PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DEN
GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUUR-
KUNDE AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE
UTRECHT, OP GEZAG VAN DEN RECTOR-MAG-
NIFICUS DR. W. E. RINGER, HOOGLEERAAR IN
DE FACULTEIT DER GENEESKUNDE, VOLGENS
BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNIVERSITEIT
IN HET OPENBAAR TE VERDEDIGEN OP
MAANDAG 21 JUNI 1937. DES NAMIDDAGS
TE 4 UUR

Het verschijnen van mijn proefschrift geeft mij de gelegen-
heid te getuigen van mijn erkentelijkheid jegens allen, die tot
mijn wetenschappelijke vorming hebben bijgedragen.

Grooten dank ben ik U verschuldigd, Hoogleeraren en Lec-
toren aan de Universiteit van Amsterdam, met wie ik via col-
lege, laboratorium en studeerkamer in nader contact mocht
komen. Dit contact heeft mij èn wetenschappelijk èn als mensch
verrijkt.

Hooggeleerde Kruyt, Uw belangstelling en medeleven zijn
mij tot grooten steun geweest. Aan de gesprekken met U be-
waar ik kostbare herinneringen.

Hooggeleerde WOLFF., Hooggeachte Promotor, het is mij
niet mogelijk, nu reeds het voorrecht, onder Uw persoonlijke
leiding gewerkt te hebben, ten volle te beseffen. De tijd, dien
ik in Uw laboratorium-gemeenschap ben opgenomen geweest,
behoort tot de gelukkigste, die een wetenschappelijk werker
kan beleven. Bij de groote mate van vrijheid, die U mij ge-
laten hebt, wist U steeds door Uw kritischen zin en Uw initia-
tief richting aan mijn werk te geven. Ik hoop in de toekomst
te kunnen toonen, dat ik Uw belangstelling en Uw vertrou-
wen waardig was.

Zeergeleerde julius, zeer veel ben ik U verschuldigd. Uw
vriendschappelijke belangstelling, Uw daadwerkelijken bijstand
en Uw helder inzicht zijn mij steeds weer tot steun geweest.

Zeergeleerde Van Eekelen, waarde Emmerie, ook op Uw
kennis en ervaring mocht ik telkens weer een beroep doen,
en niet tevergeefs.

Den directeur van het Rijks-Instituut voor de Volksgezond-
heid te Utrecht, en den chef van de serologische afdeeling van
die instelling, dank ik voor de bereidwilligheid, waarmede zij
mij diphterie-toxine en -antitoxine ter beschikking stelden.

Aan alle werkers van het Hygiënisch Laboratorium ten-
slotte mijn dank voor hun hulpvaardigheid en voor de prettige
wijze, waarop zij mij een plaats in hun kring hebben gegeven.

Toxine-antitoxine-vlokking
B. Richting van verder onderzoek .
V. Experimenten over electrolyt-invloed
VI. Bespreking van de resultaten .
VII. Algemeen overzicht:

4
6

I 2

20
24

45
48

Het doel van het onderzoek, een studie van het physisch-
chemisch karakter van processen, samenhangend met immuni-
teit, vraagt een voor dat doel geschikte experimenteelc tech-
niek. Als zoodanig is in vele gevallen een bekende optische
methode, nl. het bepalen van de licht-absorptie, bruikbaar.

De processen, die men op deze wijze kan bestudeeren, zijn
in twee groepen te splitsen:

van groep A: de precipitine-reactie, d.i. de vorming van een
specifiek precipitaat, tusschen paardenserum en
het serum van daarmee geïmmuniseerde ko-
nijnen.

van groep B: de lysis van bacteriën onder invloed van lyso-
zym, een stof, die in staat is bepaalde bacteriën
op te lossen. Vooral traanvocht en kippeneiwit
bevatten veel lysozym.

Het onderzoek, met de daarop aansluitende beschouwingen,
valt dus in twee gedeelten uiteen.

Daaraan laat ik vooraf gaan enkele opmerkingen over het
gebruik van den extinctiometer en over de waarde van troe-
belingsmetingen. Men bedenke daarbij, dat voor het onder B
genoemde proces nog geen andere quantitatieve methode be-
staat, om het lysisproces als zoodanig waar te nemen, terwijl
de meest exacte techniek voor vlokkingsreacties, de ultra-
microscopische telling, bij eiwitsolen niet toegepast kan worden.

De lichtabsorptie door een colloïdale oplossing hangt niet
op eenvoudige wijze van den toestand van de oplossing (grootte,
aantal, aard van de deeltjes) af (zie bijv. Gribnau, 13). Boven-
dien, als de absorptie voortdurend verandert, kan ze niet
nauwkeurig bepaald worden, daar de voor een meting noodige
tijd te groot is. Bij het bestudeeren van vlokkings- of lysis-
processen met behulp van den Moll-extinctiometer kan men
echter ook tevreden zijn met het bepalen van den uitslag van

den galvanometer. De galvanometer wordt dus meet-instru-
ment, inplaats van nul-instrument. De uitslag, u, hangt nog
minder dan de extinctie op bekende wijze samen met den toe-
stand van de oplossing, maar kan tenminste continu worden
afgelezen.

De regelmatige, en reproduceerbare, verandering van u met
het verloop van het proces, dat men onderzoekt, bewijst, dat
een samenhang van u met den toestand van de onderzochte
oplossing wel degelijk bestaat. Men kan zich dezen toestand
gekarakteriseerd denken door een getal T, varieerend van o
(= oorspronkelijke toestand) tot bijv. loo (= eindtoestand,
dus totale vlokking, resp. lysis). Wat voor u geldt ten opzich-
te van T, geldt evenzeer voor du|dt, de verandering van u in
de eenheid van tijd, en dT/dt. Deze laatste grootheid is de coa-
gulatie- resp. lysis-snelheid.

Indien nu een invloed van zekere variabelen op du/dt kan
worden vastgesteld, dan zal dit het gevolg zijn van den invloed,
die zij op dT/dt hebben, zij het misschien niet in precies ge-
lijke mate. Maar steeds zal een grootere invloed op dT/dt zich
uiten als een grootere invloed op du/dt, m.a.w. het verloop van
du/dt met een willekeurige variabele a geeft het verloop van
dT/dt met a weer. Speciaal de waarde van a voor bijzondere
punten is van beteekenis: waar du/dt maximaal is, moet ook
dT/dt een maximum hebben, en dergelijke.

Op deze gewoonlijk gevolgde redeneering is door Wannow
(27, daar ook verdere litt.) critiek geoefend. Het betreft in
Wannow's onderzoek de vlokking van een AS2S3-S0I door ver-
schillende zouten: KCl, MgCl^, AlCU, ThCU. Er bleek nu,
dat de bereikte maximale troebeling afhankelijk was van het
gebruikte zout. Wannow vergelijkt echter den invloed van
twee variabelen tegelijk: zoowel het zout, als de gebruikte con-
centratie. Dan geldt natuurlijk de bovenstaande redeneering
niet meer. Waar het den invloed van zouten betreft, bevatten
mijn proefreeksen slechts één variabele, n.1. de concentratie
van steeds hetzelfde zout, of den aard van het gebruikte zout,
bij steeds dezelfde concentratie. Onder deze voorwaarden is er
dus geen principieel bezwaar tegen, in het volgende du/dt als
maat voor de coagulatie- resp. lysis-snelheid te gebruiken.

Dit is natuurlijk alleen dan geoorloofd, als, behalve de te
bestudeeren variabele, alle andere grootheden, die den uitslag
van den galvanometer (u) bepalen, constant zijn. Ik wil na-

a)nbsp;De electrische stroom, waarmee de lichtbron gevoed
wordt, moet volkomen constant zijn. Ik bereikte dit,
door de voedingsbatterij tijdens het gebruik bij te laden.
De gloeistroom zelf werd met een fijn regelbaren weer-
stand ingesteld. Op deze wijze gelukte het, de variaties
zoodanig te beperken, dat zij op het resultaat niet meer
van invloed waren.

b)nbsp;Vreemde, zwevende deeltjes in de gebruikte vloeistof-
fen (vooral in de sera) werden verwijderd door met
een snelle centrifuge (14000 t.p.m.) zeer scherp te cen-
trifugeeren.

c)nbsp;De concentratie van de lichtverstrooiende en -absor-
beerende deeltjes moet constant zijn, aan het begin van
elke proef.

Bij de proeven met lysozym was dit eenvoudig te be-
reiken door steeds evenveel bacteriën toe te voegen.
Het lysozym zelf veroorzaakt, in de gebruikte hoeveel-
heden, geen waarneembaren uitslag.

Bij de precipitine-reactic is het niet mogelijk, streng aan
dezen eisch te voldoen, daar hier beide reageerende be-
standdeelen een zekere eigen extinctie hebben. Deze is
echter gering, zoolang geen vlokking optreedt. Het gaat
er dus voornamelijk om, de concentratie van het vlok-
bare sol constant te houden, in dit geval van het anti-
serum. Immers het is bekend, dat het prccipitaat voor
het grootste deel uit antilichaam bestaat (Marrack, 20,
pag. 109). Dit punt zal nog aan een nadere discussie
onderworpen worden.

Op grond van het bovenstaande meen ik, dat de experimen-
teele techniek inderdaad zooveel mogelijk aan de te stellen
eischen voldoet.

De litteratuur over het chemisch aspect van immunologi-
sche reacties, en speciaal van precipitine-reacties, is in 1934
door Marrack (20) in een voortreffelijke monografie ver-
zameld. Ik wil voor een algemeen overzicht, en voor bijzon-
derheden van de litteratuur voor 1934 naar Marrack's werk
verwijzen, en slechts die onderzoekingen nader bespreken, die
in direct verband met mijn eigen onderzoek staan.

Wat bij immunologische studies steeds weer op den voor-
grond treedt, is de merkwaardige specificiteit; deze is vooral
zoo onbegrijpelijk, omdat de reageerende systemen van col-
loïdalen aard zijn. De colloïdchemie immers kent een dergelijke
specificiteit in het geheel niet. De antilichamen zijn chemisch
niet van normale globulinen te onderscheiden (Marrack,
hfdst. II).

Door Heidelberger en Pedersen (17) zijn antisera te-
gen pneumococcen, en daaruit bereide gezuiverde antilichaam-
fracties, onderzocht met de ultracentrifuge. De sedimentatie-
constante van het antilichaam uit konijnenserum was identiek
met die van normaal konijnenserum-globuline. In paarden-
serum blijkt de antilichaamfunctie gebonden te zijn aan een
fractie met een grootere sedimentatie-constante (dus met groo-
tere deeltjes), die ook in normaal paardenserum in geringe
concentratie voorkomt. Dit bevestigt dus de opvatting, dat de
antilichaamfuncties gebonden zijn aan normale bestanddeelen
van het serum. Zoolang het niet gelukt, hen daarvan te schei-
den, moet men aannemen, dat het antilichaam veranderd glo-
buline is.

Het onderzoek naar de oorzaken van de specificiteit is in
een nieuw stadium gekomen door als antigeen te gebruiken
eiwitten, waarin vreemde verbindingen gesubstitueerd zijn. Dit
gelukt bijv. door koppeling van eiwit met diazoniumzouten
(Landsteiner) . Daardoor verandert het immunologisch ka-
rakter van het antigeen, er ontstaan nieuwe elementen in de
specificiteit. Voor de daarbij optredende regelmatigheden, zoo-

als samenhang tusschen immunologische aequivalentie van
twee antigenen, en de mengkristalvorming van de verbindin-
gen, die de karakteristieke eigenschappen aan het antigeen ver-
kenen (z.g. determinante groep) moet ik hier verwijzen naar
Marrack, hfdst. III en IV.

Het onderzoek naar de specificiteit kan zuiver qualitatief
zijn: er ontstaat een precipitaat, of niet. Daarbij stuit men
echter op bijzonderheden van quantitatieven aard, die nadere
bestudeering eischen.

Het is n.1. gebleken, dat slechts in een bepaald gebied van
concentratie-verhoudingen van antigeen en antilichaam pre-
cipitatie optreedt. Daarbuiten vindt geen zichtbare reactie
plaats. Dit is het z.g. zóne-phenomeen, dat in het volgende
aan een nadere beschouwing onderworpen zal worden (een
overzicht geeft Marrack op blz. 107 e.v.).

Het onderzoek van het zóne-phenomeen kan op verschil-
lende wijzen uitgevoerd worden. Daarbij blijft steeds de in-
richting van de proef dezelfde, n.1. een der reagentia in con-
stante hoeveelheid, het andere in steeds toenemende verdunning.
Slechts de techniek van waarneming kan verschillend zijn.

1.nbsp;De eenvoudigste methode bepaalt zich tot het consta-
teeren of er na een zekeren tijd al dan niet een neerslag
is ontstaan. Dit kan nog nauwelijks een quantitatieve
methode heeten.

2.nbsp;De analyse van precipitaten (zie b.v. HeidelberGER
en Kendall, 14, en Haurowitz, 18) is zeer tijdroo-
vend, en leent zich juist voor de studie van het zóne-
phenomeen minder goed, omdat men slechts den eind-
toestand, en niet het proces zelf waarneemt.

3.nbsp;De derde wijze van waarneming is gebaseerd op het
bepalen van den tijd, waarna zichtbare vlokken op-
treden.

Deze methode is oorspronkelijk toegepast op de toxine-anti-
toxine-vlokking, door RamoN (23). Dean en Webb (6)
bewezen, dat men bij gewone precipitine-reacties hetzelfde
resultaat krijgt. De vlokkingstijd heeft voor een bepaalde ver-
houding antigeen/antilichaam (G/A) een minimum; aan weers-
zijden van deze verhouding treedt de vlokking eerst later op.

Deze optimale verhouding („optimum proportionquot;) is ver-
schillend, als men de eene maal het antilichaam, den anderen

keer het antigcen constant houdt. De op de eerste wijze ge-
vonden verhouding bleek overeen te komen met het neutrale
punt, d.w.z. men kan dan, na volledige precipitatie, noch
antigeen noch antilichaam meer aantoonen in de bovenstaande
vloeistof. De kwestie der twee verschillende optimale verhou-
dingen zal nog nader worden besproken.

Van den invloed van elcctrolyten en van de pH op de pre-
cipitine-reactic, en speciaal op het zóne-phenomeen, is nog
maar weinig met zekerheid bekend (zie b.v. Marrack, blz. 87,
92 C.V.). Vast staat alleen, dat zouten in hooge concentratie
de precipitatie geheel onderdrukken, Heidelberger en ken-
dall (15) vermelden, dat de samenstelling van het neerslag
(uit antipneumococcen-serum cn specifiek koolhydraat-anti-
geen) verandert bij toevoeging van zouten, terwijl door
Brown (3) in hetzelfde systeem een verschuiving van de op-
timale verhouding, bij toevoeging van zout, is waargenomen.
Een verklaring van deze veranderingen geven de onderzoe-
kers niet.

De vijf gebruikte sera gaven in de ringrcactic nog ccn troc-
beling met antigccn-vcrdunningen van i : 5000 a i : 10000.

Voor het gebruik werden dc sera schcrp gecentrifugeerd,
om zc zooveel mogelijk van zwevende deeltjes te bevrijden.

De gebruikte verdunningsvlocistoffcn komen in den tekst
ter sprake. Het volume der rcactic-vIocistof was bij alle proe-
ven van ccn serie constant.

Na menging van antigcen cn antiscrum, in geschikte con-
centraties, ontstaat langzamerhand een prccipitaat. Dc eerste
periode van dit proces, nl. de toenemende troebcling, werd met
den MoII-extinctiomctcr waargenomen. Daarvoor werden aan
het instrument enkele wijzigingen aangebracht. Ter besparing
van vloeistof werd dc groote, locc bevattende, cuvcttc ver-
vangen door een kleine, met ccn inhoud van ca. 1.3cc. Daar-
toe werden op dc vlakgcslepcn einden van een stukje glasbuis

kleine glaasjes gekit. In de buis was een gaatje gemaakt voor
de vulling. Een soms noodige reiniging gelukte uitstekend met
een klein propje watten. De lichtbundel werd afgeschermd,
door aan den cuvette-houder twee diafragma's te bevestigen,
een voor en een achter de cuvette; door een metalen plaatje
met een gat op de juiste plaats werd het doel op eenvoudige
wijze bereikt.

Het geheel kwam tusschen de lamp en de thermozuil, op
de plaats van de groote cuvette.

De cuvette voor de compensatie-thermozuil werd vervan-
gen door een iris-diafragma. De uitslag, door deze zuil alleen
veroorzaakt, is een uitstekende controle op het constant zijn
van de lichtbron.

De gevoeligheid van het zoo gewijzigde instrument is na-
tuurlijk kleiner dan bij gebruik van de groote cuvette; zij bleek
echter voor de meeste gevallen voldoende.

De menging der reagentia had plaats in de cuvette, met
behulp van een capillaire pipet. Tegelijk werd een stopwatch
in werking gesteld. Vervolgens werd elke 30 seconden de stand
van den galvanometer (u) afgelezen. (Daarbij konden op de
in m.m. verdeelde schaal de halve schaaldeelen nog worden
afgelezen. Onderdeden worden met of — aangegeven, dus
25 = 25 4- etc.). Uit de gemeten waarden van uitslag (u)
en tijd (t) werd een u-t-kromme samengesteld.

Het karakter der u-t-krommen werd bestudeerd met anti-
serum L De verdunningsvloeistof was daarbij in hoofdzaak
'/i5 m. phosphaatbuffer van pH 7.7. Met '/15 m. buffer van
pH 5.9, zoowel als met physiologische NaCl-oplossing werden
analoge resultaten verkregen.

a. Indien de toename van de troebeling niet al te snel gaat,
heeft de u-t-kromme een vorm als B in fig. I. Ter vergelijking
is daarnaast gezet de u-t-kromme voor vlokking met tannine,
A, waarbij evenveel antiserum, in dezelfde verdunningsvloei-
stof, werd gebruikt als voor de bepaling van kromme B. De
hoeveelheid tannine werd zoo gekozen, dat de verkregen krom-
men goed vergelijkbaar zijn.

Kromme A vertoont den gewonen vorm, die men in het
algemeen vindt, bij troebelingsmetingen aan vlokkende solen

Kromme B daarentegen vertoont een duidelijk buigpunt.
Daar dit buigpunt volkomen reproduceerbaar blijkt, is het
waarschijnlijk een bijzonderheid van de precipitine-reactie.
Voor een nader onderzoek werden daarom de volgende proe-
ven gedaan:

	1«
2
tlJ
	12
Z
Z	10
2	8
0
	6
•n
z	^
0
z a	2

b. I. Bij constante verhouding der componenten (antigeen
en antiserum) werden de absolute concentraties gewijzigd.
Daardoor verandert natuurlijk de snelheid, waarmee u toe-
neemt '), maar tevens verandert de tijd, waarna het buigpunt
bereikt wordt (tb). Zoo vond ik de volgende cijfers:

tijd, waarna het buigpunt
bereikt wordt (tb), min.:
21/2; 3-
5y2; 6,1/2.
8 ; 9.
12 ; 13.

Bij de groote verdunningen moest zelfs de groote cuvette gebruikt
worden; de geringere troebeling kan zoo door grooter gevoeligheid van
het instrument gecompenseerd worden.

tratic van het antigcen gevarieerd („optimum-proportionquot;-
methode van Dean en Webb, 6). In navolging van Marrack
(l.c. blz. io8) zal deze virerkwijze in het vervolg als
a-methode worden aangeduid. Daarbij blijkt de „buigpunts-
tijdquot;, tb, maar weinig te veranderen. Er treden echter andere
veranderingen in dc u-t-krommc op, die ik wil weergeven
door van elke kromme twee grootheden te bepalen, n.1. dc
waarde van du|dt in het buigpunt, en een waarde van du/dt
in een later stadium, b.v. na 7 ä 8 minuten; het buigpunt
ligt hier bij ca. 3 min.).

du/dt stelt (zie inleiding) een coagulatie-snelhcid voor. Dan
is dus du/dt in het buigpunt de maximale coagulatie-snelheid,
verder S genoemd.

De tweede waarde is dan de coagulatie-snelheid op het latere
tijdstip, verder V genoemd.

kromme S: S als functie van de concentratie antigeen
(de eenige variabele in deze proeven). Daarbij gaat S
door een maximum.

kromme V: V als functie van de concentratie antigeen.
Zoo er in deze kromme al een afhankelijkheid van dc
concentratie tot uiting komt, dan is deze toch veel
minder uitgesproken dan in kromme S.

3. Bij constante concentratie antigeen werd de concentra-
tie van het antiscrum gevarieerd. Marrack duidt deze me-
thode aan als het yï-procédé. Daarbij bleek, dat in het ondcr-

zochte traject zoowel S als V regelmatig met de concentratie
antiscrum toenemen (fig. 4, waarin kromme S dc S-waarden,
V de V-waardcn geeft).

c. I. Het was nu dc vraag, in hoeverre deze resultaten
met dc andere antisera (II, III, IV en V) bevestigd konden
worden.

Bij scrum II bleek allereerst, dat, onder overigens gelijke
omstandigheden, veel meer antiserum noodig was dan met
serum I, om ccn behoorlijk meetbare trocbcling te krijgen. Het
scrum kon sicchts ca. i : 6 verdund worden, tegen i : 25 bij
scrum I. Fig. 2 leert, dat in dit geval dc tijd, noodig om het
buigpunt te bereiken, tb, zoo klein kan worden, dat van be-
trouwbare aflezingen, ter bepaling van S, geen sprake kan zijn.
Inderdaad kwam het buigpunt niet duidelijk tot uiting.

Ik moest dus zoeken naar een middel, om bij grootere ver-
dunning, bijv. I : 20, toch een behoorlijk sterke troebeling tc
krijgen. Waarschijnlijk zou dan het buigpunt later optreden,
cn dus beter voor metingen toegankelijk zijn.

Toevoeging van alcohol (ca. 15%) leidde tot het ge-
wenschte resultaat. De controle-proef met antiserum of anti-
geen alleen gaf bij die alcohol-concentratie nog geen troebe-
ling. Met meer alcohol wordt ook deze controle positief, hoe-
wel veel zwakker, dan indien beide componenten aanwezig
zijn. Bovendien treedt er bij deze controle-proeven geen buig-
punt in de u-t-kromme op, wèl bij de specifieke precipitatie.
Dit wijst dus ook weer erop, dat het buigpunt bij dc precipi-
tinc-reactic behoort. Toch is toevoeging van alcohol niet be-
vredigend.

Hetzelfde resultaat bleek nu bereikt te kunnen worden
door verlaging van de pH en van de zoutconcentratie. Zoo
werd tenslotte als verdunningsvloeistof zeer geschikt bevon-
den een 1:5 verdunde phosphaatbuffer van pH 5.9 (eind-
concentratie dus molair).

Voor scrum III gaf een NaCl-oplossing van 5 m. aeq./L heel
goede resultaten. Voor de sera IV en V voldeed deze verdun-
ningsvloeistof ook. Soms werd er, ter buffering, nog glyco-
coll aan toegevoegd, tot een concentratie van 'I20 mol|L. Een
invloed van het glycocoll zelf kon niet worden waargenomen.

2. Na de invoering van als bovenstaand gewijzigde ver-
dunningsoplossingen werden de krommen S, en, voor zoover
bepaald, V, voor alle sera teruggevonden. Een voorbeeld voor
serum II geeft fig. 5, voor scrum IV fig. 6. Resultaten met
serum III komen in het volgende nog herhaaldelijk voor (fig.
9, lo, II, 12).

maximum van kromme S (S-waarden) is bij serum II vrij
vlak, als bij serum I, bij serum III echter zeer scherp.

Uit de figuren 3 en 5 blijkt, dat de grootheid V minder
uitgesproken afhangt van de concentratie-verhouding der
reagentia dan S. De bepaling van V- krommen werd daarom
verder achterwege gelaten.

d. De reproduceerbaarheid van de u-t-krommen is in het
algemeen goed. Duplo-proeven, zelfs op verschillende dagen,

gaven slechts kleine afwijkingen in S, van de orde van —
schaaldeel, op een totaal van 8 of meer. Ook het vloeiende ver-
loop van S met de concentratie van het antigeen (fig. 3, 5. 6
enz.) wijst op goede reproduceerbaarheid.

Noch antigeen, noch antilichaam alleen precipiteeren spon-
taan. Evenmin tannine. Zoowel in de precipitine-reactie als
bij de vlokking van eiwit door tannine moet er dus een soort
verbinding ontstaan, die vervolgens uitvlokt. Het voorkomen
van een buigpunt in de u-t-kromme kan dan ongedwongen ver-
klaard worden, door aan te nemen, dat de binding van anti-
geen en antilichaam langzaam plaats vindt, die van tannine
aan eiwit echter veel sneller. De tijd, waarna het buigpunt be-
reikt wordt, kan dus ook bindingstijd genoemd worden (tb).

Deze opvatting vindt steun in de proeven, waarbij de ab-
solute concentraties gevarieerd werden (fig. 2) : bij verdun-
ning neemt de kans op botsing tusschen twee deeltjes af (dus
ook de kans op gunstige, d.i. tot binding leidende botsing),
met als gevolg een langere periode, voordat de binding zoo
volledig mogelijk is. Dan zal de ontstane verbinding het ge-
makkelijkst vlokken, dus daar treedt een maximum in du/dt
op, m.a.w. daar heeft de u-t-kromme een buigpunt.

De verhouding antigeen/antilichaam (G/A) blijkt vooral in-
vloed te hebben op de maximale coagulatie-snelheid (S). Het
maximum van S is te vergelijken met den minimum-vlok-
kingstijd in de proeven van Dean en ^VEBB (6).

Op de daarop volgende periode blijkt de invloed der ver-
houding G/A veel geringer. De grootheid V is over een groot
traject nagenoeg onafhankelijk van G/A. Hier blijkt, dat welis-
waar de begin-condities in het eindresultaat, n.1. den vlok-
kingstijd, tot uiting komen, maar toch hun invloed alleen
uitoefenen in het begin van het proces.

De vraag, of het maximum van S ligt bij de „neutralequot; ver-
houding (waarbij, na volledige precipitatie, nóch antigeen, nóch

antilichaam meer in de bovenstaande vloeistof zijn aan tc too-
nen) , evenals dc minimum-vlokkingstijd (Dean cn Webb, 6),
heb ik slechts in ccn enkele steekproef onderzocht. Het resul-
taat wees wel in deze richting. Het is evenwel a priori niet
noodig, dat men, met als criterium eenerzijds den vlokkings-
tijd, anderzijds de troebelingssnelheid, exact gelijke waarden
voor de optimale verhouding vindt. De eene methode meet
het begin, de andere het einde van hetzelfde proces. Secundaire
factoren, werkend in de periode tusschen volledige binding
(buigpunt) en vlokking, een vrij langen tijd dus (vgl. fig. 6a,
en blz. i6), kunnen op het eindresultaat nog wel een geringen
invloed hebben.

Bij proeven met constante concentratie antigeen en variatie
van het antiserum vindt men in het algemeen ook een be-
paalde verhouding, waarvoor de vlokkingstijd een minimum
is. (Taylor, 25a). Blijkbaar werd echter in de in fig. 4
weergegeven proeven de daarvoor noodige concentratie anti-
serum niet bereikt. Ook in proeven met een ander serum (V)
kon het ^-optimum niet gevonden worden. Blijkbaar moet
men daarvoor, met de gebruikte sera, de (constante) antigeen-
concentratie zeer klein nemen. In dat geval echter gaat de
vlokking zóó langzaam, dat met den extinctiometer geen be-
trouwbare resultaten meer te verkrijgen zijn. In verband met
de geringe beteekenis van de -methode voor precipitine-
reacties (zie hieronder) werden deze proeven niet verder
voortgezet.

De beide optimale verhoudingen (a- en /^-methode) vallen
niet samen. Brown (3) toonde aan, dat met een speciale tech-
niek het verschil overbrugd kon worden. Zij liet bij de
ß -methode de buizen, waarin zij de vlokking waarnam, staan
tot in alle een precipitaat was opgetreden. Door schudden
werd dit geredispergeerd. Daarbij blijkt een bepaald precipitaat
het meest resistent, n.1. dat, wat ontstaan is uit de oplossing,
waarvan de samenstelling overeen komt met de optimale ver-
houding volgens de a-methode. De zoo gewijzigde ^-methode
noemt Brown dc y-methode.

Een overeenkomstig gewijzigd a-procédé levert hetzelfde
resultaat als dc ongewijzigde, oorspronkelijke a-methode. Deze
proeven bewijzen dus, dat het a-optimum meer beteekenis
heeft dan het /S-optimum.

S-waarden, zooals als vlokkingstijden zijn slechts vergelijk-
baar, als de totale hoeveelheid vlokbaar sol constant is (verg.
inleiding). Neemt deze toe, dan zal, door grooter botsings-
kans, ook S toenemen. Daarbij bereiken de gevormde aggre-
gaten ook eerder een bepaalde grootte, d.w.z. ze worden eer-
der zichtbaar, of wel dc vlokkingstijd neemt af.

Noch de a-, noch de /J-methode voldoen geheel aan dezen
eisch. Alleen, de afwijkingen zijn bij constant antiserum veel
kleiner dan bij constant antigeen, omdat het precipitaat, dus
ook het vlokbare sol, voor het grootste deel uit antilichaam be-
staat (Marrack, blz. 109 e.v.). Variatie van het antilichaam
(/J-methode) geeft dus groote fouten, variatie van het anti-
geen (a-methode) slechts geringe. Een eventueel klein verschil
van de a-optimale verhouding en de werkelijke neutrale ver-
houding valt blijkbaar binnen de grenzen der waarneming.

d. Bij de Ramon-titratie, d.w.z. de vlokking van diphterie-
toxine en anti-toxine (Ramon, 23) wordt de /?-methode toe-
gepast. De resultaten daarvan, uitgedrukt in dc verhouding
van de werkzaamheid van antitoxine cn toxine, blijken
te kloppen met de dierproef. (Althans als er geen ana-
toxine aanwezig is. Anatoxine is toxine, dat zoodanige ver-
anderingen heeft ondergaan, dat het niet meer toxisch, wel
nog antigeen is; aanwezigheid van anatoxine uit zich dus met
in de dierproef, wel in de vlokkingsreactie.) Toch kan men
zich heel goed denken, dat een colloïdchemisch „neutraalquot;
neerslag in vivo nog een toxische werking heeft door afsplit-
sing van geringe hoeveelheden toxine. Voor neutralisatie in
vivo is dan meer antitoxine noodig dan in de vlokproef. De
overeenstemming tusschen dierproef en vlokkingstitratie vol-
gens de /J-methode kan dus ook toevallig zijn. Levert echter
werkelijk de /S-mcthode hier het „neutralequot; punt, dan moet
men aannemen, dat het precipitaat in hoofdzaak uit toxine

a - en het /?-optimum geheel samen. Dit is op theoretische gron-
den onmogelijk, maar het verschil kan wel zeer gering zijn
(zie blz. 16).

Enkele oriënteerende troebelingsmetingen werden bij de
toxine-antitoxine-vlokking uitgevoerd.

Een moeilijkheid daarbij is, dat de snelheid van troebeling
veel geringer is dan bij de onderzochte precipitine-reactie.
Daarom moest met de groote cuvette (zie inleiding), dus met
grooter gevoeligheid gevsrerkt w^orden, wat de betrouwbaar-
heid van de resultaten ongunstig beïnvloedt.

In elk geval kon het volgende worden vastgesteld:
I. de reactie verloopt ook bij kamertemperatuur met be-
hoorlijk meetbare snelheid; zulks in tegenstelling met de gang-
bare meening, die ertoe leidde, de titratie volgens Ramon bij
50° uit te voeren.') Enkele oriënteerende proeven bij hooger
temperatuur, waarbij het geheele toestel in een kleinen lucht-
thermostaat werd geplaatst, schijnen erop te wijzen, dat welis-
waar bij 37° C. het proces sneller verloopt dan bij 20°, maar
bij 50° niet sneller dan bij 37°.

Bij de gewone proefopstelling, met buizen in een waterbad,
spelen echter de convectie-stroomen een belangrijke rol: men

laat opzettelijk een deel van de reactie-vloeistof boven het wa-
teroppervlak van het verwarmingsbad uitsteken. De convectie,
die de vlokking versnelt, is natuurlijk bij 50° nog sterker dan
bij 37°. Toch komt het mij voor, dat men met deze „roer-
inrichtingquot; een clement van onzekerheid invoert. Hetzelfde
geldt natuurlijk voor op analoge wijze uitgevoerde precipitine-
reacties.

') Verschillende antitoxische sera kunnen, wat hun vlokkingssnelheid
betreft, enorm uiteenloopen: in de proef bij 50° kan de minimuni-vlok-
kingstijd varieeren van ^/s uur tot 5 uur of meer! Het is natuurlijk heel
goed mogelijk, dat de door mij gebruikte sera alle tot het „snellequot; type
behoorden. Waarop de onderlinge verschillen der sera berusten, is niet
bekend. Waarschijnlijk zijn zij vergelijkbaar met de gevonden verschillen
tusschen de gebruikte precipiteerende sera; zie c. blz. 10.

2.nbsp;De gevonden u-t-krommen toonen geen duidelijk buig-
punt; fig. 6a geeft naast elkaar een paard-antipaard-precipi-
tatie (A, met antiserum I, verg. fig. 2 en blz. 8), en een toxine-
antitoxine-vlokking, bij 50° (B). Men merke ook op, dat in
beide gevallen de uitslag na i uur nog steeds toeneemt: er zijn
dan nog geen vlokken (vgl. blz. 12, b).

De binding geschiedt hier dus blijkbaar sneller dan in de
precipitine-reactie, waardoor het bepalen van S-waarden on-
mogelijk is. Toch is de verdunning van het antiserum soms
vrij groot, i : 25 a 30 (vgl. blz. 12, a).

Als maatstaf voor de reactie-snelheid nam ik daarom een-
voudig de verandering van den galvanometer-uitslag in een
willekeurigen tijd, nl. van 1/2 tot 10 minuten. Au.

3.nbsp;Bij variatie van de concentratie antitoxine, met con-
stante toxine-concentratie (|8-methode, Ramon-titratie), vindt
men een maximum van A u voor een bepaalde verhouding der
componenten. Uit deze verhouding werd, met de bekende
werkzaamheid van het antitoxine, de sterkte van het toxine
berekend. De zoo gevonden waarde stemt bevredigend overeen
met de op de gewone wijze bepaalde waarde:

4.nbsp;Ook bij variatie van het toxine, met constant anti-
toxine (o -methode) is er een verhouding, waarvoor Au maxi-
maal is. De daaruit berekende sterkte van het toxine is ver-
schillend van de volgens 3. bepaalde:

De verschillen zijn weliswaar zeer gering, vergeleken bij wat
men met precipitine-reacties vindt. De geheele zóne is trou-
wens erg smal (zie ook blz. 14, d).

5.nbsp;De metingen worden ongunstig beïnvloed door het feit,
dat zoowel toxine als antiserum sterk gekleurd zijn. Ik heb

getracht dit eenigszins te ondervangen door als verdunnings-
vloeistof in geval 4. een bouillon te gebruiken, die ongeveer
dezelfde extinctie had als de toxine-bouillon. In geval 3. nam
ik, in enkele proeven, behalve antiserum ook nog normaal
paardenserum, en hield de som van beide constant. Hoewel
daarmee een verbetering is bereikt, geef ik toch bovenstaande
cijfers onder een zeker voorbehoud.

Een vollediger, en nauwkeuriger, onderzoek zal pas met
gezuiverde oplossingen (liefst geheel kleurloos) mogelijk zijn.

c. De gevonden verschillen tusschen de voor dc precipitine-
reactic gebruikte antisera schijnen samen tc hangen met den
colloïdalen toestand van het antilichaam (het antigeen was in
alle proeven hetzelfde paardenserum).

Een verklaring van deze verschillen is hier niet mogelijk.
Het bestaan ervan echter brengt de beteekenis naar voren van
een systematische studie van den invloed van electrolytcn en
van de pH.

1.nbsp;de binding van antigeen en antilichaam kon aangetoond,
en dc ervoor noodige tijd bepaald worden.

2.nbsp;Het zóne-phenomeen is terug te brengen tot den in-
vloed, die dc verhouding der componenten op de eerste stadia
der vlokking heeft. Op het verdere verloop der vlokking is
een invloed van deze beginconditie niet duidelijk meer aan te
toonen.

b.nbsp;Bij mijn verder onderzoek ging ik uit van de twee grond-
gedachten in de immunologie, nl. die van ehrlich en die van

Volgens Ehrlich waren immunologische reacties te verge-
lijken met echte, specifieke, chemische reacties, terwijl bordet
juist den nadruk legde op het colloïdchemische karakter der
processen. Daarbij stond (natuurlijk, in 1900) de adsorptie
op den voorgrond.

De moderne ontwikkeling der immuunchemic wijst sterk in
de door Ehrlich aangegeven richting; toch blijft ook Bordet's
inzicht van waarde. Tot een mogelijke combinatie van beide
beginselen kan men komen op grond van de volgende over-
wegingen:

2.nbsp;Variatie van de verhouding antigeen/antilichaam kan
geen invloed hebben op den aard van deze krachten.

3.nbsp;Het zóne-phenomeen moet dus verklaard kunnen wor-
den uit het niet-specifieke karakter, dat deze krachten natuur-
lijk ook moeten hebben.

4.nbsp;Daarvoor moet men dus zoeken naar analoge verschijn-
selen, berustend op krachten, die geen enkel specifiek clement
in zich hebben.

5.nbsp;Daarbij dient men zich te wenden tot het gebied der
lyophiele colloïden, waartoe immers alle immunologisch be-
langrijke verbindingen behooren.

Een dergelijke analogie kan inderdaad gevonden worden,
immers een sterk zone-effect vindt men bij de complex-coacer-
vatie, of algemeener, bij de complexvorming (Bungenberg de
Jong c.s. 4).

c. Complexvorming is de wederzijdsche vlokking van te-
gengesteld geladen hydrophiele colloïden. Het klassieke voor-
beeld is de reactie tusschen arabische gom (negatief) en gelatine
(positief, dus bij een pH, lager dan het iso-electrisch punt).
Er treedt een tweede gecondenseerde phase op, die, afhankelijk
van de omstandigheden, dunvloeiaar tot geheel vlokkig kan
zijn. De coacervatie is maximaal voor een bepaalde concen-
tratieverhouding der reagentia; deze verhouding komt vrijwel
overeen met die, waarbij het coacervaat geen electrokinetische
potentiaal heeft, dus met het neutrale punt. Met meer gelatine
is het coacervaat positief, met minder gelatine negatief ge-
laden. Bij verandering van de pH verschuift deze neutrale ver-
houding: bij hooger pH is meer gelatine noodig. Boven het
iso-electrisch punt treedt de complexcoacervatie in het geheel
niet op.

De verklaring van deze verschijnselen moet gezocht wor-
den in de electrostatische attractie tusschen de tegengesteld ge-
laden deeltjes. Is deze grooter dan de afstooting tusschen de
gelijk geladen deeltjes, dan blijft er in totaal nog een attractie
over, de z.g. effectieve attractie, die tot aggregatie van de
deeltjes leidt. De effectieve attractie is voor een bepaalde ver-
houding der solen maximaal, n.1. waar de positieve en de
negatieve ladingen elkaar juist neutraliseeren. De aggregatie
gaat gepaard met een desolvatatie. De intensiteit van deze
desolvatatie bepaalt den aard van het product der reactie: bij
zwakke desolvatatie vloeistof, bij sterkere meer een vloksel.

d.nbsp;Een vergelijking van complex-coacervatie en precipitine-
reactie levert het volgende:

2.nbsp;bij beide correspondeert de optimale verhouding met
een neutrale verhouding.

3.nbsp;Het verschil is, dat bij de complexcoacervatie de com-
ponenten tegemteld, bij de precipitine-reactie echter gelijk ge-
laden zijn, en elkaar als gevolg daarvan afstooten.

Het is echter zeer goed denkbaar, dat tusschen positieve
groepen van het eene deeltje, en negatieve groepen van het
andere deeltje een attractie bestaat. Als inderdaad daardoor
een aggregatie tot stand kan komen, dan moet dat in verband
vs^orden gebracht met stereochemische factoren, die immers in
de immuunchemie zoo'n belangrijke rol spelen (zie historisch
overzicht en hoofdstuk VII). Een dergelijk vermoeden is, op
geheel anderen grond, door Haurowitz (18) geuit, die er ver-
der geen experimenteelen steun voor geeft.

Door OSTWALD (22) is reeds de analogie tusschen complex-
coacervatie en precipitine-reactie gesignaleerd. Hij zag echter
niet de ladings-tegenstelling, maar de dehydratatie als pri-
maire oorzaak, vandaar de naam dehydratatie-vlokking. Ex-
perimenteele studies over deze analogie zijn door OSTWALD
niet gemaakt, en zijn mij ook verder niet bekend.

e.nbsp;Door Bungenberg de Jong (I.e.) is aangegeven, op
welke wijze men kan nagaan, of dc wisselwerking tusschen
twee solen op onderlinge electrostatische attractie berust (com-
plex-vorming). Ik noem:

1.nbsp;studie van coacervaat-druppels, b.v. desintegratie in
een electrisch veld.

treden geen zichtbare druppels op'), dus is desintegratie daar-
van niet mogelijk; en zoowel de uitgangssolen als het precipi-
taat zijn negatief geladen, ook electrophorese kan geen uit-
sluitsel geven. Blijft over de studie van den invloed van electro-
lyten en van de pH.

Noot bij de correctie: heidelberger en KendalL (J. Exp. Med.
65, 647 (1937)) beschrijven precipitaten (uit anti-pneumococcenserum en
specifiek koolhydraat) met een gelei-achtige consistentie. Mogelijk is dat
reeds een overgang naar een meer vloeibaren toestand.

Bij de complexcoacervatie is n.1. gebleken, dat deze door
electrolyten onderdrukt wordt. De werking van verschillende
zouten is vooral afhankelijk van de lading der ionen. Werkt
men met aequivalente concentraties, dan vindt men, dat steeds
de hoogerwaardige ionen de vlokking sterker onderdrukken;
dus als x-y een zout voorstelt met een x-valent kation en een
y-valent anion, dan vindt men

4-1 gt;3-1 gt;2-1 gt;1-1 voor de kationen, bij gelijk anion
en 1-4 gt; 1-3 gt; 1-2 gt; I-I voor de anionen, bij gelijk kation.

Dit optreden van de beide valentie-regelsis karakteristiek
voor de complex-coacervatie.

De verklaring vindt men in de verzwakking van het elec-
trisch veld van het deeltje door de ionen, waarbij hoogerwaar-
dige ionen sterker werken dan lager geladen ionen. En wel
werken natuurlijk de negatieve ionen op de positieve deeltjes,
en de positieve ionen op de negatieve deeltjes. Maar steeds is
het resultaat een verzwakking van de effectieve attractie.

f. De invloed van electrolyten is reeds in hoofdstuk I in
het kort besproken (blz. 6). Het feit, dat ook hier hooge con-
centraties electrolyt remmend werken, is al een aanwijzing voor
de analogie van precipitine-reactie en complexcoacervatie. Na-
dere gegevens, verkregen met behulp van de in het voorgaande
ontwikkelde techniek, zijn verzameld in het volgende hoofd-
stuk.

a. Eerst werd onderzocht de invloed van verschillende an-
ionen, bij gelijk kation, en wel bij één enkele verhouding anti-
geen/antilichaam. Onderzocht werden NaCl, Na2S04/2, en
K4Fe(CN) J4 (het verschil tusschen K en Na speelt in het geheel
geen rol) voor den invloed van de valentie, en KCl, KBr en
KJ voor den invloed van de lyotropie (vgl. noot i op blz. 23).
De proeven werden gedaan met antiserum II en iets minder
antigeen, dan met het neutrale punt (dus met het maximum
van S) overeen komt.

1) In de colloïdchemie bekend als Schulze-Hardy-regels; zie b.v.
Freundlich, Kapillarchemie, 4de druk, II, 121.

van het electrolyt in milli-aequivalenten per liter gegeven, en
hebben S en tb dezelfde beteekenis als tevoren.

b. Het onderzoek van een volledige reeks van positieve
ionen wordt onmogelijk gemaakt door het feit, dat 3- en meer-
waardige kationen eiwit precipiteeren en/of door hydrolyse van
hun zouten moeilijkheden geven. Bij complexe ionen kan bo-
vendien de intense kleur een bezwaar zijn. Het wegvallen van
dit criterium maakte het noodzakelijk te zoeken naar een an-
dere methode om den invloed van de valentie der ionen op
de precipitatie vast te stellen.

Dc studie van den invloed van verschillende elcctrolyten op
het zone-effect (volgens de optimum-proportie- of a-methode,
vgl. blz. 12, en fig. 3, 5 cn 6) bleek voor dit doel bruikbaar
te zijn.

tróle met antigcen-concentratie o, voldoende om met eenige
zekerheid de S-G/A-kromme te construeeren.')

Het bepalen van een grooter aantal punten was bezwaarlijk, omdat
het dan niet mogelijk bleek, een volledige reeks, dus alle zouten bij één

25 en 40 m. acq.|L. Ter vergelijking werd aan elke serie een
reeks proeven zonder zout toegevoegd.')

De resultaten zijn grafisch weergegeven in fig. g, 10 en 11,
waarbij ik mij tot de grootheid S beperkte.

c. De invloed van de pH werd, eveneens met serum III,
op geheel analoge wijze onderzocht door aan de basis-verdun-

concentratie, op één dag te bepalen. Dit laatste echter is, met het oog op
mogelijke veranderingen van de gebruikte oplossingen van antigeen en
antiserum, zeer gewenscht.

Zonder zout, of ,,in waterquot; beteekent, dat géén zout aan de basis-
verdunningsvloeistof werd toegevoegd; niet, dat de oplossing geheel zout-
vrij was. De basis-vloeistof was in alle proeven een oplossing van 5 m.
aeq./L NaCl en 50 m. mol/L glycocoll.

ningsvloeistof (die hier geen glycocoll bevatte!) phosphaatbuf-
fers van verschillende pH toe te voegen.

a.nbsp;De proeven van fig. 7 en 8 w^ijzen al in de richting van
complexvorming: inderdaad blijkt de lading van het anion
een belangrijker factor dan de plaats in de lyotrope reeks.

De invloed van het electrolyt uit zich op tweeërlei wijze:
bij toenemende concentratie neemt S af, t», toe. Vooral het
toenemen van tb is van belang; tb is een maat voor de snel-
heid, waarmee de primaire binding plaats vindt. Er blijkt
dus, dat werkelijk de primaire reactie vertraagd wordt, en niet
alleen de precipitatie van de gevormde verbinding van anti-
geen en antilichaam langzamer verloopt.

De afname van S volgt natuurlijk automatisch uit de ge-
ringere bindingssnelheid.

De onderzoekers, die zich met den invloed van electrolyten
op de precipitine-reactie hebben bezig gehouden, vestigen vooral
de aandacht op het lyotrope effect (zie DoWNS en Gottlieb, 7;
verdere Htt. bij Marrack, p. 95 e.v.). Uit het bovenstaande
is gebleken dat de valentie een grootere rol speelt. Daarbij be-
denke men echter, dat de zoutconcentratie in deze proeven veel
kleiner was dan de gebruikelijke. Daar moet wel de oorzaak
liggen, dat het effect van de valentie nu pas duidelijk naar
voren komt (zie ook blz. 27).

b.nbsp;Een vollediger inzicht in den invloed van het electrolyt
geven de proeven over het zone-effect (fig. 9, 10 en 11).
Daarbij vallen de volgende merkwaardigheden op:

1.nbsp;eenzelfde concentratie van eenzelfde zout kan, ten op-
zichte van water (n.b. zie noot i op blz. 23!), zoowel rem-
mend als versnellend op de precipitatie werken, afhankelijk
van de verhouding antigeen/antilichaam (b.v. in fig. 11).

2.nbsp;de optimale verhouding verschuift, afhankelijk van aard
en concentratie van het toegevoegde zout.

3.nbsp;de afzonderlijke waarden van S zijn ook afhankelijk
van aard en concentratie van het toegevoegde zout.

ad 2: De gevonden verschuivingen van het optimum zijn
samengevat in onderstaande tabel 2. Daarbij noem ik de ver-
schuiving: het quotiënt van de optimale verhouding met zout,
gedeeld door de optimale verhouding zonder zout (in plaats
van de verhouding G/A kan men eenvoudig de concentratie
van G nemen, daar A toch in alle proeven dezelfde concen-
tratie heeft).

* De waarde bij 10 m. aeq./L. CaCla is een onderste grens.
Een nauwkeuriger bepaling is niet mogelijk, omdat S niet goed
bepaald kon worden: het buigpunt in de u-t-kromme komt
hier te vroeg.')

Het bestaan van een verschuiving van de optimale verhou-
ding is op zichzelf al een bewijs voor den electrostatischen
aard van de specifieke attractie. Immers in het algemeen zullen
positieve en negatieve groepen niet in gelijke mate worden
veranderd; waar zonder zout aequivalentie was, zal die met
zout niet meer zijn.

De richting van de verschuiving is niet te voorspellen. In-
dien men echter de waarden voor KCl als uitgangspunt neemt,
kan van die voor aequivalente concentraties K2SO4 eenerzijds,
CaCL anderzijds, wèl iets voorspeld worden.

Immers vervanging van KCl door K2SO4 in aequivalente
concentratie laat den invloed der kationen ongewijzigd. De
negatieve groepen veranderen dus niet. Echter werkt 804quot;/2
sterker dan Cl', zoodat de positieve groepen verzwakt worden.

De nauwkeurigheid van deze cijfers moet men niet al te hoog aan-
slaan; immers de krommen zijn bepaald met slechts 5 punten (zie blz. 21).
De onderlinge verhouding in een horizontale of verticale rij is echter on-
getwijfeld juist, en het is deze onderlinge verhouding, waaraan verdere
beschouwingen vast te knoopen zijn.

Daardoor moet de optimale verhouding zoo veranderen, dat
er meer positieve, of minder negatieve groepen zijn (vgl. b.v.
den invloed van dc pH op de complcxcoacervatie van arabi-
sche gom cn gelatine).

Vervanging van KCl door CaCU echter zal dc positieve
groepen onveranderd laten, cn dc negatieve groepen verzwak-
ken; dan zijn voor optimale precipitatie méér negatieve groe-
pen noodig.

Aan het bovenstaande kan, voor alle drie onderzochte con-
centraties, voldaan worden door aan te nemen, dat dc reagce-
rendc groepen in het antilichaam positief, in het antigcen nega-
tief zijn. Daarbij is van deze groepen slechts verondersteld, dat
bun werking afhangt van hun elcctrostatisch veld; wat overi-
gens dc aard van deze groepen is, kan nog in het midden
gelaten worden.

Het verloop van de verschuiving met de concentratie van
één zout is iets minder eenvoudig. Weer zij de invloed van
KCl uitgangspunt van de beschouwing. Experimenteel blijkt,
dat dc verschuiving grooter is dan i.oo (dat er dus mèt zout
meer antigcen noodig is, om een bepaalde hoeveelheid anti-
scrum optimaal tc vlokken, dan zonder zout), dus dat de
negatieve groepen sterker worden beïnvloed dan de positieve
groepen (lo m. aeq./L). Men kan verwachten, dat bij hoogere
zoutconcentratie het verschil in werkzaamheid der ionen zich
minder zal doen voelen. Een aanduiding daarvoor vindt men
in de waarden bij 25 en 40 m. acq./L, die niet meer met zeker-
heid verschillend te noemen zijn, m.a.w. bij nog hoogere con-
centratie zou ongetwijfeld de verschuiving weer gaan afnemen.

Dit nu ziet men bij CaCU: daar wordt, door de zooveel
sterkere werking van het Ca-ion, de maximale verschuiving
eerder bereikt (n.1. al bij de eerste onderzochte concentratie),
cn dc proeven geven alleen dc daarop volgende daling weer.

Evenzoo is het duidelijk, dat bij K2SO4 het verschil tusschen
de werking van positieve en negatieve ionen kleiner is dan bij
KCl, met als gevolg een kleinere verschuiving, die in het on-
derzochte traject alleen maar toeneemt.

Uit de waarnemingen bij de drie zouten is dus het geheele
beeld af te leiden, dat één zout in ccn volledige concentratie-
reeks zou geven.

Metingen bij hoogere zoutconcentraties worden, door de
dan te kleine S-waarden, te weinig betrouwbaar. Alleen met

Inderdaad neemt dan de verschuiving verder af; bij 50 m.
aeq./L vond ik ca. 1,4, in goede overeenstemming met de waar-
de voor 40 m. aeq./L, bij 100 m. aeq./L nog slechts 1.2, juist
zooals te verwachten was.

Een verschuiving van dc optimale verhouding onder invloed
van electrolyt was totnutoe alleen in het systeem anti-pneumo-
coccen-serum specifiek koolhydraat bekend (Brown, 3).

Dat bij andere systemen nooit verschuivingen zijn gevon-
den, kan twee oorzaken hebben. In de eerste plaats is de vlok-
kingstijd, die altijd bij zóne-studies bepaald wordt (zie blz. 5),
misschien minder gevoelig voor kleine veranderingen van de
verhouding antigeen/antilichaam dan de troebelingssnelheid S.

Maar in elk geval zijn de hoogere zoutconcentraties, die
men gewoonlijk toepast (zie blz. 24), minder geschikt om
dergelijke effecten te bestudeeren. Zoowel het verschil tusschen
de zouten onderling als de invloed van verdere zout-toevoe-
ging, wordt kleiner, naarmate de uitgangsconcentratie toe-
neemt.

Men zal zich herinneren, dat de zoutconcentratic in de hier
beschreven proeven met opzet zoo laag gekozen was, om bij
kleine concentraties der reageerende componenten toch een be-
hoorlijk meetbaar effect te krijgen (blz. 11, 12). Daarbij is nu
tevens gebleken, dat door het laag houden der zoutconcentra-
ties de gelegenheid ontstond, den invloed van dit electrolyt op
de reactie te bestudeeren (vgl. ook blz. 24).

Dat in het door Brown onderzochte systeem (l.c.) toch
groote verschuivingen optreden, ondanks de hooge zoutcon-
centraties, is waarschijnlijk een speciale eigenschap van dit
systeem.

ad 3. Bij het bestudeeren van den invloed van electrolyten
op S-waarden moet rekening worden gehouden met de boven
besproken verschuiving van het optimum. Strikt vergelijkbaar
zijn slechts die S-waarden, die bij vergelijkbare (d.i. dus in het
algemeen verschillende) waarden van G/A vallen. Als verge-
lijkbare verhoudingen G/A komen slechts de optimale ver-
houdingen in aanmerking, omdat daar dc reactieve groepen in
antigeen cn antilichaam clcctrisch aequivalent zijn. Andere
vergelijkbare verhoudingen G/A kunnen alleen uit dc optimale

In tabel 3 zijn de S-waarden bij de optimale verhoudingen
(dus de maximale S-waarden) weergegeven als het quotient
van S-(max. met zout) gedeeld door S-(max. zonder zout),
dus geheel analoog aan de waarden van de verschuiving in
tabel 2.

of den invloed van de zoutconcentratie bij eenzelfde zout,
of den invloed van verschillende zouten in aequivalente
concentratie.

Men moet er hier rekening mee houden, dat op S ook de
niet-specifieke afstooting, tengevolge van de negatieve lading
en de hydratatie der deeltjes, invloed heeft. Het maximum van
S bij ca. IO m. aeq./L. KCl is daarvan een uiting. Immers de
attractie wordt door toevoeging van zout steeds verzwakt.
Een sterkere vlokking kan dus alleen het gevolg zijn van een
gelijktijdige vermindering van de afstooting, die de verzwak-
king van de attractie overcompenseert. Bij hooger concentratie
KCl overweegt de verzwakking van de attractiekrachten boven
die van de afstootende krachten.

Het gedrag van CaCU is nu duidelijk: de verzwakking der
afstooting is zooveel sterker, met als gevolg een veel hooger
maximum. Hierbij zij opgemerkt, dat de controle, G = o, bij
deze concentratie CaCU werkelijk nog o leverde, niettegen-
staande de zeer snelle troebcHng in de andere proeven.

Bij K2SO4 is de verzwakking der attractie sterker dan bij
KCl, die van de afstooting echter gelijk, zoodat hier geen
maximum in het verloop van S met de concentratie optreedt.

In de proeven van fig. 7 en 8 is hiermee geen rekening gehouden.
Dat was echter niet noodig, want het overwegen van den valentie-invloed
boven het lyotrope effect komt er even goed in tot uiting

orde in een horizontale rij, dus bij aequivalente concentratie
steeds CaCU gt; KCL gt; K2SO4, geheel in het kader van deze be-
schouwingen past.

d.nbsp;Uit deze proeven blijkt, dat de electrolyt-invloed vol-
komen te verklaren is met de hypothese, dat de precipitine-
reactie op electrostatische attractie tusschen antigeen en anti-
lichaam berust; daarbij moet men natuurlijk rekening houden
met het feit dat beide negatief geladen zijn, wat afstooting
geeft. Houdt men dat in het oog, dan is de analogie met de
complexcoacervatie inderdaad volkomen.

Er moet met nadruk op gewezen worden, dat de samen-
gesteldheid van het gebruikte antigeen op zichzelf géén ver-
klaring kan leveren voor welk der gevonden verschijnselen ook.

e.nbsp;Blijft nog te bespreken den invloed van de pH (fig. 12).
Ook deze is weer in twee deelen te splitsen, nl. bij toenemende
pH een verschuiving van het optimum en een verlaging van
de S-waarden .

I. De invloed op de S-waarden is zeer groot, en moet
worden verklaard door de met de pH toenemende negatieve
lading der deeltjes, dus door toenemende afstooting. Daarbij
zal ook de bindingstijd moeten toenemen. Inderdaad vond ik
voor de optimale verhoudingen:

2. Dat de waargenomen verschuiving van de optimale ver-
houding zoo gering is, is niet zoo eenvoudig te verklaren (men
Vergelijke b.v. den zeer grooten invloed van de pH op de
complexcoacervatie van arabische gom en gelatine). De ver-
schuiving is wel in de richting, die men verwachten zou: bij
hooger pH zijn minder negatieve groepen noodig. Als echter
de binding op b.v. COO - en NHs^-groepen berustte (zie
Haurowitz, 18), dan zou men een veel grooter verschuiving
verwachten. Een zeer geringe verschuiving werd in enkele
proeven met serum II ook gevonden. Men zou zelfs een deel
der verschuiving nog kunnen toeschrijven aan de vervanging

van de eenwaardige H2P04'-ionen in de bufferoplossing door
tweewaardige HP04quot;-ionen, met toenemende pH.

Het is wel interessant, er in dit verband op te wijzen, dat
ook bij andere processen gevallen zijn gevonden, waar de in-
vloed van de pH zeer gering is. Zoo bestudeerden Bungenberg
de Jong en Youkovsky (5) de concentratie CaCU, noodig om
een lecithine-coacervaat juist te ontladen. Deze ontladings-
concentratie bleek op eigenaardige wijze van de pH af te han-
gen: bij het iso-electrisch punt natuurlijk o, daarna stijging,
vanaf pH 4 tot pH 9 nagenoeg constant, dan verdere stijging.
Dus ook hier sterke invloed van electrolyten, blijkens de ont-
lading, en in een vrij groot traject een zeer geringe invloed
van de pH. Ik wijs slechts op de uiterlijke analogie, zonder
nu ook een dieperen samenhang met de precipitine-reactie te
veronderstellen.

Voor een verklaring van den geringen invloed van de pH
op de optimale verhouding zou men kunnen overwegen, of
misschien de actieve groepen een dipool-karakter hebben.
Voorloopig echter is het nog niet mogelijk, hier een beslissing
te treffen.

f. Het is hier de plaats om terug te komen op de ver-
schillen tusschen de sera onderling (vgl. blz. 17 en de noot op
blz. 15). De op blz. 11 geschetste maatregelen, genomen om
de precipitatie te versnellen, zijn met de kennis van het boven-
staande volkomen begrijpelijk. Immers de snelheid, waarmee
de vlokking plaats vindt, is in hooge mate afhankelijk van
de samenstelling van het milieu, waarbij zoowel de specifieke
attractie, als de niet-specifieke afstooting (lading èn hydrata-
tie, dus ook invloed van alcohol) een rol spelen. Het is alles-
zins plausibel, dat de onderlinge verhouding tusschen speci-
fieke en niet-specifieke krachten bij verschillende sera anders
kan zijn.

Zijn daarmee de verschillen der sera onderling begrijpelijk
gemaakt, de diepere oorzaak van deze verschillen onttrekt zich
nog aan de waarneming. Dit punt valt echter buiten de studie
van het mechanisme der precipitine-reactie.

Tenslotte wil ik trachten, mijn onderzoek in een breeder
verband met de vele immunochemische onderzoekingen te be-
schouwen.

De meest gangbare opvatting over het tot stand komen van
de verschijnselen van agglutinatie en precipitatie legt den na-
druk op het hydrophobe karakter van de ontstane verbinding
tusschen antilichaam en antigeen (d.i. dus de gesensibiliseerde
bacterie resp. de primaire verbinding tusschen antigeen en
antihchaam). Deze opvatting vindt steun o.a. in de electro-
phoretische metingen van northrop en DE KrUYF (19),
waarbij bleek, dat gesensibiliseerde bacteriën zich electrophore-
tisch gedragen als gedenatureerd globuline. Ook de invloed
van zeer geringe zoutconcentraties op de agglutinatie is ana-
loog aan dien op gedenatureerd globuline. Vooral door
Eagle (9) is de nadruk gelegd op deze analogie met dena-
turatie. Daar het antilichaam het grootste deel van het preci-
pitaat, resp. de oppervlakte van een gesensibiliseerde bacterie,
uitmaakt, zou denatureering van het antilichaam inderdaad
tot deze verschijnselen leiden.

Behalve dat het mechanisme van de denatureering uit den
aard der zaak geheel in het duister blijft, is er bovendien een
principieel bezwaar tegen deze theorie: zij eischt nl., dat al-
leen dc primaire binding specifiek is, terwijl de secundaire ag-
gregatie (agglutinatie of precipitatie) zou worden veroorzaakt
door het hydrophobe karakter, d.w.z. niet specifiek zou zijn.
Voor precipitine-reactics is dit niet experimenteel te toetsen,
wèl echter voor de agglutinatie van bacteriën.

Topley, Wilson en Duncan (26) onderzochten de agglu-
tinatie van een mengsel van twee op het oog te onderscheiden
bacteriën door een mengsel van de bijbehoorende antisera. De
theorie zou dan eischen, dat men in de geagglutineerde massa
dc beide bacteriën onregelmatig verdeeld vindt. Topley c.s.
vonden echter steeds groote aggregaten van één bacteriesoort.
Dergelijke groote aggregaten liggen natuurlijk wèl onregel-
matig door elkaar. De conclusie hieruit is, dat de krachten,
die het z.g. secundaire proces, dus dc eigenlijke agglutinatie,
tot stand brengen, even specifiek (en dus vermoedelijk dezelf-
de) zijn, als die, welke dc primaire binding veroorzaken. We-
gens de identiteit van agglutinine cn precipitine (Marrack,
pag. 126) geldt dan hetzelfde voor precipitine-reacties.

Door Marrack (blz. 105) is erop gewezen, dat een der-
gelijke, geheel specifieke, attractie tusschen antigeen en anti-
lichaam ook tot deeltjes met een hydrophoob karakter zou
kunnen leiden. Indien n.1. de z.g. polaire groepen van het

antilichaam, waarvan men algemeen aanneemt, dat zij de
hydratatie-centra vormen, in de reactie een rol spelen, dus van
wisselwerking met de omgeving worden uitgesloten, dan zal
de hydratatie afnemen, met als gevolg een hydrophoob ka-
rakter van het gevormde aggregaat. Indien nu zoowel anti-
lichaam als antigeen meer dan één specifiek reageerende groep
per deeltje hebben, kunnen zoo, door specifieke krachten,
groote aggregaten gevormd worden. (Vergelijk daarmee de op-
vatting van Haurowitz (i8), dat elk antilichaam-deeltje
maar één reactieve groep zou bevatten). Over den aard van de
krachten zegt Marrack niet meer, dan dat zij waarschijnlijk
op polaire groepen berusten.

Het zóne-phenomeen, waarvan elke theorie der precipitine-
reactie rekenschap zal moeten geven, komt volgens Marrack
(blz. 113) tot stand door de mate, waarin een „continu
roosterquot; (continuous lattice) gevormd kan worden, wat dan
de grootte van de ontstane aggregaten bepaalt. De optimale
verhouding zal dan bepaald worden door de grootte der pri-
maire deeltjes en het aantal reactieve groepen op elk deeltje.
Een dergelijk beeld is eerder ontleend aan kristallografische
begrippen dan aan de colloïd-chemie. Als gevolg daarvan laat
het geen ruimte voor de karakteristieke verschuiving der opti-
male verhouding onder invloed van electrolyten. Bovendien
zou de invloed van overmaat van een der componenten, spe-
ciaal van overmaat antigeen, als deze berustte op de vorming
van minder groote aggregaten, zich eerst uiten in de latere
stadia van de vlokking, terwijl in het voorgaande gebleken is,
dat juist in het begin-stadium deze invloed het sterkst merk-
baar is.

Door Heidelberger en Kendall (14) is een theorie van
het mechanisme van precipitine-reacties opgesteld, uitgaande
van de veronderstelling, dat het heele proces bestaat uit bi-
moleculaire reacties van het type:

Dit zal in principe wel niet voor bestrijding vatbaar zijn,
maar de toepassing van de wetten van het chemisch evenwicht,
dus van de thermodynamica, op dergelijke reacties tusschen col-
loïden heeft geen physische beteekenis. Dat de resultaten door
een bepaalde formule kunnen worden weergegeven bewijst nog
niet de juistheid van die formule! (Zie ook Marrack,
blz. 122). Bovendien verklaart deze theorie niet het zóne-
effect, zoodat Heidelberger en Kendall hun toevlucht
32

moeten nemen tot allerlei hypothetische oplosbaarheden van
hun aggregaten. Ook de aard van de werkzame krachten komt
in deze theorie in het geheel niet tot uiting.

Zoowel Marrack als Heidelberger en Kendall nemen
aan, in tegenstelling met de oudere denatureeringstheorie, dat
er uitsluitend specifieke krachten in het spel zijn. Dit eischt
de aanwezigheid van meer dan één actieve groep per deeltje;
immers indien een deeltje slechts één reactieve groep bevatte,
dan zou de reactie niet verder kunnen gaan dan tot de vor-
ming van een complex AG, één deeltje antilichaam een
deeltje antigeen, waarna de reactie niet verder zou kunnen ver-
loopen. Er is echter geen enkel bezwaar tegen, de aanwezig-
heid van meer reactieve groepen per deeltje aan te nemen;
integendeel, het lijkt zelfs onwaarschijnlijk, dat de groote eiwit-
deeltjes elk slechts één actieve groep zouden bevatten.

Het in de vorige hoofdstukken besproken onderzoek leidde
tot de beschouwing van de precipitine-reactie als een soort
complexvorming in den zin van Bungenberg de JoNG, met
dit verschil, dat de attractie slechts plaatselijk, gebonden aan
bepaalde groepen, is, terwijl de deeltjes elkaar in het alge-
meen afstooten als gevolg van hun negatieve lading.

Aan elke reactieve groep komt een werkingssfeer toe. De
grootte daarvan wordt uitsluitend bepaald door de sterkte van
het electrostatische veld van de groep. Komen twee groepen,
tot reactie in staat (dus de eene behoorend tot antigeen, de
andere tot antilichaam), binnen elkanders werkingssfeer, dan
zal binding het gevolg zijn. Beschouwt men nu de werkings-
sfeer als elementair deeltje, dan gaat de redeneering van BUN-
GENBERG DE Jong, ter verklaring van het zone-effect (zie blz.
i8), voor dit geval volkomen door.

Dus ook hier, evenals bij de complexcoacervatie, kan het
proces, en speciaal het zone-effect, niet begrepen worden al-
leen uit de wisselwerking tusschen twee deeltjes: de reactie van
elk deeltje wordt mede bepaald door alle andere. Daarom ook
is het voor de redeneering niet van belang, dat een aantal
actieve groepen (die in de beschouwing als elementaire deeltjes
optreden) aan één deeltje gebonden is. Dit aantal immers valt
geheel in het niet bij het totale aantal.

De totale lading van de deeltjes, dus de afstooting op
grooten afstand, vermindert de kans, dat twee werkingssferen

in reactie treden (vandaar het begrip „gunstige botsingquot;), en
wel des te sterker, naarmate de lading der deeltjes grooter is.

Verandering van de totale lading verandert echter niet de
werkingssferen zèlf, en dus ook niet de optimale verhouding.
Daaruit volgt echter nog niet, dat verandering van de pH, die
de totale lading bepaalt, nu ook de optimale verhouding totaal
onveranderd moet laten, want de pH kan ook de actieve groe-
pen zelf beïnvloeden. Daarvoor verwijs ik naar de bespreking
van den pH-invloed op blz. 29 (hoofdst. VI, e.).

Zooals elke complex-vorming zal ook de reactie tusschen
antigeen en antilichaam met een dehydratatie gepaard gaan,
waardoor de uiterlijke analogie met denatureeringsverschijn-
selen duidelijk wordt. De opvatting van de precipitine-reactie
als een complexvorming blijkt dus op eenvoudige wijze reken-
schap te geven van het colloïdchemische, d.i. dus het niet-
specifieke, deel der verschijnselen.

Het lijkt niet uitgesloten, dat aan de beschouwing van de
antigeen-antilichaamverbinding als een complexvorming een
algemeener beteekenis toekomt dan alleen voor de precipitine-
reactie. Immers ook bij bacteriolyse (Neisser en Wechs-
berg, 21) en bij de agglutinatie (b.v. DUNCAN, 8) bestaat het
zone-effect. Bij de agglutinatie is ook de verschuiving van de
optimale verhouding door electrolyt geconstateerd (BlER, i).
In een zeer recent onderzoek beschrijft DuNCAN (8a) ook den
invloed van zout (NaCl) op de agglutinatie. Zoowel de experi-
menteele resultaten (verschuiving van de optimale verhouding)
als de conclusie (invloed van het zout vooral op de primaire
reactie tusschen antigeen en antilichaam) passen geheel in het
hiervóór ontworpen beeld. De „roosterquot;-thcorie van Mar-
rack (i.c.) kan deze verschijnselen niet zoo eenvoudig ver-
klaren.

Een interessant vraagstuk, dat nog maar weinig onderzocht
is, is het mechanisme van de remming der precipitatie door
haptenen. Deze remming is specifiek (voor een overzicht zie
Marrack, hoofdst. III). Daar het hapteen in structuur over-
eenkomt met de actieve groepen van het antigeen, ligt het voor
de hand, dat het hapteen specifiek zal reageeren met de actieve
groepen van het antilichaam. Men denke zich het geval, dat
hapteen is toegevoegd in een concentratie, die de precipitatie
niet geheel verhindert, maar alleen vertraagt. Daarbij kan men
zich voorstellen, dat een aantal antilichaam-groepen door het

hapteen ontocgankeUjk wordt gemaakt voor de actieve groepen
van het volwaardige antigeen. De gelijkwaardigheid van alle
reactieve groepen van het antilichaam eischt dan echter, dat
een dergelijke verdeeling tusschen vrije en door hapteen be-
zette groepen statistisch is, zoodat in den loop van den tijd
toch alle groepen voor het antigeen toegankelijk worden. Het
systeem zal zich dus gedragen, alsof de activiteit, de werkings-
sfeer, van elke antilichaam-groep verkleind is. Daaruit zou
volgen, in het ontworpen beeld, een verandering van de opti-
male verhouding, naar minder antigeen.

Volgens een onderzoek van Marrack (blz. 115—116) zou
echter de optimale verhouding niet veranderen, hetgeen door
Marrack als een steun voor zijn theorie wordt beschouwd.
Waar echter gebleken is, dat deze theorie niet in staat is, den
electrolyt-invloed te verklaren en bovendien andere onderzoe-
kingen over dit punt mij niet bekend zijn, moet een verkla-
ring in elk geval worden uitgesteld totdat deze kwestie nader
onderzocht is. Het systeem met paardenserum als antigeen
leent zich daartoe natuurlijk niet.

Tenslotte is het mogelijk gebleken, van den invloed van
electrolyten op de optimale verhouding (die alleen vanuit het
gezichtspunt der complexvorming te begrijpen is) een practi-
sche toepassing te maken. Heidelberger en Kendall (16)
slaagden er n.1. in, door behandeling van een specifiek precipi-
taat, uit anti-pneumococcenserum en specifiek koolhydraat,
met geconcentreerde zoutoplossingen, afsplitsing van anti-
lichaam te verkrijgen en op deze wijze antiserum te zuiveren.
Zooals reeds eerder (blz, 27) vermeld, zijn de verschuivingen
in dit systeem zeer groot. Het is echter in, principe niet uitgeslo-
ten, ook andere sera, en antigenen, op deze wijze te zuiveren,
waarbij de in het voorgaande behandelde techniek van onder-
zoek een waardevol hulpmiddel zal blijken.

Is dus een bevredigend inzicht in het mechanisme der preci-
pitatie verkregen, geheel anders staat het met de kennis van de
groepen, welker elcctrostatisch veld de specifieke attractie ver-
oorzaakt. Voor zoover het het antigeen betreft, weet men,
dat tallooze verbindingen na substitutie in eiwit, b.v. via het
diazoniumzout (Landsteiner) , aan dat eiwit een eigen speci-
fiek karakter geven (Marrack, hfdst. III). Een sprekend

voorbeeld van de mate van specificiteit werd onlangs gevon-
den door Goebel (12), die aantoonde, dat het p-amino-
phenol- a -glucoside immunologisch totaal verschillend is van
het overeenkomstige glucuronide; beide verbindingen onder-
scheiden zich alleen door een CH2OH- resp. een COOH-groep
in de zijketen van den koolhydraat-zesring.

In het algemeen kan men zeggen, dat er twee factoren zijn,
die het immunologisch gevolg van de invoering van een ver-
binding in het antigeen bepalen, nl. stereochemische eigen-
schappen (ringstructuur, plaats van substituenten) en de aard
van de sterk polaire groepen (SO3H, ASO3H2, COOH). Het is
dus de geheele verdeeling van het electrische veld in de ,,deter-
minantequot; groep, die de specificiteit beheerscht (Erlenmeyer
en Berger, i i ).

Van de natuurlijke antigenen weet men nagenoeg niets. Sterk
verschillende „determinantequot; groepen zijn, althans bij de
eiwitten, niet met zekerheid bekend, zoodat waarschijnlijk de
configuratieve factoren het geheel zullen beheerschen. Mis-
schien geeft de recente vondst, dat ook eiwitten steeds een klein
percentage koolhydraat bevatten (SÖRENSEN, 25) een aanwij-
zing, in welke richting hier een oplossing mogelijk is.

Evenmin kent men de actieve groepen van het antilichaam.
Ook hier neemt men aan (Marrack, blz. 86, 104, 105), dat
de specifieke reactiviteit tot stand komt door een voor elk
geval karakteristieke verdeeling van de polaire groepen op het
oppervlak van het deeltje. Er zouden dus echte „actievequot;
plaatsen zijn (vgl. blz. 33). De electrolyt-invloed, zooals die
in het voorgaande besproken is, bevestigt de grondgedachte,
dat het electrostatische krachten zijn, die het gedrag bepalen.
In enkele gevallen heeft men kunnen aantoonen, dat bepaalde
groepen niet voor het antilichaam-karakter verantwoordelijk
zijn. Een voorbeeld daarvan is het diphterie-antitoxine, ver-
kregen door paarden met diphterie-toxine te immuniseeren.
Indien het toxine gebonden heeft, reageert het ontstane aggre-
gaat nog met precipiteerend serum tegen paardenserum; ander-
zijds kan het precipitaat van antitoxine en precipitine nog
toxine binden (Marrack, blz. 86). Voor het gedrag als anti-
lichaam zijn dus andere groepen verantwoordelijk dan voor
de eigenschappen als antigeen.

Natuurlijk heeft men ook getracht, het antiserum chemisch
te veranderen. Helaas is het totnutoe niet gelukt, een behande-

ling te vinden, die de antilichaam-functies ongewijzigd laat.
Het best onderzocht is de invloed van koppeling met diazo-
niumzouten door Brein-l en Haurowitz (2) en onlangs door
Eagle, Smith en Vickers (10). Deze laatsten onderzochten
van één serum, nl. antipneumococcen-serum, verschillende
functies, zooals agglutinatie, precipitatie van specifiek kool-
hydraat, complementbinding, in afhankelijkheid van de mate
van koppeling met diazoniumzout. Daarbij verdwijnen op den
duur alle karakteristieke eigenschappen, echter in zeer verschil-
lende mate. Het eerst de precipitatie, dan de agglutinatie enz.
In hoeverre hier de aanwezigheid van meer dan één antilichaam
een rol speelt, is nog de vraag. Men moet in elk geval quanti-
tatieve gegevens (zone-studies, electrolyt-invloed) in de be-
schouwing betrekken. Dergelijke gegevens zijn nog niet bekend.

Op geheel andere wijze is het vraagstuk door rosen-
heim (24) aangepakt. Zij bestudeerde den invloed van enzy-
matische afbraak (pepsine, trypsine) op de agglutininen in een
anti-typhusserum. Daarbij komt de merkwaardigheid aan den
dag, dat sera van dieren, die slechts één maal geimmuniseerd
zijn, zich anders gedragen dan sera, welke na een aantal im-

Bij herhaalde immunisatie wordt n.l. het z.g. H-agglutinine
veel stabieler tegen genoemde enzymen; het O-agglutinme
daarentegen ondergaat geen verandering. Men moet hier met
Rosenheim aannemen, dat de karakteristieke groepeering, die
van globuline antilichaam maakt, zich bevindt aan den bui-
tenkant van het deeltje, wat heel plausibel is. Afbraak door
enzymen begint ook aan den buitenkant, en vernietigt dus
al spoedig het agglutineerend vermogen van het deeltje. In-
dien echter in de daaronder liggende lagen dezelfde groepee-
ring voorkomt, zal het overgebleven, van zijn buitenste lagen
ontdane, deeltje toch nog agglutineerend werken. Een derge-
lijke dieper in het deeltje doorgedrongen invloed van het anti-
geen zal reeds bij de synthese van het globuline werkzaam
zijn geweest.

Waarom het verschijnsel bij het O-agglutinine met optreedt,
en of het ook bij andere systemen bestaat, deze vragen wach-
ten op nader onderzoek. De in dit proefschrift beschreven
onderzoekingsmethode zal ook een waardevol hulpmiddel kun-
nen zijn bij dergelijke onderzoekingen, die gericht zijn op de
studie van den bouw van het antilichaam, en dus van eiwitten
in het algemeen.nbsp;^^

I.nbsp;In 1922 ontdekte Fleming (30) een stof, die in staat
was, in korten tijd suspensies van bepaalde bacteriën geheel
te doen ophelderen. Deze stof, door Fleming „lysozymquot; ge-
noemd, bleek in het dierlijk organisme zeer verbreid voor
te komen.

Bij de wisselwerking tusschen bacterie en lysozym doen
zich een aantal vragen voor, nl.:

a)nbsp;Wat is lysozym, chemisch en biologisch, welke betee-
kenis heeft het voor het dierlijk organisme?

b)nbsp;Welke bacteriën worden door lysozym opgelost, ge-
dood of in hun groei belemmerd ? (dit hangt dus nauw samen
met het onder a genoemde).

Het hier tc bespreken onderzoek bepaalt zich in hoofdzaak
tot vraag c cn d; een beknopt overzicht over de op de punten
a en b betrekking hebbende litteratuur moge daaraan vooraf-
gaan.

Een onderzoek naar de chemische eigenschappen van het lyso-
zym dient door ccn reiniging te worden voorafgegaan.
Wolff (45) heeft dat het eerste geprobeerd. Als uitgangs-
materiaal gebruikte hy kippeneiwit, dat het hoogste gehalte
aan lysozym heeft. Door precipitatie met colloïdaal ijzer-
hydroxyde kon hij een groot deel van het eiwit verwijderen.
Indampen, dialyse, herhahng van de behandeling met ijzer-
hydroxyde, en precipitatie met alcohol leverden tenslotte een
vermoedelijk nog niet geheel zuiver preparaat, waarvan enkele
tienden milligrammen even werkzaam waren als i cc. eiwit.

Eerst kort geleden beschreven Meyer en medewerkers (38)
een andere methode. Eiwit wordt met ijskoude accton behan-

dcld. Het verkregen neerslag wordt gedroogd, en met alco-
holisch azijnzuur geëxtraheerd. Na een precipitatie met alco-
hol, en weer oplossen volgt als geheel nieuwe stap een precipi-
tatie met flaviaan-zuur. Zij krijgen zoo preparaten welker
werkzaamheid vrijwel dezelfde is als van die van wolff.

Het is hier de plaats, om een protest tc laten hooren tegen
hun kritiek op dc zuivering met ijzerhydroxydc: mij gelukte
deze behandeling vrijwel steeds zonder verliezen van eenige
beteekenis.

Volgens Meyer c.s. geeft het gezuiverde lysozym een aan-
tal ciwitreacties cn een positieve nitroprusside-reactie; dc
molisch-reactie op reduccercndc koolhydraten is, in overeen-
stemming met Wolff, negatief. Broom in ijsazijn wordt ont-
kleurd. Opvallend is de groote bestendigheid tegen hitte, mits
de oplossing zuur is. In alkalische oplossing wordt het lyso-
zym snel geïnactiveerd. Door peroxyden, door J in KJ en
door cupro-oxyde wordt het lysozym geïnactiveerd. Deze in-
activeering konden Meyer c.s. althans gedeeltelijk opheffen
door zwavelwaterstof. Zij concludeeren daaruit, dat lysozym
alleen in den gereduceerden vorm werkzaam is. Het reducee-
rend vermogen wordt door hen aan de aanwezigheid van sulf-
hydrylgroepen toegeschreven.

Over de moleculaire grootte van lysozym is nog weinig be-
kend. Gildemeister (33) toonde zeer elegant aan, dat het
door cellophaan diffundeert, cn dus kleinere deeltjes zou heb-
ben dan dc bactcriophaag. Toch kan men een lysozym-oplos-
sing uitstekend van zouten bevrijden door dialyse. Vermoede-
lijk is het zoo, dat er wel een geringe diffusie door het mem-
braan plaats vindt; er is echter voor een zichtbaar effect op
de bacteriën zoo weinig noodig, dat er toch practisch geen
verliezen hoeven op te treden.

Hoewel het lysozym zeer verbreid voorkomt, wordt het
slechts in traanvocht en in wit van eieren in groote concen-
tratie gevonden. Dat het daar ook een beschuttende werking
heeft, is alleszins waarschijnlijk. De groote houdbaarheid van
eiwit is vermoedelijk aan het lysozym toe te schrijven. Ten
aanzien van traanvocht is onze kennis nog iets uitgebreider.
Het is nl. bekend, dat gebrek aan vitamine A, waarbij vaak

ooginfecties optreden, gepaard gaat met een geringer lysozym-
gehalte van het traanvocht. Voor den mensch is dit door
Andersen (28) aangetoond; toediening van vitamine A aan
de patiënten had een stijging van het lysozym-gehalte van
het traanvocht tengevolge. Het verband tusschen vitamine A
en lysozym ligt nog geheel in het duister.

De functie in het overige deel van het organisme is minder
duidelijk. Dit bevat veel minder lysozym dan traanvocht. Het
gehalte van de verschillende weefsels is ook niet gelijk. Een
recent onderzoek daarover is b.v. dat van Florey (31), ter-
wijl ook Gildemeister (33) eenige resultaten meedeelt. Nu
moet hierbij worden opgemerkt, dat de methode van extractie,
eenmaal met physiologische zoutoplossing, zeker onvoldoende
IS, daar het lysozym sterk geadsorbeerd wordt. Bovendien is
de adsorptie afhankelijk van de pH, en dan nog verschillend
voor verschillende adsorbentia. Zoo adsorbeeren b.v. lecithine
cn kool sterker in alkalische oplossing dan in zure, terwijl het
^^^'^so'^Ptie door de bacterie juist andersom is (zie hoofd-
stuk E). Het is dus zaak, de cijfers, die hierover bekend zijn,
met het noodige voorbehoud te aanvaarden.

Verder is uit het geringe ter beschikking staande materiaal
met met zekerheid af te leiden, dat ook pathogene bacteriën
van lysozym een doodende of groeiremmende werking onder-
vinden. Proeven van WoLFF (45) wijzen wel in deze rich-
ting, terwijl uit het werk van Friedberger en Hoder (32)
bhjkt, dat sommige pathogene kiemen althans een invloed
ondervinden van verdund eiwit. Het onderzoek van thomp-
son en Khorazo (44) over het gedrag van een aantal staphy-
lococcenstammen onder invloed van lysozym schijnt erop te
wijzen, dat juist de minst pathogene het sterkst door lysozym
worden aangetast. Een oordeel over deze kwestie is dus bil-
den huldigen stand van onze kennis nog geheel onmogelijk.

IV. De litteratuur, betrekking hebbend op de onder 3 en
4 genoemde vragen, zal niet apart behandeld, maar in den
tekst besproken worden.

I. Als lysozym-oplossing werd gebruikt óf verdund eiwit
of een preparaat bereid volgens WoLFF (l.c.), waarbij ech^r de
laatste phase achterwege gelaten was (preparaat CEi)

dcicticus, een door FLEMING (I.e.) geïsoleerde luchtbacterie,
die zeer gevoelig is voor lysozym. Het bleek noodig,
de bacteriën aan een voorbehandeling te onderwerpen, ten-
einde te voorkomen, dat de gevoeligheid voor lysozym in den
loop van den dag veranderde. Dit kon bereikt worden door
de bacteriën te dooden. Daardoor zet men vele omzettingen
stop, m.a.w. de toestand wordt althans gedeeltelijk gefixeerd.
Doode bacteriën lyseeren even goed als levende, mits het
bacterie-eiwit niet gecoaguleerd is. Ongeschikt is b.v. het doo-
den door verhitting. Tenslotte werd als volgt te werk gegaan:
Een versehe, hoogstens 24 uur oude agarcultuur wordt op-
genomen in 4 ee. gedestilleerd water, waarna i cc. 5 % -phenol
wordt toegevoegd. In deze i % -phenol-oplossing worden de
bacteriën snel gedood. Na i uur worden de bacteriën gecentri-
fugeerd, en door eenige malen wasschen met aqua dest. en op-
nieuw centrifugeeren van phenol en bestanddeelen van den
voedingsbodem bevrijd. Tenslotte wordt dan in weinig aqua
dest. een dikke suspensie bereid, die verder voor het gebruik
verdund kan worden.

Een mogelijke invloed van het gedestilleerde water op de
doode cellen uit zich bij de lysis door lysozym niet. Een voor-
deel is bovendien, dat het suspendeeren in aqua dest. zeer ge-
makkelijk gaat, terwijl tevens de mogelijkheid ontstaat, in ge-
heel zoutvrije oplossing te werken (hoofdstuk E).

II. Over de techniek van het lysozym-ondetzoek.
Alle in de litteratuur beschreven bepalingen van lysozym
zijn verricht op de volgende wijze:

Van de te onderzoeken oplossing worden progressieve ver-
dunningen gemaakt. Aan een gelijke hoeveelheid van elke ver-
dunning wordt een eveneens gelijke hoeveelheid bacteriën toe-
gevoegd, waarna het geheel een zekeren tijd (i—48 uur) bij
een constante temperatuur bewaard wordt. Daarna gaat men
na, hoever de lysis is voortgeschreden. Dit is het zwakke punt
van deze techniek, wat het beste door een voorbeeld ge-
ïllustreerd kan worden (tabel 5) :

Uit de zeer onscherpe grens tusschen totale lysis en afwezig-
heid vari eenige lysis blijkt, dat het zeer moeilijk, zoo niet
onmogelijk is, op deze wijze verschillen in lysozym-gehalte
aan te toonen, indien zulke verschillen niet minstens 100 %
bedragen. De oorzaak ligt voor de hand: de lysis is een geleide-
lijk verloopend proces, waarvan totale opheldering ( in ta-
bel 5) het eindstadium is. Maar dan spreekt het ook vanzelf,
dat men in een reeks als hierboven beschreven ook verdunnin-
gen vindt, waarin de lysis weliswaar niet totaal is, maar waarin
toch een duidelijke vermindering der troebeling is waar te
nemen, en wel ook dit weer in verschillende mate. De onmoge-
lijkheid, om met het bloote oog geringe verschillen in troebe-
ling waar te nemen, beperkt dus de nauwkeurigheid van de
methode.

III. Ik verwachtte gunstiger resultaten met een methode,
waarbij het geheele verloop van de lysis quantitatief gevolgd
kon worden. Het aangewezen instrument hiervoor is de
extinctiometer.

Beide cuvetten van den Moll-extinctiometer worden gevuld
met de verdunningsvloeistof (buffer, zoutoplossing, bouillon
etc.), waarna de uitslag van den galvanometer met behulp van
de compensatie-inrichting op o gebracht wordt. Nu wordt aan
een der cuvetten zooveel van een dikke bacterie-suspensie toe-
gevoegd, dat de uitslag een bepaalde waarde heeft. Indien men
zorg draagt, alle omstandigheden constant te houden (zie in-
leiding), dan heeft men steeds evenveel bacteriën gesuspen-
deerd (zie ook blz. 44). Indien men nu een kleine hoeveelheid
van de te onderzoeken lysozym-oplossing toevoegt, goed
mengt en tegelijkertijd de stopwatch indrukt, dan kan men het
geheele verloop van de lysis volgen aan den steeds afnemenden
uitslag van den galvanometer.

Daarbij valt allereerst op, dat de reactie onmiddellijk begint,
zelfs met zeer kleine hoeveelheden lysozym. Dat men op deze
wijze kleinere hoeveelheden lysozym kan aantoonen dan met
de oude techniek is een bijkomstigheid van meestal slechts ge-
rmge waarde. Belangrijker is, dat men nu een getallenmaat
42

Een voorbeeld van ccn proef volgt hieronder (tabel 6). De
tijd O is niet die, waarop het lysozym werd toegevoegd, maar
die, waarop dc uitslag een bepaalde, steeds dezelfde, waarde
bereikte. Het voordeel daarvan is, dat op deze wijze dc door
de menging ontstane onregelmatigheden vermeden worden.
Men gebruikt dus steeds hetzelfde punt van de lysis als nul-
punt.

Deze cijfers eischen nauwelijks een nadere toelichting; u als
functie van t is een gladde, regelmatig afnemende lijn, van het
type, dat bij allerlei reacties gevonden wordt.

Ik heb verder getracht, een inzicht te krijgen in dc reprodu-
ceerbaarheid van de metingen, en wel op de volgende wijze.

De mcetcuvettc wordt gevuld met de heldere verdunnings-
vloeistof, cn de uitslag van den galvanometer op o gebracht.
Dan wordt uit een microburet een geconcentreerde bactcnc-
suspensie toegevoegd en na elke toevoeging de stand van den
galvanometer afgelezen. Men kent dan den bij elke (relatieve)
bacterie-concentratie (uit dc bekende volume-verhoudingen
direct tc berekenen) behoorenden galvanometeruitslag; deze

t	u
voor	86
0	80
15quot;	74
30	70'U
45	6fL
60	64V2
90	60^/4
120	57
150	54'L
180

cijfers geven, in een grafiek uitgezet, een gladde lijn. Doet men
nu een dergelijke serie aflezingen, uitgaande van een andere
bacterie-suspensie met een andere concentratie, dan krijgt men
weer een stel bij elkaar behoorende waarden van u en c (con-
centratie) Om nu beide reeksen te kunnen vergelijken, bepaalt
men, welke concentratie een bepaalden, willekeurigen, uitslag
geeft, (b.v. 70), en deelt dan de concentratie-waarden in elke
reeks door de bij die reeks behoorende uitgangsconcentratie,
waaraan de waarde 100 wordt toegekend. Beide series worden
zoo op dezelfde, procentueele, schaal gebracht. Indien nu alle
punten m een grafiek worden uitgezet, dan blijken ze op één
kromme te liggen, wat zeker een voldoende bewijs voor de
reproduceerbaarheid van de gemeten grootheid, den uitslag van

n^^g worden geacht. Ook de nauwkeurig-
heid bhjkt gunstig te zijn: afwijkingen, grooter dan 1/2 schaal-
deel, komen met voor; dit beteekent een nauwkeurigheid van
ca. I voor met al te kleine uitslagen (zie figuur 13).

Hier, zooals verder gedurende het onderzoek, werd de gal-
vanometer met op de volle gevoeligheid gebruikt, doch op ca.
/.„ daarvan, met behulp van een shunt. Bij de volle gevoelig-
heid wordt het apparaat erg gevoelig voor stofjes en dergelijke
verontreinigingen. Hoewel het niet noodig bleek, hier met deze
groote gevoeligheid te werken, heb ik toch een dergelijke con-
trole-proef uitgevoerd bij de volle gevoeligheid, waarvan de

resultaten in fig. 14 zijn samengevat. Hoewel de afwijkingen
iets grooter zijn dan in fig. 13, zooals te verwachten was, is
het resultaat toch nog zeer bevredigend, en het geeft dus een
voldoende rechtvaardiging van het gebruik, dat bij enkele der
in deel I beschreven proeven van deze groote gevoeligheid ge-
maakt is.

Indien men nu de in tabel 6 neergelegde lysisproeven wil
gebruiken voor de bepaling van het lysozym-gehalte van een
onbekende oplossing, dan dient men het volgende te bedenken.
De gemeten grootheid (uitslag van den galvanometer) is een
functie van vele variabelen, waarvan men echter een aantal
constant kan houden. Voor zoover het het toestel zelf betreft,
is dit reeds in de inleiding behandeld. De hoeveelheid toege-
voegde bacteriën kan constant gehouden worden door steeds
zooveel toe te voegen, dat een bepaalde uitslag bereikt is. De
temperatuur kan als variabele worden uitgeschakeld: de
schommelingen in de kamertemperatuur waren steeds zeer ge-
ring (N.B. voor metingen bij hoogere temperaturen kan deze
methode ook gebruikt worden; zie in deel I de proeven over
toxine-antitoxine-vlokking).

De overige variabelen in de proef oefenen hun invloed op
het eindresultaat, den galvanometer-uitslag, uit via het lysis-
proces. Het zijn allereerst de lysozym-concentratie, verder alle
denkbare veranderingen in de reactie-vloeistof, samen te vat-
ten als uitwendige variabelen.

De samenstelling van de vloeistof heeft men geheel in de
hand, daar zoowel bacteriën als lysozym in gedestilleerd water

zijn gesuspendeerd, resp. opgelost. (Hier komt al naar voren,
dat men ook den invloed van de samenstelling van de vloeistof
op deze wijze zal kunnen bestudeeren; zie hoofdstuk E.) Bij
de bepaling van lysozym houdt men dus ook deze constant.

Er blijven dan als variabelen alleen over de tijd t, en de
concentratie van het lysozym, c. Men kan dus schrijven:

Het is duidelijk, dat deze onbekende functie niet gebruikt
kan worden om c te bepalen. Iets verder komt men, door nóg
een der variabelen constant te houden, nl. u of t, m.a.w. door

f (c, u)t = O of f (c, t)„ = O
te bepalen. Daarvoor is een aantal metingen noodig.

Beide functies worden voorgesteld door kromme lijnen, die
dus experimenteel te bepalen zijn. Ik heb steeds f (c, u)t = o
bepaald door enkele punten te meten met bekende concentra-
ties lysozym, c. De hiervoor noodige 4—5 punten kunnen in
ruim i uur bepaald worden, zoodat het tijdverlies geen al te
groote rol speelt. Ik deed dit eiken keer opnieuw, en gebruikte
de zoo verkregen ijkkromme slechts één dag.

Indien men daarna de lysis meet met een oplossing van on-
bekende concentratie, dan kan men daarvoor ook een waarde
van u bepalen; door interpolatie in de ijkkromme vindt men
dan direct de waarde van c. Men bepaalt dus eigenlijk de con-
centratieverhouding van een bekende en een onbekende op-
lossing. Een voorbeeld geeft tabel 7.

veel cc. van dc eerste oplossing de betreffende hoeveelheid eiwit
correspondeert, nl.:

Tenslotte kan nu het quotiënt bepaald worden van de be-
rekende hoeveelheid standaardoplossing en de toegevoegde hoe-
veelheid eiwitoplossing:

d.w.z. I cc. eiwit i : 100 bevat evenveel lysozym als 2.63 cc.
van de oplossing van het preparaat, en dus bevat i cc. onver-
dund eiwit evenveel lysozym als 2.63 X 3.18 = 8,3 mg. van
het droge preparaat.

De nauwkeurigheid van de bepaling is alleszins bevredi-
gend, de fout in één bepaling is hier kleiner dan 5 %. Indien
men over een grooter traject van de ijkkromme werkt, zal de
fout wel iets grooter worden. Voor routine-bepalingen kan
men op een fout van ca. 10 % rekenen, wat altijd nog 10 X
zoo nauwkeurig is als de verdunningsmethode, en voor het
verdere onderzoek zeker voldoende.

Verder leert deze tabel, dat het geen verschil maakt in het
type van dc f (t, u)^ -kromme, of men met verdund eiwit of
met gezuiverd (niet: zuiver) lysozym werkt; immers in dat
geval zou de interpolatie op verschillende tydstippen tot ver-
schillende resultaten moeten leiden, wat niet het geval is. En
niet alleen qualitatief stoort het eiwit niet, ook quantitatief is
een invloed niet aan te toonen, daar dan de verschillende con-
centraties een verschillend resultaat moesten geven, wat blijk-
baar, binnen dc foutengrcnzen, ook niet het geval is. Ik heb
daarin een motief gevonden om het verdere onderzoek met
het preparaat CEi te verrichten, en de omslachtige verdere rei-
niging achterwege te laten.

Temeer meende ik dit veilig te kunnen doen op grond van
de volgende overweging: in elke proef werd een hoeveelheid
van hoogstens 0.25 cc. lysozymoplossing gebruikt. Deze be-

vatten 0.25 X 0.01 X 3.18 = 0.008 mg. vaste stof. De in
de proef gebruikte hoeveelheid bacteriën nu is van dien aard,
dat er tijdens de lysis zeker een veelvoud hiervan aan vreemde
organische stoffen in de oplossing terecht komt, zoodat een
algeheele reiniging toch hoogstens een geringen invloed zou
kunnen hebben.

Boven werd reeds aangestipt, dat men op analoge wijze ook
den invloed van uitwendige variabelen kan bestudeeren. Men
moet dan de lysozymconcentratie c constant houden (eventueel
een correctie aanbrengen voor kleine verschillen). Als men de
uitwendige variabele a noemt, kan men weer een functie
f(u, a)t, c=o bepalen, die den invloed van a weergeeft (zie
hoofdstuk E).

De morphologie van het proces is nog maar weinig bestu-
deerd. Bij Fleming (30) vindt men eenige foto's van prepa-
raten, waaruit zou zijn af te leiden, dat de coccen zeer on-
regelmatige vormveranderingen ondergaan, waarbij de kleur-
baarheid afneemt, zoodat men tenslotte niets meer ziet.
Fleming gebruikte daarbij een soort kapselkleuring, die een
tamelijk diepen ingreep in de cel vereischt. Door latere onder-
zoekers (Kigasawa, 37; Suzuki, 43) is een zwelling van de
cellen in het begin der lysis gevonden.

Ik onderzocht allereerst de lysis met donkerveldbelichting
door een cardioid-condensor. De bedoeling is duidelijk: op
deze wijze vindt men het microscopisch aequivalent van de
extinctiemetingen. Het resultaat was het volgende:

De intacte coccen zijn op den donkeren achtergrond zicht-
baar als lichte „ringetjesquot;. Als nu lysozym wordt toegevoegd
(waarvoor natuurlijk een ander preparaat gemaakt moet wor-
den) verandert er eigenlijk niets. Alleen ziet men de helder-
heid der „ringetjesquot; geleidelijk afnemen, en wel sneller naar-
mate meer lysozym was toegevoegd. Dit klopt dus goed: een
verminderde lichtverstrooiing gaat samen met een geringere
extinctie. Het verrassende echter was, dat het niet mogelijk
bleek, zoolang te wachten, dat het beeld geheel verdwenen
zou zijn. Steeds bleven zeer flauw de lichtcirkels zichtbaar.
Een aantal stadia uit dit proces geeft plaat i, foto's i—4; de
verschillen zijn in werkelijkheid nog grooter, terwijl van de
minst heldere stadia geen bruikbare foto's te maken waren;

het oog presteert hier meer dan de camera. Opvallend is ook,
dat van een zwelling niets te merken is: de grootte van den
lichtcirkel verandert tydens de lysis niet merkbaar (de vergroo-
ting is in alle foto's gelijk).

Men wordt hier geleid tot de conclusie, dat bij de lysis een
zekere wandstructuur blijft bestaan. Ik heb getracht, deze con-
clusie tc bevestigen door Oost-Indische-inkt-preparaten te ma-
ken in verschillende stadia der lysis. Later is de Oost-Indische
inkt vervangen door serum, waarin lo % eosine is opgelost
(Howie en Kirkpatrick, 36). Dit geeft een gelijkmatiger on-
dergrond. De bacteriën worden eerst met carbolfuchsine ge-
kleurd, en daarna met een paar druppels eosine-serum uit-
gestreken. Foto's 5—8 geven het resultaat van een der vele
series. De opnamen werden evenals bij de donkerveldbelich-
ting gemaakt in groen licht. Dit doet de contrasten goed uit-
komen, daar de fuchsine dan vrijwel zwart wordt.

Allereerst valt op, dat werkelijk de cellen niet verdwijnen:
de laatste foto is gemaakt na totale opheldering van de suspen-
sie. Wel is de met fuchsine kleurbare substantie uit de cel ge-
heel verdwenen. In tegenstelling met hetgeen in donkerveld
gevonden werd, zijn de cellen hier door de lysis duidelijk groo-
ter geworden. Ik meen echter, daarin niet een zwelling te moe-
ten zien, maar een zuiver mechanischen invloed: indien de
coccen onder invloed van lysozym vervormbaar worden, zul-
len zij bij het uitstrijken platgedrukt worden, waardoor zij in
het preparaat een tweemaal zoo groot oppervlak innemen.
Daarentegen is het niet goed denkbaar, dat de cel zou op-
zwellen en toch in het donkerveld geen grooter beeld zou
geven.

Een verdere bevestiging vond ik, door een groote hoeveel-
heid coccen tegelijk te laten lyseeren, b.v. een geheele agar-
cultuur. Na verloop van tijd wordt gecentrifugeerd bij hoog
toerental (14000). Het sediment blijkt nu hetzelfde volume
te hebben als het sediment van de nog niet gelyseerde, intacte
coccen. Het is, evenals dit laatste, geel gekleurd, terwijl de
bovenstaande vloeistof geheel kleurloos is (mits de coccen voor-
af grondig van aanhangende bouillon zijn bevrijd). De gele
kleurstof wordt dus blijkbaar niet uit den wand vrijgemaakt.
Voor deze proef is echter noodig, dat de lysis niet totaal is,
wat bereikt werd door de vloeistof een pH van ca. 6 te geven
(zie hoofdstuk E). Ik meen echter niet, dat in alkalischer op-
lossing de cellen wèl stuk gaan, (zie de preparaten boven),

maar dan wordt het verschil in dichtheid tusschen cel en vloei-
stof zoo gering, dat zelfs met de gebruikte snelloopende cen-
trifuge geen scheiding meer te bereiken is.

Men moet zich dus voorstellen, dat er een zekere wand-
structuur bestaat, die onder invloed van lysozym permeabel
wordt voor den cel-inhoud. Hoe men zich deze werking kan
denken komt nog ter sprake. Datgene, wat men als lysis waar-
neemt, is dus een diffusie van den cel-inhoud in de oplossing.
Daardoor verandert de brekingsindex van de cel: deze wordt
tenslotte vrijwel gelijk aan dien van de omringende vloeistof.
En dat neemt men waar als opheldering, verminderde extinctie
van de suspensie of geringere strooiïng bij donkerveldbelich-

Men kan zich nu denken, dat een dergelijk proces in eerste
instantie slechts geringen invloed zal hebben op de functies
van den celinhoud. Dit is inderdaad gevonden.

Penrose en Quastel (41) onderzochten de enzymatische
eigenschappen van Microc. Lysodeicticus vóór en na de lysis,
waarbij het volgende aan den dag kwam. De echte enzymen
(„exo-enzymenquot;) worden door lysozym sterk geactiveerd, wat
natuurlijk berust op een beter contact met het substraat. Onder-
zocht werden catalase, fumarase, urease, peroxydase en dc
reactie van Storch met p-phcnyleen-diaminc.

Alleen de z.g. „dehydrogenasequot;, bepaald door de reductie
van methyleenblauw, verdwijnt bijna geheel. Nu is het alge-
meen bekend, dat deze dehydrogenase-werking aan het intacte
protoplasma is gebonden en daarvan niet dan met verlies van
het grootste deel der werkzaamheid te scheiden is. Het is alles-
zins waarschijnlijk, dat na totale lysis het protoplasma inder-
daad ernstig beschadigd is. Meer leert het onderzoek van
Hewitt (35). die de redox-potentiaal van een lyseetende
suspensie bepaalde. Hij neemt aan, dat deze potentiaal een
maat is voor de activiteit van het protoplasma, voor de in-
tensiteit van de stofwisseling; en wel zou een negatievere po-
tentiaal een sterkere wisselwerking met het substraat beteeke-
nen. Nu blijkt, dat bij toevoeging van lysozym de redox-poten-
tiaal sterk daalt, om na het bereiken van een minimum weer
te stijgen tot een hoogere waarde dan de oorspronkelijke, cn
wel nog vóór de lysis volledig is. De conclusie hieruit is, dat
ook de protoplasma-werking onder invloed van lysozym aan-
vankelijk toeneemt, waarschijnlijk door een beter contact met
het substraat, om echter nagenoeg te verdwijnen, als tijdens dc

Ik meen in deze, reeds oudere, onderzoekingen, een bevesti-
ging te mogen zien van het ontworpen beeld van het lysis-
proces. Ook de in hoofdstuk E te bespreken proeven zijn op
dezen grondslag aanvaardbaar.

I. De scheiding tusschen lysozym-werking en lysis, die
in het vorige hoofdstuk is aangeduid, was reeds geruimen tijd
bekend, n.1. sinds Nakamura (40) het z.g. alkali-phenomeen
ontdekte. Als men lysozym en bacteriën samenbrengt in zure
oplossing, dan vindt geen opheldering plaats. Wanneer men
nu echter na verloop van tijd neutraliseert, dan heeft de lysis
bijna momentaan plaats. Hallauer (34) heeft het eerst van
dit verschijnsel een correcte verklaring gegeven, n.1. dat het
lysozym wel de bacterie aantast, maar dat de lysis niet op-
treedt doordat de inhoud van de cel onoplosbaar is in zuur.
Immers deze wordt, na lysis, uit de oplossing weer door zuur
neergeslagen (Kigasawa 37). Hoewel deze laatste onderzoe-
ker geen morphologische veranderingen kon waarnemen in
zure oplossing, (hetgeen ik met de donkerveld-methode nog
eens kon bevestigen) is er toch wel uiterlijk iets te zien. Hij
vond, dat er een karakteristieke vlokking van de bacterie-
suspensie optreedt, die duidelijk te onderscheiden is van de
vlokking door zuur alleen. Ik kon ook dit geheel bevestigen.
Hier blijkt dus weer, dat het lysozym speciaal de oppervlakte
van de cel aantast. Het boven beschreven vlokkingsverschijnsel
vertoont groote analogie met de beschrijving die Friedberger
en Hoder (32) geven van vlokking door verdund kippen-
eiwit van een aantal niet lyseerbare bacteriën. In hoeverre hier
werkelijk een verband bestaat, zal een apart onderzoek moeten
uitmaken. Tot zoover de litteratuur.

Het blijkt dus, dat de uitwendige omstandigheden een groo-
ten invloed op het verloop van de lysis hebben. Blijkbaar is de
pH een zeer belangrijke factor. Nu was mij bij proeven over
de „zuurlysisquot;, nog met de oude techniek, opgevallen, dat
deze sneller gaat dan de gewone, destijds nog in bouillon, met
een pH ca. 7, uitgevoerd. (Zie tabel 8.)

Ook bij Hallauer (l.c.) zijn dergelijke gegevens te vinden;
hij trekt er echter niet de voor de hand liggende conclusie uit,
dat dit er op wijst, dat de reactie in zuur milieu sneller gaat
dan in neutrale of zwak alkalische oplossing.

Zooals al in hoofdstuk III werd aangestipt, kan men den
invloed van de pH gemakkelijk bestudeeren door in een serie
metingen de pH als eenige variabele op te nemen, dus met
constante hoeveelheden lysozym te werken. Ik neem als maat
voor de lysozym-werking weer het verschil in galvanometer-
uitslag van twee tijden. De oplossingen waren '/15 m. phosphaat-
buffers, waarvan de pH-waarden met de chinhydron-electrode
gecontroleerd werden. Ik kreeg zoo de volgende cijfers:

In fig. 15 zijn deze gegevens grafisch voorgesteld. Men leest
eruit af, dat de werking van lysozym een maximum vertoont
bij een pH ca. 6.2. Vergelijking met bovenstaande tabel 8
maakt het echter wel zeer waarschijnlijk, dat het maximum
veroorzaakt wordt door de onoplosbaarheid van de celbestand-
deelen in zure oplossing. Volgens suranyi (42) begint de
„remmingquot; door zuur bij pH. 5.7, wat van 6.2 niet zooveel
afwijkt, als men in aanmerking neemt, dat ook de verschil-
lende bacterie-stammen hierin nog wel kunnen verschillen.

II. Vraagt men nu hoe het komt, dat lysozym in zure op-
lossing sterker werkt, dan dient men te bedenken, dat de reactie
een oppervlakte-proces is, zoodat misschien uit adsorptie-
metingen een aanwijzing te krijgen is. Nu is het niet rnogelijk
lysozym te bepalen in een oplossing, waarin al lysis heeft

plaats gehad, omdat daarbij zeker veranderingen in de samen-
stelling van de vloeistof optreden, die een volgende lysis be-
invloeden. De volgende proef illustreert dit:

Stel: a = hoeveelheid coccen, noodig om een troebelings-
proef te doen.
b = een zeer groote hoeveelheid coccen.
l = een bepaalde hoeveelheid lysozym.

De volgende oplossingen worden nu gemaakt:
i) 10 cc, buffer 5.9 2) 10 cc. buffer 5.9 3) als 2), maar na
l l b ^
na volledige lysis
centrifugeeren; de
heldere oplossing
gebruiken.

3) bevat meer lysozym dan i), (hetgeen blijkt uit 2)!) maar
toch gaat de lysis minder snel. Daaruit blijkt, dat een vooraf-
gegane lysis in de oplossing veranderingen teweeg brengt, die

verdere lysis remmen. Ook de sterk verminderde lysis-snelheid
in 2) kan, althans voor een deel, hieraan worden toegeschre-
ven. Het is dus inderdaad noodzakelijk, om lysozym-hepalin-
gen uit te voeren in oplossingen, waarin nog geen lysis heeft
plaats gehad, m.a.w. adsorptie-metingen zijn alleen mogelijk
in zure oplossing. Men moet dan ria afcentrifugeeren van de
bacteriën de vloeistof op de juiste pH brengen, cn het niet
geadsorbeerde lysozym bepalen.

Dergelijke proeven heb ik uitgevoerd om na te gaan, of cr
bij dc werking van lysozym op dc bacteriën zonder lysis soms
lysozym verloren zou gaan. Daartoe bracht ik lysozym en
een groote hoeveelheid coccen in zure oplossing samen cn cen-
trifugeerde na zekeren tijd; in dc bovenstaande oplossing werd
het lysozym, na ncutraliseercn, op de gewone wijze bepaald.
Tevens werden de bacteriën in aangezuurd gedestilleerd water
opgeschud, en werd in het extract opnieuw lysozym bepaald,
enz. enz. Daarbij teekenc men aan, dat het niet gelukt, weer een
behoorlijk homogene suspensie te krijgen. De verkregen cijfers
geven dus maar een ruwe maat voor de adsorptie, omdat het
oppervlak van de cellen niet steeds hetzelfde zal zijn. Ik kreeg
het volgende resultaat (tabel 10) :

Gezien de geringe nauwkeurigheid, die deze bepalingen heb-
ben (o.a. door het achteraf op de juiste pH brengen) is de over-
eenstemming tusschen toegevoegd cn teruggevonden lysozym
bevredigend te noemen. Dit leert ons dus, dat er bij de reactie
practisch geen lysozym verloren gaat.

met alkalische oplossing geëxtraheerd, waarbij veel meer lyso-
zym werd afgegeven (de mee opgeloste celbestanddeelen kunnen
de werking van het aanwezige lysozym slechts verminderd
hebben zie blz. 53), zoodat in werkelijkheid deze cijfers zeker
nog hooger moeten zijn). Het blijkt dus, dat in zure oplossing
de coccen veel meer lysozym adsorbeeren dan in alkalische op-
lossing, zoodat ik meen den pH-invloed op de lysis althans
voor een groot deel op rekening van het verschil in adsorptie
te kunnen schrijven.

Nadat van de bacteriën van proef I alle lysozym verwij-
derd is (zie laatste extractie) treedt toch met ammonia (in een
concentratie, die niet met lysozym behandelde bacteriën niet

aantast) nog onmiddellijk lysis op. De aanwezigheid van lyso-
zym is das voor het tot stand komen van het secundaire pro-
ces, de lysis, niet noodzakelijk.

III. In gedestilleerd water vindt door lysozym geen zicht-
bare lysis plaats. Toch is met den extinctiometer een, zij het
geringe, afname van de troebeling waar te nemen (fig. 16, a,
eerste deel van de kromme). Het bleek nu, dat bij toevoeging
van NaOH in een eindconcentratie VSn 13000 N. de lysis wel
optrad (fig. 16, c). Met minder loog C/eooo N.) begint de lysis
met precies gelijke snelheid (de pH-verandering speelt hier blijk-
baar geen rol meer), maar blijft na eenigen tijd achter
(fig. 16, b).

Het ligt voor de hand, aan te nemen, dat ook hier de te
geringe oplosbaarheid van den celinhoud in de vloeistof de

lysis remt, en wel in gedestilleerd water vrijwel direct; met
Vcooo N. loog is er wel een zekere oplosbaarheid, maar al spoe-
dig raakt de oplossing verzadigd, zoodat de zichtbare lysis
ook hier geremd wordt.

Dat echter het lysozym in gedestilleerd water wèl op de
bacterie inwerkt, kon worden aangetoond door na eenigen tijd
loog tot een concentratie van '/3000 N. toe te voegen. Daarbij
daalt de troebeling plotseling, waarna verder de normale lysis-
kromme gevolgd wordt (fig. 16, a, bij de pijl). Dit is dus
volkomen analoog aan het alkali-phenomeen van Nakamura
(zie blz. 51).

IV. De invloed van geconcentreerde zoutoplossingen op
de lysis is nog onvoldoende onderzocht. Zeer hooge zout-
concentraties (8 % NaCl) remmen de lysis totaal (Ander-
sen, 29). Het is ondenkbaar, dat in dit geval de remming een
gevolg zou zijn van onoplosbaarheid van den cel-inhoud (zie
boven), zoodat men gedwongen is, aan te nemen, dat hier
de primaire reactie niet plaats vindt. In overeenstemming daar-
mee vond Andersen geen lysis na uitwasschen met 8 % NaCl,
en brengen op voor de lysis gunstige zout-concentratie.

In verband met de in deel I verkregen resultaten was het
van belang, ook hier een systematisch onderzoek in te stellen
naar den invloed van de valentie der ionen. Daarbij kwam
wederom voor den dag, dat de remmende werking, bij aequi-
56

valentc concentratie, toeneemt met de valentie van het anion,
dusnbsp;Fe(CN)/quot;74 gt; 804quot;/2 gt; Cl'.

Voor de positieve ionen werd gevonden, dat Ca**/2 sterker
remt dan K* (zie figuur 17).

Aldus blijkt een analogie te bestaan tusschen precipitine-
reacties en de werking van lysozym. Deze analogie vindt nog
verderen steun in het feit, dat ook bij de lysis door lysozym
een zone-effect optreedt (ANDERSEN, 29). Voor nadere studie
van den electrolyt-invloed zouden dergelijke zone-effecten een
fraai object vormen (vgl. deel I!). De maximale lysis-snelheid
is echter zóó groot, dat van meting met den extintiometer,
zooals in het voorgaande beschreven, geen kwestie kon zijn.
Dit onderzoek zou weer een speciaal aan het probleem aan-
gepaste techniek eischen.

De vraag naar de chemische veranderingen bij de inwerking
van lysozym op de bacterie valt in zekeren zin buiten het
eigenlijke onderwerp van deze dissertatie, maar eischt toch een
korte bespreking.

Meyer en medewerkers (39) vonden, dat lysozym uit mu-
coïden reduceerende suikers afsplitst; deze mucoïden isoleer-
den zij uit de bacteriën en ook uit kippeneiwit. Op grond
daarvan concludeeren zij, dat ook in den bacterie-wand een
afbraak van mucoïden plaats vindt, met als gevolg het perme-
abel worden van den wand, dus, onder geschikte omstandig-
heden, lysis.

Het lysozym zou dus een enzym zijn. Deze meening is reeds
door vroegere onderzoekers uitgesproken, zonder dat dezen er
in slaagden, een enzymatische werking vast te stellen. Het feit,
dat bij de werking van lysozym op de bacterie geen lysozym
verloren gaat (blz. 54), is een bevestiging van deze opvatting.
Meyer c.s. (39) zijn er zelfs in geslaagd, uit de door hen
gebruikte sarcinen lysozym (althans een lyseerend agens, dat
Meyer c.s. als lysozym beschouwen) te isoleerenI (Het zou
dan een gewoon bestanddeel van de cel zijn?)

Nu is er één feit, dat tegen de enzymatische natuur van het
lysozym pleit, nl. de groote thermostabiliteit. Immers de
meeste enzymen worden bij 70° C. geïnactiveerd. Het is ech-
ter mogelijk, hier een compromis te vinden, en wel op de vol-
gende wijze: de algemeen gangbare opvatting over enzymen

beschouwt het enzym als een complex systeem, bestaande uit
een werkzame groep, en een colloïdalen drager. De combinatie
van beide is voor de enzymwerking noodig. Het is nu zeer aan-
nemelijk, dat de warmte-inactiveering van enzymen een gevolg
is van veranderingen van den colloïdalen drager. Immers dc
temperatuur van 70° is, wat betreft veranderingen in colloïdalc
systemen, heel gewoon (serum), daarentegen voor ontleding
van organische verbindingen in het geheel niet. Het is duide-
lijk, dat denatureering van den colloïdalen drager inactivee-
ring van het enzym ten gevolge heeft. Het lysozym nu blijkt
een colloïdalen drager van betrekkelijk kleine deeltjes-grootte
te hebben (Gildemeister, 33; zie blz. 39) ; daarmee kan heel
goed een groote thermostabiliteit gepaard gaan.

In alkalische oplossing echter wordt het lysozym door
warmte snel geïnactiveerd; dan gedraagt het zich als een ge-
woon enzym.

Een ander mogelijk bezwaar tegen de enzymatische natuur
van het lysozym zou men kunnen vinden in de uitermate
geringe concentraties, die nog werkzaam zijn. Dit bezwaar
echter kan wel schijnbaar zijn: met een kleinen colloïdalen
drager is het aantal actieve groepen per gewichtseenheid veel
grooter dan met een grooten drager. Bovendien, de natuur-
producten eiwit en traanvocht zijn zéér rijk aan lysozym,
terwijl de werkzaamheid in groote verdunning beperkt is tot
enkele bijzondere bacteriën: voor de lysis van de meeste lucht-
coccen is veel meer lysozym noodig dan voor Mier. Lyso-
deicticus.

Men kan dus, over het geheel genomen, niet zeggen, dat
er principiëele bezwaren zijn tegen de beschouwing van lyso-
zym als een mucoïden-splitsend enzym. Daarbij valt aan te
teekenen, dat dergelijke enzymen tevoren niet bekend waren
(zie Meyer c.s., 39).

Marrack (20) zegt op blz. 86: (over de antigeen-anti-
lichaam-binding) ,,Specific combination must recall the com-
bination of enzyme and substrate . . .

Het feit, dat electrolyten bij een enzymreactie (de lysis door
lysozym) een analogen invloed hebben (zie blz. 57) als bij

een serologische reactie (zie deel L blz. 20 e.v.) geeft een aan-
wijzing in deze richting.

De invloed van electrolyten op enzymatische processen is
herhaaldelijk bestudeerd; meestal echter is een vergelijking met
dc hier verkregen gegevens niet mogelijk. Ik wil slechts wijzen
op het onderzoek van MyrbaCK (39a), over den invloed van
zouten op de splitsing van zetmeel door amylase. Het blijkt,
dat de voor de reactie optimale pH door zout-toevoeging ver-
andert, terwijl deze verandering weer afhankelijk is van het
gebruikte zout. Ik kan op Myrback's interpretatie niet nader
ingaan; alleen meen ik, erop te moeten wijzen, dat ook hier
nog een terrein voor verder onderzoek ligt.

A. The time-absorption-curve shows an inflection-point,
indicating a rather slow combination of antigen and antibody.
The time of combination increases when the system is diluted.
The zone-effect was shown to be a property of the primary
reaction. It was discussed in some detail in relation to experi-
mental data on toxin-antitoxin-flocculation. A study of the
influence of electrolytes led to the analogy of immune-preci-
pitation and complex-coacervation. In a survey of the most
important littérature this analogy was discussed.

B- It was found possible to determine the lysozyme-content
of a solution within 5 %, whereas the usual technique allows
errors up to 100 %.

The morphological details of the lysis were studied.
The influence of pH and salts was discussed. Again, as in the
precipitin-reaction, the valency of the ions present was im-
portant.

The similarity of the influence of electrolytes on both pro-
cesses studied, combined with some arguments, favouring the
opinion that lysozyme is an enzyme, affords a connection
between serological and enzymatic processes, which seems
worth of further investigation.

4.nbsp;Bungenberg de Jong, o.a. Protoplasma 15, 110 (1932).
verder Bungenberg de Jong Ö Dekker, Kolloid-Beihefte,
43, 143 (1935), 43, 213 (1936) en talrijke artikelen in Bioch.
Z., Kolloid-Z., etc.

11.nbsp;Erlenmeyer Ö Berger, Bioch. Z. 255, 429 (1932).
id. id. 262, 196 (1933).

14.nbsp;Heidelberger Ö Kendall, J. Exp. Med. 61, 559 (1935), 61,
563 (1935), 62, 467 (1935), 62, 697 (1935).

20.nbsp;Marrack, The Chemistry of Antigens and Antibodies,
Med. Res. Council, Special Report Series, 194, (1934).

39.nbsp;id. id. id. id. J. Biol. Chem. 113, 479 (1936).
39a. Myrbäck, Z. f. physiol. Ch. 159, 1 (1926).

Het aardmagnetisme kan op eenvoudige wijze verklaard
worden uit bekende eigenschappen van de materie.

De opvattingen van Haurowitz over de colloxdale structuur
van de eiwitten zijn onvoldoende experimenteel gefundeerd,

Vergiftigingen door AsH., SH. SeO. en TeO. berusten, al-
thans gedeeltelijk. op de vorming van de elementen As, S, Se

De beste methode om de biochemische
(B^ D.) van rioolwater te bepalen is die met behulp van den

Het is weinig waarschijnlijk, dat bij de door Marker c.s.
aangegeven synthese in redelijke opbrengst het oestron ontstaat.

Marker, Kamm, Oakwood ö Laucius,
J. Am. Chem. Soc. 58, 1503 (1936).
Windaus 8 Deppe, Ber. 70, 76 1937).

Voor bet nauwkeurig stellen van Kaliumpermanganaat-
oplossingen verdienen kaliumjodide en arseentrioxyde als
standaard de voorkeur boven natriumoxalaat.




	a'vï v.rquot;., S

concentratie	K2SO4	KCl	CaCU
m. aeq./L.
0	I.OO	I.OO	I.OO
10	1.09	I.i7	gt; 1.65*
25	1.16	1.37	1.53
40	1.28	1.39	1.44

conc. in	K2SO,	KCl	CaCl2
m. aeq./L.
0	I.OO	I.OO	I.OO
10	0.90	I.I2	2.37
25	0.76	0.98	1.36
40	0.60	0.71	0.91

	waarden	van Uo	—ut
toegevoegd lys.-opl.	t= 60quot;	120quot;	240quot;
0.108 cc.	11.5	17.5	26
0.216	18.5	27
0.165	15	23	32.5
eiwit-oplossing, verdund	i : 100
toegevoegd:	t=6oquot;	120quot;	240quot;
i) 0.079 cc.	ifu		36V.
2) 0.056	iru		30.5
3) 0.048		20	28%

	Tabel 10.
Lysozym gehalte	Proef I	Proef	11
Oorspronkelijke vloei-
stof na adsorptie	89	52
Extract nr i	63	45
tf *f 2	69	29
„ 3	25	27
.. 4	20	63	a)
„ 5	2	20	a)
Totaal	268	236
Oorspronkelijk		236
toegevoegd	221	256

	■J.-.A'i	r ■. • . ■■.••: r ! . •

		a^jïwy»» ■

pH	S	tb
5.9	19	n
6.5	13	i'i
6.8	11	i'i
7-7	6	2


	riiti
	.ins» '*