ONDERZOEKINGEN OVER DE STOFWISSELING VAN !( )- EN d(~).GLUTAMINEZUUR IN TUMOREN METnbsp;BEHULP VAN DEUTERIUM ALS INDICATOR

ONDERZOEKINGEN OVER DE STOFWISSELING VAN !( )- EN d(�)-GLUTAMINEZUUR IN TUMORENnbsp;MET BEHULP VAN DEUTERIUM ALS INDICATOR

/.ec'

ONDERZOEKINGEN OVER DE STOFWISSELING VAN !( )- EN d(-)-GLUTAMINEZUUR IN TUMOREN METnbsp;BEHULP VAN DEUTERIUM ALS INDICATOR

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT, OPnbsp;GEZAG VAN DEN WAARNEMENDEN RECTOR MAGNIFICUS L. VAN VUUREN, HOOG-LEERAAR IN DE FACULTEIT DER LETTEREN ENnbsp;WIJSBEGEERTE, VOLGENS BESLUIT VAN DEnbsp;SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WISEN NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN OPnbsp;MAANDAG 20 APRIL 1942, DES NAMIDDAGSnbsp;TE 3 UUR

ANTONIE JACOB KLEIN

De voltooiing van dit proeischriit biedt mij een welkome gelegenheid om U, Hoogleeraien, oud-Hoogleeraren en Lectoren in de Faculteit der Wis- en Natuurkunde, hartelijk dank tenbsp;zeggen voor hetgeen Gij tot mijn wetenschappelijke opleidingnbsp;hebt bijgedragen.

In het bijzonder dank ik U, Hooggeleerde K� g 1, Hooggeachte promotor, voor de voortdurende belangstelling welke Gij voor mijn werk hebt gehad en voor het assistentschap waartoenbsp;Gij mij hebt waardig geacht. Dat ik aan het onder Uw bezielende leiding staande kankeronderzoek heb mogen deelnemen,nbsp;waardoor ik met problemen in aanraking kwam, die steeds mijnnbsp;grootste interesse hebben gehad, is een eer, welke ik nimmernbsp;zal onderschatten.

U, Zeergeleerde E r x 1 e b e n en jullie, waarde van V eer-s e n en waarde Klaarenbeek, dank ik voor de prettige samenwerking. De hulp, welke ik van jou, van V e e r s e n,nbsp;mocht ontvangen, is voor mij van zeer groote waarde geweest.

Tenslotte dank ik mijn collega's, de laboranten en het gezamenlijk personeel van het Organisch Chemisch Laboratorium voor de in velerlei opzichten verleende medewerking.

Gezien de groote beteekenis van het kankervraagstuk is het vanzelfsprekend, dat sedert geruime tijd niet alleen de medische wetenschap, maar ook de biologie en de scheikunde hebben getracht iets ter opheldering van de problemen bij te dragen. Hetgeen de biologienbsp;en wel in het bijzonder de genetische richting heeft bereikt, moetnbsp;hier uiteraard buiten beschouwing blijven. Het chemischnbsp;onderzoek strekte zich in drie richtingen uit. Als eerste hiervannbsp;noemen wij de onderzoekingen naar de chemische bestanddeelennbsp;van de gezwellen, waarbij men van de onderstelling uitging, dat hetnbsp;biologisch zoo sterk afwijkende kankerweefsel in qualitatief ofnbsp;quantitatief opzicht zou moeten verschillen van het normale weefsel. Ondanks veelvuldige pogingen is het echter tot voor kort nietnbsp;gelukt bij het doode weefsel, naast hist o-logische verschillen, ook een chemisch onderscheid te consta-teeren.

Wel heeft O. W arburg^) � en hiermede komen wij aan de tweede richting van het onderzoek � in het jaar 1924 een belangrijk verschil bij de 1 e v e n d e weefsels ontdekt ten opzichte van denbsp;glykolyse: ,,Charakteristisch f�r die Tumorzelle ist nicht dienbsp;Garung schlechthin, sondern die Garung in Sauerstoff�. De beteekenis van deze ontdekking voor het tumorvraagstuk zelf werdnbsp;echter veel kleiner, toen W a r b u r g en zijn medewerkersnbsp;vonden dat embryonale weefsels zich evenzoo gedragen. Een verklaring, waarom in het eene geval de zinlooze groei, bij de embryonbsp;echter hoogst doelmatige ontwikkeling optreedt, zal langs dezenbsp;weg niet kunnen worden verwacht.

Een derde richting van chemisch onderzoek werd omstreeks tien jaar geleden door het werk van E. L. K e n n a w a y en J. W.nbsp;Cook ingeleid. Deze auteurs hebben als kankerverwekkend agens

1) O. Warburg, K. Posener en E. Negelein, Biochem. Z. 152, 309 (1924); vgl. O. Warburg, Naturwissenschaften 25, 1 (1927).

van de steenkolenteer benzopyreen kunnen indentificeeren. Sindsdien is nog een groot aantal andere kankerverwekkende verbindingen ontdekt. Verschillende van deze cancerogene stoffen en wel vooral het methylcholanthreen, een afbraakproduct van eennbsp;galzuur (desoxycholzuur), deden de veronderstelling voor de handnbsp;liggen, dat dergelijke stoffen in het organisme door een anormalenbsp;omzetting van een steroide zouden kunnen ontstaan. Het methylcholanthreen is echter een product van het laboratorium en tot nunbsp;toe is het niet gelukt de hypothese van een anormale steroidstof-wisseling in de tumoren, door de isoleering van een chemischnbsp;gedefinieerde cancerogene stof uit gezwellen, te bewijzen. Het lijktnbsp;niet onmogelijk dat dit op den duur zal gelukken, zoodat men opnbsp;deze wijze iets over de prikkel te weten komt, welke in het organisme tot de vorming van een ,,spontaantumor� leidt.

Behalve door kankerverwekkende stoffen kunnen ook door tal van andere uitwendige factoren gezwellen ontstaan. De vraag innbsp;hoeverre deze zeer verschillende factoren in het weefsel wellichtnbsp;dezelfde storing veroorzaken, kon niet worden beantwoord, evenmin had men een verklaring voor het principieel verschillend biologisch gedrag van normale en tumorcellen.

Begin 1939 verscheen een publicatie van K�gl en E r x 1 e-b e n^), welke ten aanzien van het kankervraagstuk geheel nieuwe gezichtspunten opende. Uitgaande van de ervaring dat bij hormonen, vitaminen, enz, de antipoden van deze stoffen vaak eennbsp;andere activiteit vertoonen, met verder de ondervinding dat denbsp;proteinen .� voor zoover onderzocht ^ uitsluitend opgebouwdnbsp;zijn uit a-aminozuren van dezelfde configuratie (1-reeks), zijnnbsp;deze onderzoekers er toe overgegaan de hydrolysaten van tumor-proteinen te onderzoeken op het eventueel voorkomen van d-amino-zuren.

Zij hydrolyseerden proteinen afkomstig van verschillend materiaal en isoleerden hieruit een aantal als eiwitbouwsteenen bekende aminozuren. Van deze aminozuren werd, na reiniging door middel van herhaald omkristalliseeren of neerslaan, de specifiekenbsp;draaiing bepaald.

De resultaten van dit onderzoek kunnen zeer in het kort in de volgende drie punten worden samengevat:

1. nbsp;nbsp;nbsp;(Normaal weefsel leverde uitsluitend aminozuren van de natuurlijke (1-) configuratie.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Kwaadaardige gezwellen bevatten naast die van de natuurlijke configuratie ook bouwsteenen van de onnatuurlijke (d-)nbsp;configuratie m.a.w. de tumorproteinen zijn partieel gerace-miseerd.

3. nbsp;nbsp;nbsp;In alle onderzochte gevallen was de racemisatiegraad vannbsp;glutaminezuur het hoogst (tot 89 %).

Het spreekt vanzelf, dat die aminozuren waarvan bekend was, dat zij tengevolge van de proefomstandigheden gedurende de hydrolyse ten deele racemiseerden, al direct buiten beschouwingnbsp;werden gelaten. Ook namen K�gl en Erxleben aan, dat eennbsp;percentage d-vorm kleiner dan twee geen zeker bewijs vormdenbsp;voor racemisatie, gezien de onnauwkeurigheden bij de bepaling vannbsp;de optische activiteit.

De genoemde bevindingen hebben geleid tot het opstellen van een geheel nieuwe gezweltheorie door K�gl. Hij ziet namelijk denbsp;diepere oorzaak van de kanker in de aan iedere groei ten grondslagnbsp;liggende enzymatische eiwitsynthese en wel primair in de beschadiging van het proteolytische fermentsysteem: �es handelt sichnbsp;darum, dasz die Krebszelle die Fahigkeit verloren hat, in ihr Struk-tureiweisz wie die normale Zelle ausschlieszlich die nat�rlichennbsp;Aminosauren einzubauen�. Door synthese van verkeerde proteinennbsp;ontstaan dan de kankercellen.

De infiltratieve groei van een gezwel kan men zich zoo voorstellen, dat de normale cellen geen weerstand kunnen bieden aan het opdringen van de tumorcellen, daar zij de betreffende proteolytische fermenten, leidende tot een afbraak van de verkeerdenbsp;tumorproteinen, missen.

Ook op tal van andere punten van het kankervraagstuk werd door deze gezweltheorie een nieuw licht geworpen.

De publicatie van K�gl en Erxleben was in de afge-loopen drie jaren het onderwerp van veel discussies en in tal van laboratoria het uitgangspunt voor nieuw experimenteel werk. Welnbsp;kunnen wij constateeren dat van medische zijde nauwelijks prin-

cipieele bezwaren tegen de nieuwe gezweltheorie konden worden ingebracht. In het algemeen was men het er over eens, dat denbsp;resultaten, indien zij konden worden bevestigd, voor het kanker-vraagstuk van de grootste beteekenis zijn.

Natuurlijk rees er in de eerste plaats twijfel of men hier inderdaad met een voor gezwellen specifiek verschijnsel te doen heeft. Er werd aan de mogelijkheid gedacht dat de stereochemische afwijking slechts in de necrose optreedt en eventueel ook bij anderenbsp;pathologische weefsels wordt gevonden. K�gl, Erxleben ennbsp;Herken�) konden echter al vrij spoedig mededeelen, dat bijnbsp;} e n s e n-sarcomen en bij benzopyreentumoren de proteinen vannbsp;de necrose-arme randz�nes en het necrotische centrum na hydrolysenbsp;practisch hetzelfde percentage d-glutaminezuur leveren. Bovendien konden noch bij. niet-carcinomateuse necrose noch bij miliaar-tuberculose sterisch afwijkende bouwsteenen worden ge�soleerd.

De hoofdaanvallen tegen de nieuwe richting werden echter op het feit gebaseerd, dat in verschillende andere laboratoria de expe-rimenteele uitkomsten van K�gl en Erxleben niet kondennbsp;worden gereproduceerd. Wij willen er echter de nadruk op leggen,nbsp;dat nadien K�gl en zijn medewerkers^) aan een uitgebreid materiaal hun eerste vondsten ondubbelzinnig konden bevestigen.nbsp;Overigens zal deze kwestie een belangrijk onderdeel vormen vannbsp;de dissertatie van G. J. vanVeersen, zoodat wij op deze plaatsnbsp;hierop niet nader ingaan.

Nog uitgebreider dan de literatuur over al of niet geslaagde pogingen tot isoleering van dl-glutaminezuur uit hydrolysaten vannbsp;tumorproteinen, werd die over het optreden van d-peptidasen innbsp;weefsels en lichaamsvloeistoffen. Tot 1939 werd in de enzymologienbsp;algemeen aangenomen, dat de proteolytische enzymen zeer specifiek zijn ingesteld op de polypeptiden, respectievelijk proteinen,nbsp;welke uit de gewone 1-aminozuren zijn opgebouwd (E. Fischer,

3) nbsp;nbsp;nbsp;F. K�gl, 11. Erxleben en H. Herken, Z. physiol. Chem. 263,nbsp;107 (1940).

4) nbsp;nbsp;nbsp;F. K�gl en H. Erxleben, Z. physiol. Chem. 261, 154 (1939): 264,nbsp;108, 198 (1940); F. K�gl, H. Erxleben en A. M. Akkerman, idemnbsp;261, 141 (1939); F. K�gl, H. Erxleben en H. Herken, idem 263, 107nbsp;(1940); 264, 220 (1940); H. Erxleben en H. Herken, idem 264, 240 (1940).

M. Bergman n, enz.). De meer intensieve studie van deze vraagstukken, welke door de nieuwe gezweltheorie van K � g 1nbsp;was uitgelokt, heeft in de laatste tijd getoond, dat eenvoudigenbsp;peptiden, zooals d-leucylglycine of d-leucylglycylglycine ook doornbsp;enzym extracten van normale weefsels kunnen worden gesplitst �).nbsp;Uiteraard zal een splitsing en ook een enzymatische-synthese vannbsp;een eenvoudig di- of tripeptide niet veel kunnen zeggen over hetnbsp;verloop van de processen, welke bij de afbraak of de opbouw vannbsp;de proteinen zelf de doorslag geven.

Dat er inderdaad bij de proteolyse van normaal weefsel en van tumoren principieele verschillen optreden, konden K�glenErx-1 e b e n door de volgende proef aantoonen:

Een hond werd gedurende vier dagen gevoed met gekookt weefsel van Brow n-P e a r c e-gezwellen. Uit de faeces en urine werden peptiden ge�soleerd die respectievelijk 58 en 19 procent d( � )-glutaminezuur bleken te bevatten, terwijl de totale hoeveelheid peptide, respectievelijk glutaminezuur, in de urine tienmaal grooternbsp;was dan bij het voeden van een gelijke hoeveelheid rundvleeschnbsp;het geval was. Hiermede is aangetoond, dat in het darmkanaal innbsp;ieder geval proteinen met d-bouwsteenen veel moeilijker wordennbsp;gesplitst dan normale eiwitten en bovendien dat de aanwezigheidnbsp;van de verkeerde bouwsteenen ook het drie- tot viervoudige aannbsp;normale glutaminezuurresten onttrekt aan de inwerking der enzymen van de spijsvertering.

Reeds in de eerste mededeeling van K�gl en Erxleben werd de aandacht gevestigd op essentieele fermenten, welke denbsp;desori�nteering van de groei veroorzaken en kennelijk �in dennbsp;Zellstrukturen fest Verankert� sind�. Tot voor kort stond geennbsp;methode ter beschikking om over de actie van dergelijke onoplosbare proteinasen van het weefsel iets te weten te komen. Nu zijnnbsp;echter in de laatste jaren isotopen beschikbaar ook van die elementen, welke van belang zijn voor de organische chemie, waardoor voor de moderne biochemie geheel nieuwe wegen werdennbsp;geopend.

5) Vgl. o.a. E. B a m a n n en O. Schim ke, Biochem. Z. 370, 131 (1941): H. Herken, A. Schmitz en R. Merten, Naturwissenschaften 29. 670nbsp;(1941).

Onderzoekingen in deze richting werden vooral door Ameri-kaansche auteurs uitgevoerd. Hiervan moeten wij in verband met ons eigen werk in de eerste plaats de belangrijke publicaties vannbsp;Schoenheimer en zijn medewerkers noemen. In twee seriesnbsp;mededeelingen samengevat onder de titels �Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism� �) en �Studies in protein metabolism� deden Schoenheimer, Rittenberg ennbsp;hun medewerkers verslag van hun ervaringen en resultaten bij hetnbsp;gebruik van deuterium en als hulpmiddel bij onderzoekingennbsp;over de stofwisseling.

Uiteraard beperken wij ons ertoe van het uitgebreide materiaal slechts resultaten en ervaringen te vermelden, welke voor ons innbsp;verband met de eiwitstofwisseling onmiddellijk van beteekenisnbsp;zijn.

Volgens Schoenheimer en Rittenberg kan met behulp van deuterium als indicator op twee verschillende wijzennbsp;een onderzoek worden ingesteld naar bepaalde problemen die zichnbsp;bij de stofwisseling voordoen.

1. Men kan de weg nagaan die een met isotopen gemerkt stof-wisselingsproduct in het lichaam volgt, door het met het overige voedsel toe te dienen en na verloop van eenige tijd de overeenkomstige verbinding weer uit het lichaam te isoleeren.

Een voorbeeld van deze werkwijze is de volgende door Schoenheimer, Ratner en Rittenberg uitgevoerdenbsp;proef:

Vier ratten werden gedurende drie dagen op een dieet gehouden, dat naast de normale dieetbestanddeelen een bepaalde hoeveelheid 1( �)-leucine bevatte, dat met D en was gemerkt. Na deze drie dagen werden de dieren gedood en uit de weefselsnbsp;werd 1( �)-leucine ge�soleerd. Dit leucine werd vervolgens opnbsp;het gehalte aan D en onderzocht. Afgezien van verschillende

6) nbsp;nbsp;nbsp;R. Schoenheimer, D. Rittenberg en medewerkers, J. Biol. Chem.nbsp;111, 163, 169, 175, 183, 505 (1936); 114. 381 (1936); 117, 485 (1937); 120,nbsp;155, 503 (1937): 121. 235 (1937); 124. 159 (1938); 125. 1, 13, 23 (1938).

7) nbsp;nbsp;nbsp;R.Schoenhe imer, D. Rittenberg en medewerkers, J. Biol. Chem.nbsp;127, 285, 291, 301, 315, 319, 333, 385 (1939); 130. 703 (1939): 132, 227 (1940);nbsp;134, 653 (1940).

andere resultaten vonden de auteurs, dat het leucine ge�soleerd uit de levers van de proefdieren 0,44 atoomprocent deuterium bevatte.nbsp;Daar het deuteriumgehalte van het leucine in het dieet oorspronkelijk 1,8 atoomprocent bedroeg, volgt hieruit dat minstens 24nbsp;procent van het leverleucine door leucine uit het dieet vervangennbsp;moest zijn.

Wij halen juist dit voorbeeld aan omdat het, zooals wij later zullen zien, ook in verband met de door ons uitgevoerde onderzoekingen van groot belang is.

Schoenheimcr en Rittenberg hebben er echter nadrukkelijk op gewezen dat voor deze en soortgelijke proevennbsp;aan twee voorwaarden moet zijn voldaan. In de eerste plaats moetnbsp;het deuterium stabiel in de te onderzoeken stof zijn gebonden ennbsp;in de tweede plaats mag de te onderzoeken verbinding op haarnbsp;weg in het lichaam niet bij zoodanige reacties worden betrokken,nbsp;dat het tengevolge daarvan deuterium verliest.

Op de vraag of de met isotopen gemerkte stoffen zich hetzelfde gedragen als de gewone stofwisselingsproducten en meer in hetnbsp;bijzonder of de physiologische werkzaamheid door de invoeringnbsp;van isotopen niet verandert, gaven de auteurs het volgendenbsp;antwoord:

Het is bekend�), dat water afkomstig uit verschillende dierlijke organen hetzelfde deuteriumgehalte bezit als vrij in de natuur voorkomend, niet aan eenig organisme gebonden, water. In beide komtnbsp;namelijk op 5000 atomen H, 1 atoom D voor. Uit dit feit blijktnbsp;zonder meer dat het organisme niet in staat is onderscheid tenbsp;maken tusschen moleculen, die alleen H-atomen bevatten' ennbsp;moleculen die daarnaast ook D-atomen bevatten. Immers wanneernbsp;dit wel het geval was, dan zou een concentreering of een verdunning van de isotoop in biologisch materiaal moeten zijn waargenomen, hetgeen nooit het geval was.

Schoenheimer heeft zelf verschillende physiologisch werkzame stoffen met deuterium gemerkt en ondanks een vaaknbsp;hoog deuteriumgehalte (b.v. 11 atoomprocent) nooit iets van een

8) W. W. Steward en R. Holcomb, J. Am, Chem. Soc. 56. 1422 (1934); F. Breusch en E. Hofer, Klin. Woch. 13, 1815 (1934).

verschil in physiologische werkzaamheid ten opzichte van de niet gedeutereerde stoffen kunnen vinden.

Voor het verkrijgen van deze gedeutereerde verbindingen maakten de onderzoekers gebruik van de volgende reeds doornbsp;andere auteurs toegepaste methoden:

A. nbsp;nbsp;nbsp;De verbinding werd in sterk zuur of alkalisch milieu met DgOnbsp;verhit, waarbij het gebruik van een katalysator zooals Pt ofnbsp;Pd vaak goede diensten bewijst.

Deze methode berust op een uitwisseling van, door de omstandigheden gelabiliseerde, H-atomen tegen D-atomen.

Dergelijke uitwisselingen van H tegen D verloopen bijvoorbeeld in �COOH, �OH, �NH2, enz. buitengewoon snel. Omgekeerd is echter precies hetzelfde het geval. Wanneernbsp;verbindingen met �GOOD, �OD, �NDg, enz. worden opgelost in H2O vervangt protium oogenblikkelijk het deuterium.

Tegenover deze labiel aan zuurstof of stikstof gebonden D-atomen staan echter de aan koolstof gebonden deuterium-at�men, want deze zijn in het algemeen veel stabieler ¹).

B. nbsp;nbsp;nbsp;De gedeutereerde verbinding werd door synthese uit overeenkomstige bouwsteenen en deuterium verkregen. Dergelijkenbsp;reacties zijn bijvoorbeeld additie van D-atomen of D2O aannbsp;dubbele bindingen.

2. Een tweede methode volgens welke men over het verloop van sommige biochemische reacties iets te weten kan komen, berustnbsp;op de verhooging van het deuteriumgehalte van de lichaamsvloeistoffen. Immers wanneer het lichaamsvocht van een dier meernbsp;zwaar water bevat dan normaliter daarin voorkomt, zal ook deuterium meer dan anders aan de chemische reacties deelnemen.nbsp;Zoodoende zal het in verhoogde mate in de organische stoffennbsp;terecht komen; Schoenheimer concludeert �the rate at whichnbsp;deuterium appears in a compound may therefore be taken as anbsp;measure of the rate at which this was formed�. Inderdaad is denbsp;opneming van deuterium bij dergelijkc proeven moeilijk anders tenbsp;verklaren, dan door nieuwe vorming van de betrokken stoffen aan

Zie hiertoe blz. 19, waar de stabiliteit van de C�D-binding in glutamine-zuur wordt besproken.

te nemen. Op de vraag hoe de invoering van het deuterium in de betreffende stof tot stand komt, geeft deze methode natuurlijk geennbsp;antwoord.

Om de lichaamsvloeistoffen op een bepaald gehalte aan D2O te brengen, gaven Schoenheimer en zijn medewerkers aannbsp;muizen water te drinken, dat 2,35 atoomprocent deuterium bevatte.nbsp;Daar de cellen niet in staat zijn gedurende het proces van opnemingnbsp;en uitscheiding D2O te concentreeren (of te verdunnen), kan mennbsp;verwachten, dat na een bepaalde tijd, wanneer evenwicht is bereikt, de concentratie aan deuterium van de lichaamsvloeistoffennbsp;een constante waarde zal bereiken, die kleiner is dan die van hetnbsp;gegeven drinkwater. Bij de verbranding van het voedsel ontstaatnbsp;namelijk gewoon water, en dit zal, daar het voortdurend aan denbsp;lichaamsvloeistof wordt toegevoegd, een verdunning van hetnbsp;drinkwater ten gevolge hebben. Inderdaad bleek in het bovengenoemde experiment dat na zes dagen het deuteriumgehalte van denbsp;lichaamsvloeistof een constante waarde had aangenomen van ongeveer 1,5 atoomprocent (na 3, 4, 5, 9 en 19 dagen waren de concentraties respectievelijk 1,21, 1,09, 1,43, 1,50 en 1,51 atoomprocent).

Voor quantitatieve stofwisselingsonderzoekingen heeft de toediening van D2O in het drinkwater het bezwaar, dat het deuteriumgehalte van de lichaa'msvloeistoffen slechts langzamerhand de maximale waarde bereikt. Om dit bezwaar te ondervangen werdnbsp;bij de aanvang van de proef zooveel 98 procentig D2O subcutaannbsp;ingespoten, dat het atoompercentage deuterium daarmede direct opnbsp;een waarde van 1,5 werd gebracht. Dit percentage werd dan constant gehouden door het aan het drinkwater toegevoegde D2O.

Barbour en Trace�) vonden, dat hooge concentraties aan deuterium (20 procent) in de lichaamsvloeistof van muizen, denbsp;stofwisselingsprocessen be�nvloeden en aanleiding geven tot vergiftigingsverschijnselen. Daarom heeft !S c h o e n h e i m e! r bijnbsp;zijn proeven de concentratie zoo laag mogelijk gehouden, opmerkende, dat bij een deuteriumgehalte van 1,5 atoomprocent abnor-

Voortbouwende op de onderzoekingen van K � g 1 en Erxleben en gebruik makende van de methodiek vannbsp;Schoenheimer en zijn medewerkers hebben wij nu getrachtnbsp;een dieper inzicht te krijgen in het gedrag van de tumorcel ten opzichte van 1- en d-glutaminezuur, door van beide de stofwisseling in tumoren na te gaan.

1. nbsp;nbsp;nbsp;;Gedeutereerd 1-, d- en dl-glutaminezuur werd gevoerdnbsp;aan ratten met benzopyreen-tumoren. Na afloop werd uit denbsp;tumorproteinen 1- en d-glutaminezuur ge�soleerd en op hetnbsp;deuteriumgehalte onderzocht.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Bij ratten met benzopyreen-tumoren en bij konijnen metnbsp;Brow n-P e a r c e-tumoren werd het lichaamsvocht op eennbsp;bepaald gehalte aan deuteriumoxyde gebracht en gedurendenbsp;eenige tijd hierop gehouden. Na afloop werd ook hier uit denbsp;tumorproteinen 1- en d-glutaminezuur ge�soleerd en op hetnbsp;deuteriumgehalte onderzocht.

Bovendien werd bij deze, zoowel als bij de onder 1 genoemde proeven, naast de tumor ook normaal weefsel, in de regel afkomstig van de lever, opgewerkt en van het ge�soleerde glutaminezuur eveneens het deuteriumgehalte bepaald.

De reden waarom wij juist van 1- en d-glutaminezuur de stofwisseling onderzocht hebben en niet van een van de andere in tumorproteinen partieel geracemiseerde aminozuren, is gelegennbsp;in het feit, dat juist voor glutaminezuur in alle onderzochte gevallen verreweg de hoogste racemisatiegraad werd gevonden.

De deuteriumanalysen werden in ons laboratorium uitgevoerd door den heer G. J. van V e e r s e n, die over de toegepastenbsp;methoden en de opgedane ervaringen in zijn eigen proefschrift uitvoerig mededeeling zal doen. Gaarne betuig ik hem ook op dezenbsp;plaats voor de verleende medewerking mijn bijzondere dank. Volledigheidshalve moge hier de werkwijze in het kort worden vermeld. Voor literatuur verwijzen wij naar de nauwkeurige beschrijving welke Keston, Rittenberg en Schoenheimer�^�)nbsp;hebben gegeven.

De te onderzoeken deuteriumhoudende stof werd, onverdund of verdund met de overeenkomstige niet-gedeutereerde stof, in eennbsp;zuurstofstroom verbrand en het verbrandingswater opgevangen.nbsp;De verbranding zelf geschiedde in een voor � Vs met staafjesnbsp;koperoxyde gevulde buis van kwartsglas (lengte 75 cm). Nadatnbsp;het opgevangen water door middel van een klein stukje toegevoegdnbsp;koperdraad van het eventueel aanwezige chloor (uit de verbrandenbsp;chloorhydraten) was bevrijd, werd het bij een druk van 1 mmnbsp;kwik achtereenvolgens af gedestilleerd van a) bariumcarbonaat,nbsp;b) chroomtrioxyde en c) kaliumpermanganaat -f- KOH. Tenslottenbsp;werd nogmaals, nu echter zonder een enkele toevoeging, bijnbsp;dezelfde druk gedestilleerd.

1. nbsp;nbsp;nbsp;volgens de methode van de vallende druppel, waarbij ortho-fluoortoluol als valmedium diende,

2. nbsp;nbsp;nbsp;met behulp van de interferometer, door gebruik te makennbsp;van het verschil in brekingsindex van H2O en D2O.

10) A. Keston, D. Rittenberg en R. Schoenheimer, J. Biol. Chem. 122. 227 (1937).

Beschikten wij over een voldoende hoeveelheid te analyseeren stof, dan pasten wij in de regel beide methoden van onderzoek toe.nbsp;Was dit niet het geval, dan werd aan de valmethode, als zijndenbsp;de zuinigste in het verbruik van verbrandingswater, de voorkeurnbsp;gegeven.

In beide gevallen werd het te onderzoeken mengsel x vergeleken met van te voren ingewogen oplossingen van D2O ¹) in H2O.nbsp;Door vergelijking van de valsnelheden en de interferometrischenbsp;waarden van de bekende oplossingen met die van het onbekendenbsp;mengsel, kon het D20-gehalte van dit laatste, en zoodoende hetnbsp;deuteriumgehalte van de oorspronkelijke stof, worden bepaald.

Ter verduidelijking zullen wij voor de beide methoden, aan de hand van een enkel geval, de berekening van het deuteriumgehaltenbsp;doorvoeren.

Met deze eene serie ijkoplossingen kon ongeveer een jaar worden gewerkt. Daarna werden nieuwe oplossingen gemaakt. Men zal dan ook bij de bestu-

Het in dit proefschrift gebruikte zware water was afkomstig van de Norsk HydrO'Elektrisk Kvaelstofaktieselskab en werd ons welwillend ter beschikking gesteld door de 1. G. Farbenindustrie A. G. Werk Elberfeld. Hetnbsp;DgO-gehalte van dit product was berekend met behulp van de waarde voor hetnbsp;specifieke gewicht van 100 procentig DgO, waarvoor = 1,10541 (zienbsp;Trans. Farad. Soc. XXXIV, 769 (1938)). Het bevatte 99,(56 g/100 g D2Onbsp;(d^ = 1,10505).

deering van dit proefschrift zien dat een gedeelte van de deuteriumanalysen gedaan werd met de eerste, het andere gedeelte met de tweede serie.

= (1,14�0,76) : x�

waarin x� het gewichtspercentage �2O is, dat wij bij het gewichtspercentage van oplossing 3 moeten optellen, om dat van het mengsel X te verkrijgen.

Het verband tusschen gewichtspercentage D2O en de af te lezen interferometerwaarden is in het geheele gebied waarin we meten,nbsp;dus van 0 tot 2,79 gewichtsprocent D2O, rechtlijnig.

De betrekking die wij op kunnen schrijven wordt dan: (173�29) : (95�29) = x : 0,38

Was deze oplossing x het verbrandingswater van een gedeute-rcerde organische stof, b.v. glutaminezuur, dan werd uit het ge-wichtspercentage D2O van het verbrandingswater met behulp van de volgende formule het atoompercentage deuterium van de verbrande stof berekend:

waarbij wij onder het atoompercentage deuterium van een verbinding verstaan de verhouding van het aantal in de stof voorkomende D-atomen tot het totale aantal H- en D-atomen. Dit begrip geeft dus aan, welk gedeelte van het oorspronkelijk in denbsp;stof voorkomende aantal H-atomen is vervangen door D-atomen.

Wat betreft de fout, die bij de analyse gemaakt werd, hebben wij ondervonden, dat deze voor de onverdund verbrande stof bedroeg 0,01 atoomprocent; verdunden wij de stof daarentegen voornbsp;de verbranding bijvoorbeeld vijfmaal, dan werd de fout vijfmaalnbsp;grooter.

Tot slot vermelden wij, dat voor glutaminezuur in alle in dit proefschrift voorkomende gevallen, indien niet uitdrukkelijk andersnbsp;vermeld, het opgegeven atoompercentage deuterium werd berekendnbsp;voor het zoutzuurvrije glutaminezuur, ook dus wanneer het glutaminezuur als het hydrochloride werd verbrand.

2. Gedeutereerd !( )- en d(�)-glutaminezuur

Daar het in onze bedoeling lag om bij de voedingsproeven met gedeutereerd glutaminezuur de beide optische antipoden afzonderlijk toe te passen, zochten wij naar een geschikte methode omnbsp;rechtstreeks optisch actief gedeutereerd glutaminezuur te bereiden.

weg, uitgaande van optisch actieve stoffen, deuterium in te voeren, meenden wij tenslotte het beste ons doel te kunnen bereiken doornbsp;te trachten in een uitwisselingsreactie de waterstof vannbsp;het glutaminezuur gedeeltelijk door deuterium te vervangen.

In ons geval, waar we uitgingen van optisch zuiver !( )- en d( � )-glutaminezuur, dienden wij er dan speciaal op te letten denbsp;omstandigheden zoodanig te kiezen dat er geen, of zoo goed alsnbsp;geen, racemisatie kon optreden.

1 g Pt02.H20 reduceerden wij in 8 cm^ D2O (dM= 1,10505) met deuteriumgas ¹) tot platina en brachten daarna het geheelenbsp;mengsel over in een dikwandige glazen buis (Cariusbuis). Vervolgens werden 6 g glutaminezuur en 6 cm� geconcentreerd zoutzuur (37 %) toegevoegd, de Cariusbuis dichtgesmolten en negennbsp;dagen geschud bij 95�C. Het platina werd na afloop afgefiltreerdnbsp;en de heldere, lichtgele oplossing in vacuum drooggedampt. Denbsp;laatste bewerking herhaalden wij ^ om alle labiel gebonden deuterium te verwijderen � nog driemaal telkens met � 30 cm� water,nbsp;namen tenslotte het residu op in 50 cm� water en neutraliseerdennbsp;deze oplossing met geconcentreerde ammonia op congopapier.nbsp;Hierbij kristalliseerde het zoutzuurvrije glutaminezuur uit. Ditnbsp;glutaminezuur zuiverden wij nog verder door op te lossen in 60 cm�nbsp;heet water waarna 60 cm� warme alcohol werden toegevoegd.nbsp;Na een nacht staan in de ijskast bedroeg het gewicht van denbsp;uitgekristalliseerde hoeveelheid in beide gevallen 5 g.

Voor de specifieke draaiing van het 1 {-]-)-glutaminezuur vonden we 31�,8 (bepaald voor een 5 procentige oplossing in 9 procentignbsp;zoutzuur); voor die van het d( �)-glutaminezuur � 31�,7. Denbsp;specifieke draaiingen van de uitgangsproducten waren respectievelijk 31�,7 en � 31�,6. Een merkbare racemisatie had dus nietnbsp;plaats gevonden.

De bepaling van het deuteriumgehalte gaf als uitkomst voor het 1 (-j-)-glutaminezuur 7,4 �0,1 atoomprocent D:

Het deuterium verkregen wij eenvoudig door electrolyse van het van de Norsk Hydro-Elektrisk Kvaelstofaktieselskab afkomstige DgO (d^ = 1,10505).nbsp;Vlg. D. Rittenberg en R. Schoenheimer, J. Biol. Chem. 111, 169nbsp;(1935).

0,1020 g gedeutereerd glutaminezuur verbrand met 0,9890 g niet-gedeutereerd glutaminezuurnbsp;nulstand interferometernbsp;nbsp;nbsp;nbsp;= 28,5

Om de stabiliteit van de C�D-binding in het zoo verkregen glutaminezuur te onderzoeken, verhitten wij de stof met zoutzuur

0,200 g 1 ( )-glutaminezuur, bevattende 7,0 atoomprocent deuterium, werd opgelost in 5 cm� geconcentreerd zoutzuur en gedurende 12 uur tot juist koken in een oliebad verwarmd. Daarna dampten we de oplossing in vacuum droog en kristalliseerden hetnbsp;residu eenmaal om uit 20 procentig zoutzuur. Het deuteriumgehaltenbsp;bleek na deze behandeling te zijn gedaald tot 3,9 atoomprocent,nbsp;hetgeen overeenkomt met een verlies aan deuterium van 44nbsp;procent:

0,0962 g gedeutereerd glutaminezuur-HCl verbrand met 0,2606 g niet-gedeutereerd glutaminezuur-HClnbsp;valtijd voor oplossing x =nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;53,7 sec.

Het spreekt vanzelf dat wij, indien wenschelijk, met behulp van de beschreven methode ook in dl-glutaminezuur deuterium tot eennbsp;overeenkomstig atoompercentage zouden kunnen invoeren. Wenbsp;hebben hiervan geen gebruik gemaakt, daar wij om tot dit doel

11) D. Rittenberg,A. Keston, R. Schoenheimer en G. L. Foster, J. Blol. Chem. 125, 1 (1938).

te geraken over een andere, en zooals we hierna zullen zien, in vele opzichten betere methode beschikten.

Optisch inactief glutaminezuur met een hoog gehalte aan deuterium bereidden wij, uitgaande van a-ketoglutaarzuur, overeenkomstig de methode van K n o o p voor de synthese van gewoon glutaminezuur. Verder maakten wij gebruik van enkele gegevensnbsp;van Rittenberg en zijn medewerkers^�), welke deze reactienbsp;eveneens hebben uitgevoerd.

10,22 g a-ketoglutaarzuur (smeltpunt 108��109� C) ¹ ²) werden met 2,45 g palladiumoxyde, 122,5 cm� H2O en 32,9 cm� 25 procen-tige ammonia gedurende 12 uur in een deuteriumatmosfeer geschud. Hierbij werden � 1800 cm� deuterium opgenomen. Hetnbsp;palladium filtreerden wij na afloop van de reactie af, waarna wijnbsp;de oplossing in vacuum droogdampten. Het residu werd opgenomen in een hoeveelheid water zoodat de verkregen, eenigszinsnbsp;troebele, oplossing een volume had van 25 cm�. Deze oplossingnbsp;werd vervolgens geneutraliseerd met 37 procentig zoutzuur opnbsp;congopapier, waarbij het glutaminezuur uitkristalliseerde.

Daar dit glutaminezuur blijkens verschillende elementairana-lysen door enkel omkristalliseeren uit water of verdunde alcohol practisch niet zuiver was te krijgen, maakten wij er het zoutzurenbsp;zout van en kristalliseerden dit om uit 20 procentig zoutzuur. Denbsp;analyse gaf nu de te verwachten percentages C, H en N. Opbrengst 7 g.

Het deuteriumgehalte bleek te zijn 9,42 � 0,06 atoomprocent voor het zoutzure zout, wat overeenkomt met 10,47 � 0,06 atoomprocent voor het vrije glutaminezuur:

0,0320 g gedeutereerd glutaminezuur-HCl verbrand met 0,1553 g niet-gedeutereerd glutaminezuur-HClnbsp;valtijd voor oplossing x =nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;38,0 sec.

13) nbsp;nbsp;nbsp;D. Rittenberg, S. Ratner en H. D. H oberman, J. Am. Chem.nbsp;Soc. 62. 2249 (1940).

Uit het zoutzure zout konden wij zoonoodig weer het vrije gluta-minezuur verkrijgen, door op de gewone wijze een waterige oplossing van het zout met 25 procentige ammonia op congopapier te neutraliseeren.

Om te onderzoeken of wij het deuteriumgehalte belangrijk konden opvoeren door de reactie inplaats van in H2O in een mengsel van H2O en D2O te doen verloopen, namen wij de volgende tweenbsp;proeven.

A: 1,46 g a-ketoglutaarzuur werd met 17,5 cm� H2O, 4,7 cm� 25 procentige ammonia en 0,350 g palladiumoxyde gedurendenbsp;6 uur in een deuteriumatmosfeer geschud.

B: 1,46 g a-ketoglutaarzuur werd met 13,1 cm� H2O, 4 cm� D2O, 4,7 cm� 25 procentige ammonia en 0,350 g palladiumoxydenbsp;gedurende 6 uur in een deuteriumatmosfeer geschud.nbsp;Opgenomen werden eveneens 200 cm� D2.

In beide gevallen hebben wij op de reeds beschreven wijze, het zoutzure zout van het glutaminezuur ge�soleerd.

De deuteriumanalyse gaf voor het glutaminezuur van proef A de waarde 12,3 � 0,1 atoomprocent deuterium:

0,0286 g gedeutereerd glutaminezuur-HCl verbrand met 0,2076 g niet-gedeutereerd glutaminezuur-HClnbsp;valtijd voor oplossing x =nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;44 sec.

Voor het glutaminezuur van proef B werd gevonden de waarde 15,7 � 0,1 atoomprocent deuterium:

0,0312 g gedeutereerd glutaminezuur-HCl verbrand met 0,2139 g niet-gedeutereerd glutaminezuur-HClnbsp;valtijd voor oplossing x =nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;36,1 sec.

Inderdaad had dus toevoegen van D2O een verhooging van het deuteriumgehalte tot gevolg. Daar het er, met het oog op de uitnbsp;te voeren voedingsproeven, weinig op aan kwam of wij werkten

met een glutaminezuur, dat 12,3 atoomprocent deuterium bevatte of met een praeparaat, dat ruim 3 atoomprocent meer inhield, besloten wij, gezien de D20-besparing, aan de oorspronkelijke uitvoering van de proef in H^O-milieu vast te houden.

Ook hier, evenals bij de uitwisselingsreactie, onderzochten wij de stabiliteit van de C�D-binding door te koken met zoutzuur.

0,140 g van het volgens proef A verkregen glutaminezuur-HCl werd gekookt met 3,5 cm^ geconcentreerd zoutzuur gedurendenbsp;12 uur. De oplossing dampten wij daarna in vacuum droog en hetnbsp;residu werd eenmaal uit 20 procentig zoutzuur omgekristalliseerd.nbsp;Volgens de deuteriumanalyse bevatte het zoutzuurvrije glutaminezuur nu 11,6 atoomprocent deuterium, m.a.w. een verlies aan deuterium van 5,7 %:

0,0244 g gedeutereerd glutaminezuur-HCl verbrand met 0,1513 g niet-gedeutereerd glutaminezuur-HClnbsp;valtijd voornbsp;nbsp;nbsp;nbsp;oplossingnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;xnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;=nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;40,1nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;sec.

� nbsp;nbsp;nbsp;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;5anbsp;nbsp;nbsp;nbsp;=nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;40,2nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�

0,180 g van het volgens proef B verkregen glutaminezuur behandelden wij op dezelfde wijze met 4,5 cm� geconcentreerd zoutzuur. Hier gaf de deuteriumanalyse voor het glutaminezuur een waarde van 14,5 atoomprocent deuterium, hetgeen overeenkomtnbsp;met een verlies aan deuterium van 7,7 %:

Vergelijken wij deze waarden met de waarde gevonden bij het door uitwisseling verkregen gedeutereerde glutaminezuur, dan valtnbsp;direct op het enorme verschil in stabiliteit van de C�D-binding.nbsp;Een volledige opheldering van deze kwestie geeft echter een publicatie van Ratner, Rittenberg en Schoenheimer^^).nbsp;Op grond van hun onderzoekingen over de stabiliteit van denbsp;C�^D-binding in glutaminezuur komen deze auteurs tot de

conclusie dat het waterstofatoom in de a-positie en de waterstofatomen in de j8-positie stabiel, die in de y-positie �semilabiel� zijn. Onder semilabiel verstaan zij hier een zeer langzame uitwisselingnbsp;van D tegen H en omgekeerd. Het door hen in een uitwisselings-reactie in sterk zuur D20-milieu verkregen glutaminezuur bevattenbsp;semilabiel deuterium in de y-positie, het uit a-ketoglutaarzuur verkregen product stabiel deuterium in de �- en in de /8-positie.

Deze feiten geven een afdoende verklaring voor het door ons gevonden verschil in stabiliteit.

VOEDINiGSPROEVEN MET GEDEUTEREERD GLUTAMINEZUUR BIJ RATTEN METnbsp;BENZOPYREEN-TUMOREN

Voor de medische kant van de in de volgende hoofdstukken besproken proeven stond ons ter zijde de heer F. W. K1 a a r c n-b e e k, die in de biochemische afdeeling van ons laboratorium de benoodigde tumorstammen heeft gekweekt en operaties, inspuitingen e.d. bij de proefdieren uitvoerde. Ook op deze plaats wil iknbsp;niet nalaten hem hiervoor mijn bijzondere dank te betuigen.

Het opwekken van de benzopyreen-tumoren geschiedde door normale ratten subcutaan in de rug te injiceeren met Vz cm^ olijfolie,nbsp;waarin was opgelost 10 mg benzopyreen. Na drie tot vier maandennbsp;begon zich dan op de plaats van de inspuiting een gezwel te ontwikkelen.

De voedingsproeven voerden wij uit bij series van vier tot zes volwassen ratten met goed ontwikkelde benzopyreen-tumoren.

Rat no. 1: Gewicht 200 g. Tumor ter grootte van een walnoot (geschat gewicht 10 g).

Rat no. 2: Gewicht 205 g. Tumor ter grootte van een walnoot (geschat gewicht 15 g).

Rat no. 3: Gewicht 210 g. Tumor ter grootte van een walnoot (geschat gewicht 10 g).

Rat no. 4: Gewicht 160 g. Tumor ter grootte van een hazelnoot (geschat gewicht 5 g).

Rat no. 5: Gewicht 190 g. Tumor ter grootte van een walnoot (geschat gewicht 15 g).

Rat no. 6: Gewicht 220 g. Tumor ter grootte van een mandarijn (geschat gewicht 35 g).

De dieren werden in afzonderlijke kooien geplaatst en gedurende vier dagen op een di�et van de volgende samenstelling gehouden:

gedroogde nbsp;nbsp;nbsp;brouwerijgistnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;5nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;%

Iedere rat kreeg hiervan per dag 12 g, met 5 g water aangemaakt tot een deeg. Verder ontvingen de dieren drinkwater ad libitum.

Na afloop van de vier dagen voegden wij aan het di�et toe gedeutereerd dl-glutaminezuur, bereid op de reeds beschreven wijzenbsp;uit a-ketoglutaarzuur, met een deuteriumgehalte van 10,5 atoom-procent. Aan 98 g di�et werd 2 g gedeuteerd glutaminezuur toegevoegd.

Van het di�et met zwaar glutaminezuur gaven wij iedere rat eveneens een dagelijks rantsoen van 12 g, dat volledig verbruiktnbsp;werd. Na zeven dagen werden de dieren gedood.

Ter bepaling van het deuteriumgehalte der lichaamsvloeistoffen namen wij van de ratten nos 1, 4 en 6 ongeveer 1 cm� bloed. Dezenbsp;hoeveelheden bloed werden vereenigd en gecentrifugeerd. Denbsp;bovenstaande heldere vloeistof destilleerden wij bij een druk vannbsp;1 mm kwik, waarbij de temperatuur van het waterbad 25� C bedroeg en de ontvanger werd gekoeld in vast C02. Van het destillaat bepaalden wij het deuteriumgehalte door het evenals een vastenbsp;stof in een zuurstofstroom te verbranden, daarna te destilleeren,nbsp;enz, (zie hoofdstuk II).

Het deuteriumgehalte van het lichaamsvocht bleek te zijn 0,03 �; 0,01 atoomprocent:

De lichaamsgewichten en de tumoren waren:

Rat no. nbsp;nbsp;nbsp;1: Gewicht 230nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;g.

� nbsp;nbsp;nbsp;2:nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;260nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;g.

� nbsp;nbsp;nbsp;3:nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;230nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;g.

4: nbsp;nbsp;nbsp;200 g.

� nbsp;nbsp;nbsp;5:nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;225nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;g.

6: nbsp;nbsp;nbsp;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;280 g.

Behalve de tumoren werden ook de levers van de proefdieren uitgenomen. De tumoren werden zooveel mogelijk bevrijd vannbsp;necrotisch weefsel.

Tumoren en levers maalden wij vervolgens met behulp van een Latapie-molen. He totale gewicht van het gemalen materiaal bedroeg respectievelijk 197 g en 46 g.

Voor de isoleering van het glutaminezuur uit deze weefsels werd volgens de in ons laboratorium gebruikelijke wijze te werk gegaan.nbsp;Aangezien in vele laboratoria bij de isoleering van dl-glutaminezuurnbsp;uit tumoren experimenteele moeilijkheden zijn ondervonden, lijktnbsp;het wenschelijk de door K�gl en Erxleben en ook doornbsp;ons gevolgde werkwijze zoo minitieus mogelijk te beschrijven.

Om zeker te zijn dat het te isoleeren glutaminezuur zich oorspronkelijk in eiwitverband had bevonden, was het in de eerste plaats noodzakelijk, een fractioneering toe te passen, waardoor wij laag-moleculaire celbestanddeelen zoo goed als volledig uit het uitgangsmateriaal verwijderden.

Daartoe werden de weefselmassa�s met de zesvoudige gewichts-hoeveelheid 0,9 procentige NaCl-oplossing en een weinig toluol geschud en daarna gedurende 24 uur in de ijskast gezet. Doornbsp;centrifugeeren scheidden wij het onoplosbare gedeelte af ennbsp;waschten dit achtereenvolgens tweemaal uit met water, tweemaalnbsp;met alcohol en eenmaal met aether. Het drogen geschiedde innbsp;vacuum boven P2'05.

Aan de, het oplosbare gedeelte bevattende, NaCl-oplossing voegden wij het vier- tot vijfvoudige volume 96 procentige alcoholnbsp;toe en lieten dit mengsel 24 uur in de ijskast staan. Het neerslag,nbsp;bestaande uit de oplosbare eiwitten, werd weer door centrifugeerennbsp;afgescheiden, waarna werd uitgewasschen, eerst met 75 procentigenbsp;alcohol, daarna met 96 procentige alcohol en tenslotte met aether.nbsp;Gedroogd werd op dezelfde wijze als bij het onoplosbare gedeelte.

Vooral het uitwasschen met water, alcohol en aether dient met groote zorgvuldigheid te geschieden, daar anders de kans bestaatnbsp;dat�NaCl in de neerslagen achterblijft. Dit NaCl werkt zeer storendnbsp;bij de isoleering van het dl-glutaminezuur.

Het totale gewicht van het gedroogde tumorweefsel (oplosbaar -f- onoplosbaar gedeelte) bleek te bedragen 18 g, dat van het gedroogde weefsel der levers 8 g.

Hiertoe verhitten wij de stof gedurende zeven uur tot juist koken met de drievoudige gewichtshoeveelheid 37 procentig zoutzuur. Nanbsp;afkoelen werd het hydrolysaat met een gelijk volume gedestilleerdnbsp;water verdund en gefiltreerd. Om het zoutzuur zooveel mogelijk tenbsp;verwijderen werd het fikraat vervolgens eenige malen met gedestilleerd water in vacuum drooggedampt.

Het residu, een bruine stroop, losten wij op in de tienvoudige hoeveelheid water, waarna wij de oplossing bij kamertemperatuurnbsp;schudden met een overmaat gepoederd CU2O ter verwijdering vannbsp;de aanwezige humusstoffen. Het cuprooxyde werd hierbij in eennbsp;tijdsverloop van tien minuten portiesgewijze aan de oplossing toegevoegd, totdat de roode kleur ervan onveranderd bleef. Daarnanbsp;werd het neerslag afgezogen en het fikraat aangezuurd met weinignbsp;4 n zoutzuur en, verzadigd met H2S om de Cu-ionen neer te slaan.nbsp;De laatste bewerking geschiedde door gedurende ^ uur met eennbsp;flinke snelheid H2S in te leiden. Door filtratie verkregen wij eennbsp;min of meer gele, heldere oplossing, welke wij na eventueel opkokennbsp;met een weinig kool (om de gele kleur te verwijderen) in vacuumnbsp;concentreerden tot een middelmatig viskeuse stroop. Deze stroopnbsp;werd met behulp van een pipet overgebracht in een erlenmeyer vannbsp;het twee- tot drievoudige volume, waarna bij 0�C tot verzadigingnbsp;zoutzuurgas werd ingeleid. Wij entten met een enkel kristalletjenbsp;1-, d- en dl-glutaminezuur-hydrochloride en sloten de erlenmeyernbsp;met een kurk af. Na minstens vier dagen staan in de ijskast werdnbsp;het gekristalliseerde glutaminezuur-HCl met behulp van een glas-fiker scherp afgezogen, gewasschen met weinig ijskoud geconcentreerd zoutzuur en gedroogd in vacuum boven vast NaOH.

Tengevolge van de viscositeit van de moederloog is het afzuigen van het kristallisaat een zeer tijdroovende bezigheid. Bovendiennbsp;kan het voorkomen, dat de stroop niet zonder meer van de kristal-massa is te scheiden. De oorzaak hiervan is, dat tegen het eindenbsp;van de bewerking in de op het glasfilter liggende kristalbrij scheuren ontstaan, welke verder afzuigen nutteloos maken. In een dergelijk geval voegden wij aan de kristalmassa eenige druppels gecon-

16) Vgl. E. Abderhalden, Handb. d. biochem. Arbeitsmethoden, Bd. II, 492 (1910).

centreerd zoutzuur toe en roerden met een glasstaafje tot weer een egale kristalbrij het filter bedekte, waarna het afzuigen werdnbsp;voortgezet. Zoo noodig herhaalden wij deze bewerking. Het eindresultaat was, dat wij een zuiver witte massa, bestaande uit zeernbsp;kleine kristallen, verkregen.

De moederloog werd verder ingedampt, bij 0�C opnieuw met zoutzuurgas verzadigd en na enten weer minstens vier dagen in denbsp;ijskast gezet, waardoor een tweede hoeveelheid kristallen konnbsp;worden ge�soleerd.

Meestal volstonden wij met twee kristallisaten. Slechts in die gevallen, waarbij achteraf bleek, dat te weinig dl-glutaminezuur-HCl was gekristalliseerd, isoleerden wij een derde en desnoods eennbsp;vierde hoeveelheid. De gezamenlijke kristallisaten werden vervolgens uit zoo weinig mogelijk 20 procentig zoutzuur omgekristalliseerd. Werkten wij met parti�el geracemiseerd glutaminezuur, dannbsp;werd hierbij een verlies van hoogstens 15 procent toegestaan. Hetnbsp;omkristalliseeren met grootere verliezen heeft namelijk tot gevolg,nbsp;dat een te groot gedeelte van het aanwezige dl-glutaminezuur-HClnbsp;verloren gaat. Wij voerden de bewerking op de volgende wijze uit.nbsp;De stof werd met zoo weinig 20 procentig zoutzuur in een erlen-meyertje tot juist koken verhit, dat pas na voorzichtig druppelsgewijze zoutzuur toevoegen kon worden bereikt, dat een bij hetnbsp;kookpunt verzadigde oplossing van glutaminezuur-HCl in 20 procentig zoutzuur werd verkregen. We entten weer met 1-, d- en dl-glutaminezuur-hydrochloride en zetten de oplossing minstens 24 uurnbsp;in de ijskast. Van het verkregen product bepaalden wij na hetnbsp;drogen de specifieke draaiing.

Waren wij bij de opwerking uitgegaan van normaal weefsel, waaruit dus uitsluitend l( )'glutaminezuur kon worden verkregen, dan kristalliseerden wij daarna nog eenmaal om, hetgeen innbsp;de regel voldoende bleek om een absoluut zuivere stof in handennbsp;te krijgen. Anders was het echter, wanneer wij uitgingen vannbsp;tumorweefsel, omdat hierbij een parti�el geracemiseerd glutaminezuur werd verkregen. Daar wij zoowel het deuteriumgehalte vannbsp;het 1( )- als van het d( �)-glutaminezuur wenschten te bepalen,nbsp;dienden wij om te zien naar een middel om de beide antipoden tenbsp;scheiden. De bestaande methoden om dl-aminozuren in de optischenbsp;antipoden te splitsen, zijn echter niet eenvoudig en de verliezen,nbsp;welke er bij optreden, zijn groot.

Door gefractioneerde kristallisatie werd een scheiding teweeggebracht tusschen !( )- en dl-glutaminezuur-HCl. Dit ging betrekkelijk eenvoudig in zijn werk. Daar wij de draaiing van het kristallisaat hadden bepaald, kenden wij de hoeveelheid dl-gluta-minezuur, die er in aanwezig was. Met behulp van de waarde voornbsp;de oplosbaarheid van het dl-glutaminezuur-HCl konden wij dannbsp;berekenen hoeveel cm� 20 procentig zoutzuur wij moesten gebruiken om deze hoeveelheid bij 0�C juist in oplossing te houden. Wijnbsp;namen 25 tot 30 procent minder dan deze berekende hoeveelheidnbsp;en losten de stof hierin op. Daarna werd met 1 ( )-glutamine-zuur-iHCl ge�nt en de oplossing in de ijskast gezet. Het l(-|-)-glu-taminezuur en meestal ook een klein gedeelte van het dl-glutamine-zuur kristalliseerde nu uit. Het verkregen product leverde na eenmaal omkristalliseeren uit 20 procentig zoutzuur zuiver ](-(-)-g]uta-minezuur-^HCl. De oplossing van het dl-glutaminezuur werd ingedampt tot een klein volume en ter kristallisatie 24 uur in de ijskastnbsp;gezet. Zoo noodig kristalliseerden wij daarna nog eenmaal uitnbsp;zoutzuur om.

Hierna bepaalden wij zoowel van het 1( )quot; als van het dl-glutaminezuur het atoompercentage deuterium. Een kleine berekening leverde ons dan het deuteriumgehalte van het d( � )-gluta-minezuur.

Van ieder kristallisaat werd steeds de specifieke draaiing bepaald, terwijl de zuiverheid werd nagegaan met behulp van een elementairanalyse ¹).

Wat betreft de oplosbaarheid van het !( )- en dl-glutamine-zuur-HCl, maakten wij gebruik van de reeds eerder in ons laboratorium gevonden waarden

A. Glutaminezuur uit de levers. Het ruwe kristallisaat uit de levers bedroeg 0,660 g. Na tweemaal omkristalliseeren uit eennbsp;ruime hoeveelheid 20 procentig zoutzuur hielden wij over 0,324 g.nbsp;Hiervan was de draaiing:

Deze analysen werden uitgevoerd door den heer P. J. Hubers te Amsterdam. De stoffen werden van te voren in vacuum boven P2O5 bij kamertemperatuurnbsp;gedroogd.

17) F. K�gl, H. Erxleben en A. M. Akkerman, Z. physiol. Chem. 261. 141 (1939).

4,487 mg stof: 5,32 mg COg, 2,19 mg HgO 4,942 mg stof: 0,329 cm� Ng (23�, 771 mm)

B. Glutaminezuur uit de tumoren. Het ruwe kristallisaat bedroeg 2,115 g. Na eenmaal omkristalliseeren uit zoo weinig mogelijk 20 procentig zoutzuur hielden wij over 1,793 g.

1,20.100

Door gefractioneerde kristallisatie werd dit product gescheiden in 1 ( )- en dl-glutaminezuur-HCl.

De opbrengst aan l(-|-)-glutaminezuur-HCl bedroeg na tweemaal omkristalliseeren uit een ruime hoeveelheid 20 procentig zoutzuur 0,850 g.

De specifieke draaiingen werden bepaald voor 5 procentige oplossingen van het vrije glutaminezuur in 9 procentig zoutzuur.

Bij deze elementairanalysen geven kleine atoompercentages deuterium, zoo-als die voorkomen in het door ons ge�soleerde glutaminezuur, afwijkingen, welke Ver binnen de proeffouten liggen.

4,355 mg stof; 5,18 mg COg, 2,10 mg HgO 4,701 mg stof: 0,315 cm� Ng (23�, 771 mm)

De deuteriumanalyse gaf een gehalte aan deuterium van 0,04 � 0,01 atoomprocent:

De opbrengst van het dl-glutaminezuur-HCl na tweemaal om-kristalliseeren was 0,264 g.

0.100

5,09~

4,291 mg stol: 5,11 mg COg, 2,13 mg H2O 4,719 mg stof: 0,313 cm� Ng (23�, 771 mm)

Uit het deuteriumgehalte van het 1 ( )- en dl-glutaminezuur kunnen wij dat van het d( � )-glutaminezuur berekenen.

Aan de beschreven voedingsproef ging een, ter orienteering uitgevoerd, overeenkomstig onderzoek vooraf met gedeutereerd

l( )-glutamine2uur (7,4 atoomprocent D) en gedeutereerd d(�)-glutaminezuur (7,5 atoomprocent D). In beide was het deuterium door een uitwisselingsreactie ingevoerd (zie hoofdstuk II).

Ongetwijfeld is het door uitwisseling verkregen gedeutereerde glutaminezuur, als gevolg van het feit dat de D-atomen niet stabielnbsp;in de stof zijn gebonden, minder geschikt om het voor voedings-proeven te gebruiken. Vooral is dit het geval, wanneer men opnbsp;zichzelf staande gevolgtrekkingen van quantitatieve aard uit hetnbsp;onderzoek wil maken. Daar onze voedingsproeven echter in denbsp;eerste plaats tot doel hadden eventueel bestaande verschillen innbsp;de stofwisseling van 1- en d-glutaminezuur aan te toonen, meendennbsp;wij over het bezwaar van het niet volkomen stabiel gebonden zijnnbsp;van de deuteriumatomen te kunnen heenstappen.

A. nbsp;nbsp;nbsp;Bij toevoeging aan het dieet van gedeutereerd l(-[-)-gluta'nbsp;minezuur

Deuteriumgehalte van het 1 (-|-)-glutaminezuur uit de levers 0,07 � 0,03 atoomprocent, van het 1( )-glutaminezuur uit denbsp;tumoren 0,07 � 0,02 atoomprocent, van een mengsel bestaandenbsp;uit 52 procent dl-glutaminezuur en 48 procent 1(4-)-glutaminezuurnbsp;uit de tumoren 0,05 � 0,02 atoomprocent.

B. nbsp;nbsp;nbsp;Bij toevoeging aan het di�et van gedeutereerd d(�)-gluta-minezuur

Deuteriumgehalte van het 1(4-)-glutaminezuur uit de levers 0,06 � 0,02 atoomprocent, van het 1(4-)-glutaminezuur uit denbsp;tumoren 0,05 � 0,02 atoomprocent, van een mengsel bestaandenbsp;uit 40 procent dl- en 60 procent 1(4-)-glutaminezuur uit de tumorennbsp;0,03 �: 0,02 atoomprocent.

Men ziet uit de resultaten van de drie proefseries, dat de waarden voor het deuteriumgehalte van het ge�soleerde glutaminezuur zeer klein zijn. Verder zijn in eenzelfde proef de onderlinge verschillen van 1- en d-vorm zoo gering, dat zij practisch binnen denbsp;proef fouten vallen. Wij moeten daarom bij het maken van gevolgtrekkingen zeer voorzichtig te werk gaan (zie hoofdstuk VI).

Vijf ratten met goed ontwikkelde benzopyreen-tumoren werden subcutaan ge�njiceerd met zooveel D2O *) dat het gehalte aannbsp;deuterium van het lichaamsvocht daardoor op een atoompercentagenbsp;van �1,5 werd gebracht.

Bij de berekening van de hiervoor benoodigde hoeveelheid namen wij aan dat het gewicht van het in totaal aanwezige lichaamswaternbsp;tweederde bedroeg van het lichaamsgewicht van de rat^^), zoodatnbsp;per 100 g gewicht 1 cm� D2O (d.^= 1,10505) werd ingespoten.

Om het gehalte van 1,5 atoomprocent gedurende de proeftijd op peil te houden, waren de dieren vrij water te drinken, dat 2,5nbsp;atoomprocent deuterium bevatte.

Als voedsel werd het normale stalvoer, bestaande uit een mengsel van drie gewichtsdeelen mais, twee gewichtsdeelen tarwe en een gewichtsdeel haver, ad libitum toegediend.

Het diermateriaal en d^ nadere gegevens van de proef zijn in het volgende overzicht beschreven.

27-l-'41: Subcutaan ge�njiceerd met Yi cm� olijfolie waarin opgelost 10 mg benzopyreen.

18-6-'41: Tumor ter grootte van een mandarijn. Gewicht van het dier 150 g. Te 10 u. ingespoten met 1,5 cm� D2O.

25-6-'41: Rat des morgens dood in de kooi gevonden. Gewicht 152 g. Gewicht van de tumor 52 g. Geen metastasen.nbsp;Geen postmortale veranderingen van de organen waarnbsp;te nemen: de dood moet dus pas kort geleden zijn ingetreden.

?) Rekening houdende met de physiologische omstandigheden werd in het DgO per 100 g, 0,9 g NaCl opgelost.

18-6-'41: Tumor ter grootte van een walnoot. Gewicht van het dier 170 g. Te 10 u. ingespoten met 1,7 cm� D^O.nbsp;25-6-'41: Rat des morgens te 10 u. gedood en 1 cm� bloed ge-genomen. Gewicht van het dier 170 g. Gewicht van denbsp;tumor 25 g. Geen metastascn.

18-6-'41: Tumor ter grootte van een mandarijn. Gewicht van het dier 250 g. Te 10 u. ingespoten met 2,5 cm� D2O.nbsp;25-6-'41: Rat des morgens dood in de kooi gevonden. Gewichtnbsp;250 g. Gewicht van de tumor 97 g. Geen metastasen.nbsp;Daar van postmortale veranderingen van de organennbsp;zoo goed als niets was te constateeren, kon het dier nognbsp;niet lang dood zijn.

18-6-'41: Tumor ter grootte van een mandarijn. Gewicht van het dier 180 g. Tc 10 u. ingespoten met 1,8 cm� D2O.nbsp;25-6-'41: Rat des morgens dood in de kooi gevonden. Gewichtnbsp;155 g. Gewicht van de tumor 57 g. Geen metastasen. Behalve een blauwgroene verkleuring van de lever, geennbsp;postmortale veranderingen waar te nemen. Ook hiernbsp;moet de dood dus pas kort geleden zijn ingetreden.

18-6-'41: Tumor ter grootte van een mandarijn. Gewicht van het dier 135 g. Te 10 u. ingespoten met 1,35 cm� D2O.nbsp;25-6-'41: Rat des morgens te 10 u. gedood en � 1 cm� bloed genomen. Gewicht 125 g. Gewicht van de tumor 24 g.nbsp;Geen metastasen.

Het feit, dat drie van de vijf ratten juist op de dag dat de proef zou worden afgebroken, �s ochtends dood in de kooi werden gevonden, zal daarmede samenhangen, dat de betreffende tumoren

reeds zeer groot waren, terwijl als bijkomstige omstandigheid waarschijnlijk de gedurende de proefdagen heerschende hooge zomcr-temperatuur een rol heeft kunnen spelen.

De van rat A7 ^x^ rat 95 $ genomen hoeveelheden bloed werden vereenigd en gecentrifugeerd. De bovenstaande helderenbsp;vloeistof werd bij een druk van 1 nlm kwik gedestilleerd (temperatuur van het waterbad 25� C; ontvanger gekoeld in vast C02)-Het destillaat diende als uitgangsstof voor een normale bepalingnbsp;van het deuteriumgehalte (zie hoofdstuk II).

De lichaamsvloeistoffen bleken 1,42 � 0,01 atoomprocent deuterium te bevatten:

Bij alle proefdieren werd de tumor en de lever uitgenomen, waarbij de tumoren zooveel mogelijk werden ontdaan van neurotisch weefsel.

Zoowel de tumoren als de levers maalden wij daarna goed fijn. Het totale gewicht van de gemalen tumoren bedroeg 150 g, dat vannbsp;de gemalen levers 28 g. Na fractioneeren en drogen waren dezenbsp;gewichten respectievelijk 13 g en 4 g (oplosbaar -j- onoplosbaarnbsp;gedeelte).

A. Glutaminezuur uit dc levers* Het ruwe kristallisaat bedroeg 0,350 g. Na tweemaal omkristalliseeren uit een ruime hoeveelheidnbsp;20 procentig zoutzuur hielden wij over 0,151 g.

4,669 mg stof: 5,55 mg COg, 2,32 mg HgO 4,586 mg stof; 0,297 cm� Ng (22�, 754 mm)nbsp;CgHgO^N.HClj 183,5) ber. C 32,70 H 5,50 N 7,64nbsp;gev. C 32,42 H 5,56 N 7,44

0,1102 g gedeutereerd glutaminezuur-HCl verbrand met 0,0674 g niet-gedeutereerd glutaminezuur-HClnbsp;valtijd voor oplossing x = 113,3 sec.

B. Glutaminezuur uit de tumoren. Het ruwe kristallisaat uit de tumoren bedroeg 1,490 g. Na eenmaal omkristalliseeren uit 20 pro-centig zoutzuur hielden wij over 1,250 g.

Deze draaiing komt overeen met de aanwezigheid in het kristallisaat van 10 % d( �)-glutaminezuur.

Door toevallige omstandigheden gelukte het ons niet een volledige scheiding van 1- en dl-glutaminezuur te bewerkstelligen. Er kristalliseerde namelijk bij deze bewerking te weinig 1-glutamine-zuur-HCl uit. Door de overblijvende vloeistof steeds verder in tenbsp;dampen, waardoor steeds meer van de rechtsdraaiende componentnbsp;kon worden verwijderd, verkregen wij tenslotte een oplossing,nbsp;waaruit na concentreeren 0,203 g glutaminezuur-HCl uitkristalliseerde. Hiervan bedroeg de draaiing:

4,335 mg stof: 5,17 mg COg, 2,14 mg H2O 4,354 mg stof: 0,282 cm� Ng (22�, 754 mm)

De deuteriumanalyse van dit mengsel gaf voor het atoomper-centage D de waarde 0,27 �: 0,01:

Het bij de scheiding verkregen l(4-)-glutaminezuur-hydrochlo-ride werd eenmaal uit 20 procentig zoutzuur omgekristalliseerd. Opbrengst 0,633 g.

4,220 mg stof: 5,04 mg COg, 2,08 mg HgO 4,660 mg stof: 0,309 cm� Ng (23�, 754 mm)

Uit het deuteriumgehalte van het mengsel en dat van het 1( )-glutaminezuur kan het deuteriumgehalte van het d( � )-glutamine-zuur worden berekend. Stel het atoompercentage deuterium van dit laatste is x, dan geldt:

Verder zij nog een ter orienteering uitgevoerde proef vermeld, welke aan de bovengenoemde voorafging. Bij deze werd het zwarenbsp;water tien dagen in plaats van zeven dagen toegediend. Helaas isnbsp;deze proef bij de opwerking van het dl-glutaminezuur verongelukt,nbsp;zoodat slechts de waarde voor de l-vorm kon worden bepaald:

Deuteriumgehalte van het lichaamsvocht 1,42 � 0,01 atoomprocent, van het l(-|-)-glutaminezuur uit de lever 0,49 �: 0,01 atoom-

procent en van het 1 (-(-)-glutaminezuur uit de tumor 0,48 � 0,01 ato�mprocent.

Parallel aan het beschreven onderzoek werd in ons laboratorium door mej. Dr. H. Erxleben de volgende nog niet gepubliceerdenbsp;proef uitgevoerd:

Van elf ratten met benzopyreen-tumoren werd het deuterium-gehalte van het lichaamsvocht gedurende twaalf dagen op � 1,5 atoomprocent gehouden. Daarna werd uit de tumoren 1( )- ennbsp;d( �)-glutaminezuur, uit de levers 1 (-j-)-glutaminezuur ge�soleerdnbsp;en op het gehalte aan deuterium onderzocht. De verkregen resultaten waren:

Deuteriumgehalte van de lichaamsvloeistof 1,63 dz 0,01 atoomprocent, van het !( )-glutaminezuur uit de lever 0,51 � 0,01 atoomprocent, van het !(-)-)-glutaminezuur uit de tumor 0,51 �nbsp;0,01 atoomprocent en van het d( �)-glutaminezuur uit de tumornbsp;0,23 � 0,03 atoomprocent.

Terwijl wij bij de, in het voorafgaande hoofdstuk behandelde, voedingsproeven slechts een minimaal verschil in het deuteriumgehalte van de 1-en d-glutaminezuurbouwsteenen van het tumor-eiwit hebben gevonden, zien wij bij de D20-proeven een karakteristiek onderscheid optreden. De d-antipode bevat minder stabiel gebonden deuterium dan de 1-vorm. Bij de proeftijd van zevennbsp;dagen is het deuteriumgehalte zelfs vrijwel nihil, bij de langerenbsp;proefduur van twaalf dagen omstreeks de helft van het gehaltenbsp;van de 1-vorm.

D2O-PROEF BIJ EEN I^ONIJN MET BROWN-PEARCE-

TUMiOREN

Het leek ons wenschelijk na te gaan, of de bij de drinkproeven bij ratten met benzopyreen-tumoren verkregen resultaten ook bijnbsp;een andere diersoort, respectievelijk een ander type van tumor,nbsp;zouden optreden. Hiervoor kwam in de eerste plaats in aanmerkingnbsp;de Brow n-P e a r c e-tumor van konijnen, welke in ons laboratorium by het tumoronderzoek reeds herhaaldelijk dienst deed. Aangezien echter een konijn de behoefte aan water voor verreweg hetnbsp;grootste gedeelte kan bevredigen met het in het normale stalvoernbsp;(gras, wortels, kool e.d.) aanwezige vocht, is het niet mogelijk denbsp;D20-drinkproef bij een konijn analoog aan die bij ratten uit tenbsp;voeren. Wij dienden dus naar een andere methode te zoeken omnbsp;het D20-gehalte van het lichaamsvocht te verhoogen.

Het lag voor de hand dit op deze wijze te doen, dat bij een konijn een bepaalde hoeveelheid D2O werd ingespoten, waaropnbsp;dan van tijd tot tijd door nieuwe injecties van D2O er voor werdnbsp;gezorgd, dat de deuteriumconcentratie niet beneden een bepaaldenbsp;waarde kwam. Doordat het ingespoten D2O zich met het geheelenbsp;lichaamsvocht mengt, zal het deuteriumgehalte van de lichaamsvloeistoffen, tengevolge van de uitscheidingen, slechts geleidelijknbsp;tot de normale waarde dalen. Wij moesten nagaan met welkenbsp;snelheid dit gebeurt, respectievelijk hoeveel D2O telkens na eennbsp;bepaald aantal uren diende te worden ingespoten.

Daartoe werd een normaal konijn, gewicht 1440 g, intraveneus ingespoten met 10 cm� van een 0,9 procentige NaCl-oplossing innbsp;D2O (d?A=l,10505). De injectie geschiedde in twee keer; beidenbsp;malen werd 5 cm� ingespoten, met een tusschentijd van een half uur.

Zooals men ziet, werd in tegenstelling tot de rattenproef de injectie bij het konijn intraveneus gegeven. Ongetwijfeld is voornbsp;het dier de intraveneuse injectie met D2O gevaarlijker dan de sub-

cutane. Dat wij haar desondanks hebben toegepast, is gelegen in het feit, dat bij inspuiting in de bloedbaan het D2O zich snel overnbsp;het geheele lichaam verspreidt. Men zal bij een nadere bestudee-ring van de volgende bladzijden direct inzien, dat wij dit voor onzenbsp;proefnemingen juist noodig hadden.

Na de injecties werd van het dier op bepaalde tijden � 1 cm� bloed genomen. Dit bloed behandelden wij op de reeds eerder beschreven wijze, waarna het verkregen mengsel van H2O en D2Onbsp;op het deuteriumgehalte werd onderzocht.

Door de vijf gevonden punten is, zooals men ziet, een nagenoeg vloeiende lijn te trekken; m.a.w. de afneming van het deuterium-gehalte van het bloed, of juister van het bloedvocht, vindt volkomennbsp;regelmatig plaats.

Hoe wij met behulp van deze grafiek kunnen berekenen, in de eerste plaats de hoeveelheid D2O, die wij bij een willekeurig konijnnbsp;moeten inspuiten om een bepaald gehalte aan deuterium van hetnbsp;lichaamsvocht te verkrijgen, en verder de hoeveelheid D2O, die wijnbsp;om de 24 uur moeten inspuiten om dit deuteriumgehalte op de ge-wenschte waarde terug te brengen, zullen wij in de volgendenbsp;paragraaf behandelen.

Eerst is het noodzakelijk nog een tweede moeilijkheid te bespreken, die zich bij de rattenproef niet voordeed. Bij de ratten kunnen wij, daar de benzopyreentumoren zich direct onder de huid bevinden, eenvoudig op het oog de aanwezigheid en tevens de groottenbsp;van de tumor vaststellen. Dit is echter bij de konijnen anders.nbsp;Immers de B r o w n-P e a r c e-t�mor is een buitengewoon kwaad-

aardige enttumor. Zij wordt ge�nt door een suspensie van een omentummetastase in de testes te injiceeren. Indien de enting aanslaat, zijn de organen van het konijn reeds na weinige weken alsnbsp;het ware doorzaaid met metastasen. Al naar gelang het orgaan, datnbsp;het meest door deze dochtergezwellen wordt getroffen, blijven denbsp;dieren kortere of langere tijd in leven, echter zelden langer dan 6nbsp;weken. Voor ons doel waren alleen konijnen te gebruiken, welkenbsp;bij het begin van de proef kleine metastasen in het omentumnbsp;hadden. Omdat slechts deze gedurende de proeftijd van een weeknbsp;een voldoende hoeveelheid gemakkelijk uit te nemen tumormate-riaal leverden. De moeilijkheid berust nu daarop, dat de kleinenbsp;omentummetastasen niet te palpeeren zijn; zoodra de gezwellen opnbsp;deze wijze wel zijn vast te stellen, heeft het dier nog maar eennbsp;korte tijd te leven. De eenige mogelijkheid die overbleef, was omnbsp;door middel van een operatie de aanwezigheid van kleine omentummetastasen te constateeren. De desbetreffende operaties werdennbsp;uitgevoerd door den heer F. W. Klaarenbeek. Nadat enkelenbsp;proefoperaties aan konijnen met Brow n-P e a r c e-tumoren bevredigend waren verloopen, stonden eenige dieren ter beschikking,nbsp;welke de vereischte kleine omentummetastasen bezaten. Wijnbsp;kozen het dier, dat de meest gezonde indruk maakte.

Bij de voorbereidende proeven was o.a. gebleken, dat bij een konijn met een gewicht van 1440 g, ingespoten met 10 cm� D2O, hetnbsp;deuteriumgehalte van het bloedvocht na 2 uur 0,88 atoomprocentnbsp;bedroeg en na 24 uur 0,77 atoomprocent.

Nu namen wij aan, dat het deuteriumgehalte van het bloedvocht, 2 uur na de laatste inspuiting, gelijk is aan het deuteriumgehaltenbsp;van het lichaamsvocht¹). Hieruit volgt dan dat, wilden wij opnbsp;dezelfde manier bij een konijn van 2600 g na 2 uur het deuteriumgehalte van het lichaamsvocht gebracht zien op een atoomper-

Verder was bij de voorbereidende proeven gebleken, dat het atoompercentage deuterium van het bloedvocht van 2 uur tot 24 uurnbsp;na de laatste inspuiting, dat is dus in 22 uur, daalde van 0,88 totnbsp;0,77, hetgeen overeenkomt met een daling van 13 procent. Door eennbsp;ruwe berekening vinden wij voor het tijdvak vanaf de laatste in-

andere woorden: om het atoompercentage deuterium van het lichaamsvocht op peil te houden, moesten wij telkens 24 uur na eennbsp;14

100

Wij zullen nu een gedetailleerde beschrijving geven van proefdier en proefomstandigheden:

16-9-�41: Rechter testikel ingespoten met 1 cm� tumorsuspensie, afkomstig van een omentummetastase van Brown-P e a r c e-konijn 2, serie 2.

29-9-�41: Eerste operatie onder locaal-anaesthesie met 0,5 pro-centige novocaine-adrenaline-oplossing in physiologi-sche NaCl-oplossing. Hiervan gebruikt 18 cm�. Operatieverslag; Mediaansnede ter lengte van 8 cm, 4 cninbsp;onder de processus xyphoideus. In de buikholte geen vrijnbsp;vocht aanwezig. In het omentum en in de lever bevondennbsp;zich enkele metastasen ter grootte van een luciferskop.nbsp;In de milt en nieren geen knobbeltjes te voelen.

Serosa glad en glanzend. Buikwand in lagen gesloten met catgut en agraves. Konijn maakte het goed.nbsp;3-10-�41: In de buikholte geen knobbeltjes te palpeeren.

Tweede operatie onder locaal-anaesthesie met 0,5 pro-centige novocaine-adrenaline-oplossing in physiologische NaCl-oplossing. Hiervan gebruikt 18 cm�.

Operatieverslag: Oude wondnaden losgeknipt. In de buikholte geen vrij vocht aanwezig. In het omentum eennbsp;reeks knobbeltjes ter grootte van erwt tot hazelnoot (geschat gewicht 10 g). In de lever een enkele metastasenbsp;ter grootte van een erwt. Alleen in de linker nier enkelenbsp;knobbeltjes gepalpeerd.

Overgegaan tot intraveneuse injectie met D2O: Te MYz u. intraveneuse injectie met 20,5 cm� D2O in rechternbsp;oorvene.

Omentum vertoonde langs de groote curvatuur knobbels, samen ter grootte van een appel en metnbsp;een gewicht van 100 g.

zaadstreng, rcgionaire lymphklieren, nieren, lever, peritoneum, diaphragma en longen.

Primaire tumor in rechter testikel was, op een kleine perifere z�ne na, necrotisch.

Naast de 100 g tumorweefsel van de omentummetastasen werd 130 g spierweefsel uitgenomen. Aanvankelijk hadden wij het voornemen om, evenals bij de rattenproef, voor de bepaling aan normaalnbsp;weefsel de lever te gebruiken. Daar deze echter zeer veel metastasen bevatte, was dit onmogelijk.

Het is duidelijk, dat het deuteriumgehalte van het lichaamsvocht, als gevolg van de telkens na 24 uur toegediende D20-injecties,nbsp;maximum- en minimumwaarden zal vertoonen. De onder I, II, III,nbsp;IV, VI en VII genoemde atoompercentages deuterium zijn bepaaldnbsp;van bloed (bij VII van buikvocht), dat van het konijn werd genomen ongeveer 24 uur na een inspuiting met D2O, juist v��r eennbsp;nieuwe injectie. Deze percentages geven dus minimumwaarden vannbsp;het deuteriumgehalte van het lichaamsvocht aan.

De voorbereidende proeven leerden ons, dat het deuteriumgehalte van de lichaamsvloeistoffen in 24 uur een daling ondergaat van omstreeks 14 procent. Berekenen wij nu met behulp van ditnbsp;gegeven uit de eerste gevonden minimumwaarde de maximumwaarde, dan vinden wij hiervoor . 0,88 == 1,02 atoomprocent

D (F), hetgeen overeenkomt met 1,13 gewichtsprocent D2O. Het laatste percentage geeft het D20-gehalte van het lichaamsvocht aannbsp;na de injectie met 20,5 cm� �zware physiologische keukenzoutoplos-sing� op het oogenblik, dat de hierin voorkomende 22,3 g D2O zichnbsp;gelijkmatig over de lichaamsvloeistoffen hebben verdeeld.

Stel nu dat de totale hoeveelheid lichaamsvocht van het konijn is X gram, dan geldt:

De totale hoeveelheid lichaamsvloeistof bedraagt dus 1951 g of drievierde van het lichaamsgewicht van het konijn.

24 Uur na de eerste injectie werd een kleinere hoeveelheid ,,zware physiologische NaCl-oplossing� ingespoten, namelijknbsp;2,8 cm�, bevattende 3,05 g D2O. Deze inspuiting heeft een verhoo-ging van het deuteriumgehalte der lichaamsvloeistoffen tot gevolg

Berekenen wij op dezelfde manier de overige maxima, dan vinden wij achtereenvolgens 1,09 (III'). 1.19 (IV'), 1,20 (VI') en 1,28nbsp;atoomprocent D (VU'). De experimenteel gevonden maximumwaarde van 1,26 atoomprocent D (V) ligt iets hooger dan het berekende maximum (1,20 atoomprocent D).

In de volgende figuur is het verloop van het deuteriumgehalte der lichaamsvloeistoffen schematisch voorgesteld:

Voor de latere berekeningen namen wij als deuteriumgehalte van het lichaamsvocht van het konijn het gemiddelde van alle gevondennbsp;minima en de daaruit berekende maxima; dit bedroeg 1,08 atoom-procent.

Tumoren en spieren werden, na gemalen, gefractioneerd en gedroogd te zijn, op de gewone wijze verder opgewerkt. Het gewicht van de gemalen tumoren en spieren bedroeg voor het drogennbsp;respectievelijk 95 g en 120 g, na het drogen respectievelijk 11 g ennbsp;20 g (oplosbaar onoplosbaar gedeelte).

A. Glutaminezuur uit de spieren. Het ruwe kristallisaat bedroeg 2,030 g. Na tweemaal omkristalliseeren uit een ruime hoeveelheidnbsp;20 procentig zoutzuur hielden wij over 1,319 g.

4,807 mg stof: 5,72 mg COg, 2,32 mg HgO 3,438 mg stof: 0,231 cm^ Ng (23�, 771 mm)

B. Glutaminezuur uit de tumoren. Het ruwe kristallisaat bedroeg 1,343 g. Na eenmaal omkristalliseeren uit zoo weinig mogelijknbsp;20 procentig zoutzuur verkregen wij 1,110 g. De draaiing hiervan was;

20,8 %.

Door gefractioneerde kristallisatie scheidden wij deze stof daarna in m-)quot; en dl-glutaminezuur.

De opbrengst aan ^-j-l-glutaminezuur-HCl bedroeg na eenmaal omkristalliseeren 0,482 g.

4,594 mg stof: 5,46 mg COg, 2,22 mg HgO 4,239 mg stof: 0,277 cm� Ng (21�, 777 mm)

De opbrengst aan dl-glutaminezuur-HCl na tweemaal omkristalliseeren bedroeg 0,297 g.

0.100

4,218 mg stof: 5,00 mg COg, 2,04 mg HgO 4,610 mg stof: 0,306 cm� Ng (23�, 771 mm)

valtijd voor nbsp;nbsp;nbsp;oplossingnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;xnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;=127 sec.

Stel het deuteriumgehalte nbsp;nbsp;nbsp;vannbsp;nbsp;nbsp;nbsp;het d( �)-glutaminezuur is x

Een geheel overeenkomstige door mej. Dr, H. Erxlebcn uitgevoerde en nog niet gepubliceerde proef leverde de volgendenbsp;resultaten:

Gemiddeld deuteriumgehalte van het lichaamsvocht 0,97 � 0,01 atoomprocent, deuteriumgehalte van het l(-j-)-glutaminezuur uit denbsp;spieren 0,05 � 0,01 atoomprocent, van het 1 (-f-)-glutaminezuur uitnbsp;de lever 0,38 � 0,01 atoomprocent, van het l( )-glutaminezuur uitnbsp;de tumoren 0,35 � 0,01 atoomprocent en van het d(�)-gluta-minezuur uit de tumoren 0 � 0,03 atoomprocent.

V��r de bespreking van onze resultaten dienen wij ons eerst met de gegevens en conclusies bezig te houden, welke door anderenbsp;auteurs op dit nog zeer nieuwe gebied zijn beschreven.

In het jaar 1938 deelde Ussing^�) de volgende proef mede. Een rat kreeg met het normale voer een mengsel van gedeute-reerde aminozuren. Dit mengsel was bereid door caseine met eennbsp;oplossing van geconcentreerd H2SO4 in zwaar water 24 uur opnbsp;170� C te verhitten. Verondersteld werd, dat hierbij deuteriumnbsp;vooral op de a-plaats van de door deze bewerking ten deelenbsp;geracemiseerde ^ aminozuren werd ingevoerd. Uit het deuterium-gehalte van een leverproteinefractie werd berekend, dat na eennbsp;proeftijd van drie dagen tenminste tien procent van de leverpro-teinen nieuw was gevormd, terwijl voor het spierweefsel dit percentage 2,5 bedroeg.

Ongeveer gelijktijdig verschenen de eerste mededeelingen van Schoenheimer en zijn medewerkers over de studie van denbsp;proteinestofwisseling met behulp van isotopen. Deze auteursnbsp;konden hierbij steunen op hun rijke ervaringen, die zij haddennbsp;opgedaan bij het onderzoek over de stofwisseling van vetten ennbsp;steroiden met behulp van deuterium. In het kader van deze reeksnbsp;van publicaties verscheen als veertiende mededeeling de beschrijving van proeven, waarbij de lichaamsvloeistoffen van muizennbsp;o.a. gedurende tien dagen op een bepaald percentage aan D2Onbsp;(1,5 atoomprocent D) werden gehouden. Na afloop van de proefnbsp;hebben de auteurs een proteinefractie uit een mengsel van denbsp;weefsels gehydrolyseerd, waaruit zij tien aminozuren isoleerden.nbsp;Hiervan werd het deuteriumgehalte bepaald. De resultaten zijn innbsp;de volgende tabel samengevat:

20) nbsp;nbsp;nbsp;G. L. Foster, D. Rittenberg en R. Schoenheimer, J. Biol.nbsp;Chem. 125, 13 (1938).

Zooals men ziet, bevatten alle ge�soleerde aminozuren � behalve lysine � deuterium. In verband met ons onderzoek is het vannbsp;belang, er op te wijzen, dat verder werd aangetoond, dat hetnbsp;deuteriumgehalte van het glutaminezuur het hoogst is, De auteursnbsp;leggen er de nadruk op, dat althans bij enkele aminozuren hetnbsp;deuteriumgehalte in het lichaam zeker hooger was, omdat bij denbsp;opwerking niet alleen deuterium van de carboxyl- en aminogroepennbsp;volledig, maar ook semilabiel gebonden D-atomen aan koolstof tennbsp;deele door H-atomen zijn vervangen.

In de laatste kolom vindt men de percentages quot;carbon-bound H actually exchanged�. Deze getallen zijn het resultaat van een berekening, welke wij voor het glutaminezuur willen toelichten. Van denbsp;negen H-atomen van glutaminezuur zijn er vijf aan koolstof gebonden. Indien een H-atoom aan de uitwisseling deelneemt, zal hetnbsp;deuteriumgehalte van het ge�soleerde glutaminezuur, aannemendenbsp;dat het glutaminezuur geen bijzondere voorkeur voor een van denbsp;isotopen protium en deuterium vertoont bedragen:

zeggen 44 procent, werkelijk uitgewisseld. Deze waarde �� die wij voor het verdere betoog noodig hebben � geeftnbsp;dus het percentage weer van de maximaal mogelijke deuterium-opneming.

Nu doet zich de vraag voor, op welke wijze de uitwisseling van H- tegen D-atomen in het organisme tot stand komt. Hiervoor zijnnbsp;twee mechanismen denkbaar, namelijk chemische reacties, die ooknbsp;in vitro bekend zijn, of de werking van bijzondere enzymen, welkenbsp;de in vitro stabiel aan C gebonden H-atomen labiliseeren.

Stekol en HamilD^) hebben beweerd, dat proteolytische enzymen een dergelijke labiliseering veroorzaken; hun experimen-teele gegevens konden echter door Foster, Keston, Rit-tenberg en Schoenheimer*�) niet worden bevestigd. Denbsp;laatstgenoemde auteurs wijzen, behalve op tal van ervaringen bijnbsp;hun onderzoek over steroiden, vooral op het feit, dat lysine in laatstnbsp;genoemde proef deuteriumvrij kon worden ge�soleerd. Het is natuurlijk zeer moeilijk te bewijzen dat dergelijke enzymen inderdaadnbsp;niet bestaan, maar hun aanwezigheid mag wel als zeer onwaarschijnlijk worden beschouwd.

Als de andere mogelijkheid voor de invoering van D-atomen hebben wij chemische reacties genoemd, welke ook uit proeven innbsp;vitro bekend zijn. Schoenheimer en zijn medewerkersnbsp;wijzen hierbij op het feit dat aminozuren in het organisme volgensnbsp;talrijke ervaringen gemakkelijk oxydatief gedesamineerd kunnennbsp;worden, terwijl de daarbij gevormde ketozuren omgekeerd weer eennbsp;reductieve amineering kunnen ondergaan. Nu is het bekend datnbsp;keto-verbindingen ^ eventueel via de enolvorm �� ook in vitro heelnbsp;gemakkelijk de H-atomen op de ;S-plaats tegen D-atomen kunnennbsp;uitwisselen. Ook de reductieve amineering kan tot opneming vannbsp;aan C gebonden deuterium leiden:

22) nbsp;nbsp;nbsp;J. A. Stekol en W. H. Hamill, J. Biol. Chem. 120, 531 (1937).

23) nbsp;nbsp;nbsp;G. L. Poster, A. Keston, D. Rittenberg en R. Schoenheimer, J. Biol. Chem. 124, 159 (1938).

RCD2COCOOH ^ RCD2CD(NH2)C00H Deze verklaring staat ontegenzeggelijk op een veel re�elere basisnbsp;dan de hypothetische H-labiliseerende enzymen. Zij impliceertnbsp;echter, dat de uitwisselingsreacties aan de vrije aminozuren plaatsnbsp;zullen moeten hebben, een moeilijkheid welke Schoenheimernbsp;en zijn medewerkers in de desbetreffende publicatie niet discus-sieeren.

Wil men een soortgelijk mechanisme voor de in eiwitverband aanwezige aminozuren aannemen, dan zouden als tusschenproductnbsp;�dehydropeptidasen� moeten optreden:

Dit mechanisme is op zich zelf niet denkbeeldig, aangezien Bergmann en zijn medewerkers in de nier een dehydropep-tidase konden aantoonen, welke slechts gedehydreerde dipeptidennbsp;splitst.

Meer recente onderzoekingen van Schoenheimer en zijn medewerkers leeren echter, dat men met de hier door ons geopperdenbsp;mogelijkheid van het intermediaire optreden van dehydropeptide-structuren niet uitkomt. Schoenheimer, Ratner en Rit-tenberg^�) voerden namelijk een volwassen rat tien dagen langnbsp;een gewoon dieet, waaraan echter was toegevoegd dl-tyrosine, ge-

24) nbsp;nbsp;nbsp;M. Bergmann en H, S c h 1 e i c h, Z. physiol. Chem. 205, 65 (1932).

25) nbsp;nbsp;nbsp;R. Schoenheimer, S. Ratner en D. Rittenberg, J. Biol.nbsp;Chem. 127, 333 (1939).

merkt met het �N isotoop. Het bleek dat reeds na tien dagen tenminste 8 procent van het tyrosine uit het voedsel in de proteinen was ingebouwd. Zeer merkwaardig is echter het resultaat, dat hetnbsp;uit de proteinen van de rat ge�soleerde glutaminezuur, asparagine-zuur, histidine, arginine en ook de amidestikstof ^�jN bevatte. Innbsp;lysine werd geen gevonden; daarentengen moet het isotoopnbsp;wel in een deel van de niet ge�soleerde.aminozuren aanwezig zijnnbsp;geweest. In het jaar 1939 verscheen van dezelfde auteurs een publicatie over voedingsproeven met 1( �)-leucine�^�). Dit aminozuurnbsp;was nu niet alleen met ^�N maar ook met D-atomen gemerkt, zoodatnbsp;het lot van de aminogroep en onafhankelijk daarvan ook het lotnbsp;van het koolstofskelet in het organisme kon worden nagegaan. Nanbsp;een proeftijd van drie dagen werd minstens 32 procent van hetnbsp;leucine uit het di�et gevonden in de proteinefracties, en wel voornbsp;24 procent in het leverleucine en voor 7 procent in het leucine vannbsp;de overige weefsels. Ook hier kwam dus naar voren, dat hetnbsp;isotoop niet in leucine gelocaliseerd bleef, maar eveneens in anderenbsp;aminozuren een plaats vond. Ofschoon het als voedsel toegediendenbsp;caseine 20 procent gewoon glutaminezuur bevatte, had het glutaminezuur uit de gehydrolyseerde weefsels op leucine na verrewegnbsp;de hoogste concentratie.

De zoo juist vermelde feiten dwingen tot de conclusie, dat b ij de uitwisselingsreacties t ij del ij k peptidebin-dingen zijn verbroken en daarna opnieuwge-v o r m d. ,,It has been shown that nitrogenous groupings of tissuenbsp;proteins are constantly involved in chemical reactions; peptidenbsp;linkages open, the amino acids liberated mix with others of the samenbsp;species of whatever source, diet, or tissue. This mixture of aminonbsp;acid molecules, while in the free state, takes part in a variety ofnbsp;chemical reactions: some reenter directly into vacant positions leftnbsp;open by the rupture of peptide linkages; others transfer their nitrogen to deaminated molecules to form new amino acids�. Deze conclusie van de Amerikaansche auteurs geeft een inzicht in de dynamiek van de weefselproteinen zooals men die tot dusverre nauwelijks kon voorspellen.

26) R. Schoenheimer, S. Ratner en D. Rittenberg, J. Biol. Chem. 130, 703 (1939).

Terwijl de hierboven woordelijk aangehaalde slotzinnen sugge-reeren, dat de auteurs aan een partieele vernieuwing van bouw-steenen denken; �vacant positions left open by the rupture of peptide linkages�, hebben zij in dezelfde publicatie als andere mogelijkheid ook de volledige afbraak van de proteinen tot de bouwsteenen en daarop volgende resynthese genoemd. A. E. Braun-s t e i n merkt hiertoe op, dat hij de laatstgenoemde mogelijkheidnbsp;meer waarschijnlijk acht.

Voorloopig zal aan een van deze twee mogelijkheden geen voorkeur mogen worden gegeven. Wanneer wij een beeld zouden willen gebruiken, komt de kwestie hierop neer, dat bij een huis op velenbsp;plaatsen baksteenen worden uitgebroken en door nieuwe vervangen: in het andere geval zal het geheele gebouw worden gesloopt, waarna uit de brokstukken en nieuw materiaal wederom eennbsp;huis wordt geconstrueerd.

Bij de gewone stofwisseling ter instandhouding van het leven is verbruik en toevoer een noodzakelijk verschijnsel; op zich zelfnbsp;is ook het verslijten en weer aanmaken van gecompliceerdenbsp;lichaamsbestanddeelen zooals bijvoorbeeld haemoglobine enz. eennbsp;proces, dat de biochemie reeds lang kent. Door de onderzoekingennbsp;met isotopen als indicatoren hebben wij nu echter geleerd, dat denbsp;constante vernieuwing een veel algemeener en veel sneller verloo-pend verschijnsel is, dan men zich tot nu toe dacht. Het merkwaardigste is, dat deze processen in het geheele organisme optreden,nbsp;zonder dat het histologisch onderzoek daarvan iets kan waarnemen.nbsp;Het gebruikte beeld van het slopen en weer opbouwen van eennbsp;huis schiet te kort in de taak het verschijnsel nader tot ons begripnbsp;te brengen. Men kan het morphologisch beeld van organismen ofnbsp;van weefsels beter vergelijken met dat van een sierfontein, waarbijnbsp;de met het oog zichtbare constante vorm eveneens onder voortdurende vernieuwing van de stof tot stand komt.

Reeds in hun eerste mededeeling over de chemie der tumoren hebben K�gl en Erxleben op de beteekenis van de voort-

durende organische vernieuwing voor het kankervraagstuk gewezen^�). De sindsdien elders opgedane ervaringen bij normale weefsels hebben dit inzicht nog verdiept, waardoor het voor denbsp;hand lag om de nieuwe methodiek ook voor het onderzoek vannbsp;tumorweefsels te gebruiken.

In de eerste plaats was het van belang na te gaan of gedeute-reerd 1- en d-glutaminezuur, dat met het voedsel wordt toegediend, de weg naar de proteinen van het tumorweefsel vindt. Weliswaarnbsp;moet hierbij onmiddellijk op een principieel verschil met anderenbsp;voedingsproeven worden gewezen. De door Schoonhei m ernbsp;en zijn medewerkers als voeding toegediende aminozuren 1-tyrosinenbsp;en l-leucine behooren tot de zoogenaamde onontbeerlijkenbsp;aminozuren: volgens de definitie van R o s e zijn dat dienbsp;aminozuren, welke door het dierlijk organisme niet met de voor denbsp;normale groei vereischte snelheid kunnen worden gesynthetiseerd.nbsp;Het glutaminezuur behoort echter tot de ont-beerlijke aminozuren, d.w.z. dat het door het dierlijknbsp;organisme in de benoodigde hoeveelheid en in de vereischte tijdnbsp;zelf wordt geproduceerd. Dit verschil brengt met zich mede, datnbsp;wij van te voren bij toediening van gemerkt 1 (-f-)-glutaminezuurnbsp;minder duidelijke resultaten kunnen verwachten, dan bij een onontbeerlijk aminozuur. Immers wij kunnen ons voorstellen, dat onontbeerlijke aminozuren evenals vitaminen door de plaatsen, waar zijnbsp;benoodigd zijn, gretig worden aangetrokken. In tegenstelling daarmede zal het glutaminezuur in de weefsels zelf geproduceerdnbsp;worden, waarvoor het door de koolhydraatstofwisseling geleverdenbsp;a-ketoglutaarzuur als uitgangsmateriaal dient.

Inderdaad toonden onze proeven, dat na voedering met gedeute-reerd 1 ( )-glutaminezuur (7,4 atoomprocent D) het 1-glutamine-zuur uit de lever en dat uit de benzopyreen-t�moren van ratten slechts 0,07 atoomprocent deuterium bevat. Na afsluiting van onsnbsp;werk kregen wij een publicatie van U s s i n g in handen, waarinnbsp;voedingsproeven met gedeutereerd glutaminezuur bij normale ratten

28) nbsp;nbsp;nbsp;F. K�gl en H. Er x leb en, Z. physiol. Chem. 255, 57 (1939), blz.nbsp;8 en 89.

worden beschreven. Ook deze auteur vond, dat het na afloop uit de lever ge�soleerde glutaminezuur zoo goed als geen deuteriumnbsp;bevatte.

Ten opzichte van het gevoederde d( �)-glutaminezuur was het resultaat van te voren moeilijk te voorspellen. In het jaar 1940nbsp;hebben Ratner, Schoenheimer en Rittenberg�^)nbsp;voedingsproeven met door D en gemerkt d(-l-)-leucine, dus denbsp;niet-natuurlijke antipode, beschreven. Zooals op grond van anderenbsp;ervaringen uit de literatuur te verwachten was, bleek het organismenbsp;van de rat in staat te zijn het niet-natuurlijke leucine via het a-keto-zuur tot het natuurlijke leucine te inverteeren. Zou nu het d-glu-ta'minezuur voor de tumorcellen bij wijze van spreken ook een �onontbeerlijk aminozuur� zijn en gretig worden opgenomen? Uit onzenbsp;proef kan men berekenen, dat het d( �)-glutaminezuur uit denbsp;tumorproteinen na de toediening van gedeutereerd d-glutamine-zuur (7,5 atoomprocent D) eveneens slechts weinig of geen deuterium heeft opgenomen. Dit leidt tot de conclusie, dat ook het d-glutaminezuur in de tumorcellen zelf wordt gesynthetiseerd. Aangezien met de mogelijkheid te rekenen valt, dat in plantaardigenbsp;proteinen ook een klein percentage aan d-glutaminezuurbouw-steenen voorkomt , was het mogelijk dat dergelijke proteinen voornbsp;de kankerlijders niet onbedenkelijk zijn. Onze proeven geven echternbsp;geen aanleiding, dat een dergelijke vrees gegrond zou zijn.

Schoenheimer en zijn medewerkers wijzen er op, dat bij hun proefnemingen het leucine, dat slechts op de a-plaats doornbsp;isotopen is gemerkt, geringe waarde zou bezitten, omdat in dit gevalnbsp;de isotope atomen door de desamineering verdwijnen. Het door onsnbsp;gevoerde dl-glutaminezuur was door deutereering van a-ketoglu-taarzuur in ammoniakale oplossing bereid en zal de deuteri�mato-men voor een groot deel op de a-plaats hebben opgenomen. Ditnbsp;speelt echter voor onze probleemstelling geen rol, daar wij niet bijnbsp;het lot van het koolstofskelet zijn ge�nteresseerd; zoodra het d( � )-glutaminezuur door oxydatieve desamineering in a-ketoglutaarzuur

31) nbsp;nbsp;nbsp;S. Ratner, R. Schoenheimer en D. Rittenberg, J. Biol.nbsp;Chem. 134, 653 (1940).

32) nbsp;nbsp;nbsp;Vgl. F. K�gl en H. Er xl eb en, Z. physiol. Chem. 264, blz. 112nbsp;noot 11 (1940).

overgaat is het asymmetriecentrum opgeheven en zijn de verdere omzettingen voor ons zonder belang geworden.

Een ander bezwaar, dat tegen onze proef zou kunnen worden ingebracht, is de mogelijkheid dat het dl-glutaminezuur door hetnbsp;lichaam van de ratten niet wordt geresorbeerd. Tegen een uitscheiding in urine en faeces pleit echter het nog niet vermeldenbsp;resultaat, dat de lichaamsvloeistoffen van de ratten na afloop vannbsp;de proef 0,03 atoomprocent deuterium bevatten. Dit wijst er op, datnbsp;het gedeutereerde glutaminezuur in het lichaam wordt omgezet ennbsp;men zou zelfs kunnen aannemen, dat de kleine atoompercentages D,nbsp;welke in de glutaminezuurbouwsteenen zijn gevonden, indirect doornbsp;het iets verhoogde deuteriumgehalte van de lichaamsvloeistofnbsp;worden veroorzaakt.

Terwijl de voedingsproeven geen karakteristiek verschil tusschen de 1- en de d-glutaminezuurbouwsteenen lieten zien, hebben wij bijnbsp;de in hoofdstuk IV en V beschreven proeven wel degelijk eennbsp;opvallend onderscheid tusschen de twee antipoden kunnen con-stateeren.

Bij de twee in ons laboratorium uitgevoerde proeven met Brow n-P e a r c e-konijnen werd een in de literatuur nog nietnbsp;beschreven techniek toegepast. In een voorproef met een normaalnbsp;konijn werd geconstateerd, dat een over een half uur geprotra-heerde injectie van 10 cm'* ,,zware physiologische keukenzoutoplos-sing� goed wordt verdragen en dat hierna het D20-gehalte van hetnbsp;lichaamsvocht dagelijks omstreeks veertien procent daalt. Bij denbsp;konijnen met Brow n-P e a r c e-tumoren werd dienovereenkomstig dagelijks een bepaalde hoeveelheid D2O bijgespoten, zoodatnbsp;wij gedurende de proeftijd van een week steeds met een tusschennbsp;0,88 en 1,28 atoomprocent schommelend deuteriumgehalte werkten.nbsp;Daarenboven moesten wij om experimenteele redenen, die innbsp;hoofdstuk V zijn genoemd, ons voor de eigenlijke proef er vannbsp;overtuigen, dat de konijnen voor de inspuiting met D2O inderdaadnbsp;kleine metastasen in het omentum bezaten. Deze bleken dan nanbsp;afloop van de proef inderdaad te zijn gegroeid tot vrij groote gezwellen.

R. Schoenheimer en zijn medewerkers hebben bij hun, in deze dissertatie reeds uitvoerig beschreven, proeven gevonden,nbsp;dat de proteinen van de verschillende organen, respectievelijk weef-

seis, zeer verschillende hoeveelheden aan isotopen opnemen. De auteurs vergeleken de ,,relatieve chemische activiteitquot; van de verschillende proteinen en vonden, dat de serumproteinen bij de uitwisseling de hoogste activiteit vertoonen; de inwendige organennbsp;(dafmwand, lever, nier, hart, milt, testis) zijn iets minder actief.nbsp;Spier en huid toonen naar verhouding een geringe activiteit. Uitnbsp;onze proeven bij tumordragende dieren blijkt, dat de uitwisselingnbsp;van de H-atomen tegen D-atomen bij de 1-glutaminezuurbouwsteennbsp;van de tumoren even groot is als bij die van de lever. In overeenstemming met het bovenvermelde resultaat van de Amerikaan-sche auteurs vonden ook wij bij het 1-glutaminezuur uit het spierweefsel een veel kleiner deuteriumgehalte. Wanneer wij uitgaannbsp;van het feit, dat van de negen H-atomen van glutaminezuur vijfnbsp;stabiel �- dus aan C �� zijn gebonden, dan Iaat zich volgens de opnbsp;blz. 49 beschreven wijze berekenen, dat in de spieren 10 procentnbsp;en in de tumor 62 procent van de theoretisch mogelijke uitwisselingnbsp;van H-, respectievelijk D-atomen heeft plaats gehad. Houden wijnbsp;er rekening mede, dat van de genoemde vijf H-, respectievelijk D-atomen van glutaminezuur slechts drie de hydrolyse practisch zonder uitwisseling kunnen doorstaan, dan komen wij bij de tumornbsp;zelfs tot 100 procent van de theoretisch mogelijke uitwisseling.

Het is een verrassend nieuw feit, dat het d-glutaminezuur uit de Brow n-Pe are e-tumoren bij deze proeven vrijwel geen deuterium bevat; om misverstand te voorkomen moeten wij er echternbsp;direct aan toevoegen: geen stabiel gebonden deuterium, daarnbsp;labiel gebonden D-atomen bij de hydrolyse van de proteinen doornbsp;uitwisseling verloren gaan. Uit dit resultaat zijn verschillende conclusies te trekken, welke tot nieuwe experimenten aanleiding gavennbsp;en eerst in latere publicaties van ons laboratorium zullen wordennbsp;gediscussieerd. Hier kan reeds op ��n conclusie worden gewezen,nbsp;die voor het algemeene vraagstuk van belang is. Zooals in denbsp;inleiding kort werd vermeld, zijn verschillende auteurs in anderenbsp;laboratoria er niet in geslaagd dl-glutaminezuur uit de hydrolysatennbsp;van tumorproteinen te isoleeren. Zij meenden daarom de positievenbsp;resultaten van ons laboratorium door een min of meer toevalligenbsp;racemisatie van het 1-glutaminezuur te kunnen verklaren. Afgeziennbsp;van het feit, dat verschillende andere onderzoekers bij koken vannbsp;1-glutaminezuur met geconcentreerd zoutzuur gedurende de voor

de hydrolyse gebruikelijke tijd practisch geen racemisatie vonden^�), wordt de mogelijkheid van een secundaire racemisatie door onzenbsp;nieuwe resultaten op onafhankelijke wijze weerlegd. Immers uit eennbsp;1-glutaminezuur met stabiel gebonden D-at�men zou bij de racemisatie een dl-glutaminezuur moeten ontstaan met hetzelfde D-ge-halte. Daaruit zien wij, dat reeds in het lichaam een verschil tus-schen de 1- en d-bouwsteen bestaat. Dit kan uiteraard slechts totnbsp;stand komen, indien de bij de uitwisseling in vivo een rol spelendenbsp;biochemische reacties bij de beide antipoden niet identiek ver-loopen.

De in hoofdstuk IV beschreven drinkproeven bij ratten met ben-zopyreen-tumoren hebben getoond, dat tusschen de twee diersoorten en de twee typen van tumoren (de enttumor en het door een cancerogene koolwaterstof verkregen gezwel) geen principieel verschil bestaat. Bij de zeven dagen durende drinkproef die op rattennbsp;met benzopyreen-tumoren werd toegepast, bevatte het d-glutamine-zuur in tegenstelling tot de 1-vorm eveneens nauwelijks deuterium.nbsp;Het is zeer interessant, dat bij de twaalf dagen durende tweedenbsp;proefserie ook in de d-vorm deuterium werd gevonden, hier echternbsp;ook minder dan in de 1-bouwsteen; er was in de d-vorm 26 procent,nbsp;in de 1-vorm 57 procent van de theoretisch mogelijke uitwisselingnbsp;opgetreden. Vermoedelijk zal bij een nog langere duur van de proefnbsp;het verschil in deuteriumgehalte van de beide antipoden hoe langer hoe kleiner worden, totdat tenslotte bij een proeftijd van bijvoorbeeld drie tot vier weken beide bouwsteenen hetzelfde percentage deuterium zullen aanwijzen.

33) K. K�gl !en H. Er xl eb en, Z. physiol. Chem. 264, 202 (1940): E. Abderhalden en O. B�hm, Z. physiol. Chem. 266, 41 (1940): A. C.nbsp;C h i b n a 11, M. W. Rees, E, F. W illiams en E. Boyland, Biochem.nbsp;I. 34, 285 (1940).

SSiquot;' fquot;

quot;S 1 ^ . « .

■Cquot;; ? ,. ïquot; . . .

a! Jlt;»- 1

*-• , t.

y*-x-.^ *» ■lt; nbsp;nbsp;nbsp;*

■ nbsp;nbsp;nbsp;;•■#..■-J' 'gt;*

4^,; ';

STELLINGEN

Er bestaat een essenti�el verschil in de stofwisseling van !( )quot; en d( � )'glutaininezuur in tumorproteinen.

De verklaring, welke de Bruyn geeft voor het Ej-verloop van een AgJ-sol met amicronen bij toevoegen van Ce (NOsjs, isnbsp;in tegenspraak met zichzelf.

III

Voor het onderzoek op faecaalverontreiniging van drinkwater biedt de door Gartner uitgewerkte methode ten opzichte vannbsp;de gebruikelijke methodiek zekere voordeelen.

De proeven van M�nzberg over de aard der binding in de aromatische kern zijn ook met starre dubbele bindingen te verklaren. De berekende gemiddelde tijden voor het verspringen vannbsp;de dubbele bindingen hebben dus weinig beteekenis.

Uit de onderzoekingen van Lunde, Kringstad en Jansen mag men niet besluiten, dat het pantotheenzuur identieknbsp;is met de �anti-grijs haar� factor Bx.

De structuurformule, welke Dutt en Thorpe geven voor het aa-dimethylsuccinylfluorescine, volgt niet uit de door hen uit-gevoerde afbraak met KOH.

Uit de proeven van Karrer, Geiger en Bretscher volgt, dat vitamine A2 een volkomen hypothetische stof is.

R	R		R nbsp;nbsp;nbsp;R
j CH2	1 CH2		1 1 CH2 nbsp;nbsp;nbsp;CH2
1 �C-CH�NH-	1 -C�CH�NH�	gt;	1 1 �C-C=N-C�C=N�
II	II		II nbsp;nbsp;nbsp;II
L 0	0	X	0 nbsp;nbsp;nbsp;0
R	R		R nbsp;nbsp;nbsp;Rnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�
CD2	1 CD2		1 nbsp;nbsp;nbsp;1 CD2 nbsp;nbsp;nbsp;CD2
1 �C�C=N-	-C-C=N�		1 nbsp;nbsp;nbsp;1 �C-CD�NH�C-CD~NH�
II	II		II nbsp;nbsp;nbsp;II
0	0	X	0 nbsp;nbsp;nbsp;0

I * 1 ij I

/.ec'

ONDERZOEKINGEN OVER DE STOFWISSELING VAN !( )- EN d(-)-GLUTAMINEZUUR IN TUMOREN METnbsp;BEHULP VAN DEUTERIUM ALS INDICATOR

PROEFSCHRIFT

ANTONIE JACOB KLEIN

10

12

13

= (1,14�0,76) : x�

14

2. Gedeutereerd !( )- en d(�)-glutaminezuur

15

17

19

20

22

25

1,20.100

0.100

5,09~

^�5

4^98

^02

[�]i

34

35

D2O-PROEF BIJ EEN I^ONIJN MET BROWN-PEARCE-

TUMiOREN

37

39

100

41

42

86

46

20,8 %.

0.100

53

54

*-• , t.

.i

4^,; ';

élt;-^

STELLINGEN

II

III

IV

V

VI