisjes ge-
schiedde de beoordeeling der troebelheid door vergelijking
met ongeënte buisjes. De derde rij was als controle bedoeld
voor rij 2. Ze gaf aan, dat het uitblijven van de groei in
rij 2, wat betreft Hc, bij langere verhitting niet te wijten
was aan het overgaan van de groeifactoren in de omgeving.
Toevoeging van haematine -j- gistextract bij rij 3 gaf ook
geen groei van Hc. In verhitte bloedbouillon was de troe-
beling niet te beoordeelen.

Uit de tabel blijkt, dat Hc minder goed groeide bij aard-
appel met hoogere verhitting en niet meer groeide met
aardappel, die 10 minuten of langer verhit was bij 100° C.
Hi gaf groei in alle buisjes, behalve in die van rij 3.

Conclusies: Hc heeft voor zijn groei een zeer ther-
molabiele factor noodig. Deze factor kan de V factor niet
zijn, daar die voldoende aanwezig was blijkens de positieve
groei van Hi in buisjes waarin Hc niet meer groeide. Ge-
noemde factor wordt snel vernietigd bij 100° C. en is in
bouillon schijnbaar iets thermostabieler. Door verhitting
gaat deze factor uit aardappel niet in de omgeving over.

Om de samenhang van deze thermolabiele factor met
Hc uit te drukken werd hij in het vervolg aangeduid als
„C(oryza) factorquot;.

Proef I I : Gedrag van de groeifactoren in aardappel
ten opzichte van de temperaturen 65—100° C.

Uit proef I bleek, dat Hc voor zijn groei in aardappel-
bouillon een factor noodig had, die na korte verhitting op
100° C. vernietigd was. In proef II werd het gedrag van
deze C factor nagegaan bij temperaturen lager dan 100° C.

met diverse stukjes aardappel. Deze stukjes aardappel w.gr-
den verkregen door stukjes rauwe aardappel verschillende
tijden te verhitten bij 65—100° C. in bouillon of aqua des-
tillata.

Onderstaande tabel met verklaring geeft een beeld van
de opzet van deze proef en van haar uitkomsten.

I: Een rij buisjes bouillon met steriele stukjes rauwe aard-
appel, 10 minuten verhit bij 65—100° C.

II: Meerdere rijen buisjes bouillon met stukjes aardappel.
Deze stukjes aardappel werden verkregen door rauwe
stukjes aardappel verschillende tijden (10, 20 en 30
minuten) te verhitten in 2 cc. aqua destillata (in buis-
jes). Eerst daarna werden ze in de buisjes met bouillon
gebracht.

De beoordeeling van de groei geschiedde op dezelfde
wijze als bij proef I. Ook voor de verklaring der teekens
Wordt naar proef I verwezen.

aardappel uit rij I was alleen mogelijk door vergelijking
met ongeënte buisjes. In de ongeënte buisjes dezer rij was
reeds een troebeling, die bij de temperaturen 65°—75° C. in
sterker mate voorkwam. Bij verhitting boven 75° C. was die
troebeling meer vlokkig.

I: Vergelijking van I (10 minuten) met II (10 minuten)
geeft weer aan, dat de C factor in aardappel iets ther-
mostabieler is bij verhitting in bouillon.
II: Een half uur inwerking van de temperatuur van 75°

C. kon de C factor in aardappel niet vernietigen.
III: De tijdsduur heeft invloed op de vernietiging van de
C factor in aardappel. Terwijl in Hc II bij 10 minu-
ten op 80° C. nog een duidelijke troebeling optrad, was
deze bijna niet meer zichtbaar na verhitting gedurende
30 minuten op 80° C. Terwijl bij 10 minuten 85° C.
nog een goed zichtbare troebeling optrad, was de
bouillon bij 30 minuten 80° C. volkomen helder.
IV: Merkwaardig was het optreden van een veel sterkere
troebeling in media met verhitte aardappel (65—80°
C.) vergeleken met dat, waaraan onverhitte aardappel
was toegevoegd. Misschien moet hierbij gedacht wor-
den aan het uitschakelen door verhitting van groei-
antagonistische stoffen in aardappel.
V: X- en V factor waren steeds aanwezig blijkens de
groei van Hi.

Conclusies: Proef II is een bevestiging van proef
I wat betreft de behoefte van Hc aan een zeer thermola-
biele factor. Proef II gaf tevens aan 1. dat de tijd van
hiwerking der temperatuur invloed heeft op de vernietiging
van deze factor in aardappel, 2. dat misschien deze factor
beïnvloed kan worden door antagonistische stoffen en 3.
dat deze factor in bouillon iets thermostabieler is.

Algemeene beschouwing proef I en II:
Het raadselachtige feit, opgemerkt onder „Het Kweekenquot;,
dat Hc niet groeide op Levinthalagar ondanks de aanwezig-
heid van optimale hoeveelheden X- en V factor, is hiermee
opgelost. De verklaring is te zoeken in de te hooge ver-
hitting van Levinthalagar.

Bij de bereiding van chocoladeagar voor Hc verdient het
aanbeveling de oppervlakte van de media niet te f lambeeren
(gebruikelijk om luchtbellen te doen verdwijnen). Hierdoor
schakelt men een technische fout uit en heeft men meer
kans op zekerder resultaten.

Ook de slechte resultaten met verhitte bloedbouillon,
Levinthalbouillon en vele andere media, waarbij voor de
bereiding een te hooge temperatuur werd aangewend —
waarin toch voldoende X- en V factor aanwezig waren —
zijn hiermee te verklaren.

Fildes 1922 vond, dat de X factor uit aardappel in zuur
medium thermostabieler was dan in alkalisch medium. Als
bron voor X- en V factor uit aardappel gebruikte hij aard-
appelperssap, gefiltreerd door Berkefeld N.

Het door mij gebruikte aardappelperssap — zie latere
proeven — gefiltreerd door Berkefeld N, bevatte alleen
V factor geen X factor. Dit was de aanleiding voor mij om
de proeven van Fiedes over thermostabiliteit van de X fac-
tor uit aardappel te herhalen met aardappelweefsel.

Steriele stukjes aardappel werden verkregen volgens de
op blz. 32 aangegeven techniek.

Deze stukjes rauwe aardappel werden gedaan in buisjes
met 10 cc. aqua destillata, waarvan de Ph respectievelijk
6,8 en 7,6 was.

De eene helft van deze buisjes — zoowel van die met Ph
6,8 als 7,6 — werd 20 minuten verhit bij 100° C. in een

Met een scherpe entnaald werden de aardappelstukjes
daarna overgebracht in buisjes met het peptonNaCl-basis-
medium (zie blz. 54). Bouillon werd niet gebruikt om
eventueel hierin aanwezige X factor uit te schakelen. Zoo-
wel bij 100° als bij 120° C. bleek de aardappel meer stuk
gekookt in de aqua destillata met Ph 7,6. Hij kon echter
steeds met vereischte voorzichtigheid goed overgebracht
worden in de peptonNaCl. De aardappel uit aqua destillata
met Ph 6,8 was steeds stevig van consistentie. Aardappel
werd vooraf verhit in buisjes en niet onmiddellijk in pep-
tonNaCl om: 1. de Ph beter in de hand te hebben, 2. de
troebeling van peptonNaCl door verhitting van aardappel
hierin te voorkomen en 3. de invloed van pepton uit te
schakelen. De overgebleven vloeistof uit de buisjes, waarin
de aardappel verhit was geworden, moest afzonderlijk wor-
den onderzocht.

De aanwezigheid van X- en V factor werd vastgesteld
door een vergelijkend onderzoek met buisjes, waaraan
tevens haematine of gistextract of deze beide werden toe-
gevoegd.

De hoeveelheden haematine, gistextract en inoculum als-
mede de Öse waren dezelfde als bij proef I.

Om adsorptie van X- en V factor door Hi geheel uit te
kunnen schakelen moest in passage in hetzelfde medium
voortgekweekt worden. Hiertoe waren van ieder soort me-
dium 4 buisjes gemaakt.

Daar bij geringe troebeling microscopisch reeds veel ba-
cillen aan te toonen waren en op chocoladeagar een maxi-
male groei optrad, was de mate van troebeling het aange-
wezen middel om de graad van groei te bepalen.

Bij vergelijking van a, 1, en a, 3, bleek een duidelijk ver-
schil in troebelheid te bestaan. Gistextracttoevoeging aan
a, 1, bevorderde de groei, haematinetoevoeging niet. Er
was in a, 1, dus een gebrek aan V factor. De overgebleven
vloeistof van a, 1 — waarin de aardappel van a, 1, verhit
was geworden — werd eveneens onderzocht en bevatte ge-
ringe hoeveelheden V factor, geen X factor. Het gebrek aan
V factor in a, 1, zal hieraan toegeschreven moeten worden.

alsmede aan de mogelijk vernielende werking op de V factor
in aardappel door de temperatuur van 100° C.

In het 4e passagebuisje was er practisch geen verschil
meer in troebelheid tusschen b, 1, b, 2, en b, 3. In alle drie
was een duidelijke troebeling opgetreden. Waarschijnlijk
was dit te wijten aan het diffundeeren van de V factor uit
de diepte van de aardappel naar de oppervlakte. Reeds werd
opgemerkt, dat aardappel met Ph 6,8 niet zoo stuk gekookt
was. Mogelijk staat hiermee in verband het terugblijven van
de V factor in de diepte van de aardappel, die na 4 dagen
weer naar de oppervlakte was gekomen.

Bij 120° C. kon noch door haematine noch door gist-
extract groei verkregen worden. Hieruit moest tot afwezig-
heid van X- en V factor in aardappel, die gedurende 20 mi-
nuten op 120° C. verhit was, besloten worden. Ook in de
vloeistof, waarin de aardappel verhit was, konden geen X-
en V factor meer aangetoond worden.

Conclusie: X-en V factor in aardappel worden ver-
nietigd door verhitting gedurende 20 minuten op 120° C.
in aqua destillata. Een duidelijk verschil tusschen verhitting
in zuur of alkalisch medium kon niet vastgesteld worden.

Algemeene beschouwing: De X factor in
aardappel bleek minder stabiel dan de X factor in haema-
tine. De gebezigde haematine-oplossing werd meermalen in
de autoclaaf verhit bij 120° C. en bleef steeds werkzaam als
X factor.

Er bestond dus verschil in eigenschappen tusschen X fac-
tor uit aardappel en haematine. Daaruit zou men geneigd
zijn eerder te denken aan een of andere functie van de X
factor voor Hi dan aan een voedende beteekenis.

Haematine, meermalen verhit, behoudt zijn peroxydase-
activiteit. De plantaardige peroxydasen zijn veel gevoeliger
voor verhitting. De peroxydase-functie van de X factor
blijkt dus niet in strijd te zijn met deze proef.

Om de invloed van bouilllon na te gaan op de thermosta-
biliteit van de X factor werd een klein proefje genomen
met aardappel gevoegd bij bouillon. Na 20 minuten verhit-
ting op 120° C. waren hierin, na toevoeging van gistextract,
spaarzaam bacillen aan te toonen, hetgeen er op wees, dat de
X factor niet geheel afwezig was. ThjöTTa en AvEry ver-
hitten rauwe aardappel in bouillon en kwamen zoo tot de
thermostabiliteit van de X factor in aardappel bij 120° C.

Bij eenige bouillonbuisjes werd rauwe aardappel ge-
voegd. Deze aardappelbouillonbuisjes werden gedurende 2
dagen bewaard, de eene helft bij kamertemperatuur (16°
C.), de andere helft bij 37° C. in de broedstoof. Daarna
werd hiervan — behalve van enkele controles — de bouillon
voorzichtig afgepipetteerd en in steriele buisjes gedaan. In
deze buisjes, al of niet met de bekende toevoegingen, werd
de groei van Hi en Hc bepaald.

Toevoeging- van X factor (haematine) aan de, van de
bij 16° en 37° C. bewaarde buisjes, afgepipetteerde vloei-
stof was noodig om groei van Hi te verkrijgen. Hc groeide
alleen in de controles bij de aanwezigheid van rauwe aard-
appel.

Conclusies: Alleen V factor gaat voldoende in
bouillon over. X factor en C factor zijn vast aan aardappel
verbonden.

Beschouwing: In rauwe aardappelbouillon is de
V factor door het geheele medium verspreid aanwezig. De
X factor is alleen aanwezig in de diepte, verbonden met de
aardappel. Uit de omgeving hiervan moet dus de groei van
Hi uitgaan, daar deze zoowel X- als V factor noodig heeft.
Aanvankelijk treedt troebeling slechts op in de diepte —
om de aardappel — eerst later door het geheele medium.

1.nbsp;In haemoglobine-, bloed- en gistextractbouillon (vol-
doende X factor) het eerst groei in de bovenste lagen
van het medium waar de zuurstofspanning het grootst
was. Waarschijnlijk gaf Hi dus de voorkeur aan een
hoogere zuurstofspanning. X- en V factor waren door
het heele medium aanwezig.

2.nbsp;In bouillon met rauwe aardappel onder een laag vase-
line — dus onder anaërobe omstandigheden — het eerst
groei van Hi in de diepte om de aardappel. Hieruit
conclusies te trekken omtrent het zuurstofverbruik van
Hi lijkt mij niet mogelijk. De groei in de diepte om de
rauwe aardappel moet in de eerste plaats worden toege-
schreven aan de aanwezigheid van de X factor aldaar
— afgezien van zijn functie — en aan de afwezigheid
van de X factor in de bovenste lagen. Deze vorm van
groei is onafhankelijk van het vaselinedek.

fijngewreven tot een papje door middel van een rasp. Aard-
appelperssap werd hieruit verkregen door het papje uit'te
persen in doeken en achtereenvolgens te filtreeren eerst
door grof, daarna door fijn filtreerpapier.

Het inoculum voor Hc in deze proeven was een
4 mm.® öse rauwe-aardappelbouilloncultuur. Zooals uit voor-
gaande proeven gebleken was, bevatte deze vloeistof alleen
V factor.

Proef I. Het aardappelperssap werd gefiltreerd door
Chamberland Ls en onderzocht op groeifactoren volgens
onderstaande tabel.

Uit deze tabel is gemakkelijk af te leiden, dat in aard-
appelperssap, gefiltreerd door Chamberland Ls, alleen vol-
doende V factor aanwezig was. Toevoeging van X factor
(haematine) was noodig bij bouillon gefiltreerd perssap
om groei van Hi te verkrijgen. Bij aanwezigheid van hae-
matine gistextract in bouillon gefiltreerd perssap
werd geen groei van Hc verkregen, op grond waarvan ver-
ondersteld mag worden, dat naast de X factor ook de C
factor afwezig was.

Proef II. In plaats van door Chamberland Lg werd
aardappelperssap gefiltreerd door Berkefeld N. Dit filtraat
werd onderzocht, waarbij dezelfde resultaten verkregen

Proeflll. Mogelijk was, dat X- en C factor spoedig
vernietigd werden door vrijkomende enzymen. Om dit uit
te schakelen werd het aardappelpapje — dat spoedig bruin
werd, waarschijnlijk door oxydeerende enzymen — dade-
lijk na de bereiding 10 minuten verhit op 70° C. Hierdoor
bleef de bruinkleuring uit. Dit papje werd dan op de ge-
wone manier verwerkt tot aardappelperssap.

De resultaten met dit aardappelperssap, gefiltreerd zoo-
wel door Chamberland L3 als door Berkefeld N, waren de-
zelfde als die uit proef I en II. Alleen V factor kon worden
aangetoond.

Volgens Nelson groeide zijn coryzabacil in media waar-
aan kippenserum was toegevoegd. Dit was voor mij aan-
leiding om een onderzoek in te stellen naar de aanwezig-
heid van groeifactoren in het serum van verschillende
dieren.

Serum winning. Bij paard, rund, schaap en geit
werd serum verkregen door bloed te laten stollen, dat steriel
gewonnen was uit de vena jugularis.

Voor het verkrijgen van kippenserum werd als volgt te
werk gegaan. Kippen werden op de rug gelegd en met
chloroform onder diepe narcose gebracht. Daarna werd
van het borstbeen de huid verwijderd. Vanaf de buik werd
aan weerszijden het borstbeen ingeknipt en naar voren om-
gebogen. Hierbij diende de noodige voorzichtigheid in acht
genomen te worden om te vermijden, dat de lever geraakt
werd, daar kneuzing der lever steeds met groot bloedver-
lies gepaard ging. Het hartezakje werd met schaar en pin-

eet opengeknipt. Bloed werd opgevangen in een steriel
fleschje door een steriele canule in het hart te steken. Door
het kloppen van het hart werd het meeste bloed uit het
lichaam gepompt, hetgeen nog bevorderd werd door het
hart zoo laag mogelijk te houden. Om een groot stollings-
oppervlak te hebben werden de fleschjes op hun kant gelegd.
Ze werden één nacht in de broedstoof geplaatst om de
serumafscheiding te bevorderen.

Proef. Bij bouillon werd gevoegd versch serum al of
niet met haematine en/of gistextract. De groei van Hi en
Hc werd bepaald.

Serum van paard, rund, schaap en geit gaf alleen groei
van Hi bij aanwezigheid van gistextract (V factor). Hc
was niet tot vermeerdering in staat met genoemde sera,
ook niet als voldoende X- en V factor aanwezig waren.
Kippenserum zonder meer gaf een goede groei van Hi en
Hc.

In passage werd voortgekweekt met kippenserumbouillon
tot en met de vierde generatie. Zoowel Hi als Hc konden
m passage voortgekweekt worden.

Kippenserum, vier dagen bebroed (37° C.) en daarna
gevoegd bij bouillonbuisjes, gaf nog volledig goede groei
van Hi en Hc.

Conclusies: In paarden-, runder-, schapen- en gei-
tenserum is alleen X factor aanwezig, geen V factor. In
kippenserum zijn X-, V- en C factor aanwezig. Kippen-
serum bevat geen inactiveerend ferment voor V- of C factor
(werkzaam zijn van het serum na 4 dagen bebroeden bij
37° C).

Serum winning geschiedde door bloed, dat verkre-
gen werd door hartpunctie onder diepe narcose, te laten
stollen.

Het leek mij gewenscht kattenserum te onderzoeken, daar
het Knorr gebleken was, dat in versch kattenserum geen
ferment voorkwam hetwelk de V factor vernietigde. De
mogelijkheid, dat V factor in kattenserum aanwezig kon
zijn, was dus niet uit te sluiten. Daar de C factor steeds
samen werd aangetroffen met de V factor, kon tevens de
C factor aanwezig zijn. De verkregen resultaten (zie on-
derstaande tabel) met kattenserum waren echter maar ge-
deeltelijk in overeenstemming met bovenstaande veronder-
stellingen.

: goede groei van Hc\ geringe groei van Hi.
: geringe groei van Hc (juist zichtbare troebeling).
— : geen groei.

Vnbsp;factor was echter beperkt. Toevoeging van gistextract
gaf een veel betere groei van Hi. Er trad een veel duide-
lijker en sterker troebeling op. C factor kwam in katten-
serum niet voor. Hc groeide niet in kattenserumbouillon,
ook niet na toevoeging van gistextract.

Kattenserum 4 dagen bebroed bij 37° C. en daarna on-
derzocht, bevatte nog V factor in gelijke hoeveelheid. In
kattenserum was dus geen inactiveerend ferment voor de

Konijnenserum gaf alleen groei van Hi in tegenwoor-
digheid van gistextract, geen groei van Hc en bevatte
dus alleen X factor, geen V- en C factor.

Caviaeserum gaf een goede groei van Hi. Door toevoe-
ging van gistextract werd de troebeling nog duidelijker.
Caviaeserum bevatte dus voldoende X factor en een belang-
rijke hoeveelheid V factor. Ook Hc groeide in bouillon met
caviaeserum. Er trad een juist zichtbare troebeling op. Door
toevoeging van gistextract werd die troebeling veel duide-
lijker. Caviaeserum bevatte dus ook C factor. De veel betere
groei na toevoeging van gistextract wees op de behoefte
aan V factor van Hc.

Na 4 dagen bebroeden van caviaeserum trad zonder toe-
voeging van gistextract bij caviaeserumbouillon geen merk-
bare groei op. Werd gistextract toegevoegd, dan vertoonde
zich een duidelijke troebeling bij Hi en Hc. Caviaeserum
had V factor verloren en moest dus een inactiveerende
werking op de V factor kunnen uitoefenen.

Co n c 1 u s i e s: Konijnenserum bevat alleen X factor,
kattenserum voldoende X factor en een beperkte hoeveel-
heid V factor, caviaeserum X factor, een belangrijke hoe-
veelheid V factor en C factor. Kattenserum heeft geen
inactiveerende werking op de V factor, caviaeserum wel.

Bij het winnen van duivenserum werd dezelfde methode
gevolgd als voor kippenserum beschreven werd.

Bij het onderzoek van duivenserum op groeifactoren
werd de mogelijkheid verondersteld, dat de groeibevorde-
rende eigenschappen van kippenserum voor Hc eigen kon-
den zijn aan alle soorten vogelsera.

Duivenserum bevatte, zooals duidelijk is uit bovenstaand
schema, voldoende X-, V- en C factor. Na 4 dagen bebroe-
den bij 37° C. was het duivenserum nog volkomen werk-
zaam. Inactiveerende fermenten voor V- en C factor
waren dus uit te sluiten.

Paarden-, katten-, kippen- en duivenserum werden ge-
filtreerd door Chamberland La en onderzocht. Paarden-
seruni bevatte nog X factor, kattenserum nog X- en V fac-
tor, kippen- en duivenserum nog X-, V- en C factor. Gefil-
treerde kippenserumbouillon, die met meerdere Hc-stammen
onderzocht werd, gaf steeds groei.

Aangenomen mag dus worden, dat de betreffende fac-
toren in alle sera filtreerbaar zijn door Chamberland l3-

Om de levensnoodzakelijkheid van de X factor voor Hc
te bepalen, leek mij een onderzoek met X factor-vrij kip-
penserum van belang. Getracht werd daarom de X factor
uit kippenserum te verwijderen. Hiervoor werd het behan-
deld met carbo animale, waarvan bekend was (Thjötta en
Avëry), dat het X factor kon adsorbeeren.

P r O e f L Kippenserum werd geschud met fijn verdeelde
carbo animale in de verhouding 1 : 10 en vervolgens een
uur bewaard bij kamertemperatuur. Hierna werd de kool
afgecentrifugeerd en het serum gefiltreerd door Chamber-
land La-

Proef 1 L Adsorptie van de X factor aan kool zou be-
vorderd worden door een temperatuur van 37° C. en zou
afhankelijk zijn van de tijd.

Kippenserum werd geschud met fijn verdeelde carbo
animale in de verhouding 1 : 10 en vervolgens een nacht
weggezet bij 37° C. De volgende morgen werd het mengsel
nogmaals geschud en daarna gecentrifugeerd. Het zich

Proef III. Kippenserum werd met carbo animale ge-
mengd in de verhouding 1 : 10, flink geschud, 12 uren weg-
gezet bij 37° C. en gecentrifugeerd. Vervolgens werd het
opnieuw gemengd met een tweede hoeveelheid carbo ani-
male in dezelfde verhouding, flink geschud, 12 uren weg-
gezet bij 37° C., gecentrifugeerd en nu gefiltreerd door
Chamberland Lg.

Het onderzoek van dit aldus verkregen serum is hier-
onder schematisch weergegeven.

Om in dit kippenserum groei van Hi te verkrijgen was
toevoeging van haematine (X factor) noodig. De X factor
was er dus uit verdwenen.

Hc groeide nog rijkelijk in dit X factor-vrije serum met
bouillon en kon in passage hierin voortgekweekt worden.

Kippenserumbouillon (1 : 20) werd 10 minuten verhit bij
verschillende temperaturen en daarna onderzocht op groei-
factoren. Voor dit onderzoek werd de groei van Hi en Hc
in die verhitte kippenserumbouillon nagegaan.

Kippenserumbouillon, 10 minuten verhit bij 80° C., was
reeds troebel door verhitting. De mate van groei voor Hi
en Hc werd in de betreffende kippenserumbouillon daarom
alleen bepaald door microscopisch onderzoek en subcultuur
op chocoladeagar.

Hi groeide in alle verhitte media. X- en V factor waren
dus steeds aanwezig en werden niet vernietigd bij een tem-
peratuur van 10 minuten 100° C. Hc groeide nog slechts
minimaal in kippenserumbouillon, die 10 minuten bij 80° C.
verhit was, waardoor bevestigd werd, dat Hc aangewezen
is op een thermolabiele factor, die reeds aangeduid werd als
C factor.

Conclusie: Ook voor de groei met kippenserum heeft
Hc een thermolabiele factor (C factor) noodig.

Om een indruk te krijgen van de concentratie der groei-
factoren in kippenserum werd de groei van Hi en Hc be-

paald in bouillon, waaraan het betreffende serum in ver-
schillende verdunningen al of niet met haematine en/of
gistextract was toegevoegd.

Uit bovenstaande tabel blijkt, dat de V factor niet meer
aanwezig was in voldoende concentratie voor Hi en Hc bij
verdunning van kippenserum in bouillon 1 : 200. Hetzelfde
geldt voor de C factor ten opzichte van Hc. Bij verdunning
1 : 2000 was geen der factoren nog in voldoende hoeveel-
heid aanwezig.

I. Het groeibevorderend vermogen van verschillende
bloedsoorten werd onderzocht. Hiertoe werd aan Liebig-
bouillon 10% gedefibrineerd bloed van verschillende dieren
toegevoegd.

Alle onderzochte bloedsoorten waren in staat groei te
geven in bloedbouillon zoowel van Hi als Hc. Hierbij wer-
den enkele bijzonderheden opgemerkt.

Bij paarden-, schapen- en runderbloedbouillon evenals bij
konijnenbloedbouillon, bleef met Hc de bouillon volkomen
helder. De groei beperkte zich, zooals reeds eerder werd
opgemerkt, tot de naar de bodem gezakte laag roode bloed-
cellen. Hetzelfde gold voor Hi, maar hier ontstond eerder
een troebeling na eenige tijd bebroeden. Op den duur werd
Hc-bloedbouillon ook donker door haemolyse.

Kippen- en caviaebloedbouillon gaven een duidelijke troe-
beling van de bouillon met Hi en Hc. Dit was geheel in
overeenstemming met het onderzoek van de sera van ver-
schillende dieren, waarbij bleek, dat kippen- en caviaeserum
alle voor Hi en Hc noodzakelijke factoren bevatten.

Terwijl dus niet in alle sera de noodzakelijke groeifac-
toren aanwezig waren, werden deze wel aangetroffen in
alle onderzochte bloedsoorten. Hieruit mag besloten wor-
den, dat de meeste soorten bloedcellen de noodzakelijke
groeifactoren voor Hi en Hc bevatten.

II.nbsp;Bouillon 20% gehaemolyseerd bloed (1 bloed op
1 aqua destillata) gaf groei van Hi, niet van Hc. Misschien
is de verklaring van het niet groeien van Hc in een derge-
lijk medium te zoeken in de concentratie der groeifactoren
en wel in een te geringe hoeveelheid V factor of in een te
geringe hoeveelheid C factor. In bloedbouillon zijn alle
bloedcellen naar de bodem gezakt, waardoor de groeifac-
toren daar in grootere concentratie aanwezig zijn. Voor Hi
is de concentratie der groeifactoren in een dergelijk gehae-
molyseerd bloedbouillonmedium voldoende.

III.nbsp;Bouillon -t- haemoglobine (pulv. Merck) in verdun-
ning 1 : 1000 gaf geen groei van Hi en Hc. Toevoeging van
V2 cc. gistextract bij 10 cc. haemoglobinebouillon gaf groei
van Hi, niet van Hc.

Naast haemoglobine is voor Hi dus noodzakelijk gist-
extract. Haemoglobine kan dus fungeeren als X factor,
niet als V factor. Voor de groei van Hc bleek haemoglobine
hier van geen beteekenis. De beteekenis van het bloed voor
Hc moet in andere oorzaken gezocht worden (V- en C
factor).

Op vaste media, met onvoldoende V factor, groeit Hi
rondom andere bacteriënkoloniën in reuzenkoloniën, waar-
van de V factor, die door genoemde andere koloniën ge-
produceerd wordt, de oorzaak is. Het verschijnsel van de
reuzengroei rondom andere bacteriën wordt aangeduid als
satellitisme. De omringende koloniën worden satellieten ge-
noemd.

Groeibevorderend vermogen van ver-
se h i 1 len d e bacteriën v o o' r H a\emo\p ki-
lus i n f l u en sae en H aem o phil u s c or y -
s a e.

Een vergelijkend onderzoek werd ingesteld tusschen Hi
en Hc wat betrof hun vorming van reuzenkoloniën rondom
andere bacteriënkoloniën.

Als medium werd gebruikt 25% paardenbloedagar, in
platen. Deze platen werden uitwendig verdeeld in 5 secto-
ren. Nadat op de platen Hi respectievelijk Hc was uitge-
streken, werden verschillende bacteriënsoorten in achter-
eenvolgende sectoren uitgezet. Gelet werd op de grootte
der Hi- respectievelijk //c-koloniën rondom de andere kolo-
niën, vergeleken met de grootte van die koloniën op het
midden van de bloedagarplaten.

1)nbsp;Bij Corynebacterium gallinarum bleek een donkere doorschijnende zóne
gevormd te zijn door haemolyse. In deze zóne was de groei van Hi respec-
tievelijk Hc minimaal. Hierbuiten was een zóne van groeibevordering.

Uit de tabel blijkt:
dat verschillende bacteriën groeibevorderend werkten
op Hi en Hc\

dat er een overeenkomst was in graad van groeibevor-
dering tusschen Hi en Hc. Een uitzondering vormde
hierbij Pasteurella avicida, die alleen groeibevorderend
was voor Hi, Hc zelfs iets scheen te remmen.

Zooals reeds gezegd werd, berust het groeibevorderend
vermogen van bacteriën van Hi op hun vorming van V fac-
tor. Die door bacteriën gevormde V factor zou ook de meest
voor de hand liggende oorzaak zijn voor de groeibevorde-
ring van Hc. De werking van Pasteurella avicida zou dan
teruggevoerd moeten worden tot een bepaald antagonisme,
waarbij deze bacil naast V factor tevens remmende stoffen
voor Hc vormde.

Mogelijk was echter, dat het vermogen van bacteriën om
de groei van Hc te bevorderen, terug te voeren was tot een
vorming van thermolabiele C factor, afgezien van vorige
proeven, die wezen op de behoefte van Hc aan V factor. Om
de juiste beteekenis van de groei in reuzenkoloniën door
Hc te begrijpen, was daarom een nader onderzoek noodig.

b. Oorzaak van de groeibevordering van
Haemophilus coryzae door verschil-
lende bacteriën.

Indien de veronderstelling, dat bacteriën naast voldoende
V factor C factor vormden, juist was, moesten ze op hae-
matineagar zoowel met Hi als met Hc reuzenkoloniën
geven.

Gaven ze op haematineagar geen reuzenkoloniën voor
Hc, dan was nog mogelijk, dat die bacteriën naast C factor
voor Hc onvoldoende V factor vormden. In dit geval zou
Hc moeten groeien op haematineagar gistextract.

Werden door Hc op haematineagar -f gistextract ook
geen koloniën gevormd, dan moest worden aangenomen,
dat bacteriën niet in staat waren om C factor te vormen.
Dat bacteriën onvoldoende C factor vormden, die om reu-
zengroei van Hc te geven moest worden aangevuld met
C factor uit het medium, leek onwaarschijnlijk.

Zou Hc alleen op media met C factor in reuzenkoloniën
rondom andere bacteriën groeien — niet op haematineagar
en haematineagar -f gistextract — in welk geval moest
worden aangenomen, dat bacteriën geen C factor vormden,
dan zou het meest waarschijnlijke zijn, dat deze reuzen-
groei van Hc, evenals die van Hi, berustte op de vorming
van V factor door andere bacteriën.

Haematineagarplaten werden gemaakt van een massa,
bestaande uit 100 cc. agar, waaraan V2 cc. van een 1%-oplos-
sing van haematine werd toegevoegd.

Haematineagar gistextract, eveneens in platen ge-
bruikt, was samengesteld uit genoemde haematineagar,
door hieraan in hoeveelheid van 100 cc., 5 cc. gistextract toe
te voegen.

Uit oriënteerende proeven was gebleken, dat het over-
brengen van C factor met het inoculum vermeden moest
worden. Daarom werd met vloeistof uit rauwe-aardappel-
bouillonculturen geënt.

Van iedere soort agarplaten werden 2 groepen van 3
gebruikt, waarvan de eene groep bestreken werd met Hi,
de andere met Hc. Van iedere groep van 3 werd één plaat
op 3 plaatsen geënt met Staphylococcus aureus, een andere
met Staphylococcus albus en de derde met Staphylococcus
citreus.

Aan de hand van bovenstaande overwegingen blijkt uit
deze tabel, dat het meest waarschijnlijke is, dat het satel-
litisch groeien van Hc eveneens berust op de vorming van
V factor door andere bacteriën.

Het onderzoek op groeifactoren voor Hi is een bevesti-
ging van de levensnoodzakelijkheid voor Hi van X- en V
factor naast een derde voedende substantie.

Hc blijkt voor zijn groei geen X factor noodig te hebben,
wel V factor. Naast V factor is als groeifactor noodig een
zeer thermolabiele substantie (C factor), die in verschillen-
de bronnen aanwezig is, o.a. in alle bloedcellen, verschillende
sera en aardappel.

NEiySON filtreerde neusexudaat — verdund met bouillon
— van coryzakippen door 3% cc. Berkefeld V. Met het
filtraat was geen ziekte op te wekken. cc. Filtraat, ge-
voegd bij een agar-bloedmedium, was, na 24—48 uren be-
broeden bij 37° C., infectieus. De coryzabacil was in rein-
cultuur aanwezig. Op een eenvoudige manier kon de bacil
van Nelson aldus geïsoleerd worden.

Onderzocht werd, of het filtreeren ook beteekenis had
voor het isoleeren van Hc. Was uit Berkefeld V-filtraat
van neusexudaat Hc regelmatig te kweeken? Tevens kon
door het filtreeren een indruk verkregen worden van de
grootte van Hc onder verschillende omstandigheden. Lum-
baalvochten — welwillend ter beschikking gesteld door Dr.
Korthoff, uit Leiden — van 2 kinderen, lijdende aan in-
fluenzameningitis, werden eveneens gefiltreerd.

Filtreerbaarheidsproeven voor Hi werden verricht door
Happe en Seixas Paema. HappE beval voor het onderzoek
van fikraten een optimum medium aan, liefst vloeibaar,
omdat daarin groote hoeveelheden filtraat onderzocht kon-
den worden.

Happe 1922 filtreerde reinculturen van Hi door Berke-
feld. Uit 8 van 51 filtraten — dus 15% — was Hi in bloed-
bouillon te kweeken. Van 12 onderzochte kaarsen, lieten er 6
kiemen passeeren. Alle 3 onderzochte stammen gingen een
bepaald aantal keeren door. De doorlaatbaarheid was dus
onregelmatig. Filtraten van 6 monsters influenzasputa, door
voor Ht-cultuur niet geheel ondoorlaatbare kaarsen, bleven
steriel. Welke Berkefeld (N, V of W) gebruikt werd,
werd niet aangegeven. Wel werd vermeld, dat de poriën-
grootte van Berkefeld tusschen 0,2—0,8 micra kon schom-

Skixas Palma 1919 filtreerde bloed van influenzapatiën-
ten. Bloed werd verdund met physiologische NaCl 1 : 20,
1 uur in de broedstoof van 37° C. gezet en daarna gefil-
treerd door een nieuwe Berkefeld. Uit het filtraat was Hi
te kweeken.

Filtratietechniek. Leidraad hierbij waren de
handboeken van Rivers 1928 en Hauduroy 1934. De filters
werden gemonteerd op glasmantels, door middel van gum-
mikurken. Een zijstuk van de mantel werd afgesloten met
een wattenprop. Het geheel, gewikkeld in een doek, werd
gesteriliseerd in de autoclaaf gedurende 10 minuten bij
110—115° C. Het zijstuk van de mantel werd — met in-
schakeling van een terugslagflesch — door een gummislang
verbonden aan een waterstraalluchtpomp. Nieuwe filters
werden gecontroleerd op defecten. Schoonmaken en herstel
der filters geschiedde door uitkoken in een waterbad ge-
durende 1 uur, drogen, uitgloeien in een moffeloven, con-
trole op defecten, monteeren en steriliseeren.

Materiaal. Gefiltreerd werd materiaal van jonge en
oude coryzagevallen, die afkomstig waren uit stammen,
waarbij Hc meermalen geïsoleerd was. Hiertoe werden,
voor iedere filtratie, van twee geïnfecteerde dieren slijm-
vlies en slijm uit neus en periorbitale ruimten in een steriele
mortier onder bijvoeging van enkele dekglaasjes en een
weinig bouillon, goed fijngewreven. NeeSon verdunde dan
daarna de massa met ten hoogste 10 cc. bouillon. Werd
hetzelfde door mij gedaan, dan bleek filtratie onmogelijk
daar de filters verstopten. Daarom werd door mij sterker
verdund om hierdoor het filtratieproces mogelijk te maken.
Veelal werd in totaal 20 tot 25 cc. bouillon toegevoegd.
Aangegeven wordt ook door verschillende onderzoekers, dat
sterke verdunning van materiaal een filtratieproces bevor-
dert. Om evenwel zooveel mogelijk de trant van NeeSon

te blijven volgen, werd slechts zoo weinig mogelijk bouillon
voor verdunning gebruikt.

De onderzochte bloedbouillonculturen en lumbaalvochten
werden 1 : 1 verdund met bouillon.

Uit fikraten van jonge zoowel als van oude coryzage-
vallen waren geen i7c-bacillen te kweeken. Hc was dus
niet door filtratie te isoleeren.

Uit fikraten van jonge en oude bloedbouillonculturen
van Hc waren eveneens geen Hc-bacillen te kweeken.
Uit de twee lumbaalvochtfiltraten van kinderen met in-
fluenzameningitis ontstond een rijke groei van Hi.

1.nbsp;uit de jongste publicaties van hem, dat doorlaatbaarheid
van zijn coryzabacil door Berkefeld V ook slechts tot
de uitzonderingen behoorde;

isoleeren zijn filtratiemethode verlaten had en hierbij
zijn toevlucht zocht tot de afgesloten plaatmethode
(„being more practicalquot;). Hij noemde het een geluk-
kige omstandigheid, dat hij zijn eerste isolaties door
filtratie met Berkefeld V verkreeg. Het betrof fil-
ters met een zeldzame doorlaatbaarheid. Tevens vi^ijst
hij er nog op, dat die filters gemakkelijk verstoppen.

Door deze laatste punten, ook al mogen Hc en de coryza-
bacil van Nelson identiek blijken, worden onze onderzoe-
kingen weinig of niet tegenstrijdig.

Hier moeten vermeld worden de resultaten der onder-
zoekingen van de Blieck dienaangaande. De BliEck kon
bij enkele Hi- en /fc-stammen slechts een geringe aggluti-
natorische verwantschap aantoonen. Een grootere ver-
wantschap bleek door complementbinding. Met geconcen-
treerd f/c-antigeen waren hierbij zelfs geen verschillen tus-
schen Hi, Bac. koch-weeks en Hc aan te toonen. Met alle
waren de bindingen volledig in de toegepaste verdunningen
van Hi-serum en Bac. koch-weeks-samp;rmn-, onvolledig was
dan de binding, met Bac. haemoglobinophilus canis.

Door mij werd alleen de agglutinatorische verwantschap
van Hi en Hc nagegaan. Antisera werden hiertoe gewonnen
bij konijnen. De BliEck verkreeg met sera van kippen, die
meermalen intraveneus ingespoten waren met groote hoe-
veelheden //c-cultuur, slechts tot een verdunning van 1 :
100 een gedeeltelijke agglutinatie. Daarom en ook omdat
in de literatuur voor //i-serumbereiding overwegend konij-
nen gebruikt werden, werden door mij antisera gemaakt bij
konijnen. Met de gebruikte stammen was de normaalag-
glutinatie van die sera beneden 1 : 100. Er werden 4 sera
gewonnen, 2 voor Hc- en 2 voor Hi-stammen.

Om de 5 dagen werd ingespoten in een oorvene, tot 5
maal toe met steeds stijgende hoeveelheid bacillen. Ingespo-
ten werden suspensies van gewasschen bacillen in physio-
logische NaCl, in hoeveelheden van V'z cc., opklimmende tot
1^2 cc. De konijnen verdroegen deze hoeveelheden zonder
ziek te worden. Vijf dagen na de laatste injectie werd het
serum verzameld door uitbloeding en laten stollen van het
bloed. Het zoo verkregen serum werd nog gecentrifugeerd
om de bloedcellen geheel te verwijderen, verdund met

Het was moeilijk een voldoende Hc-bacillen-concentratie
te verkrijgen voor intraveneuze inspuiting en antigeenbe-
reiding Uit de betrekkelijk kleine Hc-koloniën op vaste
media kon bezwaarlijk een groote massa bacillen verkregen
worden In de geschikte vloeibare media was de bacillen-
dichtheid maar matig. Vooral voor antigeenbereiding leek
een grootere dichtheid gewenscht. Om mede bijfactoren,
die zouden kunnen ontstaan indien tevens mediabestand-
deelen gebruikt werden, uit te sluiten, werd daarom uitge-
gaan van gewasschen bacillen. Hiertoe werden 48 uren

oude rauwe-aardappelbouillonculturen van Hi of Hc — na
steriele verwijdering der aardappelstukjes — /2—I uur
gecentrifugeerd in Gerber's electrische centrifuge op I.ÜÜU
toeren Om het naar binnen gaan der wattenproppen hierbij
te voorkomen werden de uit de buisjes stekende stukken
circulair omgeslagen op de buisjes en met elastiekjes stevig
omwonden. Na verwijdering der vloeistof werden de neer-
geslagen bacillen gewasschen met physiologische NaCl en
daarna voor de tweede maal gecentrifugeerd. Verkregen
werden steriele hoeveelheden gewasschen bacillen.

In plaats van rauwe-aardappelbouillon- werden ook wel
kippenserumbouillon(l : 20)culturen gebruikt.

Voor intraveneuze injectie werden deze bacillen gesus-
pendeerd in physiologische NaCl. Bij de antigeenbereiding
werd y.% carbolphysiologische gebruikt. De voor antigeen-
bereiding gebruikte stammen waren van te voren 3 maal,
om de 2 dagen, overgeënt om eventueele spontaanaggluti-

De dichtheid van antigeen en geïnjiceerde suspensies was
zoodanig, dat een blauwe streep op wit papier door de
gevulde cultuurbuizen juist gezien kon worden

dund serum. De serumverdunning -
tabellen — had betrekking op het totaalvolume.

Hc 1
2

Hi 1
2

Hc 1
2

Hi 1
2

: geen uitvlokking.
± : zeer geringe uitvlokking.
— : geheele of gedeeltelijke uitvlokking.
Controle : antigeen -f physiologische NaCl.

De beoordeeling had plaats na een verblijf van de buisjes
in de broedstoof van 37° C. gedurende 1 nacht.

Uit de tabellen blijkt, dat door f/i-stammen met He-
serum en door Hc-stammen met Hi-serum slechts een lage
agglutinatietiter werd bereikt. Hc-serum bevatte dus wei-
nig agglutininen voor Hi en omgekeerd. De onderzochte
Hi- en Hc-stammen gaven echter een hooge titer met
heteroloog serum van eigen soort. Dit gold tevens voor Hi,
niettegenstaande het feit, dat de Hi-groep als heterogeen
bekend staat.

Conclusie: Tusschen Hi en Hc bestaat slechts een
geringe agglutinatorische verwantschap.

Over het al of niet veroorzaken van influenza door de
bacil van Pfeiffer is in de literatuur veel strijd gevoerd.
Door het vrij regelmatig voorkomen van Hi bij influenza
scheen zijn beteekenis vanzelfsprekend. Een afdoend be-
wijs werd echter niet gegeven. Met de bacil, althans bij
proefdieren, de ziekte op te wekken, was niet overtuigend
gelukt. Pfeiffer en zijn aanhangers hielden vast aan de
primaire rol van Hi. Hoewel zij hiervoor het bewijs ook
niet konden leveren, bouwden zij op het feit, dat er niets
was dat er tegen pleitte. Hierbij sloten aan de proeven van
Blake en Cecii, 1922 bij apen. Door intraperitoneale pas-
sage van Hi, eerst door muizen, daarna door caviae, kon-
den zij de virulentie van Hi zóó doen stijgen, dat door
applicatie ervan op de slijmvliezen van neus en mond bij
apen een infectie ontstond, die veel geleek op de influenza
van de mensch. Een groote schakel in het natuurlijke ziekte-
beeld ontbrak evenwel. Spontane besmetting door contact
kwam niet voor. De apen moesten kunstmatig besmet
worden.

Een groot bezwaar voor een overtuigend bewijs in de
richting van filtreerbaar virus of bacil was steeds het ont-
breken van een geschikt proefdier voor proeven met influ-
enzavirus. De onderzoekingen van AndrEwes, Laidlavv en
Smith kregen vooral door het vinden van een zoodanig
proefdier groote beteekenis.

In 1933 toonden de Engelsche onderzoekers Smith,
AndrewES en Laidlaw aan, dat de fret een gevoelig proef-
dier voor influenzavirus was. Filtraten — door filters met

0,6 micra poriëngrootte of zelfs door membranen met 0,25
micra poriëngrootte — van keelspoelingen van influenza-
patiënten gaven een typisch ziektebeeld bij de fret na intra-
nasale toediening. Filtraten van keelspoelingen van men-
schen, die niet lijdende waren aan influenza gaven geen
ziekte bij de fret. Hiermede was de aanwezigheid van een
filtreerbaar virus bij influenzapatiënten aangetoond.
Viruspassage was mogelijk. Door contact kon de ziekte bij
de fret worden overgebracht. Na herstel waren fretten im-
muun voor hetzelfde filtraat. Serum van een herstelde fret
neutraliseerde sterke virusemulsies, normaal fretserum
deed dat niet. Het symptomencomplex vertoonde weinig
verandering, wanneer het filtraat tezamen met Hi werd toe-
gediend. Er bestond verwantschap tusschen filtreerbaar
virus van humane influenza en filtreerbaar virus van var-

Ook varkensinfluenzavirus gaf dezelfde symptomen bij
de fret. Ook hierbij was passage in serie mogelijk, zoowel
door kunstmatige besmetting als door contact en kon ge-
lijktijdige toediening van filtreerbaar virus en Haemophi-
lus influenzae suis weinig verandering in het ziektebeeld

tusschen filtreerbaar virus van mensch en varken. Door
deze antigene verwantschap werden beide virus op een lijn
gesteld Dit was nog meer het geval door de proeven van
EekeeES 1934, waarbij bleek, dat het filtreerbare virus van
de Engelsche onderzoekers, vooral in combinatie met Hi,
longveranderingen bü biggen kon geven. Daar door de
proeven van ShopE vaststond, dat het varkensinfluenzavi-
rus een primaire rol vervult bij varkensinfluenza, werd
indirect een bewijs geleverd voor de aetiologische beteekenis

Eind 1934 maakten AndrEwES, Laidlaw en Smith een
vervolg van hun onderzoekingen bekend. Muizen bleken

gevoelig te zijn voor humaan en varkensinfluenzavirus.
Zij maakten gebruik van de vinding van ShopE — die door
hen bevestigd werd — dat fretten intranasaal geïnfecteerd
met varkensinfluenzavirus onder aetheranaesthesie ernsti-
ger ziek worden. Muizen werden intranasaal ingedruppeld
onder lichte aetheranaesthesie met humaan of varkens-
influenzavirus. Bij een gedeelte der muizen ontstonden
typische longveranderingen. Zoowel humaan als varkens-
influenzavirus was bij muizen in passage voort te kweeken.

De onderzoekingen van Andrewes, Laideaw en Smith
werden in Amerika door Francis 1935 bevestigd. Smith
1935 en Francis 1935 konden tevens uit influenzamate-
riaal in kuikenembryonaalweefsel een filtreerbaar virus
kweeken, hetwelk typische longveranderingen bij muizen
gaf. In hun culturen konden geen elementairlichaampjes
of chlamidozoën gevonden worden. Terwijl bij de Engel-
sche onderzoekers de longen van zieke dieren veelal steriel
bleken bij aëroob kweeken, kon Francis hierin bij een zeker
percentage bacteriën aantoonen.

De Duitsche onderzoeker Kairies 1936 kon: 1.
met griepmateriaal van menschen, 2. met materiaal,
afkomstig van zieke fretten, dat hem toegezonden was
door de Engelsche onderzoekers, 3. met materiaal van
„Ferkelgrippequot; van Köbe en 4. met materiaal van
varkensinfluenza van Shope, het typische ziektebeeld bij
de fret opwekken; met materiaal van Shope en Köbe ook
zonder haemophiele bacillen. Steeds konden echter bij de
zieke fretten influenza-achtige bacillen, die later tot het
geslacht Pasteurella werden gerekend, of Streptococcen
geïsoleerd worden. Ook met materiaal van zieke muizen,
eveneens van de Engelsche onderzoekers, waren muizen te
infecteeren. Uit deze muizen waren steeds Streptococcen te
isoleeren, die in reincultuur ook zware longveranderingen
bij de muis konden veroorzaken. Merkwaardig was, dat
antiserum, afkomstig van de Engelsche onderzoekers, het-

welk bereid was bij het paard, ook beschutte tegen de strep-
tococceninfecties bij muizen. Nu bleken bij gezonde fretten
ook dragers van de genoemde influenza-achtige bacillen
voor te komen. Door meermalen onder narcose glycerine
intranasaal in te spuiten, kon bij een dergelijke drager een
atypische ziekte worden verkregen. Ook blootstellen aan
vochtige koude kon bij de gezonde bacillendragers een
ziekte met hoesten veroorzaken. Spontane ziektegevallen
met een typisch ziektebeeld werden eveneens bij bacillen-
dragers waargenomen. KairiES meent daarom, dat influen-
zamateriaal de fret alleen ziek maakt, omdat het de soort-
eigen kiemen van de fret actief maakt. Door aethernarcose,
waardoor minder resistentie, zou dit nog bevorderd wor-
den. Hij blijft de oorzaak van influenza zoeken m Hi.

De onderzoekingen van Kairiës verzwakken inderdaad
de Engelsche bevindingen, maar konden die niet weer-
leggen. Hoewel door de Engelsche onderzoekers slechts een
beperkt aantal proeven werd verricht, lijkt mij — gelet op
de verwantschap met varkensinfluenzavirus van Shope —
hun filtreerbaar virus toch de meest waarschijnlijke pri-
maire oorzaak van influenza. Of Hi een secundaire rol
vervult, zooals AndrEwëS, Laidlaw en SmiTh aangaven,
dan wel medeoorzaak is, zooals Haemophilus influenzae
suis bij varkensinfluenza, zal dan nog moeten blijken.

De pathogene beteekenis van Hi bij influenzamenmgitis
is nog onbevredigend opgelost. Onderzoekingen van Mar-
garet pittman 1931 e.a. gaven hier nieuwe gezichtspunten
(zie „Andere haemophiele bacillenquot;). Daar Kairiës en
Schmidt 1936 deze en daarbij aansluitende onderzoekingen
niet in aanmerking namen, gaven ze een eenigszins ver-
ward beeld van de pathogeniteit van Hi. De toxische eigen-
schappen van de soort Hi als geheel werden te hoog aan-
geslagen. Daarmede in verband zijn ook de grootere ver-
wachtingen, welke KairiES heeft ten opzichte van Ht bij
influenza, beter te begrijpen.

Reeds vroeg in het bacteriologische tijdperk werd Hi
ontdekt. Door het ontbreken van een geschikt proefdier,
was een filtreerbaar virus bij influenza moeilijk aan te
toonen en hield men zich aan wat men had: de bacil. Het
vinden van een geschikt proefdier voor influenzavirus was
een groote stap vooruit.

Aetiologische proeven voor coryza konden bij kippen
genomen worden en hierbij was geen surrogaat-proefdier
noodig. Nooit gelukte het een filtreerbaar virus aan te
toonen. Veel bacillen werden als oorzaak aangenomen,
maar een typisch ziektebeeld werd hiermee nooit verkregen.
Veel houvast had men niet. Meest werden nog vertegen-
woordigers van het geslacht Pasteurella als oorzaak ge-
noemd. Eerst na een lange ontwikkeling van de bacteriolo-
gie ontdekte de Blieck 1931 Hc als oorzaak van coryza.

Het duurde eenige jaren voordat de ontdekking van DE
BliEck goed doorgedrongen was.

In 1934 verscheen in Amerika een uitvoerig onderzoek,
— zich uitstrekkende over eenige jaren — van Margaret
Lewis en Elizabeth MüELLER, waarvan de opzet was een
filtreerbaar virus te vinden bij de „common cold in
chickensquot;. Alle mogelijke filters werden onderzocht, veel
proeven werden genomen, maar een filtreerbaar virus kon
niet worden aangetoond. Celinsluitsels kwamen niet voor.

Nelson 1933, Dëlaplane, Erwin en Stuart 1934 en
DE BliEck 1934 konden door filtratie geen filtreerbaar
virus aantoonen bij coryza, maar allen schreven de oorzaak
van deze ziekte toe aan een haemophiele bacil.

De Bliëck vond, dat virulent neusexudaat, bewaard in
een glycerinemengsel of bij O—4° C. of in vacuum zeer
spoedig (na 4 dagen) niet meer infectieus was. Het karak-
ter van een filtreerbaar virus ontbrak dus. De contagiositeit

Door mij werden infectieproeven genomen met filtraten
van coryzamateriaal door Berkefeld V (zie onderstaand
overzicht). Was een filtreerbaar virus, gaande door 0,8—
1 2 micra groote poriën, al of niet in combinatie met een
bLcil, de oorzaak van coryza? Deze filtraten, zoowel van
jonge als van oude gevallen van coryza, waren met infec-
tieus. Materiaal, gereed voor filtratie — gebezigd als con-
trólemateriaal — was steeds infectieus en gaf een lang
ziekteverloop. 1 cc. Filtraat of 1 cc. controlemateriaal werd
gebruikt voor besmetting, intranasaal en door de gehemelte-
spleet.

Door Berkefeld V werd dus een werkzaam bestanddeel
tegengehouden. Mogelijk was, dat naast een filtreerbaar
virus een tweede bestanddeel, in de vorm van een bacil,
noodig was en dat deze bacil tegengehouden werd door het
filter. Deze bacil kon: ófwel geen bijzondere eischen stellen
en op agar groeien, ófwel bijzondere eischen stellen, zooals

Een filtreerbaar virus, passeerende door Berkefeld V, al
of niet in combinatie met bacillen, kon niet vastgesteld

infectieus, lang ziekteverloop,
infectieus, kort ziekteverloop,
niet infectieus.

Onderzocht werden de filtraten van 6 jonge en van 6
oude gevallen van coryza, nl. van die, welke verkregen wer-
den bij de filtraties, vermeld onder „Filtreerbaarheidquot;.

Zooals reeds gezegd werd, schreven dë Blieck 1931,
Neeson 1933, Deeapane, Erwin en Stuart 1934, Caeis-
Ta Eeiot en Margaret Lewis 1934 en Schalm en Beach
1934 de oorzaak van coryza toe aan een haemophiele bacil.
De beschreven bacillen werden in dit onderzoek echter als
niet identiek beschouwd (zie „Literatuurquot;).

De Blieck verkreeg met Hc „cultuurcoryzaquot;. De ver-
schijnselen van cultuurcoryza en natuurcoryza waren —
behalve de ziekteduur, die voor cultuurcoryza steeds kort
was en in sommige gevallen het incubatietijdperk
— dezelfde. Terwijl het langste ziekteverloop van cul-
tuurcoryza 18 dagen was, kon natuurcoryza tot 9 maanden
en langer duren. Cultuurcoryza kon kunstmatig en door
contact overgebracht worden. Door het blootstellen aan
koude van geïnfecteerde dieren, infectie van dieren met Hc
andere bacillen (geïsoleerd uit virulent neusexudaat),
superinfectie van cultuurcoryzadieren met Hc en infectie
van dieren met Hc filtraat kon bij cultuurcoryza geen
langdurend chronisch verloop verkregen worden.

Door mij werden in de loop van dit onderzoek voor ver-
schillende doeleinden infectieproeven met Hc genomen.

Versch geïsoleerde bloedbouillon- of agar-bloedculturen van
Hc gaven een ziekteduur van 5—18 dagen, gemidckld 6—^8
dagen; incubatie 1—2 dagen, meestal 1 dag, soms 5 dagen.
Conjunctivaal geïnfecteerd was de incubatie 2 dagen. Bij
dieren, die oedemateuze zwellingen kregen, was de ziekte-
duur vaak het langst. Met bloedbouillon verhitte aard-
appel werd het langste ziekteverloop verkregen, nl. 1 maal
25 en 1 maal 32 dagen.

Pogingen om een langdurend ziekteverloop te verkrijgen
mislukten. Beproefd werden: neuspassageënting van Hc,
neuspassageënting van Hc in combinatie met Staphylococ-
cus aureus en superinfectie van cultuurcoryzadieren met
Staphylococciis aureus. Wel konden oedemateuze zwellin-
gen bij cultuurcoryzadieren in passage opgewekt worden.

Toegegeven inoet worden, dat de oorzaak van het ver-
schil in ziekteduur tusschen cultuurcoryza en natuurcoryza
nog niet geheel werd opgelost. Verschillende overwegingen
zouden aannemelijk kunnen maken, dat bij natuurcoryza
Hc ook de eenige oorzaak is. Deze overwegingen zijn de
volgende:

3.nbsp;de mogelijkheid, dat we voor Hc nog geen volkomen
geschikt medium hebben en bij isolatie dadelijk een ver-
zwakking van Hc optreedt met als gevolg een goedaar-
dig verloop. Typisch was in dit verband, dat met een bij-
zonder medium het langste ziekteverloop werd ver-
kregen.

Echter gaven de jongste onderzoekingen van Nelson een
andere verklaring voor het verschillend verloop van na-
tuur- en cultuurcoryza.

Nelson onderscheidde coryza in twee typen, een met
korte (1—3 dagen) en een met lange (9—31 dagen) incu-
batie. Alleen bij het type met korte incubatie kon hij zijn

coryzabacil isoleeren. Door latere onderzoekingen bleek
hem, dat bij het type met lange incubatie regelmatig cocco-
bacillaire lichaampjes gevonden konden worden, die over-
eenkomst vertoonden met elementairlichaampjes van pok-
ken en andere virusziekten en die tevens leken op ricketsiae.
Deze lichaampjes konden niet gevonden worden bij gezon-
de en cultuurcoryzadieren. De aetiologische beteekenis van
genoemde lichaampjes werd nog niet afdoende aangetoond,
wel werden ze gekweekt in weefselculturen met kuiken-
embryo, nadat gebleken was, dat het kweeken op bacillaire
voedingsmedia faalde. Tevens was het hem gelukt met een
filtraat van exudaat, afkomstig van een coryzageval met
lange incubatie, door een Berkefeld V-filter, die coryza-
bacillen liet passeeren, na 27 dagen coryza op te wekken.
Uit hetzelfde filtraat waren in een agar-bloedmedium geen
bacillen te kweeken. fiierdoor komen, hoewel de sympto-
men, behalve de incubatie, grootendeels dezelfde waren,
beide typen meer als afzonderlijke ziekten naast elkaar te
staan. In één geval veranderde een coryzastam met lange
incubatie in een met korte. Hiermede ging gepaard, dat
Haemophilus gallinarum nu wel gevonden werd.

De door mij onderzochte gevallen van coryza hadden
aanvankelijk alle een korte incubatie. Ook in de gevallen
met de langste incubatie van 5 dagen kon Hc geïsoleerd
worden. Later ontmoette ik ook stammen met langere in-
cubatie, waarbij alle pogingen om Hc te isoleeren misluk-
ten. Deze stammen hadden constant hun lange incubatie-
periode, wat ook beproefd werd om die te veranderen in een
korte.

Nu hadden in de meeste ziektegevallen van NelSon zoo-
wel de dieren met korte als die met lange incubatieperiode
een lang ziekteverloop. Ook mijn coryzastammen met lang
incubatietijdperk hadden alle een lang ziekteverloop. Een
groot gedeelte van de door mij onderzocht coryzastam-
men met kort incubatietijdperk had daarentegen een kort

ziekteverloop. Eén stam was daarbij, die constant een
ziekteverloop vertoonde van 6—10 dagen.nbsp;^

Om nu het verschil in ziekteduur tusschen natuurcoryza
en cultuurcoryza te verklaren, lijkt het mij juist bij vele
gevallen van langdurende natuurcoryza met korte incuba-
tietijd, zoowel in Amerika als in ons land, een combinatie
van twee soorten van ziekte te veronderstellen. Het boven-
aangehaalde eene geval van verandering van incubatietijd-
perk kon dan een voorbeeld zijn voor het ontstaan van

Voor een combinatie van twee ziekten bij langdurende
natuurcoryza met korte incubatietijd pleiten ook mijn waar-
nemingen :nbsp;.

1.nbsp;bij enkele gevallen, waarbij na eenige dagen mcubatie
gedurende 10—12 dagen rhinitis optrad, die daarna
voor een tijd van 6—8 dagen verdween en vervolgens

2.nbsp;bij een filtraat door Berkefeld V, dat — ondanks een
verzorgde afzondering van het ermede behandelde dier
— coryza gaf na 28 dagen. Het betrof een filtraat uit
materiaal van coryzastammen waarbij Hc meermalen
geïsoleerd was.

Steeds werden jonge kippen, van 6 weken tot 3 maanden
oud, gebruikt. De dieren werden aan het instituut opgefokt
of op leeftijd van 3—6 weken betrokken van bedrijven, die
vrij van coryza waren. Alle dieren waren geënt tegen pok-
ken en diphterie met antidiphterin van de Blieck.

Calista Eliot en Margaret Lewis gebruikten kuikens
van 1—7 dagen voor hun infectieproeven. Deze kuikens
waren nooit in contact geweest met volwassen dragers,
waardoor de mogelijkheid, dat ook zij dragers waren, uit-
gesloten werd.

De door mij gebruikte proefdieren waren geïsoleerd op-
gefokt. Door het gebruik van jonge dieren werd de meest
natuurlijke toestand geschapen voor infectieproeven met
coryza. In de natuur komt immers coryza vooral en het
eerst voor bij jonge dieren, zelden bij kuikens. Door de ge-
isoleerde opfok was het drager-zijn uitgesloten.

Voor het aanhouden van coryza werd geënt van dier op
dier. Met een druppelaar werd slijm opgezogen van een
aangetaste kip. Dit neusexudaat werd goed gemengd met
een weinig physiologische NaCl door herhaald opzuigen in
de druppelaar. Geïnfecteerd werd met dezelfde druppelaar
door de neus en door de gehemeltespleet.

Voor iedere proef werd een afzonderlijke kooi gebruikt
in dezelfde ruimte. Kooien met contróleproefdieren bleven
steeds vrij van coryza. Overbrenging door indirect contact
kwam niet voor. Cultuur- en natuurcoryza met korte en
met lange incubatie werden gescheiden gehouden in aparte
ruimten.

Wat hier gezegd wordt, betreft in de eerste pla-ats de
coryza met korte incubatie. Van de coryza met lange incu-
batie waren te weinig stammen in observatie en deze wer-
den niet voldoende onderzocht — hetgeen ook niet in de lijn
van dit onderzoek lag — om hiervan een goede beschrij-
ving te kunen geven. Over het algemeen kan gezegd wor-
den, dat bij de coryza met lange incubatie, behalve de incu-
batie, geen van de coryza met korte incubatie afwijkende
eigenschappen werden aangetroffen.

Wat de coryza met korte incubatie betreft, de kortduren-
de gevallen hiervan hadden dezelfde symptomen als cul-
tuurcoryza. Experimenteel geïnfecteerde dieren vertoonden
na een korte incubatie als eerste verschijnsel het warm wor-
den van het voorste gedeelte van de kam. Dit was een zeker
teeken, dat na 24 uren neusuitvloeiïng aanwezig zou zijn
en was vooral goed te constateeren bij hanen. De neusuit-
vloeiïng was unilateraal of bilateraal. Een beginnende uni-
laterale uitvloeiing werd later meestal bilateraal of unilate-
raal aan de andere zijde. In het begin was de uitvloeiing
even dun, daarna dik muceus. Bij langdurende gevallen kon
de uitvloeiing van grijs-muceus overgaan in geel-muceus.
Dit was ook 't geval bij de langdurende cultuurcoryza. Het
gele slijm was gemengd met veel bacteriën en leucocyten.
In sommige vergevorderde stadia waren tevens kleine kaas-
granula aanwezig, tezamen met slijm. Juist dat geel wor-
den van het grijze neusexudaat onderscheidde een groot
gedeelte van de langdurende gevallen van de kortdurende.
Het neusexudaat was opgehoopt in de neusgangen en in de
orbitaalsinus, kon gemakkelijk uit de neusopeningen ge-
drukt worden of was hier aanwezig. Vaak waren de neus-
openingen bedekt met een laagje stof.

Soms was het ziektebeeld ingewikkelder door een uit-
breiding van de ontsteking naar het periorbitale weefsel.
De oogen waren dan erg gezwollen en betraand. Gesloten

Deze complicatie kon voortduren als de neusuitvloeiïng
verdwenen was en dan langzaam teruggaan. Meestal was
ze reeds eerder genezen. Ook kwam het voor, dat na eenige
tijd alleen voortbestaan der gezwollen oogen, de neusuit-
vloeiïng terugkeerde.

Bij sommige zware hoenderrassen kon de kop geheel
gezwollen zijn. Vooral was hierbij duidelijk een zwelling
van het ondertongweefsel.

De slijmvliezen van neus en sinus waren met veel
slijm bedekt en in de beginstadia i'ood. Seriecoupes, ge-
maakt van neus en orbitaalsinus, vertoonden ontstoken
slijmvliezen met veel ontstekingscellen. Behalve de veran-
deringen aan de slijmvliezen waren geen afwijkingen te
constateeren. Secties waren steeds negatief. De; Bi,ie;ck kon
met orgaanmateriaal, bloed en tracheaalslijm geen coryza
opwekken. Door mij waren uit bloed en organen geen Hc-
bacillen te kweeken. De beschreven coryza was dus een
lokaal proces, beperkt tot neus met sinus en hun omgeving.

Volgens Ne;i.son daarentegen kon bij coryza tevens het
bovenste deel van de trachea ontstoken zijn. Sciïaw en
Beach constateerden in sommige gevallen van coryza,
waarbij zij coryzabacillen aantroffen, eveneens een uitbrei-
ding naar de trachea, bronchiën en longen.

De mortaliteit van de geobserveerde coryzagevallen was
gering. In chronische gevallen konden de dieren steiven
door uitputting. Door een voortdurende belemmering van
de ademhaling met als gevolg een slechte verbranding en
stofwisseling, was deze uitputting zeer goed te verklaren.
Een veel grootere mortaliteit — van 50—80% — beschreven
SctiAEM en Beach. Ook Deeapeane, Erwin en Stuart
hadden een grootere sterfte vooral bij jonge die-ren.

Door het voorkomen van twee soorten van coryza ver-
eischt het inmiuniteitsvraagstuk een nieuw onderzoek.

1.nbsp;De chronische gevallen hiervan gaven immuniteit. Hoe-
lang deze immuniteit tegen een nieuwe infectie duurde,

2.nbsp;Na het doorstaan van een kortdurende natuurcoryza
waren de dieren maar gedeeltelijk immuun. Een ge-
deelte der dieren — opnieuw besmet met materiaal,
dat anders een chronisch verloop gaf — kreeg een kor-
ter verloop der ziekte, waarmede gepaard ging een
langere incubatie. Een dergelijk verloop geeft weer aan-
leiding om bij langdurende natuurcoryza met korte in-
cubatie een tweeledige natuur te veronderstellen. Een
ander gedeelte behield dan een chronisch verloop met
korte incubatie. Bij een kortdurende natuurcoryza
waren kippen echter immuun voor milde natuurcoryza
en cultuurcoryza. Deze geringe immuniteit was na
eenige tijd echter weer verdwenen. In een geval reeds
na een week.

3.nbsp;Cultuurcoryza gaf immuniteit voor cultuurcoryza, ook
slechts voor korte duur. Zes dagen na het verdwijnen
der ziekte bleek bij cultuurcoryza een dier, dat onder-
zocht werd, ook onvatbaar voor de natuurcoryzastam
met ziekteverloop van 6—10 dagen.

Een afdoende therapie voor coryza werd nog niet ge-
vonden. Geen van de aangegeven middelen heeft zich kun-
nen handhaven. De therapie zal rekening hebben te houden
met twee soorten van coryza. Door het locaal karakter der
ziekte en het gebleken antagonisme van Hc en Pasteurella
avicida (zie „Groeifactorenquot;, blz. 79) zou een onderzoek
naar de curatieve waarde van antagonistische bacillen van
Hc op zijn plaats zijn.

Fildes 1924 verdeelde de haemophiele bacillen naar hun
groeifactoren in 1. bacillen die X- en V factor, 2. bacillen
die alleen X factor en 3. bacillen die alleen V factor noo-
dig hadden. Deze indeeling van Fildes werd ook hier ge-
volgd. Afzonderlijk werden behandeld enkele nieuwe ver-
tegenwoordigers van deze groep, waarvan de groeifactoren
nog onbepaald waren.

Bacilvan Cohenf Bac. meningitidis cerebrospinalis
septicaemiaej. Bij kinderen komen gevallen van meningitis
met bacteriaemie voor, waarbij in het lumbaalvocht en bloed
haemophiele bacillen aanwezig zijn. Ook kan een combinatie
van meningitis, arthritis en bacteriaemie of enkel en alleen
een arthritis met haemophiele bacillen voorkomen.

Pfuhl en Walter 1896 en later Slawijk 1899 beschre-
ven reeds het voorkomen van etterige influenzameningiti-
des. Cohen 1909 vestigde er opnieuw de aandacht op. Hij
toonde aan, dat influenzameningitis en epidemische influ-
enza vrij van elkaar stonden en dat de bij influenzamenin-
gitis geïsoleerde Hi-stammen in staat waren na intrave-
neuze injectie konijnen aan bacteriaemie te doen sterven.
Hoewel morphologisch en cuhureel de meningitisstammen
niet afweken van Hi, meende Cohen, vooral op grond van
het pathogeen karakter der meningitisstammen een aparte
soort beschreven te hebben. De vraag bleef echter bestaan
of die pathogeniteit een voldoende reden voor afscheiding
was. Tevens bleek reeds een jaar later (1910) aan Cohen en
Fitzgerald, dat er ook meningitisstammen waren, die geen

bacteriaemie bij konijnen konden verwekken. Waren bij de
publicatie van de onderzoekingen van Cohen nog geen.bac-
teriaemie bij konijnen veroorzakende sputumstammen be-
schreven Parker en Parker 1922, UrEch en Schnijder
1925 beschreven ook dergelijke stammen. Martha Wöll-
stein 1919 en KapsenbErg 1929 kwamen op grond van
serologische onderzoekingen en pathogeniteit voor konijnen
tot de overtuiging, dat een deel der meningitisstammen
onder Hi een afzonderlijke plaats innam. Deze door Cohen
aangegeven afwijkende pathogeniteit voor konijnen leek
zich willekeurig te bewegen door meningitisstammen, even-
wel ook door sputumstammen. Margaret Pittman 1931
bracht de eerste beperking in deze willekeur. Door haar
werden meningitis- en sputumstammen onderzocht. Er
bleken twee soorten van Hi te bestaan, S-stammen en R-
stammen, die in elkaar konden overgaan. De S-koloniën
(5quot;mooth) waren glad en vertoonden het verschijnsel der
„bluish iridescensequot;, d.w.z. iridiseerden bij schuin doorval-
i'end kunstlicht. De R-koloniën (i?ough) waren ruw van
oppervlakte, kleiner dan de S-koloniën en niet veelkleurig
bij schuin opvallend licht. Alleen de S-stammen waren en
bleven doodelijk pathogeen voor konijnen en gaven bacte-
riaemie. WrighT en Ward 1932 konden in vitro met ge-
defibrineerd konijnenbloed de groei van een klein aantal
S-bacteriën niet tegengaan, wel van 9.000.000 R-bactenèn.
Dit wees in de richting, dat alleen S-stammen m staat
waren bacteriaemie bij konijnen te verwekken. MuldER
1934 beschouwde de S-stammen als identiek met de bacil
van Cohen. Ook alleen met S-stammen kon Mulder bacte-
riaemie bij konijnen verkrijgen. De S-stammen werden
vooral aangetroffen bij meningitisgevallen, ook kwamen ze
echter voor bij pneumonieën, in pleura-empyemen en etterig
sputum bij bronchitis. Daar S-, maar ook R-stammen onder
de meningitisstammen voorkwamen, was te begrijpen, dat
verschillende resultaten voor de pathogeniteit bij konijnen

Resumeerend bleken er dus in pathogeniteit voor konij-
nen van Hi afwijkende stammen te bestaan, die het eerst
beschreven werden door Cohhjn^ evenals Hi X- en V factor
noodig hadden en tevens afweken in groei, namelijk met
een sterke lichtschifting der koloniën bij schuin doorvallend
kunst- of zonlicht. Deze afwijkende stammen kwamen voor-
al voor bij meningitisgevallen. Waarschijnlijk zullen deze
stammen tot een afzonderlijke groep gerekend moeten wor-
den binnen het genus Haemophilus influenzae.

Bacillus koch-weeks (Bacterium aegyptiacum,
Lehmann en Neumann). In Egypte was in 1883
een commissie onder leiding van Koch belast met
het cholera-onderzoek. Door deze commissie werd o.a.
ook aandacht besteed aan de in Egypte voorkomen-
de oogontstekingen. Bij een vorm van conjunctivitis,
met mucopurulent exudaat, infectieus, werden door Koch
slanke staafjes aangetoond. Culturen van deze staafjes
werden niet aangelegd. In 1887 werden door WeEks in
New-York overeenkomstige staafjes beschreven bij infec-
tieuze conjunctivitis. Hij verkreeg groei van deze staafjes
op V2% agar, echter alleen in combinatie met een diphte-
roïde bacil. Met mengculturen van deze geïsoleerde bacil en
de diphteroïde bacil kon hij conjunctivitis bij de mensch
opwekken. Deze door Koch ontdekte en door Weeks ge-
isoleerde bacil werd later bekend onder de naam Bac. koch-
weeks.

In de conjunctiva gevonden, werd Bac. koch-weeks als
een aparte soort beschouwd. Al spoedig zag men echter
overeenkomst met Hi. Schneider 1922, Knorr 1924 en
anderen konden geen enkel verschil aantoonen tusschen
Bac. koch-weeks en Hi en beschouwden ze als gelijk.

Bac. koch-weeks zou groeien op ¥21% agar (WeEks
1887, Morax 1896, v. Nesteinger 1918) en goed groeien
op serum- en ascitesagar (Morax 1896, Axeneeed 1913

e.a.). Knorr 1924, voldoende doordrongen van de groote
gevoeligheid van Hi voor bloed en bloedderivaten toonde
aan, dat Bac. koch-weeks eveneens haemophiel was. Hij
verklaarde de groei op agar, serum- en ascitesagar van
vroegere onderzoekers door aan te nemen, dat ze bloed of
bloedbestanddeelen mede overgebracht hadden op of ver-
werkt hadden door hun media. In overeenstemming met
deze aanname was: 1. dat Morax alleen groei verkreeg bij
ernstige gevallen of met veel exudaat, dus in gevallen waar-
bij groote kans was op bloedbijmenging; 2. dat voortkwee-
ken slechts gelukte in één of een paar generaties; 3. dat
AxEnfEld verband constateerde tusschen virulentie en
kweekbaarheid en 4. dat Knorr slechts bij gebruik van een
bepaalde ascitesvloeistof in ascitesagar groei verkreeg.
Reeds Davis 1921 toonde aan, dat Bac. koch-weeks reu-
zenkoloniën vormde rondom andere bacteriën, dat Hi geen
reuzenkoloniën vormde rondom Bac. koch-weeks en om-
gekeerd, dat dus Bac. koch-weeks V factor noodig had
en geen V factor kon vormen. Dit werd bevestigd door
Knorr 1924 en FildES 1924. Fildes 1924 toonde aan, dat
Bac. koch-weeks alleen groeide in het peptonNaCl-basis-
medium met haematine en gistextract, dus X- en V factor
noodig had.

Bac koch-weeks zou de vorm van een staafje hebben,
Hi die van een coccobacillus (Morax 1896, AxEneELD 1913
e.a.). WeichsELbaum en MüllER 1899 alsmede JundELL
1902 wezen op het voorkomen van coccovormen, ook bij
Bac koch-weeks en op de overeenkomst van die vormen
met Hi. Von Nestlinger 1918, SchnEidEr 1922 en
Knorr 1924 onderscheidden bij Bac. koch-weeks, evenals
bij Hi, typen, nl. een meest voorkomend slank type en een
minder vaak voorkomend op Hi gelijkend coccotype.
SchnEidER en Knorr zagen een enkele maal ook nog lang-
dradige typen. De typen konden in elkaar overgaan. Deze
vormverschillen werden gevonden bij typische Koch-

Weeks-conjunctivitis, vrijstaande van epidemische influen-
za. Hiernaast werd nog aangegeven influenzaconjunctivi-
tis, in verband staande met epidemische influenza, die ver-
oorzaakt zou worden door Hi (JundELL e.a.). HammER-
schmidt 1921 zag, dat Hi in culturen ook vaak een slanke
vorm aannam. Resumeerend kon Bac. koch-weeks mor-
phologisch dus niet met zekerheid van Hi worden ge-
scheiden.

De aanvankelijk aangegeven verschillen tusschen Bac.
koch-weeks en Hi konden niet gehandhaafd blijven. Een
gelijkschakeling (Knorr) kon echter slechts oppervlakkig
zijn, daar met Bac. koch-weeks experimenteel conjuncti-
vitis werd opgewekt bij de mensch (Morax 1896, Wëich-
seebaum en MüelEr 1899, Hopemann 1900, LuErssen
1905), terwijl dit van Hi niet met zekerheid bekend was en
voorts omdat Koch-Weeks-conjunctivitis en epidemische
influenza onafhankelijk van elkaar stonden. Hier bleef
daarom Bac. koch-weeks in afwachting afzonderlijk ge-
plaatst.

Haemophilus influenzae suis. Deze bacil
werd door ShopE 1931 geïsoleerd uit de longen en andere
organen van aan influenza lijdende varkens en door hem
onderzocht. Alléén veroorzaakte de bacil geen varkensin-
fluenza, echter wel in combinatie met een filtreerbaar virus.
Een enkele keer was Haemophilus influenzae suis als zoo-
danig pathogeen voor het varken bij intranasale toediening,
waarbij een niet contagieus ziektebeeld ontstond. Filtreer-
baar virus alleen gaf een mild verloopende zeer contagieuze
„filtraatziektequot;.

Haemophilus influenzae suis kwam veel overeen met Hi.
Ze was onbeweeglijk, pleomorph en gramnegatief. Ze bleek
X- en V factor noodig te hebben, waarbij als X factor hae-
matine gebruikt werd en als V factor een Berkefeld-filtraat
van een streptococcencultuur. Ze vormde reuzenkoloniën
rondom andere bacteriën. Agglutinatorisch kwam een

zekere mate van verwantschap naar voren tusschen Haé?wo-
philus influenzae suis en Hi, maar niet geregeld. Chocolade-
agar was het beste vaste medium voor Haemophilus influen-
zae suis, verwarmde bloedbouillon het beste vloeibare me-
dium. Voor primaire culturen was agar-bloed (zie blz. 31)
het meest geschikt.

Bacillus h a e m o g l o b i n o p hilu s c a n i s. Deze
bacil werd onderzocht en beschreven in 1903 door FriEd-
berger, nadat ze reeds door Pfeiffer 1902 was aange-
toond. Ze kwam in groote hoeveelheid voor in praeputiaal-
etter van honden met praeputiaalcatarrhe. Praeputiaalca-
tarrhe werd veel gevonden bij volwassen honden, niet bij
onvolwassen dieren. FriEdbERGER kon met de bacil bij
jonge honden geen praeputiaalcatarrhe opwekken. Dit ge-
lukte ook niet aan latere onderzoekers, zoodat de beteekenis
van Bac. haemoglobinophilus canis onbekend bleef. FriEd-
berger beschouwde de bacil als toevallig in de fluor
levende saprophiet. De bacil bleek nauw verwant aan Hi,
maar niet volkomen eraan gelijk. Ze vormde geen reuzen-
koloniën rondom staphylococcen, groeide beter dan Hi bij
aanwezigheid van weinig haemoglobine (gehaemolyseerd
bloed).

Davis 1921, Kristensen 1922 en Fildes 1924 vonden,
dat Hi reuzenkoloniën vormde rondom Bac. haemoglo-
binophilus canis, dat dus Bac. haemoglobinophilus canis
V factor vormde. De bacil van Friedberger vormde geen
reuzenkoloniën rondom andere bacteriënkoloniën, had dus
geen V factor noodig.

Rivers 1922 toonde voor het eerst met peptonNaCl
haematine duidelijk aan, dat Bac. haemoglobinophilus canis
alleen X factor noodig had, geen V factor. Hierdoor groei-
de de bacil goed met weinig haemoglobine, hetgeen Hi niet

Bac. haemoglobinophiliis canis, afhankelijk van de
X factor, onafhankelijk van de V factor, vormde zelf V
factor.

De bacillen van deze groep waren vaak, maar niet altijd,
plomper van vorm dan Hi, hadden meer neiging tot draad-
vorming, kwamen overigens veel met Hi overeen.

Pritchett en Stielman 1919 vonden in de kelen van
gezonde menschen en van influenzapatiënten een haemoly-
tische bacil, die ze niet plaatsen konden en Bacillus „Xquot;
noemden. Rivers en LeuSchner 1921 rangschikten deze
bacil onder de haemophiele bacillen. Ze kregen reuzengroei
van Bacillus „Xquot; rondom andere bacteriënkoloniën, geen
groeibevordering van Hi door deze bacil en omgekeerd.
Hiermede was aangetoond, dat Bacillus „Xquot; V factor noo-
dig had en geen V factor kon vormen. Fildes 1924 toonde
aan, dat Bacillus „Xquot; alléén V factor noodig had.

Bacillus „Xquot; was evenzeer een bewoner van gezonde als
van zieke kelen en daarom waarschijnlijk onschadelijk.

B a c i II u s p a r a i n f l u e n z a e. Bac. parainfluensae
werd gevonden door RivERS 1922 in twee gevallen van
influenza. Bij het eene geval werd de bacil uit de keel ge-
ïsoleerd, bij het andere geval uit de trachea. Bac. parain-
fluenzae verschilde van Hi, doordat ze alleen V factor noo-
dig had en van Bacillus „Xquot; doordat ze niet haemolytisch
was.

In 1923 werden door Rivers en BaynE-Jones overeen-
komstige bacillen geïsoleerd uit de kelen van katten. In
het geheel werden 6 stammen verkregen van 50 onderzochte
katten.

en trachea van gezonde en zieke — coryzadieren e.a. —
kippen. Hij onderscheidde H-stammen en L-stammen. De
H- (heavy growth) stammen groeiden goed, de L- (light
growth) stammen groeiden slecht. Nelson 1935 vond bij
coryzakippen eveneens stammen, die alleen V factor noodig
hadden en niet pathogeen waren.

Ook bij mijn onderzoek werden uit neusexudaat van co-
ryzakippen meerdere stammen geïsoleerd, die alleen V
factor noodig hadden en niet haemolytisch waren. Ze on-
derscheidden zich van Hc doordat ze beter groeiden,
grootere koloniën vormden en groeiden in peptonNaCl
gistextract. Ze gaven echter nooit coryzaverschijnselen.

Bacterium influenzae suis. Waldmann en
Kobe 1933 onderzochten een, vooral bij jonge varkens, in
Duitschland enzoötisch voorkomende ziekte, waarbij long-
veranderingen op de voorgrond traden. Ze noemden deze
ziekte „Ferkelgrippequot;. Evenals bij de varkensinfluenza van
Shope, vonden zij, dat bij de „Ferkelgrippequot; een filtreer-
baar virus en een haemophiele bacil een rol speelden. De
haemophiele bacil noemden zij Bact. influenzae suis. Fil-
treerbaar virus alléén gaf een mild verloopende „filtraat-
ziektequot;, waarbij geen longveranderingen optraden. Bact.
influenzae suis alléén gaf geen ziekte. Filtreerbaar virus
-f Bact. influenzae suis gaf in enkele gevallen „Ferkel-
grippequot; met typische longveranderingen. Bact. influenzae
suis was echter niet zoo specifiek verbonden aan „Ferkel-
grippequot; als Haemophilus influenzae suis aan varkensinflu-
enza van Shope. Herhaaldelijk werden in de veranderde
longen ook andere bacteriën gevonden, terwijl Bact. in-
fluenzae suis soms niet voorkwam. Ook andere bacteriën
— Bac. bipolaris, Streptococcen — konden secundair een
pneumonie veroorzaken bij de filtraatziekte. Kirchen-

Bact. influenzae suis was onbeweeglijk, pleomorph en
gramnegatief. Ze groeide satelHtisch (Köbe, KirchEn-
bauer). De groeivoorwaarden van Bact. influenzae suis
werden niet onderzocht.

Door mij werden twee uit Riems toegezonden stammen
van Bact. influenzae suis op groeifactoren onderzocht.
Beide stammen groeiden niet in peptonNaCl haematine
-f gistextract, hadden dus andere groeivoorwaarden als
Hi en waarschijnlijk ook als Haemophilus influenzae suis.

Terpstra 1935 onderzocht bij varkens in ons land een-
zelfde ziektebeeld als door Waedmann en Köbe onderzocht
werd. Hij isoleerde ook een haemophiele bacil uit de
aangetaste longen van de betreffende varkens. De groei-
factoren van deze bacil werden niet onderzocht. Volgens
Terpstra was nog niet overtuigend bewezen of het influ-
enzavirus van Köbe van pestvirus te scheiden was.

Haemophilus gallinar urn. Na mijn onderzoek
van Hc was te verwachten, dat een beter oordeel gevormd
kon worden omtrent de identiteit van Hc en de Amerikaan-
sche coryzabacillen.

Voor Hc kon het bloed vervangen worden door rauwe
aardappel. Neeson 1933 verkreeg geen groei van zijn cory-
zabacil in bouillon met X- en V factor van plantaardige
oorsprong. Deeapeane, Erwin en Stuart verkregen aan-
vankelijk (1934) geen groei van hun Haemophilus gallina-
rum in aardappelbouillon volgens Thjötta en Avery, later
(1936) was de groei van hun bacil onbevredigend met
rauwe aardappel.

Hc had V- en C factor noodig, geen X factor. Schaem
en Beach 1936 concludeerden uit hun waarnemingen, dat
Haemophilus gallinarum zoowel X- als V factor noodig
had om te groeien. Evenwel werd daarmede nog niet zeker
bewezen, dat Haemophilus gallinarum ook inderdaad X- en

1.nbsp;omdat Schalm en Bëach als bron voor V factor paar-
denserum gebruikten, waarin door Tjhötta en AvëRY
e.a. alsmede door mij nooit V factor maar alleen
X factor werd aangetroffen;

2.nbsp;omdat alle media, dienende tot bewijs, slechts een ge-
ringe groei gaven, die niet macroscopisch zichtbaar
was. Zijzelf zeiden van die media, dat geen ervan gun-
stig voor de bacil was.

In tegenstelling met mijn bevindingen ten opzichte van
Hc, verkregen Schalm en Bëach eveneens groei van Hae-
mophilus gallinarum op Levinthalagar.

Er openbaarde zich dus verschil in groeivoorwaarden
tusschen de coryzabacil van de Blieck en de betreffende
Amerikaansche coryzabacillen. Verder onderzoek van de
Amerikaansche coryzabacillen zal moeten uitwijzen of dit
verschil gehandhaafd zal kunnen blijven. Bij gelijkheid
kwam om reden van prioriteit ook voor de bacil van de
Blieck de naam Haemophilus gallinarum in aanmerking.
Nu werd hiervoor gekozen de naam Haemophilus coryzae.
Ook al zouden de coryzabacil van de Blieck en de Ameri-
kaansche coryzabacillen identiek zijn, dan nog zou de naam
Haemophilus coryzae te verkiezen zijn boven die van Hae-
mophilus gallinarum, daar deze een geschikte vorm is
voor de harmonische bouw van het geslacht Haemophilus.
Zooals in Haemophilus influenzae het verband uitgedrukt
werd met influenza, werd in Haemophilus coryzae het ver-
band weergegeven met coryza.

De „Society of American Bacteriologistsquot; wenschte orde
te brengen in de chaos van bacteriologische nomenclatuur
en riep hiervoor een comité in het leven. Dit comité meende
voor die ordening een goede basis gevonden te hebben in
de „Internationale Regels voor botanische Nomenclatuurquot;,
zooals die waren vastgesteld op het Internationaal Congres
te Weenen 1905 en te Brussel 1910. Een nieuw geslacht
werd gevormd (1917) in de familie der Bacteriaceae, het-
welk „Haemophilusquot; genoemd werd. Hiervoor werd
de volgende definitie vastgesteld: kleine, niet beweeglijke,
gramnegatieve, staafvormige cellen, zonder sporen, obli-
gaat parasieten, die het best — of alleen — groeien in
tegenwoordigheid van haemoglobine en over het algemeen
bloedserum of ascitesvloeistof noodig hebben. Type van
soort: Haemophilus influenzae.

Doordat bij de vorming van Haemophilus niet voldoende
rekening werd gehouden met de karakteristieke groeivoor-
waarden van Haemophilus influenzae — die toentertijd
ook nog onvoldoende bekend waren, daar ze zich eerst
scherp afteekenden in de publicaties van Thjötta en
Avëry 1921 — werden de grenzen van dit nieuwe geslacht
te ruim genomen. Hierdoor werd plaats geboden aan ba-
cillen met afwijkende eigenschappen, zooals Bac. pertussis,
Bac. duplex en Bac. ducrey.

Verschillende onderzoekers, die desondanks „Haemophi-
lusquot; gebruikten, zagen zich genoodzaakt de eischen voor dit
geslacht te veranderen, waarbij een afhankelijkheid van
groeifactoren verlangd werd.

„Haemophilusquot; gehecht. Er werden alleen bacillen onder ge-
rangschikt, die voor hun groei en voortkweeken bepaalde
factoren uit bloed noodig hadden, welke factoren eventueel
alle of voor een gedeelte vervangen konden worden door
factoren uit plantenweefsel of door factoren van bacillen
afkomstig. Hierbij behielden echter bacillen die onder een
andere benaming beter bekend waren en bacillen waarvoor
de geslachtsnaam Haemophilus nog zou moeten worden m-
gevoerd, hun oude benamingen.

De naam Haemophilus voor een dergelijk gewijzigd ge-
slacht leek mij op zijn plaats, beter nog dan in zijn oor-
spronkelijke beteekenis, dit niettegenstaande bepaalde fac-
toren uit bloed vervangen konden worden door factoren van
andere herkomst, en wel omdat bloed toch altijd het crite-
rium bleef.nbsp;.

moest wel willekeurig zijn, daar geen wettige regels ge-
vonden werden. Te weinig werd in het verleden gelet op
een juiste classificatie. Dringend deed zich bij mijn onder-
zoek het gemis voelen van een definitieve regeling.

De coryzabacil van de Blieck heeft V factor noodig en
een zeer thermolabiele factor uit bloed of plantenweefsel,
welke aangeduid werd als „C factorquot;. Ze voldoet ook aan
de verdere eischen van Haemophilus, behoort dus hier-
onder gerangschikt te worden. Vandaar de naam „H a e-

Op grond van de behoefte aan groeifactoren kon Hae-
mophilus als volgt worden ingedeeld.

Een onderzoek werd weergegeven van de coryzabacil
van de Blieck, die genoemd werd Haemophilus coryzae
(Hc), waarbij die bacil vergeleken werd met Haemophilus

Hc deed zich voor als een pleomorphe, gramnegatieve,
onbeweeglijke bacil, die iets plomper van vorm was dan
Hi. Er werd eenig verband geconstateerd tusschen zijn
vorm en het medium van groei.

De koloniën van Hc waren dauwdruppelachtig, glad,
glanzend, doorschijnend, gaafrandig en steeds kleiner dan
de koloniën van Hi. De grootste koloniën van deze bacil,
die centraal iets wazig waren, werden gevormd op choco-
ladeagar (zie beneden) in een afgesloten ruimte en waren
ruim 1 mm. groot (Hf-koloniën 3 mm.). In verhouding tot
//c-koloniën waren Hi-koloniën fluweelachtig zacht.

Voor Hc kon geen biochemische activiteit worden aan-
getoond, geen haemolyse van bloed, vorming van indol en

Terwijl voor Hi onder wisselende omstandigheden op
een levensduur van 4 weken mocht worden gerekend, was
die levensduur van Hc ten hoogste 2 weken.

Een mengsel, bestaande uit 200 cc. agar en 100 cc. bloed,
dat 10 minuten verhit was op 65° C., gaf het beste vaste
medium voor deze bacil. 10% Bloedbouillon, waaraan een
stukje rauwe aardappel was toegevoegd, vormde het vloei-
bare medium, waarin zich de meeste bacillen ontwikkelden.

oor het aanhouden van Hc werd om andere overwegingen
10% bloedbouillon gebruikt.

Hc had voor zijn groei en voortkweeken V factor noo-
dig, geen X factor. Tevens was deze bacil aangewezen op
een thermolabiele factor, die C factor genoemd werd.
Deze C factor was aanwezig in alle onderzochte bloedcellen,
sommige sera en aardappel. Ze werd vernietigd door ver-
hitting gedurende 10 minuten op 100° C. In bouillon was
deze factor iets thermostabieler.

Het onderzoek op groeifactoren van Hi was een beves-
tiging van de behoefte van Hi aan X- en V factor naast een

De X factor, die bekend stond als thermostabiel en dit
in bloed ook bewees te zijn, bleek in aardappel minder ther-
mostabiel. Dit was niet in strijd met de peroxydase-functie
van de X factor en wel omdat haematine, meermalen verhit,
nog als peroxydase kan fungeeren, terwijl de plantaardige
peroxydasen veel gevoeliger voor verhitting zijn.

Hc uit exudaat en uit cultuur was niet filtreerbaar door
Berkefeld V. Het gelukte niet de filtratie door Berkefeld V
te benutten voor het isoleeren van Hc. Hi, uit twee lumbaal-
vochten van kinderen, die lijdende waren aan influenza-

Er was slechts een zeer geringe agglutinatorische ver-
wantschap aan te toonen tusschen Hi en Hc.

Hc gaf slechts een kortdurende „cultuurcoryzaquot;, met
incubatietijdperk van 1—2 dagen. Zijn virulentie nam af
bij voortkweeken in bloedbouillon. Bij het isoleeren werd
met succes gebruik gemaakt van chocoladeagarplaten, die
afgesloten werden in Weckflesschen. Alleen bij coryza in-
fectiosa gallinarum met kort incubatietijdperk kon Hc ge-
isoleerd worden. Bij coryza infectiosa gallinarum met lange
incubatieperiode, waarbij Nulson nimmer Haemophilus
gallinarum maar wel regelmatig coccobacillaire lichaampjes

aantrof, werd ook Hc nooit gevonden. De coryza irifectiosa
gallinarum met lang incubatietijdperk had steeds een chro-
nisch verloop. De coryza infectiosa gallinarum met korte
incubatietijd had daarentegen ook dikwijls een kort ver-
loop. Om het verschil in ziekteduur tusschen cultuurcoryza
en natuurcoryza te verklaren werd bij langdurende natuur-
coryza met korte incubatietijd in vele gevallen een combi-
natie van twee soorten van coryza verondersteld. Een fil-
treerbaar virus bij coryza infectiosa gallinarum werd niet
aangetoond.

Uit neusexudaat van kippen werden meerdere stammen
van Bacillus parainfluenzae geïsoleerd, die groeiden in
peptonNaCl gistextract, maar geen coryza gaven.

Bacterium influenzae suis bleek andere eigenschappen
te bezitten als Hi en waarschijnlijk ook als Haemophilus

Een gemis aan een definitieve regeling van de nomen-
clatuur der hier behandelde bacillen openbaarde zich.

3.nbsp;Allen R. W., 1910, Lancet, I, blz. 1263.nbsp;,, oen
4 Andrewes, L.-^idlaw en Smith, 1934, Lancet, Oct., blz. 859.

18.nbsp;Cohen Ch. en Fitzgerald J. G., 1910, Zbl. Bact., Abt. I, Orig.,
bd. 56, blz. 464.

24.nbsp;Delaplane J. P., Erwin L. E. en Stuart O. H., 1934, Bull.
244, agricultural exp. station of the Rhode Island state college.

25.nbsp;Delaplane J. P., Erwin L. E. en Stuart O. H., 1936, J. Agric.
Res., bd. 52, blz. 377.

28.nbsp;Eliot C. P. en Lewis R. M., 1934, J. Amer. Vet. Med. Ass.,
bd. 89, blz. 878.

36.nbsp;Francis T., 1935, Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. Proc., bd.
32 t)lz 1172

40.'nbsp;Cohn A. en Preyss W. v., 1902, Zbl. Bact., Abt. I, Orig.,
' bd. 32, blz. 90.

51.nbsp;Internationale Kegels botanische Nomenclatuur, Gustav Fi-
scher, Jena, 1912.nbsp;ru^ li cc

60 Knorr M. en GehlEN W., 1924, Arch. Hyg., bd. 94, bk. 136.
61. Knorr M. en GehlEn W., 1925, Zbl. Bact., Abt. I, Ong., bd.
94 blz 321

71.nbsp;Laidlaw, Smith, Andrewes en Dunkin, 1935, B. J. Exp. Path.,
bd. 16, blz. 275.

73.nbsp;Lewis R. M. en MuellER E., 1934, J. Amer. Vet. Med. Ass.,
bd. 89, blz. 759.

78.nbsp;McGaughey C. A., 1932, J. Compt. Path. Ther., bd. 45, blz. 58.
79 Med. Research Counsil: A System of Bacteriology, vol. II,

82.nbsp;Mulder J., Meer B. J. v. d., Lacroix W. en Oeseburg H.,
1934, Med. Tijdschr. Geneesk., Jg. 78, blz. 2853.

83.nbsp;Mulder J. en Ubbink J., 1934, Ned. Tijdschr. Geneesk., Jg. 78,
blz. 4447.

94.nbsp;Parker F. en Parker J. T., 1922, Soc. Exp. Biol. and Med.
Proc., bd. 20, blz. 23.

98.nbsp;Pritchett I. W. en Stillm,\n E. G., 1919, J. Exp. Med.,
bd. 29, blz. 259.

99.nbsp;Rapport Committee Soc. Amer. Bacteriologists, 1920, J. Bact.,
bd. 5, blz. 191.

112nbsp;Schmidt P. en KairiEs A., 1936, Problem der Influenza, Fer-
' dinand Enke Verlag Stuttgart.

133.nbsp;Waldmann O., 1933, Berl. Tierärztl. Wschr., bd. 47, blz. 693.
134 Waldm.\nn O., 1935, Deuts. med. Wschr., Jg. 61(1), blz

135'. Wasserm.^nn und KollE : Handbuch der pathogenen Micro-
organismen 1930.nbsp;^ , 1 1.1 ^gt;7
136. Weichselb.wm A. en müller L., 1899, Arch. Opthal., bd. 47,

138.nbsp;Williams A. W. en Povitski O. R., 1921, J. Med. Res., bd.
42, blz. 405.

139.nbsp;winchell A. J. en Stillman E. G., 1919, J. Exp. Med., bd. 30,
blz. 497.

Satellitischc sroei van Hamp;emophilus coz-yzacop 25% bloedasar
(na 24 uren) rondom Stamp;phylococcus albus. Vcrgr. 1 : 9-

Satellitischc sroei Haemophilus influenzamp;e op 5% bloedasar
(na £4 uren) rondom Stamp;phylococcus albus, welke laatste door
het nog vloeibare medium semensd was (vlg. de methode Allen).

verhitte=aardappelbloedbouiUon.
Löfflers=Methyleenblauw=preparaat gemaakt uit een 48 uren
oude cultuur. Vergr. 1 : 7oo.

Intensiel/ met Löfflers Methyleenblauw gekleurde bolletjes, al
of niet verbonden aan ketens van bacillen, uit bloedbouillon=
culturen van Hamp;emophilus coryzae (teekening naar foto's).
Vergr. 1 : 700.

Wat Goldschmidt aangeeft omtrent de overerving van
de „Weiblichkeitsfactorquot; bij Lamantria dispar is on-
mogelijk.

Richard GoIvDSchmidt.- „Einführung in die
Vererbungswissenschaftquot;, blz. 492, 496, e.a.

In het Consumptieijs-besluit dient te worden bepaald,
dat consumptieijs geen bestanddeelen van eendeneieren
mag bevatten.

De gewijzigde reactie van Martin vormt een goede en
eenvoudige methode voor het aantoonen van galkleur-
stoffen in het vleesch van icterische dieren.

De uitdrukking „onbruikbaar maken voor voedsel voor
mensch en dierquot; in de Vleeschkeuringswet is onjuist.
Het verdient aanbeveling deze te vervangen door „de-
strueeren of vernietigenquot;.

Het is noodzakelijk, dat varkenspest in ons land van
overheidswege bestreden wordt.

Het is aannemelijker, dat het virus der ziekte van
Aujeszky in ons land kwam door invoer van met dit
virus besmette varkens, dan door import van besmet
varkenspestserum.

Burggraaf A. en Lourfns L. F. D. E.:
Tijdschr. Diergk., 1932, bd. 59, blz. 981.
LourFNS L. F. D. E.: Tijdschr. Diergk., 1935,
bd. 62, blz. 885 en 949.

Bij een torsio uteri praecervicales verdient het aan-
beveling een rund van achteren laag te leggen.

Eigenschap:	X factor	V factor	Derde substantie
Functie	katalysator?	vitamine ?	voedend.
Aanwezig in	bloed, haemoglobine en ijzerhoudende derivaten, aardappel, banaan.	bloed, vooral in roode bloedcellen, bijna alle planten- weefsels en hun extracten.	bouillon, pepton, plantenweefsel. bacteriën ?
Gevormd door	geschikte bacteriën uit bepaalde ijzerverbindingen ?	bijna alle bacteriën.	---
Temperatuur	thermostabiel 120» C.	betrekkelijk thermolabiel.	---
Samenstelling	ijzerhoudend ?	proteïne natuur??	organische ?
Filtreerbaarheid	positief,	positief.	---
Adsorptie door carbo animale	volkomen.	weinig.	---

duidïg seënt in peptonNaCl -f		Micros- copisch	Troebe- ling	Sub- cultuur
1 ■\|3 4	Aardappel Ph 7,6, 20 min. 100» C. Idem -f- haematine..... Idem -(- gistextract..... Idem -f haematine -f- gistextract		t. t. tt. tt.
l b; 2 1 3 ■ 4	Aardappel Ph 6,8, 20 min. 100» C. Idem haematine..... Idem -f- gistextract..... Idem -f haematine -f- gistextract		t. t. tt. tt.
! I c 1 2 ' 3 4	Aardappel Ph 7,6, 20 min. 120» C. Idem -f- haematine ..... Idem -)- gistextract..... Idem 4quot; haematine -j- gistextract		h. h. h. tt.
-li 14	Aardappel Ph 6,8, 20 min. 120» C. Idem -}- haematine..... Idem -{- gistextract ..... Idem -j- haematine -{- gistextract		h. h. h. tt.

Serum van:	Duif
10 cc. Bouillon -j-	Hi	i
V2 cc. serum...........
Idem -(- haematine ....
Idem gistextract....
Idem -f- haematine gistextract . .
Rauwe aardappel. . .

10 cc. Bouillon -j-	Hi	Hc
Vj cc. carbo-kippenserum	—	-f
Idem gistextract ...	—
Idem haematine......		-1-
Idem haematine gistextract . .
Rauwe aardappel.........

Bouillon kippenserum	10 Minuten
Bouillon kippenserum	60quot; C.	70» C.	80' C.	90° C.	100» c,
Hi
Hc			±	—	—

Levensduur Hi zn Hc
Aantal weken:			1	2 3		4	5	6	7	8
Bloed- bouil- Ion	0»	Hi				.			±	—
	0»	Hc		-1-		—	—	-	—	—
	16»	Hi					±	-	—	—
	16»	Hc		±	—	—	—	—	—	—
	37»	Hi
	37»	Hc					±	—	—	—
Choco- lade- agar	0»	Hi	-I-				—	-	—	—
	0»	Hc					—	—	—	—
	16quot;	Hi				±	—	—	-	—
	16quot;	Hc		±	—	—	—	—	—	—
	37»	Hi
	37»	Hc			-f-				±	—

Optimum Ph Hc.
Begin Ph	Groei na :			Eind Ph (na 3 dagen)
Begin Ph	1 dag	2 dagen	3 dagen	Eind Ph (na 3 dagen)
6,6	—	±	±	6,9
6,8	±			6,9
7,0	±			7,2
7,2	±			7,2
7,4				7,4
7,6	±			7,4
7,8	±			7.6
8,0	—			7,7
8,2	—	±		8,1
8,4	—	±		8,3
8,6	—	—	±	8,5

Proefmedium	7 fiï-stammen	7 Jïc-stammen
	—	—
Basismedium -f- X factor , . .	—	—
Basismedium -fquot; V factor . . .	—	—
Basismedium -j- X- en V factor .		—

Medium	Hi	Hc
Bouillon -(- cc. aardappelperssap L3 (Bn) ....	—	—
	—	—
		—
Idem -f haematine gistextract........		—
Rauwe-aardappelbouillon...........

Serum van:	Paard		Rund		Schaap		Geit		Kip
10 cc. Bouillon	Hi	Hc	Hi	Hc	Hi	Hc	Hi	Hc	Hi	Hc

					—	—	—	—
Idem -j- gistextract......		—		—		—		-		-1-
Idem haematine -f- gistextract .		—		—		—		—
								-1-

Serum van:	Konijn		Cavia		Kat
10 cc. Bouillon -f-	Hi	Hc	Hi	Hc	Hi	Hc
Yj cc. serum.......	—	—		±		—
Idem -)- haematine ....	—	-		±		—
Idem -1- gistextract ....		—			-f	—
Idem -f- haematine -j- gistextract		-			-f	—
Rauwe aardappel.....	-f			-1-	-f-f

Aantal gevallen	Materiaal	Bloed- bouillon	Agar- bloed	j Chocola- deagar j (plaat)
20	i Jonge gevallen van coryza, 1 1 dag— 2 weken oud ...	—	—	1
6	Oude gevallen van coryza, ouder dan 4 weken ....	—	—	i ~
4 1	Bloedbouillonculturen van Hc, 24—48 uren oud..... 1	—	1	—
4	Bloedbouillonculturen van Hc, 1—2 weken oud . .	—	—	—
2	Lumbaalvocht (influenzamenin- gitis kind) . . .

Groei- factoren	Soort	Voor- komen	Ziekte	Bijzonderheden
X- en V factor	Haemophilus influ- enzae (Pfeiffer) Subgroep: Bacil v. Cohen	mensch	1, Influenza secun- dair? 2, Kindermeningitis door bac. v. Cohen?	Type van soort. Niet haemolytisch; enkele haemolytisch.
	Bacillus koch-weeks	mensch	Koch-Weeks- conjunctivitis	Identiek Hit
	Haemophilus influ- enzae suis (Shope)	varken	Varkensinfluenza van Shope in com- binatie met een filtreerbaar virus
X factor	Bacillus haemoglo- btnophilus canis (Friedberger)	hond	praeputiaalcatarrhe secundair ?
V factor	Bacillus „Xquot; van Pritchett en Stillman	mensch		In de keel bij ge- zonde en zieke menschen. Haemolytisch.
V factor	Bacillus par ainflu- enzae (Rivers)	mensch kat kip		In de respectieve- lijke respiratietracti.
V- en C factor	Haemophilus cory- zae (de Blieck)	kip	Coryza infectiosa gallinarum
Onbe- paald	Bacterium influen- zae suis (Waldmann)	varken	„Ferkelgrippequot; secundair
Onbe- paald	Haemophilus galli- nirum (Delaplane en Miss Eliot)	kip	Coryza infectiosa gallinarum (Amerika)	Identiek Hel


	J 0
rquot;	O f lt;	%