TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AANnbsp;DE RIJKSUNIVERSITEIT TE UTRECHT, OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUS L. VANnbsp;VUUREN, HOOGLEERAAR IN DE FACULTEITnbsp;DER LETTEREN EN WIJSBEGEERTE, VOLGENSnbsp;BESLUIT VAN DEN SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE TEnbsp;VERDEDIGEN OP MAANDAG 26 JULI 1943, DESnbsp;NAMIDDAGS TE 3 UUR

WILLEM JACOB ALSCHE

Het verschijneii van dit proefschrift, biedt mij de gelegenheid een algemeen woord van dank te richten tot U, Hoogleeraren, Oud-Hoog-leeraren en Docenten in de Faculteit der Wis- en Natuurkunde van denbsp;Utrechtsche Universiteit, die tot mijn wetenschappelijke vorming hebtnbsp;bijgedragen.

In het bijzonder ben ik echter U, Hooggeleerde de Graaf f, Hooggeachte Promotor, wel zeer erkentelijk voor Uw leiding bij het thans be�indigde onderzoek en voor de zelfstandigheid, welke Gij mij hebtnbsp;gelaten. Ik betreur het slechts dat, vooral den laatsten tijd, de omstandigheden een nauwer contact tusschen U en mij niet hebben toegestaan. Aan de jaren, welke ik in Uw laboratorium-gemeenschap bennbsp;opgenomen geweest, zal ik steeds met de aangenaamste herinneringennbsp;terugdenken. Dat ik nog een koi�ten tijd Uw assistent heb mogen zijn,nbsp;stel ik op hoogen prjjs.

Hooggeleerde Julius, U ben ik buitengewonen dank verschuldigd voor de zorg, welke U aan mijn proefschrift besteedde, toen ik door omstandigheden een beroep op Uw hulp moest doen. Aan dennbsp;korten tijd van hechte samenwerking zullen voor mij de aangenaamstenbsp;herinneringen verbonden blijven, terwijl tevens Uw hulpvaardigheid,nbsp;mij verleend bij het afsluiten der immuniteits-proeven, op hoogen prijsnbsp;wordt gesteld.

Tegenover U, Hooggeleerde K r u y t, gevoel ik mij zeer verplicht voor Uw toestemming, om eenige van mijn werkzaamheden op Uwnbsp;laboratorium te mogen verrichten. Het heeft mij verheugd dat ik medenbsp;hierdoor de gelegenheid kreeg het contact met U te hernieuwen.

Hooggeleerde K � g 1, tot U gaat in niet mindere mate mijn dank uit voor de groote belangstelling, welke Gij bij mij voor de biochemienbsp;hebt opgewekt.

Hooggeleerde R e i d. Uw raadgevingen op analytisch gebied zijn voor mij van groote waarde geweest.

Hooggeleerde S n ij d e r s, voor Uw belangstelling in mijn werk en Uw toezendingen van antisera en stammen, ben ik U bijzonder erkentelijk.

Zeergeleerde Timmermans, U zeg ik hartelijk dank voor Uw bereidwilligheid, om mjj in de gelegenheid te stellen eenige proefnemingen in Uw laboratorium te verrichten, terwijl ik de hulp, die iknbsp;daarbij ondervonden heb van U, zeergeleerde Vink, op hoogennbsp;prijs stel.

U, Zeergeleerde Schlemper ben ik zeer erkentelijk voor de interesse, welke U bij mij gewekt hebt voor de bacteriologie, voor Uw prac-tische raadgevingen en den prettigen omgang.

Waarde Kelder, mede door Uw groote vaardigheid en behulpzaamheid ben ik in staat geweest de dierproeven te verrichten. Hiervoor dank ik U in het bijzonder, terwijl ik verder mijn erkentelijkheid uitspreek jegens allen, die mij bij het be�indigen van dit proefschriftnbsp;op het Pharmaceutisch Laboratorium behulpzaam waren, �n jegensnbsp;hen, die mfj bij de bewerking ervan met hun raad en hulp tot grootenbsp;steun zijn geweest.

Tenslotte zal ik hen, die het mij mogelijk hebben gemaakt mijn academische opleiding aan te vangen en te volbrengen, daarvoor steedsnbsp;dankbaar blijven.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Algemeene gegevens over de chemische samenstelling van het kapselantigeen

A. nbsp;nbsp;nbsp;De bepaling vannbsp;nbsp;nbsp;nbsp;de precipitatie-titer .... 75

ALGEMEENE INLEIDING.

Het Bacterium pneumoniae behoort tot de Klebsiellae of kap-selbacteri�n, een onderfamilie van de Bacteriaceae. Daar kapsels ook door veel andere, niet tot deze groep behoorende bacteri�nnbsp;gevormd worden, noemt men de kapselbacteri�n ook wel denbsp;Friedlander-bacteri�n, naar haar ontdekker.

Men kan de kapselbacteri�n aan de hand van de ziekteprocessen, waarbij ze gevonden worden, verdeden in Klebsiellae pneumoniae, Klebsiellae rhinoscleromatis en Klebsiellae ozaenae.

J u 1 i a n e 11 e (1926,1) verdeelt, op grond van de serologi-sche eigenschappen, de Klebsiellae pneumoniae in de typen A, B en C, terwijl de Graaff (1936) naar aanleiding van denbsp;biochemische eigenschappen hen verdeelt in de typen Frank-land, lactis a�rogenes en Friedlander. Wiel en ga (1937)nbsp;kon aantonnen, dat alle stammen van het type A tot het Frank-land-type behooren, terwijl de typen B en C overeenkomen metnbsp;respectievelijk het a�rogenes- en Friedlander-type.

Om door serologische reacties een onderscheid te kunnen maken tusschen soorten of typen zijn immuniteitsproeven genomen. Sera van dieren, die met pneumoniae-stammen ge�mmuniseerd zijn, werken tevens beschuttend tegen infecties vannbsp;rhinoscleroom- en ozaena-bacteri�n, voor zoover ze althans innbsp;type overeenstemmen.

Volgens Kolle en Hetsch (1938) is het Bacterium pneumoniae een verwekker van lobaire en vooral van lobulaire pneumonie; hij verwekt meestal zeer ernstige ziekteverschijnselen, die onder omstandigheden ook epidemisch kunnen optreden.nbsp;Bij ernstige infecties komen de kapselbacteri�n in het bloednbsp;voor en geven dan aanleiding tot septichaemie. Ook zijn ze somsnbsp;de oorzaak van een otitis media, die dan door een zeer slijmerige, bacterierijke secretie gekarakteriseerd wordt, meestalnbsp;chronisch verloopt en door meningitis gecompliceerd kannbsp;worden.

Bij dieren spelen de spontane infecties een ondergeschikte rol. In enkele gevallen wordt de bacterie als verwekker van

mastitis bij koeien en van metritis bij paarden beschouwd. Ook bij marmotten en ratten komen van nature infecties voor.

Voor de dierproeven is de witte muis het meest geschikt, daarna de cavia, terwijl konijnen door inspuiting met veelnbsp;stammen w�l ziek, maar niet gedood worden.

THEORETISCH OVERZICHT.

Wanneer een stof, tengevolge van het parenteraal toedienen, in het serum van een proefdier antistoffen opwekt, die specifieknbsp;met de toegediende stof reageeren, noemen wij deze stof eennbsp;v�lwaardig antigeen.

Volwaardige antigenen zijn in het algemeen ingewikkeld gebouwde lichamen, waarvan de belangrijkste component hetnbsp;eiwit is. Landsteiner (1936) wijst er op, dat een bacterienbsp;nimmer een eenheid in antigene samenstelling is, doch dat wijnbsp;ons een bacterie als een complex van antigenen moeten voorstellen. Met deze gedachte voor oogen wordt de bekende ver-zadigingsproef der groeps-agglutinatie van Castellani begrijpelijk. Deze proef is dan niet meer in strijd met de specificiteit,nbsp;maar is juist een bevestiging ervoor hoe uiterst specifiek denbsp;antilichamen zijn.

Behalve volwaardige antigenen kennen wij onderdeelen van antigenen, die met het antilichaam specifiek serologisch reageeren, doch die zelf het vermogen missen om antilichamennbsp;bij een proefdier op te wekken. Tot deze stoffen, haptenen ge-heeten, behooren o.a. polysacchariden en lipo�den.

Wanneer een hapteen inderdaad all��n wordt ingespoten, dus in zoo zuiver mogelijken toestand, dan heeft geen vormingnbsp;van een antilichaam plaats. Wanneer men echter het hapteennbsp;met een eiwit mengt, kan men het aanvullen tot een compleetnbsp;antigeen. Gemengd met b.v. varkensserum en ingespoten bijnbsp;een proefdier worden er antistoffen gevormd tegen elk dernbsp;onderdeelen van het samengestelde antigeen. Z�� kan dus eennbsp;hapteen aangevuld worden tot een volwaardig antigeen, en isnbsp;een antilichaam tegen een hapteen in handen te krijgen, ondanksnbsp;het feit, dat deze stoffen op zich zelf het vermogen missen omnbsp;anti-lichamen op te wekken (het antiserum reageert dus opnbsp;het eiwit �n op het hapteen).

Ook onder andere omstandigheden is het mogelijk, dat antistof-vorming door een hapteen optreedt. Het gelukte Z o z a y a

(1932) soms antistof-vorming op te wekken door polysacchariden te absorbeeren aan kool, collodium, aluminiumhydroxyde ofnbsp;case�ne. Een der factoren voor antigene werking is blijkbaar,nbsp;dat de stof, in collo�daal-dispersen toestand, deeltjes moet bezitten boven een bepaalde afmeting.

Vanuit immunologisch standpunt bezien kunnen wij ons nu een bacterie voorstellen als een complex van antigenen, terwijlnbsp;sommige antigenen weer samengesteld zijn uit een complexnbsp;van haptenen.

Door een kunstmatige koppeling van een hapteen aan een eiwit is het Landsteiner gelukt volwaardige antigenen te bereiden. Hiertoe gaat hij o.a. uit van suikers, die aan para-nitro-benzylbromide gekoppeld worden onder HBr afsplitsing;nbsp;reductie en diazoteering geeft daarna de suikerdiazonium-verbinding, welke kan reageeren met globuline, zoodat eennbsp;kunstmatig saccharide-azo-prote�de wordt verkregen. Doornbsp;invoering van substituenten in de suiker-diazoniumverbindingnbsp;blijkt, dat deze de serologische specificiteit van het antigeennbsp;kunnen bepalen.

Een groot aantal kapselvormende bacteri�n produceert slijm-stoffen, welke een polysaccharide-structuur bezitten. Deze slijm-stoffen zijn aanwezig in de kapsels en komen in de media terecht door het oplossen dezer kapselstoffen.

Het was reeds lang bekend, dat bacterievrije filtraten van sommige bacteri�n een specifieke precipitatie geven met eennbsp;immuun-serum, dus met een tegen de stam gericht serum. Ditnbsp;werd uitsluitend geweten aan door autolyse vrijgekomen eiwitstoffen.

Uit een onderzoek van Dochez en Avery (1917) over pneumococcen-filtraten kwam echter vast te staan, dat langnbsp;voordat de eerste autolyse-verschijnselen optraden, een polysaccharide in het bacteriefiltraat aanwezig was, dat volgensnbsp;Heidelberger en Avery (1923) tot een z��r hooge verdunning met immuunserum specifiek precipiteerde.

Deze serologisch specifieke polyacchariden zijn gecompliceerder van bouw dan die, welke men uit vroegere onderzee-

kingen had leeren kennen. Behalve hexosen en pentosen worden aldobionzuren gevonden, benevens geamineerde of geacety-leerde suikers, en soms inosiet.

Naarmate bekend geworden was welke rol de polysacchariden bij de type-indeeling van sommige bacteri�n speelden, hebbennbsp;Goebel, Avery en Babers (1934) ooi(k disaccharidennbsp;volgens de methode van Landsteiner aan prote�den gekoppeld.nbsp;Hierbij bleek o.a. dat de plaats van de zuurstofbrug in disacchariden van invloed is op de specificiteit. Nog later, toen denbsp;specificiteit aan de uronzuur-fractie van het polysaccharide-complex geweten werd, koppelden Goebel en Hotchkissnbsp;(1937) de uronzuren, en Goebel (1938, 1939) de aldobionzuren aan prote�den volgens de methode van Landsteiner, omnbsp;hiermee immuniteitsproeven te nemen.

Met de beoordeeling van de hierna volgende gegevens uit de literatuur over de bijzondere specificiteit der polysaccharidennbsp;zullen wij zeer voorzichtig moeten zijn. Wij zullen veel tegenstrijdigheden tegenkomen, die � althans gedeeltelijk � verklaard kunnen worden uit het verschil in de methoden voor denbsp;isoleering der polysacchariden uit de volwaardige antigeen-complexen.

Om voor de immuniteitsproeven een hoogmoleculair antigeen te ontleden zouden wij namelijk een volledige scheidingnbsp;tusschen zijn componenten te weeg moeten brengen en hetnbsp;eveneens hoogmoleculaire polysaccharide, zonder ontleding, en in zijn geheel moeten afsplitsen. Daar echternbsp;verhitting, alkali�n en zuren alle ontleding veroorzaken, kunnennbsp;wij slechts trachten dit ideaal zoo goed mogelijk te benaderen.nbsp;Walker (1940) zag dit zeer goed in en maakte daarom gebruik van ureum om de eiwitten te denatureeren; ten gevolgenbsp;hiervan waren de polysacchariden, die hij afsplitste echter nietnbsp;geheel eiwitvrij.

Naast deze bezwaren zullen wij ook steeds tegenstrijdigheden tegenkomen die voortvloeien uit het feit, dat er onderzoekingennbsp;zijn die v��r, en andere die tegen de specificiteit der polysacchariden pleiten.

door het polysaccharide uit het kapsel bepaald. De drie typen A, B en C verschillen door de vorming van drie geheel verschillende polysacchariden, waarvan de samenstelling en denbsp;eigenschappen het eerst bestudeerd zijn door de Amerikanennbsp;van het Rockefeller-instituut.

Goebel (1927) isoleerde deze drie polysacchariden, die alle stikstof-vrije koolhydraten zijn en volgens Goebelnbsp;en Avery (1927) uronzuren bevatten, terwijl ze tot verdunningen van 1 : 2.000.000 een specifieke precipitatiereactie gevennbsp;met het homologe antiserum. De chemische samenstelling vannbsp;het aldobionzuur van het specifieke polysaccharide uit hetnbsp;Frankland-type lijkt op dat uit het polysaccharide van het pneu-mococcentype III. De serologische resultaten geven echter tenbsp;zien dat het G3-P. der pneumococcen g��n precipitatie met hetnbsp;antiserum van het Franklandtype geeft, en omgekeerd hetnbsp;Frankland-polysaccharide niet reageert op het anti-pneumo-coccen Ill-serum. Ter verklaring van de chemische en serologische tegenstrijdigheid neemt men aan, dat in deze twee polysacchariden de binding van glucose aan de aldehyd-groep vannbsp;het uronzuur aan verschillende C-atomen zit.

De contr�le-reacties van Heidelberger, Goebel en Avery (1925) op het polysaccharide uit het pneumococcen-type II (G2 geheeten) en op dat van het pneumoniae-B-type,nbsp;deden onverwachts een zekere verwantschap zien. Anti-B-serumnbsp;precipiteerde even goed met het polysaccharide uit een pneumoniae-B-type, als met het G2-P- Na uitprecipiteeren van het eerstenbsp;polysaccharide waren er g��n precipitinen meer voor eenignbsp;ander polysaccharide overgebleven. Na voorbehandeling metnbsp;het G2-P., waren er echter nog w�l precipitinen over voor hetnbsp;polysaccharide uit het pneumoniae-B-type. Dit doet dus veronderstellen, dat het anti-B-serum �f twee antilichamen bezit,nbsp;of een met dubbele affiniteit, waarvan ��n verzadigd kan wordennbsp;door het G2-P. uit een pneumococcen-type Il-stam.

Behalve, dat het konijnen-immuunserum van het pneumoniae-B-type het pneumococcen-type II agglutineert en het kapsel-antigeen ervan precipiteert, beschermt het ook muizen tegen deze pneumococcus. Eveneens is gebleken, dat het konijnen-anti-pneumococcen Il-serum de pneumoniae-B-bacteri�n agglutineert, het polysaccharide hiervan precipiteert en muizen be-

schermt tegen pneumoniae-B-bacteri�n. Volgens R e e s o n en Goebel (1940) zou paarden-immuunserum van het pneunio-coccen-type II deze eigenschappen niet bezitten.

Uit de onderzoekingen van Goslings en Snijders (1936) bleek, dat van immunologisch standpunt bezien, allenbsp;rhinoscleroom-stammen tot het pneumoniae-C-type behoorden.nbsp;Dit is dus een zeer homogene groep van bacteri�n. De ozaenae-stammen behooren tot verschillende typen en wel hoofdzakelijknbsp;tot het D- en E-type, terwijl door Wielenga (1937) ooknbsp;eenige stammen bij het C-type konden worden ingedeeld. Totnbsp;het pneumoniae-A-type behooren de meeste stammen die infecties bij den mensch veroorzaken; terwijl volgens J u 1 i a n e 11 enbsp;(1930) het grootste aantal stammen van dierlijken oorsprongnbsp;bij het B-type moeten worden ingedeeld. Daarenboven zijn ernbsp;nog heterogene stammen, d.w.z. stammen, die agglutineeren ofnbsp;precipiteeren met de anti-sera der drie typen; deze werdennbsp;voor het eerst gevonden door L � v y-B ruhl en Courtoisnbsp;(1940).

De eerste bekende onderzoekingen van Heidelberger, Goebel en Avery (1925) over de pneumococcen-typen Inbsp;tot IV gaven te zien, dat de respectievelijke polysaccharidennbsp;Gi tot G4 z��r specifiek waren, en all��n met hun anti-seranbsp;precipiteerden tot een titer van ongeveer 1:5,000.000. Averynbsp;en Morgan (1925) vonden, dat deze stoffen niet het immunologisch karakter der prote�den bezaten; ze wekten geen anti-lichamen op en waren dus geen antigenen maar haptenen. Eennbsp;kunstmatig prote�de, waarin het G3-P. als specifieke groep gebonden was, gaf na inspuiting bij een konijn een anti-pneumo-coccen Ill-serum, waarmee bij muizen passieve immuniteit konnbsp;worden verkregen.

Dank zij de publicaties van Zozaya en Clark (1933) over een pneumoccoccen I-extract, dat een zekere antigeniteitnbsp;ten opzichte van den mensch zou bezitten, werd opnieuw eennbsp;onderzoek ingesteld naar het Gj-complex. Hierbij bleek uit denbsp;onderzoekingen van Avery en Goebel (1933), dat het eerstnbsp;ge�soleerde Gi-complex tijdens de opwerking een verandering

had ondergaan. De acetylgroepen van dit polysaccharide waren n.1. afgesplitst, en all��n met ongeveer 6% azijnzuur in ester-vorm zou het polysaccharide van deze pneumococcus de funda-menteele immuniteitseigenschappen der prote�den bezitten.

De ontdekking, dat dit h a p t e e n plotseling een volwaar-dig antigeen was geworden, was de aanleiding tot een nieuwe serie serologische proeven. Muizen, ge�mmuniseerd metnbsp;0,75 y van het Gi-complex, konden een duizendvoudige, doodelijke dosis van een virulente pneumococcen-type I-stam doorstaan. Men concludeerde, dat het Gi-complex all��n antigeennbsp;was indien het acetylgroepen droeg.

Hier is dus het eerste bekende voorbeeld van een molecuul, waarvan de antigene werking zou afhangen van een eenvoudigenbsp;chemische eigenschap.

Deze immuniteit bij de muis kon echter slechts door zeer kleine dosis worden verwekt; bij grootere hoeveelheden hadnbsp;geen vorming van antilichaam plaats. Enders en Chao-Jen-Wu (1934) vonden, dat het Gi-polysaccharide voor hetnbsp;konijn geen antigeen was, welke dosis ook gegeven werd. Wellicht vindt hier desacetyleering in het lichaam plaats.

In tegenstelling met de algemeene opvatting, dat de acetylgroepen van groot belang zijn bij de pneumococcen antigeni-teit, wijzen de resultaten van Felton en Prescott (1939) juist op de onbelangrijkheid dezer groepen. W�l doet loog tennbsp;allen tijde de antigeniteit verdwijnen, maar. het verschil tus-schen het acetyl-percentage van de geacetyleerde preparatennbsp;die antigeen zijn, en van die welke niet antigeen zijn, is volgensnbsp;WongenKurotschki n(1939) soms slechts 0,43%, hetgeennbsp;volgens deze schrijvers te weinig is om de antigeniteit te kunnen verklaren.

Kort geleden publiceerde Felton (1940) een verslag, waaruit geconcludeerd mocht worden tot een immuniseerende werking van de Gi- �n G2-complexen der pneumococcen-typen I en II bij den mensch.

Vaccinatie met deze polysacchariden gaf bij 94,5% van de individuen aanleiding tot antistof-vorming in het bloed tegennbsp;het Gi-polysaccharide en bij 98,9% tegen het Gg-complex. Behalve dat 32% van de menschen van nature immuunstoffen

bezat, was de activiteit der sera, die na vaccinatie met de polysacchariden waren verkregen, z��r verschillend.

Zooivel het Gi- als het G2-complex (eiwitvrij) zijn dus als volwaardige antigenen bij den rwensch te beschouwen: er worden dus precipitinen door en tegen deze stoffen opgewekt!

In 1939 werd door Rachel Brown een uitgebreid onderzoek ingesteld naar de 32 verschillende pneumococcen-typen. Het bleek dat de 32 daaruit ge�soleerde polysacchariden iedernbsp;voor zich, een andere chemische samenstelling bezaten en datnbsp;ieder polysaccharide specifiek reageerde met het homologenbsp;antiserum.

Als theorie voor de infectie en voor het antilichaam bij de immuniteit treedt die van Petterson (1940) op de voorgrond. De virulente pneumococcen zouden twee verschillendenbsp;stoffen produceeren. De eerste stof bezit een negatieve chemo-taxis en stoot de leucocyten weg, de tweede (het polysaccharide)nbsp;is anti-phagocytair en verzet zich dus tegen het opnemen dernbsp;bacteri�n door de witte bloedlichaampjes. De eerste stof heeftnbsp;een gevarieerde werking op de soort van het dier: ze werktnbsp;op de leucocyten van het konijn, maar niet op die van de muisnbsp;of cavia.

Men kan met deze twee stoffen afzonderlijk antilichamen bij het dier opwekken. Om een infectie bij de cavia en muis tenbsp;verhinderen is het dus voldoende om antistoffen op te wekkennbsp;tegen de verlammende stof, dus tegen het polysaccharide, terwijlnbsp;men by het konijn antistoffen tegen beide moet opwekken.

Behalve de reeds eerder meegedeelde kruisingsreactie tus-schen het G2-P. der pneumococcen en een pneumoniae-B-serum, werden nog meer van zulke reacties bekend. Ivanovics( 1940)nbsp;vond, dat een anti-miltvuur immuunserum van het paard (nietnbsp;van het konijn), niet alleen de kapselstof uit de anthrax-bac-teri�n precipiteert, maar ook die uit het pneumococcen-typenbsp;XIV. Een anti-miltvuur-serum, dat v��rbehandeld is met hetnbsp;polysaccharide uit het pneumococcen XlV-type, behoudt zijnnbsp;precipiteerende werking voor de kapselstof uit de anthrax-bacteri�n.

Chemisch besten deze polysacchariden uit geacetyleerde glucosaminen en galactose; dit complex lijkt veel op dat uit denbsp;menschelijke erythrocyten van groep A. De anti-miltvuursera

van paard of konijn reageeren niet met de stof uit de bloedgroep A, maar precipiteeren haar w�l na voorafgegane voorzichtigenbsp;hydrolyse (zie ook blz. 12).

Serologische kruisingsreacties treden niet alleen op met polysacchariden van bacteri�ele oorsprong, maar ook met eennbsp;polysaccharide, dat uit arabische gom verkregen wordt doornbsp;gedeeltelijke hydrolyse in de koude. Evenals het G3-P. der pneu-mococcen is deze stof uit arabische gom een hexose-uronzuur,nbsp;gevormd uit glucuronzuur, maar waarvan de hexose vannbsp;galactose in plaats van glucose is afgeleid. Deze onderzoekingennbsp;van Heidelberger en Kendall (1929) konden kortnbsp;daarna door Heidelberger, Avery en Goebel (1929)nbsp;bevestigd worden. Zij vonden n.1. een bevestiging 'yoor denbsp;structureele analogie, doordat het polysaccharide uit de arabische gom een bijna specifieke precipitatie tot 10quot;� gaf metnbsp;anti-pneumococcen-serum II of III. Deze kruisingsreactie zounbsp;volgens Challinor, Haworth en Hirst (1931) tenbsp;wijten zijn aan een gelijke aanhechting tusschen het glucuronzuur en de suiker, dus glucose of galactose.

Een vergelijking van deze resultaten met de ervaringen van Goebel en Avery, Goebel of Babers en Avery over de azo-pro-te�den, afkomstig van eenvoudige sacchariden, geeft ons geennbsp;voldoening. Zij vonden een diepgaand verschil, op serologischnbsp;gebied, tusschen de structuren van glucose- en galactose-azo-prote�den. Deze gesubstitueerde sacchariden bevatten echternbsp;g��n uronzuren. Goebel en Goodner (1936) kregen metnbsp;een azo-prote�de van glucuronzuur een bijna specifieke precipitatie met anti-pneumococcen-serum II of III tot 10*6.

Het is dus mogelijk dat glucuronzuur de voornaamste drager der pneumococcen-specificiteit is. In elk geval moeten wij opmerken, dat de immunologische activiteit van het samengesteldenbsp;prote�de-glucuronzuur, bereid door Goebel en Goodner,nbsp;niet samengaat met die van de pneumococcen II en III. Hoewel het in vitro reageert met de antilichamen der pneumococcen,nbsp;is het azoprote�de z�lf niet in staat deze antilichamen bij konijnen of muizen op te wekken.

coccen-antigeen te besluiten, zal eerst deze tegenstrijdigheid moeten worden opgehelderd.

Verschillende typen streptococcen, al of geen kapsel dragend, geven ��k verschillende polysacchariden, die specifiek reagee-ren met hun antisera. Heidelberger en Kendallnbsp;(1936) konden uit een haemolytische A-streptococces een polysaccharide isoleeren dat phosphor bevatte en geen uronzuur.nbsp;Een ander polysaccharide van de haemolytische A-groep bevatte geen phosphor, maar was opgebouwd uit een gelijk aantalnbsp;moleculen glucuronzuur en acetylglucosamine. Ondanks dezenbsp;samenstelingen was het eerste w�l en het tweede niet serolo-gisch actief, noch als antigeen, noch als reagens op het anti-lichaam.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;�

Kendall, Heidelber'ger en Dawson (1937) vonden nu een groote chemische verwantschap tusschen ditnbsp;laatste polysaccharide en dat wat algemeen in het dierlijknbsp;lichaam voorkomt, b.v. een door Meyer en Palmer (1936)nbsp;ge�soleerd polysaccharide uit de menschel ij ke navelstreng ofnbsp;een uit het oogvocht van den os. Dit zou een voorbeeld zyn vannbsp;een polysaccharide, dat even goed gevormd wordt door het dierlijke organisme als door een bacterie. Derhalve zou de afwezigheid van serologische activiteit van dit polysaccharide uit denbsp;haemolytische A-streptococcen verklaard moeten worden, metnbsp;het mogelijk bestaan van zeer verwante stoffen in het organismenbsp;der zoogdieren zelf.

Om te verklaren, dat het serum van sommige normale individuen zich soms agglutineerend en zelfs lytisch ten opzichte van de erythrocyten van andere individuen van de zelfde soortnbsp;gedraagt, neemt men reeds langen tijd aan, dat in de bloedlichaampjes twee bepaalde agglutinabele bestanddeelen (b.v.nbsp;A en B), en in de sera twee correspondeerende agglutininennbsp;(a en jS) voorkomen. Men begrijpt, dat een agglutinabel bestanddeel en het correspondeerende agglutinine, door weder-

zijdsche inwerking, niet kunnen co�xisteeren in het bloed van hetzelfde individu. De verschillende agglutinabele bestand-deelen worden teruggevonden in de 'urine van individuen, dienbsp;tot de bijbehoorende bloedgroep behooren.

Uitgaande van urine maakten Brahn en Schiff (1929) extracten, die in zeer sterke verdunning reageerden met hetnbsp;bijpassende serum. Zij bevatten een geamineerd polysaccharide,nbsp;waarin zich volgens Freudenberg en Eichel (1934) denbsp;specifieke eigenschappen van de bloedgroep A bevonden. Bijnbsp;hydrolyse kon galactose en acetylglucosamine, benevens eennbsp;kleine hoeveelheid uronzuur ge�dentificeerd worden. Evenalsnbsp;bij het polysaccharide van het pneumococcen-type I, verdwijntnbsp;de serologische activiteit onder invloed van alkali. De samenhang gaat echter nog verder: Witebsky, Neter en So-botka (1935) vonden, dat het anti-bloedgroep-A-serum innbsp;vitro reageert met het Gi, dus met het geacetyleerde polysaccharide der pneumococcen van het type I. Freudenbergnbsp;en Eichel (1935) hebben aangetoond dat het door alkalinbsp;onwerkzaam gemaakte polysaccharide der bloedgroep Anbsp;opnieuw geacetyleerd kan worden, en dan weer de volledigenbsp;serologische activiteit bezit.

Een door Beeson en Goebel (1939) gevonden serologische kruisingsreactie tusschen de agglutinabele stof van de bloedgroep A en het polysaccharide van het pneumococcentypenbsp;XIV bewijst, dat deze stoffen echter niet identiek zijn. W�lnbsp;hebben Goebel, Beeson en Hoogland (1939) aangetoond, dat deze stoffen veel chemische overeenkomst bezittennbsp;en beide opgebouwd zijn uit acetylglucosaminen en galactose.

Finland en Curnen (1940) zeggen, dat de eigenschap van een groot aantal konijnen-sera, gericht tegen verschillendenbsp;typen pneumococcen om de menschelijke erythrocyten van denbsp;AB- en A-groepen te agglutineeren, een verklaring zou kunnennbsp;zijn voor de wel eens waargenomen haemoglobinurie en denbsp;doodelijke reacties na inspuitingen van deze sera.

nog vol paradoxen, gezien de kruisingsreacties tusschen veel polysacchariden van hoog moleculair gewicht n.1. de extractennbsp;van pneumococcen, Friedlander-bacteri�n of arabische gom.nbsp;Hierbij sluit ook aan de door A n a 11 y en S m e,d 1 y-M a c 1 e a nnbsp;(1937) opgemerkte kruisingsreactie tusschen een extract vannbsp;biergist en dat van het pneumococcen type II.

Heidelberger, Menzei en Kendall (1936) merken op, dat de rol van de prote�den zeker niet veronachtzaamd magnbsp;worden indien men de eigenschappen der polysacchariden wilnbsp;onderzoeken. Ze zijn daarvoor veel te actieve elementen in denbsp;specifieke bacterieverschij nselen.

Uit het feit, dat in den laatsten tijd sacchariden als normale bestanddeelen van een groot aantal prote�den voorkomen, concludeerde Bierry (1934), dat de specificiteit van deze anti-genen zelfs in het algemeen door de saccharide-fractienbsp;in hun molecuul bepaald werd.

Landsteiner (1936) merkte echter op, dat deze theorie g��n algemeene waarde kon hebben, daar in verschillende pro-te�de-antigenen geen sacchariden voorkomen. Een andere tegenwerping is, dat naburige polysacchariden, misschien zelfs identieke, fragmenten zijn geweest van zeer gedifferentieerde prote�den, uit immunologisch standpunt bezien.

Zoo werd door Leven e, Mori en Rothen (1929) een glucosamine-dimannose verkregen uit het ovomuco�de, dat mennbsp;volgens Rimington (1931) tevens vindt in de serum-pro-te�den van paard en koe. Daar deze stof zoo algemeen verspreidnbsp;is kan men moeilijk inzien, dat ze een rol zou spelen in de specificiteit ten opzichte van de soort.

Neuberger en Yuill (1940) isoleerden een polysaccharide uit het ovomuco�de en een polysaccharide uit het ovalbu-mine. Het anti-ovalbumine-serum gaf met de volledige stof een precipitatie tot 1 :100.000, terwijl het polysaccharide uitnbsp;het ovalbumine slechts een zwakke reactie gaf tot 1 :200. Opnbsp;overeenkomstige wijze gaf het ovomuco�de met haar eigen serumnbsp;een precipitatie tot 1 :100.000, terwijl het polysaccharide uitnbsp;het ovomuco�de zelfs geen reactie met dit serum gaf. Hieruitnbsp;concludeeren deze schrijvers, dat de polysacchariden g��n rolnbsp;zouden spelen in de reacties der prote�den en niet de dragersnbsp;van de specificiteit zouden zijn.

Aan den anderen kant vonden Sevag en Jeastone (1934), dat een polysaccharide-extract van het ovalbumine eennbsp;anaphylactische choc bij een cavia veroorzaakte, die met hetnbsp;ovalbumine gesensibiliseerd -was; er was echter geen precipita-tie-reactie met het anti-ovalbumine-serum van een konijn. Bijnbsp;groote dosis gaf dit polysaccharide een lichte anaphylactischenbsp;sensibilisatie voor het eiwit, maar niet voor het polysaccharidenbsp;zelf.

In ieder geval ziet men, dat er nog te veel onzekerheden bestaan om in het a 1 geme en de rol der polysacchariden bij de specificiteit der prote�de-antigenen als vaststaand te beschouwen.

Naar aanleiding van de eerder beschreven onderzoekingen over de polysaccharide-specificiteit der pneumococcen, pneumo-niae-bacteri�n en streptococcen kunnen wij echter w�l zeggen,nbsp;dat het polysaccharide van deze bacteri�n de specificiteit dernbsp;prote�de antigenen w�l bepaalt. Hierbij sluiten ook aan de onderzoekingen omtrent de polysacchariden der Salmonella-soortennbsp;door Morgan en Beckwith (1939), der V. cholera doornbsp;Bruce-White (1940), der B. coli en KI. rhinoscleromatisnbsp;door WongenKurotchkin (1939) en die van veel anderenbsp;bacteri�n.

De grootste moeilijkheden bij de beoordeeling van de proeven en de argumenten aangaande de specificiteit der polysacchariden zijn o.i.:

Gezien deze drie moeilijkheden bij de onderzoekingen der polysacchariden is het geen wonder, dat wij vaak paradoxennbsp;tegenkomen.

Ook de kruisingsreacties zullen zeker nog uitbreidingen en veranderingen moeten ondergaan. Dit beeld der co-precipitatiesnbsp;behoeft echter niet in strijd te zijn met de specificiteit der polysacchariden, maar kan daar zelfs een bewijs voor zijn.

Over het algemeen is tot nu toe wel komen vast te staan, dat de polysacchariden uit de eerder behandelde bacteri�n specifiek

zijn en niet tot de antigenen, maar tot de haptenen moeten worden gerekend. Een uitzondering vormen het G^- en G^-P.nbsp;der pneumococcen, die vooral bij den mensch als een volwaardignbsp;antigeen moeten worden beschouwd.

Aan Bottema (1940) gelukte het om een lipo�d-polysac-charide uit een KI. pneumoniae type C te isoleeren. Deze stof, verkregen volgens een iets gewijzigde methode van Heidel-berger, was in staat om b� konijnen en caviae precipitinennbsp;op te wekken; zij is dus een volwaardig antigeen. Bij muizennbsp;die met het lipo�d-polysaccharide ge�mmuniseerd waren konnbsp;echter geen bescherming tegen de virulente stam wordennbsp;opgemerkt. Deze stof was w�l toxisch voor konijnen en muizen,nbsp;maar niet voor caviae. Zoowel het lipo�d als het polysaccharidenbsp;misten ieder voor zich deze eigenschap.

Door een absorptie-proef bleek, dat na voorbehandeling van een immuunserum met het lipo�d-polysaccharide er geen precipitinen meer voor het vrije polysaccharide over waren, terwijlnbsp;omgekeerd, na voorbehandeling met het vrije polysaccharide,nbsp;het serum nog tot 1:200.000 met het lipo�d-polysaccharide konnbsp;reageeren. Er volgt dus uit, dat lipo�d-polysaccharide en vrynbsp;polysaccharide in serologisch opzicht niet gelijkwaardig zijn.

Het lipo�d-polysaccharide van het C-type is specifiek en geeft evenals het vrije polysaccharide een specifieke precipitatie-reactie met immuunserum tot 1:2.000.000.

Interessante onderzoekingen werden door L�vy-Bruhl en Jeanne Courtois (1940) gedaan over een polyvalentenbsp;stam der B. pneumoniae, een stam dus, waarvan het lipo�d-polysaccharide met de drie anti-sera A, B en C precipiteertnbsp;Daar de precipitatie-titer van het polyvalente lipo�d-polysaccharide met de drie anti-sera 1:1000 was, en de hoeveelheidnbsp;neerslag bij de ringreactie gelijk was, concludeeren ze tot eennbsp;werkelijke polyvalente precipitatiereactie. Een absorptieproefnbsp;van het lipo�d-polysaccharide met de drie anti-sera na elkaar

geeft een gefractioneerde verzadiging der drie antigenen, welke aanwezig zijn in dit polyvalente lipoM-polysaccharide complex.nbsp;Ook in vivo geeft herhaalde inspuitingen van een konijn met ditnbsp;complex een polyvalent serum, dat met de drie gefiltreerdenbsp;kuituren van de typen A, B en C reageert. Er wordt dus eennbsp;anti-lichaam ten opzichte van elk der drie antigenen opgewekt.

De Fransche onderzoekers vonden voor een lipo�d-polysac-charide van het A-type een specifieke precipitatiereactie met het anti-A-serum tot 1:10.000. Behalve deze type-specificiteitnbsp;vonden zij ook een soort-specificiteit, indien de complement-bindingsreactie toegepast werd. Er trad n.1. een positievenbsp;reactie op van ieder der drie lipo�d-polysaccharide antigenen,nbsp;niet alleen met het correspondeerende serum, maar met alle drienbsp;de immuunsera A, B en C; echter niet met het normale serum.nbsp;Daar prote�den in het lipo�d-polysaccharide complex uitgeslotennbsp;waren, konden deze niet de oorzaak van het verschijnsel zijn.nbsp;Bij de reactie van Bordet-Gengou was dus het lipo�d het eenigenbsp;element met een polyvalente rol, dat in dit geval de soort-specificiteit zou kunnen bepalen.

Met tegenovergesteld resultaat had Julianelle (1926,2) onderzoekingen gedaan met kunstmatig kapselloos gemaaktenbsp;stammen. Het bacteri�ele eiwit was in dat geval het soort-spe-cifieke antigeen: ingespoten bij proefdieren wekte het antistoffen op tegen de bacteri�n van het A-, B- en C-type. De soort-specificiteit van de pneumobacteri�n moet men nu dus wijtennbsp;aan een polyvalent e�vii �f aan een polyvalent lipo�d. Daar hetnbsp;eiwit niet chemisch op lipo�den onderzocht werd en het lipo�d-polysaccharide w�l eiwitvrij was, lijkt ons de opvatting der genoemde Fransche onderzoekers zeer goed mogelijk. V��r dezenbsp;gedachte pleit tevens de tegenwoordige zienswijze, dat in hetnbsp;algemeen bij de complement-bindingsreactie de lipo�den eennbsp;voorname rol spelen.

Aan Wong (1938) gelukte het, om uit een Klebsiella rhinos-cleromatis een specifieke stof te isoleeren welke antigeen is. Sera van met deze stof ge�muniseerde konijnen gaven echternbsp;geen precipitatie, doch w�l een complement-bindingsreactie metnbsp;de specifieke stof tot 1; 50.000. Eveneens gelukte het hem uitnbsp;een R-stam (dus een kapsellooze) van KI. rhinoscleromatis

twee verschillende specifieke polysaccharide stoffen te isoleeren, welke beide de complement-bindingsreactie gaven, echter metnbsp;een zeer verschillende titer.

Dit is opnieuw in tegenstelling met de opvattingen van Julian el Ie (1926,2) die blijkens een onderzoek over denbsp;Friedlander-bacteri�n tot de conclusie kwam, dat in �Rough�nbsp;stammen of kapsellooze stammen g��n polysacchariden aanwezig waren en dat alleen het bacterie-eiwit de soort-antigeni-teit zou bepalen.

Kurotchkin en Wong (1938) vonden behalve een positieve complement-bindingsreactie ook, dat het met een door zuurhydrolyse verkregen polysaccharide mogelijk was caviaenbsp;te sensibiliseeren. Deze eigenschap, welke men algemeen uitsluitend aan prote�den toeschrijft, zou dus ook wel aan eennbsp;polysaccharide toegekend kunnen worden. Hoewel hun preparaten eiwitvrij zijn, varieeren de N-percentages echter tusschennbsp;de 1,5 en 3,6%, zoodat wij genoodzaakt waren hun polysacchariden bij de lipo�d-polysacchariden in te deelen.

Boivin en medewerkers (1933, 1934, 1937) waren in staat uit verschillende soorten Gram-negatieve bacteri�n specifiekenbsp;lipo�d-polysacchariden te bereiden. Uit Salmonella-soortennbsp;isoleerden zij b.y. eenL.-P.,dat bij konijnen actieve immunisatienbsp;verwekte en toxisch was voor een muis. In het serum van denbsp;ge�mmuniseerde konijnen waren toen precipitinen en aggluti-ninen aanwezig. Na afscheiding van het lipo�d uit het complexnbsp;vonden zij voor een geneutraliseerde, alkalische oplossing vannbsp;dit lipo�d nog een zeer groote toxiciteit bij een muis. Uit R-vor-men konden zij lipo�d-polysacchariden, noch polysaccharidennbsp;bereiden, maar uit S-vormen naar believen het een of het andere.

Morgan en Beckwith (1939) bevestigden de antigehi-teit van het lipo�d-polysaccharide uit S-stammen van een aantal Salmonella-soorten. Zij trachtten door vergelijking van de agglutinatie- en precipitatie-reacties aan te toonen, dat dezenbsp;lipo�d-polysacchariden het eigenlijke specifieke antigeen zijn.

Ook uit B. dysenteriae Shiga kon door Morgan en Partridge (1939) volgens de methode van Boivin een lipo�d-

Terwijl wij bij de vraag of polysacchariden een specifieke werking vertoonen, op zeer veel tegenstrijdigheden en onvolkomenheden stuiten, vinden wij bijna algemeen aangegeven,nbsp;dat lipo�d-polysacchariden specifieke, vdlwaardige antigenennbsp;zijn. Hoewel ook hierbij het dier waarop de immuniteitsproe-ven worden genomen van veel invloed is, kunnen wij toch vrijnbsp;algemeen zeggen, dat er precipitinen en agglutininen wordennbsp;opgewekt, terwijl soms ook immunisatie kan worden verkregen.

Volgens Hornus en Gra'bar (1940) komt het serologisch verschil tusschen L.-P. en P. preparaten tot uiting bij de bepaling van de hoeveelheid N in het precipitaat, dat door hetnbsp;L.-P. antigeen van B. typhi �f door het correspondeerende P.nbsp;hapteen uit het immuunserum wordt neergeslag�n. Hieruitnbsp;blijkt, dat een groot gedeelte van het antilichaam niet door hetnbsp;hapteen geprecipiteerd wordt en er nog veel antilichaam overnbsp;is voor het antigeen. De zuur-hydrolyse van het lipo�d~poly-saccharide, waardoor het polysaccharide te verkrijgen is, leidtnbsp;dus tot de vernietiging of verwijdering, onder vorming vannbsp;onoplosbare producten, van een deel van dit complex. Het blijktnbsp;ook, dat het polsaccharide, dat de zuur-hydrolyse het kortstenbsp;ondergaan heeft, het meeste antilichaam precipiteert.

Deze verandering werd reeds veel eerder gevonden door Heidelberger, Kendall en Scherp (1935), die denbsp;invloed van zuur op de viscositeit van polysaccharide-oplossingennbsp;opmerkten. Door een verkleining van het complex neemt denbsp;hoeveelheid antilichaam, welke door eenzelfde hoeveelheidnbsp;polysaccharide neergeslagen wordt, af.

De type-specifieke polysacchariden zijn op twee verschillende manieren te isoleeren:

1. nbsp;nbsp;nbsp;De eerste methode gaat uit van nog intacte bacteri�n,nbsp;waarin het grootste gedeelte van de koolhydraten aan eiwitnbsp;gebonden voorkomt. Het is dan noodig om het koolhydraat vannbsp;het prote�ne los te maken en daarna dit eiwit te verwijderen,nbsp;hetgeen men meestal langs chemische en physische weg trachtnbsp;te bereiken.

Toenissen (1920) was de eerste, die gedroogde bacteri�n aan een splitsing onderwierp, door deze bij 100� C met 15%nbsp;KOH te behandelen. Tomczik (1927) maakte bij 100� Cnbsp;eveneens gebruik van KOH, Morgan (1936) hydrolyseerdenbsp;met verdund azijnzuur bij 100� C. Wieghard en Julia-nelle (1935) splitsten in de koude met verdunde zuren, terwijl Goebel en Avery (1927) van trypsine gebruik maaktennbsp;om het eiwit af te breken.

Het na splitsing vrij gekomen eiwit is meestal gemakkelijk te verwijderen, daar het vrijwel volledig kan worden geprecipiteerd, zonder dat de polysacchariden neerslaan. De laatste resten eiwit kunnen dan door gefractionneerde precipitatie metnbsp;alkohol, aceton of neutrale zouten worden verwijderd.

Heidelberger, Kendall en Scherp (1936) verwijderden andere vreemde stoffen zooals phosphaten, door een behandeling met ijsazijn van een oplossing van het koolhydraatnbsp;waaraan 20% natriumacetaat was toegevoegd. Glycogeen konnbsp;door inwerking van speeksel ontleed, of door een gefractionneerde precipitatie met koperacetaat verwijderd worden.

2. nbsp;nbsp;nbsp;De tweede methode gaat uit van vloeibare cultures,nbsp;waarin volgens Dochez en Avery (1917) de polysacchariden voor een groot gedeelte vrij voorkomen en hier moetennbsp;worden beschouwd als een stofwisselingsproduct van de levendenbsp;cellen. Hier zijn dus g��n ingrijpende middelen noodig, om denbsp;specifieke stof in vrijen toestand, te brengen.

Als algemeene isolatie methoden zijn op het oogenblik het meeste in gebruik de methode van B o i v i n bij de Franschenbsp;onderzoekers en de methode van Heidelberger by denbsp;Amerikanen, in welke laatste methode B o 11 e ih a enkele verbeteringen heeft aangebracht.

Bij de methode van Boivin, voor het eerst gebruikt door Bojvin en Mesrobeanu (1933) op enkele Salmonella-

soorten, worden de bacteri�n op vaste voedingsbodem met toevoeging van glucose gekweekt, en na 24 uur broeden met een physiologische zoutoplossing afgeslibt. Door een snelle centrifuge (6000 toeren) worden de bacteri�n neergeslagen, en innbsp;gedestilleerd water gesuspendeerd, waaraan vervolgens eennbsp;gelijk volume Vzn tricbloorazijnzuur wordt toegevoegd, om nanbsp;twee uur weer af gecentrifugeerd te worden. De trichloorazijn-zuur oplossing geeft, na dialyse tegen een groot volume water,nbsp;een practisch neutrale emulsie van het antigeen complex, welkenbsp;ongekleurd en opalescent is.

De methode van Heidelberger, die ook wij voor ons onderzoek hebben gebruikt, is voor het eerst toegepast door Heidelberger, Kendall en Scherp (1936) voor de isolatie van de pneumococcen-polysacchariden. Deze methode kost v��l meernbsp;tijd dan die van Boivin, maar bezit het voordeel, dat een azijn-zuur-natriumacetaatbuffer gebruikt wordt voor het oplossennbsp;van het polysaccharide, zoodat de kans op ontleding veel geringer is. Hierbij wordt een glucose-bouillon kuituur van drienbsp;dagen, na behandeling met 1% phenol, in vacuo bij 35� C totnbsp;1/10 van het oorspronkelijke volume ingedampt. Het polysaccharide kan, na precipitatie door alkohol en een nacht staan,nbsp;afgecentrifugeerd worden. Er ontstaan dan drie lagen: denbsp;bovenste laag of de alkoholische oplossing bevat geen specifiekenbsp;stof meer, terwijl de onderste laag waarin nog w�l specifiekenbsp;stof is tevens veel verontreinigingen bevat. All��n de middelstenbsp;laag, die zeer visceus en serologisch sterk actief is, wordtnbsp;verder verwerkt. Na suspendeeren in een zure acetaat-buffernbsp;(Ph = 5) kan men het onoplosbare deel door af te centrifugeerennbsp;verwijderen en het polysaccharide opnieuw door alkohol uit denbsp;oplossing neerslaan. De laatste eiwitresten kunnen verwijderdnbsp;worden door de methode van Sevag (1934) toe te passen.nbsp;Hiertoe schudt men de oplossing met 1/5 volume chloroformnbsp;en 1/25 volume butylalkohol. Na centrifugeeren bevindt zichnbsp;een groot gedeelte van het eiwit in de halfvaste emulsie tusschennbsp;de chlorof�rmlaag en de waterige oplossing. Een opnieuw toepassen van de Sevag-methode op de polysaccharide-oplossingennbsp;geeft na eenige malen een eiwitvrije specifieke stof. Ook uit denbsp;emulsielaag kan nog zuiver� polysaccharide gewonnen worden,nbsp;door met water uit te wasschen en op dezelfde manier te zui-

veren. Phosphaat kan worden verwijderd door een precipitatie met ijsazijn uit een 20 % natriumacetaatoplossing. Hoewel denbsp;preparaten, die Heidelberger en medewerkers nu verkrijgen, minder zuiver zijn dan vroeger, gezien de N-percen-tages, geniet deze methode o.i. boven die van B o i v i n de voorkeur, omdat g��n sterke zuren gebruikt worden.

Door Bottema (1940) zijn voor de bereiding van de specifieke stof uit B. pneumoniae type C de volgende verbeteringen aangebracht: De glucose-bouillon kan vervangen worden door eennbsp;veel goedkoopere voedingsbodem, samengesteld uit 0,5% d-glu-taminezuur, 0,5% ammoniumlactaat en 0,5% sec. kaliumphos-phaat. De broedtijd kan verlengd worden tot 10 dagen bynbsp;37� C en nog eenige weken bij kamertemperatuur, waardoornbsp;de opbrengst aan specifieke stof belangrijk verhoogd wordt.nbsp;De daarna met 0,5% phenol gedoode bacteri�n dampt hij in totnbsp;1/10 van het oorspronkelijke volume, waarna de pn met ijsazijnnbsp;op 4 gebracht wordt. Als acetaatbuffer dient een 5% natriumacetaatoplossing, die met azijnzuur op Ph = 4 gebracht kannbsp;worden. Verder maakt Bottema niet gebruik van ijsazijn ternbsp;verwijdering van de laatste resten eiwit en het phosphorzuur,nbsp;zoodat hij als specifieke stof in eerste instantie een lipo�d-poly-saccharide verkrijgt, in plaats van een polysaccharide zooalsnbsp;Heidelberger en medewerkers.

B. Gegevens over de chemische samenstelling der polysaccha-riden van B. pneumoniae, typen A, B en C.

Goebel en Avery (1927) onderzochten de specifieke stof van het A-type. Het is een amorph polysaccharide met zurenbsp;eigenschappen en zonder Fehling-reductie. De jodiumreactienbsp;is negatief en het wordt volledig geprecipiteerd door neutraal-en basisch loodacetaat. Na hydrolyse is het reduceerend vermogen 65% (t.o.v. glucose). Volgens Heidelberger ennbsp;Goebel (1927) lijkt deze specifieke stof chemisch op de poly-saccharide-fractie van het pneumococcen-type III met eennbsp;eveneens linksche draaiing (�33�) en een even laag zuur-aequivalent (340). Bovendien levert de hydrolyse chemisch-analoge stoffen op.

Bij verzeeping van de specifieke stof van het A-type met In H2SO4 gedurende 5 uur, gaf 34 g polysaccharide: 13 g aldobion-zure-calcium en 19 g suikers. Deze 13 g aldobionzure-calciumnbsp;leverde na zuivering nog slechts 9,2 g droge stof. Daarnaastnbsp;ontstond bij de zuivering een olieachtige laag, welke door denbsp;onderzoekers niet verder geanalyseerd werd. Uit de verhoudingnbsp;der zuivere stoffen concludeeren zij tot de verhouding 1/3nbsp;aldobionzuurfractie op 2/3 suikerfractie.

De aldobionzuurfractie vrijgemaakt gaf een [�]� van �54�, een zuuraequivalent van 354 en een reduceerend vermogen vannbsp;50% te zien. Zij concludeerden hieruit, dat deze fractie wasnbsp;opgebouwd uit 2 suikers: een hexose en een hexuronzuur,nbsp;waarin ��n carbonyl- en ��n aldehydgroep vrij aanwezig zijn.nbsp;De hexose werd ge�dentificeerd als glucose, het hexuronzuurnbsp;als glucuronzuur. Oxydatie van het aldobionzuur gaf saccha-robionzuur, dat als calciumzout ge�soleerd werd.

Het aldobionzuur is dus opgebouwd als een glucoside van glucuronzuur en glucose. De plaats van de brug (aan C6 ofnbsp;aan een ander koolstof atoom) is nog onbekend.

De suikerfractie was optisch inactief en had een reduceerend vermogen van 75 % t.o.v. glucose. De Molish-reactie was zwaknbsp;en de orcinolproef op pentosen was negatief. E�n gram van denbsp;suikerfractie werd na behandeling met phenylhydrazine ge�dentificeerd als glucosazon, met een opbrengst van 25%, terwijlnbsp;oxydatie met salpeterzuur het suikerzure kaliumzout van glucose gaf. Uit 10 gram werd de glucose verwijderd door fermentatie met gist; de gist-dextrinen werden daarna neergeslagennbsp;met loodacetaat, en door de oplossing vervolgens met basischnbsp;loodacetaat te behandelen, kon het loodzout van een suikerzuurnbsp;verkregen worden. De opbrengst was 3,6 g aan organisch zuur,nbsp;het reduceerend vermogen 40% en de [�Jd = �58,8�. Uit denbsp;[�]d zou men verwachten, dat dit zuur identiek met het eerdernbsp;gevonden aldobionzuur zou zijn; hier is de naphtoresorcinol-test echter negatief. Door een aparte proef met gist op denbsp;suikerfractie te doen, kon worden uitgemaakt, dat de helft vannbsp;de totale suikers weggefermenteerd kon worden.

Samenvattend werden er door hydrolyse 3 suikers verkregen: 1� een aldobionzuur (glucuronzuur-glucose);nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;2� glucose;

verhouding 1 : 1 ; 1. Het complex zou dan volgens deze onderzoekers opgebouwd zijn uit twee mol aldobionzuur (waarvan ��n in lactonvorm) en ��n mol glucose. Het (C3oH4402g)x-complex zou een zuuraequivalent moeten hebben van 410, eennbsp;C-percentage van 43,9 en een H-percentage van 5,4; hetgeennbsp;veel op de door hen gevonden waarden lijkt.

Onze bezwaren, naar aanleiding waarvan wij een aanvullend chemisch onderzoek noodzakelijk achten, waren de volgende:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Bij de zuivering van het aldobionzure-calcium is 4 gramnbsp;verloren gegaan of 30%; dit was een olieachtige laag, dienbsp;niet verder onderzocht werd. Het zal ook beter zijn om denbsp;bariumzouten van de aldobionzuren te maken, daar andersnbsp;de zouten niet vrij van sulfaat zijn en de kristalisatie bemoeilijkt kan worden (zie Bottema 1940 p. 43).

2. nbsp;nbsp;nbsp;Hoewel de suikerfactie voor 50% zou bestaan uit glucosenbsp;met een draaiing-van �52,3� en voor de andere helft uitnbsp;een suikerzuur met een draaiing van �58,8�, was de totale suikerfractie toch inactief.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Naast glucose in de suikerfractie is het voorkomen van andere suikers niet onmogelijk, gezien de geringe opbrengstnbsp;aan glucosazon.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Het niet fermenteerbare deel van de suikerfractie werdnbsp;onvoldoende onderzocht om hun zoo vergaande conclusiesnbsp;te rechtvaardigen.

5. nbsp;nbsp;nbsp;De conclusies omtrent het complex zijn aan twijfel onderhevig, daar een fractie van ongeveer 10% van de specifiekenbsp;stof door deze onderzoekers niet nader werd geanalyseerd.nbsp;Deze olieachtige laag kan of een ontledingsproduct v��r ofnbsp;na hydrolyse, van de specifieke stof zijn, waardoor de verhouding 1/3 op 2/3 oorspronkelijk anders was geweest; �fnbsp;deze laag is als zoodanig een onderdeel van de specifiekenbsp;stof, bij hydrolyse vrijgekomen, en dan is de formulenbsp;(C3oH44026)x niet juist.

Heidelberger, Goebel en Avery (1925) isoleerden het specifieke polysaccharide van het B-type, dat in tegenstellingnbsp;tot de andere zure polysacchariden moeilijk in water, doch ge-

makkelijk in NaOH oplost. Met neutraal- en basisch loodacetaat ontstaat eveneens een neerslag, terwijl na hydrolyse glucosenbsp;naast een niet nader onderzocht aldobionzuur wordt gevonden.

Het specifieke polysaccharide van dit type werd eveneens onderzocht door Goebel en Avery (1927). Het is een gemakkelijk in water oplosbare stof met zure eigenschappen t.o.v.nbsp;Congo-papier en een n�gatieve jodiumreactie. Met neutraal-en basisch-loodacetaat ontstaat eveneens een neerslag, terwijlnbsp;na hydrolyse ook glucose naast aldobionzuur aanwezig is. Eennbsp;overzicht van de eigenschappen der drie typen geeft tabel 1,nbsp;waarin tevens de eigenschappen staan vermeld welke Botte-m a voor het polysaccharide en lipo�d-polysaccharide uit eennbsp;stam van het C-type vond.

De chemische eigenschappen van de specifieke stoffen uit het C-type door Bottema en door Heidelberger onderzocht, zijn dus geheel verschillend; toeh isoleerden heiden eennbsp;polysaccharide, dat specifiek met het homologe antiserum totnbsp;1:2.000.000 reageerde.

Toen volgens Bottema en de Fransche onderzoekers L � V y-B ruhl en Courtois gebleken vi^as, dat het lipo�d-polysaccharide complex als een volwaardig antigeen moestnbsp;worden beschouwd, terwijl het polysaccharide als een hapteennbsp;moest worden opgevat, werd het van het grootste belang om tenbsp;weten welke rol het lipo�d, in het L.-P. zou spelen.

Boivin en Mesrobeanu (1933) waren de eersten, die uit een L.-P. antigeen, door verhitting in azijnzuur, een stofnbsp;verkregen van een lipo�d-achtige samenstelling. Deze stof lostenbsp;goed op in loog en na neutralisatie was de oplossing z��r toxischnbsp;voor een muis. Over de chemische eigenschappen konden wijnbsp;het volgende vinden:

Het in aether oplosbare deel (�85%) was onoplosbaar in alkohol of aceton en gaf een positieve stikstof- en phosphor-reactie; het andere deel (�15%) was onoplosbaar in alle oplosmiddelen, bevatte eveneens phosphor en stikstof, en gafnbsp;de phenolreactie van Millon.

Bottema vond voor het lipo�d uit het C-type van B. pneumoniae een zwak positieve reactie op glycerine en een aanwijzing voor vetzuren. Na zuivering van de lipo�d-fractie, door om beurten op te lossen in loog en neer te slaan met zuur, bleeknbsp;deze oplosbaar in alkohol, chloroform, aether en petroleumae-ther, maar niet in aceton.

Deze chemische gegevens kunnen o.i. hoogstens doen vermoeden, dat een phospho-lipo�d deel uitmaakt van het specifieke kapselantigeen.

HET PROBLEEM.

De opgave die wij ons nu stellen, uitgaande van de mogelijkheden, die in het voorafgaand theoretisch overzicht naar voren zijn gekomen, kunnen wij thans in vier punten samenvatten:

1. nbsp;nbsp;nbsp;Door de Amerikaansche onderzoekers Goebel en Averynbsp;is het polysaccharide van het A-type z��r uitgebreid onderzocht; t�ch moeten wij, in verband met onze bezwarennbsp;tegen dit onderzoek �n met de uitkomsten, die B o 11 e m anbsp;bij het C-type verkreeg, de chemische eigenschappen bijnbsp;het A-type z�lf nader onderzoeken.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Nadat door het onderzoek van B o 11 e m a was komennbsp;vast te staan, dat de lipo�d-polysaccharide-fractie uit denbsp;kapselstof van B. pneumoniae type C als een volwaardignbsp;antigeen moest worden beschouwd, lijkt het ons gewenschtnbsp;de antigeniteit van fracties uit het kapselcomplex van B.nbsp;pneumoniae typen A en C te vergelijken.

3. nbsp;nbsp;nbsp;De Fransche onderzoekers L � v y-B ruhl en Courtoisnbsp;vonden eveneens, dat lipo�d-polysacchariden antigenen ennbsp;niet uitsluitend haptenen zijn, zoodat wij ons moeten afvragen, hoe de samenstelling van de lipo�den is, die innbsp;staat zouden zijn om van een hapteen-koolhydraat een volwaardig antigeen te maken.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Ondanks het opwekken van precipitinen bij konijnen ennbsp;caviae door het lipo�d-polysaccharide van het C-type, konnbsp;B o 11 e m a g��n beschermende werking bij muizen waarnemen. Daar het groote belang van actieve immunisatienbsp;met eiwitvrije stoffen voor de hand ligt, willen wij dezenbsp;proeven herhalen en aanvullen voor het A-type,

PRACTISCH GEDEELTE.

Het practische gedeelte hebben wij gesplitst in twee hoofdstukken waarvan het eerste uitsluitend over het A-type en het tweede overnbsp;het C-type handelt.

In het eerste hoofdstuk wordt allereerst besproken de isolatie van het lipo�d-polysaccharide uit de kapselstof, waarbij wij achtereenvolgens nagaan de gebruikte stam, de gebruikte voedingsbodem, de iso-latie-methode van de specifieke stof uit het kapselantigeen, de ont-eiwitting en droogmethode hiervan, om tenslotte de bereiding van hetnbsp;vrije lipo�d-polysaccharide-zuur te bespreken.Daarop volgen de elementaire micro-stikstof- en micro-phosphor-bepalingen, met haar toepassing op de ge�soleerde lipo�d-polysacchariden. Vervolgens is de isolatienbsp;der vrije polysacchariden en lipo�den uit het lipo�d-polysaccharidenbsp;complex besproken, om na de bereiding.der vrije polysaccharide-zurennbsp;over te gaan tot de bespreking van de micro-stikstof- en micro-phosphor-bepalingen van deze lipo�den en polysacchariden. Daaropnbsp;volgen eenige conclusies uit deze bepalingen, die verband houden metnbsp;de beste scheidingsmethode van het lipo�d-polysaccharide in haarnbsp;componenten, om tenslotte het eerste hoofdstuk te besluiten met denbsp;chemische eigenschappen van het lipo�de en polysaccharide.

In het tweede hoofdstuk volgt dan de bereiding van de specifieke stof uit het C-type, waarbij wij achtereenvolgens behandelen; de gebruikte stam, de voedingsbodem, de isoleerings-methode van hetnbsp;lipo�d-polysaccharide uit het C-type, de verhooging van de pathogeni-teit, met tot slot de scheiding van het lipo�d-polysaccharide in zijnnbsp;componenten.

A. De gebruikte stam.

Als vertegenwoordiger van het A-type of Frankland-type hadden wij de keus uit een viertal sammen, die ons ter beschikking waren gesteld door Prof. Dr. E. P. S n ij d e r s, directeur van het Laboratorium voor Tropische Hygi�ne te Amsterdam. Zij droegen de aanduidingen Fl, F2, F15 en F23. Als vertegenwoordiger van het C-type gebruikten wij evenals Botte-m a de FlO-stam. gt;

Morphologisch zijn alle stammen asporogene, onbeweeglijke, Gram-negatieve, a�robe (facultatief ana�robe), polymorphenbsp;staafjes, die aan de uiteinden afgerond zijn. Een duidelijk kapsel is bij alle te zien in Burri-preparaten, nagekleurd metnbsp;Loefflers methyleenblauw.

Op alkalische bouillon was een diffuse groei met sediment te zien en op bouillonagar ontwikkelden zich gladde slijmerige,nbsp;verheven kolonies. De stammen deden gelatine niet vervloeien,nbsp;evenmin vormden zij in peptonwater indol.

Glucose en saccharose werden door alle vergist, terwijl voor enkele andere suikers hieronder een vergistingsschema ennbsp;eenige andere, het type kenmerkende, reacties volgen;

De kleine afwijking van het zuivere Frankland-type in de adoniet-vergisting konden wij verwaarloozen, daar serologischnbsp;uitgemaakt was, dat deze stammen tot het A-type behoorden.

De Voges-Proskauer-reactie werd beoordeeld na vijf dagen broeden bij 30� C. De glycerine-vergisting moesten wij reeds nanbsp;��n dag bepalen, daar na langeren tijd glycerine door alle stammen wordt omgezet.

Voor ons onderzoek kozen wij de F23-stam, daar deze zeer goed groeit op synthetische voedingsbodems en tevens een behoorlijke pathogeniteit bezit. Deze stam werd pas na passagenbsp;door een muis in gebruik genomen. Hiertoe werd een witte muisnbsp;subcutaan bij de staartwortel ingespoten met 0,1 cm^ van een

bacterie-suspensie, bereid door een 24 uur oude schuine agar-cultuur, bebroed bij 37� C, af te slibben met 10 cm� physiolo-gische keukenzout oplossing. Na twee dagen was de muis gestorven en vertoonde bij sectie een sterk vergroote, donkere milt. Uit het hartebloed werd nu de nieuwe F23-stam gekweekt,nbsp;waarmee wij onze proeven deden.

Volgens de reeds besproken mededeelingen uit de literatuur kwamen als voedingsbodem voor ons all��n vloeibare in aanmerking. Hierin zou immers een groot gedeelte van het polysaccharide in vrijen toestand terecht komen.

Evenals B o 11 e m a achtten wij het een eerste voorwaarde, dat in de op 'te werken cultures zoo weinig mogelijk vreemdenbsp;stoffen naast het specifieke koolhydraat aanwezig zouden zijn,nbsp;waardoor het zuiveren aanmerkelijk vereenvoudigd zou worden.nbsp;Wij maakten dus geen gebruik van pepton, alkalische bouillonnbsp;of voedingsbodems waaraan glucose was toegevoegd. In de literatuur wordt bijna uitsluitend gebruik gemaakt van glucose-bevattende cultuurmedia, wat o.i. niet juist is, indien het gaatnbsp;om het isoleeren van specifieke polysacchariden.

1. nbsp;nbsp;nbsp;0,5% d-glutaminezuur; 0,5% K2HPO4;0,5% ammonium-lactaat en 1 mg Saccharomyces cerevisiae siccum per liter.nbsp;Ph = 7,4.

2. nbsp;nbsp;nbsp;0,4% asparagine; 0,6% ammoniumlactaat; 0,2% K2HPO4;nbsp;0,5% NaCl.

Dit is de zeer bekende synthetische voedingsbodem van Uschinsky vereenvoudigd door F r a n k e b; o.a. beschreven door V e'd d e r (1935).

3. nbsp;nbsp;nbsp;0,8% Bactopepton; 0,5% NaCl en 1 mg gist per liter leidingwater.

Deze voedingsbodem diende om een vergelijking te kunnen maken met de synthetische media.

Op de eerste voedingsbodem was, na drie dagen broeden bij 37 �C, in het geheel geen groei waar te nemen. Dit is wel op-

Op de tweede voedingsbodem was een behoorlijke groei te zien; deze kon die in de derde echter niet evenaren. Daaromnbsp;trachtten wij een verbetering te verkrijgen door toevoegingnbsp;van nog andere aminozuren, waartoe de volgende oplossingennbsp;vergeleken werden:

De groei in de media .4 en 5 was zeker niet beter dan die van 2; die in 6 was echter aanzienlijk sterker, en vooral na 5 dagennbsp;'broeden bij 37�C was de groei bijna even goed als in de voedingsbodem 3.

Na fijnmalen van de asparagine werden alle vaste stoffen onder verwarming opgelost in 1 liter leidingwater. Daarnanbsp;voegden wij het ammoniumlactaat toe en werden de kolfjesnbsp;gesteld op een Ph van 7,2, waarna 30 minuten op 110� C gesteriliseerd werd. Gist voegden wij aan de voedingsbodem toe,nbsp;omdat bij het C-type gebleken was, dat de opbrengst aan specifieke stof hierdoor vergroot wordt.

36 liter van onze voedingsbodem werden be�nt met de F23-stam en gedurende 8 dagen bij 37� C bebroed, om daarna een week weggezet te worden bij kamertemperatuur¹). De oplossingen zijn dan z��r visceus geworden. Na dooden der bacteri�n

Door gebrek aan broedruimte konden wij helaas geen grootere hoeveelheden voedingsbodem tegelijkertijd bebroeden.

door 0,5% phenol, dampten wij voorzichtig bij 40� C onder verminderde druk in. Toevoeging van wat laurinealkohol kon de schuimvorming slechts gedeeltelijk tegengaan, zoodat het beschikbare destillatievat maar voor 2/3 gevuld kon worden.

Nadat het volume ongeveer 3 liter geworden was, werd de Ph met ijsazijn op 4,6 gebracht, waarbij geen zichtbare verandering optrad. Vervolgens voegden wij langzaam, onder voortdurend roeren door middel van een electrische roerder, alkoholnbsp;toe tot een concentratie van 30%. Daarbij moet alle specifiekenbsp;stof zich dan in het gevormd neerslag bevinden; na ��n nachtnbsp;staan kon de bovenstaande vloeistof voorzichtig afgeschonkennbsp;worden, daar het neerslag sterk aan elkaar kleefde.

Heidelberg er en ook B o 11 e m a centrifugeerden de door alkohol neergeslagen stof af, waarbij onder de alkoholischenbsp;oplossing twee lagen ontstonden waarvan zij alleen de b o v e n-s t e opwerkten.

In ons geval was na het centrifugeeren slechts ��n compacte slijmmassa te zien, zoodat wij het geheele neerslagnbsp;verder moesten verwerken.

De specifieke stof werd toen opgelost in 2^2 liter buffer-mengsel van een pn = 4,6, gemaakt door een 5% natriumace-taat oplossing met azijnzuur aan te zuren. Centrifugeeren van de troebele oplossing op 3000 toeren gaf slechts weinig eiwit-neerslag. Uit de gecentrifugeerde oplossing kon de specifiekenbsp;stof nu neergeslagen worden bij een alkoholconcentratie vannbsp;45%. Opnieuw oplossen in 1800 cm� buffermengsel en afcen-trifugeeren gaf met alkohol een precipitant, dat reeds volkomennbsp;in 1 liter buffermengsel oploste. De hoeveelheid neergeslagennbsp;eiwit is dan ook zeer gering in verhouding tot hetgeen Botte-m a voor het C-type vond.

Dat de eerste alkoholische oplossing geen specifieke stof meer bevatte konden wij bevestigen, doordat na indampen in vacuonbsp;het residu geen reactie meer gaf met homoloog antiserum. Bijnbsp;het verder zuiveren had de specifieke stof een steeds hoogernbsp;percentage alkohol noodig om neergeslagen te worden. Daaromnbsp;controleerden wij hierop een latere alkoholische oplossing vannbsp;72%; hierin was wel degelijk specifieke stof aanwezig, hetgeennbsp;bleek uit een positieve reactie van het residu met het homologenbsp;antiserum.

Men verlate zich dus niet al te veel op de meening, dat de specifieke stof steeds volledig door alkohol zou wordennbsp;neergeslagen.

Ter verdere onteiwitting pasten ook wij de methode van S e V a g toe. De tot 1 liter teruggebrachte acetaat-bufferop-lossing werd hiertoe gedurende drie uren geschud met 200 cm�nbsp;chloroform en 40 cm� amyl-alkohol. De bovenste troebele oplossing m�t het neerslag werd zoo goed mogelijk afgepipetteerdnbsp;en daarna gecentrifugeerd. Hierbij verschenen onder in de cen-trifuge-buizen enkele druppels chloroform en daarboven eennbsp;compacte massa, die hoofdzakelijk uit eiwit bestond. De daarnbsp;weer bovenstaande troebele oplossing der specifieke stof kon,nbsp;na afpipetteeren, nu opnieuw volgens deze methode onteiwitnbsp;worden.

Het bleek, dat de vereenigde eiwitneerslagen te weinig speci-ficieke stof bevatten om een nieuwe zuivering, door opname in het buffermengsel, loonend te maken.

Na ongeveer zeven keer de onteiwittingsmethode van S e v a g toegepast te hebben, ontstond er na lang schudden nog w�l eennbsp;neerslag, maar de eiwitreacties hierop gedaan waren negatief.nbsp;Om verder verlies te vermijden werd toen, door toevoeging vannbsp;alkohol tot een concentratie van 50%, de specifieke stof uit denbsp;opalescente oplossing neergeslagen. Als opbrengst kregen wijnbsp;gemiddeld 12 gram drooge stof per 50 liter kultuurvloeistof;nbsp;dit is bijna drie keer zooveel als maximaal voor het C-typenbsp;kon worden verkregen.

Door op te lossen in gedestilleerd water en neer te slaan bij een alkohol-concentratie van 72% kregen wij de zuivere specifieke stof in handen en wel als natriumzout.

In tegenstelling met de oorspronkelijke methode van S e v a g maakten wij bij het centrifugeeren niet gebruik van een onderlaag van chloroform. Er waren na het centrifugeeren zooalsnbsp;gezegd slechts enkele druppels chloroform onder in de buizennbsp;te zien. Dit heeft het voordeel, dat bij het vervoeren der buizennbsp;de eiwitlaag niet door elkaar geschud wordt en daardoor gemakkelijk gescheiden kan worden van de oplossing der specifieke stof. Indien men voor bezuiniging de chloroform opnieuw

zou willen gebruiken, kan dat all��n na rectificatie. Door een herhaald schudden met dezelfde chloroform gaat n.1. het specifieke zout in de oplossing, door HCl-ontwikkeling, over innbsp;het specifieke zuur en hierdoor wordt de opbrengst veel minder.

Het drogen der specifieke stof gaf ons eerst eenige moeilijkheden, daar het alkoholische neerslag na drogen in een vacuum-exicator boven CaCl2 een vuile keiharde massa opleverde. Door fijnmalen en zeven kregen wij met veel moeite een geelachtignbsp;amorph poeder.

Met de volgende methode, die ook voor het drogen van gedenatureerde eiwitten door ons met succes werd toegepast, hadden wy een verrassend resultaat:

De zoojuist met alkohol neergeslagen stof wordt nog vochtig in een Soxhlet-apparaat drie tot vijf dagen met aceton ge�xtraheerd. De aceton wordt in de loop der tijd twee keer ververscht.nbsp;Daarna kan snel in een vacuum-exsiccator worden gedroogd.nbsp;Met deze langzame dehydratatiemethode verkregen wij eennbsp;prachtig sneeuwwit volumineus poeder, in plaats van een keiharde stof, die door de zware mechanische bewerking van hetnbsp;malen en zeven ijzer-verontreinigingen bevat en er geelachtignbsp;uitziet.

Zeer groote voordeelen zijn o.a.: de tijdbesparing, een zuiverder stof, een fijnere verdeeling en daardoor weer een gemakkelijker oplossen.

Natuurlijk moesten wij ook nagaan of de specifieke stof door deze bewerking serologisch niet veranderd was. Hiertoe werdnbsp;de precipitatie-titer van de gewoon gedroogde en die van de metnbsp;aceton gedroogde specifieke stof bepaald. Beiden hadden t.o.v.nbsp;het gebruikte serum een gelijke precipitatie-titer vannbsp;1:10.000.000, zoodat een invloed van aceton op de specificiteitnbsp;niet merkbaar is.

Alle eiwitreacties negatief (Millon, ninhydrine-, biureet-en sulfosalicylzuur-reactie) en de Molish-proef op polysac-chariden sterk positief. Het stikstof-gehalte was ongeveer

0,3 %, de phosphor-reactie van Kjeldahl positief en de zwavel-reactie van Lassaigne negatief.

De optische draaiing was door opalescentie van de oplossingen niet te bepalen. Het aschgehalte was ongeveer 10%; terwijl de Ph van een 1% oplossing op 6,8 kon worden bepaald.

Een poging tot verdere zuivering, om het stikstof percentage te verminderen, werd niet gedaan, daar bij het onderzoek vannbsp;B o 11 e m a bij het C-type was gebleken, dat het specifieke zoutnbsp;bestaat uit een lipo�d-polysaccharide-complex, dus stikstof moetnbsp;bevatten.

Bij 50 cm-�� van een 2 % oplossing van het L.-P.-zout voegden wij 5 cm� 2n HCl toe. Hierna werd direct onder omschuddennbsp;alkohol toegevoegd, totdat alle stof neergeslagen was. Na afcen-trifugeeren en oplossen in zoo weinig mogelijk gedestilleerdnbsp;water, werd opnieuw aangezuurd met zoutzuur en met alkoholnbsp;behandeld. Na drie keer met zuur behandeld te hebben en hetnbsp;neerslag met de bekende aceton-droogmethode te hebben gedroogd, verkregen wij het vrije L.-P.-zuur.

Uit de vereenigde alkoholische oplossingen bleek na indampen, neutralisatie met NaOH, en opnieuw met alkohol behandelen, vrijwel geen neerslag meer te ontstaan; de verliezen bij deze bereidingsmethode waren dan ook zeer gering.

De moeilijkheden, die B o 11 e m a ondervond bij het, door middel van HCl vrijmaken van het zuur uit het L.-P.-zout vannbsp;type C, konden door ons niet opgemerkt worden. Bij onsnbsp;L.-P.-zout verkregen wij juist, bij gebruik van verdund tri-chloorazijnzuur in plaats van verdund zoutzuur, een geringerenbsp;opbrengst aan vrij lipoid-polysaccharide-zuur.

Men moet er echter w�l goed op letten het zoutzuur zoo kort mogelijk te laten inwerken, daar zuur van zeer grooten invloednbsp;is op de viscositeit der oplossingen. Uit een langeren tijd metnbsp;zuur behandelde L.-P.-oplossing zijn de polysacchariden nietnbsp;meer neer te slaan, tenzij bij een zeer hoog alkohol-percentage,nbsp;en dan met groote verliezen.

De chemische eigenschappen van het vrije L.-P.-zuur zijn in het kort de volgende:

Het zuuraequivalent kon bepaald worden op 410; terwijl een 1 %-opIossing in gedestilleerd water een pn van 4,0nbsp;had. Het aschgehalte was 0,1 % en daalde ook na meerderenbsp;zoutzuur-behandelingen niet meer. De optische draaiingnbsp;kon bepaald worden en gaf een [q:]d = �100� (c = 0,5).

Zooals wij reeds in het theoretische gedeelte blz. 25 uiteenzetten, zouden wij een nader onderzoek instellen naar de samenstelling van de lipo�d-fractie uit het lipo�d-polysaccharide-complex.

Daar zoowel BoivinenMesrobeanualsBottemabij deze lipo�den phosphar en stikstof vonden, gaan onze eerstenbsp;gedachten uit naar de plantaardige phosphatiden, die vooralnbsp;door Bleyeren Diemair (1931) en later door D i e m a i rnbsp;en Weiss (1939) onderzocht zijn. Deze schrijvers zijn metnbsp;hun onderzoekingen over de phosphatiden uit wortelen, melk,nbsp;tarwe, gerst, haver, boekweit en lupine reeds ver gevorderd.nbsp;Voor hun analyses gingen zij uit van groote hoeveelhedennbsp;materiaal, zoodat zij tenslotte met geperfectionneerde apparatennbsp;kleine hoeveelheden vetzuren quantitatief konden bepalen.

Daar wij de beschikking zouden krijgen over hoogstens enkele honderden mg zuiver lipo�d, kon er geen sprake vannbsp;zijn een volledige analyse uit te voeren en zouden wij ons totnbsp;enkele hoofdzaken moeten bepalen.

Het meest komen hiervoor de P: N-verhoudingen in aanmerking, die in phosphatiden 1:1 en 1: 2 kunnen zijn. Tot de P: N-verhouding 1:1 behooren de lecithinen en kephalinen en tot de 1: 2-verhouding de sphyngomyelinen.

Om de P: N-verhouding van het lipo�d uit het A-type vast te stellen moesten wij ons eerst bezig houden met micro-stikstof-en micro-phosphor-bepalingen.

len en Heslinga (1930) gebruikt met het door ter Meulen (1934) voorgestelde nikkel-thorium als katalysator.

Zelfs indien het stikstof-percentage maar 0,1 % zou zijn, kon worden volstaan met het afwegen van 10 mg stof.

De hydreering had plaats tusschen 250 en 280� C binnen een uur tijds, en de ontstane ammoniak werd getitreerd opnbsp;0,01 n HCl, met methylrood als indicator.

De micro-phosphor-bepaUngen leverden veel moeilijkheden op, omdat in slechts enkele mg-stof de phosphor met een nauwkeurigheid van enkele gamma�s zou moeten worden bepaald.

Volgens de literatuur is de nauwkeurigheid van de phosphor-bepalingen, waarbij de te ondei'zoeken stof ontsloten moet worden, niet erg groot. Het was ons doel om een micro-phosphor-bepaling te vinden, die zoo mogelijk dezelfde nauwkeurigheid zou bezitten als de micro-stikstof-bepalingen.

Uit een voorproefje bleek, dat de phosphor organisch gebonden was, zoodat de bepaling gesplitst kon worden in een ontsluitingsmethode en een anorganische phosphorzuur-bepaling.

Een geringe hoeveelheid anorganisch phosphaat kan op verschillende manieren zeer nauwkeurig bepaald worden; b.v. volgens Postic, Rabat� en Courtois (1942) met strych-ninemolybdaat en daaropvolgende nephelometrische vergelijking van de troebeling, �f volgens D e n i g � s met het ammonium-molybdaat-reagens en reductie b.v. met hydrochinon van hetnbsp;phosphor-molybdeenzuur tot een blauwe kleur, die veroorzaaktnbsp;wordt door het H3PO4. (Mo02.4Mo03) complex.

De methode met het strychnine-molybdaat leek ons hier niet zoo geschikt, omdat bij de voorafgaande ontsluiting stoffennbsp;kunnen ontstaan, die invloed konden uitoefenen op het colloUnbsp;dale neerslag; daarom besloten wij tot de blauwkleuring metnbsp;ammonium-molybdaat.

1. Als eerste ontsluitingsmethode voor het phospholipo�d kozen wij de elegante methode van Roepke (1937). De stofnbsp;wordt hierbij opgelost en ingedampt met 2 cm� van een 50 %nbsp;magnesium-nitraat 6aq.-oplossing. Bij temperatuursverhoogingnbsp;smelt hierbij het nitraat in zijn kristalwater, en bij deze vrijnbsp;hooge temperatuur heeft een gemakkelijke oxydatie van denbsp;elementen plaats. Ten overvloede kan nog, indien niet alle koolstof opgelost is, met een druppel HNO3 opnieuw verhit worden.

Daarna moet men echter nog bij hooge temperatuur de nitreuze dampen verdrijven, en hierbij bleek ons dat iets van het materiaal -van de kolfjes oploste. Uit pyrex kolfjes en zelfs uitnbsp;kwarts kroesjes loste een wisselende hoeveelheid materliaalnbsp;op, zoodat de blanco proeven g��n constante blauwwaarde tenbsp;zien gaven. Ook platina kroesjes werden voor een gedeelte opgelost en deugden niet voor ons doel.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Een tweede ontsluitingsmethode van Steinhoff (1938):nbsp;koken met sterk HNO3 en KMn04 en daarna ontkleuren metnbsp;H2O2, leverde eveneens te hooge en wisselende blauwwaardennbsp;voor de blanco-proeven op.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Als derde methode probeerden wij de beproefde ontsluitingnbsp;van K j e 1 d a h 1, die niet direct werd gekozen, omdat hetnbsp;zwavelzuur zoowel oxydeerend als reduceerend kan werken.nbsp;Het is namelijk een bekend feit, dat de micro-Kjeldahl stifstof-bepaling voor hoogmoleculaire stoffen te lage waarden oplevert,nbsp;vandaar onze voorkeur voor de N-bepalingen volgens ternbsp;Meulen en Heslinga. Zoo zou het ook mogelijk kunnennbsp;zijn, dat de micro-Kjeldahl phosphor-ontsluiting voor hoogmoleculaire stoffen te lage phosphorwaarden gaf.

De destructie der stof geschiedde nu door ongeveer 10 mg-stof, in een pyrex rondbodem van 50 cm� inhoud, met langen hals, te verhitten met 1 cm� sterk zwavelzuur en een seleen-mengsel zonder kopersulfaat. De lichtgele oplossing kon metnbsp;enkele druppels H2O2 (3 %) geheel ontkleurd worden. In denbsp;heldere oplossing moest nu het anorganische phosphaat bepaaldnbsp;worden.

De phosphaat-hepaling met phosphor-molybdeenzuur geeft een blauwkleuring, die wij met behulp van een �Stufenphoto-meter� exact zouden kunnen vastleggen. Daar wij hierover nietnbsp;de beschikking hadden, gebruikten wij een tintometer vannbsp;Lovibond, waarvan van As (1939) overigens terecht zegt,nbsp;dat dit apparaat niet te beschouwen is als een wetenschappelijknbsp;instrument, doch dat het zeer goed bruikbaar is voor indirectnbsp;bepalen en vergelijken van kleuren.

Het bleek later zeer juist te zijn geweest, dat wij de blauwwaarde van onze standaardoplossingen, die gewoonlyk voor vergelijking moesten dienen, hadden vastgelegd, daar deze na

ongeveer drie dagen, door invloeden van licht en zwavelzuur op het phosphor-molybdeencomplex, veranderen.

Aan de hand van de anorganische phosphaat-bepaling van Bell en Doisy (1920) �f Denig�s (1921), werd nunbsp;als volgt gewerkt:

Aan het volgens Kjeldahl ontsloten en met ammoniak in de koude op Congopapier geneutraliseerde phosphaatnbsp;voegden wij 0,4 cm� reagens Denig�s toe. De lichtgeel gekleurde oplossing werd tot aan het kookpunt verhit, waarnanbsp;0,2 cm� hydrochinon-reagens onder omschudden werd toegevoegd. Na �nkele seconden doorkoken lieten wij de vloeistof rustig af koel en, spoelden die in een 25 cm�-maatkolfjenbsp;en konden dan direct de blauwwaarde bepalen. Deze waardenbsp;blijft ongeveer drie dagen constant. Naast een phosphor-bepaling werd eenige malen een blanco proef op preciesnbsp;dezelfde manier gedaan. De blanco�s met Kjeldahl-ontslui-ting waren steeds constant en gaven slechts een blauwwaarde van 0,5 Lovibond-Eenheid.

Het reagens van Denig�s werd als volgt samengesteld: wij losten 25 gram ammoniummolybdaat op in 100 cm� water,nbsp;voegden daarna 25 cm� sterk zwavelzuur toe en vulden metnbsp;water aan tot 500 cm�.

Het hydrochinon-reagens bereidden wij door 0,5 gr hydro-chinon en 15 gr natriumbisulfiet in 100 cm� water op te lossen.

In plaats van de reagentia, volgens het oorspronkelijke voorschrift, in de koude op het phosphaat te laten reageeren, deden wij dit volgens Pesez (1942) in de warmte. De reagentia ennbsp;hoeveelheden die Pesez in zijn proeven gebruikt, zijn voornbsp;ons doel niet geschikt, daar ze gebaseerd zijn op hoeveelhedennbsp;phosphor tot 10 y.

Er moet op gelet worden, dat het D e n i g � s-reagens niet te oud is en steeds in het donker bewaard wordt. Een blanco proefnbsp;van een Denig�s-reagens, dat twee weken in het licht gestaannbsp;had, gaf een blauwwaarde van 5,3 Lo.E.; daarentegen bleefnbsp;een blanco proef van een zes maanden oud reagens, dat in hetnbsp;donker bewaard was, constant op een blauwwaarde van slechtsnbsp;0,2 Lo.E.

De metingen van 10 tot 200 y deden wij alle met 0,4 cm�' Denig�s- en 0,2 cm� hydrochinon-reagens. De nauwkeurigheidnbsp;bij het aflezen gaat tot op 0,1 Lo.E., zoodat met onze bepalingnbsp;ongeveer 3 a 4 y phosphor zuiver gemeten kan worden.

Verband tusschen de blauwwaarde bepaald met de Lovibond-tintometer en de hoeveelheid phosphor.

De P: N-verhoudingen konden nu bepaald worden van het lipo�d-polysaccharide-natriumzout en van het vrije lipo�d-poly-saccharide-zuur, terwijl daarnaast als controle een zuiver leci-thinepreparaat van Fried r. Witte, Rostock werd ingezet.nbsp;Het N-percentage werd nu bepaald door middel van de for-cmquot;* 0,01 n HCl X 13,97

genomen blauwwaarde verminderd met de correctie voor de blanco proef, met behulp van de graphiek direct het aantal ynbsp;phosphor in een oplossing konden vaststellen.

Daar de controleproef bij zuivere lecithine de juiste P: N-verhouding van 1:1 opleverde, kunnen wij concludeeren, dat onze P-bepalingen betrouwbaar waren. Wij mochten immersnbsp;aannemen, dat onze N-bepalingen, uitgevoerd volgens denbsp;methode van ter Meulen en Heslinga, ��k voor hoog-moleculaire stoffen de juiste waarden opleverden.

In de bovenstaande tabel komt het verschil in de P; N-verhoudingen van het natriumzout en het vrije zuur duidelijk naar voren. De verklaring hiervan zullen wij op blz. 45 geven.

3. ISOLATIE DER POLYSACCHARIDEN EN LIPOIDEN. A. De scheiding van het L.-P. in lipo�d en polysaccharide.

algemeen gebruikelijk is, maakten w� gebruik van verdund azijnzuur in de warmte. Hiertoe werd 300 mg L.-P. F23-zoutnbsp;opgelost in 30 cm� gedestilleerd water waarna azijnzuur werdnbsp;toegevoegd tot een concentratie van 1 normaal. Na een half uurnbsp;verhitten op het waterbad, scheidde .zich een zwaar vlokkignbsp;neerslag af, dat door centrifugeeren verwijderd kon worden.nbsp;Uit de oplossing kon met alkohol weer het polysaccharide-zoutnbsp;worden verkregen. Het neerslag, dat ongeveer 10 % van hetnbsp;ingewogen L.-P .-zout uitmaakte, was nu het ruwe lipo�d. Ditnbsp;loste op in 0,1 n NaOH en kon met azijnzuur weer wordennbsp;neergeslagen.

Wij verkregen zeer onbevredigende resultaten met deze methode. Het lipo�d loste slecht in alkohol op en daar zoowelnbsp;loog als verhitting met azijnzuur ontledingen, veroorzaken,nbsp;sloegen wij een geheel andere weg in, en trachtten een scheidingnbsp;in de koude te verkrijgen met een buffermengsel van een bepaalde Ph :

2. 200 mg L.-P.-zout werd opgelost in 20 cm� van een buffermengsel met een pn van 2,2. Deze buffer werd gemaakt door 2,5 gram oxaalzuur op te lossen in 100 cm� water en daarnanbsp;loog toe te voegen tot de juiste Ph, met tropaeoline 00 als indicator. In deze buffer werd het zout opgelost en na vijf dagennbsp;kon het neerslag dat ontstaan was afgefiltreerd worden. Ditnbsp;neergeslagen lipo�d loste grootendeels op in CH3OH, het onoplosbare gedeelte werd verwaarloosd. Indampen onder verminderde druk in stikstof-atmosfeer gaf een vaste stof, die echternbsp;slechts voor een klein gedeelte in aether oploste. Na afdampennbsp;van de aether kon de stof weer in methylalkohol worden opgenomen. Door deze alkohol af te dampen en de stof in vacuonbsp;boven P2O5 te drogen, hielden we een lichtgele vettige substantie over.

De bufferoplossing was nog troebel, doordat niet al het lipo�d was neergeslagen, maar na een half uur verhitten op het waterbad was de oplossing geheel helder geworden. Het neerslagnbsp;waschten wij met lauw water en daarna met methylalkoholnbsp;waarin het onoplosbaar was, om het vervolgens eveneens bovennbsp;P2O5 te drogen. Deze twee gedroogde stoffen zullen later bijnbsp;onze analyses behandeld worden.

De bufferoplossing waaruit het neerslag verwijderd was, bevatte nu naast het zuivere polysaccharide-zout het oxaalzuur.nbsp;Dit mengsel was niet of moeilijk te scheiden, omdat beide stoffen goed oplossen in water en moeilijk oplossen in alkohol, ter-.wijl de calciumzouten van beide onoplosbaar zyn.

Door gebruik te maken van deze oxaalzuurbuffer is het ons gelukt het lipo�d in twee fracties af te scheiden, waarvan denbsp;eene oplosbaar en de andere onoplosbaar is in methylalkohol.nbsp;Het nadeel van deze methode n.1. het verlies van het polysaccharide en de noodzakelijkheid t�ch te moeten verhitten om hetnbsp;lipo�d volledig neer te slaan, bracht ons er toe nog een derdenbsp;scheiding te beproeven.

3. Hiertoe maakten wij gebruik van het precipiteerend vermogen van ijsazijn. Wij losten 5 gram L.-P.-natriumzout op in 250 cm� gedestilleerd water en lieten deze oplossing, na toevoeging van 500 cm� ijsazijn, gedurende vijf dagen staan. Denbsp;oplossing was toen volkomen helder geworden en het neerslagnbsp;bezonken. Na afcentrifugeeren kon de bovenstaande polysac-charideoplossing voorzichtig worden afgepipetteerd. Door hetnbsp;neerslag op te nemen in 20 cm� water van hoogstens 40� C ennbsp;dit daarna opnieuw een dag met het dubbele volume ijsazijnnbsp;weg te zetten, verkregen wij het ruwe lipo�d. De aceton-droog-methode kon ook op dit ruwe lipo�d worden toegepast en gafnbsp;ons een lichtgeel amorph poeder, met een opbrengst van 9,6 %nbsp;aan droge stof.

De vereenigde ijsazijn-oplossingen gaven met alkohol een neerslag van het zuivere polysaccharide, dat nog gedeeltelijknbsp;als natriumzout aanwezig was. Door opnieuw op te lossen innbsp;gedestilleerd water, neer te slaan met alkohol en de aceton-droogmethode toe te passen, verkregen wij een mooie wittenbsp;stof met een opbrengst van 80 %. Uit de alkoholische oplossingen kon door indampen in vacuo, neutraliseeren en daarnanbsp;opnieuw met alkohol behandelen nog 9,5 % aan ruw polysaccharide-zout verkregen worden. De verliezen bij de ijsazijn-schei-ding waren dus z��r gering, gezien de bijna quantitatieve opbrengst der verschillende componenten.

Een 2 % oplossing van een P.-zout in gedestilleerd water werd daartoe eenige malen met zoutzuur en alkohol behandeld. Nanbsp;drogen van het polysaccharide-zuur met de aceton-droogmethodenbsp;verkregen wij een witte kristallijne stof. In tegenstellingnbsp;met de ervaring bij het bereiden van het vrije L.-P.-zuur, konden we hier uit de vereenigde alkoholische oplossingen nog w�lnbsp;ruw polysaccharide-zout neerslaan; er was dan ook vrij veelnbsp;verlies bij de bereiding van de vrije polysaccharide-zuren.

C. Micro-stikstof- en micr�-phosphor-hepalingen der lipo�den polysaccharide-complexen.

Door onze drie scheidingsmethoden van het lipo�d-polysac-charidecomplex zijn ons in handen gekomen: vier lipo�d preparaten en drie vrije polysaccharide-zuur preparaten.

1ste een lipo�d preparaat uit azijnzuur bij 90� C neergeslagen. 2de een lipo�d preparaat uit het buffermengsel bij 18� C neergeslagen.

5de een polysaccharide-zuur preparaat, als zout afkomstig uit de azijnzuuroplossing van 90� C.

6de een polysaccharide-zuur preparaat, als zout afkomstig uit het buffei'mengsel van 90� C.

7de een polysaccharide-zuur preparaat, als zout afkomstig uit de ijsazijnoplossing van 18� C.

Van al deze stoffen hebben wij het stikstof- en phosphor-gehalte bepaald, om uit te maken welke van de drie bereidingsmethoden het meest zuivere preparaat oplevert.

1ste P:N-bepaling van het met In azijnzuur neergeslagen lipo�d bij 90� C uit een 1 % L.-P.-natriumzoutoplossing.

N % � 4,08 en P % = 3,81; dus P: N z= 1; 2,4. 2de P: N-bepaling van het in methylalkohol oplosbare lipo�d,nbsp;neergeslagen in de koude uit een buffermengsel.

3de P; N-bepaling van het lipo�d, dat alleen door warmte neerslaat uit het buffermengsel.

N% = 3,i7 en P % = dus P: N =1: 5,2 4de P:N-bepaling van het lipo�d, dat met ijsazijn neerslaatnbsp;in de koude.

N% ^ 1,32 en P% r= 2,58; dus F:N � 1:1,2. 5de P- en N-bepaling van het vrije P.-zuur, verkregen door hetnbsp;lipo�d te verwijderen met In azijnzuur bij 90� C.

6de P-bepaling van het vrije P.-zuur, verkregen na verwijdering van beide lipo�d-fracties uit het buffermengsel. Gemengd met oxaalzuur is het P % = 0,15. Het N-percentage werd niet bepaald.

'ide P- en N-bepalingen van het vrije P.-zuur, verkregen door het lipo�d te verwijderen met ijsazijn in de koude.

Tevens werden P- en N-bepalingen gedaan van het P.-natrium-zout, verkregen door het lipo�d te verwijderen met ijsazijn in de koude. P % == 0,09; N % = 0,03.

Naar aanleiding van onze bepalingen konden wij de volgende conclusie�s trekken:

1ste Een phosphatide van de Lecithin e-K e p h a-1 i n e-groep is aanwezig in de specifieke kapselstof van B. pneumoniae type A. (Zie No. 2, 4 en 6).

2de Het phosphatide ontleedt in de warmte, waarbij de phosphor- en stikstofverbindingen gedeeltelijk vrij komen.nbsp;Deze zijn verantwoordelijk voor de te hooge percentagesnbsp;in No. 3 en 5.

3de Ons lipo�d-polysaccharide-natriumzout heeft een te hoog stikstofpercentage, zoodat wij ondanks de negatieve eiwit-reacties, niet met zekerheid kunnen beweren dat wij eennbsp;eiwitvrije stof in handen hebben gekregen .(Zie No. 1).

4de Het phosphatide kan zuiver worden afgescheiden met ij s a z ij n; de P % en N % komen mooi overeen metnbsp;die van lecithine of met die van een phosphatide van Bleyer.nbsp;(Zie No. 6, 7 en 8).

5de Het zuiverste phosphatide zal kunnen worden afgescheiden door eerst het vrije L.-P .-zuur te maken en dit daarnanbsp;met ijsazijn in de koude te behandelen. Het iets te hoogenbsp;percentage N in No. 6 moet veroorzaakt zijn door eennbsp;onzuiverheid in het lipo�d-polysaccharide-natriumzout.

Het lipo�d-complex dat het eerst bereid werd, door een oplossing van het L.-P.-natriumzout in in azijnzuur op het waterbad te verhitten, trachtten wij te zuiveren door er een loodverbin-ding van te maken. Hiertoe werd het lipo�d opgelost in 0,lnnbsp;NaOH en na filtratie direct met enkele druppels azijnzuur opnbsp;een pa van 6,0 gebracht. Daarna voegden we een geringe overmaat van een verzadigde loodacetaat-oplossing toe. Het neerslag werd na een nacht staan afgecentrifugeerd en goed uitge-wasschen. Het lipo�d-Ioodzout kon in vacuo gedroogd wordennbsp;en was toen een lichtgeel poeder.

Inplaats van een te verwachten verhooging der percentages P en N, zien wij een sterke daling van het phosphor-gehalte.nbsp;Tevens vinden wij evenals Bleyer en Diemair (1931) denbsp;onderling sterk wisselende percentages N en P, die volgensnbsp;deze schrijvers te wijten zou zijn aan resten Pb (OH) 2 in hetnbsp;neerslag. Er trad in elk geval een storing op vraardoor onzenbsp;poging, om het ruwe lipo�d door middel van het loodzout tenbsp;zuiveren, dus niet het gewenschte resultaat opleverde.

Het lipo�dcomplex werd later bereid volgens de methode, die berust op de 5de conclusie van de vorige bladzijde. Hiertoe werdnbsp;uit 10 g specifieke stof, na bereiding van het vrije lipo�d-polysaccharide-zuur, een fractie afgescheiden, die het lipo�dnbsp;moest bevatten. Na de aceton droogmethode te hebben toegepast, kregen wij echter een bijna wit amorph poeder in handen.

Deze stof was onoplosbaar in alkohol, aether, petroleum-aether, benzol, chloroform en aceton. In warm water loste de stof onder ontleding een weinig op, terwijl het lipo�d in verdunde loog bijna volledig oplosbaar was.

De eiwitreactie van M i 11 o n, de biureet- en xanthoprote�ne-reactie zijn negatief; op aminozuren zijn de ninhydrine reactie evenals de kleurreactie van Folin met jS-naphtochinonsulfon-zuur negatief, terwijl ook de reactie op tryptophaan van H o p-k i n s-C o 1 e-W i n k 1 e r negatief is.

Meulen en Heslinga, en gaf een gemiddelde van 1,6 %, terwijl de gemiddelde phosphorbepalingen 3,2% opleyerden.

De P: N-verhouding van het lipo�d is dus 1:1,1. In deze stof vonden wy hoogere P- en N-percentages, doordat het lipo�dnbsp;niet direct uit het L.-P.-natriumzout maar door middel van hetnbsp;vrije L.-P.-zuur werd afgescheiden. Ook uit de P: N-verhoudingnbsp;bleek dus, dat er een beter resultaat verkregen was.

Diemair en Weiss (1939) konden volgens de methode van Peters en vanSlyke (1932) uit het percentage amino-stikstof en het totale stikstofgehalte de kephaline- en lecithine-percentages berekenen. Het is echter bij hoogmoleculaire gemengde lipo�dcomplexen moeilijk, om volgens deze methodenbsp;het aminostikstofgehalte van het in het phosphatide aanwezigenbsp;colamine te bepalen. Door het geringe stikstofgehalte en denbsp;slechte verdeeling van het in water gesuspendeerde materiaalnbsp;kloppen de bepalingen over het algemeen slecht.

Daar ons ervaring en tyd ontbrak om met het complete origi-neele �van Slyke�-toestel te experimenteeren, waren wij tevreden met de resultaten, die in Amsterdam met het vereenvoudigde �van Slyke�-toestel voor ons bereikt werden. De eerste bepalingen vielen daar echter veel te hoog uit, doordat hetnbsp;lipo�dcomplex bij het oplossen in loog, nog geruimen tijd luchtbelletjes afgaf. Nadat de oplossingen van de stof in loog v��rnbsp;de bepaling in hoogvaccuum hadden gestaan, bleek het percentage Nnh2 = te zijn.

Uit het totale N-percentage van 1,6 berekenden wij dus voor het lipo�dcomplex 72 % kephaline en 28 % lecithine. Gezien denbsp;moeilijkheden bij de aminostikstof-bepalingen, hechtten wijnbsp;hier echter niet veel waarde aan; temeer daar de stof asch bevatte moet het kephajine-gehalte nog hooger zijn.

Ongeveer 50 mg lipo�d werd drie uur met 10 %-ig HCI boven de vrije vlam gekookt. De oplossing was toen lichtgeel en werd,nbsp;na drie keer uitschudden met aether om de vetzuren op tenbsp;lossen, ingedampt.

In het residu werd gereageerd op glycerine volgens Mul-liken met pyrogallol en zwavelzuur, evenals volgens D e n i-g � s met code�ne; beide reacties waren positief. Na neutralisatie van de zoutzure oplossing was de reactie met het alkalo�d-reagens van Bouchardat positief, hetgeen op choline wijst.

Het indampen van de aetherische oplossing leverde een vettige stof op, die zuur reageerde op lakmoes, en met loog een troebele vloeistof gaf, die bij schudden sterk schuimde. Ditnbsp;wijst op de aanwezigheid van vetzuren.

Ongeveer 50 mg lipo�d losten we op in 5cc 0,ln NaOH waarbij wij het neerslag afcentrifugeerden .en dit nog twee keer metnbsp;0,ln loog uitwaschten.

Dit onoplosbare deel woog ongeveer 0,5 mg en loste maar gedeeltelijk in 2n HCl op. De helft hiervan gebruikten wij omnbsp;op calcium te reageeren in azijnzuurmilieu met ammonium-oxalaat. Er ontstond een neerslag na verwarmen, dat in verdundnbsp;zoutzuur oploste. Uit de asch van het oorspronkelijke lipo�d konden wij de calciumreactie duidelijk bevestigen. De andere helftnbsp;gebruikten wij om met natriumphosphaat te reageeren op magnesium, waarbij geen neerslag te zien was. Het lipo�d is dusnbsp;niet vrij in onze handen gekomen, maar gebonden aan calcium;nbsp;nu kunnen wij de onoplosbaarheid van het lipo�d in organischenbsp;oplosmiddelen ook beter begrijpen.

De vereenigde O,ln-loogoplossingen werden met een dubbel volume ijsazijn weggezet; het lipo�d sloeg hiermee niet neer.nbsp;De ijsazijnoplossing kon in vacuo bij 30� C tot een klein volumenbsp;worden ingedampt; na neutralisatie met 0,ln NaOH en aanzuren met 0,ln HCl werd de oplossing drie keer met aethernbsp;uitgeschud. Na de aetherische oplossing te hebben gewasschen,nbsp;gedroogd en in vacuo te hebben ingedampt, ontstond aan denbsp;invoercapillair een kleine hoeveelheid witte amorphe slijmerigenbsp;stof. Aan de lucht was deze stof binnen tien minuten door waterdamp vervloeid, dit komt mooi overeen met het gedrag dernbsp;zuivere phosphatiden. Nadat het lipo�d opnieuw in eenige druppels aether opgenomen en in een vacuum-exsiccator gedroogdnbsp;was, bleef een witte kleverige stof over.. De opbrengst was

5. Eigenschappen van het polysaccharide-complex uit het L.-P. 49 echter slechts 4 mg, en werd voor de phosphor- en stikstof-bepalingen gebruikt. Het percentage P is 3,00 en dat van N isnbsp;1,47; dus P:N = 1:1,1.

Er werd nog een aparte proef gedaan op het lipo�dcomplex voor het aantoonen van glyceriden. Hiertoe losten wij de stofnbsp;op in In loog, voegden een druppel kopersulfaatoplossing toenbsp;en filtreerden door een propje asbest. Het filtraat gaf metnbsp;ferrocyaankalium na aanzuren met azijnzuur het bruine neerslag van het koperzout. Een meerwaardige alkohol is dus aanwezig, in dit geval glycerine.

In een aparte proef werd ook uitgenraakt, dat de reactie op cholesterine van Lieberman n-S tore h-M o r a w s k inbsp;negatief was.

1. nbsp;nbsp;nbsp;De specifieke stof van B. pneumoniae type A bevat eennbsp;phosphatide van de Lecithine-Kephaline-groe^ (P: N =nbsp;1:1,1).

2. nbsp;nbsp;nbsp;Uit het gehalte aan amino-stikstof kunnen wij berekenen,nbsp;dat het phosphatide m��r dan 72% kephaline moet bevatten.

3. nbsp;nbsp;nbsp;In het phosphatide zijn glycerine, choline en vetzuren aanwezig, maar g��n cholesterine.

4. nbsp;nbsp;nbsp;De analyse geeft %C = 42,6; %H = 6,8; %N = 1,6;nbsp;%P = 3,2; benevens asch van het calcium.

5. nbsp;nbsp;nbsp;Het phosphatide is onoplosbaar in de gebruikelijke organische oplosmiddelen en komt niet vrij, doch aan calciumnbsp;gebonden voor.

6. nbsp;nbsp;nbsp;Het is mogelijk om van het phosphatide een gedeelte af tenbsp;splitsen dat w�l oplosbaar is in aether, en waarvan denbsp;P :N-verhouding eveneens 1:1 bedraagt.

Reeds eerder vermeldden wij de methode voor de isolatie van het polysaccharide-natriumzout en de omzetting hiervan in hetnbsp;vrije zuur (blz. 43).

veelheid zuur op te lossen in gedestilleerd -water en te titreeren met 0,ln NaOH met phenolphtaleine als indicator. Het zuur-aequivalent -wordt dan berekend uit:nbsp;mg

De pH-bepalingen werden uitgevoerd t.o.v. standaard-buffer-oplossingen van een bekende pn, door middel van een geschikte kleurindicator. Een 1�%-oplossing van het vrije P.-zuur hadnbsp;een pn van 4,2.

Het optisch draai�ngsvermogen van het vrije polysaccharide-zuur kon met nauwkeurigheid bepaald worden. In verband met metingen van andere onderzoekers en met die, door ons gedaannbsp;met het vrije L.-P.-zuur, namen we toch een 0,5 %-oplossingnbsp;hiervoor. De [�jo bleek �90� te zijn.

Voor de bepaling van het aschgehalte werd de stof ongeveer 20 minuten in een platina kroesje met deksel z�� verhit, datnbsp;alleen de bodem in een zuurstofrijke vlam er roodgloeiend uitzag. Ingewogen werd ongeveer 15 mg stof per bepaling, die opnbsp;een micro-balans kon worden afgewogen.

Het aschgehalte van het polysaccharide-natriumzout, dat ongeveer 10 % was, daalde na ��n HCl-behandeling tot 3,5 %; na 3 keer met HCl behandeld te hebben, was het aschgehalte vannbsp;het vrije zuur 0,0 % geworden.

Hubers te Amsterdam, evenals de aminostikstof-bepalingen. Het polysaccharidevrije-zuur bevatte 44,1 % C en 6,2 % H.

Deze bepalingen werden op de reeds eerder beschreven wijze verricht en gaven voor het P.-vrije zuur 0,0 % N en 0,1 % P.

Een vergelijking tusschen de eigenschappen, die in Amerika en die hier in Utrecht zijn gevonden, vindt men in de volgendenbsp;tabel.

Wij zien dus aanmerkelijke verschillen tusschen de onderzoekingen; over het algemeen lijken de eigenschappen van de L.-P.-zuren uit Utrecht het meeste op die van de P.-zuren uitnbsp;Amerika.

Er kan in dit verband nog worden opgemerkt, dat wij C- en H-bepalingen lieten doen van een P.-zuur, ge�soleerd na verwijdering van het lipo�d in In-azijnzuur op het waterbad. Dezenbsp;zelfde methode werd indertijd door Bottema gebruikt en gafnbsp;bij hem voor het P.-zuur t.o.v. het L.-P.-zuur van het C-type(nbsp;een verlaging te zien van het C-percentage (van 44,7 tot 41,6)nbsp;en een verhooging van het H-percentage (van 5,9 tot 6,3). Ooknbsp;wij vonden voor dit P.-zuur t.o.v. het L.-P.-zuur van het A-typenbsp;een verlaging van het C-percentage (van 41,1 tot 40,5) en eennbsp;verhooging van het H-percentage (van 6,6 tot 6,9).

Na verwijdering van het lipo�d met ijsazijn kregen wij daarentegen voor het P.-zuur t.o.v. het L.-P.-zuur een verhooging te zien van het C-percentage (van 41,1 tot 44,1) en een,nbsp;verlaging van het H-percentage (van 6,6 tot 6,2).

Deze waarden zijn overgenomen uit de publicaties van L�vy-Bruhl en Courtois (1940).

De laatste waarden van de C- en H-percentages voor het P.-zuur uit ijsazijn kloppen met die welke door Goebel gevonden zijn.

0,5 gram polysaccharide-natriumzout werd opgelost in 50 cm^ water, en met 5 cm� 4n loog vier uur onder terugvloeikoelingnbsp;op een kokend waterbad verwarmd. Na aanzuren van de oplossing met 4n zwavelzuur werd afgedestilleerd tot een kleinnbsp;volume. Bij toevoeging van 5 cm� water en daarna opnieuwnbsp;afdestilleeren, vertoonden de verzamelde destillaten een zurenbsp;reactie op lakmoes. Door met alkohol en zwavelzuur te koken,nbsp;kon echter geen esterlucht worden waargenomen noch gaf hetnbsp;met MgO ingedampte destillaat, na filtratie, een reactie metnbsp;natrium-uranylpropionaat. Ondanks dat het destillaat zuurnbsp;was, mogen wij dus niet besluiten, dat er acetylgroepen in hetnbsp;polysaccharide aanwezig zijn.

Daar de reactie van Tollens op alduronzuren bij het destillaat sterk positief was, moeten wij aannemen, dat de uron-zuren uit ons polysaccharide met waterdamp vluchtig zyn.

Het hydrolyseeren van het polysaccharide geschiedde door een 1 %-oplossing hiervan in In zwavelzuur op een kokendnbsp;waterbad te verwarmen, totdat geen toename meer van hetnbsp;reduceerend vermogen viel waar te nemen. Dit werd gecontroleerd door ieder uur een beetje van de oplossing te nemen ennbsp;hiervan het reduceerend vermogen te bepalen volgens F o 1 i nnbsp;en W u (beschreven in de meeste handboeken voor pathologischenbsp;chemie).

Deze suikerbepaling verkozen wij boven die van Hagedorn en J e n s e n, omdat de laatste methode veel reagentia vergt dienbsp;kunnen bederven, terwijl ook de titer van de natriumthiosulfaat-oplossing na verloop van eenigen tijd moet worden bijgesteld.

Het voordeel van de glucosebepaling van F o 1 i n en W u is tevens dat de blauwwaarde gemakkelijk kan worden vastgelegdnbsp;met de Lovibond-tintometer. In plaats van 0,1 cm� van een 1 %-oplossing, beschouwden wij 5 cm� van een 0,01 %-glucoseoplos-sing als standaard 100. Deze hoeveelheid werd 6 minuten met

2 cm^ F o 1 i n s koperreagens in het waterbad verhit, en na afkoelen met 1,5 cm^ phosphormolybdeenzuur gemengd. Nanbsp;even schudden werd direct in een 50 cm� maatkolf gespoeld ennbsp;de blauwwaarde bepaald. Wij verkregen zoo:nbsp;voor de standaard 100 een gem. blauwwaarde van 5,5 Lo.E,nbsp;fynbsp;nbsp;nbsp;nbsp;jtnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;gt;gt;nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;30nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;3,8nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;,,

tt nbsp;nbsp;nbsp;ttnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ttnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ttnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ttnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ttnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ttnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;^t *nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;tt

Om met behulp van de graphiek het reduceerend vermogen van een 1%-ige onbekende suikeroplossing te kunnen bepalennbsp;moeten wij nu �1 cm� tot 100 verdunnen en hiervan de blauwwaarde per 5 cm� volgens F o 1 i n en W u vaststellen. De blauwwaarde van het molybdeenblauw neemt zeer snel af en is alleennbsp;de eerste paar minuten als juiste maatstaf te beschouwen, zoo-dat onmiddellijk af gelezen moet worden.

Met deze suikerbepaling vonden wij na 0, 1, 2, 3, 4 en 5 uur een. reduceerend vermogen van resp. 8 %, 47 %, 63 %, 64 %,nbsp;64 % en 62 %. De hydrolyse was dus na drie uur volledig, zoodatnbsp;wij ook bij latere proeven steeds 3 uur hydrolyseerden.

In tegenstelling met alle andere onderzoekers van de poly-sacchariden der Klebsiellae, vonden wij al direct een reduceerend vermogen. De F e h 1 i n g-proef op het L.-P.-zout of -zuur en op het P.-zout of -zuur vonden wij namelijk in alle gevallennbsp;zwak positief.

Na afloop van de hydrolyse werd bij kooktemperatuur een heete barietwateroplossing toegedruppeld, totdat eenige druppels een sterke geelkleuring veroorzaakten. Den volgenden dagnbsp;kon het BaS04 afgefiltreerd en met heet water uitgewasschennbsp;worden. De oplossing reageerde toen bijna neutraal op Congo-papier; in de hitte werd vervolgens een kleine overmaat BaCOgnbsp;toegevoegd. Na indampen van de oplossing in vacuo tot 5 cm'*,nbsp;werd alkohol toegevoegd tot een percentage van 80 %. Hetnbsp;neerslag zou nu het uronzure-barium zijn en de alkoholischenbsp;oplossing zou de suikers bevatten.

De alkoholische oplossing werd opnieuw in vacuo ingedampt en met alkohol op een percentage van 80 % gebracht; dit werdnbsp;zoolang herhaald totdat in 80 % alkohol geen neerslag meer ontstond. De vereenigde neerslagen van de uronzure zouten vormden toen de uronzuurfractie en het residu, na indampen van denbsp;alkoholische oplossing, bevatte de suikerfractie. De verhoudingnbsp;van de uronzuurfractie t.o.v. de suikerfractie was ongeveer alsnbsp;4:5. De suikerfractie bestond uit lichtgele kristallen, die innbsp;oplossing een sterke Fehling-reductie en soms nog een z��rnbsp;zwakke alduronzuur-reactie van Tollens vertoonden; terwijl de uronzuurfractie een zwakke Fehling-reductie en eennbsp;sterke reactie van T o 11 e n s te zien gaf.

a) nbsp;nbsp;nbsp;een deel dat slecht oplosbaar was in water, het red. verm.nbsp;was 8% t.o.v. glucose.

b) nbsp;nbsp;nbsp;een klein deel dat onoplosbaar was in 32% alkohol; hetnbsp;red. verm. was 35 %.

c) het grootste deel was oplosbaar in 32%, sloeg met 80% alkohol neer en een red. verm. had van 55%.

Alleen door het laatste deel op te nemen in weinig water en met alkohol aan te vallen tot een percentage van 90 %, sloegnbsp;het zirivere uronzure-bariumzout neer. Uit het verlies van bijnanbsp;20% bij het opnieuw neerslaan van het bariumzout bleek, datnbsp;dit zout zelfs in 90% alkohol gedeeltelijk oploste. Dit uronzure-barium is een zeer sterk hygroscopische, witte kristallij ne stof.

Het vrije uronzuur kon bereid worden door een waterige oplossing van het barium-zout met basisch loodacetaat te behandelen. Daarna werd het neerslag goed uitgewasschen, gesuspendeerd in water en met H2S verzadigd. Door de oplossing metnbsp;norit te behandelen en in vacuo in te dampen, verkregen wij nanbsp;droging mooie, bijna kleurlooze kristallen van het uronzuur.nbsp;Uittrekken met 96% alkohol bij 30� C gaf een witte kristallijnenbsp;stof, waarvan het smeltpunt door ontleding niet te bepalen was.

Het uronzuur was niet heelemaal aschvrij, zoodat de koolstof-en waterstof-bepalingen iets te laag uitvielen voor een glucuron-zuur-glucose, zooals door Goebel werd voorgesteld. Wij vonden een C-percentage van 38,9 en een H-percentage vannbsp;5,5 (theoretisch % C = 40,4; % H = 5,6).

De Md werd bepaald op �63�, bij een c = 0,5; (Goebel vond �54�). Het zuuraequivalent was 292 (Goebel 354) ennbsp;het reduceerend vermogen slechts 25% (Goebel 50%).nbsp;Verder werden eenige kleur reacties gedaan, die later beschreven zullen worden.

Hydrolyse van het alduronzuur om de suikerhelft af te splitsen, door 15 uur te koken met In H2SO4, leverde niets bruikbaars op.

De poging om glucose aan te toonen als component van het uronzuur, door met behulp van salpeterzuur het suikerzurenbsp;kaliumzout uit het glucose-deel te maken, is niet gelukt; ditnbsp;was trouwens bij dezelfde behandeling van de suikerfractie ofnbsp;van het geheele polysaccharide-complex, na sterke hydrolysenbsp;door 10 uur te koken in 4n zwavelzuur-oplossing, eveneens hetnbsp;geval.

De suikerfractie werd drie keer met warme absolute alkohol uitgetrokken. Hierdoor kregen we een in absolute alkohol oplosbaar deel Al en een in absolute alkohol onoplosbaar deel A2.

Deze lichtgele stof bevatte slechts ongeveer 5 % van de ge-heele suikerfractie, zoodat wij maar enkele eigenschappen kon-.den bepalen. Het reduceerend vermogen was 42% (Goebel 40%), en de [�]d ongeveer �30�. Een phenylosazon kon gevormd worden en deze stof was oplosbaar in aceton. Het osazonnbsp;ontleedde echter tijdens het omkristalliseeren.

De resultaten van de kleurreacties, die wij deden op de verschillende onderdeden van het polysaccharide en die o.a. te vinden zijn in het handboek voor organische analyse II vannbsp;N. S c h o o r 1, hebben wij in tabel 8 bijeengebracht. Bij denbsp;kleurreactie van Ihl-Pechmann duidt een blauwkleuringnbsp;van de amylalkohol op fructose en een groenkleuring op pento-sen. De kleurreactie van F o u 1 g e r geeft all��n blauw voornbsp;fructose, saccharose en inuline. De orcine-reactie van B i a 1 isnbsp;positief voor pentosen, rhamnose, fructose en alduronzuren.nbsp;Tenslotte duidt bij de naphtoresorcine kleurreactie van Tollens een paarskleuring in benzol all��n op alduronzuren.

De Tollen s-reactie op de suikerfractie gaf een iets groenachtige troebeling, die met een bruine kleur in aether oploste. Dit is volgens van der Haar (1920) een aanwijzing voornbsp;fructose.

Onze conclusies uit de kleurreacties zijn, dat het A^-deel fructose bevat en waarschijnlijk een pentose, maar geen aldu-ronzuren terwijl het A^-deel geen fructose, maar w�l de pentosenbsp;bevat.

De optische draaiing hiervan bleek �21,7� te bedragen. Het reduceerend vermogen was echter in plaats van ongeveer 100%nbsp;slechts 65%. Deze fractie bevat dus behalve zuivere monosennbsp;ook hoogere sacchariden.

100 mg Ai-fractie met 200 mg phenylhydrazinechloride (zuiver) en 300 mg natriumacetaat werden in 5 cm� waternbsp;opgelost. Er kwam een lichte troebeling, maar met krassen wasnbsp;ook na een uur nog geen neerslag te zien. In een kokend waterbad verhit kwam na vyftien minuten het osazon er uit. Dennbsp;volgenden dag werd het neerslag afgezogen, met water ennbsp;daarna met twee druppels alkohol gewasschen. Dit osazon konnbsp;gescheiden worden in een in aceton oplosbaar en een in acetonnbsp;onoplosbaar deel.

Het in aceton onoplosbare phenylosazon werd uit 60 %-ige A. omgekristalliseerd. Wij kregen toen gele naalden met een smeltpunt van 200� C, die gemengd met een zelfbereid fructosazonnbsp;met smeltpunt 202� C g��n depressie te zien gaven.

Het in aceton oplosbare phenylosazon sloeg door sterk te verdunnen uit de oplossing neer en kon uit aceton met petroleum-aether worden omgekristalliseerd. Het smeltpunt van deze lichtgele naalden was 172� C (gecorr.).

Gezien de oplosbaarheid van het phenylosazon in aceton en de kleurreacties, is het waarschijnlijk, dat de suiker uit de A2-fractie identiek is met de 2de suiker uit de A-^-fractie.

Volgens N e u b e r g werd deze verbinding gemaakt door 200 mg van de A^-fractie in 1 cm� water met 0,44 cm� 50 %nbsp;azijnzuur, 0,44 cm� �-methyl-phenylhydrazine en 3 druppelsnbsp;alkohol te behandelen. Na enkele oogenblikken ontstond eennbsp;neerslag van een hydrazon. Den volgenden dag kon het neerslagnbsp;worden uitgewasschen met water en omgekristalliseerd wordennbsp;uit 30 %-ige alkohol. Het zijn dan lichtgele naaldjes die oplossennbsp;in chloroform en weer neerslaan met petroleumaether. Doornbsp;met norit te behandelen in 30%-ige A. krijgen wij mooie wittenbsp;naalden met een scherp smeltpunt van 177� C (gecorr.).

Zoowel het smeltpunt van het phenylosazon als van het a-methyl-phenylhydrazon komen overeen met die van fucose.nbsp;De [ajo in pyridine van fucose- a-methyl-phenylhydrazon isnbsp;volgens de literatuur 3,6�, indien c = 2. Een oplossing van onsnbsp;hydrazon in pyridine geeft echter een [ajo = 34,2� bij eennbsp;concentratie van 1,9; de draaiing is echter moeilijk te bepalen,nbsp;daar de vloeistof sterk fluoresceert. Aangezien het reduceerendnbsp;vermogen van de geheele suikerfractie slechts 65% was (t.o.v.nbsp;glucose) zullen wij hier wel geen monosaccharide in handennbsp;hebben gekregen, maar waarschijnlijk een disaccharide.

Het eerste filtraat van het a-methyl-phenylhydrazon werd gedurende vijf minuten in een waterbad verhit, zooals bij denbsp;bereiding van een d-fructosazon. Na eenige dagen in de ijskastnbsp;gestaan te hebben was het neerslag vast geworden en kon nanbsp;filtratie met een weinig water gewasschen worden. Oplossennbsp;in chloroform en neerslaan met petroleumaether gaf een stofnbsp;met een Smp. == 138� C; na omkristallisatie uit 20%-ige A. metnbsp;norit was het smeltpunt 143� C geworden. Een mengsmeltpuntnbsp;van deze stof met een a-methyl-phenyl-d-fructosazon met eennbsp;smeltpunt 144� C, gaf g��n depressie te zien.

Het polysaccharide van B. pneumoniae type A bestaat uit ��n of meer uronzuren, d-fructose en waarschijnlijk eennbsp;disaccharide, met pentose-kleurreacties. Een samenstellingnbsp;dus die analoog is met die, welke Goebel voor het A-type

5. Eigenschappen van het polysaccharide-complex uit het L.-P. 59 vond, n.1. een aldobionzuur, d-glucose en een disaccharide-zunr-lacton.

Het is ons niet gelukt om behalve fructose nog andere suikers te identificeeren, w�l kunnen wij naar aanleidingnbsp;van de bereiding van het phenylosazon nog opmerken, datnbsp;mannose niet aanwezig is, evenmin als galactose, dat andersnbsp;als slijmzuur bij de oxydatie voor glucose te voorschijnnbsp;zou zijn gekomen.

Wij konden eenige eigenschappen van het uronzuur vaststellen, evenals de smeltpunten van het disaccharide-phenylosazon (172� C) en van het disaccharide-a-methyl-phenylhydrazon (177� C).

G 1 u c o s e in welke vorm ook is niet aanwezig in ons polysaccharide, daar wij noch uit het oorspronkelijke polysaccharide, noch uit ��n van haar onderdeden, een suiker-zuur-kaliumzout konden verkrijgen.

Gezien deze totale afwezigheid van glucose in ons polysaccharide was het onmogelijk onze bezwaren (zie blz. 23) tegen de onderzoekingen van Goebel en Avery (1927), naarnbsp;aanleiding waarvan wij een hernieuwd chemisch onderzoeknbsp;zouden instellen, te weerleggen.

In plaats van deze onderzoekingen te kunnen aanvullen en iets bij te dragen-tot de opheldering van de samenstelling vannbsp;het polysaccharide uit het A-type, verkregen wij een geheelnbsp;ander polysaccharide, waarvan de samenstelling slechts voornbsp;een zeer klein gedeelte kon worden bepaald.

Een mogelijke verklaring van deze geheel verschillende poly-sacchariden zullen wij in de slotbeschouwing geven.

HOOFDSTUK 11.

BEREIDING VAN DE SPECIFIEKE STOF UIT B. PNEUMONIAE TYPE C.

De door ons gebruikte FlO-stam is dezelfde, die B o 11 e m a bij zijn onderzoekingen over het C-type gebruikte. De eigenschappen in cultureel en morphologisch opzicht waren geheelnbsp;gelijk gebleven en weken ook niet af van een nieuwe over-enting, die wij uit Amsterdam kregen toegestuurd.

De gebruikte voedingsbodem samengesteld volgens B o t-t e m a, gaf een opbrengst aan specifieke stof van 1 gram per 50 liter kuituur, in plaats van 3 tot 5 gram.

Een Chamberland L3-filtraat van een kuituur, die ��n dag bij 37� C bebroed was, gaf met anti-C-serum, verdunning 1:5,nbsp;een positieve precipitatie-titer tot slechts 1/8. Deze preci-pitatie-titer was 10 keer zoo klein als die door B o 11 e m a gevonden werd. Dit kwam hoofdzakelijk, doordat de stam op datnbsp;moment minder specifieke stof produceerde.

Ter bevordering der productie van de hoeveelheid specifieke stof werd de groei nu nagegaan op voedingsbodems met toevoeging van Vz % van verschillende suikers. Er moet hiernbsp;nog opgemerkt worden, dat de FlO-stam niet groeit op de voedingsbodem, die wij voor de F23-stam van het A-type samenstelden. De groei van de FlO-stam werd dus nagegaan door aannbsp;de synthetische voedingsbodem van B o 11 e m a toe te voegen:nbsp;d-galactose, d-fructose, d-sorbiet, lactose, dulciet, mannose,nbsp;raffinose of glycerine.

Alleen bij glycerine-toevoeging was, na twee dagen broeden bij 37� C, een sterke groei waar te nemen. Een Chamberlandnbsp;L3-filtraat van een kuituur, die ��n dag bebroed was bij 37� C,nbsp;gaf met anti-C-serum, verdunning 1:5, nu een positieve preci-pitatie-reactie tot 1:32 verdunning. Hoewel de groei zeer snel

was, bleef de opbrengst aan specifieke stof per- 50 liter nog ver beneden het gewenschte; deze was slechts 1,5 gram.

Daarna werd de invloed van sporen cystine op de groei van de FlO-stam nagegaan. Evenals bij de F23-stam konden wijnbsp;hiermee een belangrijke verbetering van de groei bij de FlO-stam bewerkstelligen. De volgende synthetische voedingsbodemnbsp;werd sindsdien door ons gebruikt;

De stoffen werden opgelost in 1 liter leidingwater en met verdund zwavelzuur op een Ph van 7,4 gebracht. Na steriliseeren op 110� gedurende een half uur, kon de voedingsbodem directnbsp;gebruikt worden, daar het ontstane neerslag, na bezinking,nbsp;geen merkbaren invloed op de groei had. Per 50 liter kuituurnbsp;konden nu resp. 3 en 2,5 gram eiwitvrije specifieke stof wordennbsp;verkregen, hetgeen echter nog zeer weinig was in verhoudingnbsp;tot de opbrengst aan specifieke stof uit de F23-stam van hetnbsp;A-type.

De opwerkings-methode was geheel dezelfde als bij de F23-stam. Door de ingedampte kultures aan te zuren met ijs-azijn tot een Ph van 4,2, onstond echter een zwaar neerslag van eiwit en phosphorzouten. Na ��n nacht staan kon denbsp;alkoholische oplossing niet afgeschonken worden, maar moestennbsp;wij het neerslag door centrifugeeren verwijderen. Hierbijnbsp;kregen wij evenals B o 11 e m a twee vaste lagen, die gedeeltelijknbsp;gemengd waren en daarom gezamenlijk opgewerkt werden.nbsp;Door eenige malen de specifieke stof in het buffermengsel opnbsp;te lossen en neer te slaan met alkohol, konden wij zeer veelnbsp;eiwit verwilderen. Het alkoholpercentage dat noodig was omnbsp;de stof neer te slaan liep hier niet omhoog, zooals bij de specifieke stof uit de F23-stam, maar bleef constant op 45. Door de

pnteiwittingsmethode van Sevag toe te passen verwijderden wij de laatste sporen eiwit. Het lipo�d-polysaccharide-natrium-zout kregen wij vervolgens door de stof in gedestilleerd waternbsp;op te lossen en bij een alkoholpercentage van 72 neer te slaan.nbsp;Na toepassing van de aceton-droogmethode had deze stof denbsp;volgende eigenschappen: de eiwitreacties waren negatiefnbsp;(M i 11 o n-, ninhydrine-, biureet-), de polysacchahide-reactienbsp;van M o 1 i s h was sterk positief, het N-percentage was ongeveer 0,4 en de phosphorreactie zwak positief. De optischenbsp;draaiing was door opalescentie niet te bepalen. De precipitatie-titer werd bepaald op 1:3.000.000.

Vanwege de geringe opbrengst aan specifieke stof, ondanks de eenigszins verbeterde voedingsbodem, trachtten wij doornbsp;pathogeniteitsverhooging een vergrooting van de hoeveelheidnbsp;kapselstof te bewerkstelligen. De pathogeniteit van de FIO-stam was erg verminderd, en een witte muis, subcutaan ingespoten met 0,2 cm� van een afgeslibde schuine agar-kultuur,nbsp;stierf niet eens aan de gevolgen. Ondanks dat wij de FlO-stamnbsp;eenige muispassages lieten ondergaan, was de pathogeniteit ernbsp;niet beter op geworden. Het lag voor de hand, om op grond vannbsp;het verlies aan pathogeniteit, een verandering van de serolo-gische eigenschappen aan te nemen.

Door deze verandering van de FlO-stam, zijn wij niet in staat geweest om voldoende specifieke stof te isoleeren voor eennbsp;uitgebreid chemisch onderzoek van het lipo�dcomplex.

Als eerste scheidingsmethode voor het L.-P. gebruikten we die met azijnzuur op het kokende waterbad. Een 1%-oplossingnbsp;van de specifieke stof in gedestilleerd water werd met azijnzuurnbsp;gebracht tot 0,15 normaal en gedurende 1 uur verhit. Het vlokkige neerslag kon worden opgelost in 0,ln NaOH en met azijnzuur weer worden neergeslagen. Dit lipo�d was goed oplosbaarnbsp;in alkohol, aether en chloroform, echter niet in aceton. Indampen in vacuo van de alkoholische oplossing gaf per gram specifieke stof ongeveer 150 mg ruw lipo�d.

Het aschgehalte van dit lipo�d was ook zeer gering; er kon geen calcium in worden aangetoond.

De oplossing van het polysaccharide, dus die waaruit het lipo�d was neergeslagen, gaf tot in 80 % alkoholische oplossingnbsp;g��n neerslag. Bij neutraliseeren met loog, verscheen echternbsp;wel een neerslag, dat na behandeling met HCl en alkohol hetnbsp;vrije polysaccharidezuur opleverde.

Als tweede scheidingsmethode gebruikten wij die met ijsazijn in de koude, zooals reeds eerder bij de F23-stam beschrevennbsp;werd. (Zie blz. 42). Hierbij kregen we uit de polysaccharide-oplossing, dus die waaruit het lipo�d verwijderd was, met alkohol het polysaccharide-natriumzout waarvan als N-percentagenbsp;0,0 en als P-percentage 0,2 werd gevonden. Dit zout gebruiktennbsp;wij voor onze immuniteitsproeven.

De meest treffende verschillen in algemeene samenstelling tusschen de specifieke stoffen uit het A-type en C-type zijn:

1ste Het Lipo�d-Polysaccharide-�liwitcomplex van het A-type bestaat uit weinig eiwit, weinig lipo�de en veel polysaccharide; dat van het C-type uit veel eiwit, veel lipo�de en weinig polysaccharide.

2de Het lipo�dcomplex van het A-type is onoplosbaar in organische oplosmiddelen en is aan calcium gebonden, terwijl dat van het C-type goed oplosbaar is in organische oplosmiddelen en geen calcium gebonden heeft.

Of ondanks deze algemeene eigenschappen de lipo�dcomplexen van het A-type en C-type in chemische samenstelling verschillen, blijft nog een open vraag.

Voor onze immuniteitsproeven bereidden wij ook nog het polysaccharide-natriumzout van de B. pneumoniae type A uitnbsp;een F15-stam. De methode was geheel gelijk aan die voor denbsp;F23-stam, alleen was de opbrengst nog beter. Het N-percentagenbsp;hiervan was 0,0 en het P-percentage 0,1.

IMMUNITEITS-PROEVEN.

Zooals wij reeds eerder in ons hoofdstuk �Het probleem� beschreven, is het onze bedoeling om dieper door te dringen in de antigeniteit van de kapselstof der B. pneumoniae.

Het begrip antigeniteit was al sinds lang bekend en onwillekeurig dacht men hierbij direct aan eiwitten. Iedere scheikundige stof, mits een eiwit of gebonden aan een eiwit, is immers in staat antistoffen op te wekken.

Zoowel de onderzoekers L�vy-B ruhl en Courtois als B o 11 e m a vonden echter een volledige antigeniteit voornbsp;prote�de-vrije lipo�d-polysaccharide-complexen der B. pneumoniae, terwijl B o i V i n en medewerkers deze antigeniteit reedsnbsp;eerder bij Salmonella-soorten en andere bacteri�n opmerkten.

Dus niet alleen eiwitten zijn volwaardige antigenen, maar ook lipo�d-polysacchariden kunnen als zoodanig werkzaam zijn.nbsp;Bovenstaande schrijvers baseerden hun stelling op het feit, datnbsp;door het lipo�d-polysaccharide antistoffen in het bloed van hetnbsp;proefdier worden opgewekt, die zij met precipitatie-reactiesnbsp;konden aantoonen.

Hoewel de resultaten van deze onderzoekingen zeer overtuigend waren, kon of wilde men over het algemeen deze nieuwe theorie niet aanvaarden. 'Ze strookte in menig opzicht niet metnbsp;de algemeene immuniteitsleer.

Men maakte zich er van af, door te veronderstellen, dat het stikstofgehalte, dat men bij de lipo�d-polysacchariden vond,nbsp;afkomstig moest zijn van eiwitten, die dan aansprakelijk zouden zijn voor de antigeniteit dezer lipo�d-polysacchairden. Eennbsp;tweede bedenking tegen deze antigeniteit is, dat sommige vannbsp;die stoffen voor het eene dier w�l en voor het andere dier ni�tnbsp;antigeen zijn. Hierdoor krijgt men wel een zeer onduidelijknbsp;beeld van de antigeniteit der lipo�d-polysacchariden hetgeennbsp;echter niet te vermijden is, aangezien iedere diersoort nu eenmaal op eigen wijze zich zal kunnen verwerj^n tegen dezenbsp;vreemde stoffen.

Wij stelden het ons tot taak om langs chemische weg lipo�d-polysacchariden en polysacchariden te bereiden, die chemisch en mudytisch enoitvriy waren, en slaagden �r in uit de P: N-verhouding van 1:1 te bewijzen, dat het door ons verkregennbsp;L.-P. inderdaad geen eiwit meer bevatte.

Als proefdier kozen wij uitsluitend de witte muis, daar deze het voordeel heeft gevoelig te zijn en snel te reageeren, en hetnbsp;mogelijk maakt tegelijkertijd meerdere proeven in te zetten.nbsp;Het nadeel van de kleine muis, o.a. gelegen in de geringe hoeveelheid bloed, die zij kan opleveren, trachtten wij te ondervangen door de precipitaties als semi-micro-reacd;ies uit tenbsp;voeren.

Z��r tot onze spijt waren wij door de tijdsomstandigheden t�ch gedwongen om het aantal proefdieren te beperken, zoodatnbsp;onze immuniteitsproeven hoofdzakelijk tot het A-type beperktnbsp;bleven.

Voor onze antigeniteits-proeven maakten wij in de eerste plaats gebruik van precipitatie-reacties. Andere reacties, zooalsnbsp;de complementbindings-reacties of die, berustend op anaphyl-actische verschijnselen, werden niet door ons gedaan. De eerstenbsp;leverden trouwens, volgens de Fransche onderzoekers met hetnbsp;L.-P. verricht, specificiteit voor de bacterie-soort op. Denbsp;anaphylactische verschijnselen zijn over het algemeen zeernbsp;afhankelijk van de diersoort en daarom moeilijk te beoor-deelen.

B o 11 e m a was op het idee gekomen om de antigeniteit ook door actieve immunisatie te bewijzen. Dat hem dit niet geluktenbsp;was voor ons juist een prikkel te meer om deze proeven tenbsp;herhalen.

Wij zullen trachten om met uitvoeriger proeven niet alleen door de opgewekte precipitinen, maar ook door een actievenbsp;immunisatie de antigeniteit van onderdeelen van het kapsel-complex te bewijzen. Actieve immunisatie is o.i. tvel het bestenbsp;bewijs voor een volledig antigeen vermogen van de stoffen,nbsp;welke men het dier toedient.

In het nu volgende gedeelte zullen wij eerst de proeven �in vitro� behandelen, welke verdeeld worden in antigeniteits-proeven en speci-ficiteits-proeven van de lipo�d-polysacchariden en polysacchariden.nbsp;Hierop zullen de bereiding van het anti-A-serum bij het konijn, de

bepaling van de precipitatie-titer en de absorptie-proeven volgen. Daarna komen de proeven �in vivo�, welke handelen over de toxiciteitnbsp;van onderdeelen van het kapselantigeen en tot slot de actieve (anti-infectieuse) immunisatie door L.-P. en P. preparaten.

Voor onze antigeniteits-proeven maakten wij gebruik van precipitatie-reacties. Hiertoe werden muizen herhaalde malennbsp;ingespoten met een bepaalde hoeveelheid van een preparaat, omnbsp;dan na een rustpoos van 7 tot 10 dagen gedood te worden. Ditnbsp;geschiedde door lichtgas, zooals in ons laboratorium gebruikelijknbsp;was.

De precipitatie-reactie werd daarna als semi-micro-reactie uitgevoerd op de volgende manier:

Uit het hart van een juist gedoode muis werd zooveel mogelijk bloed in een kort uitgetrokken pipet-Pasteur opgezogen en daarna in een klein buisje uitgeblazen. Na een half uur konnbsp;de bloedkoek van de wand losgemaakt worden met een fijnenbsp;uitgegloeide naald. Vervolgens werd na een uur staan gecentrifugeerd en het heldere serum in een fijn uitgetrokken pipet-Pasteur opgezogen. Kleine prec'ipitatiebuisjes van ongeveernbsp;1 cm� inhoud, werden elk gevuld met 1 druppel serum en 9nbsp;druppels physiologische keukenzoutoplossing. Nadat de buisjesnbsp;even gerold waren kon men de verschillende verdunningen vannbsp;het precipitinogeen vooi'zichtig boven op de serumverdunningnbsp;pipetteeren.

De verdere uitvoering der diverse precipitatie-reacties verschilde van geval tot geval, zoodat wij die bij de volgende proeven steeds apart zullen vermelden.

Als inleidende proef werden vier muizen twee keer, om de vier dagen subcutaan ingespoten met een oplossing van denbsp;natriumzouten van het L.-P. F23 en het P. F23, terwijl dezenbsp;oplossingen voor een deel met 20 % steriel paardenserum gemengd werden. Bij gebrek aan varkensserum kon hiervan innbsp;onze proeven eerst later gebruik worden gemaakt.

De precipitatie-titer werd t.o.v. de ingespoten stof bepaald, na de buisjes 1 uur bij 37� C te hebben laten staan. Na ��n dag

was toen bij kamertemperatuur de witte ring in het grensvlak goed zichtbaar. Bij de blanco proef werd het serum van denbsp;muis ingezet t.o.v. het L.-P.

Evenals Bottema vonden wij, dat het L.-P .-zout een volwaardig precipitinogeen was en dat soortvreemd serum deze antigeene eigenschap verhoogt. Eveneens was het begrijpelijk,nbsp;dat het hapteen polysaccharide uit de F23-stam, na serumtoe-voeging als een volwaardig antigeen reageerde. Bovendien zagennbsp;wij bij No. 3 die met het zuivere P.-zout werd behandeld, datnbsp;ook het serum de hoogste door ons ingezette verdunning vannbsp;het zuivere P. F23-z�ut precipiteerde, zoodat tot een nieuwenbsp;serie proeven werd besloten.

Hiertoe werden eenige muizen subcutaan ingespoten met het L.-P. en P., w�l en niet gemengd met varkensserum. De inspuitingen geschiedden weer 2 keer om de vier dagen, terwijl vijfnbsp;dagen na de laatste injectie de muizen gedood werden. De pre-cipitatie-titer t.o.v. de ingespoten stof werd bepaald, na denbsp;buisjes 1 uur bij 37� C te hebben weggezet en dan na 1, 2 en 3nbsp;dagen af te lezen. Bij de blanco proef werd het serum van denbsp;muis ingezet t.o.v. het P. F23.

Soms ontstond pas na drie dagen een ring, niet op het oorspronkelijke grensvlak maar gt;meer boven in de buis. Dit verschijnsel zou men kunnen verklaren op grond van het N e i s-s e r-W echsberg phenomeen. Er werd gebruik gemaakt van het P. F23-natriumzout met %P = 0,1 en %N = 0,0, terwijlnbsp;het L.-P. een %P = 0,2 en %N = 0,1 bezat.

De brecipitatie-titer van het anti-L.-P. F23-serum was dus 1:10.000 en werd door varkensserum maar weinig^ verhoogd,nbsp;terwijl die van hefanti-P. F23-serum eveneens bijna 1:10.000nbsp;was.

Doordat het polysaccharide uit den F23-stam in staat was precipitinen op te wekken, moet dit zuivere polysaccharide dusnbsp;ook als een volwaardig antigeen moorden beschouwd. Het bezitnbsp;deze eigenschap dus evenals een prote�de antigeen.

Terwijl wij bij vorige dierproeven steeds precipiteerden t.o.v. de stof, waarmee de muis werd ingespoten, maakten wij bijnbsp;'No. 16 een uitzondering, door hierbij het anti-polysaccharide-A-serum in te zetten met het polysaccharide uit het C-type.

Het uitblijven van de preeipitatie-reactie bij muis No. 16 was een verrassend resultaat, later zullen wij hierover meernbsp;proefnemingen bespreken.

Er is weinig verschil in precipitinogeen karakter tusschen het L.-P. F23 en het P. F23; w�l werd van deze laatste stolnbsp;ongeveer drie keer zooveel ingespoten.

Terivijl onze oorspronkelijke gedachten waren, dat het lipo�d-polysaccharide de antigeniteit en het polysaccharide hieruit de specificiteit zou bepalen, moesten wij ons nu op het standpunt

stellen, dat het polysaccharide behalve de specificiteit ��k de antigeniteit bepaalt.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;i

Naar aanleiding van de bij muis No. 16 gevonden afwezige precipitatie t.o.v. het P. FIO zetten wij een nieuwe reeks proevennbsp;in, om de specificiteit van anti-polysaccharide-sera na te gaan.

De nbsp;nbsp;nbsp;eerste twee stoffen waren afkomstignbsp;nbsp;nbsp;nbsp;uit stammen van het

Na twee subcutane injecties om de vier dagen en dooden der muizen na vijf dagen rust, kregen wij de volgende resultatennbsp;te zien:

De precipitatie-titer werd evenals den vorigen keer afgelezen na 1 uur broeden op 37� C en 3 dagen staan bij kamertemperatuur.

Muizen ingespoten met L.-P. en geprecipiteerd t.o.v. K-P.: No. 1, 6, 7, en 8, die alle positief zijn.

Muizen ingespoten met P. F23 en geprecipiteerd t.o.v. P. F23: No. 3, 11, 12, 13, 14, 15, 18 en 19; 7 van de 8 zijn positief;nbsp;terwijl de twee blanco�s No. 17 en 23 t.o.v. P. F23 beidennbsp;negatief zijn.

Naar aanleiding van de onderzoekingen van Avery en Goebel (1933) over de immuniteit bij het Gi-polysaccharidenbsp;der pneumococcen, werden eenige veranderingen aangebracht.nbsp;De Amerikanen vonden een immuniseerende werking van hetnbsp;Gi-polysaccharide voor muizen bij intraperitoneale inspuitingennbsp;met 0,75 y stof om den anderen dag.

In navolging van deze methode werden nu muizen drie keer, om den anderen dag, intraperitoneal ingespoten met enkelenbsp;gamma�s stof, en na 6 dagen rust gedood, om de precipitatie-titer te bepalen. De resultaten zijn in tabel 12 bijeen gebracht.

De precipitatie-titer kon bepaald worden door 0,2 cm^ poly-saccharide-oplossing voorzichtig op 0,2 cm'� serum (verd. 1:10) te laten vloeien; na eenige uren staan bij kamertemperatuurnbsp;kon worden afgelezen. Door de buisjes ��n uur in de stoof bijnbsp;37� C, of een dag bij kamertemperatuur te laten staan, kwamnbsp;g��n zichtbaar precipitaat, of een uitzakken van den eerst ge-vormden precipitatie-ring.

�Wij hebben dus op twee verschillende manieren de precipitatie-titer moeten bepalen n.1.:

1�. Bij de subcutane inspuitingen met P. F23 (�20 mg) kwam het neerslag soms direct, doch meestal pas na 1nbsp;uur op 37� C en na twee tot drie dagen staan bij kamertemperatuur.

2�. Bij de intraperitoneale inspuitingen met P. F23 (� ly), kwam direct of na enkele uren bij gewone temperatuurnbsp;het neerslag; bij 37� C werd het precipitant onzichtbaar.

In het eerste geval (titer 1:10.000) hadden wij weinig anti-geen en veel precipitinen, zoodat het serum eerst door de oplossing der specifieke stof moest diffundeeren v��rdat de juiste verhouding ontstond, die noodig was om een precipitant tenbsp;vormen.

In het tweede geval (titer 1: 2000) hadden wij veel antigeen en weinig precipitinen, zoodat de verhouding antigeen: anti-lichaam gunstig was om een neerslag snel te laten ontstaan.

Ook hier dus kunnen wij het waargenomene verklaren op grond van het verschijnsel van N e i s s e r-W e c h s b e r g.

Het prozone-effect kan verklaard worden uit de lading. Men neemt uit physische overwegingen aan, dat de lading van het antigeen ennbsp;van het anti-lichaam tegengesteld zijn. Indien ��n van deze twee innbsp;groote overmaat aanwezig is, zal een verschuiving van de lading innbsp;de richting van het iso-electrische punt niet voldoende plaats vinden,nbsp;om vlokking tot stand te brengen. Indien het serum dus in verhoudingnbsp;een te groote hoeveelheid anti-lichaam bevat, zal er pas precipitatienbsp;kunnen optreden, indien, na diffundeeren in de bovenste laag, de hoeveelheid anti-lichaam voldoende verminderd is. Hierdoor ziet men denbsp;precipitatie-ring niet op het oorspronkelijke grensvlak, maar bovennbsp;in de buis ontstaan.

Naar aanleiding van de niet specifieke precipitatie in tabel 12 van het anti-polysaccharide serum van de FlO-stam en vooralnbsp;door de precipitatie van 1:1000 verdunning P. FIO met anti-P.nbsp;F15-serum, besloten wij eerst deze reactie nog eens nader tenbsp;onderzoeken.

Twee muizen No. 29 en 30 werden intraperitoneal ingespoten met een physiologische zoutoplossing en daarna werd op gelijkenbsp;manier hun sera behandeld t.o.v. de verschillende polysaccharide-verdunningen.

Het bleek toen, dat zoowel het P. F23 als het P. F15 tot een verdunning van 1:1000 en het P. FIO tot bijna 1:1000 met

In normaal muizenserum zijn dus steeds precipitinen tegen de polysacchariden der B.-pneumoniae aanwezig.

Bij hoogere verdunning tot 1:1500 waren w�l alle reacties met normaal-serum negatief, zoodat de verdunningen boven denbsp;1:1000 in de vorige tabel hun waarde als specifieke reactienbsp;behouden.

Om de specificiteit der anti-polysaccharide-sera aan te toonen, moesten wij dus eerst sera maken met een ho�gere precipitatie-titer, die wij trachtten te verkrijgen door meer antigeen in tenbsp;spuiten.

In de volgende tabel zijn de uitkomsten opgenomen van de precipitatie-reacties t.o.v. het P. F23; P. F15; P. FIO en tevensnbsp;t.o.v. het L.-P. F23 De muizen werden ieder ingespoten metnbsp;0,2 mg polysaccharide volgens reeds eerder vermelde methode.

Wij zien nu, dat het P. F23 en het P. F15 in staat zijn specifieke antilichamen op te wekken gericht tegen het polysaccharide uit het A-type en niet tegen dat uit het C-type: het anti-P.-serum type A reageert dus specifiek. Ook de P. FlO-stofnbsp;is misschien in staat om anti-C- en niet anti-A-lichamen op tenbsp;wekken.

Tevens is de precipitatie-titer van het anti-P. F23-serum t.o.v. de L.-P. F23 hooger dan die t.o.v. de P. F23-stof. Hieropnbsp;zullen wij later terug komen.

P. F15 is � beide stammen van het A-type � konden wy niet uitmaken. Hierover zullen veel meer proeven gedaan moetennbsp;worden v��r een zuiver oordeel hier omtrent kan worden ge-gevormd. Eveneens zijn wij er lang niet zeker van, dat hetnbsp;P. FIO werkelijk op zichzelf in staat zou zijn antistoffen tegennbsp;het C-type op te wekken, het aantal proeven hierover is onvoldoende, w�l moeten wij deze stof als een reagens op de precipi-tinen^van het C-type beschouwen, gezien de eerder verkregennbsp;precipitatie-titer van 1: 3.000.000 met anti-C-serum (zie blz. 62).

Tenslotte werd nog nagegaan de invloed van serum-toevoe-ging in vivo aan het P. F23 en P. F15, door intraperitoneale injecties met 0,2 mg stof. Hierbij vonden wij, dat beide poly-sacchariden tot 1: 5000 reageerden met een antiserum, verkregen uit de muizen No. 37 en No. 38 op de bovenbeschrevennbsp;manier.

Door subcutane injecties van de polysacchariden met serum-toevoeging verkregen wij reeds op blz. 68 een titer van 1:10.000 t.o.v. het polysaccharide.

De bereiding van immuunsera door middel van bacterie-sus-pensies kan op verschillende manieren geschieden. Het gehalte aan antilichaam hangt af van het proefdier z�lf en van de gevolgde methode.

Er bestaan slechts weinig gegevens omtrent de wijze waarop hoogwaardige sera bij kapselbacteri�n kunnen worden verkregen. Dit zal kunnen afhangen van de bereiding der suspensies,nbsp;de ingespoten hoeveelheden, de methode van injectie, het aantalnbsp;inspuitingen en de frequentie hiervan.

B o 11 e m a heeft de methode van injectie uitvoerig bestudeerd aan de hand van de gegevens van W i e 1 e n g a (1937). Hij komt tot het resultaat, dat de volgende manier de meestenbsp;kans op succes biedt: Als antigeen moet gebruik gemaakt worden van suspensies van bacteri�n, die bereid zijn door een 24nbsp;uur oude, schuine agarkultuur af te slibben met 10 cm� physio-logische zoutoplossing en daarna door een steriel filtreerpapiernbsp;te filtreeren. De bacteri�n moeten vervolgens gedood wordennbsp;door verhitting gedurende een half uur op 54� C., of door toe-

voeging van 0,1 % formaldehyde. Van deze suspensie moeten drie series van elk zes injecties intraveneus aan het konijnnbsp;worden toegediend. Tusschen de series is een rustpoos vannbsp;7 a 10 dagen noodig, terwijl all��n wanneer na drie series denbsp;titer nog erg laag is, een vierde serie voordeelen kan opleveren.

De resultaten van B o 11 e m a waren zeer goed voor het C-en B-type, doch bij het A-type lieten ze nogal te wenschen over. Hij verkreeg bij ��n konijn voor de Fl-stam van het A-type,nbsp;pas na vier series een titer van 1/100 en bij een ander konijnnbsp;na de 1ste, 2de en 3de reeks, de titers 0; 1/20 en 0.

Deze weinig belovende resultaten voor het anti-A-serum deden ons besluiten om ��k het antiserum te bereiden, zooalsnbsp;L � V y-B ruhlenCourtois hadden gedaan. Deze Franschennbsp;maakten anti-A-serum, door 5 weken lang achter elkaar drienbsp;injecties per week te geven. Tevens spoten zij grootere hoeveelheden antigeen in, waarbij zij opmerkten, dat na een vermagering van het konijn in de eerste week, daarna weer een ge-wichtstoename optrad.

Daar wij de beschikking hadden over drie konijnen, werd konijn A volgens de methode van Bottema en de konijnennbsp;B en C volgens die der Franschen behandeld.

Konijn A kreeg dus zes intraveneuze injecties van resp. 0,1; 0,2; 0,5; 0,5; 1 en 1 cm� van een bacterie-suspensie, waaraan 0,2 % formaldehyde was toegevoegd en na een weeknbsp;rust weer zes injecties om den anderen dag van elk 1 cm�.nbsp;Na drie series werd de agglutinatie-titer bepaald.

Konijn B en C kregen ieder vijf weken lang achter elkaar drie injecties per week, van een eveneens met 0,2 % formaldehyde behandelde bacterie-suspensie. De hoeveelheden suspensie, die toegediend werden, waren opklimmend vannbsp;0,1 cm� tot 3 cm� per injectie.

Bij deze konynen konden wij een gewichtsafname in de eerste week en daarna weer een gewichtstoename bevestigen.nbsp;Na goed vier weken succumbeerde echter konijn B en gaf bijnbsp;sectie het volgende beeld te zien;

puntvormige bloedingen in het longweefsel, geen afwijkingen van de nier, in de lever talrijke necrobiotisch-necro-tische haardjes; de long gaf bij microscopisch onderzoek plaatselijk verbreede alveolairsepta met groote celrijkdom

te zien, terwijl in enkele alveolen een groote meerkernige reuzencel aanwezig was ¹).

Het is opmerkelijk, dat dit konijn te gronde ging aan soortgelijke verschijnselen als die, welke de levende pneumobac-teri�n kunnen verwekken. Toch was de suspensie vrij van levende bacteri�n, daar zoowel door ons als bij onderzoek innbsp;het Centraal Laboratorium te Utrecht geen levende bacteri�nnbsp;hierin gevonden werden.

De agglutinatie-titers der sera uit de konijnen A en C (na tien dagen rust) werden op de in Utrecht gebruikelijke methodenbsp;bepaald op 1/100; dus voor beide sera gelijk.

Er kon worden opgemerkt, dat snel opeenvolgende intraveneuze injecties geen voordeel hadden en dat een rustpoos van een week tusschen de series zeer goed was. Bij onze opeenvolgende injecties, konijn B en C, werden meer dan 22 cm� suspensie �nbsp;ingespoten, waarbij ��n konijn dood ging, terwijl het anderenbsp;konijn er zeer slecht aan toe was en geheel verharde ooren hadnbsp;gekregen. De meer gematigde methode bij Konijn A met eennbsp;totale toegediende hoeveelheid van 9 cm� en een rustpoos tusschen de series, gaf maar weinig verharding van de ooren ennbsp;t�ch een evenhooge agglutinatie-titer.

De specificiteit der agglutinatie werd vastgesteld, doordat stammen van het type B of type C niet met deze immuunseranbsp;agglutineerden.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Een precipitatie-titer-bepaling van de sera; hieronder verstaan wij de verdunning der sera, die nog juist met eennbsp;bepaalde hoeveelheid polysaccharide reageert.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Een precipitatie-titer-bepaling van de specifieke stoffen;nbsp;hieronder verstaan wij de verdunning der specifieke stoffen, die nog juist met een bepaalde verdunning van hetnbsp;anti-A-serum reageert.

Volgens de opgaven van Dr. H. H.Vink, dierenarts, die zoo hulpvaardig was de sectie te verrichten.

Voor de bepaling van de precipitatie-titer van de sera moesten wij als standaard een bepaalde hoeveelheid polysaccharidenbsp;kiezen, waartoe gebruik gemaakt werd van een 0,1 % oplossingnbsp;van het zuivere P. F23-natriumzout; dus een verdunning vannbsp;1:1000. In tegenstelling met normaal muizenserum reageertnbsp;normaal konijnenserum niet met 1:1000 verdunning van hetnbsp;P. F23.

De reactie werd gedaan door ongeveer 1 cm� van de serum-verdunning onder in agglutinatiebuisjes te brengen en daarbovenop de standaard P;-oplossing zeer voorzichtig te pipet-teeren. Het precipitaat ontstond na 2 tot 3 uur bij kamertemperatuur. In de stoof bij 37� C ontstond nog w�l een ringreactie, die echter snel verdween. Beide sera hadden een precipitatie-titer van 1/80 en deze was specifiek, daar het P. FlO-natrium-zout (verdunning 1:1000) niet met deze sera reageerde.

Voor de precipitatie-titer-bepalingen van de specifieke stoffen werd gebruik gemaakt van een 1:10 verdund immuunserum (ongeveer 1 cm�) waarop een gelijke hoeveelheid van een P. F23^nbsp;of L.-P. F23-verdunning voorzichtig werd gepipetteerd. Hetnbsp;neerslag pntstond pas na 1 uur op 37� C en na ��n nacht staan,nbsp;volgde de beoordeeling.

De precipitatie-titer van het P. F23 bepaalden wij op 1:500.000.000 en die van het L.-P. F23-natriumzout opnbsp;1:1000.000.000.

Z�� buitengewoon hooge precipitatie-titers zijn wij nog niet in de literatuur tegen gekomen.

Deze precipitatie-titer wil zeggen, dat wanneer wij 1 mg van onze specifieke stof zouden oplossen in 1000 liter water, denbsp;aanwezigheid hiervan nog specifiek met het homologe antiserumnbsp;zou zijn aan te toonen.

Door absorptie-proeven trachtten wij uit te maken of er, evenals B o 11 e m a voor het C-type vond, een serologisch verschil bestond tusschen het L.-P. en het P. uit stammen van hetnbsp;A-type.

Hiertoe lieten wij 1 cm� antiserum (type A) reageeren met 1 cm� van een 1:1000-verdunning van het P. F23-natriumzout,nbsp;door het buisje 2 uur bij 37� C te plaatsen. Na verwijdering

van het precipitant door middel van centrifugeeren, werd de heldere oplossing opnieuw met 1 cm^ polysaccharide-oplossingnbsp;behandeld. Deze behandeling �n het afcentrifugeeren van hetnbsp;neerslag werden zoo vaak herhaald, tot geen precipitant meernbsp;ontstond. Het serum konden wij dan als �verzadigd� met polysaccharide beschouwen d.w.z. alle tegen het polysaccharide gerichte antistoffen wai-en uit het serum verwijderd. Dit inmiddels tot 1: 5 verdunde serum reageerde daarna nog tot een verdunning van 1:100.000 met het L.-P. F23.

Indien omgekeerd 1 cm^ antiserum met L.-P. F23 �verzadigd� werd, konden wij g��n precipitatiereactie meer met het P. F23nbsp;verkrijgen. W�l ontstond dan nog een precipitaat met een lipo�d-polysaccharide-eiwit-preparaat, hetgeen ook begrijpelijk is,nbsp;daar immers in het antiserum precipitinen aanwezig moetennbsp;zijn tegen het prote�de uit het kapselantigeen.

Wij zouden nu kunnen concludeeren tot een serologisch verschil tusschen het P. en het L.-P. of met andere woorden: er komen in het immuunserum precipitinen gericht tegen het P.nbsp;�n tegen het L.-P. voor. Hierop komen wij in onze slotbeschouwing nog terug.

De toxische werking van de lipo�d-polysacchariden uit B. pneumoniae is bij muizen over het algemeen gering. B o 11 e m anbsp;vond, dat pas door subcutane injectie van 2 mg L.-P. FIO denbsp;dood na 24 uur intrad. L � v y-B ruhl en Courtois vondennbsp;voor een stam uit het A-type, dat 1 mg L.-P. hiervan bij subcutane injectie de dood na 2 a 3 dagen veroorzaakte, terwijlnbsp;bij intraperitoneale injectie van deze dosis, de dood al na drienbsp;uur intrad.

In tegenstelling met deze toxiciteit konden wij bij onze eerste muizenproeven, op No. 39, iO en H gedaan, g��n doodelijkenbsp;dosis bereiken met subcutane injecties van resp. 2, 3 en 6 mgnbsp;L.-P. F23. Wij moesten dus constateeren, dat het lipo�d-polysac-charide uit de F23-stam, bij subcutane injectie, niet of weinignbsp;toxisch is voor muizen.

Hoewel de muizen, na inspuitingen met L.-P. wel ziek werden, konden wij dit niet waarnemen na de subcutane injecties met

groote hoeveelheden P. F23, zooals die gebruikt werden voor het opwekken der anti-polysaccharide precipitinen.

Ook gebruikten wij nog een L.-P.-E.-preparaat, dat afkomstig was van een vijfmaal volgens S e v a g onteiwitte-oplossing van de specifieke stof uit de F23-stam. Daar een gedeelte vannbsp;dit preparaat na 4 keer extra onteiwitten vrij van prote�den was,nbsp;kunnen wij aannemen, dat het L.-P.-E. slechts sporen bacterieel-eiwit bevatte. Muis No. werd subcutaan ingespoten met 2 mgnbsp;van dit preparaat en was na ��n dag ernstig ziek, na vier dagennbsp;bijna dood, maar de zesde dag weer geheel hersteld.

Er is dus een groot verschil in de toxiciteit van de verschillende specifieke stoffen uit de F23-stam te zien; terwijl het P. niet en het L.-P. slechts een weinig toxisch is, doet eennbsp;spoortje van het bijbehoorende eiwit de toxiciteit sterk stijgen.

Ook intraperitoneale injecties van de specifieke stoffen werden door ons gedaan.

Muis No. U3 werd intraperitofteal ingespoten met 1,5 mg L.-P. F23; deze muis was ernstig ziek gedurende 2 a 3 dagen,nbsp;na herstel op de vierde dag, kreeg hij de 5de dag weer eennbsp;injectie van 1,5 mg stof waarna geen ziekteverschijnselennbsp;optraden.

Muis No. Uh werd op gelijke manier behandeld en gaf volkomen hetzelfde ziektebeeld te zien.

De toxiciteit was bij intraperitoneale injecties dus niet hooger en het is ons niet gelukt een doodelijke intoxicatie te verwekken.

Het was de bedoeling om na te gaan, of muizen na herhaalde subcutane inspuitingen met het L.-P. P23 tegen infecties metnbsp;de virulente homologe bacteriestam bestand zouden zijn. Hiertoe werden vier muizen (No 45; 46; 47; 48) bij de staart-wortel drie keer subcutaan, om de vier dagen, ingespoten metnbsp;0,1; 0,1 en 0,2 mg specifieke stof. Na een week werden tweenbsp;muizen ge�nfecteerd met 0,1 cm^ F23-type A-kultuur, ��n metnbsp;0,2 cm^ FlO-type C-kultuur en ��n met 0,1 cm^ F24-type B-kultuur. Onder een F23-type A-kultuur verstaan wij een bac-terie-suspensie, bereid door een 24 uur oude schuine agar-kultuur, bebroed bij 37� C, af te slibben met 10 cm� physiolo-gische zoutoplossing.

Twee a drie dagen na de infectie met de verschillende bacteri�n waren de muizen, ingespoten met de F23- of F24-stam dood en konden de bacteri�n weer uit het hartebloed gekweektnbsp;worden. De met de FlO-stam behandelde muis bleef in leven,nbsp;daar deze stam niet meer virulent was.

Nadat uit de gegevens van tabel 9 gebleken was, dat w�l precipitinen in het muizen-serum aanwezig waren, zetten wijnbsp;een nieuwe serie proeven in. Hiertoe werden muizen twee keer,nbsp;om de vier dagen, subcutaan ingespoten met grootere hoeveelheden L.-P. F23 met serum gemengd (zie tabel 14). Tien dagennbsp;na de laatste injectie, werden zij toen met 0,1 cm^ F23-kultuurnbsp;besmet en stierven alle. Uit het bloed van alle muizen kon denbsp;F23-stam weer gekweekt worden.

Nadat bij de muizen No. i-2 en (zie blz. 78) het sterke ziekteverloop bij intraperitoneale injecties met het L.-P. en hetnbsp;L.-P.-E. was gebleken, werden deze muizen met 0,1 cm� F23-kultuur subcutaan besmet.

Muis No. 53, die onbehandeld was en als controle diende stierf na twee dagen. Misschien zou dus toch wel eenige immuniteit met de specifieke kapselstof verwekt kunnen worden.nbsp;Om echter goede vergelijkende waarden te vinden, zal het eerstnbsp;noodig zijn, dat wij de Minimum Letale Dosis van de bacterie-suspensie vaststellen.

Toen was komen vast te staan, dat het mogelijk was om door middel van intraperitoneafe injecties niet alleen met lipo�d-polysacchariden maar ook met vrije polysacchariden bij muizennbsp;precipitinen op te wekken, leek het ons gewenscht opnieuw denbsp;beschermende werking voor muizen na te gaan.

B o 11 e m a vond na inspuitingen met L.-P.- of P.-preparaten van de FlO-stam g��n beschermende werking bij muizen, terwijl met het Gi-polysaccharide der pneumococcen bij muizen,nbsp;door intraperitoneale injectie met 0,75 y-stof, w�l een actieve immunisatie kon worden verkregen (zie theoretisch overzicht blz. 8).

Voor het vaststellen van de M.L.D. van de- smetstof kozen wij zooveel mogelijk gelijkwaardige muizen. Hiervoor werdennbsp;acht muizen van vrijwel gelijk gewicht en uit eenzelfde nestnbsp;in behandeling genomen.

Muis No. SU werd subcutaan ingespoten met 0,1 cm'* van deze bacterie-suspensie en stierf na twee dagen; een sectie gafnbsp;longbloedinkjes en een abnormale milt (groot en zeer donker gekleurd) te zien.

Muis No. 55 werd subcutaan ingespoten met 0,1 cm^ van een 1: 10-verdunning van deze bacterie-suspensie en stierf nanbsp;3 dagen; volgens de groote-plaat-telmethode waren ongeveer 20 millioen bacteri�n ingespoten.

Muis No. 56 werd subcutaan ingespoten met 0,1 cm^ van een 1:100 verdunning van deze'bacteriesuspensie en stierf nanbsp;3 dagen; volgens een telling waren ongeveer 2 millioennbsp;bacteri�n ingespoten. Het sectie-beeld was als bij No. 54.nbsp;Muis No. 57 werd subcutaan ingespoten met 0,1 cm-� van eennbsp;1:200 verdunning van deze bacterie-suspensie en stierfnbsp;na goed 3 dagen. Er werden ongeveer 1 millioen bacteri�nnbsp;ingespoten.

Muis No. 58 werd subcutaan ingespoten met 0,1 cm� van een 1; 1000 verdunning van deze bacterie-suspensie en was nanbsp;5 dagen dood. Een sectie gaf hetzelfde beeld te zien alsnbsp;bij No. 5U.

Onderwijl werden de muizen 50 en 60 drie keer binnen een week tijds intraperitoneal ingespoten met in totaal 1,5 y P.nbsp;F23-natriumzout. Na een week rust kregen ze een nieuwe serie

inspuitingen met in het geheel 200 y van deze specifieke stof. Daarna lieten �wij deze dieren opnieuw een rustpoos van tiennbsp;dagen ondergaan, om ze vervolgens subcutaan te infecteerennbsp;met de 1:200-verdunning van de bacterie-suspensie. Als controle werd ook een muis No. 61 met dezelfde hoeveelheid bacteri�n ingespoten. Deze laatste muis stierf na 3 dagen en 5 uurnbsp;en gaf bij een sectie hetzelfde beeld te zien als No. 5U, terwijlnbsp;de F23-stam weer uit het hartebloed kon worden gekweekt. Denbsp;muizen 59 en 60 leken actief ge�mmuniseerd en vertoonden geennbsp;ziekteverschijnselen; het sectie-beeld gaf g��n afwijkingen tenbsp;zien; ook kon de F23-stam niet meer uit het bloed gekweektnbsp;worden.

Deze actieve immunisatieproef herhaalden wij op geheel dezelfde manier met acht muizen, die na de voorbehandelingnbsp;eveneens met de F23-stam besmet werden. De virulentie vannbsp;de F23-stam was echter verminderd, zoodat wij toen opnieuwnbsp;de M.L.D. op de eerder beschreven manier moesten bepalen.

Muizen ingespoten met 1:200-verdunning van de bacterie-suspensie gingen toen na 5 dagen dood, terwijl bij injecties met hoogere verdunningen de dieren steeds in leven bleven. Daarnbsp;de ge�mmuniseerde muizen niet konden wachten, totdat denbsp;pathogeniteit weer voldoende kon zijn opgevoerd, spoten wij zenbsp;in met 1:100 bacterie-verdunning, evenals de vier contr�le-dieren. Ondanks de nadeelige proefopstelling, doordat wij denbsp;muizen met een nog grooter aantal bacteri�n moesten inspuiten,nbsp;waren de resultaten bevredigend. De gemiddelde levensduurnbsp;werd zooals uit tabel 15 blijkt dank zij de voorbehandeling verhoogd, terwijl 25% der muizen actief ge�mmuniseerd was.

SLOTBESCHOUWINGEN.

Aan de hand van onze immuniteits-proeven hebben wij bewezen, dat niet alleen het lipo�d-polysaccharide maar ook het vrije polysaccharide een volwaardig antigeen is. Dit opmerkelijke feit is, voor zoover ons bekend, slechts geconstateerd bijnbsp;het Gi- en misschien bij het G2-polysaccharide der pneumo-coccen.

Allereerst zullen wij thans een verklaring trachten te vinden voor de antigeniteit van het polysaccharide.

Toen vastgesteld werd, dat lipo�d-polysacchariden in tegenstelling met polysacchariden, antigenen waren, moest de oorzaak hiervan wel in het lipo�d worden gezocht. Een moeilijkheid hierbij is echter, dat lipo�den in het algemeen (getuige de Wasser m a n n-reactie) een tamelijk polyvalente rol spelen. Uit denbsp;proeven van Bottema en ook uit die van ons, blijkt, datnbsp;eiwit-toevoeging aan het L.-P. de precipitatie-titer van hetnbsp;antiserum verhoogt, dus ook de antigeniteit. Hieruit kan mennbsp;concludeeren, dat eiwit als �activator� van het lipo�d-polysaccharide fungeert en de werking hiervan versterkt, hetgeen verklaard kan worden uit de plaatshebbende vergrooting der collo�de deeltjes.

Nu echter ook de antigeniteit van het polysaccharide gebleken is, die door' vergrooting van het polysaccharide tot een L.-P.-complex, �f tengevolge van eiwittoevoeging verhoogd kannbsp;worden, moeten wij zoowel het lipo�d als het eiwit het vermogen om als �gangmaker� dienst te doen, toeschrijven. Dezenbsp;stoffen zijn dus in staat om de antigeniteit van het polysaccharide te versterken.

Uit de absorptie-proeven, welke door ons gedaan werden, behoeft echter niet noodzakelijk te volgen, dat er verschil bestaat tusschen precipitinen, welke tegen het lipo�d-polysaccharide ennbsp;die, welke tegen het polysaccharide gericht zijn. Het is in verband met de antigeniteit van het polysaccharide ook z��r goednbsp;mogelijk, dat d i t polysaccharide als hoofdprecipitinogeennbsp;moet worden beschouwd. Het polysaccharide in het L.-P. zou dan

in anderen toestand verkeeren dan het vrije polysaccharide; dit is zelfs z��r waarschijnlijk, daar bij de isoleering van dezenbsp;laatste stof gebruik gemaakt moest worden van zuren, die zooalsnbsp;wij weten de viscositeit der oplossingen verlagen, dus tevensnbsp;van invloed zijn op de grootte der deeltjes.

Een bevestiging uit eigen ervaring hiervan vinden wij op blz. 72, waaruit bleek, dat anti-P. F23-serum met een hoogerenbsp;verdunning van het L.-P. dan van het polysaccharide zelfnbsp;reageerde. Daar een anti-P .-serum all��n precipitinen tegen hetnbsp;polysaccharide ge7'icht bevat, moet er wel een verschil bestaannbsp;tusschen het zuivere polysaccharide �n het polysaccharide, zooals het voorkomt in het L.-P. Een andere bevestiging kunnennbsp;wij o.a. vinden in de proeven van Hornus en Grabarnbsp;(1940) op blz. 18 beschreven, die vinden, dat er een groot onderscheid tusschen verschillende polysaccharide-preparaten bestaat. Het preparaat dat de zuurhydrolyse het kortste ondergaan heeft, precipiteert het m��ste antilichaam.

Wij stellen ons nu voor, dat het polysaccharide in het L.-P.-E. het h��gste a^itigeenvei�mogen bezit en dat in het L.-P. minder,nbsp;en in het polysacchai�ide z�lf weinig of geen antigeenvermogennbsp;aanwezig is, afhankelijk va7i de gebi'uikte isolatiemethode ennbsp;andere factoren die ivij hieronder zullen uiteenzetten. Zoow�lnbsp;het lipo�d als het eiwit beschouwen wij als de �gangmakers�,nbsp;die noodzakelijk zijn, om het geringe antigeen-vermogen vannbsp;het polysaccharide te versterken. Hierbij kan in het middennbsp;worden gelaten, of het lipo�d, het eiwit, respectievelijk de combinatie lipoid-eiwit daarnaast z�lf nog al of niet specifieknbsp;antigeen-vermogen hebben. Hiervoor pleiten een aantal waarnemingen, andere doen dit in twijfel trekken, dit staat echternbsp;naast hun vermogen om als �gangmaker� dienst te doen (zienbsp;hierover verder blz. 87).

Bovenstaande theorie steunt op de ontdekkingen van Zozaya (1932), die vond dat ��n van de factoren voor denbsp;antigeniteit gelegen was in de afmetingen der deeltjes in col-lo�daal-dispersen toestand (zie blz. 4). Het gelukte hem o.a.nbsp;om door absorbtie van dextrose aan collodium een precipitino-geen te verkrijgen; ingespoten bij konijnen was deze stof eennbsp;volwaardig antigeen geworden en het serum gaf een precipi-tatie-reactie met dextrose. Evenals het lipo�d of eiwit in onze

proeven de antigeniteit versterkt, moeten wij hier het collodium als �gangmaker� van de dextrose opvatten; de antigene werking wordt hierdoor versterkt.

Dat anderzijds niet ieder polysaccharide in staat is antigene werking te vertoonen all��n op grond van de afmetingen vannbsp;zijn collo�de deeltjes, volgt uit het feit, dat hoogmoleculairenbsp;stoffen zooals arabische gom of latex deze werking niet tenbsp;zien geven. Er zijn dus behalve de deeltjesgrootte nog wel degelijk andere voorwaarden, waaraan voldaan moet worden, opdatnbsp;een stof antigeen zy.

Hieronder volgen de oorzaken, die mogelijker wijze er toe hebben bijgedragen, dat andere onderzoekers de antigeniteitnbsp;der zuivere polysacchariden niet hebben opgemerkt:

1� Het isoleeren van een polysaccharide uit een lipo�d-poly-saccharide-eiwitcomplex is een moeilijke taak, daar in het algemeen deze complexen bestaan uit weinig polysaccharidenbsp;en veel eiwit. In ons geval bij de F23-stam, of althans bijnbsp;de oplosbare specifieke stof uit deze stam, bestaat hetnbsp;grootste gedeelte uit polysaccharide, zoodat wij niet intensnbsp;behoeven te onteiwitten om het polysaccharide zuiver tenbsp;verkrijgen. Daar in het algemeen de polysacchariden bijnbsp;iedere onteiwittingsmethode gedeeltelijk met het eiwitnbsp;neerslaan, is het g��n wonder, dat bij een ongunstige poly-sacharide-eiwitverhouding, geen polysaccharide gevondennbsp;wordt. Daarbij komt nog dat de polysacchariden, vooralnbsp;als ze voor een gedeelte als zuur voorkomen, ��k nog gedeeltelijk in de alkohol, benoodigd voor het neerslaan,nbsp;oplossen.

2� Zoowel H e i d e 1 b e r g e r, als anderen die zijn methode toepassen, maken bij de onteiwitting in een buffermengselnbsp;gebruik van centrifugeeren en werken all��n de bovenstenbsp;laag op. Wij daarentegen gebruiken het geheele neerslag,nbsp;en in de onderste laag nu bevinden zich juist de grootstenbsp;collo�de deeltjes, dus ook die van de specifieke stof waarnbsp;het hier om gaat.

3� Veel onderzoekers passen de onteiwittings-methode van S e V a g toe totdat er geen neerslag meer ontstaat en denbsp;oplossing vrijwel helder is. De eiwitreacties zijn echter

reeds veel eerder negatief; de laatste neerslagen bevatten veel polysaccharide en waarschijnlijk lipo�d.

De keuze van de voedingsbodem kan ook van invloed zijn geweest. Goebel en Avery krijgen uit het A-type een.nbsp;polysaccharide, dat met immuunserum precipiteert totnbsp;1:2000.000; wij daarentegen bepaalden de predipitatie-titer van ons polysaccharide op 1: 500.000.000.

Onze opwerkings-methode wordt zoo snel mogelijk achter elkaar afgewerkt, zoodat een onnoodig langen tijd vannbsp;zuurinwerking vermeden wordt.

Bij toepassing van de door ons' gevolgde droogmethode verkrijgen wij, in tegenstelling met de normale droogmethode, z��r , gemakkelijk oplosbare stoffen. Het zounbsp;mogelijk kunnen zijn, dat ook hierin een factor schuilt,nbsp;die van invloed is op de deeltjesgrootte van het polysaccharide in collo�dale toestand.

De antigeniteit van het polysaccharide kunnen wij bewijzen bij muizen, terwijl in het algemeen als proefdier voor denbsp;pneumobacteri�n gebruik gemaakt wordt van konijnen.nbsp;Gezien de ondervindingen bij de pneumococcen type I opgedaan, (blz. 8) en in verband met de theorie van Better son, (biz. 9), is het zeer wel mogelijk, dat ons polysaccharide bij een konijn geen antigeen zou zijn.

Bij de poging om de specificiteit van de polysacchariden te verklaren, bevinden wij ons in een moeilijk parket- Zooals reedsnbsp;eerder opgemerkt, wordt deze specificiteit bij de B. pneumoniaenbsp;en de pneumococcen w�l geheel en al aan de polysaccharidennbsp;geweten, maar er zijn verschillende kruisingsreacties, die moeilijkheden opleveren. Nu is uit de onderzoekingen van Botte m a en die van ons, in verband met die van Goebel, gebleken, dat het mogelijk is uit het C-type zoowel als uit hetnbsp;A-type verschillende polysacchariden te isoleeren, die t�ch totnbsp;een hooge verdunning specifiek reageeren. Deze verdunnings-graad is natuurlijk relatief, daar de zeer hooge precipitatie-titer, die G o e b e 1 voor de specifieke stof uit het A-type vindtnbsp;(1:2000.000) weer laag is tegenover de titer van een 500 mil-lioenste, welke wij voor een preparaat uit het A-type vinden.

wij voornamelijk wijten aan de voedingsbodem, en hierdoor zou het mogelijk kunnen zijn dat er nog veel meer �specifieke�nbsp;polysacchariden uit hetzelfde type ge�soleerd kunnen worden.nbsp;Om uit dit doolhof te geraken moeten wij wel aannemen datnbsp;niet zoozeer de bouwsteenen, maar de bouw zelf aansprakelijk is voor de specificiteit.

De bou IV steenen zijn dan afhankelijk van het milieu, terwijl de structuur, afhankelijk van de bacterie zelf, denbsp;specificiteit bepaalt.

1. nbsp;nbsp;nbsp;G o e b e I en A V e ry (1927), die de chemische verwantschap tusschen het Ga-polysaccharide en het polysaccharidenbsp;uit B. pneumoniae type A vaststellen, terwijl serologischnbsp;g��n verband kan worden aangetoond (blz. 6).

2. nbsp;nbsp;nbsp;Heidelberger, Goebel en Avery (1925), die denbsp;serologische verwantschap tusschen het G2-polysaccha-ride en dat uit B. pneumoniae type B vaststellen, terwijlnbsp;chemisch g��n overeenkomst aanwezig is (blz. 6).

3. nbsp;nbsp;nbsp;Goebel, Avery en Babers (1934), die vaststeldennbsp;dat de plaats der zuurstofbrug in disacchariden van invloednbsp;is op de specificiteit.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Heidelberger, Avery en Goebel (1929), die uitnbsp;een struct ureele analogie tusschen het P. uitnbsp;arabische gom en dat uit de G2- of Ga-polysacchariden metnbsp;de serologische verwantschap bevestigen, terwijl chemischnbsp;volgens Challinor, Haworth en Hirst in de polysacchariden het glucuronzuur aan glucose �f galactose gebonden is.

Serologische verwantschap tusschen polysacchariden behoeft dus niet samen te gaan met chemische verwantschap, evenminnbsp;als het omgekeerde.

Of het ons gelukt is op onze synthetische voedingsbodem de bouw van het polysaccharide uit de bacterie, in zijn natuurlijke omgeving te evenaren, is moeilijk te beweren. De actievenbsp;immunisat'ie zou daar een bewijs voor kunnen zijn.

Terwijl het voorafgaande speciaal over de B. pneumoniae handelt en misschien ook van toepassing op de pneumococcen

kan worden geacht, moeten wij toch ook in het algemeen nog even de twee opvattingen over de oorzaak der specificiteitnbsp;tegenover elkaar stellen. Aan den eenen kant staat B i e r r ynbsp;met zijn bewering, dat de specificiteit van de prote�de-antigenennbsp;in het algemeen door de saccharide-fractie in het molecuul bepaald wordt, aan den anderen kant staat Landsteiner,nbsp;volgens wien veel prote�de-antigenen specifiek zijn, zonder datnbsp;er sacchariden in voorkomen.

Hierover kunnen wij opmerken, dat het aantonnen van weinig polysaccharide naast veel eiwit zeer moeilijk is en dat de isolatie van deze polysacchariden, zoo dit al gelukt, dan tochnbsp;met zulke ingrijpende middelen moet geschieden, dat er vannbsp;de oorspronkelijke polysaccharide structuur niet veel meer overnbsp;is; en zooals wij reeds beschreven, is juist de bouw aansprakelijk voor de specificiteits-reacties.

Het feit, dat het Wo n g (1938) is gelukt om uit kapsellooze stammen, dus stammen die g��n kapselstof en g��n polysaccharide zouden bevatten, t�ch een lipo�d-polysaccharide te isoleeren,nbsp;is o.i. een bevestiging van de meening van B i e r r y en eennbsp;bewijs ervoor hoe moeilijk het is te beweren specifieke eiwittennbsp;in handen te hebben, die vrij van polysaccharide zyn.

De specificiteit der eiwitten is de laatste jaren dan ook meer en meer op de achtergrond geraakt en het lijkt ons ook in hetnbsp;algemeen zeer waarschijnlijk dat de specificiteit, zoo niet geheel dan toch voor het grootste deel door debouwderpoly-sacchariden wordt bepaald.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Uit een kapseldragende stam van Bacterium pneumoniaenbsp;type A (Frankland), isoleerden wij een lipo�d-polysaccha-ride, dat tot een verdunning van 1:1000.000.000 een specifieke precipitatiereactie gaf met het homologe antiserum.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Deze stof kon, door hydrolyse met ijsazijn in de koude, gescheiden worden in een phospholipo�de en een polysaccharide.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Het lipo�de was een phosphatide van de lecithine-kephalinenbsp;groep, het kwam aan calcium gebonden voor.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Het kristallij ne polysaccharide, dat eiwit- en lipo�d-vrijnbsp;was, bevatte d-fructose, een uronzuur en waarschijnlijknbsp;een disaccharide.

5. nbsp;nbsp;nbsp;De specifieke stof uit het C-type bestond, in verhoudingnbsp;tot die uit het A-type, uit veel eiwit, veel lipo�d en weinignbsp;polysaccharide.

6. nbsp;nbsp;nbsp;Het chemisch zuivere, gekristalliseerdenbsp;polysaccharide uit het A-type, dat met het homologe antiserum een precipitatie-titer van 1: 500.000.000nbsp;gaf, was, evenals het lipo�d-polysaccharide uit het A-type,nbsp;een volwaardig antigeen, dus in staat antilicha-men by de muis te verwekken.

7. nbsp;nbsp;nbsp;Het anti-polysaccharide-serum van het A-type was specifiek en reageerde niet met het polysaccharide uit B.nbsp;pneumoniae type C.

8. nbsp;nbsp;nbsp;Actieveimmuniteit kon, na herhaalde inspuitingennbsp;van het chemisch zuivere polysaccharide bij de muis, somsnbsp;worden opgewekt.

D�une souche encapsul�e du type A de Bacterium pneumoniae (Frankland) nous avons isol� une substance, qui pr�-cipitait sp�cifiquement par Ie serum correspondant titrant

1 p. 1.000.000.000.

Apr�s l�hydrolyse a froid avec I�acide ac�tique glacial de cette substance, elle parait �tre compos�e d�une lipide etnbsp;d�une glucide.

La lipide �tait une phosphatide du groupe l�cithine-k�phaline, li�e au calcium.

La glucide, que nous avons isol�e en �tat cristallin, exempt de prot��de et de lipide, se composait de d-fructose,nbsp;d�un acide uronique et d�une troisi�me substance, qui estnbsp;probablement une disaccharide.

A la diff�rence de la substance sp�cifique du type C, qui est compos�e de beaucoup de prot��de, beaucoup de lipidenbsp;et peu de glucide, celle du type A se trouvait compos� denbsp;peu de prot��de, peu de lipide et beaucoup de glucide.

La glucide du type A, chimiquement pure et c r i s t a 11 i n e, pr�cipitait par Ie s�rum homologue aunbsp;taux de 1 p. 500.000.000. Comme la substance glucido-lipi-dique elle avait la propri�t� d��tre un antig�ne compl�t, c�est a dire de faire naitre par injections a l�animalnbsp;(la souris) des anticorps sp�cifiques.

Le s�rum anti-glucide du type A pr�cipitait sp�cifiquement la glucide du type A, ne r�agissait pas avec la glucide du type C.

Par injections r�p�t�es de la glucide pure la souris acqu�-rait parfois une immunit� active.

1. nbsp;nbsp;nbsp;Aus einem Kapsel tragenden Stamm von Bakterium pneumoniae Typ A (Frankland) wurde ein Lipo�d-Poly-saccharid isoliert, das bis zu einer Verd�nnung vonnbsp;1; 1.000.000.000 eine spezifische Praecipitationsreaktionnbsp;mit dem homologen Antiserum gab.

2. nbsp;nbsp;nbsp;Dieser Stoff konnte durch Hydrolyse mit Eisessig in dernbsp;Kalte in ein Phosphorlipo�d und ein Polysaccharid ge-spalten werden.

3. nbsp;nbsp;nbsp;Das Lipo�d war ein Phosphatid der Lecithin-Kephalin-Gruppe, es war an Kalzium gebunden.

4. nbsp;nbsp;nbsp;Das krystallinische Polysaccharid, das Eiweiss- und Lipo�d-frei war, enthielt d-Fruktose, eine Uronsaure und wahr-scheinlich ein Disaccharid.

5. nbsp;nbsp;nbsp;Der spezifische Stoff aus dem C-Typ bestand im Gegensatznbsp;zu dem aus dem A-Typ aus viel Eiweiss, viel Lipo�d undnbsp;wenig Polysaccharid.

6. nbsp;nbsp;nbsp;Das chemisch reine, krystallisierte Polysaccharid aus dem A-Typ, das mit dem homologennbsp;Antiserum einen Praezipitationstiter von 1: 500.000.000nbsp;gab, war wie das Lipo�d-Saccharid aus dem A-Typ einnbsp;vollwertiges Antigen, also imstande, bei dernbsp;Maus Antik�rper zu erregen.

7. nbsp;nbsp;nbsp;Das Anti-Polysaccharid-Serum des A-Typs war spezi-f i s c h und reagierte nicht mit dem Polysaccharid aus B.nbsp;pneumoniae Typ C.

8. nbsp;nbsp;nbsp;Aktive Immunitat konnte nach wiederholten Injektionennbsp;des chemisch reinen Polysaccharids bei der Maus in einemnbsp;Teil der Falie erzeugt werden.

SUMMARY.

1. nbsp;nbsp;nbsp;From an encapsulated strain of Bacterium pneumoniaenbsp;type A (Frankland) we isolated a substance, which gavenbsp;a type-specific precipitin reaction with the homologousnbsp;immune serum in a dilution of 1 in 1000.000.000.

2. nbsp;nbsp;nbsp;On hydrolysis in the cold with glacial acetic acid this substance yields a lipoi'd and a polysaccharide.

3. nbsp;nbsp;nbsp;The lipo'id turned out to be a phosphatide from the groupnbsp;lecithin-kephalin, and was linked to calcium.

4. nbsp;nbsp;nbsp;The protein- and lipol'd-free, crystalline polysaccharidenbsp;was composed of d-fructose, an uronic acid and a thirdnbsp;substance, which is probably a disaccharide.

5. nbsp;nbsp;nbsp;In contrast with the specific substance from the C-type,nbsp;which consisted of much protein and lipo�d, but of littlenbsp;polysaccharide the specific substance from the A-typenbsp;consisted of little protein and lipo'id, but of much polysaccharide.

6. nbsp;nbsp;nbsp;The chemical pure, crystalline polysaccharide from thenbsp;A-type gave a specific precipitation in a dilution of 1 innbsp;500.000.000 with the homologous antiserum. Just like thenbsp;lipoid-polysaccharide it was a complete antigen, becausenbsp;it gave rise to the development of specific antibodies onnbsp;injection into animals (mouse).

7. nbsp;nbsp;nbsp;The polysaccharide antiserum of the A-type was type-specific, reacting not at all with the polysaccharide of thenbsp;C-type.

8. nbsp;nbsp;nbsp;Sometimes an active immunity could be produced by repeated injections of the chemical pure polysaccharide intonbsp;the mouse.

Goebel (W. nbsp;nbsp;nbsp;F.)......J. nbsp;nbsp;nbsp;ofnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Biol.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Chem.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1927,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;74, 619.

Goebel (W. nbsp;nbsp;nbsp;F.)......J. nbsp;nbsp;nbsp;exp. Med. 1938,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;68, 469 ennbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1939,

en Hoogland......J. nbsp;nbsp;nbsp;ofnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Biol.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Chem.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1939,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;129,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;455.

Goebel (W. nbsp;nbsp;nbsp;F.) en Goodner . . J.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;ofnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Biol.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Chem.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;1936,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;114,nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;40.

Kurotchkin (T. J.) . nbsp;nbsp;nbsp;.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;. Proc. Soc. exp. Biol. 1939, 40, 357.

STELLINGEN

De specificiteit der kapselstoffen wordt bepaald door de groepeering der polysacchariden en niet door de chemischenbsp;structuur der hydrolyse-producten.

De identificatie van typhus-bacteri�n kan, door all��n gebruik te maken van serologische reacties, binnen zeer korten tijd, eenvoudig en af doende geschieden.

III

Ten onrechte meent V a r g h a de constitutie van het benzal-d-sorbiet te hebben bewezen.

De door E n d e r s afgeleide conclusie, dat in 10% natronloog het maltose-molecuul als zoodanig niet bestaat, maar prac-tisch slechts als een oplossing van triose X, respectievelijk van methylglyoxaal voorkomt, is niet verantwoord.

Enders (C.), Biochem. Z. 313, 18, (1943). van Os (F. H. L.), Diss. Utrecht (1942), p. 119.

De voorstelling van W a s s i 1 j e w over de inwerking van kleine hoeveelheden alkoholen op albumine-solen geeft van denbsp;optredende coagulatie-versch'ijnselen een verklaring, die zeernbsp;goed in overeenstemming is met de feiten. Hiermee wordt ooknbsp;de algemeen toegepaste methode van S e v a g, ter onteiwittingnbsp;van bacterie-suspensies of specifieke stoffen, begrijpelijk.

Cerisulfaat is, in zure oplossing, een bestendig sterk oxydatie-middel, en biedt groote voordeelen boven het gebruik van kalium-permanganaat in de oxydometrie.

VII

Het onderzoek van Lebduska en Pidra, over de antiseptische werking van dampen uit vaste stoffen, levert geen bewijs voor de onwerkzaamheid van jodoform.

VIII

Indien precipitatie-reacties even gemakkelijk microscopisch waren uit te voeren als agglutinatie-reacties zou dit een grootnbsp;voordeel beteekenen.

	Lyst van afkortingen nbsp;nbsp;nbsp;95 LUST VAN AFKORTINGEN.
A.	= Aethylalkohol (96 %).
Lo. E.	= Lovibond-Eenheid.
L.	= Lipoid.
L.-P.	= Lipoid-Polysaccharide.
L.-P.-E.	= Lipoid-Polysaccharide-Eiwit.
L.-P. FXX	= Lipoid-Polysaccharide uit de FXX-stam.
P.	= Polysaccharide.
P. FXX.	= Polysaccharide uit de FXX-stam.

tev,';

HET KAPSELANTIGEEN VAN BACTERIUM PNEUMONIAE

TYPEN A EN C (Frankland en Friedlander)

ACADEMISCH PROEFSCHRIFT

WILLEM JACOB ALSCHE

Cr'''.'' nbsp;nbsp;nbsp;--�-'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;� .''=�'''.'�.'.''r'-:-^f-.S''^-^c?i'-..'

^.. nbsp;nbsp;nbsp;'v,

jsm

ALGEMEENE INLEIDING.

THEORETISCH OVERZICHT.

HET PROBLEEM.

PRACTISCH GEDEELTE.

A. De gebruikte stam.

HOOFDSTUK 11.

BEREIDING VAN DE SPECIFIEKE STOF UIT B. PNEUMONIAE TYPE C.

IMMUNITEITS-PROEVEN.

SLOTBESCHOUWINGEN.

1.

6.

SUMMARY.

/Vv*

STELLINGEN

II

III

IV

VI

VII

VIII

.s

y phosphor	Lovibond-Eenheden			y phosphor	Lovibond-Eenheden
y phosphor	Neutraal	Geel	Blauw	y phosphor	Neutraal	Geel	Blauw
00	0,1	0,0	0,2	70	0,1	0,2	2,1
10	0,1	0,0	0,4	80	0,1	0,2	2,4
20	0,1	0,0	0,7	90	0,1	0,2	2,7
30	0,1	0,1	1,0	100	0,2	0,2	3,0
40	0,1	0,1	1,2	130	0,3	0,3	3,9
50	0,1	0,1	1,6	160	0,4	0,4	4,5
60	0,1	0,1	1,7	200	0,5	0.5	6,1

tev,';

HET KAPSELANTIGEEN VAN BACTERIUM PNEUMONIAE

TYPEN A EN C (Frankland en Friedlander)

ACADEMISCH PROEFSCHRIFT

WILLEM JACOB ALSCHE

Cr'''.'' nbsp;nbsp;nbsp;--*�-'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;� .''=�*'''.'�.'.''r'-:-^f-.S''^-^c?i'-..'

^.. nbsp;nbsp;nbsp;'v,

jsm

ALGEMEENE INLEIDING.

THEORETISCH OVERZICHT.

HET PROBLEEM.

PRACTISCH GEDEELTE.

A. De gebruikte stam.

HOOFDSTUK 11.

BEREIDING VAN DE SPECIFIEKE STOF UIT B. PNEUMONIAE TYPE C.

IMMUNITEITS-PROEVEN.

SLOTBESCHOUWINGEN.

1.

6.

SUMMARY.

/Vv*

STELLINGEN

II

III

IV

VI

VII

VIII

.s

Cr'''.'' nbsp;nbsp;nbsp;--�-'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;� .''=�'''.'�.'.''r'-:-^f-.S''^-^c?i'-..'