J-

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD
VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN
DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT OP
GEZAG VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS
DR. F. H. QUIX, HOOGLEERAAR IN DE
FACULTEIT DER GENEESKUNDE, VOLGENS BESLUIT
VAN DEN SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE
BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS- EN
NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN OP DONDERDAG
11 JULI 1940, DES NAMIDDAGS TE 4 UUR

/i ' rf

Bij het verschijnen van dii proefschrift uHl ik allen, van wien ik
gedurende mijn studie onderricht mocht ontvangen en aan hen. die mij
op andere wijze bij de bewerking van dit proeischrift behulpzaam zijn
geweest, .mijn erkentelijkheid befuiffen.

In de eerste plaats wil ik U. Hooggeleerde DB GRAAPP. Hooggeachte
Promotor, dank zeggen voor Uw leiding bij het thans beëindigde onder-
zoek en voor de zelfstandigheid, welke Gij mij hierbij hebt gelaten. Aan
den tijd. quot;welke ik op Uw laboratorium werkzaam ben geweest, zal ik
steeds de meest aangename herinneringen bewaren. Het verheugt mij zeer.
dat ik nog eenigen tijd Uw assistent heb mogen zijn.

U. Hooggeleerde COHEN, betuig ik mijn dank voor Uw onderwijs in
de Physische Chemie, alsmede voor Uw toestemming eenige van mijn
werkzaamheden op Uw laboratorium te mogen verrichten.

Hooggeleerde KRUYT. Uwe colleges Kolloïdchemie en Phasenleer heb
ik met groote belangstelling gevolgd.

Hooggeleerde KÖGL, voor Uw onderwijs in de Organische Chemie
zeg ik U harteli/k dank.

Hooggeleerde SNIJDERS, voor Uw belangstelling in mijn werk ben
ik U zeer erkentelijk.

U. Zeergeleerde SCHLEMPER. zeg ik hartelijk dank voor Uw prac-
tische raadgevingen en aanwijzingen.

Ook komt een woord van dank \foe aan het personeel van het Phar-
maceutisch Laboratorium, in het bijzonder aan den Heer KELDER.

'If V'

fquot; c

Dat microörganismen het vermogen bezitten Polysaccha-
riden te synthetiseeren, was reeds in de vorige eeuw bekend.
Bij het onderzoek van de celbestanddeelen van bacteriën,
gisten en schimmels kon in vele gevallen de aanwezigheid van
op glycogeen gelijkende stoffen worden geconstateerd; ge-
woonlijk werd aangenomen, dat deze koolhydraten de rol van
reservestof vervulden.

Meer aandacht werd besteed aan de Polysacchariden,
welke door bacteriën geproduceerd, buiten het bacterielichaam
werden aangetroffen. Vele soorten bacteriën zijn n.1. in staat
groote hoeveelheden gom- of slijmachtige stoffen te produ-
ceeren, welke zijn waar te nemen óf in de cultuurvloeistof,
öf als een omhulsel van de cel, een z.g. kapsel. Deze twee
verschijnselen komen meestal gelijktijdig voor; de meeste
onderzoekers zijn dan ook van meening, dat de in vloeibare
cultuurmedia aanwezige slijmstoffen ontstaan door het in
oplossing gaan van een of meer bestanddeelen van de kapsel.
Een groot aantal van deze bacterieslijmen is in de loop der
jaren onderzocht, in hoofdzaak afkomstig van niet-pathogene
kapselbacteriën. In alle gevallen bleek men met Polysac-
chariden te doen te hebben. Deze koolhydraten waren van
een eenvoudige samenstelling, gewoonlijk kon slechts één
pentose of hexose als hydrolyseproduct worden geïsoleerd,
een enkele maal kwamen twee monosacchariden als bouw-
steen voor. Steeds meer mededeelingen verschenen over door
bacteriën geproduceerde arabanen, dextranen, laevulanen en
galactanen, het bleef echter bij een vermeerdering van het
feitenraateriaal.

Inmiddels was komen vast te staan, dat bij pathogene
bacteriën verband bestond tusschen virulentie en het bezit
van een kapsel. Pathogene kapselbacteriën zijn meestal alleen
dan virulent, wanneer ze haar kapsel bezitten, verlies van de
kapsel doet de virulentie geheel of gedeeltelijk verdwijnen.
Eenige kapselpolysacchariden van pathogene bacteriën wer-
den in studie genomen, zonder dat zich echter nieuwe
gezichtspunten voordeden.

Deze stand van zaken veranderde, toen in 1917Dochez
en A V e r y in bacterievrije fikraten van een pneumococcen-
cultuur een stof aantoonden, welke met het homologe immuun-
serum een precipitatiereactie te zien gaf (i). Dergelijke
„soluble specific substancesquot; waren reeds lang bekend. Zij
waren opgevat als eiwitstoffen, vrijgekomen door autolyse.
Genoemde onderzoekers konden echter aantoonen, dat het
hier geen autolytisch, maar een stofwisselingsproduct betrof.
Heidelberger en Avery slaagden er eenige jaren later
in deze „soluble specific substancequot; te isoleeren: het bleek een
polysaccharide te zijn (2).

Op grond van serologische reacties is de groep der pneumo-
coccen in een aantal typen te verdeden. Heidelberger,
G O e b e 1 en A V e r y onderzochten de soluble specific sub-
stances (gewoonlijk S.S.S. genoemd) van de meest voor-
komende typen (2, 3) gn constateerden, dat uk verschillende
typen verschillende koolhydraten geïsoleerd konden worden,
die ieder tot in hooge verdunningen (1 : 6.000.000.) een zeer
specifieke precipkatiereactie gaven met een immuunserum,
gericht tegen een stam van hetzelfde type. als waaruk het
polysaccharide was bereid. Bovendien bleek voor elk type,
dat de S.S.S. identiek was met de kapselstof van de onder-
zochte stam. Uk kapsellooze stammen, die geen type-speci-
ficiteit bezitten, kon geen type-specifiek polysaccharide
worden geïsoleerd.

Verder kwam aan het licht, dat de geïsoleerde Polysaccha-
riden het vermogen antistoffen op te wekken missen, het zijn
dus geen antigenen, eerst na gekoppeld te zijn aan een eiwit

krijgen zij een antigeenkarakter. Dergelijke stoffen staan
bekend als rest-antigenen of haptenen, zij bepalen de immuno-
logische specificiteit van het volledige antigeen en reageeren
specifiek met het homologe immuunserum. Algemeen wordt
thans aangenomen, dat de type-indeeling van de pneumo-
coccen berust op de aanwezigheid van Polysacchariden in de
kapsel, die de rol van hapteen spelen en bij elk type een
andere chemische samenstelling hebben. De soort-specificiteit
zou dan bepaald worden door de samenstelling van het
lichaamseiwit, het is echter niet onmogelijk dat hier boven-
dien een z.g. somatisch koolhydraat een rol speelt.

Niet alleen bij de pneumococcen, maar ook bij vele andere
bacteriën, bij welke een type-indeeling mogelijk was, wer-
den Polysacchariden met hapteen-eigenschappen aange-
troffen. Zoo konden uit de verschillende typen der meningo-
coccen, gonococcen, staphylococcen, tuberkelbacteriën en
Klebsiella-soorten, type-specifieke Polysacchariden geïsoleerd
worden, zelfs bij de erythrocyten van verschillende bloed-
groepen bleek dit het geval te zijn.

Een chemisch onderzoek bracht aan het hcht, dat de
serologisch actieve koolhydraten gecompliceerder van bouw
waren dan de uit oudere onderzoekingen bekende Polysac-
chariden. Meestal kwamen twee of meer monosacchariden als
bouwsteen voor. Behalve pentosen en hexosen werden
aangetroffen hexuronzuren, aminosuikers, inosiet en acetyl-
groepen.

Dat de specificiteit van een antigeen bepaald wordt door
de chemische structuur van een betrekkelijk klein gedeelte
van het groote antigeen-(eiwit) molecuul, was reeds uit het
werk van Landsteiner gebleken. Deze bereidde kunst-
matige antigenen door aan een bepaald eiwit aromatische
diazoverbindingen te koppelen. Het bleek, dat aard en plaat-
sing van de in de benzolkern ingevoerde substituenten de
serologische specificiteit van het antigeencomplex bepaalden.
Zoo geeft een proteïne, gekoppeld aan o-aminobenzolsulfo-

zuur e preopitaat met het seruni. bereid door proefdieren
berlf Trquot; quot;nbsp;-- -rum.

bereid met het overeenkomstige para-derivaat: omgekeerd
r ageert het serum bereid met p-aminobenzolsuLrur'
proteme, alleen met deze stof, het ortho-derivaat geeft met dit
serum geen reactie. Invoering van andere groepen in d
benzolrmg verandert eveneens de specificiteit evLals ver-

-omene. zoo geven de drie isomere wijnsteenzuren gekop!
pdd aan proteïne (via eenzelfde aromatische diazoverbiL
dmg) dne immunologisch verschillende antigenen

Nadat bekend geworden was. welk een rol polysaccha-
nden van verschillenden bouw bij de type-indeeling van som-
mige bacteriesoorten speelden, hebben Goebel Avery
en Babers het werk van Landsteiner voortgezet
door ook suikers in het onderzoek te betrekken. Zij vonden

tose (4), ook bij «- en ^-glucosiden zijn dergelijke verschillen
waar te nemen (5) Bij de meest recente onderzoekingen

Uit het resultaat van deze onderzoekingen valt dus op te
maken we ke bouwsteenen en groepeeringen in een polysac-
charidemolecuul de specificiteit van het hapteen, en dus van
het geheele antigeen, bepalen.

Over het algemeen wordt aangenomen, dat polysacchariden
geen antigenen zijn. Er zijn in de laatste jaren eenige publi-
caties verschenen, waaruit blijkt, dat onder bepaalde omstan-
digheden wel antistofvorming kan optreden. Zoo vond bv
^ozaya. dat polysacchariden geabsorbeerd aan kool
collodmm, aluminiumhydroxyde of caseïne, na injectie bij

onderzoekers zijn er echter niet in geslaagd dit verschijnsel
te reproduceeren (8).

BoivinenMesrobeanu en ook Parachivesco
slaagden erin uit enkele Gram-negatieve bacteriesoorten een
complex te isoleeren, bestaande uit polysaccharide en phos-
phatide, met zoowel toxische als antigene eigenschappen, de
beide componenten zelf zijn noch antigeen, noch toxisch
(9, 10). Ook LisbonneenMonnier (ii),Raistric'k
en Top ley (12) en Haas (ts) troffen lipoïd-polysaccha-
ridecomplexen aan bij vertegenwoordigers van de geslachten
Brucella en Salmonella.

Dit proefschrift omvat het onderzoek van de chemische en
serologische eigenschappen van een polysaccharide, voor-
komend bij een tot het geslacht Klebsiella behoorende bacterie,
en wel op verzoek van Prof. Dr. E. P. Snijders te Amsterdam
van het specifieke polysaccharide van Bacterium pneumoniae
Friedländer, type C.

Nog voor de immunologische beteekenis van de kapsel-
polysacchariden bekend was geworden, waren reeds pogingen
gedaan iets naders te weten te komen over de polysaccharide-
fractie van Friedlander's bacterie (Klebsiella pneumoniae
Friedländer).

In 1920 isoleerde Toenissen (i4) uit de kapsels van
een Friedländerstam — van welk type is niet bekend — een
niet reduceerend stikstofvrij polysaccharide, dat een roode
kleur met jodium gaf. Na hydrolyse ontstonden reduceerende
suikers, waarvan er een geïdentificeerd werd als galactose.
Door K r a m a r (15) is dit later bevestigd.

Toen werd bekend dat de „soluble specific substancequot; van
de pneumococ, in 1917 ontdekt door Dochez en
Avery (1), een polysaccharide was, en wel identiek met de
kapselstof van dit organisme (2, 3).

welke een sterke uronzuurreactie vertoonde. De volgende
hydro,ysep.oducten konden worden geïdentificeerd^^quot; t
^Wo^ur. glucose en een tweede disaccharidezuur, voor-

komend in een verhouding van ongeveer 1:1:1. Het
aldobionzuur bleek te bestaan uit glucose en glucuronzuur,
het andere disaccharidezuur is niet nader onderzocht

Heidelberger, Goebel en Avery (20) isoleerden
het specifieke polysaccharide van Friedländer's bacterie
type B. welk een amorphe stof bleek te zijn, een 0.5%-oplos-
sing had een zure reactie t.o.v. Congopapier. 'De stof loste
moeilijk op in water, echter gemakkelijk in verdunde NaOH.
Met neutraal en basisch loodacetaat ontstond een precipitaat.
Als hydrolyseproducten werden gevonden glucose en een
niet nader onderzocht aldobionzuur.

Het specifieke koolhydraat van type C is onderzocht door
Goebel en Avery (is). Het was een in water oplosbare
stof, ook hier reageerde een 0.5 %-oplossing zuur op Congo-
rood. Een precipitaat werd verkregen met oplossingen van
uranylnitraat, geconcentreerd Ba (OH) 2 en neutraal en
basisch loodacetaat; de jodiumreactie was negatief.' Na hydro-
lyse bleken, evenals bij type B. glucose en een aldobionzuur
aanwezig te zijn.

Een overzicht van de eigenschappen der drie type-speci-
fieke stoffen geeft onderstaande tabel:

Het onderzoek van het specifieke koolhydraat van Bacte-
rium pneumoniae Friedländer type C, in dit proefschrift
beschreven, bepaalt zich tot de isolatie van de zuivere stof
het bepalen van enkele chemische constanten, de identificatie
van eenige hydrolyseproducten en het onderzoek van de
serologische eigenschappen. Het lag in de bedoeling aller-
eerst te trachten de bevindingen van Heidelberger
Go eb el en Avery te reproduceeren, om daarna zoo
mogeh;k het onderzoek uit te breiden.

Zooveel mogelijk hebben wij getracht bij ieder onderdeel
volgens de door genoemde auteurs aangegeven methoden te
werk te gaan, niet alleen, omdat zij de eenigen zijn geweest
die de Polysacchariden der drie Friedländertypen hebben
bestudeerd, maar ook, omdat een literatuuronderzoek - dat
ook de type-specifieke stoffen van vele andere bacteriesoor-
ten omvatte - aan het licht bracht, dat de door hen uitge-
werkte of toegepaste methoden de voorkeur verdienden
boven die van anderen.

Elk van de nu volgende hoofdstukken zal daarom aanvan-
gen met een beschrijving van de wegen, welke Heidel-
b e r g e r, G O e b e 1 en A V e r ij hebben ingeslagen en ver-
volgens welke wijzigingen en verbeteringen zij in de loop der
jaren hebben aangebracht.

1. A. R. Dochez, O. T. Avery, Joura exp. Med. 26, 477 (1917)
t O. T. Avery. W. F. Goebel, Journ. exp. Med. 50, 533 (1929).

5.nbsp;O. T. Avery, W. F. Goebel, F. H. B ab ers, Journ. exp.
Med. 55. 769 (1932).

b.nbsp;W. F. Goebel, O. T. Avery, F. H. Babers, Journ. exp.
Med. 60, 599 (1934).

8.nbsp;S. C. Wong, T. T'ung, Proc. Soc. exp. Biol. Med. 38, 668,
39, 161 (1938).

9.nbsp;A. Bol vin, L. Mesrobeaniu, C. r. Soc. Biol. 114, 307, 115,
306 (1933), 118, 612 (1934)), 124, 1176 (1937).

12.nbsp;H. Rais tri ck, W. W. C. Topley, Brit. Journ. exp. Path. 15,
113 (1934).

16.nbsp;J. H. Mueller, D. E. Smith, S. Litarczek, Proc. Soc. exp.
Biol. Med. 22, 373 (1925).

20.nbsp;M. Heidelberger, W. F. Goebel, O. T. Avery, Journ.
exp. Med. 42, 701 (1925).

Voor de isolatie van het specifieke polysaccharide van
Klebsiella pneumoniae type C gebruikten wij een stam. ons
beschikbaar gesteld door prof. dr. E. P. Snijders, directeur
van het Laboratorium voor Tropische Hygiëne te Amsterdam.
Zij was door dr. L. A. Julianelle te Wisconsin geïsoleerd uit
het bloed van een pneumoniepatiënt, en droeg de aanduiding
F 10. Serologisch behoorde zij tot het type C.

Morphologische eigenschappen: Gram-negatieve, asporo-
gene, pclymorphe staafjes, onbeweeglijk en facultatief
anaëroob. Een duidelijke kapsel is aanwezig.

Cultureele eigenschappen: op vloeibare voedingsbodems is
de groei diffuus troebel met een sediment, op vaste voedings-
bodems ontwikkelen zich vochtige, gladde, verheven kolonies.
Gelatine wordt niet vervloeid,
in peptonwater geen indolvorming,
reactie van Voges-Proskauer negatief,
methylroodproef positief,
zuur en gas uit: glucose
lactose
saccharose
glycerine
adoniet
dulciet.
melk: zure stremming,
nitraat wordt tot nitriet gereduceerd,
groeit op de citraatvoedingsbodem van Koser.

D e G r a a f f heeft de biochemische eigenschappen onder-
zocht van een aantal vertegenwoordigers vaquot; de soo t
KJeb lella pneumoniae, hi; kwam op grond van de verkregen

Wielenga onderzocht zoowel de serologische, als de
bxo hem,sehe eigenschappen van een aantal Klebsiella!
soorten, z:,n resultaten wezen duidelijk op een overeenkomst
van de serologische indeeling met de biochemische LÏeTna
van de Graaff (.). Later is gebleken, dat alle stamm^vL'
he type A tot de Graaff s Franklandtype behooren. terlij

De hier beschreven stam F 10. welke, zooals reeds gezegd
serologisch tot het type C behoort, vertoont cultureel aï
eigenschappen van het Friedländertype.

res. Men gmg dus uit van intacte bacteriecdlen. Het was
daarom noodzakelijk het koolhydraat van het som! isThe
eiwit los te maken en daarna dit eiwit te verwijderen ^
woonl,k geschiedden beide bewerkingen gdijktijdig door
gebruik te maken van physische of chemische me hoden o
een combinatie van beide.nbsp;'

Toenissen voerde de afsplitsing uit door gedroogde
bacterien bij 100° met 1 % NaOH te behandden (3) ®
T o m c 2 i k maakte het kapsdpolysaccharide van B. lactis

Ook werd vaak behandeling met verdunde zuren toege-
past, b.v. door suspensies met azijnzuur op 100° of hooger
te verhitten. Morgan paste dit toe bij B. dysenteriae (5),
Zinsser en Parker bij typhus- en tüberkelbacteriën
en Przesmyc ki bij meningococcen (6). Verder werd
wel gebruik gemaakt van verdunde zuren in de koude, o.a.
door W i e g h a r d en Julianelle bij de isolatie van
staphylococcenpolysacchariden C^). Extractie van de cellen
met verdund trichloorazijnzuur werd toegepast door M a 1 e k
op B. typhi flavum (») en door Boivin en Mesro-
beanu op enkele Salmonellasoorten (9).

Heidelberger, Avery en Goebel hebben in den
loop der jaren de meest uiteenloopende methoden toegepast
op pneumococcen en pneumobacteriën. Ook zij maakten ge-
bruik van behandeling met zuur in de warmte (iquot;), maar
tevens van een herhaald bevriezen en ontdooien der cellen,
of oplossen in gal (pneumococcen), of ook wel van aan-
tasten van het celproteïne door trypsine (i^).

Tenslotte moet nog worden vermeld de methode van
Fuller, welke staphylococcen destrueerde door oplossing
in formamide bij 150° (12).

Het na de splitsing vrijgekomen eiwit was gewoonlijk
gemakkelijk te verwijderen, aangezien het vrijwel volledig
was geprecipiteerd of grootendeels was ontleed, terwijl het
polysaccharide in oplossing was gebleven. Indien nog een
verdere verwijdering van het eiwit noodig bleek, werd door
de meeste onderzoekers een gefractioneerde precipitatie uit-
gevoerd met alkohol, aceton of neutrale zouten, zooals
NaCl en (NH4)2S04.

Behalve de eiwitten, moesten ook andere, vreemde stoffen
van het polysaccharide worden gescheiden.

Wanneer phosphaten werden aangetroffen, konden deze
worden verwijderd door de specifieke stof eenige malen met

ijsazijn te precipiteeren uit een oplossing van het polysaccha-
ride, waaraan 20,% Na-acetaat was toegevoegd (13).
Meestal kon men echter, na de onteiwitting, de afwezigheid
van phosphaten constateeren.

Eventueel aanwezig glycogeen kon worden ontleed door
inwerking van speeksel, of door gefractioneerde precipitatie
met Cu-acetaat (i3).

Indien bij de isolatie geen sterke zuren waren gebruikt,
werd het polysaccharide als zout verkregen. Dit kon dan in
het vrije zuur worden dmgezet door precipitatie met alkohol
of aceton uit zoutzure oplossing. Uitwasschen met alkohol
of aceton, ook vaak dialyse of electrodialyse werden toe-
gepast om resten zoutzuur en andere anorganische stoffen
te verwijderen. Op deze wijze verkreeg men steeds geheel
aschvrije producten.

In latere jaren kwamen vele onderzoekers tot het inzicht
dat talrijke van de hierboven genoemde bewerkingen van
dien aard waren, dat er groote kans bestond op verande-
ringen in het polysaccharidemolecuul. Al kreeg men dan pro-
ducten in handen, welke een of meer specifieke serologische
reacties vertoonden, de vraag bleef, of zij in de cel wel in
dezelfde toestand aanwezig waren.

Avery en G o e b e 1 zijn de eersten geweest, die be-
wezen hebben, dat deze vermoedens gegrond waren (lo).
Zij konden aantoonen, dat behandeling met verdunde loog-
oplossingen reeds in de koude een belangrijke invloed had
op de serologische en chemische eigenschappen van het spe-
cifieke koolhydraat van pneumococcus type I. Werd n.1. dit
polysaccharide geïsoleerd op een wijze, waarbij behandeling
met loog vermeden was. dan verkreeg men een stof, welke
antigene eigenschappen bezat¹), deze eigenschappen waren
verdwenen, wanneer de stof blootgesteld was geweest aan
de inwerking van loog. Beide stoffen reageerden even sterk

1nbsp; Muizen, welke waren behandeld met de beschreven stof, bleken
immuun te zijn tegen infectie met pneumococcus type I. Een zuiver hapteen
is dit polysaccharide dus niet.

met homoloog antiserum, maar een verzadigingsproef bracht
verschillen aan het licht. Wanneer men aan het serum zoo-
lang de met loog behandelde stof toevoegde, totdat geen
precipitaat meer werd gevormd, reageerde het, na verwijde-
ring van het neerslag, nog wel met het product waarop geen
loog had ingewerkt. Het omgekeerde was niet het geval.

Ook kwam een verschil in optische draaiing en van het C-,
H- en N-gehalte aan het licht. Uit een nader onderzoek bleek,
dat door de behandeling met loog acetylgroepen van het mo-
lecuul werden afgesplitst. Deze verandering in de structuur
heeft dus de genoemde wijzigingen in de serologische eigen-
schappen tot gevolg. Bij de typen II en III konden dergelijke
verschijnselen niet worden waargenomen. Wel kon aan alle
drie typen worden geconstateerd een afneming van de vis-
cositeit der oplossingen na behandeling met zuren en basen
in de warmte, ook verhitting op 100° of hooger, zonder toe-
voeging van reagentia, deed de viscositeit dalen (t^). Hei-
delberger, Kendall en Scherp toonden bovendien
aan, dat de hoeveelheid antilichaam, door eenzelfde ge-
wichtshoeveelheid polysaccharide uit homoloog antiserum
geprecipiteerd, na deze bewerking daalde.

Al deze ondervindingen hebben Heidelberger,
K e n d a 11 en Scherp ertoe geleid een isolatiemethode voor
pneumococcenpolysacchariden uit te werken, waarbij het ge-
bruik van sterke zuren en basen en van herhitting zoo veel
mogelijk vermeden werd (is). Aangezien deze methode veel
navolging heeft gevonden, en ook wij haar als leidraad heb-
ben gekozen, zullen wij in het kort een beschrijving ervan
geven.

De betreffende stam, welke kort tevoren door een muis ge-
passeerd was, werd geënt op glucose-phosphaatbouillon en 3
dagen bij 37° bebroed. Vervolgens behandelden zij de cultu-
res gedurende een nacht met 1phenol en dampten dan in
tot i/io van het oorspronkelijke volumen. Dit indampen ge-
schiedde in vacuum, waarbij de temperatuur niet boven 35°
kwam. Het polysaccharide werd neergeslagen met alkoho!

en Na-acetaat en, na een nacht staan, het neerslag afgecen-
trifugeerd. Er ontstonden nu drie lagen: de bovenste bevatte
geen specifieke stof en werd weggeworpen, evenals de onder-
ste, zeer visceuze laag, waarin wel serologisch actief mate-
riaal aanwezig bleek, maar ook zeer veel verontreinigingen.
De middelste laag, welke een gomachtige consistentie had en
eveneens serologisch actief was, werd verder verwerkt. De
gom werd gesuspendeerd in een zure acetaatbuffer (pH on-
geveer 5) en het onoplosbare gedeelte door centrifugeeren ver-
wijderd; vervolgens werd het polysaccharide weer neerge-
slagen met alkohol, afgecentrifugeerd en opnieuw in een zure
acetaatbuffer opgelost. Verwijdering van het eiwit uit deze
oplossing had plaats door middel van de methode van
Scvag (15). Hiertoe werd de oplossing gedurende uur
krachtig geschud met 1/5 volumen chloroform en 1/25 volumen
butylalkohol en hierna gecentrifugeerd. Thans bevond zich
tusschen de chloroform en de waterige oplossing een half-
vaste emulsie, welke voor een groot gedeelte uit eiwit bleek
te bestaan. De bovenstaande vloeistof werd afgeheveld en
opnieuw met chloroform en butylalkohol behandeld, deze be-
werking w-erd zoolang herhaald tot geen emulsielaag meer
ontstond; het polysaccharide werd vervolgens met alkohol
neergeslagen. Ook uit de emulsielaag kon nog zuiver poly-
saccharide worden verkregen door met water uit te wasschen
en het waschwater op dezelfde wijze te zuiveren.

Glycogeen verwijderden zij door gefractioneerde precipi-
tatie met Cu-acetaat, of, indien dit niet mogelijk bleek, door
inwerking van speeksel; phosphaat door precipitatie met ijs-
azijn uit een 20 % Na-acetaatoplossing.

Tenslotte werd het gezuiverde product neergeslagen met
alkohol en wat Na-acetaat, met alkohol' uitgewasschen en
gedroogd. Op deze wijze verkregen zij een neutraal reageer-
rend Na-zout.

Het valt echter niet te ontkennen, dat de op deze wijze
verkregen preparaten minder zuiver zijn dan de vroeger door
Heidelberger en medewerkers bereide, wat vooral tot

uiting komt in het stikstofgehalte. De polysacchariden van
de pneumococcentypen II en III, welke vroeger geheel stik-
stofvrij bereid konden worden, hadden thans een stikstof-
gehalte varieerende van 0.06 tot 0.73 %. Desondanks zijn wij
begonnen met, althans in groote lijnen, de voorschriften van
genoemde onderzoekers te volgen. Wat de resultaten hiervan
waren en welke wijzigingen wij later hebben aangebracht,
zullen w^ij in het nu volgende deel van dit hoofdstuk ver-
melden.

Gezien de ervaringen van anderen, waarvan wij 14 het
voorgaande een overzicht hebben gegeven, hebben wij ge-
meend aan het gebruik van eerii vloeibare voedingsbodem
de voorkeur te moeten geven boven dat van een vaste. In
vloeibaar milieu zal n.1. een groot gedeelte van het specifieke
polysaccharide in vrije toestand aanwezig zijn, wat af te
leiden is uit het feit, dat bacterievrije fikraten geen antigene
eigenschappen bezitten. Afsplitsing van het lichaamseiwit,
met alle hieraan verbonden nadeelen, is dan niet noodig.

Wanneer in de literatuur melding wordt gemaakt van het
gebruik van een vloeibaar cultuurmedium voor de isolatie
van bacterie-polysacchariden, is dit bijna steeds alkalische
bouillon of peptonwater, eventueel met toevoeging van phos-
phaat of glucose. Van het begin af hadden wij tegen der-
gelijke voedingsbodems bezwaren. Wij achtten het n.1. wen-
schelijk, dat in de op te werken cultures naast het specifieke
koolhydraat zoo weinig mogelijk vreemde stoffen aanwezig
waren, het aantal bewerkingen, dat voor de zuivering nood-
zakelijk was, kon dan tot een minimum beperkt blijven. Nu
bestond er een zeer groote kans, dat eenige, in pepton aan-
wezige stoffen aanleiding zouden kunnen geven tot moeilijk-
heden bij de zuivering van ons product. Goebel had reeds
ontdekt, dat in pepton geregeld het specifieke polysaccharide

deren is, gezien de bereiding van het pepton uit dierlijk mate-
riaal. Het is tot nu toe steeds gelukt de pneumococcenpoly-
sacchariden van het bloedgroepkoolhydraat te scheiden, het
is echter de vraag of deze scheiding ook bij andere bacterie-
polysacchariden is uit te voeren. Ook bestaat de mogelijkheid,
dat in de voedingsbodem aanwezige stoffen serologische
verwantschap bezitten met het te isoleeren product, zoodat
bij het immunologisch onderzoek complicaties op kunnen tre-
den. Kort geleden is een dergelijk geval waargenomen, en
wel door Goebel, Beeson en Hoagland (i^). Zij
stelden een groote overeenkomst in chemische samenstelling
en serologische eigenschappen vast tusschen het specifieke
polysaccharide van bloedgroep A en dat van pneumococcus
type XIV.

Ook het voorkomen van glycogeen of daarop gelijkende
stoTIen in Liebig's vleeschextract kwam ons minder Wensche-
lijk voor.

Dit alles is voor ons een reden geweest het gebruik Van
bouillon en andere peptonhoudende voedingsbodems te ver-
mijden, en voor ons onderzoek een synthetische voedings-
bodem te kiezen. Deze heeft bovendien het voordeel aan-
merkelijk goedkooper te zijn.

Kauffmann en Smit (i») en F o 1 m p er's (i») heb-
ben in 1935 aangetoond, dat in verschillende, bij het bacterio-
logisch drinkwateronderzoek in gebruik zijnde voedings-
bodems, het pepton zonder bezwaar kan worden vervangen
door d-glutaminezuur. Wij zijn daarom begonnen met na te
gaan, of groei mogelijk was van onze Friedlanderstam F 10
op diverse, glutaminezuur bevattende voedingsbodems. Wij
hebben dezen stam allereerst geënt op/ de Volgende vloei-
stoffen:

2.nbsp;als 1, het ammoniumglutaminaat was echter vervangen
door Na-glutaminaat, bereid door het glutaminezuur te
neutraliseeren met soda. pH = 7.4.

3.nbsp;Yi!% glutaminezuur,nbsp;ammoniumlactaat en H
K2HPO4, soda wterd toegevoegd tot pH = 7.4.

In elk van de drie vloeistoffen was na 1 dag bij 37° behoor-
lijke groei waar te nemen, en wel in no. 3 sterker dan in de
beide andere. Het lag daarom voor de hand de cultuur-
vloeistof no. 3 nader op bruikbaarheid te onderzoeken, door
na te gaan of de productie van specifiek oplosbaar kool-
hydraat belangrijk verschik van die op andere voedings-
bodems. Daartoe bereidden wij de volgende oplossingen:

In elk van de drie vloeistoffen was na 1 dag bij 37° behoor-
van elke vloeistof een Chamberlandfiltraat L3 gemaakt. Om
de kans op absorptie van de specifieke stof door de kaars
zoo gering mogelijk te doen zijn, werden eerst eenige tien-
tallen cms onbeënte voedingsbodem doorgezogen, daarna nog
ongeveer 20 cm^ cultuur. Van de hierna gefiltreerde vloei-
stof bereidden wij met behulp van physiologische zoutoplos-
sing de verdunningen 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160 en 1/320.
0.5 cm3 van elke verdunning werd nu voorzichtig gepipet-
teerd op 0.5 cmS anti-F lO-serum (verdund 1/10), en na 2
uur staan bij 37° nagegaan in welke buizen zich een witte
ring in het grensvlak der twee vloeistoffen vertoonde. Als
precipitatietiter werd voor iedere reeks aangenomen de hoog-
ste verdunning welke nog positief reageerde, d.wi.z. een witte
ring in het grensvlak te zien gaf. De resultaten waren:

filtraten aanwezige hoeveelheden specifiek polysaccharide
kunnen deze uitkomsten ons een indruk geven vL de p J:

Na deze resultaten hebben wij voor onze verdere experi-
menten de voedingsbodem no. 3 gebruikt. Vergeleken mét

Volledigheidshalve volgt hier nog de bereidingswijze van
de synthetische voedingsbodem:
In 1 liter leidingwater losten wij op:
5 g d-glutaminezuur,

1 mg Saccharomyces cerevisiae siccum, Ph Ned V
en verhitten deze oplossing 5 minuten op 115°. Na filtreeren
brachten wij met verdund zwavelzuur de pH op 7.4 en vul-

300 cma inhoud. Na afsluiting met een prop watten werd
gedurende ^ uur op 110° gesteriliseerd.

50 liter van de zoojuist beschreven voedingsbodem wer-
den geent met de Friedländerstam F 10. In het begin werk-

doordat aanzienlijke hoeveelheden polysaccharide vrijkomen
door autolyse. De levende bacteriën werden gedood door
toevoeging van ^ i% phenol.

Vervolgens dampten wij de verzamelde cultures in tot
ongeveer i/io van het oorspronkelijk volume, dit geschiedde
in vacuum, waarbij gezorgd werd, dat de temperatuur van de
vloeistof niet boven de 40° kwam. De destilleerkolf was een
geglazuurd porceleinen vat met een inhoud van 25 liter.
Schuimvorming kon worden tegengegaan door wat laurine-
alkohol toe te voegen. Het residu was een strooperige, vuil-
gele vloeistof, wij brachten met ijsazijn de pH op 4, en cen-
trifugeerden het ontstane neerslag, dat grootendeels uit eiwit
bestond, af. Vervolgens voegden wij langzaam, onder voort-
durend omschudden, alkohol toe om alle specifieke stof neer
te slaan, volledige precipitatie werd bereikt bij een alkohol-
concentratie van ongeveer 50 Dat zich werkelijk alle spe-
cifiek reageerende stof in het neerslag bevond, konden wij
opmaken uit het feit, dat de vloeistof, waaruit het neerslag
door centrifugeeren en de alkohol door indampen verwijderd
was, geen reactie meer gaf met homoloog antiserum.

Na een nacht staan was het neerslag geheel bezonken.
De bovenstaande, heldere, geelgroen gekleurde, alkoholische
vloeistof werd zooveel mogelijk afgeheveld en de rest gecen-
trifugeerd. In de centrifugebuizen bevonden zich nu drie
lagen: de bovenste was de alkoholische, heldere vloeistof,
welke werd weggeworpen, de middelste bestond uit een
dikke, slijmige, vuilwitte massa, de onderste was een vis-
ceuze donkerbruine vloeistof. Deze onderste laag gaf na
verdunning nog wel een reactie met antiserum, maar bevatte
zooveel verontreinigingen (zouten en eiwitten), dat wij deze
fractie niet verder hebben verwerkt. De middelste laag bleek
het grootste gedeelte van het specifieke koolhydraat te bevat-
ten en werd daarom verder behandeld. Een volledige schei-
ding van de tWee onderste lagen was niet altijd mogelijk,
maar dit bleek de zuivering van het ruwe product niet te
bemoeilijken.

De te zuiveren fractie gaf een zeer sterke reactie met anti-
serum en een positieve Molisch-proef, de reactie van Millon
en de biureetproef waren echter eveneens positief. Een groot
gedeehe van het eiwit konden wij verwijderen door de mid-
denlaag te suspendeeren in 1000 cmS acetaatbuffer van
pH - 4 (welke 5 % Na-acetaat bevatte) en de suspensie
na een dag staan, te centrifugeeren. Het polysaccharide
bevindt zich dan in de oplossing, het eiwit voor een belang-
rijk deel in het sediment. Het koolhydraat werd nu uit de
oplossing neergeslagen met alkohol en het neerslag opnieuw
in lOOO cm3 buffermengsel gebracht. Dit suspendeeren, cen-
tnfugeeren en neerslaan met alkohol geschiedde zoolang tot-
dat het met alkohol verkregen precipitaat geheel in het buf-
iermengse] oploste; na de laatste alkoholprecipitatie werd het
koolhydraat, dat zich als een gomachtige massa op de bodem
van de centrifugebuizen bevond, in vacuum boven CaCI
gedroogd. De gedroogde stof werd nu fijngepoederd: een
vudwit, amorph poeder werd verkregen. Het bezat de vol-
gende eigenschappen:

Mohsch-reactie sterk positief, Millon's en biureetproef
zwak positief. Proef van Lassaigne positief, het stikstof-
gehalte bleek bij nader onderzoek ongeveer 2 % te bedragen
Geen kleurreactie met jodium; soms was een weinig phos-
phaat aanwezig. Een verdunning van 1 : 1 600 000 gaf nog
een positieve precipitatiereactie met homoloog antiserum
Bepaling van de optische draaiing was onmogelijk, zelfs ver-
dunde oplossingen waren melkachtig troebel. Uit 50 liter
cultuur werd 5 tot 8 gram verkregen.

Ter verdere zuivering hebben wij de onteiwitting volgens
Sevag (15) toegepast. Daartoe lostert wij de stof op in
800 cm3 acetaatbuffer met een pH = 4, en schudden deze
oplossing gedurende 2 tot 3 uur met 160 cmS chloroform en
30 cm3 amylalkohol, vervolgens centrifugeerden wij drie
kwartier. De bovenste laag werd nu afgeheveld en opnieuw
op dezelfde wijze behandeld, zoolang tot geen emulsie meer
waar te nemen was na het centrifugeeren, hetgeen na 7 a 8

bewerkingen het geval was. De verzamelde, veel eiwit bevat-
tende middenlagen werden, na'verzamelen, uitgewasschen met
het bekende buffermengsel en eveneens volgens Sevag ont-
eiwit, daarna de gezuiverde waschvloeistof bij de eerste vloei-
stof gevoegd. De melkachtige troebeling van de oplossing
was na deze zuivering geheel verdwenen en had plaats ge-
maakt voor een opalescentie. De specifieke stof werd nu
opnieuw met alkohol neergeslagen en gedroogd. Na fijn-
poederen hadden wij een sneeuwwit, amorph poeder in han-
den, de opbrengst varieerde van 3 tot 5 gram. De eigen-
schappen waren:

Eiwitreacties (Millon, Adamkiewicz, ninhydrine-, biu-
reet-, sulfosalicylzuur- en diazobenzolsulfozuur-reactie) alle
negatief.

De optische draaiing was thans te bepalen, hoewel door
de opalescentie der oplossingen niet nauwkeurig, zij bedroeg
ongeveer 100°. De stof bevatte 44.7 % C, 5.91% H en
5.6 % asch, bovendien was nog 0.3—0.4!% stikstof aan-
wezig.

Met antiserum was nog een reactie waar te nemen tot een
verdunning van 1 : 2 000 000.

Vervolgens hebben wij het verkregen product aan verschil-
lende bewerkingen onderworpen, en wel om te zien, of nog
een verdere zuivering mogelijk was. Aanleiding tot deze
pogingen was de vraag: hebben wij een homogene, zuivere
stof in handen, welke de zeer gevoelige, zeer specifieke pre-
cipitatiereactie met antiserum te zien geeft, of betreft het hier
een mengsel van verschillende stoffen, waarvan er één, mis-
schien in geringe hoeveelheden aanwezig, verantwoordelijk
is voor de serologische activiteit? Ook de aanwezigheid van
een gering percentage stikstof deed ons vermoeden, dat het
gezuiverde preparaat nog verder was te reinigen.

2., Herhaaldelijk precipiteeren met ijsazijn uit 20 % Na-ace-
taatoplossing. Er traden groote verliezen op, terwijl geen
daling van het stikstofgehalte geconstateerd kon worden.

3.nbsp;Met sulfosahcylzuur en phosphorwolfraamzuur ontstond
geen precipitaat, zoodat verwijdering van vreemde stoffen
ook op deze wijze niet uitvoerbaar bleek.

4.nbsp;Adsorptie aan noriet en aan aluminiumhydroxyde bij ver-
schillende pH. Het polysaccharide werd door deze stoffen
niet geadsorbeerd, het stikstofgehalte was na de behande-
ling niet teruggeloopen.

De serologische activiteit der preparaten (precipitatietiter)
was in alle gevallen gelijk gebleven.

5.nbsp;Gefractioneerde precipitatie met ijsazijn leverde twee frac-
ties op met vrijwel gelijk N-gehalte en dezelfde precipi-
tatietiter.nbsp;^ ^

6.nbsp;Door gefractioneerde precipitatie met aceton verkregen
wij een tweetal fracties, die ieder afzonderlijk weer op
dezelfde wijze gefractioneerd kunnen worden. In totaal
werden op deze wijze 4 fracties bereid, welke geen ver-
schillen vertoonden wat betreft precipitatietiter en opti-
sche draaiing, voor zoover deze laatste grootheid nauw-
keurig viel te meten. Het stikstofgehalte varieerde van
0.3—0.6 %.

Oplossingen van gelijke concentraties van deze vier frac-
ties vertoonden reeds op het oog een duidelijk verschil in
viscositeit, en wel waren de oplossingen visceuzer, naar-
mate minder aceton noodig was. Uit deze bevindingen
IS op te maken, dat de fracties, wat chemische constitutie
betreft, niet van elkaar verschillen, maar dat de poly-
saccharidemoleculen, waaruit zij zijn samengesteld, ver-

schillende grootte bezitten, d.w.z. uit verschillende aantal-
len bouwsteenen bestaan.

Het feit, dat ondanks herhaalde zuiveringspogingen het
stikstof gehalte niet beneden het oorspronkelijke percentage
daalde, deed ons vermoeden, dat dit element een essentieel
bestanddeel van de specifieke stof was. In het volgend hoofd-
stuk komen wij nader hierop terug.

Verder waren de voornaamste eigenschappen van ons pro-
duct na de beschreven behandelingen zóó weinig veranderd,
dat wij het zeer waarschijnlijk achtten, dat de door ons
geïsoleerde stof homogeen was.

Bij de bereiding van het type-specifieke polysaccharide
hadden wij tot nu toe behandeling met minerale zuren ver-
meden, zoodat wij konden verwachten de stof niet als vrij
zuur, maar als zout in handen te krijgen. Dit bleek inderdaad
het geval te zijn: de stof bevatte bijna 6 % asch, de oplos-
singen hadden een pH van ongeveer 7. Wij hebben nu
beproefd het zout met behulp van HCl in het vrije zuur om
te zetten.

Aan 50 cm3 1 % polysaccharideoplossing voegden wij toe
5 cm3 2 n HCl en vervolgens onder schudden 96 % alkohol.
Na toevoeging van ongeveer 200 cm^ ontstond een geringe
hoeveelheid neerslag, met meer alkohol was geen verdere
precipitatie mogelijk. Het neerslag had een aschgehalte van
1-9 %, het werd daarom opgelost in water en nogmaals met
alkohol en zoutzuur geprecipiteerd. Ook nu bleef het grootste
gedeelte van het polysaccharide in oplossing, het aschgehalte
van het geprecipiteerde deel was na de tweede bewerking
gedaald tot 0.08 ,%. Het in de alkoholische vloeistof achter-
gebleven koolhydraat was alleen terug te winnen door toe-
voeging van een Na-acetaatoplossing, waardoor het neer-
s'oeg, het bevatte dan weer eenige procenten asch. Verande-
ring van de toegevoegde hoeveelheid zoutzuur of van de
polysaccharideconcentratie leverde geen betere resultaten op,

evenmin de vervanging van de alkohol door aceton of ijsazijn.
Een iets betere opbrengst werd verkregen door in plaats van
zoutzuur trichloorazijnzuur te gebruiken, de precipitatie was
dan iets minder onvolledig, een geheel aschvrij product kon
ook op deze wijze niet vérkregen worden, het aschgehalte
kwam nooit onder de 0.1 i% en steeds was meer dan één
precipitatie noodzakelijk.

De optische draaiing kon na de behandeling met zuur iets
nauwkeuriger bepaald worden, deze varieerde bij de verschil-
lende preparaten van 108°— 120°. De precipitatietiter
was onveranderd gebleven, namelijk 1 : 2.000.000.

Hei delberger en medewerkers hadden niet de minste
moeilijkheden oiidervonden bij de bereiding van het vrije
zuur, éénmaal neerslaan met alkohol en zoutzuur was steeds
voldoende om een geheel aschvrije stof te verkrijgen, zonder
dat verliezen optraden. Ook aan de bepaling van het optische
draaiingsvermogen schenen geen bezwaren verbonden te zijn.
ook niet indien zij dit van het zout trachtten te bepalen., Wat
de oorzaak was van deze belangrijke verschillen in resul-
taten, konden wij in dit stadium van het onderzoek nog niet
vaststellen. eerst na een meer uitgebreid onderzoek kon hier-
over opheMering worden verkregen. Dit zal in het volgende
hoofdstuk uitvoerig worden besproken.

9.nbsp;A. Boivin, L. Mesrobeanu, Compt. rend. Soc. Biol. 114,307;
115, 306 (1933); 118, 612 (1934); 124, 1176 (1937).

13.nbsp;M. Heidelberger, F. E. Kendall, H. W. Scherp, Journ.
Journ. exp. Med. 64, 559 (1936).

14.nbsp;M. Heidelberger, F. E. Kendall, H. W. Scherp, Journ.
Proc. Soc. exp. Biol, and Med. 33, 188, 445 (1935).

17.nbsp;W. F. Goebel, P. B. Beeson, C. L. Hoagland, Journ. biol.
Ghem. 129, 455 (1939). Journ. exp. Med. 70, 239 (1939).

tt.ilgt;

f^'-sas-S

De door de Graaff gemaakte indeeling van de soort
Klebsiella pneumoniae, berustend op biochemische eigen-
schappen, komt overeen met de serologische indeeling volgens
J u Ii a n e il e.

De agglutinatietiter van een anti-meningococcenserum is
lager, naarmate men bij de reactie coccen met een grootere
kapsel gebruikt.

De vervanging van methyleenblauw door resazurine bij de
reductaseproef biedt voordeelen,

Een nader onderzoek is noodzakelijk naar de bruikbaar-
heid van de phosphataseproef bij het onderzoek van room.

Bij de bepahng van het jodiumgehalte van organische mate-
riaal, geeft de door Reimers uitgewerkte methode de

Tot nu toe bestaan nog slechts weinig gegevens omtrent
de structuur van het specifieke polysaccharide van Klebsiella
pneumoniae type C. Alles wat over deze stof bekend is, is
te danken aan het werk van Go eb el en A very (i)«. Door
hen is een aschvrij product geïsoleerd, dat geen stikstof
bevat, een optische draaiing van 100° en een zuuraequi-
valent van 680 bezit. Het gehalte aan koolstof en water-
stof werd niet bepaald.

Niet onderzocht is of methoxyL of acetylgroepen in de stof
voorkomen, wel hebben Goebel en Avery nagegaan
welke reduceerende suikers door hydrolyse met zwavelzuur
ontstonden. Zij deelen hierover het volgende mede:

De stof werd met 1 n zwavelzuur zoolang gekookt, totdat
het reduceerend vermogen der oplossing niet meer toenam,
hetgeen na ongeveer 5 uur het geval was. Het gehalte aan
reduceerende stoffen bedroeg toen, omgerekend op glucose.
701%. Het zwavelzuur verwijderden zij door bariumhydro-
xyde toe te voegen tot de oplossing neutraal op Congo, maar
zuur op laTcmoes reageerde, en het BaS04 af te filtreeren.
Eventueel voorkomende suikerzuren zijn dan nog in vrije toe-
stand in de vloeistof aanwezig. Door opkoken met overmaat
calciumcarbonaat en wat norit werden deze in het calciumzout
omgezet, vervolgens werd opnieuw gefiltreerd en het heldere
filtraat in vacuum tot een dikke stroop ingedampt. Deze
stroop extraheerden zij met methylalkohol en dampten ook
dit extract in. Het residu vertoonde een sterke Fehling-
reductie; de reactie van Tollens met naphtoresorcine en
zoutzuur was echter negatief. Met behulp van phenylhydra-
zine bereidden zij een osazon, dat als glucosazon geïdentifi-
ceerd kon worden. Ook oxydeerden zij de fractie met sal-
peterzuur en verkregen, na toevoeging van KOH. een kris-
tallijne stof, welke volgens hen, te oordeelen naar het kalium-
gehalte, suikerzuur kalium moest zijn. Uit deze gegevens
maken zij op. dat in het methylalkoholisch extract glucose
aanwezig moet zijn. Zij maken geen melding van pogingen,
om nog andere stoffen uit deze fractie te isoleeren.

Na het uittrekken met methylalkohol bleef nog een deel
onoplosbaar achter. Dit bevatte veel calcium en gaf een sterke
reactie met naphtoresorcine en zoutzuur, hetgeen wijst op de
aanwezigheid van uronzuur. Deze fractie is in dit geval niet
nader onderzocht, wel bij enkele andere bacteriepolysaccha-
riden, o.a. van Klebsiella pneumoniae type A. Door gefrac-
tioneerde precipitatie kon men een Ca-zout van een aldo-
bionzuur afzonderen, dat nog een verdere zuivering kon
ondergaan door bereiding van het cinchonidine-, brucine- of
morphinezout. In enkele gevallen werd zelfs vastgesteld uit
welke hexose en welk uronzuur dit aldobionzuur was opge-
bouwd, nl. bij pneumococcus type III en bij Klebsiella pneu-
moniae type A. (2, 3).

In hoofdstuk II vermeldden wij reeds, dat het geïsoleerde
polysaccharide in het vrije zuur was om te zetten door het
eenige malen neer te slaan met trichloorazijnzuur en alkohol,
waarna het neerslag werd gewasschen met alkohol en aether.
Een afgewogen hoeveelheid van dit vrije zuur losten wij op in
water en titreerden deze oplossing met 0.1 n NaOH met
phenolphtaleine als indicator. Het uit het titercijfer berekende
zuuraequivalent bleek 590 te bedragen.

Het optisch draaiingsvermogen bepaalden wij door de
draaiing van Yi % oplossingen te meten; hoogere concen-
traties waren wegens de sterke opalescentie ongeschikt voor
het verrichten van deze meting. Het meest bruikbaar waren
de oplossingen van het vrije zuur, toch bedroeg de afleesfout
nog omstreeks 0.05°. Het spreekt vanzelf, dat de [ajp
daarom niet met groote nauwkeurigheid kan worden opge-
geven, voor het vrije zuur werden waarden van 108—120°
gevonden.

Het polysaccharide bleek 44.7 % C en 5.9 % H te bevat-
ten. Deze bepalingen waren uitgevoerd door den heer
P. J. Hubers te Amsterdam.

Het stikstofgehalte bepaalden wij volgens de methode
van ter Meulen en Heslinga (4). Voor iedere bepaling werd
ongeveer 10 mg stof ingewogen, de titratie geschiedde met
0.01 n HCl. De stikstof gehalten van onze zuiverste prepa-
raten bedroegen 0.3—0.4!%.

In een micro-Zeiselapparaat verwarmden wij ongeveer
10 mg stof met joodwaterstof (s.g. 1.7), wat phenol en een
paar druppels azijnzuuranhydride onder doorleiden van COg
en leidden de dampen, na wasschen door een oplossing van
5 :% Na-thiosulfaat en 5 '% Cd-sulfaat, in een alkoholische
zdvernitraatoplossing. Indien alkoxylgroepen aanwezig zijn,
komt alkylhalogenide vrij. dat met het zilverzout een neerslag
van AgJ geeft. Dit werd echter niet waargenomen, het poly-
saccharide bevat dus geen methoxyl- of andere alkoxyl-
groepen.

0.3 g polysaccharide, opgelost in 30 cmS water, werd
geneutraliseerd met loog en, na toevoeging van 5 cm3
4 n NaOH, 4 uur onder terugvloeikoeling op een kokend
waterbad verwarmd, hierna aangezuurd met 6 cm3 4 n zwa-
velzuur en gedestilleerd tot het residu omstreeks 2 cm3 be-
droeg. Aan het residu voegden wij 5 cm3 water toe en des-
tilleerden opnieuw, dit herhaalden wij nog éénmaal. De ver-
zamelde destillaten vertoonden geen zure reactie op lakmoes
en gaven geen estergeur na koken met alkohol en zwavel-
zuur. Ook dampten wij het destillaat droog met MgO, nam,en

het residu op in water, filtreerden en reageerden in het filtraat
met Na-uranylpropionaat op acetaationen, eveneens met
negatieve uitslag. Acetylgroepen zijn dus niet aanwezig.

Wij hydrolyseerden het polysaccharide, door een 11%-
oplossing ervan in 1 n zwavelzuur op een kokend waterbad
te verwarmen, zoolang tot geen toeneming van het reducee-
rend vermogen der oplossing meer was waar te nemen. Wij
controleerden dit door ieder uur een proefje uit de oplossing
te nemen, en hiervan het reduceerend vermogen te bepalen,
volgens Hagedorn-Jensen. Deze suikerbepaling berust op
het principe, dat een afgemeten hoeveelheid kaliumferricya-
nide door de aanwezige suikers gereduceerd wordt tot ferro-
cyanide, dat als zinkzout wordt neergeslagen, de overmaat
ferricyanide is jodometrisch te titreeren en uit het titercijfer
de aanwezige hoeveelheid suiker te berekenen. Het reducee-
rend vermogen van onze oplossing drukten wij uit in procen-
ten van de waarden, welke zouden zijn gevonden, indien wij
de bepaling hadden verricht met gelijke monsters van een
1 % glucoseoplossing.

De voorschriften voor de uitvoering van de bepaling zijn
te vinden in de meeste handboeken over pathologische che-
mie, zij zijn bedoeld voor suikerbepalingen in bloed en urine.
In dergelijke gevallen is het noodig aan de eigenlijke bepaling
een onteiwitting vooraf te laten gaan, welke geschiedt door
behandeling met zinkhydroxyde. Wij hebben onze bepalingen
verricht zoowel met, als zonder deze behandeling; wij ver-
kregen in het eerste geval lagere waarden. Wij vonden:

Uit deze getallen blijkt duidelijk, dat door de behandeling
met het zinkhydroxyde reduceerende stoffen worden ver-
wijderd. De neerslagen van het Zn (OH) 2 werden daarom
uitgewasschen met warm gedestilleerd water en in zoo weinig
mogelijk azijnzuur opgelost. Deze oplossing bleek koperproef-
vocht te reduceeren en bovendiei^ een positieve reactie te
geven met naphtoresorcine en zoutzuur. Dit wijst erop, dat
door bovengenoemde bewerking uronzuren, of uronzuur
bevattende verbindingen, als zinkzout zijn neergeslagen.

Bovendien laten de uitkomsten zien, dat na 3 a 4 uur de
hydrolyse volledig is geweest. Bij latere proeven hebben wij
daarom nooit langer dan 4 uur gehydrolyseerd. De reactie
met antiserum was reeds na 1 uur negatief.

Een groote waarde moet men aan deze getallen niet toe-
kennen, men kan er ten hoogste uit afleiden wanneer de
hydrolyse geëindigd is, bovendien kan men de eindwaarde
min of meer beschouwen als een chemische constante van
het uitgangsproduct. Zij kunnen ons echter geen uitsluitsel
geven omtrent de quantitatieve samenstelling van het poly-
saccharide, vooral, omdat uronzuren bij verhitting met ver-
dunde zuren ontledingsproducten geven met onbekende
samenstelling en reduceerend vermogen.

Na ongeveer een uur hydrolyseeren was de eerst opales-
cente vloeistof geheel helder geworden, terwijl zich aan het
oppervlak grijswitte vlokken hadden verzameld. Na 3 uur
beëindigden wij de hydrolyse en scheidden de vlokken
(fractie B) van de vloeistof (fractie A) door filtratie.

Allereerst onderzochten wij de vloeistof. Wij brachten
haar op kooktemperatuur en voegden toen zooveel kokende

bariumhydroxydeoplossing toe tot een neutrale reactie op
Congo en een zure reactie op lakmoes was verkregen. Het
BaS04 werd door filtreeren verwijderd en het neerslag
eenige malen met heet water uitgewasschen. Het waschwater
voegden wij bij het filtraat en kookten dit mengsel even op
met een kleine overmaat calciumcarbonaat en wat norit,
hierna werd opnieuw gefiltreerd. Het heldere, lichtgeel ge-
kleurde filtraat dampten wij nu in vacuum geheel in, het
residu was een taaie, bruingekleurde stroop, welke in 40 cm
water werd opgenomen. Nu voegden wij alkohol toe tot een
concentratie van 901% en verwijderden het ontstane neer-
slag door centrifugeeren. De vloeistof dampten wij weer tot
klein volumen in en precipiteerden opnieuw met alkohol, het
neerslag werd weder afgecentrifugeerd en bij het eerst ver-
kregen precipitaat gevoegd, deze bewerking werd nog één-
maal herhaald. De verzamelde neerslagen gaven een sterke
Fehling-reductie en een positieve reactie op uronzuur; de
vloeistof vertoonde alleen reduceerende eigenschappen. De
vloeistof noemden wij fractie A 1, het neerslag A 2.

A 1 werd in vacuum ingedampt tot klein volumen en een
week in een vacuumexsiccator boven CaCl2 gedroogd. De
zoo verkregen dikke stroop extraheerden wij 4 maal met
kokende absolute alkohol (fractie A 3), het residu bleek ge-
heel in 80 % alkohol op te lossen (fractie A4). Beide trac-
ties werden op dezelfde wijze onderzocht: na verwijdering
van het oplosmiddel dampten wij de helft op het waterbad
in met 25:% salpeterzuur, de andere helft verwarmden wij
gedurende een half uur op het waterbad met 2 deelen zout-
zure phenylhydrazine en 3 deelen Na-acetaat.

De oxydatie met salpeterzuur leverde geen kristallijn pro-
duct op, ook niet na neutralisatie.

De behandeling met phenylhydfózine gaf een bijna witte
kristallijne stof, welke na eenige malen omkristalliseeren uit

water, een constant smeltpunt bezat van 190° *) Dit pro
duet loste niet op in 90% alkohol of aceton. Deze geqevens
deden ons vermoeden, dat wij hier te doen hadden met
mannose-phenylhydrazon, de literatuuropgaven over het
smeltpunt van deze stof liggen tusschen 185 en 197° Wij
bereidden nu op de boven beschreven wijze uit d-mannose
het hydrazon, dat eveneens een smeltpunt van 190° bleek
te bezitten. Een mengsmeltpunt van beide stoffen werd thans
bepaald: er was geen depressie waar te nemen, zoodat de
aanwezigheid van d-mannose bewezen is.

Oxydatie met salpeterzuur gaf na neutrahsatie met kalium-
carbonaat naaldjes, deze losten wij op in wat water en voeg-
den een weinig vast thalliumnitraat toe, onder het micro-
scoop waren thans lange, rechthoekige staafjes te zien, welke
typisch zijn voor het thalliumzout van slijmzuur.

Met phenylhydrazine werd ook hier mannose-phenyl-
hydrazon verkregen, maar bovendien uit de moederloog hier-
van een donkergeel kristallijn product, dat in alkohol van
verschillende concentraties oploste, evenals in methylalkohol
en aceton. Het smeltpunt was 184°, een mengsmeltpunt met
d-galactosazon gaf geen depressie; bovendien konden wij
een p-mtrophenylhydrazon bereiden met een smeltpunt van
194 . Uit al deze gegevens blijkt duidelijk, dat hier d-aalac-
tose aanwezig is.

De verzamelde neerslagen waren, op een weinig CaCOg
en Cab04 na, geheel oplosbaar in water. Wij trachtten nu
door gefractioneerde precipitatie met alkohol alle anorgani-
sche bestanddeelen uit de oplossing te verwijderen wat ech-
ter met gelukte, daar alle fracties nog sulfaat bleken te bevat-

ten. Het is mogelijk, dat deze moeilijkheid niet optreedt, wan-
neer bij de verwijdering van het zwavelzuur na de hydrolyse
geen calcium-, maar bariumcarbonaat wordt gebruikt, het
ontbrak ons echter aan voldoende materiaal om dit te con-
troleeren.

Wij voegden aan de oplossing basisch loodacetaat toe
en ontleedden het ontstane neerslag, na het afgecentrifugeerd
en in w'ater gesuspendeerd te hebben, met H2S. Het PbS
werd afgefiltreerd en het fikraat in vacuum ingedampt. Er
bleef een lichtbruin gekleurde stroop achter, welke, na een
verblijf van eenige dagen in vacuum boven CaClg. vast
werd. Deze vaste stof, welke gemakkelijk uit de kolf ge-
schraapt kon worden, vertoonde geen duidelijke kristal-
vorm en bezat geen te bepalen smeltpunt. Het reduceerend
vermogen bleek 12 % van dat van glucose te bedragen, het
zuuraequivalent was 533, aschgehalte 0.3 %.

Met phenylhydrazine en derivaten hiervan konden wij
geen kristallijne producten verkrijgen, evenmin gelukte het
ons gekristalliseerde cinchonidine- of morphinezouten te
bereiden.

De reactie op uronzuur was wederom sterk positief. Wij
kunnen dus over fractie A 2 niets anders zeggen, dan dat zij
een uronzuur bevat, dat gemengd is met. of gebonden aan
één of meer suikers van onbekende samenstelling.

De vlokken, welke gedurende de hydrolyse aan het opper-
vlak waren komen drijven, werden afgefiltreerd en met water
uitgewasschen. Zij bleken in water niet op te lossen, maar wel
in alkohol en in verdunde loog. uit deze laatste oplossing was
de stof met zuur weer neer te slaan. De reactie van Eolisch
was negatief, evenals de biureetproef en de reactie van Md-
lon, wij hadden dus een stof in handen, welke geen koolhy-
draat en geen eiwit was. De fractie werd gezuiverd door op
te lossen in 0.1 n NaOH en weer neer te slaan met 0.1 n
HCl, af te filtreeren en de op het filter achterblijvende, gelei-

1.nbsp;verzeeping van ongeveer 20 mg met 0.5 cm3 alkoholische
loog, na aanzuren en filtreeren werd in het filtraat op gly-
cerine gereageerd, de reacties van Mulliken (met pyro-
gallol en zwavelzuur) en van Denigès (oxydatie met
broomwater. daarna codeïne en zwavelzuur toevoegen)
waren beide zwak positief.

2.nbsp;bij de verzeeping ontstond na aanzuren een gele olie. die
in chloroform werd opgenomen. Deze oplossing werd
thans gewasschen met water; na afdampen van de chlo-
roform, bleef een gele olie over, welke zuur reageerde
op lakmoes en met loog een troebele vloeistof gaf, die bij
schudden sterk schuimde. Dit is een aanwijzing op vetzuur.

Meer stof konden wij voor verdere identificatiereacties niet
gebruiken, aangezien het grootste gedeelte bewaard moest
worden voor serologische proeven; om dezelfde reden moest
ook de bepaling van het phosphorgehalte achterwege blijven.

Het lipoïde moet aan het koolhydraat gebonden zijn, anders
was het bij de onteiwitting met chloroform verwijderd.

Nu is ook verklaard, waarom alle pogingen om een stik-
stofvrij polysaccharide te bereiden mislukt zijn: de in spe-
cifieke stof aanwezige stikstof is afkomstig van het lipoïde en
niet van eiwit. Phosphaat hadden wij in het koolhydraat niet
kunnen aantoonen, omdat wij steeds in de oplossingen ervan
hadden gereageerd, thans bleek ons, dat in de asch wel dege-
lijk phosphaat was te vinden. Tevens is hiermede verklaard,
waarom geen aschvrije producten konden worden verkregen.

Wij achtten het zeer waarschijnlijk, dat de bewerkingen
welke Goebel en Avery bij de isolatie van het specifieke poly-
saccharide van Klebsella pneumonia type C hadden toe-
gepast. van dien aard waren, dat het lipoïde van het koolhy-
draat werd afgesplitst en zij dus een lipoïdvrij koolhydraat
in handen kregen. Zij hadden n.1. ter verwijdering van het
bacterie-eiwit hun uitgangsmateriaal bij een pH = 7.6 met
trypsine behandeld, wij echter konden, door deze bewerking
op het zuivere polysaccharide toe te passen, het lipoïde slechts
gedeeltelijk afsplitsen. Daarom hebben wij getracht op andere
wijze het lipoïdvrije polysaccharide te bereiden, namelijk door
hydrolyse met verdund azijnzuur. Wij hebben vervolgens na-
gegaan of het zoo verkregen product dezelfde eigenschappen
bezit als het door Goebel en Avery bereide.

Aan een 1 %-oplossing van het polysaccharide voegden
wij azijnzuur toe tot een concentratie van 0.1 n en verhitten
dit op een kokend waterbad. Na ongeveer drie kwartier
scheidde het lipoïde zich als vlokken af. die wij door filtreeren
verwijderden. Aan het heldere filtraat voegden wij alkohol
toe. er ontstond een neerslag, dat uit polysaccharide bleek te
bestaan. Dit polysaccharide bleek geheel heldere oplossingen
te geven, de [aj^ kon gemakkelijk worden bepaald en be-
droeg 110°. Ook het vrije zuur werd thans zonder moeite
bereid door precipitatie met zoutzuur en alkohol: na éen
precipitatie ontstond reeds een aschvrij product, verhezen
traden niet op. De stof bevatte geen stikstof en geen phos-
phor. Het zuuraequivalent bedroeg 996, verder bevatte de
stof 41.6 % C en 6.3;% H. Het reduceerend vermogen, na
hydrolyse met zwavelzuur, was 70 % van dat van glucose,
de specifieke draaiing van het vrije zuur 118°.

Het door ons geïsoleerde, lipoïdvrije polysaccharide bezit
blijkbaar niet geheel dezelfde eigenschappen als dat van
Goebel en Avery. In het volgend hoofdstuk zullen wij
de resultaten mededeelen van het serologisch onderzoek.

1. W. F. Goebel, O. T. Avery, Journ. exp. Med. 46, 601 (1927)
0935^nbsp;613. 619 (1927); 110, 391

Bij het serologisch onderzoek van specifieke bacterie-
polysacchariden is in de literatuur allereerst gebruik gemaakt
van de precipitatiereactie met homoloog antiserum. Deze
reactie is zeer gevoelig en zeer specifiek en heeft het voordeel
gemakkelijk uitvoerbaar te zijn zonder dat daarbij bijzondere
hulpmiddelen gebruikt worden. Andere reacties zijn slechts
in enkele gevallen toegepast, zooals de complementbindings-
reactie (i) en de op anaphylactische verschijnselen berusten-
de proeven (2). De specificiteit van deze laatste reacties staat
niet achter bij die van de precipitatie, de gevoeligheid is vaak
nog iets grooter, de uitvoering is echter minder eenvoudig.
Voor het onderzoek van de door ons geïsoleerde producten:
het lipoïde-polysaccharide, het vrije lipoïde en het vrije kool-
hydraat, hebben wij uitsluitend van de precipitatiereactie
gebruik gemaakt. Ook tijdens de isolatie pasten wij de reactie
geregeld toe, om te controleeren welke van de verkregen
fracties de specifieke stof bevatte.

Om de reactie te kunnen toepassen, moesten wij be-
schikken over het homologe antiserum, bovendien was het
echter gewenscht controleproeven met een of meer heterologe
sera uit te voeren. Het koolhydraat, dat wij uit een stam van
Klebsiella pneumoniae isoleerden, moest voldoen aan den
eisch: specifiek te zijn voor het type C van genoemde soort.
Wij zijn daarom overgegaan tot de bereiding van antisera,
welke gericht waren tegen de typen A, B en C.

Als proefdieren gebruikten wij konijnen, deze werden
ingespoten met gedoode suspensies (zie later) van de stam-

men F 1 (type A), F 7 (type B) en F 10, de stam van het
type C, waaruit wij het koolhydraat hadden bereid.

De bereiding van antisera kan op zeer verschillende wijzen
geschieden, het gehalte aan antihchamen hangt af van
de gevolgde methode. De bereiding der vaccins, de inge-
spoten hoeveelheden, de wijze van injectie, het aantal injec-
ties, alsmede de frequentie, waarmee zij worden toege-
diend, spelen hier een rol. Slechts weinig gegevens bestaan
omtrent de wijze, waarop men met Klebsiella-stammen hoog-
waardige antisera kan krijgen.

Avery, Heidelberger en Goebel (3) immuniseer-
den konijnen door intraveneuze inspuitingen van door warmte
gedoode bacteriën, kleine doses werden dagelijks gedurende
6 dagen toegediend, na een rustpoos van een week werd dit
proces herhaald. Drie series injecties werden in totaal gege-
ven, 9 dagen na de laatste injectie werd bloed afgenomen en
het antistofgehalte van het serum bepaald door het vaststellen
van de agglutinatietiter. Éénmaal bereikten zij een titer van
1/40. verder werden geen waarden opgegeven.

GO s 1 i n g s (4) had uit de resultaten van J u 1 i a n e 11 e
de conclusie getrokken, dat snel opeenvolgende, intraveneuze
injecties bruikbare sera opleverden. Hij gaf daarom zijn injec-
ties intraveneus, op 3 achtereenvolgende dagen, gevolgd door
4 dagen rust, daarna weer 3 injecties enz., na 3 a 4 weken
was een agglutinatietiter van 1/32 tot 1/64 bereikt.

Wielen ga (5) gaf de injecties, eveneens intraveneus,
eens per week, hij bereikte daardoor ook titers van 1/32 ä Veé.
meestal echter pas na eenige maanden.

Hoewel de literatuur ons slechts weinig gegevens bood,
om uit te kunnen maken, hoe op de snelste wijze hoogwaar-
dige sera worden verkregen, hadden wij toch den indruk, dat
injecties, met korte tusschenpoozen toegediend, vrij spoedig
tot een aannemelijk resultaat konden leiden. Het gedurende
eenigen tijd dagelijks toedienen kwam ons echter wel wat èl
te frequent voor. Daarom hebben wij besloten de dieren om
de andere dag in te spuiten^ Zooveel mogelijk gaven wij

series van 6 injecties. 7 è 10 dagen na de laatste injectie van
iedere serie bepaalden wij de agglutinatietiter van het serum,
onmiddellijk daarna werd een nieuwe serie aangevangen.

Als antigeen kozen wij suspensies van bacteriën, bereid
door 24 uur oude, schuine agarculturen af te slibben met
10 cm3 physiologische zoutoplossing en dan door steriel
filtreerpapier te filtreeren. De bacteriën doodden wij óf door
verhitting op 54° gedurende ^ quot;ur, óf door toevoegmg van
0.1 % formaldehyde.

In deze eerste proevenreeks onderzochten wij welke wijze
van injectie de meest geschikte was. In dit stadium van ons
onderzoek hadden wij huisvesting voor slechts enkele dieren,
zoodat wij onze conclusie eigenlijk uit onvoldoende gegevens

Alle dieren werden om de andere dag ingespoten met
een door verwarming gedoode suspensie van de stam F 10
(typeC).

No. 1. 6 intraveneuze injecties van 0.1 cm3. (le serie .
6nbsp;..nbsp;„nbsp;0.5 .. , (2e serie).

De titers, bepaald aan het einde van de op iedere serie
injecties volgende rustpoos bedroegen achtereenvolgens:

Titers: 1/5, V64 en 1/200-
No. 2. 6 intramusculaire injecties van 0.2 cmS. (le serie).

'levende bacteriën (3e serie).
Titers: O, 1/16 en Vso-
No. 3. 6 intraperitoneale injecties van resp. 0.5, 1, 2. 3 4
en 5 cm3, om de andere dag (le serie).

een rustpoos van drie dagen (2e serie)
6 intraveneuze injecties van 1 cm3, ^eer als gewoon-
lijk om den anderen dag (3e serie),
en een vierde serie, geheel gelijk aan de 3e.

tsij de 3de serie zijn wij tot intraveneuze inspuitin-
gen overgegaan, aangezien de geringe stijging na de
2e serie ons deed vermoeden, dat verder intraperito-
neaal inspuiten geen belangrijke verhooging met zich
mede zou brengen. De hooge titer na de 3e serie
trachtten wij nog te vergrooten door een 4e serie tc
geven, zooals men ziet zonder resultaat.

Na deze resultaten verwachtten wij het meeste van afwis-
sel^d intraveneus en intraperitoneaal gegeven inspuitingen.
In de volgende reeks proeven hebben wij getracht na te gLn
of deze afwisseling inderdaad voordeden bood boven het
uitsluitend intraveneus toedienen. Ook gaven wij in de meeste
gevallen nog een vierde serie injecties, om te zien of de daling
m titer, welke b^ konijn no. 3 na een vierde serie optrad, zich
ook bij andere dieren zou voordoen. Deze vierde serie werd
steeds intraveneus gegeven.

Om de hierboven vermelde redenen hebben wij een gedeelte
van de tot deze reeks behoorende dieren uitsluitend intra-
veneus en een ander gedeelte afwisselend intraveneus en
intraperitoneaal ingespoten.

6 intraperitoneale injecties van 2 cmS (2e serie).
6 intraveneuze injecties van 1 cmS, waarvan de laat-
ste twee met levende bacteriën (3e serie).

Titers: Vsoo, Vioo. V2000.
No. 5. Eveneens met den stam F 10 (type C), op geheel
dezelfde wijze als no. 4, maar met een door verwar-
ming gedoode suspensie.

Titers: Vioo, Vioo. Viooo-
De door toevoeging van formaldehyde gedoode bacteriën
bleken minstens even goed antigcen te zijn als de door warmte
gedoode. De op de eerste wijze bereide suspensies bleken veel
beter houdbaar te zijn, daarom hebben wij de nu volgende
dieren met dergelijke suspensies ingespoten.

1 en 1 cm3 (le serie).
6 intraperitoneale injecties van 1 cm^ (2e serie).
6 intraveneuzenbsp;„nbsp;1 cm3 (3e serie).

No. amp;. met stam F 7 (type B). Geheel als no. 6, dus afwis-
selend intraveneus en intraperitoneaal.

Titers: 1/300, V200, V2000, Viooo-
No. 9, met stam F 7 (type B). Geheel als no. 7, dus alles
intraveneus.

No. 10.; met stam F 10 (type C). Geheel als nos. 6 en 8,
afwisselend intraveneus en intraperitoneaal.

Titers: 1/200, Vso, V2000, Viooo-
No. 11. met stam F 10 (type C). Geheel als nos. 7 en 9. alle
mjecties intraveneus. Na de 3e serie gestorven door
onbekende oorzaak.

Bij de dieren 6 t/m 11 zijn drie verschillende antigenen
gebruikt. Het valt al dadelijk op, dat men destam F r.(type A)
moeilijk te immuniseeren is, eerst na vier series injecties zijn
antistoffen in aantoonbare hoeveelheden aanwezig. Deze
stam groeit onder buitengewoon sterke slijmvorming wat
zich vooral uit in de grootte van de kapsels der bacteriën.
Waarschijnlijk is dit niet alleen van invloed op de antigene
werking, maar ook op de agglutinabiliteit.

Om een indruk te krijgen omtrent de beste wijze van in-
spuiten, moeten we vergelijken de dieren 6 met 7. 8 met 9 en
10 met 11. We zien dan, dat afwisselend intraveneus — in-

Bovendien blijkt, dat het toedienen van een vierde serie
injecties de titer doet afnemen, tenzij na drie series geen of
wemig antistoffen zijn aan te toonen.

In de derde reeks proeven hebben wij getracht te verge-
lijken de resultaten van uitsluitend intraveneus injiceeren met
afwisselend intraveneus-subcutaan.

De dieren met even nummers kregen alleen intraveneuze
injecties, die met oneven nummers ontvingen de inspuitingen
om de andere intraveneus en subcutaan.

Titers: Vwo, Vsoo, V400-
No. 18.'met stam F 10 (type C). Als voren. Gestorven tijdens
de 2e serie inspuitingen.

Onderling te vergelijken zijn de nos. 12 met 13, H met 15,
en de nos. 16 t/m 22 met de nos. 17 t/m 23. Naar ideze uit-
komsten te oordeelen, is er geen reden om aan te nemen dat
een afwisselende wijze van inspuiten voordeden geeft boven
uitsluitend intraveneus injiceeren.nbsp;\

Uit de drie reeksen proeven kunnen we condudeeren:
Voor de bereiding van antisera tegen Klebsidla-stammen,
kan men het beste gebruik maken van door formaldehyde ge-
doode bacteriën en deze om de andere dag intraveneus toe-
dienen. Meer dan drie series van 6 injecties (van dk 1 cm3)

mogen niet gegeven worden, daar anders het antistofgehahe
daah. Alleen wanneer na 3 series inspuitingen de titer zeer
laag is, kan een vierde serie voordeden opleveren.

De titers van de tegen de stammen F 7 (type B) en F 10
(type C) gerichte sera zijn opvallend hooger dan die, welke
door G o s 1 i n g s en later door W i e 1 e n g a zijn bereid. Wij
vermoedden, dat dit verschil moest worden toegeschreven aan
een verschil in uitvoering der agglutinatieproef, in het bij-
zonder aan de bij de reactie gebruikte hoeveelheid antigeen.
Reeds veel vroeger was door Arrhenius waargenomen,
dat een lagere agglutinatietiter wordt gevonden, naarmate
men bij de reactie meer antigeen gebruikt. Duncan (6)
stelde bij enkele Salmonella-stammen vast, dat het eindpunt
van een agglutinatiereeks ligt bij een bepaalde verhouding van
antigeen en antilichaam. Over het begrip „titerquot; spreekt hij
niet, maar deze zou volgens zijn uitkomsten omgekeerd even-
redig moeten zijn met de gebruikte hoeveelheid antigeen. Wij
hebben nagegaan, of deze standvastige verhouding ook bij
onze Klebsiella-stammen bestond, maar slaagden er niet in
deze vast te stellen. Wel traden bij gebruik van grootere
hoeveelheden antigeen bij de agglutinatiereactie lagere titers
op, van een evenredigheid was evenwel geen sprake; boven-
dien heeft bij het eene serum de hoeveelheid antigeen veel
meer invloed dan bij het andere. Dx. W i e 1 e n g a deelde
mij mede, dat ook hij dergelijke resultaten had verkregen.

WielengaenGoslings voerden de agglutinatieproef
uit volgens de op het Laboratorium voor Tropische Hygiëne
te Amsterdam gebruikelijke wijze, waarbij ongeveer gelijke
volumina bacteriesuspensie en serumverdunning worden ge-
bruikt, wij voegden aan 0.6 cmS serumverdunning één druppel
suspensie met een „pipet Pasteurquot; toe, dus rdatief ved min-
der antigeen, de door ons gebruikte suspensies waren echter
geconcentreerder. Vooral dit laatste feit maakt een quanti-
tatieve vergelijking tusschen de op beide laboratoria gebruike-

lijke verhoudingen antigeen: antihchaam niet mogehjk, omdat
de sterkte der suspensies moeihjk reproduceerbaar is.

Enkele sera zijn op beide laboratoria volgens de daar gel-
dende methoden onderzocht, eenige resultaten laten wij hier-
onder volgen:

We zien hier, dat er van vaste verhouding tusschen de in
Amsterdam en in Utrecht bepaalde methode geen sprake is,
met twee sera van (volgens de Utrechtsche methode bepaald)
dezelfde titer wordt zelfs geen overeenstemming verkregen!

Het bovenstaande leert ons, dat opgave van agglutinatie-
titers geen zin heeft, wanneer niet tevens wordt opgegeven
op welke wijze zij zijn bepaald.

Verder kunnen wij aannemen, dat onze methode van im-
muniseeren effectiever is dan die, welke door G o s 1 i n g s en
Wielenga gevolgd werden.

Tot slot moet nog worden vermeld, dat de titers der sera,
welke zonder toevoeging van conserveermiddelen maanden-
lang bij —4° C konden worden bewaard, op den duur tot op
ongeveer % a van de oorspronkelijke waarde terugliepen,
hetgeen echter hun bruikbaarheid bij de precipitatieproeven
niet verminderde.

De precipitatieproef voerden wij uit als ringreactie: 0.5 cm3
polysaccharide-oplossing, bereid met behulp van physiologi-
sche NaCl-oplossing, pipetteerden wij voorzichtig op 0.5 cm^
van het antiserum, zóó, dat geen vermenging van de vloei-
stoffen plaats vond. Het antiserum gebruikten wij steeds ver-
dund met physiologische NaCl-oplossing: 1 : 10. De verdun-

ningen, welke op het grensvlak der twee vloeistoffen een
witten ring veroorzaakten, beschouwden wij als positief
reageerend.

Zoowel lipoïd-polysaccharide, als vrij polysaccharide
bleken tot een verdunning van 1 : 2.000.000 te reageeren met
het tegen het type C gerichte serum, in het geheel niet met de
anti-A- en anti-B sera. Het lipoïde reageerde met geen der
drie sera.

1 cm3 antiserum (type C) lieten wij reageeren met 1 cmS
van een 1 : 1000 oplossing van het lipoïd-polysaccharide en
centrifugeerden na 2 uur bij 37° het ontstane neerslag af. Bij
de heldere bovenstaande vloeistof voegden wij opnieuw ge-
noemde oplossing en centrifugeerden ook nu af, deze bewer-
kingen werden zoolang herhaald, totdat verdere toevoeging
van polysaccharide geen neerslag meer deed ontstaan, wij
konden het serum dan als verzadigd met lipoïd-polysaccha-
ride beschouwen of, anders gezegd, alle tegen het lipoïd-
polysaccharide gerichte antistoffen zijn uit het serum ver-
wijderd. Dit „verzadigde serumquot; reageerde niet meer met het
vrije polysaccharide.

Uit een ander proefje van 1 cmS anti-C-serum verwijderden
wij op geheel dezelfde wijze alle antistoffen tegen het vrije
polysaccharide gericht. Thans bleek het verzadigde serum
nog tot een verdunning van 1 :200.000 met het lipoïd-poly-
saccharide te reageeren. Hieruit blijkt duidelijk, dat lipoïd-
houdend en lipoïdvrij koolhydraat in serologisch opzicht ver-
schillend zijn.

In de inleiding vermeldden wij reeds, dat bij een aantal
Gram-negatieve bacteriesoorten het voorkomen van lipoïd-
polysacchariden was waargenomen. Deze stoffen bleken in
staat te zijn bij proefdieren antistoffen op te wekken, en
bovendien een toxische werking te bezitten. Het lipoïde en

het polysaccharide missen deze eigenschappen, wanneer zij in
vrije toestand verlseeren. Dit was voor ons aanleiding om
na te gaan, of het door ons geïsoleerde complex eveneens
toxisch en antigeen zou zijn, daarnaast moesten controle-
proeven met de beide componenten afzonderlijk worden uit-
gevoerd.

Op de volgende wijzen hebben wij getracht de antigene
eigenschappen van het lipoïd-polysaccharide en van de vrije
componenten aan te toonen:

3.nbsp;door de beschermende werking tegen infecties na behan-
deling met de homologe stam bij muizen.

De stoffen werden intraveneus toegediend als M %'Oplos-
singen in physiologische zoutoplossing, wij maakten stee^
gebruik van de Na-zouten der koolhydraatzuren, daar de pH
van hun oplossingen weinig van die van het neutrale punt
verschilt.

Gestorven één dag na de tweede injectie.
No. 25. injecties van 1 mg lipoid-polysaCcharide. om de
andere dag toegediend. Acht dagen na de laatste
injectie gaf het serum een duidelijke precipitatie-
reactie. zoowel met het lipoïdvrije, als met het hpoid-
houdende koolhydraat, de precipitatietiter bedroeg
in beide gevallen 1 : 20.000.
No. 26. 5 injecties van 5 mg vrij polysaccharide, om de
andere dag.

No. 28. 5 injecties met 2 mg vrij lipoide, om de andere dag.
Geen antistoffen aan te toonen.

Geen antistoffen in het serum.
No. 36; 2 intraperitoneale injecties met 1 mg lipotd-poly-
saccharide, tusschenpoos 14 dagen.
8 dagen na de laatste inspuiting waren in het serum
precipitinen aan te toonen. de titer bedroeg ook hier
1 i 20.000,

(Dit dier had reeds eerder 4 intraveneuze injecties
met vrij koolhydraat ontvangen, 14 dagen na de laat-
ste van deze injecties ontving het dier de eerste
intraperitoneale inspuiting. Zie ook bij toxische
proeven).

Uit deze resultaten bhjkt, dat voor konijnen het hpoïd-
houdende koolhydraat een precipitinogeen is. bij beide
componenten van deze stof ontbreekt deze eigenschap.

Caviae werden met dezelfde oplossingen ingespoten, als
waarmede de konijnen waren behandeld, de injecties geschied-
den hier echter subcutaan.

15 dagen na de laatste injectie werden de inspuitingen
voortgezet, nog 4 injecties met elk 1 mg werden om
de andere dag gegeven,

12 dagen na de laatste injectie had het serum een
precipitatietiter van 1 : 20.000.

No. 2: gestorven 1 dag na één injectie met 5 mg lipoid-poly-
sacchacide.nbsp;^

Nos. 5 en 6 werden op dezelfde manier als no. 1. maar thans
met het vrije koolhydraat behandeld. Bij geen dezer
dieren werden in het serum precipitinen waarge-

Ook voor caviae blijkt het lipdidhoudende polysaccharide
een precipitinogeen te zijn, het vrije polysaccharide is dit met.
Daar wij niet voldoende vrij lipoïde bezaten, werden hier-
mede geen caviae behandeld.

De bedoeling van dit experiment was na te gaan of muizen,
na herhaald inspuiten met polysaccharidepreparaten, immuun
zouden zijn tegen infecties met een virulente, homologe

Twaalf witte muizen werden daartoe bij de staartwortel
3 maal subcutaan ingespoten met 0.01 mg lipoid-polysaccha-
ride, met tusschenpoozen van 4 dagen. Een week na de lotste
injecte werden alle muizen geïnfecteeerd, vier met een Kleb-
siella pneumoniaestam van het type A, vier met een stam van
het type B en vier met een stam van het type C.

Een andere serie van 12 muizen ontving op dezelfde wijze
drie injecties met 0.01 mg vry polysaccharide en werd even-
eens geïnfecteerd met dezelfde stammen.nbsp;, ui ^

Na eenige dagen waren alle muizen gestorven, uit het bloed
van de dieren was in alle gevallen de stam, waarmede geïn-
fecteerd was, weer te kweeken. Een type-specifieke immuni-
teit hadden dus onze injecties niet opgewekt.

Zoowel het lipoïdhoudende, als het lipoïdvrije polysaccha-
ride hebben wij ingespoten bij konijnen, caviae en quot;quot;'^en,
teneinde de toxische werking van genoemde stoffen bij deze
diersoorten na te gaan. De secties der gestorven dieren, het
bacteriologisch onderzoek en het vaststellen van de doods-
oorzaak werden uitgevoerd op het Rijks-Instituut voor de
Volksgezondheid te Utrecht, veel dank ben ik in dezen ver-

No. 30: 2 maal 5 mg lipoïd-polysaccharide, intraveneus tus-
schenpoos 2 dagen, dood I uur na de laatste injectie.
JJoodsoorzaak: coccidiose,

Ook hier necrotische haardjes in lever en
nier, veroorzaakt door thrombose.
Bact. onderzoek: negatief.
No. 33. 2 maal 1 mg lipoïd-polysaccharide. intraveneus tus-

Sectie: geen afwijkingen.
Bact. onderzoek: negatief.
No. 34. als no. 33, gestorven 5 dagen na de laatste injectie,
öectie: lever en milt gezwollen.

Ook nu weer necrotische haardjes in lever
en nieren, als gevolg van thrombose.
öact. onderzoek: negatief.

Het geregeld voorkomen van vaatverstoppingen deed ons
ervan afzien om met ^,%-oplossingen intraveneus in e spul
ten, w, achtten het n.l. zeer wel mogelijk, dat de vrij visceuze
oplossingen de oorzaak waren van de thrombose, welke zou
kunnen bi;dragen tot den dood van de proefdieren. In het

INo. 35. reeds eerder ingespoten met vrij polysaccharide)
1 m,g Upoid-polysaccharide, intraperitoneaal. Gestor-
ven dag na de injectie.

Bact. onderzoek: negatief.
No. 39. 5 mg lipoid-polysaccharide, intraperitoneaal. Gestor-
ven 3 uur na de injectie.

geen afwijkingen.
Bact. onderzoek: negatief.
No. 40. als no. 39, gestorven 1 dag na de injectie.

Sectie: geringe mucopurulente peritonitis.
Bact. onderzoek: negatief.
No. 41.' 2 maal 0.5 mg lipoïd-polysaccharide, intraveneus,
tusschenpoos 2 dagen. Gestorven 4 dagen na de
laatste injectie.
Sectie: geen afwijkingen.
Bact. onderzoek: negatief.
No. 42. als no. 41, dood 2 uur na de laatste injectie.
Sectie: milt enkele infarcten.

Lever gezwollen, bleek, bros: vettige dege-
neratie.
Bact. onderzoek: negatief.
Slechts in twee gevallen hebben de konijnen de injecties met
lipoïd-polysaccharide doorstaan. Dit zijn de nos. 25 en 36,
reeds vermeld bij het onderzoek naar de antigene eigenschap-
Pen. Uit bovenstaande resultaten meenen wij te mogen con-
dudeeren, dat het lipoïd-polysaccharide toxisch is voor
konijnen.

Wat de toxische eigenschappen van het vrije polysaccharide
betreft, verwijzen wij allereerst naar de nos. 26 en 27, welke,
na herhaald inspuiten met deze stof, in leven bleven. Verder
ffloeten worden genoemd:

Met het hpoïde alleen konden wij wegens gebrek aan
materiaal geen experimenten uitvoeren.

Nos. 1, 3 en 4 verdroegen alle 2 injecties met 5 mg lipoid-
polysaccharide, met een tusschenpoos van een week
gegeven, zij werden verder met deze stof behandeld
(zie hiervoor antigene eigenschappen).
No. 2. ' 5 mg Upoïd-polysaccharide, gestorven één dag na
deze injectie.

Sectie: weinig sereus vocht in de buikholte. Bloe-
dinkjes in maag, long en bijnier. Oedeem
mesenterium. Vrij sterke miltzwelling.
Bact. onderzoek: negatief.
Nos. 5 en 6 werden met het vrije polysaccharide ingespoten

op geheel dezelfde wijze als no. I, beide dieren
bleven in leven.
Bact. onderzoek: negatief.
Nos. 7 en 8 ontvingen 4 injecties met 1 mg vrij polysaccharide.
om de andere dag toegediend. Ook deze dieren
bleven in leven.

De laatste vier dieren werden nog eenige malen met 5 mg
Itpoid-polysaccharide ingespoten, zij bleven ook nu nog vol-
komen gezond.

Conclusie: ten opzichte van caviae is het lipoïd-polysaccha-
ride niet toxisch, evenmin is dit met het vrije polysaccharide
het geval.

Vier witte muizen werden subcutaan ingespoten met 2 mg
Itpotd-polysaccharide. Drie hiervan stierven binnen 24 uur, de
vierde overleed na 5 dagen.

Vier andere muizen kregen een geringere dosis van dezelf-
de stof: 0.5 mg. Eén overleed na een week aan een Pasteur-
ella-infectie, de anderen bleven in leven.

Op dezelfde wijze voerden wij de experimenten uit met het
vrije polysaccharide: vier muizen ontvingen 2 mg en vier
andere 0.5 mg. Van iedere groep overleed er één aan een
Pasteurella-infectie, alle andere bleven in leven.

Conclusie: het lipoid-polysaccharide is toxisch voor muizen,
de doodelijke dosis is echter relatief grooter dan die voor
konijnen. Het vrije polysaccharide is voor deze dieren niet
toxisch.

De immuniteitsleer verstaat onder haptenen stoffen, welke
in staat zijn om met bepaalde antisera te reageeren, maar
geen antigene eigenschappen bezitten. Eerst wanneer zij ge-
bonden zijn aan een stof. welke wel tot het opwekken van
antistoffen in staat is, ontstaat een complex, dat ook weer
antigeen is en waarvan de specificiteit bepaald wordt door
het hapteen. Van de meeste eiwitten is bekend, dat zij anti-
genen zijn, stoffen die niet tot de proteïnen behooren
zouden deze eigenschap missen, zij verkrijgen deze pas na
gebonden te zijn aan een eiwit.

In de door Landsteiner bereide antigeencomplexen
heeft deze binding plaats door middel van een diazoverbin-
ding, hoe in de natuur de stoffen met hapteeneigenschappen
aan het eiwit gebonden zijn, daarover staat nog weinig vast.
Sevag (7) zegt hierover: „Was das gemeinsame Vorkom-
men von Polysacchariden und Eiweissstoffe in Bakterien usw.
betrifft, so muss es offen bleiben, ob die Polysaccharide
chemisch oder durch Adsorptionskräfte locker an Eiweiss
gebunden sind, oder ob sie völlig unabhängig neben den
Eiweiss existierenquot;. De methode, welke hij heeft uitgewerkt
voor de scheiding van eiwit en koolhydraat, berust op de
veronderstelling dat de beide stoffen niet chemisch verbonden
zijn, maar door adsorptie. Gezien onze ervaringen met deze

methode (zie hoofdstuk II), moeten wij erkennen dat deze,
wat de scheiding van deze twee stoffen betreft, volkomen
geslaagd mag heeten, men mag echter uit dit resultaat niet de
conclusie trekken, dat er geen chemische binding tusschen
eiwit en koolhydraat aanwezig is. Het is n.1. zeer goed moge-
lijk, dat een deel van het polysaccharide steeds in vrije
toestand aanwezig is geweest, öf omdat het van nature gedeel-
telijk zoo in de cel voorkomt, öf omdat het gedurende het
kweeken wordt vrijgemaakt door fermenten. Zijn scheidings-
methode zou dan neerkomen op een scheiden van twee reeds
afzonderlijk aanwezige stoffen, en niet op het losmaken van
een niet zeer vaste verbmding hiertusschen. Dat zijn ver-
onderstelling over het bestaan van een adsorptiebinding
tusschen bacterie-eiwit en -polysaccharide onjuist is, willen
wij met beweren, zij zal echter nader dienen te worden ge-
toetst. Bovendien lijkt ons het gebruik van het woord
„adsorptie' bezwaarlijk, de beide soorten van verbindingen
waarom het hier gaat, zijn daarvoor te gecompliceerd van
bouw. Beter kan men van adsorptie spreken bij de kunst-
matige antigenen van Z o z a y a (8), welke bestaan uit poly-
saccharide en een stof met eenvoudige samenstelling, zooals
kool aluminiumovyde e.d. De met deze antigenen bereikte
resultaten zijn echter te weinig reproduceerbaar om te
mogen concludeeren dat hier inderdaad sprake is van een
adsorptiebinding.

Ook over de juistheid van Sevags derde veronderstel-
Img, n.1. dat eiwit en polysaccharide onafhankelijk van elkaar
bestaan, zijn geen experimenteele gegevens bekend. Wel is be-
kend, dat sommige orgaanextracten hapteeneigenschappen
bh,ken te bezitten, wanneer ze vermengd n^et serum (meestal
wordt hiervoor varkensserum gebruikt) bij proefdieren wor-
den ingespoten. Hierbij moet er de aandacht op worden geves-
tigd, dat het hier geen stoffen van bekende chemische struc-
tuur betreft, maar een mengsel van onbekende samenstel-
ling. Aangezien wij de beschikking hadden over polysaccha-
riden, waarvan de samenstelhng grootendeels bekend was

achtten wij het de moeite waard om deze stoffen, gemengd
met varkensserum, bij konijnen in te spuiten.

De injecties werden om de andere dag intraveneus toege-
diend, in totaal werden 5 injecties gegeven. De injectie-
vloeistoffen bestonden uit 0.5 cm^ serum en 4.5 cmS physiolo-
gische zoutoplossing, welke 5 mg polysaccharide bevatte, ^r
cm3 vloeistof was dus 1 mg polysaccharide aanwezig. Ue
ingespoten hoeveelheden bedroegen bij ieder dier resp. U.A
0.5, 0.5 0.5 en 0.5 cm3. Een week na de laatste mjectie werd
bloed afgenomen en het serum op de aanwezigheid van
precipitinen onderzocht.

Wij hebben evenwel reeds aangetoond, dat deze stot van
nature antigeen is, hier blijkt echter, dat deze eigenschap,
wanneer men met serum gemengd inspuit, sterker tot uiting
komt. immers dë nu verkregen precipitatietiters zi;n eenige
malen hooger dan de vroeger waargenomen titers Hoe merK-
waardig dit resuhaat op zichzelf ook zijn moge, het kan ons
niet inlichten over een eventueele wisselwerking tusschen üe
Polysacchariden en de moleculen der serumeiwitten.

3.nbsp;O. T. Avery. M. Heidelberger W F r. k T !
exp. Med. 42. 709 (1925).nbsp;Goebel, Journ.

/. M. G. Se vag, Biooh. Zeitschr. 273, 419 (1934).
8. J. Zozaya. Journ. exp. Med. 55^ 325 (1932).

Uit een kapseldragende stam van Klebsiella pneumoniae
(Bacterium pneumoniae Friedländer), serologisch behoorende
tot het type C, isoleerden wij een stof, welke tot een verdun-
ning van 1 : 2.000.000 een specifieke precipitatiereactie gaf
met het homologe antiserum.

Deze stof bleek te zijn samengesteld uit een polysaccharide
en een phospholipoïde. Door hydrolyse met 0.1 n azijnzuur
konden polysaccharide en lipoïde afzonderlijk worden ver-
kregen.

Uit een nader onderzoek bleek, dat het polysaccharide
d-mannose en d-galactose bevatte, bovendien kon een fractie
worden gdsoleerd welke een uronzuur. gemengd met of
gebonden aan een of meer suikers, bevatte.

Het lipoïde-polysaccharidecomplex bleek toxisch te zijn
voor konijnen en muizen, echter niet voor caviae. Ook slaag-
den wij erin met deze stof precipitinen op te wekken in het
bloed van konijnen en caviae. Deze eigenschappen ontbreken
bij het lipoïdvrije polysaccharide.

From an encapculated strain of Klebsiella pneumoniae
(Bacterium pneumoniae Friedländer), serologically belonging
to the type C, we isolated a substance, which gave a specific
Precipitationreaction with the homologue antiserum to a
dilution of 1 : 2.000.000.

and a phospholipin. These two constituents could be obtained
separated by means of hydrolysis with 0.1 n acetic acid.

A further investigation of the polysaccharide proved that it
contained d-mannose and d-galactose. Another fraction could
be isolated, which contained an uronic acid, probably mixed
with or linked to one or more sugars.

The phospholipin-polysaccharidecomplex proved to be toxic
for rabbits and mice, but not for guinea-pigs. We also
succeeded in producing with this substance precipitins in the
blood of rabbits and guinea-pigs. The lipinfree polysaccharide
does not posess these properties.

Aus einem kapseltragenden Stamm von Klebsiella pneu-
moniae (Bacterium pneumoniae Friedländer), serologisch zu
dem Typus C gehörend, isoherten wir eine Substanz, welche
bis zu einer Verdünnung von 1 : 2.000.000 eine spezifische
Prezipitationsreaktion mit dem homologen Antiserum gab.

Diese Substanz erwies sich als aufgebaut aus einem Poly-
saccharid und einem Phosphatid. Durch Hydrolyse mit 0.1 n
Essigsäure konnte Zerlegung in die Komponente Polysaccha-
rid und Phospatid durchgeführt werden.

Eine weitere Untersuchung des Polysaccharids ergab, dass
dieses d-Mannose und d-Galaktose enthielt, ausserdem
isolierten wir eine Fraktion, welche eine nicht näher identi-
fizierte Uronsäure, wahrscheinlich gebunden an oder gemischt
mit einem oder mehreren Zucker, enthielt.

Das Phosphatid-Polysaccharidekomplex zeigte sich toxisch
für Kaninchen und Mäuse, nicht aber für Meerschweinchen.
Auch gelang es uns mit diesem Stoffe im Blute von Kaninchen
und Meerschweinchen Prezipitine aufzuregen. Diese Eigen-
schaften fehlen bei dem Phosphatidfreien Polysaccharid.

Nous avons isolé dune source encapsulé de Klebsiella
pneumoniae (pneumobacille de Friedländer), appartenan
sérologiquement au type C, une substance qui, jusqu a une
dilution de 1 : 2.000.000, donnait une réaction de précipitation
spécifique avec de l'antiserum homologue.

Cette substance était un complexe glucido-lipidique, com-
posé dun polysaccharide et d'un lipoïde. Nous avons séparés
ces deux components par hydrolysation avec de 1 acide

De recherches plus détaillées il paraissait, que le poly-
saccharide contenait le d-mannose et le d-galactose. en outre
nous avons isolé une fraction, contenant un acide uronique
pas identifié, qui était probablement mêlé à ou he a un ou

Le complexe glucido-lipidique se montrait toxique pour les
lapins et les souris, mais pas pour les cobayes. Nous avons
produit avec cette substance des précipitines dans le sa g
des lapins et des cobayes. Le polysaccharide libère du hpoide
ne possède pas ces propriétés.

Type	Wd	zuur- aequiv.	%c	o/oH	hydrolyse- producten	hoogste verdun- ning pree. met hom. konijnen- serum
A	-1000	430	43.9	6.0	aldobionzuur glucose disaccharide- zuur.	1 : 2 000 000
B	1000	680	44.6	6.1	aldobionzuur glucose	1 : 2 000 000
C	1000	680			aldobionzuur glucose	1 : 2 000 OOG

stam	type	titer Amsterdam	Utrecht
F 1	A	1/32	Vioo
F 7	B	Vl28	Vsooo
F 10	C	V512	V2000
F 10	C	Vl60	V2000



	«
	ïP