DEUTERIUM ALS HULPMIDDEL BIJ DE BEPALING VAN GLUTAMINEZUURnbsp;IN DE HYDROLYSATEN VANnbsp;TUMORPROTEINEN

DEUTERIUM ALS HULPMIDDEL BIJ DE BEPALING VAN GLUTAMINEZUUR IN DE HYDROLYSATEN VANnbsp;TUMORPROTEINEN

■■i.)'^'-quot; ■ ' nbsp;nbsp;nbsp;/' ', '■:’1nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;'.quot;.-ivnbsp;nbsp;nbsp;nbsp;^ .'A: '.quot;y

DEUTERIUM ALS HULPMIDDEL BIJ DE BEPALING VAN GLUTAMINEZUURnbsp;IN DE HYDROLYSATEN VANnbsp;TUMORPROTEINEN

PROEFSCHRIFT

TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDEnbsp;AAN DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT,nbsp;OP GEZAG VAN DEN RECTOR MAGNIFICUSnbsp;L. VAN VUUREN, HOOGLEERAAR IN DEnbsp;FACULTEIT DER LETTEREN EN WIJSBEGEERTE, VOLGENS BESLUIT VAN DE SENAAT DER UNIVERSITEIT TEGEN DEnbsp;BEDENKINGEN VAN DE FACULTEIT DERnbsp;WIS- EN NATUURKUNDE TE VERDEDIGENnbsp;OP MAANDAG 15 FEBRUARI 1943, DESnbsp;NAMIDDAGS TE 4 UUR

GFRARD JOHANNFS VAN VFFRSFN

Het be�indigen van mijn studie aan de Utrechtsche Univer-siteit biedt mij een welkome gelegenheid, U, Hoogleeraren, Oud-Hoogleeraren en Lectoren in de Faculteit der Wis- en Natuurkunde, hartelijk dank te zeggen voor hetgeen Gij tot mijnnbsp;wetenschappelijke vorming hebt bijgedragen.

In het bijzonder dank ik U, Hooggeleerde K � g 1, Hooggeachte Promotor, voor de voortdurende en intense belangstelling, welke ik van U bij mijn werk mocht ondervinden. Daarnaastnbsp;weet ik het vertrouwen, dat U in mij stelde, te waardeeren. Ongetwijfeld heb ik het aan Uw energie en doorzettingsvermogennbsp;te danken, dat ik de moeilijkheden, welke zich bij mijn werkzaamheden voordeden, heb kunnen overwinnen. De tijd, gedurende welke ik als assistent aan Uw Laboratorium werkzaamnbsp;mocht zijn, is, vooral door het persoonlijk contact met U, vannbsp;zeer veel waarde voor mij geweest.

Zeergeleerde Strengers, de jaren, waarin ik het voorrecht genoot, U bij Uw colleges te mogen assisteeren, zullen mij steeds een aangename herinnering blijven.

Zeergeleerde E r x 1 e b e n, voor de daadwerkelijke steun, welke ik van U mocht ontvangen bij de uitvoering van de in ditnbsp;proefschrift beschreven experimenten, ben ik U zeer dankbaar.

Gaarne betuig ik ook jou, waarde Klein, mijn hartelijke dank voor je hulp alsmede de prettige samenwerking, welke iknbsp;met jou mocht hebben.

Tenslotte een woord van waardeering aan het personeel van het Organisch-Chemisch Laboratorium; het zijn vooral de heerennbsp;Tieland en Ruygrok, die mij bij de opbouw van denbsp;apparatuur met groote bereidwilligheid behulpzaam zijnnbsp;geweest.

HOOFDSTUK I.

INLEIDING.

Wanneer de ontwikkeling� van de verschillende gebieden der natuurwetenschappen in het laatste decennium wordt nagegaan,nbsp;dan blijkt, dat er veelvuldig een opschuiving van problemennbsp;plaats vindt van minder exacte naar meer exacte vakken. Zoonbsp;zien wij, dat vraagstukken, voor welke de chemie tevergeefsnbsp;heeft getracht een oplossing te vinden, heden ten dage met meernbsp;succes door de physica worden bewerkt. Aan de andere kantnbsp;treffen wij een analoog verschijnsel aan bij vele biologische ennbsp;medische problemen en v/el moet hier veelal de chemie met haarnbsp;methoden te hulp komen. Wie het ernstig om de vooruitgang dernbsp;wetenschap te doen is, zal deze gang van zaken niet als eennbsp;tekortkoming van zijn eigen vak beschouwen. Het gebruik makennbsp;der methodiek van zusterwetenschappen lijkt zelfs een gunstigenbsp;compensatie tegenover de meestal onvermijdelijke specialisee-ring, welke heden ten dage vrijwel ieder onderzoek met zichnbsp;brengt.

Een indrukwekkend voorbeeld voor een derg�lijke �synthese� vormt de toepassing van isotopen in de biochemische wetenschap. Aangezien ook in het onderwerp van deze dissertatie eennbsp;isotoop een belangrijke rol speelt, moge in het kort iets over denbsp;geschiedenis van de isotopen worden vermeld.

Zooals bekend, verstaan we onder isotopen elementen, die niettegenstaande verschillend atoomgewicht, op dezelfde plaats van het periodieke systeem thuis behooren. Uit de theorie vannbsp;B o h r is in combinatie met de experimenten van Moseleynbsp;gebleken, dat het chemisch gedrag van een element door zijnnbsp;kernlading, respectievelijk atoomnummer wordt bepaald, zoodatnbsp;wij isotopen ook kunnen defini�eren als elementen met hetzelfdenbsp;atoomnummer, maar met verschillend atoomgewicht. Mennbsp;onderscheidt ze in stabiele en instabiele (radioactieve) elementen. De laatsten verdeelen we weer in kunstmatige en natuurlijkenbsp;isotopen.

S o d d y werd ingevoerd, begint de geschiedenis der isotopen reeds in de laatste jaren van de vorige eeuw, toen door B e c-quereP), Curie en Schmidt de radioactieve elementennbsp;werden ontdekt. Immers de leden der radioactieve reeksennbsp;bleken natuurlijke instabiele isotopen te zijn van de zwarenbsp;elementen thallium, lood, bismuth en thorium. Het duurde geruime tijd, voordat men de isotopen van de lichtere elementennbsp;leerde kennen. Eerst in 1932 en navolgende jaren kreeg mennbsp;de beschikking over de stabiele isotopen van waterstof, koolstof,nbsp;stikstof, zwavel en zuurstof. Gelijktijdig daarmee verschenennbsp;tengevolge van de ontdekking der kunstmatige radioactiviteitnbsp;door Curie, Joliot^) en Fermi�), de instabiele isotopennbsp;ten tooneele van koolstof, zwavel, phosphor, arseen, natrium,nbsp;kalium, magnesium, calcium, de halogenen, ijzer, koper ennbsp;goud.

De wijze, waarop de isotopen kunnen worden toegepast voor de studie van chemische reacties, werd omstreeks het jaar 1920nbsp;door G. von Hevesy aangegeven; aangezien de isotopenbsp;elementen door gewone chemische middelen niet zijn te scheiden,nbsp;kon bijvoorbeeld radioactief lood (thorium B) bij de bestudee-ring van de zelfdiffusie van gesmolten lood als �indicator�nbsp;worden gebruikt. Sindsdien is deze indicatormethode in velenbsp;onderzoekingen en in allerlei variaties toegepast. Het feit, datnbsp;de eerste isotopen tot de zware elementen behoorden, veroorzaakte, dat de toepassing daarvan niet zoozeer op physiologischnbsp;als wel op analytisch-chemisch en physisch-chemisch terreinnbsp;lag. Uiteraard veranderde dit, toen de isotopen van de voor denbsp;physiologie zoo belangrijke elementen koolstof, waterstof, zuurstof, stikstof, zwavel en phosphor ter beschikking kwamen.nbsp;Natuurlijk werden ook in de biochemie de isotopen in de eerstenbsp;plaats volgens het indicatorprincipe toegepast. Hoe groot hiernbsp;de behoefte aan een dergelijke methodiek was, blijkt duidelijk,nbsp;wanneer wij nagaan, op welke wijze de betreffende vraagstukken in de periode v��r de ontdekking der isotopen van

2) nbsp;nbsp;nbsp;I. C u r i e en F. J o 1 i o t, C. r. hebd. S�ances Acad. Sci. 198,nbsp;254 (1934).

laatstgenoemde elementen moesten worden bestudeerd. Immers een van de voornaamste opgaven van het physiologisch-chemischnbsp;onderzoek is de bestudeering van reacties, welke bij de opbou'Ovnbsp;en de afbraak der stoffen van de levende cel een rol spelen. Innbsp;het algemeen moest men er vroeger mede volstaan, de bestand-deelen van het doode organisme alsmede van de uitscheidings-producten te analyseeren. Ofschoon de op deze wijze verkregennbsp;staalkaart van natuurstoffen buitengewoon belangrijk was ennbsp;is, kon men langs deze weg veelal niets te weten komen overnbsp;de lotgevallen van de afzonderlijke verbindingen in het levendenbsp;organisme. Een vooruitgang in deze richting kon slechts wordennbsp;bereikt door in de verbinding, waarvan men de physiologischenbsp;afbraak wilde nagaan, een karakteristieke groep in te voeren,nbsp;welke de latere identificatie in de uitscheidingsproductennbsp;moesten vergemakkelijken. Een typisch voorbeeld voor dezenbsp;werkwijze zijn de onderzoekingen over de biologische oxydatienbsp;van vetzuren; F. Knoopt) heeft hiervoor de phenylgroepnbsp;toegepast, d.w.z. vetzuren met een CgHg-rest op de w-plaatsnbsp;gevoederd. Latere auteurs hebben voor hetzelfde doel bv. benzol-sulfo-methylamino- of cyclo-alkylgroepen gebruikt. Alhoewelnbsp;op deze manier het belangrijke feit van de zgn.^S-oxydatie dernbsp;vetzuren kon worden ontdekt, is het bezwaar van de methodieknbsp;duidelijk. De �ge�tiketteerde� verbindingen zijn voor het organisme niet alleen vreemde stoffen, maar bovendien ook wat hunnbsp;moleculairgewicht en ten deele hun chemisch karakter betreftnbsp;reeds zeer verschillend van de moleculen der natuurlijke vetzuren. Heden ten dage is het mogelijk dergelijke onderzoekingennbsp;met vetzuren uit te voeren, welke b.v. door deuterium zijnnbsp;gemerkt; in dit geval is de kunstmatige verandering in de bouwnbsp;van het molecuul slechts minimaal.

Een ander willekeurig gekozen voorbeeld moge aantoonen, hoe de gebruikmaking van deuterium als indicator geschikt is,nbsp;in twijfelachtige gevallen meteen een definitieve beslissing tenbsp;brengen. In het jaar 1909 heeft J a f f � �) na voedering vannbsp;benzol, uit de urine van honden en konijnen in kleine hoeveelheden muconzuur kunnen isoleeren, dat hij als afbraakproduct

van benzol beschouwde. B�eseken'O en Slooff wezen er echter op, dat bij de opensplitsing van de benzolring cis-cis-muconzuur zou moeten ontstaan, terwijl J a f f � het trans-trans-zuur had ge�soleerd; zij veronderstelden daarom, dat hetnbsp;trans-trans-zuur niet uit benzol, maar b.v. uit galactose zounbsp;zijn ontstaan. Eenige jaren later echter werd door Drummond'^) en Finar ontdekt, dat het aan urine toegevoegdenbsp;cis-cis-muconzuur spoedig in het trans-trans-zuur overgaat.nbsp;Nadat dus de vraag of het organisme van de hond inderdaad innbsp;staat is de theoretisch interessante omzetting van benzol innbsp;muconzuur uit te voeren, lange tij d een onderwerp van discussienbsp;bleef, konden K. Bernhard�) en E. Gressly onlangsnbsp;de kwestie voor goed ophelderen. Zij slaagden er namelijk innbsp;na voedering van deuteriobenzol een deuterium bevattend muconzuur te isoleeren.

Een andere toepassing der isotopen ligt op zuiver analytisch terrein. Wanneer namelijk bij het bepalen van het gehalte vannbsp;een substantie A in een mengsel de gewone analytische werkwijzen geen bevredigend succes hebben, kunnen we door aan hetnbsp;mengsel een bekende hoeveelheid met isotopen ge�ndiceerdenbsp;stof A toe te voegen, uit de verdunning van de daarna ge�soleerde verbinding A, het totale gehalte berekenen.

Wat het aantonnen en bepalen van isotopen betreft, biedt het werken met radioactieve isotopen zekere voordeelen. In de tellernbsp;van Geiger en M�ller hebben we een eenvoudig te mani-puleeren apparaat, dat met groote nauwkeurigheid het gehaltenbsp;van het radioelement kan bepalen. Gezien de gevoeligheid vannbsp;het toestel is het mogelijk met geringe isotoopconcentraties tenbsp;werken, zoodat het niet noodzakelijk is van zeer actieve prae-paraten uit te gaan. Indien het alleen op de vraag aankomt, ofnbsp;een isotoop al of niet in een bepaald lichaamsdeel wordt opgenomen � bv. radioactieve phosphor in de tanden � kan mennbsp;de isoleering van zuivere verbindingen achterwege laten. Wilnbsp;men echter uitmaken of hetzelfde isotoop bv. in lecithine wordt

6) nbsp;nbsp;nbsp;J. B � e s e k e n en G. Slooff, Proc. Acad. Sci. Amst. 32, 1043nbsp;(1929).

7) nbsp;nbsp;nbsp;J. C. D r u m m o n d en I. L. F i n ar, Biochem. J. 32, 79 (1938).

8) nbsp;nbsp;nbsp;K. Bernhard en E. Gressly, Helv. Chim. Acta 24, 83nbsp;(1941).

ingebouwd, dan is de afscheiding van de zuivere verbinding slechts overbodig, indien de ruwe lecithinefractie niet radioactief zou zijn.

Een voorwaarde voor het gebruik van radioactieve isotopen is echter een voor het experiment gunstige halveeringstijd.nbsp;Zooals tabel I toont, varieert deze grootheid van een onderdeelnbsp;van een seconde tot eenige maanden.

Indien de halveeringstijd kort is, vergeleken met de duur van het experiment, dan zal aan het einde daarvan bijna alle activiteit van het radioactieve praeparaat zijn verdwenen. Bij eennbsp;lange halveeringstijd daarentegen is het aantal atomen, datnbsp;ontleedt, te gering om behoorlijk metingen te kun^ien verwnbsp;richten. Het is- duidelijk, dat de toepassing van de radioactieve koolstof (^^C) met een halveeringstijd van 20,5nbsp;minuten zeer bijzondere eischen stelt aan de keuze van de daar-

mede te onderzoeken reacties. Toch konden Amerikaansche onderzoekers met dit isotoop in de laatste tijd reeds hoogst belangrijke resultaten bereiken.

Tegenover de eenvoudige analysemethodiek van de radioactieve isotopen, staat de meer ingewikkelde der stabiele isotopen. Behalve de in het volgende hoofdstuk te noemen methoden ter bepaling van deuterium, vermelden we hier de massaspec-trometer van Bleackney, waarmede het gehalte van' denbsp;isotopen isN en wordt bepaald.

Wij verwijzen hier in het bijzonder naar de groote prestaties, welke door de school van Schoenheimer met behulp vannbsp;2H (deuterium) en isN bij de studie van vele biochemischenbsp;vraagstukken werden bereikt.

Het zou buiten het kader van deze inleiding vallen, een opsomming te geven van de vele onderzoekingen, welke onder toepassing van isotopen zijn uitgevoerd. Het eigenlijke onderwerp van dit proefschrift waartoe wij nu moeten overgaan, zal toonen,nbsp;in hoeverre ook hierbij de nieuwe isotopen een rol hebben gespeeld.

In het voorjaar van 1939 verscheen een mededeeling van F. K � g 1 �) en H. E r x 1 e b e n onder de titel �Zur Aetio-logie der malignen Tumoren�. In deze publicatie, welke in breedenbsp;kringen zeer de aandacht heeft getrokken, werd een geheelnbsp;nieuwe beschouwing over het wezen van de kwaadaardige groeinbsp;gegeven.

Terwijl zich het biochemische kankeronderzoek in de laatste twintig jaren voornamelijk met de uitwendige oorzaken bezignbsp;hield, die, zooals bv. carcinogene koolwaterstoffen tot kankernbsp;kunnen leiden, was de nieuwe theorie gefundeerd op experi-menteele feiten, welke ten nauwste samenhangen met chemischenbsp;veranderingen in het inwendige der cel. De nieuwe onderzoekingen werden naar aanleiding van de volgende overwegingennbsp;uitgevoerd:

a) Bij vele physiologisch werkzame stoffen, zooals hormonen (bv. adrenaline) en groeistoffen (bv. lt;i(;8-indodyl)-pro-pionzuur) is gebleken, dat het biologisch effect van deze

substanties ten nauwste samenhangt met de ruimtelijke rangschikking van de substituenten aan de asymmetrie-centra.

b) De bestudeering van eiwitten had o.a. als resultaat opgeleverd, dat vrijwel alle in de natuur voorkomende prote�nen zijn opgebouwd uit aminozuren van dezelfde configuratie en wel de zgn. 1-reeks.

De combinatie van deze feiten leidde tot de gedachte, dat de ontaarde groei misschien door een stereochemische verandering veroorzaakt zou kunnen zijn, met dien verstande, dat innbsp;prote�nen van kankergezwellen naast bouwsteenen van denbsp;1-reeks, ook bouwsteenen van de tegenovergestelde configuratie voorkomen. Inderdaad bleek bij de analyse van de aminozuren uit hydrolysaten van kankergezwellen, dat eenige eiwit-bouwsteenen ook in de onnatuurlijke vorm aanwezig waren.nbsp;Hiermede was voor het eerst aan het doode materiaal een chemisch onderscheid tusschen het normale en het maligne weefsel aangetoond.

In experimenteel opzicht moest voor dit onderzoek elk aminozuur uit de hydrolysaten in chemisch zuivere vorm worden afgescheiden en daarna de specifieke draaiing worden bepaald.nbsp;De gelijktijdige aanwezigheid van de antipoden moest door eennbsp;depressie in de specifieke draaiing tot uiting komen. Aminozuren, waarvan bekend was, dat ze onder de omstandighedennbsp;van de zuur-hydrolyse gedeeltelijk racemiseeren, moesten natuurlijk in dit verband a priori buiten beschouwing blijven.

In het kort kunnen de resultaten van het eerste onderzoek van. K � g 1 en E r x 1 e b e n als volgt worden samengevat. Denbsp;eiwitten van het normale weefsel zijn, voor zoover dit kon worden nagegaan, inderdaad alleen opgebouwd uit de aminozurennbsp;van de 1-reeks. Ook de tumoreiwitten zijn hoofdzakelijk uitnbsp;deze gewone bouwsteenen samengesteld; overeenkomstig denbsp;verwachting kon echter uit de prote�nen van kankerweefselnbsp;ook een niet te verwaarloozen hoeveelheid van aminozuren dernbsp;�onnatuurlijke� d-reeks worden ge�soleerd. Terwijl het percentage aan d-vorm bij leucine, lysine, oxy-glutaminezuur ennbsp;valine slechts klein was, constateerde men bij het glutamine-zuur een aanzienlijke concentratie van de d-antipode.

een nieuwe kankertheorie. Volgens hem is de diepere oorzaak van de kanker gelegen in een beschadiging van de enzymsyste-men, welke de ophouw en de afbraak van de eiwitten regelen.nbsp;Het gevolg van die beschadiging is, dat de eiwitsynthetiseeren-de fermenten niet alleen de natuurlijke, maar daarnaast ooknbsp;onnatuurlijke aminozuren in de eiwitten van de cel inbouwen.nbsp;Op zichzelf zou het optreden van partieel racemische prote�nennbsp;in de kankercel als bijkomstig verschijnsel kunnen worden beschouwd. Voortbouwende op de gedachten, welke tot de nieuwenbsp;richting hebben geleid, heeft K � g 1 echter een reeks belangrijkenbsp;argumenten genoemd, die er voor pleiten, dat zijn vondst inderdaad van zeer groot belang voor het kankervraagstuk is.nbsp;Dit werd door tal van andere auteurs eveneens beseft en denbsp;nieuwe gezweltheorie werd het uitgangspunt van vele onderzoekingen, vooral op enzymatisch gebied. Ook andere onderzoekers waren er kennelijk van overtuigd, dat de genoemdenbsp;resultaten zeker niet onbelangrijk zouden zijn, achtten hetnbsp;echter voor noodzakelijk de experimenteele grondslag, nl. hetnbsp;voorkomen van d-glutaminezuur als voornaamste onnatuurlijke bouwsteen der tumorprote�nen in eigen onderzoekingen tenbsp;verifi�eren.

Tegenover de enkele auteurs^�), aan wie het gelukt is, d-glutaminezuur uit hydrolysaten van kankergezwellen te iso-leeren, staan een lange reeks van chemici^�),nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;^�), �),

�)gt; �)) die er niet in geslaagd zijn, het genoemde aminozuur in tumorhydrolysaten aan te toonen.

10) nbsp;nbsp;nbsp;L. E. A r n o w en J. C. O p s a h 1, Science 90, 257 (1939).

11) nbsp;nbsp;nbsp;J. W h i t e en F. R. W h i t e, J. Biol. Chem. 130, 435 (1939).

12) nbsp;nbsp;nbsp;A. C. C h i b n a 11 en zijn medewerkers, Nature 144, 71 (1939),nbsp;145, 311 (1940). Biochem. J. 34, 285 (1940).

14) nbsp;nbsp;nbsp;F. Lipmann en zijn medewerkers, Science 91, 21 (1940), 92,nbsp;32 (1940).

17) nbsp;nbsp;nbsp;G. E. Woodward, F. E. R e i n h a r t en J. S. D o h a n, J.nbsp;Biol. Chem. 138, 677 (1941).

dere auteurs experimenteele moeilijkheden opleverde, werden veelal andere methoden toegepast, welke door de Utrechtschenbsp;school voor het vraagstuk nog niet waren beproefd. In de regelnbsp;werd echter telkens weer uitsluitend het 1-glutaminezuur gevonden. Zoodoende kwam een reeks van onderzoekers tot denbsp;overtuiging, dat de resultaten van K�gl en zijn medewerkersnbsp;niet juist zouden zijn en dat er tusschen normaal weefsel ennbsp;kankergezwellen niet het gepostuleerde verschil zou bestaan.

K�gl en Erxleben isoleeren het glutaminezuur uit de hydrolysaten volgens een lang bekend voorschrift als het hydrochloride, door het eiwithydrolysaat na korte behandeling metnbsp;cuprooxyde met chloorwaterstof te verzadigen. Na enting ennbsp;eenige dagen bewaren bij 0�, scheidt zich het glutaminezuur-hydrochloride kristallijn af. De opbrengst was daarbij oorspronkelijk slechts 3�4% van het prote�negewicht; hier zijnbsp;echter reeds vermeld, dat naderhand meerdere routine en ervaring er toe leidden, dat de gemiddelde opbrengst op 9 % konnbsp;worden gebracht, zonder dat hierdoor in de verhouding dernbsp;antipoden een essentieele verandering optrad.

De Engelsche en Amerikaansche auteurs gaven meestal de voorkeur aan de methode van Foreman^�). Bij deze werkwijze wordt het glutaminezuur in de vorm van zijn calcium- ofnbsp;bariumzout in water-alcohol-milieu gepraecipiteerd. Uit hetnbsp;neerslag wordt dan het glutaminezuur met behulp van zwavelzuur vrijgemaakt, waarna het eveneens als hydrochloride wordtnbsp;gewonnen. Langs deze weg kan uit elk weefselprote�ne glutaminezuur in een opbrengst van ongeveer 10 % worden verkregen,nbsp;maar het is dan ook bij tumoren vrijwel de zuivere 1-vorm.

Deze tegenstelling kon spoedig worden opgehelderd. Het gelukte K � g 1 en E r X1 e b e n^^) bij de hydrolysaten van tumor-eiwit uit de moederloog van het neerslag der calciumzouten nog een hoeveelheid glutaminezuur als hydrochloride te isoleeren.nbsp;Deze toonde de tegenovergestelde draaiing; blijkbaar heeft dusnbsp;bij de methode van Foreman onder de invloed van anderenbsp;asymmetrische stoffen van het hydrolysaat een splitsing vannbsp;dl-glutaminezuur in de antipoden plaats. Zoo kon uit het hy-

21) nbsp;nbsp;nbsp;F. K � g 1 en H. E r X 1 e b e n, Z. physiol. Chem. 264, 211 (1940).

drolysaat van een Brow n-P e a r c e-tumor eerst 9,3 % 1-glu-taminezuur worden ge�soleerd en vervolgens uit de moederloog nog 3,6 % d-glutaminezuur. Hiermede was een maximum opbrengst aan glutaminezuur van 12,9 % bereikt en een der voornaamste tegenargumenten, nl. de geringe opbrengst bij de oorspronkelijke werkwijze uit de weg geruimd.

Ofschoon het aanvankelijk gerechtvaardigde bezwaar Van de te kleine opbrengsten daarmee van de baan was, deed zichnbsp;de behoefte gevoelen, de discussie op een exacte basis te stellennbsp;door het absolute gehalte aan 1- en d-vorm in de hydrolysatennbsp;te bepalen. De weg werd gewezen door een noot van H. H.nbsp;Ussing^^). Deze auteur bepaalde het leucine-gehalte in hetnbsp;hydrolysaat van haemoglobine door na racemisatie van denbsp;aminozuren een bepaalde hoeveelheid gedeutereerd dl-leucine toenbsp;te voegen. Uit het verminderde deuterium-gehalte van hetnbsp;daarna uit het mengsel ge�soleerde dl-leucine kon het gezochtenbsp;absolute gehalte worden berekend. Naar aanleiding van dezenbsp;mededeeling hebben F. K � g U�), H. E r x 1 e b e n en H. Herken het voornemen te kennen gegeven, door een overeenkomstige wijziging van dit principe het absolute gehalte van de eiwit-hydrolysaten aan 1- en d-glutaminezuur te bepalen. Schrijvernbsp;van dit proefschrift kreeg tot taak, de methodiek der deute-riumanalyse in ons laboratorium in te voeren en bovengenoemdnbsp;werk in samenwerking met de groep van onderzoekers uit tenbsp;voeren, die zich in het organisch-chemisch laboratorium dernbsp;Rijksuniversiteit te Utrecht met het kankervraagstuk bezighoudt. Korte tijd nadat met de werkzaamheden een begin wasnbsp;gemaakt, kwam een publicatie van R. Schoenheimer^^),nbsp;S. Ratner en D. Rittenberg in onze handen, waaruitnbsp;bleek, dat deze auteurs de nieuwe analytische methode reedsnbsp;iets vroeger en onafhankelijk van H. H. U s s i n g voor de bepaling van het leucine-gehalte der prote�nen van het rattenorganisme hadden toegepast. Natuurlijk heeft de installatie vannbsp;de benoodigde toestellen � vooral onder de tegenwoordige omstandigheden � vrij veel tijd gekost. Voordat wij zelf met de

systematische bewerking van ons vraagstuk konden beginnen, verscheen een uitvoerige mededeeling van D. R i 11 e n b e r gnbsp;en G. L. Foster over de quantitatieve analyse door middelnbsp;van de �isotope dilution�. Daarmee aansluitend publiceerdennbsp;S. Graff^�),D. Rittenberg en G. L. Foster een onderzoek, waarbij de nieuwe methode met i5]Sf als indicator reedsnbsp;was toegepast op het ons interesseerende vraagstuk van denbsp;glutaminezuur-bepalingen in de hydrolysaten van tumoreiwit.nbsp;Tot onze verrassing hebben de genoemde auteurs in de zesnbsp;door hun onderzochte hydrolysaten naast gemiddeld 10 % 1-glu-taminezuur maximaal slechts 0,1 % d-vorm gevonden. Denbsp;auteurs hebben bij het uitvoeren der analysen het weefsel 12nbsp;uren gehydrolyseerd, een bepaalde hoeveelheid met gemerkt dl-glutaminezuur toegevoegd en daarna nog 3 uren gekookt. De isoleering van het glutaminezuur werd volgens denbsp;methode van Foreman uitgevoerd; de scheiding der hydro-chloriden van 1- en dl-glutaminezuur kon door gefractioneerdenbsp;kristallisatie uit het berekende volume 20-proc. zoutzuur wordennbsp;bereikt en wel op grond van de in ons laboratorium doornbsp;A. M. Akke r m a nbepaalde oplosbaarheid. Het massa-spectrometrische onderzoek van de uit de glutaminezuurprae-paraten in vrijheid gestelde stikstof leidde tot de genoemdenbsp;conclusies over het glutaminezuurgehalte van de onderzochtenbsp;tumorhydrolysaten.

Het resultaat van deze publicatie werd vooral in Amerika, maar ook elders, als definitieve weerlegging der onderzoekingennbsp;van K�glen Erxleben beschouwd. Inderdaad maakten denbsp;beide Amerikaansche publicaties in experimenteel opzicht, alsmede door de zorgvuldige foutendiscussie een zeer overtuigendenbsp;indruk. Onze werkgroep heeft zich natuurlijk bij alle aanvallennbsp;telkens weer de vraag gesteld, op welke wijze onze positievenbsp;uitkomsten tegenover deze negatieve resultaten zouden kunnennbsp;worden verklaard. Indien het om zuiver biologische proeven metnbsp;een groote spreiding in de resultaten te doen was, waarbij de

27) nbsp;nbsp;nbsp;F. K � g 1, H. Erxleben en A. M. Akkerman, Z. physiol.nbsp;Chem. 261, 151 (1939).

conclusies statistisch worden afgeleid, of indien tumoren van verschillende soort steeds een en hetzelfde lage gehalte aan d-vorm zouden leveren, zou het gevaar van een vergissing vanzelfsprekend groot zijn geweest. In werkelijkheid werd echter in onsnbsp;laboratorium gedurende drie jaren steeds weer zonder uitzondering gevonden, dat normale weefsels en myomen practisch alleennbsp;1-glutaminezuur leveren, dat niet metastaseerende enttumorennbsp;(b.v. Jens en-sarcoom) 6 a 8 %, chemotumoren (b.v. met ben-zopyreen verwekt) circa 13 % en sterk metastaseerende enttumoren (Brow n-P e a r c e) ongeveer 25 % d-glutaminezuurnbsp;geven, berekend op het in het geheel ge�soleerde glutaminezuur.nbsp;Indien werkelijk geen causaal verband zou bestaan, had in denbsp;loop van het jarenlange onderzoek beslist bij normaal weefselnbsp;en myomen nu eens vrij veel d-vorm, daarentegen bij de zeernbsp;maligne Brow n-P e a r c e-tumoren of bij levermetastasennbsp;soms uitsluitend de 1-vorm moeten optreden. Dergelijke afwijkingen in de resutaten werden echter nooit geconstateerd.

De negatieve uitkomsten van de Amerikaansche onderzoekers moesten natuurlijk de een of andere concrete oorzaak hebben.nbsp;Een nauwkeurige herhaling van dit onderzoek kwam reedsnbsp;daarom niet in aanmerking, omdat wij niet de beschikking hadden over het stikstof isotoop i^N. Onze taak moest dientengevolgenbsp;daarin bestaan, dat wij de tot nu toe verkregen ervaringennbsp;over het optreden van het onnatuurlijke glutaminezuur in denbsp;hydrolysaten van tumoren door een andere quantitatieve methode controleerden, welke eveneens onafhankelijk was van denbsp;opbrengsten bij de isoleering. Dit doel moest door gebruikmaking van deuterium als indicator te bereiken zijn.

HOOFDSTUK II.

DE DEUTERIUMANALYSE.

Sinds de ontdekking- van deuterium, het isotoop van waterstof, door Urey^�) en zijn medewerkers, zijn er diverse methoden ter bepaling van het gehalte van deuterium beschreven. De spectroscopische en massaspectroscopische methoden,nbsp;welke tot de ontdekking van deuterium leidden, zijn alleen historisch van belang; toen immers kon met semi-quantitatievenbsp;methoden worden volstaan, omdat het er slechts om ging, hetnbsp;al of niet aanwezig zijn van het isotoop aan te toonen.

Het gehalte aan het zware isotoop wordt meestal bij water vastgesteld, aangezien deze verbinding in tegenstelling met waterstof op eenvoudige wijze zeer zuiver te bereiden is. Het mee-rendeel der methoden is gebaseerd op het verschil in soortelijknbsp;gewicht van H2O (d^quot; = 0,9982) en DgO (d^quot; = 1,1054).

a) Wanneer we de beschikking hebben over een voldoende hoeveelheid water, kunnen we de dichtheid van het te onderzoeken watermonster het eenvoudigst met behulp van een pycnometer bepalen. Uit het dichtheidsverschil met gewoon waternbsp;As bij 25�, laat zich het gehalte aan zwaar water, uitgedruktnbsp;in de molfractie ND20 berekenen uit de formule:

Deze, oorspronkelijk door G. N. L e w i s '*�) en D. B. L u t e n gevonden betrekking heeft tengevolge van nauwkeuriger dicht-heidsbepalingen van D2O diverse wijzigingen ondergaan. Denbsp;onderzoekingen van L. G. Longswort h�), L. T r o n s t a d^^)

28) nbsp;nbsp;nbsp;H. C. U r e y, F. G. B r i c k w e d d e en G. M. M u r p h y, Phys.nbsp;Rev. 39, 164, 864 (1932) ; 40, 1 (1932).

29) nbsp;nbsp;nbsp;J. Am. Chem. Soc. 55, 5062 (1933), Phys. Rev. 45, 161 (1934).

en J. B r u n en E. Swift�*) hebben de formule van Lewis en L u t e n bovenstaande vorm gegeven.

b) nbsp;nbsp;nbsp;Volgens G. N. L e w i s ��) en R. T. M a c d o n a 1 d kunnen we de dichtheid bepalen met behulp van een glazen drijver.nbsp;Door de temperatuur�^) te meten, waarbij de drijver juistnbsp;zweeft, laat zich de densiteit van het water vaststellen. We kunnen ook de temperatuur fixeeren en de druk��) zoo kiezen, datnbsp;het glazen voorwerp zweeft. In beide gevallen gaat aan het gebruik een empirische ijking van de apparatuur vooraf. H.nbsp;Fromherz��), R. Sonderhoff en R. Thomas hebbennbsp;deze methodiek voor microbepalingen geschikt gemaakt. Doornbsp;zoowel druk als temperatuur te laten vari�eren, verkregen zijnbsp;een veel grootere analysemarge dan tot nog toe bij de zweef-methode mogelijk was.

c) nbsp;nbsp;nbsp;Een elegante manier om het gehalte van deuteriumoxydenbsp;in water te bepalen is de druppelmethode. Deze werkwijze werdnbsp;oorspronkelijk gebruikt door H. G. B a r b o u r�'') en W. F. H a-m i 11 o n voor de bepaling van het soortelijke gewicht vannbsp;serum en bloed. In principe komt deze methode hierop neer, datnbsp;men een klein druppeltje van het te onderzoeken vocht in eennbsp;met het vocht onmengbare vloeistof langzaam laat vallen. Denbsp;valsnelheid is een maat voor de dichtheid.

Het waren E. V o g t ��) en W. F. H a m i 11 o n eenerzijds en K. F e nger-E r iks en��), A. Krogh en H. H. Ussingnbsp;anderzijds, die deze werkmethode het eerst bij de deuterium-analyse toepasten. Belangrijke verbeteringen werden aangebracht door Schoenheimerquot;'�) en zijn medewerkers. Dezenbsp;methode, welke wij ook bij ons eigen werk gebruikten, zal naderhand uitvoerig worden besproken.

35) nbsp;nbsp;nbsp;Vgl. E. S. Gilfillan en M. P o 1 a n y i, Z. physik. Chemienbsp;A. 166, 254 (1933).

37) nbsp;nbsp;nbsp;Am. J. Physiol. 69, 654 (1924) en J. Biol. Chem. 69, 625 (1926).

39) nbsp;nbsp;nbsp;Biochem. J. 30, 1264 (1936) en Z. Elektrochemie 44, 8 (1938).

40) nbsp;nbsp;nbsp;A. S. Keston, D. Rittenberg en R. Schoenheimer,nbsp;J. Biol. Chem. 122, 227 (1937).

d) Het verschil in brekingsindex van gewoon water (n^quot; = 1,3330) en van zwaar water (n^quot; = 1,3284) verschaft onsnbsp;eveneens een middel om het gehalte aan deuteriumoxyde innbsp;water te bepalen. Meten we met een refractometer de brekingsindex van een D20-H20-mengsel, dan kunnen we evenals sub a)nbsp;met behulp van een formule van L e w i s ^�) en L u t e n uit hetnbsp;verschil An van de brekingsindices met gewoon water het gehalte aan D2O vaststellen.

Nd20 geeft wederom de molfractie DgO aan. e) Aangezien de brekingsindex zeer gevoelig is voor tem-peratuurvariaties, brengt het bepalen van de refractie-indexnbsp;moeilijkheden van practische aard met zich. Wil men de indexnbsp;bepalen met een nauwkeurigheid tot in de 6e decimaal, dannbsp;moet de temperatuur tot op 0,01� constant worden gehouden.nbsp;Zulks is voor een toestel als de refractometer niet eenvoudig.nbsp;Dit bezwaar wordt vermeden, indien we voor de bepaling vannbsp;de brekingsindex de interferometer gebruiken. Ook de inter-ferometrische methode ter bepaling van het gehalte aan zwaarnbsp;water werd door ons gebruikt en zal hierna worden behandeld.

f ) Verder kan men door het bepalen van het warmtegelei-dingsvermogen van een D2-H2-, respectievelijk D20-H20-meng-sel het gehalte aan deuterium vaststellen. F a r k a s '�^) maakte bij dergelijke bepalingen gebruik van een D2-H2-mengsel, terwijl Bonhoefferquot;*^) en Harteck^�) de overeenkomstigenbsp;analyse met een D20-H20-mengsel uitvoerden. Genoemde methode komt hierop neer, dat men van een draad, welke doornbsp;een constante electrische stroom wordt verhit en zich in eennbsp;verdund milieu van D2-H2-damp, respectievelijk DaO-HsO-dampnbsp;bevindt, de weerstand meet. Het warmtegeleidingsvermogennbsp;van het gasmengsel bepaalt de temperatuur en dientengevolgenbsp;de weerstand van de draad. De concentratie aan D2 respectie-

42) nbsp;nbsp;nbsp;O. Reitz en K. F. B o n h o e f f e r, Z. Physik. Chem.nbsp;89 (1929); A. 174, 424 (1935).

velijk D2O in het gasmengsel bepaalt op haar beurt weer het warmtegeleidingsvermogen. Aldus is door een eenvoudige weer-standsmeting het gehalte aan deuterium vast te stellen.

Alvorens nu over te gaan tot een uitvoerige bespreking van de door ons gebruikte analysemethoden, lijkt het'wenschelijk,nbsp;eerst die werkzaamheden te beschrijven, welke verricht moetennbsp;worden om een volkomen zuiver D20-H20-mengsel te verkrijgen. Wij hadden bij ons werk veel steun aan de voortreffelijkenbsp;publicaties, welke de school van Schoenheimer¹ ²quot;²) over denbsp;uitvoering van deuteriumanalysen heeft gebracht.

De verbranding van de deuterium bevattende verbinding wordt uitgevoerd in een kwartsbuis van 80 cm lengte en 2 cmnbsp;doorsnede. Deze is over een lengte van 50 cm gevuld met koper-oxyde in draadvorm. yoor de verwarming dient een electrischenbsp;oven, welke de buis op een temperatuur van 750� a 800� kannbsp;houden. De relatief groote hoeveelheid koperoxyde alsmede denbsp;hooge temperatuur garandeeren een goede verbranding van hetnbsp;te onderzoeken materiaal, hetgeen van essenti�el belang voornbsp;de analyse is. De verbranding geschiedt in een zuurstofatmos-feer. Ter verwijdering van waterstof en sporen organische verbindingen, leiden wij de zuurstof eerst door een kwartsbuis,nbsp;eveneens gevuld met koperoxyde en verhitten met een electrischenbsp;oven van hetzelfde formaat als de eigenlijke verbrandingsoven²).nbsp;Daarna passeert het gas twee met geconcentreerd zwavelzuurnbsp;gevulde waschflesschen en vervolgens een vochtvanger, welkenbsp;met vast koolzuur is gekoeld.

A. S. Keston, D. Rittenberg en R. Schoe nh e i m e r, J. Biol. Chem. 122, 227 (1937).

Er moge hier op worden gewezen, dat het moeilijk is, de zuurstof volkomen vrij te maken van waterstof en waterstofverbindingen. Ondanks onze voorzorgsmaatregelen blijkt een met normale snelheidnbsp;doorgeleide zuurstofstroom in 2 uren tijds 1 a 1,5 mg water te geven.nbsp;Aangezien wij een verbranding in ca. 25 minuten uitvoeren, veroorzaakt dit verschijnsel geen noemenswaardige fout in de analyse.

Het verbrandingswater wordt opgevangen in een U-vormige buis (A in fig. 1), welke met behulp van slijpstukken aan hetnbsp;einde van de kwartsbuis is bevestigd. A bevindt zich in eennbsp;Dewar-vat met vast koolzuur als koelmiddel. De verbrandingnbsp;van 120 mg glutaminezuur-HCl geschiedt in ca. 7 minuten,nbsp;waarna nog 18 a 20 minuten zuurstof wordt doorgeleid omnbsp;het verbrandingswater quantitatief in de U-buis te brengen ¹).

Na afloop van de verbranding vs^ordt de capillair, waarin de U-buis eindigt, dichtgesmolten en een stukje koperdraad vannbsp;V2 cm lengte aan het verbrandingswater toegevoegd. Dit heeftnbsp;ten doel het bij de oxydatie ontstane halogeen te binden. Wanneer het verbrandingswater ca. 20 uren met het koper in aan-

Ingeval bloed, urine of andere vloeistoffen van biologische aard worden geanalyseerd, destilleeren we eerst in vacuo het vocht af ennbsp;leiden het destillaat door de verbrandingsbuis.

raking is geweest, wordt � indien een stikstof houdende verbinding was verbrand � een overmaat BaCOs toegevoegd om het in dit geval gevormde salpeterzuur te neutraliseeren. Denbsp;verdere zuivering van het verbrandingswater geschiedt met behulp van de �destillation-train�, het in fig. 1 geschetste toestel.

Uit de U-buis A wordt het water overgedestilleerd naar buis B, waarin zich enkele mg chroomtrioxyde bevinden. Dit geschiedtnbsp;door A met water van ca. 30� te verwarmen en B met vast koolzuur te koelen. Het geheele toestel evacueeren we met behulpnbsp;van een oliepomp, verbonden aan F, tot een vacuum van 1 a 2nbsp;mm Hg. Op deze wijze destilleeren 60 a 70 mg water in 2 a 3nbsp;minuten over. Na afloop van deze destillatie wordt lucht toegelaten door G. Deze lucht moet volkomen zuiver zijn, aangezien denbsp;geringste onreinheid bij de analyse fouten kan veroorzaken. Omnbsp;de lucht te zuiveren, leiden we deze door twee waschflesschen,nbsp;gevuld met een alkalische oplossing van kaliumpermanganaatnbsp;resp. geconcentreerd zwavelzuur, vervolgens door twee buizen,nbsp;gevuld met noriet resp. silicagel. Wanneer de lucht is toegelaten,nbsp;vervangen we A door een glazen stop, smelten het ijs in B ennbsp;koken het water gedurende 3 minuten met het zich in B bevindende chroomtrioxyde. Hierna destilleeren we het water overnbsp;naar C. In C bevinden zich enkele mg kaliumpermanganaat ennbsp;kaliloog. Ook hiermede wordt ca. 4 minuten gekookt. Vervolgensnbsp;destilleeren we over naar D en van D naar E. Het in dit laatstenbsp;vat opgevangen water is gereed om te worden geanalyseerd.

Het zuiveren van het verbrandingswater is een der belangrijkste onderdeelen van de analyse. De verontreinigingen moeten met de uiterste zorg uit het water worden verwijderd. Hoe gevoelig beide analysemethoden zijn voor onzuiverheden, moge ge-illustreerd worden door het feit, dat enkele gamma�s HNO3 ofnbsp;KOH in 50 mg water de bepalingen merkbaar be�nvloeden.

Het destillatieapparaat is gemaakt van Jenaglas en voorzien van normaalslijpstukken No. 7; alleen aan vat E bevindt zichnbsp;een slijpstuk No. 15. Het reinigen van het glaswerk, o.a. ooknbsp;van de pipetten, voor het transport van het water, geschiedtnbsp;met chroomzuur. Na grondig spoelen met leidingwater en gedestilleerd water wordt gedurende 30 minuten gestoomd,nbsp;waarna het drogen plaats vindt in een gasoven bij ca. 150�.

Voor een uitvoerige beschrijving en gebruiksaanwijzing van de interferometer moge worden verwezen naar een publicatienbsp;van Adams�'quot;). In het kort kan van het toestel het volgendenbsp;worden gezegd. Wit licht van een 4-Volts gloeilampje wordtnbsp;door een optisch systeem in twee cohaerente lichtbundels gescheiden, welke � evenwijdig aan elkaar � twee zich naastnbsp;elkaar bevindende cuvetten doorloopen. Door een spiegel worden beide stralen teruggekaatst en passeeren nogmaals beidenbsp;cuvetten. Daarna komen beide lichtbundels tot interferentie ennbsp;geven een beeld, dat door een loupe kan worden geobserveerd.nbsp;Deze loupe wordt gevormd door een cylindrische lens, waardoor het interferentiebeeld alleen in horizontale richting wordtnbsp;vergroot. Op deze manier is het mogelijk een goede beeldver-grooting te verkrijgen, terwijl daarnaast het euvel van eennbsp;lichtzwak beeld wordt vermeden.

Bevinden zich in beide cuvetten vloeistoffen met verschillende brekingsindices, dan zal het verschil hiervan een differentie in de weglengte der beide lichtstralen veroorzaken, hetgeen zich manifesteert in een verschuiving van het interferentiebeeld. Deze verschuiving kan men waarnemen ten opzichte van een gefixeerd interferentiebeeld, dat gevormd wordt door tweenbsp;cohaerente lichtbundels, uitgaande van dezelfde lichtbron. Dezenbsp;bundels doorloopen dezelfde weg als beide bovengenoemde, metnbsp;dit verschil echtei�, dat ze beide cuvetten aan de onderkantnbsp;passeeren.

De vloeistof met de grootste brekingsindex verlengt de optische weg, waardoor een phaseverschuiving plaats vindt, welke een verschuiving van het interferentiebeeld veroorzaakt. De verandering in de optische weg tengevolge van het verschil innbsp;brekingsindex kan nu worden gecompenseerd met behulp vannbsp;een glazen plaatje, dat in beweging wordt gebracht door eennbsp;trommel, welke van een schaalverdeeling van 0 tot 3000 is voorzien. .Met behulp van deze compensator wordt het verschovennbsp;interferentiebeeld op zijn oude plaats teruggebracht.

Voor de uitvoering van de analyse brengen we in beide cu-45) Vgl. L. H. Adams, J. Am. Chem. Soc. 37, 1181 (1915).

vetten gewoon water en bepalen die stand van de trommel, waarbij de twee interferentiebeelden met elkaar tot dekking zijnnbsp;gebracht. Dit is de nulstand van de interferometer. Hiernanbsp;brengen we in ��n der beide cuvetten h�t te analyseeren D2O-HaO-mengsel. Het nu verschoven interferentiebeeld wordt metnbsp;de compensator op zijn oude plaats teruggebracht en de standnbsp;van de trommel afgelezen. Dit aantal schaaldeelen wordt verminderd met het aantal schaaldeelen van de nulstand. Het aldus verkregen getal is een maat voor het verschil in brekingsindex tusschen het DgO-HaO-mengsel en gewoon water. Hetnbsp;geeft een direct meetresultaat weer, dat met behulp van eennbsp;ijkcurve in een analytische waarde, uitgedrukt in gewichtspro-centen D2O, kan worden omgezet. (Zie fig. 2).

Het aflezen van de schaaldeelen op de trommel kan reeds 2 a 3 minuten na het vullen der cuvetten plaats vinden. Wanneernbsp;het temperatuurevenwicht nog niet bereikt is, blijkt dit duidelijk uit de scheeve stand der interferentiestreepjes. Om dergelijke stoornissen te vermijden bewaren wij de interferometer,nbsp;het voor de trog bestemde water, de ijkoplossingen enz. in ��nnbsp;vertrek.

Bij de interferometrische bepaling dient men rekening te houden met een optisch verschijnsel dat in 1912 door M a r c werd ontdekt. Teneinde dit verschijnsel duidelijk te maken,nbsp;moeten we het interferentiebeeld nauwkeuriger beschrijven. Het

beeld, ontstaan door interferentie der beide lichtstralen, bestaat uit een centrale witte streep en daarnaast twee zwarte streepjes ; naar links en rechts komen dan beurtelings witte en zwartenbsp;streepjes voor, welke meer en meer wazig worden. De dispersie

veroorzaakt, dat de strepen aan weerszijden rood en blauw zijn gekleurd. Bij het tot dekking brengen van het mobiele en hetnbsp;gefixeerde beeld zorgen we er voor, dat beide middelste zwartenbsp;streepjes boven elkaar komen te staan. Het genoemde verschijnsel bestaat nu hieruit, dat tengevolge van de optische dispersienbsp;van oplossing en HgO eenerzijds en glas en lucht anderzijds, innbsp;het mobiele interferentieb�eld een interne opschuiving vannbsp;streepjes plaats heeft, waardoor het juiste instellen wel eensnbsp;wordt bemoeilijkt. Dit verschuiven der streepjes geschiedt regelmatig om de 200 a 300 schaaldeelen. Het gevolg daarvan is, datnbsp;gedeelten van de ijkcurve parallel aan zichzelf worden verschoven. (Zie fig. 2).

Bij het bepalen van relatief lage D20-concentraties, zooals dat bij ons het geval is, vermijdt men het nadeelige gevolg vannbsp;bovengenoemd verschijnsel, door bij het uitvoeren van de analyse telkens twee ijkoplossingen te meten. De concentraties vannbsp;deze oplossingen zijn respectievelijk hooger en lager dan dienbsp;van het te onderzoeken monster en mogen, in schaaldeelen vannbsp;de interferometer uitgedrukt, niet meer dan 200 van elkaarnbsp;verwijderd liggen. Wil men groote DgO-concentraties interfero-metrisch bepalen, dan verdient het aanbeveling de interferometer te ijken volgens de voorschriften van R. H. Grist*�'),nbsp;G. M. M u r p h y en H. C. U r e y.

Voor onze metingen gebruikten wij een Zeis s-waterinterferometer met cuvetten ter lengte van 40 mm. Zooals reeds werd opgemerkt, is een der groote voordeelen van de interferometer, dat we de temperatuurco�fficient van de brekingsindexnbsp;hebben uitgeschakeld. Een ander voordeel is, dat men door eennbsp;juiste keuze van de lengte der cuvetten het toestel een passendnbsp;meetbereik geeft. Zooals uit de ijkcurve en de bijgaande tabelnbsp;blijkt, correspondeert 0,01 gew. % D2O met ongeveer 2 schaaldeelen op de trommel. Nu geeft 1 schaaldeel de foutengrensnbsp;aan, waarmede kan worden ingesteld. We zien dus, dat we doornbsp;van een 40 mm cuvet gebruik te maken de voor ons doel ver-eischte nauwkeurigheid bereiken. Met een cuvet van 80 mmnbsp;lengte wordt weliswaar de nauwkeurigheid verdubbeld, maarnbsp;eveneens de benoodigde hoeveelheid water.

De afbeelding laat duidelijk de valbuis zien, welke zich in de binnenste tank bevindt. Rechts boven is de electro-thermo-regulateur bevestigd, terwijl ongeveer in het midden de Beekman n-thermometer is aan gebracht.

In een glazen buis ter lengte van 55 cm en met een diameter van 1 cm bevindt zich o-fluoortoluol, dat als het met waternbsp;onmengbare valmedium dienst doet. Op de buis bevinden zich opnbsp;afstanden van 9 en 24 cm van de bodem ge�tste ringen; over denbsp;afstand van deze ringen wordt de snelheid van het vallendenbsp;druppeltje gemeten. Op de bodem der buis bevindt zich Na2S04nbsp;om het o-fluoortoluol droog te houden. De buis is door middelnbsp;van een staaf aan het plafond van de kamer bevestigd, om denbsp;invloed van de trillingen, welke door de synchroonmotor wordennbsp;veroorzaakt, zooveel mogelijk te elimineeren. De valbuis moetnbsp;volkomen loodrecht worden opgehangen.

Voor een goede analyse is het noodzakelijk, dat tijdens het experiment de temperatuur van het o-fluoortoluol tot op 0,001�nbsp;constant wordt gehouden. Dit bereikten wij met een thermostaat¹) van de volgende constructie. (Zie ook de afbeelding opnbsp;pag. 23). In een groote tank van 48 cm lengte, 48 cm breedtenbsp;en 80 cm hoogte, waarvan de wanden met isolatiemateriaal zijnnbsp;voorzien, bevindt zich een kleinere tank (afmetingen resp. 18,nbsp;18 en 62 cm). In de wanden zijn strooken glas aangebracht, omnbsp;observatie mogelijk te maken. Met behulp van een electrischenbsp;thermoregulateur laat zich de temperatuur in de groote tanknbsp;tot op 0,01� regelen. De binnentank vertoont schommelingen,nbsp;welke de 0,001� niet overschrijden, hetgeen we met een Beekman n-thermometer controleerden. In beide tanks bevindennbsp;zich roerders, aangedreven door een synchroonmotor.

Voor het uitvoeren van de analyse brengen we het gereinigde D20-H20-mengsel in een pipet'��), welke aan de thermostaat is bevestigd. Met behulp van deze pipet kunnen druppeltjes worden verkregen met een constant volume van 6,3 mm�. De druppeltjes worden op de volgende manier in de valbuis gelanceerd. Het uiteinde van de pipet wordt zorgvuldig gereinigd

De thermostaat met toebehooren werd geleverd door de firma Inventum te Bilthoven.

48) In gebruik bij de microtitratie-apparatuur van Linderstr^m-Lang, Chem. Weekblad 36, 4 (1939).

en juist tot onder het oppervlak van het o-fluoortoluol gebracht. Door een zeker aantal omwentelingen van de metalen stempel wordt een druppel water uit de pipet geperst. Door deze ietsnbsp;op te heffen, waardoor het uiteinde van de pipet boven hetnbsp;oppervlak van het o-fluoortoluol komt, laat het druppeltje losnbsp;en valt langzaam naar beneden. Met een chronometer metennbsp;we de tijd T, welke het druppeltje noodig heeft om van de eenenbsp;op de buis aangebrachte ring tot de andere te komen. De valsnelheid, waarvoor we 1000/T nemen, is nu een maat voor hetnbsp;DgO-gehalte van het geanalyseerde water.

Bij iedere analyse bepalen we de valsnelheden van twee ijkoplossingen, wier D20-concentraties respectievelijk hoogernbsp;en lager zijn, dan van het te onderzoeken monster. De redenen,nbsp;waarom wij dit doen, zijn de volgende:

1) nbsp;nbsp;nbsp;De constructie van de thermostaat garandeert een constante temperatuur gedurende enkele uren. Over lange periodennbsp;echter varieert de temperatuur van de thermostaat met denbsp;kamertemperatuur. Aangezien de valsnelheid sterk afhankelijknbsp;is van de temperatuur, schakelen we de invloed hiervan uit,nbsp;door steeds controle toe te passen met behulp van de ijkoplossingen.

2) nbsp;nbsp;nbsp;Zooals reeds werd opgemerkt, bevindt zich in de valbuisnbsp;Na2S04 op de bodem, om het o-fluoortoluol droog te houden.nbsp;Dit verhindert echter niet, dat in het vochtgehalte hiervan tochnbsp;variaties kunnen optreden, welke eveneens invloed op de valsnelheid uitoefenen.

Hoewel de ijkcurve (zie fig. 3) niet lineair is, mogen we het tusschen twee punten liggende deel van de curve als een rechtenbsp;beschouwen.

Uit de drie experimenteele gegevens, nl. de valsnelheden van de beide ijkoplossingen en van het onbekende mengsel, laat zichnbsp;door interpolatie het gezochte DaO-gehalte berekenen.

De temperatuur van de thermostaat kiezen we zoodanig, dat een druppel H2O voor het afleggen van de ca. 15 cm bedragendenbsp;afstand ongeveer 180 seconden noodig heeft. Voor de ijkoplossingen vinden we de valtijden en valsnelheden, zooals deze innbsp;tabel III worden vermeld.

snelheid te meten. De afwijkingen in de snelheden zijn zoodanig, dat met een relatieve fout van 1 % het D20-gehalte kan wordennbsp;bepaald. Voor de druppelmethode is ca. 0,05 cm� water noodig.

Beschikken we over een voldoende hoeveelheid water, dan kunnen we, beide bovengeschetste methoden gebruikend, met

De foutengrens geeft aan, binnen welke tijdmarge de valtijden liggen, wanneer we 4 a 5 druppels van een bepaalde ijkoplossing innbsp;successie laten vallen.

��n analyse volstaan, mits de beide uitkomsten niet meer dan 0,02 gew. % D2O verschillen. Voor het uitvoeren van de analysenbsp;worden eerst de 0,4 cm� water in de interferometer gebrachtnbsp;en het D20-gehalte bepaald. Daarna zuigen we uit de cuvetnbsp;0,04 a 0,05 cm� water in de pipet op, om vervolgens met denbsp;druppelmethode het DgO-gehalte te meten. Geven beide, vannbsp;elkaar onafhankelijke methoden, dezelfde uitkomsten, dan is ditnbsp;een bewijs voor de zuiverheid van het geanalyseerde water. Hetnbsp;groote voordeel van de door Schoenheimer beschrevennbsp;methodiek is, dat twee verschillende physische grootheden vannbsp;het water als indicator voor het D20-gehalte worden gebruikt,nbsp;nl. de brekingsindex en het soortelijke gewicht. Nu is het specifieke gewicht van zwaar water grooter dan van gewoon water,nbsp;terwijl optisch gesproken, laatstgenoemde stof dichter is dannbsp;DgO. De meest voorkomende verontreinigingen van het te ana-lyseeren water (bv. HNO3) veroorzaken een grootere dichtheid,nbsp;terwijl de brekingsindex naar de kant van het H2O verschuift,nbsp;m.a.w. de geringste onzuiverheid doet de uitkomsten sterknbsp;divergeeren.

I Gebruiken we slechts ��n der methoden, dan is het van belang het te onderzoeken water na de reeds beschreven 4-voudigenbsp;destillatie nog eens aan een 2-Voudige herdestillatie (vannbsp;KMn04 en KOH af) te onderwerpen. Het 4 en het 6 keer gedestilleerde watermonster moet dan bij de bepaling gelijke uitkomsten geven.

Hebben de te analyseeren stoffen een relatief hoog deuterium-gehalte, b.v. 10 %, dan wordt het praeparaat v��r de verbranding verdund met een bekende hoeveelheid der isotoop vrije substantie. Dit kan uiteraard geschieden bij zuivere stoffen.nbsp;Bij de uit de hydrolysaten verkregen praeparaten hebben wijnbsp;er de voorkeur aan gegeven het verbrandingswater op de gebruikelijke wijze te verdunnen.

Het komt vaak voor, dat er voor een analyse slechts weinig materiaal ter beschikking staat. Gebruiken we het destillatie-apparaat, zooals fig. 1 weergeeft, dan wordt het zuivere D2O�nbsp;HaO-mengsel eerst met behulp van een pipet uit E overgebrachtnbsp;naar een klein reageerbuisje, om daarna in de pipet te wordennbsp;opgezogen. Om verliezen bij het transport van het water tenbsp;vermijden, kan het in fig. 4 geschetste toestel worden gebruikt.

dat in de plaats van E (fig. 1) komt. Hierdoor zijn we in staat, om een analyse uit te voeren met het verbrandingswater verkregen uit 70 a 80 mg glutaminezuur-HCl. Het ^ai duidelijknbsp;zijn, dat in dit geval slechts de druppelmethode kan wordennbsp;gebruikt, als zijnde de methode, welke de geringste hoeveelheidnbsp;water vereischt. Uiteraard is in dergelijke gevallen ook geennbsp;duplobepaling na herdestillatie mogelijk, zoodat voor de controlenbsp;het herhalen van de geheele analyse noodzakelijk is.

Opgemerkt moge worden, dat alle gewone waterstofverbindin-gen 0,02 at. % deuterium bevatten. Met onze analysen bepalen we dus steeds de overmaat van het aanwezige isotoop. Geziennbsp;het geringe bedrag aan natuurlijk voorkomend isotoop, behoeven wij bij onze calculatie daarmede geen rekening te houden.

leidingwater kookten we gedurende eenige uren in een rond-bodem, voorzien van een terugvloeikoeler; daarna destilleerden we in een glasapparatuur het water af. Aangezien bij het des-tilleeren van een alkalische vloeistof vaak sporen alkali meenbsp;overgaan, werd deze bewerking herhaald. Voor de derde keernbsp;destilleerden we het water in een vacuum van � 18 mm Hgnbsp;over. Tenslotte werd het water nog in een speciaal toestel vannbsp;Jenaglas bij 2 a 3 mm gedestilleerd. Door verwarming tot 30�nbsp;destilleerde het water zonder kookverschijnselen over in eennbsp;vat, dat met vast koolzuur werd gekoeld. Het aldus verkregennbsp;water bleek volgens de interferometer en volgens de druppel-methode volkomen identiek te zijn met het gezuiverde verbran-dingswater van glutaminezuur. Ook gewoon leidingwater gafnbsp;na destillatie in het apparaat van fig. 1 geen verschil te ziennbsp;met het water, verkregen op de hierboven beschreven wijze. Verder overtuigden wij ons, dat een vijfde destillatie geen verandering in de zuiverheid van het water teweegbracht. Herhaaldenbsp;malen bereidden we aldus water voor de ijkoplossingen. Steedsnbsp;bleek het vierde destillaat gelijkwaardig te zijn met het waternbsp;van een vorige bereiding.

Het zware water ¹) destilleerden we ��n maal over onder dezelfde omstandigheden als de vierde destillatie van gewoonnbsp;water plaats vond. Uit het aldus gezuiverde H2O en D2O maakten we door inwegen een D20-oplossing van ca. 3 gew. % D2O.nbsp;Hieruit bereidden we door verdunning de andere ijkoplossingen. Een voorbeeld moge een en ander verduidelijken.

1,7497 g zwaar water (99,48% D2O) werd gemengd met 51,1972 g H2O. Bij het inwegen is het niet noodzakelijk denbsp;gewichten op het gewicht in vacuo te corrigeeren. Het verschilnbsp;in soortelijk gewicht tusschen H2O en D2O is zoo klein, datnbsp;door genoemde correctie geen invloed op de percentages D2Onbsp;der ijkoplossingen wordt uitgeoefend. Het zware water bevatte

Het zware water, dat wij gebruikten, was afkomstig van de Nor�k Hydro-Elektrisk Kvaelstofaktieselskab en werd ons door denbsp;I. G. Farbenindustrie A. G. Werk Elberfeld welwillend ter beschikking gesteld. Het Dg O gehalte was berekend met behulp van de waarde voor het soortelijke gewicht van 100-proc. DgO, waarvoor d^quot;nbsp;r= 1,10541 (zie Trans. Faraday Soc. 34, 769 (1938)). Het bevattenbsp;99,48 gew. % DgO (d;quot; = 1,10485).

99,48 gew. %, d.i. 1,7406 g D2O. Het gewichtspercentage D2O van de aldus bereidde ijkoplossing No. 8 bedroeg:

Uit deze oplossing werden door verdunning met H2O een serie ijkoplossingen met afnemende D20-concentratie bereid.

Het is van belang op te merken, dat de uitkomsten van de deuteriumaPalyse voor onze doeleinden, nl. het bepalen van hetnbsp;gehalte aan glutaminezuur in hydrolysaten, wat betreft de absolute grootte, niet juist behoeven te zijn. Zou bv. het zwarenbsp;water van de Norsk Hydro 97,0 gew. % D2O bevatten innbsp;plaats van de door ons in rekening gebrachte 99,48 %, dan zounbsp;dat in ons geval niet de geringste invloed hebben. Immers allenbsp;deuteriumanalysen zouden dan een relatief gelijke afwijkingnbsp;vertoonen, welke tengevolge van het voorkomen van de breuknbsp;Co/Cl in de op pag. 44 genoemde formule niet het minste effectnbsp;op de uitkomsten der weefselanalysen zouden hebben.

In dit verband is ook nog een andere kwestie te discussieeren. Het electrolytisch bereide D2O bevat naast ca. 100 % van hetnbsp;zware isotoop van waterstof ook nog meer dan het normale ge-'nbsp;halte aan het zuurstofisotoop ^*0. Nu worden de gedeutereerdenbsp;verbindingen verbrand met zuurstof van de normale isotopensamenstelling, zoodat het verbrandingswater uit H2O en D2Onbsp;bestaat, waarvan de zuurstof de normale isotopenverhoudingnbsp;heeft. Moet nu bij de vergelijking van dit verbrandingswaternbsp;en de ijkoplossingen een correctie worden aangebracht? Volgensnbsp;een publicatie van K. W i r t z is het soortelijke gewicht vannbsp;electrolytisch bereid 100-proc. D2O = 1,10737 � 0,00001nbsp;en van D2O met de normale verhouding van de zuurstofisotopennbsp;= 1,10726 =t 0,00001. Nu correspondeert een dichtheids-verschil van 1 in de 6de decimaal met 0,001 gew. % DgO, 1 innbsp;de 5de decimaal ongeveer met 0,01 gew. % D2O. Bij 100-proc.nbsp;D2O is het verschil in beide genoemde �D20-vari�teiten� 1 innbsp;de 4de decimaal. Onze ijkoplossingen zijn bereid uit electrolytisch verkregen D2O met gewoon water en bevatten maximaalnbsp;3 gew. fo D2O. Het verschil in dichtheid wordt dus ca. 30 maal

zoo klein, d.w.Z. 3 in de 6de decimaal. Dit komt overeen met 0,003 gew. fo DgO, hetgeen binnen de proeffout valt.

Aangezien wij de verschillende ijkoplossingen voor de bepalingen liefst zoo lang mogelijk wilden gebruiken, moesten wij controleeren of ook na maanden bewaren door de invloed vannbsp;de glaswand resp. de bestanddeelen van de lucht of door toevallige verontreinigingen een, zij het ook lichte, veranderingnbsp;optrad. Te dien einde werden de ijkoplossingen eenige keerennbsp;per maand overgedestilleerd. Op een enkele uitzondering na,nbsp;bleken ze echter volgens de uitkomsten van de interferometernbsp;en van de druppelmethode zelfs na een jaar volkomen goed tenbsp;zijn. De oplossingen werden in een exsiccator in Jena-stop-fleschjes van 50 cm� bewaard.

Het reinigen van het gebruikte glaswerk geschiedde met behulp van kokend salpeterzuur, gevolgd door spoelen met gewoon en gedestilleerd water, waarna nog gedurende 30 minuten werdnbsp;gestoomd.

Het in de valbuis gebruikte o-fluoortoluol bereidden wij analoog aan het door G. B a 1 z en G. S c h i e m a n n bij hetnbsp;para-derivaat beschreven reactie overeenkomstig het volgendenbsp;schema:

Bij de reiniging van het ruwe o-fluoortoluol verdient het aanbeveling om in plaats van water een oplossing van NaaSO^nbsp;te gebruiken, aangezien bij gebruikmaking van water als wasch-middel een moeilijk te scheiden mengsel van o-fluoortoluol ennbsp;water ontstaat tengevolge van het geringe verschil in soortelijknbsp;gewicht der beide genoemde stoffen. Het o-fluoortoluol werd

gedroogd op Na2S04 en bij ca. 80 mm overgedestilleerd. Kookpunt 50� bij 78 mm, terwijl de opbrengst berekend op het o-toluidine, 60 fo bedroeg.

Naderhand werd ons een hoeveelheid o-fluoortoluol welwillend ter beschikking gesteld door de I. G. Farbenindustrie A. G. Werk Elberfeld.

Voor de bereiding van deuterium bevattende verbindingen staan in beginsel twee wegen open, waarvan wij eerst de uit-wisselingsmethode willen bespreken. Hieronder verstaan wenbsp;het uitwisselen van in de verbinding voorkomende protiuma-tomen tegen deuteriumatomen onder invloed van chemischenbsp;agentia en katalysatoren. De hechtheid, waarmee waterstofatomen aan verschillende elementen zijn gebonden, toont uiteraard groote variaties; deze zijn echter ook bij de C�H-bindin-gen te constateeren al naar gelang van de overige substituentennbsp;in de nabijheid. Wij kunnen in eerste instantie onderscheidnbsp;maken tusschen labiel en stabiel gebonden waterstofatomen.nbsp;Van de eerstgenoemde waters tof bindingen noemen we die vannbsp;het type -OH, -COOH, -NH2, -C=CH, welke met deuteriumatomen vrijwel momentaan uitwisselen. Ook waterstofatomennbsp;op de zgn. �-plaats van verbindingen met een carbonylgroepnbsp;(�C�CHj toonen vrij snelle uitwisseling, kennelijk tengevolge

II I

van de keto-enol-tautomerie. Tot het tweede type, de stabiele waterstofbindingen behooren in het algemeen de alifatische ennbsp;aromatische C�H-bindingen. Steeds echter kunnen naburigenbsp;activeerende groepen, zooals carboxyl-, nitrogroepen enz. eennbsp;labiliseerende invloed uitoefenen. Daardoor ontstaan de zgn.nbsp;semilabiele C�H-bindingen �^). Deze binding is daardoor gekenmerkt, dat het waterstofatoom eerst na kortere of langerenbsp;tijd bij verhitting in zuur of alkalisch milieu uitwisselt. Het zijnnbsp;dan ook vooral deze waterstofatomen, welke bij katalytischenbsp;uitwisseling door deuteriumatomen worden vervangen. Vanzelfsprekend beteekent het vermogen tot uitwisseling van

H-atomen tegen D-atomen, dat ook omgekeerd de overeenkomstige deuterioverbinding onder analoge omstandigheden tot protiumverbindingen kunnen worden omgezet.

0,5 g PtOa-HgO werd in 4 cm^ DgO met electrolytisch bereid deuteriumgas gereduceerd, de katalysator met de bovenstaandenbsp;vloeistof in een Cariusbuis gebracht en na toevoeging van 3 gnbsp;1- resp. d-glutaminezuur (in het vervolg met GK aangeduid)nbsp;en 3 cm� geconcentreerd zoutzuur dichtgesmolten. Daarna hebben we de buis gedurende 9 dagen bij 95� geschud. Voor denbsp;isoleering werd de lichtgele oplossing na affiltreeren van hetnbsp;platina in vacuo ingedampt en ter verwijdering van het labielnbsp;gebonden deuterium nog 3 maal � telkens na toevoeging vannbsp;20 cm� water � afgedampt. Het residu hebben wij in 25 cm�nbsp;water opgelost en de oplossing met geconcentreerde ammonianbsp;gen�utraliseerd (congo). Het afgescheiden vrije GZ werd innbsp;30 cm� heet water opgelost en na toevoeging van hetzelfdenbsp;volume warme alcohol overnacht in de koelkast bewaard. Opbrengst 1-GZ 2,56 g; spec, draaiing Md � 31,7 (5-proc.nbsp;oplossing in 9-proc. zoutzuur). Deuteriumgehalte 6,50 at. %.nbsp;Opbrengst d-GZ 2,30 g; spec, draaiing [a]D = � 31,6. Deuteriumgehalte 5,66 at. %.

Het aldus bereide GZ heeft de eigenschap, dat het zijn deuterium door koken met bv. zoutzuur weer verliest. Dit wordt door de volgende proef gedemonstreerd. Wij kookten 600 mgnbsp;d-GZ.HCl (5,10 at. % D) opgelost in 12,5 cm� 20-proc. zoutzuur gedurende 12 uren, waarna wij uit een derde deel van denbsp;oplossing het GZ.HCl isoleerden. Dit bleek 2,30 at. % D te bevatten. Vervolgens werd het resteerende deel van de oplossingnbsp;drooggedampt en wederom gedurende 8 uren met ca. 8 cm� zoutzuur verhit. Het uit de helft van deze oplossing ge�soleerdenbsp;GZ.HCl bevatte nog maar 1,38 at. % D. Het laatste gedeeltenbsp;der oplossing, werd gedurende 40 uren gekookt, waarna hetnbsp;GZ.HCl nog slechts een deuteriumgehalte van 0,25 at. % had.

Terwijl wij bij de uitwisselingsreacties van de overeenkomstige protiumverbinding moeten uitgaan, hebben we bij de

tweede weg voor de bereiding van deuteriumverbindingen een synthese uit andere stoffen uit te voeren, waar bv. bij eennbsp;hydrolyse van D2O en bij een reductie van D2 gebruik wordtnbsp;gemaakt.

Aangezien bij de bereiding van gedeutereerd GZ volgens de uitwisselingsmethode practisch geen racemisatie optreedt, is hetnbsp;langs deze weg mogelijk de gedeutereerde antipoden van GZnbsp;in handen te krijgen. Zooals boven werd aangetoond, heeft hetnbsp;door uitwisseling verkregen GZ echter het nadeel, dat het bijnbsp;koken met zoutzuur deuterium verliest. Het kon daarom bijnbsp;de proteine-analysen eerst na de hydrolyse worden toegevoegd.nbsp;Bij de isoleering van GZ uit hydrolysaten van weefsels moetnbsp;o.a. herhaaldelijk uit zoutzuur worden omgekristalliseerd; hetnbsp;was niet buitengesloten, dat hierbij deuterium verloren zounbsp;gaan, zoodat een te hoog gehalte aan GZ zou worden verkregen.nbsp;Hoewel de resultaten van onze eerste serie analysen volstrektnbsp;niet in die richting wezen, trachtten wij toch het genoemde gevaar door bereiding van GZ met stabiel gebonden deuterium-atomen uit te schakelen.

Aangezien volgens de ervaringen van de literatuur de op de a-plaats van de aminozuren gebonden waterstof als stabiel magnbsp;gelden, hebben wij in de eerste plaats de deutereering van hetnbsp;oxim van a-ketoglutaarzuur onderzocht. Deze verbinding, welkenbsp;we volgens het voorschrift van C. R. Harington�^) ennbsp;S. S. R a n d a 11 verkregen, hebben wij in ijsazijnoplossing metnbsp;deuteriumgas en platina gereduceerd. Om het bij de reactienbsp;ontstane water weg te nemen, voegden wij aan het reactiemeng-sel Na2S04 toe. Het gevormde GZ bleek slechts 1 at. % deuterium te bevatten, terwijl theoretisch 11,1 at. % te verwachtennbsp;was. Dit lage deuterium-gehalte moet kennelijk aldus wordennbsp;verklaard, dat er een uitwisseling plaats had tusschlsn hetnbsp;deuteriumgas en het labiel gebonden waterstofatoom in denbsp;carboxylgroep van de ijsazijn. Volgens de vergelijkingnbsp;D2 2 CH3COOH :;i!: H2 2 CH3COOD wordt het deuteriumgas met de lichte waterstof gemengd. Dit euvelnbsp;kon gedeeltelijk worden vermeden door als oplosmiddel ijsazijn te gebruiken, dat 80 a 90 % CH3COOD bevatte.

Het op deze wijze bereide GZ bevatte 6 at. % deuterium, hetwelk inderdaad stabiel was gebonden. Het nadeel vannbsp;deze bereidingsmethode was echter, dat de hydreering met deuterium onder de laatstgenoemde omstandigheden omstreeks drienbsp;weken duurde. Terwijl wij nog met de verdere bestudeeringnbsp;van deze reactie bezig waren, bereikten ons twee korte mede-deelingen uit het laboratorium van Schoenheimer,nbsp;volgens welke door katalytische hydreering van a-ketoglutaar-zuur met deuteriumgas in tegenwoordigheid van ammoniak �nbsp;dus volgens de reactie van Knoop � dl-GZ met stabiel gebondennbsp;D-atomen kon worden bereid.'Aangezien deze korte publicatiesnbsp;geen nadere experimenteele details bevatten, was het niet mogelijk, precies dezelfde werkwijze te volgen. Wij verkregen bij denbsp;in gewoon water met deuteriumgas en palladium uitgevoerdenbsp;reductie dl-GZ met 10,5 at. % D. De Amerikaansche auteursnbsp;bereikten onder hun omstandigheden een deuteriumgehalte vannbsp;15,4 at. %. Wij zelf konden eerst na toevoeging van D2O aan hetnbsp;reactiemengsel tot een even hoog D-gehalte komen. Een andernbsp;verschil is bij het koken van de praeparaten met geconcentreerdnbsp;zoutzuur te constateeren. Hierbij vonden de Amerikaanschenbsp;auteurs ook na een proef duur van vijf dagen geen verliesnbsp;aan D, terwijl bij ons het D-gehalte in de eerste twaalf uur b.v.nbsp;van 12,3 op 11,6 at. % daalde, bij verder verhitten echter constant bleef. Blijkbaar heeft onder de omstandigheden van onzenbsp;proeven ook de y-plaats � welke volgens de ervaringen van denbsp;Amerikaansche onderzoekers voor een semi-labiele bindingnbsp;alleen in aanmerking komt � door uitwisseling een weinig Dnbsp;opgenomen. Vermoedelijk zijn deze kleine verschillen door ietsnbsp;afwijkende eigenschappen van de katalysatoren te verklaren.

De bereiding van het deuterio-GZ volgens de synthese van Knoop werd op ons laboratorium uitgewerkt door Dr. A. J.nbsp;Klein�^); onder zijn leiding werden later de relatief grootenbsp;hoeveelheden, welke wij voor ons onderzoek benoodigden in hetnbsp;practicum gesynthetiseerd. Gaarne betuig ik hem ook op deze

53) nbsp;nbsp;nbsp;S. Ratner, D. Rittenberg en R. Schoenheimer,nbsp;J. Biol. Chem. 135, 357 (1940). D. Rittenberg, S. Ratner ennbsp;H. D. H oberman. J. Am. Chem. Soc. 62, 2249 (1940).

plaats mijn welg-emeende dank voor de belangrijke steun, op deze �wijze ondervonden.

10,22 g a-keto-glutaarzuur werden met 2,45 g palladiumoxyde, 122,5 cm'� H2O en 32,9 cm� 25-proc. ammonia gedurende twaalfnbsp;uren in een deuteriumatmosfeer geschud. Hierbij werden �nbsp;1800 cm� deuterium opgenomen. Het palladium filtreerden wijnbsp;na afloop van de reactie af, waarna wij de oplossing in vacuonbsp;droogdampten. Het residu werd opgenomen in een hoeveelheidnbsp;water, zoodat de verkregen, eenigszins troebele oplossing eennbsp;volume had van 25 cm�. Deze oplossing werd vervolgens geneutraliseerd met 37-proc. zoutzuur op congopapier, waarbij hetnbsp;GZ uitkristalliseerde.

Het zuiveren geschiedde door eenige malen omkristalliseeren van het hydrochloride in 20-proc. zoutzuur. Opbrengst 7 g. Hetnbsp;deuteriumgehalte van het vrije GZ bedroeg 10,47 at. %.

Zooals reeds werd opgemerkt, is het voor onze doeleinden noodzakelijk, dat het gedeutereerde GZ slechts stabiel gebondennbsp;deuterium bevat. Wij hebben daarom het volgens de reactienbsp;van Knoop bereide GZ v��r het gebruik bij de analyse eerstnbsp;gedurende 20 uren met 20-proc. zoutzuur gekookt. Daarbijnbsp;worden de semilabiel gebonden deuteriumatomen door waterstofatomen vervangen. Aanvankelijk voerden wij de tumoranalysennbsp;aldus uit, dat wij het gedeutereerde dl-GZ aan het hydrolysaatnbsp;toevoegden. Op deze wijze bepaalden we in ��n hydrolysaatnbsp;tegelijk het gehalte aan 1- en d-GZ. Om later te vermeldennbsp;redenen zijn wij ertoe overgegaan, in plaats van de dl-verbin-ding de met deuterium gemerkte antipoden toe te passen. Dezenbsp;kunnen op zeer gemakkelijke wijze worden verkregen door hetnbsp;hydrochloride van het �zware� dl-GZ met een gelijke hoeveelheid van het hydrochloride der �lichte� 1- of d-vorm te mengennbsp;en uit de berekende hoeveelheid 20-proc. zoutzuur om te kris-talliseeren. Op deze wijze scheidt zich de in overmaat aanwezige antipode af; zijn deuteriumgehalte is natuurlijk slechtsnbsp;half zoo groot als dat van het uitgangsmateriaal.

bevatte na 20 uren koken met zoutzuur en twee maal omkristal-liseeren 9,5 at. % D- Bij 40 g van dit praeparaat werden 18,1 g 1-GZ.HCl gevoegd en uit 800 cm� 20-proc. zoutzuur omgekristalliseerd. Het verkregen kristallisaat, 27,2 g, hebben we ternbsp;verwijdering van nog aanwezig dl-GZ.HCl omgekristalliseerd,nbsp;waarna 18,1 g 1-GZ.HCl overbleef. Spec, draaiing [ajo: -f 31,5;nbsp;deuteriumgehalte 5,00 at. %� De moederloogen werden ver-eenigd en ingedampt tot een volume van 800 cm�. Na toevoegingnbsp;van 18,1 g d-GZ.HCl en omkristalliseeren verkregen we 22,7 gnbsp;GZ.HCl, welke bij een hernieuwde omkristallisatie 17,7 gnbsp;d-GZ.HCl opleverden. Spec, draaiing [�Id: � 31,4; deuteriumgehalte 4,80 at. %.

Wij bereidden deuteriumgas door electrolyse vanDgO��). De bij de electrolyse gebruikte platina-electroden hadden een oppervlak van ca. 2,5 cm^. Om het zware water geleidend te maken,nbsp;voegden we per gram D2O 0,02 cm� gec. zwavelzuur toe. Aangezien het niet mogelijk is, het deuterium zonder meer van uitnbsp;het electrolysevat te transporteeren, gebruikten wij een toestel ¹ ²), dat een combinatie vormt van een T o e p p 1 e r-pompnbsp;en een deuteriumrecipient (zie fig. 4). De ontleding van hetnbsp;zware water vindt plaats in het electrolysevat A, dat gedurendenbsp;de electrolyse met ijswater wordt gekoeld. De spanning tusschennbsp;de beide electroden bedraagt 60 Volts. Het aan de kathode ontwikkelde deuteriumgas passeert de CaCh-buis B om daarnanbsp;door verdringing van het kwikzilver bij kraan in de recipientnbsp;C te worden opgevangen. Bij het begin der electrolyse is Cnbsp;(volume ca. 125 cm�) geheel met kwikzilver gevuld. De drie-wegkraan K2 staat zoo, dat verbinding wordt gemaakt tusschennbsp;C en de hevel D. Deze hevel is zoodanig bevestigd, dat hetnbsp;kwikoppervlak bij p slechts een fractie van een millimeter hoo-ger staat dan bij q. Het zal duidelijk zijn, dat het ontwikkelde

55) Vgl. R. Schoenheimeren zijn medewerkers. J. Biol. Chem. 111, 169 (1935) en A. McLean en Roger Adams, J. Am.nbsp;Chem. Soc. 58, 807 (1936).

Het principe van dit toestel werd ons medegedeeld door Dr. A. H. W. Aten. Voor deze en andere eveneens voor ons van belang zijnde raadgevingen, spreken wij hierbij onze erkentelijkheid uit.

deuteriumgas slechts een zeer kleine druk behoeft uit te oefenen om zich bij kraan een weg te banen naar vat C. Kraan K4nbsp;is gesloten, terwijl kraan K3 geopend is. Wanneer C geheel isnbsp;gevuld met deuterium, wordt de electrolyse stopgezet en denbsp;kranen en K4 gesloten. Willen we nu het gas over persennbsp;naar het hydreerings-toestel, dan brengen we met behulp vannbsp;een stikstofbom bij kraan K3 een druk aan van 0,5 a 1 atm.nbsp;Door de kraan Kg zoo te stellen, dat er verbinding is tusschennbsp;de Woulfsche flesch E en vat C, wordt het gas door de nunbsp;geopende kraan K4 via een capillair in het reactievat geperst.

Het bepalen van het GZ-gehalte volgens de in dit werk beschreven methode vergt zooveel tijd en moeite, dat het niet goed mogelijk is, al de benoodigde werkzaamheden door ��n persoonnbsp;te laten uitvoeren. Eenerzijds vraagt het isoleeren van GZ uitnbsp;weefselhydrolysaten speciale bedrevenheid, anderzijds is denbsp;deuteriumanalyse een allesbehalve eenvoudige procedure. Weliswaar worden de analysen seriegewijze uitgevoerd, echter is ditnbsp;alleen mogelijk wanneer alle onderdeelen van de analyse, zooalsnbsp;de verbranding, de zuivering van het verbrandingswater etc.nbsp;voortdurend worden gecontroleerd. Doordat de isoleering vannbsp;de GZ-praeparaten uit de weefsels werd uitgevoerd door Mej.nbsp;Dr. H. E r X1 e b e n en de analytische werkzaamheden doornbsp;schrijver van dit proefschrift, konden in de beschikbaar staandenbsp;tijd veel meer gevallen worden onderzocht, dan door een enkelenbsp;experimentator. Gaarne dank ik Mej. Dr. H. Erxleben ooknbsp;op deze plaats voor de aangename en vruchtbare wijze vannbsp;samenwerken.

De opwerking van het weefsel geschiedde als volgt. Het van duidelijk necrotische deelen bevrijde tumorweefsel werd metnbsp;behulp van een L a t a p i e-molen fijngemalen. Om er vannbsp;verzekerd te zijn, dat het ge�soleerde GZ oorspronkelijk uitsluitend als bouwsteen van het prote�ne aanwezig was, hebbennbsp;wij de volgende fractionneering toegepast. De weefselmassanbsp;werd met de zesvoudige gewichtshoeveelheid 0,9-proc. NaCl-oplossing en een weinig toluol geschud en 24 uren in de koelkast bewaard. Door centrifugeeren scheidden wij het onoplosbare gedeelte der eiwjtten van het oplosbare en waschten

eerstgenoemde fractie telkens twee maal met respectievelijk water, alcohol en aether uit. Aan de NaCl-oplossing voegden wijnbsp;daarna het vier a vijfvoudige volume 96-proc. alcohol toe ennbsp;lieten het geheel wederom 24 uren in de ijskast staan. Het uitnbsp;oplosbare eiwitten bestaande neerslag werd uitgewasschen metnbsp;75-proc. alcohol, vervolgens met 96-proc. alcohol en daarna metnbsp;aether.

Het uitwasschen van het prote�nemateriaal moet zorgvuldig geschieden; zulks met het oog op de storende werking vannbsp;achtergebleven NaCl bij het isoleeren van het GZ. Immers hetnbsp;GZ wordt tot kristallisatie gedwongen in een sterk zoutzuurnbsp;milieu, m.a.w. onder omstandigheden, waarbij ook NaCl uitnbsp;zijn oplossing kristalliseert.

De beide eiwitfracties werden samengevoegd en in vacuo boven P20g gedroogd. Het gehalte aan GZ werd steeds op hetnbsp;op deze wijze gedroogde eiwit berekend.

Het droge materiaal werd met de drie-voudige gewichtshoe-veelheid 37-proc. zoutzuur gehydrolyseerd. Om later te vermelden redenen hebben wij de hydrolysetij d van 7 uren op 20 uren gebracht. In het laatste geval kristalliseerde het GZ moeilijkernbsp;en langzamer uit. Wanneer het dan ook niet om het absolutenbsp;gehalte van 1- en d-GZ te doen is, verdient de 7-urige hydrolysenbsp;de voorkeur.

Na afkoeling van het hydrolysaat voegden we een gelijk volume water toe en filtreerden de grove humusdeelen af. Om het zoutzuur zoo veel mogelijk te verwijderen, werd de zwart gekleurdenbsp;oplossing in vacuo drooggedampt, hetgeen na toevoeging van gedestilleerd water eenige malen werd herhaald. De achtergebleven donkerbruine stroop losten we in de tienvoudige hoeveelheid water op en schudden deze oplossing ter verwijderingnbsp;van humusstoffen bij kamertemperatuur met een geringe overmaat CugO-poeder. Laatstgenoemde substantie werd in de loopnbsp;van ongeveer 10 minuten toegevoegd, totdat de kleur van denbsp;laatste portie onveranderd bleef. De onoplosbare koperverbindingen werden afgefiltreerd, het filtraat met zoutzuur aangezuurd en ter verwijdering van de koperionen gedurende ongeveer drie kwartier H2S ingeleid. De geel gekleurde oplossing,nbsp;die na filtratie overbleef, kon door koken met noriet wordennbsp;ontkleurd. Onder vacuum werd tot een visceuze stroop inge-

dampt en deze in een erlenmeyer-kolfje van het 2- a 3-voudige volume overgebracht. Bij het uitvoeren van deze be'werkingennbsp;in andere laboratoria heeft men het GZ waarschijnlijk vaak innbsp;een veel te verdunde stroop laten uitkristalliseeren, waardoornbsp;de oplossing wel aan 1- maar niet aan d-GZ.HCl was oververzadigd. Voor de practische uitvoering kunnen volgende opmerkingen en raadgevingen van dienst zijn. De stroop heeft denbsp;juiste consistentie, wanneer het overgieten in het erlenmeyer-kolfje ca. twee uren in beslag neemt. Indien men de kolf v��rnbsp;het uitgieten op het waterbad verwarmt, kan men het grootstenbsp;deel van de stroop ook met behulp van een pipet overbrengen.nbsp;Voor het naspoelen mogen bij de gebruikelijke hoeveelhedennbsp;hoogstens 1 a 2 cm^ water worden gebruikt. Wanneer de stroopnbsp;zich in het kolfje bevindt, wordt deze bij 0� met HCl-gas verzadigd. Voor het inleiden gebruike men een nauw buisje. Denbsp;bellen van het HCl-gas stijgen slechts langzaam na�r de oppervlakte; ook hieruit kan men zien hoe viskeus de stroop moetnbsp;zijn. In de practijk zal het niet moeilijk vallen, aan de handnbsp;van bovengenoemde gegevens de juiste concentratie te vinden.nbsp;Voor alle zekerheid echter geven wij nog het volgende getallenvoorbeeld: uit 8 g gedroogd' prot��nemateriaal werden 7,1 anbsp;7,3 g stroop verkregen en hierbij in totaal 3 cm� water toegevoegd.

Daarna entten wij met 1- en d-GZ.HCl en bewaarden het met een kurk afgesloten kolfje in de koelkast (�2�). In de regelnbsp;werd het uitgekristalliseerde GZ.HCl na vier dagen afgefiltreerd; onder zekere omstandigheden moet men 7 of, bij wijzenbsp;van uitzondering, 14 dagen wachten, voordat zich de normalenbsp;kristallen hebben gevormd. Het affiltreeren van de kristalbrei,nbsp;welke zich in de viskeuze stroop bevindt, voerden wij aldus uit,nbsp;dat we het kolfje omgekeerd boven het glasfilter (G 3) bevestigden, zoodat de taaie massa langzamerhand vanzelf op hetnbsp;filter liep. Na scherp afzuigen werd met een weinig op 0� afgekoeld zoutzuur gewasschen en het uit kleurlooze kristallen bestaande hydrochloride in vacuo boven NaOH gedroogd. Hetnbsp;filtreeren duurt lange tijd; vaak komt het voor, dat in de kristalbrei op het filter sleuven ontstaan, waardoor verder afzuigennbsp;geen nut meer heeft. In dat geval roert men onder toevoegingnbsp;van enkele druppels ijskoud geconcentreerd zoutzuur de brei

Ter verkrijging van een tweede kristallisaat dampten we de moederloog wederom tot een taaie stroop in en verzadigdennbsp;opnieuw bij 0� met HCl-gas. Na herhaald enten en bewaren innbsp;de koelkast kon na 4 a 7 dagen een tweede fractie van hetnbsp;GZ.HCl worden af gefiltreerd. In de regel hadden we aan tweenbsp;fracties voldoende. Slechts zelden kwam het voor, dat we ternbsp;verkrijging van een derde of vierde fractie genoemde bewerkingnbsp;moesten herhalen. Voor het omkristalliseeren werden de aldusnbsp;verkregen fracties vereenigd en uit zoo weinig mogelijk 20-proc.nbsp;zoutzuur omgekristalliseerd. Dit voerden wij aldus uit, dat wenbsp;het ruwe hydrochloride in een kolfje met weinig zoutzuur aannbsp;de kook brachten en de laatste kristallen met een druppel zoutzuur oplosten. De op deze wijze bij het kookpunt verzadigdenbsp;oplossing werd na afkoeling met 1- en d-GZ.HCl ge�nt en tenminste gedurende 24 uren in de ijskast bewaard. Van het verkregen kristallisaat bepaalden we de specifieke draaiing. Betreffende de opbrengst bij het omkristalliseeren zij er wederomnbsp;met klem op gewezen, dat het gewichtsverlies slechts 10, maximaal 15 % mag bedragen.

Uit de specifieke draaiing van het ge�soleerde GZ kan worden berekend, uit hoeveel 20 proc. zoutzuur men moet omkristalliseeren om een scheiding tusschen 1- en dl-GZ.HCl teweeg tenbsp;brengen. Wij voerden dit aldus uit, dat het eerst uitkristalli-seerende 1-GZ.HCl nog een weinig Van de dl-verbinding bevatte.nbsp;Aangezien het dl-GZ.HCl twee maal zoo goed oplosbaar is alsnbsp;het 1-GZ.HCl, laat eerstgenoemde verbinding zich vrij gemakkelijk door eenige malen omkristalliseeren verwijderen.

Om er zeker van te zijn, dat een bepaald praeparaat uit zuiver dl-GZ bestond, werd voor en na het omkristalliseeren gecontroleerd of inderdaad geen optische draaiing te constateeren was. Indien het praeparaat een kleine overmaat aan 1- of d-GZnbsp;bevatte, zou dit in het nieuwe kristallisaat geconcentreerd worden, hetgeen door het bepalen van de specifieke draaiing onmiddellijk aan het licht zou treden. Het 1-GZ.HCl werd omgekristalliseerd tot constante specifieke draaiing. Deze werd doorgaansnbsp;bepaald van een 5 proc. oplossing van het vrije GZ in 9 proc.nbsp;zoutzuur. Van de aldus gezuiverde praeparaten van 1- en dl-

GZ.HCl werden C-, H- en N-analysen uitgevoerd en indien deze in orde waren, het deuteriumgehalte bepaald.

Op de hier beschreven methode is het met een weinig routine relatief eenvoudig om GZ met een opbrengst van ca. 9 % betrokken op het droge eiwit, te isoleeren. Met nadruk moge ernbsp;op worden gewezen, dat het bij het analyseeren volgens denbsp;verdunningsmethode natuurlijk niet zoozeer op een hooge opbrengst, wel echter op volkomen zuivere praeparaten aankomt.

Voordat we overgaan tot het bespreken van de berekening en de mogelijke fouten, welke bij de analyse een rol kunnennbsp;spelen, moge ter toelichting van de in de deuterium-chemie gebruikelijke uitdrukkingen, het volgende worden vermeld.

Wanneer we met een mengsel van D2O en H2O te doen hebben, drukken wij het gehalte aan deuteriumoxyde uit in ge-wichtsprocenten D2O (gew. % D2O). Mengt men 10 g D2O met 90 g H2O, dan is dit een mengsel, dat 10 gew. % D2O bevat.

Hebben we nu te doen met organische verbindingen, waarvan ��n of meerdere atomen waterstof door deuterium zijn vervangen, dan bestaat er ook een andere manier om hetnbsp;deuteriumgehalte aan te geven. Veronderstellen we, dat vannbsp;een verbinding als GZ.HCl (C5H10O4NCI) met 10 waterstofatomen, 1 H-atoom is vervangen door 1 D-atoom. In dat gevalnbsp;zeggen we, dat het molecuul 10 atoomprocenten deuteriumnbsp;(at. % D.) bevat. Wordt een gedeutereerde organische verbinding verbrand, dan zal het ver-brandingswater eenzelfde atoompercen-tage deuterium hebben als het verbrandenbsp;uitgangsmateriaal. Een verbinding, als het bovengenoemde GZ.HCl, welke 1 D-atoom bevat op 10 waterstofatomen ¹), zal bij de verbranding een mengsel van DgO en H2Onbsp;geven, waarin zich op iedere 10 waterstofatomen 1 deuterium-atoom m.a.w. 10 at. % D bevindt.

Waterstof moeten we hier opvatten als een mengsel van pro-tium (^H) en deuterium (�H).

Aangezien we eenerzijds met gew. % D2O en anderzijds met at. % D te doen hebben, is het wenschelijk over een formulenbsp;te beschikken, welke het verband tusschen deze beide weergeeft. Een dergelijke mogelijkheid verschaft ons onderstaandenbsp;betrekking:

Het analyseeren van een weefsel met behulp van de verdun-ningsmethode wordt nu als volgt uitgevoerd. Bij het begin van de hydrolyse van a g (gewicht van het gedroogde eiwit) weefsel, voegen we b g gedeutereerd 1-GZ met Co at. % D toe. Nanbsp;afloop van de hydrolyse wordt eerst het 1-GZ ge�soleerd. Ditnbsp;GZ is een mengsel van het toegevoegde 1-GZ en het uit hetnbsp;eiwit afkomstige GZ. Veronderstellen we, dat dit praeparaatnbsp;Cl at. D bevat, dan laat zich uit deze gegevens het gehaltenbsp;aan 1-GZ in het prote�ne berekenen, b g gedeutereerd 1-GZnbsp;mengt zich met x g GZ uit het weefsel, zoodat de evenredigheidnbsp;geldt:

b : (b x) = C, : Co

Het gehalte y aan 1-GZ in het weefseleiwit kunnen we nu , procentsgewijze als volgt uitdrukken:

Het gehalte aan d-GZ bepalen we analoog door gedeutereerd d-GZ toe te voegen. Het ge�soleerde mengsel van 1- en d-GZ.HClnbsp;wordt gesplitst in 1- en dl-GZ.HCl. Het dl-GZ.HCl wordt geanalyseerd. Aangezien van het praeparaat de helft uit 1-GZ bestaat, dat geen deuterium bevat, moeten we, om het deuterium-gehalte te vinden van d-GZ, de gevonden waarden met tweenbsp;vermenigvuldigen.

56) Ook met behulp van een eenvoudige grafiek laat zich at. % D in gew. Vo D2O omzetten. Vgl. W. Frank en J. M�nch, Ann.nbsp;550, 12 (1941).

In de practijk voegen we meestal het gedeutereerde GZ in de vorm van het hydrochloride toe. Voor Co en Ci vullen wenbsp;dan het deuteriumgehalte van GZ.HCl in. Bevat een praepa-raat van vrij GZ 5,00 at. D, dan zal het deuteriumgehaltenbsp;bij omzetting in het hydrochloride 9/10 . 5,00 at. % D = 4,50nbsp;at. % D bedragen.

Zooals we hebben gezien, bepalen we het gehalte aan GZ met behulp van de formule 2. De fouten, welke gemaakt wordennbsp;bij het afwegen van het weefselprote�ne en van het toegevoegdenbsp;gedeutereerde GZ, zijn zoo klein vergeleken met de fouten vannbsp;de deuteriumanalyse, dat we deze bij de foutendiscussie buitennbsp;beschouwing mogen laten.

Wanneer we aannemen, dat de te analyseeren stoffen zuiver zijn, wordt de fout in y uitsluitend bepaald door de fouten innbsp;C� en Cl. Bij de deuteriumanalyse moeten we met een gemiddelde relatieve fout van 1 % rekening houden. Beneden 0,40nbsp;at. % D wordt de fout grooter.

We willen nu nagaan, welke invloed de verhouding Co/Ci op de fout uitoefent. Stellen we Cq = 5,00 at. % D en nemennbsp;we voor Ci respectievelijk 0,50, 1,00, 1,50, 2,00 en 2,50 at. % D,nbsp;dan vinden we voor de relatieve fout in y resp. 2,2, 2,5, 2,9,nbsp;3,3 en 4,0 %. Hieruit blijkt, dat de fout het kleinst is bijnbsp;een hooge waarde van de breuk Co/Ci. Deze fout nadert asymp-totisch de waarde van 2,0 %. Een hooge waarde van de genoemde breuk bereiken we door een gedeutereerd GZ met eennbsp;hoog deuteriumgehalte te gebruiken.

Men moet rekening houden met het feit, dat deze beschouwing betreffende de proeffout slechts op ��n analyse betrekking heeft, m.a.w. wanneer we van het toegevoegde en het ge-isoleerde GZ slechts ��n analyse uitvoeren, hebben we een minimale fout van 2 %. We kunnen de fout kleiner maken door van een voldoende hoeveelheid van het toe te voegen gedeutereerde GZ uit te gaan. Hiermede bereiken we, dat we van hetnbsp;gemerkte GZ, door het uitvoeren van meerdere deuterium-analysen, het deuteriumgehalte nauwkeurig (met een fout kleiner dan 1 %) kunnen vaststellen. Wordt nu dit GZ bij een reeksnbsp;weefselanalysen gebruikt dan kunnen we Cq in de formule alsnbsp;een constante opvatten. Dit heeft tengevolge, dat de bovengenoemde reeks van relatieve fouten nagenoeg wordt gehalveerd

en dat bij een gunstige verhouding van C�/Ci de relatieve fout in y tot 1 % nadert.

Dat wij er de voorkeur aan gaven de antipoden van het ge-deutereerde GZ aan het hydrolysaat toe te voegen in plaats van de dl-verbinding, heeft de volgende reden. Wanneer we gedeu-tereerd dl-GZ toevoegen, wordt het ge�soleerde GZ gesplitst innbsp;1- en dl-GZ. Eerst bepalen we het gehalte Ci in 1-GZ, om daarnanbsp;met behulp van het deuteriumgehalte Cdi van de dl-verbinding,nbsp;gebruik makende van de formule

het deuteriumgehalte Cd van het d-GZ te berekenen. Voegen we aan het hydrolysaat gedeutereerd d-GZ toe, dan stelt denbsp;analyse van het ge�soleerde dl-GZ ons alleen reeds in staat Cdnbsp;te bepalen. Immers, aangezien het 1-GZ geen deuterium bevatnbsp;(Cl = 0), laat zich Cd uit formule 3 berekenen. Het zal duidelijk zijn, dat de fout in het laatste geval kleiner is dan innbsp;het eerste.

Gaan we de zuiverheid van de diverse, bij de weefselanalyse voorkomende substanties na, dan moeten we beginnen met opnbsp;te merken dat het uitgangsmateriaal, nl. het gedroogde weef-selprote�ne, naast variabele hoeveelheden anorganische zouten,nbsp;nog andere stoffen bevat, waardoor een zekere onnauwkeurigheid wordt teweeg gebracht. Zooals reeds werd opgemerkt betrekken we de percentages GZ op dit materiaal. Andere auteursnbsp;berekenen het eiwitgehalte uit het totale stikstofgehalte vannbsp;het hydrolysaat door vermenigvuldiging met 6,25. Ook in ditnbsp;geval is het werkelijke eiwitgehalte vermoedelijk geringer.

De als �indicator� gebruikte praeparaten mogen op grond van de bovengenoemde analytische controle als volkomen zuivernbsp;worden beschouwd. Het uit de hydrolysaten ge�soleerde GZ kannbsp;verontreinigd zijn met anorganische zouten of andere aminozuren. Eerstgenoemde verontreinigingen spelen bij de analysenbsp;geen rol, mits het praeparaat onverdund wordt verbrand. Verontreinigingen van organische aard kunnen een fout veroorzaken. Aangezien echter het ge�soleerde GZ door elementairana-lyse en specifieke draaiing op zijn zuiverheid wordt gecontroleerd, kan hierbij slechts sprake zijn van kleine fouten.

voegde gedeutereerde GZ zich volkomen mengt met het in het hydrolysaat aanwezige GZ. In verband hiermede moet mennbsp;rekening houden met het evenwicht, dat er bestaat tusschennbsp;GZ en pyrrolidon-a-carbonzuur. Op grond van de experimentennbsp;van H. Wilson�^) en R. Keith Cannan hebben S.nbsp;Graff^�), D. Rittenberg en G.L. Foster het noodignbsp;geacht na de toevoeging van het gemerkte GZ nog 3 uren tenbsp;koken, �to insure equilibration of the added glutamic acid withnbsp;pyrrolidone-carboxylic acid�. Bij het analyseeren van fibrinenbsp;hebben genoemde onderzoekers het gemerkte GZ ��n keer ooknbsp;v��r de hydrolyse toegevoegd; dit had echter geen invloed opnbsp;de resultaten, zoodat zij in het vervolg bij eerstgenoemde werkwijze bleven.

In het volgende hoofdstuk zullen we de ervaringen bespreken, die we zelf hebben opgedaan betreffende de beslissende rol, welke de volledige menging van toegevoegd en aanwezignbsp;GZ bij de analyse speelt.

Zooals wij hadden verwacht, kon vanaf de eerste bepalingen in hydrolysaten van tumoren op overtuigende wijze een gehaltenbsp;aan d-GZ worden aangetoond en ook wat betreft de hoeveelheid,nbsp;vertoonden de uitkomsten geen belangrijke afwijking met denbsp;vroegere resultaten van K�gl en Erxieben. Natuurlijknbsp;hebben wij aanvankelijk de 7-urige hydrolyse toegepast ennbsp;het hydrolysaat � na toevoeging van gedeutereerd GZ �nbsp;opgewerkt volgens de in ons laboratorium beproefde wijze.nbsp;Aangezien wij bij de eerste reeks analysen slechts de beschikking hadden over uitwisselings-GZ, moest het koken van denbsp;zure oplossing, ter verkrijging van een betere menging, wordennbsp;vermeden. Daarentegen hadden wij bij deze praeparaten vannbsp;deuterio-GZ het voordeel, dat de analysen reeds konden wordennbsp;uitgevoerd door de 1- en de d-vorm gescheiden toe te voegen.

De resultaten van de eerste reeks analysen vinden we in tabel IV. De laatste kolom vermeldt de �racemisatiegraad�. Doornbsp;deze grootheid wordt aangegeven, hoeveel procent van de totalenbsp;hoeveelheid GZ in de dl-vorm voorkomt. In de vroegere publicaties van K�gU�) en Erxieben werd ter karakteriseeringnbsp;van de onderzochte tumoren het percentage d-vorm van denbsp;totale hoeveelheid GZ vermeld, welke waarde de helft bedraagtnbsp;van de racemisatiegraad. Weliswaar moeten wij het als eennbsp;nadeel beschouwen, dat de naam racemisatiegraad de indruknbsp;wekt, alsof een partieele racemiseering van het GZ (bv. tennbsp;gevolge van de hydrolyse) had plaats gevonden, hetgeen hiernbsp;heelemaal niet het geval is. Integendeel, het begrip racemisatiegraad dient tot uitdrukking te brengen hoeveel dl-GZ er naastnbsp;1-GZ, reeds als bouwsteen der prote�nen, voorkomt.

Uit de resultaten van tabel IV blijkt, dat de racemisatiegraad der onderzochte tumoren een goede overeenstemming vertoont met die waarden, welke vroeger werden verkregen met be-58) F. K � g 1 en H. Erxieben, Z. physiol. Chem. 264, 108 (1940).

Weefselanalysen met behulp van het gedeutereerde GZ volgens Knoop, toegevoegd bij het begin van de 7-urige hydrolyse.

hulp van de specifieke draaiing; in het bijzonder valt het op, dat we evenals vroeger bij de B r o w n-P e a r c e-tumoren wederomnbsp;een twee keer zoo groote racemisatiegraad als bij de benzopy-reen-tumoren van de rat aantreffen. Wel was het opmerkelijk,nbsp;dat het totale gehalte aan GZ niet hooger werd gevonden, ofschoon door K�gl�^) en Erxleben uit hydrolysaten vannbsp;Brow n-P e a r c e-tumoren reeds 12,9 % GZ waren ge�soleerd.nbsp;Dat onze werkmethode in quantitatief opzicht inderdaad nognbsp;niet geheel en al voldeed, blijkt uit de percentages 1-GZ, gevonden in normaal weefsel, welke beslist te laag zijn.

Ondertusschen kregen wij de beschikking over het volgens de K n o o psche reactie bereide deuterio-GZ, hetwelk � na opnbsp;de reeds beschreven wijze te zijn behandeld � bij koken metnbsp;zoutzuur geen deuterium verliest. De toevoeging van dit GZnbsp;kon nu bij het begin van de hydrolyse geschieden. Zooals tabelnbsp;V toont, had dit noch op de opbrengst aan GZ, noch op denbsp;racemisatiegraad eenige invloed; bij analyse No. 16 vinden wenbsp;de opbrengst, bij analyse No. 17 daarentegen de racemisatiegraad hooger dan in de andere gevallen. Ter verklaring vannbsp;de lage percentages 1-GZ in de onderzochte hydrolysaten vannbsp;normale weefsels, zouden we kunnen aanvoeren, dat de hydrolyse van deze prote�nen langzamer verloopt. Natuurlijk kan mennbsp;eerst het absolute gehalte verwachten, wanneer alle peptide-

bindingen van GZ zijn opengesplitst; in eerste instantie was het daarom onze taak de invloed van langere duur van denbsp;hydrolyse na te gaan. Bij de volgende experimenten hydroly-seerden wij de weefselprote�nen in totaal gedurende 20 uren, ennbsp;wel werd telkens 10 g materiaal (normaal kalfshart) 17 urennbsp;gehydrolyseerd, waarna naast 187 mg van het stabiele deuterio-GZ-HCl 225 mg gewoon d-GZ werden toegevoegd; welke bijnbsp;de analyse moesten worden teruggevonden. Hierna werd denbsp;zoutzure oplossing nog 3 uren gekookt, zooals dat bij de analysennbsp;van S. Graff, G. L. Foster en D. Ritten berg ternbsp;bereiking van het evenwicht met pyrrolidon-a-carbonzuur wasnbsp;geschied. De beide op deze wijze uitgevoerde analysen gavennbsp;een zeer merkwaardige uitkomst; weliswaar vonden wij eennbsp;gehalte van 14 resp. 14,7 �/o 1-GZ, daarentegen konden we vannbsp;de toegevoegde 225 mg d-GZ slechts 60 resp. 59 mg terugvinden. Het was onder deze omstandigheden alleszins begrijpelijk, dat een op analoge wijze uitgevoerde analyse van eennbsp;Brow n-P e a r c e-tumor, waarbij geen gewoon d-GZ was toegevoegd, eveneens een belangrijk tekort aan d-GZ leverde. Hiernbsp;vonden we naast 10,5 % 1-GZ slechts 1,3 % d-GZ, hetgeennbsp;overeenkomt met een racemisatiegraad van 22 Het ligt voornbsp;de hand om in de verrassende uitkomsten van de laatstgenoemde experimenten een verklaring te zien voor de negatievenbsp;resultaten der Amerikaansche auteurs; immers het feit, datnbsp;ongeveer 2/3 deel van het toegevoegde gewone d-GZ ,,verdwijnt�, kan niet worden genegeerd. Of hierbij nog andere factoren een rol spelen, zou door proeven op grootere schaalnbsp;moeten worden uitgemaakt, hetgeen niet het primaire doel vannbsp;ons werk was. In ieder geval is de conclusie gerechtvaardigd,nbsp;dat een gedeelte van het d-GZ in het hydrolysaat onder denbsp;bovengenoemde proef omstandigheden in een dergelijke vormnbsp;voorkomt, welke een volkomen menging met het toegevoegdenbsp;�zware� d-GZ niet of niet voldoende mogelijk maakt.

Dat hierbij het pyrrolidon-a-carbonzuur een rol kan spelen, is niet ondenkbaar. Weliswaar wordt volgens de onderzoekingennbsp;van H. Wilson�'') en R. Keith Cannan het pyrrolidon-a-carbonzuur in sterk zuur milieu (2 n-zoutzuur) practischnbsp;volledig in GZ omgezet. Volgens deze auteurs bereikt men eennbsp;hydrolyse van het anhydried door genoemde oplossing ge-

durende 1 a 2 uur bij 100� te verhitten. Men dient echter niet te vergeten, dat genoemde onderzoekers het evenwicht bestudeerd hebben aan zuivere oplossingen, m.a.w. wij achten het nietnbsp;toelaatbaar de resultaten van dergelijk experiment zonder meernbsp;toe te passen op een ingewikkeld systeem, als een eiwithydroly-saat. Hierbij komt nog, dat wij meerdere malen met het uitzonderlijke gedrag van een hydrolysaat hebben kennis gemaakt.nbsp;Wij willen in dit verband wijzen op de bij de methode vannbsp;Foreman geconstateerde splitsing van het dl-GZ ondernbsp;invloed van het asymmetrische milieu van het hydrolysaat. Uitnbsp;een en ander mogen we concludeeren, dat de omstandigheden,nbsp;waaronder Graff en zijn medewerkers hun analysen hebbennbsp;uitgevoerd, met name het koken gedurende 3 uren om hetnbsp;evenwicht te bereiken, geen garantie biedt voor een volkomennbsp;menging van het toegevoegde gedeutereerde en het aanwezige GZ.

In aansluiting met genoemde experimenten voerden wij een reeks modelproeven uit met pyrrolidon-a-carbonzuur. Eener-zijds onderzochten wij de snelheid, waarmede het evenwichtnbsp;tusschen pyrrolidon-a-carbonzuur en GZ wordt bereikt, ander-zijds voegden wij pyrrolidon-a-carbonzuur toe aan eiwithydro-lysaten om het effect daarvan na te gaan. Eerstgenoemdenbsp;proeven lieten zich eenvoudig uitvoeren, door het dl-pyrrolidon-a-carbonzuur te mengen met een der gedeutereerde antipodennbsp;van GZ. Na een week opgelost te zijn geweest in 20-proc.nbsp;zoutzuur, bij 0�, werd de oplossing geconcentreerd en het GZnbsp;ge�soleerd. Uit de vermindering in het deuteriumgehalte vannbsp;laatstgenoemde stof liet zich berekenen welk deel van het pyrrolidon-a-carbonzuur zich had omgezet. De resultaten van dezenbsp;proeven stemden, voor zoover vergelijking mogelijk is, dusdanignbsp;met die van Wilson en Keith Cannan overeen, datnbsp;onder de genoemde omstandigheden het pyrrolidon-a-carbonzuur zich voor ca. 2/3 deel in GZ had omgezet.

Bij de proeven, waarbij het pyrrolidon-a-carbonzuur aan hydrolysaten werd toegevoegd, trachtten wij door sterke verdunning na afloop der hydrolyse gunstige omstandigheden tenbsp;scheppen voor de dissociatie van het eventueele complex, bestaande uit d-GZ (resp. d-pyrrolidon-a-carbonzuur) en eennbsp;onbekende asymmetrische substantie. Daarna werd eerst het

gedeutereerd GZ toegevoegd en de ca. 70-voudig verdunde oplossing nog 3 uren gekookt. Al deze experimenten brachtennbsp;ons echter niet verder, zoodat wij hierop niet nader zullennbsp;ingaan.

Wij bereikten ten slot te ons doel door een simpele wijziging in de tot nu toe gebruiktenbsp;werkwijze, waardoor wij in staat waren hetnbsp;gewone d-G Z, dat we aan een normaal weefselnbsp;toevoegden, nagenoeg quantitatief terugnbsp;te vinden. Het bleek namelijk, dat alle moei-lijkheden omzeild konden worden door hetnbsp;gedeutereerde zoowel als het gewone d-G Znbsp;bij het begin van de hydrolyse toe te voegen.nbsp;Immers daardoor werd bereikt, dat zoowelnbsp;het toegevoegde GZ als wel het gedurende denbsp;hydrolyse in vr ij heid gestelde GZ aan dezelfde invloeden blootstaan.

Men zal zich afvragen, waarom de analysen vermeld in tabel V, niet reeds betere resultaten hadden opgeleverd, aangezien ook daar v��r de hydrolyse het gedeutereerde GZ werdnbsp;toegevoegd. Men dient echter niet buiten beschouwing te laten,nbsp;dat hierbij slechts 7 uren werd gehydrolyseerd, hetgeen volgens onze ervaringen beslist te kort is om een volledige eiwit-hydrolyse te bewerkstelligen.

Behalve het toevoegen v��r de hydrolyse en de 20-urige hydrolyse moeten we nog met een derde factor rekening houden. Hoewel niet van zooveel beteekenis, komt deze toch de betrouwbaarheid van de analysen ten goede. Wij hebben n.1., evenalsnbsp;bij de eerste reeks analysen, telkens bij duplobepalingen hetnbsp;gedeutereerde 1- resp. d-GZ toegevoegd, welke nu echter stabielnbsp;gebonden deuterium bevatten, gezien de bereiding uit het volgens de synthese van Knoop verkregen dl-GZ.

Door deze onafhankelijke uitvoering van de analysen bereikten we, dat een eventueele fout bij de bepaling van 1-GZ geen invloed heeft op de waarde van d-GZ.

Zooals uit de tabel blijkt, werden van de toegevoegde hoeveelheden d-GZ gemiddeld 97 % teruggevonden; het kleine tekort

verklaart de in de tabel voorkomende negatieve waarden van de racemisatiegraad. Wanneer we de vele bewerkingen, die bijnbsp;de analyse een rol spelen, in aanmerking nemen, mogen we denbsp;resultaten als zeer bevredigend beschouwen. In tabel VII treffen we een reeks op analoge wijze uitgevoerde analysen vannbsp;verschillende typen van gezwellen aan.

Tabel VII bevat o.a. de analysen van eenige menschelijke gezwellen. Zooals vroeger reeds door K�gP�) enErxlebennbsp;was meegedeeld, werd uit de hydrolysaten van goedaardigenbsp;myoomgezwellen vooral leucine met een duidelijke depressie van

TABEL VII.

Analysen van tumoren, waarin bij de aanvang- van de 20-urige hydrolyse stabiel deuterium bevattend 1- en d-GZnbsp;werden toegevoegd.

C-, H~ en N-analysen der GZ.HCl praepwraten.

de specifieke draaiing ge�soleerd, terwijl de racemisatiegraad van GZ slechts een zeer geringe waarde had. Ook dit vindennbsp;we bevestigd bij onze quantitatieve bepalingen. Daarentegennbsp;zien we bij de geanalyseerde kwaadaardige gezwellen, zooalsnbsp;we verwacht hadden, een hooge racemisatiegraad.

Wat de practische fout der weefselanalysen aangaat, kunnen we zeggen, dat de werkelijke waarde van het gehalte aan 1- ofnbsp;d-GZ in de prote�nen 0,5 % hooger of lager kan zijn, dan werdnbsp;gevonden. Voor het totaalgehalte aan GZ in tumorprote�nennbsp;wordt de foutenmarge grooter, aangezien hierbij in uiterstenbsp;gevallen de fouten van twee onafhankelijke bepalingen moetennbsp;worden opgeteld; wanneer dus het totaalgehalte 17% is, zal degt;nbsp;werkelijke waarde tusschen 16 en 18% liggen.

Van de GZ.HCl praeparaten vermelden we in tabel VIII de uitkomsten der C-, H- en N-analysen, welke werden uitgevoerdnbsp;door den Heer P. J. H u b e r s te Amsterdam.

Aangezien wij voor onze deuteriumanalysen relatief groote hoeveelheden tumorweefsel noodig hadden, konden wij in de tij d,nbsp;die ons ter beschikking stond, slechts enkele menschelijke gevallen onderzoeken, waarover wij konden beschikken dank zij denbsp;vriendelijke medewerking van de heeren Dr. B. J. Mansensnbsp;(St. Canisiusziekenhuis te Nijmegen), Prof. Dr. P.Nieuwen-h u ij s e (Pathologisch Instituut der Rijks-Universiteit tenbsp;Utrecht) en Prof. Dr. K. de S n o o (Gynaecologische klinieknbsp;der Rijks-Universiteit te Utrecht). Verder danken wij Dr. A.nbsp;de Minjer voor het histologisch onderzoek en de voorbereidende werkzaamheden aan het materiaal uitgevoerd.

Analyse No. 35. Levermetastasen van een 68-jarige vrouw; adenocarcinoom met tamelijk uitgebreide necrose. Primairnbsp;galblaascarcinoom.

Analyse No. 36. Levermetastasen van een 47-jarige vrouw; eenigszins paillomateus gebouwd, zeer polymorphcellignbsp;carcinoom. Primair longcarcinoom.

Analyse No. 37. Ovariaaltumor met kwaadaardige epitheel-woekering, welke deels solide, deels adenomateus van bouw is. Op enkele plaatsen zijn in het epitheel groote, met eennbsp;slijmachtige massa gevulde holten gevormd.

HOOFDSTUK V.

SLOTBESCHOUWING.

Wanneer wij onze resultaten vergelijken met die van andere onderzoekers, valt het op, dat afgezien van het voorkomen vannbsp;d-GZ in tumor-hydrolysaten, het totale gehalte aan GZ in hydro-lysaten van weefsels algemeen veel hooger is. Gaan wij na,nbsp;hoeveel GZ als bestanddeel van weefselprote�nen vroegernbsp;werd gevonden, dan blijkt dat gemiddeld 10 % te zijn vannbsp;het gewicht aan gedroogd prote�ne. Zoo vonden A, C. C h i b-nall��), M. W. R e e s, E. F. Williams en E. B o y-1 a n d in doorsnede 10 % GZ met als maximum 12,1 % innbsp;een ossenhart. S. Graff^�), D. Rittenberg en G. L.nbsp;Foster verkregen bij hun analysen met gemiddeld 10,2%,nbsp;met als hoogste waarde 11,8%. Hierbij moet worden opgemerkt, dat genoemde auteurs gedurende 15 uren hydrolyseer-den, terwijl bij ons deze bewerking 20 uren in beslag nam. Uitnbsp;een recente publicatie van E. Abderhalden�^) blijkt, datnbsp;hij opbrengsten aan GZ verkrijgt, die varieeren van 8,5 totnbsp;11,5%. Th, Wieland�^) bereikt met behulp van chromato-graphie een opbrengst van gemiddeld 8,2%. In beide gevallennbsp;werd ongeveer gedurende 7 uren gehydrolyseerd.

Tot nu toe staat de door K�gU^) en E rxl eb en bij een hydrolysaat van Brow n-P e a r c e-tumoren verkregen opbrengst aan GZ van 12,9% aan de spits van de in de literatuurnbsp;vermelde resultaten van weefselanalysen. Het zal wel duidelijknbsp;zijn, dat het isoleeren van GZ uit hydrolysaten nooit geheelnbsp;quantitatief kan geschieden. Steeds zal een kleiner of grooternbsp;deel van het aanwezige GZ in de moederloog achterblijven.

Uit onze analysen blijkt, dat in normale weefselprote�nen 12,5�15,6% 1-GZ voorkomt, terwijl in eiwitten van tumorweef-sel het totale gehalte aan GZ 13,9�18,4% bedraagt. Terwille

van de overzichtelijkheid zijn de resultaten van de tabellen VI en VII in fig. 5 grafisch voorgesteld. Men ziet duidelijk, dat denbsp;karakteristieke verschillen tusschen normaal en tumor-weefselnbsp;boven het niveau van 10% liggen, hetgeen tot nog toe als denbsp;maximumwaarde van het gehalte aan GZ werd aangenomen.nbsp;Verder blijkt, dat het d-GZ soms een aliquote hoeveelheid 1-vormnbsp;vervangt, terwijl het in andere gevallen additief bij de normalenbsp;1-vorm bij komt.

Zooals reeds in de inleiding werd gezegd, waren een reeks auteurs niet in staat geweest, d-GZ uit hydrolysaten van tumoren te isoleeren, waardoor het voorkomen van genoemd aminozuur in de prote�nen van maligne weefsels werd betwijfeld.nbsp;Ons werk had ten doel het aantoonen en bepalen van d-GZ innbsp;hydrolysaten van tumoren in vergelijking met die van normaalnbsp;weefsel. In tegenstelling met de vele negatieve resultaten vannbsp;andere auteurs, konden de in de eerste**) en tweede^*) publicatie van K�gl en Erxleben gegeven uitkomsten nu opnbsp;zeer overtuigende wijze worden bevestigd. Normaal weefselnbsp;blijkt niettegenstaande 20-urige hydrolyse slechts weinig ofnbsp;geen d-GZ te bevatten. Volgens de vroegere publicaties vannbsp;K�gl en Erxleben beschouwde men een weefsel nog alsnbsp;normaal, wanneer het uit het weefselhydrolysaat ge�soleerdenbsp;GZ-praeparaat een racemisatiegraad van 4% had en wel geziennbsp;de proeffout, welke de bepaling van de specifieke draaiing metnbsp;zich brengt. Wij verwachten, dat door verbetering in de analysemethodiek in zijn geheel deze marge kan worden verkleind.

Van belang is verder het feit, dat de racemisatiegraad van het GZ uit tumoren, gevonden volgens de nieuwe methode, nagenoeg overeenstemt met die, welke de oude werkwijze onsnbsp;verschafte. Wij bedoelen hierbij de gevallen, waarbij gedurendenbsp;7 uren werd gehydrolyseerd. De verwachting, dat de racemisatiegraad zou toenemen, wanneer we de hoeveelheden d- ennbsp;1-GZ quantitatief zouden kunnen bepalen, zien we niet bevestigd. Reeds de uitkomsten verkregen door middel van de specifieke draaiing gaven de juiste verhouding der beide antipodennbsp;in het hydrolysaat weer. Ter verklaring hiervan moeten wenbsp;uitgaan van de in de publicatie van K�gP�), Erxlebennbsp;en Akkerman vermelde gegevens omtrent het door laatstgenoemde onderzochte �ternaire� systeem van 1-, d-GZ.HCl en

20-proc. zoutzuur bij 0�. Daarbij bleek, dat het dl-GZ een race-misch mengsel (conglomeraat) vormt, hetgeen beteekent, dat beide antipoden onafhankelijk van elkaar uitkristalliseeren.nbsp;Bij oververzadigde oplossingen, zooals wij deze bij een tot eennbsp;stroop ingedampt hydrolysaat hebben, komt de hoogere concentratie aan 1-GZ in de practijk daardoor tot uiting, dat denbsp;kristallisatie van deze antipode met meer waarschijnlijkheidnbsp;eerder zal beginnen, dan van de d-vorm. Bij het bereiken vannbsp;de toestand, waarbij de moederloog niet meer oververzadigd is,nbsp;zal deze nog slechts gelijke hoeveelheden van de 1- en de d-vormnbsp;bevatten. Uiteraard is het niet isoleerbare deel voor de d-vormnbsp;relatief grooter dan voor de 1-vorm. Wanneer echter het grootstenbsp;deel van het GZ is gewonnen, speelt dit slechts een kleine rol,nbsp;zoodat het gedeelte van het GZ, dat is uitgekristalliseerd beidenbsp;antipoden in de nagenoeg juiste verhouding zal bevatten. Innbsp;praeparatief opzicht dient men echter ook met twee anderenbsp;factoren rekening te houden. Indien, zooals dit in het begin bijnbsp;K�gl en Erxleben het geval was, de opbrengst niet grootnbsp;is, zal de moederloog voor een of voor beide antipoden nietnbsp;oververzadigd zijn en de bovenbeschreven eindtoestand niet zijnnbsp;bereikt. Hierbij komt nog dat het asymmetrische milieu van hetnbsp;hydrolysaat heel goed een verschillende invloed kan uitoefenennbsp;op het kristallisatievermogen van het 1- en het d-GZ.HCl.

Deze omstandigheden in aanmerking genomen, is de overeenstemming tusschen de vroegere resultaten en de nu verkregen uitkomsten zeer bevredigend te noemen. De eenige afwijking wordt gevormd door het feit, dat een racemisatiegraad van 80 %, welke vroeger in zekeren zin karakteristiek wasnbsp;voor zeer maligne weefsels, nu niet meer wordt aangetroffen.nbsp;Het is niet onmogelijk, dat deze afwijking door redenen vannbsp;biologische aard moeten worden verklaard. Anderszins lijktnbsp;ons de uitlegging, dat bij de vroegere experimenten het d-GZnbsp;bij het uitkristalliseeren een, zij het toevallige, voorsprongnbsp;heeft gehad, niet in strijd met de theorie.

Aangezien het voorkomen van d-GZ in hydrolysaten van tumoren nu afdoende bewezen geacht mag worden, blijft hetnbsp;een vraag waarom de isoleering van de d-vorm zoo afhankelijknbsp;is van de gebruikte methode. In hun zesde mededeeling wezennbsp;K�gU^) en Erxleben er reeds op, dat de splitsing van

het racemaat bij de methode van F o r e m a n zich laat verklaren door aan te nemen, dat het d-GZ door de een of andere asymmetrische substantie wordt gebonden. De ervaring, welkenbsp;wij hebben opgedaan, zijn hiermee niet in strijd. Het spreektnbsp;van zelf, dat niet willekeurige hoeveelheden d-GZ op die maniernbsp;worden vastgehouden; het feit, dat diverse auteurs de d-vormnbsp;wel bij modelproeven, maar niet in hydrolysaten van tumorennbsp;hebben gevonden, zou door genoemde werkhypothese plausibelnbsp;gemaakt kunnen worden. Wanneer het toevoegen geschiedt nanbsp;de hydrolyse of kort voor het moment, dat men het GZ gaatnbsp;isoleeren, kan ook de tijd een rol spelen, aangezien dan bij hetnbsp;praecipiteeren van de calcium-glutaminaten of bij de chromato-graphische adsorptie het toegevoegde d-GZ nog niet geheel ennbsp;al behoeft te zijn gebonden. Toekomstige onderzoekingen zullen moeten uitmaken, in hoeverre genoemde hypothesen juistnbsp;zijn en welke de aard van de asymmetrische verbinding is. Hetnbsp;is opvallend, dat ^ich de practische moeilijkheden bij die methoden voordoen, waarbij de isoleering van het GZ in zwak alkalisch (Foreman) of neutraal (T h. W i e 1 a n d) milieu plaatsnbsp;vindt, terwijl wij bij onze methode het GZ.HCl in sterk zurenbsp;oplossing tot kristallisatie brengen.

Bij beschouwing van de verschillende tabellen blijkt, dat in de gevallen, waarbij het gedeutereerde GZ v��r de hydrolysenbsp;werd toegevoegd, de racemisatiegraad bij 7-urige duur der hydrolyse grooter is, dan bij 20-urige hydrolysetijd. (Veygl. denbsp;analysen No. 16, 17, 18 en 19 uit tabel V met No. 26 en 27 uitnbsp;tabel VII). Hetzelfde kunnen we zeggen van de menschelijkenbsp;levermetastasen. (Analyse No. 35). Vonden we bij 7-urigenbsp;hydrolyse resp. 8,6 % 1- en 3,4 % d-GZ met een racemisatiegraad van 56,7 %, bij 20-urige hydrolyse blijken deze waardennbsp;resp. 13,4nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;3,6 % en 42,4 % te zijn. Ook hier dus een verla

ging van de racemisatiegraad tengevolge van de langere duur (jer hydrolyse. Uit deze getallen zien we, dat bij 20-urige hydrolyse het percentage 1-GZ aanzienlijk toeneemt, in tegenstellingnbsp;met het percentage d-GZ, dat nagenoeg dezelfde waarde blijftnbsp;behouden. Afgezien van het laatste geval, nl. dat van de levermetastasen, hebben de genoemde analysen het bezwaar, dat voornbsp;de uitvoering niet van een en hetzelfde prote�nemateriaal wasnbsp;uitgegaan. Om dit bezwaar uit de weg te ruimen, hebben wij

een aantal omentum-metastasen van Brow n-P e a r c e-konij-nen verzameld en de na de gebruikelijke op werking verkregen droge producten goed gemengd. Zoodoende hadden wij voldoende homogeen materiaal ter beschikking om in duploproevennbsp;na te gaan, welke invloed de 7- en de 20-urige hydrolyse op denbsp;analyse heeft. De resultaten vinden we in tabel IX vermeld.

Zooals men ziet, is de racemisatiegraad bij de 7-urige hydrolyse steeds duidelijk grooter. Omtrent de oorzaak van dit verschijnsel kunnen we het volgende opmerken. Het is niet onwaarschijnlijk, dat de prote�nen, waarin d-aminozuren als bouwsteenen voorkomen door koken met zoutzuur sneller worden afgebroken, dan de natuurlijke 1-prote�nen. Hierop wijst ooknbsp;het feit, dat bij een hydrolyseduur van 7 uren de tumorpro-te�nen in meerdere mate worden gehydrolyseerd dan de normalenbsp;weefselproteinen (zie tabel IV). Bovengenoemd verschijnselnbsp;zou verklaard kunnen worden door aan te nemen, dat in tumor-weefsel behalve de prote�nen, welke uit partieel racemischenbsp;aminozuren zijn samengesteld, ook eiwitten voorkomen, die geheel en al uit 1-aminozuren zijn opgebouwd, b.v. normaal bindweefsel. Het belangrijkste voor ons is echter de conclusie, welke

we uit g�enoemd verschijnsel kunnen trekken. Uit het feit, dat de racemisatiegraad bij langere hydrolysetijjd afneemt, laatnbsp;zich namelijk concludeeren, dat het d-GZ in het hydrolysaatnbsp;niet ontstaat tengevolge van racemisatie van 1-GZ. Immersnbsp;indien zulks het geval ware, zou het omgekeerde van het verschijnsel worden waargenomen.

In de eerste publicatie�) (pag. 77) en in de derde��) (pag. 161) van K�gl en Erxleben werd het vermoeden uitgesproken, dat er tusschen de racemisatiegraad en de maligniteitnbsp;van een kankergezwel een zekere correlatie zou bestaan. De oorzaak hiervan was het feit, dat de meest kwaadaardige tumorennbsp;zooals b.v. de Brow n-P e a r c e-tumoren het meeste d-GZnbsp;blijken te bevatten. Ook nu komen wij tot hetzelfde resultaat.nbsp;In dit verband vestigen wij de aandacht op de uitkomsten vannbsp;de analysen No. 31 en No. 32, welke aangeven, dat de racemisatiegraad bij een primaire F 1 e x n e r-J o b 1 i n g-tumor 17 'Jo,nbsp;daarentegen bij de metastasen van hetzelfde gezwel rond 33 %nbsp;bedraagt.

Aangezien de theorie van K�gl de basis is geweest voor vele proefnemingen op het gebied van de kanker, was het vannbsp;belang, elke poging aan te wenden om het fundamenteele feit,nbsp;nl. het voorkomen van d-GZ in hydrolysaten van tumoren, tenbsp;bewijzen. Dit werd met behulp van de volgende methoden uitgevoerd.

1) nbsp;nbsp;nbsp;Door bepaling van de specifieke draaiing van het ge�soleerde GZ.

3) nbsp;nbsp;nbsp;Door het GZ (zoowel de 1-als de d-vorm) volgens denbsp;derde scheidingsmethode van Pasteur te isolee-ren^�).

4) nbsp;nbsp;nbsp;Door tumorprote�nen te voederen aan een hond. Hetnbsp;GZ verkregen uit de peptiden, die met urine en faecesnbsp;waren uitgescheiden, bleek overwegend uit de d-vormnbsp;te bestaan �).

5) nbsp;nbsp;nbsp;Door uit een tumorhydrolysaat eerst volgens de F o r e-m a n-methode het 1-GZ te verwij deren, waarna volgens de reeds beschreven methode uit de moederloognbsp;GZ werd ge�soleerd, dat voor het meerendeel uit d-GZnbsp;bestond

6) nbsp;nbsp;nbsp;Door het d-GZ met behulp van d-aminozuur-oxydasenbsp;aan te toonen ��).

7) nbsp;nbsp;nbsp;Als laatste methode kunnen we nu de nagenoeg quanti-tatieve methode met gedeutereerd GZ noemen.

Aangezien een reeks auteurs in de hydrolysaten van tumoren geen of geen noemenswaardige hoeveelheid d-GZ konden aantonnen, echter wel omstreeks 10 % van het prote�negewicht aannbsp;het gewone 1-GZ werd gevonden, meende men de door denbsp;Utrechtsche school met de methode 1 tot 6 verkregen resultatennbsp;als onjuist te mogen beschouwen. Meestal liet men in het midden, op welke wijze onze positieve resultaten moesten wordennbsp;verklaard, doch werd soms het vermoeden uitgesproken, dat hetnbsp;geobserveerde dl-GZ door racemisatie in vitro � dus op trivialenbsp;wijze � zou zijn ontstaan. Door de in dit proefschrift beschreven quantitatieve analysen zijn echter de bovengeschetste tegenwerpingen ontzenuwd. We konden nu het bewijs leveren, datnbsp;in werkelijkheid in de hydrolysaten van tumoren zelfs nog meernbsp;1-GZ aanwezig is, dan de opponenten hebben aangetoond. Daarnaast vonden wij echter de d-vorm in een concentratie overeenkomstig de vroeger aangegeven verhouding van 1 tot d. In

64) nbsp;nbsp;nbsp;F. K � g 1 en, H. E r X 1 e b e n, Z. physiol. Chem. 264, 108 (1940).

65) nbsp;nbsp;nbsp;F. K � g 1, H. H e 1' k e n en H. E r x 1 e b e n, Z. physiol. Ch�m.nbsp;264, 220 (1940).

de toekomst kan een aanval niet meer op de isoleering van 10 % 1-GZ steunen; eerst -wanneer iemand erin slaagt om bv. in hy-drolysaten van Brow n-P e a r c e-tumoren 16�18 % van hetnbsp;prote�negewicht aan 1-vorm aan te toonen, zou een nieuwnbsp;steekhoudend tegenargument zijn gevonden.

Door F. K � g 1 en H. E r x 1 e b e n werd in 1939 het voorkomen van d-glutaminezuur in hydrolysaten van tumorpro-te�nen aangetoond. Het feit, dat normaal weefselprote�ne geen of uiterst weinig d-glutaminezuur als bouwsteen bevat, leidde innbsp;combinatie met bovengenoemde vondst tot een nieuwe kanker-theorie, welke in staat lijkt, belangrijke eigenschappen vannbsp;kwaadaardige gezwellen beter dan tot nu toe begrijpelijk tenbsp;maken.

Alhoewel het �onnatuurlijke� d-glutaminezuur op verschillende methoden in hydrolysaten van tumoren werd aangetoond, bleef door de vele negatieve resultaten van andere auteursnbsp;twijfel hieromtrent bestaan. Om deze strijdvraag definitief totnbsp;een oplossing te brengen, werd op exacte wijze het absolutenbsp;gehalte van 1- en d-glutaminezuur in hydrolysaten van normaalnbsp;resp. tumor-weefsel bepaald. Hiervoor gebruikten wij de �ver-dunningsmethode� met behulp van deuterium als indicator. Tenbsp;dien einde werd gedeutereerd glutaminezuur aan het hydroly-saat toegevoegd en na terugwinning van het glutaminezuur uitnbsp;de vermindering van de deuteriumconcentratie het gehalte aannbsp;beide antipoden van glutaminezuur vastgesteld.

De deuteriumanalysen voerden wij uit met behulp van de door A. S. K e s t o n, D. R i 11 e n b e r g en R. Schden-h e i m e r uitgewerkte methodiek. Hierbij bepaalt men op tweenbsp;verschillende manieren, nl. met de interferometer en met denbsp;druppelmethode het deuteriumgehalte.

Aangetoond werd, dat de werkwijze, volgens welke door ; S. Graff, D. Rittenberg en G. L. Foster met ^�N'nbsp;als indicator het gehalte aan glutaminezuur in hydrolysaten!nbsp;werd bepaald, aan bedenkingen onderhevig is.

. Volgens de uitkomsten van onze analysen bevatten hydroly^ saten van normaal weefsel (rattenorganisme, kalfshart en placenta) 12,5�15,6% 1-glutam-inezuur, terwijl daarnaast prac-tisch geen d-glutaminezuur voorkomt. Volgens opgaven in denbsp;literatuur kon tot nog toe in de hydrolysaten van normale

De verschillende gezweltypen laten zich karakteriseeren door hun racemisatiegraad, d.i. het percentage dl-glutaminezuur betrokken op de totale in het hydrolysaat voorkomende hoeveelheid glutaminezuur. Van de door ons onderzochte gezwellennbsp;bedroeg de racemisatiegraad bij:

goedaardige uterus-myomen primaire Flexner-Jobling carcinoomnbsp;chemotumoren: methylcholanthreennbsp;benzopyreen

Met deze resultaten worden de bevindingen van K � g 1 en E r X1 e b e n volkomen bevestigd.

5 '• ■
	' '■ - '■		' -.r.b nbsp;nbsp;nbsp;■nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;-•■ ■• ■ ‘
'/lt;' . 'V			, , }d 'fi oFsii'J -i'j ■ .- . - nbsp;nbsp;nbsp;■ ■■■!
y.*			''/i’uquot;/, .iyri.':o!'lt;;r
	A ; nbsp;nbsp;nbsp;..nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;■		' i. I’.-J'irür:'' ■ gt;
			■ nbsp;nbsp;nbsp;:t;'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;'V-:^-- ■ , r quot;i]'/’: nbsp;nbsp;nbsp;iS’l,
'r?', nbsp;nbsp;nbsp;'		/. '■'. ■	^;;' nbsp;nbsp;nbsp;■ 'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;v:-quot;'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;'
0f '^ - ^ ■• ■	: •:;^r nbsp;nbsp;nbsp;.		'■ nbsp;nbsp;nbsp;u
/ill'.' • fö-' ■■	'’A nbsp;nbsp;nbsp;Z^;-nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;■ ' ■ ■ nbsp;nbsp;nbsp;; r lt;’	\	• = nbsp;nbsp;nbsp;‘ 1nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;' ;snbsp;nbsp;nbsp;nbsp;* ✓ nbsp;nbsp;nbsp;.nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;■nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;Z' '
%-^y-	'. \ '

De wijze, waarop door Graff, Rittenberg en F oster �net behulp van ^�N als indicator, het gehalte van glutamine-zuur in hydrolysaten van tumoren werd bepaald, is aan bedenking onderhevig.

De bewering van Barbulescu, dat bij het D o n n a n-evenwicht de kollo�de stof invloed zou uitoefenen op de diffusie-snelheid van de electrolyten door het membraan, leidt tot tegenstrijdige conclusies.

De conclusies, die B o o r s m a en zijn medewerkers uit hun onderzoekingen over de ontleding van glucose door Cl. Tetaninbsp;trekken, worden door de proeven van Tasman en Bondsman zeer onwaarschijnlijk gemaakt.

Bij de bestudeering van de structuur der pernitrosogroep verdient het aanbeveling van de parachor volgens de formule van S u g d e n gebruik te maken.

R. Fusco en G. Trisoglio, Atti. R. Acad. Italia, Rend. cl. Sci. fisiche, mat. natur. 2, 618 (1941).

Ook de zuiver klassieke statistiek voert tot het optreden van een symmetriegetal in de uitdrukking voor de entropie.

A. Sommerfeld, Hand- und Jahrbuch der chemi-schen Physik. Bd. 3 (deel 2). Hoofdstuk IH (1939).

P. Ehrenfest en V. Trkal, Verslagen der Koninklijke Academie der Wetenschappen, Amsterdam 28, 906 (1920).

De opvatting van Nielsen en Hartelius over de methode ter bepaling van biotine volgens K � g 1 en zijn mede-v'erkers is onjuist.

De resultaten van de experimenten van K a r r e r, betreffende de werking van d-aminozuur-oxydase op d-aminozuren, dienen nader te worden bevestigd.

De structuurformule, welke door K a 1 n i n aan het^^ aceton-anil van K n o e v e n a g e F� wordt toegekend, moet als onjuist worden beschouwd.

Opl. No.	Gew. �/� DjO	T (sec.)	1000/T
1	0	183,- 2 ¹)	5,50
0	0,37	96,- 1	10,4
3	0,84	60,5 0,5	16,5
4	1,10	50,- 0,4	20,0
5	1,59	40,4 � 0,3	24,8
6	1,94	35,5 0,2	28,2
7	2,.38	30,5 0,2	32,8
8	2,79	27,2 0,1	36.8

No.	Weefsel	� ^ p,	Toegevoegd gedeut. dl-GZ. HCl		Ge�soleerd GZ. HCl		Percentage GZ			S T-i � 2 br
No.	Weefsel	^ �	Gew. in	At 7� D	At % D
		O B	mg	At 7� D	Cl	Cd	1-	d-	totaal
16	Brown- Pearce	5r	31,2	8,46	0,20	0,44	10,3	4,6	14,9	61,8
17	Brown- Pearce	5,-	68,7	8,46	0,61	1,05	7,1	3,9	11,-	71,-
18	Brown- Pearce	5-	150	8,46	1,13	2,33	7,8	3,2	11,-	58,2
19	Brown- Pearce	4-	250	8,46	1,97	3,49	8,2	3,6	11,8	61,-

		Gew.	Toegevoegd ge-deut. GZ. HCl.				Ge'tsol. GZ.HCl.		Percentaa�e
No.	Weefsel	te'ine in g	Ge in	w. mg	At 7� D		At 7� D			GZ		graad
		te'ine in g	1-	d-	1-	d-	Ci	Cd	1-	d-	totaal
26a	Brown-	10,-	550		2,73		0,67		13,5
b	Pearce	8,-		500		2.99	0,67	1,62	13,5	4,2	17,7	48,-
27a	Brown-	10,-	550		2,73		0,69		13,-
b	Pearce	b		410	2,73	2,99	0,69	1,79	13,-	3,7	16,7	44,-
28a	Benzo-	9,-	550		2,73		0,79		12,-
b	pyreeii	11,-		550		2,99	0,79	2,04	12,-	1,9	13,9	27,4
2!3a	Metbyl- cholan-	b,-	300		4,45		1,05		13,-
b	treen irat)	8,-		300		4,65		3,06		1,6	14,6	22,-
3�a	Methyl- cholan-	6,-	300		4,45		1,05		13,-
b	treen (rat)	8,-		300		4,65		3,06		1,6	14,6	22,-
31a	Primaire	b,-	300		4,45		0,94		14,9
	Plexner-				4,45		0,95		14,7
b	Jobling	10,-		300		4 65	0,95	2,98		1,34	16,2
	ea (rati							2,92		1,42	16,1	17,-
32a	riexner- Jobling-	V	300		4,46		1,20 1,20		13,-
i)	metasta-	L-		300		4,65	1,20 1,20	2,64		2,6
	sen (rat)							2,66		2,6	1.5,6	33,4
(��Bci	Uterus- myoom	b,-	300		4,45		0,92 0,92		15,3
b	(mensch)	8,-		400		4.65	0,92 0,92	4.36		0,3	15,6	3,6
34a	Uterus- mvoom	6,-	300		4,45		0,98 0,98		14,2
b	(nienscb)	8,-		400		4,65	0,98 0,98	4,43		0,2	14,4	2,8
35a	Levernie- tastasen	8,-	270		5,00		0,84		13,4
b	Adeno-ca	7,-		300		4,80		2,34		3,6	17,-	42,4
36 a	Leverme-tastasen ca-	8,-	270		5,00		0,93		11,8
b	Simplex	7-		300		4.80		2,44		.3,3	15,1	43,7
37a	Ovariaal-	8,-	270		5,00		0,79		14,4
b	CM.	7,-		300		4,80	0,79	2,23	14,4	7-	18,4	43.5

PROEFSCHRIFT

GFRARD JOHANNFS VAN VFFRSFN

h.t-...

f/'quot;.

,^V � V

!�f'

HOOFDSTUK I.

INLEIDING.

HOOFDSTUK II.

DE DEUTERIUMANALYSE.

II I

b : (b x) = C, : Co

(1)

X = (Co/Cl

y = (Co/C,

(2)

(3)

TABEL VII.

C-, H~ en N-analysen der GZ.HCl praepwraten.

57

HOOFDSTUK V.

SLOTBESCHOUWING.

• ■'■-*■-gt;■•■ gt;r quot; nbsp;nbsp;nbsp;‘ ■ • / / 'nbsp;nbsp;nbsp;nbsp;^ ,'■ ■-

\. -

1''-