TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT
OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS
Dr. J. BOEKE, HOOGLEERAAR IN DE FA-
CULTEIT DER GENEESKUNDE, VOLGENS
BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNIVER-
SITEIT TE VERDEDIGEN TEGEN DE BE-
DENKINGEN DER FACULTEIT DER WIS-
EN NATUURKUNDE OP MAANDAG 13 DE-
CEMBER 1937, DES NAMIDDAGS TE 4 UUR

	s -
^ «

Mjê

De voltooiing van dit proefschrift biedt mij een welkome
gelegenheid, U, Oud-Hoogleeraren, Hoogleeraren en Lectoren van
de Faculteit der Wis- en Natuurkunde, mijn hartelijken dank
uit te spreken voor alles wat gij tot mijne wetenschappelijke
opleiding heht bijgedragen.

Dit geldt natuurlijk in het bijzonder U, Hooggeleerde Kögl,
Hooggeachte Promotor, voor de voortdurende belangstelling
welke gij voor mijn werk hebt gehad. Dat ik nog eenigen tijd
als assistent onder Uwe wetenschappelijke leiding zal mogen
werken, stemt mij tot groote vreugde.

Verder dank ik al mijne collega's, die altijd bereid waren,
mij met raad en daad terzijde te staan en het personeel van het
Organisch-chemisch Laboratorium, waarvan ik steeds alle mede-
werking heb ondervonden.

Tot voor een tiental jaren was over de kleurstoffen der
krj^togamen nog zeer weinig bekend. In de oudere litteratuur
zijn slechts pogingen tot isoleering benevens sommige phy-
sische en chemische eigenschappen der onderzochte kleur-
stoffen beschreven 1).

Het systematisch onderzoek van deze verbindingen werd
in het jaar 1924 aangevat door F. Kögl en zijne medewerkers.
Deze auteurs hebben zich vooral bezig gehouden met de
studie van de kleurstoffen uit eenige algemeen bekende
paddestoelen.

Sedert 1930 zijn dan ook een reeks mededeelingen ver-
schenen van H. Raistrick en medewerkers en wel hebben
deze onderzoekers uit cultures van schimmels verschillende
stofwisselingsproducten en daaronder ook vele kleurstoffen
verkregen en bestudeerd.

Het eerste onderzoek van de school van F. Kögl houdt zich
bezig met atromentine, de kleurstof van PaxiUus
atrotomentosus Batsch., welke reeds in het jaar 1888 door
W. Thörner2) in gekristalliseerden vorm werd geïsoleerd.
F. Kögl en J. J. Postowsky^) bewezen voor deze chmon-
achtige verbinding de bruto-formule CigHiaOg. Bij destillatie
met zinkstof verkregen zij een koolwaterstof CigHii, welke

1) Zie voor oudere onderzoekingen: F. Czapek, Biochemie der
Pflanzen, Bd. III, S. 374, 2e druk; G. Fischer, Jena, 1921.

») F. Kögl en J. J. Postowsky, Ann. 440, 19 (1924); Ann. 445,
159 (1925); Ann. 465, 211 (1928).

geïdentificeerd kon worden als p-diphenylbenzol of terphenyl.
De oxydatie van atromentine gaf atromentinezuur (I), waar-
van de structuur een sterke gelijkenis vertoont met vulpine-
zuiuquot; (II) ¹). Deze verschillende waarnemingen hebben er toe
geleid aan atromentine de formule III toe te kennen.

De juistheid van deze formule kon dan ook door de S5m-
these, welke door F. Kögl en H. Becker ®) werd beschreven,
worden bewezen.

«) A. Spiegel, Ann. 219, 1 (1883); J. Volhard, Ann. 282, 1 (1894).
5) F. Kögl en H. Becker, Ann. 465, 243 (1928).

In 1925 publiceerde F. Kögl®) een onderzoek over het
polyporzuur. Deze verbinding is de kleurstof van een
bepaalde Polyporus-sooxi, welke aan zieke eiken groeit en
voor het eerst door C. Stahlschmidt') in het jaar 1877
geïsoleerd werd. F. Kögl heeft dezelfde kleurstof uit Polyporus
nidulans Pers. kunnen isoleeren en vond voor polyporzuur
de formule C18H12O4. Ook hier ontstond bij destillatie met
ïinkstof terphenyl en bij het verdere onderzoek bleek, dat
polj^orzuur identiek is met het synthetisch bereide 3,6-
dioxy-2,5-diphenyl-1,4-benzochinon (IV).

Eenige jaren later hebben F. Kögl en H. Erxleben ®)
in muscarufine, de roode kleurstof van de vliegen-
zwam {Amanita muscaria L.), nog een derde, in de natuur
voorkomend, derivaat van terphenyl gevonden.

Volgens hun onderzoekingen heeft muscarufine de samen-
stelling CjsHjgOg; het bevat een phenolische hydroxylgroep
en drie carboxylgroepen, de twee resteerende zuurstofatomen
behooren tot een chinonsysteem.

Een destillatie met zinkstof levert ook hier weer terphenyl.
Bij de katalytische hydreering neemt de kleurstof drie mol.

waterstof op, en door oxydatie van de gehydreerde verbinding
ontstaat naast adipinezuur ortho-phtaalzuur. De opbrengst
van het laatste zuur (1,4 mol.) wijst er op, dat het doorbelde
benzoïde ringen geleverd werd. Aan triacetyl-leuko-muscani-
fine kan maleïnezuuranhydride geaddeerd worden; deze
„diëen-synthesequot; doet vermoeden, dat een zijketen met twee
geconjugeerde dubbele bindingen aanwezig moet zijn. Dit
feitenmateriaal wordt verklaard door de volgende structuur-
formule (V) van muscarufine:

In tegenstelling tot de hier voor het eerst gevonden ter-
phenylverbindingen zijn onder de plantaardige kleurstoffen
reeds lang derivaten van anthraceen bekend.

2^als voor het eerst uit een onderzoeking van F. Kögl
en J. J. POSTOWSKY ») bleek, zijn ook de beide kleurstoffen
van Dermocybe sanguinea Wolf afgeleid van anthrachinon.

De gele verbinding uit deze paddestoel bleek identiek te
zijn met l,6,8-trioxy-3-methylanthrachinon, het e m o d i n e.
Voor dermocybine, de roode kleurstof, werd de for-
mule CjeHjaO, gevonden. Het bleek een tetra-oxy-methoxy-
jS-methylanthrachinon te zijn, waarbij echter de onderlinge
stand der diverse substituenten wegens gebrek aan materiaal
niet opgehelderd kon worden.

Een ander derivaat van het anthraceen werd in het
boletol, de kleurstof der blauw aardoopende boleten,
gevonden. Reeds Schönbein iquot;) heeft opgemerkt, dat de bij
het doorbreken van de paddestoelen optredende blauwe kleur
door de werking van enzymen ontstaat. Bertrand isoleer-
de uit verschillende boletensoorten een roode, chinonachtige
stof, welke hij boletol noemde. F. Kögl en W. B. Deys
verkregen het boletol uit Boletus satanas Lenz, B. luridus
Schaeff en B. hadius Fr.; zij vonden als formule van de
kleurstof CibHsO^. De stof bevat drie phenolische hydroxyl-
groepen benevens een carboxylgroep en heeft een chinoïde
structuur. Bij destillatie met zinkstof werd anthraceen ge-
vormd. Oxydatie gaf hemi-melliethzuur. Op grond van deze
en andere feiten stellen de onderzoekers de formules Vla
resp. VIb voor:

HOOC

ö OH

2[a

Boletol kon ook synthetisch bereid worden echter was
het ook langs dezen weg niet mogelijk tusschen de beide
genoemde formules te beslissen. De onderzoekers bewezen
voorts, dat de blauwe kleur, welke ontstaat bij het doorbreken

C. Schönbein, Phil. Mag. XI, 4e serie, 137 (1856).
quot;) G. Bertrand, Compt. rend. 124, 1355 (1897).
quot;) F. Kögl en W. B. Deys, Ann. 515, 10 (1935).
quot;) F. Kögl en W. B. Deys, Ann. 515, 23 (1935).

De tot nu toe behandelde kleurstoffen van paddestoelen
zijn derivaten van terphenyl of van anthraceen geweest. In
een derde groep bespreken wij nu het telephorzuur
en het xylindeïne, kleurstoffen, welke afgeleid zijn van
het phenanthreen. De kleurstof telephorzuur werd verkregen
uit Thelephora palmata Scop., Th. flabelliformis Fr., Th.
caryophyllea Schaeff, Th. terrestris Ehrh., Th. corraloïdes Fr.
e.a. De onderzoekingen over deze kleurstof door F. Kögl,
H. Erxleben en L. Janeckequot;) leidden voor telephorzuur
tot een formule CaoHjaOg. De stof heeft een chinoïde structuur
en bevat drie phenolische hydroxyl- benevens twee carboxyl-
groepen. Door de resultaten bij de afbraak verkregen, kon
de structuurformule VII in alle opzichten worden bewezen.

Xylindeïne, de malachietgroene kleurstof uit rottend hout
werd reeds in het jaar 1874 door Liebermann geïsoleerd.
De structuur van deze gecompliceerde kleurstof kon door
F. Kögl, G. von Taeuffenbach en H. Erxlebenquot;) niet

quot;) F. Kögl, H. Erxleben en L. Janecke, Ann. 482, 105 (1930).
16) C. Liebermann, B. 7, 1102 (1874).

!•) F. Kögl en G. v. Taeuffenbach, Ann. 445, 170 (1923).
F. Kögl en H. Erxleben, Ann. 484, 65 (1930).

geheel worden opgehelderd, alhoewel verschillende bijzonder-
heden van de structuur bekend werden. Xylindeïne heeft de
formule Cg^HasOn; het bevat Anier phenolische hydroxylgroe-
pen, zoomede twee enol-lactongroepen en heeft een chinoïde
structuur. Bij een „microzLnkstof-destillatiequot; ontstond in
goede opbrengst phenanthreen.

Na de onderzoekingen van F. Kögl en medewerkers
dienen vervolgens die van H. Raistrick en medewerkers te
worden genoemd. Als eerste schimmelkleurstof, welke door

H.nbsp;Raistrick en A. C. Hetherington i') onderzocht werd,
noem ik hier het citromycetine, hetwelk gevormd
wordt door Citromyces-soortea, wanneer deze gekweekt worden
op glucose-houdende media. Bij al hun onderzoekingen ge-
bruiken Raistrick e.m. de CzAPEK-Dox-voedingsbodem, welke
wat betreft de zouten, slechts in quantitatief opzicht ge-
variëerd werd.

Citromycetine heeft de formule C14H10O7. De stof bevat
twee hydroxylgroepen benevens een carboxylgroep en geeft
met broomwaterstof een zout. Een alkalische hydrolyse in
stikstofatmosfeer gaf als afbraakproducten aceton, azijnzuur
en 3,5,6-trioxyphtaalzuur. Wanneer echter de dimethoxy-
citromycetine-methylester op dezelfde manier behandeld
werd, ontstonden naast elkaar dimethoxy-oxy-methyl-y-
benzop5nron, azijnzuur en 4,5-dimethoxy-2-oxy-phtaalzuur-

I,6.nbsp;Op grond van deze afbraakreacties stellen Raistrick en
Hetherington de volgende formule (VHI) voor de kleur-
stof voor:

De functie van het zevende zuurstofatoom is nog niet
vastgesteld; bovendien dient rekening te worden gehouden

1') H. Raistrick en A. C. Hetherington, Phil. Trans. Roy.
Soc. London, serie B 220, 209 (1931).

met de afbraakproducten aceton en azijnzuur, welke afkom-
stig zullen zijn uit de nog onbekende rest (CjHsO).

Na dit onderzoek verscheen een mededeeling van H. Rai-
strick en J. H. Birkinshaw i®), waarin zij de kleurstof
beschrijven, welke zij geïsoleerd hebben uit soorten van
Pénicillium spinulosum. De kleurstof heeft de formule CgHgOj
en bevat twee phenolische hydroxylgroepen, een methoxyl-
groep en een chinoïd systeem. Op deze gronden bhjkt de kleur-
stof te zijn een dioxy-methoxy-toluchinon. De plaats der
verschillende substituenten is nog niet bekend.

Vervolgens onderzochten H. Raistrick en A. C. Hethe-
rington de kleurstof van Pénicillium citrinum Thom, welke
zij citrinine noemden. Zij vonden, dat deze eveneens
chinoïde kleurstof de formule CigHjA bezit en een hydroxyl-
groep alsmede een carboxylgroep bevat. Hydrolyse in zuur
milieu leverde als afbraakproducten kooldioxyde, mierenzuur
en een verbinding CnHigOg. Deze bevat drie hydroxylgroepen,
waarvan één alcoholisch is. Op grond van de verdere afbraak
maken de auteurs het waarschijnlijk, dat het hydrolyse-

H. Raistrick en J. M. Birkinshaw, Phil. Trans. Roy. Soc.
Lond., serie B 220, 245 (1931).

ch(oh)chj

Hp-Ci^O

De in het vervolg bestudeerde kleurstoffen uit Helmintho-
sporium-soovitrv behooren allen tot de anthrachinonreeks.
H. Raistrick en J. M. Birkinshaw alsmede H. Rai-
STRicK, J. H. V. Charles, R. Robinson en A. R. Todd^^)
isoleerden uit Helminthosporium gramineum Rabenhorst twee
bruine kleurstoffen, welke zij helminthosporine en
catenarine noemden. Deze laatste naam is afgeleid van
de schimmel H. catenarium Drechsler, uit welke groote
hoeveelheden van de tweede kleurstof verkregen werden.
Helminthosporine heeft de formule CijHioOj, catenarine daar-
entegen de samenstelling CigHioOg; de laatstgenoemde ver-
binding bevat dus slechts een zuurstofatoom meer. Helmintho-
sporine bevat drie phenolische hydroxylgroepen en geeft bij
destillatie met zinkstof j8-methylanthraceen. Bij oxydatie met
chroomtrioxyde ontstaat een monocarbonzuur, dat bij decarb-
oxyleering 1,4,5-trioxy-anthrachinon levert. Op grond van

»») H. Raistrick en J. H. Birkinshaw, Phil. Trans. Roy. Soc.
Lond., serie B 220, 331 (1931).

quot;) H. Raistrick, J. H. V. Charles, R. Robinson en A. R. Todd,
Biochem. J. 27, 499 (1933).

de verdere afbraak kwamen de onderzoekers tot het resultaat,
dat helminthosporine 2-methyl-4,5,8-trioxy-anthrachinon is.
Catenarine blijkt een oxy-iso-helminthosporine te zijn, en
wel een 4,5,8-trioxy-2-(of 6- of 7-)-oxymethyIanthrachinon;
de plaats van de oxymethylgroep is dus niet met zekerheid
bekend.

Uit een ander lid van het geslacht Helminthosporium, n.1. uit
H. Cynodontis Marignoni isoleerden H. Raistrick, R. Ro-
binson en A. R. Todd^^) een bruine kleurstof, welke zij
cynodontine noemden. De stof heeft de formule
CijHioOg en bevat vier phenolische hydroxylgroepen. De op-
heldering van de structuur was in dit geval zeer gemakkelijk,
omdat bij oxydatie van helminthosporine met behulp van
mangaandioxyde en zwavelzuur een oxyderivaat gevormd
wordt, dat identiek is met cynodontine. Cynodontine is dus
een oxyhelminthosporine en wel, zooals Raistrick e.m. be-
wezen 1,4,5,8-tetra-oxy-2-methylanthrachinon.

Als laatste der Helminthosporium-klemstoüen volgt thans
het t r i t i s p o r i n e, hetwelk in 1934 door H. Raistrick,
R. Robinson en A. R. Todd^s) geïsoleerd kon worden uit

Helminthosporium tritici-vulgaris'NisiKATgt;o. De auteurs bewe-
zen voor tritisporine de formule C15H10O7. De stof bevat één
alcohoHsche en vier phenoMsche hydroxylgroepen. Uit afbraak-
reacties concludeerden de auteurs tot formule Xla resp. Xlb.

Een andere groep van gekristalliseerde schimmelkleurstof-
fen, het flavoglaucine (geel), het auroglaucine
(oranje) en het rubroglaucine (rood) hebben H. Rai-

strick en B. S. Gould uit verschillende soorten van
Aspergillus glaucus geïsoleerd. De formules voor deze stoffen

physische en chemische eigenschappen van deze kleurstoffen
zijn bekend, echter niets over de constitutie.

XTa

Vit^PenicilUum chrysogenum Thom verkregen H. Raistrick,
P. W. Clutterbuck en R. Lovell^») een gele kleurstof,
welke zij chrysogenine noemden. De stof heeft een
formule Ci8H220g, bevat twee phenoHsche hydroxylgroepen
en heeft vermoedelijk een chinoïde structuur. Verdere bijzon-
derheden over deze kleurstof zijn nog niet ontdekt.

In 1935 isoleerden H. Raistrick, A. E. Oxford en P.
Simon art een nieuw geel pigment, f u 1 v i n e z u u r, uit
Penicillium-Gnseo-fulvum Dierckx, P. flexuosum Dale en
P. Brefeldianum Dodge. De stof heeft de formule Cj^HiaOg
en gelijkt in haar reacties op citromycetine. Ook de structuur
van deze kleurstof is tot nu toe nog niet nader onderzocht.

sporium Ravenüii Curtis en H. turcicum Passerini. H. Rai-
strick, R. Robinson en D. E. White isoleerden hieruit
een gele kleurstof, welke niet verwant was met de poly-oxy-
anthrachinonen, welke door de meeste soorten van Helmintho-
sporium geproduceerd worden. Zij noemden deze kleurstof
raveneline en stelden als formule vast CiiHmOg. De
kleurstof bevat drie hydroxylgroepen. De trimethylaether
geeft zeer gemakkelijk oxoniumzouten. Op grond van deze
en andere feiten besluiten de auteurs voor raveneline tot de
volgende structuur: 3-methyl-l,4,8-trioxy-xanthon. Dit is het
eerste poly-oxy-xanthonderivaat, dat bij een schimmel als
stofwisselingsproduct is gevonden.

Ten slotte wil ik hier nog de twee kleurstoffen memoreeren,
welke H. Raistrick, J. N. Ashley en B. C. Hobbs ^s) isoleer-
den uit Fusarium culmorum (W. G. Smith) Sacc. Op verschil-
lende gronden stellen de auteurs voor één van deze kleur-
stoffen, welke zij rubrofusarine noemen en welke een
formule C15H12O5 heeft, de structuur van methyl-methoxy-
dioxy-xanthon voor. De overeenkomstige trioxy-verbinding
zou isomeer zijn met raveneline. Voor de tweede kleurstof,
het aurofusarine, vonden zij de formule CgoHaoOja.
Over de structuur van deze verbinding zijn nog geen nadere
gegevens bekend, men weet alleen, dat zij zes hydroxyl-
groepen bevat.

Het was mij uiteraard niet mogelijk, om in dit overzicht
alle onderzoekers te vermelden, welke zich hebben bezig-
gehouden met de bestudeering van schimmelkleurstoffen.
Verdere gegevens over onderzoekingen op dit gebied vindt

men echter vermeld in een verhandeling van F. Kögl in het
„Handbuch der Pflanzenanalysequot; van G. Klein.

Het was mijn bedoeling om deze onderzoekingen over
schimmelkleurstoffen verder uit te breiden door de bestu-
deering van de kleurstof, welke gevormd wordt door de
schimmel Phoma terrestris Hansen. Ik verkreeg deze schim-
melsoort uit de collectie van het Nederlandsch Bureau voor
Schimmelcultures te Baarn; ik betuig ook vanaf deze plaats
Prof. J. Westerdijk daarvoor mijn hartelijken dank.

Phoma terrestris Hansen is verantwoordelijk voor een
ziekte, welke kan optreden bij uien; de schimmel behoort tot
de klasse der Fungi imperfecti, afdeeling Hyalosporae, familie
Sphaerioideae en de orde Sphaeropsideae. H. N. Hansen geeft
in een verhandeling: „Etiology of the Pinkroot-disease of
Onionsquot; 2») de volgende beschrijving van Phoma terrestris
Hansen:

„Pycnidia subglobose, ostiolate, papillate, dark brown to
black, carbonaceous, 170—350 /x, may occur singly, fre-
quently gregarious. Conidia continous, hyaline, oblong-
ovoid 4,5-5,5x1,8-2,3 n, biguttulate, vessile inpycnidium,
escaping as a gelatinous mass through ruptures, rarely
as a gelatinous cirrus through the ostiole. Mycelium
septate, hyaline, guttulate, 1,0-4,5 /x, frequently anasto-
mosingquot;.

Voor de mededeeling van bovenstaande gegevens ben ik
Jhr. Dr. F. M. van Beyma thoe Kingma zeer erkentelijk.

De volgende hoofdstukken bevatten de resultaten, welke ik
verkregen heb bij mijne onderzoekingen over de kleurstof
van Phoma terrestris Hansen.

Voor het kweeken van de schimmel leek het voordeehg, een
synthetische voedingsoplossing te gebruiken, d.w.z. een voe-
dingsoplossing, welke behalve een goed gedefiniëerde organi-
sche stof als koolstofbron, slechts anorganische zouten bevat.
Het spreekt vanzelf, dat onder deze omstandigheden voor de
isoleering van de kleurstof minder complicaties te verwachten
waren dan bij de toepassing van media als pepton, gelatine
of agar-agar.

Zooals in de inleiding vermeld is, hebben H. Raistrick
en medewerkers bij hun onderzoekingen den voedingsbodem
van Czapek-Dox »gt;), 3i), sz) gebruikt. Deze is vooral gekarak-
teriseerd door de toepassing van een bepaald mengsel van
anorganische zouten, terwijl als koolstofbron behalve d-glu-
cose ook dikwijls andere suikers of zetmeel dienst doen. Ook
voor mijn doel heb ik met succes van den genoemden voedings-
bodem gebruik kunnen maken.

Natuurlijk was het van groot belang, die proefomstandig-
heden te zoeken, waarbij een groei met maximale kleurstof-

31)nbsp;A. W. Dox, U. S. Dept. of Agric., Bull. No. 120, 37 (1914).
»2) A. W. Dox en Neidig, J. Biol. Chem. 18, 167; 19, 235 (1914).

productie optrad. In het algemeen bleek de kleurstofproductie
met den groei evenredig te zijn. De voorproeven toonden, dat
de schimmel zich in zuur milieu slecht ontwikkelde; een
alkalisch milieu was gunstiger, optimale groei en kleurstof-
productie vond ik echter bij p^ = 6,8. Daar na het sterili-
seeren van de voedingsoplossing de waarde van de p» ca. 5,0
bedroeg, werd een kleine hoeveelheid van een steriele vijf
proc. natriumcarbonaatoplossing toegevoegd, totdat de ver-
eischte p^ bereikt was.

Voor het kweeken op groote schaal werden vijf dagen
oude cultures van Phoma terrestris Hansen op Czapek-Dox
glucose-agar ¹) met steriel water geschud en de ontstane
schimmelsuspensie over de kolven met voedingsoplossing ver-
deeld. Terwijl nadere details in het experimenteel gedeelte
beschreven worden, zij hier kort vermeld, dat de schimmel
gedurende dertig dagen bij een temperatuur van 22° C. ge-
kweekt werd. Over de geheele oppervlakte van de cultuur-
vloeistof was dan een vrij dik, viltachtig, wit, aan den onder-
kant donkerpaars gekleurd mycelium gevormd.

Voor de isoleering van de kleurstof werd ter verwijdering
van begeleidende stoffen het gedroogde mycelium achtereen-
volgens met aether en aceton geëxtraheerd. Bij de voorproe-
ven was de behandeling met deze oplosmiddelen achterwege
gebleven en in dit geval kon alle kleurstof met p57ridine ge-
extraheerd worden. Daarbij resulteerde een diep paarse op-
lossing, waaruit de kleurstof zich bij indampen als violette
kristallen afscheidde. Na de bovengenoemde voorbehandeling
bleek echter de kleurstof slechts in geringe mate door pjnidine
geëxtraheerd te worden. In de veronderstelling, dat de kleur-

1nbsp; De schimmel groeit uitstekend op Czapek-Dox glucose-agar,
terwijl een glucose oplossing zonder agar als koolstof bron onvol-
doende is.

stof in de schimmel als alkalizout aanwezig is, werd het ge-
zuiverde myceUum gedurende twee uur behandeld met koud
verdund zwavelzuur. Hierna werd het uitgewasschen. het
gedroogde materiaal met pyridine in vacuo geëxtraheerd en
daarbij inderdaad een donker paarsroode oplossing verkregen.
Bij indampen kristaUiseerden uit deze oplossing oranjegele
naaldjes. Het oranjegele kristaUisaat loste op in pyridine
met een paarsroode kleur en was uit dit oplosmiddel ook
gemakkelijk om te kristalliseeren. Daar de kleurstof in
zeer verdunde loog (niet in meer geconcentreerde loog) met
paarse kleur oplost, is te veronderstellen, dat zij hierin en
in de pyridine-oplossing als zout aanwezig is. Uit de verdieping
van de kleur was meteen te concludeeren, dat bij de zout-
vorming één of meerdere phenohsche hydroxylgroepen be-
trokken waren. Gezien het feit, dat uit de pyridine-oplossing
de oranjegele kleurstof zelf uitkristalHseert, moet men tevens
veronderstellen, dat in deze oplossing slechts een gedeelte

De in de voorproeven verkregen paarse kristallen moesten
dus een alkalizout zijn, dat uit het niet-gezuiverde myceüum
door pyridine geëxtraheerd kon worden. Inderdaad gaf een
pyridine-oplossing van de paarse kristallen bij aanzuren een
oranjekleurig, vlokkig neerslag, dat na affiltreeren uit pyridine
kristalliseerde in den vorm van oranjegele naalden, die identiek
bleken te zijn met de kleurstof uit de hoofdopwerking. Wan-
neer de paarse stof op een platinablikje verascht werd, bleef
er een wit residu, waarm ik zoowel kalium als natrium kon
aantoonen.

Het ruwe kristaUisaat uit de hoofdopwerking bleek onder
ontleding bij 196° te smelten »). Na drie maal omkristaUiseeren

uit alcohol was het smeltpunt gestegen tot 197° en bleef dit
bij verder omkristalliseeren constant. Het microscopisch beeld
van de kleurstof vertoont oranjegele naalden, welke soms tot
bundeltjes en rozetten vereenigd zijn.

Uit de elementairanalyse bleek de aanwezigheid van stik-
stof. Daar het stikstofgehalte slechts ongeveer 3,5% bedroeg,
dacht ik eerst aan een verontreiniging, welke afkomstig zou
kunnen zijn van de als oplosmiddel gebruikte pyridine. Ten-
einde dit na te gaan werd de kleurstof opgelost in 0,01 n
KOH. De diepviolette oplossing werd aangezuurd met ver-
dund zwavelzuur, waarbij er oranje vlokken neersloegen,
welke na affiltreeren en drogen uit alcohol kristalliseerden in
den vorm van naalden. Deze hadden hetzelfde smeltpunt
en mengsmeltpunt als de oorspronkelijke kristallen; wij had-
den hier dus niet met een pyridinezout te doen.

Er bleef echter nog altijd de verdenking, dat de als oplos-
middel gebruikte pyridine bij de langdurige extractie met de
oorspronkehjke kleurstof op de één of andere wijze gereageerd
kon hebben. Teneinde dit uit te maken, isoleerde ik de kleur-
stof zonder gebruik te maken van een stikstofhoudend oplos-
middel. Dit gaat echter met zeer veel bezwaren gepaard.
Weliswaar is de kleurstof uit het gereinigde mycelium ook met
alcohol te extraheeren; deze oplossing bevat echter veel meer
verontreinigingen dan het pyridineextract. Bovendien slaan
uit de alcoholische oplossing bij het afkoelen naast de kleur-
stof vele begeleidende stoffen neer, terwijl deze in pyridine in
oplossing blijven. Het gelukte mij dan ook niet, de kleurstof
zonder gebruik van pyridine geheel te zuiveren. De kristal-
vorm en de kleur van het verkregen praeparaat geleken echter
volkomen op het kristallisaat uit pyridine. Ook het smeltpunt
(196°) en het mengsmeltpunt (196,5°) wezen op de identiteit
van beide producten. Inderdaad bleek ook het door alcohol-

extractie verkregen product stikstof te bevatten en wel 3,6%,
zoodat hiermede vaststond, dat de stikstof een integreerend
bestanddeel van het molecule is.

De oranjegele kristallen gelijken uiterlijk op die van chi-
nizarine en ook de roodpaarse oplossing in loog toont eenige
gelijkenis met die van chinizarine ¹). Ik zou daarom voor
de kleurstof van Phoma terrestris Hansen den naam pho-
mazarine willen voorstellen; deze naam heeft ook nog
het aardige, dat de lettergroep „azquot; in dit geval het stik-
stofgehalte kan aanduiden.

Er moge hier nog gewezen worden op het eigenaardige
gedrag van phomazarine ten opzichte van alkaliën. Pho-
mazarine lost op in 0,01 n KOH, maar niet in 0,1 n KOH.
Bij onderzoek bleek, dat een phomazarine-oplossing in 0,01
n KOH bij doorvallend licht een sterk Tyndall effect ver-
toont, m.a.w., het kaliumzout bevindt zich koUoïdaal in
oplossing. De vlokkingsgrens van dit sol blijkt nu erg laag
gelegen te zijn. Bij toevoeging van een meer geconcentreerde
kaliumhydroxyde-oplossing vlokt dadelijk het kaliumzout uit
in paarse vlokken. Met meerwaardige electrolyten gaat de
uitvlokking veel sneller en wel zijn hiervan sporen al vol-
doende. Het is dan ook noodig, om bij het bereiden van een
alkalische phomazarine-oplossing gebruik te maken van ab-
soluut zuiver kaliimihydroxyde.

De elementair-analyses van het gekristalliseerde phoma-
zarine leidden tot de formule CigH^OgN. Het bleek, dat de
kleurstof een alkoxylgroep bevatte. Met behulp van de me-
thode van W. Küster en W. Maag^s) werd deze alkoxyl-
groep geïdentificeerd als een methoxylgroep. Deze methoxyl-
groep kon zich niet in een carbomethoxygroep bevinden,
omdat bij behandeling met loog, gevolgd door aanzuren weer
phomazarine terug verkregen werd. Hierbij was dus de me-
thylgroep niet afgesplitst.

Tot nu toe was het mij niet mogelijk, van phomiazarine
een moleculairgewichtsbepaling volgens Rast te verrichten;
derivaten waren meestal onoplosbaar in de voor een Rast-
bepaling geschikte oplosmiddelen, of ontleedden reeds voor
het bereiken van het smeltpunt. Het eenige derivaat, hetwelk
voor deze bepaling in aanmerking kwam, was het later te
bespreken trimethoxy-decarboxy-phomazarine CaiHagOgN.
Deze stof heeft een berekend moleculairgewicht van 385,
terwijl 390 resp. 391 gevonden werd.

Als eerste derivaat van phomazarine bereidde ik een
methylester. Deze ontstond bij koken van de kleurstof met
absolute methylalcohol, waaraan 1,5 proc. zoutzuur was toe-
gevoegd. Deze ester is een oranje, in naalden kristaUiseerende
stof, welke de bruto-formule CaoHigOgN heeft. De stof bleek

twee methoxylgroepen te bevatten, zoodat wij hier met een
mono-methylester van phomazarine te doen hebben. In tegen-
stelling met de methoxylgroep, welke reeds in phomazarine
aanwezig is, kan de nieuw ingevoerde methylgroep met be-
hulp van verdunde loog afgesplitst worden. Later heb ik nog
een meer direct bewijs kunnen leveren voor de aanwezigheid
van een carboxylgroep; zooals nog beschreven wordt, is het
namelijk mogelijk, phomazarine te decarboxyleeren.

De directe acetyleering van phomazarine bleek bezwaren
op te leveren. Er ontstonden bij acetyleering met azijnzuur-
anhydride en pyridine of met azijnzuuranhydride en een
spoortje gec. zwavelzuur altijd gele vlokkige producten, welke
snel donkerder kleurden en slechts moeilijk gekristalliseerd
te verkrijgen waren.

Door de acetyleering van phomazarine-methylester met be-
hulp van azijnzuuranhydride en gec. zwavelzuur, werd een
product bereid, dat zonder moeite kristalliseerde.

Een micro-acetylbepaling volgens F. Kögl en J. J. Po-
stowsky toonde de aanwezigheid van drie acetylgroepen.
Ook de elementair-analyse kwam overeen met de samen-

De aanwezigheid van keton- of aldehydgroepen in phoma-
zarine was op geenerlei wijze aan te toonen.

In totaal waren thans zes van de acht in de formule aan-
wezige zuurstofatomen gekarakteriseerd. De veronderstelling
ligt voor de hand, dat de overige twee zuurstofatomen aan
een chinon-systeem toebehooren en ik heb dan ook getracht,
dit door de bereiding van een leuko-verbinding en van een
„hydrochinon-diacetaatquot; aan te toonen. De verwachting, dat
de reductie van phomazarine met behulp van natrium-

hydrosulfiet in alkalische oplossing tot een kleurlooze ver-
binding zou leiden, ging niet in vervulling. Bij deze reactie
veranderde de kleur van de oplossing niet, terwijl bij de
reductie met pyridine-zink-ijsazijn volgens R. Kuhn en A.
winterstein de oorspronkelijke paarsroode kleur (via
violet) violetblauw wordt, met een sterke, paarse fluorescentie.

Reductie van phomazarine met stannochloride in ijsazijn
geeft een verkleuring van de oorspronkelijk oranjeroode op-
lossing over bronsgroen en groen naar diepblauw. Bij laten
staan aan de lucht komt langzamerhand de oranje kleur
terug; voegt men nu een nieuwe hoeveelheid stannochloride
toe, dan wordt de oplossing weer blauw gekleurd en dit ver-
schijnsel laat zich ad libitum herhalen.

Wordt phomazarine in alcoholische of in azijnzure oplossing
gehydreerd met behulp van platina-oxyde volgens R. Adams
en R. L. Shriner®«), dan neemt het één molecule water-
stof op en er ontstaat een donkergekleurd neerslag. Dit neer-
slag kleurt aan de lucht in korten tijd weer oranje en is
dan volgens smeltpunt en mengsmeltpunt identiek met de
uitgangsstof. Bij hydreering van phomazarine in alkalische
oplossing wordt eveneens één molecide waterstof opgenomen.
De kleur verandert niet, maar bij aanzuren ontstaat weer een
donkergekleurd neerslag, dat aan de lucht spoedig oranje
kleurt, en dan weer identiek is met phomazarine.

Nu werden pogingen ingesteld, van phomazarine een leuko-
di-acetylverbinding te bereiden. Door de z.g. „reduceerende
acetyleeringquot; met behulp van zinkstof, azijnzuuranhydride
en natriumacetaat ontstond geen kleurlooze verbinding, maar

slechts een bruine amorfe stof, welke op geen manier tot
kristalliseeren was te brengen. Ik trachtte vervolgens een
acetylverbinding van den gehydreerden vorm van phomazarine
in handen te krijgen, door het neerslag, dat gevormd werd
bij hydreeren van phomazarine in alcoholische oplossing
onder uitsluiting van lucht te acetyleeren met azijnzuur-
anhydride en gec. zwavelzuur. De stof loste bij deze bewerking
niet op; indien echter tevens lucht aanwezig was, ontstond
het gewone tri-acetylderivaat van phomazarine. Overigens is
het feit, dat een chinon niet in een leuko-diacetylverbinding
omgezet kan worden, ook in andere gevallen geconstateerd,
b.v. bij xylindeïne

Hoewel al het bovenstaande wijst op het bestaan van een di-
hydro-verbinding, welke zich zeer gemakkelijk weer tot de
uitgangsstof laat terugoxydeeren, hebben wij daarmee nog
geen strikt bewijs voor een chinoïd systeem. Voor zijn aan-
wezigheid konden echter ook nog andere argumenten worden
gevonden. Bij een oxydatie van phomazarine met chroom-
trioxyde werd namelijk de vorming van een roodbruin ge-
kleurde lak opgemerkt; deze gaf bij verassching chromi-
oxyde en bleek dus een chroomlak te zijn. Het ontstaan van
lakken is in het algemeen een typische eigenschap van ortho-
oxy-chinonen en ik had de hoop, door een nauwkeurige studie
van deze verbindingen werkelijk een bewijs te kunnen leveren
voor de chinoïde structuur. Over dergelijke lakken vinden
we in de htteratuur belangrijke onderzoekingen van P.
Pfeiffer 3') en van O. Dimroth^s). Pfeiffer vond, dat in
het algemeen die oxyketonen en oxychinonen, welke de

quot;) P. Pfeiffer, B. 44, 2563 (1911); Ann. 398, 137 (1913).
38) O. Dimroth, B. 54, 3020 (1921); Ann. 446, 97 (1925); 456,
177 (1927).

hydroxylgroep op een a-plaats ten opzichte van de carbonyl-
groep bevatten, inwendige complexe verbindingen geven met
verschillende metaalzouten, zooals b.v. stannichloride. De
eigenlijke tinlakken zijn dan hiervan afgeleid door vervanging
van de resteerende chlooratomen door hydroxylgroepen. De
complexe stannichloride verbinding van ortho-oxy-anthra-
chinon zou volgens Pfeiffer de volgende constitutie heb-
ben (XII):

Het tinatoom is dus zoowel zoutachtig gebonden aan de
hydroxylgroep, als koördinatief aan de restvalentie van één
der chinonzuurstofatomen.

Dimroth heeft bij zijn onderzoekingen vooral gebruik ge-
maakt van het z.g. aceto-boorzuuranhydride. Deze verbinding
geeft met a-oxyketonen en ortho-oxy-chinonen complexver-
bindingen, welke een veel donkerder kleur hebben dan het
chinon zelf. Meta-oxy-chinonen geven deze reactie niet, maar
bij verwarmen wordt hier de hydroxylgroep geacetyleerd.
Als typisch voorbeeld moge het gedrag van alizarine vermeld
worden; dit geeft in de koude een mono-aceto-boorzure ester
en bij verwarming de overeenkomstige acetylverbinding. Uit
de laatste ontstaat bij verzeeping met water l-oxy-2-acetoxy-

anthrachinon, terwijl de mono-aceto-boorzure ester bij deze
behandeling alizarine terugvormt. Inderdaad geeft nu pho-
mazarine met stannichloride in absolute benzol een onoplos-
bare paarse complexe verbinding, welke met water een
oranjeroode tinlak levert. Ook met aceto-boorzuuranhydride
ontstaat een donkerpaarse oplossing.

Op zichzelf lijkt het uit de genoemde feiten wel zeer plau-
sibel, dat phomazarine een ortho-oxy-chinon is, doch wij
moeten niet uit het oog verliezen, dat ook oxyketonen
soortgelijke reacties kunnen geven. Ik kon echter aantoonen,
dat er twee verschillende aceto-boorzure esters bestaan, een
mono- en een di-ester. Wanneer ik bij een oplossing van
phomazarine in azijnzuuranhydride een hoeveelheid aceto-
boorzuuranhydride voegde, overeenkomend met één mol, ont-
stond er een dieproode kleur, zeer veel donkerder dan de kleur
van de oorspronkelijke oplossing. Zoodra ik echter twee
molen aceto-boorzuuranhydride gebruikte, werd de kleur van
het reactiemengsel dieppaars. Na verwarming van deze op-
lossing werd zij met water ontleed, waarbij phomazarine
kon worden teruggewonnen. Daaruit is te concludeeren, dat
in de meta-positie geen hydroxylgroepen aanwezig zijn en
wij dus hoogstwaarschijnlijk te maken hebben met een di-
ortho-oxy-chinon. Phomazarine is dan op de volgende wijze
schematisch te formuleeren (XIII):

cooh

och,

De volgende taak was nu, de functie van het stikstof-
atoom in phomazarine op te helderen. Allereerst doet zich de
vraag voor, of één der acetylgroepen van triacetyl-phoma-
zarine-methylester zich aan de stikstof zou kunnen bevinden
en phomazarine dus een primair of secundair amine was. Het
bleek echter, dat de triacetyl-verbinding uit een aetherische
oplossing met matig geconcentreerd zoutzuur uit te schudden
is en dus een duidelijk basisch karakter heeft. Wij mogen
hieruit de conclusie trekken, dat de drie acetylgroepen inder-
daad in drie hydroxylgroepen zijn ingevoerd en dat de stik-
stof tertiair of eventueel quaternair gebonden is¹). Hetzelfde
resultaat kon ik, onafhankelijk van deze proeven, verkrij-
gen door het bestudeeren van de inwerking van salpeterig-
zuur op phomazarine. Bij een bepaling volgens Van Slyke
kon geen primaire aminogroep worden aangetoond en ook
pogingen tot diazoteering faalden; er werd altijd het onver-
anderde uitgangsmateriaal teruggevonden. Uit het uitblijven
van een nitrosaminevorming volgt dus meteen, dat wij bij
phomazarine ook niet met een secundair amine te doen
kunnen hebben.

Wanneer wij de aanwezigheid van een quatemaire am-
moniumverbinding voorloopig als minder waarschijnlijk bui-
ten beschouwing laten, blijft de vraag, of het tertiaire stikstof-
atoom van phomazarine alkylgroepen draagt of lid van een
heterocyclisch systeem is. De eerste mogelijkheid moest wor-
den uitgesloten, omdat een alkylimid-bepaling van phoma-
zarine een negatief resultaat opleverde.

1nbsp; In dit verband moet nog vermeld worden, dat de triacetyl-
phomazarine-methylester uit de zoutzure oplossing na verloop van
eenigen tijd weer met aether is uit te schudden. We hebben dit aldus
te verklaren, dat hierbij de methylester in de zoutzure oplossing ver-
zeept wordt.

Indien phomazarine inderdaad een tertiair amine is, zou
men dit ook nog rechtstreeks moeten kunnen bewijzen door
het met behulp van methyljodide in een quatemair ammo-
niumzout om te zetten. Het was mij echter niet mogelijk, om
met de tot nu toe beschreven phomazarine-derivaten met
methyljodide een goed gekristalliseerd additieproduct te ver-
krijgen.

Voor de karakteriseering van de functioneele groepen en
vooral ook voor de latere afbraak leek het zeer gewenscht,
phomazarine in een volledig gemethyleerde verbinding om te
zetten. Helaas was het nóch met behulp van diazomethaan,
nóch door middel van dimethylsulfaat, mogelijk een dergelijk
product te bereiden. Bij behandeling met diazomethaan ont-
stond een niet-kristalliseerende bruine olie met veel te lage
methoxylwaarden; dimethylsulfaat gaf niet het gewenschte
resultaat, omdat de kleurstof in de benoodigde loog het onop-
losbare alkalizout vormt, dat niet verder reageert.

Phomazarine smelt onder sterk opschuimen bij 197°, en
een onderzoek van het daarbij gevormde gas leerde, dat
kooldioxyde afgespHtst was. Ik heb toen getracht, van deze
reactie ook in praeparatief opzicht gebruik te maken. Wan-
neer phomazarine bij sterk verminderde druk boven het
smeltpunt verhit wordt, sublimeert een product in donker-
roode blaadjes, welke een smeltpunt van 253—254° hebben.
De elementair-analyse stemt overeen met de samenstelling
CigH^OgN; er blijkt dus inderdaad, dat de carboxylgroep
verwijderd is.

Door de bereiding van een triacetyl-verbinding van de
samenstelling C24H23O9N werd bewezen, dat bij de thermische
ontleding geen verandering aan de hydroxylgroepen optrad.
De spontane wijze, waarop het phomazarine kooldioxyde
afsplitst, zou er op kunnen wijzen, dat wij hier misschien te

doen hebben met een j3-ketozuur. De plaats van de carboxyl-
groep in het molecule zou hiermede dan vastgelegd zijn. n.1.
in j3-positieten opzichte van één der chinon-carbonyl-groepen.

Het decarboxyleeringsproduct, dat wij in het vervolg
decarboxy-phomazarine willen noemen, bleek zeer geschikt
te zijn voor een methyleering met zilveroxyde en methyl-
jodide volgens de methode van Th. Purdie s»). Er ontstonden
hierbij twee producten, een dimethoxy-decarboxy-phomaza-
rine en een trimethoxy-decarboxy-phomazarine, resp. met de
formule CigHisO^NlOCHs)^ en Ci8Hi403N(0CH3)3.

Nadat dus op de hiervoor beschreven wijze de functie van
de zuurstofatomen en van het stikstofatoom in het molecule
was opgehelderd, moest ik trachten door middel van één of
andere geschikte afbraakreactie nadere gegevens te verkrijgen
voor de constitutie van phomazarine.

Een der reacties, welke het snelste tot het doel zou kunnen
leiden, n.1. de destillatie met zinkstof, die in de hand van
F. Kögl en medewerkers reeds zeer vaak nuttige diensten
heeft bewezen, had bij phomazarine niet het gewenschte
resultaat. Hoe ik de reactie-omstandigheden ook wijzigde,
steeds ontstonden slechts zeer kleine hoeveelheden van niet-
kristalliseerende, geel gekleurde, olieachtige producten.

Bij pogingen om tot een hydrolytische of een oxydatieve
splitsing van het molecule te komen, viel allereerst op, dat
phomazarine eenerzijds een groote resistentie heeft tegen een
hydrolytische afbraak in alkalisch milieu, anderzijds een geringe
weerstand tegen oxydatieve invloeden. Het bleek bijvoorbeeld
mogelijk de kleurstof gedurende drie uren te behandelen met
zeer geconcentreerde alcoholische loog; hierna werd nagenoeg
alle phomazarine onveranderd teruggevonden.

Aan den anderen kant reageert een alkalische phomazarine-
oplossing reeds in de koude snel met kaliumpermanganaat
en verbruikt daarbij zoo veel van dit reagens, dat men niet
kan hopen, belangrijke afbraakproducten te kunnen isoleeren.

Teneinde dus een inzicht te verkrijgen in den bouw van het
phomazarine, was het noodzakelijk, een oxydatieve afbraak
te vinden, waarbij een meer gematigde reactie optreedt.

Zooals al eerder is opgemerkt, ontstond bij oxydatie van
phomazarine in azijnzure oplossing met chroomtrioxyde een
onoplosbare, chroomhoudende verbinding, welke niet verder
geoxydeerd werd.

Een oxydatie met waterstofperoxyde in alkalische oplossing
bleek niet mogelijk te zijn, omdat het waterstofperoxyde
een uitvlokkende werking had op de alkahzouten van de
kleurstof. De ontstane vlokjes ontleedden dan het waterstof-
peroxyde katalytisch, waarbij echter de oxydatie geen voort-
gang vond.

Zelfs van een betrekkelijk zwak oxydatiemiddel als lood-
tetra-acetaat, worden bij oxydatie in ijsazijn acht moleculen
door phomazarine verbruikt. Uit het reactiemengsel laat zich
dan in zeer kleine hoeveelheden een bruine, olieachtige zuur-
fractie isoleeren. Het is mij niet gelukt, hieruit een kristallijn
afbraakproduct te verkrijgen, echter bevat de olie nog kleine
hoeveelheden van het onomgezette uitgangsproduct. Wel had
de bruine olie een sterke reuk naar vluchtige vetzuren.

Beter resultaat had ik bij een oxydatie met waterstof-
peroxyde in zwavelzure oplossing. Phomazarine werd opge-
lost in 50 proc. zwavelzuur en daarna met verdund water-
stofperoxyde behandeld bij 50° gedurende 20 uren. De
aanvankelijke roodoranje kleur van de oplossing heeft dan
plaats gemaakt voor lichtgeel. Ook hier is het niet gelukt,
uit de zuurfractie van het reactiemengsel een kristallijn

afbraakproduct te isoleeren. In dit geval was het echter
mogelijk, de vluchtige vetzuren te identificeeren. Deze werden
met waterdamp gedestilleerd en omgezet in de overeenkom-
stige natriumzouten. Het zoutmengsel werd nu behandeld
met w-broom-p-phenyl-acetophenon volgens de methode van
N. Drake en J. Bronitzky«). Uit het aldus verkregen
mengsel van p-phenyl-phenacylesters kon ik allereerst een
fractie isoleeren, welke bij 97° smolt en volgens analyse,
smeltpunt en mengsmeltpunt identiek bleek te zijn met de
ester van n-boterzuur. Uit de moederloogen verkreeg ik nog
een tweede ester, welke een veel lager smeltpunt had, n.1.
63,5°, en deze was volgens analyse, smeltpunt en meng-
smeltpunt identiek met de n-valeriaanzure ester.

Om het ontstaan van zoowel boterzuur als valeriaanzuur
te verklaren, moest ik aannemen, dat beide uit dezelfde
zijketen afkomstig zijn; immers voor twee verzadigde zij-
ketens is in het molecule van phomazarine geen plaats, zij
zouden samen achttien waterstofatomen voor zich opeischen.

Voor de vorming van boterzuur naast valeriaanzuur zijn
twee verklaringen mogelijk. Allereerst kan het boterzuur
secundair uit het valeriaanzuur zijn gevormd. J. Dakin
geeft aan, dat onder bepaalde omstandigheden uit valeriaan-
zuur door waterstofperoxyde boterzuur ontstaan kan.

Het is echter ook mogelijk, dat de oxydatie het molecule op
twee punten aangrijpt, eenerzijds wordt dus het eerste koolstof-
atoom van de aanwezige butylzijketen tot carboxylgroep ge-
oxydeerd, anderzijds kan ook het ring-koolstofatoom, dat
de zijketen draagt, oxydatief uit den ring worden afgesplitst
en tot carboxylgroep geoxydeerd worden volgens het schema:

«) N. Drake en J. Bronitzky, J. Am. Chem. Soc. 52, 3718
(1928); 54, 2059 (1930).

Deze tweede verklaring is waarschijnlijk de juiste, omdat
boterzuur in grootere hoeveelheid gevonden wordt dan
valeriaanzuur.

Uit de oxydatie van phomazarine met waterstofperoxyde
in zwavelzure oplossing kon ik ook nog een ander product
isoleeren. Wanneer namelijk, na verwijderen van de zuur-
fractie, het reactiemengsel alkaUsch werd gemaakt, kon ik
met aether een stof extraheeren, welke in kleurlooze naaldjes
kristalliseert. Deze stof werd echter slechts in zeer kleine
hoeveelheden gevormd (ca. 25 mg ongezuiverd product uit
850 mg phomazarine). De verwachting, dat dit product een
base zou zijn, werd niet beantwoord, het reageerde volkomen
neutraal. Dat deze stof dan niet direct in de neutrale fractie
van het reactiemengsel gevonden wordt, valt alleen te ver-
klaren, wanneer wij aannemen, dat de stof pas in het alkalisch
müieu (b.v. door hydrolyse) gevormd wordt. Bij het zuiveren
van deze stof, dat met groote moeilijkheden gepaard ging,
traden sterke verliezen op. De resteerende hoeveelheid was
helaas niet voldoende om een volledige elementair-analyse te
verrichten. Het bleek echter, dat deze stof geen stikstof be-
vatte; ook de oorspronkelijke methoxylgroep van phoma-
zarine was in dit afbraakproduct niet aanwezig.

Dit kleurlooze afbraakproduct geeft een positieve aldehyde-
reactie met fuchsine-zwaveligzuur en ontkleurt langzaam
Fehling's oplossing. Om deze verbinding te identificeeren
zouden groote hoeveelheden phomazarine opgeofferd moeten
worden.

Het blijkt dus uit deze oxydaties, dat het zeer moeilijk
is, een oxydatieve afbraak van phomazarine zoo te leiden,
dat er afbraakproducten ontstaan, welke ons een inzicht
kunnen geven in den bouw van het ringsysteem.

Ook oxydaties van derivaten van phomazarine hadden niet
het gewenschte resultaat. Zoo kon ik uit een oxydatie van
dimethoxy-decarboxy-phomazarine met chroomtrioxyde
slechts oxaalzuur isoleeren naast de vluchtige vetzuren. Bo-
vendien wordt altijd weer een groot gedeelte van het uitgangs-
product onomgezet teruggevonden (in de basenfractie). Tri-
methoxy-decarboxy-phomazarine wordt bijna in het geheel
niet aangegrepen. Het gedeelte van phomazarine en phoma-
zarine-derivaten, dat aangegrepen wordt door oxydatie, wordt
dus blijkbaar bijna volkomen verbrand.

Aan het feit, dat een n-butylzijketen in het molecule
van phomazarine aanwezig is, kunnen wij thans eenige theore-
tische beschouwingen verbinden. Allereerst volgt uit de for-
mule CigHiyOgN dat wij hier te maken hebben met een
onverzadigde verbinding. Daar wij reeds gezien hebben, dat
bij hydreering van phomazarine slechts één molecule water-
stof opgenomen wordt, blijkt dat, afgezien van de chinoïde
groepeering, er geen alifatische dubbele bindingen in het
molecule aanwezig zijn. Wij hebben hier dus te doen met een
verbinding, welke thuis hoort in de aromatische (heterocy-
clische) reeks. Om theoretisch iets te weten te komen omtrent
den aard van de stamkern van phomazarine, kan men zich
elke substituent vervangen denken door een waterstof-
atoom. Tevens denken wij ons de chinoïde kern door hydree-
ring omgezet in een aromatische. Er ontstaat dan een ver-
binding C13H9N.

Het zal zonder meer duidelijk zijn, dat hier sprake is van
een vrij sterk gecondenseerd aromatisch (heterocyclisch)

systeem. Tenslotte kunnen wij ons het tertiaire stikstof-
atoom vervangen denken door een methingroep. Uit de rest
CiaHgN ontstaat dan een verbinding C14H10 en dit komt over-
een met den graad van de condensatie van een anthraceen-
of phenanthreensysteem.

Uit het feit, dat men bij phomazarine te maken heeft met
een /S-ketozuur en de daaruit getrokken conclusie, dat de
carboxylgroep zich dan aan den chinoïden ring moet bevinden,
kan men besluiten, dat de chinonring slechts aan één zijde
gecondenseerd kan zijn met een anderen ring. Daar wij boven-
dien reeds gezien hebben, dat een di -„orthoquot;-oxy-chinon-
groepeering vaststaat, kunnen wij de volgende voorloopige
formuleering (XIV) opschrijven¹):

Door de studie van de gemethyleerde decarboxy-phoma-
zarine-derivaten kon nog een nader inzicht in het molecule
worden verkregen.

Het was mij onmogelijk om de tot nu toe beschreven acetyl-
derivaten van het phomazarine, met behulp van methyl-
jodide om te zetten in een quaternair ammoniumzout. Na af-

1nbsp; Hierbij laat ik in het midden of de plaats naast de carboxyl-
groep al dan niet door een hydroxylgroep of een andere substituent
bezet is.

loop der reactie vond ik steeds de uitgangsstoffen onveranderd
terug. Niet-geacetyleerde derivaten van phomazarine reageer-
den wel met methyljodide, maar gaven reactieproducten,
welke niet kristallijn te verkrijgen waren. Deze stoffen be-
vatten bovendien geen jodium, hetgeen toch bij de vorming
van een quaternair ammoniumzout verwacht moest worden.
Al deze amorfe producten bleken slecht oplosbaar te zijn
in aether, maar vertoonden een vrij goede oplosbaarheid in
water.

Het eenige gekristalliseerde quatemaire ammoniumzout,
hetwelk ik heb kunnen verkrijgen, is afgeleid van het tri-
methoxy-decarboxy-phomazarine. Het kristalliseerde uit
chloroform-aether in lange, oranjeroode naalden, welke bij
193° smolten. Bij de elementair-analyse bleek het product
de formule CgiHagOgN te bezitten en dus geen jodium te
bevatten. Daar de gele uitgangsstof dezelfde bruto-formule
bezit, maar bij 160° smelt, hebben wij klaarblijkelijk met een
isomeer te doen. Het isomere product bevat slechts drie
methoxylgroepen, in tegenstelling met trimethoxy-decarboxy-
phomazarine, waarin vier van deze groepen aanwezig zijn *).

Hierbij dient nog opgemerkt te worden, dat hetzelfde oranje-
roode product ook gevormd wordt, wanneer men dimethoxy-
decarboxy-phomazarine en methyl-jodide met elkaar laat
reageeren.

Om deze verschijnselen te verklaren, heb ik gedacht aan
de reactie van hygrinezuur met methyljodide, welke als voor-
beeld zou kunnen dienen voor de isomerisatie van deze
phomazarine-derivaten. Bij de methyleering van hygrinezuur
wordt stachydrine gevormd en wel zoodanig, dat het hygrine-

♦) Een van deze methoxylgroepen is oorspronkelijk al in phomaza-
rine voorhanden.

zuur eerst een molecule methyljodide addeert onder zout-
vorming; dit quaternaire ammoniumzout splitst dan jood-
waterstof af, waarbij een betaïne gevormd wordt:

In het geval van het dimethoxy-decarboxy-phomazarine
zou dus ook secundair joodwaterstof afgesplitst kunnen zijn
en zou dus het met trimethoxy-decarboxy-phomazarine iso-
mere product de structuur van een betaïne bezitten.

In verband hiermede dient opgemerkt te worden, dat één
der phenolische hydroxylgroepen van phomazarine een bij-
zondere plaats in het molecule inneemt. Bij het methyleeren
van decarboxy-phomazarine volgens Purdie worden namelijk
twee methoxylgroepen snel ingevoerd, terwijl de derde
hydroxylgroep veel langzamer reageert. Ook andere onder-
zoekingen wijzen op deze eigenaardigheid, n.1. bepalingen
van het aantal actieve waterstofatomen volgens L. Tschu-
gaeff en Th. Zerewitinoff. De heer Drs. G. C. v. Wessem
was zoo vriendelijk, deze bepaling bij twee phomazarine-
derivaten volgens de nieuwe micromethode van A. Soltys
te verrichten, waarvoor ik hem ook op deze plaats mijn harte-
lijken dank betuig.

verwachten, n.1. één afkomstig van de carboxylgroep en drie
van de hydroxylgroepen. De analyse bewijst echter, dat
slechts drie van deze vier actieve waterstofatomen reageeren.
Om te onderzoeken, welke groepen hiervoor in aanmerking
kwamen, werd de bepaling herhaald met dimethoxy-decar-
boxy-phomazarine. Hier bleek geen actieve waterstof aan-
wezig te zijn. Niettegenstaande dit feit moet dimethoxy-
decarboxy-phomazarine toch nog een hydroxylgroep bevatten,
aangezien de stof methoxyl- en acetyl-derivaten kan vormen.

Het was van belang te weten, of de oxygroep, welke dit
afwijkend karakter heeft, identiek is met een der hydroxyl-
groepen in de „orthoquot;positie van de chinonkern. Om dit te
onderzoeken, behandelde ik dimethoxy-decarboxy-phomaza-
rine met aceto-boorzuuranhydride. Inderdaad bewees de daar-
bij optredende dieproode kleur, dat één der ,,orthoquot;-oxy-
groepen niet gemethyleerd is. Deze groep onderscheidt zich
dus van de andere hydroxylgroepen; klaarblijkelijk wordt dit
door den invloed van het stikstofatoom veroorzaakt en het lag
voor de hand, een samenhang tusschen de verschillende op-
vallende reacties, zooals isomeriseering van trimethoxy-
decarboxy-phomazarine, gedrag van dimethoxy-decarboxy-
phomazarine t.o.v. aceto-boorzuuranhydride en de afwijkende
ZEREWiTiNOFF-bepaling, te zoeken. Zij zouden misschien te
verklaren zijn door phomazarine te formuleeren als een
phenol-betaïne (XV), waarbij dus de ,,bijzonderequot; hydroxyl-
groep met het tertiaire stikstofatoom onder zoutvorming
gereageerd heeft.

Het lijkt mij wenschelijk, de experimenteele gegevens ook
in een structuurformule tot uiting te brengen; er moet
hierbij echter uitdrukkelijk op gewezen worden, dat de for-
mule XV in menig opzicht zuiver hypothetisch is en alleen
als type van een mogelijke structuur beschouwd moet worden.

Dat phomazarine niet uitsluitend in den betaïnevorm voor-
komt, blijkt o.a. uit de vorming van een triacetyl-derivaat.
Er bestaat dus een evenwicht tusschen beide vormen.

In dit verband moge gewezen worden op de recente onder-
zoekingen over enolbetaïnen, welke uitgevoerd zijn door
F. Kröhnke en medewerkers^®), volgens welke toevoeging
van alkali het evenwicht verschuift naar de zijde van het
enol-betaïne, terwijl in zuur milieu het optreden van de niet-
polaire verbinding begunstigd is.

Terwijl oorspronkelijk verondersteld werd, dat de isomeri-
satie van trimethoxy-decarboxy-phomazarine over een inter-
mediair additieproduct met methyljodide verloopt, lijkt het
om deze redenen meer waarschijnlijk, dat de methyleering
van decarboxy-phomazarine door het volgende schema aan-
gegeven wordt ¹): (XVI)

De evenwichten in dit schema zullen door een alkahsche
reactie van het milieu steeds naar rechts verschoven worden. Dit
geeft dus de verklaring voor het feit, dat bij de methyleering

ochj o

CHj3

Afi

trimethoxy-decarboxy-phomazarine
tertiair amine {geel)nbsp;betaïne {oranjerood)

van decarboxy-phomazarine met behulp van methyljodide
en zilveroxyde slechts weinig van het gele trimethoxy-

OOK O

decarboxy-phomazarine gevormd wordt en bij de methyleering
van dimethoxy-decarboxy-phomazarine bijna geheel niets.
Aan den anderen kant reageert phomazarine in zure oplossing
in zijn niet-polairen vorm, zooals bij de acetyleering.

De opvatting, dat phomazarine een enol-betaïne is, stelt
ons niet alleen in staat, de bij de methyleering opgemerkte
verschijnselen te begrijpen, zij geeft ons ook een verklaring
wat betreft de kleur van bepaalde phomazarine-derivaten.
Volgens F. Kröhnke zijn de enol-betaïnen gekleurde ver-
bindingen. Een verbinding als b.v. het phenacyl-pyridinium-
enol-betaïne (XVII) is geeloranje gekleurd:

Het gele trimethoxy-decarboxy-phomazarine is overeen-
komstig zijn chinoïde structuur geel gekleurd, daarentegen
is de isomere betaïnevorm oranjerood, klaarblijkelijk omdat
er een nieuw chromophoor bijgekomen is. In dit verband
moet dan ook nog opgemerkt worden, dat de kleur van den
vorm van phomazarine misschien eveneens te ver-
klaren zou zijn uit de polaire structuur van een phenol-
betaïne.

Over de plaats van de buiten de structuur-formule ge-
schreven hydroxyl-, methoxyl- en n-butylgroep valt tot nu
toe niets met zekerheid te zeggen.

Om de beschikking te hebben over een voldoende hoeveel-
heid phomazarine, was het noodzakelijk om op groote schaal
cultures van Phoma terrestris Hansen aan te leggen. De
voedingsbodem bestond uit:

In 350 Erlenmeyerkolven van 750 cm® werden telkens
180 cm® van deze voedingsoplossing gebracht. De kolven
werden met een wattenprop gesloten en op drie achtereen-
volgende dagen gedurende dertig minuten op 100° verhit.
Na de sterilisatie voegde ik aan elke kolf 5 cm® van een
steriele 5 proc. natriumcarbonaatoplossing toe, de Ph bedroeg
hierna 6,8—7,0. Natuurlijk werd bij alle bewerkingen de in
de microbiologie gebruikelijke methodiek toegepast.

Als entmateriaal gebruikte ik vijf dagen oude cultures van
Phoma terrestris Hansen op Czapek-Dox agar (30 cm®
2 proc. agar in kolfjes van 100 cm® inhoud), welke gekweekt
waren bij 22°. Deze werden geschud met 20 cm® steriel

water en de ontstane schimmelsuspensie verdeeld over de
kolven met voedingsoplossing. Daarna kweekte ik de schimmel
gedurende dertig dagen bij 22°. Na dezen tijd was dan in
iedere kolf een dik, viltachtig mycelium gevormd. De schim-
melmassa werd nu in een doek uitgeperst en vervolgens in
water gebracht, dat ik in den loop van vier en twintig uur
twee maal ververschte. Het mycelium bracht ik dan over op
een Büchnertrechter en filtreerde zoo scherp mogelijk af.
Teneinde ook het resteerende water te verwijderen, behandelde
ik de massa gedurende vier en twintig uur met alcohol.
Nadat weer door persen de grootste hoeveelheid alcohol ver-
wijderd was, werd de bovenbeschreven bewerking nog eens
herhaald, maar nu met aether als extractiemiddel. Tenslotte
werd de thans brokkelige massa bij 40° in vacuo gedroogd
en daarna het mycelium gepoederd. In totaal verkreeg ik op
deze wijze 620 g van een donkerpaars poeder.

Het gedroogde mycelium werd in Soxhlet-apparaten in
porties van vijftig gram eerst met aether, daarna met aceton
geëxtraheerd en wel zoolang als de oplosmiddelen begeleidende
stoffen opnamen. Daarna werd de wederom gedroogde massa
gedurende twee uur behandeld met ca. 10 proc. zwavelzuur.
Vervolgens filtreerde ik de massa scherp af en waschte zoo-
lang met water uit, totdat het waschwater geen reactie op
zwavelzuur meer gaf. Het tusschen filtreerpapier gedroogde
mycelium werd nu in een vacuum-Soxhlet-apparatuur, welke
geheel van glas vervaardigd was, met droge pyridine bij
ca. 45° geëxtraheerd. De kleurstof loste snel op met een
paarsroode kleur en na eenigen tijd kristalliseerden er oranje
kristallen uit. Na affiltreeren en drogen werden de kristallen
omgekristalliseerd uit pyridine. Er ontstonden oranje ge-

Om deze kristallen te zuiveren, werden zij eenige malen
omgekristalliseerd uit alcohol of aceton, waarbij het smeltpunt
tot 197° steeg. Een verdere zuivering trachtte ik nog te be-
reiken door de kleurstof op te lossen in 0,01 n KOH, gevolgd
door aanzuren met verdund zwavelzuur. Het phomazarine
slaat dan neer in den vorm van amorfe, oranje vlokjes. Deze
kristalliseerden uit alcohol; het smeltpunt was echter door
deze behandeling niet verhoogd. In totaal verkreeg ik uit
60 1 voedingsbodem 9,8 g phomazarine.

Voor de elementair-analyse werd de stof steeds bij 80°
in hoogvacuum boven P^Og gedroogd.

I.nbsp;Praeparaat omgekristalliseerd uit pyridine en daarna vier maal
uit alcohol; smpt. 197° C.

Schoeller: 4,437 mg stof: 9,590 mg COj en 1,730 mg H^O
3,027 mg stof: 0,108 cm» N^ bij 25° en 748 mm.

neergeslagen met verd. H^SO, en omgekristalliseerd uit
alcohol; smpt. 197° C.
Schoeller: 5,415 mg stof: 11,745 mg COjj en 2,170 mg HjO.

3,758 mg stof: 0,129 cm^ N^ bij 25,5° en 767 mm.
3,482 mg stof: 2,150 mg AgJ.
III. Praeparaat als analyse I, daarna twee maal omgekristalliseerd

3,717 mg stof: 0,130 cm' N, bij 22° en 744 mm.
3,119 mg stof: 5,10 cm'n/100 thiosulfaatopl.

*) De micro-analyses werden meestal in het laboratorium van Dr. Ing.
A. Schoeller te Berlijn, Schmargendorf, of door den heer P. Hubers
in het Org. Chem. Lab. der Universiteit te Amsterdam uitgevoerd.

I. C 58,96 %; H 4,33 %; N 3,97 %;
II. C 59,15 %; H 4,45 %; N 3,92 %; OCH3 8,14 %.
III. C 58,74 %; H 4,41 %; N 3,96 %; OCH3 8,45 %.

Alle analysewaarden wijzen dus op de samenstelling
CigH^OgN, alleen de waarde voor de stikstof werd telkens
ca. 0,3 % te hoog gevonden. Zooals later zal blijken, toonen
ook de analyses van phomazarine-derivaten dezelfde afwijking.

Phomazarine bezit geen karakteristiek absorptiespectrum;
een alcohoUsche oplossing van de kleurstof vertoont een
breeden band, welke zich in het zichtbare spectrum uitstrekt
van het groen tot aan het violet.

Moleculairgewichtsbepaling van trimethoxy-
decarboxy-phomazarine .
I. 0,344 mg stof in 3,824 mg kamfer: smeltpuntsdepressie 9,2°
II. 0,276 mg stof in 2,861 mg kamfer: smeltpuntsdepressie 9,9°
Berekend voor CgiHagOeN M.G. = 385
Gevonden I. M.G. = 391
II. M.G. = 390.

Phomazarine-methylester.
25 mg phomazarine werden gedurende 4 uren met 10 cm®
11/2 proc. methylalcoholisch zoutzuur op een waterbad ge-
kookt. Hierbij gaat de kleurstof in oplossing; na afkoelen
ontstaat een kristallisaat, dat bestaat uit oranje naalden.
Het smeltpunt van deze kristallen ligt bij 212—213°
onder ontleding, na twee maal omkristalliseeren uit alcohol
bedraagt het 213°, en blijkt dan bij verder omkristalliseeren
constant. De stof vormt oranje naalden met een bronsachtigen
glans. Opbrengst 19 mg.

25 mg phomazarine werden opgelost in 10 cm® droge
pyridine en vervolgens 1 cm® azijnzuuranhydride toegevoegd.
Bijna oogenblikkelijk werd de aanvankelijk donkerroode kleur
lichter, totdat na enkele minuten de kleur goudgeel was. Ik
bracht de oplossing daarna op stukjes ijs, waaraan zoo veel
verdund zwavelzuur was toegevoegd, dat juist alle pyridine
gebonden werd. Er ontstond een geel, vlokkig neerslag,
waarvan de kleur echter spoedig in oranje overging.

Betere resultaten verkreeg ik door de volgende methode:
25 mg phomazarine worden met 2 cm® azijnzuuranhydride,
waaraan een spoor gec. HgSO, is toegevoegd, zoo lang zacht
verwarmd (ca. 60—70°), totdat de roode kleur heeft plaats
gemaakt voor geelbruin. Na afkoelen wordt het reactie-
mengsel met weinig water bedeeld en het azijnzuuranhydride
voorzichtig bij lage temperatuur ontleed. De gevormde gele
vlokjes worden in dit geval iets minder snel oranje dan bij
de eerste acetyleering. Na affiltreeren en drogen kon de stof
uit butylalcohol omgekristalliseerd worden; hierbij ontston-
den gele naalden, welke zich echter na eenigen tijd steeds
weer zwak oranje kleurden, ook na meerdere malen om-
kristalliseeren. De stof smolt onscherp bij 180—185° onder
sterke ontleding. Opbrengst 9 mg.

4,730 mg stof: 10,093 mg COj en 1,933 mg Hp.
3,719 mg stof: 0,099 cm» N^ bij 22° en 744 mm.
Berekend voor CasHsjjOuN of Ci.H^ObN (OCOCHa), (513):

Een acetylbepaling werd niet uitgevoerd, omdat deze
stof zeker niet geheel zuiver was.

30 mg phomazarine-methylester werden zacht verwarmd
met 3 cm® azijnzuuranhydride, waaraan een spoor gec.
H2SO4 was toegevoegd. Spoedig maakte de oorspronkelijk
roode kleur van de oplossing plaats voor geel. Na afkoelen
werd het azijnzuuranhydride zeer voorzichtig met water
ontleed. Hierbij kristalliseerden gele naaldjes uit, welke vaak
tot rozetten vereenigd waren. De stof sinterde bij ca. 160°
en smolt onder ontleding bij 168—169°. Het onzuivere acety-
leeringsproduct werd omgekristalliseerd uit ligroïne en vormde
dan gele, in rozetten gegroepeerde naalden, welke vanaf 160°
langzaam donkerder werden en bij 170° smolten. Opbrengst
22 mg.

3,863 mg stof: 8,415 mg COj, en 1,630 mg H^O.
3,043 mg stof: 0,079 cm» Nj bij 25° en 760 mm.
3,730 mg stof: 3,370 mg AgJ.
Berekend voor C^eHjsOiiN of CisHmOaN (O.CO.CH3)3(OCH3)2 (527).

C 59,20 %; H 4,75 %; N 2,66 %; OCH3 11,77 %.
Gevonden: C 59,40 %; H 4,71 %; N 2,93 %; OCH3 11,91 %.

10,40 mg stof: 2,77 cm» 0,0212 n NaOH.
Berekend voor Ci8Hi„03N(0.C0.CH,),(0CH3),:

10 mg phomazarine werden bedeeld met 0,5 cm® azijnzuur-
anhydride, 25 mg electrolytzinkstof en 25 mg natrium-
acetaat en zacht verwarmd. De aanvankelijk roode kleur
werd eerst roodbruin en ging dan langzaam in bruin over.
Na afkoelen werd het azijnzuuranhydride met water ontleed,
waarbij bruine vlokjes neersloegen. Deze konden uit geen
enkel oplosmiddel kristallijn verkregen worden.

25 mg phomazarine werden in 20 cm® alcohol opgelost en
met 15 mg platina-oxyd-katalysator volgens Adams-Shriner
gehydreerd in een toestel voor microhydreering. Bij deze
reactie nam de kleurstof 1,61 cm® waterstof op, terwijl ik
berekende, dat voor een dubbele binding 1,46 cm® opgenomen
moesten worden. Bij de hydreering werd de oranjegele pho-
mazarine-oplossing langzaam donkerder en er ontstond een
paarsachtig donkerbruin gekleurd neerslag. Dit werd afge-
filtreerd en aan de lucht gedroogd. Na ca. 10—12 uur
was de kleur weer oranje geworden. De stof smolt na
omkristaUiseeren uit alcohol bij 197°. Het mengsmeltpunt

M) Voor de bereiding van de electrolytzinkstof zie men het voor-
schrift van F. Hansgirg, geciteerd door W. B. Deys, diss. Utrecht
(1934).

met phomazarine vertoonde geen depressie, dus was de kleur-
stof uit het donkere neerslag geregenereerd.

15 mg phomazarine werden opgelost in 10 cm® 0,01 n KOH
en vervolgens op de bekende wijze gehydreerd met 15 mg
platina-oxyd-katalysator. De kleurstof nam 1,15 cm® water-
stof op, terwijl de berekende hoeveelheid voor een dubbele
binding 1,04 cm® bedroeg.

De paarse kleur van het kaliumzout bleef gedurende de
hydreering onveranderd. Wanneer ik de gehydreerde oplos-
sing echter voorzichtig aanzuurde, ontstond er een donker-
bruin vlokkig neerslag, dat bij drogen aan de lucht weer
oranje kleurde. Na omkristalliseeren uit alcohol was ook hier
het smeltpunt en het mengsmeltpunt met phomazarine 197°.

Zoowel in neutraal als in alkalisch miHeu neemt phomaza-
rine bij hydreeren met platina-oxyd dus 1 mol waterstof op,
onder vorming van een donkergekleurde dihydro-verbinding.
Deze dihydro-verbinding oxydeert aan de lucht weer tot
phomazarine.

25 mg phomazarine werden op de bekende wijze in alcoholi-
sche oplossing gehydreerd. Het gevormde neerslag van de
dihydro-verbinding werd onder uitsluiting van lucht afge-
filtreerd door een Jena glasfilter G III. Het neerslag werd
daarna, steeds onder uitsluiting van lucht, behandeld met
warm azijnzuuranhydride, waaraan een spoor gec. HgSO^
was toegevoegd. Bij deze behandeling werd het dihydro-
phomazarine niet geacetyleerd, tenzij ik lucht liet toetreden.
De dihydro-verbinding loste dan na voorafgaande oxydatie

met roode kleur op, terwijl spoedig een kleuromslag naar
geel optrad. Uit het reactiemengsel was dan het reeds eerder
beschreven triacetyl-phomazarine te isoleeren.

5 mg phomazarine werden opgelost in 10 cm® droge pyri-
dine, waaraan 0,5 proc. water was toegevoegd. In deze op-
lossing bracht ik 100 mg zinkstof, waarbij de vloeistof
violet kleurde. Vervolgens werd 0,1 a 0,2 cm® ijsazijn toege-
voegd en hierna veranderde de kleur van violet in violet-
blauw, terwijl tevens een sterke, paarse fluorescentie optrad.
Na toevoeging van meer ijsazijn werd de kleur van de oplos-
sing iets lichter, bij schudden met lucht kwam echter de
donkere kleur weer terug.

5 mg phomazarine werden opgelost in 2 cm® ijsazijn en dan
werd 0,5 cm® van een 5 proc. stannochloride-oplossing in ijs-
azijn, welke een spoortje zoutzuur bevatte, toegevoegd. De
oorspronkelijk oranjeroode oplossing veranderde binnen 30
minuten via bronsgroen, groen en groenblauw in diepblauw.
Bij staan aan de lucht kwam langzamerhand de oranjeroode
kleur terug, wanneer al het aanwezige stannochloride geoxy-
deerd was. Toevoeging van een nieuwe hoeveelheid stanno-
chloride gaf dan weer de zoo juist beschreven verschijnselen.

5 mg phomazarine werden opgelost in 2 cm® absolute
benzol en hierbij voegde ik een kleine overmaat van een

oplossing van stannichloride in absolute benzol. Dadelijk ont-
stond een paars neerslag, dat bij behandelen met water een
oranje gekleurde tinlak leverde. Na affiltreeren en drogen
van deze verbinding werd zij op een platinablikje verascht.
Er bleef een witte aschrest van stanni-oxyde achter.

5 mg phomazarine werden opgelost in 1 cm® azijnzuur-
anhydride en vervolgens werden 5 mg aceto-boorzuuranhy-
dride, dat in azijnzuuranhydride was opgelost, toegevoegd.
De oplossing kleurde langzaam donkerpaars, sneller wanneer
ik korten tijd op 50° verwarmde. Nu bereidde ik een 0,1 n
aceto-boorzuuranhydride-oplossing. Deze werd gesteld met
behulp van 0,1 n baryt (volgens de methode van O. Dimroth
met als indicatoren neutraalrood en phenolphtaleïne). Van
phomazarine werd nu een oplossing in azijnzuuranhydride
bereid, welke tien maal zoo sterk verdund was als de op-
lossing van aceto-boorzuuranhydride. Bij 10 cm® van deze
oplossing voegde ik nu 1 cm® van de oplossing van aceto-
boorzuuranhydride, waarbij de kleur donker w ij n r o o d
werd. Bij een tweede hoeveelheid van 10 cm® phomazarine-
oplossing voegde ik 2 cm® van de oplossing van aceto-boorzuur-
anhydride. Bij verwarmen op 50° werd de kleur donker-
paars. Er zijn bij de reactie van phomazarine met aceto-
boorzuuranhydride dus duidelijk twee stadia te onderscheiden.

Wordt een phomazarine-oplossing, welke een overmaat van
aceto-boorzuuranhydride bevat, gekookt, dan verandert de
paarse kleur niet. Bij toevoeging van water ontstaat een
oranje neerslag, dat na omkristalliseeren identiek bhjkt te
zijn met phomazarine. Volgens O. Dimroth is er dus geen

hydroxylgroep in meta-positie aanwezig, daar deze geace-
tyleerd zou moeten zijn gedurende de beschreven bewerkingen.

1 mg phomazarine bracht ik in een smeltpuntsbuisje, dat
voorzien was van een wijder bovengedeelte. Nu werd het
buisje geëvacueerd tot een druk van 0,001 mm, en de capillair
nabij het wijde gedeelte tot een haarcapillair uitgetrokken
en dichtgesmolten. Vervolgens verwarmde ik het phomazarine
tot even boven het smeltpunt, waarbij onder sterk opschui-
men ontleding plaats vond. De capiUair werd nu omgekeerd
in een buisje geplaatst, dat een weinig baryt bevatte, en ver-
volgens door stooten geopend. Het ontwijkende CO^ gaf hierbij
een neerslag van bariumcarbonaat.

50 mg phomazarine werd in een sublimeeringsapparaat
bij 0,001 mm druk op 220—230° verhit. Het gevormde

decarboxyleeringsproduct subUmeerde als een donkerroode
kristalmassa. Op den bodem van de buis bleef een geringe
hoeveelheid verkoolde stof achter (ong. 4 mg). De aan de
koeler hechtende kristallen werden opgelost in warmen alcohol
en kristaUiseerden daaruit bij afkoeling in donkerroode
blaadjes. Soms ook vormde de stof eenigszins hchter gekleurde,
breede, lensvormige naalden. Beide vormen kwamen naast
elkaar voor. Het smeltpunt van de geheel zuivere kristallen
bedroeg 254°. De opbrengst was 35 mg. Voor de analyse
werd de stof bij 80° in hoogvacuum boven V^O^ gedroogd.

4,363 mg stof: 10,056 mg COj en 2.000 mg H,0.
4,562 mg stof: 0,169 cm» N, bij 23° en 759 mm.
5,170 mg stof: 9,37 cm» n/100 thiosulfaatopl.
Berekend voor CigHuO.N (343):

C 62,97 %; H 4,96 %; N 4,08 %; OCH, 9,04%.
Gevonden: C 62,86 %; H 5,13 %; N 4,27 %; OCH, 9,37 %.

20 mg decarboxy-phomazarine werden met 0,5 cm' azijn-
zuuranhydride, waaraan een spoor gec. HgSOi was toege-
voegd, zacht verwarmd. Daarbij verkleurde de aanvankehjk
roodbruine oplossing spoedig naar geelbruin en bij het ont-
leden van het azijnzuuranhydride met water ontstonden gele
vlokjes. Deze kristalliseerden als gele naaldjes uit een mengsel
van gelijke deelen azijnzuuranhydride en ijsazijn. Bij 210°
begon de stof zich donkerder te kleuren en smolt bij ongeveer
250°. Door de toenemende verkleuring was het smeltpunt
niet scherp waar te nemen.

3,254 mg stof: 7,330 mg CO, en 1,520 mg H,0.
3,152 mg stof: 0,093 cm' Nj bij 23° en 764 mm.
3,761 mg stof: 4,90 cm' n/100 thiosulfaatopl.
4 262 mg stof: 2.60 cm» n/100 NaOH.

Ber. vwr Cj4H„0,N of C„H„0,N(0.C0.CH,)3(0CH3) (469):
C 61,41 %; H 4,90 %; N 3,00 %; OCH, 6,61 %; COCH,
27,51 %.

droge chloroform en vervolgens werden 150 mg zilver-
oxyde benevens 0,5 cm» gedestilleerd methyljodide toege-
voegd. Deze oplossing werd gedurende 5 uur gekookt, daarna
gefiltreerd en in vacuo verdampt. Het residu loste ik weer op
in 5 cm® chloroform en voegde nogmaals 100 mg AggO en
0,5 cm® CHgJ toe. Na 3 uur koken werd de oplossing weer
gefiltreerd en in vacuo verdampt; er bleef een donkerrood-
bruin residu achter. Ik behandelde dit met 5 cm® kokende
ligroïne. Een gedeelte van de stof ging met roodbruine kleur
in oplossing en na afkoelen kristalliseerden hieruit gele naal-
den, welke nog verontreinigd waren met oranje, olieachtige
producten. Nadat dit product eenige malen was omgekristalli-
seerd uit ligroïne, had het een zuiver gele kleur en smolt
bij 159°. De laatste sporen verontreiniging konden slechts
verwijderd worden door omkristaUiseeren uit alcohol. Uit
dit oplosmiddel — waarin de stof in onzuiveren toestand zeer
sterk oplosbaar is, maar met toenemende zuiverheid steeds
jjiinder — kristalliseerden lichtgele, tot rozetten en schoven
vereenigde naaldjes, welke bij 160° smolten. Opbrengst 8 mg.
Voor de analyse werd de stof bij 50° in hoogvacuum boven
P2O5 gedroogd.

De in Ugroïne onoplosbare rest was oranje gekleurd. Deze
werd drie maal uit weinig benzol omgekristalhseerd. De

zuivere stof vormde dan licht oranje gekleurde naaldjes,
welke meestal in rozetten gegroepeerd waren. Het praeparaat
begon bij 170° te verkleuren en smolt bij 184—185° onder
ontleding. Volgens de methoxyl-bepaling bevatte de stof drie
OCHg-groepen; bij de methyleering waren dus twee methoxyl-
groepen ingevoerd. De stof is een dimethoxy-decarboxy-
phomazarine. Opbrengst 26 mg.

3,070 mg stof: 7,310 mg CO2 en 1,700 mg HjO.
4,046 mg stof: 0,122 cm» Nj bij 24° en 768 mm.
3,416 mg stof: 8,12 cm» n/50 thiosulfaatopl.

10 mg phomazarine werden goed vermengd met 200 mg
electrolyt-zinkstof en dan in een buisje voor „micro-zinkstof-
destillatiequot; gebracht, zooals dat door F. Kögl en mede-
werkers beschreven werd. In het begin verhitte ik met
een kleine vlam, daarna iets sterker. Er destilleerde een
nauwelijks waarneembare nevel over, welke in het koudere
gedeelte van het buisje tot kleine oliedruppeltjes conden-
seerde. Deze werden in aether opgelost. Uit 100 mg phoma-
zarine verkreeg ik op deze wijze slechts 3 mg van een lichtgeel
gekleurde olie, welke niet tot kristalliseeren was te brengen.
Een poging, om hieruit een pikraat te bereiden, mislukte.
Bovendien was de zeer kleine opbrengst een beletsel om
hiermede nog verdere onderzoekingen te verrichten.

*■gt;) F. Kögl e.m., Ann. 445, 159 (1925); Ann. 447, 78 (1925); Ann.
479, 11 (1930); Ann. 482, 105 (1930); Ann. 515, 10 (1935).

Destillaties met zinkstof van derivaten van phoma-
zarine, zooals decarboxy-phomazarine en het later te be-
schrijven desmethyl-phomazarine hadden geen beter resultaat.

100 mg phomazarine werden opgelost in 25 cm® ijsazijn
en deze oplossing op ca. 60—70° verwarmd. Hierin bracht ik
langzaam vast lood-tetra-acetaat, waarbij de kleur eerst in
bruin en daarna in geel veranderde. Dit stadium werd bereikt,
wanneer ongeveer 900 mg lood-tetra-acetaat toegevoegd
waren, hetgeen overeenkwam met ongeveer acht molen. Ik
verdunde de oplossing dan met het vijfvoudige volume water
en schudde daarna de vloeistof met aether uit. Bij verdampen
van de aether bleef een bruine olie achter, welke enkele
kristallen bevatte. De olie had een gewicht van 20 mg en
was goed oplosbaar in water in tegenstelling met de kristallen.
Er bleven ca. 2 mg bruine kristallen onopgelost, welke bij
196° smolten en vermoedelijk uit onomgezet phomazarine
bestonden. De olie (16 mg), welke een sterken reuk had naar
vluchtige vetzuren, werd in 80 proc. alcohol opgelost en een
kleine hoeveelheid calcium-acetaat-oplossing toegevoegd. Daar
er geen neerslag ontstond, waren volgens H. Raistrick
e.m. «) dus behalve vluchtige vetzuren geen andere organische

Het met aether uitgeschudde reactiemengsel werd met
behulp van 10 proc. NaOH-oplossing zwak alkaUsch gemaakt
en weer met aether geëxtraheerd. Na drogen en verdampen
van de aether bleef 0,6 mg van een kleurlooze olie, welke

sporen van kristallen bevatte, achter, wat natuurlijk niet
voldoende was voor een meer diepgaand onderzoek.

25 mg phomazarine werden gedurende 3 uur met 3 cm®
joodwaterstof-oplossing (d. 1,7) gekookt. Na afkoelen werd
de vloeistof met het viervoudige volume water verdimd.
Hierbij ontstond een oranje, vlokkig neerslag, dat na
affiltreeren en wasschen met water blauwgroen kleurde. Waar-
schijnlijk is bij het koken met joodwaterstof-oplossing de
kleurstof gereduceerd en treedt aan de lucht reoxydatie op,
waarbij de blauwgroene stof ontstaat. Het product weegt na
drogen 21 mg; het heeft een geringe oplosbaarheid in de
meeste organische oplosmiddelen. Bij verwarmen met alcohol
verandert de groene kleur in bruin. Het groene desmethyl-
product is eveneens met groene kleur oplosbaar in verdunde
loog; bij aanzuren slaan weer groene vlokjes neer. De alkali-
sche oplossing kleurt na eenigen tijd bruin.

250 mg phomazarine werden opgelost in 20 cm® gec. HgSO^
en daarna voegde ik onder koelen voorzichtig 20 cm® water toe
en vervolgens 6 cm® van een mengsel van gelijke deelen
30 proc. HA en gec. HaSO«. Deze oplossing werd gedurende
20 uur op 50° verhit; de aanvankelijk oranjeroode vloeistof
was dan lichtgeel gekleurd. Het reactiemengsel verdunde ik
met 250 cm® water en verkreeg dan met aether een geel
gekleurd extract. De aether bevatte 33 mg van een niet-
kristaUiseerende bruine olie, welke een sterken reuk naar
vluchtige vetzuren had (fractie A).

gemaakt en weer met aether uitgeschud. De aether bevatte
8 mg van een kleurlooze stof, welke in witte naalden en
dendrieten kristalliseerde, echter nog met een hoeveelheid
Uchtgele ohe verontreinigd was (fractie B). Op deze wijze
werden 850 mg phomazarine geoxydeerd, meestal in porties
van 25 mg, omdat de opbrengst aan oxydatieproducten bij
verwerking van grootere hoeveelheden slechter was. In totaal
verkreeg ik 106 mg van fractie A en 25 mg van fractie B.

Het eerste product kon ik in twee fracties scheiden, 95 mg
van een in natriumbicarbonaat oplosbare olie, welke een
sterken reuk naar vluchtige vetzuren had en 7 mg van een
neutraal product, dat in kleurlooze naalden kristalliseerde,
maar dat niet identiek was met fractie B. Deze hoeveelheid
was te klein om het product nader te onderzoeken. De zuur
reageerende oliefractie werd onderworpen aan een destillatie
met waterdamp. Het destillaat neutraliseerde ik met 0,1 n
NaOH, hiervan verbruikten de zuren 9,8 cm®; na verdampen
van hét water bleven 114 mg natriumzouten achter. Deze
werden opgelost in 1,5 cm® water en daarbij 2,5 cm® alco-
hol gevoegd, vervolgens bracht ik 250 mg co-broom-p-phenyl-
acetophenon in deze oplossing en verhitte het mengsel gedu-
rende 1 uur op een waterbad. Na afkoelen kristalliseerden
95 mg van een kleurlooze stof, welke echter gele olieachtige
verontreinigingen bevatte. Bij indampen van de moederloog
tot de helft van het volume, kristalliseerde nog een tweede
esterfractie, welke 120 mg woog. Door behandelen met dier-
lijke kool in aetherische oplossing werden beide producten
van de olieachtige verontreiniging bevrijd. Het sme tpunt
van de eerste fractie lag bij 75°, dat van de tweede fractie
bij 4amp;-50°. Beide hoeveelheden kristalliseerde ik verscheidene
malen om uit verdunden alcohol; zij smolten toen bij 97 ,
respectievelijk 63-«3,5° en deze smeltpunten bleven bij ver-

der omkristalliseeren constant. Een mengsmeltpunt van het
bij 97° smeltende product met de n-boterzure p-phenyl-
phenacylester vertoonde geen depressie. Hetzelfde vond ik
bij het mengsmeltpunt van de laag smeltende verbinding met
de n-valeriaanzure p-phenyl-phenacylester. Ook de analyses
gaven waarden, welke overeenkwamen met de samenstelling
van de n-boterzure resp. n-valeriaanzure p-phenyl-phenacyl-
ester. Beide esters werden voor de analyse in hoogvacuum
boven P2O5 gedroogd.

Fractie B werd als volgt gezuiverd: Met behulp van laag
kokende petroleum-aether (kpt. 40—60°) werd de olieachtige
verontreiniging grootendeels verwijderd, de rest loste ik
op in weinig benzol en voegde het tienvoudige volume laag
kokende petroleum-aether toe, waarbij enkele kleurlooze vlok-
jes neersloegen. Het filtraat werd in vacuo verdampt, waarbij
er 12 mg van een witte kristallijne stof achterbleven, welke
een smeltpunt van 220° had. Nu werd omgekristalliseerd uit
alcohol; opbrengst 7 mg met een smpt. van 225°. Uit dit
nog onzuivere product verkreeg ik tenslotte door de stof om
te kristalliseeren uit aethylacetaat 4 mg witte naaldjes, welke
bij 226° smolten. Deze hoeveelheid was helaas te gering om
een volledige elementair-analyse mogelijk te maken. Zoowel
een stikstof- als een methoxyl-bepaling hadden bij deze stof
echter een negatief resultaat.

40 mg trimethoxy-decarboxy-phomazarine werden opge-
lost in 2 cm® gedestilleerd methyljodide en in een toe-
gesmolten buis 10 uur op 100° verhit. De oorspronkelijk
goudgele kleur was dan roodbruin geworden. Het methyl-
jodide werd nu bij verminderden druk verdampt, en het
achterblijvende roodbruine residu in weinig chloroform op-
gelost. Nu voegde ik zooveel absoluten aether toe, dat de
oplossing juist troebel werd. Bij afkoelen op 0° kristaUiseerden
oranjeroode naalden uit. Na nogmaals omkristalliseeren uit
chloroform-aether bedroeg het smeltpunt 193°, en dit bleef
bij herhalen van deze bewerking constant.

3,861 mg stof: 9,130 mg CO^ en 2,090 mg H^O.
3,873 mg stof: 0,118 cm» N,, bij 22° en 767 mm.
3,249 mg stof: 7,63 cm' n/50 thiosulfaatopl.

De in ligroïne oplosbare fractie van de methyleering van
decarboxy-phomazarine volgens Purdie bevat behalve het
gele trimethoxy-decarboxy-phomazarine nog een stof, die na
verdampen van de Hgroïne bij verminderden druk als een
roodbruine olie achterblijft. Ook uit deze oUe kon ik het
geïsomeriseerde product verkrijgen. De isoleering werd ver-
gemakkelijkt, doordat de stof de eigenschap heeft m warm
water vrij goed oplosbaar te zijn, na afkoelen kristalliseeren
dan lange, fijne naalden uit. Deze werden omgekristalliseerd

uit chloroform-aether op de boven beschreven wijze en hadden
dan eveneens het smeltpunt 193°. Een mengsmeltpunt met
het product uit trimethoxy-decarboxy-phomazarine gaf geen
depressie.

Wanneer ik dimethoxy-decarboxy-phomazarine bij 100°
behandelde met methyljodide, verkreeg ik uit het reactie-
mengsel ook weer het geïsomeriseerde product met het smelt-
punt 193°.

Zoowel uit het bij de methyleering volgens Purdie reeds
gevormde trimethoxy-decarboxy-phomazarine, als uit het
dimethoxy-decarboxy-phomazarine kan dus het trimethoxy-
decarboxy-phomazarine-enolbetaïne gevormd worden. Dit
verklaart de slechte opbrengst aan trimethoxy-decarboxy-
phomazarine, dat klaarblijkelijk op de genoemde wijze verder
reageeren kan.

95°: 0,21 cm» CH,
Bepaling bij 20quot;: 5,718 mg stof: 1,09 cm» CH,
blanco: 0,17 cm» CH,

5,718 mg stof: 0,92 cm» CH,
Gevonden: aantal actieve H atomen = 2,78.
Bepaling bij 95°: 5,718 mg stof: 1,23 cm» CH,
blanco: 0,21 cm» CH,

Dintethoxy-decarboxy-phomazarine {zelfde praeparaat als bij ele-
mentair analyse).

8,817 mg stof: —0,01 cm» CHi
Gevonden: geen actieve H atomen aanwezig.
Bepaling bij 95°: 8,837 mg stof: 0,23 cm» CH,

De onderzoekingen van Verkade en medewerkers over
de afbraak van de verzadigde vetzuren in het dierhjk orga-
nisme hebben het bestaan van een w-oxydatie, als een proces
van groote physiologische beteekenis, naast de ^-oxydatie,
zeer aannemelijk gemaakt.

Op grond van de thans bekende feiten is het onmogelijk,
met eenige zekerheid uitspraken te doen over de structuur
der primaire ozoniden.

R Pummerer en H. Richtzenhain, A. 529, 33 (1937).
c.'d. Harries,nbsp;A. 374, 303 (1910).

Hoewel het onderzoek van Levene en Christman naar de
katalytische reductie van glucosamine te wenschen overlaat,
is het toch zeker een waarschuwing tegen het te eenvoudig
voorstellen van het verloop eener katalytische hydreering.

De door Diels uit cholesterylchloride door dehydreeren
met selenium verkregen koolwaterstof CigH^g moet als identiek
met het door Bergmann en Hillemann synthetisch ver-
kregen y-methyl-l,2-cyclopenteno-phenantreen worden be-
schouwd.

Tegen de door Caspar bij de isoleering van type-specifieke
koolhydraten uit gonococcen gebruikte methodiek, zijn ern-
stige bezwaren in te brengen.

Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 31, 37 (1933).
O. T. Avery en W. F. Goebel, J. Exp. Med. 58, 731 (1933).
M. Heidelberger en F. E. Kendall,

De conclusie, welke Hirschler trekt uit beschouwingen
over het verband tusschen de dampspanning en de absolute
temperatuur van verzadigde zoutoplossingen, is onjuist.

Indien in de potentiaalkrommen, welke Hamaker gebruikt
in zijn theorie van de kolloïde verschijnselen, een energie-
minimum optreedt bij grooten afstand van de deeltjes, zal
in het algemeen coacervatie optreden en niet, zooals Hamaker
aanneemt, gelvorming.

Het is noodzakelijk bij het onderzoek naar de immunisee-
rende waarde van een anatoxine, een bepaling in vivo te
verrichten, naast die in vitro.

few.

fc^fSfi»^

fmw
	\
	' -S
i.
gt;	r

	6, -f V - ;
V ' ■ . .V	t

	0 oh U 1

Y	yy
hooc	n 1 0 oh