BIJDRAGE TOT DE KENNIS VAN DE AFSTERVING
VAN MICRO-ORGANISMEN ONDER INVLOED •
VAN ALKALOÏDEN EN VERWANTE BASEN quot;

bijdrage tot de kennis van de afsterving
van micro-organismen onder invloed
van alkaloïden en verwante basen

PROEFSCHRIFT TER VERKRIJGING VAN DEN GRAAD
VAN DOCTOR IN DE WIS- EN NATUURKUNDE AAN
DE RIJKS-UNIVERSITEIT TE UTRECHT. OP GEZAG
VAN DEN RECTOR-MAGNIFICUS
Jhr. Dr. B. C. DE SAVORNIN LOHMAN
HOOGLEERAAR IN DE FACULTEIT DER RECHTSGE-
LEERDHEID VOLGENS BESLUIT VAN DEN SENAAT
DER UNIVERSITEIT TEGEN DE BEDENKINGEN VAN
DE FACULTEIT DER WIS- EN NATUURKUNDE TE
VERDEDIGEN OP DONDERDAG 18 JUNI 1931 DES
NAMIDDAGS TE 4 UUR

r\\r%wnbsp;_ .....................................................•••••••■••quot;••••iii»»quot;ii»\'iiiiiMiiiMniiinMiiiMM»iiiiiiiiMiiitiiiiiMiiiiiiinMiMiMMiiiiimiiiniMimiMMiii

Bij het voltooien van dit proefschrift, is het mij een aan-
gename taak. U, Oud-Hoogleeraren en Hoogleeraren in
de faculteit der Wis- en Natuurkunde, te danken voor
het onderwijs, van U genoten.

U in de eerste plaats. Hooggeleerde de Graaff, Hoog-
geachte Promotor, ben ik zeer erkentelijk, dat gij mij in
staat gesteld hebt, een onderwerp onder Uw leiding te
mogen bewerken. In het bijzonder dank ik U voor den
steun en de belangstelling, die gij mij hierbij in zoo ruime
mate betoond hebt.

Hooggeleerde van Romburgh, Uw boeiende colleges
zullen mij steeds een aangename herinnering blijven.

U, Hooggeleerde Ruzicka, dank ik voor het onderricht
van U genoten en voor de wijze, waarop gij Uw leerlingen
steeds terzijde staat.

Hooggeleerde Cohen, dankbaar ben ik U voor hetgeen
ik op Uw practicum en Uw colleges mocht leeren.

Zeer erkentelijk ben ik U, Hooggeleerde Kruyt, voor
Uw onderricht in de Kollóid-chemie en de Phasen leer.

U, Hooggeleerde Schoorl, dank ik zeer voor de bereid-
willigheid en de gastvrijheid in Uw laboratorium genoten.

De afsterving van micro-organismen onder invloed
van alkaloïden en verwante basen.

Overzicht en discussie van de werkwijzen,
in gebruik voor het bepalen van het desin-
fecteerend vermogen eener stof . . . . 17

Het toenemen van de resistentie van Bacterium coli . 55
Samenvatting.............72

Omtrent de bactericide werking van alkaloïden treft
men in de litteratuur betrekkelijk weinig onderzoekingen
aan. Wel is van een aantal chinine-derivaten onderzocht
of zij evenals chinine een specifieke werking op bepaalde
micro-organismen uitoefenen: met de overige alkaloïden
heeft men zich in dit opzicht weinig bezig gehouden.

Lübbert^) onderzocht de desinfecteerende kracht
van eenige alkaloïden t.o.v. Staphylococcus aureus. Hij
vond o.a., dat chinine in een verdunning van 1 op 550
doodelijk was voor dit organisme; hetzelfde gold voor
morphine 1 : 50.

Het eerste uitgebreide onderzoek in deze richting is
van SSadikow^). Het feit, dat zich in een 1 %
waterige oplossing van strychnine-sulfaat Bacillus subtilis
had opgehoopt, was voor hem aanleiding een nader
onderzoek in te stellen. Hij voegde aan bouillon-agar en
aan bouillon bepaalde hoeveelheden strychninezouten
toe met verschillend anion en entte deze voedingsbodems
met Bacterium coli. Staphylococcus aureus, Sarcina [lava
en schimmels. Het bleek, dat Bacillus subtilis in een
bouillon, bevattende 5 % strychnine-sulfaat, 3 a 4 dagen
in leven bleef.

Overigens groeiden op een 2 % strychnine bevattende
agar slechts Staphylococcen en schimmels. De overige
onderzochte organismen verdroegen, op dezen agar geënt,
reeds 1 % alkaloïde niet meer; bij een concentratie van
0.5 % strychnine-phosphaat groeiden Bacillus subtilis.

\') Biologische Spaltpilz Unters. 1892.
2) Centralbl. f. Bakt. Abt. I Orig. 60. 417.

Voor Bacterium coli geeft de tabel een overzicht van
de door hem verkregen resultaten.

In \'t algemeen blijkt, dat, behalve van den aard van het
organisme, de uitkomsten sterk afhankelijk waren van het
anion der opgeloste strychnine-zouten. Zoo leefde Bacillus
subtilis in ^ % strychnine-phosphaat-bouillon nog 72
dagen; in % strychnine-chloride-bouillon was steriliteit
in 24 uur bereikt.

1 % zoutzure strychnine doodde Bacterium coli in 1 dag,
bij 1 % phosphaat was na 1 dag nog groei te zien; Bacillus
mesentericus groeide op 1 % strychnine-phosphaat 22
dagen, op 1 % strychnine-HCl 8 dagen. Verder consta-
teerde S S a d i k O w, dat bij langdurigen groei van de
bacteriën in den alkaloïde-bevattenden bouillon, op den
duur het vrije alkaloïde door basische splitsingsproducten,
die de bacteriën uit den voedingsbodem vormen, vrij
gemaakt wordt en uitkristalliseert. Hij vermeldt niet, dat
het alkaloïde door de organismen als voedingsstof gebruikt
wordt.

gisten in staat waren van diverse alkaloïden en verwante
basen, als stikstofbron voor hun voeding, gebruik te maken.
Hij voegde aan een voedingsbodem, bevattende K-phos-
phaat 0.03 NaCl 0.01 %, MgS04 0.01 % en 2 % in-
vertsuiker, de stikstof-verbindingen toe tot een concen-
tratie van 0.2

Onderzocht werden o.a. pyridine, piperidine, coniïne,
nicotine, brucine, cocaïne en morphine. Het bleek, dat As-
pergillus niger en Penicillium glaucum na een jaar nog
in leven waren. Door het mycelium te verzamelen, uit te
wasschen en bij 105° te drogen, kon een stikstofanalyse
uitgevoerd worden en had b.v. Penicillium glaucum ^/q van
de aanwezige piperidine verbruikt.

Z i r p O I O ging den invloed na van alkaloïden op den
groei en het lichtend vermogen van lichtbacteriën. Mor-
phine-HCl in concentraties van 1 op 5 en 1 op 20, belem-
merde den groei geheel. Bij concentraties van 1 op 50
verschenen pas na 5 dagen lichtverschijnselen; bij 1 op 100
tot 200 reeds na 2 dagen, terwijl door verdere verdunning
tot 1 op 1000 na 24 uur reeds het lichten te zien was.

Evenwel beïnvloedde een concentratie van 1 % de licht-
kracht niet, wanneer deze concentratie aan een reeds lich-
tende cultuur werd toegevoegd.

R O n a en N i c o 1 a ï ^) verrichtten onderzoekingen
omtrent het gistend vermogen van biergist onder invloed
van zoutzure chinine.

Zelfs door verzadigen met chinine-zout gelukte het niet,
vergiftigingsverschijnselen van de fermenten te veroor-
zaken. Zij geven een methode aan, om de vergiftigings-
factoren, die hier in \'t spel zijn, n.1.: de concentratie van
het alkaloïde, den duur van de inwerking en den zuurgraad
van de oplossing, afzonderlijk te onderzoeken.

De gunstigste p^ voor glucose-vergisting bleek te
liggen tusschen p^ 4.5 en p^ 6.5. Bij p^ 5.3 en 20 %
zoutzure chinine werd geen invloed op het gistend ver-
mogen bemerkt. Wordt de p^ onder dezelfde omstandig-
heden op 6.2 gebracht dan vermindert de CO2 ontwikke-
ling. Door de vloeistof alkalisch te maken zou men te ver
van het pgt;„ -optimum voor de gisting verwijderd geraken.
Om dit bezwaar te ontgaan maken zij de basen uit de al-
kaloïde-zouten vrij met NaHCOg, behandelen met deze
oplossing eenigen tijd de gistende vloeistof en brengen met
een buffermengsel de p^ weer op de optimum p^ voor
gisting. Als controle werd hetzelfde gedaan met de bicar-
bonaat-oplossing alleen. Het bleek op deze wijze, dat het
vermogen, de vergisting te belemmeren, evenredig was
aan de concentratie van de vrije chinine-base en dat con-
centraties van 10-4 tot 10 -5 molair nog een duidelijken
invloed in dezen zin uitoefenden.

B i e 1 i n g 1 ) onderzocht een aantal chinine-verbindin-
gen, als hydrochinine, optochin e.a. en vond een sterke
specifieke werking op pneumococcen. Vele andere orga-
nismen, als typhus- en para-typhusbacteriën, Bactenum
coli en Bactenum pyocyaneum waren, vergeleken met de
pneumococcen, ongevoeliger voor deze alkaloïden.

Een aantal onderzoekers wijzen op den groei-belemme-
renden invloed van caffeïne.

R O t h 2 ) opperde de mogelijkheid, caffeïne in een be-
paalde concentratie toe te voegen, om aldus een selectieven
voedingsbodem voor typhus-bacteriën te verkrijgen.

Gaethgens^) slaagde erin door toevoegen van
0.33 % caffeïne aan Endo-agar, de selectieve werking van
dezen voedingsbodem t.o.v. typhusbacteriën te verbeteren.

Ook Z a n d a ^) vermeldt een conserveerende werking
van 1 % caffeine op bloedserum, melk e.d. Minder resis-
tente kiemen sterven op den duur af onder invloed van
deze concentratie.

Tot een overeenstemmend resultaat komt S e c h i ^):
Caffeine in een concentratie van 1 % belemmerde den
groei van de meeste organismen. Verder stelde hij vast,
dat in een verdunning van 1 op 1000 tot 10000 soms een
buitengewoon sterke groei optrad.

Als een voorbeeld van een practische toepassing kan
genoemd worden een 1 % caffeïne-bouillon, gebruikt
voor het ophoopen van Streptococcen.

H aim en Torresgingen de groei-belemme-
rende en bacterie-doodende eigenschappen na van een
aantal alkaloïden t.o.v. verschillende micro-organismen.
Zij voegden de alkaloïden in bepaalde concentraties toe
aan bouillon-agar of aan bouillon en gingen na hoe lang de
organismen in leven bleven. Daarnaast werden de bacte-
riën gebracht in de zuivere oplossing van de alkaloïden;
na één of meer dagen gingen zij dan door toevoegen van
bouillon na, of nog groei plaats vond.

De resultaten zijn lastig in \'t kort samen te vatten. Zij
vonden b.v. dat bij enten op agar-voedingsbodems, be-
vattende respectievelijk morphine 0.35 %, atropine-sulfaat
0.09 %, scopolamine HBr 0.09 heroïne 0.35 % en
aconitine 0.35 na 2 dagen Bacterium colt, Sarcina
[lava, Bacterium pyocyaneum en Staphylococcus albus nog
groeiden; typhus-bacteriën waren niet meer tot groei in
staat. Door verhoogen van de concentratie der eerste vier
stoffen tot respectievelijk 0.92, 0.23, 0.23 en 0.92
waren na 5 dagen alle hierboven genoemde organismen
gedood.

In alkaloïde-bouillon was 0.66 % morphine, 0.09 %
strychnine-nitraat en 0.36 % heroïne doodelijk; concen-
traties van atropine-sulfaat 0.28 %, scopolamine-hydro-
bromide 0.28 % weerstonden alle organismen 4 dagen.

Bij de proeven verricht met de zuivere oplossingen van
de alkaloïden, werden veel grootere concentraties toege-
past, n.1.:

Na 4 dagen leefden alle organismen nog, behalve typhus
bacteriën en Sarcina [lava.

De schrijvers constateeren, dat het verschil in bacteri-
cide-werking afhankelijk schijnt te zijn van den aard van
het milieu, waarin de alkaloïden opgelost worden. De bac-
terie-doodende en groei-belemmerende eigenschappen
worden door verhoogen van de concentraties ster-
ker. Van een specifieke werking blijkt zeer weinig;
sommige uitkomsten wijzen op een gevoeligheid van typhus
bacteriën voor morphine. Zooals uit het medegedeelde
volgt werden willekeurig de vrije alkaloïden en hun zouten
gebruikt en onderling vergeleken.

Wanneer men de beschreven resultaten beziet, komt
men tot de slotsom, dat het van belang zou kunnen zijn,
eenige alkaloïden en verwante basen nog eens nader te
onderzoeken op hun bactericide vermogen, ten einde na
te gaan, in hoeverre bij de inwerking op een micro-orga-
nisme van de basen eener zij ds en van hun zouten ander-
zijds, verschillen te voorschijn komen.

Overzicht en discussie van de werkwijzen, in
gebruik voor het bepalen van het desinfec-
teerend vermogen eener stof.

Wanneer wij de methoden beschouwen, die in den loop
der tijden door een aantal onderzoekers ontworpen zijn.
om het bactericide vermogen t.o.v. verschillende stoffen
of mengsels te leeren kennen, blijkt, dat het in de eerste
plaats in de bedoeling lag dit doodend vermogen t.o.v.
micro-organismen op een zoo goed mogelijk onderling ver-
gelijkbare wijze vast te leggen, liefst een en ander uit te
drukken in een getal, dat op het eerste gezicht vergelijking
toestaat; in de tweede plaats door directe proeven op
micro-organismen een chemische analyse van het betref-
fende desinfectans te vermijden. Natuurlijk zou het
denkbaar zijn, dat, gegeven het bactericide vermogen van
de bestanddeelen, door optellen de eigenschappen van het
mengsel in dit opzicht verkregen werden. Gezien echter
factoren van allerlei aard hier hun invloed doen gelden,
is dit niet mogelijk, en is de directe weg de veilige.

Als we ons rekenschap geven van de vraag op welke
wijze een gegeven aantal bacteriën gedood wordt door een
of anderen schadelijken invloed, dan komen we o.a. te
staan voor de vragen: Ie Hoe lang duurt het afstervings-
proces? 2e vertoont het afnemen van het aantal levende
kiemen een regelmatig verloop?

Uit talrijke onderzoekingen blijkt, dat door inwerking
van een oorzaak, die op den duur doodelijk is voor micro-
organismen, hetzij door inwerking van hooge temperatuur,
hetzij door toevoegen van schadelijke chemische agentia,
niet alle bacteriën tegelijk afsterven ^). Het blijkt, dat het
in \'t algemeen zeer korten tijd duurt, voordat deze invloe-
den zich doen gelden. Daarna neemt gedurende een be-
paalden tijd het aantal levende kiemen snel af; later gaat
de afsterving steeds langzamer en kan het op deze wijze
geruimen tijd duren, voordat volledige steriliteit ver-
kregen is.

le. De geënte hoeveelheid bacteriën bevat gevoelige,
minder gevoelige en meer resistente vormen.

2e. De meest resistente vormen, welke dus aan een der
uitersten der variabiliteits-curve zijn gelegen, en dus t.o.v.
het totale aantal verre in de minderheid zijn, blijven ten
slotte over.

In vele gevallen bleek, dat het aantal in een bepaalden
tijd afstervende kiemen evenredig was met het nog aan-
wezige aantal levende, waardoor zich een analogie op-
drong aan de vergelijking, die geldt voor het verloop
van de mono-moleculaire reactie. Het spreekt van zelf, dat
deze analogie niet meer dan formeel is, gezien de zeer in-
gewikkelde en geheel onbekende processen, die zich in
deze gevallen afspelen. Evenwel kan men toch uit de
kiemcijfers, door telling gedurende het verloop van het pro-
ces verkregen, in vele gevallen een constante berekenen ^).

gt;) Eykman. Bioch. Zeitschr. 11. 12. 1908.
Madsen en Nyman. Zeitschr. f. Hyg. u. Infect. Krankh. 57. 388.

2) Chick. Journ. of Hyg. VIII 92.
Chick. Journ. of Hyg. X 237.
Paul. Bioch. Zeitschr. 18. 1. 1909.
Paul, Birstein en Reusz, Bioch. Zeischr. 25. 367. 1910.
Lee en Gilbert. Journ. Phys. Chem. 22. 348.
Falk en Winslow. Journ. Bach. 11. 1-25. 1925.
Buchanan. Journ. Inf. dis. 23. 109. 1918.

In deze constanten zou men dan een maat hebben voor
het bactericide vermogen van de betreffende stof.

Echter is het aantal kiemen per cm^., waarvan men bij
dergelijke proeven uit gaat, van grooten invloed op de
waarde en het verloop van de constante gedurende het
experiment en het heeft niet aan pogingen ontbroken, om
de optredende afwijkingen te verklaren.

Reichenbach^) was van meening, dat afwijkingen
van het logarithmische verloop van de afstervingskromme
voor een groot deel te wijten waren aan de onderlinge re-
sistentie-verschillen van een bepaalde hoeveelheid kiemen.
Door a^^rax-sporen bloot te stellen aan verhitting of aan
de inwerking van HgCU, vond hij zeer bevredigende
constanten; echter liep bij soortgelijke proeven, verricht
met een toevallig geïsoleerden sporedrager, de constante,
naarmate de proef teneinde liep, steeds hooger op. Daar
deze resultaten sterk afhankelijk waren van den ouderdom
van de cultuur, was hij van meening, dat de resistentie met
den ouderdom van de kiemen samenhing.

Door aan te nemen, dat bij den groei van een bacterie-
cultuur door deeling, telkens een constante fractie van het
aantal levende kiemen zich niet verder deelt, en dat de
resistentie afhankelijk is, niet van de totale, maar van den
generatie-ouderdom, kon R e i c h e n b a c h mathematisch
aannemelijk maken, dat een cultuur, waarvan de samen-
stelling op deze wijze tot stand gekomen is, een logarith-
mische afstervingskromme vertoonen kan.

Nevenstaande tabel geeft een overzicht van het percen-
tage gedoode kiemen in 5 min. in verband met den ouder-
dom der gebruikte cultuur. Hoe jonger de cultuur is, des
te sneller gaat de afsterving in het werk; van een 13-uur

oude cultuur werd bij verhitting van een suspensie \'op
50° C. nog slechts de helft in 5 minuten gedood.

Hiernaast ging Reichenbach den groei na van
denzelfden para-typhusstam in bouillon bij 37°. Uit de
telllingen van agarplaten bleek, dat na een korten incubatie-
tijd van ± Yi uur, gedurende welken tijd het toenemen
van het aantal kiemen langzaam in zijn werk ging, de
groeisnelheid vanaf 1 uur, na het begin van de proef, snel
opliep en dat deze snelle vermeerdering =b 4 uur aanhield.
Vervolgens nam het aantal kiemen steeds langzamer toe en
van 13 uur tot 60 uur bleef het totale aantal kiemen vrijwel
constant.

Het aantal afstervende kiemen in een bepaalden tijd is
dan dus gelijk aan het aantal nieuwe, dat door deeling ont-
staat en blijft volgens Reichenbach in dit tijdvak de
verdeeling van het totale aantal levende kiemen over gene-
raties van verschillenden ouderdom het best gehandhaafd.
Deze verdeeling brengt dus volgens zijn berekeningen en
veronderstellingen een logarithmische afstervingskromme
met zich mee.

Inderdaad bleek, dat bij het bepalen van de afstervings-
kromme van een suspensie, bereid uit denzelfden para-

typhusstam van een cultuur van 13 uur oud en die de-
zelfde hoeveelheid kiemen per cm^ bevatte als bij de
bovenstaande groeiproef het geval was, een zeer bevredi-
gende constante gevonden werd. Ook bij gebruik van
cultures respectievelijk 18-, 28-, 48- en 55 uur oud was dit
het geval. Bij proeven, gedaan met cultures jonger dan 13
uur, werden de afstervingskrommen steeds steiler.

Hiertegenover is E ij k m a n ^) van meening, dat ver-
schillen in resistentie hun oorsprong vinden in variaties der
organismen. Elk dezer variaties heeft een bepaalde resis-
tentie; in een cultuur bevindt zich een kleine groep met zeer
geringen weerstand t.o.v. schadelijke invloeden, een groote
groep van gemiddelden weerstand en ten slotte een klein
aantal zeer levenskrachtige organismen. Hij is van mee-
ning, dat uit de variatiekromme geen logarithmische afster-
ving te verwachten is.

Bepaalt men alleen den tijd. die noodig is om\' een af-
sterving van alle kiemen in een suspensie te veroorzaken,
dan is men ook afhankelijk van de hoeveelheid kiemen, die
de suspensie per cm^ bevat; een zeer groot aantal maakt
de kans grooter, dat een grooter aantal van een zeer le-
venskrachtige generatie, of van een zeer resistente variatie,
aanwezig is.

Ficker-\', E ij kman-\'^) en V. L in gelshei m4)
vonden dan ook. dat verdunde suspensies van micro-orga-
nismen door hitte of inwerking van chemische agentia
sneller afstierven, dan suspensies, die meer kiemen per
cm-\' bevatten.

In dit verband is van belang een onderzoek van
L a n g e ö). Het bleek, dat de resistentie van een bepaalde

suspensie verhoogd werd door toevoegen van pas gedoode
bacteriën. De verschillen kwamen minder aan den dag bij
de door toepassen van hooge temperatuur veroorzaakte
korte afstervingstijden, dan bij lagere temperatuur en
langen afstervingstijd. Vooral kwam deze invloed duidelijk
te voorschijn, wanneer als ..Keimunterlagequot; van battist
lapjes gebruik gemaakt werd.

Indien vermengen met pas afgestorven organismen deze
werking uitoefent, moet zulks ook het geval zijn, wanneer
de suspensie zeer veel kiemen per cm«^ bevat, gezien gedu-
rende de proef dan vanzelf vele, pas afgestorven indivi-
duen, zich voegen bij de nog in leven zijnde. Lange komt
op deze wijze tot de conclusie, dat met dit verschijnsel
rekening gehouden moet worden, wanneer men volgens
Reichenbach, Eijkman e.a, in het aantal kiemen,
dat een suspensie per cm^ bevat, een voorname factor ziet,
wat betreft den afstervingstijd.

Overigens bleek, dat, om een voorbeeld te noemen, de
beschreven invloed pas merkbaar werd, door aan een
mengsel van 6 cm*\' Yi % kresol 4quot; 3 druppels coli sus-
pensie 1 cm^ gedoode bacteriën toe te voegen.

Bij toevoegen van een dergelijke groote hoeveelheid
kiemen, lijkt een adsorbtie van het desinfectans hieraan
niet geheel uitgesloten.

Het blijkt dus, dat zoowel het aantal kiemen, waarmede
wij bij desinfectieproeven werken, als de ouderdom der
gebruikte cultuur van grooten invloed zijn.

Verder laten vele onderzoekers niet het desinfectans
direct inwerken op een bacterie-suspensie, maar brengen
de te onderzoeken kiemen op een of ander weefsel in lapjes
of draden of op granaatjes, die dan na eventueel drogen
in de op bactericide vermogen te onderzoeken vloeistof
gebracht worden.

goed mogelijk van de „Keimunterlagequot; verwijderen en
deze op groei of steriliteit onderzoeken.

Bij deze wijze van werken is de gekozen „Keimunter-
lagequot; van grooten invloed op de verkregen uitkomsten.

LockemannenPicheri) verrichtten vergelijken-
de onderzoekingen in dezen zin. Zij gingen na, in hoeverre
de adsorbtie van den desinfectantia aan de „Keimunter-
lagequot;, eventueel een extra opeenhoping van kiemen hier-
aan, van invloed was op het desinfecteerend vermogen van
een stof, en onderzochten, of de uitkomsten, verkregen uit
proeven aan suspensies, veel verschilden met de eerst
genoemden.

Het bleek, dat bij gebruik van stoffen als „Keimunter-
lagequot;, die metaalzouten het sterkst adsorbeerden, de
slechtste desinfe.ctie-resultaten werden verkregen. Alleen
bij gebruik maken van granaatjes waren de verschillen in
uitkomsten, vergeleken met die, met suspensies verkregen,
gering, terwijl oplossingen van zeepen en van kresol in \'t
geheel weinig verschillen te zien gaven. Ook hier bleek,
dat, hoe verdunder de suspensie van bacteriën was, des te
sneller afsterving plaats vond; wanneer van een „Keim-
unterlagequot; gebruik gemaakt werd, was de invloed van de
hoeveelheid kiemen per cm-quot;^ geringer, hetgeen bevestigd
wordt door Hailer 2).

Een van de eerste methoden, die onderlinge vergelijking
der verkregen resultaten toeliet, werd uitgewerkt door
Koch3).

Een suspensie van Bacillus antracis werd aan zijden
draadjes gedroogd en gedompeld in een oplossing van het

\') Zeitschr. f. Hyg. u. Inf. Krankh. 108. 125 en 746.
Arb. Reichsges. Ambt 52. 696. 1920.
Arb. Ksl. Ges. Ambt. I 1881.

desinfectans. Na bepaalde tijden werden deze draadjes
uit de oplossing verwijderd, van het desinfectans door
uitwasschen zoo goed mogelijk bevrijd, en de organismen
vervolgens op groei onderzocht. K o c h vond op deze wijze
o.a. dat HgCl2 een sterk desinfectans was.

Fraenkel^) en v. Behring^) wezen er op, dat
uitwasschen alleen van die draadjes niet alle desinfectans
verwijderde. Een gevonden steriliteit van den controle-
voedingsbodem kon dus te wijten zijn aan daarin overge-
brachte chemicaliën.

In de werkwijze, gevolgd door Krönig en PauH)
vinden we een zeer verbeterde manier om tot vergelijkbare
resultaten te komen. Als „Keimunterlagequot; gebruiken wij
zoo goed mogelijk van gelijke grootte uitgezochte gra-
naatjes. Na reinigen en steriliseeren brengen zij op deze
granaatjes een suspensie van antrax-sporen en drogen.
Op een aantal aldus behandelde granaatjes laten zij het
desinfectans inwerken en nemen er op bepaalde tijden
telkens vijf uit. Na verwijderen van het desinfectans door
Na2S en uitwasschen met water, worden de aangekleefde
sporen door schudden in steriel water gebracht en van de
ontstane suspensie agar-platen gegoten.

Z i k e s 4) gaf een meer technische methode aan. Hij
liet het desinfectie-proces verloopen in een buis met een
afneembaar vernauwd gedeelte. Na eenigen tijd word*:
gecentrifugeerd en een nieuwe buis, gevuld met steriel
water op het vernauwde gedeelte gebracht. Na omschud-
den wordt nogmaals gecentrifugeerd en tenslotte door
aanbrengen van een buis met bouillon op groei ge-
controleerd.

1) Zeitschr. f. Hyg. 6. 1889.
V Zeitschr. f. Hyg. 1890.
3) Zeitschr. f. Physik. Chemie 21. 4 H. 1896.
Alg. Z. f. Brauerei u. Malzfabr. 1904.

Op deze wijze kan men het desinfectans op een groote
hoeveelheid van een organisme in laten werken, terwijl het
geheele bacterie-materiaal op kiemkracht onderzocht kan
worden.

Van de proeven, verricht aan suspensies, is de eerste
betrouwbare methode, die van RidealenWalker^).
Zij beschreven nauwkeurig de gevolgde techniek en ver-
geleken de gevonden desinfecteerende werking van een
stof met die van phenol. Deze methode werd door andere
onderzoekers becritiseerd en dikwijls in onderdeelen ver-
anderd, zoodat nog een aantal suspensie-methoden be-
schreven zijn, zooals de werkwijze aanbevolen door
„T heLancetcommissionquot;2),cle Amerikaansche
,,H ygienic Laborator yquot; methode ^) en die van
W r i g h t ^), die kritiek op het berekenen van den coëf-
ficiënt uitoefende.

In het algemeen voegt men bij een bepaalde temperatuur,
bij oplossingen, die de op het bactericide vermogen te
onderzoeken stof in verschillende concentraties bevatten,
een hoeveelheid bacterie-suspensie en gaat na regelmatige
tusschenpoozen na, of steriliteit reeds is ingetreden, door
een oogje uit deze buizen te brengen in sterielen bouillon
en dezen bij een geschikte temperatuur te bebroeden.

Verschillende voorzorgen t.o.v. een aantal zich hier
doen geldende omstandigheden moeten in acht worden
genomen.

The Lancet. 177. Nos. 4498. 4499 en 1500.
Anderson en Mc. Clintic. Hyg. Lab. Bul. 82.
Journ. Bact. 1917. 315. 346.

b.nbsp;Zijn resistentie moet in den loop der tijden zooveel
mogelijk dezelfde blijven.

c.nbsp;Het moet gemakkelijk voort te kweeken zijn op de
gebruikelijke voedingsbodems.

d.nbsp;Het moet liefst een groote, maar vooral een gelijk-
matige resistentie bezitten t.o.v. desinfectantia.

Aan de eerste en de derde voorwaarde is gemakkelijk te
voldoen. Wat den tweeden eisch betreft, kan men niet
meer doen, dan de voorgeschiedenis van de cultuur altijd
dezelfde te kiezen. Aan de voorwaarde van een gelijk-
matige resistentie is echter zeer lastig te voldoen, gezien
er vele voorbeelden bekend zijn, waarbij desinfectantia
een zeer specifieke werking op een bepaald organisme uit-
oefenen. Volgens Chick en Martini)is naar
gelang van de keuze van het organisme 17 ä 25 maal zoo-
veel phenol noodig voor het dooden van sporedragers, dan
voor vegetatieve kiemen.

Bechhold^) onderzocht chloor- en broom-deri-
vaten van y§-naphtol. Mono-Cl-/j-naphtol werkte in een
verdunning van 1 op 2000 groeibelemmerend op Bacterium
pyocyaneum en verder vrijwel gelijkmatig op diverse
andere bacteriën. Tri-Br-^-naphtol vertoonde in een con-
centratie van 1 op 1000 geen enkele werking op Bacterium
pyocyaneum, noch op tuberkelbacillen; op staphylococcen
was nog in een verdunning van 1 op 400000 een groei-be-
lemmerenden invloed merkbaar.

Rochaux en Pinet«¹^) wijzen op de sterk speci-
fieke werking van 3-5-dibroom-salicylzuur op staphylo-
coccen. Ook Zoller en Eaton^) en Felley^)
vonden groote verschillen in phenol-coëfficienten, wanneer
van verschillende organismen gebruik gemaakt werd.

Branham^) stelde gist voor als vergelijkingsorga-
nisme en koos als criterium voor totale desinfectie de meest
verdunde oplossing, die na een uur ingewerkt te hebben,
CO2 vorming uit een suikeroplossing belette. Overigens
bewijst dit niet, dat in dat geval volledige afsterving plaats
vond.

Van de genoemde methoden kozen zoowel R i d e a 1 en
W alker als Anderson en Mc. Clintic typhus
bacteriën; ,,t h e Lancet C o m m i s s i o nquot; gaf de
voorkeur aan Bactevium coli.

2e. Zooals boven uiteengezet is, moet de toegevoegde
hoeveelheid bacterie-suspensie in alle gevallen zooveel
mogelijk eenzelfde aantal kiemen bevatten per cm«^ en
moet dit aantal liefst een gelijke samenstelling bezitten
wat betreft resistentie. Praktisch kan men niet veel meer
doen dan steeds eenzelfde hoeveelheid (0.1 ä 0.2 cm*quot;^) te
nemen, steeds op dezelfde wijze bereid uit een cultuur van
denzelfden ouderdom.

3e. In hoeverre het gewenscht is, de desinfecteerende
werking steeds met phenol te vergelijken, is de vraag. Van
een dergelijke stof, als standaard gebruikt, mag zeker de
specifieke werking op verschillende organismen niet te
groot zijn. Volgens van Os-) en Lockemann^)
verdient het aanbeveling voor iedere groep van desinfec-
tantia een aparte standaardstof uit te kiezen.

4e. De samenstelling van den contrölevoedingsbodem
kan fouten veroorzaken. Anderson en Mc. Clin-
t i c geven voor dit doel de voorkeur aan Liebig\'s extract,
lettende op de constante samenstelling en de eenvoudige
doseering. Voor den zuurgraad geven zij aan p^ 8.5 voor

typhus. Voor Bacferium coli is volgens Spyeri) de
optimale groei te verwachten bij p„ ruim 7.

5e. De tijd, gedurende welken men het desinfectans in
Iaat werken, is min of meer willekeurig, even als de keuze
der tijdstippen, waarop men de geïnfecteerde buizen op
kiemkracht nagaat, mits natuurlijk steeds op dezelfde wijze
gewerkt wordt.

Evenwel loopen wij hier het gevaar, dat bij grootere
verdunning de onderlinge verhouding van twee desinfec-
tantia verandert, welk bezwaar zich natuurlijk ook in hooge
mate doet gelden bij de gebruikelijke wijze van het bereke-
nen der phenolcoëfficienten. Hierop zal later worden
teruggekomen.

6e. De proeven moeten bij constante temperatuur ge-
schieden en ook het bebroeden en nagaan van de contrôle-
cultures moet steeds op dezelfde wijze gebeuren. Meestal
wordt gecontroleerd na 24 en 48 uur. Wanneer gebruik
gemaakt wordt van Bactenum coli wordt zelden na 48 uur
nog groei geconstateerd.

7e. Het is dikwijls gewenscht, teneinde een geval uit
de praktijk zooveel mogelijk te benaderen, vreemde stoffen
als eiwit, urine, pepton etc. vóór de proef toe te voegen en
van het mengsel de doodende werking te bepalen. Meestal
valt de aldus gevonden waarde onvoordeeliger uit t.o.v.
het desinfectans.

Als vergelijkingsorganisme werd gekozen Bacterium
coli. De bacterie-stam werd vooraf op zuiverheid onder-
zocht en dit onderzoek werd van tijd tot tijd herhaald. De
stam bezat de kenmerkende eigenschappen der soort.

De gebruikte suspensie werd verkregen door op een
24 uur-oude, schuine agar-cultuur 5 cm«^ steriel water te
schenken en te schudden. De verkregen suspensie werd
gefiltreerd door een trechtertje en filter, dat in zijn geheel
vooraf op 170° gesteriliseerd was. Door het fikraat op te
vangen in een steriele buis, heeft men voor eenige proeven
suspensie in voorraad.

Het infecteeren van de in een thermostaat geplaatste
buizen, voorzien van bepaalde concentraties van de te on-
derzoeken stof, geschiedde door met een pipet-Pasteur
5 druppels van de boven beschreven suspensie toe te
voegen. Om te voorkomen, dat bij het inbrengen van de
kapillair, suspensie tegen den wand van de buis komt, trekt
men de buis zoover dun uit in de vlam, dat bij loodrecht
houden de vloeistof slechts zeer langzaam uitvloeit. Uit de
ervaring bleek, dat hiermede tevens bereikt wordt, dat het
toegevoegde volumen practisch constant is. Direct na het
inbrengen van de suspensie, werden de watteproppen van
de buizen vervangen door van te voren uitgegloeide ko-

peren doppen. Deze voorkomen eventueele infectie met
luchtkiemen en zijn gemakkelijker en sneller te behandelen
dan watten.

Alle proeven werden gedaan in een thermostaat bij 30°
de temperatuur van het water werd door een toluol-re-

De algemeene gang van zaken is de volgende-
5 steriele cultuurbuizen, in ieder waarvan men 5 cm^ var
de op desinfecteerend vermogen te onderzoeken stof in be-
paalde concentratie gebracht heeft, worden 20 min. in de
thermostaat geplaatst om op temperatuur te komen. Ten-
emde nu om de 5 minuten van iedere buis een waarneming
omtrent al dan niet ingetreden steriliteit te kunnen doen
worden, gerekend vanaf een bepaald tijdstip, de respec-
tieve bu.zen om de minuut op de boven beschreven wijze
gemfecteerd. Eén minuut na de daartoe vereischte 5 mi-
nuten wordt begonnen, met tusschenpoozen van I minuut
een oogje uit de buizen te brengen in gereedstaande buizen
met 10 cmj sterielen, alkalischen bouillon. Deze wordt na
afloop bebroed en op groei of steriliteit gecontroleerd na
1-. 2- en 3-maal 24 uur. Over \'t algemeen is de uitkomst
van een serie na 24 uur reeds duidelijk; slechts enkele
bmzen vertoonen nog groei na 2 dagen; na 3 maal 24 uur
werd zelden meer een positief resultaat gevonden. Bij
enkele proeven, gedaan met staphylococcen als vergelij-
kmgsbacterie, bleken deze, soms zelfs na een week nog
groei te vertoonen.

De gebruikte bouillon werd gemaakt door in 1 1. water
o^e lossen 10 gram L i e b i g \' s extract, 10 gram pepton
..Witte en 1 gram Na-phosphaat. Door toevoegen van
verdunde soda-oplossing werd de bouillon alkalisch ge-
maakt tot een p^^ van 7.5.

De verschillende concentraties van een te onderzoeken
stof werden verkregen door bepaalde hoeveelheden van
een oplossing van bekende sterkte en steriel water met
gecalibreerde steriele pipetten bij elkaar te voegen, steeds?
tot een totaal volumen van 5 cm^^.

Bij het maken van de oplossingen werden steriliteits-
voorzorgen in acht genomen, door het benoodigde glas-
werk als weeg fleschjes, maatkolven, glazen stoppen, etc.
van te voren ingepakt en van watteproppen voorzien, een
half uur op 170° te steriliseeren. Het inspoelen van de
op te lossen stoffen geschiedde met steriel water. Op deze
wijze kan het steriliseeren van de oplossingen voorkomen
worden, wat in verband met verdampen van de opgeloste
stoffen of chemische omzettingen zeer bezwaarlijk kan zijn.

De resultaten kunnen in tabellen worden aangegeven.
Van boven naar onder vindt men de onderzochte concen-
traties in procenten; van links naar rechts de tijden in mi-
nuten. De aanduiding of — geeft aan respectievelijk
groei of geen groei in den bouillon.

Het eerste inzicht, wat betreft de ligging van de
doodelijke concentraties van een bepaalde stof, wordt ver-
kregen aan de hand van een bepaling, waarbij de concen-
tratieverschillen tamelijk groot gekozen worden. Weet
men eenmaal ongeveer de ligging, dan kunnen meer ge-
differentieerde reeksen uitgevoerd worden. Op deze wijze
verkrijgt men een aantal kleine diagrammen, die telkens
van 5 concentraties aangeven de tijden, waarin deze con-
centraties de afsterving veroorzaken.

Door telkens een volgende tabel gedeeltelijk over de
vorige te laten vallen met de bovenste of onderste con-
centratie, heeft men een goede controle omtrent de ver-
kregen uitkomsten.

Op deze wijze werden de verschillende concentraties
tot 30 minuten, om de 5 minuten onderzocht; bij längeren

In eenige gevallen zijn waarnemingen om de minuut
gedaan. In deze gevallen moet iedere concentratie afzon-
derlijk behandeld worden.

Bij de keuze van de onderzochte concentraties is er
zooveel mogelijk rekening mede gehouden, dat de inwer-
kingstijden, behoorende bij opeenvolgende doodelijke
doses, niet meer dan 5 a 10 minuten van elkaar verschillen,
ten einde een zoo regelmatig mogelijk verloopend diagram
te verkrijgen.

De gebruikte stam van Bacterium coli bleek gedurende
het geheele onderzoek steeds dezelfde resistentie te
bewaren.

Volgens de in het vorige hoofdstuk beschreven werk-
wijze werd nu van eenige alkaloïden en verwante basen de
doodende werking onderzocht in verband met inwerkings-
tijd en concentratie.

De gebruikte chemicaliën waren Merck- en S c h u-
c h a r t-preparaten, die, zoo noodig door destillatie of door
omkristallisatie, gezuiverd werden.

a.nbsp;De doodelijke doses in 5 minuten zijn scherp vast te
stellen en men vindt bij herhaling van de proef steeds de-
zelfde uitkomsten.

b.nbsp;Hoe langer de onderzochte stoffen op de bacteriën
inwerken, des te moeilijker wordt het, om steeds dezelfde
resultaten te verkrijgen.

Wat betreft het opgemerkte onder a kan worden ge-
zegd, dat dit resultaat niet te verwonderen is. Na korten
tijd kan nog een groot aantal levende bacteriën aanwezig
zijn, terwijl de minst resistente gedood zijn.

Met betrekking tot het sub b genoemde mag worden
aangenomen, dat in dit geval de meest resistente indivi-
duen overgebleven zijn. De mogelijkheid is niet uitgesloten,
dat er zich onder deze eenige bevinden, die zich, na even-
tueel overbrengen in den bouillon, slechts langzaam van de
langdurige inwerking van de vreemde stof herstellen. Ook
neemt met het geringe totale aantal nog levende kiemen de
kans af, om op een gegeven oogenblik eenige levenskrach-
tige individuen in den bouillon over te brengen, vooral bij
de gevolgde techniek, waarbij één oogje wordt over-
gebracht.

Geconstateerd werd het feit, dat bij de bepaling van een
diagram het eindresultaat van de hoogere concentraties
met bij behooren den korten inwerkingstijd, na 24 uur
meestal niet meer verandert; bij längeren inwerkingsduur
is dit veelvuldig het geval.

Teneinde in de eerste plaats de onderzochte basen met
elkaar te vergelijken, zijn uit de voorgaande tabellen eenige
inwerkingstijden gekozen met de bijbehoorende doodelijke
doses, die onderlinge vergelijking zoo goed mogelijk toe-
laten. In onderstaande tabel zijn de basen gerangschikt
volgens toenemende dissociatie-constanten, terwijl voor
de doodelijke doses in 5 minuten de p^^ bepaald werd met
behulp van buffermengsels en indicatoren. Achter iedere
stof staan vermeld de doodelijke doses in 5, 15 a 20, 30 ä
40 en 80 ä 90 minuten, uitgedrukt in procenten.

Op deze wijze is een verband tusschen doodelijke dosis
en alkaliteit slechts globaal te zien.

Hierna werd nagegaan of een beter resultaat in dezen
zin verkregen werd, wanneer de concentraties in molen per
Liter uitgedrukt werden. Dit bleek inderdaad het geval
te zijn, zooals uit de tabel te zien is.

Deze tabel is in bijgaande figuur in lijnvorm gebracht.
De ordinaat geeft de doodelijke doses in molen per Liter
aan; de abcis de bijbehoorende inwerkingstijden. De aldus
verkregen punten worden door rechte lijnen verbonden.

Beziet men deze lijnen, lettende op de OH-concentratie,
die van onder naar boven afneemt, dan blijkt:

a.nbsp;Hoe sterker de base gedissocieerd is, des te kleiner
wordt voor eenzelfden inwerkingsduur de letale dosis.

b.nbsp;Tevens loopen deze lijnen met toenemende disso-
ciatie-constante steeds vlakker.

Vergelijken we dit resultaat met de uitkomsten van T e-
k e 1 e n b u r g 1), die vond. dat Bacterium coli bij 30° nog
60 minuten een Ph = 11.2 verdroeg, terwijl hij vaststelde,
dat bij een Ph = 11.61 binnen de 5 minuten afsterving
plaats vond, dan wordt het zeer waarschijnlijk, dat bij pi-
peridine en coniïne de werking van het OH-ion als doo-
dende factor de overheerschende is. De invloed van de
ongesplitste base en het anion staat bij deze stoffen op de
tweede plaats.

concentratie weldra sterk af en maakt deze dan plaats voor
de werking van het ongedissocieerde molecule.

In een dergelijk geval loopen de hier gegeven lijnen
steiler op; de OH-concentratie toch is gering en dus niet
snel doodend, zoodat er, om in korten tijd een volledige
afsterving van de organismen te bereiken, vrij veel van de
betreffende stof moet worden toegevoegd.

Het feit, dat een tamelijk hooge OH-concentratie nog
weinig of geen invloed heeft op de organismen, blijkt uit de
volgende proef.

Het diagram van pyridine werd nog eens bepaald,
waarvoor een standaard-oplossing werd bereid van 2.5 %
pyridine en 0.0025 NaOH. Van deze NaOH oplossing
was van te voren nagegaan, dat na een inwerking van
6 uren op Bacterium Coli nog geen volledige afsterving
bereikt was. Er mocht dus veilig worden aangenomen, dat
deze loogconcentratie voor ons doel van geen invloed was.
Bij het maken van de verdunningen pipetteert men bij met
0.0025 NaOH, zoodat op deze wijze alle concentraties
naast de respectieve concentraties van pyridine tevens
0.0025 NaOH bevatten. De Ph van deze oplossingen
was ± 10.5. Een diagram, op deze wijze bepaald, levert
dezelfde resultaten op als een bepaling zonder toevoeging
van NaOH.

Teneinde de onderzochte zouten met elkaar te vergelij-
ken, zijn eveneens eenige doodelijke doses uitgekozen, be-
hoorende bij een gelijken inwerkingstijd. De keuze was hier
beperkt, gezien de zeer hooge concentraties, die van de
zouten van niccvtine, piperidine en pelletierine noodig zijn
om de organismen te dooden. De oplosbaarheid van co-
deïne-HCl belette verder te gaan dan een 5 % oplossing;
na 100 minuten was nog steeds geen afsterving verkregen.

In\'t algemeen is te zeggen, dat de Hydrolyse en de daar-
door veroorzaakte zure reactie een voorname rol speelt.
Vergelijken we van deze stoffen twee uitersten, als pyri-
dine- en piperidine-HCl, dan zien we, dat het verschil in
doodelijke werking tusschen de respectieve oplossingen
vooral gelegen is in de concentraties van waterstof-ionen
en ongesplitste base; het Cl-ion, anion of ongespHtste zout
oefenen blijkens de hooge benoodigde doodelijke dosis van
piperidine-zout, geen overheerschenden invloed uit. Dit
laatste is evenmin het geval bij de zouten van nicotine en
pelletierine. De doodende werking van deze zouten wordt
dus geringer, naarmate de hydrolyse afneemt.

Iets dergelijks vindt Tekelenburg bij de neutra-
lisatie van zwakke organische zuren met sterke basen.
De neutrale zouten hebben een geringe doodende kracht;
zure zouten desinfecteeren sneller, terwijl de zuren zelf
desinfecteerend werken naar gelang van de waterstof-
ionen concentratie. Bij weinig gedissocieerde zuren over-
weegt de invloed van het ongedissocieerde molecule.

Er werd nog getracht ook eenige proeven te doen met
andere vergelijkingsorganismen, n.1.: Staphylococcus
aureus en Bacterium pyocyaneum.

Het bleek, dat met Staphylococcen de vereischte nauw-
keurigheid niet te bereiken was. Twee diagrammen met

gelijke concentraties gaven geheel andere uitkomsten; soms
werd nog na een week groei geconstateerd in den contrôle-
bouillon.

Cone.

NICOTINE.

Cone.

PIPERIDINE

Cone,

2.2				3.0				0.22
2.1				2,8				0.20
2.0				2.6				0.18
1.9				2.4				0.16
1.8				2.2				0.14
min.	5	10	15	min.	5	\|io	15	min.	5	10	15

De verkregen tabellen bieden een goede gelegenheid,
de berekening van de verschillende in zwang zijnde phe-
nol-coëfficienten te bespreken.

Werkende volgens de Rideal-Walker methode
bepaalt men van het desinfectans en van phenol een dia-
gram. Men doet waarnemingen omtrent groei of steriliteit
om de lYi minuut voor iedere concentratie en kiest nu uit
beide diagrammen één concentratie uit, die in denzelfden
tijd volledige afsterving van de organismen veroorzaakt.

De verhouding van deze concentraties geeft dan de
coëfficiënt aan (de concentraties uitgedrukt als: i op x
gram water).

In de bijgaande tabel is voor een aantal inwerkingstijden
deze verhouding voor de onderzochte stoffen berekend en
deze is achter iedere stof van links naar rechts af te lezen.

Het bezwaar, dat algemeen tegen deze wijze van bere-
kenen ingebracht wordt, komt ook hier duidelijk aan den
dag: bij een voortschrijdende verdunning kunnen de af-
wijkingen zeer groot worden.

De berekening van de coëfficiënt volgens A Tl d 6 U S O
en M c C 1 i n t i c\'s Hygienic Laboratory methode komt
eenigszins aan dit bezwaar tegemoet, door het gemiddelde

doodelijke dosis desinfectans
doodelijke dosis phenol
respectievelijk na lYi minuut en na 15 minuten.

Aan de cijfers in de tabel is te zien, dat van de onder-
zochte stoffen, binnen dit tijdsverloop, deze verhouding
nog tamelijk weinig verandert. Bovendien is op deze wijze
de keuze van den inwerkingsduur, gebruikt bij de bereke-
ning, vastgelegd; iets wat volgens Rideal-Walker
niet het geval is. Een en ander waarborgt een betere
overeenstemming tusschen proeven, gedaan door verschil-
lende onderzoekers.

De invloed van een längeren duur van inwerking op de
benoodigde doodelijke dosis komt ook hier niet te
voorschijn.

Ook bij de berekening van den coëfficiënt volgens de
Lancet-commission neemt men een gemiddelde
tusschen 2 inwerkingstijden aan. Zij kiest het gemiddelde
tusschen de verhouding:

doodelijke dosis phenol in lYi minuut
doodelijke dosis phenol in 30 minuten
en dezelfde voor het te onderzoeken desinfectans.

De tijd is dus iets langer gekozen; overigens gelden hier
dezelfde bezwaren als boven.

De groote moeilijkheid is dus gelegen in het feit, dat van
twee desinfectantia de doodelijke doses, behoorende bij een
korten inwerkingstijd, zeer veel van elkaar kunnen ver-
schillen, terwijl bij een längeren inwerkingsduur hun werk-
zaamheid. uitgedrukt in de doodelijke concentraties, zeer
sterk tot elkaar nadert.

L O c k e m a n n ^) wil om deze reden bij de bepalingen
van deze soort gaan van 5 minuten tot 60 minuten, met

tusschenpoozen van 5 minuten. Ook is hij een voorstander
van het indeelen der desinfectantia in groepen, die che-
misch verwante stoffen omvatten. Voor iedere groep kan
dan een stof als eenheid gekozen worden. Op deze wijze
kan het bovengenoemde bezwaar van den invloed der ver-
dunning sterk verminderd worden.

Gegenbaueri) ig yan meening, dat naast een
uitvoerige beschrijving van de gevolgde werkwijze, de
volledige diagrammen van het desinfectans en de als een-
heid gekozen stof gegeven moeten worden.

Dikwijls bleek het mogelijk, de resistentie van een
bacteriestam t.o.v. een bepaald desinfectans, op te voeren.
Door kleine hoeveelheden van voor het betreffende orga-
nisme giftige stoffen aan b.v. bouillon toe te voegen en
maanden achtereen steeds over te enten in denzelfdcn
voedingsbodem, waarbij de dosis giftige stof geleidelijk
opgevoerd werd, doch steeds gehouden werd onder den
groei geheel belemmerende dosis, gelukte het de organis-
men aan betrekkelijk hooge concentraties van de toege-
voegde stof te gewennen. Dat wil zeggen: de dosis, die
ten laatste den groei verhinderde, kon eenige malen groo-
ter zijn dan die, waarmede de proef aanving. Dit gold voor
een bepaalden bacteriestam slechts t.o.v. één desinfectans
of t.o.v een chemisch hieraan zeer na verwante stof.

Zooals vroeger uiteengezet is, sterven, wanneer we op
een bacterie-suspensie een desinfectans in laten werken,
niet alle bacteriën tegelijk af; een klein aantal weerstaat
het langst den schadelijken invloed.

De resistentie van een bepaalden stam zou dus ook
grooter moeten worden, wanneer het mogelijk zou zijn,
het gedeelte zeer resistente individuen te vergrooten,
Theoretisch wordt de maximale weerstand van den stam
bereikt, indien ten slotte alle individuen dezelde resisten-

de bezitten, als die, welke gedurende het afstervings-
proces het langst in leven bleven..

Op de volgende wijze werd getracht deze fractie van
meer resistente kiemen op te voeren in een cultuur van
Bacterium coli.

Wanneer volgens de beschreven werkwijze het des-
infecteerend vermogen van phenol t.o.v. Bacterium coli
bepaald wordt, blijkt, dat 0.5 % phenol in 50 minuten een
suspensie van den hier gebruikten stam volledig doet af-
sterven. Als om de 5 minuten een waarneming verricht
wordt, door een oogje, uit de buis met desinfectans en bac-
terie-suspensie, te brengen in bouillon, blijkt, dat na 45
minuten inwerkingstijd voor het laatst groei wordt ge-
constateerd.

Volgens het voorgaande zouden zich op dat moment
in de buis met desinfectans relatief een grooter aantal
individuen met een grootere resistentie moeten bevinden.
Voor het geval, dat de nakomelingen van deze individuen
ook weer een grootere resistentie bezitten, zal dus een
cultuur, aangelegd uit den contrôle-bouillon, waarin na
45 minuten inwerking van 0.5 % phenol nog groei optrad,
een grootere resistentie moeten vertoonen, dan de eerst-
gebruikte cultuur.

Aangezien men natuurlijk sterk afhankelijk is van de
kans, al dan niet dezen resistenten vorm reeds bij de
eerste maal in een groot aantal over te enten, zal pas na
eenige malen herhalen van deze proef, dus door telkens
opnieuw met een cultuur, gegroeid uit de kiemen, welke
den schadelijken invloed van phenol het langst weerstaan,
het onderzoek voort te zetten, geconstateerd kunnen wor-
den, of van eenig effect in dezen zin sprake is.

Tijdens een dergelijke proef zou dus het aantal resis-
tente kiemen in de opeenvolgende gebruikte suspensies
steeds toe moeten nemen. De mogelijkheid, om met het

oogje eenige zeer levenskrachtige individuen in den con-
trôle-bouillon over te brengen, wordt dan dus steeds
grooter. Op deze wijze zou geconstateerd kunnen worden,
dat de gevonden tijd, noodig om volledige afsterving te
bereiken, steeds grooter werd.

Teneinde dit na te gaan, werd 0,5 % phenol gekozen
als concentratie en op de gewone wijze den tijd, voor de
volledige afsterving vereischt, bepaald. Zooals gezegd
werd na 45 minuten voor de laatste maal groei geconsta-
teerd. Van de uit phenol verkregen bouilloncultuur werd
vervolgens een schuine agarcultuur gemaakt; een suspen-
sie, hiervan bereid, diende voor de tweede proef. Zoo
voortgaande bleek, dat de tijd, vereischt om steriliteit te
verkrijgen, toenam, en eerst na 5 à 6 maal herhalen van
dit procédé constant bleef ( Diagram I ).

Ter controle werd nu ook nagegaan, of bij kortere
inwerkingstijden en hoogere concentraties dit resistentie
verschil ook aan den dag trad. Om dit te kunnen consta-
teeren was het noodig, zeer kleine concentratie-sprongen
te kiezen en om de minuut waarnemingen te doen omtrent
al dan niet bereikte steriliteit.

Iedere concentratie moet dan natuurlijk afzonderlijk
onderzocht worden. Het geconstateerde verschil in resis-
tentie tusschen de oorspronkelijke cultuur A eenerzijds en
cultuur B anderzijds, komt ook op deze wijze duidelijk te
voorschijn (Diagram II en III). Door de proef wordt de
doodelijke dosis in één minuut, die voor cultuur A 0.9 ^o
phenol bedraagt, verhoogd tot 1 % phenol (cultuur B)*!^

Verder blijkt b.v., dat door 0.675 % phenol een suspen-
sie van cultuur A in 6 minuten afsterft, terwijl hiertoe bij
toepassing van cultuur B 9 minuten vereischt zijn.

Wanneer we aannemen, dat inderdaad een opeen-
hooping plaats vindt van de meer resistente individuen,
blijft toch nog de vraag over, hoe het gesteld is met de

De totale resistentie, die wij hier meten, is de resultante
van een bepaalde verdeeling der groepen van verschillen-
de resistentie. Het zou van belang kunnen zijn, na te
gaan, of in een ééncel-cultuur ook zoo\'n verdeeling voor-
komt. Wanneer de resistentie van de nakomelingschap
van één enkele bacterie eveneens op de boven beschreven
wijze is op te voeren, moet daaruit besloten worden, dat
ook hierin meer resistente- naast minder resistente variaties
kunnen optreden.

Er werden nu 8 ééncel-cultures gekweekt uit de coli-
stam b. Mej. b. c. H. b r o e k isoleerde deze met den
micro-manupilator volgens Schouten, waarvoor hiei
gaarne onze dank gebracht wordt. Van deze 8 stammen
werd een diagram t.o.v. phenol bepaald. Het bleek, dat vier
van deze stammen zich, wat de resistentie betreft, gedroe-
gen gelijk aan de oorspronkelijke cultuur A (No.\'s 2, 4. 6
en 8; doodelijke dosis in 1 minuut 0.925 % phenol). De
vier andere (No.\'s 1, 3, 5 en 7; doodelijke dosis in ! minuut
1 % phenol) waren gelijkwaardig aan stam b. (Diaqram
IV tot XII.)

Het bleek mogelijk, door toepassing van de boven
beschreven werkwijze, de minder resistente ééncel-stam-
men (No.\'s 2, 4, 6 en 8; doodelijke dosis in 1 minuut
0.925 % phenol) toch nog op de sterkte van den oor-
spronkelijken stam B (doodelijke dosis in 1 minuut 1 %
phenol) te brengen (Diagram XII tot XVI).

Het gelukte niet de doodelijke dosis in 1 minuut, die
voor de stammen No.\'s 1, 3, 5 en 7 gelijk was aan die van
stam B, en wel 1 % phenol, nog verder op te voeren.

Op volkomen gelijke wijze was eveneens een toeneming
van de resistentie te verkrijgen, indien in plaats van phe-
nol met benzoëzuur of salicylzuur van een bepaalde, voor

Verhooging der resistentie van de oorspronkelijke
cultuur A t.o.v. salicylzuur en benzoëzuur.

Cone.

in O/o

XXV TOT XXIX. BENZOËZUUR.

Salic, z. resist, cult. Benz. z. resist, cult. Phenol, resist, cult.

Cone.

in o/o

Cone.

0.30				0.30					0.30					0.30	4-	4-
0.29				0.29					0.29					0,29	4-	4-
0.28				0.28					0.28					0.28	4-	4-
0.27				0.27					0.27					0.27	4-	4-	4-
0.26				0.26					0.26					0.26	4-	4-	4-	4-
0.25				0.25					0.25					0 25	4\'	4-	4-	4-
0.24				0.24					0.24				4-	0.24	4-	4-	4-	4-
0.23				0.23					0.23	4-			4-	0.23	4-	4-	4-	4-
min.	1	2	3	min.	1	2	3	4	min. j	1	2	3	4	min.	1	2	3	4

dit doel geschikte concentratie werd gewerkt (Diagram
XVI tot XXI). Hierbij wederom uitgaande van cultuur
A, bleek, dat bij den aanvang der proef met 0,025 %
salicylzuur volledige afsterving in 45 minuten bereikt
werd; na 5 „passagesquot; was steriliteit verkregen in 85
minuten. Voor .benzoëzuur (conc. 0,13%) waren deze
afstervingstijden respectievelijk vóór en na de proef 40
minuten en 80 minuten.

Getracht werd, hetzelfde ook met pyridine uit te voe-
ren. Dit gelukte echter niet, noch uitgaande van een één-
cel-cultuur noch met de oorspronkelijke cultuur A. Na 10
„passagesquot; was de resistentie nog dezelfde als bij den
aanvang der proef.

Het is dus mogelijk phenol-vaste, salicylzuur-vaste en
benzoëzuur-vaste stammen te verkrijgen; met pyridine
kon een analoog resultaat niet verkregen worden.

Vervolgens kan nu, met de verkregen stammen, die
respectievelijk phenol, benzoëzuur en salicylzuur resistent
zijn, nagegaan worden, of deze verhoogde weerstand spe-
cifiek is t.o.v. de stof, waarmede de proef werd gedaan.

Teneinde dit te constateeren, stelt men voor iedere stof
hetzelfde diagram vast, en wel van de oorspronkelijke
cultuur A, alsmede voor de drie cultures, die resistenter
gemaakt zijn t.o.v. respectievelijk salicylzuur, benzoëzuur
of phenol (Diagram XXI tot XXXVII).

Het blijkt, dat door 0,125 % salicylzuur een suspensie
van de oorspronkelijke cultuur A binnen de minuut af-
sterft. Echter zijn hiertoe bij toepassing zoowel van de
salicylzuur-vaste cultuur, als van de benzoëzuur- en
phenolvaste cultuur 3 minuten vereischt.

Ook t.o.v. benzoëzuur en phenol vertoonden de salicyl-
zuur-, benzoëzuur- en phenolvaste stammen een verhoog-
de resistentie.

Pyridine bepaald. De doodelijke dosis van de oorspronke-
lijke cultuur A in één minuut werd vastgesteld op 3.6 %
Pyridine, die van de salicylzuur-, benzoëzuur- en phenol-
vaste stammen waren weer onderling gelijk en wel 4 %
Pyridine. Van specificiteit is dus geen sprake, hetgeen
pleit voor de opvatting, dat de proefondervindelijk aan-
getoonde verhoogde resistentie van de beschreven coli-
stammen slechts kan worden verklaard door het feit, dat
een successieve opeenhooping plaats vindt van de meer
resistente variaties, die in gering aantal reeds aanwezig
waren in de oorspronkelijke cultuur.

Ook in de nakomelingschap der ééncel-cultures moeten
dergelijke variaties worden aangenomen.

Het feit, dat uit de resistente cultuur B 8 ééncel-cultures
verkregen zijn. waarvan er 4 resistent en 4 minder resis-
tent waren, zou er op kunnen wijzen, dat door een ver-
grooting van het aantal „passagesquot; deze verhouding
wellicht ten gunste van de resistente cultures verschoven
kan worden. De gevolgde techniek echter verhindert
wellicht deze ophooping, want met het oogje, bij het over-
enten gebruikt, zullen altijd ook minder resistente vormen
in den contrôle-bouillon overgebracht worden.

Het aantal proeven, dat verricht werd. is evenwel te
gering, om op grond daarvan deze conclusie met zeker-
heid te mogen trekken.

Wat betreft het behouden van de verkregen verhoogde
resistentie van de genoemde stammen, kan worden ge-
zegd. dat na 6 maanden nog geen verlies van deze
eigenschap geconstateerd werd.

Hoewel de hier gegeven opvatting de eenvoudigste
hjkt, is het toch ook nog mogelijk bij deze resistentie-
veranderingen van een aanpassing te spreken. De vraag
komt dan naar voren, hoe we deze veranderingen op
moeten vatten in verband met de erfelijkheidstheorie. In

. de Genetica wordt de erfelijkheid bepaald door de geno-
typische constitutie: een erfelijke combinatie van een aan-
tal eigenschappen. Deze genotypus is volgens de erfelijk-
heidsleer in het algemeen onveranderlijk.

Daarnaast hebben we de phaenotypus, als reactie van
den genotypischen aanleg op bepaalde uitwendige om-
standigheden.

Echter behoeven individuen van denzelfden geno-
typischen aanleg onder practisch gelijke levensomstandig-
heden nog niet volkomen gelijk te zijn. Zij kunnen
variëeren. d.w.z. onderlinge verschillen vertoonen. Men
onderscheidt daarbij:

De fluctuaties of modificaties zijn niet erfelijk. Zij zijn
dus nimmer veranderingen van den genotypus, maar juist
eigenschappen daarvan. Wanneer men een zuivere lijn
beschouwt, hebben alle individuen dezelfde genotypische
constitutie, waaraan door selectie niets is te veranderen.
Modificaties behoeven dus nooit duurzaam te zijn, omdat
de genotypische aanleg onveranderd blijft.

De mutaties of sprong-variaties stellen we ons theore-
tisch echter voor als een plotselinge verandering van de
genotypische constitutie, waarvan de eigenlijke oorzaak
ons nog onbekend is. Deze mutaties zijn dus wel degelijk
erfelijk.

Ook in de bacteriologie zijn de begrippen genotypus en
phaenotypus ingevoerd i). Ook voor bacteriën kunnen
we dan een genotypischen aanleg aannemen, waardoor
de soort gekenmerkt is en bovendien een phaenotypi-
schen aanleg, die aangeeft, op welke wijze de soort rea-
geert op de uitwendige omstandigheden.

wen als verschillen, die niet door selectie zijn vast te
houden; verschillen, als b.v. de grootte van koloniën,
ontstaan op een agar-plaat. Het is niet mogelijk door
uitzoeken een stam te krijgen, die uitsluitend groote of
uitsluitend kleine kolonies geeft.

Vervolgens komt de vraag naar voren, op welke wijze
we het tijdelijk verwerven of verliezen van een bepaalde
eigenschap, moeten beschouwen. Deze eigenschappen
toch verdwijnen weer, als de oorzaak wordt opgeheven.
Het kan echter in sommige gevallen zeer lang duren, voor
dat dit het geval is en men heeft voor dit verschijnsel dan
ook den naam „Dauermodificationquot; voorgesteld.

Echter is volgens de Genetica een modificatie een ver-
andering, die slechts samenhangt met de eigenschappen
van het milieu. Wanneer men dus in strijd hiermee een
modificatie opvat, als zijnde veroorzaakt door een tijde-
lijke verandering van de erfelijke eigenschappen, dan zou
dus de genotypische aanleg zeker tijdelijk veranderd
moeten zijn.

Van Loghem^) geeft, naar aanleiding van deze
moeilijkheid, beschouwingen, waarin tot uiting komt, hoe
men nu, sprekende over bacterieëele erfelijkheid, deze
tegenstrijdigheid vermijden kan.

Volgens de Genetica heeft de veranderlijkheid betrek-
king op verschillen tusschen het ouderlijk individu en zijn
nakomeling en tusschen de nakomelingen onderling. Bij
de hoogere organismen kan men gemakkelijk ouder en
nakomeling onderscheiden en met elkaar vergelijken en
men stelt vast, dat beide verschillende individuen zijn.

Bij de bacteriën is dit minder gemakkelijk. Bij één-
celligen, die zich uitsluitend door deeling vermenig-
vuldigen, ontstaat feitelijk geen nakomeling als af-

zonderlijk individu, doch is het een deel van den ouder
zelf, dat als nakomeling voordeeft. Wil men het begrip
individu behouden, dan moet men daarvoor dus kiezen
de heele reeks cellen, die tenslotte uit één ééncellig wezen
ontstaat. Deze reeks individuen geeft v. L o g h e m den
naam ,,kloonquot;.

Aldus opgevat is een verandering van den kloon, als
individu beschouwd, dus mogelijk en kan worden op-
gevat als een verandering van de phaenotypische
constitutie, als gevolg van de reacde op een wijziging van
het milieu.

Deze reacde of aanpassing aan het milieu kan nu weer
van negadeven of van posideven aard zijn.

Wat het eerste geval betreft: men kan b.v. een asporo-
gene miltvuur-stam verkrijgen, door kweeken op 42°.
De Genedca noemt dit een mutade, want ook onder de
gunsdgste omstandigheden gebracht, blijft deze negatieve
eigenschap gehandhaafd.

Volgens de opvatting van van Loghem echter is
de kloon door de behandeling bij 42° verminkt en blijft
deze verminking verder behouden. Er heeft een mutilade
plaats gevonden; dus geen genotypische verandering of
mutatie.

Op deze wijze voortgaande is ook de bacteriëele adapta-
tie niet erfelijk, doch een vorm van een tijdelijke indivi-
dueele of kloon-aanpassing. Toch blijft de moeilijkheid op
welke wijze een verandering te verklaren, die een werke-

lijk blijvende aanwinst van eigenschappen beteekent. De
opvatting, als zou een dergelijke verandering een terugslag
beteekenen tot een vroeger bezeten eigenschap, levert
moeilijkheden, kan zelfs bezwaarlijk gehandhaafd worden
met betrekking tot een aanpassing aan phenol.

Voor het geval, dat men toch de boven beschreven
resistentie-verhoogingen, waargenomen aan stammen van
Bacterium coli, als een aanpassing aan de gebruikte che-
mische agentia wenscht te beschouwen, moet deze aan-
passing opgevat worden als een wijziging van de phaeno-
typische constitutie van den kloon in positieven zin, die ziel\'
in ons geval tot nu toe gedurende 6 maanden, onder
overigens geheel normale omstandigheden (agar-cultuur),
geheel onverzwakt heeft gehandhaafd.

Een overzicht werd gegeven van de voornaamste lite-
ratuur over de bactericide werking van alkaloïden op
micro-organismen, alsmede van de werkwijzen, in gebruik
voor het bepalen van het desinfecteerend vermogen eener
stof.

Van een aantal alkaloïden en verwante basen werd het
desinfecteerend vermogen bepaald t.o.v. Bacterium coli.
Het bleek, dat bij de sterke basen (b.v. coniïne en piperi-
dine) de werking van het OH-ion als doodende factor de
overheerschende was.

Bij de zwakke basen nam de invloed van de OH-con-
centratie weldra sterk af en maakt deze plaats voor de
werking van de ongedissocieerde moleculen.

Eveneens werd de bactericide werking van een aantal
zouten van de onderzochte basen nagegaan. Gevonden
werd, dat de doodende werking van de zouten van de
sterke basen zeer gering was, vergeleken met die der
zouten van de zwakke basen.

Dit verschil in bactericide werking werd toegeschreven
aan de optredende hydrolyse, die in de oplossing van de
respectieve zouten verschillen veroorzaakt in de concen-
tratie van de waterstof-ionen en die der ongedissocieerde
moleculen.

Vervolgens werd een werkwijze beschreven om de
resistentie van Bacterium coli, met behulp van een des-
infectans, te verhoogen.

Dit toenemen van de resistentie bleek niet specifiek te
zijn t.o.v. de stof, die hierbij als desinfectans gebruikt was.

Tenslotte werd getracht een verklaring te geven van
de proeven, in het tweede gedeelte beschreven, mede aan
de hand van de verkregen resultaten met ééncel-cultures.

Het is niet bewezen, dat de verandering in physische
eigenschappen, die Baker e.a. vonden, alleen aan dro-
ging moet worden toegeschreven.

De metingen van Tammann en von Gronow,
verricht aan dunne vliesjes van Na-oleaat, veroorloven
geen voorspellingen omtrent de lengte van andere onver-
zadigde vetzuur-moleculen.

Een verklaring van de abnormale dampspanningen van
tridymiet en kristoballiet, gevonden doof van N i e u-
wenberg en Blumendal, is alleen mogelijk na de
bepaling van het P, T-diagram SiOo—H2O.

De asymmetrische formule van dicyclopentadieen ver-
dient de voorkeur boven de symmetrische.

Het is niet bewezen, dat de fluorescentie, die optreedt
bij de reactie op /5-naphtol volgens de Haas, toege-
schreven moet worden aan acetaldehyde.

Het onderzoek van van Dooren de Jong wijst
uit, dat de bacteriophaag een product is van de levende
bacterie-cel.

De prijs van een desinfectans mag niet bepaald worden
door phenolcoëfficienten, met het oog op de wijze, waarop
deze laatste berekend worden.

Gecontroleerd na	Strychninezout in %	Anion	geen groei = — groei =
2 dagen	3	PO4
1	I	if
8 „	1	i*
50 „	Vi	n
1	2	cr
1 ..	1	gt;gt;
8 „	Vi	if
50 „	Vi	sorquot;

Temp. waarbij af-	Ouderdom der	Afgestorven
sterving plaats vond	cultuur	in 5 minuten
51 °	6 uur	100 %
49 °	5]/2 uur	86 Jo
47 °	SYi uur	71 %
49 °	8 uur	73 %
5o.r	13 uur	58 %
48 °	28 uur	3 Jo

	Ph	Doodelijke doses in % na resp.
5 min.	10è15 min.	30a40 min.	80 él 90 min-
Pyridine	8.3	2.3	1.8	1.2	0.06
«r-picoline	8.6	2.0	1.6	1.3	0.7
nicotine	9.7	3.1	2.2	1.4	1.1
pelleteriene	10.1	2.0	1.0	0.84	0.55
piperidine	11.0	0.24	0.19	0.09	0.05
coniïne	11.1	0.19	0.13	0.09	0.6

	Ph	Doodelijke doses in	molen p. L.	na resp.
	5 min.	15è20 min.	30 a 40 min.	80 a 90 min.
pyridine	8.3	0.29	0.23	0.15	0.076
«-picoline	8.6	0.22	0.17	0.14	0.075
nicotine	9.7	0.19	0.14	0.086	0.068
pelleteriene	10.1	0.14	0.07	0.057	0.039
coniïne	11.0	0,028	0.02	0.011	0.0058
piperidine	11,0	0,015	0.01	0.007	0.0047

	Ph	Letale doses In 15 è 20 minuten
		in%	in molen p. L.
pyridine HCl	3.2	3.5	0.3
nicotine HCl	3.8	15	0.75
piperidine HCl	4.6	gt;25	gt; 2.0
pyridine HNO3	3.6	1	0.07
pyridine H2SO4	2.6	0.18	0.01
pelletierine H2SO.i	5.4	±15	0.62

	Doodelijke dosis in 5 minuten
in %	in molen p. L.
pyridine	2.2	0.27
a-picoline	1.9	0.20
nicotine	2.8	0.17
piperidine	0.20	0.023

Concen- tratie									MINUTEN
in pro- centen	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20	25	30	35	40 \|45	50 55	60	70	80	90	100
0.925	±																														1
0.900
0.875
0.850
0.825		±
0.800
0.750			±
0.700
0.675
0.650
0.625
0.600												±	±
0.575 0.550 0,525 0,500 0.480 0.460 0.440 0.420								4-								4-	±	± ■			±			±		±		±	±	±

Cone, in o/o	MINUTEN
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11		! 12	1 13	14	1 15	20	25	30	40	50	60	70	80	90	100
4.0	±
3.8
3.6
3.4
3.2
3.0
2.8
2.6			±
2.4				±
2.3
2.2
2.1									±
2.0		4-											±	±
1.6		-1-									-t-
1.2																			±
1.0																			±
0.8
0.7
0.6																							±
0.55																								±
0.50																								±	±

2.0
1.9
1.8
1.7
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2								±
1.1								±	±
1.0						■
0.9
0.8
0.7											±
0.65											±
0.60													±
0.55													±
min.	5	10	15	20	25	30	40	50	60	70	80	90	100

11 quot;/Ü 3.1
3.0
2.9
2.8
2.7
2.6
2.5
2.4
2.2
1.8				±
1.4					±
1.3			■
1.2								±
1.1										±
1.0
0.9		H-		.									±

min.	5	10	1	20	25	30	40	50	60	70	80	90	ioo\|

m wo 1.8	±
1.6
1,4
1.2
1.0				±
0.9
0.8						±
0.7								±
0.65
0.60									±
0.55											±
0.50
0.45					-f
min.	5	10	15	20	25	30	40	50	60	70	80	90	100

lu vyu 1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8				±
0.7				±
0.65
0.60								±
0,55
0.50												±
min.	5	10	15	20	25	30	40	50	60	70	80	90	100

0.45
0.40	±
0.35
0,30
0.25
0.20
0.18
0.15				±
0.10
0.09
0.07
0,05								±
0.04												±
0.03
min.	5	10	15	20	25	30	40	50	60	70	80	90 j	100

in
5.0	±
4.8
4.6
4.5
4.0
3.5
3.0				±
2.5							1
2.25
2.0							±	±
1.9
1.8
1.7									±
1.6										±
1.5							-1-
min.	5	10	15	20	25	30	40	50 1	60	70	80 1	90	100

Cone. in o/o	MINL	TEN
1	2	3	4	5	6	1 7	8	9	10	11	12	13	14	15	20	25	30	35	40	45	50	55	60
0.125
0,120
0.115
0.110
0.105
0.100
0.095
0.085			±
0.080			±
0.0775
0.075
0,072^					±
0.070					±	±
0.067\'								±
0.065									±
0,062\'									±	±
0.060		4-
0.055											■	±	±
0050
0.045
0.040
0.035
0030																				-t-
0.025											-f				H-
0.022\'

Pyridine	0.23	0.24	0.28	0.31	0.30	1 0.30				0.30					0.30			0.21			0.7			0.88
Salicylzuur Benzoëzuur	7.4 3.3	78 3.3	8.4 3.4	9.4 3.4	9.6 3.5	9.3		9.3 3.6		9.6				3.7	10.6	4.1	4.2	15.8			22.2	4.3		4.4
a Picoline					0.34					0.34					0.37	0.38	0.39		0.39			0.60		0.65
Nicotine					0.23					0.26					0.27			0.39		0.38	0.40			0-46
Pelletierine					0.38					0.52							0.61				0.77			0.87
Piperidine					2.9					3.1					4.0	7.1				12.5	7.2			15.3 8.8
Coniïne					3.7					4.2					4.3	4.8		5.5
Pyr. HCl					0.13					0.13					0.14	0.16	0.18				0.26			0.29
Pyr. HNO3					0.43					0.52					0.54	0.63	0.68				0.83			0.92
Pyr. H2SO4					1.7					2.5					3.0	3.2	3.6				9.6	1		11.0
minuten	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	1 20	\|25	30	40	50	1 60	70	80	90

11. lt;0 25
22.5
20
17.5
15
min.	5	10	15	20	25	30

20
15
10

2
mill.	5	10	15	20	25	30

cunuur. 2
4
6
8
minuten	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90
Nos, één-cel- cultuur.
2									-
4
6
8
minuten	30 1	\|35	40	1 45	1 50	1 55	1 60	1 65	70	\|75	1 80	1 85	1 90

Conc.	MINUTEN
in %	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	20	25	30	40	50	60	\|70	80	90
0.30																						1
0.28
0.27
0.26																						1
0.25
0.24
0.23
• 0.22
0.20					±
0.18							±
0.16			4-
0.14
0.13				4-
0.125
0.120
0.115
0.110												\'									±
0.105

1.00
0.975
0.950
0.925
0.900
0.875
0.850
0.825
0.800
0.775
0.750
0.725
0.700
0.675
0650		■
0.625
0.600
min.	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15

1 Conc. in o/o				2 Conc. in o/o		3 Conc. in o/o				4 Conc. in o/o
1.00				1,00				1.00				1.00
0.975				0.975				0.975				0.975
0.950				0.950				0.950				0.950
0.925				0.925				0.925				0.925
0.900				0.900				0.900				0.900
0.875				0.875				0.875				0.875
0.850				0.850				n.850				0.850
min.	1 1	2\|	3\|	min.	1	2	3	min.	1	2	3	min.	1	2\|	3

1.00				--- ■ u 1.00				1.00				1.00
0.975				0.975				0.975				0.975
0.950				0.950				0.950				0.950
0.925				0.925				0.925				0.925
0.900				0.900				0.900				0.900
0.875				0.875				0.875				0.875
0.850 (				0.850				0.850				0.850
min.	1 1	2 1	3	min.	1	2 1	3	min.	1	2 1	3\|	min. 1	1	2 j	3

^UilUUl . . 2
4
6 8			1
minuten	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80 i	85 1	90
Nos. één-cel- cultuur.
2
4
6
8
minuten \|	1 30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	! 80	85	90

^ . ^ 0.025 i 0.0225											-f
										rf
Benzoëz. ^ \' 0.12
minuten	30	35	40	45	50	55	60	65	70	75	80	85	90

1.000				1«« 1.000				1.000				1.000
0.975				0.975				0.975				0.975
0.950				0.950				0.950				0.950
0.925				0.925				0.925				0.925
0.900				0.900				0.900				0.900
0.875				0.875				0.875				0-875
0.850				0.850				0.850				0.850
min	1	2	3	min.	1	2	3	min.	1	2	3	min.	1	2	3