TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT
OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS
DR. W. E. RINGER, HOOGLEERAAR IN DE FACULTEIT
DER GENEESKUNDE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN
SENAAT DER UNIVERSITEIT TE VERDEDIGEN
TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT
DER WIS- EN NATUURKUNDE OP MAANDAG
7 DECEMBER 1936, DES NAMIDDAGS TE 3 UUR
DOOR

Het beëindigen van mijn wetenschappelijke opleiding aan de
Utrechtsche Universiteit biedt mij een welkome gelegenheid,
U, Hoogleeraren, Oud-Hoogleer aren en Lectoren in de Facul-
teit der Wis- en Natuurkunde, mijn hartelijke dank te betuigen
voor hetgeen Gij aan die opleiding hebt bijgedragen.

Hierbij geldt mijn dank wel in de eerste plaats U, Hoog-
geleerde DE GRAAFF, Hooggeachte Promotor, voor alles,
wat ik van U, gedurende de tijd, dat ik mijn proefschrift bij
U bewerkte, mocht ondervinden. Uw raadgevingen en critische
opmerkingen zijn van zeer veel waarde voor mij geweest; Uw
hartelijke belangstelling zal mij steeds bijblijven.

Hooggeleerde KONINGSBERGER, de bereidwilligheid,
waarmede Gij mij in staat steldet het schimmelpracticum in
Uw laboratorium te volgen, stel ik op hooge prijs.

Verder dank ik mijn vrienden en collega's voor hun belang'
stelling en hulpvaardigheid, die zij mij gedurende mijn studie-
tijd betoonden.

Het personeel van het Pharmaceutisch Laboratorium betuig
ik mijn dank voor de verleende hulp.

Het onderzoek over de deugdelijkheid van de toestand,
waarin levens- en genotmiddelen verkeeren en waarbij zoowel
de daarin aanwezige schimmel- als bacteriesoorten een rol
spelen, althans kunnen spelen, heeft al sinds lange tijd de
belangstelling van de voedingsmiddel-scheikundigen gehad.
Zeer vele onderzoekers hebben zich met het vraagstuk, welke
schimmels en bacteriën hierin voorkomen en welke, meestal
schadelijke invloeden zij op de waar uitoefenen, beziggehouden.

In dit proefschrift zullen enkele levens- en genotmiddelen
in het bijzonder behandeld worden, nl. cacao, meel en eenige
specerijen. De redenen hiervoor zijn de moeilijkheden, ver-
bonden aan het onderzoek hiervan, vooral wat betreft het
schimmelgehalte.

De proef, die gewoonlijk voor het onderzoek daarvan,
althans hier te lande, wordt gekozen, de zoogenaamde
„Schimmelproefquot;^), levert in de praktijk bezwaren op, voor-
namelijk bij de interpretatie der resultaten. Het is daarom,
dat wij aan dit deel van het onderzoek bijzondere aandacht
hebben geschonken.

Na het mykologisch onderzoek werd tevens de bacteriologie
dezer waren in beschouwing genomen.

Om een indruk te krijgen, aan welke infectiemogelijkheden
de door ons in het onderzoek betrokken waren blootstaan en
welke de, daarin te verwachten micro-organismen zijn of kunnen
zijn, willen wij beginnen met een zeer korte uiteenzetting
van de bewerkingen, die deze voedingsmiddelen ondergaan.

De cacaoboonen worden, nadat zij uit de vrucht gehaald
zijn, ter verwijdering van de resten van het aanhangend
vruchtvleesch i) en ter verfijning van de smaak aan een
fermentatie onderworpen. Deze fermentatie bestaat daarin,
dat men de boonen in bakken stapelt en luchtig afgedekt laat
gisten, tengevolge waarvan de temperatuur stijgt. Wij onder-
scheiden hier een uitwendige en een inwendige fermentatie,
d.w.z. een fermentatie van het vruchtmoes en een fermentatie,
die zich in het inwendige der boonen afspeelt. De processen,
die bij de eerstgenoemde fermentatie tot stand komen, zijn
vrijwel bekend, hoewel toch een algeheele opheldering nog
ontbreekt; van de fermentatie in de boonen weten wij nog
maar zeer weinig.

De fermentatie van het vruchtmoes begint bij het opsta-
pelen en eindigt bij het drogen. Een nauwkeurig onderzoek
hiernaar is in 1912 ingesteld door Bainbridge en Da-
vies''). Eenige jaren geleden heeft Otto een uitvoerige
samenvatting over de cacaofermentatie gegeven, welke in
hoofdzaak met de eerstgenoemde onderzoekingen overeen-
stemt. Het verloop van deze fermentatie is in groote trekken
het volgende: Zij wordt veroorzaakt door micro-organismen,
die uit de lucht, van het gebruikte materiaal en, niet te ver-
geten, van de handen der arbeiders op de vruchten geraken.
Het is gebleken, dat als micro-organismen vele gistsoorten,
schimmels, bacteriën en actinomyceten voorkomen.

Door de opstapeling der boonen en de heerschende tem-
peratuur beginnen de aanwezige micro-organismen zich snel
te ontwikkelen, waardoor de temperatuur in de stapel in

O. Loew, C. f. Bakt. II Abt. 21, 533 (1908).
Fickendey, „ II „ 25, 313 (1910).
') J. S. Bainbridge en S. H. Davies, }. Chem. Soc. 101, 2210(1912).
A. Otto, Off. int. d. Fabr. de Choc. et de Cacao II, 437 (1932).

2—3 dagen tot 45°—48° C stijgt. Door de boonen dagelijks
om te werken, wordt er voor zorg gedragen, dat zij niet
hooger wordt dan 50° C.

In het eerste stadium ontwikkelen zich voornamelijk gisten,
zooals Mycoderma-, Saccharomyces- en verschillende Torula-
soorten. Hierdoor worden de aanwezige suikers in alcohol
omgezet. Na deze alcoholische gisting worden de gisten door
bacteriën verdrongen en wel voornamelijk door azijnzuur-
bacteriën, die de alcohol tot azijnzuur oxydeeren. Daarnaast
komen ook coli- en aerogenesbacteriën, melkzuurbacteriën en
schimmels voor, die de suiker afbreken tot melkzuur en andere
organische zuren. Zelfs kan bij een te lange voortzetting en
bij te geringe zuurstoftoevoer een boterzure gisting op-
treden, die zeer ongewenscht is. De door de azijnzure gisting
veroorzaakte verzuring mag niet te sterk zijn, daar dan de
fermentatie, die in de boonen plaats heeft, vertraagd of zelfs
tot stilstand gebracht kan worden. Hiervoor wordt ook door
het dagelijksch omwerken zorg gedragen. De sterke verzuring
in het vruchtmoes heeft tengevolge, dat de bacteriën hun
eigengevormd zuur niet meer kunnen verdragen en beginnen
af te sterven. Dan begint de derde phase, waarin door ver-
schillende schimmelsoorten, gisten en talrijke bacteriën, voor-
namelijk aërobe, sporenvormende bacteriën der subtilis-mesen-
tericusgroep, de organische zuren worden ontleed. Hierdoor
wordt de zuurgraad dus verlaagd. Dit proces mag niet te
lang doorgaan en om rotting te voorkomen, beëindigt men
na een dag of zes de fermentatie door de cacao, na weg-
wasschen van de nog los aanhangende resten van het vrucht-
vleesch, te laten drogen, hetzij in de zon, of kunstmatig in
drooghuizen. Deze drie phasen in het verloop der fermentatie

A. Schulte im Hofe, Die Kakaofermentation u.s.w., Berlin, 1908.
W. Roepke, Cacao, 1917.

Hoewel deze fermentatie vrij nauwkeurig bestudeerd is, is
zij nog steeds niet geheel verklaard. Een belangrijk gevolg
van het proces is, dat het moes voor een groot deel wordt
opgelost en uit de fermenteerbakken afvloeit. Daardoor komen
de boonen vrij. Mogelijk is het hier. evenals bij de kofïie-
fermentatie, een oplossen van de pectinestofFen door micro-
organismen en enzymen in de cellen maar het bewijs hiervoor
ontbreekt alsnog.

Een bijzondere beteekenis heeft de fermentatie van het
vruchtmoes door haar invloed op de fermentatie, die in de
boonen plaats heeft; allereerst door de verhooging der tem-
peratuur en misschien ook door de gevormde stoffen, die in
de boonen kunnen diffundeeren.

De fermentatie in de boonen is het proces, waarop het
bij de bewerking van de cacao speciaal aankomt. Van dit proces
weten wij, zooals gezegd, nog zeer weinig. Wij zien alleen de
uitwerking: het aroma wordt gevormd en de kleur verandert
van violet in chocoladebruin, dit laatste waarschijnlijk door de
splitsing van het glucoside „cacaoninequot;, door een in de boonen
aanwezig enzym in cacaorood, suiker, coffeïne en theobro-
mine. Men stelt zich voor, dat, door de verhoogde tempera-
tuur en door het binnendringen van afcohol uit het moes, ten
eerste de kiem en vervolgens het weefsel der beide cotylen
wordt gedood, waardoor de processen, die wij tezamen fer-
mentatie noemen, kunnen plaats hebben. Men neemt aan,
dat deze processen onder invloed van enzymen uit de cel tot
stand komen. Welke enzymen dit zijn, daaromtrent tasten
wij nog vrijwel in het duister. Deze fermentatie is niet, zooals
die van het vruchtmoes, bij het drogen afgeloopen. Het ver-

') W. Lazarus, Bot. Centralbl. 56, 296 (1893).
C. Schweltzer, Pharmaz. Zeitung 43, 389 (1898).

dient zelfs aanbeveling de boonen niet te snel te laten drogen,
daar zij tijdens het drogen dikwijls nog meer aromatisch
worden.

De cacao bevat dus na de fermentatie als micro-organismen
reeds gisten, schimmels en talrijke bacteriën, vnl. aërobe
sporendragers. Daarbij komt nog het feit, dat vele bewer-
kingen bij de cacao, o.a. het wasschen en het sorteeren, geheel
met de hand geschieden, waarvan besmetting met talrijke
bacteriën het gevolg is. Bij het bewaren van het verkregen
product zal daarna nog infectie kunnen optreden met kiemen,
die in de lucht aanwezig zijn, waaruit dus blijkt, dat in cacao
een zeer groote verscheidenheid van micro-organismen kan
worden aangetroffen.

Dat micro-organismen in meel niet ontbreken, is bij de
zoo ruimschoots bestaande gelegenheid tot infectie eigenlijk
niet te verwonderen. Het aantal dezer kiemen kan dan ook
dikwijls zeer groot zijn.

1.nbsp;infectie van de buitenkant van de graankorrel, de „uit-
wendige infectiequot; en

De eerste is quantitatief overheerschend en ook technisch
meer van belang. Over de „inwendige infectiequot; hebben ver-
schillende onderzoekingen plaats gehad: Na een eerste waar-
neming van Galippe^) heeft kort daarop Bernheim
aangetoond, dat het inwendige van graankorrels niet steriel
was, maar dat daarin coccen aanwezig waren. Echter be-

F. Lafar, Handb. d. techn. Mykologie II, 504 (1905-1908).
') M. Galippe, La semaine médicale 26, 267 (1887) réf. C. Bakt. 3,
108 (1888).

wezen spoedig daarna Büchner i), Fernbach en Leh-
mann®), dat de door Bern heim gebezigde methode voor
het aantoonen van deze micro-organismen niet betrouwbaar
was en onjuiste resultaten gaf. In 1902 is door Lindner
en Chrzaszcz^) evenwel aangetoond, dat bij de gerst reeds
in de bloeitijd verschillende soorten micro-organismen binnen-
dringen, die dan in de rijpe korrel nog aanwezig en kiem-
krachtig zijn.

De grootte van de „uitwendige infectiequot;, dus het aantal
kiemen, dat op de buitenkant van de graankorrel aanwezig
is, hangt geheel af van de mate van reinheid, waarmede de
oogst en de daarop volgende bewerkingen plaats hebben.
Dientengevolge loopt het kiemgetal van de graankorrels, die
in de handel worden gebracht, zeer sterk uiteen, wat ook
blijkt uit de quantitatieve gegevens van H off mann s) en van
Becker «), waarvan de laatste per gram gerst 5000—12.000.000
kiemen telde.

Het kiemgehalte van meel zal des te lager zijn, naarmate
de korrels zorgvuldiger van de zemelen zijn ontdaan. Uit de-
zelfde korrel bereid, zal dus een in technische zin fijner meel
minder kiemen bevatten dan een grover, d.w.z. een meel,
rijker aan zemelen. Waar om verschillende redenen uit tarwe
een meel van hoogere fijnheid bereid wordt dan uit rogge ''),
2al in het algemeen roggemeel meer kiemen bevatten dan
tarwemeel. Een volledige verwijdering van de vruchtwand en
de zaadhuid en de zich daarop bevindende kiemen, is technisch

P. Lindner, zie F. Lafar, Handb. d. techn. Mykologie V, 163
(1905—1914). T. Chrzaszcz, Wochenschrift f. Brauerei, 19, 590 (1902).

niet uit te voeren; de groeve nl., die in de lengterichting over
de korrel verloopt, is door de vruchtwand en de zaadhuid be-
kleed, welke niet van de korrel loslaten. Een door Thomann
onderzocht monster van roggemeel bevatte per gram onge-
veer 28000 op bouillongelatine kweekbare kiemen, tarwe-
meel ongeveer 20000 kiemen.

Luchtkiemen zal men dus in de eerste plaats in meel kunnen
aantreffen, zoowel bacteriën als schimmelsporen, beide in groote
getale. Wij willen hier nog niet nader ingaan op de soorten,
die er in aan te treffen zijn. Het zullen voornamelijk sporen-
dragers zijn en wel, zooals gebleken is, van de subtilis-mesen-
tericusgroep, met alle onaangename gevolgen van dien (vgl.
het draderig worden van brood, z.g.n. „lengquot; door Bacillus
mesentericus ruber).

Schimmelsporen treft men er ook zeer vele op aan. Een
nadere uiteenzetting hiervan willen wij eveneens tot het des-
betreffende hoofdstuk uitstellen.

Zooals reeds in het handboek van Beythien®) door
Kossowicz^) is opgemerkt, is het gehalte aan bacteriën en
schimmels van specerijen vrij hoog. Zijn onderzoekingen gaan
vnl. over de voor tafelmosterd benoodigde grondstoffen. Daarbij
bleek hem, dat dit geldt voor alle gedroogde vruchten en
zaden, die als specerijen worden gebruikt, zooals mosterd-
zaad, anijs, venkel, kardamom, koriander, kummel, nootmus-

A. Beythien, C.Hartwich en M. Klimmer, Handbuch der Nah-
rungsmitteluntersuchung, 1920, III. Teil, 503—504.

wiiten aan de LCnetLr^rf^^^^^ ^^-«^^^alte te
en verpakken en dit gehalte worT^
hooger. Ook hier gaat he irff ^
voorkomende. sporLvortldettfnbsp;quot; ^^ ^quot;^ht

Nu worden vele speceSet t T ^'^^^--'«Poren.
behandelingen onderworpeTzooair? quot;
^et sterke azijn e.a waaJdonbsp;behandeling

kiemgehalte plaits he;ft quot; T'^'^-ing van bet
olie. die Zich in de versmalende quot;ef
cide werking ui, die troZefsVoZ Tnbsp;'

de schimmelproef^) woX ond ' '' ^^ ^^^el aan
-eel. nootmuscaat en pe^nbsp;^^^ cacao.

-Hen de laatste hoofdstkkTaan Te b': -^quot;^-^en.
waren worden gewijd.nbsp;^ bacteriologie van deze

In de „Vereinbarungen zur Untersuchung von Nahrungs-
und Genuszmitteln für das Deutsche Reichquot; beschrijft
E mm erlin g reeds in 1897 een methode om voedings-
middelen op de aanwezigheid van schimmel te onderzoeken.
Hij geeft daar het volgende voorschrift: In ein Erlenmeijer-
Kölbchen von etwa 200—300 cm® Inhalt giebt man ca.
100 cm® Wasser, verschlieszt dasselbe mit sterilisirter Watte,
kocht das Wasser auf etwa 25—30 cm® ein und läszt, nach-
dem man über den Baumwollepfropfen eine Papierhülse ge-
stülpt hat, erkälten. Nach Entfernung des Baumwollepropfens
füllt man thunlichst schnell in das schräg gehaltene Kölbchen —
um das Hineinfallen von Luftstaub zu verhinderen — mittels
eines sterilisirten Löffels aus der Mitte des Gegenstandes so
viel von letzterem ins Kölbchen, dasz die Masse gut durch-
feuchtet ist. Darauf verschlieszt man das Kölbchen wieder
schnell mit dem Baumwollepropfen und Papier und stellt es
in einem Raum von Bruttemperatur (30°—40° C) auf.

Bei stark verschimmelten Gegenständen zeigt sich schon
innerhalb 24 Stunden ein weiszer Ueberzug auf der breiigen
Masse, bei mäszig verschimmelten Gegenständen tritt dieser
erst nach 3—4 Tagen hervor, durchweg um so später, je
weniger Schimmelsporen und Bakterien vorhanden sind.

Vereinbarungen zur einheitlichen Untersuchung und Beurtheilung von
Nahrungs- und Genussmitteln, sowie Gebrauchsgegenständen für das
Deutsche Reich. Heft I, 20 (1897).

moeten hebben. Later zag men in, dat de proef beter in een
Petri-schaal uitgevoerd kon worden, omdat daar meer aërobe
omstandigheden heerschen dan in een Erlenmeijer kolf, daar
in een Petri-schaal een, zij het ook geringe, luchtcirculatie
plaats heeft en schimmels sterk aëroob zijn. De proef bleek
in een Petri-schaal inderdaad iets sneller en iets sterker po-
sitief uit te vallen. Waarom men wel voor meel en cacao,
maar niet voor specerijen, de bepaling heeft veranderd, is ons
niet bekend. Aan de Keuringsdienst in Utrecht wordt steeds,
ook voor specerijen, de proef in een Petri-schaal uitgevoerd.

1. Het resultaat van de proef is sterk afhankelijk van de
wijze van uitvoering. Vooral de vochtigheid is van groote
invloed en moet dan ook nauwkeurig aangegeven worden.
De hoeveelheid water, die men toe moet voegen, is in sommige
gevallen zoodanig, dat de massa nog zeer visceus is; in an-
dere gevallen is de inhoud van de schaal zoo dun-vloeibaar,
dat deze niet om te keeren is. Natuurlijk heeft dit invloed
op de schimmelgroei, wat blijkt uit de volgende waarnemingen,
waarbij enkele monsters meel, cacao, peper en nootmuscaat
3 dagen bij 37° C zijn bewaard met resp. 2, 3 en 4 cm®
water per 1.5 gram der waar.

Hierin beteekent , dat de plaat voor een deel met een
schimmellaag was begroeid, , dat de geheele plaat met
een dikke laag schimmel was bedekt.

Het voorschrift geeft aan: 1.5 g 3 cm^ water. Men ziet,
dat bij verschillende monsters de schimmelproef bij een toe-
voeging van 2 cm» water sterker positief uitvalt. Bij 4 cm®
water is de groei in vele gevallen minder sterk dan bij de
voorgeschreven hoeveelheid.

2.nbsp;De temperatuur van 37° C, die het K.B. voorschrijft
voor de proef, is volgens ons niet de meest aanbevelens-
waardige. Zooals wij later uitvoeriger zullen laten zien, is
deze te hoog. De meeste schimmels hebben een vrij wat
lagere optimum-temperatuur. Het komt meermalen voor, dat
monsters een negatieve schimmelproef bij 37° C geven, daaren-
tegen bij 22° C de uitslag van de proef positief is. Dit is
afhankelijk van de soorten schimmels, die in de waar aan-
wezig zijn en bij 37° C niet, bij 22° C wel groeien. Als
de temperatuur, waar de meeste schimmelsporen gelegenheid
tot uitgroeien verkrijgen, zouden wij 25° C willen noemen.

3.nbsp;Het grootste bezwaar van de schimmelproef is wel de
feeoorc/ee/mg^. Oorspronkelijk was het bij Emmer ling alleen
een qualitatieve proef; men heeft haar later door een in-
deeling in sterk positief, positief, zwak positief en zeer zwak
positief, semi-quantitatief gemaakt. Het is nu echter de moeilijk-
heid, dat deze quahficatie sterk afhankelijk is van de persoon,
die de uitslag beoordeelt. Positief noemt de één het, als de
schaal voor een derde gedeelte met schimmel is bedekt; een
ander noemt de uitslag eerst positief, als de geheele plaat
met schimmel is begroeid. Dit is nog niet zoo erg, tenslotte
mag ieder zijn qualiflcatie voor zich weten, als het punt,
waarop de waar afgekeurd wordt, maar bij de verschillende
onderzoekers hetzelfde is en dat is nu zeker niet altijd het
geval. De één is in zijn beoordeeling veel scherper dan de
ander en daarom wordt behoefte gevoeld aan een scherp

omschreven maat voor de beoordeeling van dit onderzoek.
Om deze reden zijn wij gaan zoeken naar een meer quan-
titatieve en minder subjectieve methode.

Ook is het gewenscht bij de beoordeeling rekening te
houden met de herkomst van het product. De Koninklijke
Besluiten doen voorkomen, alsof de waarde van de schimmel-
proef voor alle waren dezelfde is. Zij stellen immers, zoowel
in het Meel- en Cacao-, als in het Specerijenbesluit, de eisch,
dat na de schimmelproef de waar noch schimmelig, noch op
andere wijze duidelijk bedorven of ontleed mag zijn. Deze
eisch is voor waren als peper e.d., die verkregen zijn, enkel
door het vermalen van het ruwe product, veel scherper dan
voor waren als cacao e.d., die een zekere zuivering, i.e. een
roostproces, hebben ondergaan en dientengevolge minder
schimmelsporen zullen bevatten dan de eerstgenoemde.

Als men de proef volgens het K.B. uitvoert, zal de ge-
dachte opkomen, of dit nu wel de meest geschikte wijze is,
om door schimmel sterk verontreinigde waar te herkennen;
bovendien, om de daarin aanwezige schimmelsporen te doen
groeien, n.1. door het aanmengen met water en het dan één
dag of langer bij verhoogde temperatuur te laten staan. De
meest geschikte methode om de schimmelsporen te laten ont-
kiemen is het zeker niet, daarvoor zijn wel betere voedings-
bodems te vinden, dan een cacao-, meel- of peperpapje, maar
dat is de bedoeling ook niet. Juist, als op deze wijze, enkel
door het bevochtigen en op iets hoogere temperatuur be-
waren, beschimmelen optreedt, is er zeer veel kans, dat de
waar, ook zonder zoo sterke bevochtiging, reeds bij een iets
verhoogde temperatuur gaat beschimmelen en bederven en
dus niet voor het gebruik geschikt mag worden geacht.

Wij keuren de méthode van het K.B. dan ook niet in zijn
geheel af, omdat wij het principe ten volle aanvaarden, n.1.
het uit de handel weren van waren, die in ondeugdelijke
toestand verkeeren, of zoo aanstonds zullen verkeeren, maar

wij willen trachten haar te verbeteren cn aan te vullen door
een wijze van uitvoeren, welke minder persoonlijke factoren,
subjectieve gevoelens en inzichten bij de beoordeeling doen
spreken.

In de hteratuur wordt de proef zeer zelden genoemd.
Emmerling beschrijft haar het eerst in de „Vereinbarungen
zur Untersuchung von Nahrungs- und Genussmitteln für das
Deutsche Reichquot; i). König zegt in zijn handboek bij de be-
paling van het kiemgehalte van meeP), dat de door Emmer-
ling beschreven bepaling „kein einwandfreies Bildquot; geeft.

De proef is opgenomen in de Codex Alimentarius en staat,
als gevolg daarvan, beschreven in de Koninklijke Besluiten
tot toepassing van de artikelen 14 en 15 der Warenwet
(Staatsblad 1919, no. 581).

In de buitenlandsche literatuur wordt er niet over gerept
en het schijnt, dat de proef alleen in ons land geregeld wordt
toegepast.

In 1926 heeft Imhoff®) reeds zijn bezwaren tegen de
schimmelproef uitgesproken op de conferentie voor voedings-
middelscheikunde. Daarna zijn nog eenige artikelen van
Va n Raalte^) verschenen, die het gebruik van pruimenagar
aanraadt.

J. A. Imhoff, Chem. Wkbl. 23, 293 (1926).
A. V. Raai te, Chem. Wkbl. 28, 199 (I93I).

Daar de schimmelproef, op boven beschreven wijze uit-
gevoerd, niet het gewenschte resultaat geeft, zijn wij be-
gonnen met een nieuwe methode te onderzoeken, nl. door
gebruik te maken van speciaal voor schimmels geschikte
voedingsbodems.

In de literatuur worden verschillende daarvoor genoemd;
men kan ze verdeelen in:

1.nbsp;natuurlijke, gemaakt van vruchten als pruimen, rozijnen,
kersen, verder van rijst, aardappelen, wortelen, mout e.d. en

2.nbsp;kunstmatige, bestaande bijv. uit een waterige oplossing
van anorganische zouten en een suiker als koolstofbron.

Het voorschrift, dat Boddaert^) hiervoor geeft, luidt:
200 gram ontpitte, gedroogde pruimen worden met 1 liter
water Vs quot;ur gekookt, gecoleerd, opgekookt en gefiltreerd.
Het Altraat wordt na toevoeging van 2 %nbsp;gedurende

De agar, die wij op deze wijze maakten, bleek bij af-
koeling tot kamertemperatuur niet geheel stijf te worden en
dus niet goed gebruikt te kunnen worden. Het zure pruimen-

') Mededeeling aan Dr. J. D. Filippo, secretaris van de Commissie ex
art. 17 van de Warenwet.

aftreksel zal de agar bij het verhitten op 120° C gedurende
20 min gedeeltelijk ontleed hebben, waardoor deze niet meer
vast wordt. Wij hebben daarom het pruimendecoct en de
agar afzonderlijk gesteriliseerd en deze daarna samengevoegd,
waardoor dit bezwaar was opgeheven.

200 g ontpitte, gedroogde pruimen worden met 500 cm®
water V2 uur gekookt, gecoleerd, daarna 1 uur verhit op
120° C, gefiltreerd, en 20 minuten gesterihseerd op 120° C.
Daarnaast worden 25 g agar opgelost in 500 cm® water,
5 min voorverhit op 120° C, gefiltreerd, daarna 20 min
gesteriliseerd op 120° C. Het pruimenaftreksel en de agar
worden hierna op steriele wijze en onder schudden bij elkaar
gevoegd, in steriele Erlenmeijer kolven van 250 cmquot; ge-
schonken en. afgesloten met een wattenprop, bewaard.

Voor het gieten van de platen smelt men de agar in kokend
water. Als men zorgt, dat men de pruimenagar na samen-
voegen niet lange tijd boven 100° C verhit, blijft zij goed
en verliest de agar niet haar speciale stollings-eigenschappen.

De op deze wijze verkregen pruimenagar had een Pj^, die
variëerde van 3.8 tot 4.2.

Deze worden op dezelfde wijze bereid. De kersen worden
ontpit en de rozijnen worden zoo goed mogelijk in een mor-
tier fijngewreven. Ook hier is het wenschelijk het vruchten-
aftreksel en de agar van elkaar gescheiden te steriliseeren,
hetgeen vooral bij kersen noodzakelijk is, daar deze nog
sterker zuur reageeren dan pruimen.

Een mengsel van 49% moutextract, 49% water en 2%
agar 1 uur voorverhitten op 120° C, flltreeren, buizen vullen

met elk 10 cm® en deze 20 minuten steriliseeren op 120° C.
Ook hier hebben wij het eenmaal gehad, dat de agar niet
mooi stijf werd, zoodat het ook hiervoor waarschijnlijk aan
te bevelen is, het moutextract en de agar eerst na sterilisatie
samen te voegen. Moutagar — 3.7.

De Py hebben wij door toevoeging van een passende in-
dicator (methylrood of methyloranje) in de comparator be-
paald. Hiervoor is het, voornamelijk bij moutagar omdat
deze zeer donker van kleur is, noodig, de agar eenige malen
te verdunnen, voordat men in de comparator beoordeelen
kan. Dit maakt de bepaling natuurlijk minder nauwkeurig,
maar voor ons doel is zij voldoende.

M. Levine and H. W. Schoenlein, A compilation of culture
media for the cultivation of microorganisms, 1930, 23.

Deze laatste drie voedingsbodems bleken minder geschikt
te zijn. Wij wilden nl. een voedingsbodem bereiden, speciaal
voor schimmels, waarop de bacteriën niet of weinig groeiden.
Voor dit doel waren de anorganische agar, de pepton-saccha-
rose-glucose-agar en de zetmeelagar niet zuur genoeg. Boven-
dien groeiden op de anorganische agar aanmerkelijk minder
soorten schimmels.

Behalve deze hebben wij nog een appelagar onderzocht,
maar daarop groeiden de schimmels in 't geheel niet.

De andere voedingsbodems, pruimen-, kersen-, mout- en
rozijnenagar zijn alle evengoed bruikbaar. Op alle komen de
verschillende schimmelsoorten goed op.

Wij hebben bij onze verdere proeven nagenoeg uitsluitend
pruimenagar gebruikt, om het voordeel, dat gedroogde pruimen
het geheele jaar door te verkrijgen en goedkoop zijn en men
dus niet. zooals bij kersenagar het geval zou zijn, in de zomer
groote voorraden zou moeten bereiden en bewaren, wat
natuurlijk zijn practische bezwaren heeft.

De eerste proeven, om de schimmelproef uit te voeren op
een vaste voedingsbodem en deze daardoor minder subjectief en
meer quantitatief te maken, zijn genomen door Van Raalte.
Deze deed zijn proeven met pruimenagar als voedingsbodem
en onderzocht verschillende hoeveelheden der waar, nl. 25,
50 en 75 mg op het aantal aanwezige schimmelsporen, om
na te gaan, of inderdaad het aantal opkomende schimmels
evenredig was met de hoeveelheid gebruikt materiaal en om
uit te maken, welke hoeveelheid materiaal voor de beoor-
deeling het meest geschikt was. De platen werden 2 X 24 uur

bij 37° C bebroed. Proeven zijn gedaan met tarwebloem,
kindermeel, maizena en nootmuscaat. Bij een klein aantal op-
gekomen kolonies bleek van een directe evenredigheid geen
sprake te zijn; bij een opkomen van tien of meer schimmels
op de plaat van 75 mg was de geleidelijke opklimming in
aantal met de geënte hoeveelheid echter wel duidelijk. Waar-
schijnlijk zou men, indien men met een grooter aantal schimmels
per plaat had gewerkt, wel betere evenredigheid hebben ver-
kregen, want in de microbiologie gaat de evenredigheid in
het algemeen niet tot minder dan tien kolonies per plaat.
Op de beoordeeling van zijn platen komen wij later terug.

Een nauwkeurig voorschrift van hun werkwijze is niet ge-
publiceerd. Ook wordt niet vermeld op welke wijze de pruimen-
agar is bereid.

Boddaert^) beveelt een methode ter onderzoek aan, die
als volgt luidt: 1 gram meel, resp. cacao, wordt met 10 cm®
steriel water in een steriel mortiertje aangewreven, met een
steriele pipet wordt 0.1 cm® gebracht op de oppervlakte
van pruimenagar, welke zich bevindt in een Petri-schaal van
12 cm diameter, en daarop met een metalen draad zoo ge-
lijk mogelijk verdeeld. De plaat wordt daarna in een broed-
stoof van ca 34° C geplaatst. Na 24 uur worden de schimmel-
kolonies geteld. Later geeft hij nog aan de proef, in plaats
van met 0.1 cm®, met 0.2 cm® van de suspensie uit te voeren
en de platen ook na 2 X 24 uur te beoordeelen.

Verder zegt hij, indien 10 kolonies per 0.1 cm® zijn op-
gekomen, de uitkomst als positief te beschouwen.

Door het aanmengen met water wordt het meel, de cacao
enz., beter in de pruimenagar verdeeld dan wanneer men het
materiaal droog met de pruimenagar mengt.

de agar gaat met behulp van een metalen draad niet ge-
makkelijk. Men kan daarvoor beter een steriele glazen Dri-
galsky-spatel nemen. Het bezwaar hiervan, nl. dat er vrij veel
van het meel aan blijft hangen, is op te heffen, door op een
tweede plaat een tweede 0.1 cm® met dezelfde spatel uit te
strijken, waarbij men mag verwachten, dat hieraan ongeveer
een zelfde hoeveelheid meel of andere materie blijft kleven.
Het is echter niet noodzakelijk dit te doen, omdat ons ge-
bleken is, dat deze fout ver binnen de proeffout valt. De fout
is nl. 1 7o deze overeenkomst bereiken de duplo-be-
palingen nimmer.

Wij hebben bij onze bepalingen de methode nog iets ge-
wijzigd, nl. door van de suspensie van 1 g der waar in 10 cm®
water, 1 cm® in een Petri-schaal te brengen en hieraan de
nóg juist vloeibare pruimenagar toe te voegen, waarna de
plaat wordt rondgezwenkt, teneinde het meel goed in de agar
te verdeelen.

De reden, dat wij 1 cm®, dus vijfmaal zooveel als Bod-
daert, van het materiaal gebruiken, is, dat wij liefst zooveel
mogelijk kolonies per plaat wilden verkrijgen, zooveel, dat
de plaat nog goed telbaar, d.w.z. met goed gescheiden schim-
melkolonies bedekt, was, omdat dit getal het meest overeen
zal komen met het werkelijke aantal kiembare schimmelsporen
in de waar.

Ten tweede verdeelen wij de suspensie in de pruimen-
agar en strijken haar niet over de oppervlakte uit. In het
laatste geval zou men de plaat niet kunnen omkeeren, omdat
1 cm® water niet door de pruimenagar wordt opgenomen,
maar er op blijft liggen. Wij gaven er de voorkeur aan,
de platen omgekeerd in de broedstoof te plaatsen om geen
hinder te hebben van condenswater, dat zich tegen het deksel
van de Petri-schaal verzamelt en op de voedingsbodem
druppelt.

is, de schimmelsporen over de oppervlakte van devoedings-
bodem uit te strijken dan hen in deze te verdeelen, omdat
schimmels sterk aëroob zijn. Wij hebben echter steeds gewerkt
met een dunne laag pruimenagar in de Petri-schaal en het
bleek, dat op deze wijze dezelfde schimmels in hetzelfde
aantal opkwamen, als bij verdeeling over de oppervlakte.
De schimmelsporen schijnen door deze dunne laag agar ge-
makkelijk te kunnen uitgroeien tot de oppervlakte en daar
een kolonie te vormen. Zie hiervoor tabel II.

Bij waren, als nootmuscaat e.d., waarin harde brokjes voor-
komen en waarvan geen, pipetteerbare, suspensie te maken
is, hebben wij 0.1 g in de Petri-schaal afgewogen, even met
een weinig steriel water bevochtigd, opdat wij deze beter in
de pruimenagar konden verdeelen en zij niet in klontjes aan
elkaar zouden blijven hangen, om daarna de agar toe te voegen.

Wij hebben nog proeven genomen met het vermalen van
nootmuscaat tot een fijnheidsgraad B 20 in een goed gerei-
nigde molen, maar voordeden bleek dit niet te bieden.

Blijft de kwestie van de broedtemperatuar. De temperatuur
van 37° C, die in fiet K.B. aangegeven staat, is allerminst de
juiste. Deze temperatuur werd waarschijnlijk gekozen, omdat
het meeste bacteriologische onderzoek bij die temperatuur
wordt uitgevoerd en het alleen de bedoeling was het materiaal
bij grootere vochtigheid en een verhoogde temperatuur te
observeeren. Deze temperatuur is echter voor het meerendeel
der schimmels te hoog. Gaat men na, welke de optimumtem-
peratuur van de verschillende, meest voorkomende schimmels
is 1), dan blijkt, dat, wil men zoo veel mogelijk alle aanwezige
schimmelsporen op de plaat zien verschijnen, men een tem-
peratuur tusschen 20° C en 30° C zal moeten kiezen.

Na vier dagen broeden, ontstaan platen met vele kleine,
goed van elkaar gescheiden schimmelkolonies, hoofdzakelijk
bestaande uit Penicillium glaucum en Mucor stolonifer. Deze
platen zijn goed telbaar. Aspergillus-soorten komen bij deze
temperatuur niet op. In reincultuur groeien zij bij 22° C wel,
zij het niet vlug, maar in de Petri-schaal, waar het gaat om'
de survival of the fittest, is Penicillium glaucum in het voor-
deel, die 22° C als optimum-temperatuur heeft.

Directeur van die dienst op deze plaats nogmaals onze hartelijke dank be-
tuigen.

groot deel overgroeid, dus niet meer telbaar zijn. Dit is
voornamelijk het geval bij meelsoorten, waarin zich sporen
van Mucor stolonifer bevinden, die zich bij deze temperatuur
zeer snel ontwikkelen en in korte tijd de geheele plaat over-
groeien. Daar dit een zeer veel voorkomende schimmel is,
is het dus niet aan te bevelen de proef alleen bij 37° C uit
te voeren. Penicillium glaucum komt dan zelfs in het geheel
niet op. Bij 37° C ontstaan voornamelijk kolonies van Mucor
stolonifer en van verschillende Aspergillus-soorten.

Echter is de proef ook niet alleen bij 22° C in te zetten.
Als men de proef bij beide temperaturen uitvoert, zoowel bij
37° C, als bij 22° C, brengt men op deze wijze alle soor-
ten tot ontwikkeling en krijgt men een overzicht van de
schimmelrijkdom, qualitatief, zoowel als quantitatief, van de
waar.

Omdat het de bepaling zou vereenvoudigen, werd gezocht
naar een temperatuur, gelegen tusschen 22° C en 37° C,
waarbij zich zooveel mogelijk alle schimmelsoorten zouden
ontwikkelen, terwijl de platen niet te snel zouden worden
overgroeid, dus goed telbaar bleven.

Deze temperatuur bleek nog te hoog te zijn. Aspergillus-
soorten groeiden te snel, vormden te groote kolonies, terwijl
aanwezige Penicillium glaucum niet geregeld opkwam.

Dit bleek een goede tusschen-temperatuur te zijn. De meest
voorkomende soorten komen hier goed op. De platen zijn
in het algemeen goed telbaar, soms reeds na drie, meestal na
vier dagen. Hiermede is natuurlijk niet gezegd, dat men alle
aanwezige schimmelsporen bij deze temperatuur tot ontwik-
keling zal brengen. Dit zal waarschijnlijk ook wel niet het
geval zijn, maar deze temperatuur is, volgens ons, de meest ge-

1 g der waar wordt met 10 cm® „f^wol * •
r-ecn-scnaal, met diameter van 9 a innbsp;u i

De beoordeeling van het resultaat behoort te geschieden,
rekening houdende met de voorafgegane behandeling van het
product; men mag niet aan alle waren, als meel, cacao en
specerijen, zoo totaal verschillend in aard, wezen en samen-
stelling, dezelfde graad van reinheid stellen, zooals het K.B.
dit doet.

Men kan zich afvragen, of het noodig is, dat men de proef
steriel uitvoert, omdat in de praktijk de waren ook niet
steriel behandeld worden. Dit is in ieder geval noodig, om
een zoo juist mogelijk beeld te krijgen van de toestand, waar-
in de waar zich bevindt, omdat de mogelijkheid bestaat, dat
bij de reiniging van het glaswerk nog schimmelsporen hierin
achterblijven, die de proef minder nauwkeurig zouden doen
uitvallen, te meer, daar jonge schimmelsporen zéér groote
kiemkracht bezitten.

Invloed van eenige aetherischc oliën cn anorganische
zouten op de groei van Mucor stolonifer

Deze schimmel behoort tot de Phycomycetes en wel tot
de Mucorineae ( en - vormen zygosporen). Zij vormt
lange, onvertakte hyphen zonder tusschenschotten en hecht
zich door middel van zoogenaamde rhizoiden aan het sub-
straat. Aan het einde van elke hyphe vormt zich bij Mucor
stolonifer een sporangium met columella. Dit sporangium is
geheel gevuld met sporen en springt bij het rijp zijn der
sporen open, waardoor deze laatste worden verspreid.

Men ziet bij een cultuur in een Petri-schaal een grijs-witte
massa van lange, dooreengevlochten hyphen en een groote
hoeveelheid zwarte kopjes, de sporangia. Mucor stolonifer
komt zeer verspreid in de natuur voor en is dientengevolge
vnj geregeld in cacao, meel e.d. producten aan te treffen.

Voert men met deze waren de schimmelproef uit, dan is
bij aanwezigheid van sporen van deze schimmel binnen drie
dagen de geheele pruimenagar-oppervlakte bedekt met de
hyphenmassa, die van één spore afkomstig kan zijn. Hier-
door kan men kolonies van andere, aanwezige, schimmelsporen
niet zien en als gevolg daarvan geen goed beeld krijgen van
de schimmelrijkdom van de waar.

waren cacao en meel, dan bemerkt men, dat tallooze malen
de platen overgroeid waren, soms bij één. maar dikwijls
bij beide ingezette proeven. Deze overgroeiïng is bijna steeds
aan Mucor stolonifer te wijten. Een enkele maal was Mucor
racemosus de oorzaak, eveneens een veel voorkomende schim-
mel, die na verwant is aan Mucor stolonifer. waarvan de
hyphen echter racemeus vertakt zijn, terwijl de hyphen van
Mucor stolonifer onvertakt zijn.

Ons doel was om te trachten de een of andere stof aan
de pruimenagar toe te voegen, waardoor de groei van Mucor
stolonifer een weinig werd belemmerd en deze niet zóó sterk
uitgroeide, terwijl de andere schimmelsoorten er geen, of ten-
minste heel weinig, hinder van zouden ondervinden.

In de literatuur zijn vrij veel proefnemingen te vinden over
werkingen van vergiften op schimmels, maar vele van deze
proeven zijn uitgevoerd met Penicillium glaucum, Aspergillus
niger e.a. Penicillium- en Aspergillus-soorten, maar niet velen
hebben Mucor stolonifer als proefobject gebruikt.

In 1902 beschrijft Pulst i) proeven, genomen over de
„Empßndlichkeit der Vegetation und Fruktifikation der Schim-
melpilze gegen Cu-, Ni- und Zn-salzenquot;. Hij gaat dit na
voor Mucor mucedo, Aspergillus niger, Botrytis vulgaris en
Penicillium glaucum. Hij gebruikt de volgende voedingsop-
lossing :

Hij ging de invloed na van koper in de vorm van koper-
sulfaat en complex gebonden als tartraat, verder van zink-

Hij kwam bij zijn proeven ook tot het, door het werk van
Richards i)e.a. reeds bekende feit, dat kleine hoeveelheden
van deze metaalionen een vermeerdering van de groei be-
werkstelligen, maar dat een iets grootere hoeveelheid vrij
sterk remmend daarop werkt.

Uit bovenstaande en ook uit andere tabellen blijkt, dat
volgens Pulst Penicillium glaucum de grootste hoeveelheid
van deze zouten kan verdragen, dan volgen Aspergillus niger
en Botrytis vulgaris en het gevoeligst is Mucor mucedo.

Andere onderzoekingen over dit onderwerp zijn o.a. die
van Fargher, Galloway en Probert die de giftigheid
van salicylanilide. o-chloormercuriphenol. p-acetoxymercuria-
nilide, thalliumcarbonaat, p-nitro- en trichloorphenol nagingen
voor enkele soorten van de geslachten Penicillium en Asper-
gillus, o.a. Aspergillus niger en Aspergillus flavus en Rhizopus
arrhizus, Cladosporium herbarum en Fusarium. Zij gebruikten
niet Mucor stolonifer als proefobject, dus deze waarnemingen
geven ons geen vergelijkingsmateriaal, evenmin de proeven

R. G. Fargher, L. D. Galloway, M. E. Probert, Journ. Textile
Inst. 18, 99 (1927); Journ. Textile Inst. 21, 245 (1930)

van Burgess 1), die voornamelijk de werking van de vet-
zuren naging, waarvan capryl-, capron- en laurinezuur de
groei van schimmels bleken te vertragen, terwijl de meer
samengestelde vetzuren, als bijvoorbeeld oliezuur, deze be-
vorderen.

Behalve van bovengenoemde stoffen, is het bekend, dat
ook aetherische oliën een sterk remmende werking op de
schimmelgroei uitoefenen. Burgess geeft ook aan, dat deze
oliën wol tegen schimmelvorming beschermen. Twintig jaar
voor hem vond Bitting^), dat piment, kaneel en kruidnagelen
sterker antiseptische eigenschappen bezitten dan de andere
specerijen. Hij ging hiervan de werking na op een schimmel,
waarvoor hij Penicillum glaucum nam, en een gist, die niet nader
is omschreven. Reeds geringe hoeveelheden van een waterig
extract van kaneel en kruidnagelen verhinderden de groei
van de schimmel; mosterd, paprika en cayenne-peper belem-
merden de groei wel, maar konden deze niet geheel tegengaan,
terwijl gember, foelie en zwarte peper geen uitwerking hadden.

De resultaten met de gist verschilden weinig hiermede.
Kaneel vertoonde de sterkste werking, dan volgde kruidna-
gelen, na deze cayenne- en zwarte peper, terwijl gember,
mosterd en foelie geen invloed uitoefenden.

Later publiceerden Hoffmann en Evans®) en Bach-
ra an n^) resultaten van uitgebreidere onderzoekingen, die in
het algemeen met het werk van Bitting overeenstemmen.
Voornamelijk kaneelaldehyde en eugenol vertoonen een zeer
sterke werking, welk feit door B a c h m a n n later nogmaals
werd bevestigd.

Wij hebben nu zelf proeven genomen, om de invloed van
aetherische oliën, zoowel als van eenige anorganische zouten
op de meest voorkomende schimmels na te gaan, hierbij dus
speciaal lettende op het verschillend gedrag van Mucor
stolonifer ten opzichte van de andere schimmels.

De eerste proeven zijn uitgevoerd met kaneel- en kruid-
nagelolie. Deze oliën hebben een zeer sterk antiseptische
werking: kaneel en kruidnagelen geven dan ook altijd een
negatieve schimmelproef. Onttrekt men echter de aetherische
olie, bijvoorbeeld door extractie met aether — waarvan, zoo-
als kon worden vastgesteld, de schimmelsporen geen nadeelige
invloed ondervinden; immers, het aantal kiembare sporen op
pruimenagar van een pepermonster, dat met aether werd
behandeld, bleek, voor en na de extractie, gelijk - dan kan
het resultaat van de schimmelproef volgens het K.B. wel
degelijk positief zijn.
Bijvoorbeeld:

Ditzelfde verschijnsel merkt Imhoff op in zijn: „De
schimmelproef en haar beteekenis voor de beoordeeling 'van
voedingsmiddelenquot;

Uit de proef met kaneel ziet men. dat zelfs de kleine
hoeveelheid olie, in 0.1 g kaneel aanwezig, een hoeveelheid,
die bij een gehalte van 1.5% vluchtige oHe in kaneelbast!
overeenkomt met 0.0015 g aetherische olie, op 10 cm® pruimen-
agar gebracht, de schimmelsporen belet te ontkiemen.

Bij het nagaan van de invloed, die de verschillende schimmel-
soorten van aetherische oliën ondervinden, zijn wij steeds op
de volgende wijze te werk gegaan:

Buisjes, gevuld met 10 cm» pruimenagar, werden in kokend
water geplaatst, daarna afgekoeld tot de inhoud nog juist
vloeibaar was. Met behulp van een steriele pipet voegden
wij bepaalde hoeveelheden aetherische olie aan de agar toe
en daarna werden de buisjes geënt met reincultures van ver-
schillende schimmelsoorten. Daarna, uitgegoten in steriele
Petri-schalen en geplaatst in de broedstoof van 25° C, gingen
wij na, bij welke concentratie der aetherische olie nog groei
optrad. wââr de schimmel een minder sterke groei ging ver-
toonen en wââr de grens van groei werd bereikt. Er werd
altijd een blancoproef, d.w.z. de schimmel, geënt op zuivere
pruimenagar, ter controle mede ingezet; een controle aan de
eene kant, of de schimmelcultuur nog kiemkrachtig was, aan de
andere kant ter beoordeeling van het verschil in groeisterkte
en uiterlijk van een even oude cultuur van de schimmel zonder
toevoeging van aetherische olie aan de agar.

De schimmelcultures, waarmede wij deze proeven uitvoerden,
zijn uit verschillende waren door middel van de plaatmethode
geïsoleerd; zij bleken bij onderzoek rein.

De schimmelsoorten, die onderzocht werden, waren steeds
Mucor stolonifer, Mucor racemosus, Aspergillus niger en
Pénicillium glaucum, soms aangevuld met enkele andere,
veel voorkomende schimmels. In het bijzonder werd gelet op
het gedrag van Mucor stolonifer en Mucor racemosus.

Zouden wij een vluchtige olie vinden, die de gewenschte
belemmering van de groei van deze schimmels bewerk-
stelligde, zonder tevens de groei van de andere schimmels
in merkbare mate te beinvloeden, dan zouden wij deze olie
op verschillende monsters met alle mogelijke schimmelsoorten
nagaan en zien, of het aantal opgekomen kolonies met en
zonder toevoeging van die olie praktisch met elkaar over-
eenstemt.

De Mucor ondervond hiervan dus minder hinder dan de
andere soorten, dus was voor het ons gestelde doel deze
olie niet te gebruiken.

Hierna hebben wij kruidnagelolie en ook eugenol, het hoofd-
bestanddeel van de aetherische olie. zoowel van de kruid-
nagelen, als van piment, onderzocht, maar het resultaat vol-
deed ook hier niet; Mucor stolonifer kon nog meer verdragen
dan Penicillium glaucum.

De hoeveelheden, die men van deze sterk antiseptische
ohën moet toevoegen om algeheele schimmelgroei tegen te
gaan, zijn zóó gering, nl. een concentratie van 2 oogjes olie
op 10 cm® pruimenagar, dat men hiervan misschien bij sterk
schimmelende stofFen ter schimmelwering gebruik zou kunnen
maken, hoewel men hierbij bedacht zal moeten zijn op reuk
en smaak, omdat de olie daarop invloed zal kunnen uitoefenen.
Er zijn in deze richting wel eens proeven genomen, o.a. door
Bitting®), maar, zoover ons bekend, niet met een practisch
resultaat.

Nu was het ons reeds eerder opgevallen, dat bij de schimmel-
proeven met peper nooit en met nootmuscaat zelden over-
groeiïng van de platen met Mucor optrad. De mogelijkheid
bestond dus, dat de oorzaak hiervan de aanwezige aetherische
olie zou zijn. Dat deze olie sterk remmend op de schimmel-
groei werkt, is trouwens een bekend feit.

0.1 oogje verkregen wij, door 1 oogje olie op te lossen in 1 cm' alcohol
en hiervan 0.1 cm' in 10 cm' agar te verdeelen, daar deze hoeveelheid
alcohol geen invloed op de schimmelgroei uitoefent.

Bij peper kwam op de pruimenagar hoofdzakelijk Asper-
gillus niger op, met een klein percentage van andere schimmels.
Bij nootmuscaat Aspergillus niger, Aspergillus flavus, een enkele
maal nog andere Aspergillus-soorten als Aspergillus glaucus.
Aspergillus chevaheri, Aspergillus amstelodami e.a. Eenmaal
is hierbij Aspergillus galeritus Blochw. geconstateerd; verder
Penicilliumsoorten, Botrytis cinerea, enkele malen Mucor
mucedo en hoogst zelden Mucor stolonifer.

Daarom hebben wij hierna de invloed van nootmuscaat-
en peperolie, zoowel als van piperine nagegaan. Nootmus-
caatolie en piperine zijn in de handel aanwezig, peperolie
niet. Wij hebben ons daarom door stoomdestillatie uit zwarte
peper een hoeveelheid van deze olie zelf bereid, i) Hiertoe
zijn wij uitgegaan van 250 g zwarte peper. Deze werden in
een rondbodemkolf met water en iets zwavelzuur aangemengd,
zoodat de reactie ten opzichte van congopapier zuur was,
dit ter hydrolyse van het zetmeel. De olie werd hierna over-
gestoomd, hetgeen eenige dagen duurde; het destillaat, na
verzadiging met keukenzout, met aether uitgeschud, de
aetherische oplossing op uitgegloeid natriumsulfaat gedroogd
en de aether hierna op een waterbad van 45° C afge-
destilleerd. Uit 250 g zwarte peper verkregen wij op deze
wijze 1.76 g aetherische olie. Deze was lichtgroen van kleur,
had een aangename, niet prikkelende geur. Van deze olie
en van piperine hebben wij de invloed op verschillende
schimmels nagegaan.

Piperine bleek de groei van geen der schimmels tegen te
gaan. Daar deze stof in water zeer moeilijk oplosbaar is,
hebben wij haar in alcoholische oplossing toegevoegd, er
voor zorg dragende niet meer dan 0.1 cm® alcohol per 10 cm®
pruimenagar toe te voegen; deze hoeveelheid alcohol heeft
nl. geen invloed op de schimmelgroei. Wij hebben tot 13 mg

piperine per 10 cm® pruimenagar toegevoegd en alle schim-
melsoorten, inclusief Mucor stolonifer, tierden welig. Meer
dan 10 mg toe te voegen had geen zin, daar die grootere
hoeveelheid bij toevoeging aan de pruimenagar voor een
groot deel uitkristalliseerde; 10 mg bleef practisch geheel in
oplossing.

Met de peperolie kregen wij het resultaat, hetwelk in
tabel V op blz. 44 is weergegeven.

Wij zien daar, dat Mucor stolonifer en Aspergillus niger
ongeveer evenveel, Penicillium glaucum minder kan verdragen.
Voor het tegengaan van het uitgroeien van Mucor stolonifer
is dan ook deze olie niet te gebruiken.

De ervaring, die wij opgedaan hebben met de schimmel-
proef op peper volgens het K.B., die vrijwel altijd negatief
is. klopt hiermede. Men kan dit als volgt berekenen: men
neemt 5 g peper -f- 10 cm® water, dus een verhouding 1 : 2
en aangenomen, dat peper 2 % aetherische olie bevat,
bevat dus het peper -f water-papje 0.7 % olie, hetgeen over-
eenkomt met 10 cm® pruimenagar, waaraan 0.07 cm® ohe is
toegevoegd. Uit de tabel ziet men, dat deze hoeveelheid, bij
een beoordeeling na drie dagen, weliswaar niet voor alle
schimmels een algeheele groeibelemmering zal zijn, maar dat
toch vele er door in meerdere of mindere mate worden tegen-
gehouden.

Hierna zijn wij met het onderzoek van nootmuscaatolie be-
gonnen. Hierbij werd eenig resultaat bereikt. Het bleek nl.,
dat bij een toevoeging van 0.007 cm® olie op 10 cm® pruimen-
agar, Mucor stolonifer niet zoon dichte, witte hyphenmassa
vormde, maar ijler groeide. Aspergillus niger ondervond geen
merkbare invloed van deze hoeveelheid olie, terwijl Penicil-
lium glaucum iets kleinere, maar nog zeer duidelijk zichtbare
en goed herkenbare kolonies vormde. Wij hebben vervolgens
een cacaomonster in onderzoek genomen, dat vrij veel schimmel
bevatte, o.a. ook Mucor stolonifer in merkbare hoeveelheid

en hiervan 0.1 g, zoowel op pruimenagar, als op pruimen-
agar 0.007 cm® nootmuscaatolie per 10 cm® agar gezet
Vergeleek men de platen na een broedtijd van vier dagen
bl) 25 C, dan trad er een duidelijk verschil in het oog De
aanwezige sporen van Mucor stolonifer hadden bij de plaat
zonder Ohe deze geheel overgroeid. Men zag wehswaar onder
deze hyphenmassa de kleuren schemeren van de andere aan-
wezige schimmelkolonies, maar het tellen van het aantal
kolonies bleek practisch onmogelijk. Anders was het op de
plaat, waaraan olie was toegevoegd. Hier was Mucor stolo-
nifer niet zoo dicht gegroeid en konden de andere schimmel-
kolonies mooi en duidelijk begrensd worden gezien. Deze
platen waren dan ook inderdaad telbaar. Bij oppervlakkige
beschouwing leek dit resultaat dus fraai, maar bekeek men
de kolonies der opgekomen soorten aandachtiger, dan zagen
zij er zeer ongewoon uit. Ook het microscopische beeld was
geheel verschillend van het normale. De hyphen van de ver-
schillende schimmelsoorten waren op vele plaatsen sterk ge-
zwollen, terwijl de sporenvorming abnormaal was. De schim-
mels zagen er uit. alsof zij op een voedingsbodem waren
gegroeid, waarop zij zich in het geheel niet thuis voelden.

Nu is dit voor het tellen van de kolonies wel geen be-
zwaar. maar het geeft geen normaal beeld van de schimmels.
Daarom zijn wij naast de aetherische oliën onze proeven
begonnen met anorganische zouten.

Wij begonnen ons onderzoek met zinksulfaat en koper in
complexe oplossing aan wijnsteenzuur gebonden, omdat volgens
Pulst 1) Penicillium glaucum, Aspergillus niger en Botrytis
vulgaris daarvan veel meer kunnen verdragen dan Mucor
mucedo. Wij wilden thans van deze stoffen de invloed op
Mucor stolonifer nagaan.

Wij maakten van deze anorganische zouten oplossingen
C. Pulst, Jahrb. wiss. Bot. 37, 205 (1902).

van bekende sterkte, steriliseerden deze in de autoclaaf, voeg-
den met behulp van een steriele pipet een bepaalde hoeveel-
heid aan de pruimenagar toe, waarna het buisje werd geënt
met de schimmel en hierna de inhoud in een steriele Petri-
schaal werd uitgegoten. Broedtijd vier dagen bij 25° C.

Wij hadden met geen van de bovengenoemde stofFen eenig
succes, want de schimmels verdroegen van kopertartraat alle
een gelijke, zeer groote hoeveelheid; van zinksulfaat bleek
een concentratie van 1/600, d.w.z. 1 g zinksulfaat op 600 cm®
pruimenagar, alle evenzeer te beïnvloeden en Mucor stolo-
nifer niet op de door ons gewenschte wijze.

Betere resultaten werden verkregen met kopersulfaat. Dit
zout bleek veel sterker op de schimmels te werken dan zink-
sulfaat. Concentraties van 1/10000. 1/5000 en 1/2000 konden
alle soorten verdragen; bij een concentratie van 1/1500. d.w.z.
1 g op 1500 cm® agar, zagen wij echter op de plaat, waarop
Mucor stolonifer geënt was, de kolonies minder sterk uit-
groeien; de hyphen waren nog wel lang en verspreidden
zich over de geheele oppervlakte van de pruimenagar heen,
maar de schimmel vormde geen ondoorzichtige witte massa's
van draden meer, daarentegen minder talrijke, fijne draden.
Deden wij een proef met een cacaomonster. waarin zich
allerlei soorten schimmelsporen bevonden, dan zagen wij een
zeer duidelijk verschil, indien wel of geen kopersulfaat was
toegevoegd. De platen zonder kopersulfaat waren geheel over-
groeid en bedekt met schimmeldraden, terwijl de platen met
kopersulfaat afzonderlijke, duidelijk te tellen kolonies ver-
toonden. De foto geeft een afbeelding hiervan. Niet altijd was
de overgroeiïng zoo afdoende verdwenen als hier, soms waren
nog wel lange hyphen van de Mucor stolonifer-kolonies
over de plaat heengegroeid, maar steeds waren in die ge-
vallen de onderliggende kolonies van de andere schimmel-
soorten, goed afgegrensd, zichtbaar. Op de foto ziet men ook
het verschil in uiterlijk van de kolonies, die behalve hieraan.

ook aan de kleur, bij eenige ervaring, macroscopisch reeds zijn
te herkennen. Men ziet eenige kolonies van Aspergillus flavus,
één kolonie van Penicillium glaucum, twee kolonies van Mucor
stolonifer, twee Mucor racemosus en één Aspergillus niger.

Als men het resultaat vergelijkt van de toevoeging van
kopersulfaat en van die van nootmuscaatolie, die, zooals boven
beschreven, ook een dergelijke invloed heeft, verdient onge-
twijfeld de eerste de voorkeur. Door kopersulfaat toch worden
de andere schimmels lang niet zoo sterk beïnvloed. Ook hier
zijn de kolonies, voornamelijk van Aspergillus flavus, kleiner
dan normaal en ook de kleur is iets lichter, maar toch zijn
de kolonies gelijk van vorm en niet zoo afwijkend als op
pruimenagar, waaraan nootmuscaatolie is toegevoegd.

Uit onderstaande tabel blijkt, dat aan geen der schimmel-
sporen, door de toevoeging van kopersulfaat, het uitgroeien tot
kolonie wordt belet. Het aantal schimmelkolonies op platen
met en zonder kopersulfaat stemt voldoende met elkaar overeen:

Voor wij ook het microscopische uiterhjk van de schimmel-
kolonies in de beschouwing betrekken, willen wij volledig-
heidshalve vermelden, dat wij nog proeven hebben genomen
met zilvernitraat en zilver als protargol, dus complex ge-
bonden, geen van beide echter met eenig resultaat; beide
hadden een veel te sterk remmende invloed op de schimmel-
groei.

Hierna hebben wij nog proeven gedaan met het plaatsen
van een dunne, metalen plaat in de Petri-schaal, om op deze
wijze de oligodynamische werking van het metaal na te gaan.
Deze plaat paste juist in de doos van de Petri-schaal. Wij
legden haar in de deksel en plaatsten de doos met pruimen-
agar, met schimmelsporen geënt, er omgekeerd bovenop,
zoodat de metalen plaat door een luchtlaag van de voedings-
bodem gescheiden was. Dit geheel werd dan in de broed-
stoof geplaatst. Met een zinken en messingplaat was, na
enting met Mucor stolonifer, de plaat na twee dagen, met
een rood-koperen en met een zilveren na drie dagen geheel
volgegroeid. Van een remmende invloed was dus nagenoeg
niets te bemerken.

Wij hebben nu na het macroscopisch goede resultaat met
kopersulfaat ook microscopisch de schimmelkolonies, die op
de kopersulfaat-houdende pruimenagar waren gegroeid, be-
studeerd. Het bleek, dat het microscopische beeld van bijna
alle schimmels, die wij onderzochten, normaal was gebleven.
Penicillium glaucum, Aspergillus niger. Mucor mucedo, Botrytis
cinerea en ook Mucor stolonifer en Mucor racemosus ver-
toonden het gewone beeld. Alleen Aspergillus flavus zag er
iets afwijkend uit. Ook macroscopisch is de kolonie van deze
schimmel niet geheel normaal. Zij groeit niet zoo hoog op
de voedingsbodem, maar spreidt zich meer over de oppervVakte
hiervan uit. Ook de kleur is niet groengeel, maar meer zuiver
geel. Microscopisch vertoonen de myceliumdraden op vele
plaatsen opzwellingen en men ziet verder, dat het blaasvormige

einde van de conidiëndrager niet rondom met sterigmen is
bezet, zooals anders het geval is. Er zijn veel minder sterig-
men op aanwezig en deze zijn een weinig gezwollen en iets
afwijkend van vorm. Ook zijn niet dergelijke lange sporen-
ketens te zien als op zuivere pruimenagar. Dit is echter de
eenige schimmel, waarvan wij microscopisch een afwijkend
beeld konden constateeren.

Als resultaat willen wij dus aanraden, bij aanwezigheid van
Mucor stolonifer, de schimmelproef op pruimenagar met koper-
sulfaat in een concentratie van 1/1500, d.w.z. 1 g op 1500 cm®
agar, uit te voeren, daar dit de overgroeiïng, zooal niet
opheft, dan toch zeer sterk tegengaat, zoodat een behoorlijk
voldoende telling uitvoerbaar blijft.

Bij cacao is uit zeer veel schimmelproeven gebleken, dat
een positief resultaat een aanwijzing is voor een in bederf
verkeeren der waar. Dikwijls gaat hiermede een hooge zuur-
graad van het vet gepaard. Hiernevens echter komen ook
cacaomonsters voor, die, terwijl zij duidelijk muf rieken en
onder het microscoop schimmeldraden blijken te bevatten,
niettemin een negatieve schimmelproef geven!

Men kan hier tegen in brengen, dat deze schimmels en/of
sporen kunnen zijn afgestorven en dat de schimmelproef hier
ook niet meer noodig was, omdat de cacao reeds op het oog
schimmelig was, dus reeds direct afgekeurd moest worden,
maar toch bleek hier eenige malen, dat, indien de proef bij
een dergelijk cacaomonster bij lagere temperatuur, bijv. bij
22° C, werd ingezet, zij wel degelijk een positief resultaat
gaf. Bij de methode op pruimenagar bleken de schimmel-
sporen dan ook niet alle dood geweest te zijn, want er ont-
stond een groot aantal kolonies op de plaat.

Dergelijke, en ook omgekeerde gevallen, nl. een positieve
schimmelproef bij cacao met volkomen normale geur en smaak,
komen niet veel voor en in 't algemeen kan men zeggen, dat
de schimmelproef volgens het K.B. voor cacao een goede be-
oordeeling van de toestand veroorlooft.

Gaat men nu de tabel na van de schimmelproeven van
het K.B. en van die op pruimenagar, tabel IX aan het einde

van dit proefschrift, dan ziet men. dat alle monsters, die na
24 uur positief waren - hetwelk hier beteekent: de geheele
plaat met schimmel bedekt, welke monsters dus afgekeurd
werden — op pruimenagar na vier dagen bij 25° C meer
dan 50 schimmelkolonies vertoonden.

Men ziet hiernaast nog aangegeven: pruimenagar bij 37° C.
Men gaat nl. in de praktijk wel eens zoo te werk. dat men
— indien de proef volgens het K.B. bij cacao na 24 uur
positief is en men het niet aandurft de cacao hierop reeds
af te keuren — tevens de proef op pruimenagar inzet, even-
eens bij 37° C en eerst als hierop veel kolonies ontstaan, de
cacao afkeurt. Bij deze temperatuur komen echter, zie boven,
maar een deel der aanwezige schimmelsporen op. Men ziet.
dat de getallen in de vierde kolom ook altijd grooter zijn dan
in de derde.

Beziet men tabel IX, dan lijkt het ons, dat men voor cacao
zal kunnen volstaan met de proef op pruimenagar bij 25° C.
Indien hier meer dan 50 kolonies per 0.1 g cacao zich ont-
wikkelen, is deze af te keuren.

De vraag, of deze schimmels ook in staat zijn cacao te
doen beschimmelen, kan bevestigend beantwoord worden,
daar ons uit vergelijkende proeven is gebleken, dat de
schimmelsoorten, die op de vochtige cacao, zooals de K.B.-
methode deze voorschrijft, gegroeid zijn, ook op de pruimen-
agar voorkomen. Er zijn door ons uit cacao geen schimmels
geïsoleerd, die op de pruimenagar wél en op de cacao niét
groeien, de cacao dus bij aanwezigheid niet duf zullen maken.
Was dit wél het geval, dan zou de eisch, aan het aantal schimmel-
kolonies op de pruimenagar gesteld, te scherp zijn voor de
praktijk. Bovendien blijkt hieruit, dat er geen reden bestaat,
de proef van het K.B. naast de proef op de pruimenagar
uit te voeren.

Het maximum van 50 kolonies per 0.1 g wordt op grond
van onze waarnemingen genoemd, staat evenwel nog niet

onwrikbaar vast. Daarvoor is het aantal cacaomonsters, dat
wij onderzocht hebben, feitelijk nog te klein.

Hiervoor geldt in hoofdzaak hetzelfde, als voor cacao,
dus kunnen wij hierover kort zijn. Het aantal maizena-
monsters, dat wij onderzocht hebben, is vrij wat kleiner dan
van cacao en dus is het maximum aantal kiembare sporen,
hetgeen wij als grens zouden willen stellen, zelfs nog minder
zeker dan daar, maar toch kregen wij sterk de indruk, dat
men hier niet meer dan 25 kolonies per 0.1 g zal mogen
toelaten.

Deze zijn niet alle over één kam te scheren, zooals in het
K.B. geschiedt, waar aan alle dezelfde eisch wordt gesteld.

Ten eerste kunnen wij kruidnagelen, kaneel en piment buiten
beschouwing laten, daar deze nooit schimmelen. Zooals wij
reeds boven gezien hebben, bevatten deze specerijen voldoende
aetherische olie om alle schimmelgroei tegen te gaan. Ook
al komen er schimmelsporen op of in voor, wat zeker het
geval is, want zij zullen er reeds uit de lucht op vallen, dan
nog kunnen zij deze specerijen niet doen beschimmelen. Van
deze waren behoeft dus nooit een schimmelproef ingezet te
worden.

Bij peper is de schimmelproef volgens het K.B. meestal
negatief, soms zwak positief, een enkele maal positief. Onder
zwak positief wordt hier verstaan, dat een deel der plaat,
bijv. de helft, met schimmel is bedekt; positief, dat de plaat
praktisch geheel met een dun laagje schimmel begroeid is;
sterk positief als de geheele plaat dik met schimmel is bedekt.
Heeft de schimmelgroei zoodanig plaats gehad, dat afzonder-

lijke kolonies te tellen zijn, dan komt men bij een 40-tal
per plaat tot een beoordeeling: positief.

Het bleek bij onderzoek van een aantal pepermonsters, dat
bij witte peper een positieve schimmelproef meer voorkomt dan
bij zwarte peper.

Voert men de proef zoodanig uit, dat men, indien deze
volgens het K.B. positief verloopt, tevens de proef op pruimen-
agar inzet, dan kan men onherroepelijk alle witte peper uit
de handel afkeuren, want op deze platen ontstaat steeds
een ontelbaar aantal schimmelkolonies. Ook de pepermonsters
met negatieve schimmelproef volgens het K.B. bevatten een
groot aantal schimmelsporen! Bij witte peper schommelt dit
aantal gewoonlijk tusschen 1000 en 3000 kolonies per 0.1 g
peper, bij zwarte peper is het ongeveer 100-200. Zelfs de
niet gemalen peperkorrel bevat reeds vrij veel sporen, hoewel
dit aantal door infectie bij het malen nog sterk vergroot
wordt. Wij hebben naast elkaar het aantal schimmelsporen
bepaald in de peperkorrel, die wij daartoe in een steriel
mortiertje fijnmaalden en hiervan 0.1 g op pruimenagar zetten
en in het, in de fabriek daarvan gemalen, peperpoeder. Dit
laatste getal bleek vrij wat grooter, wat ook niet verwonderlijk
is, omdat in een dergelijke malerij de lucht en de maalwerken
zeer veel schimmelsporen zullen bevatten.

Dat deze groote hoeveelheid schimmelsporen nog niet altijd
een positieve schimmelproef tengevolge heeft, komt door de
aanwezigheid van de aetherische olie. Gaat men de hoeveel-
heid peperolie na, die verschillende schimmels kunnen ver-
dragen, dan blijkt het volgende:

Zooals reeds op blz. 34 is aangetoond, bevat het mengsel
peper -f water in de verhouding 1 : 2, zooals het K.B. voor-
voorschrijft, ± 0.7 7o vluchtige olie, d.w.z. 10 cm® agar
0.07 cm® ohe.

Uit de tabel blijkt, dat Aspergillus niger en Mucor stolo-
nifer op een dergelijke voedingsbodem na drie dagen wel.
hoewel weinig, Penicillium glaucum in 't geheel niet zicht-
baar wordt. De schimmel, die men na de schimmelproef op
peper dan ook in verreweg de meeste gevallen aantreft, is
Aspergillus niger.

Bij de proef op pruimenagar voegt men aan 10 cm® hier-
van 0.1 g peper toe, hetgeen dus, bij een aetherisch ohe-
gehalte van 2 o/o- neerkomt op 0.002 g aetherische olie, met
een s.g. van 0.9, dus 0.0022 cm® ohe. Deze hoeveelheid
kunnen de schimmels zeer goed verdragen, dus groeien alle
aanwezige sporen op de pruimenagar tot kolonies uit.

De schimmelproef volgens het K.B., maar dan bij 25° C
uitgevoerd, is bruikbaar. Behalve door schimmels heeft men
bij peper ook dikwijls een positief resultaat wegens ontleding
door bacteriën. In dat geval moet de peper ook afgekeurd
worden.

Beziet men tabel IX i) van de serie schimmelproeven
volgens het K.B. en op de pruimenagar, dan komen de uit-
komsten hiervan, in tegenstelling met cacao en maizena, waar
dit wel het geval was, geenszins overeen. Men ziet monsters,
die volgens het K.B. na twee dagen reeds positief zijn en
toch niet veel schimmelsporen bevatten en aan de andere
kant monsters met meer dan 100 kolonies per 0.1 g noot-
muscaat, die niettemin in het geheel niet schimmelen of slechts
een zwak positieve schimmelproef vertoonen.

De reden van een positieve of negatieve schimmelproef kan
dus niet liggen aan een groot, resp. klein aantal schimmelsporen
in de nootmuscaat, maar moet een andere zijn.

Wij hebben gedacht aan de mogelijkheid, dat het aethedsch
oliegehalte van nootmuscaat juist op de grens zou liggen van
hetgeen de schimmels kunnen verdragen. Is dit het geval, dan
zal dit de bepalende factor zijn en alleen als dit gehalte laag
is. zullen de aanwezige schimmelsporen kunnen uitgroeien en
de waar beschimmelen. Is het aan de hooge kant, dan zullen
de sporen, al komen er ook nóg zooveel op voor (vgl. peper),
niet kunnen uitgroeien en het nootmuscaatpoeder blijft dus
bij het bewaren volkomen goed.

Wij hebben verschillende aetherische olie-bepalingen gedaan.
Hiertoe zijn wij steeds uitgegaan van 5 g nootmuscaat, voegden
30 g keukenzout toe en 100 cm® water en destilleerden met stoom
de vluchtige olie over, waartoe ongeveer 300 cm® water over-
gedestilleerd moesten worden. Deze werden met keukenzout
verzadigd en hierna met aether uitgeschud. De aetherische
oplossing droogden wij op chloorcalcium; later gebruikten wij

liever pentaan of loco-pentaan i) voor het uitschudden, omdat
dit in het geheel geen water opneemt. De aether, resp. pentaan,
wordt op een waterbad van 45° C afgedampt, de olie. die
achterblijft in een vacuumexsiccator even van de laatste resten
aether ontdaan en gewogen:

In deze tabel, die de bepalingen bevat, hebben wij de
monsters gerangschikt naar opklimmend aetherisch oliegehalte.
Links daarvan staat het aantal schimmelkolonies, dat ontstaan is
uit de sporen in O.I g nootmuscaat op pruimenagar bij 25° C.
Er is in het geheel geen verband te zien tusschen dit aantal
en het gehalte aan aetherische ohe. Rechts is de schimmel-

Laagst kokende fractie van petroleumaetfier (kpt 27°~40° C).
') Deze zijn gedeeltelijk door Dr. F. Th. v. Voorst in Alkmaar uitgevoerd,
waarvoor wij hem hier nogmaals onze hartelijke dank betuigen.

proef volgens het K.B. aangegeven: het blijkt, dat de meeste
sterk-positieve en positieve resultaten zijn te vinden bij een
laag aetherisch oliegehalte en de meeste zwak-positieve en
negatieve bij hoog gehalte hieraan. Inderdaad schijnt dus dit
ohegehalte beslissend te zijn voor de vraag, of de waar kan
beschimmelen of niet. Een verband tusschen de schimmel-
baarheid en het aantal aanwezige sporen is er niet; hiervoor
is dus geen maximum te stellen.

Om na te gaan, of het vet. aanwezig in nootmuscaat. in-
vloed op de schimmelgroei uitoefent, hebben wij ons een
hoeveelheid daarvan uit nootmuscaatpoeder bereid. Daartoe
werd het poeder gedurende 10 uur met aether geëxtraheerd
waardoor wij zoowel de aetherische, als de vette olie ver-
kregen. Dit mengsel werd aan een stoomdestillatie onder-
worpen en de achtergebleven rest nogmaals met aether ge-
ëxtraheerd. Op deze wijze verkregen wij uit 10 g noot-
muscaatpoeder 2.5 g vet met een smeltpunt van 49°-50° C
Wij hebben dit vet, samen met steriele pruimenagar, op-
gesmolten in kleine steriele buisjes, flink dooreengeschud en
d^rna snel in koud water afgekoeld, onderwijl de buisjes
schuin houdende. Het mengsel van vet en agar stolt on-
middellijk en op de schuine oppervlakte werden sporen van
verschillende schimmels geënt, waarvan in de broedstoof bij
25 C de groei werd nagegaan.

Hierbij is ons gebleken, dat sporen van PeniciUium glaucum,
Aspergillus niger en Mucor stolonifer het percentage vet,
hetwelk in nootmuscaat aanwezig is, nl. 30—40 ge-
makkelijk kunnen verdragen. De groei wordt hierdoor in het
geheel niet belemmerd of zelfs maar vertraagd.

De aetherische olie blijkt dus voor de schimmelgroei de
bepalende factor te zijn.

peper, de pruimenagar achterwege laten, daar de uitslag
hiervan niets zegt en volstaan met de proef volgens het
K.B. bij 25° C. Indien hier de plaat na 3 X 24 uur geheel,
of tenminste voor drievierde gedeelte, met schimmel is be-
dekt. is de waar af te keuren.

Bij ons onderzoek over de schimmelproef hebben wij zeer
veel schimmelsoorten kunnen isoleeren, meest veel voor-
komende, maar ook enkele, minder bekende soorten.

Hieronder volgt een kort overzicht, dat geenszins volledig
alle soorten, die in de onderzochte waren kunnen voorkomen
beschrijft, maar toch de belangrijkste daarvan. Zij bleken te
behooren tot de volgende geslachten:

Geslachten Rhizopus en Mucor behooren beide tot de
familie der Mucoraceae en tot de klasse der Phycomycetes.
Het mycelium is rijk ontwikkeld; de hyphen zijn sterk ver-
takt en ongedeeld. De lange sporangiëndrager bezit aan het
emde een sporangium met columella. Het sporangium is kogel-
rond, de grootte loopt sterk uiteen; het bevat een groot
aantal sporen, waarvan de oppervlakte meestal glad is,
hoogstens met fijne stekeltjes bezet. Vorm en kleur dezer
sporen zijn kenmerkend voor de soort.

Bij vele soorten van het geslacht Mucor komen in de
hyphen cellen voor van afwijkende, meer afgeronde vorm,
die men chlamydosporen noemt.

Voor de uitvoering der determinatie van de verschillende schimmels,
welke Prof. Dr. J o h a. Wes t er dij k zoo vriendelijk was, in haar labo-
ratorium in Baarn te doen uitvoeren, willen wij op deze plaats nogmaals
onze hartelijke dank uitspreken.

natuur voorkomt en ook in alle mogelijke voedingsmiddelen,
die aan de lucht blootgesteld geweest zijn, wordt aangetroffen!
De hyphen zijn sterk vertakt. Technische beteekenis komt
haar niet toe; als sterke eiwitsplitser is deze schimmel dik-
wijls de oorzaak van het bederf van zuivelproducten.

Mucor racemosus met sporangiëndragers met racemeuse ver-
takking. Deze schimmel vormt een sterk ontwikkeld, grauw-
grijs mycelium op vruchten, brood, mest. rottende stoffen enz.,
komt zeer verspreid in de natuur voor. De kleine sporangiën
bevatten elliptische sporen, geelgrijs-bruin van kleur; in het
mycelium worden veel chlamydosporen gevormd. Mucor
racemosus inverteert rietsuiker en vormt in suikerhoudende
voedingsbodems tot 7 % alcohol.

Mucor stolonifer of Rhizopus nigricans is wel een van de
meest voorkomende schimmels. Zij is door vele onderzoekers
zoowel in Europa als daarbuiten, uit talrijke grondstoffen
geïsoleerd. Wij hebben haar ook in alle onderzochte waren
aangetroffen. Zij vormt uitloopers, stolonen. waarmede zij
zich aan het substraat hecht. De hyphen en sporangiën zijn
in jonge toestand wit en kleuren zich later donker. De sporen
zijn onregelmatig gevormd, gestreept en donkerbruin van
kleur. Chlamydosporen komen niet voor. Rhizopus nigricans
vormt talrijke enzymen, waardoor eiwitten en koolhydraten
kunnen worden ontleed.

Geslacht Penicillium. In 1809 gaf Link deze naam aan
schimmels, waarbij de conidiëndrager een penseelvormige
vertakking vormt, aan het einde waarvan lange ketens conidiën
worden afgesnoerd. Zeer vele onderzoekers hebben zich met
deze belangrijke groep van schimmels beziggehouden. Een
van de laatsten was Th om. wiens boek „The Penicilliaquot; i)

van groot nut is bij het determineeren van onbekende
Penicilliumsoorten. Wel de meest verspreide schimmel van dit
geslacht is de groene penseelschimmel Penicillium glaucum.
Deze vormt een grijsgroen mycelium, dat bij het ouder worden
iets verkleurt. De conidiën komen in de lucht, in de grond
op granen, vruchten enz. voor; zij groeien zeer gemakkelijk
tot uitgebreide schimmelvegetaties uit. Algemeen bekend is de
door deze schimmel veroorzaakte schimmelige of muflfe smaak
en reuk. De penseelschimmel heeft haar optimum temperatuur
bij ± 20° C. ontleedt vele organische zuren, waaronder,
appelzuur, wijnsteenzuur en citroenzuur. Daarnaast heeft een
neutralisatie van deze zuren plaats door gevormde ammoniak
Naast talrijke andere enzymen vormt zij ook proteolytische
en kan hierdoor peptonen en eiwitten sterk ontleden, waarbij
veel ammoniak ontstaat.

Bijzondere Penicilliumsoorten worden daarom ook in de kaas-
bereiding, bij de rijping van bepaalde kaassoorten, gebruikt.
Zoo veroorzaakt Penicillium roqueforti, die blauw-groene
conidiën vormt, in de Roquefortkaas een afbraak van de
caseïne onder vorming van verbindingen met een zeer bepaalde
smaak en geeft de groene adering in het inwendige der kaas.

Volgens Th om is Penicillium roqueforti dezelfde als
Penicillium glaucum. Dergelijke dubbele benamingen komen
bij schimmels zeer veel voor en zijn bij determinatie een groote
moeilijkheid.

Als andere Penicilliumsoorten willen wij nog noemen:
Penicillium majusculum, Penicillium crustaceum en Penicillium
luteum, die alle zeer verspreid in de natuur voorkomen en
tengevolge hiervan ook in de door ons onderzochte waren
zijn gevonden.

overal in de natuur voor. Deze schimmels zijn na verwant
aan de Penicillia. alleen is de conidiëndrager aan het einde
niet vertakt maar blaasvormig opgezwollen. Deze blaas is
rondom bezet met sterigmen, die vertakt kunnen zijn en op
deze wijze in twee rijen zijn te onderscheiden, aan het einde
waarvan lange ketens conidiën worden afgesnoerd. Door
middel van de kleur van het mycelium en de sporen, de vorm
van de blaasvormige verdikking, de vertakking van de sterigmen
en de grootte der sporen, worden de soorten onderverdeeld i).

De meest voorkomende soorten zijn Aspergillus niger
(zwart). Aspergillus flavus (geelgroen). Aspergillus glaucus
(grijsgroen), Aspergillus ochraceus (geel) en vele anderen.

Wij zijn in eenige monsters nootmuscaat sporen tegenge-
komen van Aspergillus chevalieri en Aspergillus amstelodami.
Deze behooren beide tot de Aspergillus glaucus-groep. gelijken
zeer veel op elkaar, vormen groengele peritheciën. gevuld
met asci. die elk acht ascosporen bevatten. Deze ascosporen
zijn eivormig en zijn door de verschillende teekening van
elkaar te onderscheiden.

Eén monster nootmuscaat bevatte sporen van Aspergillus
galeritus. Deze schimmel is tot nu toe niet ia Europa ge-
vonden, maar komt in de tropen en in Amerika voor en is
dus waarschijnlijk met deze nootmuscaat in Nederland ge-
komen. De kleur van deze schimmel is geelbruin, het mycelium
IS weinig boven de voedingsbodem verheven, meer over de
oppervlakte van de agar uitgespreid. Microscopisch blijkt
onder de blaasvormige verdikking aan het einde van de conidiën-
drager, deze eenigszins ingesnoerd te zijn. Er zijn twee
rijen sterigmen — op één van de eerste rij bevinden zich
drie a vier van de tweede rij - die voornamelijk aan één
zijde van de blaas zijn ingeplant; niet, zooals bij Aspergillus

Geslacht Citromyces omvat maar weinig soorten, die
zoowel van Penicillium, als van Aspergillus goed zijn te onder-
scheiden. De sterigmen staan verspreid ingeplant op een kleine
blaasvormige verdikking aan het einde van de conidiëndrager.
Alle soorten kunnen vrij groote hoeveelheden citroenzuur uit
suiker vormen en komen veel op rottende vruchten voor.

Geslacht Verticillium is van Penicillium te onderscheiden
door de vorming van sterigmen in kransen. Zeer algemeen
voorkomend is Verticillium glaucum, blauwgroen van kleur.

Geslacht Botrytis komt veel op organisch materiaal voor.
Kenmerkend is de stand van de conidiën in kransen. Botrytis
cinerea is de best bekende soort, die algemeen verspreid
op plantendeelen en in vele voedingsstoffen voorkomt. Aan
deze schimmel is het bruin worden van wijn te danken

Geslacht Fusarium. Deze veroorzaken veelal het bederven
van groenten. Ook zijn soorten van dit geslacht geïsoleerd
als de oorzaak van het bederf van kaas en komen zij in
afvalwater voor. Vooral in deze groep heerscht bij de
benaming zeer groote verwarring. Deze schimmels zijn in het
bezit van meercellige sporen, die typisch sikkelvormig zijn,
hyalien en aan beide einden toegespitst.

Geslacht Sporotrichum, o.a. Sporotrichum carougeaui, die
wij uit cacao isoleerden. Deze is wit van kleur en vormt
lange sporenketens.

Verder hebben wij nog enkele soorten van de geslachten
Oidium en Monilia geïsoleerd.

Het geslacht Oidium beschrijft Wichmann^) als volgt:
„Die Arten der Gattung Oidium sind durch ein typisches
Mycelium charakterisiert, dasz aus gefächerten, unregelmäszig
verzweigten Hyphen besteht, welche meist an den Enden,
aber auch in der Mitte, in kurz-zylindrische Zellen von fast
rechteckigem, nur an den Ecken etwas abgerundeten Umrisz
zerfallen. Sprossung kommt im Bereiche dieser Gattung nur
ausnahmsweise vorquot;. De meest bekende schimmel van dit
geslacht is wel Oidium lactis, die zeer verspreid voorkomt
en op zure melk bijna altijd is te vinden. Hierop vormt zij
een witte schimmellaag. Ook in boter en vele andere voedings-
middelen wordt deze schimmel dikwijls aangetroffen.

Monilia is een geslacht, dat tusschen de gisten en de
schimmels instaat. Monilia Candida is de meest bekende
saprophyt van dit geslacht. Andere soorten zijn nog Monilia
sitophila en Monilia variabilis.

Naast een onderzoek naar de schimmels wilden wij de, door
ons ter hand genomen, waren eveneens aan een bacteriologisch
onderzoek onderwerpen, om op deze wijze een volledig
inzicht te verkrijgen in de microbiologische gesteldheid van deze
producten. In de inleiding zijn bij de behandeling van de
processen, waaraan de producten worden onderworpen, reeds
de dientengevolge aanwezige bacteriën en schimmels besproken,
waarbij tevens de rol, die deze organismen hierbij spelen,
gebleken is. Om niet in herhalingen te vervallen, willen wij

De geïsoleerde bacteriën zullen blijken geen andere te zijn,
dan die. welke men op grond van de bewerkingen en de
infectiemogelijkheden kan verwachten aan te treffen.

Bij de beoordeeling van de schimmelproef wordt ook aan
de bacteriën aandacht geschonken. Er wordt immers op ge-
wezen, dat de waar nóch beschimmeld, nóch op andere
wijze bedorven of ontleed mag zijn, welke ontleding in vele
gevallen door aanwezige bacteriën wordt veroorzaakt.

De eenvoudigste methode om na te gaan, hoeveel en welke
soorten bacteriën in de waar aanwezig zijn, zou wezen, een
emulsie te maken in steriel water en deze emulsie op agar-
en gelatineplaten uit te strijken. Hierbij bleek ons echter, dat
het aantal kolonies op deze platen slecht te tellen was door
de aanwezige cacao-, resp. meel- of nootmuscaatdeeltjes. De

methode, door Amos en Kent Jones^) aangegeven bij hun
onderzoek over meel en bloem, nl. het schudden met steriel
zand, dit te laten bezinken en van de bovenstaande suspensie
verdunningen op platen te maken, is bij fljngepoederde waren
als cacao e.d. niet aan te bevelen, omdat de fijne deeltjes
hiervan niet zinken, maar blijven zweven, waardoor zij later
het tellen der platen zeer bemoeilijken; het is dikwijls op de
wijze, waarop de platen geteld worden, nl. met een loupe
bekeken, niet zoo gemakkelijk uit te maken, of men met een
kolonie, dan wel met een korreltje meel of cacao te doen heeft.

Wij hebben daarom onze suspensie, verkregen door 1 gram
der waar in een steriel mortiertje met 10 cm® steriel water
te verwrijven, door steriel filtreerpapier gefiltreerd en van
dit filtraat verdunningen op agar- en gelatineplaten gemaakt.
De agarplaten werden als regel na 1, 2 en 3 dagen geteld,
de gelatineplaten na 3, 4 en 5 dagen, dikwijls na nog
langere tijd.

Als voedingsbodems hebben wij alkalische bouillonagar
resp. -gelatine gebruikt. Veelal wordt voor het onderzoek
van meelproducten zetmeelagar verkozen, maar voor de waren,
die wij onderzocht hebben — dezelfde, als die aan de schimmel-
proef worden onderworpen, nl. cacao, maizena, peper en
nootmuscaat bood zetmeelagar geen enkel voordeel. Wij
hebben vergelijkende proeven verricht met zetmeelagar en
alkalische bouillonagar, waaruit ons bleek, dat in vele gevallen
de kolonies op zetmeelagar later opkwamen. Het aantal op
beide platen was gelijk, dus gaven wij de voorkeur aan
alkalische bouillonagar en -gelatine.

Wat het aantal kolonies betreft, dit loopt bij cacao en
meel sterk uiteen, nl. van 1000—30.000 per gram; bij sommige

monsters was dit getal nog aanzienlijk grooter! In het alge-
meen was het aantal kolonies, hetwelk bij 37° C op de
agarplaten opkwam, grooter dan op de gelatineplaten bij 22° C.
Amos en Kent Jones^) vonden bij hun proeven over meel
een aantal kolonies, dat overeenstemt met het door ons ge-
vondene, maar in tegenstelling verkregen zij als regel op de
gelatine meer kolonies dan op de agarplaten.

Gaan wij van dezelfde monsters het schimmel- en bacterie-
gehalte na, dan blijkt hiertusschen geenerlei verband te be-
staan. Hieronder volgt een tabel, waarin eenige onzer be-
palingen zijn samengevat:

Vervolgens een klein overzicht van de verschillende bacteriën,
die wij uit de waren isoleerden, waarbij zal blijken, dat be-
halve degene, die er door de bereiding reeds in zijn te ver-
wachten, door luchtinfectie de aanwezigheid der andere
bacteriën is te verklaren. Zooals wij reeds in de inleiding
betoogden, is de kans op besmetting bij deze waren groot,
zoowel uit de lucht, als van het materiaal en de handen

der arbeiders. Men zal dus een groote verscheidenheid van
bacteriën hierin kunnen aantreffen.

Een identificatie in deze groep is zeer moeilijk; dit komt
vnl. door de eenvormigheid van de stofwisseling dezer bac-
teriën, zoodat de indeeling bijna uitsluitend op morphologische
verschillen moet berusten. De beste onderzoekingen over deze
groep organismen zijn in 1916 verricht door Ford en mede-
werkers i), die in de voor die tijd heerschende groote ver-
warring orde schiepen en dubbele namen deden verdwijnen.
Zij onderzochten hiertoe meer dan 1700 cultures op morpho-
logie. Gramkleuring, gelatinevervloeiïng en wijze van sporen-
vorming: grootte, vorm en Hgging der sporen. Zij kwamen
op grond hiervan tot een indeeling in de volgende 9 groepen:

Kleine, homogene, sterk bewegelijke staafjes; afmeting
0.375 bij 1.5—2.5 fi. Op glucoseagar kolonies zonder uitloopers.
Centrale of excentrische, ovale sporen, 0.5 bij 0.75—0.875 /x,
dikwijls met aanhangende resten protoplasma.Op vastevoedings-
bodems harde, in het medium dóórdringende kolonies; in
vloeibaar milieu gekweekt, wordt een taaie oppervlaktehuid
gevormd.

Kleine, homogene, zeer bewegelijke staafjes; afmeting: 0.5
bij 2—4 fl. Op glucoseagar vormen zij veelal kolonies met
lange uidoopers. Centrale of excentrische, ovale sporen,

1) ]. S. Lawrence and W. W. Ford, J. Bact. 1, 273 (1916).
C. A. Laubach, J. L. Rice and W. W. Ford, Bact. 1, 493 (1916).

0.5 bij 1 — 1.125 yw, met aanhangende resten protoplasma. Op
vaste voedingsbodems vormen zij een zachte massa met een
neiging tot rimpelen, op vloeibare media een broze, ge-
makkelijk breekbare oppervlaktehuid.

Bewegelijke staafjes, iets grooter dan Bacillus subtihs of
Bacillus mesentericus; grootte 0.375—0.75 bij 0.75—3 /x.
Op glucoseagar ontstaan dikkere en langere vormen. In-
volutievormen komen reeds in jonge cultures voor. CyUndrische,
centraal gelegen sporen, 0.56—0.75 bij 1 — 1.5 Op vaste
voedingsbodems vormen zij een zachte massa, in vloeibare
groeien zij diffuus troebel, vormen geen of een weinig ont-
wikkelde oppervlaktehuid.

Groote, rechthoekige staafjes, die dikwijls lange draden vor-
men. Afzonderlijke cellen 0.5 bij 3—6 fi. Op glucoseagar
vormen zij dikkere en langere staven, gevuld met bolvormige
elementen. Sporen centraal of excentrisch, rond of ovaal tot
cylindrisch, 0.75—1 bij 1—2 fi. Sporen zijn zeer wisselend
van grootte en vormen dikwijls ketens. Groei op vaste

voedingsbodems droog en dóórdringend in het medium, op
vloeibare voedingsbodems flink ontwikkelde, taaie opper-
vlaktehuid.

Groote, bewegelijke staafjes, met ronde hoeken, 0.75 bij
2.25—4 fji. Groeien soms in korte ketens. Op glucoseagar
dikker en langer, met inwendig bolvormige lichaampjes.
Centrale of excentrische, cylindrische sporen, 0.5—0.75 bij
1.125—1.5 fi. Sporen dragen resten protoplasma aan één of
beide einden. Zij gelijken dikwijls op groote subtilis- of mesen-
tericussporen. Groeien op vaste voedingsbodems als een zachte
massa, soms rimpelig, in een vloeibare voedingsbodem ge-
kweekt, vormen zij een dikke, broze oppervlaktehuid.

Zeer groote, sterk bewegelijke staafjes, 0.75—1.25 bij
3—9 fi, dikwijls in lange draden liggend, die hun cytoplasma
verliezen en aan de peripherie eigenaardige protoplasma-
aanhangsels vertoonen. Protoplasma verandert snel in sterk
lichtbrekende, bolvormige lichaampjes, speciaal op glucose-
agar. Er ontstaan reeds vroeg doorschijnende vormen. Sporen
centraal, excentrisch of eindstandig, ovaal tot cylindrisch,
0.75—1.125 bij 1.5—2 varieeren sterk in vorm, soms rond,
soms rechthoekig, dikwijls niervormig. Groei op vaste voedings-
bodems als een dikke, zachte massa, in vloeibare diffuus troebel
met geen of een weinig ontwikkelde oppervlaktehuid.

Kleine, sterk bewegelijke staafjes, 0.5—0.75 bij 1.5—3
vormen in oude cultures dikwijls lange draden. Protoplasma
homogeen. Sporen eindstandig, rond, dikker dan het overige
deel van het organisme, 1 — 1.5 fj. in diameter.

Kleine, smalle, sterk bewegelijke staafjes, 0.375—0.5 bij
2.5—4 ^i. Op glucoseagar iets grooter, maar geen ver-
andering in het protoplasma. Sporen eindstandig, cylindrisch,
0.75 bij 1.125-1.5 /X.

Lange, sterk bewegelijke staafjes, aan de einden toege-
spitst, 0.375—0.5 bij 1.125—4 /i. Op glucoseagar iets grooter,
maar geen verandering in het protoplasma. Sporen ontwik-
kelen zich in het midden van het staafje, waardoor dit spoel-
vormig wordt. Sporen cylindrisch, groot, 0.625—0.875 bij
1.125-1.5 fl.

Ford deelt deze bacillen dus primair in naar morphologie,
bewegelijkheid en wijze van sporenvorming, secundair naar
de cultureele eigenschappen.

Bergey^) geeft 95 verschillende aërobe, niet-pathogene
sporendragers, die hij echter niet in groepen indeelt.

Vele van de genoemde bacteriën komen in de door ons
onderzochte waren voor, hetgeen ook niet te verwonderen is,
daar het bacteriën zijn, die in groote getale in lucht, water
en aarde voorkomen.

Door ons zijn geïsoleerd:
uit cacao, 15 stammen, behoorende tot de soorten:
Bac. mes. vulgatus
Bac. mes. fuscus
Bac. megatherium
Bac. danicus
Bac. laterosporus
Bac. subtilis
Bac. robur
Bac. mycoides
Bac. cereus.

uit maizena, 23 stammen, behoorende tot de soorten:
Bac. mes. vulgatus
Bac. mes. fuscus
Bac. mes. panis viscosi
Bac. megatherium
Bac. petasites
Bac. simplex
Bac. adhaerens
Bac. graveolens
Bac. subtilis.

uit nootmuscaat, 24 stammen, behoorende tot de soorten:
Bac. mes. vulgatus
Bac. mes. fuscus
Bac. mes. ruber
Bac. adhaerens

De determinatie van deze soorten is geschied op grond
van hun morphologische en biochemische eigenschappen door
middel van vorm, bewegelijkheid, wijze van groei op agar,
gelatine, aardappel, in bouillon, melk, vorming van indol in
peptonwater, zuur uit suikers, vervloeiing van gelatine. Verder
werden, indien noodig, nog de thermotolerantie, haemolyse
e.a. eigenschappen nagegaan.

Zooals wij reeds in de inleiding zagen, ontwikkelen deze
aërobe, sporendragende bacteriën zich in cacao reeds tijdens
de fermentatie en veroorzaken daar een ontleding van orga-
nische StofFen, welke ontleding van niet te lange duur mag
zijn, daar anders rotting gaat optreden. Tot deze groep be-
hooren nl. uitgesproken rottingsorganismen.

De belangrijkste vertegenwoordigers hiervan zijn Bact. coÜ
en Bact. lactis aerogenes (zie blz. 65). Uit cacao is door
ons verder nog Bact. crinatum geïsoleerd, een onbewegelijke,
niet-pathogene bacterie, behoorende tot de Anthrax-groep

De geïsoleerde soorten hiervan bleken veelal tot de „lucht-
coccenquot; te behooren, d.w.z. coccen, die veelvuldig in de
lucht voorkomen en dus vandaar uit de waren hebben besmet.

Micrococcus aurantiacus
Micrococcus cereus
Micrococcus subcitreus
Micrococcus flavus
Micrococcus Candidus

Verder bevatten verschillende monsters cacao Streptococcus
lacticus, waarschijnlijk afkomstig van de fermentatie.

Wij hebben voor het onderzoek hiervan gebruik gemaakt
van de methode „Veillonquot;. Deze methode munt nl. uit door
eenvoud en geeft zeer goede resultaten. Negen monsters
nootmuscaat zijn door ons op de aanwezigheid van anaërobe
bacteriën nagegaan, waarvan zes alleen aërobe organismen
bleken te bevatten. Uit de overblijvende drie monsters ver-
kregen wij vijf stammen, die bij nader onderzoek bleken niet
obligaat anaëroob te zijn, maar aëroob-fac. anaëroob. Van
deze vijf stammen waren vier coccen, behoorende tot de
soorten:

Bij deze laatste stam hebben wij als bijzonderheid opge-
merkt, dat de bacteriën, afkomstig van de kolonies, die diep
in de agar, dus anaëroob waren gegroeid, veel op boon-
vormige diplococcen geleken. Na eenige malen overenten
op alkalische bouillon en alkalische glucosebouillon, werd
het aantal normale micrococcen steeds grooter en na 3—4
maal overenten, bestonden zij weer geheel uit micrococcen.
Het is ons niet bekend, dat in de literatuur dit verschijnsel
reeds eerder is beschreven. De andere coccen vertoonden
niet een dergelijke vormverandering.

Zooals bij het water- en melkonderzoek deze verontreiniging
nagegaan wordt door het opsporen van de typische faecaal-

organismen: Bact. coli, Streptococcen en Bac. enteritidis sporo-
genes, werden de door ons onderzochte waren volgens de daar
gebruikelijke methoden op de aanwezigheid dezer organismen
nagegaan.

Wij gingen uit van de gefiltreerde emulsie van cacao,
maizena en nootmuscaat met steriel water. Als ophoopingsvloei-
stof voor Bact. coli werd gebruik gemaakt van zure-lactose-
neutraalrood-bouillon, voor Streptococcen van alkalische glu-
cosebouillon, voor Bac. enteritidis sporogenes van steriele melk.

Wij zullen niet een geheel overzicht geven van alle, door
ons verrichte proeven, maar volstaan met het algemeene
resultaat:

Naast Bact. coli hebben wij ook eenige malen Bact. lactis
aerogenes geïsoleerd.

Van deze groep organismen hebben wij tweemaal een
vertegenwoordiger geïsoleerd:

Bij de determinatie dezer organismen stuit men op vele
moeilijkheden, vnl. omdat nog geen bevredigend systeem hier-
voor bestaat. Wij zullen daarom volstaan met de eigenschappen
van de beide geïsoleerde stammen te vermelden:

na 4 dagen haemolyse
sterk vertakte draden
geen conidiën
na 7 dagen erythrodextr.
na 14 dagen geheel ontleed
lange, vertakte draden
onbewegelijk

geen haemolyse
sterk vertakte draden
geen conidiën
na 14 dagen erythrodextr.
na 21 dagen geheel ontleed

Met deze eigenschappen lijkt het waarschijnlijk, dat stam 29
Actinomyces albus zou zijn, een vrij veel voorkomende,
mesophyle saprophyt Aan een voorspelling omtrent de
identiteit van stam 1 hebben wij ons niet gewaagd.

Daar ons bij het onderzoek over de schimmelproef gebleken
was, welke sterk remmende werking de aetherische oliën
uit de specerijen op de groei der schimmels uitoefenen, zijn
wij tevens de werking hiervan op eenige bacteriestammen
nagegaan.

Dit zijn alle bacteriën, die wij in de door ons onderzochte
waren kunnen verwachten aan te treffen.

Wij hebben voor ons onderzoek gebruikt:
peperolie
nootmuscaatolie
kaneelolie
kruidnagelolie
eugenol.

Van deze oliën maakten wij verdunningen van 5 2.5
1 0.5 In elk dezer verdunningen werd een flinke hoe-
veelheid bacteriemateriaal geënt; na zeven uur bij kamertem-
peratuur te hebben laten staan, entten wij één oogje uit
elke verdunning over in alkalische bouillon en gingen na of
nog levende bacteriën aanwezig waren.

Uit de tabel blijkt, dat de bacteriën van peper- en nootmuscaat-
olie geen hinder ondervinden. Zelfs een verblijf van 7 uur in een
5 % olieëmulsie heeft geen invloed op de levende cel. Anders
is het bij kaneelolie, kruidnagelolie en eugenol. Kaneelolie
blijkt, zelfs in 0.5 % emulsie, Bact. coli, Bact. lactis aerogenes
en Bact. proteus te dooden. terwijl Bac. mes. vulgatus en
Str. lacticus nog een 5 % emulsie verdragen kunnen. Kruid-
nagelolie blijkt iets sterker te werken, daar hier Str. lacticus
in de 5 % emulsie is afgestorven. Eugenol heeft de sterkste
werking; alleen Bac. mes. vulgatus kan dit verdragen. Het
was trouwens te verwachten, dat de eenige sporendrager, die
bij ons onderzoek gebruikt werd, het beste tegen de invloed
der oliën bestand zou zijn.

Men mag, na deze werking te zijn nagegaan, nog geen
oordeel vellen over het voorkomen van deze bacteriën in de
specerijen, daar de omstandigheden hierin geheel anders zijn
dan in een door ons kunstmatig gemaakte emulsie.

Na dit overzicht over de voorkomende bacteriën in de
verschillende waren kunnen wij nog geen uitspraak doen over
de waarde en de beteekenis hiervan voor de beoordeeling
der waar.

Het zou zeker aanbeveling verdienen ook deze zijde te
beschouwen, met als resultaat: het stellen van een maximum
aan het aantal aanwezige bacteriën, hetgeen aan de hygiënische
gesteldheid der producten zeer zeker ten goede zou komen.

In dit proefschrift is een onderzoek ingesteld naar de zoo-
genaamde „Schimmelproefquot;, waaraan cacao, meel en specerijen
hier te lande worden onderworpen, om na te gaan of deze
schimmelig zijn of bij het bewaren groote kans hebben, spoedig
te gaan schimmelen en dus aan het gebruik moeten worden
onttrokken. De methode, die in de Koninklijke Besluiten voor
deze proef staat aangegeven, biedt vele moeilijkheden, voor-
namelijk bij de interpretatie der resultaten.

Om de subjectiviteit, die aan deze interpretatie is verbonden,
uit te sluiten, wordt een quantitatieve methode gegeven met
behulp van pruimenagar. Broedtijd 4 dagen bij 25° C.

Om de uitgroeiïng van Mucor stolonifer tegen te gaan,
welke schimmel geheele platen overgroeit en dientengevolge
ontelbaar maakt, wordt aan de pruimenagar kopersulfaat
toegevoegd in een concentratie van 1 g op 1500 cm® agar.

Behalve met anorganische zouten zijn ook proeven verricht,
om de invloed van verschillende aetherische oliën op de groei
van Mucor stolonifer en andere schimmels na te gaan. Hierbij
bleken kaneel- en kruidnagelolie de sterkste werking uit te
oefenen, daarna volgden peper- en nootmuscaatolie.

Vervolgens is een klein overzicht gegeven van de schimmels,
die in de verschillende waren aan te treffen zijn. Het laatste
hoofdstuk is aan de bacteriologie dezer waren gewijd.

Overzicht over de verrichte schimmeiproeven volgens het Koninklijk
Besluit en op pruimenagar

Deze kolom geeft duplo-bepalingen aan.
') = overgroeid.
Deze monsters werden afgekeurd.

17	—	12 ov.
7	—	4
3	—	7
5	—	11
2	—	1
3	—	5
1	—	2
2	—	1
10	—	9
1	—	0
1	—	0
1	—	2 ov.
5	—	1 ov.
1 ov.-		0
12	—.	4
1	—,	1
2	—	3
0	—	5
0	—	1
3	—	1
1	—	0
4	—	ov.
8ov.—		8ov.
0	—	3

Invloed van eenige aetherische oliën en anorga-
nische zouten op de groei van Mucor stolonifer.

Het is wenschelijk, de schimmelproef uit het Koninklijk
Besluit voor cacao en meel te vervangen door die op pruimen-
agar, waaraan per 1500 cm® agar 1 gram kopersulfaat wordt
toegevoegd.

Het onderscheid, dat Hruszek geeft voor humane en
bovine tuberculine, moet aan verontreinigingen worden toe-
geschreven.

De onderzoekingen van Pellegrini vormen geen bewijs
voor de pathogeniteit van Bacillus subtilis.

Een bewijs voor een stoechiometrische reactie bij de oxy-
datie van hexosen door koperhoudende alkalische oplossingen
is door Spengler, Tödt en Scheuer niet gegeven.

O. Spengler, F. Tödt en M. Scheuer, Zeitschr.
d. Wirtschaftsgruppe Zuckerind., Techn. Teil, 86,
130 (1936).

Het verdient de voorkeur de bepaling van het vetgehalte
in melkbrood te verrichten in de kruim als zoodanig.

Kristallen zijn opgebouwd uit deeltjes van bepaalde ultra-
microscopische afmetingen, welke een zekere stabiliteit be-
zitten.

De interpretatie van de adsorptie-isotherm volgens Cun-
ningham biedt voordeelen boven die van Langmuir.

De verklaring, die Bertram geeft voor de cis-transisomerie
van oliezuur en elaïdinezuur, is onjuist.

	a	b	c
Monster	1.5g 2cm5	1.5 g 3 cm'	1.5g 4cm'
	water	water	water
meel	22 kolonies	17 kolonies		a gt; b gt; c
nootmuscaat		-t-		a gt; b =c
nootmuscaat			—	a gt; b gt; c
nootmuscaat		—	—	a gt; b = c
nootmuscaat				a =b = c
witte peper			zwak -t-	a gt; b gt; c
cacao		5 kol.		a = b = c
cacao		4 kol.	2 kol.	a gt; b gt; c
cacao				a =b = c

No.	0.1 g suspensie, daarop agar.	Agar, daarop 0.1 g suspensie.
Cacao
138	20	21
863	4	3
390	1	2
144	6	5
136	2	3
4544	41	48
Maizena
74	ontelbaar	ontelbaar
102	40	35
134	18	25
213	34	30
298	19	20

No.	Pruimenagar	Pruimenagar -t- kopersulfaat
	Cacao
1246	60-94	74-102
1281	2-0	I-O
1219	5-2*	2-4
1354	4-0	1-1
184	_*	2-5
400	106_99	83-63
2249	_	24-31
	Maizena
2148	29-*	14-27
2353	18-20	19-25
2463	ir_*	22-22
2572	4-1	1-4
2580	3-2	3-6

Pruimenagar 25° C aantal kol. per 0.1 g	Aetherisch oliegehalte	Schimmelproef K.B.
Pruimenagar 25° C aantal kol. per 0.1 g	Aetherisch oliegehalte	sterk-pos.	pos.	zwak-pos.	neg.
160	2.16
73	2.30
211	2.58	-H-
89	2.62
287	2.78	-H- -t-H-	-1-
19	2.98	-H- -t-H-
7	3.02
17	3.08
353	3.10
132	3.16		-H-
8	3.38
110	3.58
45	3.82
1	4.06
349	4.54
110	4.62

	Bacteriekolonies per gram		Schimmels per gram
	agar 37° C	gelatine 22° C	pruimenagar 4 d bij 25 °C
Cacao	70	_	20
	12700	110	60
	870	340	280
	6900	2000	20
	23300	3000	160
Maizena	33400	18400	170
	1700	700	80
	2000	6600	70
••	400	200	90

3922	3	16
4020	7	-F
4065	8	-1-
4090	2	4-
4175	2	-t-
4331	-1-
4380	13	4-
4528	1	11
4544
4554	8	-1-
4581	16
4590	—	-f-
4638	10	-1-
4653	_
4663	2	-t-
4679	_	4
4681	—	6
4750
4770
4823	_	2
4843		12
4901	-
4919	_	10
4952	5	-f
4981	—	24
5047	—	5
5096	6
5119	—	6
5183	—	9
5193	3	25
5214	2	-t-
136	—
138	1
144		zw. -1-
182		31

9 —	ov. 8
15 —	ov. 8
ov.—	6
ov.-	6ov.
12 —	7 ov.
87 —	60 ov.
51 —	45 ov.
4 —	3
58 ov.—	36 ov.
86 —	50 ov.
8 —	13
9ov.—	26
40 ov.—	45 ov.
9	6
1S —	17
43 ov.—	53
7 —	9
95 —	106
157 —	104
2 —	3
102	94
7 —	6
3 —	5
15 —	17
6 —	4
4 ov.—	8ov.
18 ov.—	16 ov.
10 —	11
3 —	2
10 —	20
26 —	33
6 —	3
20 —	21
3 —	0
11 —	12

Mon- ster	Volgens K.B. 1.5 g cacao 24 uur 2 X 24 uur		Pruimenagar 37 °C 0.1 g cacao 24 uur 2 X 24 uur	Pruimenagar 25° C 0.1 g cacao 4 X 24 uur
216	5			76 ov.'—	64 ov.
219	—	-1-		20 —	17
262	3	-1-		4 ov.—	10
276	_	-t-		7 ov.—	15
330	—	1		5 —	8
351	_	3		4 ov.—	6
388	_			2 —	1
459	3	■		70 ov.—	ov.
490	12			49 ov.—	46 ov.
511	—	zw.-l-		3 ov.—	9ov.
546	3	-t-		0 —	ov.
581	—	5		0 —	0
587	—	16		3 —	0
601	—	18		21 —	27
636		8		7 —	4
660		-H		14 —	10 ov.
675	10	-1-		ov.—	14 ov.
689	zw.-l-	-1-		13 —	5
690		-1-		23 —	16
714		-f-		19 —	18
741	1	-1-		39 —	9ov.
803	—	-1-		13 —	6
843	9	-1-		10 —	17
846	3	4-		13 ov.—	19 ov.
848	2	-1-		10 —	8
883	—	46		12 —	12
986	1	10		2 —	3
995	2	4-		9 —	10
997	3	zw.4-		ov.—	2
1002	13	4-		9 —	16
1067	1	4-		21 —	12 ov.
1105	—	4-		11 —	6
1180	5	4-		19 —	58
1187	9	4-		6 —	8ov.

2913
4115	—	ZW.
4224	—	—
4167	—	—	—.
4381	—	1	ZW.
4406	—	11
4441	—	—
4494	—	6
4499	—
4642	—	_	7
4690	—	—
4769	—	—	3
5010	—.	zw. •
5014	—	—
5075	—	4	ZW.
3	—	—	5
55	—	—
141	—	22
152	—	23
268	—	2	29
376	—	4
460	—	5
774	—	2	3
836	_	_
1428	—	35
1617	—
1626	-	3
2353	—	14
2463
2543
2580	2	40

Mon- ster	24 u	Volgens K.B. 5 g peper 2X24u, 3X24u		Pruimenagar 37° C 0.1 g peper 24 uur 2 X 24 uur		Pruimenagar 25° C 0.1 g peper 4 X 24 uur
3861	_		*		1072	2290
4030	—	—	—			90 — 99
4196	—	—	—			910 — 880
4618	—	—	ZW.			960 — 1020
4669	—		*	350		1860 — 2120
5095	—	—	—			1540 — 1260
5213	—	—	zw.-\|-			1100 — 870
23	—	—	—			gt; 500
191	—	2W.-\|-	*	sterk-f-	ontelbaar	3520 — 4400
767	—		*		ontelbaar	3000 ä 4000
861	—	-	zw.--h			2480 — 3100
886	—	-	—			2270 — 2700
951	—	-	—			920 — 820
963	—	-	ZW.			1230 — 1530
988	—				270	3000 è 4000
1053	—	-	—			2010 — 1470
1075	—	-	.—			2150 — 2220
1137	—	-	—			8160 — 7200
1190	—	-	—			3160 — 3360
1194	—	—'	zw.-\|-			2930 — 3300
1237	—	-	—			4040 — 3000
1280	—■	-	—			3310 — 3890
1312	—		ZW.			1220 — 1390
1362	—		*		ontelbaar	2540 — 2910
1503	—	—	—			2850 — 2590
1507	—		zw.-(-			3320 — 2910

Mon- ster	24 u	Volgens K.B. 5 g peper 2X24u 3X24u		Pruimenagar 37 ° C 0.1 g peper 24 uur 2 X 24 uur	Pruimenagar 25° C 0.1 g peper 4 X 24 uur
4013					230 — 293
4197	—	—	_		123 — 139
4330	—	—	—		211 — 260
4361	—	—	—		207 — 225
4685	—	—	—		173 — 170
4688	—	—	—		118 — 130
4687	—	—	zw.-f-		118 — 144
4736	—	—	z.z.-j-		710 — 790
5011	—	—	_		360 — 510
309	—	—	2		14 ov.— 55
456	_	_	_		132 — 140
539	—	—	_		183 — 195
609	—:	—	_		90 — 98
682	—	_	18		ontelbaar
765	—	—	—,		70 — 69
842	—	—	—		28 — 26
887	—	—	—		60—58
1191	—	—	—		124 — 117

Mon- ster	24 u	Volgens K.B. 5 g nootmuscaat 2X24u 3X24u				Pruimenagar 37° C 0.1 g nootmuscaat 24 uur 2 X 24 uur	Pruimenagar 25° C 0.1 g nootmuskaat 4 X 24 uur
3761	_			*		108	77	— 70
4014	—	28		68			24	— 18
4086	—-				9		0	— 2
4135	—	zw.-j-				9	19	— 13
4168	—	18		54			20	— 13
4223	—	48					15	— 15
4357	—	zw.-j-					17	— 24
4383	—		1		7		68	— 60
4463	—		8	52			1	— 4
4536	—	16		ZW.quot;			17	— 14
4579	—						158	— 161
4583	—	—	8	35			114	— 96
4588	—	zw.-\|-					18	— 20
4597	—	zw.-j-					6	— 9
4716	—	zw.4-					247	— 260
4864	—		7	42			3	— 11
4874	—		1	zw.-f-			43	— 61
4939	—						41	— 37
5024	_	zw.-f-				- 26	30	— 28
5036	—			zw.-}-			129	— 144
5107	—	12		zw.-(-			11	— 17
5117	—					900	2540	—2260
5206	—			10			69	— 65
5211	—		9	zw.-\|-			11	— 10
108	—	zw.-\|-					11	— 10
148	—					— ontelbaar	1040	— 980
161	—			11			192	— 156
190	—	zw.-				20	14	— 12
206	—	zw.-				160	113	— 109
241	—						20	— 16
242	—			12			192	— 188
279	—	21					9	— 11
387	—		9	zw.-\|-			11	— 18
397	_	zw.-					48	— 51
411	_	ZW.quot;					64	— 55
420	_	zw.-					300	— 390
516	—			zw.-\|-			27	— 23
618	_	zw.-f-				60	82	— 72
638	_				*	100	152	— 153
695	—						3	— 4
688	_						7	— 4
947	_		2				120	— 111
959	—	12		zw.-i-			30	— 22
999	_			ZW.-l-			15	— 12
1107	—			zw.-f-			100	— 126
1336	_	zw.-f		4-			30	— 33
1623	—						20	— 28