TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN
DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE
AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT,
OP GEZAG VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS
Dr. J. BOEKE, HOOGLEERAAR IN DE FACUL-
TEIT DER GENEESKUNDE, VOLGENS BE-
SLUIT VAN DEN SENAAT DER UNIVERSITEIT
TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACUL-
TEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE TE VER-
DEDIGEN OP MAANDAG 11 APRIL 1938, DES
NAMIDDAGS TE 2 UUR

Bij het voltooien van dit proefschrift wil ik U, Oud-Hoog-
leeraren, Hoogleeraren en Lectoren der Rijks-Universiteit hartelijk
dank zeggen voor hetgeen Gij tot mijn wetenschappelijke vor-
ming hebt bijgedragen.

U, Hooggeleerde Kögl, Hooggeachte Promotor, zij een bij-
zonder woord van dank gewijd. Niet alleen het voorrecht, gedu-
rende eenige jaren Uw privé-assistent te hebben mogen zijn,
stemt mij tot groote dankbaarheid, ook wat Gij buiten ons we-
tenschappelijk werk om voor mij zijt geweest, zal ik niet licht
vergeten. Het feit, dat het door U aan mij opgedragen onderzoek
in zoo hooge mate Uw belangstelling had, was de oorzaak van
het bijzondere contact, dat ik steeds met U gehad heb en dat mij
in staat gesteld heeft, zeer veel van U te leeren. Ook hiervoor
zal ik U steeds erkentelijk blijven.

Het voor het laatste deel van mijn onderzoek benoodigde bioti-
ne kon ik in den beschikbaren tijd slechts bereiden, doordat
de I. G. Farbenindustrie A.G., Werk Elberfeld, een groot
gedeelte van de opwerking van 1000 KG. eigeel op zich had ge-
nomen. Het is mij een behoefte, den Heeren Professor Dr. H.
H ö r 1 e i n en Dr. F. Schultz voor deze grootscheepsche hulp
mijn oprechten dank te betuigen.

Verder dank ik al mijn collega's, op wier hulp ik steeds heb
mogen rekenen, in het bijzonder den Heer de Man, die mij
bij een deel der opwerking krachtig behulpzaam is geweest.

Tenslotte wil ik mijn dank betuigen aan het personeel van het
Organisch-chemisch Laboratorium voor den ijver en de bereid-
willigheid, betoond bij het overwinnen van de vele bezwaren, die
aan het opwerken van zulke groote hoeveelheden materiaal in
een Universiteitslaboratorium zijn verbonden.

In zijn In 1860 verschenen publicatie: „Mémoires sur la Fer-
mentation Alcooliquequot; beschreef Pasteur^) proefnemingen,
waarbij hij zeer kleine hoeveelheden biergist had geënt op een voe-
dingsbodem, die slechts bestond uit een waterige oplossing van
suiker, ammoniumtartraat en gistasch. Daar zijn gist zich hierin
goed ontwikkelde, concludeerde hij daaruit, dat voor den groei
der gist geen andere stoffen noodzakelijk waren, ofschoon hij
wel constateerde, dat door toevoeging van druiven-, beetwortel-
of gistsap de groei en de gistingsintensiteit sterk toenamen.

Elf jaar later verscheen een publicatie van Liebig^), waar-
in deze de juistheid van de resultaten van Pasteur in twijfel
trok. Het gelukte hem n.l. niet om zijn gist in een oplossing van
suiker, ammoniumtartraat en gistasch tot ontwikkeling te bren-
gen, wanneer hij volgens de aanwijzingen van Pasteur te
werk ging.

Oogenblikkelijk toonde Pasteur^) zich bereid, in Parijs voor
de oogen van L i e b i g zijn proeven te herhalen, desnoods met
voedingsoplossingen, samengesteld uit stoffen, die deze zelf mee
zou brengen. L i e b i g, die toen reeds tegen de zeventig was, ac-
cepteerde deze uitnoodiging niet. Doordat hij een jaar later over-
leed en niemand zijn partij overnam, was de controverse van
de baan.

Pas 30 jaar later ontdekte W i 1 d i e r s in Ide's laborato-
rium te Leuven, dat het inderdaad niet gelukte op de manier van
Pasteur op synthetische voedingsbodems gist te kweeken, als
men de enthoeveelheid maar klein genoeg nam, tenzij men een
weinig wort, gistextract, pepton of vleeschextract toediende. Dat

in het geval van een grootere enthoeveelheid de gist wel groeien
wilde, schreef W i 1 d 1 e r s toe aan de grootere hoeveelheid wort,
die tegelijk met de entgist in den voedingsbodem werd gebracht.

Op grond van zijn proeven kwam hij tot de conclusie, dat in
wort, gistextract, enz. een nog onbekende stof aanwezig moest
zijn, welke de gist noodig had om tot normale ontwikkeling te
kunnen komen. Dit onbekende iets noemde hij bios, en hij toonde
aan, dat het een organische stof moest zijn, aangezien bios wel
voorkwam in gist, maar niet in gistasch.

Deze opvattingen van W i 1 d i e r s ontmoetten zeer veel tegen-
stand. A. Fernbach^) en W. Windisch«) namen aan,
dat W i 1 d i e r s' gist in een synthetisch milieu niet groeide, om-
dat zijn zouten kleine hoeveelheden van vergiftige stoffen zouden
bevatten, welke door het eiwit uit de wort of uit het gistextract
gebonden en zoo onwerkzaam gemaakt zouden worden.

H. Pringsheim'), die zich schamper uitliet over Wil-
dier s' „levenselixerquot;, gooide het over een anderen boeg en ver-
veronderstelde, dat de gist zich bij overenting op een synthetisch
milieu eerst acclimatiseeren moest. Bij enting met een groote
hoeveelheid gistsuspensie is er dan meer kans op de aanwezig-
heid van krachtige cellen, die in staat zijn, zich aan het vreemde
milieu aan te passen dan bij enting met een kleine hoeveelheid.
Deze „verklaringquot; mag misschien opgaan bij de latere proeven
van Naumann**), die vond, dat bij entingen met 5 gistcellen
geen groei optrad en met 50 gistcellen wèl, maar voor de proeven
van W i 1 d i e r s is ze niet steekhoudend. L a s h Miller be-
rekende, dat W i 1 d i e r s toch nog altijd minstens een millioen
cellen voor zijn entingen moet hebben gebruikt®). Bovendien
legde W i 1 d i e r s heelemaal niet den nadruk op het aantal cel-
len, waarmee hij entte, maar op de hoeveelheid wort, die hij te-
gelijk met deze cellen toevoegde. Een kleine hoeveelheid gist
groeide ook op synthetisch milieu, als men maar een weinig gist-
extract toevoegde.

Overigens erkende ook P r i n g s h e i m, dat gistextract een
„buitengewoon goed cultuurmediumquot; is voor gist en hij ver-

moedde, dat gistextract een voor gist bijzonder geschikte eiwit-
achtige stof bevatte.

Intusschen ging men in Leuven rustig voort op den ingeslagen
weg. Het gelukte A m a n d de op hypothesen „gefundeerdequot;
bezwaren van Fernbach en Windisch te weerleggen. Hij
vond ook, dat het bios gedurende den groei van de gist uit de
voedingsoplossing verdween, dus verbruikt werd.

Ide^^) kon geen acclimatisatie bij de door hem gebruikte gist
constateeren. Integendeel, wanneer zijn gistcellen gedurende
eenigen tijd in een biosarme voedingsoplossing hadden moeten
leven, bleken zij zoo zeer verzwakt, dat ze zelfs bij toevoeging
van bios niet meer tot normale ontwikkeling waren te brengen.

R. D e v 1 O 0 die op het werk van W i 1 d i e r s voortbouw-
de, onderzocht verschillende natuurproducten en ontdekte, dat
diegene, welke choline bevatten, ook biosactiviteit vertoonden.

Choline zelf bleek echter onwerkzaam te zijn. Lecithine-pre-
paraten waren actief. Maar pogingen om het bios te isoleeren
bleven vruchteloos.

A. Kossowicz^^) ontdekte, dat gist wel kon groeien op
een synthetischen voedingsbodem, wanneer deze door schimmels
of bacteriën geïnfecteerd was.

Langzamerhand verminderde de kritiek, doch dit was niet al-
leen een gevolg van de onderzoekingen van het Leuvensche labo-
ratorium, maar had gedeeltelijk een geheel andere oorzaak. Reeds
in 1881 had L u n i n quot;) in Bazel geconstateerd, dat muizen bij
voedering met melkpoeder maanden lang in leven waren te hou-
den, terwijl ze na korten tijd stierven op een diëet, dat was samen-
gesteld uit caseïne, botervet, rietsuiker en melkasch. Hij zocht
ook reeds de verklaring in de goede richting, nl. in de aanwe-
zigheid van een onbekende, in de melk voorkomende stof, welke
voor het leven der dieren noodzakelijk was. Talrijke andere on-
derzoekers kregen soortgelijke resultaten, zoodat de oude theorie,
volgens welke dieren slechts eiwitten, koolhydraten, vetten, be-

Een zeer belangrijken stap in de goede richting beteekende het
onderzoek, dat Eijkman op het einde der vorige eeuw
over de beri-beri begon. Uit statistieken, opgesteld over een'groot
aantal gevangenissen op Java, bleek duidelijk, dat er een ver-
band bestond tusschen het optreden van beri-beri en eenzijdige
voeding met geslepen rijst. In 1896 kon Eijkman bij hoen-
ders kunstmatig een op de menschelijke beri-beri gelijkende
polyneuritis opwekken door de dieren uitsluitend met geslepen

Door toediening van de bij het polijsten der rijst verwijderde
zilvervliesjes kon hij de dieren weer genezen. Hiermede was
voor het eerst een experimenteele „avitaminosequot; en de genezing

E ij k m a n's medewerker G r ij n s sprak het vermoeden uit,
dat in het zilvervlies je een bepaalde stof voorkwam, welke men-
schen tegen beri-beri en hoenders tegen polyneuritis beschermde.
Deze onderzoekers toonden verder aan, dat de betreffende stof
met alkohol of zuur uit rijstzemelen was te extraheeren en
ook in tal van andere natuurproducten voorkwam, b.v. in gist.

Een groot aantal onderzoekers (H o p k i n s, Funk, Mc C o 1-
lum en Davis, Osborne en Mendel en vele anderen)
vielen hen bij en het werd steeds duidelijker, dat er bepaalde
stoffen bestaan, welke voor het in stand houden van een gezond
dierlijk organisme noodzakelijk zijn. Funk stelde in 1911 voor,
deze stoffen vitaminen te noemen.

Door deze ervaringen in de dierphysiologie was het ook meer
plausibel, dat gist voor den groei een bijzondere stof noodig
heeft.

Aangezien het anti-beri-beri-vitamine, nu. vitamine B^ of aneu-
rine genoemd, zelf in gist voorkwam en verschillende onderzoe-
kers ontdekten, dat preparaten, die een sterke antineuritische
werking vertoonden, ook steeds den groei van gist sterk bevorder-
den, nam men aanvankelijk aan, dat vitamine B^ en bios iden-

tiek zouden zijn. Williams trachtte zelfs het vitamine B^ met
behulp van deze werking op gist quantitatief te bepalenquot;). Het
bleek echter vrij spoedig, dat de beide stoffen niet identiek
konden zijn, omdat het mogelijk was, preparaten te bereiden,
die wel den groei van gist bevorderden, maar geen antineuri-
tische werking vertoonden of omgekeerd^®). Funk stelde toen
voor om bios vitamine D te noemen, maar dit vond geen bijval.

Toch waren er in dezen tijd ook nog wel onderzoekers, die
geenszins van het bestaan van een groeifactor voor de gist over-
tuigd waren

McDonald en McCollumquot;^quot;) constateerden, dat hun gist
wel groeide, zij het ook niet zeer sterk, op een voedingsoplossing,
welke slechts gewone rietsuiker en anorganische zouten bevatte.
Echter toonden Funk en Freedman^^) aan, dat in gewone
rietsuiker een spoor van een verontreiniging aanwezig is, die
den groei van gist bevordert en verwijderd kan worden door de
suiker eenige malen uit alkohol om te kristalliseeren.

In 1923 vonden Fulmer, Nelson en White^^), dat een
bepaalde giststam zelfs goed groeide in een oplossing, welke be-
halve anorganische zouten slechts een synthetische suiker (me-
those uit formaldehyde) bevatte. Hieruit bleek reeds, dat bios
niet voor alle gistsoorten noodzakelijk is en dit werd ten volle
bewezen door het belangrijke onderzoek van A. M. Co p-
p i n g^®).

C O p p i n g constateerde, dat wilde gisten zich in een syn-
thetisch milieu zonder bios goed ontwikkelden, terwijl daaren-
tegen sterk veredelde rassen onder zulke omstandigheden slechts
een zeer geringen groei vertoonden.

Het is niet onwaarschijnlijk, dat de uiteenloopende resultaten
van Pasteur en Liebig veroorzaakt zijn door het gebruik
van verschillende gistsoorten.

Inmiddels vorderden de pogingen, die ten doel hadden hetquot; bios
te isoleeren, slechts zeer langzaam. Weliswaar verschenen er en-
kele publicaties van Amerikaanscheen Japanschequot;®) onder-
zoekers, die beweerden een actieve stof in gekristalliseerden vorm
in handen te hebben, maar deze onderzoekingen werden later
niet bevestigd. Het probleem werd nog ingewikkelder, toen bleek,
dat bios geen enkelvoudige stof was, maar uit verschillende fac-
toren moest bestaan, die tezamen een sterkere werking vertoon-
den dan afzonderlijk^®).

L a s h M i 11 e r's medewerker G. H. W. Lucas verkreeg
bij biospreparaten van verschillenden oorsprong een scheiding
met behulp van alkoholische barietoplossing of met basisch
loodacetaat. Hij noemde den factor in het neerslag bios I, dien in
het filtraat bios 11. E. V. E a s t c o 11 slaagde er in, gebruik
makend van deze scheidingsmethode, uit theestof het bios I te
isoleeren en te bewijzen, dat het identiek was met meso-inosief-^'*).

R. J. Williams, die met verschillende gistrassen werkte,
constateerde in het jaar 1931, dat deze ook verschillende bios-
factoren noodig hebben-®). Bij de behandeling van gistextract
met vollers aarde bleek, dat hierdoor de activiteit van het extract
tegenover Gebr. M a y e r-gist en W i 1 d i e r s' gist niet vermin-
derde. Daarentegen was het extract door deze behandeling voor
andere gistrassen, o.a. 578 van de American Type Culture col-
lection, inactief geworden. De aan vollers aarde geadsorbeerde

factor kon met alkali worden geëlueerd; hij was op zichzelf on-
werkzaam, bij combineeren met het filtraat werd echter weer de
oorspronkelijke activiteit verkregen.

De geadsorbeerde factor bleek vervangen te kunnen worden
door gekristalliseerd vitamine B^.

Later voerde Williams een scheiding uit door middel
van gefractioneerde electrolyse. Met behulp hiervan kon
hij aantoonen, dat ook het voor W i 1 d i e r s' gist noodzakelijke
bios in twee factoren was te splitsen, nl. een basischen en een
zuren factor, die afzonderlijk nagenoeg inactief waren-'quot;).

De voor de Gebr. May er-gist benoodigde groeistof bleek
slechts uit den enkelvoudigen zuren factor te bestaan, die uit de
meest uiteenloopende dierlijke en plantaardige producten met
80 %-ige methylalkohol te extraheeren was. Hij noemde deze stof
pantotheenzuur. Op grond van diffusieproeven berekende Wil-
liams het moleculairgewicht op 150—200. Bij verestering van
zijn preparaten (met alkohol en zwavelzuur) verdween de ac-
tiviteit en keerde na verzeeping voor een groot gedeelte weer
terug.

In 1934 deelde W i 11 i a m s mede, dat hij uit geautolyseer-
de lever een zeer actief preparaat van dit zuur had bereid, dat
echter nog niet chemisch zuiver was.

Hierbij dient te worden opgemerkt, dat W i 11 i a m s voor zijn
gistculturen een voedingsoplossing gebruikte, die o.a. asparagine
bevatte. Volgens een later verschenen publicatie®'') is panto-
theenzuur bij afwezigheid van asparagine inactief. In deze zelfde
mededeeling vermeldt Williams, dat ;8-alanine, tezamen met
inosiet of met asparaginezuur en inosiet, bij verschillende gist-
soorten een sterke groeibevorderende werking vertoont.

Intusschen hadden ook Lash M i 11 e r en zijn medewer-
kers nieuwe resultaten gepubliceerd: zij konden bios II door be-
handeling met kool opnieuw in 2 factoren splitsen, nl. IIA, die in
de oplossing bleef en IIB, die aan de kool geadsorbeerd werd en

met behulp van aceton-ammoniak hiervan te elueeren was. In
1934 werd in dit laboratorium factor HA in den vorm van een
gekristalliseerde Cu-verbinding uit tomatensap geïsoleerd''quot;).
Volgens een mededeeling uit het jaar 1936 blijkt bios HA uit
een mengsel van j8-alanine en 1-leucine te bestaan. Tomatensap
bevat echter bovendien nog een factor^''), die met behulp van
tannine is neer te slaan. Dit „bios Vquot;, een schijnbaar zeer labiele
verbinding, kon nog niet in zuiveren toestand worden afge-
scheiden.

Van het jaar 1932 af werd in het laboratorium te Utrecht in
verband met de onderzoekingen over de auxinen ook het bios-
probleem bestudeerd. Kögl en Tonnis kozen eigeel als uit-
gangsmateriaal voor de isoleering van een biosfactor, welks wer-
king met het zoogenaamde gistras M getest werd.

De toegepaste fractioneering sloot zich in het begin aan bij
de door Lash M i 11 e r gevolgde methode. Na verwijderen van
het meso-inosiet met behulp van ammoniakaal loodacetaat, kon
nl. de voornaamste factor eveneens aan kool geadsorbeerd en
met aceton-ammoniak hiervan geëlueerd worden. Na een reeks
zuiveringstrappen slaagden de auteurs er in den factor, na een
3.000.000-voudige concentreering, in den vorm van zeer actieve
kristallen te isoleeren Bij de opwerking bleek, dat de actieve
verbinding een amphotere stof was. Aangezien bij de zuivering
een behandeling met methylalkoholisch zoutzuur was toegepast,
konden de kristallen uit een methylester, een lacton of een lac-
taam van den oorspronkelijken factor bestaan.

Voor de nieuwe groeistof werd de naam biotine ingevoerd en
wel met dien verstande, dat deze uitdrukking later zou gebruikt
worden voor het actieve zuur. Biotine heeft ook zonder toevoe-
ging van co-factoren bij gistras M een zeer groote activiteit. De
groeibevorderende werking, welke zelfs nog in een verdunning
van 1 :4 X 10quot; is aan te toonen, blijft echter in quantitatief
opzicht beneden die van gistkooksap. Inderdaad kan de activi-

teit van biotine door inosiet en aneurine verhoogd worden; het
lijkt echter, dat in gistkooksap toch ook nog andere co-factoren
aanwezig moeten zijn.

Ik had de gelegenheid, reeds bij het laatste gedeelte van de
genoemde onderzoekingen mede te werken. In het vervolg was
het mijn taak, de bereidingsmethode van het biotine te verbe-
teren en deze kostbare nieuwe groeistof zoo ver mogelijk te be-
studeeren.

Uit den aard der zaak bestaat dus een nauw verband tusschen
bovengenoemd onderzoek van Kögl en T ö n n i s en dit proef-
schrift. Het is daarom noodzakelijk, allereerst de testmethode te
beschrijven welke ook voor mijn eigen onderzoek toegepast werd.

Bij het begin van het onderzoek in het Utrechtsche laborato-
rium stond vast, dat meerdere biosfactoren existeeren en dat de
verschillende gistrassen niet alleen in quantitatief, maar ook in
qualitatief opzicht een verschillende behoefte hebben aan deze
factoren. Het was dus duidelijk, dat al naar gelang van het voor
de test gekozen gistras, bij het concentreeren van de actieve stof-
fen öf de activiteit van de extracten door splitsing in de op zich-
zelf inactieve componenten verdwijnen zou, öf een op zichzelf
reeds actieve factor op den voorgrond zou treden.

W i 1 d i e r s en de latere onderzoekers van het laboratorium
te Leuven namen als maat voor de bioswerking de gisting, welke
zij bepaalden door het gewichtsverlies van hun cultures na te
gaan, dat optrad tengevolge van de koolzuurontwikkehng. Tot
heden heeft men echter geen duidelijk beeld over den samen-
hang tusschen groei en gisting en het blijkt ook uit de ervaringen
van de practijk, dat deze beide processen niet geheel parallel
behoeven te gaan. Onder deze omstandigheden hebben de Ameri-
kaansche en Canadeesche onderzoekers er den voorkeur aan ge-
geven, den groei van de gist op de een of andere manier recht-
streeks te bepalen. De meesten van hen maten de toeneming van
het aantal cellen door deze te tellen in hangende druppels (W i 1-
liams, Swoboda), resp. in een haemacytometer (M c C o 1-
1 u m, F u 1 m e r, F r a s e r). Op den duur is deze methode echter
buitengewoon tijdroovend en vermoeiend, maar zij is wel de
eenige, waarbij de groei niet langs indirecten Weg bepaald wordt.
Op zichzelf zou natuurlijk de groei ook door bepaling van het
drooggewicht der gist nauwkeurig kunnen worden nagegaan. In
de practijk (Williams) was echter deze weg om voor de hand
liggende redenen voor serieonderzoekingen niet geschikt.

Funk en ook Lash M i 11 e r centrifugeerden hun gistcul-
tures in buisjes, die van een schaal verdeeling waren voorzien.
De hoogte van de gistkolom was een maat voor het volume der
gevormde gist. Een bezwaar van deze methode is het gevaar.

dat een verschil in dichtheid van pakking der afgecentrifugeerde
gistcellen een belangrijke foutenbron kan opleveren.

R. J. W i 111 a m s beschreef in 1929 een methode, waarbij
de troebeling der gistcultures door middel van een nephelometer
werd bepaald. Dit was een verbetering van de methode van
Peskett^«), waarbij de troebeling door vergelijking met
BaS04-suspensies met het bloote oog werd geschat.

De nephelometrische methode scheen zeer betrouwbare resul-
taten te geven en had het groote voordeel, zeer snel te zijn. Om
deze redenen heeft men ook in het Utrechtsche laboratorium
hieraan den voorkeur gegeven. Ter controle werd echter af en
toe de groei in een telkamer gemeten en hierbij bleek, dat inder-
daad de toeneming van de troebeling vrijwel parallel ging met
de toeneming van het aantal cellen.

Van niet minder belang was het vinden van een geschikt test-
object. Nadat een aantal gistrassen onderzocht was, viel de keuze
op „Rasse Mquot;, een branderij-bovengist van het „Institut für
Gärungsgewerbequot; te Berlijn, welke in een synthetisch milieu
slechts zeer geringen groei vertoonde, daarentegen op toedie-
ning van een kleine hoeveelheid gistextract met een sterken groei
reageerde.

Ras M werd te Berlijn reeds vele jaren in het groot voor bran-
derijen en gistfabrieken gekweekt en wel, zooals na informatie
bleek, in de eerste trappen uitsluitend organisch, in de latere
trappen daarentegen voornamelijk anorganisch. Slechts in dit
laatste stadium is zij dermate arm aan bios, dat zij zonder toe-
diening ervan slechts een zeer geringen groei vertoont.

Wij hebben deze vier onderrassen afzonderlijk op hun gevoe-
ligheid tegenover bios onderzocht, na ze eerst op mout en daarna
in synthetisch milieu gekweekt te hebben. Hierbij bleek, dat de ge-
voeligheid van ras M hoofdzakelijk veroorzaakt wordt door Lft. 73
en, in mindere mate, door Spc. 152. Natuurlijk zou het meer cor-
rect geweest zijn om voor onze onderzoekingen slechts het onder-

ras Lft. 73 te gebruiken en wij hebben dan ook moeite gedaan,
deze gist zelf te kweeken. De ervaring leerde echter, dat het zeer
tijdroovend is, op laboratoriumschaal toereikende hoeveelheden
van dit gistras met een constant laag biosgehalte te bereiden. Het
plan, het benoodigde gistras in het „Institut für Garungsge-
werbequot; op langen termijn onder constante condities te laten
kweeken, was in verband met de hooge kosten eveneens niet te
realiseeren. Aangezien wij van het feit, dat ras M uit vier onder-
rassen bestaat, tot nu toe nooit bezwaren hebben ondervonden,
hebben wij er dan ook van afgezien, het door Lft. 73 te ver-
vangen.

Wij verkregen wekelijks een versch monster van ras M per
vliegpost; de fijn verdeelde gist werd in de koelkast bewaard.

Er is bij het transport en het bewaren van de gistmonsters
natuurlijk kans op infectie door andere micro-organismen. Wij
hebben echter in dit opzicht geen moeilijkheden ondervonden,
omdat in de korte door ons gekozen kweektijd (5 uren) infec-
teerende micro-organismen nauwelijks tot ontwikkeling komen.

Als voedingsbodem voor de test werd steeds gebruikt een door
V. R e a d e r aangegeven oplossing van de volgende samen-
stelling :

De gebruikte stoffen hadden de kwaliteit „pro analysiquot;.
De oplossing werd gelijk verdeeld over 20 flgschjes en gedurende
2 x 45 minuten bij 100° gesteriliseerd.

Gebruikt werd een nephelometer volgens W. J. H. M o 11,
bestaande uit twee zeer gevoelige thermozuilen, symmetrisch op-
gesteld ten opzichte van een kleine lamp.

42)nbsp;W. J. H. Moll, Versl. Akad. Wetensch. Amsterdam 28, 1001 (1919—'20);
Cent. Bakt. I, 115, 228 (1930).

Tusschen deze lamp en iedere thermozuil bevindt zich een gla-
zen cuvet van ± 10 cm» inhoud. Cuvet A is gevuld met gedestil-
leerd water, in cuvet B wordt de te meten gistcultuur gebracht.
Bij doorlichting van beide cuvetten worden de thermozuilen dus
verschillend sterk belicht. De hierdoor onstane electrische stroom
veroorzaakt een galvanometeruitslag, die door inschakelen van
een weerstand wordt gecompenseerd. Deze ingeschakelde weer-
stand is een maat voor de troebeling van de gemeten oplossing.

Alvorens een serie metingen te beginnen wordt cuvet B ge-
vuld met een 0,1 %-ige m-chloor-p-kresol-oplossing in water en
met behulp van een koolweerstand de galvanometer op nul inge-
steld.

Tijdens het meten van een serie kolfjes bleek het niet noodig
te zijn, dat de cuvet voor elke nieuwe gistsuspensie zorgvuldig
van binnen schoongemaakt werd. Goed leeggieten en daarna één
maal goed uitwasschen met de volgende te meten gistcultuur was
voldoende.

Het toestel was geijkt door suspensies van bekend gistgehalte
te meten en de gevonden extincties (uitgedrukt in ohms inge-
schakelde weerstand) graphisch uit te zetten tegen de „concen-
tratiesquot;. Uit de zoo verkregen curven kon dan voor iedere wille-
keurige extinctie het gistgehalte, en dus de toeneming hiervan ten
opzichte van een bepaalde beginwaarde, eenvoudig worden afge-
lezen.

8—12 mg gist=:---) wordt in 50 cm^quot; voedingsoplossing door
schudden fijn verdeeld. Deze suspensie blijft 45 a 60 min. bij
kamertemperatuur staan alvorens voor de test gebruikt te worden.

Van iedere oplossing, die getest moet worden, wordt een be-
paald volume in een Jena-erlenmeyertje van 25 cm'' inhoud gepi-
petteerd en dit volume met stofvrij gedestilleerd water tot 1 cm''
aangevuld. Bij dezen cmquot; vloeistof wordt 1 cm® van de gistsuspen-

sie gepipetteerd (de gistsuspensie wordt direct vóór het pipettee-
ren van eiken cm® nog even omgeschud) en het kolfje vervolgens
gesloten met een kurk, welke met een dun collodiumhuidje be-
dekt is.

De kolfjes worden hierna in een thermostaat (temp. 30°
± 0,5°) gedurende 5 uren geschud, waarna de gist wordt gedood
door aan elk kolfje 20 cm® van een 0,1 %-ige m-chloor-p-kre-
sol-oplossing toe te voegen. Vervolgens wordt de troebeling van
den inhoud der kolfjes nephelometrisch bepaald.

Bij elke testserie wordt in 4 kolfjes in het geheel geen biotine
toegevoegd, maar slechts 1 cm® water en 1 cm® gistsuspensie. Bij
twee van deze kolfjes wordt de gist reeds dadelijk gedood met
20 cm® chloorkresol-oplossing en de troebeling gemeten. Deze
leveren dus de „uitgangswaardequot; in duplo. De beide anderen wor-
den met de overige kolfjes 5 uren in de thermostaat geschud en
leveren na dooden en meten de „blancowaardequot;.

Het verschil tusschen blancowaarde en uitgangswaarde geeft
dus den normalen groei van de gist aan onder de omstandigheden
van de test. Deze wisselde ongeveer tusschen O en 40 %.

Daar de gevoeligheid van de gist voor biospreparaten dage-
lijksche schommelingen vertoont, werd steeds een oplossing van
constante biosconcentratie als standaard medegemeten. Als
standaardoplossing ¹) gebruikte ik, evenals Tonnis, een gistex-
tract van zoodanige concentratie, dat 0,1 cm® hiervan een groei
van de gist veroorzaakte van 120 % (als gemiddelde van een zeer
groot aantal metingen).

Kögl en Tonnis hebben als eenheid (Saccharomyces-een-
heid =: SE) aangenomen: die hoeveelheid stof, welke onder de om-
standigheden van de test een groei veroorzaakt van 100 %. Daar
bij niet te groote biosconcentraties de groeitoeneming evenredig is
met de hoeveelheid toegevoegde bios, werd de standaardoplos-
sing gerekend een activiteit te bezitten van 12 S.E. per cm®.

Van deze standaardoplossing werd steeds een volledige groei-
curve bepaald, d.w.z. den groei, veroorzaakt door 0,1—0,3—0,5

1nbsp; Deze standaardoplossing was als volgt bereid: Yj KG. gist werd 2 uren
met de viervoudige hoeveelheid water gekookt. Na afkoelen werd het celma-
teriaal af gecentrifugeerd, de vloeistof door een Ultra-Cella-filter gefiltreerd en
het volimie van het filtraat met gedestilleerd water tot 2 L aangevuld. Om als
standaardoplossing gebruikt te kunnen worden moest de zoo verkregen vloeistof
dan nog tien maal worden verdund. De geconcentreerde oplossing werd steriel
in toegesmolten buizen in de frigidaire bewaard. Iedere nieuwe standaardop-
lossing werd op de oude geijkt.

en 1,0 cm^ Van een oplossing van een preparaat met onbekend
biosgehalte werd het groeieffect bepaald, veroorzaakt door 0,1 en
0,3 cm® en de oplossing vervolgens zoodanig verdund, dat 0,1 cm''
een even sterken groei veroorzaakte als 0,1 cm® van de standaard-
oplossing. In dit geval bevatte de oplossing dan eveneens 12 SE
per cm®, zoodat uit de verdunning de activiteit van het betreffende
preparaat te berekenen was.

Het groeieffect, veroorzaakt door 0,1 cm® standaardoplossing
werd steeds in duplo bepaald.

De groeicurve van zuiver biotine heeft een veel vlakker verloop
dan de groeicurve van het als standaard gebruikte gistextract
(Fig. 1). Ruwe eigeelpreparaten geven curven, die tusschen deze
beiden inliggen, maar bij een zekere graad van zuiverheid (na de
eerste kooladsorptie) geven zij een curve, die identiek is met die

van het zuivere biotine. Daarom hebben wij bij de verdere opwer-
king de meer gezuiverde preparaten steeds vergeleken met een
tweeden standaard, die bestond uit een voldoende ver gereinigd
eigeelpreparaat of uit een oplossing van zuiver biotine in een con-
centratie 1 : 2 X 10».

In het geheel hebben Kögl en Tonnis door opwerking van
250 KG. eendeneigeel 1,1 mg kristallen bereid, die een activiteit
hadden van omstreeks 25 milliard SE. per gram. De genoemde
auteurs ondervonden vooral bij den laatsten trap van de zuivering
groote moeilijkheden, doordat de actieve kristallen van het hoog-
vacuumdestillaat zeer moeilijk te scheiden waren van de er aan
hechtende inactieve olie.

In tegenstelling tot de vroegere onderzoekers ben ik van kip-
peneigeel uitgegaan, dat door zijn hoogere activiteit en door de
gunstigere eigenschappen van de ballaststoffen beter geschikt
was.

De eerste trappen van de opwerking konden nagenoeg zonder
wijziging ook op het nieuwe materiaal toegepast worden, eenige
van de latere trappen konden vervallen, terwijl andere gewijzigd
of verbeterd werden. Ofschoon de opbrengst aan zeer actieve ruwe
preparaten mede door het andere uitgangsmateriaal aanzienlijk
beter was, was het ook mij langen tijd niet mogelijk, de actieve
kristallen op eenvoudige wijze van de hardnekkig er aan hechtende
olie te bevrijden en pas na bijna een jaar werk vond ik een weg,
welke op steeds reproduceerbare wijze tot zuivere kristallen leidde.

In het begin trachtte ik de destillatie in micro retort j es zóó
uit te voeren, dat de actieve fractie zoo veel mogelijk in de minder
viskeuze voorloop getrokken werd. Daarna werd onderzocht, of
een andere uitvoering van de verestering voordeelen bood; te dien
einde werden de HCl-concentratie, de temperatuur en de reactie-
duur gevarieerd. Dit had echter geen succes, evenmin het ver-
vangen van methylalkohol door aethylalkohol. Hierna heb ik ge-
tracht, de „esterbasequot; door uitschudden met zuren van verschil-
lende sterkte te fractioneeren, zooals dat bij de scheiding van vele
andere natuurproducten (bijv. de porphyrinen) toepassing ge-
vonden heeft. Helaas hebben al deze pogingen gefaald. Er bleef
nu slechts de uitweg, de methodiek van de gefractioneerde des-
tillatie te verbeteren. Hierbij was het vooral ook gewenscht,

eenigszins grootere hoeveelheden te kunnen destilleeren, omdat
bij de tot nu toe gebruikte techniek de procentueele opbrengst
aan zeer actief destillatieproduct verminderde, zoodra meer dan
10—12 mg ruw product gedestilleerd werden. Een mogelijkheid
in die richting bood de zoogenaamde „moleculaire destillatiequot; ¹),
welke reeds door verscheidene onderzoekers met succes was toe-
gepast. Belangrijk is hierbij de zeer korte afstand tusschen den
koeler en het oppervlak van het te destilleeren product, alsmede
een lage temperatuur van het koeloppervlak. Terwijl om dit laatste
te bereiken gewoonlijk vloeibare lucht gebruikt wordt, bleek voor
ons geval reeds de temperatuur van een mengsel van alkohol en
vast koolzuur voldoende te zijn. Wij construeerden voor ons doel
het hiernaast afgebeelde toestel.

Het destilatie-vat was gemaakt van een normaal slijpstuk
(50/10) van Jena-glas. Het koelvlak bevond zich ongeveer 1,5 mm
boven den bodem van het vat. De koeler, gemaakt van vernikkeld
messing, werd in de door de pijlen aangegeven richting door-
stroomd door alkohol, die met behulp van een mengsel van vast
koolzuur en alkohol, tot ongeveer —50° was afgekoeld. De koel-
vloeistof stroomde na het verlaten van den koeler door een klein
vat, waarin een thermometer stak, waarmee de temperatuur van
de koelvloeistof gecontroleerd kon worden. De alkohol werd door
den koeler gepompt met behulp van een heeteluchtmotor. Daar de
alkohol het pompje zeer snel passeert, bleek dit geen bezwaar op te
leveren. Van het pompje stroomde de alkohol naar het koelvat
terug, waar hij weer tot —50° werd afgekoeld. Koelvat, koeler en
pomp waren verbonden door gewone koelerslang, geïsoleerd met

Wij hebben talrijke destillaties met dit toestel verricht en het
geheel heeft ons uitstekend voldaan.

Het voordeel bestond ten eerste daarin, dat een hoeveelheid
van 150—200 mg in eens gedestilleerd kon worden en ten tweede,
dat de actieve stof reeds bij een badtemperatuur van 150—155°
overging, terwijl bij de gewone hoogvacuumdestillatie een temp.
van 225—250° noodig was. Deze aanzienlijke temperatuursver-
laging had een veel betere kwaliteit van het destillatieproduct
tengevolge; het met behulp van chloroform van den koeler afge-

1nbsp; J. N. Bronsted en G. Hevesy, Philos. Mag. J. Sci. [6], 43, 31 (1922)
J. W. Hills, Science 76, 218 (1932); Z. 1933, I, 3598.

spoelde condensaat gaf na het indampen van de oplossing onmid-
dellijk een prachtig gekristalliseerd product. Ofschoon de activi-
teit van deze fracties ongeveer twee maal zoo groot was als die
van de vroeger verkregen destillaten, bleef toch ook nu nog de
moeilijkheid bestaan, dat de kristallen slechts met groote verliezen
van de aanwezige olie te scheiden waren. Reeds in een vroeger
sfadium van dit onderzoek heb ik veel moeite gedaan om een op-
losmiddel te vinden, dat wel de olie, echter niet of slechts wei-
nig de kristallen oplost. Dit had geen succes, hoewel tientallen
vloeistoffen in vele combinaties geprobeerd werden. Gelukkig
vond ik bij de hervatting van deze proeven in mesityloxyde een
oplosmiddel, dat aan de gestelde eischen op ideale wijze voldeed.
Voor analyses heb ik de twee maal uit mesityloxyde omgekristal-
liseerde biotine-ester nog uit een mengsel van chloroform en petro-
leumaether omgekristalliseerd. Als smeltpunt¹) van de zuivere
verbinding werd 158° (ongecorr.) gevonden. T ö n n i s had bij het
eerste preparaat een smeltpunt van 148° opgegeven. Dit verschil
werd waarschijnlijk door een kleine verontreiniging veroorzaakt,
want de activiteit van beide preparaten stemt vrijwel overeen:
Tonnis bepaalde haar in 1934 op 25 milliard SE. per gram.
Ik zelf vond in de laatste jaren iets lagere activiteiten (20—25
milliard SE per gram). Men krijgt den indruk, dat de gevoeligheid
van ras M voor biotine geleidelijk een weinig verminderd is. Een
dergelijke verandering is na zoovele generaties zeker niet ver-
rassend en men kan zelfs omgekeerd uit de afwijking van hoog-
stens 20 % concludeeren, dat ras M in den loop van drie jaren
op relatief zeer constante wijze gekweekt is en dat ook de door
ons toegepaste testmethodiek aan alle eischen voldoet.

In het geheel werden 1650 kg kippeneigeel opgewerkt. Terwijl
ik de eerste portie van het begin af zelf opwerkte, had ik voor
de laatste 1000 kg de hulp van de I. G. Farbenindustrie A. G.
Werk Elberfeld, welke de eerste 8 trappen van den zuiverings-
gang voor mij uitvoerde. Ik betuig daarvoor den heeren Prof.
Dr. H. H ö r 1 e i n alsmede Dr. F. S c h u 11 z ook op deze plaats
mijn oprechten dank. Zeker had ik de genoemde hoeveelheden
niet in den ter beschikking staanden tijd kunnen afwerken zon-
der dat mij bij het laatste gedeelte de heer D e M a n terzijde

gestaan had; ik ben hem voor de toewijding, waarmee hij een deel
van de opwerkingen op zich nam, buitengewoon erkentelijk.

In de volgende beschrijving van het zuiveringsprocédé zijn bij
de verschillende trappen de gemiddelde opbrengsten aan actief
materiaal aangegeven voor een uitgangshoeveelheid van 100 KG
eigeel.

Bij versehe preparaten verliep de opwerking steeds gunstiger,
d.w.z. de hoeveelheid actieve stof, die in de juiste fractie terecht
kwam, was, vergeleken met de hoeveelheid, die in de nevenfrac-
ties bleef, procentueel steeds grooter dan bij oude preparaten.
Dit gold vooral voor de tweede kooladsorptie. Die nevenfracties
waren echter nog niet verloren. De meer actieve werden opnieuw
aan een kooladsorptie, verestering enz. onderworpen; de minder
actieve afvalfracties werden in water opgelost en deze oplossing
na aanzuren met zoutzuur met n-butylalkohol uitgeschud. Het
biotine ging hierbij voor het grootste deel in den butylalkohol
over en het na af dampen van den butylalkohol achterblijvende
residu werd dan weer verder via kooladsorptie en verestering op-
gewerkt.

Het fijngemalen eigeel werd in wijdmondsche flesschen met de
vijfvoudige hoeveelheid koud water aangeroerd, waarbij een brei
ontstond, die practisch niet te filtreeren was. Na 12 uur staan
had het eigeel zich in twee lagen afgescheiden, waartusschen zich
een laag nagenoeg heldere oplossing bevond, die zoo goed moge-
lijk met behulp van een hevel tusschen de beide eigeellagen werd
weggezogen. Met dit koud extract werd tamelijk veel in water
oplosbaar inactief materiaal verwijderd. Per 100 kg eigeel be-
vatte dit extract ongeveer 4000 g vaste stof met een totale acti-
viteit van ca 4 X SE. Dit extract werd weggeworpen.

De achtergebleven eigeelbrei werd onder mechanisch roeren
in de vijfvoudige hoeveelheid kokend water gebracht en vervol-
gens 1 uur onder voortdurend roeren gekookt. Na afkoelen tot
50 ä 60° werd in aardewerkfilters gefiltreerd (het best door

neteldoek) en het afgefiltreerde eigeel op dezelfde wijze nog
1 a 2 maal¹) met de vijfvoudige hoeveelheid water uitgekookt.
Het verkregen extract werd in een vertind-ijzeren vacuumketel
van 50 L. inhoud ingedampt (onder toevoeging van een weinig
laurinealkohol tegen het schuimen). Badtemperatuur: 50—55°.

Het extract van 100 kg eigeel (1000 L) werd tot ± 5Ö L ge-
concentreerd; de gele emulsie bevatte ongeveer 3000 g vaste stof
met een activiteit van ca 8,4 X 10quot; SE/g, dus in het geheel 2,5 X10»
SE, overeenkomende met 100 mg biotine.

Bij het opwerken van de laatste kisten eigeel hebben wij bij het uitkoken
kort vóór het filtreeren op aanraden van Dr. Schultz een weinig azijnzuur
(ongeveer 0,5 cc per L. vloeistof) toegevoegd. Hierdoor pakte het eigeel goed
samen, zoodat het gemakkelijker gefiltreerd kon worden. Wel verdient het
dan aanbeveling, het geconcentreerde extract te neutraliseeren.

Bij het ingedampte extract werd onder mechanisch roeren (in
gegalvaniseerd-ijzeren pannen) een gelijk volume aceton uit
scheitrechters bijgedruppeld (snelheid van bijdruppelen ± 10 L
per uur). Er vormde zich een dik geelwit neerslag, dat na eenige
uren staan zoover bezonken was, dat van de bovenstaande heldere
lichtbruine oplossing een groot gedeelte door een (glazen) hevel
kon worden weggezogen. De rest werd gecentrifugeerd en het
neerslag na testen weggeworpen. De heldere oplossing werd in
glazen kolven in vacuo ingedampt tot 10 L, welke 1900 g vaste
stof bevatten met een activiteit van 1,2 X 10® SE/g, tezamen dus
2,3 X 10» SE.

Bij het ingedampte acetonfiltraat werd op geheel analoge wijze
het viervoudige volume absolute alkohol gedruppeld. Het neer-
slag, dat hierbij ontstond, was soms lichtbruin en vlokkig en kon
dan gemakkelijk op een grooten Buchner-trechter worden afge-
zogen. Soms plakte het als een donkerbruine kleverige massa aan
den bodem. De heldere bovenstaande oplossing kon er dan een-
voudig worden afgegoten. Het neerslag werd weggeworpen.
De oplossing werd ingedampt tot ± 8 L, waarin nog aanwe-

1nbsp; De laatste extractie rendeert echter slechts bij een zeer groote activiteit
van het eigeel.

zig was 1300 g vaste stof met een activiteit van 1,7 X 10® SE/g,
totaal dus 2,2 X 10® SE.

Het ingedampte alkoholisch filtraat werd gelijk verdeeld over 3
wijdmondsche flesschen van 15 L inhoud en hierin met water ver-
dund, tot elke flesch 10 L vloeistof bevatte. Onder roeren met
een houten spaan werd nu aan iedere flesch een oplossing van
400 g neutraal loodacetaat in 1 L water toegevoegd, waarbij een
dik lichtgeel neerslag ontstond, dat door een Sharples-Supercentri-
fuge werd afgecentrigureerd. Bij de heldere vloeistof werd vervol-
gens zooveel ammonia toegevoegd, dat de vloeistof alkalisch re-
ageerde tegenover lakmoes. Hierbij ontstond opnieuw een dik
oranje neerslag, dat eveneens werd af gecentrifugeerd. Uit de zoo
verkregen heldere oplossing werd het nog aanwezige lood, na
neutraliseeren met HCl, met HgS neergeslagen. Het PbS werd
afgefiltreerd en het filtraat in glazen kolven in vacuo ingedampt
tot 10 L. De beide neerslagen werden weggeworpen.

Het filtraat van het loodneerslag (10 L) werd gedurende 15
min. met 100 g kool (Carbo medicinalis Merck) krachtig ge-
roerd. Vervolgens werd de kool op een Buchner-trechter afgezo-
gen en hierop met een weinig Avater nagewasschen. Het filtraat
werd direct daarna opnieuw 15 min. met 100 g kool geroerd en
deze portie kool na affiltreeren en uitwasschen met de eerste
portie kool vereenigd. (Het filtraat werd getest en indien noodig
nog voor een derde maal met 100 g kool behandeld, welke laatste
portie kool later apart werd geëlueerd.)

De twee eerste porties kool werden gezamenlijk gedurende M uur
met 2 L aceton-ammoniak (1200 cm^ aceton 50 cm^ 20 %-ige.
NH4OH 750 cm^ water) geroerd. Na affiltreeren werd deze be-
werking nog twee maal herhaald. De drie acetoneluaten werden
vereenigd en drooggedampt.

Vroeger werd steeds 1000 g kcol genomen en vóór de elutie met aceton-
ammoniak een elueering met 50%-igen alkohol uitgevoerd ter verwijdering
van geadsorbeerd inactief materiaal. Bij gebruik van 200 g kool kon deze
elutie met alkohol vervallen. Door zeer kleine porties kool (25 g) tè nemen
en deze apart te elueeren, konden zelfs eluaten verkregen worden met een
activiteit van 80 x 10quot; SE/g. De verdere opwerking van deze zeer actieve
preparaten verliep echter niet zóó gunstig, dat het meerdere werk er door
beloond werd.

Het bij 6 verkregen kooleluaat werd in 110 cm® 5 %-ig zwavel-
zuur opgelost en quantitatief in een bruine wijdmondsche stopflesch
overgebracht. Vervolgens werd hierbij gevoegd een oplossing van
200 g phosphorwolfraamzuur in 200 cm® 5 %-ig zwavelzuur en het
reactiemengsel enkele minuten krachtig geschud. Het neerslag
werd afgezogen, met weinig 5 %-ig zwavelzuur nagewasschen
en goed op het filter afgeperst. Het neerslag werd ontleed door
het in een mortier onder toevoeging van een weinig verzadigde
barietoplossing met een overmaat vast bariet te wrijven. Na af-
filtreeren werd deze bewerking zoo vaak herhaald, tot het filtraat
nog maar zwak geel gekleurd was. Uit het heldere filtraat werd
vervolgens de overmaat bariet verwijderd door titreeren met
5 %-ig zwavelzuur.

Bij deze wijze van ontleding van het phosphorwolfraamzuurneerslag, welke
ik eveneens aan Dr. Schultz dank, traden weinig of geen verliezen op,
in tegenstelling met de vroeger toegepaste methode (roeren van het neerslag
in een 2%-ige barietoplossing), waarbij vermoedèlijk steeds actief materiaal
door het bariumphosphorwolframaat werd ingesloten. Ook de ontleding van
het phosphorwolfraamzuurneerslag, door het in 75%-ige aceton op te lossen
en bij deze oplossing 2%-ige barietoplossing te voegen, verliep niet naar
wensch.

Het bij den vorigen trap verkregen product werd met 350 cm®
absoluten alkohol en porseleinen kogeltjes geschud. Het onoplos-

bare deel werd afgefiltreerd en met absoluten alkohol nagewas-
schen. De alkoholische oplossing, die nagenoeg alle actieve stof
bevatte, werd in vacuo drooggedampt.

Opbrengst: 19.5 g ä 8,4 X 10^ SE/g; dus totaal 1,6 X 10® SE.
Concentreering: ± 3400-voudig.

De vroeger na den achtsten trap uitgevoerde scheiding met behulp van
alkoholische sublimaat-oplossing heb ik niet toegepast, omdat de hoeveelheid
van dit reagens, waarbij de actieve stof nog niet neergeslagen wordt, moeilijk
is aan te geven.

Ook bij deze kooladsorptie bleek door gebruik te maken van een kleinere
hoeveelheid kool de elutie met verdunden alkohol te kunnen vervallen.

Het product van den 8sten trap werd opgelost in de 15-voudige
hoeveelheid water en deze oplossing gedurende 15 min. met de
halve gewichtshoeveelheid kool geschud. Vervolgens werd de kool
afgefiltreerd, op het filter met een kleine hoeveelheid water uit-
gewasschen en daarna drie maal V^ uur met de 10-voudige hoe-
veelheid aceton-ammoniak geëlueerd. De beide eerste eluaten
werden vereenigd en drooggedampt.

De hierna door Tonnis toegepaste herhaling van de behandeling met
phosphorwolfraamzuur werd eveneens van het begin af weggelaten, daar
preparaat 9b reeds de vereischte activiteit bezat en bij de opwerking van
het eerste phosphorwolfraamzuumeerslag op de wijze, zooals ik die vroeger
uitvoerde (met 2%-ige bariet-oplossing), soms groote verliezen aan actieve
stof optraden.

Dezen trap heb ik ingevoerd in plaats van het broompikrolonzuur-neerslag
tusschen de trappen 11 en 12, omdat hierbij soms vrij veel actief materiaal in
het neerslag overging, welk verlies des te sterker optrad naarmate de prepa-
raten actiever en dus beter waren. Weliswaar verliep deze eerste verestering
ook niet altijd naar wensch, en bleef soms een groote hoeveelheid actieve stof
in de waterlaag, maar deze behoefde dan slechts na droogdampen opnieuw
veresterd te worden, waarbij nagenoeg geen verliezen optraden. Voor het
ontleden van een broompikrolonzuur-neerslag had ik geen bevredigende
methode.

zoutzuur gedurende eenige uren onder een terugvloeikoeler ge-
kookt. Vervolgens werd het reactiemengsel in vacuo droogge-
dampt en het residu opgenomen in ±; 15 cm'' water en 10 cmquot; chlo-
roform. Na afscheiden van de chloroformlaag in een scheitrech-
tertje werd de waterlaag nog 9 maal met ± 5 cmquot; chloroform uit-
geschud. De chloroformextracten werden vereenigd en daarna 15
maal uitgeschud met ongeveer het halve volume 3 N zoutzuur.

Het bij den vorigen trap verkregen zeer actieve residu van het
HCl-extract werd, na goed gedroogd te zijn, opnieuw met ± 20 cmquot;
1,5 %-ig methylalkoholisch zoutzuur gedurende 1 uur gekookt en
vervolgens drooggedampt. Na oplossen van het achtergebleven pro-
duct in een kleine hoeveelheid absoluten methylalkohol en opnieuw
droogdampen (om het HCl zoo goed mogelijk te verwijderen) werd
het residu opgenomen in ± 10 cmquot; water en een gelijk volume
chloroform. Na afscheiden van de chloroformlaag werd deze nog
2 maal met een gelijk volume water uitgeschud en werden deze
waterige extracten vereenigd.

Vervolgens werd de chloroformlaag 10 maal uitgeschud met
10 cmquot; N zoutzuur en werden ook deze extracten vereenigd en
drooggedampt.

Fractie 11b werd opnieuw veresterd door 1 uur koken met
1,5 %-ig methylalkoholisch zoutzuur (± 10 cmquot;). Na droogdampen
werd het residu opgelost in ca 5 cmquot; water en bij deze oplos-
sing zooveel vast NaHCOg gevoegd, dat zij alkalisch reageerde

tegenover lakmoes. Vervolgens werd deze alkalische oplossing 5
maal uitgeschud met een gelijk volume chloroform.

De waterlaag werd na aanzuren met zoutzuur eveneens droog-
gedampt. Deze fractie heb ik later met soortgelijke fracties ver-
eenigd en na extractie met absoluten alkohol (ter verwijdering
van NaCl) opnieuw opgewerkt.

Het met den naam „esterbasequot; aangeduide product bestond uit
een bruine stroop, waarin na längeren tijd gewoonlijk een groot
gedeelte van de er in aanwezige biotine-methylester uitkristal-
liseerde. Door dit product direct met mesityloxyde te behande-
len heb ik ook eenige malen de actieve stof kunnen isoleeren
(naar activiteit en mengsmeltpunt identiek met het na des-
tillatie verkregen product). Echter moest bij deze manier van
opwerken wegens de groote hoeveelheid nog aanwezige veront-
reinigingen steeds zoo veel mesityloxyde worden toegevoegd, dat
de opbrengst aan zuivere kristallen betrekkelijk gering was.

De verkregen esterbase werd in porties, die gewoonlijk vari-
eerden van 150—200 mg, onder een druk van 0,005—0,010 mm
kwik gefractioneerd in het toestel voor „moleculaire destillatiequot;,
dat reeds in de inleiding van dit hoofdstuk besproken is.

De destillaties heb ik uitgevoerd als volgt: De esterbase werd
in het destillatievat gebracht en na hierin goed gedroogd te
zijn, de vacuumpomp in werking gesteld. Tegelijkertijd werd
begonnen met het afkoelen van den alkohol in het koelvat.

Nadat de druk tot 0,01 mm was gedaald, werd het motortje
aangezet, dat den alkohol door den koeler pompte; zoodra de tem-
peratuur van den uit den koeler stroomenden alkohol tot —50°
was gedaald, werd het oliebad onder het destillatievat op de
gewenschte hoogte aangebracht en langzaam opgewarmd tot
125°. Daarna werd het bad Va uur op deze temperatuur gehou-
den, vervolgens verwijderd en nadat het destillatievat afgekoeld
was, de vacuumpomp en het alkoholpompje afgezet. Door middel

van een driewegkraan werd gezorgd, dat het destillatievat onder
vacuum bleef. Pas nadat de koeler op kamertemperatuur was ge-
komen (na ± 2 uur), werd lucht toegelaten en het onderste slijp-
stuk van het destillatietoestel afgenomen.

Door den koeler eenigszins schuin te plaatsen kon het destillaat
er gemakkelijk met chloroform worden afgespoeld., Deze,oplos-
ling werd in vacuo drooggedampt. Dit product, dat bestond uit een
lichtgele stroop, bevatte slechts zeer weinig biotine-ester.

Vervolgens werd op dezelfde manier de hoofdfractie overge-
destilleerd door de temperatuur van het oliebad op te voeren tot
150° en 1 uur op 150°—155° te houden.

Dit destillaat zette zich gewoonlijk ook als een laag licht ge-
kleurde stroop op den koeler af (slechts zeer zelden waren reeds
op den koeler kristalnaaldjes te zien), maar na afspoelen met
chloroform en voorzichtig droogdampen van deze chloroform-
oplossing in een vacuumexsiccator, bleef een product achter, dat
nagenoeg geheel kristalliseerde.

Deze hoofdfractie bevatte 70 a 80 % van de in de oorspronke-
lijke esterbase aanwezige hoeveelheid biotine-ester, terwijl het ge-
wicht ongeveer ^/g van dat der esterbase bedroeg.

In het destillatievat bleef een bruinzwart residu achter. Dit be-
vatte in den regel nog voldoende biotine, om de moeite van het
opwerken waard te zijn. Soms werd het nogmaals aan een distil-
latie onderworpen, waarbij de temperatuur tot 170° werd opge-
voerd, maar meestal werden de residu's van meerdere distillaties
vereenigd en de chloroformoplossing hiervan met 3 N zoutzuur
uitgeschud, waarbij het nog aanwezige biotine'bijna geheel in het
zoutzuur overging. Na verdampen van het zoutzuur werd het hier-
bij achterblijvende residu dan opnieuw in de esterbase omgezet
en deze weer aan een destillatie onderworpen.

Het destillatieproduct werd met behulp van zoo weinig moge-
lijk chloroform in een micro-erlenmeyertje overgebracht en deze
oplossing in een vacuumexsiccator bij kamertemperatuur goed
drooggedampt. Aan het mengsel van kristallen en stroop werden

1nbsp; Het bleek aanbeveling te verdienen om het mesityloxyde kort voor het
gebruik te fractioneeren, althans voor het omkristalliseeren geen mesityloxyde
te bezigen, dat langer dan een week gestaan had.

nu eenige druppels mesityloxyde toegevoegd. De stroop lost hier-
bii gemakkelijk op. terwijl de kristallen slechts zeer wemig oplos-
sen. De oplossing werd met een fijne capillair tusschen de

De achterblijvende kristallen werden nu omgekristalliseerd
door ze in zoo weinig mogelijk mesityloxyde op te lossen onder

kristallen weggezogen. De kristallen, die nog licht geel gekleurd
waren door het laatste restje bruine stroop, werden opgelost in
chloroform, de oplossing gefiltreerd en drooggedampt. Daarna
werd het residu opnieuw onder verwarming in mesityloxyde op-
gelost na afkoelen de moederloog weer met een capillair weg-
gezogen en de kristallen in het erlenmeyertje eerst met mesityl-
Lyde en daarna met petroleumaether (kpt 40-60°) uitgewas-
schen De na het verdampen van de petroleumaether achterblij-
vende droge kristallen konden nu gemakkelijk zonder verhezen
met een spateltje in een trechtertje met een ingeslepen glazen
paddestoeltjequot; (zonder filtreerpapier) worden gebracht. Hierop
werden ze opnieuw met versch mesityloxyde aangeroerd, droog-
gezogen, één maal nagewasschen met mesityloxyde en daarna

In het geheel hebben wij 136,- mg biotine-methylester Jaereid.
Zooals vanzelf spreekt moest ik mij bij de analyses en alle be-
werkingen tot het allernoodzakelijkste beperken, terwijl verschil-
lende op zichzelf zeer wenschelijke proeven tot later uitgesteld
moesten worden. Onder deze omstandigheden kunnen sommige
resultaten slechts met een zeker voorbehoud genoemd worden;
zij zullen echter in elk geval als werkhypothesen van nut kunnen
zijn.

Oplosbaarheid van biotin e-m ethylester. De
bij de opwerking van het eigeel verkregen biotine-methylester
kristalliseert in den vorm van kleurlooze fijne naaldjes, die bij
158° smelten. Zooals dat ook het geval is bij de isoleering van an-
dere zeer actieve stoffen, bleken de kristallen van biotine-me-
thylester veel minder goed oplosbaar te zijn dan op grond van de
ervaringen bij de opwerking vermoed was. De zuivere ester is
in water en in de gebruikelijke organische oplosmiddelen matig
oplosbaar, in aether en vooral in petroleumaether nagenoeg onop-
losbaar. Naar schatting bedraagt de oplosbaarheid in methylalko-
hol bij kamertemperatuur ongeveer 1 gram per 100 gram oplos-
middel.

Bij de in hoofdstuk III vermelde pogingen, de kristallen van
biotine-methylester te scheiden van de er aan hechtende olie, heb
ik een vijftigtal oplosmiddelen onderzocht, waarbij bleek, dat de
kristallen in paraffinekoolwaterstoffen nagenoeg onoplosbaar zijn,
doch in onverzadigde koolwaterstoffen (cyclohexeen, benzol) aan-
merkelijk beter oplossen. De oplosbaarheid in alkoholen is rela-
tief groot, ook die in gehalogeneerde koolwaterstoffen. Aceton
en methylaethylketon zijn eveneens goede oplosmiddelen voor
biotine-methylester. Terloops zij nog vermeld, dat inplaats van
mesityloxyde voor het omkristalliseeren ook phoron, methylhep-
tenon of allylbenzol gebruikt zouden kunnen worden.

Optische activiteit. Voor de bepaling van de specifieke
draaiing scheen absolute methylalkohol als oplosmiddel het meest

geschikt. De boven reeds vermelde oplosbaarheid in metylalkohol
was echter geringer dan wij verwachtten. Daar biotine-methyles-
ter een vrij sterke draaiing toont, was deze ook in de verdunde
oplossing goed waar te nemen; evenwel kan door de genoemde
omstandigheden en door het feit, dat ons geen micro-meetbuis van
grootere lengte dan 1 dM ter beschikking stond, de specifieke
draaiing slechts met een nauwkeurigheid van eenige graden wor-
den opgegeven.

Ultravioletabsorptie. De heer C. Koningsberger had de
vriendelijkheid, bij verschillende van mijn preparaten na te gaan,
of zij al dan niet in het ultraviolet een absorptie vertoonden. In-
derdaad vond hij bij het eerste preparaat (in chloroform) een
zeer geringe absorptie bij 240 m/x. Daar dit preparaat slechts twee
keer uit mesityloxyde was omgekristalliseerd en dit «jS-onverza-
digde keton in aethylalkohol het karakteristieke maximum bij
235 m/x toont lag het voor de hand aan te nemen, dat de ab-
sorptie van ons preparaat door een verontreinigng met mesityl-
oxyde veroorzaakt was; een gehalte van 1 % mesityloxyde zou
de absorptie kunnen verklaren. Ik heb toen een dergelijk prepa-
raat van biotine-methylester in chloroform opgelost en hieruit
met petroleumaether neergeslagen. Inderdaad bleek na deze be-
handeling de absorptie geringer te zijn, en wel zou ze nu over-
eenkomen met de aanwezigheid van 0,4 % mesityloxyde. Een vol-
gend preparaat van biotine-methylester heb ik twee keer uit me-
sityloxyde, één keer uit een mengsel van chloroform en petroleum-
aether (1 : 1) en tenslotte nog één keer uit absoluten methylalkohol

en A. E. Gillam, J. Chem. Soc. 1936, 667.
J Bielecki en V. Henri, Ber. 47, 1690 (1914).

omgekristalliseerd. Ook in dit geval was nog een, zij het ook zeer
geringe absorptie bij 240 m^ te constateeren, die overeen zou
komen met een verontreiniging door 0,25 % mesityloxyde. Aan-
gezien deze absorptie zoo gering was, dat zij met de gevoeligheid
van de gebruikte apparatuur maar net kon worden waargenomen,
hebben wij ervan afgezien, de met groote verliezen gepaard gaan-
de zuivering van onze kristallisaten nog verder voort te-zetten.
Zooals bekend, is het ook bij stoffen, welke in onbeperkte hoeveel-
heid ter beschikking staan, niet altijd gemakkelijk ze optisch ab-
soluut zuiver te verkrijgen. Misschien is het niet overbodig erop
te wijzen, dat bij de elementairanalyse en ook bij de bepaling van
de physiologische activiteit dergelijke sporen van verontreinigin-
gen meestal niet aan te toonen zijn. Het is niet buitengesloten, dat
de absorbeerende stof uit het eigeel zelf afkomstig is; helaas kon-
den wij dit niet uitmaken door mesityloxyde als oplosmiddel te
vermijden, daar deze of een soortgelijke verbinding voor de zuive-
ring onmisbaar was.

De door den heer Koningsberger gevonden waarden zijn
weergegeven in onderstaande tabel, waarin h = de absorptie-
coëfficiënt van de betreffende oplossingen.

Prep. 956: 2 X omgekristalliseerd uit mesityloxyde; verontreiniging 1%.
(gerekend als mesityloxyde).

Prep. 960: 2 x omgekrist. uit mesityloxyde, daarna 1 x uit CHCla-petrol.;
verontreiniging: 0.4% (gerekend als mesityloxyde).

Prep. 10501: 2 x omgekrist. uit mesityloxyde, 1 x uit CHCls-petroleumaether
en 1 x uit absoluten CHsOH; verontreininging: 0,25%, (gerekend
als mesityloxyde.)

Bepaling van de brutoformule.
Kögl en Tonnis hebben geconstateerd, dat de kristallen
van biotine-methylester stikstof bevatten; de reactie op zwavel
en phospor werd toentertijd slechts met een zeer actief ruw pro-
duct uitgevoerd en leverde een negatief resultaat, klaarblijkelijk
werd toen voor deze proeven te weinig materiaal opgeofferd. Bij
de herhaling met de gekristalliseerde biotine-methylester bleek
nl., dat de verbinding inderdaad vrij is van phospor, doch wel
zwavel bevat. Het is zeer opmerkelijk, dat behalve aneurine ook
nog een tweede bios-factor een stikstof- en zwavelhoudende ver-
binding blijkt te zijn.

Voor de in verschillende laboratoria uitgevoerde quantitatieve
analyses werden preparaten gebruikt, welke twee keer uit mesi-
tyloxyde en daarna één keer uit een mengsel van chloroform
en petroleumaether omgekristalliseerd en vervolgens bij 80° in
hoogvacuum boven PoOg gedroogd waren.

Gevonden: C 51,21 %; H 7,11 %; N 10,86 %; S 11,06 %
C 51,17 %; H 7,11 %; N 10,64 %;

Zooals bij het onderzoek naar de ultravioletabsorptie vermeld
werd, bevatten ook de voor de analyses gebruikte preparaten nog
sporen van een bij 240m/x absorbeerende verontreiniging. In
de veronderstelling, dat deze verontreiniging uit mesityloxyde
zou bestaan, hebben wij ter controle uitgerekend, of in dit geval
de analyses onbetrouwbaar worden; het bleek echter, dat dit

gewicht van biotine-methylester volgens de methode van Rast
met kamfer als oplosmiddel niet was te bepalen. Zij hebben ge-
tracht, het moleculairgewicht door bepaling van den diffusie-
coëfficient volgens de methode van Bruin s-W e n t vast te
stellen ; de verkregen resultaten wezen op een waarde van ± 200.

44-1 F W Went, Diss. Utrecht 1927; H. R. Bruins, Diss. Utrecht 1922;
vgl ook Stefan, Sitzgsber. Kgl. Akad. Wien 79, 161 (1879) en Kawalki,
Wied. Ann. 52, 185 (1894).nbsp;^^

Door de slechte oplosbaarheid van biotine-methylester in de voor
de methode van R a s t in aanmerking komende oplosmiddelen was
het helaas ook mij niet mogelijk, het moleculairgewicht nauw-
keurig te bepalen. Uit de verhouding van de zwavel tot de overi-
ge atomen volgt voor biotine-methylester het moleculairgewicht
258 resp. een veelvoud hiervan. De physisch-chemische eigen-
schappen van biotine-methylester pleiten niet voor een molecu-
lairgewicht van 516 of hooger, zoodat wij de eenvoudigste formule
als de juiste aannemen.

Methoxylbepaling. Aangezien bij een van de laatste
zuiveringstrappen een behandeling met methylalkoholisch zout-
zuur werd toegepast, kon het actieve kristallisaat een methylester,
een lacton of een lactaam van den oorspronkelijken groeifactor
zijn. Om dit uit te maken hebben wij allereerst een methoxylbe-
paling volgens Zeisel uitgevoerd. Daar micro-Zeiselbepalingen
gewoonlijk met hoeveelheden van gt; 3,- mg stof worden uitgevoerd,
heb ik eerst onderzocht, of deze methode ook met hoeveelheden
van omstreeks 1 mg betrouwbare resultaten geeft. Zooals uit
proeven met vanilline en /3-indolylazijnester blijkt, is dit inder-
daad het geval. Om het gevormde methyl jodide te binden werd
steeds 1 cmquot; alkoholische zilvernitraatoplossing gebruikt, waarvoor
de door F r i e d r i c haangegeven correctie van 0,06 mg werd
aangebracht.

Ook ons actief kristallisaat splitste bij de behandeling met HJ
methyl jodide af:

Het feit, dat de actieve verbinding één methoxylgroep bevat,
zou er op kunnen wijzen, dat wij inderdaad met een methylester
te doen hebben. Het was echter nog mogelijk, dat de door het
HJ afgesplitste methylgroep niet aan een COOCHg-groep toebe-

45) A. Friedrich, Die Praxis der quantitativen organischen Mikroanalyse.
1933, blz. 141.

hoorde, ook met een thiomethy la ether (zooals in methionine!)
moest rekening worden gehouden.

Titratie. Terwijl zich het vrije biotine bij de opwerking
kennelijk als een amphotere stof gedroeg, konden wij biotine-
methylester uit een chloroform-oplossing bijv. met 3 N zoutzuur
uitschudden. Ik heb daarom allereerst nagegaan, of biotine-me-
thylester met zuur te titreeren is. Dit was echter niet het geval:
1,455 mg biotine-ester, opgelost in 1 cm^ methylalkohol en 5 cm^
water, bleek geen zoutzuur te verbruiken (methylrood als indica-
tor). Een controleproef je met /3-indolylazij nester gaf hetzelfde
resultaat, terwijl 1-tyrosinemethylester onder deze omstandighe-
den 1 aequivalent HCl bleek te binden.

Toen heb ik onderzocht, of de actieve verbinding bij verwar-
men met loog verzeept kon worden. Bij de voor het bovenstaande
proefje gebruikte oplossing van 1,455 mg biotine-ester werd 1,32
cm^ 0,0172 N carbonaatvrije NaOH oplossing (d.w.z. ongeveer 4
aequivalenten) gevoegd en de oplossing 15 min. op 70° verwarmd.
Na afkoeling werd de overmaat loog met 0,0209 N zoutzuur
teruggetitreerd (phenolphtaleïne als indicator). Bij dit terugti-
treeren werd 0,815 cm^ zuur verbruikt.

Na dit resultaat en de bovenvermelde methoxylbepaling werd
het meer en meer waarschijnlijk, dat ons kristallisaat een methyl-
ester zijn moest. Daar aminozure esters dikwijls buitengewoon
gemakkelijk verzeepen, moest onderzocht worden of de geringe
basisiteit van onze ester niet in werkelijkheid veroorzaakt was
door de snelle verzeeping tot biotine zelf.

Ik heb daarom een oplossing van biotine-methylester recht-
streeks met loog getitreerd:

1,170 mg biotine-ester werd opgelost in 1 cm^ methylalkohol en
5 cm® water en bij deze oplossing een druppel phenolphtaleïneop-
lossing toegevoegd als indicator. Reeds de eerste druppel 0,0172
N NaOH veroorzaakte echter een rosekleuring, die eenige secon-
den bleef bestaan. Ook na korten tijd koken en zelfs na 24 uur
staan werd geen NaOH verbruikt. In neutraal milieu trad dus
geen merkbare hydrolyse van de ester op. Vervolgens werd 1 cm''
van de NaOH-oplossing toegevoegd en het reactiemengsel 15 min.
op 70° verwarmd. Een contrólekolfje, waarin eveneens 1 cm'' me-

thylalkohol, 5 cm® water en een druppel phenolphtaleïne-oplossing
waren gebracht, werd analoog behandeld. Na afkoelen werd de
loog in beide kolfjes met 0,0209 N zoutzuur teruggetitreerd. Het
biontine-kolfje verbruikte 0,650 cm®, het contrólekolfje 0,850 cm®
zuur.

Opnieuw werd aan beide kolfjes 1 cm® 0,0172 N NaOH-oplos-
sing toegevoegd en na een uur verwarmen op 70° de overmaat
loog met zoutzuur teruggetitreerd. Het biotinekolfje verbruikte
nu 0,820 cm®, het controlekolfje 0,840 cm® zuur.

Blijkbaar wordt dus biotine-methylester reeds door zeer ver-
dunde loog bij 70° in 15 min. vrijwel quantitatief verzeept.

Gerekend naar het totale NaOH-verbruik werd gevonden:
18,68 % COOH, terwijl berekend was: 18,44 %.

Bereiding van biotine door verzeeping van de
m e t h y 1 e s t e r. 20 mg biotine-ester werd opgelost in 10 cm®
0,1 N zoutzuur en hierin 30 min. op 70° verwarmd. Deze oplos-
sing werd vervolgens in een vacuumexsiccator boven P2O5 en
natronkalk drooggedampt. Het residu, bestaande uit fijne naald-
jes, werd weer in water opgelost, de oplossing gefiltreerd en
daarna opnieuw in den exsiccator drooggedampt om nog eventueel
aanwezig HCl te verwijderen. De nu achtergebleven kristallen
werden onder verwarming in 5 cm® water opgelost. Bij afkoeling
kristalliseerde het biotine in prachtige naaldjes uit. Deze werden
afgefiltreerd en na uitwasschen op het filter met weinig water,
in den exsiccator boven P2O5 gedroogd.

Gewicht: 14,1 mg. Het smeltpunt werd gevonden bij 216° (mi-
croscoop). De activiteit was gelijk aan die van de ester:
25 X 10quot; SE per gram. (Zie ook blz. 20).

De kristallen waren onoplosbaar in chloroform, aether of pe-
troleumaether, slecht oplosbaar in water. Zij bevatten geen HCl.

Bij een titratie van de carboxylgroep verbruikte 1,290 mg van
de kristallen (opgelost in 5 cm® water) 0,290 cm® 0,0172 N NaOH
(phenolphtaleïne).

*) Het is mogelijk, dat biotine-methylester gedurende de test verzeept wordt,
zoodat de hiervoor gevonden activiteit eigenlijk door het vrije biotine veroor-
zaakt is.

worden afgezien het biotine te analyseeren. Het feit, dat door de
behandeling met zuur een product verkregen werd, dat recht-
streeks een aequivalent loog verbruikt, wijst er op, dat wij in-
derdaad hierbij een ester verzeept hebben. Het is buitengewoon
onwaarschijnlijk, dat de vrijgekomen carboxylgroep door open-
splitsing van een lacton- of lactaamring gevormd werd; door de
behandeling met zuur zouden omgekeerd dergelijke ringen juist
gesloten moeten worden. Verdere onderzoekingen zullen de langs
indirecten weg voor biotine afgeleide formule CioHieOsNgS door
micro-analyses moeten bevestigen.

De oplossing van de eerste COOH-titratie (oorspronkelijk be-
vattende 1,455 mg biotine-ester) werd drooggedampt en het re-
sidu met 5 cmquot; 0,1 N NaOH onder Ng op 80° verwarmd. Op be-
paalde tijden werd van deze oplossing 0,01 cmquot; afgepipetteerd
voor de test. Na 7 uur verwarmen bleek de activiteit nog niet
afgenomen te zijn. Vervolgens werd de NaOH-concentratie met
12 N loog op 1 N gebracht en opnieuw op 80° verwarmd.

Ongeveer 1/5 deel werd daarna nog 2 uur op 150° verwarmd,
waarna de activiteit teruggeloopen was tot 30%. Bij de proeven
werd steeds met loodacetaat op Squot;-ionen gereageerd, er bleek
echter geen zwavel afgesplitst te zijn.

De rest werd opgewerkt door na aanzuren met zoutzuur droog
te dampen en het residu met absoluten methylalkohol te extra-
heeren. Ik heb toen onderzocht, of uit het reactieproduct met be-
hulp van pikrolonzuur of pikrinezuur een fractie was neer te
slaan. Met pikrolonzuur ontstond een mikrokristallijn vlokkig
neerslag; met pikrinezuur een neerslag, dat blijkbaar uit olie-
druppeltjes bestond. De neerslagen geleken heel veel op de over-

eenkomstige neerslagen van het bij de behandeling met zuur ver-
kregen product, maar de hoeveelheid was te gering voor een
identificatie,
b. Zuurbestendigheid:

De van de tweede COOH-titratie afkomstige oplossing (oor-
spronkelijk bevattende 1,170 mg biotine-ester) werd droogge-
dampt en het residu met 5 cm® 5 %-ig zoutzuur verwarmd. Na
2 uur verhitten op 100° was de activiteit nog onveranderd. Ver-
volgens werd de oplossing in een Carius-buis overgebracht en het
kolfje met 5 cm® 15 %-ig zoutzuur nagespoeld, zoodat de stof zich
opgelost bevond in ± 10 cm® 10 %-ig zoutzuur. Na IV2 uur ver-
hitten op 125° bleek de activiteit nog steeds niet afgenomen te zijn.

De oplossing werd hierop drooggedampt, het residu opgenomen
in 2 cm® sterk zoutzuur (s.g. 1,191) en deze oplossing gedurende
1 uur op 200—210° verhit. Hierna bleek de activiteit vrijwel
verdwenen te zijn.

Een verzadigde oplossing van pikrinezuur in water gaf met
een proefje van deze oplossing een olieachtig geel neerslag, dat
niet tot kristallisatie was te brengen.

Een verzadigde waterige oplossing van pikrolonzuur gaf
daarentegen een dik geel microkristallijn neerslag.

Bij de rest van de oplossing werd nu eveneens pikrolonzuur
gevoegd en het gevormde neerslag uit water omgekristalliseerd,
afgecentrifugeerd, goed uitgewasschen en daarna gedroogd. Het
product bestond uit gele „Morgensternequot;, die geen scherp smelt-
punt vertoonden. Bij verhitting kleurden zij zich vanaf 150° ge-
leidelijk bruin en vormden bij 240—250° een donkere smelt.

Bij latere proeven bleek, dat na verhitting van biotine-ester
(1,2 mg) in sterk zoutzuur (0,6 cm®) gedurende 1 uur op 180° nog
1/6 a 1/7 deel ongesplitst was.

24,4 mg biotine-ester werden opgelost in 12,2 cm® geconcen-
treerd zoutzuur (s.g. 1,191) en deze oplossing gedurende 1 uur
op 200—205° verhit. Hierbij trad een geringe verkoling op. Het
reactieproduct werd in vacuo drooggedampt. Het residu, be-
staande uit een bruine stroop en kristallen, werd in water opge-
lost en de oplossing gefiltreerd.

Bij het filtraat werd een overmaat verzadigde waterige op-
lossing van pikrolonzuur *) gevoegd en het ontstane neerslag

Het neerslag werd vervolgens twee keer uit water omgekris-
talliseerd en daarna in vacuo boven P2O5 gedroogd.
Gew. 23,75 mg.

De analyses, die werden uitgevoerd door den heer Hubers (Amsterdam),
leverden de volgende waarden:
N-analyse:

De functie van de hetero-atomen. Uit de gege-
vens van de titratie en de methoxylbepaling mogen wij beslui-
ten, dat biotine een carboxylgroep bevat. Aangezien biotine, resp.
zijn ester, noch met semicarbazide, noch met p-nitrophenylhydra-
zine een neerslag geeft, blijkt het derde zuurstofatoom van het
molecule niet in den vorm van een aldehyde- of ketongroep aan-
wezig te zijn. De wijze waarop het gebonden is werd door de zuur-
splitsing opgehelderd. Zooals zoojuist werd vermeld ontstond daar-
bij onder afsplitsing van een CO-rest een product CgHisOgNgS.
In tegenstelling met de nagenoeg niet basische uitgangsstof kon
zich dit afbraakzuur met twee mol. pikrolonzuur verbinden. Het
derde zuurstofatoom blijkt dus in een groepeering N-CO-N gebon-
den te zijn, en wel moet deze aan een ring toebehooren, daar anders
het molecule in kleinere deelen gesplitst zou zijn. Inderdaad vindt
men bij sommige pyrimidine-derivaten een soortgelijke be-
stendigheid tegenover loog en zuur. Reeds vroeger hebben
Kögl en Tonnis bij ruwe biotine-preparaten vastgesteld, dat
de acyleering met azijnzuur-anhydride, resp. benzolychloride, tot

Het bij de behandeling met zoutzuur ontstane product bleek ook met de
volgende alkaloïdreagentia een neerslag te kunnen geven: broompikrolonzuur,
fjaviaanzuur, rufiaanzuur, styphninezuur, anthrachinon-ß-sulfonzuur, broomanil-
zuur, platinachloorwaterstofzuur, kaliumchloroplatiniet en goudchloride. Een
eantal van deze neerslagen was echter olieachtig; sommige waren betrekkelijk
goed oplosbaar. Slechts het rufianaat vertoonde evenals het pikrolonaat naast
een geringe oplosbaarheid een betrekkelijk goed kristallisatievermogen. Daar
rufiaanzuur zelf echter ook zwavel bevat, hetgeen met het oog op de analyses
minder aangenaam was, werd aan het pikrolonzuur den voorkeur gegeven.

inactieve producten leidt; na verzeeping keerde de activiteit weer
gedeeltelijk terug.

Zoo lang de functie van de zuurstofatomen niet bekend was,
kon niet worden uitgemaakt of de acyleering aan de stikstof-
atomen of aan een eventueel aanwezige hydroxylgroep pla-ats
heeft. Nu blijkt, dat het eerste het geval moet zijn.

Vervolgens hebben wij getracht, de functie van het zwavel-
atoom op te helderen. Daar biotine-methylester noch een cupro-
verbinding, noch een andere zwaarmetaalverbinding geeft, met
loog geen zwavelwaterstof afsplitst en ook geen neiging tot de
vorming van een dimoleculaire S-S-verbinding bestaat, mogen
wij de aanwezigheid van een SH-groep als onwaarschijnlijk be-
schouwen. Aangezien voor een sulfon- of een SOsH-groep niet
de benoodigde zuurstofatomen ter beschikking staan, moeten wij
per exclusionem tot de aanwezigheid van een aetherachtig gebon-
den zwavelatoom besluiten.

Tenslotte doet zich nog de vraag voor, of biotine al dan niet
een verzadigde verbinding is. De methylester geeft geen kleur-
reactie met tetranitromethaan en ontkleurt een oplossing van
broom in chloroform niet. Met een door soda alkalisch gemaakte
oplossing van permanganaat is geen spontane ontkleuring te zien.
De na ver loop van eenigen tijd optredende bruinsteenafscheiding
is vermoedelijk aan de oxydatie tot een sulfon te wijten.

Bij de katalytische hydreering van biotine-methylester met be-
hulp van platina-oxyde in ijsazijn bleek de activiteit achteruit
te gaan, terwijl ze bij een overeenkomstige proef in methanol-
oplossing (0,325 mg biotine-ester 1 uur bij 20° in 2 cm® absol.
CHgOH) onveranderd bleef. Het is mogelijk, dat de inactiveering
bij het hydreeren in ijsazijn door een acetyleering aan de stik-
stofatomen tot stand komt. Toch kan de aanwezigheid van een
(weliswaar niet zeer reactieve) dubbele binding voorloopig niet
buitengesloten worden. Daar biotine-methylester geen karak-
teristieke absorptie in het gemakkelijk toegankelijke ultraviolet
vertoont, zou de eventueel aanwezige dubbele binding niet in con-
jugatie tot de CO- of de COOCHg-groep kunnen staan. Samen-
vattend kunnen wij concludeeren, dat biotine op grond van zijn
brutoformule, de functie van zijn hetero-atomen en het gedrag bij
de zuursplitsing öf één ring en een dubbele binding, öf twee rin-
gen zal bevatten; de twee ringen kunnen al of niet met elkaar
gecondenseerd zijn.

Nadat het gelukt was, biotine in zuiveren toestand te bereiden,
bestond de mogelijkheid om na te gaan, in hoeverre deze verbin-
ding bij den groei van andere organismen dan het voor onze test
gebezigde gistras, een rol zou spelen. Terwijl over aneurine
(vitamine Bi) in dit opzicht reeds talrijke onderzoekingen zijn
verrichtdie op de algemeene beteekenis van dezen bios-fac-
tor wijzen, was dit bij biotine tot voor kort nog niet mogelijk
geweest. In de laatste jaren zijn echter in het Utrechtsche labo-
ratorium ook met het biotine in die richting proeven genomen,
waarvoor ik preparaten van de gekristalliseerde methylester ter
beschikking heb gesteld.

Dat biotine bij den groei van hoogere planten een rol zal spelen
was op zichzelf niet onwaarschijnlijk, gezien het relatief hooge
bios-gehalte van een groot aantal onderzochte zaden (van
Hasselt). quot;»)

F. K ö g 1 en A. J. H a a g e n S m i t konden een derge-
lijken invloed bij erwten duidelijk aantoonen. Zij kweekten
erwtenembryo's, waarvan de cotylen waren verwijderd, op een
sterielen, bios-vrijen voedingsbodem en constateerden, dat toe-
voeging van biotine een betrekkelijk sterken groei, speciaal van
het spruitgedeelte, veroorzaakte. Zelfs in een verdunning
1 :1,25 X 10® bleek nog een duidelijk waarneembare groeiver-
hooging ten opzichte van de controleplantjes op te treden. Ook
aneurine verhoogde den groei, maar werkte meer op de wortel-
vorming; de groeitoeneming van het spruitgedeelte was geringer
dan bij een even groote biotine-concentratie. Daarentegen ont-
wikkelden zich bij toevoeging van aneurine vaak naast een lange
hoofdwortel ook nog bij wortels, terwijl bij de biotine- en de con-
troleplantjes steeds slechts een korte hoofdwortel optrad.

47)nbsp;Literatuuropgaven bij R. Grew e, Ergebnisse d. Physiologie etc. Bnd. 39.
Verlag S. F. Bergmann, München 1937.

Biotine en aneurine samen gaven, zooals te verwachten was
een sterker effect dan de beide stoffen afzonderlijk.

F. Kögl en N. Fries®quot;) vonden, dat biotine ook een groei-
factor is voor verschillende schimmels. Bijzonder interessant zijn
hun proeven met Nematospora gossypü. Deze op katoenplanten
levende parasiet heeft volgens onderzoekingen van H. W.
B u s t o n quot;) en medewerkers twee groeifactoren noodig om zich
in synthetisch milieu goed te kunnen ontwikkelen. De eene is
meso-inosiet, zooals Buston bewees. Wat den tweeden factor
betreft, konden Kögl en Fries aantoonen, dat deze door
zuiver biotine kon worden vervangen.

Aneurine had bij deze schimmel een zeer gering effect. Daaren-
tegen was het bij enkele andere schimmels (Pohjporus adustus,
Polyporus abietinus) juist omgekeerd; deze reageerden sterk op
aneurine, terwijl biotine en inosiet geen effect hadden.

De auteurs veronderstelden, dat bij den groei van al deze schim-
mels evenals bij gist de drie factoren (meso-inosiet, biotine en
aneurine) een rol spelen, maar dat de schimmels niet in staat
zijn, alle drie factoren zelf te synthetiseeren. De ontbrekende fac-
toren (inosiet en biotine, resp. aneurine) moeten zij uit hun voe-
dingsbodem kunnen opnemen.

Met behulp van de gisttest kon worden aangetoond, dat het
mycelium van P. adustus na kweeken in een synthetisch milieu een
groote hoeveelheid biotine bevatte, ondanks het feit dat aan den
voedingsbodem van buiten af geen biotine was toegevoegd.

In de veronderstelling, dat tijdens den groei de door de schim-
mels gesynthetiseerde factoren ook voor een deel in den voedings-
bodem zouden overgaan, (wat K ö g 1 en F.r i e s voor Phycomyces
Blakesleeanus, die zeer sterk biotine bleek te produceeren, ook
inderdaad konden aantoonen), entten zij nu Nematospora gossy-
pü en Polyporus adustus beide op dezelfde voedingsoplossing
zonder een der groeifactoren toe te voegen. Èn inderdaad bleek
na ongeveer een week een krachtige groei van beide schimmels
op te treden.

Een dergelijke „kunstmatige symbiosequot; verkregen deze onder-
zoekers ook met Nematospora gossypü en Polyporus abietinus.

51 H W Buston en B. N. Pramanik, Biochem. J. 25. 1656, 1671 (1931)
H W Buston en S. Kasinathan, Biochem. J. 27, 1859 (1933).

F. Kögl en W. J. van Wagtendonk®^) constateerden,
dat biotine ook een zeer sterken invloed heeft op den groei van
Staphylococcus pyogenes aureus. Deze bacterie heeft volgens
B.C.J. G. Knight^®) twee groeifactoren noodig om zich in een
zuiver synthetischen voedingsbodem te kunnen ontwikkelen, n.l.
nicotinezuur (resp. nicotinezuuramide) en aneurine; afzonderlijk
zijn beide factoren inactief.

Kögl en van Wagtendonk konden dit bevestigen, maar
constateerden bovendien, dat in tegenstelling met aneurine en
nicotinezuur, zuivere biotine-methylester op zichzelf ook reeds een
groei veroorzaakte en wel was nog in een verdunning van
1 : 2 XIOquot; een duidelijke invloed waar te nemen.

Het door biotine veroorzaakte groeieffect werd vrij sterk ver-
groot door toevoeging van nicotinezuur en (in mindere mate)
door aneurine. De drie factoren tezamen gaven een bijzonder
sterken groei. Ter toelichting diene de volgende tabel, waarin
eenige van de door Kögl en van Wagtendonk verkregen
getallen zijn weergegeven.

Uit bovenvermelde onderzoekingen is duidelijk gebleken, dat
biotine niet slechts voor ras M een belangrijke groeifactor is,

maar ook op den groei van andere, zeer uiteenloopende, plantaar-
dige organismen een grooten invloed uitoefent. Hoewel het aantal
proefnemingen in die richting uit den aard der zaak nog germg
is wettigen de tot nu toe verkregen resultaten echter wel het ver-
moeden, dat aan het biotine evenzeer als aan het aneurme.een
algemeene beteekenis als groeifactor toekomt. Zoo lang echter
de structuur van deze interessante verbinding nog met is opge-
helderd en de bereiding nog met zulke groote kosten en moeite
gepaard gaat, is men wel genoodzaakt, zeer spaarzaam te werk
te gaan bij het opofferen van actieve kristallen aan physiolo-
gische proeven. Het is daarom te hopen, dat ook deze groeistof
later beter toegankelijk wordt.

	■■ 'ï ■■
_ ■-■■ja:'

	rr jr.i.,

aqua dest.	1000 cm'
glucose	10 g
(NH4)2S04	3 „
MgS04.7H20	0,7 „
KH2PO4	1 „
K2HPO4	0,16,,
NaCl	0,5 „
Ca(N03)2	0,4 „

	Preparaat	i ' Preparaat	Preparaat
Golflengte	956	960	1050 I
Golflengte	conc. 740 mg/L conc. 660 mg/L;		conc. 740 mg/L
	h. ;	h.	h.
405 270 m/x	0	i 0	0
265 m^a	—	—	0,01
254 „	0,12	0,03	0,02
248 „	0,17	0,06	0,05
240 „	0,24	0,09	0,06
238 „	0,19	0,07	0,05
234 „	0,14	0,05	0,05

Toegevoegde factor	Groei
Nicotinezuur 5 y/cm®	10 %
Aneurine 5 y/cm®	10 „
Biotine-ester 0,005 y/cm®	140 „
Nicotinezuur 5 y/cm® biotine-ester 0,005 y/cm® j	320 „
Aneurine 5 y/cm® -t- „ „ „	200 „
Nicotinezuur 0,05 y/cm® -1- aneurine 0,05 y/cm®	150 „
,, JÎ ff ff -F biotine-ester 0,005 y/cm®	665 „
Nicotinezuur 5 y/cm® aneurine 5 y/cm®	675 „
„ -f biotine-ester 0,5 y/cm®	770 „

	groei


	j	^^--^
	/
/	;-