i

f

GROEI VAN GIST EN ACTIVATOREN VAN DE GISTING

GROEI VAN GIST EN ACTIVATOREN VAN DE GISTING

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT. OP GEZAG VAN DENnbsp;RECTOR MAGNIFICUS DR. H. R. KRUYT, HOOG-LEERAAR IN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DERnbsp;UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DEnbsp;FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN OP MAANDAG 9 JUNI 1941, DES NAMIDDAGSnbsp;TE 4 UUR, DOOR

WILHELMUS ADRIANUS JOSEPHUS BORG

GEBOREN TE SLOTEN (N.-H.)

lt;$gt;?

?

1941

DRUKKERIJ Fa. SCHOTANUS 6 JENS - UTRECHT

De voltooiing van dit proefschrift, waardoor een gedeelte van mijn studietijd wordt afgesloten, biedt mij een welkome gelegenheid om U, Hoogleeraren, oud'nbsp;Hoogleeraren en Lectoren in de Faculteit der Wis- en Natuurkunde van hartenbsp;te danken voor al datgene, wat tot mijn wetenschappelijke vorming heeft bijgedragen.

Wel in het bijzonder geldt deze dank U, Hooggeleerde KOGL, Hooggeachte Promotor, want niet alleen Uw groote en voortdurende belangstelling in mijnnbsp;onderzoek, maar ook Uw waardevolle raadgevingen en het feit, dat ik deze studie-periode als een van Uw assistenten mocht doorbrengen, stemmen mij tot grootenbsp;erkentelijkheid. Daarbij zal Uw medeleven en daadwerkelijke steun in persoonlijkenbsp;omstandigheden tijdens mijn afwezigheid en na mijn terugkeer op Uw Laboratoriumnbsp;steeds in mijn herinnering blijven voortleven.

Ook U, Hooggeleerde BIJLSMA, ben ik dankbaar voor de leiding, die U mij tijdens een deel van mijn studie hebt gegeven.

Verder wil ik hier mijn oprechten dank betuigen aan hen, die mij de studie hebben mogelijk gemaakt, terwijl ik mij tevens in denzelfden geest richt tot denbsp;leden van den wetenschappelijken staf, alsmede het geheele personeel, van hetnbsp;Organisch-Chemisch Laboratorium voor de medewerking en hulp, die ik steedsnbsp;mocht ondervinden, waarbij ik ook hen, die ik tot mijn vrienden mag rekenen,nbsp;vooral wil noemen.

HOOFDSTUK I

INLEIDING¹)

Het probleem van de alcoholische gisting — al dan niet in verband met den groei van de gistcellen — heeft al sedert tientallennbsp;jaren de aandacht getrokken. Reeds Pasteuri) onderzocht innbsp;1860 de ontwikkeling van gist op synthetische voedingsbodems.nbsp;Daarbij werd door hem waargenomen, dat toevoeging van plantaardige stoffen of gistsappen aan een dergelijken voedingsbodemnbsp;een aanzienlijke celvermeerdering en een grootere gistingsintensiteitnbsp;veroorzaakte. Wel bleek later aan W i 1 d i e r s '2), dat het kweekennbsp;van gist op zuiver synthetische voedingsbodems, zooals Pasteurnbsp;dit deed, onmogelijk was, tenzij er nog ruwe producten van orga-nischen oorsprong mede aanwezig waren, zooals gistsap, vleesch-extract of pepton.

Deze proefnemingen van W i 1 d i e r s bevestigden de inzichten van von Liebig 3), die reeds in 1871 de resultaten van Pasteur bestreed. Maar ook het „bios”, zooals W i 1 d i e r s denbsp;onmisbare stof noemde, die noodig was voor de ontwikkeling vannbsp;gist, bleef nog lang het onderwerp van veel strijd. Van meernbsp;theoretischen aard waren de aanvallen van Fernbach^) ennbsp;W i n d i s c h 5). Zij veronderstelden, dat aan de eiwitten van hetnbsp;toegevoegde gistextract de anorganische zouten werden gebonden.

1

De gegevens voor dit overzicht zijn gedeeltelijk ontleend aan de volgende samenvattingen: F. W. Tanner, Chem. Rev. 1, 397 (1925), W. Lashnbsp;M i 11 e r, J. Chem. Educ. 7, 257 (1930), F. K ö g 1 en B. T ö n n i s, H. S. 242,nbsp;43 (1936).

^) L. Pasteur, Ann. Chim. Phys. 3. Série 58, 323 (1860).

E. Wildiers, La Celluie 18,313 (1901).

®) J. V. Liebig, Ann. Chim. Phys. 4 Série 23, 5 (1871).

¦^) A. Fernbach, Ann. Brasserie et Destillerie 1901, 510.

®) W. Windisch, Wochenschr. f. Brauerel 19, 2 (1902).

10

die in de voedingsoplossingen van W i 1 d i e r s giftig zouden werken. Het werk van A m a n d 6) weerlegde deze opvatting volkomen, daar hij aantoonde, dat het toegevoegde bios tijdens hetnbsp;groeiproces werd verbruikt, terwijl Krüger'^) bewees, dat kleinenbsp;hoeveelheden metaal den groei van gist juist kunnen bevorderen.

PringsheimS) behoorde ook tot de aanvallers op het bios-bolwerk. Niet dat hij in gistextract de aanwezigheid ontkende van stoffen, die den groei van gist stimuleerden, maar wel kwam hijnbsp;op tegen de meening, dat die stoffen onmisbaar zouden zijn voornbsp;een gewonen groei van de gistcellen. In zijn gedachtengang veronderstelde hij de cel in staat zich te kunnen wennen aan bios-arme omstandigheden.

In Leuven, de school van W i 1 d i e r s, werkte men intusschen staag verder aan de ontwikkeling van het bios-principe, wantnbsp;in 1908 bleek uit een onderzoek van Ide^) aldaar, dat bios-armnbsp;gegroeide cellen, zooals Pringsheim die kweekte, dermatenbsp;waren verzwakt, dat toevoeging van bios geen enkel resultaatnbsp;meer had.

Maar langzamerhand verminderde de oppositie tegen de bios-stelling, waaraan de ontdekking van organische verbindingen, die in geringe hoeveelheden naast de normale behoefte aan gewonenbsp;voedingsmiddelen, noodzakelijk zijn voor het in stand houden vannbsp;het dierlijk organisme, zeker niet vreemd zal zijn geweest.

Als eerste van dat soort stoffen, die vitaminen werden genoemd, kon het anti-beriberi-vitamine, het latere vitamine of aneurine,nbsp;worden geïsoleerd. En toen ook bleek, dat preparaten met eennbsp;sterk antineuritische werking den groei van gist bevorderden lo) 11) 12) 13) 14)^ werd zelfs verondersteld, dat bios ennbsp;aneurine dezelfde verbinding was.

6) A. Amand, La Celluie 20, 225 (1902): 21, 329 (1904gt;.

F. Krüger, Centr. Bakt., Abt. 1, 10 (1895).

®) H. Pringsheim, Centr. Bakt. 16, 111 (1906).

M. Ide, Centr. Bakt. II, 18, 193 (1907).

K. Kurono, J. Coll. Agr. Imp. Univ. Japan 5, 305 (1915).

R. J. Williams. J. Biol. Chem. 38, 465 (1919); 42, 259 (1920).

W. H. Eddy en H. C. Stevenson, J. Biol. Chem. 43, 295 (1920). F. Swoboda, J. Biol. Chem. 44, 531 (1920).

1^) C. Funk en H. E. Du bin, J. Biol. Chem. 44, 487 (1920).

11

Eenigen tijd later echter verschenen mededeelingen 16) 17)^ dat preparaten met een sterke bios-werking in het geheel geennbsp;antineuritische werking hadden.

Weldra kwam men tot het inzicht dat bios geen enkelvoudige stof vertegenwoordigde 18) 19). Van dien tijd dateeren ook denbsp;pogingen om uit gistextracten en andere natuurproducten de werkelijke groeistoffen te isoleeren 20) 21)^ terwijl tevens in 1924 doornbsp;von Euler in gistextract een stof werd ontdekt, door hemnbsp;factor Z genoemd, die de alcoholische gisting zeer versnelde 22)^nbsp;welke werking niet aan het door Harden en Young23) innbsp;1904 geïsoleerde, voor de gisting onontbeerlijke, coënzyme, datnbsp;door von Eu Ier 24) cozymase werd genoemd, kon worden toegeschreven.

Het verloop van de alcoholische gisting zelf werd ook aan vele onderzoekingen onderworpen. Daarbij gelukte het Meyerhof 25)nbsp;en medewerkers een reactieschema op te stellen, waardoor ditnbsp;vraagstuk voor een deel is opgelost.

Wel waren door de proefnemingen van Neuber g, die reeds eerder de carboxylase had geïsoleerd als een deel van de zymase 26)^nbsp;in de jaren 1915 tot 1922 27) verschillende organische stoffen,nbsp;zooals a-ketocarbonzuren, aldehyden en purinederivaten, bekendnbsp;^®) A. D. Emmet en M. J. Stockholm, J. Biol. Chem. 43, 287 (1920).nbsp;4®) W. D. Fleming, J. Biol. Chem. 49, 119 (1921).

^’^) E. J. Fulmer, J. Biol. Chem. 57, 397 (1923).

^®) E. J. Fulmer en V. E. Nelson, Proc. lowa Acad. Sci 29, 371 (1922). ^®) E. J. F u 1 m e r, W. W. D u e c k e r en V. E. Nelson, }. Am. Chem.nbsp;Soc. 46, 723 (1924).

2®) G. H. W. Lucas, J. Physic. Chem. 28, 1180 (1924).

21) nbsp;nbsp;nbsp;E. V. Eastcott, J. Physic. Chem. 28, 1194 (1924).

22) nbsp;nbsp;nbsp;H. v. Euler en O. Swartz, H. S. 140, 146 (1924).

2®) A. Harden en W. J. Young, ]. of Physiol. 32 Proc. physiol. Soc. Nov. 1904.

21) H. v. Euler en K. Myrback, H. S. 131, 180 (1923).

2®) O. Meyerhof, Helv. Chim. Acta 18, 1030 (1935);

O. Meyerhof, W. Kiessling en W. Schulz, Biochem. Z. 292, 25 (1937).

2®) C. N e u b e r g en H. W a s t e n s o n, Sitzungsber. d. Berl. Physiol. Ges. 20 Jan. 1911.

21) C. Neuberg en M. Sandberg, Biochem. Z. 125, 202 (1921); 126, 153 (1921) en vroegere publicaties.

12

geworden, die zoowel de celvrije als de gewone alcoholische gisting sterk bevorderden.

De benoodigde hoeveelheden waren echter groot (20 % van de gebruikte hoeveelheid gist), zoodat die verbindingen zeker nietnbsp;verantwoordelijk konden worden gesteld voor de werking van denbsp;verschillende natuurproducten. Een ingrijpen in het normalenbsp;gistingsverloop door a-ketozuren en aldehyden is dan ook waarschijnlijk, daar gistende suikermengsels het vermogen bezitten omnbsp;a-ketozuren af te breken tot de overeenkomstige aldehyden, dienbsp;weer tot de desbetreffende alcoholen worden gereduceerd, op welknbsp;verschijnsel de thans gebruikelijke biochemische hydreeringen berusten 28). Wat de activiteit van de purinederivaten betreft, moetnbsp;worden vermeld, dat N e u b e r g voor al zijn proeven een mediumnbsp;gebruikte, dat noch anorganisch noch organisch gebonden stikstofnbsp;bevatte, vandaar dat voor dergelijke verbindingen een werking alsnbsp;stikstofbron niet mag worden uitgesloten.

Vooral ten aanzien van de groeistoffen werd het bios-vraagstuk op verschillende laboratoria energiek ter hand genomen. Zoo ooknbsp;in het Organisch Chemisch Laboratorium te Utrecht 29), alwaarnbsp;dit sinds 1932 in samenhang met het auxine-onderzoek 3o) eennbsp;onderwerp van nadere studie vormde.

Tegelijkertijd werd in laatstgenoemd instituut het onderzoek aangevat naar den gistingsfactor, die in gistkooksap aanwezig is 3i).

Zooals hierboven reeds kort vermeld, beschrijft v o n Euler de werking van factor Z als niet identiek met die van de al eerdernbsp;bekende cozymase. Dit werd nogmaals bevestigd door het onderzoek van von Euler en Myrback32), toen werd aangetoond,nbsp;dat zuivere cozymase de gisting niet versnelde.

In een verdere publicatie van von Eu Ier 33) werd vermeld, dat factor Z in een 80 %-ige alcohol-oplossing niet wordt neergeslagen (cozymase is in 70 %-ige alcohol geheel onoplosbaar);

^®) F. G. Fischer, Fortschr. der Chemie Org. Naturstoffe III, 30 (1939). 29) F. Kögl en B. Tönnis, H. S. 242, 43 (1936).

99) F. Kögl, A. J. Ha a gen Smit en H. Er x leb en, H. S. 214, 247 (1933) en 225, 215 (1934).

9^) C. J. v a n H u 1 s s e n, Dissertatie Utrecht 1936.

92) H. V. Euler en K. Myrback, H. S. 141, 297 (1924).

99) H. v. Euler en K. Myrback, H. S. 176, 258 (1928).

13

evenmin werd met bariet een scheiding verkregen. Tegelijkertijd werd de Z-werking nagegaan van verbindingen, die bij de stofwisseling van hoogere diersoorten een rol spelen, zooals tryptophaan ennbsp;histidine. In hoeveelheden van 100 y tot 10 mg per cm3 was hetnbsp;resultaat negatief; hetzelfde werd vermeld van mengsels niet nadernbsp;genoemde aminozuren. De geringe werking van hexosemono- ennbsp;-diphosphorzuur sloot eveneens een identiteit met factor Z uit.

Behalve de beschrijving van de testmethode, die in het verdere gedeelte van dit proefschrift nog uitvoerig wordt behandeld, konnbsp;in een ander artikel reeds een methode voor de isoleering vannbsp;een preparaat met een achtmaal zoo sterke Z-werking als die vannbsp;gistkooksap worden gegeven 34),

Ongeveer tegelijkertijd deelde von Euler mede, dat uit vrijwel alle dierlijke organen extracten konden worden verkregen met een soortgelijke werking als die van Z-preparaten uit gist 35).nbsp;Glycerine of glycerinephosphaat waren geheel onwerkzaam, maarnbsp;meso-inosiet (bios I) vertoonde een niet te verwaarloozen effect 36),nbsp;Dat factor Z geen invloed heeft op de ademhaling van de gist,nbsp;werd aangetoond door Meyerhof en Iwasaki37). die tevensnbsp;meenden dat de gistingstimuleerende substantie voortdurend in denbsp;cel wordt gevormd en in het substraat diffundeert. Ook toondennbsp;Myrb'ack en Larsson®*) later aan, dat het Z-effect zoowelnbsp;bij de aerobe als bij de anaerobe gisting optreedt.

Daar het ook niet mogelijk bleek, factor Z neer te slaan met phosphorwolfraamzuur of lood-, kwik- en zilverzouten, kwamnbsp;P h i 1 i p s o n 39) er toe te onderzoeken of het antineuritischenbsp;vitamine misschien als de gistingsfactor werkzaam was. Door hetnbsp;toepassen van de scheidingsmethode volgens Kinnersley ennbsp;Peters^o) werd bewezen, dat vitamine niet identiek wasnbsp;met factor Z,

=*4) H, V. Euler, E. Brunius en S. Proffe, H. S. 178, 202 (1928).

H. V. Euler en H. Johansson, H. S. 178, 215 (1928) en Sv. kern. Tidskr. 40, 209 (1928): C. 1928, II, 1905.

®®) H. V. Euler en H. Johansson, geciteerd door T. Philipson, H. S. 193, 16 (1930).

®'^) O. Meyerhof en K. Iwasaki, Blochem. Z. 226, 16 (1930).

®®) K. Myrb ack en H. Lar s son, Biochem. Z. 258, 118 (1933).

»») T. Philipson, H. S, 193, 15 (1930).

4®) H. W. Kinnersley en R. A. Peters, Biochem. J. 21, 777 (1927).

De verdere resultaten van dit onderzoek kwamen niet overeen met die van v o n Euler, daar P h i 1 i p s o n als bios I de cel-vermeerderingsfactoren isoleerde, terwijl zijn bios II alleen Z-activiteit vertoonde.

VonEule r en Philipson^i) onderzochten eveneens kleine hoeveelheden van verschillende purinederivaten op een eventueelenbsp;Z-werking, maar een dergelijk effect bleef volkomen achterwege.nbsp;Ook plantaardig materiaal werd onderzocht, dat met uitzonderingnbsp;van een moutextract, vrijwel geen — althans weinig — Z-factorennbsp;bevatte.

Verder kwamen von Euler en Philipson tot de overtuiging, dat factor Z ook uit verschillende componenten bestaat, daar het gelukte met behulp van metaalhydroxyden verschillendnbsp;actieve fracties te isoleeren. Ook werd in urine een actieve Z-

verbinding aangetoond ^4) 42),

Von Euler gebruikte voor zijn proefnemingen altijd een versche bovengist, want reeds in 1924 stelde hij vast, dat gedroogdenbsp;gist door factor Z niet wordt geactiveerd 32),

In 1933 verscheen er echter de reeds genoemde publicatie van Myrback en Larsson, waarin een Z-werking op gedroogdenbsp;gist wordt beschreven, hetgeen een invloed van factor Z op denbsp;zymase zou beteekenen 38). Het is echter mogelijk, dat de nog innbsp;gedroogde gist aanwezige levende cellen 43) voor het Z-effectnbsp;hebben zorggedragen: daar door Myrback en Larsson geennbsp;bijzonderheden omtrent de gebruikte gedroogde gist worden gegeven, blijft het verschijnsel van de door factor Z geactiveerdenbsp;gedroogde gist een onopgelost vraagstuk, dat vooral van belangnbsp;is in verband met de veronderstelling, dat factor Z een invloednbsp;heeft op de permeabiliteit van den gistcelwand, zooals dit reedsnbsp;door von Euler werd verondersteld 33).

Uit de verdere, in 1934 gepubliceerde, resultaten van von E u 1 e r en L a r s s o n ^4) bleek, dat zij door het toepassen van

H. v. Euler en T. Philipson, H. S. 195, 81 (1931).

H. v. E u 1 e r en T. P h i 1 i p s on, H. S. 198, 1 (1931) en Biochem. Z. 249, 245 (1932).

4®) W. Hennenberg, Handbuch der Garungsbakteriologie Berlin 1926, en wel deel I, pag. 332.

44) H. v. Euler en H. Larsson, H. S. 223, 189 (1934).

15

de scheidingsmethode van Lucases) uit een gistextract een fractie verkregen, die bios I (meso-inosiet) bevatte, welke geennbsp;Z-werking vertoonde en slechts een geringe celvermeerdering veroorzaakte. De andere fractie bleek zoowel bios II als factor Z tenbsp;bevatten. Dit was weer niet in overeenstemming met de vroegerenbsp;ondervindingen van P h i 1 i p s o n, want ook na verdere chemischenbsp;bewerkingen vertoonden de fracties, waarin het bios II voorkwam,nbsp;steeds een sterk stimuleerende werking op het verloop van denbsp;alcoholische gisting. Vandaar dat von Euler tot de gevolgtrekking kwam dat factor Z en bios II identiek zouden zijn.

De werking van factor Z = bios II op gist zou dan in twee phasen moeten verloopen, waarvan de eerste merkbaar was doornbsp;een gistingsversnelling, gepaard gaande met een opbouw van stoffen, die in de tweede phase aanleiding gaven tot celvermeerdering.

Maar een meer dan achtvoudige vermeerdering van factor Z in een gistpreparaat bereikte von Euler ook toen nog nietje).

Wel vermeldden korten tijd later Borchardt en Prings-heim^T), dat zij met behulp van aether- en alcoholextractie, gevolgd door een zilvernitraatbehandeling een honderdvoudige con-centreering van factor Z hadden bereikt. Maar ook dit onderzoek helderde nog niet de samenstelling van factor Z op.

Gelijktijdig hadden de onderzoekingen van Kögl en Tön-nis48)29)_ uitgaande van eenden eigeel, geleid tot de iso-leering van een zeer werkzamen bios-factor, die biotine werd genoemd, welke ook in gist werd aangetoond. Tevens gelukte hetnbsp;Kögl en van Hasseltss) bios-factor I, meso-inosiet, uit gistnbsp;af te zonderen. Het bleek echter spoedig, dat de twee gekristalliseerde stoffen, meso-inosiet en biotine, niet voor de volledigenbsp;groeiwerking van een gistextract aansprakelijk waren. Wel werdnbsp;door van Hasselt aangetoond, dat de ontbrekende stoffennbsp;slechts een co-werking hadden. Want weliswaar werd de groei.

«) G. H. W. Lucas, J. Phys. Chem. 28. 1180 (1924).

^®) H. v. Euler, D. Burström en G. Günther, Svensk. Kem. Tidskr. 46, 250 (1934); C. 1935 I, 2388.

^'^) H. Borchardt en H. Prlngsheim, Buil. Soc. Chim. biol. 16, 736 (1934).

4®) F. Kögl, Ber. 68, Abt. A, 16 (1935).

^®) W. V. Hasselt, Dissertatie Utrecht 1935.

16

door biotine en meso-inosiet veroorzaakt, vergroot, maar zonder toevoeging van laatstgenoemde verbindingen groeide de gebruiktenbsp;gist niet. Het aneurine bleek een gedeelte van de co-werking tenbsp;kunnen uitoefenen. Niet alleen door dit onderzoek werd bewezen,nbsp;dat bios II in verschillende factoren te splitsen moet zijn, maarnbsp;ook Lash Miller ^o) toonde het aan. Volgens laatstgenoemdennbsp;auteur scheen de samenstelling van bios II A te wijzen op eennbsp;oxyaminoboterzuur 51); het bios II B kon aan kool worden geadsorbeerd.

Korten tijd later gaf Lash Miller^a) voor bios II A de volgende samenstelling: jS-alanine, 1-leucine en bios V. Verdernbsp;was uit tomatensap een verbinding met tannine neer te slaan,nbsp;waarvan een goed gekristalliseerd koperzout werd verkregen, datnbsp;zich gedroeg als dat van een oxyaminozuur 53), hetwelk echternbsp;niet identiek is met threonine, dat volgens een onderzoek vannbsp;Rose 51) als een onmisbaar voedselbestanddeel voor de groei vannbsp;ratten werd vastgesteld. Bios V werd in 1936 gddentificeerd alsnbsp;aneurine 55),

Door electrodialyse van de meest verschillende plantaardige en dierlijke extracten ontdekte Williams 56) een stof, door hemnbsp;pantotheenzuur genoemd, die op vele gistsoorten slechts eennbsp;co-werking uitoefende, maar zeer sterk als groeifactor werkzaamnbsp;is op de door hem gebruikte „Gebrüder Mayer”-gist. Ook bleeknbsp;het pantotheenzuur eenigszins in staat de gisting te stimuleeren

®®) W. Lash Miller, E. V. Eastcott en J. E. Maconachie, J. Am. Chem. Soc. 55, 1502 (1933).

®i) W. Lash Miller, E. V. Eastcott en E. M. Sparling, Trans.

Roy. Soc. Canada III (3) 26, 165 (1932); C. 1933 I, 3463.

®^) W. Lash Miller, Trans. Roy. Soc. Canada III (3) 30, 99 (1936): C. 1937 I, 3003.

®®) W. Lash Miller, Trans. Roy. Soc. Canada III (3) 29, 163 (1935): C. 1936 I. 3359.

*“*) R. H. Mc Coy, C. E. Meyer en W. C. Rose, J. Biol. Chem. 112, 283 (1935) en 115, 721 (1936).

55) W. Lash Miller, Trans. Roy. Soc. Canada III (3) 31, 159 (1937). 5®) R. J. Williams en ]. H. T r u e s d a i 1, J. Am. Chem. Soc. 53, 4171nbsp;(1931).

17

evenals yS-alanine en aethanolamine 57). Na verloop van eenige jaren is de constitutie van het pantotheenzuur geheel opgehelderd,nbsp;terwijl ook de synthese is gelukt 58).

Bij het vergelijken van de verschillende onderzoekingen valt het direct op, dat een factor, die zeer actief werkt bij de proefnemingennbsp;van een bepaalden auteur, in een ander laboratorium slechts eennbsp;matige of een co-werking vertoont. Dit behoeft geenszins verwondering te wekken, daar bij vergelijkende onderzoekingen met verschillende gistrassen reeds vroeger is gebleken 59), dat de behoeftenbsp;aan bios-factoren totaal verschillend kan zijn. Wilde gisten kunnennbsp;zich op vrijwel synthetische voedingsbodems normaal ontwikkelen.

Een recent voorbeeld van een dergelijk verschil in activiteit ten opzichte van verschillende gistsoorten, geeft de quantitatievenbsp;aneurinebepaling met Fleischmann bakkersgist, zooals die werdnbsp;voorgesteld en uitgewerkt door S c h u 11 z en zijn medewerkers 55).nbsp;waarvan door H ey ns 5i), die dezelfde methode nog verder heeftnbsp;onderzocht, werd aangetoond, dat juist Fleischmann gist zeer sterknbsp;op kleine hoeveelheden aneurine reageert, terwijl andere, niet metnbsp;name genoemde gistsoorten, slechts een gering effect vertonnen.

Dit overzicht zou zeker niet compleet zijn, als vitamine Bg, adermine, onvermeld bleef, want S ch u It z 52) heeft een werkingnbsp;van adermine op de groei en gisting waargenomen, terwijl ooknbsp;W i 11 i a m s 53) tegelijkertijd de beteekenis van vitamine Be be-

®7) R. J. Williams, W. A. Mosher en E. Rohrman, Biochem. J. 30, 2036 (1936).

R. J. Williams en E. F. Pratt, Science 89, 200 (1939).

58) nbsp;nbsp;nbsp;R. J. Williams, Science 91, 246 (1940).

59) nbsp;nbsp;nbsp;A. M. Copping, Biochem. J. 23 II, 1050 (1929).

99) A. Schultz, L. Atkin en C. N. F r e y, J. Am. Chem. Soc. 59, 948, 2457 (1937) en 60, 1514, 3084 (1938).

A. Schultz, L. Atkin en C. N. Frey, Science 88, 547 (1938).

R. J. Williams en E. F. Pratt, Science 89, 200 (1939).

L. Atkin, A. Schultz en C. N. Frey, J. Biol. Chem. 129, 471 (1939). 61) K. Heyns, H. S. 258, 219 (1939).

92) A. Schultz, L. Atkin en C. N. Frey, J. Am. Chem. Soc. 61, 1931 (1939).

99) R. J. Williams en R. E. Eakin, J. Am. Chem. Soc. 61, 1932 (1939).

18

schreef als groeifactor. Dit vitamine is later zoowel door K u h n als door Harrises) gesynthetiseerd.

Tenslotte willen wij dan nog wijzen op enkele artikelen, waarin vooral de gisting aan een nader onderzoek werd onderworpen.nbsp;Hartelius^e) kon, door een gistextract te schudden met gist,nbsp;het bios-gehalte verminderen tot op 8 %, terwijl de Z-werking voornbsp;50 % behouden bleef, waarbij hij nog vermeldde, dat de uitgeschudde Z-actieve stoffen niet te vervangen waren door ;8-alaninenbsp;of andere, niet nader genoemde aminozuren.

Runnström®^) zoekt de oplossing van het Z-probleem in een permeabiliteitskwestie, daar de remmende werking van toegevoegd fluoride des te sneller verloopt, naarmate de gisting isnbsp;geactiveerd door factor Z-preparaten.

De publicaties van L i e b e n ) kunnen worden gezien als een vervolg op het nog verder voortgezette, reeds vermelde, onderzoeknbsp;van N e u b e r g 27) 69), waarbij bleek, dat ook aminozuren gisting-stimuleerend konden optreden, waarvoor hij onder andere dc decar-boxyleering van het aminozuur aansprakelijk stelde. L i e b e nnbsp;onderzocht de werking van glycocol, alanine en histidine, die,nbsp;zonder toevoeging van andere N-bronnen, een gelijke activeeringnbsp;van de gisting teweeg brachten. Hij vermoedde, dat een voorbijgaande reactie plaats had tusschen suiker en aminozuur, zooalsnbsp;N e u b e r g deze heeft waargenomen bij een fructoseoplossing,nbsp;waarvan het linksdraaiend vermogen sterk vermeerderde, zoodranbsp;bij kamertemperatuur dl-alanine werd toegevoegd. Maar ook hiernbsp;was een optreden van het aminozuur als N-bron niet uitgesloten.

Op alle verdere literatuur over factor Z en gistingsstimuleering

R. K u h n, K. W e s t p h a 1, G. W endt en O. Westphal, Naturwiss. 27, 469 (1939).

®®) S. A. Harris en K. Folkers, J. Am. Chem. Soc. 61, 1245 (1939). ®®) V. H a r t e 11 u s en N. Ni e 1 s s en, Biochem. Z. 298, 125 (1938).

®'') J. Runnström, E. Sperber en E. Karlsson, Arkiv för Kerai, Min. o. geol. 13 B, No. 10, 1 (1939).

®®) F. Li eb en en B. Bauminger, Biochem. Z. 279, 321 (1935) en vroegere publ.

®®) C. Neuberg en M. Kobel, Biochem. Z. 162, 496 (1925).

19

willen wij hier niet ingaan; daarvoor verwijzen wij den lezer naar de oorspronkelijke publicaties

Zooals hierboven reeds kort vermeld, werd het onderzoek naar factor Z ook in het Organisch Chemisch Laboratorium te Utrechtnbsp;ter hand genomen.

De isoleering van biotine door Kögl en Tdnnis^s), gaf aan van Hulssen^i) de gelegenheid om dezen bios-factornbsp;te testen op een Z-werking. Hij ging daarbij te werk volgens denbsp;methode van v o n Euler, waarbij de koolzuurontwikkeling vannbsp;een phosphaat-glucoseoplossing, waarin een bepaalde hoeveelheidnbsp;gist was gesuspendeerd, werd bepaald zonder en bij aanwezigheidnbsp;van factor Z 36) 44), Als gist werd gekozen Ras M, een bovengist,nbsp;die van het „Institut für Garungsgewerbe” te Berlijn destijds wekelijks per vliegpost werd ontvangen. Deze gist had zich bij denbsp;biotine-isoleering als zeer bruikbaar getoond voor de bepaling vannbsp;de activiteit der fracties'^i).

In principe kwam de testmethodiek overeen met de werkwijze, die in een volgend hoofdstuk uitvoerig zal worden beschreven.nbsp;Daarom willen wij thans volstaan met te vermelden, dat denbsp;voedingsoplossing 5 % glucose en 0,5'% phosphaatmengsel bevatte. Nadat gedurende 60 minuten was geschud bij 30°, werdnbsp;de koolzuurontwikkeling in het volgende uur manometrisch bepaald.

Om de verkregen resultaten en de verschillende fracties te kunnen vergelijken, was het wenschelijk een Z-eenheid in te voeren.

Von Euler 34) stelde voor als eenheid de helft van de minimum hoeveelheid stof, die noodig is om de grootst mogelijkenbsp;koolzuurontwikkeling te verkrijgen van 50 mg gist in een suiker-

’^6) H. Zeiler, Biochera. Z. 266, 360 en 367 (1933) en vroegere med.

K. Zipf en K. Rathert, Biochem. Z. 275, 90 (1935).

J. Hanak en L. Schwarz, Chem. Obzor 10, 81 (1935); C. 1935 II, 2966. A. Lasnitzki en E. Szörenyi, Biochem. J. 29, 580 (1935).

J. Dadlez en W. Kokowski, Biochem. Z. 283, 292 (1936).

R. Guillem ent, C. R. hebd. Séances Acad. Sci. 201, 1517; C. 1936 1, 3702.

R. Geoffrey en G. Labour, Bull. Soc. Chim. biol. 19, 922 (1937); C. 1938 II, 4258.

’^^) L. Pons, Dissertatie Utrecht 1938.

20

phosphaatoplossing van constante samenstelling. Een op die wijze gestandaardiseerd preparaat vertoonde echter in de meeste gevallennbsp;bij een nieuwe gistzending een andere activiteit. Daarom was hetnbsp;begrijpelijk, dat naar een andere eenheid werd gezocht, waarbij denbsp;wisselende gevoeligheid van de gist zooveel mogelijk werd uitgeschakeld. Daar de ontwikkelde hoeveelheid koolzuur bij een acti-veering van nul tot ongeveer honderd procent recht evenredig wasnbsp;met de aanwezige hoeveelheid Z-factor, kon van Hulssen^i)nbsp;als Z-eenheid kiezen die hoeveelheid stof, die in een proef gedurende een uur de koolzuurontwikkeling van 50 mg gist in eennbsp;voedingsoplossing van constante samenstelling bij 30° met 50 %nbsp;verhoogde ten opzichte van een tegelijkertijd uitgevoerde test metnbsp;eenzelfde hoeveelheid gist zonder toevoeging van een actief preparaat. In een paar voorproeven werd waargenomen, dat ook gistrasnbsp;M op toevoeging van gistkooksap reageerde met een grooterenbsp;koolzuurontwikkelin g.

Zuivere biotinepreparaten bleken echter totaal geen Z-werking uit te oefenen. In het onderzoek, dat later door E r x 1 e b e n werdnbsp;voortgezet, gelukte het, uitgaande van gistkooksap of Marmite,nbsp;een 10.000-voudige concentreering van een Z-factor te verkrijgen t2). Helaas bleek later dit effect niet meer te reproduceeren,nbsp;hetgeen zeer waarschijnlijk moest worden geweten aan technischenbsp;wijzigingen in de kweekmethode van de gebruikte gist bij hetnbsp;„Institut für Garungsgewerbe”, die juist destijds plaats vonden.nbsp;Ook bestaat de mogelijkheid, dat een zeer snel werkende bios-factornbsp;werd gdsoleerd, die in korten tijd reeds een dergelijke celvermeer-dering veroorzaakte, welke invloed had op de koolzuurproductie.

De pogingen om een gist te verkrijgen, gelijk aan het vroegere ras M, bleven vruchteloos. Dit was de reden, waarom toen naarnbsp;een geheel andere testmethode werd gezocht.

In dit stadium van het onderzoek werd het mijn taak, een goede testmethode voor factor Z uit te werken, waardoor het Z-probleemnbsp;nader tot een oplossing zou kunnen worden gebracht.

F. K ö g 1, Naturwiss. 1937, 468.

HOOFDSTUK II

DE TESTMETHODE

In het laboratorium van I d e te Leuven werd het bios-vraagstuk verder bestudeerd met behulp van een testmethode’^3)^ waarbij denbsp;gisting als maat voor de toegevoegde hoeveelheid bios-factor gold.

In het kort was de werkwijze aldaar als volgt:

Een voedingsoplossing van de samenstelling^{1 2}):

werd per 125 cm® geënt met ongeveer 400.000 gistcellen, een hoeveelheid, die zonder toevoeging van bios-verbindingen, zich niet kon vermeerderen, waardoornbsp;een meetbare koolzuurontwikkeling achterwege bleef.

De kolfjes werden afgesloten met U-vormige glazen buisjes, gevuld met geconcentreerd zwavelzuur, waardoor het koolzuur kon ontwijken, maar denbsp;meegevoerde waterdamp werd geabsorbeerd.

Het groei' en gistingsproces geschiedde in een broedstoof bij 30°, terwijl de kolfjes eenmaal daags werden gewogen.

Als een bios-factor werd beschouwd een of andere verbinding, die bij toevoeging aan de voedingsoplossing, na 3 tot 4 dagen een duidelijke koolzuur-ontwikkeling deed ontstaan.

Het leek nu de moeite waard om na te gaan of door toevoeging van een Z-preparaat een snellere gisting kon worden verkregen,nbsp;want de gisting speelt natuurlijk als een van de beide energie-

1

''3) R. De vlo o. La Celluie 23, 363 (1906).

2

De gebruikte chemicaliën waren van de kwaliteit „pro analyst”.

22

bronnen ook bij de vermeerdering van de gistcellen een grooten rol, alhoewel de ervaring leert, dat de betrekkingen tusschen gistingnbsp;en celvermeerdering — afhankelijk van de gebruikte gist en haarnbsp;kweekmethode — zeer verschillend kunnen zijnes).

Allereerst werd onderzocht de werking van gistkooksap, waardoor een afzonderlijke toevoeging van groeistoffen overbodig was. Wij gebruikten voor al onze proeven een geconcentreerd gistkooksap, dat onder den naam „Marmite” van de Marmite Food Extractnbsp;Co. London in den handel verkrijgbaar is.

Aan 30 cm^ voedingsoplossing van de hiervoor genoemde samenstelling, in kolfjes van ongeveer 50 cm^, werd één cm3 van een Marmite oplossing toegevoegd. Nadat de kolfjes met een watten-prop waren afgesloten, volgde sterilisatie bij 100° gedurende 30nbsp;minuten, hetgeen na twee dagen nog eens werd herhaald.

Als gist werd gebruikt ras 1100, een Wildier s-gist, die werd gekweekt in steriele bierwort. Door verdunnen met steriel waternbsp;ontstond een suspensie, die per druppel ongeveer 100.000 cellennbsp;bevatte.

23

Het enten geschiedde door aan den inhoud van elk kolfje een druppel van bovengenoemde suspensie toe te voegen; tegelijkertijdnbsp;werd de zwavelzuurafsluiting aangebracht. Nadat de kolfjes warennbsp;gewogen, werden deze in een broedstoof bij 25° geplaatst. Daarnanbsp;had telkens na ongeveer 24 uur gewichtscontrole plaats.

De testen werden verschillende malen herhaald, waarbij bleek, dat de verkregen waarden een goede overeenstemming vertoonden.

In figuur 1 zijn de resultaten weergegeven van dergelijke proeven met toevoegingen van 5 tot 20 mg Marmite. (Minder dan 5 mgnbsp;gaf een zeer onregelmatig resultaat, waarom wij deze hoeveelheidnbsp;als een grenswaarde beschouwden.) Tegelijkertijd is in deze figuurnbsp;opgenomen het verloop van de koolzuurontwikkeling wanneer alsnbsp;groeistoffen zijn toegevoegd aneurine en jS-alanine in hoeveelhedennbsp;van 10 y.

Uit het verloop van de krommen was nu op eenvoudige wijze af te leiden, dat, ongeacht de toegevoegde hoeveelheid Marmite,nbsp;de waarneembare koolzuurontwikkeling vrijwel op hetzelfde tijdstipnbsp;begint, namelijk na ongeveer 25 uur. Wel verloopt daarna de gistingnbsp;sneller naarmate er meer Marmite aanwezig is. Of dit aan eennbsp;snellere groei der cellen of aan een factor Z-werking moest wordennbsp;toegeschreven, was aan de hand van deze proeven niet vast tenbsp;stellen.

Het groeiverschijnsel hebben wij later wel nagegaan, waarvoor de troebele voedingsoplossing volgens I d e eerst moest wordennbsp;gefiltreerd, hetgeen zonder invloed was op het gistingsverloop.

Eerst willen wij echter vermelden, dat de chemisch zuivere verbindingen jS-alanine, nicotinezuuramide en asparaginezuur, alleen of in combinatie, geen effect in de I d e-test teweeg brengen, dusnbsp;ook geen groei. Dit was wel het geval met aneurine, maar pas nanbsp;ongeveer 200 uur, welke tijd door toevoeging van ;S-alanine totnbsp;de helft kon worden bekort.

Het was opvallend dat, wanneer er gisting optrad, de geproduceerde hoeveelheid koolzuur per tijdseenheid voor elke test afzonderlijk spoedig een constante waarde kreeg, zooals uit het rechtlijnige verloop der krommen in figuur 1 is te zien. Dit zou ernbsp;op kunnen wijzen, dat de celvermeerdering op een bepaald puntnbsp;tot stilstand kwam, of dat de celvermeerdering gelijken tred hieldnbsp;met het afsterven van oude cellen.

24

Door middel van nephelometrische bepalingen is het groeiproces te volgen. Daar dit soort metingen al sinds jaren in ons laboratoriumnbsp;wordt verricht bij de uitvoering van de biotinetest met behulp vannbsp;een nephelometer volgens Moll'^^)^ Jig reeds uitvoerig doornbsp;Pons'll) is beschreven, zal hier op het meetinstrument zelf nietnbsp;nader worden ingegaan.

Het resultaat van een dergelijke groei- en gistingsbepaling is in de volgende figuur weergegeven:

Figuur 2

Het groei- en gistingsverloop van een I d e-test

De werkwijze voor deze bepalingen was als volgt; een serie kolfjes met 15 cm® voedingsoplossing volgens Ide maar gefiltreerd en 0,5 cm® van denbsp;te testen oplossing werd met gist 1100 geënt, daarna gewogen en vervolgensnbsp;in een schudthermostaat bij 25° geplaatst. Het gewichtsverlies aan CO2 werdnbsp;dagelijks door wegen bepaald. Telkenmale werd dan een kolfje uit de serienbsp;genomen voor een nephelometrische bepaling. Daartoe werd 0,9 cm® van denbsp;goed geschudde gistsuspensie gepipetteerd in 20 cm® van een 0,1 %-ige chloor-

W. J. H. Moll, Versl. Akad. Wetensch. Amsterdam 28, 1001 (1919— 1920).

25

kresol oplossing, waarin de gist direct afsterft. Deze bepalingen alsook alle andere proeven van het geheele onderzoek werden minstens in duplo uitgevoerd ^{1 2}).

Uit het verloop van de krommen was duidelijk te zien, dat, zoodra de extinctie een waarde hooger dan die van de blancoproevennbsp;vertoonde, ook de koolzuurontwikkeling waarneembaar werd. Ditnbsp;gold zoowel voor de proeven met Marmite, als voor die met eennbsp;mengsel van aneurine en ;8-alanine. Terwijl tevens aan de testennbsp;met Marmite kon worden geconstateerd, dat de gisting een constante waarde kreeg zoodra de celvermeerdering tot stilstand wasnbsp;gekomen.

Aan de hand van de verkregen resultaten was het duidelijk, dat een werking van een Z-preparaat pas met succes zou kunnennbsp;worden waargenomen bij een zich niet meer vermeerderend aantalnbsp;cellen met een constante gisting.

Bij den aanvang van de test is immers het groei- en gistingsproces zoo nauw met elkaar verbonden, dat een geactiveerde gisting zeer moeilijk, zoo niet onmogelijk zal kunnen worden opgemerkt,nbsp;vooral als een, nog met groeifactoren verontreinigd, Z-preparaatnbsp;ook snellere groei doet ontstaan. Om deze moeilijkheden te vermijden werd de volgende testmethode ontworpen, die neerkomt opnbsp;een combinatie van de I d e- en de reeds vroeger toegepastenbsp;V o n E u 1 e r-testmethodiek.

In een serie kolfjes met 30 cmS voedingsoplossing en één cm3 gedestilleerd water, waarin 8 mg Marmite**) was opgelost, werdnbsp;bij 26° in de broedstoof een hoeveelheid gist gekweekt, die na ongeveer 100 uur een constante koolzuurontwikkeling van circa 2 mgnbsp;CO2 per uur leverde. Deze hoeveelheid Marmite werd gekozen,nbsp;omdat dan na vier a vijf dagen een behoorlijke hoeveelheid gistnbsp;was gevormd: nephelometrische bepalingen toonden, dat er pernbsp;kolfje op dat tijdstip ongeveer 50 mg gist aanwezig was.

Van een kweeken met minder Marmite werd afgezien om den groeitijd te bekorten, hetgeen ook de reden was waarom niet alsnbsp;groeistoffen aneurine en ^-alanine werden verkozen. Buitendien

1

*) Voor den ijver en de nauwgezetheid, waarmede M e j. M. V i s s e r de nephelometrische- en verschillende gistingsbepalingen voor mij uitvoerde, betuig ik haar hier mijn oprechten dank.

2

Later werd die hoeveelheid op 9 mg Marmite gebracht.

26

hadden vroegere proeven nog getoond, dat een gist, die werd gekweekt op aneurine en (8-alanine, zoodanig veranderde, dat toevoeging van een weinig Marmite geen invloed meer uitoefende op het groei- en gistingsverloop.

Door dagelijks het gewicht van de kolfjes te bepalen, kon uit het verloop van de koolzuurontwikkeling ook het groeiproces wordennbsp;gevolgd. Voor het verdere gedeelte van de test, dat direct na denbsp;laatste gewichtsbepaling plaats vond, werden alleen die kolfjesnbsp;gebruikt, waarvan de waarde der koolzuurafgifte overeenkwam metnbsp;het gemiddelde gewichtsverlies van de geheele serie.

Nadat bij een dergelijk kolfje 1 cm^ oplossing (of gedestilleerd water voor een ,,blanco” ¹)-proef) was gevoegd, werd het aangesloten aan een open-manometer volgens W a r b u r g in een schud-thermostaat bij 26°, die tot op 0,1° nauwkeurig was geregeld. Denbsp;manometers waren gevuld met Brodiesche vloeistof, een oplossingnbsp;van 23 gram keukenzout en 5 gram choleïnezuurnatrium in 500 cm^nbsp;water, die met een weinig eosine was gekleurd. Het gebruik vannbsp;een dergelijke oplossing vergemakkelijkte het aflezen van den standnbsp;der manometers buitengewoon, daar de glaswand beter wordt bevochtigd.

De gisting verliep nu bij een druk vrijwel gelijk aan dien van de buitenlucht, waarbij het kweekproces ook had plaats gevonden.nbsp;Wel bestaat de mogelijkheid van koolzuurabsorptie in de mano-metervloeistof, maar, daar wij de gistingsactiveering steeds berekenen ten opzichte van een tegelijkertijd uitgevoerde blanco-proef,nbsp;waarbij eveneens absorptie plaats zal vinden, meenen wij den invloed van dit verschijnsel, zeker bij een biologische test, te kunnennbsp;verwaarloozen.

Het aantal schommelingen per minuut bedroeg honderd. Alvorens de eigenlijke meting, die twee uur duurde, een aanvang nam, moesten de kolfjes met inhoud een uur worden geschud,nbsp;waarna de gisting een regelmatig verloop had gekregen. Tijdensnbsp;het aflezen van den stand der manometers, dat elk uur geschiedde,nbsp;moest de schudinrichting worden gestopt.

De waarden van de resultaten, vermeld in tabel I, alhoewel geens-

1

Deze uitdrukking zullen wij kortheidshalve altijd bezigen bij proeven, waar uitsluitend gedestilleerd water aan de voedingsoplossing wordt toegevoegd.

27

zins van gelijke grootte, toonden toch wel, dat de gevoeligheid van het zelfgekweekte ras 1100 zeer gering was.

Tabel I

Het factor Z-effect bij gistras 1100, dat op Marmite was gekweekt

Tabel II

Het factor Z-effect bij, op Marmite gekweekt gistras M en ras No. 1169, in vergelijking met dat bij het technische ras M

Op gelijke wijze werden een andere Wildier s-gist: ras No. 1169 en ras M gekweekt, maar het resultaat was ongeveernbsp;gelijk aan dat van ras 1100. De gevoeligheid voor factor Z is bijnbsp;een fabrieksproduct veel grooter, want 25 mg gist van het tech-

1

Kortheidshalve zullen wij dikwijls ook in het vervolg Marmite aangeven met M.

2

Bepaald volgens de formule van pag. 30.

28

nische ras M in 31 cm^ voedingsoplossing gaf onder volkomen gelijke condities van de manometertest met 10 mg Marmite eennbsp;activeering van 42 % en met 25 mg Marmite zelfs 61 %.

Nu was het wel duidelijk, dat een gist, gekweekt volgens de methode van I d e, eigenschappen had, welke volkomen afwekennbsp;van die van een technisch product. Niet alleen dat de verkregennbsp;waarden groote schommelingen vertoonden, maar ook de Z-eenheidnbsp;(50 ‘% gistingsvermeerdering) werd nimmer bereikt.

Daar deze test bovendien voor een standaardmethode te veel tijd bleek te vereischen, werd het tot nu gevolgde principe geheelnbsp;verlaten.

Daarom werd opnieuw de reeds bekende werkwijze van v o n E u 1 e r 44) met een in den handel verkrijgbare gist aan een nauwkeurig onderzoek onderworpen.

a. De voedingsoplossing

De voedingsoplossing werd, in afwijking van de vroeger gebruikelijke, samengesteld op de door Reader’^5) aangegeven wijze. Alleen het glucose-gehalte werd verhoogd, opdat tijdens denbsp;test nimmer een gebrek aan suiker zou kunnen ontstaan. Zoodoende werd de samenstelling: ^{1 2})

Een groote hoeveelheid van deze oplossing werd twee maal gedurende 30 minuten gesteriliseerd en in een ijskast bewaard.

1

''®) V. Reader, Biochem. J. 21, 904 (1927).

2

De gebruikte chemicaliën waren van de kwaliteit „pro analyst”.

29

b. Dc uitvoering van de von Eule r-test )

Een willekeurig afgewogen hoeveelheid gist werd gesuspendeerd in zoo veel voedingsoplossing, van de hiervoor aangegeven samenstelling, dat per cm^ oplossing 50 mg gist aanwezig was. Dezenbsp;suspensie werd in een fleschje bij kamertemperatuur gedurendenbsp;15 minuten krachtig geschud, waarna het afgesloten fleschje nognbsp;ongeveer 40 minuten bij dezelfde temperatuur bleef staan. In diennbsp;tusschentijd werden de proefkolfjes, die een inhoud hebben vannbsp;50 cm3, voorzien van één cm3 oplossing, die op haar Z-activiteitnbsp;moest worden onderzocht.

Vervolgens werd nauwkeurig 1 cm3 van de telkens opnieuw geschudde gistsuspensie in elk kolfje gepipetteerd op een dusdanig tijdstip, dat de kolfjes precies na 60 minuten, gerekend van hetnbsp;tijdstip waarop de gist aan de voedingsoplossing werd toegevoegd,nbsp;in den schudthermostaat konden worden geplaatst.

Deze schudthermostaat was ingericht voor 12 proefkolfjes. De temperatuur werd op 30° (± 0,1°) gehouden, terwijl geschudnbsp;werd met een tempo van ongeveer honderd schommelingen pernbsp;minuut. De koolzuurontwikkeling werd weer manometrisch bepaald,nbsp;terwijl als manometervloeistof de reeds eerder beschreven Brodieschenbsp;oplossing diende.

De beginstand van de manometers werd 15 minuten na het plaatsen van de kolfjes in den schudthermostaat af gelezen. Denbsp;verdere bepalingen hadden telkens om de 15 minuten plaats, waardoor ook het tusschentijdsche verloop der gisting kon wordennbsp;waargenomen. Nadat de kolfjes 60 minuten waren geschud, wasnbsp;de koolzuurproductie bekend tijdens de laatste 45 minuten. Dezenbsp;waarde werd met 4/3 vermenigvuldigd, waardoor de koolzuurontwikkeling werd verkregen, die plaats had in het „eerste uur”.nbsp;Van deze formuleering werd nooit afgeweken. De waarde voornbsp;het „tweede uur” was direct als verschil van twee manometer-standen te bepalen.

Bij elke serie van twaalf kolfjes waren er steeds twee, een aan het begin en een aan het eind van de reeks, waarbij één cm®nbsp;gedestilleerd water aan de gistsuspensie was toegevoegd, ter bepaling van de blanco-gisting.

30

c. Dc gist

Elk gistmonster werd na ontvangst op het laboratorium fijn verdeeld en in een koelkast bewaard. Een dergelijke zending diendenbsp;hoogstens acht achtereenvolgende dagen voor de test en werdnbsp;daarna vervangen door een nieuwe hoeveelheid. Daar de gewonenbsp;testduur in den regel slechts drie uren bedroeg, was de kans,nbsp;dat vreemde micro-organismen tot ontwikkeling zouden komen,nbsp;zeer gering.

De gewone bakkersgisten, Hollandia- en Koningsgist, alsook de bier gisten van Heineken en De Drie Hoefijzers werden in vergelijking met elkaar onderzocht. Tegelijkertijd vonden ook bepalingen plaats van het toenmalige gedrag van ras M. De resultatennbsp;waren:

De biergisten bleken totaal ongeschikt voor een test op factor Z, want zelfs in het tweede uur kon met 20 a 25 mg Marmite slechtsnbsp;een activeering van ongeveer 28,% worden verkregen.

De resultaten met Koningsgist en ras M waren veel beter. Hollandiagist vertoonde een vrij hooge spontane gisting, die doornbsp;Marmite slechts in geringe mate kon worden verhoogd.

31

Overigens blijkt ook nog uit de waarden van tabel III, dat alleen in het eerste uur kan worden gesproken van een maximale gisting,nbsp;zooals V o n E u 1 e r 32) dit begrip had ontwikkeld, waarop wij innbsp;het derde hoofdstuk nog terugkomen.

Hollandiagist verkrijgt reeds door een toevoeging van 5 mg Marmite zijn maximale gistingsvermogen, hetgeen doet vermoeden,nbsp;dat het den gistcellen bij hun kweekproces aan niet veel mankeert,nbsp;tenzij de cellen van deze gistsoort zelf in staat zijn de noodigenbsp;stoffen te synthetiseeren. Daarom werd van het gebruik van Hol-landia-gist voor de test afgezien.

De uitkomsten, verkregen met Koningsgist in vergelijking met ras M, waren zoodanig, dat een keuze voor het verdere werknbsp;moeilijk was te nemen. Aanvankelijk werden dan ook de meestenbsp;proeven met beide gistsoorten verricht; later moest door bijzonderenbsp;omstandigheden dikwijls alleen Koningsgist worden gebruikt.

Tot dusverre waren in het Utrechtsche laboratorium de Z-testen zoo uitgevoerd, dat de verhoogde koolzuurontwikkeling in het,nbsp;door mij genoemde, tweede uur werd bepaald. Niet alleen denbsp;ervaring, dat juist dan de waarde van de activiteit eenige tientallennbsp;procenten kan verschillen, maar ook de toen nog onbekende oorzaaknbsp;van die geweldige activeering, deed ons besluiten, de gisting innbsp;het éérste uur voor de Z-test te gebruiken,

De veronderstelling, dat er reeds in het tweede uur bij aanwezigheid van Marmite celvermeerdering optrad, kon later zoowel nephelometrisch bij ras M, als met telproeven bij Koningsgist wordennbsp;bewezen.

De nephelometrische test werd als volgt uitgevoerd:

Een serie van 14 kolfjes werd op de gebruikelijke wijze voorzien van elk 25 mg gist en een onderling gelijke hoeveelheid Marmite. Zoo ook een blanconbsp;serie. Aan het begin van het eerste uur werden twaalf kolfjes in den schud-thermostaat geplaatst, terwijl de gist in de overblijvende kolfjes werd gedoodnbsp;met 45 cm® chloorkresoloplossing. De totale inhoud van de verkregen 47 cm®nbsp;was voldoende voor een nephelometrische bepaling in duplo; van het tweedenbsp;kolfje werd een andere waarde verkregen, die met de eerste goed overeenstemde.nbsp;Van de overige kolfjes werd de gisting op de normale wijze bepaald, terwijlnbsp;tijdens het aflezen van de manometerstanden telkens twee kolfjes werden verwijderd om nephelometrisch te worden gemeten.

Het eenige verschil met de gewone test bestond hierin, dat er in plaats van

32

50 mg gist per kolfje, 25 mg aanwezig was, omdat de verkregen extinctie-waarde voor 50 mg erg hoog was, namelijk ± 85 Q.

De uitkomsten van een paar nephelometrische bepalingen zijn in tabel IV ondergebracht.

De extinctiewaarden geven niet direct den procentueelen groei aan. Deze werd bepaald aan de hand van figuur 3, waarin denbsp;kromme is samengesteld door de extincties van verschillende suspensies uit te zetten tegen de ingewogen hoeveelheden gist.

De resultaten, zooals die in tabel IV zijn vermeld, duiden wel aan, dat er vooral bij aanwezigheid van Marmite celvermeerderingnbsp;heeft plaats gevonden. Maar men mag niet over het hoofd zien,nbsp;dat een hoogere nephelometerwaarde twee oorzaken kan hebben,nbsp;namelijk:

1. celvergrooting, hetgeen den groei verklaart, wanneer er geen Marmite wordt toegevoegd. Het verschijnsel werd overigensnbsp;ook onder den microscoop geconstateerd;

33

2. celvermeerdering, die het surplus van de Marmite werking boven den blanco-groei moet verklaren.

Figuur 3

Het verband tusschen het aantal mg gist in 47 cm® vloeistof en de troebelingswaarde in fl

Dat wij inderdaad in het tweede uur reeds rekening moesten houden met celvermeerdering, werd nog bevestigd door telproeven,nbsp;die van Koningsgist met een Bürker-Zeiss telkamer werden uitgevoerd. Het resultaat daarvan is in tabel V opgenomen.

Tabel V

Telproeven van 50 mg Koningsgist met de Bürker-Zeiss telkamer. (Het aantal cellen moet telkens met 2,5 millioen worden vermenigvuldigd.)

34

De gist in de 2 cm® testoplossing werd gedood met 23 cm® chloorkresol-oplossing. Van de aldus verkregen suspensie werd met behulp van een pipet een druppel in de telkamer gebracht. Vervolgens had de telling plaats van denbsp;gistcellen in 40 hokjes van V400 mm^, waarbij ook de dochtercellen, zoodra dezenbsp;de grootte van ± ^/s der moedercel hadden bereikt, als afzonderlijke cellennbsp;werden beschouwd. Daar de telkamer een hoogte had van 0,1 mm, had elknbsp;vakje een inhoud van 0,00025 mm®. Het totaal aantal cellen bedroeg zoodoendenbsp;25000 mm®

0,00025 mm®

Het enorme activeeringspercentage in het tweede uur zou misschien een veel grootere celvermeerdering doen verwachten, maar de activiteit wordt berekend op de blanco-gisting met een gelijknbsp;gebleven cellental, terwijl bij de geactiveerde gisting ook de nieuwnbsp;gevormde cellen meewerken aan een maximale gisting.

Daardoor is het activeeringspercentage in het tweede uur zeker geflatteerd, terwijl de procentueele celvermeerdering eerder aan dennbsp;lagen kant is, doordat ook doode cellen, zoowel nephelometrischnbsp;als in de telkamer, hun waarde doen gelden.

Thans kon met zekerheid worden geconcludeerd, dat het gistings-verloop vooral in het eerste uur voor de Z-werking kenmerkend is.

Op dit tijdstip moesten de proefnemingen wegens buitengewone omstandigheden gedurende 15 maanden worden gestaakt.

HOOFDSTUK III

DE INVLOED VAN BIOS-FACTOREN OP DE GISTING

Bij de voortzetting van het onderzoek werd rekening gehouden met de mogelijkheid, dat factor Z identiek kan zijn met één vannbsp;de thans bekende bios-factoren of dat deze factor een combinatie isnbsp;van enkele dier verbindingen.

Voor een dergelijk onderzoek kwamen in aanmerking aneurine (vitamine Bj), adermine (vitamine Be), pantotheenzuur, biotine ennbsp;meso-inosiet, terwijl verder nog de werking van lactoflavine (vitamine B2), ascorbinezuur (vitamine C), cozymase, y8-alanine ennbsp;nicotinezuuramide afzonderlijk en in combinatie met de genoemdenbsp;bios-factoren kon worden nagegaan.

Om een aansluiting met de reeds besproken resultaten te verkrijgen, was het noodzakelijk de werking van Marmite op Konings-gist en ras M opnieuw te onderzoeken.

36

In vergelijking met tabel III vertoont ras M vrijwel hetzelfde gedrag als vroeger. Koningsgist heeft echter een lagere blanco-gisting met een grootere gevoeligheid voor Marmite gekregen.

Deze laatste ondervinding, met het verschijnsel dat de activee-ringswaarde van later ontvangen gistmonsters van ras M aan groote schommelingen onderhevig was, waaraan de transportduur van 7 totnbsp;10 dagen, onder de gewijzigde omstandigheden, zeker niet vreemdnbsp;zal zijn geweest, deed ons besluiten het onderzoek in hoofdzaak metnbsp;Koningsgist (van de Nederlandsche Gist- en Spiritusfabriek tenbsp;Delft) uit te voeren.

Toch bleek ook de werking van Koningsgist in een tijdsverloop van ongeveer negen maanden niet constant. Dit was onder anderenbsp;merkbaar aan een langzaam verminderende blanco-gisting, die hetnbsp;volgende verloop had:

Reeds eerder werd opgemerkt, dat alleen in het eerste uur van een maximale gisting kan worden gesproken. Dit bleek nóg hetnbsp;geval te zijn, terwijl tevens werd waargenomen, dat de minimalenbsp;hoeveelheid Marmite noodig voor een totaal geactiveerde gistingnbsp;met den tijd verschoof naar grootere Marmite-concen tra ties. Ditnbsp;laatste is waar te nemen aan het volgende voorbeeld, dat ook innbsp;teekening is gebracht:

37

Tabel VIII

De werking van Marmite bij ras M

*) Door omstandigheden werd de COe-ontwikkeling van 15 tot 30 minuten niet bepaald.

Figuur 4

De werking van Marmite bij ras M

38

De waargenomen verschijnselen bevestigden onze veronderstelling, dat de maximaal geactiveerde gisting door minstens twee factoren wordt beïnvloed. In de eerste plaats zal de permeabiliteitnbsp;van den celwand de opneming in de cel regelen van de versnellendenbsp;factoren, terwijl verder een toenemend aantal cellen ook eennbsp;grootere hoeveelheid actieve stoffen noodig zal hebben. Beidenbsp;factoren kunnen geheel of gedeeltelijk dit verloop van de maximalenbsp;activeering verklaren.

Vervolgens werden de, in het begin van dit hoofdstuk genoemde verbindingen aan het gistingsmilieu toegevoegd met resultaten, dienbsp;achtereenvolgens zullen worden beschreven.

a. De toevoeging van aneurine (vitamine Bj)

De hoeveelheden, die aan de twee cm^ testoplossing werden toegevoegd, variëerden tusschen 0,002 y en 2 mg. Een quantitatief effect, zooals S c h u 11 z 60) en H e y n s 6i) dit opmerkten bij denbsp;door hen gebruikte Fleischmann-gist, bleef zoowel bij Koningsgistnbsp;als bij ras M volkomen achterwege.

De bereikte activeering was zeer gering, maar vrijwel constant voor hoeveelheden variëerende tusschen 0,5 y en 2 mg. Vandaarnbsp;dat bij latere proeven werd volstaan met een toevoeging van 1 totnbsp;8 y aneurine.

b. De toevoeging van adermine (vitamine Bg)

Adermine, als chloorhydraat, had in hoeveelheden tusschen 2 en

39

500 y geen enkele werking op ras M; Koningsgist vertoonde wel eenige activiteit: in het tweede uur werd met dezelfde hoeveelheden een gistingsversnelling bereikt van ongeveer 10 %, meernbsp;dan 500 y adermine deed die activeering weer verminderen.

c. nbsp;nbsp;nbsp;De toevoeging van meso-inosiet

De aanwezigheid van meso-inosiet (200 tot 800 y) in het gistingsmiiieu kon in het geheel geen verandering in de koolzuur-ontwikkeling teweeg brengen, zoodat wij de werking van meso-inosiet, die von Euler ^6) bij de door hem gebruikte gist opmerkte, niet konden bevestigen.

d. nbsp;nbsp;nbsp;De toevoeging van biotine *)

Indien zuiver biotine, als methylester, werd toegevoegd, verminderde de gisting van ras M met een waarde van enkele procenten, terwijl bij Koningsgist in dezelfde concentraties — 10 tot 50 ynbsp;per 2 cm3 — een zeer geringe activeering van de koolzuurontwik-keling viel waar te nemen. Dit eigenaardige gedrag van biotinenbsp;zal later worden behandeld.

In het algemeen komt dit resultaat overeen met dat van van Hulssen^i), hetwelk met een niet-gekristalliseerd preparaat was verkregen.

c. De toevoeging van dl-pantotheenzuur **)

Als Na-zout werd deze stof bij de gistende oplossing gevoegd. Ook hier werd de werking nagegaan op Koningsgist en ras M.

Het biotine werd mij welwillend door den Heer J. H. Verbeek ter beschikking gesteld, waarvoor ik hem hierbij mijn welgemeenden dank betuig.

I Dit preparaat werd, evenals het aneurine, adermine en het later te behandelen ay-dioxy-^/3-dimethylboterzuurlacton, 2-methyl-5-methylamine-6-aminopyrimidine en 4-methyl-5,0-oxyaethylthiazool, ontvangen van de I. G. Farbenindustrie, Werk Eiber fe ld, waarvoor ik mijnnbsp;bijzonderen dank betuig.

40

Tabel X

De gistingsactiveering door pantotheenzuur van Koningsgist en ras M

Hoeveelheden van 2,5 y tot 625 y hadden bij beide gistsoorten totaal geen werking.

' nbsp;nbsp;nbsp;Figuur 5

De werking van pantotheenzuur bij Koningsgist en ras M

Zooals uit de figuur, die bovenstaande tabel in beeld brengt, duidelijk is te zien, vertoont de gistingswaarde van beide gistsoorten een maximum bij de toevoeging van 5 a 10 mg pantotheen-

41

zuur, alleen met dit verschil, dat Koningsgist in het algemeen veel sterker reageert op de aanwezigheid van dezen factor.

De benoodigde hoeveelheden om een dergelijk effect te bereiken waren echter groot; in het verdere gedeelte zal blijken, dat eennbsp;co-factor een belangrijke pantotheenzuurbesparing kan geven.

W i 11 i a m s heeft ook een gistingstimuleerende werking van pantotheenzuur waargenomen 57)^ waarvan hij echter niet een alsnbsp;door ons verkregen maximum vermeldt.

f. De toevoeging van lactoflavine (vit. B2), ascorbinezuur (vit. C), cozymase» /S-alanine en nicotinezuuramide ¹)

Geen tot 7 % activeering geeft lactoflavine aan de beide gist-soorten in een concentratie van 0,02—50 y. Daar bij de biologische testmethode rekening moet worden gehouden met een fout vannbsp;ongeveer 5 %, kan de werking van lactoflavine worden verwaarloosd.

Ascorbinezuur had in het geheel geen invloed op het gistings-verloop (Konings gist).

Dit was eveneens het geval als een cozymase-preparaat (per gram 290.000 co) in hoeveelheden, variëerend tusschen 20 y ennbsp;500 y werd toegevoegd, hetgeen in overeenstemming was met hetnbsp;resultaat, dat von Euler^^) 33) vroeger had verkregen.

Zooals te verwachten was, had nicotinezuuramide, dat door een hydrolytische splitsing van cozymase is te verkrijgen, geen belangrijke invloed op het verloop van de koolzuurontwikkeling. Hoeveelheden kleiner dan ongeveer 500 y werkten zelfs remmend op denbsp;gisting, 1 mg veroorzaakte slechts gemiddeld 5 % activeering, terwijlnbsp;4 mg het niet verder bracht dan 20 %,

Schultz heeft ook een dergelijk resultaat met nicotinezuuramide verkregen '^®).

Het effect, dat j8-alanine veroorzaakte, was minder dan werd verwacht. Door W i 11 i a m s werd aangetoond, dat /3-alanine een

1

Deze stoffen werden in hun werking hoofdzakelijk op ras M getest.

78) A. S. Schultz, L. Atkin en C. N. F r e y, ]. Am. Chem. Soc. 60, 1514 (1938).

42

belangrijk deel uitmaakt van pantotheenzuurterwijl het ook gedeeltelijk de groeiwerking van dezen factor kan bewerkstelligen'^8). De bereikte percentages voor hoeveelheden tusschennbsp;200 y en 1,6 mg bleven beneden de 5 % en moesten dus wordennbsp;verwaarloosd.

g. Gelijktijdige toevoeging van bovengenoemde verbindingen

Daar ook met de mogelijkheid rekening werd gehouden, dat de factor Z-werking zou kunnen worden verkregen door een combinatie van groeifactoren met of zonder andere verbindingen, werdennbsp;verschillende mengsels op hun Z-activiteit getest.

Het aantal mogelijkheden is legio, vooral omdat ook de gewichtsverhoudingen kunnen worden gevariëerd.

Het hier volgende overzicht kan dan ook geenszins aanspraak maken op volledigheid. Wel meenen wij de belangrijkste combinatiesnbsp;te hebben onderzocht.

Pantotheenzuur had getoond een Z-actieve verbinding te zijn. Al spoedig bleek dat aneurine een belangrijk ,,pantotheenzuur-besparende” werking had, zoowel bij het gebruik van Koningsgistnbsp;als van ras M.

43

Als voorbeeld van een dergelijke pantotheenzuur-besparende werking van aneurine wordt het resultaat van een test metnbsp;Koningsgist in onderstaande tabel XII met bijbehoorende figuur 6nbsp;volledig weergegeven.

Tabel XII

De gistingsactiveering door pantotheenzuur met en zonder aneurine

Figuur 6

De gistingsactiveering door pantotheenzuur met en zonder aneurine

44

Daar in dit voorbeeld de resultaten zijn vermeld van één uitgevoerde test, wijken de percentages eenigszins af van die van tabel XI, welke de gemiddelde cijfers geeft van alle uitgevoerdenbsp;testen met dezelfde toevoeging. Dit laatste geldt voor allenbsp;tabellen van dit proefschrift, die uitsluitend het Z-effect in procentennbsp;vermelden.

Tevens werden beproefd mengsels van pantotheenzuur met /3-alanine, nicotinezuuramide en cozymase, doch zonder effect.

Ook grootere (tot ruim 2 mg) en kleinere hoeveelheden aneurine zijn nog toegevoegd aan pantotheenzuur, maar voor beide gist-soorten bleek, dat de co-werking achterwege bleef bij de aanwezigheid van minder dan 1 y aneurine, terwijl grootere aneurine-concentraties de co-werking niet verhoogden.

Bij het verdere onderzoek werd het mengsel van 1 mg pantotheenzuur met 8 y aneurine in vele gevallen als een standaardmengsel gekozen.

Een verdere menging met adermine, y8-alanine, lactoflavine, cozymase, nicotinezuuramide en biotine leverde geen resultaat.

Het j8-alanine, dat geen noemenswaardig Z-effect veroorzaakte, bleek evenals het pantotheenzuur bij gebruik van aneurine als coverbinding, een niet te verwaarloozen werking uit te oefenen. Eennbsp;verdere toevoeging van adermine was ook hier zonder succes. Innbsp;tabel XIII zijn deze resultaten weergegeven.

45

pantotheenzuur kan worden bereikt, voor een zeer belangrijk deel aan het ;8-alanine gedeelte van het pantotheenzuur moet wordennbsp;toegeschreven, evenals dit het geval is bij de groeiwerking vannbsp;dit zuur'^8). Deze overtuiging wordt nog versterkt door het feitnbsp;dat jS-alanine in kleine hoeveelheden geen invloed heeft op hetnbsp;Z-effect, dat door middel van pantotheenzuur wordt verkregen.

Dat het andere bestanddeel van pantotheenzuur geen invloed op de gisting uitoefent, werd nog proefondervindelijk bewezen doornbsp;500 y van het ay-dioxy-j8^-dimethylboterzuurlacton met aneurinenbsp;toe te voegen, waarbij slechts de ane'urineactiviteit werd bereiktnbsp;(zie tabel XXI).

Van alle onderzochte combinaties moeten tenslotte nog die worden vermeld, waarin nicotinezuuramide als voornaamste bestanddeel aanwezig is.

Tabel XIV

De werking van nicotinezuuramide met en zonder aneurine bij gistras M

Deze werking van nicotinezuuramide was des te meer verrassend, daar cozymase, waarvan het nicotinezuuramide deel uitmaakt, geennbsp;werking vertoonde. De activeering door de betrekkelijk grootenbsp;hoeveelheden nicotinezuuramide zal waarschijnlijk berusten opnbsp;diep ingrijpende veranderingen van de oxydo-reductie systemen,nbsp;die in de cellen aanwezig zijn.

Ook in vergelijking met het reeds genoemde onderzoek van Schultz'^®), die eveneens het effect van nicotinezuuramide-

46

toevoeging bestudeerde op een al aanwezige aneurine-werking bij Fleischmann-gist, zijn de voor gistras M benoodigde hoeveelhedennbsp;erg groot.

Maar ook een mengsel van alle bekende bios-factoren vertoonde geen verrassend groote werking ten opzichte van die, welke door hetnbsp;aneurine-pantotheenzuur mengsel werd verkregen, zoodat wij toennbsp;laatstgenoemd paar verbindingen wel als een voornaam bestanddeelnbsp;van factor Z moesten opvatten.

Of het mengsel aneurine-pantotheenzuur geheel verantwoordelijk kan worden gesteld voor de verhoogde koolzuurontwikkeling, dienbsp;met Marmite wordt verkregen, werd nagegaan door, behalvenbsp;Marmite, ook genoemd mengsel aan het gistingsmilieu toe te voegen.

Zooals uit tabel XVI blijkt, moet de werking van het mengsel worden gezien als een verschijnsel, waarbij Marmite en de combinatie pantotheenzuur-aneurine vrijwel onafhankelijk van elkandernbsp;op de gisting inwerken, of wij zouden een gehalte van 20 % 1( )nbsp;pantotheenzuur in Marmite moeten veronderstellen, hetgeen zeernbsp;onwaarschijnlijk is, daar, volgens de ervaringen van W i 11 i a m s ’^9),

'^9) R. J. Williams, J. H. T r u e s d a i 1, H. H. W e i n s t o c k Jr., E. Roh r man, C. M. Lyman en C. H. Mc Burney, J. Am. Chem.nbsp;Soc. 60, 2719 (1938).

47

lever slechts 0.004 % pantotheenzuur bevat, maar toch het meest geschikte uitgangsmateriaal is voor de isoleering van dit zuur.

Alhoewel von Euler 33) geen resultaat door toevoeging van mengsels van aminozuren had verkregen, meenden wij bij onzenbsp;testmethode met een voedingsoplossing, die meer aan het natuurlijkenbsp;gistingsmilieu is aangepast, de aminozuren als eventueele co-verbindingen niet te mogen verwaarloozen.

HOOFDSTUK IV

DE INVLOED VAN AMINOZUREN OP DE GISTING

De technische gistsoorten kunnen, afhankelijk van de kweek- en voedingsomstandigheden, een eiwitgehalte hebben, dat schommeltnbsp;tusschen 22 en 67 %, terwijl ook het vet- en glycogeengehalte zeernbsp;verschillend kan zijn. Tot dusverre heeft men nog geen verbandnbsp;gevonden tusschen eiwitgehalte en gistingsvermogen, daar gistnbsp;met hoog eiwitgehalte een geringe gisting kan veroorzaken, terwijlnbsp;het omgekeerde: laag eiwitgehalte en een groote gisting, ook kannbsp;voorkomen 80),

Dat echter een zoo belangrijk celbestanddeel als eiwit geen rol bij de gisting zou spelen, leek ons onwaarschijnlijk, temeer daar ernbsp;wel een omgekeerde evenredigheid blijkt te bestaan tusschen hetnbsp;glycogeen- en eiwitgehalte terwijl verschillende onderzoekingennbsp;ook al een verband hebben gelegd tusschen de aanwezigheid vannbsp;a-aminozuren en de groei van gist 52) 82) 83), Bovendien zijn verschillende aminozuren van belang als stikstofbron voor de gist 84).

Daar dit gedeelte van het onderzoek werd aangevangen met de bedoeling na te gaan of het mengsel pantotheenzuur-aneurine doornbsp;de co-werking van een aminozuur een nog grootere activeering zounbsp;kunnen bewerkstelligen, werden drie mengsels van elk vijf verschillende aminozuren met en zonder de pantotheenzuur-aneurine-combinatie getest.

De verkregen resultaten toonden onomstootelijk aan, dat amino-

80) 2ie 43) en wel Deel I, pag. 244.

*4) Zie 43) en .^^gl Deel I, pag. 254.

N. Nielsen en V. H a r t e 1 i u s, Biochem. Z. 295, 211 (1938), 296, 359 (1938) en 301, 125 (1939).

®®) R. J. Williams, R. E. Eakin en E. E. Snell, J. Am. Chem. Soc. 62, 1204 (1940).

®4) V. Hartelius, Biochem. Z. 299, 317 (1938).

49

zuren — althans onder de omstandigheden, zooals wij die hadden gekozen — een effect op de gisting hadden. Vooral de aminozurennbsp;van oplossing I geven zoowel met als zonder het aneurine-panto-theenzuurmengsel een onverwacht hooge stimuleering van denbsp;gisting.

50

Om nu een inzicht te verkrijgen in de werking van de aminozuren afzonderlijk, werden allereerst de vijftien aminozuren van bovengenoemde oplossingen elk apart onderzocht.

Aan de hand van de resultaten, die in onderstaande tabel zijn vermeld, zullen wij achtereenvolgens die aminozuren nader bespreken, welke een werking op de gisting uitoefenen.

Tabel XVIII

De invloed van aminozuren afzonderlijk op de gisting met en zonder het aneurine-pantotheenzuurmengsel

a. Glycine (Glycocol)

Ook bij afwezigheid van het pantotheenzuur-aneurinemengsel toont glycine een zeer groote Z-activiteit *). Nog meer dan dit metnbsp;pantotheenzuur-aneurine het geval is, treedt het verschijnsel

Wij hebben gebruik gemaakt van een meermalen gekristalliseerd glycine-preparaat en van verschillende producten van andere herkomst, zoodat een verontreiniging niet de oorzaak kan zijn van het glyclne-effect.

51

duidelijk naar voren in het tweede uur van onze test. Bij het gebruik van Koningsgist wordt de werking van het pantotheenzuur-aneurinemengsel zelfs verre overtroffen door die van ± 300 ynbsp;glycine. Bij ras M daarentegen kunnen wij, omdat de gistingnbsp;weinig stijgt bij een toevoeging van uitsluitend glycine, een co-werking van de pantotheenzuur-aneurine-combinatie aannemen ofnbsp;omgekeerd glycine als een co-factor beschouwen van het panto-theenzuur-aneurinemengsel.

Helaas bleek de hoedanigheid van gistras M in dit tijdvak der proefnemingen zóó onregelmatig, dat van een verder gebruik vannbsp;deze gistsoort moest worden afgezien.

Het glycine-effect bij een test met Koningsgist komt heel duidelijk naar voren in onderstaande tabel, die gedeeltelijk in figuur 7 innbsp;teekening is gebracht:

Tabel XIX

De invloed van glycine op de gisting van Koningsgist met en zonder aneurine of het aneurine-pantotheenzuur-mengsel

Zooals reeds opgemerkt, vertoont glycine pas langzamerhand zijn volledige werking. Om dit te verklaren moeten wij denken aannbsp;een invloed op de permeabiliteit van den celwand, of aan een

52

opbouw door de gistcel van een voor de gisting belangrijke verbinding, waarbij glycine een rol speelt als bouwsteen. Dat de laatste veronderstelling het meest waarschijnlijk is, zou pas door het verderenbsp;onderzoek worden bewezen. Op de later weer terugloopendenbsp;gistingsactiveering van 100 y glycine komen wij nog terug.

*eyB,

*8yB,

tSy B,

*8y B,*1mgRz.

Figuur 7

De invloed van glycine op de gisting (zie tabel XIX)

Eerst dachten wij aan de mogelijkheid, dat een pantotheenzuur-derivaat met behulp van glycine en het in de cel aanwezige panto-theenzuur werd gesynthetiseerd, waarvoor 200 y glycine meer dan voldoende was.

53

Tabel XX

De invloed van de combinatie glycine, aneurine en pantotheenzuur op de gisting

Zooals uit de waarden van tabel XX is te zien, wordt de werking van toegevoegd pantotheenzuur pas maximaal, als er een hoeveelheid van 1 mg dl-pantotheenzuur aanwezig is naast ±; 300 ynbsp;glycine. Wanneer wij verder aannemen, dat ook bij de gistingnbsp;alleen het ( )zuur werkzaam is 8^) ®®), dan zullen waarschijnlijknbsp;vrijwel dezelfde molaire hoeveelheden beschikbaar zijn voor eennbsp;effect, dat grooter is dan dat, waartoe de cel zelf, met het daarinnbsp;aanwezige pantotheenzuur, in staat is met minder dan 200 y glycine.

Pantotheenzuur is op te bouwen uit jS-alanine en ay-dioxy-j8y8-dimethylboterzuur:

CHs

CHjOH—C—CHOH—CO—NH—CHj—CH, —COOH CH3

ar-dioxy-;S/S-dimethyl- nbsp;nbsp;nbsp;,S-alanine

boterzuur

Nu zou een Z-actief „nor-pantotheenzuur” in plaats van de, voor de gisting minder belangrijke, jS-alanine-groep, in pantotheenzuur, glycine kunnen bevatten.

Volgens de methode van Kuhn en Wieland'^s) werd de

E. T. Stiller, S. A. Harris, J. F i n k e 1 s t e i n, ]. C. K e r e s z t e s y en K. Folkers, J. Am. Chem. Soc. 62, 1784 (1940).

R. Kuhn en Th. Wiel and, Ber. 73, 1134 (1940).

®'t) E. T. Stiller, J. C. K e r e s z t e s y, J. F i n k e 1 s t e i n, J. Am. Chem. Soc. 62, 1779 (1940).

®®) R. Kuhn en Th. Wieland, Ber. 73, 971 (1940).

54

benzylester van glycine gecondenseerd met het lacton van ay-dioxy-/3j8-dimethylboterzuur. Het verkregen product, gehydreerd met platina-oxyde als katalysator, leverde het ruwe nor-pantotheen-zuur op als een lichtgeel gekleurd stroop je, dat zich in de testnbsp;volkomen inactief gedroeg.

H

-COH

HjC CO H2N—CH,—COOCH2—CeHs

\/

O

CH3

CH3—C-COH

I I /OH

HjC Clt; nbsp;nbsp;nbsp; H, (Pt)

\ /' \NH—CHi—COOCH2—CeHs--gt;¦

O

CH3

1

CH2OH—C—CHOH-CO-NH-CH2-COOH C6HS-CH3

I

CH3

„nor-pantothcenzuur” nbsp;nbsp;nbsp;toluol

Tabel XXI

Proeven met „nor-pantotheenzuur” en het ay-dioxy-Z^^-dimethylboterzuurlacton

1

De aneurine-activeering was na verloop van tijd grooter geworden.

55

Uit deze metingen konden wij besluiten, dat zoowel het lacton, als het nor-pantotheenzuur inactief is, terwijl de gistcel zelf ooknbsp;niet in staat is om uit het lacton met glycine een gistingactieve stofnbsp;te synthetiseeren. In verband met deze ondervinding en het feit,nbsp;dat de zuivering van pantotheenzuur zelf veel tijd in beslag neemt,nbsp;hebben wij er van afgezien, uit het ruwe product, zuiver nor-pantotheenzuur af te zonderen.

Een dusdanige celvermeerdering in den korten testduur als verklaring voor de grootere koolzuurontwikkeling, werd uitgeslotennbsp;geacht, daar v o n! E u 1 e r '22) in zijn test ter bepaling van denbsp;activiteit van bios-factoren, welke in een tijdsverloop van 20—48nbsp;uren groei veroorzaken, als voedingsmilieu een oplossing gebruikte,nbsp;die naast andere aminozuren ook glycine als organische stikstofbronnbsp;bevatte. Ook telproeven, die wij op dezelfde wijze als voorheennbsp;met behulp van de Bürkel-Zeiss-telkamer verrichtten, benevensnbsp;nephelometrische bepalingen, bewezen, dat glycine na een testduurnbsp;van 2 uur geen celvermeerdering veroorzaakt.

a. nbsp;nbsp;nbsp;Telproeven:

Blanco-beginwaarde: nbsp;nbsp;nbsp;289 X 2.500.000 cellen

Blanco na het Ie uur: nbsp;nbsp;nbsp;280 X

400 y glycine na het Ie uur: nbsp;nbsp;nbsp;285 X

Blanco na het 2e uur: nbsp;nbsp;nbsp;290 X

400 y glycine na het 2e uur: nbsp;nbsp;nbsp;276 X

b. nbsp;nbsp;nbsp;Nephelometrische bepaling:

Blanco-beginwaarde: nbsp;nbsp;nbsp;61.6nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;62.4nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;n,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;„Groei”nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;0'%

Blancowaarde na het 2e nbsp;nbsp;nbsp;uur:nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;70.8nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;„ 71.6nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;„nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;„nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;25 ,,

400 y glycine „ „ ,. nbsp;nbsp;nbsp;„ :nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;68.6nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;„ 70.6nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;„nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;„nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;28 „

Uit verdere proeven nbsp;nbsp;nbsp;kregennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;wij nog denbsp;nbsp;nbsp;nbsp;volgende resultaten:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Een hoeveelheid van meer dan 200 a 300 y glycine veroorzaakt ook in het tweede uur geen grootere activeering.

2. nbsp;nbsp;nbsp;De toevoeging van aneurine als co-factor kan vrij uiteen-loopende resultaten opleveren. Zelfs kon bij bepaalde gistzendingennbsp;geen enkel aneurine-effect boven de aanwezige glycine-werkingnbsp;worden waargenomen. Bij een dergelijke gist, die dan tegelijkertijdnbsp;een lage blanco-gisting vertoonde, veroorzaakte 200 y glycinenbsp;alleen een activeering van 431% in het eerste en 59 % in hetnbsp;tweede uur. 1 mg glycine gaf geen verhooging van deze percentagesnbsp;(resp. 44 en 59%). De verklaring van deze verschijnselen zal

56

moeten worden gezocht in een veranderlijk aneurinegehalte van de gist.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Wanneer aneurine als co-factor een invloed uitoefende opnbsp;het glycine-effect, was het onverschillig of 0,5 tot 8 y werd toegevoegd. Sindsdien werd voor die werking steeds één y gebruikt.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Een gedeelte van het aneurinemolecule is niet in staat denbsp;co-werking uit te oefenen, daar bij onze proeven het 4-methyl-5/8-oxyaethylthiazool het glycine-effect niet vergrootte, terwijl hetnbsp;2-methyl-5-methylamine-6-aminopyrimidine daartoe slechts in zeernbsp;geringe mate in staat was. Pas wanneer zoowel het thiazool- alsnbsp;het pyrimidine-derivaat in de vereischte hoeveelheden werden toegevoegd, kon een effect boven dat van glycine worden waargenomen, zooals dit ook door aneurine wordt veroorzaakt. Bij denbsp;quantitatieve aneurine-test heeft Sc h uitzoo) met de genoemdenbsp;bouwsteenen van aneurine soortgelijke ondervindingen.

5. nbsp;nbsp;nbsp;De werking van glycine is specifiek, daar verbindingen, waarinnbsp;andere eenvoudige groepen zijn gesubstitueerd, een geringer effectnbsp;veroorzaakten.

In verband met dit laatste punt hebben wij behalve het reeds in tabel XVIII genoemde alanine nog onderzocht: sarkosine, betaïne,nbsp;serine en de aethylester van glycine.

De zeer geringe invloed van de glycine-aethylester op het gistingsverloop is misschien een aanwijzing voor de verklaring vannbsp;de terugloopende activiteit van kleine hoeveelheden glycine (zienbsp;tabel XIX en figuur 7), die dan tijdens het gistingsproces zoudennbsp;worden veresterd.

57

Neuberg en Lie ben waren vroeger tot geheel andere gevolgtrekkingen gekomen. Wel vermeldt Neuberg §9), zooalsnbsp;ook al eerder door E h r 1 i c h 9®) ^as gepubliceerd, dat suiker-aminozuurmengsels met versche gist sneller vergisten dan eennbsp;suikeroplossing met dezelfde gist. Voor de verklaring van dit verschijnsel onderstelt hij twee mogelijkheden.

In de eerste plaats neemt Neuberg daarvoor aan, dat er ook in een gistend mengsel een reactie optreedt tusschen aminozurennbsp;en suikers, gelijk hij die heeft waargenomen 99) aan het snel veranderde polarisatie-vermogen van een fructose-oplossing, zoodranbsp;daaraan alanine wordt toegevoegd. Wel verloopt een dergelijkenbsp;reactie in een glucose-oplossing minder snel, maar Neubergnbsp;acht het toch mogelijk, dat een aminozuur-suikerproduct snellernbsp;wordt afgebroken dan suiker alleen, alhoewel zijn proefnemingennbsp;het strikte bewijs daarvoor niet leveren.

Von Euler 91) onderzocht dezelfde reactie van glycine in een glucose-oplossing bij verschillende zuurgraden. Ook hier verandert het draaiend vermogen van het mengsel, hoewel langzaam.nbsp;De glycine-concentraties zijn echter haast vijfhonderd maal grooternbsp;dan bij onze gistingsproeven, zoodat wij eenig verband dan ooknbsp;uitgesloten achten.

Bij de andere mogelijkheid, die Neuberg veronderstelt, zou de grootere koolzuurontwikkeling te wijten zijn aan een decar-boxyleering van het toegevoegde aminozuur. Dit laatste is zekernbsp;niet op onze resultaten van toepassing, daar een volledige decar-boxyleering van 300 y glycine slechts ongeveer 0,1 cm^ koolzuurnbsp;oplevert.

L i e b e n 68) 92) 93) gebruikt bij zijn gistingsproeven amino-zuurconcentraties, die ongeveer tachtig maal grooter zijn dan bij ons werk het geval is. Glycine, dl-alanine en histidine vertoonennbsp;dan een gelijksoortige gistingsactiveering, die volgens onze meeningnbsp;vermoedelijk zal worden veroorzaakt doordat de aminozuren op-

®9) C. Neuberg en M. Kobel, Biochem. Z. 174, 464 (1926). 90) F. Ehrlich, Biochem. Z. 2, 52 (1906) en 18, 391 (1909).

9^) H. V. Euler en K. Josephson, H. S. 153, 3 (1926).

92) F. Li eb en en V. Get reu er, Biochem. Z. 269, 69 (1934). 99) F. Li e b en en S. Mo 1 n a r, Biochem. Z. 277, 165 (1935).

58

treden als stikstofbron, want het substraat bevat uitsluitend het onderzochte aminozuur. Dit laatste kan ook gelden voor denbsp;proeven van N e u b e r g, want ook daar werden geen anorganische verbindingen toegevoegd.

Dat de samenstelling van het voedingsmilieu een rol speelt, veronderstelden wij reeds in den aanvang van het onderzoek; de gist is anders uitsluitend aangewezen op de stoffen, die tegelijk metnbsp;de gist in de testoplossing worden gebracht. Inderdaad bleef hetnbsp;glycine-effect vrijwel volkomen achterwege, wanneer de gistings-proeven in een enkele glucose-oplossing werden uitgevoerd; zelfsnbsp;trad bij ras M een remming van de koolzuurontwikkeling op!

Daar de blanco-gisting een volkomen normaal verloop had, lijkt ons een gebrek aan phosphaat als verklaring volkomen uitgesloten.nbsp;In het verdere gedeelte zullen wij echter nog op dit verschijnselnbsp;terugkomen.

Alhoewel N i e 1 s e n 82) de werking van aminozuren uitsluitend als groeifactor onderzoekt, willen wij toch op deze publicatie wijzen,nbsp;daar ook hierin wordt vermeld, dat glycine geen rol speelt alsnbsp;groeifactor bij een 24-uurs-test, waarin naast een standaardmengselnbsp;bios het te onderzoeken aminozuur wordt toegevoegd.

b. Alaninev valine, leucine, asparaginczuur, glutaminezuur en arginine

Bovengenoemde aminozuren waren, zooals in tabel XVIII is vermeld, in staat een klein Z-effect te veroorzaken, terwijl ook eeniger-

59

mate de werking van aneurine en van het aneurine-pantotheenzuur-mengsel werd verhoogd.

De activeering, die door de aminozuur-mengsels I, II en III tot stand wordt gebracht, veronderstellen wij daarom de som te zijn vannbsp;de werkingen, die door de aminozuren afzonderlijk kunnen wordennbsp;bewerkstelligd, terwijl niet moet worden vergeten, dat de toegevoegde groote hoeveelheid organisch gebonden stikstof in dienbsp;gevallen zeker een rol kan spelen.

Alanine, valine, leucine, arginine, glutaminezuur en asparagine-zuur bleken zich ten opzichte van glycine niet anders te gedragen. Zelfs was de verhooging, die door de vier eerstgenoemde aminozuren werd veroorzaakt, zoo klein, dat in verband met de proeffoutnbsp;de additieve werking op glycine kon worden verwaarloosd.nbsp;Asparagine- en glutaminezuur toonden zich werkzamer:

Tabel XXIV

De invloed van asparaginezuur, glutaminezuur, biotine en adermine op de gisting-activeerende werking van het mengsel pantotheenzuur-aneurine-glycine

Koningsgist

Toegevoegd aan het mengsel 1 mg P.z., 8 y aneurine en 300 y glycine

Ie uur 2e uur

In bovenstaande tabel hebben wij tegelijkertijd opgenomen de resultaten van een toevoeging van biotine met en zonder aderminenbsp;bij de genoemde aminozuren. Vooral met adermine trad een vermindering der activeering op, een verschijnsel, waarop wij laternbsp;nog terugkomen.

De resultaten van een extra toevoeging van asparagine- en glutaminezuur blijven ver achter bij de activeering, die door glycine

60

alleen te voorschijn wordt geroepen, hetgeen de reden was, dat het onderzoek in deze richting niet verder werd voortgezet.

Alhoewel onze veronderstelling, dat uit glycine door de gistcel ,,nor-pantotheenzuur” zou worden gevormd, als onjuist terzijdenbsp;moest worden gelegd, blijft de mogelijkheid bestaan, dat er uitnbsp;glycine een andere Z-actieve verbinding wordt gevormd, bijvoorbeeld een ander aminozuur.

Daarom werden nu nog andere ook in de natuur voorkomende aminozuren bij het onderzoek betrokken. De in onderstaandenbsp;tabel vermelde verbindingen, waaronder cysteïne, dat volgensnbsp;Runnström^s) de aerobe gisting met bakkersgist sterk verhoogde, leverden echter een negatief resultaat.

Dit was echter niet het geval met threonine, een ;S-oxy-a-amino-zuur.

c. Threonine

Threonine is door Rose 54) geïsoleerd als een groeifactor voor ratten.

J. Runnström en E. Sperber, Biochem. Z. 298, 340 (1938).

61

COOH

I

HjN—CH

I

HCOH

I

CHa

(—)threonine

Voordien was deze stereoisomere vorm van a-amino-j8-oxy-boterzuur, die in verband met de structureele overeenkomst tot threose, threonine is genoemd, nog onbekend.

Bij de pogingen om dit aminozuur te synthetiseeren had men tot dusverre alleen het andere stereoisomeer — het zoogenaamde allo-threonine — verkregen, maar het lukte tenslotte aan W est ooknbsp;het threonine te bereiden

Alhoewel L a s h Miller, zooals wij reeds in de inleiding hebben vermeld, uit tomatensap ook een oxyaminoboterzuur meendenbsp;geïsoleerd te hebben als een groeifactor voor gist, kwam hij laternbsp;tot de overtuiging, dat de bios-werking van zijn product stellignbsp;niet aan threonine kon worden toegeschreven, maar door een geringenbsp;hoeveelheid j8-alanine si) 52) 53) werd veroorzaakt.

Met threonine zagen wij een ander gistingsverloop als met glycine, daar in het eerste uur van de test, ook bij afwezigheidnbsp;van aneurine of van het mengsel aneurine-pantotheenzuur, eennbsp;uitzonderlijk hooge activeeringswaarde werd verkregen.

Aan het slot van het tweede hoofdstuk merkten wij op, dat de gistingsversnelling vooral in het eerste uur kenmerkend voornbsp;factor Z moet worden geacht.

Vandaar dat het threonine-effect aan een uitgebreid onderzoek werd onderworpen, waarvoor een synthetisch dl-threonine-preparaat

Door Meyer en R o s e werd de structuur van het natuurlijke threonine — geïsoleerd uit fibrine — vastgesteld, zooals wij deze hebben geformuleerd.nbsp;Zij geven echter aan dezen vorm den naam d(—) threonine naar analogienbsp;met d(—) threose, alhoewel het physiologisch tot de aminozuren moet wordennbsp;gerekend. Daarom lijkt het ons beter dezen vorm aan te duiden metnbsp;1(—) threonine, daar alle aminozuren met dezelfde configuratie, die in denbsp;natuur voorkomen, tot de l-reeks behooren.

®®) H. D. West en H. E. Carter, J. Biol. Chem. 119, 103 (1937).

62

werd gebruikt met een smeltpunt van 227°—229° (ongecorrigeerd), dat was bereid volgens de methode van W e s t 9^).

Tabel XXVI

De invloed van dl-threonine op Koningsgist

De invloed van dl-threonine op Koningsgist (200 y, 300 y, 400 y en blanco-waarde uit tabel XXVI)

63

Uit het verloop van de gisting moesten wij de gevolgtrekking maken, dat threonine in het gistingsproces wordt afgebroken, resp.nbsp;door een andere oorzaak zijn activiteit verliest (mogelijk speeltnbsp;hier ook verestering, zooals bij glycine, een rol), want na verloopnbsp;van twee uur of langer zakt ook de koolzuurontwikkeling van eennbsp;test met 300 y of meer dl-threonine tot de blancowaarde.

Het verschijnsel der maximale gisting zien wij hier weer terug; de maximale gistingswaarde met 200 y of 500 y dl-threonine isnbsp;gelijk, alleen blijft die waarde bij aanwezigheid van veel threoninenbsp;langer behouden.

Alhoewel, zooals reeds vermeld, het threonine door R o s e 54) als een groeifactor voor ratten was geïsoleerd, konden wij denbsp;verhoogde koolzuurontwikkeling als gevolg van celvermeerderingnbsp;direct uitgesloten achten, daar het gistingsverloop in dat geval denbsp;volgende figuur op zou moeten leveren:

waarin a het tijdperk voorstelt, waarin groei plaats heeft met toenemende koolzuurontwikkeling en b dat met de constantenbsp;koolzuurontwikkeling van de nu grootere hoeveelheid gist, waarvannbsp;de groei tot stilstand is gekomen.

Niet alleen was het verschijnsel van de na verloop van tijd terug-loopende maximale gisting een steun voor onze onderstelling, ook

64

latere telproeven en nephelometrische bepalingen sloten elke door threonine veroorzaakte celvermeerdering uit 53).

Het threonine-effect bleek, alhoewel iets minder dan dit bij glycine het geval was, nog te versterken, wanneer aneurine en hetnbsp;aneurine-pantotheenzuurmengsel mede in het gistingsmilieu aanwezig waren;