DE AUXINE VAN EEN LICHTGEVOELIGE SCHIMMEL EN ONDERZOEKINGEN OVERnbsp;ANTIPODEN VAN EEN SYNTHETISCHE

1778 3758

DE AUXINE VAN EEN LICHTGEVOELIGE SCHIMMEL EN ONDERZOEKINGEN OVERnbsp;ANTIPODEN VAN EEN SYNTHETISCHE

GROEISTOF

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VAN DENnbsp;WAARNEMENDEN RECTOR MAGNIFICUS L. VANnbsp;VUUREN, HOOGLEERAAR IN DE FACULTEIT DERnbsp;LETTEREN EN WIJSBEGEERTE, VOLGENS BESLUITnbsp;VAN DE SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DEnbsp;BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS- ENnbsp;NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN OP MAANDAGnbsp;16 MAART 1942, DES NAMIDDAGS TE 3 UUR

Bij hei verschijnen van dit proefschrift is het mij een behoefte in de eerste plaats mijn ouders dank te zeggen. Zij toch hebben het mij mogelijk gemaakt eennbsp;zoo aangename studententijd aan de Utrechtsche Alma Mater te beleven ennbsp;thans is het ook dank zij hen dat deze dissertatie het licht ziet.

Altijd zal ik erkentelijk zijn voor de klassieke vooropleiding, welke ik onder Uw rectoraat. Zeergeleerde ROGGE, van de leeraren van het Erasmiaanschnbsp;Gymnasium te Rotterdam mocht ontvangen.

Uw lessen. Gestrenge ESSER, zijn de hechte grondslag geweest, waarop ik bij de universitaire studie verder kon bouwen.

Vervolgens gaat mijn dank uit naar U, oud^Hoogleeraren, Hoogleeraren en Lectoren van de Faculteit der Wis- en Natuurkunde, voor al hetgeen U hebtnbsp;bijgedragen tot mijn wetenschappelijke vorming.

Hooggeleerde COHEN, Hooggeleerde KRUYT. voor Uw lessen in de physische chemie wil ik U op deze plaats mijn dank betuigen.

Hooggeleerde K�GL, Hooggeachte Promotor, het was voor mij een groot voorrecht deze dissertatie op Uw laboratorium en onder Uw leiding te mogennbsp;bewerken. Uw belangstelling voor mijn experimenten en Uw waardevolle suggesties hebben mijn werklust steeds gestimuleerd. Ik ben U bijzonder erkentelijk,nbsp;omdat U mij waardig keurde voor de functie van assistent in de biochemischenbsp;afdeeling van Uw laboratorium. Dit heeft mij mede in staat gesteld dit proefschrift te voltooien.

Hooggeleerde KONINGSBERGER, vele zijn ook de redenen tot dankbaarheid jegens U. Het werk voor mijn bijvak, onder Uw directe leiding, hetwelk eennbsp;gemeenschappelijke publicatie opleverde, heeft mijn belangstelling naar biochemische problemen doen uitgaan. Steeds weer was het een genoegen, ook voornbsp;vele deelen van dit onderzoek, gastvrijheid te mogen genieten in Uw laboratorium.nbsp;De prettige sfeer van onderlinge samenwerking en hulpvaardigheid, die Gijnbsp;daar hebt weten te scheppen, zal ik niet licht vergeten. Ook ben ik U erkentelijknbsp;voor Uw voortdurende interesse in mijn werk en de raadgevingen, welke ik vannbsp;U mocht ontvangen.

Het personeel van het Organisch Chemisch en het Botanisch Laboratorium dank ik voor de onontbeerlijke technische hulp.

Dat jij, COKS, mij zoowel bij de redactie van dit proefschrift, als bij verschillende experimenten, die er aan ten grondslag liggen, terzijde hebt gestaan, stemt mij tot groote vreugde. Het is hierdoor ons gemeenschappelijk werknbsp;geworden.

INHOUD

DEEL 1.

G. nbsp;nbsp;nbsp;Kan de remanente activiteit door auxine-a worden veroorzaakt? 24

OVER DE GROEISTOF VAN PHYCOMYCES BLAKESLEEANUS.

Hoewel het groeistofprobleem slechts ongeveer een kwart eeuw oud is, heeft het speciaal de laatste 15 jaren zoozeer de belangstelling van de botanische en chemische onderzoekers opgewekt,nbsp;dat een vrij omvangrijk boekdeel noodig is om een overzicht vannbsp;resultaten te geven.

Aangezien vele zulke samenvattende monografi�n verschenen zijn, wil ik hier volstaan naar enkele der meest recente hiervannbsp;te verwijzen (Boysen Jensen 1935; Avery en Burkholder 1936; W ent en Thimann 1937; S � d i n g 1938;nbsp;B�nning 1939; von Guttenberg 1932�1940).

In deze inleiding zullen we ons beperken tot het bespreken van die publicaties, welke in meer direct verband staan met het hiernbsp;te behandelen onderzoek.

Nadat K�gl, Haagen SmitenErxleben (1932, 1934) uit urine 2 groeistoffen, auxine-a en hetero-auxine, hadden ge�soleerd benevens een derde, auxine-b, uit ma�s-olie en moutnbsp;(K�gl, Erxlebenen Haagen Smit, 1934) en de structuurnbsp;dezer verbindingen was vastgesteld (K�gl en E r x 1 e b e n, 1934nbsp;en 1935), rees natuurlijk direct de vraag of de reeds in verschillendenbsp;plantaardige organen gevonden groeistoffen identiek met een vannbsp;bovengenoemde phytohormonen zouden zijn.

altijd uiterst gering zijn, kon de meest directe weg om tot de beantwoording van deze vraag te komen, n.1. zuiver isoleeren van de groeistof door extractie uit de plant, niet worden bewandeld.

Derhalve zijn twee indirecte methoden door de verschillende onderzoekers in gebruik genomen, met behulp waarvan een ori�ntatienbsp;omtrent de aard van onbekende groeistoffen, reeds als deze innbsp;groote verdunning aanwezig zijn, mogelijk is.

De eerste van deze methoden bestaat in de bepaling van het raoleculairgewicht. Went (1928) maakte als eerste hiervan gebruik. Hij liet gedurende zekere tijd groeistof uit een agar-agar-plaatje diffundeeren in drie even groote, op elkaar gelegde, ditonbsp;plaatjes. Vervolgens werden de vier plaatjes van elkaar genomen,nbsp;elk in twaalf blokjes gesneden en op vier rekjes Afena-coleoptielennbsp;getest. De gemiddelde krommingen der vier rekjes zijn nu eennbsp;maat voor de relatieve concentraties der groeistof in de vier agar-plaatjes.

X = waarde, welke berekend kan worden uit de relatieve concentraties, volgens tabellen, gegeven door Stefannbsp;(1879, later verbeterd door Kawalki, 1894) en interpolatie-formules, uitgewerkt door Bruins (1922).

door �holm (1912). Deze formule heeft volgens genoemden auteur een algemeene geldigheid voor moleculairgewichten tusschennbsp;50 en 500.

De nauwkeurigheid van deze methode van moleculairgewichts-bepaling is niet erg groot. Men moet rekening houden met een mogelijke fout van ongeveer 20 %, welke hoofdzakelijk zijn oorzaaknbsp;vindt in het feit, dat men bij de bepaling der relatieve concentratienbsp;met Auena-coleoptielen werkt, waarvan de gevoeligheid bij denbsp;W e n t-test niet alleen aan dagelijksche variabiliteit onderhevig is,nbsp;maar ook een individueele veranderlijkheid vertoont. Een tweedenbsp;foutenbron is aan te wijzen bij de diffusie zelf. Zijn de agarplaatjes

te droog of te nat, dan vindt men verkeerde waarden voor de diffusie-co�fficient.

Het zal derhalve niet mogelijk zijn kleine verschillen in moleculair-gewicht, zooals van auxine-a (328) en auxine-b (310), op deze wijze op te sporen. Wel kan hetero-auxine (M =175) van beidenbsp;andere genoemde stoffen worden onderscheiden.

De belangrijkste resultaten der moleculairgewichtsbepalingen van verschillende auteurs zijn in onderstaande tabel samengevat;

top van Mafs-coleoptiel nbsp;nbsp;nbsp;.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;346nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;K�gl, Haagen Smit

De tweede methode om iets over een onbekende groeistof te weten te komen is beschreven door K�gl, Haagen Smit ennbsp;Erxleben (1934). Het bleek hen n.1. dat de activiteit vannbsp;hetero-auxine door koken met verdund zoutzuur geheel verdwijnt,nbsp;terwijl zij bij koken met verdunde loog nauwelijks verandert.

Bij auxine-a vonden zij juist het omgekeerde. Deze stof is bestendig tegen zuren, maar door loog wordt de activiteit te niet gedaan,

Door dit gedrag van de drie groeistoffen hebben we dus een middel hen van elkaar te onderscheiden en kunnen we een aanwijzing vinden omtrent de aard van onbekende groeistoffen.

Zoo vonden K�gl, Haagen Smit en Erxleben (1934) dat de groeistof uit de coleoptielen van Graminee�n zich in ditnbsp;opzicht als auxine-a gedraagt, terwijl de groeistoffen uit gist,nbsp;Rhizopus en Aspergillus volgens K�gl en Kostermans (1934)nbsp;in hun gedrag tegenover zuur en loog met hetero-auxine overeenkomen.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�

Uit de resultaten met beide methoden verkregen kan men zien, dat met groote waarschijnlijkheid aan te nemen is, dat zich in denbsp;coleoptielen en wortels van grassen (dus in hoogere planten)nbsp;auxine-a bevindt, terwijl in cultures van schimmels hetero-auxinenbsp;voorkomt.

Algemeen wordt thans aangenomen dat deze laatste stof als ,,slak� bij de stofwisseling der schimmels � als afbraakproductnbsp;van tryptophaan � moet worden beschouwd en dat zij niet essentieel is voor de groei van het organisme (K�gl en Kostermans, 1934). Waarschijnlijk is vitamine hier de groeistof ofnbsp;een van de voornaamste groeistoffen, zonder welke geen groeinbsp;plaats vindt.

Bij de huidige stand der wetenschap moeten we echter aannemen dat auxine voor de hoogere planten een groeistof is, zonder welkenbsp;geen groei mogelijk is (Went (1928), van Santen (1940),nbsp;e.a.). Het absolute bewijs hiervoor kan echter pas worden geleverdnbsp;als het gelukt, levende planten of plantendeelen volledig groeistof-vrij te maken.

PROBLEEMSTELLING.

Nu doet zich de vraag voor: hoe moeten de phototropische groei-bewegingen bij de lagere planten worden verklaard?

Bij de hoogere planten is dit geschied door een ongelijke ver-deeling aan te nemen van de auxine aan licht- en schaduwzijde.

Hoe deze teweeggebracht wordt is nog steeds een twistpunt. Deels meenen de onderzoekers dat door de belichting een lateraalnbsp;transport van de auxine van licht- naar schaduwzijde wordt veroorzaakt. (C h o 1 o d n y-W e n t-theorie; vgl. WentenThimannnbsp;(1937) blz. 166 e.v.). Nadat echter in 1936 door K�gl denbsp;hypothese was uitgesproken, dat ook in de cel auxine-a via hetnbsp;lacton ge�nactiveerd kan worden, is een ander deel een ongelijkenbsp;photo-inactiveering aan licht- en schaduwzijde als oorzaak van denbsp;ongelijke verdeeling gaan beschouwen. Latere experimenteele gegevens verleenen ook steun aan deze opvatting.

De meening hieromtrent van schrijver dezes is reeds in 1938 medegedeeld (Koningsberger en Verkaaik, 1938). Innbsp;deze publicatie zijn proeven beschreven waarbij Auena-coleoptielennbsp;door ontzaden volgens de methode van Skoog (1937) zooveelnbsp;mogelijk groeistofvrij werden gemaakt. Werd na tweemaal decapi-teeren een agarblokje met auxine-a plat op het coleoptiel gelegd dannbsp;trad bij continue belichting met 100 M.K. een positief phototropischenbsp;kromming op, welke achterwege bleef, in dien het blokje hetero-auxine bevatte. Verder werden vier proef series vergeleken, waarbijnbsp;aan ontzaadde coleoptielen auxine-a resp, alzijdig, aan de lichtzijdenbsp;en aan de schaduwzijde werd toegevoerd, terwijl de vierde serienbsp;in het donker eenzijdig van auxine-a werd voorzien.

In het donker werd de grootste kromming verkregen; werd de auxine aan de schaduwzijde toegevoerd, dan was de kromming

ongeveer 25 % kleiner evenals bij alzijdig toevoeren der auxine, terwijl belichten aan de agarzijde een zeer geringe negatieve kromming gaf, die misschien zonder beteekenis is.

Uit deze proeven moest worden geconcludeerd dat de photo-tropische basisreactie veroorzaakt wordt door photo-inactiveering van auxine-a, welke aan de lichtzijde grooter is dan aan denbsp;schaduwzijde.

Hiertoe moet auxine-a in de plant, evenals in vitro (K � g 1, C. Koningsberger en Erxleben 1936), in evenwicht zijnnbsp;met zijn lacton (vgl. K�gl 1936) dat volgens C. Koningsberger (1936) door ultraviolet licht geinactiveerd wordt.nbsp;Nu kan auxine-a geen zichtbaar licht absorbeeren, zoodat eennbsp;,,sensibilisator�, die zulks wel kan, in de plant aanwezig moet zijn.nbsp;Door proeven van Wald en du Buy (1936) en B � n n i n gnbsp;(1937), die vonden dat de golflengten, welke het grootste photo-tropisch effect veroorzaakten, ook het meest door carotine geabsorbeerd worden, was het waarschijnlijk geworden dat ;8-carotinenbsp;deze rol vervult. Dit is vrijwel vast komen te staan door het werknbsp;van Schuringa (1941), die ook in vitro inactiveering vannbsp;auxine-a vond, indien hij /8-carotine aan zijn groeistof-oplossingennbsp;toevoegde. De inactiveering was weder het grootst bij gebruik vannbsp;golflengten, die door carotine het sterkst worden geabsorbeerd.

Wij willen er hier op wijzen dat Koningsberger en V e r k a a i k bovenstaande conclusies trokken voor de photo-tropische basisreactie, waarop hun proeven slechts betrekkingnbsp;hadden, terwijl zij aannamen dat in de coleoptiel-toppen, die zoonbsp;geheel verschillend van bouw zijn, photo-inactiveering wel voor zalnbsp;komen, maar dat daarnaast andere factoren in het spel kwamen.nbsp;Zij lieten in het midden, of de herverdeeling, die door denbsp;C h o 1 o d n y-W e n t-theorie wordt aangenomen, hier ook eennbsp;rol kan spelen, zooals uit proeven van vele onderzoekers is afgeleid. Oppenoorth (1939) bevestigt deze zienswijze grooten-deels, daar hij bij extractie van belichte Aueua-toppen een ongeveernbsp;30 % geringere hoeveelheid groeistof vindt dan bij onbelichte; ditnbsp;is echter zoowel aan de licht- als aan de schaduwzijde het geval.nbsp;Hij geeft op grond van zijn experimenten verschillende redenennbsp;aan, waarom in de uiterste top herverdeeling der auxine voor hetnbsp;phototropisch effect verantwoordelijk zou kunnen zijn, maar in het

overige, holle deel van het coleoptiel de grootere inactiveering aan de lichtzijde dit effect veroorzaakt.

Op de publicatie van Koningsberger en Verkaaik is door twee auteurs n.1. Laibach (1938) en von Gutten-berg (1938) critiek geleverd. Wij willen deze gelegenheid gebruiken om hierop te antwoorden.

Laibach decapiteert zijns inziens groeistofarme hypocotylen van in het licht gekweekte Cucumis-kiemplantjes en voorziet denbsp;snijvlakte met een pasta, waarin het kaliumzout van yS-indolyl-azijnzuur verwerkt is, en vergelijkt dit met gelijk behandeldenbsp;plantjes, voorzien van pasta zonder groeistof. Aangezien de eerstgenoemde series grootere krommingen geven dan de laatste, wordtnbsp;besloten, dat de conclusies van Koningsberger en Verkaaik verkeerd zijn. Dit besluit wordt kracht bijgezet doornbsp;vergelijking van op bovenstaande wijze met het kaliumzout vannbsp;hetero-auxine behandelde Cucumis-hypocotylen met series hiervan,nbsp;die hij besmeerde met een pasta van Orchidee�n-pollinia, welkenbsp;volgens Laibach (1932) auxine bevatten. De verkregen krommingen zijn voor beide series gelijk, waaruit geconcludeerd wordt,nbsp;dat de phototropische gevoeligheid door auxine en hetero-auxinenbsp;op dezelfde wijze wordt be�nvloed.

Tegen L a i b a c h�s werk zijn vele bezwaren aan te voeren. Cucumis-hypotocylen is een materiaal, waarvan het gedrag tennbsp;opzichte van de groeistof heel weinig bekend is. Het eenige, datnbsp;men er van kan zeggen is, dat ze meer groeistof moeten bevattennbsp;dan de volgens S k o o g ontzaadde Auena-coleoptielen, daar denbsp;blanco proeven krommingen tot 12� geven. Verder werktnbsp;Laibach met pasta�s, die zulke abnormaal hooge concentratiesnbsp;bevatten, dat ze nooit vergeleken mogen worden met die, welkenbsp;in de levende plant voorkomen. Bovendien is nauwkeurignbsp;quantitatief werk met deze pasta�s geheel uitgesloten. Datnbsp;Orchidee�n-pollinia auxine en niet hetero-auxine bevatten is o.i.nbsp;door Laibach geenszins bewezen. Laibach smeert ook nognbsp;hetero-auxinepasta en blanco pasta op ge�soleerde, gedecapiteerdenbsp;Auena-coleoptielen en verkrijgt bij de eerste behandeling ietsnbsp;grootere krommingen dan bij de laatstgenoemde; doch ook hierbijnbsp;geven de blanco controleplanten nog krommingen van 8��12�. Ditnbsp;is volmaakt onbegrijpelijk. L a i b a c h�s bewering dat inactiveering

door licht van zichtbare golflengten in de plant onwaarschijnlijk is, moet sinds de eerder genoemde onderzoekingen van Oppen-oorth (1939) worden teruggenomen, terwijl het niet juist isnbsp;gebleken, dat de resultaten van Koningsberger en Ver-k a a i k door vermindering der auxine-concentraties anders worden,nbsp;zooals later zal worden beschreven (blz. 27). Verhooging dernbsp;concentratie schijnt ons zinloos om bovengenoemde redenen; totnbsp;verlaging van de concentratie tot een physiologisch voorkomendenbsp;zijn wij overgegaan, daar men terecht zou kunnen zeggen, dat ooknbsp;de concentraties door Koningsberger en Verkaaik gebruikt aan de hooge kant zijn. De invloed van de licht-intensiteitnbsp;hebben we tot onze spijt nog niet kunnen nagaan, aangezien dezenbsp;quaestie slechts in zijdelingsch verband met het onderhavige onderzoek staat,

Von Guttenber g�s kritiek berust niet op eigen experimenten, maar op oudere litteratuurgegevens, waarvan het zijn grootste bezwaar is, dat ze niet alle door Koningsbergernbsp;en Verkaaik zijn aangehaald. We willen echter opmerken,nbsp;dat in laatstgenoemde publicatie, die een voorloopig karakter draagt,nbsp;slechts de direct op het onderzoek betrekking hebbende litteratuurnbsp;is genoemd. Verder schijnt von Guttenbcrg de strekkingnbsp;van het stuk niet goed begrepen te hebben, want hij stelt de vraag,nbsp;of de auteurs aannemen dat de photo-inactiveering slechts in de topnbsp;plaats vindt, terwijl zij deze juist voor de rest van de plant bewezennbsp;hebben. Het door von Guttenberg aangehaalde werk vannbsp;Koch (1934) gaat er van uit, dat reeds vast zou staan, datnbsp;phototropie door lateraal auxinetransport teweeg wordt gebracht,nbsp;maar al zijn resultaten zijn ook door inactiveering te verklaren. Hijnbsp;krijgt n.1. bij eenzijdig toevoeren van auxine aan de schaduwzijdenbsp;(door de plantjes alleen aan de lichtzijde te dccapiteeren) grooterenbsp;kromming dan bij de controles in het donker, terwijl Koningsberger en Verkaaik dit andersom vinden. Dit is duidelijk,nbsp;als men bedenkt dat Koch met niet-ontzaadde planten werkt,nbsp;die meer eigen groeistof bevatten en dus in het donker mindernbsp;gevoelig zijn, terwijl bij belichting ook de reeds in de plantnbsp;aanwezige auxine aan de lichtzijde geinactiveerd wordt, waardoornbsp;de kromming naar het licht dus grooter wordt. Het feit, dat ooknbsp;ontzaadde planten niet geheel groeistofvrij zijn, is niet als tegen-

argument aan te voeren, daar zij wel zoo weinig groeistof blijken te bevatten, dat ze onder de heerschende omstandigheden geennbsp;phototropische reactie meer vertoonen. Wanneer Koch aan denbsp;schaduwzijde decapiteert zijn de negatieve krommingen grooter dannbsp;wanneer Koningsberger en Verkaaik agar aan denbsp;lichtzijde opzetten. Koch�s belichtingstijden zijn kleiner, waardoornbsp;minder auxine geinactiveerd kan zijn. Een proef, waarbij slechtsnbsp;het halve topje belicht werd onder afscherming van de rest vannbsp;de plant, geeft een S-vormige kromming, die zonder moeite verklaard kan worden, doordat slechts het basisgedeelte onder denbsp;intacte helft van de top groeistof krijgt en dus van het licht afnbsp;kromt, terwijl in de top inactiveering plaats kan hebben met alsnbsp;gevolg: positieve phototropie. In deze halve top is echter lateraalnbsp;transport, zooals reeds vroeger betoogd, zeer wel mogelijk. Bij denbsp;overige proeven van Koch, waar groeistof-agar wordt aangebracht, is niet vermeld welke groeistof gebruikt is. Daar ,,progynon�,nbsp;Penicillium~ en Auena-groeistof door elkaar worden gebruikt, kannbsp;over de resultaten niet verder gediscussieerd worden, temeer daarnbsp;meestal met 5 a 7 planten ge�xperimenteerd is, waarvan vaaknbsp;slechts de helft een kromming te zien gaf.

Von Guttenberg haalt bovendien nog een proef aan van Braun er (1922), die aantoonde dat gedecapiteerde Avena-coleoptielen, na kort belichten, in het donker recht blijven, maarnbsp;na wederopzetten van de top een positieve kromming geven. Dezenbsp;proef kon bij herhaling op het Botanisch Laboratorium te Utrechtnbsp;niet worden bevestigd. De conclusie van Boysen Jensennbsp;(1928), dat in de top lateraal transport van groeistof moet plaatsnbsp;vinden, berust op experimenten, waarbij Auena-coleoptielen metnbsp;gespleten toppen, die in de spleet van een dekglaasje voorziennbsp;waren, positief phototropisch krommen, indien de spleet parallelnbsp;aan de lichtrichting is aangebracht, maar zulks nauwelijks doen,nbsp;indien het licht loodrecht op het glaasje invalt. Deze proef is onaanvechtbaar. Het is dan ook een der argumenten waardoornbsp;Koningsberger en Verkaaik lateraal transport in denbsp;top mogelijk bleven achten.

Ook van Overbeek (1939) kent transversaal transport bij phototropische reacties een beperkte rol toe en acht het slechtsnbsp;in massieve plantendeelen mogelijk; d.w.z. bij Auena-coleoptielen

alleen in de top. Hij komt tot deze zienswijze op grond van het feit dat het door hem (1933) in massieve cylindertjes van Raphanus-hypocotylen aangetoonde transversale transport niet optreedt innbsp;holle coleoptielcylindertjes van Avena (du Buy, 1933) ennbsp;hypocotylen van Helianthus. Photo-inactiveering van auxine-a ennbsp;-b ¹) via hun lacton kan, volgens van Overbeek, alleen ofnbsp;tezamen met lateraal transport, de oorzaak zijn van een photo-tropische kromming.

Een recente publicatie van Oppenoorth (1941) werpt nieuw licht op het mechanisme van de phototropische topreactie.nbsp;Oppenoorth stelt vast dat bij gebruik van lichtintensiteiten,nbsp;die de eerste positieve of eerste negatieve phototropische krommingnbsp;te voorschijn roepen, naast inactiveering van groeistof, steeds eennbsp;vermeerdering van de auxineproductie optreedt, waarvan de groottenbsp;afhankelijk is van de lichtintensiteit. Bij de eerste negatieve kromming is de totale hoeveelheid groeistof zelfs direct na de belichtingnbsp;al grooter dan er voor. Oppenoorth is de meening toegedaan,nbsp;dat de productie aan licht- en schaduwzijde altijd even grootnbsp;en een lateraal transport voor de kromming aansprakelijk is, maarnbsp;geeft toe, dat al zijn proeven ook een verklaring op grond van eennbsp;ongelijke productie aan licht- en schaduwzijde toestaan. Daar zeker,nbsp;een verval van de intensiteit in het coleoptiel moet optreden, lijktnbsp;het ons mogelijk, dat een ongelijke productie althans medewerktnbsp;aan het tot stand komen van de phototropische kromming. Denbsp;resultaten van de meeste vorige auteurs (b.v. Went, 1928), dienbsp;tot het bestaan van lateraal transport concludeerden, kunnen ooknbsp;door ongelijke auxineproductie naast inactivatie worden verklaard.nbsp;De reeds genoemde proeven van Boysen Jensen (1928)nbsp;en van Overbeek (1933) maken het echter onmogelijk, hetnbsp;bestaan van het zoo moeilijk begrijpelijke laterale transport tenbsp;ontkennen en in de beschouwingen over phototropie geheel te

Van Overbeek neemt, evenals Stewart en Went (1939), als vaststaand aan dat auxtne-b op dezelfde wijze door licht ge�nactiveerd kan wordennbsp;als auxine-a. Tot nu toe is echter geen poging gedaan om bij experimentennbsp;in vitro aan te toonen, of auxine-b-lacton door licht al dan niet wordtnbsp;ge�nactiveerd. Dientengevolge lijkt het noodzakelijk, bij experimenten met ma�snbsp;als bron van groeistoffen, geen v�rgaande conclusies te trekken.

vervangen door de begrippen: inactivatie en productie, waarvan men zich een duidelijke voorstelling kan maken.

Met het bovenstaande meenen we, dat het ons gelukt is de kritiek van von Guttenberg en Laibach te ontzenuwen.

Terugkomende op de in het begin van dit hoofdstuk gestelde vraag, wat het mechanisme der phototropie bij lagere organismennbsp;is, moet gezegd worden, dat dit slechts dan analoog kan zijn aannbsp;dat der hoogere planten, wanneer ook bij eerstgenoemden auxine-anbsp;(resp. een nauw verwante verbinding) en carotine in de cellennbsp;aanwezig zijn.

Derhalve hebben we ons tot taak gesteld dit te onderzoeken. De resultaten er van worden in de volgende hoofdstukken beschreven.

Op grond van de in hoofdstuk I gegeven beschouwingen weten wij, dat door onderzoek naar de gevoeligheid der verschillendenbsp;groeistoffen voor zuur en alkali en door moleculairgewichts-bepalingen is komen vast te staan, dat in alle onderzochte schimmelsnbsp;hetero-auxine voorkomt.

De meeste schimmels zijn phototropisch ongevoelig, er zijn echter enkele uitzonderingen. Zoo vertoonen de sporangi�ndragers vannbsp;Phycomyces, Pilobolus en Mucor een sterke phototropische reactienbsp;waardoor speciaal de eerstgenoemden, reeds lang als proefobject ternbsp;bestudeering der phototropie in gebruik zijn.

Om twee redenen hebben ook wij voor dit onderzoek onze keuze op deze schimmelsoort laten vallen; in de eerste plaats is Phycomycesnbsp;een gemakkelijk in reincultuur te kweeken schimmel en ten tweedenbsp;levert zij dikke bossen hoog �pschietende sporangi�ndragers, dienbsp;eenvoudig van het substraat te scheiden zijn.

Tachtig P e t r i-schalen van 1 cm hoogte en 20 cm doorsnede werden elk met 30 cm^ rijstkorrels en 100 cm^ water gevuld ennbsp;gedurende }/^ uur bij 120� gesteriliseerd. De aldus gemaaktenbsp;voedingsbodems werden na afkoelen ge�nt met een minus-cultuurnbsp;van Phycomyces Blakesleeanus ¹), door 10 cm^ van een sporensuspensie van deze schimmel over iedere voedingsbodem uit tenbsp;gieten. De schimmel kreeg nu gelegenheid zich in de gesloten schalen

De reincultuur werd ons welwillend door Prof. Dr. V. J. Konings-I e r g e r ter beschikking gesteld.

te ontwikkelen, waarvoor we deze in een geheel verduisterd vertrek bij kamertemperatuur hadden opgesteld. Hier kon slechts rood lichtnbsp;worden gemaakt; derhalve is photo-inactiveering van eventueel aanwezige auxine tijdens het kweeken uitgesloten. Vijf a zes dagen nanbsp;het enten zijn de sporangi�ndragers zoo lang, dat ze het dekselnbsp;van de P e t r i-schaal raken. Om hen gelegenheid te geven langernbsp;uit te groeien, werd er vervolgens van afgezien steriel te kweekennbsp;en werden de deksels verwijderd. Het gevaar voor infectie is opnbsp;dat moment niet groot meer; het mycelium is zoo door de rijstnbsp;heen gegroeid, dat vreemde sporen hierop moeilijk tot ontwikkelingnbsp;komen. Acht a negen dagen na het enten hadden wij culturesnbsp;verkregen met vier a vijf cm lange sporangi�ndragers, die sterknbsp;phototropisch gevoelig waren. Deze gebruiken we voor onzenbsp;proeven.

Allereerst moest worden nagegaan welke groeistof in de P/iycomi/ces-sporangi�ndragers voorkomt. Hierover geeft de litteratuur slechts ��n aanwijzing. Heyn (1935) bepaalde reeds hetnbsp;moleculairgewicht van deze groeistof en vond een waarde 149nbsp;(zie Hoofdstuk I). Hij volstond met ��n bepaling: deze wijst er op,nbsp;dat we hier, evenals bij andere onderzochte schimmels, met hetero-auxine te doen zouden hebben.

Voor ons onderzoek knipten we de sporangi�ndragers vlak boven het substraat af, er voor zorgend dat geen rijstkorrels medegenomennbsp;werden, en wreven hen in een mortier met zoutzuurhoudend waternbsp;zoo goed mogelijk fijn. Dit waterige extract werd afgezogen ennbsp;driemaal met peroxyde-vrije aether¹) uitgeaetherd. Het residunbsp;werd ook nog driemaal met aether ge�xtraheerd, waarna de ver-eenigde extracten tweemaal met een verzadigde oplossing vannbsp;natriumbicarbonaat werden uitgeschud. De bicarbonaatfractie werd,nbsp;na aanzuren met zoutzuur, wederom driemaal uitgeaetherd. Tenslotte is dit etract in vacuo ingedampt en de overblijvende stroopnbsp;boven phosphorpentaoxyde in een vacuum-exsiccator gedroogd. Alnbsp;deze bewerkingen zijn steeds bij oranje licht uitgevoerd ter voorkoming van eventueele photo-inactivatie.

Voor alle verdere extracties werd eveneens peroxyde-vrije aether gebruikt hoewel dit er niet steeds weer bij zal worden vermeld.

Voor de hierna volgende activiteitsbepalingen maakten we gebruik van de standaard Anena-test volgens W ent. Deze werd uitgevoerd met �Siegeshafer� uit Sval�v, oogst 1938, in een kamer vannbsp;constante temperatuur en vochtigheid, welke respectievelijk 23� C.nbsp;en 92 % bedroegen.

Van de uit de schimmels verkregen extracten werd een afgewogen hoeveelheid in enkele druppels aethanol opgelost en verdund met water, dat 160 mg kaliumchloridc en 0,2 cm^ azijnzuur per liternbsp;bevatte. In series oplossingen van verschillende concentratie werdennbsp;agar-agarplaatjes van 6 X 8 X 0,45 mm gelegd, zoodat de test-planten van blokjes van 2 X 2 X 0,45 mm konden worden voorzien.nbsp;Voor iedere bepaling gebruikten wij 9�12 planten en alle bepalingennbsp;werden minstens in tweevoud uitgevoerd. Gelijktijdig met iederenbsp;activiteitsbepaling werd steeds een standaardoplossing vannbsp;/3-indolyl-azijnzuur in concentraties 10~'^ en Yi � 10^'^ getest.

Ten einde het moleculairgewicht van de zich in de verkregen stroop bevindende groeistof te bepalen, maakten we gebruik vannbsp;de reeds beschreven diffusiemethode.

Als resultaat van deze bepalingen vonden we als waarden voor het moleculairgewicht achtereenvolgens 168, 165 en 167, Ternbsp;controle van onze techniek uitgevoerde parallelproeven metnbsp;^-indolyl-azijnzuur leverden de waarden 188 en 170 op. In overeenstemming met Heyn (1935), die M = 149 vond, wijzen dus ooknbsp;deze bepalingen er op, dat we in de sporangi�ndragers vannbsp;Phycomyce^ met hetero-auxine te maken hebben.

Om dit nader te onderzoeken werd een hoeveelheid actieve stroop gedurende drie uur met 5 %-ig zoutzuur gekookt, terwijl een even-groote hoeveelheid diezelfde behandeling met 5 %-ig natrium-hydroxyde onderging. Nadat de beide reactiemengsels � het laatstenbsp;na aanzuren � uitgeaetherd waren en de aether afgedestilleerd was,nbsp;werden hun activiteiten opnieuw bepaald. Volgens de verwachtingnbsp;had de behandeling met loog geen invloed op de activiteit gehad.

maar de werkzaamheid van de met zuur gekookte portie was niet geheel verdwenen; een dertigste deel der oorspronkelijke activiteitnbsp;bleek nog aanwezig. Daar wij vermoedden met een proeffout tenbsp;doen te hebben, kookten we de reeds behandelde portie nogmaalsnbsp;drie uren met zoutzuur; hierdoor veranderde de werkzaamheid nietnbsp;meer. Een klein deel der groeistof is dus tegen zuur bestand, echternbsp;niet tegen loog, want na drie uren daarmede te hebben gekookt,nbsp;konden we nog slechts een onwerkzaam praeparaat uit het reactie-mengsel extraheeren. Ook de activiteit, die we voortaan de remanentenbsp;zullen noemen, was dan dus verdwenen. Een en ander kon zoowelnbsp;bij volgende hoeveelheden stroop als bij nieuw bereide Phycomyces-extracten bevestigd worden. Een overzicht van de gevondennbsp;waarden is in tabel I opgenomen.

We zien hieruit dat de remanente activiteiten, evenals de totale, een vrij constante waarde hebben, terwijl hun verhouding tusschennbsp;1/25 en 1/30nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;twee laatste kolommen zijn de totale en

remanente activiteiten per mg droge schimmel opgenomen, welke ook mooi constant zijn.

De drooggewichten, noodig voor het berekenen van deze waarden, zijn bepaald door de sporangi�ndragers na de extractie in eennbsp;droogstoof bij 110� te drogen en, na afkoelen in een exsiccatornbsp;boven phosphorpentaoxyde, snel te wegen. Het drogen werd voortgezet, tot constant gewicht bereikt was.

Extract IV is, op dezelfde wijze als de andere, bereid uit sporangi�ndragers van een cultuur, die een maand oud was en geennbsp;phototropische gevoeligheid meer vertoonde. Hierbij bleek geennbsp;remanente activiteit aanwezig te zijn.

Deze vraag komt op grond van bovenstaande resultaten natuurlijk direct naar voren. Allereerst omdat de remanente activiteit veroorzaakt wordt door een stof, die wel door loog maar niet door zuurnbsp;te vernietigen is; in de tweede plaats, omdat deze stof slechts innbsp;de jonge, phototropisch gevoelige, cultures voorkomt, maar niet innbsp;oude, ongevoelige.

Als echter auxine-a in de sporangi�ndragers van Phycomgces verantwoordelijk zou zijn voor de phototropische gevoeligheid, lijktnbsp;het vreemd dat slechts 1/25 a 1/30 van de totale werkzaamheid doornbsp;deze stof wordt teweeggebracht. Wanneer men echter bedenkt, datnbsp;de hetero-auxine als �slak� bij de stofwisseling van de schimmelnbsp;moet worden beschouwd, ziet men, dat het foutief is de eventueelnbsp;van auxine-a afkomstige activiteit met de totale te vergelijken. Ofnbsp;hier veel of weinig �auxine-a� aanwezig is, kan beter beoordeeldnbsp;worden door de remanente activiteit per mg drooggewicht te stellennbsp;tegenover deze zelfde grootheid van auxine-a in toppen van Avena-coleoptielen.

Door aetherextractie werd gevonden dat zeven dozijn Avena-coleoptieltoppen (lengte 3 mm) met een drooggewicht van 3 mg een activiteit hebben van 10,2 AE. Deze waarden zijn gemiddeldennbsp;van 12 bepalingen¹). Per mg drooggewicht heeft auxine-a uitnbsp;Auena-toppen dus een activiteit van 3,4 AE tegenover waardennbsp;tusschen 0,4 en 1,0 AE voor de niet met zuur te ontleden groeistofnbsp;in Phycomgces. Men ziet dus, dat concentraties van dezelfde ordenbsp;van grootte in beide objecten aanwezig zijn, zoodat het physio-logisch niet onmogelijk is, dat in Phycomgces auxine-a bij de photo-tropie een analoge rol vervult als in Avena.

Dat een ongeveer vier maal zoo geringe concentratie als in coleoptielen geen beletsel behoeft te zijn voor physiologische werkzaamheid is duidelijk, als men zich de auxine-concentratie van

Dr. W. F. F. Opp e n o o r t h willen wij dank zeggen voor het uitvoeren van deze extracties volgens de door hem (1939) uitgewerkte methode. Tevensnbsp;zij opgemerkt, dat de hoeveelheid auxine-a in Auena-coleoptielen nogal variabelnbsp;is. Derhalve zijn deze proeven gelijktijdig uitgevoerd met de extracties vannbsp;Phycomyces.

Afena-wortels, welke ongeveer 10� maal zoo klein is als in stengels, voor oogen stelt.

Daar er dus wel argumenten uit onze proeven naar voren komen, die er voor pleiten de boven deze paragraaf gestelde vraag bevestigend te beantwoorden, terwijl er geen redenen te vinden zijnnbsp;voor een ontkennend antwoord, hebben we getracht de aanwezigheidnbsp;van auxine-a in sporangi�ndragers van Phycomyces nader te bevestigen.

H. nbsp;nbsp;nbsp;Bepaling moleculairgewicht van dc niet met zuur te vernietigennbsp;groeistof.

Allereerst hebben we daartoe, wederom van de diffusie-methode gebruik makend, het moleculairgewicht bepaald van de groeistof,nbsp;die de remanente activiteit veroorzaakt.

Daarvoor is weer een hoeveelheid uit sporangi�ndragers bereide actieve stroop met 5 %-ig zoutzuur behandeld en van het uitge-aetherde residu een oplossing in de vloeistof van K � g 1 ennbsp;Haag en Smit gemaakt, welke theoretisch ongeveer 40�nbsp;kromming geeft. Hiermede zijn de diffusieproeven op de reedsnbsp;beschreven wijze uitgevoerd. Ook nu controleerden we weder onzenbsp;techniek door deze moleculairgewichtsbepalingen af te wisselen metnbsp;dito bepalingen uitgevoerd met hetero-auxine.

Het resultaat van deze experimenten was, dat wij, behoudens een mislukte bepaling, voor de met zuur gekookte groeistof uitnbsp;Phycomyces achtereenvolgens M = 311; 369; 359; 299 en 312nbsp;vonden, terwijl hetero-auxine de waarden 195; 122; 135 en 178nbsp;opleverde.

Daar nu het gemiddelde van de gevonden moleculairgewichten 330 bedraagt en de voor auxine-a berekende waarden 328 is, steunennbsp;deze proeven de hypothese, dat hier ook in een lager organismenbsp;auxine-a voorkomt.

I. nbsp;nbsp;nbsp;Physiologische proeven met de remanent actieve groeistof.

Om nog meer zekerheid te verkrijgen over de identiteit van de groeistof, waarvan het gedrag tot dusver steeds met auxine-a overeenkwam, hebben we, daar verdere chemische methoden ontbreken,nbsp;physiologische proeven genomen.

Koningsberger en Verkaaik (1938) een herstel der phototropische gevoeligheid bij ontzaadde, tweemaal gedecapiteerdenbsp;haver-coleoptielen, indien men auxine-a uit plat- op de snij vlaktenbsp;gelegde agarblokjes in de stomp laat diffundeeren, terwijl denbsp;planten bij gebruik van hetero-auxine phototropisch ongevoelignbsp;blijven. Om nu na te gaan of ook in dit opzicht het gedrag vannbsp;de te onderzoeken groeistof analoog is aan dat van auxine-a,nbsp;drenkten we agarplaatjes in oplossingen van met zuur gekooktnbsp;Phgcomyces-extract, welke theoretisch een kromming van 40� innbsp;de W e n t-test gaven. De gebruikte haverplantjes werden 18 urennbsp;voor de eerste decapitatie ontzaad. Anderhalf uur na de eerstenbsp;volgde een tweede decapitatie, waarna we onmiddellijk de agarblokjes¹) opzetten. Dan werden de plantjes een half uur in hetnbsp;donker gelaten om de groeistof gelegenheid te geven in de cellennbsp;te diffundeeren en vervolgens gedurende vijf uren eenzijdig belichtnbsp;met 100 M.K. Ter controle zijn altijd parallelproeven met hetero-auxine van physiologisch even groote concentratie genomen, terwijlnbsp;de beide oplossingen 5 X verdund in het donker op ontzaaddenbsp;planten werden getest. De resultaten zijn in tabel II samengevat.

In deze tabel stelt ieder getal in de kolommen A tot D de gemiddelde kromming van een rekje (9�12 planten) voor, vijf uren na opzetten der agarblokjes.

Daar de in deze paragraaf beschreven proeven op het Botanisch Laboratorium zijn uitgevoerd, werden agarblokjes van 2 X 2 X 0,9 mm gebruikt, zooals daar gewoonte is. Tevens is hierdoor een betere vergelijking mogelijk met denbsp;resultaten van Koningsberger en Verkaaik (1938), die eveneens blokjesnbsp;van deze grootte gebruikten.

A. nbsp;nbsp;nbsp;Phycomyces-extract alzijdig toegevoerd, eenzijdig belicht (photo-tropische kromming).

B. nbsp;nbsp;nbsp;Hetero-auxine (5: 10'') alzijdig toegevoerd, eenzijdig belichtnbsp;(phototropische kromming).

C. nbsp;nbsp;nbsp;Phycornyces-axtxazi; contn�letest met 1/5 der bij A gebruiktenbsp;concentratie.

We zien dus, dat ons extract een herstel der phototropische gevoeligheid te voorschijn roept in tegenstelling tot hetero-auxine.nbsp;De kleine kromming met deze stof op 14/10 verkregen is te wijtennbsp;aan te laat ontzaden der haverplanten, waardoor er nog te veelnbsp;eigen groeistof in is achtergebleven.

Een tweede reeks physiologische experimenten bestaande uit acht series en eveneens berustende op resultaten van Koningsberger en Verkaaik is daarna begonnen.

Vier series omvatten planten, die evenzoo zijn behandeld als de series A tot D in de voorafgaande proeven. Om echter kritieknbsp;op de vrij hooge concentraties, welke daar in navolging vannbsp;Koningsberger en Verkaaik zijn gebruikt, te voorkomen, pasten we thans ook voor de behandelingen A en B denbsp;physiologisch normale, vijf maal zoo kleine concentratie toe.nbsp;Verder zijn er, zoowel voor Phycornyces-cxtmct als voor hetero-auxine, twee series aan toegevoegd, waarbij de groeistof-agarnbsp;respectievelijk aan de licht- en aan de schaduwzijde van eenzijdignbsp;belichte planten is opgezet. In tabel III zijn wederom de krommingennbsp;aangegeven, welke vijf uren na het aanbrengen van de agar-blokjesnbsp;verkregen zijn. Voor de belichting is ook weer een intensiteit vannbsp;100 M.K. gebruikt.

Allereerst geeft deze tabel in de kolommen P en W hetzelfde resultaat te zien als de vorige in de kolommen A en B.

Bovendien ziet men, dat ons Phycomyces-cxtiact zich ook verder gedraagt als de zuivere auxine-a, welke Koningsberger ennbsp;V e r k a a i k gebruikten. Terwijl hetero-auxine, onafhankelijk vannbsp;belichting, bij eenzijdige toevoer steeds dezelfde kromming geeftnbsp;(X, Y en Z), is deze bij planten, die van ons extract zijn voorzien,nbsp;in het licht (R en S) kleiner dan in het donker (Q). De kromming isnbsp;vrijwel ¹) geheel verdwenen, als de auxinetoevoer aan de lichtzijde

Aangezien krommingen kleiner dan 1� niet re�el behoeven te zijn, leek het aanbevelenswaardig deze met 0 aan te duiden.

plaats vond (S), terwijl zij slechts 15�20 % verminderd is bij toevoer aan de schaduwzijde (R). Noemt men, in overeenstemmingnbsp;met Koningsberger en Verkaaik, de hoeveelheid auxinenbsp;aan de schaduwzijde p en aan de lichtzijde q, dan vinden we dusnbsp;in Tabel III sub R de krommingen door p en sub S die door qnbsp;veroorzaakt. Hoewel de door aftrekking berekende waarde voornbsp;p�q niet in elk afzonderlijk geval zoo mooi klopt met de gevondenenbsp;(kolom P) als in het �schoolvoorbeeld� van Koningsbergernbsp;en Verkaaik, is dit bij het gemiddelde wel het geval en wijnbsp;zijn de meening toegedaan, dat de beide hier beschreven physio-logische proevenreeksen niet alleen een nieuw punt van overeenkomst tusschen auxine-a en de onderzochte P/zycomyces-groeistofnbsp;hebben aangetoond, maar dat zij tevens steun verleenen aan denbsp;opvatting over het mechanisme der phototropie in het basale deelnbsp;van coleoptielen, zooals die door Koningsberger en Verkaaik wordt gegeven. Het feit, dat thans ook met concentratiesnbsp;gewerkt is, die voor de plant physiologisch normaal zijn, is in ditnbsp;verband o.i, belangrijk.

Wanneer men de gegevens uit de in dit hoofdstuk beschreven proeven beschouwt, dan ziet men, dat de groeistof, die naast hetero-auxine in sporangi�ndragers van Phycomyces aanwezig is ennbsp;aanleiding geeft tot remanente activiteit, de volgende punten vannbsp;overeenkomst heeft met auxine-a:

2. nbsp;nbsp;nbsp;Zij is gemakkelijk te inactiveeren door koken met 5 %-ig natrium-hydroxyde.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Zij kan herstel der phototropische gevoeligheid bewerken bijnbsp;ontzaadde, tweemaal gedecapiteerde havercoleoptielen.

5. nbsp;nbsp;nbsp;Zij wordt, als deze coleoptielen eenzijdig worden belicht, hierinnbsp;aan de lichtzijde sterker ge�nactiveerd dan aan de schaduwzijde.

Daarentegen hebben wij geen verschilpunt kunnen aantoonen. De conclusie, dat in sporangi�ndragers van Phycomyces auxine-anbsp;voorkomt, lijkt derhalve niet gewaagd; toch zullen we voorzichtigheidshalve zeggen: ,,auxine-a of een ten nauwste daarmee verwantenbsp;stof.�

Terloops zij opgemerkt, dat de in het vierde en vijfde punt genoemde argumenten voor de aanwezigheid van auxine-a innbsp;Phycomyces onafhankelijk zijn van de beschouwingen, in hoofdstuk II gewijd aan de photo-inactiveering van auxine-a als oorzaaknbsp;van phototropische reacties. Immers deze argumenten berustennbsp;niet op bedoelde theoretische beschouwingen, maar op een feit:nbsp;Phycomyces-gioeistoi gedraagt zich bij de beschreven proevennbsp;geheel anders dan hetero-auxine en vertoont dezelfde eigenschappen als Koningsberger en Verkaaik bij zuiverenbsp;auxine-a vonden.

Nu de aanwezigheid van auxine-a in de sporangi�ndragers van Phycomyces met vrij groote zekerheid is vastgest�ld, zal men zichnbsp;afvragen, of het hierin dezelfde rol bij de phototropie speelt als innbsp;de hoogere planten. Voor een positief antwoord op deze vraagnbsp;pleiten twee argumenten. Ten eerste bleek de concentratie vannbsp;de groeistof in de sporangi�ndragers van dezelfde orde van groottenbsp;als die van auxine-a in coleoptieltoppen van Avena; ten tweede isnbsp;deze groeistof slechts in jonge, phototropisch gevoelige cultures

aanwezig, niet in oude, ongevoelige. Er moet echter carotine in de cellen der sporangi�ndragers aanwezig zijn, wil het mogelijknbsp;zijn, dat de aanwezige auxine-a de rol speelt, welke we haar hiernbsp;hebben toegedacht.

De litteratuur geeft hierover uitkomst. Castle (1931) en Buder (1932) bepaalden bij sporangi�ndragers van Phy corny cesnbsp;de afhankelijkheid der phototropische gevoeligheid van de golflengtenbsp;van het gebruikte licht, waarbij een tweetoppige curve werd verkregen met maxima bij 450 en 475 mix. Deze vond Castle (1935)nbsp;ook bij het bepalen van een absorptiespectrum van een carotino�de-extract in hexaan, uit deze sporangi�ndragers bereid. Runningnbsp;(1937) reageerde in een sporangi�ndrager onder het microscoopnbsp;op carotine en vond een positieve Car r-P r i c e-reactie, terwijlnbsp;hij tevens door toevoegen van methanol kristallen verkreeg, welkenbsp;op die van j8-carotine lijken. B � n n i n g voerde zijn experimentennbsp;hoofdzakelijk aan Pilobolus uit. Hij bepaalde bij deze schimmel eennbsp;absorptiespectrum van de sporangi�ndrager zelf en geeft maximanbsp;bij 445 en 470�480 my op. Tevens meldt hij, dat Phycomycesnbsp;eenzelfde resultaat opleverde. Schopfer (1935), tenslotte, heeftnbsp;het absorptiespectrum van Phycomyces-extiact in zwavelkoolstofnbsp;gemeten en de door hem gevonden curve met maxima bij 487 ennbsp;517 my klopt eveneens mooi met die, welke Kuhn en Lederernbsp;(1931) bepaalden voor zuivere /3-carotine in hetzelfde oplosmiddel.nbsp;Laatstgenoemde kromme heeft maxima bij 450, 485 en 521 my.

Op grond van al deze gegevens staat het derhalve vast, dat ;0-carotine in sporangiophoren van Phycomyces aanwezig is. Bijnbsp;deze schimmel is een verklaring, overeenkomend met die voor denbsp;phototropie van hoogere planten gegeven, dus mogelijk.

Inactiveering en versnelde productie van auxine onder invloed van het licht zullen bij sporangi�ndragers van Phycomycesnbsp;uitsluitend aansprakelijk zijn voor de phototropische reactie.nbsp;Transversaal transport, dat in Auena-coleoptieltoppen op kannbsp;treden, is hier uitgesloten, aangezien dit steeds als gevolg vannbsp;polaire permeabiliteitsveranderingen wordt verklaard en deze innbsp;een eencellig orgaan niet goed denkbaar zijn. Bovendien kan wordennbsp;opgemerkt, dat, wanneer positieve krommingen worden verkregen,nbsp;de versnelde productie, althans aan de achterzijde, moet over-heerschen. Immers deze krijgt, door de lenswerking van het orgaan.

het meeste licht en groeit toch sneller. Blaauw (1918) vond ook bij alzijdige belichting eerst een vermeerdering van de groei-snelheid. Derhalve moet ook dan de auxineproductie sneller plaatsnbsp;grijpen dan de inactiveering.

Gaarne hadden wij ook in een andere phototropisch gevoelige schimmel b.v. Pilobolus, het voorkomen van auxine-a nagegaan.nbsp;Zoowel de sporangi�ndragers van Pilobolus als die van Mucornbsp;hebben een veel geringere afmeting dan de voor dit onderzoeknbsp;gebruikte Phycomyces-sporangi�ndragers en hierdoor is een veelnbsp;te groot aantal cultures noodig om een eventueele, toch al geringe,nbsp;hoeveelheid auxine-a aan te toonen. Bovendien is Pilobolus moeilijknbsp;op groote schaal in reincultuur te kweeken en nog moeilijker tenbsp;oogsten, terwijl Mucor slechts een geringe phototropische reactienbsp;vertoont.

Derhalve hebben wij er van af gezien om onze proeven met een andere schimmel te herhalen. Hierdoor is de stelling: zondernbsp;auxine~a geen phototropie, slechts met groote waarschijnlijkheid,nbsp;niet met zekerheid, te formuleeren.

An investigation was made on the nature of the growth substance in young Phycomyces-sporangiophores, which show phototropicnbsp;response.

According to its molecular weight and its behaviour against acid and alkali, the bulk of the growth substance is similar tonbsp;indole'3-acetic acid.

It returns the sensibility for light to deseeded Auena-coleoptiles, while in these coleoptiles its activity is destroyed by light, morenbsp;so when it flows at the light-side than when it flows at the dark-sidenbsp;of the stump.

Because of these similarities it seems very likely that auxin-a is present in Phycomr/ces-sporangiophores.

The rest-activity is only found in young sporangiophores, not in old ones, which do not show phototropic sensibility.

The concentration of the remanently active substance in the sporangiophores is shown to be of the same order of magnitudenbsp;as that of auxine-a in tips of Auena-coleoptiles.

These two facts, together with the occurance of jS-carotene in the sporangiophores, make it highly probable that phototropic curvaturesnbsp;of Phycomyces should be explained in the same terms as thosenbsp;of shoots of higher plants.

The vision of Koningsberger and Verkaaik on the latter problem is discussed and defended against the criticism bynbsp;von Guttenberg and Laibach.

DE PHYSIOLOGISCHE WERKING VAN DE ANTIPODEN VAN a.(;8MNDOLYL)PROPIONZUUR.

In 1937 deelde K �gl in een voordracht te Weenen mede dat bij een onderzoek in zijn laboratorium was gebleken, dat de beidenbsp;antipoden van a-(/3'-indolyl)-propionzuur {a-methyl-a(^'indolyl)-azijnzuur) in de Auena-test volgens Went een verschillendenbsp;werkzaamheid vertoonden.¹)

De gemiddelde waarden voor de activiteit, bepaald nadat enkele maanden getest was, bedroegen:

23 nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,, racemaat.

Het ( )zuur is dus 30 maal actiever dan het (�)zuur. Dit resultaat is daarom zoo merkwaardig, omdat vele verbindingennbsp;bekend zijn geworden, welke een met auxine-a en -b te vergelijkennbsp;activiteit bezitten, ofschoon ze in structureel opzicht nauwelijks metnbsp;de echte auxinen verwant zijn. Hier heeft nu echter een kleinnbsp;stereochemisch verschil bij dezelfde structuur groote invloed ennbsp;wel bij een normaliter niet door de plant zelf gevormde verbinding!

Het racemaat, door Dr. J. K. Bottema bereid, was door Mej. Dr. M. A. M. K1 o m p � in de antipoden gesplitst. De splitsingsmethoden voornbsp;( ) en (�) zuur zijn respectievelijk door den heer C. van Wessem ennbsp;Dr. J. K. Bottema uitgewerkt.

K � g 1 concludeert, dat bovengenoemde antipoden in de plant met asymmetrische stoffen, waarschijnlijk eiwitbestanddeelen vannbsp;het protoplasma, reageeren en geeft op grond hiervan een mogelijknbsp;schema voor het mechanisme.

We hebben ons thans tot taak gesteld de physiologische betee-kenis van het verschijnsel nader te onderzoeken. Hiertoe stonden ons de praeparaten, die voor bovenstaand onderzoek hadden gediend, ter beschikking.

Het racemaat was bereid op een wijze, analoog aan die, welke MajimaenHoshino (1925) voor jS-indolylazijnzuur hebbennbsp;beschreven:

CHsCHBr-CSN

CH3

-C-CSEN H,0 Hnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;-lt;----

	CHa
	C�COOH
.L 11 ]i	H
N
H	H
	C-COOH

20 0/0

KOH nbsp;nbsp;nbsp;H

�Mg

CHsCH-CSSf^' \

II 11 II

\/\/^

CH,

De laatste trap, de verzeeping, mislukte bij volgen van M a j i m a�s voorschrift. Een goed resultaat werd verkregen, wanneer het gezuiverde a-((S'-indolyl)propionitril gedurende 7 uur gekookt werd met 10%-ig bariumhydroxyde. Het reactiemengselnbsp;werd, om nevenproducten te verwijderen, uitgeaetherd en vervolgens geneutraliseerd met 2 n zoutzuur; dan eenige malen afwisselend met aether ge�xtraheerd en verder aangezuurd. Na drogennbsp;der vereenigde extracten op natriumsulfaat en verdrijven van denbsp;aether bleef een taaie lichtbruine stroop over, welke na eenigenbsp;dagen in een vacuumexsiccator boven calciumchloride gestaan te

hebben, bij krassen vast werd. Door 3 maal omkristalliseeren uit benzol kon het racemische a-(yS'-indolyl)propionzuur zuiver wordennbsp;verkregen. Het zijn witte kristallen die bij 111� ¹) smelten.

Om uit het racemaat de antipoden zuiver te bereiden is voor de (�) component gebruik gemaakt van cinchonine, voor de ( )nbsp;component van chinine. Aequimoleculaire hoeveelheden van racemaat en alkalo�de werden droog gemengd en opgelost in alcohol;nbsp;aan de oplossing werd water toegevoegd tot blijvende troebeling,nbsp;waarna het mengsel eenige weken in de frigidaire werd gezet.nbsp;Dan scheidde zich een gele stroop af, die, na decanteeren van denbsp;moederloog, door krassen spoedig vast werd. Dit alkalo�dezout werdnbsp;omgekristalliseerd uit 96%-ige alcohol tot constante draaiing. Voornbsp;het cinchoninezout was dan [a]D'= 108�: voor het chininezoutnbsp;[ajo^-�104�. Hierna zijn de zouten ontleed door hen in eennbsp;weinig alcohol op te lossen en aan deze oplossing 2 n natrium-hydroxyde toe te voegen. De alkalo�den sloegen neer en werdennbsp;afgefiltreerd. Uit de oplossingen, die de natriumzouten der optischnbsp;actieve zuren bevatten, werden deze zelf door aanzuren met zoutzuur en uitschudden met aether vrijgemaakt. De zuren kunnen uitnbsp;benzol worden omgekristalliseerd en hebben de volgende physischenbsp;constanten: Smp. 138�, [uId respectievelijk �77� en 77�.

De vijf jaar oude praeparaten waren eenigszins verkleurd en hun smeltpunten ongeveer vier graden gedaald. Door eenige malennbsp;omkristalliseeren uit benzol konden de stoffen weer wit verkregennbsp;worden, terwijl dan ook smeltpunt en draaiing wederom de opgegeven waarden hadden.

CiiHii02N(191,21) Berekend; nbsp;nbsp;nbsp;69,83 % C.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;5,86 % H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;7,40nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;% N.

Gevonden: nbsp;nbsp;nbsp;( )zuurnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;70,09'%C.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;5,53 % H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;7,07nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;% N.

70,09'%C. nbsp;nbsp;nbsp;5,76 %H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;7,11nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;%N.

racemaat nbsp;nbsp;nbsp;69,75'%C.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;5,84 % H.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;7,21nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;% N.

Om na te gaan of de physiologische werkzaamheid van de stoffen in de loop der jaren constant was gebleven, zijn de antipoden ennbsp;het racemaat gedurende enkele weken aan de Auena-test onderworpen, waarbij wij de onderstaande gemiddelde activiteiten vonden:

(-) .. 1.1......

Het is gebleken, dat de gevoeligheid der nu gebruikte 21uena'kiemplantjes voor hetero-auxine 5 a 10 maal geringer is dan tijdens de onderzoekingen, dienbsp;ongeveer 5 jaar geleden in ons laboratorium zijn uitgevoerd. Daar ds komennbsp;vast te staan, dat we hier met niet te controleeren variaties in het planten-materiaal te doen hebben, zijn de AE in deze publicatie steeds betrokken opnbsp;hetero-auxine als standaard, waarbij 1 mg hetero-auxine een activiteit vannbsp;25 millioen AE is toegekend. Dit is in overeenstemming met de wijziging van denbsp;oorspronkelijke definitie van de AE, welke vroeger reeds noodzakelijk werdnbsp;door de dagelijksche variatie in de gevoeligheid van de planten.

GROEI OF TRANSPORT ?

A. Inleiding.

De eerste vraag, die wij ons stelden, was: �Is het waar, dat het verschil in activiteit van de beide antipoden van a-(jS'-indolyl)-propionzuur in de Anena-test berust op een verschillende mate vannbsp;deelnemen aan een of meer der reacties, die samen het celstrek-kingsproces vormen?�

Men zou geneigd zijn deze vraag bevestigend te beantwoorden, aangezien de kromming in de Aaena-test toch veroorzaakt wordtnbsp;door verschil in strekkingsgroei tusschen de zijde van het haver-coleoptiel, waar groeistof toegevoerd wordt, en de zijde waar zulksnbsp;niet geschiedt. Indien men deze redeneering volgt, neemt mennbsp;echter aan, dat de beide antipoden op dezelfde wijze en met dezelfde snelheid in het coleoptiel vervoerd worden naar de plaatsen,nbsp;waar ze hun werking uitoefenen. Dit behoeft a priori niet zoo tenbsp;zijn. Om nu tot een antwoord op de gestelde vraag te komen,nbsp;moest dus de groei onder invloed van de twee antipoden zoodanignbsp;worden nagegaan, dat eventueele transportverschillen onze resultaten niet kunnen vertroebelen. Hiertoe is de methode vannbsp;Bonner (1933) zeer geschikt, aangezien daarbij transport in denbsp;physiologische zin van het woord geheel uitgeschakeld is; de groeistof wordt toegediend op de plaats waar zij werkzaam is. De techniek van deze testmethode, zooals die door ons is toegepast, willennbsp;wij hier in het kort weergeven; zij is dezelfde als die, welke doornbsp;van Santen (1940) werd gebruikt.

B. Methodiek van de cylindertest.

van 23� en 92 % relatieve vochtigheid, zooals dat bij de W e n t-test gebruikelijk is. Wanneer zij precies 3 dagen oud zijn, worden coleoptielen van 16�20 mm lengte (gemeten van top tot meso-cotyl) af geknipt en van telkens 10 stuks tegelijk wordt, met behulpnbsp;van een coleoptiel-microtoom van van der W e y (1932) V/2 mmnbsp;uit de groeizone gesneden. We kozen hiervoor steeds de zone, dienbsp;6 tot 73^ mm onder de top ligt. De cylindertjes worden dan metnbsp;een fijn penseel van het scheermesje op een sliertje vaseline, aangebracht op een objectglas, gestreken, waarbij zorg gedragen moetnbsp;worden, dat zij zoo goed mogelijk evenwijdig aan het glas komennbsp;te liggen. Deze sliertjes kunnen het best gemaakt worden doornbsp;vaseline uit een tube met nauwe opening op de voorwerpglaasjesnbsp;te persen en deze dan een half uur in een droogstoof van 30� tenbsp;leggen, opdat de vaseline goed aan het glas hecht en de breedtenbsp;der sliertjes toch zoo klein mogelijk blijft. De objcctglaasjes metnbsp;de cylindertjes worden dan zoodanig in P e t r i-schalen met groei-stofoplossing gelegd, dat ze net geheel ondergedompeld zijn. Ondernbsp;een microscoop wordt dan telkens de lengte gemeten met eennbsp;oculairmicrometcr bij gebruik van een oranje lichtbron. Wanneernbsp;niet wordt gemeten blaast een fijne luchtstroom steeds verschenbsp;oplossing langs de cylindertjes. Bij deze behandeling wordt er voornbsp;gezorgd, dat het celvocht door diffusie van alle zijden snel denbsp;concentratie van de groeistofoplossing aanneemt en deze gedurendenbsp;de proef houdt (van Santen, 1938 en 1940).

Op boven beschreven wijze gingen wij nu de invloed op de groei na van het racemaat en de optische antipoden van onsnbsp;a-(jS'-indolyl) propionzuur in verschillende concentraties. Wenbsp;richtten onze proeven zoo in, dat we de lengte der cylindertjesnbsp;maten 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 en 24 uur na het dompelen in de oplossingen.nbsp;Op ��n dag vergeleken wij de groei in gedestilleerd water met dienbsp;in oplossingen, bevattende concentraties van respectievelijk 10^quot;*nbsp;(=100 mg per liter), 10��, 10��, '3^.10��, 10�'^ en 10�� aannbsp;een der te onderzoeken stoffen. Dit geschiedde, met het oog opnbsp;de variabiliteit van de test, tien maal voor elk der drie substanties,nbsp;zoodat de proeven zich uitstrekten over een tijdvak van enkelenbsp;maanden. De gemiddelde relatieve groei werd berekend en voor

iedere proefdag in een grafische voorstelling tegen de tijd uitgezet. De tien grafieken, die op dezelfde stof betrekking hadden en waarvan de curven slechts quantitatieve verschillen vertoonden, werdennbsp;wederom gemiddeld, zoodat er drie resulteerden (figuur 1, 2, 3),nbsp;elk met zeven lijnen (voor zes concentraties en voor gedestilleerdnbsp;water). Aangezien de drie lijnen voor gedestilleerd water nog enkelenbsp;procenten uit elkaar liepen moesten wij om de resultaten vergelijkbaar te maken, nog een correctie aanbrengen. Hiertoe middeldennbsp;we de lijnen voor gedestilleerd water en rekenden de andere opnbsp;de aldus verkregen standaard (tabel IV) om. Voor ieder punt kannbsp;deze bewerking aldus worden geformuleerd:

waarin A de relatieve groei na zekere tijd in een der groeistof-oplossingen en B die, na dezelfde tijd, in gedestilleerd water aangeeft.

De gecorrigeerde grafieken, die nu vergelijkbaar zijn, worden hierbij weergegeven. We zien er uit, dat de curven voor iederenbsp;concentratie in de drie figuren elkaar vrijwel dekken, zoodat wenbsp;de groeibevorderende werking der drie praeparaten, indien we metnbsp;de variabiliteit in het gedrag van ons proefobject rekening houden,nbsp;gelijk kunnen noemen. Aangezien een vergelijking van de figurennbsp;1, 2 en 3 misschien niet voor ieder even gemakkelijk is, hebben wijnbsp;de resultaten der proeven ook in tabel V samengevat, waarin de, bijnbsp;elke gebruikte concentratie behoorende, gecorrigeerde relatievenbsp;groei na ieder tijdsverloop voor de drie stoffen naast elkaar isnbsp;opgegeven. Zoowel uit de grafieken als uit tabel V is af te lezen,nbsp;dat een concentratie 10~^ slechts in het eerste uur groeibevorderendnbsp;werkt. Daarnaast treedt een schadelijke werking op, die bij hetnbsp;voortzetten der proef de overhand krijgt. Bij concentratie 10~�nbsp;zien we, dat de schadelijke invloed nog bestaat en zich manifesteertnbsp;in een vrij scherpe knik in de curven, nadat de groei gedurendenbsp;de eerste uren zeer groot is geweest; bij IQ�� is deze knik nauwelijksnbsp;en bij 3^ X 10�quot;� in het geheel niet meer merkbaar. De laatstenbsp;curve is de optimale. Kleinere concentraties geven dan ook krommen,nbsp;die over hun geheele lengte lager liggen.

Groei'tijd curven van cylindertjes uit Avena-coleoptielen (1 Va mm lang en 6'�7^ji mm van de top gesneden) in oplossingen van ( ) a-(/S'-indolyl)propionzuur (Gemiddelde

Groei-tijd curven van cylindertjes uit ^uena-copeoptielen (1 Va nim lang en 6�7 Va mm van de top gesneden) in oplossingen van (�) a-(/�'-indolyl)propionzuur (Gemiddelde

Groei'tijd curven van cylindertjes uit ^uena-coleoptielen mm lang en 6�7Vj mm van de top gesneden) in oplossingen van racemisch a-(/9''indoIyl)propionzuurnbsp;(Gemiddelde van 100 cylindertjes).

Gemiddelde groei in procenten van Avena-coleoptielcylindertjes in gedestilleerd water.

Gemiddelde groei in procenten van .Avena-coleoptielcylindertjes in verschillende concentraties ( ), (�) en racemisch a-(iS'-indolyl)proprionzuur na 1, 2, 3, 4,nbsp;5, 6 en 24 uur (omgerekend op de standaardproef in gedestilleerd water).

In figuur 4 is de groei na 24 uur uitgezet tegen de logarithme van de concentratie. Hier krijgen we dus optimum-krommen, dienbsp;elkaar vrijwel dekken en hun top bij ��6,3 hebben. Aan de hand

van deze figuur willen wij onze conclusie, dat de drie gebruikte stoffen even sterk groeibevorderend werken, nader toelichten, doornbsp;te discussieeren, hoe zij er uit zou zien, indien het ( )zuur 30 maalnbsp;zoo sterk werkzaam zou zijn als het (� )zuur, gelijk het resultaat vannbsp;de Avena-test deed vermoeden. We moeten dan met twee mogelijkheden rekening houden. In de eerste plaats kunnen de groeistof-werking en de schadelijke werking �gekoppelde factoren� zijn;nbsp;d.w.z. dat voor de gebruikte stoffen een groeibevorderende activiteitnbsp;van een bepaalde grootte steeds met een even groote schadelijkenbsp;werking gepaard gaat. Wanneer we dit aannemen, moet de curvenbsp;voor het ( )zuur zoodanig ten opzichte van die voor het (� )zuurnbsp;horizontaal naar links verschoven liggen, dat de overeenkomstigenbsp;punten een afstand 1,5 (= log. 30), langs de abscis gemeten.

uit elkaar liggen. Een tweede mogelijkheid is, dat de schadelijke werking bij gelijke concentraties voor de drie verschillendenbsp;substanties even groot is en dus onafhankelijk van de groei-bevorderende; dan kunnen de drie curven rechts van de top, waarnbsp;eerstgenoemde invloed overheerscht, elkaar benaderen en wel hetnbsp;dichtst bij de sterkste concentratie, maar moet de 30 maal sterkerenbsp;groeistofwerking links van de top tot uiting komen in een verschuiving als boven beschreven.

Aangezien echter de onderlinge spreiding der curven in figuur 4 veel kleiner is dan op grond van de twee hier besproken veronderstellingen verwacht kan worden en tevens van geheel andere aardnbsp;is � immers de lijn voor de (�jantipode ligt het hoogst � moetennbsp;we besluiten, dat de groeibevorderende activiteit van onze drienbsp;praeparaten gelijk is, maar hun transport in het coleoptiel' opnbsp;verschillende wijze wordt be�nvloed.

Interessant is ook een vergelijking van figuur 4 met de analoge, door vanSanten (1940, p. 63) voor yS-indolylazijnzuur bepaaldenbsp;curve. We zien dan, dat de thans onderzochte verbindingen in kleinenbsp;concentraties actiever zijn dan hetero-auxine, terwijl de krommennbsp;elkaar benaderen bij supra-optimale, waaruit blijkt, dat de schadelijke invloed in beide gevallen even groot is. De top is bijgevolgnbsp;voor hetero-auxine iets smaller en lager; tevens ligt hij bij eennbsp;ongeveer tweemaal zoo hooge concentratie, waaruit volgt, dat denbsp;groeibevorderende activiteit ook ongeveer de helft bedraagt vannbsp;die, welke ieder der drie soorten a-(j8'-indolyl)propionzuur bezitten,nbsp;In de Auena-test vinden we deze verhouding slechts terug tennbsp;opzichte van de ( )antipode, hetgeen ons tot de conclusie brengtnbsp;dat deze in het coleoptiel op dezelfde wijze getransporteerd wordtnbsp;als hetero-auxine, zoodat het (�)zuur de antipode is, die eennbsp;bijzonder gedrag vertoont op zijn weg uit het agar-agarblokje naarnbsp;de cellen, waar zijn werkzaamheid tot uiting kan komen.

Daar de activiteit van het racemaat het midden houdt tusschen die van ( ) en (�)zuur, zal zijn gedrag waarschijnlijk voortvloeien uit dat van de (�) bouwsteen in deze verbinding. Daaromnbsp;willen wij ons bij het verder onderzoek tot de beide optisch actievenbsp;stoffen beperken.

Als we nagaan, wat er met ons (�)zuur op zijn weg in het coleoptiel kan gebeuren om aanleiding te geven tot het bij denbsp;Afena-test waargenomen verschijnsel, dan zullen we een keusnbsp;moeten doen uit twee mogelijkheden.

Ten eerste kan een lateraal transport optreden, waardoor de groeistof ten deele weglekt naar de van het agarblokje afgekeerdenbsp;zijde van het coleoptiel. Het verschil aan groeistof in de beidenbsp;helften is dan kleiner met als resultaat een geringere kromming;nbsp;dit verschijnsel zou overeenkomen met hetgeen optreedt bij toedienen van te hooge groeistofconcentratie met dien verstande, datnbsp;nu niet een gewone diffusie maar een asymmetrische reactie in denbsp;plant er de oorzaak van is.

Het alternatief is, dat het basipetale transport van het (�jzuur op ongunstige wijze wordt be�nvloed, zoodat de groeizone niet, ofnbsp;althans in veel mindere mate, van groeistof wordt voorzien, dannbsp;bij toedienen van het ( ) zuur.

Een aanwijzing, dat de tweede veronderstelling juist is, hebben we in het feit, dat de kromming in de Apena-test, door denbsp;(�) antipode veroorzaakt, beperkt is tot de direct onder de topnbsp;gelegen zone, terwijl het (i jzuur het coleoptiel over veel grooterenbsp;lengte doet krommen (zie figuur 5).

Om echter tot een definitief bewijs te komen, zijn metingen gedaan van de rechte groei van gedecapiteerde havercoleoptielen,nbsp;die onmiddellijk na de decapitatie voorzien werden van agarblokjes,nbsp;gedrenkt in oplossingen van een van de beide antipoden. Daar denbsp;coleoptiel en nu aan alle zijden evenveel groeistof toegediend krijgen.

is lateraal transport uitgesloten. Wanneer derhalve de beide stoffen bij deze proef wederom een verschillende activiteit zouden vertoonen,nbsp;moet dit op rekening van ongelijk basipetaal transport worden geschreven: zou nu echter blijken, dat hun werkzaamheid even grootnbsp;is, dan moet tijdens de Auena-test een lateraal transport van denbsp;(�)antipode plaats vinden.

In de eerste jaren van het groeistofonderzoek was meting van rechte groei een door velen toegepaste methode, die op verschillendenbsp;manieren werd uitgevoerd. Thimann en Bonner (1933)nbsp;geven het principe aan, waarvan ook bij dit onderzoek gebruiknbsp;gemaakt is. Een korte samenvatting ervan, met de wijzigingen eropnbsp;aangebracht, moge hier volgen,

Kiemplanten van haver worden wederom op de gebruikelijke wijze in een donkere kamer van 23� en 92 % vochtigheid gekweekt.nbsp;Ze kunnen het best voor de proeven worden gebruikt, als zij drienbsp;dagen oud zijn; de coleoptielen, die een lengte van ongeveer dertignbsp;millimeter hebben, vertoonen dan namelijk volgens Koningsberger (1922) hun maximale groeisnelheid. Na een decapitatienbsp;van 3 mm wordt het primaire blad losgetrokken en geheel verwijderd: onmiddellijk daarop worden de stompen voorzien van agar-agarblokjes (2 X 2 X 0,45 mm), die tevoren in groeistofoplossingennbsp;gedrenkt zijn. Een rekje met aldus behandelde planten, geklemdnbsp;in een zware koperen houder, waarop ook een zinken bakje met

water staat, kan nu zoodanig over een slede heen en weer worden geschoven, dat de planten beurtelings een horizontaal opgesteldnbsp;microscoop passeeren. Met behulp van een geijkte oculairmicrometernbsp;kan, door herhaalde meting, de groeisnelheid worden bepaald. Denbsp;microscoop is in verticale richting verstelbaar, terwijl de afstand,nbsp;waarover zulks geschiedt, met ,een nonius in tienden van millimetersnbsp;kan worden afgelezen. Dit geeft de mogelijkheid de proeven tenbsp;kunnen voortzetten, ook al groeien de planten buiten de schaal-verdeeling van de micrometer. Het belangrijkste verschil tusschennbsp;de hier toegepaste techniek en die van Thimann en Bonnernbsp;is dus, dat laatstgenoemde auteurs een photografische registratienbsp;van de groei toepasten, terwijl thans microscopische aflezingennbsp;worden genoteerd.

Bij het onderzoek naar het gedrag van de beide antipoden van a-(j8'-indolyl)propionzuur maakten wij gebruik van een rekje metnbsp;24 planten, waarvan de helft met het ( )zuur, de andere helftnbsp;met het (�)zuur werd behandeld. De eerste aflezing kon 15 minutennbsp;na de decapitatie geschieden; daarna werd ieder kwartier de lengte-toeneming gemeten, totdat de proef 3 uur later afgebroken moestnbsp;worden wegens uitdrogen van de agarblokjes. Het bleek het nauwkeurigst steeds de plaats van het grensvlak tusschen coleoptiel ennbsp;agarblokje af te lezen.

Bij iedere proef gebruikten wij steeds dezelfde concentratie van beide zuren en constateerden in alle gevallen een sterkere groeinbsp;bij de planten, die met de ( )component waren behandeld. Hieruitnbsp;moet dus worden geconcludeerd, dat inderdaad een verschil in matenbsp;van basipetale transporteerbaarheid de oorzaak is van de verschillende activiteit in de Auena-test, hetgeen figuur 5 ons reedsnbsp;suggereerde. De resultaten van de proeven met concentraties 10~*,nbsp;10~'^,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;10�� en 10~^ alsmede met blanco-agar zijn in tabel VI

Vergelijken we het resultaat van de blanco proef met de waarden, die Thimann en Bonner (1933) vonden voor niet vannbsp;agar voorziene gedecapiteerde coleoptielen, dan zien we een goede

overeenstemming gedurende de eerste twee uur, tijdens welke we een vertraging van de groei door het verbruiken van de nognbsp;aanwezige groeistof waarnemen. Dan treedt echter bij denbsp;Amerikaansche onderzoekers een toenemen van de groeisnelheidnbsp;op tengevolge van regeneratie van groeistof, terwijl deze nu, althansnbsp;gedurende de eerste drie uren, achterwege blijft. Dit komt omdatnbsp;bij onze proeven agarblokjes zijn opgezet, die volgens S k o o gnbsp;(1937) regeneratie grootendeels tegengaan. G o r t e r�s (1927)nbsp;positieve krommingen in de Auena-test, welke bij gebruik vannbsp;blanco agar 2J/2nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;decapitatie optraden, berusten hier

eveneens op. De verklaring van het verschijnsel moet waarschijnlijk worden gezocht in het feit, dat acropetaal getransporteerde auxine-precursor in het agarblokje diffundeert en daar niet kan wordennbsp;geactiveerd.

Groeisnelheid van gedecapiteerde Argt;ena-coleoptielen (in mm per kwartier) na behandeling met verschillende concentraties ( ) en (�) �-(^'-indolyl)-propionzuur of met blanco-agar.

Bij het beoordeelen der getallen in tabel VI behoeven we derhalve geen rekening te houden met regeneratie; wel is het noodig denbsp;werking van de nog in de stomp aanwezige auxine in minderingnbsp;te brengen, indien men zich een juist beeld wil vormen van hetnbsp;effect, door de antipoden van onze, synthetische groeistof veroor-

zaakt. De aldus gecorrigeerde waarden zijn hier in twee grafische voorstellingen weergegeven (figuur 6 en 7).

De beteekenis van deze grafieken is aan de hand van de reeds eerder getrokken conclusie, n.1. dat de verschillende activiteit dernbsp;antipoden berust op een verschil in mate van basipetale transporteer-baarheid, gemakkelijk te verklaren.

In physiologische concentraties (10�� en 10��) bereikt het ( )zuur binnen een uur de groeizone, die bij de gebruikte plantennbsp;volgens Avery en Burkholder (1936) 6 tot 8 mm onder

de top, dus 3�5 mm onder het agarblokje, ligt. Dit gaat gepaard met een sterk toenemen van de groeisnelheid, welke bij verdernbsp;transport van de groeistof in de richting van de basis nog slechtsnbsp;in geringe mate stijgt. Bij gebruik van hoogere concentraties isnbsp;nauwelijks eenig verschil waarneembaar: groeistof is geen beperkende factor meer. Lagere concentraties (10~�) brengen eennbsp;kleinere transportintensiteit, hetgeen zich uit in een langzamernbsp;stij ging van de groeisnelheid ¹).

Het (�)zuur bereikt daarentegen de groeizone niet, in dien we het in physiologische concentraties toedienen. Het wordt boven innbsp;het coleoptiel door asymmetrische reactie geadsorbeerd. Derhalvenbsp;is de groeiversnelling klein. Terwijl hier verlaging van de concen-

Uit enkele afzonderlijke proeven bleek 10�� bij geen van beide antipoden eenige merkbare activiteit te hebben.

tratie dus geen groote invloed zal hebben, zien \ve, dat verhooging een duidelijke versnelling van de groei geeft. De groeizone wordtnbsp;nu wel bereikt. Bij 10^� dringt nog slechts weinig stof door; bijnbsp;10~'� zooveel, dat reeds gedurende het eerste uur een flink toenemennbsp;van de groeisnelheid te zien is.

De groeizone is steeds gepunteerd, terwijl door de pijlen aan weerszijden van het coleoptiel wordt aangegeven, over welke afstand ( ) en (�) zuur tijdens denbsp;proef worden getransporteerd.

Voor het ( )zuur, dat af gezien van een gering verbruik voor de groeireactie ongehinderd wordt getransporteerd, kunnen de begrippen transportsnelheid en transportintensiteit, zooals die doornbsp;van der Wey (1932) zijn gedefinieerd, worden toegepast.nbsp;De eerste grootheid is onafhankelijk van de concentratie, hetgeennbsp;Went en White (1939) bevestigden. Derhalve zijn denbsp;linker pijlen in figuur 8 even lang. De transportintensiteit neemtnbsp;daarentegen, tot een zeker maximum, toe met de concentratie,nbsp;zoodat er in geval c en b meer groeistof per tijdseenheid omlaagnbsp;wordt getransporteerd dan in geval a.

Schijnbaar in tegenspraak met de definities van van der W e y zijn de rechter pijlen ongelijk van lengte. Men bedenke echter dat,nbsp;wanneer een stof geadsorbeerd wordt, niet de snelheid van iedernbsp;molecule afzonderlijk een maat is voor de afstand, waarover dezenbsp;na een gegeven tijd doorgedrongen zal zijn. Voor een juist begripnbsp;diene de volgende vergelijking: Een colonne geniesoldaten marcheertnbsp;in constant marschtempo van A naar B. Bij iedere telegraafpaalnbsp;blijft er ��n staan ter verrichting van reparati�n. Op deze wijzenbsp;zullen er slechts soldaten in B arriveeren als de colonne meernbsp;menschen bevat dan er telegraafpalen langs de weg staan. Hoe

zwakker het contingent, des te verder blijft het van B verwijderd. Toch is de snelheid van iedere soldaat onafhankelijk van denbsp;numerieke sterkte van de troep. Zoo is ook in onze Avena-coleoptielen de snelheid van elk groeistofmolecule onafhankelijknbsp;van de concentratie; de transportintensiteit neemt in basale richtingnbsp;tot nul af en de afstand, waarover zulks geschiedt, wordt met toenemende concentratie grooter.

De �transporteerbaarheid�, welke term we ter vermijding van begripsverwarring invoerden, is het omgekeerde van het verval dernbsp;transportintensiteit.

We kunnen aan de hand van de genomen proeven niet be-oordeelen, of de adsorptie van het (� )zuur het transportmechanisme al dan niet blokkeert. Mocht zulks het geval zijn, dan is het, alsofnbsp;de achterblijvende soldaten van onze colonne niet rustig hunnbsp;reparatiewerkzaamheden verrichten, maar de telegraafpalen dwarsnbsp;over de weg laten vallen. Hun makkers kunnen dan niet langsnbsp;de normale route verder en worden tegengehouden. Wanneer hunnbsp;aantal groot is, worden ze echter van de weg afgedrongen en bereiken hun doel door de belendende weilanden.

Zoo kan ook voor het geval van een stopzetten van het physiologisch transportmechanisme verklaard worden, dat de groei-zone bij hooge concentraties toch bereikt wordt. Dit geschiedt dannbsp;op een abnormale manier, b.v. door diffusie.

Voor echter op dit probleem in te gaan hebben wij eerst getracht de juistheid der adsorptie-hypothese, waarop onze verklaring dernbsp;waargenomen verschijnselen voor een goed deel berust, nader tenbsp;toetsen.

A. nbsp;nbsp;nbsp;Inleiding.

We hebben aangenomen, dat de (�) component van a-(j8'-indo-lyljpropionzuur slecht door het coleoptielweefsel wordt getransporteerd, omdat het door een reactie met een der asymmetrische bestanddeelen van de cellen wordt vastgehouden. Het lijkt dan hetnbsp;meest waarschijnlijk, dat eiwitten, die vele asymmetrische koolstof-atomen bevatten, hiervoor aansprakelijk zijn. Koolhydraten ennbsp;lipo�den komen echter eveneens in aanmerking. We weten derhalvenbsp;ook niet, of de betreffende stof uit coleoptielen te extraheeren is,nbsp;of dat zij deel uitmaakt van de celwanden.

Om moeilijkheden van deze aard te omzeilen hebben we nagegaan, of een brij van coleoptielen in staat is om uit een oplossing vannbsp;(;�)a-(/8'-indolyl)propionzuur een merkbare hoeveelheid van dezenbsp;stof te binden.

B. nbsp;nbsp;nbsp;Methodiek.

Drie porties van elk 250 coleoptielen (4 dagen oud) werden in een mortier met een weinig kwartszand tot brij gewreven. Aan tweenbsp;porties werd 5 cm^ respectievelijk ( ) en (�) a-(jS'-indolyl)-propionzuur toegevoegd, waarna bij alle drie zooveel water werdnbsp;gedaan, dat de totale hoeveelheid water inclusief het plantenvochtnbsp;50 cm3 bedroeg. De concentratie is dan 10~''. De suspensies werdennbsp;bij daglicht twee uur aan zichzelf overgelaten en, na zoo goednbsp;mogelijk afcentrifugeeren van de brij, werd met de oplossingen eennbsp;cylindertest uitgevoerd. Eveneens werden met onbehandelde op

Is onze hypothese juist, dan moet de met brij behandelde ( jzuur-oplossing vrijwel dezelfde activiteit hebben als de controle.nbsp;Het (�^)zuur moet daarentegen practisch geheel gebonden zijnnbsp;door de brij, zoodat de curve voor het behandelde (�)zuur samennbsp;zal vallen met die voor water, tenzij het additieproduct weinignbsp;stabiel en in water oplosbaar is.

Dat van 250 coleoptielen voldoende effect mag worden verwacht, blijkt uit de volgende berekening;

Uit de Avena^test blijkt, dat 3 mm van een coleoptielhelft het (�)zuur uit 2 X 2 X 0,5 = 2 mm^, concentratie 10~�, bindt.nbsp;250 coleoptielen van 30 mm binden dus de groeistof uitnbsp;250 X 2 X 10 X 2 mm3 =10 cm3 van die concentratie. Dit komtnbsp;overeen met 100 cm3 van de concentratie 10~�'. Wij gebruiktennbsp;slechts 50 cm3 zoodat volledige adsorptie te verwachten is.

De eerste proeven mislukten door het gebruik van leidingwater voor de extracties en het verdunnen. Waarschijnlijk werken kleinenbsp;hoeveelheden hierin voorkomend koper toxisch op de test-cylin-dertjes, welke bijna geen groei vertoonden. Daarom is voor verderenbsp;proeven steeds gedestilleerd water gebruikt. Doch ook dan trad innbsp;de met brij behandelde oplossingen gisting en bederf op, gepaardnbsp;met uitvlokking van eiwitten. Deze bezwaren konden niet wordennbsp;ondervangen door de oplossingen voor de test eenige tijd op 80�nbsp;te verhitten. Wel ontstond bij die behandeling een neerslag, datnbsp;kon worden verwijderd, maar toch bedierven de oplossingen nognbsp;tijdens de test.

De methodiek is toen als volgt gewijzigd: Na afcentrifugeeren van de brij werd deze eenige malen uitgewasschen met water. Denbsp;vereenigde oplossingen werden een half uur op 80� verhit, wederomnbsp;gecentrifugeerd en daarna uitgeaetherd. De aether-extracten moesten worden gedroogd op natriumsulfaat, waarbij ontmenging vannbsp;ontstane emulsies plaats vond. Vervolgens werden zij in vacuo ingedampt na toevoegen van enkele cm3 water. Zoo kregen wijnbsp;tenslotte van de eventueel uitgeaetherde groeistoffen weer waterigenbsp;oplossingen, welke tot 50 cm3 werden aangevuld. Schadelijke stoffennbsp;bleken nu te zijn verdwenen. Zij zijn dus onoplosbaar in aether.nbsp;De toegepaste procedure brengt echter het gevaar mede, dat denbsp;aether de gebonden groeistof, indien deze niet met de brij of het

uitgeylokte neerslag is afgecentrifugeerd, weder vrijmaakt en oplost. Deze mogelijkheid moest nader worden beschouwd, indien zounbsp;blijken, dat de brij de activiteit van het (�)zuur in de cylindertestnbsp;niet be�nvloedt.

C. Proeven en resultaten.

Zes tests zijn uitgevoerd, waarbij de groei van 10 cylindertjes in met coleoptielbrij behandelde en onbehandelde oplossingen (conc.nbsp;10~^) van ( ) en (�) a-(/?'-indolyl)propionzuur alsmede in waternbsp;werd vergeleken. Tabel VII geeft de resultaten van deze proeven,nbsp;terwijl in figuur 9 de daaruit berekende gemiddelde groei van denbsp;cylindertjes na verschillende tijden kan worden afgelezen.

We zien nu in de eerste plaats, dat de twee curven voor gedestilleerd water samenvallen, waaruit volgt, dat de natieve auxine-a uit de coleoptielen ge�nactiveerd is of althans in zoo�n kleinenbsp;concentratie aanwezig is, dat de groeibevorderende werking geennbsp;effect sorteert. Verder zien we, dat de activiteit van de ( ) antipodenbsp;door de behandeling slechts in geringe mate be�nvloed wordt, terwijlnbsp;de (�)antipode, die onbehandeld even actief is als het ( )zuur,nbsp;na de behandeling een curve geeft, die nauwelijks van die voornbsp;gedestilleerd water verschilt.

D. Discussie.

De conclusie uit deze resultaten is, dat onze hypothese juist was. Het weefsel bevat een component, die wel het (�)zuur vasthoudt,nbsp;maar het (-f )zuur niet of bijna niet. Het lager liggen van de curvenbsp;voor de behandelde ( )antipode kan n.1. te wijten zijn aan denbsp;onmogelijkheid om de brij grondig uit te wasschen.

Wat de aard van de voor het verschijnsel verantwoordelijke asymmetrische weefselcomponent is, is moeilijk uit te maken. Eennbsp;lipo�dc stof lijkt onwaarschijnlijk, nu het aether-extract van de metnbsp;(�)zuur behandelde brij inactief bleek. Tusschen koolhydraten ennbsp;eiwitten is geen keuze te maken, terwijl natuurlijk ook nog anderenbsp;mogelijkheden kunnen bestaan.

Groei'tijd curven van Auena-coleoptielcylindertjes (I72 mm lang, nbsp;nbsp;nbsp;mm van

de top gesneden) in oplossingen van ( ) en (�) o-(/?'-indolyl)propionzuur (concentratie 10��), al dan niet behandeld met brij van 250 Awena-coleoptielen (Gemiddelde van 60 cylindertjes).

Deze vraag, welke wij reeds in de voorafgaande beschouwingen aanroerden, kon op grond van de tot dusver beschreven proevennbsp;nog niet worden beantwoord. Toen gebleken was, dat (�)nbsp;indolyljpropionzuur inderdaad boven in het At^ena-coleoptiel wordtnbsp;vastgehouden, hebben we getracht vast te stellen, of zulks gepaardnbsp;gaat met een beschadiging of blokkeering van het physiologischnbsp;transportmechanisme, Is dit het geval, dan zal een goed transporteer-bare groeistof, in physiologische concentratie toegediend, niet innbsp;staat zijn de groeizone te bereiken in een coleoptiel, dat eerst voorzien is van (�) a-(jS'-indolyl)proprionzuur. Op deze gevolgtrekkingnbsp;hebben we onze experimenten gebaseerd.

Kiemplantjes van haver kweekten we zooals dat voor de standaardtest te doen gebruikelijk is; toen ze ongeveer 90 uur oudnbsp;waren, werden zij gedecapiteerd, waarna de primaire bladeren geheel werden uitgetrokken. Deze bewaarden we in een Petri-schaal op vochtig filtreerpapier, waar zij zoodanig in rijen vannbsp;twaalf werden gerangschikt, dat hun volgorde correspondeerde metnbsp;die van de kiemplantjes, waaruit zij afkomstig waren. Anderhalfnbsp;uur na de eerste decapitatie volgde een tweede, waarna wij onmiddellijk agarblokjes met (�) a-(j8'-indolyl)propionzuur plat opnbsp;de stompen legden, zoodat het coleoptiel deze stof alzijdig toegediend kreeg. Parallelseries werden voorzien van agarblokjes metnbsp;de ( ) antipode of van blanco agar. Twee uur na deze behandelingnbsp;zijn de blokjes verwijderd en de primaire bladeren weer voorzichtignbsp;in de bijbehoorende coleoptielcylinders geschoven. Dan werden

nieuwe agarblokjes met een goed transporteerbare groeistof, waarvoor we jS-indolylazijnzuur en ( ) a-(|8'-indolyl)propionzuur kozen, eenzijdig opgezet. Wederom twee uur later werden de plantennbsp;gephotographeerd.

Indien het transportmechanisme door de voorbehandeling met (� )zuur ongunstig wordt be�nvloed, zal vervolgens toegediendenbsp;hetero-auxine of ( ) zuur in physiologische concentratie niet ofnbsp;minder goed worden getransporteerd. De coleoptielen zullen dannbsp;niet krommen of minder krommen dan de controles, die een voorbehandeling met ( ) zuur hebben ondergaan, mits dit in dezelfdenbsp;verdunning is toegediend als het (�)zuur.

Wordt het transportmechanisme daarentegen door (� )zuur niet aangetast, dan zullen de krommingen onafhankelijk van de voorbehandeling zijn. Eventueel kan zelfs de voorbehandeling metnbsp;( )zuur tot een kleinere kromming aanleiding geven, daar hetnbsp;mogelijk is, dat de planten, wanneer een zekere hoeveelheid groeistof over het geheele coleoptiel verdeeld is en zich dus ook in denbsp;groeizone bevindt, ongevoeliger zijn dan wanneer evenveel groeistofnbsp;in de uiterste top gebonden is,

De eerste veronderstelling brengt tevens mede, dat, indien planten, die met (� )zuur voorbehandeld zijn, krommen, hun krommingennbsp;veel geringer moeten zijn dan die van planten, welke een voorbehandeling met blanco agar ondergingen. Is echter de tweedenbsp;veronderstelling juist, dan zal dat verschil slechts klein mogen zijnnbsp;en geweten moeten worden aan een grootere gevoeligheid vannbsp;planten, die minder groeistof bevatten.

In tabel VIII vindt men de resultaten van proeven, waarbij de groeistoffen zoowel voor de alzijdige toevoer van de voorbehandeling, als voor de eenzijdige toevoer van de nabehandeling in eennbsp;concentratie van 0,1 mg per liter (10^^) werden gebruikt.

We kunnen uit deze tabel concludeeren, dat de voorbehandeling geen invloed heeft gehad op de werking van de daarna toegediendenbsp;groeistof. Hieruit volgt, dat het binden van het (� )zuur doornbsp;weefselbestanddeelen boven in het coleoptiel niet gepaard gaat metnbsp;een blokkeering of een beschadiging van het transportmechanisme.

Het verschijnsel, dat aan (�) �-(y�'-indolyljpropionzuur eigen is, heeft dus geen algemeene beteekenis. Tevens toont de tabel, datnbsp;een alzijdige groeistoftoevoer in een concentratie 10~^ geen merkbare invloed heeft op de gevoeligheid van de coleoptielen; immersnbsp;de kromming na voorbehandeling met blanco agar is niet grooternbsp;dan na de voorbehandeling met groeistof. Tenslotte willen wij nognbsp;opmerken, dat ook hier weer tot uitdrukking komt, dat ( ) a-(/J'-indolyljpropionzuur een dubbel zoo groote groeibevorderendenbsp;werking heeft ^Is ^-indolylazijnzuur.

E�n tegenwerping zou nog tegen onze conclusies kunnen worden gemaakt, n.1. dat de concentratie van het (�)zuur bij de voorbehandeling te klein is om een effectieve blokkade te verkrijgen.nbsp;Derhalve hebben we dezelfde proeven herhaald bij gebruik vannbsp;een 10 maal zoo groote groeistofconcentratie (10~'*) voor denbsp;alzijdige toevoer. Tabel IX toont hiervan het resultaat.

De waarden van deze tabel zijn minder nauwkeurig dan die van tabel VIII, omdat bij de alzijdige toevoer van deze hooge concentratie een minder goed contact tusschen coleoptiel en agar-agar opnbsp;een punt aanleiding tot een aanzienlijke kromming kan geven.

Desalniettemin kunnen we concludeeren, dat ook nu het (�)2uur geen invloed heeft op het transportmechanisme, omdat de voorbehandeling met (�) en ( )zuur tot vrijwel gelijke krommingennbsp;leidt. Het is natuurlijk niet te verwonderen, dat, nu zooveel groeistofnbsp;alzijdig toegevoerd is, de planten, waarbij zulks geschied is, mindernbsp;gevoelig zijn dan de blanco controles. Als het verschil tusschen denbsp;waarden 5,2 en 5,9 in de beide eerste kolommen van tabel IX re�elnbsp;is, kan dit op analoge wijze worden verklaard. Zooals reeds uiteengezet is, moet dan worden aangenomen, dat die planten in de testnbsp;het gevoeligst zijn, die speciaal in de groeizone het armst aannbsp;groeistof zijn.

Tenslotte zijn nog enkele proeven genomen, waarbij voor de nabehandeling auxine-a gebruikt werd; hiertoe hadden we de beschikking over een uit urine bereid praeparaat van een sterkte vannbsp;ongeveer 4 millioen AE per mg. Uit deze experimenten bleek, datnbsp;ook auxine-a bij het transport geen hinder ondervindt van voorafnbsp;toegediend (�) a-(j8'-indolyl)propionzuur.

HOOFDSTUK IX.

WORTELVORMING.

In verband met de resultaten, ten aanzien van de groei-bevorderende werking verkregen, kwam het ons interessant voor tevens na te gaan of de antipoden van a'(/8'-indolyl)propion2uurnbsp;een verschillende dan wel een even groote wortelvormende activiteitnbsp;vertoonen.

Het is immers door de onderzoekingen van T h i m a n n en Went (1934), K�gl (1935), Thimann en Koepflinbsp;(1935), Thimann (1935) en Haagen Smit en Wentnbsp;(1935) komen vast te staan, dat vrijwel alle stoffen, die als groeistof werkzaam zijn, tevens wortelvormende eigenschappen bezittennbsp;en dat het z.g. rhizocaline van Bouillenne en W ent (1939)nbsp;identiek is met natuurlijk auxine. Later heeft Went (1938)nbsp;waarschijnlijk gemaakt, dat nog andere specifieke factoren denbsp;wortelvorming be�nvloeden, terwijl hij (1939), mede op grond vannbsp;proeven van Cooper (1936, 1938), de groeistoffen gaat beschouwen als regulatoren en activatoren van het eigenlijkenbsp;phytohormoon van de wortelvorming, waarvoor hij wederom denbsp;naam rhizocaline kiest. Het zou te ver voeren hier nader op dezenbsp;hypothese in te gaan, temeer daar zij geen verband houdt metnbsp;hetgeen volgt.

De eenige quantitatief uitgewerkte methode, die de litteratuur voor het bepalen van de wortelvormende werking oplevert, is denbsp;erwtentest van Went (1934).

Hierbij wordt aan stekken van ge�tioleerde kiemplantjes van Pisum sativum groeistof apicaal toegediend. Vervolgens worden denbsp;stekken met hun basis eerst een week in saccharose-oplossing en

dan een week in water geplaatst. Na afloop van deze periode worden de wortels, die zich aan het basale einde gevormd hebben,nbsp;geteld. Het best geschiedt dit in dwarscoupes van de stengels, daar,nbsp;speciaal bij gebruik van hooge groeistofconcentraties, niet alle wortel-beginsels tot uitwendig zichtbare wortels uitgroeien. Het aantalnbsp;gevormde wortels per stek blijkt nu, binnen zekere grenzen, evenredig te zijn met d� gebezigde groeistofconcentratie. Voor /3-indolyl-azijnzuur bestaat deze proportionaliteit bij oplossingen sterker verdund dan 0,05 %.

Terwijl dus tijdens de hier weergegeven uitvoering van de erwtentest een polair basipetaal groeistoftransport optreedt, is hetnbsp;bij gebruik van �100 maal sterkere oplossingen mogelijk geblekennbsp;wortelvorming te verkrijgen op de plaats van toedienen (W ent,nbsp;1936). Zoo verkreeg Thimann (1935) dan ook wel wortelvorming aan de basis bij basaal toedienen van ;8-indenylazijnzuur,nbsp;welke stof in de erwtentest onwerkzaam is wegens zijn geringenbsp;transportsnelheid.

Daar nu, door de in de vorige hoofdstukken beschreven proeven, is komen vast te staan, dat de verschillende activiteit van (� ) ennbsp;(�) a-(j8'-indolyl)propionzuur in de Aaena-test wordt veroorzaakt,nbsp;doordat eerstgenoemde stof beter wordt getransporteerd, verwachtten wij een sterkere wortelvormende activiteit van het (�)zuurnbsp;bij apicale en een gelijke werkzaamheid der beide stoffen bij basalenbsp;behandeling der testplanten. Immers in het eerste geval zal transportnbsp;plaats moeten vinden; in het tweede geval is zulks niet noodig.

Het is echter niet mogelijk geweest deze veronderstelling proefondervindelijk te toetsen. De stekken der Ptsumsoorten, die als testmateriaal dienst moesten doen, beschimmelden of verrotten reedsnbsp;op de vierde of vijfde proefdag, hoewel alle voorzorgen werdennbsp;genomen om infectie tegen te gaan. Steriliseeren van oplossingennbsp;en glaswerk, noch ontsmetten der erwten leverden resultaat op,nbsp;zoodat van de erwt als testobject moest worden afgezien. Experimenten met Lupinus albus, die hoopvoller perspectieven openden,nbsp;konden nog niet worden uitgevoerd, wegens vertraging van denbsp;aanvoer der zaden uit Frankrijk.

Aangezien de wortelvormende werking van basaal toegediende groeistoffen door land- en tuinbouwkundigen tegenwoordig veelvuldig in praktijk wordt gebracht voor de beworteling van stekken

van velerlei planten, hebben we in de betreffende publicaties naar een andere testplant omgezien. Hoewel we nergens een quantitatiefnbsp;uitgewerkte test vinden, omdat de praktijk zich met qualitatievenbsp;en semi-quantitatieve methoden tevreden stelt, zijn er enkele opgaven, waaruit blijkt, dat ook bij gebruik van groene planten eennbsp;evenredigheid bestaat tusschen het aantal gevormde wortels en denbsp;gebezigde groeistofconcentratie. De totale lengte der wortels isnbsp;hiervan echter onafhankelijk. Van der Lek en Kr ij the (1940)nbsp;vinden dit b.v. voor Tsuga heterophylla en Bougainvillea glabra.nbsp;behandeld met indolylazijnzuur. Deze planten zijn als testobjectnbsp;niet wel bruikbaar, doordat ze moeilijk in groote hoeveelheid tenbsp;kweeken zijn en de test er mede eenige maanden duurt.

We hebben bij het onderhavige onderzoek onze toevlucht genomen tot de tomatentest van Hitchcock en Zimmermann (1938). Deze test is weliswaar, evenmin als de van tabaksplantennbsp;gebruik makende test van Hitchcock (1935), met een voldoende variatie van de groeistofconcentratie uitgevoerd om zekernbsp;te zijn van een evenredig verband tusschen het aantal gevormdenbsp;wortels en de sterkte van de gebruikte groeistofoplossingen, maarnbsp;biedt anderzijds verschillende voordeelen. De korte proef duur ennbsp;het gemakkelijk verkrijgen van voldoende materiaal zijn hiervan denbsp;belangrijkste. We hebben getracht bovengenoemde onzekerheidnbsp;zoo goed mogelijk uit onze resultaten te elimineeren door denbsp;experimenten met een groot aantal tomatenbladeren uit te voeren.nbsp;Dit moet noodzakelijk worden geacht met het oog op de grooterenbsp;variabiliteit van dit soort materiaal, vergeleken met onder standaardcondities gekweekte planten. Het is in dit verband jammer, datnbsp;Hitchcock en Zimmermann nergens aangeven op hoeveel waarnemingen hun resultaten zijn gebaseerd.

Daar zij evenmin een volledige beschrijving van hun techniek geven, volgt hier de methode, zooals die bij onze proeven isnbsp;toegepast.

Tomatenplanten (Lycopersicum esculentum) werden gedurende de zomer gekweekt in een onverwarmde broeikas. Voor de testnbsp;werden bladeren van 20�30 cm lengte geheel onder aan de blad-

steel afgeknipt. Dit zijn de jongste stevige bladeren boven aan de planten. Onmiddellijk na het afknippen werd het bladoppervlaknbsp;gereduceerd door verwijdering van het apicale einde van de bladsteel met drie blaadjes. De andere blaadjes werden loodrecht opnbsp;de middennerf gehalveerd. De aldus behandelde stekken zijn steedsnbsp;direct bij vier stuks tezamen in erlenmeyers van 50 cm^ inhoud,nbsp;die met 30 cm3 groeistofoplossing gevuld waren, geplaatst. Denbsp;erlenmeyers werden dan in een zinken bak gezet, welke met glazennbsp;platen afgedekt was. Na 24 uur werd de groeistofoplossing vervangen door leidingwater, terwijl de opstelling verder ongewijzigdnbsp;bleef. De geheele proef vond plaats in de broeikas. Indien mennbsp;zorg draagt, dat de bodem van de zinken bak steeds met een dunnbsp;laagje water bedekt is en tusschen de glazen platen openingennbsp;van Yi cm blijven, treedt geen verwelken van de bladeren op, tenzijnbsp;de proeven op bijzonder warme dagen plaats vinden.

Bij ori�nteerend werk bleek, dat het aantal zichtbare wortels tot de negende dag na het begin van de proef toenam en daarna nietnbsp;meer veranderde. Derhalve zijn de tellingen steeds op de negendenbsp;dag verricht. Aan de onbehandelde controles vertoonden de wortelsnbsp;zich het eerst en werden het langst.

Hoe grooter de gebruikte groeistofconcentratie was, des te korter bleven de wortels; dit is in overeenstemming met de resultaten vannbsp;van der Lek en Kr ij the (1940) bij verschillende houtigenbsp;stekken en van Went (1938) bij Pisum-kiemplanten. Laatstgenoemde auteur schrijft dit toe aan de remmende werking van groeistoffen op de lengtegroei van wortels.

De experimenten werden �s zomers uitgevoerd in een periode van voortdurend bedekte lucht. Iedere proefdag werden gelijkenbsp;aantallen stekken met ( ) en (�) a-(j8'-indolyl)propionzuur behandeld. Afhankelijk van het aantal beschikbare bladeren werdennbsp;per dag een of meer concentraties getest. Over de geheele periodenbsp;zijn de concentraties gevarieerd tusschen 10^�* en 10~�, terwijl naastnbsp;iedere proef controles van onbehandelde en met hetero-auxine behandelde stekken werden aangezet. De gedetailleerde resultatennbsp;vindt men in tabel X opgenomen.

In tabel XI zijn de op verschillende data verkregen waarden gecombineerd en is voor elke concentratie het gemiddelde aantal wortels per stek berekend.

Met de twee sterkste concentraties is slechts eenmaal gewerkt, omdat deze een toxische werking hebben. De bladstelen rotten dannbsp;geheel weg, wanneer ze met a-(;S'-indolyl)propionzuur werden behandeld, terwijl hetero-auxine nog onschadelijk is. Verder ziet mennbsp;uit de tabellen X en XI, dat, tegen de verwachting, ( ) en (� )zuurnbsp;een ongelijke activiteit vertoonen. Volgens tabel XI zou eerstgenoemde stof 5 maal zoo actief zijn als de tweede. Indien men echternbsp;de variaties tusschen de afzonderlijke proeven in tabel X beziet, isnbsp;het geenszins uitgesloten, dat ook hier het ( )zuur de dertigvoudigenbsp;activiteit van de (�) antipode heeft, temeer daar soms vrijwel allenbsp;wortels aan slechts een of twee van de vier stekken in eenzelfdenbsp;erlenmeyer ontstaan waren. Dit was speciaal daar, waar hetnbsp;(�)zuur veel wortels gevormd had, n.1. op 11 Juli bij concentratienbsp;10~� en op 24 Juli bij concentratie 2.10~�.

Dat het gevonden verschil tusschen de beide antipoden toegeschreven moet worden aan een ongelijke wortelvormende werking is onwaarschijnlijk. Immers tot dusver is steeds gevonden, dat, bij

uitsluiting van transportverschillen, groeibevorderende en wortel-vormende activiteit bij verschillende verbindingen evenredig zijn. Bovendien weten we uit het voorafgaande, dat de groeibevorderendenbsp;werking van de twee stoffen gelijk is.

Nu waren de met ( ) a-(jS'-indolyl)propionzuur behandelde stekken, wanneer de oplossingen sterker dan 2.10�� waren, over eennbsp;afstand van 5�8 cm beworteld, terwijl de met (�)zuur voorzienenbsp;bladeren (behoudens de twee genoemde uitzonderingen), evenalsnbsp;die met hetero-auxine, slechts aan de onderste centimeter wortelsnbsp;kregen. We mogen echter niet zeggen, dat dus ook hier hetzelfdenbsp;verschil in mate van transporteerbaarheid een rol speelt als bij denbsp;groeiproeven met .Auena-coleoptielen. Door W ent en W h i t enbsp;(1939) is n.1. wederom bevestigd, dat in laatstgenoemde geval hetnbsp;transport strict polair basipetaal is, zooals van der W e ynbsp;(1932, 1934) dit reeds eerder had gevonden.

Een en ander blijkt moeilijk verklaarbaar: grootere bekendheid met het mechanisme der wortelvorming in het algemeen en bijnbsp;groene stekken in het bijzonder zal in de toekomst mogelijk opheldering brengen. Thans kunnen we slechts een speculatievenbsp;hypothese geven: Beide antipoden worden in de transpiratiestroomnbsp;van de groene stek omhoog gevoerd. In de vaatbundels zal denbsp;concentratie van beide stoffen op gelijke hoogte even groot zijn.nbsp;Op hun weg van de vaatbundels naar de pericykel, waar zij hunnbsp;werking uitoefenen, wordt het (�)zuur door asymmetrische reactienbsp;sterker gebonden dan het ( )zuur, waardoor het laatste actievernbsp;schijnt. Terwijl het aantal gevormde wortels onderaan de stek, waarnbsp;ook groeistof door de epidermis en door het snijvlak naar denbsp;pericykel diffundeert, in beide gevallen vrijwel gelijk is, kan hetnbsp;( )zuur daarenboven nog wortels hooger aan de stengel vormen.

It has been investigated why ( )indole'3-2'-propionic acid has an activity in the Avena test, thirty times stronger than itsnbsp;(�) antipode.

The actual growth promoting activity was measured and proved to be equal for both compounds.

This has to be ascribed to an adsorption of the ( �)acid by an asymetrical reaction with a cell-constituent, possibly a protein, innbsp;the upper zones of the coleoptile, because it proved possible tonbsp;inactivate solutions of the acid by means of crushed Avena coleop-tiles. Neither the ( )acid nor hetero-auxin can be inactivated innbsp;the same way.

The adsorbed (�)indole-3-2'-propionic acid does not interfere with the mechanism of transport for other growth substances.

The adsorption, mentioned above can fully explain the different behaviour of the two antipodes in the Auena-test.

As transport velocity and transport intensity, as defined by van d e r W e y, cannot describe the differences in transportnbsp;discovered here, a new term: �transportability� was introduced.

Attention has also been paid to the root forming activity of the optical antipodes. A difference of the same order of magnitude asnbsp;found in the Avena-test was discovered. Only a highly speculativenbsp;explanation of this phenomenon can be given.

LITTERATUUROVERZICHT.

Avery, G. S. en P. R, Burkholder (1936), Bull. Torrey Bot. Club 63, 1. B 1 a a u w, A. H. (1918), Med. Landbouwhoogeschool 15, 89.

B o u i 11 e n n e, R. en F. W. Went (1939), Ann. Jard. bot. Buitenzorg 43, 25. Boysen Jensen, P. (1928), Planta 5, 464.

Gorter, C. J. (1927), Proc. Kon. Akad. Wet. Amsterdam 30, 728. Guttenberg, H. von (1932�1940), Wachstum und Bewegung. Fortschrittenbsp;der Botanik I�IX.

Ha a gen Smit, A. J. en F. W. Went (1935), Proc. Kon. Akad. Wet. Amsterdam 38, 852.

H e y n, A. N. J. (1935), Proc. Kon. Akad. Wet. Amsterdam 38, 1074. Hitchcock, A. E. (1935), Contrib. Boyce Thompson Inst. 7, 87.

L e k, H. A. A. van der en E. Krijthe (1940), Med. Landbouwhoogeschool 44, Verb. 7.

� h o 1 m, L. W. (1912), Meddel. fra. Vet. Acad. Nobelinst. 2, No. 3. Oppenoorth, W. F. F. (1939), Proc. Kon. Akad. Wet. Amsterdam 42, 902.

Santen, A. M. A. van (1938), Proc. Kon. Akad. Wet. Amsterdam 41, 513. -, (1940), Diss. Utrecht.

STELLINGEN

De door van Overbeek gegeven verklaring voor de photO' tropische gevoeligheid van Phycomyces is onjuist.

Reductie door zinkstofdestillatie van di-substitutieproducten van phenol geeft niet altijd een betrouwbare aanwijzing omtrent denbsp;plaats der substituenten ten opzichte van elkaar.

III

Uit de proeven van Avery en medewerkers moet de conclusie worden getrokken, dat auxine in verschillende toestanden in denbsp;cel voorkomt.

Het is aan twijfel onderhevig, of Kuhn en Morris vitamine-A uit /?'ionylideen-acetaldehyde hebben gesynthetiseerd.

Voor het onderzoek naar het verband tusschen deeltjesgrootte en concentratie bij AgJ-solen is een andere reeks oplossingen noodig,nbsp;dan Hermann heeft gebruikt.

De beteekenis van het door Warburg en N egelein bepaalde quantenrendement van de COg-assimilatie is door onderzoekingennbsp;van Emerson en Lewis aanvechtbaar geworden.

De onderzoekingen van Mali en Bersin pleiten voor de opvatting, dat bij lijders aan schizophrenic geen organische afwijkingen optreden.

T ..f *-. nbsp;nbsp;nbsp;*.'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;^ tnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ï »gt;ƒ?*gt;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;' J t^- t '

■gt;' nbsp;nbsp;nbsp;‘nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;. i' *nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;*.•',•■ :•. ■ •,'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;\r.».7«'^nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;■nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;..nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;■ ■'■■ - ■nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;■ 'U

Na uren	1	2	3	4	5	6	24
o/o groei	6,3	10,7	13,0	14,3	15,3	16,1	, 25,0

Tijd in	10-*			10-�			Vj X 10-		6
uren		�	R		�	�		�	R
1	6,4	.6,5	6,5	7,8	7,5	7,8	8,0	8,2	8,1
2	11,7	11,3	11,8	15,0	14,5	14,8	15,1	15,1	15,2
3	15,7	15,2	16,2	20,6	20,6	20,0	21,0	21,0	21,1
4	17,9	17,9	19,7	25,5	25,2	24,3	25,4	26,5	25,9
5	19,9	20,5	22,4	28,5	29,1	27,5	29,0	30,6	29.8
6	21,3	22,8	24,4	30,8	32,0	30,5	31,2	34,1	33,0
24	33,6	36,6	36,5	45,6	50,3	46,7	48,6	53,9	50,8

Tijd in	10-�			10-5			10-^
uren		�	R		�	R		�	R
1	8,8	8,4	9,5	10,9	11,5	11,1	12,1	9,6	10,4
2	15,9	16,1	17,3	19,0	19,0	18,8	12,3	9,3	10,4
3	21,3	21,1	23,2	23,4	24,4	23,0	8,3	5,7	6,7
4	25,5	25,8	27,1	25,8	27,6	25,8	5,5	3,8	4,6
5	28,2	30,0	30,0	27,3	29,8	27,9	4,2	2,9	3,7
6	30,1	33,2	32,3	28.3	31,3	29,2	3,7	2,7	3,4
24	45,4	52,0	47,1	37,4	39,6	38,0	3,0	2,0	2,8

Concentratie	10	�8	10	� 1	10	� 6	10	_5	10	�4	0
Tijd na decap. in kwartieren		�		�		�		� ,		�
2	14	14	21	19	21	17	22	18	24	22	15
3	10	9	23	20	18	14	23	14	21	18	9
4	8	8	20	14	19	13	23	12	20	21	5
5	8	8	16	9	20	13	21	13	22	17	4
6	9	8	17	9	18	10	23	12	19	17	4
7	10	9	16	9	21	9	22	14	23	17	3
8	12	10	16	8	22	11	25	14	21	15	3
9	14	10	17	7	25	11	24	15	21	17	2
10	16	11	18	7	25	12	25	15	21	17	3
11	16	10	18	8	22	11	25	15	22	18	2
12	16	10	18	9	24	11	25	15	23	19	1
13	17	9	17	8	24	11	24	14	24	18	1

Concentratie	Datum	Aantal stekken	Totaal aantal gevormde wortels in
Concentratie	Datum	Aantal stekken	( ) zuur	(�) zuur	hetero- auxine	water
10-�	11 Juli	4	0	0	50	10
5.10-^	23 Juli	4	0	0	40	0
10-*	9 Juli	4	149	15	3	8
	11	4	110	0	5	10
	H	4	53	8	47	0
	18	8	158	0	25	18
	25	4	23	0	27	5
5.10-�	15 Juli	12	173	21	3	0
	17	12	111	19	8	0
	24	8	35	2	29	1
	25	4	58	0	58	5
2.10-�	9 Juli	4	73	20	5	8
	24	4	129	77	18	1
	25	4	92	0	2	5
	29	4	44	6	9	1
io-�	9 Juli	4	29	37	22	8
	11	4	85	77	11	10
	14	8	77	42	101	0
	22	4	56	4	7	0
	29	4	70	2	1	1
5.10-�	28 Juli	12	111	45	35	12
2.10-�	28 Juli	12	63	23	21	2
		4	51	6	6	1
10-�	22 Juli	4	27	4	1	0
	28	12	31	14	7	4
	30	4	13	8	6	1
10-�	29 Juli	12	3	2	2	2

i2

1778 3758

DE AUXINE VAN EEN LICHTGEVOELIGE SCHIMMEL EN ONDERZOEKINGEN OVERnbsp;ANTIPODEN VAN EEN SYNTHETISCHE

GROEISTOF

INHOUD

DEEL 1.

OVER DE GROEISTOF VAN PHYCOMYCES BLAKESLEEANUS.

10

12

PROBLEEMSTELLING.

17

19

21

22

23

25

H. nbsp;nbsp;nbsp;Bepaling moleculairgewicht van dc niet met zuur te vernietigennbsp;groeistof.

I. nbsp;nbsp;nbsp;Physiologische proeven met de remanent actieve groeistof.

DE PHYSIOLOGISCHE WERKING VAN DE ANTIPODEN VAN a.(;8MNDOLYL)PROPIONZUUR.

% /

II II I

II 11 II

35

(-) .. 1.1......

GROEI OF TRANSPORT ?

A. Inleiding.

B. Methodiek van de cylindertest.

40

41

42

49

53

A. nbsp;nbsp;nbsp;Inleiding.

B. nbsp;nbsp;nbsp;Methodiek.

C. Proeven en resultaten.

D. Discussie.

57

60

61

HOOFDSTUK IX.

WORTELVORMING.

66

67

68

LITTERATUUROVERZICHT.

72

STELLINGEN

I

II

III

IV

V

q 4

ff*

P: »P pP-’‘ '

■,