BIOLOGISCHE ONDERZOEKINGEN OVER VITAMINE E

BIOLOGISCHE ONDERZOEKINGEN OVER VITAMINE E

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RI|KS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VAN DENnbsp;RECTOR MAGNIFICUS DR. H. R. KRUYT, HOOG-LEERAAR IN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DERnbsp;UNIVERSITEIT IN HET OPENBAAR TE VERDEDIGENnbsp;OP MAANDAG 26 MEI 1941, DES NAMIDDAGS TEnbsp;4 UUR, DOOR

CHRISTIAAN GERARDUS JOHANNES MARIA ENGEL

GEBOREN TE EIBERGEN

1941

DRUKKERlf Fa. SCHOTANUS 6 JENS - UTRECHT

(bibliotheek der

RIJKSUNIVER jITc.it UTRECHT.

Ter nagedachtenis aan mijn Dochtertje Josientje. Aan mijn Ouders.

Aan mijn Vrouw,

Bij het beëindigen van mijn universitaire studie, grijp ik gaarne de gelegenheid aan, mij door dit proefschrift geboden, om metnbsp;een enkel woord dank te brengen aan allen die tot mijn academische vorming hebben bijgedragen.

Op de eerste plaats gaat mijn erkentelijkheid uit naar wijlen den Hooggeleerden Wolff, zijn aansporingen hebben mij in aanraking gebracht met vitamine E problemen.

Den Hooggeleerden Jordan dank ik dat hij mij in de gelegenheid gesteld heeft als assistent werkzaam te zijn.

Hooggeleerde Julius, Hooggeachte Promotor, het was een groot voorrecht voor mij om het reeds onder Uw voorganger begonnen onderzoek over vitamine E onder Uw leiding te mogennbsp;voortzetten.

Voorts geldt deze dank alle Hoogleeraren en overige Docenten van wie ik colleges en practica heb gevolgd.

Ook U, mijn ouders breng ik hier dank, dat U mij in staat gesteld hebt mijn opleiding te voltooien.

Zeer geleerde Vonk, Emmerie en van Eekelen het is steeds een groot genoegen voor mij geweest om met U te mogennbsp;samenwerken.

Inleiding

HOOFDSTUK I.

De biologie van het vitamine E...........

Verschijnselen van vitamine E gebrek bij de vrouwelijke rat Verschijnselen van vitamine E gebrek bij de mannelijke rat .

c. nbsp;nbsp;nbsp;Vitamine E en de groei van ratten.........

d. nbsp;nbsp;nbsp;Spierdystrophie................

e. nbsp;nbsp;nbsp;Vitamine E en de endocrine organen ........

ƒ. Werkingsmechanisme van vitamine E ........

HOOFDSTUK II.

De chemie van het vitamine E.............26

a. nbsp;nbsp;nbsp;Eigenschappen en isolatie van het vitamine E .......26

b. nbsp;nbsp;nbsp;Structuur en synthese der tocopherolen..........28

c. nbsp;nbsp;nbsp;Biologische activiteit van de tocopherolen en van andere synthetische

stoffen .....................29

HOOFDSTUK III.

De biologische bepaling van vitamine E.........31

a. nbsp;nbsp;nbsp;Literatuur....................31

b. nbsp;nbsp;nbsp;Uitvoering der ijkingen ............ 34

c. nbsp;nbsp;nbsp;Zwangerschapsresorptie en implantatie..........38

d. nbsp;nbsp;nbsp;liking van oliën en concentraten............39

e. nbsp;nbsp;nbsp;Vergelijking van de biologische en de chemische bepaling van vitamine E 44

f. nbsp;nbsp;nbsp;Vergelijking der biologische activiteit van het synthetische dl-a-

tocopherol en het natuurlijke d-a-tocopherol........49

g. nbsp;nbsp;nbsp;Biologische activiteit van de oxydatie producten van tocopherol .nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;51

h. nbsp;nbsp;nbsp;Vergelijking van de biologische activiteit van dl-a-tocopherol en

van d/-«-tocopheryl-acetaat..............56

X

HOOFDSTUK IV.

De biologische activiteit van c?/-a-tocopherol bij mannelijke ratten .......................58

HOOFDSTUK V.

Vitamine E bepaling in bloedserum ...........62

a. nbsp;nbsp;nbsp;Vergelijking van de chemische bepalingen van tocopherol in bloed-

scrum volgens de methode van Furter en Meyer en van Emmerie en Engel ......... 64

b. nbsp;nbsp;nbsp;Spectrophotometrisch aantoonen van vitamine E in bloedserum .nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;66

c. nbsp;nbsp;nbsp;Tocopherol in het bloedserum van ratten.........73

HOOFDSTUK VI.

Tocopherol in het bloedserum van den mensch......81

HOOFDSTUK VII.

Vitamine E therapie bij den mensch...........83

a. nbsp;nbsp;nbsp;Vitamine E en de voortplantingsstoornissen........83

b. nbsp;nbsp;nbsp;Toepassing van vitamine E buiten het gebied der voortplanting .nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;86

Samenvatting.....................87

Summary •......................88

Zusammenfassung...................89

Literatuurlijst.....................90

INLEIDING.

In de laatste jaren hebben verscheidene clinici het vitamine E, in de vorm van tarwekiemolie of een concentraat hieruit, aangewend bij den mensch in gevallen van verschillende vruchtbaarheidsstoornissen.

In tal van publicaties, die in het 7e hoofdstuk, pag. 83 besproken worden, werden de al of niet gunstige resultaten vastgelegd.

Naast deze clinische proeven met vitamine E als therapeuticum bij den mensch, waren geen clinische of physiologische gegevensnbsp;bekend. Het al of niet bestaan van een vitamine E-avitaminosenbsp;bij menschen, werd dan ook door anderen betwijfeld, daar ditnbsp;alleen berusttè op resultaten in de kliniek bereikt, die elkaar bovendien gedeeltelijk tegenspraken.

Onlangs verscheen een Nederlandsche publicatie over het vitamine E in verband met veterinaire toepassingen [Herschel (1938)]. Dit was voor ons een rede om die vraagstukken buitennbsp;beschouwing te laten.

De eerste vraag, die we ons stelden, is dus, bestaat er een E-avitaminose bij den mensch, in welke vorm uit deze zich en is deze experimenteel vast te stellen.

De chemische bepaling van vitamines in bloedserum of bloed, respectievelijk van vitamine A en C, had in deze gevallen nuttigenbsp;diensten bewezen om langs eenvoudige weg een avitaminose vastnbsp;te stellen. Om een indruk te krijgen of er al of niet een E-avi-taminose bij den mensch voorkwam, was dit ons inziens de meestnbsp;geschikte weg.

Alvorens we hiertoe konden overgaan, moesten verschillende moeilijkheden worden opgelost.

In het begin van 1938, toen we ons onderzoek over vitamine E begonnen, was er zelfs geen quantitatieve bepalingsmethode vannbsp;vitamine E bekend, terwijl toch een eenvoudige chemische of

12

physische methode ter bepaling van het vitamine E ons alleen tot het gewenschte doel zou kunnen voeren.

Een tweede vraag, die niet definitief was opgelost, was de volgende: wordt de E-avitaminose bij de mannelijke rat door gebrek aan dezelfde stof veroorzaakt, als bij de vrouwelijke rat. Deze vraagnbsp;was ook van belang voor den mensch.

Het doel van deze dissertatie was een eventueele E-avitaminose bij den mensch te bestudeeren.

De resultaten door anderen bereikt, vooral wat betreft de chemie van het vitamine E (tocopherol) in 1938 en 1939, was voor ons eennbsp;welkome steun,

De ontwikkeling van een chemische en biologische bepaling van vitamine E en vergelijking van deze beide, was de eerste stap innbsp;de richting van ons doel. Dit wordt in het 3e hoofdstuk uitvoerignbsp;besproken en is verwezenlijkt.

De identiteit van het vitamine E voor mannelijke en vrouwelijke ratten is in het daarop volgende hoofdstuk behandeld.

We stelden ons voor de gevonden vitamine E-bepaling in bloed-serum te gebruiken om het verband vast te leggen tusschen het gehalte in het bloed en de E-avitaminose. Dit kan bij de rat zeernbsp;eenvoudig geschieden en bij de experimenteele avitaminose van denbsp;rat kon dit verband dan ook vastgelegd worden. Bij den menschnbsp;zou het voorkomen van de E-avitaminose pas kunnen blijken uitnbsp;een zeer groot aantal bepalingen van gezonden en zieken. Door denbsp;mobilisatie zijn we echter niet verder kunnen komen dan eennbsp;gering aantal bepalingen bij den mensch, die door hun kleine aantal nog geen beslissende uitslag hebben gegeven over het verbandnbsp;tusschen een eventueele E-avitaminose bij den mensch en de waarden, die in het bloed werden gevonden.

HOOFDSTUK I.

DE BIOLOGIE VAN HET VITAMINE E.

De historische feiten, die de grondslag zijn geweest voor het vitamine E onderzoek, mogen hier voorafgaan.

Mattill en Conklin (1920) bewezen als eersten, dat een dieet, dat voldoende was voor een rat tot instandhouding van eennbsp;goede groei en goede gezondheid, niet toereikend was voor denbsp;voortplanting.

Evans (1922) vond bij een onderzoek over het effect van de voeding op de oestrus-cyclus, dat ratten op een bepaald dieet,nbsp;waaraan de tot dan toe bekende vitamines waren toegevoegd, in denbsp;eerste generatie gedeeltelijk, in de tweede geheel steriel waren.nbsp;Deze steriliteit kon worden opgeheven door zekere natuurlijkenbsp;voedingsmiddelen.

Evans en Bishop (1922) toonden aan, dat een in vet oplosbare factor, die niet overeenkwam met de toenmaals bekende vitamines, noodig was voor de voortplanting.

Sure (1923, 1923a) vond hetzelfde, onafhankelijk van bovengenoemde auteurs en noemde deze factor: vitamine E.

In de volgende jaren werd het biologische onderzoek van verschillende zijden begonnen.

Het spreekt vanzelf, dat er ook onderzoekers waren, die het bestaan van vitamine E ontkenden [Anderegg en Nelsonnbsp;(1926), Nelson, Heller en Fulmer (1924) en Hogannbsp;en Harshaw (1924)].

Zij schreven de steriliteit toe aan de groote hoeveelheid reuzel gebruikt in vitamine E-vrije diëeten. Dat echter vetrijke diëetennbsp;op zichzelf geen steriliteit veroorzaken, werd door Mattill,nbsp;Carman en Clayton bewezen (1924). Evans en Burr

H

(1927a, 1927b) toonden aan, dat reuzel antagonistisch werkt ten opzichte van vitamine E en later bleek, dat de diëeten vannbsp;Nelson c.s. niet voldoende vitamine E-vrij waren geweest. Hierna moesten ook degenen, die het bestaan van vitamine E ontkenden hun standpunt wel opgeven.

In 1936 slaagden E,vans, Emerson en Emerson (1936) erin de stof, die verantwoordelijk is voor de antisteriliteitswerkingnbsp;van tarwekiemolie, te isoleeren. Zij noemden deze (x-tocopherol.nbsp;Verschillende in de natuur voorkomende stoffen bleken vitamine E-werking te bezitten; zij zijn in chemisch opzicht nauw verwant:nbsp;physiologisch is tot nu toe alleen een quantitatief verschil gevonden.

Het chemisch onderzoek, dat besloten werd met de synthese van tocopherol, kan men thans reeds als een afgerond geheel beschouwen en wordt in het tweede hoofdstuk besproken. Het biologischnbsp;onderzoek is nog in vollen gang en wordt in de volgende paragrafennbsp;besproken. Daar ons doel is de E-avitaminose bij den mensch tenbsp;bestudeeren en wij daarvoor de proeven bij de rat als grondslagnbsp;aanvaarden, kunnen we de literatuur, die hierop geen betrekkingnbsp;heeft, zooals de verhandelingen over E-avitaminose bij huisdierennbsp;en vogels, buiten beschouwing laten.

a. Verschijnselen van vitamine E gebrek bij de vrouwelijke rat.

De symptomen zijn bij de vrouwelijke rat het eerst en het meest uitgebreid onderzocht, hetgeen wel zijn oorzaak zal hebben in denbsp;zeer opvallende resorptie-steriliteit.

Aan de oorspronkelijke histologische bewerkingen van Evans (1927) is door latere onderzoekers dan ook weinig toegevoegd.

De avitaminose, die zich tenslotte openbaart in een resorptie-steriliteit, geeft ook in mindere graad aanleiding tot verschijnselen. We zien bij niet voldoende opname van vitamine E als eerstenbsp;symptoom, dat de moederdieren hun jongen niet voeden [V e r z a rnbsp;(1932), J u h a s z-S c h a f f e r (1931)]. Of hierbij een onvoldoende melksecretie of andere factoren de oorzaak zijn, is niet metnbsp;zekerheid bekend.

Een volgend stadium van de E-avitaminose heeft men als de jonge moederdieren met een nog net voldoende hoeveelheid vitamine E gevoerd worden of als ze op een vitamine E-vrij dieet gezet.

15

de in hun lichaam aanwezige hoeveelheid nog niet hebben verbruikt. Een deel der jongen wordt dan dood geboren. In dit stadium is ernbsp;eenig verband tusschen het aantal geworpen levende jongen en denbsp;hoeveelheid vitamine E, in het dieet of afzonderlijk oraal toege-diend; zie fig. 1 [B o m s k o v (1938) ].

B o m s k o V vermeldt ook nog een zg. ..Treppenwachstum”. Terwijl in het algemeen de jongen van een normale rat even zwaarnbsp;wegen en even groot zijn, zijn de pasgeboren ratjes in dit stadiumnbsp;van vitamine E-gebrek, in grootte en gewicht van elkaar verschillend.

12

lO

cm® Tarwekiemolie.

Fig. 1.

Verband tusschen aantal jongen en dosis vitamine E.

Bomskov (1938).

Volgens J u h a s z-S chaffer (1933) is het grootste deel der levend geborenen wijfjes en zou de mannelijke foetus gevoeligernbsp;zijn voor vitamine E-gebrek.

Bij nog verdere E-avitaminose worden geen levende jongen meer geboren of worden niet geheel ontwikkelde jongen te vroeg geboren. Hierop volgt het volledige symptoom, een typische resorptie-steriliteit. Deze toestand kan op een geeigend dieet zeer lang blijvennbsp;bestaan zonder dat andere verschijnselen zich voordoen.

16

Op een goed vitamine E-vrij dieet kan men vrouwelijke ratten in 2 a 3 maanden zoo krijgen. In het geval, dat ze na het zoogennbsp;direct Op E-vrij dieet komen, zijn ze van het begin der geslachtsrijpheid af onvruchtbaar. De oestrus cyclus blijft voortgaan. Denbsp;functie der ovariën blijft normaal en ovulatie treedt regelmatig op.

Na copulatie met gezonde mannetjes worden de wijfjes gewoon bevrucht. De bevruchting en ovulatie zijn niet te onderscheidennbsp;van gewone ratten. De foetus ontwikkelt zich de eerste dagennbsp;normaal. Het gewicht van het moederdier stijgt overeenkomstignbsp;deze ontwikkeling. Na de 10e dag treedt er echter een gewichts-daling in, gepaard gaande met bloedingen.

De beschrijving van het verloop der resorptie is door Evans reeds gegeven (1927): Op de achtste dag der zwangerschap zietnbsp;hij de eerste afwijkingen. De embryonen zijn minder ontwikkeld.nbsp;Op de tiende dag zijn afwijkingen te zien aan de kop en de allantois. Weinig bloedcellen zijn in de bloedvaten aanwezig. Op denbsp;dertiende dag zijn de meeste foeten dood. Reeds op de vijftiendenbsp;dag is de geheele foetus geautolyseerd en zijn de organen niet meernbsp;te herkennen. Nog weer eenige dagen later is van de embryonennbsp;door resorptie niets meer te vinden.

Bij de ontwikkeling van de placenta ziet men een dergelijk verschijnsel. Het geheele proces van stilstand der ontwikkeling, auto-lyse en resorptie is echter eenige dagen verder verschoven.

Het moederdier is spoedig weer hersteld, kan opnieuw bevrucht worden en weer een resorptie-steriliteit door maken. Normalenbsp;oestrus treedt steeds daarna weer op. De dood der embryonennbsp;wordt blijkbaar veroorzaakt door een abnormaliteit in de stofwisseling. Hoe echter vitamine E past in deze stofwisseling isnbsp;onbekend.

Door Evans werd niet opgemerkt de bruine pigmentatie van de uterus van E-deficiente ratten, die Moore, Martin ennbsp;Rajagopal (1939) het eerst beschreven. De aard van dezenbsp;pigmentatie is geheel onbekend. Ze verdwijnt niet meer door toediening van vitamine E. wel echter door een zwangerschap.

De vele publicaties, waarin gewezen wordt op de invloed van vitamine E-gebrek op de endocrine organen, op de groei en op denbsp;zg. spierdystrophie worden apart besproken, daar deze voor man-

17

netje en vrouwtje ongeveer dezelfde zijn (zie dit hoofdstuk c, d, e en f).

b. Verschijnselen van vitamine E-gebrek bij de mannelijke rat.

Vitamine E is noodig voor de spermatogenese. Ook dit is reeds door Evans bij vitamine E-gebrek waargenomen.

Het vertoont zich eerder op een E-vrij dieet dan de resorptie-steriliteit. Blijkbaar verbruiken mannetjes hun voorraad vitamine E sneller dan vrouwtjes.

Mason en Bryan (1938) nemen zelfs, na 50—60 dagen E-vrij dieet, reeds de eerste veranderingen waar, terwijl Evansnbsp;en Burr (1927) 90—150 dagen opgeven.

De veranderingen in de spermatogenese betreffen in de eerste plaats de spermiën zelf. Ze verliezen hun beweeglijkheid en zijnnbsp;daardoor niet meer in staat een bevruchting tot stand te brengen.nbsp;Later ontbreken de geesels geheel en zijn de kernen vergroot ennbsp;anders van vorm.

Parallel hiermee gaan ook degeneratieve veranderingen in de testes. Er worden reus-cellen gevormd door het samenklonterennbsp;der spermatidenkernen. Het germinatieve epitheel verdwijnt geheel.

De zaadkanaaltjes met spermatogoniën en spermatocyten atro-phieeren. Het interstitieele weefsel blijft echter intact. Ook macroscopisch is deze testis-degeneratie tenslotte te zien in een verschrompeling en aanzienlijk gewichtsverlies [Grijns (1938)]. Terwijl wijfjes door vitamine E toe te dienen ten allen tijde te genezennbsp;zijn, kunnen al deze verschijnselen bij mannetjes niet meer genezen worden. Slechts in het begin, als de degeneratie de geheelenbsp;testis nog niet heeft aangetast en de spermatogenese in sommigenbsp;deelen nog normaal is, kan de fertiliteit behouden blijven.

Zelfs zeer langdurige vitamine E-therapie is niet in staat eenmaal voortgeschreden degeneratie te genezen [Mason (1926), R i n g-sted (1936), Zagami en Sindoni (1933)]. Ringstednbsp;stelt de veranderingen der testis voor als criterium voor een biologische bepalingsmethode van het vitamine E. De resultaten metnbsp;een dergelijke methode verkregen, zijn nog niet vergeleken metnbsp;die verkregen bij wijfjes, waarvan het principe en uitvoering in hetnbsp;vierde hoofdstuk beschreven zijn.

18

c. Vitamine E en de groei van ratten.

Naast deze vitamine E-deficientie verschijnselen, in verband met de voortbrenging, zijn later nog vele andere verschillen t.o.z. vannbsp;normaal gevoede dieren opgemerkt.

De normale groei, die zooals bekend van bijna alle vitamines afhankelijk is, is ook in verband gebracht met vitamine E. Ter verduidelijking moge figuur 2 dienen.

200

Fig. 2.

Schema van groelcurven van de rat. - op normaal voer.

---op vitamine E vrij voer.

De teekens 9 en cj geven aan wanneer de dieren geslachtsrijp zijn.

In deze figuur beschouwen we het eerste deel der curven tot de teekens ? en 3 als „jeugdgroei” het verdere deel der curven alsnbsp;,.latere groei”. Zooals bekend mag worden verondersteld, is denbsp;eerste groeiperiode vooral afhankelijk van vitamine A. Bij de eerstenbsp;proeven van Evans (1928/29) over de invloed van vitamine Enbsp;op de groei bleek reeds, dat deze jeugdgroei geheel onafhankelijknbsp;was van vitamine E, maar dat de latere groei van geslachtsrijpenbsp;dieren, zoowel mannelijke als vrouwelijke, onvolledig is door

19

vitamine E-gebrek. Dit effect wordt niet veroorzaakt door geringere activiteit der gonade. Het is een eigenschap van het vitamine E zelf, want na castratie van vitamine E-vrije mannetjes kan tochnbsp;weer een verbeterde groei verkregen worden na toediening vannbsp;vitamine E. Het vitamine E was hier toegediend in de vorm vannbsp;een concentraat, vrij van sterinen. Ook deze proeven van Evansnbsp;zijn door anderen bestreden: Mason (1929) en Blumbergnbsp;(1935), die de feiten van Evans in groote trekken wel erkennen, maar ook de jeugdgroei geremd zien door vitamine E-gebrek.nbsp;Mason experimenteert met mannetjes, Blumberg met beidenbsp;geslachten. Interessant is nog, dat de laatste vaststelt, dat hetnbsp;xanthophyl als groeifactor onwerkzaam is. v. Euler (1932)nbsp;meende nl. aan het xanthophyl een zekere rol te moeten toeschrijvennbsp;in verband met het vitamine E, daar het in de natuur steeds hiervan vergezeld voorkomt.

De eerste proeven van Evans zijn door Emerson en Evans (1937), Olcott en Mattill (1934) en Ran do innbsp;en Netter (1934) bevestigd en uitgebreid. Bij verschillendenbsp;E-vrije diëeten heeft men ongeveer hetzelfde effect. Vetrijke of vetarme diëeten blijken van weinig invloed te zijn. Zoolang geennbsp;zuiver vitamine E verkregen was, bleef nog onopgelost de vraag,nbsp;of de groeifactor vitamine E of een andere factor was, daar bijnbsp;al deze proeven natuurlijke vitamine E-rijke producten gebruiktnbsp;zijn. Martin (1937) doet pogingen om deze factoren te scheiden.nbsp;Zijn resultaat, dat de antisteriliteits-factor niet, maar de groeifactornbsp;wel vernietigd wordt door tarwekiemolie in een autoclaaf te verhitten, moet als een qualitatief verschil gekarakteriseerd worden.nbsp;Het omgekeerde, groeifactor behouden en antisteriliteits-werkingnbsp;vernietigd, kon niet bereikt worden.

Na het verkrijgen van zuiver tocopherol zijn door Evans, Emerson en Emerson (1938, 1939) de proeven herhaald metnbsp;hetzelfde resultaat. Hieruit blijkt duidelijk, dat tocopherol de laterenbsp;groei beïnvloedt en dat gebrek hieraan de groei remt, zooals denbsp;stippellijnen in fig. 2 aangeven.

Afgezien van deze groei bij ratten, zijn er nog vele publicaties over de invloed van vitamine E op de celgroei van tumoren en denbsp;groei van wcefsclculturen.

J u h a s z-S c h a f f e r (1931a) vindt in weefselculturen een

20

vermeerderde celgroei van embryonaal en carcinoomweefsel. Ook op het ontstaan van tumoren zou vitamine E van invloed zijn.

Evans (1928) nam reeds deciduaal-tumoren waar bij vitamine E-deficiente ratten. Andere onderzoekers zien echter juist het ontstaan van tumoren door extra vitamine E toe te voegen in de vormnbsp;van tarwekiemolie [Rowntree, Lansbury en Steinbergnbsp;(1937) en Dorrance en Ciccone (1937)]. Vele anderennbsp;hebben dit experiment niet kunnen bevestigen [Carruthersnbsp;(1938), Zagami (1933a), Marches! (1933), Dinge-mansê en v. Eek (1939)]. Na het werk van Demolenbsp;(1938/39) weten we, dat a-tocopherol geen enkele invloed heeftnbsp;op de tumorvorming. In de ruwe tarwekiemolie van Rowntreenbsp;c.s. moet iets anders de oorzaak voor het optreden van tumorennbsp;geweest zijn.

d. Spierdystrophie.

Het verschijnsel van de spierdystrophie bij ratten op een vitamine E-vrij dieet, is de laatste jaren in het middelpunt dernbsp;belangstelling gekomen door gelijkenis met spierdystrophie bij dennbsp;mensch. Alle vitamine E onderzoekers hebben op hun beurt hetnbsp;symptoom opgemerkt en vermeld. We onderscheiden bij de ratnbsp;twee leeftijdsperioden, waarin deze dystrophiën optreden, die verschillend zijn al naar de leeftijd van de rat.

1. Dystrophie bij dc jonge rat,

Evans en Burr (1928) beschreven in 1928 het verschijnsel bij het jonge dier.

Jongen van vitamine E-arme ratten krijgen parese na 18—20 dagen Evans en Burr (1928), 17—20 dagen Barrie (1937)nbsp;en 16—20 dagen Demole en Pfaltz (1939, 1940). Het percentage ziekte is door de auteurs opgegeven van 90 % (Demolenbsp;en Pfaltz) tot 75% (Evans en Burr). Een groot percentage sterft, een ander gedeelte 10—20 % herstelt en een gedeeltenbsp;leeft nog eenigen tijd zonder te genezen. Bij de jonge rat heeftnbsp;de ziekte een zeer snel verloop. Ze begint bij de achterpooten,nbsp;breidt zich in enkele dagen uit tot de kop, waarna het dier meestalnbsp;sterft. De ziekte is te voorkomen met tarwekiemolie of tocopherol

21

als het voor de 15e dag gegeven wordt [M o r e 11 e (931), Barrie (1937 ),DemoleenPfalt2 (1939, 1940) en E v a n snbsp;(1928)].

Het is duidelijk dat het ontbreken van vitamine E de oorzaak is van deze ziekte. Curatieve behandeling met vitamine E heeftnbsp;geen succes. De pathologische, anatomische en histologische afwijkingen van spieren en zenuwen zijn door Demoleen Pfaltznbsp;(1939, 1940) beschreven.

De geheele spierstructuur is veranderd: De spier is niet meer prikkelbaar: de cellen zijn hyalien, de dwarsstreping verdwijnt.nbsp;Sterke proliferatie der sarcolemmacellen treedt op. Ook het zenuwstelsel is aangetast, vooral het periphere. Lipschitz (1936)nbsp;meent ook een afwijking in het labyrinth-systeem te hebben gevonden.

2. Dystrophic bij de volwassen rat

Deze werd het eerst opgemerkt door Evans (1932) en door vele anderen later bevestigd.

Einarson en Ringsted (1938) hebben er een speciale studie aan gewijd. De bewegingsstoornissen verschijnen langzaamnbsp;en zijn van neuro-musculaire aard. De ontwikkeling begint bij denbsp;achterpooten en gaat langzaam naar voren. Dit duurt van 4 totnbsp;12 maanden (De mole en Pfaltz) of volgens Einarsonnbsp;en Ringsted (1938) van 6 tot 15 maanden.

Het eerste optreden der ziekte vertoont zich na ongeveer twee jaar (Einarson en Ringsted), 22 maanden Burr, Brownnbsp;en Moseley (1937), 15—22 maanden Evans, Emersonnbsp;en Telford (1938) en na 14—17 maanden volgens D e m o 1 enbsp;en Pfaltz. De zieke dieren kunnen nog zeer lang in levennbsp;blijven. De uitwendig zichtbare gebreken beschrijven Einarsonnbsp;en Ringsted. Het begint met krampachtig loopen, parese dernbsp;achterpooten en zijdelings spreiden der pooten tot een breedernbsp;steunvlak, vervolgens kramptoestanden en volkomen onbeweegbaarheid. De dwarsstreping der spieren verdwijnt.

De spierspanning is, gemeten bij contractie van een uitgenomen gastrocnemicus, verminderd [Knowlton en Hines (1938)]nbsp;t.o.z. van de normale bij directe electrische prikkeling van de spiernbsp;of via de zenuw.

22

In tegenstelling met de overeenkomstige ziekte bij de jonge rat, heeft hier curatieve toediening van tarwekiemolie (E i n a r s o nnbsp;en Ringsted), concentraten van tarwekiemolie [Burr,nbsp;Brown en Moseley (1937)], c?/-a-tocopherol [Knowlton,nbsp;H in es en Brinkhóus (1939) ] en tocopheryl-acetaat (D e-mole en Pfaltz) gedeeltelijk succes. Het voortschrijden dernbsp;ziekte kan daarmee gestuit worden, volledige genezing kan er nietnbsp;mee verkregen worden.

Bij al deze waarnemingen werd vitamine E als eenige factor genoemd, die de musculaire dystrophie kan voorkomen.

Morgulis en Spencer (1936) en Morgulis, Wilder enEppstein (1938) hebben een spierdystrophie ook opgewektnbsp;bij konijnen. Hier zijn, volgens deze onderzoekers, verschillendenbsp;factoren in het spel en zou ook nog een wateroplosbare factornbsp;uit tarwekiemen noodzakelijk zijn voor de genezing. Dit is intus-schen weer tegengesproken door Mackenzie, Levine ennbsp;McCollum (1940). Zoowel bij de rat als het konijn is dus denbsp;spierdystrophie te voorkomen door zuiver tocopherol zonder anderenbsp;factoren.

e. Vitamine E en de endocrine organen.

De typische verschillen bij de mannelijke, en de vrouwelijke E-avitaminose, en de vroeger voor waarschijnlijk gehouden sterol-natuur, Dingemanse (1929), van het vitamine E is voor velen een aanleiding geweest, om de werking van vitamine E te zoeken innbsp;een invloed op de endocrine organen, in de eerste plaats op die,nbsp;welke in verband staan met de geslachtsfuncties en later ook op denbsp;thyreoidea. Zeer vele afwijkingen zijn gevonden en sommige zijnnbsp;als uitgangspunt gekozen voor het opstellen van een hypothesenbsp;over de werking van vitamine E.

Naar het schijnt zijn echter al deze verschijnselen als secundair te beschouwen. Met een korte opsomming van de voornaamstenbsp;publicaties op dit gebied kan dan ook volstaan worden.

Aan tarwekiemolie na orale toediening of injectie wordt toegeschreven oestrogenewerking door Szarka (1929), Ver z ar (1929) en A d 1 er en B ö 11 i n k (1929), vroegtijdige openingnbsp;der vagina-membraan en uterine hypertrophic [ V e r z a r (1931,

23

1932)] bij normale, maar niet bij gecastreerde, infantiele ratten en muizen.

Vitamine E-deficiente ratten zouden een verminderde grondstof-wisseling vertoonen en een zijdeachtige pels gelijkend op die van hypophyselooze ratten, die kunnen herstellen na toediening vannbsp;vitamine E [Verzat c.s. (1931), Gierhake (1933, 1935)].nbsp;Verzat ziet in deze feiten, dat vitamine E zeer nauw verbondennbsp;is met de gonadotrope hormonen van de hypophyse of misschiennbsp;noodig is voor de synthese van deze in het lichaam. Deze veronderstellingen zijn echter herhaalde malen en nadrukkelijk tegengesproken [v. Euler, Zondek en Klussmann (1933),nbsp;J u h a s z-S c h a f f e r (1933), Diakov en Krizeneckynbsp;(1933, 1933a, 1935), Olcott en Mattill (1934), Kudrja-schov (1935) en Saphir (1936)].

Het histologische beeld van de hypophyse-voorkwab van E-deficiente mannelijke ratten laat een verandering zien van de basophiele cellen, zeer sterk gelijkend op veranderingen, veroorzaakt door cryptorchisme en castratie [van W a g e n e n (1925),nbsp;Nelson (1933), Geiler (1934) en Gierhake (1933,nbsp;1935)].

Nelson meent, dat de structureele veranderingen in de hypophyse secundair zijn en veroorzaakt worden door degeneratienbsp;der kiemcellen van de testis en niet herstelbaar zijn evenmin alsnbsp;deze. Bij vrouwelijke ratten kan geen enkele verandering in denbsp;hypophyse waargenomen worden [Nelson (1933), Steinnbsp;(1935) en Müller en Müller (1937)] wat eveneens pleitnbsp;voor het secundaire der verschijnselen bij het mannetje. Functio-neele veranderingen zijn waargenomen maar weer tegengesprokennbsp;door Mason (1939).

Een andere weg om aan te toonen, dat vitamine E direct verband houdt met hormonen, is door verschillende auteurs gevolgd nl. door vitamine E-deficiente ratten te behandelen met hormonen,nbsp;orgaanextracten etc.

Follikel hormoon [Bisceglie (1929)], hypophyse extract, zwangeren-urine [Ag noli (1930)] en placentaal extractennbsp;[Marches! (1935)] zouden in staat zijn de resorptie-steriliteitnbsp;bij vrouwelijke ratten te voorkomen of te genezen. Hier tegenovernbsp;staan weer andere publicaties van Csik (1932), Nelson

24

(1931) en Mason (1933), waarin gezegd wordt, dat al deze hormonen en extracten onwerkzaam zijn.

Al deze gegevens en het feit, dat de geslachtsfuncties bij het vrouwtje normaal zijn en de secundaire geslachtsklieren bij hetnbsp;mannetje niet aangegrepen worden door vitamine E-gebrek, doennbsp;vermoeden, dat de deficiëntie in de hypophyse bij het mannetjenbsp;meer een gevolg dan de oorzaak van de steriliteit is. Men kan dusnbsp;tot nu toe zeggen, dat vitamine E-deficientie zich uit bij hetnbsp;mannetje in een directe werking op de gonade en bij het wijfjenbsp;op de foetus.

f. Werkingsmechanisme van vitamine E.

We kunnen wel zeggen, dat er nog geen verklaring is voor de vele verschijnselen, veroorzaakt door vitamine E gebrek. Het heeftnbsp;niet aan hypothesen ter verklaring van de werking ontbroken.

De proeven van V e r z a r, welke een verband van vitamine E en hypophyse-voorkwab trachten te leggen, bespraken we in denbsp;voorgaande paragraaf. Volgens Verzaren Kokas (1931) kannbsp;het hypophyse-voorkwabhormoon gedeeltelijk het vitamine E vervangen.

Het vitamine E zou nu noodig zijn voor de vorming van hypo-physe-voorkwabhormoon. Het is echter waarschijnlijk, dat de testis-veranderingen verantwoordelijk zijn voor de aantasting der hypophyse en niet omgekeerd.

Deze hypophyse-theorie, zooals ik die kortheidshalve wil noemen, kan bovendien zeer veel andere symptomen niet verklaren.

Een andere hypothese, die de moeilijkheden echter verschuift naar het volkomen onbekende gebied der groei en celdeeling, isnbsp;van Evans en Juhas z-S chaffer. De laatste toonde denbsp;invloed aan van vitamine E op celvermeerdering in weefselculturen.nbsp;Deze hypothese is veel meer omvattend en er zijn tot nu toe geennbsp;positieve feiten, welke kunnen aantonnen, dat ze foutief is.

Nog een derde hypothese moeten we noemen n.1. van de onderzoekers Waddell en Steenbock (1928) enKudryashof (1933), die de werking van vitamine E trachten te verklaren doornbsp;te wijzen op de analoge verschijnselen van het Waddell ennbsp;Steenbock effect en die van resorptie-steriliteit.

Dit is het volgende verschijnsel:

25

Aether extracten, van met ferrichloride behandelde voeder-mengsels, veroorzaken aan ratten toegediend resorptie steriliteit.

Kudryashof verkreeg hetzelfde resultaat met ketonachtige oxydatie producten van vetten. Vitamine E zou nu in de stofwisseling het optreden van dergelijke stoffen voorkomen. Dit echternbsp;is niet bewezen, waardoor deze simpele verklaring ook nog tot denbsp;hypothesen behoort.

HOOFDSTUK II.

DE CHEMIE VAN HET VITAMINE E.

Het ligt buiten het terrein van dit proefschrift, om een volledig overzicht te geven van alle chemische onderzoekingen over vitaminenbsp;E. We laten het dan ook bij een oppervlakkige beschouwing vannbsp;de voornaamste resultaten.

a. Eigenschappen en isolatie van vitamine E.

De meeste eigenschappen waren reeds gevonden, terwijl het vitamine E nog niet in zuivere vorm verkregen was.

Ter bestudeering kwamen vooral in aanmerking concentraten, bereid uit tarwekiemolie, katoenzaadolie en dergelijke plantaardigenbsp;oliën, waarvan bekend was uit biologische proeven, dat ze rijknbsp;waren aan vitamine E.

Bij de vervaardiging der concentraten werden deze oliën verzeept. waarbij het vitamine E in het onverzeepbare deel achterbleef. Dit deel is goed oplosbaar in de gebruikelijke lipoid-oplosmiddelen.nbsp;Na het afscheiden der sterinen uit de onverzeepbare rest, zijn ernbsp;verschillende wegen om nog sterker werkzame preparaten te verkrijgen.

Hoog-vacuum destillatie werd toegepast door O 1 c o 11 en M a 11 i 11 (1934), waarbij het vitamine bij 0.1—0.05 mm Hg druknbsp;tusschen 200—250'’ C overdestillcert.

Door Evans c.s. (1935) zijn de concentraten verdeeld tusschen petroleum-aether en methylalcohol (92 %) en uitgeschud met absolute methylalcohol.

Drummond (1935, 1935a) past een chromatografische reini-

27

ging toe. Al deze methoden gaven producten, welke in doses van 5—20 mg werkzaam waren bij de vrouwelijke E deficiënte rat.

Kristallijne stoffen konden op deze manier niet verkregen worden. Eerst later toen men reeds meer wist van de eigenschappennbsp;van het vitamine E is door Evans, Emerson en Emersonnbsp;het vitamine E in de vorm van zijn ester met allophaanzuur alsnbsp;eerste kristallijne product afgescheiden. Door verzeeping werdnbsp;hieruit weer het zuivere vitamine E verkregen wat zij a-tocopherolnbsp;noemden (formule C29H50O2). Het is een lichtgele olie, met eennbsp;zeer zwakke optische draaiing [Moss (1938)].

De stof bleek bestendig tegen zuur maar niet tegen loog. Het absorptiespectrum in ultraviolet licht is karakteristiek en de bepaling hiervan had reeds zijn diensten bewezen bij de reiniging dernbsp;concentraten [Drummond (1935, 1935a)].

Het tocopherol is zeer gevoelig voor oxydatiemiddelen. Ferri-chloride, goudchloride en zilvernitraat vernietigen het alle. Zelfs voor de zuurstof uit de lucht is de zuivere stof gevoelig in tegenstelling met de concentraten, waarin het eenigszins beschermdnbsp;voorkomt door de daarin voorkomende antioxydantia, die in denbsp;natuurlijke producten het vitamine E steeds vergezellen.

De reduceerende eigenschappen van tocopherol ten opzichte van ferrichloride en goudchloride zijn door Karrer en Keilernbsp;(1938g) en door Emmerie en Engel (1938, 1938a) gebruikt,nbsp;om quantitatieve chemische bepalingsmethoden te ontwikkelen.

Karrer en Keiler oxydeeren met goudchloride en voeren een potentiometrische titratie uit. De methode van Emmerie ennbsp;Engel is een colorimetrische, waarbij het door de oxydatie metnbsp;ferrichloride gevormde ferro-ijzer met a : a'-dipyridyl bepaaldnbsp;wordt.

De tocopherolen geven bij behandeling met geconcentreerd salpeterzuur roode kleurstoffen [John (1939a)], deze eigenschapnbsp;is later door Furteren Meyer (1939) nog benut, om een bepalingsmethode uit te werken.

Na de isolatie van dit eerste a-tocopheryl-allophanaat met een smeltpunt van 158° C zijn er nog het /3- en het y-tocopherol bijnbsp;gekomen. Het laatste werd uit katoenzaadolie geïsoleerd. De smeltpunten zijn respectievelijk 143—144° C en 135° C (formulenbsp;C28H48O2) [Emerson (1937a)].

28

b. Structuur en synthese der tocopherolen.

De eerste grondslagen voor het vaststellen van de structuur zijn door Fernholz (1937) gelegd.

Door thermische ontleding verkreeg hij een product (I), dat hem leidde tot de veronderstelling, dat tocopherol een mono-aether wasnbsp;van het duro-hydrochinon (II). John, Dietzel en Günthernbsp;(1938), Fernholz (1938) zelf en ook Berge 1, Todd ennbsp;W ork (1938) kwamen echter reeds spoedig tot andere conclusiesnbsp;en Fernholz (1938) slaagde erin, om een structuurformulenbsp;(III) op te stellen, die beter met de eigenschappen van het tocopherol overeenkwam.

CH3

HO I CH,

CHj nbsp;nbsp;nbsp;CH3nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;CH3nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;CH3

I nbsp;nbsp;nbsp;Inbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Inbsp;nbsp;nbsp;nbsp;I

C-jCHda-CH-lCHds-CH-lCHds-CH

^1 nbsp;nbsp;nbsp;I

I nbsp;nbsp;nbsp;CH3

III.

dl-a-tocopherol.

Ook voor de isomere j3~ en y-tocopherolen, die een methylgroep minder hebben als het a-tocopherol, kon een overeenkomstige formule gevonden worden, waarbij de plaats van de methylgroepennbsp;aan de benzolkern nog niet vastgesteld kon worden.

De synthese van a-tocopherol werd het eerst door K a r r e r, Fritzsche, Ringier en Salomon (1938, 1938d) uitge-

29

voerd. Trimethylhydrochinon werd met phytylbromide gecondenseerd onder inwerking van watervrij zinkchloride. Men krijgt zoo het dZ-a-tocopherol in ongeveer quantitatieve opbrengst.

Berge], Todd en medewerkers (1938, 1938a) en Smith en medewerkers (1938) hebben op ongeveer gelijke wijze kort nanbsp;K a r r e r hetzelfde bereikt. Bij de synthese wordt een optisch inactieve stof verkregen, die K a r r e r d/-a-tocopherol noemde. Doornbsp;middel van de broom-camphersulfonzure ester heeft hij een component kunnen afscheiden, die identiek was met die van hetnbsp;natuurlijke tocopherol. De synthese van de 3 mogelijke /3-isomeren,nbsp;is door Karrer c.s. (1938, 1939, 1939a) eenerzijds en doornbsp;Berge 1, Todd c,s, anderzijds uitgevoerd. Hierbij bleek, dat IVnbsp;overeenkwam met het natuurlijke /3-tocopherol, V met het y-toco-pherol en VI nog niet in de natuur gevonden was.

30

voldoende zijn, om de vruchtbaarheid te herstellen, en y-toco-pherol zijn minder actief. Ongeveer 10 mg zijn noodig in een rattentest. Het derde synthetische /3-tocopherol (VI) schijnt denbsp;activiteit van a-tocopherol te evenaren [Jacob, Sutcliffe ennbsp;Todd (1940)]. De wijze waarop de verschillende auteurs totnbsp;deze waarden komen, zijn niet steeds geheel vergelijkbaar, hetgeennbsp;men bij deze getallen steeds in acht moet nemen.

Zeer vele stoffen, die in de loop van de chemische onderzoekingen zijn gesynthetiseerd, zijn op hun biologische activiteit onderzocht. Hierbij waren er, die in chemisch opzicht ver van het tocopherol afstonden en toch eenige activiteit vertoonden, andere, die slechts betrekkelijk weinig hiervan verschilden en die geheel inactief bleken.

Een systematisch onderzoek naar het verband van structuur der tocopherolen en de biologische activiteit is door Karrer (1938e)nbsp;begonnen.

Veranderingen aan de benzolkern verminderen de activiteit, evenals veranderingen in de zijketen. In dit opzicht is a-tocopherolnbsp;wel zeer specifiek de meest actieve vorm.

Door verestering van tocopherol krijgt men gedeeltelijk actieve producten b.v. tocopheryl-acetaat, tocopheryl-benzoaat en toco-pheryl-phosphaat maar ook inactieve, zooals tocopheryl-allophanaatnbsp;en het tocopheryl-urethaan.

Over de activiteit van de oxydatie producten van tocopherol, hebben we een eigen onderzoek uitgevoerd (pag. 51), waarbij ooknbsp;de literatuur besproken is.

HOOFDSTUK III.

DE BIOLOGISCHE BEPALING VAN VITAMINE E.

a. Literatuur.

Toen we in 1938 ons onderzoek over vitamine E begonnen, was ons eerste werk een quantitatieve biologische bepalingsmethodenbsp;op te bouwen. De chemische terzelfder tijd door E m m e r i e ennbsp;schrijver (1938) gevonden, kon hiermee vergeleken worden. Elknbsp;verder onderzoek zou zonder deze chemische methode onverge-lijkelijk veel moeilijker zijn, door de lange duur en vele andere moeilijkheden bij de biologische bepalingen.

Voor een goed begrip van onze moeilijkheden in het begin van onze onderzoekingen moet nog vermeld worden, dat ten tijde, datnbsp;deze biologische methode noodzakelijk geacht werd om de chemische uitkomsten te controleeren, het tocopherol nog niet gesynthetiseerd was en nog niet verkrijgbaar. De chemische structuurnbsp;was door het werk van Fernholz (1937) en John (1937)nbsp;reeds ten deele bekend. Quantitatieve biologische bepalingsmethoden bestonden niet. Door verschillende auteurs waren reeds pogingen gedaan, om de oude testmethode van Evans (1927) tenbsp;verbeteren. We noemen vooral Palmer (1937), Bacharachnbsp;(1937, 1938, 1938a), Bomskov (1938) en Mason (1939).nbsp;Deze gaan voort op de methode van Evans. Hierbij wordennbsp;vrouwelijke ratten gebruikt. De E-avitaminose is bij de rat nietnbsp;door uitwendige symptomen gekenmerkt, die eventueel in aanmerking kunnen komen als testreactie. Slechts twee criteria komen alsnbsp;zoodanig in aanmerking. De resorptie-steriliteit bij vrouwelijkenbsp;ratten en de testisdegeneratie bij mannelijke ratten. Een ijking kannbsp;dan berusten op het genezen (curatieve ijking) of het voorkomennbsp;(prophylactische ijking) van deze deficientie-verschijnselen. Daar

32

de testisdegeneratie niet herstelbaar is, spreekt het vanzelf dat we hier slechts een prophylactische ijkingsmethode zouden kunnennbsp;toepassen.

De andere symptomen, veranderingen der hypophyse, verlammingsverschijnselen en groeiremming komen niet in aanmerking. De methoden van bovengenoemde auteurs berusten allen op denbsp;resorptiesteriliteit, terwijl Ringsted (1936) nog een methodenbsp;voorstelt met mannelijke ratten dus berustend op de testisdegeneratie. Ik bespreek verder alleen de methode, die we later zelf gebruikt hebben, n.1. de curatieve ijkingsmethode met vrouwelijkenbsp;ratten.

Werkingskrommen van tarwekiemolie (Bomskov) en tarwekiemolie-concentraat (Bacharach).

Door Bacharach en Bomskov is het eerst ingezien, dat, wilde men een quantitatieve ijking verkrijgen, men het verbandnbsp;moest kennen tusschen de dosis vitamine en de uitwerking daarvan. Het vaststellen hiervan ging reeds met vele moeilijkheden gepaard; het resultaat is in fig. 3 vermeld.

De werking van het vitamine E wordt hier uitgedrukt in vruchtbaarheids percentage. Dit is het percentage ratten, dat jongen werpt betrokken op het aantal, dat zwanger is geworden. Als we

33

de werkingskrommen nader bezien, blijkt, dat er slechts een gering gradueel verschil is. De uitslag van de ijking heeft min of meer hetnbsp;karakter van een „alles of niets” werking. Een geheel anderenbsp;manier om de werking uit te drukken is later nog door Masonnbsp;(1939) gepubliceerd, welke dit bezwaar tracht te ondervangen. Hijnbsp;kon op de volgende wijze numerieke waarden verkrijgen, die hijnbsp;„uterine index” noemt. Bij een proef doodt hij zijn proefdierennbsp;op den lóden dag der zwangerschap. Dit bleek voordeelen tenbsp;hebben en nieuwe gezichtspunten op te leveren. De uterus wordtnbsp;er uitgehaald en gewogen zoowel voor als na verwijdering van denbsp;levende foetus, doode foetus en resorptie resten. Hij verkreeg metnbsp;behulp van de volgende vergelijking getallen, die volgens hem eennbsp;meer gradueel verschil aangeven van de E-avitaminose:

Gewicht van uterus inhoud aantal levende foetus

in g. nbsp;nbsp;nbsp;(als twee of meer aanwezig zijn)

Waarden kleiner dan 1 noemt hij negatief. Positieve uitkomsten tusschen 1 en 4 blijken evenredig te zijn met de dosis vitaminenbsp;E. IJkingen met deze en met de methode van Bacharach gavennbsp;gelijke uitkomsten. Mij komt de methode wat kunstmatig voor ennbsp;de practische bruikbaarheid moet nog bevestigd worden.

Uit de werkings-krommen kan men afleiden, dat men het best kan ijken met doses, die de steriliteit voor ongeveer 50 % opheffen.

De dosis, die bij 50 % der ratten de resorptie-steriliteit opheft noemt Bomskov de R(atten) E(enheid). Bacharach berekent een M(ean) F(ertility) D(ose) en vindt het volkomen overbodig om een eenheid in te voeren, daar deze dosis uitgedrukt kannbsp;worden in een zekere hoeveelheid tocopherol.

De genoemde auteurs gingen van de veronderstelling uit, dat hun dosis-werkingskromme iets absoluuts was, zoodat ze een onbekend preparaat in één dosis gegeven, hiermee direct kondennbsp;ijken.

Daar we veronderstelden, dat een curve van een biologisch symptoom als de resorptie-steriliteit niet steeds hetzelfde behoefdenbsp;te zijn, hebben we, evenals bij de vitamine A ijkingen gebruikelijknbsp;is, steeds naast de onbekende preparaten een standaard gebruikt.

34

Oorspronkelijk namen we hiervoor een tarwekiemolie, later c?/-a-tocopherol en daar deze stof niet stabiel is t.o.z, van de zuurstof van de lucht lijkt het ons beter tocopheryl-acetaat te gebruiken.nbsp;De activiteit is dan ook door ons t.o.z. van tocopherol bepaald. Bijnbsp;de ijking van onbekende preparaten stellen we dus steeds naastnbsp;elkaar de werkingskrommen van de standaard en van de onbekende stof. Als vergelijkingspunt namen we de dosis waarbij innbsp;beide krommen 50 % der dieren de zwangerschap tot een goednbsp;einde bracht. De sterkte van het onbekende preparaat is dannbsp;gemakkelijk te berekenen en uit te drukken in een gehalte aannbsp;tocopherol.

b. Uitvoering der ijkingen.

Bij het samenstellen van de werkings-krommen gaan we als volgt te werk. Aan een aantal groepen van volkomen gelijk behandeldenbsp;dieren, die zoolang een vitamine E-vrij dieet hebben gehad, dat ze

allen resorptie-steriliteit vertoonden (± 3 maanden), worden verschillende doses van een preparaat, opgelost in een inactieve olie gegeven.

De totale dosis wordt verdeeld over vijf dagen, per os gegeven, te beginnen met de dag waarop de mannetjes bij de wijfjes worden

35

gelaten (drie mannetjes bij ongeveer tien wijfjes bleek steeds voldoende om alle wijfjes te bevruchten).

De bevruchting kan men op verschillende manieren vaststellen, door na te gaan of er spermiën in de vagina gevonden worden ofnbsp;een vaginaal prop of ook een toeneming van het gewicht. Denbsp;laatste methode pasten we toe. De wijfjes worden voor dit doelnbsp;tweemaal per week gewogen. Uit de gewichtscurven kan men afleiden of de ratten zwanger zijn geworden en of er een resorptienbsp;optreedt (fig. 4, 5 en 6).

Als de zwangerschap normaal verloopt, wordt na ongeveer 21 dagen een nest jongen geworpen. We noemen de zwangerschapnbsp;normaal als er één levend ratje geboren wordt. Bacharachnbsp;beveelt het gebruik van virgineele ratten aan. B o m s k o v gebruikt

36

zijn ratten meerdere malen. Bij onze methode, waar steeds standaard curven ter controle gemaakt worden, kan men deze laatste methode toepassen. Het spreekt echter van zelf, dat men de ijkingen

van standaard en onbekende preparaten met een groep geheel gelijk behandelde dieren moet uitvoeren. Bij deze bepalingen wasnbsp;een uniforme behandeling van het dier materiaal en de samenstelling van het dieet van groot belang. Deze waren als volgt:

1. Dieren.

Jonge vrouwelijke albinoratten met een gewicht van 60—80 g.

37

4—5 weken oud, van moeders, gevoed met ons normale fokvoer, werden op een vitamine E-vrij dieet gezet, dat hen ad libitum gegeven werd. De dieren werden met 8 a 10 te samen in kooien metnbsp;een inhoud van 45 X 45 X 40 cm gehouden, terwijl drinkwaternbsp;steeds tot hun beschikking was. Ze vertoonden na drie maandennbsp;resorptiesteriliteit. Het is dus niet noodig om speciale voorzorgennbsp;te nemen, zooals Mason voorstelt, om te verhinderen, dat denbsp;jongen terwijl ze nog gezoogd worden een vitamine E-voorraadnbsp;opdoen door van het voer van de moederdieren te eten.

2. Het dieet.

Ons fokvoer voor de moederdieren en voor de normale mannetjes bestond uit het volgende:

Gemalen mais............200

Magere melkpoeder..... 150

Bier gist....... 75

Oleum arachidis...........25

Reuzel..............50

500

De dieren waren op dit dieet volkomen normaal. Een vitamine E-vrij dieet kan men op verschillende manieren bereiken. Men kannbsp;van grondstoffen uit gaan die absoluut vitamine E-vrij zijn.

Dit zijn in het algemeen vetvrije diëeten [B 1 u m b er g (1935)]. Een andere methode is die van W addel en Steenbocknbsp;(1931); hierbij worden de voermengsels behandeld met een ferri-chloride oplossing in aether. Het vitamine E wordt dan geoxydeerd.nbsp;Een derde methode vindt men in de vetrijke diëeten. Hierin wordennbsp;de eventueele hoeveelheden vitamine E geoxydeerd door de bijnbsp;het rans worden ontstane peroxyden. Als vet komt vooral in aanmerking reuzel daar dit gemakkelijk rans wordt. Bij de twee laatstenbsp;methoden zou men volgens W addel en Steenbock complicaties kunnen verkrijgen daar de door het rans worden ontstanenbsp;producten alleen reeds voldoende zouden zijn om een resorptiesteriliteit te veroorzaken. Dit is in nog sterkere mate het geval metnbsp;de oxydatie producten, die ontstaan bij de behandeling met ferri-chloride. De eerste methode lijkt dus het beste. De groei is dan

38

echter meestal slecht. Wij hebben daarom een tusschenweg gekozen, het dieet bestond uit:

Caseine (technische).........900

Amylum oryzae........... 3450

Biergist.............300

Reuzel..............195

Zoutmengsel (Steenbock no. 40)..... 220

5065

20 g levertraan per kg voer.

De ratten vertoonden op dit dieet na drie maanden zonder uitzondering resorptie-steriliteit.

3. Waardeering der resultaten.

De werkingskrommen van standaard en onbekende preparaten werden opgesteld door de vruchtbaarheidsgraad na te gaan nanbsp;toediening van verschillende doses aan groepen van vitaminenbsp;E-vrije ratten. Bij de berekening nemen we als vergelijkingspunt denbsp;dosis, waarbij 50 % der ratten, waarbij een implantatie vastgesteldnbsp;was, een zwangerschap tot een goed einde brachten.

Het resultaat van de ijkingen, waarbij c?/-a-tocopherol, dat de firma Hoffmann-La Roche ons ter beschikking stelde, als standaard preparaat gebruikt werd, wordt in de volgende bladzijdennbsp;besproken.

c. Zwangerschaps-resorptie en implantatie.

Voorgaand schreven we reeds, dat Bacharach bij voorkeur virgineele ratten gebruikt, terwijl B o m s k o v de ratten meerderenbsp;malen voor achtereenvolgende ijkingen bezigt. De reden vannbsp;Bacharach (1937, 1938) hiervoor is het volgende feit, datnbsp;anderen en ook wij bij onze proeven hebben opgemerkt. Maaktnbsp;een groep ratten een zwangerschaps-resorptie door, dan wordt bijnbsp;een volgende dekking een zeker percentage niet zwanger. Dit percentage wordt na nog meer resorpties hoe langer hoe grooter. Daarnbsp;deze dieren waardeloos zijn voor de proef, brengt het groote nadoelen mee; men moet dan, om een vereischt behoorlijk aantal te

39

krijgen, van een veel grooter aantal uitgaan. Ook Karrer en D e m o 1 e (1938) vermeldden deze daling van het percentage metnbsp;normale implantatie, nadat de ratten een of meer zwangerschaps-resorpties hadden doorgemaakt. Door Bacharach (1938)nbsp;werd bewezen, dat het een gevolg is van de zwangerschaps-resorptie zelf en niet van het langer verblijven op een vitamine E-vrij dieet. Ook wij konden deze achteruitgang vaststellen, zooalsnbsp;blijkt uit de volgende tabel, waarin ook de cijfers van bovengenoemde auteurs vermeld zijn.

Het is niet bekend of deze steriliteit tengevolge van zwangerschaps-resorpties herstelbaar is.

d. IJking van oliën en concentraten.

Het doel van deze ijkingen was om bij een aantal preparaten na te gaan of de uitkomsten met de chemische bepaling overeenkwamen met die van de biologische. Het was immers zeer goednbsp;mogelijk, dat we evenals bij vitamine A zeer groote verschillen

40

zouden vinden in beide methoden. De chemische methode wordt daardoor niet geheel waardeloos, maar verliest, vooral bij eennbsp;physiologisch onderzoek, veel van zijn voordeelen.

De volgende ijkingen zijn met eenzelfde groep ratten uitgevoerd. Als standaard preparaat werd o?/'a-tocopherol gebruikt. Van denbsp;onbekende preparaten werd een dosis-werkingskromme geconstrueerd. Met behulp van krommen werd grafisch de dosis gevondennbsp;waarbij 50 % der dieren een normale zwangerschap vertoonden.nbsp;Uit deze dosis is dan, door middel van de dosis gevonden met hetnbsp;c?/-a-tocopherol, direct het tocopherol-gehalte der onbekende preparaten te berekenen.

T a b e 1 2.

Verband tusschen de dosis en de werking van cW-a-tocopherol.

41

1. nbsp;nbsp;nbsp;dZ-a-tocopheroI.

Het preparaat opgelost in olijfolie. De verschillende doses verdeeld over de eerste vijf dagen der proef per os aan de ratten toegediend (zie tabel 2 en fig. 7).

De zwangerschap verloopt bij 50 % der dieren normaal bij een dosis van 1.2 mg.

2. nbsp;nbsp;nbsp;TarwekicmoUe,

„Koud geperste” tarwekiemolie uit de handel.

Als zoodanig onverdund aan de dieren per os gegeven.

De zwangerschap verloopt bij 50 % der dieren normaal bij een dosis van 0.39 g. Het gehalte aan tocopherol is dus 0.33 %.

42

3. Concentraat uit tarwekiCmoUe bereid.

Door verzeeping en uitvriezen der sterinen uit voorgaande tarwe-kiemolie verkregen (concentraat 1). Concentraat verdund met olij folie.

De zwangerschap verloopt bij 50 % der dieren normaal bij een dosis van 5 mg. Het gehalte aan tocopherol is dus 24 %.

4, Katoenzaadolie.

Niet geraffineerde katoenzaadolie uit de handel. Als zoodanig onverdund aan de ratten per os gegeven.

43

Tabel 5.

Verband tusschen de dosis en de werking van katoenzaadolie.

De zwangerschap verloopt bij 50 % der ratten normaal bij een dosis van 0.6 g. Het gehalte aan tocopherol is dus 0.2 %.

5. Concentraat uit katoenzaadolie.

Door verzeeping en uitvriezen der sterinen uit voorgaande olie verkregen (concentraat 2). Het concentraat verdund met olijfolie.

T a b e 1 6.

Verband tusschen de dosis en de werking van concentraat 2.

44

De zwangerschap verloopt bij 50 % der ratten normaal bij een dosis van 8.5 mg. Het tocopherol gehalte is dus 14 %.

e. Vergelijking van de biologische en de chemische bepaling van vitamine E.

De biologische ijkingen van deze preparaten geven ons eenige cijfers ter vergelijking met waarden gevonden met de chemischenbsp;bepalingsmethoden voor het vitamine E. Naast de methode vannbsp;Emmerie en Engel (1938a), hebben we ook nog eenige bepalingen uitgevoerd op een wijze' als door Karrer en Keilernbsp;(1938g) beschreven is. Beide methoden berusten op de reduceeren-de eigenschappen van het vitamine E. Zij verschillen slechts innbsp;oxydatie middel. Bij de methode van Emmerie en Engelnbsp;wordt met ferrichloride het tocopherol geoxydeerd en het gevormdenbsp;ferro-ijzer met behulp van a : a'-dipyridyl colorimetrisch bepaald,nbsp;bij de methode van Karrer en Keiler is goudchloride hetnbsp;oxydans en wordt het verbruikte goudchloride potentiometrischnbsp;getitreerd. Bij beide methoden kunnen de in de oliën aanwezigenbsp;carotinoiden storen. Men kan hiervoor een correctie aanbrengennbsp;[Karrer en Keiler (1938g)] of ze quantitatief verwijderennbsp;[Emmerie en Engel (1939)].

45

Chemische bepalingen.

De bepalingen werden uitgevoerd met het onverzeepbare deel der oliën. De concentraten waren reeds verzeept, zoodat het hierinnbsp;rechtstreeks bepaald kon worden.

1. Tarwekicmolie.

5 g afgewogen en met 10 cm3 2 n methyl-alcoholische KOH gedurende 10 min. bij kooktemperatuur onder een stikstof atmos-pheér verzeept. Het mengsel verdund met 15 cm3 methanol ennbsp;40 cm3 water en daarna driemaal met 50 cm3 aether geëxtraheerd.nbsp;De vereenigde aether extracten met water, verdunde loog en weernbsp;met water tot alkali-vrij gewasschen. De aether oplossing overnbsp;calciumchloride gedroogd en in vacuo verdampt. De rest in 50 cm3nbsp;aethanol opgenomen (oplossing 1).

Deze oplossing gebruikt voor de bepaling van carotine en tocopherol:

1 cm3 bevat 6 y carotine.

1 cm3 van oplossing 1 met 1 cm3 0.2 % ferrichloride in aethanol en 1 cm3 0.5 % a : a'-dipyridyl eveneens in aethanol verdund totnbsp;25 cm3. Stuphometer aflezing met 1 cm cuvet 43.5 d.i. 246 ynbsp;tocopherol.

Carotine correctie; Deze waarde moet nog gecorrigeerd worden voor het aanwezige carotine. Bij deze geringe carotine hoeveelhedennbsp;komt 1 y carotine overeen met 1 y tocopherol. Per cm3 jg dusnbsp;240 y tocopherol aanwezig d.i. 0.24 % berekend op de oorspronkelijke olie.

20 cm3 van oplossing 1 met een oplossing van goudchloride volgens Karrer en Keiler potentiometrisch getitreerd. 1.30 cm3 van deze goudchloride oplossing komt overeen met 1 mg tocopherol.

Het gemiddelde der potentiaal sprong werd grafisch uit de figuur afgeleid. Het is in dit geval bij 7.3 cm3 AuCls oplossing.

Carotine correctie.

20 cm3 van oplossing 1 bevatten 130 y carotine. 1 mg carotine komt overeen met 4.01 cm3 goudchloride oplossing. 130 y is dusnbsp;0.52 cm3. Voor tocopherol blijft dus over 6.78 cm3 dj. 5.21 mgnbsp;tocopherol of 0.26 % der oorspronkelijke olie (Biol, waardenbsp;0.33 %).

2. Concentraat 1.

100 mg afgewogen en opgelost in 50 cm^ aethanol.

Carotine: 10 cm3 bevatten 72 y carotine.

Tocopherol: 0.5 cm3 met ferrichloride-dipyridyl behandeld. Stuphometer aflezing: 44.5 d.i. 240 y dus na carotine correctienbsp;232 y of 23.6 % tocopherol berekend op het concentraat.

10 cm3 der oplossing gebruikt voor potentiometriche titratie met goudchloride.

Het gemiddelde van de potentiaal-sprong is bij 6.3 cm3.

Carotine correctie: 72 y komt overeen met 0.30 cm3 goudchloride oplossing. Voor tocopherol blijft dus over 6.00 cm3 d.i. 4.62 mgnbsp;of 23.1 % tocopherol berekend op het concentraat (biol. waardenbsp;24 %).

3. Katoenzaadolie.

Bewerkt als tarwekiemolie. Het onverzeepbare van 5 g olie op-gelost in 50 cm^ aethanol.

Carotine: 2 cm3 van deze oplossing bevatten 1.7 y carotine.

Tocopherol: 2 cm3 met ferrichloride-dipyridyl reagens behandeld geven een stuphometer aflezing van 36 d.i. 304 y gecorrigeerd voor carotine dus 302.3 y of 0.15 % tocopherol berekend op denbsp;oorspronkelijke katoenzaadolie.

20 cm3 met goudchloride getitreerd.

Het gemiddelde van de potentiaal-sprong ligt bij 3.4 cm3.

Na carotine correctie blijft 3.30 cm3 over voor tocopherol of 2.54 mg. het gehalte aan tocopherol der katoenzaadolie is dusnbsp;0.13 % (biol. waarde 0.20 %).

Tabel 9.

Potentiometrische titratie van het onverzeepbare deel van katoen-zaadolie.

4. Concentraat 2,

100 mg afgewogen en opgelost in 50 cm^ aethanol.

10 cm3 van deze oplossing bevatten 12 y carotine.

2 cm3 met ferrichloride-dipyridyl reagens behandeld geven een aflezing van 29 d.i. 368 y tocopherol dus na carotine correctienbsp;367 y of 18,3 % berekend op het concentraat (biol. waarde 14 %).

In onderstaande tabel hebben we de uitkomsten der chemische en der biologische bepalingen samengevat.

Tabel 10.

Vergelijking van de biologische en de chemische bepaling van vitamine E.

49

Zooals uit de tabel blijkt, komen de beide chemische methoden in uitkomsten vrijwel overeen. Ook de biologische ijkingen wijkennbsp;niet veel af als men in aanmerking neemt de groote fouten, die mennbsp;bij deze ijkingen niet kan vermijden.

Lester Smith en Bailey (1939) onderzochten later een grooter aantal oliën en concentraten en vonden de beide chemischenbsp;methoden van Karrer en Keiler en van E m m e r i e ennbsp;Engel in overeenstemming met elkaar. In vergelijking met denbsp;biologische vinden zij, dat bij de chemische methoden in het algemeen de waarden te hoog gevonden worden bij concentraten ennbsp;te laag Bij oliën. Biologische uitkomsten zijn echter niet vermeld.nbsp;Zij gebruiken de methode van Bacharach.

f. Vergelijking der biologische activiteit van het synthetische dl-ix-tocopherol en het natuurlijke d~a~tocopherol.

Ten tijde, dat wij reeds het synthetisch c//-a-tocopherol als standaard gebruikten voor onze ijkingen, was het nog niet bekend of de biologische activiteit identiek was met die van het natuurlijke tocopherol. Een scheiding in de componenten kon door Karrernbsp;(1938c) slechts ten deele verwezenlijkt worden. Later bleek, dat denbsp;verhoudingen gecompliceerder waren dan oorspronkelijk vermoednbsp;was [Karrer (1939)].

Een biologische ijking van beide preparaten naast elkaar was nog door niemand uitgevoerd. In de literatuur kwamen wel verschillende getallen voor over de werking der beide preparaten, maarnbsp;geheel vergelijkbaar zijn deze niet door verschil in methode.

In onderstaande tabel zijn de gegevens uit de literatuur samen gevat. Hieruit blijkt ook heel duidelijk, dat men steeds weer eennbsp;standaard moet gebruiken om een bepaald preparaat te ijken ennbsp;dat men niet kan volstaan met een voor altijd samengestelde dosis-werkings kromme [Bacharach (1938a)].

50

Tabel 11.

Biologische activiteit van dl-a-tocopherol en van d-a-tocopherol.

51

Eigen ijking.

Voor de ijking van c?-a-tocopherol gebruikten wij een zuiver tocopheryl-allophanaat, dat dr. J o h n (Gottingen) ons ter beschikking stélde. Het werd voor het toedienen op de gebruikelijke maniernbsp;met methyl-alcoholische KOH verzeept. Door een chemische bepaling werd het gehalte na verzeeping bepaald en een geschiktenbsp;verdunning gemaakt in arachisolie.

Het d/-a-tocopherol (Hoffmann-La Roche) werd eveneens in arachisolie verdund.

De activiteit van beide preparaten is dus ongeveer gelijk. In vergelijking met de voorgaande ijkingen is het tocopherol hier sterker werkzaam (zie tabel 2 blz. 40). Een verklaring kan hiervoornbsp;niet gegeven worden.

g. Biologische activiteit van de oxydatie producten van tocopherol.

Indien de oxydatie producten van tocopherol eenige vitamine E-activiteit hadden, was de chemische bepalingsmethode vannbsp;Emmerie en Engel waardeloos. Geoxydeerde productennbsp;worden immers met deze methode, die juist berust op de reducee-rende eigenschappen van het tocopherol, niet mee bepaald. In aansluiting aan de ijkingen van de natuurlijke oliën en concentratennbsp;onderzochten wij terstond de oxydatie producten van het synthetische c//-a-tocopherol en van het c?-a-tocopherol met ferrichloridenbsp;op hun biologische activiteit.

In een vroegere publicatie, Emmerie en Engel (1939),

52

deelden wij het resultaat reeds mee, waarbij wij opmerkten, dat hoewel deze oxydatie producten onwerkzaam waren, zij nog wel eennbsp;reactie vertoonden met de alcoholisch salpeterzuur bepalingsmethodenbsp;van Furter en Meyer (1939). Het lijkt eenigszins overbodignbsp;deze proef te doen, daar immers W addell en Steenbocknbsp;(1931) hun dieet voor het verkrijgen van vitamine E-vrije rattennbsp;met ferrichloride in aether behandelden, waarbij het eventueel aanwezige vitamine E onwerkzaam wordt. Daartegenover stond, datnbsp;Olcott en Mattill (1934) en Evans, Emerson ennbsp;.Emerson (1936) slechts een verminderde activiteit vonden nanbsp;oxydatie met zilvernitraat. Na het afsluiten van onze eigen proevennbsp;verschenen er verscheidene publicaties over dit onderwerp. K a r r e rnbsp;(1938a, 1938f), J o h n (1939a), v. W e r d e r (1939) en W rightnbsp;(1940) vonden de oxydatie producten inactief. Hierbij dient vermeld te worden, dat door de oxydatie middelen zooals gewoonlijknbsp;gebruikt (ferrichloride, goudchloride en zilvernitraat) niet identieke producten ontstaan. Met ferrichloride en goudchloride ontstaat in hoofdzaak een product VII, dat K a r r e r tocopherol-chinon, John tocopherylchinon en Emerson toco-chinonnbsp;noemt. Met zilvernitraat ontstaat naast VII nog het rood gekleurdenbsp;para-chinon VIII het „tocopherol-rot”, dat eveneens ontstaat bijnbsp;de oxydatie met alcoholisch salpeterzuur.

CHs

O nbsp;nbsp;nbsp;Inbsp;nbsp;nbsp;nbsp;CHj

‘ nbsp;nbsp;nbsp;quot;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;¦ \

CH2 nbsp;nbsp;nbsp;CHsnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;CHsnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;CHs

I nbsp;nbsp;nbsp;Inbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Inbsp;nbsp;nbsp;nbsp;I

C-jCH^js-C-jCHds-C-iCHjb-CH-CH^

|\ nbsp;nbsp;nbsp;Hnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;H

HO CH,

VII.

H3C

VIII. John.

53

Des te merkwaardiger is daarom het resultaat van Emerson, Emerson en Evans (1939), die een quantitatief even grootenbsp;activiteit vinden van toco-chinon en tocopherol.

Karrer en Geiger (1940) komen met een uitgebreid onderzoek nogmaals terug op deze vraag en bevestigen nogeens hun reeds vroeger vermeld resultaat.

De vraag of tocopheryl-chinon biologisch werkzaam is of onwerkzaam, is niet alleen van belang voor de chemische bepaling maar heeft ook een andere beteekenis. Emerson (1939) ennbsp;Wright (1940) veronderstelden n.1., dat beide producten in denbsp;cel in elkaar konden overgaan, een redox-systeem zouden vormennbsp;en men stelde zich voor, dat het tocopherol ook op deze wijze innbsp;de cel zou werken.

H,

CH

CH,

I

C—CibH,

/\/\HO CH H,C I Onbsp;CH

a-T ocophery 1-chinon

IX. Oxydo-reductie systeem verondersteld door Wright en Drummond.

Wright (1940) en Karrer (1940) ontkennen dit, terwijl Emerson (1939) dit bewezen meent te hebben. Karrer heeftnbsp;intusschen wel aan getoond, dat de methode van oxydatie vannbsp;Emerson zeer onvolledig was en geeft daarbij dezelfde getallen,

54

die wij ook vonden voor het niet geoxydeerde gedeelte. In het experimenteele gedeelte komen wij daarop nader terug (blz. 55).nbsp;Hieronder volgt een samenvatting van de biologische ijkingen vannbsp;de diverse auteurs.

Tabel 13.

Biologische activiteit van de oxydatie producten van tocopherol.

55

Experimenteel gedeelte.

dl-a-'Y ocophcryl-chinon.

275 mg JZ-a-Tocopherol afgewogen en in 30 cm^ methanol opgelost. Hieraan 1 g FeCls- 6 aq toegevoegd en zeven uur bijnbsp;kamertemperatuur laten staan. Met ongeveer 70 cm^ water verdundnbsp;en driemaal met peroxyd-vrije aether geextraheerd. De vereenigdenbsp;aether oplossingen met verdund zoutzuur en water gewasschen ennbsp;over natriumsulfaat gedroogd. Na filtratie de aether oplossing gemengd met 18.4 cm^ olijfolie en de aether in vacuo verdampt.

Oplossing I. 1 cm3 van deze oplossing bevat dus 15 mg geoxy-deerd tocopherol. Na deze oxydatie bleek nog 7 % van de oorspronkelijke hoeveelheid reduceerende stof berekend als tocopherol aanwezig.

d-a-T ocopheryl-chinon.

Daar wij niet de beschikking hadden over zuiver d-a-tocopherol werd deze proef met een concentraat uit tarwekiemolie uitgevoerd.nbsp;Dit bevatte 24 % tocopherol. 700 mg concentraat d.i. 168 mg tocopherol afgewogen en m.et 500 mg FeCls. 6 aq. in 30 cm3 methanolnbsp;zeven uur bij kamertemperatuur laten staan. Verder verwerkt alsnbsp;bij dZ-a-tocopherol. Opgelost met olijfolie tot 11.2 cm3. Oplossing II.

56

Oplossingen I en II in doses van 400 en 800 mm^, dit is 6 en 12 mg oorspronkelijk tocopherol, aan vitamine E-vrije ratten gegevennbsp;en de werking vergeleken met die van zuiver tocopherol. Dezenbsp;doses waren over de eerste vijf dagen van de proef verdeeld.

De oxydatie producten zijn dus in de gegeven doses 'onwerkzaam.

h. Vergelijking van de biologische activiteit van dl~c(,~tocopherol en van dl-a.~tocopheryl~acetaat.

Het voordeel van een constante, tegen oxydatie bestendige, standaard is duidelijk. Een tocopherol-derivaat, dat als zoodanig denbsp;voorkeur verdient boven tocopherol, zou moeten voldoen aan denbsp;eisch:

Ie. dat het biologisch actief is en

2. dat het bestendig is tegen oxydatie door de luchtzuurstof.

De allophaanzure-ester van tocopherol is wel bestendig, is echter biologisch inactief. Door Olcott (1935) werd aangetoond, datnbsp;acetyleering van tocopherol, een biologisch actief product gaf, innbsp;tegenstelling met het resultaat van Evans en Burr (1927) innbsp;een ouder onderzoek vermeld. Isler (1938) vond, dat het toco-pheryl-acetaat gt;bestendig was tegen luchtzuurstof. Dit was voornbsp;ons aanleiding om deze ester als standaard in te voeren in plaatsnbsp;van tocopherol. Een nadeel bij het gebruik van het tocopheryl-acetaat is, dat men niet zoo gemakkelijk de hoeveelheid chemischnbsp;kan bepalen als van het vrije tocopherol, daar men steeds eerst eennbsp;verzeeping moet uitvoeren.

Demole en Karrer c.s. (1939a) onderzochten dit product (en nog enkele andere esters) op de biologische activiteit en vondennbsp;het zelfs sterker werkzaam dan het vrije tocopherol. Deze conclusienbsp;leek ons aan de hand van hun gepubliceerd cijfer materiaal eenigs-zins voorbarig. quot;Voor een juiste vergelijking der activiteit kan mennbsp;niet met slechts één dosis van het tocopherol volstaan. Daar wenbsp;bij eventueel latere ijkingen van preparaten, waarbij we tocopheryl-acetaat als standaard zouden gaan gebruiken, het gehalte aannbsp;tocopherol wilden uitdrukken in mg van het laatste, leek het onsnbsp;gewenscht een juiste vergelijking der activiteit der beide preparatennbsp;uit te voeren. De resultaten van een ijking volgens onze eigennbsp;methode met dit doel uitgevoerd volgen hieronder.

57

dZ-a-Tocopherol en (iZ-a-tocopheryl-acetaat in sesamolie opgelost. De totale doses verdeeld over de eerste vijf dagen der proef ennbsp;per os toegediend.

De sterkte der beide preparaten is ongeveer gelijk; 0.7 mg is voldoende om bij 50 % der ratten de steriliteit op te heffen.

Over de biologische activiteit van het tocopheryl-acetaat zijn later meerdere gegevens bekend geworden.

Wright en Drummond (1940) vinden bij 5 mg 30 % en bij 10 mg 50 % fertiliteit. Demole heeft in een latere publicatienbsp;(1939b) ook gelijke sterkte in biologische activiteit gevonden vannbsp;tocopherol en tocopheryl-acetaat. De volgende getallen wordennbsp;door hem nog gegeven (doses per os toegediend):

0—20 % fertiliteit 40—60 %

80—100 % „

HOOFDSTUK IV.

DE BIOLOGISCHE ACTIVITEIT VAN d/-a-TOCOPHEROL BIJ MANNELIJKE RATTEN.

Het werk van Grijns (1938) en medewerkers (1933) is aanleiding geweest tot dit onderzoek. G r ij n s, die, voorzoover we konden nagaan, de eerste Nederlandsche auteur was over anti-steriliteitsproblemen, heeft sinds 1921 vele proeven genomen metnbsp;ratten. Hij meende daarbij gevonden te hebben, dat de antisterili-teitsfactoren voor vrouwelijke en mannelijke ratten verschillendnbsp;waren en er bovendien nog een lactatiefactor in de voeding noodignbsp;was. Een lactatiefactor is ook door anderen gevonden [Nakaharanbsp;(1934/35 en Z a g a m i (1933a)]. De door hen genoemde factornbsp;is wateroplosbaar en komt in lever en gist voor. Het ziet er naarnbsp;uit alsof men hier met een factor uit de B-groep te doen heeft ennbsp;of het beter is deze factor maar niet onder het vitamine E tenbsp;rekenen. Grijns en Dingemanse hebben getracht de mannelijke en vrouwelijke E-vitamines van elkaar te scheiden. De conclusies waartoe Grijns (1938) tenslotte gekomen is kunnen wijnbsp;kort samenvatten:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Er is een antisteriliteitsfactor, die de vrouwelijke resorptie-steriliteit opheft. Dit is hetzelfde als het vitamine E (tocopherol)nbsp;van de Amerikaansche onderzoekers (Evans, Sure en Mat-till).

2. nbsp;nbsp;nbsp;Er is een factor, die de steriliteit van mannelijke rattennbsp;voorkomt en deze is niet gelijk aan bovengenoemde factor.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Er is behalve deze twee antisteriliteitsvitamines nog eennbsp;factor, die noodzakelijk is voor de lactatie.

Hij meent de punten 1 en 2 bewezen te hebben, door een scheiding van de beide factoren. Wij kunnen ervan afzien de proeven

59

van G r ij n s over dit onderwerp uitvoerig te beschrijven. Ze zijn bovendien in zijn publicaties zeer kort samengevat, hoewel ze nietnbsp;op alle punten even duidelijk zijn.

Ons doel was om na te gaan, of het zuivere tocopherol werkzaam was bij mannelijke ratten. Dit kon thans geschieden doordat wijnbsp;de beschikking hadden over zuiver tocopherol.

Eigen proeven.

1. Curatieve proeven.

Eenige oriënteerende proeven werden uitgevoerd, waaruit bleek, dat de mannelijke ratten op ons vitamine E-vrij voer steriel werden.

22 ongeveer 5 maanden oude ratten, werden op vitamine E-vrij dieet gezet. De vruchtbaarheid werd nagegaan, door iedere tweenbsp;weken elk mannetje samen te brengen met twee normale wijfjes.nbsp;Werd een of allebei zwanger, dan was het mannetje nog fertiel.nbsp;Fig. 15 geeft het verband tusschen fertiliteit en de tijd doorgebrachtnbsp;op vitamine E vrij dieet.

Ofschoon uit de literatuur reeds bekend was, dat curatieve toediening van tarwekiemolie geen of slechts weinig effect had, beslo-

60

ten we bij eenige ratten, die volgens onze test vier weken steriel waren, te behandelen met een dosis van 2 mg dZ-a-tocopherol; hierna waren zij nog steriel. Behandeling met tweemaal een dosis vannbsp;6 mg met tusschenpoozen van 14 dagen had evenmin een gunstignbsp;resultaat. Het histologisch onderzoek van de testes van deze rattennbsp;en van onbehandelde, die even lang op het vitamine E-vrij dieetnbsp;hadden geleefd, gaf een verrassende uitkomst. De dieren warennbsp;toen i 2 a 3 maanden onvruchtbaar, maar het histologisch beeldnbsp;van de behandelde dieren was nog nagenoeg normaal, terwijl datnbsp;van de niet behandelde dieren het typische degeneratie beeld vertoonde zooals dat door anderen reeds beschreven was. i)

Hieruit kon men dus reeds concludeeren, dat de tocopherol-behandeling het voortschrijden van de degeneratie belet en dus werkzaam is. Niet tevreden echter met dit resultaat heb ik nognbsp;eenige prophylactische proeven uitgevberd met het synthetischenbsp;c?/-a-tocopherol bij mannelijke ratten en heb tevens getracht denbsp;ontstane steriliteit bij de curatieve proef op te heffen, door te behandelen met hormqonpreparaten, waarvan sommige onderzoekersnbsp;een gunstig effect hadden waargenomen. Ik had hiertoe de beschikking over pregnyl en gestyl. 2)

Geen der preparaten gecombineerd met c?/-a-tocopherol of tarwe-kiemolie gaf eenig resultaat. De eenheden gestyl en pregnyl hierbij toegediend varieerden van 2 tot 80 R.E. per week.

2. Prophylactische proeven.

Een prophylactische proef werd als volgt uitgevoerd; 6 groepen van elk 8 ratten werden op een leeftijd van ongeveer 10 wekennbsp;op vitamine E-vrij dieet gezet; o?/-a-tocopherol en tarwekiemolienbsp;werden per os toegediend. De mannetjes werden na drie maandennbsp;getest door ze samen te brengen met normale vrouwtjes. Het resultaat is in tabel 16 vermeld.

Ofschoon bij deze doses tocopherol niet alle ratten fertiel

Het histologisch onderzoek werd door dr. Freud te Amsterdam uitgevoerd, waarvoor ik hem op deze plaats nogmaals dank zeg.

2) Pregnyl = gonadotroop hormoon uit de hypophysevoorkwab.

Gestyl = gonadotroop hormoon uit het serum van zwangere merries.

(Beide preparaten afkomstig van de Fa. Organon te Oss).

61

bleven, blijkt ook hier heel duidelijk de werking van tocopherol. Na het afsluiten van onze proeven over dit onderwerp zijn ooknbsp;Evans, Emerson en Emerson tot hetzelfde resultaat gekomen (1939).

Tabel 16.

Biologische activiteit van synthetisch dZ-a-tocopherol en tarwekiemolie bij mannelijke ratten.

HOOFDSTUK V.

VITAMINE E BEPALING IN BLOEDSERUM.

In de inleiding op pg. 11 schreven we reeds, dat een vitamine bepaling in het bloed ons inziens de meest waardevolle weg wasnbsp;om een avitaminose te bestudeeren. In 1939 deelden E m m e r i enbsp;en schrijver (1939) een chemische methode mede voor de bepalingnbsp;van tocopherol in bloedserum. Dat we bij deze methode werkelijknbsp;het vitamine E bepaalden, wordt wel zeer waarschijnlijk gemaaktnbsp;door het feit, dat bij vitamine E vrije ratten geen en na toedieningnbsp;van tarwekiemolie wel tocopherol in het bloedserum kon wordennbsp;aangetoond. Op verschillende manieren, die hieronder besprokennbsp;worden, hebben wij overwogen nog meer bewijzen hiervoor aannbsp;te voeren,

1°. Afscheiding van het tocopherol uit het bloedserum en identificatie. Dit ideale bewijs kon niet gebracht worden. Rattenserum bevat ± 20 y per 10 cm^ serum en zeer veel andere stoffen, dienbsp;niet door verzeeping te verwijderen zijn. De verhouding vannbsp;vreemde stoffen en tocopherol was te ongunstig. De afscheidingnbsp;van tocopherol uit het onverzeepbare gedeelte van oliën geschiedtnbsp;in de vorm van zijn allophanaat. Gezien de moeilijkheden, die velenbsp;onderzoekers en ook wij reeds gehad hadden, om het tocopherolnbsp;af te scheiden uit een verzeepingsrest van tarwekiemolie, was denbsp;kans, dat dit bij een verzeepingsrest van bloedserum zou gelukkennbsp;al zeer gering, afgezien nog van de groote hoeveelheden bloed,nbsp;die voor een dergelijke proef noodig zouden zijn, We hebbennbsp;dan ook geen poging gedaan om dit te bereiken.

2°. De biologische proef om te bewijzen, dat de bepaalde stof werkelijk tocopherol was. Men zou hierbij ongeveer 10 liter serumnbsp;noodig hebben om 10 a 20 mg tocopherol in een of ander concen-

63

traat te verkrijgen, wat wel voldoende zou zijn voor een test met eenige ratten. Een dergelijke hoeveelheid serum kon niet doornbsp;ons verwerkt worden.

3°. Kar r er (1939b) wees er reeds op, dat bij de bepaling van tocopherol in organen na de toegepaste extractie en ver-zeeping geen andere bekende stoffen meer aanwezig waren, dienbsp;AuCls of FeCls reduceeren, behalve vitamine A en carotinoiden.nbsp;Ook deze worden bij onze methode verwijderd. Ofschoon dit geennbsp;direct bewijs is, dat het bepaalde tocopherol is, maakt het dit tochnbsp;wel zeer waarschijnlijk.

4°. De roode kleurstof, die als reactie op tocopherol door John (1939) werd beschreven, geeft een indruk over het al of niet aanwezig zijn van tocopherol of derivaten ervan:

Door John (1939) werd een reactie beschreven van tocopherol met salpeterzuur, waarbij een roode kleurstof ontstaat, het para-chinon, welk product we reeds noemden in verband met de biologische activiteit van oxydatie producten van tocopherol (blz. 52).

Furter en Meyer (1939) hebben deze reactie uitgewerkt tot een quantitatieve bepalingsmethode. Ofschoon wij deze methodenbsp;ongeschikt achten om vitamine E te bepalen, daar eenerzijds ooknbsp;tocopheryl-chinon (biologisch onwerkzaam) dezelfde reactie vertoont en zij anderzijds veel te ongevoelig is voor de hoeveelheden,nbsp;die bij een bepaling in serum in aanmerking komen, geeft dezenbsp;reactie tóch wel een indruk over het al of niet aanwezig zijn vannbsp;tocopherol of derivaten ervan. De reactie berust op andere grondslagen dan die met AuCls of FeCls, waarbij alleen de reductie-eigenschappen van het tocopherol bepaald worden. De kleinstenbsp;hoeveelheid, die met de methode van Furter en Meyer bepaald kan worden is 150 y. Dit is in 75 cm^ serum van rattenbloednbsp;aanwezig. Eenige bepalingen werden op deze wijze uitgevoerd ennbsp;vergeleken met de uitkomsten verkregen met onze eigen methodenbsp;(zie blz. 66).

5°. Langs spectrografische weg aantoonen van tocopherol. Door Moore (1940) werd tocopherol in het peritoneale vet vannbsp;ratten aangetoond. Daar deze physische methode als bevestigingnbsp;van de chemische de eenvoudigste was, hebben we deze ook toegepast op bloedserum (blz. 66).

De onder 4° en 5° genoemde mogelijkheden om nog een bewijs

64

te brengen, dat het bepaalde werkelijk vitamine E was, hebben we in de volgende bladzijden beschreven. We vergeleken daartoenbsp;eerst de beide chemische methoden, die op een verschillend principe berusten. De methode van Kar r er (1938g), de titratie metnbsp;AuCls laten we buiten beschouwing, daar deze op dezelfde redu-ceerende eigenschappen berust, waarvan bij onze eigen methodenbsp;gebruik gemaakt is. Naast deze chemische bepalingen beschrijvennbsp;we ook nog eenige spectrografische bepalingen en vergelijken denbsp;uitkomsten hiervan met de chemische.

a. Vergelijking van de chemische bepalingen van tocopherol in bloedserum volgens de methode van F u r t e r en M e y e r ennbsp;van E m m e r i e en Engel.

We hebben in enkele gevallen in bloedserum van ratten en menschen het tocopherol gehalte bepaald. Hierbij was het de bedoeling om van dezelfde oplossingen, waarmee de chemische bepalingen uitgevoerd werden, de spectrograaf opnamen te maken, dienbsp;hieronder beschreven worden. Het spreekt vanzelf, dat we voornbsp;het laatste zooveel mogelijk stoffen verwijderen, om een zoo geringnbsp;mogelijke algemeene absorptie te hebben in het ultraviolette gedeelte van het spectrum. Daarom werden eenige bewerkingen meernbsp;uitgevoerd dan voor een chemische bepaling volgens F u r t e r ennbsp;Meyer of volgens Emmerie en Engel noodig waren. Denbsp;reactie van Furter en Meyer wordt uitgevoerd door de tenbsp;onderzoeken stof in absolute aethanol op te lossen en met geconcentreerd salpeterzuur eenigen tijd te koken. De daarbij uit tocopherol gevormde roode kleurstof wordt colorimetrisch gemeten. Denbsp;minimum hoeveelheid tocopherol, welke hierbij bepaald kan wordennbsp;is zt 150 y.

Voor een bepaling volgens Emmerie en Engel kan men met 10 y tocopherol volstaan. Deze hoeveelheden waren aanwezignbsp;in ongeveer 75 cm^ bloedserum van ratten of in 20 cm^ serum vannbsp;menschen. Door de spectrograaf opnamen eerst te maken was hiervoor geen grootere hoeveelheid serum vereischt. Een voorbeeld vannbsp;de bewerkingen, die noodig waren om een oplossing te verkrijgen,nbsp;waarmee de twee chemische bepalingen en de-spectrograaf opnamenbsp;gemaakt konden worden, volgt hieronder:

65

Dertig normale vrouwelijke ratten gedood en het bloed verzameld. Hiervan werd 70 cm^ serum verkregen.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Extractie. Het serum met een half volume 0.2n KOHnbsp;verdund en daarna 100 cm^ formaldehyd oplossing 37 %nbsp;(neutraal op phenolphthaleine) en 100 cm^ aethanol toegevoegd. Driemaal met 500 cm3 aether geextraheerd. De verzamelde aetheroplossingen gewasschen met 2 % KOH ennbsp;1 % H2SO4 en daarna met water tot zuurvrij. Aether oplossing gedroogd over Na2S04.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Verzeeping. De voorgaande aether oplossing gefiltreerdnbsp;en in vacuo drooggedampt. Het residue met 10 cm3 0.2 n KOHnbsp;in methanol gedurende 10 min. bij 65° verzeept. De oplossingnbsp;met 40 cm3 water en 10 cm3 methanol verdund en wederomnbsp;driemaal met 50 cm3 aether uitgeschud. De verzamelde aethernbsp;extracten verder als onder 1 verwerkt.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Scheiding van vitamine A en carotinoiden. Na verdampen der aether oplossing in vacuo, de rest opgenomen in ongeveer 10 cm3 benzol. De benzol oplossing gefiltreerd over eennbsp;kolom van Floridin XS aarde. Het vitamine A en de carotinoiden blijven aan de aarde geadsorbeerd.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Verwijdering der sterinen. Het filtraat in benzol drooggedampt en het residue in 10 cm3 heete methanol opgelost.nbsp;De heete methanol oplossing langzaam afgekoeld tot —5° C,nbsp;waarbij de grootste massa der sterinen uitkristalliseerden.nbsp;De sterinen door filtratie verwijderd. (0.2 g dezer sterinennbsp;gaven geen reactie met ferrichloride-dipyridyl, het tocopherolnbsp;is dus in oplossing gebleven). De methanol oplossing drooggedampt en de rest in aethanol opgelost. (Oplossing I).

Met deze en dergelijke oplossingen, verkregen van andere groepen ratten en van menschen, werden eenige vergelijkende chemische bepalingen volgens de bestaande methoden uitgevoerd en werden tevens van dezelfde oplossingen spectrograaf-opnamen gemaakt. In ónderstaande tabel zijn de chemische uitkomsten vermeld.nbsp;In de laatste kolom zijn de overeenkomstige no’s der spectrograafnbsp;opnamen opgenomen, die hierna beschreven worden.

66

Tabel 17.

Met deze serum extracten wordt ook de roode kleurstof verkregen, waaruit de aanwezigheid van tocopherolen blijkt.

De uitkomsten met de methode van Furter en Meyer zijn steeds hooger dan met de methode van Emmerie en Engel.

Dit quantitatieve verschil wordt vermoedelijk veroorzaakt door biologisch inactieve oxydatie producten van het tocopherol. Dezenbsp;oxydatie producten reageeren n.1. wel bij de methode van Furternbsp;en Meyer en niet bij die van Emmerie en Engel.

b. Spectrophotometrisch aantoonen van vitamine E in bloedserum.

Evans en Burr (1927) waren niet in staat om in absorptie-spectra van vitamine E houdende oliën aanwijzingen te vinden voor bepaalde banden, die in verband konden staan met de biologisch actieve stof.

Eerst Bowden en Moore (1933, 1934) konden verschillende banden in tarwekiemolie concentraten naar voren brengen. Eennbsp;zekere correlatie werd door hen waarschijnlijk gemaakt van eennbsp;absorptieband tusschen 320—285 mp, en het vitamine E. Terzelfdernbsp;tijd kwamen ook Morton en Edisbury (1933) met dergelijkenbsp;resultaten.

In 1934 vonden Martin en medewerkers (1934) een goed gedefinieerde absorptie bij 294 mp.

67

Ook Olcott (1935a, 1935) vindt dezelfde band in het onver-zeepbare gedeelte van katoenzaadolie, maar is van meening, dat deze band niet eigen is aan het vitamine E.

Drummond (1935, 1935a) en medewerkers hebben, ofschoon zij het probleem, of de band bij 294 m/j, al of niet behoorde bij hetnbsp;vitamine, niet hebben opgelost, zeer veel met de spectrorafischenbsp;methode onderzocht en met behulp daarvan het vitamine E eennbsp;eindweegs kunnen zuiveren. Zij stelden ook voor om het absorptienbsp;maximum en het absorptie minimum bij 267 mp. met elkaar in verband te brengen. De verhouding van de absorptie intensiteiten bijnbsp;het maximum en minimum zou dan een aanwijzing geven over denbsp;zuiverheid en het verschil van het minimum en het maximum zounbsp;een maat zijn voor de hoeveelheid.

Dat de band bij 294 mp werkelijk karakteristiek is voor het vitamine E, bewezen Evans, Emerson en Emerson (1936)nbsp;na bereiding van zuiver tocopherol uit natuurlijke oliën en K a r r e rnbsp;(1938c) na de synthese van c?/-a-tocopherol.

Het opsporen van kleine hoeveelheden tocopherol in extracten van weefsels of, zooals in ons geval, in bloedserum, is evenwel nietnbsp;eenvoudig. Met zuiver sterk geconcentreerde vitamine E preparatennbsp;uit oliën is het soms nog moeilijk de gevonden absorptie spectra tenbsp;interpreteeren, tengevolge van de algemeene absorptie, die denbsp;typische vitamine E-band bij 294 mp overvleugelt. In dierlijk materiaal kan men bovendien nog de storing ondervinden van aanwezignbsp;vitamine A met een uitgesproken absorptieband bij 328 m^u,.

(In extracten van dierlijke organen werd het vitamine E spectro-grafisch het eerst door Moore, Martin en Rajagopal aangetoond (1939). Zij konden het tocopherol alleen vinden in de vetdepóts van ratten, die gedurende langen tijd een dieet gehadnbsp;hadden met 60 % tarwekiemen, In andere weefsels konden zij hetnbsp;niet vinden. De door hen gebruikte methode van extraheeren dernbsp;weefsels moet echter verworpen worden. Zij koken nl. het weefselnbsp;gedurende 2 uur met 1 n KOH. Wij konden aantoonen, dat bijnbsp;een dergelijke verhitting in basisch milieu het tocopherol vernietigdnbsp;wordt [Emmerie en Engel (1939a)]. Ook enkele pogingennbsp;om het op deze manier uit levers te extraheeren mislukten, zooalsnbsp;onderstaande proeven laten zien.

68

4 g lever (rat) met 10 cm^ 1 n KOH en 1 cm^ tocopherol in alcohol (302 y) gedurende 30 min. op een waterbadnbsp;gekookt. Eenzelfde proef ingezet zonder toevoeging van tocopherol.

Na extractie met aether enz. werd in het eerste geval 260 y, in het tweede 203 y tocopherol gevonden. Verschil 57 y slechtsnbsp;19 % van het toegevoegde dus teruggevonden.

Cuthbertson, Ridgeway en Drummond (1940) gaven na het afsluiten van ons onderzoek nog een andere methodenbsp;van spectroscopisch onderzoek. Ze oxydeeren het aanwezige tocopherol, waardoor een meer uitgesproken maximum ontstaat bijnbsp;± 270 m/j. van tocopheryl-chinon en de gevoeligheid der bepalingnbsp;aanmerkelijk wordt verhoogd. Ook in bloedserum hebben zijnbsp;sporen kunnen aantoonen naast grootere hoeveelheden in de vet-depöts. In andere organen, ook in de lever, was het niet aan tenbsp;toonen. Hun extractie methode der weefsels was minder ingrijpendnbsp;dan die van Moore en geeft een grootere kans, dat het aanwezigenbsp;tocopherol niet verdwenen is bij de extractie.

Onze eigen methode om in bloedserum spectrophotometrisch tocopherol aan te toonen is in principe dezelfde als die vannbsp;Moore. De' methode van extraheeren echter geheel anders. Hierbij pasten we dezelfde methode toe, zooals we bij de chemischenbsp;bepaling beschreven blz. 65.

We krijgen dan tenslotte de serum-lipoiden, die het vitamine E bevatten, zonder verwarming of hydrolyse der proteïnen in eennbsp;voor ons doel geschikte oplossing. Voor het maken van een spectro-graaf opname is het echter noodig, om zooveel mogelijk stoffen tenbsp;verwijderen. We verzeepten daarom de lipoiden op een zoodanigenbsp;wijze, dat het tocopherol niet vernietigd werd. Ook na deze ver-zeeping was het nog mogelijk om verschillende onverzeepbare stoffen af te scheiden. Door filtratie over Floridin XS aarde werdennbsp;de carotinoiden en het vitamine A verwijderd en door uitvriezennbsp;in methanol ook de hoofdfractie der sterinen. Zelfs na deze bewerkingen, die bij de chemische bepaling reeds beschreven werden,nbsp;was het moeilijk de verkregen absorptie spectra te interpreteeren.

De apparatuur, die tot onze beschikking stond, werd reeds uitvoerig door Julius (1932) beschreven.

69

Een opname van tocopherol opgelost in aethanol werd ter vergelijking opgenomen.

Opname 1. Het resultaat is in tabel 18 en fig. 16 vermeld.

Tabel 18.

Log -j bij verschillende golflengten van een dl-a-toco-pherol oplossing in aethanol. 75 y per cm®. 1 cm cuvet.

1 “/o^

1 cm

70

Opname 2. Serum-extract van normale ratten.

De alcoholische oplossing bevatte 7 y tocopherol per cm^ (chemisch bepaald) zie tabel 19 en fig. 17.

Tabel 19.

Log y bij verschillende golflengten van een serumextract van normale vrouwelijkenbsp;ratten.

71

Opname 3. Serum van vitamine E-deficiente vrouwelijke ratten, die 15 uur van te voren 5 mg tocopheryl-acetaat per os gekregennbsp;hadden. 1 cm^ der oplossing bevatte 26 y tocopherol (chemischnbsp;bepaald). Zie tabel 20 en fig. 18.

Tabel 20.

Log ~ bij verschillende golflengtenvan een serum-extract van vitamine E-deficientenbsp;vrouwelijke ratten na toediening van 5 mg tocopheryl-acetaat.

72

Opname 4. Serum van vitamine E-deficiente mannelijke ratten, die 15 uur van te voren 5 mg tocopheryl-acetaat per os gekregennbsp;hadden. 1 cm3 der oplossing bevatte 28 y tocopherol (chemischnbsp;bepaald). Zie tabel 21 en fig. 19.

Tabel 21.

Log y bij verschillende golflengten van een serum-extract van vitamine E-deflcientenbsp;mannelijke ratten na toediening van 5 mg tocopheryl-acetaat.

73

Opname 5. Serum-extract van menschenbloed { S).

1 cm3 der oplossing bevatte 6 y tocopherol (chemisch bepaald). Zie tabel 22 en fig. 20.

Tabel 22.

De resultaten van deze opnamen zijn niet erg overtuigend te noemen. Men kan door de algemeene absorptie van de extractennbsp;slechts van zeer verdunde oplossingen opnamen maken, waardoornbsp;het absorptie-maximum van tocopherol bij 295 m/t nauwelijks isnbsp;waar te nemen.

Al zijn de uitkomsten op zich niet bewijzend, zij pleiten toch zeker niet voor het tegendeel.

c. Tocopherol in het bloedsecum van ratten.

Uit het voorgaande (blz. 62 tot 72) waren we dus overtuigd, dat hetgeen we chemisch bepaalden in het bloedserum met de

74

ferrichloride-dipyridy] reactie, werkelijk vitamine E was. Met behulp van deze betrekkelijk eenvoudige methode was het ons nu mogelijk verschillende vragen te beantwoorden.

1. De vorm van voorkomen van vitamine E in het bloed.

Zooals bekend reageert het veresterde tocopherol niet met ons reagens en wordt alleen het vrije tocopherol door ferrichloride-dipyridyl geoxydeerd. Indien het vitamine E dus veresterd in hetnbsp;serum voorkwam, zou men het niet zonder verzeeping kunnen aantonnen. Als beide vormen naast elkaar voorkwamen zou na verzeeping meer tocopherol gevonden worden. Dit is niet het geval.nbsp;Het komt dus alleen als vrij tocopherol in het serum voor, zooalsnbsp;uit de volgende proef blijkt.

Aan 5 vrouwelijke ratten, welke reeds 2 maanden op ons vitamine E vrij dieet geleefd hadden, werd per os 5 mg dl-a.-tocopheryl-acetaat gegeven. Aan 2 andere ratten van dezelfdenbsp;groep werd niets gegeven: controle dieren.

10 uren, nadat de dosis gegeven was, werden de dieren gedood en het bloed van elke categorie afzonderlijk verzameld.nbsp;In het serum der controle dieren werd (zonder verzeeping)nbsp;2 y tocopherol per 10 cm^ serum gevonden. Het bloed van denbsp;5 dieren, welke tocopheryl-acetaat gehad hadden, gaf 10 m^nbsp;serum. Dit werd in twee gedeelten van elk 5 cm^ verwerkt.nbsp;1°. Directe tocopherolbepaling na de bewerkingen als doornbsp;Emmerie en Engel (1939a) beschreven, dus zondernbsp;verzeeping. 2°. Na de extractie der lipoiden de aethernbsp;der oplossing verdampt en de overblijvende rest met 5 cm^nbsp;0.2 n KOH in methanol gedurende 10 min. bij 65° verzeept.nbsp;Als beschreven op pg. 65 verder verwerkt en de scheidingnbsp;van vitamine A en carotinoiden uitgevoerd.

Gevonden werd 1°. onverzeept 98 y tocopherol

per 10 cm® serum.

2°. verzeept 90 y tocopherol

per 10 cm® serum.

Hieruit blijkt, dat het tocopherol als zoodanig aanwezig is, ook als het in veresterde vorm gegeven is. Het kleine verschil in de

75

gevonden waarden moet toegeschreven worden aan verliezen bij de verzeeping, zie ook Emmer ie (1940).

2. Opname van dl~a~t ocopherol en dl-a.-t oco-pheryl-acetaat.

Is Ier (1938) wees het eerst op het gebruik van veresterde tocopherolen, die bestendiger zijn tegen oxydatie dan het vrijenbsp;tocopherol en vond het acetaat van tocopherol ongeveer even werkzaam als het tocopherol zelf, In een publicatie van E m m e r i e ennbsp;schrijver (1939b) gaven we een tabel van het gehalte aan tocopherol na toediening van dagelijksche doses tarwekiemolie, tocopherol en tocopheryl-acetaat. We hadden toentertijd geen achtnbsp;geslagen op de tijdsduur tusschen toediening der doses en denbsp;bepaling in het bloedserum, In onderstaande proef wordt het gehalte aan tocopherol in het bloedserum bepaald en vergeleken nanbsp;opname van dZ-a-tocopherol en dZ-a-tocopheryl-acetaat, waarbijnbsp;speciaal rekening werd gehouden met de tijdsduur tusschen toediening en bepaling.

Aan twee groepen van elk 12 vrouwelijke vitamine E-deficiente ratten werd respectievelijk 5 mg d/-a-tocopherol en d/-a-tocopheryl-acetaat per rat gegeven.

Op verschillende tijden na toediening van deze dosis werden van elke groep drie ratten gedood. In het serum van het verzamelde bloed werd het tocopherol gehalte bepaald. In tabel 23nbsp;en fig. 21 is het resultaat vermeld.

Het tocopherol-gehalte is na de dosis van tocopheryl-acetaat geringer. Daar er bij de vorige proef geen veresterd tocopherolnbsp;werd gevonden, is de oorzaak vermoedelijk, dat de ester niet zoonbsp;snel wordt geresorbeerd als het vrije tocopherol. Het uiteindelijknbsp;gehalte aan tocopherol is bij beide preparaten ongeveer gelijk,nbsp;zooals de volgende proef ook laat zien na toediening van dage-lijksche doses van tarwekiemolie, c/Z-a-tocopherol en dl-a-toco-pheryl-acetaat.

Aan drie groepen van vrouwelijke vitamine E deficiënte ratten werden respectievelijk de volgende doses gegeven:

0.4 cm3 tarwekiemolie = 0.97 mg d-a-tocopherol.

1 mg c?/-a-tocopherol in 0.4 cm^ sesamolie.

1 mg d/-a-tocopheryl-acetaat in 0.4 cm3 sesamolie.

Twee dagen na toediening der laatste dosis werd het gehalte van tocopherol in het bloedserum bepaald.

In onderstaande tabel zijn de waarden vermeld na verschillende proefduur.

77

Het tocopherol gehalte in het bloedserum is dus bij inname van tocopherol of tocopheryl-acetaat gelijk.

3. Tocopherol gehalte van het bloedserum van mannel ij ke en v r ouwel ij ke ratten opnbsp;vitamine E vrij dieet.

In het 4e hoofdstuk bleek, dat de doses, die voor vrouwelijke ratten voldoende zouden zijn om de resorptie-steriliteit te genezen,nbsp;niet voldoende waren om de steriliteit bij mannetjes te voorkomen.

Bij de bepaling van het tocopherol in het bloedserum van mannetjes en vrouwtjes kwam echter op geen enkele wijze een verschil tot uitdrukking, zooals uit onderstaande proef blijkt.

Aan een groep mannelijke en vrouwelijke ratten, die vier maanden op vitamine E vrij dieet geleefd hadden en waarbijnbsp;in het serum geen tocopherol meer was aan te toonen, werdennbsp;verschillende doses dZ-a-tocopherol per os gegeven en nanbsp;zekere tijden het tocopherol gehalte in het bloedserum bepaald.nbsp;Aan mannetjes werden doses van 2, 5 en 10 mg en aannbsp;vrouwtjes doses van 2 en 10 mg ineens gegeven.

In onderstaande tabel en fig. 22 en 23 is het resultaat verwerkt.

78

T a b e 1 25.

Gehalte van tocopherol in het bloedserum van vitamine E-deficiente ratten na toediening van verschillende doses d/'«-tocopherol.

Uit de figuren 22 en 23 blijkt:

1°. Geen verschil tusschen mannelijke en vrouwelijke rat.

2°. Bij toediening van kleine dosis tocopherol (2 mg) aan vitamine E-deficiente vrouwelijke ratten is het tocopherol reeds na 4 dagen uit het bloedserum verdwenen.

Bij grootere dosis blijft het tocopherol langer in het serum aantoonbaar.

79

4. Tocopherol gehalte in het bloedserum en deficiëntie verschijnselen tengevolge vannbsp;vitamine E gebrek.

Uit het voorgaande zagen we reeds, dat er verschillen zijn in het tocopherol gehalte in het bloedserum van vitamine E deficiëntenbsp;ratten al naar de dosis toegediend. In de volgende proef werd het

80

verband vastgelegd tusschen het gehalte tocopherol in het bloed-serum en het optreden der E-avitaminose: resorptie-steriliteit bij vrouwtjes resp. steriliteit bij mannetjes.

Een groep normale mannelijke en vrouwelijke ratten werd op vitamine E vrij dieet gezet. Na verschillende perioden werdnbsp;telkens een groep van drie mannetjes gepaard met normalenbsp;vrouwtjes, waarna ze gedood werden en in het bloedserumnbsp;het tocopherol gehalte bepaald werd. De vrouwtjes werdennbsp;met normale mannetjes gepaard, waarna eerst het verloop vannbsp;de zwangerschap werd afgewacht voor ze gedood werden. Innbsp;onderstaande tabel is het resultaat vermeld.

Tusschen 10 en 5 y tocopherol per 10 cm3 ügt dus het niveau waar de deficiëntie verschijnselen beginnen op te treden.

HOOFDSTUK VI.

TOCOPHEROL IN HET BLOEDSERUM VAN DEN MENSCH.

Het was de opzet om aan de hand van een groot aantal bepalingen bij normale menschen en patiënten het vitamine E gehalte van het bloedserum na te gaan om hieruit eventueel conclusies te trekken.

Bij de E avitaminose van de rat zagen we reeds, dat er een zeer duidelijk verband bestaat tusschen het optreden van de E-avita-minose en het gehalte van het vitamine E in het bloed.

Om de stabiliteit van tocopherol in bloedserum van den mensch na te gaan werd nog het vitamine E gehalte na verschillende tijdennbsp;bepaald, terwijl het serum bij kamertemperatuur maar niet in directnbsp;zonlicht bewaard werd.

zodat bleek, dat het na een of twee dagen nog bepaald kon worden,

In tabel 27 zijn de resultaten vermeld van tot nu toe bewerkte sera.

Het zou voorbarig zijn uit deze tabel conclusies te trekken, tenzij negatieve. Bv. kan men wel zeggen, dat er bij diabetes patiëntennbsp;geen gestoord vitamine E niveau in het bloed is.

Er zijn er onder deze patiënten slechts twee waarbij het vitamine E gehalte laag is (11 en 16). Hierbij werd een vitamine E therapienbsp;toegepast. Achteraf kregen wij dit preparaat tot onze beschikking,nbsp;om het tocopherol daarin te bepalen. Het bleek een olie met eennbsp;betrekkelijk laag tocopherolgehalte te zijn, zoodat slechts in totaalnbsp;14 mg gegeven zijn. Dit is natuurlijk onvoldoende om het vitaminenbsp;E gehalte op te voeren (patient 11, 55 y 2e bepaling). Later werdnbsp;nu gewone tarwekiemolie gegeven (3e bepaling).

Bij de tweede patiënt (16) is nog geen resultaat bekend.

82

Tabel 27.

Tocopherolgehalte van bloedsera van patiënten.

HOOFDSTUK VIL

VITAMINE E THERAPIE BIJ DEN MENSCH.

Er is een respectabele hoeveelheid literatuur ontstaan over de werking van vitamine E bij den mensch.

Er zijn onderzoekers, die groote successen aan het vitamine E toeschrijven: anderen, die het nut ervan zeer twijfelachtig zooal nietnbsp;geheel negatief vinden.

Bij den mensch is het vitamine E toegepast bij vele stoornissen, die eenige gelijkenis vertoonden met de deficiëntie verschijnselen bijnbsp;de rat. Bij de rat kan men de resorptie-steriliteit opheffen, bij dennbsp;mensch heeft men getracht de habitueele abortus, dreigendenbsp;abortus en dergelijke stoornissen te genezen of te voorkomen. Ooknbsp;mannelijke steriliteit heeft men met vitamine E behandeld. Anderenbsp;ziekten buiten de voortbrengings functie’s om worden de laatstenbsp;tijd ook met vitamine E bestreden. Bij de rat zagen we de paralysennbsp;bij het jonge en oude dier.

Overeenkomstige ziekten bij den mensch, amyotrophische lateraal-sclerose en musculaire atrophieën, zijn met wisselend succes met vitamine E behandeld.

Hieronder worden de resultaten, bekend uit de literatuur, besproken.

a. Vitamine E en de voortplantingsstoornissen.

De eerste, die vitamine E in de vorm van tarwekiemolie toepastte bij den mensch, was V o g t-M ö 11 e r (1931). Bij habitueele abortus verkreeg hij een gunstig resultaat (1933, 1936). In 70—80 %nbsp;van de gevallen trad genezing op.

Het is niet de bedoeling om hier in discussie te treden over de al of niet gunstige werking van vitamine E, De habitueele abortus

84

kan door vele oorzaken optreden [vanVonno (1938)] en hieronder is er een, die wellicht vitamine E deficiëntie genoemd kan worden. Andere methoden hebben dan ook bij habitueele abortusnbsp;dergelijke successen behaald en de gunstige werking van vitaminenbsp;E wordt door vele onderzoekers dan ook betwijfeld. De moeilijkheidnbsp;bij dit soort onderzoek is, dat men geen controle personen heeftnbsp;gehad en dat het niet bekend is, hoe dikwijls spontaan na eennbsp;of meer malen abortus de geboorte normaal verloopt.

De voorstanders van de vitamine E therapie meenen, dat het percentage van 70—80 % zeker meer is dan bij onbehandeldenbsp;patiënten. Om op deze wijze tot een oplossing te komen zou mennbsp;statistisch het heele probleem moeten bewerken. Hiervoor is hetnbsp;cijfermateriaal nog lang niet voldoende. Ook bij dreigende abortusnbsp;heeft S h u t e successen vermeld; deze vindt echter bij habitueelenbsp;abortus geen gunstige invloed.

De voorstanders van een vitamine E therapie komen dus ook onderling niet tot overeenstemmende resultaten. Met een opsomming van de in de literatuur vermelde gevallen kan hier wordennbsp;volstaan.

85

86

De resultaten van sommige ^onderzoekers zijn zeer overtuigend. Toch moeten deze even goed als de meer negatieve zeer critischnbsp;beschouwd worden.

Uit eigen ervaring bleek mij nl. dat vele van de zg. zeer actieve vitamine E preparaten slechts een zwakke vitamine E activiteitnbsp;hadden en dat er zelfs een was, waar geen vitamine E in aan tenbsp;toonen was, terwijl een van de bovengenoemde onderzoekers daarnbsp;goede resultaten mee verkregen had bij habitueele abortus. Ook denbsp;gewone tarwekiemoliën loopen sterk in activiteit uiteen en de meestenbsp;clinici hebben niet de gelegenheid om de activiteit vast te stellen.

b. Toepassing van vitamine E buiten het gebied der voortplanting.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Afwijkingen in het spier-zenuwstelsel.

Einarson en Ringsted (1938) wezen reeds op de overeenkomst van de degeneratie van het zenuwstelsel, die ontstaat bij vitamine E gebrek van het proefdier en bij amyotrophische lateraal-sclerose.

W e c h s 1 e r (1940) heeft twee patiënten, die volgens hem leden aan deze afwijking, behandeld met vitamine E (tocopheryl-acetaat) en heeft er goede uitkomsten mede verkregen. Vitaminenbsp;Bi was niet van invloed.

Een behandeling van een uitgebreider aantal patiënten met meer uiteenlopende ziektebeelden is nog door Bicknell (1940) beschreven. Hij behandelt naar aanleiding van een publicatie vannbsp;Goettsch en Ritzmann (1939) met versche tarwekiemen,nbsp;waarin zoowel water- als lipoid factoren voorkomen, met een gunstige werking tegen spierdystrophie bij konijnen. (Zie ook blz. 22).

In 13 gevallen van musculaire dystrophie ziet hij in 12 verbetering. Bij amyotrophische lateraal-sclerose ziet hij in 2 van de vier gevallen verbetering. Bij tabes dorsalis en peronéale musculairenbsp;atrophie blijft de werking uit.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Vitamine E en groei.

W i d e n b a u e r (1938) zag bij 17 praemature kinderen een snelle gewichtstoename na voorafgaande groeistilstand. G a e d t k enbsp;en Bennhold t-T h o m s e n (1938) ontkennen eenigen invloed.

SAMENVATTING.

Een biologische bepalingsmethode voor het vitamine E werd ontwikkeld, waarbij de gebreken van de methoden van Bacharach en B o m s k o V werden geëlimineerd. De biologische uitkomstennbsp;werden vergeleken met de chemische volgens de methoden vannbsp;Karrer en Keiler en volgens Emmerie en Engel. Innbsp;oliën en concentraten werden overeenkomende waarden gevonden.

De biologische activiteit van c//-a-tocopherol en c/-a-tocopherol bleek ongeveer gelijk. Ook bij c?/-a-tocopheryl-acetaat was de werking gelijk aan die van c?/-a-tocopherol.

Het oxydatieproduct van tocopherol met ferrichloride bleek biologisch inactief. Bij mannelijke ratten bleek synthetisch c?/-a-tocopherol werkzaam.

De chemische bepaling van tocopherol in bloedserum werd vergeleken met de chemische methode van Furter en Meyer en met spectrophotometrische opnamen.

Eenige physiologische proeven bij ratten zijn vermeld. De opname van tocopherol en tocopheryl-acetaat zijn nagegaan aan de hand van het gehalte aan vitamine E in het bloedserum. Het verband van vitamine E gebrek en het tocopherolgehalte in het bloednbsp;werd bij ratten vastgelegd. Bij 5 a 10 y tocopherol per 10 cm^nbsp;serum beginnen de deficientieverschijnselen op te treden, terwijl hetnbsp;normale gehalte bij ratten tusschen 20 en 50 y ligt.

Het gehalte aan tocopherol van menschensera bleek te varieeren van 44 tot 190 y per 10 cm^ serum.

Dit waren waarden verkregen bij patiënten. Bij een aantal normale personen ligt het gehalte bij ongeveer 100 y per 10 cm^. In het laatste hoofdstuk wordt de literatuur over vitamine E in denbsp;therapie bij den mensch besproken.

SUMMARY.

A quantitative biological estimation of vitamin E by resorption-sterility has been given.

By this method we have compared the biological activities of a number of natural oils and concentrates with the tocopherol contents as estimated by the chemical methods of Karrer and Kellernbsp;and of Emmerie and Engel. Both biological and chemical methodsnbsp;gave essentially the same results.

The biological activity of synthetic d/-a-tocopherol and of natural d-a-tocopherol is the same and equal to the activity of toco-pheryl-acetate.

The oxidation product of a-tocopherol with ferric-chloride, toco-quinone, is biologically inactive.

Synthetic c?/-a-tocopherol prevents sterility in male rats on a vitamin E deficient diet.

The chemical estimation of tocopherol after Furter and Meyer and after Emmerie and Engel has been applied to bloodserum andnbsp;compared.

Besides the spectroscopic method has been used to detect vitamin E in bloodserum.

Some physiological experiments on administration of tocopherol in relation to content of the bloodserum of male and female ratsnbsp;have been described.

The normal tocopherol content of bloodserum of rats varies from 20 y to 50 y p. 10 cm3.

The symptoms of vitamin E deficiency appear when the tocopherol content of the blood is less than 10 y p. 10 cm3.

The tocopherol content of normal human bloodserum is about 100 y p, 10 cm3 whereas for patients values from 44 to 190 y p.nbsp;10 cm^ were found.

The therapeutic employment of vitamin E in medical practice has been discussed.

ZUSAMMENFASSUNG.

Es wird eine quantitative Auswertungsmethode für Vitamin E auf Grund der Heilung der Resorptionssterilitat ausgearbeitet.

Die Ergebnisse der biologischen Auswertung von Ölen und Konzentraten und jene der chemischen Bestimmungen nach Karrernbsp;und Keiler bzw. Emmerie und Engel stimmen gut überein.

Die biologischen Aktivitaten des d/-a-Tocopherols und des d-a-Tocopherols waren gleich grosz, ebenso die des Tocopheryl-acetats.

Das durch Einwirkung von Ferrichlorid entstehende Oxydations-produkt des Tocopherols, Tocopheryl-chinon, war biologisch in-aktiv (Dosis 12 mg).

Das synthetische c?/-a-Tocopherol verhindert die durch Vitamin E-Mangel verursachte Sterilitat bei Mannchen.

Die beiden chemischen Bestimmungsmethoden des Tocopherols von Furter und Meyer bzw. von Emmerie und Engel wurden beinbsp;Blutserum verglichen, wobei zum Nachweis des Tocopherols innbsp;Serum auch spektrophotometrische Aufnahmen herangezogennbsp;wurden.

Bei einigen physiologischen Versuchen mit Ratten wurde die Aufnahme des Tocopherols und des Tocopheryl-acetats verfolgt,nbsp;und die Beziehung zwischen Vitamin E-Mangel und Tocopherol-gehalt im Blut von Ratten kontrolliert.

Der normale Tocopherolgehalt des Blutserums von Ratten ist 20 bis 50 7 p. 10 cm®.

Die Symptome Vitamin E-Mangels beginnen bei einem Ge-halt von weniger als 10 y p. 10 cm® Serum.

Bei Menschen wurde immer ein höherer Gehalt gefunden und zwar etwa 100 y p. 10 cm® bei normalen Personen und 44 bis 190nbsp;y p. 10 cm® bei Patiënten.

Die Literatur über die Vitamin E-Therapie bei Menschen ist im letzten Abschnitt zusammengefasst.

LITERATUUR.

Adler, K. en Böltink, E. 1929. Monatsh. Geburts. u. Gynaek. 82, 19.

A g n o 1 i, R. 1930. Boll. soc. ital. biol. sper. 5, 937.

And er eg g, L. T. en Nelson, V. E. 1926. Industr. Engineer. Chem. 18, 620. Bacharach, A. L. 1938. Biochem. J. 32, 2017.

- 1939. Vitamin E symposium. Soc. chem. Industry. Londen.

Bacharach, A. L. en A 1 c h o r n e, E. 1938a. Biochem. J. 32, 1298. Bacharach, A. L. en A 1 c h o r n e, E. en Glynn, H. E. 1937. Biochem. J.nbsp;31, 2287.

Barrie, M. M. O. 1937. Nature 140, 426.

B e r g e 1, F., Copping, A. U., Jacob, A., Todd, A. R. en Work, T. S. 1938a. J. Chem. Soc. 1382.

Berg el, F., Todd, A. R. en Work, T. S. 1938. J. Chem. Soc. 1375. Bickenbach, 1939. Med. Klin. 35, 501.

B i c k n e 11, F. 1940. Lancet, 10,

B i s c e g 1 i e, V. 1929. Riv. pat. sper. 4, 119.

Blumberg, H. J. 1935. J. biol. Chem. 108, 227.

B o m s k o V, C. 1938. Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 190, 627.

Bowden, F. P. en Moore, T. 1933, Nature 131, 512.

- 1934. Nature 132, 204.

Brown, F. J. 1939. Vitamin E symposium. Soc. chem. Industry. Londen. Burr, G. O., Brown, W. R. en Moseley, R. L. 1937. Proc. Soc. exp.nbsp;Biol. Med. 36, 780.

Carruthers, C. 1938. ]. biol. Chem. 123 xix.

Cromer, J. R, 1937. Med. Ann. Dist. Columbia 7, 145.

Csik, L. 1932. Arb. Ungar. biol. Forsch. Inst. Tihany 5, 181.

Currie, D. 1937. Brit. med. J. 1218 II.

- 1939. Vitamin E Symposium Soc. chem. Industry. Londen.

Cuthbertson, W. F. J., Ridgeway, R. R. en Drummond, J. C. 1940. Biochem. J. 34, 34.

Demole, V. 1938/39. Z. Vitaminf. 8, 341.

- 1939b. C.r.Soc. physiol. Suisses.

De mole, V., I s 1 e r, O., Ringier, B. H., Salomon, H. en K a r r e r, P. 1939a. Helv. chem. Acta 22, 65.

Demole, V. en Pfaltz, H. 1939. Schweiz. Med. Ws. 69, 123.

- 1940. Rev, Med. Suisse rom. 60, 464.

91

D i a k o V, F. A. en K r i 2 e n e c k y, J. 1933. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 31, 58.

- 1935. Biol. generalis 11, 149.

- 1933a. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 31, 59.

Dingemanse, E. 1929. Arch, néerl. Physiol. 14, 268.

Dingemanse, E. en van Eek, W. F. 1939. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 41, 622.

Dorrance, G. M. en Cl cc one, E. F. 1937. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 36, 426.

Drummond, J. C. en Singer, E. en M a c W a 11 e r, R. J. 1935. Biochem. J. 29, 456.

-- 1935a. Biochem. J. 29, 2511.

Einarson, L. en R i n g s t e d, A. 1938. Kopenhagen. Levin en Munksgaard. Emerson, O. H., Emerson, G. A. en Evans, H. M. 1939. }. biol. Chem.nbsp;131, 409.

Emerson, O. H., Emerson, G. A., Evans, H. M. en Mohamad, A. 1937a. J. biol. Chem. 122, 99.

Emerson, G. A. en Evans, H. M. 1937. J. Nutrit. 14, 169.

E m m e r i e, A. 1940. Ree. trav. Chem. 59, 246.

E m m e r i e, A. en nbsp;nbsp;nbsp;Engel, Cnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;h r.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1938 Nature 142, 873.

- 1938a. Ree. nbsp;nbsp;nbsp;trav.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;chim.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;57,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1351.

- 1939. Ree. nbsp;nbsp;nbsp;trav.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;chim.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;58,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;283.

- 1939a. Ree. nbsp;nbsp;nbsp;trav.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;chim.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;58,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;895.

-- 1939b. Vitamin E symposium. Soc. chem. Industry. Londen.

Von Euler, H. en Klussmann, E. 1932. Biochem. Z. 256, 11.

V o n Euler, H., Zondek, B. en Klussmann, E. 1933. Ark. f. Kemi. Min. Geol. 11 B, 1.

Evans, H. M. 1922. Science 56, 650.

- 1928. Amer. J. Physiol. 85, 149.

- 1928/29. J. Nutrit. 1, 23.

- 1932. J.A.M.A. 99, 469.

Evans, H. M. en Bishop, R. S. 1922. J. mefabol. res. 1, 319 en 335. Evans, H. M. en Burr, G. O. 1927. The antisterility vitamin fat soluble E.nbsp;Mem. University of California.

- 1927a. J.A.M.A. 88, 1462.

- 1927b. J.A.M.A. 89, 1587.

- 1928. J. biol. Chem. 76, 273.

Evans, H. M., Emerson, G. A. en Emerson, O. H. 1936. J. biol. Chem. 113, 319.

- 1938. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 38, 197.

- 1939. Anat. ree. 74, 257.

Evans, H. M., Emerson, G, A. en Telford, I. R. 1938. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 38, 665.

Evans, H. M., Murphy, E. A., Archibald, R. C. en Cornish, R. E.

1935. J. biol. Chem. 108, 515.

Fernholz, E. 1937. J. am. chem. Soc. 59, 1154.

92

- 1938. J. am. chem. Soc. 60, 700.

F u r t e r, M. en Meyer, R. E. 1939. Helv. chim. Acta 22, 240.

Gaedke, G. en B e n n h o ld t-T h o m s e n, C. 1938. Z. Kinderheilk. 60, 52. Geiler, F. C. 1934. Arch. f. Gynak. 156, 345.

Gierhake, E. 1933. Arch. f. Gynaek. 156, 348.

- 1935. Deutsch. med. Ws. 61, 1674.

- 1936. Münch. med. Ws. 83, 1720.

Goettsch, M. en Ritzmann, J. 1939. J. Nutrit. 17, 371.

Grijns, G. 1938. Z. Vitaminf. 8, 197.

Grijns, G. en D i n g e m a n s e, E. 1933. Proc. royal Acad. Amsterdam 36, 242.

Herschel, A. 1938. Onderzoekingen over E-avitaminose, Utrecht, dissertatie, Kemink en Zn.

Hogan, A. G. en H a r s h a w, H. M. 1924. J. metabol. Res. 5, 111.

I s 1 e r, O. 1938. Helv. chim. Acta 21, 1756.

J a c o h, A., Sutcliffe, F. K. en T o d d, A. R. 1940. ]. chem. Soc. 327. John, W. 1937. Z. physiol. Chem. 250, 11.

John, W., D i e t z e 1, E. en E m t e, W. 1939a. Z. physiol. Chem. 257, 173. John, W., Dietzel, E. en Günther, Ph. 1938. Z. physiol. Chem. 252, 208.nbsp;John, W. en E m t e, W. 1939. Z. physiol. Chem. 261, 24.

Julius, H. W. 1932. Verslagen en Mededeelingen betr. de Volksgezondheid. 84. J u h a s Z'S c h a f f e r, A. 1931. Virchows Arch. 281, 3.

- 1931a. Virchows Arch. 281, 35.

- 1933. Erg. inn. Med. 45, 129.

Karr er, P. en Demo Ie, V. 1938. Schweiz, med. Ws. 68, 954.

K a r r e r, P., E s c h e r, R., F r i t z s c h e, H., Keiler, H., R i n g i e r, B. H.

en Salomon, H. 1938a. Helv. chim. Acta 21, 939.

Kar r er, P. en Fritzsche, H. 1938b. Helv. chim. Acta 21, 1234.

- 1939. Helv. chim. Acta 22, 260.

Karrer P. en Keiler, H., 1939b. Helv. chim. Acta 22, 253.

Karrer, P., Fritzsche, H., R i n g i e r, B. H. en Salomon, H. 1938c. Helv. chim. Acta 21, 520.

- 1938d. Helv. chim. Acta 21, 820.

Karrer, P. en Geiger, A. 1940. Helv. chim. Acta 23, 455.

Karrer, P. en Jensen, H. 1938e. Helv. chim. Acta 21, 1622.

Karrer, P. en Keiler, 1938g. Helv. chim. Acta 21, 1161.

K a r r e r, P., Koenig, H., R i n g i e r, B. H. en Salomon, H. 1939a. Helv. chim. Acta 22, 1139.

Karrer, P., Salomon, H. en Fritzsche, H. 1938f. Helv. chim. Acta 21, 309.

Knowlton, G. C. en Hines, H. M. 1938. Proc. Soc. exp. Biol. Med. 38, 665. Knowlton, G. C. Hines, H. M. en Brinkhous, K. M. 1939. Proc. Soc.nbsp;exp. Biol. Med. 42, 804.

Kudrjaschov, B. A. 1933. Arch. f. exp. Path, und Pharm. 169, 275. - 1935. Trans. Dynam. Development 10, 40.

93

L e s t e r-S m i t h, E. en Bailey, R. 1939. Vitamin E Symposium. Soc. chem. Industry. Londen.

Lipschitz, M. D. 1936. Rev. neurol. 65, 221.

MacDonald, C. R. 1939. Vitamin E symposium. Soc. chem. Industry. Londen.

Mackenzie, C. G., Levine, M. D. en MacCollum, E. V. 1940. J. Nutrit. 20. 399.

Marchesi, F. 1933. Riv. Pat. sper. 11, 396.

- 1935. Sperimentale 89, 622.

Martin, G. J. 1937. J. Nutrit. 13, 679.

Martin, A. J. P., Moore, T., Schmidt, M. en Bowden, F. P. 1934. Nature 134, 214.

Mason, K. E. 1926. J. exp. Zool. 45, 159.

- 1929. nbsp;nbsp;nbsp;J. Nutrit. 1, 311.

- 1933. nbsp;nbsp;nbsp;Am. J. Anat. 52, 153.

- 1939. nbsp;nbsp;nbsp;Sex. and internal Secretionsnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1149.

- 1939. nbsp;nbsp;nbsp;Vitamin E Symposium. Soc.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;chem.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Industry.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Londen.

Mason, K. nbsp;nbsp;nbsp;E. en Bryan, W. L. 1938.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Biochem.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;J.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;32.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1785.

M a 11 i 11, H. A., Carman, J. en Clayton, M. 1924. J. biol. Chem. 61, 729. Mat till, H. A. en Conklin, R. E. 1920. J. biol. Chem. 46, 137.

Moore, T. en R a j a g o p a 1, K. R. 1940. Biochem. J. 34, 335.

Moore, T., Martin, A. J. P. en R a j a g o p a 1, K. R. 1939. Vitamin E Symposium. Soc. chem. Industry. Londen.

Morelle, J. 1931. C.r.soc. Biol. 108, 804.

Mor gul is, S. en Spencer, H. C. 1936. J. Nutrit. 11, 573.

M o r g u 1 i s, S., Wilder, V. M. en E p p s t e i n, S. H. 1938. J. Nutrit. 16, 219.

Morton, R. A. en E d i s b u r y. 1933. Nature 131, 618.

Moss, A. R., C u t h b e r t s o n, W. F. J., D a n i e 11 i, J. F. en Drummond, ]. C. 1938. J. Soc. Chem. Ind. 57, 135.

Müller, J. H. en Muller, C. 1937. Endokrinologie 18, 369.

Nakahara, W. en I n u k a i, F. 1934ƒ35. Nutr. Abstr. 4, 133.

Nelson, W. E. 1931. Anat. Ree. 51, 37.

- 1933. Anat. Ree. 56, 241.

Nelson, W, E., Heller, G., Parks, T. B. en Fulmer, E. J. 1924. J. biol. Chem. 61, 729.

Olcott, H. S. 1935a. J. biol. Chem. 109, Ixxii.

- 1935. J. biol. Chem. 110, 695.

Olcott, H. S. en M a 11 i 11, H. A. 1934. J. biol. Chem. 104, 423.

- 1937. J. Nutrit. 14, 305.

Palmer, L. S. 1937. J. biol. Chem. 119, Ixxv.

Plate, W. P. 1940. Nederl. Tijds. Geneesk. 84, 4134.

Randoin, L. en Netter, P. 1934. Buil. Soc. Chim. Biol. 16, 581. Ringsted, A. 1936. Diss. Kopenhagen. Nyt Nordisk Forlag.

94

R o w n t r e e, I. G., L a n s b u r y, ]. en Steinberg, A. 1937. Proc. Soc. exp. BioL Med. 36, 42%

Sap hir, W. 1936. Endocrinology 20, 107.

S h u t e, E. 1939. Vitamin E Symposium. Soc. chem. Industry. Londen. Smith, L. J., Irwin, W. B. en Ungnade, H. E. 1939. J. am. chem. Soc.nbsp;61, 2424.

Smith, L. ]., Ungnade, H. E. en Prichard, W. W. 1938. Science, 88, 37. Stein, S. I. 1935. J. Nutrit. 9, 611.

Sure, B. 1923. J. biol. Chem. 58, 681.

- 1923a. J. biol. Chem. 58, 693.

S z a r k a, A. 1929. Arch. f. d. ges. Physiol. 223, 657.

Tanberg, A. 1936. Nord. med. Tids. 12, 1785.

Verzar, F. 1929. Proc. Staff meet. Mayo Clinic, 4, 351.

- 1931. Arch. f. d. ges. Physiol. 227, 499.

—- 1932. Z. vitaminf. 1, 116.

Verzar, F., v. A r v a y, A. en v. K o k a s, E. 1931. Biochem. Z. 240, 19. Verzar, F. en v. Kok as, E. 1931. Arch. f. d. ges. Physiol. 227, 511.nbsp;Vogt-Moller, P. 1931. Lancet 221, 182.

- 1933. Hospit. Tidende 76, 621.

- 1936. Klin. Ws. 15, 1883.

- 1939. Vitamin E Symposium. Soc. chem. Industry. Londen.

V. V o n n o, N. C. 1938. Geneesk. Gids 16, 686.

W a d d e 11, J. en S t e e n b o c k, H. 1928. J. biol. Chem. 80, 431.

- 1931. J. Nutrit. 4, 79.

van Wagenen, G. 1925. Anat. Ree. 29, 398.

Watson, E. M. 1936. Canad. med. Assoc. J. 34, 134.

Watson, E. M. en Tew, W. P. 1935. Amer. J. Ostet. Gynaecol. 31, 252. Wechsler, I. S. 1940. J.A.M.A. 114, 948.

V. Werd er, F., Moll, Th. en Jung, F. 1939. Z. physiol. Chem. 257, 129. Widenbauer, F. 1938. Z. Kinderheilk. 60, 216.

Wright, M. D. en Drummond, J. C. 1940. Biochem. J. 34, 32.

Zag a mi, V. en S i n d o n i, M, 1933. Riv. Pat. Sper. 10, 25.

Zagami, V. 1933a. Riv. Pat. Sper. 11, 381.

Xs'f'

STELLINGEN.

I.

De conclusie van Moyer, dat kwartsdeeltjes zich in serum met albumine bedekken, collodiumdeeltjes daarentegen met globuline,nbsp;is onjuist en vindt in zijn experimenten geen enkele steun.

Moyer, L. S. Transactions of the Faraday Society XXXVI, 248 (1940).

II.

Het is niet bewezen, dat er een groep proteinasen bestaat, die hun substraat speciaal bij het I.E.P. aantasten.

Nord, F. F. en Weidenhagen, R. Handbuch d. Enzymologie (1940) 611.

III.

De synthese van proteïnen in hydrolysaten van eiwitten door proteinasen is door Maver en Voegtlin niet bewezen.

Ma ver, M. E. en Voegtlin, C. Enzymologie VI, 219 (1939).

IV.

Aan het begrip „Corpus luteum” is de secretie van een geslachtshormoon inherent. Het is daarom foutief de geovuleerde, degen ereerende follikels van anamnia slechts uit vergelijkend-ana-tomisch standpunt „Corpora lutea” te noemen.

Hett, I. Handbuch der Vergl. Anat. d. Wirbeltieren VI, 253 (1933).

V.

Voor het vitamineeren van levensmiddelen met vitamine D is het toevoegen van zuiver vitamine te verkiezen boven het bestralennbsp;van de levensmiddelen met ultraviolet licht.

VI.

Emerson, Emerson en Evans hebben niet bewezen, dat het oxydatieproduct van tocopherol met ferrichloride biologischnbsp;actief is.

Emerson, O. H., Emerson, G. A. en Evans, H. M,, J. biol.

Chem. 131, 409 (1939).

VII.

De opvattingen van Myrback en Ortenblad over de activitie der gebonden amylase in gerst zijn te verkiezen boven die vannbsp;Chrzaszcz en Janicki.

Myrback, K. en Ortenblad, B. Enzymologia IX, 43 (1940),

VIII.

De theorie van G r é g o i r e over de morphologische waarde van de vruchtbladen van de angiospermen vindt geen steun in hetnbsp;werk van Sprot te.

Sprot te, K. Bot. Arch. 40, 463 (1940).

i