H1gt;

MICROSPECTROPHOTOMETRIE VAN FLUORESCENTIELICHT,nbsp;een methode van histologisch onderzoek.

�y�

MICROSPECTROPHOTOMETRIE VAN FLUORESCENTIELICHT,nbsp;een methode van histologisch onderzoek.

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE GENEESKUNDE AANnbsp;DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT, OPnbsp;GEZAG VAN DEN WAARNEMEND RECTORnbsp;MAGNIFICUS L. VAN VUUREN, HOOG-LEERAAR IN DE FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJSBEGEERTE, VOLGENSnbsp;BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VANnbsp;DE FACULTEIT DER GENEESKUNDE TEnbsp;VERDEDIGEN OP DINSDAG 28 APRIL 1942,nbsp;DES NAMIDDAGS TE 4 UUR

Hoewel mijn stadie bij het verschijnen van dit proefschrift nog niet be�indigd is, betuig ik hier in de eerste plaats mijn dank aannbsp;U, Hoogleraren en Docenten van de Utrechtse Universiteit, voornbsp;Uw aandeel in mijn vorming tot arts.

Hooggeleerde Boeke, meerdere jaren heb ik, eerst als gast, later als assistent, in Uw laboratorium mogen doorbrengen. Ik heb U innbsp;dien tijd niet alleen als man van de wetenschap, doch ook als mensnbsp;hoog leren schatten. Gij hebt mij, door Uwe grote vriendelijkheidnbsp;en tegemoetkomendheid in alle opzichten, telkens weer bewezennbsp;hoe belangrijk het is, dat er aan het hoofd van een laboratoriumnbsp;iemand staat, die zijn mensen warm tegemoettreden kan. Dat Gijnbsp;mijn promotor hebt willen zijn, is mij een groot voorrecht.

Zeergeleerde Berkelbach v. d. Sprenkel, veel heb ik geleerd van de wijze waarop Gij, bij Uw eigen onderzoek en bij Uw voort~nbsp;durende belangstelling en aanmoediging voor het mijne, vasthieldtnbsp;aan strenge physische eisen en criteria; ik ben oprecht blij, datnbsp;hetgeen in dit proefschrift is neer gelegd, in Uw oog aan dezelfdenbsp;eisen voldoet. Het is hier niet de plaats, om uit te weiden over hetnbsp;vele waardevolle, dat ik uit onze lange gesprekken in het levennbsp;medeneem of over de welwillendheid en het onuitputtelijke geduld,nbsp;waarmede Gij mij altijd weer hebt aangemoedigd en geholpen. Iknbsp;dank U slechts voor de vele blijken van vriendschap, in den ruim-sten zin van het woord, die Gij mij hebt betoond.

Hooggeleerde Ringer en Zeergeleerde Terwen, U beiden zeg ik dank voor de bereidwilligheid, waarmede Gij mij voorzaagt vannbsp;enkele zeer zuivere urobiline-monsters. Ook U beiden. Hooggeleerde Julius en Zeergeleerde Tausk, doe ik mijn dank toekomennbsp;voor de monsters zuivere vitaminen en hormonen, die Gij mijnbsp;afstondt. Hooggeleerde Nieuwenhuyse, Gij liet mij de beschikkingnbsp;over sectie-materiaal; ik betuig U hiervoor mijn hartelijke dank.

U allen, die het personeel van het Embryologisch en Histologisch Laboratorium vormt, breng ik op deze plaats mijn welgemeendenbsp;dank voor Uw onvermoeide hulpvaardigheid en Uw grote vriendelijkheid, die er toe bijdroegen, dat de jaren op dit laboratoriumnbsp;voor mij altijd zulk een prettige herinnering zullen vormen.

Zeergeachte Mej. du Buy, een groot deel van het ondankbare administratieve werk, dat aan de voorbereidingen van een proefschrift inhaerent is, hebt Gij mij uit handen genomen. Mijn hartelijke dank voor de toewijding, waarmede Gij mij ook in dit opzichtnbsp;geholpen hebt.

ALGEMEEN OVERZICHT.

Indien men leest over de fluorescentieverschijnselen, die in microscopische praeparaten waargenomen kunnen worden, dannbsp;valt op, hoe onvolledig de aanduiding van de kleuren van hetnbsp;fluorescentielicht vaak is. Benamingen als �zachtrose� en �lichtblauw met violette inslag� zijn als voorlopige opgave bruikbaar,nbsp;maar volkomen ongeschikt als het er om gaat anderen iets mede tenbsp;delen over conclusies aangaande de aard der stoffen, die aan eennbsp;bepaald deel van het praeparaat een speciale fluorescentie verlenen. Dit geldt bij uitstek voor die gevallen, waar de fluores-centiekleuren weinig uiteenlopend zijn. Zo zal bijvoorbeeld hetnbsp;nierepitheel na een subcutane injectie van een sterk fluorescerende stof als fluoresceine spoedig oplichten in de voor dezenbsp;stof karakteristieke groene kleur, zodat er weinig twijfel bestaannbsp;kan over de aanwezigheid van die stof in de nierepitheelcellen.nbsp;Heel anders wordt het evenwel, als de concentratie van denbsp;gezochte stof zeer gering wordt. Dan zal het nodig zijn om denbsp;intensiteit van het, de fluorescentie opwekkende, licht sterk te verhogen. Dit kan evenwel niet geschieden, zonder dat tevens denbsp;zwakke, blauw gekleurde, fluorescentie van de cel-eiwitstoffennbsp;hinderlijk wordt. Er ontstaan dan mengkleuren van de groennbsp;fluorescerende fluoresceine en de blauw fluorescerende eiwitstoffen. In die mengkleuren zullen door het oog de componentennbsp;niet gescheiden waargenomen kunnen worden en het gevoel vannbsp;zekerheid, dat de epitheelcellen in de nier fluoresceine bevatten,nbsp;maakt plaats voor een gevoel van twijfel, of de kleur nog welnbsp;�groenig� genoeg is om de aanwezigheid van fluoresceine tenbsp;bewijzen.

De enige manier om langs de weg van de kleur van het fluorescentielicht ook in zulke gevallen zekerheid te krijgennbsp;omtrent de aanwezigheid van de gezochte stof, is die, waarbijnbsp;van het fluorescentielicht het spectrum onderzocht wordt.

Onder de wijzen, waarop men in het algemeen een spectrum onderzoekt, kan onderscheiden worden tussen de spectroscopienbsp;en de spectrophotometrie. Bij de spectroscopie volstaat men metnbsp;het bezien van het spectrum en met het noteren van de daarbijnbsp;opvallende details; de resultaten bestaan bij deze onderzoekmethode uit een opgave van de ligging der banden in hetnbsp;spectrum, voor zover die op deze wijze zichtbaar zijn, en vannbsp;de volgorde in de intensiteiten van deze banden, indien zondernbsp;meting verschillen in deze intensiteiten zijn waar te nemen. Bijnbsp;een spectrophotometrisch onderzoek daarentegen worden denbsp;intensiteiten van alle delen van het spectrum gemeten. De uitkomsten van een dergelijke meting worden gewoonlijk neergelegdnbsp;in een curve, zodanig, dat de toppen in de curve corresponderen

met de heldere delen van het spectrum en de dalen met de daar tussen gelegen minder heldere gedeelten. Van zulk een curve zijnnbsp;evenwel niet alleen de plaatsen van de banden af te lezen, dochnbsp;bovendien de juiste verhoudingen in getallen van de intensiteitennbsp;in alle delen van het spectrum. Daarom geeft een spectrophoto-metrische curve een veel vollediger weergave van een spectrumnbsp;dan een nog zo lange beschrijving van een spectroscopischenbsp;waarneming. Bovendien vindt men op deze curven bijzonderhedennbsp;in de intensiteitsverhoudingen binnen de banden en in ogenschijnlijk diffuse gedeelten van het spectrum, die ons bijnbsp;spectroscopisch onderzoek ontgaan.

Hoe het in het algemeen mogelijk is om bij het fluorescentie-onderzoek van deze eigenschappen der spectrophotometrie partij te trekken, kunnen wij het beste aan een voorbeeld laten zien.nbsp;Indien men een eiwitoplossing bereidt en het fluorescentielichtnbsp;van deze oplossing spectrophotometrisch onderzoekt, dan zalnbsp;men een curve krijgen met een geleidelijk van blauw naar roodnbsp;afdalend verloop, geheel in overeenstemming met de mat-blauwenbsp;kleur van het fluorescentielicht. Onderzoekt men evenwel denbsp;fluorescentie van een helder groen fluorescerende fluores-ceineoplossing op dezelfde wijze, dan toont de curve de vorm vannbsp;een driehoek, gelegen tussen 500 en 600 mjji, met de top bij 530 mpi.nbsp;De curve van een oplossing, die zowel eitwit als fluoresceine bevat,nbsp;laat van beide componenten de karakteristieke eigenschappen zien:nbsp;een geleidelijk van blauw naar rood aflopende lijn, die tussen 500nbsp;en 600 m^r een verheffing vertoont met de top bij 530 mj^. Trektnbsp;men van elke waarde, die in deze curve is uitgezet, het aandeel, datnbsp;de ..eiwitfluorescentie� in deze waarden heeft, af, dan houdt mennbsp;juist de ,,fluoresceinecurve� over; een curve, die in zijn gedaantenbsp;volkomen gelijke intensiteitsverhoudingen aangeeft als die van eennbsp;zuivere fluoresceineoplossing.

Door middel van de spectrophotometrie kan men dus in een mengsel stoffen herkennen door een voor die stoffen in hoge matenbsp;specifieke physische eigenschap.

Op volkomen gelijke wijze zijn in cellen stoffen, die een van de blauwe eiwitfluorescentie afwijkend spectrum vertonen, aan tenbsp;tonen en zelfs te localiseren. Stoffen, die hiervoor in aanmerkingnbsp;komen, zijn dezulke, die spontaan een specifiek fluorescentielichtnbsp;uitzenden of daartoe door een reactie gebracht kunnen worden. Eennbsp;voorbeeld van de eerste categorie is het lactoflavine, een vertegenwoordiger van de tweede het urobiline. Voor het aantonen en localiseren van deze stoffen in een cel is het dus noodzakelijk, dat mennbsp;het door onderdelen van de cel uitgezonden fluorescentielichtnbsp;spectrophotometrisch kan onderzoeken. Het ligt voor de hand omnbsp;hiertoe een bestaande opstelling voor fluorescentiemicroscopie uitnbsp;te breiden met een der bekende microspectrophotometrische apparaten, doch indien men met een dergelijke combinatie tracht metingen uit te voeren aan de eigen fluorescentie van celonderdelen in

zeer dunne weefselcoupes blijkt het, dat het fluorescentielicht hiervoor veel te zwak is. De huidige opstellingen voor fluorescentie-microscopie zijn uitgerust met ultraviolette lichtbronnen, welke in weefselcoupes, die met fluorescerende stoffen �gekleurd� (ge-�fluorochromeerd�) zijn, een voldoend sterke fluorescentie opwekken; voor het opwekken van een sterke fluorescentie in niet metnbsp;deze stoffen behandelde praeparaten zijn zij evenwel te zwak. Dochnbsp;indien men ook al de sterkste lichtbron, die de techniek ons levert,nbsp;toepast, dan blijkt nog, dat het fluorescentielicht, dat in de praeparaten wordt opgewekt, zo zwak is, dat metingen met de huidigenbsp;microspectrophotometrische methoden niet uitvoerbaar zijn. Allenbsp;bekende methoden voor dit doel zijn immers bedoeld voor sterk,nbsp;doorvallend licht en zonder meer niet geschikt voor onze metingennbsp;aan het uitermate zwakke fluorescentielicht. Uit het ontbreken vannbsp;een apparatuur, die zowel op het punt van de lichtbron, als op datnbsp;van de meetmethode aan de geringe lichtsterkte van de fluores-centieverschijnselen is aangepast, moet zonder twijfel het ontbrekennbsp;van elke aanduiding in de literatuur over deze soort van metingennbsp;verklaard worden.

Bij de bewerking van dit proefschrift werd mij, in het kader van een wijder onderzoeksplan, als opgave gesteld te trachten in dezenbsp;leemte in de histologische techniek te voorzien. Het hierna volgendenbsp;geeft in de eerste plaats een kritische beschouwing van de physi-sche eisen, waaraan een opstelling voor de microspectrophotometrienbsp;van fluorescentieverschijnselen moet voldoen en vervolgens een uitvoerige beschrijving van de door ons gebouwde apparatuur, waarbijnbsp;aan deze theoretische eisen voldaan wordt. In een kort verslag vannbsp;een histologisch onderzoek wordt de practische bruikbaarheid vannbsp;deze methode bewezen, terwijl uit dit onderzoek tevens blijkt, waarnbsp;de grenzen van het praestatievermogen van deze methode bij denbsp;huidige physische hulpmiddelen liggen.

I. INLEIDING.

Men spreekt van fluorescentie, wanneer een gas, een vloeistof of een vaste stof geabsorbeerde stralingsenergie weer als stralingsenergie uitzendt, zonder dat hierbij sprake is van buiging ofnbsp;reflexie en waarbij de emissie practisch tegelijk met de bestralingnbsp;ophoudt.

Bestraalt men b.v. een oplossing van fluoresceine in water met onzichtbaar ultraviolet licht, dan licht de vloeistof geelgroennbsp;fluorescerend op.

Men is nog niet voldoende ingelicht over het mechanisme van dit proces, doch zoveel is wel zeker, dat het geabsorbeerde lichtnbsp;een gedeelte van zijn energie overdraagt aan de moleculen vannbsp;de fluorescerende stof, die daardoor overgaan in een toestandnbsp;van excitatie. Deze toestand is labiel en duurt slechts kort; hetnbsp;molecuul valt snel terug op het oude energieniveau en zendt de

hierbij vrijkomende energie als straling uit. In het atoommodel kan men zich de verandering van de in het atoom opgehooptenbsp;energie voorstellen als een overgang van een electron van denbsp;ene baan in een andere, waarbij de potenti�le energie van hetnbsp;electron ten opzichte van de kern verandert. Elke overgang, dienbsp;met energieverandering gepaard gaat, uit zich in de opname ofnbsp;afgifte van een of meer energiequanten, welk proces wij waarnemen als absorptie of emissie van licht. Een grote energiesprongnbsp;correspondeert naar de quantentheorie met licht van korte golflengte, een kleine met licht van grote golflengte.

Hiermede in overeenstemming zijn de waarnemingen bij de studie van de eenvoudigste vormen van fluorescentie: die dernbsp;resonantiestraling. Dit verschijnsel doet zich voor bij eenvoudignbsp;gebouwde gassen van metaalatomen onder lage druk. Het geabsorbeerde licht heeft ��n golflengte (wordt dus in het absorptie-spectrum weergegeven door ��n lijn) en het uitgezonden fluores-centielicht vertoont eveneens slechts ��n lijn bij dezelfde golflengte. Er is in het molecuul slechts ��n, voor dit molecuul volkomen typische energiesprong mogelijk: de door het molecuulnbsp;opgenomen energie is gelijk aan de afgegeven energie bij denbsp;emissie en dus zijn golflengten van absorptie en emissie aannbsp;elkaar gelijk en ieder even specifiek voor de onderzochte stof.nbsp;Dit geldt alleen in het geval van de resonantiestraling, in allenbsp;andere gevallen wordt door de meer gecompliceerde bouw vannbsp;atomen en moleculen, door de inwerking van de moleculen opnbsp;elkaar en door de thermische beweging van de moleculen denbsp;scherpte van de energieniveaux z� vervaagd, dat er in de plaatsnbsp;der scherp omschreven energiesprong van de resonantiestralingnbsp;een hele serie energieovergangen van verschillende grootte mogelijk wordt. Hierdoor ontstaan in het absorptie- en emissiespectrumnbsp;gecompliceerde lijnsystemen of zelfs, zoals bij de organische verbindingen regel is, min of meer vage banden. De genoemde factoren, die hun invloed doen gelden op de scherpte der energieniveaux, leiden ook bijna altijd tot een vermindering van de voornbsp;de emissie vrijblijvende energie. Daar, zoals boven werd vermeld,nbsp;de kleinste energie correspondeert met de grootste golflengte, zalnbsp;deze energievermindering zich in het spectrum uiten in een verschuiving van de emissiebanden ten opzichte van de absorptie-banden naar de rode zijde. Dit werd door Stokes in 1852 in denbsp;naar hem genoemde wet vastgelegd. Dat deze eigenschap vannbsp;betekenis is voor de fluorescentieanalyse, is duidelijk. Hierdoornbsp;is het n.1. mogelijk om als fluorescentie opwekkende stralen lichtnbsp;te gebruiken, waarvoor ons oog niet gevoelig is: ultraviolet licht.nbsp;In vele gevallen zal dan de fluorescentie juist in het zichtbarenbsp;gebied vallen en zonder moeite bestudeerd kunnen worden.

Hoewel dus de verhoudingen niet overal zo eenvoudig zijn als bij de resonantiestraling, bestaat ook voor de organische verbindingen een principi�le samenhang tussen de bouw van het mole-

cuul en de grootte der mogelijke energieovergangen. De afhankelijkheid van de golflengten van het ge�mitteerde licht van de grootte dier overgangen, maakt de spectrale analyse tot eennbsp;noodzakelijke aanvulling van elk fluorescentieonderzoek, dus ooknbsp;van het microscopische fluorescentieonderzoek in de histologie.nbsp;Want, hoewel het door de grote complicaties in de bouw dernbsp;moleculen en de wisselwerking der moleculen onderling, vooralsnog niet mogelijk is om nauwkeurige opgaven te doen overnbsp;het verband tussen constitutie en fluorescentiespectrum, blijkt hetnbsp;toch nu reeds, dat de fluorescentiebanden van sommige organischenbsp;stoffen zeer bepaalde localisaties en intensiteitsverhoudingennbsp;kunnen vertonen, die heel goed bruikbaar zijn voor het typerennbsp;en herkennen van die stoffen.

Dat met de huidige methoden voor microspectrophotometrisch onderzoek geen metingen verricht zijn op het belangrijke gebiednbsp;van de fluorescentiemicroscopie, is zeker te wijten aan het feit,nbsp;dat deze methoden zonder uitzondering onbruikbaar zijn voornbsp;metingen aan het uitermate zwakke fluorescentielicht. Slechtsnbsp;indien men zijn toevlucht neemt tot de opwekking van de fluorescentie met de sterkste lichtbronnen, die de techniek ons levertnbsp;en meetprincipes toepast, die bij veel geringere lichtintensiteitennbsp;metingen toelaten dan de gangbare methoden, is het mogelijknbsp;om op dit, ook voor de histologie veelbelovende terrein doornbsp;te dringen.

Zoals reeds werd opgemerkt, heeft het gebruik van ultraviolet licht als opwekkende straling bij de studie van fluorescentie-verschijnselen het voordeel, dat dit licht de waarneming nietnbsp;stoort, ook al wordt het eventueel door het object verstrooid ofnbsp;gereflecteerd. Zo is fluorescentieanalyse haast synoniem gewordennbsp;met analyse in ultraviolet licht en daardoor is de fluorescentiemicroscopie practisch de microscopie van fluorescentielicht, datnbsp;wordt opgewekt door ultraviolette stralen. Dat hierbij de opstellingnbsp;zo kan zijn, dat de ultraviolette stralen wel degelijk storen, zalnbsp;nog blijken. In ieder geval heeft het gebruik van deze stralennbsp;dan nog het voordeel, dat zij door een eenvoudig filter afdoendenbsp;ge�limineerd kunnen worden. Dat er nog andere mogelijkheden,nbsp;zijn, bewijzen de onderzoekingen over fluorescentiemicroscopienbsp;met blauw licht. Hierbij is echter een oculairfilter noodzakelijk,nbsp;hetwelk dit blauwe licht tegenhoudt, zodat slechs een gedeeltenbsp;van het toch reeds korte zichtbare deel van het spectrum voornbsp;de waarneming overblijft. In den regel zijn dus fluorescentie-verschijnselen, die in het zichtbare deel van het spectrum vallennbsp;en door ultraviolette straling opgewekt kunnen worden, hetnbsp;onderwerp van macroscopisch en microscopisch onderzoek.

verbonden geweest met de vordering in de methode tot isolatie van ultraviolette stralen uit het licht van onze lichtbronnen. Daarnbsp;de isolatie van het ultraviolette licht door middel van kwarts-monochromatoren niet voor algemeen gebruik in aanmerkingnbsp;kwam, werd het gebied der fluorescentieanalyse eerst goed ontsloten, toen er bruikbare filters in de handel kwamen. Wood ennbsp;Lehmann ontwierpen vloeistoffilters, die in 1919 op voorstel vannbsp;den eersten vervangen werden door nikkeloxyde bevattendenbsp;glazen filters. Deze filters werden door Metzner (�28) in denbsp;microscopie ingevoerd en zijn tegenwoordig, gecombineerd metnbsp;een kopersulfaat-cuvette voor de absorptie van de door hetnbsp;nikkeloxyde-glas doorgelaten rode stralen, de meest gebruiktenbsp;ultraviolet-filters, daar de transmissie-curve op ideale wijze samenvalt met de emissie der voor fluorescentiedoeleinden het meestnbsp;in aanmerking komende lichtbron: de kwiklamp in zijn diversenbsp;uitvoeringen.

Voordat er kwiklampen gebouwd werden met een grote opper-vlaktehelderheid, kwam alleen de booglamp in aanmerking als ultraviolette lichtbron, voorzien van normale koolspitsen (Lehmann (�13)) of van ijzeren electroden (Haitinger (�38)). Vooralnbsp;de uitvoering met speciale ijzeren electroden van Haitinger isnbsp;gekenmerkt door een grote rijkdom aan ultraviolet licht bij eennbsp;redelijk stroomverbruik en behoorlijke bedrijfszekerheid. Denbsp;nieuwe types van hogedrukkwiklampen als de Philips H.P. 300nbsp;hebben echter een bijna even grote oppervlaktehelderheid bijnbsp;gebruik als ultraviolette lichtbron en zijn nog eenvoudiger ennbsp;constanter in het gebruik. (Melczer (�39), Haitinger (�40)).

Met de bespreking van de lichtbronnen en het filter is het integrerende deel van de opstelling voor fluorescentiemicroscopienbsp;vermeld. Toch moeten nog enige bijzonderheden van het microscoop zelf genoemd worden. (Hierover en over de lichtbronnennbsp;vindt men in de monographic van Haitinger verdere gegevens.)

De normale microscoopspiegel geeft belangrijke verliezen en kan het beste vervangen worden door een speciale ,,ultraviolet-spiegel� of door een totaal reflecterend prisma van kwarts. Bijnbsp;het gebruik van de kwiklamp en het nikkeloxyde-filter is denbsp;overheersende golflengte in de ultraviolette straling die van denbsp;groep om 366 mp.. Deze golflengte wordt door gewoon glas vrijwel onverzwakt doorgelaten, zodat het uit dien hoofde niet noodzakelijk is om de condensor te vervangen door een exemplaarnbsp;met lenzen van kwarts of van speciaal voor ultraviolet licht doorzichtig glas. De fluorescentie van glazen condensors kan echternbsp;hinderlijk sterk zijn, zodat het gebruik van de genoemde anderenbsp;condensoren soms toch aanbeveling verdient. Hetzelfde geldtnbsp;voor het materiaal der objectglazen. Hier stuit men echter bij eennbsp;wat groter, materiaal op practische bezwaren en bij de door onsnbsp;gebruikte soort (qualiteit ,,halbweiss�) was de fluorescentie vannbsp;het glas zeer gering (vgl. Danckwortt (�34)).

Bij de bouw der ultropak- en andere systemen voor belichting van boven af is met deze eisen van fluorescentievrijheid en door-gankelijkheid voor ultraviolet licht rekening gehouden.

Als insluitmiddel voor de coupes is canadabalsem door zijn fluorescentie ongeschikt. Bruikbaar zijn gedestilleerd water, glycerine van grote zuiverheid en bepaalde soorten paraffinum liqui-dum (Haitinger (�33), (�38)). Wij gebruiken paraffinum liqui-dum Ph. N. V., s.g. 0,875. Een nadeel is de afwijkende brekingsindex van die van glas; zij bedraagt nl. 1,433, doch in de practijknbsp;weegt dit nadeel niet op tegen de voordelen, die de paraffineolienbsp;biedt als inactief, niet fluorescerend insluitmedium. Als de ultraviolette stralen in het praeparaat de fluorescentie hebben opgewekt, is dat deel, dat niet geabsorbeerd is door de delen der coupe,nbsp;waardeloos en zelfs, indien men geen bijzondere maatregelennbsp;neemt, schadelijk voor de waarneming. Als deze stralen nl. in hetnbsp;objectief binnendringen, ontstaat er in de materialen van ditnbsp;lenzenstelsel en in onze oogmedia een fluorescentie, die de waarneming van het object storen kan. Het binnendringen der stralennbsp;in het objectief kan men voorkomen door het inrichten van denbsp;belichting, zoals bij de microscopie in het donkere veld, of doornbsp;het aanbrengen van een filter tussen object en objectief, dat hetnbsp;ultraviolette licht tegenhoudt en het zichtbare licht doorlaat. Denbsp;eerste methode is onoeconomisch, vooral bij de sterke objectievennbsp;met grote numerieke apertuur, daar de corresponderende apertuurnbsp;van de condensor door een centraal diaphragma van de belichtingnbsp;uitgeschakeld dient te worden. Deze overweging deed Lehmannnbsp;zoeken naar een glassoort, die voldeed aan de volgende eisen:nbsp;Absorptie van alle ultraviolette stralen bij de dikte van een normaal dekglas, geen absorptie in het zichtbare gebied, ontbrekennbsp;van fluorescentie en bezit van de juiste brekingsindex. Aan dezenbsp;eisen voldoet het beste het z.g. euphos-glas. 'Tegenwoordig zietnbsp;men er meestal van af om de fluorescentie in het objectief tenbsp;onderdrukken en volstaat met een euphosfilter op het oculair.nbsp;Voor spectrale onderzoekingen aan zeer zwak fluorescerendenbsp;praeparaten is het euphos-dekglas evenwel onmisbaar. Bij de toepassing van deze dekglazen behoeft de immersie-olie niet ,,fluo-rescentievrij� te zijn. Toch verdient het aanbeveling om ooknbsp;hiervoor een blijvend niet-fluorescerend medium te gebruiken (denbsp;door ons geprobeerde ,,fluorescentievrije immersie-olie� bleef nietnbsp;vrij van fluorescentie tijdens de waarneming), daar het bij denbsp;geringe grootte der euphosglaasjes niet altijd te voorkomen is,nbsp;dat iets van de immersievloeistof zich mengt met de paraffineolie, waarin het praeparaat is ingebed. Het is dus logisch ennbsp;practisch om ook paraffineolie als immersievloeistof te gebruiken,nbsp;niettegenstaande de afwijkende brekingsindex.

Tenslotte nog enkele woorden over de objecten van het onderzoek met het fluorescentiemicroscoop. Haitinger onderscheidt primaire en secundaire fluorescentie, waarbij de primaire fluores-

centie die is van de onbehandelde weefsels en de secundaire die van met fluorescerende stoffen (fluorochromen) behandelde prae-paraten. Een belangrijke tussenvorm is de fluorescentie, die doornbsp;ingrepen met op zich zelf niet fluorescerende chemicali�n of doornbsp;andere procedures in het praeparaat te voorschijn geroepen kannbsp;worden. Een geheel nieuw gebied van microscopisch-physio-logisch onderzoek werd geopend door de toepassing der fluores-centiemicroscopie met behulp van de ultropaksystemen op levendenbsp;organen van al dan niet met fluorescerende vitale ,.kleurstoffen�nbsp;behandelde dieren � een waarlijk zeer fraaie techniek. (Ellingernbsp;(�30), Hirt (�30), (�39), (�40), Wimmer (�39), Singer (�32) e.a.).

Voor een nadere uiteenzetting over de onderwerpen van het microscopisch fluorescentieonderzoek, speciaal voor zover bij dezenbsp;onderwerpen de microspectrophotometrie een onmisbare aanvulling is, zij verwezen naar de beschouwingen op blz. 59 e.v.

a. nbsp;nbsp;nbsp;Methoden, waarbij de dispersie geschiedt door middel vannbsp;prisma of rooster en de intensiteit der sjsectrumdelen visueelnbsp;of langs lichtelectrische weg gemeten wordt (bijv. de K�nig-Martense spectrophotometer):

b. nbsp;nbsp;nbsp;Methoden, waarbij de dispersie op dezelfde wijze geschiedt,nbsp;het spectrum echter gephotographeerd wordt en de zwartingnbsp;der plaat als maat voor de relatieve lichtintensiteiten dientnbsp;(spectrophotograaph en microphotometerbank):

c. nbsp;nbsp;nbsp;Methoden, waarbij het licht door middel van filters in bepaalde golflengtegebieden ontleed en in den regel visueelnbsp;gemeten wordt (bijv. de Pulfrich-Stufenphotometer).

In 1881 ontwierp en gebruikte Waelchli een microspectrophoto-metrische opstelling, waarmede hij de lichtabsorptie van de gekleurde bolletjes in vogelretinae (objecten van 2�5yr doorsnede) onderzocht. Hij gebruikte een �microspectraaloculair� van Abbe ennbsp;een normaal-kaars als standaardlichtbron. Een microspectraaloculair is een oculair, dat in het vlak van het diaphragma een spleetnbsp;van regelbare breedte bezit; scharnierend aan het bovenvlak is eennbsp;rechtziend prisma bevestigd, zodat men na het opzoeken van hetnbsp;gewenste object en na het regelen der spleet dit prisma slechts opnbsp;de oculairlens behoeft te klappen om het spectrum waar te nemen.nbsp;De spleet is nog voorzien van een klein totaal reflecterend prisma,nbsp;dat het mogelijk maakt om naast het onderzochte spectrum het

spectrum van een bekende lichtbron ter vergelijking te projecteren; terzijde van het prisma bevindt zich een golflengteschaal, die tegelijk met het te onderzoeken spectrum waargenomen kan worden.

De intensiteit van het licht der vergelijkingslichtbron veranderde Waelchli meetbaar door tussen de kaars en het spectraaloculairnbsp;een matglaasje op te stellen en de afstand van kaars tot matglasnbsp;te vari�ren. De intensiteiten van het standaardlicht, die hij door hetnbsp;spectraaloculair waarnam, waren dan omgekeerd evenredig met hetnbsp;kwadraat van de afgelezen afstanden tussen kaars en matglas. Hetnbsp;is bij deze metingen wenselijk om slechts dat gedeelte van hetnbsp;sfgt;ectrum waar te nemen, dat gemeten wordt, opdat niet verschillennbsp;links en rechts van dit deel de uitkomst der meting be�nvloeden.nbsp;Bij de meeste spectrophotometers is de inrichting dan ook zodanig,nbsp;dat men door een tweede spleet, de oculairspleet, elk gewenst deelnbsp;van het spectrum afzonderlijk kan bestuderen. Hierbij ziet men dusnbsp;niet het gehele te onderzoeken spectrum en het gehele vergelijks-spectrum, doch slechts van beide spectra eenzelfde, beperkt, golf-lengtebereik en men kan de gelijkheid van de lichtintensiteiten vannbsp;onderzocht en vergelijksspectrum in dat golflengtebereik beoordelen zonder daarbij gehinderd te worden door eventuele ongelijkheden in de op dat ogenblik niet gemeten, andere, delen van hetnbsp;spectrum. Dit is evenwel bij een microspectraaloculair, waarbij vannbsp;de collimatorspleet door de optiek een virtueel beeld gevormdnbsp;wordt, niet mogelijk. Het pleit voor den waarnemer, dat hij doornbsp;eenvoudige fixatie van het gewenste deel van het spgt;ectrum die matenbsp;van nauwkeurigheid heeft weten te bereiken, welke uit zijn opgaven blijkt.

Dat dit systeem op den duur niet voldeed, spreekt evenwel vanzelf en enige jaren later ontwierp Engelmann (�88) een speciale microspectrophotometer. Dit apparaat was voorzien van een regelbare oculairspleet, zodat elk gewenst gedeelte van het spectrumnbsp;ge�soleerd gemeten kon worden. In principe minder fraai dan bijnbsp;de hiervoor beschreven opstelling, was de wijze waarop het lichtnbsp;van het vergelijkingsspectrum meetbaar gevarieerd werd: dit geschiedde door verandering van de breedte van de collimatorspleetnbsp;voor dit spectrum (Vierordt�s principe). Bij het toestel vannbsp;Engelmann was de collimatorspleet n.1. gescheiden in twee, innbsp;eikaars verlengde liggende spleten, die elk meetbaar en symmetrischnbsp;te verstellen waren. De ene spleet diende voor het te onderzoekennbsp;licht en werd al naar behoefte ingesteld, de andere ontving lichtnbsp;uit de standaardlichtbron. De intensiteit van het door deze laatstenbsp;spleet doorgelaten licht is recht evenredig met de breedte, dienbsp;afleesbaar is. Het is duidelijk, dat bij, ten opzichte van de dispersienbsp;van het prisma, grote spleetbreedten de verschillen tussen de beidenbsp;collimatorspleten ook onderscheid in de ,,reinheid� der vergelekennbsp;spectra veroorzaken. Voor metingen aan de weinig lichtsterkenbsp;fluorescentieverschijnselen is deze methode dan ook niet aan tenbsp;bevelen.

Een microspectrographische methode beschrijft Wychgram (�12). Hij bouwde op een microspectraaloculair een photographisch opzet-stuk en verving de oculairlens van het Spectraalapparaat hiertoenbsp;door een achromaat of photographeerde het spectrum eenvoudignbsp;met een photographisch objectief, daarbij het photographischnbsp;apparaat boven het spectraaloculair houdend in plaats van het oog.nbsp;Uit niets blijkt evenwel, dat hij bij de zo verkregen spectra ooknbsp;photometrisch de zwarting bepaald heeft.

R. F�rth vermeldt een opstelling voor het meten der kleuren van door ultramicroscopische deeltjes teruggekaatst en afgebogen licht,nbsp;waarbij de golflengtebereiken uitgezeefd werden door combinatiesnbsp;van vloeistoffilters. Daar dit uitzeven van golflengten hier evenwelnbsp;geschiedt voordat het licht het object bereikt, komt deze methodenbsp;voor toepassing op fluorescerende microscopische objecten niet innbsp;aanmerking.

Wel wordt hiervoor een ander systeem, dat met filters werkt, aanbevolen: het �photometeroculair� (Haschek en Haitingernbsp;('33)), een inrichting voor visuele photometric, geschikt voor bepalingen aan microscopische objecten. Door gebruik van filters kannbsp;men met dit apparaat ook kleurbepalingen verrichten, op dezelfdenbsp;wijze als dat voor macroscopische objecten met een ,,Stufenphoto-meter� mogelijk is.

In de laatste jaren zijn nog enkele mededelingen verschenen over absorptie-spectrophotometrie aan microscopische objecten.nbsp;Vl�s en Gex (�28) beschrijven de toepassing van hun micro-ultra-violet-spectrograaph op het onderzoek van eicellen. Hassk� ennbsp;Lassmann (�36) onderzochten de absorptie van oxyhaemoglobinenbsp;in zeer kleine celonderdelen (afm. 0,12 y^) door de cellen met eennbsp;microscoop te projecteren op een scherm, waarin zich een spleetjenbsp;bevond. De door deze spleet doorgelaten stralen werden in eennbsp;K�nig-Martense spectrophotometer geleid en gemeten. Een licht-electrische methode geeft Caspersson aan; hij onderzocht hiermedenbsp;de ultraviolette absorptie van de chromosomen-eiwitten van denbsp;sprinkhaan (�dO). Tenslotte wordt in het Zeitschr. f. Wiss. Mikr.nbsp;een artikel vermeld van Cole en Brackett (�40) over de absorptie-sjrectra van erythrocyten, doch het betreffende no. van de Physic.nbsp;Rev. is nog niet voorhanden.

Alle genoemde methoden waren bedoeld voor metingen met doorvallend licht. De lichtsterkten, die hierbij gemeten worden, zijnnbsp;vele malen groter dan die, welke bij onderzoek aan niet met fluoro-chromen behandelde cellen gevonden worden. Inderdaad leentnbsp;geen der bovenstaande methoden zich zonder meer voor toepassingnbsp;op het fluorescentieonderzoek. Een nadere bespreking van elk dezernbsp;methoden is dan ook overbodig, te meer waar in het volgendenbsp;hoofdstuk nog een kritische discussie gegeven zal worden van denbsp;toepassingsmogelijkheden der drie op blz. 8 genoemde hoofdgroepen bij het fluorescentieonderzoek.

metrisch onderzoek in de fluorescentiemicroscopie nadrukkelijk vermeldt, is Policard (�25). Hij beveelt, als eenvoudig en voor verbetering vatbaar hulpmiddel, een opstelling aan, die overeenkomt met die van Waelchli en waaraan dus dezelfde, op blz. 9 aangeduidenbsp;nadelen kleven, doch waarbij het licht voor het vergelijkings-spectrum geleverd wordt door een nitralamp en meetbaar gevarieerd wordt door een combinatie van een vaste en een draaibarenbsp;nicol. Hij geeft enige curven: van vaseline, van kraakbeen en vannbsp;follikelvloeistof. Histologische onderzoekingen, met deze opstellingnbsp;verricht, zijn niet bekend geworden.

Dh�r� (�34) beschrijft het prachtige universele �microspectraal-apparaat� van K�nigsd�rffer, dat gelegenheid biedt tot spectroscopisch en spectrophotographisch onderzoek (men zie ook bij Borst en K�nigsd�rffer (�29)), doch voegt er aan toe, dat nog geennbsp;quantitatieve uitkomsten, hiermede verkregen, gepubliceerd zijn.

Charlotte Kern (�26) onderzocht de spectra van fluorescerende stoffen bij donkerveld-belichting en geeft een microspectrogramnbsp;van rhodamine; v. Euler c.s. (�35) namen met een eenvoudigenbsp;opstelling, bestaande uit een zakspectroscoop en een kleine photo-graphische camera door een microscoop de fluorescentiespectra opnbsp;van de n. opticus, de lens en het glaslichaam dicht bij de retina vannbsp;het oog van een vis. In geen van deze gevallen werd evenwel denbsp;zwarting der negatieven gemeten en medegedeeld, zodat de genoemde spectrogrammen niet meer zijn dan spectroscopische documenten en niet als spectrophotometrische gegevens beschouwdnbsp;kunnen worden.

Uit het voorgaande blijkt dus, dat in feite niet ��n spectrophotometrische bepaling van de eigen, �primaire�, fluorescentie van cellen of celonderdelen bekend is geworden. In de mij toegankelijkenbsp;literatuur ontbrak op dit punt elk gegeven.

De opwekking van fluorescentieverschijnselen kan in het algemeen geschieden met licht van elke golflengte, korter dan die der fluorescentiestraling. indien deze golflengte door de fluorescerendenbsp;stof geabsorbeerd wordt. De fluorescentiesterkte is daarbij evenredig met de intensiteit van het ingestraalde licht. Niet alle geabsorbeerde energie wordt echter omgezet in fluorescentielicht: hetnbsp;rendement is kleiner dan 1. Een deel der geabsorbeerde energienbsp;wordt blijkbaar omgezet in kinetische energie der moleculen of innbsp;andere, voor ons nog onbekende energievormen. In verband hiermede moet gewezen worden op het verschijnsel van uitdoving dernbsp;fluorescentie. In het algemeen hebben gelijksoortige moleculen eennbsp;uitdovende werking op eikaars fluorescentie, zodat in een oplossing

van fluorescerende moleculen de fluorescentie niet evenredig met de concentratie dezer moleculen toeneemt. Een dergelijke werkingnbsp;hebben ook sommige vreemde moleculen op de emissie van fluorescerende stoffen. Men noemt deze moleculen in de Franse literatuur �inhibiteurs� (J. en F. Perrin (�27) en verder Hirschlaffnbsp;(�38)). Gewoonlijk doven deze inhibiteurs de fluorescentie min ofnbsp;meer uit zonder verandering van het fluorescentiespectrum. In hoeverre er bij de fluorescentiemicroscopie van weefselcoupes met dezenbsp;uitdovende stoffen rekening gehouden moet worden, is onbekend.nbsp;Voor bloedserum hebben Boutaric (�35) en ZuckerkandI (�37)nbsp;aangetoond, dat in bijzondere gevallen de fluorescentie van fluores-ceine-zouten wordt uitgedoofd. Ook zonder dat men zijn toevluchtnbsp;neemt tot deze uitdoving kan men de geringe intensiteit der innbsp;coupes waargenomen eigen fluorescentie geredelijk verklaren uitnbsp;de geringe absorptie der opwekkende straling. Voor enkele synthetische kleurstoffen toonden Wawilow e.a. (geciteerd naarnbsp;Hirschlaff) aan, dat binnen het absorptiegebied dezer stoffen hetnbsp;rendement min of meer constant is, doch het is niet zeker, of ditnbsp;voor alle stoffen geldt. Zo vond Josephy (�34) dat met de sterknbsp;geabsorbeerde ultraviolette straling van 270 my, in een lactoflavine-oplossing nauwelijks enige fluorescentie kon worden opgewekt,nbsp;terwijl bestraling met de golflengte 445 my^, die minder sterknbsp;geabsorbeerd wordt, duidelijke fluorescentie te voorschijn riep.

De spectrale verdeling van het fluorescentielicht is volkomen onafhankelijk van de golflengte van de opwekkende straling, zoalsnbsp;Goldstein (�ll) en Starckiewicz (�29) voor synthetische organischenbsp;verbindingen en Aharoni en Dh�r� (�30) voor aetioporphyrinenbsp;konden aantonen. Blijkbaar kan de opwekkende straling, van welkenbsp;golflengte deze ook zij, bij deze stoffen slechts ��n, door de bouwnbsp;der moleculen volkomen vastgelegde, toestand van excitatie veroorzaken. De terugkeer van deze toestand tot de rustphase verlooptnbsp;eveneens volgens ��n zeer bepaalde combinatie van energieover-gangen, hetgeen zich uit in de constantheid van de samenstellingnbsp;der fluorescentiestraling.

Deze regel geldt natuurlijk niet voor mengsels van fluorescerende stoffen, zoals die in de natuur vaak zullen worden aangetroffen.

Hierbij is het n.1. heel goed mogelijk, dat bij de opwekking van de fluorescentie door monochromatisch licht van de ene golflengtenbsp;de component a het grootste deel van de opwekkende stralen omzetnbsp;in fluorescentielicht en bij opwekking door een andere golflengtenbsp;de component b. Het spectrum van het fluorescentielicht van hetnbsp;mengsel zal in het eerste geval de meeste gelijkenis vertonen met datnbsp;van a, in het tweede geval met dat van b. Hieruit volgt, dat hetnbsp;gewenst is bij opgave over fluorescentiespectra van stoffen, waarvannbsp;de zuiverheid niet vaststaat, de gebruikte opwekkende golflengtenbsp;mede te delen en dat de vergelijking der fluorescentiespectra vannbsp;��n stof bij verschillende opwekkende golflengten aanwijzingen kannbsp;geven omtrent de zuiverheid der stof.

De fluorescentiespectra van de organische verbindingen bestaan bij gewone temperatuur nooit uit de haarscherpe lijnen, die ons uitnbsp;de anorganische emissiespectra bekend zijn, doch voorzover datnbsp;tot nog toe gebleken is, uit min of meer vage banden. Van sommigenbsp;stoffen ligt de emissie uitsluitend in het ultraviolette deel van hetnbsp;spectrum, van vele evenwel, althans gedeeltelijk, in het zichtbarenbsp;gebied.

Bij de studie van de fluorescentie van vele stoffen blijken de ultraviolette stralen nog op andere wijze werkzaam te zijn dan alsnbsp;fluorescentie-opwekkers. Vooral de gecompliceerde organischenbsp;verbindingen kunnen zeer gevoelig zijn voor de inwerking van dezenbsp;stralen en tot de gevolgen der bestraling behoren ook veranderingennbsp;in de intensiteit en de spectrale samenstelling van het fluorescentie-licht. Deze veranderingen in het fluorescentielicht van papier,nbsp;gelatine enz. beschrijft Liesegang (�26). Wat betreft de intensiteits-veranderingen vindt men op dit punt verder waarnemingen vannbsp;Wels (�28) aan eiwitoplossingen, van Wels en Jokisch ('29) aannbsp;weefsels en cellen en aan oplossingen van aminozuren vannbsp;Wiegand (�29). Eros (�32) vermeldt de ook door mij geregeldnbsp;waargenomen afname der fluorescentie in weefselcoupes ennbsp;Querner (�35) noemt de �deluminescentie� als een van de kenmerken van zijn �Leuchtstoff X�. Andere voorbeelden zijn de vormingnbsp;van �t groen fluorescerende urobilinezink uit rood fluorescerendenbsp;porphyrinezink-oplossingen (Gouzon (�33)) en van lumiflavine uitnbsp;lactoflavine (Bierry en Gouzon (�35) geven voor dit geval de verandering in het fluorescentiespectrum). In sommige gevallen kannbsp;men door doeltreffende keuze der opwekkende straling dezenbsp;destructieve invloed met behoud van de fluorescentie ontgaannbsp;(Jager (�40) voor het geval van vitamine A); in andere gevallennbsp;evenwel zal de meting van het fluorescentiespectrum moeten geschieden v��rdat zich een merkbare verandering heeft voorgedaan.nbsp;De methode van Dh�r� (�32, �37), die in dergelijke gevallen denbsp;onderzochte stof herhaaldelijk ververste, leent zich alleen voornbsp;spectrographisch onderzoek en in het geheel niet voor histologische.nbsp;gevallen.

Overwegen wij thans aan de hand van deze gegevens, aan welke voorwaarden een microspectrophotometrische opstelling voornbsp;onderzoek van fluorescerende objecten moet voldoen, dan blijkt, dat:

a. nbsp;nbsp;nbsp;De opwekkende stralen zo sterk moeten zijn als de lichtbronnbsp;c.q. het object toelaat;

b. nbsp;nbsp;nbsp;de opwekkende straling monochromatisch en van bekendenbsp;golflengte moet zijn;

c. nbsp;nbsp;nbsp;de meting van zeer geringe lichtintensiteiten mogelijk moet zijn;

e. nbsp;nbsp;nbsp;De methode moet uitkomsten opleveren, die quantitatief vergelijkbaar zijn met die der gangbare macroscopische onderzoekingsmethoden.

f. nbsp;nbsp;nbsp;de oplossing van de spectra niet zo streng behoeft te zijn, alsnbsp;bij de analyse van vlamspectra regel is.

(De eis e. verdient enige toelichting: Indien wij metingen verrichten met een op blz. 8 onder c. genoemde methode � met een filtermethode dus � dan is het door ons onderzochte licht gekenmerkt door de transmissiecurven van de daarbij gebruikte filters.nbsp;Aangezien deze curven geen regelmatige geometrische figuren zijn,nbsp;die een nauwkeurige opgave toelaten van het door deze filtersnbsp;doorgelaten licht, zijn onze gegevens slechts van waarde voor dennbsp;onderzoeker, die over een identiek stel filters beschikt. Beschikt hijnbsp;over een andere methode, dan zijn onze gegevens voor hem waardeloos. Meten wij evenwel met een onder a. genoemde methode,nbsp;dan kunnen de onderzochte delen van het spectrum nauwkeurignbsp;worden aangegeven door de vermelding van de verhouding tussennbsp;de breedten van collimator- en oculairspleten tot de dispersie vannbsp;het prisma. Deze opgaven zijn volmaakt onafhankelijk van de bouwnbsp;of de grootte van het gebruikte apparaat en iedere onderzoeker, dienbsp;de een of andere prisma- of roosterspectrophotometer bezit, kannbsp;zijn instrument instellen op de door ons gebruikte waarden en dusnbsp;metingen verrichten, die volkomen vergelijkbaar zijn met de onze.nbsp;Doet hij dit niet en meet hij met andere spleetbreedten, dan heeftnbsp;hij uit onze opgaven toch in ieder geval reeds een indruk van denbsp;overeenkomst, die hij tussen zijn en onze waarnemingen magnbsp;verwachten).

Het is bezwaarlijk om in een practisch bruikbare opstelling zowel aan a als aan b te voldoen. Monochromatisering bereikt men bijnbsp;een lichtbron met een continu spectrum slechts met een dubbelenbsp;prismamonochromator of bij een lichtbron met een lijnenspectrumnbsp;in sommige gevallen met filters. Zo kan men met een voldoend diknbsp;nikkeloxyde-glas-filter, gecombineerd met een kopersulfaatcuvette,nbsp;uit de straling van een gewone kwikontladingslamp de lijnengroepnbsp;365,0�366,3 mjji,, dus practisch monochromatisch licht, isolerennbsp;(Dh�r� {�34)). De oppervlaktehelderheid dezer bij lage druknbsp;brandende kwiklampen is evenwel te gering voor metingen bijnbsp;sterke vergrotingen van de fluorescentie van dunne weefselcoupes.nbsp;Daarvoor komt in aanmerking de superhogedrukkwiklamp, typenbsp;Philips H.P. 300 en eerst recht de superhogedrukkwiklamp typenbsp;Philips S.P. 500. Slechts bij toepassing van deze laatste lamp zijnnbsp;metingen aan onderdelen van cellen in dunne, niet met fluoro-

chromen behandelde, weefselcoupes mogelijk. De totale lichtstroom van de S.P. 500 bedraagt 30.000 lumen, de lengte van de ontlading 12,5 mm en de breedte ongeveer 2,5 mm, De overeenkomende waarden voor de H.P. 300 zijn: lichtstroom 3000 lumen,nbsp;lengte der ontlading 25 mm en breedte ongeveer 5 mm. Hoewelnbsp;het verschil in de spectrale samenstelling van het door deze lampennbsp;uitgezonden licht een exacte vergelijking niet mogelijk maakt, isnbsp;het duidelijk, dat de oppervlaktehelderheid van de S.P, 500 dienbsp;van de H.P. 300, ook bij gebruik als ultraviolette lichtbron, velenbsp;malen moet overtreffen. Aangezien Haitinger (�40) opmerkt, datnbsp;de oppervlaktehelderheid van lampen als de H.P. 300 practischnbsp;niet bij die van zijn ijzer-electroden-booglamp ten achter staat,nbsp;mag worden aangenomen, dat wij met de S.P. 500 de sterkstenbsp;ultraviolette lichtbron in de histologische techniek hebben ingevoerd, die tot nu toe vervaardigd is.

Bij deze lichtbronnen is de spectrale verdeling van het uitgezonden licht evenwel niet gelijk aan die der genoemde, bij lage druk werkende, lampen. Marie Wreschner (�38) ontleent curvennbsp;aan metingen van Elenbaas en van Wijk, waaruit blijkt, dat bijnbsp;de S.P. 500 de kwiklijnen zich verbreed hebben tot banden en datnbsp;zich tussen die banden een niet te verwaarlozen continuum bevindt. Bij pogingen om door strenge filtering of door middel vannbsp;een monochromator hieruit een monochromatische straling tenbsp;isoleren wordt het voordeel van de enorme helderheid van dezenbsp;lamp te niet gedaan, zodat de straling, die meetbare fluorescentienbsp;in onbehandelde weefselcoupes opwekt, slechts bij benaderingnbsp;monochromatisch kan zijn. Een filter, bestaande uit een 6 cm dikkenbsp;laag van een 5 �/o kopersulfaatoplossing in water en uit twee lagennbsp;van 2,5 mm nikkeloxyde-glas. Iaat van het spectrum der S.P. 500nbsp;het licht van 360 tot 380 m^l in grote sterkte door en, zeer verzwakt, de banden bij 334 en 313 mjji,. Dat geen licht van groterenbsp;golflengte dan 400 m;/, wordt doorgelaten kon ik spectroscopischnbsp;vaststellen, terwijl de verzwakking der golflengten, korter dannbsp;360 mjx, mij bleek bij de combinatie van een Backstr�m-filter, datnbsp;alleen deze golflengten doorlaat, met het bovengenoemde filternbsp;van kopersulfaatoplossing en nikkeloxyde-glas.

Een dergelijke tegenstrijdigheid tonen de voorwaarden, die de meettechniek zelve betreffen. Stelt men de eis e. voorop, dan isnbsp;het duidelijk, dat alleen methoden met prismatische of rooster-dispersie in aanmerking komen. De uitkomsten van photometrischenbsp;bepalingen door filters kunnen immers wel op dezelfde wijze verwerkt worden als die der bovengenoemde methoden (Eisenbrandnbsp;(�34)), doch behouden altijd een onzekere factor, daar het doornbsp;filters doorgelaten licht niet zo nauwkeurig gedefinieerd kan wordennbsp;als het licht, dat door de oculairspleet van een spectrophotometernbsp;valt. Daar in het algemeen geen scherp omschreven lijnen in hetnbsp;spectrum te verwachten zijn, kan men met prismatische dispersienbsp;volstaan. Bij de grote dispersie over het gehele spectrum der

roosterspectroscopen zijn metingen immers toch niet mogelijk door de geringe intensiteit van de fluorescentieverschijnselen.

\Vat de keuze der registratiemethode betreft is het volgende op te merken: De spectrographie is een zeer gevoelige methodenbsp;door de summatieve werking van de photographische plaat.nbsp;Zoals echter reeds werd uiteengezet, is het bij het microscopischnbsp;onderzoek niet mogelijk om tijdens de belichting veranderdenbsp;objecten te vervangen door nieuwe, zoals dat bij de macroscopischenbsp;fluorescentiespectrographie geschiedt. Daarom is de spectrographienbsp;als algemene methode niet geschikt voor het microscopischnbsp;fluorescentieonderzoek aan biologische objecten.

De lichtelectrische en thermoelectrische registratiemethoden (resp. met ,,Sperrschichtzelle� en vacuumthermoelement) hebbennbsp;het voordeel, dat hun werkingssfeer zich niet beperkt tot het zichtbare spectrum en dat zij objectief registreren, De gevoeligheidnbsp;dezer methoden is echter slechts onder bijzondere omstandighedennbsp;gelijk aan die van ons oog of nog groter (Tomaschek (�35)),nbsp;zodat voor practisch gebruik de toepassing der visuele registratienbsp;vooralsnog aangewezen blijft, in weerwil van de nadelen: hetnbsp;kleine gebied van grote gevoeligheid en de subjectiviteit van denbsp;waarneming. Het nadeel van het geringe meetbereik van de visuelenbsp;methode weegt echter niet zo zwaar, daar het grootste gedeelte vannbsp;de hedendaagse kennis omtrent fluorescentieverschijnselen juistnbsp;die verschijnselen betreft, waarvan de golflengten, althans gedeeltelijk, binnen het meetbereik vallen,

In overeenstemming met deze overwegingen kozen wij een methodiek, waarbij het fluorescentielicht bij relatief geringenbsp;dispersie visueel spectrophotometrisch onderzocht werd. Aan eennbsp;nauwkeurige beschrijving van deze methodiek laten wij enkelenbsp;beschouwingen, die de keuze van bepaalde details motiveren,nbsp;voorafgaan.

Allereerst het spectroscopische deel der apparatuur. Zoals reeds werd opgemerkt, behoeft de spectrale oplossing bij hetnbsp;fluorescentieonderzoek aan de meeste organische stoffen nietnbsp;groot te zijn. Dit veroorlooft ons het gebruik van relatief weinignbsp;dispergerende spectroscopen. Voor de isolatie van het gewenstenbsp;spectraalgebied is het noodzakelijk, dat de niet gemeten delen vannbsp;het spectrum afgeschermd kunnen worden: de spectroscoop moetnbsp;voorzien zijn van een oculairspleet. Zakspectroscopen en micro-spectraaloculaircn, waarbij van de collimatorspleet alleen op denbsp;retina een re�el beeld ontworpen wordt, zijn dus niet bruikbaar.nbsp;De relatieve opening van de afbeeldende optiek in de spectroscoopnbsp;moet minstens even groot zijn als die van het lenzenstelsel, datnbsp;het object op de collimatorspleet afbeeldt, anders treden verliezennbsp;op, die hier zwaar wegen.

Ook met spectroscopen van geringe dispersie kunnen microscopische fluorescentieverschijnselen slechts met grote spleet-breedten gemeten worden. Een analyse van de ,,reinheid� van het

onder deze omstandigheden door de oculairspleet waargenomen deel van het spectrum geeft het volgende beeld: Zij het beeldnbsp;van de collimatorspleet in het vlak van de oculairspleet bij denbsp;golflengte a, dat bij de golflengte b en dat bij de golflengte c. Valt nu bij een bepaalde stand van het prisma de asnbsp;van C samen met die van de oculairspleet O en beschouwen wijnbsp;de verhoudingen voor het eenvoudige geval, dat O even breed isnbsp;als dan is het duidelijk, dat al het in het spectrum aanwezigenbsp;licht van de golflengte a door O het oog bereikt. Stel, dat de asnbsp;van door de andere breking in het prisma valt op de rand vannbsp;O, dan zal slechts de helft van het licht van de golflengte b doorgelaten worden. Valt C net naast O, dan zal van de golflengte cnbsp;in het geheel geen licht door de oculairspleet vallen. Nu zijn

en alle even breed en er volgt uit het voorgaande, dat het aandeel, dat elke golflengte levert aan het door O doorgelatennbsp;licht, lineair afneemt met de afstand, waarop die golflengte in hetnbsp;spectrum verwijderd ligt van de maximaal doorgelaten golflengte.nbsp;Immers, de as van Cj^ viel op de rand van O, dus op een afstandnbsp;van Yi- O van a en van C^, die net naast O viel, op een afstandnbsp;van 1.0 van a, terwijl b voor de helft vertegenwoordigd was innbsp;het door O doorgelaten licht en c in het geheel niet. Het verloopnbsp;van de dispersiekromme van het prisma heeft echter als gevolg,nbsp;dat in werkelijkheid de afstanden tussen a, b en c niet gelijk zijn.nbsp;De hierboven afgeleide verhouding geldt dan ook slechts bijnbsp;benadering en voor kleine verschillen tussen de golflengten a, bnbsp;en c. Het is duidelijk, dat � op deze benadering na � het gemetennbsp;licht door de vermelding van de bij de meting gebezigde spleet-breedten volledig gekarakteriseerd is, waardoor aan de belangrijkenbsp;voorwaarde, dat de metingsuitkomsten physisch welomschrevennbsp;moesten zijn, beter wordt voldaan dan bij de uitzeving van analogenbsp;spectrumdelen door middel van filters mogelijk is.

Meet men met vaste collimator- en oculairspleet, dan wisselt bij de metingen in de verschillende golflengtegebieden voortdurendnbsp;de reinheid van het onderzochte spectrum. Immers, het beeld vannbsp;de collimatorspleet is bij de verschillende standen van het prismanbsp;constant van grootte, terwijl de dispersie van het rood naar hetnbsp;blauw gestadig toeneemt. Daardoor zal in het blauw de golflengte,nbsp;die niet meer door de oculairspleet wordt doorgelaten, veel mindernbsp;verschillen van de maximaal doorgelaten golflengte dan in hetnbsp;rood. Weliswaar is het mogelijk voor elke golflengte voor ��nnbsp;vaste waarde van C en O de reinheid van het door O doorgelatennbsp;deel van het spectrum te defini�ren, doch het is veel eenvoudigernbsp;om bij de meting van elke golflengte C en O een dusdanigenbsp;waarde te geven, dat de reinheid van het onderzochte licht overnbsp;het gehele spectrum constant is. Hiertoe kan men de verhoudingennbsp;kiezen zoals die boven zijn uiteengezet en dus O gelijk houden

aan C en beide een waarde geven, welke overeenkomt met de afstand, waarop in het betreffende deel van het spectrum tweenbsp;lijnen, met een golflengteverschil van bijv. 20 mp,, van elkaar verwijderd liggen. Uit de bovenvermelde verhoudingen blijkt dan, datnbsp;in dat geval slechts ��n golflengte maximaal aanwezig is in hetnbsp;onderzochte licht, de golven, die 10 mp langer of korter zijn,nbsp;slechts voor de helft vertegenwoordigd zijn, en die van 20 mpnbsp;verschil met de maximaal doorgelaten golflengte er in het geheelnbsp;niet in voorkomen. In het gebied van grote dispersie zullen O en Cnbsp;hiertoe groter moeten zijn dan in dat van geringe dispersie. Bijnbsp;het voordeel van de gelijkblijvende reinheid van het spectrum komtnbsp;dus nog dat van de toenemende lichtsterkte in het blauw. Doornbsp;verbreding van de oculairspleet neemt immers het gemeten lichtvlakje toe in grootte, terwijl door de verbreding van de collimator-spleet de lichtintensiteit van dit vlakje groter wordt dan zij bijnbsp;vaste spleten zou zijn. Deze toename in het blauwe deel van hetnbsp;spectrum is bijzonder welkom, daar de gevoeligheid van het oognbsp;in dit gedeelte juist geringer is dan in het geel en het groen. Eennbsp;belangrijk nadeel van de prismaspectroscopen, dat van de ongelijkmatige dispersie, wordt op deze wijze ge�limineerd. Een bezwaarnbsp;van de veranderlijkheid van de collimatorspleet is de eis, dat denbsp;verlichting van deze spleet, zowel door het object als door de ver-gelijkingslichtbron, ook bij de grootst mogelijke spleetbreedte volkomen gelijkmatig moet zijn. Is dit niet het geval, dan bestaat denbsp;mogelijkheid, dat bij de vergroting van de spleetbreedte de intensiteit van het licht uit het object niet op gelijke wijze toeneemt als dienbsp;van het vergelijkingslicht, met de daaruit voortvloeiende onnauwkeurigheid in de meting. In de practijk kan men deze onnauwkeurigheid vermijden door voor de meting slechts objecten te kiezen,nbsp;waarvan het beeld het werkzame deel van de collimatorspleet, ooknbsp;in de wijdste stand, geheel en gelijkmatig opvult. Door de groottenbsp;van de collimatorspleet, die, behalve door de constructie van denbsp;spectroscoop, bepaald wordt door de boven vermelde overeenkomstnbsp;met 20 mp dispersie, en door de mate van de vergroting, die hetnbsp;object ondergaat, voordat het op de collimatorspleet geprojecteerdnbsp;wordt, is dus tevens de grootte van het object, die nog metingennbsp;toelaat, vastgelegd.

De wetenschap, dat bij een dergelijke opstelling de onderzochte delen van het spectrum niet uit monochromatisch licht bestaan,nbsp;doet er ons voor waken grote waarde te hechten aan gegevens,nbsp;die verkregen zijn in gedeelten, waar de spectrale samenstellingnbsp;van gemeten licht en standaardlicht sterk uiteenlopen, In die delennbsp;van het spectrum, waar plotselinge overgangen in helderheid voorkomen, kan het resultaat van de vergelijking tussen fluorescentie-licht en standaardlicht zeer onbetrouwbaar zijn.

Aangezien ons oog slechts in staat is tot het waarnemen van verschillen en niet tot metingen, moet telkens naast het onderzochte deel van het spectrum een corresponderend licht van gelijke

golflengte ter vergelijking worden aangeboden. Varieert men de sterkte van dat licht, dan zal ons oog binnen zekere grenzen welnbsp;in staat zijn om aan te geven, wanneer beide lichtsoorten � gemeten licht en standaardlicht ^ even sterk zijn. De hiervoor benodigde intensiteit van het standaardlicht kan worden afgelezen.

In den regel worden standaardlicht en te meten licht bij de visuele spectrophotometrie op de volgende wijze vergeleken; denbsp;lichtsoorten vallen ieder op een deel van de collimatorspleet, worden door het prisma gedispergeerd en door bijzondere optischenbsp;inrichtingen in twee aan elkaar grenzende velden in de oculairspleetnbsp;geprojecteerd. In de stralengang van ��n of van beide lichtsoortennbsp;is een inrichting tot meetbare variatie der intensiteit aangebracht.nbsp;Bij gelijkheid der lichtintensiteiten in de beide velden verdwijnt denbsp;scheidingslijn.

Voor metingen aan fluorescentieverschijnselen is deze methode evenwel niet goed bruikbaar, daar hierbij intensiteiten gemetennbsp;moeten worden, die een scherp waarnemen van de scheidingslijnnbsp;tussen de velden niet veroorloven. Slechts na langdurige adaptatienbsp;wordt bij deze metingen de oculairspleet zichtbaar en van hetnbsp;onderscheiden van d�tails is geen sprake. In ander verband toonden Vermeulen en Hagedoorn (�36) aan, dat visuele vergelijkingnbsp;van twee intensiteiten ook mogelijk is door successief contrast.nbsp;Hierbij valt het standaardlicht afwisselend met het te onderzoekennbsp;licht op eenzelfde, eventueel peripheer, retinadeel. Weliswaar is denbsp;nauwkeurigheid geringer dan die bij simultaancontrast (Vermeulennbsp;en Hagedoorn, Haas (�26)), doch de methode laat metingen toe bijnbsp;intensiteiten, die anders niet meetbaar zijn. Hetzelfde principe isnbsp;door ons toegepast op de spectrophotometrie van microscopischenbsp;fluorescentieverschijnselen. Een eenvoudige inrichting met eennbsp;spiegeltje, dat bewogen wordt door middel van een, uit de photo-graphie welbekende, draadontspanner, maakt het mogelijk snelnbsp;van de observatie van het licht uit de vergelijkingslichtbron overnbsp;te gaan op die van het fluorescentielicht. Na enige oefening is hetnbsp;heel goed mogelijk, door variatie van de intensiteit van hetnbsp;standaardlicht, een waarde tc vinden, waarbij beide lichtintensiteiten gelijk zijn.

Aan de bespreking van de wijze, waarop de variatie van de intensiteit van het standaardlicht tot stand moet komen, mag eennbsp;korte uiteenzetting van de berekening, die aan de vergelijking vannbsp;onderzocht spectrum en vergelijksspectrum in het algemeen tennbsp;grondslag ligt, voorafgaan, daar hieruit de gewenste eigenschappen van de voornaamste verdere onderdelen der apparatuur vanzelf volgen.

Laten wij derhalve, zonder ons voorlopig te bekommeren over de juiste wijze, waarop de variatie van het standaardlicht geschiedt, aannemen, dat de intensiteit van dit licht afleesbaar isnbsp;op een schaalverdeling, en dat deze schaal zo is ingericht, dat hetnbsp;standaardlicht bij de stand van de wijzer op 2 of op 3 ook inder-

daad 2 resp. 3 maal zo groot is aLs bij de stand 1, m.a.w., dat de intensiteit van het standaardlicht evenredig is met de aflezing.

Stel, dat bij een meting deze aflezing bedraagt a voor het golflengtebereik a, |3 voor het bereik b enz., dat de intensiteitnbsp;van het standaardlicht bij de aflezing 1, i^ erg/sec. cm^ is voornbsp;het bereik a, ij^ erg./sec. cm^ voor het bereik b enz., dan is dusnbsp;de intensiteit (I) van het gemeten licht in het golflengtebereik a:nbsp;I = a . i erg/sec. cm^ en voor het bereik b; = p . i^^ erg/sec.nbsp;cm^. Veronderstelt men verder, dat door de aanwezigheid vannbsp;filters, reflecterende vlakken, niet-achromatische lenzenstelselsnbsp;e.d. zowel de samenstelling van het te meten licht als die van hetnbsp;standaardlicht gewijzigd wordt, voordat deze lichten vergelekennbsp;kunnen worden, dan kan in de formule deze invloed worden weergegeven door een eigen factor voor elke golflengte:

Absolute metingen vallen buiten het kader van deze onderzoekingen: van de standaardlamp zijn de absolute lichtwaarden niet bekend. Bekend zijn slechts verhoudingen tussen intensiteitennbsp;van spectrumdelen, en deze verhoudingen zijn constant, of men nunbsp;veel of weinig licht van de lamp voor de meting gebruikt. Ditnbsp;kan worden weergegeven door het invoeren van een voor allenbsp;golflengten constante factor C in de formule (1):

. C, l

In deze formule zijn a, P enz. bekend, C de genoemde constante, terwijl de waarden der producten i^ . x^ , ij, . Xj, enz. bepaaldnbsp;worden door ijking (zie blz. 29).

Uit het voorgaande blijkt, dat bij de variatie van de intensiteit van het standaardlicht de spectrale samenstelling hiervan ongewijzigd moet blijven. Zou immers het standaardlicht bij de aflezingen a en P anders van samenstelling zijn dan bij de aflezingennbsp;2a en 2P, dan zouden de factoren en Xj, niet voor alle aflezingennbsp;constant zijn, en dus een berekening van de metingsuitkomstennbsp;onmogelijk worden. Bovendien is het van voordeel, als de matenbsp;van lichtverzwakking niet door ijking behoeft te worden vastgesteld en aLs de verhoudingen der schaaldelen dadelijk die dernbsp;doorgelaten intensiteiten weergeven. Tenslotte dient ervoor gezorgd te worden, dat de optiek, die het standaardlicht aan denbsp;collimatorspleet toevoert, een apertuur heeft, die overeenkomtnbsp;met die van de optiek, die het fluorescerende object afbeeldt opnbsp;de collimatorspleet, daar anders het verschil in de subjectievenbsp;indruk van beide lichten de nauwkeurigheid der metingen be�nvloedt. Indien men n.1. de opstelling z� maakte, dat alle stralennbsp;van het standaardlicht onder zeer kleine hoeken met de optischenbsp;as de collimatorspleet bereikten, dan zouden allerlei stofjes e.d.nbsp;op de oppervlakken der lenzen mede afgebeeld worden op de

retina en zo het subjectieve beeld van de oculairspleet bij het observeren van het standaardlicht geheel anders doen zijn dan bijnbsp;de observatie van het onder grotere hoeken invallende fluores-centielicht.

Toepassing van de �afstandswet� (verlichting is omgekeerd evenredig met het quadraat van de afstand), zoals Waelchli deed,nbsp;ware mogelijk, doch is bij kleine afstanden weinig nauwkeurig ennbsp;bij grote onpractisch. Van de andere bekende methoden voornbsp;meetbare lichtverzwakking voldoet die der sneldraaiende en verstelbare sectoren aan de genoemde eisen, doch bij gebruik vannbsp;door wisselstroom gevoede lichtbronnen treden hinderlijke interferentieverschijnselen op. Bij meetbare uitdoving van het licht dernbsp;standaardlamp met behulp van nicols (Policard (�25)) wordt gepolariseerd standaardlicht vergeleken met niet gepolariseerd fluo-rescentielicht, hetgeen een onzekere factor in de uitkomstennbsp;brengt. Het is n.1. niet bekend, of bij zeer geringe intensiteitennbsp;de verhouding tussen de indrukken, die door gepolariseerd en nietnbsp;gepolariseerd licht worden teweeggebracht, wel voor alle golflengten constant is. De onzekerheid wordt nog vergroot door denbsp;niet onbelangrijke polarisatie, die in prismaspectroscopen optreedt.nbsp;Tracht men deze moeilijkheden te ontgaan door beide lichtsoortennbsp;te polariseren, zoals in de spectrophotometer volgens K�nig-Martens geschiedt, dan gaat dat ten koste van de intensiteit vannbsp;het te onderzoeken licht. De methode volgens Vierordt metnbsp;dubbele collimatorspleet (Engelmann) komt voor de successief-contrast-methode niet in aanmerking. Neutrale grijze glazennbsp;wiggen zijn bruikbaar, moeten evenwel geijkt worden en zijn nietnbsp;altijd geheel neutraal.

Aan alle genoemde eisen voldoen bepaalde vormen van dia-phragmata. Een diaphragma als lichtverzwakker dient zo te worden aangebracht, dat het alleen het licht verzwakt en nietnbsp;wordt afgebeeld: bij een afbeeldend lenzensysteem dus in of nabijnbsp;het optisch middelpunt. In dat geval is het diaphragmavlak gelijkmatig verlicht en de helderheid van een door deze lenzen ontworpen beeld evenredig met het oppervlak van de opening vannbsp;het diaphragma. Daarbij behoort de opening van het diaphragmanbsp;variabel te zijn bij constante apertuur van het lenzensystcem.nbsp;Alleen in dat geval is de chromatische afwijking van het lenzenstelsel constant. Bovendien hebben Stiles en Crawford (geciteerdnbsp;naar Kohlrausch (�35)) doen zien, dat de lichtindruk, die het oognbsp;ontvangt van een door een lenzenstelsel afgebeeld object, nietnbsp;evenredig toeneemt met de opening van het diaphragma, indiennbsp;daarbij de apertuur der lenzen verandert. De periphere stralennbsp;worden naar verhouding n.1. minder helder waargenomen dan denbsp;centrale. Een quadratisch diaphragma is dus minder geschikt, daarnbsp;hier de periphere delen van het lenzensysteem alleen aan denbsp;afbeelding deelnemen als het diaphragma ver openstaat. Welnbsp;geschikt bleek bij onze experimenten te zijn een sectorendia-

phragma, dat bijv. kan bestaan uit drie vaste en drie losse sectoren van 60�, die ten opzichte van elkaar verspringen. De losse sectoren zijn met elkaar verbonden en draaibaar om de optischenbsp;as van het lenzensysteem. Een schaalverdeling in graden geeftnbsp;aan, welk gedeelte der lensopening bij elke stand van het stelnbsp;losse sectoren vrijgelaten wordt. De apertuur van het systeem isnbsp;hierbij constant en het oppervlak der opening is recht evenredignbsp;met de aflezing in graden, als 0� bij volkomen sluiting staat. Ternbsp;vermijding van fouten door buiging worden de waarden onder 5�nbsp;niet gebruikt. Het meetbereik is dus 5 : 60. Was een groter bereiknbsp;gewenst, dan werd deze uitbreiding bewerkt door variatie vannbsp;de afstand van de lichtbron tot het door het lenzenstelsel afge-beelde reflecterende vlakje.

Thans rest ons nog de bespreking van de wijze, waarop het te onderzoeken licht en het standaardlicht aan de hier aangeduidenbsp;spectrophotometrische combinatie behoort te worden toegevoerd.

In principe is het mogelijk het re�le beeld, dat het microscopische objectief ontwerpt, direct op de collimatorspleet te projecteren. Deze oplossing brengt echter practische bezwaren mede, daar in dat geval de gehele spectroscoop voor het opzoeken vannbsp;het gewenste deel in de coupe van het microscoop verwijderdnbsp;zou moeten worden. Een nauwkeurige projectie van een kleinnbsp;object op de collimatorspleet is door de bewegingen bij het verstellen van de knoppen van de spectroscoop op deze wijze bovendien nooit te bereiken. Beter is de volgende methode: spectrophotometer en microscoop worden niet onmiddellijk mechanischnbsp;verbonden, maar ieder voor zich op de tafel opgesteld. Eennbsp;prisma, dat op eenvoudige wijze op het oculair kan worden bevestigd, ontwerpt via een aan de collimatorbuis gemonteerde lensnbsp;op de collimatorspleet een beeld van een wijzer, die zich in hetnbsp;diaphragma van het oculair bevindt. Als men het prisma van hetnbsp;oculair afgenomen heeft, kan men op de normale wijze micro-scopiseren en het gewenste deel van het praeparaat voor denbsp;oculairwijzer brengen. Voor de meting behoeft men slechts hetnbsp;prisma op het oculair te bevestigen om dit deel van het praeparaat op de collimatorspleet te projecteren.

Het licht van de vergelijkingslichtbron is afkomstig van de gloeidraad van een nitralampje. Aangezien de chromatische afwijking van het afbeeldende lenzenstelsel door de geringe afmetingen van deze gloeidraad al te hinderlijk zou zijn, indien mennbsp;de gloeidraad direct op de collimatorspleet zou afbeelden ennbsp;bovendien de helderheid van het licht van dit lampje zeer aanzienlijk gereduceerd moet worden, wordt een effen wit vlakje,nbsp;beschenen door de nitralamp, op de collimatorspleet geprojecteerd. Een blauw filter zorgt voor een betere aanpassing vannbsp;het standaardlicht aan het fluorescentielicht; deze maatregel komtnbsp;de nauwkeurigheid der metingen ten goede, daar hierdoor denbsp;verschillen in de indruk, die de niet-monochromatische delen van

het spectrum op ons oog maken (zie blz. 18) tot een minimum teruggebracht worden. Bovendien vallen de meeste waarnemingen bij het gebruik van dit filter binnen het meetbereiknbsp;van het sectorendiaphragma.

Hier volgt thans een beschrijving van de opstelling, zoals die door ons gebruikt werd bij het in het volgende hoofdstuk tenbsp;bespreken onderzoek.

De bron voor de ultraviolette stralen is de Philipslamp S. P. 500. De eigenlijke lamp bestaat uit een dikwandig buisje van kwarts metnbsp;aan elk einde een ingesmolten wolfraam-electrode. In het lumennbsp;van het buisje bevindt zich een kleine hoeveelheid kwik en eennbsp;inactief gas onder zeer hoge druk. De ontlading is 12,5 mm langnbsp;en slechts enkele mm breed. De energie, die in deze kleine ruimtenbsp;met een hoog rendement wordt omgezet in infrarood, zichtbaar ennbsp;ultraviolet licht, bedraagt 500 Watt. De lamp wordt via een transformator aangesloten op het wisselstroomnet. Daar het buisje zonder koeling in korten tijd door de optredende verhitting vernieldnbsp;zou worden, wordt geforceerde waterkoeling toegepast. Hiertoenbsp;wordt het ontladingsbuisje ingesloten in een metalen huis, dat aannbsp;��n zijde voorzien is van een bol stralingsvenster van kwarts. Tussen het buisje en dit venster bevindt zich nog een dekglaasje, datnbsp;eveneens van kwarts vervaardigd is. Het huis is voorzien vannbsp;aansluitingen voor toe- en afvoer van het koelwater. Voor denbsp;koeling wordt een speciaal aggregaat geconstrueerd, bestaande uitnbsp;een electrisch aangedreven centrifugaalpompje en een radiator,nbsp;doch aansluiting van de koeling op de waterleiding is onder bepaalde omstandigheden ook mogclijk. Het leidingwater dient daartoenbsp;een hoge graad van zuiverheid te bezitten, daar zich anders op hetnbsp;warme kwartsbuisje een neerslag vormt, dat het rendement en denbsp;levensduur van de lamp ongunstig be�nvloedt. Daar elke stagnatienbsp;in de koeling de in bedrijf zijnde lamp grote schade doet, behoortnbsp;ook bij koeling door middel van de waterleiding in de primairenbsp;stroomketen van de transformator der lamp een schakelaar te worden opgenomen, die de stroom verbreekt, zodra er iets aan denbsp;koeling hapert. Deze schakelaar hebben wij in onze opstelling alsnbsp;volgt ingericht: uit het einde van de af voorleiding A (fig. 1) kannbsp;het koelwater door een zijbuis B, welks lumen door de klemkraannbsp;C regelbaar is, afstromen. Door de locale weerstand bij C stijgtnbsp;de druk in A en het water dringt het buisje D binnen, de luchtnbsp;hierin en in de reageerbuis E boven het kwikniveau comprimerend.nbsp;Onder invloed van deze drukverhoging stijgt het kwik F in de stijg-buis G omhoog en bereikt de electrode H. Steeds in het kwik gedompeld is de electrode I en de beide genoemde electroden zijn zonbsp;verbonden met het lichtnet en de transformator van de S. P. 500,nbsp;dat de primaire stroom doorgaat, zolang het kwik de electrode H

bereikt. Elke vermindering in de doorstroming van de koelmantel van de lamp uit zich in een afname van de druk in A en zal, indiennbsp;zij groot genoeg is, aanleiding geven tot de verbreking van hetnbsp;contact tussen het kwik en de electrode H. De weerstand C wordtnbsp;zo ingesteld, dat dit contact eerst tot stand komt, als een ruim overschot boven het voor de koeling van de lamp benodigde minutenvolume door de koelmantel stroomt.

De gemiddelde levensduur van de S. P. 500 wordt opgegeven als 200 uur; zij is zeer sterk afhankelijk van het aantal malen, datnbsp;de lamp aan- en uitgeschakeld wordt, zodat enkele lange periodennbsp;van constant gebruik oeconomischer zijn dan vele korte. (Onzenbsp;eerste lamp brandde bij een gemiddelde gebruiksduur van 2Y2 uurnbsp;in totaal ongeveer 150 uren. Van een neerslag op de buitenzijdenbsp;van het kwartsbuisje was geen spoor te bekennen: blijkbaar leentnbsp;het Utrechtse leidingwater zich voortreffelijk voor de koeling.)

Deze lamp werd opgesteld op de plaats van de lichtboog in een Reichert-Haitinger�se ultravioletstraler, de Reichert Kam F. Dit isnbsp;een metalen huis, dat aan ��n zijde voorzien is van een cylindrischenbsp;uitbouw, waarin een tweelenzige kwartscollector verstelbaar is aangebracht. (fig. 2, Cl). Bij de originele constructie vond ook de

kopersulfaatcuvette een plaats in deze uitbouw, doch daar deze cuvette voor het gebruik bij de S. P. 500 te ondiep was, werd zijnbsp;vervangen door een veel diepere, die toen evenwel tussen hetnbsp;lamphuis en het microscoop moest worden opgesteld.

Het filter, dat uit de straling der kwiklamp de ultraviolette stralen afzondert, bestaat uit deze cuvette (F^) en uit twee lagen nik-keloxyde-glas (F2 en F3). De cuvette is 6 cm diep en wordt gevormd door een inwendig geparaffineerde koperen cylinder metnbsp;dubbele wanden, die aan beide zijden door kwartsplaten wordtnbsp;afgesloten. Rubber ringen zorgen voor een goede aansluiting. Denbsp;cuvetteruimte kan door een kleine opening in de koperen wandnbsp;gevuld worden; de normale vulling bestaat uit een 5 % oplossingnbsp;van CUSO4.7 H2O in aqua dest. Twee buizen monden uit in denbsp;ruimte tussen de wanden van de cylinder, zodat daarin koelwaternbsp;kan circuleren. De door de kopersulfaatoplossing geabsorbeerdenbsp;warmtestraling brengt zonder deze maatregel de inhoud dernbsp;cuvette snel op kooktemperatuur.

De stralengang in het microscoop is als volgt: Het totaal reflecterend prisma P4 is van kwarts en leidt de ultraviolette stralen in de condensor C2, waarvan de lenzen eveneens uit kwarts vervaardigd zijn. Deze condensor concentreert de ultraviolette stralen innbsp;het object, dat op het objectglas in paraffineolie is ingesloten. Alsnbsp;dekglas dient het euphos-dekglaasje F^, terwijl tussen dit glaasjenbsp;en de frontlens van het objectief Ob wederom een druppeltjenbsp;paraffinum liquidum voor het optische contact zorg draagt. De vannbsp;het object uitgaande divergente stralen worden door het objectiefnbsp;en de veldlens van het compensatie-oculair Oc verenigd in hetnbsp;beeldvlak van dit oculair, waar een gaatje in de wijzer W eennbsp;klein gedeelte van het beeld isoleert, zoals, in de juiste verhouding,nbsp;op de schets naast de schematische voorstelling van het oculair tenbsp;zien is. Deze oculairwijzer bevindt zich in het hoofdbrandvlak vannbsp;de bovenste lens. Indien men dus het praeparaat scherp instelt,nbsp;terwijl men tegelijk het gaatje in de wijzer scherp ziet, dan zullennbsp;de stralen uit het object, die zich in dit hoofdbrandvlak tot eennbsp;beeld verenigen, de bovenste oculairlens evenwijdig lopend verlaten. Het scherp zien van de wijzer is dus alleen mogelijk bij instelling van het oog op het zien in de verte.

Na de instelling kan op het oculair het prisma P2 bevestigd worden. Het rust daarbij met drie punten op de bovenrand van het oculair en kleine uitsteeksels van het prisma corresponderen metnbsp;groefjes in de zijrand van de vatting van de oculairlens. Op dezenbsp;wijze kan het prisma telkens in volmaakt gelijke stand op het, innbsp;de microscooptubus vastgezette, oculair bevestigd worden.

De in het volgende hoofdstuk vermelde metingen werden uitgevoerd met een Leitz 1/12 olie-immersie (n.a.: 1.30) en een Zeiss compensatie-oculair van 5 X. Zoals reeds werd opgemerkt, kannbsp;men door verandering in de toegepaste vergroting wijziging bren-

Als spectroscoop wordt de kleine monochromator van Leitz gebruikt. Dit instrument is uitgerust met een rechthoekig afbuigend prisma P3 en met verstelbare oculair- en collimatorspleten (O. S.nbsp;en C. S.). De spectroscoop is stevig aan een statief bevestigd, 20,nbsp;dat de as der collimatorbuis horizontaal ligt en die der oculairbuisnbsp;schuin naar boven wijst onder een hoeklimet het horizontale vlak, dienbsp;rustig waarnemen van de oculadrspleet mogelijk maakt. De collimatorbuis draagt een verlengstuk, dat aan het einde wordt afgesloten door de lens Lj^, Deze lens verenigt alle stralen, die evenwijdig aan de as der collimatorbuis invallen, op de collimatorspleet.nbsp;De opstelling is zodanig, dat via het prisma juist het gaatje innbsp;de wijzer W op de collimatorspleet wordt afgebeeld. De lenzen L3 ennbsp;L4 ontwerpen van de collimatorspleet door het dispergerend prismanbsp;heen een beeld in het vlak van de oculairspleet. De werkzame lengtenbsp;van de oculairspleet is bij ons model door twee dicht langs de snedennbsp;der spleet aangebrachte reepjes bladtin zoveel verkort, dat de hoogtenbsp;ongeveer twee maal de grootste breedte is. Het beeld van het gaatjenbsp;in de wijzer W valt op het met dit deel van de oculairspleet corresponderende gedeelte van de collimatorspleet. Tengevolge van denbsp;dispergerende werking van het prisma vallen de collimatorspleet-beelden van de verschillende golflengten naast elkaar: door verdraaiing van het prisma, dat hiertoe van een instelknop is voorzien,nbsp;kan men elke golflengte in het midden van de oculairspleet brengen. De bedieningsknoppen voor de regeling van de breedten vannbsp;oculair- en collimatorspleet en voor de verstelling van het prismanbsp;hebben wij bij onze spectroscoop voorzien van gladde koperennbsp;ringen, waartegen nokjes verend drukken. Bij die standen dernbsp;knoppen, die bij de meting in aanmerking komen, zijn in de ringennbsp;kleine groefjes gevijld, waarin de genoemde nokjes passen. Daardoor wordt telkens enige weerstand geboden aan het verder draaien,nbsp;zodat de instelling der knoppen bij het in acht nemen van. een vastenbsp;volgorde op het gevoel geschieden kan. Het tijdrovende en inspannende aflezen van slecht bereikbare schaalverdelingen in eennbsp;verduisterd vertrek vervalt hierdoor.

De stralengang van het licht van de standaardlichtbron blijkt uit het linker deel van fig. 2. Het licht van een via een transformatornbsp;gevoede nitralamp N valt door het blauwe filter F5 (Kodak Wratten filter 78 A) op het reflecterende vlakje R (plakkaatwit opnbsp;blank metaal). Dit vlakje wordt door het lenzenstelsel L2 via hetnbsp;spiegeltje S afgebeeld op de collimatorspleet. Tussen de lenzen vannbsp;L2 bevindt zich, dicht bij het optisch middelpunt, het sectorendia-phragma D, dat terzijde van de stralengang nog eens, van bovennbsp;gezien, wordt weergegeven. De opening, die de sectoren vrijlaten,nbsp;is van buitenaf te vari�ren en in graden afleesbaar. Het spiegeltjenbsp;S bevindt zich in de collimatorbuis tussen de collimatorspleet en denbsp;lens L^. Het kan door middel van een photographische draad-

ontspanner om de as a.�b weggeklapt worden en laat dan het licht, dat door de lens valt, door. Staat het spiegeltje ingeklapt, zoalsnbsp;in de tekening, dan wordt deze stralengang onderbroken en hetnbsp;licht uit L2 op de collimatorspleet geleid.

De gehele opstelling is afgeschermd, zodat noch het zichtbare licht van de S. P. 500, noch dat van de standaardlamp in het vertrek schijnen kan. Alleen onder die omstandigheden is de voor denbsp;metingen vereiste graad van adaptatie te bereiken en te behouden.nbsp;De aflezingen van het sectorendiaphragma geschieden bij het lichtnbsp;van een hiertoe ontstoken donkerrode lamp, daar dit licht denbsp;adaptatie niet schaadt.

Met deze opstelling wordt aldus gemeten; als de onderzoeker aan het donker geadapteerd is, worden de S. P. 500 en denbsp;standaardlamp ontstoken. Het te onderzoeken deel van de coupenbsp;brengt men met behulp van de kruistafel onder het gaatje in denbsp;oculairwijzer W, daarna bevestigt men het prisma P2 op hetnbsp;oculair en begint met de eigenlijke meting. Hiertoe wordt hetnbsp;prisma P3 van de spectroscoop z� gesteld, dat de golflengte 450 m^j.nbsp;juist in het midden van de oculairspleet valt en de breedte van dezenbsp;spleet wordt gelijk gemaakt aan die van het collimatorspleetbeeldnbsp;en wel zo breed, als de lijnen 440 en 460 mjx uiteenliggen. De standen, die de knoppen hiertoe moeten innemen, zijn eens en vooralnbsp;bepaald en vastgelegd door de plaatsing van de groefjes in de ringen om de knoppen. Het instellen is op deze manier het werk vannbsp;een ogenblik. Terwijl het oog door de loupe L5 de oculairspleetnbsp;waarneemt, kan men door het spiegeltje S te bewegen afwisselendnbsp;het licht uit de onderzochte coupe en dat uit de standaardlichtbronnbsp;bezien. Door verstelling van het sectorendiaphragma vindt men denbsp;stand, waarbij deze lichtsoorten gelijk van intensiteit zijn. Dezenbsp;stand wordt afgelezen en genoteerd. (Het is mogelijk om voor denbsp;registratie van deze waarden een methode te vinden, die dit aflezennbsp;overbodig maakt, doch de ervaringen met een dergelijke inrichtingnbsp;leerden al spoedig, dat ons oog reeds na de waarneming van enkelenbsp;wisselingen minder gevoelig wordt voor intensiteitsverschillen ennbsp;dat de gevoeligheid gedurende de korte pauze, die nodig is voornbsp;de aflezing en het noteren van de diaphragmawaarden, zich juistnbsp;herstelt.) Is de eerste waarde vastgelegd, dan zet men het prismanbsp;op 470 mp., regelt oculair- en collimatorspleetbreedten bij en vergelijkt weer de intensiteiten. Zo gaat men verder, zo ver als denbsp;lichtsterkte en het spectrum dat toelaten. De directe metingsuitkom-sten zijn dus aflezingen van de gradenverdeling van het diaphragma,nbsp;geordend naar de golflengten. Aangezien de helderheid van hetnbsp;door dit diaphragma doorgelaten licht recht evenredig is met denbsp;opening in graden, kan men deze metingsuitkomsten direct verwer-

ken als a, (3, enz. in de formule (2) op blz. 20. Voor de bepaling van de factoren (i^ . xj, (ij, � Xj,), enz. in deze formule moet echternbsp;aan een meting een ijking voorafgaan.

De ijking van een opstelling komt in het algemeen hierop neer, dat men aan de hand van een meting aan een bekend objectnbsp;nagaat, welke de apparaatconstanten zijn, die moeten worden ingevoerd bij de berekening van de uitkomsten van een meting aannbsp;een onbekend object. Voorwaarde voor een ijking is, dat de metingnbsp;aan het bekende object onder gelijke omstandigheden geschiedtnbsp;als die aan het onbekende. Hierbij stuit men in het onderhavigenbsp;geval op grote moeilijkheden. Practisch bruikbare ,.bekendenbsp;objecten� zijn gloeidraden van gloeilampen. De gemiddelde temperatuur van deze draden (en daarmede de spectrale intensiteits-verdeling van het door deze draden uitgezonden licht) is doornbsp;de constructie en door het gebruik bij de voorgeschreven spanningnbsp;vastgelegd en voor de verschillende typen van gloeilampen bekendnbsp;(Danckwortt). Deze gloeidraden zijn evenwel niet op die plaatsnbsp;aan te wenden, waar de te meten fluorescentieverschijnselen ontstaan, t.w. tussen euphos- en objectglas. Het licht van de gloei-draad moet dus met behulp van lenzen geconcentreerd worden opnbsp;deze plaats en van daar uit het objectief op dezelfde wijze en innbsp;dezelfde verdeling over de apertuur als het fluorescentielichtnbsp;bereiken. In fig. 2 is de frontlens terzijde nog eens, vergroot, weergegeven. Eronder ziet men het object O en tussen beide F^, hetnbsp;euphosfilter. Het is duidelijk, dat in deze figuur de straal OAnbsp;een kortere weg aflegt door het euphosglas dan de straal OB.nbsp;Daar het euphosglas ook het zichtbare licht verandert, zal OAnbsp;in het verdere verloop anders verzwakt zijn dan OB. Het onderzochte licht is een mengsel van de stralen OA, OB en alle over-gangen hiertussen, zodat streng genomen de spectrale samenstelling van dit menglicht dus afhankelijk is van de verhoudingen,nbsp;waarin deze categorie�n vertegenwoordigd zijn in het licht, datnbsp;door het objectief valt. Het licht van de ijklamp zal in dezelfdenbsp;verhouding aan het objectief aangeboden moeten worden. Nu isnbsp;over de verdeling van het licht uit fluorescerende deeltjes weinignbsp;bekend, daar de factoren, die hierop van invloed zijn, zoals denbsp;vorm van de deeltjes en de eigen absorptie van het fluorescentielicht, in microscopische praeparaten niet bekend zijn. Derhalvenbsp;worden bij de ijking enige benaderingen ingevoerd; het licht vannbsp;een gloeidraadlamp, dat door een condensor, voorzien van eennbsp;matglaasje, op het object O geconcentreerd wordt, is in spectralenbsp;samenstelling gelijk aan dat van de gloeidraad, die het matglaasjenbsp;beschijnt en treedt door �t euphosglas in het objectief met eenzelfde verhouding tussen centrale en periphere stralen als hetnbsp;fluorescentielicht. De overeenkomst tussen de metingsresultaten

bij het gebruik van objectieven van verschillende aperturen en van ijklampen van verschillende �kleurtemperaturen� leert, datnbsp;deze benaderingen bij de bestaande proeffout geoorloofd zijn. Ooknbsp;de chromatische afwijking van het gebruikte immersieobjectiefnbsp;blijkt, bij de afmetingen van onze objecten, de metingsresultatennbsp;niet merkbaar te be�nvloeden.

De verwerking van de bij de ijking verkregen aflezingen geschiedt aan de hand van de formule:

(�a nbsp;nbsp;nbsp;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;=

enz.

waarin de relatieve intensiteit is van de ijklamp voor de golflengte a, in een willekeurige maat uitgedrukt (in procenten van de intensiteit bij 560 m;^ bijv.) en a de aflezing bij de golflengte a.nbsp;De factor C wordt niet bepaald, daar het slechts gaat om relatieve en niet om absolute intensiteitswaarden. Men kiest voor Cnbsp;een waarde, waarvoor de producten (i^ . xj, . x^), enz. prac-tisch bruikbare getallen worden. Zoals men ziet, wordt slechts hetnbsp;product (i. x) bepaald en niet i en x ieder apart. In de practijk isnbsp;de kennis van dit product voldoende, zoals blijkt uit de formule (2)nbsp;op blz. 20. Bij onze opstelling was de spectrale samenstelling vannbsp;het licht van de standaardlamp zelf dan ook niet bekend, daarnbsp;deze lamp op een geringere spanning brandde dan ervoor werdnbsp;voorgeschreven. Dit kwam de levensduur der lamp ten goede ennbsp;bovendien was de aanpassing van de ijkcurve aan het in weefsel-coupes overheersende blauwe fluorescentielicht bij deze spanningnbsp;beter.

Tot de ijking behoort ook de geregelde controle op de juistheid der instelling van de groefjes op de bedieningsknoppen. De prisma-instelling wordt gecontroleerd bij nauwe collimator- ennbsp;oculairspleet aan de hand van het lijnenspectrum van een kwik-lamp. Op grond van hetzelfde lijnenspectrum hebben wij eennbsp;schaal vervaardigd, die aangeeft, op welke afstand in elk spec-traalgebied golflengten, die 20 m^. verschillen, van elkaar verwijderd liggen. Deze schaal is de grondslag voor de controle opnbsp;de breedten v.an oculair- en collimatorspleet bij elk in aanmerkingnbsp;komend spectrumdeel. Dat het hierbij niet om kleine verschillennbsp;gaat, blijkt uit het feit, dat de spleetbreedten bij 450 mp, ruimnbsp;2,5 maal zo groot kunnen zijn als bij 600 mp,. Hieruit blijkt welnbsp;duidelijk, welke winst aan lichtsterkte wij in het blauwe deel vannbsp;het spectrum konden behalen, zonder dat de nauwkeurigheidnbsp;geringer werd dan die, welke in het gebied van 600 mpi mogelijk was.

Tenslotte moet van tijd tot tijd worden nagegaan, of het gaatje in de wijzer van het oculair nog wel juist op de collimatorspleetnbsp;geprojecteerd wordt. Hiertoe worden oculair- en collimatorspleet

wijd opengezet en het totaal reflecterende kwartsprisma onder de microscoopcondensor vervangen door een electrisch natrium-lampje. Staat de spectroscoop op de golflengte der natriumlijnennbsp;ingesteld, dan kan men bij dit monochromatische licht door denbsp;spectroscoop heen het gaatje afgebeeld zien op de collimator-spleet en eventuele ontregelingen nauwkeurig herstellen.

houdingen en zo geven dus ook de metingsuitkomsten energie-verhoudingen aan. Men kan deze verhoudingen weergeven in een ordinatenstelsel, waarin op het horizontale heen de golflengten zijn afgezet en op het verticale een willekeurige verdelingnbsp;is aangebracht. Men vermenigvuldigt alle uitkomsten van eennbsp;meting met een dusdanige, voor alle golflengten gelijke, factor,nbsp;dat de curven op overzichtelijke wijze ten opzichte van ditnbsp;ordinatenstelsel en ten opzichte van elkaar getekend kunnennbsp;worden. Daarbij worden de waarden uitgezet bij de golflengten,nbsp;die bij de bepaling maximaal in de gemeten spectrumdelen vertegenwoordigd waren.

Bayle, Fabre en George (�25) vermenigvuldigden de getallen, die de energieverhoudingen aangaven, nog met de bij de golflengtennbsp;behorende helderheidsco�fficienten van ons oog en kregen zo eennbsp;curve van relatieve helderheidsverdeling. Hetzelfde doet, in hunnbsp;voetspoor, Policard. Inderdaad is de kleur van het onderzochtenbsp;licht hierdoor gekarakteriseerd, doch het gaat bij dit onderzoek nietnbsp;zozeer om de kleur van het licht als wel om een identificatie of eennbsp;typering van de stof, die het licht uitzendt. Hiervoor nu is de curvenbsp;van spectrale energieverdeling even bruikbaar als die van denbsp;spectrale helderheidsverdeling en om de eenvoudiger afleiding tenbsp;verkiezen. Nog afgezien van het feit, dat de gebruikte helderheidsco�fficienten slechts gelden voor een gemiddelden waarnemer bijnbsp;een bepaalde adaptatietoestand en dus slechts van betrekkelijkenbsp;waarde zijn. Slechts in die gevallen, waar het gaat om een juistenbsp;definitie van de kleur van het licht, zoals bij onderzoekingen overnbsp;de physiologie van het zien, of bij proeven op het terrein van denbsp;verlichtingstechniek, is een dergelijke herleiding van de curve vannbsp;spectrale intensiteitsverdeling gerechtvaardigd.

Aan de hand van een getallenvoorbeeld zullen wij de berekeningen, die bij de ijking en de meting uitgevoerd moeten worden, illustreren:

470 mp^: 33�,

dan deelt men dcxir deze waarden (a, (3, y enz. uit de formule (3)) de relatieve intensiteitswaarden van de ijklamp (2400� C), (innbsp;procenten van de intensiteit bij 560 my;,):

450 my: 1,

470 my: 0,93,

Deze waarden zijn niet practisch in curven uit te zetten, daarom kiezen wij voor de factor C de waarde 0, 033, vermenigvuldigennbsp;dus de bovenstaande getallen met 30 en krijgen als bruikbare waarden voor onze ijkcurve:

450 my: 30,

470 my: 28,

Bij de berekening van de uitkomsten van een meting is het proces juist omgekeerd, zoals blijkt uit de formule (2) op blz. 20.

Hier worden de aflezingen in graden vermenigvuldigd met de waarden van de bovengenoemde producten (i^ . xj, (ij^ . x^) enz.,nbsp;en met een geschikte factor, zodat de curven overzichtelijk tennbsp;opzichte van elkaar getekend kunnen worden. Waren dus denbsp;aflezingen:

daar reeds bij de ijking C niet bepaald werd en een willekeurige waarde kreeg, kunnen geen absolute intensiteiten worden opgegeven, in eenheden als erg/sec. cm2. Derhalve worden de bovengenoemde waarden door de keuze van C = 0,1 herleid tot denbsp;practisch bruikbare verhoudingsgetallen:

Uit de berekening van de uitkomsten van de metingen bleek, dat bij elke berekening de aflezingen in graden vermenigvuldigd moeten worden met de bijbehorende producten (i^ . xj, . x^^), enz.,nbsp;welke producten bij de ijking bepaald werden. Aangezien, de waarden van deze producten bij de verschillende ijkingen tamelijk constant werden gevonden, loonde het de moeite tabellen te vervaardigen, waarin de vermenigvuldigingen van deze producten met elknbsp;der mogelijke aflezingen in graden van 5� tot 60� eens en voor alnbsp;waren uitgevoerd en vastgelegd. Na een meting behoefden wij dusnbsp;slechts de uitkomsten dier vermenigvuldigingen in de tabellen op tenbsp;zoeken, hetgeen een belangrijke tijdsbesparing betekende. Wijnbsp;hadden deze tabellen aangelegd voor alle waarden der productennbsp;tussen 35 en 18, zodat wij in het geval, dat de ijkcurve wat andersnbsp;uitviel, slechts door een gelukkige keuze van de factor C zorgden,nbsp;dat de waarden der producten (i^ . x^), (ij^ . Xj^), enz. zich binnennbsp;deze grenzen bewogen, om voor elke golflengte over een dergelijkenbsp;rekentabel te beschikken. In het geval van de ijkcurve op grafiek 1nbsp;waren dus slechts de tabellen voor de waarden 30, 28, 25, 24, 23,nbsp;en 22 nodig; bij andere uitkomsten van de ijking hadden wij bijvoorbeeld die voor de waarden 27 en 21 bovendien van node.

Het meetbereik is afhankelijk van de intensiteit en het spectrum van het te onderzoeken licht. Bij onderzoek aan de eigen fluorescentie van celbestanddelen in dunne coupes zijn metingen mogelijknbsp;van 450 tot 570 of 590 m^r, al naar de kleur van het licht. De sterktenbsp;van het fluorescentielicht van dergelijke, niet met fluorochromennbsp;behandelde coupes was nog juist zo groot, dat met de methodenbsp;metingen mogelijk waren; absolute metingen over de lichsterkten,nbsp;die met onze methode nog meetbaar zijn, werden niet verricht. Denbsp;kleinste afmetingen van de vlakjes, welker fluorescentie in coupesnbsp;van 5 dikte bij onze optiek gemeten konden worden, bedroegennbsp;ongeveer 5 ^ in het vierkant, De nauwkeurigheid, waarmede denbsp;metingen gereproduceerd konden worden, was aan de uiteindennbsp;van het meetbereik geringer dan in het midden, gemiddeld bedroegnbsp;de afwijking evenwel niet meer dan 5 %.

De hiervoor beschreven opstelling is niet in korte tijd ontstaan; eerst gedurende vele proefnemingen bleek het belang van de, in de inleiding tot dit hoofdstuk genoemde, factoren voor hetnbsp;welslagen der metingen. Bovendien moesten talrijke vraagstukkennbsp;van gering principieel, doch van groot practisch belang, opgelostnbsp;worden. De grootste moeilijkheden betroffen de wisseling van hetnbsp;licht voor de verkrijging van het successieve contrast, de ultraviolet-filters, de standaardlichtbron en de plaatsing van �t euphos-filter.

Vermeulen en Hagedoorn geven een wisselmechanisme aan, waarbij de afwisseling tussen te meten licht en standaardlichtnbsp;geheel automatisch en regelmatig geschiedt. Een hoorbaar signaalnbsp;diende daarbij als waarschuwing voor den onderzoeker, dat denbsp;overgang van de ene lichtsoort op de andere geschiedde. Ditnbsp;systeem beviel ons niet, daar het bleek, dat het voor een metingnbsp;niet noodzakelijk was, dat de beide lichtsoorten evenlang werdennbsp;waargenomen en dat metingen bij de allergeringste intensiteitennbsp;een grotere tussenpoos tussen de wisselingen eisten dan die bijnbsp;iets grotere helderheden. Bovendien hield het hoorbare signaalnbsp;voor ons een element van verrassing in zich, dat de uitkomstennbsp;der metingen nadelig be�nvloedde. In verband hiermede kozen wijnbsp;het beschreven wisselmechanisme, dat deze nadelen niet vertoont;nbsp;men heeft het tempo der wisselingen geheel in de hand en kentnbsp;volkomen zeker het moment van de overgang van de ene lichtsoort op de andere. Op een mogelijkheid, om de invloed van denbsp;ultraviolette stralen op het object tot een minimum te beperkennbsp;bij het gebruik van de successief-contrast-methode, moet in ditnbsp;verband nog gewezen worden; in gevallen, waar de inwerkingnbsp;van de ultraviolette straling op het praeparaat de metingen onmogelijk maakt, kan men aan het lichtwisselmechanisme mechanisch of electrisch een onderbreker voor de ultraviolette stralingnbsp;koppelen, zodat deze straling slechts gedurende de tijd, dat het

fluorescentielicht door het metende oog gepercipieerd wordt, tot het praeparaat wordt toegelaten. Op deze wijze kan de schadelijke invloed van dit ultraviolette licht zeer belangrijk beperktnbsp;worden, zoals in een dergelijke, door ons gebruikte, opstellingnbsp;bleek.

Uit een streven om een voor meerdere golflengten bruikbaar �universeel� filter toe te passen, vloeiden, experimenten voortnbsp;met een ,,Christiansen-fiIter voor ultraviolet licht�. Christiansen-filters zijn in het algemeen cuvetten, waarin een vaste stof innbsp;poedervorm en een vloeistof, gemengd, voorkomen. De stoffennbsp;worden z� gekozen, dat zij bij een bepaalde temperatuur slechtsnbsp;voor ��n golflengte een gelijke brekingsindex hebben. Slechts voornbsp;die golflengte is het filter transparant, terwijl het de stralen vannbsp;andere golflengten verstrooit en slechts zeer verzwakt doorlaat.nbsp;Men kan door variatie van de temperatuur van het filter invloednbsp;uitoefenen op de brekingsindices der gebruikte vulmiddelen ennbsp;daarmede op de golflengte, welke maximaal wordt doorgelaten.nbsp;Een dergelijk filter, dat bruikbaar is in het nabije ultraviolet ennbsp;dat door v. Fragstein ('33) werd ontworpen, hebben wij beproefd. Het bleek evenwel, dat het bij dit filter noodzakelijk wasnbsp;het licht van onze kwiklamp van te voren door een nikkeloxyde-glas te zeven, daar het de zichtbare stralen van deze lamp in tenbsp;grote intensiteit doorlaat. Daarmede verviel evenwel het voordeel van de universele bruikbaarheid, daar de transmissie-curvenbsp;van het nikkeloxyde-glas, die een sterke top bij 360 m^. vertoont,nbsp;dit glas niet tot een ideaal v��rfilter stempelt voor gebruik bijnbsp;334 of 313 mj/., daar deze golflengten dus slechts zeer verzwaktnbsp;doorgelaten worden. Hetzelfde bezwaar geldt het door mijnbsp;beproefde Backstr�m-filter. Dit filter bestaat uit een mengsel vannbsp;oplossingen van nikkel- en cobaltsulfaat. Het laat ultraviolet lichtnbsp;van kortere golflengte dan 334 my, door. Bovendien evenwel enignbsp;geel licht en dit is bij ons onderzoek zeer storend. Weliswaar kannbsp;men de laagdikte van het filter veel groter nemen dan in het originele voorschrift staat, bovendien het filter combineren met ��n laagnbsp;nikkeloxyde-glas, doch dan wordt de intensiteit van het doorgelaten licht z� gering, dat metingen aan de er door opgewektenbsp;fluorescentie niet mogelijk zijn. Tenslotte trachtte ik met eennbsp;vloeistoffilter volgens de voorschriften van Kubowitz en Haasnbsp;(�32) de violette kwiklijnen te isoleren. Ook hierbij was de intenrnbsp;siteit van het ge�soleerde licht te gering voor metingen aan denbsp;eigen fluorescentie van cellen.

De grootste moeilijkheden bij de keuze der standaardlichtbron vloeiden voort uit een overschatting van de invloed, die de wisselingen in de spanning van het stadsnet zouden hebben op denbsp;helderheid van de ultraviolette lichtbron (en daarmede op denbsp;helderheid van het fluorescentielicht) en van de standaardlamp.nbsp;Het lag voor de hand een standaardlichtbron te kiezen, waarvannbsp;de helderheid gelijkmatig met die van het te meten fluorescentie-

licht zou vari�ren, dus een door dezelfde ultraviolette lichtbron beschenen fluorescerende standaard. In de practijk is het evenwelnbsp;moeilijk een fluorescerende standaard te vinden, die een geschiktnbsp;emissiespectrum paart aan een absolute ongevoeligheid voor denbsp;ultraviolette bestraling. Onze proeven met mengsels van oplossingen van fluorescerende stoffen leverden in dit opzicht evenminnbsp;iets bruikbaars als experimenten met aan krijt geadsorbeerdenbsp;minerale olie. Het uraanglas, dat als standaard voor dergelijkenbsp;doeleinden wel gebruikt is, vertoont in de spectrale curve eennbsp;stompe top bij 520 tot 540 mj/, met naar beide zijden zeer snelnbsp;afnemende intensiteiten en is dus, gezien de overweging opnbsp;blz. 18, al zeer weinig geschikt als vergelijkingsobject voornbsp;metingen van 450 tot 590 m|ji,. Bovendien verandert de fluores-centiekleur van uraanglas zich volgens Danckwortt reeds bijnbsp;geringe verwarming. Ook Na-salicylaat leent zich op grond vannbsp;het fluorescentiespectrum niet voor het gebruik als standaard,nbsp;daar onze metingen een zeer steil verloop van het blauw naarnbsp;het rood in de spectrale curven lieten zien, ook nog niet, als hetnbsp;licht door een geelfilter gemodificeerd wordt. Op grond van dezenbsp;ervaringen kozen wij tenslotte de aangegeven combinatie vannbsp;nitralamp, filter en reflecterend vlakje, die, zoals de vergelijkingnbsp;van de ijkcurve (grafiek 1) met de curven der blauwe celfluores-centie (grafieken 3 tot 8) in het volgende hoofdstuk doet zien,nbsp;een ideale aanpassing van het standaardlicht aan het gemetennbsp;licht levert. In de practijk blijkt een hinderlijke invloed van denbsp;netschommelingen op de metingen niet te bestaan; deze invloednbsp;blijft beneden de foutengrens der methode.

Op blz. 29 wordt gesproken over het gebruik van het euphos-filter op een plaats, waar de stralen zeer sterk divergent zijn en alle dus trajecten van verschillende lengte in het euphosglasnbsp;afleggen en over de consequenties hiervan voor de ijking. Bijnbsp;vele van de vroegere metingen werd het filter dan ook aangewendnbsp;op een plaats, waar de doorvallende stralen ongeveer parallelnbsp;lopen, t.w. vak boven het objectief. Toen evenwel metingen aannbsp;dunnere coupes noodzakelijk werden, bleek de eigen fluorescentienbsp;van het � bij deze opstelling niet tegen de ultraviolette stralennbsp;beschermde � objectief zo hinderlijk te zijn, dat de nauwkeurigheid der metingen belangrijk verminderde, zodat het euphosglasnbsp;weer als dekglas in gebruik moest komen.

Zo ontstond gaandeweg de in dit hoofdstuk beschreven apparatuur. Natuurlijk werden er reeds metingen verricht, voordat de methode tot de huidige vorm ontwikkeld was: over de resultatennbsp;van deze metingen zal in hoofdstuk VI nog een en ander medegedeeld worden, over de metingen, die gedaan werden met denbsp;hierboven beschreven opstelling, bericht hoofdstuk V.

Urobiline is een kleurstof, die bij den mens in normale faeces en �' in zeer geringe hoeveelheden � in normale urine, voorkomt.nbsp;Deze stof is in water matig, en in vele organische solventia goednbsp;oplosbaar. De oplossingen kenmerken zich door een circumscriptenbsp;lichtabsorptie in de buurt van 490 m;/,. Door gecompliceerdenbsp;extractiemethoden (Terwen (�24) e.a.), kan men het urobiline minnbsp;of meer zuiver isoleren, waarbij blijkt, dat het een, al naar de graadnbsp;van zuiverheid, amorph of kristallijn oranjerood poeder is. Reedsnbsp;de eerste onderzoekers hadden opgemerkt, dat het urobiline vaaknbsp;niet als zodanig in faeces of urine aanwezig was, maar als eennbsp;kleurloos voorstadium, als een chromogeen: het urobilinogeen.nbsp;Deze stof gaat licht door oxydatie over in urobiline, zodat men innbsp;excrementen, die niet onder bijzondere voorzorgsmaatregelennbsp;bewaard zijn, meer urobiline dan urobilinogeen kan aantreffen, ooknbsp;al was de verhouding oorspronkelijk andersom. Deze omzettingnbsp;wordt begunstigd door de aanwezigheid van zuurstof en doornbsp;licht; en eerst recht door de aanwezigheid van oxydantia.

Het onderzoek naar de constitutie van urobiline en urobilinogeen bevestigde het reeds op klinische en experimentele gronden aangenomen verband tussen deze stoffen en de afbraakproducten dernbsp;bloedkleurstof. Het bleek n.1., dat urobiline de volgende formulenbsp;bezit (Siedel en Meier (�36)):

CHrC-

-C-CiHs

OH-C.

-C-C. nbsp;nbsp;nbsp;��C==C.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.C-

urobiline

C-

�OH

Het molecuul bestaat dus uit een gestrekte keten van 4 pyrrol-kernen. Uit de plaatsing der substituenten is het bewezen, dat deze verbinding ontstaat uit bilirubine, welke stof uit een dergelijkenbsp;keten bestaat. Bilirubine nu is direct af te leiden van de geslotennbsp;ring van 4 pyrrolkernen, die de prosthetische groep in het haemo-globinemolecuul vormt. Urobiline is een schakel in de keten vannbsp;producten, die bij de afbraak van de bloedkleurstof ontstaan. Dezenbsp;keten voert via biliverdine en/of bilirubine over mesobilirubinogeen,nbsp;dat identiek is met urobilinogeen, tot urobiline. De omzetting vannbsp;bilirubine in mesobilirubinogeen is een reducticproces, die vannbsp;mesobilirubinogeen in urobiline een oxydatie.

De laatste onderzoekingen hebben geleerd, dat er een stof voorkomt in normale faeces en urine, die sterk op urobiline lijkt en eerst kort geleden als chemisch en physisch ervan verschillendnbsp;is herkend; stercobiline (Fischer en Halbach (�35)). Siedel ennbsp;Grams (�40) pleiten voor de volgende structuurformule, die hetnbsp;beste zou overeenkomen met de chemische verschillen tussennbsp;urobiline en stercobiline:

CH2COOH CH2COOH

CH2 nbsp;nbsp;nbsp;CH2

I nbsp;nbsp;nbsp;I

-C nbsp;nbsp;nbsp;C==C-CH3 CHj-C-

�C-C^Hs CH3-C-

OH I

'C. nbsp;nbsp;nbsp;r�c=cnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�c-

sfepcooii/ne

�//

Stercobiline is dus 4 H-atomen rijker dan urobiline. Het onderscheidt zich van urobiline o.a. door zijn optische activiteit en door de grotere weerstand tegen de oxydatie met FeClg. De constitutienbsp;maakt het zeer waarschijnlijk, dat ook stercobiline uit bilirubinenbsp;ontstaat, doch dit geschiedt niet via urobilinogeen. Wel is hetnbsp;bestaan van een aan dit chromogeen analoog voorstadium van hetnbsp;stercobiline waarschijnlijk (Watson (�36)). Over de verhoudingen,nbsp;waarin de stoffen urobiline en stercobiline naast elkaar voorkomen,nbsp;is nog zo goed als niets bekend; beide zijn in normale faeces aangetroffen (Halbach (�38)).

Over de normale stofwisseling van urobiline en stercobiline zijn alleen gegevens bekend uit proeven en waarnemingen, waarbijnbsp;met het verschil tussen de beide stoffen geen rekening is gehouden.nbsp;Aangezien stercobiline dezelfde reacties geeft, die gewoonlijk voornbsp;de Impaling van urobiline gebruikt worden, hebben de onderzoekers v��r �35 beide stoffen gezamenlijk bepaald. Voor een historischnbsp;overzicht der theorie�n, die naar aanleiding van het urobiline-vraagstuk opgesteld zijn, kan verwezen worden naar het uitstekende samenvattende artikel van Royer (�35). De situatie wasnbsp;toen z�, dat genoemde auteur liever spreken wilde van denbsp;,,enterohepatische kringloop van het urobiline� als van een wet dannbsp;als van een theorie. Deze opvatting zegt, dat urobiline (resp.nbsp;urobilinogeen) all��n in de darm ontstaat uit bilirubine; dat eennbsp;deel hiervan geresorbeerd wordt en uit het bloed, dat door denbsp;V. portae de lever bereikt, door dit orgaan quantitatief verwijderdnbsp;wordt. Slechts als het aanbod veel groter is dan normaal, of wanneer de leverfunctie te kort schiet, kan een deel van het urobilinenbsp;(of van het urobilinogeen) de rest van de bloedsomloop bereiken.nbsp;Dan wordt het door de nieren opgevangen en in de urine uitgescheiden. (Zo geldt de urobilinetest in de urine in de kliniek als eennbsp;gevoelige reactie op de functie van de lever voor die gevallen,nbsp;waarin men mag aannemen, dat de productie en de resorptie van

het urobiline normaal is.) Sinds de klassieke en veel geciteerde proeven van Fr. v. M�ller op dit gebied heeft het evenwel nietnbsp;ontbroken aan pogingen om te bewijzen, dat urobiline ook opnbsp;andere plaatsen dan in de darm kan ontstaan. Een verzameling vannbsp;argumenten in deze richting kan men vinden in een recente publicatie van Halbach ('38). Deze auteur betrekt ook het stercobilinenbsp;in zijn discussie en breekt een lans voor de hepatogene ontstaanswijze van deze stof. In dat geval zou dus de physiologie van hetnbsp;stercobiline een geheel andere kunnen zijn dan die van urobiline.nbsp;Het is echter de vraag, in hoeverre sommige der door hem genoemde proeven de toets der kritiek kunnen doorstaan. Dit geldtnbsp;speciaal voor de reacties met Schlesingers reagens op urobiline innbsp;bloedserum (Dymschitz (�28), Brunner (�35)), die zonder spectro-photometrische controle eigenlijk niet specifiek genoeg zijn. Eennbsp;zeer originele en interesscuite kijk op het urobilinevraagstuk geeftnbsp;tenslotte Ten Bokkel Huinink (�41). Zijn conclusies komen er voornbsp;de ontstaanswijze van urobiline (resp. urobilinogeen) op neer, datnbsp;slechts in de darm urobilinogeen ontstaat en wel alleen uit extra-hepatisch gevormde bilirubine, De door de lever zelf geproduceerdenbsp;bilirubine zou daarentegen niet in urobilinogeen worden omgezet.

De bovenstaande opmerkingen geven zeker geen volledige indruk van het urobilineprobleem, doch wel doen zij zien, dat nog lang nietnbsp;alles over de urobiline- en stercobilinestofwisseling bekend is, zodatnbsp;een histologische methode, die ons in staat stelt om deze stoffennbsp;in de cellen op te sporen en eventueel te localiseren, dus bijzondernbsp;welkom moet zijn.

Voor het aantonen en bepalen van urobiline, zowel als voor stercobiline en de corresponderende chromogenen, zijn voornamelijknbsp;twee reacties in gebruik: de reactie van Schlesinger en die met hetnbsp;reagens van Ehrlich (paradimethylaminobenzaldehyd). De eerstenbsp;reactie is er een op urobiline en stercobiline, de tweede wordt alleennbsp;gegeven door de chromogenen. Wenst men met de eerste reactie ooknbsp;deze ,,leucoverbindingen� te bepalen, dan voegt men een zwaknbsp;oxydatiemiddel toe; jodiumtinctuur is geschikt voor dit doel.nbsp;Wil men bij de tweede reactie ook de kleurstoffen in de bepaling betrekken, dan moet men die reduceren tot de chromogenen.

De betrouwbaarheid dezer reacties in hun uitvoering als quanti-tatieve of qualitatieve methode wordt verschillend beoordeeld. Royer (�35) pleit voor de fluorescentiereactie van Schlesinger,nbsp;Terwen (�24) voor de kleurreactie met Ehrlich�s reagens. Nau-mann (�36) vergeleek de beide methoden in de kliniek en vond,nbsp;dat de fluorescentiereactie als qualitatieve methode betere uitkomsten gaf dan de reactie van Ehrlich. Ten Bokkel Huininknbsp;tenslotte verwerpt de reactie van Schlesinger als quantitatievenbsp;methode en houdt zich aan de Watson-Terwen�se uitvoering vannbsp;de reactie met het aldehydereagens. Wij kozen voor de histologische methode de fluorescentiereactie.

uitvoering van de reactie van Schlesinger, dan blijkt het volgende: De reactie van Schlesinger berust op de geelgroene fluorescentie,nbsp;die een verbinding tussen urobiline en zink vertoont. Deze fluorescentie wordt volgens Naumann in urine het best zichtbaar,nbsp;wanneer men het originele voorschrift van Schlesinger volgt ennbsp;de urine, dieniet zuur mag zijn, verdunt met een gelijk deel reagensnbsp;(een 10 % suspensie van zinkacetaat in alcohol) en filtreert. Mennbsp;verdeelt de vloeistof over twee buisjes en voegt aan de inhoudnbsp;van ��n der buisjes een paar druppels verdund zoutzuur toe. Innbsp;dat buisje verdwijnt de fluorescentie van het eventueel aanwezigenbsp;urobilinezink, zodat het als vergelijkingsobject kan dienen. Nadatnbsp;men de fluorescentie in het andere buisje heeft waargenomen,nbsp;voegt men aan elk buisje enkele druppels van n/10 jodiumoplos-sing toe en vergelijkt opnieuw. Een toename in de fluorescentienbsp;duidt aan, dat in de vloeistof aanwezig chromogeen geoxydeerdnbsp;is tot urobiline (resp. stercobiline). Door vergelijking met fluorescerende standaarden kan men de methode tot een quantitatievenbsp;maken. Welke zijn nu de mogelijke fouten bij deze en dergelijkenbsp;bepalingen?

a. nbsp;nbsp;nbsp;Niet alleen urobiline reageert met zink onder vorming vannbsp;een groen fluorescerende verbinding. Dit is zeker zo, wantnbsp;ook het van urobiline chemisch verschillende stercobiline geeftnbsp;de reactie en wel op volkomen gelijke wijze. Ook in het fluo-rescentiespectrum is geen verschil waar te nemen. (Fischernbsp;en Halbach (�35), Siedel en Meier (�36)). Bovendien toondenbsp;Fischer (�ll), (�23), (�31) aan, dat nog andere stoffen metnbsp;pyrrolstructuur, zelfs zulke met slechts 2 pyrrolkernen, metnbsp;zinkacetaat een groene fluorescentie kunnen vertonen. Hijnbsp;geeft echter geen fluorescentiespectra. Deze verbindingen verliezen evenwel hun belang als foutenbronnen door het feit,nbsp;dat zij nog niet in de natuur gevonden zijn. Hetzelfde geldtnbsp;voor het met zink eveneens groen fluorescerende oxydatie-product van bilirubine, het choleteline.

b. nbsp;nbsp;nbsp;Er zijn andere groen fluorescerende stoffen in het reactie-mengsel. Deze fout kan ons vooral dan parten spelen, als hetnbsp;zuur in het controlebuisje, dat de fluorescentie van de uro-bilinezinkverbinding uitdooft, ook de storende fluorescentienbsp;opheft, zoals dat met de groene fluorescentie van lactoflavinenbsp;het geval is. Eerst goed loopt men de kans op dergelijke vergissingen als men in het geheel geen controles gebruikt ennbsp;alleen op de fluorescentie afgaat, zonder spectrophotometrienbsp;van het fluorescentielicht, zoals Brunner (�35) deed bij hetnbsp;onderzoek naar het voorkomen van urobiline in bloed. Hetnbsp;was naar aanleiding van dit onderzoek, dat Heilmeyer ennbsp;Ohlig (�36) wezen op twee stoffen, die aan het serum eennbsp;fluorescentie kunnen verlenen, welke gelijkt op die van de

urobilinezink-verbinding: lactoflavine en bilirubine. De welbekende spectrale verdeling van het fluorescentielicht van lactoflavine maakt verwisseling met dat van urobilinezinknbsp;bij spectrophotometrisch onderzoek onwaarschijnlijk. Over denbsp;fluorescentie van bilirubine in het serum is niet veel bekend.nbsp;Dh�r� volstaat in zijn zeer volledig gedocumenteerde mono-graphie (�37) met de opmerking, dat oplossingen van bilirubine geen duidelijke fluorescentie vertonen, behalve die innbsp;chloroform, welke geel-groen oplicht. Heilmeyer en Ohlignbsp;merken evenwel op, dat bilirubine aan het serum een fluo-rescentiekleur geeft, die wat blauwer is dan die van urobilinezink, zodat ook deze foutenbron spectrophotometrisch ge�limineerd moet kunnen worden.

c. nbsp;nbsp;nbsp;Er ontstaat tijdens de reactie of tijdens de belichting urobiline,nbsp;dat oorspronkelijk niet aanwezig was. Dat het eerste heel goednbsp;mogelijk is bewijst reeds de toevoeging van jodiumtinctuurnbsp;aan een oplossing van urobilinogeen, dat onmiddellijk daaropnbsp;overgaat in urobiline, dat met zink reageert. Bovendien bewezen Barrenscheen en Weltmann (�23) bij hun critiek opnbsp;urobilinebepalingen volgens Adler, dat ook uit andere stoffennbsp;dan urobilinogeen stoffen kunnen ontstaan, die de urobiline-reactie geven. Adler bepaalde het gehalte van bloedserum aannbsp;urobiline en urobilinogeen door middel van de reactie vannbsp;Schlesinger en voegde soms daarvoor jodium als mild oxydansnbsp;toe. Barrenscheen en 'Weltmann toonden echter aan, dat eruit het serumbilirubine onder de invloed van het jodium stoffennbsp;ontstonden, die met zink een groene fluorescentie vertonen;,nbsp;welke niet van die van urobilinezink is te onderscheiden. Eennbsp;aanduiding, dat bij lang belichten in het reactiemengsel urobiline kan ontstaan, geven Bierry en Larguier des Blancelsnbsp;(�11). Het was hun opgevallen, dat in een oplossing vannbsp;chlorophyll in alcohol onder de invloed van de bestraling metnbsp;kwiklicht een product ontstond, dat met Ehrlichs en Schle-singers reagentia positief reageerde. Gouzon (�33) onderzochtnbsp;dit proces nader en photographeerde de fluorescentiespectra vannbsp;porphyrine- en chlorophylloplossingen, waaraan zink was toegevoegd, aan het begin en aan het einde van een langdurigenbsp;bestraling met ultraviolet licht. Hij zag dan, dat de streep innbsp;het rood, die de fluorescentie van chlorophyll en van porphyrine kenmerkt, plaats had gemaakt voor de voor urobilinezink karakteristieke band in het groen en het geel.

d. nbsp;nbsp;nbsp;Tenslotte is het mogelijk, dat in het reactiemengsel factorennbsp;aanwezig zijn, die de vorming of de fluorescentie van de uro-bilinezinkverbinding verhinderen. Op een van beide wijzennbsp;werkt de overmaat zuur in het contr�lebuisje. In hoeverrenbsp;fluorescentie-uitdovende factoren de uitslag van de reactie van

Schlesinger kunnen be�nvloeden, is niet bekend. Bij quantita-tieve bepalingen met deze reactie moet met de mogelijkheid van fluorescentie-uitdoving zeker rekening gehouden worden.

Deze opsomming van de bekende foutenbronnen der reactie van Schlesinger maakt duidelijk, dat men de uitkomsten van dezenbsp;reactie in zijn gewone vorm slechts met reserve kan aanvaarden,nbsp;doch dat de betrouwbaarheid veel groter wordt, wanneer mennbsp;het fluorescentielicht spectrophotometrisch onderzoekt. Op dezenbsp;voorwaarde is een poging gerechtvaardigd, een uitvoeringsvormnbsp;der reactie te vinden, die het aantonen van urobiline en stereo-biline in coupes mogelijk maakt.

Te meer, daar het fluorescentiespectrum van de urobilinezink-verbinding uit de onderzoekingen van Dh�r� en Roche ('31) goed bekend leek te zijn. De auteurs geven als voornaamste band in ditnbsp;spectrum op; die van 515 tot 527 mjj^, naar de rode zijde gevolgdnbsp;door enkele minder intensieve banden, waarvan de dichtsbijzijnde,nbsp;die van 540 tot 560 m^., bij langere belichting op de spectrogram-men versmelt met de eerdergenoemde. Deze band bij 540 tot 560 mjji.nbsp;was evenwel niet zo duidelijk bij een monster van Ter'wens urobiline, als bij een derivaat van het synthetische mesobilirubinogeen.

Wij onderzochten urobilinemonsters na toevoeging van zink-acetaat in alcoholische oplossing en kwamen tot de volgende resultaten:

Binnen het meetbereik werd slechts ��n band, die in de spectro-photometrische curven werd weergegeven door een steile top bij 510 en 520 m(/� gevonden. Deze metingen betreffen een urobiline-monster van 'Terwen, een waterig faeces-extract en de urine vannbsp;een patient met uitgesproken urobilinurie. Deze uitkomsten lekennbsp;zo overtuigend, dat wij een oplossing van zuivere urobiline bij eennbsp;muis intraperitoneaal inspoten, het dier na een kwartier dooddennbsp;en het mesenterium na een korte behandeling met zinkacetaat innbsp;alcohol via xylol insloten in paraffineolie en onder het fluorescentie-microscoop onderzochten. In het mesenterium vonden wij zeer helder groen fluorescerende strengen, waarschijnlijk bloed of lymphe-vaten, afwisselend met veel minder duidelijk oplichtende gedeelten.

De meting liet evenwel niet de verwachte top bij 510 en 520 mjjL zien, doch een bredere top, die zich uitstrekte van 510 tot 530 mpr,nbsp;zodat de overeenkomst met de reeds bekende curven niet zeernbsp;bevredigend was. Eerst later bleek, dat met zuivere urobiline ooknbsp;een dergelijke brede top in de curve is te bereiken, door de omstandigheden, waaronder de zuivere urobilinezink-verbinding gemetennbsp;wordt, beter aan die waarbij de weefsels onderzocht worden, gelijknbsp;te maken. Het bleek n.l., dat urobiline, dat op een objectglas wordtnbsp;opgelost en gemengd met een alcoholische zinkacetaat-oplossing ennbsp;vervolgens gedroogd en ingesloten in paraffineolie, bij meting eveneens de top van 510 tot 530 mpi, vertoont, op volmaakt gelijke wijzenbsp;als de urobiline, die kunstmatig in weefsels gebracht is. Eerst toennbsp;ons de invloed, die de omstandigheden, waaronder de urobilinezink-

verbinding onderzocht wordt, uitoefenen op de details van het fluorescentiespectrum, duidelijk geworden was, stond de weg totnbsp;nieuwe experimenten over de beste wijze van behandeling dernbsp;coupes open.

Een histologische methode voor het aantonen van urobiline in de cel zou er als volgt uit kunnen zien: van het weefsel wordennbsp;coupes vervaardigd, op die coupes laat men een zinkacetaat-bevat-tend reagens inwerken en men onderzoekt de coupes vervolgens innbsp;een ge�igend insluitmiddel onder het fluorescentiemicroscoop. Vindtnbsp;men in de dusdanig behandelde coupes groene fluorescentie, en innbsp;onbehandelde coupes niet, dan is de aanwezigheid van urobilinenbsp;waarschijnlijk, doch voldoende mate van zekerheid verkrijgt mennbsp;eerst door het spectrophotometrisch onderzoek van de gevondennbsp;fluorescentie. Daarbij moet men er zorg voor dragen, dat denbsp;urobiline inderdaad door het reagens bereikt wordt op de plaats,nbsp;waar dit in het levende organisme aanwezig is. Tijdens de bewerquot;nbsp;kingen, die het weefsel ondergaat, voordat het als ingesloten coupenbsp;onder het fluorescentiemicroscoop ligt, mogen dus geen medianbsp;gebruikt worden, die urobiline of het reactieproduct oplossen, tenzijnbsp;deze stoffen van te voren dusdanig in de cel gefixeerd worden, datnbsp;ook oplossende media hen niet uit de coupe verwijderen of in denbsp;cel verplaatsen. De mogelijkheid om het weefsel slechts te behandelen met vloeistoffen, waarin urobiline en stercobiline zowel als hunnbsp;chromogenen en de reactieproducten niet oplossen (xylol, paraffine-olie e.d.), komt niet in aanmerking, daar niet alleen de praeparatennbsp;bij een dergelijke behandeling histologisch niet fraai zijn, dochnbsp;bovendien een zinkverbinding, die in een dergelijk oplosmiddelnbsp;wordt aangeboden, niet met urobiline reageert. Dit bewezen proeven, die wij deden met urobilinepartikeltjes op een objectglas, toegedekt met een dekglas. Indien men deze partikels onder hetnbsp;fluorescentiemicroscoop beziet, dan vindt men slechts de rodenbsp;fluorescentie van het vaste urobiline. Laat men dan, tijdens de waarneming, van opzij een oplossing van zinkacetaat in alcohol toevloeien, dan ziet men hoe het urobiline snel oplost, terwijl zich denbsp;vorming van de urobilinezink-verbinding kenbaar maakt door denbsp;intensief groene fluorescentie, die de vloeistof aanneemt. Iets dergelijks kan men waarnemen, indien men in plaats van aethylalcohol,nbsp;methyl- of isobutylalcohol gebruikt als oplosmiddel voor het zinkacetaat, of glycerine en, in mindere mate, water. Het urobiline lostnbsp;evenwel niet op en er ontstaat geen groene fluorescentie in suspensies van zinkacetaat in xylol, tetrachloorkoolstof, aether e.d.nbsp;P. W. O. Wyga, chem. drs., bereidde voor ons zinkstearinaatnbsp;(waarvoor wij hem hier hartelijk dank zeggen), doch in een oplossing van deze stof in paraffineolie vormde zich evenmin een groennbsp;fluorescerende urobilinezink-verbinding. Als bruikbare zinkzoutennbsp;voor de fluorescentieproef op urobiline noemt Steensma (�18) het

acetaat en het chloride: als geschikte en gelijkwaardige oplosmiddelen hiervoor; methylalcohol, aethylalcohol, glycerine en aceton. In deze stoffen lossen alle in aanmerking komende substanties:nbsp;urobiline, stercobiline enz. op. De reactie op urobiline �in situ�nbsp;moet dus geschieden met een urobiline-oplossend reagens. Nu blijktnbsp;evenwel, dat bij fixatie der celeiwitstoffen althans een deel van hetnbsp;aanwezige urobiline dusdanig verankerd wordt, dat het door eennbsp;kort verblijf in alcohol niet uit de coupes verwijderd wordt. Daarbijnbsp;behoudt het urobiline het vermogen om te reageren met zinkacetaatnbsp;onder vorming van het fluorescerende product. Bij een langdurignbsp;oponthoud in de alcoholische zinkacetaat-oplossing lost het urobi-linezink evenwel uit de coupes op, zodat het reagens slechts kortnbsp;mag inwerken en voor de observatie vervangen moet worden doornbsp;een inactief insluitmiddel. Hiertoe leent zich paraffinum liquidum,nbsp;waarin de urobilinezink-verbinding niet oplost en haar fluorescentienbsp;behoudt.

De techniek, die wij op grond van deze overwegingen uitwerkten en beproefden op weefsels, die veel urobiline bevatten, is denbsp;volgende:

a. nbsp;nbsp;nbsp;Snijden van het verse weefsel op het vriesmicrotoom met onderkoeld mes (Schultz-Brauns (�32)) en opplakken van de coupenbsp;op de voor deze methode aangegeven wijze:

b. nbsp;nbsp;nbsp;korte fixatie (enkele seconden) in alcohol 70 %, resp. in alcoholnbsp;70 %, verzadigd met zinkacetaat, of in alcohol 70 %, verzadigdnbsp;met zinkacetaat, waaraan enkele druppels tinctura jodii zijnnbsp;toegevoegd:

c. nbsp;nbsp;nbsp;snel doorvoeren door alcohol absolutus (resp. door alc. abs. nbsp;zinkacetaat, of door alc. abs. zinkacetaat J):

De door Schultz-Brauns aangegeven v��rfixatie van de coupe in osmiumzuur-damp moet vervallen wegens de sterk uitdovendenbsp;werking van zware metalen op fluorescentieverschijnselen.

Zoals uit de beschrijving van de techniek blijkt, werden telkens drie categorie�n van praeparaten vervaardigd, n.1. coupes, dienbsp;tijdens de gehele bewerking niet met zink in aanraking kwamen,nbsp;coupes, die met zinkacetaat behandeld werden en coupes, waarnbsp;zowel jodium als zinkacetaat op inwerkten. Zo werd getracht omnbsp;tot eeni differentiatie te geraken tussen de in de cellen aanwezigenbsp;kleurstoffen en hun chromogenen. In de praeparaten van de eerstenbsp;categorie kan dan geen fluorescentie van de urobilinezink-verbinding optreden, in die van de tweede soort alleen fluorescentienbsp;tengevolge van het aanwezige urobiline en in de derde categorienbsp;van coupes zou de fluorescentie van de door het jodium geoxy-deerde chromogenen daar nog bijkomen. Soms vindt men evenwelnbsp;in de niet met zink behandelde praeparaten reeds de typische

fluorescentie, zij het niet in die sterkte, welke de zink-praeparaten tonen. Of in dat geval het weefsel of wellicht de reagentia genoegnbsp;zink bevatten in een vorm, die met het urobiline reageren kan,nbsp;of dat urobiline ook zonder zink-toevoeging groen kan fluoresceren, is niet uitgemaakt. (Dat alle weefsels wel enig zink bevatten is zeker (Sluiter (�30) en evenzo is het mogelijk, dat denbsp;alcohol die bij de behandeling van de coupes gebruikt wordtnbsp;sporen van dit metaal bevat. Dat zuivere urobiline in oplossingnbsp;groenig kan fluoresceren, toonden Siedel en Meier aan voor denbsp;oplossing in chloroform van het hydrochloride,) Tussen de prae-paraten, die met en zonder toevoeging van jodium aan het zink-acetaatreagens waren behandeld, werd nooit enig verschil opgemerkt. De meest plausibele verklaring hiervan is, dat al het aanwezige urobilinogeen in de dunne coupe door de in de lucht ennbsp;de reagentia aanwezige zuurstof volledig tot urobiline geoxydeerdnbsp;wordt, zodat de toevoeging van een oxydans overbodig is. Hetzelfde ziet men, in veel langzamer tempo, in urine en faeces (o.a.:nbsp;Naumann). Coupes van weefsels, waarin het gehalte aan urobilinogeen, door mij in oplossing bereid door reductie van eennbsp;faecessuspensie met Mohr�s zout volgens Terwen, kunstmatignbsp;verhoogd was, lieten evenmin enig verschil tussen beide categorie�n van praeparaten zien als die van weefsels, waarin het uro-biline-gehalte verhoogd was.

De op de boven aangegeven wijze vervaardigde coupes werden onder het fluorescentiemicroscoop bekeken en, de delen, die daarvoor in aanmerking kwamen, werden spectrophotometrisch onderzocht met de in het vorige hoofdstuk beschreven opstelling. Hiertoe moet het normale dekglas, waarmede het praeparaat na denbsp;vervaardiging werd afgedekt, opzij geschoven worden en vervangen worden door het euphos-dekglas. Hiervan werd n.1, steedsnbsp;eenzelfde exemplaar gebruikt, want in de ijking van de apparatuurnbsp;is de absorptie van dit speciale dekglas verwerkt,

De opwekkende straling bestond voornamelijk uit de band bij 366 mjx- Het zal blijken, dat voor het spectrophotometrisch onderzoek op urobiline, het gehele spectrum van 450 tot 570 mj/, gemeten moet kunnen worden. De opwekkende stralen moeten bijnbsp;onze opstelling dus buiten dit gebied vallen, en de enige golflengte, korter dan 450 m|x, die bij de bestaande lichtbronnen ennbsp;filters in voldoende sterkte enigszins zuiver ge�soleerd kan worden,nbsp;is die van de genoemde band bij 366 mj/., (Policard en Leuliernbsp;(�24) toonden aan, dat het product van de reactie van Schlesingernbsp;ook bij bestraling met deze golflengte intensief fluoresceert.nbsp;Deze waarneming is niet in strijd met de recente publicatie vannbsp;Pruckner en Stern (�37) over de lichtabsorptie van urobiline ennbsp;verwante stoffen. Weliswaar geven deze auteurs geen absorptie-curven van het urobilinezink-complex, doch wel die van urobiline^nbsp;van kryptopyrrhometheen en van het zinkcomplex van de laatstenbsp;stof. Al deze stoffen vertonen, behalve de karakteristieke absorptie

in het zichtbare deel van het spectrum, ook een duidelijke band in het gebied van 366 mj/, en de overeenkomst tussen al de gepubliceerde curven maakt het zeer waarschijnlijk, dat de absorptienbsp;van het urobilinezink-complex in dezelfde streek eveneens aanzienlijk is.) De stabiliteit van de urobilinezink-verbinding in ditnbsp;ultraviolette licht is vrij groot.

In het fluorescentiebeeld van de praeparaten overheerst de blauwe fluorescentie. Bindweefselvezels fluoresceren helder blauw,nbsp;veel minder helder licht het protoplasma van de cellen op. Hiernbsp;en daar ziet men (althans in de op de boven aangegeven wijzenbsp;vervaardigde praeparaten) bindweefselcellen, beladen met lichtblauwe korreltjes. Elders zijn deze partikeltjes in het protoplasmanbsp;helder geel. (Voor nadere opgaven over de eigen fluorescentienbsp;in histologische praeparaten zij verwezen naar de monographienbsp;van Haitinger (�38). Deze auteur wijdt weliswaar zelf de meestenbsp;aandacht aan de secundaire fluorescentie, doch hij geeft waarde-volle literatuuropgaven op het punt van de primaire weefsel-fluorescentie.) De ruimten tussen de weefseldelen zijn min ofnbsp;meer donker, doch hoe betrekkelijk dit donker is, blijkt, wanneernbsp;men in het praeparaat een pigmentcel opzoekt, zoals die in denbsp;lever van de kikker zoveel voorkomen. In deze cellen ziet mennbsp;geelrood fluorescerende lichamen, doch ook enkele volmaaktnbsp;zwarte gedeelten: de pigmentbrokken zijn vrij van elke fluorescentie en absorberen alle licht. Vergelijking van de helderheidnbsp;van deze zwarte gedeelten met die van de weefselspleten leert,nbsp;dat de ultraviolette stralen niet alleen in het weefsel, doch ooknbsp;in het objectglas, in de paraffineolie of in het euphosglas of wellicht in alle drie fluorescentie opwekken. Deze fluorescentie, dienbsp;als een licht waas over het beeld heen ligt, stoort de waarnemingnbsp;niet merkbaar, doch moet bij de meting in rekening gebrachtnbsp;worden.

Wanneer men gewend raakt aan het beeld van de weefsel-coupes in het eigen fluorescentielicht, wordt het allengs mogelijk om histologische en microscopisch-anatomische bijzonderheden tenbsp;herkennen. De kernen zijn vaag in hun omtrekken te zien, groterenbsp;bloedvaten verraden zich door de fluorescentie van de bindweefselvezels in de wand, in de lever kan men celbalken onderscheiden en duidelijk is te zien welke openingen bloedcapillairennbsp;voorstellen. In praeparaten van de kikkerlever zijn de parenchym-cellen veelal wat geschrompeld, zodat zij alle door een smalnbsp;spleetje van hun buren gescheiden zijn. In de menselijke levernbsp;vindt men in het midden der celbalken geelrood fluorescerendenbsp;bolletjes, waarvan de fluorescentiekleur na korte bestraling overgaat in geel-groen, in de stercellen van v. Kupffer liggen heldernbsp;fluorescerende ,.brokken� van weer een andere tint geel en mennbsp;geraakt onwillekeurig diep onder de indruk van de schoonheidnbsp;der beelden, die deze methodiek ons levert.

den, doch deze metingen hebben eerst zin, als zij ons iets leren omtrent de aard der fluorescerende stoffen. Dit nu eist de kennisnbsp;van de fluorescentie en speciaal van de fluorescentiespectra vannbsp;deze stoffen in zuivere toestand. Derhalve zal hier verder alleennbsp;bericht worden over de fluorescentiespectra van deze weefsel-coupes in verband met het onderzoek naar het voorkomen vannbsp;een stof, waarvan het fluorescentiespectrum ons goed bekend was,nbsp;het urobiline- (resp. het stercobiline-) zink.

Vergelijkt men de coupes, die met zinkacetaat behandeld werden, met die, welke niet met dit reagens in aanraking kwamen, dan valt direct op, dat de blauwe fluorescentie in de eerste categorie over het algemeen helderder is. Blijkbaar fluoresceert hetnbsp;denaturatieproduct van de bestanddelen der cellen helderder bijnbsp;fixatie door alcohol met zinkacetaat dan bij fixatie met alcoholnbsp;alleen. Bevat de coupe bovendien veel urobiline, dan springt denbsp;groene fluorescentie van de urobilinezink-verbinding dadelijk innbsp;het oog. Veel minder duidelijk is deze groene fluorescentie innbsp;coupes, waarin slechts weinig urobiline aanwezig is, zoals in dienbsp;van de normale kikkerlever. In dat geval kan het slechts eennbsp;gering verschil in tint van een deel ener cel zijn, dat ons aanleiding geeft tot een spectrophotometrisch onderzoek.

Dit onderzoek verloopt in de praktijk als volgt: Het deel van de cel, waarvan de fluorescentie ons interesseert, wordt ondernbsp;het gaatje van de wijzer W in het oculair gebracht en het totaalnbsp;reflecterend prisma P2 komt weer op het oculair. Indien men nunbsp;gaat meten bij 450, 470 mpt, enz. en na afloop de meting voor denbsp;zekerheid herhalen wil, dan blijkt het, dat de waarden de tweedenbsp;maal aanzienlijk veel lager liggen dan de eerste maal het gevalnbsp;was. Dit is een gevolg van de afname van de blauwe fluorescentienbsp;van de celbestanddelen onder invloed van de ultraviolette stralen.nbsp;Aangezien de ervaring mij geleerd heeft, dat de fluorescentie vannbsp;de urobilinezink-verbinding niet zo gevoelig is voor deze stralen,nbsp;is er in dit geval niets tegen, om te wachten met de definitievenbsp;meting, totdat de fluorescentie van de andere celbestanddelennbsp;zich in zoverre gestabiliseerd heeft, dat enige metingen achtereennbsp;bevredigende overeenkomst tonen. Verricht men op deze wijzenbsp;metingen op verschillende plaatsen in de coupe, dan kunnen zichnbsp;verschillen in de curven voordoen, die hierna ter sprake zullennbsp;komen. Vooraf moet evenwel nog een correctie besproken worden,nbsp;die noodzakelijk is, om de invloed van de storende fluorescentienbsp;van objectglas en insluitmedium te elimineren.

Men mag aannemen, dat deze storende fluorescentie niet alleen in de weefselspleten, waar zij waargenomen wordt, doch ook innbsp;het fluorescentielicht van de coupe voorkomt en wel overal innbsp;gelijke sterkte. De absorptie van dunne weefselcoupes is n.1. zonbsp;gering (pigmentcellen uitgezonderd), dat dit storende licht, zonbsp;het onder de coupe, in het objectglas, ontstaat, door de coupenbsp;onverzwakt wordt doorgelaten en dat het ultraviolette licht, dat

de storende fluorescentie in of boven de coupe in paraffineolie of euphosglas opwekt, door de bestanddelen van de cellen niet merkbaar sterker verzwakt wordt dan door de paraffineolie in denbsp;weefselspleten. Het gemeten fluorescentielicht bestaat dus uit denbsp;som van het fluorescentielicht uit de celbestanddelen en hetnbsp;storende fluorescentielicht. Wil men het eigen fluorescentielichtnbsp;van de cel bepalen, dan moet men de intensiteit van het storendenbsp;fluorescentielicht voor elke golflengte onder gelijke omstandigheden ge�soleerd meten en de gevonden waarden aftrekken vannbsp;die, welke bij de meting aan het celonderdeel gevonden werden.nbsp;Men bepaalt de storende fluorescentie door, zonder iets aan denbsp;opstelling te veranderen, de coupe na een meting aan een celonderdeel zover te verschuiven, dat zich een weefselspleet ondernbsp;het gaatje in de oculairwijzer bevindt en dan nog een meting uitnbsp;te voeren. Men kan dan een curve berekenen van het totale licht,nbsp;dat bij de meting aan het celonderdeel werd gevonden (a), ennbsp;een van het storende licht, dat bij de meting aan de weefselspleet bepaald werd (b). Het verschil van a en b geeft dan denbsp;gezochte waarden voor de eigen fluorescentie van het celonderdeel. Aangezien echter voor de berekening van de curven a en bnbsp;de afgelezen schaaldelen met dezelfde factoren vermenigvuldigdnbsp;worden, kan men eenvoudiger deze aflezingen van elkaar aftrekken en uit de verschillen de enige curve, die ons interesseert,nbsp;n.l. die van de eigen fluorescentie van het celonderdeel, doornbsp;vermenigvuldiging met de genoemde factoren berekenen. Dat hetnbsp;hiervoor noodzakelijk is, dat de afgelezen waarden van hetnbsp;sectorendiaphragma recht evenredig zijn met de intensiteiten vannbsp;het doorgelaten licht spreekt vanzelf (hier geven wij dus eerstnbsp;de nadere motivering van deze reeds op blz. 20 gestelde eis).nbsp;Vindt men dus bijv., dat het diaphragma voor het licht uit eennbsp;celonderdeel bij 450 mp^, 30� moet openstaan en bij 470 mgi., 28�nbsp;en zijn deze waarden voor het licht uit een weefselspleet resp.nbsp;10� en 11�, dan blijken er in de waarden van 30� en 28� dusnbsp;slechts resp, 20� en 17� voor rekening van het eigen fluorescentielicht van het celonderdeel te komen. Deze waarden wordennbsp;dan gebruikt voor de berekening van de spectrophotometrischenbsp;curve.

Op de boven beschreven wijze vervaardigden wij van allerlei materiaal coupes, die vervolgens spectrophotometrisch op uro-biline (stercobiline) onderzocht werden. In het nu volgende deelnbsp;zullen enkele van deze proeven als voorbeelden, die in hun volgorde de gedachtengang, die aan dit onderzoek ten grondslag ligt,nbsp;weergeven, beschreven worden.

a. Aan een alcoholische oplossing van urobiline werd op een objectglas een oplossing van zinkacetaat in alcohol toegevoegd.

Nadat de alcohol verdampt was, werd de droogrest in paraf-fineolie ingesloten en onderzocht als voor de weefselcoupes beschreven is. Het amorphe neerslag fluoresceerde zeer heldernbsp;groen: de grafiek 2 laat de relatieve intensiteitsverdeling vannbsp;het fluorescentielicht zien.

In de dijspier van een kikker werden enige korreltjes urobiline gebracht en na een kwartier werden van de spier op de beschreven wijze praeparaten vervaardigd. In het fluores-centiebeeld toonden vele spiervezels (in het met zinkacetaatnbsp;behandelde praeparaat) een diffuse, heldergroene fluorescentie.nbsp;Ook het bindweefsel was hier en daar diffuus groen. Op sommige plaatsen waren cellen te zien, die in het protoplasmanbsp;talrijke, op elkaar gepakte, zeer helder groen fluorescerende,nbsp;bolletjes vertoonden. In andere cellen was de groen fluorescerende substantie zo fijn als stof te zien. Grafiek 3 toont denbsp;fluorescentiespectra van het protoplasma van deze twee soortennbsp;van bindweefselcellen en van bindweefsel buiten de urobiline-

c. In de V. abdominalis van een kikker (waarbij deze vene, zoals bekend is, een tak van de v. portae is) werd een oplossingnbsp;van urobiline in een 0,6 % NaCl-oplossing, waaraan terwille

van de oplosbaarheid van het urobiline een weinig ammonia liquida was toegevoegd, ge�nfundeerd. In de praeparaten vannbsp;de lever bevatten de cellen, die naar hun ligging als stercellennbsp;imponeerden, dezelfde groen fluorescerende bolletjes als denbsp;onder b. beschreven bindweefselcellen. Het fluorescentie-spectrum van deze bolletjes was aan dat van die in denbsp;genoemde bindweefselcellen identiek, In niet met zink behandelde praeparaten was de fluorescentie in deze cellen veelnbsp;geringer en in leverpraeparaten, afkomstig van normalenbsp;kikkers, vindt men in deze cellen alleen blauw fluorescerendenbsp;bolletjes.

d. In de v. abdominalis van een kikker werd een oplossing van urobiline in een mengsel van gelijke delen phosphaatbuffernbsp;(pH; 7,2) en 0,6 % NaCl-oplossing ge�nfundeerd, In de levernbsp;van deze kikker vonden wij geen opvallende fluorescentie vannbsp;de in de bloedvaten gelegen cellen, doch de van de bloed-capillairen af gekeerde zijde van de parenchymcellen toondennbsp;in de met zinkacetaat behandelde praeparaten een duidelijknbsp;groenere tint dan de aan de bloedcapillairen grenzende gedeelten. De curven van elk dezer gedeelten toont de grafiek 4.nbsp;In de contr�le-praeparaten was dit verschil in fluorescentienbsp;niet waar te nemen.

Lever van een kikker na injectie van een urobiline-oplossing in de v. abdominalis.

Vervolgens werden levers van normale kikkers op deze wijze onderzocht. Ook hierbij werden de in de vorige proef vermelde verhoudingen, zij het veel minder duidelijk, gevonden.nbsp;De curven geeft grafiek 5.

Grafiek 5,

II:

Normale kikkerlever, behandeld met Zn-reagens. van een bloedvat verwijderd deel van een parenchymcel.nbsp;aan een bloedvat grenzend deel van die cel.

Beziet men de curven op grafiek 2, dan blijkt het, dat de fluorescentie van de urobilinezink-verbinding vrij abrupt begint tussen 490 en 510 mjji, en naar 570 m[jt, toe geleidelijk afneemt. Neemtnbsp;men nu aan, dat het urobilinezink in de weefsels op dezelfde wijzenbsp;fluoresceert als de op een objectglas in paraffineolie ingeslotennbsp;verbinding, en dat het fluorescentielicht van de het urobilinezinknbsp;bevattende celdelen de som is van het fluorescentielicht van denbsp;blauw fluorescerende celbestanddelen en de groene fluorescentienbsp;van de urobilinezink-verbinding, dan moet men de fluorescentienbsp;van deze verbinding terug kunnen vinden indien men van dezenbsp;som de blauwe fluorescentie aftrekt. Indien men echter dezenbsp;berekening wil uitvoeren, dient men voor elke golflengte in denbsp;curven van de gemengde fluorescentie te weten, welk aandeelnbsp;wordt geleverd door de blauwe fluorescentie. De blauwe fluorescentie van het celdeel naast het groenige levert ons, ondernbsp;de aanname, dat de fluorescentie in de verschillend getinte celdelen alleen verschilt door de aanwezigheid van de urobilinezink-verbinding, wel de spectrale samenstelling, doch niet denbsp;intensiteit van de blauwe fluorescentie in het urobilinehoudendenbsp;deel. want de coupes zijn niet overal even dik en het protoplasmanbsp;is niet overal even dicht gevoegd, zodat het heel goed mogelijknbsp;is, dat de blauwe celfluorescentie in de urobiline bevattende celdelen niet dezelfde absolute waarde heeft als die in de delen,nbsp;welke geen urobiline bevatten. Nu blijkt echter uit de curven opnbsp;grafiek 2, dat de urobilinezink-verbinding geen meetbare fluorescentie vertoont bij de golflengten 450 en 470 mp;,. Men magnbsp;dus aannemen, dat al het in de gemengde fluorescentie voorkomende licht van deze golflengten afkomstig is van de blauwenbsp;fluorescentie van de celbestanddelen. De waarden van de curvennbsp;van het gemengde fluorescentielicht voor de golflengten 450 ennbsp;470 mp, geven ons dus een maatstaf voor het aandeel van denbsp;blauwe fluorescentie in dit licht, terwijl de curven van de blauwenbsp;celgedeelten ons de spectrale samenstelling van dit licht doennbsp;kennen. Indien wij dus de waarden, die bij de meting der op hetnbsp;oog in het geheel niet groenige delen van de levercellen gevondennbsp;werden, met een zodanige factor vermenigvuldigen, dat zij voornbsp;de golflengten 450 en 470 mp, samenvallen met die welke bij denbsp;meting aan de groenig fluorescerende celdelen gevonden werden,nbsp;dan krijgt men een curve, die ook voor de golflengten 490, 510 mpnbsp;enz. aangeeft, welk aandeel de blauwe fluorescentie in deze gemengde fluorescentie heeft. In de curven van de grafieken 3 tot 5nbsp;is deze berekening reeds uitgevoerd, zodat overal de gemiddeldennbsp;tussen de waarden voor 450 en 470 mp samenvallen. In denbsp;grafiek 6 zijn de verschillen tussen de �gemengde� (protoplasmanbsp;met groen fluorescerende stof) en de �blauwe� (protoplasmanbsp;zonder groen fluorescerende stof) curven uitgezet en wel opnbsp;gelijke schaal, zodat in elke curve het gemiddelde tussen de

waarden bij 510 en 530 nifj^, 48 bedraagt. Deze curven geven dus het ,,groene� aandeel in de gemengde fluorescentie weer. Bijnbsp;vergelijking van de curven van de groene fluorescentie van denbsp;zuivere urobilinezink-verbinding (grafiek 2) blijkt de overeenkomst hiervan met die van grafiek 6. Inderdaad liggen de afwijkingen binnen de foutengrens der methode, zodat deze overeenkomst achteraf wel een zeer sterke bevestiging geeft van denbsp;juistheid van de hier boven gegeven afleiding.

Grafiek 7 geeft analoge curven, zoals die gevonden werden bij metingen aan de lever van de normale muis. Over elkaar heennbsp;getekend zijn de curven van het licht groen getinte centrum ennbsp;de wat blauwiger oplichtende peripherie van een levercelbalkje.nbsp;De derde curve op deze grafiek is de verschilcurve, die op gelijkenbsp;wijze is berekend en getekend als de curven op grafiek 6.

Grafiek 8 tenslotte, is een weergave van de metingsresultaten aan een menselijke lever. Door de postmortale veranderingenj?)nbsp;konden wij evenwel in de met zinkacetaat behandelde coupe geennbsp;delen van de parenchymcellen vinden, waarvan de curve denbsp;verheffing van 510 tot 530 mj^ niet vertoonde, zodat de ,.blauwe�nbsp;curve in dit geval afkomstig is van een meting aan de onbehandelde contr�lecoupe. De overeenkomst van de verschilcurve metnbsp;de curven van grafiek 2 is, wellicht tengevolge hiervan, niet zonbsp;fraai als in de vorige gevallen.

Voor de discussie van de specificiteit van deze reactie moet allereerst verwezen worden naar hetgeen hierover in de inleiding tot dit hoofdstuk werd gezegd, (blz. 40 e.v.). Wij zullen de mogelijkheden in dezelfde volgorde nog eens in het kort nagaan:

a. nbsp;nbsp;nbsp;Andere stoffen met een fluorescentiespectrum, gelijk aan datnbsp;van de urobiline- (resp. stercobiline-) zinkverbinding zijn in denbsp;physiologie der gewervelde dieren nog niet bekend geworden.

b. nbsp;nbsp;nbsp;Het spectrum van lactoflavine verschilt van het door ons gevonden urobilinezink-spectrum (Bierry en Gouzon (�35) e.a.), ooknbsp;dat van lactoflavine in weefsels (v. Euler c.s. (�35)), want ditnbsp;kenmerkt zich door een brede band van 515 tot 615 mp, metnbsp;het (photographische) maximum bij 560 mp. Over het spectrumnbsp;van de blauwgroene fluorescentie, die bilirubine volgensnbsp;Heilmeyer en �hlig aan het serum zou kunnen verlenen, isnbsp;niets bekend.

c. nbsp;nbsp;nbsp;Dat urobiline, of een stof, die met zink een dergelijke fluorescentie geeft, in de coupe ontstaat, is mogelijk door de inwerkingnbsp;van jodium op bilirubine, doch ook in de niet met jodium behandelde coupes werd de beschreven fluorescentie gevonden. Tegennbsp;het ontstaan van urobiline uit porphyrine onder inwerking vannbsp;de ultraviolette bestraling pleit het ontbreken van de rodenbsp;jxjrphyrine-fluorescentie bij het begin van de waarneming ennbsp;het feit, dat de �urobilinetop� reeds waar te nemen is, v��rdatnbsp;de blauwe celfluorescentie zich gestabiliseerd heeft, dus op eennbsp;moment, dat de ultraviolette straling nog maar kort heeftnbsp;ingewerkt.

Wel moet men rekening houden met de mogelijkheid, dat door de postmortale veranderingen het urobiline niet alleen kannbsp;wegdiffunderen, maar dat bovendien het totale gehalte van denbsp;lever aan urobiline of urobilinogeen veranderen kan. Felix ennbsp;Moebus (�35) toonden n.1. aan, dat bij aanwezigheid van zuurstof urobilinogeen, dat aan leverbrei werd toegevoegd, nanbsp;verloop van enigen tijd niet meer werd teruggevonden alsnbsp;urobilinogeen of als urobiline. Daar tegenover staat de oudenbsp;waarneming van Magnus-Levy (�02), dat bij de autolyse vannbsp;leverweefsel urobiline ontstaat,

d. nbsp;nbsp;nbsp;In hoeverre het ontbreken der urobiline-reactie in bepaaldenbsp;gevallen en in sommige gedeelten van de cel ook inderdaadnbsp;wijst op de afwezigheid van urobiline of van stercobiline (resp.nbsp;van de chromogenen) is niet te zeggen. De chromogenen gevennbsp;de fluorescentiereactie niet dan na oxydatie tot de kleurstoffen.nbsp;Het is evenwel zeer waarschijnlijk, dat de luchtzuurstof dezenbsp;oxydatie volledig verricht, daar nooit enig verschil werd waargenomen tussen coupes, die niet, en coupes, die wel met het

oxydatiemiddel bij uitnemendheid voor deze stoffen, het jodium, behandeld werden, ook niet, wanneer het gehalte aan urobilino-geen in de weefsels verhoogd was. Over de stoffen, die denbsp;vorming van de urobilinezink-verbinding verhinderen, is weinignbsp;meer bekend dan het effect van de toevoeging van sterk zuurnbsp;aan het reactiemengsel. Dat er in de celdelen, die niet denbsp;urobilinezink-fluorescentie vertonen, fluorescentie-uitdovendenbsp;factoren aanwezig zouden zijn, die de fluorescentie der anderenbsp;celbestanddelen intact zouden laten en de fluorescentie van denbsp;urobilinezink-verbinding selectief zouden uitdoven, is, evenminnbsp;als de mogelijkheid, dat het urobiline tijdens de behandelingnbsp;juist uit die celdelen zou zijn opgelost of verplaatst, uit tenbsp;sluiten, doch veel minder voor de hand liggend dan de veronderstelling, dat urobiline in die celdelen, ook tijdens het leven,nbsp;in een te geringe concentratie aanwezig was om nog door onzenbsp;methode aangetoond te kunnen worden.

Over de betekenis van de op deze wijze met grote zekerheid aangetoonde aanwezigheid en met waarschijnlijkheid gedemonstreerde localisatie van urobiline of stercobiline in normale levercellen zalnbsp;hier niet gesproken worden, evenmin als over de vraag, of urobilinenbsp;ook bij andere dieren en in andere organen gevonden kan worden,nbsp;daar deze vraagstukken buiten het kader van dit onderzoek vallen.nbsp;De hier gegeven uiteenzettingen over het aantonen van urobiline ennbsp;stercobiline in weefselcoupes hebben voldoende doen zien, dat metnbsp;behulp van de microspectrophotometrie van fluorescentielicht stoffen door hun specifieke physische eigenschappen in weefsels herkend kunnen worden. Zo geven zij de practische aanvulling vannbsp;de in de algemene inleiding genoemde theoretische argumentennbsp;voor de invoering van deze physische methode in het histologischenbsp;onderzoek.

Bij het urobiline-onderzoek kenden wij het fluorescentiespectrum van ��n der fluorescerende bestanddelen van de cel en konden doornbsp;de analyse van de totale fluorescentie dit bekende fluorescentiespectrum in het mengsel van spectra terugvinden. Daarbij beschouwden wij de blauwe fluorescentie der overige celbestanddelennbsp;niet nader. Hoe moeilijk een analyse van een dergelijke, in denbsp;spectrophotometrische curve niet door duidelijke toppen of dalennbsp;gekenmerkte, fluorescentie is, leerden wij bij onderzoekingen overnbsp;de fluorescentie van de ooglens.

Koch en Fischer (�33) gaven aan, dat de ooglens bij kippen-embryonen niet voor de 6de dag der bebroeding fluoresceert en het leek van belang om het proces van de wording van dezenbsp;fluorescentie stap voor stap te volgen. Een dergelijk onderzoeknbsp;zou evenwel slechts waarde hebben, indien het steunde op gegevensnbsp;over de fluorescentiespectra van de in aanmerking komende bestanddelen van de lens. (Over de aard van de fluorescerende stoffen innbsp;de lens is niet veel bekend. Fischer (�34, �40) geeft aan, dat in denbsp;lens verschillende fluorescerende bestanddelen voorkomen, waaronder het groen fluorescerende lactoflavine en een hemelsblauwnbsp;fluorescerende, dialysabele stof, die waarschijnlijk uit aminozurennbsp;of nauw daarmede verwante verbindingen bestaat, daar de amino-zuur-reacties positief zijn. Bovendien komen in lenzen met cataractanbsp;brunescens groen fluorescerende stoffen voor, die hij met denbsp;melanoidines van Maillard kon identificeren. Het fluorescentiespectrum van de lens nam Ie Grand (�38) photographisch op. Denbsp;door hem gepubliceerde cijfers geven een geleidelijke afname vannbsp;de relatieve intensiteit van het blauw naar het rood aan. Vannbsp;belang is, dat de fluorescentiespectra volmaakt aan elkaar gelijknbsp;waren, indien zij met monochromatisch ultraviolet licht van uiteenlopende golflengten werden opgewekt. Zoals op blz. 12 werdnbsp;opgemerkt, pleit dit tegen de aanname dat in het geval van Ie Grandnbsp;zeer uiteenlopende stoffen een aandeel in de door hem gemetennbsp;fluorescentie hadden.) Aangezien de labiliteit van de fluorescentienbsp;van de lens bij de bestraling met 366 mpi, (welke labiliteit zich uitnbsp;in een vermindering van de fluorescentieintensiteit, gepaard metnbsp;een verandering in de spectrale samenstelling van het fluorescentie-licht) het vermoeden wettigde, dat de lens de fluorescentie, althansnbsp;voor een deel, ontleende aan de eiwitstoffen (vgl. de door Liesegangnbsp;en Wels waargenomen veranderlijkheid van de fluorescentie vannbsp;deze stoffen onder invloed van de ultraviolette bestraling), onderzochten wij de fluorescentie van de bekende eiwitfracties van denbsp;lens, die wij bereidden naar de voorschriften van M�rner (�94).nbsp;Daar de fluorescentiespectra van deze stoffen geen uitgesproken

verschillen met die van de lens zelf vertoonden, gingen wij nog een stap terug en betrokken de aminozuren in ons onderzoek. Het wasnbsp;ons gebleken, dat de fluorescentie-eigenschappen van de gedroogdenbsp;lens niet duidelijk verschilden van die van de verse en in overeenstemming met deze waarneming besloten wij de aminozuren eveneens droog te onderzoeken. Het bleek, dat er, bij opwekking doornbsp;366 m[x, categorie�n van aminozuren te onderscheiden waren m�tnbsp;en zonder duidelijke fluorescentie (vgl. Vl�s (�36) en dat de duidelijk fluorescerende zich lieten onderverdelen in labiele (bijv tryp-tophaan) en stabiele (bijv. tyrosine). In deze eigenschappen, zowelnbsp;als in de fluorescentiespectra toonden gelijke aminozuren van verschillende herkomst evenwel geen constantheid, zodat met denbsp;volgende algemene opmerkingen mag worden volstaan. De fluorescentiespectra der vaste aminozuren vertonen (bij opwekking doornbsp;366 mp,) over het algemeen geen uitgesproken bijzonderheden:nbsp;altijd weer het min of meer geleidelijke aflopen van de curve vannbsp;het blauw naar het rood. Zeer steil liep de curve af bij een monsternbsp;van tyrosine, bij andere monsters (o.a. die van phenylalanine) liepnbsp;de curve ongeveer horizontaal en slechts in ��n geval werd eennbsp;oplopen van de curve naar de rode zijde waargenomen (1.�4�nbsp;oxyproline). Te gering voor de meting was de fluorescentie bij denbsp;volgende aminozuren: d.-valine, l.-asparaginezuur, l.-glutamine-zuur, 1.-cystine en histidinehydrochloride. Bij vele van de monstersnbsp;veranderde de fluorescentieintensiteit tijdens de waarneming: metnbsp;zekerheid werd slechts vermindering waargenomen. In den regelnbsp;ging deze vermindering gepaard met veranderingen in het fluores-centiespectrum, zonder dat dit spectrum hierdoor meer karakteristiek voor het aminozuur werd. Aangezien de proeven van Wiegandnbsp;het waarschijnlijk maakten, dat de zuurstof van de lucht vannbsp;invloed zou kunnen zijn op deze veranderingen namen wij ooknbsp;spectra op van aminozuren, die zich bevonden in een speciaalnbsp;daartoe geconstrueerde dunwandige cel, waarin een vacuum konnbsp;worden onderhouden. De uitkomsten, die met deze opstelling verkregen werden, waren voor de verschillende monsters van gelijknamige aminozuren ook niet constant: voor een monster vannbsp;phenylalanine kon evenwel worden aangetoond, dat de aanwezigheid van lucht onder normale druk van invloed was op de verandering in het fluorescentielicht. De fluorescentie-curve van gedroogdenbsp;lenssubstantie vertoont een dergelijk verloop als die van de meestenbsp;aminozuren, de steilheid der curve doet denken aan die van tyrosine- en tryptophaan-monsters, evenals de veranderingen in hetnbsp;fluorescentiespectrum tijdens de bestraling herinneren aan die vannbsp;tryptophaan.

Wij konden evenwel niet voldoende gegevens in handen krijgen om met enige kans op succes de reeds begonnen metingen aannbsp;embryonale ooglenzen weer op te vatten. De onbekendheid met denbsp;fluorescentiespectra van de meest elementaire fluorescerende bestanddelen van de lens, de aminozuren, deed het uitzicht van een

onderzoek naar de lensfluorescentie als geheel voorlopig weinig hoopvol schijnen. Als illustratie van de invloed, die de keuze vannbsp;de lichtbron op de uitslag van deze onderzoekingen kan hebben,nbsp;vermelden wij in dit verband nog slechts, dat bij onze lichtbronnennbsp;de fluorescentie van de lens van kippenembryonen ook op de 4de,nbsp;althans lang voor de 6de, bebroedingsdag, reeds duidelijk waarneembaar is.

Uit het voorbeeld van de onderzoekingen over de lensfluorescentie blijkt, hoe belangrijk het is, dat men bij dit soort onderzoekingen de fluorescentiespectra van de stoffen waar men naar zoekt goed kent �n dat deze spectra binnen het meetbereik iets karakteristieks vertonen. Bij de berekening van de urobiline-curven uitnbsp;de curven van het gemengde fluorescentielicht bleek bovendien,nbsp;hoeveel zekerder de uitkomsten zijn, indien er in het spectrum vannbsp;het gemengde fluorescentielicht gedeelten zijn, die uitsluitend opnbsp;rekening van een der componenten komen. Dit houdt in, dat in denbsp;eerste plaats die stoffen voor onderzoek met deze methode in aanmerking komen, die, spontaan of na een reactie, een fluorescentie-spectrum bezitten, waarvan de spectrophotometrische curve op eennbsp;of meerdere plaatsen binnen het meetbereik de nullijn bereikt, zoalsnbsp;de curve van de urobilinezink-verbinding dat doet bij 450 ennbsp;470 mp.. Alleen in dat geval is de, in het vorige hoofdstuk uiteengezette, eenvoudige berekening van de aandelen der componentennbsp;in het gemengde spectrum mogelijk. Indien men deze eisen in hetnbsp;oog houdt, doen zich vele onderwerpen voor, die zich lenen voornbsp;dit spectrophotometrische fluorescentie-onderzoek.

Een volledig overzicht van de literatuur op dit punt zal hier niet gegeven worden, want alles over de fluorescentiespectra vannbsp;biologisch belangrijke stoffen vindt men in de reeds genoemdenbsp;monographie van Dh�r� op overzichtelijke wijze bijeen, terwijlnbsp;Haitinger in zijn �Fluoreszenzmikroskopie� de toegang geeft totnbsp;de literatuur over deze zijde van het onderwerp. Derhalve zullennbsp;hier slechs enkele feiten, die de bijzondere belangstelling verdienen,nbsp;genoemd worden.

Wat de eigen fluorescentie van weefsels betreft, moeten in de eerste plaats de recente onderzoekingen van Hirt en Wimmernbsp;(�39, �40) over de fluorescentie van vitaminen vermeld worden.nbsp;Genoemde auteurs onderzochten de weefsels van met grote vita-mine-doses behandelde proefdieren tijdens het leven onder hetnbsp;fluorescentiemicroscoop. Ter controle vervaardigden zij na afloopnbsp;van dit onderzoek vriescoupes van de onderzochte organen, welkenbsp;coupes eveneens onder het fluorescentiemicroscoop bekeken werden. Ge�njiceerd werden bij de dieren grote doses van de vitaminennbsp;A, Bj, B� C en nicotinezuuramide. Zij vermelden nauwkeurig denbsp;localisatie en de kleur van de in het protoplasma der cellen optredende fluorescerende stoffen. Het laat zich aanzien, dat hetnbsp;microspectrophotometrisch onderzoek van de door hen beschrevennbsp;fluorescentieverschijnselen eerst de directe bewijzen kan leveren

van de door de auteurs geponeerde theori�n omtrent de aard van deze stoffen. De behoefte aan spectrophotometrische controle bijnbsp;het fluorescentie-onderzoek op vitaminen hebben Querner (�35)nbsp;en Schairer c.s. (�39) reeds uitgesproken. Zij konden evenwel aannbsp;de licht veranderlijke, aan vitamine A toegeschreven, fluorescentienbsp;van de �Leuchtstoff X� geen betrouwbare metingen verrichten.nbsp;Wellicht is dit met een methode als de onze, bij gebruik van denbsp;door Jager (�40) voor deze ,,Leuchtstoff� aanbevolen bestralingnbsp;met blauw in plaats van met ultraviolet licht (filters: Jager (�39)nbsp;e.a.) mogelijk. Onze eigen waarnemingen aan praeparaten vannbsp;vitamine Bj, nicotinezuur, vitamine D en ascorbinezuur in vastennbsp;vorm gaven geen spectra met uitgesproken �toppen en dalen� innbsp;de curven te zien, die het vermoeden rechtvaardigen, dat dezenbsp;stoffen in zo lage concentraties herkend zouden kunnen wordennbsp;als dat voor de urobilinezink-verbinding waarschijnlijk is, dochnbsp;dit zegt niet, dat de genoemde vitaminen op deze wijze in hetnbsp;geheel niet op te sporen zouden zijn, daar zij plaatselijk in hogenbsp;concentraties aangetroffen kunnen worden. In kleine concentraties zullen deze stoffen eerst aan hun eigen fluorescentie herkend kunnen worden wanneer de physica ons meetmethoden heeftnbsp;geleverd, die in meetbereik, gevoeligheid en nauwkeurigheid denbsp;tegenwoordig practisch te verwezenlijken werkwijzen verre overtreffen. Ook nu bestaat evenwel reeds de mogelijkheid, dat ernbsp;reacties gevonden worden, die, zoals bij de zinkacetaatreactie opnbsp;urobiline, deze vitaminen omzetten in stoffen met een duidelijknbsp;herkenbare fluorescentie. (Bijv. de thiochroom-methode voor hetnbsp;aantonen en bepalen van vitamine Bj (Westenbrink en Goudsmitnbsp;(�37)) en de reactie op een bepaald B2-complex (?) met eennbsp;speciale trypaflavinesoort van Hirt (�39)).

Hetzelfde geldt voor de door ons in vaste toestand op hun fluorescentie onderzochte zuivere hormonen (progesteron, testo-steronpropionaat, oestradiol, oestradiol-3-monobenzoaat, oestron,nbsp;pregneninolon, desoxycorticosteronacetaat en insuline, ons welwillend voor dit doel afgestaan door de N.V. Organon te Oss).nbsp;Dh�r� vermeldt de onderzoekingen van Bicrry en Gouzon overnbsp;fluorescentiereacties op geslachtshormonen en Haitinger (�40)nbsp;bericht over een nieuwe fluorescentiereactie op folliculine vannbsp;Kocsis en Bugyi.

De mogelijkheid moet genoemd worden om de beschreven urobilinereactie om te keren en met urobiline op zink te reageren.nbsp;Hierop berust de microchemische zink-bepaling volgens Lutz,nbsp;welke door Burstein (�29) werd aangewend voor het onderzoeknbsp;naar de verdeling van het zink tussen serum en bloedlichaampjes.nbsp;Mogelijk leent deze reactie zich ook voor de uitvoering opnbsp;weefselcoupes. De vraag naar de functie van het zink in hetnbsp;organisme is weer actueel door de vaststelling, dat insuline-praeparaten zink bevatten en door het gebruik van insuline-

Kreuzwendedich v. d. Borne beschrijft fluorescentie-spectro-grammen van verdunde urine en wijst op de gelijkenis tussen de door hem gevonden curven met die van indoxyl-vcrbindingen.nbsp;Een poging, deze stoffen ook in het weefsel aan het fluorescentie-spectrum te herkennen, is zeker gerechtvaardigd.

De bovenstaande opmerkingen gelden het herkennen van stoffen, die onder normale omstandigheden in het organisme voorkomen,nbsp;aan de eigen of de door een reactie ge�nduceerde fluorescentie.nbsp;Zoals uit het voorbeeld van het urobiline-onderzoek bleek, kannbsp;men met de spectrophotometer in het algemeen stoffen met eennbsp;karakteristiek fluorescentie-spectrum aantonen in concentraties,nbsp;die zich bij eenvoudige beschouwing nog niet met zekerheid aannbsp;de fluorescentiekleur laten herkennen. Hetzelfde geldt voor stoffen,nbsp;die kunstmatig in het lichaam worden gebracht, zoals dat bij denbsp;vitale kleuring geschiedt. Daar sommige stoffen een karakteristieknbsp;spectrum paren aan een grote fluorescentieintensiteit, zelfs bij zeernbsp;sterke verdunning, lijken deze stoffen aangewezen voor vitalenbsp;�kleuring� bij concentraties der �kleurstof�, die bij de gebruikelijkenbsp;methoden nog niet bereikt konden worden. Ellinger en Hirt (�30)nbsp;beschrijven de waarneming van de excretie van fluoresceine-Na innbsp;nieren van kikkers en merken een verschil op in de tint van denbsp;uitgescheiden fluoresceine in de verschillende delen der niertubuli,nbsp;welk verschil zij toeschrijven aan verschillen in de zuurgraad vannbsp;de urine in deze delen van het nephron. Zij geven een tabel innbsp;kleurendruk, die de kleuren van het fluorescentielicht van fluoresceine-Na in bufferoplossingen van verschillende pH weergeeft.nbsp;Dat deze kleurverschillen eerst recht spectrophotometrisch goednbsp;kunnen worden onderzocht en weergegeven spreekt vanzelf. Innbsp;dit verband is belangrijk het artikel van Spek (�38), waarin hijnbsp;vermeldt, dat gekleurde indicatoren bij juiste keuze van de kleurstoffen ook gebruikt kunnen worden voor pH-bepalingen in cellen.nbsp;In tegenstelling met wat men geneigd zou zijn te verwachtennbsp;behoeft de eiwit- en zoutfout bij deze bepalingen niet groot te zijn.nbsp;Hij bepaalde de absorptiespectra van de indicatoren in gedeeltennbsp;van cellen met de microspectrophotometer volgens Engelmann, denbsp;visuele waarneming van de kleuren aldus aanvullende met spectro-photometrische data. Een uitgebreid onderzoek naar de bruikbaarheid van fluorescerende indicatoren voor dit doel is, gezien denbsp;geringe concentratie waarin deze stoffen reeds een meetbarenbsp;fluorescentie kunnen geven, zeer gewenst. Een ander geval vannbsp;het inbrengen van fluorescerende stoffen in het lichaam is dat vannbsp;de chemotherapie. Vele chemotherapeutica fluoresceren (o.a.:nbsp;Oesterlin (�36 a)) en een nadere uiteenzetting van het belang enernbsp;histologische localisatie van deze stoffen is wel overbodig.

Tenslotte kan men het vraagstuk van de werking van de carcinogene stoffen wellicht iets nader tot de oplossing brengen

door partij te trekken van de specifieke fluorescentiespectra, die vele van deze stoffen eigen zijn (men zie hiervoor Hieger (�30),nbsp;Sanni� (�36) en Maneyord en Roe (�36)). Buitengewoon belangwekkende waarnemingen over de belemmerende werking, dienbsp;bepaalde stoffen zowel op de fluorescentie als op de carcinogenenbsp;werking van benzopyreen zouden hebben, beschrijft Oesterlinnbsp;(�36 b). Hij vond reeds macroscopisch de fluorescentie vannbsp;benzopyreen terug in een pathologische verhoorning, die bij eennbsp;zijner proefdieren, als gevolg van de behandeling met deze stof,nbsp;optrad. Microscopische waarnemingen op dit punt worden vermeld in de fraaie publicatie van Graffi (�40).

In de voorgaande hoofdstukken is een methode beschreven, die, voor het eerst, een quantitatief, spectrophotometrisch onderzoeknbsp;aan het eigen fluorescentielicht van onderdelen van cellen in histo-logische coupes mogelijk maakt. Daarbij zijn de uitkomsten dernbsp;methode volkomen vergelijkbaar met die van de macroscopischenbsp;spectrophotometrische bepalingen. De resultaten der metingen worden n.1. uitgedrukt in getallen, die de energieverhoudingen in denbsp;verschillende delen van het spectrum weergeven, terwijl daarbij denbsp;invloed van de, door de zwakte van het fluorescentielicht noodzakelijk gemaakte, benadering nauwkeurig kan worden opgegeven doornbsp;de vermelding van de omstandigheden, waaronder de meting geschiedde. De omstandigheden, die beslissend zijn voor de aard vannbsp;de uitkomsten en die dus in iedere publicatie op dit gebied dienennbsp;te worden opgegeven, zijn: de golflengte van het opwekkende lichtnbsp;(in het geval van het urobiline-onderzoek: vooral 366 m^, en verder, zwak, de banden bij 334 en 313 mp, en het, deze golflengtennbsp;verbindende, continuum) en de verhouding tussen de afmetingennbsp;van het collimatorspleetbeeld, die van de oculairspleet en de dispersie van het prisma (in ons geval: collimatorspleetbeeld evennbsp;breed als de oculairspleet en corresponderend met 20 myi, dispersie).

Dat bij andere onderzoekingen de keuze op deze punten anders zal kunnen uitvallen, spreekt vanzelf. Bij onderzoek van celonder-delen, die helderder fluoresceren dan de door ons onderzochte, zalnbsp;men de filtering van het opwekkende licht strenger kunnen maken,nbsp;de spleetbreedten geringer (en daarmede de zuiverheid van denbsp;onderzochte delen van het spectrum groter) en het meetbereiknbsp;ruimer. Sommige stoffen zullen door de door ons gebruikte golflengte niet tot fluoresceren gebracht kunnen worden of er in kortennbsp;tijd door vernietigd worden: in dat geval zijn proeven met anderenbsp;golflengten aangewezen.

Wij kozen het urobiline-onderzoek als paradigma van hetgeen met de methode te bereiken is, omdat het een eigenschap toont,nbsp;die o.i. elk onderzoek met een der gelijke methode moet kenmerken:

de fluorescentie, die wordt waargenomen, moet werden ontleed aan de hand van bekende fluorescentiespectra. Alleen op deze wijzenbsp;wordt een spectrophotometrische methode zinvol aangewend. Hetnbsp;is heel goed mogelijk, dat een spectrophotometrische vergelijkingnbsp;van de gele fluorescentie van de argentophiele cellen in de verschillende organen (Eros ('32)) een overeenkom.st of een verschilnbsp;tussen deze cellen waarschijnlijk maakt, doch nader tot de oplossingnbsp;van de vraag naar het wezen van de geel fluorescerende stof brengtnbsp;dit onderzoek ons niet. Spectrophotometrisch onderzoek vannbsp;fluorescentielicht in microscopische praeparaten, dat niet steunt opnbsp;de kennis der fluorescentiespectra van een of meer van de cel-bestanddelen, buit de mogelijkheden van deze onderzoeksmethodenbsp;onvoldoende uit. In het geval van het urobiline-onderzoek was hetnbsp;'t fluorescentiespectrum van de urobilinezink-verbinding, die onsnbsp;uit de literatuur en uit eigen onderzoek bekend was; een pogingnbsp;om deze fluorescentie in de, verder onbekende, celfluorescentienbsp;terug te vinden was dus gerechtvaardigd en de overeenkomstnbsp;tussen de gevonden en de verwachte curven geeft steun aan denbsp;veronderstellingen, die aan de berekening van deze curven tennbsp;grondslag liggen. De uitkomsten bewezen, dat wij met dezenbsp;methode urobiline en stercobiline met grote zekerheid kunnennbsp;aantonen en localiseren in normale cellen, daarbij afgaande opnbsp;een zeer karakteristieke physische eigenschap, het emissiespectrum.

Voor zover onze middelen dat toelaten is dus voldaan aan de opgave: het ontwerpen van een microspectrophotometrische methode, geschikt voor onderzoek aan fluorescentielicht en hetnbsp;bewijzen van de bruikbaarheid van de methode door de toepassingnbsp;ervan op een, practisch, histologisch vraagstuk.

Zo is dit proefschrift op te vatten als de vrucht van een doelbewust en stelselmatig pogen physische methoden dienstbaar te maken aan het Histologisch onderzoek.

lm I. Kapittel werden die Fluoreszenzerscheinungen vom phy-sikalischen Standpunkte betrachtet und es wird dargetan, dass die Fluoreszenzanalyse ihre h�chste Spezifizitat erreicht, wenn dienbsp;spektrale Energieverteilung des ausgesandten Lichtes ermitteltnbsp;wird.

Zunachst folgt eine �bersicht �ber die jetzigen fluoreszenz-mikroskopischen und mikrospektrophotometrischen Methoden, wahrend im Anfang des IV. Kapittels die erw�nschten Eigenschaften eines zu Messungen an der Eigenfluoreszenz d�nnernbsp;Gewebsschnitte geeigneten mikrospektrophotometrischen Instru-mentes eingehend und kritisch besprochen werden. Es wird dar-gelegt, dass f�r diesen Zweck nur die starksten Ultraviolettlicht-quellen brauchbar sind und dass eine visuelle mikrospektrophoto-metrische Methode in diesem Falie das Verfahren der Wahl ist.nbsp;Es wird weiter gezeigt, dass die Reinheit des durch den Okular-spalt des Spektroskopen fallenden Lichtes konstant und wohl-definiert gehalten werden kann durch sinngemasse Anderung dernbsp;Breiten von Okular- und Kollimatorspalten in �bereinstimmungnbsp;mit der Variation in der Dispersion des Spektroskopenprismas.nbsp;Wir waren zu diesen �berlegungen gen�tigt durch die Unm�glich-keit an den schwachen Fluoreszenzlichtern Messungen mit geringennbsp;Spaltweiten durchzuf�hren. In gleicher Weise begr�ndet ist dienbsp;Wahl des Sukzessivkontrastes als Verfahren zur Vergleichungnbsp;von Fluoreszenz- und Vergleichslicht. Im letzten Teil diesesnbsp;Kapittels wird die von uns benutzte Philips S.P. 500 �berhoch-druckquecksilberlampe mit Wasserk�hlung besprochen, und einenbsp;ausf�hrliche Beschreibung gegeben von dem weiteren Aufbau dernbsp;Apparatur, dem Messungs- und Eichungsverfahren und der Be-rechnung der Ergebnisse.

Einen Beispiel der Anwendung des Verfahrens auf die L�sung eines histologischen Problems gibt Kapittel V. Es wird einenbsp;Methode beschrieben, wobei ganz frische Gewebsschnitte kurz innbsp;einer alcoholischen Zinkazetatl�sung gebadet und in Paraffin�lnbsp;eingeschlossen werden, und die Ergebnisse von Messungen annbsp;bestimmten Stellen dieser Schnitte werden in Kurvenform mit-geteilt. Aus den Kurven erhellt, dass die an den Blutkapillarennbsp;grenzenden Partien in normalen Froschleberzellen urobilinfreinbsp;sind, wahrend in den �brigbleibenden Teilen dieser Zeilen dasnbsp;spezifische Fluoreszenzspektrum des Schlesingerschen Reaktions-produktes nachweisbar ist.

Im Kapittel VI werden einige weitere Ergebnisse mitgeteilt und Anregungen �ber die Anwendungsm�glichkeiten dieses histologischen Verfahrens gegeben.

GERAADPLEEGDE LITERATUUR:

Aharoni, J. en Ch. Dh�r�: Etude de l�influence excerc�e par Ia longueur d'onde des rayons excitateurs sur Ie spectre de fluorescence de l��tioporphyrine.

Barrenscheen, H. K. en O. Weltmann: �ber fluoreszierende Oxydationsprodukte des Bilirubins und deren Bedeutung als Fehlerquelle bei dem �blichennbsp;Urobilinnachweis.

Bayle, E., R. Fabre en H. George: Contribution a I��tude de la fluorescence et ses applications.

Bierry, H. en B. Gouzon: Spectres de fluorescence de l�hepatoflavine avant et apr�s irradiation.

Bierry, H. en B. Gouzon: D�tection des hormones oestrog�nes dans 1�urine de la femme enceinte, par une reaction de fluorescence.

Bierry, H. en ]. Larguier des Blancels: Action de la lumi�re �mise par la lampe a raercuie sur les solutions de chlorophylle.

Bokkel Huinink, J. W. G. ten: Over de verklaring van de urobilinurie bij haema.' tomen en een nieuw gezichtspunt betreffende het ontstaan van urobilinogeennbsp;uit galkleurstof.

Boutaric, A.: Une nouvelle m�thode d�investigation clinique, bas�e sur la fluorescence.

Burger, G. C. E. en B, H. Stockmann: Over de beoordeling der urobiline-reactie volgens Schlesinger.

Burstein, A. I.: Die Verteilung des Zinks im Blute des Menschen und der h�heren Tiere.

Cole, P. A. en F. S. Brackett: Absorption spectra of microscopie structures. Physic. Rev. [2] vol. 57, p. 1060 (1940).

Danekwortt, P. W.; Lumineszenzanalyse im filtrierten ultravioletten Licht. 3 Aufl. Akad. Verlagsges., Leipzig (1934).

Dh�r�, Ch.: L��tude spectroscopique et spectrographique des fluorescences biologiques. Sa r�alisation pratique. Avantages de la spectrographie,nbsp;Annales de Physiologie t. 8, p. 760 (1932).

Dh�r�, Ch.: Nachweis der biologisch wichtigen K�rper durch Fluoreszenz und Fluoreszenzspektren.

Dh�r�, Ch. en V. Castelli; Sur les propri�t�s de photoluminescence de la flavine synthetique.

Dh�r�, Ch. en J. Roche: Sur Ia fluorescence et sp�cialement sur les spectres de fluorescence des pigments du groupe de I�urobiline.

Dymschitz, J. en G. Frenckell: �ber die Schlesingersche Fluoreszenz in den Venen innerer Organe.

Eisenbrand, J. en G. Siewert: Die Kennzeichnung und Reproduzierbarkeit von Fluoreszenzerscheinungen an festen Stoffen und ihre Verwendbarkeit zunbsp;Konzentrationsbestimmungen.

Ellinger, P. en A. Hirt: Eine Methode zur Beobachtung lebender Organe mit starksten Vergr�sserungen im Lumineszenzlicht. (Intravitalmikroskopie).nbsp;Abderhaldens Hdbch. d. Biol. Arbeitsmeth. V, 2, II, S. 1753 (1930).

Eros, G.: Eine neue Darstellungsmethode der sogenannten �gelbenquot; argentaffinen Zeilen des Magendarmtraktes.

Euler, H. v., H. Hellstr�m en Z. Adler: Fluoreszenzmikroskopische Studi�n �ber das Flavin in Augen.

Fabre, R.: Contribution a l��tude de l�application du ph�nom�ne de fluorescence en chimie biologique.

Arch. Augenheilk. Bd. 108, S. 544 (1934).

F�rth, R.: Versuch einer Spektralphotometrie der Farben ultramikroskopischer Einzelteiichen.

Goldstein, E.: �ber die Untersuchung der Emissionsspektra fester aromatischer Substanzen mit dem Ultraviolettfilter.

Gouzon, B.: Production d'urobiline par action des rayons ultraviolets sur la chlorophylle et les porphyrines.

Graffi, A.: Intracellulare Benzpyrenspeicherung in lebenden Normal- und Tumorzellen.

Haas, E.; R�cherches nouvelles sur la sensibilit� lumineuse diff�rentielle successive pour la lumi�re blanche.

Haitinger, M.: Fluoreszenzmikroskopie, ihre Anwendung in der Histologie und Chemie.

Haitinger, M.: Neue Ergebnisse der Fluoreszenzanalyse auf dem Gebiete der Chemie und venvandter Wissenschaften.

Haitinger, M. en H. Hamperl: Die Anwendung des Fluoreszenz-Mikroskopes zur Untersuchung tierischer Gewebe.

Halbach, H.: �ber Sterkobilin und Urobilin IX, a-Erg. Inn. Med. Bd. 55, S. 1 (1938).

Haschek, E. en M. Haitinger: Eine einfache Methode zur Farbbestimmung, ange-wendet auf Fluoreszenzfarben.

Hassk�, A. en P. Lassmann: Einfache Methode zur spektroskopischen Untersuchung der Zelle.

Hieger, I.: The spectra of cancer-producing tars and oils and of related substances.

Hirt, A. en K. Wimmer: Lumineszenzmikroskopische Beobachtung �ber das Verhalten von Vitaminen im lebenden Organismus. Das Vitamin Bz innbsp;der Leber.

Hirt, A. en K. Wimmer: Lumineszenzmikroskopische Beobachtungen �ber das Verhalten von Nicotinsaure und Nicotinsaureamid im lebenden Organismus.nbsp;Klin. Wochenschr. Bd. 18, S. 765 (1939).

Hirt, A. en K. Wimmer: Lumineszenzmikroskopischen Untersuchungen am lebenden Tier.

Chem. Rubber Publishing Cy., Cleveland (1935). lager, R.: referent in: Zeitschr. Wiss. Mikr. Bd. 57, S. 187 (1940).

Koch, C. en F. P. Fischer: fiber das Verl�schen der Fluoreszenz der Linse im kurzwelligen Lichte.

Kreuzwendedich von dem Borne, G. A.: De blauwe fluorescentie van urine in het ultraviolette licht door indoxylverbindingen.

Kubowitz, F. en E. Haas; Ausbau der photochemischen Methoden zur Unter-suchung des Sauerstoffiibertragenden Ferments.

Melczer, N. en T. Venkei-Wlassics: Die Quecksilberhochdrucklampe als Licht-quelle fiir Fluoreszenzmikroskopie und Mikrophotographie.

M�mer, C. Th.: Untersuchungen der Proteinsubstanzen in den lichtbrechenden Medien des Auges.

Naumann, H. N.: A study on Ehrlich's test for urobilinogen and Schlesinger's reaction for urobilin.

Perrin, F.: La desactivitation induite des mol�cules et la th�orie des antioxyg�nes.

Policard, A.: Application de la spectrophotometrie aux r�cherches de fluoroscopic histologique (microspectrophotometrie).

Policard, A. en A. Leulier: Caract�risation de Th�matoporphyrine et de l'urobi-line urinaire par la lumi�re de Wood.

Querner, F. en K. Sturm: Die paraplasmatischen Fetteinschl�sse der Leberzellen und der Leuchtstoff X.

Sanni�, C.: Carcinogenic action and absorption and fluorescencespectra of 1 : 2-benzpyrene.

Schultz Brauns, O.: Verbesserungen und Erfahrungen bei Anwendung der Methode des Gefrierschneidens unfixierter Gewebe.

Siedel, W.: Synthese des Glaukobilins, sowie iiber Urobilin und Mesobiliviolin. Zeitschr. Physiol. Chemie Bd. 237, S. 8 (1937).

Siedel, W. en E. Grams: �ber Bildung und Konstitution der Mesobilipurpu-rine usw.

Siedel, W. en E. Meier: Synthese des Urobilins (Urobilin IX, a), sowie der isomeren Urobiline -III, a und -XIII, a.

Singer, E.: A microscope for observation of fluorescence in living tissues. Science (N. Y.) vol. 75, p. 289 (1932).

Sluiter, E.: De stofwisseling der mineralen in het dierlijke organisme, I. Zink. Ned. Tijdschr. v. Geneesk. dl. 74, biz. 5040 (1930).

Starkiewicz, J.: Einfluss der Wellenlange der erregenden Strahlen auf das Fluoreszenzspektrum von viscosen und festen Losungen.

Steensma, F. A.: Klinische en experimenteele onderzoekingen over urobiline en urobilinurie.

Terwen, A. ]. L.: De quantitatieve bepaling van urobiline en urobilinogeen in urine en faeces.

Vermeulen, D. en J. G. Hagedoorn: Visual intensity measurement with the aid of successive contrast.

Vl�s, F. en M. Gex.: R�cherches sur Ie spectre ultraviolet de I�oeuf d� Oursin. Arch. Phys. Biol. t. 4, p. 255 (1928).

Waelchli, G.: Mikrospektroskopische Untersuchungen der gefarbten Kugeln in der Retina von V�geln.

Wels, P.: Der Einfluss kurzwelliger Strahlen auf die Fluoreszenr von Eiweiss-k�rpem und ihren Spaltprodukten.

Wels, P. en M. Jokisch: Der Einfluss der Quarzlampenbestrahlung auf die Fluoreszenz von Geweben und Zeilen.

Westenbrink, H. G. K. en J. Goudsmit; Een chemische methode voor de bepaling van het aneurine in urine.

Wiegand, Chr.: Der Einfluss der Photooxydationsprodukte von Aminosauren auf die Fluoreszenz von Aminosauren.

Wimmer, K. en A. Hirt: Die Stellung des Reticuloendothels im Vitaminstoff' wechsel nach lumineszenzmikroskopischen Beobachtungen am lebenden Tier.nbsp;Anat. Anz. Bd. 88, Erg.-H., S. 42 (1939).

Abderhaldens Hdbch. d. Biol. Arbeitsmeth. V, 10, II, S. 1248 (1938). Wychgram, E.: �ber Mikro-Spektrographie.

Zuckerkandl, F.: Le pouvoir antifluorescent du s�rum humain, vis-a-vis de quelques seis de fluoresc�ine.

STELLINGEN

Quantitatieve bepalingen, die gegrond zijn op het meten van fluorescentie-intensiteiten en waarbij met het verschijnsel vannbsp;fluorescentie-uitdoving niet quantitatief rekening gehouden is ofnbsp;kan worden, zijn waardeloos.

De uitkomsten van de onderzoekingen van Karrer en Fritsche geven geen steun aan de theorie van v. Euler c.s. over de functienbsp;van het lactoflavine bij het zien in schemerlicht.

III

De fluorescentiereactie van Boutaric c.s. kan over het serum van carcinoomlijders en andere pati�nten waardevolle inlichtingennbsp;geven.

De snijtechniek volgens Schultz Brauns biedt ook voor het pathologisch-anatomisch onderzoek tijdens een operatie voordelen.

Het is mogelijk, dat men op klinische en microscopisch-anato-mische gronden besluit tot de diagnose: ziekte van D�j�rine-Sottas, hoewel de verdikking van de zenuwen ontbreekt.

Het nalaten van het � bij een doelmatig, gereedstaand instrumentarium weinig tijd en moeite eisende � haematologisch onderzoek kan ook in de algemene praktijk een ernstig verzuim zijn.

Voor de diagnose van lichte gevallen van diabetes dient de glucose-belastingsproef voorafgegaan te worden door een voldoende koolhydraten bevattend dieet.

Bij arthritis deformans beproeve men de bestrijding van de pijn met R�ntgenstralen.

Uit histologisch oogpunt is geen bezwaar te maken tegen het gebruik van kunstmatig uit collagene substantie gesponnen chirurgisch hechtmateriaal.

Er is in het medisch opleidingsplan behoefte aan een samenvattende cursus over de sexuele problemen, waarmede de arts in zijn praktijk te maken kan krijgen.

n.

�y�

MICROSPECTROPHOTOMETRIE VAN FLUORESCENTIELICHT,nbsp;een methode van histologisch onderzoek.

PROEFSCHRIFT

ALGEMEEN OVERZICHT.

I. INLEIDING.

10

11

20

21

(3)

470 mp^: 33�,

450 my: 1,

470 my: 0,93,

450 my: 30,

470 my: 28,

'S/'

CH2 nbsp;nbsp;nbsp;CH2

-C2H5

'C. nbsp;nbsp;nbsp;r�c=cnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�c-

44

49

61

GERAADPLEEGDE LITERATUUR:

66

Arch. Augenheilk. Bd. 108, S. 544 (1934).

67

68

69

70

STELLINGEN

I

II

III

IV

V

VI