TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VANnbsp;DEN RECTOR MAGNIFICUS L. VAN VUUREN,nbsp;HOOGLEERAAR IN DE FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJSBEGEERTE, VOLGENS BESLUITnbsp;VAN DE SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DEnbsp;BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WISEN NATUURKUNDE TE VERDEDIGEN OPnbsp;MAANDAG 23 NOVEMBER 1942,

GERRIT JOHANN MEINE VAN DER KERK

Bij de voltooiing van mijn proefschrift betuig ik U, Hoogleeraren, Oud-Hoogleeraren en Lectoren in de Faculteit der Wis- en Natuurkunde te Utrecht mijii groote dank voor de wetenschappelijke vorming, welke ik 'aan dezenbsp;Universiteit heb genoten.

In het bijzonder gaat daarbij mijn dank uit naar U, Hooggeleerde K � g l, Hooggeschatte Promotor. Ik heb het steeds als een bijzonder voorrecht beschouwd mij onder Uwe leerlingen te mogen tellen. Hoewel dit onderzoeknbsp;buiten Uw Laboratorium en niet onder Uwe directe leiding werd uitgevoerd,nbsp;hebt Gij er van de aanvang af in toegestemd als mijn Promotor op te tredennbsp;en mij bij het �verk ook meermalen Uw steun verleend. Dat Gij, ook toen hetnbsp;onderzoek een meer biophysische richting insloeg, bereid, waart Uwe toezeggingnbsp;gestand te doen, stemt mij tot groote erkentelijkheid.

Hooggeleerde M Hat z, met groote vreugde denk ik terug aan de gastvrijheid en vriendschap, die ik in het Physisch Laboratori^im heb mogen ondervinden. Voor Uwe critische belangstelling voor de meer physische gedeelten van mijn proefschrift betuig ik U mijn oprechte dank.

Dankbaar gedenk ik de leiding, welke Gij, Hooggeleerde Kluy v er, aanvankelijk tezamen met Professor Dr. L. S. Ornstein, naderhand onder moeilijke omstandigheden all��n, aan het onderzoek hebt gegeven. Ik acht hetnbsp;een groot voorrecht, dat ik in de afgeloopen jaren in zoo ruime mate vannbsp;Uwe veelzijdige kennis heb mogen profiteeren. Zeer erkentelijk ben ik U voornbsp;de warme belangstelling, tvelke Gij voor het tot stand komen van dit proefschrift hebt getoond en voor de vele tijd, ivelke Gij hieraan ten koste hebtnbsp;willen leggen.

Met groote iveemoed gedenk ik het verscheiden van Professor Ornstein op 20 Mei 19il.

Ik heb er naar gestreefd dit onderzoek, dat hij niet meer voltooid, heeft mogen zien, doch dat nog mede onder zijn leiding werd aangevangen, in zijnnbsp;geest voort te zetten en te be�indigen.

Dat het onderzoek tot een goed resultaat kon worden gebracht dank ik voor een belangrijk deel aan de groote medewerking, welke Mej. A. van dernbsp;Burg, ph�. docta, in het bijzonder wat betreft de\ uitwerking der physischenbsp;meetmethodieken, hierbij heeft willen verleenen. Maar ook de goede onderlingenbsp;verstandhouding en de geest van samenwerking, welke in de Biophysischenbsp;Researchgroep in zijn geheel steeds hebben geheerscht, zijn voor het welslagennbsp;van het tverk van veel beteekenis geweest. Ik stel er dan ook prijs op hier denbsp;namen te verm.elden van hen, die in het tijdvak, waarin ik hij de Biophysischenbsp;Researchgroep werkzaam ivas, hiervan eveneens gedurende kortere of langerenbsp;tijd deel uitmaakten: Dr. E. C. W as s ink. Mevr. Dr. L. E. W as sink-van Lumm el, Dr. Ir. K. L. van Schouwenburg, Dr. Ir. P. B. R o t-

tier, biologen, en Mej. A. van d e r B ur g, Dr. E. Kat z, Dr. F. Dorre-s t e in, Dr. J.A. H.Kersten en K. H.J.Bokhove, physici.

Voorts verzoek ik Mej. E. G. Pannebakker, analyste, en het personeel van het Physisch Laboratorium, van wie ik steeds de meest aangename medewerking mocht ondervinden, mijn dank te willen aanvaarden voor de innbsp;zoo ruime mate verleende technische hulp.

Tenslotte tuil ik niet nalaten aan de Directie van de Koninklijke Industrieele Maatschappij v.h. Noury en Van der Lande N.V. mijn erkentelijkheidnbsp;te betuigen voor de faciliteiten, mij bij de voorbereiding van dit proefschriftnbsp;verleend.

DE BESTAANDE INZICHTEN AANGAANDE DE AARD VAN HET BIOLUMINESCENTIE-PROCES EN VAN DE DAARBIJnbsp;BETROKKEN MOLECULEN.

� 2. Het chemisch onderzoek en de eigenschappen van luciferase en luciferine...................

HET VRAAGSTUK VAN DE AFSCHEIDING VAN HET LICHTGEVEND SYSTEEM UIT DE BACTERIECEL.

DE INVLOED VAN UITWENDIGE BESTRALING OP HET LICHTEND VERMOGEN VAN LICHTGEVENDE ORGANISMEN.

� 2. Bespreking van de principieele mogelijkheid om uit het bestra-lingseffect het absorptiespectrum van het lichtabsorbeerende

� 3. nbsp;nbsp;nbsp;Besprekingnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;vannbsp;nbsp;nbsp;nbsp;enkele overeenkomstige onderzoekingen uit de

DE SAMENHANG TUSSCHEN DE EXPERIMENTEEL VAST TE STELLEN PHOTOCHEMISCHE WERKING EN DE ABSORPTIECO�FFICI�NT VAN HET RECEPTORMOLECULE ....

DE DEFINITIEVE METHODE TER BEPALING VAN HET PHOTOCHEMISCHE INACTIVEERINGSSPECTRUM.

de bestraling en de berekening van de photochemische werking. 80 � 5. De meting van de spectrale energieverdeeling in het op denbsp;bacteriecultuur geworpen spectrum; berekening van de specifieke photochemische werking............87

der gebruikte plaatcultures op de nbsp;nbsp;nbsp;verrichte metingen ....nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;92

EENIGE OPMERKINGEN OVER DE MOLECULAIRE ABS�RP-TIE-CO�FFICIENT VAN DE PHOTO-GEVOELIGE STOF EN OVER HET QUANTENRENDEMENT VAN DE PHOTOCHEMISCHE REACTIE BIJ BESTRALING VAN PHOTOBACTERIUMnbsp;PHOSPHOREUM...................126

Meer dan een halve eeuw is thans verloopen sinds het tijdstip, waarop de Fransche physioloog Rapha�l Dubois door een fundamenteel belangrijkenbsp;proefneming de aard van het bioluminescentie-proces vaststelde. Doordat hijnbsp;het bewijs kon leveren, dat de lichtpreductie in sommige gevallen ook buitennbsp;het levende organisme � d.w.z. met behulp van daaraan ontleende praeparatennbsp;� kon verloopen, kwam vast te staan, dat de bioluminescentie in wezen eennbsp;chemoluminescentie is.

Ondanks het groote aantal onderzoekingen, dat hiermede werd ingeluid, is de vraag naar het chemisme van het bioluminescentie-proces evenwel nog allerminst volledig tot oplossing gebracht.

De Biophysische Researchgroep Utrecht-Delft, welke in 1935 onder leiding van Prof. Dr. L. S. O r n s t e i n en Prof. Dr. A. J. K1 u y v e r hare werkzaamheden aanving, heeft eveneens gemeend o.m. het vraagstuk van de stralings-emissie door de levende cel ter hand te moeten nemen. De indrukwekkendenbsp;luminescentie der lichtbacteri�n scheen haar hiervoor een bij uitstek gunstignbsp;studie-object op te leveren.

Toen schrijver van dit proefschrift tegen het einde van 1938 in de groep werd opgenomen, kreeg hij tot taak te trachten het vraagstuk dezer luminescentie langs meer direct chemische weg aan te vatten. Van de aanvang afnbsp;was het echter duidelijk, dat hieraan groote moeilijkheden waren verbonden,nbsp;in zooverre dat de rechtstreeksche isoleering van componenten van het lichtgevend systeem uit lichtbacteri�n nauwelijks uitvoerbaar schijnt, zoo lang mennbsp;er niet in is geslaagd het lichtemissie-proces dezer bacteri�n ook extracellulairnbsp;te doen verloopen. Hernieuwde pogingen om dit te bereiken, waren dus in denbsp;eerste plaats aangewezen.

Op grond van de resultaten van Eymers en van Schouwenburg (26, 28) scheen voorts een systematisch onderzoek naar de aard der fluores-ceerende bestanddeelen der lichtbacteri�n alsmede naar de beteekenis van lacto-flavine voor de lichtemissie gerechtvaardigd te zijn. Als onderdeel van ditnbsp;programma werd o.m. besloten tot de isoleering van het in de bacteri�n voorkomende flavine, waarvoor evenwel moest worden vastgesteld, dat dit identieknbsp;is met het in de levende natuur zoo algemeen verspreide lactoflavine. Hoewelnbsp;het overige, in samenwerking met eenige andere groepsleden, ondernomennbsp;onderzoek in deze richting wel tot eenige van belang zijnde resultaten leidde,nbsp;openden deze ten aanzien van het bioluminescentie-vraagstuk geen nieuwenbsp;perspectieven. Om deze reden zijn de bij dit onderzoek verkregen uitkomstennbsp;in dit proefschrift buiten beschouwing gebleven; zij zullen te zijner tijd eldersnbsp;worden gepubliceerd.

Inmiddels had zich evenwel een nieuw gezichtspunt voorgedaan, dat de mogelijkheid scheen te openen langs indirecte weg iets te leeren kennennbsp;aangaande de chemische aard van ��n der componenten van het lichtemit-teerend systeem der lichtbacteri�n. Door de groepsleden Mej. A. van dernbsp;B u r g en Dr. Ir. K. L. vanSchouwenburg was namelijk in 1939 terloopsnbsp;de waarneming gedaan, dat uitwendige bestraling een doovend effect heeftnbsp;op de lichtemissie der bacteri�n en tevens, dat dit effect duidelijk afhankelijknbsp;is van de kleur van het ingestraalde licht. In beginsel lag hierin de mogelijkheidnbsp;opgesloten te komen tot de vaststelling van het absorptiespectrum van eennbsp;photo-gevoelige component van het lichtemitteerend systeem.

Het grootste deel van dit proefschrift is nu gewijd aan een verslag over het in deze richting ingestelde onderzoek, dat dus gekenmerkt is door de zekernbsp;opmerkelijke omstandigheid, dat daarin de twee hoofdproblemen der radiobiologie, namelijk de emissie van straling door en de invloed van bestraling opnbsp;levende materie, gelijktijdig aan ��nzelfde organisme zijn bestudeerd.

HOOFDSTUK I.

INLEIDENDE OPMERKINGEN OVER HET VERSCHIJNSEL DER BIOLUMINESCENTIE.

Het verschijnsel, dat sommige levende wezens in staat zijn voor het men-schelijk oog waarneembare straling uit te zenden, is reeds van oudsher bekend in landen waar vuurvliegen en glimwormen voorkomen. De ontdekking, datnbsp;ook het lichten van de zee, van halfvergaan hout, van doode visch en vannbsp;vleesch aan levende wezens moet worden toegeschreven, is van veel laterenbsp;datum en valt ongeveer samen met de vervolmaking van het microscoop.

Bioluminescentie is minder zeldzaam dan men aanvankelijk geneigd is te denken; speciaal in de warmere landen wordt het veelvuldig waargenomen.nbsp;Harvey geeft in zijn monografie �The Nature of Animal Light� een overzicht van de lichtgevende organismen uit het planten- en dierenrijk, waarbijnbsp;het treft, dat in het dierenrijk het verschijnsel het meest en het grilligst isnbsp;verbreid.

Harvey typeert het voorkomen van lichtende vormen in de natuur als volgt 1) : �Apparently there is no rhyme or reason in the distribution ofnbsp;�luminescence throughout the plant or animal kingdom. It is as if the variousnbsp;�groups had been written on a blackboard and a handful of sand cast overnbsp;�the names. Where each grain of sand strikes, a luminous species appears. Thenbsp;�Coelenterates 2) have received most sand.�

Bij de planten beperkt zich het voorkomen van lichtende soorten tot enkele lagere vormen, alle behoorende tot de klassen'van de schimmels en de bacteri�n.

Bij de schimmels komen vrijwel uitsluitend onder de plaatzwammen lichtende soorten voor. De bekendste zijn wel Armillaria mellea, welke zwamnbsp;veelal verantwoordelijk is voor het lichten van hout, Clitocybe olearia ennbsp;Mycena polygramma.

De lichtende bacteri�n zijn vrijwel alle zoutwater- (of tenminste brakwater-) vormen. De meest bekende soorten zijn Photobacterium phosphoreum, Ph. Fischeri, Pk. splendidum en de als Vibrio Sonnenschein beschrevennbsp;zoetwatervorm.

Bij de tusschen de planten en de dieren in staande Dinoflagellaten komen lichtende Peridinee�n voor.

In de dierenwereld treft men zeer veel lichtende vormen aan, echter niet bij hoogere dieren dan de visschen. De volgende hoofdvormen en klassen tellennbsp;lichtende vertegenwoordigers:

De Protozo�n (oerdieren), o.a. Noct�uca m�iaris (de zeevonk), welke in onze streken de voornaamste bewerker van het lichten der zee is.

De Mollusken (weekdieren), o.a. de lichtende boormossel Pholas dactylus. De Crustacae�n (schaaldieren); hieronder worden zeer veel lichtendenbsp;vormen aangetroffen, waaronder de meest bekende en best bestudeerdenbsp;vorm, het lichtgevende kreeft je Cypridina h�gendorf�.

De Insecten; ook hieronder komen betrekkelijk veel lichtende vormen voor, o.a. de vuurvliegen (Pyrophorus, Lampyrus, Photinus en Photuris).nbsp;De Visschen; alleen onder de haaien en de beenvisschen. Bij de visschennbsp;komen veel lichtende vormen voor die niet zelf lichten, doch hun lichtendnbsp;vermogen danken aan symbiontisch aanwezige lichtbacteri�n.

Bij de schimmels en de bacteri�n is, voor zoover men heeft kunnen nagaan, het lichtend vermogen diffuus over de geheele cel verdeeld, terwijl het lichtnbsp;continu wordt uitgezonden. Men is er bij de plantaardige organismen nog nimmer in geslaagd het lichtemitteerend systeem van de celstructuur te scheiden.

Bij de lichtgevende organismen in het dierenrijk zijn, de photogene cellen doorgaans slechts op bepaalde plaatsen van het lichaam vereenigd tot lichtgevende organen en treedt bovendien het lichten dikwijls eerst na voorafgaande prikkeling, dus discontinu, op (bijv. bij de vuurvliegen). Bij enkelenbsp;dieren is de lichtproductie niet gebonden aan de celstructuur, doch vindt excretie van het luminesceerend systeem plaats.

DE BESTAANDE INZICHTEN AANGAANDE DE AARD VAN HET BIOLUMINESCENTIE-PROCES EN VAN DE DAARBIJ BETROKKEN

De vraag naar het chemisme van het bioluminescentie-proces is, ondanks ruim vijftig jaren onderzoek, tot dusverre niet tot oplossing gebracht. Eensdeels vindt dit ongettvijfeld zijn oorzaak in de moeilijkheid om een voldoendenbsp;hoeveelheid voor chemisch onderzoek geschikt uitgangsmateriaal ter beschikking te krijgen. Voorts is ook de instabiliteit in vitro van de stoffen, welkenbsp;bij de lichtemissie zijn betrokken, mede oorzaak van het betrekkelijk geringenbsp;succes, dat het chemisch onderzoek tot dusverre heeft opgeleverd.

De eenige groep van lichtgevende organismen, welke men zich in betrekkelijk groote hoeveelheden, kan verschaffen, vormen de lichtbacteri�n. Als uitgangsmateriaal voor het chemisch onderzoek naar de aard van de moleculen,nbsp;welke bij het bioluminescentie-proces zijn betrokken, zijn deze echter weinignbsp;geschikt, aangezien alle pogingen om het lichtgevend proces te scheiden vannbsp;de bacteriecel � een conditio sine qun^ non voor iedere rechtstreeksche studienbsp;van het chemisme van het luminescentie-proces � tot dusverre zijn mislukt.

Voor de bestudeering van de plaats van het lichtgevend proces in het celmetabolisme en voor het op indirecte wijze verkrijgen van een nader inzichtnbsp;in het verloop van de lichtemitteerende reactie vormen lichtbacteri�n daarentegen een zeer bruikbaar proefobject.

Gezien het feit, dat de tot dusverre verkregen ervaringen er op wijzen, dat in alle lichtgevende organismen het lichtgevend systeem uit overeenkomstigenbsp;bestanddeelen is opgebouwd, lijkt het ons minder gewenscht de besprekingnbsp;van het chemisme van het bioluminescentie-proces te splitsen in twee afzonderlijke gedeelten, waarvan het ��ne betrekking zou hebben op extracellulairenbsp;en het andere op intracellulaire luminescentie. Wij zien des te gereeder vannbsp;deze splitsing af, omdat over en weer de resultaten van de bestudeering dernbsp;extracellulaire en der intracellulaire luminescentie elkaar sterk hebben be�nvloed.

In 1667 toonde Boyle (12) aan, dat voor het optreden van biolumi-nescentie de aanwezigheid van lucht noodzakelijk is. Nadat de samenstelling van de lucht was bekend geworden, bleek het de zuurstof te zijn, die een essenti�elenbsp;rol in het bioluminescentie-proces speelt (zie o.a. Harvey (52)).

waarneming van de Reaumur (100) in 1723, dat het door een bepaalde mollusk afgescheiden lichtgevende slijm bij snel indrogen ophield met lichten,nbsp;doch dat het lichtend vermogen na bevochtiging met water weer terugkeerde.nbsp;Hetzelfde toonde Spallanzani (109) in 1794 aan voor een lichtende kwal.

Na deze twee fundamenteele ontdekkingen: de noodzakelijkheid van lucht (zuurstof) en van water voor het optreden van de bioluminescentie, duurdenbsp;het circa 150 jaar alvorens men weer een vondst deed, welke voor het begrijpennbsp;van het bioluminescentie-proces van beteekenis was.

In 1885 namelijk verrichtte Dubois (20) een uiterst belangrijke proef, waardoor hij het enzymatisch karakter van het bioluminescentie-proces rechtstreeks kon aantoonen. Hij bracht het lichtgevende orgaan van de vuurvliegnbsp;Pyrophorus noctilucus in heet water, het licht doofde tengevolge hiervan onmiddellijk uit; hierna werd het verkregen extract tot op kamertemperatuur afgekoeld. Vervolgens wreef hij een tweede lichtgevend orgaan in koud waternbsp;fijn, waarbij het lichten langzamerhand in intensiteit afnam en tenslotte geheelnbsp;ophield. Mengde hij nu tenslotte de twee bovengenoemde orgaanextracten, dannbsp;verkreeg hij opnieuw licht. Hetzelfde experiment voerde hij uit met het lichtgevend orgaan van de mossel Pholas dactylus, eveneens met positiefnbsp;resultaat (21).

In 1887 (22) gaf D u b oi s een verklaring van de waargenomen verschijnselen, die tot op de huidige dag ongeschokt stand heeft kunnen houden. Volgens Dubois bevindt zich in het heet water-extract een thermostabiele stof, doornbsp;hem luciferine genoemd, die onder lichtemissie kan worden geoxydeerd doornbsp;tusschenkomst van een enzym luciferase, dat thermolabiel is. De luciferasenbsp;bevindt zich, tezamen met luciferine in het koud water-extract; het luciferinenbsp;daarin wordt onder lichtemissie geoxydeerd, terwijl de luciferase in actievenbsp;vorm overblijft. Door extractie met heet water wordt de luciferase ge�nactiveerd en blijft daarentegen het luciferine onaangetast. Bij het mengen van denbsp;twee extracten treden luciferine en luciferase in actieve vorm samen metnbsp;zuurstof, hetgeen oxydatie van het luciferine onder lichtemissie tengevolgenbsp;heeft. Volgens Dubois katalyseert dus het enzym luciferase de oxydatie vannbsp;luciferine door moleculaire zuurstof; deze reactie vindt plaats onder lichtemissie.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;^

Deze klassieke proeven van Dubois werden nadien met vrijwel alle lichtende organismen herhaald, echter slechts in betrekkelijk weinig gevallennbsp;met positief resultaat.

Behalve met de vuurvlieg Pyrophorus noctilucus en de mossel Pholas dactylus, gelukte de luciferine-luciferase proef nog met andere vuurvliegennbsp;(40), met het schaaldier Cypridina hilgendorfii (43), met de worm Odonto-syllis (47) en met de visch Malacocephalus (61). Van de in totaal dertig anbsp;veertig lichtgevende dieren, welke door Harvey in dit opzicht werdennbsp;onderzocht, gelukte het slechts voor de bovengenoemde het enzymatisch karakter van het lichtgevend proces direct aan te toonen (47, 53).

De lichtende plantaardige organismen � bacteri�n en schimmels � hebben tot dusverre aan alle pogingen er lichtgevende celvrije preparaten uit te ver-

krijgen weerstand geboden, hoewel men zich speciaal wat de lichtbacteri�n betreft zeer veel moeite heeft gegeven. In hoofdstuk IV komen wij nader opnbsp;de in deze richting gedane onderzoekingen terug. Bij de lichtbacteri�n ontbreekt dus het directe bewijs voor het enzymatisch karakter van het lichtgevend proces. Dit neemt niet weg dat men, als resultaat van het aan de lichtbacteri�n verrichte onderzoek, toch algemeen aanneemt, dat het biolumines-centie-proces in lichtbacteri�n volkomen vergelijkbaar is met dat in organismen,nbsp;waarbij de luminescentie zich ook buiten de cel kan afspelen.

Een der eerste onderzoekingen, welke in dit opzicht duidelijke aanwijzingen gaven, was het onderzoek van Gerretsen (35), waarin deze o.a. de invloednbsp;van bestraling met ultraviolet licht op lichtbacteri�n naging.

Gerretsen onderwierp Ph. phosphoreum aan de inwerking van ultraviolette straling (van een kwiklamp) en toonde aan, dat door een bestraling van een pasnbsp;ge�nte gelatinecultuur van Ph. phosphoreum gedurende slechts twee minuten (op bepaalde afstand van de lamp) de ontwikkeling van koloni�n geheel werd voorkomen.nbsp;Blijkbaar hadden tengevolge van de bestraling alle aanvankelijk aanwezige lichtbacteri�nnbsp;hun reproductie-vermogen verloren.

Bij bestraling gedurende twintig minuten van een goed gegroeide en goed lichtende plaatcultuur van Ph. phosphoreum (op dezelfde afstand van de lamp als bij de eerstenbsp;proef) bleek, dat na afloop der bestraling de cultuur in geen enkel opzicht in lichtintensiteit was gedaald. Slechts langzamerhand nam de lichtintensiteit van het bestraalde cultuurgedeelte af, waarbij na zes a acht uur volledige uitdooving optrad.nbsp;Naastgelegen onbestraalde cultuurgedeelten zonden dan nog een helder licht uit.

Uit de vernietiging van het reproductie-vermogen na een bestralingstijd van twee minuten eenerzijds en de klaarblijkelijke ongevoeligheid van de lichtfunctie zelfs voornbsp;een bestralingstijd van twintig minuten anderzijds, concludeerde Gerretsen, datnbsp;men in de bestraling met ultra-violet licht een middel bezit, om bij volledig behoudnbsp;van de lichtfunctie de lichtbacteri�n van hun reproductie-vermogen te berooven. Hijnbsp;toonde tevens aan, dat deze werking slechts optreedt met straling van zeer kortenbsp;golflengte; glas, mica en zelfs een gelatinehuidje van 0.1 mm dikte hielden de actievenbsp;straling geheel tegen.

Door op de beschreven wijze een scheiding te bewerkstelligen tusschen het reproductie-vermogen en het lichtgevend vermogen en door aan te toonen, dat na de bestraling de lichtfunctie dezelfde gevoeligheid bezit voor temperatuurveranderingen als daarvoor, maakte hij het enzymatisch karakter van het lichtproces in de lichtbacteri�nnbsp;waarschijnlijk en wel concludeerde hij

Ie dat het ontstaan van een �Leuchtstoff� in de bacteriecel op een enzymatisch proces berust;

2e dat de oxydatie van deze �Leuchtstoff� eveneens geschiedt onder invloed van een enzym (een oxydase).

Latere onderzoekingen over het lichtemitteerend proces in lichtbacteri�n hebben geleid tot een nadere aanduiding van de plaats van dit proces temiddennbsp;der andere enzymatische celprocessen en hebben tevens bijgedragen tot verdieping van ons inzicht aangaande het mechanisme van de lichtgevende reactie.nbsp;De bespreking hiervan stellen wij echter uit tot hoofdstuk III.

Over de specificiteit van luciferine en luciferase loopen in de litteratuur de meeningen nogal uiteen. Dubois (21) geeft voor Pholas dactylus op.

dat het hieruit bereide luciferine-preparaat niet alleen licht geeft met Pholas-luciferase, doch tevens met koud water-extracten en bloed uit verschillende niet-lichtende organismen. Bovendien vond hij, dat Pkoias-luciferine door verschillende anorganische oxydantia onder lichtemissie kan worden ge�xydeerd.

Geheel afwijkend hiervan vindt Harvey (42, 53), dat Cypridina-luci-ferine slechts door tusschenkomst van Cypridina-hiciferase onder lichtemissie kan worden ge�xydeerd. Cypridina-luciferine en -luciferase zijn dus zeer specifiek op elkaar ingesteld. Ook waarnemingen van Harvey aan anderenbsp;lichtgevende organismen wijzen in de richting van een groote specificiteit.

Hoezeer wij thans ook gewend zijn juist bij enzymreacties een hooge specificiteit aan te treffen, toch trekken deze waarnemingen de aandacht,nbsp;doordat men geneigd is aan te nemen, dat de (laag-moleculaire) luciferinen vannbsp;alle lichtgevende organismen zoo al niet gelijk, dan toch zeker zeer nauwnbsp;verwant zullen zijn, zoodat men in deze eerder quantitatieve dan qualitatievenbsp;verschillen zou verwachten.

Intusschen gelukte het Harvey bij zeer verwante dieren met de luciferine- en de luciferase-preparaten bij combinatie over en weer licht tenbsp;krijgen (42). Hierbij deed hij de merkwaardige ontdekking, dat in zoo�n gevalnbsp;de kleur van het uitgezonden licht karakteristiek is voor het organisme, dat denbsp;luciferase heeft geleverd. Zoo vond hij bij combinatie van de luciferinen en denbsp;luciferasen uit de roodachtig lichtende vuurvlieg Photimis en de geelachtignbsp;lichtende vuurvlieg Photuris:

Photinus-Xuciferme X P/iotm^s-luciferase -Pliotmws-luciferine X P/^�o^^{ns-luciferase -Photuris-lnc�QYme X P/iotwis-luciferase -Photuris-lnciierme X P/iotm%s-luciferase -In 1924 (49) voerde Harvey dezelfde proef uit met twee nauw verwante lichtende kreeftjes (Cypridina en Cypripina) met overeenkomstig resultaat.

Aangezien het waarnemen van kleurverschillen bij kleine lichtintensiteiten zeer moeilijk is en onder deze omstandigheden intensiteitsverschillen op het oog de indruknbsp;kunnen wekken van kleurverschillen (P u r k i n j e-effect), heeft Harvey zijnnbsp;proeven met grootere luciferase-concentraties herhaald. Ook in dit geval vond hijnbsp;dezelfde kleurverschillen, zoodat hij concludeerde, dat het waargenomen verschijnselnbsp;re�el was.

Hoewel voor een juist inzicht inzake de vraag naar de specificiteit der uit verschillende organismen verkregen luciferinen en luciferasen een nieuw onderzoek zeker gewenscht is, lijkt het noodzakelijk op grond van de thans ternbsp;beschikking staande gegevens onderscheid te maken tusschen de luciferinennbsp;en luciferasen van verschillende herkomst. Op voorstel van Harvey plaatstnbsp;men voor het betreffende luciferine- of luciferase-preparaat de naam van hetnbsp;organisme waaruit het is verkregen. Indien wij evenwel in de hieronder volgende uiteenzetting spreken over luciferine en luciferase zonder meer, bedoelennbsp;wij hiermede steeds Cypridma-Xaciterme en Ci/przdma-luciferase, omdat het

chemisch onderzoek naar de aard van het luminescentie-proces en -van de moleculen, welke erbij zijn betrokken, vrijwel uitsluitend is verricht aan hetnbsp;lichtende Japansche zeekreeftje Cypridina hilgendorfii.

Zooals reeds is opgemerkt, heeft Harvey juist bij Cypridina-luciferine en -luciferase een hooge mate van specificiteit gevonden. Aangezien wij geennbsp;ander luciferase-preparaat hadden dan dat, afkomstig van Cypridina, kon denbsp;specificiteit ten opzichte van luciferase niet worden geverifieerd. Wel echternbsp;kunnen wij de opgave van Harvey bevestigen, dat de oxydatie van luciferinenbsp;onder lichtemissie uitsluitend langs enzymatische weg is te realiseeren. Wijnbsp;hebben namelijk met geen enkel der gebruikelijke anorganische oxydatie-middelen, hetzij in neutraal, hetzij in alkalisch milieu, luciferine onder lichtemissie kunnen oxydeeren.

Van de twee componenten van het lichtgevend systeem � de luciferase en het luciferine � is luciferine verreweg het beste bestudeerd. Dit behoeftnbsp;geen verwondering te wekken, aangezien weldra bleek, dat luciferase eiwit-natuur bezit, terwijl luciferine als dialyseerbare stof tot de laag-moleculairenbsp;verbindingen moest worden gerekend en een onderzoek hiervan dus chemischnbsp;de beste kansen bood. Men heeft zich dan ook voornamelijk toegelegd op denbsp;isoleering in zuivere toestand van luciferine en het vaststellen van zijnnbsp;chemische structuur, waarbij echter tot op heden noch het ��n, noch het andernbsp;volledig met succes is bekroond.

Luciferase, het enzym dat de oxydatie van de laag-moleculaire stof luciferine door moleculaire zuurstof katalyseert, wordt door verwarming gedenatureerd, dialyseert niet, is oplosbaar in water, verdunde zout-, zuur- en alkali-oplossingen, is onoplosbaar in organische oplosmiddelen en wordt door trypsine aangetast. Het bezit dus geheel het karakter van een eiwit en als zoodanignbsp;van een albumine.

Dubois rekende luciferase enzymatisch tot de oxydasen, omdat luciferase-preparaten in staat zijn de voor oxydasen karakteristieke oxydaties van guajac, p-phenyleendiamine en andere, uit te voeren. Terecht merkte Harvey echter op, dat de met onzuivere luciferase-preparaten verrichte proeven yan Dubois geenszins bewijzend zijn; oxydasen komen zeer algemeen voor en hun aanwezigheid in eennbsp;onzuiver luciferase-preparaat moet niet uitgesloten worden geacht.

Ook systematisch lijkt ons de kenschetsing van luciferase als een oxydase, welke overigens algemeen wordt aanvaard (2, 11, 95), niet juist. Weliswaar vormt moleculaire zuurstof de specifieke acceptor en is geen enkel ander oxydatiemiddel in staatnbsp;de oxydatie van luciferine bij aanwezigheid van luciferase onder lichtemissienbsp;te doen verloopen, doch anderzijds mist luciferase de voor oxydasen karakteristiekenbsp;gevoeligheid voor sporen HCN. De lichtreactie is n.1. niet gevoelig voor HCN-concen-traties, die sterk remmend werken op de ademhaling. Hieruit kan met vrij groote zekerheid worden afgeleid, dat het luciferase-molecule g��n zwaar metaal bevat (zooals b.v.

voor het fermenthaemine van Warburg, de polyphenoloxydase van Kubowitz en andere oxydasen is aangetoond). In het door Oppenheimer (95) gegevennbsp;systeem van enzym-classificeering behoort luciferase dan te worden geplaatst tusschennbsp;de dehydrogenasen en de oxydasen in de klasse der oxhydrasen, waarvan de gemeenschappelijke kenmerken zijn: substraat-specifieke, dehydrogeneerende enzymen, welkenbsp;waarschijnlijk metaalvrij zijn (zij zijn ongevoelig voor HCN, CO en dergelijke metaal-giften); de acceptorspecificiteit bepaalt zich uitsluitend of vrijwel uitsluitend totnbsp;moleculaire zuurstof.

Met de zuivering van luciferase heeft men tot dusverre slechts geringe vorderingen gemaakt. Een ruwe luciferase-oplossing verkrijgt men doornbsp;Cypridina-Tpoeder met koud water te extraheeren en nadat het extract is uitgelicht de onoplosbare bestanddeelen door filtratie of centrifugatie af te scheiden. Voor de verdere zuivering van deze ruwe enzym-oplossingen zijn 'denbsp;volgende methoden toegepast:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey (45) precipiteerde de luciferase, tezamen met andere prote�nen, door verzadiging van de oplossing met ammoniumsulfaat. Na oplossennbsp;van het neerslag in water, werden de laag-moleculaire bestanddeelen doornbsp;dialyse verwijderd.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Kanda (69) voegde aan de ongezuiverde luciferase-oplossing eennbsp;2 %-ige oplossing van sublimaat toe, totdat zich geen neerslag meer vormde.nbsp;De luciferase bleef hierbij in het filtraat.

Hoewel ook het luciferine nog niet in zuivere toestand is verkregen, heeft men, vrijwel uitsluitend door de onderzoekingen van Harvey en zijn medewerkers, toch eenig inzicht verkregen in zijn chemische structuur.

Aanvankelijk meende Harvey luciferine tot de albumosen te moeten rekenen: het is oplosbaar in water en alcoholen, onoplosbaar in vetoplosmid-delen, het is dialyseerbaar en geeft positieve eiwitreacties. Zijn onderzoekingennbsp;waren echter verricht met ongezuiverde Cypridina-extracten en lieten bovengenoemde conclusie niet toe. In 1929 toonde Kan da (70) aan, dat luciferinenbsp;weliswaar niet met vetoplosmiddelen uit gedroogde Cypridina�s is te extraheeren, doch dat het na extractie met methanol uit vet-vrije gedroogde Cypri-dina�s w�l oplosbaar is in benzol. Hieruit leidde K a n d a af, dat luciferine eennbsp;phospholipoide zou zijn, een opvatting die naderhand door .i^nderson echternbsp;afdoende kon worden weerlegd. In 1932 deelde Kan da (71) mede, dat hijnbsp;erin was geslaagd een kristallijn luciferine-preparaat in handen te krijgen,nbsp;zonder echter verdere details te vermelden. In 1935 trok ilarvey (57) zijnnbsp;aanvankelijke opvatting omtrent de chemische natuur van luciferine weer in,nbsp;zonder nochtans in staat te zijn andere suggesties te doen.

De oudere onderzoekingen over de aard en de eigenschappen van luciferine hebben, zooals men uit het bovenstaande ziet, weinig positiefs opgeleverd. Tochnbsp;was H a r V e y tot ��n belangrijk inzicht gekomen en wel betreffende de wijze,nbsp;waarop het luciferine wordt geoxydeerd (44, 48). Hij merkte op, dat bij de

oxydatie van luciferine g��n afbraak van het luciferine-molecule plaats vindt, doch dat het oxydatieproduct, door hem oxyluciferine genoemd, slechts weinignbsp;van het oorspronkelijke luciferine kan verschillen, aangezien het met reductie-middelen gedeeltelijk weer in luciferine is terug te voeren. Harvey vondnbsp;later, dat luciferine, zoowel bij aanwezigheid als bij afwezigheid van luciferase,nbsp;door moleculaire zuurstof wordt geoxydeerd, in het eerste geval onder lichtemissie, in het tweede geval echter niet. Verder waren de meest uiteenloopendenbsp;oxydatiemiddelen in staat het luciferine, eveneens zonder lichtemissie, te oxy-deeren. In al deze gevallen nam Harvey ��n oxydatieproduct, het oxyluciferine, aan.

LH2 -h % O2 �gt; L -f- H2O

De tot dusverre beschreven pogingen om de chemische natuur van luciferine te benaderen waren verricht aan slechts weinig gezuiverde extracten. Eennbsp;groote stap voorwaarts beteekenden de onderzoekingen van Anderson. Dezenbsp;stelde opnieuw pogingen in het werk om luciferine in zuivere toestand tenbsp;isoleeren en bestudeerde nader de oxydatie van luciferine door moleculairenbsp;zuurstof, al of niet bij aanwezigheid van luciferase en door oxydatiemiddelen.

Eerst werkte Anderson echter een voor de isoleeringspogingen noodzakelijke betrouwbare quantitatieve test uit, waqrbij hij uitging van de waarneming van Stevens (110), dat de totale hoeveelheid uitgezonden licht evenredig is met de aanvankelijke hoeveelheid luciferine en slechts weinig afhangt van de hoeveelheid luciferase of de luciferase-concentratie. De photometrischenbsp;bepalingsmethode van Stevens was echter betrekkelijk onnauwkeurig ennbsp;bovendien tijdroovend.

Bij de door Anderson uitgewerkte testmethode (3) werd het licht opgevangen op een photocel en werd de veroorzaakte photostroom gebruiktnbsp;voor het opladen van een condensator. De eindlading hiervan werd bepaaldnbsp;met een electrometer volgens Lindemann en was een maat voor de totalenbsp;hoeveelheid licht, welke bij de reactie was uitgezonden.

Anderson bevestigde de resultaten van Stevens, dat, binnen de grenzen van bepaalde luciferine- en luciferase-concentraties, de totale hoeveelheid uitgezonden licht een directe maat is voor de bij het begin der reactienbsp;aanwezige hoeveelheid luciferine.

Het bleek echter, dat de totale hoeveelheid licht behalve van het aanvankelijk aanwezige luciferine, ook sterk afhankelijk was van uitwendige factoren, waarvan de belangrijkste zijn: de pH, de temperatuur en de zoutconcentratie

(speciaal de NaCl-concentratie) in de oplossing. Anderson verkreeg betrouwbare uitkomsten, door deze uitwendige factoren volkomen te standaar-diseeren.

De eerste isoleeringspogingen van Anderson berustten op de gedachte � welke ook reeds door Harvey (54, 58) experimenteel was getoetst �nbsp;te trachten niet het zeer autoxydabele luciferine te isoleeren, doch oxyluciferine.nbsp;Deze pogingen mislukten, aangezien het tegen de verwachting niet mogelijknbsp;bleek het oxyluciferine door middel van waterstof en fijn verdeeld platina ofnbsp;met natriumhydrosulfiet (Na2S204) weer met bevredigende opbrengst te redu-ceeren tot actief luciferine.

Meer succes had een poging luciferine om te zetten in derivaten, welke minder autoxydabei zijn dan luciferine zelf (4). Door inwerking van benzoyl-chloride of azijnzuuranhydride op een oplossing van luciferine in butanol ontstonden onder bepaalde voorwaarden derivaten, die aan deze eisch voldeden.nbsp;Uit de benzoyl-verbinding van luciferine kon met goede opbrengst door verwarming met verdund HCl het vrije luciferine worden terug verkregen.

De door Anderson uitgewerkte zuiveringsmethode verliep als volgt: gedroogde, fijn gemalen Cypridina�s werden, na voor-extractie met aether en benzol, bij gewone temperatuur in waterstof-atmosfeer ge�xtraheerd met methanol. Na filtratienbsp;en toevoeging van butanol werd de methanol in vacuum bij kamertemperatuur afgedestilleerd. Aan de butanol-oplossing voegde hij vervolgens benzoylchloride toe. Nanbsp;eenige tijd staan werd de overmaat benzoylchloride door wasschen met water ontleed.nbsp;Na opnemen van de butanol-oplossing in een overmaat water extraheerde hij het ben-zoylderivaat van luciferine met aether. Na verdamping van de aether werd de benzoyl-verbinding door verwarming met H m HCl in waterstof-atmosfeer verzeept. Nanbsp;extractie van het benzo�zuur en het butylbenzoaat met aether kon vervolgens het luciferine met butanol uit de HCl-oplossing worden ge�xtraheerd. De benzoyleering werdnbsp;hierna nog eens op dezelfde wijze uitgevoerd.

Met behulp van deze methode slaagde A n d er s o n erin luciferine-prepa-raten te verkrijgen, die een activiteit bezaten � 2000 maal zoo hoog als die van het Cypridina-'poeder, waarvan hij was uitgegaan. Dit zijn tevens de zuiverste preparaten, welke tot dusverre in de � mij toegankelijke � litteratuur zijnnbsp;beschreven.

Aan deze preparaten bestudeerde Anderson thans nader de chemische eigenschappen van luciferine (5). Hierbij bleek, dat na oxydatie van luciferinenbsp;met moleculaire zuurstof bij aanwezigheid van luciferase (de lichtreactie), toevoeging van reductiemiddelen (Na2S204 of Pt H2) slechts een zeer geringenbsp;terugvorming van actief, d.w.z. met luciferase -j- O2 lichtgevend, luciferine tennbsp;gevolge had.

Anderzijds oxydeerde hij luciferine met een aantal oxydatiemiddelen (o.a. cerisulfaat en kaliumferricyanide) waarbij een oxydatieproduct ontstond, datnbsp;met luciferase O2 geen licht meer gaf. Voegde hij nu echter na niet te langenbsp;tijd een der bovengenoemde reductiemiddelen toe en vervolgens O2, dan zondnbsp;het reactiemengsel weer licht uit in een mate, waaruit bleek, dat het oorspronkelijke luciferine voor het grootste deel in actieve toestand was terug gevormd.

Hiermede had Anderson het belangrijke feit ontdekt, dat in het luciferine-molecule twee gescheiden oxydatiemogelijkheden aanwezig zijn:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Een reversibele �donkere� oxydatie met Oo (bij afwezigheid van luci-ferase) of met oxydatiemiddelen;

2. nbsp;nbsp;nbsp;Een irreversibele lichtgevende oxydatie met O2 bij aanwezigheid vannbsp;luciferase.

Naar aanleiding hiervan stelde Anderson voor om de door Harvey ingevoerde naam oxyluciferine, welke voor beide oxydatieproducten was bedoeld, te laten vallen en het eindproduct van de reversibele oxydatie van luciferine geoxydeerd luci-ferine te noemen; voor het eindproduct van de irreversibele oxydatie stelde hij hetnbsp;geven van een naam uit, totdat de eigenschappen nader bekend zouden zijn.

Een belangwekkend door Anderson naar voren gebracht gezichtspunt is, dat luciferine, geheel af gezien van zijn specifieke activiteit in de lichtreactie,nbsp;met het geoxydeerde luciferine zou kunnen behooren tot de klasse der oxydo-reductie systemen, welke, zooals bekend is, een belangrijke rol spelen in hetnbsp;proces der biologische oxydatie. Wij zullen in het volgende hoofdstuk zien, datnbsp;dit gezichtspunt van Anderson speciaal voor de bestudeering van het biolu-minescentie-proces in lichtbacteri�n vruchtbaar is geweest.

Anderson putte uit het verrichte onderzoek ook nog een suggestie betreffende de chemische natuur van luciferine.

Uit de vorming van benzoyl- en acetylderivaten onder de beschreven omstandigheden volgt de aanwezigheid van actieve waterstof in het luciferine-molecule. Deze actieve waterstof kan gebonden zijn aan stikstof, zwavel of zuurstof. Anderson merkte op, dat de oxydatie en de reductie van luciferinenbsp;eenige punten van overeenkomst vertoont met die van zekere in de natuurnbsp;voorkomende sulfhydryl- en hydroxybenzolderivaten (Ball (7)). De oxydatie-reductiepotentiaal van het luciferine-systeem stemt nu bovendien vrijwel overeen met die van sommige poly-oxybenzolderivaten. Andersons onder-voorbehoud gegeven conclusie luidde dan ook, dat de aanwezigheid van een poly-oxybenzolstructuur in het luciferine-molecule mogelijk moet worden geacht.

In een recent onderzoek, eveneens uit de school van Harvey, hebben Chakravorly en Ballentine (14) een belangrijke vondst gedaan metnbsp;betrekking tot dat gedeelte van het luciferine-molecule, dat direct bij de luminescente oxydatie is betrokken.

Toepassing van ultra-microanalyse (31) op de meest gezuiverde luciferine-preparaten van Anderson (4) toonde slechts de aanwezigheid van koolstof, waterstof en zuurstof aan; de proeven op stikstof, zwavel, halogenen en aschnbsp;vielen alle negatief uit.

Uitgaande van de waarnemingen van Anderson betreffende de irreversibele oxydatie bij de lichtgevende reactie en de omstandigheden waaronder de benzoyleering plaats vindt, benevens van de door Giese en Chase (37)nbsp;gevonden irreversibele inactiveering van luciferine door blauwzuur, stelden zijnbsp;de hypothese op, dat luciferine een keto-hydroxy-groep (een ketol-groep) zounbsp;bevatten, die bij de lichtgevende reactie op de volgende wijze oxydatief zounbsp;worden afgebroken:

Zij maakten de aanwezigheid van een keto-groep bovendien nog waarschijnlijk door aan te toonen, dat door toevoeging van hydroxylamine-acetaat aan de luciferine-preparaten een microkristallijn neerslag ontstaat, dat inactiefnbsp;is ten opzichte van luciferase, doch dat na zure hydrolyse weer licht geeft metnbsp;dit enzym.

Chakravorly en Ballentine merkten op, dat indien hun hypothese juist was, zij uit in de lichtreactie geoxydeerd luciferine door de volgende serie reacties weer een actief luciferine-preparaat moesten terug krijgen:

Zij testten het reactieproduct, door na behandeling met H2S (als reductie-middel) luciferase toe te voegen en vervolgens lucht door te leiden. De test viel positief uit; de oplossing lichtte duidelijk op en het was hun blijkbaar gelukt,nbsp;door de beschreven reacties het luciferine, althans gedeeltelijk, te regenereeren.

Het resultaat van hun onderzoek en van de onderzoekingen van Anderson werd vastgelegd in de volgende schematische en partieele structuurformule voor luciferine:

De oxydatieve afbraak van B door O2 bij aanwezigheid van luciferase stelt de irreversibele lichtgevende oxydatie van luciferine voor:

Wegens gebrek aan uitgangsmateriaal � Cypridina hilgendorfii wctrdt slechts in Japan in voldoende hoeveelheid aangetroffen � stellen de auteurs zichnbsp;voor langs synthetische weg de genoemde resultaten te bevestigen en de completenbsp;structuur van luciferine te bepalen.

1) Hoewel dit door Chakravorly en Ballentine niet nadrukkelijk wordt opgemerkt, ligt het zeer voor de hand hierbij tevens oxydatie van de poly-phenol-groepeering aan te nemen.

Terwijl het vorig-e hoofdstuk in hoofdzaak was gewijd aan het verkregen inzicht in de chemische aard van luciferase en luciferine, zullen wij ons thansnbsp;bezig houden met de vraag, op welke wijze deze twee componenten metnbsp;elkaar reageeren en welk molecule uiteindelijk verantwoordelijk is voor denbsp;lichtemissie.

Achtereenvolgens zullen worden besproken de voorstelling, welke Harvey op grond van zijn oudere onderzoekingen aangaande het mechanisme van denbsp;lichtgevende reactie had ontwikkeld en de uitbreiding, welke deze voorstellingnbsp;door het onderzoek van de laatste jaren heeft ondergaan. Tenslotte volgt dannbsp;nog een critische beschouwing, waarbij wij, mede aan de hand van eenige eigennbsp;waarnemingen, nader zullen ingaan op de vraag, welk molecule voor de lichtemissie verantwoordelijk moet worden gesteld.

In tegenstelling met het onderzoek naar de chemische aard der stoffen, welke bij het bioluminescentie-proces zijn betrokken, heeft men bij de bestudee-ring van het mechanisme van de lichtgevende reactie vooral in de laatste tijdnbsp;veelal gebruik gemaakt van lichtbacteri�n als proefobject, hoewel men daarbijnbsp;toch geheel is uitgegaan van het inzicht, waartoe Harvey door bestudeeringnbsp;van het Cypridina luciferine-luciferase systeem was gekomen.

In dit verband herinneren wij er aan, hoe Harvey vond, dat slechts bij aanwezigheid van luciferase de oxydatie van luciferine door moleculaire zuurstof tot lichtemissie leidt. Harvey meende nu, dat weliswaar luciferinenbsp;het specifieke substraat vormt voor luciferase in de lichtgevende reactie, dochnbsp;dat de lichtemissie zelve door het luciferase-molecule geschiedt. Hij had hiervoor de volgende argumenten:

1. nbsp;nbsp;nbsp;oxydatie van luciferine bij afwezigheid van luciferase leidt niet totnbsp;lichtemissie;

2. nbsp;nbsp;nbsp;bij kruisingsproeven met luciferinen en luciferasen van verwante organismen (zie � 1 van hoofdstuk II) bepaalt de herkomst van de luciferasenbsp;de kleur van het ge�mitteerde licht.

Volgens de huidige physische opvattingen wordt de emissie van licht veroorzaakt, doordat een molecule, hetwelk op ��n of andere wijze in de aangeslagen toestand is geraakt, onder emissie van een quant zijn overmaat energie weer afgeeft.

Voor het verkrijgen van een inzicht in de luminescente reactie tusschen luciferine, luciferase en zuurstof zijn de volgende vragen van belang:

door welke oorzaak geraakt bij deze reactie een molecule in de aangeslagen toestand en welk molecule emitteert de straling?

Aangezien het optreden van het bioluminescentie-proces onafhankelijk is van voorafgaande uitwendige bestraling, moet de lichtemissie optreden, doordatnbsp;de bij een chemische reactie vrijkomende energie bij lage temperatuur via eennbsp;aangeslagen molecule als stralingsenergie wordt uitgezonden; men noemt ditnbsp;verschij nsel chemoluminescentie.

Dubois heeft reeds vroeg (22) de bioluminescentie herkend als een che-moluminescente oxydatie-reactie.

Theoretisch bestaan er nu nog twee mogelijkheden aangaande het molecule, dat uiteindelijk de straling emitteert; in de eerste plaats kan het zijn, dat hetnbsp;primair aangeslagen molecule zelf het lichtquant uitstraalt, doch in de tweedenbsp;plaats kan ook het primair aangeslagen molecule door botsing met een geheelnbsp;ander molecule dit laatste in de aangeslagen toestand en vervolgens tot luminescentie brengen.

Harvey meende nu om de onder 1 en 2 genoemde redenen, dat weliswaar het luciferine bij de oxydatie in de aangeslagen toestand zou ontstaan, dochnbsp;dat dit zijn aanslagenergie vervolgens zou af geven aan het luciferase-molecule,nbsp;waarop dit dan het lichtquant zou emitteeren.

In 1935 (57) preciseerde hij zijn voorstelling in het hieronder volgende reactie-schema:

Dit reactieschema is thans, zooals ook reeds door van Schouwenburg (106) werd betoogd, in verschillende opzichten onbevredigend:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Na de publicatie van dit schema is door de onderzoekingen van A n-d e r s o n en van Chakravorly en Ballentin e bekend geworden, dat de lichtgevende oxydatie van luciferine een minder eenvoudig verloop heeft, dan aanvankelijk door Harvey werd aangenomen.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Het van de normale reversibele oxydatie afwijkende verloop van denbsp;lichtgevende oxydatie van luciferine onder invloed van luciferase isnbsp;moeilijk te combineeren met de ondergeschikte rol, die het luciferase-molecule bij de eigenlijke oxydatiereactie (1) speelt.

3. nbsp;nbsp;nbsp;De argumenten, welke Harvey heeft voor zijn stelling, dat uiteindelijk de luciferase het lichtgevend molecule is (namelijk de op blz. 8nbsp;beschreven kruisingsproeven), zijn slechts zwak. Bovendien zijn er,nbsp;zooals wij reeds zagen, van andere lichtgevende organismen luciferinennbsp;bekend, die wel buiten aanwezigheid van luciferase door anorganischenbsp;oxydatiemiddelen onder lichtemissie kunnen worden geoxydeerd; ditnbsp;geldt bijvoorbeeld voor het P/ioias-luciferine (21).

De hierna te beschrijven onderzoekingen hebben geleid tot een wijziging van het primair door Harvey gegeven reactieschema, waardoor althans denbsp;onder 1 en 2 genoemde bezwaren konden worden opgeheven.

Zooals reeds is opgemerkt, heeft de studie van het bioluminescentie-proces der lichtbacteri�n krachtige indirecte argumenten opgeleverd voor de aanwezigheid daarin van een luciferine-luciferase systeem van overeenkomstige aard, alsnbsp;dat van de bekende extra-cellulaire luminescenties. Bovendien hebben dezenbsp;onderzoekingen ons inzicht verschaft in de vraag naar de plaats van de lichtgevende reactie in de stofwisseling der lichtbacteri�n.

Reeds sedert lange tijd vroeg men zich af, of het lichtgevend proces al of niet was verbonden met het ademhalingsproces der lichtbacteri�n, waarbij mennbsp;op grond van bepaalde experimenteele aanwijzingen eensdeels geneigd was eennbsp;dergelijk verband aan te nemen [Sachs (103), Beijerinck (10), Harvey (46), Johnson (65)], doch anderzijds een samenhang tusschen beidenbsp;processen van de hand wees [M o 1 i s c h (94), Harvey (56), Root (101),nbsp;Taylor (112), Shoup (108)].

De vroegere medewerkers van de Biophysische Researchgroep van Schouwenburg en Eymers (27, 106) hebben eenerzijds op grond vannbsp;de waarneming, dat toevoeging van een veradembaar substraat aan een sub-straatvrije suspensie van Ph. phosphoreum zoowel de ademhaling als de lichtemissie stimuleert, aannemelijk kunnen maken, dat ademhaling en lichtemissienbsp;van hetzelfde dehydrogeneerend systeem der bacteriecel afhankelijk zijn, dochnbsp;anderzijds door remmingsproeven met blauwzuur en aethylurethaan kunnen bewijzen, dat de lichtemitteerende reactie naast het sterk blauwzuur-gevoeligenbsp;deel der ademhaling (de haemine-ademhaling) een apart zuurstof verbruikendnbsp;proces is en dat deze processen om de zuurstof concurreeren.

Het totale zuurstofverbruik van Ph. phosphoreum kon � afgezien van een geringe voor blauwzuur niet gevoelige restademhaling � worden gesplitst innbsp;een haemine-ademhaling en een lichtademhaling, waarbij deze laatste nog weernbsp;in twee gedeelten uiteenviel, te weten, een zeer gering zuurstofverbruik directnbsp;behoorende bij de lichtemissie en een veel grooter zuurstofverbruik verbonden met een �donkere� reversibele oxydatie-reductie van het systeem luci-ferine/geoxydeerd luciferine.

Van Schouwenburg geeft dus aan luciferine de rol van waterstof-transporteur in het ademhalingssysteem der bacteriecel, welke opvatting hoofdzakelijk is gebaseerd op het inzicht, waartoe Anderson (5) was gekomen naar aanleiding van de door hem ontdekte twee oxydatie-mogelijkheden in hetnbsp;molecule van Cypridina-luciferme.

Een belangrijke consequentie, welke uit het genoemde reactieschema voortvloeit is, dat de maximale intensiteit van het bacterielicht niet door de hoeveelheid luciferine, doch door de capaciteit van de luciferase wordt bepaald.

afwijkende conclusie. Hij constateerde (66), dat een suspensie van pepton-vrij gewasschen cellen van Ph. Fischeri in fructose-bevattende phosphaatbuffer nanbsp;eenige uren aereeren � 90 % van zijn lichtintensiteit had verloren, doch datnbsp;gedurende die tijd de ademhaling vrijwel constant was gebleven.

Hij besloot, dat blijkbaar een essentieel constituens van het lichtemittee-rend systeem � mogelijkerwijs het luciferine � wordt verbruikt en veronderstelde, dat een uit zijn voedingsmedium gehaalde cel een bepaalde hoeveelheid luciferine bezit, welke in de loop van de tij d irreversibel in de lichtreactie wordtnbsp;geoxydeerd, terwijl de cel met behulp van koolhydraat all��n niet in staat is omnbsp;nieuw luciferine te synthetiseeren.

In een volgend onderzoek (67) gaf Johnson een nadere uitwerking van de genoemde veronderstelling.

Bij aereeren van twee suspensies van Ph. Fischeri, de ��n met, de ander zonder glucose, had de laatstq voortdurend een lagere lichtintensiteit dannbsp;de eerste. Werd na zekere tijd aan de laatste suspensie eveneens glucose toegevoegd, dan steeg zijn lichtintensiteit in korte tijd boven die van de eerste suspensie op dat moment. De totale hoeveelheid licht, welke van de aanvang afnbsp;gerekend, na eenige uren door de beide suspensies was uitgezonden, bleek echternbsp;ongeacht de verdeeling over de tijd dezelfde te zijn.

Johnson ziet de fructose, resp. de glucose als waterstofdonator voor de vorming van een stof, noodig voor de lichtemissie, waarvan het primairenbsp;substraat al in de cel aanwezig is. Als zoodanig neemt hij een molecule L aan,nbsp;dat met medewerking van het dehydrogeneerend systeem wordt gehydreerdnbsp;tot luciferine LHg. De lichtgevende reactie voert dan, naar analogie van denbsp;waarnemingen van Anderson bij Cypridina, tot een niet-reversibel geoxydeerd product, voorgesteld door L^.

(2)

Johnson heeft de opvatting, dat zoowel de totale hoeveelheid uitgezonden licht als de lichtintensiteit op ieder moment worden bepaald door de hoeveelheid luciferine en dat niet, zooals van Schouwenburg meende,nbsp;de lichtintensiteit door de capaciteit van de luciferase wordt bepaald.

Een door Johnson, van Schouwenburg en van der Burg (68) uitgevoerd onderzoek bracht een nadere uitwerking en verdieping van denbsp;beschreven reactieschema�s. Zij onderzochten aan suspensies van lichtbacteri�nnbsp;het verschijnsel van de �flash�, waaronder men verstaat de plotselinge zeernbsp;hooge lichtintensiteit � hooger dan de stationnaire lichtintensiteit bij onafgebroken aeratie � welke optreedt, indien zuurstof wordt toegevoerd aan eennbsp;suspensie, waarvan tengevolge van zuurstof-tekort het licht is uitgedoofd. Denbsp;lichtintensiteit bereikt na ca V2 sec. zijn maximale waarde, neemt vervolgensnbsp;exponentieel af, om na ongeveer 4 sec. zijn eindwaarde te hebben bereikt.

Ter verklaring namen zij aan, dat tijdens de anaerobiose een overmaat luciferine wordt opgehoopt; bij toevoeging van zuurstof uit zich dit in een hoo-

gere reactie-snelheid en dus in een hoogere lichtintensiteit dan in de station-naire toestand. Het bleek, dat de bij de �flash� uitgezonden extra hoeveelheid licht bij niet al te korte tijden � ca 10 a 20 sec. � onafhankelijk is van de tijdnbsp;van anaerobiose en dat dus de hoeveelheid opgehoopte luciferine snel een eindwaarde bereikt. Het optreden van de �flash� bewees tevens, dat luciferasenbsp;in de lichtreactie zeker niet altijd de beperkende factor is.

Vergelijking (1) geeft de functie weer, welke het dehydrogeneerend systeem van de cel in de lichtreactie speelt: een stof L, welke wij dehydro-lucifefine zullen noemen, wordt door de waterstofdonator XH2 gereduceerd totnbsp;luciferine LH2.

Volgens vergelijking (2) vormt luciferine een dissociabele verbinding met het luciferase-molecule A.

Volgens vergelijking (3) wordt daarna het complex A.LH2 door moleculaire zuurstof onder lichtemissie geoxydeerd. Hierbij ontstaat weer actieve luciferase en � volgens Anderson � het irreversibel geoxydeerde eindproduct Li van de lichtgevende reactie.

In vergelijking (2) ligt de mogelijkheid opgesloten, dat in bepaalde gevallen de capaciteit van de luciferase de beperkende factor voor de lichtintensiteit kan zijn.

Essentieel in het reactieschema van Johnson, van Schouwenburg en van der Burg is, dat slechts aan luciferase gebonden luciferine onder lichtemissie wordt geoxydeerd.

Chance, Harvey, Johnson en Millikan (15) waren in staat, eveneens door middel van �flash�-proeven, de door Johnson en zijn medewerkers in lichtbacteri�n waarschijnlijk gemaakte, v��r de lichtgevende oxydatienbsp;plaatsvindende, binding tusschen luciferine en luciferase, voor Cypridina-luciferine en -luciferase in vitro te bewijzen. Zij toonden namelijk aan, dat hetnbsp;lichten later optreedt, wanneer luciferine en luciferase eerst afzonderlijk metnbsp;zuurstof worden gemengd en daarna worden gecombineerd, dan wanneer luciferine en luciferase eerst ana�roob worden gemengd en vervolgens met zuurstof worden samengebracht.

Uit het kinetisch verloop van de �flash� viel verder af te leiden, dat de eigenlijke oxydatie-reactie nog weer uiteenvalt in twee gedeelten. Eerst ver-eenigt het complex A.LH2 zich zeer snel met zuurstof tot een geoxygeneerdnbsp;complex A.LH2.O dat dan vervolgens oxydatief uiteenvalt onder emissienbsp;van licht.

1) Harvey en medewerkers hebben hier een niet geheel correcte schrijfwijze gevolgd, aangezien zij hebben bedoeld, dat ��n molecule A. LH, zich bindt met een half

Zij stellen zich het schematisch verloop van het lichtgevend proces als volgt voor:

In het geval van de lichtbacteri�n zou aan de gegeven vergelijkingen dan nog de vergelijking

Door Schoepfle (104) bij verschillende temperaturen verrichtte �flash� proeven met Ph. Fischeri toonden, dat het door Harvey en medewerkersnbsp;voorgestelde verloop van de eigenlijke oxydatiereactie eveneens van toepassingnbsp;is op de bioluminescentie der lichtbacteri�n. Tot hetzelfde resultaat kwamnbsp;Schoepfle (105), door de invloed van het narcoticum veronal en het denbsp;ademhaling stimuleerende dinitrophenol op het kinetisch verloop van de �flash�nbsp;na te gaan.

Het zwakke punt van het gegeven reactieschema is ongetwijfeld de kwestie, welk molecule uiteindelijk verantwoordelijk moet worden gesteld voor de lichtemissie. In � 1 van dit hoofdstuk wezen wij er op, dat de desbetreffende, reedsnbsp;in het oorspronkelijke schema van Harvey aangenomen, voorstelling vatbaarnbsp;is voor critiek.

In de volgende paragraaf zal het reactieschema, wat dit punt betreft, aan een nadere beschouwing worden onderworpen.

� 3. Critischc beschouwing van de tot dusver gegeven reactieschema�s, in het bijzonder wat betreft de vraag naar het lichtemitteerende molecule.

Het schema van Johnson had het bezwaar, dat het de rol van luci-ferase volkomen in het midden liet; in het schema van Johnson, van Schouwenburg en van der Burg is er naar gestreefd dit bezwaarnbsp;te ondervangen door aan te nemen, dat LH2 en A zich tot een dissociabele mole-cuulverbinding A.LH2 kunnen vereenigen. All��n de oxydatie van het complexnbsp;A.LH2 zou tot lichtemissie leiden.

Er moet intusschen op worden gewezen, dat inj deze voorstelling een nadere specificatie van het lichtemitteerend molecule achterwege is gelaten.

In dit verband zij opgemerkt, dat in het schema van Johnson en zijn medewerkers weliswaar tot uitdrukking komt, dat de luciferase van zeer nabijnbsp;bij het lichtemitteerend proces is betrokken, doch dat Harvey zoowel in zijnnbsp;eerste als in zijn meest recente schema een stap verder is gegaan, door opnbsp;grond van de in � 1 van hoofdstuk II beschreven kruisingsproeven de luciferasenbsp;zelve als het lichtemitteerende molecule aan te wijzen.' In � 1 van dit hoofdstuknbsp;hebben wij echter betoogd, dat de voor deze extreme opvatting aangevoerdenbsp;argumenten geenszins afdoende zijn.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,

Een reactieschema, dat ook wat deze kwestie betreft in staat is een met de experimenteele gegevens in overeenstemming zijnde voorstelling te geven,nbsp;kunnen wij baseeren op het reactieschema van H a r v e y en zijn medewerkers,nbsp;door daarin de vergelijkingen (3) en (4) door de hierna af te leiden vergelijkingen te vervangen.

Wij gaan hierbij uit van de gedachte, dat bij de inwendige oxydatie van het complex A.LH2.O primair het complex A.L^ ontstaat en wel in aangeslagennbsp;toestand.

Vervolgens geeft het complex A.Li* onder emissie van straling zijn aan-slagenergie af:

Het complete schema, waarbij vergelijking (a) de functie van het dehydro-geneerend systeem ten dienste van de lichtemissie aangeeft, luidt dan:

Karakteristiek voor dit schema is, dat noch het luciferase-molecule, noch het irreversibel geoxydeerde luciferine-molecule afzonderlijk verantwoordelijknbsp;worden gesteld voor de lichtemissie, doch dat wordt aangenomen, dat het licht-quant door het aangeslagen complex A.Li* wordt ge�mitteerd.

Deze voorstelling geeft tevens een ongedwongen verklaring van de in � 1 van hoofdstuk II beschreven kruisingsproeven van Harvey.

Het is duidelijk, dat door de oxydatie van de complexen A1.LH2 en A2.LH2, waarin dus twee verschillende luciferase-moleculen Ai en A2 zijn aangenomennbsp;en waarbij resp. de complexen A^.Li* en A^.Li* ontstaan, de grootte van hetnbsp;uitgezonden quant mede door de aard van het betreffende luciferase-moleculenbsp;zal worden bepaald.

In dit verband moge worden gewezen op de verschuiving, welke het absorptie-en het fluorescentie-spectrum van een laag-moleculaire verbinding veelal vertoont, indien deze aan een boog-moleculaire stof, bijv. een dragereiwit, wordt gebonden. Hierbijnbsp;blijkt, dat de grootte van de verschuiving hoofdzakelijk door de aard van de betreffende hoog-moleculaire stof wordt bepaald.

Men vergelijke bijv. de onderzoekingen van Vermeulen, Was sink en Reman (113) en van Katz en Wassink (76) over de fluorescentie- ennbsp;absorptiespectra van chlorophyll-eiwit complexen.

1) Reeds Johnson (67) merkte op, dat het geenszins is uitgesloten, dat het molecule L^, hoewel het voor de lichtreactie zijn bruikbaarheid heeft verloren, nognbsp;een algemeene functie als waterstofoverdrager in de stofwisseling der lichtbacterie-celnbsp;zou bezitten.

De bovenbeschreven, op zuiver theoretische overwegingen gefundeerde, nadere uitwerking van het reactieschema van Harvey c.s. konden wij doornbsp;een eenvoudige proef nog aan waarschijnlijkheid doen winnen.

Harvey (46i)) had geconstateerd, dat een zekere hoeveelheid lucife-rase slechts van een bepaalde hoeveelheid luciferine de oxydatie onder lichtemissie katalyseert en besloot op grond hiervan, dat de luciferase bij deze reactie wordt verbruikt.

Het nader uitgewerkte reactieschema veroorlooft ons echter, dit verbruik van de luciferase slechts te zien als een reversibele inactiveering, door blok-keering van het luciferase-oppervlak door het oxydatieproduct L^.

Uit twee Cypridina�s bereidden wij, door fijnwrijven met koud water en filtreeren van het extract, 25 cm3 luciferase-oplossing. Door koken van 20 fijngewreven Cypridina�s met 10 cm3 water en filtreeren van het extract, werdnbsp;een geconcentreerde luciferine-oplossing verkregen.

Bij 1 cm3 luciferase-oplossing voegden wij 1 cm3 van de afgekoelde luciferine-oplossing,waarbij onmiddellijk een vrij intensief lichten optrad. Nadatnbsp;het mengsel was uitgelicht, werd een tweede cm3 luciferine-oplossing toegevoegd, enz., waarbij de intensiteit van het na iedere toevoeging optredende lichtnbsp;allengs minder werd.

Bij de zesde toevoeging van luciferine trad g��n lichten meer op, zoodat het geleek, of thans de luciferase was verbruikt.

Na nog een cm3 luciferine-oplossing te hebben toegevoegd, dialyseerden wij het mengsel gedurende 2 maal 24 uur in de ijskast tegen gedestilleerdnbsp;water; na 24 uur werd het water ververscht. Bij deze dialyse werd er voornbsp;gezorgd, dat het volumen van het reactiemengsel hetzelfde bleef.

Na be�indiging der dialyse brachten wij de oplossing weer op kamertemperatuur en voegden opnieuw 1 cm3 luciferine-oplossing toe. Onmiddellijk trad een vrij intensief lichten op, hetgeen bewees, dat de oplossing actievenbsp;luciferase bevatte.

Door deze proef is dus in hooge mate aannemelijk gemaakt, dat het door Harvey geconstateerde verbruik van luciferase slechts schijnbaar is en datnbsp;de luciferase-activiteit afneemt door blokkeering van het luciferase-oppervlaknbsp;door een laag-moleculair oxydatieproduct van luciferine.

De beschreven proef vormt een aanmerkelijke steun voor de realiteit van verg. (5) van het reactieschema en zoodoende tevens voor die van de geheelenbsp;door ons gegeven nadere uitwerking van het schema van Harvey c.s.

Resumeerende mogen wij vaststellen, dat het door gecombineerd onderzoek van de extra-cellulaire en de intra-cellulaire luminescenties mogelijk is geblekennbsp;een schema op te stellen voor het verloop van de lichtgevende reactie, dat opnbsp;alleszins bevredigende wijze met alle experimenteele gegevens overeenstemtnbsp;en dat ons tevens in staat stelt extra-cellulaire en intra-cellulaire luminescentienbsp;van uit ��n gezichtspunt te beschouwen.

HOOFDSTUK IV.

HET VRAAGSTUK VAN DE AFSCHEIDING VAN HET LICHTGEVEND SYSTEEM UIT DE BACTERIECEL.

Het directe chemische onderzoek van het bioluminescentie-proces in licht-bacteri�n staat of valt met de mogelijkheid om, hetzij het lichtgevend systeem in zijn geheel, hetzij ��n der componenten daarvan in actieve vorm af tenbsp;scheiden van de levende cel.

Zooals -wij in � 1 van hoofdstuk II reeds opmerkten, hebben evenwel alle tot dusverre beschreven pogingen om lichtende celvrije preparaten uit licht-bacteri�n te bereiden tot een negatief resultaat geleid.

Aangezien wij als uitgangsmateriaal voor ons onderzoek vrijwel uitsluitend de beschikking hadden over lichtbacteri�n, was het van belang desalnietteminnbsp;deze mogelijkheid nogmaals na te gaan.

De tot dit doel ondernomen proeven werden echter evenmin met succes bekroond. Achtereenvolgens geven wij een overzicht van de betreffende litteratuur en een korte beschrijving van de eigen proeven.

De mislukking van alle pogingen om het lichtemitteerend proces van de levende bacteriecel te scheiden, bracht reeds Beij erinck (8) in 1891 ertoenbsp;te besluiten, dat het lichten was gebonden aan het levende protoplasma ennbsp;gezien de onontbeerlijkheid van pepton voor de groei en het lichten van lichtbacteri�n sprak hij de meening uit, dat de lichtemissie optreedt bij de overgangnbsp;van de peptenen in �levende stof�, het protoplasma.

Macfadyan (91) trachtte het lichtend systeem van de levende cel te scheiden, door de lichtbacteri�n in vloeibare lucht te brengen. De cellen weerstonden een verblijf van zes uur bij � 190� C., zonder dat hun lichtintensiteit of hun reproductie-vermogen, nadat zij weer op gewone temperatuurnbsp;waren gebracht, in het minst was geschaad. Fijnwrijven bij � 190� C. voerdenbsp;niet alleen tot vernietiging der bacteriecellen, doch tevens tot het verlies vannbsp;het lichtgevend vermogen.

Het uitvoerigst hebben zich ook met dit onderdeel van het bioluminescentie-vraagstuk weer Harvey en zijn medewerkers bezig gehouden. Wij zien af van een bespreking van hun oudere publicaties (41, 59) en gaan alleen in opnbsp;het meest uitgebreide en tevens meest recente onderzoek van Korr (77).

K o r r onderwierp onder zorgvuldige uitsluiting van zuurstof drie verschillende soorten van lichtbacteri�n � een zoetwaterbacterie V. phosphorescens en twee zoutwatervormen nl. Achr. Fischeri en een niet nader gekarakteri-

seerde soort � aan diverse inwerkingen, waarbij de celstructuur volkomen verloren ging. Noch na cytolyse met behulp van vetoplosmiddelen of hypoto-nische oplossingen, noch na mechanisch fijnwrijven of na intensieve bestralingnbsp;met ultra-korte geluidsgolven, nam hij bij toelaten van zuurstof het optredennbsp;van licht waar.

Bij het nagaan van de vraag, welke functies van de cel door de genoemde inwerkingen verloren waren gegaan, vond K o r r, dat de verkregen preparaten nog slechts een zeer gering reductie-vermogen vertoonden t.o.v. methyleenblauw, doch datnbsp;de Nadi-test � de oxydatie van a-naphtol en dimethyl-p-phenyleendiamine tot indophe-nol, kenmerkend voor de indophenol-oxydase (het fermenthaemine van Warburg) �nbsp;positief uitvalt. Uit zijn proeven bleek dus, dat zijn preparaten vrijwel g��n dehydroge-nase-activiteit bezaten.

Volledigheidshalve moeten wij opmerken, dat er in de litteratuur ��n opgave is, waarin een positieve luciferine-luciferaseproef met preparaten uitnbsp;lichtbacteri�n is beschreven. Het betreft de in � 1 van hoofdstuk II reeds genoemde publicatie van Gerretsen uit 1920 (35). Gerretsen vermelddenbsp;hierin, dat de door hem, volgens de klassieke methode van Dubois (20),nbsp;uitgevoerde luciferine-luciferaseproef bij Ph. phosjphoreum negatief uitviel,nbsp;doch dat hij met preparaten uit Ph. javanense, een lichtbacterie welke op denbsp;gewone wijze van visch uit de Indische wateren was ge�soleerd, een zeer zwaknbsp;positief resultaat had verkregen.

Na Gerretsen hebben zich nog verscheidene onderzoekers aan het probleem van de verkrijging van extra-cellulaire luminescentie uit lichtbacteri�n gewijd (o.a. Harvey en Korr), echter zonder het gewenschtenbsp;resultaat.

Wij moeten dus, af gezien van de nog niet geverifieerde, incidenteele waarneming van Gerretsen aan Ph. javanense besluiten, dat het verkrijgen van lichtende, celvrije preparaten uit lichtbacteri�n tot dusverre niet is gelukt.

� 2. Eigen proeven tot het verkrijgen van lichtende preparaten uit lichtbacteri�n.

Wij hebben ons op het standpunt gesteld, dat het weinig zin had de recente en onder de meest zorgvuldige voorzorgsmaatregelen verrichte proeven vannbsp;Korr te herhalen en besloten, in navolging van Macfadyan (91), eennbsp;poging te doen om door behandeling van lichtbacteri�n met vloeibare lucht hetnbsp;lichtemitteerend systeem van de levende cel af te scheiden en wel om tweenbsp;redenen:

Ie de behandeling met vloeibare lucht moge wellicht groote structuurveranderingen teweeg brengen, voor chemische verandering behoeft men echter bij de temperatuur van vloeibare lucht nauwelijks bevreesdnbsp;te zijn;

2e de voor korte tijd door Lynen (90) verrichte stofwisselingsproeven met gist, welke met vloeibare lucht was behandeld, alsmede de doornbsp;genoemden onderzoeker daaraan verbonden beschouwingen, openden

ook voor het probleem van de extra-cellulaire luminescentie nieuwe gunstige perspectieven.

L y n e n bracht versche, aan substraten �verarmde�, gist in vloeibare lucht en vergeleek, nadat de gist weer op kamertemperatuur was gebracht, de ademhaling ennbsp;de gisting hiervan met die van onbehandelde, versche gist. Bij suspendeeren vannbsp;dezelfde hoeveelheden versche en bevroren gist in gelijke hoeveelheden water, blekennbsp;ademhaling en gisting van de bevroren gist zeer gering te zijn, vergeleken met die vannbsp;versche gist. Volgens L y n e n moest deze geringe activiteit van de bevroren gist nietnbsp;worden toegeschreven aan beschadiging van de enzymen zelve of aan beschadiging vannbsp;het enzymverband, doch aan de concentratieveranderingen, welke de afzonderlijkenbsp;componenten van het enzymsysteem in de reactieve phase hadden ondergaan. L y n e nnbsp;bewees zijn opvatting met de volgende proeven.

Bij centrifugeeren van de bevroren en weer op kamertemperatuur gebrachte gist kreeg hij een scheiding in twee lagen, nl. een geel gekleurde, zwak opalescente vloeistof en de vaste celbestanddeelen. De aldus verkregen celvloeistof kwam in haar enzymatische eigenschappen in groote trekken overeen met het perssap volgens Buchnernbsp;en met maceratiesap.

Bij het bevriezingsproces worden blijkbaar de celmembranen vernietigd, de natuurlijke permeabiliteitsomstandigheden worden verstoord en de oplosbare bestand-deelen van het enzymsysteem kunnen buiten het celverband treden.

L y n e n vond nu evenwel, dat indien men de bij het centrifugeeren verkregen vaste celbestanddeelen niet in water, doch in de genoemde celvloeistof suspendeerde,nbsp;waardoor dus als het ware oplosbare en onoplosbare celbestanddeelen weer vrijwel innbsp;hun natuurlijke concentraties naast elkander aanwezig waren, een systeem werd verkregen, waarvan de enzymatische activiteit volkomen op ��n lijn stond met die vannbsp;versche gist.

Het welslagen van L y n e n�s pogingen, door bevriezing een cel-desinte-gratie te bewerkstelligen met vrijwel volledig behoud van de enzymatische activiteit, is voor het door ons beschouwde probleem van zooveel belang, omdat bij de tot dusverre beschreven pogingen tot het verkrijgen van extra-cellulairenbsp;luminescentie uit lichtbacteri�n, met name ook bij de proeven van K o r r,nbsp;geen rekening werd gehouden met de bij vernietiging der cellen tegelijkertijdnbsp;optredende verdunning. K o r r toch voerde de in � 1 reeds genoemde cytolysennbsp;en de bestraling met ultra-korte geluidsgolven uit met suspensies van lichtbacteri�n, waarbij dus onmiddellijk na de destructie van de cel de daarin aanwezige oplosbare bestanddeelen een aanzienlijke verdunning ondergingen.

Geheel afgezien nog van de vraag, of K o r r er al of niet in is geslaagd luciferine en luciferase in actieve vorm af te scheiden van de bacteriecel, kannbsp;dus het mislukken van zijn pogingen om extra-cellulaire luminescentie uit lichtbacteri�n te verkrijgen, ook reeds worden verklaard vanuit het door Lynennbsp;naar voren gebrachte gezichtspunt.

Dit zou de oorzaak kunnen zijn, dat de door K o r r bereide cel vrije preparaten g��n of slechts een zeer geringe dehydrogenase-activiteit bezaten.

Aangezien nu de bevriezingsmethode volgens Lynen, in tegenstelling tot de door K o r r toegepaste destructie-methoden, in principe scheen te kunnennbsp;leiden tot een zoodanige desintegratie van het celverband, dat daarbij de enzymatische activiteit blijft behouden, leken de kansen op een positief resultaat geenszins denkbeeldig.

De voor de proeven benoodigde lichtbacteri�n (Ph. 'phosphoreum i)) werden gekweekt in wij dmondsche glazen flesschen van 10 liter, welke om overschuimen te voorkomen slechts voor ongeveer de helft met de cultuurvloeistof werdennbsp;gevuld.

Na het oplossen werd de pH met een verdunde oplossing van NaOH gebracht op ca 7.4, waarna de cultuurvloeistof werd gesteriliseerd.

Toevoeging van 20 cms steriel gistwater per liter cultuurvloeistof had een zeer gunstig effect op de groei en de lichtintensiteit van de bacteri�n. Ternbsp;bekorting van de �lag-time�� entten wij zwaar.

Het kweeken geschiedde bij een temperatuur van 16 a 18� C., onder voortdurend doorleiden van fijn verdeelde lucht, door middel van een luchtperspomp. De fijne verdeeling van de doorgeblazen lucht werd bereikt met aquarium-steentjes, welke door middel van rubber slangetjes aan de centrale toevoerbuisnbsp;waren verbonden. Na 18 a 22 uur werd de cultuur, die een schitterend lichtnbsp;verspreidde, in een Sharpless super-centrifuge bij een toerental van 24.000 pernbsp;minuut afgecentrifugeerd. De bacteriemassa werd vervolgens in de Sharpless-centrifuge gewasschen met een 3 %-ige NaCl-oplossing. De opbrengst bedroegnbsp;per flesch gemiddeld 40 a 60 gram vochtige bacteri�n, met een gehalte aannbsp;droge stof van � 30 %.

Terloops moge hier worden opgemerkt, dat dit droge stof-gehalte overeenstemt met dat van versche gist, zooals deze door L y n e n werd gebruikt.

De aldus verkregen bacteriemassa brachten-wij op een roerstaaf direct in vloeibare lucht. Na een uur werd de bevroren massa snel van de staaf af gebrokkeld en in een centrifugebuis overgebracht, welke, na met een rubber stopnbsp;te zijn gesloten, in water van kamertemperatuur werd opgewarmd. Na hetnbsp;bereiken van de kamertemperatuur bleken de bacteri�n nog zeer intensief tenbsp;lichten.

Vervolgens centrifugeerden wij de bacteriemassa gedurende 15 minuten bij een toerental van 3500 per minuut. Er bleek hierna evenwel geen scheidingnbsp;in twee lagen, zooals bij de overeenkomstige proeven van L y n e n met gist,nbsp;te zijn opgetreden. Het gelukte niet de gewenschte scheiding in twee phasennbsp;te bewerkstelligen, zelfs niet, nadat wij alvorens te centrifugeeren de bacteriemassa achtereenvolgens tien maal in vloeibare lucht hadden gebracht en weernbsp;opgewarmd. De lichtintensiteit van de bacteri�n was na deze behandeling nognbsp;aanzienlijk; eerst na dertien maal bevriezen en opwarmen viel een duidelijkenbsp;afneming der lichtintensiteit te constateeren. Het meest teleurstellend wasnbsp;intusschen, dat kweekproeven uitwezen, dat een groot percentage van de cellen

1) Afkomstig uit de verzameling van het Laboratorium voor Microbiologie der Technische Hoogeschool te Delft.

na dertien maal met vloeibare lucht te zijn behandeld, nog over hun reproductie-vermogen beschikten en dus volledig intact waren gebleven.

Dat echter van een deel der cellen door het bevriezingsproces de celmembranen waren vernietigd, bleek, door een bevroren en weer opgewarmde bacteriemassa tenbsp;schudden met enkele cm3 3%-ige NaCl-oplossing. Na afcentrifugeeren vormde zichnbsp;thans een heldere, geelgekleurde vloeistoflaag, die b� toevoeging van azijnzuur eennbsp;dik eiwitneerslag gaf. Een controleproef met lichtbacteri�n, die niet aan de inwerkingnbsp;van vloeibare lucht waren onderworpen geweest, leverde onder overigens dezelfdenbsp;omstandigheden een kleurloos centrifugaat, dat geen opgeloste eiwitten bevatte.

De door afcentrifugeeren verkregen lichtgele vloeistof zond g��n licht meer uit; evenmin na voorafgaande reductie door toevoeging van een kleine hoeveelheid Na2S204.nbsp;Teneinde eenig inzicht te krijgen in de vraag, welke celbestanddeelen onder de gekozennbsp;omstandigheden buiten de cel waren getreden, werd het absorptiespectrum van hetnbsp;geelgekleurde centrifugaat bepaald. Ondanks het feit, dat het absorptiespectrum geennbsp;scherp uitgesproken karakteristieken vertoonde, waren toch in het spectrum twee goednbsp;aanwijsbare aanduidingen voor maxima aanwezig, resp. bij ca. 470 mfi en bij ca.nbsp;410 mp . Reeds aanstonds rees hierdoor de gedachte, dat in het centrifugaat eennbsp;compleet geel ferment aanwezig zou zijn, waarbij het opviel, dat de toppen ver naarnbsp;de zijde van het rood zijn verschoven. (Zie voor een recent overzicht van de liggingennbsp;der absorptie-maxima van verschillende flavine-fermenten het artikel van Ball (6)).nbsp;Door behandeling van het centrifugaat met verdund azijnzuur en methanol, werdennbsp;onder afsplitsing van de kleurstofcomponent, de opgeloste eiwitten neergeslagen. Hetnbsp;absorptiespectrum van de overblijvende gele oplossing vertoonde thans het voor lacto-flavine kenmerkende maximum bij ca 445 mtc � Hierdoor wint de hierboven uitgesproken gedachte aan waarschijnlijkheid.

Hoewel is gebleken, dat door het bevriezing�sproces, althans van een deel der lichtbacteri�n de celmembranen worden gedestrueerd, hebben wij het doelnbsp;van dit onderzoek, de scheiding van de cel-massa in twee phasen, die iedernbsp;op zich geen licht uitzenden, doch bij combinatie weer licht geven, niet kunnennbsp;verwezenlijken.

Nu de pogingen om het complete, bij de lichtreactie betrokken enzym-systeem in actieve vorm van de bacteriecel af te scheiden, een negatief resultaat hadden opgeleverd, vroegen wij ons af, of het niet mogelijk zou zijn de intactenbsp;bacteri�n zelf als testobject te gebruiken voor het aantoonen van het laag-moleculaire deel van het lichtgevend systeem, het luciferine.

De mogelijkheid hiertoe scheen gegeven, bij een nadere beschouwing van de door Johnson (66, 67) verrichte proeven over de totale hoeveelheid licht,nbsp;welke door een suspensie van lichtbacteri�n kan worden uitgezonden. Johnsonnbsp;toonde, zooals in hoofdstuk III � 2 reeds werd opgemerkt, aan, dat een pepton-vrije suspensie van Ph. Fischeri, welke een overmaat veradembaar koolhydraatnbsp;bevatte, na eenige uren aereeren � 90 % van zijn lichtintensiteit had verloren,nbsp;terwijl daarentegen de ademhaling in die tijd slechts weinig was teruggeloopen.nbsp;Hij verklaarde dit, door aan te nemen, dat het in de bacteriecellen aanwezigenbsp;luciferine irreversibel in de lichtreactie wordt verbruikt, terwijl door het ont-

breken van een assimileerbare stikstofbron, de vorming van nieuw luciferine niet mogelijk is. Uit het vrijwel constant blijven van de ademhaling mogen wijnbsp;besluiten, dat de activiteit van de daarbij betrokken enzymsystemen dezelfdenbsp;is gebleven. J o h n s o n�s verklaring van het beschreven verloop der lichtintensiteit berust op de veronderstelling, dat ook de luciferase-activiteit niet isnbsp;af genomen en dat de afneming der lichtintensiteit uitsluitend is te wijtennbsp;aan een afneming van de luciferine-concentratie en dus in laatste instantienbsp;van de door Johnson met L aangeduide stof, die wij dehydro-luciferinenbsp;hebben genoemd.

Door aereeren van een bacteriesuspensie onder de door Johnson aangegeven omstandigheden, putten wij de in de bacteri�n aanwezige hoeveelheid luciferine, resp. dehydro-luciferine, uit; vervolgens voegen wij op zeker momentnbsp;een extract, bereid uit goed lichtende bacteri�n, toe aan de genereerde suspensie.nbsp;Lukt het inderdaad op deze wijze nieuw luciferine, resp. dehydro-luciferine, innbsp;de bacteriecellen te brengen, dan zal zich dit kenbaar moeten maken in eennbsp;verhooging van de lichtintensiteit.

Ook met deze parti�ele lichttest, welke dus alleen op het luciferine was gericht, hadden wij echter geen succes.

De proeven werden eveneens gedaan met Ph. phosphoreum. De bepaling van de lichtintensiteit der bacteriesuspensie geschiedde in relatieve maat, volgens de doornbsp;Eymers en van Schouwenburg uitgewerkte (27) en op blz. 56 van ditnbsp;proefschrift beschreven visueele methode.

De extracten uit lichtbacteri�n werden onder zoo mild mogelijke omstandigheden bereid, zoowel uit versche, als uit in vacuum boven silicagel gedroogde bacteri�n. Denbsp;extractie geschiedde met 80%-ige methanol, welke IH % HCl bevatte, onder koolzuur, zoowel bij kamer- als bij kooktemperatuur. Hierbij zij opgemerkt, dat volgensnbsp;Harvey Cypridina-lnciierme bestand is tegen 6 uur koken met 20-%-ig HCl.

Er ontstond een vrijwel wit neerslag van gedenatureerde eiwitten, dat door centri-fugeeren van de gele oplossing werd gescheiden. Het gele cel-extract werd bij kamertemperatuur in vacuum drooggedampt en het residu werd opgenomen in een weinig van het suspensiemedium, dat bestond uit een oplossing, welke 2% NaCl, % m phos-phaatbuffer van pH � 7.4 en 11/2 % glucose bevatte. Van de verkregen oplossing voegden wij een kleine hoeveelheid toe aan de aan luciferine �verarmde� bacteriesuspensie.nbsp;Een positief effect was in geen enkel geval waar te nemen.

In verband met zekere aanwijzingen voor een, relatie tusschen lactoflavine en het lichtemitteerend proces (zie hoofdstuk V), gingen wij eveneens de invloed na van eennbsp;geringe hoeveelheid lactoflavine op de lichtintensiteit van de op bovengenoemde wijzenbsp;�verarmde� bacteriesuspensies. Ook hiervan was het effect nihil.

Het is moeilijk om voor het mislukken van deze, in beginsel toch veelbelovende, test een oorzaak aan te wijzen.

Men zou zich kunnen voorstellen, dat het op de bovenbeschreven wijze niet is gelukt, om bacterie-luciferine (resp. dehydro-luciferine) uit de bacteriecelnbsp;te extraheeren. Het betreft hier echter de extractie van een, hoogst waarschijnlijk laag-moleculaire, component, welke wij mogen vergelijken met Cypridina-luciferine. Uit het werk van Anderson (4) is nu bekend, dat Cypridina-luciferine onder de toegepaste omstandigheden stellig in actieve vorm zou zijn

ge�xtraheerd. Het is natuurlijk mogelijk, dat na de extractie oxydatie door luchtzuurstof of een andere omzetting heeft plaatsgevonden, welke tot inactieve stoffen heeft geleid. In dit geval zouden wij echter gedwongen zijn, het bacterie-luciferine principieel andere eigenschappen toe te kennen dan het Cypridina-luciferine, iets waartoe tot dusverre geen enkele experimenteele ervaring aanleiding geeft.

Ook is het mogelijk, dat, ondanks het toevoegen van een weliswaar actief extract, de permeabiliteit van de bacteriecel voor de toegevoegde stoffen nognbsp;een essentieele rol speelt.

De discussie van deze en andere mogelijke oorzaken valt echter buiten het kader van dit proefschrift.

Overeenkomstig de geringe verwachtingen, die wij na de bestudeering van de betreffende litteratuur koesterden, zijn onze pogingen tot isoleering van eennbsp;lichtgevend luciferine-luciferase systeem uit lichtbacteri�n (Ph. phosphoreum)nbsp;niet met succes bekroond. Evenmin gelukte het, uit goed-lichtende bacteri�nnbsp;een stof te extraheeren, die bij toevoeging aan een bacteriesuspensie, welke doornbsp;langdurig aereeren bij aanwezigheid van een overmaat glucose aan luciferinenbsp;was verarmd, een herstel van de lichtintensiteit bewerkt.

Bij beschouwing van de vraag, waarom het lichtgevend systeem bij lichtbacteri�n niet buiten de levende cel is te verkrijgen, zijn de volgende mogelijkheden denkbaar:

Ie het lichtgevend systeem is in die organismen, waarvan de luminescentie aan de levende cellen is gebonden, van andere aard dan in de gevallennbsp;van luminescente excreties;

2e de luciferase kan al naargelang van het betreffende organisme als lyo-, endo- of desmo-enzym aanwezig zijn.

De eerste mogelijkheid is weinig aannemelijk, omdat, zooals in hoofdstuk III is uiteengezet, de bij het onderzoek van de bioluminescentie der lichtbacteri�nnbsp;verkregen resultaten sterk pleiten voor de aanwezigheid van een luciferine-luciferase systeem, overeenkomend met dat bij Cypridina.

De tweede mogelijkheid achten wij veel waarschijnlijker. Er zijn namelijk organismen bekend, zooals Cypridina en de visch Malacocephalus, die een celvrij,nbsp;lichtgevend slijm afscheiden. In deze gevallen heeft luciferase het karakter vannbsp;een lyo-enzym. Andere organismen, zooals de vuurvliegen, geven weliswaar eennbsp;positieve luciferine-luciferase reactie, doch scheiden onder normale omstandigheden hun lichtend systeem niet buiten de cel af; hier moeten wij de luciferasenbsp;dus beschouwen als een een endo-enzym.

Het ligt voor de hand aan te nemen, dat er ook organismen zullen zijn, waarin de luciferase als desmo-enzym, waarvan de activiteit is gebonden aannbsp;de structuur van de cel, aanwezig is.

Men moet hierbij bedenken, dat de grenzen tusschen de drie genoemde enzym-groepen geenszins scherp zijn. Uiteindelijk moet men aannemen, dat deze indeeling, vooral voor wat betreft de endo- en de| desmo-enzymen meer een kwestie is van experimenteels techniek, dan dat zij op een wezenlijk onderscheid berust.

Wij hebben ons in dit hoofdstuk bepaald tot het geven van een algemeene beschouwing en hebben, aangezien onze proeven niet tot een positief resultaatnbsp;hebben gevoerd, de beschrijving daarvan tot de hoofdzaken beperkt.

Hoewel in dit stadium van het onderzoek de kansen voor een directe chemische aanval op het vraagstuk der bioluminescentie in lichtbacteri�n weinig gunstig leken, was er nog in het werk van Eymers en van Schouwenburg (27) en in een naar aanleiding van hun resultaten verricht onderzoeknbsp;van Doudoroff (19) een aanduiding te vinden, dat mogelijkerwijze hetnbsp;lactoflavine of een daarmede nauw verwant molecule betrokken zou zijn bij hetnbsp;lichtemitteerend proces. De bespreking van deze onderzoekingen en van hetnbsp;eigen in verband daarmede verrichte werk vormt het onderwerp van het volgende hoofdstuk.

Zooals in � 2 van hoofdstuk III reeds is opgemerkt, toonden E y m e r s en van Schouwenburg (27) aan, dat in lichtbacteri�n de lichtemissie isnbsp;verbonden met een voor HCN slechts weinig gevoelig deel van de totale ademhaling. Dit deed bij hen dadelijk het vermoeden rijzen, dat de niet HCN-gevoeligenbsp;lichtademhaling der lichtbacteri�n, evenals de in normale �donkere� cellennbsp;voorkomende niet HCN-gevoelige ademhalingsprocessen, op ��n of andere wijzenbsp;zou samenhangen met een geel ferment en dus uiteindelijk met de aanwezigheidnbsp;van lactoflavine in de cellen.

Zij vonden steun voor dit vermoeden, door een eveneens door hen uitgevoerd onderzoek naar de spectrale intensiteitsverdeeling van het door diverse lichtbacterie-stammen uitgezonden licht en van het licht uitgezonden door enkele chemolumines-cente reacties (26), benevens dat van een aantal biologisch belangrijke fluoresceerendenbsp;stoffen (28). De leidende gedachte bij dit onderzoek was, dat chemoluminescentie (bio-luminescentie) en fluorescentie physisch zeer nauw verwante processen zijn. In beidenbsp;gevallen komt de lichtemissie tot stand, doordat een aangeslagen molecule in een lagerenbsp;energietoestand terugvalt. De wijze, waarop de moleculen in aangeslagen toestand zijnnbsp;geraakt, is echter verschillend. In het geval van de chemoluminescente (biolumines-cente) reactie wordt door de vrijkomende reactie-energie een molecule aangeslagen,nbsp;terwijl bij de fluorescentie de aanslag plaats vindt door absorptie van van buiten afnbsp;ingestraalde energie.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�

De gevonden spectra werden geanalyseerd door aan te nemen, dat deze uit ��n of meer verbreede grondfrequenties waren opgebouwd. Eymers en van Schouwenburg merkten namelijk op, dat de spectra van chemoluminescente reacties innbsp;de gasphase steeds ��n of meer lijnen � overeenkomende met karakteristieke frequenties � vertonnen en veronderstelden, dat dit althans in beginsel in de vloeibare phasenbsp;ook zoo zou zijn. In dit geval zou echter, ten gevolge van de invloed van het medium,nbsp;een symmetrische verbreeding van de grondfrequenties plaats vinden. Zij namen dusnbsp;aan, dat de bioluminescentie- (chemoluminescentie- en fluorescentie-) spectra uitnbsp;symmetrisch verbreede grondfrequenties waren opgebouwd. Bij uitzetten van denbsp;spectrale energieverdeeling tegen de frequenties, moest het dan volgens hen anderzijdsnbsp;mogelijk zijn, de aldus verkregen spectra te analyseeren, door ze in symmetrisch verbreede grondfrequenties te doen uiteenvallen.

Ie van de door hen onderzochte lichtbacteriestammen Ph. phosphoreum, Ph. splen-didum en V. S o n,n enschein waren de emissiespectra identiek en tevens onafhankelijk van diverse uitwendige omstandigheden als pH, temperatuur,nbsp;zoutgehalte van het suspensiemedium en ouderdom der cultuur. Zij leiddennbsp;hieruit af, dat in al deze gevallen ��n en hetzelfde molecule voor de lichtemissienbsp;verantwoordelijk moest zijn;

2e alle onderzochte spectra bleken uit een slechts gering aantal grondfrequenties te zijn opgebouwd. Zij vonden voor lactoflavine een in zijn geheel symmetrisch en dus uit slechts ��n grondfrequentie opgebouwd fluorescentiespectrumnbsp;en deze zelfde grondfrequentie bleek nu voor te komen in de bioluminescentie-spectra der lichtbacteri�n.

Het scheen dus, alsof hun hypothese, dat lactoflavine op een of andere wijze met het lichtemitteerend proces der lichtbacteri�n zou samenhangen, aanmerkelijke steunnbsp;had ontvangen.

Inmiddels is echter, door voortgezet onderzoek van Mej. A. van der Burg over de emissiespectra der lichtbacteri�n en van schrijver dezes in samenwerking metnbsp;Mej. A. vanderBurg, Dr. P. B. R o 11 i e r en den Heer F. A. Rodrigo over hetnbsp;fluorescentiespectrum van lactoflavine (nog niet gepubliceerd) komen vast te staan,nbsp;dat tegen de door Eymers en van Schouwenburg uitgevoerde analysennbsp;der emissiespectra bezwaren zijn aan te voeren en dat in het bijzonder zoowel hetnbsp;door hen gepubliceerde luminescentiespectrum der lichtbacteri�n, als het fluorescentiespectrum van lactoflavine, nog correctie behoeft. Ten gevolge hiervan moet de aanvankelijk gegeven interpretatie der spectra zeker nog worden herzien.

De opvatting van Eymers en vanSchouwenburg, dat lactoflavine betrokken zou zijn bij de licbtemissie der licbtbacteri�n, gaf Doudoroffnbsp;(19) aanleiding, de invloed van lactoflavine na te gaan op de lichtintensiteit vannbsp;halfdonkere en donkere varianten, welke door vrijwillige dissociatie warennbsp;ontstaan, uit een goed lichtende stamcultuur van Ph. phosphoreum. Doudoroff veronderstelde, dat in deze varianten het normale ademhalingsprocesnbsp;(de haemine-ademhaling) het met de lichtemissie verbonden ademhalings-'nbsp;proces in meerdere of mindere mate had teruggedrongen en merkte nu op,nbsp;dat het mogelijk was, sommige van de halfdonkere varianten van Ph. phos-phoreum weer goed tot lichten te brengen door een extra toevoeging vannbsp;lactoflavine aan het cultuurmedium.

Bij gebruik van een voedingsmedium, dat als-stikstof bron pepton Witte bevatte, constateerde hij, dat alleen die halfdonkere varianten met vergrootingnbsp;van de lichtintensiteit op lactoflavine-toevoeging reageerden, waarvan ook denbsp;groei slechts na toevoeging van lactoflavine aan het cultuurmedium optrad.nbsp;Quantitatief liepen de in deze twee gevallen benoodigde hoeveelheden lactoflavinenbsp;echter sterk uiteen. Voor het optreden van normale groei was de toevoegingnbsp;van 0.02 7 lactoflavine per cm^ cultuurmedium voldoende; de bacteri�n behielden dan echter hun geringe lichtintensiteit. Met hun lichtintensiteit reageerden de lichtbacteri�n eerst op een toevoeging van grootere hoeveelheden lactoflavine. Door de lactoflavine-concentratie tot 10 7 per cm3 cultuurmediumnbsp;op te voeren, gelukte het Doudoroff de intensiteit van de betreffendenbsp;halfdonkere varianten gelijk te maken aan die van een niet-gedissocieerdenbsp;goed lichtende stam.

Bij overenten van een aldus met lactoflavine weer tot goed lichten gebrachte variant op een lactoflavine-arme voedingsbodem werden de bacteri�n weer halfdonker, hetgeen bewees, dat het hier een directe werking van het lactoflavinenbsp;op de lichtemissie betrof.

Een. invloed van lactoflavine-toevoeging op de ademhaling kon Doudoroff in geen enkel geval vaststellen. Bovendien veroorzaakte de toevoeging van lacto-

flavine aan de voor deze ademhalingsmetingen gebruikte halfdonkere variant tijdens de proef duur van drie uren geen verhooging van de lichtintensiteit dernbsp;bacteri�n. Doudoroff concludeerde uit zijn proefnemingen, dat de betreffende halfdonkere varianten het vermogen hadden verloren, zelf voldoendenbsp;lactoflavine te produceeren en dat zijn proeven tevens steun gaven aan denbsp;opvatting van Eymers en van Schouwenburg, dat lactoflavine ofnbsp;een derivaat daarvan nauw bij de lichtemitteerende reactie zou zijn betrokken,nbsp;(�it is probable that flavin or some derivative of it is one of the enzymesnbsp;involved in the luminescence of bacteria�)-

Bij een critische beschouwing van de proeven van Doudoroff moet worden toegegeven, dat lactoflavine inderdaad onder bepaalde omstandighedennbsp;in staat is, om het lichtemitteerend vermogen van een bacteriestam, die ditnbsp;vermogen gedeeltelijk heeft verloren, weer te herstellen. Dit behoeft echternbsp;geenszins in te houden, dat lactoflavine of een derivaat daarvan rechtstreeksnbsp;bij de lichtemissie zelve is betrokken. Doudoroff vond geen directe werkingnbsp;van lactoflavine op de lichtemissie, doch slechts via een complete groeicyclus,nbsp;waarin het geheele enzymatische systeem der cel en dus ook het lichtemitteerend systeem, opnieuw was gesynthetiseerd. Zijn proeven bewijzen dusnbsp;hoogstens, dat onder bepaalde omstandigheden lactoflavine onmisbaar is voornbsp;de vorming van de bij de lichtreactie betrokken moleculen en geenszins, datnbsp;lactoflavine een directe rol speelt bij, en dus ��n der componenten is van, hetnbsp;lichtemitteerend systeem.

Een dergelijke, meer indirecte rol van lactoflavine in het bioluminescentie-proces is volkomen in overeenstemming met de universeele beteekenis, welke de flavine-enzymen (de gele fermenten) in het stofwisselingsproces der cellennbsp;hebben. Men zie hiervoor bijv. het recente overzichtsartikel van Ball (6).

Een directe medewerking van lactoflavine bij de lichtemissie leek ons ook reeds minder waarschijnlijk, gezien het resultaat van een onderzoek, dat doornbsp;Dr. P. B. Rottier op ons verzoek werd uitgevoerd.

Hierbij werd, op de door Rottier (102) beschreven methode, het lacto-flavinegehalte bepaald van eenige culturen van Ph. phosphoreum:

a. nbsp;nbsp;nbsp;eennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;cultuurnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;vannbsp;nbsp;nbsp;nbsp;eennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;goed lichtendenbsp;nbsp;nbsp;nbsp;stam;

b. nbsp;nbsp;nbsp;eennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;cultuurnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;vannbsp;nbsp;nbsp;nbsp;eennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;donkere stam;

c. nbsp;nbsp;nbsp;eennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;cultuurnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;vannbsp;nbsp;nbsp;nbsp;eennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;goed lichtendenbsp;nbsp;nbsp;nbsp;stam,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;welke cultuur echter door

Binnen de nauwkeurigheidsgrenzen der bepalingsmethode stemden de lac-toflavine-gehalten van de bacteri�n onder a, b en c genoemd met elkaar overeen.

Dit resultaat pleit al evenmin ten gunste van de door Doudoroff getrokken conclusie.

De physiologisch wel zeer hooge dosis lactoflavine, welke voor het optreden van het door hem waargenomen effect op de lichtintensiteit noodig is, scheennbsp;het intusschen m�gelijk te maken, dat bij dit effect eerder een omzettings-product van lactoflavine, dan het lactoflavine zelve werkzaam zou zijn.

Onder meer in verband hiermede, besloten wij een poging te wagen, uit Ph. phosphoreum flavine in kristallijne toestand te isoleeren en dit te vergelijken met synthetisch lactoflavine.

� 2. Dc isolccring van lactoflavine als kristallijn lactoflavinc-tetraacetaat uit Ph. phosphoreum.

Men is in staat geweest, lactoflavine en lactoflavine-derivaten uit zeer uiteenloopende biologische materialen, zoowel van dierlijke als plantaardigenbsp;oorsprong, in kristallijne toestand te isoleeren (25, 38, 72 t/m 75, 81 t/m 86,nbsp;99, 111, 120). Tot dusverre is de isoleering uit bacteri�n echter nog niet beschreven. 1)

Bij het zoeken naar een geschikte isoleeringsmethode kregen wij aanvankelijk de indruk, dat deze in zijn geheel in de zeer uitgebreide litteratuur over dit onderwerp voor ons gereed zou liggen. Het blijkt echter telkens weernbsp;bij werken met biologisch materiaal, dat de voor ieder materiaal specifiekenbsp;begeleidende stoffen het opstellen van algemeen geldige isoleeringsmethodennbsp;vrijwel onmogelijk maken. Ook in ons geval waren wij gedwongen diverse innbsp;de litteratuur beschreven methoden gecombineerd te gebruiken. Zonder datnbsp;wij genoodzaakt waren principieel nieuwe scheidingstrappen in te voeren,nbsp;wijkt de door ons gevolgde reinigingsmethode toch weer af van de voor andernbsp;uitgangsmateriaal beschreven methoden. Het is om deze reden, dat wij, metnbsp;weglating van overbodige bijzonderheden, de diverse reinigingstrappen zullennbsp;beschrijven.

Wij besloten als uitgangsmateriaal Ph. phosporeum te gebruiken. Het kweeken geschiedde geheel volgens de op blz. 27 beschreven methode. Per dagnbsp;verkregen wij 40 a 60 gram vochtige bacteri�n. In totaal hebben wij ruim 3 kgnbsp;vochtige bacteri�n, overeenkomende met een drooggewicht van ca 1000 gram,nbsp;opgewerkt.

De extractie geschiedde in twee trappen. De afgecentrifugeerde en met een 3%-ige oplossing van NaCl gewasschen bacteriemassa werd gedurendenbsp;de periode dat wij dagelijks kweekten, bewaard in 80%-ige methanol. Nadatnbsp;wij een voldoende hoeveelheid lichtbacteri�n hadden gekweekt, hevelden wijnbsp;het heldere methanol-extract af en kookten de bacteriemassa uit met 5 1. 2 fo-ignbsp;azijnzuur. Na afcentrifugeeren werden het methanolextract en het azijnzuur-extract vereenigd en in vacuum ingedampt tot een volumen van �4 1.

De oplossing was sterk troebel en bevatte naast lipoiden nog veel eiwitten. De lipoiden en het grootste deel der eiwitten konden wij verwijderen, door denbsp;oplossing te schudden met ��n vierde van zijn volumen aan chloroform. Denbsp;waterlaag en de chloroformlaag werden door centrifugeeren gescheiden. Hetnbsp;aldus voorgereinigde waterige extract was de uitgangsoplossing voor de isolee-

1) In ��n geval echter wel uit het cultuurmedium waarin bacteri�n waren gegroeid. De Japansche onderzoeker Yamasaki (120) constateerde namelijk, dat aceton-butylalkoholbacteri�n onder bepaalde omstandigheden groote hoeveelheden lactoflavine in het cultuurmedium afscheiden en slaagde er in, uit de door centrifugeeren van bacteri�n bevrijde cultuurvloeistof lactoflavine in kristallijne toestandnbsp;af te zonderen.

ring van het flavine. Wij volgden iedere reinigingstrap quantitatief, door bepaling van het lactoflavine-gehalte volgens de door Rottier (102) beschreven methode. Tevens werden ook van de bij het reinigingsproces verworpen oplossingen steeds de absorptiespectra bepaald, teneinde vast te stellen, datnbsp;daarin geen stoffen voorkwamen, welke in het voor lactoflavine kenmerkendenbsp;gebied een specifieke absorptie vertoonden. Reeds dadelijk moge worden opgemerkt, dat dit nimmer het geval was; de bij de zuivering opgetreden verliezennbsp;aan lactoflavine zijn dus aan onvolledige elutie te wijten.

Het uitgangsextract had een volumen van 4 liter en bevatte in totaal 48 mg flavine.

Aan het uitgangsextract voegden wij 25 cm^ 10 %-ig HCl en 125 g frankoniet KL toe. Na een half uur schudden centrifugeerden wij de suspensienbsp;in de Sharpless-centrifuge af. Het centrifugaat was vrijwel kleurloos en bevatte dus geen flavine meer. Het frankoniet werd ��nmaal gewasschen metnbsp;1/2 %-ig HCl.

Wij vermeden de toepassing van een groote overmaat frankoniet, aangezien hieraan tevens een blauwfluoresceerende verontreiniging werd geabsorbeerd. Wij hebben in de loop der isoleering de ervaring opgedaan, dat de quantitatieve scheiding tusschennbsp;het (geelgroen fluoresceerende) flavine en deze blauw fluoresceerende verontreinigingnbsp;zeer moeilijk is.

De elutie van het frankoniet-adsorbaat geschiedde volgens Green en Black (38) met 3/2 1. 0.1 n NaOH in 60 %-ige aethanol. Onmiddellijk nanbsp;de afscheiding van het frankoniet zuurden wij het eluaat aan met verdundnbsp;azijnzuur. Na verwijdering van het gevormde neerslag werd het grootste deelnbsp;van de alcohol in vacuum afgedestilleerd; het volumen van het aldus verkregennbsp;eluaat bedroeg 1/2 1., met een gehalte van 23.7 7 flavine per cm^. In totaalnbsp;dus �: S5 mg flavine.

Aan het frankoniet-eluaat werden 15 g Pb-acetaat en 5 g Na-acetaat toegevoegd. Na verzadiging van de oplossing met HgS en afcentrifugeeren van het PbS waschten wij dit ��nmaal met verdund azijnzuur uit. De elutie vannbsp;het aan PbS geadsorbeerde flavine geschiedde, door het PbS viermaal achtereenvolgens met 1 1. gedestilleerd water uit te koken. Na indampen in vacuumnbsp;bedroeg het volumen van het helder gele eluaat 2 1., met 12.1 7 flavine pernbsp;cm3. In totaal dus � 25 mg flavine.

Aan het eluaat van de eerste PbS-adsorptie voegden wij 10 g Pb-acetaat toe en verzadigden de oplossing met H2S. Het uitwasschen en de elutie van

het PbS geschiedden op overeenkomstige wijze als bij de eerste adsorptie aan PbS. Het volumen van het ingedampte eluaat bedroeg 375 cm^ met 49.5 7nbsp;flavine per cm^, in totaal dus 18.5 mg flavine.

Aan het eluaat van de tweede PbS-adsorptie voegden wij 3.75 g Pb-acetaat toe en verzadigden de oplossing met HgS. Na uitwasschen van het PbS-neerslagnbsp;kookten wij dit driemaal met telkens 300 cm^ water uit. Na indampen van hetnbsp;eluaat tot op een volumen van 120 cm3 bedroeg het flavine-gehalte 135.8 7 pernbsp;cm3. In totaal dus 16.3 mg flavine.

Verschillende malen is men er reeds in geslaagd (zie o.a. Kuhn (86), RaffyenMirimanoff (99)) om na herhaalde adsorptie aan PbS kristallij ne flavine-preparaten in handen te krijgen. In ons geval lukte dit na dezenbsp;reinigingstrap nog niet. Wel verkregen wij door indampen van het laatstgenoemde eluaat kristallijne neerslagen, doch deze bestonden slechts voor eennbsp;deel uit flavine. Bovendien bleek bij meting van het absorptiespectrum, datnbsp;onze preparaten nog een in het ultraviolet zeer sterk absorbeerende verontreiniging bevatten. Ongetwijfeld hangt dit geheel samen met de aard van hetnbsp;betreffende biologische uitgangsmateriaal.

Het eluaat van de derde PbS-adsorptie werd met NH4OH juist geneutraliseerd en vervolgens werd een overmaat 5 %-ige AgNOs-oplossing toegevoegd. Na het roodbruine zilverzout te hebben afgecentrifugeerd, waschten wij ditnbsp;tweemaal met gedestilleerd water uit. Het zilverzout werd gesuspendeerd innbsp;100 cm3 2V2 %-ig azijnzuur en vervolgens door inleiden van H2S ontleend.

Na afcentrifugeeren waschten wij het Ag2S ��nmaal uit met 100 cm3 ge, destilleerd water en nog eens met 25 cm3 warm 2y2 %-ig azijnzuur. Het flavinenbsp;bevond zich in het centrifugaat, dat door uitkoken van H2S werd bevrijd.nbsp;Volumen 225 cm3, met 63.1 7 flavine per cm'�. In totaal dus 14-^ nig flavine.

Opnieuw trachtten wij door indampen kristallijn flavine te verkrijgen. Ook nu weer bevatten de kristallij ne neerslagen wisselende hoeveelhedennbsp;flavine, terwijl het absorptiespectrum nog steeds de aanwezigheid van een innbsp;het ultraviolet sterk absorbeerende verontreiniging vertoonde. Blijkbaar haddennbsp;wij te maken met verontreinigende stoffen, waarvan het adsorptiegedrag en denbsp;oplosbaarheid veel overeenkomst vertoonden met die van het flavine.

Wij besloten daarom van verdere reinigingspogingen in waterig milieu af te zien en over te gaan tot chromatografische adsorptie uit een organischnbsp;oplosmiddel. Hiertoe was het noodig het flavine om te zetten in een derivaatnbsp;dat, in tegenstelling met het flavine zelf, uit waterig milieu met organischenbsp;oplosmiddelen kan worden uitgeschud. Als zoodanig waren geschikt het tetra-acetaat, het tetrabenzoaat en de acetonverbinding. Wij kozen het tetraacetaat.

uit het feit, dat wij door chromatografische adsorptie van het tetraacetaat aan AI2O3 uit benzol niet, doch uit aethylacetaat w�l tot een zuiver kristallijnnbsp;preparaat konden geraken.

4. Omzetting van het flavine in het tetraacetaat en chromatografische adsorptie hiervan cuin Al^O^.

Nadat de flavine-oplossing, afkomstig van reinigingstrap 3, in vacuum was drooggedampt, extraheerden wij het flavine uit de droge rest, door deze driemaal met telkens 10 cm^ droge pyridine uit te koken. Het pyridine-extractnbsp;werd daarna in vacuum tot op 10 cm^ ingedampt. Aan de pyridine-oplossingnbsp;voegden wij 21/2 cm^ azijnzuur-anhydride toe. Nadat de oplossing eenige urennbsp;had gestaan, werd zij gedurende ��n minuut gekookt. Na afkoeling verdundennbsp;wij met 20 cm^ chloroform. Het verkregen mengsel goten wij hierna onder ijs-koeling langzaam uit in een overmaat 2 n HCl (de reactie moest na afloopnbsp;nog zuur zijn op Congo-papier). De chloroformlaag, die al het flavine als tetraacetaat bevatte, werd gewasschen met ijskoud verdund HCl en tweemaal metnbsp;gedestilleerd water en daarna gedroogd op natriumsulfaat.

Na affiltreeren van het chloroformextract dampten wij in vacuum het chloroform af en namen de kristallijne rest op in 50 cm^ absolute benzol.

De benzol-oplossing werd onderworpen aan chromatografische adsorptie aan AI2O3 (volgens Brockmann); lengte van de kolom 15 cm, doorsnede 1 cm.

De adsorptie verliep niet mooi; een scherpe scheiding in ringen trad niet op. Boven in de buis bevond zich een bruine laag, welke diffuus overgingnbsp;in een breed lichtgeel gebied. Bij ontwikkeling van het chromatogram metnbsp;benzol, welke een spoor methanol bevatte, werd het beeld niet veel beter.

Het lichtgele gebied van de AlgOs-zuil werd apart genomen en ge�lueerd met benzol-methanol 1:1. Het eluaat werd in vacuum drooggedampt en hetnbsp;residu werd opgenomen in eenige cm^ gedestilleerd water. Na toevoeging vannbsp;iets azijnzuur dampten wij de oplossing in tot op een volume van 1 cm^. Bijnbsp;staan in de ijskast vormden zich weliswaar kristallen, doch deze waren ondernbsp;het microscoop niet homogeen.

Wij besloten opnieuw te chromatografeeren, echter nu volgens K u h n en Kaltschmitt met aethylacetaat als oplosmiddel.

De onder a verkregen flavine-oplossing werd in vacuum drooggedampt en het residu werd opnieuw volgens de onder a beschreven methode geacetyleerd,nbsp;om eventueel door verzeeping ontstaan flavine weer om te zetten in het tetraacetaat. Thans namen wij echter de droge rest na het verdampen van de chloroform op in alcoholvrije aethylacetaat. Ditmaal verliep de chromatografischenbsp;adsorptie voortreffelijk; er werd ontwikkeld met aethylacetaat.

In het filtraat bevond zich een intensief blau-w fluoresceerende verontreiniging.

Elutie met aethylacetaat-methanol 4 :1. Het eluaat werd in vacuum ingedampt en het restant opgenomen in gedestilleerd water. In een willekeurige verdunning bepaalden wij van deze oplossing het absorptiespectrum. Dit isnbsp;weergegeven in fig. 1.

Deze bepaling geschiedde met de door Rottier (102) uitvoerig beschreven photo�lectrische spectraalphotometer.

Door toepassing van de door Rottier (102) beschreven extrapolatie-methode konden wij aantoonen, dat dit absorptiespectrum niets anders voorstelt dan een sterk verontreinigd lactoflavine-spectrum.

De lactoflavine-absorptie is gesuperponeerd op een, naar het ultra-violet steil oploopende, continue ondergrond. De aard van de verontreiniging is onsnbsp;niet bekend.

Elutie met aethylacetaat-methanol 4 : 1. Het eluaat werd na filtratie in vacuum drooggedampt. Het kristallij ne residu namen wij op in enkele cm^nbsp;gedestilleerd water. Na toevoeging van eenige druppels verdund azijnzuurnbsp;dampten wij de oplossing in vacuum tot op 2 cm^ in. Na ��n dag staan in denbsp;ijskast hadden zich fijne, gele naaldjes afgescheiden, welke onder het microscoop volkomen homogeen waren. De naaldjes werden op een microtrechtertjenbsp;af gefiltreerd, gewasschen met ijskoud gedestilleerd water en in vacuum bovennbsp;silicagel gedroogd.

Zooals wij in de aanvang van deze paragraaf reeds opmerkten, is dit de eerste maal, dat uit bacteri�n een kristallijn flavine-derivaat is ge�soleerd.

Ter vergelijking bereidden wij volgens Kuhn en Wagner-Jauregg (84) uit 5 mg synthetisch lactoflavine eveneens het tetraacetaat.

Mengsmeltpunt van het synthetische preparaat met dat, afkomstig uit de lichtbacteri�n: 232 a 233� C., dus geen depressie.

Voor een elementair-analyse was de door ons ge�soleerde hoeveelheid stof niet toereikend, w�l .konden wij echter het moleculaire absorptiespectrumnbsp;bepalen.

water. Per cms bevatte deze oplossing 7.58 y flavine-tetraacetaat, overeenkomend met 4.69 y flavine. Het moleculaire absorptiespectrum is weergegeven in fig. 2.

Deze waarden stemmen vrijwel overeen met de door Rottier (102) gevonden waarden aan een synthetisch lactoflavine-preparaat.

Hiermede is dus bewezen, dat het in Ph. phosphorerim voorkomende flavine geheel identiek is met lactoflavine. Het onderzoek heeft voorts geen enkelenbsp;aanwijzing verschaft voor de aanwezigheid van een tweede, van lactoflavinenbsp;afwijkend, flavine in de onderzochte bacteriestam.

De verkregen resultaten geven geen aanleiding het door Doudoroff geconstateerde effect van lactoflavine op de lichtintensiteit van sommige halfdonkere stammen van Ph. phosphoreum te interpreteeren in de zin van eennbsp;directe medewerking van lactoflavine aan de lichtemitteerende reactie.

Wij meenen dan ook, dat het lactoflavine evenals in zoovele andere cel-processen slechts een algemeene rol vervult bij de lichtemissie, in die zin, dat de vorming van de componenten van het lichtgevend systeem bepaald wordtnbsp;door omstandigheden, die uiteindelijk door de al of niet aanwezigheid van lactoflavine in het leven worden geroepen.

Evenmin is er eenigerlei aanwijzing voor het bestaan van een correlatie tusschen het lichtend vermogen van een Ph. phosphoreum-cwMnur en het lacto-flavine-gehalte daarvan, zoodat er, ook dit in aanmerking nemende, alle redennbsp;is de bedoelde werking van lactoflavine op de lichtemissie te zien als eennbsp;indirecte werking.

Hoe wij ons deze indirecte werking moeten voorstellen is vooralsnog niet duidelijk. Wij meenen echter te hebben aangetoond, dat deze werking niet totnbsp;stand komt, doordat het lactoflavine-molecule in de lichtbacteri�n wordt omgezet in een verwant molecule, dat dan een directe rol zou spelen bij denbsp;lichtemissie.

Het is duidelijk, dat de resultaten van de tot dusver beschreven onderzoekingen ons slechts weinig verder hebben gebracht tot het doel, dat wij ons hadden gesteld, namelijk het verkrijgen van een nader inzicht in de aardnbsp;der moleculen, welke bij het bioluminescentie-proces in lichtbacteri�n zijn betrokken.

Wij wezen er intusschen reeds eerder op, dat de mogelijkheid tot direct chemisch onderzoek ten nauwste samenhangt met de vraag, of het zou gelukkennbsp;het lichtgevend systeem af te scheiden van de bacteriecel. De negatieve uitslagnbsp;van alle desbetreffende in de litteratuur beschreven onderzoekingen in aanmerking nemende, hebben wij ons in dit opzicht niet veel illusies gemaakt. Dit neemtnbsp;niet weg, dat wij meenden, in het bijzonder daar er eenige veelbelovende nieuwe

Daar voorts het onderzoek naar het voorkomen van lactoflavine in de lichtbacteri�n geen aanwijzingen opleverde, welke spraken voor een directenbsp;medewerking daarvan aan het lichtemitteerend proces, schenen verderenbsp;pogingen tot een direct chemisch onderzoek naar de aard van de verbindingen,nbsp;welke bij het bioluminescentie-proces in lichtbacteri�n zijn betrokken, weinignbsp;uitzicht te bieden.

Er bleek nu evenwel een zeer aantrekkelijke en veelbelovende mogelijkheid tot verder onderzoek voor ons gereed te liggen in de bestudeering van het effectnbsp;van uitwendige bestraling met licht van verschillende golflengte op de lichtemissie van lichtbacteri�n. In principe scheen het namelijk mogelijk, om aldusnbsp;langs indirecte weg het absorptiespectrum te bepalen van een bij de lichtemissienbsp;nauw betrokken molecule.

De bespreking van het desbetreffende onderzoek en van de verkregen resultaten vormt de inhopd van de volgende hoofdstukken van dit proefschrift.

DE INVLOED VAN UITWENDIGE BESTRALING OP HET LICHTEND VERMOGEN VAN LICHTGEVENDE ORGANISMEN.

Het deel van het onderzoek, dat met het onderhavige hoofdstuk begint en dat door zijn aard een meer physisch karakter draagt, is mede dank zij denbsp;theoretische zoowel als de experimenteele medewerking van Mej. A. vannbsp;der Burg, physisch doctoranda, tot stand gekomen.

De schrijver van dit proefschrift rekent het zich dan ook tot een aangename plicht, op deze plaats de prettige samenwerking met Mej. van der Burgnbsp;met groote erkentelijkheid te gedenken.

De indirecte methode, met behulp waarvan wij hebben getracht ons inzicht in het bioluminescentie-proces der lichtbacteri�n te vergrooten, vindt zijnnbsp;oorsprong in een terloops verrichte waarneming van van Schouwenburg en van der Burg (niet gepubliceerd). Zij bestudeerden de invloednbsp;van koolmonoxyde in verschillende concentraties op de ademhaling en denbsp;lichtemissie van Ph. phosphoreum en tevens � naar analogie van de bekendenbsp;proeven van Warburg � de invloed van �itwendige bestraling op hetnbsp;door koolmonoxyde veroorzaakte effect (107). Hiervoor was het noodig tijdensnbsp;de uitwendige bestraling de intensiteit van het door de bacteriesuspensie ge-emitteerde licht te kunnen meten. Dit was principieel op twee manieren mogelijk;nbsp;men kon namelijk eenerzijds bestralen met geel en rood licht en de intensiteitnbsp;van het bacterielicht bepalen met behulp van een blauw-filter, anderzijds konnbsp;men bestralen met blauw licht en het bacterielicht waarnemen door een geel-rood-filter. Bij het experimenteel nagaan van beide mogelijkheden deden zij denbsp;verrassende waarneming, dat bestraling van een genereerde suspensie vannbsp;Ph. phosphoreum met blauw licht een intensiteitsvermindering van het door denbsp;bacteri�n ge�mitteerde licht tengevolge heeft, terwijl bestraling met geel ofnbsp;rood licht hierop geenerlei invloed uitoefent. Bovendien bleek het door bestraling met blauw licht veroorzaakte effect reversibel te zijn, dat wil zeggen, nanbsp;afloop der bestraling herkreeg de intensiteit van het bacterielicht na zekerenbsp;tyd zijn oorspronkelijke waarde.

Nu had Harvey reeds in 1925 geconstateerd (50), dat het lichten van een Cypridina-extract door bestraling gedurende enkele secunden met het vollenbsp;licht van een koolboog volledig wordt gedoofd en tevens, dat na korte tijdnbsp;staan in het donker het lichtgevend vermogen van het bestraalde extract gedeeltelijk terugkeert. Door luciferine- en luciferase-oplossingen afzonderlijk

te bestralen en vervolg�ens te combineeren, kon hij aantoonen, dat bij deze bestraling het luciferine en niet de luciferase werd ge�nactiveerd. Deze photo-chemische inactiveering trad bovendien slechts op bij aanwezigheid van moleculaire zuurstof; bestraling van een luciferine-oplossing bij afwezigheid vannbsp;zuurstof was zonder invloed op het lichtgevend vermogen.

Qualitatief kon Harvey vaststellen, dat het waargenomen effect, behalve van de intensiteit waarmede werd bestraald, afhangt van de spectrale samenstelling van het gebruikte licht. Met behulp van lichtfilters toonde hijnbsp;aan, dat rood, geel en groen licht luciferine niet inactiveeren, evenmin infra-roode straling en ultra-violette met een golflengte korter dan 300 mp . Ook bijnbsp;350 mp vond hij nog slechts een geringe werkzaamheid. Een duidelijk effectnbsp;trad op bij bestraling met golflengten tusschen 380 en 460 mp. Hoewel ditnbsp;onderzoek slechts een qualitatief karakter droeg en het al of niet optredennbsp;van een effect visueel werd vastgesteld, bleek toch duidelijk, dat de inactiveering van luciferine door licht bij aanwezigheid van moleculaire zuurstof eennbsp;photochemisch proces is, dat in sterke mate golflengte-afhankelijk moet zijnnbsp;(zie ook nog (55)).

Na dit effect bij extracten van Cypridina te hebben waargenomen, bestraalde Harvey suspensies van B. phosphorescens (volgens B e ij e-rinck identiek met Ph. phosphorewn), in de verwachting ook daarmede een overeenkomstig effect te kunnen aantoonen (51). Het gelukte hem echternbsp;niet om, zelfs onder gebruikmaking van hooge lichtintensiteiten, een doovendnbsp;effect van uitwendige bestraling te constateeren. Met de gedachte, dat mogelijkerwijze het herstel der lichtintensiteit na de bestraling tot op zijn oorspronkelijke waarde zeer snel zou verloopen, richtte hij zijn proeven zoo in, datnbsp;binnen 1/200 secunde na de bestraling het door de suspensie ge�mitteerde lichtnbsp;kon worden waargenomen. Een waarneembaar positief effect bleef echter uit.nbsp;Zijn conclusie luidde dan ook, dat de intensiteit van het door lichtbacteri�n uitgezonden licht niet door uitwendige bestraling wordt be�nvloed. Aangeziennbsp;zoowel de waarnemingen van van Schouwenburg en van dernbsp;Burg als die van Harvey op een visueele methode berustten, moeten wijnbsp;wel aannemen, dat Harvey toch nog met te geringe intensiteiten heeftnbsp;bestraald. Voor de inactiveering van C�/pridma-luciferine-oplossingen zijn betrekkelijk lage intensiteiten voldoende. Klaarblijkelijk bereikt � zooals reedsnbsp;door van Schouwenburg en van der Burg in ander verband isnbsp;opgemerkt (107) � door de speciale structuur van de kleine, sterk licht-brekende, coccenvormige cellen van Ph. phosphorewn slechts weinig licht hetnbsp;inwendige van de cel.

De opheffing van een bepaalde remming der ademhaling door CO vonden van Schouwenburg en van der Burg bij gelijke intensiteit van het ingestraaldenbsp;licht voor een gistsuspensie aanzienlijk veel grooter dan voor een suspensie van Ph.nbsp;phosphoreum. Ook hier moet in het geval van de lichtbacteri�n de intensiteit van hetnbsp;ingestraalde licht zeer hoog zijn om een buiten de proef fout vallend effect te kunnennbsp;waarnemen.

� 2, Bespreking van de principieele mogelijkheid om uit het bestralingseffect het absorptiespectrum van het lichtabsorbeerende molecule te bepalen.

Het door van Schouwenburg en van der Burg waargenomen effect van bestraling op de intensiteit van het door Ph. phosphoreum uitgezonden licht schept een zeer belangwekkende mogelijkheid om op de indirecte wijzenbsp;iets naders omtrent de eigenschappen van het lichtgevend systeem te leerennbsp;kennen.

Wij mogen uiteraard aannemen, dat de photo-werking, met als resultaat een reversibele afneming van de intensiteit van het bacterielicht, hetzij direct aangrijpt op het lichtemitteerend systeem, hetzij op een molecule, dat daarmedenbsp;in de nauwste relatie staat.

Om nu te doen inzien, welke belangrijke experimenteele mogelijkheid in de beschreven waarneming van van Schouwenburg en van dernbsp;Burg ligt opgesloten, knoopen wij aan bij de twee hoofdwetten uit de photo-chemie.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Volgens de wet van G r o 11 h u s-D r a p e r kan slechts door eennbsp;systeem geabsorbeerde energie op dat systeem photochemisch inwerken. Ondernbsp;systeem verstaan wij hier mede eventueel werkzame sensibilisatoren.

Een veel gebruikte uitdrukking voor deze wet is ook, dat een systeem photochemisch niet wordt aangetast door straling, welke door het betreffende systeem niet wordt geabsorbeerd.

De door een chemisch systeem geabsorbeerde straling behoeft echter niet photochemisch werkzaam te zijn; in de meeste gevallen wordt slechts de kinetische energie van de moleculen verhoogd en de temperatuur van het systeem stijgt, zonder dat eenigenbsp;chemische reactie plaats vindt.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Volgens de photochemische aequivalentie-wet van Einstein, oefentnbsp;ieder geabsorbeerd quant dezelfde primaire photochemische werking uit ennbsp;wel de activeering van ��n molecule.

De nadruk dient hier wel zeer speciaal te vallen op de primaire werking, aangezien door het veelvuldig optreden van volg- en kettingreacties het uiteindelijk reactiebeeld vaker een afwijking dan een bevestiging van de wetnbsp;van Einstein oplevert. Wat uiteindelijk de grootte van het quantenrende-

i. nbsp;nbsp;nbsp;jnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;j �1...nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;aantal omgezette moleculen

Wij kunnen nu onder toepassing van de bovengenoemde wetten als volgt redeneeren.

Indien wij voor een willekeurig lichtgevoelig systeem de photochemische inactiveering nagaan voor licht van verschillende golflengten, doch voor gelijkenbsp;aantallen ingestraalde quanten, dan zijn wij in staat een �inactiveerings-spectrum� te bepalen, waarbij de gebruikte golflengten zijn uitgezet tegen de

� voorloopig nog in willekeurige maat uitgedrukte � photochemische inacti-veering door ieder der gekozen golflengten veroorzaakt. Nu kan slechts geabsorbeerde straling photochemisch werken, waaruit volgt, dat dit inactiveerings-of ^verkingsspectrum identiek is met het absorptiespectnim van dat bestanddeel van het ge�nactiveerde systeem, hetwelk de werkzame straling heeft geabsorbeerd. (Onder identiteit verstaan wij in dit verband ook evenredigheid over het geheele golflengtegebied). Voor ons beteekent dit, dat wij, door licht-bacteri�n te bestralen met licht van verschillende golflengten en de optredendenbsp;dooving van het bacterielicht te bepalen voor gelijke aantallen ingestraaldenbsp;quanten, in staat zijn het inactiveeringsspectrum en daarmede het absorptie-spectrum van een bij de lichtemissie nauw betrokken molecule vast te leggen i).

Het is niet overbodig vast te stellen, welk deel van het absorptie-spectrum wij in dit verband beschouwen.

Indien men spreekt over het absorptiespectrum zonder meer, bedoelt men hiermede gewoonlijk het electronen-bandenspectrum en laat daarbij bewust de rotatie- en vibratie-bandenspectra buiten beschouwing. Ook in ons geval vallen de beide laatstgenoemdenbsp;spectra buiten de discussie, aangezien de energie�n, welke met deze spectra samenhangen, voor het bewerken van photochemische omzettingen te gering zijn. Slechts denbsp;bij het aanslaan van electronen-niveaux werkzame energie�n zijn in staat photochemische omzettingen te bewerkstelligen.

Nu is het bekend, dat zeer kortgolvige straling door vrijwel alle organische moleculen wordt geabsorbeerd, waarbij dan tevens een min of meer destructieve ontleding van die moleculen plaats vindt. Deze photochemische destructie en de er aan voorafgaande lichtabsorptie hebben wij bij de bestudeering van het onderhavige photochemische verschijnsel echter niet op het oog.

Wat wij in dit verband als photochemische inactiveering zouden willen beschouwen, hangt samen met electronenovergangen in het voor het photogevoelige molecule kenmerkende chromophore systeem en dus met het voor dat systeem kenmerkendenbsp;absorptiespectrum.

Wij moeten intusschen opmerken, dat de gelijkstelling van het photochemische werkingsspectrum en het absorptiespectrum, hoewel zeer aannemelijk, niet zonder eenige restrictie toelaatbaar is. De waarde van het quantenrendement bij de photochemische reactie doet principieel niet terzake, w�l echternbsp;of het quantenrendement over het geheele golflengtegebied dezelfde waardenbsp;heeft. Dit laatste behoeft nu niet zonder meer het geval te zijn; wij kunnennbsp;ons toch indenken, dat in eenzelfde molecule verschillende aanslagmogelijkheden, ieder met een eigen quantenrendement, aanwezig zijn.

De temperatuur is in dit verband van minder belang. Bestaat de photochemische reactie uit de absorptie van een lichtquant en ��n volgreactie, dan is de geheele reactienbsp;onafhankelijk van de temperatuur; zijn er meerdere gekoppelde volgreacties, dan wordt

1) Hoewel wij ons bij de verdere uiteenzettingen op het standpunt zullen blijven stellen, dat het bestudeerde bestralingseffect door een directe inwerking op een bestanddeel van het lichtemitteerend systeem tot stand komt, zullen wij in hoofdstuk XIV denbsp;mogelijkheid, dat het op de beschreven wijze bepaalde inactiveeringsspectrum een sen-sibilisatorspectrum zou zijn, nog aan een nadere beschouwing onderwerpen.

de geheele reactie temperatuur-afhankelijk, waarbij de temperatuui�sinvloed de gewone wetten der chemische kinetica volgt. Zou dus ^ al een andere waarde krijgen, dannbsp;hangt deze waarde niet samen met het primaire proces � de temperatuurco�fficientnbsp;van photochemische processen is bovendien meestal zeer gering � en uit zich dit slechtsnbsp;in een over het geheele golflengtegebied evenredige hoogteverandering van het wer-kingsspectrum.

Uiteraard kan slechts het achteraf vinden van hetzelfde absorptiespectrum aan een der in zuivere toestand ge�soleerde componenten van het lichtgevendnbsp;systeem het uiteindelijke bewijs leveren voor de identiteit van photochemischnbsp;inactiveerings- en absorptiespectrum. Dit neemt niet weg, dat er gronden zijnnbsp;aan te voeren, die de identiteit van photochemisch inactiveeringsspectrum ennbsp;absorptiespectrum in hooge mate waarschijnlijk maken. In de volgende paragraaf zullen wij namelijk zien, dat het in sommige gevallen is gelukt, hetnbsp;absorptiespectrum van een verbinding op twee wijzen te bepalen; in de eerstenbsp;plaats door directe meting aan de zuivere verbinding en voorts langs indirecte photochemische weg, waarbij steeds volledige overeenstemming tus-schen de op beide wijzen bepaalde spectra werd gevonden.

Men zal zich na bovenstaande uiteenzettingen wellicht afvragen of het niet raogelijk is, door directe meting van de lichtabsorptie van een dunnenbsp;laag bacteri�n of van een bacterie-extract, gegevens te verkrijgen over denbsp;lichtabsorptie van het in de bacteri�n aanwezige lichtgevende systeem of eennbsp;onderdeel daarvan.

Wij wijzen er echter op, dat men bij een normale absorptiemeting alle in het onderzochte spectraalgebied absorbeerende bestanddeelen van denbsp;bacteriecel mede bepaalt; een directe meting van de absorptie mist iederenbsp;specificiteit.

Rottier (102) heeft, zij het ook om andere redenen, absorptiemetingen aan extracten van lichtbacteri�n verricht. De naar de zijde van het ultra-violetnbsp;zeer sterk oploopende absorptiespectra vertoonen geen enkele karakteristiekenbsp;afwijking van op dezelfde wijze bepaalde spectra van niet-lichtende micro-organismen.

De hierboven in beginsel aangegeven indirecte methode ter bepaling van het absorptiespectrum van een der bij de lichtemissie betrokken moleculennbsp;is gekenmerkt door haar specificiteit; temidden van de veelheid der absor-beerende systemen zijn wij in staat ��n enkel systeem door een specifiekenbsp;eigenschap � de reversibele uitdooving van het ge�mitteerde licht bij uitwendige bestraling � afzonderlijk te bestudeeren.

Wij herinneren in dit verband aan een uitlating van Warburg (114), die ceteris 'paribus ook voor het hier gestelde probleem kenschetsend is:

�Da die Erfahrung lehrt, dasz man die Katalysatoren der lebendigen �Substanz � die Fermente � von ihren inaktiven Begleitstoffen nicht trennennbsp;�kann, so liegt es nahe, auf die Methoden der praparativen Chemie zu ver-�zichten, und die Fermente unter ihren nat�rlichsten Wirkungsbedingungen,nbsp;�in der lebenden Zelle selbst, zu untersuchen. Sie sind hier zwar im Sinn

�der praparativen Chemie so unrein wie m�glich. Findet man aber Reagenzien, �die nur mit den Fermenten und nicht mit den �brigen Zellbestandteilehnbsp;�reagieren, so stort die inaktive Zellsubstanz ebensowenig, wie bei chemischennbsp;�Reaktionen die Gefasze storen, in denen man die Reaktionen ausf�hrt. Dannnbsp;�kann man die Fermente wie reine Stoffe untersuchen und aus ihren Reak-�tionen auf ihre Zusammensetzung schlieszen.�nbsp;� 3. Bespreking van enkele overeenkomstige onderzoekingen uit de litteratuur.

Lasareff (88) onderzocht in 1907 het bekende verschijnsel van het bleeken van lichtgevoelige organische kleurstoffen onder invloed van uitwendige bestraling. Zette hij voor de verschillende ingestraalde golflengten denbsp;mate, waarin een kleurstof was gebleekt, uit tegen de golflengte, dan kreeg hijnbsp;een curve, die vrijwel identiek was met de curve, welke weergaf hoeveel energienbsp;(uitgedrukt in calorie�n) van elk der onderzochte golflengten tijdens de bestraling door de kleurstoflaag was geabsorbeerd.

Hij vond aldus, dat binnen de waarnemingsfout photochemisch werkings-spectrum en absorptiespectrum samen vielen. De geringe systematische afwijking, welke tusschen de twee spectra bleek te bestaan, valt weg, indien men de geabsorbeerde energie niet, zooals Lasareff deed, uitdrukt in calorie�n doch in quanten, zooals de wet van Einstein dit verlangt.

O. Warburg heeft tezamen met N e g e 1 e i n in zijn beroemde onderzoekingen over de chemische aard van het ademhalingsferment voor het eerst langs indirecte, photochemische weg aan biologisch materiaal het absorptiespectrum van een daarin aanwezige katalytisch werkzame verbinding bepaaldnbsp;(115, 117, 118). Reeds vroeg had hij verwantschap vermoed tusschen hetnbsp;in alle aerobe cellen aanwezige ademhalingsferment en de in het bloed voorkomende zuurstof overdrager haemoglobine, die beide gevoelig zijn voor blauwzuur en koolmonoxyde.

Nu hadden Haldane en Smith (39) reeds in 1896 gevonden, dat de verbinding tusschen koolmonoxyde en haemoglobine lichtgevoelig is en datnbsp;het evenwicht

dat zich in het donker instelt, door belichting naar links verschuift. Warburg overwoog, of niet oqk de verbinding: van koolmonoxyde metnbsp;het ademhalingsferment lichtgevoelig zou kunnen zijn en vond inderdaad, datnbsp;de remming van de ademhaling van gistcellen door koolmonoxyde door belichting der cellen gedeeltelijk werd opgeheven. De opheffing was, behalvenbsp;van de intensiteit, afhankelijk van de golflengte van het gebruikte licht. Doornbsp;achtereenvolgens te bestralen met licht van verschillende golflengte en bekendenbsp;quantenintensiteit kon hij uit de mate van opheffing der ademhalingsremmingnbsp;besluiten tot de mate, waarin de gebruikte golflengte door de verbindingnbsp;CO-ademhalingsferment werd geabsorbeerd, m.a.w. tot het relatieve absorptiespectrum van deze verbinding.

Warburg was in staat aan de hand van modelreacties met systemen, die chemisch zeer nauw verwant zijn met het door hem in de cel vermoedenbsp;systeem, de juistheid van de gevolgde bepalingsmethode te bewijzen. In hetnbsp;haemonicotine vond hij een stof die katalytisch werkzaam is bij de oxydatienbsp;van cyste�ne tot cystine en waarvan de CO-verbinding, evenals die van hetnbsp;ademhalingsferment, lichtgevoelig is. Voor de koolmonoxyde-verbinding vannbsp;haemonicotine vond hij nu een zeer goede overeenstemming tusschen het rechtstreeks (bolometrisch) opgenomen absorptiespectrum eh het photochemischenbsp;werkingsspectrum, dat de mate van opheffing der CO-remming van de doornbsp;haemonicotine gekatalyseerde oxydatie-reactie voor verschillende golflengten bijnbsp;gelijke ingestraalde quantenintensiteit weergaf. Later bewees hij tezamen metnbsp;N e g e 1 e i n in nog twee andere gevallen de identiteit tusschen het absorptiespectrum en het relatieve photochemische werkingsspectrum, nl. voor het kool-monoxide-ferrocyste�ne en het koolmonoxide-pyridine haemochromogeen (116).

In 1930 onderzocht Gates (32) het bekende verschijnsel van de letale werking van ultra-violette straling op micro-organismen. Hij bestraalde culturennbsp;van Bact. coli met monochromatisch ultra-violet licht van bekende intensiteitnbsp;en bepaalde voor verschillende golflengten de hoeveelheid energie, welke moestnbsp;worden ingestraald, om 50 % van de cellen te dooden. De reciproke van denbsp;aldus gevonden curve gaf voor de diverse golflengten bij gelijke ingestraaldenbsp;energie de mate van letaliteit weer. Deze letaliteitscurve strekte zich uit totnbsp;even voorbij 300 mg, had een maximum bij 260 a 270 mg, een minimum bijnbsp;� 240 mg, terwijl bij nog kortere golflengten de letale werking weer snelnbsp;steeg. Tegelijkertijd bepaalde hij door directe meting het absorptiespectrumnbsp;van een laag coK-bacteri�n (laagdikte 0.8 g). Het absorptiespectrum en hetnbsp;letaliteitsspectrum waren identiek.

Kubowitz en Haas (78) bestudeerden aan een zuiver urease-prepa-raat de photochemische inactiveering door monochromatisch licht van verschillende golflengte. Het door hen gevonden inactiveeringsspectrum stemde volkomen overeen met het door directe meting bepaalde absorptiespectrum vannbsp;urease. De inactiveering begon bij � 265 mg en nam beneden 250 mg zeernbsp;snel toe.

Op overeenkomstige wijze als Kubowitz en Haas bepaalde Gates in 1934 (33, 34) het absorptiespectrum en het photochemische inactiveeringsspectrum van pepsine. Ook in dit geval stemden de spectra met elkaar overeennbsp;en er bestond groote overeenkomst met het door Kubowitz en Haasnbsp;bepaalde urease-spectrum.

het inactiveeringsspectrum van het tabaks-moza�ekvirus, dat boven 3100 A g��n photo-inactiveering optreedt, dat na een regelmatige stijging de curve

bij � 2650 A een vrij vlak maximum heeft, terwijl bij nog kortere golflengten de photochemische werkzaamheid, na een geringe daling, zeer snel stijgt.nbsp;In 1937 publiceerden Lavin en Stanley (89) het absorptiespectrumnbsp;van een kristallijn preparaat van het tabaks-moza�ekvirus. Dit absorptie-

spectrum stemde in wezen overeen met het door Duggar en Hollaender gevonden photochemische inactiveeringsspectrum.

Tenslotte moge nog worden gewezen op een onderzoek van B�nning (13). Deze onderzoeker bepaalde de phototropische gevoeligheids-curve voor spo-rangi�ndragers van Piloholus voor licht van verschillende golflengten. Dezenbsp;curve vertoonde twee maxima nl. bij ca 445 mu en bij ca 485 mg en eennbsp;minimum bij ca 460 mg. B�nning toonde vervolgens aan, dat in de spo-rangi�ndragers een carotino�de voorkomt, waarvan het absorptiespectrumnbsp;overeenstemt met de bovengenoemde phototropische gevoeligheidscurve.

Wij zien uit deze voorbeelden, welke op zeer uiteenloopende typen van verbindingen betrekking hebben, hoe in de tot dusverre bestudeerde gevallennbsp;steeds overeenstemming werd gevonden tusschen het photochemische inactiveeringsspectrum en het absorptiespectrum.

DE SAMENHANG TUSSCHEN DE EXPERIMENTEEL VAST TE STELLEN PHOTOCHEMISCHE WERKING EN DE ABSORPTIECO�FFICI�NT VAN HET RECEPTORMOLECULE.

De vraag is thans, op welke wijze wij uit de intensiteiten van het door de bacteri�n uitgezonden licht Yo en Y, respectievelijk voor en na de bestralingnbsp;met monochromatisch licht van de golflengte X, kunnen besluiten tot de waardenbsp;van de absorptie-co�fficient /3 van het bestanddeel van het lichtemitteerendnbsp;systeem, dat de werkzame straling heeft geabsorbeerd.

Nu ligt het voor de hand de intensiteit Y van het op ieder oogenblik door de bacteri�n uitgezonden licht rechtstreeks te koppelen aan de op dit oogenbliknbsp;aanwezige hoeveelheid m van de photogevoelige component M, met dien verstande, dat

Voor de photochemische ontleding van de component M geldt, dat deze evenredig is met het aantal door deze verbinding geabsorbeerde quanten, m.a.w.

A het aantal per tijdseenheid door de stof M geabsorbeerde quanten; t de bestralingstijd.

Igo de quantenintensiteit (quanten/cm2 x sec.) is van het ingestraalde licht in de bacteriecellen ter plaatse van het absorbeerend systeem ^),

1) Wij gaan hierbij eenvoudigheidshalve uit van de veronderstelling, dat Igo in alle bacteriecellen dezelfde waarde heeft.

y een numerieke constante is, waarvan wij in hoofdstuk XIII de waarde zullen berekenen.

In deze vergelijking zijn nu Y en t rechtstreeks te bepalen experimen-teele grootheden, terwijl p en y constanten zijn.

Slechts over I^o moet nog het een en ander worden opgemerkt. Deze grootheid toch is niet voor experimenteele bepaling toegankelijk; wel geldt dit voor de intensiteit van het ingestraalde licht Iq, zooals dit ter plaatse waar denbsp;bacteri�n zich bevinden door de bestralingsbron wordt geleverd. Nu bestaatnbsp;er intusschen alle aanleiding om te besluiten, dat Iqo over het geheele golf-lengtegebied in eerste benadering evenredig zal zijn met Iq, een kwestie waaropnbsp;overigens hieronder nog zal worden teruggekomen. Wij mogen dus voor het

f' stelt dan voor het schijnbare quantenrendement van de photochemische omzetting, berekend op de quantenintensiteit van het ingestraalde licht zooalsnbsp;dit de bacteriecellen bereikt.

(8)

Het rechtstreeks te berekenen resultaat van een bestralingsproef is nu de uitdrukking In , welke wij in het vervolg als de photochemische werking Wnbsp;zullen aanduiden.

v?erking W evenredig is met 1, en met t en dus met het totale aantal ingestraalde quanten.

De kromme, welke het verband weergeeft tusschen W en A zullen wij verder als werkingskromme aanduiden.

Door nu voorts in een aan iedere bestralingsproef te koppelen intensiteits-meting van het ingestraalde licht de waarde van Iq vast te stellen, wordt het mogelijk de waarde van de verhouding

te berekenen, welke waarde dus onafhankelijk is van de bijzondere voorwaarden der proefneming en de photochemische werking per ingestraald quant weergeeft. Deze grootheid zullen wij als de specifieke photochemische werkingnbsp;aanduiden.

Het behoeft geen toelichting, dat de aldus bepaalde specifieke photochemische werking W(A) blijkens vergelijking (8) recht evenredig is met de absorptie-co�fficient p� van het bestanddeel van het lichtemitteerend systeem,nbsp;dat de werkzame straling heeft geabsorbeerd. Uit de vergelijkingen (8) ennbsp;(9) volgt

W{l) = PfXf'y. nbsp;nbsp;nbsp;(10)

Wanneer ^vij dus de kromme vaststellen, welke W(\) als functie van de golflengte A weergeeft, zal het aldus vastgelegde photochemische inactiveerings-spectrum tevens het gezochte absorptiespectrum in relatieve maat weergeven.

Zou de photochemische inactiveering met een quantenrendement ^ = 1 aantal omgezette moleculen \

Iq, dan konden wij uit het photochemische inactiveeringsspectrum, aangezien de getalwaarde van y bekend is (zie hoofdstuk XIII), direct het absolutenbsp;absorptiespectrum berekenen. Is het quantenrendement niet gelijk aan 1 dochnbsp;kleiner (het meest waarschijnlijke geval) en (of) Iqo niet gelijk aannbsp;Iq, dan zijn W (A) en nog door een onbekende evenredigheidsfactor f', hetnbsp;schijnbare quantenrendement, verbonden.

Nadat wij in het bovenstaande de betrekking tusschen de moleculaire absorptie-co�fficient pen de specifieke photochemische werking W(A) hebbennbsp;afgeleid, is het gewenscht nader in te gaan op eenige beperkende veronderstellingen, die wij bij de afleiding moesten invoeren.

uitgegaan van de veronderstelling, dat ^ nbsp;nbsp;nbsp;in woorden, dat de intensiteit

van het bacterielicht evenredig zou zijn met de hoeveelheid van een voor de lichtreactie essentieele stof M. Voorts hebben wij verondersteld, dat de photochemische werking evenredig is met de quantenintensiteit van het ingestraaldenbsp;licht en met de bestralingstijd, m.a.w., dat voor de bestudeerde photochemische

voor de aanvaarding van de wet van Bunsen-Roscoe voor de photo-chemische ontleding van de stof M. Bij de bespreking van de experimenteele resultaten komen wij op deze kwestie en op die van het quantenrendementnbsp;nog terug.

Een tweede beperking hangt samen met onze veronderstelling, dat de verhouding van Iqo (de quantenintensiteit van het ingestraalde licht in denbsp;bacteriecellen ter plaatse van het absorbeer end systeem) en Iq (de gemetennbsp;quantenintensiteit van het ingestraalde licht ter plaatse van de bacteri�n)nbsp;over het geheele onderzochte golflengtegebied dezelfde zou zijn. Deze laatstenbsp;veronderstelling houdt namelijk in, dat de grootte van het lichtverlies bijnbsp;doorstraling van de bacteri�n niet, of slechts zeer weinig, van de golflengtenbsp;afhankelijk mag zijn. Zou nu het lichtverlies mede zijn oorzaak vinden in eennbsp;sterke lichtabsorptie door de bestanddeelen van de bacteriecellen, dan viel ditnbsp;zeker niet te verwachten, aangezien bekend is, dat de lichtabsorptie in biologisch materiaal naar de zijde van het ultra-violette spectraalgebied zeernbsp;sterk toeneemt. In dit geval zou het ons niet zonder meer mogelijk zijn denbsp;opgetreden photochemische werking met de intensiteit van het ingestraaldenbsp;licht in verband te brengen. In � 3 van hoofdstuk VIII is evenwel een proefnbsp;beschreven die aantoont, dat het lichtverlies door absorptie bij doorstralingnbsp;van een bacteriesuspensie inderdaad verwaarloosbaar klein is.

Vermelding verdient nog, dat wij in een enkel geval � namelijk bij de bestudeering van het herstel der lichtintensiteit na afloop van de bestraling, de herstelreactie (zie

hoofdstuk XI) � van de hierboven afgeleide formuleering W = In y� voor de photochemische werking zullen afwijken en gebruik zullen maken van de uitdrukking W = Y �Y

�� welke, met 100 vermenigvuldigd, de procentueele intensiteitsvermindering van

Men dient echter goed te beseffen, dat deze laatste uitdrukking voor de afleiding van de specifieke photochemische werking niet kan worden gebruikt, aangezien zij, in

tegenstelling tot de uitdrukking W = In , niet evenredig is met het aantal ingestraalde quanten.

Tenslotte willen wij nog opmerken, dat de absolute intensiteiten van het door de bacteri�n uitgezonden licht niet ter zake doen, aangezien deze tochnbsp;slechts als verhouding in onze definitie van de photochemische werking voorkomen. Wij kunnen bij het bepalen van deze intensiteiten volstaan met hetnbsp;bepalen van de relatieve intensiteiten, uitgedrukt dus in een willekeurigenbsp;maat.

Aanvankelijk hadden wij het voornemen de te gebruiken golflengten te isoleeren uitgaande van lichtbronnen, welke een lijnenspectrum uitzenden, bijv.nbsp;de kwiklamp en de heliumlamp.

Reeds spoedig bleek evenwel, dat de benoodigde intensiteiten zeer hoog moesten zijn, wilden wij een buiten de foutengrens van onze bepalingsmethodenbsp;liggende intensiteitsvermindering van het bacterielicht verkrijgen, zoodat denbsp;bepaling van de photochemische werking slechts voor drie lijnen, namelijknbsp;de 366 mg, de 405 mg en de 436 mg-lijn en het spectraalgebied boven denbsp;500 mg, alle afkomstig uit de straling van een kwikdamplamp, mogelijk bleek.

Voor deze bestralingsproeven gebruikten wij Ph. phosphoreum, omdat deze bacterie van de in ons bezit zijnde vormen het sterkst lichtend is. Hetnbsp;kweeken geschiedde bij een temperatuur van 15 'k 17� C in aeratiekolvennbsp;volgens K1 u y V e r.

Als cultuurvloeistof gebruikten wij een oplossing van de volgende samenstelling :

De pH werd met een verdunde NaOH-oplossing gebracht op ca. 7.4. Na het steriliseeren werden 350 cm^ cultuurvloeistof ge�nt met enkele druppelsnbsp;van een geconcentreerde bacteriesuspensie, afkomstig van een cultuurhuis. Innbsp;afhankelijkheid van de temperatuur waren na 12 tot 18 uur aereeren de groeinbsp;en het lichten optimaal.

Voor de proeven werden de bacteri�n afgecentrifugeerd, ter verwijdering van pepton opgespoten in een 3 %-ige NaCl-oplossing, opnieuw afgecentrifugeerd en tenslotte opgespoten in een medium bestaande uit gelijke voluminanbsp;van een 3 %-ige glucose-oplossing en een oplossing bevattende % m phosphaat-buffer van pH 7.6 en 4% NaCl.

Het uiteindelijk suspensiemedium bevatte dus 2 % NaCl, VA % glucose en 34 m phosphaatbuffer. Glucose en phosphaatbuffer werden afzonderlijk gesteriliseerd, teneinde een met bruinkleuring gepaard gaande ontleding der glucose te voorkomen.

De dichtheid van de bacteriesuspensie bedroeg bij alle proeven 10 Tromsdorff-eenheden per cms. E�n Tromsdorff-eenheid (1 T.E.) =nbsp;1 mm3 vochtige bacteri�n.

Gedurende de bestralingsproef werd de bacteriesuspensie door middel van een fijn uitgetrokken capillair geaereerd.

Ook door de voorraad-suspensie werd voortdurend lucht geleid. Hierdoor bereikten wij, dat de lichtintensiteit der bacteriesuspensie slechts zeer langzaam in de loop dernbsp;tijd afnam. Ph. phosphoreum is namelijk zeer gevoelig voor anaerobiose, welke eennbsp;blijvende beschadiging van de cellen en een snelle achteruitgang van de lichtintensiteitnbsp;tengevolge heeft (68).

Voor het bepalen van de lichtintensiteit van de bacteriesuspensie v��r en na de bestraling werd in beginsel gebruik gemaakt van de reeds doornbsp;Eymers en van Schouwenburg gebruikte wisueele methode (27),nbsp;welke is gebaseerd op hun waarneming, dat de spectrale samenstelling vannbsp;het door Ph. phosphoreum uitgezonden licht niet afhankelijk is van uitwendigenbsp;omstandigheden. De proefopstelling is weergegeven in figuur 3.

Opstelling voor het bepalen van de relatieve intensiteit van het bacterielicht en voor de bestraling der bacteriesuspensies.

Cuvet Cl bevat de bacteriesuspensie, waarin door middel van het capillaire buisje B fijn verdeelde lucht wordt geblazen. In het scherm S, bevindt zich een kleinenbsp;opening O, waardoor het bacterielicht naar voren wordt uitgestraald. Het lichtnbsp;van de langs de rail R beweegbare lamp A valt via het kleurfilter Ca op de voorzijde Van het scherm Si. Bij wegvallen der contouren van de opening O is denbsp;stand van de lamp A een relatieve maat voor de intensiteit van het bacterielicht.nbsp;Het licht van de bestralingsbron L valt via het kleurfilter F op de cuvet Ci.

De bacteriesuspensie bevond zich in de cuvet C^, welke was geplaatst achter het scherm Si. Dit scherm was aan de naar de cuvet Ci toegekeerdenbsp;zijde dof zwart, aan de voorzijde wit geschilderd. (De gebruikte witte lak vertoont in het zichtbare spectrum geen selectieve absorptie). Het scherm hadnbsp;op 23^ cm hoogte een cirkelvormige opening O van 5 mm doorsnede. Door deze

opening kon het licht van de bacteriesuspensie naar buiten treden. Anderzijds werd het witte voorvlak van Si belicht door de op constante spanning brandende lamp A (een 12 Volts autolamp), met tusschenplaatsing van de cuvetnbsp;C2. De cuvet C2 was gevuld met een oplossing van Neptunusblauw in waternbsp;van een zoodanige concentratie, dat de kleur van het doorgelaten licht overeenstemde met de kleur van het bacterielicht. Werd de langs de Zeiss-rail verplaatsbare lamp A nu zoo ingesteld, dat de contouren van de opening in schermnbsp;Si wegvielen, dan werd deze aan de voorzijde (door de lamp A) en aan denbsp;achterzijde (door de bacteriesuspensie) even sterk verlicht. Bij nauwkeurignbsp;constante spanning op de lamp A, is de stand van deze lamp dus een directenbsp;maat voor de intensiteit van het bacterielicht. Aan de voet van de lamp A wasnbsp;een wijzer aangebracht, waarmede op een langs de rail R bevestigde kwadratische schaal de relatieve intensiteit direct kon worden afgelezen. Iedere opgegeven intensiteit is het gemiddelde van 6 a 8 waarnemingen, welke tezamennbsp;ca 60 secunden duurden.

Doordat de spiraal van de lamp A klein is t.o.v. de afstand van A tot Si, mogen wij bij de berekening van de intensiteit van het op het voorvlak van Si vallende lichtnbsp;uit de stand van lamp A de kwadratenwet toepassen.

De bestraling van de bacteriesuspensie geschiedde met de eveneens langs de rail R verplaatsbare superhoogedruk-kwiklamp Li). Tusschen deze lampnbsp;en de bacteriesuspensie stond op ca 5 cm van de cuvet Ci een aan weerszijdennbsp;dofzwart scherm 83, met een opening ter grootte van de cuvet Ci. Voor dezenbsp;opening bevond zich het gewenschte kleurfilter F al naar gelang van de golflengte, waarmede een bestralingsproef werd uitgevoerd.

Ook de relatieve intensiteit van het voor de bestraling gebruikte licht kon voor iedere golflengte met voldoende nauwkeurigheid worden berekend, doornbsp;bij de diverse standen van de lamp L de kwadratenwet toe te passen.

Voor de stand van de lamp L, waarbij het midden van de lichtende kwartsbuis 20.5 cm was verwijderd van het midden der cuvet Ci, werd (willekeurig) de intensiteit op 100 gesteld. Voor de afstanden 20.5 � 1.7, 20.5 2.5,nbsp;20.5 -f- 5, 20.5 10, 20.5 -f 15, en 20.5 -h 20 cm werden de relatieve intensiteiten aldus resp. 118, 80, 66, 47, 35 en 27.

Na afloop van deze proeven legden wij de absolute intensiteit van elk der gebruikte lijnen bij een bepaalde stand van de lamp L vast. Een bestralingsproef verliep nu als volgt.

De cuvet Ci werd tot een daarop aangebrachte merkstreep gevuld met de bacteriesuspensie, terwijl er voor werd gezorgd, dat door het voortdurendnbsp;doorborrelen van fijne luchtbelletjes de suspensie met lucht verzadigd bleef.nbsp;De bepaling van de intensiteit van het bacterielicht, nadat deze gedurende eennbsp;periode van 10 minuten nagenoeg constant was gebleven, leverde de waardenbsp;van Yo op (de intensiteit van het bacterielicht v��r de bestraling). Gedurendenbsp;de volgende periode van 10 minuten werd de suspensie door middel van denbsp;lamp L en het filter F bestraald. Onmiddellijk hierna werd de intensiteit van

het bacterielicht opnieuw bepaald. Door deze bepaling vonden wij de intensiteit Y (de intensiteit van het bacterielicht na de bestraling).

Het filter voor de 436 mi(f-lijn bestond uit een combinatie van de Schott-filters BG 24 en GG 3 elk met een laagdikte van 2 mm.

De doorlating bij 436 mii bedroeg 45%, bij 405 mii 6 %. Straling met een golflengte kleiner dan 400 mp werd niet doorgelaten.

Oplossing van 0.?5 g chinine-hydrochloride en 30 mg diamantfuchsine in 100 cm3 96%-ige aethanol, met een laagdikte van 1 cm.

De doorlating bij 366 mii bedroeg 65.5%, bij 405 mfi 5%. Licht van grootere golflengte werd vrijwel niet doorgelaten. Beneden 366 mfi is denbsp;doorlating nog aanzienlijk, doch dit golflengtegebied werd door de gebruiktenbsp;lamp slechts met geringe intensiteit ge�mitteerd, terwijl bovendien de glazennbsp;cuvet Cl deze straling volkomen absorbeerde.

De gebruikte filters lieten behalve de aangegeven golflengten ook nog roode en infra-roode straling door, terwijl het 405 en het 436 mfi -filternbsp;bovendien in het groen en het geel nog straling lieten passeeren. Dit was bijnbsp;de bestralingsproeven niet van beteekenis, aangezien licht van deze golflengten op de lichtbacteri�n photochemisch niet werkt. Bij de energiemetingennbsp;moesten wij hier echter rekening mede houden.

Bij de bestralingsproeven konden wij de photochemisch niet werkzame, doch in verband met de energiemetingen ongewenschte straling boven 500 m/t niet elimineeren,nbsp;aangezien hierdoor ook het gewenschte golflengtegebied zoo zeer zou zijn verzwakt,nbsp;dat de photochemische werkingen voor de metingen te geringe waarden zouden hebbennbsp;verkregen.

Aangezien het niet mogelijk was in de door ons gebruikte apparatuur meer dan ��n bestralingsproef tegelijkertijd uit te voeren, werd ter eliminee-

ring van de vrij groote spreiding bij de meting van ieder der gewenschte intensiteiten achtereenvolgens een reeks van 3 tot 6 bestralingen uitgevoerd. Voor ieder der gebruikte kwiklijnen zal als voorbeeld ��n volledige intensiteitsreeksnbsp;�worden weergegeven, terwijl de volledige resultaten tabellarisch zullen wordennbsp;samengevat. In de weergegeven grafieken zijn tenslotte de photochemische

groote spreidingen in de uitkomsten zijn de uiteindelijk berekende W�s niet weergegeven door punten doch door lijntjes, waarvan de lengte gegeven wordtnbsp;door 2e. e stelt de halve middelbare fout voor berekend met de formule

X�XI

gevonden afzonderlijke waarden van In en hun gezamenlijk gemiddelde voorstellen en n het totaal aantal waarnemingen.

In tabel II vindt men een overzicht van de uit een aantal intensiteits-reeksen voor W X 100 gevonden waarden.

Uit de grafiek volgt, dat binnen de nauwkeurigheid der door ons gevolgde methode voor de 436 m//-lijn de photochemische werkingen evenredig zijnnbsp;met de ingestraalde relatieve intensiteiten, zooals dit volgens de formulenbsp;W = lt;p'yj3^ Iqt wordt verlangd (zie hoofdstuk VII).

Samenvatting van de uit de intensiteitsreeksen berekende waarden van de photo chemische werking W (X 100), bij bestraling met de 436 mp-lijn.

Verband tusschen de relatieve bestralingsintensiteit en de photocbemische werking W (X 100), bij bestraling met de 436 m^a-lijn.

2. De 405 mti -lijn.

Het voor de isoleering van de 405 mw -lijn gebruikte filter had slechts een vrij geringe doorlating (25%) voor deze golflengte, aangezien het niet mogelijknbsp;was een groot doorlatend vermogen voor de 405 mft -lijn te combineeren metnbsp;een geringe doorlaatbaarheid voor de 436 mii -lijn.

Bij de toch al betrekkelijk geringe intensiteit van de 405 mflt; -lijn in het kwikspectrum, was het hierdoor niet mogelijk het verband tusschen W en denbsp;ingestraalde intensiteit voor een even groot aantal intensiteiten te onderzoeken

als voor de 436 en de 366 my-lijnen. Wij moesten ons tot drie relatieve intensiteiten beperken.

Het overzicht van de voor W X 100 in een aantal intensiteitsreeksen gevonden waarden is weergegeven in tabel IV.

Samenvatting van de uit de intensiteitsreeksen berekende waarden van de photochemische werking W (X 100), bij bestraling met de 405 mfi-lijn.

Ook voor de 405 mti -lijn vinden wij evenredigheid tusschen de relatieve bestralingsintensiteiten en de daardoor veroorzaakte photochemische werkingen.

3. De 366 mii -lijn.

Verband tusschen de relatieve bestralingsintensiteit en de photochemische werking W (X 100), bij bestraling met de 405 m/t-lijn.

TABEL V.

Tabel VI geeft een overzicht van de voor W X 100 in een aantal intensi-teitsreeksen gevonden -waarden.

TABEL VI.

Samenvatting van de uit de intensiteitsreeksen berekende waarden van de photochemische werking W (X 100), bijnbsp;bestraling met de 366 mfx-lijn.

Evenals voor de beide vorige lijnen vinden wij voor de 366 mu -lijn evenredigheid tusschen de relatieve bestralingsintensiteiten en de photochemische werkingen.

Hoewel dit gebied eenige zeer intensieve lijnen bevat, waaronder de groene kwiklijn bij 546 mu en de gele kwiklijnen bij 577 en 579 mf/, tradnbsp;door bestraling met dit spectraalgebied geen intensiteitsverandering van hetnbsp;bacterielicht op. Straling in dit golflengtegebied werkt dus op het lichtemit-teerend systeem van Ph. phosphoreum photochemisch niet in.

waarden voor de photochemische werkingen W (X 100) bij de relatieve intensiteit 100, weergegeven.

De voor de onderzochte golflengten gevonden waarden van de photochemische werking,nbsp;bij de relatieve bestralingsintensiteit 100.

Om uit deze waarden de specifieke photochemische werkingen te berekenen, moet de intensiteit van elk der gebruikte lijnen achter het voorvlak van cuvet Cj, eveneens bij de relatieve intensiteit 100, worden bepaald. Deze bepaling wordt in de volgende paragraaf beschreven.

� 3, De intensiteitsmetingen en de berekening van de specifieke photochemische werkingen.

De intensiteitsmetingen geschiedden met de in figuur 7 weergegeven opstelling. Voor zoover de notaties in deze figuur dezelfde zijn als in figuur 3 wil dit zeggen, dat zij op dezelfde onderdeden betrekking hebben.

is aangesloten op een gevoelige galvanometer G met spiegelaflezing. De uitslag van G is evenredig met de per secunde op het systeem van Th vallende energie in erg per cm2. Het gewenschte filter F is zoo dicht mogelijk tegennbsp;Th geplaatst, teneinde het binnentreden van niet-monochromatisch verstrooidnbsp;licht te voorkomen. Het midden van de lichtende kwartsbuis der lamp L bevindt zich op 20.5 cm afstand van het systeem van de thermozuil Th. Dezenbsp;afstand komt overeen met de bij de bestralingsproeven gebruikte relatievenbsp;intensiteit 100.

Bij de bestralingsproeven stoorde, zooals in de voorgaande paragraaf reeds werd opgemerkt, de door de gebruikte filters doorgelaten straling met eennbsp;golflengte grooter dan 500 mu niet; bij de bepaling van de intensiteiten vannbsp;de photochemisch werkzame golflengten moesten wij echter deze straling doornbsp;middel van een verschilmeting bepalen en op de totaal gemeten intensiteit innbsp;mindering brengen.

Het infra-rood elimineerden wij met behulp van cuvet W, gevuld met een 20 %-ige oplossing van kopersulfaat. De verschilmetingen ter elimineeringnbsp;van de zichtbare straling met een golflengte grooter dan 500 mu geschieddennbsp;door tusschenplaatsing van het Schott-filter GG 11 met een laagdikte vannbsp;4 mm (gestippeld geteekend en aangegeven met H), dat alle straling benedennbsp;500 mfi tegenhoudt en straling boven 500 mp voor ca 90 % doorlaat. Uiteraardnbsp;werd hierbij voor de verzwakking, welke de 366, de 405 en de 436 mp-lijnennbsp;door deze filters ondergingen, gecorrigeerd.

De intensiteitsmetingen werden bij dezelfde spanning op de lamp L uitgevoerd als de bestralingsproeven voordien. nbsp;nbsp;nbsp;,

De spanning op de lamp bedroeg 215 Volt; per Volt spanningsverandering vertoonde de galvanometeruitslag een gelijkgerichte verandering van 1.1 %.

Wij vonden, na de genoemde correcties te hebben toegepast, voor de drie kwiklijnen op 20.5 cm van het midden der lamp L de in tabel VIII onder Inbsp;weergegeven intensiteiten in erg per cm2 gec.

Met behulp van deze gegevens en met de in tabel VH (blz. 64) aangegeven waarden voor de photochemische werkingen W, zijn wij thans in staat voor de onderzochte golflengten de specifieke photochemische werking W(X)nbsp;(de photochemische werking per ingestraald quant) te berekenen.

Met de in � 5 van hoofdstuk IX aangegeven formule zetten wij de intensiteiten in erg per cm2 y gec. om in quanten per cm2 gec. Deze vindt men in de kolom I,. In de kolom Iq X t staat het totale aantal ingestraalde quantennbsp;(t = 600 sec.). Tenslotte zijn in de kolom W(A) de specifieke photochemische werkingen W(X) voor de onderzochte golflengten berekend.

De resultaten van de hierboven beschreven proeven zijn in figuur 8 grafisch weergegeven. De gevonden punten van het photochemische inacti-veeringsspectrum stellen volgens het vroeger besprokene tevens punten voornbsp;van het relatieve absorptiespectrum der photochemisch omgezette verbinding.

340 nbsp;nbsp;nbsp;380nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;420 460nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;500

A in

Bij vergelijking van deze waarden met die, welke wij voor dezelfde golflengten bij onze definitieve bestralingsproeven vonden, blijkt, dat de overeenkomst qua grootte-orde goed is, doch dat de laatstgenoemde waarden ongeveer een factor 2 lager zijn. Een omstandigheid, welke hierbij zeker een rol heeftnbsp;gespeeld, is de groote lichtverstrooiing, welke in een bacteriesuspensie optreedt,nbsp;waardoor tengevolge van de terugverstrooi�ng de gemiddelde bestralings-intensiteit in de bacteriesuspensie zeker hooger is geweest dan die, welke doornbsp;ons ter plaatse van het midden der suspensie werd bepaald.

Een indruk van de lichtverstrooiing in een suspensie van Ph. phosphoreum met een dichtheid van 10 T.E. per cm� kregen wij door de volgende proef.

De cuvet Ci, gevuld met de bacteriesuspensie (in figuur 5 niet aangegeven), werd zoo dicht mogelijk tegen de thermozuil Th geplaatst; het kleurfilter Fnbsp;zetten wij zoo dicht mogelijk voor de cuvet. Vervolgens bepaalden wij voor denbsp;436, de 405 en de 366 m/^f -lijn de galvanometeruitslagen van de thermozuil-galvanometercombinatie. Daarna deden wij hetzelfde, terwijl cuvet Ci metnbsp;water was gevuld. In tabel IX zijn de verkregen galvanometeruitslagen in cmnbsp;samengevat.

In tabel IX is onder 3 uitgerekend, hoeveel procent de intensiteit van het door de bacteriesuspensie doorgelaten licht bedraagt van die, welke door denbsp;met water gevulde cuvet wordt doorgelaten. Deze percentages stemmennbsp;voor de drie onderzochte golflengten nagenoeg overeen.

In de eerste plaats kunnen wij constateeren, dat het intensiteitsverlies in de richting van de ingestraalde bundel bij doorstraling van de bacteriesuspensie aanzienlijk is, namelijk ruim 50 %.

In de tweede plaats valt uit de beschreven proef af te leiden, dat de intensiteitsvermindering optredend hij doorstraling van de bacteriesuspensienbsp;in wezen berust op verstrooiing en dat hierbij de lichtabsorptie is te verwaar-loozen. Zou namelijk ook de lichtabsorptie een invloed van beteekenis hebben,nbsp;dan ware het intensiteitsverlies in de richting van het ultra-violet zeker sterknbsp;toegenomen. Het is toch een bekend feit, dat de lichtabsorptie in biologischnbsp;materiaal in de richting van het ultra-violette spectraalgebied zeer sterk toeneemt. Hierbij moge nog worden opgemerkt, dat de lichtverstrooiing in veelnbsp;mindere mate van de golflengte afhankelijk is.

Bovengenoemde conclusie is voor de interpretatie van de bestralings-proeven van veel belang, aangezien wij in hoofdstuk VII bij de afleiding van de formuleering voor de photochemische werking zijn uitgegaan van de ver-

onderstelling, dat het lichtverlies door absorptie bij het doorstralen van een bacteriesuspensie met de gebruikte dichtheid slechts een te verwaarloozennbsp;fractie zou zijn van de intensiteit van het ingestraalde licht. Deze veronderstelling is door de hierboven beschreven uitkomsten thans in eerste benadering experimenteel bevestigd.

Wij kunnen het resultaat van de bovenbeschreven proef ook tot uitdrukking brengen door te zeggen, dat voor de drie gebruikte spectraallijnen de gemiddelde intensiteiten in de bacteriesuspensie in dezelfde verhouding staan tot de intensiteiten, vt'aarmede zij werden ingestraald.

Zooals hierboven reeds werd opgemerkt, zien wij uit de in tabel IX gegeven cijfers, dat de lichtverstrooiing door de gebruikte suspensie van Ph. phosphoreum zeer aanzienlijk is. De consequentie hiervan is dat wij, alhoewelnbsp;de absolute quantenintensiteit van het ingestraalde licht is bepaald op denbsp;plaats, die wij bij de bestralingsproeven aangaven met: relatieve intensiteitnbsp;100, geenszins in staat zijn om de werkelijke intensiteit (c.q. het intensiteits-verloop) in de bacteriesuspensie aan te geven.

Hieruit volgt, dat aan de door ons gevonden waarden voor de specifieke photochemische werking zeker geen absolute waarde mag worden toegekend,nbsp;echter volgens bovenstaande uiteenzetting wel relatieve. Zoolang slechts voornbsp;iedere onderzochte golflengte blijft gelden, dat de gemiddelde intensiteit in denbsp;bacteriesuspensie in dezelfde verhouding staat tot de ingestraalde intensiteit,nbsp;stellen punten van het photochemische inactiveeringsspectrum tevens puntennbsp;voor van het relatieve absorptiespectrum van de photochemisch omgezettenbsp;verbinding.

Gezien het bemoedigende resultaat van onze voorloopige bestralingsproeven leek het gewenscht, deze proeven tot een grooter aantal golflengten uit te breiden. Weldra bleek echter, dat dit niet met de tot dusverre gevolgde methodenbsp;kon worden gerealiseerd, om.dat het niet mogelijk was, behalve de drie reedsnbsp;gebruikte lijnen, nog meer lijnen van voldoende intensiteit te isoleeren. Zelfsnbsp;bij gebruik van lichtbronnen die slechts lijnen uitzenden (bijv. de kwiklamp ennbsp;de heliumbuis), bleek het geenszins eenvoudig te zijn in het spectraalgebied,nbsp;dat voor ons onderzoek moest worden gebruikt: het blauw, het violet en hetnbsp;ultraviolet, met filtercombinaties lijnen te isoleeren. Het lukte dan ook nochnbsp;bij gebruik van een kwiklamp, noch bij dat van een heliumbuis, verderenbsp;spectraallijnen van voldoende zuiverheid in de voor onze proeven gewenschtenbsp;intensiteit af te zonderen.

Aanvankelijk hadden wij voor ons doel veel verwachtingen van het dispersiefilter volgens Christanse n-W e i g e r t, dat bij evenwijdig invallend licht een hoog rendement aan monochromatische straling geeft en waarvan het doorgelaten golflengtege-bied door de temperatuur van het filter wordt bepaald. Het gebruik van dit filternbsp;bracht echter evenmin verbetering, aangezien de groote verliezen hier optreden bij hetnbsp;evenwijdig maken van de lichtbundel, door de geringe openingshoek van het daarvoornbsp;benoodigde optische systeem.

Nu het niet mogelijk bleek om langs de weg van met filters ge�soleerde lijnen onze waarnemingen tot een grooter aantal golflengten uit te breiden,nbsp;restte ons slechts een poging te wagen om onder gebruikmaking van eennbsp;spectrograaf en onder gelijktijdige reductie van de afmetingen van de be-stralingscuvet, de bij bestraling van een bacteriesuspensie optredende photo-chemische werking aan te toonen.

De bacteriesuspensie bevond zich daartoe in een ronde cuvet van 3 cm lengte en yk cm doorsnede, die aan de buitenzijde wit was geverfd, op eennbsp;vertikale streep van 1 cm lengte en 1 mm breedte na. De cuvet werd tot evennbsp;boven de streep gevuld met een suspensie van Ph. pnospnoreum met een dichtheid van 10 T.E/cm3, waarvoor 2 cm� suspensie voldoende waren. De aeratienbsp;geschiedde met een fijn-uitgetrokken buisje. Een koolboog werd scherp af geheeld op de voorspleet van een Fuess kwartsspectograaf. De streep op denbsp;cuvet diende nu als spleet voor een bestraling gedurende tien minuten met hetnbsp;bij ca 436 mp liggende deel van het continue spectrum van de koolboog achternbsp;de spectrograaf. V��r en na de bestraling werd de intensiteit van het bacterie-licht bepaald, door meting van het uit de streep tredende licht, met behulpnbsp;van de in � 1 sub b beschreven visueele methode. Door de cuvet geheel wit tenbsp;verven bereikten wij, dat het in de cuvet gestraalde licht door herhaalde inwendige reflecties zoo volledig mogelijk werd benut. Desondanks namen wij bijnbsp;deze proef geen photochemische werking waar in een golflengtegebied, waarinnbsp;deze, blijkens onze in � 2 beschreven proeven, bij voldoende intensiteit vannbsp;het ingestraalde licht moet optreden.

Het was na deze pogingen duidelijk, dat wij, hoe hoopvol het aanvankelijk bereikte resultaat ook leek, voor ,een mogelijke uitbreiding van het inacti-veeringsspectrum over -een grooter golflengtegebied, naar een geheel anderenbsp;methode moesten omzien.

Wij vonden de oplossing, door van de bestraling van homogene bacterie-suspensies over te gaan naar die van plaatcultures.

De beschrijving van de gevolgde methode en de daarmede bereikte resultaten vormt het onderwerp van de volgende hoofdstukken van dit proefschrift.

DE DEFINITIEVE METHODE TER BEPALING VAN HET PHOTOCHEMISCHE INACTIVEERINGSSPECTRUM.

In � 4 van hoofdstuk VHI beschreven wij een poging om photochemische werking aan te toonen bij bestraling van een bacteriesuspensie, welke zich innbsp;een achter een spectrograaf geplaatste microcuvet bevond. Deze poging mislukte, doch bij critische beschouwing van de gebruikte proefopstelling liet hetnbsp;zich aanzien, dat er nog ��n principi�ele verbetering moest zijn aan te brengen.

Wanneer het namelijk zou gelukken alle bacteri�n, welke bij deze proef homogeen in de suspensie waren verdeeld, samen te brengen voor de op denbsp;cuvet aangebrachte spleet, zouden wij bereiken, dat alle bacteri�n tegelijkertijd aan de hoogste bestralingsintensiteit zouden zijn blootgesteld.

In beginsel was deze mogelijkheid te realiseeren door van een bacteriesuspensie over te gaan naar een plaatcultuur, bij welke wijze van kweeken de cellen een zeer compacte laag vormen.

Dat door toepassing van een plaatcultuur inderdaad een vergrooting van de bestralingseffectiviteit kan worden verkregen, bewees de volgende proef.

Onder gebruikmaking van dezelfde koolboog en spectrograaf als bij de hierboven genoemde bestralingsproef, bestraalden wij gedurende vijf minutennbsp;een plaatcultuur van Ph. phosphoreum, waarvan het oppervlak scherp op hetnbsp;uit de spectrograaf tredende spectrum was ingesteld. Na afloop der bestralingnbsp;namen wij over een gebied van ca 380 tot ca 460 m^i een duidelijke photochemische werking waar, in de vorm van een streep van geringere lichtintensiteit dan de daarnaast gelegen onbestraalde cultuurgedeelten. Wij brengennbsp;hierbij in herinnering, dat bij de overeenkomstige in � 4 van hoofdstuk VIIInbsp;beschreven bestralingsproef, bij een bestraling van 2 cm^ bacteriesuspensie metnbsp;het golflengtegebied bij ca 436 mu gedurende tien minuten, geen verminderingnbsp;van de intensiteit van het bacterielicht kon worden geconstateerd.

Bovendien bood het gebruik van de plaatcultuur boven dat van een suspensie nog de volgende voordeelen:

Ie een plaatcultuur heeft gedurende eenige uren een zeer constante lichtintensiteit ;

2e er is directe vergelijking mogelijk van de lichtintensiteiten van naast elkaar gelegen bestraalde en onbestraalde cultuurgedeelten.

De overgang van de homogene bacteriesuspensie naar de plaatcultuur be-teekende dus een principi�ele methodische verbetering.

heeft bijgedragen, was, dat wij in dit stadium voor ons onderzoek de beschikking kregen over een lichtbron, die de door ons aanvankelijk gebruikte koolboog en superhoogedruk-kwiklamp in intensiteit meermalen overtrof: de met waternbsp;gekoelde Philips superhoogedruk-kwiklamp SP 500. Zonder deze lichtbron zounbsp;het ons niet mogelijk zijn geweest het photochemische werkingsspectrum, zoo-als thans is geschied, tot beneden 300 m� te bepalen.

Een overweging, die eveneens heeft bijgedragen tot de overgang naar de plaatcul-tures was, dat het lichtverlies door verstrooiing in de zeer compacte bacterielaag van een plaatcultuur waarschijnlijk geringer zou zijn dan in een homogene suspensie metnbsp;gemiddeld veel grootere onderlinge afstand der cellen. Blijkens onze ervaringen bij denbsp;in � 3 van hoofdstuk VIII beschreven intensiteitsmetingen is het door verstrooiingnbsp;optredende lichtverlies bij bestraling van een homogene bacteriesuspensie zeer aanzienlijk.

In � 6 van dit hoofdstuk beschrijven wij een bestralingsproef, die bovenstaande zienswijze ten zeerste steunt.

De bepaling van de intensiteit van het bacterielicht v��r en na de bestraling geschiedde na invoering van de plaatcultuur niet meer visueel, doch langs objectieve, photografische weg. Het bleek namelijk mogelijk te zijn de bacterie-cultuur door middel van het eigen licht te photografeeren, waarvoor expositie-tijden van slechts 30 a 45 secunden noodig waren. In principe was hierdoor denbsp;mogelijkheid geopend om door ��n enkele bestralingsproef de photochemischenbsp;werking voor het geheele ingestraalde golflengtegebied te bepalen.

De intensiteit van het in�gestraalde licht werd direct in het spectrum achter de spectrograaf gemeten met de combinatie vacuumthermoelement-galvano-meter.

Het bleek wegens de geringe dispersie van de kwartsspectrograaf in het gebied gt; 400 mw noodzakelijk te zijn voor -de bepaling van de photochemische werking in het zichtbare spectrum een glasspectrograaf te gebruiken.

Het methodisch gedeelte van de bestralingsproeven valt uiteen in de volgende vier hoofdpunten:

c Het bepalen van de intensiteit van het bacterielicht voor en na de bestraling en de berekening van de photochemische werking.

d De meting van de spectrale energieverdeeling in het op de bacterie-cultuur geworpen spectrum en de berekening van de specifieke photochemische werking.

Van de aanvang af was het duidelijk, dat de eischen, welke aan de te gebruiken bacteriecultures moesten worden gesteld, zeer hoog waren: de intensiteit van het bacterielicht moest zoo hoog mogelijk zijn, teneinde de belichtingstijd bij de photografische intensiteitsbepaling zoo kort mogelijk te maken;

Onder de tot onze beschikking staande lichtbacteriestammen waren er slechts drie, welke een voor onze proeven voldoende lichtintensiteit bezaten,nbsp;namelijk Ph. phosphorettm, Ph. Fischeri en Ph. splewdidum. Een verderenbsp;beperking echter in de keuze van het voor onze proeven bruikbare bacterie-materiaal was gelegen in de noodzakelijkheid, de bacteri�n te bestralen op eennbsp;volkomen heldere, dus niet licht-verstrooiende, onderlaag. Een vaste voedingsbodem bereid met behulp van agar-agar is sterk opalescent en verstrooit dusnbsp;het licht zeer sterk. Het ligt voor de hand, dat ten gevolge hiervan de intensiteit van het op een willekeurige plaats der bacteriecultuur ingestraalde lichtnbsp;door een niet met zekerheid vast te stellen verstrooi�ngsfactor wordt be�nvloed,nbsp;terwijl door de verstrooiing tevens verontreiniging door licht van andere golflengten plaats vindt en dus de breedte van de ingestraalde golflengtegebiedennbsp;op onoverzichtelijke wijze afneemt. Een vaste voedingsbodem bereid met doornbsp;middel van kippeneiwit geklaarde gelatine is � althans in het zichtbare gebied � afgezien van een geringe T y n d a 11-verstrooi�ng optisch helder en isnbsp;naar wij meenen de eenige, welke aan deze eisch voldoet. Dientengevolge bleefnbsp;ons als eenig proefobject Ph. phosphorum over, aangezien zoowel Ph.nbsp;Fischeri als Ph. splendidum gelatine doen vervloeien.

Het kweeken van Ph. phosphoreum geschiedde in P e t r i-schalen op een voedingsbodem, bestaande uit 1% pepton-gelatine, die 3% keukenzout bevattenbsp;en 12% gelatine. Deze voedingsbodem werd ge�nt met een bacteriesuspensienbsp;met een dichtheid van 6 a 8 T.E. per cm^, welke door filtreeren (door filtreer-papier van Schleicher en Sch�ll no. 595) zorgvuldig was bevrijd vannbsp;vlokjes geagglutineerde cellen.

Dit filtreeren kon uiteraard nauwelijks onder aseptische voorwaarden geschieden. In dit stadium is dit echter niet zeer belangrijk meer, omdat vreemde micro-organismennbsp;naast de sterke overmaat der lichtbacteri�n in de korte kweektijd van 18 a 20 uur en bynbsp;een temperatuur van 15� a 17� C. waarbij werd gekweekt, zich blijkens onze ervaringennbsp;niet ontwikkelen op de door toevoeging van 3 % NaCl vrij selectieve voedingsbodem.nbsp;Wij hebben er ons van overtuigd, dat de cultures bij de bovenbeschreven wijze van behandelen na 3 maal 24 uur staan nog geen infectie vertoonden, terwijl wij ze steeds nanbsp;omstreeks 24 uur gebruikten.

Door heen en weer zwenken van de Petri-schaal bereikten wij, dat de entsuspensie homogeen over het geheele oppervlak werd verdeeld, waarbij hetnbsp;soms geruime tijd duurde, voordat alle luchtbelletjes van het oppervlak warennbsp;verdwenen. Nadat het gelatine-oppervlak geheel door de suspensie was bevochtigd, werd deze zoo volledig mogelijk afgeschonken. Het kweeken geschieddenbsp;vervolgens bij een temperatuur van 15� a 17� C. gedurende 18 a 20 uur. Nanbsp;deze tijd was de lichtintensiteit optimaal, bleef vervolgens eenige uren vrijwelnbsp;constant, om tenslotte met de tijd langzaam af te nemen.

Voor de bestralingsproeven met het in � 3 te beschrijven apparaat was het noodig, dat uit een aldus gekweekte cultuur gelatineblokjes werden gesneden met een volkomen gelijkmatige dikte. Wij bereikten dit door de volgendenbsp;kunstgreep.

De leege Petr i-schalen werden op een zoo goed mogelijk horizontale onderlaag opgesteld en tot een hoogte van % cm gevuld met een 2%-ige oplossing van agar-agar, welke 3% NaCl bevatte. Nadat deze laag was gestold,nbsp;werden in iedere P e t r i-schaal twee steriele microscopische vooiTverpglaasjesnbsp;met ca 1 cm tusschenruimte op de agarlaag gelegd. Hierop werd dan de pepton-gelatine in een laagdikte van a 1 cm gegoten. Nadat deze laag was gestold,nbsp;entten en kweekten wij op de boven beschreven wijze. Op elk der voorwerp-glaasjes bevond zich nu een overal even dikke laag gelatine, waarop de bacteri�n waren gegroeid.

Wilden wij tot een bestralingsproef overgaan, dan werd een voorwerp-glaasje met de geheele daarop liggende gelatinelaag uitgesneden, waarbij de onderzijde van het voorwerpglaasje van agar-agar werd bevrijd. Van de opnbsp;het voorwerpglaasje liggende gelatinelaag sneden wij met een scherp mesnbsp;zooveel weg, dat wij een in de lengterichting van het glaasje liggend gelatine-blokje overhielden, dat aan de bovenzijde 3,5 cm lang en 1 cm breed was. Denbsp;zijkanten van het gelatineblokje waren schuin weggesneden, zoodat de basisnbsp;iets grootere afmetingen had; dit werd gedaan om het aanhechtingsvlak vannbsp;het gelatineblokje te vergrooten, teneinde met het naderhand verticaal stellennbsp;van het voorwerpglas een doorzakken van de gelatinelaag te voorkomen. Hetnbsp;uiteindelijk beeld is in figuur 9 weergegeven.

Zijaanzicht

Boven- en zijaanzicht van een op het voorwerpglaasje D uitgesneden gelatineblokje.

Gedurende de verdere bewerkingen � photografeeren en bestralen � werd het voorwerpglaasje in de slede S van het in � 3 beschreven instelapparaatnbsp;bevestigd.

Microscopisch zijn bij een vergrooting van ca 120 maal op het gelatine-oppervlak geen afzonderlijke koloni�n van Ph. phosphoreum meer te zien; deze zijn vergroeid totnbsp;een samenhangend geheel zonder plekken, waarop het gelatine-oppeiwlak niet volledignbsp;met bacteri�n is bedekt.

Wij konden aantonnen, dat na het bereiken van de optimale lichtintensiteit geen verdere groei van de bacteriecultuur meer optrad. Dit geschiedde door de volgendenbsp;benaderende bepaling van de gemiddelde dikte der bacterielaag.

De in de P e t r i-schaal gegroeide bacteri�n werden na de gewenschte incubatietijd met behulp van een zacht penseel en een 3 %-ige NaCl-oplossing van het gelatine-oppervlak af geborsteld en homogeen verdeeld in een bekend volumen 3 %-ige NaCl-oplossing. Van de verkregen suspensie bepaalden wij in duplo de dichtheid in T r o m s-d o r f f-eenheden per cm� suspensie (mm� vochtige bacteri�n per cm� suspensie). Zoodoende vonden wij het volumen van de bacteriemassa, die op het geheele gelatine-oppervlak was gegroeid. Uit het bekende oppervlak van de cultuur kon nu worden berekend het volumen in mm� van de bacteri�n, welke op 1 mm^ van het cultuuroppervlak warennbsp;gegroeid.

Microscopisch was voor de gemiddelde doorsnede van de coccenvormige cellen van Ph. phosphoreum de waarde van ca lu gevonden. Van een enkelvoudige laag bacteri�n bedraagt de inhoud aanwezig op 1 mm^ cultuuroppervlak dus 0.001 mm�. Uit hetnbsp;voor de betreffende cultuur bepaalde bacterievolumen per mm^ kon, door deeling doornbsp;het volumen bij een laagdikte ��n, de gemiddelde laagdikte van de cultuur wordennbsp;gevonden.

dichtheid per cm�; 20 T.E., opgespoten in 7 cm� 3 %-ige NaCl-oplossing. totale hoeveelheid vochtige bacteri�n 140 mm�,nbsp;per mm*^ 140/9500 = 0.0147 mm� bacteri�n,nbsp;gemiddelde laagdikte 0.0147/0.001 = 15 bacteri�n.

dichtheid per cm�: 23.5 T.E., opgespoten in 7 cm� 3 %-ige NaCl-oplossing. totale volumen vochtige bacteri�n 165 mm�,nbsp;per mm^ 165/9500 = 0.0174 mm� bacteri�n,nbsp;gemiddelde laagdikte 0.0174/0.001 = 17 bacteri�n.

dichtheid per cm�: 20 T.E., opgespoten in 7 cm� 3 %-ige NaCl-oplossing. totale volumen vochtige bacteri�n 140 mm�,nbsp;per mm^ 140/9500 = 0.0147 mm� bacteri�n,nbsp;gemiddelde laagdikte 0.0147/0.001 = 15 bacteri�n.

Hoewel wat de absolute waarde van deze uitkomsten betreft zeker eenige reserve moet worden in acht genomen, mogen wij nochtans constateeren, dat na het bereikennbsp;van de optimale lichtintensiteit de groei practisch stilstaat. Aangezien wij de culturesnbsp;nooit binnen deze tijd voor onze bestralingsproeven gebruikten, mogen wij aannemen,nbsp;dat de bestralingsproeven niet door tusschentijdsche groei en daarmede verbonden veranderingen van de lichtintensiteit zijn gecompliceerd.

Wij kunnen uit de bepaling van de gemiddelde laagdikte der gebruikte cultures nog een belangrijke conclusie trekken. Bij onze voorbereidende bestralingsproeven (zienbsp;hoofdstuk VIII) vonden wij bij de intensiteitsmeting van het doorgestraalde licht,nbsp;dat � tenminste voor de 436, de 405 en de 366 mn -lijn � het intensiteitsverlies van denbsp;lichtbundel bij het doorstralen van een suspensie van Ph. phosphoreum met een dichtheid van 10 T.E. per cm� in wezen een verstrooi�ngseffect is en dat het lichtverlies doornbsp;absorptie verwaarloosbaar klein is. Denken wij ons de bacteri�n uit de suspensie, welkenbsp;een laagdikte had van 1 cm, neergeslagen als een vlakke laag, waarvan het oppervlak

in cm^ in getalwaarde gelijk is aan het volumen in cm� der suspensie, dan bedraagt de dikte van deze bacterielaag 100 bacteri�n.

Voor deze laag toonden wij aan, dat de absorptie bij de lichtverzwakking geen invloed van beteekenis heeft; eerst recht geldt dit dus voor de gebruikte plaatcultures,nbsp;waarvan de gemiddelde laagdikte zooals wij zagen slechts ongeveer 15 bacteri�n bedraagt.

Zooals in de inleiding over de grondslagen der methode reeds vrerd opgemerkt, kon de bepaling van het inactiveeringsspectrum voor het ultra-violette en het zichtbare spectraalgebied bezwaarlijk met ��n en dezelfde spectrograafnbsp;geschieden. Door de geringe dispersie in het zichtbare gebied was het metnbsp;name niet goed mogelijk het begin van het inactiveeringsspectrum aan de zijdenbsp;der lange golflengten met een kwartsspectrograaf voldoende nauwkeurig vastnbsp;te leggen. Onze bestralingsproeven vallen dus noodzakelijkerwijze in twee gedeelten uiteen. Aangezien wij de meeste experimenten met het ultra-violettenbsp;spectraalgedeelte hebben verricht, zullen wij de voorbeelden, welke ter illustratie van de gevolgde methode worden gegeven, kiezen uit de opnamen metnbsp;de kwartsspectrograaf. Het eenige verschil tusschen de twee opstellingen is,nbsp;dat voor metingen in het zichtbare spectraalgebied de kwartsspectrograaf wordtnbsp;vervangen door een glasspectrograaf met grootere dispersie.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Het apparaat, noodig om het cultuuroppervlak te brengen in het vlak,nbsp;waarin het spectrum scherp wordt afgebeeld.

ad 1. Figuur 10 vertoont een schematische afbeelding van de opstelling, waarmede het spectrum werd ontworpen.

De lichtbron L werd via het onveranderlijke diafragma D^ door middel van de kwartslens M scherp afgebeeld op de voorspleet Sp van de kwarts-spectograaf K.

Lens 1 bevond zich op een afstand van 13 cm van de voorspleet Sp; de afstand van lens 2 tot aan het gebied bij 360 mu in het spectrum bedroegnbsp;15 cm. De doorsnede der lenzen 1 en 2 was 3 cm. De dispersie in het spectrumnbsp;bij 360 m^i bedraagt 10 mu/mm. Als constante breedte van de spleet Spnbsp;namen wij 0.3 mm. Deze spleetbreedte kwam in het spectrum overeen met eennbsp;golflengtegebied, waarvan de breedte bedraagt; bij 400 mff, 12 m^ ; bij 360nbsp;mu, 9 mu ; bij 320 mu , 6,5 mft ; bij 280 mu , 4 mp . De overeenkomstige getallen, beboerende bij de voor metingen in het zichtbare spectraalgebied gebruikte glasspectrograaf, zijn op blz. 105 vermeld.

Het spectrum was scherp in het vlak S, dat op geringe afstand voorbij het achtervlak van de spectrograaf is gelegen. De intensiteit van het geheelenbsp;spectrum kon worden geregeld met behulp van het in de spectrograaf aangebrachte irisdiafragma Dg. V��r de spectrograaf bevond zich nog een sluiter SI.

Als lichtbron L gebruikten wij een watergekoelde Philips superhoogedruk-kwiklamp S.P. 500. Het spectrum van deze lamp vertoont een, vooral in het zichtbare spectraalgebied, sterke continue emissie, waarop de verbreede kwik-lijnen zijn gesuperponeerd. Ook in het nabije ultra-violet vertoont het continuum nog een aanmerkelijke intensiteit. Men zie hiervoor � 5 van dit hoofdstuk,nbsp;waarin de energiemetingen in het spectrum worden beschreven.

De lamp bestaat uit een dikwandig buisje van kwarts met ingesmolten wolfraam-electroden. In het capillaire lumen van het buisje bevindt zich een weinig kwik en een inactief gas onder hooge druk (� 70 atm.). De lengte van de ontlading, die door 700nbsp;Volt 50 perioden wordt in stand gehouden, bedraagt 12.5 mm, de doorsnede 1 mm. Denbsp;lamp werd via een transformator aangesloten op het 220 Volt wisselstroomnet en heeftnbsp;een vermogen van 500 Watt. Om de lamp bevindt zich een metalen koelinrichting,nbsp;waarin een kwartsvenster is aangebracht ter doorlating van de straling. De koelingnbsp;geschiedde met stroomend leidingwater. Op de lange duur vormde zich op de kwarts-ontladingsbuis een zeer gering neerslag, dat de ultra-violette straling met een golflengte korter dan 300 mf{ sterk absorbeert. Teneinde een hinderlijke vorming van ditnbsp;neerslag te voorkomen werd de ontladingsbuis dikwijls gereinigd. Voor een naderenbsp;beschrijving, benevens de schakeling der lamp verwijzen wij naar de desbetreffendenbsp;prospectus.

De lamp L was in een vaste opstelling aanwezig, zoodanig, dat het ont-ladingsbuisje loodrecht stond op de voorspleet Sp van de spectrograaf. Voor wat betreft de hoogte van het in vlak S ontworpen spectrum waren wij dusnbsp;gebonden aan de doorsnede der ontlading, aangezien het niet goed mogelijk wasnbsp;hetzij de lamp L, hetzij de spectrograaf met toebehooren over een hoek vannbsp;90 graden te draaien. De doorsnede van de ontlading bedroeg 1 mm, de ver-grooting door de lens M bedroeg 2 :1, waardoor bij de afbeelding 1 : 1 doornbsp;de spectrograaf de hoogte van het spectrum uiteindelijk 2 mm werd. Dit wasnbsp;bij de door ons gevolgde methode voldoende.

ad 2. Voor het scherpstellen van het spectrum op het oppervlak van de bacteriecultuur ontwierpen wij het in de figuren 11 en 12 weergegeven apparaat.

Boven de grondplaat A (zie: fig. 11), welke aan het chassis C is bevestigd, loopen twee ronde rails r^^ en rg, door middel waarvan het eigenlijke instelapparaat met behulp

van een schroefbeweging met trommelaflezing naar voren en naar achteren kan worden verplaatst. Het instelapparaat bestaat uit de plaat B, waaraan van onderen eenigenbsp;blokjes zitten ter geleiding langs de rails r^ en rg en waarvan de voorzijde de slede-houder H draagt. De voortbeweging van het instelapparaat geschiedt door middel van

Apparaat voor het scherpstellen van het bestralingsspectrum op het oppervlak van de bacteriecultuur.

In het bovenaanzicht is de slede S met het gelatineblokje in de sledehouder Hnbsp;geplaatst; in het zijaanzicht is de sledenbsp;S weggelaten. Voor de beschrijving vannbsp;het apparaat verwijzen wij naar de tekst.

de knop K, welke op de as L is bevestigd; het eveneens op de as L geplaatste wormwiel W grijpt in een op de plaat B van het instelapparaat bevestigde getande staaf G. In de sledehouder H past de slede S (zie: fig. 12), welke op zijn beurt weer het object-glas met de zich daarop bevindende gelatinelaag plus bacteriecultuur draagt. Het object-glas O wordt in de slede S gefixeerd, doordat de door middel van twee veertjes met de

slede S verbonden drukplaat D het objectglas tegen de geleiders drukt. Door middel van een in de figuur 11 niet geteekende verplaatsbare stuitknop, welke op de bovenrandnbsp;van de sledehonden H kan worden vastgeschroefd, kan de slede S, al naar de proef ditnbsp;eischt, op volledig reproduceerbare wijze verder of minder ver in de sledehondennbsp;worden geschoven.

Het chassis C (zie: fig. 11) diende ter bevestiging van het geheele apparaat aan de achterzijde van de spectrograaf. Hierbij werd dit chassis zoodanig ingesteld, dat hetnbsp;uit de spectrograaf tredende spectrum zoo nauwkeurig mogelijk op het midden van denbsp;bacteriecultuur viel, waarbij ten overvloede nog zij opgemerkt, dat dus de uiteindelijkenbsp;stand van de bacteriecultuur zoodanig was, dat zijn lengterichting samenviel met denbsp;lengterichting in het opvallend spectrum.

De hoogte-instelling was zeer eenvoudig en kon met voldoende nauwkeurigheid op het oog geschieden, door van opzij de loop van het spectrum door de gelatinelaagnbsp;waar te nemen.

De scherpstelling van het spectrum op het cultuuroppervlak moest langs een omweg geschieden. Wij maakten daarbij gebruik van het in figuur 13 geteekende hulp-apparaat.

Hulpapparaat voor het scherpstellen van het bestra-lingsspectrum op het oppervlak van de bacteriecultuur. Beschrijving in de tekst.

Op een massieve messing staaf E zijn volgens de teekening messing wiggetjes aangebracht, welke een lengte hebben van 2.5 mm en waarvan de uiteinden een doorsnede hebben van 1/3 mm. De hoogte van de wiggetjes bedraagt 3 mm en is voor allenbsp;wiggetjes nauwkeurig even groot. Verder zijn in de messing staaf twee cylindervormigenbsp;gaten geboord, wier afstand en diameter zoodanig zijn gekozen, dat de staaf kan wordennbsp;bevestigd aan het chassis C (in fig. 11) door hem op de pennetjes en Pg te schuiven.nbsp;De hoogte waarop de pennetjes zijn aangebracht is zoodanig, dat het midden van denbsp;open ruimte, welke door de uiteinden der wiggetjes wordt begrensd (in fig. 13 doornbsp;de stippellijn aangegeven), even hoog is gelegen als het midden van de bacteriecultuur.

De scherpstelling van het spectrum op het oppervlak van de bacteriecultuur geschiedde nu als volgt:

De messing staaf E werd op de pennetjes en Pg geschoven en de bacteriecultuur werd door draaien aan de instelknop K juist met zijn oppervlak tegen de wig-getjes aangedrukt. De hierbij behoorende stand van het instelapparaat w�rd op de trommel T tot in tienden van schaaldeelen afgelezen. Vervolgens werd de bacteriecultuur teruggedraaid, de messing staaf verwijderd en hierna de bacteriecultuur in denbsp;daareven afgelezen stand teruggebracht. Door van uit deze stand de bacteriecultuurnbsp;nog over een afstand overeenkomende met 16 schaaldeelen naar voren te verplaatsen,nbsp;bereikten wij tenslotte, dat het spectrum scherp op het oppervlak van de cultuur wasnbsp;af geheeld.

Dat deze verplaatsing naar voren 16 schaaldeelen moest bedragen, was eens en voor altijd op de volgende wijze bepaald, waarbij de voor de bestralingsproeven gebruikte watergekoelde superhoogedruk-kwiklamp door een luchtgekoelde superhooge-druk-kwiklamp H.P. 500 werd vervangen. Deze laatste lichtbron zendt slechts smallenbsp;lijnen uit en niet zooals eerstgenoemde een continuum met lijnen, hetgeen voor denbsp;scherpstelling van wezenlijk voordeel is. Een objectglas met een daarop gekit vierkant,nbsp;gepolijst staafje van fluoresceerend glas (uraanglas) werd in de slede S geschoven ennbsp;de messing staaf E aan het chassis C opgehangen. Evenals dit voor de bacteriecultuurnbsp;is beschreven, bepaalden wij de stand van het instelapparaat op de trommel T, waarbijnbsp;het voorvlak van het fluoresceerende staafje juist tegen de wiggetjes was geplaatst:nbsp;stand I. Vervolgens brachten wij, na verwijdering van de messing staaf E, door naarnbsp;voren draaien van het instelapparaat het voorvlak van het fluoresceerende staafje op denbsp;plaats, waar het uit de spectrograaf tredende spectrum scherp was. Dit kon zeer nauwkeurig geschieden, door waarneming van de loop der afzonderlijke kwiklijnen (resp. denbsp;door deze opgewekte fluorescenties) in het inwendige van het fluoresceerende staafje.nbsp;De hierbij behoorende stand van het instelapparaat zij stand II. Het verschil tusschennbsp;stand I en stand II gaf nu aan het aantal schaaldeelen, waarover het instelapparaatnbsp;in de richting van de spectrograaf moest worden verplaatst, om van uit de stand waarinnbsp;het fluoresceerende staafje juist tegen de wiggetjes van staaf E was aangedrukt, hetnbsp;spectrum scherp af geheeld te krijgen op hef voorvlak van het fluoresceerende staafje.nbsp;Deze verplaatsing bedroeg 16 schaaldeelen en het is duidelijk, dat deze waarde evenzeernbsp;geldt voor het geval, dat wij een bacteriecultuur in de slede S hebben geplaatst ennbsp;onder gebruikmaking van de watergekoelde superhoogedruk-kwiklamp als lichtbron.

a. nbsp;nbsp;nbsp;de wisselende dikte der gelatinelagen wordt automatisch ge�limineerd;

b. nbsp;nbsp;nbsp;de instelling geschiedt geheel langs indirecte weg, zoodat geen voortijdigenbsp;bestraling van de bacteriecultuur plaats vindt.

Bij de instelling werd er steeds op gelet of alle wiggetjes tegelijkertijd het cultuur-oppervlak raakten, met andere woorden er werd vastgesteld, of de betreffende gelatine-laag wel een gelijkmatige dikte bezat. Bleek dit niet zoo te zijn, dan werd een dergelijke cultuur niet voor een bestralingsproef gebruikt.

Als gevolg van de beschreven wijze van instellen verschenen op de bacteriecultuur twee reeksen streepjes op de plaatsen, waar de wiggetjes het cultuuroppervlak hadden geraakt. Deze streepjes zijn bij de uitwerking der proeven nog van belang,nbsp;zooals bij de bespreking van de photografische intensiteitsbepaling van het bacterielichtnbsp;(� 4 van dit hoofdstuk) nader zal worden toegelicht.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Het objectglas met de daarop uitgesneden bacteriecultuur werd in denbsp;slede S bevestigd en deze in de sledehouder van het instelapparaat geplaatst.

2. nbsp;nbsp;nbsp;De messing staaf E werd aan het chassis C bevestigd en het oppervlak

van de bacteriecultuur juist tegen de wiggetjes gedraaid. De bijbehoorende stand van het instelapparaat werd op de trommel T afgelezen.

3. nbsp;nbsp;nbsp;De onbestraalde cultuur werd gephotografeerd (beschrijving zie volgende paragraaf).

4. nbsp;nbsp;nbsp;Na herplaatsing van de slede in het instelapparaat werd dit, na verwijdering van de messing staaf E, gebracht in de onder 2 afgelezen stand,nbsp;minus 16 schaaldeelen.

5. nbsp;nbsp;nbsp;De bacteriecultuur werd gedurende de gewenschte tijd en met de ge-wenschte intensiteit bestraald.

Tijdens de bestraling zoowel als tijdens het photografeeren, bleef het objectglas met de gelatinelaag in de slede S geplaatst. De slede werd in zijnnbsp;geheel van het bestralings- naar het photografisch apparaat overgebracht.

Op de bestralingsproef volgde dan steeds nog de meting van de spectrale energieverdeeling in het achter de spectrograaf ontworpen spectrum. Dezenbsp;meting wordt afzonderlijk in � 5 van dit hoofdstuk beschreven. Eerst volgtnbsp;thans de beschrijving van de langs photografische weg uitgevoerde intensi-teitsbepaling van het door de bacteri�n uitgezonden licht v��r en na de bestraling.

� 4. Het bepalen van de intensiteit van het bacterielicht voor en na de bestraling en de berekening van de photochemische werking.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Het photografeeren van de bacteriecultuur v��r en na de bestraling.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Het afleiden van de intensiteiten van het bacterielicht v��r en na denbsp;bestraling uit de photografische opnamen.

ad 1. Voor het photografeeren gebruikten wij de in figuur 14 schematisch aangegeven, eenvoudige opstelling.

De lens L ontwierp een beeld 1 : 1 van de lichtende bacteriecultuur op de photografische plaat A (Ilford Special Rapid, extra sensitive; ontwikkeld bij 18� C., gedurende zes minuten in metol-borax).

Het diafragma D, waarvan de rechthoekige opening 35 X 8 mm bedraagt, was zoo geplaatst, dat, wanneer het oppervlak van de bacteriecultuur in ��n vlak lag met denbsp;achterrand van het diafragma, de cultuur scherp op de photografische plaat wasnbsp;af geheeld.

Om deze instelling te bereiken werd de slede S, waarin het objectglas met de bacteriecultuur was aangebracht, in het instelapparaat C geplaatst. De slede werd hierinnbsp;op zijn plaats gehouden door de geleider R en de knop K. Het instelapparaat C bezatnbsp;twee micrometerschroeven (in de figuur niet geteekend), voor zijwaartsche en v��r-en achterwaartsche beweging. De hoogte-instelling van het instelapparaat C was onveranderlijk. De photografische plaat A was in een in verticale richting verplaatsbaarnbsp;chassis geplaatst (niet geteekend), waardoor het mogeljjk was meerdere opnamen opnbsp;��n plaat te verkrijgen.

onbestr.

Reproductie van enkele photografische negatieven, verkregen door het opnemen van eenige bacterie-culturen in het eigen licht, op verschillende tijdennbsp;na afloop der bestraling.

A onmiddellijk na een bestraling gedurende twee minuten; de afzonderlijke kwiklijnen zijn duidelijknbsp;waarneembaar.

B twee uur na afloop der bestraling; de photochemische werking is reeds weer sterk afgenomen. In hetnbsp;gebied lt; 300 m/i is de intensiteitnbsp;van het bacterielicht hooger dan innbsp;het naastgelegen onbestraalde gebied.

C de normale photochemische werking is geheel verdwenen. In hetnbsp;gebied lt; 300 mfi is volledige uitdoo-ving opgetreden.

f'll

Schematische afbeelding van de opstelling voor het photografeeren van de onbestraalde en de bestraalde bacteri�n.

De lens L ontwerpt een beeld 1 : 1 van de lichtende bacteriecultuur Op op de photografische plaat A. Verdere beschrijving in de tekst.

Omdat de intensiteit van het bacterielicht van dag tot dag eenigszins varieerde in afhankelijkheid van niet geheel controleerbare uitwendige omstandigheden, bepaalden wij v��r iedere serie bestralingsproeven door middel vannbsp;een tijdreeks de meest geschikte belichtingstijd. Deze belichtingstijd varieerdenbsp;tusschen 30 en 45 seconden.

In fig. 15 zijn de photografische opnamen weergegeven van een onbestraalde en een bestraalde bacteriecultuur.

Zoowel op de bestraalde, als op de onbestraalde cultuur ziet men de indrukken van de wiggetjes (zie � 3, ad 2). Deze indrukken speelden bij de beoor-deeling van de bruikbaarheid van de opnamen en bij de uitwerking ervan een belangrijke rol. In de eerste plaats was aan de scherpte waarmede zij warennbsp;weergegeven de afbeeldingsscherpte van de bacteriecultuur op de photografischenbsp;plaat te controleeren en in de tweede plaats dienden zij, om overeenkomstigenbsp;gedeelten van de onbestraalde en de bestraalde cultuur op elkaar te betrekken.

ad 2. Het afleiden van de intensiteiten, welke op overeenkomstige plaatsen door de bacteri�n v��r en na de bestraling waren uitgezonden, uit de verkregen opnamen, geschiedde langs de voor photografische intensiteitsmetingen gebruikelijke weg, door photometreeren van de negatieven, uitmeten van denbsp;photogrammen en het met behulp van de zwartingskrommen omzetten van denbsp;procentueele doorlatingen in relatieve intensiteiten. Deze methode is uitvoerignbsp;beschreven in de monographie: �Objektive Spektralphotometrie� van Orn-stein, Moll en Burger (96). In het kort geven wij slechts de hoofdpunten van de door ons gevolgde werkwijze weer en verwijzen voor een uitvoerige bespreking naar genoemde monographie.

Na het opnemen van de werkingsspectra, plaatsten wij op dezelfde photografische plaat de zwartingsmerken met behulp van een geijkte wolfraam bandlamp, door voornbsp;een reeks intensiteiten �� verkregen door variatie van de stroomsterkte � de door denbsp;lamp en een willekeurige spectrograaf ontworpen spectra te photografeeren. Voor iederenbsp;golflengte was de relatieve intensiteit af te leiden uit de gebruikte stroomsterkte. De

spectra stelden ons dus in staat, om voor iedere golflengte het verband tusschen de zwarting van de gebruikte photografische plaat en de opgevallen energie, die dezenbsp;zwarting veroorzaakte, te bepalen. Het bepalen van de zwarting van de photografischenbsp;plaat geschiedde met de micro-photometer van Moll. Hierin wordt een fijne lichtbundel door de photografische plaat gestuurd, waarbij met behulp van een thermo�le-ment in combinatie met een gevoelige galvanometer in relatieve maat de hoeveelheidnbsp;licht wordt bepaald, die wordt doorgelaten door een ongezwart (en dus onbelicht)nbsp;plaatgedeelte (Iq) en door een gezwart plaatgedeelte (I). De zwarting wordt gedefinieerd alsnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Meestal gebruikt men niet de zwarting, doch de daarmede nauw ver-

De galvanometeruitslagen, welke evenredig zijn met de door de plaat tredende hoeveelheid licht, worden registrografisch vastgelegd.

Voor iedere golflengte kon nu de zoogenaamde zwartingskromme worden getee-kend, waarbij de gemeten zwarting werd uitgezet tegen de logarithme van de opgevallen energie. Heeft men de zwartingskromme ��nmaal voor een bepaalde golflengte geconstrueerd, dan kan men omgekeerd uit de zwarting door licht van deze golflengtenbsp;teweeggebracht, de opgevallen energie op de zwartingskromme aflezen. Strikt genomennbsp;zouden wij �lt; aangezien het door de bacteri�n uitgezonden licht niet monochromatischnbsp;is � de zwartingskromme voor licht van die samenstelling moeten bepalen. Dit bleeknbsp;echter overbodig te zijn, omdat voor de golflengten tusschen 4400 en 5000 A � hetnbsp;hoofdemissiegebied der lichtbacteri�n � de zwartingskrommen vrijwel evenwijdignbsp;waren, terwijl bovendien boven 5000 A de gevoeligheid der gebruikte photografischenbsp;plaat snel tot vrijwel 0 daalde. Wij bepaalden dan ook slechts voor vier golflengten uitnbsp;het spectrum der wolfraam bandlamp tusschen 4400 en 5000 A de zwartingskrommennbsp;en gebruikten het gemiddelde hiervan als zwartingskromme voor het afleiden van denbsp;door de bacteriecultures uitgezonden lichtintensiteiten uit de gemeten zwartingen.

In de figuur zijn zoowel de procentueele zwarting als de procentueele doorlating aangegeven. De energie is in een willekeurige maat logarithmisch uitgezet. Aangeziennbsp;de energie�n het nauwkeurigst vastliggen op het lineaire gedeelte der zwartingskrommenbsp;(tusschen 30 en 70 % zwarting, resp. doorlating), hebben wij de belichtingstijd steedsnbsp;zoo gekozen, dat de zwartingen binnen dit gedeelte vielen.

De door het photometreeren verkregen micro-photogrammen vertonnen steeds eenigszins getande lijnen, welke tandingen worden veroorzaakt door de korrel van denbsp;photografische plaat. In ons geval kwamen hier nog bij de onregelmatigheden veroorzaaktnbsp;door de uiteraard nooit volkomen homogene lichtemissie der bacteriecultuur. Voorzoovernbsp;deze onregelmatigheden van systematische aard waren, werden zij voldoende ge�limineerd door de photometreering van de opnamen v��r en na de bestraling nauwkeurignbsp;op dezelfde hoogte uit te voeren. De toevallige onregelmatigheden konden grootendeelsnbsp;worden uitgeschakeld door in het te bestralen, resp. bestraalde cultuurgedeelte nietnbsp;��nmaal, doch drie maal te photometreeren op verschillende hoogte en wel; precies innbsp;het midden van het werkingsspectrum, 0.3 mm boven en 0.3 mm onder het middennbsp;ervan en deze drie photometercurven te middelen.

Fig. 17 geeft schetsmatig de wijze van photometreeren van een photografische opname eener bacteriecultuur in onbestraalde en in bestraalde toestand weer.

h is de hoogte van het bestraalde cultuurgedeelte. In fig. 17 zijn de drie photome-treeringen in het bestraalde gebied (resp. het te bestralen gebied) aangegeven met bj, bg en bg. Verder werden beide opnamen op de plaatsen aangegeven met a, dat wilnbsp;zeggen op overeenkomstige hoogten in het niet bestraalde cultuurgedeelte, gephotome-treerd. De reden hiervoor was, dat wij rekening moesten houden met een geringe achteruitgang van de intensiteit van het bacterielicht door andere oorzaken dan de uitwendige bestraling, bijv. door temperatuursschommeling tijdens de proef, door vocht-

Abscis: de relatieve energie, logarith-misch uitgezet; ordinaat: de procentu-eele zwarting en de procentueele doorlating. Tusschen 30 en 70% doorlating (zwarting) verloopt de zwartingskrommenbsp;lineair.

bestraald

De hoogte van het bestraalde gebied is aangegeven met h. De photometreeringen bi, b2 en bs vallen op overeenkomstige plaatsen innbsp;het te bestralen resp. bestraalde gebied; de photometreeringen anbsp;vallen op overeenkomstige plaatsen in het onbestraalde gebied.

verlies van de bacteri�n, etc. Deze achteruitgang werd procentueel voor de geheele bestraalde bacteriecultuur in rekening gebracht.

In fig. 18 geven wij twee micro-photogrammen weer, afkomstig van ��n en dezelfde bacteriecultuur resp. v��r de bestraling en na de bestraling.

Ter verduidelijking van de gevolgde werkwijze volgt thans in tabel X de volledige uitwerking van een klein gedeelte van het in fig. 18 weergegevennbsp;photogram.

Micro-photometercurven van de photografische negatieven der in fig. 15 weergegeven bestraalde (boven) en onbestraalde bacteriecultures.

De aanduidingen a, bi, b2 en bs stemmen overeen met de in fig. 17 schetsmatig aangegeyen wijze van photometreeren.

Nul uitsl. geeft de nuluitslagen weer van de galvanometer resp. voor de plaatsen a, bi, b2 en ba.

a, hl, bl en ba (zonder nadere toevoeging) zijn de galvanometeruitslagen bp het photometreeren van de betreffende plaatsen van het photografisch negatief.

bl. pl. bl is de galvanometeruitslag bij het photometreeren van een onbelicht (blank) gedeelte van het photografisch negatief, behoorende bij de photome-treering bi. Voor a, b2 en ba zijn hiervoor de galvanometeruitslagen niet aangegeven, aangezien deze met bi een zelfde bedrag verschillen als de nuluitslagen.

Voorbeeld: p is de galvanometeruitslag voor een willekeurig punt van de photo-metreering bi, in het te bestralen gebied; q is de hierbij behoorende galvanometeruitslag bij het photometreeren van de onbelichte plaat; ^ X 100 stelt dan

de procentueele doorlating voor op de beschouwde plaats van het photografisch negatief.

In de practijk gebruikten wij niet de hier weergegeven photometercurven zelf, doch vloeiende lijnen, welke zoo goed mogelijk gemiddeld door de sterk getandenbsp;photometercurven werden gelegd. Deze lijnen zijn in bovenstaande figuur nietnbsp;geteekend.

De golflengten van enkele der ingestraalde kwiklijnen zijn in het micro-photo-gram aangegeven.

Kolom 1: horizontale afstand in mm op het photogram vanaf het midden der 436 mfi -lijn.

Kolom 2 t.m. 13: op het registrogram afgelezen galvanometeruitslagen in mm, v��r de bestraling en na de bestraling. In de kolommen 7 en 13 staan denbsp;door middelen van bi, b2 en bs gevonden waarden van de photometreeringennbsp;b resp. voor en na de bestraling. Onder bl. pl. vindt men de galvanometeruitslagen voor de blanke (onbelichte) plaat.

Kolom 14 t.m. 17: de uit de galvanometeruitslagen berekende procentueele doorlatingen; in kolom 14 en 16 voor de onbestraalde cultuur, in kolomnbsp;15 en 17 voor de bestraalde cultuur.

Kolom 18: de met behulp van de zwartingskromme bepaalde energie�n, beboerende bij de in kolom 16 weergegeven doorlatingen. Deze kolom stelt dus tevens de relatieve intensiteiten voor, welke op de te bestralen plaatsennbsp;door de bacteriecultuur v��r de bestraling werden uitgezonden.

Kolom 19: dezelfde energie�n als in kolom 18, doch omgerekend op na de bestraling. Dit geschiedde met behulp van de gemiddelde waarden voor a uit kolom 14 en 15. De hierbij beboerende waarden geven de gemiddeldenbsp;intensiteiten weer van de niet bestraalde cultuurgedeelten, resp. v��r ennbsp;na de bestraling. De verhouding van deze intensiteiten levert de procentueele intensiteitsvermindering door andere oorzaken dan de bestraling.nbsp;De waarden in kolom 19 volgen uit de overeenkomstige in kolom 18 doornbsp;vermenigvuldiging met deze verhouding.

Kolom 20: de met behulp van de zwartingskrommen bepaalde energie�n, be-hoorende bij de in kolom 17 weergegeven doorlatingen. In kolom 20 staan

dus de relatieve intensiteiten, welke direct na de bestraling- door de bacteri�n in het bestraalde gebied werden uitgezonden.

Het is duidelijk, dat de kolommen 19 en 20 ons de in hoofdstuk VII bedoelde intensiteiten �� en Y leveren, de intensiteiten dus, welke op overeenkomstige plaatsen resp. v��r en na de bestraling door de bacteriecultuur worden uitgezonden.

Kolom 21: De uit de intensiteiten v��r en na de bestraling, resp. Y� en Y, berekende photochemische werking W = In , vermenigvuldigd met 100.nbsp;Kolom 22: De met de afstanden in kolom 1 correspondeerende golflengten.

Aparte golflengtemerken waren hiervoor overbodig, aangezien wij door de nauwkeurig bekende ligging der kwiklijnen en de scherpe reproductie hiervan in het wer-kingsspectrum, over een door de methode zelve gegeven middel beschikten om de geheele dispersiekromme �� d.w.z. het verband tusschen golflengte en afstand � tenbsp;kunnen teekenen. Uit deze dispersiekromme konden wij omgekeerd voor de tusschennbsp;de kwiklijnen gelegen continua de correspondeerende golflengten aflezen.

Deze geeft dus het verloop weer van de photochemische werking W met de golflengte, zooals dit zich manifesteert by de intensiteitsverdeeling in hetnbsp;gebruikte bestralingsspectrum.

460 500 A in m

By vergeiyking van deze photochemische werkingscurve met het bijbehoorende in fig. 20 weergegeven energiespectrum van de gebruikte kwiklamp zien wy, dat denbsp;werkingscurve op het eerste gezicht overeenkomst vertoont met het energiespectrum.nbsp;Het is echter geen getrouwe afspiegeling ervan, omdat voor de grootte van de photochemische werking behalve de intensiteitsverdeeling in het kwikspectrum, ook de specifieke photochemische werking der afzonderlyke golflengten bepalend is.

� 5. De meting van de spectrale energieverdeeling in het op de bacteriecultuur geworpen spectrum; berekening van de specifieke photochemische werking.

De intensiteit van het ontworpen spectrum was voldoende groot om met de combinatie vacuum-thermo�lement (volgens Moll) en daarmede in serienbsp;geschakelde gevoelige galvanometer te kunnen worden gemeten.

Het systeem van het thermoelement bestond uit een manganien-constantaan bandje, dat lju dik, 0.1 mm breed en 7 mm lang was. Het bandje was gezwart met een nietnbsp;selectief absorbeerende stof (roet). Omdat het thermo�lement voor en�rgiemetingen innbsp;het ultra-violet moest worden gebruikt, was het venster van kwarts vervaardigd. Denbsp;stroomsterkte in de keten van het thermo�lement is recht evenredig met de op het bandjenbsp;vallende stralingsenergie.

Op het kwartsvenster was een diafragma bevestigd, waarvan de hoogte kleiner was dan de hoogte van het door te meten spectrum. De hoogte van het spectrum neemtnbsp;in de richting van de korte golflengten af en aangezien wij niet de energie over de totalenbsp;hoogte, doch de energiedichtheid wilden meten, moest de hoogte van het diafragmanbsp;steeds kleiner zyn dan de hoogte van het door te meten spectrum.

Om het spectrum te kunnen doormeten was het thermo�lement achter de spectrograaf gemonteerd op een slede, welke kon worden verplaatst door middel van een micrometerschroef waarop de verplaatsing kon worden afgelezen.nbsp;De instelling van het thermo�lement was zoodanig, dat:

Ie het spectrum scherp op het bandje was afgebeeld en dat bij verplaatsing van het thermo�lement door middel van de micrometerschroef het bandje zich evenwijdig aan de achterwand van de spectrograaf voortbewoog;

Dit was aan de halfwaardebreedten der kwiklijnen te beoordeelen; had het thermo�lement de juiste stand, dan moest deze achtereenvolgens voor alle kwiklynen minimaal zyn.

2e het bandje bij verplaatsing van het thermo�lement zich horizontaal door het spectrum verplaatste.

Wij vonden zoo de spectrale energieverdeeling voorloopig nog uitgedrukt in mm uitslag van de galvanometer. Door teekenen van de dispersiekrommenbsp;waren wij in staat, de met iedere stand van de micrometerschroef correspon-deerende golflengte af te lezen.

intensiteiten in het spectrum, uitgedrukt in erg per cm^ X sec., door de uitslag van de thermo�lement-galvanometer combinatie te vergelijken met die eenernbsp;absoluut geijkte combinatie van een groote oppervlakte thermozuil volgensnbsp;M o 11 en een galvanometer, bij gelijke intensiteit van het opvallende licht (wijnbsp;gebruikten voor deze vergelijking wit licht). Hieruit was de intensiteit van hetnbsp;opgevallen licht in erg per cm2 y gec. voor 1 mm uitslag van de thermo�lement-galvanometer combinatie te berekenen. Aangezien de gevoeligheid van het gebruikte thermo�lement in de loop van de tijd langzaam afnam, moest bij iederenbsp;bestralingsproef waaruit wij waarden voor het photochemische inactiveerings-spectrum wilden af leiden op de boven beschreven wijze de absolute intensiteitnbsp;in erg per cm2 gec. per mm uitslag van de thermo�lement-galvanometernbsp;combinatie opnieuw worden bepaald. Zooals in hoofdstuk VI, � 2 en in hoofdstuk VII is uiteengezet, gebruikten wij uit theoretische overwegingen niet denbsp;ingestraalde lichtenergie in erg per cm2 gec., doch in quanten per cm^ X sec.

Zij de absolute intensiteit van het ingestraalde licht I erg /cm2 x sec., dan vindt men voor de quantenintensiteit I,:

c de lichtsnelheid (3 X 10� cm per sec.) h de constante van Planck (6.55 X 10quot;^'^ erg X sec.)

Slechts bij die bestralingsproeven, waaruit wij tenslotte het absolute photochemische inactiveeringsspectrum wilden afleiden, was het noodig de quantenintensiteit van het ingestraalde licht in absolute maat vast te leggen. Bij de overige proevennbsp;was het voldoende de quantenintensiteit in relatieve maat te bepalen, door de afgelezennbsp;uitslagen van de thermo�lement-galvanometer combinatie met de bijbehoorende golflengte te vermenigvuldigen.

Ter illustreering van hetgeen over de energiemetingen is gezegd, is in fig. 20 de intensiteitsverdeeling in het ingestraalde spectrum, behoorende bijnbsp;de in fig. 19 weergegeven werkingskromme, geteekend. In het bedoelde gevalnbsp;bedroeg de absolute intensiteit per mm uitslag van de galvanometer:

Voor een bepaalde golflengte A (uitgedrukt in mq ) bedraagt dus de ingestraalde quantenintensiteit:

Deze curve geeft het verloop van de quantenintensiteit weer in het spectrum achter de spectrograaf.

De optredende photochemische werking W wordt echter niet door de quantenintensiteit bepaald, doch door het totale aantal ingestraalde quantennbsp;Iq X t (t is de bestralingstijd in sec.).

De quantenenergiecurve, weergevende het totale aantal ingestraalde quanten, ontstaat uit de intensiteitscurve door vermenigvuldiging van denbsp;intensiteiten met de bestralingstijd in secunden.

De berekening van de specifieke photochemische werking W(A.) � de photochemische werking W per ingestraald quant � geschiedde nu in principe,nbsp;door de, volgens de in dit hoofdstuk in � 4 besproken methode bepaalde, photochemische werkingscurve te deelen door de daarbij behoorende quantenenergiecurve.

Theoretisch zou men aldus door ��n enkele opname het geheele photo-chemische inactiveeringsspectrum als gesloten curve kunnen bepalen. Dit bleek echter in de practijk niet mogelijk te zijn en wel om. de volgende redenen:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Kleine onnauwkeurigheden in de voor de werkingscurve en het enep-giespectrum bepaalde dispersiekrommen komen speciaal op de steile hellingennbsp;der afzonderlijke kwiklijnen tot uiting, waardoor het niet mogelijk is op denbsp;hellingen met voldoende nauwkeurigheid de bij een bepaalde photochemischenbsp;werking beboerende ingestraalde energie aan te geven. Slechts de toppen dernbsp;kwiklijnen � welke zoowel in de werkingscurve als in het energiespectrumnbsp;nauwkeurig vast liggen � en de tusschen de kwiklijnen inliggende, slechtsnbsp;weinig verloopende continua leveren ons punten op, waarbij werking en bijbe-hoorende energie nauwkeurig zijn aan te geven.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Zooals wij in hoofdstuk X nog nader zullen aantoonen, bleek, dat binnennbsp;de nauwkeurigheid van onze metingen de photochemische werking W rechtnbsp;evenredig is met de bestralingsintensiteit en met de bestralingstij d. Deze evenredigheid ging echter slechts op tot een photochemische werking W (X 100)nbsp;van ca 50, overeenkomende met een procentueele intensiteitsverminderingnbsp;van het bacterielicht van ca 40%. Bij grootere photochemische werkingennbsp;waren deze geringer dan met de ingestraalde energie overeen kwami). Omnbsp;onnoodige complicaties te vermijden, beperkten wij onze metingen tot photochemische werkingen die niet grooter waren dan ca 50. Tevens stelden wij innbsp;verband met de bij de photografische methode nu eenmaal voorkomende vrjjnbsp;groote spreidingen, nog versterkt door een onvermijdelijke geringe inhomoge-niteit der bacteriecultures, de ondergrens op een photochemische werking vannbsp;ca 10. Slechts in uitzonderingsgevallen zijn wij van deze grenzen afgeweken.nbsp;De in dat geval gevonden waarden voor de specifieke werking zijn dienovereenkomstig als minder vaststaand te beschouwen.

Uit beide overwegingen volgt, dat wij dus tenslotte het photochemische inactiveeringsspectrum niet als gesloten curve, doch als afzonderlijke puntennbsp;moesten bepalen en tevens, dat wij, gezien de zeer uiteenloopende intensiteits-verdeeling in het gebruikte kwikspectrum, genoodzaakt waren voor ieder spec-traalgebied door variatie van de bestralingsintensiteit of van de bestralingstij dnbsp;de photochemische werking een voor de meting geschikte waarde te geven.

Ter illustreering van de in deze paragraaf besproken bepaling van de specifieke photochemische werking, is in fig. 21 voor een gedeelte van het

1) Indien men niet, zooals wh in hoofdstuk VII hebben gedaan, uitgaat van de veronderstelling, dat in alle bacteri�n die met dezelfde intensiteit 1, worden bestraaldnbsp;dezelfde intensiteit I^,, heerscht, doch dat integendeel deze laatste intensiteiten uiteen-loopen, is een afwijking van de I X t-wet, zooals door Mej. A. vanderBurg langsnbsp;mathematische weg kon worden aangetoond, in de hierboven genoemde zin bij grootenbsp;photochemische werkingen theoretisch te verwachten.

spectrum geteekend de gemeten photochemische werking, het daarbij beboerende gemeten energiespectrum en de door deeling van bepaalde punten van het energiespectrum op overeenkomstige punten van de photochemische wer-kingskromme gevonden punten van het photochemische inactiveeringsspectrum.

Het volledige experimenteele materiaal en het daaruit afgeleide definitieve photochemische inactiveeringsspectrum van Ph. phosphoreum worden in het volgende hoofdstuk weergegeven.

� 6. Onderzoek naar de invloed van de lichtverstrooiende werking der gebruikte plaatcultures op de verrichte metingen.

Voor wij overgaan tot weergave van de proeven, welke leidden tot de uiteindelijke bepaling van het photochemische inactiveeringsspectrum, moetnbsp;nog een proef worden beschreven, welke voor de discussie der resultaten vannbsp;veel belang is.

Bij bestraling van een plaatcultuur is van de verstrooiing van het ingestraalde licht door de laag bacteri�n niets met zekerheid bekend. 'Slechts spraken wij in � 1 van dit hoofdstuk het vermoeden uit, dat deze verstrooiingnbsp;voor eenzelfde aantal bacteri�n geringer zou zijn dan in een bacteriesuspensie.nbsp;Zou de mate van verstrooiing in een laag bacteri�n echter eveneens aanzienlijknbsp;zijn, dan zou dit het voor ons zeer onaangename effect meebrengen van eennbsp;�versmering� van het ingestraalde spectrum. In dit geval viel te vreezen, datnbsp;als gevolg van het sterk geaccidenteerde verloop van het ingestraalde spectrum,nbsp;vooral aan weerszijden van de intensieve lijnen de gemeten photochemischenbsp;werking niet slechts door het ter plaatse invallende licht was veroorzaakt, dochnbsp;tevens door een onbekende hoeveelheid verstrooid licht.

Om een nadere indruk van dit verstrooiingseffect te krijgen, voerden wij de volgende proef uit.

Op de spleet Sp van de kwartsspectrograaf (zie fig. 10) werd de ontlading van een Philips superhoogedruk-kwiklamp H.P. 500, die in tegenstelling totnbsp;de in hoofdstuk IX � 3 beschreven lichtbron slechts lijnen en geen continuumnbsp;uitzendt, scherp afgebeeld. De spleetbreedte bedroeg bij deze proef slechtsnbsp;0.05 mm. Hierdoor ontstond achter de spectograaf een lijnenspectrum, bestaande uit zeer scherpe lijnen van betrekkelijk geringe intensiteit. Met ditnbsp;spectrum bestraalden wij op de gewone wijze gedurende 10 minuten een plaatcultuur van Ph. phosphoreum. Vervolgens bepaalden wij de door de 436 mfi -lijnnbsp;en de 366 mw -lijn veroorzaakte photochemische werkingen en maten tevens,nbsp;met behulp van de thermo�lement-galvanometer combinatie, het intensiteits-verloop in deze beide lijnen. In fig. 22 is het resultaat van deze metingen weergegeven. De schalen, waarop de photochemische werking en de ingestraaldenbsp;energie zijn uitgezet, zijn zoo gekozen, dat voor de 366 miti-lijn de toppen vannbsp;de W- en de I-curve even hoog zijn (ter vergemakkelijking van het vergelijkennbsp;der halfwaardebreedten).

W en I zijn tegen dezelfde, willekeurig gekozen, afstandsmaat uitgezet. Men ziet, dat de werkings- en de energiecurve vrijwel samenvallen en dat metnbsp;name de halfwaardebreedten nagenoeg even groot zijn, zoodat wij kunnen con-stateeren, dat het door ons gevreesde verstrooiingseffect geheel afwezig is.

Bepaling van het verstrooi�ngseffect door bestraling van een plaatcultuur van Ph. phosphoreum, onder gebruikmaking van een Philips luchtgekoelde superhooge-druk-kwiklamp als lichtbron en met een zeer nauwenbsp;voorspleet van de spectograaf.nbsp;o o o gemeten energieverloop in de kwiklijnen,

De gemeten energiekromme is ten opzichte van de werkelijkheid iets verbreed doordat zij is gemeten met een thermo�lement m^t een, bandje van 0.1 mm breedte,nbsp;hetgeen overeenkomt met 0.3 schaaldeel in de figuur. De �versmering� van de ingestraalde lijnen strekt zich dus uit over een gebied van hoogstens 0.6 schaaldeelen. Hetnbsp;energieverloop bijv. in het in fig. 20 geteekende energiespectrum bedraagt over eennbsp;met dit aantal schaaldeelen overeenkomende afstand in de maxima en de vlak verloo-pende minima minder dan 2 %, op de steil verloopende hellingen circa 15 %. Zooalsnbsp;reeds eerder is opgemerkt, werden echter, ook om andere redenen, deze hellingen nietnbsp;voor de metingen gebruikt.

Wij mogen hieruit de belangrijke conclusie trekken, dat ook bij het gebruik van onze gewone bestralingsbron, de photochemische werking op ieder punt slechts wordt veroorzaakt door de in dat punt in het bestralingsspectrumnbsp;heerschende oppervlaktehelderheid.

Voor de definitieve bepaling van het photochemische inactiveeringsspec-trum hebben wij de volgende bestralingsproeven uitgevoerd:

a. nbsp;nbsp;nbsp;Een bestralingsproef met de kwartsspectrograaf, waarby de intensiteit van het ingestraalde licht werd gevarieerd, bij een constante bestralings-tijd van twee minuten.

b. nbsp;nbsp;nbsp;Twee bestralingsproeven met de kwartsspectrograaf, waarbij, bijnbsp;constante intensiteit, de bestralingstijd werd gevarieerd.

c. nbsp;nbsp;nbsp;Twee bestralingsproeven met de glasspectrograaf, waarbij de intensiteit van het ingestraalde licht werd gevarieerd, bij een constante bestralingstijd van twee minuten.

In principe was het gunstig om de bestralingstijd zoo kort mogelijk te nemen en dus de intensiteit zoo hoog mogelijk, om zoo min mogelijk storing tenbsp;ondervinden van de herstelreactie i). Het bleek, dat wij bij maximale diafrag-mastand in het minst intensieve spectraalgebied (het continuum bij ca 350 mg )nbsp;minstens ��n minuut moesten bestralen om betrouwbare metingen van denbsp;photochemische werking te kunnen uitvoeren. Om ook in dit gebied nognbsp;metingen met intensiteits- en tijdsvariaties mogelijk te maken, stelden wij bijnbsp;al onze proeven als basis een bestralingstijd vast van twee minuten. Bij denbsp;proeven met intensiteitsvariaties werden met behulp van het diafragma D2nbsp;(zie: fig. 10) de intensiteiten op ongeveer Vi, 34, 34 en ^/le van de maximalenbsp;waarde gebracht; bij de proeven met tijdvariaties bestraalden wij resp. 34, 34,nbsp;1, 2 en 4 minuten met maximaal geopend diafragma.

Deze bestralingstijden zijn in ieder geval, zooals later nog zal blijken, door de geringe snelheid van de herstelreactie, kort ten opzichte van de hersteltijd.

In de navolgende paragrafen zullen de resultaten van de genoemde proeven worden weergegeven.

� 1. Bestralingsproef met de kwartsspectrograaf onder toepassing van intensi-teitsvariatie.

Hierbij was het mogelijk om zoowel voor het zichtbare als voor het ultraviolette gebied de photochemische werkingen te bepalen. Weliswaar bezit de kwartsspectrograaf in het zichtbare spectrum een geringe dispersie, doch de

sterke diafragmeering, welke bij de bepaling van de photochemische werking in het zichtbare gebied noodig was, verbeterde tevens de afbeeldingsscherpte,nbsp;zoodat wij een goede overeenstemming vonden met de later beschreven bestra-lingsproeven met de glasspectrograaf.

Uit de hierna volgende tabellen gebruiken wij alleen die photochemische werkingen, wier waarden liggen tusschen de in hoofdstuk IX � 5 genoemdenbsp;grenzen van ca 10 en ca 50. Ter ori�nteering geven wij voor gebieden waarinnbsp;de photochemische werking aanmerkelijk buiten deze grenzen valt, slechts denbsp;gemeten werking in de toppen der in deze gebieden liggende kwiklijnen weer.nbsp;Aangezien, zooals reeds in het vorige hoofdstuk werd opgemerkt, op de hellingen der kwiklijnen het nauwkeurig aangeven van bij elkaar beboerende energie�n en daardoor veroorzaakte photochemische werkingen niefmogelijk is,nbsp;leidden wij hieruit geen waarden voor de specifieke photochemische werking af.

Wij moeten bij de beschouwing van de gevonden photochemische werkingen bedenken, dat de voor ��n punt bepaalde werking een vrij groote waarschijnlijke fout zal bezitten. In de eerste plaats passen wij de photografische intensiteitsmeting toe ondernbsp;ongunstige omstandigheden: onvermijdelijke spreidingen in de homogeniteit van hetnbsp;bacterielicht, welke veel grooter zijn dan bij normale photografische intensiteits-metingen voorkomen. Verder blijkt het steeds weer, dat bij bestudeering van een bepaalde werking op biologisch materiaal de spreidingen in de proefuitkomsten doornbsp;tal van moeilijk te controleeren nevenfactoren ongunstig worden be�nvloed. De groottenbsp;van de voor afzonderlijke punten te verwachten fout is moeilijk te schatten, doch zalnbsp;toch zeker van de orde van 10 a 20% zijn. Het best liggen uiteraard die punten vast,nbsp;waarvoor wij bij meerdere intensiteiten de photochemische werking konden bepalen.

Wij kunnen uit de in tabel XIII gegeven cijfers direct de belangrijke conclusie trekken, dat, evenals dit reeds vroeger was gevonden bij de bestralings-proeven met homogene suspensies, de photochemische werking W evenredig is met de bestralingsintensiteit, omdat voor iedere golflengte binnen de nauw-keurigheidsgrenzen van de methode de waarden van W(A.) voor verschillendenbsp;bestralingsintensiteiten constant blijken te zijn.

In figuur 23 zijn de gemiddelde waarden van W(X) uitgezet tegen de bijbehoorende golflengten; deze grafiek toont ons dus het uit de beschrevennbsp;bestralingsproef afgeleide absolute photochemische inactiveeringsspectrum vannbsp;Ph. phosphoreum.

Bij de beschouwing van deze figuur moeten wij bedenken, dat niet aan alle punten dezelfde beteekenis toekomt. Zoo is bij de metingen in het gebiednbsp;bij ca 350 mg voor de drie daarin onderzochte golflengten telkens slechtsnbsp;��n meetpunt voor de photochemische werking beschikbaar; bovendien liggennbsp;de hierbij gevonden waarden dicht aan de door ons gestelde onderste grens.

TABEL XIII.

Absolute specifieke photochemische werkingen W(A,), berekend uit de bestralingsproef met intensiteitsvariatie.

Het bij de bestralingsproef met intensiteitsvariatie gevonden verband tusschen d^nbsp;specifieke photochemischenbsp;�werking W(A.) en de golflengte van het ingestraaldenbsp;licht.

Dcor middel van proeven met tijdsvariatie konden evenwel ook in dit gebied betrouwbare waarden voor de specifieke photocbemische werking wordennbsp;gevonden.

In het gebied van 334 tot 302 mu vertoont de curve een kenmerkende knik. Wanneer men ook in dit gebied geneigd zou zijn de curve, zooals dit innbsp;het gebied bij ca 350 mfi is geschied, zoo goed mogelijk gemiddeld door denbsp;gevonden punten te trekken, moge men bedenken, dat juist in het gebied vannbsp;334 tot 302 mff ieder punt het gemiddelde vormt van een aantal afzonderlijkenbsp;waarden voor de photochemische werking. Bovendien liggen in dit gebied denbsp;gevonden waarden ruimschoots binnen de gestelde grenzen van ca 10 tot ca 50,nbsp;zoodat het alleszins geoorloofd is in dit gebied de curve vloeiend door de gevonden punten heen te trekken. Wij zullen dan ook zien, dat deze karakteristieke knik eveneens bij de proeven met tijdsvariatie wordt gevonden.

� 2. Bestralingsproeven met de kwartsspectrograaf onder toepassing van tijds-variatie.

Achtereenvolgens zullen de resultaten van twee bestralingsproeven tabellarisch worden weergegeven.

De eerste bestralingsproef geschiedde met de bestralingstijden 14, Yi, 1, 2 en 4 minuten.

In tabel XIV en tabel XV staan de bij elkaar behoorende gemeten photochemische werkingen en de quantenintensiteiten van het ingestraalde licht.

Absolute intensiteiten in quanten per cm^ X sec. bij de eerste bestralingsproef met tijdsvariatie.

Absolute specifieke photochemische werkingen W(X.), berekend uit de eerste bestralingsproef met tijdsvariatie.

De in tabel XVI weergegeven resultaten zijn in figuur 24 grafisch uitgezet. Wij zien, dat in het gebied gt; 400 mti de spreiding der punten veel grooter is dan bij de bestralingsproef met intensiteitsvariatie, hetgeen zijnnbsp;verklaring kan vinden in de omstandigheid, dat door het geheel geopendenbsp;diafragma de afbeeldingsscherpte in dit golflengtegebied zeer te wenschennbsp;overlaat tengevolge van de geringe dispersie van de kwartsspectrograaf. Wijnbsp;hebben dan ook gemeend, de in dit gebied gelegen punten niet voor de uiteindelijke bepaling van het photochemische inactiveeringsspectrum te mogennbsp;gebruiken.

Het bij de eerste bestra-lingsproef met tijdsvariatie gevonden verband tusschennbsp;de specifieke photochemischenbsp;werking W(A) en de golflengte van het ingestraaldenbsp;licht.

Tweede bestralingsproef.

By de tweede bestralingsproef was door een onvoldoende homogeniteit van de gebruikte bacteriecultuur de opname met een bestralingstyd van Mnbsp;minuut onbruikbaar.

Photochemische werkingen Wi (X 100), gevonden hij de tweede bestralingS'proef met tijdsvariatie.

Absolute intensiteiten in quanten per cm^ X sec. bij de tweede bestralingsproef met tijdsvariatie.

Uit tabel XVII en tabel XVIII zijn weer de in tabel XIX weergegeven absolute specifieke photochemische werkingen W(X) berekend.

Absolute specifieke photochemische werkingen W(A), berekend uit de tweede bestralingsproef met tijdsvariatie.

In figuur 25 vindt men de in tabel XIX gegeven waarden grafisch voorgesteld. Ook bij deze proef vertoonen de punten van het photochemische inacti-veeringsspectrum, die in het gebied gt; 400 mu liggen, een aanzienlijke spreiding. By de afleiding van het uiteindelyke inactiveeringsspectrum zyn ook deze punten niet in de berekening betrokken.

Uit de tabellen XVI en XIX zien wij, dat, zij het ook met grootere spreidingen dan bij de proeven met intensiteitsvariatie, de voor de afzonderlijke golflengten gevonden waarden van W(k) bij de verschillende bestralings-tijden constant zijn. Hieruit volgt, dat de photochemische werking W evenredignbsp;is met de bestralingstijd, zoodat wij thans hebben aangetoond, dat tot photochemische werkingen van ca 50 de wet van B u n s e n-R o s c o e voor de bestudeerde photochemische reactie geldt, dus dat:

Deze relatie geldt blijkbaar over het geheele onderzochte golflengte-gebied. � 3, Bcstralingsproeven met de glasspectrograaf.

Wegens de snelle afneming van het doorlatend vermogen voor golflengten lt; 400 mA4 was de kortste golflengte, waarvoor wij met behulp van de glasspectrograaf de photochemische werking hebben bepaald, 405 mn.

Met de glasspectrograaf zijn twee bestralingsproeven verricht, welke weer na elkander zullen worden besproken.

103

Aangezien wij bij de proeven met behulp van de kwartsspectrograaf de geldigheid van de wet W = � Iq x t reeds hadden aangetoond, achtten wij hetnbsp;overbodig deze geldigheid ook nog eens te bewijzen bij gebruik van de glas-spectrograaf. Wij zagen derhalve af van proeven met tijdvariatie, zoodat beidenbsp;bestralingsproeven met intensiteitsvariatie zijn geschied. De bestralingstijdnbsp;bedroeg wederom twee minuten.

Bij de bepaling van de absolute waarde van de ingestraalde intensiteit bleek, dat bij de eerste bestralingsproef een uitslag van 1 mm van de thermoelement-galvanometer combinatie overeenkwam met 4.17 X 10� erg per cm^nbsp;X sec. en bij de tweede bestralingsproef met 8.80 X lO'^ erg per cm^ X sec.

Met behulp van de op blz. 88 genoemde formule herleidden wij de intensiteiten in erg per cm^ X sec. in intensiteiten in quanten per cm^ X sec.

TABEL XX.

TABEL XXL

104

TABEL XXII.

Absolute specifieke photochemische werkingen W(X), berekend uit de eerste bestralingsproef met. de glasspectrograaf.

In fig. 26 is tabel XXII grafisch voorgesteld.

Bij de beschreven eerste bestralingsproef met de glasspectrograaf be-

105

droeg de spleetbreedte van de voorspleet der spectrograaf 1.45 mm, hetgeen bij de vergrooting 1 : 2 neerkomt op een breedte in het spectrum van 2.90 mm.nbsp;Hiermede kwamen in het spectrum overeen de in tabel XXIII weergegevennbsp;golflengtegebieden in mg.

Gezien het feit, dat wij bij ca 430 mg een aanduiding hebben gevonden voor de aanwezigheid van een nevenmaximum, was het gewenscht bij denbsp;tweede bestralingsproef met de glasspectrograaf de voorspleet nauwer te makennbsp;en zoodoende de golflengte-nauwkeurigheid te verhoogen, waardoor een eventueel nevenmaximum scherper tot zijn recht zou kunnen komen.

Bij de tweede bestralingsproef bedroeg de breedte der voorspleet 0.48 mm; in tabel XXIV vindt men de hiermede overeenkomende golflengtegebieden innbsp;het spectrum voor eenige golflengten opgegeven.

TABEL XXV.

106

TABEL XXVI.

Absolute intensiteiten in quanten per c'w? X sec. bij de tweede bestralingsproef met de glasspectrograaf.

TABEL XXVII.

Absolute specifieke photochemische werkingen W(A), berekend uit de tweede bestralingsproef met de glasspectro graaf.

In fig. 27 vindt men de resultaten uit tabel XXVII grafisch uitgezet.

Wij zullen thans de verkregen gegevens samenvatten; deze samenvatting levert ons het photochemische inactiveeringsspectrum van Ph. phosphoreumnbsp;in absolute maat.

Om reeds genoemde redenen zullen wij de resultaten van de bestralings-proeven met tijdvariatie slechts gebruiken voor zoover ze zijn verkregen met het golflengtegebied beneden 400 mu ; de resultaten van de bestralingsproefnbsp;met intensiteitsvariatie (kwartsspectrograaf) worden over het geheele golflengtegebied gebruikt; van de proeven genomen met de glasspectrograaf nemennbsp;wij slechts de uitkomsten verkregen met de golflengten grooter dan 400 mfi.

Zoodoende krijgen wij de volgende samenvatting onzer proeven, waarbij de gemiddelden zijn opgegeven van de bij de afzonderlijke proeven gevonden

derlijke bepalingen, waarop dit gemiddelde betrekking heeft, aangegeven, benevens de door e voorgestelde halve middelbare fout, welke met de reeds op blz. 59 genoemde formule is berekend.

108

TABEL XXVIII.

In fig. 28 geven wij tenslotte het beeld van het door ons bepaalde photo-chemische inactiveeringsspectruna van Ph. phosphoreum in absolute maat.

Wij vinden een spectrum met twee uitgesproken maxima bij 405 a 410 mu en bij 290 mg en met twee aanduidingen voor nevenmaxima bij canbsp;430 mg en bij ca 320 mg. Voorts is er een minimum bij 350 mg, terwijl hetnbsp;spectrum eindigt bij ca 470 mg .

Zooals men in de figuur ziet, is de aansluiting van het met de kwarts-spectrograaf bepaalde deel van het spectrum (270�390 mg ) aan het met de glasspectrograaf bepaalde gedeelte (405 mg en hooger) voortreffelijk.

Ten overvloede zij nog opgemerkt, dat de beschreven bestralingsproeven op zeer uiteenloopende data en met bacterieculturen met varieerende lichtintensiteiten zijn geschied.

Voor een nadere bespreking van het gevonden inactiveeringsspectrum wordt hier naar hoofdstuk XIV verwezen.

� 1. Het verloop van de lichtintensiteit na afloop der bestraling (de herstel' reactie).

In � 1 van hoofdstuk VI is reeds opgemerkt, dat de uitdooving van het bacterielicht tengevolge van uitwendige bestraling reversibel is: na afloop vannbsp;de bestraling neemt de intensiteit van het bestraalde cultuurgedeelte langzaamnbsp;weer toe, totdat tenslotte na verloop van 6 a 8 uur de intensiteitsverschillennbsp;tusschen de bestraalde en de onbestraalde cultuurgedeelten weer geheel zijnnbsp;verdwenen. Behalve deze reversibele photochemische werking op het lichtemit-teerend systeem, welke door van Schouwenburg en van der Burgnbsp;voor het eerst bij lichtbacteri�n voor zichtbare straling is aangetoond (nietnbsp;gepubliceerd) en welke, zooals nog eens nadrukkelijk naar voren moge wordennbsp;gebracht, de overige functies van de cellen niet nadeelig be�nvloedt (de ademhaling blijft o.a. bij deze bestraling constant), kennen wij uit de proeven vannbsp;Gerretsen (35) en van G i e s e (36) de schadelijke invloed van ultra-violettenbsp;straling op het lichtend vermogen en de ademhaling van lichtbacteri�n. Voor watnbsp;betreft de invloed van uitwendige bestraling op het reproductie-vermogen vannbsp;lichtbacteri�n � door Gerretsen onderzocht aan een cultuur van Ph. phosphor eum � leverden deze onderzoekingen geen gezichtspunten op afwijkend vannbsp;die, welke men ten aanzien van de invloed van ultra-violette straling op willekeurige micro-organismen reeds bezat, n.L, dat zelfs door een korte bestralingnbsp;met het licht van een kwiklamp het reproductie-vermogen der cellen wordtnbsp;opgeheven en dat deze werking wordt veroorzaakt door straling met zeer kortenbsp;golflengte.

Uit later gedane, meer quantitatieve onderzoekingen over de invloed van bestraling met ultra-violet licht op bacteri�n weten wij, dat straling met eennbsp;golflengte kleiner dan 300 mfi een sterke bactericide werking vertoont en datnbsp;boven de 300 mw deze werking snel tot nul daalt i).

Aangezien het door ons gevonden inactiveeringsspectrum zich tot in dit �letale� stralingsgebied uitstrekt, moesten wij bij onze proeven rekeningnbsp;houden met een mogelijke doorkruising van het bestudeerde reversibele bestra-lingseffect op het lichtemitteerend systeem en het letale effect op de cel als

1) Zie voor een nauwkeurig quantitatief onderzoek naar de invloed van ultraviolette stralen op bacteri�n: F. L. Gates (32) en voor een recent algemeen overzicht over de invloed van bestraling op bacteri�n het desbetreffende hoofdstuk in: B. M. Duggar, Biological Effects of Radiation (23).

geheel. Een dergelijke doorkruising zou begrijpelijkerwijze de interpretatie van het inactiveeringsspectrum in het bedoelde spectraalgebied uiterst onzekernbsp;maken en zou ons zeker niet toestaan het in het letale gebied gevonden deelnbsp;van het inactiveeringsspectrum zonder meer toe te schrijven aan hetzelfdenbsp;molecule als dat, wat door de niet-letale straling wordt aangetast. In � 2 vannbsp;dit hoofdstuk zullen wij een proef beschrijven, die het ons heeft mogelijk gemaakt de beide processen � reversibele photochemische inactiveering van hetnbsp;lichtgevend systeem en irreversibele letale werking op de cel als geheel �nbsp;scherp van elkaar te scheiden. Deze proef bestond uit het quantitatief volgennbsp;van het verloop met de tijd van de intensiteit van het bacterielicht na afloopnbsp;der bestraling.

Er is volgens van Schouwenburg en van der Burg (107) geen invloed van uitwendige bestraling op de ademhaling der lichtbacteri�n in het niet-letalcnbsp;deel van het spectrum.

Giese (36) vond, dat in het ultra-violette gebied de ademhaling van Ph. Fischeri evenredig met de hoeveelheid ingestraalde energie afneemt. Dit effect staatnbsp;blijkbaar in nauw verband met de letale werking op de geheele cel.

Aangaande de invloed van ultra-violette straling op de lichtintensiteit van Ph. phosphoreum vond Gerretsen, dat bij bestraling van een lichtendenbsp;plaatcultuur met het volle licht van een kwiklamp, onmiddellijk na de bestralingnbsp;de bestraalde gebieden even goed lichtten als ernaast gelegen onbestraalde gedeelten. Na verloop van enkele uren daalde de lichtintensiteit van het bestraaldenbsp;cultuurgedeelte; na zes a twaalf uur trad volledige uitdooving op. Bij sommigenbsp;proeven trad evenwel het verrassende effect op, dat vlak na de bestraling hetnbsp;bestraalde cultuurgedeelte aanmerkelijk intensiever lichtte dan het onbestraalde.nbsp;Gerretsen nam aan, dat door de bestraling in het cultuurmedium sporennbsp;eener actieve zuurstofverbinding werden gevormd, welke tot een snellere oxy-datie van het luciferine leidden en zoodoende een hoogere lichtintensiteit veroorzaakten. Hij wees er voorts op, hoe het blijkbaar door middel van bestralingnbsp;met ultra-violet licht mogelijk was, het reproductie-vermogen der cellen tenbsp;scheiden van het luminesceerend vermogen, waarbij het reproductie-vermogennbsp;het eerst verloren ging.

Hij herinnerde in dit verband aan een proef van Beijerinck (9), die in staat was, door het kweeken van lichtbacteri�n bij een hoogere temperatuur dan de optimale,nbsp;donkere mutanten te verkrijgen. Onder deze omstandigheden is dus blijkbaar omgekeerd de lichtfunctie gevoeliger dan het reproductie-vermogen.

Giese vond, dat na bestraling van Ph. Fischeri met ultra-violet licht de lichtintensiteit sneller afneemt dan de ademhaling en tevens, dat bij kleinenbsp;bestralingsintensiteiten de afneming van de intensiteit van het bacterielichtnbsp;evenredig is met de ingestraalde energie. Hij meent het waargenomen effect tenbsp;moeten toeschrijven aan de photochemische ontleding van het bacterie-luciferine.nbsp;Deze verklaring kan echter niet voldoende zijn, omdat hieruit niet is te begrijpen,nbsp;dat de intensiteit van het bacterielicht ook na afloop van de bestraling blijftnbsp;afnemen.

Waarschijnlijker is het, dat Giese een irreversibele afneming van de intensiteit van het bacterielicht als gevolg van een beschadiging van de celnbsp;als geheel heeft waargenomen.

De proeven van Giese zijn niet scherp te interpreteeren, omdat hij bij zijn proeven geen monochromatische straling heeft gebruikt, terwijl toch steedsnbsp;rekening moet worden gehouden met het feit, dat in photochemisch opzicht denbsp;verschillende golflengten zich niet alleen quantitatief, maar ook qualitatief verschillend kunnen gedragen.

Het bleek ons, dat het door Gerretsen vermelde effect van een tijdelijk hoogere lichtintensiteit op de bestraalde plaatsen, all��n optreedt na bestraling met golflengten korter dan 300 rau ; in dit zelfde golflengtegebied vindt naderhand volledige irreversibele uitdooving plaats door het afstervennbsp;der cellen. Ter illustreering zijn in fig. 29 enkele photografische opnamen weergegeven van een plaatcultuur van Ph. phosphoreuvt op verschillende tijden nanbsp;afloop van de bestraling met het complete kwikspectrum.

Opname A, een cultuur van Ph. phosphoreum gephotografeerd direct na afloop van een bestraling gedurende twee minuten met het volledige spectrumnbsp;van de watergekoelde superhoogedruk-kwiklamp. De door de afzonderlijkenbsp;kwiklijnen veroorzaakte photochemische werking is duidelijk waarneembaar. In de reproductie zijn de golflengten van eenige lijnen aangegeven.nbsp;Opname B, een cultuur ca 2 uur na de bestraling gephotografeerd. Het gebiednbsp;links van de 302 mw -lijn vertoont een aanmerkelijk hoogere lichtintensiteit dan de naastgelegen onbestraalde gebieden. Rechts van de 302 mu -lynnbsp;(golflengten gt; 302 mq ) zien wij, dat de photochemische werking, vergeleken met die van opname A, alweer aanmerkelijk is afgenomen.

Opname C, een cultuur ca 6 uur na de bestraling gephotografeerd. Het gebied links van de 302 m;i-lijn is thans volledig uitgedoofd. Deze uitdooving isnbsp;irreversibel. In het gebied rechts van de 302 m/�-lijn bezit het bestraaldenbsp;cultuurgedeelte weer vrijwel dezelfde intensiteit als de aangrenzende niet-bestraalde gedeelten.

Ie, dat, althans in het onderzochte intensiteitsgebied, slechts straling met een golflengte kleiner dan 300 mu op Ph. phosphoreum letaal werkt;

2e, dat, althans in het onderzochte intensiteitsgebied, slechts straling met een golflengte kleiner dan 300 mu het door Gerretsen voor het eerst waargenomen effect van een voorbijgaande intensiteitsverhooging van het bacterielicht kan bewerken.

De verklaring voor de onder Ie genoemde letale werking moet worden gezocht in de photochemische ontleding van voor het leven der cel essentieele eiwitten, waarschijnlijk nucleoprote�den; men vergelijke hiervoor de gedeeltelijknbsp;reeds eerder genoemde publicaties van Duggaren Hollaender (24, 62).

h^Hi

IHIIiiiilH�iH

onbestr.

Reproductie van enkele photografische negatieven, verkregen door het opnemen van eenige bacterie-culturen in het eigen licht, op verschillende tijdennbsp;na afloop der bestraling.

A onmiddellijk na eeh bestraling gedurende twee minuten; de afzonderlijke kwiklijnen zijn duidelijknbsp;waarneembaar.

B twee uur na afloop der bestraling; de photochemische werking is reeds weer sterk afgenomen. In hetnbsp;gebied lt; 300 mju. is de intensiteitnbsp;van het bacterielicht hooger dan innbsp;het naastgelegen onbestraalde gebied.

C de normale photochemische werking is geheel verdwenen. In hetnbsp;gebied lt; 300 m/j. is volledige uitdoo-ving opgetreden.

Wat betreft de onder 2e genoemde voorbijgaande intensiteitsverhooging van het bacterielicht zou men kunnen veronderstellen, dat het dehydrogeneerend systeemnbsp;tengevolge van de bestraling tijdelijk wordt geactiveerd. Dit zou beteekenen,nbsp;dat er per tijdseenheid meer LH2 uit L wordt gevormd (zie hoofdstuk III � 2nbsp;en 3), hetgeen een hoogere lichtintensiteit ten gevolge moet hebben. In dit verband zij opgemerkt, dat men als gevolg van een bestraling met ultra-violet lichtnbsp;wel eens een tijdelijke stimuleering van de ademhaling heeft vastgesteldnbsp;(Masure, 1932 (92)).

Alvorens in te gaan op het mechanisme van de herstelactie, zullen wij thans een proef beschrijven, waarbij wij het verloop der lichtintensiteit van denbsp;bestraalde bacteriecultuur na be�indiging der bestraling quantitatief hebbennbsp;gevolgd.

Wij bestudeerden het verloop van de herstelactie, door een bacteriecultuur gedurende twee minuten te bestralen (onder gebruikmaking van de kwarts-spectrograaf) en hem daarna op bepaalde tijden te photografeeren en wel;nbsp;direct, 4', 8', 15', 30', 60' en 120' na afloop van de bestraling. Op de' gewonenbsp;wijze bepaalden wij uit de micro-photogrammen de relatieve intensiteiten vannbsp;het bacterielicht op overeenkomstige onbestraalde en bestraalde plaatsen dernbsp;cultuur en konden zoo voor een reeks golflengten over het geheele golflengte-gebied het verloop van de photochemische werking W met de tijd volgen.

Voor ieder der beschouwde golflengten werd de onmiddellijk na de bestraling gevonden photochemische werking op 100, gesteld en werden de werkingen bij de diverse tijden procentueel in deze beginwerking uitgedrukt. In tabelnbsp;XXIX geven wij de aldus voor iedere golflengte procentueel bepaalde werkingen weer. Wij hebben de tabel in twee gedeelten gesplitst: boven de streepnbsp;hebben de gevonden waarden betrekking op het niet-bactericide deel van hetnbsp;spectrum, beneden de streep op het bactericide deel. Van beide gedeelten zijnnbsp;afzonderlijke gemiddelden opgemaakt.

Na 60 minuten blijkt de intensiteit van het cultuurgedeelte, dat met het golflengtegebied lt; 300 m/u was bestraald, hooger te zijn dan die van het neven-liggende onbestraalde cultuurgedeelte, terwijl voor de bacteri�n, welke met hetnbsp;niet-bactericide golflengtegebied gt; 300 mu zijn bestraald, de photochemischenbsp;werking dan nog 27% bedraagt van zijn waarde op het tijdstip 0'. Bij eennbsp;beschouwing van de gemiddelden blijkt, dat tot een tijd van 30 minuten na denbsp;bestraling het herstel van de lichtintensiteit over het geheele onderzochte golflengtegebied van 280 tot 436 m^^, dus zoowel in het bactericide als in het niet-bactericide deel van het spectrum, eenzelfde verloop heeft. Dit wil dus zeggen,nbsp;dat het mechanisme van de herstelreactie over het geheele onderzochte golflengtegebied hetzelfde is, iets wat sterk pleit voor de opvatting, dat bij dp 'primair intrede-nde photochemische reactie slechts ��n bepaalde component vannbsp;het lichtgevend systeem tvordt aangegrepen.

114

TABEL XXIX.

Bij herstellij den langer dan 30 minuten treedt evenwel bij de bacteri�n die met het golflengtegebied lt; 300 mti zijn bestraald, de in � 1 reeds besprokennbsp;secundaire werking op: de lichtintensiteit neemt zeer snel toe tot een waarde,nbsp;welke ver ligt boven die van de naastgelegen onbestraalde cultuurgedeelten,nbsp;om na verloop van eenige uren weer vrij snel af te nemen en tenslotte nanbsp;6 a 7 uur nul te worden. Dit is dus de reeds genoemde letale werking, welkenbsp;blijkbaar nog wordt voorafgegaan door een opleving van bepaalde functiesnbsp;van de bacteriecel.

Een belangrijk gezichtspunt is nu, dat wij, door aan te toonen dat gedurende de eerste 30 minuten na afloop der bestraling de teruggang van de oorspronkelijke photochemische werking over het geheele golflengtegebied, dus ook in het letale gebied, eenzelfde verloop heeft, de irreversibele letale werkingnbsp;scherp hebben kunnen scheiden van de door ons bestudeerde reversibele inac-tiveering van het lichtemitteerend systeem. Dit houdt tevens de voor ons onder-

zoek zeer belang^rijke conclusie in, dat de bepaling van het photochemische inactiveeringsspectrum van ��n der bestanddeelen van het lichtemitteerendnbsp;systeem niet ivordt gestoord, door een tegelijkertijd optredende photochemischenbsp;werking op een voor de activiteit van de cel als geheel essentieel bestanddeel.

Wij kunnen nu bij de interpretatie van de herstelreactie van de volgende twee mogelijkheden uitgaan;

a) nbsp;nbsp;nbsp;het herstel der lichtintensiteit vindt plaats, doordat de bij de lichtemissie

betrokken photo-gevoelige stof, welke door de bestraling is omgezet, in de loop van de tijd door de cel wordt bij gevormd;

b) nbsp;nbsp;nbsp;de photochemische reactie is werkelijk reversibel, wat dus inhoudt, dat het

in de lichtgevende reactie actieve molecule in de loop van de tijd uit het omzettingsproduct van de photochemische reactie wordt teruggevormd.

Bij het herstel van de lichtintensiteit volgens a) spelen de celenzymen ongetwijfeld een rol. Het is moeilijk te voorspellen, wat in dat geval de orde van de beschouwde naleveringsreactie zal zijn. Verloopt de herstelreactie echternbsp;volgens b), dan moet deze ongetwijfeld een monomoleculair karakter hebben.nbsp;Het verloop van de herstelreactie volgens b) toch eischt, dat de snelheid vannbsp;terugvorming van de photo-gevoelige stof op ieder moment evenredig is met denbsp;op dat moment omgezette hoeveelheid van die stof.

m de hoeveelheid photo-gevoelige stof onmiddellijk na de bestraling (voor t = 0);

mt de hoeveelheid photo-gevoelige stof op de tijd t na de bestraling; 5 de snelheidsconstante van de herstelreactie.

Herinneren wij ons de in hoofdstuk VII gemaakte opmerking over de koppeling van de intensiteit van het bacterielicht aan de hoeveelheid photo-gevoelige stof, dan is het duidelijk, dat Wt' en Wo' de procentueele photochemische werkingen voorstellen respectievelijk op de tijden 0 minuten en t

'Wo' nbsp;nbsp;nbsp;2.3^'�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;2.3

Wil nu aan de eisch, welke uit de voorstelling sub b) voortvloeit � toeneming van de hoeveelheid photo-gevoelige stof (:) de photochemisch omgezette hoeveelheid � zijn voldaan, dan moeten wij volgens het voorafgaande eennbsp;lineair verband verwachten, indien wij de logarithme van de procentueele werking uitzetten tegen de tijd, of, wat slechts op een evenwijdige verschuiving

W^

Wo'

Uit de in tabel XXIX gegeven gemiddelde waarden voor de photochemische werking Wt berekenen wij de volgende waarden voor de procentueele photochemische werking Wt' en voor (tabel XXX).

Wo'

TABEL XXX.

Het quantitatieve verloop van de herstelreactie.

0�

4�

8�

15�

30�

60�

120�

Wt'

235

Wt'

Wo'

100

935

175

Hiermede is bewezen, dat de restauratie van het lichtemitteerend systeem, welke optreedt 'naar aanleiding van de photochemische inactiveering van ��nnbsp;der componenten daarvan, het karakter heeft van een monomoleculaire reactie.

Wanneer men op grond van het bovenstaande all��n zou willen concludee-ren tot de juistheid van het onder b) veronderstelde reversibele verloop van de herstelreactie moge men bedenken, dat weliswaar deze veronderstelling kloptnbsp;met het experimenteel gevonden verloop, doch dat wij geenszins hebben be-

wezen, dat het herstel volgens de mogelijkheid onder a) genoemd niet monomoleculair of schijnbaar monomoleculair zou kunnen verloopen.

Voorloopig zullen wij dan ook dienaangaande nog g��n beslissing kunnen treffen. In � 2 van hoofdstuk XIV komen wij nog op deze kwestie terug ennbsp;zullen dan zien, dat er argumenten zijn aan t^ voeren ten gunste van de zienswijze, dat de herstelreactie inderdaad een reversie van de photochemischenbsp;ontleding is.

� 3. Nadere beschouwing van de formuleering der photochemische werking in verband met de herstelreactie.

In hoofdstuk VII veronderstelden wij bij het zoeken naar een geschikte uitdrukking voor de photochemische werking W, dat een bepaalde, met denbsp;lichtemissie verbonden stof M bij de bestraling photochemisch wordt aangegrepen en dat deze omzetting zou gehoorzamen aan de vergelijking:nbsp;dm

(Iqo is de quantenintensiteit van het ingestraalde licht in de bac-teriecellen ter plaatse van het absorbeerend systeem, a is de snel-heidsconstante van de photochemische reactie, welke ter afkorting in de plaats van het product is gezet).

omdat wij geen rekening hielden met de ook reeds tijdens de bestraling plaats vindende herstelreactie.

Hierin is: mo de hoeveelheid van de photo-gevoelige stof M voor de bestraling; m idem na de bestraling gedurende t sec.;

S de snelheidsconstante van de herstelreactie. In � 2 van dit hoofdstuk is bewezen, dat de snelheid van de herstelreactie evenredig is met de op ieder oogenblik photochemisch ontlede hoeveelheidnbsp;van de stof M.

Wij vinden dus, dat de door ons gebruikte formuleering voor W, ook wanneer wij de herstelreactie in de beschouwing opnemen, zijn practische juistheid behoudt.

Wij hebben in � 1 van hoofdstuk VI reeds opgemerkt, dat Harvey (50) kon aantonnen, dat het lichten van een Cypridina-extract door uitwendigenbsp;bestraling wordt gedoofd en tevens, dat deze dooving zijn oorzaak vindt in eennbsp;photochemische omzetting van het luciferine, niet van de luciferase.

Hij bewees verder, dat deze omzetting slechts plaats vindt bij aanwezigheid van moleculaire zuurstof; bestraling van zuurstof-vrije Cypridina-extracten of van zuurstofwrije luciferine-oplossingen had niet het minste effect op het lichtemitteerend vermogen.

De (reversibele) uitdooving van een lichtend Cypridina-extract door bestraling berust dus op een photochemische oxydatie van het luciferine.

Uit de proeven van Harvey volgt nog, dat de snelheid, waarmede deze photo-oxydatie verloopt, grooter moet zijn dan de snelheid, waarmede luciferine onder invloed van luciferase door moleculaire zuurstof wordt geoxydeerd.nbsp;Harvey was niet in staat om bij lichtbacteri�n (Ph. phosphoreum) een overeenkomstig bestralingseffect aan te toonen (51).

teri�n de lichtemissie reversibel afneemt, leek het dus van veel belang ook voor dit geval te onderzoeken, of de aanwezigheid van moleculaire zuurstof voorwaarde is voor het optreden van het effect. Wij namen daartoe de volgendenbsp;eenvoudige proeven.

Om een, op de in hoofdstuk IX � 2 beschreven wijze uitgesneden, gelatine-cultuur van Ph. phosphoreum plaatsten wij een van boven en van onderen vlak geslepen messing manteltje, dat aan twee zijkanten een messing buisjenbsp;droeg, resp. als in- en uitlaat voor het door te leiden gas. De messingnbsp;mantel werd met behulp van gesmolten kleefwas luchtdicht gekit op het voor-werpglaasje met de bacterie'cultuur. Aan de bovenzijde werd de mantel eveneens luchtdicht afgesloten door middel van een op maat gesneden voorwerp-glaasje dat met gesmolten kleefwas werd vastgekit. Het voorwerpglas dat denbsp;bacteriecultuur en het beschreven kamertje droeg, plaatsten wij in de slede Snbsp;van het op blz. 76 beschreven instelapparaat. De bestraling geschiedde metnbsp;behulp van de kwartsmonochromator, waarbij te bedenken valt, dat wij wegensnbsp;het glazen dekplaat je echter slechts in het zichtbare en in het nabije ultraviolette spectraalgebied een effect konden verwachten. Wij leidden door middelnbsp;van de in- en uitlaatbuisjes waterstof, die ter verwijdering van sporen zuurstof over verhit palladium-asbest was gevoerd, door het kamertje. Hoewel denbsp;.intensiteit van het bacterielicht na eenige minuten doorleiden zeer geringnbsp;werd en bleef, gelukte het ons niet de cultuur volkomen donker te krijgen.nbsp;Wij herinneren in dit verband aan eveneens onder alle mogelijke voorzorgennbsp;gedane proeven van Johnson, van Schouwenburg en van dernbsp;Burg (68), die er evenmin in slaagden het licht van een bacteriesuspensie opnbsp;overeenkomstige wijze volledig te dooven. Deze ervaringen leggen nog eensnbsp;weer de nadruk op de reeds door B e ij e r i n c k aangegeven bruikbaarheidnbsp;van lichtbacteri�n om sporen vrije zuurstof aan te toonen (vergelijk ook;nbsp;Meyer, 1942 (93)).

Ook doorleiding van gezuiverde stikstof en van gezuiverd koolzuur leidde niet tot volledige uitdooving van het bacterielicht. Hoewel wij er dus niet innbsp;slaagden de lichtbacteri�n bij deze proeven in een volledig zuurstof vrije gasatmosfeer te brengen, was de zuurstof in ieder geval voor de lichtreactie innbsp;hooge mate een beperkende factor.

Nadat het bacterielicht tengevolge van de doorleiding van waterstof een constante, zeer lage intensiteit had verkregen, bestraalden wij onder voortdurend doorleiden van waterstof de cultuur gedurende twee minuten. Nanbsp;afloop der bestraling viel ondanks de z��r geringe intensiteit van het bacterielicht onmiskenbaar een photochemisch effect waar te nemen. Na toelating vannbsp;lucht lichtte de bacterie-cultuur in zijn geheel sterk op, terwijl er geen spoornbsp;van een photochemische werking meer waarneembaar was.

Wij meenen uit deze waarnemingen te moeten besluiten, dat het waargenomen photochemische effect inderdaad gebonden is aan de aanwezigheid van sporen zuurstof. Dat het effect na toetreding der lucht niet langer waarneembaar was, zou dan zijn verklaring moeten vinden in de omstandigheid,nbsp;dat met sporen zuurstof slechts een zoo geringe hoeveelheid van de photo-

gevoelige component was omgezet, dat dit in de verdere stralingsintensiteit niet tot uiting kwam.

Wij hebben dezelfde proef herhaald, ditmaal met een bestralingstijd van vijf minuten. Ook nu weer zagen wij in de waterstofatmosfeer een duidelijknbsp;intensiteitsverschil tusschen de onbestraalde en de bestraalde plaatsen; bijnbsp;toelating van lucht nam de lichtintensiteit sterk toe en het cultuuroppervlaknbsp;lichtte weer volkomen homogeen. Ter controle bestraalden wij dezelfde cultuurnbsp;nog eens twee minuten in lucht; de werking vertoonde thans het normalenbsp;beeld. Deze cultuur werd nu nogmaals in waterstofatmosfeer gebracht ennbsp;opnieuw bestraald gedurende vier minuten. De normale werking was nanbsp;afloop dezer bestraling geheel overdekt door de veel diffusere werking innbsp;waterstofatmosfeer. Bij toelating van lucht verdween deze laatste werkingnbsp;wederom geheel en de oorspronkelijke photochemische werking (ontstaannbsp;door de bestraling in lucht) werd weer zichtbaar.

Lieten wij na een bestraling in waterstofatmosfeer g��n lucht toe, dan konden wij constateeren, dat de veroorzaakte photochemische werking reedsnbsp;na vijf a zes minuten weer volkomen was verdwenen. De bestralingsduur bedroeg hierbij vijf minuten; bij eenzelfde bestralingsduur in lucht duurt hetnbsp;zes a acht uren voor de intensiteiten van de onbestraalde en de bestraalde cul-tuurgedeelten weer gelijk zijn.

Hoewel het niet doenlijk is voor al deze verschijnselen een passende verklaring te geven, lijkt het toch gerechtvaardigd uit de genomen proeven te concludeeren, dat de aanwezigheid van zuurstof voor het optreden van denbsp;normale photochemische werking noodzakelijk is.

Hierbij zijn dan voor wat betreft de beteekenis van de zuurstof nog twee mogelijkheden denkbaar:

2. nbsp;nbsp;nbsp;de photo-inactiveering zelve is niet afhankelijk van de aanwezigheid

van zuurstof, doch het photo-gevoelige molecule is slechts onder aerobe omstandigheden in de cel aanwezig.

In � 2 van hoofdstuk XIV zal blijken, dat er argumenten zijn aan te voeren ten gunste van de laatstgenoemde veronderstelling.

Om de in hoofdstuk IX � 2 genoemde redenen konden wij voor de definitieve bestralingsproeven met plaatcultures slechts gebruik maken van Ph. phosphoreum.

Toch hebben wij gemeend ook nog de twee andere goed lichtende soorten, welke in ons bezit zijn; Ph. splendidum en Ph. Fischeri'^), in ons onderzoek te moeten betrekken ondanks het feit, dat wij deze bacteri�n niet opnbsp;gelatine konden kweeken, doch dit op agar-agar-platen moesten doen.

Ook de bestraling geschiedde met de zeer sterk lichtverstrooiende agar-agar als onderlaag, waardoor de verkregen resultaten zeker minder betrouwbaar zijn dan die met Ph. phosphoreum. nbsp;nbsp;nbsp;,

Omdat het hier toch slechts om orienteerende proeven ging, voerden wij de bestraling alleen uit met het zichtbare spectraalgebied, onder gebruikmaking van de glasspectrograaf.

In tegenstelling met Ph. phosphoreum, welke voor de groei en het lichten een laag temperatuur-optimum bezit (15� a 17�), moesten Ph. splendidumnbsp;en Ph. Fischeri bij 23� a 25� worden gekweekt. Overigens geschiedden hetnbsp;enten en het kweeken op overeenkomstige wijze als dit in hoofdstuk IX uitvoerig voor Ph. phosphoreum is beschreven. De kweektijd bedroeg 16 a 20nbsp;uur. Het bleek, dat zoowel Ph. splendidum als Ph. Fischeri slechtsnbsp;gedurende korte tijd hun optimale lichtintensiteit behielden, zoodat het noodignbsp;was telkens eenige series platen met twee uur tusschenruimte te enten.nbsp;Tijdens het kweeken plaatsten wij de P e t r i-schalen onder een geringe helling,nbsp;aangezien bij een vlakke stand van de schalen de bacterielaag zeer vochtignbsp;blijft en dan tijdens de bestralingsproef dooreenvloeit (een agar-cultuur isnbsp;door het slecht opnemend vermogen van agar-agar voor water, in tegenstelling tot een gelatine-cultuur, steeds vochtig).

Het was ons niet mogelijk om goed lichtende plaatcultures van Ph. splendidum en Ph. Fischeri te verkrijgen met een even geringe dikte van de bacterielaag als ditnbsp;voor Ph. phosphoreum was gelukt (15 a 17 p,).

1) Beide afkomstig uit de verzameling van het Laboratorium voor Microbiologie der Technische Hoogeschool te Delft.

Op overeenkomstige wijze als destijds voor 'Ph. phosphoreum bepaalden wij na een kweektijd van 16 uur de laagdikte, waarbij wij vonden;

Deze geschiedden, evenals de uitwerking ervan, geheel volgens de reeds voor Ph. phosphoreum beschreven methode.

Reeds aanstonds viel bij de bestralingen een duidelijk verschil op met Ph. phosphoreum: bij eenzelfde bestralingsintensiteit was de photochemischenbsp;werking bij Ph. splendidum en Ph. Fischeri veel geringer dan bij Ph. phosphoreum en bovendien scheen de werking veroorzaakt door de 405 mg-lijnnbsp;ten opzichte van die veroorzaakt door de 436 mg -lijn grooter te zijn dan ditnbsp;destijds bij de bestraling van Ph. phosphoreum-cultures was gevonden. Dezenbsp;laatste waarneming konden wdj na het photometreeren en uitwerken der photo-grammen bevestigen en objectief vastleggen.

Vooreerst scheen het dug, alsof wij bij Ph. splendidum en bij Ph. Fischeri niet alleen een quantitatief, doch ook een aanzienlijk qualitatief verschil vondennbsp;met Ph. phosphoreum.

Bestraald gedurende 4' en gedurende 2'. Spleetbreedte 0.48 mm, diafragma maximaal.

B� de beoordeeling hiervan moet men bedenken, dat de gevonden waarden voor het meerendeel van ��n waarneming afkomstig zijn. Wij hechten dan ook slechtsnbsp;belang aan het algemeene karakter der gevonden krommen en de ongeveere liggingnbsp;van de maxima, niet aan eventueel aanwijsbare nevenmaxima, aangezien deze, in tegenstelling tot de nevenmaxima in het werkingsspectrum van Ph. phosphoreum waar wijnbsp;voor ieder punt over gemiddeld 6 a 7 afzonderlijke waarnemingen beschikten, volkomennbsp;binnen de proeffout vallen.

a. Ph. splendidum.

Bepaling van de photochemische werking in absolute moat aan een plaatcultuur van Ph. splendidum. Laagdikte 55p.

Ain m

Het bij een bestralingsproef met Ph. splendidum in het zichtbare spectraalgebied gevonden verbandnbsp;tusschen de specifieke photochemische werkingnbsp;W(A) en de golflengte van het ingestraalde licht.

A in m//	4� hestr. W X 100	Iq X 10-14
A in m//	4� hestr. W X 100	Iq X 10-14	Iq X t
4405	(4.6)	100	(0.19)
436	22.5	216	0.43
431	9.2	67.0	0.57
426	8.7	45.0	0.81
421	9.2	32.8	1.17
416	10.9	27	1.67
414	12.2	28.8	1.77
412	12.4	32.7	1.58
411	14.4	33.8	1.78
410	17.9	35.3	2.11
405	37.0	78.8	1.96

Voor Ph. splendidum vinden wij een maximum bij ca 410 mg ; voor Ph. Fischeri waarschijnlijk ook, hoewel daarbij de spreiding der punten zoodanignbsp;is, dat de ombuiging der curve binnen de proeffout valt.

Wat de ligging van het werkingsmaximum in het zichtbare spectraal-gebied betreft, schijnen dus de inactiveeringsspectra van Ph. splendidum en met eenige waarschijnlijkheid ook van Ph. Fischeri, met dat van Ph. phospho-reum nagenoeg overeen te stemmen. Een duidelijk qualitatief verschil echternbsp;tusschen Ph. phosphoreum ��nerzijds en Ph. splendidum en Ph. Fischerinbsp;anderzijds is, dat het spectrum bij de laatstgenoemde soorten zich minder vernbsp;uitstrekt in het zichtbare spectraalgebied. Voor Ph. phosphoreum vondennbsp;wij, dat het inactiveeringsspectrum eindigde bij ca. 470 mg ; de inactiveeringsspectra van Ph. splendidum en Ph. Fischeri eindigen daarentegen reeds tusschen 440 en 450 mg .

Vergelijken wij de absolute hoogte der maxima bij ca 410 mg in de inactiveeringsspectra van Ph. phosphoreum, Ph. splendidum en Ph. Fischeri dan vinden wij resp. 0.85 X 10quot;^�, 2.40 X 10'^� en 2.10 X lOquot;�^�.

Voor Ph. splendidum en Ph. Fischeri vinden wij dus vrijwel overeenstemmende waarden, doch deze zijn een factor ruim vier lager dan voor Ph. phosphoreum.

Een gevolg van de verschillende laagdikten der bacteri�n kan dit nauwelijks zijn.

Bij de proeven met Ph. phosphoreum bedroeg de gemiddelde laagdikte 16g, terwijl bij de zoojuist beschreven bestralingsproeven voor Ph. splendidum en Ph. Fischeri resp. 55g en 28g werd gevonden.

Zou de laagdikte een invloed van beteekenis hebben op de absolute hoogte van het photochemische inactiveeringsspectrum, dan zouden wij zeker voornbsp;Ph. splendidum en Ph. Fischeri geen nagenoeg overeenstemmende waardennbsp;hebben gevonden.

De verklaring voor het verschil in absolute hoogte moet waarschijnlijk worden gezocht in verschillen in lichtbrekend vermogen tusschen de cellen der diverse bac-teriesoorten, waardoor de hoeveelheid licht, welke in de cel komt, van soort tot soortnbsp;sterk kan varieeren.

Het mislukken van de pogingen van andere onderzoekers (Harvey, G i e s e), om de voor het eerst door Harvey aan Ci/pridma-extracten waargenomen invloednbsp;van uitwendige bestraling ook bij lichtbacteri�n aan te toonen, kan door deze omstandigheid zijn veroorzaakt.

Het is dan ook niet onmogelijk, dat wij door zuiver toevallige omstandigheden juist dat organisme voor ons onderzoek hebben gebruikt, dat op vrywel ideale wijzenbsp;aan alle eischen, welke dit onderzoek stelde, voldeed.

BENIGE OPMERKINGEN OVER DE MOLECULAIRE ABSORPTIECO�FFICI�NT VAN DE PHOTO-GEVOELIGE STOF EN OVER HET QUANTENRENDEMENT VAN DE PHOTOCHEMISCHE REACTIEnbsp;BIJ BESTRALING VAN PHOTOBACTERIUM PHOSPHOREUM.

In hoofdstuk VII leidden wij de volgende betrekking af tusschen de specifieke photochemische werking W(A) en de moleculaire absorptie-co�fficient van de receptor:

(7)

(11)

buiten de bacteriecellen en in de bacteriecellen ter plaatse van het absorbeerend systeem,-

y een constante, welke onder aanvaarding van zekere praemissen kan worden bepaald en dan, zooals hieronder blijkt, de waardenbsp;10quot;

Wij nemen aan, dat de photogene, lichtgevoelige stof M homogeen verdeeld aanwezig is in een lichtbundel van de intensiteit J en met de golflengte A. Wij veronderstellen voorts, dat de absorptie gering is, zoodat de procentueele verzwakking van de ingestraalde lichtbundel in de absorbeerende laag eveneens klein is.

Dan geldt volgens de definitie van de moleculaire absorptie-co�fficient voor de verzwakking van de lichtbundel van de intensiteit J

In deze vergelijking is nu voorts �dJ het aantal per cm2 geabsorbeerde quanten over de laagdikte dx cm, waarvoor wij overeenkomstig vergelijking (3) van bladzijdenbsp;51 ook kunnen schrijven.

m is hierin het aantal moleculen van de stof M, voorkomende in de laag met een oppervlak van 1 cm2 en met een laagdikte dx cm, dus

Vergelijking (12) bevat nu nog twee onbepaalde grootheden, namelijk if en de verhouding

Een nadere berekening van is, dus zonder verdere veronderstellingen, welke op genoemde grootheden betrekking hebben, niet uitvoerbaar.

In � 3 van hoofdstuk XIV zullen wij echter zien, dat op grond van de bouw van het vastgestelde inactiveeringsspectrum zekere veronderstellingennbsp;zijn te maken omtrent de aard van het photochemisch omgezette molecule.nbsp;Indien wij ons hierop baseeren, zijn wij in staat met eenige waarschijnlijkheidnbsp;de orde van grootte van voor het meest langgolvige maximum in het inactiveeringsspectrum (ca 410 mu ) aan te geven en komen dan tot een waardenbsp;van ca 2.2 X 10�.

Hiervan uitgaande is het mogelijk nog een en ander over het quantenrendement ip op te merken.

Substitutie van de waarde ySqjo = 2.2 x 103 en van�de voor W(410) gevonden waarde (0.85 X lO'is) in vergelijking (12) geeft

Veronderstellen wij nu eens, dat Iqo gelijk is aan I^, dan volgt uit vergelijking (13) voor (p de waarde 0.23, een quantenrendement dat reeds vrij hoog is te noemen. In werkelijkheid zal nu evenwel Iqo zeker aanzienlijk veelnbsp;kleiner zijn dan I^.

Dit blijkt uit een in hoofdstuk VI � 1 beschreven proef van van Schouwenburg en van der Burg (107). Deze onderzoekers bepaalden de invloed van bestraling op de remming van de ademhaling van een gistsuspensie en een suspensie

van Ph. phosphoreum door koolmonoxyde. Bij de lichtbacteri�n was de bestralings-effectiviteit hierbij veel geringer dan bij gist. Als aannemelijke verklaring hiervoor nemen zij aan, dat het licht gemakkelijker in de gistcellen dan in de veel kleinere,nbsp;sterk lichtbrekende bacteriecellen binnendringt.

Indien nu Iqo lt; Iq, dan zal onder de gestelde voorwaarden de voor f berekende waarde een minimumwaarde zijn en zal dus de werkelijke waarde ervan niet onaanzienlijk hooger liggen. De reeds vrij hooge minimumwaardenbsp;van lt;p in aanmerking nemende, wordt men er toe gebracht te veronderstellen,nbsp;dat het quantenrendement in werkelijkheid de waarde 1 zal bezitten of althansnbsp;zal benaderen.

Wij zijn bij de bestralingsproeven uitgegaan van de gedachte, dat het mogelijk zou zijn door bestraling van lichtbacteri�n met licht van verschillendenbsp;golflengte het photochemische inactiveeringsspectrum en daarmede het absorp-tiespectrum van een der componenten van het lichtemitteerend systeem tenbsp;bepalen.

Dat inderdaad bij de bestraling uiteindelijk een der componenten van het lichtemitteerend systeem wordt omgezet in een verbinding, welke niet meernbsp;geschikt is om deel te nemen aan de lichtgevende reactie, volgt onmiskenbaarnbsp;uit de verkregen resultaten. Een geheel andere kwestie is echter, of deze uiteindelijk omgezette component ook zelf de voor deze omzetting noodige energienbsp;in de vorm van lichtquanten heeft geabsorbeerd.

In � 2 van hoofdstuk VI wezen wij reeds terloops op de mogelijkheid, dat het gevonden absorptiespectrum een photo-sensibiUsatorspectrum zou kunnennbsp;zijn, met andere woorden, dat weliswaar een der componenten van het lichtgevend systeem tengevolge van de bestraling wordt omgezet tot een in de licht-reactie niet meer actief product, doch dat de eigenlijke lichtabsorptie � datnbsp;wil zeggen juist die phase van het inactiveeringsproces, welke ons het inactiveeringsspectrum levert � door een geheel aqder molecule, een sensibilisator-molecule, zou geschieden. Dit sensibilisatormolecule zou dan door botsing zijnnbsp;aanslagenergie aan een der in de lichtreactie werkzame moleculen kunnennbsp;doorgeven en aldus aanleiding geven tot een photochemische reactie van denbsp;tweede soort.

Het spreekt welhaast vanzelf, dat indien zou blijken, dat het door ons langs indirecte weg bepaalde absorptiespectrum inderdaad een photo-sensibili-satorspectrum voorstelt, de gevolgde methode ons niets zou leeren omtrent denbsp;aard van een direct bij de lichtemissie betrokken molecule.

Wij zullen dus in de eerste plaats moeten trachten uit te maken, of er bij de bestudeerde verschijnselen een directe photo-inactiveering van een molecule,nbsp;werkzaam in de lichtreactie, plaats vindt, dan wel dat hier een sensibilisator-werking in het spel is.

Wanneer wij thans de hierboven geformuleerde vraag aan de orde stellen, is het verleidelijk in de eerste plaats ook aandacht te schenken aan de ervaringen, welke andere onderzoekers in zake de bestraling van bioluminescentenbsp;systemen hebben opgedaan.

Wij herinneren er dan allereerst aan, dat Harvey (50) reeds in 1925 vaststelde, dat bij bestraling van een lichtend extract van Cypridina hilgen-dprfii met een voldoend sterke lichtbron de intensiteit van het door het extractnbsp;uitgezonden licht afnam. Het bleek Harvey, dat dit photochemische effectnbsp;optrad bij bestraling met golflengten in het gebied van ca 380�ca 460 mg,nbsp;doch door toevoeging van bepaalde kleurstoffen kon het systeem ook voor lichtnbsp;van langere golflengten worden gesensibiliseerd.

Een nadere analyse van het verschijnsel leerde, dat niet de luciferase-doch wel de luciferine-component van het luminescente systeem photo-gevoelig was en voorts, dat de photo-inactiveering slechts optrad, indien gelijktijdignbsp;moleculaire zuurstof aanwezig was.

Op het eerste gezicht spreken deze uitkomsten zeer tengunste van de zienswijze, dat het bewuste effect van de bestraling moet worden toegeschrevennbsp;aan een rechtstreeksche photo-oxydatie van het luciferine.

Door een recent onderzoek van Chase en Giese (17) is deze interpretatie echter weer in hooge mate onzeker geworden. Deze onderzoekers stelden namelijk vast, dat een volgens Anderson (4) gezuiverd luciferine-preparaat voor licht met een golflengte grooter dan 300 mg weinig gevoelig is. Daarentegen bleek een bestraling met de golflengten 230�280 mu luciferine snel te inactiveeren, doch dit zou, gezien de sterk destructieve werking van deze korte ultra-violette stralen op zeer uiteenloopende organischenbsp;verbindingen, een volkomen aspecifiek effect kunnen zijn. Belangrijk is intus-schen, dat Chase en Giese vonden, dat door toevoeging van bepaalde kleurstoffen � onderzocht werden eosine, fluoresce�ne en lactoflavine � de gezuiverde luciferine-oplossing ook voor golflengten grooter dan 300 m{.i werd gesensibiliseerd. Voor deze photo-inactiveering werd nu weer � in tegenstellingnbsp;tot wat bleek te gelden voor de hierboven genoemde ontleding in het verrenbsp;ultra-violet � vastgesteld, dat zij afhankelijk was van de aanwezigheid vannbsp;moleculaire zuurstof. Het is begrijpelijk, dat Chase en Giese in deze laatstenbsp;waarnemingen de verklaring meenen te vinden voor het door Harvey aannbsp;de onzuivere luciferine-oplossing vastgestelde bestralingseffect. Het door dezennbsp;gebruikte extract zou dus een sensibilisator hebben bevat, welke werkzaam isnbsp;bij de photo-oxydatie van het luciferine en Chase (16) wijst terecht op denbsp;mogelijkheid, dat dit lactoflavine zou kunnen zijn geweest.

Wanneer wij het voorafgaande overzien, dan krijgt de hypothese, dat wij bij het door ons bestudeerde bestralingseffect eveneens met een sensibilisator-werking te doen hebben, een zekere mate van waarschijnlijkheid.

De vraag is dan evenwel, welke stof in de levende bacteriecel als sensibilisator heeft gefungeerd.

Aangezien uit quantitatieve bepalingen van Rottier (102) is gebleken, dat Ph. phosphoreum relatief veel lactoflavine bevat, zou men zich, in aanmerking nemende de door Chase en Giese geconstateerde sensibiliseerendenbsp;invloed van lactoflavine op de photo-inactiveering van Cypridina-luciferine,nbsp;zeer goed kunnen voorstellen, dat lactoflavine ook in Ph. phosphoreum denbsp;photo-inactiveering van het bacterie-luciferine sensibiliseert. In dit geval

evenwel zou het gevonden inactiveeringsspectrum identiek moeten zijn met het absorptiespectrum van lactoflavine. Een vergelijking echter van het inactiveeringsspectrum met het op pag. 40 weergegeven absorptiespectrum vannbsp;lactoflavine-tetraacetaat (dat gelijk is aan dat van lactoflavine) leert intus-schen, dat hier van identiteit geen sprake is. Men bedenke slechts, dat hetnbsp;meest langgolvige absorptiemaximum van lactoflavine bij 447 miCi ligt, terwijlnbsp;bij deze golflengte de photochemische werking op Ph. phosphoreum nog slechtsnbsp;gering is. Bovendien vinden wij een werkingsmaximum bij ca 410 m^, waarnbsp;het lactoflavinespectrum juist een minimum bezit. Deze afwijkingen zijn nietnbsp;toe te schrijven aan een verschuiving van het absorptiespectrum van lactoflavine, zooals deze bijv. optreedt bij binding van dit molecule aan een eiwit,nbsp;daar in dergelijke gevallen steeds een verschuiving naar grootere golflengtennbsp;plaats vindt. Geheel afgezien van deze overweging moet voorts worden geconstateerd, dat de algemeene bouw van het inactiveeringsspectrum zeer merkbaarnbsp;van die van het lactoflavinespectrum afwijkt.

In tweede instantie komt men er toe de mogelijkheid in beschouwing te nemen, dat een vertegenwoordiger van een geheel andere groep van stoffen,nbsp;waarvoor sensibilisatorwerking in vivo reeds eenige malen is geconstateerd,nbsp;ook voor het bij de lichtbacteri�n waargenomen effect verantwoordelijk zounbsp;kunnen zijn. In hoofdstuk VI maakten wij er reeds melding van, dat B � n n i n gnbsp;(13) aantoonde, dat de phototropische gevoeligheidscurve van de sporangi�n-dragers van Pilobolus identiek was met de absorptiekromme van een in dezenbsp;sporangi�ndragers voorkomend carotino�de, een resultaat, dat onmiskenbaarnbsp;wijst op een sensibilisatorwerking van dit carotino�de.

Het lijkt dus loonend de vraag onder de oogen te zien, of ook bij het bestralingseffect op de lichtbacteri�n niet e�n carotino�de als sensibilisatornbsp;werkzaam zou kunnen zijn. In dit verband is nu het volgende op te merken.

Van de carotino�den met 40 C-atomen absorbeert het flavoxanthine (C4oHg603) het meest kortgolvig; in aethanolische oplossing bezit het absorp-tiemaxima bij 448 en 421 mg (KuhnenBrockmann (79)). Deze maximanbsp;liggen nog aanmerkelijk meer naar de zijde van de lange golflengten dan hetnbsp;in het zichtbare spectraalgebied gelegen maximum in het werkingsspectrumnbsp;van Ph. phosphoreum (ca 410 mg ).

Van de carotino�den met minder C-atomen bezitten � af gezien van het vitamine A, dat tengevolge van de geringe lengte van het chromophore systeemnbsp;eerst bij 328 mg een absorptiemaximum vertoont � crocetine en azafrine,nbsp;ieder met zeven geconjugeerde dubbele bindingen, het eenvoudigste chromophore systeem. De absorptiemaxima van crocetine en azafrine zijn bepaaldnbsp;door Kuhn, Winterstein en Both (87). Zij vonden voor crocetinenbsp;(C20 H24 O4) absorptiemaxima bij 463 en 435.5 mg en voor azafrinenbsp;(C27 H38 O4) bij 458 en 428 mg. Crocetine en azafrine absorbeeren dusnbsp;eveneens te langgolvig om als sensibilisator verantwoordelijk te kunnen wordennbsp;gesteld voor het in het zichtbare spectraalgebied gelegen maximum in het photochemische inactiveeringsspectrum van Ph. phosphoreum. Aangezien dus geennbsp;der thans bekende carotino�den een absorptiespectrum bezit, dat met het wer-

kingsspectrum overeenstemt, zou men gedwongen zijn als sensibilisator een carotino�de, eenvoudiger van bouw dan de tot dusverre bekende, te postuleeren,nbsp;indien men de hypothese, dat bij de bestudeerde photo-inactiveering een carotino�de als sensibilisator medewerkt, zou willen handhaven. Voor de aanwezigheid van een dergelijk carotino�de in Ph. phosphoreum ontbreekt intusschennbsp;iedere aanwijzing.

Bovendien is te bedenken, dat ook de algemeene bouw van de bekende carotino�denspectra zeer merkbaar afwijkt van die van het inactiveerings-spectrum; de eerstgenoemde stoffen toch missen alle de zoo geprononceerdenbsp;absorptie in het golflengtegebied lt; 300 mg.

Dit alles in aanmerking nemende, mogen wij concludeeren, dat ook de medewerking van een carotino�de als sensibilisator bij de photo-inactiveeringnbsp;van het lichtgevend systeem in Ph. phosphoreum uitermate onwaarschijnlijk is.

Hoewel dus uit het voorafgaande volgt, dat een eventueel bij het bestra-lingseffect werkzame photo-sensibilisator niet behoort tot de tot dusver in de physiologie als zoodanig aangetroffen klassen van verbindingen, blijft uiteraard de mogelijkheid bestaan, dat hier een verbinding van geheel andere aardnbsp;sensibilisatorwerking uitoefent.

De vraag is dus, of er overwegingen van algemeene aard zijn, welke tegen deze zienswijze pleiten. Het komt ons nu voor, dat dit inderdaad hetnbsp;geval is.

waarin �� en Y de intensiteiten van het door de bacteri�n uitgezonden licht, resp. v��r en na de bestraling, voorstellen. Deze formule was gebaseerd op denbsp;veronderstelling, dat de genoemde lichtintensiteiten evenredig zouden zijn metnbsp;de hoeveelheden mo en m van een stof M, welke nauw betrokken is bij de lichtemissie en welke door de bestraling photochemisch wordt ontleed.

Wij leidden nu voorts af, dat in dit geval de als boven gedefinieerde photochemische werking evenredig moest zijn met de quantenintensiteit van het ingestraalde licht en met de bestralingstijd (wet van B u n s e n-R o s c o e).

Het feit, dat wij blijkens het in hoofdstuk X � 2 medegedeelde de betrekking :

W =: � I, X t

inderdaad � zij het ook binnen zekere grenzen � experimenteel bevestigd hebben gevonden, mag als een sterke steun worden beschouwd voor de juistheid van de koppeling van aan .

Maar tevens spreekt dit resultaat tengunste van de opvatting, dat slechts ��n bepaalde stof, welke bij het lichtgevend proces der lichtbacteri�n is betrokken, door de bestraling rechtstreeks photochemisch wordt ontleed. Indiennbsp;toch bij het bestralingseffect een sensibilisatorwerking in het spel zou zijn,nbsp;zou de vastgestelde evenredigheid geenszins altijd behoeven op te treden. Hetnbsp;zal namelijk duidelijk zijn, dat in dit geval de bedoelde betrekking alleen van

kracht zal kunnen zijn, indien aan zekere voorwaarden betreffende de wijze van voorkomen en de concentraties van sensibilisator en Van de bij de lichtemissie betrokken photo-gevoelige stof is voldaan. Wanneer men hierbij dannbsp;nog beseft, dat het waargenomen effect zich afspeelt in de intacte bacteriecel,nbsp;d.w.z. in een geprononceerd micro-heterogeen systeem, dan lijkt de waarschijnlijkheid hiervan niet groot. Dit klemt temeer, omdat men aan de uitdoovingnbsp;van de lichtemissie der lichtbacteri�n bezwaarlijk een physiologische beteeke-nis kan toekennen, zooals bijv. wel geldt voor de phototropische reactie van denbsp;sporangi�ndragers van Pilobolus, waarbij het alleszins aanvaardbaar is,nbsp;dat in de betreffende cellen een speciaal perceptie-apparaat is ontwikkeld.nbsp;Indien men in het geval van de lichtbacteri�n tot een sensibilisator-werkingnbsp;zou willen besluiten, dan ligt het veel meer voor de hand het waargenomennbsp;effect als een toevalseffect te beschouwen. Tegen deze voorstelling pleit dannbsp;intusschen weer de overweging, dat wij het bestralingseffect niet alleen bijnbsp;Ph. phosphoreum, maar ook bij Ph. Fischeri en Ph. splendidum hebbennbsp;vastgesteld. Juist de groote overeenstemming in de werkingsspectra bij dezenbsp;drie tot zeer uiteenloopende natuurlijke groepen behoorende soorten maaktnbsp;het in hooge mate onwaarschijnlijk, dat men in al deze gevallen met eennbsp;�toevals�-sensibilisator te maken zou hebben.

Begrijpelijk wordt daarentegen het algemeene voorkomen van het bestralingseffect bij alle bioluminescente systemen, wanneer men ��n der rechtstreeks bij de lichtemissie betrokken verbindingen als photochemisch gevoelige stofnbsp;aanvaardt en in de volgende paragraaf zullen wij dan ook nog eenige verderenbsp;argumenten aanvoeren, welke tengunste van deze zienswijze spreken.

� 2. Discussie, leidende tot een nadere karakteriseering van het photo-gevoelige gevoelige molecule.

Tentijde dat wij de in de vorige paragraaf behandelde vraag overwogen, deed zich nu juist een nieuw moment gelden, dat voor onze uiteindelijke instelling ten opzichte daarvan van veel belang is geweest. Door zorgvuldige onderzoekingen van Mej. A. van der Burg, welke binnenkort uitvoerig eldersnbsp;zullen worden gepubliceerd, is komen vast te staan, dat, in afwijking van denbsp;oudere waarnemingen van Eymers en van Schouwenburg (28), ernbsp;een weliswaar gering, doch anderzijds onmiskenbaar verschil bestaat tusschennbsp;de spectra van het respectievelijk door Ph. phosphoreum en door Ph. splendidum ge�mitteerde licht. Het is namelijk gebleken, dat het emissiespectrumnbsp;van eerstgenoemde bacteriesoort naar de zijde van de korte golflengten veelnbsp;steiler afloopt en zich dus minder ver uitstrekt in het violette spectraalgebied.nbsp;Nu hebben wij in hoofdstuk XII er op gewezen, dat voor de inactiveerings-spectra van beide genoemde bacteriesoorten juist geldt, dat het spectrum vannbsp;Ph. phosphoreum zich verder uitstrekt naar de zijde van het rood. Zonder hiernbsp;verder in te gaan op de theoretische samenhang van emissie- en absorptie-spectrum van eenzelfde molecule � hierop zal door Mej. van der Burgnbsp;later nog worden teruggekomen � moet worden geconstateerd, dat in de inac-tiveeringsspectra van Ph. phosphoreum en Ph. splendidum analoge verschillen

optreden als in de respectievelijke emissiespectra. Dit nu is alleen denkbaar, indien de stof, waarvoor wij langs indirecte weg het absorptiespectrum hebbennbsp;bepaald, hetzij identiek is met, hetzij nauw verwant is aan de verbinding, welkenbsp;voor de lichtemissie in de bacteri�n verantwoordelijk is.

Nu hebben wij in hoofstuk III � 3 argumenten gegeven, welke ons deden besluiten, dat het licht door het complex A.Li*, wordt ge�mitteerd, met diennbsp;verstande, dat het molecule � het volgens Anderson in de lichtreactienbsp;irreversibel geoxydeerde luciferine � de aard van het ge�mitteerde spectrumnbsp;in eerste instantie bepaalt.

Tegen de gelijkstelling van het bij de bestralingsinactiveering photo-ge-voelige molecule en Li pleit nu evenwel het door Anderson aangetoonde feit, dat het product der irreversibele, lichtgevende oxydatie van het luciferinenbsp;voor de verdere lichtreactie verloren is, een gezichtspunt, dat door de eveneensnbsp;reeds geciteerde recente onderzoekingen van Chakravorly en Ballentin e wel buiten twijfel is gesteld. Dit geldt niet alleen voor het vrijgekomennbsp;Li, maar uiteraard ook reeds voor het Li, zooals dit primair in zijn complexenbsp;verbinding met A optreedt, aangezien toch de irreversibele oxydatie, welke denbsp;energie levert voor het ontstaan van de aangeslagen toestand, ook hier al heeftnbsp;plaats gevonden.

Het voorafgaande in aanmerking nemende, moeten wij wel besluiten, dat de als bestralingseffect optredende photo-inactiveering aangrijpt bij een verbinding, welke aan de vorming van voorafgaat en nochtans met deze verbinding wat betreft de chemische bouw in belangrijke mate overeenstemt.

In dit opzicht bestaat er dus aanleiding om aandacht te schenken zoowel aan het luciferine LH2 als aan de moederstof daarvan, het dehydro-luciferine L.

Men zou nu geneigd kunnen zijn op grond van de in � 1 genoemde ervaringen van Harvey (50) aangaande de photochemische gevoeligheid van het C^prMma-luciferine te besluiten, dat ook bij onze bestralingsproeven hetnbsp;in de bacteri�n aanwezige luciferine de photo-gevoelige component van hetnbsp;lichtemitteerend systeem is.

Wij zagen evenwel reeds in de voorafgaande paragraaf, dat de recente onderzoekingen van Chase en Giese (17) het zeer onwaarschijnlijk maken,nbsp;dat het CypridinaAnciiQxmQ in het zichtbare deel van het spectrum rechtstreeks photo-gevoelig zou zijn. De ook bij afwezigheid van moleculaire zuurstof verloopende destructie in het korte ultra-violet kan toch in het beschouwdenbsp;verband buiten beschouwing blijven, terwijl de wel aan de aanwezigheid vannbsp;zuurstof gebonden ontleding door bestraling met golflengten langer dan 300nbsp;mi-i alleen optreedt bij aanwezigheid van een sensibilisator.

Hiernaast pleiten ook overwegingen van gansch andere aard tegen de aanwijzing van bacterie-luciferine als het photochemisch gevoelige molecule.

In hoofdstuk III � 2 vermeldden wij, dat uit proefnemingen van Johnson moet worden besloten, dat in lichtbacteri�n in aerobe toestand naast luciferine LH2 ook dehydro-luciferine L voorkomt. Johnson, vannbsp;Schouwenburg en van der Burg (68) bewezen door middel vannbsp;�flash� proeven, dat de nalevering van LH2 uit L door het hydrogeneerend

systeem der bacteri�n zeer snel geschiedt, door aan te toonen, dat een anaero-biose van enkele tientallen secunden voldoende is m hec aicifer lt;se-nppervlak volledig met LH2 te bezetten. Anderzijds toonden wij in hoofdstuk XI � 1 aan,nbsp;dat na afloop der bestraling eerst na verloop van enkele uren de lichtintensiteiten van de bestraalde en de onbestraalde bacteri�n weer aan elkaar gelijknbsp;zijn geworden. Zouden wij nu als gevolg van de bestraling evenals bij de bestraling van Cypridina-extracten photochemische oxydatie van het LH2 aannemen, dan stuiten wij op de moeilijk te beantwoorden vraag, waarom innbsp;beide genoemde gevallen de nalevering van het LH2 met zoo sterk uiteenloo-pende snelheden geschiedt.

Op grond van deze overwegingen komen wij er dus veeleer toe de photochemische omzetting van het dehydro-luciferine voor het optreden van het bestralingseffect verantwoordelijk te stellen.

Hoewel wij eerst in de volgende paragraaf nader op de kwestie van de mogelijke chemische structuur van luciferine en dehydro-luciferine zullennbsp;ingaan, willen wij er reeds hier de aandacht op vestigen, dat op grond vannbsp;het reeds eerder genoemde onderzoek van ChakravorlyenBallentinenbsp;(14) voor het C?/pH(Ztn�-dehydro-luciferine een chinon-structuur zeer waarschijnlijk moet worden geacht (zie � 2 van hoofdstuk II). Een belangrijkenbsp;steun voor de juistheid van de gemaakte keuze inzake het photo-gevoelige molecule is nu, dat alle chinonen in meerdere of mindere mate photo-gevoelig zijn.

Het bovenstaande doet ons dus onder zeker voorbehoud besluiten, dat bij de bestraling van lichtbacteri�n het dehydro-luciferine L photochemisch wordtnbsp;omgezet en dat dientengevolge het absorptiespectrum, dat wij langs indirectenbsp;weg hebben bepaald, het absorptiespectrum voorstelt van het in Ph. phospho-reum aanwezige dehydro-luciferine.

Wij willen hier thans nog even terugkomen op de kwestie van het verloop der herstelreactie, waarvoor wij in hoofdstuk XI � 2 twee mogelijkheden hadden opgeworpen. In de hierboven ontwikkelde gedachtengang zouden wij dusnbsp;moeten kiezen tusschen:

Ie nalevering van het door de photochemische omzetting verbruikte dehydro-luciferine door synthetische werkzaamheid van de bacteriecel,

2e terugvorming van het dehydro-luciferine uit het photochemisch omzet-tingsproduct.

Johnson (67) toonde aan (zie hoofdstuk III � 2), dat in een suspensie van lichtbacteri�n in een slechts koolhydraten bevattend medium geen groeinbsp;van beteekenis plaats heeft. Een dergelijke suspensie bevat volgens hem eennbsp;beperkte hoeveelheid luciferine en dehydro-luciferine, die in de lichtreactienbsp;langzaam irreversibel wordt verbruikt. In hoofdstuk IX � 2 bewezen wij,nbsp;dat na verloop van een incubatietijd van circa 18 uren de dikte van de bacterie-laag van de gelatinecultures, welke voor de bestralingsproeven werden gebruikt, niet meer toeneemt en dat dus ook hier geen verdere groei der bacteri�n meer plaats vindt. Aangezien wij de bacteri�n nimmer gebruikten v��rnbsp;het intreden van de groeistilstand, moeten wij aannemen, dat ook in het door

ons gebruikte bacteriemateriaal een beperkte hoeveelheid luciferine en dehydro-luciferine aanwezig is, welke niet meer door synthese wordt aangevuld.

Dit in aanmerking nemende, zou de herstelreactie moeten worden gezien als de langzame, uiteraard mono-moleculaire, terugvorming van dehydro-luci-ferine uit zijn photochemisck omzettingsproduct.

Samenvattend zou het bestudeerde bestralingseffect op Ph.phosphoreum dus neerkomen op een reversibele photochemische omzetting van het dgarinnbsp;aanwezige dehydro-luciferine.

Tenslotte willen wij nog even stil staan bij de vraag, hoe de door ons in hoofdstuk XI � 4 aangetoonde onmisbaarheid van moleculaire zuurstofnbsp;voor de totstandkoming van het bestralingseffect is te verklaren. Wij moestennbsp;daar ter plaatse in het midden laten, of de photo-inactiveering op een photo-oxydatie zou berusten, dan wel dat de aanwezigheid van zuurstof slechts onmisbaar was voor de vorming van het photo-gevoelige molecule.

Wij herinneren er dan in de eerste plaats aan, dat Johnson, van Schouwenburg en van der Burg voor de vorming van het bacterie-luciferine de reactievergelijking

Van Schouwenburg besloot voorts uit zijn proefnemingen, dat slechts een gering gedeelte van het op ieder moment in lichtbacteri�n aanwezigenbsp;luciferine in de eigenlijke lichtreactie wordt verbruikt en dat het grootste deelnbsp;van het luciferine reversibel door moleculaire zuurstof �donker� wordt ge-oxydeerd. Het is duidelijk, dat bij deze reversibele oxydatie de door Johnsonnbsp;met L aangeduide stof, het dehydro-luciferine, wordt teruggevormd. Wij moeten aannemen, .dat in aerobe toestand in lichtbacteri�n luciferine en dehydro-luciferine beide aanwezig zijn. In anaerobe toestand daarentegen geraakt denbsp;geheele bacteriecel in sterk gereduceerde toestand en zal het bovenstaandenbsp;evenwicht dus vrijwel volledig naar rechts zijn verschoven. In anaerobe toestand treffen wij dus slechts luciferine in de bacteriecel aan, in aerobe toestandnbsp;bovendien nog dehydro-luciferine.

In de gedachtengang, dat dehydro-luciferine het bij de bestraling van lichtbacteri�n photochemisch omgezette molecule is, ligt het dus voor de handnbsp;te besluiten, dat de aanwezigheid van moleculaire zuurstof noodzakelijk is voornbsp;het optreden van de photo-inactiveering, omdat alleen dan het photo-gevoeligenbsp;dehydro-luciferine in belangrijke hoeveelheid in de cel voorkomt.

� 3. Hypothese aangaande de chemische structuur van dehydro-luciferine en van luciferine.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,

Nadat wij ons hebben uitgesproken voor de zienswijze, dat bij bestraling van Ph. phosphoreum het daarin aanwezige dehydro-luciferine photochemischnbsp;wordt omgezet en dat het gevonden photochemische inactiveeringsspectrum

dus tevens het absorptiespectrum voorstelt van dit dehydro-luciferine, is het verleidelijk thans na te gaan, in hoeverre hieraan gevolgtrekkingen zijn tenbsp;verbinden aangaande de chemische structur van dehydro-luciferine en vannbsp;luciferine.

Deze gevolgtrekkingen zuilen noodzakelijkerwijze een speculatief karakter dragen, aangezien ons huidige inzicht in het verband tusschen absorptiespectrum en chemische constitutie nog zeer gebrekkig is.

Men geeft zich reeds geruime tijd veel moeite wetmatigheden te vinden in het verband tusschen absorptiespectrum en chemische constitutie en ofschoonnbsp;de beschikbare hoeveelheid feitenmateriaal overstelpend groot mag wordennbsp;genoemd, is men nog zeer ver verwijderd van de mogelijkheid, uit een gegevennbsp;absorptiespectrum deductief tot de chemische structuur van het daarbij be-hoorende molecule te besluiten, of omgekeerd, het bij een bepaalde structuur-'formule beboerende absorptiespectrum aan te geven i).

Het meeste succes hebben nog die onderzoekingen gehad, welke zich bezig hielden met de ligging van de meest langgolvige absorptieband (de zoogenaamde eindabsorptie), in afhankelijkheid van de uitgebreidheid van het chro-mophore systeem.

Welhaast klassiek in dit opzicht zijn de onderzoekingen van Kuhn en zijn medewerkers (60) over de lichtabsorptie van de m, o'-diphenylpolyenen,nbsp;waarbij onder meer bleek, dat met toenemende lengte van het systeem vannbsp;geconjugeerde dubbele bindingen een volkomen regelmatige verschuiving vannbsp;de eindabsorptie naar de zijde van het rood plaats vindt.

Is men over het geheel genomen nog niet in staat de chemische structuur uit het absorptiespectrum af te leiden, wel bezit men reeds geruime tijd hetnbsp;inzicht, dat het absorptiespectrum in hoogQ, mate jkenmerkend is voor denbsp;moleculaire structuur, of juister gezegd, voor de structuur van het in hetnbsp;absorbeerend molecule aanwezige chromophore systeem. In het algemeen magnbsp;men aannemen, dat in bouw overeenstemmende absorptiespectra wijzen op denbsp;aanwezigheid van overeenkomstige chromophore systemen in de absorbeerendenbsp;moleculen en voorts, dat de door substituties veroorzaakte verschuivingen volkomen wetmatig zijn. In de erkenning hiervan ligt nu de mogelijkheid vannbsp;het min of meer empirisch gebruik, dat men met zooveel succes in het organisch-chemisch structuuronderzoek van de absorptiespectra heeft gemaakt. Wij behoeven slechts te herinneren aan het uiterst moeizame onderzoek naar de structuur van vitamine door Williams en zijn medewerkers (119), waarbijnbsp;de structuur van ��n der splitsingsproducten mede kon worden opgehelderdnbsp;door een vergelijkend spectraalonderzoek van verschillend gesubstitueerdenbsp;pyrimidine-derivaten.

1) In een recent overzicht vat Dimroth (18) de ervaringen betreffende het verband tusschen absorptiespectrum en chemische constitutie samen, waarbij hij zichnbsp;evenwel beperkt tot verbindingen, welke slechts koolstof en waterstof of koolstof,nbsp;waterstof en zuurstof bevatten.

een absorptiespectrum kleeft, een poging hebben gedaan uit het photochemische inactiveeringsspectrum een mogelijk structuurbeeld voor het bacterie-dehydro-luciferine af te leiden, vindt zijn redenen in de volgende overwegingen:

Ie door het onderzoek van Anderson (5) en van Chakravorly en Ballentine (14) heeft men een goed gefundeerd inzicht verkregen in de structuur van enkele functioneele groepen, welke in hetnbsp;molecule van C^/pndma-luciferine voorkomen (zie � 2 van hoofdstuk II);

2e in de litteratuur vonden wij spectra beschreven, die, zij het ook allerminst in detail, dan toch in algemeene bouw overeenkomst vertoonen met het photochemische inactiveeringsspectrum van Ph. phosphoreum}).

In hoofdstuk II � 2 is uiteengezet, hoe op grond van het tot dusverre verrichte onderzoek de volgende partieele en schematische structuurformule voor Cypridina-luciterine (I) door Harvey en zijn medewerkers kon worden opgesteld :

(II)

Wij moeten hierbij echter opmerken, dat de door Chakravorly en Ballentine aangegeven parastand der OH-groepen in hun schematischenbsp;formule voor Cypridina-lmiferme niet berust op eenige experimenteele aanwijzing. Anderson, die het voorkomen van een polyphenolstructuur in hetnbsp;luciferine-molecule waarschijnlijk maakte, schreef slechts ^): �It is scarcelynbsp;�necessary to mention explicitly that the luciferin system has an oxidation-�reduction potential but slightly below the range of naturally occurring poly-�hydroxy benzene derivatives. In view of some other characteristics the possi-

1) Wellicht ten overvloede wijzen wij er op, dat wij zeker met het bestaan van geringe verschillen tusschen Cypridina- en bacterie-luciferine rekening moeten houden,nbsp;doch dat wij ons voorstellen, dat beide verbindingen tot ��n en dezelfde groep vannbsp;stoffen behooren.

�bility of this grouping- being present as a part of the luciferin molecule must �be kept in mind�. Over de stand der OH-groepen -wordt hier dus nietsnbsp;opgemerkt.

Bij beschouwing van het photochemische inactiveeringsspectrum van Ph. phosphoreum trof het ons, dat de algemeene bouw hiervan overeenkomst vertoont met de door Rndulescu en zijn medewerkers (97, 98) vastgesteldenbsp;absorptiespectra van naphtaline, anthraceen en naphtaceen. Een vergelijkingnbsp;tusschen de genoemde spectra eenerzijds en het inactiveeringsspectrum anderzijds leert, dat beide aan de zijde der langere golflengten een breed maximumnbsp;bezitten en een hooger, smal maximum meer naar de zijde van het ultra-violet.nbsp;Een dergelijk steil verloopend maximum in het ultra-violet is veelal karakteristiek voor een systeem van gecondenseerde aromatische ringen (vgl. ooknbsp;D i m r o t h (18)).

Weliswaar bezitten, in tegenstelling met die van het werkingsspectrum, de langgolvige absorptiebanden van naphtaline, anthraceen en naphtaceen een uitgesproken fijnstructuur, doch het is bekend, dat de fijnstructuur, die kenmerkend is voor eenvoudige, symmetrisch gebouwde moleculen, verloren gaat bijnbsp;invoering van substituenten, welke een verandering van het chromophorenbsp;systeem veroorzaken.

Uitbreiding van het chromophore systeem leidt, behalve tot een �versme-ring� van de fijnstructuur, ook tot een verschuiving van het geheele spectrum naar de zijde van de langere golflengten. De grootte van deze verschuivingnbsp;behoeft echter voor de afzonderlijke absorptiebanden niet even groot te zijn.

Het werkingsspectrum vertoont dus een algemeene bouw, welke kenmerkend mag worden genoemd voor een systeem van eenige gecondenseerde aromatische ringen. nbsp;nbsp;nbsp;/-

Echter moet, zooals wij zagen, op grond van de ervaringen van Chakra-vorly en Ballentin e, het voorkomen van een chinon-structuur in het dehydro-luciferine molecule eveneens worden aangenomen. Het is nu ongetwijfeld hoogst belangrijk, dat aan de hand van absorptiespectra van verschillend gesubstitueerde 1,4-naphtochinonen blijkt, dat bij overgang van naphtaline naar derivaten van 1,4-naphtochinoh het algemeene karakter van hetnbsp;absorptiespectrum, afgezien van een aanzienlijke verschuiving naar de zijdenbsp;van de langere golflengten, grootendeels behouden blijft.

Als voorbeeld toonen wij in figuur 33 het door Fieser, Campbell en Fry (30) bepaalde absorptiespectrum van 6,7-dimethyl-2,3-diallyl-l,4-naphtochinon. De bouw van dit spectrum komt nu in wezen overeen met die vannbsp;het door ons bepaalde photo-inactiveeringsspectrum van Ph. phosphoreum. Innbsp;figuur 34 is dit inactiveeringsspectrum eveneens weergegeven, waarbij wij ernbsp;op wijzen, dat, in tegenstelling met in figuur 28 (zie blz. 109) de specifiekenbsp;photochemische werking W(A) thans logarithmisch is uitgezet, teneinde eennbsp;directe vergelijking met het in figuur 33 geteekende absorptiespectrum vannbsp;6,7-dimethyl-2,3-diallyl-l,4-naphtochinon mogelijk te maken.

In aansluiting hierop merken wij op, dat de absorptiespectra der overeenkomstige 1,2-naphtochinonen in bouw van die der 1,4-naphtochinonen aanzien-

Absorntiespectrum van 6,7-di-methyl-2,3-diallyl-l,4-naphtochinon in hexaan (volgens Fieser et al.nbsp;(30)).

Op grond van deze overwegingen lijkt het tvaarschijnlijk, dat ook in dehydro-luciferine de CO-groepen in de chinonring in 1,4-positie zijn geplaatst.nbsp;Het bovenstaande leidt ons tot de volgende uitbreiding (III) van de schematische formule van Chakravorly en Ballentine:

Hierin is x ��n, of hoogstens twee; het geval, dat x de waarde drie of hooger heeft, kunnen wij uitsluiten op grond van het feit, dat het absorptie-spectrum van de koolwaterstof naphtaceen, met vier gecondenseerde benzol-ringen, reeds verder naar de zijde van het rood is gelegen dan het werkings-spectrum (97); eerst recht zal dit dus het geval zijn bij het daarvan afgeleide

1.4- naphtochinon of gesubstitueerd 1,4-antrachinon kunnen beslissen, indien wij

de beschikking hadden over de vergelijkingsspectra van de ongesubstitueerde of slechts door verzadigde groepen gesubstitueerde verbindingen. Van hetnbsp;1,4-anthrachinon zijn zulke spectra echter niet bekend. Toch kunnen wij metnbsp;behulp van de volgende indirecte redeneering met eenige waarschijnlijkheidnbsp;een beslissing treffen.

De eindabsorpties van naphtaline en anthraceen bedragen respectievelijk 287 en 379 mu (98). De eindabsorptie van 2,3-dimethyl-l,4-naphtochinon isnbsp;gelegen bij 330 mp (30), dus circa 43 mp langgolviger dan die van naphtaline.nbsp;Nemen wij nu aan, dat bij de overgang van anthraceen in 1,4-anthrachinon eennbsp;verschuiving naar het rood van ongeveer dezelfde grootte plaats vindt � eennbsp;veronderstelling, die gezien de zeer groote overeenkomst in chemische eigenschappen tusschen 1,4-naphtochinonen en 1,4-anthrachinonen (29) zeker toelaatbaar is � dan komen wij voor het 1,4-anthrachinon op een eindabsorptienbsp;bij ca 422 mp . Dit zou dan de eindabsorptie zijn van de ongesubstitueerde, ofnbsp;slechts door verzadigde resten gesubstitueerde verbinding. Bij invoering vannbsp;de groep �CO�^CHgOH zou de eindabsorptie ongetwijfeld nog meer naar denbsp;zijde van het rood verschuiven. Volgens deze redeneering zou de meest lang-golvige absorptieband van het beschouwde 1,4-anthrachinonderivaat aanmerkelijk verder naar het rood zijn gelegen dan het overeenkomstige maximumnbsp;in het werkingsspectrum, hetgeen de 1,4-anthrachinonstructuur in hooge matenbsp;onwaarschijnlijk maakt.

Op grond van bovenstaande uiteenzetting meenen wij dus een l,4--naphto-chinonstmctuur voor het dehydro-luciferine als de meest waarschijnlijke te mogen beschouwen.

Om de betrekkelijk langgolvige absorptie te kunnen verklaren � 1,4-naphtochinonen met verzadigde zijketens of me^ dubbele bindingen in |�,y-positie aan de chinonring hebben een eindabsorptie tusschen 330 en 340 mp (30) �nbsp;zouden wij tevens moeten aannemen, dat de groep �CO�CH2OH in de chinonring is gesubstitueerd. Uit onderzoekingen van Hooker (63) is namelijknbsp;bekend, dat, in tegenstelling tot de invoering van een dubbele binding in denbsp;^,7-positie, invoering van een a,j8-standige dubbele binding in de chinonringnbsp;van de 1,4-naphtochinonen een aanzienlijke kleurverdieping bewerkt. Hetzelfdenbsp;mogen wij mutatis mutandis aannemen voor de carbonylgroep.

Dit alles in aanmerking genomen, zoudpn wij dus het volgende structuur-beeld voor het bacterie-dehydro-luciferine willen poneeren (IV):

Het is duidfilijk, dat wij, door dehydro-luciferine op te vatten als een derivaat van 1 ,j-naphtochinon, het plaatsen in de klasse der physiologisch belangrijke vitamine K-derivaten, waarvan bekend is, dat zij door de meest uit-eenloopende organismen kunnen worden gesynthetiseerd^).

De opvatting van dehydro-luciferine als een stof, welke verwant zou zijn met de vitaminen K, maakt eveneens, afgezien van de overige overwegingen,nbsp;plaatsing van de �CO�CH20H-groep in de chinonring waarschijnlijker dannbsp;die in de benzolring.

Er moge nog op worden gewezen, dat de formules (IV) en (V) goed schijnen overeen te stemmen met de tot dusverre bekende eigenschappen vannbsp;dehydro-luciferine. Dat luciferine gemakkelijk reversibel oxydeerbaar en zelfsnbsp;autoxydabel is, is voor een 1,4-naphtohydrochinon-derivaat alleszins begrijpelijk. De door Chase en Giese (17) geconstateerde ongevoeligheid van gezuiverd Cypridina-luciierine voor straling met golflengten grooter dan 300nbsp;mu , kunnen wij verklaren door te beseffen, dat luciferine als 1,4-naphtohydrochinon-derivaat slechts weinig langgolviger dan naphtaline zal absorbeeren ennbsp;hoogstwaarschijnlijk boven 300 mu geen absorptiebanden bezit. Verder is,nbsp;zooals in � 2 van dit hoofdstuk reeds werd opgemerkt, de lichtgevoeligheidnbsp;van het dehydro-luciferine volkomen in overeenstemming met de ervaring, datnbsp;de chinonen en met name ook de vitamine K-derivaten photo-gevoelig zijn (zienbsp;bijv. Almquist (1)).

Wij willen er evenwel dadelijk met nadruk op wijzen, dat de aanwezigheid van nog andere groepen in dehydro-luciferine en in luciferine geenszins uitgesloten mag worden geacht. In dit opzicht zijn de formules (IV) en (V)nbsp;nog zuiver schematisch. Het is dan ook geenszins te verwachten, dat een synthetisch �luciferine�, dat de in formule (V) aangegeven constitutie bezit, metnbsp;een luciferase-preparaat van willekeurige herkomst licht zal geven; men moetnbsp;veeleer aannemen, dat de specificiteitsverschillen tusschen luciferinen vannbsp;verschillende herkomst hun oorzaak vinden in de aanwezigheid van verschillende en verschillend geplaatste substituenten.

Het is interessant in dit verband te herinneren aan het onderzoek van Kuhn,DesnuelleenWeygand (80), die bewezen, dat de physiologischenbsp;activiteit van lactoflavine (de werking als vitamine B2) is gebonden aan hetnbsp;voorkomen van methylgroepen op de plaatsen 6 en 7, terwijl anderzijds het

1) Met eenige waarschijnlijkheid mogen wij aannemen, dat de moleculaire absorp-tie-co�fficient van dehydro-luciferine van dezelfde orde van grootte zal zijn als die van de overige 1,4-naphtochinonen, namelijk'2.2 X 10� (zie; F i es er en zijn medewerkers (30)). Hiervan hebben wij in hoofdstuk XIII reeds gebruik gemaakt.

voor de flavinen karakteristieke absorptiespectrum wel qua ligging, doch niet qua vorm van de aan- of afwezigheid of de plaats der methylgroepen afhankelijk is.

Wij moeten de hierboven ontwikkelde formules dan ook voorloopig slechts zien als een aanknoopingspunt voor synthetisch werk. Hierbij zal dan in denbsp;eerste plaats de juistheid van de in dit hoofdstuk gegeven deducties moetennbsp;worden getoetst door na te gaan, of inderdaad de stof met de structuurformulenbsp;(IV) een absorptiespectrum vertoont, dat in wezen overeenstemt met hetnbsp;photochemische inactiveeringsspectrum van Ph. phosphoreum.

In tweede instantie zal men zich dan moeten afvragen, door welke substituties men tot physiologisch actieve preparaten zou kunnen komen. Hoewel het zeker verleidelijk zou zijn in deze richting eenige suggesties te doen,nbsp;komt het ons niettemin voor, dat wij hiermede in dit stadium van het onderzoek slechts hypothesen van de tweede orde zouden opwerpen.

Liever dan ons hieraan te wagen, zullen wij dit dan ook aan het toekomstig onderzoek overlaten.

Chapter I. A short survey has been given of the distribution of bioluminescence in nature. Among the animals luminous forms appear in all lower classes including the fishes; in the vegetable kingdom such forms arenbsp;only found amongst bacteria and fungi.

In contrast to what holds for bacteria and fungi, some animal organisms are characterized by the property that the luminous substance is excreted.

Chapter II. The investigations made so far prove that in all probability bioluminescence is in all cases due to the oxidation by molecular oxygen of a thermostable compound of low molecular weight: luciferin, through thenbsp;intermediary of an enzyme: luciferase.

In those cases in which one has succeeded in separating luciferin and luciferase from different living organisms, the two compounds proved to benbsp;rather specifically adapted to each other (� 1).

The chemical investigations of the said compounds made until now are far from being complete, it even can be said that up to now luciferase hasnbsp;scarcely been investigated at all.

For luciferin it has been made acceptable that its molecular structure includes two oxidation possibilities: the reversible �dark� oxidation withnbsp;oxygen or other inorganic oxidizers to dehydro-luciferin is probably based onnbsp;the presence of a polyphenol-grouping (Anderson), whereas in the irreversible �luminescent� oxidation with oxygen and luciferase a �CO�CH2OH-group is oxidized to a �COOH-group (Chakravorly and B a 11 e n t i n e)nbsp;(� 2).

Chapter III. The schemes for the mechanism of bioluminescence drawn up so far have been briefly discussed. The theory put forward by Harveynbsp;and his collaborators that luciferase should be the light emitting molecule wasnbsp;rejected. Arguments were given in favour of the view that on oxidation of thenbsp;luciferase-luciferin complex the complex of luciferase and irreversibly oxidizednbsp;luciferin primarily appears in an excited state and that it is this excited complex which is responsible for the light emission (�� 1 and 3).

Moreover attention was drawn to the fact that many considerations support the opinion that the nature of the process of bioluminescence is the same in all luminous organisms, and that more specifically the various luciferins willnbsp;all be closely related substances.

Chapter TV. As a direct chemical investigation of the phenomenon of bioluminescence depends on the possibility of studying this process in vitro,

we decided � notwithstanding the negative experiences of earlier investigators � to make some fresh efforts to separate the luminous system from the bacterial cell.

Action of liquid air on Ph. phosphoreum did produce in our experiments a cell disintegration, but no extra-cellular luminescence resulted (�2).nbsp;Attempts to extract from strongly luminescent bacteria a substance whichnbsp;would be able to restore the luminous capacity of bacteria darkened by exhaustion also led to negative results (�3).

The possible causes for the failure of these and other attempts to obtain active preparations from luminous bacteria were discussed (� 4).

Chapter V. The observation that light emission of luminous bacteria is bound up with a non HCN-sensitive part of the total respiration, togethernbsp;with some other observations bearing on the case, had made E y m e r s andnbsp;van Schouwenburg suggest that, just as in the �dark�, non HCN-sensitive respiration processes, a flavin-enzyme might also co-operate in the lightnbsp;reaction.

This view was supported in some respects by the observations of Dou-d 0 r 0 f f who under special conditions succeeded in restoring the light intensity of some bacterial strains with weakened light emission by adding riboflavin to the culture medium. Doudoroff looked upon this result as an indication that riboflavin, or a derivative of it, would be directly involved innbsp;the luminescent process.

With a view to the fact that the riboflavin effect is only manifest, if a complete growth cycle is involved, and that, moreover, there exists no correlation between the luminescence of bacterial cultures and their riboflavin content, we were already inclined to reject the suggestions made by Eymersnbsp;and van Schouwenburg and by Doudoroff (� 1).

Moreover, in order to test the possibility that in bacterial luminescence some special derivative of riboflavin would take part, we isolated from Ph.nbsp;phosphoreum a flavin in the form of its tetraacetate. As to its melting pointnbsp;and its absorption spectrum this compound proved to be fully identical withnbsp;synthetical riboflavin-tetraacetate, a result which is also unfavourable for thenbsp;riboflavin hypothesis (�2).

As further direct chemical investigation seemed to offer little prospect, we decided to pass to an indirect method for the identification of one of thenbsp;components of the luminous system (�3).

Chapter VI. In the same way as Harvey had found for the luminescence of Cypridina-extrSiCts van Schouwenburg and van der Burg could prove for luminous bacteria that the intensity of the emitted light isnbsp;reversibly reduced by irradiation. Apparently a photochemical conversion ofnbsp;one of the components of the light emitting system occurs. This radiation effectnbsp;proved to be clearly dependent on wave-length (�1).

A closer study of the radiation effect seemed, therefore, to open the possibility of determining an �inactivation spectrum� which at the same time would be the absorption spectrum of that component of the light emitting systemnbsp;which has absorbed the active radiation (�2).

Attention was drawn to a number of investigations described in literature in which absorption spectra determined according to this indirect principlenbsp;proved to be identical with absorption spectra obtained by direct measurementnbsp;(� 3).

Chapter VII. The question was examined in which way the required absorption co�ffici�nt for a definite wave-length will depend on the experimentally determinable quantities, viz., the intensities Yo and Y of the bacterialnbsp;light before and after irradiation. Accepting certain premises it was found

that the quantity In � designated by us as �photochemical effect� �- will be

definitive, with the restriction, however, that this quantity is proportional to the total number of quanta, that is to say to the product of the time of irradiation and the quantum intensity of the light on the spot of the absorbing system.

By calculating the photochemical action per incident quantum, we obtained a quantity, defined by us as �specific photochemical effect� which forms anbsp;direct measure for the required absorption co�ffici�nt. The curve representingnbsp;the relation between the wave-length and the corresponding specific photochemical effect � the inactivation spectrum � will represent at the same timenbsp;the absorption curve in a relative measure of the compound which has absorbednbsp;the photochemically active radiation.

Chapter VIII. In radiation experiments with bacterial suspensions we succeeded only for a few wave-lengths to estimate with sufficient accuracynbsp;the photochemical effect. Nevertheless these experiments were in so far ofnbsp;importance that they already offered us a first insight into the structure of thenbsp;inactivation spectrum in the visible region.

As we did not succeed in isolating a greater number of wave-lengths with the required intensity, it proved, however, to be impossible to make a sufficientnbsp;number of observations for the construction of a spectrum.

Chapter IX. In order to obtain measurements over a larger range of wave-lengths we modified our method substantially. In the first place wenbsp;passed from bacterial suspensions to homogeneously grown plate cultures,nbsp;whilst at the same time the irradiation by means of isolated mercury linesnbsp;was replaced by irradiation with the light from a water-cooled super-highnbsp;tension mercury lamp, which light on passing a spectrograph yielded a continuous spectrum. Using this method it proved possible to estimate the intensitynbsp;of the bacterial light before and after irradiation for a great number of wavelengths with the aid of the objective photographic method (� 1).

(�2), the apparatuses employed and the way in which the bacterial cultures were irradiated (� 3), the photographic measurement of the intensity of thenbsp;light emitted by the bacterial cultures before and after irradiation (�4), andnbsp;the estimation of the spectral energy distribution in the spectrum used fornbsp;the irradiation. An example was given to show how for the various wavelengths the specific photochemical effect was computed from the obtained datanbsp;(� 5).

Finally we showed in some special experiments that the scattering of the incident light by the bacterial cultures did not endanger the reliability ofnbsp;our results (�6).

Chapter X. In this chapter a description is given of the estimation of the photochemical inactivation spectrum of Ph. phosphoreum. For the ultraviolet region we employed a quartz spectrograph making successive experiments, in which either the irradiation intensity (� 1) or the time of irradiationnbsp;was varied (� 2). For the visible range a glass spectrograph was used onnbsp;account of its greater dispersive power (�3).

Within wide limits the photochemical action proved to be satisfactorily proportional to the time of radiation and to the radiation intensity, so thatnbsp;the B u n s e n-R o s c o e law appears to hold for the photochemical conversionnbsp;under examination.

By summarizing and averaging all results the photochemical inactivation spectrum of Ph. phosphoreum was obtained (� 4). This spectrum shows markednbsp;maxima at 405 to 410 mp and 290 mu , a minimum at about 350 mp and furthernbsp;indications for two.additional maxima at about 430 and 320 mp (see fig. 28).

Chapter XI. Hereupon the recovery of the light intensity after irradiation was studied. It appeared that those parts of the culture which were irradiated with wave-lengths from the region lt; 300 mp showed a secondarynbsp;effect, earlier described by Gerretsen: after an initial increase in lightnbsp;intensity to a value exceeding that of the adjacent non-irradiated parts of thenbsp;culture, a complete extinction occurs, owing to the death of the bacteria (�1).

A quantitative study of the course of the recovery process showed, however, that up to about 30 minutes after the end of the irradiation this course is thenbsp;same for the entire wave-length region examined, and that only after thisnbsp;period the above mentioned secondary effect becomes manifest.

We inferred from this that the decrease in light intensity owing to irradiation is primarily only due to the photochemical conversion of one and the same compound, and that consequently the inactivation spectrum indeed representsnbsp;the absorption spectrum of one single compound. Although it was proved thatnbsp;the course of recovery had a monomolecular character, this result did notnbsp;allow a decision regarding the nature of the recovery process (�2).

When deriving the formula for the photochemical action given in chapter VII we did not take into account the fact that recovery must already occur

during the irradiation period. However, a simple calculation showed that the said formula answers all practical requirements, owing to the low value of thenbsp;velocity constant of the recovery process as compared with that of the photochemical conversion (�3).

Finally we made some experiments in order to investigate the significance of oxygen for the photochemical reaction. These experiments led to the conclusion that the presence of oxygen is essential for the occurence of the radiationnbsp;effect on the light emission of Ph. phosphoreum.

Chapter XII. Irradiation experiments on Ph. splendidum and Ph. Fischeri � made merely for the visible range of the spectrum � showed thatnbsp;the irradiation effect described for Ph. phosphoreum also occurs with thesenbsp;bacterial species. In general the inactivation spectra obtained mutually showednbsp;a great resemblance, although the spectra of the two first mentioned speciesnbsp;extend somewhat less far into the red.

Chapter XIII. A brief consideration of the value of the quantum efficiency of the photochemical reaction occurring on the irradiation of Ph.nbsp;phosphoreum showed that the possibility of a quantum efficiency of 1 is not tonbsp;be excluded.

Chapter XIV. On discussing the question which molecule is photoche-mically converted when Ph. phosphoreum is irradiated, the possibility had first to be considered that the radiation could have been absorbed by anothernbsp;molecule than the finally inactivated one, or in other words that a photo-sensitizer could have been responsible for the photo-inactivation observed. Itnbsp;appeared that in this respect two obvious possibilities � i.e. the action of riboflavin or of a carotene as a photo-sensitizer � could be conclusively refuted;nbsp;further considerations of a general nature made it less probable that a so farnbsp;unknown sensitizer would be involved (� 1).

Moreover^ an additional argument could be brought forward in favour of the view that the observed radiation effect is due to a direct action on one ofnbsp;the components of the light emitting system. Various considerations led to thenbsp;view that with great probability dehydro-luciferin has to be considered to benbsp;the photosensitive component.

On this basis the course of recovery and the indispensability of oxygen for the radiation effect was once more briefly discussed. Our conclusion was thatnbsp;oxygen will be essential for the photo-inactivation as only then a larger quantity of dehydro-luciferin is present in the cell (�2).

Finally we tried to answer the question whether the absorption spectrum determined by us might contribute to the development of a structural formulanbsp;for dehydro-luciferin. Taking into account the results obtained by Anderson and by Chakravorly and Ballentine in their chemical studies

of Cypridina luciferin, and by comparing our spectrum with several apparently related spectra, we could give arguments in favour of the view that dehydro-luciferin might be a derivative of 1,4-naphthoquinone, in which the CO-CH2OH-group � accepted to be present by Chakravorly and Ballentine �nbsp;is a direct substituent of the quinone nucleus.

For luciferin a corresponding naphthohydroquinone structure was deemed to be the most probable.

Abschnittl. Es wurde eine kurze �bersicht �ber die Verbreitung der Bioluminescenzerscheinung gegeben. In der Tierwelt trifft man in samtlichennbsp;niedrigeren Klassen, bis einscbliesslich der Fische, leuchtende Formen an, innbsp;der Pflanzenwelt findet man sie nur unter den Bakterien und Pilzen.

lm Gegensatz zu den leuchtenden Bakterien und Pilzen scheiden einige Tierarten leuchtende Exkrete aus.

Abschnitt II. Die bisher vorgenommenen Untersuchungen haben ergeben, dass Bioluminescenz allem Anschein nach immer auf der Oxydationnbsp;eines niedrigmolekularen, thermostabilen Stoffes (Luciferin) durch moleku-laren Sauerstoff unter Vermittlung eines Enzyms (Luciferase) beruht. In dennbsp;Fallen, in denen Luciferin und Luciferase vom lebenden Organismus abzutren-nen war, ergab sich, dass diese zwei Komponenten ziemlich spezifischnbsp;aufeinander eingestellt sind (�1).

Die chemische Untersuchung von Cypridma-Luciferin ist noch keines-wegs abgeschlossen und mit der Untersuchung von Luciferase wurde sogar noch kaum begonnen.

Hinsichtlich des Luciferinmolek�ls liess sich plausibel machen, dass seine Struktur zwei Oxydationswege gestattet. Die reversible �dunkle� Oxydation zunbsp;Dehydroluciferin durch Sauerstoff oder Oxydationsmittel beruht wahr-scheinlich auf dem Vorhandensein einer Polyphenolgruppe (Anderson),nbsp;wahrend bei der irreversiblen �leuchtenden� Oxydation durch Sauerstoffnbsp;eine �CO�CHgOH-Gruppe unter dem Einfluss von Luciferase zu einernbsp;�COOH-Gruppe oxydiert wird (Chakravorly und B a 11 e n t i n e) (�2).

Abschnitt UI. Es wurde eine �bersicht �ber die bisher aufgestellten Schemata f�r den Mechanismus der Leuchtreaktion gegeben (�� 1 und 2). Dienbsp;Ansicht, dass Luciferase das lichtemittierende Molek�l sein soil, wie Harveynbsp;und Mitarbeiter annehmen, wurde abgelehnt. Es wurde die Auffassung be-gr�ndet, dass bei Oxydation des Luciferase-Luciferinkomplexes der Komplexnbsp;von Luciferase und irreversibel oxydiertem Luciferin primar in angeregtemnbsp;Zustande entsteht und dass die Lichtemission auf Rechnung dieses Komplexesnbsp;zu stellen ist (�� 1 und 3).

Weiterhin liess sich die Auffassung st�tzen, dass die Art des Biolumines-cenzprozesses in samtlichen Leuchtorganismen die gleiche ist und dass beson-ders auch die verschiedenen Luciferine einander nahe verwandt sind.

minescenzerscheinung abhangt von der M�glichkeit den betreffenden Prozess in vitro zu studieren, entschlossen wir uns � trotz der negativen Erfahrungennbsp;anderer Autoren � die M�glichkeit der Abtrennung des leuchtenden Systemsnbsp;von der Bakterienzelle neuerdings zu pr�fen.

Einwirkung fl�ssiger Luft auf P/i. phosflioreum ergab bei unseren Ver-suchen zwar eine Zelldesintegration, f�brte jedoch nicht zu einer extrazellu-laren Luminescenz (�2).

Weiterhin wurde vergeblich versucht aus gut leuchtenden Bakterien einen Extrakt zu gewinnen, der imstande ware die Leuchtfahigkeit ausgeleuchteternbsp;Bakterien wiederherzustellen (�3).

Die etwaigen Ursachen des Scheiterns dieser und anderer Versuche zur Gewinnung aktiver Praparate aus Leuchtbakterien wurden kurz er�rtert (�4).

Abschnitt V. Die Beobachtung, dass die Lichtemission der Leuchtbakterien mit einem nicht HCN-empfindlichen Teil der Gesamtatmung zusam-menhangt, sowie einige weitere diesbez�gliche Beobachtungen, hatten E y m e r s und van Schouwenburg zu der Hypothese gef�hrt, dass wienbsp;bei den �dunkien� nicht HCN-empfindlichen Atmungsprozessen die Mitwirkungnbsp;eines Flavinenzyms auch bei der Lichtreaktion in Frage komme.

Diese Auffassung wurde einigermassen gest�tzt durch die Beobachtungen Doudoroffs, vi4)nach es unter bestimmten Umstanden gelang, durch Zu-f�gung von Lactoflavin zum Kulturmedium von Bakterienstammen, derennbsp;Leuchtkraft abgenommen hatte, die Lichtintensitat wieder zu steigern.

Doudoroff betrachtete dieses Ergebnis gleichfalls als St�tze f�r die Auffassung, dass Lactoflavin oder ein Derivat dieses Stoffes unmittelbar beinbsp;der Lichtemission mitwirkte.

Auf Grund der Tatsache, dass der mit Lactoflavin erzielte Effekt nur �ber einen vollstandigen Wachstumszyklus zustande kommt, sowie auf Grundnbsp;der Erwagung, dass im allgemeinen zwischen der Leuchtfahigkeit von Bak-terienkulturen und ihrem Lactoflavingehalt kein Zusammenhang besteht,nbsp;glaubten wir die von E y m e r s und van Schouwenburg und vonnbsp;Doudoroff ausgesprochene Vermutung ablehnen zu m�ssen (� 1).

Zwecks Feststellung ob etwa ein zu Lactoflavin nahe verwandtes Um-wandlungsprodukt in den Leuchtbakterien verhanden war, isolierten wir aus Ph. phosphoreum ein Flavin in Form seines Tetraacetats; dieses war jedochnbsp;nach Schmelzpunkt und Absorptionsspektrum identisch mit synthetischemnbsp;Lactoflavin-Tetraacetat. Auch diese Untersuchung fiihrte mithin nicht zu einernbsp;Bestatigung der Auffassung Doudoroffs (� 2).

Da eine Fortsetzung der direkten chemischen Untersuchung des Biolu-minescenzprozesses in Leuchtbakterien geringe Aussicht auf Erfolg versprach, versuchten wir eine deh Komponenten des lichtemittierenden Systems mitnbsp;Hilfe einer indirekten Methode zu charakterisieren (�3).

Ci/pndma-Extrakten gefunden hatte, konnten van Schouwenburg und vanderBurg auch f�r Leuchtbakterien nachweisen, dass die Intensitat desnbsp;ausgesandten Lichtes durch aussere Bestrahlung reversibel abnimmt und dassnbsp;mithin anscheinend einer der Bestandteile des lichtemittierenden Systems durchnbsp;die Bestrahlung photochemisch umgesetzt wird. Es ergab sich, dass der Be-strahlungseffekt stark von der Wellenlange abhangig war (� 1).

Ein Studium des genannten Bestrahlungseffektes schien nunmehr die M�glichkeit zu bieten das Inaktivierungsspektrum und damit auf indirektemnbsp;Wege das Absorptionsspektrum jenes Bestandteiles des lichtemittierendennbsp;Systems zu bestimmen, der die wirksame Strahlung absorbiert hat (� 2).

Iri diesem Zusammenhang wurden verschiedene in der Literatur beschrie-bene Untersuchungen besprochen, in denen nach obigem Prinzip bestimmte Absorptionsspektren sich als identisch erwiesen mit den durch direkte Mes-sung erhaltenen Absorptionsspektren (�3).

Abschnitt VII. Eine Betrachtung der Frage, in welcher Weise der gesuchte Absorptionskoeffizient f�r eine bestimmte Wellenlange mit dennbsp;experimenten zu bestimmenden Grossen � und zwar den Intensitaten Yo undnbsp;Y des Bakterienlichtes vor und nach der Bestrahlung � zusammenhangennbsp;w�rde, lehrte, dass unter Annahme gewisser Voraussetzungen die als �photo-

Dies gilt in dem Sinne, dass diese Grosse der Gesamtzahl der wahrend des Versuches eingestrahlten Quanten (Produkt der Bestrahlungszeit und dernbsp;Quantenintensitat des Lichtes an der Stelle des absorbierenden Systems) proportional ist.

Durch Berechnung der photochemischen Wirkung pro eingestrahltes Quant erhielten wir nun eine als �spezifische photochemische Wirkung� be-zeichnete Grosse, welche ein direktes Mass f�r den zu bestimmenden Absorp-tionskoeffizienten bildet.

Die Kurve, die den Zusammenhang zwischen der Wellenlange und der dazu geh�rigen spezifischen photochemischen Wirkung wiedergibt � das Inaktivierungsspektrum � stellt nunmehr gleichzeitig die Absorptionskurve dernbsp;Verbindung, die die photochemisch wirksame Strahlung absorbiert hat, innbsp;relativem Masse dar.

Abschnitt VIII. Bei Bestrahlungsversuchen mit homogenen Bakte-riensuspensionen ergab sich nur f�r einige Wellenlangen die M�glichkeit, die photochemische Wirkung mit befriedigender Genauigkeit zu bestimmen. Trotz-dem war das Ergebnis dieser Versuche insoferne sehr hoffnungsvoll, als es unsnbsp;bereits einen ersten Einblick in den Bau des Inaktivierungsspektrums im sicht-baren Spektralgebiet gewahrte (� 1�3).

Es steilte sich bei der angewandten Methode jedoch als unm�glich heraus, die Beobachtungen auf eine gr�ssere Anzahl Wellenlangen auszudehnen, da es

nicht gelang, die gew�nschten Wellenlangen mit hinreichender Intensitat zu isolieren (�4).

Abschnitt IX. Indem von homogenen Bakteriensuspensionen zu homogen gewachsenen Plattenkulturen �bergegangen wurde und gleichzeitignbsp;statt der Bestrahlung mittels isolierter Quecksilberlinien eine Bestrahlung mitnbsp;dem durch einen Spektrographen entworfenen Quecksilberapektrum zurnbsp;Anwendung kam, ergab sich die M�glichkeit, die Messungen auf ein gr�sseresnbsp;Wellenlangengebiet auszudehnen. Hierbei wurde die Intensitat des Bakterien-lichtes vor und nach der Bestrahlung auf objektivem photographischem Wegenbsp;bestimmt (�1).

Weiterhin wurde die Z�chtung der erforderlichen Bakterienkulturen (� 2), die benutzte Versuchsapparatur und die Bestrahlung der Bakterienkulturennbsp;(� 3), die photographische Intensitatsmessung des Bakterienlichtes vor undnbsp;nach der Bestrahlung (� 4) und die Bestimmung der spektralen Intensitats-verteilung in dem eingestrahlten Spektrum beschrieben (� 5). An Hand einesnbsp;naher erlauterten Beispiels wurde gezeigt, wie aus den erhaltenen Angabennbsp;die spezifische photochemische Wirkung f�r jede der untersuchten Wellenlangen bestimmt werden kann (� 5).

Schliesslich wurde noch experimenten nachgewiesen, dass die lichtzer-streuende Wirkung der benutzten Bakterienkulturen die Zuverlassigkeit der Ergebnisse nicht beeintrachtigt (�6).

Abschnitt X. Nach Ausarbeitung der Methodik wurde das photochemische Inaktivierungsspektrum von Ph. phosphoreum bestimmt. F�r das ultraviolette Spektralgebiet erfolgte dies mittels eines Quarzspektrographen,nbsp;wobei erst Aufnahmen unter Variation der Bestrahlungsintensitat (� 1) undnbsp;dann solche unter Variation der Bestrahlungszeit (�2) gemacht wurden. F�rnbsp;das sichtbare Spektralgebiet wurde mit R�cksicht auf die gr�ssere Dispersionnbsp;ein Glasspektrograph ben�tzt (�3).

Es steilte sich heraus, dass die photochemische Wirkung der Bestrahlungszeit und der Bestrahlungsintensitat innerhalb weiter Grenzen proportional war, sodass das Gesetz von B u n s e n-R o s c o e f�r die untersuchte photochemischenbsp;Umsetzung gilt.

Aus den Mittelwerten der erhaltenen Ergebnisse Hess sich das photochemische Inaktivierungsspektrum von Ph. phosphoreum ableiten (�4). Dieses Spektrum enthalt ausgesprochene Maxima bei 405 a 410 ran und bei 290 mg ,nbsp;ein Minimum bei ca 350 mg und weiter Andeutungen zweier Nebenmaximanbsp;bei ca 430 und 320 mu (siehe Fig. 28).

Abschnitt XI. Hinsichtlich der Erholung der Lichtintensitat nach Ablauf der Bestrahlung ergab sich, dass an den Stellen, welche mit den Wellenlangengebiet lt; 300 mf{ bestrahit waren, ein sekundarer Effekt eintritt,nbsp;der bereits fr�her von Gerretsen beschrieben worden war; dieser besteht

hieraus, dass nach einer anfanglichen Zunahme der Lichtintensitat � die jene der unbestrahlten Kulturoberflache �bertrifft � eine vollstandigenbsp;L�schung des Lichtes infolge Absterbens der Bakterien eintritt (� 1).

Der quantitative Verlauf der Erholungsreaktion lehrte jedoch, dass diese bis zu etwa 30 Minuten nach der Bestrahlung f�r das ganze untersuchtenbsp;Wellenlangengebiet gleich verlauft und dass erst nachher bei den Bakterien,nbsp;welche im genannten Wellenlangengebiet bestrahit wurden, der genanntenbsp;sekundare Effekt eintritt.

Wir folgerten hieraus, dass der unmittelbar nach Beendigung der Bestrahlung eingetretene R�ckgang in der Lichtintensitat durch die photochemi-sche Umsetzung nur eines bestimmten Stoffes beherrscht wird und dass infol-gedessen das Inaktivierungsspektrum das Absorptionsspektrum eines einzelnen Stoffes darstellt. Obgleich sich ergab, dass der Verlauf der Erholungsreaktionnbsp;einen monomolekularen Charakter hatte, liess sich hieraus vorlaufig �ber dienbsp;Art des bei der Erholungsreaktion eintretenden Vorganges noch kein Schlussnbsp;ziehen (�2).

Bei der Ableitung der im Abschnitt VII gegebenen Formulierung f�r die photochemische Wirkung vrar die Tatsache, dass die Erholungsreaktion auchnbsp;wahrend der Bestrahlung eintritt, nicht ber�cksichtigt worden. Eine einfachenbsp;Berechnung zeigte jedoch, dass die gegebene Ableitung � infolge des ge-ringen Wertes der Geschwindigkeitskonstante der Erholungsreaktion im Ver-gleich zu jener der photochemischen Reaktion � praktisch richtig bleibt (�3).

Schliesslich wurde noch kurz die Bedeutung von Sauerstoff f�r die photochemische Reaktion gepr�ft. Die Versuche f�hrten zu der Folgerung, dass das Vorhandensein von Sauerstoff f�r das Auftreten des Bestrahlungseffektes beinbsp;Ph. phosphoreum erforderlich ist (�4).

Abschnitt XII. Die nur im sichtbaren Spektralgebiet durchgef�hrten Bestrahlungsversuche mit Ph. splendidum und Ph. Fischeri zeigten, dass auchnbsp;bei diesen Bakterienarten der f�r Ph. phosphoreum beschriebene Bestrahlungs-effekt eintritt und dass die gefundenen Inaktivierungsspektren im allgemei-nen sehr ahnlich sind, obgleich die Inaktivierungsspektren der zwei erst genannten Bakterienarten eine etwas geringere Ausdehnung nach der langwel-ligen Seite des Spektrums zeigen.

Abschnitt XIII. Die Grosse der Quantenausbeute der photochemischen Reaktion bei Bestrahlung von Ph. phosphoreum zeigte, dass eine Quantenausbeute von 1 unter Annahme gewisser Voraussetzungen hierf�r nicht alsnbsp;ausgeschlossen zu erachten ist.

Abschnitt XIV. Bevor die Frage, welches Molek�l bei der Bestrahlung von Ph. phosphoreum photochemisch umgesetzt wird, naher behandelt wurde, war die M�glichkeit zu ber�cksichtigen, dass ein anderes Molek�l alsnbsp;das schliesslich inaktivierte die Strahlung absorbiert habe, m.a.W. dass bei

der untersuchten Photoinaktivierung ein Photosensibilisator im Spiel gewesen sei. Es zeigte sich, dass in dieser Hinsicht zwei naheliegende M�glichkeiten �nbsp;und zwar, dass entweder Lactoflavin oder ein Carotin als Photosensibilisatornbsp;fungiert haben w�rde � endgiiltig ausgeschlossen werden k�nnen; Erwagun-gen allgemeiner Art machen auch die Mitwirkung eines noch unbekanntennbsp;Sensibilisators wenig wahrscheinlich (� 1).

Verschiedene Erwagungen fiihrten zu der Einsicht, dass mit grosser Wahrscheinlichkeit nicht Luciferin selbst, sondern Dehydroluciferin als dernbsp;lichtempfindliche Bestandteil zu betrachten ist.

In Zusammenhang hiermit wurde der Verlauf der Erholungsreaktion und die Notwendigkeit von Sauerstoff zum Auftreten des Bestrahlungseffektesnbsp;nochmals kurz betrachtet.

Die beobachteten Erscheinungen lassen sich am besten mit folgender Vor-stellung in Einklang bringen. Das gefundene Inaktivierungsspektrum von Ph. phosphoreum stellt das Absorptionsspektrum des in der Zelle vorhandenennbsp;Dehydroluciferins dar, das bei der Bestrahlung reversibel photochemisch um-gesetzt wird. Sauerstoff ware dann fiir das Auftreten der Photoinaktivierungnbsp;deshalb erforderlich, weil Dehydroluciferin nur im anaeroben System in gros-serer Menge auftritt (�2).

Zum Schluss wurde versucht an Hand des bestimmten Absorptionsspek-trums ein m�gliches Strukturbild fiir das Dehydroluciferin zu entwickeln, wobei von den von Anderson und von Chakravorly und Ballen-tine auf rein chemischem Wege bei CypridiTia-huciferin erhaltenen Ergeb-nissen ausgegangen wurde.

Auf Grund verschiedener Erwagungen und einiger Vergleichsspektren aus der Literatur befiirworteten wir die Arbeitshypothese, dass das Dehydroluciferin als ein Derivat von 1,4-Naphtochinon aufzufassen ist, wobei dannnbsp;die von Chakravorly und Ballentine nachgewiesene CO�CH2OH-Gruppe am Chinonring haften w�rde; Luciferin ware dann das entsprechendenbsp;Naphtohydrochinon.

LITTERATUUROPGAVE.

ALGEMEENE LITTERATUUR

D a h 1 g r e n, U., The Production of Light by Animals. J. Frankl. Inst. 1915��17. Dubois, R., La Vie et la Lumi�re. Paris, 1914.

H a r V e y, E. N., Recent Advances in Bioluminescence. Physiol. Review's 4, 639 (1924). Harvey, E. N., et al.. Chemiluminescence, Bull. Nr. 59, Nat. Research Council.nbsp;Washington (D.C.), 1927.

H a r V e y, E. N., Luciferase, the Enzyme concerned in Luminescence of Living Organisms. Erg. Enz. Forsch. 4, 365 (1935).

H a r V e y, E. N., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 3, 261 (1935). Harvey, E. N., Living Light. Philadelphia, 1941.

P r a t j e,, A., Das Leuchten der Organismen. Eine �bersicht �ber die neuere Litera-tur. Erg. d. Physiol. 21, 166 (1923).

Schouwenburg, K. L. van. On Respiration and Light Emission in Luminous Bacteria. Diss. Delft, 1938.

SPECIALE LITTERATUUR

1. nbsp;nbsp;nbsp;A 1 m q u i s t, H. J., Purification of the Antihemorrhagic Vitamin. J. Biol. Chem.

2. nbsp;nbsp;nbsp;A m m 0 n, R. en W. D i r s c h e r 1, Fermente, Hormone, Vitamine und die Be-

3. nbsp;nbsp;nbsp;A n d e r s 0 n, R. S., The Chemistry of Bioluminescence. I Quantitative Deter

4. nbsp;nbsp;nbsp;Anderson, R. S., Studies on Bioluminescence. 11 The partial Purification

5. nbsp;nbsp;nbsp;A n d e r s o n, R. S., Studies on Bioluminescence. Ill The Reversible Reaction

of Cypridina Luciferin with Oxidizing Agents and its Relations to the Luminescent Reaction. J. Cell, and Comp. Physiol. 8, 261 (1936).

6. nbsp;nbsp;nbsp;B a 11, E. G., The Role of Flavoproteins in Biological Oxidations. Cold Spring

7. nbsp;nbsp;nbsp;B a 11, E. G. and Tun g-T o u Chen, Epinephrines and Related Compounds.

8. nbsp;nbsp;nbsp;B e ij e r i n c k, M. W., Sur I�aliment photog�ne et I�aliment plastique des bac-

t�ries lumineuses. Arch. N�erl. d. Sc. Exactes et Naturelles 24, 369 (1891); Verz. Geschriften 2, 239.

9. nbsp;nbsp;nbsp;B e ij e r i n c k, M. W., Die Mutation bei Mikroben. Folia Mikrobiol. 1, 4 (1912).

157

10. nbsp;nbsp;nbsp;Beijerinck, M. W., Die Leuchtbakterien der Nordsee im August und Sep

11. nbsp;nbsp;nbsp;B e r s i n, Th., Kurzes Lehrbuch der Enzymologie Leipzig 1939.

12. nbsp;nbsp;nbsp;Boyle, R., Phil. Trans. Roy. Soc. Abridged 5th Ed. 2, 206 (1722) en ibid. 3,

13. nbsp;nbsp;nbsp;Biinning, E., Phototropismus und Carotinoide. I Planta 26, 719 (1937), II

14. nbsp;nbsp;nbsp;C h a k r a V o r 1 y, P. N. and R. Ballentin e. On the Luminescent Oxydation

16. nbsp;nbsp;nbsp;Chase, A. M., Riboflavin and the Photochemical Oxydation of Cypridina Lu

17. nbsp;nbsp;nbsp;Chase, A. M. and A. C. G i e s e. Effects of Ultraviolet Radiation on Cypridina

18. nbsp;nbsp;nbsp;D i m r 0 t h, K., Beziehungen zwischen den Absorptionsspektren im Ultraviolet

19. nbsp;nbsp;nbsp;D 0 u d 0 r 0 f f, M., Lactoflavin and Bacterial Luminescence. Enzymol. 5, 239

20. nbsp;nbsp;nbsp;Dubois, R., Fonction photog�nique des Pyrophores. C. R. Soc. Biol. 37, 559

21. nbsp;nbsp;nbsp;Dubois, R., De la fonction photog�nique chez le Pholas dactylus. C. R. Ac. Sc.

22. nbsp;nbsp;nbsp;Dubois, R., Note sur la fonction photog�nique chez les Pholades. C. R. Soc.

23. nbsp;nbsp;nbsp;D u g g a r, B. M., Biological Effects of Radiation. New York and Londen 1936.

24. nbsp;nbsp;nbsp;D u g g a r, B. M. and A. Hollaender, Irradiation of Plant Viruses and

of Micro-Organisms with Monochromatic Light. I J. Bact. 27, 219 (1934); II ibid. 27, 241 (1934).

25. nbsp;nbsp;nbsp;E 11 i n g e r, Ph. und W. K o s c h a r a, Uber eine neue Gruppe tierischer Farb-

26. nbsp;nbsp;nbsp;E y m e r s, J. G. and K. L. van Schouwenburg, On the Luminescence

of Bacteria. I A Quantitative Study of the Spectra of the Light emitted by Photobacterium pkospkoreum and by some Chemiluminescent Reactions.nbsp;Enzymol. 1/2, 107 (1936).

27. nbsp;nbsp;nbsp;Eymers, J. G. and K. L. van Schouwenburg, On the Luminescence

of Bacteria. 11 Determination of the Oxygen consumed in the Light emitting Process of Photobacterium phosphoreum. Enzymol. 1, 328 (1937).

28. nbsp;nbsp;nbsp;Eymers, J. G. and K. L. van Schouwenburg, On the Luminescence

of Bacteria. Ill Further Quantitative Data regarding Spectra connected with Bioluminescence. Enzymol. 3, 235 (1937).

29. nbsp;nbsp;nbsp;F i e s e r, L. F., 2-Hydroxy-l,4-Anthraquinone. J. Am. Chem. Soc. 50, 465 (1928).

30. nbsp;nbsp;nbsp;F i e s e r, L. F., W. P. C a m p b e 11 and E. M. Fry, Synthesis of Quinones

31. nbsp;nbsp;nbsp;F o u 1 k e, D. G. and F. Schneider, The Microtechnic of Organic Qualitative

32. nbsp;nbsp;nbsp;Gates, F. L., The Absorption of Ultra-Violet Light by Bacteria. J. Gen. Physiol.

33. nbsp;nbsp;nbsp;Gates, F. L., The Absorption of Ultra-Violet Radiation by Crystalline Pepsin.

34. nbsp;nbsp;nbsp;Gates, F. L., The Temperature Co�ffici�nt of Inactivation of Crystalline Pep

158

35. nbsp;nbsp;nbsp;G e r r e t s e n, F. C., �ber die Ursachen des Leuchtens der Leuchtbakterien.

36. nbsp;nbsp;nbsp;G i e s e, A., Werking van ultra-violette straling op de luminescentie en de

ademhaling van Achromobacter Fischeri. J. Cell, and Comp. Physiol. 17, 203 (1941); gecit. naar Chem. Zentr. 1941ii^, 2093.

37. nbsp;nbsp;nbsp;G i e s e, A. C. and A. M. Chase, The Effect of Cyanide on Cypridina Luci-

38. nbsp;nbsp;nbsp;Green, R. D. and A. Black, The Preparation of Pure d-Riboflavin from

39. nbsp;nbsp;nbsp;H a 1 d a n e, J. S. and J. L. Smith, The Oxygen Tension of Arterial Blood.

40. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., The Mechanism of Light Production in Animals. Science

41. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., Studies on Bioluminescence. II On the Presence of Luciferin

42. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., What Substance is the Source of the Light in the Firefly?

43. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., Studies on Bioluminescence. IV The Chemistry of Light

Production in a Japanese Ostracod Crustacean Cypridina hilgendorfii, Muller. Am. J. Physiol. 42, 318 (1917).

44. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., Studies on Bioluminescence. VII Reversibility of the Photo

45. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., Studies on Bioluminescence. IX Chemical Nature of Cypri

46. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., The Nature of Animal Light. Philadelphia 1920.

47. nbsp;nbsp;nbsp;H a r v e y, E. N., Studies on Bioluminescence. XIV The Specificity of Luci

48. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., Studies on Bioluminescence. XV Electroreduction of Oxyluci-

49. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., Bioluminescence. XVI What determines the Color of the Light

50. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., The Inhibition of Cypridina Luminescence by Light. J. Gen.

51. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., The Effects of Light on Luminous Bacteria. J. Gen. Physiol.

52. nbsp;nbsp;nbsp;H a r V e y, E. N., Oxygen and Luminescence with a Description of Methods for

53. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., The Specificity of Luciferin and Luciferase together with a

54. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., The Oxydation-Reduction Potential of the Luciferin-Oxy-

55. nbsp;nbsp;nbsp;H a r V e y, E. N., Further Studies on the Inhibition of Cypridina Lumines

cence by Light, with some Observations on Methylene Blue. J. Gen. Physiol. 10, 103 (1926).

56. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., The Evolution of Bioluminescence and its Relation to Cell

57. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., Luciferase, the Enzyme concerned in Luminescence of Living

58. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N. and G. I. Lav in. Reduction of Oxyluciferin by Atomic Hy

59. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., and A. L. Loomis, The Destruction of Luminous Bacteria

159

60. nbsp;nbsp;nbsp;H a u s s e r, K. W., R. K u h n, A. S m a k u I a en anderen, Zeitschr. f. Phys.

61. nbsp;nbsp;nbsp;Hickling, C. F., A New Type of Luminescence in Fishes, J. Biol. Assoc.

62. nbsp;nbsp;nbsp;H o 11 a e n d e r, A. and B. M. Duggar, Irradiation of Plant Viruses and of

Microorganisms with Monochromatic Light. Ill Resistance of the Virus of Typical Tobacco Mosaic and Escherichia coli to Radiation from A 3000 tonbsp;A 2250 A. Proc. Nat. Acad, of Sc. 22, 19 (1936).

63. nbsp;nbsp;nbsp;Hooker, S. C., Condensation of Aldehydes with j8-Hydroxy-~-Naphtoquinone.

64. nbsp;nbsp;nbsp;Johnson, F. H., The Aerobic Oxydation of Carbohydrates by Luminous

Bacteria and the Inhibition of Oxydation by certain Sugars. J. Cell, and Comp. Physiol. 9, 439 (1936).

65. nbsp;nbsp;nbsp;Johnson, F. H., Hexose Oxydation by Luminous Bacteria. I The Effect of

some Natural and Synthetic Glycosides and Related Substances. J. Cell, and Comp. Physiol. 9, 199 (1937).

66. nbsp;nbsp;nbsp;Johnson, F. H., Hexose Oxydation by Luminous Bacteria. Ill The Escape

of Respiration and Luminescence from Inhibition by alpha Methylglucoside, with a Note on Urethanes. J., Cell, and' Comp. Physiol. 12, 281 (1938).

67. nbsp;nbsp;nbsp;Johnson, F. H., Total Luminescence of Bacterial Suspensions in Relation

68. nbsp;nbsp;nbsp;J ohn s on, F. H., K. L. V an S ch o u w e nb u r g and A. v an der Burg,

The Flash of Luminescence following Anaerobiosis of Luminous Bacteria. Enzymol. 7, 195 (1939).

69. nbsp;nbsp;nbsp;Kan da, S., Physico-Chemical Studies on Bioluminescence. IV The Physical

and Chemical Nature of the Luciferase of Cypridina hilgendorfii. Am. J. Physiol. 55, 1 (1921).

70. nbsp;nbsp;nbsp;K a n d a, S., Physico-Chemical Studies on Bioluminescence. VII The Solubility

of Cypridina Luciferin in Organic Solvents. Sci. Papers Inst. Phys. Chem. Res. (Tokyo) 10, 91 (1929). Gecit. naar Chem. Abstr. 23, 2617 (1929).

71. nbsp;nbsp;nbsp;K a n d a, S., Crystalline Luciferin. Sci. Papers Inst. Phys. Chem. Res. (Tokyo)

72. nbsp;nbsp;nbsp;K a r r e r, P., H. Salomon und K. S c h � p p, Isolierung des Hepaflavins.

73. nbsp;nbsp;nbsp;Karrer, P. und K. Sch�pp, Isolierung des Lyochroms aus Eigelb (Ovo

74. nbsp;nbsp;nbsp;Karrer, P. und K. Sch�pp, Isolierung eines pflanzlichen Flavins^). Helv.

75. nbsp;nbsp;nbsp;Karrer, P. und K. Sch�pp, Isolierung des Flavins aus Malz. Helv. Chim.

76. nbsp;nbsp;nbsp;K a t z, E. and E. C. W a s s i n k. Infrared Absorption Spectra of Chlorophyllous

77. nbsp;nbsp;nbsp;Korr, I. M., The Relation between Cell Integrety and Bacterial Luminescence.

78. nbsp;nbsp;nbsp;Kubowitz, F., und E. Haas, �ber das Zerst�rungsspektrum der Urease.

79. nbsp;nbsp;nbsp;Kuhn, R. und H. Brockmann, Flavoxanthin. Z. Physiol. Chem. 213, 192

80. nbsp;nbsp;nbsp;Kuhn, R., P. D e s n u e 11 e und F. W e y g a n d, Zur Spezifitat des Lacto-

81. K u h n, R., P. G y � r g y und Th. W a g n e r-J a u r e g g, Uber Ovoflavin, den Farbstoff des Eiklars. Ber. 66, 576 (1933).

Kuhn, R., P. G y � r g y und Th. W a g n e r-J a u r e g g, �ber Lactoflavin, den Farbstoff der Molke. Ber. 66, 1034 (1933).

Kuhn, R. und H. Kaltschmitt, Isolierung von Lactoflavin (Vitamin B2) aus Heu. Ber. 68, 128 (1935).

Kuhn, R. und Th. Wagner-Jauregg, �ber die aus Eiklar und Milch isolierten Flavine. Ber. 66, 1577 (1933).

Kuhn, R. und Th. Wagner-Jauregg, �ber Lactoflavin Ber. 66, 1950 (1933).

Kuhn, R. und Th. Wagner-Jauregg, Lactoflavin (Vitamin Bg) aus Leber. Ber. 67, 1770 (1934).

Kuhn, R., A. Winterstein und H. Roth, �ber den Polyenfarbstoff der Azafranillowurzeln. Ber. 64, 333 (1931).

L a s a r e f f, P., Ueber das Ausbleichen von Farbstoffen im sichtbaren Spek-trum. Ann. Physik IV Folge 24, 661 (1907).

Lav in, G. J. and W. M. Stanley, The Ultraviolet Absorption Spectrum of Crystalline Tobacco Mosaic Virus Protein. J. Biol. Chem. 118, 269 (1937).nbsp;L y n e n, F., �ber den Stoffwechsel der Hefe nach dem Einfrieren in fliissigenbsp;Luft. Ann. 539, 1 (1939).

M a c f a d y a n. A., On the Influence of the Prolonged Action of Liquid Air on Micro-Organisms and the Effect of Mechanical Trituration at the Temperature of Liquid Air on Photogenic Bacteria. Proc. Roy. Soc. London 71,nbsp;76 (1902).

M a s u r e, M. P., The Effects of Ultraviolet Radiation on Growth and Respiration of Pea Seeds. Botan. Gaz. 93, 21 (1932).

Meyer, K. P., Nachweis und Messung geringer Konzentrationen an freiem Sauerstoff (bis 1 : 10^�) vermittels Leuchtbakterien. Helv. Physica Acta 15,nbsp;3 (1942).

Molisch, H., Leuchtende Pflanzen. Jena 1904.

Oppenheimer, C. and K. G. Stern, Biological Oxydation. Den Haag 1939. 0 r n s t e i n, L. S., J. W. Moll und H. C. Burger, Objektive Spektralphoto-metrie. Sammlung Vieweg, Berlin 1932.

97. R !) d u 1 e s c u, D. und F. B a r b u 1 e s c u, Beitrage zur Bestimmung der Struktur der Absorptions-Resonatoren der organischen Chromophore. IX:nbsp;Extinktions-Kurven einiger w, w'-Diphenyl-polyene. Ber. 64, 2225 (1931).nbsp;ii d u 1 e s c u, D. und G. Ostrogovitch, Beitrage zur Bestimmung dernbsp;Struktur der Absorptions-Resonatoren der organischen Chromophore. XI;nbsp;Die Struktur der Gemeinschaftsresonatoren im Anthracen, Acridin, Phe-nazin, Phenanthren und Pyren. Ber. 64, 2233 (1931).

R a f f y, A. et A. M i r i m a n 0 f f. Extraction et cristallisation de la flavine d�une ascomyc�te: Eremothecium Ashbyii. Bull. Soc. Chim. Biol. 20, 1166nbsp;(1938).

R�aumur, R.A.F. d e. M�m. Acad. Paris, 198, 204, 287 (1723). Gecit. naar E. N. Harvey, Erg. Enz. Forsch. 4, 365 (1935), l.c. biz. 366.

101. nbsp;nbsp;nbsp;Root, C. W., The Relation between Respiration and Light Intensity of Lumi

nous Bacteria, with Special Reference to Temperature. I. Temperature and Light Intensity. J. Cell, and Comp. Physiol. 1, 195 (1932). II Temperaturenbsp;and Oxygen Consumption. Ibid. 5, 219 (1934).

102. nbsp;nbsp;nbsp;Rottier, P. B., Fluorometrische en spectrophotometrische bepaling van lacto-

flavine in micro-organismen. Diss. Delft, 1942.

161

103. nbsp;nbsp;nbsp;Sachs, J., Handbuch der Experimental-Physiologie der Pflanzen. Leipzig

104. nbsp;nbsp;nbsp;Schoepfle, G. M., Kinetics of Luminescent Flashes in the Bacterium, Achro-

mobacter Fischeri, at different Temperatures. J. Cell, and Comp. Physiol. 16, 341 (1940).

105. nbsp;nbsp;nbsp;Schoepfle, G. M., Kinetics of Bacterial Luminescent Flashes: Effects of

Veronal, Dinitrophenol, and Osmotic Pressure. J. Cell, and Comp. Physiol. 17, 109 (1941).

106. nbsp;nbsp;nbsp;Schouwenburg, K. L. van. On Respiration and Light Emission in Lumi

107. nbsp;nbsp;nbsp;Schouwenburg, K. L. van and A. van der Burg, On the Influence

of Carbon Monoxide on Respiration and Light Emission of Luminous Bacteria. Enzymol. 9, 34 (1940),

108. nbsp;nbsp;nbsp;S h 0 u p, C. S., Luminescence and Respiration of Bacteria in Carbon Monoxide.

109. nbsp;nbsp;nbsp;Spallanzani, L., Memoria sopra le Meduse fosforiche. Mem. Soc. Ital.

Verona 7, 271 (1794). Gecit. naar Harvey, The Nature of Animal Light; l.c. biz. 85.

110. nbsp;nbsp;nbsp;Stevens, K. P., Studies on the Amount of Light emitted by Mixtures of

111. nbsp;nbsp;nbsp;Stuart J., E. R. 0 r e n t and E. V. Me C o 11 u m, A Simplified Method for

Preparing Lactoflavin and a Study of its Growth Effect. J. Biol. Chem. 108, 579 (1935).

112. nbsp;nbsp;nbsp;Taylor, G. W., The Effect of Hormones and certain other Substances on

Cell (Luminous Bacteria) Respiration. J. Cell, and Comp. Physiol. 1, 297 (1932).

113. nbsp;nbsp;nbsp;Vermeulen, D., E. C. W a s s i n k and G. H. Reman, On the Fluorescence

114. nbsp;nbsp;nbsp;Warburg, 0., Liber die katalytischen Wirkungen der lebendigen Substanz.

115. nbsp;nbsp;nbsp;Warburg, 0. und E. N e g e 1 e i n, Tiber den Einflusz der Wellenlange auf

die Verteilung des Atmungsferments (Absorptionsspektrum des Atmungs-ferments). Biochem. Z. 193, 339 (1928).

116. nbsp;nbsp;nbsp;Warburg, O. und E. N e g e 1 e i n, �ber die photochemische Dissoziation

von Eisencarbonylverbindungen (Kohlenoxyd-Hamochromogen, Kohlenoxyd-Ferrocystein) und das photochemische Equivalentgesetz. Biochem. Z. 200, 414 (1928).

117. nbsp;nbsp;nbsp;Warburg, 0. und E. N egel e in, tiber die photochemische Dissoziation

bei intermittierender Belichtung und das absolute Absorptionsspektrum. des Atmungsferments. Biochem. Z. 202, 202 (1928).

118. nbsp;nbsp;nbsp;Warburg, O. und E. Ne gele in, Tiber das Absorptionsspektrum des At

119. nbsp;nbsp;nbsp;Williams, R. J., E. R. B u c h m a n and A. E. R u e h 1 e. Studies of Crystal

line Vitamin Bj^. VIII Sulfite Cleavage. II Chemistry of the Acidic Product. J. Am. Chem. Soc. 57, 1093 (1935).

120. nbsp;nbsp;nbsp;Yamasaki, L, Tiber Flavine, die bei der Garung von Aceton-Butylalkohol-

bakterien gebildet werden (Garungsflavine). I Tiber Garungsflavin aus Reis, Biochem. Z. 300, 160 (1939).

-ioioa nf'aoia^im� JAgiJ �ne oo�lsiifiaarf'tfO ,flisvJ[ Ji -,^t�dft9WBorf33 'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;, �nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.88e�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;-��^I

i^�9aJ^nT%��^ad�;igi tra tab nsv .A bas nsv .J .X ,*( t � cf n a w 0 o ff �? 8 ^onifliuJ lij noif-�!ma 'Jf�gL� brar noiJBsiq�aH'kto-afeixoii�M iiodfMi�'tO''�-'�'� quot;'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;� quot; .�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.(Otei) !�� .fcMSXsaJ i;!'!

�sbixofl�M h(^b3 ai iHisltfia �c noHatiqBsH ba��99ns�8�Hi�H,'iJ ;;8 ^^��amp;atdfS 1861

' i-^ ^ nbsp;nbsp;nbsp;- ��' xefmy ore ,id (.iif:�A) MifH hm

^lli''*gt;o8 .maM ^jdaStotfioV'^ubaM '��'t��qo�' *m�H9M' nbsp;nbsp;nbsp;�:Sttfeiii�iq8; -JOl

;M^iJ fcr�amp;iA Ito 9tHlsgt;f arfT .vsttSsH �/�5ft''.li*i90 .(bOTI) ITS ;! BnotsV -^ nbsp;nbsp;nbsp;^nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;� �: -'rnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;^nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;��

lo BsiuixiM nbsp;nbsp;nbsp;MgLt fo XnuienA Sfl� m'^R^ibttiS ,'/f'U8a'si�9;J^8.;gt;0Jl

. .lt;fsei) ea3\,�i jatBTdda..ff90�b

tol boifiaM faii^iiqawB A ,iaoMo3 aM ,V .3 b^� jastP .H .3 ,.l Jt�wt8 '.msiiP JoiH ,l 499ii!3 dlwot��^- 4llgt;ulS *^bas nr/r'A - jnJ � r-.;':

- ,, nbsp;nbsp;nbsp;,. � lt;;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;� � ,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;^nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.7v;f:lt;^gt;-er5-;.,.

ao 899caj8da8 1941� nifiJt� b�B eartao�igH io nbsp;nbsp;nbsp;94^ pVf �9,.�t C|Ij^,A;T

TOS ,1 nbsp;nbsp;nbsp;-amoD bna .IlaO ;T. .ooilfiiiqsta (�itsJaBa Buonim�J) �faO

-� nbsp;nbsp;nbsp;'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Vnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;i.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;v; � �t.nivjoir; H;'?;.;!;.;}!;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;_ ..(,S8fcy 5^,_

'9O09D8y�O�t3 9dJ riQ # ft ar aX .H .D � i � ? � W ,0 .3 ,.a ,a o � 0 9 ra 19 V '*� �nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;. .{TSglX.fedS ,* 4omx-'!aiif .6U^ sn:isw3ri4��fiale43:,3p , .

.snftlBdM �agtbnadgi i6b nagauJftlW i�if3t�Hi*lB3l-3tb ��ad^ �O ,iat�4isW ^.11 ^nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;- �nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.1 .sIcT .9.1 ,8Sei .mhsa

afgnBinslIsW tsb sBf/llaia 99b iwTO ,�t Isd aii a'W .3 bnjj .0 u d t b W .511 .^esnyitilA gsb' rninMaqeswrfi^oadk)'''Sl�saffrta�a-SHWfntj^flwfr^iBlft^TaV�^ a�tv' � � �;�

rf8S�t) �Rt ;i?l.�'.S'.i�i-'f3flia ,((4asfkt9�i'p)�gt;!-

r.aoili�^wfiiQ arf'j�fitmif'jdJ.Q^'aib tadlj, ,n.i ai9 s 9 V! ,3 bun .0 ^-oj d'taW -btxoft^rfoX .aagotgotifDonisJI-b'^a^^^^) tiogntrfjftfdts^i^nodiQ^asra noV'-'-.iW: .S josirfaoia .slteggJirafsviupX adaeim^da��iHiq' scb�bna^ CAi^a'^WtaX' '

eab raOTt^aqesxwilq�CwdA Mw.'aadis samp;k bm gaaixfoi?^' �ab^iiii�mai�i \

. quot; nbsp;nbsp;nbsp;�gt; �nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;-X^t) XOS

'^A'tisb mmi^a^tfoihTKaidA mb ��i^S nbsp;nbsp;nbsp;K ,3 b^ .0 .at�d.iiw ,811

r�t n�4 - 't il'quot;' ', nbsp;nbsp;nbsp;^ �WS .%a�srf?�gt;p .sdaMaiaibSsajjjH^'/, V ,

^a^Plo �9Jbul8 ,91 d 9 0 a .3 .A bas anmtfouS .3 .3 ..I .3 ,a ^ t lli '�tooftotara�fDA 9dl,40 vBiWffpdPnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;:3lj%8nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;aimMiV-^il

. nbsp;nbsp;nbsp;�nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;� ^ ' �''� : -.lt;^eigt;, liCOi .9lt;3a ,.i�9f�,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;��'^ -

-kMfoiflBrt.tba.i(bi33A fto'r ..s0m^D i9d 9ib. �saiT6l3-l�d� .i^Jtas ra* Y., .921 .�193 niVfd��^ifff^O tadp I .(9Biv^�sn�f#3y eabteDt-i-sblEcftS nattahfed

� ' nbsp;nbsp;nbsp;� Aei^i) i�i .�ee-.s jndd?o(ggt;

STELLINGEN.

De luciferinen mogen volgens de ter beschikking staande gegevens worden opgevat als derivaten van 1,4-naphtohydrochinon.

II.

Lactoflavine is niet direct bij de bioluminescentie der lichtbacteri�n betrokken.

III.

De permeabiliteit van celmembranen wordt zoowel door electrische factoren als door L o n d o n-v an der Waal s�sche krachten bepaald.

IV.

Physostigmine versterkt de werking Van acetylcholine niet slechts door een remming van de choline-esterase, doch tevens door een direct synergistischnbsp;effect.

J. F r e u d en I. E. U y 1 d e r t, Arch. Int. de Pharmacodynamie et de Th�rapie 52, 238 (1936).

Antagonisme van physiologisch actieve stoffen zal veelal zoo zijn te verklaren, dat deze stoffen in de cellen w�l elkanders plaats, doch niet elkanders functie overnemen.

VI.

De proeven van Eichhoff en van K o p p pleiten vooralsnog tegen het algemeen aanvaarden van de meening, dat acht a twaalf quanten voor de assimilatie van een molecule koolzuur bij belichting van Chlorella in de station-naire toestand noodig zijn.

De carboxylase-modellen van Langenbeck moeten als onvolledige modellen worden beschouwd.

De proeven van W i n d a u s en zijn medewerkers spreken niet overtuigend tegen de door R o f f o aangegeven vorming van carcinogene phenan-threen-derivaten bij de photo-oxydatie van cholesterine.

De door Georg voorgestelde structuur van isosaccharose lijkt aannemelijker dan de door Schlubach en Middelhof! gegeven formuleering.

Het verdient overweging de wetenschappelijke opleiding van den leeraar met een candidaatsexamen te doen eindigen.

De leeraarsbevoegdheid zou dan echter pas moeten worden toegekend na een hierop volgende, bijzonder op het doel gerichte, opleiding.

LH2 -f- A ^	A.LH2	(betrekkelijk langzaam)	(1)
A.LH2 1/202 -	A.LH2.O	(zeer snel)	(2)
A.LH2.O -	A* Li H2O	(vrij snel)	.(3)
A* -	A h.	(snel)	(4)

Relatieve intensiteit van het ingestraalde licht	Waarden kend nit		voor W X 100 here-de intensiteitsreeksen				W X 100 gemiddeld	amp;
100	40.8	33.2	51.5	.37.3	40.2	_	40.6	�2.8
80	36.0	32.0	28.3	42.3	30.4	29.5	33.1	�2.3
66	24.5	28.6	20.3	27.5	20.6	�	24.3	�1.9
47	15.5	18.2	22.2	17.6	22.9	16.2	18.8	�1.4
35	14.8	10.1	13.2	13.7	�	�	12.9	�1.1
27	10.4	9.9	9.5	6.4	14.7	�	10.2	�1.2

Relatieve intensiteit van het ingestraalde licht	118	100	80
Relatieve intensiteit van het bacterielicht v��rnbsp;de bestraling, Yo.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.	15.05	16.20	12.30
Relatieve intensiteit van het bacterielicht na denbsp;bestraling, Y . . . .	12.40	13.70	10.93
W = ln^(X100) . .	19.3	16.7	11.8

Relatieve intensiteit van het ingestraalde licht	Waarden kend uit		voor W X 100 bere-de intensiteitsreeksen				w X100 ge middeld	�
118	19.3	18.9	18.2			_	18.8	�0.4
100	16.7	19.1	12.6	18.3	14.0	15.7	16.1	�1.1
80	11.8	14.4	9.9	12.4	�	�	12.1	�0.9

Relatieve intensiteit van het ingestraalde licht	100	80	66	47	35	27
Relatieve intensiteit van het bacterielicht v��rnbsp;de bestraling, Yo. .nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.	15.3	15.2	26.9	16.0	27.0	25.1
Relatieve intensiteit van het bacterielicht na denbsp;bestraling, Y . . . .	7.42	8.50	16.7	18.2	22.5	23.4
W = ln^(X100) . .	72.2	S8.1	47.6	36.6	18.2	7.0

Relatieve intensiteit van het ingestraalde licht	Waarden voor W X 100 berekend nit de intensiteitsreeksen				WX 100 gemiddeld	e
100	72.2	93.4	72.3	62.6	75.1	�6.7
80	58.1	53.8	64.8	�	58.9	3.5
66	47.6	42.2	49.5	�	46.4	2.5
47	35.6	37.1	31.6	29.1	33.4	2.2
35	18.2	16.5	22.2	29.4	21.6	3.1
27	}7.0	20.3	13.4	_	13.6	3.4

A in m/x		W X 100				A in m/x	W X 100
A in m/x	diafr. 1	diafr.	diafr. i	diafr. i	diafr. tV	A in m/x	diafr. 1	diafr. i	diafr.	diafr. i	diafr. 1 TH
490	3.9	0	0	1.0	0	355	14.0	4.5
470	31.0	3.0	1.0	4.1	0	350	10.0	4.9	�	�	�
460	�	20-	9.2	5.1	2.9	345	12.8	5.4	�	__	_
436	142.5	114	80.0	52-	27.0	334	26.2	14.6	7.3		�
4215	�	�	39	19.9	10.6	328	19.3	9.9	--		�
4185	�	�	38-	19.6	9.7	313	52	27.0	12.4	�
415		�	37.0	19.2	9.0	3065	20.7	7.4	�	�
4135	�	�	38-	19.9	9.0	302	33-	17.7			�
405	134.5	102	67	40.0	21.6	297	35.6	18.4	�		�
390	�	37-	20.7	8.5	�	292	23.3	12.6	�	�
386	�	33.5	17.9	8.5	�	289	27.0	12.2	�	�	�
3795	�	31.0	13.6	7.6	�	280	15.4	�	�	�	�
376	57.5	29.5	14.1	8.5		275	10.6	�	�	�	�
366	91.5	60.0	32.9	18.1	9.8	270	6.2	�	�	�	�

A in mi^	W(A) X 1018					W(A) X 1018 gem.	A in m/-t	W(A) X 1018					W(A) X 1018 gem.
A in mi^	diafr. 1	diafr. I	diafr. i	diafr. 1 �8'	diafr. fV	W(A) X 1018 gem.	A in m/-t	diafr. 1	diafr.	diafr. i	diafr. quot;S�	diafr. 1	W(A) X 1018 gem.
490	0.03	0.00	0.00	0.04	0.00	0.01	355	0.37					0.37
470	0.17	0.03	0.02	0.18	0.00	0.08	350	0.28	�	�	�	�	0.28
460	�	0.18	0.185	0.21	�	0.19	345	0.34	�	�	�	�	0.34
436	�	�	�	0,58	0.60	0.59	334	0.44	0.49	0.45	�	�	0.46
4215	�	�	0.645	0.675	0.70	0.67	328	0.50	0.52	�	�	�	0.51
4185	�	�	0.71	0.765	0.74	0.74	313	0.60	0.615	0.52	�	�	0.58
415	�	�	0.77	0.79	0.76	0.77	3065	0.70	�	�	�	�	0.70
4135	�	�	0.78	0.82	0.76	0.79	302	0.74	0.77	�	�	�	0.76
405	�	�	�	0.80	0.86	0.83	297	0,90	0.92			�	0.91
390	�	0.75	0.81	0.69	�	0.75	292	1.55	1.60	�	�	� '	1.57
386	�	0.70	0.70	0.69	�	0.70	289	1.51	1.29	�	�	�	1.40
3795	�	0.64	0.54	0.585	�	0.59	280	1.20	�		�	�	1.20
376	�	0.52	0.50	0.61	�	0.54	275	0.98	�	�	--	�	0.98
366	�	�	0.40	0.45	0.48	0.44	270	0.75	�	�	�	�	0.75

A in mfj.	Iq X 10-14	A in	Iq X 10-14	A in niAi	Iq X 10-14	A in m/z	Iq X 10-14	A in ra//	Iq X 10-14	A in m//	Iq X 10-14
490	142	415	145	3795	82.0	350	30.2	313	76	292	16-
470	127	405	294	376	97.4	345	31.8	3065	29.4	289	16
460	1515	390	78	366	2525	334	52.4	302	39.6	280	12.4
436	490	386	78.5	355	32.0	328	36.4	297	31.9	275	10.03

A in ra//	W(/) X 1018					W( ) X lO'S gera.	A in ra//	W(A) X 1018					W(A) X 1018 .gem.
A in ra//	4�	2�	1�	�	i�	W( ) X lO'S gera.	A in ra//	4�	.2�	1�		i�	W(A) X 1018 .gem.
490	0.06	0.06	0.03	0.00	0.00	0.03	350	0.445	0.35	__	,_	_	0.40 .
470	�	�	0.20	�	�	0.20	345	0.43	0.41		__ �	�	0.42
460	�	�	0.38	0.30	� �	0.34	334	�	0.485	0.42	0.55	�	0.485
436	�	�	�	�	0.59	0.59	328	p.60	0.475	0.57	�	�	0.55
415	�	�	-;	0.92	0.92	0.92	313	---	0.52	0.60	� � '	�	0.56
405	�	�	�	_	0.71	0.71	3085	0.60	0.49	0.76	�	�	0.62
390	�	�	0.81	0.95	0.88	0.88	302	�	0.65	0.87	�	�	0.76
386	�	�	0.74	0.80	0.85	0.80	297		0.84	1.19	� �	�	1.01
3795	�	�	0.673	0.71	0.765	0.72	292	1.05	1.00	1.38	�	� �	1.14
376	_	�	0.54	0.63	0.62	0.60	289	1.15	1.23	1.50	� .	�	1.29
366		_	�	0.44	0.51	0.48	280	0.82	0.66	�	�	�	0.74
355	0.45	0.33	�	�	�	0.39	275	0.725	0.58	�	�	�	0.65

A in m/L4	W X 100				A in m/z	W X 100
A in m/L4	4�	2�	1�	i�	A in m/z	4�	2�	1�	i�
490	3.5	7-	2.0	0.0	345	25	14.0
470	24.0	22.0	8.0	4-	334	52.0	27-	14-	�
460	�	40.5	20	14.0	328	43	21.5	11.0	�
436	�	144.5	89	66-	313	88.0	51.0	29.5	14-
415	�	�		30.5	3065	40.0	21-	10.0	�
405	�	136.5	77.0	45	302	67	40.0	20.0	�
390	�	�	28.5	14.8	297	73	48.5	26.5	16.0
386		56.0	26.5	14.5	292	�	30.5	15	�
3795	�	53.0	25.6	13.8	289	�	39.0	19.5	�
376	�	56.5	27.5	15-	280	38-	23	15.0	�
366	142	97-	53.5	29.5	275	31.0	18.5	9.5	�
355	28.2	14.5	8.8	�	270	26.0	13.5	�	�
350	22	13.5	�

A in	Iq X 10-H	A in	Iq X 10-14	A in m/x	Iq X 10-14	A in m/x	Iq X 10-14	A in m/x	Iq X 10-14
490	172	405	339	366	302	328	42.0	292	17.7
470	1655	390	96.0	355	38.2	313	93.5	289	20.4
460	1935	386	96.4	350	34.7	3065	32.6	280	15.3
436	588	3795	100.4	345	38.4	302	48.0	275	12.7
415	184	376	113	334	64	297	43.9	270	10.0

A in m{A		W (a) X 1018				W(A) X 1018 gem.	A in m//	W (A) X 1018					W(A) X 1018 gem.
A in m{A	diafr. 1	diafr. i	diafr. i	diafr. 1 *	diafr. tV	W(A) X 1018 gem.	A in m//	diafr. 1	diafr. i	diafr. X	diafr.	diafr. t TH	W(A) X 1018 gem.
490	0	0	0	0	_	0	427	_	0.565	0.59	0.61	_	0.59
478	0	0	0	0	�	0	424	�	0.61	0.58	0.64		0.61
468	0.04	0.07	0	0	�	0.03	4185	�	0.78	0.61	0.85	_	0.75
460	0.19	0.21	�	�	�	0.20	413	�	0.845	0.78	0.885	�	0.84
451	�	0.45	0.50	0.35	�	0.43	405	�	0.755	0.68	0.91	0.91	0.81
436	�	�	0.51	0.71	0.61	0.61

A in m/tt	Ic	X 10-	-14	A in m//	Iq X 10-		-14
A in m/tt	diafr. 1	diafr. i	diafr. 1	A in m//	diafr. 1	diafr.	diafr. i
490	46.5	24.4	11.9	427	34.9	18.5	8.95
465	29.7	15.6	7.6	424	28.3	14.8	7.25
460	30.9	16	7.9	422	25.3	13	6.5
4555	34.2	18.0	8.75	420	22.6	11.9	5.8
451	36.4	19.1	9.3	4185	20.4	10.7	5.2
445	46.0	24.2	11.8	415	20.0	10.5	5.1
436	156.5	82.0	40.0	413	22.6	11.9	5.8
429	40.2	21.1	10.3	405	57.1	30.0	14.6

A in miA	W(A) X 1018			W(A) X 1018 gem.	A in m//	W(a) X 1018			W(^) X 1018 gem.
A in miA	diafr. 1	diafr. i	diafr. i:	W(A) X 1018 gem.	A in m//	diafr. 1	diafr. i	diafr. i	W(^) X 1018 gem.
490	0	0		0	427	0.79	0.755		0.77
465	0	0	�	0	424	0.825	0.755	�	0.79
460	0.05	�	�	0.05	422	0.815	0.71	�	0.76
4555	0.18	0.21	�	0.195	420	0.805	0.79	�	0.80
451	0.28	0.29	�	0.285	4185	0.81	0.74	�	0.775
445	0.485	0.445	�	0.465	415	0.855	0.775	�	0.815
436	�	__	0.75	0.75	413	0.91	�	�	0.91
429	0.815	0.73	�	0.77	405	�	0.96	0.885	0.92

A in mfi	4� bestr. W X 100	2� bestr. W X 100	Iq X 10-gt;4	4� bestr.	2� bestr. w	W(A) X 1019nbsp;gem.
A in mfi	4� bestr. W X 100	2� bestr. W X 100	Iq X 10-gt;4	Iq X	Iq X t^'	W(A) X 1019nbsp;gem.
436	27.0	13.9	216	0.52	0.54	0.53
431	12.5	�	67.0	0.78	�	0.78
426	14.0	�	45.0	1.29	�	1.29
421	12.8	�	32.8	1.62	�	1.62
416	11.5	�	27.0	1.76	�	1.76
414	14.3	�	28.8	2.06	�	2.06
412	19.4	�	32.7	2.48	�	2.48
410	20.0	�	35.3	2.36	�	2.36
405	39.5	20.8	78.8	2.09	2.20	2.14

S f

fm

■^wr?

■SS.

1394 2846

ONDERZOEKINGEN OVER DE BIOLUMINESCENTIE DERnbsp;LICHTBACTERI�N

PROEFSCHRIFT

GERRIT JOHANN MEINE VAN DER KERK

HOOFDSTUK I.

INLEIDENDE OPMERKINGEN OVER HET VERSCHIJNSEL DER BIOLUMINESCENTIE.

LH2 -h % O2 �gt; L -f- H2O

O,

/N CH2 IInbsp;\N

/\/\

15

(2)

HOOFDSTUK IV.

HET VRAAGSTUK VAN DE AFSCHEIDING VAN HET LICHTGEVEND SYSTEEM UIT DE BACTERIECEL.

27

37

42

46

47

Y,

(6)

(8)

W{l) = PfXf'y. nbsp;nbsp;nbsp;(10)

X�XI

2. De 405 mti -lijn.

3. De 366 mii -lijn.

62

TABEL V.

Tabel VI geeft een overzicht van de voor W X 100 in een aantal intensi-teitsreeksen gevonden -waarden.

TABEL VI.

66

340 nbsp;nbsp;nbsp;380nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;420 460nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;500

A in

67

72

Zijaanzicht

74

75

76

77

78

'jlZSl

79

80

s?E;

onbestr.

81

f'll

op

82

83

-a

-b,

bestraald

Ter verduidelijking van de gevolgde werkwijze volgt thans in tabel X de volledige uitwerking van een klein gedeelte van het in fig. 18 weergegevennbsp;photogram.

85

86

460 500 A in m

87

� 5. De meting van de spectrale energieverdeeling in het op de bacteriecultuur geworpen spectrum; berekening van de specifieke photochemische werking.

A in

91

92

93

97

TABEL XIII.

100

Tweede bestralingsproef.

By de tweede bestralingsproef was door een onvoldoende homogeniteit van de gebruikte bacteriecultuur de opname met een bestralingstyd van Mnbsp;minuut onbruikbaar.

103

TABEL XX.

TABEL XXL

104

TABEL XXII.

In fig. 26 is tabel XXII grafisch voorgesteld.

Bij de beschreven eerste bestralingsproef met de glasspectrograaf be-