�'

��.

V nbsp;nbsp;nbsp;'^5e-

' ' *f '''*'

'-- J

'�� 'ShS' SS

DE CHEMISCHE BEPALING VAN TOCOPHEROL (VITAMINE E)

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VAN DENnbsp;RECTOR MAGNIFICUS DR. H. R. KRUYT, HOOG-LEERAAR IN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE, VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT DERnbsp;UNIVERSITEIT IN HET OPENBAAR TE VERDEDIGENnbsp;OP MAANDAG 19 MEI 1941, DES NAMIDDAGS TEnbsp;3 UUR, DOOR

ADRIANUS EMMERIE

VJ T R � C ri T.

Jia

Bij het afsluiten van dit proefschrift rust op mij de aangename taak 11. Hoog-leeraren in de Afdeeling der Scheikundige Technologie der Technische Hoogeschool, mijn dank te betuigen voor hetgeen Gij hebt bijgedragen tot mijn wetenschappelijkenbsp;ontwikkeling.

Hooggeleerde SJOLLEMA, U dank ik voor het vele, dat ik in Uw laboratorium heb mogen leeren.

Met eerbied gedenk ik wijlen Professor L. K. WOLFP. Aan zijn wetenschap-pelijk enthousiasme en stuwende kracht heb ik veel te danken.

Hooggeleerde JULIUS, Hooggeachte Promotor. Het is mij een bijzonder voorrecht, dat Gij als mijn Promotor wilt optreden. Voor Uw belangstelling en voor denbsp;vrijheid, die Gij mij gelaten hebt bij mijn onderzoekingen, ben ik U zeer dankbaar. De steun, dien Gij mij bij het bewerken van dit proefschrift hebt verleend,nbsp;is voor mij van groote waarde geweest.

Zeergeleerde VAN EEKELEN. de meest aangename herinneringen bewaar ik aan onze samenwerking, die tot een blijvende vriendschap heeft geleid.

Waarde ENGEL, Uw medewerking op biologisch gebied aan het vitamine E-probleem is voor mij van groote waarde geweest, ik stel deze medewerking op hoogen prijs.

Tenslotte een woord van dank aan alle medewerkers aan het Hygi�nisch Laboratorium, die mij steeds hun welwillendheid hebben betoond.

INHOUD

INLEIDING.

Een verrassend snelle oplossing van het vitamine E-probleem in chemisch opzicht heeft gedurende de laatste 4 jaren plaats gevonden, waarbij het gelukt is het vitamine E te isoleeren, te iden-tificeeren en te synthetiseeren. Deze feiten zullen niet alleen dennbsp;chemicus voldoening verschaffen, doch eveneens van groot belang zijn voor den clinicus (medicus en veterinair). Ofschoon hetnbsp;vitamine E reeds verscheidene jaren bij mensch en dier wordtnbsp;toegepast, zijn de tot heden verkregen resultaten niet eensluidendnbsp;gebleken en heerscht er lang geen overeenstemming over de resultaten van de vitamine E-therapie bij den mensch. Hierop is zekernbsp;van invloed geweest het feit, dat men steeds genoodzaakt was hetnbsp;vitamine E toe te dienen in den vorm van onzuivere en niet constante vitamine E-preparaten (tarwekiemolie of concentraten hiervan ), waarbij bovendien nog komt, dat men in onzekerheid verkeertnbsp;of de hierin naast het vitamine E aanwezige stoffen biologischenbsp;beteekenis hebben. Door het beschikbaar komen van zuiver synthetisch vitamine E zal men in staat zijn een beter inzicht te krijgennbsp;in de beteekenis van het vitamine E bij den mensch. Immers denbsp;groote vlucht, die het onderzoek naar de vitaminevoorziening bijnbsp;mensch en dier in het algemeen heeft genomen, is voor een grootnbsp;deel te danken aan het vinden van chemische of physische methoden om vitamines in het bloed of in andere lichaamsvloeistoffennbsp;te bepalen.

Het doel van dit proefschrift is geweest een chemische bepalingsmethode voor vitamine E in allerlei materiaal uit te werken en deze methode geschikt te maken om dit vitamine in bloed tenbsp;bepalen. Met behulp van deze methode zal men dan in staat zijnnbsp;nadere gegevens over de biologie van het vitamine E te verzamelen.

ONTDEKKING EN GESCHIEDENIS VAN HET VITAMINE E.

Tot v��r 1920 wist men niet beter dan dat een di�et, waarop de rat of muis voldoende groeide en in goede conditie verkeerde,nbsp;eveneens volwaardig was ten opzichte van de voortplanting.

Mattill en Conklin (1) vonden in 1920 echter, dat vrouwelijke ratten, die op een volle-melk di�et leefden, niettegenstaande ze goeden groei vertoonden en in goede gezondheid verkeerden,nbsp;meestal steriel waren.

In 1922 vonden Evans en Scott (2), dat vrouwelijke ratten, die op een di�et waren gezet dat voldoende eiwit, koolhydratennbsp;en de toenmaals bekende vitamines bevatte, in de eerste generatienbsp;gedeeltelijk en in de tweede generatie geheel steriel waren. Dezenbsp;steriliteit kon worden opgeheven door een onbekenden voedings-factor, dien zij X noemden en die in sommige natuurlijke voedingsstoffen aanwezig was, zooals in versche sla, tarwekiemen ennbsp;alfalfa. Evans en Bishop (3, 4, 5) vonden, dat de doornbsp;Evans en Scott genoemde stof X oplosbaar in vetten, dochnbsp;niet identiek met ��n der bekende vitamines was.

Ook Sure (6, 7) kwam onafhankelijk van de voornoemde onderzoekingen tot de conclusie, dat een bepaalde stof noodig wasnbsp;voor de instandhouding van de vruchtbaarheid bij de rat en steldenbsp;voor den nieuwen factor vitamine E te noemen. Dat deze factornbsp;eveneens noodig was voor de mannelijke rat en muis, werd aangetoond door Beard (8, 9), M a s o n (10, 11) en door Evansnbsp;en Burr (12).

Toch werd gedurende eenige jaren na deze ontdekkingen het bestaan van het vitamine E in twijfel getrokken. Zooals later werd

gevonden, was de oorzaak hiervan gelegen in de verschillende di�eten der onderzoekers. Een belangrijke rol heeft reuzel alsnbsp;bestanddeel der di�eten gespeeld bij dit meeningsverschil, terwijlnbsp;ook gebleken is, dat enkele di�eten niet voldoende vitamine E-vrijnbsp;waren. Nelson en medewerkers (13) veronderstelden, dat denbsp;steriliteit ontstond door de aanwezigheid van het vrij hooge percentage reuzel, dat door Evans in zijn di�eten werd gebruikt.nbsp;In latere publicaties van Evans (14) en van Evans en Burrnbsp;(12) werd geconstateerd, dat de aanwezigheid van reuzel inderdaad bevorderlijk was voor de eigenschappen van een bepaaldnbsp;di�et om steriliteit bij de rat te veroorzaken. Dat niet het percentage vet de steriliteit-veroorzakende factor was, werd bewezennbsp;doordat een even hoog percentage boter in het di�et geen steriliteitnbsp;veroorzaakte. Verder bleek uit onderzoekingen van E v a n s ennbsp;Burr (15, 16), dat reuzel de werking van vitamine E neutraliseerde wanneer het met het vitamine E werd gemengd, terwijlnbsp;dit niet het geval was, wanneer het vitamine E afzonderlijk werdnbsp;toegediend.

Een monumentaal werk over vitamine E-onderzoekingen gedurende het hier boven beschreven tijdperk is verschenen van de hand van Evans en Burr, getiteld ,,The antisterility fat solublenbsp;vitamin E� en werd gepubliceerd in Memoirs of the University ofnbsp;California 8 (1927).

Tot 1936 volgden een aantal onderzoekingen over het vitamine E, die zich zoowel op biologisch als op chemisch gebied bewogennbsp;en waarbij men een aantal chemische eigenschappen van hetnbsp;vitamine E kon vaststellen.

In 1936 gelukte het aan de beide Emersons (17) twee kristallijne esters uit tarwekiemolie te bereiden, die na verzeepingnbsp;producten met sterke vitamine E-activiteit leverden, welke stoffennbsp;a- en ;S-tocopherol werden genoemd.

Opheldering van de chemische constitutie dezer stoffen was grootendeels te danken aan Fernholz (18), die in 1938 vaststelde, dat a-tocopherol een chromaanderivaat was. In hetzelfdenbsp;jaar gelukte het Karrer en medewerkers (19) het a-tocopherolnbsp;synthetisch te bereiden, terwijl uit 1938 en 1939 de chemischenbsp;bepalingsmethoden der tocopherolen dateeren (20, 21, 22).

CHEMIE VAN HET VITAMINE E.

Het vitamine E komt veel verspreid in de natuur voor, zij het dan in het algemeen in kleine hoeveelheden en in geringe concentraties. Ofschoon tot nu toe een eenigszins volledige opgave overnbsp;de aanwezigheid van het vitamine E in de natuur ontbreekt, kannbsp;men toch zeggen, dat het in het plantenrijk veelvuldig voorkomt.

Goede bronnen voor het vitamine E zijn de zaden en kiemen van granen, waarbij in de eerste plaats de tarwekiemen moetennbsp;worden genoemd, terwijl ook de zaden van de katoenplant als bronnbsp;voor vitamine E kunnen dienen. Van de groene planten is sla tenbsp;noemen als vitamine E-bron. Tarwekiemen en vooral de daaruitnbsp;verkregen olie, de tarwekiemolie, hebben een zeer belangrijke rolnbsp;gespeeld bij het vitamine E-onderzoek. Niet alleen hebben tarwekiemolie en concentraten hiervan een groot aandeel gehad in hetnbsp;biologisch onderzoek, doch eveneens zijn de zuivere vitamine E-factoren, de tocopherolen, het eerst uit concentraten van tarwekiemolie ge�soleerd. De olie wordt door persen of door extractienbsp;met een organisch oplosmiddel (aether of petroleumaether) uit denbsp;kiemen verkregen. Grandel (23), die een onderzoek heeft verricht over tarwekiemolie en het vitamine E-gehalte ervan, komtnbsp;tot de volgende conclusies:

Het vitamine E-gehalte neemt af wanneer het zuurgetal der olie stijgt. Oli�n, die door koude persing der kiemen worden gewonnen,nbsp;hebben lagere zuurgetallen dan oli�n, die door extractie uit denbsp;kiemen worden verkregen. In het eerste geval krijgt men oli�n metnbsp;een hoogere concentratie aan vitamine E, terwijl men in het laatstenbsp;geval meer olie uit de kiemen verkrijgt. Tevens blijkt, dat het

vitamine E-gehalte van goede tarwekiemolie bij bewaren bij lage temperatuur en bij afwezigheid van zuurstof zeer stabiel is.

In de volgende tabel zijn enkele waarden opgegeven betreffende het tocopherolgehalte van tarwekiemoli�n en andere oli�n, waarbijnbsp;de waarden langs chemischen weg zijn bepaald.

Deze waarden zijn natuurlijk slechts ori�nteerend, aangezien hierbij factoren als herkomst, ouderdom en raffinage van grootennbsp;invloed zijn.

Over het vitamine E-gehalte van organen of weefsels is tot nu toe weinig met zekerheid bekend; in het algemeen schijnt hierinnbsp;weinig vitamine E aanwezig te zijn.

Daar tarwekiemolie de rijkste natuurlijke bron voor het vitamine E was, werd bij de bereiding van concentraten steeds hiervan uitgegaan.

Evans en Burr (12) hadden reeds gevonden, dat na ver-zeeping der olie het vitamine E overging in de onverzeepbare fractie; zoodoende kon een aanzienlijke concentratie van hetnbsp;vitamine worden verkregen.

* De door ons onderzochte oli�n zijn welwillend ter beschikking gesteld door de N.V. Organon.

Het bleek echter, dat het vitamine tegenover alkali niet geheel stabiel was, zoodat het noodig was bij de verzeeping voorzorgsmaatregelen te nemen. Evans en zijn medewerkers (25) kwamennbsp;tot de conclusie, dat de verzeeping van tarwekiemolie het best konnbsp;worden uitgevoerd met een oplossing van kaliumhydroxide in abso-luten methylalcohol onder koken. De verzeeping vond plaats in eennbsp;stikstof- of waterstofatmospheer, terwijl de extractie van het on-verzeepbare deel met aether geschiedde. Volgens hun onderzoekingen gaf deze methode betere resultaten dan verzeepen metnbsp;kaliumhydroxide in aethylalcohol of verzeeping bij kamertemperatuur. Eigen onderzoekingen hierover zullen later worden beschrevennbsp;(zie hoofdstuk VI). Het onverzeepbare deel der olie bevat naastnbsp;het vitamine E nog talrijke andere stoffen, hoofdzakelijk sterinennbsp;(o.a. sitosterine), terwijl eveneens carotino�den (xanthophyl ennbsp;kryptoxanthine) aanwezig zijn (26). Door behandeling van hetnbsp;onverzeepbare met bepaalde oplosmiddelen (pentaan of methylalcohol) bij lagere temperatuur lieten de sterinen zich grootendeelsnbsp;verwijderen, terwijl een deel der overblijvende sterinen door preci-pitatie met digitonine werd verwijderd (12). Verdere zuivering dernbsp;aldus verkregen concentraten werd door Evans en Burr bereikt door het concentraat op te lossen in petroleumaether en uitnbsp;te schudden met 92 % methylalcohol, waarbij het vitamine E in denbsp;petroleumaetherlaag bleef en inactieve stoffen gedeeltelijk in dennbsp;methylalcohol overgingen. Bij de verdeeling van het concentraatnbsp;tusschen petroleumaether en absoluten methylalcohol, verdeeldenbsp;het vitamine E zich ten gunste van den methylalcohol (27). Verdere methoden tot zuivering bestonden in het sterk afkoelen vannbsp;oplossingen van het concentraat in alcohol of in aceton, waarbij eennbsp;gedeelte der inactieve stoffen precipiteerde.

Bij gebruik maken van hoogvacuumdestillatie vonden Evans en Burr (12), dat de actieve fractie overging bij 200�233� Cnbsp;(0.5 mm Hg druk) en dat bij herhaald fractioneeren het destillaatnbsp;tusschen 225�230� C (0.01 mm Hg druk) actief was.

OlcottenMattill (28) vonden voor de actieve fractie een kookpunt van 190�220� C (0.1 mm Hg druk).

Drummond en medewerkers (26, 29) maakten gebruik van het principe der chromatographische analyse volgens T s w e 11 (30). Bijnbsp;dit principe wordt de stof in een oplosmiddel (meestal petroleum-

aether of benzol) door een laag adsorbens gefiltreerd. Deze laag adsorbens bevindt zich in een verticaal geplaatste glazen cylinder,nbsp;die aan het ondereinde een vernauwing heeft en daar afgeslotennbsp;wordt door een watteprop of een geperforeerde plaat met filter. Denbsp;oplossing wordt voorzichtig op het adsorbens gegoten en na passagenbsp;door de kolom wordt nagewasschen met het zuivere oplosmiddel. Innbsp;tegenstelling met een gewone adsorptie, verkregen door schuddennbsp;van de oplossing met het adsorbens, waarbij men tenslotte slechtsnbsp;een scheiding krijgt tusschen niet-geadsorbeerde stof en wel-geadsorbeerde stof, is het bij de analyse volgens T s w e 11 mogelijk veel beter te differentieeren. Hierbij n.1. kan men een scheidingnbsp;maken tusschen stoffen die sterker en minder sterk worden geadsorbeerd; immers de stoffen, die het sterkst worden geadsorbeerdnbsp;bevinden zich boven in de kolom en de minder sterk geadsorbeerdenbsp;stoffen bevinden zich in het onderste deel. Door de kolom adsorbensnbsp;voorzichtig uit de glazen buis te drukken, waarbij de kolom intactnbsp;moet blijven, kan men deze in stukken verdeelen en zoodoende eennbsp;scheiding verkrijgen. De geadsorbeerde stoffen kan men door behandeling van het adsorbens met alcohol, aether e.d. stoffennbsp;elueeren. Een andere methode om een scheiding te krijgen tusschennbsp;de geadsorbeerde stoffen bestaat hierin, dat men de kolom intactnbsp;laat en doorspoelt met bepaalde elutievloeistoffen, waarbij men denbsp;gewenschte component in het filtraat kan verzamelen.

Deze methode, die bij het onderzoek van natuurstoffen zijn bruikbaarheid heeft bewezen, werd door Drummond op tarwekiem-olieconcentraten toegepast. Als adsorbens werd aluminiumoxyde gebruikt en als oplosmiddel voor het concentraat petroleumaethernbsp;of benzol.

Ook op onverzeepte tarwekiemolie pasten Moss en Drummond (31) het principe der chromatographische analyse toe, met het doel concentraten te verkrijgen onder vermijding van het ver-zeepingsproces.

Al deze onderzoekingen waren zeer tijdroovend, omdat steeds als controle der verkregen fracties een biologische ijking noodignbsp;was. Drummond en medewerkers hebben bij hun onderzoekingen ook gebruik gemaakt van de spectrographische methode om hetnbsp;vitamine E te bepalen, waarover later uitvoeriger (zie hoofdstuknbsp;II en IV).

Ofschoon het vitamine E pas in 1936 in zuiveren toestand werd verkregen, waren er v��r dit tijdstip reeds verscheidene onderzoekingen gedaan over de eigenschappen van vitamine E met behulp van concentraten. Een groot gedeelte dezer chemische eigenschappen hebben Evans en Burr reeds beschreven in hunnbsp;standaardwerk over vitamine E en op een enkele uitzondering nanbsp;bleken deze eigenschappen later, toen de zuivere tocopherolennbsp;waren ge�soleerd, daarmede in overeenstemming te zijn. Men moetnbsp;echter niet uit het oog verliezen, dat de resultaten van deze onderzoekingen verkregen werden met behulp van de dierproef en dusnbsp;onderhevig waren aan de strooingen, die hierbij optreden, zoodatnbsp;een nauwkeurigheid, zooals bij de latere chemische bepalingennbsp;aanwezig is, ontbreekt.

Zoowel het natuurlijke vitamine E als de later te noemen tocopherolen zijn goed oplosbaar in organische oplosmiddelen en in vetten, onoplosbaar in water en in verdunde alkali�n of zuren.

Zooals reeds eerder werd vermeld is het vitamine E min of meer labiel tegenover alkali, een eigenschap, waarover in de hoofdstukken VI en VII uitvoeriger zal worden bericht. Tegenover zuren isnbsp;de stabiliteit veel grooter. Het vitamine is stabiel tegenover 20 %nbsp;zoutzuur bij kamertemperatuur evenals tegenover alcoholisch zoutzuur (12). Zie eveneens hoofdstuk VII.

Tegen katalytische hydreering met waterstof en platina bleek het vitamine E zeer goed bestand, evenals tegenover hydreeringnbsp;bij hoogen druk (Bowden en Moore (32), Olcott ennbsp;Mattill (28), Olcott (33, 37), Drummond en medewerkers (26, 29)).

Wanneer gesproken wordt over vitamine E, dan wordt bedoeld deze stof in natuurlijke producten of hun concentraten; wordt gesproken over de zuiverenbsp;stoffen met vitamine E-werking, dan worden deze aangeduid als tocopherolen.

Het vitamine E is tegenover oxydatiemiddelen niet stabiel. Oxydantia, zooals ferrichloride en zilvernitraat, maken het vitamine Inbsp;geheel of gedeeltelijk inactief. Het ferrichloride heeft dienst gedaannbsp;om vitamine E-vrije di�eten te bereiden, waarbij oplossingen vannbsp;ferrichloride in aether over het voer werden gegoten; na mengingnbsp;liet men den aether verdampen (W addell en Steenbock(34)).

Andere oxydatiemiddelen als ozon. kaliumpermanganaat en per-benzo�zuur maken het vitamine E eveneens biologisch onwerkzaam (Olcott en Mattill (28), Olcott (35)).

Bij proeven met zuiver d/-a-tocopherol toonde Isler (36) aan, dat dit door zuurstof wordt geoxydeerd, doch dat de esters stabielnbsp;zijn tegenover zuurstof.

Bromeeren of chloreeren vernietigt de activiteit van het vitamine, doch door koken van het hierbij verkregen reactieproduct met zinknbsp;en methylalcoholisch zoutzuur kan de activiteit hersteld wordennbsp;(Olcott (35)).

Door de onderzoekingen van Olcott (37) werd bewezen, dat het vitamine E een hydroxylgroep bevat. Olcott vond, dat nanbsp;behandeling met methyljodide en zilveroxyde een inactief productnbsp;ontstond. Het door behandeling met phenylisocyanaat ontstanenbsp;reactieproduct was inactief, doch door hydrolyse kon de biologischenbsp;activiteit hersteld worden.

Na acetyleeren van het vitamine E werd een product verkregen, dat zijn biologische werkzaamheid had behouden, dus in tegenstelling met het veresteren met phenylisocyanaat.

Dat bij het acetyleeren inderdaad een verestering had plaats gevonden, werd aangetoond door het na acetyleeren verkregennbsp;product met phenylisocyanaat te behandelen. Het product bleefnbsp;hierbij werkzaam, in tegenstelling dus met het feit, dat na directenbsp;behandeling van het vitamine E met phenylisocyanaat een biologisch onwerkzaam product ontstond.

acetyleeren een mono-acetylderivaat ontstond, dat biologisch werkzaam is en na verzeeping deze werkzaamheid behoudt.

Reeds eerder werd melding gemaakt van het aandeel, dat reuzel heeft gehad in de door Evans en Burr gebruikte di�eten. Hierbij bleek, dat reuzel in staat was om stoffen zooals boter, die bijnbsp;aanwezigheid in het dieet steriliteit kunnen voorkomen, onwerkzaam te maken.

Uit onderzoekingen van Mattill (38) was komen vast te staan, dat ransige vetten het vitamine E vernietigen. Vooral denbsp;vetten, die sterk onderhevig zijn aan ransig worden (reuzel ennbsp;levertraan), vernietigen het vitamine E het snelst (Cummingsnbsp;en Mattill (39)).

De auto-oxydatie van vetten kan geremd worden door z.g. anti-oxydantia, waartoe o.a. meerwaardige phenolen behoorennbsp;(Mattill (40), Olcott (45)), terwijl carotino�den dezenbsp;oxydatie bevorderen (45).

Uit onderzoekingen van Mattill en Crawford (41), Olcott en Mattill (42), Olcovich en Mattill (43)nbsp;en van Bradway en Mattill (44) is komen vast te staan,nbsp;dat het onverzeepbare deel van plantaardige producten (gele wortelen, sla, tomaten, katoenzaadolie en tarwekiemolie) anti-oxydantia bevat (dit werd onderzocht tegenover reuzel).

Tusschen de anti-oxydantia uit de diverse producten bleken onderling verschillen te bestaan. Bij een verdeeling tusschennbsp;petroleumaether en 92 % methylalcohol vond in sommige gevallennbsp;(wortelen, tomaten, sla) een verdeeling ten gunste der methylalcohol plaats, terwijl weer in andere gevallen (katoenzaadolie ennbsp;tarwekiemolie) het anti-oxydans zich ten gunste der petroleumaether verdeelde (46, 44).

In deze laatste gevallen vertoonde het anti-oxydans dus hetzelfde gedrag als het aanwezige vitamine E, waarvan het chemisch niet gescheiden kon worden. De mogelijkheid was dus niet uitgesloten, dat het vitamine E zelf ook als anti-oxydans werkzaam is.nbsp;Dat dit inderdaad het geval is, werd aangetoond door Olcott

en Emerson (47), die vonden dat de zuivere natuurlijke toco-pherolen als anti-oxydantia tegenover reuzel werkzaam waren, We zien hieruit, dat de stabiliteit van het vitamine E in oli�nnbsp;afhangt van het ransig worden der olie en dat men dus door toevoeging van anti-oxydantia in staat is de stabiliteit van het vitaminenbsp;E te verhoogen.

Tot 1936 was men er niet in geslaagd het vitamine E in kristallijnen toestand te bereiden of kristallijne derivaten er van te iso-leeren. Alle pogingen daartoe waren vruchteloos gebleven, totdat het in 1936 aan de beiden Emersons (17), medewerkers vannbsp;Evans, gedurende hun verblijf in het laboratorium van W i n d-a u s in Gottingen gelukte om kristallijne esters (allophanaten) vannbsp;twee vitamine E-factoren te bereiden.

Als eerste derivaat werd een allophanaat met smeltpunt 159� 160� C ge�soleerd, waaruit door verzeeping een lichtgele olie werdnbsp;verkregen. Deze olie bezat vitamine E-werking in een dosis vannbsp;3 mg en werd door de ontdekkers a-tocopherol genoemd (tocos =nbsp;geboorte; phero = dragen; -ol wijst op hydroxylgroep). Uit denbsp;moederloog van het eerste kristallisatieproduct werd nog een tweedenbsp;allophanaat verkregen met smeltpunt 138� C, dat na verzeepingnbsp;de tweede vitamine E-factor, het /8-tocopherol leverde, eveneensnbsp;een olie, die echter minder biologisch actief was dan a-tocopherol.

Dit resultaat was een stap verder in de geschiedenis van het vitamine E-onderzoek. Aan de hand van de analyses door ver-estering tot het allophanaat en het p-nitrophenylurethaan werdnbsp;voor het a-tocopherol de formule C29H50O2 opgesteld. Het a-toco-pherylallophanaat werd later door Emerson en medewerkersnbsp;(48) ook uit katoenzaadolie ge�soleerd. Verschillende onderzoekersnbsp;zijn er na de ontdekking der Emersons in geslaagd de beidenbsp;tocopherolen uit tarwekiemolie af te zonderen.

Het a-tocopherylallophanaat werd ge�soleerd door Moss en Drummond (31) met smeltpunt 158.5�159.5� C en doornbsp;Kar r er en Salomon (49) met smeltpunt 159�160� C. Hetnbsp;/3-tocopherylallophanaat werd ge�soleerd door T o d d en medewerkers (50) met smeltpunt 143.5�144.5� C, Moss en mede-

werkers (51) met smeltpunt 145�146� C, John (52) met smeltpunt 146�147� C, Karrer en Salomon (49) met smeltpunt 143�144� C en door Moss en Drummond (31) met eennbsp;smeltpunt 144.5�145.5� C.

Uit deze waarden zien we, dat het smeltpunt van het /S-toco-pherylallophanaat van de Emersons lager was dan dat der andere onderzoekers. In een latere publicatie van Emerson ennbsp;medewerkers (53) werd dan ook een hoogere waarde opgegeven,nbsp;namelijk 144�146� C.

Moss en Drummond (31) trachtten beide allophanaten uit een tarwekiemolieconcentraat te isoleeren, dat volgens de chromato-graphische methode uit de olie was bereid (dus zonder verzeeping).nbsp;Hierbij konden geen kristallijne allophanaten worden verkregen,nbsp;hetgeen mogelijk te wijten was aan de aanwezigheid van vetten innbsp;het concentraat. Uit spectroscopische onderzoekingen van Mossnbsp;en Drummond bleek, dat er wel allophanaten waren gevormd.nbsp;Na verzeeping van het concentraat konden hieruit kristallijne allophanaten bereid worden. Hierbij werd gevonden, dat het a-toco-pherylallophanaat zwak optisch actief was, [a]p = 4.8�, terwijlnbsp;het door de Emersons verkregen allophanaat geen draaing vertoonde. Moss en Drummond veronderstelden, dat het in denbsp;olie aanwezige optisch actieve a-tocopherol door behandeling metnbsp;loog racemisatie ondergaat en dat dit laatste bij de verzeeping vannbsp;hun concentraat in mindere mate het geval was dan bij directenbsp;verzeeping der olie (Emersons). Het door Karrer en medewerkers (54) genoemde neo-tocopherol (uit tarwekiemolie verkregen) en het door John (52) genoemde cumo-tocopherol (eveneens uit tarwekiemolie) zijn identiek gebleken (55) met het door denbsp;Emersons genoemde j8-tocopherol. Het a- en het /S-tocopherolnbsp;vertoonden groote overeenkomst in chemische eigenschappen ennbsp;later is dan ook gebleken, dat het homologen waren (zie pag. 29).nbsp;Wat betreft hun chemische eigenschappen bleken deze bijna zondernbsp;uitzondering overeen te komen met die, welke reeds eerder zijnnbsp;beschreven bij het vitamine E in concentraten. De hoeveelheden a-en j8-tocopherylallophanaat, die men uit tarwekiemolie heeft ge�soleerd, zijn variabel en bedragen hoogstens 1 g per kg olie. Meermalen is gevonden, dat de onderlinge verhouding der beide allophanaten zeer wisselend is, een feit, dat mogelijk aan de herkomst

der olie te wijten is (75). Uit de vorming van allophanaten in het concentraat volgens Moss en Drummond bereid (zondernbsp;verzeeping) blijkt, dat de tocopherolen geheel of gedeeltelijk innbsp;vrijen toestand (onveresterd) in de olie voorkomen. Dit feit is laternbsp;eveneens geconstateerd bij de chemische bepaling der tocopherolennbsp;(zie hoofdstuk VI).

Een derde biologisch werkzame vitamine E-factor, het y-toco-pherol (smpt. van het allophanaat 138�H0� C), is uit katoenzaad-olie bereid (Emerson en medewerkers (48, 53), Olcott en Emerson (47), zie verder onder G).

Door de juist genoemde onderzoekingen was gebleken, dat het a-tocopherol de formule C29H50O2 had, terwijl er in het moleculenbsp;een hydroxylgroep aanwezig was. Het tweede zuurstofatoom innbsp;het molecuul bleek indifferent.

Bij vergelijking met andere natuurproducten heeft men gedacht aan een verwantschap met sitosterine (C29H50O), doch bij hetnbsp;onderzoek van de absorptiespectra van a-tocopherol en sitosterinenbsp;bleek een belangrijk verschil tusschen beide spectra te bestaan. Hetnbsp;spectrum van a-tocopherol heeft een maximum bij 294 m/x, dat vannbsp;sitosterine bij 190 m/x. Bovendien zijn de spectra van sterinen ennbsp;hun esters (b.v. acetaten) vrijwel hetzelfde, in tegenstelling met dienbsp;van a-tocopherol en a-tocopherylacetaat.

Naar aanleiding van het maximum bij 294 rap, nam W i n d a u s (56), in analogie met bekende verbindingen, de aanwezigheid vannbsp;3 geconjugeerde dubbele bindingen in het molecule aan. Aangeziennbsp;de formule in vergelijking met een aliphatischen alcohol 10 waterstof atomen minder bevat, moet het molecule bij aanwezigheid vannbsp;3 dubbele bindingen 2 ringsystemen bevatten.

We zullen zien, dat ook bij de verdere onderzoekingen naar de constitutie van het a-tocopherol het absorptiespectrum zeer belangrijke aanwijzingen heeft gegeven. John (52) vond bij vergelijkingnbsp;der absorptiespectra van a-tocopherol en phenolen een zekerenbsp;overeenstemming, waarbij bleek, dat tusschen esters van a-tocopherol en van phenolen deze overeenstemming eveneens bestond.nbsp;V��r phenolstructuur pleitte ook het feit, dat esters van phenolen

en van a-tocopherol minder aantastbaar zijn voor oxydatiemiddelen dan de niet-veresterde verbindingen. Tegen het aannemen vannbsp;phenolstructuur pleitte echter het feit, dat de tocopherolen noch denbsp;gebruikelijke kleurreacties geven, noch zure eigenschappen bezitten.

Een belangrijke stap verder in het inzicht der constitutie van de tocopherolen werd door Fernholz (57) gedaan. Hij vond, datnbsp;bij thermische ontleding van a-tocopherol bij 350� C een subli-matieproduct ontstond, dat tetramethylhydrochinon bleek te zijn.nbsp;Ongeveer terzelfder tijd (onafhankelijk van Fernholz) verkregen McArthur en Watson (58) uit a-tocopherol doornbsp;dehydreering met selenium bij 300�330� C een kristallijn productnbsp;dat als tetramethylchinon werd ge�dentificeerd. Bij de thermischenbsp;ontleding van y8-tocopherol ontstond trimethylhydrochinonnbsp;(John (52), Bergel en medewerkers (59)).

Naar aanleiding van deze vondsten meenden Fernholz, J o h n en anderen, dat a- en ^-tocopherol mono-alkylaethers warennbsp;van tetra- en trimethylhydrochinon, onder meer gebaseerd op hetnbsp;feit, dat dergelijke aethers bij thermische ontleding ook tetra- ennbsp;trimethylhydrochinon gaven. In verschillende laboratoria werdnbsp;een aantal van dergelijke aethers synthetisch bereid en hun eigenschappen met die der tocopherolen vergeleken. Naast de genoemdenbsp;overeenstemming bij thermische ontleding was b.v. de onoplosbaarheid in alkali ook een eigenschap, die de aethers en de tocopherolennbsp;gemeen hadden. Doch spoedig bleken bezwaren tegen een aether-structuur der tocopherolen te bestaan. Door vergelijking dernbsp;absorptiespectra bleek n.h, dat er een duidelijk verschil tusschen denbsp;tocopherolen en de synthetische aethers bestond. Terwijl a-tocopherol een maximum van absorptie bij 294 m/x vertoonde, was ditnbsp;voor een aether, met ongeveer hetzelfde moleculairgewicht, bijnbsp;280�285 m/x gelegen, terwijl bovendien de extinctie van hetnbsp;maximum bij den aether veel kleiner was (Fernholz (18),J ohnnbsp;(60)). Meerdere bezwaren tegen een aetherstructuur der tocopherolen kwamen aan het licht toen gevonden werd, dat a-tocopherol door zilvernitraat veel sneller geoxydeerd werd dan denbsp;aethers, terwijl de ontstane oxydatieproducten een groot onderscheid vertoonden. Bij deze oxydatie van a-tocopherol ontstondnbsp;een chinon met hetzelfde aantal koolstofatomen als het a-toco-

pherol, terwijl de aethers bij deze oxydatie gesplitst werden in tri- of tetramethylchinon en den alcohol van de alkylgroep vannbsp;den aether (John (61), Ka rr er en medewerkers (55)). Bovendien vond K a r r e r, dat uit a-tocopherylallophaiiaat bij verhittingnbsp;met een joodwaterstofzuur-ijsazijn mengsel bij 150� C een koolwaterstof ontstond met formule C29H50, waarbij dus geen splitsingnbsp;van het molecule had plaats gevonden, zooals bij een aetherstructuurnbsp;te verwachten was. Van de zijde van Moss en zijn medewerkersnbsp;(51, 62) kwamen eveneens bezwaren tegen aetherstructuur, waarbijnbsp;deze auteurs op grond van metingen van de oppervlakte-spreidingnbsp;veronderstelden, dat in het tocopherolmolecule 3 of meer ring-systemen voorkwamen (zie echter ook (31)), Bergel en medewerkers (63) vonden verschillen tusschen de absorptiespectra dernbsp;aethers en a-tocopherol en veronderstelden voor a-tocopherol eennbsp;oxychromaan- of oxycumaraanstructuur, waarbij dus het tweedenbsp;zuurstofatoom van het a-tocopherolmolecule in een ringsysteemnbsp;aanwezig was. Een door hen bereid oxycumaraanderivaat vertoonde in reductievermogen, spectrum en gedrag bij thermische ontleding veel overeenkomst met a-tocopherol.

Opnieuw was het aan de onderzoekingen van Fernholz (18) te danken, dat verdere opheldering van de structuur der toco-pherolen werd verkregen. Door inwerking van chroomzuurnbsp;op a-tocopherol gelukte het Fernholz als afbraakproductennbsp;dimethylmale�nezuuranhydride en een optisch actief lactonnbsp;C21H40O2 te isoleeren. Het dimethylmale�nezuuranhydride wasnbsp;afkomstig van de aromatische ring van het a-tocopherolmolecule, het lacton van het aliphatische deel van het molecule.nbsp;Dit lacton was afkomstig van een oxyzuur C21H42O3, waarvan eennbsp;kristallijn derivaat kon worden verkregen. Aangezien dit oxyzuurnbsp;gemakkelijk overging in het lacton, was het dus een y- of eennbsp;8-oxyzuur. Een 8-oxyzuur is minder waarschijnlijk, omdat dan eennbsp;koolstof-zuurstofring met 7 atomen aanwezig zou moeten zijn. Denbsp;hydroxylgroep van het oxyzuur moest tertiair zijn aangezien dezenbsp;zich niet of moeilijk liet oxydeeren en moeilijk te veresteren bleek.nbsp;De vorming van een y-oxyzuur sluit dan tevens de mogelijkheidnbsp;eener cumaraanstructuur uit, want in dat geval zou een ;S-oxyzuurnbsp;ontstaan zijn, terwijl een chromaanstructuur een y-oxyzuur levert.

Schematisch kon deze oxydatie van het a-tocopherol als volgt worden voorgesteld, waarbij F e r n h o 1 z chromaanstructuur aannam:

CH,

/ \

0=C CHj I I

O � C�C16H33 I

CH3

lacton

H3C CH3

I nbsp;nbsp;nbsp;I

c=c

I nbsp;nbsp;nbsp;I

o=c c=o

\ /

o

dimethylma'

le�nezuur-

anhydride

CHj

C C16H33

O CH3

CH3\_____

a-tocopherol

Bij oxydatie van a-tocopherylacetaat met een chroomzuur-azijn-zuurmengsel onder koken en afdestilleeren der vluchtige producten, werden de volgende producten ge�soleerd: aceton, diacetyl,nbsp;dimethylmale�nezuuranhydride, een keton met formule CisHseOnbsp;en een verzadigd mono-carbonzuur met formule C16H32O2. Hetnbsp;keton was ontstaan door verdere oxydatie van het reeds vermeldenbsp;oxyzuur C21H42O3;

terwijl het zuur C10H32O2 weer als afbraakproduct van het keton CigHsgO kon worden beschouwd:

Het gevormde zuur C16H32O2 was geen palmitinezuur en aan de hand van de bepaling van het aantal C�CH3-groepen meendenbsp;Fernholz de volgende structuur aan dit zuur te moeten toekennen:

Aan de hand van al deze gegevens stelde Fernholz de volgende formule voor a-tocopherol op, waarbij hij voor de aliphatische zijketen isopreenstructuur aannam, een veronderstelling, gebaseerdnbsp;op het voorkomen van analoge structuur bij natuurstoffen;

Zeer kort na F e r n h o 1 z�s onderzoekingen werd door K a r r e r en zijn medewerkers (19) het a-tocopherol synthetisch bereid doornbsp;condensatie van trimethylhydrochinon met phytylbromide bij aanwezigheid van watervrij zinkchloride. Deze vlot verloopende reactienbsp;leverde nagenoeg in quantitatief rendement het d/-a-tocopherol.nbsp;Het allophanaat hiervan smolt bij 172� C, tegenover dat van natuurlijk a-tocopherol bij 160� C. Het verschil in smeltpunt bleek te verklaren uit het feit, dat het synthetische c?/-a-tocopherol bij splitsingnbsp;in zijn optisch actieve componenten een d-vorm leverde, waarvannbsp;de ester met 3-broom-d-kamfersulfochloride identiek was met dienbsp;van natuurlijk a-tocopherol (64) (deze zaak is echter gebleken gecompliceerder te zijn, zie hiervoor K a r r e r en medewerkers (65)).

De synthese van a-tocopherol is ook uitgevoerd door B e r g e 1 en medewerkers (66, 67) (condensatie van trimethylhydrochinonnbsp;met phytol) en door Smith en medewerkers (68) (uit trimethylhydrochinon en phytadi�en).

Zooals we gezien hebben nam Fernholz voor a-tocopherol een chromaanstructuur aan. Hiertegen werd door Karrer (19,

55, 64) stelling genomen, volgens hem was cumaraanstructuur min-stens even waarschijnlijk.

CH^

1

C-

, y I

o H

chromaanstructuur

CHj

1

C-

yi

o H

cumaraanstructuur

K a r r e r (19) achtte het o,a. niet uitgesloten, dat het y-oxyzuur van Fernholz ontstaan was door omlegging uit een /3'Oxyzuurnbsp;(dit laatste was dan afkomstig van een cumaraanstructuur). Dezenbsp;omlegging zou dan hebben plaats gevonden onder invloed van hetnbsp;azijn-zuur, dat werd gebruikt bij de oxydatie volgens Fernholz,nbsp;Emerson (69) bewees echter, dat hetzelfde y-oxyzuur uit a-toco-pherol ontstond door oxydatie met kaliumpermanganaat. Verderenbsp;argumenten van K a r r e r ten gunste van een cumaraanstructuurnbsp;bestonden in het feit, dat allylbromide CH2 = CH � CH2Br bijnbsp;condensatie met trimethylhydrochinon een cumaraanderivaat leverde (64, 70). Uit crotylbromide CH3 � CH = CH � CH2Br ennbsp;trimethylhydrochinon ontstonden zoowel een chromaan- als eennbsp;cumaraanderivaat (71).

(68, 71) bij condensatie met trimethylhydrochinon een chromaan-derivaat gaf (men kan phytylbromide beschouwen als een di-gesubstitueerd y : y-allylbromide). Tevens bleek, dat het oxydatie-product van a-tocopherol, het a-tocopherylchinon, een tertiaire hydroxylgroep bevatte (70) (geen ketenvorming met aluminium-isobutylaat). Deze feiten deden Karrer besluiten eveneensnbsp;chromaanstructuur voor a-tocopherol aan te nemen.

Verdere bewijzen voor de chromaanstructuur van a-tocopherol werden geleverd door J o h n en medewerkers (60, 61, 72, 73), dienbsp;eveneens vonden, dat het a-tocopherylchinon een tertiaire hydroxylgroep bevatte, terwijl de studie der absorptiespectra van de allo-

phanaten van synthetische chromaan- en cumaraanderivaten ten gunste eener chromaanstructuur van a-tocopherol uitviel.

De synthese van het j8-tocopherol is door K a r r e r en Fritzsche (74) uitgevoerd. De feiten, dat jS-tocopherol zeernbsp;nauw verwant in chemische eigenschappen met a-tocopherol is; dalnbsp;j8-tocophero] bij thermische ontleding trimethylhydrochinon geeft,nbsp;terwijl j8-tocopherol bij chroomzuur-oxydatie hetzelfde C^i-lactonnbsp;leverde als a-tocopherol (Emerson (75)), waren het bewijs, datnbsp;a- en ^�-tocopherol homologen zijn. De synthese van het y8-toco-pherol werd uitgevoerd door condensatie van dimethylhydrochinonnbsp;met phytylbromide. Daar er echter drie isomere dimethylhydrochi-nonen bestaan, was het noodzakelijk elk dezer isomeren te conden-seeren met phytylbromide'. Het bleek evenwel bij deze condensaties,nbsp;dat de reactie hier gecompliceerder verliep dan bij de synthese vannbsp;a-tocopherol. Kregen wij bij de synthese van a-tocopherol dit laatste met vrijwel quantitatief rendement, zoo kreeg men bij de condensatie der dimethylhydrochinonen naast het gewenschte reactie-product ook producten, die ontstonden uit 1 molecule dimethylhydrochinon met 2 moleculen phytylbromide, welke min of meernbsp;bezwaarlijk van de mono-substitutieproducten te scheiden waren.

Om dit bezwaar te vermijden bleek het beter de synthese uit te voeren met phytol in plaats van phytylbromide en mierenzuur alsnbsp;condensatiemiddel te gebruiken. J a c ob en medewerkers (76) vermeden het gemelde bezwaar door de synthese uit te voeren met denbsp;mono-benzoaten der dimethylhydrochinonen en het condensatie-product later te verzeepen.

Door vergelijking van de mengsmeltpunten van de allophana-ten en p-nitrophenylurethanen der 3 verkregen condensatieproduc-ten met die van natuurlijk y8-tocopherol kon K a r r e r (77) de volgende formule voor j8-tocopherol opstellen:

v/\ / I nbsp;nbsp;nbsp;I

Wat betreft het y-tocopherol, dat beschouwd werd als een iso-meer van yS-tocopherol (Emerson (75) vond bij y-tocopherol door oxydatie met chroomzuur eveneens het reeds eerder besprokennbsp;C2i~lacton en bij thermische ontleding van y-tocopherol het trime-thylhydrochinon), werd door Karrer en zijn medewerkers (78)nbsp;het vermoeden geuit, dat y-tocopherol onzuiver /3-tocopherol was.nbsp;Bij bepaling der mengsmeltpunten van een door Karrer ge�soleerd y-tocopherylallophanaat en van een aan hem door Evansnbsp;beschikbaar gesteld preparaat met de allophanaten van ieder dernbsp;drie isomere ;8-tocopherolen, bleek alleen het mengsmeltpunt metnbsp;het j8-tocopherylallophanaat z�lf geen depressie te geven. Hieruitnbsp;besloot Karrer, dat het y-tocopherol een iets onzuiver yS-toco-pherol was. ¹

Reeds eenige malen is bij de bespreking der onderzoekingen over het vitamine E gewag gemaakt van het absorptiespectrum der tocopherolen en andere verbindingen, waarbij gewezen werd op de belangrijke rol, die deze spectra gespeeld hebben bij de ophelderingnbsp;der constitutie. Hier volgt de geschiedenis van het onderzoek vannbsp;het spectrum van vitamine E in chronologische volgorde:

De eerste onderzoekingen over het spectrum zijn afkomstig van Evans en Burr (12), die vonden, dat vitamine E-concentratennbsp;sterke algemeene absorptie in het ultraviolet vertoonden zondernbsp;specifieke banden. Bowden en Moore (79, 32) vonden innbsp;tarwekiemolieconcentraten een sterke toeneming der absorptienbsp;vanaf 302 m^u, met een maximum bij 255 m/i, terwijl verder in hetnbsp;ultraviolet algemeene absorptie optrad vanaf 244 m/i.

Door vergelijking tusschen de intensiteit der absorptie en de biologische werkzaamheid van de concentraten, die aan verschillende chemische behandelingen werden onderworpen, kwamen zijnbsp;tot de conclusie, dat er evenredigheid bestond tusschen de intensiteitnbsp;der absorptie bij 285�320 m/x en de biologische werkzaamheid.

Volgens een recente publicatie van Emerson en Smith (128) heeft 7-tocopherol de beide methylgroepen in de aromatische ring op de plaatsennbsp;7 en 8.

Martin en medewerkers (80) vonden bij een fractie, die door hoogvacuumdestillatie van een vitamine E-concentraat was verkregen en welke fractie werkzaam was in een dosis van 16 mg, eennbsp;factor E}�/o = 27 (bij 294 m^).

Olcott (33, 81) vond een absorptieband met maximum bij 294 m/i in concentraten van tarwekiemolie en katoenzaadolie, dochnbsp;deze band was eveneens aanwezig in een biologisch onwerkzaamnbsp;palmolieconcentraat. Olcott besloot hieruit, dat deze absorptieband niets te maken had met vitamine E, een meening, die laternbsp;gebleken is foutief te zijn, In een latere publicatie handhaafdenbsp;Olcott (37) niettemin deze meening, mede in verband met hetnbsp;feit, dat hij bij gefractioneerde destillatie van tarwekiemolieconcen-traten producten verkreeg, die bij gelijke absorptie-intensiteit ongelijke biologische werkzaamheid hadden (hierbij is mogelijkerwijsnbsp;een ongelijke verhouding van a- en jS-tocopherol in de productennbsp;de oorzaak).

Drummond en medewerkers (26, 29) vonden bij een onderzoek van concentraten in de biologisch meest werkzame fracties een maximum bij 294 m/^ en een minimum bij 267 m/r. Bij een v�r-gezuiverd preparaat vonden zij E |nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;= 59 (294 xnjj,). Wel vond

Drummond, dat werkzame preparaten steeds een maximum bij 294 mju, vertoonden, doch tevens, dat sommige fracties minder werkzaam waren dan men volgens de intensiteit der absorptie zou verwachten. De eerste onderzoekingen, waarbij gebruik gemaakt werdnbsp;van de zuivere tocopherolen, geschiedden door Evans en medewerkers (17),

Bij de bepaling van het absorptiespectrum der zuivere tocopherolen vonden zij bij a-tocopherol een dubbel maximum (in hexaan) bij 292 en 298 m/x; E |nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;= 90 � 10 (298 rap).

Moss en Drummond (31) vonden voor a-tocopherol eveneens een dubbel maximum in hexaan met de waarde E } nbsp;nbsp;nbsp;= 80

� 2 (292 en 298 mp). In aethylalcohol vonden zij ��n maximum E l�/o = 70 � 2 (292 mp).

Voor j8-tocopherol in aethylalcohol werd een maximum bij 295 m/i gevonden met E |nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;= 82 � 2.

Verdere bepalingen waren afkomstig van T o d d en medewerkers (50), die voor ^-tocopherol in aethylalcohol de waarde E }

= 87 (295 m/i) en van Moss en medewerkers (51), die voor y8-tocopherol ^ 1 cm ~nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(294�295 mji) in aethylalcohol vonden.

Voor synthetisch d/-a-tocopherol vonden W e r d e r en medewerkers (82) E J = 69 (290 m/i), terwijl Ka r r e r en medewerkers (19) E j = 76 (294 mu) vonden.

El�/o = 77 (294 mic).

In aansluiting hierbij is gebleken, dat bij inwerking van ultraviolet licht op vitamine E, hetzij in concentraten, hetzij als de zuiverenbsp;tocopherolen, het vitamine E vernietigd wordt (Drummond en

In het voorgaande literatuuroverzicht is reeds eenige malen gesproken over de gevoeligheid der tocopherolen tegenovernbsp;oxydantia. De oxydatieproducten zijn nu niet alleen van belangnbsp;geweest voor de structuurbepaling der tocopherolen, maar ook voornbsp;de later te bespreken chemische bepalingsmethoden, die allen opnbsp;de oxydeerbaarheid van het tocopherolmolecule berusten. Doornbsp;oxydatie van a-tocopherol met ferrichloride, zilvernitraat of goud-chloride ontstaat het a-tocopherylchinon, C29H50O3 (Karrernbsp;en medewerkers (70), Moss en medewerkers (51, 62), Johnnbsp;(61), John en medewerkers (73)).

CHj nbsp;nbsp;nbsp;CHsnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;CH3nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;CH3

I nbsp;nbsp;nbsp;Inbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Inbsp;nbsp;nbsp;nbsp;I '

C-iCHds-CH-lCHjjs-CH-jCHds-CH

1

CH3

CHs OH

a-tocophcrylchinon (C20H6OO3)

Zooals reeds eerder werd beschreven bevat het a-tocopheryl-chinon een tertiaire hydroxylgroep daar het zich niet laat omzetten met aluminiumisobutylaat tot een keton, wat dan ook ��n der redenen was, dat Karrer zich bij de chromaanstructuur van a-toco-pherol heeft aangesloten.

Het a-tocopherylchinon laat zich door reductie met waterstof en palladium of met zink en ijsazijn omzetten in het a-tocopheryl-hydrochinon, een stof, die buitengewoon oxydabel is en door luchtzuurstof snel overgaat in het chinon (73). We zien dus, dat tus-schen chinon en hydrochinon een oxydatie-reductiesysteem bestaat.

Het a-tocopherylchinon kan door verhitting met zink en ijsazijn-broomwaterstofzuur weer overgaan in het a-tocopherol, terwijl het hydrochinon door verwarming met sterke zuren weer kan overgaannbsp;in het a-tocopherol. Deze omzettingen kunnen als volgt schematischnbsp;worden weergegeven;

goudchlorlde

ferrichloride

HBr

zink ijsazijn; katalytische Hj

lt;----------

zuurstof

a-tocopherylhydro-

chinon

Het jS-tocopherol gedraagt zich bij oxydatie analoog aan het a-tocopherol. Zilvernitraat is minder geschikt voor de omzetting vannbsp;a-tocopherol in a-tocopherylchinon, omdat bij de inwerking vannbsp;alcoholisch zilvernitraat de oxydatie gemakkelijk verder gaat, waarbij een rood gekleurde verbinding, het a-tocopherolrood, ontstaatnbsp;(John en Emte (85)), hetgeen eveneens ontstaat door verhitting van a-tocopherol met alcoholisch salpeterzuur (John (52)).

I nbsp;nbsp;nbsp;Inbsp;nbsp;nbsp;nbsp;I

Voor onderzoekingen over dergelijke oxydatieproducten van eenvoudige chromaanverbindingen zie K a r r e r en medewerkersnbsp;(71, 78), John en medewerkers (73) en Smith en medewerkers (127).

BIOLOGIE VAN HET VITAMINE E.

De bespreking van de biologie van het vitamine E zal zeer beknopt geschieden. We zullen ons hierbij beperken tot de rat, die, vanaf de ontdekking van het vitamine E tot heden toe, het gebruikelijke proefdier voor de biologische onderzoekingen over het vitaminenbsp;E is ge'weest en waarbij het verschijnsel der vitamine E-defici�ntienbsp;het best bestudeerd is.

Vrouwelijke ratten worden op een vitamine E-vrij di�et steriel. De ovaria zijn niet beschadigd, terwijl ovulatie en oestrus normaalnbsp;zijn, evenals paring en implantatie van het bevruchte ei. In plaatsnbsp;van een normaal zwangerschapsbeloop sterft de foetus echternbsp;vroegtijdig af en wordt geresorbeerd. Dit is het beeld eener volledige E-avitaminose.

'Indien de vrouwelijke rat nog niet voldoende lang op een vitamine E-vrij di�et is geweest verloopt de zwangerschap normaal:nbsp;de jonge dieren komen normaal ter wereld, doch een groot percentage er van sterft spoedig. Soms ook zien we, dat bij de jongennbsp;verlammingsverschijnselen optreden, die bij tijdig toedienen vannbsp;vitamine E kunnen voorkomen worden (86), doch in latere stadianbsp;moeilijk te genezen zijn (87, 88).

Vitamine E-gebrek bij mannelijke ratten vertoont zich het eerst bij de spermatogenese. De spermi�n verliezen eerst hun beweeglijkheid en als gevolg hiervan de geschiktheid tot bevruchten. In latere

stadia vertoonen de spermi�n degeneratieverschijnselen en na 8�10 maanden worden ze niet meer gevormd. Dan is degeneratienbsp;van de testis opgetreden. In tegenstelling met de vrouwelijke ratnbsp;zijn bij de mannelijke rat slechts de aanvangsstadia van de gevolgen eener E-avitaminose te herstellen door vitamine E-toediening;nbsp;in latere stadia is dit niet meer mogelijk.

Behalve bij de rat heeft men ook bij andere dieren den invloed van het vitamine E (in den vorm van tarwekiemolie) bij steriliteitnbsp;onderzocht, waarbij de onderzoekingen zich grootendeels op veterinair gebied bewegen (huisdieren). V o g t-M � 11 e r (89) wasnbsp;de eerste, die het vitamine E bij steriliteit van runderen toepaste ennbsp;zijn tot op heden verkregen resultaten zijn over het algemeennbsp;succesvol te noemen, evenals die van andere onderzoekers op ditnbsp;gebied (runderen, paarden en varkens).

Een andere belangrijke toepassing van de vitamine E-toediening bij huisdieren is die bij infectie met Bacillus abortus Bang. De resultaten, die hierbij met vrij groot materiaal (runderen) zijn verkregen,nbsp;zijn zeer hoopvol. Volgens Lange (90) verhoogt het toedienennbsp;van vitamine E de weerstand der dieren tegen deze infectie, zondernbsp;echter de virulentie van de infectie te be�nvloeden.

Ook bij hoenderen heeft het vitamine E toepassing gevonden; bij kippen is gebleken, dat de aanwezigheid van het vitamine in hetnbsp;voeder van belang is voor de broeduitkomsten (Ender (91)).nbsp;Wanneer voldoende vitamine E in het voeder aanwezig is, heeftnbsp;extra toediening er van echter geen invloed op de broeduitkomstennbsp;(Dols (92)). Voor literatuur op dit gebied zie V o g t-M � 11 e rnbsp;(89), Karrer (93), Grandel (23) en Herschel (129).

Het al of niet werpen van levende jongen door zwangere ratten is de grondslag voor het bepalen van het vitamine E langs biolo-gischen weg, een methode, die reeds door de grondleggers van hetnbsp;vitamine E-onderzoek, Evans en Burr, werd toegepast. Aangezien er geen internationaal erkende methode voor de biologischenbsp;ijking bestaat, is het dikwijls lastig de resultaten van verschillende

onderzoekers te vergelijken, omdat deze veelal verschillende criteria aanleggen. De te onderzoeken stof moet daarom steeds vergeleken worden met een standaardpreparaat, waarvoor geen internationale eenheid bestaat. Vroeger nam men als standaardpreparaatnbsp;tarwekiemolie, dat echter geen constant vitamine E-gehalte bezit.nbsp;Sedert de synthese van JZ-a-tocopherol kan men dit of nog beternbsp;het c?/-a-tocopherylacetaat ¹) nemen, dat stabiel is. Sommige onderzoekers (Bacharach (94)) nemen als vergelijkingspunt bij denbsp;biologische bepaling de -dosis, die bij 50 % der dieren de steriliteitnbsp;opheft, anderen (Karrer en Demole (95)) bepalen de minimum dosis, die bij 80�100 % der dieren de steriliteit opheft.

Voor synthetisch c?/-a-tocopherol zijn de hoeveelheden, volgens beide methoden bepaald, resp. 1.2 en 3 mg, voor j8-tocopherol resp.nbsp;1.9 en 6�10 mg.

Zooals we reeds zagen, is het /3-tocopherol, dat 2 methylgroepen in de aromatische ring van het tocopherolmolecule heeft, mindernbsp;werkzaam dan het a-tocopherol (dat 3 methylgroepen in de aromatische ring bezit).

In verband hiermede verdient een publicatie van Jacob en medewerkers (96) de aandacht. Dezen vonden, dat ��n der iso-meren van het ;8-tocopherol in een dosis van 3 mg de steriliteitnbsp;ophief bij 100 % der dieren (Karrer en medewerkers (65)nbsp;hadden voor dit isomeer een waarde van 10 mg gevonden). Ditnbsp;verschil is des te merkwaardiger, omdat Jacob en medewerkersnbsp;voor yS-tocopherol en het andere isomeer vrijwel dezelfde waardennbsp;vonden als Karrer. We zien dus, dat de quantitatieve werkzaamheid der a- en j8-tocopherolen nog niet geheel vast staat. Eennbsp;synthetisch tocopherol met 1 methylgroep in de aromatische ringnbsp;was in een dosis van 40 mg onwerkzaam (77). Bij vervanging vannbsp;1 of 2 methylgroepen door aethylgroepen werden producten verkregen, die in doses van resp. 16 en 10 mg werkzaam waren (97,

Onder den naam �Ephynal� door de firma Hoffmann-La Roche in den handel gebracht.

98). Een dehydro-a-tocopherol was volgens K a r r e r en medewerkers (99) werkzaam in een dosis van 6 mg.

Van een aantal esters van het a-tocopherol (acetaat, propionaat, butyraat e.a.) werd gevonden, dat de biologische werkzaamheidnbsp;hiervan niet ten achter staat bij het a-tocopherol zelf (100). Eennbsp;phosphorzure-ester van a-tocopherol was ook ongeveer even werkzaam als het a-tocopherol (101).

Terwijl een aantal onderzoekers (73, 82, 102) vonden, dat deze stof tot een dosis van 20 mg onwerkzaam was, vonden Emersonnbsp;en medewerkers (103), dat het chinon vrijwel even werkzaam wasnbsp;als het a-tocopherol zelf.

Karrer en Geiger (102) hebben echter aangetoond, dat bij de bereidingswijze van het chinon volgens Emerson (uitnbsp;c?/-a-tocopherol met ferrichloride) slechts gedeeltelijke oxydatie vannbsp;het o?/-a-tocopherol plaats vond (Emerson beweerde echter datnbsp;zijn chinon g��n tocopherol bevatte).

Evenals bij vorige onderzoekingen vond Karrer bij zorgvuldige bereiding van het chinon, dat dit onwerkzaam was in een dosis van 25 mg. Dit werd bevestigd door Wright ennbsp;Drummond (104) (in een dosis van 10 mg).

Niettegenstaande de uitkomsten van Emerson is het dus vrij zeker, dat het chinon onwerkzaam is (zie ook Engel (105) ennbsp;G o 1 u m b i c (106)).

4. nbsp;nbsp;nbsp;Verbindingen waarvan structuur verwant is aan die der tocopherolen.

Men heeft een groot aantal verbindingen gesynthetiseerd, zoowel chromaan- en cumaraanderivaten als aethers afgeleid van tri-methylhydrochinon en andere hydrochinonen. Vergeleken met a-en yS-tocopherol bezitten deze stoffen weinig of geen biologischenbsp;E-werkzaamheid (W erder en Moll (107), W e r d e r ennbsp;medewerkers (82), Evans en medewerkers (108, 109)).

Men kan in het algemeen zeggen, dat, met als uitgangspunt het a-tocopherol (dat het meest werkzaam is), vermindering van hetnbsp;aantal methylgroepen of vervanging hiervan door andere groepen

Eveneens van groot belang is de phytolrest in het molecule: bij vervanging door een andere groep gaat de werkzaamheid zeer sterknbsp;achteruit of verdwijnt. Dit is eveneens het geval bij verdwijningnbsp;der chromaanstructuur (cumaraan- of aetherstructuur).

Over de werking van het a- of /3-tocopherol in het organisme is nog niets bekend. De mogelijkheid zou kunnen bestaan, dat hetnbsp;oxydatie-reductiesysteem chinon-hydrochinon een rol speelt, ofschoon dit niet zeer waarschijnlijk is op grond van de feiten, datnbsp;1 � het chinon biologisch onwerkzaam is en dat 2� Cuthbertsonnbsp;en medewerkers (110) gevonden hadden, dat na toediening vannbsp;groote doses d/-a-tocopherol aan ratten geen chinon in de organennbsp;werd gevonden.

CHEMISCHE EN PHYSISCHE BEPALING DER TOCOPHEROLEN.

Niettegenstaande de langdurige en kostbare biologische bepalingsmethoden heeft het vitamineonderzoek een snelle ontwikkeling ondergaan. Niet zoodra was een vitamine als voedingsfactor ontdekt, of verscheidene onderzoekers zetten zich aan het werk omnbsp;dit vitamine te isoleeren, te identificeeren en te synthetiseeren. Bijnbsp;een dergelijk onderzoek waren steeds langdurige biologische bepalingsmethoden noodig om vast te stellen, in hoeverre men doornbsp;toepassing van chemische kunstgrepen erin geslaagd was hetnbsp;Vitamine van het uitgangsmateriaal te concentreeren. Het is zekernbsp;niet overdreven om te zeggen, dat bij deze chemische onderzoekingen de meeste tijd werd besteed aan biologische bepalingen, terwijlnbsp;men pas aan de hand van het resultaat hiervan verder kon komen.

Op een enkele uitzondering na (b.v. de reactie volgens Carr en Price (111) op vitamine A), zijn de chemische of physischenbsp;bepalingsmethoden pas tot ontwikkeling gekomen, nadat men erinnbsp;geslaagd was de vitamines in zuiveren toestand te verkrijgen. Ditnbsp;is in zooverre niet te verwonderen, omdat men slechts dan pas eennbsp;goede chemische bepalingsmethode kan opstellen, wanneer men ernbsp;zeker van is, dat all��n het vitamine zelf en geen andere stoffen,nbsp;die b.v. in chemisch opzicht verwant zijn aan het vitamine en hiervan moeilijk te scheiden zijn, zooals in concentraten het geval kannbsp;zijn, de reactie geven of op gelijke wijze als het vitamine reageeren.

Het doel van een chemische bepalingsmethode is de langdurige en kostbare biologische methodiek te omgaan. Chemische methodennbsp;zijn sneller, goedkooper en nauwkeuriger dan de biologische. Deze

voordeelen zijn duidelijk aan den dag getreden bij het bepalen van het vitaminegehalte van commercieele producten in den vorm vannbsp;vitaminepreparaten.

Een ander belangrijk voordeel van de chemische methoden is hun veel grootere gevoeligheid. Hierdoor is men in staat geweestnbsp;uitgebreide onderzoekingen te doen op physiologisch gebied, onderzoekingen, die met behulp van de biologische methode niet mogelijknbsp;zouden geweest zijn, omdat de aanwezige hoeveelheid vitaminenbsp;hiervoor ontoereikend is.

De groote vlucht, die het onderzoek naar een avitaminose bij den mensch heeft genomen, is te danken aan de chemische bepalingsmethoden. Hiermede zijn wij b.v. in staat om in een hoeveelheidnbsp;bloed, die men zonder bezwaar aan een pati�nt kan onttrekken,nbsp;een bepaling van het vitaminegehalte te doen.

Op ��n punt echter staan de chemische methoden ten achter bij de biologische:

De biologische werkzaamheid van een vitamine is ten nauwste verbonden met de chemische structuur er van. Kleine wijzigingennbsp;in deze structuur kunnen, zonder de chemische of physische eigenschappen van het molecule merkbaar te veranderen, ingrijpendenbsp;wijzigingen in de biologische werkzaamheid ten gevolge hebbennbsp;(zie b.v, hoofdstuk III).

Aangezien de chemische bepalingsmethoden berusten op bepaalde chemische en physische eigenschappen van het vitamine, zooals kleur, fluorescentie, reductievermogen of absorptie in het ultraviolet, is het in verband met het bovenstaande duidelijk, dat denbsp;chemische methode minder specifiek is dan de biologische.

Ter toetsing heeft men van vele producten het vitaminegehalte volgens beide methoden bepaald. De resultaten, die men hierbijnbsp;heeft verkregen, kunnen in het algemeen bevredigend worden genoemd. Wel is echter gebleken, dat slechts die chemische methodennbsp;zich hebben kunnen handhaven, die de grootste specificiteitnbsp;bezitten. Eveneens is het dikwijls noodzakelijk, om de extractennbsp;waarin men een chemische bepaling wil uitvoeren, door kunstgrepen b.v. verzeeping of adsorptie, te zuiveren van stoffen, die denbsp;reactie storen. De moeilijkheid blijft echter bestaan, dat men in velenbsp;gevallen deze storende stoffen en dus ook hun eigenschappen nietnbsp;kent.

Bij het bepalen van het vitaminegehalte van physiologisch materiaal langs chemischen weg is het echter dikwijls niet mogelijk, wegens het geringe gehalte, een biologische bepaling als controlenbsp;uit te voeren. Het onderzoek heeft uitgewezen, dat ook in dezenbsp;gevallen de chemische methoden meestal voldoende betrouwbaarnbsp;zijn om een indruk te geven van het vitaminegehalte. Het is b.v.nbsp;gebleken, dat onderzoekingen naar de vitamine-voorziening bij dennbsp;mensch met behulp der chemische methoden een waardevolle mogelijkheid bieden om een inzicht hierin te krijgen (zie o.a. Wolffnbsp;(112)).

1. nbsp;nbsp;nbsp;Physische methode, berustende op de bepaling der intensiteitnbsp;van de absorptie in het ultraviolet.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Titratie met goudchloride volgens de potentiometrische methode.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Colorimetrische bepaling door oxydatie met alcoholisch salpeterzuur.

Reeds eerder werd melding gemaakt van het absorptiespectrum van de tocopherolen en de verschillende onderzoekingen, die tennbsp;doel hadden een betrekking te vinden tusschen de intensiteit dernbsp;absorptie en de biologische activiteit. Zooals reeds werd beschreven (zie hoofdstuk II), kon men na de isoleering en synthese dernbsp;tocopherolen het absorptiespectrum definitief vastleggen.

Onder de onderzoekers, die veelvuldig gebruik van deze methode hebben gemaakt, dienen D r u m m o n d|en medewerkers te wordennbsp;genoemd. Recente onderzoekingen met behulp van de spectrophoto-metrische methode zijn uitgevoerd door Moore en Rajagopalquot;nbsp;(83) en door Cuthbertson en medewerkers (110). Dezenbsp;laatsten maakten tevens gebruik van de methode om het tocopherolnbsp;door oxydatie om te zetten in tocopherylchinon en hiervan denbsp;absorptie (bij 265 mju.) te bepalen.

onzekerheid van de quantitatieve tocopherolbepaling langs spectro-photometrischen weg hierin gelegen, dat de aanwezigheid van stoffen, die eveneens in het ultraviolet absorbeeren, dikwijls aanleiding kan zijn tot storing of zelfs de bepaling �nmogelijk kan maken.nbsp;Wanneer wij bijvoorbeeld extracten hebben, waarin vitamine Anbsp;naast tocopherol voorkomt, kan de veel sterkere absorptie van het

vitamine A (EJ*'/� nbsp;nbsp;nbsp;= 1600 bij 328 m/x) veel hinder veroorzaken,

daar a-tocopherol een veel lagere absorptie-intensiteit bezit (E } �/o = 77 bij 294 mji).

Reeds vroeger deelden wij mede, dat a-tocopherol door oxydatie met zilver- of ijzerzouten (ferri) overgaat in het a-tocopheryl-chinon.

Karrer en medewerkers (70) vonden, dat a-tocopherol door een alcoholische ferrichlorideoplossing onvolledig geoxydeerdnbsp;wordt, doch dat goudchloride zeer geschikt was om het a-tocopherolnbsp;snel en quantitatief tot chinon te oxydeeren. Deze bepalingsmethode, die door Karrer en Keiler (20) werd uitgewerkt,nbsp;geschiedt langs potentiometrischen weg. Men lost een hoeveelheidnbsp;van 5�10 mg a-tocopherol op in ongeveer 250 cm^ 80 % aethyl-alcohol. Dit mengsel wordt op � 50� C gehouden en hieraan wordtnbsp;in kleine hoeveelheden uit een microburet een oplossing van 0.01 nnbsp;goudchloride in aethylalcohol toegevoegd. Na iedere toevoegingnbsp;van goudchloride wordt gewacht tot zich een evenwicht heeft ingesteld, waarna opnieuw goudchloride wordt toegevoegd, totdatnbsp;tenslotte een overmaat aanwezig is. De geheele titratie wordtnbsp;potentiometrisch uitgevoerd. Daar de potentialen zich langzaamnbsp;instellen duurt een titratie ongeveer 3 uren.

Later hebben K a r r e r en Keiler (113) bij de bepaling van het tocopherolgehalte in oli�n het oplosmiddel gewijzigd, daarnbsp;oli�n in 80 % aethylalcohol zeer weinig oplosbaar zijn. Bij hetnbsp;bepalen in oli�n werd als oplosmiddel 96 % aethylalcohol metnbsp;benzol (5:1) gebruikt, waaraan wat lithiumchloride werd toegevoegd om de geleidbaarheid te verhoogen.

Voor verdere oplosmiddelen bij deze titratiemethode zie Grandel en Neumann (114).

Deze methode, die afkomstig is van Furter en Meyer (22), berust op het reeds eerder door John gevonden feit, dat toco-pherolen door koken met alcoholisch salpeterzuur een roode kleurstof vormen, door hem tocopherolrood genoemd. Deze reactie isnbsp;door Furter en Meyer uitgewerkt tot een quantitatieve bepaling en wordt als volgt uitgevoerd:

Men gaat uit van 1�5 mg stof, die minstens 0.3 mg tocopherol moet bevatten en die opgelost is in 5 cm^ absoluten aethylalcohol.nbsp;De oplossing bevindt zich in een kolfje van 25 cm3, voorzien vannbsp;een terugvloeikoeler. Onder omroeren wordt 1 cm3 65 % salpeterzuur toegevoegd en wordt het reactiemengsel precies 3 minuten opnbsp;een waterbad gekookt. Na afkoelen wordt de intensiteit der roodenbsp;kleur bepaald met den Zeis s-P u 1 f r i c h photometer, waarbijnbsp;gebruik wordt gemaakt van filter S 47 en de 1 cm cuvette.

Bij de bepaling van tocopherol in oli�n volgens deze reactie ontstaan 2 lagen, die ieder afzonderlijk moeten worden bepaald met den photometer en waarvan de kleurintensiteiten opgeteld worden.

Voor een critische bespreking van de chemische bepalingsmethoden zie hoofdstuk VIII.

De methode berust op de oxydatie van tocopherol door ferri-chloride en de colorimetrische bepaling van het hierbij gevormde ferro-zout met behulp van a : a'-dipyridyl als rood gekleurdenbsp;complexe verbinding (21, 115). Deze door BI au (116) ontdektenbsp;reactie op ferro-zouten (zie ook Feigl en Hamburg (117)) isnbsp;een der meest gevoelige reacties hierop en wordt niet gestoordnbsp;door ferri-zouten.

Daar het niet mogelijk was de reactie uit te voeren in water, zooals gebruikelijk bij micro-ijzerbepalingen, kozen we 96 %nbsp;aethylalcohol als oplosmiddel. Zoowel tocopherol als ferrichloridenbsp;en dipyridyl lossen hierin voldoende op, terwijl de reactie zelf ooknbsp;vlot in dit milieu verloopt. Evenwel bleek later bij toepassing dernbsp;reactie op oli�n, dat het hierbij wenschelijk was het milieu iets tenbsp;wijzigen, reden waarom wij er toe zijn overgegaan een mengselnbsp;van 96 % aethylalcohol en benzol te nemen (5 cm^ benzol opnbsp;25 cm3 mengsel). De toevoeging van benzol was niet alleen gunstig voor de oplosbaarheid der te onderzoeken preparaten, dochnbsp;was eveneens een voordeel bij onze adsorptieproeven voor de scheiding van tocopherol van andere stoffen (zie pag. 53). Het bleek,nbsp;dat zoowel de uitvoering der reactie in 96 % aethylalcohol als innbsp;het alcohol-benzol-mengsel dezelfde colorimeter-aflezingen gafnbsp;voor een bepaalde hoeveelheid a-tocopherol.

De aethylalcohol (handelsproduct) en de benzol (Pharm. Ed. V) werden beide v��r het gebruik uit een geheel glazen apparaatnbsp;gedestilleerd, waarbij � 5 % als voorloop en evenveel als laatstenbsp;fractie der destillatie niet werden gebruikt. Beide oplosmiddelennbsp;worden in het donker bewaard. De ferrichlorideoplossing bestaatnbsp;uit 0.2 % FeCls 6 aq. (Merck�s ferrum sesquichloratum cryst. p.a.)nbsp;in aethylalcohol, de oplossing van a : a'-dipyridyl (Merck) heeftnbsp;een concentratie van 0,5 % in aethylalcohol. Beide oplossingennbsp;worden dagelijks versch bereid en moeten'eveneens in het donkernbsp;worden bewaard.

Reeds dadelijk bleek, dat zonlicht en sterk daglicht grooten invloed op. de reactie hebben. Een blanco oplossing der reagentia, die zwak geel gekleurd is, wordt bij blootstellen aan zon- of daglicht meer of minder snel rood. We zien dus, dat onder invloed vannbsp;het licht een reactie plaats heeft, waarbij het ferrichloride in alcoholisch milieu wordt gereduceerd tot f�rrochloride, dat met hetnbsp;dipyridyl reageert.

Na een aantal proeven met lichtfilters bleeks, dat een filter, hetwelk licht doorlaat van golflengte 650�700 m^ (rood licht), het gunstigst was voor de stabiliteit der blanco, terwijl de sterkste verandering der blanco plaats vond'm�t een filter, dat licht doorlaatnbsp;van golflengte 450�500 m/t.' Het is evenwel niet noodig de geheelenbsp;reactie in een donkere kamer uit te voeren. Bij de bepaling kunnennbsp;de reagentia bij sterk gedempt daglicht of zwak kunstlicht wordennbsp;toegevoegd, terwijl daarna het reactiemengsel in het donker wordtnbsp;bewaard tot de meting plaats vindt. Daar bij de meting het reactiemengsel aan het licht van de photometerlamp is blootgesteld, wasnbsp;het noodig den invloed van deze lichtbron op de reactie na te gaan.

Bij de colorimetrische bepaling werd gebruik gemaakt van den Zeis s-P u 1 f r i c h photometer, ook wel Stufenphotometer genoemd. Als lichtfilter werd het filter S 50 gekozen, dat na onderzoek het gunstigst bleek.

Om den invloed van de photometerlamp op de reactie na te gaan, werd ��n der cuvettes (van 1 cm) met het blanco reagentiamengselnbsp;en de andere cuvette met water gevuld. Onder voortdurende belichting werd telkens na bepaalden tijd een aflezing gedaan. In

de hieronder volgende tabel zijn de resultaten vermeld, waarbij de waarden van de aflezingen op den trommel van den photometernbsp;de hoeveelheden doorgelaten licht in percenten voorstellen. Aangezien de oplossing met de blanco-reagentia zwak geel gekleurdnbsp;is door het ferrichloride, wordt door deze blanco, die vergelekennbsp;wordt met water, reeds in den aanvang minder dan 100 % lichtnbsp;doorgelaten.

We zien hieruit, dat de blanco slechts langzaam verandert en dat het raadzaam is deze niet langer dan 10 minuten bij serie-bepalingen te gebruiken. Men kan dan eenvoudig een nieuwe blanconbsp;nemen van de 25 cm^ blanco-oplossing, die men in het donker heeftnbsp;bewaard. We zien bovendien, dat aan het uitvoeren der reactie zelfnbsp;bij matig kunstlicht geen enkel bezwaar is verbonden, mits, zooalsnbsp;reeds werd gezegd, de reactie-mengsels in het donker worden bewaard. Na eenige uren in het donker bewaard te zijn, geeft denbsp;blanco dezelfde aflezing als direct na de bereiding.

3. Snelheid en stabiliteit der reactie van ferrichloride en dipyridyl met d/-a-tocopherol. ¹)

De snelheid en stabiliteit dezer reactie werden bepaald door meting der intensiteit van de roode kleur. Hierbij werd gevonden,nbsp;dat de reactie na 1�2 minuten is afgeloopen, terwijl de kleur-intensiteit minstens enkele uren stabiel is.

Het synthetisch bereide dl-a-tocopherol is welwillend ter beschikking gesteld door de firma Hoffmann-La Roche.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Invloed van het dipyridyl op de reactie tusschen dZ-a-tocopheroI ennbsp;ferrichloride.

Bij onze onderzoekingen over het verloop van de reactie van d/'-a-tocopherol met het lerrichloride-dipyridyl-reagens bleek, datnbsp;het dipyridyl niet alleen diende om de rood gekleurde verbindingnbsp;te geven, doch tevens, dat eerst het dipyridylnbsp;de oxydatie volledig maakte.

Zonder dipyridyl toevoeging vonden we een onvolledige omzetting van tocopherol in tocopherylchinon (zie ook hoofdstuk III). Datnbsp;inderdaad bij afwezigheid van dipyridyl onvolledige oxydatie plaatsnbsp;vindt, werd bewezen door gelijke hoeveelheden d/-a-tocopherolnbsp;(0.4 mg) te oxydeeren met ferrichloride bij aanwezigheid en afwezigheid van dipyridyl (op 25 cm3 reactiemengsel werden toegevoegd 1 cm3 ferrichloride- en al of niet 1 cm3 dipyridyloplossing).nbsp;Na 10 minuten werden beide oplossingen onder toevoeging vannbsp;water met zuiveren aether ge�xtraheerd. Na verdamping van dennbsp;aether werd met beide residu�s opnieuw de ferrichloride-dipyridyl-reactie uitgevoerd. Bij afwezigheid van dipyridyl bleek slechts 66 %nbsp;van het d/-a-tocopherol te zijn geoxydeerd, bij aanwezigheid vannbsp;dipyridyl was 100 % geoxydeerd.

Ook bij de oxydatie van carotine door ferrichloride is dit verschijnsel gevonden (zie pag. 52).

5. nbsp;nbsp;nbsp;Het opstellen van een graphiek voor de reactie van dZ-a-tocophcrol metnbsp;ferrichloride-dipyridyl.

Een bepaalde hoeveelheid dZ-a-tocopherol werd na afwegen opgelost in 96 % aethylalcohol en verschillende volumina hiervan in maatkolfjes van 25 cm3 gebracht. Achtereenvolgens werden 1 cm3nbsp;ferrichlorideoplossing (0,2 % in aethylalcohol) en 1 cm3 dipyridyloplossing (0,5 % in aethylalcohol) toegevoegd en met aethylalcohol het volume op 25 cm3 gebracht.

Zooals reeds eerder werd gezegd, wordt de reactie in sterk gedempt daglicht of in zwak kunstlicht uitgevoerd en de kolfjesnbsp;met de reactiemengsels in het donker bewaard tot de meting aanvangt. In de volgende tabel (III) zijn de resultaten weergegeven.

We zien uit de tabel, dat de waarden der extincties evenredig zijn met de hoeveelheid c//-a-tocopherol, wat blijkt uit het feit, datnbsp;de E (100 y) constant is. Het reactiemengsel volgt dus de wetnbsp;van Beer.

Reactie tusschen cH-a-tocopherol en het ferrichloride-dipyridyl-reagens. Aflezingen 10 minuten na toevoeging der reagentia.

Op dezelfde wijze werd een graphiek gemaakt voor ferro-ammoniumsulfaat. Het doel hiervan was uit deze graphiek te berekenen, hoeveel ferro-zout uit de reactie tusschen d/-a-tocopherol en ferrichloride ontstaat.

Bij het maken van deze graphiek werd van verdunningen van ferro-ammoniumsulfaat in water uitgegaan. Hiervan werd steedsnbsp;1 cm^ genomen, 1 cm^ dipyridyloplossing toegevoegd en met aethyl-alcohol tot 25 cm^ aangevuld, terwijl na 10 minuten de kleur-intensiteit werd bepaald.

*) De extinctie is afgeleid uit E = log y, waarbij Jo het invallend licht en � het

doorgelaten licht voorstelt. Aangezien de aflezing van den photometer het percen-

Het is nu mogelijk te berekenen hoeveel ferro-zout door dl-a.-tocopherol uit ferrichloride wordt gevormd. Hiertoe moet men de hoeveelheid ferro-ijzer bepalen, die aequivalent is met 1 gram-mol. dZ-a-tocopherol bij gelijke extincties volgens tabellen 3 en 4.nbsp;Aangezien de extincties van ferro-ijzer en d/-a-tocopherol zichnbsp;verhouden als 556 : 146, correspondeert 1 grammol. dZ-a-tocopherolnbsp;146

Hieruit volgt dus, dat 1 grammol. o?/-a-tocopherol 2 grammol. ferrichloride reduceert.

Aan de hand van de gevonden extinctie voor o?/-a-tocopherol zijn we nu in staat in diverse stoffen het tocopherolgehalte tenbsp;bepalen en wel het totaal tocopherolgehalte, hetgeen dus wil zeggennbsp;de som van a-, /3- en y-tocopherol. De fout, die wij maken bij aanwezigheid van j8- of y-tocopherol is gering, aangezien het mole-culairgewicht dezer stoffen (416) weinig van a-tocopherol (430)nbsp;verschilt en ji~ en y-tocopherol dus per gewichtseenheid iets groo-tere kleurintensiteit (zh 3 %) bij de reactie zullen geven dannbsp;a-tocopherol. De biologische waarde van dergelijke mengsels vannbsp;de tocopherolen kan echter veel sterker vari�eren, omdat j8- ennbsp;y-tocopherol minder werkzaam zijn dan a-tocopherol (zie hoofdstuk IIiI). Deze overwegingen gelden eveneens bij de bepaling volgens Karrer en Keiler of volgens Furter en Meyer.

De hoeveelheden tocopherol, die wij met onze methode bepalen, vari�eren in het algemeen van 100 tot 400 y. In verband met denbsp;nauwkeurigheid bij het aflezen van den photometer ligt de laagstenbsp;waarde bij ongeveer 30 y, bij welke waarde we echter op eennbsp;bepalingsfout van de orde van 10 % moeten rekenen. Met onzenbsp;micromethode (zie later) kunnen we nog 5 maal geringere hoeveelheden tocopherol bepalen.

Dat bij een bepaling van 500 y a-tocopherol nog een ruime overmaat der reagentia aanwezig is, leert de volgende berekening:nbsp;1 grammol. a-tocopherol (430 g) heeft theoretisch noodig 2 grammol. FeCls 6 aq = 540 g. Hierbij worden 2 gramat. ferro-ijzernbsp;gevormd, waarvoor noodig zijn 6 grammol. dipyridyl = 936 g.

hoeveelheden ferrichloride en dipyridyl resp. 0,6 en 1,1 mg. We voegen toe resp. 2 en 5 mg; er is dus een ruime overmaat dernbsp;reagentia aanwezig.

6, Reactie van carotino�den en vitamine A met het ferrichloride-dipyridyl reagens.

Daar het in de bedoeling lag onze bepalingsmethode toe te passen op natuurproducten en biologisch materiaal, werd eerst hetnbsp;gedrag van ;S-carotine en vitamine A ten opzichte van het reagensnbsp;onderzocht. Immers de carotino�den komen zeer verspreid in hetnbsp;plantenrijk voor en het vitamine A is dikwijls in biologisch materiaal aanwezig. Beide zijn evenals het tocopherol onverzeepbaar ennbsp;oplosbaar in organische oplosmiddelen, zoodat een extractiemethodenbsp;voor het tocopherol ook de carotino�den en vitamine A omvat. Hetnbsp;bleek, zooals te verwachten was, dat beide het ferrichloride-dipyridyl-reagens reduceerden, zoodat een scheiding van dezenbsp;stollen van het tocopherol noodig was. Allereerst werd het gedragnbsp;van zuiver jS-carotine quantitatief nagegaan. De reactie werd uitgevoerd zooals aangegeven bij c?/-a-tocopherol

Uit deze getallen blijkt, dat de E (100 y) stijgt bij toeneming van de hoeveelheid jS-carotine, die aan de reactie deelneemt.

Zooals reeds werd medegedeeld is de kleur bij de reactie met dZ-a-tocopherol zeer stabiel. Bij /3-carotine vonden we echter, datnbsp;de kleurintensiteit langzaam toeneemt met den reactietijd (tabel VI).

Ook bij jS-carotine bleek weer, eveneens bij c?/-a-tocopherol, dat de aanwezigheid van dipyridyl op de oxydatie door het ferrichloridenbsp;grooten invloed had. Dit werd bewezen door na 10 minuten reactie

het reactiemengsel zonder dipyridyl te verdunnen met water en uit te schudden met petroleumaether, waarbij de gele kleur dernbsp;petroleumaetheroplossing als carotine werd bepaald (tabel VII).

Wanneer deze zelfde hoeveelheden werden geoxydeerd bij aanwezigheid van dipyridyl, waren de petroleumaetherextracten vrijwel kleurloos.

Karrerenjaeger (118) onderzochten, naast j8-carotine, nog een aantal andere carotino�den op hun gedrag tegenover goud-chloride. Hierbij werd gevonden, dat a- en j8-carotine, xanthophyl,nbsp;zeaxanthine en lycopine per 3 grammol. 7,5-�8 grammol. goud-chloride gebruikten. Astacine en rhodoxanthine gebruikten pernbsp;3 grammol. ongeveer 2 grammol. goudchloride, terwijl bixine ennbsp;violaxanthine geen goudchloride reduceerden.

Daar het vitamine A zeer oxydabel is, stond het vrijwel vast, dat dit eveneens zou worden geoxydeerd door ons reagens, Denbsp;moeilijkheid bij het onderzoek hiervan bestond in het feit, dat we

niet over zuiver vitamine A beschikten. Daarom werd gebruik gemaakt van het onverzeepbare deel van heilbotleverolie (dienbsp;� 1 % vitamine A bevatte), waarvan door uitvriezen een gedeelte der sterinen was verwijderd. Hierbij werd gevonden:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Het v/as mogelijk het preparaat door chromatographischenbsp;analyse in fracties te verdeden, die, bij gelijk vitamine A-gehaltenbsp;(bepaald volgens de reactie van Carr en Price), geheel verschillende kleurintensiteiten gaven met ferrichloride-dipyridyl. Ernbsp;waren dus nog andere stoffen aanwezig die reageerden.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Vitamine A werd langzaam geoxydeerd door het reagens.nbsp;Uitgaande van een hoeveelheid van 100 Lovibond-eenhedennbsp;vitamine A van een der gezuiverde fracties, bleek na 10 minutennbsp;4 %, na 60 minuten 8 % van het vitamine A te zijn geoxydeerd.

3. nbsp;nbsp;nbsp;De reactie nam vrij sterk in kleurintensiteit toe met den tijdsduur. Zoo was b.v. de kleurintensiteit van de onder 2 genoemdenbsp;fractie na 60 minuten 3 maal grooter dan na 10 minuten. Dit allesnbsp;maakte het onmogelijk, om quantitatief de reactie-intensiteit voornbsp;vitamine A te bepalen, doch zeker is het, dat het vitamine A wordtnbsp;geoxydeerd. Dit werd bovendien bewezen, doordat bij langere inwerking (22 uur) en grootere overmaat van ferrichloride-dipyridylnbsp;81 % van het aanwezige vitamine A was verdwenen.

Karrer en Keiler (84), uitgaande van een preparaat dat � 50 % vitamine A bevatte, vonden eveneens oxydatie door goud-chloride, doch konden het niet langs potentiometrischen weg quantitatief bepalen.

Uit deze proeven bleek dus, dat zoowel carotine als vitamine A de reactie gaven en dus verwijderd moesten worden bij de bepaling van tocopherol. Bij plantaardig materiaal (waarin geennbsp;vitamine A aanwezig is) zou het nog mogelijk zijn, wanneer alleennbsp;carotine voorkwam, hiervoor een correctie aan te brengen metnbsp;behulp der carotinegraphiek. Doch vrijwel steeds zijn ook anderenbsp;carotino�den aanwezig, zoodat deze correctie practisch onmogelijknbsp;wordt. Om deze redenen zijn we er dan ook toe overgegaan eennbsp;scheiding met behulp van adsorbentia te zoeken.

en vitamine A adsorbeerde en deze zoodoende van tocopherol, dat dan niet mocht worden geadsorbeerd, te scheiden. Na onderzoek van een aantal adsorbentia (o.a. aluminiumoxyde, frankoniet,nbsp;montana-aarde), die niet geschikt bleken, omdat ook dZ-a-toco-pherol gedeeltelijk geadsorbeerd werd, bleek Floridin XS-aarde¹)nbsp;in principe geschikt te zijn. Bij filtratie van een benzolische oplossing van dZ-a-tocopherol door een laag van het adsorbens (zooalsnbsp;bij de chromatographische analyse) en bij nawasschen met benzolnbsp;werd het dZ-a-tocopherol echter niet geheel quantitatief in het fil-traat teruggevonden, terwijl niet te groote hoeveelheden ^-carotinenbsp;en vitamine A quantitatief werden geadsorbeerd.

Na een aantal proeven met de Floridin XS-aarde bleek het evenwel mogelijk deze zoodanig te behandelen, dat het tocopherolnbsp;quantitatief in het fikraat werd teruggevonden. Deze behandelingnbsp;geschiedde als volgt: 50 g aarde werden met 200 cm^ 37 % HCl innbsp;een bekerglas gedurende 1 uur in een kokend waterbad geplaatst.nbsp;Na decanteeren van het geelbruine HCl werd opnieuw 200 cm^nbsp;37 % HCl toegevoegd en het geheel onder af en toe omroeren bijnbsp;kamertemperatuur gedurende eenige uren bewaard. Hierna werdnbsp;gedecanteerd en werd de aarde met leidingwater gewasschen totnbsp;het water zuur-vrij reageerde, waarna nog 2 maal met 200 cm^nbsp;gedestilleerd water werd gewasschen. Na scherp afzuigen op eennbsp;B�chnertrechter werd de aarde 24 uur bij 37� C gedroogd. Dezenbsp;droogtemperatuur is van belang, omdat bij hoogere temperatuur denbsp;aarde neiging toont om tocopherol te adsorbeeren. Zoo werd gevonden, dat de bij 37� C gedroogde aarde na 1 uur drogen bijnbsp;60� C 5 % tocopherol adsorbeerde; na 1 uur drogen bij 120� Cnbsp;werd 50 % tocopherol geadsorbeerd. Aan den anderen kant geeftnbsp;echter drogen bij lagere temperatuur (kamertemperatuur) eennbsp;aarde, die weliswaar geen tocopherol adsorbeert, doch in dit gevalnbsp;zijn de hoeveelheden jS-carotine en vitamine A, die geadsorbeerdnbsp;kunnen worden, minder dan wanneer bij 37� C wordt gedroogd.nbsp;De adsorptie werd als volgt uitgevoerd:

Een verticale glazen buis (120 X 12 mm) met een vernauwing van onderen, werd afgesloten met een wattenprop en hierop een

Deze aarde is door Koschara (120) en door van Eekelen en Emmerie (121) gebruikt bij de adsorptie van vitamine 82.

laag adsorbens (20 mm) gebracht. Na doorspoelen met benzol werden 5 cm^ benzolische d/'a-tocopheroloplossing voorzichtignbsp;op de aarde gegoten en een destilleerkolfje onder de buis geplaatstnbsp;om het fikraat op te vangen. Nadat de 5 cm^ tocopheroloplossingnbsp;de zuil met aarde was gepasseerd, werd telkens met porties vannbsp;5 cm3 benzol, in totaal 25 cm3, nagewasschen. Het verzameldenbsp;fikraat werd daarna in vacuo onder CO2 ingedampt en hiermedenbsp;de tocopherolbepaling uitgevoerd. Voor de resultaten zie tabel VIII.

De hoeveelheden ;S-carotine en vitamine A, die door een laag adsorbens van 20 mm hoogte (12 mm diameter) kunnen wordennbsp;geadsorbeerd, bedroegen 110�120 y voor ^S-carotine en voornbsp;vitamine A 80�90 Lovibond-eenheden (512�576 I.E.).

BEPALING VAN HET TOCOPHEROLGEHALTE IN OLI�N.

De methode voor de chemische bepaling van tocopherol in oli�n werd het eerst toegepast op tarwekiemolie. Reeds eerder werd beschreven, dat deze olie een der rijkste natuurlijke bronnen voornbsp;tocopherol is. Oplossingen van tarwekiemolie gaven met het reagensnbsp;een roode kleur, wat niet alleen wees op het aanwezig zijn vannbsp;tocopherol (behoudens de mogelijkheid van aanwezigheid vannbsp;andere reduceerende stoffen), doch tevens aanduidde, dat hetnbsp;tocopherol in vrijen vorm voorkwam. Immers de reactie gaat alleennbsp;op, wanneer de hydroxylgroep van het tocopherol vrij is; estersnbsp;geven de reactie slechts na verzeeping. Zooals reeds gezegd, lossennbsp;oli�n in aethylalcohol weinig op en werd daarom bij oli�n de reactienbsp;uitgevoerd door op 25 cm^ reactievloeistof 5 cm3 benzol te nemennbsp;(er bleek met cf/-a-tocopherol geen verschil in kleurintensiteit tenbsp;zijn bij uitvoering der reactie in dit mengsel of in aethylalcoholnbsp;alleen). Een onzekere factor bij de bepaling in tarwekiemolie bleeknbsp;de gele kleur der olie te zijn, die grootendeels door een mengselnbsp;van carotino�den wordt veroorzaakt. Het bleek niet mogelijk dezenbsp;carotino�den door adsorptie met Floridin XS geheel te verwijderennbsp;bij de onverzeepte olie, aangezien klaarblijkelijk de aanwezigheidnbsp;der olie de adsorptie min of meer belemmerde. Na verzeeping dernbsp;olie is dit bezwaar echter verdwenen.

Wanneer we de aanwezige carotino�den als ;8-carotine bepaalden en hiervoor een correctie aanbrachten op de gevonden toco-pherolwaarden, bleek deze correctie bij goede soorten tarwekiemolie (die ongeveer 0,25 % tocopherol bevatten) ongeveer 5 % te bedragen van de gevonden totale redactiewaarde. Dit is echternbsp;slechts bij benadering juist.

Bij het onderzoek van het tocopherolgehalte van tarwekiemolie en andere oli�n bleek, dat deze oli�n in staat waren de reactienbsp;tusschen tocopherol en het reagens te onderdrukken; dat wil zeggen,nbsp;dat door de aanwezigheid der oli�n bij de bepaling minder tocopherol werd gevonden, dan er inderdaad aanwezig was.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Bij de bepaling van het tocopherolgehalte van tarwekiemolienbsp;werd bij uitvoering der reactie met toenemende hoeveelhedennbsp;der olie een afneming van het percentage tocopherol gevonden.nbsp;Bij soyaolie, dat eveneens vrij veel tocopherol bevatte, werdnbsp;dit niet gevonden.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Wanneer aan olijfolie of cocosvet c?/-a-tocopherol werd toegevoegd, kwam het sub 1 genoemde verschijnsel sterk tenbsp;voorschijn.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Uitgaande van de mogelijkheid, dat het bij de reactie gevormde ferrochloride door stoffen in de olie werd geoxydeerd gedurende het tijdsverloop tusschen toevoeging van ferrichloridenbsp;en van dipyridyl, werd de reactie zoodanig gewijzigd, datnbsp;eerst dipyridyloplossing werd toegevoegd. Hierbij bleek hetnbsp;sub 2 genoemde verschijnsel veel minder te zijn.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Bij toevoeging van c?/-a-tocopherol aan tributyrine werd geennbsp;onderdrukking van de reactie geconstateerd.

5. nbsp;nbsp;nbsp;Het verschijnsel der onderdrukking van de reactie staat innbsp;verband met de aanwezigheid van peroxyden in de oli�n.

Bepaling van tocopherol in olijfolie en cocosvet, waaraan bepaalde hoeveelheden dZ-a-tocopherol zijn toegevoegd.

Bepaling van tocopherol in olijfolie en cocosvet, waaraan dl-a-tocopherol is toegevoegd: tevens bepaling in tarwekiemolie. Reactie is zoodanig uitgevoerd, datnbsp;dipyridyl is toegevoegd v��r het ferrichloride.

Wat betreft het sub 4 genoemde verschijnsel bleek, dat bij toevoeging van dZ-a-tocopherol aan tributyrine (50�300 mg), het tocopherol onder alle experimenteele omstandigheden quantitatiefnbsp;werd teruggevonden. Aangezien vermoed werd, dat peroxyden innbsp;de oli�n of in het cocosvet de oorzaak waren van het onderdrukkennbsp;der reactie, werden de actieve-zuurstof-getallen bepaald, zooalsnbsp;aangegeven is door Sabalitschka (122).

We zien uit deze waarden en uit de voorafgaande tabellen, dat er een verband is tusschen het onderdrukken der reactie van tocopherol met het reagens door de olie en het actieve-zuurstof-getal er van. Hoe hooger dit laatste, des te sterker is de onderdrukking (cocosvet). Stoffen, waarvan dit getal 0 of zeer geringnbsp;is (tributyrine of soyaolie), onderdrukken de reactie niet.

Een mogelijke verklaring van deze feiten kan als volgt worden gegeven: Bij het reageeren van het tocopherol met ferrichloridenbsp;ontstaat ferrochloride, dat gedeeltelijk door de in de olie aanwezige peroxyden wordt geoxydeerd. Na toevoeging van dipyridylnbsp;ontstaat dus een geringere kleurintensiteit, dan met de hoeveelheidnbsp;tocopherol correspondeert.

Het feit, dat de onderdrukking der reactie minder is wanneer we eerst dipyridyl toevoegen, kan dan verklaard worden, doordat innbsp;dit geval het ontstane ferrochloride direct met het reeds aanwezigenbsp;dipyridyl kan reageeren, terwijl bij eerst toevoegen van ferrichloridenbsp;v��r dipyridyltoevoeging het ferrochloride door de peroxyden gedeeltelijk wordt geoxydeerd en dan niet meer geheel voor hetnbsp;dipyridyl beschikbaar blijft. Dit alles maakt de bepaling van toco-

pherol in onverzeepte oli�n of vetten bezwaarlijk, ofschoon het in principe mogelijk is een bepaling te doen, indien deze stoffen geennbsp;of weinig peroxyden bevatten.

(123, 124).

Nog meer redenen noodzaakten ons, tot verzeepen over te gaan. Het bleek, dat b.v, katoenzaadolie reduceerende stoffen bevat, dienbsp;na verzeepen verdwijnen; bovendien moesten we eveneens rekeningnbsp;houden met de mogelijkheid van het v��rkomen van veresterd tocopherol. Daarom werd overgegaan tot het uitwerken eener ver-

zeepingsmethode, die voor alle gevallen zou voldoen. De moeilijkheid, die zich hierbij voordeed, was gelegen in de instabiliteit van tocopherol tegenover alkali. In verband met de reeds besprokennbsp;onderzoekingen van Evans en medewerkers (zie hoofdstuk II)nbsp;over de verzeeping van tarwekiemolie, werd besloten dit spoor tenbsp;volgen. Allereerst werd de stabiliteit van dZ-a-tocopherol ennbsp;dZ-a-tocopherylacetaat tegenover KOH in absoluten methylalcoholnbsp;onderzocht.

Uit tabel XIII blijkt, dat de stabiliteit van c?/-a-tocopherol en het acetaat (dat verzeept wordt) afneemt bij toeneming der KOH-concentratie.

Na toevoeging van 15 cm^ water werd 3 maal ge�xtraheerd met 50 cm3 peroxyde-vrijen aether. De gecombineerde aetherextractennbsp;werden met gedestilleerd water alkali-vrij gewasschen, gedroogdnbsp;op watervrij Na2S04 en in vacuo ingedampt (onder CO2), waarnanbsp;met het residu de tocopherolbepaling werd uitgevoerd.

De peroxyde-vrije aether werd bereid door 1 L aether (Pharm. Ed, V) 2 maal uit te schudden met 100 cm3 10 % ferrosulfaat-oplossing, daarna 2 maal te wasschen met 100 cm3 gedestilleerdnbsp;water, vervolgens 2 maal uitschudden met 100 cm3 10 % KOH-oplossing en alkali-vrij te wasschen met gedestilleerd water.

De zoo behandelde aether wordt in de ijskast bewaard en is minstens 1 week houdbaar. Na deze onderzoekingen werd overgegaan tot het bepalen van de meest geschikte verzeepingsmethode voornbsp;oli�n, waarbij een compromis moest worden gevonden tusschen denbsp;factoren, die de stabiliteit van het tocopherol beheerschen en die,nbsp;welke de verzeeping bepalen. Deze factoren zijn b.v.:

De hoeveelheid KOH, die voor de verzeeping noodig is, wordt bepaald door het verzeepingsgetal der olie, waarbij een kleine overmaat KOH noodig is om volledige verzeeping te verkrijgen. Wanneer we bovenstaande factoren beschouwen blijkt het, dat er zeernbsp;vele variaties in het verzeepingsproces mogelijk zijn. Daar het on-

mogelijk was al deze variaties te onderzoeken, werden, mede in verband met de resultaten van een aantal ori�nteerende proeven,nbsp;2 factoren als vast aangenomen, namelijk de verzeepingstempera-tuur, die op 72�74� C werd gesteld, en de verzeepingsduur, dienbsp;op 10 of 15 minuten werd bepaald. Met tarwekiemolie werden eennbsp;aantal verzeepingen uitgevoerd, terwijl eveneens na iedere ver-zeeping het tocopherolgehalte werd bepaald.

Uit deze tabel zien we, dat bij alle proeven de verzeeping quan-titatief of bijna quantitatief was; het meest gunstige resultaat werd verkregen in proef 4, omdat hier zoowel quantitatieve verzeepingnbsp;als het hoogste tocopherolgehalte werden gevonden. In proef 3 wasnbsp;het resultaat wat tocopherolgehalte betreft, even gunstig, ofschoonnbsp;hier de verzeeping nog niet geheel quantitatief was. Bij de proevennbsp;3 en 4 waren de gebruikte hoeveelheden KOH geringer dan bij denbsp;andere proeven. Men mag nu echter zonder meer niet besluiten,nbsp;dat de verzeepingsvoorwaarden in proef 4 een quantitatieve bepaling van het tocopherol in de tarwekiemolie waarborgen. Het isnbsp;immers mogelijk, dat, niettegenstaande in dit geval het hoogstenbsp;tocopherolgehalte werd gevonden, toch nog een gedeelte van hetnbsp;tocopherol gedurende de verzeeping vernietigd was. Het bewijs,nbsp;dat inderdaad een quantitatieve bepaling van het tocopherolgehaltenbsp;heeft plaats gevonden, kan slechts dan worden geleverd, indien nanbsp;toevoeging van een bepaalde hoeveelheid dZ-a-tocopherol aan de

olie, deze hoeveelheid na de verzeeping quantitatief wordt teruggevonden. Het resultaat van dit experiment is in de volgende tabel weergegeven.

Inderdaad blijkt dus, dat onder deze verzeepingsvoorwaarden het tocopherolgehalte quantitatief wordt teruggevonden. Bij deze bepaling was aan de tarwekiemolie een vrij groote hoeveelheid tocopherol toegevoegd, omdat anders de verhouding ten opzichte vannbsp;de hoeveelheid tocopherol in de olie te ongunstig zou worden. Omnbsp;te bewijzen, dat kleinere hoeveelheden tocopherol eveneens quantitatief worden teruggevonden, werd uitgegaan van een olie, dienbsp;weinig tocopherol bevat (olijfolie).

Men ziet hieruit, dat ook van kleinere hoeveelheden tocopherol niets verloren gaat.

Na de verzeeping werden 8 cm^ methylalcohol en 10 cm^ gedestilleerd water toegevoegd, waarna 3 maal met 50 cm^ peroxyde-

vrijen aether werd ge�xtraheerd. De gezamenlijke aetherextracten werden achtereenvolgens gewasschen met 25 cm^ 0,2 n KOH ennbsp;met gedestilleerd water tot alkali-vrij. Hierna werd gedroogd metnbsp;Na2S04 en in vacuo onder CO2 tot droog ingedampt. Het residunbsp;werd in een passende hoeveelheid aethylalcohol of benzol opgenomen, in het laatstgenoemde, wanneer een adsorptie met Floridinnbsp;XS-aarde noodig was om de carotino�den te verwijderen (tarwe-kiemolie). Het bleek hierbij, dat deze carotino�den, die hoofdzakelijk uit xanthophyl bestaan, vlot geadsorbeerd werden.

De verzeepingen werden uitgevoerd in reageerbuizen (15 X 150 mm), voorzien van een kleine terugvloeikoeler.

Het bovengenoemde bezwaar, dat bestond bij de bepaling van tocopherol in onverzeepte oli�n en dat, zooals beschreven, lag in hetnbsp;onderdrukken der reactie bij de bepaling, was dus na de verzeepingnbsp;verdwenen. Bij het bepalen van tocopherol na verzeeping in eennbsp;aantal tarwekiemoli�n of andere oli�n, waaraan tocopherol wasnbsp;toegevoegd, bleek ook, dat de hoeveelheid van het onverzeepbarenbsp;deel, waarmede de reactie werd uitgevoerd, geen invloed had op denbsp;bepaling van het tocopherolgehalte, terwijl eveneens dezelfde waarden werden gevonden, wanneer men de volgorde van het toevoegennbsp;van ferrichloride en dipyridyl wijzigde.

BEPALING VAN TOCOPHEROL IN SERUM (123).

Reeds bij de inleiding van hoofdstuk IV werd gewezen op het belang van chemische bepalingsmethoden voor het onderzoek vannbsp;het vitaminegehalte in bloed of serum bij den mensch. Om dezenbsp;redenen werd er dan ook toe overgegaan om te onderzoeken of denbsp;ferrichloride-dipyridyl-methode geschikt was om het tocopherol innbsp;serum te bepalen. Hierbij kwam het er dus op aan een methode tenbsp;vinden om het tocopherol uit serum te extraheeren. Evenmin als bijnbsp;het vitamine A bleek het mogelijk, door behandeling van het serumnbsp;met aether, het tocopherol er direct uit te verkrijgen.

In analogie met de methode voor vitamine A-bepaling in serum (125), werd aan de mogelijkheid gedacht om op een dergelijkenbsp;manier tocopherol te extraheeren. Eerst werd echter de stabiliteitnbsp;van c//-a-tocopherol tegenover waterige- en verdund-alcoholischenbsp;loog bepaald. Zooals reeds werd vermoed, naar aanleiding vannbsp;hetgeen werd gevonden bij het onderzoek van de stabiliteit vannbsp;d/-a-tocopherol in methylalcoholische loog, bleek deze stabiliteit nietnbsp;groot te zijn.

Hier bleek dus weer, dat de bestendigheid afneemt met toenemende loogconcentratie. Ofschoon het nog mogelijk was, dat in tegenwoordigheid van serum deze bestendigheid grooter zou zijn,nbsp;bleek, dat bij toepassing der methode zooals dit voor vitamine Anbsp;geschiedt, van toegevoegd c?/-a-tocopherol aan serum zeer weinignbsp;werd teruggevonden.

Hierna werd de mogelijkheid overwogen om het tocopherol te extraheeren na hydrolyse van de serum-eiwitten met pepsine-zout-zuur. Dus was het noodig de bestendigheid van c//-a-tocopherolnbsp;tegenover zoutzuur te bepalen.

We zien hieruit, dat het tocopherol tegenover zoutzuur behoorlijk stabiel is. Bij een aantal proeven met runderserum onder toevoeging van dZ-a-tocopherol en behandeling met pepsine-zoutzuur werd echter het tocopherol niet quantitatief teruggevonden.

Na deze experimenten werden een aantal proeven genomen met het doel te onderzoeken in hoeverre een extractie van het tocopherolnbsp;(met aether) uit serum mogelijk was na denatureeren van de eiwittennbsp;op andere wijze en wel door toevoeging van aethylalcohol, verdunde alkali en formaldehyde-oplossing (33�34 i%), indien dezenbsp;stoffen hetzij afzonderlijk of in combinatie werden toegevoegd.

Uit de tabel volgt, dat extractie in zwak alkalisch milieu met aether alleen (1) een zeer slecht resultaat geeft, terwijl toevoegingnbsp;van aethylalcohol een behoorlijke verbetering geeft (2 en 3). Eennbsp;combinatie van aethylalcohol, formaldehyde-oplossing en verdundenbsp;alkali is weer veel beter, ofschoon het tocopherol hierbij nog nietnbsp;geheel quantitatief wordt teruggevonden.

Uit al deze gegevens bleek, dat we op den goeden weg waren en na een aantal nieuwe proeven, werd tenslotte de volgendenbsp;methode gevonden, die quantitatieve resultaten gaf.

In een scheitrechter van 250 cm^ worden bij 10 cm3 serum achtereenvolgens onder menging toegevoegd:

5 cm3 KOH 0,2 n, 15 cm3 neutrale formaldehyde-oplossing 33�34 % (Pharm. Ed. V) en 15 cm3 aethylalcohol. Daarna wordtnbsp;3 maal ge�xtraheerd met 50 cm3 peroxyde-vrijen aether. V��r denbsp;2e en 3e aetherextractie voegt men 10 cm3 aethylalcohol aan denbsp;serumoplossing toe. De gecombineerde aetherextracten worden ge-wasschen met 25 cm3 0,2 n KOH, 25 cm3 o,2 n H2SO4 en daarnanbsp;eenige malen voorzichtig (om emulsie te vermijden) met 50 cm3nbsp;gedestilleerd water tot zuur-vrij.

vacuo onder CO2 ingedampt. Daarna voegt men aan het residu 10 cm3 benzol toe en dampt opnieuw in (om resten aetherdamp tenbsp;verwijderen). Het residu wordt in 5 cm3 benzol opgenomen ennbsp;door een kolom (30 X 12 mm) Floridin XS-aarde gefiltreerd. Denbsp;aarde wordt nagewasschen met porties van 5 cm3 benzol (totaalnbsp;25 cm3) en het fikraat in vacuo ingedampt (in destilleerkolfje vannbsp;100 cm3).

Hierna wordt van een blanco-reagentia-oplossing (1 cm3 ferri-chlorideoplossing, 1 cm3 dipyridyloplossing, 5 cm3 benzol en met aethylalcohol tot 25 cm3 aangevuld) 5 cm3 toegevoegd aan het zeernbsp;geringe residu in het destilleerkolfje. Dit wordt afgesloten ennbsp;onder af en toe zwenken (terwijl het kolfje in donker wordt bewaard) wordt na 10 minuten de colorimetrische bepaling uitgevoerd. Deze wijziging in de methodiek was noodig, omdat wij steedsnbsp;de reactie uitvoerden met 25 cm3, daar het vroeger onderzochtenbsp;materiaal (tarwekiemolie b.v.) meestal voldoende tocopherol bevatte. Bij onze onderzoekingen met rattenserum bleek dit zoo weinignbsp;tocopherol te bevatten, dat een reactievolume van 25 cm3 te grootnbsp;was. Aangezien de cuvette van den photometer een inhoud heeftnbsp;van 4,5 cm3, ban men volstaan met het reactievolume bij de bepalingen te reduceeren tot 5 cm3, waardoor het mogelijk is, 5 maalnbsp;kleinere hoeveelheden tocopherol te bepalen dan met de macro-methode. Met oplossingen van o?/-a-tocopherol hebben we er onsnbsp;ten overvloede van overtuigd, dat de waarden verkregen bij bepaling volgens de macro- of micro-methode volkomen identieknbsp;waren. Het is hierbij duidelijk, dat de extincties verkregen bij denbsp;micrometh�de door 5 moeten worden gedeeld om vergeleken tenbsp;kunnen worden met de extincties bij de macromethode.

In de volgende tabel zijn een aantal waarden gegeven, waaruit blijkt, dat de door deze methode bepaalde hoeveelheid tocopherolnbsp;in serum quantitatieve resultaten oplevert. ¹

Wanneer we vitamine A in serum bepaalden na extractie volgens deze methode werden dezelfde waarden gevonden, als bij opwerken volgens denbsp;gebruikelijke methode (125).

Bepaling van tocopherol in runderserum (10 cm�) onder toevoeging van d/'ff-tocopherol.

We hebben hierna het tocopherolgehalte bepaald in het serum van vrouwelijke ratten, die op een vitamine E-vrij di�et warennbsp;gezet en waaraan later tocopherolpreparaten werden toegediend.

Bepaling van tocopherol in serum van vrouwelijke ratten, die na geruimen tijd op een vitamine E-vrij di�et te zijn geweest, tocopherolpreparaten kregen

Het tocopherol werd bepaald 48 uur na laatste toediening van het preparaat. Niet alleen blijkt, dat door tocopherol toedienennbsp;het gehalte in het serum stijgt, doch bovendien, dat na het verstrekken van c?/-a-tocopheryl-acetaat een toeneming van c//-a-tocopherolnbsp;in het serum plaats vindt.

Deze onderzoekingen dienden om een voorloopigen indruk te krijgen over het tocopherolgehalte van normaal menschenserum.nbsp;Het doel der chemische bepalingsmethode voor tocopherol in serumnbsp;is gelegen in de toepassing bij het probleem der abortus of steriliteit, voor zoover deze problemen bij den mensch in verband zoudennbsp;kunnen staan met een vitamine E-gebrek.

HOOFDSTUK VIII.

ONDERLINGE VERGELIJKING DER CHEMISCHE BEPALINGSMETHODEN.

Bij een onderlinge vergelijking der methodiek van de bepalingen volgens Karrer en Keiler, Furter en Meyer en vannbsp;Emmerie en Engel kan geconstateerd worden, dat de poten-tiometrische methode van Karrer en Keiler verreweg hetnbsp;meest tijdroovend en het minst geschikt is voor seriebcpalingen.nbsp;De methode van Furter en Meyer en de eigen methoden zijnnbsp;vrijwel even snel en zijn beiden geschikt voor seriebepalingen.nbsp;Bij beide methoden wordt gebruik gemaakt van den Zeiss-P u 1 f r i c h photometer.

De hoeveelheden tocopherol, die Karrer en Keiler gebruikten bij hun bepalingen, varieerden van 2,8 tot 12,9 mg.

Bij de methode van Furter en Meyer is volgens deze auteurs een hoeveelheid van minstens 300 y tocopherol noodig voornbsp;een bepaling. Aangezien Furter en Meyer en ook wij den-zelfden photometer gebruiken (alleen de gebruikte filters verschillen), kunnen we uit de verhouding der extincties der beide reactiesnbsp;hun gevoeligheid bepalen.

Bij F u r t e r en M e y e r (zie hun tabel 6) correspondeert een E = 1 met 480 y c//-a-tocopherol per cm^ reactievolume. Bij onzenbsp;bepaling vonden we voor 100 y c?/-a-tocopherol in 25 cm^ reactievolume (4 y per cm3) een E = 0,147, voor 480 y per cm3 is dusnbsp;onze E= 120 X 0,147 = 17,6.

grooter is dan van die volgens Furteren Meyer. Uit de bovenstaande waarden volgt, dat alleen onze methode in aanmerking komt voor het bepalen van tocopherol in serum bij klinische onderzoekingen.

Karrer en Keiler vonden bij hun methode (die in principe met onze methode parallel loopt), dat carotinoiden en vitamine Anbsp;eveneens goudchloride reduceerden. Ook in water oplosbare biologische stoffen, zooals cyste�ne en ascorbinezuur reduceeren, dochnbsp;zijn na extractie met organische oplosmiddelen niet meer aanwezig.nbsp;Bij aanwezigheid van carotinoiden werd door Karrer ennbsp;Keiler in afzonderlijke proeven het reductievermogen bepaald,nbsp;v��r en na acetyleeren van het product. Het verschil tusschen beidenbsp;uitkomsten is dan het reductievermogen van het tocopherol. Wanneer vitamine A aanwezig was, werd het te onderzoeken productnbsp;met het reagens van Carren Price behandeld en na regeneratienbsp;het tocopherol bepaald. Het spreekt vanzelf, dat deze manipulatiesnbsp;tijdroovend zijn en aanleiding kunnen geven tot verliezen. Bij onzenbsp;methode worden carotinoiden en vitamine A door adsorptie verwijderd.

Volgens Furter en Meyer is hun methode specifieker dan die van Karrer en Keiler of van ons. Inderdaad geven stoffennbsp;als carotine en vitamine A geen of weinig kleur met het alcohol-salpeterzuur-reagens, doch daartegenover staat, zooals wij vonden,nbsp;dat de reactie in andere opzichten ernstige bezwaren heeft. Hetnbsp;bleek, dat het oxydatieproduct van c//-a-tocopherol, het c?/-a-toco-pherylchinon, hetwelk vrijwel zeker geen biologische werkzaamheidnbsp;bezit, bijna even sterke klcurintensiteit (94 %) geeft als het tocopherol zelf. Dit is niet te verwonderen, omdat de reactie vannbsp;Furter en Meycr niets anders dan een oxydatie van hetnbsp;tocopherol is. Bovendien vonden we, dat stoffen als ergosterine ennbsp;calciferol (vitamine D2) eveneens reageerden, zij het dan, dat denbsp;kleur van het Furter en Meyer reagens met ergosterinenbsp;oranje-geel, die met calciferol geel was: met tocopherol isnbsp;de kleur rood. Doch deze kleuren storen bij de bepaling metnbsp;het S 47 filter- Bij onderzoek van ergosterine en calciferol met denbsp;reactie volgens Furter en Meyer werd gevonden, dat deze

stoffen 42,5 resp. 19,2 % van de kleurintensiteit van dZ-a-toco-pherol gaven, terwijl deze stoffen (bepaald in hoeveelheden van 5 mg) bij onze reactie niet stoorden. Bij toepassing van onze reactienbsp;op ergosterine (32 mg) vonden de v. Eulers (126), dat hierbijnbsp;een kleur ontstond, waarvan de intensiteit met den tijdsduur toenam (na 120 minuten kwam de kleur overeen met die van 480 ynbsp;d/-a-tocopherol). Bij het herhalen van deze proef vond ik echter,nbsp;dat na 150 minuten reactie met zeer zuiver ergosterine (32 mg)nbsp;geen verschil met een blanco te zien was.

Bij de reactie van Furteren Meyer zien we eveneens, dat sommige oli�n een storende gele kleur geven. Bij de bepaling innbsp;onbekend materiaal met onze eigen methode kan die van F u r t e rnbsp;en Meyer ter vergelijking goede diensten bewijzen, omdat dezenbsp;in een aantal gevallen specifieker is.

De specificiteit van onze eigen methode hangt nauw samen met die volgens Karrer en Keiler.

Evenmin als bij hen komen in onze extracten in water oplosbare reduceerende stoffen voor, terwijl wij evenals Karrer ennbsp;Keiler door behandeling met alkali stoffen met phenolisch ofnbsp;zuur karakter verwijderen. Tevens is het bij onze methode omnbsp;carotino�den en vitamine A te verwijderen door adsorptie niet uitgesloten, dat hierbij nog andere storende stoffen ge�limineerdnbsp;worden.

Bij onze onderzoekingen met rattenserum kwam aan het licht, dat het tocopherolgehalte in het serum bij vitamine E-defici�ntienbsp;vrijwel tot nul daalde, wat er voor pleit, dat bij serum als uitgangsmateriaal geen andere stoffen dan tocopherol de reactie te voorschijn roepen.

Met de 3 methoden bepalen we steeds het totale tocopherolgehalte, dus zoowel a-, als jS- en y-tocopherol, waarbij de getallenwaarden worden uitgedrukt in a-tocopherol. Zooals reeds eerder werd besproken, is de chemische bepalingsfout hierbij gering, dochnbsp;de biologische fout kan veel grooter zijn, aangezien de verschillendenbsp;tocopherolen niet even sterk biologisch werkzaam zijn.

SAMENVATTING.

Voor de bepaling van tocopherol (vitamine E) werd een chemische methode gevonden en uitgewerkt. Deze methode berust op de oxydatie van tocopherol door ferrichloride, waarbij het ontstanenbsp;ferrochloride colorimetrisch wordt bepaald door toevoeging vannbsp;a : a'-dipyridyl.

Carotino�dcn en vitamine A, die de reactie storen, werden verwijderd door adsorptie met Floridin XS-aarde. De methodenbsp;werd uitgewerkt voor de bepaling van tocopherol in onverzeeptenbsp;en verzeepte oli�n. Het bleek, dat een bepaling in onverzeeptenbsp;oli�n in sommige gevallen niet mogelijk is.

Tevens werd een methode voor het bepalen van tocopherol in serum uitgewerkt. In een proef op ratten bleek, dat het gehalte innbsp;het serum der proefdieren, die van tevoren op een vitamine E-vrijnbsp;dieet waren geplaatst, evenredig met het toedienen steeg. Het isnbsp;mogelijk, dat deze methode diensten kan bewijzen bij het onderzoeknbsp;naar een E-avitaminose bij den mensch.

SUMMARY.

A colorimetric method of determination of tocopherol (vitamin E) based on the reducing properties of tocopherol towards ferric-chloride is described. The ferrous salt which is formed in thenbsp;reduction is determined colorimetrically with a ta'-dipyridyl. Tonbsp;investigate the tocopherol content of biological material it isnbsp;necessary to remove carotenoids and vitamin A, The separationnbsp;of carotenoids and vitamin A from tocopherol is carried out bynbsp;adsorption with Floridin XS earth. The method of determinationnbsp;has been applied to saponified and unsaponified oils. In the latternbsp;case the determination is not always possible.

A method for the estimation of tocopherol in blood-serum has been devised. Administration of tocopherol preparations to ratsnbsp;gives an increase of the tocopherol content of the blood.

It is possible that the method can be used for obtaning information as to the existence of a human E-avitaminosis.

ZUSAMMENFASSUNG.

Es wurde eine colorimetrische Bestimmungsmethode f�r Tocopherol (Vitamin E) ausgearbeitet, welche auf der Reduktion von Eisen (3)-chlorid durch Tocopherol und der Bestimmung desnbsp;entstehenden Eisen (2)-chlorids mit Hilfe von a : a'-Dipyridylnbsp;beruht. Die bei dieser Methode st�renden Carotinoide und dasnbsp;Vitamin A werden durch Adsorption mit Floridin XS-Erde ent-fernt. Bei Anwendung der Methode zur Bestimmung des Toco-pherolgehalts von verseiften und unverseiften �len wurde gefun-den. dass eine Bestimmung in unverseiften �len infolge st�rendernbsp;Stoffe nicht immer m�glich ist.

Auch die Bestimmung von Tocopherol in Blutserum wurde mit Hilfe dieser Methode durchgef�hrt. Verabreichung von Toco-pherol-Praparaten an Ratten ruft eine Erh�hung des Tocopherol-gehalts im Serum hervor. Die neue Methode k�nnte auch beinbsp;Untersuchungen �ber einer E-Avitaminose beim Menschen ange-wandt werden.

1. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;A.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Mat till en R. E. Conklin, J. Biol. Chem. 44,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;137 (1920).

2. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;M.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;E V a n snbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;K. J. S c o 11, Science 56, 650 (1922).

3. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;M.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Evansnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;K. S. Bishop, ]. Am. Med. Ass. 81, 889 (1923).

4. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;M.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Evansnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;K. S. Bishop, J. Metab. Res. 3, 202nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1923).

8. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Beard, Am. J. Physiol. 75,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;668 (1925��26).

9. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Beard, Am. J. Physiol. 75,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;682 (1925��26).

12. nbsp;nbsp;nbsp;H. M. Evans'en G. O. Burr, Memoirs Univ. California, 8 (1927).

13. nbsp;nbsp;nbsp;'V'. E. Nelson, V. G. Heller en E. I. Fulmer, J. Biol. Chem. 57,nbsp;415 (1923).

15. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;M.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Evans en G. O. Burr, ].nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Am. Med. Ass. 88,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1462nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1927).

16. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Mnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Evans en G. O. Burr, J.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Am. Med. Ass. 89,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1587nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1927),

17. nbsp;nbsp;nbsp;H. M. Evans, O. H. Emerson en G. A. Emerson, J. Biol. Chem.nbsp;113, 319 (1936).

19. nbsp;nbsp;nbsp;P. Karrer, H. F r i t z s c h e, B. H. Ringier en H. Salomon, Helv.nbsp;Chim. Acta 21, 520 (1938).�

1.22. nbsp;nbsp;nbsp;M. Fur ter en R. E. Meyer, Helv. Chim. Acta 22, 240 (1939).

24. nbsp;nbsp;nbsp;E. Lester Smith en R. Bailey, Vitamin E Symposium, London, 18nbsp;(1939).

25. nbsp;nbsp;nbsp;H. M. Evans, E. A. Murphy, R. C. Archibald en R. E. Cornish, J. Biol. Chem. 108, 515 (1934).

26. nbsp;nbsp;nbsp;J. C. Drummond, E. Singer en R. J. M a c W a 11 e r, Biochem. J.nbsp;29, 456 (1935).

27. nbsp;nbsp;nbsp;R. E. Cornish, R. G. Archibald, E. A. Murphy en H. M.nbsp;Evans, Ind. Eng. Chem. 26, 397 (1934).

28. nbsp;nbsp;nbsp;H. S. Olcott en H. A. Mat till, J. Biol. Chem. 104, 423 (1934).

29. nbsp;nbsp;nbsp;J. C. Drummond, E. Singer en R. J. Mac W alter, Biochem. J.nbsp;29, 2510 (1935).

31. nbsp;nbsp;nbsp;A. R. M o s s en ]. C. D r u m m o n d, Biochem. J. 32, 1953 (1938).

34. nbsp;nbsp;nbsp;J. Waddell en H. S t e e n b o c k, J. Biol. Chem. 80, 431 (1928); J.nbsp;Nutrit. 4, 79 (1931).

41. nbsp;nbsp;nbsp;H. A. Mattill en B. Crawford, Ind. Eng. Chem. 22, 341 (1930).

42. nbsp;nbsp;nbsp;H. S. Olcott en H. A. Mattill, J. Biol. Chem. 93, 59, 65 (1931).

43. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;S.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;O 1 c o V i t cnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;h en H. A. M a 11 i 11, J. Biol. Chem. 92, XXXInbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1931).

44. nbsp;nbsp;nbsp;E.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;M.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;B r a d w a ynbsp;nbsp;nbsp;nbsp;en H. A. M a 11 i 11, J. Am. Chem. Soc. 56,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;2405nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1934).

45. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;S.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Olcott, ].nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Am. Chem. Soc. 56, 2492 (1934).

46. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;S.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Olcott ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;H. A. Mattill, J. Am. Chem. Soc. 58,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1627nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1936).

47. nbsp;nbsp;nbsp;H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;S.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Olcott ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;O. H. E m e r s o n, J. Am. Chem. Soc. 59,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1008nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1937).

48. nbsp;nbsp;nbsp;O. H. Emerson, G. A. Emerson en H. M. Evans, Science 83, 421nbsp;(1936).

50. nbsp;nbsp;nbsp;A. R. T o d d, F. Ber gel en T, S. Work, Biochem. J. 31, 2257 (1937).

51. nbsp;nbsp;nbsp;A. R. Moss, W. F. ]. Cuthbertson, J. F. Danielli en J. C.nbsp;Drummond, J. Soc. Chem. Ind. 57, 133 (1938).

53. nbsp;nbsp;nbsp;O. H. Emerson, G. A. Emerson, A. Mohammad en H. M.nbsp;Evans, J. Biol. Chem. 122, 99 (1937).

54. nbsp;nbsp;nbsp;P. Karrer, H. Salomon en H. F r i t z s c h e, Helv. Chim. Acta 20,nbsp;1422 (1937).

55. nbsp;nbsp;nbsp;P. Karrer, H. Salomon en H. F r i t z s c h e, Helv. Chim. Acta 21,nbsp;309 (1938).

59. nbsp;nbsp;nbsp;F. Ber gel, A. R. Todd en T. S, Work, Chem. and Ind. 1054 (1937).

62. nbsp;nbsp;nbsp;A. R. Moss, W. F, J. Cuthbertson, J. F. Danielli en J. C.nbsp;Drummond, Chem. and Ind. 275 (1938).

63. nbsp;nbsp;nbsp;F. Ber gel, A. R. Todd en T. S. Work, J. Chem. Soc. 253 (1938).

64. nbsp;nbsp;nbsp;P. Karrer, H. F r i t z s c h e, B. H. R i n g i e r en H. Salomon,nbsp;Helv. Chim. Acta 21, 820 (1938).

65. nbsp;nbsp;nbsp;P. K a r r e r, H. Koenig, B. H. R i n g i e r en H. Salomon, Helv.nbsp;Chim. Acta 22, 1139 (1939).

66. nbsp;nbsp;nbsp;F. B er gel, A. Jacob, A. R. Todd en T. S. Work, Nature 142,nbsp;36 (1938).

67. nbsp;nbsp;nbsp;F. B e r g e 1, A. Jacob, A. R. Todd en T. S. Work, J. Chem. Soc.nbsp;1382 (1938).

68. nbsp;nbsp;nbsp;L. I. Smith, H. E. U n g n a d e en W. W. Prichard, Science 88, 37nbsp;(1938).

70. nbsp;nbsp;nbsp;P. K a r r e r, R. E s c h e r, H. F r i t z s c h e, H. Keiler, B. H. R1 n g i e rnbsp;en H. Salomon, Helv. Chim. Acta 21, 939 (1938).

71. nbsp;nbsp;nbsp;P. Karrer, R. Escher en H. Rentschler, Helv. Chim. Acta 22, 1287nbsp;(1939).

72. nbsp;nbsp;nbsp;W. John, E. D i e t z e 1, P h. G � n t e r en W. E m t e, Naturwiss. 26,nbsp;366 (1938),

73. nbsp;nbsp;nbsp;W. John, E. Dietzel en W. Emte, Z. physiol. Chem. 257, 173nbsp;(1939).

76. nbsp;nbsp;nbsp;A. Jacob, M. Steiger, A. R, Todd en T. S. Work, J. Chem. Soc.nbsp;542 (1939).

78. nbsp;nbsp;nbsp;P. Karrer, H. Fritzsche en R. Escher, Helv. Chim. Acta 22, 661nbsp;(1939).

80. nbsp;nbsp;nbsp;A. J. P. Martin, T. Moore, M. Schmidt en F. P. Bowden,nbsp;Nature 134, 214 (1934).

82. nbsp;nbsp;nbsp;F. V o n W e r d e r, Th. Moll en F. J u n g, Z. physiol. Chem. 257,nbsp;129 (1939).

86. nbsp;nbsp;nbsp;G. C. K n o w 11 o n, H. M. Hines en K. M. B r i n k h o u s e, Proc. Soc.nbsp;exp. Biol. Med. 41, 453 (1939).

90. nbsp;nbsp;nbsp;A.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;E. Lange,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Tierartzl. Runds. 239 (1938).

91. nbsp;nbsp;nbsp;F.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;En der, Z.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Vltaminforsch.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;4, 106 (1935).

95. nbsp;nbsp;nbsp;P.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Karrer ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;V. Demole,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Schweiz, med. Wschr.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;68,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;954nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1938).

96. nbsp;nbsp;nbsp;A.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;J a c o b, F. K. S u t c 1 i f f enbsp;nbsp;nbsp;nbsp;en A. R. T o d d, J.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Chem.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Soc.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;327nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1940).

97. nbsp;nbsp;nbsp;P.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Karrernbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;O,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Hoffmann,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Helv.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Chim.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Actanbsp;nbsp;nbsp;nbsp;23,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;654 (1940).

98. nbsp;nbsp;nbsp;P.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Karrernbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;O.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Hoffmann,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Helv.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Chim.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Actanbsp;nbsp;nbsp;nbsp;23,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1126 (1940).

99. nbsp;nbsp;nbsp;P. Karrer, R, G. L e g 1 e r en G. Schwab, Helv. Chim. Acta 23, 1132nbsp;(1940).

100. nbsp;nbsp;nbsp;V. D e m o 1 e, O. I s 1 e r, B. H. R i n g i e r, H. Salomon en P. Karrer,nbsp;Helv. Chim. Acta 22, 65 (1939).

101. nbsp;nbsp;nbsp;P.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Karrernbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;G.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;B u s s m a n n,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Helv.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Chim.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Actanbsp;nbsp;nbsp;nbsp;23,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1137 (1940).

102. nbsp;nbsp;nbsp;P.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Karrernbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;A.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Geiger, Helv. Chim. Acta 23,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;455nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;(1940).

103. nbsp;nbsp;nbsp;O. H. Emerson, G. A. Emerson en H. M. Evans, J. Biol. Chem.nbsp;131, 409 (1939).

107. nbsp;nbsp;nbsp;F. von W er der en Th. Moll, Z. physiol. Chem. 254, 39 (1938).

108. nbsp;nbsp;nbsp;H. M. Evans, G. A. Emerson en O. H. Emerson, Science 88, 38nbsp;(1938).

H. nbsp;nbsp;nbsp;E. U n g n a d e, W. W. Prichard, F. L. Austin, H. H. H o e h n,

110. nbsp;nbsp;nbsp;W. F. J. Cuthbertson, R. R. Ridgeway en J. C. Drummond,nbsp;Biochem. J. 34, 34 (1940).

Ill4. F. Grandel en H. Neumann, Z. Unters. Lebensm. 79, 57 (1940). f 115. A. Emmerie en Chr. Engel, Ree. trav. chim. 57, 1351 (1938).

119. nbsp;nbsp;nbsp;A. Emmerie en C h r. Engel, Ree. trav. chim. 58, 283 (1939).

121. nbsp;nbsp;nbsp;M. vanEekelen en A. Emmerie, Acta Brevia Neerl. Physiol. Pharmacol. Microbiol. 5, 77 (1935).

122. nbsp;nbsp;nbsp;Th. Sabalitschka, Z. Unters. Lebensm. 79, 143 (1940).nbsp;fl23. A. Emmerie en Chr. Engel, Ree. trav. chim. 58, 895 (1939).

125. nbsp;nbsp;nbsp;M. van Eekelen en A. Emmerie, Acta Brevia Neerl. Physiol. Pharmacol. Microbiol. 4, 171 (1935).

126. nbsp;nbsp;nbsp;B. von Euler en H. von Euler, Z. physiol. Chem. 265, 147 (1940).

127. nbsp;nbsp;nbsp;L. I. Smith, W. B. Irwin en H. E. Ungnade, J. Am. Chem. Soc.nbsp;61, 2424 (1939).

128. nbsp;nbsp;nbsp;O. H. Emerson en L. I. Smith, J. Am. Chem. Soc. 62, 1869 (1940);nbsp;ref. Biol. Abstr. 15, 205 (1941).

STELLINGEN.

De door John en Emte voorgestelde structuurformule voor a-tocopherolrood is waarschijnlijk onjuist,

De chromatographische adsorptie ter zuivering van organische stoffen dient critisch te worden toegepast.

Men diene een scherp onderscheid te maken tusschen vitamine-gehalte en vitaminewaarde van een voedingsmiddel.

De crttiek van Balarew op de analysemethode van Winkler, volgens welke talrijke neerslagen na droging en zonder gloeiennbsp;tot weging worden gebracht, is misplaatst.

Alvorens een conserveeringsmiddel in de levensmiddelen-industrie mag worden toegepast, dient dit door een officieele instantie aannbsp;een uitgebreid physiologisch en pharmacologisch onderzoek tenbsp;worden onderworpen.

VI.

De aanwezigheid van phthiocol in Mycobacterium tuberculosis is niet met zekerheid vastgesteld.

De bepaling van lactoflavine, zooals deze o.a. door Schorm�ller wordt uitgevoerd, is niet te verkiezen boven die, waarbij de metingnbsp;van de kleurintensiteit van het lactoflavine plaats vindt.

Pezold en Dittmar hebben niet bewezen, dat hun methode voor het bepalen van aneurine in urine de werkelijke waardenbsp;oplevert.

De veronderstelling van Gabbe en Fischer, dat bij het ont-eiwitten van bloed het ascorbinezuur aan het oxyhaemoglobine wordt geadsorbeerd, is onjuist.

De bepaling van tocopherol in onverzeepte oli�n volgens de ferrichloride-dipyridyl methode kan foutieve uitkomsten geven.

dl-a-toco-pherol (y)	Photometer aflezing	Extinctie *)	EjlOO r)
29	91	0,041	0,141
72,5	78	0,108	0,149
145	61,5	0,211	0,146
217,5	48	0,319	0,147
290	38	0,420	0.145
435	23	0.638	0,147
			1 gemiddeld 0,146

Ferro-ijzer (y)	Photometer- aflezing	Extinctie	E (100 y)
20	77	0.114	0.568
40	60	0.222	0.555
60	47	0.328	0.547
80	36	0.444	0.555
			gemiddeld 0.556

Preparaat	Dage- lijksche dosis	Toediening van preparaatnbsp;(dagen)	Totale dosis tocopherol (mg)	Tocopherol (7) in 10 cm�nbsp;serum
Tarwekiemolie . . .	0,4 cm�	6	5,8	2 26
dZ-a-tocopherol . . .	1 mg	6	6	31
cW-ci-tocopherylacetaat	1 �	13	13	45

Product	Toegevoegde hoeveelheid dl-a-toco-pherol (y)	Hoeveelheid olie bijnbsp;reactie (mg)	Gevonden en berekend alsnbsp;tocopherol {y)	Percentage terug gevonden tocopherol
Olijfolie		50	8
	�	100	16	--
		200	28
		300	40	�
	258	50	251	94
	258	100	237	86
	258	200	218	74
	258	300	206	64
Cocosvet		50�300	0	___
	258	50	178	69
	258	100	128	50
	258	200	36	14
gt;�	258	300	31	12

Toegevoegd dl-a-toco-pherol (7)	Gevonden hoe-. veelheid tocopherol (7)	Teruggevonden tocopherol (O/o)
.	25
25	49	96
50	74	98
100	123	98
136	� 160	99
272 �	296	100

m:,

Pr ;