i jiu.yjSiJp'J.

EEN ONDERZOEK NAAR DE

GROEIFACTOREN VAN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

^IBUOTHEEK

U T R FT C H T. :

W. J. VAN WAGTENDONK

■ ■ • ''i

'■'yT/h-^l^f.

''îm

mu

■K- i''

-c ■

; .....

i'Yïyy. ' y--: r-.-..y y'.^ quot; ; y

s-

^ -'quot;hj':
«. 1

■

EEN ONDERZOEK NAAR DE GROEIFACTOREN
VAN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

EEN ONDERZOEK NAAR DE

GROEIFACTOREN VAN
STAPHYLOCOCCUS AUREUS

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DE
GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NA-
TUURKUNDE TE UTRECHT OP GEZAG VAN
DEN RECTOR MAGNIFICUS Dr. J. BOEKE,
HOOGLERAAR IN DE FACULTEIT DER GE-
NEESKUNDE, VOLGENS BESLUIT VAN DE
SENAAT DER UNIVERSITEIT TE VERDEDI-
GEN TEGEN DE BEDENKINGEN DER FA-
CULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE OP
MAANDAG 8 NOVEMBER 1937, DES NAMID-
DAGS TE VIER UUR
DOOR

WILLEM JOHAN VAN WAGTENDONK

GEBOREN TE BATAVIA.

DRUKK BROEKHOFF N.V. v.h. KEMINK EN ZOON, DOMPLEIN 2, UTRECHT

1937

BIBLIOTHEEK DER
RIJKSUNIVERSITEIT

U T 9 e ^ H T.

m'

AAN MIJN OUDERS.
AAN LIEN.

Nu door het verschijnen van dit proefschrift mijn studie
aan de Utrechtse Universiteit een einde heeft genomen,
wil ik U, Oud-Hoogleraren, Hoogleraren en Lectoren van
de Faculteit der Wis- en Natuurkunde, hartelijk dank
zeggen voor mijn wetenschappelijke opleiding.

Hooggeleerde Kögl, Hooggeachte Promotor, U dank ik
in het hijzonder voor het vele, dat ik van U mocht leren
en voor het assistentschap, dat Gij mij hebt verleend.

Verder dank ik al mijn collega's en het personeel van
het Organisch-Chemisch Laboratorium voor hun mede-
werking.

■y

INHOUD.

Blz.

INLEIDING..............1

HOOFDSTUK I............3

Andere onderzoekingen over de groeifactoren van
bacteriën.

HOOFDSTUK II.............15

Quantitatieve bepaling van de groei van Staphy-
lococcus aureus.

HOOFDSTUK III.............22

Pogingen tot isolering van de groeifactoren.

HOOFDSTUK IV............34

Aneurine, nicotinezuur en biotine als groeifac-
toren.

SLOTBESCHOUWING..........45

AANHANGSEL.............47

Over de groeifactoren van Aspergillus niger.

LITERATUURLIJST...........62

INLEIDING.

Het is van ouds bekend, dat de groei zonder uitzonde-
ring afhankelijk is van de toevoer of de productie van
voedselstoffen. Nog een tiental jaren geleden moest men
veronderstellen, dat dit levensverschijnsel uitsluitend ge-
reguleerd wordt door een samenwerking van de talrijke
enzymen. Eerst in de jongste tijd heeft men gevonden,
dat bij de regeling van de plantaardige groei bepaalde
phytohormonen respectievelijk groeistoffen een belangrijke
rol spelen. Het zekere bewijs daarvoor werd het eerst bij
de celstrekking geleverd. F. K ö g 1 en zijn medewerkers
A. J. H a a g e n Smit, H. E r x 1 e b e n en D. G. F. R.
Kostermans zijn, steunend op het botanisch werk
van de school van wijlen F. A. F. C. W e n t — erin ge-
slaagd, de vooral bij de celstrekking werkende auxinen
uit verschillende bronnen in gekristalliseerde vorm af te
scheiden en hun constitutie op te helderen. De belangrijk-
ste stoffen van deze groep zijn auxine-a (C18H32O5) en
auxine-b (C18H30O4); later werd gevonden, dat ook (3-
indolylazijnzuur (hetero-auxine) een werkzaamheid ver-
toont, welke in vele opzichten overeenkomt met die van
auxine-a.

Schematisch kan men by een plantaardige cel drie
stadia in de groei onderscheiden, te weten celdeling, plas-
magroei en celstrekking. Het begrip celdeling behoeft hier
geen toelichting, wel echter het pas twee jaar geleden
door F. Kögl en verschillende botanici ingevoerde be-
grip plasmagroei. Dit stadium is vooral gekarakteriseerd
door de toeneming aan protoplasma, waarbij de dochter-
cel tot de grootte van de moedercel uitgroeit.

Een tweede groep van onderzoekingen van F. Kögl
heeft zich bezig gehouden met de stoffen, welke bij de
vermeerdering van de gistcellen en waarschijnlijk in het
algemeen bij celdeling en plasmagroei van betekenis zijn.
Hun bestaan werd in het jaar 1901 door E. W i 1 d i e r s
ontdekt en van hem is ook de naam „biosquot; afkomstig,
waaronder deze groep van stoffen ook heden nog samen-
gevat wordt.

Twee bios-componenten waren door oudere onderzoe-
kingen reeds bekend, en wel meso-inosiet (E. V. E a s t-
cott, 1928) en aneurine (R. J. Williams en R. R.
Roehm, 1930). In het jaar 1934 hebben F. Kögl en
B. Tonnis een derde bios-factor, het biotine, geïso-
leerd. Het uit eigeel verkregen actieve kristallisaat is
volgens een onderzoek van F. Kögl en L. Pons een
methylester van de samenstelling CnHigOsNaS. Dat de
werking van biotine niet beperkt is tot bepaalde gistras-
sen werd voor het eerst bewezen door een onderzoek van
F. Kögl en A. J. Haagen Smit over de groei van
geïsoleerde embryonen van erwten.

Het is nu reeds zeker, dat behalve inosiet, aneurine en
biotine nog andere bios-factoren bestaan, en het is van
belang te onderzoeken, welke van deze factoren bij de
overige schimmelsoorten en bij bacteriën een rol spelen.

F. Kögl en N. Fries hebben te dien opzichte de
groei van verschillende schimmelsoorten bestudeerd en
ook schrijver van dit proefschrift heeft in oriënterende
proeven de groei van een schimmel (Aspergillus niger)
nagegaan. Zijn voornaamste taak was echter de studie
van de groeibevorderende factoren van een pathogene
bacterie, en wel van Staphylococcits aureus.

HOOFDSTUK I.

Andere onderzoekingen over de groeifactoren
van bacteriën.

Men kan de bacteriën, al naar de samenstelling van
hun voedingsbodems, in twee grote groepen verdelen. De
eerste wordt gevormd door de bacteriën, welke op media
van eenvoudige samenstelling kunnen groeien, terwijl de
tweede die organismen omvat, welke gecompliceerde me-
dia nodig hebben om tot ontwikkeling te kunnen komen.

Op een paar uitzonderingen na behoren tot de eerste
groep bacteriën, welke van medisch standpunt bekeken
van weinig belang zijn,hoewel zij in economisch opzicht
vaak een grote rol kunnen spelen. De pathogene bacteriën
behoren voornamelijk tot de tweede groep. Het is opval-
lend, dat de meeste pathogene organismen juist hierin
thuis horen, en men zou kunnen vermoeden, dat dit een
diepere oorzaak heeft.

In vele gevallen (meningococcen, haemolytische Strep-
tococcen) is het noodzakelijk, dat aan de voedingsbodem
bepaalde stoffen (ascitesvocht, bloedserum of bloed) toe-
gevoegd worden. Slechts dan kunnen de bacteriën tot ont-
wikkeling komen. De hoogmoleculaire eiwitten, die in de
genoemde vloeistoffen voorkomen, kunnen vervangen
worden door eenvoudiger verbindingen, maar dan blijkt
dat er nog bepaalde stoffen toegevoegd moeten worden
om de voedingsbodem geschikt te maken voor deze bac-
teriën.

Zoals bü de dierlijke organismen hormonen en vitami-
nen een grote rol spelen, hebben wij ook bij de plantaar-
dige organismen, volgens de recente onderzoekingen, met
soortgelijke katalysatoren te rekenen. De naam bio-„ka-
talysatorenquot; duidt al aan, dat deze stoffen hun invloed
in zulke kleine concentraties uitoefenen, dat daarbij hun
calorische waarde van geen belang kan zijn.

Reeds in 1901 werd door E. W i 1 d i e r s gewezen
op de belangrijkheid van factoren, welke bij de groei van
micro-organismen een rol spelen. Deze onderzoeker nam
waar, dat waterige extracten van gist in zeer sterke mate
de groei van dit organisme in een synthetisch milieu be-
vorderden.

Pas 15 jaar later heeft men het onderzoek naar de
groeibevorderende factoren voor micro-organismen voort-
gezet.

Volgens de onderzoekingen van Dorothy J.
L1 O y dnbsp;zijn voor de groei van Meningococcen

behalve aminozuren ook groeistoffen („vitaminesquot;) no-
dig. Zij vond, dat bij aanwezigheid van veel vrije ami-
nozuren de Meningococcus zonder toevoeging van „vita-
minequot; groeide, het vitamine was noodzakelijk wanneer in
het medium weinig aminozuren aanwezig waren. Volgens
haar opvatting zouden de aminozuren de essentiëele voe-
dingsstoffen zijn, terwijl de functie van de vitaminen
hierin zou bestaan, dat zij het proteïne-evenwicht in
de cel gunstig beïnvloedden, waardoor de groei ver-
sneld werd. Deze vitaminen zouden in bloed en melk
aaviwezig zijn.

M. Flack^®) toonde aan, dat de groeistoffen, nood-
zakelijk voor de groei van de Meningococcus, in erwten

voorkomen, terwijl F. E b e r s o n quot;) de aanwezigheid
hiervan in gist vaststelde.

M. H. Gordon en T. G. M. Hinnequot;) bevestigden
het resultaat van D. J. L1 o y d, dat bloed een groeibe-
vorderende factor bevat.

Iets meer van de aard van deze stof komen we te weten
door de publicatie van C. S h e a r e r De factor is op-
losbaar in water, minder in aethanol en slecht oplosbaar
in aether. Bovendien is de factor thermostabiel, terwijl de
activiteit niet vernietigd wordt, door de extracten gedu-
rende 12 uur met sterk zoutzuur te koken.

Ofschoon de eigenschappen van deze groeifactoren voor
het verdere onderzoek niet ongunstig leken te zijn, is
het onderwerp hierna niet meer bestudeerd.

Het onderzoek naar de groeifactoren voor haemolyti-
sche streptococcen is ook nog niet ver gevorderd.

Onderzoekingen van B. Leichtentritten M. Zie-
laskowsky^^®, evenals die van S. Hosoya en
M. K u r O y a wezen uit, dat deze factor (of factoren)
in vele dierlijke en plantaardige extracten, in vruchten-
sap, gist enz. voorkomt.

J. H. Mueller^®,nbsp;heeft pogingen in het werk

gesteld, deze groeifactoren te isoleren. Daartoe ging hy
uit van pepton en gehydrolyseerde gelatine. Hieruit iso-
leerde hij twee fracties, die de groei van Streptococcus
haemolyticus bevorderden. Een hiervan werd door Ag2S04
neergeslagen. Uit het filtraat isoleerde hij een nieuw ami-
nozuur, het methionine (C5H11O2NS), dat echter op zich-
zelf niet verantwoordelijk was voor de activiteit van de
fractie.

L. F r e e d m a n en C. F u n k slaagden erin, de

groeibevorderende factoren door adsorptie aan vollers
aarde of noriet uit extracten van rundvlees en gist in
geconcentreerde vorm te verkrijgen.

Volgens H. R. W h i t e h e a dnbsp;was een anorga-

nisch phosphaat onontbeerlijk voor de groei.

H. Davidson®) vergeleek de eigenschappen van de
groeifactor met die van het vitamine B-complex en het
bios-complex van Wildiers. Bij verwarming en bij be-
handelen met alkali schenen de factoren stabieler te zijn
dan het „vitamine Bquot; en minder stabiel dan Wildiers'
bios.

Vele onderzoekers hebben zich gewijd aan de bestude-
ring van de groeibevorderende factoren van Bacterium
influenzae Pfeiffer. In het jaar 1918 nam men, in
overeenstemming met het toen heersende standpunt aan,
dat de vitaminen bij de groei van deze bacteriën een rol
spelen.

H^. Agulhon en R. Legroux^) gaven blijk, reeds
toen een zuiver inzicht in het groeistoffenprobleem gehad
te hebben: „L'influence favorisante des liquides naturels
(sang, sérum, ascite, etc.) sur les cultures des micro-or-
ganismes est expliquée non plus par l'introduction dans le
milieu d'albumines intactes, mais par la présence de vita-
mines de croissance dans ces liquidesquot;
en verder:

„D'autres microbes peuvent profiter de l'addition de
solutions de vitamines. Les vitamines ne semblent pas
être spécifiques pour une seule ou quelques espèces bac-
tériennes. D'autre part il faudra rechercher les différen-
tes sources de vitamines, étudier leur électivité, si elles en
possèdent, essayer de déterminer leur nature, le mécanis-

me de leur action. Ces catalysateurs de croissance doi-
vent-ils, comme les diastases, leur activité à un état phy-
sique particulier, ou bien seulement à leur composition
chimique? Certaines de leurs propriétés, que nous avons
précisées, rendent la première hypothèse assez vraisem-
blable.quot;

Maar ook deze auteurs hebben slechts de aanwezigheid
van een groeibevorderende factor waarschijnlijk kunnen
maken, terwijl ook R. Legroux en J. Mesnard^'^)
geen vorderingen gemaakt hebben.

B. influenzae Pfeiffer heeft, om normaal te kunnen
groeien, een ingewikkeld complex van factoren nodig.
Twee daarvan zijn scherp te onderkennen ; het zijn de be-
kende factor X en factor V.

T. T h j ö 11 a en O. T. A v e r ynbsp;beschrijven de

factor V als een vitamine-achtige stof, welke uit rode
bloedlichaampjes, gist en groenten geëxtraheerd kan
worden. De factor zou volgens deze auteurs thermolabiel
zijn. De factor X zou ook in rode bloedlichaampjes
voorkomen, maar thermostabiel zijn. Terwijl men enige
tijd veronderstelde, dat factor V identiek zou zijn met
„vitamine Cquot;, toonde K. Meyer^®,^«) aan, dat ascor-
binezuur geen groeibevorderende invloed op de influenza-
bacil had.

De factor V wordt door verschillende bacteriën (o.a.
B. haemoglobinus canis) gesynthetiseerd, zoals uit on-
derzoekingen van D. J. D a v i s ^ , P. F i 1 d e s
en F. G. O. V a 1 e n t i n e en T. M. R i V e r s bleek.

De factor X hangt samen met het bloedpigment. Hae-
moglobine zelf is inactief, het haematine is actief. De ac-
tiviteit schijnt hoofdzakelijk een gevolg te zijn van het
komplex gebonden ijzer, daar de nauwverwante ijzervrije

pyrrolderivaten inactief zijn. Volgens L. T. Webster
en O. Baudisch^®), alsmede volgens O. Bau-
d i s c h schijnen zelfs bepaalde FegOg-praeparaten een
grote rol te spelen¹).

Veel aandacht is besteed aan het vraagstuk van de groei
van het Mycobacterium tuberculosis hominis, de verwek-
ker van de tuberculose. Bij het kweken van deze bacterie
is het vooral opvallend, dat het zeer moeilijk is om door
directe overenting uit tuberculeus materiaal, van dit or-
ganisme culturen in vitro te verkrijgen.

H. G. Wells en E. R. Long^») schrijven:

„Massive growth in synthetic media compounded from
pure chemicals indicates that in ordinary culture it is
not dependent on outside sources for the accessory groAvth
factors necessary for many higher forms of live. Never-
theless, the experience of original isolation from infective
materials, and of inoculation with minute seedings teaches
that some accessory factor is necessary. Synthetic media
are not suitable for first isolation and cultivation in them
is not successful following inoculation of a small number
of bacilli.quot;

Niettegenstaande de zeer moeilijke isolatie, blijkt het
daarna mogelijk te zijn, de tuberkelbacil op betrekkelijk
eenvoudige media te kweken, hetzij om tuberculine te ver-
krijgen, hetzij voor het onderzoek naar specifieke polysac-
chariden (G. A. C. Gough ^^ ).

A. Borrel en medewerkers vonden, evenals
H. Schmidt«®), dat in oude culturen van de tuberkel-
bacil, maar ook in culturen van schimmels, die tot het ge-

1nbsp; Uit zeer recente onderzoekingen van A. Lwoff en M. Lwoff
(Comp. rend. 204, 1510 (1937)) is gebleken, dat de factor V identiek
is met cozymase, terwijl de factor! X het haematine is.

slacht Mucor behoren, groeibevorderende factoren aan-
wezig waren. W a n g 1 i a n g kwam tot dezelfde con-
clusie, terwijl hij bovendien de aanwezigheid van deze
factoren in tomaten aantoonde.

Uit wat tot nu toe bekend is kan men de conclusie trek-
ken, dat de tuberkelbacil direct na de overenting uit tu-
berculeus materiaal, bepaalde groeistoffen nodig heeft,
welke de bacterie eerst in het organisme van den gast-
heer aantrof. Wanneer de bacterie eenmaal op een eenvou-
dige voedingsbodem groeit, is zij in staat deze stoffen zelf
te synthetiseren.

Bij de bestudering van het groeistof-vraagstuk van
Corynebacterium diphtheriae doet zich de bijzondere moei-
lijkheid voor van de grote variabiliteit van dit organisme.
Sommige stammen groeien zonder moeite op media van
eenvoudige samenstelling, terwijl andere haast niet in
vitro te kweken zijn. Reeds N. Uschinsky'^®) gebruikte
een eenvoudig medium, bestaande uit anorganische zou-
ten, glycerine, ammoniumlactaat en asparaginezuur, waar-
op hij het C. diphtheriae kweekte. Ook hij vermeldde
reeds, dat niet alle stammen op dit medium tot ontwikke-
ling kwamen, pas geïsoleerde bacteriën waren op deze
voedingsbodem zeer lastig te kweken, terwijl oudere „an
saprophytische Lebensweise gewöhnte Kulturen leicht
wachsen.quot;

Het belangrijkste werk is verricht door J. H. M u e 1-
1 e r. Hij beperkte zich bij het onderzoek naar de groei-
bevorderende factoren tot één stam, C. diphteriae Yü. Hij
fractioneerde de voor de groei noodzakelijke extracten van
caseïne en vlees. Het bleek, dat voor de gebruikte stam de
volgende fracties onmisbaar waren :

1.nbsp;uit caseïne:

a.nbsp;cystine

b.nbsp;de fractie oplosbaar in butanol

c.nbsp;tryptophaan;

2.nbsp;uit vleesextract:

een nog niet gedefiniëerde stof.

J. H. Mueller®^) voerde een quantitatieve werkwijze
in om de groei van de bacterie te bepalen. Hij schrijft
daarover:

„Because of the nature of the mixtures used, commer-
cial meat extracts and crude protein hydrolysate, cleanly
negative controls could practically never be secured. It
was felt that the amount of growth must be accurately
determined, thus rendering possible the differentiations
which it was necessary to make, in such manner that re-
sults could be strictly comparable even over a period of
monthsquot;.

Als maatstaf voor de groeitoeneming van de bacterie nam
hij het N-gehalte van de bacteriecultuur, die hij met de
micro-K j e 1 d a h 1-methode volgens P r e g 1 bepaalde

Dit was zeer belangrijk, daar de meest gebruikelijke
methode (de bepaling van de groei door meting van op-
tredende troebeling) hier niet gebruikt kan worden, om-
dat de bacterie in de vorm van een huidje op de voedings-
oplossing groeit.

Op grond van zijn onderzoekingen kwam hij tot de con-
clusie, dat er behalve een reeks aminozuren (1-trypto-
phaan, 1-cystine, 1-h'ystidine-HCl, d,l-phenylalanine, d,l-
methionine, glycerine, d,l-valine en d-glutaminezuur)
toch nog een kleine hoeveelheid Vleesextract voor de
groei nodig was. Dit extract zou dan waarschijnlijk een

groeibevorderende factor bevatten. Het bleek, dat lever-
extract veel actiever was. M u e 11 e r stelde nu pogingen
in het werk uit lever de actieve stoffen verder te con-
centreren.

Door praecipitatie met basisch loodacetaat in alcoho-
lisch milieu — waarbij in hoofdzaak inactief materiaal
neersloeg — en daarop volgende adsorptie aan noriet en
elutie met aangezuurde aethanol, verkreeg hij een actief
praeparaat, dat de factor echter nog niet in zuivere toe-
stand bevatte.

Zoals gezegd, zijn de genoemde onderzoekingen met een
bepaalde bacteriestam uitgevoerd; in dat verband moet nog
opgemerkt worden, dat de verschillende stammen zeer uit-
eenlopen in hun behoefte aan aminozuren en groeifacto-
ren. Bovendien schijnen ook nog andere factoren nood-
zakelijk te zijn voor de toxineproductie.

In de laatste jaren hebben ook Engelse onderzoe-
kers een werkzaam aandeel gehad in de bestudering van
het groeistofprobleem voor bacteriën. P. F i 1 d e s en
medewerkers stelden een onderzoek in naar de groeifac-
toren voor Clostridium sporogenes. (B. C. J. G.
Knight P. Fildesquot;); P. Fildes, G. M. R i-
chardson^®) en A.M.Pappenheimer Jr.

Het leek aanvankelijk, dat de actieve stof identiek of
verwant zou kunnen zijn met de door F. Kögl en mede-
werkers geïsoleerde auxinen of het hetero-auxine quot;).
De stabiliteit van de „sporogenes factorquot; ten opzichte van
zuur en loog wees echter uit, dat deze noch met auxine-a
of auxine-b, noch met hetero-auxine identiek kon zijn.
Bovendien bleek het, dat de auxinen en het hetero-auxine
voor Cl. sporogenes niet actief waren.

De „sporogenes factorquot; is bovendien ook voor de groei
van Cl. botulinum noodzakelijk^®). Door verdere onder-
zoekingen van P. F i 1 d e s, G. P. G1 a d s t o n e en B. C.
J. G. Knight^®) alsmede van B. C. J. G. Knight
en F. F i 1 d e s bleek, dat de actieve stof door ver-
schillende bacteriën (Bact. aertrycke, My co. tuberculosis
hominus en Bact. typhosum) en door een schimmel (As-
pergillus versicolor) gesynthetiseerd wordt.

De factor komt in vele dierlijke en plantaardige
extracten voor.

Terwijl B. C. J. G. K n i g h t en P. F i 1 d e s als uit-
gangsmateriaal voor de isolatie gistextract en urine van
mensen gebruikten, heeft A. M. Pappenheimer
Jr. voor dit doel urine van merries toegepast. Het
laatst genoemde onderzoek leidde tot de isolatie van een
olieachtig zuur, dat nog in een concentratie van 0,4 y/cm®
actief was. Door verestering met methanol werd een in-
actief product verkregen. Over de structuur van de
„sporogenes factorquot; is nog niets naders bekend.

Tenslotte zijn nog verschillende bacteriesoorten te
vermelden, waarvan de groeifactoren, evenals bij de
reeds genoemde haemolytische streptococcen, verwant of
identiek leken te zijn met het B-vitamine.

Een dergelijk verband werd reeds door A. Itano''®)
in het jaar 1923 voor de groeifactoren van Azotobacter
chroococcum vermoed en in 1927 door C. H. Werk-
man®quot;) experimenteel nader getoetst. Deze auteur
heeft met het natuurlijk nog ruwe praeparaat van de
B-vitaminen wel een verhoogde groei gekregen; toevoe-
ging van meer voedingsstoffen had echter hetzelfde
resultaat. Hij achtte het daarom mogelijk, dat het effect
door de „verontreinigingenquot; van het vitaminepraeparaat

veroorzaakt was, temeer omdat Azotobacter chroococcum
(alsmede Rhizohium leguminosaurum) zelf B-vitamine
synthetiseren.

Tegen de tot nu toe genoemde onderzoekingen over de
betekenis van de B-vitaminen voor de bacteriegroei was
het bezwaar in te brengen, dat de gebruikte onzuivere
praeparaten naast B-vitaminen ook nog geheel andere
actieve stoffen konden bevatten. In dat opzicht bete-
kende de onderzoeking van R. A. P e t e r s en mede-
werkers®®) een vooruitgang. sDeze onderzoekers hebben,
op grond van vergelijkende proeven met duiven en
Streptothrix corallinus, het zeer waarschijnlijk gemaakt,
dat deze bacterie inderdaad het antineuritische vitamine
voor zijn groei nodig heeft.

J. O r r-E w i n g en V. Reader®®) hebben boven-
dien gevonden, dat Streptothrix corallinus zonder vita-
mine Bi tot ontwikkeling kon komen, indien op de ge-
bruikte voedingsbodem vooraf Mening ococcus-soorteji
hadden gegroeid. Zij concludeerden daaruit, dat de
laatstgenoemde bacteriën het vitamine zelf konden syn-
thetiseren en dat zij het ten dele aan de voedingsbodem
hadden afgegeven.

Nadat R. J. Williams en R. R. R o e h m®®) in het
jaar 1930 met het gekristalliseerde vitamine B^ van
B. C. P. Jansen en W. P. D o n a t h bij twee gistras-
sen een sterk groeieffect verkregen hadden, leek het zeer
waarschijnlijk, dat ook andere micro-organismen deze
stof voor de groei nodig zouden kunnen hebben.

In 1935 heeft W. H. S c h o p f e r aangetoond, dat
vitamine B^ of aneurine — zoals het nu genoemd wordt
—- voor een schimmel (Phycomyces blakesleeanus) een
onontbeerlijke groeifactor is.

Dat het aneurine inderdaad ook by de groei van bac-
teriën een rol speelt werd pas door onderzoekingen van
de laatste twee jaren aangetoond.

Met de eigen onderzoekingen over de groeifactoren
van Staphylococcus aureus werd in het jaar 1935 begon-
nen en er zal in de volgende hoofdstukken gelegenheid
zijn, de sindsdien verschenen publicaties van andere
auteurs nader te bespreken.

Op deze plaats moet alleen nog een publicatie van B.
C. J. G. Knight^') over de groeifactoren van Staphy-
lococcus aureus vermeld worden. Hierin deelt hij mee,
dat deze bacterie bij aëroob kweken op een medium, dat
behalve glucose en anorganische zouten bovendien nog
cystine, tyrosine, tryptophaan en gehydrolyseerde gela-
tine bevatte, alleen groeien kon indien een extract van
gist werd toegevoegd. Knight heeft getracht, de
groeifactor uit gistextract (marmite) te isoleren, en is
er ook in geslaagd tamelijk actieve praeparaten te be-
reiden, welke echter zeker nog niet zuiver waren.

In verband met de onderzoekingen over het bios-
vraagstuk, welke sedert het jaar 1931 in dit labora-
torium uitgevoerd worden, leek het belangrijk, ook de
groeifactoren van bacteriën nader te bestuderen. Het
was niet buitengesloten, dat een bepaalde groeistof van
bacteriën identiek kon zijn met één van de bios-factoren
en omgekeerd. Om verschillende redenen hebben wij voor
dit onderzoek eveneens Staphylococcus aureus gekozen,
en het lag oorspronkelijk in de bedoeling, na dit niet
al te moeilijk te hanteren testobject ook nog de groei-
factoren van andere pathogene organismen in dit on-
derzoek te betrekken.

HOOFDSTUK II.

Quantitatieve bepaling van dc groei van
Staphylococcus aureus.

In het onderzoek van B. C. J. G. Knightquot;) werd
de groei van Staphylococcus aureus door visuele schat-
ting van de troebeling bepaald. Het leek echter beter, de
groeitoeneming langs nephelometrische weg met behulp
van de extinctiometer van W. J. H. Moll te bepa-
len. Deze methode heeft by het bios-onderzoek van F.
Kögl en medewerkers zeer goed voldaan''®).

Natuurlijk was de voor het kweken en meten van gist-
suspensies uitgewerkte methode niet zonder meer op dit
geval toe te passen. De gist wordt namelijk in kolfjes,
die met een kurk afgesloten zijn, gekweekt en kan reeds
na 5 uur gemeten worden. Deze wyze van kweken kon
bij de Staphylococcus aureus niet toegepast worden, om-
dat dan de kans op infectie, die bij de gist geen rol
speelt, veel te groot is. Ook de in de bacteriologie ge-
bruikelijke methode (cultuurbuizen, afgesloten met een
wattenprop) kon niet toegepast worden, daar dan tame-
lijk veel vezels in de cultuur komen, waardoor de gevoe-
lige nephelometrische methode onbruikbare resultaten
oplevert.

Teneinde deze bezwaren te ondervangen heb ik de in
figuur I getekende kolfjes gebruikt. Zij hebben een in-
houd van 50 cm® en zijn met een glazen kapje (normaal
slijpstuk) af te sluiten. Bij dit model bestond geen ge-

vaar, dat vanuit het kleine watten-
propje vezels in de cultuur konden
vallen, terwijl toch de mogelijkheid
bestond om het kolfje op steriele
wijze te voorzien van voedingsop-
lossing, te testen praeparaten en bac-
teriesuspensie. Het slijpstuk kon
gemakkelijk geflambeerd worden.

Om te voorkomen, dat er van voor-
afgaande proeven groeibevorderende
factoren in de kolfjes aanwezig wa-
ren, werden voor elke nieuwe test
alle kolfjes en pipetten met een
chroom-zwavelzuurmengsel behan-
deld. Pipetten en kolfjes werden tenslotte droog gestereli-
seerd.

Ik gebruikte de, ook in het onderzoek van B. C. J. G.
Knight^^) toegepaste voedingsoplossing. Om cara-
melisering te voorkomen werd zij in twee delen afzon-
derlijk gestereliseerd.

1. Na-citraat puriss.nbsp;3,00 g

KH2PO4 „nbsp;4,50 g

1-cystine (Chem. Fabr. Th. Schu-

chardt, Görlitz)nbsp;0,05 g

tyrosine „reinstquot; (Fränkel-Landau) 0,05 g
gehydrol. gelatine ¹)nbsp;25 cm®

tot 600 cm^

Deze oplossing werd met NagCOs (puriss.) op een
Pj^ = 7,4 gebracht.

2. MgS04 7 aq p. a.nbsp;0,04 g
tryptophaan „reinstquot; (Frankel-

Landau)nbsp;0,02 g

glucose p. a. anh.nbsp;2,50 g

ged. waternbsp;400 cm®

Deze twee oplossingen werden door een gehard filter
gefiltreerd, gedurende 15 minuten op 120° verhit, en
daarna bij elkaar gevoegd.

Voor dit onderzoek stond een stam van Staphylococcus
aureus ter beschikking, welke ik door de welwillendheid
van Dr. H. W. Julius van het Hygiënisch Labora-
torium, wien ik van deze plaats hartelijk dank zeg, ge-
kregen heb.

Op de hierboven beschreven voedingsbodem kwam deze
bacterie in het algemeen zonder toevoeging van gist-
extract niet tot ontwikkeling.

De voor de test benodigde bacteriën waren steeds van
een 24 uur oude cultuur, op een normale agar-voedings-
bodem gekweekt, afkomstig. Met behulp van een entnaald
werd de cultuur voorzichtig van de agar gestreken en in
10 cm® voedingsoplossing gesuspendeerd. De bacterie-
suspensie was nu gereed voor de test. De hoeveelheid
entmateriaal werd zoveel mogelijk constant gehouden.

Van elke verdunning werd een serie van 5 kolfjes in-

gezet. De groeimetingen begonnen, naar het voorbeeld
van de biotinetest, dagelijks met de bepaling van de zoge-
naamde nulwaarde, blancowaarde en standaardwaarde.

Deze drie grootheden kunnen als volgt gedefiniëerd
vv^orden:

1.nbsp;de nulwaarde is die nephelometerwaarde, welke ver-
kregen wordt door de bacteriën in een testkolfje on-
middellijk na enting te doden met 20 cm'' chloorkresol-
oplossing (l»/oo) en daarna te meten.

2.nbsp;De blancowaarde is de nephelometerwaarde, welke
verkregen wordt door de bacteriën in een testkolfje,
waaraan geen groei bevorderende factoren zijn toe-
gevoegd, bij 37° 48 uren aëroob te kweken en daarna
te doden met 20 cm® chloorkresoloplossing en te meten.

3.nbsp;De standaardwaarde is de nephelometerwaarde, welke
verkregen wordt door de bacteriën in een testkolfje,
waaraan 0,1 cm® marmite-oplossing (1 %) is toege-
voegd, bij 37° 48 uren aëroob te kweken en daarna te
doden met 20 cm® chloorkresoloplossing en te meten.

De groeitoeneming wordt berekend uit de formule:
b — a

- 100, waarin a de extinctie voorstelt van de kolf-

a

jes, welke de nulwaarde leveren, en b de extinctie van een
willekeurige andere serie.

Het was theoretisch juister geweest, voor a niet de nul-
waarde, maar de blancowaarde te nemen. In de practijk
bleek echter, dat de blancowaarde sterk schommelde en
meestal beneden de nulwaarde lag. De oorzaak hiervan is
waarschijnlyk, dat de bacteriën in dit milieu niet alleen
geen groei vertonen, maar ook eerder afsterven, waarbij
plasmolyse optreedt.

Als voorbeeld is in tabel I de samenstelling van de voe-
dingsoplossing van een reeks proeven aangegeven:

Tabel I

De te meten praeparaten werden altijd in verschillende
verdunningen getest. De verdunning, waarbij de groei-
toeneming in de nabijheid van 100% lag, werd gekozen
voor de berekening van de activiteit. De eenheid was per
definitie vastgelegd:

Een voedingsoplossing bevat 1 eenheid (IE) per cm®,
wanneer Staphylococcus aureiis hierin gedurende 48 uren
aëroob bij 37° gekweekt, een groeitoeneming vertoont van
100

Hierdoor was het gemakkelijk, de praeparaten op een-
voudige wijze te vergelijken.

Aan het einde van de groeiperiode (48 uren) werden
de bacteriën met 20 cm=' chloor-kresoloplossing (1 quot;/oo)
gedood. De troebeling werd met de extinctiometer bepaald.

20
Tabel II

De cuvetten werden voor iedere meting zorgvuldig uit-
gespoeld en met een zemen lapje afgedroogd. De inhoud
van een te meten kolfje werd voorzichtig geschud, zodat
zich geen luchtbelletjes vormden, welke de meting zouden
storen; daarna werd de verkregen suspensie in de cu-
vette gegoten en gemeten zoals in de publicatie van
W. J .H. M 011 is beschreven.

Als standaard gebruikte ik 0,1 cm® van een oplossing,
die 1 % marmite bevatte. Deze hoeveelheid veroorzaakte
gemiddeld een groeitoeneming van 500 %.

Hoewel het dus voor de hand had gelegen, de concen-
tratie lager te kiezen (om 100 % groeitoeneming te be-
reiken) heb ik toch aan de concentratie van 1 % vastge-
houden, omdat ook hier de variabiliteit van het organis-
me een grote rol speelde. Soms kreeg ik abnormaal lage
waarden, een andere maal buitengewoon hoge. In het
eerste geval zouden, als ik een lagere concentratie had
gekozen, de uitkomsten onbruikbaar zijn geworden.

Ter verduidelijking van de wijze, waarop ik de activi-
teit van mijn praeparaten bepaalde, moge hier in tabel II
(zie blz. 20), een voorbeeld volgen.

Het gemiddelde van de standaardgroei is dus 487
dat van het gemeten praeparaat in de laagste concentra-
tie 125 %.

500

0,5 y veroorzaakt een groeitoeneming van:-X 125 =

48''7

129 %.

0,5y bevatten dus 1,29 E of:

1 g van het praeparaat komt overeen met 2.000.000 X
1,29 E = 2.580.000 E.

HOOFDSTUK IH.

Pogingen tot isolering van de groeifactoren.

Zoals I uit vele onderzoekingen van anderen reeds was
gebleken, is gistextract een uitstekend uitgangsmateriaal
voor de isolering van de groeifactoren voor bacteriën.

In het begin heb ik het gistextract zelf bereid. Het
bleek echter spoedig, dat het voordeliger was, gistextract
als zodanig uit de handel te betrekken. Ik heb even-
als B. C. J. G. K n i g h t „Marmitequot; gebruikt; 1 kg hier-
van komt volgens myn ervaring overeen met 20 kg gist.

,Daar B. C. J. G. K n i g h t in zijn eerste publicatie over
dit onderwerp reeds een aanzienlijke concentratie van de
groeifactoren bereikt had, ben ik begonnen dit voorschrift
na te werken. Natuurlijk heb ik de gang van de scheiding
in actief en inactief materiaal steeds gecontroleerd.

Na een voorproef met 2 kg „Marmitequot; was het al
duidelijk, dat ik met een veel grotere hoeveelheid uit-
gangsmateriaal moest beginnen, om een kans op isolering
van de groeifactoren te hebben.

In het kort zij hier de gevolgde werkwijze vermeld:

ƒ. Extractie met aethanol.

50 kg „Marmitequot; ( activiteit 10.000 E per gram) wer-
den in 4 gelijke porties verdeeld. Deze werden elk in 8 1
gedestilleerd water opgelost en gedurende 1 uur gekookt.
Aan de nog warme oplossing voegde ik, onder voortdu-
rend roeren, absolute aethanol toe, tot de vloeistof 75 %

aethanol bevatte. Nadat het neerslag bezonken was, de-
canteerde ik de bovenstaande vloeistof af, en behandelde
het praecipitaat, na verdunnen met 5 1 water, nog een-
maal met aethanol. De beide aethanoloplossingen werden
verenigd en in vacuo geconcentreerd tot een volume van
5 1. Op deze wijze verkreeg ik vier porties aethanolextract,
welke volgens een steekproef met 12 kg droge stof over-
eenkwamen.

Drooggewicht aethanolextract: 12 kg.

Activiteitnbsp;13.300 E per gram.

IL Extractie met n-butanol.

De geconcentreerde aethanolextracten werden met na-
triumcarbonaat alkalisch gemaakt t.o.v. lakmoes en ge-
durende 1 uur intensief met pas gedestilleerde butanol
(6 liter per portie) geroerd. In het alkalische milieu trad
zeer sterke emulsievorming op. Door centrifugeren kon
echter de butanoloplossing zuiver afgescheiden worden.
Het in n-butanol onoplosbare residu werd op dezelfde wijze
nog vier maal met dit oplosmiddel behandeld. Deze bu-
tanolextracten werden in vacuo tot telkens 2,5 1 gecon-
centreerd, waarbij ook het in de n-butanol opgeloste water
grotendeels verwijderd werd. De ingedampte oplossingen
werden in een ijs-zout-mengsel afgekoeld; het gevormde
neerslag, dat hoofdzakelijk uit anorganisch materiaal be-
stond, werd afgefiltreerd en nog drie maal met 500 cm®
kokende absolute aethanol uitgewassen, waarna de ver-
kregen aethanoloplossing met het butanolextract ver-
enigd werd.

IIL Vervanging van de n-butanol door aethanol.

Het butanol-aethanol-mengsel werd nu weer aan een

destillatie onder verminderde druk onderworpen. Door
telkens opnieuw met absolute aethanol te verdunnen en
opnieuw te destilleren kon langzamerhand alle butanol
verwijderd worden; het volume van één portie bedroeg
tenslotte 2 1. Na afkoelen in ijs en zout sloeg ook nu weer
hoofdzakelijk anorganisch materiaal neer, dat verwijderd
werd.

Drooggewicht van de fractie oplosbaar in absolute

aethanol: 1400 g.

Activiteitnbsp;35.800 E per gram.

IV.nbsp;Praecipitatie met sublimaat.

De volgens III verkregen extracten van twee porties
werden verenigd en in de koude met sublimaat behan-
deld. Daartoe werd aan de vloeistof (4 1) een verzadigde
oplossing van sublimaat in absolute aethanol (2 1) onder
voortdurend roeren langzaam toegevoegd. Nadat het meng-
sel 12 uren in de ijskast gestaan had, werd het neerslag
afgefiltreerd en verscheidene malen met koude absolute
aethanol uitgewassen. De kwikzouten in het filtraat wer-
den op de gebruikelijke wijze met zwavelwaterstof ont-
leed, en daarna verwijderd. Na verdrijven van de zwa-
velwaterstof met behulp van kooldioxyde en neutraliseren
met soda werd de aethanol afgedampt. De resterende
stroop werd nu in gedestilleerd water opgenomen, de op-
lossing door toevoegen van loog op p^ = 10 gebracht en
met pas gedestilleerde n-butanol geëxtraheerd.

V.nbsp;Extractie met n- H^SOi.

Het butanolextract werd met een zwavelzuuroplossing
(In) uitgeschud, waarbij de actieve stof in het zwavel-
zuur overging, terwijl donkerbruine verontreinigingen in

de butanol achterbleven. Het zure extract werd met soda
geneutraliseerd en daarna geconcentreerd. Na afkoelen
kristalliseerde uit de vloeistof tamelijk veel natriumsul-
faat uit. Dit werd afgefiltreerd en verscheidene malen
met absolute aethanol uitgewassen. Teneinde het reste-
rende natriumsulfaat zoveel mogelijk te verwijderen, werd
het filtraat nog met absolute aethanol behandeld, en het
neergeslagen zout opnieuw afgefiltreerd. Tenslotte heb
ik de filtraten en wasvloeistoffen verenigd en ingedampt,
waarna een lichtgeel gekleurde stroop achterbleef.

Drooggewicht residu: 110 g.

Activiteit:nbsp;91.800 E per gram.

VI. Praecipitatie met sublimaat.

Bij de opwerking volgens Knight zou nu het mate-
riaal aan een destillatie in hoogvacuum onderworpen moe-
ten worden. Bij een voorproef bleek mij echter, dat de
activiteit van het destillaat (100.800 E per g) niet veel
beter was dan die van het uitgangsproduct (91.800 E per
g). Het leek daarom gewenst, de destillatie uit te stellen
en eerst te trachten, door middel van neerslagen met zou-
ten van zware metalen, respectievelijk alcaloïdreagentia
een verdere zuivering te bereiken. In tabel Hl (zie blz. 26)
is aangegeven, in welke gevallen een neerslag optreedt.

Een voorproef toonde aan, dat door sublimaat in wa-
terige oplossing inactieve stoffen werden neergeslagen en
dat dus op deze wijze een verdere concentrering bereikt
kon worden.

Aan een oplossing van de in trap V verkregen stroop
in water (10 %) voegde ik een even groot volume ver-
zadigde sublimaatoplossing (in water) toe en filtreerde
daarna het gevormde neerslag af. Neerslag en filtraat

werden op de gewone wijze ontleed en het bleek inder-
daad, dat alleen het filtraat actief was. De na indampen
verkregen stroop behandelde ik met absolute aethanol,
teneinde het organische materiaal zo goed mogelijk van
keukenzout te bevrijden.

Drooggewicht residu: 58,9 g.

Activiteit:nbsp;150.300 E per gram.

Tabel III

VII. Praecipitatie met flaviaanzuur (2,i-dinitro-l, naph-
tol-7-sulf onzuur).

Er werd nu nagegaan, of ook de andere in tabel III
vermelde neerslagen voor de verdere zuivering te gebrui-
ken waren. Daarnaast werden dezelfde proeven ook in
aethanolisch milieu uitgevoerd.

In tabel IV is aangegeven, in welke gevallen een neer-
slag optrad.

Tabel IV

,De behandeling met flaviaanzuur leek, wat quantiteit
en kristallisatievermogen van het verkregen neerslag be-
trof, veel gunstiger dan die met de andere reagentia, en
reeds bij een voorproef bleek, dat de activiteit op deze
wijze sterk was op te voeren: bij deze bewerking kreeg
ik uit 112 mg een residu van 15 mg, dat nog gedeeltelijk
anorganisch materiaal bevatte en dat, zoals de test uit-
wees, de verrassend hoge activiteit van 2.600.000 E per
gram bezat. Het verloop van de proef was als volgt: aan
112 mg van het in trap VI verkregen product, opgelost
in 3 cm® absolute aethanol, werd een overmaat van een
verzadigde flaviaanzuur-oplossing (eveneens in aethanol)
toegevoegd. Er ontstond onmiddellijk een oranjerood
kristallijn neerslag. Nadat het mengsel 24 uren in de
koelkast had gestaan, werd het neerslag afgefiltreerd, drie

maal met absolute aethanol uitgewassen, gedroogd en
daarna in gedestilleerd water opgelost, met enige drup-
pels n-HCl aangezuurd en onder verwarming met wol
ontleed®®). De kleurloze oplossing werd geneutraliseerd
en in vacuo ingedampt.

Daar het flavianaat zich uit een vrij verdunde oplos-
sing in fraaie oranjerode naaldjes afscheidde, leek het
niet waarschijnlijk, dat het nog veel verontreinigingen
zou bevatten. Om dit uit te maken heb ik het flavianaat
2 X uit een aethanol-watermengsel (1:1) omgekristalli-
seerd, en daarna telkens een aliquoot gedeelte met wol
ontleed en getest. Inderdaad veranderde de activiteit door
omkristalliseeren — de foutengrens van 10 % in aanmer-
king genomen — practisch niet. Na 1 x omkristalliseren
bedroeg de activiteit 3.200.000 E per gram, na 2 x res-
pectievelijk 3.300.000 E en 3.400.000 E per gram.

Bij de analyse bleek echter, dat de verbinding ten dele
uit anorganisch materiaal bestond. Er werd een asgehalte
van 15,9 % gevonden.

In de as, welke geheel in water oplosbaar was, kon ik
calcium- en phosphaationen aantonen. Een test wees uit,
dat zowel de gloeirest als calciumphosphaat physiologisch
onwerkzaam waren. Een gedeeltelijke scheiding van de
organische en anorganische stoffen kon ik verkrijgen
door het mengsel na de ontleding van het flavianaat met
absolute aethanol te behandelen. Het in aethanol oplos-
bare gedeelte had een activiteit van 10.200.000 E per
gram, terwijl de in absolute aethanol onoplosbare stof
onwerkzaam was. Met de reeds genoemde reagentia ont-
stonden de in tabel V vermelde neerslagen.

De behandeling met flaviaanzuur heeft niet alleen een
grote stijging van de activiteit tengevolge (van 150.000

29
Tabel V

E per gram tot 10.200.000 E per gram), maar daaren-
boven ook een schijnbare toeneming van de absolute hoe-
veelheid aan actieve stof, wat bij de daarop volgende op-
werking van een grotere hoeveelheid nog treffender was:
hierbij werden 59 g van het product uit trap VI op de-
zelfde wijze met flaviaanzuur behandeld, waardoor 3,21
g ruw flavianaat verkregen werd. Na éénmaal omkris-
talliseren uit een aethanol-watermengsel (1:1) bedroeg
de activiteit van het ontlede product 4.800.000 E per gram.

Uit een voorproefje met 82 mg van dit product bleek,
dat een betere scheiding van de organische en anorgani-
sche bestanddelen verkregen kon worden door de stroop,
welke na ontleding met wol achterbleef te behandelen met
een mengsel van absolute aethanol en benzeen (2:1). De
activiteit werd hierdoor vertienvoudigd.

Uit 82 mg flavianaat kreeg ik 34,8 mg stroop met een
totale activiteit van 170.600 E. Het gewicht van het residu

na de behandeling me het aethanol-benzeen-mengsel be-
droeg 16,8 mg, terwijl de activiteit gestegen was tot
50.000.000 E per gram. Deze hoeveelheid bevatte dus
840.000 E. Dit is een opbrengst van 500 %.

De oplossing van de as bevatte Ca- en phosphaationen en
was wederom physiologisch onwerkzaam. Zoals te ver-
wachten was, had toevoeging van calciumphosphaat geen
invloed op de groei van Staphylococcus aureus. De schijn-
bare toeneming van het actieve materiaal is moeilijk te
verklaren. De eerste veronderstelling zou kunnen zijn, dat
met de anorganische fractie bestanddelen verwijderd zijn,
welke op de bacteriën toxisch werkten, en op deze wijze
gedurende de hele opwerking de activiteit geremd hebben.

Als tweede verklaring zou men kunnen aannemen, dat
het ruwe product inactieve stoffen bevat, welke door de
behandeling met flaviaanzuur in actief materiaal worden
omgezet. Zo zou bijvoorbeeld een inactieve dihydro-ver-
binding door het flaviaanzuur tot de actieve stof gedehy-
dreerd kunnen worden. Helaas was het niet mogelijk, deze
theorie nader aan de feiten te toetsen.

Drooggewicht stroop: 568 mg.

Activiteit:nbsp;50.000.000 E per gram.

VIII. Destillatie hij verminderde druk.

Terwijl de destillatie in vacuo in een vroeger stadium
geen gunstig resultaat bleek op te leveren, leek nu de zui-
vering van de praeparaten zover gevorderd, dat deze be-
werking met succes kon worden toegepast. De eerste des-
tillaties voerde ik uit in een klein retort je, zoals is aan-
gegeven door F. Kögl en B. Tonnis®®), en wel bij
een druk van 0,001 mm. Er werden drie fracties opgevan-
gen. In tabel VI is het resultaat van de destillatie vermeld.

Tabel VI

De kleurloze olieachtige destillaten werden verenigd en
in een aceton-kooolzuur-mengsel afgekoeld. Na een dag
staan had zich daarin een geringe hoeveelheid fraaie
kleurloze kristallen afgescheiden.

Met de reeds genoemde reagentia ontstonden de in tabel
VII vermelde neerslagen.

Tabel VII

Helaas is een groot gedeelte van dit kostbare, zeer ac-
tieve praeparaat verongelukt. Bovendien was ik door
omstandigheden gedwongen, het practische werk geduren-
de enkele maanden te onderbreken.

Na deze periode werd de herhaling van de in dit hoofd-
stuk beschreven opwerking overbodig, doordat juist in
dit stadium belangrijke publicaties van B. C. J. G.
Knight verschenen, waarin deze mededeelde, dat de
combinatie van nicotinezuur en aneurine de groei van
Staphylococcus aureus in sterke mate bevorderde. Dit
had natuurlijk invloed op de verdere richting van mijn
onderzoek. Behalve dat de resultaten van Knight be-
vestigd behoorden te worden, moest vooral nagegaan
worden, of de werkzaamheid van de actieve destillaten
uitsluitend door nicotinezuur en aneurine veroorzaakt
werd.

Zoals in het volgende hoofdstuk aangetoond zal worden,
speelt bij de groei van Staphylococcus aureus behalve de
reeds genoemde factoren, ook nog biotine een rol.

SCHEMA VAN DE OPWERKING VAN „MARMITE'

Marmite, 50 kg, 10000 E/g.

abs. C-2H5OH tot 75%
opkoken met H2O, 1 utir

filtraat, 13300 E/g

alkalisch op lakmoes
extractie C4H9OH

Butanolfractie, 35800 E/g

C4H9OH vervangen door abs. C2H5OH
(Residu van 25 kg marmite in vol. v.
4 1 neerslaan met 2 1 HgCk
verzadigde absolute C2H5OH) _

Oplossing

Hg verwijderen met HaS, H2S verw. CO2

Hg vrij ^jjgjj^pgjj^ opnemen in H2O, alkalisch tot ph =10
uitschudden met C4H9OH _

Butanolopl.

I uitschudden met H2SO4

H2S04-oplossing

neutraliseren met Na2C03, mdampen,
Na2S04 filtreren

stroop, 110 g (uit 50 kg marmite)

91.800E/g ^ ,
in vol. van 1,1 1 neerslaan met evengroot vol.
verzadigde HgCk-opl.nbsp;_

Hg verwijderen met H2S, H2S verwijderen, neu-
traliseren met NaaCOs, indampen_

stroop, 58,9 g., 150.300 E/g

opnemen in abs. aethanol, neerslaan met flavi-
aanzuur in aethanol opl.

flavianaat, 4.800.000 E/g

ontleden met wol, behandelen met abs. benzeen-
aethanol 1 : 2

oplosbaar, 50.000.000 E/gnbsp;onoplosbaar

hoogvacuumdest. badtemp. 130-145°, residu;
druk 0.001 nwnnbsp;bevat Ca-phosphaat

residu
(inactief)

stroop; na koelen in aceton-C02 kristallen
200.000.000E/g

HOOFDSTUK IV.

Aneurine, nicotinezuur cn biotine als groei-
bcvorderende factoren.

In een in 1937 verschenen publicatie deelde B. C. J.
G. Knight mede, dat nicotinezuur (of het nicotine-
zuur-amide) tot in een concentratie van 0,005 y per cm® de
groei van Staphylococcus aureus bevorderde, indien de
bacterie gekvsreekt vi^erd op een voedingsbodem, welke als
stikstofbron behalve cystine, tyrosine en tryptophaan ook
gehydrolyseerde gelatine bevatte¹).

Nicotinezuur (respectievelijk nicotinezuuramide) was
echter niet actief, indien het aan de zuiver synthetische
voedingsbodem van P. Fildes, G. M. Richardson,
B. C. J. G. Knight en G. P. Gladstonequot;) werd
toegevoegd.

Het is niet mogelijk op deze voedingsbodem, welke be-
halve anorganische zouten en glucose een hele reeks be-
kende synthetisch bereide aminozuren bevat, Staphylococ-
cus aureus te kweken zonder groeifactoren toe te voegen.
Nu was echter het destillaat, dat Knight verkregen
had, op deze synthetische voedingsbodem wel werkzaam.
Hieruit concludeerde deze onderzoeker, dat zowel in het

1nbsp; In een recente publicatie deelde J. H. MuellerSS) „lede, dat
nicotinezuur één van de groeifactoren van C. diphteriae is '

destillaat, als in de gehydrolyseerde gelatine nog meer
groeifactoren aanwezig zouden zijn.

Zoals in hoofdstuk I al vermeld is, speelt aneurine een
rol als groeifactor van bepaalde gistrassen. Eind 1936
verscheen een publicatie van E. L. T a t u m, H. G. W o o d
en W. H. Peterson®®), waarin medegedeeld werd, dat
dit vitamine een groeibevorderende factor is voor Pro-
■pionïbacterium pentosaceum.

Terwijl nu aneurine op zichzelf geen invloed heeft op
de groei van Staphylococcus aureus, heeft Knight ge-
constateerd, dat het in combinatie met nicotinezuur wel
degelijk een groeieffect veroorzaakt. Bij tegenwoordig-
heid van de twee genoemde stoffen bleek, dat Staphylo-
coccus aureus op de genoemde synthetische voedings-
bodem een aanzienlijke groei vertoonde.

Wij werden voor het eerst met dit belangrijke feit in
kennis gesteld door een particulier schrijven van Dr. B.
C. J. G. Knight.

In de een maand later verschenen publicatie deelde
B. C. J. G. K n i g h t nog eenige nadere bijzonderheden
mee. Terwijl K n i g h t's destillaat in een concentratie van
20 y per cm® een sterke groeibevorderende werking ver-
toonde („gave an abundant growthquot;) werd dit effect reeds
verkregen-, wanneer aneurine en nicotinezuur respectieve-
lijk in concentraties van 0,02 y en 2 y per 10 cm® voedings-
oplossing waren toegevoegd.

Nadere gegevens over het percentage van de groei-
toeneming en over de drempelwaarde van de activiteiten
waren op dit tijdstip nog niet bekend.

Het aneurine is uit een thiazol- en een pyrimidine-helft
opgebouwd; twee delen, welke bij de afbraak en ook bij
de synthese een grote rol hebben gespeeld.

N3=4C-NH2
H3C-C2 5C-CH2-NH,
N 1—6 CH

4-amino-5-aminomethyl-
2-methyl-pyrimidine
I

N=C-NH,

HoC—C

HC 2—1 S

5C-CH2—CH^OH
■3_4C

I

CH3

4-methyl, S-^hydroxy-
aethyl-thiazol
II

HC—S

I

C—CH2-CH,0H
il

—c

Cl. CH3
aneurine-chloride
III

In een zeer recente onderzoeking van Knight®»)
v^erd nagegaan, of Staphylococcus aureus eveneens in staat
zou zijn, aneurine uit deze twee verbindingen op te bou-
wen. Inderdaad bleek dit het geval te zijn. Ook is geble-
ken, dat, wanneer bijvoorbeeld in de pyrimidine-ring in
de positie 4 de aminogroep door een hydroxylgroep ver-
vangen wordt, de activiteit verloren gaat. Het organisme
is dus niet in staat op de 4-plaats een hydroxylgroep
door een aminogroep te substitueren. Het is dus ook niet
meer verwonderlijk, dat een pyrimidine-verbinding, waar-
bij in positie 2 inplaats van een methylgroep een hydro-
xylgroep staat, evenmin door het micro-organisme ge-

bruikt kan worden om samen met het thiazol een actieve

stof op te bouwen.

Na de hervatting van mijn werk was het eerste, wat
op mijn weg lag, na te gaan in hoeverre de door K n i g h t
gevonden resultaten ook op dit laboratorium bevestigd
konden worden.

Zoals in hoofdstuk II vermeld is, gebruikte ik voor
mijn onderzoekingen eveneens de voedingsbodem, welke
gehydrolyseerde gelatine bevatte. Het bleek onmiddellijk,
dat, zowel nicotinezuur, als het nicotinezuuramide in een
concentratie van 0,005 y — 5 7 per cm' inactief waren.
Blijkbaar bevatte dus mijn gehydrolyseerde gelatine geen
aneurine, respectievelijk afbraakproducten van dit vita-
mine.

Ik heb vervolgens nagegaan, of nicotinezuur en aneu-
rine samen even werkzaam waren als mijn actiefste prae-
paraten, welke door middel van een destillatie bij 0,001
mm. verkregen waren. Te dien einde heb ik de combi-
natie aneurine en nicotinezuur elk in concentraties van
0,005 7 — 5 7 per cm® aan de voedingsbodem toegevoegd.

' De tabel VII vat de uitkomsten van mijn proeven

samen.

Tab. VII

Ofschoon er dus geen twijfel meer bestond, dat nico-
tinezuur en aneurine twee groeifactoren zijn, welke
Staphylococcus aureus in staat stellen, op synthetische
voedingsbodems te groeien, bleef toch nog de vraag open,
of bovendien niet nog één of meerdere andere factoren
mede een rol spelen.

Inderdaad schenen enige verkregen resultaten in die
richting te wijzen. Ik had namelijk met de rest van mijn
actiefste praeparaat een zogenaamde moleculairdestil-
latie¹) uitgevoerd, waarbij vier fracties bij een badtem-
peratuur van 50°, 75°, 100° en 125° werden opgevangen
(tabel VIII).

Tab. VIII

De vier fracties werden afzonderlijk en in combinatie
getest, waarbij de fracties in gelijke, in de eerste kolom
vermelde concentraties werden toegevoegd. (Tabel IX).

1nbsp; Ik kon hierbij gebruik maken van een op dit laboratorium door
den heer L. Pons uitgewerkt apparaat, dat in diens dissertatie
beschreven zal worden.

39
Tab. IX

Het residu was inactief.

Wanneer men de, met de laagste concentratie van
aneurine en nicotinezuur, verkregen groeitoeneming ver-
gelijkt met de groei, veroorzaakt door de laagste concen-
tratie van de vier destillaten, valt het direct op, dat vooral
bij de vierde fractie de groeitoeneming relatief hoger is.

Het was daarom niet onwaarschijnlijk, dat inderdaad
nog een derde component deel uit zou maken van dit com-
plex. Daar in gist — het uitgangsmateriaal voor de isole-
ring van deze groeifactoren — biotine voorkomt, was het
niet onmogelijk, dat deze verbinding de derde factor zou
zijn. Inderdaad bleek bij een oriënterende proef, biotine
— bij aanwezigheid van aneurine en nicotinezuur — een
sterke groeibevorderende werking te hebben.

Bij drie componenten wordt het aantal mogelijkheden,
wat de onderlinge verhouding van de hoeveelheid der drie
factoren betreft, zeer groot.

Slechts enkele van de mogelijke combinaties konden
onderzocht worden.

In de tabellen X en XI zyn de resultaten van vier tes-
ten vermeld. In tabel X is de concentratie van biotine de

variabele factor, terwijl de concentraties van aneurine en
nicotinezuur constant gehouden zijn; in tabel XI blijft de
concentratie van biotine en nicotinezuur constant, en die
van aneurine variëert.

Voor de test gebruikte ik steeds de gekristalliseerde
biotine-methylester, welke mij door den heer L. Pons
welwillend ter beschikking was gesteld. Klaarblijkelijk

Tabel X

wordt de methylester in de micro-organismen gemakkelijk
gehydrolyseerd. In elk geval is tot nu toe bij gist geen
verschil geconstateerd in de werkzaamheid van de ester
en van het vrije zuur. Waar in het vervolg van biotine

T'

c
ö

èOO

700

600

500

'lOO

300

XOO

100

_L

0,005ï 0,05ï

Fig. II.

Groeicurve bij toenemende concentraties van
A(neurine) en N(icotinezuur) (C^ = C^)
Groeicurve bij C^^ = Cjj = 0.05 y/cm® en bio-
tine in stijgende concentraties.

Groeicurve bij C^ = Cfj = 5 y/cm® en bio-
tine in stijgende concentraties.

sprake is, wordt steeds de biotine-methylester bedoeld.

De invloed van biotine is, zoals uit bovenstaande cijfers
blijkt, zeer groot. Bij een concentratie van aneurine en
nicotinezuur elk van 0,05 y per cm® bedraagt de groeitoe-
neming 170 %, terwijl toevoeging van slechts 0,005 y
biotine per cm® dit bedrag tot 700 % doet stijgen.

In de grafiek (Fig. II), waarin de cijfers van tabel X
verwerkt zijn, komt de invloed van het biotine nog spre-
kender uit.

Zoals te verwachten was, is het effect van biotine zon-
der de aanwezigheid van de andere factoren aanzienlijk
kleiner. Ik heb biotine-methylester in concentraties van
0,000004 y tot 0,4 y per cm® getest en kreeg over de hele
linie een groeitoeneming, die — de foutengrens in aanmer-
king genomen — gelyk was en 100 % bedroeg (tabel XII).

Tabel XII

Gezien het feit, dat zowel nicotinezuur als aneurine af-
zonderlijk toegediend geen groei veroorzaken, is het ver-
rassend, dat biotine alleen wel degelijk groei veroorzaakt.
Waarschijnlijk is biotine alleen niet, of zeer weinig

werkzaam. Dat er toch nog een vrij aanzienlijke groei op-
treedt, vindt misschien zijn oorzaak hierin, dat de bac-
teriën een kleine hoeveelheid aneurine en nicotinezuur be-
vatten, welke uit de agarvoedingsbodem is opgenomen.
Deze bevat behalve agar ook pepton en vleesextract. Voor-
al in dit laatste zullen de twee genoemde factoren in meer-
dere of mindere mate voorkomen en men mag veronder-
stellen, dat in het entmateriaal op deze wijze kleine hoe-
veelheden aanwezig zijn.

In een volgende reeks proeven werd bij een constante
concentratie van nicotinezuur (5 y per cm®) de invloed
van variërende concentraties biotine onderzocht (van 0,002
y tot 0,1 y per cm®) (tabel XIII).

Tabel XIII

Ook de combinaties van aneurine (0,005 y tot 5 y per
cm®) met biotine (in concentraties van 0,000004 y en
0,00004 y per cm®) heb ik op hun werkzaamheid onder-
zócht (tabel XIV).

Tabel XIV

De combinatie biotine-nicotinezuur is dus 3 — 4 maal
zo actief als die van biotine-aneurine.

SLOTBESCHOUWING.

Volgens de in het laatste hoofdstuk vermelde onderzoe-
kingen werden de resultaten van B. C. J. G. Knight,
volgens welke nicotinezuur (nicotinezuuramide) en aneu-
rine (vitamine Bi) belangrijke groeifactoren voor Staphy-
lococcus aureus zijn, bevestigd.

Terwijl B. C. J. G. K n i g h t bij zijn onderzoek de groei
alleen door visuele schatting bepaalde, kon bij mijn proe-
ven, met behulp van de in hoofdstuk II beschreven meet-
methode, de bereikte groei quantitatief bepaald worden.

Het feit, dat aneurine en nicotinezuur bij Staphylococ-
cus aureus en — zoals het zich aan laat zien — ook bij
andere micro-organismen als groeistoffen fungeren, is

van grote betekenis.

Door recente onderzoekingen van O. W a r b u r g quot;) en
H. V O n E u 1 e r quot;) is aangetoond, dat nicotinezuuramide
een deel uitmaakt van de zogenaamde „Wirkungsgruppequot;
van de cozymase („di-phospho-pyridine-nucleotidequot; of „co-
dehydrase Iquot; (IV) en ook van de „co-dehydrase Uquot; („tri-
phospho-pyridine-nucleotidequot;).

H^N—C=iN
N-C CH

CONII^nbsp;—

I Vnbsp;Onbsp;OHnbsp;CH

/ \ N—Pentose—O—P—O—P—O— Pentose —N—C—

O O
IV

Terwijl deze co-enzymen in samenwerking met de spe-
cifieke proteïnen dienst doen als overdragers van water-
stof, speelt een derivaat van aneurine een rol bij de om-
zetting van pyrodruivenzuur tot aceetaldehyde. Door
zeer recente onderzoekingen van K. Lohmann en
P h. S c h u s t e r weet men namelijk, dat de cocar-
boxylase identiek is met de pyrophosphorzure ester van
aneurine.

Er is dus nu in twee gevallen een verband gelegd tussen
groeistoffen en „Wirkungsgruppequot; van een ferment, wat
uit de aard der zaak een grote verdieping van ons inzicht
in het chemisme van de groei betekent. Natuurlijk mogen
deze resultaten niet zonder meer gegeneraliseerd worden.

Het belangrijkste resultaat van dit proefschrift is de
vaststelling van het feit, dat behalve aneurine en nicotine-
zuur ook het door F. K ö g 1, B. T ö n n i s en L. P o n s ge-
isoleerde en gekarakteriseerde biotine één van de groei-
factoren voor Staphylococcus aureus is. Het zal de taak
van toekomstige onderzoekingen zijn na te gaan, of dit
„phytohormoonquot; ook bij de groei van andere bacterie-
soorten mede een rol speelt.

Voorlopig is het niet bekend, of de biologische reactie
van het biotine ook met een bepaalde fermentwerking sa-
menhangt. De drempelwaarde van zijn werkzaamheid ligt,
volgens onderzoekingen van F. Kögl en medewerkers,
voor het gistras M bij de verdunning van 1:400.000.000.000
en voor Nematospora gossypii bij een verdunning van
1:250.000.000.000.

Bij Staphylococcus aureus werd in dit proefschrift met
de concentratie van 0,000004 y per cm®, d.i. een verdun-
ning van 1:250.000.000.000, zonder toevoeging van de
andere factoren nog een groeitoeneming van 90 % be-
reikt, zodat ook hier de drempelwaarde dezelfde is.

AANHANGSEL.

Over de groeifactoren van Aspergillus niger.

In de laatste jaren zijn verschillende publicaties van
N. Nielsen en V. Hartelius verschenen, welke zich
bezig hielden met de bestudering van de groeibevorderen-
de factoren van Aspergillus niger.

N. N i e 1 s e n vond dat een voedingsoplossing, waar-
op Rhizopus suinus gekweekt was, stoffen bevatte, welke
zowel de groei van de avenacoleoptile, als de productie
van celmateriaal bij gist en Aspergillus niger bevorderden.
Hij vatte deze stoffen samen onder de naam „Rhizopinquot;.

Later vond hij, dat „Rhizopinquot; bestond uit de
„Wuchsstoffe Aquot;, welke in aether oplosbaar zijn en ge-
makkelijk geoxydeerd kunnen worden, en de „Wuchsstof-
fe Bquot;, welke bestand zijn tegen oxydatie. De „Wuchsstoff
Aquot; is gekenmerkt door de werking op de avenacoleop-
tile en is — naar ons weten — identiek met /3-indolyl-
azijnzuur®%™). „Wuchsstoff Bquot; stimuleert de groei van
Aspergillus niger en van gist.

Ten aanzien van het ontstaan van „Wuchsstoff Bquot; ver-
melden N. Nielsen en V. Hartelius verschillende
merkwaardige feiten; in het jaar 1932 schreven zij:

„Die hier mitgeteilten Untersuchungen haben gezeigt,
dass man auf rein chemischem Wege einen Wuchsstoff
darstellen kann, der die Trockensubstanzproduktion von
Aspergillus niger befördert. Dieser Wuchsstoff bildet
sich, wenn Zuckerarten mit verschiedenen organischen

Säuren oder deren Ammoniumsalzen erwärmt werden.
Eine notwendige Bedingung für die Wuchsstoffbildung
ist die Anwesenheit von Filtrierpapier. Dieses ist wirk-
sam auf Grund seines Gehalts an gewissen unverbrenn-
lichen Substanzen. Auf Grund dieser Untersuchungen
muss angenommen werden, dass der betreffende Wuchs-
stoff stickstoffrei ist.quot;

Een jaar daarop komen ze tot de volgende conclusie ®®):
„Filtrierpapier wirkt nicht, wie früher angenommen
wurde, als Katalysator bei der Bildung von Wuchsstoff
B. Diese Substanz bildet sich beim Erwärmen von Zucker
mit gewissen organischen Säuren oder deren Ammo-
niumsalzen, auch wenn kein Filtrierpapier anwesend
ist. Das Filtrierpapier wirkt dagegen als Co-Wuchsstoff,
d. h. der Wuchsstoff B ist nur schwach wirksam, wenn
der Nährlösung nicht gleichzeitig gewisse aus dem Fil-
trierpapier stammende Stoffe zugeführt werden. Das
Filtrierpapier selbst hat keinen, oder nur ganz schwa-
chen Einfluss auf die Trockensubstanzproduktion, wenn
nicht gleichzeitig Wuchsstoff B in der Lösung anwesend
ist.

Welche Stoffe die Wirkung des Filtrierpapieres ver-
ursachen, bleibt unentschieden. Möglicherweise ist es
eine Mischung von verschiedenen Metallen.

Auch Zink wirkt als Co-Wuchsstoff, sodass ein Zink-
zusatz die Wirkung des Wuchsstoffes B auf die Trocken-
substanzproduktion fördert. Zink scheint indessen auf
andere Weise zu wirken als Filtrierpapier, da die Wir-
kung einer optimalen Aschenmenge durch Zinkzusatz
weiter verstärkt wird.

Bei der Bildung von Wuchsstoff B auf biologischem
Wege durch Zucht von Rhizopus suinus ist der Einfluss

des Filtrierpapieres von gleicher Art wie bei der che-
mischen Wuchsstoffbildung. Wird Rhizopus suinus auf
Ammoniumtartrat-Glukose ohne Filtrierpapier gezogen,
so bildet sich zwar Wuchsstoff B, welcher jedoch nur
dann auf die Trockensubstanzproduktion von Aspergil-
lus niger wirken kann, wenn dem Präparat Filtrierpa-
pier oder ein Auszug aus Filterasche oder Zink zugesetzt
worden ist.quot;

In 1935 publiceerden N. Nielsen en V. Harte-
l i u s een nieuw onderzoek, waarbij zij gevonden had-
den, dat een mengsel van de chloriden van Ba, Be, Hg, Cr,
Ca, Zn, Cd, Cu, Mn, Co en Li een sterkere „Co-Wuchsstoff-
wirkungquot; vertoonde dan de as van filtreerpapier. Afzon-
derlijk waren de meeste metalen onwerkzaam. De invloed
van het filtreerpapier, respectievelijk de as, op de vor-
ming van een groeistof verklaren de auteurs daardoor,
dat de meeste der genoemde metalen hierin aanwezig
zouden zijn.

Voordat ik met mijn eigen onderzoek begon, hetwelk
ten doel had, de invloed van verschillende groeifactoren
op Aspergillus niger na te gaan, heb ik enige der boven-
genoemde proeven van N. Nielsen en V. Hartelius
nagewerkt.

Ik bereidde de „Rhizopinquot;-oplossing op de door Niel-
sen en Hartelius aangegeven wijze®®). Daartoe
kweekte ik de schimmel Rhizopus suinus, waarvan mij
een cultuur welwillend werd verstrekt door het Centraal-
bureau van Schimmelcultures te Baarn, op de volgende
voedingsbodem:

MgS04 7 aq.nbsp;P-a.nbsp;0,5 g

KH2PO4nbsp;puriss. 0,5 g

Glucosenbsp;P-a. anh. 10 g

NH^-tartraatnbsp;puriss. 10 g

FeClg-opl. (1 %)nbsp;10 druppels

Gedest. waternbsp;1000 cmquot;

Van deze oplossing werden telkens 25 cm® in Petrischa-
len (25 cm. diam.) gepipetteerd. Na toevoegen van twee
vellen filtreerpapier (Schleicher en Schüll No. 597) van
20 cm. doorsnede werden de schalen gedurende een half
uur bij 110° gesteriliseerd. Nadat de oplossingen geënt
waren met een sporensuspensie van Rhizopus suinus —
welke verkregen was door een mycelium met steriel water
te schudden — werd de schimmel 5 dagen bij 33° ge-
kweekt. Vervolgens werd de voedingsoplossing van het
mycelium en het filtreerpapier afgeperst en in vacuo tot
1/5 van het oorspronkelijke volume geconcentreerd. Ten-
einde de zo verkregen oplossing te steriliseren werd zij
door een steriel filter volgens Seitz gefiltreerd, waarna
ik de werkzaamheid van de vloeistof ten opzichte van de
groei van Aspergillus niger heb onderzocht.

Deze schimmel, Aspergillus niger v. T i e g h e m, even-
eens van het Centraalbureau voor Schimmelcultures af-
komstig, werd op de volgende, reeds door Nielsen en
Hartelius®®) beschreven voedingsbodem gekweekt:
MgS04 7 aqnbsp;p.a.nbsp;0,5 g

KH2PO4nbsp;puriss. 0,5 g

NH4NO3nbsp;„ 4 g

Glucosenbsp;p.a., anh. 10 g

FeClg-oplossing (1 %)nbsp;10 druppels

Gedest. waternbsp;1000 cm®

Telkens 200 cm® van deze oplossing werden in erlenmeyers
van 750 cm® gedurende Vz uur bij 110° gesteriliseerd.

De proeven voerde ik op de volgende wijze uit:

Er werden twaalf series, elk bestaande uit 20 erlen-

meyers, ingezet. Aan de ene helft van elke serie werd per
kolf 4 cm® van de ingedampte voedingsbodem van Rhizo-
pus suinus toegevoegd, terwijl de andere 10 erlenmeyers
van 4 cm® steriel water werden voorzien. Deze laatste dien-
den ter bepaling van de blancowaarde na afloop van de
proef.

Daarna entte ik alle kolven met 1 cm® sporensuspensie
van Aspergillus niger, welke ik verkregen had door een
mycelium van deze schimmel (een 4 dagen oude, rijkelijk
van sporen voorziene cultuur) met 200 cm® steriele voe-
dingsbodem te schudden. De culturen werden bij 33° ge-
kweekt.

De twaalf series dienden om na te gaan, in hoeverre
de productie van celmateriaal bij toediening van het „Rhi-
zopinquot; ook afhing van de kweektijd. Te dien einde werd,
te beginnen na 24 uren, telkens om de 12 uren een
serie afgebroken en het drooggewicht van de culturen
met en zonder toevoeging van Rhizopine bepaald. Na 36
uren heb ik om de 24 uren een serie voor de bepaling van
het drooggewicht gebruikt.

De mycelia werden door een glasfilter van de voedings-
oplossing afgefiltreerd, en met gedestilleerd water ge-
wassen, tot het waswater neutraal reageerde ten opzichte
van lakmoes. De mycelia werden daarna bij 105° tot con-
stant gewicht gedroogd.

In tabel XV zijn de gevonden resultaten samengevat.

De opgegeven gewichten zijn de gemiddelden van 10 be-
palingen. De fout is berekend volgens « = V n(ii—1)quot;'

waarin S de afwijking van elke bepaling van de gemid-
delde waarde en n het aantal bepalingen is.

De in de laatste kolom vermelde grootheid f geeft de
verhouding aan van het drooggewicht van een cultuur met
„Rhizopinquot; en die van een cultuur zonder „Rhizopinquot;
^^ gew. met „Rhizopinquot; ^

gew. zonder „Rhizopinquot;

Tabel XV

Uit de tabel blijkt duidelijk, dat de culturen bij toevoe-
ging van „Rhizopinquot; vooral in de loop van de eerste vier
dagen een grotere toeneming van het drooggewicht tonen
dan de controleculturen. Het quotiënt „fquot; heeft de grootste
waarde (2,74) na 36 uren bereikt, om dan in de loop der
volgende zes dagen geleidelijk tot 1 terug te lopen.

■ «•. \

36 «a 60 72 ö'* 96

___: Curve van het quotient f.

______ . Groeicurve van Aspergillus niger zonder toevoe-
ging van „groeifactorenquot;.

______: Groeicurve van Aspergillus niger met toevoeging

van „Rhizopinquot;.

De culturen met „Rhizopinquot; zijn echter, zonder voorbe-
houd, niet met de controleculturen te vergelijken. Door toe-
voeging van 4 cm® Rhizopinoplossing werd tegelijk een ze-
kere hoeveelheid voedingsstoffen in het substraat ge-
bracht, zodat dus de concentratie hiervan groter werd dan
die in de controlekolven. De mogelijkheid was niet uitge-
sloten, dat de aanwezigheid van meer voedingsstoffen ook
een vermeerdering van de groei tengevolge zou hebben.

Om dit na te gaan, dampte ik 1 1 van de voor het kweken
van Rhizopus suinus gebruikelijke voedingsbodem in vacuo
tot een volume van 200 cm® in. Deze oplossing werd op de-
zelfde wijze getest als hierboven reeds beschreven is.

Na 48 uren bedroeg het drooggewicht van de Aspergil-
lus niger-cultuur zonder enige toevoeging 0,462 g ± 0,006 g
en van de cultuur, waaraan de ingedampte voedingsbodem
was toegevoegd, 0,468 g ± 0,005 g. De hogere concen-
tratie heeft dus geen invloed op de groeivermeerdering.

(

Mijn resultaten vertoonden dus wel overeenkomst met
die van N. Nielsen en V. Hartelius. Ook ik vond,
dat door toevoeging van de „Rhizopinquot;-oplossing, Asper-
gillus niger sterker groeide, wat tot uiting kwam in de
toeneming van het drooggewicht van de mycelia. In beide
gevallen bereikte het quotiënt f na 36 uren het maximum,
maar terwijl dit bij N. Nielsen en V. Hartelius
bij 3,51 lag, bedroeg de overeenkomstige waarde bij mijn
proeven 2,74.

Door de boven vermelde onderzoekingen van N. N i e 1-
senenV. Hartelius was het waarschijnlijk gemaakt,
dat de factoren („Wuchsstoffe Bquot;), welke de groei van
Aspergillus niger beïnvloeden, ook werkzaam zijn bij de
vermeerdering van de gist.

Aangezien het bekend is, dat gist voor celvermeerde-
ring en plasmagroei de verschillende bios-factoren nodig
heeft, lag het voor de hand na te gaan, of de bij Asper-
gillus niger werkzame groeistof identiek was met één der
factoren van het bios-complex.

Te dien einde heb ik drie componenten hiervan op hun
werkzaamheid onderzocht:

1)nbsp;meso-inosiet

2)nbsp;biotine

3)nbsp;„Bios IHquot;.

E. V. Eastcott®) had voor het eerst aangetoond,
dat meso-inosiet identiek is met een der bios-factoren en
aan F. K ö g 1 en W. v. H a s s e 11 =gt;«) is het gelukt, deze
stof uit gist te isoleren.

Biotine is door F. K ö g 1 en medewerkers uit eigeel
in gekristalliseerde toestand verkregen en ook reeds ge-
karakteriseerd.

Van de factor III is tot nu toe nog weinig bekend; zelfs
is de mogelijkheid niet uitgesloten, dat men hier nog met
een complex van meerdere factoren te maken heeft.

Van deze drie factoren bezit het biotine de grootste
werkzaamheid; het oefent reeds in een verdunning van
1:400.000.000.000 een merkbare invloed uit op de groei
van gist, terwijl de twee andere factoren afzonderlijk pas
in veel hogere concentraties als groeistof fungeren.

Het was gewenst, de invloed van deze factoren op de
groei van Aspergillus niger, zowel afzonderlijk als in ver-
schillende combinaties, na te gaan.

I

Voor de proeven met biotine gebruikte ik een zeer ac-
tief praeparaat (basische halfester, activiteit 15.000.000
SE/g), hetwelk mij welwillend door den heer L. P o n s ter

hand was gesteld.

Het praeparaat van „Bios IIIquot; was een ingedampt
„koolfiltraatquot; zoals W. v. H a s s e 11 het in zijn dissertatie
^schreven heeft(activiteit: 50 y/g).

Ik heb de volgende series ingezet:
1) blanco

2)nbsp;1 mg meso-inosiet /lOO cm®

3)nbsp;biotine; 85 SE/100 cm®

4)nbsp;10 mg „Bios Hlquot; /lOO cm®

5)nbsp;1 mg meso-inosiet /lOO cm® biotine; 85 SE/100 cm®
6 1 mg meso-inosiet /lOO cm® 10 mg „Bios IIIquot;

/lOO cm®.

7)nbsp;biotine; 85 SE/100 cm® -f 10 mg „Bios IIIquot; /lOO cm®

8)nbsp;1 mg meso-inosiet /lOO cm® biotine; 85 SE/IOO
cm® 10 mg „Bios IIIquot; /lOO cm®.

De groeitijd bedroeg 48 uren.

Uit het volgende staatje blijkt, dat de toegevoegde fac-
toren in genoemde concentraties, zowel afzonderlijk als

Tabel XVI

Tabel XVII

Ol

in combinatie, de groei van Aspergillus niger niet beïn-
vloeden.

Vervolgens heb ik dezelfde combinaties der factoren in
grotere concentraties getest, namelijk:
meso-inosiet 10 mg/100 cm®
biotine 3000 SE/100 cm®
„Bios IIIquot; 100 mg/100 cm®

Bij deze proeven heb ik tegelijkertijd de invloed van
de kw^eektijd onderzocht, door de gewichten van de my-
celia na 48, 72 en 96 uren te bepalen.

Het bleek echter ook hierbij, dat het bios-complex slechts
een zeer gering effect op de vorming van celmateriaal heeft
(tabel XVH).

Van de drie factoren vertoont feitelijk alleen „Bios IIIquot;
een zeer zwakke werkzaamheid.

Ter bevestiging van deze resultaten heb ik proeven met
nog hogere concentraties van biotine uitgevoerd, echter
zonder een werkzaamheid van deze factor te kunnen con-
stateren. (tabel XVIII). De kweektijd bedroeg 48 uren.

Tabel XVIII

Het feit, dat de onderzochte bios-factoren voor Asper-
gillus niger niet de betekenis hebben van groeistoffen, is
in overeenstemming met een onlangs gepubliceerd onder-
zoek van N. Nielsen en V. Hartelius®^). Deze
auteurs komen tot de conclusie, dat de „Wuchsstoffe Bquot; in
twee groepen gesplitst moeten worden, nl. „Wuchsstoffe
Biquot;, welke op de celvermeerdering van gist invloed hebben

_en waarvoor dus in de overige literatuur sinds lang de

benaming bios-factoren, respectievelijk bios-complex ge-
bruikelijk is — en „Wuchsstoffe Baquot;, welke — slechts bij
aanwezigheid van metalen als „Co-Wuchsstoffequot; — de
groei van Aspergillus niger bevorderen.

W. H. S c h O p f e r heeft bij de schimmel Phycomy-
ces Blakesleeanus gevonden, dat aneurine een bijzonder
sterke groeibevorderende invloed heeft, zodat de auteur
voorstelt, deze schimmel als gevoelig testobject voor de
bepaling van aneurine te gebruiken. Dit feit gaf er aan-
leiding toe na te gaan, of misschien ook de groei van As-
pergillus niger gestimuleerd zou worden door toevoeging
van aneurine aan de voedingsbodem. Daar ik bij de proe-
ven over de invloed van het bios-complex gevonden had,
dat het meso-inosiet de groei, zij het ook in zeer geringe
mate, bevorderde, heb ik tevens de combinatie meso-ino-
siet aneurine getest. De gevolgde methodiek was ge-
lijk aan de hierboven reeds beschrevene. De broedtijd was

48 uren (tabel XIX).

De resultaten wezen uit, dat de groei van Aspergillus
niger door toediening van aneurine niet beïnvloed wordt.

In een volgende proef heb ik tenslotte nog nagegaan,
of de combinatie biotine (5y/100 cm®), meso-inosiet (20
mg/100 cm®) en aneurine (5 y/lOO cm®) misschien een be-

Tabel XIX

vordering van de groei tengevolge zou hebben. Uit de be-
paling na een kvsreektyd van 48 uren verkreeg ik voor f
de vs^aarde: f = 1,30. De grootte van het quotiënt f is hier
dus van dezelfde orde als die in de tabellen XVII en XVIII,
waar alleen meso-inosiet en biotine waren toegevoegd.
Onder de gegeven omstandigheden heeft aneurine dus
geen stimulerende invloed op de vermeerdering van cel-
materiaal bij Aspergillus niger.

Het is tot nu toe niet gelukt, voor Aspergillus niger een
specifieke groeistof aan te tonen, welke — in geringe
hoeveelheden toegediend — voor de celvermeerdering van
deze schimmel noodzakelijk is. De werkzaamheid van
de ruwe ,,Rhizopinquot;-oplossingen en van het eveneens nog
zeer onzuivere „Bios III' is nog geen bewijs voor de aan-
wezigheid van een echte groeifactor in deze extracten. In
een recente publicatie®^) hebben N. N i e 1 s e n en V. H a r-

telius meegedeeld, dat toevoeging van pyrodruiven-
zuur en glycolzuur aan de voedingsbodem een duidelijke
verhoging van het drooggewicht van Aspergillus niger
tengevolge heeft. Ook glyoxylzuur alleen, of in combinatie
met de twee genoemde stoffen, heeft een dergelijke in-
vloed. In dezelfde richting wijzen de reeds eerder be-
schreven proeven van deze auteurs, waarbij door verhitten
van de voedingsoplossing met organische zuren de „Wuchs-
stoffe Bquot; zouden ontstaan.

Weliswaar is het niet altijd mogelijk een scherpe grens
te trekken tussen de voor het organisme noodzakelijke voe-
dingsstoffen en de specifieke actieve stoffen, zoals , vita-
minen en hormonen. In dit geval echter moeten m.i. pyro-
druivenzuur, glycolzuur, enz. ongetwijfeld onder de nood-
zakelijke voedingsstoffen worden gerangschikt.

LITERATUURLIJST.

1.nbsp;H. Agulhon, R. Legrouxnbsp;:

2.nbsp;O. Baudischnbsp;:

3.nbsp;A. Borrel, A. de Coulon, L. Boez,

J. Quimardnbsp;:

4.nbsp;A. Borrel, L. Boez, A. de Coulon:

5.nbsp;A. Davidsonnbsp;:

6.nbsp;D. J. Davisnbsp;:

7.nbsp;D. J. Davisnbsp;:

8.nbsp;D. J. Davisnbsp;:

9.nbsp;E. V. Eastcottnbsp;:

10.nbsp;F. Eberson

11.nbsp;H. v. Euler, F. Schlenknbsp;:

12.nbsp;P. Fildesnbsp;:

13.nbsp;P. Fildesnbsp;:

14.nbsp;P. Fildesnbsp;:

15.nbsp;P. FÜdes, G. P. Gladstone,

B. C. J. G. Knightnbsp;:

16.nbsp;P. Fildes, G. M. Richardsonnbsp;:

17.nbsp;P. FUdes, G. M. Richardson.

B. C. J. G. Knight, G.P. Gladstone:

18.nbsp;M. Flacknbsp;:

19.nbsp;L. Freedman, C. Funknbsp;:

20.nbsp;L. Freedman, C. Funknbsp;:

21.nbsp;M. H. Gordon, T. G. M. Hinnenbsp;:

22.nbsp;G. A. C. Goughnbsp;:

23.nbsp;G. A. C. Goughnbsp;:

24.nbsp;W. V. Hasseltnbsp;:

25.nbsp;S. Hosoya, M. Kuroya

26.nbsp;A. Itano

27.nbsp;B. C. J. G. Knight

28.nbsp;B. C. J. G. Knightnbsp;:

29.nbsp;B. C. J. G. Knightnbsp;:

30.nbsp;B. C. J. G. Knightnbsp;:

31.nbsp;B. C. J. G. Knight, P. Fildesnbsp;:

32.nbsp;F. Köglnbsp;:

33.nbsp;F. Köglnbsp;:

34.nbsp;F. Kögl, D. G. F. R. Kostermans:

35.nbsp;F. Kögl, B. Tönnisnbsp;:

36.nbsp;F. Kögl, W. V. Hasseltnbsp;:

37.nbsp;D. G. F. R. Kostermansnbsp;:

38.nbsp;R. Legroux, J. Mesnardnbsp;:

Compt. rend. 167, 597 (1918).
Biochem. Z. 245, 278 (1932).

Compt. rend. Soc. Biol. 86, 388 (1922).

Compt. rend. Soc. Biol. 89, 191 (1923).

Biochem. Z. 150, 304 (1924).

J. inf. Dis. 21, 392 (1917)..

J. inf. Dis. 29, 171 (1921).

J. inf. Dis. 29, 187 (1921).

J. phys. chem. 32, 1094 U928).

J. Am. med. ass. 72, 852 (1919).

H. S. 246, 64 (1936).

Brit. J. exp. path. 2, 16 (1921).

Brit. J. exp. path. 4, 265 (1923).

Brit. J. exp. path. 5, 69 (1924).

Brit. J. exp. path. 14, 189 (1933).
Brit. J. exp. path. 16, 326 (1935).

Brit. J. ex. path. 17, 481 (1936).

Brit. med. J. 1916 II, 682.

J. metabol. Res. 1, 457 (1922).

J. metabol. Res. 1, 469 (1922).

Brit. med. J. 1916 II, 78.

Biochem. J. 26, 248 (1932).

Bioohem. J. 27, 1049 (1933).

Dissertatie Utrecht 1935, blz. 78—80.

C. 1925 11, 1051.

J. bact. 8, 483 (1923).

Brit. J. exp. path. 16, 315 (1935).

Nature 139, 628 (1937).

Biochem. J. 31, 731 (1937).

Biochem. J. 31, 966 (1937).

Brit. J. exp. path. 14, 112 (1933).

Ber. 68. 16 (1935).

Naturwiss. 23, 839 (1935).

H. S. 288, 113 (1934).

H.S. 242, 43 (1936).

H.S. 242, 74 (1936).

Dissertatie Utrecht 1935.

Compt. rend. 170, 901 (1920).

Biochem. Z. 131, 499 (1922).

Biochem. Z. 131, 512 (1922).

J. path. 21, 113 (1916).

Brit. med. J. 1916 H, 143.

Brit. med. J. 1917 I, 11.

Naturwiss. 25, 26 (1937).

Centr. Bakt. Parasitenk. I. Abt. Orig.

131, 289 (1934).
Centr. Bakt. Parasitenk. L Abt. Orig.

131, 291 (1934).
Verslag Akad. Wetenschappen, Am-
sterdam 28, 1001 (1919—1920).
J. bact. 7, 309 (1922).
J. bact. 7, 325 (1922).
J. biol. chem. 56, 158 (1923).
J. bact. 29, 383 (1935).
J. bact. 30, 513 (1935).
J. biol. chem. 120, 219 (1937).

J. bact. 25, 509 (1933).

H. S. 209, 207 (1932).

C. R. Lab. Carlsberg 19, No. 5 (1931).

C. R. Lab. Carlsberg 19, No. 8 (1932).

Biochem. Z. 256, 2 (1932).

Biochem. Z. 259, 340 (1933).

Biochem. Z. 276, 183 (1935).

Nature 138, 203 (1936).

C. R. Lab. Carlsberg 22, No. 1 (1937).

Biochem. J. 22, 443 (1928).

Biochem. J. 29, 2057 (1935).

Biochem. J. 22, 445 (1928).

Centr. Bakt. Parasitenk. I. Abt. Orig.

94, 94 (1925).
Z. Vitaminforschg. 4, 67 (1935).
Lancet 1917 I, 59.

; Biochem. J. 30, 1898 (1936).
: J. biol. chem. 109, 279 (1935).
: J. exp. med. 34, 97 (1921).
: J. exp. med. 34, 455 (1921).
: Centr. Bakt. Parasitenk. I. Abt. Orig.

14, 316 (1893).
: Centr. Bakt. Parasitenk. I. Abt. Orig.

21, 146 (1897).
: J. exp., med. 45, 993 (1927).
: Compt. rend. Soc. Biol. 112, 429 (1933),

Biochem. Z. 282, 157 (1935).

78.nbsp;L. T. Webster, O. Baudisch

79.nbsp;H. G. Wells, E. R. Long

80.nbsp;C. H. Werkman

81.nbsp;H. R. Whitehead

82.nbsp;H. R. Whitehead

83.nbsp;H. R. Whitehead

84.nbsp;E. Wildiers

85.nbsp;R. J. Williams, E. R. Roehm

J. exp. med. 42, 473 (1925).

The chemistry of tuberculosis 2nd ed.

1932, blz. 10.
J. bact. 14, 335 (1927).
Biochem. J. 17, 742 (1923).
Biochem. J. 18, 829 (1924).
Biochem. J. 20, 1147 (1926).
La Cellule 18, 313 (1901).
J. biol. chem. 87, 581 (1930).

L

STELLINGEN.

De bepaling van het oxydatie-aequivalent kan van grote
waarde zijn bij het onderzoek naar de constitutie van
biologisch belangrijke stoffen.

r. j. Williams, J. Am. Chem. Soc. 59, 288 (1937).

II

Uit de onderzoekingen van L. H. L e o n i a n en V. G.
Lilly mag niet de conclusie worden getrokken, dat he-
tero-auxine in het algemeen een remmende werking heeft
op de groei.

L. H. Leoni an, V. G. Lilly, Am. J. bot. 24, 133
(1937).

III

Het is niet zeker, dat het door Rosenheim en Star-
ling verkregen A®-cholesteen-diol (3,4) een „cisquot;-glycol is.

A. Butenandt, E. Hausmann, Ber. 70, 1154
(1937).

IV

De conclusie van P. H i d n e r t, dat antimoon tussen 20°
en 560° C. geen polymorfie zou vertonen, berust op zwak-
ke gronden.

P. Hidnert: J. Research National Bureau of Stan-
dards 14, 523 (1935).

J. L. Culbertson en L. L. Winter hebben niet
bewezen, dat de anomaliteiten, welke optreden bij de be-
paling van de dichtheden van poedervormige stoffen, toe
te schrijven zouden zijn aan de vermindering van de op-
pervlakte-energie, veroorzaakt door adsorptie.

J. L. Culbertson, L. L. Winter: J. Am. Chem.
Soc. 59, 308 (1937).'

VI

De onderzoekingen van G. I. Finch en medewerkers
maken het waarschijnlijk, dat de zogenaamde „B e i 1 b yquot;-
laag amorph is.

G.nbsp;I. F i n c h, A. G. Q u a r r e 11, H. W i 1 m a n: Trans.
Farad. Soc. 31, 1051 (1935).

H.nbsp;G. Hopkin s: Trans. Farad. Soc. 31, 1095 (1935).

C. S. Lees: Trans. Farad. Soc. 31, 1102 (1935).

G. I. F i n c h, H. W i 1 m a n: Trans. Farad. Soc. 33, 337
(1937).

VII

De vorming van antistoffen in de plant is waarschijn-
lijk gelijkwaardig aan die in het dierlijke organisme.

Th. Frémont, Ann. de 1 Institut Pasteur 58, 531
(1937).

- ï-^- ■

: ■ ' ». .'A s gt;

mim,'-

M

............

.A-;:

■^mmmMm

m

i

)

»-lyKVi-'

Jquot;

'. v '.vv

' 1, it
. J

■■■•s. v^''quot; gt;•■ ■-
quot; ? quot;t

Sii

'^îï

iiilWÄJfii«

mmmmiiêm.

m