iff t:

f.

'dy:

ï»

.... : ■

■gt; - S '

BIOTINE EN BIOS

#11.-SS;

■Y/tc^^

BIOTINE EN BIOS

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR
IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKS-
UNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VAN DEN
RECTOR MAGNIFICUS DR. H. R. KRUYT, HOOG-
LERAAR IN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUUR.
KUNDE, VOLGENS BESLUIT VAN DE SENAAT DER
UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE
FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE TE VER-
DEDIGEN OP MAANDAG 7 OCTOBER 1940, DES
NAMIDDAGS TE 4 UUR

DOOR

THEODORUS JOHANNES DE MAN

GEBOREN TE UTRECHT

1940

DRUKKERIJ Fa. SCHOTANUS 6 JENS - UTRECHT

Ou.Âi

Het verschijnen van dit proefschrift biedt mij gelegenheid, U, Oad-
Hoogleraren, Hoogleraren en Lectoren van de Faculteit der Wis- en
Natuurkunde, mijn hartelijke dank uit te spreken voor alles wat Gij tot
mijn wetenschappelijke vorming hebt bijgedragen.

In het bijzonder gaat mijn dank natuurlijk uit tot U, Hooggeleerde
Kögl, Hooggeachte Promotor. Voor het feit, dat ik gedurende een aantal
jaren Uw privé-assistent mocht zijn, zal ik U steeds erkentelijk blijven.
Uw belangstelling in mijn werk en mijn persoon zal ik niet vergeten.

Zeergeleerde Van Romburgh, ook Uw belangstelling heb ik altijd
zeer op prijs gesteld.

Ook ben ik jou. Pons, dank verschuldigd voor alles wat je mij leerde.

Ten slotte dank ik mijn collega's en het personeel van het Organisch-
Chemisch Laboratorium voor de medewerking, die ik steeds van hen mocht
ondervinden, in het bijzonder Mej. Visser voor de ijver en nauwkeurig-
heid, waarmede zij mij steeds terzijde stond.

tcr^

INHOUD.

Bladz.

Inleiding..................... 3

HOOFDSTUK I.

Overzicht van het biosvraagstuk.......... 5

HOOFDSTUK II.

De chemie van Biotine....................28

HOOFDSTUK III.

Experimenteel gedeelte...............42

Samenvatting...................67

INLEIDING.

In 1936 gelukte het aan F. Kögl en B. Tonnis een ge-
kristalliseerde stof uit eigeel te isoleren, welke de groei van
gistras „Mquot;, een branderij bovengist van het „Institut für
Garungsgewerbequot; te Berlijn, in een synthetische voedingsop-
lossing zeer sterk bevorderde. Na een groot aantal zuiverings-
trappen slaagden zij er in de factor, na een 3.000.000-voudigc
concentrering, in de vorm van kristallen af te zonderen.

De auteurs gaven als smeltpunt van de geïsoleerde methylester
146°^ 147° C op en stelden voor het overeenkomstige vrije
zuur biotine te noemen. Later bleek deze kristalfractie nog
niet geheel zuiver te zijn, hetgeen niet was te verwonderen,
daar slechts 155 y werden geïsoleerd.

L. Pons (Diss. Utrecht 1938), die de opwerking wist te
vereenvoudigen, verkreeg biotinemethylester als een zuivere,
scherp bij 158° C smeltende stof en kon uit verschillende
analysen de brutoformule CuHigOgNgS afleiden. Ook was
hij in de gelegenheid enkele afbraakreacties met de zuivere
kristallen uit te voeren. Het was nu de taak van den schrijver
van dit proefschrift, in de eerste plaats een nieuwe hoeveel-
heid biotinemethylester uit gedroogd eigeel te isoleren en
hiermee verdere afbraakreacties te doen om aanwijzingen te
verkrijgen over de structuur van deze zo actieve en kost-
bare stof.

Een zeer belangrijk gedeelte van de beschikbare tijd werd
aan dit isoleren besteed. Daar echter deze zuivering reeds
uitvoerig in bovengenoemde dissertatie was beschreven, zal
hierop in dit proefschrift niet verder worden ingegaan.

De grootste moeilijkheid was natuurlijk gelegen in de slechte

toegankelijkheid van het materiaal, waardoor een sterke be-
perking was geboden, zowel in aantal afbraakreacties, dat
verricht kon worden, als in het aantal milligrammen, dat voor
iedere afbraak ter beschikking stond.

Aangezien juist in de laatste tijd zeer belangrijke publicaties
over het biosvraagstuk waren verschenen, leek het wenselijk
een tamelijk uitgebreide samenvatting hierover in dit proef-
schrift op te nemen. In deze recente artikelen werd onder
anderen het bekend worden der structuur beschreven van
een zeer belangrijke biosfactor, het pantotheenzaur. terwijl
bovendien enkele aanwijzigingen begonnen te komen over de
verhouding, waarin sommige vitaminen tot de voornaamste
biosfactoren staan.

Dat het bij biotine nog niet gelukt is een volledig structuur-
bewijs te leveren, vindt in de eerste plaats zijn oorzaak in
de minimale hoeveelheid, waarover bij de afbraakreacties be-
schikt kon worden. Bovendien was de hardnekkigheid, waar-
mee de stof zich tegen enkele afbraken verzette, een grote
handicap. Daar men zich, en niet alleen te Utrecht, zeer
intensief met deze verbinding bezig houdt, is te verwachten,
dat een volledig bekend worden van de structuur niet al te
lang meer zal duren.

HOOFDSTUK I.

OVERZICHT VAN HET BIOSVRAAGSTUK.

De tot nu toe verschenen belangrijkste overzichten van de
biosliteratuur mogen hier in het kort genoemd worden.

In 1925 werd een zeer uitgebreide samenvatting van
F. W. T a n n e r gepubUceerd, waarin, voor zover ik heb
kunnen nagaan, de tot dat tijdstip verschenen hteratuur vrijwel
volledig is beschreven. Wat betreft de oudere publicaties heb
ik dan ook voornamelijk van dit overzicht gebruik kunnen
maken.

In 1930 verscheen een kort, maar zeer duidelijk en interessant
artikel van W. Lash Miller®) over het vraagstuk, terwijl
tenslotte W. van Hasselt®) in zijn dissertatie in 1935 een
tamelijk uitgebreid overzicht schreef.

Dat het nuttig lijkt ook in dit proefschrift een samenvatting
van het biosprobleem op te nemen, vindt zijn oorzaak in de
grote vooruitgang, die het vraagstuk juist in de laatste jaren
heeft ondergaan. Om de allerbelangrijkste stappen te noemen,
wil ik hier reeds wijzen op het isoleren van het pantotheen-
zuur, een zeer belangrijke biosfactor voor verschillende gist-
rassen en op het vaststellen van de structuur van deze
verbinding.

Bovendien is men in de laatste tijd, voornamelijk door

F. W. Tanner. Chem. Rev. 1, 397 (1925).
W. Lash Miller. J. chem. Educ. 7, 257 (1930).
W. van Hasselt. Diss. Utrecht 1935.

proeven, die men met het zuivere pantotheenzuur en biotine
heeft kunnen doen, meer en meer tot de overtuiging gekomen,
dat deze factoren niet alleen voor de groei van gist, maar
voor lagere organismen in het algemeen van betekenis zijn.
Ook heeft men aanwijzingen verkregen over de verhouding,
waarin de beide verbindingen tot enige vitaminen staan.

Om een geheel te krijgen werd, terwijl de nieuwere
publicaties uitvoerig werden gerefereerd, in deze samenvatting
toch kort op de oudere biosliteratuur ingegaan, tenminste
voor zover dit voor een goed begrip noodzakelijk bleek.

A. Pogingen om dc biosfactoren te isoleren en te iden-
tificeren.

In 1901 werd door den Belg E. Wildiers^) de naam
„biosquot; voorgesteld voor een factor, die hem noodzakelijk
bleek te zijn voor de groei van gist in een milieu, dat verder
slechts bestond uit in water opgeloste minerale voedings-
zouten en suiker.

Dat het bestaan van zulk een factor maar niet voetstoots
op Wildiers' gezag werd aangenomen, was in de eerste
plaats te wijten aan de autoriteit van L. Pasteur die
reeds in 1860 een door hem uitgevoerde proef beschreef,
waarin het hem was gelukt gist te doen groeien in een
synthetisch milieu.

Wel bleek in 1871, dat J. von Liebig®) deze proeven
niet kon reproduceren en wel protesteerde hij dan ook tegen
de opvatting van Pasteur, maar mede door het sportieve
aanbod, dat de laatste deed'') om de proeven onder toezicht
van Li eb ig te herhalen met stoffen, door Liebig zelf mee-
gebracht en ook door het uitblijven van enig antwoord van
de kant van Liebig op dit voorstel, zegevierde in die tijd
de opvatting van Pasteur.

E. Wildiers. La Celluie 18, 313 (1901).
L. Pasteur. Ann. chim. Phys. 3. serie 58, 323 (I860).
«) J. von Liebig. Ann. chim. Phys. 4. serie 23, 5 (1871).
') L. Pasteur. Ann. chim. Phys. 4. serie 25, 145 (1872).

Een andere oorzaak voor het feit, dat Wil diers in zijn
idee over een zo actieve organische stof niet algemeen ge-
volgd werd, is gelegen in de omstandigheid, dat de tijd er
als het ware nog niet rijp voor was. Men was nog niet door
het vitaminebegrip vertrouwd geraakt met het bestaan van
dergelijke verbindingen, die in buitengewoon grote verdunning
zulk een belangrijke rol spelen.

Wanneer ik hier schreef, dat de Belgische onderzoeker niet
algemeen gevolgd werd, drukte ik mij ongetwijfeld te zacht
uit. Want wat algemeen was, was de kritiek, die naar aan-
leiding van zijn publicatie loskwam. En deze kritiek op het
degelijk experimenteel werk van Wildiers was niet het
gevolg van proeven, die zijn tegenstanders op hun beurt deden,
maar uitsluitend het gevolg van het niet kunnen wennen aan
het begrip, dat aan de naam „biosquot; was gekoppeld.

Een groot aantal publicaties is in die jaren verschenen,
welke allen tegen de opvattingen van Wildiers ingingen,
maar, daar zij het biosvraagstuk niet verder brachten en boven-
dien in de reeds eerder genoemde samenvattingen zeer uit-
voerig werden beschreven, zal op deze kritiek in dit over-
zicht niet worden ingegaan.

Het laboratoriumwerk werd in die tijd vrijwel geheel
overgelaten aan de school van prof. M. Ide, te Leuven,
waartoe ook Wildiers behoorde.

Had deze laatste in zijn experimenten reeds pogingen ge-
daan om bios chemisch enigszins te identificeren, R. Devloo
zette deze voort. Een reeks van eigenschappen van de factor
werd gegeven en een nog groter reeks van stoffen welke
geen biosactiviteit bezaten.

Toen het vitaminebegrip algemener bekendheid verwierf,
kon niet meer worden ontkend, dat minimaal kleine hoeveel-
heden van organische stoffen nodig waren voor het gezond
zijn van levende wezens; waarom dan ook niet voor gist.
Op deze wijze kon het biosbegrip meer en meer worden

R. Devloo. La Celluie 23, 361 (1906).

geaccepteerd. Zoals haast te verwachten was, ging men te
ver met vergelijken. Enkele jaren lang hield men bios voor
identiek met het eerst ontdekte vitamine, het aneurine, tot-
dat omstreeks 1920 een aantal onderzoekers concentraten
maakten, die wél de gistgroei bevorderden, maar die niet in
staat waren om polyneuritische duiven te genezen, of ratten
te doen groeien en omgekeerd.

Wat kan men, nu het biosbegrip algemeen wordt aan-
genomen, als de reden opgeven van het meningsverschil tussen
Liebigen Pasteur? Vermoedelijk vinden de tegengestelde
proefuitkomsten hun oorzaak in het feit, dat men in die dagen
slechts sprak van „biergistquot;, zonder enige verdere onder-
scheiding.

Het feit bijvoorbeeld, dat Liebig bij zijn experimenten
een Münchener ondergist gebruikte, leek geheel zonder be-
lang. Zelfs Wil diers, die zijn proeven deed met verschillende
handelsgisten en met twee zuivere rassen, dacht, dat hij de
behoefte aan bios voor alle biergisten had bewezen.

Puim er en medewerkersquot;) toonden echter in 1923 aan,
dat er minstens één gistsoort was, die zich in een bios-vrij
medium kon ontwikkelen. Een Fleischmann-gist werd door
overenten in hun „medium-Fquot;, bestaande uit een oplossing
van anorganische zouten en zuivere suiker, langer dan een
jaar in leven gehouden, hoewel de groei minder intensief
bleek te zijn dan in wort. Was dit reeds een aanwijzing,
later bleek uit verschillende proeven, dat het voor onder-
zoekingen over het biosvraagstuk niet onverschillig was met
welk gistras deze proeven waren uitgevoerd.

A. M. Copping R. J. Williams en medewerkers i®).

o.a. A. D. Emmett en M. Stockholm. J. Biol. Chem. 43, 287 (1920).
E. I. Fulmer, V. E. Nelson en A. White. J. Biol. Chem. 57.
397 (1923).

quot;) A. M. Copping. Biochem. J. 23, 1050 (1929).
quot;) R. J. Williams, M. E. Warner en R. R. Roehm. J. Am. Chem.
Soc. 51, 2764 (1929).

en H. StantiaP®) toonden allen aan, dat de behoefte aan
bios niet voor alle gistsoorten bleek te bestaan.

De eerste onderzocht een twintigtal gistrassen en bewees,
dat zwak ademende gisten de grootste behoefte aan bios
hadden. Dit waren dan de veredelde soorten. De wilde
rassen groeiden daarentegen ook zonder toevoeging van bios
normaal.

In 1939 verscheen van de hand van den Engelsman
C. Rainbow in J. Inst. of Brewing een verslag van een
uitgebreid onderzoek, getiteld: „The bios requirements of
various strains of Saccharomyces Cerevisiaequot;. Op zijn resul-
taten zal verder in dit overzicht nog worden ingegaan.

Gecompliceerder werd het vraagstuk toen langzamerhand
bleek, dat bios geen enkelvoudige stof was. In 1922 namen
E. I. Fulmer en V. E. Nelson als eersten waar, dat bios
minstens uit twee componenten bestond. Sedert die tijd is de
samengesteldheid door verschillende onderzoekers bevestigd.

W. Lash Miller en medewerkers konden na uitgebreide
onderzoekingen, die zich over een reeks van jaren uitstrekten,
het volgende schema van fractionering opstellen:

H, Stantial. Trans. Roy. Soc. Canada. Sect. Ill (3) 26, 163 (1932).
E. I. Fulmer en V. E. Nel son. Proc. Iowa Acad. Sci. 29,371 (1922).

Bios-bron.

behandeling met
bariet en alcohol,
of met
loodacetaat en ammonia.

adsorptie aan
actieve kool.

niet geadsorbeerd:
Bios IIA.

geadsorbeerd:
Bios IIB.

(geëlueerd door

een aceton-
ammonia-water-
mengsel).

De eerste scheiding werd in 1923 door Lash Miller's
medewerker G. H.W.Lucasquot;) beschreven, die wort met
bariet en alcohol behandelde.

Twee fracties werden verkregen, het neerslag en het filtraat,
die beide van barium werden bevrijd. Geen der fracties af-
zonderlijk had effect op de groei van hun Fleischmann-gist,
maar met de beide fracties tezamen was het effect bijna even
groot als met het oorspronkelijk wort.

De factor, die zich in het neerslag bevond, werd bios I
genoemd, terwijl de zich in het filtraat bevindende fractie
de naam bios II werd gegeven.

G. H. W. Lucas, Proc. Trans. Roy. Soc. Canada Sect. Ill (3) 17,
157 (1923).nbsp;* '

Idem. ]. Phys. Chem. 28, 1180 (1924).

Na een aantal voorbereidende pogingen gelukte het
E. V. Eastcottquot;) van dezelfde Canadese school in 1928 de
fractie bios I in zuivere toestand te isoleren. Als uitgangs-
materiaal werd theestof gekozen. Het bleek nu. dat de actieve
verbinding identiek was met meso-inosiet, een verbinding,
waarvan het zeer verspreid in de natuur voorkomen reeds
lang bekend was.

Al spoedig bleek echter, dat deze splitsing in twee compo-
nenten de samengesteldheid van bios nog lang niet ten volle
weergaf.

In 1932 verscheen van Lash Millerquot;) de eerste voor-
lopige publicatie over de scheiding van bios II in twee fracties,
die bios IIA en bios IIB genoemd werden.

Een jaar later verscheen een groot artikel over deze
splitsing quot;). Een ruw bios II preparaat, dat uit Fleischmann-
gist was verkregen, werd met actieve kool behandeld. Op
deze manier werden ook hier twee fracties geïsoleerd. Het
gedeelte, dat niet aan de kool was geadsorbeerd, kreeg de
naam bios IIA, terwijl het geadsorbeerde deel bios IIB werd
genoemd. Deze laatste factor werd van de kool verwijderd
door elueren met een aceton-ammonia mengsel.

In het jaar 1933 was dus gebleken, dat bios uit gist in drie
fracties te splitsen was, bios I, IIA en IIB. In een overigens
synthetisch milieu, bestaande uit een oplossing van voedings-
zouten en suiker, gaven elk der drie factoren afzonderlijk
toegevoegd, slechts een geringe groei; een iets grotere groei
werd veroorzaakt, wanneer twee van de drie factoren werden
toegevoegd, terwijl een werkelijk goede groei pas plaats vond,
wanneer alle drie aanwezig waren.

Buitengewoon interessant is in dit artikel de beschrijving
van het feit, dat bovengenoemd schema van fractionering is

16\

E. V. Eastcott. ]. Phys. Chem. 32, 1094 (1928).
quot;) W. Lash Miller, E. V. Eastcott en E. M. Sparling. Trans.'
Roy. Soc. Canada Sect. Ill (3) 26, 165 (1932).

quot;) W.Lash Miller, E. V. Eastcott en J. E. Maconachie. J. Am
Chem. Soc. 55, 1502 (1933).

toe te passen op de meest uiteenlopende biosbronnen. Wat
betreft de afscheiding van bios I werden in dit verband ge-
noemd : moutkiemen, rijstvliesjes, thee, paddestoelen, melasse,
sinaasappelen en tomaten. De splitsing van bios II in zijn
componenten was uitgevoerd bij moutkiemen, tomaten en gist.

Physiologisch zijn alle overeenkomstige fracties gelijkwaardig,
ongeacht de bron. Daar bovendien het chemisch proces, volgens
hetwelk de splitsing in componenten werd uitgevoerd, in alle
gevallen hetzelfde was, maken de auteurs uit deze feiten de
gevolgtrekking, dat er geen enkele reden is om meer dan
één bios I, IIA en IIB aan te nemen, totdat er een biosbron
gevonden wordt, die anders dan de reeds genoemde met
alcohol en bariet geen scheiding geeft in bios I en bios II
en met kool geen verdere splitsing van deze laatste factor.

Na het bekend worden van bios I als meso-inosiet, heeft,
zoals te verwachten was, de school van Lash Miller ver-
schillende pogingen gedaan om ook de andere componenten
te identificeren. In 1934 werd de isolering van een actief
koperzout uit de bios IIA fractie beschreven quot;). De elemen-
tairanalyse hiervan zou overeenkomen met de formule van
een oxyaminoboterzuur, maar later bleek, dat synthetisch
oxyaminoboterzuur de geïsoleerde verbinding niet kon ver-
vangen ^0). Wel bleek dat ^-a/anme de werking van bios IIB
sterk verhoogde

De eigenschappen van de bios IIA fractie zijn dus, ten
minste in ieder geval gedeeltelijk, te danken aan zijn gehalte
aan ^-alanine. Ook werd 1-leucine in dit verband genoemd.
Men krijgt dus sterk de indruk, dat het geïsoleerde en ge-
analyseerde koperzout uit de bios IIA fractie een mengsel
is geweest.

In 1936 gaf Miller's medewerkster M.L. Elder het
bestaan van een nieuwe factor in het koolflltraat aan, die bios V

W. La sh Miller. Trans. Roy. Soc. Canada Sect. Ill (3) 28, 185 (1934)
W. Lash Miller, id. 29, 163 (1935).

quot;) W. Lash Miller, id. 30, 99 (1936).

quot;) M. L. Elder, id. 30, 89 (1936).

genoemd werd. Deze labiele verbinding bleek later identiek
met vitamine B^ te zijn In dezelfde publicatie, waarin dit
feit vermeld staat, wordt ook

nog aangegeven, dat carnosine-
nitraat na hydrolyse met zuur of bariet de groei-bevorderende
eigenschappen van bios IIA geeft. Daar carnosine de structuur
van /3-aminopropionylhistidine heeft, lijkt mij dit verklaarbaar,
daar deze verbinding bij een hydrolyse het ;8-alanine moet
leveren.

Bovendien werd nog in dit artikel door Lash Miller
als goede bron voor de bereiding van bios IIB, concentraten
van de afvalkool van suikerraffinaderijen genoemd. Na ver-
schillende bewerkingen kon een actief preparaat worden ver-
kregen, ofschoon nog niets werd vermeld over een gekristal-
liseerde actieve verbinding in deze fractie.

Als het ware evenwijdig met de belangrijke onderzoekingen,
die in Toronto door Miller en medewerkers werden uit-
gevoerd, loopt het niet minder interessante werk van den
Amerikaan R. }. Williams, dat zich over ongeveer dezelfde
reeks van jaren uitstrekt. Na een reeks artikelen, waarop
echter in deze samenvatting niet zal worden ingegaan, omdat
zij in hoofdzaak slechts een voorlopig karakter hadden en niet
noodzakelijk zijn voor een goed begrip van het volgende,
werd door Williams®^) en medewerkers in 1927 gepubli-
ceerd over de eerste pogingen om een actief principe uit
gistextract te concentreren.

Al spoedig was ook hier de samengesteldheid van bios
gebleken. Met behulp van vollers-aarde werd een splitsing
in twee fracties uitgevoerd, die ieder voor zich op de gist
die voor het testen werd gekozen, slechts een geringe groei
uitoefende. Pas een mengsel van beide fracties bleek een
activiteit te bezitten, welke ongeveer overeenkwam met die
van het oorspronkelijke gistextract.

W. Lash Miller. Trans. Roy. Soc. Canada Sect III (3) 31, 159(1937).
quot;) R. J. Williams, J. L. Wilson en F. H. von der Ahe. J. Am.
Chem. Soc. 49, 227 (1927).

Men moet in dit verband grote nadruk leggen op de gist.
die voor de experimenten werd gekozen; deze was in dit
geval No. 578 van de „American Type Culture Collectionquot;.
Het bleek namelijk aan Williams bij een onderzoek,
hetwelk zich over verschillende gistrassen uitstrekte, dat niet
alle rassen zo gecompliceerd waren in hun behoefte aan bios.
Bijvoorbeeld bleek, dat de gist van het type „Gebrüde Mayerquot;
bijna even sterk groeide, wanneer extracten waren toegevoegd,
die met vollers-aarde waren behandeld, als met onbehandelde
extracten. Bij hun proeven in dit artikel beschreven, kregen
de auteurs geen aanwijzing, dat de stof, die de groei van
„Gebr. Mayerquot; gist stimuleert, meer dan één verbinding is.

Daar ook Wildiers zijn bios beschreef als een stof, die
niet door een van de gewone middelen wordt neergeslagen
en de eigenschappen veel overeenkomst vertonen met die
van de stof, welke de groei van „Gebr. Mayerquot; gist be-
vordert, menen de auteurs, dat de groeistof, die zij onder-
zochten, identiek is met het oorspronkelijke bios van Wildiers.

Deze mening verkregen zij mede op grond van vergelijkings-
proeven, die met de gist uit het laboratorium van Ide uit
Leuven werden uitgevoerd.

Voor hun verdere isoleringspogingen hebben de auteurs
dan ook als gist voor hun proeven de „Gebr. Mayerquot; soort
gekozen

In 1931 werd door Williamsquot;) voor het eerst de ge-
fractioneerde electrolyse beschreven als een middel om Wil-
diers' bios verder te zuiveren. Bij een onderzoek met de
oorspronkelijke stam, die Wildiers ook had gebruikt, bleek,
dat zijn bios met behulp van deze methode te splitsen was
in een zuur en een basisch bestanddeel. Voor de „Gebr. Mayerquot;

R. J. Williams, M. E. Warner en R. R. Roehm. J. Am. Chem.
Soc. 51, 2764 (1929).

R. J. Williams en E. M. Bradway. J. Am. Chem. Soc. 53, 783
(1931)''^ I- Williams en J. H. Truesdail. J. Am. Chem. Soc. 53, 4171

gist werd gevonden, dat slechts één enkele zure stof voor
de groei noodzakelijk was.

Nadat in 1932 in een voorlopige mededeling door
Williams^®) en medewerkers reeds aangegeven was, dat
een actieve zure stof in het meest uiteenlopende materiaal
voorkwam en zelfs al enige eigenschappen van deze stof
werden genoemd, verscheen het jaar daarop de eerste grote
publicatie over dit onderwerp getiteld: „Pantothenic Acid,
a Growth Determinant of Universal Biological Importancequot;

Weefselextracten, uit verschillende bronnen bereid, werden
onderzocht en het bleek, dat alle extracten een stimulerende
werking uitoefenden op de groei van „Gebr. Mayerquot; gist.
Nu werd op elk van deze extracten een gefractioneerde
electrolyse uitgevoerd. Na de 48 uur, die deze behandeling
duurde, werd van de inhoud van ieder der acht cellen van
het toestel de P^ bepaald. Bovendien werd de inhoud van
elke cel op de groeiwerking getest.

Het bleek nu, dat, onverschillig welke bron was gebruikt
om het biosextract te maken, het gedrag van het actieve
principe bij alle electrolyses eender was. De grootste hoe-
veelheid actieve stof was na de electrolyse steeds in de cel
aanwezig, die een P^j van ongeveer 3,6 had.

Door middel van theoretische beschouwingen, waarvoor
ik naar het origineel moet verwijzen, komen de auteurs tot
de conclusie, dat de actieve verbinding vermoedelijk een poly-
oxyzuur is. Het merkwaardige is, dat de mededelingen in dit
artikel niet gedaan zijn op grond van proeven met de zuivere
stof, maar met nog zeer ruwe extracten.

Door diffusie-experimenten werd bijvoorbeeld vastgesteld,
dat het moleculairgewicht ongeveer 150 moest zijn. De diffusie
van de stof werd ook hier weer bepaald door met testproeven
de doordringing van het actieve principe te volgen.

R. J. Williams, C. M. Lyman, G. H. Goodyear en J. H. Trues-
dail. J. Am. Chem. Soc. 54, 3462 (1932).

R. J. Williams, C. M. Lyman, G. H. Goodyear, J. H. Truesdail
en D. Holaday. J. Am. Chem. Soc. 55, 2912 (1933).

Bovendien werd in dit onderzoek het gedrag der activiteit
van de extracten nagegaan t.o.v. verschillende chemische in-
werkingen: hydrering, verestering, enz. Steeds liepen de
activiteitsveranderingen paralel, ongeacht de bron, waaruit
het extract was gemaakt. Dit alles wees zeer sterk op het
bestaan van één enkele stof, die steeds voor de activiteit
aansprakelijk moest worden gesteld. Als naam voor deze zo
algemeen voorkomende verbinding werd door Williams
„pantotheenzuurquot; voorgesteld.

Op grond van hun gehele serie proeven werd, behalve
het reeds genoemde, nog vastgesteld, dat pantotheenzuur geen
dubbele binding bezat en makkelijk was te oxyderen. Ten slotte
werd nog de afwezigheid van een aantal groepen aanneme-
lijk gemaakt.

Met hoeveel moeilijkheden het zuiveren van pantotheenzuur
gepaard ging, blijkt wel uit het feit, dat het vijfjaar duurde, voor-
dat een tweede artikel over deze verbinding werd gepubliceerd.

In deze tussentijd verschenen wel is waar enkele artikelen
over deze stof, maar hierin werden physiologische proeven
beschreven, die met ruwe extracten waren uitgevoerd

In deze tweede publicatie werd het concentreren en de
zuivering van pantotheenzuur uit lever beschreven De
moeilijkheid was natuurlijk in de eerste plaats gelegen in het
feit, dat de concentratie van het zuur zo uiterst gering was.
Zelfs het relatief bios-rijkste uitgangsproduct, dat als uitgangs-
materiaal genomen werd: de lever, bevatte slechts ongeveer
4 mg per kg. Ingewikkelder werd de isolering ook door de
zeer grote oplosbaarheid in water, het kristallisatievermogen
en de geringe stabiliteit van het pantotheenzuur.

R. J. Williams en D. H. Saunders. Biochem. J. 28, 1887 (1934).

quot;) R. J. Williams, W. A. Mosher en E. Rohrman. Biochem. T
30, 2036 (1936).

R. J. Williams en E. Rohrman. Plant Physiol. 10, 559 (1936).

R. J. Williams, J. H. Truesdail, H. H. Weinstock,
E. Rohrman, C. M. Lijman en C. M. Mc Burney. 1. Am. Chem Soc
60, 2719 (1938).

Bij de isolering werden op een autolyse-extract van schapen-
lever een tiental zuiveringstrappen uitgevoerd. Als eindproduct
verkregen W i 11 i a m s en medewerkers een amorf calciumzout,
waarvan de aanwezigheid physiologisch reeds kwantitatief
was aan te tonen, wanneer 0,0005 y per cm^ voedingsoplos-
sing aanwezig was. Dit preparaat had een activiteit van
11000, vergeleken met een standaardpreparaat uit rijstzemelen
als eenheid.

Door verder te fractioneren gelukte het niet de activiteit
te verhogen.

In een volgend artikel werden allereerst verschillende
„oxydatie-aequivalent-analysenquot; beschreven van preparaten
met een activiteit van 5000—11000 en elementairanalysen
uitgevoerd met de actiefste preparaten.

Alle uitkomsten wezen op een formule (CgHi^OgN)^ Ca
voor het calciumzout, waaruit dan de formule QH15O5N voor
het vrije pantotheenzuur werd afgeleid. Bovendien werden
met preparaten van zeer uiteenlopende activiteit reacties uit-
gevoerd op verschillende groepen, waarbij dan steeds het
gedrag der activiteit werd nagegaan.

Nadat in 1936 Williams^®) reeds gevonden had, dat
/S-alanine bij zijn gist als bios kon fungeren, werd in de vol-
gende publicatie over pantotheenzuur beschreven, dat bij een
splitsing van deze verbinding /S-alanine ontstaat Uit diverse
proeven was namelijk naar voren gekomen, dat de „Gebr.
Mayerquot; gist het pantotheenzuur slechts dan kan synthetiseren,
wanneer ^ö-alanine aanwezig was. Dat de ontstane activiteit
werkelijk van het gesynthetiseerde pantotheenzuur afkomstig
was, en niet van het alanine, volgde uit electrolyseproeven.

Door deze physiologische experimenten was men op het

R. J.Williams, H. H. Wein stock, E.Rohrman, J. H. Trues-
dail, H. K. Mitchel en C. E. Meyer. J. Am. Chem. Soc. 61, 454 (1939).
R.J.Williams. J. Am. Chem. Soc. 59, 288 (1937).
R.J.Williams en E.Rohrman. J. Am. Chem. Soc. 58, 695 (1936).
quot;) H.H. Weinstock, H.K.Mitchel, E.E.Pratt en R.J.Williams.
J. Am. Chem. Soc. 61, 1421 (1939).

idee gekomen, dat /5-alanine een bestanddeel van pantotheen-
zuur was. Deze verbinding werd in een 90 %-ige opbrengst
als /S-naphtalinesulfo-;S-alanine geïsoleerd.

Hiermee waren de grootste moeilijkheden, die deze bios-
factor opleverde, overwonnen.

Enkele maanden geleden, in hetzelfde nummer van Science,
waarin D. W. Woolley het isoleren van een gekristalli-
seerd derivaat van pantotheenzuur beschreef, publiceerde R.
J. Williams, in samenwerking met R.T. Major van het
laboratorium van Merck, een voorlopige mededeling over
de structuur van deze stof.

In de Amerikaanse laboratoria van Merck werden grote
hoeveelheden leverextract opgewerkt en gezuiverd tot con-
centraten, die 3—40 % bariumpantothenaat bevatten. Hieruit
verkreeg men door splitsing een zuiver lacton, dat een smelt-
punt van 91°-92° C bleek te bezitten. Uit analyseq werd
als brutoformule CeHioOg afgeleid en met behulp van af-
braakreacties werd gevonden, dat d^ verbinding de structuur
van a-oxy-/9jS'-dimethyl-y-butyrolacton moest bezitten.

Tenslotte werd het lacton ook gesynthetiseerd en aan f)~
alanine gekoppeld. Dit synthetisch pantotheenzuur bleek
physiologisch actief.

Het pantotheenzuur zelf moet men onderstaande structuur
toekennen:

CHa

I OH

I I

HOCH3-C-CH-CO-NH.CHO.CH,.COOH

CHa

Deze structuuropheldering, die bij M erek werd verricht, werd
uitgevoerd door de chemici: E. T. Stiller, J. C. Keresztesy

D.W. Woolley. Science 91, 245 (1940).

R.J.Williams en R. T. M a j o r. Science 91, 246 (1940).

en J.Finkelstein. Een uitvoerige publicatie hierover werd
in de voorlopige mededeling aangekondigd.

Nu dus de bouw van het pantotheenzuur bekend is ge-
worden, is het interessant nog eens na te gaan, welke „voor-
spellingenquot; Williams reeds in 1932 deed op grond van
de uitkomsten van zijn „testproefjesquot;, die hij met ruwe
extracten uitvoerde. Achteraf blijkt dan, dat zijn conclusies
van toen, door de latere afbraken op het zuivere materiaal
gedaan, volkomen bevestigd werden. Een reden te meer om
waardering te hebben voor dit buitengewoon mooie onderzoek.

De derde plaats waar gedurende een reeks van jaren over
bios-factoren werd gewerkt, is het Organisch Chemisch
Laboratorium der Rijks Universiteit te Utrecht. In 1932
namen F. Kögl en medewerkers dit onderzoek ter hand en
vier jaren later konden zij mededeling doen over de isolering
van een gekristalliseerde verbinding uit eigeel, die de groei
van hun gist reeds in zeer grote verdunning bevorderde

Voor deze zo actieve stof werd de naam „biotinequot; voor-
gesteld. Bij de concentrering werd, ten minste in het begin,
de fractioneringsmethode van Lash Miller gevolgd.

Het meso-inosiet werd verwijderd door middel van ammonia-
kaal loodacetaat. Hierna bleek de „biotine-factorquot; aan kool
geadsorbeerd te worden en hieruit kan men concluderen, dat
biotine volgens het schema van Lash Miller zijn plaats in
de fractie IIB zou moeten vinden.

Met behulp van de test door F. Kögl en B. Tonnis
toegepast, waarvoor zij het gistras „Mquot; van het Institut für
Gärungsgewerbe te Berlijn gebruikten, kon worden vastgesteld,
dat deze factor, ook zonder toevoeging van andere fracties,
buitengewoon actief was. De groei-bevorderende werking
was nog aan te tonen, wanneer het biotine zich slechts in
een verdunning 1 :4X bevond.

Het effect kon echter nog verhoogd worden door toe-
voeging van meso-inosiet en aneurine

F. Kögl en B. Tonnis. Z. Physiol. Chem. 242, 43 (1936).

quot;) W. V. Hasselt. Diss. Utrecht 1935.

Van het biotine, dat als methylester werd geïsoleerd, waar-
aan men op grond van elementair-analysen de brutoformule
CuHigOgNgS heeft moeten toekennen, lukte het tot nu toe
niet de structuur volledig vast te stellen (zie voor bijzonder-
heden het tweede hoofdstuk van dit proefschrift).

Teneinde de voortgang van de isolering na de verschillende
zuiveringstrappen goed te kunnen volgen en in een kwanti-
tatieve maat uit te kunnen drukken, hebben Kögl en Tonnis
als eenheid een Saccharomyces eenheid (S.E.) aangenomen,
zijnde dié hoeveelheid stof, welke onder de omstandigheden
van de test een groei veroorzaakte van 100 quot;/o-

De activiteit van biotinemethylester, in deze eenheid uit-
gedrukt, bleek 25 milliard S.E. per gram te bedragen.

Nu het actieve principe in zuivere toestand is verkregen,
lijkt het mij gewenst deze eenheid los te maken van mogelijke
veranderingen in de eigenschappen van ras „Mquot;. De eenheid,

zó gedefinieerd, zou dan zijn: 25 y 10quot; ^ biotinemethylester.

Behalve te Utrecht wordt momenteel nog in verschillende
andere laboratoria aan biotine gewerkt. Om slechts de aller-
belangrijkste publicaties te noemen, wil ik hier wijzen op een
onderzoek, dat in 1938 door G. Drum el en L. Hubert^^)
in het laboratorium van M. Ide te Leuven werd uitgevoerd
en op een artikel van R. Devloo^quot;) van hetzelfde instituut.
De isolering van actieve stoffen was bij deze auteurs echter
nog niet zover gevorderd, dat een gekristalliseerd product
kon worden verkregen.

Bovendien blijkt uit een zeer recent artikel van R. J. Wil-
liams en medewerkers, dat deze onderzoekers, aangemoe-
digd door hun succes met pantotheenzuur, ook de bestudering
van biotine ter hand hebben genomen. Ook hier kon men

G. Drumel en L. Hubert. Arch. int. Physiol. 46, 141 (1938).
quot;) R. Devloo. Arch. int. Physiol. 46, 157 (1938).
quot;) E. E. Snell, R. E. Eakon en R.J.Williams. T. Am. Chem.
Soc. 62, 175 (1940).

nog geen zuiver product beschrijven, hoewel aangenomen
mag worden, dat dit niet lang meer op zich zal laten wachten.

Zijn gewoonte getrouw heeft Williams weer verschillende
proefjes uitgevoerd, waarin de verandering werd nagegaan
van de activiteit bij inwerking van diverse reagentia op de
extracten. Op grond van de uitkomsten van deze experimenten
kent Williams dan aan zijn nog te isoleren verbinding
verschillende eigenschappen toe, die vrijwel overeenstemmen
met die van ons gekristalliseerd biotine.

Ook wil ik hier nog wijzen op een tweetal, in 1939 ver-
schenen publicatiesquot;)^®), die de stimulerende werking be-
handelen, die vitamine Bg op de groei van enkele gistrassen
blijkt uit te oefenen.

Overigens kan in dit verband worden opgemerkt, dat dit
vitamine in onze test op ras „Mquot; geen physiologische acti-
viteit vertoonde.

Dit gedeelte van het overzicht, dat de isolering en het
identificeren van de biosfactoren behandelt, wil ik niet ein-
digen zonder een drietal artikelen te noemen, die in 1939
van de hand van de Engelsen L. R. Bishop en C. Rainbow
verschenen «)

Na in het eerste artikel een test te hebben beschreven,
gaan de auteurs in de tweede publicatie na, welke de invloed
van verschillende bioscomponenten is op de groei van een
zevental gistrassen. Op grond van hun proefuitkomsten wisten
de Engelsen verschillende schijnbare tegenspraken uit de lite-
ratuur te verklaren; bovendien gaven zij diverse oorzaken
op, die deze verschillen in de hand hebben gewerkt.

A. Schultz, L. Atkin en C. N. Frey. ]. Am. Chem. Soc, 61, 1931
(1939).

R. E. E akin en R. J. Williams. ]. Am. Chem. Soc. 61, 1932(1939).
L. R. Bishop en C. Rainbow. J. of the Inst. of Brewing. 45, 33
(1939).

C. Rainbow. J. of the Inst. of Brewing. 45, 533 (1939).
quot;quot;) C. Rainbow en L. R. Bishop. ]. of the Inst. of Brewing 45, 593
(1939).

Het derde en laatste artikel, tot nu toe van deze auteurs
verschenen, handelt in hoofdzaak over de concentrering van
een tweetal biosfactoren. Een van deze factoren, die in eigen-
schappen op pantotheenzuur gelijkt, werd gevonden in de
fractie IIA, volgens het schema van Lash Miller, dat door
hen werd gevolgd. De andere uit de fractie IIB kwam in
eigenschappen volkomen met het biotine overeen. Hoewel
nog niet een geheel zuiver gekristalliseerd product werd ge-
maakt, konden toch reeds enkele eigenschappen worden op-
gegeven, welke doen vermoeden dat het hier werkelijk om
biotine gaat.

Ook te Utrecht is gedurende de laatste jaren intensief met
deze stof gewerkt en wel zijn hoofdzakelijk pogingen gedaan
om meer over de structuur te weten te komen. Hierop zal
echter in hoofdstuk II van dit proefschrift uitvoerig worden
ingegaan.

B. Physiologische betekenis van pantotheenzuur en bio-
tine voor verschillende lagere organismen.

Hoewel reeds uit de uitkomsten van proeven, genomen
met ruwe extracten, met zekerheid was komen vast te staan,
dat een zeer nauw verband bestond tussen de biosfactoren
(in engere zin opgevat als stoffen, die de groei van gist be-
vorderen) en de groeistoffen die verschillende bacteriën nodig
blijken te hebben, kon men eerst na het isoleren van zuiver
pantotheenzuur en zuiver biotine goed reproduceerbare ex-
perimenten op dit gebied uitvoeren. In dit overzicht worden
dan ook hoofdzakelijk die proeven beschreven, waarvoor de
zuivere stoffen werden gebruikt.

Wat pantotheenzuur betreft, bleek al spoedig, dat deze
factor voor een goede ontwikkeling van diverse bacteriën in
een overigens synthetisch voedingsmilieu noodzakelijk was.
Zo konden in 1938 J. H. Mueller en A. W. Klotz ^o) de
onmisbaarheid van deze verbinding voor de groei van diphte-

]. H. Mueller en A. W. Klotz. J. Am. Chem. Soc. 60,3086(1938).

ritis bacillen aantonen. De stimulerende werking die /3-alanine
op de ontwikkeling van deze organismen uitoefende, bleek
het gevolg te zijn van het vermogen om uit deze stof het
pantotheenzuur op te bouwen.

Pas dit door de bacillen zelf gesynthetiseerde pantotheen-
zuur werkte dan als groeistof.

Niet alle bacteriën waren in staat tot deze synthese, evenals
niet alle gistrassen pantotheenzuur uit /S-alanine konden maken.
E. E. Snel, E. M. Strong en W. H. Peterson quot;) konden
bijvoorbeeld de onmogelijkheid hiertoe bij melkzuurbacteriën
aantonen.

Dat pantotheenzuur ook noodzakelijk is voor een goede
ontwikkeling van verschillende stammen van haemolytische
Streptococcen, bleek b.v. uit pubHcaties van Y. Subbarow
en L. Rane en van B. L. Hutchings en D. W. Woolley
welke artikelen in het jaar 1939 verschenen.

Naast de wetenschap dat verscheidene micro-organismen
in staat zijn om pantotheenzuur uit jß-alanine op te bouwen,
is het artikel van D. W. Woolley interessant, waarin hij
aantoont, dat een bepaalde stam (H. 69 D. van Lancefleld)
van haemolytische Streptococcen slechts reageert op het zure
gedeelte van pantotheenzuur. Dus deze stam is in staat om
uit a}'-dioxy-|Sjö'-dimethylboterzuur het pantotheenzuur te syn-
thetiseren.

Ook de noodzakelijkheid van biotine voor een aantal lagere
organismen is met zekerheid gebleken.

F.Kögl en N. Friesquot;) vonden reeds in 1937, dat biotine
ook als een groeifactor voor verschillende schimmels te be-
schouwen is. De parasiet Nematospora gossypü bleek voor
een goede groei in een synthetisch milieu als groeifactoren

quot;) E. E. Snell, F. M. Strong en W. H. Peterson. ]. Am. Chem.
Soc. 60, 2825 (1939).

quot;) Y. Subbarow en L. Rane. ]. Am. Chem. Soc. 60, 1616 (1939).

B. L. Hutchings en D. W. Woolley. Science 90, 41 (1939).
quot;) D.W. Woolley. ]. Biol. Chem. 130, 417 (1939).
quot;) F.Kögl en N.Fries. Z. Physiol. Chem. 249, 93 (1937).

meso-inosiet en biotine nodig te hebben. Terwijl toevoeging
van aneurine weinig effect had, waren de verhoudingen bij
enkele andere schimmels (Polyporus adustus, Polypoms abie-
tinus) juist omgekeerd. Deze laatste soorten hadden namelijk
aneurine nodig, terwijl toevoeging van biotine geen invloed had.

Aangetoond kon worden, dat het mycelium van P. adustus
na het groeien in een synthetisch milieu, biotine bevatte.
Daar nu verondersteld werd, dat de door de schimmels ge-
synthetiseerde groeifactoren ook voor een deel in de voedings-
bodem waren overgegaan, werden hierop Nematospora gos-
sypii en Polypoms adustus tezamen op één voedingsbodem
geënt. Door deze „kunstmatige symbiosequot; bleek het mogelijk
de schimmels ook zonder toevoeging van biotine of (en) aneurine
te doen groeien.

In dit verband is het de moeite waard te wijzen op een oud
experiment van A. Kosso wicz 5«) quot;), waarbij hij omstreeks
1903 ontdekte, dat gist in een synthetische voedingsbodem
wel groeide wanneer tevens ook bacteriën aanwezig waren.
Hoewel Kossowicz zijn proeven niet als een symbiose
wilde beschouwen, omdat ook dood mycelium de gistgroei
bleek te versnellen, was het verschijnsel in principe niets
anders dan de „kunstmatige symbiosequot; van Kögl en Fries.

De stimulerende werking van biotine op de groei van
Staphylococcus Pyogenes Aureus werd in 1938 door F. Kögl
en W. V. Wa g ten donk geconstateerd, terwijl L. E.
Hawker de groeiwerking op Melanospora destruens
aantoonde.

In 1939 werd door E. F. Möller zowel voor panto-
theenzuur als voor biotine, de werkzame invloed bij melk-
zuurbacteriën aangetoond, terwijl in hetzelfde jaar ook de

A. Kossowicz. Z. Landw. Versuchsw. Oesterr. 6, 27 (1903).
A. Kossowicz. Z. Landw. Versuchsw. Oesterr. 17, 688 (1906).
F.Kögl en W. v. Wag tend onk. Ree. trav. chim. 57, 747 (1938).
^nbsp;E. Hawker. Nature 142, 1038 (1938); Annals of Botany New

Series Vol III, 657 (1939).

quot;) E.F.Möller Z.f. Physiol. Chem. 260, 246 (1939).

activiteit van de laatste verbinding bij de groei van bact. radi-
cicola bleek squot;).

Ten slotte valt nog te wijzen op een publicatie, waarin
E.E.Snell en R. J.Williams®^) aantoonden, dat biotine
een groeifactor is voor de bacteriën, die de butanolgisting
veroorzaken.

Op het feit dat, zoals F. Kögl en A. J. Haagen Smit®®)
aantoonden, biotine ook een duidelijke invloed op de groei
van hogere planten bleek te bezitten, kan in deze samen-
vatting niet nader worden ingegaan.

De vraag doet zich nu voor of we, nadat de stimulerende
invloed van biosfactoren op verschillende lagere organismen
bewezen is, nog steeds aan het bios-principe slechts de groei
van gist moeten vastkoppelen, of dat we dit principe moeten
uitbreiden tot de groei van deze organismen in het algemeen.

C. Vitaminc'werking van paatotheenzuur en biotine.

Om van de vitamine-werking van de „biosfactorenquot; aneurine
en adermine te spreken, klinkt enigszins eigenaardig. Wanneer
wij de ontzaggelijke hoeveelheid literatuur beschouwen, die
de werking van deze stoffen als vitaminen beschrijft; wanneer
we dan verder bedenken, dat de ontdekking en isolering
geheel op deze werking berustte, is het duidelijk, dat men
beter kan spreken van vitaminen met een bioswerking.

Inmiddels tonen deze mogelijkheden wel het innig verband
aan, dat tussen beide klassen bestaat.

Men kan zich nu afvragen, of de twee belangrijkste bios-
factoren, het pantotheenzuur en het biotine, ook de een of
andere vitamine-werking uitoefenen.

Voor pantotheenzuur is dit inderdaad bewezen. T. H.} uke s

R. Nilsson en G. Bjälfve en D. Burström. Naturw. 27, 389
(1939).

E.E.Snellnbsp;en R.J.Williams. J. Am. Chem. Soc. 61, 3594 (1939).

F.Köglnbsp;en A. J. Haagen Smit. Z. f. Physiol. Chem. 243, 209 (1936).
T. H. Jukes. J. Am. Chem. Soc. 61, 975 (1939).

(

die van R. J. Williams een zeer actief pantotheenzuur-
preparaat kreeg, stelde in 1939 vast, dat deze verbinding
ook werkzaam was als „filtraatfactorquot; (kippen anti-dermatitis-
factor).

In hetzelfde nummer van de Journal of the Am. Chem. Soc.,
waarin Juk es zijn voorlopige mededehng hierover publiceerde,
verscheen een artikel van D. W. Woolley, H. A. Waisman
en C. A. Elvehem waaruit bleek, dat concentraten der
kippen anti-dermatitisfactor, na behandeling met alkali, hun
activiteit verloren. Hierna werd uit het reactiemengsel
alanine geïsoleerd. Daar ook alle andere eigenschappen van
de filtraatfactor met pantotheenzuur overeenstemmen, werd
ook in dit artikel de gevolgtrekking gemaakt, dat beide
identiek zijn.

Later werd door Jukes«®) bewezen, dat een kip in 100 g
voedsel ca. 1,4 mg pantotheenzuur nodig heeft.

Terwijl kippen als filtraatfactor beslist pantotheenzuur nodig
hebben en dus onder de omstandigheden van de anti-dermatitis-
test niet reageren op vrij ^-alanine, bleek uit een onderzoek
van M. Hofer en T. Reichstein««), dat bij ratten de
filtraatfactor volledig door /S-alanine vervangen kon worden.
Voor deze dieren is dus /9-alanine het essentiele deel van
het pantotheenzuurmolecule, daar zij op dezelfde manier op
pantotheenzuur als op |S-alanine reageren.

Is dus bij pantotheenzuur de vitamine-werking volkomen
bewezen te achten, bij biotine is men nog niet zo ver.

Wel werd dit ook bij deze verbinding zeer waarschijnlijk
gemaakt door een artikel dat in 1940 verscheen van Paul
György«^) en medewerkers, getiteld: „The possible identity
of vitamin H with biotin and coenzyme Rquot;.

D. W. Woolley, H. A. Waisman en C. A. Elvehem. T. Am
Chem. Soc. 61, 977 (1939).

quot;) T. H. Jukes. J. Biol. Chem. 129, 225 (1939).

quot;quot;) M. Hofer en T. Reichstein. Nature. 144, 72 (1939).

quot;) P- György, D. B. Melville. D. Burk en V. du Vianeaud
Science 91, 243 (1940).

De auteurs begonnen in deze publicatie erop te wijzen,
dat zij bij hun studie over de chemie van vitamine H, ge-
troffen werden door de overeenkomst in eigenschappen van
dit vitamine met die van biotine en coenzyme R, een groei-
factor voor Rhizobium.

Overigens was de gelijkheid in eigenschappen tussen biotine
en coenzyme R reeds aangeduid door P. M. W e s t en
P. W. Wilson die hun conclusies trokken, nadat zij de
groeieffecten van concentraten van beiden op Saccharomyces
cerevisiae en op Rhizobium trifolii vergeleken hadden.

R. Nilsson, G. Bjalfve en D. Burström kwamen
tot dezelfde conclusie door het effect te vergelijken, dat ge-
zuiverd biotine en concentraten van coenzyme R hadden
op Rhizobium.

De waarschijnlijkheid, dat de drie principes identiek zijn,
wordt door György en medewerkers naar voren gebracht,
door in de eerste plaats te wijzen op een onmiskenbare
paralelliteit in het voorkomen in de natuur.

Bovendien wezen de auteurs op het feit, dat in alle drie
de gevallen ongeveer dezelfde oplosbaarheid wordt waarge-
nomen, terwijl ook het gedrag bij neerslaan en adsorberen
op een identiteit wijst.

Ten slotte blijkt ook het gedrag tegenover verschillende
reagentia een zeer sterk argument voor de gelijkheid te zijn.

Hoewel het natuurlijk voor een „identiteitsbewijsquot; nood-
zakelijk is, dat alle drie de stoffen in de vorm van zuivere
kristallen verkregen zijn, hebben P. György en medewerkers
de gelijkheid toch wel zeer waarschijnlijk gemaakt.

P. M. West en P. W. Wilson. Science 89, 607 (1939).

HOOFDSTUK II.

DE CHEMIE VAN BIOTINE.

In totaal werden in het Organisch Chemisch Laboratorium
der Rijks Universiteit te Utrecht ongeveer 230 mg biotine-
methylester in de vorm van zuivere kristallen uit eigeel ge-
isoleerd. Hiervan werden door L. Pons voor analysen en
afbraakreacties 130 mg verbruikt. Van de door hem verkregen
resultaten kan men de volgende korte samenvatting geven.

De brutoformule van biotinemethylester bleek CnHigOgNgS
te zijn.

Uit methoxylbepalingen en titraties werd besloten tot de
aanwezigheid van één COOCHg-groep in het molecule. Door
verzeping van de methylester werd het vrije biotine verkregen,
een zuur, dat in prachtige naalden kristalliseerde, die bij 216° C
smolten.

Ook bij het vrije biotine werd door titratie het carboxyl-
gehalte bepaald. Deze laatste titratie stemde overeen met
de aanwezigheid van 1 COOH-groep en de brutoformule
QoHieOgNjS. Om het materiaal te sparen werd tot nu toe
afgezien van een directe elementairanalyse van het vrije
biotine, zodat de laatstgenoemde brutoformule nog niet recht-
streeks is bewezen.

Door verhitting van biotinemethylester met geconcentreerd
zoutzuur op 200° C werd een Cg-diaminozuur ¹) verkregen,
dat als pikrolonaat werd geïsoleerd en geanalyseerd. De bruto-
formule hiervan bleek C9H18O2N3S.2C10H8O5N, te zijn.

In tegenstelling tot het nagenoeg niet basische biotine, was
dit zuur, dat onder afsplitsing van een CO-rest was ontstaan,
in staat tot het binden van twee mol pikrolonzuur. Het derde
zuurstofatoom van biotine-ester bleek dus in een groepering
N-CO-N gebonden te zijn en deze atoomgroep moest deel
uitmaken van een ring, daar anders het molecule bij afsplit-
sen van de CO-groep in kleinere delen uiteengevallen zou zijn.

Men vindt inderdaad bij sommige pyrimidine-derivaten
dezelfde bestendigheid tegen zuur en loog als bij biotine. Zo
wordt a-methyltrimethyleenureum gesplitst in 1,3 diaminobu-
taan door met geconcentreerd zoutzuur op 200° C te ver-
hitten

Tenslotte bleek biotine geen dubbele bindingen te bevatten.
Nadat dus door L. Pons de aanwezigheid van een COOCH3-
groep, en van een N-CO-N-groep in een ring was bewezen,
was nu mijn taak allereerst uit te maken op welke manier
de zwavel in het molecule was gebonden.

Daar de stabiliteit en andere eigenschappen niet in over-
eenstemming te brengen zouden zijn met de aanwezigheid
van een thioaldehyde- of een thioketon-groep in het biotine-
molecule en omdat voor plaatsing van een thiozuur-, sulfon-
zuur-, sulfoxyde-, of sulfon-groep niet genoeg zuurstofatomen
in het molecule aanwezig zijn, komen voor binding van het
zwavelatoom slechts de volgende mogelijkheden in aanmerking:

a.nbsp;Meccaptaan-groep.

b.nbsp;Disulflde-groep. Hiertegen pleit reeds het grote mole-
culairgewicht, dat biotine zó geformuleerd zou moeten
hebben.

De brutoformule zou dan worden:
2 X CnHigOsN^S - 2H = Q^Hg^OeNA- Het mol.
gew. zou dan 514 zijn.

F. Kögl en B. Tonnis hadden echter reeds geprobeerd
het moleculairgewicht vast te stellen door bepaling van
de difFusie-coëfflcient volgens de methode van Bruins-

Went'^i) en hadden resultaten verkregen, die wezen
op een mol. gew. van ongeveer 200.

c. Sulfide-groep.

A. Oxydaties met kaliumpermanganaat.

Om nu tussen deze drie mogelijkheden te beslissen, leek
een oxydatie met kaliumpermanganaat de aangewezen weg
De drie typen zouden zich onder deze omstandigheden geheel
verschillend moeten gedragen.

a.nbsp;Een mercaptaan zou tot een sulfonzuur geoxydeerd
worden. Elk molecule zou dan 3 atomen zuurstof moeten
verbruiken bij deze oxydatie;

b.nbsp;Een disulflde-mohcnle zou 5 atomen zuurstof moeten
opnemen onder vorming van twee sulfonzuur-groepen.
Dit betekent dus voor het één S-atoom bevattende halve
molecule een opneming van 2% atomen zuurstof;

c.nbsp;Tenslotte zou een thioaether onder opneming van 2
zuurstofatomen in een sulfon moeten overgaan.

Allereerst was het natuurlijk noodzakelijk bij enige model-
proeven na te gaan, of deze methode voldoende nauwkeurig
was. om met enkele milligrammen stof uit te maken, op welke
manier de zwavel was gebonden.

Om dit te bereiken werden cysteïne-hydrochloride, cystine
en tetra-hydrothiopheen-a-carbonzuur ¹) geoxydeerd. Het bleek
inderdaad, dat deze drie verbindingen zich op de te ver-
wachten manier tegenover permanganaat verschillend ge-
droegen. Bovendien waren de titraties reeds met 2 mg stof
uit te voeren.

Hierna werd overgegaan tot de permanganaat-oxydatie van

1nbsp; De tetra-hydrothiopheen-derivaten zullen verder in dit proefschrift

(verg. voor nomenclatuur b.v. C. 1938

biotinemethylester zelf. Volgens de titratie nam 1 mol biotine-
ester 1,98 atoom zuurstof op. Hieruit was dus de conclusie
te trekken, dat de zwavel in het biotine in een C-S-C-groep
aanwezig moet zijn. Bovendien werd het door deze oxydatie
ontstane „biotinesulfonquot; ¹) uit het reactiemengsel geïsoleerd.
Het bleek een verbinding te zijn, die — niet omgekristalliseerd
— onder het smeltpuntsmicroscoop bij 265°—267° C smolt.

Om het materiaal te sparen moest ook hier voorlopig van
een zuivering door omkristalliseren en van een elementair-
analyse van het zuivere „biotinesulfonquot; worden afgezien.

B. Splitsingsprocvcn met j ood water stof♦

Toen eenmaal de functie van het zwavelatoom in het
biotinemolecule was vastgesteld, lag het voor de hand pogingen
te doen om de afbraakreacties zó te leiden, dat de koolstof-
zwavel-binding werd aangegrepen.

Naar aanleiding van uit de literatuur bekende proeven,
waarin S-methylverbindingen met joodwaterstof gesplitst wer-
den, leek een behandeling met HJ van biotine veel belovend.

A. Lacourtsplitste bij enkele S-methylverbindingen de
methylgroep af door te verhitten met joodwaterstof (d. 1,7)
op een temperatuur van 180°—190° C.

D. Baernsteinwerkte een micromethode uit voor
de bepaling der methylgroep in methionine met joodwaterstof.

Daar wij verwachten konden, dat bij biotine de koolstof-
zwavelbindingen moeilijker gesplitst zouden worden, dan bij
de toch altijd bijzondere methylgroep het geval was, werd
eerst met enkele modelverbindingen geprobeerd om gunstige
omstandigheden voor deze afbraak te vinden.

Hiervoor werden genomen cis-thiophaan aa'-dicarbonzuur

en lt;5-thiodivaleriaanzuur *). Wij hebben deze stoffen met HJ
(d. 1,96) gedurende twee uur op 180° C verhit en verkregen
onder ontwikkeling van zwavelwaterstof uit het thiophaan-
««'-dicarbonzuur adipinezuur. Uit (3-thiodivaleriaanzuur werd
^-joodvaleriaanzuur verkregen, dat als p-phenylphenacylester
werd geïsoleerd.

Ter controle hebben wij nog het gedrag van een ureum-
groepering in een ring onder deze omstandigheden nagegaan
Te dien einde verhitte ik a-methyltrimethyleenureum met HJ
en isoleerde een diamine in de vorm van een dipikraat. Dit
dipikraat bleek identiek te zijn met dat, wat verkregen was
na splitsing van het methyltrimethyleenureum met geconcen-
treerd zoutzuur.

Tenslotte ging ik over tot dezelfde afbraak van 4 8 mg
biotinemethylester. Uit het reactiemengsel werd als pikrolo-
naat een basische stof geïsoleerd, welk pikrolonaat door om-
kristalliseren werd gezuiverd. Uit analysen berekend, bleek
de brutoformule QHi^O.N.S . 2Q0H3O3N, te bedragen. Ook
wat betreft smeltpunt en ander gedrag was het pikrolonaat
identiek met dat, wat vroeger reeds was geïsoleerd na de
„zuursphtsingquot; van biotine. Hetzelfde Q-diaminozuur was dus
ontstaan.

Het was dus niet gelukt onder deze omstandigheden de
zwavel uit het biotinemolecule te splitsen. Daar was gebleken,
dat het zwavelatoom vaster was gebonden dan wij hadden
verwacht, werd hierna geprobeerd of niet door opvoeren
van de reactietemperatuur het doel bereikt kon worden. Eerst
werd 1,5 mg biotine-ester met joodwaterstof (d. 1 96) ge
durende twee uur op 210° C verhit. Wij konden 2,4 mg
pikrolonaat isoleren, dat zich geheel eender gedroeg als het
pikrolonaat van het gewone C^-diaminozuur.

Ten slotte hebben wij zowel temperatuur als tijd nog op-
gevoerd door 2,4 mg biotinemethylester gedurende vijf uur
met HJ (d. 1,96) op 250° C te verhitten. Nu bleek echter
het molecule reductief volkomen gesphtst te zijn; de stikstof
werd slechts als anorganisch ammoniumzout teruggevonden.

Als laatste proef met joodwaterstof werd biotinemethylester
met HJ en rode phosphor verhit. Daar er gevallen bekend
zijn, waarbij een dergelijke reactie ook tot reductie van de
carboxylgroep leidtquot;), heb ik bij de opwerking van dit
reactieproduct er rekening mee gehouden, dat een amine was
ontstaan. Helaas bleek noch de zwavel, noch de carboxyl-
groep door deze reductiemethode te zijn aangetast. Het ge-
wone Cg-diaminozuur had zich gevormd.

Dat de zwavel zich in het biotine zoveel stabieler tegen-
over joodwaterstof gedroeg, dan de modelproeven deden
verwachten, was natuurlijk zeer teleurstellend. De mogelijk-
heid bestond, dat de aminogroepen een ongunstige invloed
in deze richting uitoefenden.

Inderdaad zijn in de literatuur gevallen bekend, waaruit
blijkt dat aminogroepen een sterke invloed op het gedrag
van zwavel in sulfide-vorm kunnen uitoefenen

In dat geval zou het aanbeveling verdienen eerst deze
aminogroepen uit het molecule te verwijderen en daarna pas
een HJ-reductie uit te voeren.

Nu had L. Pons¹) indertijd door een proef reeds een
mogelijkheid tot dit verwijderen der aminogroepen gegeven.
Hij toonde aan, dat het Cg-diaminozuur onder de gewone
omstandigheden der Van S1 ij k e - bepaling met natriumnitriet
in azijnzuur milieu 2 mol stikstof geeft, dus dat de beide
aminogroepen primair zijn.

Het leek ons nu de juiste weg, eerst met natriumnitriet de
beide aminogroepen uit het Cg-diaminozuur te verwijderen en

1nbsp; nog te publiceren.

dan op het dioxycarbonzuur. dat hierdoor zou moeten ont-
staan, HJ te laten inwerken. Dit experiment is uitgevoerd,
maar wij hebben geen vetzuur kunnen isoleren, hoewel uit
het ontstaan van zwavelwaterstof gebleken was, dat de koolstof-
zwavelbindingen door deze bewerking waren aangetast.

Natuurlijk is bij deze microproefjes altijd een bezwaar, dat
het niet kunnen isoleren van een verwacht reactieproduct te
wijten kan zijn aan het te geringe aantal milligrammen waarvan
wordt uitgegaan. Materiaal om deze proef met een grotere
hoeveelheid nog eens te herhalen was echter niet aanwezig.

C. Inwerking van KOH-oplossing op sulfoncn.

Ook de tweede weg, die we gevolgd hebben in onze
pogmgen om de binding tussen de koolstof en de zwavel te
verbreken, was gebaseerd op experimenten met modelstoffen.

Het was namelijk gebleken, dat, wanneer het sulfon, het-
welk ontstond door permanganaat-oxydatie van thiophaan-
a-carbonzuur, verwarmd werd met een geconcentreerde op-
lossing van KOH op 200° C, de zwavel als zwaveldioxyde
vrijwel kwantitatief uit het molecule werd gesplitst.

Dit laatste werd bewezen door het SO^ met broomwater
te oxyderen en het ontstane zwavelzuur als bariumsulfaat te
bepalen. Over deze reactie hebben we niets in de literatuur
kunnen vinden, maar het leek al bij voorbaat zeer waar-
schijnlijk, dat onder dergelijke omstandigheden een hydro-
lytische splitsing zou optreden.

Om enige aanwijzingen te krijgen over het gedrag der
ureumgroepering in biotine, werd ook trimethyleenureum met
loog verwarmd. Het bleek, dat in dit geval de KOH-splitsing
geheel analoog liep met de gewone splitsing met zoutzuur,
daar het ontstane vluchtige amine in een zeer goede op-
brengst als dipikraat werd geïsoleerd.

Na deze voorbereidingen werd begonnen met de oxydatie
van 10 mg biotinemethylester en de verhitting van het ont-
stane biotinesulfon met KOH-oplossing. Om deze laatste trap

uit te voeren, was het natuurlijk niet nodig het biotinesulfon
te zuiveren door het te scheiden van de anorganische zouten;
het gehele mengsel werd met de sterke loogoplossing verwarmd.

Ook bij deze proef ontstond zwaveldioxyde, maar wat
minder gunstig was, was het feit, dat de stikstof van het
biotinemolecule zich geheel anders gedroeg, dan we verwacht
hadden op grond van het uitgevoerde modelproefje met
trimethyleenureum. We toonden namelijk ammoniak in het
reactiemengsel aan. Wel konden we een in aether oplosbare
organische stof afzonderen, die enigszins de geur had van
een oxyzuur en wel gelukte het ons hiervan een p-phenyl-
phenacylester te maken, maar de afbraak had in ieder geval
zijn overzichtelijkheid verloren, die hij ongetwijfeld gehad
zou hebben, wanneer die complicatie met de aminogroepen
niet was opgetreden.

De geïsoleerde p-phenylphenacylester bleek geen zwavel
en geen stikstof te bevatten. Bovendien werd een CH-ana-
lyse op de ester uitgevoerd. De hiervoor beschikbare hoeveel-
heid was echter te gering om volkomen betrouwbare waarden
te leveren, opdat uit de getallen een brutoformule zou kunnen
worden afgeleid. Hiertoe zou deze proef met meer materiaal
herhaald moeten worden, waarover ik echter niet de be-
schikking had.

D. Mcthylering cn afbraak volgens A. W. Hofmann.

Na bovenstaande splitsing met geconcentreerde loog hebben
wij geprobeerd het biotinemolecule eenvoudiger te maken door
middel van een methylering en afbraak volgens A.W. Hofmann.

Daar verschillende gevallen bekend zijn, dat methyljodide
aan sulfiden wordt geaddeerd onder vorming van een sul-
foniumjodide,leek het wenselijk allereerst deze stof op

quot;) A. van Oefele. Ann. 132, 82 (1864).

H. Klinger en A. Maassen. Ann. 243, 193 (1888).

quot;) D. Strömholm. Ber. 33, 823 (1900).

]. V. Braun, W, Teuffert en K. Weiszbach. Ann. 472, 121
(1929).

biotinemethylester te laten inwerken. Inderdaad trad hierbij
een gewichtsvermeerdering op, die overeenkwam met die,
welke plaats zou moeten hebben bij additie van 1 mol CHgJ.'

Na een poging om met zilveroxyde het overeenkomstige
hydroxyde te maken en na verhitting van het ontstane reactie-
product in vacuo op 150° C, bleek de stof die door deze
bewerking was ontstaan, in een testproefje dezelfde activiteit
te hebben op de groei van onze gist als biotine, zodat de
gevolgtrekking voor de hand lag, dat het sulfoniumhydroxyde
bij verhitting methanol had afgesplitst.

Om zekerheid te hebben, dat werkelijk het jodide in het
hydroxyde was omgezet, leek het ons gewenst deze reactie
nog eens zodanig uit te voeren, dat eerst het jodide met
behulp van zilverchloride in het sulfoniumc/z/oricfe zou worden
veranderd; hierna zou dan pas de inwerking van het zilver-
oxyde moeten volgen. Zo ver kwam het echter niet. Het
bleek namelijk, dat de stof, die volgens dit schema het sul-
foniumchloride zou moeten zijn, physiologisch dezelfde activi-
teit had als biotine en daar bovendien het gewicht van deze
fractie klopte met dat van de oorspronkelijke hoeveelheid
biotine, kon hieruit worden besloten, dat het chloride reeds
bij kamertemperatuur CH3CI afgesphtst had om weer het
oude sulfide te leveren.

Inderdaad zijn in de literatuur gevallen bekend, waaruit
blijkt, dat sulfoniumchloriden minder stabiel zijn dan de over-
eenkomstige jodiden

Dat in ons geval van het sulfoniumhydroxyde methanol
werd afgesplitst, is op zich zelf in het geheel niet verwon-
derlijk, want dat deze ongewenste reactie bij het verhitten
plaats kan vinden, blijkt o.a. uit publicaties van J. v. Braun ^o)
en van C. K. In gold met hun medewerkers. Zij verhitten
verschillende sulfoniumhydroxyden en vonden dat steeds een

H. Blätter. Monatsh. 40, 417 (1919).

C.K.Ingold, J.A.Jessop, K. I. Kur iy an en A. M. M. Man d ou r
). Chem. Soc. 533, (1933).

zeker gedeelte oorspronkelijk sulfide terug ontstond door af-
splitsen van methanol. Een ander percentage ontleedde dan
op de gewenste manier onder ontstaan van een olefine.

Deze beide mogelijkheden van splitsing treden natuurlijk
ook op bij de overeenkomstige ammoniumhydroxyden

Welke de verdeling is tussen de beide mogelijkheden, hangt
af van de structuur van het molecule. In zeer eenvoudige
gevallen heeft men gemeend een zekere regelmaat te kunnen
onderkennen, maar de grondslag is nog te wankel, om, bij
de afbraak van een tamelijk ingewikkelde stof als biotine,
van te voren reeds voorspellingen te doen.

Nadat we dan bij onze afbraakpogingen reeds twee maal
het oorspronkelijke uitgangsmateriaal terug hadden gekregen,
besloten we eerst een zoutzuursplitsing op het biotine uit te
voeren en hierna het ontstane Cg-diaminozuur volledig te
methyleren. Voor deze laatste bewerking leek ons in dit ge-
val hoopgevend om de methode, die T. Purdie^^) voor het
methyleren van suikers had uitgewerkt, hier toe te passen.

Om de geschiktheid van deze manier van methyleren voor
ons Cg-diaminozuur na te gaan, heb ik eerst ornithine ge-
methyleerd met zilveroxyde en methyljodide. Het auraat dat
ik uit het reactiemengsel kon isoleren, bleek identiek met het
auraat, dat ik na methyleren volgens R. v. Engeland®®)
verkreeg.

Na dit voorproefje werd dan overgegaan tot het methy-
leren van ons Cg-diaminozuur en, na omzetting van het hierbij
ontstaan jodide in het hydroxyde via het chloride, heb ik na
droogdampen van de oplossing het reactiemengsel gedurende
15 minuten op 150° C verhit in vacuum. Het gelukte hierna
uit het verhittingsproduct een auraat te isoleren, waarvan
de analysen zeer goed klopten met de formule CipHgeN^SAugClg.

Hieruit bleek dus, dat bij de verhitting de reactie, tenminste

J.V.Braun. Ann. 382, 1 (1911); 386, 273 (1912).
T.Purdie en J.C.Irvine. J. Chem. Soc. 83, 1021 (1903).
D. Ackermann. Z.f. Biologie 59, 433 (1913).

m hoofdzaak, het ongewenste verloop had genomen, daar

zowel de zwavel als de beide stikstofatomen nog in het product

aanwezig waren. Dat echter toch bij deze proef een tamelijk

diep ingrijpende verandering had plaats gevonden, bleek wel

uit het feit, dat de carboxylgroep uit het molecule was ver-
dwenen.

Jammer genoeg is op het ogenblik onze kennis van de
biotinestructuur nog onvoldoende om een goede verklaring
van dit verdwijnen te kunnen geven.

E. Verhitting van biotinesulfon met zoutzuur.

Tenslotte hebben wij een poging gedaan om in biotine-
sulfon de bindingen tussen de koolstof en de zwavel te ver-
breken door middel van verwarming met zoutzuur. Hoewel
uit een modelproefje, dat we eerst uitvoerden, was gebleken
dat het sulfon. hetwelk ontstond door oxydatie van ^-thio-
divaleriaanzuur, tegen deze inwerking bestand was, bestond
toch de mogelijkheid, dat de bindingen in het biotinemolecule
zich minder hardnekkig zouden gedragen.

Als „voorproefjequot; werden hiertoe eerst 3,1 mg genomen van
een door permanganaatoxydatie van biotinemethylester ver-
kregen biotinesulfon. Na de verhitting van dit product met
^utzuur, werd uit het reactiemengsel een pikrolonaat geïsoleerd.
Dit pikrolonaat, dat zwavel bleek te bevatten, gedroeg zich
zowel wat oplosbaarheid als wat smeltpunt betrof, geheel
anders dan het pikrolonaat van het C,-diaminozuur.

Daar niet was aan te nemen, dat alleen een vervangina
van een sulfide- door een sulfon-groep een zo grote ver-
andering in eigenschappen te weeg zou brengen, leek het
er inderdaad op, dat een splitsing was opgetreden, waardoor
een sulfonzuur zou moeten zijn ontstaan. De rest van het
geïsoleerde pikrolonaat hebben wij gebruikt voor de uitvoering
van een kwantitatieve N-analyse en het bleek, dat de waarde

rlnbsp;prachtig klopte met de formule:

QH^oO^N.S. 2 QoHsO.N,.

Er zou dan een diamino-sulfonzuur-carbonzuur zijn ontstaan,
dat hetzelfde aantal C-atomen bevatte als het Cg-diaminozuur.

Uit het feit, dat het aantal C-atomen niet was verminderd,
zou dan de conclusie kunnen worden getrokken, dat de zwavel
in het biotine in sulfldevorm deel uitmaakt van een ring,
want anders moest bij splitsing van een binding tussen de
koolstof en de zwavel het molecule uiteen zijn gevallen in
twee kleinere stukken.

Het spreekt vanzelf, dat zulk een vergaande gevolgtrekking
niet geoorloofd is alleen op grond van een enkele stikstof-
analyse. Daarom werd ter controle deze proef nog eens
herhaald, zij het in een iets andere vorm. Door oxydatie van
biotinemethylester werden 13,7 mg biotinesulfon verkregen
en deze werden gesplitst door met geconcentreerd zoutzuur
op 200° C te verhitten. Na droogdampen van het reactie-
mengsel verkreeg ik een mooi gekristalliseerde rest met een
gewicht van 16,7 mg.

Hiervan heb ik 13,5 mg genomen voor het maken van een
derivaat, waarbij werd afgezien van het oorspronkelijk plan
om weer een pikrolonaat te maken, daar juist enkele maanden
geleden een publicatie was verschenen over de geringe oplos-
baarheid en het goede kristallisatievermogen van dilituraten
Dit zijn zouten, die organische basen met dilituurzuur (5-nitro-
barbituurzuur) vormen.

Het bleek inderdaad mogelijk een mooi dilituraat te isoleren,
dat door één maal omkristalliseren gezuiverd werd. Het ge-
drag bleek hierna niet veranderd. Tenslotte verkreeg ik
7,5 mg zuiver product, dat zwavel bevatte. Uit een CH-
en een N-analyse kon als brutoformule afgeleid worden:
C^H^oO^NaS. 2 C^HsO^Ng.

De uit deze formule berekende percentages klopten goed
met de gevonden waarden, hoewel het haast vanzelf spreekt,
dat aan micro-analysen met materiaal uitgevoerd, dat in zo
kleine hoeveelheden moest worden gezuiverd, niet dezelfde

C. E. Redemann en C. Niemann. J. Am. Chem. Soc. 62, 590 (1940).

eisen te stellen zijn, als wanneer een ongelimiteerde hoeveelheid
materiaal ter beschikking staat.

Om te zien of de aanwezigheid van een sulfonzuurgroep zich
ook zou uiten in een „zuurderquot; zijn van het molecule, ver-
geleken met het Q-diaminozuur. hebben we nog enkele
milligrammen opgeofferd aan een potentiometrische titratie
met verdunde loog *).

Allereerst werd een titratie van ornithine-dihyrochloride
uitgevoerd en daarna van het dihydrochloride van het ge-
wone Q-diaminozuur. Daar van beide verbindingen vast
staat, dat het diaminomonocarbonzuren zijn, was te verwachten,
dat het verloop van de titratielijnen identiek zou zijn. Inder-
daad bleek dit het geval.

Bij beide titraties had een sterke stijging van de P^ met
de toegevoegde loog plaats, nadat reeds 1 aequivalent was
toegevoegd. Uit de titratie van het „zuursplitsingsproductquot;
van biotinesulfon bleek, dat de sterke stijging van de
met de toegevoegde loog eerst plaats had, nadat reeds 2 aequi-
valenten loog waren toegevoegd.

Dus ook de titratie wees duidelijk op het aanwezig zijn
van een zure groep méér in de verbinding, vergeleken met
de eerst getitreerde stoffen. Hiervoor komt slechts de sulfon-
zuurgroep in aanmerking. Daar de titraties niet met analyse-
zuivere producten waren uitgevoerd, kan men aan de kwan-
titatieve uitkomsten niet al te hoge eisen stellen, maar het
verschil tussen beide ..zuursplitsingsproductenquot; was zó duidelijk,
dat men hieruit, gecombineerd met de analysen van het pikro-
lonaat en het diluturaat, de gevolgtrekking kan maken, dat
het product, dat ontstond na de zuursplitsing van biotinesulfon,
een diamino-sulfonzuur-carbonzuur was. Uit het feit dat hierin
nog alle 9 C-atomen aanwezig waren, kon besloten worden
tot een zwavelhoudende ring in biotine.

Hoe nuttig deze laatste wetenschap ook kan zijn voor de

keuze van mogelijke volgende afbraken, het was ons natuur-
lijk toch liever geweest, wanneer de zwavel in het biotine-
molecule als sulfide in een keten zijn plaats gevonden had.
Bij het uitvoeren van bovenstaande splitsing waren we in
dat geval enkele C-atomen kwijt geraakt en hadden we een-
voudiger producten kunnen isoleren, die mogelijk reeds be-
kende verbindingen zouden blijken te zijn, of die gesynthe-
tiseerd zouden kunnen worden.

HOOFDSTUK III

EXPERIMENTEEL GEDEELTE.

A. Oxydaties met kaliumpermanganaat.

De oxydaties werden uitgevoerd bij kamertemperatuur met
een 0,02 molaire oplossing van kaliumpermanganaat, die
5,6 g soda per liter bevatte.

1. Oxydatie van cysteine-hydrochloride.

2,065 mg cysteïnehydrochloride werden in 5 cm« water
opgelost en uit een microburet werd de 0,02 molaire per-
manganaatoplossing bijgedruppeld. Steeds, na toevoegen van
een druppel, schudde ik om tot de paarse kleur verdwenen
was. Dit was telkens in enkele seconden het geval, totdat in
totaal 1,29 cm® was toegevoegd.

Toen bleef de zwakke paarse tint langer dan 15 minuten.

Deze oxydatie was dus als een zeer scherpe titratie uit te
voeren.

1,29 cm« van de oplossing komt overeen met het opnemen
van 2,95 atomen zuurstof, terwijl theoretisch voor een oxy-
datie tot sulfonzuur 3 atomen zuurstof nodig zouden zijn.

2. Oxydatie van cystine.

2,039 mg werden onder verwarmen opgelost in ca 10 cm»
water. Na afkoelen werd de titratie met kaliumpermanganaat
op dezelfde manier als boven uitgevoerd. Ook hier was
weer scherp te titreren. De oplossing bleef een paarse tint
behouden, nadat in totaal 1,61 cm» van de 0,02 molaire
permanganaatoplossing was toegevoegd.

Dit komt, berekend voor het gehele, twee zwavelatomen
bevattende molecule, overeen met een opneming van 4,92 atomen
zuurstof. Voor het halve cystine-molecule zou dit dus betekenen,
dat 2,46 atomen zuurstof waren opgenomen. Wanneer 1 molecule
cystine geoxydeerd zou zijn tot twee moleculen cysteïnezuur,
zouden hiervoor theoretisch 5 atomen zuurstof nodig zijn.

3.nbsp;Oxydatie van thiophaan-a~carbonzuur.

Een oplossing van 12,5 mg thiophaan-a-carbonzuur in water
werd op dezelfde manier getitreerd. Nu moesten 6,40 cm® worden
toegevoegd om een blijvende paarse tint te verkrijgen. Dit
komt overeen met een opneming van 2,04 atomen zuurstof
per molecule thiophaan-a-carbonzuur, terwijl voor een oxydatie
tot het overeenkomstige sulfon theoretisch 2 atomen nodig
zouden zijn.

4.nbsp;Oxydatie van biotinemethylester.

2,735 mg werden in waterige oplossing met de 0,02 molaire
permanganaatoplossing getitreerd op dezelfde manier als reeds
bij bovenstaande modelproefjes werd beschreven. Ook hier
kon ik de titratie zeer scherp uitvoeren. Om een blijvende
paarse kleur te krijgen moest in totaal 0,70 cm® worden toe-
gevoegd. Dit komt overeen met een opneming van 1,98 atomen
zuurstof¹) per molecule biotinemethylester, terwijl theoretisch
voor een oxydatie van sulfide tot sulfon 2 atomen zuurstof
nodig zouden zijn.

De opwerking van het reactiemengsel voerde ik als volgt uit.

De zeer zwak paars getinte oplossing werd met enkele
druppels methanol enige minuten op een kokend waterbad
gezet. Hierdoor verdween de kleur. Na afkoelen en een
nacht staan bij kamertemperatuur filtreerde ik het bruinsteen,
dat prachtig was uitgevlokt af en waste zorgvuldig met water uit.

1nbsp; Later heb ik, als onderdeel van reacties die verderop in dit experimenteel
gedeelte beschreven worden, deze oxydatie nog enige malen uitgevoerd. Toen
vond ik een opneming van 2,02; resp. 2,03 atomen zuurstof per molecule
biotinemethylester.

Na het kleurloze, volkomen heldere fikraat met enkele
druppels verdund zoutzuur zuur op kongo gemaakt te
hebben, heb ik de oplossing in een vacuumexsiccator voor-
zichtig drooggedampt boven phosphorpentoxyde en KOH. De
droogrest was prachtig wit gekleurd. Tussen de anorganische
zoutkristallen waren reeds duidelijk witte naalden te zien.

Na toevoegen van 1 cm® water en voorzichtig omschudden,
losten de anorganische zouten op, terwijl slechts mooi los-
zwevende naalden onopgelost bleven. Met een zeer fijn pipetje
heb ik hierna de oplossing tussen de naalden weggezogen.
Op dezelfde manier werd twee maal met 0,5 cm® water
nagewassen.

Na drogen bleek de rest te bestaan uit mooie witte dunne
naalden. Een smeltpuntsbepaling onder het smeltpuntsmicros-
coop had tot resultaat: 265°—267° C ¹). (Eerst boven 240° C
begon de stof zich een weinig bruinachtig te kleuren; bij het
smelten kon ik geen gasontwikkeling waarnemen.)

B. Splitsingsproeven met joodwaterstof.

1. Inwerking van HJ (d. 1,96) op d-thiodivaleriaanzuur
bij 175°^18(P C.

67 mg ^-thiodivaleriaanzuur werden met 2 cm® zuiver HJ
(d. 1,96) gedurende twee uur in een schietkast verhit op
175°—180° C. Na afkoelen werd de buis geopend, waarbij
geen overdruk te constateren viel. Ik kon een sterke geur
van zwavelwaterstof waarnemen, terwijl een vochtig lood-
acetaatpapiertje in de damp direct werd zwart gekleurd,
waarbij ook duidelijk de metaalglans van loodsulfide was
waar te nemen. Het reactiemengsel werd met behulp van
ca. 15 cm® water in een scheitrechtertje overgebracht en
hierna vier maal met 15 cm® aether uitgeschud. Na de aether-
fractie twee keer met bicarbonaatoplossing geschud te hebben,

werd de lichtbruin gekleurde bicarbonaatfractie met behulp
van zoutzuur zuur op kongo gemaakt.

Hierna werd een gelijk volume aether toegevoegd en enkele
druppels SOg-water, waardoor de bruine tint verdween en
het mengsel volkomen kleurloos werd. Na nogmaals vier
maal met aether te hebben uitgeschud, heb ik deze aether-
fractie eerst gedroogd met natriumsulfaat, waarbij weer een
lichte geelkleuring optrad. Na alBltreren van het natrium-
sulfaat heb ik de aetheroplossing tot bijna droog ingedampt.
De rest werd geneutraliseerd op lakmoes met 2,5 cm®
0,1 N. NaOH-oplossing. Bij de ca. 4 cm® oplossing voegde
ik 8 cm® alcohol en 60 mg p-phenylphenacylbromide.
Op de gewone manier werd een p-phenylphenacylester
gemaakt

Opbrengst: 54 mg van een slechts zeer weinig lichtbruin
gekleurd product. Smeltpunt 99°—100° C.

Mengsmeltpunt met de p-phenylphenacylester van (5-jood-
valeriaanzuur 99°-100° C.

Om dit mengsmeltpunt te kunnen bepalen moest eerst de
overeenkomstige ester van ó-joodvaleriaanzuur gemaakt
Worden.

2. p-phenylphenacylester van è-joodvaleriaanzuur.

41 mg ó.joodvaleriaanzuur werden met 2.0 cm® 0,1 N. NaOH-
oplossing geneutraliseerd op lakmoes. Hierna werden 4 cm®
alcohol en 48 mg p-phenylphenacylbromide toegevoegd en
veresterd.

Opbrengst (zonder opwerking van de moederloog) 45 mg
met een smeltpunt 101°—102° C. Witte wollige naaldjes.
De verbinding bevatte jodium.

Het bleek dus, dat een HJ-behandeling van ó-thiodivaleriaan-
zuur tot ó-joodvaleriaanzuur leidde. Ter controle heb ik ook

nog het (5-joodvaleriaanzuur met HJ op dezelfde manier in
de schietkast verhit. Het bleek mogelijk een groot gedeelte
van de verbinding als p-phenylphenacylester uit het reactie-
mengsel terug te winnen.

3. Inwerking van HJ op cis-thiophaandicarbonzuur bij
175°^I8(P C.

113 mg cis-thiophaan-aa'-dicarbonzuur (Sp 141°—143° Q
werden met 2 cm» HJ (d. 1,96) in een schietkast gedurende
twee uur verwarmd op 175°-180° C. Na afkoelen werd de
buis geopend, waarbij een sterke geur van zwavelwaterstof
viel waar te nemen, terwijl een vochtig loodacetaatpapiertje
in de damp oogenblikkelijk een zwarte metaalglans aannam

Met behulp van wat water heb ik de gehele buisinhoud
in een erlenmeyertje overgebracht en alles op een waterbad
drooggedampt onder wegzuigen van de damp; hierna nog
twee maal wat water toegevoegd en op dezelfde manier
drooggedampt. Door deze bewerking was het gelukt om
practisch alle jodium te verwijderen. Dikke naalden bleven
achter, die in ongeveer 5 cm» water onder verwarmen werden
opgelost. Na een weinig zeer donker gekleurd onopgelost
materiaal afgefiltreerd te hebben, werd de vrijwel kleurloze
heldere oplossing drooggedampt.

Op deze manier werden 74 mg witte kristallen verkregen.
Smeltpunt: 150°-151° C.

Mengsmeltpunt met adipinezuur: 150°—152° C. Theoretisch
zou uit 113 mg thiophaandicarbonzuur 83 mg adipinezuur
moeten ontstaan. Geïsoleerd: 74 mg; dat is 90 % der
theorie.

4. Inwerking van HJ op a~methyltrimethyleenureum bij
175°^180° C.

17 mg a-methyltrimethyleenureum werden met 1 cm» zuiver
HJ jd. 1,96) in een schietkast gedurende twee uur op 175°—
180° C verhit. Na afkoelen werd de buis geopend en het
reactiemengsel met wat water in een erlenmeyertje over-

gebracht. Na op een waterbad onder wegzuigen van de
damp drooggedampt te hebben, voegde ik twee maal een
weinig water toe en dampte op dezelfde manier droog om
alle jodium te verwijderen. Het residu werd opgelost en, na
van een spoortje onopgelost materiaal afgefiltreerd te hebben,
voegde ik een waterige oplossing van pikrinezuur toe, waar-
door een neerslag ontstond van een blijkbaar zeer weinig op-
losbaar pikraat.

Ten slotte werden 37 mg geïsoleerd. Smeltpunt 246°—248° C,
onder opschuimen en zeer donker worden. Ik deed geen poging
om nog een tweede hoeveelheid uit de moederloog te ver-
krijgen.

Ter controle of dit pikraat werkelijk het dipikraat was van
1,3-diaminobutaan, heb ik deze stof eerst als volgt bereid:

7 mg a-methyltrimethyleenureum werden met 1 cm® ge-
concentreerd zoutzuur in een schietkast gedurende een half
uur op 200° C verhit. Na afkoelen heb ik de buis geopend
en de inhoud met behulp van een weinig water in een er-
lenmeyertje overgebracht; daarna de oplossing in een vacuum-
exsiccator boven P^Oe en KOH goed drooggedampt. De rest
werd opgelost in een weinig water, de oplossing van een
spoortje onopgelost materiaal afgefiltreerd en hierna op de
gewone manier een pikraat gemaakt.

Dit had een smeltpunt van 245°—248° C onder opschuimen
en zeer donker worden.

Bij het bepalen van een mengsmeltpunt van beide pi-
kraten vond ik niet de geringste depressie. Ook het mengsel
smolt bij 245°—248° C onder opschuimen en zeer donker
worden.

5. Inwerking van HJ op biotinemethylester bij 175°^180° C.

4,8 mg biotinemethylester werden met 1 cm® zuiver HJ
(d. 1,96) in een toegesmolten buis in de schietkast gedurende
twee uur op 175°—180° C verhit. Na afkoelen werd de
buis geopend en practisch geen overdruk geconstateerd. Een
vochtig loodacetaatpapiertje in de damp kleurde zich slechts

zeer langzaam een weinig donker, waarbij geen metaalglans
van loodsulfide viel waar te nemen.

Met behulp van wat water bracht ik de buisinhoud over
in een erlenmeyertje en dampte droog door verwarmen op
een kokend waterbad, terwijl de damp werd weggezogen.
Bij de droogrest werd 1 cm® water gevoegd en nog eens
op dezelfde manier drooggedampt om op deze manier de.
overmaat jodium te verwijderen. Ik hield na goed drogen in
een vacuumexsiccator 8,5 mg over van een slechts iets licht-
geel gekleurde olie, die volledig in grote naalden kristalliseerde.

Deze rest werd in wat water opgelost en de oplossing ge-
filtreerd om een weinig onopgelost materiaal te verwijderen.
Teneinde een mogelijk nog aanwezig spoortje jodium kwijt
te raken, heb ik nog eens drooggedampt en goed gedroogd
in een vacuumexsiccator boven PsOg en KOH. Het gewicht
van de gedroogde rest bedroeg nu 8,3 mg. Deze werden in
ongeveer 0,5 cm® water opgelost en bij deze oplossing werd
een verzadigde waterige pikrolonzuuroplossing gevoegd. Er
ontstond een dik lichtgeel neerslag („Morgensternequot;).

Na afBltreren, uitwassen en drogen bleek het gewicht 11
mg te zijn. Een smeltpuntsbepaling onder het microscoop
gaf het volgende resultaat.

Vanaf 160° C begonnen witte vlekjes om de gele kristal-
deeltjes op te treden, die bij ongeveer 170° C duidelijker
werden. Smeltpunt: 187°-189° C onder bruin worden. Toen
waren de grootste deeltjes nog niet gesmolten; dit was eerst
bij ca 200° C het geval.

Het pikrolonaat werd omgekristalliseerd uit pikrolonzuur-
houdend water. Het bleek zeer moeilijk oplosbaar te zijn.
Weer ontstonden „Morgensternequot;. Het neerslag leek onder
het microscoop volkomen homogeen. Na afflltreren, uitwassen
en drogen bleek het gewicht 8,3 mg te bedragen. Een micro-
smeltpuntsbepaling had hetzelfde resultaat als vóór het om-
kristalliseren. Wéér smolten de kleinste deeltjes bij 187°— 189° C.
Bij ongeveer 200° C was weer alles gesmolten, of juister:
ontleed onder zeer donker worden.

De analysen leverden de volgende waarden: ¹)

CH-analyse:

3,115 mg stof; 5,32 mg CO2 en 1,27 mg HjO.

N-analyse:

2,202 mg stof: 0,352 cm' Nj bij 22° C en 767 mm.

S-analyse:

1,893 mg stof; 0,60 mg BaS04.

Berekend voor C9H18O2N2S . 2 C10H8O5N4:

C 46,62 0/0; H 4,590/0; N 18,770/0; S 4,30 0/0.

Gevonden: C 46,58 o/o; H 4,56 0/0; N 18,67 0/0; S 4,35 0/0.

6. Inwerking van HJ op biotinemethylester bij 21(P C.

1,5 mg biotinemethylester werd met 1 cm® zuiver HJ (d.1,96)
in een schietkast gedurende twee uur op 208°—210° C ver-
warmd. Na afkoelen werd de buis geopend, waarbij vrijwel
geen overdruk geconstateerd werd. Een vochtig loodacetaat-
papiertje in de damp gehouden, kleurde zich slechts zeer
langzaam een weinig donker, waarbij geen metaalglans van
loodsulfide te zien was.

Met water werd de buisinhoud in een erlenmeyertje over-
gebracht. Na het reactiemengsel op een kokend waterbad
onder wegzuigen van de damp drooggedampt te hebben,
loste ik de droogrest weer in water op en dampte op dezelfde
manier nogmaals droog om de overmaat jodium te verwijderen.
Hierna werd het residu weer in wat water opgelost en af-
gefiltreerd van een spoortje onopgelost materiaal. Tenslotte
heb ik nog een keer drooggedampt om er zeker van te zijn,
dat het laatste restje jodium verwijderd was.

Na goed drogen bleek het gewicht van deze droogrest 3,5 mg
te zijn. Wéér maakte ik op de gewone manier een pikrolonaat;
wéér bestond dit pikrolonaat uit „Morgensternequot;, die ook

1nbsp; Voor de meer dan gewone zorg, waarmee de Heer Hubers te Amsterdam
de analysen van al mijn kostbare afbraakproducten uitvoerde, betuig ik
hem, ook op deze plaats mijn dank. Het is duidelijk dat deze analysen, daar
vrijwel nooit voldoende materiaal voor herhaling aanwezig was, steeds een
belangrijk slot van iedere afbraak vormden.

onder het smeltpuntsmicroscoop hetzelfde gedrag vertoonden
als het pikrolonaat van het Cg-diaminozuur.

Opbrengst aan pikrolonaat: 2,4 mg.

7. Inwerking van HJ op biotinemethylester bij 250° C.

2,4 mg biotinemethylester werden met 1 cm® zuiver HJ (d.1,96)
5 uur lang in een schietkast op 247°—255° C verhit. Na
afkoelen werd de buis geopend; er bleek slechts weinig over-
druk te zijn. Ik kon een duidelijke geur van zwavelwaterstof
waarnemen, terwijl een vochtig loodacetaatpapiertje in de
damp ogenblikkelijk bruinzwart werd, waarbij ook een metaal-
glans optrad.

Na de buisinhoud met behulp van wat water in een erlen-
meyertje te hebben overgebracht, werd op een kokend waterbad
drooggedampt onder gelijktijdig wegzuigen van de damp. Om
de overmaat jodium te verwijderen, werd de droogrest nog
eens in water opgelost en de oplossing nog eens op dezelfde
manier drooggedampt.

Na zorgvuldig in een vacuumexsiccator te hebben gedroogd,
bleek het gewicht der rest 4,9 mg te bedragen (vrijwel kleur-
loos en goed gekristalliseerd).

Door uitvoeren van een microproefje werd geconstateerd,
dat met een druppel waterige pikrolonzuuroplossing geen
neerslag ontstond, hetgeen zeker het geval zou moeten zijn,
wanneer het gewone Cg-diaminozuur het reactieproduct was
geweest.

Hierna heb ik de gehele oplossing met overmaat zilver-
chloride geschud om alle jodium door chloor te vervangen.
Na afBltreren van zilverhalogenide en droogdampen van het
Altraat, ontstond een kleurloze gekristalliseerde rest van 2,2 mg.
In dit product waren de waaiervormen te onderscheiden, die
voor ammoniumchloride zo kenmerkend zijn. Bovendien bleek
uit een microproefje, dat met een oplossing van platinachloride
in water een neerslag ontstond, welk bij beschouwen onder
het microscoop het uiterlijk bleek te hebben van ammonium-
choroplatinaat.

Ter contrôle heb ik nog de oplossing met behulp van
bariet alkalisch gemaakt en tot een klein volume afgedestil-
leerd. Het destillaat, dat basisch bleek te reageren, werd met
0,110 N. HCl getitreerd tot een omslag van de indicator
methylrood. Nodig waren 0,12 cm®. Dit komt overeen met
60 % van de theoretisch berekende hoeveelheid voor het
geval dat alle stikstof, die oorspronkelijk in het biotinemole-
cule aanwezig was, tot ammoniak was gereduceerd. Bij de
interpretatie van dit percentage moet er natuurlijk rekening
mee worden gehouden, dat voor de uitvoering van boven-
genoemde microreacties al reeds een gedeelte verbruikt was.

8. Inwerking van HJ en rode phosphor op biotinemethylester
bij 180° C.

9,8 mg biotinemethylester werden met 65 mg rode phosphor
en 1 cm® HJ (d.1,96) twee uur lang in een Cariusbuis op 180° C
verwarmd. Na afkoelen werd de buis geopend; de inhoud
was van lichtbruin tot volkomen kleurloos geworden; een
vochtig loodacetaatpapiertje kleurde zich in de damp slechts
langzaam iets bruinachtig, waarbij niet de metaalglans van
loodsulfide waargenomen werd.

Na het reactiemengsel met behulp van wat water in een
erlenmeyertje overgebracht te hebben, werd op een waterbad,
onder gelijktijdig wegzuigen van de damp drooggedampt.
Hierbij trad aan het eind een lichte geelkleuring op. Er
bleef een zeer lichtgeel gekleurde olie achter. Om het laatste
restje jodium te verwijderen, werd nogmaals met een weinig
water op dezelfde manier drooggedampt. Een vrijwel kleur-
loze rest bleef achter. Deze werd in 5 cm® water opgelost,
waarna een spoortje onopgelost materiaal werd afgefiltreerd.

Na door toevoegen van 0,4 g natriumhydroxyde sterk
alkalisch gemaakt te hebben, heb ik de oplossing onder door-
leiden van stikstof drooggedampt, door het kolfje in een
oliebad te houden, dat aan het eind van de destillatie een
temperatuur van 190° C had. Tenslotte werd de droogrest
nog 15 minuten op deze temperatuur gehouden.

Het destillaat bleek na aanzuren met enkele druppels ver-
dund zoutzuur en droogdampen vrijwel geen droogrest op te
leveren. Het spoortje, dat achterbleef, gaf na oplossen in water
geen neerslag met pikrolonzuur- of goudchloride-oplossing.
Hierdoor was dus gebleken, dat een vluchtige base bij deze
bewerking in het geheel niet, of slechts in minimale hoeveel-
heid was ontstaan.

De rest, die was verkregen na droogdampen van de alkalische
oplossing, heb ik hierna met een overmaat zoutzuur enige tijd
op een waterbad verwarmd. Een vlokkige massa bleek on-
opgelost te blijven en werd afgefiltreerd en zorgvuldig met
water uitgewassen. Bij nadere beschouwing bleek dit kiezel-
zuur te zijn, dat natuurlijk was ontstaan, doordat de sterke
loog het glas van het destilleerkolfje had aangetast.

Na droogdampen van het fikraat, werd bij de droogrest
10 cm® van een 1,5 0/o-ige oplossing van zoutzuur in absolute
methanol gevoegd en gedurende 1 uur aan een opstijgende
koeler gekookt. Na droogdampen en goed drogen in een
vacuum exsiccator boven NaOH en PgOg, heb ik de rest in
10 cm® water opgelost en met natriumbicarbonaat alkalisch
gemaakt. De waterige oplossing werd hierna vijf maal met
chloroform uitgeschud. Na drogen van deze fractie met be-
hulp van uitgegloeid natriumsulfaat en afHltreren van dit
droogmiddel, werd de chloroformoplossing drooggedampt.

Het gewicht van de gele olie, die overbleef, bleek na drogen
in een exsiccator 4,6 mg te zijn. Na verzeping met HCl
werd weer drooggedampt. Nu bleek de droogrest een ge-
kristalliseerd product te zijn, terwijl het gewicht 4,7 mg be-
droeg. Deze rest werd in water opgenomen en deze oplossing
gaf met een waterige oplossing van pikrolonzuur een zeer
moeilijk oplosbaar pikrolonaat. Na dit pikrolonaat geïsoleerd
te hebben en één maal te hebben omgekristalliseerd, heb ik
tenslotte 4,7 mg mooi lichtgeel product verkregen, dat onder
het microscoop uit homogene „Morgensternequot; bleek te be-
staan. Het gedrag onder het smeltpuntsmicroscoop was vol-
komen hetzelfde als van het pikrolonaat van het Cg-diaminozuur.

Ook hier een ontleding van de kleinste deeltjes onder zeer
donker worden bij een temperatuur van ca 190° C, terwijl
de grotere partikeltjes eerst bij een iets hoger gelegen temperatuur
een ontleding ondergingen. Bij ongeveer 210° C bleek alles
ontleed en zeer donker gekleurd te zijn.

Een kwalitatieve zwavelanalyse, met het pikrolonaat uit-
gevoerd, bleek een positief resultaat te hebben.

CH-analyse:

3,036 mg stof: 5,11 mg COj en 1,18 mg HjO (bovendien 0,046 mg as).
Berekend voor: CsHisO^N^S . 2 CioHsOsNi: C 46,62 o/o; H 4,59 o/o.

Gevonden: C 45.90 o/o; H 4,35 o/q.
Door rekening te houden met de 1,52 o/o as, kunnen de gevonden
waarden gecorrigeerd worden.

Deze worden dan: C46,59O/o; H4,42O/o.

9. Splitsing van biotinemethylester met zoutzuur, gevolgd
door behandeling met nitriet en redactie met HJ.

9,3 mg biotinemethylester werden met 2 cm® geconc. HCl
een half uur in een schietkast op 200° C verhit. Na openen
der buis en droogdampen van de oplossing bleef een rest
van 10,1 mg. achter. Hierbij werd gevoegd 1 cm® water en
0,3 cm® ijsazijn; tenslotte een oplossing van 100 mg natrium-
nitriet in 1 cm® water. Gasontwikkeling trad op.

Na 30 minuten staan bij kamertemperatuur, heb ik de op-
lossing bij een temperatuur van ca 40° C in een vacuumkolfje
tot bijna droog ingedampt; hierna 0,5 cm® gec. HCl toe-
gevoegd en op dezelfde manier geheel drooggedampt. In een
vacuumexsiccator werd boven P^Og en KOH nog zorgvuldig
gedroogd.

Door gebruik te maken van de oplosbaarheid in chloroform,
werd een scheiding organisch-anorganisch bereikt. Na droog-
dampen van de chloroformoplossing, verkreeg ik tenslotte
als organische fractie een rest van 8,3 mg lichtgele olie.

Deze olie werd met 1 cm® zuiver H} (d. 1,96) in een
schietkast gedurende twee uur op 180° C verwarmd. Na af-
koelen en openen der buis bleek een vochtig loodacetaat-

papiertje, in de damp gehouden, zich ogenblikkehjk donker
te kleuren, terwijl ook de voor loodsulflde zo karakteristieke
metaalglans waargenomen werd. Bovendien was zwavel-
waterstof zeer duidelijk te ruiken.

Dat de zwavel er als zwavelwaterstof was afgesplitst, was
dus met zekerheid aangetoond.

Het reactiemengsel, dat door jodiumafscheiding donker was
getint, werd met water verdund en hierna met zwaveldioxyde-
oplossing ontkleurd. De ontkleurde oplossing werd na filtreren
5 maal met hetzelfde volume chloroform uitgeschud. Na drogen
van de chloroformfractie met behulp van natriumsulfaat, heb
ik de chloroform bij lage temperatuur afgedampt en slechts
een spoortje als rest verkregen (minder dan 0,1 mg).

C. Inwerking van KOH-oplossing op sulfonen.

1. Inwerking van KOH op het sulfon van thiophaan-a-
carhonzuur.

Het sulfon werd op de gewone manier uit thiophaan-a-
carbonzuur gemaakt door oxydatie met de permanganaat-
oplossing. De gezuiverde verbinding bleek bij 126°—127° C
te smelten.

85 mg van dit sulfon werden in een stalen micro-autoclaafje
met een oplossing van 0,4 g KOH in 0,4 cm» water gedurende
1 uur op 200° C. verhit. Na afkoelen en openen werd de
inhoud met behulp van wat water in een erlenmeyertje over-
gebracht. Hierna maakte ik met zoutzuur zuur, waarna een
SOj-lucht was waar te nemen. Na een geringe overmaat
broom te hebben toegevoegd, waardoor het zwaveldioxyde
tot zwavelzuur werd geoxydeerd, werd dit laatste als barium-
sulfaat bepaald.

Ongeveer 70 % van de theoretisch mogelijke hoeveelheid
aan BaSO^ werd geïsoleerd (80 mg). Wanneer men rekening
houdt met een in gasvorm ontweken kleine hoeveelheid zwavel-
dioxyde, kan men uit deze proef de conclusie trekken, dat
vrijwel alle zwavel uit het oorspronkelijke molecule is gesplitst.

2.nbsp;Inwerking van KOH op trimethyleenuream.

100 mg trimethyleenureum werden op dezelfde manier als
bij de vorige proef met een oplossing van 0,4 g KOH in
0,4 cm® water gedurende 1 uur op 200° C verwarmd. Na
opening was een sterke aminelucht waar te nemen. Met wat
water werd het reactiemengsel in een destilleerkolfje over-
gebracht. Na afgedestilleerd en het destillaat in zoutzuur op-
gevangen te hebben, werd de zoutzuuroplossing drooggedampt.
De droogrest werd in water opgenomen en het diamine als
een dipikraat met een waterige pikrinezuuroplossing neerge-
slagen.

In totaal werd door mij, zonder opwerking van de moeder-
loog, 300 mg pikraat geïsoleerd (60 % der theoretische hoe-
veelheid). Ontledingstraject: 230°—235° C. Een mengsmeltpunt,
genomen met het dipikraat van 1,3 diaminopropaan, dat ik
maakte door een splitsing van trimethyleenureum met zout-
zuur, gaf geen depressie in ontledingstraject.

3.nbsp;Oxydatie van biotinemethylester en KOH~inwerking op
het biotinesulfon.

10,1 mg biotinemethylester werden bij kamertemperatuur
op de gewone manier met de 0,02 molaire oplossing van
kaliumpermanganaat geoxydeerd. Opgenomen werden 2,65
cm®; dat zijn 2,02 atomen zuurstof. Na afBltreren van het
bruinsteen, werd het fikraat met zoutzuur tot zuur op kongo
gemaakt en drooggedampt.

De droogrest wreef ik met een spateltje fijn en bracht
hierna het poeder in een micro-autoclaafje. Na toevoeging
van een oplossing van 35 mg KOH in 0,05 cm® water en
sluiten van het autoclaafje, werd I uur lang op 200° C ver-
warmd. Na afkoelen en openen werd de gele oplossing met
behulp van wat water in een erlenmeyertje overgebracht.
Een vochtig rood lakmoespapiertje werd in de damp ogen-
blikkelijk blauw gekleurd; bovendien meenden wij duidelijk
ammoniak te ruiken.

Alvorens de gehele hoeveelheid op te werken, heb ik met

een druppeltje van de lichtgeel gekleurde oplossing het vol-
gende microproefje uitgevoerd. Het druppeltje werd met een
spoortje zoutzuur tot zuur op kongo gemaakt en hierna een
weinig broomwater toegevoegd. In deze oplossing toonde ik
nu zwavelzuur aan, door een druppel bariumchlorideoplossing
toe te voegen, waardoor een neerslag van BaS04 in de vorm
van een geringe troebeling optrad.

Na op deze manier het ontstaan van SO3 aangetoond te
hebben, werd met de opwerking van de rest van de oplossing
verder gegaan. Ook hier werd met zoutzuur tot zuur op kongo
gemaakt, waardoor een troebeling ontstond, die bij verwarmen
van de oplossing bijna geheel weer oploste. Slechts zeer
weinig donker uitziend materiaal bleef onopgelost. Teneinde
dit te verwijderen, heb ik de oplossing heet gefiltreerd en
daarna drooggedampt.

Door gebruik te maken van dc oplosbaarheid in aether
heb ik tenslotte het organisch materiaal van de anorganische
reactieproducten weten te scheiden. Ik verkreeg uiteindelijk
4,5 mg van een lichtgele olie, die de geur van een oxyzuur
had. Teneinde deze olie nog nader te kunnen identificeren,
werd op de volgende manier een p-phenylphenacylester ge-
maakt. De olie werd op lakmoes geneutraliseerd met 2,16 cm»
0,012 N. NaOH-oplossing. Hierna voegde ik 5 cm» alcohol
en 7 mg p-phenylphenacylbromide toe en kookte het reactie-
mengsel een uur aan een opstijgende koeler. Hierna werd,
teneinde een weinig verontreiniging kwijt te raken, de op-
lossing heet gefiltreerd; vervolgens werd door nog iets in te
dampen en hierna af te koelen, 4,5 mg neerslag geïsoleerd.

Smeltpuntsbepaling onder het microscoop: bij ca 80° C
begon het product te verweken; smeltpunt 83°—85° C.

Na 1 maal omkristalliseren uit 70 %-ige alcohol werden
tenslotte 2 mg van een vrijwel kleurloos materiaal verkregen.
Onder het microscoop bleek de ester te bestaan uit kleurloze,
zuilvormige kristallen.

Een smeltpuntsbepaling van dit omgekristalliseerde product,
onder het microscoop gedaan, gaf hetzelfde resultaat als vóór

de zuivering. Opgemerkt moet echter worden, dat het smelt-
punt op deze manier door de doorzichtigheid van de kristallen
niet zeer duidelijk was waar te nemen.

Na met behulp van kwalitatieve microproefjes de afwezigheid
van zwavel en van stikstof in de ester vastgesteld te hebben,
werd de rest voor een CH-analyse gebruikt.

CH-analyse:

1,569 mg stof: 3,67 mg CO^ en 0,72 mg HjO.

Gevonden: C 63,79 O/q; H 5,13 O/o.

Het zal duidelijk zijn dat de hoeveelheid materiaal, voor deze analyse
beschikbaar, te gering was om een betrouwbare uitkomst te garanderen,
zodat er op deze plaats van wordt afgezien om een brutoformule af
te leiden.

D. Methylering en afbraak volgens A. W. Hofmann.

1. Inwerking van methyljodide op biotinemethylester en
poging om met het reactieproduct een afbraak volgens
Hofmann uit te voeren.

Bij 10 mg biotinemethylester werd, na oplossen in 1,5 cm®
methanol en enkele druppels water ¹), 1,5 cm® zuiver, kleurloos
methyljodide gevoegd. Het reactiemengsel werd hierna ge-
durende 2^/2 uur aan een opstijgende koeler gekookt, waarbij
een slechts lichte geelkleuring werd waargenomen. Na droog-
dampen van de oplossing en drogen van de rest in een exsiccator
bleef 14,7 mg lichtgele olie achter (berekend voor het geval
dat additie van 1 CHsJ-groep en verzeping van de estergroep
had plaats gevonden: 14,9 mg).

De oplossing van dit prodruct in 3 cm® water werd hierna
20 minuten lang geschud met een overmaat vers neergeslagen,
vochtig zilveroxyde. Hierna heb ik afgefiltreerd en het neer-
slag goed met water nagewassen. Het heldere filtraat, waarin
een microreactie op halogeenionen met negatief resultaat was
gedaan, heb ik in een kolfje drooggedampt en tenslotte in

1nbsp; Water schijnt de additie te bevorderen, vgl. A. v. Oefele. Ann. 132,
82 (1864).

vacuo nog 15 minuten in een oliebad van 150° C gehouden.

De inhoud van het kolfje bleek na deze bewerking nog
een gewicht van 10,2 mg te hebben. Deze inhoud werd op-
gelost in overmaat verdund zoutzuur, en na afBltreren van
een spoortje onopgelost, donker gekleurd materiaal, werd het
fikraat drooggedampt. De droogrest bestond uit 10,6 mg
kleurloos product, dat practisch volkomen in naalden gekris-
talliseerd bleek te zijn. Uit een test op de groeiwerking op
gist, met 0,1 mg van deze fractie uitgevoerd, werd duidelijk,
dat de volledige biotine-activiteit behouden was gebleven.

2.nbsp;Hernieuwde behandeling met CH^J en poging om het
jodium door chloor te vervangen.

De 10,6 mg rest van het bovenstaande proefje werd, na
oplossen in 3 cm® methanol plus enkele druppels water, ge-
durende 2 uur gekookt met 2 cm® zuiver CHgJ aan een op-
stijgende koeler, waarbij een zeer lichte geelkleuring op te
merken was.

Na droogdampen van de oplossing en drogen van de rest
in een exsiccator, bleek 15,1 mg licht gekleurde olie achter
te blijven.

Nadat in 2 cm® water opgelost was, werd 15 minuten lang
met overmaat zilverchloride geschud. Hierna werd de geel
geworden, vaste stof afgefiltreerd, goed met water uitgewassen,
en het heldere filtraat in een vacuumkolfje drooggedampt.
Na drogen van het achtergeblevene in een exsiccator be-
droeg het gewicht 10,6 mg.

Hiervan heb ik 0,1 mg genomen om de groeiwerking
tegenover gist te testen, waarbij bleek dat de gehele biotine-
activiteit behouden was gebleven.

3.nbsp;Splitsing met zoutzuur en methylering van het Cg-
diaminozuur.

De droogrest uit de vorige proef werd met 2 cm® gec.
HCl gedurende een half uur in een schietkast op 200° C
verhit. Na openen van de afgekoelde buis, heb ik de inhoud

in een erlenmeyertje overgebracht met behulp van wat water
en in een vacuumexsiccator drooggedampt boven KOH en
PgOj. Het gewicht van de geheel gekristalliseerde rest bleek
11,6 mg te bedragen. Met enkele 7's hiervan heb ik onder
het microscoop een pikrolonaat gemaakt, dat uit de „Mor-
gensternequot; bleek te bestaan, die zo karakteristiek zijn voor
het pikrolonaat van het Cg-diaminozuur.

Teneinde de methylering uit te voeren, werden deze 11,6 mg,
na oplossen in 2 cm® methanol plus enkele druppels water,
gedurende IV2 uur aan een opstijgende koeler gekookt met
2 cm® zuiver methyljodide. Na droogdampen bleek de rest
een gewicht van 19 mg te bezitten. Het was een lichtgele
olie, die later kristalliseerde. Na oplossen in 1 cm® absolute
methanol, werden 100 mg, vers bereid, droog zilveroxyde
toegevoegd, waardoor een wit waas ontstond.

Na toevoegen van 1 cm® CHgJ, heb ik het reactiemengsel
4 uur lang aan een opstijgende koeler gekookt. Na deze
4 uur werden nog eens 100 mg Ag^O en 1 cm® CHgJ toe-
gevoegd en nog IV2 uur gekookt. Deze laatste behandeling
werd nog eens herhaald.

Hierna heb ik het reactiemengsel drooggedampt, overmaat
verdund zoutzuur toegevoegd en een kwartier op een kokend
waterbad verwarmd. Tenslotte werd heet gefiltreerd en de
afgefiltreerde zilverhalogeniden zeer zorgvuldig met kokend
water uitgewassen. Na droogdampen van de vrijwel kleurloze
heldere oplossing, bleek de droogrest uit een kristalliserende
lichtgele olie te bestaan en een gewicht van 24,7 mg te
bezitten.

Teneinde het jodide in het overeenkomstige chloride om
te zetten, heb ik na oplossen in 4 cm® water, geschud met
een overmaat zilverchloride. De eerste toegevoegde porties
werden duidelijk geel. Na afBltreren van de zilverzouten en
goed uitwassen, bleek de rest, die ik overhield na droog-
dampen van het fikraat, een gewicht van 20,4 mg te hebben
en te bestaan uit een doorgekristalliseerde, vrijwel kleur-
loze olie.

4.nbsp;Afbraak volgens A. W. Hofmann.

De bovenstaande 20,4 mg werden opgelost in 4 cm» water
en hierna voegde ik een overmaat, vers neergeslagen, vochtig
zilveroxyde toe, waarbij bleek, dat de eerste porties duidelijk
wit werden. Na ongeveer 10 minuten geschud te hebben,
werd afgefiltreerd en grondig met water uitgewassen.

Het heldere, alkalisch reagerende filtraat werd eerst in een
kolfje drooggedampt en tenslotte werd het kolfje gedurende
15 minuten in vacuo in een oliebad van 150° C gehouden.
De droge rest in de kolf, die een gewicht van 15,1 mg bleek
te bezitten, was slechts weinig donker gekleurd. Na toevoegen
van overmaat verdund zoutzuur, werd van zeer weinig on-
opgelost materiaal afgefiltreerd; hierna werd de oplossing
drooggedampt. De rest bleek een practisch kleurloze kristal-
liserende olie te zijn, terwijl het gewicht 17,7 mg bedroeg.

Deze olie werd opgelost in 3 cm» water en deze oplossing
voor de zekerheid nog eens gefiltreerd. Nadat uit een micro-
proefje was gebleken, dat met een 20 %-ige waterige HAUCI4-
oplossing een lichtgeel neerslag ontstond, heb ik bij de gehele
oplossing een overmaat van dit reagens gevoegd. Na affiltreren,
uitwassen en drogen, bleek 6,4 mg auraat te zijn ontstaan.
De verbinding, die onder het microscoop een volkomen
homogeen uiterlijk had, bleek onder ontleding bij 199°—200° C
te smelten.

Nadat uit een kwalitatieve reactie op zwavel was gebleken,
dat het auraat dit element bevatte, werd met de rest een
CH-, Au- en een N-analyse uitgevoerd.

CH- en Au-analyse:

2,649 mg stof: 1,33 mg COj: 0,76 mg H^O en 1,216 mg Au.

N-analyse:

2,158 mg stof: 0,062 cm' Nj bij 22° C en 764 mm.

Berekend voor CioHjeNjSAujCls:

C 13,58 0/0; H 2,96 0/0! N 3,17 0/0; Au 44,62 o/q.

Gevonden: C 13,69 O/o; H 3,21 O/q; N 3,34 O/q; Au 45,90 0/0.

5.nbsp;Methylering van ornithine volgens de methode van Purdie.

105 mg ornithinedihydrochloride werden met 2,5 cm®
absolute methanol en 2 cm® zuiver methyljodide, na toevoegen
van 1 g, vers gemaakt, droog zilveroxyde, gedurende 2 uur
aan een opstijgende koeler gekookt. Hierna heb ik nog eens
2 cm® CHgJ en 0,4 g Ag^O toegevoegd en na nog eens
2 uur lang gekookt te hebben, drooggedampt.

Bij de droogrest werd nu een overmaat verdund zoutzuur
gevoegd en hierna op een waterbad onder voortdurend om-
schudden verwarmd. De oplossing werd heet gefiltreerd en
zeer grondig met verdund zoutzuur en heet water uitgewassen.
Dit uitwassen bleek zeer belangrijk te zijn.

De rest, die na het droogdampen van het kleurloze, heldere
filtraat overbleef, had een gewicht van 152 mg. Teneinde
alle jodium door Cl te vervangen, heb ik deze rest opgelost
en de oplossing goed met AgCl geschud, waarbij voor een
overmaat werd gezorgd en waarbij ik kon waarnemen, dat
de eerste porties zich geel kleurden.

Na affiltreren en uitwassen, heb ik tenslotte uit de oplossing,
door toevoegen van een 20 0/o-ige HAuCl^ oplossing, een
lichtgeel auraat neergeslagen. Na affiltreren, uitwassen en
drogen, bleek het gewicht 267 mg te bedragen. Het auraat
bleek bij 204°—205° C onder ontleding te smelten.

Een mengsmeltpunt, gedaan met het auraat van gemethy-
leerd ornithine, dat ik maakte volgens de methode van
R. Engeland, gaf geen depressie.

Bovendien heb ik enkele Au-analysen uitgevoerd, die het volgende
resultaat hadden;

4,010 mg stof: 1,750 mg Au. Au 43,86 o/o.

4,550 mg stof; 2,002 mg Au. Au 44,00 O/o.
Berekend voor CnH^OiNjAujCls : Au 43,85 O/o.

E. Verhitting van biotinesulfon met zoutzuur,

1. Inwerking van zoutzuur op het sulfon van d-thiodi-
valeriaanzuur.

Uit ó-thiodivaleriaanzuur werd eerst het overeenkomstige

sulfon gemaakt door oxydatie bij kamertemperatuur met de
gewone 0,02 molaire permanganaatoplossing. De stof bleek
een goed uit water om te kristalliseren verbinding te zijn, die
na zuiveren smolt bij 178° C. Ook hier was het sulfide weer
als het ware te titreren met de permanganaatoplossing; twee
atomen zuurstof werden opgenomen.

37 mg van dit sulfon werden nu met 2 cm® geconc. HCl
gedurende 2 uur verhit op 250° C in een Carius-buis. Na
afkoelen werd de buis geopend en het reactiemengsel droog-
gedampt. De overmaat zoutzuur werd verwijderd in vacuo
boven KOH en P2O5. De rest bleek na drogen nog steeds
een gewicht van 37 mg te hebben, terwijl het smeltpunt slechts

1nbsp;graad was verlaagd. Een mengsmeltpunt met het oorspron-
kelijke sulfon gaf geen depressie.

2. Zuursplitsing van biotinesulfon.

3,1 mg biotinesulfon, gemaakt door permanganaatoxydatie
van biotinemethylester, werden met 1 cm® gec. HCl in een
schietkast gedurende V2 quot;ur op 200° C verwarmd. Na droog-
dampen van het reactiemengsel en verwijderen van de over-
maat zoutzuur door in vacuo te laten staan boven KOH en
P3O5, heb ik de droogrest in weinig water opgelost en, na
filtreren van de oplossing, op de gewone manier een pikrolonaat
gemaakt.

Na omkristalliseren uit weinig water, waaraan een druppeltje
pikrolonzuuroplossing was toegevoegd, gelukte het mij om

2nbsp;mg van een zuivere, tamelijk oplosbare stof te isoleren.

Uit een bepaling onder het microscoop volgde, dat het

smeltpunt 139° C was. Na eerst in deze stof kwalitatief de
zwavel te hebben aangetoond, werd de rest gebruikt voor
de uitvoering van een N-analyse.

N-analyse:

1,510 mg stof: 0,228 cm' Nj bij 24° C en 768 mm.

Berekend voor QH^oOjN^S . 2 QoHsOjNi: 17,58 O/o N.

Gevonden: 17,54 0/0 N.

3. Oxydatie van biotinemethylester tot biotinesulfon, ge-
volgd door splitsing met zoutzuur.

15,4 mg biotinemethylester werden bij kamertemperatuur
geoxydeerd met de 0,02 molaire oplossing van kaliumperman-
ganaat, die wij steeds voor onze oxydatieproeven gebruikten.
Nadat in totaal 4,04 cm® was toegevoegd, verdween de paarse
tint niet meer. Dit komt overeen met een opneming van 2,03
atomen zuurstof. Na enkele druppels methanol te hebben toe-
gevoegd, werd de oplossing 5 minuten op een waterbad ver-
warmd, om het bruinsteen goed te laten uitvlokken. Na een
nacht staan bij kamertemperatuur, werd dit afgefiltreerd en goed
met water uitgewassen. Het heldere, kleurloze fikraat werd,
na een overmaat zoutzuur te hebben toegevoegd, in een
vacuumexsiccator boven P2O5 en KOH ingedampt.

Toen het volume nog ongeveer 2 cm® bedroeg, heb ik met
een zeer fijn pipetje de moederloog tussen de prachtig ge-
vormde, kleurloze dunne naalden uitgezogen. Op dezelfde
manier werd één maal met 1 cm® en 3 maal met 0,5 cm® water
gewassen. Na drogen in een exsiccator bleek dat ik 13,7 mg
biotinesulfon had geïsoleerd.

Een smeltpuntsbepaling onder het microsmeltpuntsmicroscoop
had tot resultaat: 268°-270° C. Eerst bij het smeken kleurde
zich de kleurloze stof een weinig. Gedurende het smeken kon
ik onder het microscoop geen gasontwikkeling constateren.

Teneinde de zuursplitsing uit te voeren, werden deze 13,7 mg
met 3 cm® gec. HCl een half uur in een schietkast op 200° C
verhit. Na afkoelen werd de buis geopend. Er bleken zich
geen harsachtige deeltjes gevormd te hebben; de oplossing
was mooi kleurloos en helder gebleven.

Deze opl. werd hierna in een vacuumexsiccator boven
P2O5 en KOH drooggedampt. Het gewicht van de droogrest
bedroeg 16,8 mg (hygroscopisch). Het product was kleurloos
en volledig gekristalliseerd: naalden.

Van de 16,8 mg heb ik 13,5 mg genomen om een ver-
binding met dilituurzuur te maken. Hiertoe werd het product
in 3 cm® water opgelost en deze oplossing voor de zekerheid

nog gefiltreerd, ofschoon hij op het oog geheel helder leek.
Nadat uit een microproefje was gebleken, dat het dilituraat
bestond uit los-zwevende, prachtig homogeen gekristalliseerde
oliedruppeltjes „Morgensternequot;, werd bij de gehele oplossing
een verzadigde waterige opl. van dilituurzuur gedruppeld,
waarbij ervoor werd gezorgd, dat uiteindelijk een overmaat
van dit reagens aanwezig was.

Na enige tijd in de ijskast te hebben gestaan, werd het
neerslag afgefiltreerd, goed met water uitgewassen en gedroogd.
Aanwezig bleken te zijn 11,6 mg, die onder het microscoop
een volkomen homogeen uiterlijk hadden. Bij een bepaling
onder het smeltpuntsmicroscoop bleek de stof bij 232°—238° C
te ontleden, onder zeer donker worden van de smelt.

Na omgekristalliseerd te hebben uit ca 1,5 cm» water, plus
enkele druppels dilituurzuuroplossing, verkreeg ik tenslotte
7,5 mg gezuiverd product. Het ontledingstraject hiervan was
235°—240° C. Onder het microscoop zag de verbinding er
volkomen homogeen uit en bleef gedurende het opwarmen
prachtig kleurloos. Eerst toen de stof begon te ontleden, werd
de smelt zeer donker gekleurd.

Nadat in dit dilituraat de aanwezigheid van de zwavel was
aangetoond, werd de rest gebruikt voor een CH- en een
N-analyse.

CH-analyse:
3,120 mg stof: 3,76 mg CO^ en 1,24 mg H,0.

N-analyse:

1,901 mg stof: 0,297 cm' Nj bij 22» C en 749 mm.

Berekend voor CgHjoOsNaS . 2C4H3O5N3: C 33,20 0/0;

H 4,270/0; N 18,22 0/0.

Gevonden: C 32,87 0/0;

H 4,450/0; N 17,82 0/0.

4. Potentiometrische titraties.

De volgende titraties werden uitgevoerd:

a.nbsp;Van 4,00 mg ornithinedihydrochloride.

b.nbsp;Van 2,15 mg dihydrochloride van het Cg-diaminozuur (ge-

maakt uit de overeenkomstige hoeveelheid biotinemethyl-
ester).

c. Van 1,61 mg dihydrochloride van het „zuursplitsings-
productquot; van biotinesulfon.

Ik titreerde steeds met een 0,00876 N.carbonaatvrije NaOH-
opl. De producten werden in 15 cm® water opgelost, 1 cm®
van een 2 quot;/o-ige KCl-opl. toegevoegd en hierna het spannings-
verschil gemeten tussen een AgCl-electrode en een glaselec-
trode in de oplossing, onder doorleiden van een koolzuurvrije
stikstofstroom. Steeds na een druppel loog toegevoegd te
hebben, werd het spanningsverschil opnieuw gemeten.

In de bijbehorende grafieken heb ik de hoeveelheid toe-
gevoegde loog uitgezet tegen de P^ van de oplossing.

Bovendien werden verticale stippellijnen getekend bij 1 en
bij 2 aequivalenten toegevoegde loog.

a. Titratie van ornithine-dihydrochloride.

Uit de grafiek blijkt, dat de grote sprong in de curve
optreedt, wanneer 1 aequivalent loog is toegevoegd.

Uit de grafiek blijkt, dat de grote sprong in de curve op-
treedt, wanneer 1 aequivalent loog is toegevoegd.

c. Titratie van het dihydrochloride van het zuursplitsings~
product van biotinesulfon.

Uit de grafiek blijkt, dat de grote sprong in de curve op-
treedt, wanneer 2 aequivalenten loog zijn toegevoegd.

SAMENVATTING.

I. Een literatuuroverzicht van het bios-vraagstuk werd ge-
geven, waarin vooral de nieuwste publicaties werden ge-
refereerd.

II. Enkele reacties met biotinemethylester werden beschreven.

A.nbsp;Biotinemethylester nam bij oxydatie twee zuurstof-
atomen op en ging over in „biotinesulfonquot;. Hiermee werd
bewezen, dat de zwavel in sulfidevorm aanwezig was.

B.nbsp;Door verhitting met joodwaterstof werden de C-S-
bindingen niet aangetast. Een Cg-diamino-carbonzuur,
waarin de zwavel nog aanwezig was, werd als pikro-
lonaat geïsoleerd.

C.nbsp;Door inwerking van sterke loog op biotinesulfon werden
zowel de stikstof, als de zwavel uit het molecule
verwijderd.

D.nbsp;Een afbraak volgens de methode van A. W. Hofmann
leidde tot het isoleren van een zuiver auraat, dat ook
geanalyseerd werd. Zowel de zwavel, als de stikstof
waren nog in het molecule aanwezig, maar de carboxyl-
groep was verdwenen.

E.nbsp;Door biotinesulfon met zoutzuur te verhitten, ontstond
een diamino-sulfonzuur-carbonzuur met hetzelfde aan-
tal C-atomen. Hierdoor werd de aanwezigheid van
het zwavelatoom in een ring aangetoond.

SUMMARY.

1.nbsp;A survey of the literature on the bios-problem is given,

in which especial reference is made to the most recent

publications.

2.nbsp;A few reactions with biotinmethylester are described.

A.nbsp;On oxidation biotinmethylester took up two atoms of
oxygen and was converted into „biotin sulphonquot;. From
this it was established that the sulphur was present in
the form of sulphide.

B.nbsp;On heating with hydroiodic acid the C-S-bonds were
not attacked, A Cg-diamino carboxylic acid, in which
the sulphur was still present, was isolated as a picro-
lonate.

C.nbsp;On treating biotin sulphon with a strong solution of
KOH, the nitrogen as well as the sulphur were split
off from the molecule.

D.nbsp;A degradation according to the method of A. W, Hof-
mann led to the isolation of a pure auratc, which has
also been analysed. Both the sulphur and the nitrogen
were still present in the molecule, but the carboxyl
group had disappeared.

E.nbsp;On heating biotin sulphon with hydrochloric acid a
diamino-sulphonic acid-caboxylic acid with the same
number of C-atoms was formed. From this it was
shown that the place of the sulphur atom is in a ring.

T«

.. vT

o - r

STELLINGEN.

I.

Het is wenselijk, dat de synthese van vitamine A volgens
R. Kuhn herhaald wordt, echter uitgaande van zuiver ß-)ony~
lideen-acetaldehyde.

P. Karrer en A. Rüegger. Helv. 23, 284 (1940).

R. Kuhn en C. J. O. R. Morris. Ber. 70, 853 (1937).

II.

De door Fieser voorgestelde structuurformule voor vita-
mine Kg is onwaarschijnlijk.

P. Karrer en A. Epprecht. Helv. 23, 272 (1940).

L. F. Fieser en medew. J. Am. Chem. Soc. 61, 2206 (1939).

III.

Het is zeer goed mogelijk, dat biotine en vitamine H
identiek zullen blijken te zijn.

P. György, D. B. Melville, D. Burk en V. du Vigneaud.

Science 91, 243 (1940).

IV.

Voordat men een physiologisch actieve verbinding in zuivere
toestand heeft geïsoleerd, kunnen reeds talrijke aanwijzingen
over de structuur verkregen worden.

V.

Germer heeft niet aangetoond, dat de door hem onder-
zochte dunne metaallagen amorf zijn.

L. H. Germer. Physic. Rev. 56, 58 (1939).

Vgl. J. A. Prins. Nature. 131, 760 (1933).

De door Ham en Dean waargenomen stijging van de
electro-kinetische ladingsdichtheid bij toevoeging van neutrale
electrolyten, kan een physische betekenis hebben.

A. J. Ha m en E. D. M. Dean. Trans. Farad. Soc. 36, 52 (1940).

VII.

De proeven van Ruyssen bewijzen niet, dat bariumionen
door een KCl-oplossing van een bariumsulfaatoppervlak ver-
drongen worden.

R. G. Ruyssen. ). of Physic. Chem. 44, 265 (1940).

-V-V

sa