TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VAN DENnbsp;RECTOR MAGNIFICUS L. VAN VUUREN, HOOGLERAAR IN DE FACULTEIT DER LETTEREN ENnbsp;WIJSBEGEERTE, VOLGENS BESLUIT VAN DE SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGENnbsp;VAN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDEnbsp;TE VERDEDIGEN OP MAANDAG 26 JULI 1943, DESnbsp;NAMIDDAGS TE 4 UUR

ALIDA VAN DER BURG

Het onderzoek, dat in dit proefschrift wordt beschreven, verrichtte ik als medewerkster van de Biophysiese Werkgroep. Aan de leiders van deze groep. Prof. Dr. A. J. Klagver en Prof. Dr. J. M. W. Milatz, mijn promotor, wil ik opnbsp;deze plaats mijn oprechte dank betuigen voor het grote vertrouwen, dat zij innbsp;mij hebben gesteld en voor hun voortdurende belangstelling in het mij opgedragennbsp;onderzoek. Aan de tijd, gedurende welke ik onder hun leiding heb mogen werken,nbsp;bewaar ik de mooiste herinneringen,

De invloed, die het groepsverband op mij en op mijn werk heeft gehad, is niet te onderschatten en laat zich moeilijk analyseren. Onderlinge gedachtenwisseling,nbsp;wederzijdse hulp en vriendschap vormden ��n geheel, welke het gemakkelijkernbsp;maakte te blijven volharden en de juiste lijn te blijven volgen bij het vaak zonbsp;moeilijke wetenschappelijke werk. Hiervoor ben ik allen, die medewerkten in denbsp;groep zeer dankbaar. In het bijzonder geldt dit Dr, G. J. M. van der Kerk ennbsp;C. J. P. Spr ui t, die mij steeds met raad en daad terzijde stonden, waar ik behoefte had aan hulp op chemies gebied.

Voorts wil ik mijn hartelijke dank betuigen aan allen, die buiten de Biophysiese Werkgroep op enigerlei wijze bijdroegen tot het tot stand komen van dit proefschrift, in het bijzonder aan Mej. E. J. van Rijckevor sel en aan F. A.nbsp;Rodrigo.

Het lichten van planten en dieren, dat men vooral in warmer streken in zo talloze vormen in de levende natuur ontmoet, heeft door alle tijdennbsp;heen een diepe indruk gemaakt. Fascinerend als het lichten is, werdnbsp;het door vele onderzoekers bestudeerd. De bedrieglijke eenvoud vannbsp;het verschijnsel heeft hen echter in zoverre teleurgesteld, dat het totnbsp;nog toe slechts mocht gelukken enkele zeer algemene trekken ervannbsp;op te helderen.

Daar men hier met een zeer karakteristiek biologies-physies verschijnsel te maken heeft, nam de Biophysiese Werkgroep, die in 1935 op initiatief van de Rockefeller Foundation haar werkzaamheden ondernbsp;leiding van Prof. Dr. L. S. O r n s t e i n en Prof. Dr. A. J. K 1 u y v e rnbsp;begon, onder meer ook het bioluminescentievraagstuk ter hand.

Dit proefschrift nu vindt zijn oorsprong in de gedachte, dat de spektrale verdeling van het licht, dat door levende organismen wordtnbsp;uitgezonden, aanwijzingen moet kunnen geven over de aard van hetnbsp;emitterend molekuul. Zelfs kan men zo ver gaan te zeggen, dat mennbsp;in beginsel aan het spektrum het emitterend molekuul zou moeten kunnennbsp;herkennen. In deze konkrete vorm werd het probleem herhaalde malennbsp;door Prof. K 1 u y v e r op de groepsbesprekingen naar voren gebracht.nbsp;Hoewel deze gedachte in hoofdzaak zeker juist is, heeft de ervaringnbsp;geleerd, dat we van de verwezenlijking ervan nog z��r ver zijn verwijderdnbsp;en is de opgave, die de bioloog hier aan d� physicus stelt, een z��r zwarenbsp;gebleken te zijn.

Reeds lang geleden is men tot het inzicht gekomen dat de lichtemissie door levende organismen bij ��n van de vele chemiese omzettingen geschiedt, die in de cel plaats vinden, vermoedelijk als onderdeel van hetnbsp;ademhalingsproces. De bioluminescentie moeten we daarom zien als eennbsp;bijzonder geval van de chemoluminescentie, evenwel minder toegankelijknbsp;dan deze laatste, doordat het biologies kleed, dat het omgeeft, de reaktienbsp;waarbij het licht uitgezonden wordt, verbergt. Daarom kan een studienbsp;van het lichten bij chemiese reakties ons nader brengen tot het oplossennbsp;van het probleem der bioluminescentie.

Het nagaan van het verband, dat bestaat tussen de spektrale samenstelling van het licht, dat bij bekende chemiese reakties wordt uitgezonden en de aard van het emitterend molekuul was dan ook sinds lang eennbsp;programmapunt van de Biophysiese Werkgroep. Het was daarbij de

bedoeling de verkregen kennis zo mogelijk te gebruiken om de struktuur van het molekuul, dat in de bioluminescentie een rol speelt, op te helderen.nbsp;Door Mej. Dr. J. G. Eymers en Ir. K. L. van Schouwenburgnbsp;werd hiermede een begin gemaakt. Dit proefschrift vormt een voortzetting van hun werk.

Voor we het vraagstuk van de samenhang tussen spektrum en mole-kuulbouw aan de orde stellen, voelen we de behoefte om de bouw en het ontstaan van het spektrum zelf te begrijpen. Daarbij komen voor eennbsp;physicus verschillende vragen naar voren: Welk soort overgangen in hetnbsp;molekuul zijn verbonden met de lichtemissie? Wat is de oorzaak vannbsp;het kontinue karakter van het spektrum? Hoe geschiedt de aanslag ennbsp;welke processen verlopen er tussen het moment van de aanslag en vannbsp;het uitzenden van het licht?

Door een studie van absorptie- en fluorescentiespektra is het mogelijk op deze vragen ten dele een antwoord te geven. De wijze van aanslag,nbsp;namelijk door absorptie van licht, verschilt weliswaar van die bij denbsp;chemoluminescentie, waar ze geschiedt tengevolge van een chemiesenbsp;reaktie. Daartegenover staat echter, dat fluorescentie als vorm vannbsp;lichtemissie beter onderzocht is en tot op zekere hoogte inzicht moetnbsp;kunnen geven in de lichtverschijnselen bij chemiese reakties. Deze laatstennbsp;zijn op hun beurt minder toegankelijk dan het verschijnsel der fluorescentie, doordat het chemies kleed, dat hen omgeeft, het emitterend molekuul verbergt.

Uitgaande van de kennis over absorptie- en fluorescentieprocessen zullen we ons een beter gedetailleerd beeld kunnen vormen van hetnbsp;chemoluminescentieproces. Na het bestuderen van enkele chemolumines-cente reakties behandelen we in het laatste hoofdstuk de spektrale zijdenbsp;van het bioluminescentievraagstuk en gaan na in hoeverre het in denbsp;voorafgaande hoofdstukken verkregen inzicht tot een oplossing van ditnbsp;vraagstuk kan bijdragen. Het zal dan blijken, dat, hoewel ons inzicht innbsp;het chemoluminescentie-en het bioluminescentieproces verdiept is, het opnbsp;het ogenblik nog moeilijk is, uit de aard van het bepaalde spektrumnbsp;gevolgtrekkingen te maken aangaande de bouw van het emitterendnbsp;molekuul.

ALGEMENE BESCHOUWINGEN OVER ABSORPTIE- EN FLUORESCENTIEPROCESSEN DOOR ORGANIESEnbsp;MOLEKULEN IN OPLOSSING

Het in dit hoofdstuk gegeven beeld van het absorptie- en het fluorescentieproces is ontstaan uit een bewerking van in de literatuurnbsp;verspreid voorkomende experimentele gegevens en theoretiese beschouwingen.

We beperkten ons daarbij tot een globale beantwoording van die Vragen, die voor ons verdere werk van belang zijn. Op tal van puntennbsp;zijn aanvullingen mogelijk, terwijl meerdere nog niet begrepen verschijnselen zijn weggelaten. De vele literatuurverwijzingen voorzien, naar wijnbsp;hopen, enigermate in dit tekort.

� 1. Gebruik van golflengte- en frequentieschaal.

Voor we tot de eigenlijke bespreking van het onderwerp van dit hoofdstuk overgaan, moeten we enige woorden wijden aan de wijze,nbsp;Waarop men absorptie- en emissiespektra voorstelt.

In het algemeen zet men in het absorptiespektrum de absorptie-ko�ffici�nt uit tegen de golflengte van het licht, in het emissiespektrum �ie per eenheid van golflengtegebied, per sek. uitgezonden energie.

In beginsel is het juister de spektra niet tegen de golflengte maar tegen de frequentie van het licht uit te zetten, daar deze grootheidnbsp;evenredig is met de energie van het lichtquant volgens de betrekkingnbsp;Van Einstein:� = hv.

Wanneer men de spektra op deze wijze uitzet, spreekt men van het Qebruik van de frequentieschaal in tegenstelling tot het gebruik van denbsp;9olflengteschaaL

Het verband tussen de energi�n E(X) en E(v) in de emissiespektra Wordt gegeven door de betrekking:

waarin dX en dv met elkander korresponderende golflengte- en frequentie-gebieden voorstellen,

Ook energi�n drukt men wel kortheidshalve uit in cm�i, d.w.z. men gebruikt het golfgetal van het lichtquant, dat volgens de betrekking vannbsp;Einstein met de betreffende energie overeenkomt, als maat voornbsp;deze energie.

In het algemeen zullen we ons aan de meer gebruikelijke golflengte-schaal houden. Alleen in die gevallen, waarin de frequentieschaal theo-retiese voordelen oplevert, zullen we deze laatste gebruiken.

Daar de verzadigde organiese verbindingen eerst beneden 2000 A absorberen, zullen we hier uitsluitend de onverzadigde organiese verbindingen beschouwen. De absorptiespektra, die men bij de ingewikkeldernbsp;molekulen van dit type aantreft, bestaan als regel uit enkele zeer bredenbsp;banden in het ultraviolet. Dit geldt voornamelijk voor de vloeibare ennbsp;de opgeloste toestand, maar in vele gevallen ook voor het gas. Wanneernbsp;het absorptiespektrum zich tot in het zichtbare golflengtegebied uitstrekt,nbsp;spreekt men van een kleurstof,

In analogie met de spektra van eenvoudige molekulen in de gastoestand zullen we het absorptiespektrum moeten toeschrijven aan een beperkt aantal elektronenovergangen in het molekuul.

Tot op heden is ons inzicht in de aard van de elektronenovergang, die bij de absorptie plaats heeft, zeer beperkt. Zo heeft men lange tijd innbsp;het duister getast aangaande de vraag, in welk gedeelte van het molekuulnbsp;in de verschillende gevallen deze over gang zich af speelt. Daarbij meendennbsp;sommige onderzoekers, dat ze in een bepaalde binding kon wordennbsp;gelokaliseerd. Voor absorptieprocessen, waarbij de golflengte van hetnbsp;geabsorbeerde licht in het verre ultraviolet is gelegen, is deze opvattingnbsp;voor een deel juist gebleken. Een sprekend voorbeeld hiervan is denbsp;dubbele binding in de carbonylgroep, C = 0. Deze geeft aanleiding totnbsp;een absorptieband bij ca. 2800 A, die men bij alle aldehyden en ketonennbsp;aantreft 1).

Langzamerhand is men echter tot het inzicht gekomen, dat bij vele van de absorptieprocessen, die plaats vinden in het zichtbare en ultraviolette deel van het spektrum, niet de elektronen van een bepaaldenbsp;binding worden aangeslagen, maar dat men te maken heeft met eennbsp;verandering van de toestand van het elektronensysteem van het molekuulnbsp;als geheel, of van een gedeelte ervan. Dit is bijvoorbeeld het geval voornbsp;het bandensysteem van benzol bij 2500 A 2).

Enerzijds was men van experimentele zijde tot dit inzicht gekomen. Anderzijds voerde de toepassing van de quantenmechanica op molekuul-

problemen tot dezelfde opvatting en leidde tot een verdieping van het inzicht. Door de quantenmechanica wordt tevens de weg gewezen totnbsp;een kwantitatieve behandeling van de chemiese en optiese eigenschappennbsp;van de door ons beschouwde organiese molekulen *). Voorlopig is ditnbsp;echter nog slechts mogelijk voor zeer eenvoudige gevallen.

Door Lewis en Calvin^) is enkele jaren geleden een poging gedaan door toepassing van enkele zeer algemene regels, deels nognbsp;Werkend met klassieke voorstellingen, ook de absorptiespektra van ingewikkelder organiese molekulen te interpreteren. Aan de hand van ��nnbsp;der eenvoudigste voorbeelden zullen we dit nader toelichten:

We beschouwen het molekuul aethyleen H2C = CH2 enerzijds, butadieen H2C = CH�CH �CH2 anderzijds. De absorptie van aethyleennbsp;is gelegen beneden 2000 A en moet worden toegeschreven aan eennbsp;elektronenovergang in de dubbele binding tussen de twee C-atomen. Innbsp;dit gebied absorbeert ook butadieen, welke absorptie we aan dezelfdenbsp;elektronenovergang toeschrijven als in aethyleen, aangezien de enkelenbsp;C-C-binding bij aanzienlijk korter golflengte absorbeert. Daarnaast bezitnbsp;butadieen een absorptiegebied bij groter golflengte (tot 2300 A), datnbsp;overeenkomt met een elektronenovergang in het molekuul als geheel.

Quantenmechanies moet men zich dit als volgt denken; De grondtoestand van een molekuul kan als regel niet door ��n struktuurformule met bepaalde enkele en dubbele bindingen worden beschreven. In zekerenbsp;benadering kan ze worden opgevat als de superpositie van meerderenbsp;dergelijke strukturen. Voor butadieen zijn daarbij de strukturen a, b en cnbsp;de belangrijkste:

De niet-polaire struktuur a met de kleinste energie heeft het grootste aandeel in de grondtoestand, terwijl de beide polaire strukturen b en cnbsp;Oen groter energie bezitten en minder tot de grondtoestand bijdragen.nbsp;De werkelijke grondtoestand, die een superpositie is van a, b en c, bezitnbsp;door deze samenwerking of resonantie een energie, die kleiner is dan dienbsp;quot;Van elk der afzonderlijke strukturen**).

*) Voor de theoretiese organiese chemie zijn deze beschouwingen zeer vruchtbaar S^bleken, waar men overigens reeds veel vroeger tot dergelijke voorstellingen wasnbsp;Qekomen door de verschijnselen van mesomerie en tautomerie �).

**) In het algemeen spreekt men alleen van de resonantie van meerdere strukturen, Wanneer deze gelijke energie bezitten, zoals dat met de twee K � k u 1 � strukturen vannbsp;benzol het geval is:

0�0

Behalve deze superpositie, die de toestand van laagste energie vormt, zijn ook andere superposities mogelijk met hoger energie, die overeenkomen met aangeslagen toestanden van het molekuul. Volgens Lewisnbsp;spelen in de aangeslagen toestanden, die door absorptie van licht ontstaan, de polaire strukturen b en c een belangrijke rol, zodat we kunnennbsp;schrijven:

Hierin stellen ip^, ipi, en de golffunkties voor overeenkomende met de strukturen a, b en c.

De strukturen b en c danken de mogelijkheid van hun bestaan aan de afwisseling van enkele en dubbele bindingen, zogenaamd gekonju-geerde dubbele binding, tussen de vier C-atomen en onderscheiden zichnbsp;van struktuur a, behalve door de ladingsverschuiving, nog door denbsp;verandering van dubbele bindingen in enkele en omgekeerd. Daar denbsp;grondtoestand n�ch door a, n�ch door b of c gegeven wordt, maarnbsp;alle drie bevat, is het niet mogelijk de dubbele en enkele bindingen tenbsp;lokaliseren. Men kan dit z� opvatten, dat de dubbele bindingselektronennbsp;enigermate over het gehele molekuul verdeeld zijn. Op deze wijzenbsp;kunnen we ons voorstellen, dat er absorptieprocessen mogelijk zijn,nbsp;waarbij het elektronensysteem van het gehele molekuul betrokken is.nbsp;In de meeste gevallen zijn het dit soort overgangen, die een rolnbsp;spelen in fluorescentie- en chemoluminescentieprocessen van organiesenbsp;molekulen.

Wanneer men de konjugatie der dubbele bindingen in butadieen door tussenvoegen van een verzadigd koolstofatoom verbreekt, zijnnbsp;de polaire strukturen met de verlegde dubbele binding niet meernbsp;mogelijk en bezit het molekuul alleen nog de absorptiebanden, dienbsp;karakteristiek zijn voor de C = C binding;

Als algemene regel 4) heeft men gevonden, dat de absorptiegebieden, die met elektronenovergangen van het zo juist beschreven type kor-responderen, bij des te langer golflengte zijn gelegen naarmate hetnbsp;molekuul een groter opeenvolging van gekonjugeerde dubbele bindingennbsp;bezit. Dit is bijvoorbeeld het geval in de reeks benzol, naphtaline,nbsp;anthraceen 1), die een toenemende roodverschuiving van het absorptie-

I I nbsp;nbsp;nbsp;1

die eveneens bij langer golflengte absorberen naarmate de keten Van C-atomen langer is.

Men moet zich voorstellen, dat deze roodverschuiving samenhangt met de grootte van het elektronensysteem, dat betrokken is bij veranderingen van de elektronentoestand van het molekuul. Daarnaastnbsp;spelen ook andere invloeden een rol, o.a. de aanwezigheid van bepaaldenbsp;atoomgroepen, ionentoestanden van het molekuul enz. Hiervan treffennbsp;we in de hoofdstukken IV en V enige voorbeelden aan.

Het absorptiespektrum van een atoom is een lijnenspektrum. Elke lijn komt overeen met een overgang van het valentieelektron van de grond- naar een aangeslagen toestand.

Ook het elektronensysteem van een tweeatomig molekuul kan in verschillende toestanden voorkomen. Bovendien voeren de atomen trillingen ten opzichte van elkaar uit en roteert het molekuul. Daarbij zijn alleen diskrete trillings- en rotatietoestandennbsp;mogelijk. De energie der trillingen is klein ten opzichte van het energieverschil tussennbsp;grond- en aangeslagen elektronentoestand. De energie der rotatie is klein ten opzichtenbsp;van die der trillingen.

Het absorptiespektrum van een dergelijk molekuul is een bandenspektrum. Bij elke elektronenovergang behoort een bandengroep. Elke band komt met een bepaaldenbsp;trillingsovergang overeen, terwijl de lijnen, waaruit ��n band opgebouwd is, overeenkomen met verschillende rotatieovergangen. Voor nadere bijzonderheden zie men bijv.nbsp;bij S p o n e r �).

Bij de door ons beschouwde organiese molekulen heeft men vele trillingsmogelijkheden. Daaronder zijn er van grote energie, 1000 a 3000nbsp;cm�1, zoals de trillingen van de atomen in de groepen OH, CH, C �O,nbsp;C�O, C�C ten opzichte van elkaar. Echter zijn er ook trillingen vannbsp;kleine energie. Tot deze laatsten rekenen we de trillingen van los gebonden molekulen van het oplosmiddel ten opzichte van de op gelostenbsp;stof, bijvoorbeeld de watermolekulen van gehydrateerde stoffen. Doornbsp;deze trillingen van kleine energie zijn de afstanden der afzonderlijkenbsp;trillingsniveau�s zeer gering.

Van een bepaalde rotatietoestand van een molekuul in een oplossing kan men niet spreken, daar de rotatie sterk gestoord wordt door de omringende molekulen. Hiervoor in de plaats komen onregelmatige bewegingen, die niet gequantiseerd zijn en des te sterker zijn naarmatenbsp;de temperatuur hoger is.

Wat de trillingen betreft, zijn bij kamertemperatuur uitsluitend de trillingen van kleine energie aangeslagen, daar de energie der warmte-beweging, Yi klein is, namelijk van de orde van 50 cm�i.

Alle absorptieprocessen gaan daardoor uit van de zeer lage trillings-niveaus van de elektronengrondtoestand.

Bij de overgang van het elektronensysteem van de grond- naar de aangeslagen toestand verandert als regel ook de trillingstoestand vannbsp;het molekuul, waarbij verschillende trillingen in verschillende mate kunnen


5 - nbsp;nbsp;nbsp;; 1
1 nbsp;nbsp;nbsp;1nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;w' ( 1 A-	t\ ! J\i\i		A
3 -	' \ / _1__	- 1

2000

3000

4000

soooj

Fig. 1.

Absorptie- en fluorescentiespektrum van 3 anthraceen volgens Ley en Specker�).

worden aangeslagen. Elke tril-lingsovergang geeft aanleiding tot een kontinue absorptieband innbsp;tegenstelling tot de scherpe lijnennbsp;in het spektrum van een molekuulnbsp;in de gastoestand. Op de oorzaken van deze verbreding komennbsp;we hieronder nog terug.

De verschillende trillingsban-den behorend bij ��n elektronen-overgang zijn vaak tot een vloeiende kromme verenigd. Innbsp;andere gevallen zijn ze nog alsnbsp;deelbanden in het absorptiespek-trum aanwezig. Dit is bijvoorbeeldnbsp;het geval bij anthraceen. Zie fig. 1.nbsp;De deelbanden van de absorptieband tussen 3000 en 3900 A liggennbsp;hier op konstante afstanden in denbsp;frequentieschaal en komen overeen met ��n bepaalde trillingsmogelijkheidnbsp;van grote energie, die in verschillende mate aangeslagen wordt analoognbsp;aan de trillingstoestanden van een harmoniese oscillator. We moeten onsnbsp;hierbij voorstellen, dat ��n deelband waarschijnlijk nog opgebouwd isnbsp;uit de absorptiebanden, die overeenkomen met trillingsovergangen vannbsp;kleine energie.

De intensiteitsverdeling in het gedeelte van het absorptiespektrum, behorend bij ��n elektronenovergang wordt in eerste benadering gegevennbsp;door het principe van Franck-Condon�). Volgens het oorspronkelijke principe van F r a n c k ^) veranderen op het moment van denbsp;elektronenovergang de snelheden en onderlinge afstanden der atomennbsp;niet. In grond- en aangeslagen elektronentoestand zullen in het algemeen de evenwichtsafstanden der atomen verschillend zijn, daar denbsp;bindingswijze verandert. Dit betekent, dat wanneer aanvankelijk geennbsp;trilling aangeslagen is, bij de elektronenovergang zeer bepaalde trillingstoestanden aangeslagen worden. Zijn aanvankelijk wel trillingen aangeslagen dan zullen eveneens zeer bepaalde trillingsovergangen plaatsnbsp;hebben. Ter illustratie hiervan diene fig. 2 a en b voor een tweeatomignbsp;molekuul. Hierin is de potenti�le energie der kernen uitgezet tegen hunnbsp;onderlinge afstand voor grond- en aangeslagen elektronentoestand. In

fig. 2 a verandert de evenwichtsafstand der atomen, bepaald door het minimum der potentiaalkromme, niet en wordt vanuit de trillingsgrond-toestand bij overgang naar de hogere elektronentoestand geen trillingnbsp;aangeslagen. In fig. 2 b verandert de evenwichtsafstand wel en vindtnbsp;overgang plaats naar een trillingstoestand, waarbij de oorspronkelijkenbsp;evenwichtsafstand omkeerpunt is van de beweging, daar alleen bij dezenbsp;overgang de snelheid en de onderlinge afstand der kernen niet verandert.

Later werd door Condon het principe van Franck uitgebreid en is als zodanig bekend onder de naam van het principe van Franck-Condon. Volgens dit principe zijn ook andere overgangen mogelijk,nbsp;echter met een waarschijnlijkheid, die klein is ten opzichte van dienbsp;voor overgangen waarbij aan het principe van Franck is voldaan.nbsp;We zullen hier echter niet verder op ingaan.

We gaan nu over tot een bespreking van de oorzaken, die aan de verbreding ten grondslag liggen en aan het absorptiespektrum zijnnbsp;kontinue karakter geven.

De verbreding van ��n trillingsband ontstaat zowel door oorzaken in het molekuul zelf als door de wisselwerking met de omringende vloeistof. De stoorvelden der naburige molekulen veroorzaken:

2�. een wisselende verschuiving en dus een verbreding van het elek~ tronenniveau (Starkeffekt).

Ook naburige delen van het molekuul kunnen dit veroorzaken, zodat de verbreding van het elektronenniveau een verbredingsoorzaak is, dienbsp;zowel inter- als intramolekulair van karakter is. Hetzelfde geldt voornbsp;de derde oorzaak:

3�. Verbreding van het bij de overgang aangeslagen trillingsniveau tengevolge van een korte levensduur van de trillingstoestanden, hetzijnbsp;door uitwisseling der trillingsenergie, hetzij door ontleding van hetnbsp;molekuul.

Als vierde oorzaak voor het kontinue karakter van het absorptie-spektrum kunnen we nog aangeven:

4�. Het dicht opeenliggen der trillingsniveau�s, die vanuit de grondtoestand kunnen worden aangeslagen.

Over de vraag, hoe in de verschillende gevallen deze mogelijke oorzaken samenwerken tot het ontstaan van de al of niet uit deelbandennbsp;opgebouwde absorptieband, is nog slechts weinig bekend. De verschillende onderzoekers verschillen van opvatting over de mate waarin dezenbsp;oorzaken van betekenis zijn. Blijkbaar is voor eenvoudige, symmetriesenbsp;molekulen als benzol, anthraceen de laatste oorzaak niet z� sterk aanwezig, dat de trillingsstruktuur geheel verdwijnt. Het aantal mogelijkenbsp;trillingen in deze molekulen is betrekkelijk klein.

De verbreding, die het gevolg is van het wegvallen der rotatie-struktuur, omvat het golflengtegebied, dat in de ongestoorde toestand van het molekuul ingenomen wordt door niet te zwakke rotatielijnen.

De aanwezigheid van de tweede verbredingsoorzaak ligt voor de hand, daar de grootte van de elektronenovergang mede bepaald wordt doornbsp;de ligging der omringende molekulen van het oplosmiddel, die met hetnbsp;absorberend molekuul in wisselwerking staan. Deze ligging draagt eennbsp;toevallig karakter. Over het bedrag van de verbreding kan men misschiennbsp;een indruk krijgen uit de verschuiving, die optreedt in het absorptie-spektrum, wanneer men van het ene naar het andere oplosmiddelnbsp;overgaat. Deze bedraagt als regel niet meer dan enkele tientallennbsp;Angstr�meenheden. We schatten daarom, dat de verbreding van hetnbsp;elektronenniveau, die het gevolg is van de wisselwerking met de nabuur-molekulen, ook van de grootteorde van 10 A is.

De verbreding van het elektronenniveau door naburige delen van het molekuul ontstaat op analoge wijze, doordat de verschillende delen vannbsp;het molekuul tengevolge van de thermiese beweging enigszins verschillende standen ten opzichte van elkaar kunnen innemen. Bijvoorbeeld isnbsp;dat het geval bij biphenyl to):

Eventueel kunnen ook deformaties van het molekuul verbreding van het elektronenniveau tengevolge hebben.

De derde oorzaak werd door Lewis'*) naar voren gebracht om de waargenomen breedte der trillingsbanden in molekulen als benzol,nbsp;anthraceen e.a. te verklaren:

Het verband tussen de natuurlijke breedte van een niveau en de levensduur ervan wordt gegeven door de onzekerheidsrelatie vannbsp;Heisenberg:

T X aE = h, waarin t�= levensduur, aE � breedte van het niveau, h = konstante van Planck.

Bij een verbreding van 100 a 1000 cm�i behoort volgens deze formule een levensduur van 3.10�13 a 3.10�14 sek.

Volgens Lewis zou de energie, die bij de aanslag aan bepaalde trillingen wordt toegevoerd, in 10�13 a 10�14 sek. worden verdeeldnbsp;over alle trillingsmogelijkheden van het molekuul van kleine energie.nbsp;Zodat de trillingsband een breedte krijgt van 100 a 1000 cm�i zoals mennbsp;als regel waarneemt. We kunnen ons daarbij voorstellen, dat de zonbsp;over het gehele molekuul verdeelde trillingsenergie, waardoor hetnbsp;..Warmer� is dan de omgeving, naar de omringende molekulen wegvloeit.

Dat er inderdaad een zeer snelle omzetting van de trillingsenergie plaats heeft, blijkt uit een studie der fluorescentiespektra, waarop we innbsp;� 6 nog terug komen. Hieruit volgt dat de omzetting in hoogstensnbsp;10�10 a 10�11 sek. plaats heeft. Of ze zo snel geschiedt als door Lewisnbsp;Wordt aangenomen, kan men hieruit nog niet opmaken.

Daarnaast treedt in vele gevallen een sterke verkorting van de levensduur op doordat het molekuul tengevolge van de toegevoerde trillingsenergie ontleed wordt lo), een proces, dat �f gelijktijdig met de absorptie plaats heeft (dissociatie) �f zeer kort daarna (predissociatie).

Zoals we gezien hebben treden enkele van de verbredende oorzaken ook reeds op in het ongestoorde molekuul: De ontleding en de storendenbsp;invloed van naburige delen van het molekuul zijn in de zeer verdundenbsp;gastoestand de voornaamste oorzaken voor het optreden van bredenbsp;absorptiebanden of van geheel kontinue absorptie. Voor een mooi overzicht van de theoretiese en experimentele resultaten, die men verkregennbsp;heeft bij de studie van de absorptiespektra van molekulen in de gastoestand, verwijzen we naar een verhandeling van T ereninU) in denbsp;Acta Physica Polonica V, 229�254, 1936.

We vragen ons nu af, wat het lot is van de energie der elektronenaanslag. Voor een aangeslagen molekuul zijn er twee mogelijkheden:

1�. Het keert naar de grondtoestand terug onder emissie van een lichtquant {fluorescentie).

2�. Het keert stralingsloos naar de grondtoestand terug, waarbij de elektronenenergie in trillingsenergie wordt omgezet: of ondergaat eennbsp;ehemiese verandering, waarbij de energie voor een deel ook in chemiesenbsp;energie wordt omgezet.

Bij niet fluorescerende molekulen treden alleen de onder 2� genoemde processen op. Bij fluorescerende molekulen treedt daarnaast ook hetnbsp;eerste proces op wanneer het quantenrendement der fluorescentie, d.i, denbsp;verhouding van het aantal ge�mitteerde en geabsorbeerde quanten, kleinernbsp;IS dan ��n. Bij enkele zeer sterk fluorescerende stoffen heeft men ondernbsp;geschikte omstandigheden een quantenrendement van nagenoeg ��nnbsp;kunnen waarnemen 12). Daarbij treedt dus geen degradatie der elek-

tronenenergie op wanneer de aanslag geschiedt naar hetzelfde elektronenniveau als van waaruit de fluorescentie plaats heeft.

We beschouwen nu de onder 2� genoemde stralingsloze processen nader. Ten dele hebben deze plaats onder invloed van de omringendenbsp;vloeistofmolekulen, ten dele ligt de oorzaak ervan in het molekuul zelf,nbsp;zoals blijkt uit de afwezigheid van fluorescentie bij de meeste organiesenbsp;verbindingen in de verdunde gastoestand n). Men heeft daar vaak eennbsp;ontleding van het molekuul tengevolge van de absorptie kunnen waarnemen, terwijl in andere gevallen geen ontleding optreedt en het molekuulnbsp;stralingsloos naar de grondtoestand moet zijn teruggekeerd.

Wil men zich een beeld vormen van een dergelijke stralingsloze over-gang naar de grondtoestand, dan moet men zich voorstellen dat de potentiaaloppervlakken in de (n l)-dimensionale ruimte (n = aantalnbsp;ko�rdinaten van het molekuul) van grond- en aangeslagen toestand innbsp;bepaalde gebieden elkaar zeer dicht naderen, zodat er een grote waarschijnlijkheid is voor een overgang in dit gebied van het ene op hetnbsp;andere oppervlak waarbij geen sprong in de energie van het systeemnbsp;optreedt. Voor een tweeatomig molekuul kan men bijvoorbeeld eennbsp;situatie hebben als in figuur 3 is weergegeven. De stralingsloze overgang heeft plaats in het punt B, wanneer het molekuul zich vanuit

toestand A in de richting van toestand C beweegt onder verlies van zijn trillings-energie. Het komt daarbij in de hoge trillings-toestand D van de elektronengrondtoestandnbsp;en valt tenslotte terug naar toestand E ondernbsp;verdere afgifte van zijn trillingsenergie.

De stralingsloze terugkeer naar de grondtoestand, zoals deze hierboven werd beschreven, kan in sommige gevallen eerst optreden wanneer het molekuul door de omringendenbsp;molekulen gestoord wordt. Of ze kan hetnbsp;gevolg zijn van een botsing, waarbij een deelnbsp;der energie aan de botsende partner overgedragen wordt. Tenslotte kan het aangeslagen molekuul ontleden of chemies reageren met molekulen uit de omgeving ennbsp;op deze manier de elektronenenergie innbsp;chemiese energie omzetten. Deze processen spelen een rol bij de zogenaamde demping der fluorescentie. Hieronder verstaat men de afnamenbsp;van het fluorescentierendement van een stof tengevolge van de toevoeging van bepaalde stoffen, veelal in lage koncentraties.

We letten nu op de spektrale samenhang tussen fluorescentie en absorptie. Volgens de wet van Stokes is de golflengte van het uitgezonden licht groter dan van het geabsorbeerde, of ook: Het fluorescentie-spektrum ligt bij kleiner frequentie dan het absorptiespektrum.

Het is reeds vroeg opgevallen, dat er een zekere mate van symmetrie bestaat tussen beide spektra, welke in fig. 1 voor anthraceen duidelijknbsp;zichtbaar is. In absorptie en fluorescentie heeft men hetzelfde aantal

deelbanden met dezelfde relatieve intensiteitsverdeling. We laten daarbij het absorptiespektrum beneden 3000 A buiten beschouwing, daar ditnbsp;waarschijnlijk bij een andere elektronenovergang behoort.

De kwalitatieve symmetrie wordt in sommige gevallen kwantitatief, wanneer men de spektra uitzet tegen de frequentie en de intensiteit innbsp;het fluorescentiespektrum in quantenjsek. uitdrukt. Zie fig. 4. In dezenbsp;vorm werd de wet der spiegelsymmetrie in 1931 door Lews chintz)nbsp;naar voren gebracht. Hij liet zien, dat door vele kleurstoffen aan dezenbsp;wet voldaan wordt en gaf in 193715) gen interpretatie ervan, die wenbsp;hier verkort weergeven.

We beschouwen het absorptie- en fluorescentiespektrum behorend bij ��n elektronenovergang en onderstellen, dat zowel absorptie alsnbsp;fluorescentie uitgaan van de trillingsgrondtoestanden (fig. 5 a en b)nbsp;terwijl de overeenkomstige afstanden der trillingsniveau�s dezelfde zijnnbsp;voor grond- en aangeslagen elektronentoestand. In het absorptiespektrumnbsp;treden dan de frequenties Vo An op, waarin;

In het fluorescentiespektrum treden de frequenties Vo�An op. Wanneer nu de overgangswaarschijnlijkheden voor overgangen van het o� naarnbsp;het n= trillingsniveau in absorptie en fluorescentie gelijk zijn, krijgt mennbsp;in beide spektra dezelfde intensiteitsverdeling over de trillingsbanden.

Deze is in fig. 5 c weergegeven en voldoet aan de wet der spiegel-symmetrie. De bovendien nog optredende verbreding der afzonderlijke frequenties tengevolge van de in � 4 naar voren gebrachte oorzaken,nbsp;verandert dit in beginsel niet.

Het is eenvoudig in te zien, dat er in het algemeen spiegelsymmetrie zal optreden wanneer aan de volgende voorwaarden is voldaan:

1�. de ligging der trillingsniveau�s ten opzichte van elkaar in gronden aangeslagen toestand dezelfde is;

2�. de verdeling der molekulen, die absorberen resp. fluoresceren over deze trillingsniveau�s dezelfde is;

3�. de waarschijnlijkheid voor een overgang van het n� trillingsniveau van de grondtoestand naar het m^ van de aangeslagen toestand gelijknbsp;is aan de waarschijnlijkheid voor een overgang van het n= trillingsniveaunbsp;van de aangeslagen toestand naar het m' van de grondtoestand.

In het algemeen is aan voorwaarde 1� niet voldaan. Bijvoorbeeld zijn bij anthraceen de afstanden der deelbanden konstant en in het absorptie-spektrum gelijk aan 1430 cm�i, in het fluorescentiespektrum gelijk aannbsp;1350 cm�1, d.w.z. de afstanden der trillingsniveau�s zijn verschillendnbsp;in de grond- en in de aangeslagen toestand.

De tweede voorwaarde houdt in, dat de verdeling der fluorescerende molekulen over de trillingstoestanden van de aangeslagen toestand denbsp;temperatuucverdeling zal zijn, daar dit voor de grondtoestand zo is. Ditnbsp;betekent, dat de door de aanslag toegevoerde extra trillingsenergie verdwenen moet zijn in een tijd, die kort is ten opzichte van de levensduurnbsp;van de aangeslagen toestand. Dit past geheel in de voorstelling vannbsp;L e w i s 4),

De juistheid van deze onderstelling kon in meerdere gevallen op de volgende wijze getoetst worden: Wanneer het instellen van de even-wichtsverdeling van de molekulen in de aangeslagen toestand over denbsp;trillingsniveau�s een proces is, dat langzaam verloopt vergeleken met de

overgang naar de grondtoestand onder emissie van een fluorescentie-quant, moet men verwachten, dat het fluorescentiespektrum afhankelijk zal zijn van het trillingsniveau, dat bij de absorptie wordt aangeslagen,nbsp;dus van de golflengte van het geabsorbeerde licht. In alle onderzochtenbsp;gevallen bleek, dat het fluorescentiespektrum onafhankelijk is van denbsp;golflengte van het ingestraalde licht 16. 17)_ voorbeeld hiervan treftnbsp;men aan in hoofdstuk IV voor dimethyldiacridyliumnitraat. Een uitzondering moet misschien gemaakt worden voor visceuze oplosmiddelennbsp;bij anti-S t o k e s�e aanslag d.w.z. bij absorptie in het golflengte-gebied waarin ook fluorescentie optreedt. Dit betreft een geheel andernbsp;verschijnsel, waar we hier niet op in zullen gaan daar de hierop betrekking hebbende experimentele gegevens nog zeer onvolledig zijn.

Verder kunnen er ook in de gastoestand afwijkingen optreden bij gasdrukken beneden 0.1 mmH). Hieruit blijkt, dat de wisselwerking met de omringende molekulen een rol speelt bij het bereiken van de even-wichtsverdeling.

Uit het feit, dat het fluorescentiespektrum onafhankelijk is van de golflengte van het geabsorbeerde licht, mogen we besluiten, dat denbsp;evenwichtsverdeling der molekulen over de trillingstoestanden bereiktnbsp;wordt in een tijd, die kort is ten opzichte van de levensduur van denbsp;aangeslagen toestand. Deze laatste werd voor enkele kleurstoffen zowelnbsp;langs dirckte ^^) als langs indirekte^o) weg gemeten en bleek 10~�nbsp;a 10�9 sek. te bedragen. Hieruit zou volgen, dat de uitwisseling vannbsp;trillingsenergie plaats heeft in een tijd van hoogstens 10�lo sek. Het zounbsp;interessant zijn na te gaan of het fluorescentiespektrum voor bepaaldenbsp;kleurstoffen en onder daartoe gunstige omstandigheden niet inderdaadnbsp;afhankelijk is van de golflengte van het geabsorbeerde licht. We denkennbsp;hier speciaal aan zeer zwakke en aan sterk gedempte fluorescenties, waarnbsp;men waarschijnlijk met een korter levensduur van de aangeslagen toestand te maken heeft tengevolge van het optreden van konkurrercndcnbsp;processen.

Aan de derde voorwaarde zal in het algemeen kwalitatief zijn voldaan. Met behulp van het principe van Franck-Condon kunnen we ditnbsp;als volgt begrijpen: Wanneer de evenwichtsafstanden der atomen bij denbsp;overgang niet veranderen, heeft de trillingsovergang 0�0 de grootstenbsp;Waarschijnlijkheid. Voor de overgangen 0�n neemt de waarschijnlijkheidnbsp;af naarmate n toeneemt. Veranderen daarentegen de evenwichtsafstandennbsp;wel, dan zal een overgang 0�p de grootste waarschijnlijkheid hebben.nbsp;Voor de overgangen 0�n neemt de waarschijnlijkheid af, naarmate nnbsp;meer van p gaat verschillen. Dit geldt zowel bij de absorptie als bij denbsp;fluorescentie.

Wanneer voor een 2-atomig molekuul de potentiaalkrommen in gronden aangeslagen toestand symmetries en gelijk van vorm zijn, kan men aantonen 21), dat de intensiteitsverdeling in absorptie- en fluorescentie-

spektrum dezelfde is. Is hieraan niet voldaan, dan treden er afwijkingen op, die des te groter zijn naarmate de krommen meer verschillen.nbsp;Kwantitatief zijn er dan ook grote afwijkingen mogelijk van de derdenbsp;voorwaarde, waaraan voldaan moet zijn voor het optreden van spiegel-symmetrie. Een voorbeeld hiervan treffen we aan in hoofdstuk IV.

Naar aanleiding van het voorgaande kunnen we nog twee belangrijke gevolgtrekkingen maken:

1�. In die gevallen, dat het fluorescentiespektmm onafhankelijk is van de golflengte van het geabsorbeerde licht, vindt de fluorescentieovergangnbsp;plaats vanuit ��n aangeslagen elektronentoestand.

Immers, wanneer er fluorescentie mogelijk is vanuit meer dan ��n elektronentoestand, is het spektrum een superpositie van de bij deze verschillende toestanden behorende fluorescentiespektra. De relatieve intensiteit dezer spektra zal in dat geval worden bepaald door de golflengtenbsp;van het geabsorbeerde licht. Bijvoorbeeld moet het dan mogelijk zijn hetnbsp;spektrum, behorend bij de laagste aangeslagen elektronentoestand afzonderlijk te krijgen door in te stralen met licht van voldoend grotenbsp;golflengte.

Het is intussen niet uitgesloten, dat vanuit het bepaalde elektronenniveau fluorescentieovergangen plaats hebben naar meer dan ��n lager liggend niveau. De waarschijnlijkheid hiervoor is echter gering en alsnbsp;regel zal men alleen met een overgang naar de elektronengrondtoestandnbsp;te maken hebben. Voor dat geval geldt de tweede gevolgtrekking:

2�. Wanneer er tevens spiegelsymmetrie optreedt van absorptie~ en fluorescentiespektrum vindt de overgang in de symmetriese delen vannbsp;deze spektra plaats van de elektronengrondtoestand naar de laagste aangeslagen toestand en omgekeerd.

In dat geval kan men dus met zekerheid het fluorescentiespektrum en het spiegelsymmetriese deel van het absorptiespektrum aan ��n ennbsp;dezelfde elektronenovergang toeschrijven.

� 7. Fluorescentierendement in afhankelijkheid van de golflengte van het ingestraalde licht.

Sterk fluorescente stoffen zijn zeer sporadies in de grote klasse van organiese verbindingen. Zwak fluorescente stoffen zijn er aanzienlijknbsp;meer, terwijl men de bewering, dat elke stof fluoresceert, zij het ook metnbsp;een z��r klein rendement, niet kan tegenspreken. Enerzijds moet mennbsp;dus zeggen, dat fluorescentie in het geheel niet zo�n zeldzaam verschijnsel is als men vaak meent. Anderzijds neemt dit niet weg, dat denbsp;stralingsloze terugkeer van de aangeslagen- naar de grondtoestandnbsp;(ev. chemiese reaktie) regel is, terwijl de terugkeer onder emissie vannbsp;een fluorescentiequant een hoge uitzondering moet worden genoemd.nbsp;Voor bepaalde molekulen kan deze echter belangrijk worden.

Men moet zich voorstellen, dat beide processen naast elkaar voorkomen. Daarbij is de waarschijnlijkheid voor de overgang verbonden m�t straling als regel aanzienlijk kleiner dan voor de stralingsloze overgang. De verhouding van deze waarschijnlijkheden bepaalt het quantenrendement der fluorescentie.

Een sterke fluorescentie of wel een hoog fluorescentierendement kan men nu toeschrijven �f aan een grotere overgangswaarschijnlijkheid voornbsp;de spontane emissie �f aan een kleinere waarschijnlijkheid van denbsp;stralingsloze processen. Blijkbaar is het laatste het geval: De levensdurennbsp;van 10quot;¹ a 10�� sek., die men voor fluorescerende kleurstoffen gemetennbsp;heeft, komen namelijk overeen met geheel normale overgangswaarschijn-lijkheden voor spontane emissie.

Een sterke fluorescentie moeten we dus toeschrijven aan een kleine waarschijnlijkheid der stralingsloze processen.

Fig. 6. Schematiese voorstelling van een fluorescerend en een niet-fluorescerend

molekuul voorstellen als in fig. 6 a en b ¹). De vertikale pijl symboliseert de met straling verbonden overgang, de vertikale streep de stralingslozenbsp;overgang. Deze laatste is als het ware een kortsluiting tussen de tweenbsp;niveau�s.

We beschouwen nu het geval, dat bij een fluorescerend molekuul een hoger elektronentoestand aangeslagen wordt. We kunnen dannbsp;de volgende twee extreme gevallen onderscheiden, weergegeven innbsp;fig. 7 a en b:

a. Er treedt geen fluorescentie op bij absorptie in de band, die met de hogere elektronentoestand overeenkomt.

De afzonderlijke trillingstoestanden, behorend bij ��n elektronentoestand zijn in fig. 6 en 7 als ��n niveau weergegeven.

Dit is het geval, wanneer het betreffende niveau 2 door een stralings-loze overgang kortgesloten is met de grondtoestand 0. Een voorbeeld hiervan treft men aan bij decacycleen 22),

b. De fluorescentie wordt ook opgewekt in de absorptieband, die met de hogere elektronentoestand overeenkomt. Het fluorescentierendementnbsp;is hetzelfde als voor de fluorescentie opgewekt in de bij groter golflengtenbsp;liggende absorptieband.

Dit is het geval wanneer het hogere niveau 2 door een stralingsloze overgang kortgesloten is met het niveau 1 van waaruit de fluorescentienbsp;plaats heeft, niet echter met de grondtoestand 0.

Een voorbeeld van dit geval treffen we aan in hoofdstuk V bij 3-aminophtaalzuurhydrazide.

Behalve deze extreme gevallen zijn alle tussenvormen denkbaar, waarbij het fluorescentierendement in de bij korter golflengten gelegen absorptie-banden kleiner is dan in de absorptieband, die met de fluorescentienbsp;korrespondeert. In die gevallen zal het mogelijk zijn het absorptiespektrumnbsp;te analyseren naar de verschillende elektronenovergangen door hetnbsp;rendement te bepalen als funktie van de golflengte.

Het op het ogenblik beschikbare, geringe experimentele materiaal zou erop kunnen wijzen, dat geval b regel is. Bij uitzondering treedt geval anbsp;op, namelijk wanneer de overgang naar de twee aangeslagen elektronentoestanden 1 en 2 plaats heeft in twee delen van het molekuul, die watnbsp;betreft hun elektronensystemen van elkander ge�soleerd zijn.

Volledigheidshalve vermelden we hier nog, dat het quantenrendement binnen de absorptieband korresponderend met de fluorescentieband, voor enkele kleurstoffennbsp;konstant gevonden werd door Wawilow^�), terwijl Szczeniowski^^) ennbsp;Nichols een geringe toename vonden bij toenemende golflengte van het ingestraalde licht. Het fluorescentierendement in het anti-Stokes�e absorptiegebied neemtnbsp;volgens Jablonski^�) en Wawilow^�) snel af. Op de interpretatie van ditnbsp;verschijnsel gaan we hier niet in.

ALGEMENE BESCHOUWINGEN OVER CHEMOLUMINESCENTIE.

� 1. Voorkomen van chemoluminescentie,

In de loop van de tijd zijn er vele chemiese reakties bekend geworden, die onder lichtemissie verlopen. Verreweg de meeste van deze reaktiesnbsp;zijn oxydatieprocessen. Voorbeelden hiervan zijn:

b. nbsp;nbsp;nbsp;de oxydatie van talloze organiese verbindingen in oplossing al ofnbsp;niet bij aanwezigheid van een katalysator: aldehyden, pyrogallol, paknbsp;mitinezuur, aesculine, lophine, Grignard verbindingen 28.29).

De bekendste reakties van dit type zijn de in de hoofdstukken IV en V te behandelen chemoluminescenties van dimethyldiacridyliumnitraat ennbsp;'^an 3-aminophtaalzuurhydrazide. Bij de eerste wordt een sterk groen,nbsp;bij de tweede een sterk blauw licht uitgezonden. Verder is ook de reaktienbsp;van pyrogallol 29) met peroxyd en formaline in alkalies milieu zeer be-kend. Deze verloopt onder grote warmteontwikkeling, waarbij een vrijnbsp;zwak rood licht wordt uitgezonden,

c. nbsp;nbsp;nbsp;Chemoluminescentie van aan oppervlakken geadsorbeerde kleur^nbsp;stoffen bij behandeling met ozon so) en van aan gels geadsorbeerde kleurstoffen bij oxydatie van het gel si).

Daarnaast zijn er ook chemoluminescente ontledingsreakties bekend, o-a. de droge destillatie van hydrobenzamide in waterstofatmosfeer S2).

Een derde type van chemoluminescente reakties treft men aan in de gasphase, namelijk bij de reaktie van metalen met halogenen, o.a. natriumnbsp;en kwik met chloor ss).

Een chemoluminescente reaktie onderscheidt zich van een gewone reaktie doordat een deel van de vrijkomende bindingsenergie in de vormnbsp;van licht uitgezonden wordt. Bij niet-chemoluminescente reakties komtnbsp;ze geheel als warmte vrij, de zogenaamde reaktiewarmte.

Daar de emissie van een lichtquant in het zichtbare golflengtegebied overeenkomt met een grote reaktiewarmte, voor A = 5000A bedraagt dezenbsp;57 kcal/grm, zal men chemoluminescentie alleen waarnemen bij reaktiesnbsp;niet een groot energieoverschot. Daardoor is het begrijpelijk, dat j*:istnbsp;bij oxydatieprocessen het verschijnsel het veelvuldigst voorkomt. Omge-

keerd behoeft een reaktie waarbij veel energie vrijkomt, allerminst chemoluminescent te zijn, daar het chemoluminescent vermogen zeernbsp;nauw samenhangt met de optiese eigenschappen der betrokken molekulen,

Het probleem der chemoluminescentie kunnen we splitsen in twee delen, die tot op zekere hoogte gescheiden kunnen worden behandeld:

Het verloop van de chemiese reaktie is in de meeste gevallen slechts ten dele bekend. Als regel neemt men aan, dat men te maken heeft metnbsp;een reaktieketen, d.w.z. een reaktie, die uit meerdere schakels bestaat.nbsp;De reaktieschema�s, die door de verschillende onderzoekers zijn opgesteld, berusten grotendeels op hypothesen, die in vele opzichten nognbsp;nader getoetst moeten worden. In hoofdstuk IV en V zullen we hiervannbsp;twee gevallen nog nader bespreken. Daar dit gebied echter grotendeelsnbsp;buiten ons onderzoek valt, zullen we er slechts in zoverre op ingaan alsnbsp;in verband met ons werk nodig is.

We gaan nu over tot een nadere beschouwing van het eigenlijke proces der chemoluminescentie. Hieronder verstaan we dat onderdeel van denbsp;reaktie waarbij de chemiese energie als licht vrijkomt.

Volgens het natuurkundig inzicht in emissieverschijnselen moet men zich voorstellen dat het uitzenden van een lichtquant gepaard gaat aannbsp;een overgang van ��n of ander elektronensysteem van een hoger naarnbsp;een lager energietoestand. Dit elektronensysteem zal het elektronensysteem van een bepaald chemies individu zijn. Hieronder verstaan wenbsp;in dit verband een al of niet in chemies opzicht stabiel molekuul, eennbsp;radikaal, een ion, een additieprodukt van twee molekulen enz. In hetnbsp;volgende zullen we er vaak eenvoudig ..molekuul� voor schrijven.

We kunnen nu twee gevallen onderscheiden, die ieder weer onderverdeeld kunnen worden;

Het molekuul, dat het chemoluminescentielicht uitzendt, is tussen-of eindprodukt van de reaktie en ontstaat bij de reaktie in aangeslagen toestand.

B. nbsp;nbsp;nbsp;Indirekte chemoluminescentie of chemofluorescentie door overdracht.

Het emitterend molekuul is een willekeurig in het reaktiemengsel voorkomend molekuul, dat in aangeslagen toestand is geraakt doornbsp;botsing met een tussen- of eindprodukt van de reaktie, dat dragernbsp;is van reaktieenergie.

In deze paragraaf zullen we ons uitsluitend bezig houden met het geval van de direkte chemoluminescentie, terwijl in � 3 de indirekte chemoluminescentie behandeld zal worden.

Hoe moeten we ons voorstellen, dat een tussen- of eindprodukt bij de reaktie in een aangeslagen toestand ontstaat? Hierin is niets wonderlijksnbsp;gelegen. Immers, elke chemiese deelreaktie komt uiteindelijk neer op eennbsp;overgang van de elektronensystemen der reagerende partners in die dernbsp;reaktieprodukten. Het is zeer goed denkbaar, dat daarbij het elektronensysteem van ��n der reaktieprodukten niet in de grond~ maar in eennbsp;aangeslagen toestand ontstaat.

Wat de aard van het door dit molekuul uitgezonden licht betreft, kunnen we nog drie gevallen onderscheiden:

1�. het chemoluminescentielicht is steeds afkomstig van hetzelfde goed gedefinieerde chemiese individu, dat tijdens de levensduur van de aangeslagen toestand niet in wisselwerking staat met andere reaktieprodukten.

2�. het emitterend molekuul ondergaat gedurende de levensduur der aangeslagen toestand veranderingen. We kunnen ons hierbij denken, datnbsp;het molekuul ,,in staat van wording� is of dat het in een tijdsafhankelijkenbsp;wisselwerking met andere reaktieprodukten staat,

3�. het emitterend molekuul is weliswaar een onafhankelijk chemies individu, als onder 1 � aangegeven werd, het kan echter in meerdere goednbsp;gedefinieerde modifikaties optreden. We denken hier bijvoorbeeld aannbsp;enolisatie of ionisatie in een voor de chemiese reaktie onbelangrijkenbsp;zijketen.

In het eerste geval ligt het voor de hand te onderstellen, dat het betrokken molekuul door absorptie van licht in dezelfde aangeslagen elektronentoestand kan komen en daarbij een fluorescentie zal vertonennbsp;van dezelfde spektrale samenstelling als het chemoluminescentielicht.nbsp;Met andere woorden, dat chemoluminescentie- en fluorescentiespektrumnbsp;identiek zullen zijn.

In welke trillingstoestand het molekuul tengevolge van de chemiese reaktie ontstaat, doet in dit verband niet ter zake. In hoofdstuk I zagennbsp;we namelijk, dat de bij absorptie aan het molekuul toegevoerde extranbsp;trillingsenergie verloren gaat in een tijd die zeer kort is vergeleken metnbsp;de levensduur van de aangeslagen toestand. Er is geen reden aan tenbsp;nemen, dat dit niet het geval zou zijn voor een molekuul, dat tengevolgenbsp;Van een chemiese reaktie in aangeslagen toestand is ontstaan.

Het is echter niet uitgesloten, dat het betrokken molekuul niet fluoresceert of dat chemoluminescentie- en fluorescentiespektrum nietnbsp;identiek zijn doordat de elektronentoestand, die bij de chemiese reaktienbsp;ontstaat, niet door absorptie vanuit de grondtoestand kan worden aangeslagen. Voor molekulen in oplossing is dit echter in hoge mate onwaarschijnlijk, daar in dat geval de storing door de omringende molekulennbsp;z� groot is, dat de eventuele verbodsregels voor bepaalde overgangennbsp;veel minder scherp zijn dan in de verdunde gastoestand.

1� genoemde geval het chemoluminescerende molekuul ook fluoresceert en dat de spektra identiek zijn.

Het voorgaande geldt evenzeer voor de afzonderlijke molekuulvormen van de onder 2� en 3� genoemde gevallen. Echter is dan het uiteindelijknbsp;spektrum in het tweede geval een superpositie van de spektra van eennbsp;kontinuum van molekuulvormen, in het derde geval een superpositie vannbsp;de spektra van een aantal bepaalde molekuulvormen. Het derde gevalnbsp;zal uiteraard weinig voorkomen, daar de onderstelling van meerderenbsp;molekuulvormen in de meeste gevallen op zichzelf reeds onwaarschijnlijknbsp;is en tevens omdat, zo deze al aanwezig zijn, het zeer goed mogelijknbsp;is, dat slechts ��n daarvan tot emissie in staat is. Wat het tweede gevalnbsp;betreft, is het moeilijk enige definitieve uitspraak te doen.

In de volgende hoofdstakken zullen we ons veelal op het standpunt van het eerste geval plaatsen, daar de onderstelling, dat een bepaaldnbsp;chemies individu, hetzij stabiel hetzij instabiel, het chemoluminescentie-licht uitzendt, de eenvoudigste onderstelling is, die men kan maken.

Onder indirekte chemoluminescentie of chemofluorescentie door over~ dracht verstaan we die vorm van chemoluminescentie, waarbij de reaktie-energie door botsing overgedragen wordt aan een ander in het reaktie-mengsel voorkomend molekuul, dat het als fluorescentielicht uitzendt.nbsp;Hiervan vinden we in de literatuur twee voorbeelden:

1�. de chemoluminescente reaktie van natrium en chloor in de gas-phase. Hierbij wordt de Na-D lijn uitgezonden,

2�. de chemoluminescentie van aan gels geadsorbeerde kleurstoffen bij oxydatie van het gel en van de chemoluminescente oxydatie van aannbsp;gels geadsorbeerde kleurstoffen door ozon.

In het eerste geval maakten Evans en Polanyi^s) het waarschijnlijk, dat de energie vrijkomend in de reaktie:

als trillingsenergie in het molekuul NaCl wordt opgehoopt. Door botsing met een Na-atoom wordt deze trillingsenergie omgezet in elektronen~nbsp;energie van het Na-atoom.

Het tweede voorbeeld betreft de door Kautsky^i) onderzochte chemoluminescentie van aan uitgelicht silikon geadsorbeerde kleurstoffen,nbsp;die bij oxydatie van het gel door kaliumpermanganaat chemoluminescentienbsp;vertonen in de kleur van de fluorescentie van de betreffende kleurstof.nbsp;In welke vorm de reaktie�nergie in dit geval door het reagerend molekuulnbsp;van het gel overgedragen wordt aan het kleurstofmolekuul, is niet bekend. Hetzelfde verschijnsel treedt op wanneer de geadsorbeerde kleurstof zelf geoxydcerd wordt met behulp van ozon ). De overdracht

geschiedt in dat geval van een geoxydeerd op een niet-geoxydeerd kleurstofmolekuul.

We gaan nu na in hoeverre deze processen kunnen optreden bij chemoluminescente reakties in oplossing. Het is duidelijk, dat daar denbsp;omstandigheden voor overdracht van energie, hetzij als trillings- hetzijnbsp;als elektronenenergie, door de aanwezigheid van het oplosmiddel veelnbsp;ongunstiger zijn dan bij een adsorbaat of in een gas. Een eenvoudigenbsp;berekening leert, dat bij de gebruikelijke koncentratie aan chemoluminescente stof de bovenste grens van de waarschijnlijkheid voor eennbsp;direkte overdracht van energie slechts 15 % bedraagt:

De levensduur van een trillingstoestand van hoge energie in een vloeistof moeten we volgens hoofdstuk 1, � 6 op niet langer dan 10�lo sek. schatten. Hetzelfde geldt voornbsp;een aangeslagen elektronentoestand, die niet met fluorescentie verbonden is. In dezenbsp;djd legt een willekeurig molekuul van de soort A, dat drager is van de reaktie�nergie,nbsp;l�etzij als trillings- hetzij als elektronenenergie, in de oplossing een weg af van de ordenbsp;van 10�6 cm, wanneer het met een snelheid beweegt, die overeenkomt met de tempe-ratuurbeweging. We nemen daarbij aan, dat het molekulairgewicht van de orde 200 is.nbsp;De weg, die het molekuul moet afleggen om te botsen met een voor de lichtemissienbsp;verantwoordelijk molekuul B, berekenen we als de vrije weglengte van molekuul Anbsp;in een gas van molekulen B. Nemen we daarbij aan, dat de molekulen bollen zijn metnbsp;6en straal van 3.10�8 cm, terwijl de koncentratie van de molekulen B 5.10�6 grm/cm�nbsp;bedraagt, dan vinden we, dat deze afstand ca. 7.10�6 cm is. Waar de reaktie�nergienbsp;gemiddeld over een weg van ten hoogste 10�6 cm wordt verplaatst, zien we dus, datnbsp;bij deze koncentratie van het emitterend molekuul B hoogstens in 15 % van de gevallennbsp;de reaktie�nergie van A op B kan worden overgedragen.

In werkelijkheid is de waarschijnlijkheid voor overdracht veel geringer dan uit de bovenstaande berekening volgt, daar de weg, die de molekulennbsp;doorlopen zeker niet rechtlijnig is, maar vergelijkbaar met de Brownsenbsp;beweging van een kollo�daal deeltje in een vloeistof. Dat dit over dezenbsp;kleine afstanden reeds het geval is, volgt uit absorptiemetingen aan gassennbsp;Wanneer deze met inerte gassen verdund worden ai). Daarbij blijkt, datnbsp;bet aantal botsingen tussen gelijksoortige molekulen aanzienlijk kleinernbsp;Wordt door de aanwezigheid van het inerte gas.

Of deze vorm van chemoluminescentie, namelijk door overdracht van reaktie�nergie in een bepaald geval geheel voor het lichten aansprakelijknbsp;IS, kan men experimenteel nagaan door de intensiteit van het chemo-luminescentielicht te meten als funktie van de koncentratie van denbsp;chemoluminescente stof. Bij kleine koncentraties zal de intensiteit ongeveer evenredig zijn met het kwadraat ervan, daar zowel de reaktie-snelheid als de waarschijnlijkheid voor een botsing evenredig zullen zijnnbsp;niet de koncentratie. We onderstellen daarbij, dat de overdracht geschiedtnbsp;aan een molekuul van de chemoluminescente stof of aan een daaruitnbsp;Qevormd molekuul.

Daarnaast is het zeer goed denkbaar, dat dit proces als nevenverschijnsel optreedt bij chemoluminescente reakties van het type A als

in � 2 werd beschreven. De levensduur van de drager der reaktie�nergie, het chemoluminescente molekuul, is in dat geval langer (10�^ a 10�� sek.)nbsp;en daardoor is de waarschijnlijkheid voor chemofluorescentie door overdracht groter. In dit verband zullen we er in hoofdstuk IV nog opnbsp;terugkomen.

In de gasphase treedt blijkbaar een direkte overdracht van trillings-energie bij de reaktie tussen natrium en chloor wel in belangrijke mate op. Men moet dit hieraan wijten, dat de trillingsenergie in dat gevalnbsp;alleen overgedragen wordt aan reaktiepartners en niet, zoals in eennbsp;vloeistof het geval is, bijna uitsluitend aan indifferente molekulen vannbsp;de oplossing. Bij kleurstofadsorbaten zijn de omstandigheden eveneensnbsp;geheel anders: het geoxydeerde molekuul en het luminescerende kleurstof-molekuul bevinden zich in elkanders direkte nabijheid.

Voorbeelden van deze vorm van chemoluminescentie in oplossingen zijn er niet bekend. \Vel worden er in de literatuur enkele gevallen vermeld. Deze berusten echter ten dele op een geheel ander verschijnsel,nbsp;dat we chemofluorescentie door absorptie zullen noemen. Dit procesnbsp;treedt op, wanneer het chemoluminescentielicht van een bepaalde reaktienbsp;door een in de vloeistof voorkomende fluorescente stof wordt geabsorbeerd en in diens fluorescentielicht wordt omgezet. Een voorbeeld hiervan treffen we aan in hoofdstuk IV.

Volgens Tamamushi�^) en Schales�^) zou er, op direkte energieoverdracht berustende, chemofluorescentie optreden bij de chemoluminescentie van 3-aminophtaalzuurhydrazide bij aanwezigheid van eennbsp;fluorescerende kleurstof, bv. fluoresce�ne. Men neemt in dat geval waar,nbsp;dat het blauwe licht van de chemoluminescente reaktie van 3-aminonbsp;overgaat in het groene fluorescentielicht van fluoresce�ne. Dit wordtnbsp;toegeschreven aan een direkte overdracht van de elektronenenergienbsp;van het aangeslagen oxydatieprodukt van 3-amino op het fluorescerendenbsp;molekuul.

Het is echter ook mogelijk het waargenomen verschijnsel op de volgende wijze te verklaren:

Bij de door Tamamushi en Schales gebruikte koncentraties aan fluoresce�ne wordt in het absorptiegebied van fluoresce�ne alle doornbsp;3-amino uitgezonden licht geabsorbeerd en daarbij grotendeels omgezetnbsp;in fluorescentielicht van fluoresce�ne. Van het chemoluminescentielichtnbsp;blijft daardoor alleen het buiten het absorptiegebied van fluoresce�nenbsp;liggende deel over. Doordat het fluorescentiespektrum van fluoresce�nenbsp;direkt aansluit bij het absorptiespektrum, ligt dit deel in hetzelfde golf-lengtegebied als waar fluoresce�ne fluoresceert. De oplossing zendt dusnbsp;in hoofdzaak licht uit van golflengten, die ook in het fluorescentiespektrum van fluoresce�ne voorkomen, waarbij het blauwe deel van hetnbsp;chemoluminescentiespektrum nagenoeg is verdwenen, terwijl het groene

deel is versterkt. De onderlinge ligging der spektra van 3-amino en fluorescdne zijn weergegeven in fig. 8.

Dat de door de ontdekkers der chemofluorescentie gegeven interpretatie onjuist is, blijkt nu hieruit, dat het verschijnsel niet optreedt

wanneer men het 3-amino, bij elektrolyse van de oplossing, aan de anode oxydeert. In dat geval treedt de emissie van het chemolumines-centielicht alleen op in een dun vloeistofhuidje om de anode ¹). Wanneernbsp;men de anode waarneemt als deze zich vlak bij de kuvetwand bevindt,nbsp;kan men op het oog geen kleurverandering waarnemen van de heldernbsp;blauw lichtende anode bij toevoeging van fluoresce�ne aan denbsp;oorspronkelijke oplossing van 3-amino. Wanneer er direkte overdrachtnbsp;van de aanslagenergie van het chemoluminescente molekuul op hetnbsp;fluoresce�nemolekuul plaats had, zou men nu de kleurverandering vannbsp;blauw naar groen ook moeten opmerken.

Neemt men bij aanwezigheid van fluoresce�ne de anode door een dikke laag van de vloeistof waar, dan is de kleur groen tengevolge vannbsp;de absorptie van het blauwe deel van het chemoluminescentielicht. Ernbsp;treedt dus wel absorptie op van het licht door het toegevoegde fluoresce�ne, welke gevolgd wordt door fluorescentie; deze laatste stoort hiernbsp;echter niet, daar ze hoofdzakelijk buiten de lichtende z�ne plaats heeft.nbsp;Bovendien is ze door de plaatselijke emissie van het chemoluminescentielicht veel zwakker dan in het geval van een homogeen lichtende vloeistof,nbsp;waar in een bepaald volumenelement chemoluminescentielicht uit a/lenbsp;delen van de oplossing wordt geabsorbeerd en omgezet in fluorescentie-licht. In hoofdstuk IV zullen we een analoog geval ontmoeten.

Voor bijzonderheden van de elektrolysemethode verwijzen we naar hoofdstuk V, � 3.

A. nbsp;nbsp;nbsp;Fluorescentie. Het emitterend molekuul komt door absorptie vannbsp;licht in de aangeslagen toestand.

B. nbsp;nbsp;nbsp;Direkte chemoluminescent ie. Het emitterend molekuul ontstaat bijnbsp;een chemiese reaktie in aangeslagen toestand en is tussen- of eindproduktnbsp;van de reaktie.

C. nbsp;nbsp;nbsp;Indirekte chemoluminescent ie of chemofluorescentie door overdracht. Het emitterend molekuul is een willekeurig in het reaktiemengselnbsp;voorkomend molekuul en komt in aangeslagen toestand door botsing metnbsp;een reaktieprodukt, dat drager is van reaktie�nergie.

D. nbsp;nbsp;nbsp;Chemofluorescentie door absorptie. De chemoluminescentie verloopt volgens proces B of C. Het chemoluminescentielicht wordt geabsorbeerd door een in het reaktiemengsel aanwezige stof en alsnbsp;fluorescentielicht van deze stof gere�mitteerd.

Tenslotte merken we nog op, dat bij een bepaalde chemoluminescente reaktie de processen B, C en D naast elkaar kunnen optreden.

In de loop van het onderzoek werden zowel absorptie- als emissie-spektra bepaald. De absorptiespektra werden foto�lektries, de emissie-spektra fotografies gemeten.

schematies weergegeven. Monochromaties licht werd verkregen van de lichtbron L met behulp van een kwartsdubbelmonochromator M volgensnbsp;Van Cittert. De relatieve intensiteit van de monochromatiese lichtbundel werd gemeten met behulp van een wisselstroomversterker Vnbsp;Volgens Milatz^*6). Als fotocel werd een Cs-CsO vacuumfotocel innbsp;kwartsballon F gebruikt. Daar de versterker alleen wissellicht met eennbsp;periode van 50 per sek. meet, was voor de monochromator een Saja-synchroonmotor S geplaatst waarop een schijf met 30 openingen wasnbsp;aangebracht. Bij een toerental van 100 per minuut wordt het licht dannbsp;juist 50 keer per sek. onderbroken.

Als lichtbron in het ultraviolet diende een Philips hogedrukkwiklamp HP 300, 75 Watt zonder glasballon en zo nodig de anode van eennbsp;koolboog in lucht. In het zichtbare golflengtegebied en het nabije ultra-

violet tot 3400 A werd een 12 Volts autolamp je gebruikt. Het door de monochromator doorgelaten golflengtegebied bij gebruik van de koolboognbsp;bedroeg 10 A, bij gebruik van het autolampje 20 A.

De absorptiemeting geschiedde achter de monochromator, waarbij achtereenvolgens een kuvet met de te meten oplossing en eenzelfde kuvetnbsp;met oplosmiddel in de lichtbundel werd gebracht op de plaats, waar denbsp;kwartslens K2 een afbeelding geeft van het in de monochromator aangebrachte diafragma D. De kuvetten bestonden uit dikwandige cilindriesenbsp;glazen buizen, die afgesloten werden door kwartsplaatjes tegen de vlakkenbsp;uiteinden te klemmen.

De intensiteit I van de lichtbundel, zoals deze door de uitslag van de galvanometer, die met de versterker verbonden is, wordt gegeven, werdnbsp;direkt als logarithme afgelezen, zodat het verschil van de twee aflezingen,

In de figuren is de absorptieko�ffici�nt (i uitgezet, in cm^/grm, gedefinieerd door de betrekking:

= doorlating van de oplossing van koncentratie c en laagdikte d voor een evenwijdige monochromatiese lichtbundel.

De nauwkeurigheid, waarmede de absorptieko�ffici�nt op deze wijze werd bepaald, bedraagt 1 a 2 %.

Bij de fotografiese intensiteitsmeting ter bepaling der emissiespektra werd gebruik gemaakt van een klein type glasspektrograaf merk Fuess,nbsp;met uittredeopening f/9. Bij de latere opnamen van zeer zwakke chemo-luminescente reakties en van de emissiespektra van schimmels en licht-bakteri�n werd de fotografiese lichtsterkte van deze spektrograaf nognbsp;circa vier keer vergroot door het spektrum twee keer verkleind af tenbsp;beelden.

Het lichtend objekt, waarvan de spektrale verdeling moest worden bepaald, werd met behulp van een achromatiese lens afgebeeld op denbsp;spleet van de spektrograaf. Als regel werd een trapspleet gebruikt metnbsp;enkele treden van verschillende breedte, zodat meerdere spektra gelijktijdig werden opgenomen en de nauwkeurigheid door middelen konnbsp;worden vergroot. De zwartingsmerken werden opgenomen door hetnbsp;lichtend objekt te vervangen door een met magnesiumoxyd gewit vlak,nbsp;verlicht door een geijkte wolfraambandlamp of door een 12 Volt�nbsp;20 Watt autolampje, dat met behulp van deze bandlamp geijkt was.nbsp;Door voor de spleet van de spektrograaf een Schott-filter BG 23, 2 mm

te plaatsen werd bereikt, dat het rode deel van het spektrum van de bandlamp werd verzwakt en de zwarting in het spektrum gelijkmatiger was.

Voor de zwartingsmerken werd steeds eenzelfde trapspleet gebruikt met zes treden, vari�rend tussen 0,02 en 0,30 mm. Daardoor was hetnbsp;mogelijk een volledig stel zwartingsmerken te verkrijgen met behulp vannbsp;slechts twee of drie belichtingen bij verschillende stroomsterkten van denbsp;bandlamp. Het gelijktijdig opnemen van meerdere zwartingsmerken wasnbsp;vooral in ons geval de meest aangewezen weg daar de belichtingstijdennbsp;vaak zeer lang waren. Voor de zwartingsmerken en voor de opnamenbsp;mogen deze niet te veel uiteenlopen. In ons geval verschilden de belichtingstijden hoogstens een faktor drie.

De golflengte in de gefotografeerde kontinue spektra werd vastgelegd door twee heliumlijnen op het spektrum te superponeren. Hiervoornbsp;werden de 6678 A en de 3889 A-lijn gebruikt, die met behulp van geschikte filters (Schott, RG 1, 2 mm resp. UG 1, 2 mm) uit het lichtnbsp;van een heliumontladingsbuisje werden ge�soleerd.

2�. [otogra[ies, met behulp van een serie opnamen van de trapspleet bij verschillende stroomsterkten van de bandlamp;

3�. [oto�lektries, door de doorlating der spleten te meten wanneer de homogeen verlichte eindspleet van de monochromator met een lensnbsp;afgebeeld werd loodrecht op de lengterichting van de trapspleet.

Tussen het voorwerp en de lens, die de afbeelding op de spleet van de spektograaf verzorgt, was steeds een diafragma geplaatst. De plaatsnbsp;van dit diafragma werd zodanig bepaald, dat het beeld, dat door de lensnbsp;en door de kollimatorlens van de spektrograaf van het diafragma gevormdnbsp;wordt, in het midden van de spektrograaf lag. De grootte van het diafragma werd zo gekozen, dat de lichtbundel in de spektrograaf niet verdernbsp;gediafragmeerd werd door prisma en lenzen. Hierdoor wordt bereikt,nbsp;dat bij een maximale opening van de lichtbundel het in de spektrograafnbsp;optredende valse licht tot een minimum beperkt wordt, daar geen onregelmatige reflektie aan de lensranden kan plaats vinden. Tevens is dezenbsp;wijze van diafragmeren voor punten op verschillende hoogte van denbsp;voorspleet dezelfde en zijn de intensiteiten in de zes treden van hetnbsp;zwartingsmerk daardoor evenredig met de spleetbreedten.

Als fotografiese plaat werd steeds Agfa Isopan Super Special gebruikt, welke over het golflengtegebied van 3800�6500 A een vrij gelijkmatige en grote gevoeligheid bezit, zodat steeds het emissiespektrum in dit gebied in ��n opname kon worden bepaald. Boven 6500 A daalt denbsp;gevoeligheid van de fotografiese plaat snel tot nul, terwijl beneden 3800 A

het licht door de glasdelen van de spektrograaf te sterk wordt geabsorbeerd om gemeten te kunnen worden. Voorts werden de platen steeds met rood licht voorbelicht tot een zwarting van ca. 6 %. Voor zwartingennbsp;van 20 % wordt de gevoeligheid daardoor nog ruim twee keer vergroot.

Voor het opnemen van fluorescentiespektra werd de oplossing in een rechthoekig kuvet gebracht. Het licht, dat de fluorescentie opwekt, werdnbsp;ingestraald in een richting loodrecht op de richting van waarneming. Alsnbsp;lichtbron werd een Philips hogedrukkwiklamp, HPW 500, 120 Wattnbsp;gebruikt met nikkeloxyd glasballon en tussengeplaatst Schott-filter UG 1,nbsp;2 mm. Het ingestraalde licht bestaat zodoende hoofdzakelijk uit hetnbsp;kwiktriplet 3650�3663 A, enkele procenten van de 3342 A-lijn en eennbsp;zwak kontinuum met banden beneden 3850 A.

Het uitwerken van de fotografiese opname geschiedde op de gebruikelijke wijze door fotometreren der spektra met behulp van een micro-fotometer volgens Moll en het bepalen van het verband tussen zwarting en intensiteit bij bepaalde golflengten met behulp van denbsp;zwarting en de intensiteit in de zwartingsmerken bij deze golflengten.nbsp;De intensiteit is bekend uit de ijking van de bandlamp en van de trap-spleet, de zwarting uit het fotogram. Met behulp van de op deze wijzenbsp;voor elke golflengte verkregen zwartingskrommen kunnen de zwartingennbsp;in de te meten spektra in relatieve intensiteiten worden omgezet.

De spektrale verdeling E(X) van het uit een absorberende laag van dikte d tredende licht wordt gegeven door:

laag van de absorberende stof voor een evenwijdige lichtbundel van golflengte X.

De gemeten verdeling E(X) wordt dus op absorptie gekorrigeerd door te vermenigvuldigen met de faktor e�

In een richting loodrecht op de laag wordt de intensiteit van het uittredende licht gegeven door:

(2)

de doorlating voorstelt van de betreffende laag van dikte d voor een evenwijdige monochromatiese lichtbundel van golflengte X.

Wanneer de absorptie en eventueel ook de emissie met de tijd veranderen, moeten we voor (4) schrijven:

Waarbij we onderstellen, dat de spektrale verdeling der primaire emissie ]{X) niet met de tijd verandert, wel de intensiteit. Dit wordt tot uitdrukking gebracht door de faktor F{t).

Hierin stelt het linkerlid de gemeten spektrale energieverdeling voor, ]{X) de primaire emissie. De faktor voor absorptiekorrektie krijgt dus denbsp;gedaante;

A(X,t) � omgekeerde van de korrektiefaktor als funktie van de tijd. De korrektiefaktor kan in een bepaald geval numeriek berekendnbsp;Worden, wanneer de absorptie en de emissie als funktie van de tijdnbsp;bekend zijn.

Dimethyldiacridyliumnitraat ¹) is een gele stof, die met een eveneens gele kleur in water oplost. Daarbij doet ze door een sterke groenenbsp;fluorescentie veel denken aan fluoresce�ne. De fluorescentie verdwijntnbsp;voor een deel, wanneer men de oplossing alkalies maakt, bijv. met eennbsp;kleine hoeveelheid kaliumhydroxydoplossing. Voegt men nu wat water-stofperoxyd toe, dan gaat de gehele oplossing sterk groen lichten. Vooralnbsp;wanneer men de koncentratie aan ,,dimethyl� niet te klein neemtnbsp;(ca 1 mg/cm3) is deze chemoluminescentie een buitengewoon indrukwekkend gezicht.

In alkalies milieu is ,,dimethyl� bij aanwezigheid van zuurstof instabiel. Dit komt doordat de chemoluminescente reaktie ook reeds zonder peroxydnbsp;verloopt: de alkaliese oplossing licht bij kamertemperatuur zwak. Bovendien treedt er in het daglicht een ontleding op van de alkaliese oplossingnbsp;(fotolyse), die waarschijnlijk zonder lichtemissie verloopt. Er vormt zichnbsp;daarbij een bruin neerslag, dat hoofdzakelijk uit methylacridon blijkt tenbsp;bestaan. Bij de chemoluminescente reaktie vormt zich deze zelfde stofnbsp;met een opbrengst van ca 10 %. De chemiese formules van dimethyldiacridyliumnitraat en methylacridon zijn hieronder weergegeven.

In het volgende zullen we dit vaak afkorten tot �dimethylquot;. De bij sommige schrijvers voorkomende benaming lucigenine gebruiken we niet.

Bij temperaturen van 60� tot 100� C vertoont de chemoluminescentie een geheel ander beeld: Een alkaliese oplossing van �dimethyl� van eennbsp;voldoend lage koncentratie (ca 0.1 mg/cm^) licht bij aanwezigheid vannbsp;peroxyd bij kamertemperatuur zwak groenblauw. Verwarmt men dezenbsp;oplossing in een reageerbuis boven de vlam, dan ziet men op de verwarmde plaatsen helder blauwe slierten ontstaan. Zodra de gehele vloeistof verwarmd is, licht ze gedurende korte tijd zeer intensief hemelsblauw.nbsp;De kleur van deze chemoluminescentie verschilt zo opvallend van dienbsp;bij lage temperatuur, dat men zich moeilijk anders kan voorstellen, dannbsp;dat men met twee geheel verschillende luminescentieverschijnselen tenbsp;maken heeft. Dit zal ook inderdaad het geval blijken te zijn. Zoals innbsp;� 3 nader uiteengezet zal worden mag men echter deze gevolgtrekkingnbsp;niet zonder meer maken. Er treden namelijk twee storende processen op,nbsp;die bij lage temperatuur de kleurindruk kunnen vervalsen: zelfabsorptienbsp;en chemofluorescentie door absorptie (zie blz. 24). De intensiteit van hetnbsp;licht bij lage temperatuur en bij z� lage koncentraties, dat deze storendenbsp;verschijnselen geen rol meer spelen, is te gering om de kleur te kunnennbsp;waarnemen. We kunnen daarom dit probleem alleen oplossen door denbsp;spektrale verdeling van het chemoluminescentielicht te bepalen. Dit wordtnbsp;in � 4 beschreven.

Verwarmt men de met zuurstof verzadigde alkaliese oplossing zonder dat men er peroxyd aan toevoegt, dan treedt het kortdurende blauwenbsp;lichten eveneens op. De intensiteit is echter veel geringer. Maakt mennbsp;de oplossing bovendien zuurstofvrij, dan licht ze bij verwarmen niet. Hetnbsp;,,dimethyl� wordt dan tengevolge van de hoge temperatuur echter welnbsp;vernietigd, zoals blijkt bij toevoegen van peroxyd aan de afgekoeldenbsp;oplossing: Het blauwgroene lichten blijft achterwege. Behalve denbsp;chemoluminescente reaktie treedt dus bij hoge temperatuur ook een snelnbsp;verlopende donkere nevenreaktie op.

In � 2 en � 3 zullen we eerst de fluorescentie- en absorptieeigenschap-pen van ,,dimethyl� en van het reaktiemengsel behandelen, daar we deze in � 4 bij de bepaling en de bespreking van het chemoluminescentie-spektrum nodig zullen hebben.

� 2. Fluorescentie- eii absorptieeigenschappen van dimethyldiacridylium-nitraat.

In fig. 10 is het absorptie- en het fluorescentiespektrum van een neutrale oplossing van dimethyldiacridyliumnitraat weergegeven, uitgezet tegennbsp;de golflengte. Het absorptiespektrum is voor X gt; 3900 A opgebouwd uitnbsp;drie banden, resp. bij 4550 A, 4320 A en 4100 A. In het fluorescentiespektrum kan men nog slechts twee banden onderscheiden, resp. bijnbsp;4800 A en 5100 A.

Om na te gaan in hoeverre er aan de wet der spiegelsymmetrie is voldaan, zijn de spektra in fig. 11 uitgezet tegen het golfgetal voor

het golflengtegebied boven 3800 A. De intensiteit in het fluorescentie-spektrum is in quanten per sek. uitgedrukt.

Wanneer men de absorptiekromme en de gespiegelde fluorescentie-kromme vergelijkt, krijgt men de indruk, dat mogelijk ook het fluorescentiespektrum opgebouwd is uit drie banden, die in sterker matenbsp;verbreed zijn dan in het absorptiespektrum het geval is. Hierdoor is denbsp;derde verdwenen en liggen de banden in het fluorescentiespektrum dichternbsp;bij elkaar dan in het absorptiespektrum. Dit laatste kan misschien terug-gebracht worden tot het algemene verschijnsel, dat de afstand tussennbsp;de maxima van twee deelbanden kleiner wordt naarmate de verbredingnbsp;toeneemt.

Met niet te veel moeite kan men aan fig. 11 de wet der spiegel-symmetrie herkennen, zij het ook dat er slechts kwalitatief aan is voldaan. Hierdoor is het mogelijk het absorptiespektrum enigermate tenbsp;analyseren (zie blz. 16). Het absorptiegebied boven 3900 A korrespon-deert met ��n elektronenovergang: dezelfde als bij de fluorescentie plaatsnbsp;heeft. Het gebied tussen 3000 en 3900 A moet aan een tweede elektronenovergang worden toegeschreven, daar deze absorptie niet in het fluores-centiespektrum wordt weerspiegeld.

We vragen ons nu af wat de aard is van de elektronenovergang, die �et de fluorescentie is verbonden. Daartoe vergelijken we in fig. 12nbsp;het absorptiespektrum van dimethyldiacridyliumnitraat met het doornbsp;Radulescu^'^) bepaalde spektrum van het acridine-ion: De overeenkomst in bouw der spektra is zeer duidelijk. We moeten hieruit besluiten.

Zoals we in hoofdstuk I, � 7 reeds zagen wordt in vele gevallen de fluorescentie ook opgewekt in de absorptiebanden, die met overgangen naar hogernbsp;elektronentoestanden overeenkomen; dit is voor �dimethyl� eveneens het geval. Isnbsp;daarbij het fluorescentierendement afhankelijk van de elektronenovergang, dan kannbsp;aten met behulp van het rendement een analyse van het absorptiespektrum doorvoeren.nbsp;Is daarentegen het rendement konstant (zie bijv. hoofdstuk V, � 10), dan vervaltnbsp;deze mogelijkheid. De analyse met behulp van de spiegelsymmetrie in fluorescentie-absorptiespektrum kan men dan nog wel toepassen.

dat de absorptie van het dimethyldiacridyliumion, zoals dat in de neutrale oplossing van het nitraat voorkomt, teruggebracht moet worden op denbsp;absorptie van het halve ion. Behoudens de methylgroep is dit identieknbsp;met het acridine-ion, zoals uit de hieronder weergegeven formules blijkt.

De verschuiving naar langer golflengte van het absorptiespektrum van het �dimethyl�ion ten opzichte van dat van het acridine-ion, moet wordennbsp;toegeschreven aan de C-C binding tussen de twee molekuulhelften vannbsp;�dimethyl� en aan de substitutie der methylgroepen.

In dezelfde figuur is ook het absorptiespektrum van acridine weergegeven, dat niet als ion maar als neutraal molekuul in de oplossing aanwezig is. Het absorptiespektrum hiervan verschilt belangrijk van dat van het ion. Het vertoont daarentegennbsp;veel overeenkomst met het absorptiespektrum van anthraceen (zie fig. 1).

Het absorptiegebied boven 3000 A komt bij acridine en anthraceen overeen met slechts ��n elektronenovergang, zoals uit het fluorescentiespektrum blijkt.

Het verschil tussen acridine en het acridine-ion is gelegen in de positieve lading van de laatste. Deze kan zich zowel bij de N bevinden als bij de C:

Deze beide vormen maken deel uit van de grondtoestand van het molekuul. Een dergelijke struktuur treedt bij acridine niet op. Dit molekuul is wat zijn elektronensysteem betreft geheel gelijkwaardig aan anthraceen.

Men moet zich ons inziens voorstellen, dat de hierboven besproken elektronen-overgangen, die aanleiding geven tot absorptie in het golflengtegebied boven 3000 A, overgangen zijn in het elektronensysteem van de driering als geheel. Voor anthraceennbsp;kon men dit langs quantenmechaniese weg aantonen^).

Voor dimethyldiacridyliumnitraat werd nagegaan of het fluorescentie-spektrum onafhankelijk was van de golflengte van het ingestraalde licht en wel voor de golflengten 2534 A, 3650�3663 A en 4356 A. Dezenbsp;Werden met behulp van een kleine kwartsspektrograaf uit het licht vannbsp;een hogedrukkwiklamp ge�soleerd. De drie fluorescentiespektra blekennbsp;binnen de nauwkeurigheid der fotografiese intensiteitsmeting volkomennbsp;identiek te zijn. We hebben hier dus te maken met het op blz. 18 besproken geval, dat de aanslag naar een hoger elektronenniveau gevolgdnbsp;Wordt door een stralingsloze overgang naar het lager liggende elektronenniveau van waaruit de fluorescentie plaats heeft. Daar het fluorescentie-rendement bij de drie golflengten van het ingestraalde licht niet werdnbsp;gemeten, kunnen we niet zeggen of dit proces een waarschijnlijkheidnbsp;Van 100 % bezit of dat de aanslagenergie ook op andere wijze kannbsp;verdwijnen, bijvoorbeeld door een stralingsloze overgang direkt naar denbsp;grondtoestand.

Het absorptiespektrum van de alkaliese en van de zure oplossing valt geheel samen met dat van de neutrale. Naar alle waarschijnlijkheidnbsp;geldt dit ook voor het f/uorescentiespektrum. Met het oog beoordeeldnbsp;hangt de kleur van het fluorescentielicht nl. niet af van de pn der oplossing (verg. ook de noot onder aan blz. 39). Zoals we reeds in � 1nbsp;vermeldden, is de �uorescentieintensiteit van de alkaliese oplossing evenwel aanzienlijk geringer dan die van de neutrale nl. ca zes keer zwakker,nbsp;terwijl er gelijktijdig fotolyse optreedt. Het is niet uitgesloten, dat hetnbsp;lage rendement der fluorescentie in de alkaliese oplossing veroorzaaktnbsp;Wordt doordat de fluorescentie en de ontleding van het aangeslagennbsp;molekuul konkurrerende processen zijn.

In neutrale en zure oplossing is het het ,,dimethyl�ion, dat absorbeert en fluoresceert. In alkaliese oplossing neemt men als regel aan, dat hetnbsp;molekuul als carbinolbase aanwezig is (zie blz. 32). Dit zou betekenen,nbsp;dat ion en carbinolbase dezelfde optiese eigenschappen zouden bezitten.nbsp;Gezien de verschillende elektronenkonfiguratie komt ons dit vreemd voor.nbsp;In hoeverre de gemaakte gevolgtrekking dan ook juist is, durven wenbsp;niet te zeggen.

� 3. Fluorescentie- en absorptieeigenschappen van methylacridon en van het reaktiemengsel.

In fig. 13 is het absorptie- en fluorescentiespektrum van methylacridon Weergegeven, dat als eindprodukt bij de chemoluminescente reaktie op-

treedt en bij de ontleding van de alkaliese oplossing van ,,dimethylquot; onder invloed van licht ontstaat. In fig. 14 zien we, dat een toetsingnbsp;van de wet der spiegelsymmetrie het verrassende resultaat levert, dat denbsp;symmetrie bijna volmaakt is. De relatieve hoogte van de twee hoofdmaxima is iets verschillend. Verder is in beide spektra bij ca 26800 cm�inbsp;een uitbochting aanwezig, die wijst op de aanwezigheid van nog ��n ofnbsp;meer trillingsbanden.

Het tweetoppig absorptiegebied in het nabije ultraviolet moeten we dus, zoals uit het fluorescentiespektrum blijkt, toeschrijven aan ��nnbsp;elektronenovergang. Beneden 3400 A begint er een absorptie op te treden,nbsp;die aan een elektronenovergang naar een hoger niveau moet wordennbsp;toegeschreven.

Om na te gaan welke fluorescerende stoffen in het reaktiemengsel voorkomen, werd het fluorescentiespektrum op genomen tijdens en nanbsp;de reaktie. De reaktie werd uitgevoerd met een oplossing, waarin denbsp;koncentratie aan ,,dimethyl� 8 y/cm^ bedroeg, aan KOH 0.024 n., aannbsp;H2O2 0.04 %. Veertig minuten na menging was de intensiteit dernbsp;chemoluminescentie ongeveer op de halve beginwaarde gekomen en werdnbsp;de oplossing gedurende vijf minuten voor de spektrograaf geplaatst ennbsp;met de kwiklamp bestraald. Dit werd twaalf keer met verschillende oplossingen herhaald. De absorptie werd aan het begin en aan het eindnbsp;Van de vijf minuten gemeten en veranderde in die tijd slechts weinig.nbsp;De absorptiekorrektie van het fluorescentiespektrum werd aangebrachtnbsp;met behulp van de gemiddelde waarde van de gemeten absorptie. Hetnbsp;feit, dat de oplossing tijdens de opname ook chemoluminescentielichtnbsp;uitzendt, stoorde hier niet, daar de intensiteit ervan niet meer dan 1 %nbsp;Van de fluorescentieintensiteit bedroeg.

Het fluorescentiespektrum van de oplossing, zestien uur na het begin der reaktie, werd eveneens opgenomen en bleek identiek te zijn met datnbsp;van methylacridon. Het fluorescentiespektrum van de oplossing tijdensnbsp;de reaktie bleek een lineaire kombinatie te zijn van de spektra vannbsp;dimethyldiacridyliumnitraat en methylacridon.

Hieruit volgt, dat in het reaktiemengsel alleen het �dimethyl� zelf en het gevormde methylacridon in merkbare mate fluoresceren¹).

Bij hoge koncentraties van ,,dimethyl� in het reaktiemengsel (ca 1 mg/ cm3) is de kleur van het chemoluminescentielicht helder groen. Naarmatenbsp;men de koncentratie verlaagt, wordt ze meer blauwgroen. Bij een zo lagenbsp;koncentratie, dat men nog juist de kleur kan waarnemen is deze eerdernbsp;blauw dan groen. Ten dele kan dit berusten op het P u r k i n j e-effekt;nbsp;bij kleine intensiteiten wordt het oog voor blauw licht relatief gevoeliger.nbsp;Grotendeels moet de waargenomen kleurverandering echter ons inziensnbsp;Worden toegeschreven aan de twee in � 1 genoemde storende effekten,nbsp;namelijk:

1�. zelfabsorptie van het uitgezonden licht door het in de oplossing aanwezige ,,dimethyl� voor golflengten beneden 4800 A;

2�. chemofluorescentie door absorptie, waarbij het geabsorbeerde chemoluminescentielicht omgezet wordt in fluorescentielicht vannbsp;�dimethyl�.

Er is hier stilzwijgend aangenomen, dat het fluorescentiespektrum van �dimethyl� in alkaliese oplossing identiek is met het spektrum van de neutrale oplossing. Opnbsp;blz. 37 hadden we reeds een aanwijzing voor de identiteit, terwijl het hier gevondennbsp;resultaat er een bevestiging van geeft.

uitgezonden licht kan men voldoende nauwkeurig op zelfabsorptie korrigeren en zodoende het eerste storende effekt uitschakelen¹). Hetnbsp;zo bepaalde spektrum is het somspektrum van het per volumeneenheidnbsp;uitgezonden chemoluminescentie- en fluorescentielicht. We gaan nu nanbsp;in welke verhouding deze komponenten in het op absorptie gekorrigeerdenbsp;spektrum aanwezig zijn:

We denken ons de gehele ruimte gevuld met een vloeistof die homogeen licht uitzendt van golflengte X. De vloeistof absorbeert het licht van deze golflengte eveneens, zodat alle primair uitgezonden licht weernbsp;door de vloeistof wordt geabsorbeerd. De hoeveelheid licht, die pernbsp;volumeneenheid wordt geabsorbeerd is in dit geval gelijk aan de hoeveelheid, die per volumeneenheid wordt uitgezonden. In een vloeistofnbsp;echter, die zich in een vat van bepaalde afmetingen bevindt, is denbsp;absorptie per volumeneenheid kleiner dan de primaire emissie.

In ons geval wordt een geheel spektrum uitgezonden, waarvan alleen het licht van golflengten beneden 4800 A door het in de oplossing aanwezige ,,dimethyl� wordt geabsorbeerd. Zoals uit het chemoluminescentie-spektrum in fig. 15 zal blijken, wordt daardoor hoogstens de helft vannbsp;het aantal uitgezonden quanten geabsorbeerd. Verder zagen we in � 2,nbsp;dat het fluorescentierendement van de alkaliese oplossing van ,,dimethyl�nbsp;ongeveer 15 % bedraagt van het rendement van de neutrale oplossing.nbsp;Als bovenste grens voor het fluorescentierendement kunnen we dus 15 %nbsp;opgeven. Het aantal quanten, dat per volumeneenheid als fluorescentielicht wordt uitgezonden, bedraagt daardoor maximaal 8 % van het aantalnbsp;quanten, dat als chemoluminescentielicht wordt uitgezonden²).

Het fluorescentielicht van �dimethyl� ondergaat in de oplossing prakties geen absorptie en geeft daardoor geen aanleiding tot verderenbsp;fluorescentieprocessen, waarmee men eventueel rekening zou moetennbsp;houden. Ook treedt er geen fluorescentie op van het in het reaktie-mengsel gevormde methylacridon, daar deze stof niet absorbeert in hetnbsp;golflengtegebied, waarin het chemoluminescentielicht wordt uitgezonden.

Uit het voorgaande blijkt, dat tengevolge van het lage rendement der fluorescentie van ,,dimethyl� in alkalies milieu de chemofluorescentie doornbsp;absorptie, slechts een ondergeschikte rol kan spelen.

Bij het aanbrengen der absorptiekorrektie volgens hoofdstuk III � 3 nemen we aan, dat de emissie homogeen is. Hieraan is niet geheel voldaan, wanneer er chemofluorescentie door absorptie optreedt. De per volumeneenheid geabsorbeerde energienbsp;en dus ook de per volumeneenheid als fluorescentielicht uitgezonden energie is namelijknbsp;afhankelijk van d� plaats in het kuvet en van de vorm ervan. Dit is echter eennbsp;tweede-orde effekt en kan als regel verwaarloosd worden.

Door een geschikte keuze van de vorm van het reaktievat en de koncentratie van �dimethyl� kan men het effekt nog aanzienlijk kleiner maken dan met de hierbovennbsp;weergegeven maximale waarde overeenkomt: geen der afmetingen van het vat moetnbsp;groter zijn dan nodig is, terwijl de koncentratie zo laag mogelijk gehouden moet worden.

Behalve chemofluorescentie door absorptie, bestaat de mogelijkheid van chemofluorescentie door overdracht der reaktie�nergie aan eennbsp;fluorescerend molekuul van de oplossing. Dat dit niet in merkbare matenbsp;optreedt, volgt uit de koncentratie-afhankelijkheid van de lichtintensiteit.nbsp;Deze is niet kwadraties, zoals bij de indirekte chemoluminescentie hetnbsp;geval is (zie blz. 23), maar lineair.

Hieruit volgt, dat we te maken hebben met een direkte chemoluminescentie, waarbij het emitterend molekuul reaktieproduct is en in aangeslagen toestand ontstaat.

We geven nu de wijze van opnemen van het chemoluminescentie-spektrum en het resultaat ervan kort weer:

De reaktie werd uitgevoerd in een laagdikte van 8 mm bij een koncentratie aan �dimethyl� van 0.15 mg/cm^, in 0.12 n KOH ennbsp;0.2 % H2O2. Het kuvet werd 20 sek. na menging gedurende 7 min.nbsp;voor de spektrograaf geplaatst, in welke tijd'de chemoluminescentie-intensiteit tot ongeveer de halve beginwaarde daalde. De reaktie werdnbsp;150 keer herhaald zodat de opname zich over bijna 20 uur uitstrekte.

Het aanbrengen der absorptiekorrektie geschiedde volgens de in hoofdstuk III � 3 onder C beschreven methode (blz. 31), waarvoor de intensiteit en de absorptie van de oplossing als funktie van de tijd gemeten werden. Voor A gt; 4300 A neemt de absorptieko�ffici�nt ongeveer evennbsp;snel exponentieel af als de lichtintensiteit. Voor A lt; 4300 A is de afnamenbsp;der absorptie langzamer, waarschijnlijk tengevolge van de vorming vannbsp;andere absorberende stoffen, De korrektiefaktor (blz. 31) bedroeg bijnbsp;4800 A, 1.1.; bij 4700 A, 1,6; bij 4500 A, 2,8 en voor A lt; 4350 A ca 3,3.nbsp;Voor de opname werd een spleetbreedte gebruikt van 0.3 mm. In hetnbsp;spektrum komt dit overeen met een golflengtegebied van 18 A bij 4200 A,nbsp;38 A bij 5000 A en 65 A bij 6000 A.

Het resultaat van twee opnamen is in fig. 15 weergegeven. De nauwkeurigheid van dit spektrum is geringer dan men onder gunstige omstandigheden met de fotografiese intensiteitsmeting kan bereiken. De oorzaak hiervan is gelegen in de vrij grote absorptiekorrektie en in hetnbsp;feit dat het opgenomen spektrum vrij zwak was.

Bij het beoordelen van het spektrum moeten we er volgens het voorgaande mee rekening houden, dat het een somspektrum is van hetnbsp;eigenlijke chemoluminescentielicht en het na absorptie uitgezondennbsp;fluorescentielicht van ,,dimethyl�. De totale intensiteit van dit fluores-centielicht schatten we op hoogstens 4 % ¹) van die van het chemoluminescentielicht en kunnen we in eerste benadering verwaarlozen.

� 5. Het bestaan van twee chemoluminescente processen bij de oxydatie van �dimethyl�.

Zoals uit het gemeten chemoluminescentiespektrum bij lage temperatuur blijkt, is er nog een belangrijke emissie in het blauwe deel van hetnbsp;spektrum. De kleur van het licht zou groenblauw zijn wanneer er geennbsp;absorptie optrad. Ze verschilt dientengevolge van de kleur der chemo-luminescentie bij hoge temperatuur, die zeer bepaald blauw is.

V/e moeten hieruit besluiten, dat er tenminste twee verschillende chemoluminescente processen mogelijk zijn.

Een tweede aanwijzing hiervoor vinden we in de literatuur bij G 1 e u en Schaarschmidt^�), die o.a. de chemoluminescentie vannbsp;dip/ieny/diacridyliumnitraat onderzochten. Ze namen daarbij het volgendenbsp;waar: Bij lage koncentraties aan ,,diphenyl� en peroxyd is de kleur dernbsp;chemoluminescentie helder blauw. Laat men in een dergelijke blauwnbsp;lichtende oplossing een druppel gekoncentreerd waterstofperoxyd vallen,nbsp;dan krijgt men op die plaats een intensieve groene luminescentie. Hiernbsp;hangt het blijkbaar van de peroxydkoncentratie af welke van de reaktiesnbsp;de meest waarschijnlijke is.

In verband met het voorgaande heeft het zin te trachten een analyse van het in fig. 15 weergegeven spektrum te geven, daar het zeer goednbsp;mogelijk is, dat dit spektrum een superpositie is van de chemolumines-centiespektra van twee verschillende reakties.

Het blijkt nu, dat voor A gt;5100 A de spektrale verdeling van het door de oplossing bij kamertemperatuur uitgezonden licht dezelfde gedaante heeft als het fluorescentiespektrum van ,,dimethyl�. Trekt mennbsp;dit van het gemeten spektrum af, dan houdt men een spektrum over, datnbsp;in fig. 15 als de �blauwe komponent� is aangegeven. Dit vertoont zekere

We nemen daarbij aan, dat het fluorescentierendement van de neutrale oplossing van �dimethyl� niet 100% maar 50% bedraagt. Een fluorescentierendement van bijnanbsp;100 % heeft men namelijk alleen nog waargenomen in zeer visceuze oplosmiddelen^^).nbsp;In waterig milieu is ze als regel kleiner.

overeenkomst met het fluorescentiespektrum van methylacridon, maar ligt ca. 50 A meer naar het rood. Vergelijk fig. 13 en fig. 15. Hoewelnbsp;het verschil tussen de spektra van deze blauwe komponent en dat vannbsp;de fluorescentie van methylacridon vrij groot is, is het niet uitgesloten,nbsp;dat ze bij een nauwkeuriger bepaling van de spektrale verdeling van hetnbsp;bij de chemoluminescente reaktie uitgezonden licht, identiek zoudennbsp;blijken te zijn.

Wanneer het emissiespektrum bij hoge temperatuur bekend is, zal het mogelijk zijn te zeggen of aan de gegeven analyse de betekenis magnbsp;worden gehecht van een analyse van het spektmm in de spektra dernbsp;alzonderlijke reakties. Het emissiespektrum bij hoge temperatuur moetnbsp;in dat geval uit dezelfde twee komponenten zijn opgebouwd in anderenbsp;intensiteitsverhouding; eventueel kan het identiek zijn met dat van denbsp;blauwe komponent.

In deze gedachtengang voortgaande, moeten we ons dan voorstellen, dat bij de ene chemoluminescente reaktie het ,,dimethyl�molekuul in aangeslagen toestand ontstaat en zijn. fluorescentielicht uitzendt (zie ooknbsp;� 6): bij de andere reaktie een ander molekuul (methylacridon?), datnbsp;de blauwe komponent als fluorescentielicht uitzendt.

Tenslotte merken we naar aanleiding van deze onder groot voorbehoud gegeven analyse nog op, dat de groene komponent van het spektrum �iiet kan worden toegeschreven aan chemofluorescentie door overdrachtnbsp;van reaktie�nergie aan het ,,dimethyl�molekuul, daar we hier te makennbsp;hebben met een direkte chemoluminescentie, zoals we op blz. 41 reedsnbsp;opmerkten naar aanleiding van de lineaire koncentratie-afhankelijkheidnbsp;van de intensiteit van het uitgezonden licht.

We zullen hier kort weergeven, welke reaktiemechanismen men in de loop van de tijd heeft voorgesteld, om na te gaan in hoeverre deze innbsp;overeenstemming zijn met de door ons gevonden feiten.

Volgens Gleu en Petsch^s) komt de reaktie neer op een oxydatie van het �dimethyl� door peroxyd, gevolgd door een reduktie,nbsp;eveneens door peroxyd, waarbij het �dimethylquot; teruggevormd wordt.nbsp;Het ontstaat daarbij in aangeslagen toestand en zendt het fluorescentielicht van ,,dimethyl� uit. Uiteindelijk komt deze reaktie neer op eennbsp;splitsing van waterstofperoxyd in water en zuurstof, waarbij �dimethyl�nbsp;als katalysator optreedt. De energie van het lichtquant zou dus afkomstignbsp;zijn van de ontleding van peroxyd.

Ook door Tamamushi en AkiyamaSOj js een reaktieschema opgesteld, dat in wezen hetzelfde is.

Dat er in het proces een reduktietrap is ingeschakeld zou volgen uit de waarneming, dat men de chemoluminescentie ook te voorschijn kannbsp;roepen bij afwezigheid van peroxyd met een sterk reduktiemiddel en

zuurstof. Men schrijft dit echter ook wel toe aan een intermediaire vorming van peroxyd.

Het reaktieschema volgens Gleu en Petsch verkreeg een grote waarschijnlijkheid toen Eymers en van Schouwenburgnbsp;het chemoluminescentiespektrum van �dimethyl� bepaalden en vonden,nbsp;dat dit identiek was met het fluorescentiespektrum. Daar ze echter metnbsp;een hoge koncentratie aan ,,dimethyl� werkten en geen korrektie aanbrachten voor absorptie moet de identiteit van de door hen bepaaldenbsp;spektra toegeschreven worden aan een prakties volledige absorptie vannbsp;het blauwe deel van het chemoluminescentielicht.

Tot op zekere hoogte is het door ons bepaalde spektrum in tegenspraak met de opvatting, dat bij de chemoluminescente reaktie het �dimethyl�-molekuul aansprakelijk is voor de lichtemissie. Immers, het chemoluminescentiespektrum is niet identiek met het fluorescentiespektrum vannbsp;�dimethyl�� Wanneer het echter blijkt, dat de in de vorige paragraafnbsp;gegeven analyse juist is, en ��n van de chemoluminescente processen eennbsp;spektrum heeft, dat identiek is met het fluorescentiespektrum vannbsp;�dimethyl�, dan kan het voorgestelde reaktiemechanisme voor dit procesnbsp;in ere hersteld worden. Op het ogenblik kan men daar echter nietsnbsp;van zeggen.

Daarnaast bestaat de mogelijkheid, dat we bij lage temperatuur met slechts ��n reaktie te maken hebben. In dat geval zal men het gemetennbsp;spektrum in zijn geheel moeten toeschrijven aan de emissie door eennbsp;bepaald molekuul, waarschijnlijk een tussenprodukt. Vanuit dit standpunt kan men opmerken, dat het ongeanalyseerde chemoluminescentiespektrum, zoals dat in fig. 15 is weergegeven, overeenkomst vertoontnbsp;met het fluorescentiespektrum van ,,dimethyl� in fig. 10 en zeer goednbsp;het emissiespektrum kan zijn van een aan ,,dimethyl� verwant molekuul.nbsp;Het is namelijk opgebouwd uit drie banden, zoals we in � 2 ook voornbsp;het fluorescentiespektrum van ,,dimethyl� vonden. Het chemoluminescentiespektrum ligt als geheel bij korter golflengte dan het fluorescentiespektrum.

Het lijkt ons echter waarschijnlijker, dat bij lage temperatuur twee reakties naast elkaar voorkomen en we dus met een mengspektmm tenbsp;maken hebben.

We komen tenslotte tot de gevolgtrekking, dat verdere spektrale onderzoekingen nodig zijn om over het emitterend molekuul en hetnbsp;reaktiemechanisme definitieve uitspraken te kunnen doen, in het bijzondernbsp;bij hoge temperatuur.

DE CHEMOLUMINESCENTIE DER PHTAALZUUR-HYDRAZIDEN EN VAN PYROMELLIETZUURHYDRAZIDE.

De oxydatie van 3-aminophtaalzuurhydrazide (I), ook wel luminol genoemd, in alkaliese oplossing is een der bekendste chemoluminescentenbsp;reakties. Het uitgezonden licht is zeer sterk en helder blauw van kleur.

Niet alleen het 3-aminophtaalzuurhydrazide is chemoluminescent, maar alle phtaalzuurhydraziden (II) vertonen het verschijnsel der chemo-luminescentie in meer of minder mate. Afhankelijk van de substituenten,nbsp;die men in de benzolring op de plaatsen 3, 4, 5 en 6 invoert, varieert denbsp;kleur van het uitgezonden licht van violet tot blauwgroen. Dit feit maaktnbsp;het aantrekkelijk aan deze groep stoffen de invloed na te gaan van eennbsp;kleine verandering in het molekuul � nl. de substitutie van een bepaaldenbsp;groep in de benzolring � op het chemoluminescentiespektrum. Met ditnbsp;doel werd het spektrale onderzoek van de chemoluminescentie der phtaalzuurhydraziden dan ook opgezet.

In de loop der jaren zijn, in het bijzonder door Drew^i) een betrekkelijk groot aantal derivaten van phtaalzuurhydrazide bereid en werd door enkele onderzoekers de kleur en intensiteit der chemoluminescentienbsp;van deze derivaten vastgesteld 41�44)_ De kleur geeft echter alleen aanwijzingen betreffende de spektrale ligging van het maximum van emissie,nbsp;voor zover er geen storende absorptie optreedt. Van de spektrale energie-

betrekking hebben op 3-aminophtaalzuurhydrazide 40. 45. 46). Van enkele andere derivaten werden ook lotometerkrommen gepubliceerd van gefotografeerde spektra 47. 48). Deze zijn echter voor ons doel van nietnbsp;meer waarde dan de opgave van de kleur van het uitgezonden licht. Hetnbsp;was om deze reden een buitengewoon gelukkige omstandigheid, datnbsp;wij Prof. H. D. K. Drew van Queen Mary College, Londen bereidnbsp;vonden ons kleine hoeveelheden van de door hem bereide en reeds opnbsp;chemoluminescent vermogen onderzochte gesubstitueerde phtaalzuur-hydraziden af te staan. Het is ons een behoefte Prof. Drew ook hiernbsp;ter plaatse onze zeer welgemeende dank te betuigen voor deze voornbsp;ons zo belangrijke medewerking.

Doordat Prof. Dr. J. P. W i b a u t zo vriendelijk was een kleine hoeveelheid mellietzuur af te staan, was bovendien Dr. G. J. M. v a nnbsp;der Kerk in de gelegenheid enig pyromellietzuurhydrazide (III) voornbsp;ons te vervaardigen, waarvan bekend is, dat het eveneens chemoluminescent is met een gele kleur van het uitgezonden licht.

Behalve het chemoluminescentiespektmm, werden van deze elf stoffen ook fluorescentie- en afesorptiespektra opgenomen, met het doel denbsp;invloed der substitutie in de benzolring na te gaan op de ligging dernbsp;energieniveau�s in de bekende uitgangsstof. Door de invloed op hetnbsp;chemoluminescentiespektrum hiermede te vergelijken was het de bedoelingnbsp;iets naders te weten te komen van de aard van het bij de chemo-luminescente reaktie emitterende molekuul.

De meest gebruikelijke wijze om de phtaalzuurhydraziden onder lichtemissie te oxyderen is door aan de alkaliese oplossing van de hydraziden waterstofperoxyd en een sterk oxydatiemiddel, bv. natriumhypochlorietnbsp;toe te voegen. Het oxydatiemiddel kan men ook vervangen door eennbsp;katalysator, d.w.z. een stof, die uit peroxyd zuurstof vrijmaakt, resp. dezenbsp;daarin aktiveert, zoals kaliumferricyanide, koperzouten, haemine ennbsp;peroxydase uit aardappelen. Afhankelijk van de pn der oplossing en denbsp;koncentraties aan peroxyd en oxydatiemiddel of katalysator verkrijgt mennbsp;een korte sterke lichtemissie of een langdurig zwak lichten der oplossing.nbsp;Vooral met haemine en peroxyd verloopt bij 3-aminophtaalzuurhydrazidenbsp;de reaktie onder de emissie van een fraai intensief blauw licht.

Peroxyd speelt steeds een essenti�le rol in zoverre dat naast het oxydatiemiddel of de katalysator de aanwezigheid ervan steeds nodignbsp;is om een sterke lichtemissie te verkrijgen. Peroxyd all��n is echter nietnbsp;voldoende; voegt men geen katalysator of oxydatiemiddel toe, dan lichtnbsp;de alkaliese oplossing van 3-amino met peroxyd slechts zwak. Denbsp;intensiteit van dit licht neemt toe bij verhoging der temperatuur.

De door ons gevolgde methode voor het opnemen der chemolumines-centiespektra werd het eerst beschreven door Harvey 49) en wijkt enigszins van die in homogeen milieu af. Ze bestaat uit het elektrolyserennbsp;van de met KOH alkalies gemaakte oplossing van het hydrazide, waaraannbsp;wel waterstofperoxyd maar geen oxydatiemiddel of katalysator is toe-gevoegd. De aan de anode gevormde atomaire zuurstof speelt dan denbsp;rol van het oxydatiemiddel. Men bereikt hierdoor, dat de chemoluminescente reaktie alleen plaats heeft in een dun vloeistofhuidje omnbsp;de anode, in tegenstelling tot de andere methoden, waarbij de gehelenbsp;vloeistof homogeen licht. Ook kan men de reaktie elk ogenblik stopzetten, nl. door de elektrolyse te onderbreken. Een verder voordeel vannbsp;deze methode is, dat het door een lens gevormde beeld van de lichtendenbsp;anode gebruikt kan worden als spleet van de spektrograaf, zodat allenbsp;ge�mitteerde licht, voor zover de openingshoek van de spektrograaf datnbsp;toelaat, gebruikt wordt voor het vormen van het spektrum. Bij de anderenbsp;methoden zou men dit alleen kunnen bereiken door gebruik te makennbsp;van een zeer smal kuvet. Daar we van de meeste derivaten slechts overnbsp;zeer kleine hoeveelheden, vari�rend tussen 70 en 1000 mgr beschikten,nbsp;was de elektrolysemethode wel de meest aangewezene. Een laatste voordeel van praktiese aard is, dat eenzelfde oplossing gedurende lange tijdnbsp;gebruikt kan worden. Deze bedroeg maximaal 24 uur en zou in beginselnbsp;nog verlengd kunnen worden door van een groter volumen oplossingnbsp;uit te gaan. Echter gaat dan het stofverbruik, tengevolge van het altijdnbsp;aanwezige zwakke homogene lichten, overwegen op het verbruik aannbsp;de anode.

De intensiteit van het licht aan de anode neemt snel af, wanneer er niet voor een voortdurende verversing van de vloeistof om de anodenbsp;wordt gezorgd. Dit werd bereikt door de stilstaande elektroden tenbsp;plaatsen in een glazen kuvet, dat op een wagentje heen en weer werdnbsp;bewogen met behulp van een motor.

De intensiteit van het licht is afhankelijk van de koncentraties aan alkali, peroxyd en hydrazide, van de stroomsterkte en van de aard vannbsp;de anode. Een glad oppervlak levert beter resultaten dan een ruw.nbsp;Metaalelektroden verkleuren op den duur en zouden door selektievenbsp;reflektie vertekening van het spektrum geven. Daarom werden kool-elektroden gebruikt: Faber potloodstiften van 0,8 mm dikte.

Als funktie van de stroomsterkte en de alkalikoncentratie gaat de lichtintensiteit door een maximum. De optimale alkalikoncentratie ¹) ligtnbsp;bij 5 a 10 keer de koncentratie van het hydrazide. De optimale lichtintensiteit is onafhankelijk van de peroxydkoncentratie, wanneer dezenbsp;groter is dan die van het hydrazide. Ze neemt evenredig met de peroxyd-

koncentratie af, wanneer deze kleiner dan die van het hydrazide wordt. Op deze waarneming komen we in � 18 nog terug. Tenslotte is de lichtintensiteit o.nder optimale omstandigheden evenredig met de hydrazide-koncentratie, wanneer deze van de orde van 10^2 grm/cm^ of kleiner is.

De lichtende anode werd af geheeld in het midden van de wijd geopende voorspleet van de spektrograaf, zodat het anodebeeld de rol van de spleet vervulde. Dit werd gedaan om de spektrale vertekening tenbsp;ondervangen, die optreedt tengevolge van de chromatiese aberratie vannbsp;de afbeeldende lens. Deze gaat een rol spelen, wanneer de breedte vannbsp;het beeld van het lichtend objekt van dezelfde grootteorde wordt als denbsp;spleetbreedte. Door de anode vergroot of verkleind af te beelden werdnbsp;hetzelfde bereikt als men anders door spleetbreedtevariatie verkrijgt. Denbsp;zeer zwakke spektra werden op genomen met een twee keer vergrotenbsp;afbeelding, overeenkomend met een spleetbreedte van 1,6 mm, de sterkerenbsp;met een twee keer verkleinde afbeelding, overeenkomend met een spleetbreedte van 0,4 mm. Voor de zeer zwakke spektra werd bovendien denbsp;uittredeopening van de spektrograaf en daarmede ook de fotografiesenbsp;lichtsterkte vier keer vergroot door de lens, die het spektrum afbeeldt,nbsp;te verdubbelen (zie hoofdstuk III, blz. 28). De belichtingstijd bedroegnbsp;in dat geval toch nog acht etmalen.

In alle gevallen bleek het noodzakelijk de gemeten chemoluminescentie-spektra te korrigeren op de absorptie, die het licht ondergaat bij het doorlopen van de vloeistoflaag tussen elektrode en kuvetwand. Denbsp;absorptie van de oplossing neemt naar het ultraviolet snel toe. Naarmatenbsp;de oplossing langer gebruikt is, neemt de absorptie bij bepaalde golflengtenbsp;geleidelijk af, aangevende dat het hydrazide bij de elektrolyse verbruiktnbsp;wordt. Het bleek voldoende nauwkeurig de gemiddelde absorptie-ko�ffici�nt van de oplossing v��r en na gebruik in rekening te brengennbsp;voor het bepalen van de absorptiekorrektiefaktor, e�d. In de meeste gevallen werd de korrektie eerst merkbaar in de naar het violet aflopendenbsp;tak van het emissiespektrum, terwijl de hydrazidekoncentratie z� gekozennbsp;werd, dat de korrektiefaktor voor de bij de kleinste golflengten gelegennbsp;punten niet groter werd dan 1,20. Aanvankelijk gebruikten we een afstandnbsp;van de anode tot de glaswand van ca. 0,8 mm en brachten de korrektienbsp;aan voor een laagdikte van 1 mm, rekening houdend met de dikte vannbsp;de anode. Om bij de zwakst lichtende hydraziden de koncentratie tenbsp;kunnen opvoeren en de belichtingstijd te verkorten, brachten we denbsp;korrektiefaktor tot een minimum terug door de elektrode vlak langs denbsp;glaswand te laten lopen en een laagdikte van 34nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;rekening te

brengen. De grootste onnauwkeurigheid in de absorptiekorrektie is in dat geval afkomstig van de laagdikte, die men in rekening moet brengen.

bedroeg de absorptiekorrektie voor A lt; 4100 A meer dan 20 �%. Wegens de betrekkelijk grote onnauwkeurigheid in de korrektiefaktor ligt daardoor het maximum van de emissiekromme van het nitrophtaalzuur-hydrazide niet voldoende vast. Voor het gekorrigeerde spektrum ligtnbsp;dit bij 4020 A, voor het niet-gekorrigeerde spektrum bij 4130 A.

Voor dit hydrazide was het noodzakelijk bij de elektrolyse de elektroden te scheiden, daar tengevolge van de reduktie aan de kathode uit 3-nitrophtaalzuurhydrazide kleine hoeveelheden van het tienduizendnbsp;keer sterker chemoluminescente 3-aminophtaalzuurhydrazide wordt gevormd. Dit uit zich daarin, dat na verloop van tijd de sterkte van hetnbsp;licht aan de anode toeneemt en aanzienlijk groter wordt dan de oorspronkelijke lichtintensiteit. De scheiding geschiedde door de elektrodennbsp;in verschillende kuvetten te plaatsen, die door een agarbrug verbondennbsp;werden.

Iets dergelijks treedt op bij het Na 3-hydrazino jS-sulfonaat, waar ook bij gescheiden elektroden de anode-intensiteit door een maximum gaat.nbsp;Waarschijnlijk hebben we hier te maken met een oxydatie van denbsp;substituent, waardoor het hydrazide in een sterker chemoluminescentnbsp;hydrazide overgaat. Het bepaalde spektrum wordt daarom met enignbsp;voorbehoud gegeven.

In de figuren 16, 17 en 18 zijn de spektra weergegeven van de tien phtaalzuurhydraziden, waaronder het ongesubstitueerde phtaalzuur-hydrazide zelf, voorts acht hydraziden met een substituent op de 3-plaats

in de benzolring, o.a. het S-aminophtaalzuurhydrazide en tenslotte het phtaalzuurhydrazide met de aminogroep op de 4-plaats. Ter vergelijkingnbsp;is in alle drie de figuren het spektrum van 3-amino opgenomen.

In kolom 2 vindt men van elke substituent de chemiese formule. In kolom 4 en 5 stellen en X2 de golflengten voor, waar de energie innbsp;het spektrum de helft is van de waarde in het maximum. Het verschilnbsp;van deze golflengten, weergegeven in kolom 6 is de zg. halfwaardebreedtenbsp;van het spektrum.

De intensiteiten in kolom 7 zijn visueel bepaald. De lichtende anode Werd daarbij vergeleken met een door een lampje plus blauw filter verlichte witte naald, waarvan de belichtingssterkte op bekende wijze konnbsp;Worden gevarieerd door regeling van de stroom door het lampje. Denbsp;nauwkeurigheid van deze meting bedraagt niet meer dan 100 %. Denbsp;intensiteit van het 3-amino is daarbij willekeurig op 100 gesteld. Denbsp;andere intensiteiten gelden voor gelijke koncentraties van het hydrazidenbsp;onder optimale omstandigheden.

Met behulp van deze ruwe intensiteitsmeting was het mogelijk direkt de juiste belichtingstijd te kiezen voor de fotografiese opname van hetnbsp;spektrum. In beginsel is het mogelijk om achteraf uit deze opname denbsp;intensiteit van de chemoluminescente reaktie nauwkeuriger te bepalennbsp;door het verkregen spektrum te vergelijken met de zwartingsmerken,nbsp;voor welke de intensiteit in absolute waarde bekend is. De intensiteitnbsp;Van de anode is echter vrij sterk afhankelijk van het oppervlak van de

anode en van andere faktoren, die men niet in de hand heeft. Daardoor was de sterkte van het licht tijdens de opname ver van konstant ennbsp;had een nauwkeuriger intensiteitsmeting weinig zin. Alleen voor 3-aminonbsp;voerden we de berekening wel uit, nl. om een schatting van de absolutenbsp;waarde van het quantenrendement te kunnen maken. Hiervoor vondennbsp;we de waarde van 0,4 o/oo. d.w.z.:

Per tienduizend molekulen 3-amino, die bij de reaktie worden verbruikt, worden slechts vier quanten als chemoluminescentielicht uitgezonden. De quantenopbrengst per aan de anode gevormd zuurstofatoom is nog ca. 10 keer kleiner.

De phtaalzuurhydraziden zijn in de tabel gerangschikt naar de ligging van het maximum van emissie. Voor het 3-nitrophtaalzuurhydrazide ligtnbsp;dit bij de kleinste golflengte, daarop volgt het phtaalzuurhydrazide zelf,nbsp;daarop het 3-hydroxy, 3-broom en 4-amino met prakties dezelfde liggingnbsp;van het maximum (fig. 17), daarop het 3-amino, Na 3-hydrazino ^-sulfo-naat en het 3-aceetamido, daarop het methylamino en tenslotte hetnbsp;3-acetylcarbamido (fig. 18). We willen hier alleen nog op het volgendenbsp;wijzen:

De spektra van de hydraziden met de amino- of een daarvan afgeleide groep op de 3-plaats zijn het verst naar het rood verschoven ten opzichtenbsp;van het ongesubstitueerde hydrazide en vertonen de grootste halfwaarde-breedten. We komen later hierop nog terug.

Het spektrum van het d-aminophtaalzuurhydrazide is het gemiddelde van drie verschillende opnamen. De afwijking der afzonderlijke spektranbsp;ten opzichte van het gemiddelde bedroeg maximaal 5 %. Het spektrumnbsp;van het 4-aminophtaalzuurhydrazide is het gemiddelde van twee verschillende opnamen die onderling maximaal 5 % verschilden. De overigenbsp;spektra zijn afkomstig van telkens ��n opname, waarbij van ��n stofnbsp;drie spektra gelijktijdig opgenomen werden door de anode af te beeldennbsp;in het midden van een trapspleet met drie treden, die verschillend langnbsp;belicht werden. De in de figuren weergegeven spektra zijn steeds denbsp;gemiddelden van deze drie spektra. De nauwkeurigheid moeten we opnbsp;ca. 5 % stellen. Voor X lt; 4000 A is de nauwkeurigheid geringer tengevolge van het steile verloop der apparaatgevoeligheid, welke veroorzaakt wordt door een afneraende plaatgevoeligheid en door een toenemende absorptie van het licht bij afnemende golflengte door de glasdelen van de spektrograaf. Een kleine fout in de golflengtebepalingnbsp;veroorzaakt daardoor een betrekkelijk grote fout in de energie, terwijlnbsp;tevens in dat gebied de energie als regel bepaald werd met behulp vannbsp;kleine zwartingen.

maxima, dan spreiden de punten om deze kromme maximaal 5 %. Hieruit mogen we besluiten, dat binnen de bereikte nauwkeurigheid van ca. 5 %nbsp;geen nevenmaxima o[ aanwijzingen daarvoor aanwezig zijn.

Behalve met de nauwkeurigheid van de fotografiese intensiteitsmeting hebben we echter bij het beoordelen der spektra ook te maken met denbsp;vertekening door de apparaatkromme, die in ons geval geheel wordtnbsp;bepaald door de breedte van het anodebeeld. In de laatste kolom vannbsp;tabel 1 is deze breedte opgegeven bij de opname der verschillendenbsp;chemoluminescentiespektra, terwijl in tabel 2 de hiermee korresponderendenbsp;golflengtegebieden zijn opgegeven bij vier golflengten in het spektrum.

Binnen deze gebieden verwachten we geen fijnstruktuur van het chemo-luminescentiespektrum, gezien de aard van het weliswaar nog onbekende emitterende molekuul. Een steun hiervoor is gelegen in de absorptiespektranbsp;der phtaalzuurhydraziden, die met groter golflengtenauwkeurigheid bepaald konden worden en geen fijnstruktuur van deze orde vertonen.nbsp;In � 11 komen we op deze kwestie nog terug.

In een kontinu spektrum is op een helling de vertekening tengevolge Van de spleetbreedte van de tweede orde, in maxima en minima van denbsp;eerste orde. Vergelijking van de golflengtegebieden uit tabel 2 met denbsp;spektra in de figuren 16, 17 en 18 leert, dat de energie in de maximanbsp;hoogstens 1 % te laag is bepaald door de optredende vertekening. Ditnbsp;geldt ook voor eventuele bredere nevenmaxima, die na de vertekeningnbsp;buiten onze waarneming vallen.

Tenslotte is er nog ��n oorzaak voor vertekening aanwezig, die de gedaante van het spektrum kan hebben gewijzigd, nl. in die gebieden.nbsp;Waar de apparaatgevoeligheid sterk verloopt in het met de spleetbreedtenbsp;overeenkomende golflengtegebied. Dit is het geval voor X lt; 4000 A. Berekening aan de hand van een bepaald geval, nl. dat van het spektrumnbsp;van phtaalzuurhydrazide bij een spleetbreedte van 1,6 mm leert, dat denbsp;energie bij 4000 A 2 %, bij 3900 A 4 % en bij 3800 A 8 % te hoognbsp;bepaald werd. Hiervoor werd geen korrektie aangebracht, daar de foutnbsp;in de fotografiese intensiteitsmeting bij deze golflengten allicht vannbsp;dezelfde grootte is.

In de literatuur zijn drie opgaven van de spektrale energieverdeling van het licht, uitgezonden bij de chemoluminescente reaktie van 3-amino-phtaalzuurhydrazide te vinden:

Harris en Parker46) bepaalden het spektrum van de reaktie met waterstofperoxyd en natriumhypochloriet fotografies. Ze publiceerden dit echter niet, maar volstaan met de opmerking, dat het een vlaknbsp;maximum bezit tussen 4100 en 4400 A, zich uitstrekt van het violet totnbsp;ver in het rood en dat het licht voornamelijk uitgezonden wordt in hetnbsp;golflengtegebied tussen 3800 en 5000 A. Deze opgave is geheel in overeenstemming met het door ons gevonden spektrum (fig, 16).

Eymers en van Schouwenburg 40) bepaalden het spektrum van de reaktie met waterstofperoxyd en kaliumferricyanide en vindennbsp;een kromme met maximum bij 4750 A. Later bepaalden zij het spektrumnbsp;van de reaktie met peroxyd en haemine 45) en vonden een van de vorigenbsp;afwijkende kromme met maximum bij 44 a 4600 A. De spektra werdennbsp;niet op absorptie gekorrigeerd. In deze gevallen is het zeker nodig ditnbsp;te doen, daar zowel kaliumferricyanide als haemine voor X lt; 4600 Anbsp;sterk en selektief absorberen. Hoewel het dus lijkt alsof deze literatuuropgaven geen waarde hebben voor een vergelijking met het door onsnbsp;bepaalde spektrum, is dit toch niet helemaal het geval. Achteraf is hetnbsp;nl. mogelijk de door hen bepaalde spektra op absorptie te korrigeren voornbsp;golflengten beneden 4400 A: Voor een homogeen lichtende oplossing is

is met de absorptieko�ffici�nt. Voor X lt; 4400 A was bij Eymers en van Schouwenburg de waarde van a z� groot, dat

vangen kan worden door a. Daardoor is het relatief verloop der absorptiekorrektiefaktor bekend ook al is deze, door gebrek aan gegevens, zelf niet bekend. Na vermenigvuldiging der spektra met de absorptieko�ffici�ntnbsp;van kaliumferricyanide resp. haemine verkrijgt men dan in beide gevallennbsp;krommen met maximum bij 42 a 4300 A, terwijl het door ons bepaaldenbsp;spektrum een maximum bezit bij 4240 A. Voorts blijkt, dat voornbsp;X gt; 5000 A de beide spektra nagenoeg evenredig zijn met dat van fig. 16nbsp;voor 3-aminophtaalzuurhydrazide.

Uit deze beide feiten mag men besluiten, dat er sterke aanwijzingen zijn voor de gehele of nagenoeg gehele identiteit van het emissie spektrumnbsp;van de chemoluminescente reaktie met kaliumferricyanide resp. metnbsp;haemine en dat van de reaktie aan de anode bij elektrolyse van denbsp;oplossing.

Om dit geheel buiten twijfel te stellen, bepaalden we zelf ook het spektrum van de reaktie met peroxyd en haemine, waarbij zo nauwkeurignbsp;mogelijk op absorptie werd gekorrigeerd.

Voor de opname werden 64 reakties uitgevoerd in een kuvet van 1 cm dikte. De molaire koncentraties aan S-amino, KOH, peroxyd en haemine bedroegen in hetnbsp;reaktiemengsel resp. 10��, 8.10��, 1,6.10�� en 3.10�� grm per cm�. Elk reaktie-mengsel werd gedurende 5 minuten voor de spektrograaf geplaatst, 20 sek. na menging.nbsp;Gedurende deze 5 minuten verandert de absorptie van de oplossing en daarmede de

van de aanwezigheid van haemine groter was dan bij de elektrolysemethode werd de in hoofdstuk III onder C beschreven exakte methode gebruikt voor de bepalingnbsp;van de absorptiekorrektiefaktor. De lichtintensiteit werd visueel gemeten en bleeknbsp;exponentieel af te nemen met de tijd. De absorptie werd als funktie van de tijdnbsp;gemeten met behulp van de absorptieopstelling (blz. 27). Achteraf bleek, dat de ruwerenbsp;methode voor het aanbrengen der absorptiekorrektie met behulp van de gemiddeldenbsp;absorptie der oplossing, binnen de beoogde nauwkeurigheid dezelfde waarde leverde.nbsp;Bij 4000 A bedroeg de korrektiefaktor 1,2, bij 3900 A 1,5 en bij 3800 A 3,0.

Het zo bepaalde spektrum valt binnen de meetfout (5 %) samen met het gemiddelde van twee opnamen volgens de elektrolysemethode. Hetnbsp;gemiddelde van de drie spektra is in de figuren 16, 17 en 18 weergegeven.

We mogen dus besluiten, dat het chemoluminescentiespektrum van 3-aminophtaalzuurhydrazide onafhankelijk is van de wijze waarop mennbsp;de reaktie uitvoert. Met zekerheid geldt dit voor de reaktie met haeminenbsp;en voor de reaktie aan de anode bij elektrolyse van de oplossing. Metnbsp;grote waarschijnlijkheid geldt het ook voor de reaktie met kaliumferri-cyanide en voor die met natriumhypochloriet.

� 8. Chemoluminescentiespektrum van pyromellietzuurhydrazide.

In het geval van pyromellietzuurhydrazide werden de drie afzonderlijke spektra der opname niet tot ��n kromme gemiddeld, maar twee ervannbsp;werden gemiddeld tot het spektrum a, het derde werd afzonderlijk weergegeven als spektrum b (fig. 19). Er bleek nl. een buiten de meetfout

vallend verschil op te treden tussen dit spektrum en de beide andere: Zowel het spektrum a als het spektrum b vertonen een maximum bijnbsp;4300 A a 4400 A en een breed nevenmaximum in het geelgroene gebied.nbsp;Echter is dit laatste voor b meer uitgesproken dan voor a.

Nu is het spektrum a afkomstig van oplossingen die gebruikt zijn tot gemiddeld ruim de helft van het hydrazide verdwenen was. Het spektrumnbsp;b is afkomstig van oplossingen, waarvan gemiddeld slechts 30 % vannbsp;het hydrazide gebruikt werd. De oorzaak voor de afwijking, die tussennbsp;de spektra a en b optreedt, is voor de hand liggend: Bij de al- of nietnbsp;chemoluminescente oxydatie van een hydrazide neemt men algemeen aan,nbsp;dat er althans ten dele een reaktie verloopt waarbij de hydrazideringnbsp;afgebroken wordt. Uit het pyromellietzuurhydrazide ontstaat dan, zoalsnbsp;uit de hieronder weergegeven formules blijkt, in eerste instantie een opnbsp;de 4- en 5-plaats gesubstitueerd phtaalzuurhydrazide, waarbij de substi-tuenten de resten van de afgebroken hydrazidering zijn.

Eventueel zou zich meer dan ��n phtaalzuurhydrazide kunnen vormen, die alle meer of minder chemoluminescent zullen zijn. De spektra a en bnbsp;zijn nu superposities van het chemoluminescentiespektrum van pyromellietzuurhydrazide en ��n of meer van deze phtaalzuurhydraziden. Innbsp;spektrum a is dit laatste naar verhouding meer aanwezig dan in b,nbsp;doordat de oplossing langer werd gebruikt en zich meer van hetnbsp;phtaalzuurhydrazide kon vormen.

Aannemende, dat we te maken hebben met de superpositie van slechts twee spektra, 'is het mogelijk de beide komponenten te bepalen, wanneernbsp;we verder onderstellen, dat voor X lt; 4150 A in hoofdzaak de ene kom-ponent, voor A gt; 5500 A uitsluitend de andere komponent aanwezig is.nbsp;Deze onderstelling is voor de hand liggend, daar de spektra a en bnbsp;in deze gebieden evenredig zijn, terwijl we verder weten, dat voor bijnanbsp;alle phtaa/zunrhydraziden het deel van het chemoluminescentiespektrumnbsp;boven 5500 A te verwaarlozen is (fig. 16, 17 en 18).

De twee komponenten en A2 vindt men als het verschil der spektra a en b, nadat men ze resp. voor A lt; 4150 A en A gt; 5500 A door evenredige vergroting heeft doen samenvallen en zijn in fig. 20 weergegeven.

De nauwkeurigheid van deze werkwijze is uit den aard der zaak gering. Het spektmm zullen we onder voorbehoud toeschrijven aan dat vannbsp;het pyromellietzuurhydrazide en is als zodanig in tabel 1 vermeld. Hetnbsp;spektrum A2 is dat van een op de 4- en S-plaats gesubstitueerd phtaal-zuurhydrazide. Het vertoont de meeste overeenkomst met de spektranbsp;van het 3-hydroxy, 3-broom en 4-aminophtaalzuurhydrazide: De liggingnbsp;van het maximum is hetzelfde evenals de naar het rood aflopende tak.nbsp;De naar het violet aflopende tak is steiler, ligt echter ook mindernbsp;goed vast (verg. fig. 17 en tabel 1).

De onderstelling, dat het gemeten spektrum opgebouwd is uit dat van het pyromellietzuurhydrazide en nog ��n ander spektrum, behoeft nietnbsp;te betekenen, dat zich slechts ��n chemoluminescent phtaalzuurhydrazidenbsp;vormt. Het is voldoende te onderstellen, dat er ��n verre de overhandnbsp;heeft, hetzij door zijn grote vormingswaarschijnlijkheid, hetzij door zijnnbsp;groot chemoluminescent vermogen. Daar de lichtintensiteit van de anodenbsp;bij enkele der oplossingen na enige tijd boven de beginintensiteit uitkwam,nbsp;is het chemoluminescent vermogen van het betreffende phtaalzuurhydrazide zeker groter dan dat van het pyromellietzuurhydrazide.

Een andere overweging, die de gevolgde werkwijze rechtvaardigt, is gelegen in het feit, dat zoals we op blz. 76 zullen zien, men moet verwachten, dat de spektra van deze op de 4- en 5-plaats gesubstitueerdenbsp;phtaalzuurhydraziden zeer weinig uiteenlopen en zeer dicht staan bij dienbsp;van het 3-broom, 3-hydroxy en 4-aminophtaalzuurhydrazide. Dit isnbsp;voor het spektrum A2 inderdaad het geval.

Na de zo juist gegeven beschrijving van de chemoluminescentiespektra der hydraziden, behandelen we in � 9�� 11 de fluorescentie- ennbsp;absorptieeigenschappen van deze hydraziden.

� 9. Fluorescentie- en absorptiespektra van 3-amino- en 3-methylaniino-phtaalzuurhydrazide.

Vanouds is de sterke fluorescentie van 3-amino in zuur milieu opgevallen, waarvan de kleur op het oog niet te onderscheiden is van die der chemoluminescentie. Dit feit heeft enkele onderzoekers tot de onderstelling gebracht, dat het de zure vorm van het hydrazide zelf is, datnbsp;bij de chemoluminescente reaktie in aangeslagen toestand ontstaat ennbsp;het licht uitzendt (zie ook � 19). De a/ of niet identiteit der beide spektranbsp;is daarom ��n der eerste belangrijke gegevens, dat een onderzoek dernbsp;fluorescentiespektra kan leveren. Zoals uit fig. 22, blz. 61 blijkt, zijn denbsp;spektra niet identiek. Daarmede vervalt deze mogelijkheid voor eennbsp;identifikatie van het chemoluminescente molekuul. De door ons verrichtenbsp;studie van de fluorescentie- en absorptieeigenschappen der phtaalzuur-hydraziden moeten we daarom beschouwen als een studie over de invloednbsp;van een substitutie in de benzolring op de optiese eigenschappen vannbsp;de bekende uitgangsstof.

Deze eigenschappen zijn op vrij ingewikkelde wijze afhankelijk van de Ph der oplossing. Vanuit chemies standpunt is dit begrijpelijk, daarnbsp;we bij de phtaalzuurhydraziden de mogelijkheid van een keto-enolover-gang ¹) hebben volgens onderstaand schema:

In het algemeen kan men verwachten, dat bij de enolvormen de COH-groepen kunnen ioniseren tot CO� H , zodat men theoreties vele vormen van het molekuulnbsp;heeft: diketo-, mono- en di-enolvorm, al of niet ge�oniseerd. Voor de gesubstitueerdenbsp;phtaalzuurhydraziden maakt het daarbij nog verschil, welk van de twee C=:0-groepennbsp;ge�noliseerd is, resp. welk van de C�OH-groepen ge�oniseerd is.

Over het al of niet voorkomen van deze verschillende vormen van het hydrazide bij een bepaalde Pjj is het moeilijk enige definitieve uitspraak te doen.

Daar we niet weten met welke vorm het bij de chemoluminescente reaktie emitterende molekuul de grootste overeenkomst vertoont, interesseert ons zowel de fluorescentie en absorptie in zuur als in alkalies milieu,nbsp;al vindt de chemoluminescente reaktie in alkalies milieu plaats. Van de

verschillende phtaalzuurhydraziden zullen we eerst de eigenschappen van S-amino en 3-methylamino bespreken:

In zuur milieu vertoont 3-amino een intensieve blauwe fluorescentie, die bij een pn = 3 het sterkst is. In niet te sterk alkalies milieu is denbsp;fluorescentie ca. 300 keer zwakker en blauwviolet van kleur, terwijl bijnbsp;zeer hoge pn (ca. H) een eveneens zwakke vaalgroene fluorescentienbsp;verschijnt. De absorptie- en fluorescentiespektra werden opgenomen bijnbsp;een Ph = 3 (0.001 n HCl), een pn = 12 (0.01 n KOH) en een pn = Hnbsp;(1 n KOH). Deze zijn in fig. 22 op blz. 61 weergegeven¹): de fluorescentiespektra in het rechterdeel der figuur bij de grote golflengten, denbsp;absorptiespektra in het linkerdeel bij de kleine golflengten. De eerstenbsp;bezitten slechts ��n maximum, de laatste zijn tweetoppig.

In fig. 21 a en b, waar de spektra tegen de frequentie zijn uitgezet, zien we, dat wanneer we voorlopig alleen letten op het absorptiemaximumnbsp;bij de grootste golflengte, absorptie- en fluorescentiespektra bij de pn�snbsp;3 en 12 spiegelsymmetries zijn, zij het ook dat deze symmetrie niet geheelnbsp;kwantitatief is. Verder zien we, dat in 0,01 n KOH zowel absorptie- alsnbsp;fluorescentiespektrum naar het violet verschoven zijn ten opzichte vannbsp;die in 0.001 n HCl. Men kan zich hierbij denken, dat bij de overgangnbsp;van het molekuul van de zure naar de alkaliese modifikatie de energienbsp;van de elektronenovergang toeneemt, waardoor de beide spektra naarnbsp;kleiner golflengte verschuiven.

Het is niet mogelijk met zekerheid te zeggen welke vormen van het molekuul voor de achtereenvolgende fluorescenties verantwoordelijk zijn.

De golflengtenauwkeurigheid in de fluorescentiespektra korrespondeert met een spleetbreedte van hoogstens 0,3 mm. Zie tabel 2 blz. 53.

Die in zuur milieu schrijft men als regel toe aan de diketovorm (biz. 58). Die in alkalies milieu zou dan bij een enolvorm behoren. Verder moetennbsp;we nog rekening houden met de mogelijkheid, dat de zwakke fluorescenties, zoals deze in alkalies milieu optreden, afkomstig kunnen zijnnbsp;van verontreinigingen.

Bij 3-methylamino is de ligging der absorptie- en fluorescentiespektra (fig. 23) geheel analoog aan die bij 3-amino. Alle spektra zijn naar hetnbsp;rood verschoven t.o.v. de overeenkomstige spektra bij 3-amino. Er zijnnbsp;twee verschilpunten met 3-amino:

2�. waar bij 3-amino de alkaliese oplossing slechts zwak fluoresceerde, is de intensiteit bij 3-methylamino juist zeer groot, nl. van dezelfdenbsp;grootteorde als die der zure oplossing. Hierdoor wordt het waarschijnlijk,nbsp;dat de zwakke blauwviolette fluorescentie van de oplossing van 3-aminonbsp;in 0.01 n KOH re�el is en niet aan een verontreiniging moet wordennbsp;toegeschreven. Blijkbaar is het rendement bij 3-amino veel geringer dannbsp;bij 3-methylamino.

In het pjj-gebied tussen 5 en 8 vindt bij 3-methylaniino een geleidelijke overgang plaats van de blauwgroene fluorescentie in zuur, naar de blauwe fluorescentie innbsp;alkalies milieu, in die zin, dat het spektrum een lineaire kombinatie blijkt te zijnnbsp;van de spektra bij pg = 3 en Ph = 12.

Wanneer we de chemoluminescentiespektra van 3-amino en 3-methylamino (fig. 22 en 23) bekijken ten opzichte van de fluorescentiespektra, komen daarbij twee punten naar voren:

1�. het maximum van het chemoluminescentiespektrum valt voor beide stoffen samen met het maximum van het fluorescentiespektrum der zurenbsp;oplossing:

2�. de chemoluminescentiespektra zijn breder dan de overeenkomstige fluorescentiespektra.

/	/	\		3 -amir	lophlaa	z. hydr.
-r / / / /	\ / \_/	\ \ \ \ nbsp;nbsp;nbsp;/ \ nbsp;nbsp;nbsp;/	lt;7' \ 7 \ V	/ /	\ \
/ / // /� //		1 /	'7 ' nbsp;nbsp;nbsp;' ' � ' � nbsp;nbsp;nbsp;\ 1 \ �nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;\	C\ ^ V\ / V� '	\	\ �\
// quot;'1		\	� nbsp;nbsp;nbsp;\ [ \	\ ^ \\ \\		\ \ \ \ �n
		/V / A/ A	/ y	's \ s V

3000

4000

5000

/ /	\ \ N	/ \	3�m	ethylam	inophta	alz.hydr.
\ 1 1 / � /nbsp;�/	\ \ \ \ \' /	/ \ l l	/ /f V
-1/ 1/ if if 1 nbsp;nbsp;nbsp;y	\ ' ' \	1 / V	^ ' / / � / / // 1; / / � /	' \\ \ nbsp;nbsp;nbsp;y� \ \*
\ 7 v y		A \ t	� � / / , 1 /	\ \ \ \ \ \
		\ / /	* I	\ s	�s

3000 nbsp;nbsp;nbsp;4000nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;5000nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;6000 A

Fig. 22 en Fig. 23. Absorptie- en emissiespektra van 3-amino en 3-methylaminophtz. hydr.

absorptie en fluorescentie van de zure oplossing (0.001 n HCL).

� . � . � fluorescentie van de alkaliese oplossing (1 n KOH). --------chemoluminescentie.

� 10. Fluorescentie- en absorptiespektra van 4-aminophtaalzuurhydrazide.

Beperkte geldigheid van de wet der spiegelsymmetrie.

In zuur milieu fluoresceert 4-amino vrij sterk blauw. Het rendement is ca. vier keer kleiner dan bij 3-amino, het maximum ligt bij dezelfdenbsp;golflengte, de halfwaardebreedte van het spektrum is echter groter. Innbsp;alkaliese oplossing ontbreekt de bij kleiner golflengte liggende fluores-

centie en treedt alleen een vale en zwakke blauwgroene fluorescentie op met maximum bij 4800 A. Zie fig. 28, blz. 65.

De absorptiespektra (fig. 28) verschillen aanzienlijk van die der beide vorige derivaten. Het eerste absorptiemaximum ligt bij veel kleiner golflengte en is lager. Van de spiegelsymmetrie tussen fluorescentie- ennbsp;absorptiespektra is weinig overgebleven: Waar bij kleine golflengte hetnbsp;fluorescentiespektrum eindigt, is er nog bijna geen sprake van absorptie.nbsp;Het is alsof de spektra afkomstig zijn van verschillende stoffen. Datnbsp;dit niet het geval is, blijkt uit een bepaling van het fluorescentierendement:

Zoals we in hoofdstuk I (blz. 18) bespraken heeft men in verschillende gevallen gevonden, dat het fluorescentierendement, dit is het quoti�ntnbsp;van het aantal ge�mitteerde en het aantal geabsorbeerde quanten, kon-stant was bij instralen met licht van golflengten uit verschillende delennbsp;van het absorptiespektrum. Voor de zure oplossing van 3-a/ninophtz.nbsp;hydr. toetsten we eerst deze wet voor drie golflengten: 3650�3663 A,nbsp;3132 A en 2654 A, afkomstig van de kwiklamp. Deze zijn gelegen innbsp;het eerste absorptiemaximum, tussen het eerste en tweede en voorbij hetnbsp;tweede maximum (fig. 22).

De bepaling geschiedde door de uit de monochromator tredende lichtbundel door een kuvet met de oplossing te laten vallen en de fluorescentieintensiteit visueel tenbsp;meten. Daarbij werd tegen het kuvet een wit vlakje geplaatst, waarin een openingnbsp;was aangebracht om het fluorescentielicht waar te nemen. Het vlakje werd met behulpnbsp;van een 12-Volts lampje, voorzien van een blauw filter verlicht. De intensiteitsmetingnbsp;geschiedde door de afstand van het lampje z� te regelen, dat vlakje en opening evennbsp;sterk verlicht waren, waarbij de intensiteit evenredig is met het omgekeerde kwadraatnbsp;van de afstand. Vervolgens werd de totale intensiteit van de opvallende mono-chromatiese lichtbundel gemeten met behulp van een microthermozuil volgens Moll,nbsp;direkt verbonden aan een galvanometer volgens Zernike (type Ze, aanwijstijd 7 sek.).nbsp;Een uitslag van 1 mm bij een schaalafstand van 50 cm korrespondeerde met 7.10�� Voltnbsp;in de keten. Dit kwam overeen met een energiestroom van 10�� Watt/cm^. De totalenbsp;intensiteit van de lichtbundel kon tot ca. 4.10�� Watt worden opgevoerd door denbsp;monochromatorspleten voldoende breed te nemen (2 mm). Vervolgens werd bij denbsp;verschillende golflengten de absorptieko�ffici�nt, P, van de oplossing bepaald met denbsp;versterkeropstelling.

Het relatieve quantenrendement der fluorescentie, rj, bij deze golflengten kan men nu berekenen met behulp van de formule:

E = intensiteit van het opwekkende monochromatiese licht met golflengte X ter plaatse, waar de fluorescentie gemeten wordt.

Voor het relatieve rendement bij de golflengten 3650�3663 A, 3132 A en 2654 A vonden we resp. 1,2, 1,3 en 1,0. We zien, dat binnen onzenbsp;vrij grote meetfout het rendement konstant is.

Hetzelfde voerden we uit voor de zure oplossing van 4-am('nophtz. hydr. en vonden resp. 0,25, 0,4 en 0,3. De afwijking van de konstantheid is

hier iets groter, maar valt toch grotendeels binnen de meetfout ¹). Uit de geldigheid van de rendementswet voor de fluorescentie van 4-aminonbsp;mogen we nu omgekeerd besluiten, dat deze afkomstig is van een stofnbsp;met een absorptiespektrum, dat weinig verschilt van het gemetennbsp;spektrum, o.a. bij 3660 A een z��r geringe absorptie bezit. Naar allenbsp;waarschijnlijkheid is deze stof 4-amino zelf, al kan de mogelijkheid vannbsp;een verontreiniging niet worden uitgesloten. Echter blijft ook dan denbsp;op het ogenblik belangrijkste gevolgtrekking geldig, nl. dat er blijkbaarnbsp;aanzienlijke afwijkingen mogelijk zijn van de wet der spiegelsymmetrie.nbsp;In � 16 komen we op de interpretatie hiervan terug.

�11. Fluorescentie- en absorptiespektra der overige phtaalzuur-hydraziden en van pyromellietzuurhydrazide.

In de fig. 24 t/m 31 zijn van elk der overige phtaalzuurhydraziden de absorptie- en fluorescentiespektra weergegeven; die van de zure oplossing getrokken, die van de alkaliese oplossing gestreept. Ter vergelijking is ook het chemoluminescentiespektrum kort gestreept ingetekend. De voornaamste bijzonderheden vermelden we hieronder in hetnbsp;kort:

In zuur milieu zijn de fluorescentiespektra van 3-aceetamido, 3-nitro en 3-broomphtz. hydr. identiek met dat van 3-amino, terwijl die vannbsp;Na-3-hydrazino jS-sulfonaat en 3-acetylcarbamido slechts zeer weinignbsp;daarvan afwijken: de topligging is dezelfde evenals de violette tak. Denbsp;rode tak valt langzamer af, waardoor de halfwaardebreedte groter isnbsp;dan bij 3-amino. De fluorescentie van de zure oplossing van het ongesubstitueerde phtaalzuurhydrazide was te zwak om waar te nemen.

In alkalies milieu vertonen 3-aceetamido, 3 broom en het ongesubstitueerde phtaalzuurhydrazide weer de weinig karakteristieke zwakke vaalgroene fluorescentie. 3-Acetyl' carbamide daarentegen bezit in de alkaliese oplossing alleen een blauwviolettenbsp;fluorescentie, die bij kleiner golflengte is gelegen dan die van de zure oplossing.nbsp;Hetzelfde geldt voor het 3-hydroxyphtaalzuurhydrazide. Van deze stof werden denbsp;spektra echter niet opgenomen, daar ze vooral in alkalies milieu onderhevig is aannbsp;een sterke fotolyse, die zich uit in een snelle verandering van het absorptiespektrumnbsp;en een bruinkleuring van de oplossing. Het 3-nitrophtaalzuurhydrazide fluoresceert innbsp;alkalies milieu niet merkbaar, evenmin het Na 3-hydrazino /3-sulfonaat.

In tabel 3 vindt men het fluorescentierendement voor de zure en de alkaliese oplossing van de verschillende phtaalzuurhydraziden opgegeven.nbsp;Het betreft hier een ruwe schatting aan de hand van de fotografiesenbsp;opname, waarbij het rendement van het betreffende hydrazide vergelekennbsp;werd met dat van de zure oplossing van 3-amino. Voor deze laatste

De lage waarde van het rendement bij 3665 A kan een gevolg zijn van bij groter golflengten absorberende verontreinigingen, die hier een groter rol spelen dannbsp;bij de beide andere golflengten tengevolge van de zeer geringe absorptie van hetnbsp;4-amino zelf.

berekenden we de absolute waarde van het rendement, dat ca. 10 % bleek te bedragen. Het fluorescentierendement van de zure oplossingnbsp;is als regel vrij groot, nl. enkele procenten, die van de alkaliese oplossingnbsp;daarentegen zeer gering, nl. slechts enkele tiende promilles.

Zoals uit de figuren blijkt, vertonen de absorptiespektra der diverse phtaalzuurhydraziden onderling veel groter verschillen dan de fluores-centiespektra. Verder zien we, dat bij de meeste de spiegelsymmetrienbsp;tussen absorptie- en [luorescentiespektrum geheel ontbreekt, zoals datnbsp;ook bij 4-amino het geval was. Alleen bij Na d-hydrazino y�-sulfonaatnbsp;heeft men dezelfde situatie als bij 3-amino en 3-methylamino en bestaatnbsp;er een kwalitatieve spiegelsymmetrie voor de spektra van de zure oplossing.

Naar aanleiding der absorptiespektra maken we nog de volgende opmerking: Het absorptiespektrum van- de zure oplossing van enkele dernbsp;phtaalzuurhydraziden nl. het 3-hydroxy, 3-aceetamido en 3-acetylcarba-mido (fig. 25, 26 en 27), vertoont meer struktuur dan de overige spektra.nbsp;Het eerste absorptiemaximum bezit ��n of meer nevenmaxima, waaruitnbsp;volgt, dat het opgebouwd moet zijn uit meerdere afzonderlijke banden.nbsp;Dit zal waarschijnlijk ook het geval zijn voor de andere absorptiespektranbsp;en eventueel ook voor de emissiespektra. De afzonderlijke banden zijnnbsp;daar echter tot een vloeiende kromme verenigd of voor zover ze nog alsnbsp;aanduiding aanwezig zijn, ontsnappen ze aan de waarneming. Intussennbsp;is de waargenomen struktuur in de absorptiespektra zo gering, dat zenbsp;bij een fotografiese intensiteitsmeting slechts door een herhaalde metingnbsp;zou kunnen worden vastgelegd. Echter is dit een aanleiding om ook bijnbsp;de emissiespektra bedacht te zijn op de eventuele aanwezigheid van eennbsp;zwak aangeduide bandenstruktuur. Bij een nauwkeuriger bepaling dernbsp;spektra blijft het denkbaar dat deze te voorschijn zou komen.

Pyromellietzuurhydrazide fluoresceert in zuur milieu zwak blauw. Daar zich in de zure oplossing direkt een wit neerslag vormt, hetgeen gepaardnbsp;gaat aan een vrij ingrijpende verandering van het absorptiespektrum, isnbsp;de oorsprong van deze fluorescentie twijfelachtig. In alkalies milieu treedtnbsp;een zeer zwakke gele fluorescentie op, die niet meer kon worden gemeten. In fig. 32 zijn daarom alleen de absorptiespektra weergegevennbsp;benevens het chemoluminescentiespektrum.

nlO

1 1 1	/' / /	N \ \ \			� Pyrom	� ellietzu	urhydr.
	/ / / /	\ \ \ \
h \ \ /*. 1 ''	/l\ ' ' \ / \ ^	\ \ \ \		/		'	\
1 1,	/ ' / /		\ \ / /
			' \ \ \ \

3000 nbsp;nbsp;nbsp;4000nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;50006000^

Fig. 32. Absorptie- en emissiespektra van pyromellietzuurhydrazide.

- absorptie en fluorescentie van de zure oplossing (0,001 n HCl).

---- absorptie van de alkaliese oplossing (0,01 n KOH).

------chemoluminescentie (Analysekromme Ai, fig. 20).

De chemoluminescentiespektra der phtaalzuurhydraziden (fig. 16�18) zijn vloeiende krommen zonder nevenmaxima en lopen onderling vrijnbsp;sterk uiteen. De spektra van de hydraziden met een substituent afgeleidnbsp;van de aminogroep zijn het verst naar het rood verschoven en vertonennbsp;de grootste halfwaardebreedten. De chemolum. spektra der overige gesubstitueerde phtaalzuurhydraziden zijn in vergelijking met dat vannbsp;3-aminophtz. hydr. naar kleiner golflengte verschoven; de vorm van hetnbsp;spektrum verandert daarbij slechts weinig.

Bij 3-methylamino vertoont het fluorescentiespektrum van de zure oplossing in vergelijking met dat van 3-amino een verschuiving naar groter golflengte en wel van dezelfde grootte als de verschuiving van hetnbsp;chemoluminescentiespektrum. Bij de overige hydraziden verschillennbsp;daarentegen de fluorescentiespektra van de zure oplossing, in tegenstelling tot de chemoluminescentiespektra, onderling nagenoeg niet. Hetnbsp;Samenvallen van het maximum van chemoluminescentie- en fluorescentiespektrum, zoals dat bij 3-amino, 3-methylamino, 3-aceetamido en Na 3-hydr. jS-sulf. optreedt, moet daarom als een toevallige k�incidentie worden

beschouwd. Bij 3-nitro. 3-broom, 4-amino en 3-acetylcarbamido vallen de maxima niet samen. Verder zijn met uitzondering van 4-amino de chemo-luminescentiespektra breder dan de overeenkomstige fluorescentiespektra.

Bij 3-amino, 3-methylamino en Na d-hydr. ^-sulf. bestaat er een kwalitatieve spie gels ymmetrie tussen het fluorescentiespektrum van denbsp;zure en de alkaliese oplossing en de overeenkomstige absorptiespektranbsp;wat betreft de bij de grootste golflengte liggende absorptieband. Dezenbsp;symmetrie ontbreekt bij de overige hydraziden geheel.

De fluorescentie van de alkaliese oplossing der hydraziden is slechts zwak, behalve bij d-methylamino.

Het chemoluminescentiespektrum van 3-aminophtz. hydr. blijkt onafhankelijk te zijn van de wijze waarop men de reaktie uitvoert.

Tenslotte is het gemeten chemoluminescentiespektrum van pyromelliet-zuurhydrazide een superpositie van het spektrum van dit hydrazide zelf en van een op de 4- en 5-plaats gesubstitueerd phtaalzuurhydrazide.

In de volgende paragrafen zullen we een poging wagen de verkregen resultaten te behandelen vanuit elektronentheoreties standpunt. Eennbsp;exakte quantenmechaniese behandeling van het beschouwde molekuul-probleem is echter z� ingewikkeld, dat de mogelijkheid van een oplossingnbsp;daarvan ten enen male is uitgesloten. Voor een half empiriese, halfnbsp;quantenmechaniese behandeling van de invloed van de substituent opnbsp;de optiese eigenschappen van het molekuul is daarentegen een bepaaldnbsp;inzicht nodig in het elektronensysteem van het grondmolekuul. Hierinnbsp;schiet onze kennis verre tekort. Het enige, dat we daarom kunnen doennbsp;is te trachten verband te leggen tussen het spektrum enerzijds en bekendenbsp;elektromere verschijnselen van de substituent in verband met het verderenbsp;molekuul anderzijds (zie � 14), Voor we hiertoe overgaan maken we nognbsp;enkele opmerkingen naar aanleiding van de in � 12 samengevatte experimentele resultaten;

Het feit dat het fluorescentiespektrum van de hydraziden prakties onafhankelijk is van de substituent, het chemoluminescentiespektrumnbsp;daarentegen sterk varieert betekent, dat de invloed van de substituentnbsp;op het spektrum in sterke mate afhangt van het molekuul, waaraan hetnbsp;is gesubstitueerd en voorts, dat het in de zure oplossing fluorescerendenbsp;molekuul en het chemoluminescerende molekuul essentieel verschillendnbsp;van bouw zijn. Bij 3-methylamino is dit in vergelijking met 3-amino nietnbsp;het geval en is de invloed van de substituent op het fluorescerend en het

chemoluminescerend molekuul dezelfde. Dit afwijkend gedrag van de methylaminogroep is moeilijk te begrijpen.

In de tweede plaats wezen we er op, dat de chemoluminescentiespektra breder zijn dan de fluorescentiespektra der zure oplossing, waaraan mennbsp;de gevolgtrekking zou kunnen verbinden, dat het chemoluminescentie-spektrum opgevat moet worden als de superpositie van meerdere spektra,nbsp;zoals dat op blz. 21 ter sprake kwam. Bij d-amino treedt echter juistnbsp;het omgekeerde op en is het fluorescentiespektrum breder. Hierdoor verliest de onderstelling in zijn algemeenheid aan waarschijnlijkheid en komtnbsp;het ons voor, dat de verschillende vorm van het chemoluminescentie- ennbsp;[luorescentiespektntm teruggebracht moet worden op een verschillendenbsp;bouw der emitterende molekulen zelf.

� H. Invloed van de substituent op de elektronen verdeling van het grondmolekuul in verband met het chemoluminescentiespektrum.

Volgens de op het ogenblik algemeen aanvaarde opvatting van de chemiese binding komt deze tot stand door middel van de valentie-elektronen der bij de binding betrokken atomen. Bij de zg. homopolairenbsp;enkele binding stelt elk atoom ��n valentie�lektron beschikbaar, zodatnbsp;deze binding door twee elektronen wordt verzorgd, het zg. gemeenschappelijke elektronenpaar. Op dezelfde wijze komt de dubbele en driedubbele binding tot stand door middel van vier, resp. zes valentie-elektronen.

Wanneer een C, N of O-atoom is opgenomen in molekuulverband is het aantal valentie�lektronen waarover het beschikt als regel acht, zodat zijn L-schaal geheelnbsp;gevuld is (Oktetregel). De elektronen afkomstig van de bindingspartners van hetnbsp;atoom moet men daarbij meetellen. Zoals men onmiddellijk inziet gaat daarbij hetnbsp;C-atoom met vier valentie�lektronen vier bindingen aan (4 enkele, 2 enkele en ��nnbsp;dubbele enz.). Het 7V-atoom met vijf valentie�lektronen gaat drie bindingen aan ennbsp;houdt twee valentie�lektronen over als een zogenaamd eenzaam elektronenpaar. Hetnbsp;O-atoom met zes valentie�lektronen gaat twee bindingen aan en houdt twee eenzamenbsp;elektronenparen over. Het Br-atoom met zeven valentie�lektronen gaat ��n bindingnbsp;aan en houdt drie eenzame elektronenparen over.

Daarnaast spelen ook de zg. semipolaire bindingen een rol, waarbij beide elektronen van het gemeenschappelijk elektronenpaar van eennbsp;binding van ��n der partners afkomstig zijn.

In de schrijfwijze van Eis t er t 3) wordt een elektronenpaar voorgesteld door een streep of pijl en wel:

A � B, een streep tussen twee atomen, wanneer ��n elektron afkomstig is van A, ��n van B {homopolaire binding).

A B, een pijl tussen twee atomen, wanneer beide elektronen afkomstig zijn van A (semipolaire binding).

Het chemies gedrag van molekulen, waarin deze groepen voorkomen heeft nu tot het volgende inzicht geleid: Wanneer de nitrogroep is opgenomen in een gekonjugeerd systeem A, bijv. aan benzol gesubstitueerd,nbsp;heeft het de neiging uit dit systeem een elektronenpaar op te nemennbsp;volgens onderstaand schema *):

De nitrogroep krijgt daardoor een negatieve lading �e, het systeem A een positieve lading e.

Wanneer de aminogroep opgenomen is in een gekonjugeerd systeem A, heeft het de neiging zijn eenzaam elektronenpaar af te staan om met datnbsp;systeem een dubbele binding aan te gaan **);

De aminogroep krijgt in dat geval een positieve lading e, het systeem A een negatieve lading �e.

Deze beide zogenaamde elektromere verschijnselen, resp. de opname en de afgifte van een elektronenpaar door de substituent, spelen eennbsp;grote rol in de chemie o.a. bij het begrijpen van substitutiereakties. Tengevolge van deze elektromere verschijnselen wijzigt zich de elektronenverdeling van het grondmolekuul in die zin, dat bepaalde strukturen ¹)nbsp;van het molekuul en wel polaire, meer op de voorgrond treden. Denbsp;quantenmechaniese uitdrukking hiervan is, dat deze polaire strukturennbsp;een groter aandeel in de grondtoestand verkrijgen.

We illustreren dit aan de hand van het chemoluminescente molekuul, waarvan we de chemiese formule als volgt schematiseren:

We laten hierbij in het midden hoe het rechterdeel van het molekuul er uit ziet. Een substituent van het type van de aminogroep zal nu naast de hoofdstruktuur anbsp;de volgende strukturen, b en c meer naar voren brengen in de grondtoestand vannbsp;het molekuul.

De negatieve lading verschijnt bij struktuur b in het hydrazidegedeelte van het molekuul, bij de strukturen c in de benzolring in ortho- of parapositie en wel alsnbsp;eenzaam elektronenpaar aan een C-atoom.

Een substituent van het type van de nitrogroep bevoorrecht de strukturen volgens c, nu echter met een positieve lading in ortho- of parapositie. Zoals men eenvoudignbsp;inziet is het opnemen, van de negatieve lading vanuit de hydrazidering alleen mogelijk,nbsp;wanneer deze een dubbele binding heeft naar de benzolring:

De aminogroep gesubstitueerd op de 4-plaats geeft aanleiding tot analoge polaire strukturen b en c naast de hoofdstruktuur a.

Een �struktuurquot; van het molekuul moeten we hier opvatten in dezelfde betekenis als ze op blz. 5 werd gebruikt. Ze komt overeen met de klassieke struktuurformulenbsp;van de organiese chemie, stelt echter geen toestand van het molekuul voor.

De vraag die we ons nu moeten stellen is, wat het verband is tussen de invloed van de substituent op de elektronenverdcling van het molekuulnbsp;en de ligging van grond- en aangeslagen toestand ten opzichte van elkaar:nbsp;met andere woorden wat het verband is tussen de elektromere verschijnselen en de golflengte van het uitgezonden licht. In zijn artikel geeftnbsp;L e w i s 4) enige voorbeelden, waarbij het meer op de voorgrond tredennbsp;van polaire strukturen in de grondtoestand, gepaard gaat aan een roodverschuiving van de absorptieband.

Nu kan men met behulp van gegevens uit de chemie een volgorde opstellen van substituenten, die het elektromere verschijnsel in toenemendenbsp;mate vertonen. Voor de door ons gebruikte substituenten is deze volgorde de volgende:

NOj H Br OH NHj NHCH^ opname |nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;-gt;� toenemende afgifte van een elektronenpaar.

De volgorde NO2, H, (Br, OH, NH2, NHCH3) spreekt voor zichzelf, daar de N02-groep een elektronenpaar opneemt, de groepen Br, OH,nbsp;NH2 en NHCH3 een elektronenpaar afgeven, terwijl het H-atoom n�chnbsp;opneemt n�ch afgeeft. Tot de volgorde Br, OH, NH2, NHCH3 komtnbsp;men op grond van de volgende overwegingen:

Het is in de chemie een bekend feit, dat de zg. elektronenaffiniteit (zie Eist er t blz. 30) toeneemt voor elementen in horizontale richtingnbsp;van het periodiek systeem, afneemt in vertikale richting. Daardoor isnbsp;de elektronenaffiniteit van O groter dan van N. Dit houdt in, dat bijnbsp;O het eenzaam elektronenpaar vaster gebonden is dan bij N het geval is.nbsp;Hierdoor is het elektromeer effekt van de OH-groep kleiner dan van denbsp;NH2-groep, zoals in de chemie welbekend is. De elektronenaffiniteit vannbsp;O is volgens de bovengenoemde regels kleiner dan van F, van Br eveneens kleiner dan van F, zodat de volgorde van de elektronenaffiniteitnbsp;van Br en O hieruit niet volgt. Om die reden zijn in de bovenstaandenbsp;reeks de groepen Br en OH door een accolade verbonden. Doordatnbsp;van de CH3-groep bekend is dat ze het elektronenoktet van het atoom,nbsp;waaraan ze gebonden is instabiel maakt (zie Eistert blz. 35), is hetnbsp;eenzaam elektronenpaar van de N in de NHCHs-groep beweeglijkernbsp;dan bij de NH2-groep en het elektromeer effekt daardoor groter.

Wanneer we de op deze wijze verkregen reeks van substituenten vergelijken met tabel 1 op blz. 51, zien we, dat het maximum van het chemoluminescentiespektrum in dezelfde volgorde naar het rood verschuift. Het maximum bij de Br- en de OH-groep ligt daarbij op dezelfdenbsp;plaats.

We zien dus, dat een toenemend elektromeer effekt van de substituent in verband met het verdere molekuul, gepaard gaat aan een roodverschuiving van het chemoluminescentiespektrum. Daar het spektrum van

het op de 4-plaats gesubstitueerde hydrazide bij korter golflengte is gelegen dan dat van 3-amino, kan men omgekeerd konstateren, dat eennbsp;substitutie op de 4-plaats blijkbaar als een verzwakking van het elektro-mere effekt werkt.

We onderwerpen nu de groep van substituenten, afgeleid van NH2 aan een nadere beschouwing. We zien, dat in deze groep de chemo-luminescentiespektra het meest uiteenlopen. Het spektrum is in het algemeen breder dan bij 3-amino zelf, hetgeen al of niet gepaard gaat aannbsp;een roodverschuiving. We kunnen daarbij drie gevallen onderscheiden;

1�. Het spektrum verschuift naar langer golflengte met slechts een kleine verbreding: methylamino.

2�. Het spektrum verbreedt zich, terwijl de top niet verplaatst: aceet-amido en Na hydrazino jS-sulfonaat.

3�. Er heeft zowel een verbreding als een roodverschuiving plaats: acetylcarbamido.

Het spektrum van methylamino past geheel in de zo juist opgestelde serie; NO2, H, Br, OH, NH2, NHCH3, die zich kenmerkt door eennbsp;toenemende roodverschuiving met behoud van de vorm van het spektrum.nbsp;We denken hierbij aan een verandering in de grootte van de elektronen-overgang, die blijkbaar in de genoemde volgorde afneemt bij toenemendnbsp;elektromeer effekt van het eenzaam elektronenpaar van de substituent.nbsp;De spektra van de drie andere van amino afgeleide substituenten vertonen een verbreding, die we kunnen opvatten als een herverdeling vannbsp;, de intensiteit in de emissieband. Volgens hoofdstuk I � 3 moeten wenbsp;dit op het principe van Franck-Condon^) terugvoeren: De kon-figuratie der atomen in de aangeslagen toestand van het molekuul tennbsp;opzichte van die in de grondtoestand wijzigt zich. Naarmate deze kon-figuratie meer gaat afwijken van die in de grondtoestand, worden bij denbsp;overgang van het molekuul van de aangeslagen- naar de grondtoestandnbsp;hoger trillingsniveau�s aangeslagen en heeft een verbreding van hetnbsp;spektrum plaats, waarbij het maximum van emissie naar langer golflengtenbsp;verschuift, zonder dat daarbij de elektronenovergang behoeft te veranderen. Wanneer men te maken heeft met spektra van uiteenlopendenbsp;gedaante, is de violetgrens van het spektrum het beste kenmerk voornbsp;de grootte van de elektronenovergang. Voor de hier beschouwde substituenten krijgen we op grond van de uit de chemoluminescentiespektranbsp;bepaalde violetgrens (zie tabel 5b, blz. 80), de volgorde: aceetamido,nbsp;acetylcarbamido. Na hydrazino ,jS-sulfonaat, amino waarbij de laatstenbsp;twee prakties gelijk zijn. Zoals we hieronder zullen zien is dit wederomnbsp;de volgorde waarin het elektromeer effekt van het eenzaam elektronenpaar van de substituent toeneemt.

We letten daartoe op de elektromere verschijnselen, die zich in de substituenten zel[ kunnen afspelen, nl. bij aceetamido en acetylcarbamido.nbsp;Het eenzaam elektronenpaar van de aan benzol gebonden stikstof is innbsp;beide gevallen zowel verplaatsbaar naar de eraan verbonden ketogroep

als naar het hydrazidemolekuul. Bij acetylcarbarnido is nog een tweede stikstofatoom aanwezig, dat zijn eenzaam elektronenpaar zowel naar denbsp;eerste als naar de tweede ketogroep van de substituent kan sturen, Wenbsp;hebben dus de volgende mogelijkheden:

In het geval van aceetamido is het eenzaam elektronenpaar in minder mate beschikbaar voor het hydrazidemolekuul dan bij amino, daar hetnbsp;ook naar de ketogroep kan uitwijken, waardoor het elektromere effektnbsp;kleiner is. Bij acetylcarbarnido is dit in minder mate het geval daar denbsp;dubbele funktie van het eenzaam elektronenpaar van het eerste stikstofatoom voor een deel overgenomen wordt door het eenzaam elektronenpaar van het tweede stikstofatoom. In Na hydrazino jS-sulfonaat is hetnbsp;weer volledig ter beschikking van het hydrazidemolekuul. De elektronen-konfiguratie hiervan wordt gegeven door de formule:

Het eenzaam elektronenpaar van het tweede stikstofatoom is onbeweeglijk en er treden in deze substituent geen elektromere verschijnselen op. Het elektromere effekt naar het hydrazidemolekuul is daardoor hetzelfde als bij amino.

We mogen dus besluiten, dat voor alle substituenten de grootte van de elektronenovergang parallel gaat met het elektromere e[[ekt van hetnbsp;eenzaam elektronenpaar van de substituent naar het hydrazidemolekuul,nbsp;in die zin. dat de elektronenovergang in grootte afneemt naarmate hetnbsp;elektromere effekt toeneemt.

gestelde wetmatigheid, twijfelen we eraan, of deze regel algemeen geldig zal blijken te zijn. Vanuit theoreties standpunt lijkt het alleszins denkbaar, dat de bedoelde wetmatigheid nog door andere faktoren zal wordennbsp;doorkruist.

We letten nu op de vorm van het spektrum. Bij de niet van NH2 afgeleide substituenten is de halfwaardebreedte (tabel 1, blz. 51) nagenoeg konstant. Voor de van NH12 afgeleide substituenten neemt ze vannbsp;820 A tot 1360 A toe in de volgorde: 3 amino. Na 3-hydr. j3-sulf.,nbsp;3-methylamino, 3-aceetamido, 3-acetylcarbamido. We merken nu op, datnbsp;in dezelfde volgorde ook de elektromerie in de substituent toeneemt.nbsp;Voor de eerste drie is deze beperkt tot het eenzame elektronenpaar vannbsp;het stikstofatoom. Bij 3-aceetamido neemt, zoals we reeds zagen ook denbsp;ketogroep deel aan de elektromerie, terwijl bij 3-acetylcarbamido tweenbsp;ketogroepen en het eenzame elektronenpaar van het tweede stikstofatoom meewerken. De verbreding van het spektrum van 3-methylaminonbsp;t.o.v. dat van 3-amino wordt hiermede niet verklaard; deze is echternbsp;slechts gering.

Dat de verbreding niet samenhangt met de lengte van de substituent volgt uit het gedrag van Na 3-hydr. j8-sulf., waarvoor ze in dat gevalnbsp;dezelfde zou moeten zijn als voor 3-acetylcarbamido. In werkelijkheid isnbsp;het spektrum echter slechts weinig breder dan dat van 3-amino.

Het verschil in vorm van de chemoluminescentiespektra der phtaal-zuurhydraziden met een van NH2 afgeleide substituent brengen we dus in verband met de elektromere verschijnselen in de substituent. Naarmatenbsp;de elektromerie groter is. is het spektrum breder.

We vergelijken tenslotte onze resultaten met de opgaven van Drew^i), weergegeven in tabel 4. Er blijkt in hoofdzaak overeenstemming te bestaan. Op enkele punten is er een bevestiging en uitbreiding mogelijk:

voorgelegd. Voorts speelt bij de benaming de intensiteit een rol, terwijl tenslotte selektieve absorptie de kleur kan doen veranderen.

We zien nu uit bovenstaande tabel, dat een enkele en een dubbele substitutie van chloor weinig verschil maken met hydroxyl en dus ook overeenkomen met de broom-substitutie. Hydrazine, NHNH2 gedraagt zich overeenkomstig onze verwachting alsnbsp;3-amino. Benzamido, NHCOCeHs, eveneens, terwijl we verwachten, dat het zich alsnbsp;aceetamido zal gedragen. De kleurbenaming van 3-hydrazino /3-sulfonaat als blauwwitnbsp;kan betrekking hebben op de kleine verbreding van het spektrum. Waarschijnlijker isnbsp;het echter, dat ze samenhangt met de lage intensiteit, daar ook het zeer zwakke ongesubstitueerde phtaalzuurhydrazide blauwwit genoemd wordt, dat volgens ons blauw-violet zou moeten zijn. De benamingen van methylamino en aceetamido komen overeennbsp;met onze verwachtingen. Een dubbele substitutie in para-positie van de amino ennbsp;de aceetamidogroep geeft blijkbaar een verbreding, eventueel ook een roodverschuivingnbsp;van het spektrum, zoals blijkt uit de benamingen -witachtig en groenac/ifip. Eennbsp;roodverschuiving (en een verbreding bij aceetamido) zouden we verwachten, wanneernbsp;een dubbele substitutie werkt als een vergroting van het elektromeer effekt. De kleur-benoeming van 4-amino moet volgens ons blauwviolet zijn in plaats van blauw. Ditnbsp;berust waarschijnlijk op een subjektief effekt. Of 4-aceetamido al of niet naar het roodnbsp;is verschoven ten opzichte van 4-amino is daardoor niet uit de tabel op te maken.nbsp;Merkwaardig is, dat 4 : 5-diamino en 4 : 5-dichloor gelijk van kleur zijn en blauwviolet. Dit kan betekenen, dat alle substituties op de 4- en 5-plaats weinig invloednbsp;op het spektrum hebben. Voor 4 : 5-diamino zou het ook kunnen betekenen, datnbsp;de substituenten eikaars werking verzwakken, aangezien 4-amino blauw genoemdnbsp;wordt. Tenslotte moet de kleurbenaming van 3- en 4-nitro berusten op een sterkenbsp;zelfabsorptie voor golflengten beneden 5000 A, daar de oplossing sterk geelbruinnbsp;gekleurd is tengevolge van de hoge koncentratie, die nodig is om de kleur van hetnbsp;uitgezonden licht te kunnen waarnemen.

Uit het voorgaande volgt, dat we voor het 4 : 5-ges�bstitueerde derivaat van phtaalzuurhydrazide, dat ontstaat bij de oxydatie van pyromelliet-zuurhydrazide aan ��n der hydrazideringen, een chemoluminescentienbsp;moeten verwachten in hetzelfde golflengtegebied als 4-amino. Zoals wenbsp;reeds gezien hebben is dit ook het geval (tabel 1, analysekromme A2).nbsp;In dit verband moeten we erop wijzen, dat pyromellietzuurhydrazide zelfnbsp;zich niet als een 4 : 5-gesubstitueerd phtaalzuurhydrazide gedraagt ennbsp;de ringvorming blijkbaar een grote invloed heeft op het spektrum. Wenbsp;zouden dit kunnen vergelijken met de werking van acetylcarbamido opnbsp;de 3-plaats en dus het waargenomen zeer brede spektrum niet zozeernbsp;toeschrijven aan een verandering van de elektronenovergang als wel aannbsp;een zeer sterke herverdeling der intensiteit in het spektrum tengevolgenbsp;van een sterke elektromerie in de hydrazidering, die niet bij de chemo-luminescente reaktie betrokken is.

We willen hier nog vermelden, dat men in de chemie een tweede verschijnsel in verband met de binding onderscheidt, nl. het zogenaamde effekt van de alternerendenbsp;polariteit¹). Hieronder verstaat men een afwisselende opeenvolging van stabiele ennbsp;instabiele elektronenoktets van atomen in een keten, welke afwisseling zich door denbsp;keten voortplant.

/(S)\

I i

\W/'

Heeft bijv, de substituent R een instabiel elektronenoktet, dan worden de elektronen-oktets van de C-atomen 3, 1 en 5 gestabiliseerd (s), van de C-atomen 2, 6 en 4 instabiel gemaakt (i). Het omgekeerde geldt voor het geval, dat de substituent eennbsp;stabiel elektronenoktet bezit. De grootte van dit effekt wordt bepaald door denbsp;elektronenaffiniteit van het direkt aan de benzolkern gebonden atoom. Daardoor neemtnbsp;het voor de groepen H, Br, OH, NHa, NHCHs in dezelfde volgorde toe als hetnbsp;elektromere effekt, nl. bij afnemende elektronenaffiniteit van het centrale atoom. Hetnbsp;N-atoom in de N02-groep heeft echter verreweg het minst stabiele elektronenoktetnbsp;en komt geheel rechts in de rij te staan, terwijl het wat zijn spektrum betreft geheelnbsp;links staat. Hieruit kan men de gevolgtrekking maken, dat het alternerende effektnbsp;van de substituent op de benzolkern waaraan het is gesubstitueerd, niet te makennbsp;heeft met de optiese eigenschappen van het molekuul.

In ieder geval verwachten we, dat het elektromere effekt belangrijker is voor de optiese eigenschappen, daar dit direkte veranderingen van de elektronentoestand vannbsp;het molekuul veroorzaakt naar meer polaire strukturen. Hoe men zich het alternerendenbsp;effekt in de quantenmechanica moet voorstellen is daarentegen niet duidelijk. Ooknbsp;in chemies opzicht is het elektromere effekt beter bekend en is het belangrijker dannbsp;het alternerende effekt, dat nog wel aan enige twijfel onderhevig is. We hebben daaromnbsp;gemeend de bespreking van de invloed van de substituent op de elektronenverdelingnbsp;van het molekuul in hoofdzaak tot het elektromere effekt te moeten beperken.

� 15. Vergelijking van de invloed van de substituent op het fluorescerend en chemoluminescerend molekuul.

We gaan nu over tot een bespreking van de fluorescentiespektra van de phtaalzuurhydraziden in de zure oplossing en nemen daarbij aan, datnbsp;daarin de diketovorm aanwezig is. Zoals we gezien hebben, weerspiegelennbsp;de verschillende substituties in de benzolkern zich prakties niet in denbsp;fluorescentiespektra. Wanneer men tracht zich een idee te vormen, watnbsp;hiervoor de reden is, vervalt men vanzelf in meer of minder spekulatievenbsp;beschouwingen. Vanuit het gezichtspunt, zoals we dat in de vorigenbsp;paragraaf naar voren hebben gebracht, kan men op meer dan ��n wijzenbsp;trachten een verklaring te geven, die echter geen van alle in staat zijnnbsp;het afwijkend gedrag van de methylaminogroep te begrijpen. Het komtnbsp;ons daarom voor, dat het eerst mogelijk zal zijn deze problemen op tenbsp;lossen, wanneer men over meer gegevens en middelen beschikt om denbsp;optiese eigenschappen af te leiden uit de molekuulbouw.

We willen toch een enkele van deze beschouwingen hier weergeven, omdat men daaraan kan laten zien, hoe in de toekomst de chemo-luminescentiespektra direkte aanwijzingen kunnen geven aangaande denbsp;bouw van het emitterend molekuul.

In de diketovorm van het phtaalzuurhydrazide hebben we behalve met het elektromere effekt van de substituent ook te maken met een elektromeer effekt in de hydrazidering,nbsp;dat zijn oorsprong vindt in de eenzame elektronenparen van de stikstofatomen innbsp;deze ring.

Het elektromere effekt van een substituent als de aminogroep volgens schema b blz. 71, neemt de volgende gedaante aan:

11 i

I II I nbsp;nbsp;nbsp;II I I

We zien dus, dat de ketogroep C = O zowel door het eenzaam elektronenpaar van de hydrazide-stikstof als door dat van de substituent over kan gaan in C ^ O. Mennbsp;kan zich nu voorstellen dat daardoor de invloed van de substituent op de elektronenverdeling in de hydrazidering wordt verzwakt. Aannemende, dat deze invloed voornbsp;de optiese eigenschappen van het al of niet gesubstitueerde phtaalzuurhydrazide ennbsp;eraan verwante molekulen aansprakelijk is, kan men dan begrijpen, dat in het gevalnbsp;van de diketovorm van het molekuul de substituent g��n invloed uitoefent, in hetnbsp;geval van het chemoluminescente molekuul w�l: Wanneer het laatste molekuul overeenkomst vertoont met de diketovorm van het phtaalzuurhydrazide, zal het eenzaamnbsp;elektronenpaar van de hydrazide-stikstof op een of andere wijze geblokkeerd zijn.nbsp;Dat het fluorescentiespektrum van 3-methylamino wel naar langer golflengte is verschoven ten opzichte van 3-amino is hiermede niet te begrijpen, tenzij men de onwaarschijnlijke onderstelling maakt, dat het elektromere effekt een drempelwaarde overschrijdt, waardoor het zich merkbaar kan maken.

Men kan ook onderstellen, dat de optiese eigenschappen van het molekuul in hoofdzaak bepaald worden door het verschijnen van negatieve lading in de benzolkernnbsp;volgens schema c.

Bij het chemoluminescente molekuul zou dan g��n uitwijken van deze negatieve lading naar het hydrazidegedeelte van het molekuul moeten plaats hebben en daardoornbsp;een sterke invloed van de substituent aanwezig zijn, terwijl in het fluorescerend

molekuul de negatieve lading in hoofdzaak zou uitwijken. We willen deze gedachtengang niet verder voortzetten daar het zonder meer duidelijk is, dat we n�ch over de gegevens, n�ch over de middelen beschikken om hier, zij het ook slechts kwalitatievenbsp;uitspraken te doen.

De fluorescentie van de alkaliese oplossing levert geen nieuwe gezichtspunten, daar het in het geheel niet bekend is, welke vorm van het molekuul de fluorescentie veroorzaakt (zie blz. 58). Met uitzonderingnbsp;van methylamino is bovendien het rendement zeer laag, zodat het nietnbsp;is uitgesloten, dat ze aan een verontreiniging moet worden toegeschreven.

Geheel tegen onze verwachtingen in, lopen de absorptiespektra der verschillende phtaalzuurhydraziden aanzienlijk uiteen.

We beschouwen eerst de absorptiespektra van 3-amino (fig. 22), 3-methylamino (fig. 23) en Na 3-hydr. j8-sulf. (fig. 24). Hierin zijnnbsp;twee absorptiemaxima aanwezig, resp. bij 35 a 3700 A en bij 29 a 3000 A.nbsp;Wegens het optreden van spiegelsymmetrie tussen het absorptie- ennbsp;fluorescentiespektrum (zie fig. 21), schrijven we het absorptiemaximumnbsp;bij 35 a 3700 A toe aan ��n elektronenovergang en wel aan dezelfdenbsp;als het fluorescentiespektrum. Het absorptiemaximum bij 29 a 3000 Anbsp;behoort bij een andere elektronenovergang.

We beschouwen nu de spektra van 3-aceetamido, 3-acetylcarbamido, 3-hydroxy en 4-amino (fig. 25�28). Hier ligt het langstgolvige, vaaknbsp;meertoppige absorptiemaximum van de zure oplossing bij aanzienlijknbsp;korter golflengte dan bij de drie vorige. Wanneer men deze absorptie-band aan dezelfde elektronenovergang wil toeschrijven als die bij denbsp;fluorescentie optreedt, moet men aannemen, dat tengevolge van hetnbsp;principe van F r a n c k - C o n d o n �) �f bij de absorptie, �f bij denbsp;fluorescentie �f bij beide een overgang plaats heeft naar gemiddeld zeernbsp;hoge trillingstoestanden, waardoor een groot deel der energie als trillings-energie verloren gaat.

Een andere mogelijkheid is, dat we hier met verschillende elektronen-overgangen te maken hebben. We moeten dan onderstellen, dat de absorptieband, die met de elektronenovergang van de fluorescentie overeenkomt, wel aanwezig is op de plaats, waar we hem volgens het principenbsp;van de spiegelsymmetrie moeten verwachten, maar dat de absorptie-ko�ffici�nt z� klein is, dat hij niet gemeten wordt of door het verderenbsp;absorptiespektrum wordt overdekt.

De absorptiespektra der alkaliese oplossingen van het beschouwde viertal hydraziden strekken zich naar langer golflengten uit, terwijl ernbsp;boven 2700 A slechts ��n breed absorptiemaximum aanwezig is, datnbsp;waarschijnlijk twee of meer elektronenovergangen omvat. Bovendien kannbsp;het nog een superpositie zijn van de spektra van meerdere vormen vannbsp;het molekuul.

Tenslotte is in de absorptiespektra van het ongesubstitueerde phtaal-zuurhydrazide, het 3-nitro en S-broom (fig. 29�31) slechts ��n maximum aanwezig. Voor deze spektra geldt hetzelfde als gezegd werd van dienbsp;der vorige vier substituenten.

We hadden gehoopt, dat de absorptiespektra nieuw licht zouden werpen op de speciale elektronenovergang die bij de fluorescentie ennbsp;chemoluminescentie optreedt. Echter wordt blijkbaar het beeld doornbsp;andere elektronenovergangen z� vertroebeld, dat zelfs geen analysenbsp;mogelijk is. We zien er daarom van af de absorptiespektra nog nadernbsp;te interpreteren.

� 17. Intensiteit der chemoluminescente reaktie en relatief rendement van de fluorescentie van de zure oplossing.

In de bovenstaande tabellen zijn de verschillende substituenten in twee groepen gerangschikt naar de grootte van de elektronenovergang bij denbsp;chemoluminescentie. In de eerste groep is de volgorde van deze groottenbsp;gebaseerd op het maximum, in de tweede op de violetgrens (20 % vannbsp;het maximum).

We zien, dat de intensiteit van het licht bij de chemoluminescente reaktie in hoofdzaak toeneemt met af nemende grootte van de elektronenovergang. Wat de diepere grond hiervan is, is niet duidelijk. Overigensnbsp;is de intensiteit van de chemoluminescente reaktie in veel sterker matenbsp;afhankelijk van de substituent, dan de grootte van de elektronenovergang.

Het fluorescentierendement loopt in hoofdzaak parallel met de intensiteit der chemoluminescente reaktie. Hierdoor wordt het waarschijnlijk, dat het verschil in chemoluminescent vermogen der phtaalzuurhydrazidennbsp;teruggebracht moet worden op een verschil in fluorescentierendement vannbsp;het emitterend molekuul. We stellen ons hierbij op het standpunt, datnbsp;de chemoluminescentie een fluorescentie is van het emitterend molekuulnbsp;(zie hoofdstuk II, � 2).

De absolute waarde van het rendement van de chemoluminescente reaktie wordt bepaald door:

1�, de mate waarin nevenreakties optreden naast de eigenlijke chemoluminescente reaktie;

2�. de waarschijnlijkheid, dat het emitterend molekuul bij de reaktie in aangeslagen toestand ontstaat;

Op blz. 52 zagen we, dat zelfs voor het sterkst chemoluminescente phtaalzuurhydrazide, 3-amino, het rendement van de chemoluminescentenbsp;reaktie zeer gering is, nl. ca. 0,4 o/oo- Dit lage rendement zal in hoofdzaaknbsp;moeten worden toegeschreven aan het optreden van nevenreakties enjofnbsp;aan een kleine waarschijnlijkheid, dat het molekuul in aangeslagennbsp;toestand ontstaat.

Wat betreft het fluorescentierendement en het relatief chemoluminescent vermogen der phtaalzuurhydraziden, is het vanuit theoreties standpunt veel moeilijker uitspraken te doen dan over de spektrale ligging; Het fluorescentierendement wordt bepaald door het quoti�nt van denbsp;overgangswaarschijnlijkheid voor spontane emissie en de kans, dat denbsp;aanslagenergie op andere wijze verdwijnt. Zoals we in hoofdstuk I, � 7nbsp;bespraken, moet men het sterk uiteenlopende fluorescentierendement innbsp;hoofdzaak toeschrijven aan een verschillende kans op degeneratie vannbsp;de elektronenenergie. Dit proces nu geeft waarschijnlijk aanleiding totnbsp;een van de meest ingewikkelde problemen op het gebied van de optiesenbsp;eigenschappen van molekulen. Een enkele poging in deze richting heeftnbsp;men toch gewaagd. Zo berust volgens L e w i s 4) het lage fluorescentierendement van nitrobenzol ten opzichte van dat van benzol � op eennbsp;degeneratie van de elektronenaanslagenergie in trillingsenergie van denbsp;nitrogroep. Dat dit vopr het nitro-phtaalz. hydr. niet het geval is, blijktnbsp;uit het feit, dat zowel bij de fluorescentie als de chemoluminescentie ooknbsp;het ongesubstitueerde molekuul een zeer laag rendement vertoont.

In � 12 kwamen we tot de gevolgtrekking, dat het bij de chemoluminescente reaktie emitterende molekuul niet het phtaalzuurhydrazide zelf kon zijn, n�ch in zijn zure, n�ch in zijn alkaliese konfiguratie, Innbsp;verband met de uitgesproken invloed van de substituent op het emissie-

spektrum besloten we ertoe, dat het essentieel anders van bouw moet zijn dan het molekuul waarvan we uitgaan.

Uit het volgende zullen we zien, dat het emitterend molekuul waarschijnlijk ook geen eindprodukt is van de reaktie. Dit zou in dat geval een fluorescentie moeten vertonen met hetzelfde spektrum als de chemo-luminescentie: Volgens sommige onderzoekers wordt er bij de reaktienbsp;het vrije phtaalzuur gevormd. Het 3-hydroxy en 3-aminophtaalzuur nunbsp;fluoresceren in alkalies milieu geel, in tegenstelling tot de blauwe chemo-luminescentie. In zuur milieu is er geen fluorescentie. Hiermede is denbsp;mogelijkheid, dat het vrije phtaalzuur het emitterend molekuul zou zijn,nbsp;uitgesloten. Verder blijkt, dat er geen verband bestaat tussen denbsp;fluorescentie van de uitgelichte oplossing en de chemoluminescentie.nbsp;Deze ligt soms bij langer soms bij korter golflengte of ontbreekt geheel.nbsp;Hieruit kunnen we geen aanwijzingen putten voor de aanwezigheid vannbsp;een ander eindprodukt, dat voor de chemoluminescentie aansprakelijk zounbsp;zijn. Intussen blijft het denkbaar, dat het emitterend molekuul als eindprodukt van de chemoluminescente deelreaktie chemies stabiel is en hetnbsp;mogelijk kan zijn het reaktieverloop z� te leiden dat dit niet verdernbsp;wordt afgebroken. In dat geval kan men zeggen, dat het emitterendnbsp;molekuul eindprodukt is van de reaktie.

Tenslotte meenden we in � 13, dat er geen aanleiding was te onderstellen, dat het chemoluminescentiespektrum een superpositie is van meer dan ��n spektrum. niettegenstaande het als regel breder is dan denbsp;fluorescentiespektra van de zure oplossing. Hoe onwaarschijnlijk het onsnbsp;ook toelijkt, mogen we deze mogelijkheid toch niet geheel uitsluiten.

Hoewel het niet op onze weg ligt het voor en tegen van de verschillende reaktieschema�s te bespreken, die men in de loop van de tijd heeft opgesteld voor de chemoluminescente reaktie, willen we toch aan denbsp;hand van enkele eigen waarnemingen een paar woorden aan dit probleemnbsp;wijden.

Volgens verschillende onderzoekers (Drew 28)^ KautskySi), A 1 b r e c h t 47)) wordt bij de chemoluminescente reaktie uiteindelijk hetnbsp;oorspronkelijk molekuul teruggevormd. Hiervoor had men verschillendenbsp;argumenten:

1�. De spektrale overeenkomst van het chemoluminescentielicht en de fluorescentie van de zure oplossing. Het eindprodukt zou volgensnbsp;A 1 b r e c h 147) de ketovorm van het phtaalzuurhydrazide zijn, dat innbsp;aangeslagen toestand ontstaat. Daar men echter al spoedig afwijkingennbsp;van de identiteit van het fluorescentie- en chemoluminescentiespektrumnbsp;meende te moeten vaststellen, verviel dit argument voor de laterenbsp;onderzoekers.

hydrazide bracht sommige onderzoekers tot de opvatting, dat elk molekuul meer dan ��n quant moest uitzenden. Dit was mogelijk, wanneer het denbsp;reaktieketen meerdere malen doorliep.

H arris en Parker 46) bepaalden echter het quantenrendement van de reaktie van 3-amino bij oxydatie met peroxyd en natrium-hypochloriet op slechts 3 o/oo. d.w.z. per 1000 molekulen wordennbsp;3 quanten uitgezonden. Uit onze schatting van het rendement bij denbsp;elektrolysemethode op blz. 52 volgde, dat het ca. 0,4*o/qq bedroeg voornbsp;het sterkst chemoluminescente phtaalzuurhydrazide, 3-amino en overeenkomstig minder voor de zwakkere. Hieruit is het duidelijk, dat genoemdnbsp;argument voor de terugvorming van het hydrazide ten enen male vervalt.

3�. KautskySi) oxydeerde 3-amino met perchloron, Ca(OCl)2. Door aan de oplossing van het oxydatieprodukt in aceton waterige alkalienbsp;toe te voegen lichtte deze gedurende korte tijd sterk blauw. Na afloopnbsp;was hij in staat in de oplossing 3-amino aan te tonen door er eennbsp;oxydatiemiddel aan toe te voegen, waarbij de bekende chemoluminescentienbsp;van 3-amino optrad. Dit is de enige aanwijzing voor een mogelijke terugvorming van het hydrazide bij de chemoluminescente reaktie. Ons inziensnbsp;staat echter de verklaring van deze proeven nog min of meer open ennbsp;kunnen ze niet zonder meer als bewijs dienen voor de terugvormingnbsp;van het hydrazide.

Door Drew28) werd een reaktieschema opgesteld, waarin, in tegenstelling met dat van Albrecht 47) aan peroxyd een essenti�le rol wordt toegekend. Inderdaad is, zoals we reeds gezien hebben, peroxydnbsp;nodig wil men een intensieve chemoluminescentie verkrijgen. Volgensnbsp;Drew wordt er allereerst een peroxydverbinding van het phtaalzuurhydrazide gevormd, dat na dehydrogenatie en afsplitsen van zuurstofnbsp;tot de beginstof terugvoert. Ergens op deze weg wordt het licht uitgezonden. Inderdaad gelukte het hem een peroxyd van enkele phtaal-zuurhydraziden te isoleren.

Het idee van een peroxyd vorming wordt nu tot op zekere hoogte gesteund door onze waarneming, dat bij de elektrolysemethode ondernbsp;optimale omstandigheden de intensiteit van de chemoluminescentie onafhankelijk is van de peroxydkoncentratie mits deze groter is dan denbsp;koncentratie van het phtaalzuurhydrazide. Ze neemt ten naaste bij evenredig met de peroxydkoncentratie af wanneer de koncentratie kleinernbsp;wordt dan die van het phtaalzuurhydrazide. Men zou hieruit kunnennbsp;besluiten, dat het de peroxydvorm van het molekuul is, welke reageert.nbsp;Tenslotte is er nog een tweede aanwijzing gelegen in het absorptie-spektrum: Door toevoegen van peroxyd aan een alkaliese oplossing vannbsp;het phtaalzuurhydrazide vermindert de absorptieko�ffici�nt in de naarnbsp;het rood aflopende tak van het absorptiespektrum met ca. 10 %.nbsp;Bijzonder duidelijk is dit bij de nitroverbinding, waar de kleur van denbsp;oplossing tengevolge van de toevoeging van peroxyd van goudgeel om-

slaat naar lichtgeel. Het is niet onmogelijk dat dit aan een peroxyd-vorming moet worden toegeschreven. Globale waarneming leert, dat molair een ��n a twee keer groter hoeveelheid peroxyd moet wordennbsp;toegevoegd dan van het phtaalzuurhydrazide aanwezig is, om de kleuromslag geheel tot stand te brengen. Verder toevoegen van peroxydnbsp;verandert de kleur niet meer.

Doordat er naast de eigenlijke chemoluminescente reaktie ook in belangrijke mate nevenreakties optreden, wordt aan het ophelderen van het reaktiemechanisme langs chemiese weg grote moeilijkheden in de wegnbsp;gelegd en is voor het verdere onderzoek een nauwe samenwerking tussennbsp;physici en chemici nodig.

HOOFDSTUK VI

BIOLUMINESCENTIE.

In dit hoofdstuk wordt de bepaling van de emissiespektra van enkele lichtbakteri�n en lichtende schimmels beschreven. Hieraan worden enigenbsp;algemene beschouwingen verbonden.

Bij de tot dusver in de literatuur gepubliceerde emissiespektra van lichtgevende mikro-organismen heeft men steeds volstaan met eennbsp;spektrale analyse van het licht, zoals dit door de betreffende kulturesnbsp;als geheel werd uitgezonden. De hieronder volgende uiteenzetting mogenbsp;doen inzien, dat het aldus verkregen resultaat niet bevredigend is, wanneer men zich tot taak stelt de spektrale energieverdeling van de straling,nbsp;welke door het lichtemitterende molekuul wordt uitgezonden zo nauwkeurig mogelijk vast te stellen.

We zagen toch reeds in de beide vorige hoofdstukken, dat het bij het bepalen van het spektrum van het licht, uitgezonden bij chemiese reakties,nbsp;steeds nodig is dit te korrigeren op de absorptie, die het licht in denbsp;oplossing ondergaat. Bij lichtende bakteri�n, schimmels enz. is het nunbsp;niet mogelijk deze korrektie op eenvoudige wijze aan te brengen, doordatnbsp;er naast absorptie ook een sterke en min of meer selektieve verstrooiingnbsp;optreedt van het licht aan de cellen, die zich op de weg van het uittredende licht bevinden, welke de weglengte vergroot. Bovendien is denbsp;absorptie in en buiten de cel verschillend. Het is daardoor niet duidelijknbsp;voor welke laagdikte een korrektie moet worden aan gebracht en evenminnbsp;welke absorptieko�ffici�nt in rekening moet worden gebracht. Het enigenbsp;middel, dat ons ten dienste staat om toch het zuivere emissiespektrumnbsp;te bepalen, is het beperken van de absorptie tot een minimum. Bij denbsp;lichtbakteri�n kan dat gedaan worden door met zeer verdunde suspensiesnbsp;te werken, zoals in � 2 zal worden uitgewerkt. In zulke suspensies treedtnbsp;weliswaar nog een aanzienlijke verstrooiing van het licht door de cellennbsp;op, doch deze all��n veroorzaakt geen vertekening van het spektrum,nbsp;doordat de cellen hun licht in alle richtingen gelijkmatig uitzenden.

hechten als aan de spektra verkregen van chemoluminescente reakties. Het is namelijk in laatste instantie altijd nog het emissiespektrum vannbsp;een bakteriecel en dus reeds vertekend door de absorptie, die het lichtnbsp;in de cel zelf ondergaat door de daarin voorkomende gekleurde cel-hestanddelen.

In welke mate dit het geval is, kan niet met zekerheid gezegd worden, zolang we de inwendige struktuur van de bakteriecel en de verdelingnbsp;van de erin aanwezige kleurstoffen niet kennen. Het is echter wel mogelijknbsp;om met de kennis, die ons op het ogenblik ter beschikking staat, eennbsp;schatting te maken van de grootte-orde ervan, waarbij het blijkt, datnbsp;de absorptie in ��n cel naar alle waarschijnlijkheid niet meer dan enkelenbsp;procenten zal bedragen:

Van de gekleurde stoffen, die in elke bakteriecel voorkomen zijn de haemineverbindingen (fermenthaemine, cytochromen) en het lactoflavinenbsp;de meest bekende. Deze spelen een rol in het ademhalingsproces van denbsp;cel en komen in hoofdzaak aan eiwitten gebonden voor. De haemine-verbindingen bezitten absorptiebanden in het zichtbare gebied. Lactoflavine, vitamine B2 is een gele kleurstof met een breed absorptiemaximumnbsp;bij 4450 A, dat in betrekkelijk grote hoeveelheden in de cel aanwezig is.nbsp;De overige celbestanddelen: water (ca. 80%), eiwitten (ca. 10%),nbsp;koolhydraten, anorganiese verbindingen en lipo�den absorberen eerst innbsp;het ultraviolet met uitzondering van de lipo�den, die soms zwak geelnbsp;gekleurd zijn en een geringe absorptie in het violet bezitten. We kunnennbsp;ons daarom in hoofdzaak tot de aan eiwitten gebonden kleurstoffennbsp;bepalen.

Van de absorptie, die in een bakteriecel optreedt tengevolge van de aanwezigheid van lactoflavine, kunnen we een schatting maken, wanneernbsp;we onderstellen, dat ze homogeen over de cel verdeeld is: Volgens denbsp;metingen van Rot tier 52) bevatten lichtbakteri�n ca. 40 y lactoflavinenbsp;per gram natte bakteri�n¹). Bij een homogene verdeling bedraagt dannbsp;de koncentratie van de kleurstof 10^'^ grm/cm^ (mol. gew. van lactoflavine = 367).

In de volgende globale berekeningen zullen we voor de verschillende celbestanddelen een soortelijk gewicht ��n aannemen en dus gewicht en volumen gelijk stellen.

Voor ^ ~ ^ wordt bijv. cd 400 keer zo groot en treedt er een absorptie op van de orde van 5 %.

Het lijkt dus alsof de absorptie willekeurig hoge waarde kan aannemen, wanneer r voldoende klein wordt. De volgende overwegingen stellen hieraan echter waarschijnlijk een grens; De kleurstoffen, die innbsp;de levende cel voorkomen, verrichten een bepaalde funktie en zijn daarbij,nbsp;zover men weet, steeds aan eiwitoppervlakken gebonden. De maximalenbsp;koncentratie van de kleurstof in de cel vinden we dan door het eiwitnbsp;als oppervlak ter dikte van ��n molekuul aanwezig te denken en ditnbsp;oppervlak geheel te bezetten met kleurstofmolekulen. De volumenverhouding van kleurstof en eiwit wordt dan gegeven door de verhoudingnbsp;in diameter der molekulen of door de derdemachtswortel uit de verhouding der molekulairgewichten. Nemen we voor de mol. gewichtennbsp;van kleurstof en eiwit resp. de waarden 400 en 10^ aan, dan wordtnbsp;deze verhouding 0,16. De maximale kleurstofkoncentratie bedraagt dannbsp;0,16nbsp;400

eiwit bestaat, is bij de meest gekoncentreerde verdeling der kleurstof deze aanwezig in een bolletje met een straal, die de helft is van die

Bij een dergelijke struktuur van de eiwitoppervlakken in de bakteriecel bevindt zich op elk eiwitmolekuul ca. 40 kleurstofmolekulen, terwijl mennbsp;als regel aanneemt, dat ��n of enkele kleurstofmolekulen aan ��n eiwitmolekuul gebonden zijn. Daardoor wordt het waarschijnlijk, dat de hierboven gegeven bovenste grens voor de absorptie vele malen te groot isnbsp;en we zeker geen absorptie behoeven te verwachten, die de waarde vannbsp;10 % overschrijdt.

In � 2 geven we op grond van experimentele gegevens n�g een schatting van de betreffende absorptie.

Lichtbakteri�n kan men veelal isoleren uit zeewater en met vrij grote regelmaat van dode zeevis. Nagenoeg alle soorten lichtbakteri�n zijnnbsp;dan ook zoutwatervormen. Men kweekt ze in vloeibare voedingsmedianbsp;of op vaste voedingsbodems (agar agar, gelatine). De groei geschiedtnbsp;zeer snel, zodat men als regel een dag na het enten over een goednbsp;lichtende kuituur beschikt.

Bij voldoend lage dichtheid van een bakteriesuspensie is de kleur van het uitgezonden licht blauwgroen. Bij grote dichtheden is de kleur groennbsp;door een sterker absorptie van het blauwe deel van het spektrum. Denbsp;twee bakteriesoorten, waarvan het spektrum werd opgenomen, zijn vrijnbsp;makkelijk lichtsterk te verkrijgen.

Ph. ¹) phosphoreum werd gekweekt in een aeratiekolf in een voedingsmedium met 2 % pepton, 1 % NaNOs en 2 % NaCl, Ph. splendidum in staande kolven in eennbsp;voedingsmedium met 10 % gistautolysaat, 1 % NaNOs en 2 % NaCl. Na ca. 20 uurnbsp;werden de bakteri�n afgecentrifugeerd en gesuspendeerd in 0,125 molair phosphaatbuffernbsp;van Pjj = 7,5 met 3 % glucose en 1 % NaNOs. De suspensie werd met lucht ge-aereerd en in een kuvet voor de spektrograaf geplaatst. De achterwand van de kuvetnbsp;was als regel zwart geverfd om een vergroting van de weglengte door reflektie tenbsp;voorkomen.

De belichtingstijd bedroeg voor de meest verdunde suspensie twaalf uur bij een spleetbreedte van de spektrograaf van 0,3 mm (zie blz. 41).

In fig. 33 zijn verschillende emissiespektra van Ph. phosphoreum weergegeven. De spektra A en B hebben betrekking op suspensies met een dichtheid van resp. 2 en 8 mm3 natte bakteri�n²) per cm3, beide opgenomen in een laagdikte van 1 cm. Het spektrum C werd opgenomennbsp;in een gewit kuvet bij een dichtheid van 40 mm3/cm3.

Het verschil tussen de spektra A en B is zeer gering: voor A lt; 4600 A ligt spektrum A 10 a 15 % hoger dan spektrum B, voor Agt; 4600 Anbsp;valt het verschil binnen de meetfout en bedraagt minder dan 3 %. Blijkbaar is bij deze dichtheden de absorptie van het licht tengevolge vannbsp;het doorlopen van meerdere bakteriecellen te verwaarlozen in het gebiednbsp;boven 4600 A. Beneden 4600 A bewerkt een vier keer groter absorptienbsp;een intensiteitsafname van 10 l� 15 %. Deze intensiteitsvermindering komtnbsp;overeen met drie keer de absorptie, die nog in spektrum A aanwezig is,nbsp;welke laatste dus 3 .a 5 % bedraagt in het beschouwde golflengtegebied.

De aldus aangegeven dichtheid heeft betrekking op het volumen der bakteri�n na centrifugeren in een Tromsdorff-buisje.

Doordat het spektrum A het gemiddelde is van meerdere spektra en meerdere opnamen is de nauwkeurigheid ervan groter dan de 5 %, welkenbsp;men als regel bij de fotografiese intensiteitsmeting bereikt en we schattennbsp;deze nauwkeurigheid op 3 %. We kunnen dit spektrum identificeren metnbsp;het gemiddelde spektrum, dat door een bakteriecel wordt uitgezonden.nbsp;met uitzondering van het gebied beneden 4600 A, waar dit laatste 3 a 5 %nbsp;hoger gelegen zal zijn.

C..

\ '

gt;

1! /

/ ?

*gt;

A �'

ll �: i

\ \

ifi

Fig. 33. Emissiespektrum van Ph. phosphoreum.

A. nbsp;nbsp;nbsp;dichtheid 2 mm^/cm�, laagdikte 1 cm.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;D. emissiespektrum volgens E y m e r s

B. nbsp;nbsp;nbsp;dichtheid 8 maP/cnP, laagdikte 1 cm.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;en van Schouwenburg

C. nbsp;nbsp;nbsp;dichtheid 40 mm�/cm�, gewit kuvet.

Uit het verschil tussen de spektra A en B kunnen we tevens een ruwe schatting maken van de absorptie door ��n bakterie: Bij een dichtheidnbsp;van 2 mm3 pgj- cmS doorloopt het licht een weg van 20 p in de bakteri�n,nbsp;wanneer het rechtlijnig door een 1 cm dikke laag van de suspensie gaat.nbsp;De gemiddelde weglengte van het uittredende licht is, wanneer er geennbsp;verstrooiing optreedt, 0,5 cm, wat overeenkomt met een weg van 10 pnbsp;in de bakteri�n. Tengevolge van de verstrooiing wordt de gemiddeldenbsp;weg langer en verandert tevens de verhouding van de weglengten, afgelegd in en buiten de bakteriecel. Van dit laatste effekt is het moeilijknbsp;iets te zeggen, daar het bepaald wordt door het verloop van de brekingsindex in de bakterie. We nemen daarom aan, dat het licht bij spektrum Anbsp;gemiddeld door tien bakteriecellen is gegaan. De absorptie, die hiervannbsp;het gevolg is, bedraagt zoals we zagen maximaal 5 %, zodat uit dezenbsp;schatting volgt, dat de absorptie door ��n bakterie maximaal j/2 %nbsp;bedraagt.

suspensies en kleine laagdikte gewerkt wordt blijkt in fig. 33 uit kromme C, bepaald bij hoge koncentratie en grote laagdikte. Voornbsp;A, gt; 5500 A kan men kromme C laten samenvallen met A en B. Waarschijnlijk is de absorptie in dit gebied te verwaarlozen. Van 55 tot 5100 Anbsp;treedt een zwakke absorptie op, terwijl beneden 4800 A een gelijkmatigenbsp;vrij sterke absorptie aanwezig is.

Door Eymers en van Schouwenburg 40) werd in 1936 een emissiekromme van Ph. phosphoreum gepubliceerd, dat van het doornbsp;ons bepaalde spektrum A afwijkt en in fig. 33 als kromme D is weergegeven. Bij 5400 A vertoont het een nevenmaximum, dat door ons nooitnbsp;werd gevonden. Wanneer we van dit nevenmaximum afzien, ligtnbsp;kromme D tussen de krommen A en C in en we moeten dan ook besluiten, dat bij de bepaling van het emissiespektrum door Eymers ennbsp;van Schouwenburg de dichtheid van de suspensie te groot isnbsp;geweest. Behalve dit spektrum werden door hen later ook andere emissie-spektra voor Ph. phosphoreum gevonden, die beter overeenstemmen metnbsp;het door ons bepaalde spektrum. Onder andere ontbreekt daarin alsnbsp;regel het nevenmaximum. Deze werden echter niet gepubliceerd.

Op geheel dezelfde wijze als voor Ph. phosphoreum bepaalden we het emissiespektrum van Ph. splendidum. De opname geschiedde bij eennbsp;dichtheid van 6 en 18 mm^/cm^ in een laagdikte van 0,5 cm. Het spektrumnbsp;bij dichtheid 6 is in fig. 34 weergegeven tesamen met spektrum A vannbsp;Ph. phosphoreum. Voor X gt; 4500 A was er geen systematiese afwijkingnbsp;tussen de spektra bij dichtheid 6 en 18. Bij 4400 A lag het spektrumnbsp;behorend bij de kleinste dichtheid 5 % boven het andere, bij 4300 A

/ y / /

t /

! / ti

f�

\ \

\ N

5000 nbsp;nbsp;nbsp;6�OOA

Fig. 34. Emissiespektra lichtbakteri�n.

----Ph. phosphoreum

- Ph. splendidum

16 % en bij 4200 A 30 %. Het verschil tussen de beide spektra komt in dit geval overeen met twee keer de absorptie, die nog in het spektrumnbsp;bij dichtheid 6 aanwezig is. Het emissiespektrum van ��n bakterie ligtnbsp;daardoor bij 4400 A 2^ % boven het in fig. 34 weergegeven spektrum,nbsp;bij 4300 A 8 % en bij 4200 A 15 %. Brengt men in fig. 34 in de spektranbsp;van Ph. phosphoreum en Ph. splendidum de betreffende korrekties aan,nbsp;dan veranderen deze nauwelijks, De gekorrigeerde gedeelten der spektranbsp;zijn door een dun getrokken, resp. gepunte lijn aangegeven.

In tegenspraak met de waarneming van Eymers en van Schouwenburg 45)^ die vermelden, dat de emissiespektra van Ph. phospho~ reum en Ph. splendidum identiek zijn, blijkt uit fig. 34, dat dit niet hetnbsp;geval is: Het emissiespektrum van Ph. phosphoreum is smaller en valtnbsp;naar het violet steiler af, terwijl het maximum 150 A naar het violetnbsp;verschoven is ten opzichte van dat van Ph. splendidum. Daar we, zoalsnbsp;in de vorige paragrafen gebleken is, de emissiespektra met een hoge matenbsp;van waarschijnlijkheid mogen identificeren met de spektra der betreffendenbsp;chemoluminescente reakties, komen we tot de gevolgtrekking, dat wenbsp;bij de twee bakteri�n met verschillende emitterende molekulen hebbennbsp;te maken.

Fig. 34 doet ons denken aan fig. 18 op blz. 50, waarin de chemo-luminescentiespektra van 3-amino- en 3-aceetamidophtaalzuurhydrazide analoge verschillen vertonen; Het spektrum van 3-amino is smaller dannbsp;dat van 3-aceetamido en valt naar het violet steiler af. Het maximumnbsp;ligt op dezelfde plaats. Bij 3-acetylcarbamido is ook het maximum naarnbsp;langer golflengte verschoven.

Het is dus zeer goed mogelijk, dat het emitterend molekuul bij Ph. phosphoreum en Ph. splendidum in hoofdzaak hetzelfde is en hetnbsp;verschil uitsluitend in een zijketen of substituent optreedt. Men treftnbsp;een dergelijk verschil in struktuur bij eenzelfde funktie van het molekuulnbsp;in de biologie meermalen aan. Bijvoorbeeld is dat het geval voor chloro-phyl a en b in de groene planten en voor vitamine E bij dieren. Denbsp;verschillende molekuulvormen komen daar in hetzelfde organisme naastnbsp;elkaar voor. De mogelijkheid, dat ook bij ��n lichtbakteriesoort meernbsp;dan ��n vorm van het emitterend molekuul voorkomt, kunnen we daaromnbsp;niet uitsluiten.

Daarnaast bestaat de mogelijkheid, dat het emitterend molekuul wel hetzelfde is in de twee gevallen en het verschil in spektrum moet wordennbsp;toegeschreven aan een verschillend dragereiwit, waaraan dit molekuulnbsp;is gebonden. Een dergelijke invloed op het ahsorptiespektrum is wel bekend: Bij in de natuur voorkomende kleurstoffen verschuift het absorptie-spektrum door de eiwitbinding naar langer golflengte. Uit metingen innbsp;de Biophysiese werkgroep verricht door Dr. E. K a t z en Dr. E. C.

W a s s i n k, bleek dat bij bacteriochlorophyl een verschuiving van ca. 200 A optreedt, bij bacterioviridine zelfs van ca. 1000 A^^).

Nog v��r het bekend was, dat de emissiespektra van Ph. phosphoreum en Ph. splendidum verschillend zijn, was uit door van der Kerknbsp;en mij verrichte metingen gebleken, dat hun inaktiveringsspektra duidelijknbsp;verschilden ^4),

Wanneer lichtbakteri�n uitwendig bestraald worden door violet of ultraviolet licht wordt de eigen emissie der bakteri�n ten dele gedoofd.nbsp;In de loop van enkele uren herstelt zich de eigen emissie weer geleidelijk.nbsp;De dovende werking hangt af van de golflengte van het gebruikte lichtnbsp;en wordt door van der Kerkse) toegeschreven aan de absorptienbsp;door en de ontleding van een voor de lichtemissie noodzakelijke stof.nbsp;In het inaktiveringsspektrum is nu de dovende werking per ingestraaldnbsp;quant uitgezet tegen de golflengte van het ingestraalde licht en mennbsp;kan aannemelijk maken, dat dit spektrum het absorptiespektmm voorsteltnbsp;van het lichtgevoelige molekuul, dat tengevolge van de bestraling wordtnbsp;ontleed.

In � 4 zullen we de vraag naar het lichtemitterend en het licht-absorberende molekuul nader onder het oog zien. Hierop vooruit lopende vermelden we nu reeds dat van der Kerkse) op grond van denbsp;voorstellingen, die men zich van het bioluminescentieproces maakt, meentnbsp;dat het lichtgevoelige molekuul nauw verwant is aan het emitterendnbsp;molekuul. Zelfs kan men zich van het bioluminescentieproces en hetnbsp;fotochemies ontledingsproces een zodanige voorstelling maken, dat hetnbsp;emitterend resp. absorberend molekuul identiek zijn (zie blz. 95). Omnbsp;die redenen zijn in fig. 33 de emissiespektra van Ph. phosphoreum ennbsp;Ph. splendidum uitgezet tegen het golf getal (energie in quanta) en zijnnbsp;in dezelfde figuur ook de inaktiveringsspektra van deze bakteri�n getekend. We hebben hier in ��n figuur het emissiespektrum van hetnbsp;emitterend molekuul en het absorptiespektrum van het lichtgevoeligenbsp;molekuul en willen nagaan in hoeverre er spiegelsymmetrie tussen dezenbsp;spektra optreedt. In deze gedachtengang identificeren we het emissiespektrum stilzwijgend met het fluorescentiespektrum van het betrokkennbsp;molekuul. We zien nu, dat er inderdaad een zekere mate van spiegelsymmetrie bestaat: Zowel bij Ph. phosphoreum als bij Ph. splendidumnbsp;eindigt het emissiespektrum, waar het inaktiveringsspektrum begint. Denbsp;inaktiveringsspektra der verschillende bakteriesoorten vertonen wat denbsp;spektrale ligging betreft, onderling hetzelfde verschil als de emissiespektra. Het einde van het emissiespektrum bij hoog golfgetal en hetnbsp;begin van het inaktiveringsspektrum van Ph. splendidum zijn beide naarnbsp;groter golfgetal verschoven ten opzichte van die van Ph. phosphoreum.

Wat de vorm der spektra betreft is er evenwel geen volledige symmetrie aanwezig: bij Ph. phosphoreum is de helling in het emissiespektrum

groter dan in het inaktiveringsspektrum. Bij Ph. splendidum is juist het omgekeerde het geval.

We mogen dus uit fig. 35 niet zonder meer de gevolgtrekking maken, dat de twee verschillende soorten spektra bij hetzelfde molekuul behoren.nbsp;Echter kan men de waargenomen kwalitatieve spiegelsymmetrie wel alsnbsp;argument gebruiken voor een nauwe verwantschap, zo niet identiteitnbsp;van het emitterende en het bij de fotochemiese ontleding absorberendenbsp;molekuul.

Voor een uitvoerige behandeling van het bioluminescentieproces, voor zover het de chemiese reaktie betreft, welke eraan ten grondslag ligt,nbsp;verwijzen we naar het proefschrift van G. J. M. van der Kerk54).nbsp;Sinds Duboises) (1885) stelt men zich voor, dat bij de lichtreaktienbsp;twee stoffen zijn betrokken, een laagmolekulaire en een hoogmolekulairenbsp;(eiwit), die men de namen luciferine en luciferase heeft gegeven. Voornbsp;sommige organismen o.a. het kreeftje Cypridina hilgendorlii kon mennbsp;deze stoffen in meer of minder zuivere toestand uit de cel isoleren. Denbsp;reaktie, waarbij het licht wordt uitgezonden, is een oxydatie van luciferinenbsp;door zuurstof, waarbij luciferase als katalysator optreedt.

In de loop van de jaren is door de Amerikaanse onderzoekers E. N. Harvey e.m. enerzijds en de medewerkers van de Biophysiesenbsp;werkgroep anderzijds deze reaktie nader gepreciseerd. Bij van dernbsp;Kerk neemt ze uiteindelijk de volgende gedaante aan:

Ludferine, LHg wordt aan het luciferase, A gebonden: ALH2. Dit verenigt zich met zuurstof tot het komplex ALH2O, dat een inwendigenbsp;oxydatie ondergaat. Het aan het luciferase gebonden oxydatieproduktnbsp;van het luciferine, AL^ ontstaat daarbij in aangeslagen toestand en zendtnbsp;het bioluminescentielicht uit:

Deze oxydatie is irreversibel. Het oxydatieproduct diffundeert van de katalysator weg en is verder voor het lichtproces verloren.

Doordat in dit schema het emitterend molekuul aan het luciferase oppervlak is gebonden, is het mogelijk om de zg. kruisingsproeven vannbsp;H arvey 29) te begrijpen. Uit deze proeven volgt nl., dat de kleur vannbsp;het uitgezonden licht bij nauw verwante lichtende organismen niet wordtnbsp;bepaald door het luciferine maar door het luciferase.

Naast deze irreversibele oxydatie treedt er in de cel ook een reversibele oxydatie van het luciferine op, waarbij het beurtelings geoxydeerd wordtnbsp;tot L en weer gereduceerd wordt tot LH2. Hierbij wordt .geen licht uitgezonden. Als zodanig speelt het een rol in het ademhalingsproces alsnbsp;overbrenger van waterstof. In de cel komt dus zowel L als LH2 voor.

Onder zeker voorbehoud komt van der Kerk tot de gevolgtrekking, dat bij de fotochemiese inaktivering het dehydroluciferine L het licht absorbeert, waardoor het reversibel wordt ontleed.

Volgens deze voorstelling is het bioluminescentiespektrum het emissie-spektrum van het kleurstof-eiwitkomplex AL^, het fotochemies inakti-veringsspektrum het absorptiespektrum van dehydroluciferine, L. De spektra in fig. 35 hebben dus betrekking op twee nauw verwante mole-kulen, Li en L, waarvan het eerste aan een eiwit gebonden is, het tweedenbsp;evenwel niet. Daar een binding aan een eiwit als regel een verschuivingnbsp;van het spektrum naar groter golflengte met zich brengt, geven we ernbsp;de voorkeur aan te onderstellen, dat ook het L aan een eiwit gebonden isnbsp;(eventueel aan hetzelfde als Li). In dat geval kan men namelijk denbsp;waargenomen kwalitatieve spiegelsymmetrie beter begrijpen op grondnbsp;van de nauwe verwantschap tussen de molekulen L en L^.

Naar aanleiding van hetgeen in hoofdstuk II werd besproken, kunnen we evenwel het eigenlijke lichtproces ook anders voorstellen. We zagennbsp;daar nl., dat aan oppervlakken geadsorbeerde fluorescerende kleurstoffennbsp;het verschijnsel der chemofluorescentie door overdracht kunnen vertonen. In de cel komen dergelijke systemen veelvuldig voor, nl. als eiwit-oppervlakken waaraan kleurstoffen gebonden zijn. We kunnen ons hetnbsp;bioluminescentieproces daarom ook z� voorstellen, dat niet de stof, dienbsp;aan het luciferase oppervlak geoxydeerd wordt het licht uitzendt, maarnbsp;dat de reaktie-energie overgedragen wordt aan een fluorescerende kleurstof, die aan hetzelfde oppervlak gebonden is en die het als fluorescentie-licht emitteert. Het op het ogenblik aanwezige experimentele materiaal

over de bioluminescentie in bet algemeen staat het niet toe deze chemo-fluorescentie door overdracht te onderscheiden van de direkte chemo-luminescentie, zoals deze door van der Kerk verdedigd wordt.

In wezen verschilt de eerstgenoemde voorstelling zeer weinig van die van Harvey 56) en medewerkers, volgens welke het lucif erase tengevolge van de oxydatie van luciferine in aangeslagen toestand zou geraken en het bioluminescentielicht zou uitzenden. Het enige verschil is,nbsp;dat in onze voorstelling niet het luciferase zelf, maar een eraan gebondennbsp;kleurstof de energie opneemt. In beide gevallen kan men inzien, dat denbsp;kleur van het uitgezonden licht weer bepaald wordt door het luciferase.nbsp;Dit is ook de reden waarom de Amerikaanse onderzoekers steeds vasthouden aan het idee, dat luciferase het emitterend molekuul is.

Wanneer er direkte en indirekte chemoiuminescentie naast elkaar in bioluminescente systemen optreedt of wanneer er meer dan ��n fluorescerende kleurstof aanwezig is,nbsp;bestaat de mogelijkheid, dat het emissiespektrum voor eenzelfde organisme bij verschillende behandeling verschillend kan zijn, namelijk afhankelijk van de koncentratienbsp;van de betreffende kleurstoffen. In dit verband merken we evenwel op, dat het emissiespektrum van Ph. phosphoreum in de loop van enkele jaren niet veranderde, terwijlnbsp;Eymers en van Schouwenburg vaststelden, dat het spektrum onafhankelijknbsp;was van ouderdom, temperatuur, en zoutgehalte van de kuituur.

Wanneer men de zo juist gegeven voorstelling van het biolumines-centieproces als een chemofluorescentie door overdracht aanvaardt en tevens diepere betekenis toekent aan de kwalitatieve symmetrie van hetnbsp;emissie- en het inaktiveringsspektrum, komt men tot de gevolgtrekking,nbsp;dat het bij de inaktivatie absorberende molekuul, evenmin als dat bij denbsp;lichtemissie het geval is, een zel[ bij de lichtreaktie betrokken molekuulnbsp;kan zijn. We komen dan tot de door van der Kerk verworpennbsp;gedachte van een gesensibiliseerde fotochemiese reaktie. Door hem wordtnbsp;reeds vermeld, dat de Amerikaanse onderzoekers Chase ennbsp;Gies e5t) bij Cgpridina-lucileiine konden aantonen, dat de fotochemiese ontleding daarvan wel op sensibilisatie berust: Het gezuiverdenbsp;luciferine wordt niet fotochemies ontleed, wel echter na toevoegen vannbsp;een kleurstof (lactoflavine, eosine e.a,). Hoewel het niet zeker is, datnbsp;het inaktiveringsproces bij lichtbakteri�n op dezelfde manier verlooptnbsp;als bij Cypridina-luciferine, rechtvaardigt genoemd onderzoek toch omnbsp;deze mogelijkheid ook bij de lichtbakteri�n onder het oog te zien.

De eenvoudigste voorstelling, die we ons dan kunnen maken is, dat de aan het luciferase gebonden kleurstof, welke het bioluminescentielichtnbsp;uitzendt, ook het fotochemies aktieve licht absorbeert en de aanslag-energie overdraagt aan een direkt of indirekt bij de lichtreaktie betrokkennbsp;molekuul, dat aan hetzelfde eiwit gebonden is en dat hierdoor wordtnbsp;ontleed. Wat de inaktivering zelf betreft zou dan kunnen worden vastgehouden aan de door van der Kerk voorgestelde hypothese, nl.nbsp;dat het dehydroluciferine, L wordt ontleed.

Het bezwaar dat door van der Kerk terecht tegen de hier beschreven sensibilisatie wordt gemaakt is, dat door het tussenschakelen van een overdrachtsmechanisme het moeilijker is in te zien, dat de doornbsp;hem gedefinieerde fotochemiese werking evenredig is met het totalenbsp;aantal ingestraalde quanten, zoals men dat bij de lichtbakteri�n waarneemt. Echter laten zich wel omstandigheden denken, waarbij het verloopnbsp;van een gesensibiliseerde fotochemiese ontleding hetzelfde is als van eennbsp;direkte ontleding, zodat genoemd bezwaar niet zo ernstig moet wordennbsp;opgevat.

Tenslotte vermelden we nog de mogelijkheid, dat de inaktivering op een ontleding van de fluorescerende kleurstof zelf berust. De dovendenbsp;werking van de bestraling op de eigen emissie der bakteri�n moet dannbsp;worden toegeschreven aan het verdwijnen van de fluorescerende acceptornbsp;van de bij de oxydatie van luciferine vrijkomende energie. Deze vormnbsp;van inaktivatie treedt bij Cypridina niet op, daar ze neer zou komen opnbsp;een inaktivatie van het luciferase, welke men niet heeft gevonden s��).nbsp;Daarom zullen we op deze mogelijkheid hier niet verder ingaan.

Het bekende lichten van dood hout wordt hier te lande doorgaans veroorzaakt door het mycelium van de honingzwam, Armillaria mellea.nbsp;Ook de mycelia van sommige andere zwammen, o.a. Mycena polygramma,nbsp;Omphalia flavida, Clitocybe olearia, kunnen onder daartoe gunstigenbsp;voorwaarden lichtend zijn. Meestal is het lichten z��r zwak, zodat eennbsp;goede donkeradaptatie nodig is om het te zien. De kleur van het lichtnbsp;kan men bij deze lage intensiteit evenwel niet vaststellen.

Sedert enkele jaren verzamelt Dr. W a s s i n k voor de Biophysiese werkgroep verschillende lichtende schimmels. Het gelukte hem van denbsp;bovengenoemde vier soorten kuituren te kweken, die voldoende lichtsterk waren om de bepaling van het spektrum mogelijk te maken. Denbsp;voorlopige resultaten van de opname van drie van deze schimmels gevennbsp;we hier beknopt weer. Binnenkort zal een uitgebreider verslag van ditnbsp;werk elders worden gepubliceerd.

Het lichtend mycelium van de op kersen- of brood-agar gekweekte schimmels is zuiver wit van kleur, zodat een belangrijke vertekening vannbsp;het spektrum door absorptie niet is te verwachten. De lichtende laagnbsp;bezit bovendien een geringe dikte.

A. mellea en M, polygramma werden opgenomen met de nog onveranderde spektrograaf bij een spleetbreedte van 0,3 mm en een belichtingstijd van 60 uur. O. flavida werd gedurende 12 dagen opgenomen met de vier keer lichtsterker inrichting van de spektrograaf. Toch was denbsp;zwarting van de fotografiese plaat voor de laatste twee schimmels nognbsp;gering (10%�25 %) en zijn de bepaalde spektra daardoor minder

nauwkeurig dan men als regel met de fotografiese intensiteitsmeting kan bereiken.

A. mellea. Vergelijken we het spektrum met dat van de lichtbakteri�n in fig. 34, dan zien we, dat het bij groter golflengte is gelegen. Hetnbsp;maximum van emissie ligt in het groen, namelijk bij 5250 A, de violet-grens bij ca. 4700 A. Waar de kleur van het door de lichtbakteri�nnbsp;uitgezonden licht blauwgroen is, zal die van de schimmels geelgroen zijn.nbsp;In vorm vertoont het spektrum de meeste overeenkomst met het spektrumnbsp;van Ph. splendidum, hoewel de halfwaardebreedte geringer is.

Door Coblentz en Hughes ^8) werd eveneens het emissie-spektrum van lichtend hout opgenomen. Dit valt in hoofdzaak samen met het door ons bepaalde spektrum (maximale afwijking ca. 10%).

M. polygramma. In het golflengtegebied van 4850 A tot 5800 A valt het spektrum binnen 5 % samen met dat van A. mellea. Het verschilnbsp;van 10 %, dat boven 5800 A optreedt is niet groter dan de onnauwkeurigheid bij de meting. Deze was vrij groot, doordat de zwarting dernbsp;fotografiese plaat boven 5800 A slechts 10�15 % bedroeg.

O. llavida. In het golflengtegebied van 4900 A tot 5300 A valt het spektrum binnen 5 % samen met dat van de beide andere schimmels.nbsp;Boven 5300 A ligt het 15 % lager dan dat van A. mellea. Of dit verschil

re�el is zal door een nauwkeuriger bepaling van het emissiespektrum moeten worden uitgemaakt.

We zien dus, dat de spektra van de drie schimmels zeer weinig verschillen en misschien zelfs identiek zijn. Het is dus zeer goed mogelijk, dat we bij alle drie met hetzelfde emitterende molekuul te maken hebben.

Door Eymers en van Schouwenburg werden de emissiespektra van enkele lichtende organismen en chemoluminescentenbsp;reakties tegen de frequentie uitgezet en in twee of drie symmetriesenbsp;krommen geanalyseerd. Ze gingen daarbij uit van de gedachte, dat dezenbsp;symmetriese krommen door verbreding uit zogenaamde grondfrequentiesnbsp;zouden zijn ontstaan. De op deze wijze voor de verschillende biolumines-centie-spektra verkregen grondfrequenties bleken gelijk of nagenoegnbsp;gelijk te zijn, zij het dat zij in deze spektra met verschillende intensiteits-verhoudingen optraden. Een verdere wetmatigheid meenden zij te mogennbsp;zien in de omstandigheid, dat de voor deze spektra vastgestelde grondfrequenties eveneens werden aangetroffen bij een overeenkomstigenbsp;analyse van de spektra van enkele chemoluminescente reakties (3-amino-phtaalzuurhydrazide en dimethyldiacridyliumnitraat).

Afgezien van het feit, dat de door hen voor de analyse gebruikte spektra later voor een deel onjuist zijn gebleken, maakt de hierondernbsp;volgende overweging het hoogst onwaarschijnlijk, dat een dergelijke wetmatigheid zou optreden.

Zoals we in hoofdstuk I gezien hebben, moeten we het emissiespektrum inderdaad opvatten als te zijn op gebouwd uit meer of minder symmetriesenbsp;trillingsbanden. De spektrale ligging van het trillingsbandensysteemnbsp;hangt af van de grootte van de elektronenovergang. Deze kan, zoalsnbsp;we ook in hoofdstuk V bij de phtaalzuurhydraziden zagen, met kleinenbsp;bedragen veranderen, wanneer men kleine veranderingen in het emitterend molekuul aanbrengt. Het optreden van dezelfde frequenties metnbsp;verschillende intensiteitsverhoudingen in verschillende spektra zou betekenen, dat bij verwante molekulen de grootte van de elektronenovergang niet veranderde, wel de intensiteitsverdeling over de trillingsbanden. Hoewel dit niet uitgesloten is, moeten we toch verwachten, datnbsp;als regel ook de elektronenovergang zal veranderen en dus eveneens denbsp;frequenties der trillingsbanden. Gelijke grondfrequenties zal men dusnbsp;wanneer men te maken heeft met ��n emitterend molekuul, in het algemeen niet kunnen verwachten.

Verder kan men als regel de bandenstruktuur niet meer in het spektrum terugvinden en zal een analyse niet mogelijk zijn.

Intussen is het niet mogelijk om voor de theorie der symmetriese grondfrequenties een andere in de plaats te stellen en kan voorlopig tussen spektrum en molekuulbouw nog geen verband worden gelegd. Enerzijds

vindt dit zijn oorzaak in het weinig karakteristieke der emissiespektra, anderzijds in het ook in hoofdstuk V duidelijk naar voren gekomen feit,nbsp;dat naverwante molekulen vrij sterk uiteenlopende spektra kunnennbsp;bezitten.

Slechts wanneer de bouw van het molekuul in grote trekken bekend is, zal het nu reeds mogelijk zijn om uit het spektrum nadere bijzonderheden aangaande die bouw te voorspellen.

Daarnaast blijft altijd de mogelijkheid bestaan, dat men in een bepaald geval het emissiespektrum herkent als het fluorescentiespektrum van eennbsp;bekend molekuul en een directe identifikatie van het emitterend molekuulnbsp;mogelijk is. Naarmate van meer stoffen de fluorescentiespektra nauwkeurig bepaald worden, zal de mogelijkheid van een identifikatie langsnbsp;deze weg worden vergroot.

De processen van absorptie- en fluorescentie worden behandeld aan de hand van in de literatuur voorkomende gegevens.

Het absorptiespektmm van een onverzadigd organies molekuul in oplossing moet i.h.a. worden toegeschreven aan een beperkt aantalnbsp;elektronenovergangen in het molekuul als geheel of in een gedeelte vannbsp;dit molekuul. De voornaamste oorzaken voor de verbreding van de afzonderlijke trillingsbanden, behorend bij ��n elektronenovergang wordennbsp;aangegeven.

Het [luorescentiespektmm van een organies molekuul in oplossing moet als regel aan slechts ��n elektronenovergang worden toegeschreven ennbsp;is, voor zover bekend, onafhankelijk van de golflengte van het ingestraalde licht. Hieruit volgt, dat de door de absorptie toegevoerdenbsp;trillingsenergie verdwenen is in een tijd, die kort is t.o.v. de levensduurnbsp;van de aangeslagen toestand. Naast de fluorescentie kunnen verschillende stralingsloze processen optreden. Een hoog fluorescentierendementnbsp;wordt toegeschreven aan een kleine waarschijnlijkheid voor dezenbsp;processen.

Wanneer men absorptie- en fluorescentiespektra uitzet tegen de frequentie van het licht en de fluorescentieintensiteit uitdrukt innbsp;quanten/sek. zijn deze spektra in vele gevallen ongeveer spiegel-symmetries, in sommige gevallen zelfs geheel (Wet der spiegel-symmetrie). De voorwaarden waaraan het molekuul moet voldoen, wilnbsp;deze symmetrie optreden, worden behandeld (Hfdst. I).

De chemoluminescentieprocessen, die kunnen voorkomen worden onderscheiden in direkte en indirekte. De direkte chemoluminescentie wordt opgevat als een fluorescentie van het molekuul, dat bij de reaktie innbsp;aangeslagen toestand is ontstaan. Van indirekte chemoluminescentie ofnbsp;chemofluorescentie door overdracht zijn bij oplossingen geen voorbeeldennbsp;gevonden. Er wordt aangetoond, dat de waarschijnlijkheid voor dit procesnbsp;in een oplossing gering is.

Daarnaast kan een sekundair verschijnsel, chemofluorescentie door absorptie een rol spelen (Hfdst. II).

Bij het bepalen van emissiespektra wordt de nadruk gelegd op de noodzakelijkheid deze op absorptie te korrigeren.

temperatuur is een direkte chemoluminescentie. Het emissiespektrum hiervan werd bepaald (fig. 15).

Het bestaan van twee chemoluminescente reakties bij de oxydatie van �dimethyl� wordt aannemelijk gemaakt uit het feit, dat bij hoge temperatuur de kleur van het licht blauw, bij kamertemperatuur groenblauw is.nbsp;Het emissiespektrum bij lage temperatuur wordt geanalyseerd in eennbsp;groene en in een blauwe komponent (fig. 15). De groene komponent isnbsp;identiek met het fluorescentiespektrum van ,,dimethyl�. De mogelijkheidnbsp;wordt aangegeven, dat deze analyse de spektra weergeeft van de afzonderlijke reakties, waarbij twee verschillende molekulen in aangeslagennbsp;toestand ontstaan, o.a. het �dimethyl� zelf.

Absorptie- en fluorescentiespektrum van ,,dimethyl� en van methyl-acridon voldoen tot op grote hoogte aan de wet der spiegelsymmetrie (fig. 11 en 14). Het fluorescentiespektrum van ..dimethyl� is onafhankelijk van de golflengte van het ingestraalde licht. Voorts komen bij denbsp;chemoluminescente oxydatie van ,,dimethyl� als enige fluorescerendenbsp;stoffen ,,dimethyl� en methylacridon in het reaktiemengsel voornbsp;(Hfdst. IV).

De chemoluminescentiespektra van tien gesubstitueerde phtaalzuur-hydraziden en van pyromellietzuurhydrazide werden bepaald m.b.v. de elektrolysemethode (fig. 16�19).

Het spektrum van 3-aminophtaalz.hydr. werd eveneens bepaald bij oxydatie met peroxyd en haemine en blijkt onafhankelijk te zijn van denbsp;wijze, waarop de reaktie wordt uitgevoerd. Het spektrum van pyromellietzuurhydrazide wordt geanalyseerd in dat van het hydrazide zelfnbsp;en van een op de 4- en 5-plaats gesubstitueerd phtaalzuurhydrazide.

Voor de phtaalzuurhydraziden blijkt, dat de grootte van de elektronen-overgang, die plaats heeft bij de chemoluminescentie, toeneemt bij toenemende neiging van de substituent om aan het verdere molekuul een elektronenpaar af te geven.

Bij de van NH2 afgeleide substituenten zijn de spektra als regel breder dan bij de andere, welke verbreding aan elektromere verschijnselen innbsp;de substituent wordt toegeschreven. Ook het spektrum van pyromellietzuurhydrazide kan in dit verband worden begrepen.

Het chemoluminescentierendement bedraagt voor het sterkst chemoluminescente hydrazide, 3-amino, nog geen promille. Ook in dit verband wordt er op gewezen, dat er geen redenen zijn om aan te nemen, datnbsp;bij de chemoluminescente reaktie het oorspronkelijke molekuul wordtnbsp;teruggevormd.

De wijze waarop de chemoluminescentie-intensiteit afhangt van de koncentratie aan peroxyd en voorts de verandering van het absorptie-spektrum bij toevoegen van deze stof aan de oplossing van het hydrazide,nbsp;steunen de opvatting van Drew, dat zich primair een peroxyd vannbsp;het hydrazide vormt.

102

De fluorescentie- en absorptieeigenschappen van de hydraziden worden bestudeerd (fig. 22�32). Bij enkele der phtaalzuurhydraziden valt hetnbsp;maximum van het fluorescentiespektrum van de zure oplossing samennbsp;met dat van het chemoluminescentiespektrum. Bij andere is dat niet hetnbsp;geval. Voorts is met uitzondering van 4-aminophtz.hydr. het chemoluminescentiespektrum breder dan het fluorescentiespektrum van de zurenbsp;oplossing. Uit deze feiten wordt de gevolgtrekking gemaakt, dat het innbsp;de zure oplossing fluorescerende molekuul essentieel anders van bouwnbsp;is dan het molekuul, dat het chemoluminescentielicht uitzendt.

Bij de meeste hydraziden voldoen absorptie- en fluorescentiespektrum niet aan de wet der spiegelsymmetrie (Hfdst. V).

De emissiespektra van twee soorten lichtbakteri�n Ph. phosphoreum en Ph. splendidum werden bepaald waarbij de absorptie van het lichtnbsp;door andere cellen werd ge�limineerd (fig. 34). Aannemelijk wordtnbsp;gemaakt, dat de absorptie binnen de cel die het licht uitzendt, te verwaarlozen is en dat de gemeten spektra de spektra zijn van de betreffende chemoluminescente reakties. Voor de twee soorten bakteri�n blijkennbsp;de spektra verschillend te zijn. In fig. 35 worden ze vergeleken met denbsp;overeenkomstige inaktiveringsspektra, waarbij er een gedeeltelijke symmetrie blijkt op te treden.

Naast het door van der Kerk opgestelde schema, waarbij aan het luciferase gebonden, irriversibel geoxydeerde luciferine, AL^ hetnbsp;bioluminescentielicht uitzendt, het dehydroluciferine, L het fotochemiesnbsp;aktieve licht absorbeert, wordt de mogelijkheid naar voren gebracht, datnbsp;de bioluminescentie een chemofluorescentie is door overdracht van reaktie-energie aan een kleurstof, die aan het luciferase gebonden is en dienbsp;tevens als sensibilisator optreedt bij de fotochemiese inaktivatie.

De emissiespektra van drie lichtende schimmels, Armillaria mellea, Omphalia flamda en Mycena polygramma werden bepaald en blijkennbsp;nagenoeg identiek te zijn (fig. 36). Het spektrum ligt bij langer golflengte dan de spektra der lichtbakteri�n (Hfdst. VI).

LITERATUUROPGAVE.

1. nbsp;nbsp;nbsp;M o h 1 e r, H., Das Absorptionsspektrum der chemischen Bindung. Jena, 1943.

2. nbsp;nbsp;nbsp;F � r s t e r, Th., Die Lichtabsorption aromatischer Kohlenwasserstoffe. Zs. f.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Lewis, G. N. and Calvin, M., The color of organic substances. Chem.

5. nbsp;nbsp;nbsp;Kuhn, R. und Win ter stein. A., Ueber konjugierte Doppelbindungen I�IV.

7. nbsp;nbsp;nbsp;Ley, H. und S p e c k e r, H., Fluoreszenz- und Absorptionsmessungen bei Benzol-

derivaten insbesondere bei kondensierten Systemen. Zs. f. Wiss. Phot. 38, 13 en 96, 1939.

8. nbsp;nbsp;nbsp;Condon, E. U., Nuclear motions associated with electron transitions in diatomic

9. nbsp;nbsp;nbsp;Franck, J., Elementary processes of photochemical reactions. Trans. Far. Soc.

10. nbsp;nbsp;nbsp;Kirkbride, F. W. and Norrish, R. G. W., The photochemical properties

11. nbsp;nbsp;nbsp;T e r e n i n. A., La photoluminescence des molecules organiques a l'�tat gazeux.

12. nbsp;nbsp;nbsp;S z c z e n i o w s k i, S., Sur le rendement de la fluorescence des solutions. Bull.

13. nbsp;nbsp;nbsp;Photochemical Processes. A general discussion. Part I. Molecular spectra in relation

14. nbsp;nbsp;nbsp;L e w s c h i n, W. L., Das Gesetz der Spiegelkorrespondenz der Absorptions-

15. nbsp;nbsp;nbsp;L e w s c h i n, W. L., An attempt at a quantum interpretation of the mirror-

symmetry of absorption- and luminescence spectra. Acta Phys. chim. U.R.S.S. 6, 213, 1937.

16. nbsp;nbsp;nbsp;Nichols, E. L. and Merritt, E., Studies on luminescence, II. Phys. Rev. 18,

17. nbsp;nbsp;nbsp;Jablonski, A., Sur la repartition de l�intensit� dans le spectre de fluorescence

excit� par la lumi�re de diff�rentes longueurs d�onde. C. R. Soc. Pol. de Phys. 7, 1, 1926.

18. nbsp;nbsp;nbsp;S t a r k i e w i c z, J., I'lnfluence de la longueur d�onde du rayonnement excitateur

sur le spectre de fluorescence des solutions visqueuses et solides. C. R. Soc Pol. de Phys. 4, 73, 1929.

19. nbsp;nbsp;nbsp;G a viol a, E., Die Abklingungszeiten der Fluoreszenz von Farbstoffl�sungen.

20. nbsp;nbsp;nbsp;W a w i 1 o w, S. I., Die Ausloschung der Fluoreszenz in fl�ssigen L�sungen. Acta

21. nbsp;nbsp;nbsp;Jablonski, A., Ueber einige optische Eigenschaften der in festen und fl�ssigen

22. nbsp;nbsp;nbsp;K1 a r n e r, B. und Woszczerowicz, S., Ueber die Absorptions- und

Fluoreszenzspektren des Dekacyklens und des Tribenzildekacykiens. Acta Phys. Pol. 2, 1, 1933.

23. nbsp;nbsp;nbsp;W a w i 1 o w, S. I., The dependency of the intensity of the fluorescence of dyes

24. nbsp;nbsp;nbsp;Nichols, E. L. and Merritt, E., The specific exciting power of different

wavelength of the visible spectrum in the case of the fluorescence of eosin and resorufin. Phys. Rev. 31, 381, 1910.

25. nbsp;nbsp;nbsp;J a b 1 o n s k i. A., Ueber die Fluoreszenzausbeute in wassrigen Fluoresceinl�sungen

26. nbsp;nbsp;nbsp;W a w i 1 o w, S. I., Die Fluoreszenzausbeute von Farbstoffl�sungen als Funktion

27. nbsp;nbsp;nbsp;R i d e a 1, E. K., Chemiluminescence. Nature 123, 417, 1929.

28. nbsp;nbsp;nbsp;D r e w, H. D. K., Chemiluminescence in the oxidation of certain organic sub

29. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., The nature of animal light. Philadelphia, 1920.

30. nbsp;nbsp;nbsp;K a u t s k y, H. und M�ller, G. O., Chemiluminescenz adsorbierter Farbstoffe.

31. nbsp;nbsp;nbsp;Kautsky, H. und Neitzke, O., Spektren emissionsfahiger Stoffe bei Er

32. nbsp;nbsp;nbsp;L i f s c h i t z, J., Moderne opvattingen der chemoluminescentie en verwante phe-

33. nbsp;nbsp;nbsp;Evans, M. G. and Polanyi, M., Notes on the luminescence of sodium

34. nbsp;nbsp;nbsp;T a m a m u s h i, B., Ueber sensibilisierte Chemiluminescenz in L�sungen. Naturw.

35. nbsp;nbsp;nbsp;Schales, O., Versuche zur Beeinflussung der Luminescenz des Luzigenins.

36. nbsp;nbsp;nbsp;M i 1 a t z, J. M. W., De aanslagfunctie van het metastabiele Ss-niveau van neon.

37. nbsp;nbsp;nbsp;R a d u 1 e s c u, D. und O s t r o g o v i c h, G., Die Struktur der Gemeinschafts-

resonatoren im Anthracen, Acridin, Phenazin, Phenanthren, Pyren. Ber. d. D. Chem. Ges. 64, 2233, 1931.

38. nbsp;nbsp;nbsp;Gleu, K. und Schaarschmidt, R., Weitere Diacridene und Diacridylium-

39. nbsp;nbsp;nbsp;Gleu, K. und P e t s c h, W., Die Chemiluminescenz der Dimethyldiacridylium-

40. nbsp;nbsp;nbsp;Eymers, J. G. and van Schouwenburg, K. L., On the luminescence of

bacteria I. A quantitative study of the spectrum of the light emitted by P/i. phosphoream and by some chemiluminescent reactions. Enzymologia 1,nbsp;107, 1936.

41. nbsp;nbsp;nbsp;Drew, H. D. K. and P e a r ra a n, F. H., Amino- and hydrazino-cyclo-phtal-

42. nbsp;nbsp;nbsp;Z e 11 n e r, C. N. and Dougherty, G., The chemiluminescence of phtal-

43. nbsp;nbsp;nbsp;Witte, A. M. M., Luminescence phenomena with benzhydrazides and benzene-

44. nbsp;nbsp;nbsp;W e g 1 e r, R., Chemiluminescenz cyclischer Hydrazide. ]. Prakt. Chem. 148,

45. nbsp;nbsp;nbsp;Eymers, J. G. and van Schouwenburg, K. L., On the luminescence of

bacteria III. Further quantitative data regarding spectra connected with bioluminescence. Enzymologia 3, 235, 1937.

105

46. nbsp;nbsp;nbsp;Harris, L. and Parker, A. S., The chemiluminescence of S-aminophtal-

47. nbsp;nbsp;nbsp;A 1 b r e c h t, H. O., Ueber die Chemiluminescenz des Aminophtalsaurehydrazides.

48. nbsp;nbsp;nbsp;S V e s n i k o V, B. ]., On the mechanism of the chemiluminescence of 3-aminO'

49. nbsp;nbsp;nbsp;Harvey, E. N., Luminescence during electrolysis. J. Phys. Chem. 33, 1456, 1929.

50. nbsp;nbsp;nbsp;T a m a m u s h i, B. and A k i y a m a, H., Notes on the chemiluminescence of

51. nbsp;nbsp;nbsp;Kautsky, H. und Kaiser, K. H., Ueber den Mechanismus der Chemilumi

52. nbsp;nbsp;nbsp;Rottier, P. B., Fluorometrische und spectrofotometrische bepaling van lacto-

53. nbsp;nbsp;nbsp;K a t z, E. and W a s s i n k, E. C., Infrared absorptionspectra of chlorophyllous

54. nbsp;nbsp;nbsp;Kerk, G. J. M. van der. Onderzoekingen over de bioluminescentie der licht-

55. nbsp;nbsp;nbsp;Dubois, R., Note sur la fonction photog�nique chez les Pholades. C. R. Biol. 4,

56. nbsp;nbsp;nbsp;Chance, B., Harvey, E. N., Johnson, F. H. and M i 11 i'jk a n, G., The

57. nbsp;nbsp;nbsp;Chase, A. M. and G i e s e, A. C., Effects of ultraviolet radiation on Cypridina-

58. nbsp;nbsp;nbsp;C o b 1 e n t z, W. W. and Hughes, C. W., Spectral energy distribution of

the light emitted by plants and animals. Sc. Pap. Bur. of Stand. 21, 521, 1926, Nr. 538.

Algemene beschouwingen over absorptie- en fluorescentiepro-cessen door organiese molekulen in oplossing.

� nbsp;nbsp;nbsp;3.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Fluorescentie- en absorptieeigenschappen vannbsp;nbsp;nbsp;nbsp;methylacridonnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;van

De chemoluminescentie der phtaalzuurhydraziden en van pyro-mellietzuurhydrazide.

� nbsp;nbsp;nbsp;1. Storende omstandigheden bij het bepalen van biolumlnescentiespektra

STELLINGEN.

Chemoluminescentie is een fluorescentie van het bij de reaktie emitterende molekuul en kan spektraal daarvan niet worden onderscheiden.

II.

De proeven van Gaffron leveren een fraaie bevestiging van de opvatting, dat een sensibilisatie van fotochemiese reakties innbsp;vloeibaar milieu slechts kan optreden, wanneer er tussen sensibilisatornbsp;en fotogevoelig systeem (acceptor) komplexvorming plaats heeft.nbsp;Het rendement van de reaktie wordt bij deze proeven bepaaldnbsp;door het aantal molekulen van de acceptor, dat zich aan ��n molekuulnbsp;van de sensibilisator hecht.

III.

Uit de afwijking van de / X t-wet bij de fotochemiese inakti-vering van lichtbakteri�n, is het mogelijk een bovenste grens aan te geven van de inhomogeniteit van het licht in de bakteriecellen,nbsp;welke het gevolg is van de optredende verstrooiing en absorptie.

IV.

In de door Hellmann weergeven �differentiaalvergelijkingen van Fock� voor een atoom met N elektronen, zijn een aantalnbsp;termen ten onrechte weggelaten.

De methode van aarding door middel van een opgerolde koperen plaat is onvoordelig. Met een buis, waarvan de diameternbsp;gelijk is aan de buitendiameter van de opgerolde plaat, bereiktnbsp;men hetzelfde resulta�t. De aarding kan nog aanmerkelijk wordennbsp;verbeterd door het slaan van een tweede pijp op een voor denbsp;bepaalde grondsoort voldoend grote afstand.

VI.

De verhouding, waarin bij het evenwicht de beide isomeren in een keto-enolmengsel aanwezig zijn, wordt niet alleen bepaaldnbsp;door de verblijftijd van het proton in elk van deze isomeren, maarnbsp;tevens door de eigenschappen van het mesomere ion.

VII.

De sterke toename van de oplossnelheid van zuurstof in water bij verhogen van de temperatuur, zoals deze door Miyamotonbsp;gevonden werd, is niet re�el en moet worden toegeschreven aannbsp;een groter snelheid van de reaktie tussen natriumsulfiet en zuurstof.

VIII.

De gevolgtrekking van Montfort, dat het quantenrendement van de fotosynthetiese koolzuurassimilatie bij bruinwieren voor groennbsp;licht groter is dan voor rood, wordt door zijn proeven niet gerechtvaardigd.

a R	b R(-)	Cl nbsp;nbsp;nbsp;R (-)	C2 R (-)
1	It	It	It
1 1		( )
			\A ( )

SPEKTRALE ONDERZOEKINGEN OVER CHEMO- EN'bIOLUMINESCENTIE

PROEFSCHRIFT

ALIDA VAN DER BURG

ALGEMENE BESCHOUWINGEN OVER ABSORPTIE- EN FLUORESCENTIEPROCESSEN DOOR ORGANIESEnbsp;MOLEKULEN IN OPLOSSING

� 1. Gebruik van golflengte- en frequentieschaal.

I I

I I

( )

I I

0�0

I I nbsp;nbsp;nbsp;1

ALGEMENE BESCHOUWINGEN OVER CHEMOLUMINESCENTIE.

� 1. Voorkomen van chemoluminescentie,

20

26

(2)

(3)

^ (2) nbsp;nbsp;nbsp;.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;/ nv_j E

Uk A/

aA Au

(XVk

A/\ /\u

\/\

. ( )

\/\

\/\

III

\/\

c

( )

X\/

\/\

( )

I II I

/\/\ /

II

c

I

/ \/\/ \

I

I

II

in de benzolring, o.a. het S-aminophtaalzuurhydrazide en tenslotte het phtaalzuurhydrazide met de aminogroep op de 4-plaats. Ter vergelijkingnbsp;is in alle drie de figuren het spektrum van 3-amino opgenomen.

� 8. Chemoluminescentiespektrum van pyromellietzuurhydrazide.

II

c

II

c

II

II

/\/\

I

II

c

II

c

II

o

� 10. Fluorescentie- en absorptiespektra van 4-aminophtaalzuurhydrazide.

Beperkte geldigheid van de wet der spiegelsymmetrie.

FIG 29

1 nbsp;nbsp;nbsp;quot; I

t

-o-gt;

lt;^Br:

|0|

t

^ I �

I

tl �

I

|o-

o|

( )

It

I

,rY �

\/\

b

R_/\/